KR20040022208A - 변형 단백질, 디자이너 독소, 및 이들의 제조 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 단백질성 화합물의 생물학적 활성은 유지시키면서 이러한 화합물의 항원성을 저하시키는 방법 뿐만 아니라 항원성이 저한된 생물학적 활성을 나타내는 단백질성 조성물에 관한 것이다. 이들 방법 및 조성물은 상기 화합물 및 조성물을 필요로 하는 대상체에게 상당히 유익하다. 또한, 절단되고/되거나 저하된 항원성을 지니고 있는 변형 독소 화합물이 포함된다. 이러한 디자이너 독소는 특히 면역독소로서의 치료학적, 진단적 및 예방적 장점을 갖고 있다. 이들 면역독소를 사용하여 암을 치료하는 방법이 제공된다.

Description

변형 단백질, 디자이너 독소, 및 이들의 제조 방법{Modified proteins, designer toxins, and methods of making thereof}

펩타이드, 폴리펩타이드 및 단백질은 수 많은 예방적, 진단적 및 치료학적 이점을 나타낸다. 그러나, 한 가지 단점은 이러한 단백질성 화합물의 이점을 제공받기를 원하는 대상체에게서 상기 화합물에 대한 면역 반응이 유발될 수도 있다는 것이다. 상기 화합물에 대한 면역 반응은 이들을 사용함으로써 달성할 수 있는 이점들을 감소시키거나 또는 없앨 수 있다. 따라서, 숙주 내에서의 면역 반응 유발로 인해 이의 효능이 저하될 수 있는 화합물의 항원성 또는 면역원성을 감소시키는것이 일반적으로 요망된다.

한 가지 특정한 유형의 단백질인 모노클로날 항체를 주요 대상으로 하여, 예방적, 진단적 및 치료학적 이점을 알아보기 위한 수 많은 연구와 개발이 진행되어 왔다. 각종 세포-표면 항원을 인식하는 고도의 특이적 면역독소가 지난 20 년간 개발되고 시험되었다. 면역독소가 흥미를 끄는 특징적인 점은, 세포독성 효과를 유발시키기 위해 이들 단백질 제제를 정확한 세포내 구획 내로 성공적으로 전달하는데 극히 소수의 분자 만이 요구된다는 것이다. 각종 독소, 예를 들면, 사포닌, 아브린, 리신 A 쇄(RTA), 슈도모나스 외독소(PE), 디프테리아 독소(DT) 및 겔로닌을 함유하는 면역독소가 작제된 바 있다.

면역독소의 생체내 사용과 연관된 문제점으로는 다음과 같은 것이 있다: 모세관 누출 증후군을 유발시키는 혈관성 손상, 세망내피계에 의한 해당 독소 부분의 인식으로 인한 잘못 표적화, 표적 항원 발현의 이질성(heterogeneity), 및 대략 14일 간의 협소한 치료 일수 만을 제공해 주는 항-독소 항체의 개발. 항-독소 및 항-접합체 항체의 개발은 이들의 명백한 항종양 효과에도 불구하고, 환자의 재치료에 사용되지 못할 수도 있다. 면역독소를 환자에게 장시간 사용하는 것 또한 문제점을 유발시켰다. RTA 및 PE를 함유하는 면역접합체가 환자에게 고도로 면역원성인 것으로 밝혀졌다. 또한, 면역독소 작제물 중의 이들 단백질의 크기(대략 30kDa)는 면역접합체가 고형 종양 내로 효과적으로 침투하지 못하게 하는 것으로 추정된다. RTA와 같은 유형 I 단백질의 구조적 변형이, 대부분의 경우에 성공적이지 못하였다[참조: Munishkin et al., 1995]. 여러 개의 아미노산을 변형시킨 수많은 RTA 돌연변이체가 생성되었다. 1995년에 보고된 울(Wool) 등의 문헌에는 RTA의 45개 단일 아미노산 결실물이 기재되어 있다. 물론, 8개의 단일 아미노산 결실물 만이 생물학적 활성을 나타내는 것으로 밝혀지긴 하였지만, 본래의 RTA와 비교한 이들 결실 변이체의 상대적 생물학적 활성은 조사되지 않았다. 흥미롭기는 하지만, RTA 조사에 관한 연구는 제한된 유용성을 지니고 있는데, 이는 예를 들어, RTA가 겔로닌과 같은 기타 독소와 단지 30% 정도의 서열 상동성을 나타내기 때문이다.

모노클로날 항체(MAb)에 근거한 과정의 구체적인 적용은 전통적으로, 사람 암의 진단과 치료법에서 찾아 볼 수 있다. 그러나, 이들 제제의 임상적 용도는 상기 접근법과 연관된 단점들, 예를 들면, 항원 발현의 이질성, 부분적으로 항체 크기로 인한 고형 종양 내로의 침투 불량 및 항체의 항원성으로 인해, 제한적으로 성공을 거두었다[참조: Roselli et al., 1993; Berkower, 1996; Pullybland et al., 1997; Panchagnula et al., 1997; Panchal, 1998]. 이들 문제점을 피하기 위해, 통상적인 항체 구조를, 보다 작고 보다 간단한(단일쇄) 포맷으로 본래 구조의 항원-결합 부분을 함유하는 마우스:사람 키메라, 완전한 사람 항체 또는 재성형된 항체 단편으로 바꾸기 위한 수 많은 분자상 접근법이 적용되어 왔다[참조: Bird et al., 1988; Kipriyanov et al., 1994; Owens et al., 1994; McCartney et al., 1995; Worn et al., 1998]. 모 면역글로불린(IgG)의 결합 특징을 보유하고 있는 단일쇄 항체(scfv, sfv)는 고안된 가요성 펩타이드 링커에 의해 연결된 항체 V_L및V_H도메인으로 이루어진다[참조: Wels et al., 1992; Kurucz et al., 1993]. 더우기, scFvs는 현재 통상적인 MAbs 또는 이의 Fab 단편을 사용하는 임상 및 진단 적용 분야에 바람직할 수도 있는데, 이는 이들의 보다 작은 크기로 인해, 종양 조직을 보다 잘 침투할 수 있고, 약물동력학이 개선되며, 정맥내 투여된 쥐(murine) 항체를 사용한 경우에 관찰된 면역원성이 저하될 수 있기 때문이다.

정상 조직과 비교해서 흑색종 세포 내에서 높은 수준으로 발현되는 소수의 표적 항원은 특히, 대부분의 흑색종 세포주 및 신선한 종양 샘플에서 발견되는 고분자량 당단백질(gp240)의 표면 도메인이다[참조: Kantor et al., 1982]. 이러한 항원 상의 상이한 에피토프를 인식하는 2개의 쥐 항체(9.2.27 및 ZME-018로 명명됨)이 선행 기술 분야에서 분리되어 보고되었다[참조: Morgan et al., 1981; Wilson et al., 1981]. 상기 쥐 모노클로날 항체 ZME-018은 흑색종에 대한 고도의 특이성을 보유하고 있고, 각종 정상 조직과 최소한도로 반응성이기 때문에, 추가 연구에 대한 유망한 후보 대상이다. 이러한 항체가 흑색종 병변 내에 국재하는 능력을 조사하는 임상적 시도 결과, 전이성 종양에 선택적으로 집중된다는 사실이 입증되었다[참조: Macey et al., 1988; Koizumi et al., 1988].

종양-표적화 치료제의 성공적인 개발은 부분적으로는, 치료제의 부위-특이적 전달에 좌우되고, 또한 이와 같이 전달된 제제의 생물학적 활성에 좌우된다. 무차별적으로 세포독성 제제, 예를 들면, 독소, 방사성핵종 및 성장 인자에 대한 선택성을 부여하기 위해 모노클로날 항체가 이용되었다[참조: Williams et al., 1990;Rowlinson-Busza et al., 1992; Wahl, 1994]. 이러한 분자 중의 하나가, 리신 A-쇄(RTA)와 유사한 작용 기전과 효능을 지니고 있지만 안정성이 개선되고 독성이 감소된, 29-kDa 리보솜-불활성화 식물 독소인 겔로닌이다[참조: Stirpe et al., 1992; Rosenblum et al., 1995]. 본 연구소의 선행 연구에서, 식물 독소 겔로닌과 각종 항체와의 수 많은 화학적 접합체를 동정하고 이의 생물학적 특성을 조사하였다[참조: Boyle et al., 1995; Xu et al., 1996; Rosenblum et al., 1990]. 선행 연구에서는, 항체 ZME-018을 정제된 겔로닌에 화학적으로 커플링시킨 결과, 이러한 면역접합체가 조직 배양물과 사람 종양 이종이식편 모델 둘 다에서 항원-양성 흑색종 세포에 대해 특이적 세포독성을 지니고 있는 것으로 입증되었다[참조: Rosenblum et al., 1991; Mujoo et al., 1995]. 그러나, 이러한 작제물은 일반적으로 면역독소와 마찬가지로, 사람 환자에 있어서 내재된 항원성 문제점을 지니고 있다.

이와 같은 면역독소의 부작용과, 이들 문제점을 감소시키기 위해 이루어진 제한된 진행 과정을 고려하면, 질병 및 질환의 치료, 예방 및 진단에 사용하기 위한, 보다 덜 항원성인 단백질, 폴리펩타이드 및 펩타이드의 개발이 지속적으로 요망된다. 해당 독소 분자 중의 항원성 서열을 대체시키는 것은 비-항체 폴리펩타이드, 예를 들면, 독소에 대한 발상이다. 이러한 발상이 쥐 면역글로불린 골격(framework) 도메인을 사람 면역글로불린 골격 도메인으로 대체시켜 사람/마우스 키메릭 분자를 성공적으로 창출시키는데 사용되긴 하였지만, 동일한 발상이 본원에 기재된 방법을 사용하거나, 또는 기타 분자, 특히 식물 공급원으로부터의 효소 또는 독소에는 결코 성공적으로 적용되지 못하였다.

발명의 요약

본 발명은 변형되지 않거나 본래의 단백질에 비해 이점을 지니고 있는 변형 단백질을 형성하도록 변형시킨 단백질성 화합물의 생성 및 제조 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한, 이들 방법으로부터 생성된 조성물을 포함한다.

본 발명의 몇몇 양태에서는, 본래의 겔로닌 서열에 대해 변화시킨 재조합 겔로닌 독소가 제공된다. 이러한 재조합 겔로닌 독소는 본원에 참조문헌으로써 삽입된 미국 특허 제5,631,348호에 기재되어 있고 유전자은행 수탁 번호 L12243으로써 공급되는, 본래의 겔로닌 단백질 서열(서열 1에 제시됨)과 비교해서 제거되었거나 대체시킨 아미노산을 가질 수 있다. 본 발명의 재조합 겔로닌 독소는 서열 1의 아미노산 전부를 지니고 있지 않지만, 몇몇 양태에서는, 서열 1의 아미노산 잔기 110-210로서 규정된 코어(core) 독소 영역을 포함한다. 본 발명의 기타 화합물에는 코어 독소 영역 이외에도, 코어 독소 영역 이외의 서열 1의 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 또는 100개 이상의 연속되는 아미노산 잔기를 함유하는 재조합 겔로닌 독소가 포함된다. 본 발명의 화합물은 또한, 서열 1의 연속되는 아미노산 잔기를 포함하는 다발성 영역을 포함하는 것으로 고려된다. 예를 들면, 특정 화합물은 코어 독소 영역 이외에도, 코어 독소 영역 앞에 서열 1의 10개의 연속되는 아미노산 잔기를 포함하고 코어 독소 영역 다음에 서열 1의 20개의 연속되는 아미노산 잔기를 포함한다.

본 발명의 재조합 겔로닌 독소에는 또한, 해당 독소에 서열 1의 5, 10, 20, 30, 40, 50개 이상의 아미노산이 결여되도록 본래의 서열에 기준하여 절단시킨 겔로닌 독소가 포함된다. 본 발명의 몇몇 양태에서는, 상기 독소가 코어 독소 영역을 함유하는데, 이는 이러한 코어 독소 영역 외부 어느 곳에도 없는 아미노산이다. 결실 이외에도, 본 발명의 재조합 겔로닌 독소는 제거된 아미노산 대신 특정의 아미노산을 가질 수도 있다. 예를 들면, 겔로닌 단백질 서열 중의 위치 7에서의 글라이신 잔기가 비-글라이신 아미노산 잔기 또는 변형된 아미노산으로 대체될 수 있다. 이러한 위치 7에서의 글라이신 잔기가 단순히 제거되는 경우에는, 서열 1의 위치 8에서의 알라닌이 위치 7이 되긴 하지만, 이것이 대체로 간주되지는 않는데, 이는 아미노산의 위치가 단순히 1 위치씩 이동하였기 때문이다. 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100개 이상의 아미노산이 대체될 수 있는 것으로 고려된다.

본 발명의 추가의 양태에서는, 재조합 겔로닌 독소를 제2의 폴리펩타이드에 부착시킬 수 있다. 몇몇 경우에는, 이러한 제2의 폴리펩타이드가 겔로닌 독소를 특정한 세포 유형(특정한 유전자형 또는 표현형을 갖는 세포, 예를 들면, 암 세포 또는 병원체에 감염된 세포 포함), 신체 일부 또는 기타 특정한 위치에 대해 표적화시키는 작용을 한다. 따라서, 본 발명의 단백질성 화합물에는 재조합 겔로닌 독소, 예를 들면, 변형된 겔로닌 독소와 제2의 폴리펩타이드 둘 다를 함유하는 화합물이 포함된다. 몇몇 양태에서는, 상기 2개의 폴리펩타이드를 서로 접합시키는 반면, 다른 양태에서는, 상기 폴리펩타이드를 재조합적으로 공학 처리하여 융합 단백질을 생성시킨다. 접합된 화합물은 링커에 의해 서로 부착시킬 수 있다. 본 발명의 변형 단백질은 부가의 폴리펩타이드 조성물을 포함할 수 있는데, 이들 전부 또는 일부는 서로 공유적으로 연결될 수 있다.

본 발명은 1개 이상의 폴리펩타이드 실체가 단일 화합물로서 존재하는 다중폴리펩타이드 조성물에 관한 것이다. 따라서, 변형 단백질을 제2, 제3, 제4, 제5, 제6 또는 그 이상의 폴리펩타이드에 부착시킬 수 있다. 또 다른 한편, 2개 이상의 변형 단백질이 단일 단백질성 화합물로서 존재할 수도 있다. 본 발명의 몇몇 양태에서는, 제2의 폴리펩타이드가 항체, 예를 들면, 항원 결합 영역을 갖는 항체이다. 항체가 종양 항원, 종양유전자(oncogene) 생성물, 세포성 수용체, 또는 상기 다중폴리펩타이드 조성물을 국재시키는 기타 모든 화합물에 대해 지시될 수 있는 것으로 고려된다. 본원에 기재된 바와 같이, 제2의 폴리펩타이드는 효소, 사이토킨, 세포독성 분자, 성장 인자, 리간드 또는 수용체, 또는 세포 성장 특징을 조절할 수 있는 모든 분자일 수 있다.

본 발명의 기타 조성물에는 a) 항체를 사용하여 효소 중의 하나 이상의 항원성 영역을 동정하는 단계; b) 이러한 효소로부터 하나 이상의 항원성 영역을 제거하여 변형된 효소를 형성하는 단계; 및 c) 이러한 변형된 효소가 효소적 활성을 지니고 있는지를 결정하는 단계를 포함하는 방법에 의해 생성된 변형된 효소가 포함된다. 효소는 세포 내의 특이적 화학 반응을 촉매하는 생물학적 실체이므로, 이는 단백질 또는 핵산 분자일 수 있다. 그러나, 효소와 관련하여 논의된 어떠한 방법도, 일반적으로 폴리펩타이드에 적용할 수 있는 것으로 고려된다. 항원성 영역은 특정 유기체의 T-세포 수용체 또는 항체에 의해 특이적으로 인식되는 폴리펩타이드의 영역이다. 어느 한 영역이 한 종에서는 항원성일 수 있지만, 또 다른 종에서는 아닐 수 있으므로, 특정 화합물의 항원성은 특정한 유기체에 대한 특징적인 사항이라는 것을 인지해야 한다. 항원성 영역의 일부인 아미노산을 제거하는 것 이외에도, 하나 이상의 항원성 영역으로부터의 아미노산을 본 발명의 효소로부터 제거할 수 있는 것으로 고려된다. 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20개 이상의 항원성 영역의 전부 또는 일부로부터의 아미노산을 해당 폴리펩타이드로부터 제거할 수 있다. 몇몇 경우에는, 이와 같이 제거된 영역을, 제거된 영역 보다는 덜 항원성인 영역으로 대체시킨다. 물론, 항원성 영역을 플랭킹하는 아미노산은, 예를 들어, 편의상 제거될 수도 있다는 것을 인지해야 한다. 따라서, 항원성 영역의 어느 한 측면 또는 양 측면을 플랭킹하는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20개 이상의 아미노산을 제거하거나 대체시킬 수 있다.

덜 항원성인 영역(들)은 단백질 데이터베이스를 대상으로 하여, 항원성 영역과 상동성이거나 또는 이와 공통의 몇몇 잔기를 지니고 있는 영역에 대해 조사함으로써 동정할 수 있다. 항원성 영역을 동정할 수 있으며, 이러한 서열을 사용하여, 변형 단백질에 기준하여 보다 덜한 항원성이 요망되는 유기체의 공지된 단백질 서열을 동정한다. 따라서, 사람 단백질 데이터베이스를 사용하여, 사람에게서 덜 항원성이길 요망되는 단백질의 항원성 영역의 잔기와 동일하거나 또는 이에 필적하는다중 잔기를 갖는 사람 단백질 서열을 발견할 수 있다. 한 잔기가 또 다른 잔기에 필적한다는 것은, 이들 잔기가 동일하지는 않지만 유사한 화학적 특성을 공유하고 있다는 것을 의미한다. 이러한 관계는 당업자에게 널리 공지되어 있다.

몇몇 양태에서는, 항체를 이용하여 항원성 영역을 동정한다. 항체가 폴리클로날일 수 있다는 것이 고려된다. 항체의 유기체 공급원은, 덜 항원성인 변형 단백질을 요망하는 유기체와 동일한 종이다. 따라서, 사람에게서 특정 효소 또는 단백질이 덜 항원성이길 요망하는 경우에는, 몇몇 양태에서, 항원성 영역을 동정하기 위해, 또는 변형 단백질이 변형되지 않은 단백질(본래 단백질 또는 완전한 길이의 재조합 단백질) 보다 덜 항원성인지를 결정하기 위해 사람 항체를 사용하는 것이 바람직하다. 바람직한 양태에서는, 변형 효소 또는 단백질을 대상으로 하여, 변형 효소 또는 단백질의 항원성을 변형되지 않은 효소 또는 단백질의 항원성과 비교함으로써 감소되거나 보다 낮은 항원성에 대해 평가하는데, 이는 i) 변형 단백질을 투여하거나 이에 노출시키기에 앞서 특정 대상체로부터 샘플을 수득하고, 이러한 샘플을 사용하여, 상기 변형 단백질의 항원성과 동일한 단백질의 변형되지 않은 버젼을 비교하는 단계, 또는 ii) 변형 단백질을 투여하거나 이에 노출시킨 후에 특정 대상체로부터 샘플을 수득하고, 이러한 샘플을 사용하여, 상기 변형 단백질의 항원성과 동일한 단백질의 변형되지 않은 버젼을 비교하는 단계에 의해 수행될 수 있다. 샘플은 체액, 예를 들면, 혈액(혈청)을 포함한, 면역 세포 또는 항체를 함유하는 어떠한 조성물일 수 있다. 이어서, 상기 샘플을 사용하여, ELISA와 같은 면역검출법을 수행할 수 있다. 대상체는 변형되지 않은 단백질에 기준하여 실험받은적 없는 것일 수 있지만, 해당 샘플을 제공해주는 대상체를 변형되지 않은 단백질에 미리 노출시키는 것이 바람직한 것으로 고려된다. 몇몇 양태에서는, 샘플이 모노클로날 항체 하이브리도마로부터의 배양 배지인 것이 적당할 수 있다.

본 발명의 기타 국면에서는, 변형 단백질 또는 효소가 활성을 보유하고 있는지를 결정하는 단계를, 이러한 변형 단백질을 대상으로 하여 활성, 예를 들면, 효소적 활성에 대해 검정함으로써 수행할 수 있다.

본 발명의 방법에 따라서 어떠한 효소도 변형시킬 수 있다. 이러한 효소는 하이드롤라제(예: 데아미나제, 에스테라제, 글리코시다제, 리파제, 뉴클레아제, 펩티다제, 포스파타제, 포스포디에스테라제 및 프로테이나제); 이소머라제(예: 에피머라제, 뮤타제 및 라세마제); 리가제 또는 신테타제(예: 아실-CoA 신테타제, 아미노-아실-tRNA 신테타제, 및 카복실라제); 리아제(예: 알도라제, 데카복실라제, 데하이드라타제 및 뉴클레오타이드 사이클라제); 옥시도리덕타제(예: 데하이드로게나제, 디옥시게나제, 하이드로게나제, 모노옥시게나제, 니트로게나제, 옥시다제 및 리덕타제); 및 트랜스퍼라제(예: 아실트랜스퍼라제, 아미노트랜스퍼라제, 글리코실트랜스퍼라제, 키나제, 메틸트랜스퍼라제, 뉴클레오티딜트랜스퍼라제, 포스포릴라제 및 설포트랜스퍼라제)일 수 있다. 특정 양태에서는, 상기 효소를 독소로서 분류하는데, 이는 세포, 조직 또는 유기체에 대해 독성이 있다는 것을 의미한다. 구체적으로 언급하면, 식물에 의해 생성된 독소, 예를 들면, 겔로닌이 본 발명의 일부로서 고려된다. 앞서 논의된 바와 같이, 변형 효소를 본 발명의 변형된 겔로닌 폴리펩타이드와 마찬가지로, 부가의 폴리펩타이드에 부착시킬 수 있다. 변형된 겔로닌에 대한 어떠한 양태도 변형된 효소에 적용할 있고, 그 반대의 상황도 마찬가지라는 것이 고려된다.

본 발명은 또한, 항원성이 저하된 변형 단백질, 및 몇몇 경우에는, 특히 대상체에 대해 항원성이 저하된 변형 단백질을 생성시키는 방법에 관한 것이다. 몇몇 양태에서는, 상기 방법이 a) 제1 대상체에게 투여하기를 요망하는 단백질을 선별하는 단계; b) 제1 대상체로부터의 항혈청 또는 제1 대상체와 동일한 종의 제2 대상체로부터의 항혈청을 사용하여 제1 대상체에서 항원성인 단백질 영역을 동정하는 단계; c) 이와 같이 동정된 영역이 부재하는 변형 단백질을 생성시키는 단계; 및 d) 상기 변형 단백질이 저하된 항원성을 지니고 있는지를 확인하는 단계를 포함한다. 앞서 논의된 바와 같이, 상기 최종 단계는 변형 단백질의 변형되지 않은 버젼에 미리 노출시킨 바 있는 개개인, 또는 변형 단백질에 대한 면역 반응 저하가 요망되는 개개인으로부터의 샘플(예: 혈청)을 사용하여 수행할 수 있다.

변형 단백질을 생성시키는 방법이, 해당 단백질의 항원성 영역과 상동성인 덜 항원성인 영역을 동정하기 위해 사람 단백질 데이터베이스를 스크리닝하고, 항원성 영역을, 상기 동정된 덜 항원성인 영역의 전부 또는 일부로 대체시켜 변형 단백질을 형성시키는 단계를 포함하는 것이 추가로 고려된다. 큰 사람 단백질 데이터베이스를 스크리닝하는 것이 필수적이지는 않지만, 바람직하다. 따라서, 항원성 영역과 상동성이거나 동일한 잔기를 갖는 특정한 사람 단백질의 서열이 사람 단백질 데이터베이스를 스크리닝하는 것과는 독립적으로 공지되어 있는 경우, 이러한 방법도 본 발명의 범위 내에 포함될 것이다. 예를 들면, 이의 항원성 저하가 요망되는 마우스 효소의 사람 상동체의 서열이 공지될 수 있으므로, 본 발명은 마우스 단백질 내의 영역을 사람 서열로부터의 잔기로 대체시키는 것에 관한 것이다. 본 발명의 방법 및 조성물은 특정 폴리펩타이드의 아미노산 잔기를 대체, 결실, 및/또는 변형시키는 것을 포함한다. 대체되는 잔기는 나머지 아미노산의 순서와 수가, 이러한 잔기가 대체되기 전의 폴리펩타이드와 동일하게 되도록 한다. 특정 잔기를 보존적 또는 비-보존적 잔기로 대체시킬 수 있다. 결실되는 잔기는 나머지 아미노산의 순서를 혼란시키지 않지만, 해당 폴리펩타이드의 잔기 수가 1개 감소된다. 변형되는 잔기는 화학적으로 변화된 것이며, 이러한 변화는 폴리펩타이드 내의 나머지 아미노산의 순서 또는 수에 영향을 미치지 않는다.

몇 가지 양태에서, 당해 방법은 변형 단백질 또는 효소를 달성하기 위해 재조합 핵산 기술을 사용하는 것을 포함한다. 따라서, 항원성 영역을 암호화하는 핵산 서열을 덜 항원성인 영역을 암호화하는 핵산 서열로 대체시키도록, 변형시키고자 하는 효소에 대한 cDNA 서열을 조작할 수 있다. 또 다른 한편, 상기 동정된 영역을 제거함으로써 변형 단백질을 생성시킬 수 있다. 제거되는 영역은 부재하는 것으로 간주된다. 부재 영역은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100개 이상의 아미노산 잔기를 함유할 수 있다. 더우기, 변형 단백질은 제거되거나 대체된 하나 이상의 항원성 영역을 가질 수 있고, 이러한 영역을 플랭킹하는 아미노산이 또한 제거되거나 대체될 수 있다. 상기 부재 항원성 영역을 제거되는 동일한 수의 아미노산 잔기로 대체시킬 수 있다는 것이 고려된다.

본 발명의 방법에서는, 항원성 영역을 동정할 수 있거나 또는 변형 단백질을 ELISA 검정을 사용하여 평가할 수 있다. 대상체가 포유류, 예를 들면, 사람일 수 있다.

본 발명의 기타 조성물은 대체된 아미노산을 갖는 재조합 겔로닌 독소 보다 사람에게서 덜 항원성인 아미노산으로 대체된 항원성 도메인 1, 2, 3 또는 4개 중의 하나 이상으로부터의 3개 이상의 아미노산을 갖는 사람화된(humanized) 재조합 겔로닌 독소를 포함한다. 겔로닌 독소의 항원성 도메인은 다른 곳에도 기재되어 있다. 항원성 도메인 1, 2, 3 및/또는 4개로부터의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 75, 100개 이상의 아미노산이 대체, 결실 또는 변형된다는 것이 고려된다. 2, 3 또는 4개 이상의 항원성 도메인으로부터의 아미노산을 조작할 수 있다.

본 발명의 부가의 양태는 a) 포유류에서 항원성인, 겔로닌 독소 중의 하나 이상의 영역을 동정하는 단계; 및 b) 적어도 이러한 항원성 영역의 일부분을, 포유류에게서 덜 항원성인 영역으로 대체시키는 단계를 포함하는 방법에 의해 생성된 재조합 겔로닌 독소를 제공한다. 겔로닌 독소는 재조합일 수 있는데, 즉 시험관 내에서 조작된 핵산 서열로부터 유도될 수 있다. 상기 방법은 또한, 상기 동정된 항원성 영역을 포유류 아미노산 서열과 비교함으로써, 포유류에게서 덜 항원성인 영역을 동정하는 단계, 또는 포유류에게서 덜 항원성인 영역을 동정하는 단계를 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서는, 상기 포유류가 사람이다. 앞서 언급된 바와 같이, 본원에 기재된 어떠한 방법 및 조성물도 본원에 기재된 기타 모든 방법 및 조성물에 적용할 수 있다.

본 발명은 또한, 본 발명의 조성물을 사용하는 치료 방법에 관한 것이다. 이들은 특정 세포 또는 유기체를 사멸시키거나 또는 없애는 형태로 치료가 이루어지는 모든 질병의 치료에 사용될 수 있는데, 이는 본 발명의 독소에 의해 수행된다. 하나의 조성물 또는 방법에 대해 논의된 양태가 본 발명의 다른 모든 조성물 또는 방법에 적용될 수 있는 것으로 고려된다.

몇 가지 양태에서는, 겔로닌 독소의 전부 또는 일부(예를 들면, 이의 코어 독소 영역) 및 항체의 전부 또는 일부(이는 면역독소가 특정한 세포에 대해 지시되도록 이용된다)를 포함하는 유효량의 면역독소를 암 또는 종양 세포에 제공함으로써, 이러한 암 또는 종양 세포를 사멸시키는 방법이 제공된다. "유효량"이란 의도한 목적을 달성시키는 양을 지칭한다. 암 또는 종양 세포를 사멸시키는 방법의 경우에는, 이것이 암 또는 종양 세포를 사멸시키기 위한 양이다. 본 발명의 기타 방법에는 암 세포를 특이적으로 표적으로 하는 단일쇄 항체 및 겔로닌의 코어 독소 영역을 포함하는 면역독소를 포함하는 유효량의 조성물을 환자에게 투여함으로써, 이러한 환자에게서 암을 치료하는 방법이 포함된다. 치료와 관련한 "유효량"이란 대상체에 치료학적 이점을 부여하는 양을 지칭한다. 본원 전반에 걸쳐 사용된 "치료학적 이점"이란 용어는 해당 대상체의 질환을 의학적으로 치료하는 것과 관련해서 대상체의 안녕(well-being)을 증강 또는 증진시키는 모든 것을 지칭한다. 암 맥락에서(기타 질환에도 역시 적용될 수 있다), 전암, 암 및 과증식성 질병의 치료를 포함한 치료학적 이점에는 다음의 대략적인 예가 포함된다: 대상체의 삶이 일정기간 연장되고; 종양성 질병 발생이 감소 또는 지연되며; 과증식이 감소되고; 종양 성장이 저하되며; 전이가 지연되고; 암 세포 또는 종양 세포 증식률이 감소하며; 대상체의 상태에 기인될 수 있는 대상체의 통증이 감소된다.

본 발명의 몇몇 양태에서는, 상기 독소가 겔로닌이다. 추가의 양태에서, 당해 면역독소는 서열 1의 아미노산 서열 전부 또는 일부를 포함한다. 당해 면역독소는 완전한 길이의 겔로닌 단백질 서열 보다 몇개 적은 아미노산을 포함할 수 있지만, 몇몇 양태에서는 완전한 길이의 서열을 포함하는 것으로 고려된다. 상기 독소를 사람화시킬 수 있고, 이는 본원에 기술 또는 기재된 어떠한 독소 또는 작제물일 수 있다는 것이 추가로 고려된다.

추가의 양태에서는, 면역독소의 항체가 사람화된 것이고/이거나 단일쇄 항체이다. 본 발명의 방법에서는, 특이적 표적화를 허용하는 한은, 항체가, 면역독소가 표적화 암 세포을 표적으로 하도록 하지만, 이것은 완전한 길이가 아닐 수 있다. 몇몇 양태에서는, 항체(항체 단편 포함)가 표적화 세포의 표면 상의 항원을 특이적으로 표적으로 한다(즉, 결합한다). 보다 구체적인 양태에서는, 항체가 종양 항원을 표적으로 한다. 이러한 항체는 모든 포유류 항체일 수 있지만, 구체적으로, 이 항체가 마우스, 토끼, 랫트, 염소 또는 원숭이 항체라는 것이 고려된다. 상이한 종 기원이긴 하지만 상기 항체는 본 발명에 따라서 또는 당업자에게 공지된 기타 방법에 따라서 사람화시킬 수 있다. 항체가 단일쇄 항체인 경우, 이는 흑색종 세포에 대해 지시된 항체인 9.2.27 또는 ZME-018을 포함할 수 있다. 구체적인 예에서, 상기 면역독소는 본원에 기재된 scfvMEL-2018 또는 scfvMEL-2025(서열 11)이다.

표적화되는 암 세포는 전립선, 폐, 뇌, 피부, 간, 유방, 림프계, 위, 고환, 난소, 췌장, 뼈, 골수, 머리 및 목, 경부, 식도, 눈, 담낭, 신장, 부신, 심장, 결장 또는 혈액으로부터 유래된 세포일 수 있다. 또 다른 한편, 암 환자는 상기 명시된 기관/조직 내에 또는 이로부터의 암을 가질 수 있다. 본 발명의 몇몇 양태에서는, 상기 암 세포가 흑색종 세포이다. 암 또는 종양 세포는 환자 내에 존재할 수 있다는 것이 고려된다. 몇 가지 양태에서는, 환자에게 유효량의 치료학적 조성물을 투여할 것이며, 이는 특정한 목적하는 결과, 예를 들면, 치료를 달성하기 위해 필요한 양을 지칭한다. 예를 들어, 암 맥락에서의 목적하는 결과는 암 또는 종양 세포를 사멸시키는 것일 수 있다.

당해 면역독소는 약제학적 또는 약리학적으로 허용되는 조성물 내에 포함될 수 있다. 치료 섭생의 일부로서, 환자에게 기타 항암 요법, 예를 들면, 화학요법, 방사선요법, 유전자 요법, 수술 또는 기타 면역요법을 적용할 수도 있다.

추가의 양태에서는, 당해 면역독소를 암호화하는 핵산 서열을 함유하고 면역독소를 발현시킬 수 있는 발현 작제물을 제공함으로써, 당해 면역독소를 특정 세포 또는 환자에게 제공할 수 있다는 것이 고려된다. 몇 가지 양태에서는, 상기 발현 작제물이 바이러스성 벡터인데, 이에는 아데노바이러스 벡터, 아데노-관련 바이러스 벡터, 간염 바이러스, 헤르페스 바이러스, 렌티바이러스, 레트로바이러스 또는 백시니아 바이러스가 포함되지만, 이에 제한되지 않는다.

"포함하는"이란 단어와 연계해서 본 명세서 및/또는 청구의 범위에 사용된바와 같은 단어 "a" 또는 "an"은 "1개"를 의미할 수 있지만, 이는 "하나 이상"의 의미와 부합되기도 한다.

본 발명의 기타 목적, 특징 및 이점은 다음의 상세한 설명으로부터 명백해질 것이다. 그러나, 본 발명의 구체적인 양태를 지시해주는 상세한 설명 및 구체적인 실시예는 단지 예로써만 제시된 것이라는 것을 인지해야만 하는데, 이는 본 발명의 요지 및 범주 내에 속하는 각종 변화 및 변형이 본원의 상세한 설명으로부터 당업자에게는 명백할 것이기 때문이다.

본 발명은 일반적으로, 분자 생물학 및 독성학 분야에 관한 것이다. 보다 특히, 본 발명은 보다 짧고/짧거나 덜 항원성인 폴리펩타이드인 변형 단백질(modified proteins) 뿐만 아니라 이러한 폴리펩타이드를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 식물 독소 겔로닌(gelonin)의 보다 짧고 덜 항원성인 변형물이 본원에 기재되어 있다. 이러한 변형 단백질은, 예를 들어, 면역독소로서의 치료학적 용도와 진단 용도를 지니고 있다.

이하의 도면은 본 명세서의 일부분을 구성하며, 본 발명의 특정한 관점을 추가로 설명하기 위해 포함된다. 본 발명은 본 명세서에 제시된 구체적인 양태의 상세한 설명과 함께 이들 도면 하나 이상을 참고로 하여 더 잘 이해될 수 있다.

도 1은 사람 혈청 샘플에 대한 항-r겔로닌 항체를 사용하여 수행된 ELISA이다.

도 2는 사람 항-겔로닌 항체에 의해 인식된 r겔로닌의 에피토프이다.

도 3A 내지 3B는 겔로닌 결실 작제물이다. 겔로닌 결실 작제물의 구조가 도시되어 있다.

도 4는 sfvMEL/rGel 융합 독소의 PCR-이용 작제 및 pET-32a 유도된 벡터 내로의 연결에 관한 도식도이다.

도 5는 sfvMEL/rGel 융합 작제물의 완전한 DNA 서열 분석을 도시한 것이다(서열 10).

도 6은 모 ZME-rGel 화학적 접합체와 sfvMEL-rGel 융합 작제물("sfvMEL/rGel"와 동일함)의 결합도를 비교한 것이다. ELISA 및 폴리클로날 토끼 항-겔로닌 폴리클로날 항체를 사용하여, A-375 세포에 대한 결합도를 평가하였다. 표적 세포에 대한 양 작제물의 결합도는 유사하지만, 재조합 융합 작제물에 대해서 약간 높은 결합도가 관찰되었다.

도 7은 항원-양성 A375 사람 흑색종 세포에 대한 모 ZME-rGel 화학적 접합체와 sfvMEL-rGel 융합 작제물의 시험관내 세포독성을 비교한 것이다. 세포를 도말한 다음, 각종 용량의 sfvMEL/rGel 융합 작제물, ZME-rGel 화학적 접합체 또는 자유 재조합 겔로닌으로 72시간 동안 처리하였다. 양 면역접합체에 대한 IC₅₀값은 대략 8nM인 반면, 재조합 겔로닌에 대한 IC₅₀값은 대략 2 x 10³nM으로 몇 차수 높았다.

도 8은 sfvMEL/rGel 면역독소와 ZME 항체와의 경쟁적 억제를 나타낸 것이다. 각종 농도의 재조합 면역독소를 로그-상 배양 하의 A-375 사람 흑색종 세포에 4회 가하였다. 또 다른 세트의 웰에, 고정 농도의 항체 ZME(50㎍/ml)를 각종 용량의 sfvMEL/rGel 면역독소와 함께 혼합하고 72시간 동안 항온 처리하였다. 자유 ZME 항체를 부가하면, 면역독소 세포독성이 대략 3배 정도 저하되었다.

도 9. 우측 플랭크에서 성장하는 잘 발달된 흑색종 종양(A-375)이 있는 누드 마우스를 식염수(대조군) 또는 sfvMEL/rGel를 2mg/kg 또는 20mg/kg(총 용량)으로 4일 연속해서(화살표) 처리하였다(정맥내). 종양 면적을 30일 동안 측정하였다. 식염수 처리된 대조군 종양은 이 기간 동안 30에서 150㎟ 으로 증가하였다. 가장 낮은 용량의 면역독소로 처리된 종양은 30에서 60㎟로 증가하였다. 가장 높은 용량의 면역독소로 처리된 동물은 종양 크기가 전반적으로 본래의 30㎟로부터 증가하지 않은 것으로 나타났다.

도 10. scfvMEL-CFR2018(또한, "sfvMEL-CFR2018"로서 공지되기도 함)의 세포독성을 시험관내 세포독성 검정에서 A375-M 흑색종 세포에 대한 scfvMEL-CFR2025의 세포독성과 비교하였다.

항원성이 저하된 단백질과 폴리펩타이드는 면역계를 지닌 유기체에게 투여된 조성물로서 엄청난 이점을 제공해줄 수 있다. 이러한 단백질 및 폴리펩타이드를 고안 및 생성시키는 방법이 본원에 기재되어 있고, 이로써 생성된 분자들이다. 이들 방법에 특히 흥미로운 후보가 효소인데, 이는 특정 효소의 효소적 활성을 보존시킬 뿐만 아니라 대상체 내에서의 이의 항원성을 저하시키는 것이(이는 해당 단백질의 효소적 활성으로부터 유익할 수 있다) 바람직할 수 있기 때문이다. 리보솜-불활성화 단백질(RIP)이 이러한 단백질의 한 예이다. 따라서, 본 발명의 몇몇 양태에서는, 식물 독소, 예를 들면, 겔로닌을 포함하는 핵산 및 폴리펩타이드 조성물이 제공된다. 하나의 폴리펩타이드가 또 다른 폴리펩타이드(예를 들면, 표적화 분자)와 조합하여 독성 기능을 제공해주도록 단백질을 디자인할 수 있다. 이들 디자이너 독소는 광범위하게 적용된다.

I. 단백질성 화합물

특정 양태에서, 본 발명은 본래의 단백질 또는 야생형 단백질에 비해 변형시킨 단백질성 분자를 포함하는 신규한 조성물에 관한 것이다. 몇몇 양태에서는, 상기 단백질성 화합물에서 아미노산 잔기가 결실되었고; 기타 양태에서는, 단백질성 화합물의 아미노산 잔기가 대체된 반면, 추가의 양태에서는, 단백질성 화합물 내에서 아미노산 잔기의 결실과 대체 모두가 이루어졌다. 더우기, 단백질성 화합물은 하나 이상의 폴리펩타이드 실체를 포함하는 아미노산 분자를 포함할 수 있다. 본원에 사용된 바와 같은 "단백질성 분자", "단백질성 조성물", "단백질성 화합물", "단백질성 쇄" 또는 "단백질성 물질"은 일반적으로, 특정 유전자로부터 해독된 완전한 길이의 내인성 서열 또는 약 200개 이상의 아미노산 잔기의 단백질; 약 100개 이상의 아미노산의 폴리펩타이드; 및/또는 약 3 내지 약 100개의 아미노산의 펩타이드를 지칭하지만, 이에 제한되지 않는다. 상기 기재된 "단백질성" 용어 모두는 본원에 상호교환적으로 사용될 수 있다. 더우기, 이들 용어는 또한 융합 단백질 또는 단백질 접합체에도 적용될 수 있다.

특정 양태에서, 하나 이상의 단백질성 분자의 크기는 약 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 275, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400,1500, 1750, 2000, 2250, 2500개 이상의 아미노 분자 잔기, 및 이들에서 유도될 수 있는 모든 범위의 잔기를 포함할 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 화합물은 서열 1 및/또는 서열 11로부터의 상기 언급된 수의 연속되는 아미노산을 포함할 수 있다. 서열 1에 대해 양태를 본원에 기재된 기타 모든 아미노산 서열(서열 11 포함)에 대해서도 이용할 수 있으며, 경우에 따라, 그 반대의 상황도 가능하다는 것이 고려된다.

따라서, "단백질성 조성물"이란 용어는 천연적으로 합성된 단백질 내의 20개의 공통 아미노산 중의 1개 이상, 또는 하나 이상의 변형되거나 생소한 아미노산(이에는 다음 표 1A에 제시된 것이 포함되지만, 이에 제한되지 않는다)을 포함하는 아미노 분자 서열을 포괄한다:

본원에 사용된 바와 같은 "아미노 분자"는 당업자에게 공지된 바와 같은 모든 아미노산, 아미노산 유도체 또는 아미노산 모사체를 지칭한다. 특정 양태에서, 단백질성 분자의 잔기는, 아미노 분자 잔기의 서열을 차단하는 어떠한 비-아미노 분자도 함유하지 않으면서 순차적이다. 기타 양태에서는, 상기 서열이 하나 이상의 비-아미노 분자 잔기를 포함할 수 있다. 특정 양태에서는, 단백질성 분자의 잔기 서열이 하나 이상의 비-아미노 분자 잔기에 의해 차단될 수 있다.

