CN104558180A - 靶向t淋巴细胞的人源单链抗体 - Google Patents

Abstract

本发明涉及基因工程和蛋白质工程技术领域。具体涉及编码包含人源CD3抗体可变区片段的重组融合蛋白的DNA、其所编码的融合蛋白、该融合蛋白的生产方法、该融合蛋白的应用。本发明提供了包含人源CD3单链抗体的蛋白，其能够结合CD3阳性的T淋巴细胞，不结合CD3阴性细胞，显示出特异的靶向结合活性，具有良好的应用前景。

Description

靶向T淋巴细胞的人源单链抗体

技术领域

本发明涉及基因工程和蛋白质工程技术领域，具体地说，涉及编码包含人源CD3抗体可变区片段的DNA、其所编码的重组蛋白、该重组蛋白的生产方法、该重组蛋白的用途。

发明背景

T淋巴细胞是一种在人体内广泛分布的免疫效应细胞，在肿瘤免疫中发挥重要作用。T淋巴细胞发挥抗肿瘤效应的前提是其细胞内活化、增殖信号的启动。研究表明，CD3分子(clusterof differentiation 3)是T淋巴细胞活化的关键分子，其细胞内的免疫受体酪氨酸活化基序(ITAM)可以提供T淋巴细胞活化所需的下游信号。目前，针对CD3分子的单克隆抗体可以有效诱导CD3细胞内的ITAM磷酸化，从而激活T淋巴细胞。因此，CD3抗体可以被用作一种提高肿瘤免疫的药物。比如，商品化的CD3抗体OKT-3，当采用低剂量时已经被用于激活T淋巴细胞，可以提高肿瘤免疫。

当前，单克隆抗体已经成为一类重要的生物技术药物，主要以gamma球蛋白为主，即IgG型抗体。IgG型抗体由2条重链和2条轻链通过二硫键构成，分子量约150kD。作为人体治疗用的单克隆抗体主要为IgG型嵌合抗体和采用CDR移植技术构建而成的人源化抗体。在这些抗体中，原来鼠源的抗体恒定区被替换为人源抗体恒定区，甚至鼠源抗体可变区中框架区的部分氨基酸也被替换为人源抗体基因的氨基酸。通过这些改造，在一定程度上减少了原来鼠源抗体疗法引起的HAMA(Human antimous antibody)效应，提高了临床治疗效果。尽管如此，由于抗体可变区的部分氨基酸仍然为鼠源序列，因此无法完全避免HAMA效应的发生。

从抗体药物应用来说，人源抗体是用于人体治疗最理想的抗体，可以有效减少抗-抗体的产生，这可以避免提高抗体药物的耐药。但是由于技术上的难度，目前世界上成功的人源抗体极少。首先，由于伦理限制，无法采用类似制备小鼠杂交瘤细胞的方法借助人体生产人源抗体。其次，目前世界上转人源抗体基因的工程小鼠极少，更为关键的是由于抗体多样性产生的过程需要重链V-D-J基因重排和轻链V-J基因重排，而人抗体基因重排过程在小鼠体内受到很大限制，因此导致抗体的多样性受限。另外，抗体库技术近年来也被用于筛选人源抗体，但是由于缺乏类似人体内生发中心中的抗体亲和力成熟过程，因此产生的抗体亲和力常常较低。然而，由于人源抗体独特的优势和巨大的治疗价值，目前已经成为抗体药物发展的重要方向。已经上市的阿达木单抗(adalimumab)就是通过抗体库技术产生的人源单克隆抗体，用于治疗自身免疫性疾病，已经获得了巨大成功。

近年来，基因工程抗体发展迅速，其中单链抗体(single-chain variable fragment，scFv)就是一种重组小分子抗体。单链抗体由重链可变区和轻链可变区通过一条柔性连接肽构成，其大小仅为完整IgG型抗体的1/6，因而具有较好的组织渗透性。由于体积较小，单链抗体也经常与其他效应分子融合，作为重组蛋白药物的靶向识别域，因此单链抗体具有十分广阔的应用前景。尽管如此，由于缺乏抗体恒定区的支撑，因此并非所有单链抗体都能够保留有效的抗体结合活性，需要进行检验证实。而且，多数单链抗体的结合活性不足，往往需要进一步优化，因此获得具有足够结合活性的单链抗体是比较有挑战性的工作。