1. 작용성 국면

본 발명은 변형 단백질, 특히 대상체에게 치료학적 이점을 부여해주는 변형 단백질에 관한 것인데, 이는 당해 변형 단백질이 변형되지 않은 단백질에 필적하는 작용적 활성을 나타내긴 하지만, 변형 단백질은 변형되지 않은 단백질에 비해 대상체에게서 부가의 장점을 나타내는데, 예를 들어, 항원성이 보다 덜하고/하거나 부작용을 보다 적게 유발시키고/시키거나 보다 우수하거나 보다 긴 효능을 나타내기 때문이다. 따라서, 본원이 "변형 단백질"의 작용 또는 활성을 언급하는 경우, 당업자는 이것이, 예를 들어, 1) 변형되지 않은 단백질과 동일한 특이성을 지니거나 또는 동일한 활성을 실행하지만, 상이한 수준의 활성을 지닐 수 있고; 2) 변형되지 않은 단백질에 비해 부가의 장점을 보유하고 있는 단백질을 포함한다는 것을 인지할 것이다. 활성의 결정은 당업자에게 친숙한 검정, 특히 단백질의 활성에 대해 당업자에게 친숙한 검정을 이용하여 달성할 수 있으며, 비교 목적을 위해, 예를 들면, 변형되거나 변형되지 않은 단백질의 본래 및/또는 재조합 버젼을 사용할 수도 있다.

2. 변형 단백질

본 발명의 변형 단백질은 아미노산 결실물 및/또는 치환물을 보유할 수 있으므로, 결실이 있는 단백질, 치환이 있는 단백질, 및 결실과 치환 둘 다가 있는 단백질이 변형 단백질이다. 몇몇 양태에서, 이들 변형 단백질은 삽입되거나 부가된 아미노산을 추가로 포함할 수 있는데, 예를 들면, 융합 단백질 또는 링커가 있는 단백질일 수 있다. "결실된 변형 단백질"은 본래 단백질의 하나 이상의 잔기가 결여되어 있지만, 본래 단백질의 특이성 및/또는 활성을 보유하고 있다. "결실된 변형 단백질"은 또한, 저하된 면역원성 또는 항원성을 지닐 수도 있다. 결실된 변형 단백질의 한 예는 하나 이상의 항원성 영역, 즉 특정한 유기체, 예를 들면, 변형 단백질을 투여할 수 있는 유기체 유형 내에서 항원성이도록 결정된 단백질 영역으로부터 결실된 아미노산 잔기를 갖는 것이다.

치환 또는 대체 변이체는 전형적으로, 하나의 아미노산을 해당 단백질 내의 하나 이상의 부위에서의 또 다른 아미노산으로 교환시킨 것을 함유하는데, 이는 해당 폴리펩타이드의 한 가지 이상의 특성을 조정하도록 디자인될 수 있는데, 특히 이의 면역원성/항원성을 저하시키거나, 대상체 내에서의 모든 부작용을 감소시키거나 또는 이의 효능을 증가시키도록 디자인될 수 있다. 이러한 종류의 치환은 바람직하게는 보존적인데, 즉 하나의 아미노산이 유사한 외형과 전하의 아미노산으로 대체된다. 보존적 치환은 당업계에 널리 공지되어 있으며, 이에는, 예를 들어, 다음과 같은 변화가 포함된다: 알라닌을 세린으로 치환; 아르기닌을 리신으로 치환; 아스파라긴을 글루타민 또는 히스티딘으로 치환; 아스파르테이트를 글루타메이트로 치환; 시스테인을 세린으로 치환; 글루타민을 아스파라긴으로 치환; 글루타메이트를 아스파르테이트로 치환; 글라이신을 프롤린으로 치환; 히스티딘을 아스파라긴 또는 글루타민으로 치환; 이소류신을 류신 또는 발린으로 치환; 류신을 발린 또는 이소류신으로 치환; 리신을 아르기닌으로 치환; 메티오닌을 류신 또는 이소류신으로 치환; 페닐알라닌을 티로신, 류신 또는 메티오닌으로 치환; 세린을 트레오닌으로 치환; 트레오닌을 세린으로 치환; 티립토판을 티로신으로 치환; 티로신을 트립토판 또는 페닐알라닌으로 치환; 및 발린을 이소류신 또는 류신으로 치환. 폴리펩타이드의 항원성 영역을 덜 항원성인 영역으로 치환할 수 있고, 이러한 덜 항원성인 영역은 본래의 단백질 내의 상응하는 잔기와 동일한 잔기를 함유할 수 있지만, 몇몇 보존적 치환물 및/또는 비-보존적 치환물을 함유하기도 한다.

결실 또는 치환 이외에도, 변형 단백질은, 전형적으로 해당 폴리펩타이드 내의 하나 이상의 잔기 부가물을 포함하는 잔기 삽입물을 보유할 수 있다. 이에는 표적화 펩타이드 또는 폴리펩타이드의 삽입물, 또는 간단히 단일 잔기의 삽입물이 포함될 수 있다. 융합 단백질로 불리우는 말단 부가물이 다음에 논의된다.

용어 "생물학적 작용성 등가물"은 당업계에 널리 인지되어 있고 본원에 추가로 상세히 규정된다. 따라서, 본래의 폴리펩타이드의 아미노산과 동일하거나 작용성 등가물이 아미노산을 약 70 내지 약 80%, 약 81 내지 약 90%, 또는 약 91 내지 약 99% 갖는 서열이 포함되는데, 단 이러한 단백질의 생물학적 활성은 유지된다. 변형 단백질은 이의 본래의 대응물과 생물학적 작용성 등가물일 수 있다.

아미노산 및 핵산 서열은 부가의 잔기, 예를 들면, 부가의 N 또는 C-말단 아미노산 또는 5' 또는 3' 서열을 포함할 수 있지만, 본원에 기재된 서열 중의 하나에 제시된 바와 본질적으로 같을 것임을 인지해야 하는데, 단 이러한 서열은 단백질 발현과 관련된 경우에는 생물학적 단백질 활성의 유지를 포함한 상기 제시된 기준을 충족시켜야 한다. 말단 서열의 부가는 특히, 예를 들어, 암호화 영역의 5' 또는 3' 부분 중의 어느 하나를 플랭킹하는 각종 비-암호화 서열을 포함할 수 있거나 또는 유전자 내에 발생되는 것으로 공지되어 있는 각종 내부 서열, 즉 인트론을 포함할 수 있는 핵산 서열에 적용한다.

등가이거나 심지어 개선된 제2 세대 분자를 생성시키기 위해 단백질의 핵산을 변화시키는 것에 근거한 논의가 다음에 제시된다. 예를 들면, 기질 분자에 대한 결합 부위와 같은 구조물과의 상호작용성 결합 능력의 실질적인 손실없이, 특정 아미노산을 단백질 구조 내의 다른 아미노산으로 치환시킬 수 있다. 이는 단백질의 생물학적 작용성 활성을 규정하는 단백질의 상호작용성 능력과 특성이기 때문에, 특정의 아미노산 치환이 단백질 서열 내에서 및 이의 하부 DNA 암호화 서열 내에서 이루어질 있으며, 그럼에도 불구하고 유사한 성질을 지닌 단백질이 생성된다. 따라서, 다음에 논의된 바와 같이 이들의 생물학적 유용성 또는 활성의 실질적인 손실 없이 유전자의 DNA 서열 내에서 각종의 변화가 이루어질 수 있는 것으로 본 발명자에 의해 고려된다. 표 1은 특정의 아미노산을 암호화하는 코돈을 제시한 것이다. 단백질성 분자는 다음의 "상동률 기준" 중의 하나가 충족되는 경우에, 제2의 단백질성 분자에 대한 "상동률"을 나타내거나 이러한 분자와 "상동성"인 것으로 간주된다: 1) 단백질성 분자의 30% 이상이 제2의 단백질성 분자와 동일한 위치에서 서열 동일성을 나타내거나, 2) 제2의 단백질성 분자와 동일한 위치 및 동일하지 않은 잔기에서 몇몇 서열 동일성을 나타내고, 이들 중의 30%가 다음에 기재된 바와 같이 제2의 단백질 분자에 대해 보존적 차이를 나타내거나 또는 3) 단백질성 분자의 30%가 제2의 단백질성 분자와 서열 동일성을 나타내지만, 동일한 잔기 간에는 동일하지 않은 잔기 갭이 존재할 수도 있다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "상동성"은 전체 분자 대신 단백질성 분자의 특정 영역에 동등하게 적용될 수 있다. 용어 "상동률" 또는 "상동성"은 수치, 예를 들면, "50% 상동률" 또는 "50% 상동성"으로써 한정되는데, 이때 1), 2) 및 3)에 대한 상동률 기준은 "30% 이상"에서 "50% 이상"으로 조정된다. 따라서, 2개의 단백질성 분자 또는 단백질성 분자의 일정 부분 간에는 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 이상의 상동률이 존재할 수 있는 것으로 고려된다.

이러한 변화를 만드는데 있어서, 아미노산의 수치료 지수가 검토될 수 있다. 특정 단백질에 상호작용성 생물학적 기능을 부여하는데 있어서의 수치료 아미노산 지수의 중요성은 일반적으로 당업계에 인지되어 있다[참조: Kyte & Doolittle, 1982]. 아미노산의 상대적 수치료 특징이, 생성된 단백질의 2차 구조에 기여하고, 이것이 궁극적으로 상기 단백질과 기타 분자, 예를 들면, 효소, 기질, 수용체, DNA, 항체, 항원 등과의 상호작용을 규정하는 것으로 용인되고 있다.

유사한 아미노산의 치환은 친수도를 기준으로 하여 효과적으로 만들어질 수 있는 것으로 당업계에 또한 인식되고 있다. 본원에 참조문헌으로써 삽입된 미국 특히 제4,554,101호에는 이의 인접한 아미노산의 친수도에 좌우되는 바와 같은, 특정 단백질의 가장 큰 국소 평균 친수도는 해당 단백질의 생물학적 특성과 상관이 있다고 언급되어 있다. 미국 특허 제4,554,101에 상세한 바와 같이, 다음의 친수도 값이 아미노산 잔기에 지정되었다: 아르기닌(+3.0); 리신(+3.0); 아스파르테이트(+3.0±1); 글루타메이트(+3.0±1); 세린(+0.3); 아스파라긴(+0.2); 글루타민(+0.2); 글라이신(0); 트레오닌(-0.4); 프롤린(-0.5±1); 알라닌(-0.5); 히스티딘(-0.5); 시스테인(-1.0); 메티오닌(-1.3); 발린(-1.5); 류신(-1.8); 이소류신(-1.8); 티로신(-2.3); 페닐알라닌(-2.5); 트립토판(-3.4).

아미노산을 유사한 친수도 값을 지닌 또 다른 아미노산으로 치환시킬 수 있으며, 이로써 생물학적으로 등가이고 면역학적으로 등가인 단백질이 생성될 것이다. 이러한 변화에서는, 이의 친수도 값이 ±2 범위 내인 아미노산을 치환하는 것이 바람직하고, 친수도 값이 ±1 범위 내인 아미노산을 치환하는 것이 특히 바람직하며, 친수도 값이 ±0.5 범위 내인 아미노산을 치환하는 것이 보다 특히 바람직하다.

다음에 요약된 바와 같이, 아미노산 치환은 일반적으로, 아미노산 측쇄 치환체들의 상대적 유사도, 예를 들면, 이들의 소수도, 친수도, 전하, 크기 등에 근거한 것이다. 전술된 각종 특징들을 고려한 치환의 예가 당업자에게 널리 공지되어 있고, 이에는 아르기닌과 리신; 글루타메이트와 아스파르테이트; 세린과 트레오닌; 글루타민과 아스파라긴; 및 발린, 류신 및 이소류신이 포함된다.

표 2에는 본원에 기재된 본 발명의 방법에 따라서 변형될 수 있는 단백질과 폴리펩타이드의 목록이 제공되어 있다. 비-사람 폴리펩타이드가, 사람에게서 이의 항원성을 저하시키기 위한 본 발명의 방법의 표적으로서 구체적으로 고려된다. 치료학적 가치를 지닌 비-사람 단백질은 본 발명의 범위 내에 있는 것으로 고려된다. 본 명세서에 논의된 기타 모든 단백질 또는 폴리펩타이드를 본 발명의 방법에 따라서 변형시킬 수 있다.

본 발명에 따르는 변형 폴리펩타이드를 제조하기 위한 또 다른 양태는 펩타이드 모사체를 사용하는 것이다. 모사체는 단백질 2차 구조 요소를 모사하는 펩타이드 함유 분자이다[참조: Johnson (1993)]. 펩타이드 모사체를 사용하는 것 이면의 근본적인 이유는 단백질의 펩타이드 주쇄가, 항체와 항원의 분자상 상호작용과 같은 상호작용을 촉진시키는 방식으로 아미노산 측쇄를 주로 배향시키도록 존재하기 때문이다. 펩타이드 모사체는 천연 분자와 유사한 분자상 상호작용을 허용하는 것으로 예상된다. 이들 원리를 상기 언급된 원리와 연계해서 사용하여, 본래 단백질의 천연 특성 중의 많은 특성을 지니고 있지만, 변화된 특징을 지니고 있고 몇몇 경우에는 심지어 개선된 특징을 지니고 있는 제2 세대 변형 단백질 분자를 공학적으로 처리할 수 있다.

3. 다중폴리펩타이드 단백질성 화합물

본 발명은 하나 이상의 폴리펩타이드로부터의 아미노산 서열을 포함할 수 있는 단백질성 화합물에 관한 것이다. 단백질성 화합물 또는 분자는, 예를 들어, 항체의 항원 결합 영역을 지닌 변형된 독소를 포함할 수 있다. 이러한 다중폴리펩타이드 단백질성 분자는 서로 화학적으로 접합된 2개 이상의 단백질일 수 있거나, 또는 이는 동일한 핵산 분자에 의해 암호화된 2개 이상의 폴리펩타이드의 융합 단백질일 수 있다. 활성을 지닌 제2 폴리펩타이드와 독소를 포함하는 융합 또는 접합 단백질이 "이중 독소"로서 지칭될 수 있다. 따라서, 다중폴리펩타이드 단백질성 화합물은 제1 폴리펩타이드의 전부 또는 일부와, 제2 폴리펩타이드, 제3 폴리펩타이드, 제4 폴리펩타이드, 제5 폴리펩타이드, 제6 폴리펩타이드, 제7 폴리펩타이드, 제8 폴리펩타이드, 제9 폴리펩타이드, 제10 폴리펩타이드, 또는 그 이상의 폴리펩타이드의 전부 또는 일부로 구성될 수 있다.

디자이너 독소는 그 자체로는 일반적으로, 세포 표면과 결합하거나 특이적 세포 내에서 이동하는 능력을 지니고 있지 않다. 따라서, 이들 제제는 특이적 표적 세포와 결합할 수 있고, 일단 결합되면 세포 내로 효율적으로 이동할 수 있는 제제/단백질과의 화학적 접합 또는 융합을 요구한다. 표 3에는, 특히 공학적으로 처리된 단백질성 화합물을 특정하게 위치된, 예를 들면, 특이적 세포 유형 또는 신체 일부에 표적화시키는 것을 포함하는 양태에서, 본 발명의 독소와 접합 또는 융합될 수 있는 단백질 및 폴리펩타이드의 목록이 제시되어 있다. 본 발명은 추가로, 독소 분자의 전부 또는 일부를 표 2에 열거된 단백질의 전부 또는 일부와 인접시키는 것을 포함한다. 본 발명은 이들 표 2 및 3에 제시된 예를 포함하지만, 이에 제한되지 않는 것으로 고려된다.

a. 융합 단백질

삽입 변이체의 특수 종류가 융합 단백질이다. 이러한 분자는 일반적으로, N- 또는 C-말단에서, 제2 폴리펩타이드의 전부 또는 일정 부분에 연결된 본래 분자의 전부 또는 상당 부분을 갖는다. 예를 들면, 융합물은 전형적으로, 이종 숙주 내에서의 특정 단백질의 재조합 발현을 허용하기 위해 기타 종으로부터의 리더(leader) 서열을 이용한다. 또 다른 유용한 융합물에는 융합 단백질의 표적화 또는 정제를 촉진시키기 위해, 항체 에피토프 또는 기타 태그와 같이 면역학적으로 활성인 도메인의 부가물이 포함된다. 태그로서 6xHis 및 GST(글루타치온 S 트랜스퍼라제)를 사용하는 것은 널리 공지되어 있다. 융합 연결부 또는 그 근처에 절단부위를 봉입시키는 것은 정제 후 관계없는 폴리펩타이드의 제거를 촉진시켜 줄것이다. 기타 유용한 융합물에는 작용성 도메인, 예를 들면, 효소(예: 하이드롤라제)로부터의 활성 부위, 글리코실화 도메인, 세포성 표적화 시그날 또는 막관통(transmembrane) 영역의 연결물이 포함된다.

면역독소가 본 발명의 양태로서 구체적으로 고려된다. 면역독소는 적어도 항체의 일정 부분과 독소 분자의 일정 부분을 포함하는 세포독성 화합물이다. 이러한 항체와 독소를 서로 융합 또는 접합시킬 수 있다. 면역독소에 관한 보다 상세한 내역이 다음에 제시된다.

b. 접합 단백질

본 발명의 추가로, 하나 이상의 제제에 연결되어 항체 접합체를 형성하는, 일반적으로 모노클로날 유형의 접합 폴리펩타이드, 예를 들면, 해독된 단백질, 폴리펩타이드 및 펩타이드를 제공한다. 진단제 또는 치료제로서의 항체 분자의 효능을 증가시키기 위해서는, 하나 이상의 목적하는 분자 또는 잔기를 연결시키거나 공유적으로 결합시키거나 복합체를 형성시키는 것이 통상적이다. 이러한 분자 또는 잔기는 하나 이상의 효과인자(effector) 또는 리포터(reporter) 분자일 수 있지만, 이에 제한되지는 않는다. 효과인자 분자는 목적하는 활성, 예를 들면, 세포독성 활성을 지닌 분자를 포함한다. 항체에 부착시킨 효과인자 분자의 비-제한적 예에는 독소, 항-종양제, 치료학적 효소, 방사성 표지된 뉴클레오타이드, 항바이러스제, 킬레이트제, 사이토킨, 성장 인자 및 올리고- 또는 폴리-뉴클레오타이드가 포함된다. 이와는 대조적으로, 리포터 분자는 특정 검정을 이용하여 검출할 수 있는모든 잔기로서 규정된다. 항체에 접합시킨 리포터 분자의 비-제한적 예에는 효소, 방사성 표지물, 합텐, 형광성 표지물, 인광성 분자, 화학발광성 분자, 발색단, 발광성 분자, 광친화성 분자, 착색 입자 또는 리간드, 예를 들면, 바이오틴이 포함된다.

충분한 선택성, 특이성 또는 친화성을 지닌 어떠한 항체도 항체 접합체에 대한 기준물로서 이용될 수 있다. 이러한 단백질은 당업자에게 공지된 통상적인 면역학적 스크리닝 방법을 이용하여 평가할 수 있다. 표준 항원 결합 부위 이외에, 항체 분자 내에서 생물학적 활성 분자와 결합하기 위한 부위에는 병원체, B 세포 슈퍼항원, T 세포 공-수용체 CD4 및 HIV-1 엔벨로프와 결합할 수 있는 가변 영역 내에 존재하는 부위가 포함된다[참조: Sasso et al., 1989; Shorki et al., 1991; Silvermann et al., 1995; Cleary et al., 1994; Lenert et al., 1990; Berberian et al., 1993; Kreier et al., 1991]. 또한, 가변 영역은 항체 자가-결합과 연관이 있고[참조: Kang et al., 1988], 이는 항-항체에 의해 인식된 에피토프(이디오토프)를 함유한다[참조: Kohler et al., 1989].

항체 접합체의 특정 예는 항체가 검출 가능한 표지물에 연결된 접합체이다. "검출 가능한 표지물"은 이의 특이적 작용성 특성, 및/또는 화학적 특징으로 인해 검출될 수 있는 화합물 및/또는 요소인데, 이의 사용으로 인해, 이들에 부착된 항체를 검출할 수 있고/있거나, 경우에 따라, 이를 정량화할 수 있다. 이의 또 다른 예는 세포독성 또는 항-세포성 제제에 연결된 항체를 포함하는 접합체의 형성인데, 이는 "면역독소"로 지칭될 수 있다.

항체 접합체를 진단제로서의 용도에 이용할 수 있다. 항체 진단제는 일반적으로, 2가지 부류에 속하는데, 즉 시험관내 진단, 예를 들면, 각종 면역검정에서의 같은 시험관내 진단에 사용하기 위한 용도, 및/또는 일반적으로 "항체-지시된 영상화"로서 공지된 생체내 진단 프로토콜에 사용하기 위한 용도를 지닌다.

적당한 수 많은 영상화제가 당업계에 공지되어 있고, 이들을 항체에 부착시키는 방법 또한 공지되어 있다[참조: 본원에 참조문헌으로써 삽입된 미국 특허 제5,021,236호; 제4,938,948호; 및 제4,472,509호]. 사용된 영상화 잔기는 상자성 이온; 방사성 동위원소; 형광단; NMR-검출 가능한 물질; X선 영상화일 수 있다.

상자성 이온의 경우에는, 이의 예로써 크롬(III), 망간(II), 철(III), 철(II), 코발트(II), 니켈(II), 구리(II), 네오디뮴(III), 사마륨(III), 이테르븀(III), 가돌리늄(III), 바나듐(II), 테르븀(III), 디스프로슘(III), 홀뮴(III), 및/또는 에르븀(III) 등의 이온이 언급될 수 있으며, 가돌리늄이 특히 바람직하다. 기타 맥락, 예를 들면, X선 영상화에 유용한 이온에는 란타늄(III), 금(III), 납(II), 및 특히 비스무트(III)가 포함되지만, 이에 제한되지 않는다.

치료 및/또는 진단 적용을 위한 방사성 동위원소의 경우에는, 아스타틴²¹¹,¹⁴탄소,⁵¹크롬,³⁶염소,⁵⁷코발트,⁵⁸코발트, 구리⁶⁷,¹⁵²Eu, 갈륨⁶⁷,³수소, 요오드¹²³, 요오드¹²⁵, 요오드¹³¹, 인듐¹¹¹,⁵⁹철,³²인, 루테늄¹⁸⁶, 루테늄¹⁸⁸,⁷⁵셀레늄,³⁵황, 테크니슘^99m및/또는 이트륨⁹⁰이 언급될 수 있다. 특정 양태에 사용하는데에는¹²⁵I가 종종바람직하고, 테크니슘^99m및/또는 인듐¹¹¹역시 이들의 낮은 에너지와 긴 범위 검출에 대한 적합성으로 인해 종종 바람직하다. 본 발명의 방사성 표지된 모노클로날 항체는 당해 분야에 공지된 방법에 따라서 생성할 수 있다. 예를 들면, 모노클로날 항체는 나트륨 및/또는 칼륨 요오드화물 및 화학적 산화제, 예를 들면, 나트륨 하이포클로라이트, 또는 효소적 산화제, 예를 들면, 락토퍼옥시다제와 접촉시킴으로써 상기 항체를 요오드화시킬 수 있다. 본 발명에 따르는 모노클로날 항체는, 리간드 교환 공정, 예를 들면, 퍼테크네이트를 주석 함유 용액으로 환원시키고, 이와 같이 환원된 테크네튬을 세파덱스 칼럼 상으로 킬레이트시킨 다음, 항체를 상기 칼럼에 적용시킴으로써, 테크네튬^99m으로 표지시킬 수 있다. 또 다른 한편, 직접적인 표지화 기술을 사용할 수 있는데, 예를 들면, 퍼테크네이트, 환원제, 예를 들면, SNCl₂, 완충제 용액, 예를 들면, 나트륨-칼륨 프탈레이트 용액 및 항체를 항온 처리할 수 있다. 금속성 이온으로서 존재하는 방사성 동위원소를 항체에 결합시키기 위해 종종 사용되는 중간 작용성 그룹은 디에틸렌트리아민펜타아세트산(DTPA) 또는 에틸렌 디아민테트라아세트산(EDTA)이다.

접합체로서 사용하기 위해 고려된 형광성 표지물에는 알렉사 350, 알렉사 430, AMCA, BODIPY 630/650, BODIPY 650/665, BODIPY-FL, BODIPY-R6G, BODIPY-TMR, BODIPY-TRX, 케스케이드 블루, Cy3, Cy5,6-FAM, 플루오레세인 이소티오시아네이트, HEX, 6-JOE, 오레곤 그린 488, 오레곤 그린 500, 오레곤 그린 514, 파시픽 블루, REG, 로다민 그린, 로다민 레드, 레노그라핀, ROX, TAMRA, TET, 테트라메틸로다민,및/또는 텍사스 레드가 포함된다.

본 발명에 고려된 또 다른 유형의 항체 접합체는 주로 시험관내에서 사용하도록 의도된 것인데, 여기서는 항체를 2차 결합 리간드 및/또는 효소(효소 태그)에 연결시키는데, 이는 색소원성 물질과의 접촉시 착색 생성물을 생성시킬 것이다. 적합한 효소의 예에는 우레아, 알칼린 포스파타제, (서양 고추냉이) 수소 퍼옥시다제 또는 글루코즈 옥시다제가 포함된다. 바람직한 2차 결합 리간드는 바이오틴 및/또는 아비딘 및 스트렙트아비딘 화합물이다. 이러한 표지물의 용도는 당업자에게 널리 공지되어 있고, 예를 들면, 미국 특허 제3,817,837호; 제3,850,752호; 제3,939,350호; 제3,996,345호; 제4,277,437호; 제4,275,149호; 및 제4,355,241호(이들 각각이 본원에 참조문헌으로써 삽입되어 있다)에 기재되어 있다.

분자를 항체에 부위-특이적으로 부착시키는 것으로 공지된 또 다른 방법은 항체를 합텐계 친화성 표지물과 반응시키는 것을 포함한다. 본질적으로, 합텐계 친화성 표지물은 항원 결합 부위 내의 아미노산과 반응함으로써, 이러한 부위를 파괴시키고 특이적 항원 반응을 차단시킨다. 그러나, 이러한 방법은 불리할 수도 있는데, 이는 상기 항체 접합체에 의해 항원 결합이 상실되기 때문이다.

아지도 그룹을 함유하는 분자를 또한 사용하여, 낮은 세기의 자외선에 의해 발생되는 반응성 니트렌 중간체를 통하여 단백질에 대한 공유 결합을 형성시킬 수 있다[참조: Potter & Haley, 1983]. 특히, 퓨린 뉴클레오타이드의 2- 및 8-아지도 동족체가, 조 세포 추출물 중의 뉴클레오타이드 결합 단백질을 동정하기 위한 부위-지시된 광프로브로서 사용되어 왔다[참조: Owens & Haley, 1987; Atherton etal., 1985]. 2- 및 8-아지도 뉴클레오타이드가 또한, 정제된 단백질의 뉴클레오타이드 결합 도메인을 지도화하기 위해 사용되어 왔으며[참조: Khatoon et al., 1989; King et al., 1989; and Dholakia et al., 1989], 이는 항체 결합 제제로서 사용될 수 있다.

항체를 이의 접합체 잔기에 부착 또는 접합시키기 위한 몇 가지 방법이 당해 분야에 공지되어 있다. 몇몇 부착 방법은 예를 들어, 항체에 부착된 유기 킬레이트제, 예를 들면, 디에틸렌트리아민펜타아세트산 무수물(DTPA); 에틸렌트리아민테트라아세트산; N-클로로-p-톨루엔설폰아미드; 및/또는 테트라클로로-3α-6α-디페닐글리코우릴-3을 이용하여 금속 킬레이트 착물을 사용하는 것을 포함한다[참조: 본원에 참조문헌으로써 삽입된 미국 특허 제4,472,509호; 및 제4,938,948호]. 모노클로날 항체를 커플링제, 예를 들면, 글루타르알데히드 또는 퍼요오데이트의 존재 하에 효소와 반응시킬 수도 있다. 플루오레세인 마커와의 접합체는 이들 커플링제의 존재 하에 제조하거나 또는 이소티오시아네이트와 반응시킴으로써 제조한다. 미국 특허 제4,938,948호에서는, 모노클로날 항체를 사용하여 유방 종양을 영상화시키고, 이러한 검출 가능한 영상화 잔기를 링커, 예를 들면, 메틸-p-하이드록시벤즈이미데이트 또는 N-석신이미딜-3-(4-하이드록시페닐)프로피오네이트를 사용하여 항체에 결합시킨다.

기타 양태에서는, 항체 결합 부위를 변화시키지 않는 반응 조건을 사용하여, 면역글로불린의 Fc 영역 중의 설프하이드릴 그룹을 선택적으로 도입함으로써 면역글로불린을 유도체화시키는 것이 고려된다. 이러한 방법에 따라서 제조된 항체 접합체는 개선된 수명, 특이성 및 민감성을 나타내는 것으로 보고되었다[참조: 본원에 참조문헌으로써 삽입된 미국 특허 제5,196,066호]. 리포터 또는 효과인자 분자를 Fc 영역 중의 탄수화물 잔기에 접합시키는, 효과인자 또는 리포터 분자의 부위-특이적 부착 방법이 또한 다음 문헌에 보고되었다[참조: O'Shannessy et al., 1987]. 이러한 접근법은 현재 임상 평가 중인, 진단적 및 치료학적으로 탁월한 항체를 생성시키는 것으로 보고되었다.

i. 링커/커플링제

예를 들어, 접합된 면역독소를 갖는 다중 펩타이드 또는 폴리펩타이드는 생물학적으로 방출 가능한 결합, 예를 들면, 선택적으로 절단 가능한 링커 또는 아미노산 서열을 통하여 연결시킬 수 있다. 예를 들면, 종양 환경 내에서 활성이거나 이에 우선적으로 국재된 효소에 대한 절단 부위를 포함하는 펩타이드 링커가 고려된다. 이러한 펩타이드의 예시적 형태는 우로키나제, 플라스민, 트롬빈, 인자 IXa, 인자 Xa, 또는 메탈로프로테이나제, 예를 들면, 콜라게나제, 젤라티나제 또는 스트로멜리신에 의해 절단되는 것이다. 또 다른 한편, 펩타이드 또는 폴리펩타이드를 아쥬반트(adjuvant)에 연결시킬 수도 있다.

아미노산, 예를 들면, 선택적으로 절단 가능한 링커, 합성 링커 또는 기타 아미노산 서열을 사용하여 단백질성 잔기를 분리시킬 수 있다. 부가적으로, 독소 잔기를 표적화 제제와 접합시키는데 성공적으로 이용될 수 있는 수 많은 유형의 디설파이드-결합 함유 링커가 공지되어 있긴 하지만, 약리학적 특징과 성능이 상이하다는 것에 근거한 특정의 링커가 다른 링커에 비해 일반적으로 바람직할 것이다.예를 들면, 입체적으로 "장애된" 디설파이드 결합을 함유하는 링커가 바람직해야 하는데, 이는 이들이 생체내에서 보다 안정적이어서, 독소 잔기가 작용 부위에 결합하기도 전에 방출되는 것을 방지할 수 있기 때문이다. 더우기, 본 발명에 따르는 특정의 이점은 겔로닌, 및 리신의 탈글리코실화 A 쇄를 포함한 수 많은 독소 잔기의 사용을 통하여 실현될 것이다.

면역독소에 사용하기 적당한 모든 생화학적 가교-링커가 또한, 본 발명에 사용될 것이라는 것이 일반적인 지침으로서 간주될 수 있으며, 부가의 링커가 또한 고찰될 수도 있다.

가교결합 시약을 사용하여, 2가지 상이한 분자, 예를 들면, 안정화제와 응고제의 작용성 그룹을 함께 묶어주는 분자상 브릿지(bridge)를 형성시킨다. 2가지 상이한 단백질을 단계별 방식으로 연결시키기 위해, 바람직하지 못한 동족중합체 형성을 피하게 해주는 헤테로-이작용성 가교-링커를 사용할 수 있다.

가교-링커는 본 발명의 변형 단백질 분자를 이용하여 이행될 수 있는 것으로 고려된다. 이작용성 가교결합 시약은 친화성 매트릭스의 제조, 다양한 구조물의 변형 및 안정화, 결합 부위의 동정 및 구조적 연구를 포함한 각종 목적에 광범위하게 사용되어 왔다. 본 발명의 맥락에서는, 이러한 가교-링커를 사용하여, 해당 폴리펩타이드를 안정화시키거나 또는 이것이 치료제로서 보다 유용하도록 만들 수 있는데, 예를 들면, 당해 변형 단백질의 표적화 성능 또는 전반적인 효능을 개선시킨다. 가교-링커는 또한 절단 가능할 수 있는데, 예를 들면, 디설파이드, 산-민감성 링커 등일 수 있다. 2개의 동일한 작용성 그룹을 수반하는 호모-이작용성 시약은동일한 거대분자와 상이한 거대분자 또는 특정 거대분자의 소단위체 간의 가교결합을 유도시키고, 폴리펩타이드를 결합 파트너 상의 특이적 결합 부위에 연결시키는데 상당히 효능이 있는 것으로 입증되었다. 헤테로-이작용성 시약은 2가지 상이한 작용성 그룹을 함유한다. 이러한 2가지 상이한 작용성 그룹의 반응성 차이에 편승하여, 가교결합을 선택적이면서도 순차적으로 조절할 수 있다. 이작용성 가교결합 시약은 이들의 작용성 그룹, 예를 들면, 아미노, 설프하이드릴, 구아니디노, 인돌, 카복실 특이적 그룹의 특이성에 따라서 나눌 수 있다. 이들 중에서, 자유 아미노 그룹에 대해 지시된 시약이 특히 가장 널리 이용되고 있는데, 이는 이들의 입수 용이성, 합성 용이성 및 이들이 적용될 수 있는 반응 조건의 유순성(mild) 때문이다. 대다수의 헤테로-이작용성 가교결합 시약은 1급 아민-반응성 그룹과 티올-반응성 그룹을 함유한다.

리간드를 리포좀에 가교결합시키는 방법의 예가 미국 특허 제5,603,872호 및 제5,401,511호(이들 각각의 전문이 본원에 참조문헌으로써 삽입되어 있다)에 기재되어 있다. 아민 잔기의 가교결합을 통하여, 각종 리간드를 리포좀성 표면에 공유 결합시킬 수 있다. 리포좀, 특히 다층 소포체(MLV) 또는 단층 소포체, 예를 들면, 미세유화 리포좀(MEL) 및 큰 단층 리포좀(LUVET)(각각 포스파티딜에탄올아민(PE)을 함유한다)이 정립된 과정에 의해 제조되었다. 리포좀 내에 PE를 봉입시키면, 가교결합 목적상 리포좀성 표면 상에 활성 작용성 잔기, 1급 아민이 제공된다. 상피 성장 인자(EGF)와 같은 리간드를 PE-리포좀에 성공적으로 연결시켰다. 리간드를 리포좀 표면 상의 별개의 부위에 공유 결합시킨다. 이들 부위의 수와 표면 밀도는리포좀 제형과 리포좀 유형에 의해 결정될 것이다. 리포좀성 표면은 또한, 비-공유 연합을 위한 부위를 가질 수도 있다. 리간드와 리포좀의 공유 접합체를 형성시키기 위해, 가교결합 시약을 대상으로 하여, 이의 유효성과 생체적합성에 대해 연구하여 왔다. 가교결합 시약에는 글루타르알데히드(GAD), 이작용성 옥시란(OXR), 에틸렌 글리콜 디글리시딜 에테르(EGDE), 및 수용성 카보디이미드, 바람직하게는 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필) 카보디이미드(EDC)가 포함된다. 가교결합의 복합체 화학을 통하여, 인식성 물질의 아민 잔기와 리포좀의 연결을 정립시킨다.

또 다른 예에는, 헤테로-이작용성 가교결합 시약 및 이러한 가교결합 시약을 사용하는 방법이 기재되어 있다[참조: 본원에 참조문헌으로써 삽입된 미국 특허 제5,889,155호]. 이러한 가교결합 시약은 친핵성 하이드라지드 잔기를 친전자성 말레이미드 잔기와 결합시켜, 한 예로 알데히드를 자유 티올에 커플링시킬 수 있다. 가교결합 시약을 변형시켜 각종 작용성 그룹을 가교결합시킬 수 있으므로, 이는 폴리펩타이드와 당을 가교결합시키는데 유용하다. 표 3에는 본 발명에 유용한 것으로 간주된 특정의 헤테로-이작용성 가교-링커가 상세히 기재되어 있다:

특정의 폴리펩타이드, 예를 들면, 겔로닌이 이의 본래의 서열에서 소정의 가교결합 시약을 받아들일 수 있는 잔기를 함유하지 못하는 경우에는, 1차 서열에 있어서의 보존적 유전 또는 합성 아미노산 변화를 활용할 수 있다.

4. 단백질 정제

본 발명의 몇몇 양태가 재조합 단백질과 관련된 것이긴 하지만, 본 발명은 또한, 변형 단백질 및 재조합 단백질을 포함한 단백질의 정제 방법에 관한 것이다. 일반적으로, 이들 기술은 한 가지 수준에서는, 세포성 환경을 폴리펩타이드 및 비-폴리펩타이드 분획으로 조 분획화시키는 것을 포함한다. 해당 폴리펩타이드를 기타 단백질로부터 분리시키고자 경우에는, 크로마토그래피 및 전기영동 기술을 사용하여 관심있는 폴리펩타이드를 추가로 정제시켜 부분 또는 완전한 정제(또는 균질성이 되도록 하는 정제)를 달성할 수 있다. 순수한 펩타이드를 제조하는데 특히 적합한 분석 방법은 이온-교환 크로마토그래피, 배제 크로마토그래피; 폴리아크릴아미드 겔 전기영동; 등전 포커싱(isoelectric focusing)이다. 펩타이드를 정제하는데 특히 효율적인 방법은 신속 단백질 액체 크로마토그래피 또는 심지어 HPLC이다. 또한, 이러한 기술이 수행되는 조건은 정제된 분자의 작용성 활성과 같은 특징에 영향을 미칠수 있다.

본 발명의 특정 국면은 암호화된 단백질 또는 펩타이드의 정제, 및 특정 양태에서는, 실질적인 정제에 관한 것이다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "정제된 단백질 또는 펩타이드"는 기타 성분으로부터 분리 가능한 조성물을 지칭하는데, 상기 단백질 또는 펩타이드는 이의 천연상 수득 가능한 상태와 비교하여 어떠한 정도로도 정제된다. 따라서, 정제된 단백질 또는 펩타이드는 또한, 이의 천연 발생적 환경으로부터 유리된 단백질 또는 펩타이드를 지칭한다.

일반적으로, "정제된"이란 각종의 기타 성분들을 제거하기 위해 분획화시킨바 있는 단백질 또는 펩타이드 조성물을 지칭할 것이며, 이러한 조성물은 이의 발현된 생물학적 활성을 실질적으로 보유하고 있다. "실질적으로 정제된"이란 용어가 사용된 경우, 이러한 지명은 해당 단백질 또는 펩타이드가 주성분을 형성하는 조성물을 지칭할 것인데, 예를 들면, 조성물 중의 펩타이드가 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99%, 약 99.2%, 약 99.4%, 약 99.6%, 약 99.8%, 약 99.9% 이상을 차지한다.

단백질 또는 펩타이드의 정제도를 정량화하기 위한 각종 방법이 본 명세서의 관점에서 당업자에게 공지되어 있을 것이다. 이들 방법에는, 예를 들면, 활성 분획의 특이 활성을 결정하는 방법, 또는 SDS/PAGE 분석에 의해 특정 분획 내의 폴리펩타이드의 양을 평가하는 방법이 포함될 것이다. 특정 분획의 순도를 평가하는데 바람직한 방법은 이러한 분획의 특이 활성을 산정하고, 이를 초기 추출물의 특이 활성과 비교한 다음, 이로써 순도를 산정(이는 본원에서 "-배 정제"로써 평가된다)하는 것이다. 활성 량을 나타내는데 사용된 실제적인 단위는 물론, 정제를 수행하기 위해 선택된 특정한 검정 기술에 좌우되고, 발현된 단백질 또는 펩타이드가 검출 가능한 활성을 나타내는지 여부에 좌우될 것이다.

단백질 정제에 사용하는데 적합한 각종 기술이 당업자에게 널리 공지되어 있을 것이다. 이들 기술로는, 예를 들어, 황산암모늄, PEG, 항체 등으로 침전시키거나 또는 열 변성시킨 다음, 원심분리시키는 기술; 크로마토그래피 단계, 예를 들면, 이온 교환, 겔 여과, 역 상, 하이드록실아파타이트 및 친화 크로마토그래피; 등전 포커싱; 겔 전기영동; 및 이들 기술과 기타 기술과의 조합이 있다. 당해 분야에 일반적으로 공지된 바와 같이, 각종의 정제 단계를 수행하는 순서를 변화시킬 수 있거나, 또는 특정 단계를 생략하고도 실질적으로 정제된 단백질 또는 펩타이드를 제조하는데 적합한 방법을 유지할 것으로 여겨진다.

일반적으로, 해당 단백질 또는 펩타이드가 항상 이들의 최상의 정제된 상태로 제공되어야만 한다는 규정은 없다. 실제로, 실질적으로 덜 정제된 생성물이 특정 양태에 유용할 것으로 고려된다. 보다 적은 수의 정제 단계를 사용하거나 또는 상이한 형태의 동일한 일반적 정제 과정을 활용함으로써 부분 정제를 달성할 수 있다. 예를 들면, HPLC 장치를 활용하여 수행된 양이온-교환 칼럼 크로마토그래피가 일반적으로, 저압 크로마토그래피 시스템을 활용하는 동일한 기술 보다 "수배" 더 높은 정제를 가져다줄 것으로 인지된다. 보다 낮은 상대적 정제도를 나타내는 방법이 단백질 생성물의 총 회수율 면에서 유리할 수 있거나, 또는 발현된 단백질의 활성을 유지시키는데 있어서 유리할 수 있다.

폴리펩타이드의 이동은 SDS/PAGE의 상이한 조건에 따라서 다양할 수 있는데, 종종 상당히 다양할 수 있는 것으로 공지되어 있다[참조: Capaldi et al., 1977]. 따라서, 상이한 전기영동 조건 하에서는, 정제된 또는 부분 정제된 발현 생성물의 외견상(apparent) 분자량이 다양할 수 있는 것으로 인지될 것이다.