鉴于此，本发明提供了一种CD3单链抗体，特别的是，其重链和轻链可变区来源于人类抗体胚系基因，因此组成此CD3单链抗体的氨基酸为人源抗体序列。本发明的CD3人源单链抗体能够结合并靶向CD3阳性的T淋巴细胞。更重要的是，此抗体为全人源序列，可以有效地避免临床治疗应用中的HAMA发生。为本领域的具体提供了一种新的有效选择，具有很好的应用前景。

发明内容

本发明要解决的技术问题之一是提供一种抗人CD3的人源单链抗体，其能够结合CD3阳性的T淋巴细胞。

本发明首先提供了一种抗人CD3的抗体轻链可变区，其氨基酸序列如序列表中SEQ IDNO.4所示。

本发明还提供了一种抗人CD3的抗体重链可变区，其氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.2所示。

上述的两段序列均为本发明首次获得的人源化序列。

在获得了上述人源化序列的基础上，本发明提供了一种抗人CD3的单链抗体，该单链抗体是是由上述的抗人CD3的抗体轻链可变区和抗人CD3的抗体重链可变区连接而成。

轻链可变区和重链可变区的排列方式为VH-VL或VL-VH，VH位于单链抗体的N端，VL位于单链抗体的C端，表示为CD3ScFv-VHVL。VL位于单链抗体的N端，VH位于单链抗体的C端，表示为CD3ScFv-VLVH，

其中，上述抗人CD3的单链抗体中，所述的抗人CD3的抗体轻链可变区和抗人CD3的抗体重链可变区之间通过连接肽进行连接。连接肽可用本领域常用的各种连接肽。

其中，上述抗人CD3的单链抗体中，其结构可选的为轻链可变区-重链可变区、重链可变区-轻链可变区、轻链可变区-连接肽-重链可变区或重链可变区-连接肽-轻链可变区中的任意一种。

其中，在上述抗人CD3的单链抗体中，所述的连接肽的氨基酸序列为GGGGSGGGGSGGGGS或VEGGSGGSGGSGGSGGVD。

优选的，上述抗人CD3的单链抗体的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.6或SEQ ID NO.8所述。

本发明还提供了编码上述抗人CD3的抗体轻链可变区的基因。本发明提供了编码上述述抗人CD3的抗体重链可变区的基因。本发明还提供了编码上述的的抗人CD3的单链抗体的基因。

其中，上述的编码抗人CD3的抗体轻链可变区的基因，其核苷酸序列如序列表中的SEQID NO.3或其简并序列所示。

上述的编码抗人CD3的抗体重链可变区的基因，其核苷酸序列如序列表中的SEQ ID NO.1或其简并序列所示。

其中，上述的编码抗人CD3的单链抗体的基因，其核苷酸序列如序列表中的SEQ ID NO.5或7所示，或为它们的简并序列所示。

在上述方案的基础上，本发明还提供了上述编码基因的重组载体。这些种族载体可以选自质粒或病毒。

本发明也进一步地提供了包含上述重组载体的宿主细胞。所述宿主细胞可是真核细胞或原核细胞。

本发明还提供了上述的抗人CD3的单链抗体在制备T淋巴细胞结合剂中的应用。

本发明的有益效果在于：提供了一组抗体重链和轻链可变区的序列，由该重链可变区和轻链可变区重组而成的单链抗体具有结合CD3的生物学活性，从而能够靶向CD3阳性的T淋巴细胞。