본 발명의 방법 및 조성물과 조합하여 펩타이드 태그를 사용하는 것이 또한 고려된다. 태그는 2개 폴리펩타이드 간의 상호작용을 이용한다. 이러한 상호작용에 관여하는 폴리펩타이드 중의 하나의 일정 부분을 태그로서 사용할 수 있다. 예를 들면, 글루타치온 S 트랜스퍼라제(GST)의 결합 영역을 태그로서 사용하여, 글루타치온 비드가 GST 태그를 함유하는 화합물을 풍부하게 하는데 사용될 수 있다. 아미노산 영역이 항체 또는 T 세포 수용체에 의해 인식되는 에피토프 태그를 사용할 수 있다. 이러한 태그는, 융합 단백질이 핵산 분자에 의해 암호화되도록, 변형 단백질을 암호화하는 핵산 절편에 작동적으로 연결되는 핵산 절편에 의해 암호화될 수 있다. 기타 적합한 융합 단백질은 β-갈락토시다제, 우비퀴틴, 헥사히스티딘(6xHis) 등과의 융합 단백질이다.

5. 항체

특정 양태에서, 본 발명은 항체를 포함한다. 예를 들면, 모노클로날, 단일쇄 또는 사람화된 항체의 전부 또는 일부를, 변형 겔로닌 독소와 같은 또 다른 단백질성 화합물에 화학적으로 접합시키거나 재조합적으로 융합시킬 수 있다. 또 다른 한편, 본 발명의 기타 국면은 단백질성 화합물 본래의 형태 보다 면역원성이 저하된 단백질성 화합물을 디자인 및/또는 제조하기 위해 특정의 항원 또는 항원성 영역에 대한 면역 반응(즉, 항체 반응)을 인식하는 것을 포함한다. 상기에 상세한 바와 같이, 완전한 길이의 단백질에 대해 발생된 항체 이외에도, 항체는 또한, 야생형 및 돌연변이체 에피토프를 포함한, 에피토프성 코어 영역을 포함한 보다 작은 작제물에 반응하여 생성될 수도 있다. 에피토프는 항원성 결정기이다. 항원은 항체 또는 T-세포 수용체에 의해 특이적으로 인식되는 모든 물질이다. 면역원은 특이적 면역 반응을 유도시키는 항원이다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "항체"는 IgG, IgM, IgA, IgD 및 IgE와 같은 모든 면역학적 결합 제제를 광범위하게 지칭한다. 일반적으로, IgG 및/또는 IgM이바람직한데, 이는 이들이 생리학적 환경 하에서 가장 통상적인 항체이고 실험실 세팅에서 가장 용이하게 만들어질 수 있기 때문이다.

모노클로날 항체(mAbs)는 특정의 이점, 예를 들면, 재현성 및 대규모 생산이 가능한 것으로 인식되고 있으므로, 이들을 사용하는 것이 일반적으로 바람직하다. 따라서, 본 발명은 사람, 쥐, 원숭이, 랫트, 햄스터, 토끼 및 심지어 치킨 기원의 모노클로날 항체를 제공한다.

"항체"란 용어는 항원 결합 영역을 지니고 있는 모든 항체-유사 분자를 지칭하는데 사용되며, 이에는 항체 단편, 예를 들면, Fab', Fab, F(ab')₂, 단일 도메인 항체(DABs), Fv, scFv(단일 쇄 Fv) 등이 포함된다. 각종 항체-이용 작제물 및 단편을 제조 및 사용하는 기술이 당해 분야에 널리 공지되어 있다. 항체를 제조하고 성상 확인하기 위한 수단이 또한 당해 분야에 널리 공지되어 있다[참조: Harlow and Lane, "Antibodies: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, 1988; 이는 본원에 참조문헌으로써 삽입되어 있다].

모노클로날 항체(mAbs)를 생성시키는 방법은 일반적으로, 폴리클로날 항체를 제조하기 위한 것과 동일한 라인을 따라 시작된다. 간략하게 언급하면, 폴리클로날 항체는, 본 발명에 따르는 면역원성 폴리펩타이드 조성물로 동물을 면역시킨 다음, 이와 같이 면역시킨 동물로부터 항혈청을 수집함으로써 제조할 수 있다. 또 다른 한편, 본 발명의 몇몇 양태에서는, 특정한 항원에 노출시킨 바 있는 사람으로부터 혈청을 수집한다. 특정한 항원에 대한 노출은 작업 환경 하에서 일어날 수있기 때문에, 이러한 사람은 특정한 항원에 직업상 노출되어 왔고 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질에 대한 폴리클로날 항체를 발생하여 왔다. 본 발명의 몇몇 양태에서는, 직업상 노출된 사람으로부터의 폴리클로날 혈청을 사용하여, 면역검출법을 사용함으로써 겔로닌 독소 내의 항원성 영역을 동정한다.

광범위한 동물 종이 항혈청의 생성에 사용될 수 있다. 전형적으로, 항혈청의 생성에 사용된 동물은 토끼, 마우스, 랫트, 햄스터, 기니아 피그 또는 염소이다. 토끼의 혈액 용량이 비교적 크기 때문에, 폴리클로날 항체의 생성에 토끼가 바람직하게 선택된다.

당해 분야에서 널리 공지된 바와 같이, 소정의 조성물은 그의 면역원성에 있어서 다양할 수 있다. 따라서, 펩타이드 또는 폴라펩타이드 면역원을 담체에 커플링시킴으로써 이루어질 수 있는 것으로 숙주 면역 시스템을 추가자극(boost)시키는 것이 종종 필요하다. 바람직한 담체의 예로는 키홀 림펫 헤모시아닌 (keyhole limpet hemocyanin; KLH) 및 소 혈청 알부민 (BSA)이다. 오브알부민, 마우스 혈청알부민 또는 토끼 혈청 알부민과 같은 기타 알부민을 담체로서 사용할 수도 있다. 폴리펩타이드를 담체 단백질에 접합시키는 수단은 당해 분야에서 널리 공지되어 있으며, 이에는 글루타르알데히드, m-말레이미도벤조일-N-하이드록시석신이미드 에스테르, 카보디이미드 및 비스-비아조티즈화 벤지딘이 포함된다.

당해 분야에 또한 널리 공지된 바와 같이, 특정의 면역원 조성물의 면역원성은 아쥬반트로서 공지된, 면역 반응의 비-특이적 자극인자를 사용함으로써 증강시킬 수 있다. 적합한 분자 아쥬반트에는 허용 가능한 모든 면역자극성 화합물, 예를 들면, 사이토킨, 독소 또는 합성 조성물이 포함된다.

사용될 수 있는 아쥬반트에는 IL-1, IL-2, IL-4, IL-7, IL-12, γ-인터페론, GMCSP, BCG, 수산화알루미늄, MDP 화합물, 예를 들면, thur-MDP 및 nor-MDP, CGP (MTP-PE), 지질 A 및 모노포스포릴 지질 A(MPL)이 포함된다. 세균으로부터 추출된 3가지 성분을 함유하는 RIBI, MPL, 트레할로즈 디미콜레이트(TDM), 및 2% 스쿠알렌/트윈 80 에멀션 중의 세포벽 골격(CWS)이 또한 고려된다. MHC 항원을 사용할 수도 있다. 종종 바람직한 아쥬반트의 예에는 완전 프로인트 아쥬반트 (사멸된 마이코박테리움 튜버큘로시스(Mycobacterium tuberculosis)를 함유하는 면역 반응의 비-특이적 자극인자), 불완전 프로인트 아쥬반트 및 수산화알루미늄 아쥬반트가 포함된다.

아쥬반트 이외에도, T 세포 면역성을 상향 조절하거나 억제인자 세포 활성을 하향 조절하는 것으로 밝혀진 생물학적 반응 조절제(BRM)를 함께 투여하는 것이 바람직할 수 있다. 이러한 BRM에는 시메티딘(CIM; 1200mg/d)(Smith/Kline, PA); 저용량 사이클로포스파미드(CYP; 300mg/㎡)(Johnson/Mead, NJ), 사이토킨, 예를 들면, γ-인터페론, IL-2 또는 IL-12, 또는 면역 헬퍼(helper) 기능에 관계된 단백질을 암호화하는 유전자, 예를 들면, B-7이 포함되지만, 이에 제한되지 않는다.

폴리클로날 항체의 생성에 사용된 면역원 조성물의 양은 면역화를 위해 사용된 동물 뿐 아니라 면역원의 성질에 따라 달라진다. 면역원의 투여를 위해서는 다양한 경로(피하, 근육내, 피내, 정맥내 및 복강내)가 사용될 수 있다. 폴리클로날 항체의 생성은 면역시킨 동물의 혈액을, 면역화시킨 후의 다양한 시점에서 샘플링함으로써 모니터할 수 있다.

제2의 추가자극제(booster) 주사가 또한 제공될 수 있다. 추가자극(boosting) 및 적정(titering)의 과정은 적합한 역가가 수득될 때 까지 반복한다. 목적하는 수준의 면역원성이 수득되면, 상기 면역시킨 동물을 출혈시킬 수 있으며, 이렇게 하여 분리되고 저장된 혈청 및/또는 동물을 사용하여 mAbs를 생성시킬 수 있다.

mAbs는 본원에 참조문헌으로써 삽입된 미국 특허 제4,196,265호에 예시된 바와 같이 널리 공지된 기술을 사용하여 용이하게 제조할 수 있다. 전형적으로, 이러한 기술은 적합한 동물을 선택된 면역원 조성물, 예를 들어 정제되거나 부분적으로 정제된 폴리펩타이드, 펩타이드 또는 도메인(이는 야생형 또는 돌연변이체 조성물이다)으로 면역시키는 것을 포함한다. 면역화 조성물은 항체 생성 세포를 자극시키는데 유효한 방식으로 투여된다.

mAbs는 경우에 따라, 여과, 원심분리 및 각종 크로마토그래피 방법, 예를 들면, HPLC 또는 친화 크로마토그래피를 사용하여 추가로 정제시킬 수 있다. 본 발명의 모노클로날 항체의 단편은, 펩신 또는 파파인 등의 효소로 분해시키고/시키거나 디설파이드 결합을 화학적 환원에 의해 절단시키는 것을 포함하는 방법에 의해 생성된 바와 같은 모노클로날 항체로부터 수득할 수 있다. 또 다른 한편, 본 발명에 의해 포괄된 모노클로날 항체 단편은 자동화 펩타이드 합성기를 사용하여 합성할 수 있다.

mAbs를 생성시키기 위해 분자 클로닝 접근법이 사용될 수 있다는 것이 또한고려된다. 이를 위해, 면역시킨 동물의 비장으로부터 분리된 RNA로부터 조합(combinatorial) 면역글로불린 파아지미드(phagemid) 라이브러리를 제조하고, 항원을 발현하는 세포 및 대조군 세포를 사용하여 패닝함으로써, 적당한 항체를 발현하는 파아지미드를 선별한다. 이러한 접근법이 통상적인 하이브리도마 기술에 비해 이로운 점은 대략 10⁴배 정도로 많은 양의 항체가 1회전에서 생성 및 스크리닝될 수 있고, H 및 L 쇄 조합에 의해 신규한 특이성이 발생되는데, 이는 적당한 항원을 발견할 기회를 추가로 증대시켜 준다.

사람화된 모노클로날 항체는, 본래의 항원 특이성은 유지시키면서 불변 영역 및/또는 가변 영역 골격 서열을 사람 서열로 대체시키는 유전 공학 기술을 사용하여 변형시킨, 동물 기원의 항체이다. 이러한 항체는 통상적으로, 사람 항원에 대한 특이성을 지니고 있는 설치류 항체로부터 유도된 것이다. 상기 항체는 일반적으로, 생체내 치료학적 적용 분야에 유용하다. 이러한 전략은 외래 항체에 대한 숙주 반응을 감소시키고, 사람 효과인자 작용의 선별을 허용해준다.

"사람화된" 항체가 또한 고려되는데, 이는 사람 불변 및/또는 가변 영역 도메인, 이중-특이성 항체, 재조합 및 공학적으로 처리된 항체 및 이의 단편을 보유하고 있는 마우스, 랫트 또는 기타 종으로부터의 키메릭 항체이다. 사람화된 면역글로불린의 제조 기술은 당업자에게 널리 공지되어 있다. 예를 들면, 미국 특허 제5,693,762호에는 하나 이상의 상보성 결정 영역(CDR's)을 갖는 사람화된 면역글로불린의 조성물 및 이의 생성 방법이 기재되어 있다. 본래의 항체와 조합되는 경우, 사람화된 면역글로불린은 사람에게서 실질적으로 비-면역원성이며, 항원, 예를 들면, 단백질 또는 에피토프 함유 기타 화합물에 대한 공여자 면역글로불린과 실질적으로 동일한 친화성을 보유하고 있다. 이러한 분야의 기타 기술에 관한 예가, 본원에 참조문헌으로써 삽입된 미국 특허 제6,054,297호; 제5,861,155호 및 제6,020,192호에 기재되어 있다. 특정 환자의 질병에 "맞춰진(custom-tailored)" 항체의 개발 방법이 또한 공지되어 있고, 이러한 맞춰진 항체가 또한 고려된다.

6. 면역검출 방법

논의된 바와 같이, 몇몇 양태에서, 본 발명은 폴리펩타이드 및 펩타이드 상의 새물학적 성분(예: 항원성 영역)을 결합, 정제, 제거, 정량화 및/또는 검출하기 위한 면역검출 방법에 관한 것이다. 본 발명의 면역검출 방법은, 특히 표적 대상체 내에서의 특정 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질의 면역원성 또는 항원성을 저하시키는데 있어서 치료학적으로 밀접한 영향을 미치는, 상기 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질의 항원성 영역을 동정하는데 사용될 수 있다.

면역검출 방법에는 효소 연결 면역흡착 검정(ELISA), 방사성 면역검정(RIA), 면역방사성측정 검정, 형광면역검정, 화학발광 검정, 생체발광 검정, 및 웨스턴 블롯이 포함되며, 이들 중의 몇 가지는 당업자에게 널리 공지되어 있다. 유용한 각종 면역검출 방법의 단계들이 과학 문헌, 예를 들면, 문헌[참조: Doolittle MH and Ben-Zeev O, 1999; Gulbis B et al., 1993; De Jager R et al., 1993; and Nakamura et al., 1987; 이들 각각이 본원에 참조문헌으로써 삽입되어 있다]에 기재되어 있다.

일반적으로, 면역결합 방법은 특정 단백질, 폴리펩타이드 및/또는 펩타이드를 함유하는 것으로 추정되는 샘플을 수득하고, 이러한 샘플을 본 발명에 따라서, 면역복합체의 형성을 허용하는데 유효한 조건 하에, 제1 모노클로날 또는 폴리클로날 항체와 접촉시키는 것을 포함한다.

이들 방법에는 소기관, 세포, 조직 또는 유기체의 샘플로부터 특정 단백질, 폴리펩타이드 및/또는 펩타이드를 정제시키는 방버이 포함된다. 이들 경우, 항체는 샘플로부터 항원성 단백질, 폴리펩타이드 및/또는 펩타이드 성분을 제거시킨다. 이 항체를 고체 지지체, 예를 들면, 칼럼 매트릭스 형태의 고체 지지체에 연결시키는 것이 바람직할 것이며, 상기 단백질, 폴리펩타이드 및/또는 펩타이드 항원성 성분을 함유하는 것으로 추정되는 샘플을 상기 고정화시킨 항체에 적용할 것이다. 바람직하지 못한 성분은 칼럼으로부터 세척 제거하여, 고정화시킨 항체와 면역복합체를 형성한 항원이 용출되도록 한다.

면역결합 방법에는 또한, 특정 샘플 중의 항원 성분 량을 검출 및 정량화하는 방법 및 결합 공정 동안에 형성된 모든 면역 복합체의 검출 및 정량화 방법이 포함된다. 본원에서는, 항원 또는 항원성 도메인을 함유하는 것으로 추정되는 샘플을 수득하고, 이 샘플을 상기 항원 또는 항원성 도메인에 대한 항체와 접촉시킨 다음, 특이적 조건 하에 형성된 면역 복합체의 양을 검출 및 정량화할 것이다.

항원 검출 측면에서 보면, 분석된 생물학적 샘플은 항원 또는 항원성 도메인을 함유하는 것으로 추정되는 모든 샘플, 예를 들면, 조직 절편 또는 표본, 균질화된 조직 추출물, 세포, 소기관, 분리 및/또는 정제된 형태의 상기 항원-함유 조성물, 또는 심지어 세포 또는 조직과 접촉하게 되는 모든 생물학적 유체(혈액 및/또는 혈청 포함)일 수 있다.

선택된 생물학적 샘플을, 면역 복합체(1차 면역 복합체)를 형성시키기에 충분한 시간 및 이에 유효한 조건 하에 항체와 접촉시키는 것은 일반적으로, 항체 조성물을 상기 샘플에 단순히 가하고, 상기 항체가, 존재하는 모든 항원과 면역 복합체를 형성하기에, 즉 이와 결합하기에 충분히 긴 시간 동안 상기 혼합물을 항온 처리하는 사항이다. 이후, 상기 샘플-항체 조성물, 예를 들면, 조직 절편, ELISA 판, 도트 블롯 또는 웨스턴 블롯을 일반적으로 세척하여, 비-특이적으로 결합된 모든 항체 종을 제거함으로써, 상기 1차 면역 복합체 내에 특이적으로 결합된 항체 만이 검출될 수 있도록 한다.

일반적으로, 면역복합체 형성의 검출은 당해 분야에 널리 공지되어 있고, 이는 수 많은 접근법을 적용함으로써 이루어질 수 있다. 이들 방법은 일반적으로, 표지물 또는 마커, 예를 들면, 방사성, 형광성, 생물학적 및 효소적 태그 중의 어느 특정의 것을 검출하는 것에 근거한다. 상기 표지물의 용도에 관한 미국 특허로는 제3,817,837호; 제3,850,752호; 제3,939,350호; 제3,996,345호; 제4,227,437호; 제4,275,149호; 및 제4,366,241호(이들 각각이 본원에 참조문헌으로써 삽입되어 있다)가 있다. 물론, 당해 분야에 공지된 바와 같이, 2차 결합 리간드, 예를 들면, 제2 항체 및/또는 바이오틴/아비딘 리간드 결합 배열의 사용을 통하여 부가의 이점을 발견할 수도 있다.

상기 검출에 이용된 항체는 그 자체가, 검출 가능한 표지물에 연결될 수 있는데, 이때 상기 표지물을 간단히 검출함으로써, 해당 조성물 내의 1차 면역 복합체의 양을 결정할 수 있다. 또 다른 한편, 1차 면역 복합체 내에 결합하게 되는 제1 항체는, 이러한 항체에 대한 결합 치환성을 지닌 제2 결합 리간드를 사용함으로써 검출할 수 있다. 이들 경우, 상기 제2 결합 리간드를 검출 가능한 표지물에 연결시킬 수 있다. 제2 결합 리간드 자체가 종종 항체이므로, 이것이 "2차" 항체로 명명될 수 있다. 1차 면역 복합체를, 2차 면역 복합체를 형성시키기에 충분한 시간 동안 및 이에 유효한 조건 하에, 상기 표지된 2차 결합 리간드 또는 항체와 접촉시킨다. 이어서, 이러한 2차 면역 복합체를 세척하여, 비-특이적으로 결합된 표지된 2차 항체 또는 리간드를 모두 제거한 다음, 2차 면역 복합체 중의 나머지 표지물을 검출한다.

추가의 방법에는 2-단계 접근법에 의해 1차 면역 복합체를 검출하는 방법이 포함된다. 항체에 대한 결합 친화성을 지닌 제2 결합 리간드, 예를 들면, 항체를 사용하여, 상기 언급된 바와 같이 2차 면역 복합체를 형성시킨다. 세척 후, 상기 2차 면역 복합체를, 면역 복합체(3차 면역 복합체)를 형성시키기에 충분한 시간 동안 및 이에 유효한 조건 하에, 제2 항체에 대한 결합 친화성을 지닌 제3 결합 리간드 또는 항체와 접촉시킨다. 이러한 제3 리간드 또는 항체를 검출 가능한 표지물에 연결시켜, 상기와 같이 형성된 3차 면역 복합체를 검출할 수 있다. 이 시스템은 경우에 따라, 시그날 적용에 제공될 수 있다.

챨스 칸토르(Charles Cantor)에 의해 디자인된 면역검출 방법 중의 한 방법은 2가지 상이한 항체를 사용한다. 제1 단계에서는, 바이오티닐화 모노클로날 또는 폴리클로날 항체를 사용하여 표적 항원(들)을 검출하고, 제2 단계에서는, 항체를 사용하여, 상기 복합체를 형성한 바이오틴에 부착된 바이오틴을 검출한다. 이 방법에서는, 시험하고자 하는 샘플을 먼저, 상기 제1 단계 항체를 함유하는 용액 중에서 항온 처리한다. 표적 항원이 존재하는 경우에는, 몇몇 항체가 이 항원과 결합하여 바이오티닐화 항체/항원 복합체를 형성한다. 이어서, 이러한 항체/항원 복합체를, 스트렙트아비딘(또는 아비딘), 바이오티닐화 DNA, 및/또는 상보적 바이오티닐화 DNA의 연속 용액에서 항온 처리함으로써 증폭시키는데, 각 단계에서는 부가의 바이오틴 부위를 상기 항체/항원 복합체에 가한다. 이러한 증폭 단계는 적합한 수준의 증폭이 이루어질 때까지 반복하는데, 이때 바이오틴에 대한 제2 단계 항체를 함유하는 용액 중에서 상기 샘플을 항온 처리한다. 이러한 제2 단계 항체는, 예를 들어, 색소원 기질을 이용하는 조직효소학에 의해 항체/항원 복합체의 존재 여부를 검출하는데 사용될 수 있는 효소를 사용하여 표지시킨다. 적합한 증폭을 이용하는 경우, 육안으로 볼 수 있는 접합체가 생성될 수 있다.

또 다른 공지된 면역검출 방법은 면역-PCR(폴리머라제 연쇄 반응) 방법론을 이용한다. 이러한 PCR 방법은 바이오티닐화 DNA와 함께 항온 처리하는 것 까지는 칸토르 방법과 유사하지만, 스트렙트아비딘 및 바이오티닐화 DNA 항온 처리를 수 차례 사용하는 것 대신, DNA/바이오틴/스트렙트아비딘/항체 복합체를, 해당 항체를 방출시키는 낮은 pH 또는 고염 완충액으로 세척 제거시킨다. 이어서, 이로써 생성된 세척 용액을, 적당한 제어 하에 적합한 프라이머를 사용하여 PCR 반응을 수행하는데 사용한다. 적어도 이론상으로는, PCR의 수 많은 증폭 능력과 특이성을 활용하여, 단일 항원 분자를 검출할 수 있다.

a. ELISA

상세한 바와 같이, 가장 간단하고/하거나 직접적인 개념에서의 면역검정법은 결합 검정이다. 특정의 바람직한 면역검정법은 당해 분야에 공지되어 있는 각종 유형의 효소 결합 면역흡착 검정법(ELISA) 및 방사성 면역검정법(RIA)이다. 조직절편을 사용하는 면역조직화학적 검출도 특히 유용하다. 그러나, 검출법이 이러한 기술로만 제한되지 않고/않거나, 웨스턴 블롯팅, 도트 블롯팅, FACS 분석 등도 사용할 수 있다는 것을 용이하게 인지할 수 있을 것이다.

ELISA의 한가지 예에서는, 항체를 폴리스티렌 미세역가 판 내의 웰(well)과 같이 단백질 친화성을 나타내는 선택된 표면 상에 고정화시킨다. 이어서, 해당 항원을 함유하는 것으로 추정되는 시험 조성물, 예를 들면, 임상 샘플을 웰에 가한다. 결합 및/또는 세척하여 비-특이적으로 결합된 면역 복합체를 제거한 후에, 결합된 항원을 검출할 수 있다. 검출은 일반적으로, 검출 가능한 표지물에 연결되는 또 다른 항체를 부가함으로써 수행된다. 이러한 유형의 ELISA가 간단한 "샌드위치 (sandwich) ELISA"이다. 검출은 또한, 제2 항체를 가한 다음, 이러한 제2 항체에 대한 결합 친화성을 지닌 제3 항체를 가함으로써 이루어질 수 있는데, 상기 제3 항체도 검출 가능한 표지물에 연결되어 있다.

ELISA의 또 다른 예에서는, 해당 항원을 함유하는 것으로 추정되는 샘플을 웰 표면 상에 고정화시키고/시키거나, 이어서 상기 항체와 접촉시킨다. 결합 및/또는 세척하여 비-특이적으로 결합된 면역 복합체를 제거한 후, 결합된 항-항체를검출한다. 초기 항체가 검출 가능한 표지물에 연결된 경우, 면역 복합체는 직접 검출할 수 있다. 또 다시, 면역 복합체는 제1 항체에 대한 결합 친화성을 지니고 검출 가능한 표지물에 연결되어 있는 제2 항체를 사용하여 검출할 수 있다.

항원을 고정화시키는 또 다른 ELISA는 검출에 항체 경쟁을 이용한다. 이러한 ELISA에서는, 특정 항원에 대한 표지된 항체를 웰에 가하고, 결합되도록 하고/하거나 이들의 표지물을 통하여 검출한다. 미지의 샘플 내의 항원의 양은, 피복된 웰과 함께 항온 처리하는 동안 샘플을 상기 항원에 대한 표지된 항체와 혼합시킴으로써 측정된다. 샘플 내에 항원이 존재하면, 이는 웰에 결합하기 위해 이용될 수 있는 항원에 대한 항체의 양을 감소시키는 작용을 하며, 따라서 궁극적인 시그날을 감소시킨다. 이는 또한, 미지의 샘플 내의 항원에 대한 항체를 검출하는데 적당하며, 여기서는 표지되지 않은 항체가 항원-피복된 웰에 결합하고, 또한 상기 표지된 항체를 결합시키는데 이용될 수 있는 항원의 양을 감소시킨다.

이용된 포맷과는 무관하게, ELISA는 공통적으로 피복, 항온 처리 및 결합, 비-특이적으로 결합된 성분의 제거를 위한 세척, 및 결합된 면역 복합체의 검출와 같은 특징을 갖는다. 이들은 다음에 기재된다.

항원이나 항체로 특정 판을 피복시키는 경우에는, 일반적으로 이러한 판의 웰을 항원 또는 항체의 용액과 함께 밤새 또는 지정된 기간 동안 항온 처리한다. 이어서, 상기 판의 웰을 세척하여 불완전하게 흡착된 물질을 제거한다. 이어서, 남아 있는 이용 가능한 웰의 표면은, 시험용 항혈청과 관련하여 항원적으로 중성인 비특이적 단백질로 "피복"시킨다. 이들에는 소 혈청 알부민(BSA), 카세인, 또는분유의 용액이 포함된다. 이러한 피복에 의해, 고정화 표면 상의 비특이적 흡착 부위를 차단시킬 수 있고, 따라서 표면 상에서 항혈청의 비특이적 결합에 의해 야기되는 백그라운드(background)를 감소시킨다.

ELISA에서는, 아마도 직접적인 과정 보다는 2차 또는 3차 검출 수단을 사용하는 것이 보다 통상적이다. 즉, 웰에 단백질 또는 항체를 결합시키고 비-반응성 물질로 피복시켜 백그라운드를 감소시키고, 세척하여 결합되지 않은 물질을 제거한 후에, 고정화 표면을 면역 복합체(항원/항체) 형성을 수행하는데 유효한 조건 하에, 시험하고자 하는 생물학적 샘플과 접촉시킨다. 이때, 면역 복합체의 검출은 표지된 2차 결합 리간드 또는 항체, 및 표지된 3차 항체 또는 3차 결합 리간드와 연계한 2차 결합 리간드 또는 항체를 필요로 한다.

"면역 복합체(항원/항체) 형성을 수행하는데 유효한 조건하"란 해당 조건이 바람직하게는, 항원 및/또는 항체를 BSA, 소 감마글로불린(BGG) 및 인산염 완충 식염수(PBS)/트윈과 같은 용액으로 희석하는 것을 포함함을 의미한다. 이들 부가된 제제는 또한, 비-특이적 백그라운드의 감소에 도움을 주는 경향이 있다.

"적합한" 조건은 또한, 효과적인 결합을 수행하기에 충분한 온도 또는 충분한 시간 동안 항온 처리하는 것을 의미한다. 항온 처리 단계는 전형적으로 약 1 내지 2 내지 4시간 동안, 바람직하게는 25℃ 내지 27℃의 온도에서 수행하거나, 또는 약 4℃ 정도에서 밤새 수행할 수도 있다.

ELISA에서 모든 항온 처리 단계를 수행한 후, 복합체를 형성하지 않은 물질을 제거하도록 상기 접촉된 표면을 세척한다. 세척 과정은 PBS/트윈 용액 또는 보레이트 완충액으로 세척하는 것을 포함한다. 시험 샘플과 본래 결합된 물질 간에 특이적 면역 복합체를 형성시키고 후속 세척한 후에, 미량이라도 면역 복합체의 발생을 결정할 수 있다.

검출 수단을 제공하기 위해, 제2 또는 제3 항체는 검출 가능한 결합된 표지물을 갖는다. 이것은 적당한 색소원성 기질과 함께 항온 처리시 발색을 일으키는 효소이다. 따라서, 예를 들면, 제1 및 제2 면역 복합체를, 추가의 면역 복합체 형성의 발현에 바람직한 조건 및 시간 동안, 우레아제, 글루코즈 옥시다제, 알칼리성 포스파타제 또는 수소 퍼옥시다제-접합된 항체와 접촉 또는 항온 처리(예를 들어, PBS-트윈과 같은 PBS-함유 용액 중에서 실온 하에 2시간 동안 항온 처리)하는 것이 바람직하다.

표지된 항체와 함께 항온 처리하고 후속 세척하여 결합되지 않은 물질을 제거한 후에, 예를 들어, 우레아 또는 브로모크레졸 퍼플, 또는 효소 표지물로서 퍼옥시다제인 경우에는 2,2'-아지노-디-(3-에틸-벤즈티아졸린-6-설폰산(ABTS) 또는 H₂O₂와 같은 색소원성 기질과 함께 항온 처리함으로써, 표지물의 양을 정량화한다. 이때, 정량화는 발색의 정도를, 예를 들어 가시 스펙트럼 분광광도계를 사용하여 측정함으로써 이루어진다.

b. 면역조직화학

본 발명의 항체는 또한, 면역조직화학(IHC)에 의한 연구용으로 제조된 갓 동결되고/되거나 포르말린 고정된, 파라핀-포매된 조직 블록과 연계해서 사용할 수도있다. 예를 들면, 면역조직화학을 활용하여 본 발명의 특정한 면역독소를 평가할 수 있다. 이들 미립형 표본으로부터 조직 블록을 제조하는 방법이 각종 예후 인자의 선행 IHC 연구에 성공적으로 사용되어 왔고/왔거나, 이는 당업자에게 널리 공지되어 있다[참조: Brown et al., 1990; Abbondanzo et al., 1990; Allred et al., 1990].

간략하게 언급하면, 동결된 "미분된" 조직 50ng을 작은 플라스틱 캡슐 내의 인산염 완충 식염수(PBS) 중에서 실온 하에 재수화시키고, 이러한 입자를 원심분리시킴으로써 펠릿화하고; 이들을 점성 포매 배지(OCT)에 재현탁시키며; 상기 캡슐을 전위시키고/시키거나 원심분리시킴으로써 다시 펠릿화시키며; -70℃ 이소펜탄에서 즉시 동결시키고; 상기 플라스틱 캡슐을 절단하고/하거나 동결된 조직 실린더를 꺼내며; 저온조 마이크로톰 척(cryostat microtome chuck) 상에 조직 실린더를 단단히 고정시키고/시키거나 25 내지 50개 시리즈의 절편으로 절단시킴으로써 제조할 수 있다.

영구적-절편은 샘플 50mg을 플라스틱 마이크로퓨즈 튜브에서 재수화시키고; 펠릿화하며; 4시간의 고정화 동안 10% 포르말린에 재현탁시키고; 세척/펠릿화하며; 따뜻한 2.5% 한천에 재현탁시키고; 펠릿화하며; 빙수에 냉각시켜 상기 한천을 경화시키고; 조직/한천 블록을 상기 튜브로부터 꺼내며; 이 블록을 파라핀에 침윤 및/또는 포매시키고/시키거나 50개 이하의 일련의 영구적-절편으로 절단시키는 것을 포함하는 유사한 방법에 의해 제조할 수 있다.

II. 핵산 분자

A. 본래의 단백질 또는 변형 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드

본 발명은 전체 게놈성 DNA를 함유하고 있지 않고 특정 단백질 또는 폴리펩타이드의 전부 또는 일부를 발현할 수 있는, 세포로부터 분리 가능한 폴리뉴클레오타이드에 관한 것이다. 이러한 폴리뉴클레오타이드는 변형 단백질을 암호화하도록 조작시킬 수 있는 본래의 단백질을 암호화할 수 있다. 또 다른 한편, 당해 폴리뉴클레오타이드는 변형 단백질을 암호화할 수 있거나 또는 이는 변형 단백질과 융합 단백질을 만드는데 사용하게 될 폴리뉴클레오타이드를 암호화할 수 있다. 예를 들어, 폴리뉴클레오타이드는 다중 잔기, 예를 들면, 표적화 폴리펩타이드(예: 종양 항원)에 공유적으로 부착되는 변형 겔로닌 폴리펩타이드를 암호화할 수 있다. 단일 폴리뉴클레오타이드 분자는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 이상의 상이한 폴리펩타이드를 (전부 또는 일부) 암호화할 수 있다. 표 2에 기재된 어떠한 폴리펩타이드, 단백질 또는 펩타이드도 본 발명의 일부로서 재조합적으로 생성될 수 있다. 더우기, 표 2에 기재된 어떠한 단백질성 화합물도 표 2 또는 본원에 기재된 기타 하나 이상의 폴리펩타이드와 함께 동일한 핵산 분자 상에서 암호화시킬 수 있어, 융합 단백질이 생성되도록 한다. 재조합 단백질을 발현성 세포로부터 정제하여 활성 단백질을 수득할 수 있다. 따라서, 본 발명의 양태에는 서열 1의 전부 또는 일부를 암호화하는 핵산의 사용이 포함된다. 이러한 핵산에는 겔로닌 폴리펩타이드(GenBank 수탁 번호 L12243)를 암호화하는 cDNA 서열에 상응하는 서열 2의 전부 또는 일부가 포함된다. 따라서, 핵산과 관련하여 본원에 논의된 방법 및 조성물 중의 어떠한 것도 서열 2에 대해 적용할 수 있다는 것이 고려된다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "DNA 절편"는 특정한 종의 전체 게놈성 DNA을 함유하지 않도록 분리시킨 DNA 분자를 지칭한다. 따라서, 폴리펩타이드를 암호화하는 DNA 절편은 야생형, 다형성 또는 돌연변이체 폴리펩타이드-암호화 서열을 함유하지만, 전체 포유류 또는 사람 게놈성 DNA로부터 분리 제거되거나 또는 이를 함유하지 않도록 정제된 DNA 절편을 지칭한다. 용어 "DNA 절편"에는 폴리펩타이드(들), 폴리펩타이드 보다 작은 DNA 절편, 및 재조합 벡터(예를 들어, 플라스미드, 코스미드, 파아지, 바이러스 등이 포함됨)가 포함된다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "폴리뉴클레오타이드"는 전체 게놈성 핵산을 함유하지 않도록 분리시킨 핵산 분자를 지칭한다. 따라서, "본래의 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드"는 전체 포유류 또는 사람 게놈성 DNA로부터 제거 분리되거나 또는 이를 함유하지 않도록 정제된 야생형 또는 다형성 폴리펩타이드-암호화 서열을 함유하는 DNA 절편을 지칭한다. 따라서, 예를 들면, 본원이 겔로닌 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화되는 "변형 겔로닌 폴리펩타이드", "본래의 겔로닌 폴리펩타이드" 또는 겔로닌의 작용 또는 활성을 지칭하는 경우, 이는 폴리뉴클레오타이드가 RIP로서의 효소적 활성을 지닌 분자를 암호화한다는 것을 의미한다.

용어 "cDNA"는 주형으로서 전령 RNA(mRNA)를 사용하여 제조된 DNA를 지칭한다. 게놈성 DNA, 또는 게놈성의 프로세싱되지 않거나 부분적으로 프로세싱된 RNA 주형으로부터 중합화된 DNA와는 달리, cDNA를 사용하는 경우의 이점은 이러한 cDNA가 상응하는 단백질의 암호화 서열을 주로 함유하고 있다는 것이다. 완전 또는 부분 게놈 서열이 바람직한 경우, 예를 들면, 최적의 발현을 위해 비-암호화 영역이 요구되거나 또는 인트론과 같은 비-암호화 영역을 안티센스 전략에서 표적화시켜야 하는 경우에 있을 수 있다.

소정의 종으로부터의 특정한 폴리펩타이드가, 약간 상이한 핵산 서열을 지니지만 그럼에도 불구하고 동일한 단백질을 암호화하는 천연 변이체로써 나타낼 수 있다는 것이 또한 고려된다(상기 표 1 참조).

유사하게, 분리 또는 정제된 야생형, 다형성 또는 돌연변이체 폴리펩타이드 유전자를 포함하는 폴리뉴클레오타이드는 야생형, 다형성 또는 돌연변이체 폴리펩타이드 암호화 서열을 지칭하고, 특정 국면에서는, 기타 천연 유전자 또는 단백질 암호화 서열로부터 실질적으로 분리된 조절성 서열을 지칭한다. 이와 관련하여, 용어 "유전자"는 작용성 단백질, 폴리펩타이드 또는 펩타이드-암호화 단위를 단순히 지칭하기 위해 사용된 것이다. 당해 분야에 인지되어 있는 바와 같이, 상기 작용성 용어에는 게놈 서열, cDNA 서열, 및 단백질, 폴리펩타이드, 도메인, 펩타이드, 융합 단백질 및 돌연변이체를 발현하거나 또는 이를 발현하도록 적응시킬 수 있는, 공학적으로 처리된 보다 작은 유전자 절편이 포함된다. 본래 또는 변형 폴리펩타이드의 전부 또는 일부를 암호화하는 핵산은 다음 길이, 즉 약, 적어도 또는 최소한 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580, 590, 600, 610,620, 630, 640, 650, 660, 670, 680, 690, 700, 710, 720, 730, 740, 750, 760, 770, 780, 790, 800, 810, 820, 830, 840, 850, 860, 870, 880, 890, 900, 910, 920, 930, 940, 950, 960, 970, 980, 990, 1000, 1010, 1020, 1030, 1040, 1050, 1060, 1070, 1080, 1090, 1095, 1100, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, 5000, 5500, 6000, 6500, 7000, 7500, 8000, 9000, 10000개 이상의 뉴클레오타이드, 뉴클레오시드 또는 염기 쌍의 폴리펩타이드의 전부 또는 일부를 암호화하는 연속되는 핵산 서열을 함유할 수 있다. 이러한 길이의 연속되는 잔기를 서열 2 내지 10을 포함한, 본원에 기재 또는 논의된 모든 핵산 서열에 적용할 수 있다.

특정 양태에서, 본 발명은 본래의 폴리펩타이드에 따르는 또는 본질적으로 이러한 폴리펩타이드에 상응하는 연속되는 아미노산 서열이 이의 아미노산 서열 내에 포함되는, 야생형, 다형성 또는 변형 폴리펩타이드 또는 펩타이드를 암호화하는 DNA 서열이 혼입된 재조합 벡터 및 분리된 DNA 절편에 관한 것이다. 따라서, 분리된 DNA 절편, 또는 DNA 절편을 함유하는 벡터는, 예를 들어, 본래의 겔로닌 폴리펩타이드의 리보솜-불활성화 활성과 특이성을 지니고 있긴 하지만 아미노산이 상이한 변형된 겔로닌 폴리펩타이드를 암호화할 수 있다. 용어 "재조합"은 폴리펩타이드 또는 특정 폴리펩타이드의 명칭과 연계해서 사용될 수 있으며, 이는 일반적으로, 시험관내에서 조작시켰거나 또는 해당 분자의 복제된 생성물인 핵산 분자로부터 생성된 폴리펩타이드를 지칭한다.

기타 양태에서, 본 발명은 특정 폴리펩타이드에 따르는 또는 본질적으로 이러한 폴리펩타이드에 상응하는 연속되는 아미노산 서열이 이의 아미노산 서열 내에포함되는 폴리펩타이드 또는 펩타이드를 암호화하는 DNA 서열이 혼입된 재조합 벡터 및 분리된 DNA 절편에 관한 것이다.

본 발명에 사용된 핵산 절편은 암호화 서열 자체의 길이와 상관없이, 기타 핵산 서열, 예를 들면, 프로모터, 폴리아데닐화 시그날, 부가의 제한 효소 부위, 다중 클로닝 부위, 기타 암호화 절편 등과 조합될 수 있어, 이들의 전체 길이가 이에 따라 다양해질 수 있다. 따라서, 거의 모든 길이의 핵산 단편이 이용될 수 있는 것으로 고려되며, 총 길이는 바람직하게는, 제조의 용이성과 의도된 재조합 DNA 프로토콜에서의 용도에 의해 제한된다.

본 발명의 핵산 작제물은 모든 공급원으로부터 유래된 완전한 길이의 폴리펩타이드를 암호화하거나, 또는 폴리펩타이드의 절단된 버젼, 예를 들면, 절단된 겔로닌 폴리펩타이드를 암호화하여, 암호화 영역의 전사체가 상기 절단된 버젼을 나타내도록 할 수 있다. 이어서, 상기 절단된 전사체를 절단된 단백질로 해독할 수 있다. 또 다른 한편, 핵산 서열은 예를 들어, 해당 폴리펩타이드의 정제, 전송, 분비, 해독후 변형을 허용해주거나 또는 표적화 또는 효능과 같은 치료학적 이점을 제공해주기 위해 부가의 이종 암호화 서열을 갖는 완전한 길이의 폴리펩타이드 서열을 암호화할 수 있다. 상기 논의된 바와 같이, 태그 또는 기타 이종 폴리펩타이드를 당해 변형 폴리펩타이드-암호화 서열에 가할 수 있는데, 여기서 "이종"이란 당해 변형된 폴리펩타이드와 동일하지 않은 폴리펩타이드를 지칭한다.

비-제한적 예에서는, 특정한 유전자, 예를 들면, 독소 겔로닌과 동일하거나 또는 이에 상보적인 뉴클레오타이드의 연속 연장물을 포함하는 하나 이상의 핵산작제물을 제조할 수 있다. 핵산 작제물은 길이가 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 250, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1,000, 2,000, 3,000, 4,000, 5,000, 6,000, 7,000, 8,000, 9,000, 10,000, 15,000, 20,000, 30,000, 50,000, 100,000, 250,000, 500,000, 750,000 내지 1,000,000개 이상 뉴클레오타이드인 것일 뿐만 아니라 효모 인공 염색체와 같은 핵산 작제물의 도래가 당업자에게 공지되어 있다면, 염색체성 크기(모든 중간 길이 및 중간 범위 포함) 보다 크거나 이러한 크기 이하인 작제물일 수 있다. 본원에 사용된 바와 같은 "중간 크기" 및 "중간 범위"는 인용된 값을 포함하거나 이 사이의 값을 포함한 모든 길이 또는 범위(즉, 상기 값을 포함하고 이 사이의 값을 포함한 모든 정수)를 의미한다.

본 발명에 사용된 DNA 절편은 생물학적 작용성 등가물 변형 폴리펩타이드 및 펩타이드, 예를 들면, 변형 겔로닌 독소를 포괄한다. 이러한 서열은 핵산 서열 및 이로써 암호화된 단백질 내에 천연적으로 발생되는 것으로 공지되어 있는 작용정 등가성과 코돈 중복성의 결과로서 생겨날 수 있다. 또 다른 한편, 작용상 등가 단백질 또는 펩타이드는 재조합 DNA 기술을 적용함으로써 생성시킬 수 있는데, 여기서는 교환되는 아미노산의 종류에 근거하여, 단백질 구조 상의 변화를 공학적으로 처리할 수 있다. 예를 들어, 해당 단백질의 항원성을 개선시키거나, 단백질이 제공된 대상체에 대한 상기 단백질의 생체내 독성 효과를 감소시키거나, 또는 이러한 단백질과 관련된 모든 치료 효능을 증대시키기 위해, 부위-지시된 돌연변이 유발 기술을 적용함으로써, 사람에 의해 디자인된 변화를 도입할 수 있다.

1. 벡터

본래 및 변형된 폴리펩타이드는 벡터 내에 포함된 핵산 분자에 의해 암호화될 수 있다. 용어 "벡터"는 이를 복제시킬 수 있는 세포 내로의 도입을 위해 핵산 서열이 삽입될 수 있는 운반체 핵산 분자를 지칭하는데 사용된다. 핵산 서열은 "외인성"일 수 있는데, 이는 이것이, 벡터가 도입되는 세포에 대해 외래라는 것을 의미하거나, 또는 상기 서열이 본래 발견되지 않는 숙주 세포 핵산 내의 특정 위치를 제외하고는 해당 세포 내의 서열과는 상동성이라는 것을 의미한다. 벡터에는 플라스미드, 코스미드, 바이러스(박테리오파아지, 동물 바이러스, 및 식물 바이러스) 및 인공 염색체(예: YACs)가 포함된다. 당업자는 문헌[참조: Sambrook et al., 1989 and Ausubel et al., 1996; 이들 모두는 본원에 참조문헌으로써 삽입된다]에 기재된 표준 재조합 기술을 통하여 벡터를 원활히 작제할 수 있을 것이다. 변형 겔로닌과 같은 변형 폴리펩타이드를 암호화하는 것 이외에도, 벡터는 태그 또는 표적화 분자와 같은 비-변형 폴리펩타이드 서열을 암호화할 수 있다. 이러한 융합 단백질을 암호화하는데 유용한 벡터에는 후기 정제 및 분리 또는 절단을 위한 글루타치온 S-트랜스퍼라제(GST) 가용성 융합 단백질을 생성시키는데 사용하기 위한 pGEX 벡터, pIN 벡터(Inouye et al., 1985) 및 히스티딘 연장물을 암호화하는 벡터가 포함된다. 표적화 분자는 변형 폴리펩타이드가 대상체 체내의 특정 기관, 조직, 세포 또느 기타 위치에 지시되도록 하는 것이다.

용어 "발현 벡터"는 전사될 수 있는 유전자 생성물의 적어도 일부를 암호화하는 핵산 서열을 함유하는 벡터를 지칭한다. 몇몇 경우에는, 이때 RNA 분자가 단백질, 폴리펩타이드 또는 펩타이드로 해독된다. 기타 경우, 이들 서열은, 예를 들어, 안티센스 분자 또는 리보자임을 생성시키는데 있어서는 해독되지 않는다. 발현 벡터는 특정한 숙주 유기체 내의 작동적으로 연결된 암호화 서열의 전사 및 가능하게는 해독에 필요한 핵산 서열을 지칭하는 각종 "제어 서열"을 함유할 수 있다. 전사와 해독을 좌우하는 제어 서열 이외에도, 벡터 및 발현 벡터는 기타 기능도 제공해주는 핵산 서열을 함유할 수 있으며, 이는 다음에 기재된다.

a. 프로모터 및 인핸서(enhancer)

"프로모터"는 개시 및 전사 속도가 제어되는 핵산 서열 영역인 제어 서열이다. 이는 RNA 폴리머라제와 같은 조절성 단백질 및 분자 및 기타 전사 인자를 결합시킬 수 있는 유전적 요소를 함유할 수 있다. "작동적으로 위치된", "작동적으로 연결된", "제어 하" 및 "전사 제어 하"란 표현은 프로모터가, 해당 서열의 전사 개시 및/또는 이의 발현을 제어하기 위한 핵산 서열과 관련해서 정확한 작용성 위치 및/또는 배향으로 존재한다는 것을 의미한다. 프로모터는 핵산 서열의 전사적 활성화와 관련된 시스-작용성 조절 서열을 지칭하는 "인핸서"와 연계해서 사용될 수 있거나 그렇치 않을 수 있다.

프로모터는 유전자 또는 서열과 천연적으로 연합된 것일 수 있는데, 이는 암호화 절편 및/또는 엑손의 상단부에 위치한 5' 비-암호화 서열을 분리시킴으로써 수득할 수 있다. 이러한 프로모터는 "내인성"으로 지칭될 수 있다. 유사하게, 인핸서는 해당 서열의 하단부 또는 상단부에 위치한 핵산 서열과 천연적으로 연합된 것일 수 있다. 또 다른 한편, 이의 천연 환경에서는 핵산 서열과 통상 연합되지않는 프로모터를 지칭하는 재조합 또는 이종 프로모터의 제어 하에 암호화 핵산 절편을 위치시킴으로써 특정의 이점을 획득할 수 있다. 재조합 또는 이종 인핸서는 또한, 이의 천연 환경 하에서는 핵산 서열과 통상 연합되지 않는 인핸서를 지칭하기도 한다. 이러한 프로모터 또는 인핸서에는 기타 유전자의 프로모터 또는 인핸서; 기타 모든 원핵성, 바이러스성 또는 진핵성 세포로부터 분리된 프로모터 또는 인핸서; 및 "천연적으로 발생"되지 않은, 즉 상이한 전사 조절성 영역의 상이한 요소, 및/또는 발현을 변화시키는 돌연변이물을 함유하는 프로모터 또는 인핸서가 포함될 수 있다. 프로모터 및 인핸서의 핵산 서열을 합성적으로 생성시키는 것 이외에도, 본원에 기재된 조성물과 연계해서 PCR™을 포함한 핵산 증폭 기술 및/또는 재조합 클로닝 기술을 사용하여 서열을 생성시킬 수 있다[참조: 본원에 참조문헌으로써 삽입된 미국 특허 제4,683,202호, 제5,928,906호]. 더우기, 미토콘드리아, 엽록체 등의 비-핵화 소기관 내에서의 서열의 전사 및/또는 발현을 지시하는 제어 서열을 또한 이용할 수 있는 것으로 고려된다.

본래, 발현을 위해 선택된 세포 유형, 소기관 및 유기체 내에서의 DNA 절편의 발현을 효과적으로 지시해주는 프로모터 및/또는 인핸서를 이용하는 것이 중요할 수 있다. 분자 생물학 분야의 전문가는 일반적으로, 단백질 발현을 위한 프로모터, 인핸서 및 세포 유형 조합물의 용도를 인지하고 있다[참조: Sambrook et al., 1989; 본원에 참조문헌으로써 삽입됨]. 이용된 프로모터는 도입된 DNA 절편의 높은 수준의 발현을 지시하는데 적당한 조건 하에서 유용성일 수 있고/있거나 구성성, 조직-특이성 및/또는 유도성일 수 있는데, 예를 들면, 이는 재조합 단백질및/또는 펩타이드의 대규모 생산에 유리하다. 프로모터는 이종 또는 내인성일 수 있다.

표 5에는 유전자의 발현을 조절하기 위해 본 발명의 맥락에서 이용될 수 있는 몇 가지 요소/프로모터가 열거되어 있다. 상기 목록은 발현 증진과 관련된 가능한 모든 요소를 전부 다 제시하지는 않고, 단지 이들의 예일 뿐이다. 표 6에는 특이적 자극에 반응하여 활성화될 수 있는 핵산 서열 영역인 유도성 요소의 예가 제공되어 있다:

조직-특이적 프로모터 또는 요소의 정체 뿐만 아니라 이들의 활성을 특징화하기 위한 검정은 당업자에게 널리 공지되어 있다. 이러한 영역의 예에는 사람 LIMK2 유전자(Nomoto et al., 1999), 소마토스타틴 수용체 2 유전자(Kraus et al., 1998), 쥐 에피디디말 레티노산-결합 유전자(Lareyre et al., 1999), 사람 CD4(Zhao-Emonet et al., 1998), 마우스 알파2(XI) 콜라겐(Tsumaki et al., 1998), DIA 도파민 수용체 유전자(Lee et al., 1997), 인슐린-유사 성장 인자 II(Wu et al., 1997), 사람 혈소판 내피 세포 부착 분자-1(Almendro et al., 1996)이 포함된다.

b. 개시 시그날 및 내부 리보솜 결합 부위

암호화 서열을 효율적으로 해독시키기 위해서는 특이적 개시 시그날이 요구될 수 있다. 이들 시그날에는 ATG 개시 코돈 또는 인접한 서열이 포함된다. ATG 개시 코돈을 포함한 외인성 해독 제어 시그날이 필요에 따라 제공될 수 있다. 당업자는 이를 용이하게 결정할 수 있고 필요한 시그날을 제공할 수 있을 것이다. 전체 삽입물의 해독을 보장하기 위해서는 개시 코돈이 목적하는 암호화 서열의 판독 프레임과 "동일 프레임 내"에 있어야만 한다는 것은 널리 공지되어 있다. 외인성 해독 제어 시그날 및 개시 코돈은 천연 또는 합성일 수 있다. 발현 효능은 적당한 전사 인핸서 요소를 봉입시킴으로써 증강시킬 수 있다.

본 발명의 특정 양태에서는, 내부 리보솜 도입 부위(IRES) 요소를 사용하여 다중 유전자 또는 폴리시스트론성 메시지를 창출시킨다. IRES 요소는 5' 메틸화 Cap 의존적 해독의 리보솜 스캐닝 모델을 바이패스할 수 있고 내부 부위에서 해독을 시작한다(Pelletier and Sonenberg, 1988). 포유류 메시지로부터의 IRES[참조: Macejak and Sarnow, 1991] 뿐만 아니라 피코르나바이러스 계열의 2가지 구성원(폴리오 및 뇌심근염)으로부터의 IRES가 보고되었다[참조: Pelletier and Sonenberg, 1988]. IRES 요소는 이종 개방 판독 프레임에 연결할 수 있다. IRES에 의해 각각 분리된, 다중 개방 판독 프레임을 함께 전사하여, 폴리시스트론성 메시지를 창출시킬 수 있다. IRES 요소를 통하여, 각각의 개방 판독 프레임이 효율적인 해독을 위해 리보솜에 접근 가능하다. 다중 유전자는 단일 메시지를 전사하기 위한 단일 프로모터/인핸서를 사용하여 효율적으로 발현될 수 있다[본원에 참조문헌으로써 삽입된 미국 특허 제5,925,565호 및 제5,935,819호 참조].

c. 다중 클로닝 부위

벡터는 다중 제한 효소 부위를 함유하는 핵산 영역인 다중 클로닝 부위(MCS)를 포함할 수 있는데, 이중 어떠한 것도 벡터를 분해시키기 위한 표준 재조합 기술과 연계해서 사용될 수 있다[참조: Carbonelli et al., 1991, Levenson et al., 1998 and Cocea, 1997; 이들 각각이 본원에 참조문헌으로써 삽입되어 있다]. "제한 효소 분해"는 핵산 분자 내의 특정한 위치에서만 작용하는 효소를 사용하여 핵산 분자를 촉매적으로 절단시키는 것을 지칭한다. 이들 제한 효소의 상당 수가 시판되고 있다. 상기 효소의 용도는 당업자에게 광범위하게 인식되고 있다. 자주, MCS 내부를 절단하여 외인성 벡터가 벡터에 연결될 수 있도록 해주는 제한 효소를 사용하여, 벡터를 선형화시키거나 단편화시킬 수 있다. "연결"은 서로 연속되거나 연속되지 않을 수 있는 2개의 핵산 단편 간에 포스포디에스테르 결합을 형성시키는 공정을 지칭한다. 제한 효소 및 연결 반응과 관계된 기술은 재조합 기술 분야의 전문가에게 널리 공지되어 있다.

d. 스플라이싱 부위

전사된 대부분의 진핵성 RNA 분자는 RNA 스플라이싱을 진행하여 1차 전사체로부터 인트론을 제거시킬 것이다. 게놈성 진핵성 서열을 함유하는 벡터는, 단백질 발현을 위해 전사체의 적당한 프로세싱을 보장해주는 공여자 및/또는 수용자 스플라이싱 부위를 요구할 수 있다[참조: Chandler et al., 1997; 본원에 참조문헌으로써 삽입되어 있다].

e. 종결 시그날

본 발명의 벡터 또는 작제물은 일반적으로, 하나 이상의 종결 시그날을 포함할 것이다. "종결 시그날" 또는 "종결인자"는 RNA 폴리머라제에 의한 RNA 전사체의 특이적 종결과 관련된 DNA 서열로 구성된다. 따라서, 특정 양태에서는, RNA의 전사체의 생성을 종결시키는 종결 시그날이 고려된다. 종결인자는 목적하는 메시지 수준을 달성하기 위해 생체내에서 필요할 수 있다.

진핵성 시스템에서는 종결인자 영역이, 폴리아데닐화 부위를 노출시키도록 새로운 전사체의 부위-특이적 절단을 허용해주는 특이적 DNA 서열을 포함할 수도 있다. 이는 특수 내인성 폴리머라제를 시그날시켜, 약 200 A 잔기(폴리 A)의 연장물을 전사체의 3' 말단에 부가시킨다. 이러한 폴리 A 꼬리로 변형시킨 RNA 분자는 보다 안정적이고 보다 효율적으로 해독된다. 따라서, 진핵체를 포함하는 기타 양태에서는, 종결인자가 RNA의 절단에 대한 시그날을 포함하는 것이 바람직하고, 종결인자 시그날이 메시지의 폴리아데닐화를 촉진시키는 것이 보다 바람직하다. 종결인자 및/또는 폴리아데닐화 부위 요소는 메시지 수준을 증강시키고/시키거나 카세트로부터 기타 서열 내로의 판독을 최소화시키는 작용을 할 수 있다.

본 발명에 사용하도록 고려된 종결인자로는 본원에 기재되거나 당업자에게 공지된 바와 같은 모든 공지된 전사 종결인자가 있는데, 이에는 예를 들어, 소의 성장 호르몬 종결인자와 같은 유전자의 종결 서열, 또는 SV40 종결인자와 같은 바이러스성 종결 서열이 포함되지만, 이에 제한되지 않는다. 특정 양태에서는, 종결 시그날에는 전사 가능하거나 해독 가능한 서열이 결여될 수 있으며, 이는 예를 들어, 서열 절단물 때문이다.

f. 폴리아데닐화 부위

발현, 특히 진핵성 발현에는, 전사체의 적당한 아데닐화를 수행하기 위한 폴리아데닐화 시그날이 전형적으로 포함될 것이다. 폴리아데닐화 시그날의 종류는 본 발명의 성공적인 실시에 결정적인 것으로 여겨지지 않고/않거나 이들 서열 중의 어떠한 것도 이용될 수 있다. 바람직한 양태에는 각종 표적 세포에서 잘 작용하는 것으로 공지되고/되거나 편리한, 소의 성장 호르몬 폴리아데닐화 시그날 및/또는 SV40 폴리아데닐화 시그날이 포함된다. 폴리아데닐화는 전사체의 안정성을 증가시킬 수 있거나 또는 세포질성 수송을 촉진시킬 수 있다.

g. 복제 오리진

벡터를 숙주 세포에서 증식시키기 위해서는, 복제가 개시되는 특이적 핵산 서열인 하나 이상의 복제 오리진 부위(종종 "ori"로 명명됨)를 함유할 수 있다. 또 다른 한편, 숙주 세포가 효모인 경우에는 자가 복제성 서열(ARS)을 이용할 수 있다.

h. 선별 및 스크리닝 가능한 마커

본 발명의 특정 양태에서는, 발현 벡터 내에 마커를 혼입시킴으로써, 본 발명의 핵산 작제물을 함유하는 세포를 시험관내 또는 생체내에서 동정할 수 있다. 이러한 마커는 상기 발현 벡터를 함유하는 세포를 용이하게 동정해주는, 세포에 대한 동정 가능한 변화를 부여해줄 것이다. 일반적으로, 선별 마커는 선별을 허용해주는 특성을 부여해준 것이다. 가능한 선별 마커는 마커의 존재로 인해 이의 선별이 가능해진 것인 반면, 음성 선별 마커는 이의 존재로 인해 이의 선별이 방지되는 것이다. 양성 선별 마커의 한 예가 약물 내성 마커이다.

통상적으로, 약물 선별 마커의 봉입은 형질전환체의 클로닝과 동정에 도움을 주는데, 예를 들면, 네오마이신, 푸로마이신, 하이그로마이신, DHFR, GPT, 제오신 및 히스티디놀에 대한 내성을 부여해주는 유전자가 유용한 선별 마커이다. 조건 이행에 근거하여 형질전환체를 구별시켜 주는 표현형을 부여해주는 마커 이외에도, 비색 분석에 기준한, GFP와 같은 스크리닝 가능한 마커를 포함한 기타 유형의 마커가 또한 고려된다. 또 다른 한편, 단순 포진 바이러스 티미딘 키나제(tk) 또는 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제(CAT)와 같은 스크리닝 가능한 효소를 활용할 수 있다. 당업자는 또한, 면역학적 마커를, 가능하게는 FACS 분석과 연계해서 이용하는 방법을 인지하고 있을 것이다. 사용된 마커는 이것이 유전자 생성물을 암호화하는 핵산과 동시에 발현될 수 있는 한은 중요한 것으로 여겨지지 않는다. 선별 및 스크리닝 가능한 마커의 추가의 예가 당업자에게 널리 공지되어 있다.

2. 숙주 세포

본원에 사용된 바와 같은 용어 "세포", "세포주" 및 "세포 배양물"은 상호 교환적으로 사용될 수 있다. 이들 명칭 모두에는 또한, 다음 세대인 자손 모두가 포함된다. 계획적이거나 불가피한 돌연변이로 인해 모든 자손이 동일할 수는 없다는 것으로 고려된다. 이종 핵산 서열을 발현하는 것과 관련해서는, "숙주 세포"가 진핵성 또는 원핵성 세포를 지칭하는데, 이에는 벡터를 복제할 수 있고/있거나 벡터에 의해 암호화된 이종 유전자를 발현할 수 있는 모든 형질전환 가능한 유기체가 포함된다. 숙주 세포는 벡터에 대한 수용체로서 사용될 수 있거나 사용되어 왔다. 숙주 세포는 "형질감염" 또는 "형질전환"될 수 있는데, 이는 변형 단백질-암호화서열과 같은 외인성 핵산이 숙주 세포 내로 형질감염 또는 도입되는 공정을 지칭한다. 형질전환된 세포에는 1차 대상체 세포 및 이의 자손이 포함된다.

목적하는 결과가 벡터의 복제인지 아니면 벡터-암호화된 핵산 서열의 일부 또는 전부의 발현인지에 따라서, 숙주 세포를 효모 세포, 곤충 세포 및 포유류 세포를 포함한 진핵생물 또는 원핵생물로부터 유도될 수 있다. 수 많은 세포주 및 배양물이 숙주 세포로서 이용될 수 있으며, 이들은 살아있는 배양물과 유전적 물질에 대한 보관소로서 작용하는 협회인 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(ATCC)을 통하여 수득할 수 있다. 적당한 숙주는 벡터 주쇄 및 목적하는 결과에 근거하여 당업자에 의해 결정될 수 있다. 많은 벡터의 복제를 위해, 예를 들면, 플라스미드 또는 코스미드를 원핵성 숙주 세포 내로 도입할 수 있다. 벡터 복제 및/또는 발현을 위해 숙주 세포로서 사용된 세균성 세포에는 DH5α, JM109, 및 KC8 뿐만 아니라 수 많은 시판용 세균성 숙주, 예를 들면, SURE^®적격 세포 및 SOLOPACK™ Gold 세포(STRATAGENE^®, La Jolla)가 포함된다. 또 다른 한편, 이. 콜라이 LE392와 같은 세균성 세포를 파아지 바이러스용 숙주 세포로서 사용할 수 있다. 적당한 효모 세포에는 삭카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae), 삭카로마이세스 폼베(Saccharomyces pombe) 및 피치아 파스토리스(Pichia pastoris)가 포함된다.

벡터의 복제 및/또는 발현을 위한 진핵성 숙주 세포의 예에는 HeLa, NIH3T3, 저캣, 293, Cos, CHO, Saos 및 PC12가 포함된다. 각종 세포 유형 및 유기체로부터의 많은 숙주 세포가 이용 가능하고, 이는 당업자에게 공지되어 있다. 유사하게,바이러스성 벡터를 진핵성 또는 원핵성 숙주 세포, 특히 벡터의 복제 또는 발현을 허용해주는 것과 연계해서 사용할 수 있다.

몇몇 벡터는 원핵성 세포와 진핵성 세포 모두에서 복제 및/또는 발현될 수 있도록 해주는 제어 서열을 이용할 수 있다. 당업자는 상기 언급된 숙주 세포를 유지시키고 벡터의 복제를 허용하기 위해 상기 숙주 세포 모두를 항온 처리시키는 조건을 추가로 인지할 것이다. 또한, 벡터에 의해 암호화된 핵산 및 이들의 동족 폴리펩타이드, 단백질 또는 펩타이드의 생성 뿐만 아니라 벡터를 대규모로 생성시켜줄 수 있는 기술 및 조건이 인지 및 공지되어 있다.

3. 발현 시스템

상기 논의된 조성물의 전부 또는 적어도 일부를 포함하는 수 많은 발현 시스템이 존재한다. 원핵생물- 및/또는 진핵생물-이용 시스템이, 핵산 서열 또는 이들의 동족 폴리펩타이드, 단백질 및 펩타이드를 생성시키기 위해 본 발명에 사용하는데 이용될 수 있다. 이러한 많은 시스템이 시판되고 널리 이용 가능하다.

곤충 세포/바쿨로바이러스 시스템은 본원에 참조문헌으로써 삽입된 미국 특허 제5,871,986호 및 제4,879,236호에 기재된 바와 같이 이종 핵산 절편의 고수준의 단백질 발현을 가져다줄 수 있으며, 이는 예를 들어, INVITROGEN^®및 BACPACK™ BACULOVIRUS EXPRESSIONS SYSTEM FROM CLONTECH^®으로부터 MAXBAC^®2.0이란 상표명으로 구입할 수 있다.

기재된 본 발명의 발현 시스템 이외에도, 기타 발현 시스템의 예에는 합성엑디손(ecdysone)-유도성 수용체가 관여하는 STRATAGENE^®'s COMPLETE CONTROL™ 유도성 포유류 발현 시스템, 또는 이의 pET 발현 시스템, 즉 이. 콜라이 발현 시스템이 포함된다. 유도성 발현 시스템의 또 다른 예는 완전한 길이의 CMV 프로모터를 이용하는 유도성 포유류 발현 시스템인 T-REX™(테트라사이클린-조절된 발현) 시스템을 수반하는 INVITROGEN^®으로부터 입수 가능하다. INVITROGEN^®은 또한, 메틸향성 효모 피치아 메타놀리카(Pichia methanolica)에서 재조합 단백질을 높은 수준으로 생성하도록 고안된, 피치아 메타놀리카 발현 시스템으로 불리우는 효모 발현 시스템을 제공해준다. 당업자는 벡터, 예를 들면, 발현 작제물을 발현하여 핵산 서열 또는 이의 동족 폴리펩타이드, 단백질 또는 펩타이드를 생성시키는 방법을 알고 있을 것이다.

4. 바이러스성 벡터

발현 벡터를 세포 내로 도입할 수 있는 수 많은 방법이 있다. 본 발명의 특정 양태에서는, 발현 벡터가 바이러스, 또는 바이러스성 게놈으로부터 유도된 공학 처리된 벡터를 포함한다. 특정의 바이러스가 수용체-매개된 세포내이입을 통하여 세포 내로 유입되고, 숙주 세포 게놈 내로 통합되며 바이러스성 유전자를 안정적이고도 효율적으로 발현시키는 능력은 이들 바이러스를, 외래 유전자를 포유류 세포 내로 수송하는데 있어 관심을 끄는 후보로 만들었다[참조: Ridgeway, 1988; Nicolas and Rubenstein, 1988; Baichwal and Sugden, 1986; Temin, 1986]. 유전자 벡터로서 사용된 첫 번째 바이러스는 파포바바이러스(원숭이 바이러스 40, 소의유두종 바이러스 및 폴리오마)[참조: Ridgeway, 1988; Baichwal and Sugden, 1986] 및 아데노바이러스[참조: Ridgeway, 1988; Baichwal and Sugden, 1986]을 포함한 DNA 바이러스이다. 이들은 외래 DNA 서열에 대해 비교적 낮은 능력을 지니고 있고 제한된 숙주 스펙트럼을 갖는다. 더우기, 허용 가능한 세포에서의 이들의 종양유전자성 잠재적 효과는 안전성 우려를 가져다 준다. 이들은 외래 유전 물질을 8kb 이하로만 수용할 수 있지만, 각종 세포주 및 실험실용 동물에 용이하게 도입할 수 있다[참조: Nicolas and Rubenstein, 1988; Temin, 1986].

레트로바이러스는 이들의 RNA를 감염된 세포에서 이중 가닥 DNA로 전환시킬 수 있는 능력을 특징으로 하는 일종의 단일 가닥 RNA 바이러스 그룹이며; 이들을 벡터로서 사용할 수도 있다. 기타 바이러스성 벡터가 본 발명에서 발현 작제물로서 이용될 수 있다. 백시니아 바이러스[참조: Ridgeway, 1988; Baichwal and Sugden, 1986; Coupar et al., 1988], 아데노-관련 바이러스(AAV)[참조: Ridgeway, 1988; Baichwal and Sugden, 1986; Hermonat and Muzycska, 1984] 및 헤르페스 바이러스 등의 바이러스로부터 유도된 벡터를 이용할 수 있다. 이들은 각종 포유류 세포에 대해 몇 가지 관심을 끄는 특징을 제공해준다[참조: Friedmann, 1989; Ridgeway, 1988; Baichwal and Sugden, 1986; Coupar et al., 1988; Horwich et al., 1990].

B. 핵산 검출

본원에 기재된 핵산 서열이 디자이너 독소 및 변형 단백질, 폴리펩타이드 및/또는 펩타이드의 발현을 지시하는데 사용하는 것 이외에도, 이들 핵산 서열은각종의 기타 용도를 지니고 있다. 예를 들면, 이들은 핵산 하이브리드화와 관련된 양태에 대한 프로브 또는 프라이머로서의 용도를 지니고 있다. 변형 단백질 또는 디자이너 독소를 암호화하는 핵산의 검출이 본 발명에 의해 포괄된다.

1. 하이브리드화

뉴클레오타이드 길이가 13개 내지 100개, 바람직하게는 17개 내지 100개, 또는 본 발명의 몇몇 양태에서는 1 내지 2킬로염기 이상인 프로브 또는 프라이머를 사용하면, 안정하면서도 선택적인 이중 분자를 형성할 수 있다. 수득된 하이브리드 분자의 안정성 및/또는 선택성을 증가시키기 위해서는, 일반적으로 길이가 10염기 이상인 인접 서열에 대해 상보적인 서열을 갖는 분자가 바람직하다. 일반적으로는 뉴클레오타이드가 20개 내지 30개, 또는 경우에 따라 그 이상인 상보 서열을 하나 이상 포함하는 핵산 분자가 하이드리드용으로 바람직할 것이다. 이러한 단편은, 예를 들어 화학적 방법에 의해 단편을 직접 합성하거나 선택된 서열을 재조합 생산용 재조합 벡터에 도입함으로써 용이하게 제조할 수 있다.

따라서, 본 발명의 뉴클레오타이드 서열은 DNA 및/또는 RNA의 상보 서열을 갖는 이중 분자를 선택적으로 형성시키거나 샘플의 DNA 또는 RNA 증폭용 프라이머를 제공하기 위해 사용될 수 있다. 계획된 경우에 따라, 표적 서열에 대한 프로브 또는 프라이머의 선택도를 다양화하기 위해 여러가지 하이브리드 조건을 사용하는 것이 바람직할 것이다.

높은 선택성이 요구되는 경우, 전형적으로는 비교적 고도의 엄격한 조건을 사용하여 하이브리드를 형성하는 것이 바람직할 것이다. 예를 들어 약 0.02M 내지약 0.10M NaCl과 같은 비교적 낮은 염 및/또는 높은 온도 조건이 제공된다. 이러한 고도의 엄격한 조건은 프로브 또는 프라이머와 주형 또는 표적 쇄간의 가능한 미스매치(mismatch)를 거의 허용하지 않으며, 특이적 유전자를 분리시키거나 특이적 mRNA 전사체를 검출하는데 특히 적합하다. 일반적으로는 부가하는 포름아미드의 양을 증가시키면 조건이 보다 엄격해지는 것으로 공지되어 있다.

예를 들어, 위치 지정 돌연변이와 같이 특별한 경우에 있어서는 보다 덜 엄격한 조건이 바람직하다. 이러한 조건하에서는 하이드리드화 쇄의 서열이 완벽하게 상보적이지 않더라도 하이브리드화가 일어날 수 있지만 하나 이상의 위치에서 미스매치가 일어난다. 염의 농도를 증가시키고/시키거나 온도를 감소시키으로써 보다 덜 엄격한 조건을 만들 수 있다. 예를 들어, 중간 정도의 엄격한 조건은 약 0.1M 내지 0.25M NaCl 및 약 37℃ 내지 약 55℃의 온도이며, 낮은 정도의 엄격한 조건은 약 0.15M 내지 0.9M NaCl 및 약 20℃ 내지 약 55℃의 온도이다. 하이브리드화 조건은 목적하는 결과에 따라 용이하게 조절할 수 있다.

다른 양태에서는, 예를 들어 50mM Tris-HCl(pH 8.3), 75mM KCl, 3mM MgCl₂, 1.0mM 디티오트레이톨, 약 20℃ 내지 약 37℃의 온도하에 하이브리드화를 실시할 수 있다. 10mM Tris-HCl(pH 8.3), 50mM KCl, 1.5mM MgCl₂, 약 40℃ 내지 약 72℃의 온도를 포함하여 다른 하이브리드화 조건을 사용할 수도 있다.

특정 양태에서는, 하이브리드화를 결정하기 위해 표지와 같은 적절한 방법과 병행하여 본 발명의 정의된 서열의 핵산을 사용하는 것이 유리할 수 있다. 검출가능한 형광, 방사능, 효소 또는 다른 리간드(예: 아비딘/바이오틴)를 포함하여 여러가지 적절한 표시자가 당분야에 공지되어 있다. 바람직한 양태에서는 방사능 또는 기타 환경적으로 유해한 시약 대신에 우레아제, 알칼라인 포스파타제 또는 퍼옥시다제와 같은 효소 택(tag) 또는 형광 표지를 사용하는 것이 바람직할 수 있다. 효소 택의 경우, 상보 핵산 함유 샘플과의 특이적 하이브리드화를 검출하기 위해 가시적으로 또는 분광광도계로 검출가능한 검출방법을 제공하는데 사용될 수 있는 발색 지시 기질이 공지되어 있다.

일반적으로는, 상응하는 유전자의 발현여부를 검출하기 위한 용액 하이브리드화(예: PCR^TM)뿐만 아니라 고형상을 사용하는 양태에서는 시약으로써 본원에서 기술한 프로브 또는 프라이머가 유용하다. 고형상을 수반하는 양태에서는, 시험 DNA(또는 RNA)를 흡착시키거나 선택된 매트릭스 또는 표면에 고정시킨다. 그런 다음, 이렇게 고정시킨 일본쇄 핵산을 목적하는 조건하에 선택된 프로브와 하이브리드화시킨다. 선택된 조건은 개개의 환경(예를 들어, G-C 함량, 표적 핵산의 유형, 핵산 공급원, 하이브리드화 프로브 크기 등)에 따라 다양하다. 관심있는 특정 경우에서 하이브리드화 조건을 최적화하는 방법은 당분야의 숙련자에게는 익히 공지되어 있다. 비특이적으로 결합된 프로브 분자를 제거하기 위해 하이브리드화된 분자를 세척한 후, 결합된 표지의 양을 측정하여 하이브리드화를 검출하고/하거나 정량한다. 대표적인 고형상 하이브리드화 방법은 미국 특허 제5,843,663호, 제5,900,481호 및 제5,919,626호에 기술되어 있다. 본 발명의 실시에 사용할 수있는 다른 하이브리드화 방법은 미국 특허 제5,849,481호, 제5,849,486호 및 제5,851,772호에 기술되어 있다. 본 명세서 부분에서 명시된 상기한 문헌 및 다른 참조문헌의 관련 부분은 본원에서 참조문헌으로 인용된다.

2. 핵산 증폭

증폭용 주형으로 사용되는 핵산은 표준방법(참조문헌; Sambrook et al., 1989)에 따라 세포, 조직 또는 다른 샘플로부터 분리시킬 수 있다. 특정 양태에서는 주형 핵산을 실제 정제하지 않고 세포 전체 또는 조직 균질물 또는 체액 샘플상에서 분석을 실시한다. 핵산은 게놈 DNA, 또는 전체 세포의 RNA 또는 단편화된 RNA일 수 있다. RNA를 사용하는 경우, RNA를 상보적인 DNA로 먼저 전환시키는 것이 바람직할 수 있다.

본원에서 사용되는 용어 "프라이머"는 주형 의존적 과정에서 초기 핵산 합성을 개시할 수 있는 모든 핵산을 포함한다. 전형적으로 프라이머는 길이가 10개 내지 20개 및/또는 30개의 염기쌍인 올리고뉴클레오타이드이지만 보다 긴 서열을 사용할 수도 있다. 일본쇄 형태의 프라이머가 바람직하지만 이본쇄 및/또는 일본쇄 형태 둘다를 사용할 수도 있다.

서열 1 또는 임의의 다른 서열에 상응하는 핵산과 선택적으로 하이브리드화하도록 디자인된 프라이머쌍은 선택적인 하이브리드화를 허용하는 조건하에 주형 핵산과 접촉시킨다. 경우에 따라, 프라이머에 대해 완벽하게 상보적인 서열만 하이브리드화하도록 고도의 엄격한 하이브리드화 조건을 선택할 수도 있다. 다른 양태에서는 프라이머 서열과 하나 이상 미스매치된 핵산을 증폭시키도록 보다 덜 엄격한 조건하에 하이브리드화를 실시할 수 있다. 일단 하이브리드화되면, 주형-프라이머 복합체를 하나 이상의 효소와 접촉시켜 주형 의존적 핵산 합성을 촉진시킨다. 생성되는 증폭 생성물의 양이 충분할 때까지 "사이클(cycle)"로도 언급되는 다중 증폭을 실시한다.

증폭 생성물은 검출하고 정량할 수 있다. 특정 경우에서는 가시적으로 검출도 가능하다. 또한, 화학발광, 혼입된 방사능의 방사능 섬광조영술 또는 형광 표지에 의해, 심지어는 전기 및/또는 열 충격 시그날을 사용한 시스템(참조문헌; Affymax 기술; Bellus, 1994)을 통해 생성물을 직접 확인할 수 있다.

다수의 주형 의존적 방법을 사용하여 소정의 주형 샘플에 존재하는 올리고뉴클레오타이드 서열을 증폭시킬 수 있다. 가장 널리 공지된 증폭방법 중 하나는 미국 특허 제4,683,195호, 제4,683,202호 및 제4,800,159호, 및 본원에서 전문이 참조문헌으로 인용된 문헌(참조문헌: Innis et al., 1988)에 상세하게 기술되어 있는 중합효소 연쇄 반응(PCR^TM)이다.

역전사효소 PCR^TM증폭방법을 사용하여 증폭된 mRNA의 양을 정량할 수 있다. RNA를 cDNA로 역전사시키는 방법은 익히 공지되어 있다(참조문헌: Sambrook et al., 1989). 또다른 역전사방법은 열안정 DNA 중합효소를 사용한다. 본 방법은 WO 제90/07641호에 기술되어 있다. 중합효소 연쇄 반응 방법은 당분야에 익히 공지되어 있다. RT-PCR의 대표적인 방법은 미국 특허 제5,882,864호에 기술되어 있다.

또다른 증폭방법은 본원에서 전문이 참조문헌으로 인용된 유럽 특허원 제320 308호 기술되어 있는 리가제 연쇄 반응(Ligase chain reaction; "LCR")이다. 미국 특허 제4,883,750호는 표적 서열에 프로브 쌍을 결합시키는 LCR과 유사한 방법을 기술하고 있다. 미국 특허 제5,912,148호에 기술되어 있는, PCR^TM및 올리고뉴클레오타이드 리가제 분석(Oligonucleotide ligase assay; OLA)을 기본으로하는 방법을 사용할 수도 있다.

본 발명의 실시에 사용할 수 있는, 또다른 표적 핵산 서열 증폭방법은 본원에서 전문이 참조문헌으로 인용된 미국 특허 제5,843,650호, 제5,846,709호, 제5,846,783호, 제5,849,546호, 제5,849,497호, 제5,849,547호, 제5,858,652호, 제5,866,366호, 제5,916,776호, 제5,922,574호, 제5,928,905호, 제5,928,906호, 제5,932,451호, 제5,935,825호, 제5,939,291호, 제5,942,391호, 영국 특허원 제2 202 328 및 PCT 특허원 제PCT/US89/01025호에 기술되어 있다.

PCT 특허원 제PCT/US87/00880호에 기술되어 있는 Q베타 리플리카제는 본 발명의 증폭방법에 사용할 수도 있다. 이 방법에서는 표적 서열과 상보적인 영역을 지닌 복제 RNA 서열을 RNA 중합효소의 존재하에 샘플에 가한다. 증폭효소는 검출가능한 복제 서열을 복사할 것이다.

제한 엔도뉴클레아제 및 리가제를 사용하여, 한쪽 쇄의 제한 부위에 뉴클레오타이드 5'-[알파-티오]-트리포스페이트 포함한 표적 분자를 증폭시키는 등온 증폭방법이 본 발명의 핵산 증폭에 유용할 수 있다(참조문헌: Walker et al., 1992). 미국 특허 제5,916,779호에 기술되어 있는 쇄 대체 증폭방법(Strand Displacement Amplification; SDA)은 다중 쇄 대체 및 합성, 즉 닉(nick) 전사를 수반한 핵산 등온 증폭방법을 수행하는 또다른 방법이다.

다른 핵산 증폭방법에는 핵산서열 기본 증폭방법(nucleic acid sequence based amplificaiotn; NASBA) 및 3SR과 같은 전사 기본 증폭 시스템(transcription-based amplification; TAS)이 포함된다(참조문헌: Kwoh et al., 1989; PCT 특허원 제WO 88/10315호). 유럽 특허원 제329 822호에는, 본원에서 사용가능한 주기적 합성 일본쇄 RNA("ssRNA"), ssDNA 및 이본쇄 DNA(dsDNA)를 수반하는 핵산 증폭방법이 기술되어 있다.

본원에서 전문이 참조문헌으로 인용된 PCT 특허원 제WO 89/06700호에는, 표적 일본쇄 DNA("ssDNA")에 프로모터 영역/프라이머 서열을 하이브리드화한 다음, 서열의 다수 RNA 복사체를 전사시킴을 기본으로 하는 핵산 서열 증폭방법이 기술되어 있다. 이러한 방법은 주기적이지 않은데, 즉 수득한 RNA 전사체로부터 새로운 주형이 생성되지 않는다. 다른 증폭방법으로는 "RACE" 및 "한면 PCR"(참조문헌: Frohman, 1990; Ohara et al., 1989)이 있다.

3. 핵산 검출

증폭한 다음, 주형 및/또는 과량의 프라이머로부터 증폭 생성물을 분리시키는 것이 바람직하다. 한가지 양태에서는 표준방법을 사용하여 아가로스,아가로스-아크릴아미드 또는 폴리아크릴아미드 겔 전기영동법에 의해 증폭 생성물을 분리시킨다(참조문헌: Sambrook et al., 1989). 분리된 증폭 생성물은 절단한 다음 추가로 조작하여 겔로부터 용출시킬 수 있다. 저융점 아가로스 겔을 사용하면, 분리된 밴드를 가열하여 겔을 제거한 다음 핵산을 추출할 수 있다.

당분야에 공지된 크로마토그래피 기술에 의해 핵산을 분리할 수도 있다. 본 발명의 실시에 사용할 수 있는 여러 종류의 크로마토그래피가 있는데, 여기에는 흡착, 분배, 이온교환, 하이드록실아파타이트, 분자체, 역상, 컬럼, 페이터, 박층 및 기체 크로마토그래피뿐만 아니라 HPLC도 포함된다.

특정 양태에서는 증폭 생성물을 가시화할 수 있다. 전형적인 가시화방법은 겔을 에티듐 브로마이드로 염색하고 UV 광선하에 밴드를 확인하는 것을 수반한다. 또한, 증폭 생성물이 방사능 또는 형광 표지된 뉴클레오타이드로 완전하게 표지된 경우, 분리된 증폭 생성물을 x선 필름에 노출시키거나 적절한 여기 스페트럼하에 노출시킨다.

한가지 양태에서는, 증폭 생성물을 분리시킨 후, 표지된 핵산 프로브를 증폭된 마커 서열과 접촉시킨다. 프로브를 발색단과 결합시키는 것이 바람직하지만 방사능으로 표지할 수도 있다. 또다른 양태에서, 프로브는 결합 파트너, 예를 들어 항체 또는 바이오틴과 결합시키거나 검출가능한 잔기를 갖는 또다른 결합 파트너에 결합시킨다.

특정 양태에서는 표지 프로브와의 하이브리드화 및 서던 블롯팅(Southern blotting)에 의해 검출할 수 있다. 서던 블롯팅에 수반되는 기술은 당분야의 숙련가에게는 익히 공지되어 있다(참조문헌: Sambrook et al., 1989). 이의 한가지 예는, 자동 전기영동 및 핵산 전달방법 및 장치를 기술하고 있으며 본원에서 참조문헌으로 인용된 미국 특허 제5,279,721호에 기술되어 있다. 장치는 겔의 외부 조작없이도 전기영동 및 블롯팅을 가능하게하며 본 발명에 따른 방법을 수행하는데 매우 적합하다.