附图说明

图1.本发明CD3单链抗体的人类胚系基因(germline gene)来源。

图2.本发明CD3单链抗体的蛋白空间结构示意图。

图3.本发明CD3单链抗体重组载体示意图。

图4本发明CD3单链抗体的表达鉴定和纯化分析。左：免疫印迹检测细胞培养上清中CD3单链抗体的表达。右：细胞培养上清通过镍柱亲和纯化，凝胶电泳显示高纯度的CD3单链抗体。

图5.流式细胞术分析本发明CD3单链抗体的靶向结合活性。上：阴影峰为阴性对照，中间线形峰为CD3单链抗体，最右侧线形峰为商品化CD3抗体。下：阴影峰为阴性对照，线形峰为CD3单链抗体。

图6.ELISA分析本发明CD3单链抗体的靶向结合活性。

具体实施方式

本发明设计并构建了一种CD3单链抗体，其具有足够的靶向性。更重要的是，此抗体为全人源序列，可以有效地避免临床治疗应用中的HAMA发生，从而能够更有效地减少耐药现象的发生，可以提高药物的利用效率和治疗效果。

人体内的天然抗体是由重链和轻链组成，其中重链可变区和轻链可变区结构对于抗原的结合特别重要。本发明的研究表明，由重链可变区和轻链可变区组成的融合蛋白(即单链抗体)仍然具有良好的抗原结合活性。此单链抗体分子量仅约25kD，体积仅为天然抗体的1/6，因此具有较好的组织渗透能力。天然抗体可变区是由重链可变区和轻链可变区两条肽链组成的异二聚体，而单链抗体是由重链可变区和轻链可变区组成的融合单链，可能会形成空间位阻，难以形成有效的抗原结合构象。因此，需要在重链可变区和轻链可变区之间引入一条柔性连接肽，从而保证单链抗体能够形成正确的空间构象，具备有效的抗原结合活性。

本发明的CD3单链抗体可以与其他蛋白进一步融合，以达到其他额外的作用，而不影响其靶向性。本发明在抗体的C端融合了His6标签蛋白，从而能够利用金属离子亲和层析法纯化。

本发明的CD3单链抗体可以与其他抗肿瘤单链抗体融合，所形成的抗体一方面可以发挥靶向肿瘤细胞的作用，另一方面可以结合T淋巴细胞，从而发挥其杀伤肿瘤靶细胞的作用。

本发明的CD3单链抗体也可以与荧光或毒素分子连接，所形成的重组抗体可以诊断和杀伤T淋巴细胞白血病等恶性肿瘤。

本发明描述的抗体可通过常规的基因重组技术所构建，具体实验步骤如《分子克隆》第三版(Joseph Sambrook，科学出版社)及类似的实验手册所记载。所用的CD3单链抗体编码的核苷酸序列如SEQ ID NO.5或SEQ ID NO.7所示，氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.6或SEQ ID NO.8所示。

上述单链抗体的DNA可以通过常规的基因重组技术获得。所需编码CD3单链抗体的DNA序列分别来源于人类抗体胚系基因。将编码上述单链抗体的DNA序列用PCR获得后分别克隆到载体中，所用载体可以是分子生物学常用的质粒、病毒或基因片段。在编码上述抗体的DNA序列前端加上蛋白分泌信号肽序列，以保证抗体能够从细胞中分泌。载体序列中包括用于基因表达的启动子、蛋白质翻译起始和终止信号、以及多聚腺苷酸(PolyA)序列。载体中含有抗生素抗性基因，以利于载体在宿主细胞如细菌和真核细胞中的复制和表达。另外，载体中还包括真核细胞选择性基因，用于稳定转染宿主细胞株的选择。

本发明的单链抗体中重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的排列方式，可以是VH-VL，也可以是VL-VH，它们都属于本发明的范畴。