본 발명의 실시에 사용할 수 있는 다른 핵산 검출방법은 본원에서 참조문헌으로 인용된 미국 특허 제5,840,873호, 제5,843,640호, 제5,843,651호, 제5,846,708호, 제5,846,717호, 제5,846,726호, 제5,846,729호, 제5,849,487호, 제5,853,990호, 제5,853,992호, 제5,853,993호, 제5,856,092호, 제5,861,244호, 제5,863,732호, 제5,863,753호, 제5,866,331호, 제5,905,024호, 제5,910,407호, 제5,912,124호, 제5,912,145호, 제5,919,630호, 제5,925,517호, 제5,928,862호, 제5,928,869호, 제5,929,227호, 제5,932,413호 및 제5,935,791호에 기술되어 있다.

4. 다른 검정방법

예를 들어 게놈 DNA, cDNA 미/또는 RNA 샘플중 돌연변이를 검출하기 위해서는 다른 유전자 선별방법을 본 발명의 범주내에서 사용할 수 있다. 점돌연변이를 검출하는데 사용되는 방법에는 변성 구배 겔 전기영동(denaturing gradient gel electrophoresis; "DGGE"), 제한 단편 길이 다형성 분석(restriction fragment length polymorphism analysis; "RFLP"), 화학적 또는 효소적 절단방법, PCR^TM에 의해 증폭된 표적 영역의 직접적인 서열분석(상기 참조), 일본쇄 변형 다형성 분석(single-strand conformation polymorphism analysis; "SSCP") 및 당분야에서 익히 공지된 다른 방법이 포함된다.

점돌연변이를 선별하는 또다른 방법은 RNA/DNA 또는 RNA/RNA 이종이본쇄 미스매치 염기쌍의 RNase 분해를 기본으로 한다. 본원에서 사용되는 바와 같이 "미스매치"는 이본쇄 RNA/RNA, RNA/DNA 또는 DNA/DNA 분자중 하나 이상이 쌍을 이루지 않거나 쌍이 잘못 짝지어진 영역을 의미한다. 따라서 이러한 정의에는 삽입/결실 돌연변이에 기인한 미스매치뿐만 아니라 단일 또는 다중 염기 점돌연변이가 포함된다.

미국 특허 제4,946,773호에는, 일본쇄 DNA 또는 NRA 시험 샘플과 RNA 프로브를 어닐링한 다음, 핵산 이본쇄를 RNase A로 처리함을 포함하는 RNase A 미스매치 분해 분석이 기술되어 있다. 미스매치를 검출하기 위해, 크기에 따라 전기영동에 의해 분리한, RNase A 처리 일본쇄 생성물은 유사하게 처리한 대조 이중체와 비교한다. 대조 이중체에서는 나타나지 않는 보다 작은 단편(분해 생성물)을 포함한 샘플을 양성으로서 집계한다.

다른 조사자는 RNase I 미스매치 분석의 사용을 기술하고 있다. 미스매치 검출을 위해 RNase I을 사용하는 것은 프로메가 바이오테크(Promega Biotech)의 문헌에 기술되어 있다. 프로메가는 4개의 공지된 미스매치중 세개를 분해하는 RNase I을 포함한 키트를 시판하고 있다. 일본쇄 염기 미스매치를 검출하기 위해 MutS 단백질 또는 다른 DNA 복구 효소를 사용하는 것도 또한 공지되어 있다.

본 발명의 실시에서 사용될 수 있는 결실, 삽입 또는 치환 돌연변이를 검출하는 또다른 방법은 본원에서 전문이 참조문헌으로 인용된 미국 특허 제5,849,483호, 제5,851,770호, 제5,866,337호, 제5,925,525호 및 제5,928,870호에 기술되어 있다.

C. 유전자 전달방법

본원에서 기술한 바와 같거나 당분야의 숙련가에게 공지된 바와 같이, 본 발명의 조성물의 발현을 수행하는데 적합한 핵산 전달방법은 실제 핵산(예: 바이러스 및 비바이러스 벡터를 포함한 DNA)을 유기체, 세포, 조직 또는 기관에 도입할 수 있는 어떠한 방법도 포함한다. 이러한 방법에는 주입에 의한 직접적 DNA 전달(각각 본원에서 참조문헌으로 인용된 미국 특허 제5,994,624호, 제5,981,274호, 제5,945,100호, 제5,780,448호, 제5,736,524호, 제5,702,932호, 제5,656,610호, 제5,589,466호 및 제5,580,859호), 미세주입(본원에서 참조문헌으로 인용된 미국 특허 제5,789,215호; Harlan 및 Weintraub), 전기천공(본원에서 참조문헌으로 인용된 미국 특허 제5,384,253호), 인산칼슘 침전법(Graham 및 Van Der Eb, 1973; Chen 및 Okayama, 1987, Rippe et al., 1990), DEAE-덱스트란 실시후 폴리에틸렌 글리콜 사용(Gopal, 1985), 직접 음파 부하(Fechheimer et al., 1987), 리포좀 매개 형질감염(Nicolau 및 sene, 1982, Fraley et al., 1979; Nicolau et al., 1987; Wong et al., 1980; Kaneda et al., 1989; Kato et al., 1991), 미세추진 충격(본원에서 참조문헌으로 인용된 PCT 특허원 제WO 94/09699호 및 제95/06128호, 미국 특허제5,610,042호, 제5,322,783호, 제5,563,055호, 제5,550,318호, 제5,538,877호 및 제5,538,880호), 실리콘 카바이드 섬유를 이용한 교반(본원에서 참조문헌으로 인용된 미국 특허 제5,302,523호 및 제5,464,765호; Kaeppler et al., 1990), 아그로박테리아 매개된 형질전환(본원에서 참조문헌으로 인용된 미국 특허 제5,591,616호 및 제5,563,055호), 원형질의 PEG 매개된 형질전환(본원에서 참조문헌으로 인용된 미국 특허 제4,684,611호 및 제4,952,500호; Omirulleh et al., 1993), 건조/억제 매개된 DNA 획득(Potrykus et al., 1985) 등이 포함되지만 이로써 제한되지는 않는다.

III. 리보솜 불활성화 단백질

리보솜 억제 독소(RIT)는 진핵세포에서 단백질 합성의 유력한 억제제이다. 이러한 단백질의 효소 도메인은, 일단 세포내 구획으로 들어가면 리보솜을 촉매적으로 불활성화시킬 수 있는 세포독성 n-글리코시다제로서 작용한다. 이는 28srRNA중 4324번 위치의 아데닌의 n-글리코사이드 결합을 절단하며 이로 인해 신장인자의 결합 부위가 파괴되어 명백하게 리보솜이 비가역적으로 불활성화된다. 세균으로부터 분리된 RIT는 고등 식물에 많이 있다. 식물에서는 2가지 유형이 있다: 유형 I 독소는 리보솜 억제 활성을 갖는 단일 폴리펩타이드 쇄를 포함하며 유형 I 단백질이 디설파이드 결합에 의해 세포 결합 특성을 지닌 B 쇄에 연결되어 있는데 반해, 유형 II 독소는 A 쇄를 갖는다. 유형 I RIT 의 예에는 겔로닌, 도데칸드린, 트리코산틴, 트리코키린, 브리요딘, 미라빌리스 항바이러스 단백질, 보리 리보솜 불활성화 단백질(BRIP), 미국자리공 항바이러스 단백질(PAP), 사포린, 러핀 및 모모르딘이 있다. 유형 II 독소에는 리신 및 아브린이 포함된다. 독소는 본원에서 논의된 임의의 폴리펩타이드와 함께 융합 단백질로서 발현되거나 이에 결합될 수 있다. 또한 본 발명의 변형된 독소를 화학치료제 또는 표적 시약과 같은 소분자에 결합시킬 수도 있다.

A. 면역독

본 발명의 독소는 세포독성 치료제 성분으로 사용하기에 특히 적합하다. 이러한 세포독성 제제는 생체내에서 사용되어, 독소 성분의 제2 성분의 특이적 결합능이 표적인 특정 세포 유형을 선택적으로 제거할 수 있다. 세포독성 제제를 형성하기 위해 본 발명의 변형된 독소는 키메라 항체, CDR-이식 항체 및 항체 도메인/단편(예: Fab, Fab', F(ab').sub2, 단일쇄 항체 및 Fv 또는 단일쇄 가변 도메인)을 포함한 모노클로날 항체에 접합시킬 수 있다. 독소를 포함하는 면역접합체로는 면역독을 들 수 있다. 면역독은 면역접합체가 아닌 융합 단백질로 이루어질 수도 있다.

유전학적으로 조작되어 유리 시스테인 잔기를 포함하는, 모노클로날 항체에 접합된 변형 독소도 본 발명의 범주에 포함된다. 본 발명에서 유용한 Fab' 및 F(ab').sub2 단편의 예는 본원에서 참조문헌으로 인용된 제WO 89/00999호에 기술되어 있다.

또한 변형 독소는 사람화된 항체 또는 사람의 조작된 항체에 접합시키거나융합시킬 수 있다. 이러한 사람화된 항체는 마우스 항체 가변 영역으로부터 작제할 수 있다.

1. 항체 영역

면역글로불린 일족의 다양한 일원으로부터 유래한 영역이 본 발명에 포함된다. Fc 영역과 같은 주효인자 분자와 결합하는 항체 중화 영역 및 상보성 결정 영역(CDR)을 포함한 특이적 항체의 가변 영역 모두가 본 발명에 포함된다. 항체로부터의 항원 특이적 암호화 영역(IgG, IgM 또는 IgA의 가변 영역)은 항체 중화 영역 또는 상기한 치료 화합물중 하나와 혼합된 독소와 같은 다른 분자와 함께 사용할 수 있다.

또다른 양태에서, 한가지 유전자는 단일쇄 항체를 포함할 수 있다. 단일쇄 항체를 생산하는 방법은 당분야의 숙련가에게 익히 공지되어 있다. 이 방법의 대해서 숙련가는 참조문헌으로 인용된 미국 특허 제5,359,046호를 참조한다. 단일쇄 항체는 짧은 펩타이드 링커를 사용하여 중쇄 및 경쇄의 가변 영역을 함께 융합시킨 다음, 단일 분자상의 항원 결합 부위를 재구성함으로써 만든다.

항원 결합 또는 결합 특이성을 유의적으로 파괴하지 않으면서 15개 내지 25개 아미노산 펩타이드 또는 링커를 통해 한 가변 영역의 C-말단이 다른 도메인의 N-말단에 연결된 단일쇄 항체 가변 단편(single-chain antibody variable fragments; scFvs)이 개발되었다(참조문헌: Bedzyk et al., 1990; Chaudhary et al., 1990). 이러한 Fvs는 본래의 항체의 중쇄 및 경쇄에 존재하는 불변 영역(Fc)이 결핍되어 있다. 단일쇄 항체를 이용하는 면역독은 참조문헌으로 인용된 미국 특허 제6,099,842호에 상세하게 기술되어 있다.

종양유전자, 종양 관련 항원, 사이토킨, 성장인자, 호르몬, 효소, 전사인자 또는 수용체와 같은 여러가지 분자에 대한 항체가 고려될 수 있다. 또한 항체, 혈관형성인자(예: VEGF/VPF, βFGF 및 αFGF 등), 응고인자 및 혈관형성에 필요한 내피세포 항원(예: V3 인테그린)에 대해 표적화되고 분비된 항체가 고려될 수도 있다. 형질변형 성장인자, 섬유아세포 성장인자 및 혈소판 유래 성장인자(PDGF) 및 PDGF 일족과 같은 성장인자가 특별하게 고려될 수 있다.

본 발명은 항원 특이적 서열을 사용하여 특별한 병원체를 표적으로 하거나 세포를 확인하는 세포 표면 마커를 발현시켜 특이적 세포 유형을 표적으로 하는 조성물을 추가로 포함한다. 이러한 세포 표면 마커의 예에는 종양 관련 항원 또는 세포 유형 특이적 마커(예: CD4 또는 CD8)가 포함된다.

면역독의 일부로서 본 발명에서 사용되는 항체는 어떠한 항원도 표적으로 할 수 있다. 항원은 유기체, 세포 유형, 질병 또는 건강상태 또는 병원체에 대해 특이적일 수 있다. 항원의 예에는 세표 표면 단백질, 예를 들어 종양 관련 항원, 바이러스 단백질, 미생물 단백질, 전사후 변형체 또는 탄수화물 및 수용체가 포함된다. 통상의 종양 마커에는 발암배아 항원, 전립선 특이적 항원, 비뇨기 종양 관련 항원, 태아 항원, 티로시나제(p97), gp68, TAG-72, HMFG, 시아릴 루이스 항원(Sialyl Lewis Antigen), MucA, MucB, PLAP, 에스트로겐 수용체, 라미닌 수용체, erbB 및 p155이 포함된다. 표적이 될 수 있는 다른 항원에는 EGF 및 VEGF,TIE-1 및 -2, CD-33, CD38, CD-20, CD-52, GP-240, Lym-1, MMO-2 및 MMP-9에 대한 수용체가 포함된다.

B. 다른 표적 잔기

리간드-수용체 상호작용을 포함한 단백질-단백질 상호작용을 조정하는 단백질 영역의 사용이 본 발명에서도 고려된다. 이러한 영역은 단백질-단백질 상호작용의 억제제 또는 경쟁제로서 사용되거나 특이적 표적 모티프로서 사용될 수 있다. 결과적으로, 본 발명은 독소, 또는 특정 신체 일부, 기관, 조직 또는 세포에 대한 치료 또는 진단 폴리펩타이드를 수집하기 위해 표적 잔기를 사용함을 포함한다. 본 발명의 조성물이 표적 모티프를 통해 특정 지역에 도달하면 독소 또는 다른 폴리펩타이드가 작용할 수 있다.

표적 잔기는 단백질-단백질 상호작용을 이용할 수 있다. 여기에는 수용체와 리간드, 수용체와 수용체, 중합체성 복합체, 전사인자, 키나제와 하부스트림 표적, 효소와 기질간의 상호작용과 같은 단백질간 상호작용이 포함된다. 예를 들어, 리간드 결합 도메인은 리간드와 이의 동족 수용체간의 단백질:단백질 상호작용을 조절다. 결과적으로 이러한 도메인은 내인성 리간드 결합을 억제하거나 이와 경쟁하는데 사용되거나, 또는 겔로닌 독소와 같은 치료 폴리펩타이드에 작용가능하게 결합된 리간드 결합 도메인을 인지할 수 있는 수용체를 발현하는 세포 유형을 보다 특이적으로 표적화하는데 사용될 수 있다.

리간드 결합 도메인의 예에는 VEGF/VPF, βFGF, αFGF, 응고인자, 및 혈관형성에 필요한 내피세포 항원(예: V3 인테그린)과 같은 리간드; 형질전환 성장인자, 섬유아세포 성장인자, 콜로니 자극인자, KIT 리간드(KL), flk-2/flk-3 및 혈소판 유래 성장인자(PDFG), 및 PDGF 일족과 같은 성장인자; MHC 분자와 같은 세포 표면 수용체에 결합하는 리간드가 포함된다.

가장 특징적인 리간드는 아시알로오로소뮤코이드(ASOR)(참조문헌: Wu 및 Wu, 1987) 및 트랜스페린(참조문헌: Wagner et al., 1990)이다. 최근 ASOR과 동일한 수용체를 인지하는 합성 당신생단백질이 유전자 전달 비히클로 사용되며(참조문헌: Ferkol et al., 1993; Perales et al., 1994), 내피 성장인자(EFG)도 유전자를 판상 암종세포로 전달하는데 사용될 수 있다(참조문헌: Myers, EPO 제0273085호).

다른 양태에서는 락토실-세라마이드를 사용하는데(참조문헌: Nicolau et al., 1987), 갈락토스-말단 아시알강글리오사이드를 리포좀으로 도입하면 간세포에 의한 인슐린 유전자 흡수가 증가되는 것이 관찰되었다. 또한 사람 전립선 특이적 항원(참조문헌: Watt et al., 1986)을 전립선 조직 전달용 수용체로서 사용할 수 있다.

추가 양태에서는, 표면에 특정 탄수화물기를 발현하는 세포에 대해 화합물을 표적화하는데 레시틴 분자를 사용할 수 있다.

1. 사이토킨

독소와 같은 치료 폴리펩타이드에 작동가능하게 연결시킬 수 있는 다른 화합물 부류에는 인터류킨 및 사이토킨이 포함되는데, 예를 들어 인터류킨 1(IL-1),IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, β-인터페론, α-인터페론, γ-인터페론, 안지오스타틴, 트롬보스포딘, 엔도스타틴, METH-1, METH-2, Flk2/Flt3 리간드, GM-CSF, G-CSF, M-CSF 및 종양 괴사인자(TNF)가 있다.

2. 성장인자

본 발명의 다른 양태에서, 성장인자 또는 리간드를 치료제와 복합시킬 수 있다. 성장인자의 예에는 VEGF/VPF, FGF, TGFβ, TIE와 결합하는 리간드, 종양 관련 피브로넥틴 이소형, 분산인자, 간세포 성장인자, 섬유아세포 성장인자, 혈소판인자(PF4), PDGF, KIT 리간드(KL), 콜로니 자극인자(CSF) 및 TIMP가 포함된다.

3. 세포내 증식 유도인자

변형된 겔로닌 독소와 같은 본 발명의 변형된 단백질과 함께 사용할 수 있는 또다른 그룹의 단백질에는 세포내 증식을 유도하는 단백질이 포함된다. 몇몇 양태에서, 독소를 리보자임에 작동가능하게 연결하여 세포내 증식 유도인자를 불활성화시킬 수 있지만, 다르게는 독소를 유도인자 자체에 연결시킬 수도 있다. 또한 세포 증식 유도인자를 인지하는 항체에 독소를 결합시킬 수도 있다.

이러한 단백질 모두의 공통점은 세포내 증식을 조절하는 능력이다. 예를 들어, sis 종양유전자인 PDGF형은 분비 성장인자이다. 종양유전자는 성장인자를 암호화하는 유전자로부터는 좀처럼 생성되지 않으며 현재 sis만이 공지된 천연 종양형성 성장인자이다. 본 발명의 한가지 양태에서는, 세포 증식의 특정 유도인자에 대해 지시된 안티센스 mRNA를 사용하여 세포 증식 유도인자의 발현을 억제하는 것을 고려할 수 있다.

단백질 FMS, ErbA, ErbB 및 neu는 성장인자 수용체이다. 이들 수용체에 돌연변이가 일어나면 조절 기능이 상실된다. 예를 들어 Neu 수용체 단백질의 막통과 도메인에 영향을 미치는 점돌연변이가 neu 종양유전자에서 일어난다. erbA 종양유전자는 갑상선 호르몬에 대한 세포내 수용체로부터 유래한 것이다. 변형된 종양형성 ErbA 수용체는 내인성 갑성선 호르몬 수용체와 경쟁하여 비조절된 성장을 일으키는 것으로 여겨지고 있다.

가장 큰 부류의 종양형성 유전자에는 시그날 유도 단백질(예: Src, Abl 및 Ras)이 포함된다. 단백질 Src는 세포질 단백질-티로신 키나제로, 몇몇 경우에 있어서는 티로신 잔기 527번에서 돌연변이가 일어나 원종양유전자에서 종양유전자로 변형된다. 이와는 반대로 서열중 12번 아미노산에서 발린이 글라이신으로 돌연변이되면 GTPase 단백질 ras가 원종양유전자에서 종양유전자로 변형되어 GTPase 활성을 감소시킨다.

단백질 Jun, Fos 및 Myc는 전사인자로서 핵내 기능에 직접 작용하는 단백질이다.

4. 세포 증식 억제인자

종양 억제인자는 과도한 세포 증식을 억제하는 기능을 한다. 이러한 유전자의 불활성화는 이의 억제 활성을 파괴하여 증식을 조절하지 못하게 된다. 돌연변이 종양 억제인자 또는 야생형 종양 억제인자를 인지하는 항체에 독소를 결합시킬 수도 있다. 또한 종양 억제인자의 전부 또는 일부에 독소를 결합시킬 수도 있다. 종양 억제인자 p53, p16 및 C-CAM은 하기하는 바와 같다.

고수준의 돌연변이 p53은 화학적 발암, 자외선 방사 및 몇몇 바이러스에 의해 형질전환된 다수의 세포에서 발견된다. p53 유전자는 여러가지 사람 종양에서 돌연변이성 불활성의 빈번한 표적이 되는데, 이는 통상의 암에서 가장 빈번하게 돌연변이되는 유전자인 것으로 이미 밝혀져있다. 50% 이상의 사람 NSCLC(참조문헌: Hollstein et al., 1991)와 다양한 다른 종양에서 p53의 돌연변이가 일어난다.

p53 유전자는 거대 T 항원 및 E1B와 같은 숙주 단백질과 복합체를 형성할 수 있는 393개 아미노산의 인단백질을 암호화한다. 이 단백질은 정상 조직 및 세포에서도 발견되지만 형질전환 세포 또는 종양 조직과 비교시 그 양이 매우 적다.

야생형 p53은 여러가지 세포 유형에서 중요한 성장 조절인자로서 알려져있다. p53에 있어서는 미스센스 돌연변이가 빈번하며 이는 종양유전자의 형질전환능에 있어 필수적이다. 점돌연변이에 의한 단일 유전자 변화는 발암성 p53을 만들 수 있다. 그러나 다른 종양유전자와 달리, p53 점돌연변이는 30개 이상의 별개의 코돈에서 일어나며, 동형접합성을 감소시키지 않으면서 세포 표면형을 변화시키는 우세 대립형질을 만드는 것으로 공지되어 있다. 또한 유기체에서는 이러한 우세 음성 대립형질의 다수가 허용되며 배선을 통과한다. 여러가지 돌연변이 대립형질은 최소의 기능부전에서 침투성이 강한 우세 음성 대립형질까지 다양하게 나타난다(참조문헌: Weinberg, 1991).

또다른 세포 증식 억제인자는 p16이다. 진핵세포 주기의 주된 변화는 사이클린 의존적인 키나제(CDK)에 의해 유발된다. CDK중 하나인 사이클린 의존적인 키나제 4(CDK4)는 G₁을 통해 진행을 조절한다. 이 효소의 활성은 레이트 G₁에서 Rb를 인산화시킬 수 있다. CDK4의 활성은 활성화 아단위인 D-유형 사이클린 및 억제 아단위에 의해 조절되며, p16^INK4는 생화학적으로는 CDK4와 특이적으로 결합하여 이를 억제함으로써 Rb 인산화를 조절할 수 있는 단백질이다(참조문헌: Serrano et al., 1993; Serrano et al., 1995). p16^INK4단백질은 CDK4 억제인자(참조문헌: Serrano, 1993)로 이 유전자가 결실되면 CDK4의 활성이 증가되어 Rb 단백질이 과인산화된다. p16은 CDK6의 기능을 조절하는 것으로도 공지되어 있다.

p16^INK4은 새로 기술된 CDK 억제 단백질의 부류에 포함되는데 여기에는 또한 p16^B, p19 및 p27^KIP1이 포함된다. p16^INK4유전자는 다수의 종양형에서 빈번하게 염색체 영역이 결실된 9p21에 대해 유전자 지도가 작성되었다. p16^INK4유전자의 동형 결실 및 돌연변이는 사람 종양 세포주에서 빈번하다. 이러한 사실은 p16^INK4유전자가 종양 억제인자 유전자임을 시사한다. 그러나, 배양된 세포주보다 비배양된 1차 종양에서 p16^INK4유전자의 빈번한 변화가 훨씬 적다는 관찰에 의해 상기한 해석에이의가 제기되었다(참조문헌: Caldas et al., 1994; Cheng et al., 1994; Hussussian et al., 1994; Kamb et al., 1994; Kamb et al., 1994; Mori et al., 1994; Okamoto et al., 1994; Nobori et al., 1995; Orlow et al., 1994; Arap et al., 1995). 플라스미드 발현 벡터를 이용한 형질전혼에 의해 야생형 p16^INK4기능을 복구하면 몇몇 사람 암세포주에서 콜로니 형성이 감소되었다(참조문헌: Okamoto et al., 1994; Arap, 1995).

본 발명에 따라 다른 유전자를 사용할 수도 있는데, 여기에는 Rb, APC, mda-7, DCC, NF-1, NF-2, WT-1, MEN-1, MEN-II, zacl, p73, VHL, MMAC1/PTEN, DBCCR-1, FCC, rsk-3, p27, p27/p16 융합체, p21/p27 융합체, 항혈전증 유전자(예: COX-1, TEPI), PGS, Dp, E2F, ras, myc, neu, raf, erb, fms, trk, ret, hst, abl, E1A, p300, 혈관신생에 수반되는 유전자(예: VEGF, FGF, 트롬보스포딘, BAI-1, GDAIF 또는 이의 수용체) 및 MCC가 포함된다.

5. 프로그램된 세포사의 조절인자

세포소멸 또는 프로그램된 세포사는 정상적인 배발생에서 필수적인 과정으로 성숙한 조직에서 항상성을 유지하며 발암을 억제한다(참조문헌: Kerr et al., 1972). 단백질의 Bcl-2 일족 및 ICE 유사 프로테아제는 다른 시스템에서 세포소멸의 중요한 조절자 및 주효인자인것으로 입증되었다. 여포성 림프종과 관련되어 발견된 Bcl-2 단백질은 세포소멸을 조절하는데 중요한 역할을 하며, 다양한 세포소멸자극에 반응하여 세포 생존을 향상시킨다(참조문헌: Bakhshi et al., 1985; Cleary 및 Sclar, 1985; Cleary et al., 1986; Tsujimoto et al., 1985; Tsujimoto 및 Croce, 1986). 진화적으로 불변인 Bcl-2 단백질은 세포사 효능인자 또는 세포사 길항인자로서 분류된 관련 단백질 일족인 것으로 최근 알려졌다.

Apo2 리간드(Apo2L은 TRAIL로도 불린다)는 종양 괴사인자(TNF) 사이토킨 일족의 일원이다. TRAIL은 다수의 암세포 유형에서 신속한 세포소멸을 활성화하지만 정상 세포에서는 독성을 나타내지 않는다. TRAIL mRNA는 다양한 조직에 존재하다. 가장 정상적인 세포는 TRAIL의 세포독성 작용에 대해 내성을 나타내는데, 이는 TRAIL에 의한 세포소멸 유도로부터 보호할 수 있는 작용기전이 존재한다는 것을 시사한다. TRAIL에서 기술한 첫번째 수용체인 세포사 수용체 4(DR4)는 세포질 "세포사" 도메인을 포함하며, DR4는 TRAIL에 의해 운반되는 세포소멸 시그날을 전달한다. DR5로 불리는 한 수용체는 세포질 세포사 도메인을 포함하며 DR4와 매우 유사하게 세포소멸 시그날을 전달한다. DR4 및 DR5 mRNA는 다수의 정상 세포 및 종양 세포주에서 발현된다. 최근 DcR1 및 DcR2와 같은 유인 수용체가 DR4 및 DR5를 통한 세포소멸 유도로부터 TRAIL을 보호하는 것으로 확인되었다. 따라서 이러한 유인 수용체는 세포 표면에서 세포소멸전 사이토킨에 대한 감수성을 직접 조절하는 신규한 작용기전을 나타난다. 정상 조직에서 이러한 억제 수용체의 우선 발현은, TRAIL이 정상 세포에 영향을 미치지 않으면서 암세포에서 세포소멸을 유발하는 항암제로서 유용할 수 있음을 제시한다(참조문헌: Marsters et al. 1999).

이에 후속하여 Bcl-2는 다양한 자극에 의해 유발된 세포사를 억제하는 작용이 있는 것으로 밝혀졌다. 또한 이는 공통적인 구조 및 서열 동종성을 가진 Bcl-2 세포사 조절 단백질 일족인 것이 명백하다. 이러한 상이한 일족의 일원은 Bcl-2와 유사한 기능을 갖거나(예: Bcl_XL, Bcl_W, Bcl_S, Mcl-1, Al, Bfl-1) Bcl-2 작용을 중화하여 세포사를 촉진하는 것으로 나타났다(예: Bax, Bak, Bik, Bim, Bid, Bad, Harakiri). TRAIL을 포함한 상기한 폴리펩타이드, 또는 세포소멸을 유도하거나 촉진하는 다른 폴리펩타이드중 어떤 것도 독소에 작동가능하게 연결할 수 있으며, 상기한 폴리펩타이드를 인지하는 항체를 독소에 결합시킬 수도 있다.

IV. 변형된 단백질의 제조방법 및 독소 디자인방법

본 발명은 단백질상에서 항원 영역을 확인하는 방법, 항원성이 적은 영역을 확인하는 방법, 본래의 단백질에 상당하는 활성을 지닌, 항원성이 낮은 단백질을 제조하는 방법, 및 항원성과 활성을 분석하고 측정하는 방법을 포함한다.

A. 항원 영역

항체 및 항체 검출방법의 일반적인 논의는 상기한 바와 같다. 용어 "항원 영역"은 항체 또는 T 세포 수용체에 의해 특이적으로 인지되는 단백질 부분을 의미한다. 용어 "항원성이 낮은"은 항체 반응이 적거나 소수의 항체(폴리클로날)에 의해 인지되거나 또는 항체 관련 결합이 감소된 단백질 또는 단백질 영역을 의미한다.

항원성은 특정 유기체와 관련되어 있다. 본 발명의 다수 양태에서, 유기체는 사람이지만, 또한 예를 들어 원숭이, 고릴라, 소, 토끼, 마우스, 양, 고양이, 개, 돼지, 염소 등과 같은 포유류뿐만 아니라 조류 및 면역 반응을 일으킬 수 있는 다른 유기체애 관해서도 항원성을 논의할 수 있다.

본 발명의 몇몇 양태에서는 특정 단백질중 항원 영역을 확인하기 위해 상기에서 논의한 면역검출법과 함께 폴리클로날 혈청을 사용할 수 있다. 폴리클로날 혈청은 직업상 특정 단백질에 노출된 것으로 의심되는 근로자, 특정 단백질 또는 유기체에 대한 항체에 의해 유발되거나 수반되는 건강상태 또는 질환으로써 진단되거나 의심되는 환자, 특정 단백질 또는 유기체에 대한 항체에 수반되는 건강상태 또는 질환으로 인해 더 이상 치료받지 않는 환자 및 무작위적 피검체를 포함한 다양한 공급원으로부터 수집할 수 있다.

B. 데이타베이스

본 발명의 몇몇 방법에서는 특정 단백질내에서 추정되는 항원 영역을 확인한 다음, 단백질 데이타베이스를 사용한다. 상기한 영역은, 본 영역에 대한 면역반응이 낮은 유기체의 단백질 서열을 포함한 데이타베이스와 비교한다. 이러한 데이타베이스 다수는 GenBank, GenPept, SwissProt, PIR, PRF, PDB를 포함하여 상업적 및 공적으로 존재하며, 이들 모두는 다음 웹사이트에서 찾을 수 있다(National Center for Biotechnology Information: http://www.ncbi.nlm.njh.gov/).

C. 항원 영역 제거 및/또는 대체

일단 항원 영역을 확인하면 이를 제거하여 절단(truncated) 단백질을 만들 수 있다. 또한 항원성이 적은 영역으로 이를 대체할 수도 있다.

항원 영역을 제거하기 위해 폴리펩타이드를 프로테이나제로 분해하거나, 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 조작하여 항원 영역을 제거할 수 있다. 통상의 재조합 DNA 기술, 예를 들어 제한 효소 또는 DNAse를 사용하여 폴리뉴클레오타이드로부터 영역을 제거할 수도 있다.

항원 영역은 치환된 아미노산으로 대체할 수도 있다. "대체"는 특정 위치의 아미노산이 상이한 아미노산 잔기 또는 변형된 아미노산으로 치환됨을 의미한다. 이는 여러가지 방법으로 수행할 수 있다. 먼저 항원 영역을 제거한 다음 대체 영역을 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드에 도입할 수 있다. 재조합 DNA 기술을 사용하여 특정 암호화 영역을 폴리뉴클레오타이드로 혼입시킬 수 있다. 또한 당분야의 숙련가에게 익히 공지된 부위 특이적 돌연변이 기술을 사용하여 항원 영역에 돌연변이를 일으킬 수 있다.

항원 영역 양측면에 위치한 아미노산을 제거하거나 대체하여 변형 단백질 생성을 촉진하거나, 항원성 감소, 단백질 안정성 증가, 단백질 활성 증가, 단백질 활성 감소 등과 같은 여러 방식으로 단백질을 개선할 수 있다. 또한 다중 아미노산을 항원 영역, 측면 영역 또는 둘다로부터 제거하거나 대체할 수 있다. 따라서 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개, 25개, 26개, 27개,28개, 29개, 30개, 31개, 32개, 33개, 34개, 35개, 36개, 37개, 38개, 39개, 40개, 41개, 42개, 43개, 44개, 45개, 46개, 47개, 48개, 49개, 50개, 51개, 52개, 53개, 54개, 55개, 56개, 57개, 58개, 59개, 60개, 61개, 62개, 63개, 64개, 65개, 66개, 67개, 68개, 69개, 70개, 71개, 72개, 73개, 74개, 75개, 76개, 77개, 78개, 79개, 80개, 81개, 82개, 83개, 84개, 85개, 86개, 87개, 88개, 89개, 90개, 91개, 92개, 93개, 94개, 95개, 96개, 97개, 98개, 99개, 100개, 105개, 110개, 115개, 120개, 125개, 130개, 135개, 140개, 145개, 150개, 155개, 160개, 165개, 170개, 175개, 180개, 185개, 190개, 195개, 200개, 210개, 220개, 230개, 240개, 250개, 260개, 270개, 280개, 290개, 300개, 310개, 320개, 330개, 340개, 350개, 360개, 370개, 380개, 390개, 400개, 410개, 420개, 430개, 440개, 450개, 460개, 470개, 480개, 490개, 500개, 510개, 520개, 530개, 540개, 550개, 560개, 570개, 580개, 590개, 600개, 620개, 640개, 660개, 680개, 700개, 720개, 740개, 760개, 780개, 800개, 820개, 840개, 860개, 880개, 900개, 920개, 940개, 960개, 980개, 1000개 또는 그 이상의 아미노산을 제거하거나 대체할 수 있다.

변형 단백질의 항원성 또는 활성을 측정하는 분석법은, 예를 들어 면역검출 방법을 설명한 부분에서 기술한 바와 같거나 당분야의 숙련가에게 익히 공지된 바와 같다. 특정 단백질의 적절한 분석은 단백질에 따라 다양하다. 예를 들어, 효소 분석은 본래의 단백질에 대한 변형 단백질의 활성을 평가하는데 적절하다. 상기한 바와 같이, 변형 단백질은 다른 폴리펩타이드, 펩타이드 또는 단백질에 결합(접합 또는 융합)시킬 수 있다. 당분야의 숙련가라면 폴리펩타이드 성분의 활성에따라 본 발명의 변형된 접합 단백질 또는 융합 단백질을 평가할 수 있을 것이다.

V. 병행 치료

본 발명의 치료 조성물의 효능을 증가시키기 위해서는, 특징 질환 또는 건강상태의 치료에 유효한 다른 제제와 본 조성물을 병행하는 것이 바람직할 수 있다. 미세물 병인, AIDS, 자가면역 질환, 암을 포함한 과증식성 질환, 백혈병, 관절염, 염증 질환, 심혈관 질환 및 건강상태, 병원성 질환 및 건강상태 및 당뇨병과 같은 다양한 질환 또는 건강상태를 치료하는 것이 고려될 수 있다. 상세하게는 AIDS, 암 및 다른 과증식성 질환을 고려할 수 있다. 여러가지 치료제를 병행하여 사용할 수 있다: 변형 단백질을 포함한 조성물이 "A"라면 두번째 조성물은 "B"이다 - A/B/A B/A/B B/B/A A/A/B A/B/B B/A/A A/B/B/B B/A/B/B B/B/B/A B/B/A/B A/A/B/B A/B/A/B A/B/B/A B/B/A/A B/A/B/A B/A/A/B A/A/A/B B/A/A/A A/B/A/A A/A/B/A.

A. 과증식성 질환의 치료

과증식성 질환에는 암이 포함되는데, 암의 경우 항암제 또는 수술과 같은 다양한 치료방법이 있다. "항암제"는, 예를 들어 암세포 사멸, 암세포에서의 세포소멸 유도, 암세포의 성장률 감소, 전이 발생 및 전이 횟수 감소, 종양 크기 감소, 종양 성장 억제, 종양 또는 암세포의 혈액 공급 감소, 암세포 또는 종양에 대한 면역 반응 개시, 암의 진행 방지 또는 억제, 또는 암이 있는 피검체의 수명 연장에 의해 개개인의 암에 부정적인 영향을 미칠 수 있다.

항암제에는 생물학적 제제(생물치료제), 화학치료제 및 방사능치료제가 포함된다. 보다 일반적으로 이러한 조성물은 세포를 사멸시키거나 증식을 억제하는 혼합량으로 제공된다. 상기한 방법은 발현 작제물 및 이와 동시에 제제 또는 다중 인자를 세포와 접촉시킴을 포함할 수 있다. 이는 상기한 제제 모두를 포함한 단일 조성물 또는 약리학적 제형을 세포와 접촉시키거나, 이와 동시에 별개의 2가지 조성물 또는 제형을 세포와 접촉시킴으로써 실시할 수 있다(이때 한 조성물은 발현 작제물을 포함하고 다른 조성물은 두번째 제제를 포함한다).

화학치료제 및 방사능 치료제에 대해 내성이 있는 종양 세포는 임상 종양학에서 중요한 문제이다. 현재 암 연구의 한가지 목적은 유전자 치료와 병행하여 화학치료 및 방사능치료의 효능을 개선시키는 방법을 개발하는 것이다. 예를 들어, 레트로바이러스 벡터 시스템에 의해 헤르페스 심플렉스 티미딘 키나제(HS-tK) 유전자를 뇌종양에 도입하면, 항바이러스제 간시클로비르에 대한 감수성이 성공적으로 유도된다(참조문헌: Culver et al., 1992). 본 발명에서는 전세포소멸 제제 또는 세포주기 조절제 외에 화학치료, 방사능치료, 면역치료 또는 다른 생물학적 방법과 병행하여 변형된 단백질을 이용하는 치료법이 고려될 수 있다.

또한 유전자 치료 또는 변형 단백질의 단백질 투여를 진행하거나, 수분 내지 수주의 간격으로 다른 제제로 치료를 실시할 수 있다. 다른 제제 및 발현 작제물이 세포에 개별적으로 적용되는 양태에서는, 일반적으로 각각의 제제를 전달하는 시간 사이에 유효 기간을 놓치치 않아 제제 및 발현 작제물이 세포상에서 병행 효과를 유리하게 발휘할 수 있도록 해야한다. 이러한 경우에서는, 각각 약 12 내지24시간내, 바람직하게는 약 6 내지 12시간내에 두가지 형태의 제제를 세포와 접촉시키는 것이 고려된다. 그러나 몇몇 상황에서는 각각의 투여 사이에 간격(2일, 3일, 4일, 5일, 6일 또는 7일) 내지 수주(1주, 2주, 3주, 4주, 5주, 6주, 7주 또는 8주)을 두어 치료 기간을 연장시키는 것이 바람직할 수 있다

본 발명의 치료적 발현 작제물을 환자에 투여하는 것은, 발생할지도 모를 벡터의 독성을 고려하여 화학치료제의 투여에 관한 일반적인 프로토콜에 따른다. 경우에 따라 치료 주기가 반복될 수도 있다. 또한 다양한 표준 치료법뿐만 아니라 외과 수술을 상기한 과증식성 세포 치료와 병행하여 적용하는 것을 고려할 수도 있다.

a. 화학치료

암 치료법에는 화합물 기본 및 방사선 기본의 치료법 모두와 병행되는 다양한 치료법이 포함된다. 병행 화학치료제에는, 예를 들어 시스플라틴(CDDP), 카보플라틴, 프로카바진, 메클로레타민, 사이클로포스파미드, 캄프토테신, 이포스파미드, 멜팔란, 클로람부실, 부술판, 니트로스우레아, 닥티노마이신, 다우노푸비신, 독소루비신, 블레오마이신, 필리코마이신, 마이토마이신, 에토포사이드(VP16), 카목시펜, 랄록시펜, 에스트로겐 수용체 결합 제제, 탁솔, 젬시타비엔, 나벨바인, 파르네실-단백질 트랜스퍼라제 억제제, 트랜스팔라티늄, 5-플루오로우라실, 빈크리스틴, 빈블라스틴 및 메토트렉세이트, 테마졸로마이드(DTIC의 수용액 형태) 또는 상기한 화합물의 여러가지 유사체 또는 유도체가 포함된다. 화학치료제를 생물치료제와 병행한 것은 생화학치료제로 공지되어 있다.

본 발명의 몇몇 앵태에서는 화학치료제가 독소 분자와 같은 변형된 단백질에 작동가능하게 결합시키는 것이 고려된다.

b. 방사능치료

DNA 손상을 유발하고 광범위하게 사용되는 다른 인자에는 γ-선, X-선 및/또는 종양 세포에 대한 방사능동위원소의 직접 전달로 공지된 방법이 포함된다. 극초단파 및 UV-방사와 같은 다른 형태의 DNA 손상 인자를 고려할 수도 있다. 이러한 이자 모두는 DNA, DNA 전구체, DNA 복제 및 복구, 염색체 회합 및 유지에 광범위한 손상을 일으킬 수 있다. X-선 용량 범위는 장기간(3주 내지 4주)인 경우 1일 50 내지 200뢴트겐에서 단일 사용시 2000 내지 6000뢴트겐으로 다양하다. 방사성동위원소의 용량 범위는 다양하며 동위원소의 반감기, 방출되는 방사능의 강도 및 유형, 및 신생 세포에 의해 흡수되는 정도에 따라 다르다.

용어 "접촉" 및 "노출"은, 세포에 적용하는 경우 치료 작제물 및 화학치료제 또는 방사능치료제를 표적 세포에 전달하거나 표적 세포와 직접 병치되도록 위치시키는 과정을 기술하는데 사용된다. 세포사 또는 세포 정지를 실시하기 위해, 상기한 제제 모두는 세포를 죽이거나 세포 분열을 방지하는데 유효한 혼합량으로 세포에 전달한다.

c. 면역치료

일반적으로 면역치료는 면역 주효인자 세포, 및 암세포에 대해 표적화되어 이를 파괴하는 분자를 사용한다. 면역 주효인자는, 예를 들어 종양 세포 표면상의 몇몇 마커에 대해 특이적인 항체일 수 있다. 항체는 치료의 주효인자로서 단독으로 사용되거나 다른 세포를 소집하여 세포사에 실질적인 영향을 미친다. 본 발명에서 청구한 조성물과 관련하여 상기 논의한 바와 같이, 항체는 약물 또는 독소(화학치료제, 방사성핵종, 리신 A 쇄, 콜레라 독소, 백일해 독소 등)와 접합시킬 수 있으며 표적제로만 작용한다. 또한 주효인자는 종양 세포 표적과 직접 또는 간접적으로 상호작용하는 표면 분자를 운반하는 림프세포일 수 있다. 다양한 주효인자 세포에는 세포독성 T 세포 및 NK 세포가 포함된다. 치료법의 병행, 즉 직접적인 세포독성 활성 및 면역 활성은 암치료에 있어 유리한 치료 잇점을 제공할 수 있으므로 본 발명의 치료 조성물과 병행하여 면역치료제를 사용할 수 있다. 예를 들어, 암과 같은 질환 치료시 두가지 상이한 면역독을 피검체에 투여하거나 면역 독소를 다른 면역치료 혼합물과 병행하여 투여할 수 있다.

면역치료의 한가지 양태에서, 종양 세포는 다수의 다른 세포에는 존재하는 않는, 표적임을 표시하는 몇몇 마커를 포함해야만 한다. 다수의 종양 마커가 존재하며 상기한 바와 같이 이들중 어떤 것도 본 발명의 표적화에 적합할 수 있다. 면역치료의 다른 양태는 전세포소멸 효과와 면역 자극 효과를 병행하는 것이다. 그러나 사이토킨(예: IL-2, IL-4, IL-12, GM-CSF, γ-IFN), 케모킨(예: MIP-1, MCP-2, IL-8) 및 성장인자(FLT3 리간드)를 포함한 다른 면역 자극 분자도 있다. 단백질로서 면역 자극 분자와 혼합하거나 또는 종양에 대한 면역독과 병행한 유전자 전달을 이용하여 항종양 효과를 향상시킬 수 있다.

상기 논의한 바와 같이, 현재 사용중이거나 조사중인 면역치료의 예로는 면역 아쥬반트(예: 마이코박테리움 보비스, 플라스모디움 팔시파룸, 디니트로클로로벤젠 및 방향족 화합물; 참조문헌: 미국 특허 제5,801,005호, 미국 특허 제5,739,169호, Hui 및 Hashimoto, 1998; Christodoulides et al., 1998), 사이토킨 치료(예: 인터페론 α,β 및 γ, IL-1, GM-CSF 및 TNF; 참조문헌: Bukowski et al., 1998, Davidson et al., 1998, Hellstard et al., 1998), 유전자 치료(예: TNF, IL-1, IL-2, p53; 참조문헌: Qin et al., 1998, Austin-Ward 및 Villaseca, 1998, 미국 특허 제5,830,880 및 미국 특허 제5,846,945호) 및 모노클로날 항체(예: 항강글리오사이드 GM2, 항-HER-2, 항-p185; 참조문헌: Pietras et al., 1998, Hanibuchi et al., 1998, 미국 특허 제5,824,311호)가 있다. 헤르셉틴(trastuzumab)은 HER-2neu 수용체를 차단하는 키메라(마우스-사람) 모노클로날 항체이다. 이는 항종양 활성을 지니며 악성 종양 치료에서의 사용이 승인되었다(참조문헌: Dillman, 1999)

i. 수동성 면역치료

암의 수동성 면역치료를 위한 여러가지 방법들이 있다. 이는 광범위하게는 다음과 같이 분류된다: 항체 단독 주사; 독소 또는 화학치료제와 커플링된 항체 주사; 방사능동위원소에 커플링된 항체 주사; 항-유전자형 항체 주사; 및 최종적으로 골수중 종양 세포 제거.

바람직하게는, 수동성 면역치료에는 부작용이 없거나 적은 사람 모노클로날 항체를 사용한다. 그러나, 항체의 양이 적어서 적용에 다소 한계가 있어 지금까지는 병소에만 투여하였다. 강글리오사이드 항원에 대한 사람 모노클로날 항체는 피부 재발성 흑색종 환자의 병소에 투여한다(참조문헌: Ire & Moron, 1986). 매일 또는 주마다 병소내로 주사시 10명의 환자중 6명에서 흑색종의 퇴화가 관찰되었다. 또다른 연구에서는 2가지 사람 모노클로날 항체를 병소내로 주사시 적절한 성공 결과를 얻을 수 있었다(참조문헌: Irie et al., 1989).

2가지의 상이한 항원에 대해 하나 이상의 모노클로날 항체, 또는 다중 항원 특이성이 있는 항체를 투여하는 것이 바람직하다. 치료 프로토콜에는 림포킨 또는 다른 면역 증강제의 투여가 포함될 수도 있다(참조문헌: Bajorin et al., 1988). 사람 모노클로날 항체의 개발은 본 명세서의 다른 부분에 보다 상세히 기술되어 있다.

ii. 능동성 면역치료

능동성 면역치료에서는 별개의 세균성 아쥬반트와 함께 항원 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질, 또는 자가조직 또는 동종 종양 세포 조성물 또는 백신을 투여한다(참조문헌: Ravindranath & Morton, 1991; Morton & Ravindranath, 1996; Morton et al., 1992; Mitchell et al., 1990; Mitchell et al., 1993). 흑생종 면역치료에서 IgM 반응이 높은 환자는 종종 IgM 항체가 없거나 적은 환자보다 생존률이 높다(참조문헌: Morton et al., 1992). IgM 항체는 항-강글리오사이드 또는항탄수화물 항체이지만 예외적으로 종종 일시적인 항체로 나타난다.

iii. 양자 면역치료

양자 면역치료에서는, 환자의 순환 림프세포 또는 종양 침윤 림프세포를 시험관내에서 분리하고 IL-2와 같은 림포킨으로 활성화시키거나 종양 괴사 유전자로 형질전환시켜 재투여한다(참조문헌; Rosengberg et al., 1988, 1989). 이를 실시하기 위해 상기한 바와 같은 아쥬반트가 혼합된 항원 펩타이드 조성물과 병행하여 활성화 림프세포의 면역학적 유효량을 동물 또는 사람 환자에게 투여한다. 활성화 림프세포는 혈액 또는 종양 샘플로부터 분리한 다음 시험관내에서 활성화(또는 "확장")시킨 환자 자신의 세포가 가장 바람직하다. 이러한 면역치료 형태는 몇몇 흑색종 및 신장암의 퇴화를 일으키지만 반응률은 비반응률에 비해 낮다.

d. 유전자

또다른 양태에서, 2차 치료는 변형 폴리펩타이드 또는 변형 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 투여전, 투여후 또는 이와 동시에 치료 폴리뉴클레오타이드를 투여하는 유전자치료이다. 또한 2가지 상이한 치료 폴리펩타이드 분자를 암호화하는 단일 벡터를 사용할 수 있다. 상기한 바와 같이 본 발명의 범주내에는 여러가지 단백질이 포함된다. 예를 들어, 암세포에 대해 야생형 종양 억제 유전자를 제공하는 측면에서 유전자치료를 이용할 수 있다.

e. 수술

암환자의 약 60%는 예방, 진단 또는 기결정, 치료 및 경감 수술을 포함한 몇가지 수술법을 실시한다. 치료 수술은 본 발명의 치료, 화학치료, 방사능치료, 호르몬치료, 유전자치료, 면역치료 및/또는 다른 치료를 포함한 여러가지 치료와 병행하여 사용할 수 있는 암 치료법이다.

치료 수술은 암 조직 전부 또는 일부를 외과적으로 제거하고 절개하고/하거나 파괴하는 절제술을 포함한다. 종양 절제는 종양의 적어도 일부를 외과적으로 제거하는 것이다. 종양 절제외에, 수술에 의한 치료법으로는 레이저 수술, 냉동수술, 전기수술 및 현미경 수술(모스기법; Mohs' surgery)이 포함된다. 본 발명을 피상적인 암, 전암 또는 부수적인 정상 조직 제거와 병행하여 사용할 수도 있다.

암세포, 조직 또는 종양 일부를 절제하는 경우, 신체내 공동이 생성될 수 있다. 부가적인 항암치료와 함께 관류, 직접 주사 또는 국소 적용에 의해 치료를 실시할 수 있다. 이러한 치료는, 예를 들어, 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일 또는 7일마다, 또는 1주, 2주, 3주, 4주 또는 5주마다, 1개월, 2개월, 3개월 4개월 5개월, 6개월, 7개월, 8개월, 9개월, 10개월, 11개월 또는 12개월마다 반복할 수 있다. 이러한 치료에서 용량은 또한 다양할 수 있다.

f. 다른 제제

치료제의 치료 효능을 높히기 위해 다른 제제를 본 발명과 병행하여 사용하는 것도 고려할 수 있다. 이러한 부가적인 제제에는 면역조절제, 세포 표면 수용체 및 GAP 경계의 상위 조절에 영향을 미치는 제제, 세포증식억제제 및 분화제, 세포 부척 억제제, 세포소멸 유도인자에 대한 과증식성 세포의 감수성을 증가시키는 제제 또는 기타 생물학적 제제가 포함된다. 면역조절제에는 종양 괴사인자, 인터페론 α, β 및 γ, IL-2 및 다른 사이토킨, F42K 및 다른 사이토킨 유사체, 또는 MIP-1, MIP-1β, MCP-1, RNATES 및 다른 케모킨이 포함된다. 또한 세포 표면 수용체와 이의 리간드(예: Fas/Fas 리간드, DR4 또는 DR5/TRAIL(Apo-2 리간드))간의 상위 조절은, 과증식성 세포상에 파라크린 또는 오토크린 효과를 설정함으로써 본 발명의 항함 능력을 증강시킬 수 있다. GAP 경계의 수를 높여 세포내 시그날 전달을 증가시킴으로써 이웃한 과증식성 세포 집단에 대한 항-과증식 효과를 증가시킬 수 있다. 다른 양태에서, 세포증식억제제 또는 분화를 본 발명과 병행 사용하여 치료의 항증식성 효능을 개선시킬 수 있다. 본 발명의 효능을 개선시키는데 세포 부착 억제제를 고려할 수도 있다. 세포 부착 억제제의 예에는 병소 부착 키나제(FAK) 억제제 및 로바스타틴이 있다. 또한 세포소멸에 대한 과증식성 세포의 감수성을 증가시키는 다른 제제(예: 항체 c225)를 본 발명과 병행 사용하여 치료 효능을 개선시킬 수도 있다.

세포독성 화학치료 약물을 도입한 후에 암 치료법이 크게 진보되었다. 그러나, 화학치료의 결과중 하나로 약물 내성 표현형의 획득/발달 및 다중 약물 내성 발달이 발생하였다. 약물 내성 발달은 상기한 종양 치료에서 주용한 장애가 되었으며, 이에 따라 유전자치료와 같은 대안이 명백하게 요구되고 있다.

다수의 조사자들이 연구한 결과로부터, TRAIL에 내성이 있는 종양 세포는 약물/사이토킨의 독성 농도 이하에서 감작되고 감작된 종양 세포는 TRAIL에 의해 상당량 사멸되는 것으로 입증되었다(참조문헌: Bonavida et al., 1999; Bonavida et al., 2000; Gliniak et al., 1999; Keane et al, 1999). 또한 CPT011 또는 독소루비신과 같은 화학치료제와 TRAIL를 병행하면 항종양 활성이 향상되며 세포소멸이 증가된다. 이러한 효과중 몇몇은 TRAIL 또는 동종 수용체의 상위 조절을 통해 일어나지만, 다른 것은 이를 경유하지 않는다.

화학치료, 방사능치료 또는 생물치료와 병행하여 사용하는 다른 형태의 치료법에는 환자의 조직이 고온(160℉ 이상)에 노출시키는 방법인 고열법이 포함된다. 국소적, 지역적 또는 전신 고열 적용시 외부 또는 내부 열 장치가 수반될 수 있다. 국소 고열에는 종양과 같은 작은 영역에 열을 적용하는 것이 포함된다. 신체의 외부에 있는 장치로부터 종양을 표적으로 하는 고주파를 이용하여 외부에서열을 생성할 수 있다. 내부 열에는, 온수로 충전된 동공 튜브 또는 얇고 가열된 와이어, 이식된 극초단파 안테나 또는 무선주파수 전극을 포함한 멸균 프로브가 수반될 수 있다.

국소 치료의 경우, 자석과 같이 고에너지를 생성하는 장치를 사용하여 환자의 기관 또는 사지를 가열한다. 또한 환자의 혈액 일부를 제거하고 혈액을 가열하여, 내부적으로 가열된 영역에 관류시킬 수 있다. 또한 암이 신체에 분포되어 있는 경우, 전신 가열을 실시할 수도 있다. 이러한 목적에 온수 담요, 고온 왁스, 유도 코일 및 열 챔버를 사용할 수 있다.

상기한 다른 암치료법 또는 본 발명과 병행하여 호르몬 치료를 사용할 수 있다. 호르몬법은 유방암, 전립선암, 난소암 또는 경부암과 같은 특정 암 치료에 사용하여 테스토스테론 또는 에스트로겐과 같은 특정 호르몬의 수준을 낮추거나 이의 효과를 차단할 수 있다. 이러한 치료법은 선택 치료법과 같은 다른 암치료법 하나 이상과 병행하여 사용하거나 전이 위험을 감소시키는데 사용한다.

B. 바이러스 병인론

본 발명의 조성물 및 방법이 바이러스 병인론의 치료 또는 진단과 관련되어 있음을 당연히 이해할 것이다. 예를 들어, HIV 감염에 의해 유발되는 AIDS 치료에 본 발명의 사용이 고려될 수 있다. 따라서, 본 발명은 전통적인 치료제 투여와 병행하여 사용할 수 있다. 이러한 치료중 몇몇은 하기하는 바와 같다.

1. AZT

AIDS 치료에서 익히 공지된 전통 치료법은 조비도부딘(AZT^TM; Burroughs Wellcome)을 포함한다. 이는 HIV 역전사효소를 억제하여 HIV 복제를 차단하는 디데옥시뉴클레오사이드로서 공지된 뉴클레오사이드 유도체 부류중 하나이다. 항-AIDS 약물 지도부딘(AZT)은 대부분 리팜핀과 병행하여 제한된 상황에서 사용될 수 있다(참조문헌: Burger et al., 1993).

본원에서 기술한 조성물 및 방법은, 백혈구 세포의 바람직한 수준을 유지함으로써 바이러스 복제를 억제하도록 디자인된 프로테아제 억제제 및/또는 AZT와 같은 형태의 치료제와 병행할때 특히 효과적이다. 이로 인해 사실상 환자에 있어서 항-바이러스 치료에 필요한 시간이 절약된다.

2. HAART

HIV 감염 환자의 치료시 새로운 약물 병행 치료가 유망한 결과를 나타내었다. 효능있는 항-HIV 약물 병행 치료는 "활성이 높은 항-레트로바이러스 치료법(HAART)로서 언급되는데, 이는 임상적 개선 및 보다 높은 생존률를 제공하며 HIV 질환의 4단계 과정중 HIV에 감염된 사람의 생활의 질을 개선시킨다. HAART의 예에는 2가지의 뉴클레오사이드 유도체(AZT/ddI, d4T/ddI, AZT/ddC, AZT/3TC 또는 d4T/3TC)와 병행되는 프로테아제 억제제(인디나비르, 넬피나비르, 리토나비르, 리토나비르/사퀴나비르 또는 사퀴나비르)가 포함된다.

V. 약제학적 조성물 및 투여 경로

본 발명은 변형 단백질(융합 단백질 포함)을 암호화하는 핵산 분자뿐만 아니라 다른 단백질 화합물 또는 소분자에 접합시킬 수 있는 변형 단백질을 포함한다. 몇몇 양태에서는 약제학적 조성물을 피검체에 투여한다. 본 발명의 다른 양태는 유효량의 수용성 조성물을 투여함을 포함한다. 본 발명의 또다른 양태에서는 면역독으로서 변형된 겔로닌이 특별하게 고려된다. 이러한 조성물은 일반적으로는 약제학적으로 허용되는 담체 또는 수용성 매질에 용해 또는 분산시킬 수 있다. 또한 이러한 조성물은 치료할 질환 또는 건강상태에 따라 다른 치료와 병행하여 투여할수 있다. 암 치료가 수술 또는 화학치료제, 방사능치료제, 면역치료제 또는 호르몬의 투여를 포함하는데 반해 AIDS의 치료는 HAART 또는 AZT, 또는 둘다의 투여를 포함한다.

A. 투여 경로

당분야의 숙련가라면 생체내 또는 생체외 위치에 유전자를 전달하는 방법을 익히 알고 있을 것이다. 바이러스 벡터의 경우, 바이러스 벡터 스톡을 제조할 수 있다. 바이러스 종류 및 가능한 역가에 따라 1 내지 100, 10 내지 50, 100 내지 1000 또는 1x10⁴, 1x10⁵, 1x10⁶, 1x10⁷, 1x10⁸, 1x10⁹, 1x10¹⁰, 1x10¹¹또는 1x10¹²이상의 감염성 바이러스 입자를 환자에게 전달할 수 있다. 리포좀 또는 다른 비바이러스성 제형의 경우, 상대적인 흡수 효율을 비교하여 외삽법에 의해 유사한 수치를 얻을 수 있다. 약제학적으로 허용되는 조성물로서의 제형은 하기하는 바와 같다.

용어 "약제학적으로 허용되는" 또는 "약리학적으로 허용되는"은, 동물 또는 사람에게 적절하게 투여하는 경우 역반응, 알러지반응 또는 기타 나쁜 반응을 일으키지않는 조성물 및 분자체를 의미한다. 본원에서 사용하는 바와 같이, "약제학적으로 허용되는 담체"에는 임의의 모든 용매, 분산 매질, 피복제, 항바이러스제, 항진균제, 등장제 및 흡수 지연제 등이 포함된다. 약제학적 활성 물질에 있어서 이러한 매질 및 제제를 사용하는 것이 당분야에 익히 공지되어 있다. 임의의 통상적인 매질 또는 제제가 활성 성분과 혼화되지 않는 경우를 제외하고는 치료 조성물에이들을 사용할 수 있다. 다른 항암제와 같은 부수적인 활성 성분을 조성물에 혼입할 수도 있다.

정맥내 또는 근육내 주사와 같이 비경구 투여용으로 제형화된 화합물외에, 다른 약제학적으로 허용되는 형태에는, 예를 들어 정제 또는 경구 투여용 고형제, 서방성 캡슐, 및 크림제, 로션제, 구강세척제, 흡입제 등을 포함해 현재 사용되는 기타 형태의 제제가 포함된다.

본 발명의 활성 화합물은 비경구 투여용으로 제형화할 수 있는데, 예를 들어 정맥내, 근육내, 흉부내, 피하 또는 심지어 복강내 경로를 통해 주사하기 위한 형태로 제형화할 수 있다. 본 발명의 측면에서 MHC 부류 I 분자의 발현을 증가시키는 화합물을 포함하는 수용성 조성물의 제조방법은 당분야의 숙련가에게 익히 공지되어 있다. 전형적으로 이러한 조성물은 용액 또는 현탁액과 같은 주사가능한 형태 및 주사전 액체를 가하여 용액 또는 현탁액을 제조하기에 적합한 고체형으로 제조할 수 있으며 또한 제제를 유화시킬 수도 있다.

유리 기재 또는 약제학적으로 허용되는 염으로서의 활성 화합물 용액을 물에서 계면활성제(예: 하이드록시프로필셀룰로스)와 적절하게 혼합하여 제조할 수 있다. 분산액은 글리세롤, 액체 폴리에틸렌 글리콜 및 이의 혼합물, 및 오일중에서 제조할 수도 있다. 통상의 저장 및 사용 조건하에 이들 제제는 미생물 성장을 방지하는 방부제를 포함한다.

주사용으로 적합한 약제형에는 멸균 수용액 또는 분산액; 참깨 오일, 땅콩 오일 또는 수용성 프로필렌 글리콜을 포함한 제형; 멸균 주사용 용액 또는 분산액의 즉석 제조를 위한 멸균 분말이 포함된다. 모든 경우에서, 제형은 멸균시켜야만 하고 용이하게 주사할 수 있을 정도로 유동성을 지녀야 한다. 또한 제조 및 저장 조건하에 안정해야하며 세균 및 진균과 같은 미생물의 오염 작용으로부터 보호되어야 한다.

활성 화합물은 중성 또는 염의 형태인 조성물내에 제형화할 수 있다. 약제학적으로 허용되는 염에는 산부가염(단백질의 유리 아미노 그룹을 이용하여 형성) 및 무기산(예: 염산 또는 인산) 또는 유기산(예: 아세트산, 옥살산, 타르타르산, 만델산) 등을 이용하여 형성시킨 염이 포함된다. 유리 카복실 그룹을 이용하여 형성시킨 염은 무기 염기(예: 나트륨, 칼륨, 암모늄, 칼슘 또는 수산화철) 및 유기 염기(예: 이소프로필아민, 트리메틸아민, 히스티딘, 프로카인 등)로부터 유도된 것이다.

또한 담체는, 예를 들어 에탄올, 물, 폴리올(예: 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 이의 적절한 혼합물 및 식물성 오일을 포함한 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 예를 들어 피복제(예: 레시틴)를 사용하고 분산액의 경우 요구되는 입자 크기를 유지하며 계면활성제를 사용하여 적절한 유동성을 유지할 수 있다. 예를 들어 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르브산, 티메로살 등과 같은 다양한 항세균제 및 항진균제를 도입하여 미생물의 작용을 방지할 수 있다. 다수의 경우에서, 당 또는 염화나트륨과 같은 등장제를 포함시키는 것이 바람직하다. 예를 들어 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴과 같이 흡수를 지연하는 제제를 조성물에 사용하여 주사용 조성물 흡수를 연장시킬 수 있다.

멸균 주사용 용액은, 경우에 따라 적절한 용매중에 상기한 다양한 성분과 함께 요구량의 활성 화합물을 혼입시킨 다음, 멸균 여과시켜 제조한다. 일반적으로 다양한 멸균 활성 성분을, 기본 분산 매질 및 상기한 다른 필요 성분을 포함하는 멸균 비히클에 혼입시켜 분산액을 제조한다. 멸균 주사용 용액을 제조하기 우한 멸균 분말의 경우, 바람직한 제조방법은 미리 멸균 여과시킨 용액으로부터 다른 바람직한 부가 성분과 함께 활성 성분 분말을 생성하는 진공 건조 및 동결 건조 기술이다.

특별한 경우에, 본 발명의 치료 제형은 크림제 및 로션제와 같이 국소 투여에 적합한 형태로 제조할 수도 있다. 이러한 형태는 여러가지 육종과 같은 피부 관련 질환 치료에 사용할 수 있다.

본 발명에 따른 치료 조성물 투여는, 경로를 통해 표적 조직에 유효한 어떠한 공통 경로를 통해서도 실시할 수 있다. 바이러스 벡터로서 본 발명을 사용하는 경우, 벡터에 의해 운반되는 이종 서열에 있어 바람직한 위치를 먼저 고려한다. 투여 경로에는 경구, 비강, 구강, 직장, 질 또는 국부 투여가 포함된다. 예를 들어, 흑색종 또는 AIDS 관련 피부 상태의 치료 또는 바이러스 벡터에 의해 피부 상태 치료에 유용한 이종 유전자를 운반하는 경우에는 국소 투여가 특히 유리할 수 있다. 또한 정위, 피내 피하, 근육내, 복강내 또는 정맥 주사로 투여할 수 있다. 이러한 조성물은 생리학적으로 허용되는 담체, 완충액 또는 다른 부형체를 포함한, 약제학적으로 허용되는 조성물로서 일반적으로 투여될 수 있다. 폐 질환 치료의 경우, 에어로졸 형태로 폐에 적용하는 것이 고려된다. 에어로졸의 양은 약 0.01㎖내지 0.5㎖이다. 유사하게 결장 관련 질환 치료에 바람직한 방법은 관장제를 이용하는 것이다. 관장제의 양은 약 1㎖ 내지 100㎖이다. 보다 특별한 양태에서는 연속적으로 종양내로 관류시키는 종양내 직접 주사가 바람직하다.

특정 양태에서는 환자에게 치료 조성물을 연속적으로 공급하는 것이 바람직할 수 있다. 정맥내 또는 동맥내 경로의 경우, 점적 시스템을 이용한다. 국소 적용의 경우, 반복 적용시킨다. 여러가지 방법에서, 제한되지만 일정량의 치료제를 연장된 시간에 걸쳐 제공하는 방출 지연 제형을 사용한다. 내부 적용의 경우, 예를 들어 이종 핵산 단편을 포함하는 바이러스 벡터를 이용하여 문제의 영역을 연속 관류시키는 것이 바람직할 수 있다. 이는 몇몇 경우에서 수술후 카테테르를 설치한 다음 치료제를 연속 투여함으로써 실시할 수 있다. 관류 시간은 특별한 환자 및 상황에 따라 임상의가 선택할 수 있지만 약 1 내지 2시간, 2 내지 6시간, 약 6 내지 10시간, 약 10 내지 24시간, 약 1일 내지 2일, 약 1주 내지 2주 또는 그 이상일 수 있다. 일반적으로 연속 관류를 경유하는 경우, 치료 조성물의 용량은 단일 또는 다수 주사시의 양과 동등하며 주사액을 투여하는 시간은 조절할 수 있다. 그러나 관류를 통해 보다 많은 용량을 투여할 수 있는 것으로 생각된다.

수용액의 비경구 투여의 경우, 예를 들어 용액은 경우에 따라 적절하게 완충시켜야 하며 액체 희석액은 먼저 충분한 염수 또는 글루코스를 이용하여 등장성을 유지해야 한다. 이러한 특정 수용액은 정맥내, 근육내, 피하 및 복강내 투여에 특히 적합하다. 이와 관련하여 사용할 수 있는 멸균 수용성 매질은 본 발명과 관련하여 당분야의 숙련가에게 익히 공지되어 있다. 예를 들어 1회 용량을 등장성NaCl 용액 1㎖에 용해시키고, 대량피하 주사액 1000㎖에 부가하거나 지명된 주입 부위에 주사할 수 있다(참조문헌: Remington's Pharmaceutical Science, 1990). 본질적으로는 치료할 피검체의 건강 상태에 따라 용량을 변화시킬 수 있다. 경우에 따라 투여 책임자가 개체에게 적절한 용량을 결정한다.

유효량의 치료 조성물은 의도한 목적에 따라 결정한다. 용어 "기본 용량" 또는 "용량"은 피검체에 사용하기에 적합한 물리적 이산 단위로, 각 단위는 투여, 즉, 적절한 경로 및 치료방법과 관련하여 상기에서 논의한 목적 반응을 일으키도록 계산하여 미리 결정한 양의 치료 조성물을 포함한다. 치료제의 양 및 치료 용량에 따라 투여할 조성물의 양은 목적하는 바에 따라 다르다.

치료 조성물의 정확한 양은 실시자의 판단에 또한 좌우되며 각 개체마다 다르다. 용량에 영향을 미치는 인자에는 환자의 물리적 및 임상적 상태, 투여 경로, 치료 목적(증상 경삼 또는 치료), 및 특정 치료 물질의 효능, 안정성 및 독성이 포함된다.

제형의 경우, 용액은 용량 제형과 양립할 수 있는 방식 및 치료학적으로 유효한 양으로 투여한다. 제형은 상기한 주사용 용액 형태와 같이 다양한 용량형으로 용이하게 투여하지만 약물 방출 캡슐 등을 사용할 수도 있다.

본원에서 사용되는 용어 시험관내 투여는 배양물중 세포를 포함하지만 이로써 제한되지는 않는 동물의 세포상에서 조작을 실시함을 의미한다. 용어 생체외 투여는 세포를 시험관내에서 조작한 후, 후속적으로 살아있는 동물에 투여함을 의미한다. 용어 생체내 투여에는 동물의 세포상에서 실시되는 모든 조작을 포함한다.

본 발명의 특정 양태에서, 조성물은 시험관내, 생체외 또는 생체내 투여할 수 있다. 특정 시험관내 양태에서, 변형 단백질을 암호화하는 발현 작제물로 숙주 세포를 형질도입시킬 수 있다. 그런 다음, 형질도입된 세포를 시험관내 분석 또는 생체내 투여에 사용할 수 있다.

본원에서 둘다 참조문헌으로 인용된 미국 특허 제4,690,915호 및 제5,199,942호는 치료시 사용하기 위한 혈액 단핵 세포 및 골수 세포의 생체외 조작방법을 기술하고 있다.

본 발명의 조성물의 생체내 투여를 고려할 수도 있다. 이의 예로 방광내에 있는 카테테르를 통해 본 발명의 형질도입 조성물을 투여함으로써 방광 표피세포를 형질도입시키는 것(참조문헌: Bass, 1995) 및 카테테르를 통해 문맥으로 적절한 형질도입 조성물을 주입함으로써 살아있는 세포를 형질도입시키는 것(참조문헌: Bao, 1996)이 포함되지만 이로써 제한되지는 않는다. 추가의 예로 직접적인 형질도입 조성물을 종양에 직접 주사하는 것 및 형질도입 조성물을 비강내 또는 기관내 점적시켜 폐세포를 형질전환시키는 것이 있다.

본 발명은 정맥내, 피내, 동맥내, 복강내, 병소내, 두개내, 관절내, 전립선내, 늑막내, 기관내, 비강내, 초자체내, 질내, 직장, 국소, 종양내, 근육내, 복강내, 피하, 소포내, 점막, 심낭내, 경구, 국소 및 국부적으로 투여하고/하거나 에어로졸, 주사, 주입, 연속 주입, 직접 또는 카테테르를 통해 표적 세포를 세척하는 국소 관류 및/또는 세척을 이용하여 투여할 수 있다.

B. 지질 조성물

특정 양태에서, 본 발명은 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드와 관련된 하나 이상의 지질을 포함하는 신규한 조성물에 관한 것이다. 지질은 물속에서는 불용성이며 유기 용매와 함께 추출할 수 있는 특징을 지닌 물질이다. 본원에서 상세하게 기술한 것 이외의 다른 지질 화합물도 당분야의 숙련가라면 익히 알 수 있을 것이며, 본 발명의 조성물 및 방법에 이 또한 포함된다.

지질은 천연 또는 합성(즉 사람에 의해 생산되거나 디자인된) 지질일 수 있다. 그러나, 지질은 일반적으로 생물학적 물질이다. 생물학적 지질은 당분야에 익히 공지되어 있으며, 예를 들어 천연 지방, 인지질, 포스포글리세라이드, 스테로이드, 테르펜, 라이소리피드, 글리코스핑고리피드, 글루코리피드, 설파타이드, 에테르 및 에스테르 결합된 지방산이 있는 지질 및 중합성 지질, 및 이들의 혼합물을 포함한다.

1. 지질 유형

중성 지방은 글리세롤 및 지방산을 포함할 수 있다. 전형적인 글리세롤은 3쇄 알콜이다. 지방산은 일반적으로 쇄 말단에 산성 잔기(예: 카복실산)가 있는 탄소 쇄를 포함하는 분자이다. 탄소 쇄는 임의 길이의 지방산일 수 있지만, 탄쇄 수가 약 2개, 약 3개, 약 4개, 약 5개, 약 6개, 약 7개, 약 8개, 약 9개, 약 10개, 약 11개, 약 12개, 약 13개, 약 14개, 약 15개, 약 16개, 약 17개, 약 18개, 약 19개, 약 20개, 약 21개, 약 22개, 약 23개, 약 24개, 약 25개, 약 26개, 약 27개, 약 28개, 약 29개, 약 20개, 또 그 이상인 것이 바람직하며, 탄소수는 이 범위내에서 변화될 수 있다. 그러나, 지방산의 쇄 부분에서 약 14개 내지 약 24개의 탄소수가 바람직하며 특정 양태에서는 약 16개 내지 약 18개의 탄소수가 특히 더 바람직하다. 특정 양태에서, 지방산 탄소쇄는 홀수의 탄소원자를 포함하지만 특정 양태에서는 짝수의 탄소수를 포함하는 것이 바람직할 수 있다. 탄소쇄에 단일결합만 포함하는 지방산은 포화 지방산이라 하고 탄소쇄에 하나 이상의 이중결합을 포함하는 지방산은 불포화 지방산이라 한다.

구체적인 지방산에는, 리놀레산, 올레산, 팔미트산, 리놀렌산, 스테아르산, 라우르산, 미리스트산, 아라키드산, 팔미놀레산, 아라키돈산, 리시놀레산, 투베르쿨로스테르산, 락토바실르산이 포함되지만 이로써 제한되지는 않는다. 하나 이상의 지방산의 산성 그룹은 글리세롤의 하나 이상의 하이드록실 그룹에 공유 결합되어 있다. 따라서, 모노글리세라이드는 글리세롤 및 한개의 지방산을 포함하고, 디글리세라이드는 글리세롤 및 두개의 지방산을 포함하며, 트리글리세라이드는 글리세롤 및 세개의 지방산을 포함한다.

인지질은 일반적으로 글리세롤 또는 스핑고신 잔기, 양성 화합물을 생성하는 이온성 인 그룹 및 하나 이상의 지방산을 포한한다. 인지질 종류에는, 예를 들어 인 그룹이 디글리세라이드 글리세롤의 첫번째 탄소에 결합되어 있는 포스포글리세라이드, 및 인 그룹이 스핑고신 아미노 알콜에 에스테르 결합되어 있는 스핑고포스포리피드(예: 스핑고마이엘린)이 포함된다. 스핑고포스포리피드의 다른 예로는,양성 분자를 만드는 이온성 황 그룹을 포함하는 설파타이드가 있다. 물론 인지질은, 인 그룹에 결합된 알콜과 같은 다른 화학 그룹을 포함할 수 있다. 이러한 알콜 그룹의 예로는 세린, 에탄올아민, 콜린, 글리세롤 및 이노시톨이 있다. 이에 따라, 구체적인 포스포글리세라이드에는 포스파티딜 세린, 포스파티딜 에탄올아민, 포스파티딜 콜린, 포스파티딜 글리세롤 또는 포스파티딜 이노시톨이 포함된다. 다른 인지질로는 포스파티드산 또는 디아세틸 포스페이트가 있다. 한가지 양태에서, 포스파티딜콜린에는 디올레오일포스파티딜콜린(a.k.a.카디올리핀), 달걀 포스파티딜콜린, 디팔미토일 포스파티딜콜린, 모노미리스토일 포스파티딜콜린, 모노팔미토일 포스파티딜콜린, 모노스테아로일 포스파티딜콜린, 모노올레오일 포스파티딜콜린, 디부트로일 포스파티딜콜린, 디발레로일 포스파티딜콜린, 디카프로일 포스파티딜콜린, 디헵타노일 포스파티딜콜린, 디카프릴로일 포스파티딜콜린 또는 디스테아로일 포스파티딜콜린이 포함된다.

당지질은 스핑고포스포리피드와 관련있지만 스핑고신의 일차 하이드록실 그룹에 인 그룹 보다는 탄수화물 그룹이 결합되어 있다. 세레브로사이드로 불리는 당지질 종류는 일차 하이드록실 그룹에 결합된 한개의 당 그룹을 포함한다. 당지질의 또다른 예로는 측쇄로 존재하며 일차 하이드록실 그룹에 결합된 당 그룹이 약 2개, 약 3개, 약 4개, 약 5개, 약 6개, 약 7개 또는 그이상인 강글리오사이드(예: 모노시알로강글리오사이드, GM1)가 있다. 다른 양태에서, 당지질로는 세라마이드(예: 락토실세라마이드)가 있다.

스테로이드는 페난트렌의 4원환계 유도체이다. 스테로이드는 종종 세포, 조직 및 유기체에서 조절 기능을 가지며, 이의 예로는 프로게스타겐 관련 화합물 및 호르몬(예: 프로게스테론), 글루코코티코이드(예: 코티솔), 무기질 코티코이드(예: 알도스테론), 안드로겐(예: 테스토스테론) 및 에스트로겐(예: 에스트로겐)이 있다. 콜레스테롤은 스테로이드의 또다른 예이며, 일반적으로는 조절 기능보다 구조를 지탱한다. 비타민 D는 스테롤의 또다른 예이며 장에서의 칼슘 흡수와 관련이 있다.

테르펜은 5개 이상의 탄소 이소프렌 그룹을 포함하는 지질이다. 테르펜은 여러가지 생물학적 기능을 갖는데, 예를 들어 비타민 A, 조효소 Q 및 카로티노이드(예: 리코펜 및 β-카로틴)이 있다.

2. 전하를 띤 지질 및 중성 지질 조성물

특정 양태에서, 조성물의 지질 성분은 전하가 없거나 거의 전하를 띄지 않는다. 한가지 양태에서, 조성물의 지질 성분은 하나 이상의 중성 지질을 포함한다. 다른 양태에서, 조성물의 지질 성분은 음이온 및 양이온 지질을 실질적으로 포함하지 않는다. 특정 양태에서, 전하가 없거나 거의 전하를 띄지 않는 지질 조성물의 지질 성분은 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99% 또는 약 100%의 전하를 띄지 않는 지질을 포함하는데, 실질적으로 전하가 없는 지질 및/또는 지질 혼합물은 양전하 및 음전하의 수가 동일하다.

다른 양태에서, 지질 조성물은 전하를 띌 수 있다. 예를 들어, 전하가 있는 인지질을 사용하여 본 발명에 따른 지질 조성물을 제조할 수 있는데, 인 지질은 순수하게 양전하 또는 음전하를 띌 수 있다. 비제한적 실시예에서, 디아세틸 포스페이트를 사용하여 지질 조성물에 음전하를 부여할 수 있으며, 스테아릴아민을 사용하여 지질 조성물에 양전하를 부여할 수 있다.

3. 지질 제조

지질은 천연 공급원 또는 시판되는 공급원으로부터 입수하거나, 당분야의 통상의 숙련가에게 익히 공지된 바와 같이 화학적으로 합성할 수 있다. 예를 들어, 인지질은 달걀 또는 대두 포스파티딜콜린, 뇌 포스파티드산, 뇌 또는 식물 포스파티딜이노시톨, 심장 카디오리핀 및 식물 또는 세균 포스파티딜에탄올아민으로부터 유래된 것일 수 있다. 또다른 예에서, 본 발명에 사용하기에 적합한 지질은 시판되는 공급원으로부터 입수할 수 있다. 예를 들어 디미리스티릴 포스파티딜콜린("DMPC")는 시그마 케미칼 캄파니(Sigma Chemical Co.)에서 시판중이고, 디세틸 포스페이트("DCP")는 K & K 래보러토리즈(K & K laboratories)에서 시판하고 있으며, 콜레스테롤("Chol")은 칼바이오켐-베링(Calbiochem-Behring)에서 시판중이고, 디미리스티릴 포스파티딜글리세롤("DMPG") 및 다른 지질은 아반티 폴라 리피드 인코포레이트(Avanti Polar Lipids, Inc.;Brimingham, Ala)에서 시판하고 있다. 특정 양태에서, 클로로포름 또는 클로로포름/메탄올중 지질 저장액은 약 -20℃에서 보관한다. 바람직하게는, 용매로서 메탄올보다 증발시키기가 용이한 클로로포름만 사용한다.

4. 지질 조성물 구조

지질 관련 화합물은 지질을 함유한 용액에 분산시키거나, 지질과 함께 용해시키거나, 지질과 함께 유화시키거나, 지질과 함께 혼합하거나, 지질과 함꼐 결합시키거나 지질에 공유결합시키거나, 지질중 현탁액으로 포함되거나, 다른 방식으로 지질과 연관시킨다. 본 발명의 지질 또는 지질 관련 조성물은 특정 구조로 제한되지 않는다. 예를 들어, 이들은 용액중 단순히 분산시켜 크기 또는 형태가 일정하지 않은 응집체를 형성할 수 있다. 다른 실시예에서, 이들은 마이셀로서 이중층으로 존재하거나 "붕괴된" 구조로 존재할 수 있다. 다른 비제한적 예에서, 리포펙타민(Gibco BRL) 또는 Superfect(Qiagen) 복합체를 고려할 수도 있다.

특정 양태에서, 지질 조성물은 약 1%, 약 2%, 약 3%, 약 4%, 약 5%, 약 6%, 약 7%, 약 8%, 약 9%, 약 10%, 약 11%, 약 12%, 약 13%, 약 14%, 약 15%, 약 16%, 약 17%, 약 18%, 약 19%, 약 20%, 약 21%, 약 22%, 약 23%, 약 24%, 약 25%, 약 26%, 약 27%, 약 28%, 약 29%, 약 30%, 약 31%, 약 32%, 약 33%, 약 34%, 약 35%, 약 36%, 약 37%, 약 38%, 약 39%, 약 40%, 약 41%, 약 42%, 약 43%, 약 44%, 약 45%, 약 46%, 약 47%, 약 48%, 약 49%, 약 50%, 약 51%, 약 52%, 약 53%, 약 54%, 약 55%, 약 56%, 약 57%, 약 58%, 약 59%, 약 60%, 약 61%, 약 62%, 약 63%, 약 64%, 약 65%, 약 66%, 약 67%, 약 68%, 약 69%, 약 70%, 약 71%, 약 72%, 약 73%, 약 74%, 약 75%, 약 76%, 약 77%, 약 78%, 약 79%, 약 80%, 약 81%, 약 82%, 약 83%, 약 84%, 약 85%, 약 86%, 약 87%, 약 88%, 약 89%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99%, 약 100% 또는 이로부터 유래된 범위의 특정한 지질을 포함하는데, 지질 종류 및 비지질 성분(예: 약물, 단백질,당, 핵산 또는 본원과 관련된 다른 물질)은 당분야의 숙련가에게 익히 공지되어 있다. 비제한적 예로서, 지질 조성물은 약 10% 내지 약 20%의 중성 지질, 약 33% 내지 약 34%의 세레브로사이드 및 약 1%의 콜레스테롤을 포함할 수 있다. 다른 비제한적 실시예에서, 리포좀은 약 4% 내지 약 12%의 테르펜(이때 구체적으로는 마이셀의 약 1%가 리코펜이고 리포좀의 약 3% 내지 약 11%는 다른 테르펜을 포함한다), 약 10% 내지 약 35%의 포스파티딜 콜린 및 약 1%의 약물을 포함한다. 이에 따라, 본 발명의 지질 조성물은 어떠한 조합이나 백분률 범위로 지질, 지질 종류 또는 다른 성분들을 포함할 수 있다.

a, 에멀젼

지질은 에멀젼에 포함시킬 수 있다. 지질 에멀젼은 기계적 교반 또는 유화제로서 공지된 물질을 소량 부가하여 생성되는, 정상적으로는 서로 용해되지 않는 두가지 이상의 액체의 실질적인 영구 이종 액체 혼합물이다. 지질 에멀젼을 제조하는 방법 및 추가 성분을 부가하는 방법은 당분야에 익히 공지되어 있다(참조문헌: Modern Pharmaceutics, 1990).