本发明单链抗体内部连接肽的目的在于提供更好的柔韧性，以避免结构上的空间位阻，因此连接肽氨基酸序列和长度均可以有一定的变化，它们都属于本发明的范畴。

本发明单链抗体可以与其他效应分子进一步融合，以达到其他额外的作用，而不影响其靶向性，它们都属于本发明的范畴。

在完成含编码上述抗体的DNA序列的质粒构建以后，即可用该重组载体转染或转化宿主细胞，表达相应的蛋白质。能够用于表达抗体的表达系统有多种，可以是真核细胞，也可以是原核细胞，它们包括哺乳动物细胞、昆虫细胞、酵母、细菌等。由于原核细胞表达抗体容易形成包涵体，因此哺乳动物细胞是表达该蛋白的优选系统。可用于大规模表达抗体的哺乳动物细胞有多种，例如CHO细胞、293细胞、NS0细胞、COS细胞等，它们都包括在本发明所能使用的细胞之列。含有编码上述抗体基因的重组质粒可经转染进入宿主细胞，转染细胞的方法有多种，其中包括电穿孔法、脂质体转染法和磷酸钙转染法等。

一种较佳的蛋白表达方法是利用稳定转染的宿主细胞表达。例如，用含有新霉素(Neomycin)抗性基因的重组载体稳定转染无新霉素抗性的宿主细胞后，可在细胞培养液中增加新霉素的浓度以筛选出高表达的稳定细胞株；又例如用含有二氢叶酸还原酶(DHFR)基因的重组载体稳定转染缺乏DHFR的宿主细胞后，可在细胞培养液中增加氨甲喋呤(MTX)的浓度以筛选出高表达的稳定细胞株。

哺乳动物细胞以外的其他表达系统，例如昆虫细胞、酵母、细菌等也可以用于表达本发明的抗体，它们也被包含本发明所能使用的宿主细胞之列。这些表达系统的蛋白质产量比哺乳动物细胞的较高，但是容易形成包涵体，因此需要进一步蛋白复性。

从重组体培养液中获得相应的抗体后，可以用流式细胞术和ELISA来检测其对CD3阳性细胞的结合活性，实验结果表明，本发明的抗体能够结合CD3阳性的细胞如Jurkat细胞或T淋巴细胞，因此本发明所构建的抗体可以有效靶向T淋巴细胞。

本发明的抗体还可以用病毒载体来运载和表达，这些病毒载体包括但不限于腺病毒载体(adenoviral vectors)、腺相关病毒载体(adeno-associated viral vectors)、反转录病毒载体(retroviral vectors)、单纯疱疹病毒载体(herpes simplex virus-based vectors)、慢病毒载体(lentiviral vectors)。

本发明的抗体可以按照药剂学常规技术制备成各种形式的药物制剂，较优选的是注射剂，最优选的是冷冻干燥注射剂。

本发明的抗体可以与其他药物形成药物组合物，所述组合物可以和其他治疗方法一起治疗疾病，所述其他治疗方法包括化学疗法、放射疗法、生物疗法。

以下实例对本发明所涉及的单链抗体的构建、试验和应用作了详细说明。但是本发明的内容和用途并不仅限于实例的范畴。

实施例一 本发明单链抗体的DNA序列及重组载体的构建

本发明中编码单链抗体的基因片段可以通过经典的分子生物技术获得，并且该基因序列可针对哺乳表达系统优化，以便得到更佳的表达量。单链抗体基因片段与相应的表达载体重新连接可获得重组载体，以适应哺乳细胞的表达和筛选。

本发明的人源CD3单链抗体可变区的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)基因是由来人类抗体胚系基因中筛选得到(见图1)。VH编码的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.1所示，氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.2所示。VL编码的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.3所示，氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.4所示。本发明CD3单链抗体的蛋白空间结构提示，重链可变区的3个CDR区和轻链可变区的3个CDR区呈明显的环状排列，形成一个类似“口袋”的结构(见图2)。