예를 들어 한가지 이상의 지질을 에탄올 또는 클로로포름, 또는 기타 적합한용매에 가한 다음, 수동으로 또는 기계적 기술에 의해 교반한다. 그런 다음, 혼합물로부터 용매를 증발시켜 건조된 지질 글레이즈를 남긴다. 지질은 수용성 매질(예: 인산 완충된 염수)에 재현탁시켜 에멀젼을 수득한다. 유화된 지질이 보다 균질한 크기로 분포하기 위해서는 통상의 초음파 기술을 사용하여 혼합물을 초음파분해한 다음, 미세유동화기(예: Microfluidizer, Newton, Mass.)를 사용하여 추가로 유화시키고/시키거나 압출 장치(extruder Device, Lipex Biomembranes, Vancouver, Canada)를 사용하여 고압(예: 600psi)하에 압출시킨다.

b. 마이셀

지질은 마이셀내에 포함시킬 수 있다. 마이셀은 일반적으로 지질 단층의 형태인 지질 화합물의 클러스터 또는 응집체로서, 당분야의 숙련가에게 익히 공지된 마이셀 제조 프로토콜을 사용하여 제조할 수 있다(참조문헌: Canfield et al., 1990; El-Gorab et al., 1973; Colloidal Surfactant, 1963; 및 Catalysis in Micellar and Macromolecular System, 1975). 예를 들어, 전형적으로는 하나 이상의 지질을 유기 용매중 현탁액으로 제조하고 용매를 증발시킨 다음, 지질을 수용성 매질에 재현탁시키고 초음파분해한 다음, 원심분리시킨다.

5. 리포좀

특정 양태에서, 지질은 리포좀을 포함한다. "리포좀"은 밀봉된 지질 이중층 또는 응집체가 생성되어 형성된 여러가지 단층 및 다중 라멜라 지질 비히클을 포함하는 용어이다. 리포좀은 이중층 막을 갖는 소포 구체를 지니며 일반적으로는 인지질을 포함하고 내부 매질은 일반적으로 수용성 조성물을 포함하는 것이 특징이다.

다중 라멜라 리포좀은 수용성 매질에 의해 분리되는 다중 지질층을 갖는다.인지질을 포함한 지질이 과량의 수용액에 현탁될 때 라멜라 리포좀이 자발적으로 형성된다. 지질 성분은 밀봉 구조를 형성하기 전에 자체 재배열되어 지질 이중층 사이에 물과 용해된 용질을 가두어 놓는다(참조문헌: Ghosh 및 Bachhawat, 1991). 또한 친지성 영역이 있는 친지성 분자는 지질 이중칭내에 용해되거나 이와 결합할 수 있다.

특별한 양태에서, 지질 및/또는 변형 단백질, 또는 변형 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는, 예를 들어 리포좀의 수용성 내부에 포집하거나, 리포좀 지질 이중층내에 분산시키거나, 리포좀 및 조성물 모두와 결합된 결합 분자를 통해 리포좀에 결합시키거나, 리포좀에 가두거나, 리포좀과 복합시킬 수 있다.

a. 리포좀 제조

본 발명에 따라 사용되는 리포좀은 당분야의 숙련가에게 익히 공지된 바와 같은 여러가지 방법으로 제조할 수 있다.

예를 들어, 중성 인지질 디올레오일포스파티딜콜린(DOPC)과 같은 인지질(Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL)을 3급 부탄올에 용해시킨다. 그런 다음, 지질을 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드 및/또는 다른 성분과 혼합한다. Tween 20이 조성물 중량의 약 5%가 되도록 Tween 20을 지질 혼합물에 가한다. 3급 부탄올이 95% 이상 되도록 과량의 3급 부탄올을 이 혼합물에 가한다. 혼합물을 볼텍싱(vortexing)하고 건조 아이스/아세톤 욕에서 동결시키고 밤새 동결건조시킨다. 동결건조시킨 제제는 -20℃에서 보관하는데 이를 3개월까지 사용할 수 있다. 동결건조시킨 리포좀이 필요한 경우, 이를 0.9% 염수중에 재구성한다. 화합물을 포집시키기 위해 Tween 20을 사용하여 수득한 입자의 평균 직경은 약 0.7 내지 약 1.0㎛이다.

또한 리포좀은 배 모양의 유리 플라스크와 같은 용기내에서 용액중에 지질을 혼합하여 제조할 수 있다. 용기는 리포좀의 예상 현탁액 양보다 10배 이상 용적이 커야한다. 회전 증발기를 사용하여 약 40℃, 음압하에 용매를 제거한다. 용매는 목적하는 리포좀의 양에 따라 보통 약 5분 내지 2시간 이내에 제거된다. 그런 다음, 진공하 데시케이터에서 추가로 건조시킨다. 일반적으로는 시간이 지남에 따라 지질의 질이 저하되는 경향이 있기 때문에 1주일 후에는 건조시킨 지질을 버린다.

건조시킨 지질은 지질막이 재현탁될 때까지 진탕시킴으로써, 멸균된 발열원 부재 물 중에서 약 25 내지 50mM의 인지질로 수화시킨다. 수용성 리포좀을 분취량으로 나눈다음, 바이알에 각각 넣고 냉동건조시키고 진공하 밀봉시킨다.

다른 방법으로, 다른 공지된 실험실 방법에 따라 리포좀을 제조할 수 있다(참조문헌: Bangham et al., 1965; Gregoriadis, 1979, Deamer 및 Uster 1983, Szoka 및 Papahadjopoulos, 1978). 이러한 방법은 수용성 물질을 포집하는 능력과 수용액 대 지질 비율이 각각 상이하다.

상기한 바와 같이 제조한 건조 지질 및 냉동건조 리포좀은 탈수시키고 억제 펩타이드 용액중에서 재구성하고 적합한 용매(예: DPBS)에 적절한 농도로 희석시킬 수 있다. 그런 다음, 혼합물을 볼텍스 믹서에서 격렬하게 진탕시킨다. 호르몬, 약물, 핵산 작제물 등을 포함하지만 이로써 제한되지 않는 제제와 같이 포집되지않은 부가 물질은 29,000 x g에서 원심분리하여 제거하고 리포좀 펠렛을 세척한다. 세척한 리포좀은 적절한 총 인지질 농도, 예를 들어 약 50 내지 200mM로 재현탁시킨다. 포집된 부가 물질 또는 활성 제제의 양은 표준방법에 따라 측정할 수 있다. 리포좀 제제내에 포집된 부가 물질 또는 활성 제제의 양을 결정한 다음, 리포좀을 적절한 농도로 희석시키고 사용하기 전까지 4℃에서 보관한다. 리포좀을 포함한 약제학적 조성물은 일반적으로 약제학적으로 허용되는 멸균 담체 또는 희석제, 예를 들어 물 또는 염수 용액을 포함한다.

리포좀의 크기는 합성방법에 따라 다양하다. 본 발명의 리포좀은 크기가 다양할 수 있다. 특정 양태에서, 리포좀의 크기가 작은데, 예를 들어 외경이 약 100㎚ 이하, 약 90㎚, 약 80㎚, 약 70㎚, 약 60㎚, 또는 약 50㎚ 이하이다. 이러한 리포좀 제조시, 본원에서 기술한 프로토콜이나 당분야의 통상의 숙련가에게 익히 공지된 방법을 사용할 수 있다. 리포좀의 비제한적 제조방법 예는 미국 특허 제4,728,578호, 제4,728,575호, 제4,737,323호, 제4,533,254호, 제4,162,282호 및 제4,310,505호; 제PCT/US85/01161호 및 제PCT/US89/05040호, 영국 특허원 제GB2193095 A호; Mayer et al., 1986, Hope et al., 1985, Mayhew et al., 1987, Mayhew et al., 1984, Cheng et al., 1987 및 리포좀 기술(Liposom Technology, 1984)에 기술되어 있다.

수용액에 현탁된 리포좀은 일반적으로 지질 이중층 분자의 하나 이상의 동심원층을 지닌 구형 소포체 모양이다. 각각의 층은 화학식 XY(여기서, X는 친수성 잔기이고 Y는 소수성 잔기이다)로 표현하는 분자의 평행 배열로 이루어져있다. 수용성 현탁액에서, 동심원층은, 친수성 잔기가 수용성 상과 접촉한채 유지되고 소수성 영역이 자체 결합되도록 배열되어 있다. 예를 들어, 수성 층은 리포좀내에 존재하거나 리포좀없이 존재하는 경우, 지질 분자는 라멜라로도 공지된 XY-YX 배열의 이중층을 형성할 수 있다. 한분자 이상의 지질의 친수성 및 소수성 부분이 각각 결합하는 경우 지질 응집체가 형성될 수 있다. 이러한 응집체의 크기 및 모양은, 용액중 다른 화합물의 존재 및 용매의 성격에 따라 다양할 수 있다.

지질 제형은 (I) 역상 증발 (II) 탈수-재수화 (III) 세제 투석 및 (IV) 박막 수화를 실시한 후, 리포좀 혼합물을 연속 압출하거나 초음파분해하여 제조한다. 한가지 양태에서, 특정한 경우의 리포좀을 제조하는 방법으로 가열하고 초음파분해하며 공극 크기를 감소시키는 막 또는 필터를 통해 지질을 압출시켜 작고 안정한 리포좀 구조를 형성시킨다. 이러한 제조 과정은 최대 활성을 나타내며 구조적으로 안정한, 크기가 적절하고 일정한 리포좀 단독 또는 리포좀/치료 화합물을 생성한다. 이러한 기술은 당분야의 숙련가에게 익히 공지되어 있다(참조문헌: Martin, 1990).

지질 구조물을 일단 제조하면, 순환시 독성(예: 화학치료제)이 있거나 불안정한(예: 핵산) 화합물을 포집시키는데 이를 사용한다. 리포좀 포집으로 상기한 화합물의 독성이 낮아지면 혈청내 반감기가 보다 길어진다(참조문헌: Gabizon et al., 1990).

여러가지 질환 치료에서는 통상의 치료법을 향상시키거나 신규한 치료법, 특히 과증식성 질환의 치료법을 정립하기 위해 지질 기본의 유전자 전달방법을 사용한다. 리포좀 제형화의 진보는 생체내 유전자 전달 효능을 개선시키며(참조문헌: Templeton et al., 1997) 상기한 방법에 의해 제조한 리포좀 사용이 고려되고 있다. 핵산 전달을 위한 지질 기본 제형을 제조하는 또다른 방법은 제WO 99/18933호에 기술되어 있따.

또다른 리포좀 제형에서, 용매 희석 미세담체(SMDC)로도 불리는 양성 비히클이 특정 분자를 지질 비히클 이중층으로 통합시킬 수 있다(참조문헌: 미국 특허 제5,879,703호). SDMC는 리포다당류, 폴리펩타이드, 핵산 등을 전달하는데 사용할 수 있다. 물론 당분야의 숙련가에게 공지된, 다른 리포좀 제조방법을 사용하여 본 발명에서 바람직한 리포좀 제형을 수득할 수 있다.

b. 리포좀 표적화

본 발명의 조성물을 리포좀과 결합시키면 이의 생체분포성 및 기타 특성이 개선될 수 있다. 예를 들어, 리포좀 매개된 핵산 전달 및 시험관내 외부 DNA 발현은 매우 성공적이었다(참조문헌: Nicolau 및 Sene, 1982; Fraley et al., 1979, Nicolau et al., 1987). 배양된 닭 배아, HeLa 및 간암세포에서의 리포좀 매개된 전달 및 외부 DNA 발현의 실행가능성 또한 입증되었다(참조문헌: Wong et al., 1980). 정맥내 주사후 리포좀 매개된 유전자 전달은 성공하였다(참조문헌: Nicolau et al., 1987).

리포좀 조성물은 조직에 전달하기 위한 부가 물질을 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 특정 양태에서, 지질 또는 리포좀을 헤마글루틴화된바이러스(HVJ)와 결합시킬 수 있다. 이는 세포막과의 융합을 촉진시켜 리포좀-포집된 DNA의 세포내 도입을 촉진하는 것으로 나타났다(참조문헌: Kaneda et al., 1989). 다른 예에서, 지질 또는 리포좀은 핵의 비-히스톤 염색체 단백질(HMG-1)과 복합되거나 이와 결합되어 사용될 수 있다(참조문헌: Kato et al., 1991). 또다른 추가 양태에서, 지질은 HVJ 및 HMG-1 모두와 복합되거나 이와 결합되어 사용될 수 있다.

본 발명의 상기한 화합물 다량을 전달하는 리포좀의 능력을 감소시키지 않으면서 리간드를 부가하여 표적 전달을 수행할 수 있다. 이는 특별한 세포, 조직 및 기관으로의 전달을 가능하게 한다. 리간드 기본 전달 시스템의 표적 특이성은 상이한 세포 유형에서의 리간드 수용체 분포를 기본으로 한다. 표적 리간드는 지질 복합체와 비공유결합 또는 공유결합으로 연결시킬 수 있으며, 다양한 방법에 의해 리포좀에 접합시킬 수 있다.

리포좀에 리간드를 가교결합시키는 방법(몇몇은 상기한 바와 같음)은 본원에서 전문이 참조문헌으로 인용된 미국 특허 제5,603,872호 및 미국 특허 제5,401,511호에 기술되어 있다. 아민 가교결합 잔기를 통해 다양한 리간드를 리포좀 표면에 공유결합시킬 수 있다. 리포좀, 특히 다중 라멜라 소포체(MLV) 또는 단일 라멜라 소포체(각각 포스파티딜에탄올아민(PE)를 포함하는 미세유화 리포좀(MEL) 및 거대 단일 라멜라 리포좀(LUVET))를 정립된 방법으로 제조한다. 리포좀에 포함된 PE는 가교결합을 위해 활성 기능 잔기인 1급 아민을 리포좀 표면에 제공한다. 내피성장인자(EGF)와 같은 리간드를 PE-리포좀에 성공적으로 연결시킬 수 있다. 리간드는 리포좀 표면상의 이산 부위에 공유결합된다. 이러한 부위의 수 및 표면 밀도는 리포좀 제형 및 리포좀 종류에 따라 결정된다. 또한 리포좀 표면은 비공유 결합 부위도 갖는다. 리간드 및 리포좀의 공유 접합체를 형성하기 우해, 효과적이며 생체적합성을 지닌 가교-링커가 연구되고 있다. 가교-링커에는 글루타르알데히드(GAD), 이관능성 옥시란(OXR), 에틸렌 글리콜 디글리시딜 에테르(EGDE) 및 수용성 카보디이미드(바람직하게는 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카보디이미드(EDC))가 포함된다. 가교결합의 복잡한 화학반응을 통해, 인지 물질 및 리포좀의 아민 잔기 결합이 이루어진다.

i. 표적 리간드

표적 리간드는 복합체의 친수성 부분의 반응성 말단 그룹에 연결하거나 복합체의 소수성 부분에 고정시킬 수 있다. 표적 리간드는, 예를 들어 친수성 중합체의 원거리 말단상의 반응성 그룹에 연결시킴으로써 리포좀에 결합시킬 수 있다. 바람직한 반응성 그룹에는 아미노 그룹, 카복실 그룹, 하이드라지드 그룹 및 티올 그룹이 있다. 당분야의 숙련가에게 공지된 유기 화학의 표준방법에 의해 친수성 중합체에 표적 리간드를 커플링시킬 수 있다. 특정 양태에서, 표적 리간드의 총 농도는 약 0.01 내지 약 10%mol이다.

표적 리간드는 표적 영역의 특징적인 성분에 특이적인 리간드이다. 바람직한 표적 리간드에는 단백질(예: 폴리클로날 또는 모노클로날 항체, 항체 단편 또는 키메라 항체, 또는 효소), 호르몬 또는 당(예: 단당류, 올리고당류 및 다당류)이있다(참조문헌: Heath et al., 1986). 예를 들어, 디시알로강글리오사이드 GD2는 분리된 신경외배엽 유래의 종양(예: 신경모세포증, 흑색종, 폐소세포암, 신경교종 및 몇몇 육종)의 종양 항원이다(참조문헌: Cheresh et al., 1986, Schulz et al., 1984). 항-디시알로강글리오사이드 GD2 모노클로날 항체를 포함한 리포좀을 사용하여 종양 항원 발현 세포에 리포좀을 표적화할 수 있다(참조문헌: Montaldo et al., 1999; Pagnan et al., 1999). 다른 비제한적인 예로 본원에서 참조문헌으로 인용된 미국 특허 제5,939,277호에는 유방암 및 부인암 항원 특이적 항체가 기술되어 있다. 또다른 비제한적 예로 참조문헌으로 인용된 미국 특허 제7,107,090호에는 전립선암 특이적 항체가 기술되어 있따. 따라서, 본 발명의 조성물 및 방법과 병행하면서, 본원에서 기술한 항체 또는 당분야의 통상의 숙련가에게 익히 공지된 항체를 사용하여 특이적 조직 및 세포 유형을 표적화할 수 있다. 본 발명의 특정 양태에서, 고려되는 표적 리간드는 인테그린, 프로테오글리칸, 당단백질, 수용체 또는 수송체와 상호작용한다. 적합한 리간드에는 암과 같은 국소 병리의 결과로서 순환에 노출된 표적 기관의 세포 또는 표적 기관의 구조에 대해 특이적인 모든 것이 포함된다.

본 발명의 특정 양태에서, 세포의 형질도입을 향상시키거나, 표적 세포의 형질도입을 향상시키거나, 또는 목적이 아닌 세포의 형질도입을 제한하기 위해, 항체 또는 사이클릭 펩타이드 표적 잔기(리간드)를 지질 복합체와 결합시킨다. 이러한 방법은 당분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 특이적으로 포유류 중추신경계의 세포를 표적으로 하는 리포좀이 또한 기술되어 있다(참조문헌: 미국 특허제5,786,214호). 리포좀은 필수적으로 N-글루타릴포스파티딜에톤올아민, 콜레스테롤 및 올레산으로 구성되는데, 이때 신경교에 특이적인 모노클로날 항체가 리포좀에 접합되어 있다. 모노클로날 항체 또는 항체 단편을 사용하여 포유동물의 특정 세포, 조직 또는 기관(예: 뇌, 심장, 폐, 간 등)에 표적을 전달할 수 있다.

또한, 본 발명의 화합물은 지질 또는 리포좀을 포함하는 비히클의 표적화 및/또는 수용체 매개된 전달을 통해 표적 세포에 전달할 수 있다. 이는 표적 세포에서 일어날 수 있는 수용체 매개된 세포내이입에 의해 거대분자를 선택적으로 흡수할 수 있다는 장점이 있다. 다양한 수용체의 세포형 특이적 분포 측면에서, 이러한 전달방법은 본 발명에서 각각 다른 정도의 특이성을 부여한다.

따라서, 본 발명의 특정 양태에서는 표적 세포 집단에서 특이적으로 발현하는 수용체에 상응하도록 리간드를 선택한다. 본 발명의 화합물의 세포 특이적 전달 및/또는 비히클 표적화는 리포좀과 연관되어 있는 특이적 결합 리간드를 포함할 수 있다. 전달될 화합물은 리포좀내에 저장되고 특이적 결합 리간드는 리포좀 막내로 기능적으로 혼입된다. 이에 따라, 리포좀은 표적 세포의 수용체에 특이적으로 결합하고 함유물을 세포에 전달한다. 이러한 시스템은, 예를 들어 핵산을 세포로 전달하는 수용체 매개된 전달법에서 내피성장인자(EGF)가 사용되어 EGF 수용체를 상위 조절하게되는 시스템를 이용하여 기능하는 것으로 나타났다.

특정 양태에서, 수용체 매개된 전달 및/또는 비히클 표적화는 세포 수용체 특이적 리간드 및 결합제를 포함한다. 다른 것은 전달한 변형 단백질 또는 변형 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 가동가능하게 부착시킨 세포 수용체 특이적 리간드를 포함한다. 예를 들어, 몇몇 리간드는 기술 작동법이 정립된 수용체 매개된 유전자 전달에 사용된다(참조문헌: Wu 및 Wu, 1987; Wagner et al., 1990; Perales et al., 1994; Myers, EPO 제0273085호). 또다른 예로 다른 포유류 세포 유형에서 특이적인 전달이 기술되어 있다(참조문헌: Wu 및 Wu, 1993).

또다른 양태에서, 특이적 결합 리간드는 세포 특이적 결합을 지시하는 당단백질 또는 하나 이상의 지질을 포함할 수 있다. 예를 들어, 락토실-세라마이드인 갈락토스-말단 아시알강글리오사이드를 리포좀으로 혼입시키면 간세포에 의한 인슐린 유전자 흡수가 증가한다(참조문헌: Nicolau et al., 1987). 말단 갈라토실 잔기를 포함한 아시알로당단백질인 아실알로페투인이 리포좀을 간에 표적화시킬 수 있음이 또한 입증되었다(참조문헌: Spanjer 및 Scherpof, 1983; Hara et al., 1996). 폴리펩타이드 골격에 결합하는 경우, 당인 만노실, 푸코실 또는 N-아세틸 글루코사민은은 만노스 수용체에 높은 친화성을 나타내며 결합하다(참조문헌: 미국 특허 제5,432,260호). 유사한 방법으로 본 발명의 세포 또는 조직 특이적 형질전환 작제물을 표적 세포로 특이적으로 전달할 수 있다.

다른 예로, LDL 수용체 관련 단백질(예: 아포지단백질 E3("ApoE"))을 표적으로 하는 락토실 세라마이드 및 펩타이드가 리포좀을 간으로 표적화하는데 유용하다(참조문헌: Spanjer 및 Scherphof, 1983, 제WO 98/0748호).

엽산염 및 엽산염 수용체가 또한 세포내 표적화에 유용한 것으로 기술되어 있다(참조문헌: 미국 특허 제5,871,727호). 이의 예로, 비타민 엽산염을 복합체와 커플링시킨다. 엽산염 수용체는 이의 리간드와 친화성이 높으며, 폐, 유방 및 뇌종양을 포함한 몇몇 악성 세포주 표면에서 과발현된다. 메토트렉세이트와 같은 항-엽산염을 리간드 표적화에 사용할 수도 있다. 트랜스페린 매개된 전달 시스템은 트랜스페린 수용체를 발현하는, 광범위한 복제 세포를 표적으로 한다(참조문헌: Gilliland et al., 1980).

c. 리포좀/핵산 혼합물

리포좀 조성물이 세포 또는 조직 특이적 핵산을 포함하는 경우, 이 기술을 본 발명에 적용할 수 있다. 특정 양태에서, 지질 기본의 비바이러스성 제형은 바이러스 유전자치료에 대란을 제공한다. 다수의 세포 배양 연구가 지질 기본의 비바이러스 유전자 전달로 입증되었지만, 지질 기본 제형을 통해 전신에 유전자를 전달하는데는 한계가 있다. 비바이러스성 지질 기본 유전자 전달의 주된 한계는 비바이러스성 전달 비히클을 포함하는 양이온성 지질의 독성에 있다. 리포좀의 생체내 독성은 시험관내 및 생체내 유전자 전달 결과간의 불일치성을 부분적으로 설명한다. 모순된 이러한 데이타를 만드는 또다른 인자는 혈청 단백질의 존재여부에 따라 리포좀 안정성이 달라지는 점이다. 리포좀과 혈청 단백질간의 상호작용은 리포좀의 안정성에 대단한 영향을 미친다(참조문헌: Yang 및 Huang, 1997). 양이온성 리포좀은 음전하로 하전된 혈청 단백질을 유인하여 이와 결합한다. 혈청 단백질이 피복된 리포좀은 용해되거나, 대식세포에서 흡수되어 순환계로부터 제거된다. 현재의 생체내 리포좀 전달방법은 에어로졸화, 피하, 피내, 종양내 또는 두개내 주사를 이용하여 순환시 양이온성 지질과 관련된 독성 및 안정성 문제를 피하고 있다. 리포좀과 혈장 단백질간의 상호작용이 시험관내(참조문헌: Felgner et al., 1987) 및 생체내 유전자 전달(참조문헌: Zhu et al., 1993; Philip et al., 1993; Solodin et al., 1995; Liu et al., 1995; Thierry et al., 1995; Tsukamoto et al., 1995; Aksentijevich et al., 1996) 효능간에 차이를 만든다.

단일 세포 특이적 마커가 결여된 세포에 바이러스 입자를 표적화시키기 우한 방법의 예가 미국 특허 제5,849,718호에 기술되어 있다. 이 방법에서는, 예를 들어 항체 A는 종양과 또한 정상 심장 및 폐 조직에 대해 특이적이지만, 항체 B는 종양과 또한 정상 간세포에 대해 특이적이다. 항체 A 또는 항체 B를 단독으로 사용하여 종양에 항증식성 핵산을 전달하면, 심장, 폐 또는 간세포에 원치않는 손상이 발생할 수도 있다. 그러나, 항체 A 및 항체 B를 함께 사용하여 세포 표적을 개선시킬 수 있다. 따라서, 항체 A를 항증식성 핵산을 암호화하는 유전자와 커플링시키고 수용체 매개된 흡수 시스템을 통해 종양과 심장 및 폐 조직에 전달한다. 그러나, 이 유전자는 필수적인 전사인자가 결핍되어 있어 상기한 세포에서는 전사가 일어나지 않는다. 항체 B는 항증식성 핵산의 전사에 필수적인 전사인자를 암호화하는 공통 활성 유전자에 커플링시키며 종양 및 간세포에 전달한다. 따라서, 심장 및 폐 세포에 불활성 항증식성 핵산만이 전달되어 전사가 일어나지 않아 어떠한 역효과도 발생하지 않는다. 간세포에는 전사인자를 암호화하는 유전자가 전달되고 전사가 일어나지만, 항증식성 핵산 유전자가 존재하지 않기 때문에 어떠한 영향도 미치지 않는다. 그러나, 종양 세포에는 유전자 모두가 전달되고 전사인자가 항증식성 핵산의 전사를 활성화시켜 종양 특이적 독성 효과를 나타낸다.

과증식성 질환을 치료하기 위해 유전자 전달용 표적 리간드를 부가하면, 유전자 생성물이 비표적 시스템보다 독성이 있는 유전자를 전달할 수 있다. 전달될 수 있는 독성 유전자의 예로는, 바이러스 및 다른 병원체 유래된 유전자(예: 프로드럭 6-메틸퓨린 데옥시리보사이드를 독성있는 퓨린 6-메틸퓨린으로 전환하는 소위 "자살 유전자"로 불리는 이. 콜라이 퓨린 뉴클레오사이드 포스포릴라제 및 아데노바이러스 E4orf4)와 더불어 세포소멸전 유전자(예: Bax 및 Bak)가 포함된다. 프로드럭 치료에서 사용되는 자살 유전자의 다른 예로는 이. 콜라이 시토신 데아미나제 유전자 및 HSV 티미딘 키나제 유전자가 있다.

비표적 또는 표적 지질 복합체를 사용하여 재조합 또는 변형 바이러스를 생체내에서 생성할 수도 있다. 예를 들어, 두가지 이상의 플라스미드를 사용하여 레트로바이러스 서열과 함께 치료 유전자를 과증식성 세포로 도입시킬 수 있다. 한가지 플라스미드로부터 트랜스 형태로 제공되는 레트로바이러스 단백질은 두번째 치료 유전자 운반 플라스미드의 패키징을 가능하게 한다. 따라서 형질도입된 세포는 치료 유전자를 운반하는 비복제 레트로바이러스 생산 부위가 된다. 그런 다음, 이러한 레트로바이러스는 인접 세포를 감염시킬 수 있다. 치료 유전자의 프로모터는 유도성 또는 비유도성이거나, 조직 특이적 또는 조직 비특이적일 수 있다.

유사하게, 전달된 핵산은 바이러스 게놈(예: 아데노바이러스 E1a 또는 E2b 영역의 전부 또는 일부가 결여되어 있고, E1a 및/또는 E1b 영역으로부터 전사를 유도하는, 하나 이상의 조직 특이적 또는 유도성 프로모터를 갖는 아데노바이러스 게놈)을 조건부로 복제하거나 복제 능력이 있는 DNA일 수 있다. 이러한 복제 또는조건부 복제 핵산은 종양 억제 유전자 또는 항종양유전자와 같은 부가의 치료 유전자를 포함하거나 포함하지 않을 수 있다.

d. 지질 투여

환자에게 투여할 지질 조성물(예: 리포좀 변형 단백질 또는 변형 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드)의 실제 용량은 체중, 질환의 중증도, 환자의 특발성 및 투여 경로와 같은 물리적 및 생리학적 인자에 의해 결정할 수 있다. 상기한 바를 고려하여, 특정 피검체에 대한 지질 조성물의 용량 및 치료방법을 용이하게 결정할 수 있다.

V. 실시예

하기 실시예는 본 발명의 특정 양태를 입증하기 위한 것이다. 당분야의 숙련가라면, 본 발명자에 의해 발명된 대표적인 기술을 따르는 실시예의 기술들로 본 발명을 잘 실행할 수 있으며, 이 기술들이 본 발명에 있어서 실시방법을 구성할 수 있음을 인지할 것이다. 그러나, 본 발명의 측면에서 당분야의 숙련가라면, 기술된 특정 양태를 다양하게 변화시킬 수 있으며, 본 발명의 범주 및 요지를 벗어나지 않으면서 동일하거나 유사한 결과를 수득할 수 있음을 인지할 것이다.

실시예 1

연속 결실 연구

재조합 겔로닌(서열 2)를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 주형으로 사용하여 독소를 제조한다. rGel의 서열 분석 및 구조 모델결정은 분자 다수가 주름진 판상, 베타 코일 및 헤어핀 루프로 폴딩됨을 보여준다. 본 연구에 따르면, 아미노산 200번 내지 277번(C-말단)은 이의 B쇄의 RTA의 결합구와 유사하게 결합 포켓으로 폴딩되는 것으로 나타났다. rGel이 B 쇄를 갖지 않기 때문에 "결합구"는 이론상 독소의 흔적 부분으로 이 단백질의 생물학적 활성에는 불필요할 수 있다.

도 3A 및 도 3B, 및 표 7에 나타낸 바와 같이 C-말단 및 N-말단에서 rGel을 암호화하는 cDNA 분자의 연속 결실 돌연변이가 만들어졌고 CFR1901-CFR1905라 지정하였다. 예비 연구에서는, 작제물 CFR 1904, 1905, 2001, 2007 및 2024은 토끼 망상적혈구 용해물 분석(Rabbit Reticulocyte Lysate Assays; RRLA)에서 검출가능한 활성이 입증되었다. 이러한 작제물은 "활성" 독소 분자 범주로 간주되는 CFR 1888 보다 10⁵내지 10³낮은 활성을 나타내었다(참조문헌: Munishkin et al., 1995).

CFR1901

아미노산 1번 내지 46번이 결실된 CFR 1901을 만들기 위해, pX2 벡터(원래 pET-22b계; Novagen, Inc.)에 포함된 CFR 1888의 정제된 cDNA 1㎍를 제한 엔도뉴클레아제 NcoI 및 SmaI(Boeringer-Mannheim) 50단위로 분해한다. 5' NcoI 부위의 돌출된 단편은 멍빈(Mung Bean) 뉴클레아제(New England Biolabs) 1단위를 부가하여절단하고 30℃에서 0.5시간 동안 항온처리한다. Qiagen PCR 정제 키트를 사용하여 멍빈(Mung Bean) 뉴클레아제를 제거한다. 수득한 DNA는 3' 블런트 SmaI 부위에서 연결하여 원형을 만든다.

CFR1902

CFR 1888은 NcoI 및 ClaI 제한 엔도뉴클레아제로 분해한다. 재연결전 부위를 블런트로 만들기 위해, 3' 돌출된 곳은 Klenow 효소(New England Biolabs)를 사용하여 말단을 충전함으로써 정확한 판독 프레임을 구성한다.

단백질 발현의 경우, 플라스미드 DNA 50ng으로 CL21(DE3)pLysS 컴피턴트 이. 콜라이 숙주 세포(Novagen, Inc.)를 형질전환시킨다. 개별적인 콜로니를 선택하고, 암피실린(Sigma Chemical Co.) 200㎍/㎖를 함유한 루리아 브로쓰(Luria Broth) 100㎖중에서 진탕시키면서 37℃에서 OD₆₀₀이 0.6 내지 0.8이 될 때까지 성장시킨다. 그런 다음, IPTG를 배양물에 가하여 재조합 단백질을 유도하여 0.1mM의 최종 농도에 이르게 한다. 배양물은 원심분리하여 수집하기 전까지 37℃에서 2시간 더 항온처리한다.

실시예 2

항원성 선형 펩타이드 도메인 지도

rGel 분자상의 항원성 도메인은 이전에 기술된 적이 없었다. rGel 분자의 항원성 도메인은 분자의 탄수화물 또는 펩타이드 서열에 좌우될 수 있다. 세균에서 생산되는 재조합 rGel은 단백질 글리코실화가 일어나지 않기 때문에 rGel에 대해 지시된 항체는 분자상의 펩타이드 도메인을 인지한다.

rGel 분자상의 항원성 도메인을 확인하기 위해, 직업상 재조합 겔로닌에 노출된 실험자의 혈청으로부터 사람 폴리클로날 항체를 먼저 분리한다. 3명의 실험자로부터 입수한 혈청은 rGel로 피복시킨 96웰 ELISA 플레이트에 가한다. 그런 다음, 항-사람 항체를 사용하여 플레이트를 전개하여 사람 항-겔로닌 항체의 존재여부를 확인한다. 3명의 실험자중 2개의 혈청에서 대조 사람 항체의 것과 비교시 상당한 항체 역가가 나타났다(도 1). 이들 두명의 작업자의 혈청 20㎖를 수득한 다음, rGel을 포함한 Affi-gel 친화성 수지를 사용하는 친화 크로마토그래피로 폴리클로날 사람 항-겔로닌 항체를 수득한다.

전장 rGel를 포함하는 10개의 펩타이드를 합성한 다음, 96웰 플레이트에 이를 피복시킨다. 사람 항-겔로닌 항체 용액을 플레이트에 가하여 반응시키고, ELISA를 이용하여 펩타이드 피복된 웰에 결합된 사람 항체의 존재여부를 평가한다. 도 2에 나타낸 바와 같이, 23번 내지 53번(도메인 1), 72번 내지 89번(도메인 2), 181번 내지 198번(도메인 3) 및 223번 내지 252번(도메인) 펩타이드에서 폴리클로날 항체의 유의한 반응성이 수득되었다. 디자이너 독소 CFR-2001-2024는 겔로닌에 대한 사람 폴리클로날 항체에 의해 특이적으로 인지되는 상기한 도메인이 결실되도록 디자인한다.

실시예 3

항원성 서열의 사람 서열로의 대체

겔로닌 분자중 상기한 4개의 특이적 항원성 도메인(아미노산 205번 내지 257번, 23번 내지 42번, 71번 내지 88번 및 189번 내지 204번)을 확인하기 위해, 상기한 사람 항-겔로닌 항체를 사용하여 수득한 항원성 도메인에 관한 정보를 이용하여 사람/식물 키메라 분자를 디자인한다. 상기한 서열은 진퀘스트/블라스트(GenQuest/blast) 데이타 베이스를 사용하여 추가 분석하여 공지된 사람 단백질에 대한 동종성을 조사한다. 본 연구에서는 디자인된 독소 분자중 "사람" 동종성 서열을 확인할 뿐만 아니라 이러한 서열을 정렬시켜, 수득한 하이브리드 분자의 효소(n-글리코시딕) 작용을 유지하는 것도 고려한다.

디자이너 독소중에 삽입하기 위한 4개의 후보를 데이타베이스로부터 확인하고 아미노산 변화에 대한 기준으로 사용한다(표 8). 도메인 1의 사람 동종 서열은, 아연 결합 도메인을 갖는 혈액 그룹 단백질인 사람 KELL 단백질과 동종성이 높다(40%). 흥미롭게도, 천연 겔로닌의 초기 연구는 이 분자가 아연과 결합할 수 있음을 제시하고 있지만(참조문헌: sPERTI ET AL., 1986) 아직 확인된 바가 없다. 도메인 4(아미노산 189번 내지 204번)의 분석으로 사람의 간 기능에 있어 보조인자로 중요한 사람 CFAH 단백질과 동종성(40%)이 있음이 입증되었다. 도메인 2(아미노산 23번 내지 42번)의 동종성 조사로, 세포내 혈장막의 세포골격 지지에 중요한 사람 UTRO 단백질과 44%의 동종성이 있는 것으로 나타났다.

항원 부위 변형 및 결실을 포함한 디자이너 독소는 도메인 3에서 추가 변형시키면 사람 KELL 단백질과 100% 일치한다는 것이 확인되었다. KELL 서열이 측면에 위치한 디자이너 분자의 아미노산을 조절하여 전장 KELL 단백질 서열 정렬과 거의 유사하게 만든다. 도메인 3을 대체하기 위해 디자인된 최종 서열은 표 8에 나타내었다. 표 9는 사람 동종성 단백질을 포함하는 전장 단백질에 대한 Gen Bank 서열 동종성 조사결과를 나타낸 것이다.

본 연구의 결과는, 초기 주형으로서 재조합 겔로닌을 사용하면 특별한 결실을 디자인해 작제하고 시험할 수 있다는 것을 명백하게 입증한다.

실시예 4

디자이너 겔로닌 독소

하기에서는 상기한 실시예에 기술한 방법을 사용하여 겔로닌 독소를 작제하는 방법을 기술할 것이다.

결실 독소

CFR 1888

본 발명의 재조합 겔로닌 주형으로부터 시작하여, 원래의 KDPE의 C-말단을 KDEL으로 변형시켜 세포내 리보좀 구획에 대한 단백질의 세포내 추적을 용이하게 한다.

CFR 1901-1905(표 7 및 도 3A 참조)

CFR 1888을 주형으로 사용하여 N-말단 및/또는 C-말단으로부터 일련의 연속 결실 돌연변이를 생성시킴으로써, 생물학적 활성에 영향을 미치지 않으면서 결실이 일어나는 분자 부분을 결정한다. 도 3A에 나타낸 바와 같이, 개별적인 결실 1901, 1902 및 1903은 불활성인 것으로 나타난다. 그러나, 단일 결합을 조합하는 경우(CFR 1904 및 CFR 1905) 생물학적 활성이 재정립된다(도 3A).

CFR 2018

CFR 1888을 주형으로 사용하여, 표 7에 나타낸 바와 같이 단백질을 추가 변형시켜 보다 작은 분자를 만들고 C-말단에 알라닌 잔기를 추가하여, 세균 숙주에서 단백질이 생성되는 동안의 생체내 안정성을 개선시킨다.

항원 연구을 기본으로 한 독소

분자상의 항원성 도메인은 겔로닌 분자를 포함하는 선형 펩타이드를 사용하여 지도를 작성한다. 도 1에 나타낸 바와 같이, 사람 폴리클로날 항-겔로닌 항혈청은 분자상의 개별적인 4개의 항원성 도메인을 보여준다. 도메인 1은 아미노산 205번 내지 257번을 포함하고 도메인 2는 아미노산 23번 내지 42번으로 이루어져있으며 도메인 3은 아미노산 71번 내지 88번을 포함하며 도메인 4는 아미노산 89번 내지 204번을 포함한다.

CFR 2001-2024

도 3B에 나타낸 바와 같이, 관찰된 항원성 도메인을 기본으로 하여 6개의 결실 돌연변이를 만든다. 3개의 단백질은 불활성인 반면 또다른 3개의 단백질은 생물학적 활성을 나타낸다.

CFR 2019-2042

대체 연구에서는 사람/식물 키메라 분자를 만든다. 4개의 항원성 도메인은 서열 분석을 위해 진뱅크(GenBank)에 제출하였다. 스위스프로트(Swissprot) 단백질 서열을 조사하여, 상기한 4개의 항원성 도메인을 기본으로 하는 사람의 동종성 서열을 찾는다.

사람 동종성 서열

사람 혈액 그룹 단백질 KELL(P23276)중에서 서열지도를 작성하여 도메인 1(아미노산 205번 내지 257번)을 밝혀내었다. 이 서열은 상기 단백질과 40% 동일하고 65% 양성인 것으로 나타났다.

도메인 2(아미노산 23번 내지 42번)는 사람 UTRO 단백질(P46939)과 44% 일치하는 것으로 나타났다.

도메인 3(아미노산 71번 내지 88번)의 경우, 이 서열은 사람 단백질 MAOM(P23368)과 37% 일치하고 68% 양성인 것으로 나타났다. 이 단백질은 표 8에 기술하였다.

도메인 서열 4(189번 내지 204번)의 경우, 사람 단백질 CFAH(P08603)과 40% 일치하는 것으로 나타났다.

4개의 항원성 도메인에 상응하는 사람 키메라 서열을 상이한 데이타로부터 만든다(표 8). 이 서열은 식물 단백질의 항원성 도메인 대신 사람 비항원성 서열로 대체된 것이다.

CFR 2019-2024

CFR 2019 및 2024를 주형으로 시작하여, CFR 2019-2042로 지정된 다수의 신규한 디자이너 단백질을 제조한다(표 7). 이 단백질은 분자중 1번, 2번, 3번 또는 4번 도메인이 사람 키메라 동족체로 대체된 것이다. 이들 디자이너 독소중 몇몇(CFR 2018, 2019, 2024 및 2025)은 50kDa 태그 함유 세균에서 발현시키고 정제하여 동종성을 조사한다. 택에 대한 폴리클로날 항혈청을 사용하여 웨스턴 분석을 실시한다.

2019, 2024 및 2025는 시작 주형 2018 단백질에 비해 크기가 감소되었다. 또한 웨스턴 분석은, SDS-PAGE상에서 각각의 독소 분자에 일정하게 로딩된 항-태그항체에 대해 단백질이 거의 동등한 반응성이 나타난다는 것을 입증하였다. 웨스턴 블롯은 본래의 CFR 1888 분자에 대한 항체를 사용하여 다시 프로브를 결합시킨다. 웨스턴 블롯에 의해 나타난 바와 같이 2018 단백질에 대한 항체 반응성은 우수하지만, 2019 및 2025 디자이너 독소에 대한 폴리클로날 항체는 실제 반응성이 없으며 2024 디자이너 독소에 대해서는 반응성이 약간 있다. 특이적 결실(CFR 2024) 또는 항원성 도메인(CFR 2019) 대체, 또는 항원성 도메인(CFR 2025)의 결실 및 대체에의해, 모분자에 대한 항체에 의해 실제 인지되지 않아 항원성 측면이 감소된 신규한 독소 분자를 생성할 수 있다.

CFR 2143-2146

단백질 CFR 1888 및 CFR 2018의 최적의 기능을 포함하도록 일련의 하이브리드 분자를 디자인한다.

CFR 2247-2458

선택된 전세포소멸 사람 분자(예: BAX 및 GranzymeB)와 유형 I 독소의 n-글리코시딕 기능이 결합된 일련의 분자를 개발한다. 이 분자에서 겔로닌 성분의 활성 기능 및 BAX 및 그랜자임 B(Granzyme B)의 활성을 평가한다. 세포 부재 단백질 합성 억제에 대한 이의 효과를 평가한다.

세포중 BAX의 발현과 관련하여 일련의 분자상에서 먼저 평가를 실시한다. 이는 면역검정(예: 면역침전 또는 웨스턴 블롯팅)에서 항-공통 Bax 6A7과 같은 BAX 항체를 사용하여 실시할 수 있다. Bax 발현이 확인되면, 세포의 생존력을 측정한다. 이는 개똥벌레 루시퍼라제 작제물 사용을 포함한 여러가지 방법으로 실시할 수 있다. 이를 위해 포유류 세포주를, 개똥벌레 루시퍼라제(Luc) 구조 유전자를 운반하는 포유류 발현 벡터 pGL3(Promega)와 BAX 및 BAX 융합 단백질을 암호화하는 플라스미드로 형질감염시킨다. 루시퍼라제 활성은 세포 추출물 20㎖를 사용하여 액체 섬광측정기로 측정할 수 있다. 확인된 대조 플라스미드와 비교하여 시험 작제물의 상대적인 루시퍼라제 활성으로서 세포 생존력을 측정할 수 있다.

그랜자임 B 폴리펩타이드의 전부 또는 일부를 포함하는 하이브리드는, L-글루타밀-2-나프틸아미드(Bachen, Philadelphia, PA)를 가수분해한 후 2-나프틸아민을 형광측정하여 이의 효소 활성을 평가한다. 아미드 활성은 340㎚에서 형광 여기 가 일어나며 415㎚에서 형광 방사(모두 5㎚ 대역)가 관찰되는 Perkin-Elmer 650-10M 분광형광계상에서 완충액 A(1M NaOH, 1mM Na₂EDTA 0.05M(v/v), Triton x-100을 사용하여 pH를 7.0로 조절한 0.1M HEPES, 0.3M NaCl)중 1.00mM L-글루타밀-2-나프틸아미드를 사용하여 21℃에서 측정한다. 소량의 효소 용액 분취량을 기질 용액에 가하고, 형광 방사 증가를 10 내지 40분 동안 모니터한다. 또한 그랜자임 B 활성은 기질로서 BAADT(N-a-t-부톡시카보닐-L-알라닐-L-알라닐-L-아스파르틸-티오벤질 에스테르)를 사용하여 연속 비색 검정으로 측정한다. 컬럼 분획 분석의 경우, (CH₃)₂50중 1M(v/v) 10mM BAAST 및 (CH₃)₂50중 1M(v/v) 11nM 디티오비스(2-니트로벤조산; Sigma)와 함께 1 내지 50㎕를 21℃에서 완충액 A에 가하고, Thermomax plate 판독기(Thermomax plate reader; Molecular Devices Inc., Palo Alto, CA)상에서 405㎚에서 흡광도 증가를 측정한다. 흡광도 증가를 효소률로 전환시킨다.

실시예 4

실시예 5를 위한 방법 및 재료

재료

키트(Novagen, Madison, WI; Invitrogen Corp., Carlsbad, CA)를 사용하여, 쥐의 항체를 발현하는 하이브리도마 세포로부터 수득한 하이브리도마 RNA로부터 항체 ZME-018을 암호화하는 cDNA를 증폭시킨다. PCR 시약을 구입하고(Fisher Scientific, Pittsburgh, PA) 분자 생물 효소를 구입한다(Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN; 또는 New England Biolabs, Beverly, MA). 세균 균주 및 pET 세균 발현 플라스미드를 구입하고(Novagen, Madison, WI) 성장 배지도 구입한다(Difco Laboratories, Detroit, MI). 모든 화합물 및 시약을 구입한다(Fisher Scientific 또는 Sigma Chemical CO, St. Louis, MO). 금속 친화성 수지(Talon)을 구입한다(Clontech Laboratories, Palo Alto, CA). 다른 크로마토그래피 수지 및 재료도 구입한다(Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ). 조직 배양 시약도 구입한다(GIBCO BRL, Gaithersburg, MD).

항체 ZME-018의 VH 및 VL 도메인 클로닝

항체 ZME-108(IgG2A)을 발현하는 쥐 하이브리도마 FMT 112 P2의 전령 RNA는 인비트로젠 패스트 트랙(Invitorgen fast Track) 키트를 사용하여 분리하고, 특별한 조건에서 인비트로젠 카피(Invitrogen Copy) 키트를 사용하여 cDNA로 전사시킨다. 항체 경쇄 및 중쇄 가변 영역은 마우스 Ig 프라이머 세트가 있는 노보젠(Novagen) Ig-Prime 키트를 사용하여 증폭시킨다. 경쇄 증폭에 있어서 PCR 조건은 다음과 같다: 94℃ x 1분, 60℃ x 1분 및 72℃ x 1분을 30회 반복하고 마지막 5분은 72℃에서 항온처리. 중쇄 반응의 경우, 어닐링 온도가 60℃가 아닌 50℃인 것을 제외하고도 상기와 동일한 조건을 사용한다. 이 과정을 통해 증폭시킨 DNA는 추가 정제없이 인비트로젠(Invitrogen) T/A 클로닝 벡터 pCRII에 클로닝하고이. 콜라이 XL1-Blue를 형질전환시킨 후, 청색-백색 선별 과정을 이용하여 확인한다. 양성 클론(각각 5개의 중쇄 및 경쇄 라이브러리)은 T7 및 SP6 프로모터 프라이머를 사용해 서열분석하고, 항체 도메인과 다른 면역글로블린 서열과의 동종성을 확인한다.

단일쇄 항체 scfvMEL 및 면역독소 scfvMEL/rGel을 암호화하는 유전자 작제

경쇄 및 중쇄 DNA 클론을 주형으로 사용하여 2단계 스플라이싱-중복 연장 PCR 방법(참조문헌: Sambrook et al., 1989)에 의해 단일쇄 항체 ZME-018을 작제한다. 경쇄 서열은 프라이머 A(5'-GCTGCCCAACCAGCC ATGGCGGACATTGTGATG-3') 및 C(5'-GCCGGAGCCTGGCTTGC(A/C)GCTGCCGCTGGTGGAGCCTTTGATC(A/T)CCAG-3')를 이용하여 증폭시키고, 중쇄 DNA는 프라이머 B(5'-AAGCCAGGCTCCGGCGAAGGCAGCACCAAAGG CGAAGTGAAGGTT-3') 및 D(5'-GCCACCGCCACCACTAGTTGAGGAGACTGT-3')를 이용하여 증폭시킨다. 각 반응 세트의 PCR 조건은 다음과 같다: 94℃에서 1분간 변성, 50℃에서 1분간 어닐링 및 72℃에서 1분간 신장시키는 것을 30회 반복하고 마지막 5분은 72℃에서 항온처리. 각각의 반응물의 1/10용적을 합하고, 이전과 동일한 조건으로 프라이머 A 및 D만을 사용하여 두번째 PCR을 직접 실시한다. 최종 생성물은 진 클린(Geneclean II; Bio 101, Vusta CA)를 사용하여 정제하고, 제한효소 NcoI 및 SpeI을 사용하여 분해한 다음, T7계 플라스미드 벡터 pET-22b에 클로닝한다. scfvMEL 및 재조합 겔로닌을 암호화하는 유전자는, 주형으로써 항체 및 겔로닌 DNA, 및 프라이머 NbsphZME(5'-GGCGGTGGCTCCGTCATGACGGACATTGTGATGACCCAGTCTCAAAAATTC-3'), 프라이머 NTXOM(5'-GGTGGCGGTGGCTCCGGTCTAGACACCGTGACG-3') 및 프라이머 XOMBAC(5'-AAGGCTCGTGTCGACCTCGAGTCATTAAGC TTTAGGATCTTTATC-3')를 이용한 스플라이싱-중복 연장 PCR 방법을 사용하여 서로 융합시킨다(도 4). 그런 다음, 정제한 PCR 생성물을 정제하고 상기한 바와 같이 분해한 다음, 벡터 pET-32a에 클로닝한다. 서열분석한 DNA 클론으로 융합 독소 발현을 위해 노보젠(Novogen)으로부터 구입한 이. 콜라이 균주 AD494(DE3) pLys S를 형질전환시킨다.

이. 콜라이에서의 단백질 발현

면역독을 발현하기 위해, 강력한 항생제 선별능이 있는 2xYT 성장 배지(200㎍/㎖ 암피실린, 70㎍/㎖ 클로람페니콜 및 15㎍/㎖ 카나마이신)에서 세균 배양물을 37℃에서 항온처리하고 초기 로그 상태에 이를 때(A₆₀₀=0.4-0.8)까지 성장시킨다. 동일 농도의 항생제를 포함한 신선한 2xYT 성장 배지를 이용하여 배양물을 1:1로 희석시키고, 0.1mM IPTG를 가하여 23℃에서 16 내지 23시간 동안 표적 단백질 발현을 유도한다. 그런 다음, 유도된 세균 배양물을 원심분리하고 정제하기 전까지 -80℃에서 냉동 보관한다.

면역독/단백질 정제

면역독소 scFvZME-Gel을 발현하는 유도된 배양물 유래의 냉동 세균 펠렛을실온에서 해동시키고, 10mM Tris-HCl(pH 8.0)중 1㎎/㎖ 라이소자임을 가하여 4℃에서 30분 동안 용해시킨다. 세균 용해물은 각각 10초간 3회 초음파분해하여 세포를 파괴하고, 4℃, 14,000rpm에서 30분 동안 원심분리한다. 상층액을 분리하고 얼음상에서 저장하고, 세포 펠렛으로 초음파분해를 반복한다. 그런 다음, 두번째 용해물의 상층액을 합하고 4℃ SS-34 로터중 40,000rpm에서 45분 동안 한외원심분리한다. 가용성 단백질만을 포함한 샘플을 여과(공극 0.22㎛)한 다음, 1M Tris-HCl(pH 8.0)을 이용하여 40mM Tris-HCl로 조절한 다음, 동일 완충액으로 미리 평형시킨 탈론(Talon) 금속 친화성 컬럼에 이를 로딩한다. 로딩 후, 컬럼을 3배 컬럼 용적의 로딩 완충액으로 세척하고, 3배 컬럼 용적의 40mM Tris-HCl(pH 8.0), 500mM NaCl 및 5mM 이미다졸로 세척한다. 그런 다음, 결합된 단백질은 40mM Tris-HCl(pH 8.0), 500mM NaCl 및 100-200mM 이미다졸을 포함한 완충액 5배 컬럼 용적으로 용출시킨다. 면역독을 포함한 분획을 합하고 정량한 다음, 20mM Tris-HCl(pH 7.2), 50mM NaCl로 투석한 다음, 엔테로키나제로 분해하고 Novagen(Madison, WI)의 방법을 사용하여 6xHis 택을 제거한다.

ELISA 및 웨스턴 분석

별다른 언급이 없는한 모든 ELISA 항온처리 단계는 실온에서 1시간 동안 실시하고, 항온처리 사이에 모든 웰은 ELISA 세척 완충액(10mM Tris-HCl(pH 8.0), 150mM NaCl, 0.2% Tween-20)로 세척한다. 96웰 미세역가 플레이트의 웰은 각각 50,000gp240-항원-양성 A375M 흑색종 세포로 피복하고 건조시킨다. 그런 다음, 이를 탈수시키고 완충액중 3% BAS로 차단시킨다. 플레이트를 항온처리하고 정제된 면역독소 샘플, 토끼 항-겔로닌 폴리클로날 항체[희석 완충액(1㎎/㎖ 농도의 BSA를 포함하는 ELISA 완충액)중 100ng/㎖] 및 퍼옥시다제 접합된 염소 항-토끼 IgG(Sigma, 희석 완충액중 1:5,000배로 희석하여 사용)를 가한다. 각각의 웰을 세척 완충액으로 완전하게 세척한 다음, 30분 동안 0.1M 시트르산 완충액(pH 4.2)중 ABTS(2,2'-아지노-비스[3-에틸벤즈티아졸린-6-설폰산])로 발현시키고 405㎚에서 시그널을 측정한다.

웨스턴 블롯의 경우, 별다른 언급이 없는한 모든 항온처리는 실온에서 1시간 동안 실시한다. 간단히, 단백질을 SDS-PAGE로 분리하고, 40v에서 완충액(25mM Tris-HCl(pH 7.5), 190mM 글라이신, 20%(v/v) HPLC 등급의 메탄올)중 4℃에서 밤새 니트로셀룰로스로 이동시킨다. 필터를 웨스턴 차단 완충액(50mM Tris-HCl(pH 7.5), 150mM NaCl)중 5% BSA로 차단한 다음, 토끼 항-겔로닌 폴리클로날 항체(웨스턴 세척 완충액 TBS(pH R7.6) 및 0.5% Tween-20중 100ng/㎖의 농도) 및 퍼옥시다제 접합된 염소 항-토끼 IgG(Sigma, 세척 완충액에 1:10,000로 희석)와 연속적으로 반응시킨다. Amersham ECL 검출 시스템을 사용하여 시그널을 확인한다.

망상적혈구 용해물 시험관내 해독 검정

제조회사(Promega)가 명시한 바와 같고 상기한 바와 같이, 다양한 용량의 면역독을 투여한 후, 세포 부재 단백질 합성 시스템에서 단백질로 혼입된 방사능표지된(³H) 류신의 겔로닌 유도 억제를 실행한다(참조문헌: Press et al., 1986).

면역형광 염색

항원-양성(A375 흑색종) 세포는 챔버당 10⁴세포수로 폴리라이신 피복된 16웰 챔버 슬라이드(Nunc)에 가하고 5% CO₂대기하 37℃에서 밤새 항온처리한다. 세포는 다양한 시간 동안 scfvMEL/rGel 융합 작제물 50㎍/㎖ 농도로 처리한다. 세포를 PBS로 간단히 세척한 다음, 글라이신 완충액(500mM NaCl, 0.1M 글라이신, pH 2.5)과 10분 동안 항온처리하여 세포 표면에 결합된 단백질을 떼어내고, 0.5M Tris(pH 7.4)로 중화시키고 PBS로 간단히 세척한 다음, 3.7% 포름알데히드(Sigma)중 실온에서 15분 동안 고정시킨 다음, PBS로 간단히 헹군다. 세포는 0.2% Triton-X-100M을 함유한 PBS중에서 10분 동안 침지시키고, PBS로 3회 세척한 다음, 3% BSA를 함유한 PBS로 1시간 동안 실온에서 항온처리한다. PBS로 간단히 세척한 후, 토끼 항-scfvMEL, 또는 0.1% Tween-20 및 0.2% BSA를 함유한 PBS에 1:500으로 희석시킨 토끼 항-rGel 폴리클로날 항체와 실온에서 1시간 동안 항온처리한다. 0.1% Tween-20을 함유한 PBS(PBST)중에서 10분 동안 세포를 3회 세척하고, 3% BSA를 함유한 PBS로 실온에서 1시간 동안 차단한 다음, 1:100으로 희석시킨 플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC) 커플링된 항-토끼 IgG(Sigma)로 차단하나. 대조 세포는 2차 FITC-커플링된 항-토끼 IgG(1:100)만으로 항온처리한다. PBST로 최종 3회 세척한 후, PBS중에서 세포를 10분 동안 1회 세척하고 봉입 매질에 봉입시킨다. 슬라이드를 형광현미경으로 분석하고, 각가의 사진은 각 실험마다 400배 배율로 10곳 이상의 지역을 나타낸다.

시험관내 세포독성 검정

샘플은, 로그 상태(5,000/웰)의 항원-양성 A375M 및 항원-음성 Me-180 또는 SK-OV-3 세포 단층을 사용하고 이전에 기술한 바와 같은 크리스탈 바이올렛 염색방법을 사용하는 표준 72시간 세포 증식 검정으로 평가한다(참조문헌: Nishikawa et al., 1992).

생체내 세포독성 연구

4 내지 6주된 무흉선(누드) 마우스를 케이지당 5마리의 마우스 그룹으로 나눈다. 로그 상태의 A-375 사람 흑색종 세포(5x10⁶세포/마우스)를 오른쪽 옆구리 피하에 주사하고 종양을 만든다. 종양의 중량을 측정하고(약 30 내지 50㎟), 5일 연속 염수(대조) 또는 다양한 농도의 scfvMel/rGel 융합 독소으로 처리(꼬리 정맥내)한다. 동물을 모니터하고 30일 동안 종양을 측정한다.

실시예 5

겔로닌에 융합된 단일쇄 재조합 항-흑생종 항체

scfvMEL/rGel 융합 단백질의 디자인

ZME-018 항체에 대한 가변 영역 유전자 및 겔로닌 유전자(참조문헌: Rosenblum et al., 1999)가 항-흑색종 면역독소 유전자 작제의 주형이 된다. 제1 단계로서, 한 방향으로 면역독을 어셈블리하고, 항-양성 A375M 흑색종 세포에 대한 이의 결합 및 세포독성을 평가한다. 겔로닌 단편 및 항체를 암호화하는 유전자는 PCR 기본 방법을 사용하여 서로 결합시켜, 항체-겔로닌 방향의 융합체를 작제한다. 면역독소 유전자는 C-말단에 헥사히스티딘 서열이 연결되어 있고, 노보젠(Novagen) T7 기본의 발현 벡터 pET-32b를 사용하여 이. 콜라이 AD494(DE3) pLysS에서 발현시킨다.

도 4는 발현된 면역독의 방향을 기술하고 있으며, 또한 단백질 도메인 결합부에 있는 아미노산 링커 서열을 나타내고 있다. 항원은, V_HC-말단과 18개 아미노산 유연성 펩타이드 링커(참조문헌: Alfthan et al., 1995)를 갖는 단백질 N-말단에서의 경쇄 가변 영역(V_L)을 암호화하도록 작제한다. 겔로닌(CFR 2018)(본 실시예에는 rGel로도 언급됨)은, 다른 링커 다음에 있는 V_H의 하부스트림에 위치시킨다. 본 발명자들은 항체 결합 부위의 유연성이 방해받지 않는다는 이유로 이러한 형태를 선택하였다. 2가지 단백질 잔기의 최적의 공간 배향을 위해서는 융합 단백질의 N-말단에 독소가 있는 보다 긴 펩타이드가 필요하며, 이러한 변형체의 작제가 진행중이다. 최종 융합 유전자(도 5)의 DNA 서열분석 연구로, 최종 생성물의 서열과 PCR 방법으로 도입된 서열에 오차가 없음을 확인할 수 있다. 또한 서열분석으로 표적 유전자가 pET-32b 벡터의 정확한 판독 프레임에 삽입되었음을 확인할 수 있다.

재조합 겔로닌이 없는 시스템에 비해, 세포 부재 재조합 융합 독소 시스템에서의 단백질 합성 억제 활성은, 디자인된 본 발명의 모델에서 항체 단편의 접근성으로 인해 겔로닌 활성 부위 균열부에서 유의한 입체적 혼잡이 발생하지 않는다는 것을 나타낸다. 본 발명의 융합 작제물내에서는 단백질이 절단된 부위가 없기 때문에, 또한 데이타는 생물학적 활성을 유지하기 위해 작제물로부터 겔로닌을 절단할 필요가 없다는 것을 나타낸다. 이는 생물학적 활성을 회복하기 위해 단백질 담체로부터 분리될 필요가 있는 리신 A 쇄(RTA)를 이용한 연구와는 완전히 반대되는 결과이다(참조문헌: Kim et al., 1988; O'Hare et al., 1990). 겔로닌 및 RTA이 동일한 작용기전을 공유하고(참조문헌: Stripe et al., 1992) 또한 30%의 서열 동종성이 있으므로(참조문헌: Rosenblum et al., 1999) 이같은 사실은 놀라운 일이다.

융합 단백질의 발현 및 정제

융합 유전자를 포함하는 플라스미드 벡터 pET-32b로 이. 콜라이 AD494(DE2)pLysS를 형질전환키고 IPTG를 부가하여 표적 단백질을 유도한다. 쿠마씨 염색된 겔에서 나타나는 바와 같이, 예상 분자량(68kDa)의 단백질이 유도되었다. 이 단백질은 IMAC 수지를 사용하여 정제하고, 용출물은 재조합 엔테로키나제(EK)에 노출시켜 56kDa의 한개의 밴드로서 이동하는 최종 고유 융합 작제물을 수득한다. 융합 작제물은 또한 항-겔로닌 항체 및 항-단일쇄 항체를 사용하는 웨스턴 블롯으로 조사한다. 56kDa에서 이동하는 sfvMEL/rGel 융합 작제물은 상기한 항체 모두와 반응하는데, 이는 융합 작제물에서 독소 성분 및 면역반응성 항체가 존재한다는 것을 입증한다. 유도된 세균 배양물로부터의 가용성 sfvMEL/rGel 면역독의 추정 수율은 대략 700㎍/ℓ이지만, 정제한 최종 융합 독소의 수율은 약 200㎍/ℓ이다. 수율이 감소한 일차적인 이유는 이용가능한 가용성 표적 단백질 모두를 완전하게 포획하는 IMAC의 무능력함에 있었다. 결합 완충액 및 조건을 바꾸고 또한 IMAC 포획 수지를 종류를 바꾸어도 상기한 결과가 개선되지는 않았다.

면역독의 ELISA 결합

정제된 융합 단백질이 항원 결합 능력을 보유하는지 확인하기 위해, 항원 공급원으로 완전한 항원-양성 사람 흑색종 세포를 사용하는 경쟁 ELISA 기본 결합 검정으로 완전한 IgG ZME-018-겔로닌 화학 접합체 및 IgG ZME-018의 결합과 본 단백질의 결합을 비교한다(도 6). scfvMEL/rGel 융합 작제물은 화학 접합체에 상응할 만한 결합 친화성을 보유하는 것으로 나타났다. 본 단백질은 SK-OV-2 또는 ME-180 세포에 대해 배경 결합 수준을 지닌 A375M 흑색종 세포를 표적으로 하여, 특이적이고 중요한 ELISA 결합 활성이 있음이 입증되었다.

sfvMEL 융합 독소의 세포 부재 단백질 합성 억제 활성

융합 작제물로 혼입시 독소의 생물학적 활성이 상당히 손실될 수 있다. 융합 작제물의 rGel 성분의 n-글리코시드 활성을 조사하기 위해, 분리된 토끼 망상적혈구에 의해³H-류신을 혼입시키는 시험관내 단백질 해독 검정에 상기 물질을 가한다. 융합 작제물 및 고유 rGel에 대한 억제 곡선을 비교하면 두 분자에 대한 IC₅₀수치가 실질적으로 동일한 것으로 나타났다(각각 100pM 대 104pM).

면역형광법에 의한 scfvMEL/rGel의 결합 및 내부화

투여 후 각각 다른 시간에 A375-M 세포를 scfvMEL/rGel로 처리하여 면역형광 염색을 실시한다. 내부화된 작제물은 토끼 항-rgel 또는 토끼 항-scfvMEL 항체를 사용한 다음, FITC 커플링된 항-토끼 IgG를 사용하여 검출한다. 처리 후 세포질에서 scfvMEL/rGel 융합 단백질의 rGel 잔기가 먼저 관찰되었으며, 시간이 경과함에 따라 세포질중 rGel의 양이 증가하였다. 또한 scfvMEL/rGel의 scfvMEL 잔기가 세포질에서 관찰되었다. 이는 융합 작제물이 세포와 효율적으로 결합할 수 있으며 로그 상태의 세포에 노출된 후에 rGel 독소의 내부화가 일어났다는 것을 입증한다.

면역독의 시험관내 세포독성 활성

항-양성(A375M) 및 항-음성(SK-OV-3) 세포주에 대한 특이적 세포독성의 경우 scfvMEL/rGel 정제된 융합 단백질 및 본래의 ZME/rGel 화학 작제물로 시험한다. 도 7에 나타낸 바와 같이, 화학적으로 생산된 융합 작제물 둘다는 IC₅₀이 대략 10nM인 것으로 입증되었다. 이와 반대로 rGel 독소의 IC₅₀은 대략 200배가 더 높았다(약 2,000nM). 항-음성 SKOV-3 세포에 대한 면역독의 세포독성 효과는 겔로닌 단독의 효과와 유사하였다. 예상한 바와 같이 유리 ZME 항체를 scfvMEL/rGel 면역독과 함께 투여하면(도 8) 용량 반응 곡선이 약간 이동하는데, 이는 융합 작제물의 세포내 독성 개발이 표면 항원 인지에 의존한다는 것을 입증한다.

이종이식 모델에서 sfvMEL/rGel의 항종양활성

잘 개발된 A-375 흑색종 이종이식조직을 갖는 마우스는 염수(대조) 또는 scfvMEL/rGel을 2 또는 20㎎/㎏으로 4일 동안 처리한다. 도 9에 나타낸 바와 같이, 대조 그룹에서는 28일의 실험 기간에 걸쳐 종양 크기가 30에서 150㎟로 증가하였다(500% 증가). 이와는 반대로, 2㎎/㎏의 융합 독소으로 처리한 마우스에서는 종양 크기가 약간 감소한 후에 약 60㎟로 증가하였다(100% 증가). 융합 독소 20㎎/㎏ 용량으로 처리한 마우스는 처리 기간 동안 종양 크기가 50% 감소하였고, 28일에 걸쳐 종양 크기가 원래의 종양 크기로 서서히 회복되었다(전체적으로 성장하지는 않았다). 상기한 용량에서는 마우스에 대한 면역독의 독성 효과가 나타나지 않았는데, 이는 상기한 계획에서 최대 허용량(MTD)에 도달하지 않았음을 나타낸다.

실시예 6

시험관내 세포독성 검정

세포 배양방법

사람 흑색종 종양 세포 A375M은 10% 열 불활성화 송아지 태아 혈청과 100μM 비필수 아미노산, 2mM L-글루타민 1mM 나트륨 피루베이트, 비타민 및 항생체가 보충된 최소 필수 배지(MEM)중에서 유지시킨다. 배양된 세포는 일반적인 절차에 따라 선별하였고 마이코플라즈마 감염은 없었다.

세포 증식 검정

세포주는 37℃의 5% CO₂가습된 공기 항온처리기내의 완전 배지중 배양물에 유지시킨다. 재조합 독소 및 면역독소 검정의 경우, 배양물을 세척하고 베르센을 사용하여 세포를 떼어낸 다음, 25 x 10³세포/㎖의 밀도로 완전 배지에 재현탁시킨다. 200㎕의 분취량을 96웰 미세역가 플레이트에 분배한 다음, 세포를 방치하여 부착시킨다. 그 결과 군데군데 씨딩된 세포 집단이 생성되었다. 24시간 후, 배지는 여러가지 농도의 면역독소 또는 겔로닌을 포함한 배지로 대체한다. 세포를 72시간 동안 항온처리하고 크리스탈 바이올렛 염색에 의해 상대적인 세포 증식을 분석한다.

크리스탈 바이올렛 염색

세포는 칼슘 함유 PBS로 3회 세척하고 마그네슘으로 고정시키고, 0.5%(w/v) 크리스탈 바이올렛을 포함하는 20%(v/v) 메탄올로 염색한다. 결합한 염료는 실온에서 1시간 동안 150㎕의 쇠렌슨(Sorensen) 시트레이트 완충액(0.1M 나트륨 시트레이트, pH 4.2-50%(v/v) 에탄올)으로 용출시킨다. Bio-Tek 미세역가 판독기를 사용하여 600㎚에서 흡광도를 측정한다. 하기하는 바와 같이 상대적인 세포 증식(RCP)을 계산한다:

정제한 scfvMEL-CFR2018, scfvMEL-CFR2025 및 CFR2018 샘플은, 로그 상태(5,000/웰)에 있는 항원-양성 A375M 세포 단층을 이용한 표준 72시간 세포 증식 검정법 및 상기한 크리스탈 바이올렛 염색법을 사용하여 검정한다.

결과

도 10은 상기한 바와 같이 72시간 성장시킨 A-375 사람 흑색종 세포주에서 시험한 재조합 분자 각각의 세포독성을 나타낸 것이다. 나타난 바와 같이, scfvMEL-CFR2018 및 scfvMEL-CFR2025는 융합 작제물은 배양물에서 흑색종 세포의 성장을 억제한다. 대조 수치의 50%(I.C.₅₀)까지 세포의 성장을 억제하는데 필요한 각 제제의 농도는 100nM이다. 이와 반대로, 유리 독소(CFR2018)에 의한 세포 성장은 항체 융합 작제물보다 거의 8배가 더 높은 농도인 800nM 이상에서 억제되었다. scfvMEL 항체에 융합시킴으로써 종양 세포에 대한 CFR2018 독소의 항체 표적화는 독성이 8배 증가하였다. 또한, CFR2018 독소와 비교시, 항체 담체를 이용하여 종양 세포에 이들을 전달하는 경우, CFR2025로 지정된 디자이너 독소는 CFR2018에 상응할만한 세포독성을 갖는다.

본 발명에서 기술하고 청구한 모든 조성물 및 방법은 본 발명의 측면에서 불필요한 실험없이 실행되고 제조될 수 있었다. 본 발명의 조성물 및 방법을 양태와 관련하여 기술하고 있지만, 당분야의 숙련가라면 본 발명의 개념, 요지 및 범주를 벗어나지 않으면서 상기한 방법의 연속적인 단계 또는 단계중에서 본 조성물 및 방법을 다양하게 변형시킬 수 있음을 명백히 인지할 것이다. 보다 상세하게는, 화학적 및 물리적으로 관련된 특정 제제를 본원에서 기술한 제제로 대체하여 유사하거나 동일한 결과를 성취할 수 있음이 명백할 것이다. 당분야의 숙련가에게 명백한 모든 유사한 대체 및 변형은 청구한 바와 같은 본 발명의 요지, 범주 및 개념을 벗어나지 않는 것으로 간주한다.

참조문헌

하기의 참조문헌들은 이들이 본원에 제시된 것을 보충하는 예시된 과정 또는 기타 세부사항을 제공하는 정도로 본원에 참조로서 특별히 인용된다.

Claims (88)

1. 서열 1의 아미노산 잔기 110-210으로서 규정된 코어 독소 영역을 포함하는, 서열 1의 독소 이외의 재조합 겔로닌 독소.
2. 제1항에 있어서, 코어 독소 영역 이외에, 서열 1의 10개 이상의 연속되는 아미노산 잔기를 포함하는 재조합 겔로닌 독소.
3. 제2항에 있어서, 코어 독소 영역 이외에, 서열 1의 20개 이상의 연속되는 아미노산 잔기를 포함하는 재조합 겔로닌 독소.
4. 제3항에 있어서, 코어 독소 영역 이외에, 서열 1의 30개 이상의 연속되는 아미노산 잔기를 포함하는 재조합 겔로닌 독소.
5. 제4항에 있어서, 코어 독소 영역 이외에, 서열 1의 50개 이상의 연속되는 아미노산 잔기를 포함하는 재조합 겔로닌 독소.
6. 제1항에 있어서, 코어 독소 영역으로부터의 아미노산이 아닌, 서열 1의 10개 이상의 아미노산이 부재하는 재조합 겔로닌 독소.
7. 제1항에 있어서, 코어 독소 영역으로부터의 아미노산이 아닌, 서열 1의 20개 이상의 아미노산이 부재하는 재조합 겔로닌 독소.
8. 제1항에 있어서, 코어 독소 영역으로부터의 아미노산이 아닌, 서열 1의 30개 이상의 아미노산이 부재하는 재조합 겔로닌 독소.
9. 제1항에 있어서, 코어 독소 영역으로부터의 아미노산이 아닌, 서열 1의 5개 이상의 아미노산이 대체된 재조합 겔로닌 독소.
10. 제9항에 있어서, 코어 독소 영역으로부터의 아미노산이 아닌, 서열 1의 10개 이상의 아미노산이 대체된 재조합 겔로닌 독소.
11. 제10항에 있어서, 코어 독소 영역으로부터의 아미노산이 아닌, 서열 1의 20개 이상의 아미노산이 대체된 재조합 겔로닌 독소.
12. 제1항의 재조합 겔로닌 독소 및 제2 폴리펩타이드를 포함하는 단백질성(proteinaceous) 화합물.
13. 제12항에 있어서, 제2 폴리펩타이드가 재조합 겔로닌 독소에 접합되는 단백질성 화합물.
14. 제13항에 있어서, 제2 폴리펩타이드가 링커에 의해 재조합 겔로닌 독소에 접합되는 단백질성 화합물.
15. 제12항에 있어서, 제2 폴리펩타이드와 재조합 겔로닌 독소가 융합 단백질을 형성하는 단백질성 화합물.
16. 제12항에 있어서, 제2 폴리펩타이드가 항체인 단백질성 화합물.
17. 제16항에 있어서, 항체가 항원 결합 영역을 포함하는 단백질성 화합물.
18. 제16항에 있어서, 항체가 종양 항원에 대해 지시되는 단백질성 화합물.
19. 제12항에 있어서, 제2 폴리펩타이드가 효소 활성을 갖는 단백질성 화합물.
20. a) 항체를 사용하여 효소 중의 하나 이상의 항원성 영역을 동정하는 단계;

    b) 상기 효소로부터 하나 이상의 항원성 영역을 제거하여 변형 효소를 형성시키는 단계; 및

    c) 이러한 변형 효소가 효소 활성을 갖는지를 결정하는 단계

    를 포함하는 방법에 의해 생성된 변형 효소.
21. 제20항에 있어서, 결정 단계가, 변형 효소를 대상으로 하여 이의 효소 활성에 대해 검정하는 단계를 포함하는 변형 효소.
22. 제20항에 있어서, 하나 이상의 항원성 영역을, 대체된 영역(들) 보다는 덜 항원성인 아미노산 영역으로 대체시키는 단계를 추가로 포함하는 변형 효소.
23. 제22항에 있어서, 덜 항원성인 영역(들)이, 상동 영역을 알아보기 위한 단백질 데이터베이스 조사에서 동정되는 변형 효소.
24. 제23항에 있어서, 데이터베이스가 사람 단백질 데이터베이스인 변형 효소.
25. 제20항에 있어서, 항원성 영역이 사람에 대해 항원성인 변형 효소.
26. 제20항에 있어서, 항체가 폴리클로날인 변형 효소.
27. 제26항에 있어서, 폴리클로날 항체가 사람 기원인 변형 효소.
28. 제20항에 있어서, 식물 독소인 변형 효소.
29. 제28항에 있어서, 식물 독소가 겔로닌인 변형 효소.
30. 제20항에 있어서, 제2 폴리펩타이드를 변형 효소에 부착시키는 단계를 추가로 포함하는 변형 효소.
31. 제30항에 있어서, 제2 폴리펩타이드가 변형 효소에 접합되는 변형 효소.
32. 제30항에 있어서, 제2 폴리펩타이드와 변형 효소가 융합 단백질을 형성하는 변형 효소.
33. 제30항에 있어서, 제2 폴리펩타이드가 항체인 변형 효소.
34. 제30항에 있어서, 제2 폴리펩타이드가 독소인 변형 효소.
35. 제30항에 있어서, 제2 폴리펩타이드가 제2 효소인 변형 효소.
36. 제30항에 있어서, 제2 폴리펩타이드가 세포소멸(apoptosis)을 증진시키는 변형 효소.
37. a) 제1 대상체에게 투여하고자 하는 단백질을 선택하는 단계;

    b) 제1 대상체 또는 제1 대상체와 동일한 종의 제2 대상체로부터 유래된 항혈청을 사용하여, 제1 대상체에게서 항원성인 단백질 영역을 동정하는 단계;

    c) 이와 같이 동정된 영역이 부재하는 변형 단백질을 생성시키는 단계; 및

    d) 변형 단백질이 저하된 항원성을 갖는지를 확인하는 단계

    를 포함하여, 항원성이 저하된 변형 단백질을 생성시키는 방법.
38. 제37항에 있어서,

    d) 해당 단백질의 항원성 영역과 상동성을 나타내는 덜 항원성인 영역을 동정하기 위해 사람 단백질 데이터베이스를 스크리닝하는 단계;

    e) 이러한 항원성 영역을, 덜 항원성인 상기 동정된 영역의 전부 또는 일부로 대체시켜 변형 단백질을 형성시키는 단계

    를 추가로 포함하는 방법.
39. 제38항에 있어서, 대체 단계가, 변형 단백질을 암호화하는 핵산 분자를 사용하여 재조합적으로 수행되는 방법.
40. 제37항에 있어서, 변형 단백질이, 동정된 영역을 제거함으로써 생성되는 방법.
41. 제37항에 있어서, 부재 영역이 5개 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 방법.
42. 제41항에 있어서, 부재 영역이 10개 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 방법.
43. 제42항에 있어서, 부재 영역이 15개 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 방법.
44. 제43항에 있어서, 부재 영역이 20개 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 방법.
45. 제44항에 있어서, 부재 영역이 25개 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 방법.
46. 제40항에 있어서, 부재 항원성 영역이, 제거되는 아미노산 잔기와 동일한 수로 대체되는 방법.
47. 제37항에 있어서, 영역이 ELISA 검정에 의해 동정되는 방법.
48. 제37항에 있어서, 대상체가 포유류인 방법.
49. 제48항에 있어서, 포유류가 사람인 방법.
50. 대체된 아미노산을 갖는 재조합 겔로닌 독소 보다 사람에게서 덜 항원성인 아미노산으로 대체된 항원성 도메인 1, 2, 3 또는 4 중의 하나 이상으로부터의 3개이상의 아미노산을 갖는 사람화된(humanized) 재조합 겔로닌 독소.
51. 제50항에 있어서, 항원성 도메인 1로부터의 3개 이상의 아미노산이 대체되는 사람화된 재조합 겔로닌 독소.
52. 제50항에 있어서, 항원성 도메인 2로부터의 3개 이상의 아미노산이 대체되는 사람화된 재조합 겔로닌 독소.
53. 제50항에 있어서, 항원성 도메인 3으로부터의 3개 이상의 아미노산이 대체되는 사람화된 재조합 겔로닌 독소.
54. 제50항에 있어서, 항원성 도메인 4로부터의 3개 이상의 아미노산이 대체되는 사람화된 재조합 겔로닌 독소.
55. 제50항에 있어서, 2개 이상의 항원성 도메인으로부터의 3개 이상의 아미노산이 대체되는 사람화된 재조합 겔로닌 독소.
56. 제50항에 있어서, 항원성 도메인 1 내지 4 중의 하나 이상으로부터의 6개 이상의 아미노산이 대체되는 사람화된 재조합 겔로닌 독소.
57. a) 포유류에서 항원성인 겔로닌 독소 내의 하나 이상의 영역을 동정하는 단계; 및

    b) 적어도 항원성 영역의 일정 부분을, 포유류에서 덜 항원성인 영역으로 대체시키는 단계를 포함하는 방법에 의해 생성된 재조합 겔로닌 독소.
58. 제57항에 있어서, 단계 a)에서 동정된 항원성 영역이 재조합 겔로닌 독소인 재조합 겔로닌 독소.
59. 제57항에 있어서, 방법이, 동정된 항원성 영역을 포유류 아미노산 서열과 비교함으로써, 포유류에게서 덜 항원성인 영역을 동정하는 단계를 추가로 포함하는 재조합 겔로닌 독소.
60. 제57항에 있어서, 방법이, 포유류에게서 덜 항원성인 영역을 동정하는 단계를 추가로 포함하는 재조합 겔로닌 독소.
61. 제60항에 있어서, 포유류가 사람인 재조합 겔로닌 독소.
62. 암 세포를 특이적으로 표적화하는 단일쇄 항체와 겔로닌의 코어 독소 영역을 포함하는 면역독소의 유효량을 암 세포에게 제공하는 단계를 포함하여, 상기 암 세포를 사멸시키는 방법.
63. 제62항에 있어서, 면역독소가 서열 1을 포함하는 방법.
64. 제62항에 있어서, 항체가 종양 항원을 표적화하는 방법.
65. 제62항에 있어서, 항체가 마우스 항체인 방법.
66. 제62항에 있어서, 암 세포가 흑색종 세포인 방법.
67. 제66항에 있어서, 항체가 9.2.27 또는 ZME-018을 포함하는 방법.
68. 제66항에 있어서, 면역독소가 scfvMEL-2018 또는 scfvMEL-2025인 방법.
69. 제62항에 있어서, 세포가 환자 내에 있는 방법.
70. 제69항에 있어서, 면역독소가 약제학적으로 허용되는 조성물내에 있는 방법.
71. 제62항에 있어서, 면역독소가, 이러한 면역독소를 발현할 수 있는 발현 작제물을 암 세포에게 투여함으로써 상기 세포에 제공되는 방법.
72. 제71항에 있어서, 발현 작제물이 바이러스성 벡터인 방법.
73. 제72항에 있어서, 바이러스성 벡터가 아데노바이러스 벡터, 아데노-관련 바이러스 벡터, 간염 바이러스, 헤르페스 바이러스, 렌티바이러스, 레트로바이러스 또는 백시니아 바이러스인 방법.
74. 암 세포를 특이적으로 표적화 하는 단일쇄 항체와 겔로닌의 코어 독소 영역을 포함하는 면역독소를 포함하는 조성물의 유효량을 환자에게 투여함을 포함하여, 이러한 환자에게서 암을 치료하는 방법.
75. 제74항에 있어서, 암이 전립선, 폐, 뇌, 피부, 간, 유방, 림프계, 위, 고환, 난소, 췌장, 뼈, 골수, 머리 및 목, 경부, 식도, 눈, 담낭, 신장, 부신, 심장, 결장 또는 혈액 암인 방법.
76. 제74항에 있어서, 면역독소가 서열 1을 포함하는 방법.
77. 제74항에 있어서, 항체가 흑색종 세포를 표적화하는 방법.
78. 제77항에 있어서, 면역독소가 scfvMEL-2018 또는 scfvMEL-2025인 방법.
79. 제50항의 사람화된 재조합 겔로닌 독소를 포함하는 조성물의 유효량을 환자에게 투여함을 포함하여, 이러한 환자에게서 암을 치료하는 방법.
80. 제79항에 있어서, 조성물이 항체를 추가로 포함하는 방법.
81. 제80항에 있어서, 항체가 사람화된 방법.
82. 제80항에 있어서, 항체가 단일쇄 항체인 방법.
83. 제80항에 있어서, 항체가 암 세포 상의 항원과 결합되는 방법.
84. 제83항에 있어서, 암 세포가 뼈, 뇌, 유방, 경부, 결장, 신경교종, 잇몸, 머리 및 목, 신장, 백혈병, 간, 폐, 흑색종, 난소, 전립선, 위 또는 혀 세포인 방법.
85. 제84항에 있어서, 암 세포가 흑색종 세포인 방법.
86. 제82항에 있어서, 단일쇄 항체가 9.2.27 또는 ZME-018인 방법.
87. 제79항에 있어서, 환자에게 화학요법, 방사선 요법, 유전자 요법 또는 제2 면역요법을 투여함을 추가로 포함하는 방법.
88. 제79항에 있어서, 환자로부터 전암성 또는 암성 병변 또는 종양을 절개하는 단계를 추가로 포함하는 방법.