本发明中表达CD3单链抗体的完整基因是通过合成的基因片段由拼接PCR扩增所得。按照VH-VL的排列方式，并在VH和VL之间插入连接肽(GGGGSGGGGSGGGGS)，可以融合构成本发明的CD3单链抗体CD3ScFv-VHVL(编码核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.5所示，氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.6所示)。合成编码小鼠免疫球蛋白kappa轻链(Ig kappa)的分泌信号肽基因以及编码His6标签蛋白的基因，通过拼接PCR，在单链抗体N端加上Ig kappa信号肽，并在单链抗体C端加上His6标签，不但可以保证其分泌到哺乳细胞外，而且还能够利用亲和层析纯化得到高纯度的目标蛋白。

获得的完整PCR基因片段插入到质粒载体pcDNA3.1(+)的BamHI和XhoI酶切位点，从而获得编码CD3单链抗体的重组载体(见图3)。

包含本发明单链抗体蛋白基因的重组质粒利用CMV启动子来表达融合蛋白，并包含SV40的多聚腺苷酸(PolyA)元件以保证其转录终止。该重组质粒含有新霉素(Neomycin)抗性基因，以利于其在细菌中的复制以及稳定转染细胞的筛选。将编码所述单链抗体的重组质粒转化E.coli后加入LB培养基培养过夜，以获取大量重组质粒的拷贝，用质粒提取试剂盒(Qiagen公司)提取质粒后进行测序鉴定。

实施例二 本发明单链抗体的表达和纯化

本发明中单链抗体是在CHO细胞中表达并分泌到培养液中的，并利用镍柱亲和层析的方法纯化所得。

1、单链抗体在CHO细胞中的表达

获得高纯度编码CD3单链抗体的重组质粒后，利用Lipofectamine 2000质粒转染试剂盒(Invitrogen公司)将重组质粒转染CHO细胞，在无血清培养基中培养三天后收集CHO细胞上清液，可以用免疫印迹检测单链抗体的表达(见图4)，所用检测抗体为抗His6抗体。

上述瞬时表达方法可用于快速地获取少量的抗体蛋白，如希望获取较多量的抗体蛋白，则可以在CHO细胞中稳定表达。将编码抗体的重组质粒用Lipofectamine 2000质粒转染试剂盒(Invitrogen公司)转染CHO细胞，培养两天后加入新霉素，采用有限稀释法进行细胞克隆培养，大约14天后挑取新霉素抗性的细胞克隆进行细胞的扩大培养，并选取状态良好的细胞在液氮中冷冻保存。稳定转染后的CHO细胞可以在滚动细胞培养瓶中进一步扩大培养以生产大量的抗体蛋白。

2、抗体的纯化

在本实施例中，包含单链抗体的细胞培养液通过镍柱亲和层析的方法进行纯化。镍层析柱(GE Healthcare公司)按照说明书以缓冲液平衡后，将超滤器浓缩过的CHO细胞培养上清液进样，以A280(nm)进行监测，用清洗液洗至未结合的蛋白全部被洗脱，然后用洗脱液洗脱目标抗体。包含单链抗体的洗脱液经缓冲液置换为PBS，并进一步超滤浓缩后，可以用考马斯亮蓝法蛋白测定试剂盒和蛋白凝胶电泳测定其浓度和纯度(见图4)。纯化后的抗体可置于4℃短期保存，也可置于-20℃长期保存。

实施例三 本发明单链抗体与CD3阳性细胞的结合活性检测

本发明的单链抗体在体外能够结合相应的靶细胞。本发明以Jurkat细胞作为CD3阳性的细胞，并以本发明中的单链抗体CD3ScFv-VHVL来检测细胞结合活性。

将本实施例得到的单链抗体与Jurkat细胞混合于含0.02％叠氮钠的PBS缓冲液中，至冰上孵育1小时。细胞用PBS缓冲液洗涤1次，然后与异硫氰酸荧光素(FITC)标记的鼠抗His6抗体至冰上孵育30分钟。阳性对照采用商品化的FITC-标记的CD3抗体。阴性对照一方面采用FITC-标记的鼠抗His6抗体孵育Jurkat细胞；另一方面采用本发明抗体和FITC-标记的鼠抗His6抗体孵育CD3阴性的HepG2细胞。细胞用缓冲液洗涤3次后，用流式细胞仪(BDFACSCalibur)进行分析。结果显示，本发明的单链抗体能够特异结合CD3阳性的Jurkat细胞(见图5)，而不结合CD3阴性的HepG2细胞(见图5)。

实施例四 本发明单链抗体的重链和轻链可变区的排列方式变化及连接肽不同的结合活性试验

本发明单链抗体的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的排列方式，不仅可以是VH-VL，而且还可以是VL-VH，单链抗体内部的连接肽也可以采用本领域常用的其他连接肽，本实例通过实验进行了验证。

在本实施例中，参照按照实施例一和实施例二中所描述的方法生产本发明的另一种可选的CD3单链抗体，其可变区的排列方式为VL-VH，内部采用另一种可选的连接肽(VEGGSGGSGGSGGSGGVD)，表示为CD3ScFv-VLVH(编码核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.8所示)。本实施例采用ELISA方法检测CD3ScFv-VHVL和CD3ScFv-VLVH这2种排列方式和连接肽不同的CD3单链抗体对T淋巴细胞的特异结合活性。

单链抗体CD3ScFv-VHVL、CD3ScFv-VLVH和牛血清白蛋白(BSA)分别与CD3阳性细胞T淋巴细胞(T cell)和CD3阴性细胞K562混合于含0.02％叠氮钠的PBS缓冲液中，至冰上孵育1小时。细胞用PBS缓冲液洗涤2次，然后与辣根过氧化物酶(HRP)标记的鼠抗His6抗体至冰上孵育30分钟。细胞用缓冲液洗涤3次后，离心到96孔板，加入TMB显色试剂室温避光孵育20分钟。显色完成后，用2M硫酸终止显色，在450nm波长下检测光密度OD值。结果显示，CD3ScFv-VHVL和CD3ScFv-VLVH都能够特异结合T淋巴细胞(见图6)，而不结合CD3阴性的K562细胞(见图6)。

上述实例表明，本发明的人源CD3单链抗体可以在CHO细胞中表达，能够进一步通过亲和层析纯化。所得到的抗体可以结合CD3阳性的T淋巴细胞，具备良好的生物学活性。

Claims (12)

1.抗人CD3的抗体轻链可变区，其特征在于：氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.4所示。

2.抗人CD3的抗体重链可变区，其特征在于：氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.2所示。

3.抗人CD3的单链抗体，其特征在于：由权利要求所述的抗人CD3的抗体轻链可变区和权利要求2所述的抗人CD3的抗体重链可变区连接而成。

4.根据权利要求3所述的抗人CD3的单链抗体，其特征在于：在抗人CD3的抗体轻链可变区和抗人CD3的抗体重链可变区之间通过连接肽进行连接。

5.根据权利要求3或4所述的抗人CD3的单链抗体，其特征在于其结构为:轻链可变区-重链可变区、重链可变区-轻链可变区、轻链可变区-连接肽-重链可变区或重链可变区-连接肽-轻链可变区。

6.根据权利要求4或5所述的抗人CD3的单链抗体，其特征在于所述的连接肽的氨基酸序列为GGGGSGGGGSGGGGS或VEGGSGGSGGSGGSGGVD。

7.根据权利要求6所述的抗人CD3的单链抗体，其特征在于，其氨基酸序列如序列表中SEQID NO.6或SEQ ID NO.8所述。

8.编码权利要求1所述抗人CD3的抗体轻链可变区的基因、编码权利要求1所述抗人CD3的抗体重链可变区的基因或编码权利要求3-7任一项所述的抗人CD3的单链抗体的基因。

9.根据权利要求8所述的基因，特征在于其核苷酸序列见序列表中的SEQ ID NO.1，3，5，7所述。

10.含有权利要求8所述基因的重组载体。

11.包含权利要求6所述重组载体的宿主细胞。

12.权利要求3-7中任一项所述的抗人CD3的单链抗体在制备T淋巴细胞结合剂中的应用。