KR101666618B1 - 디스트로핀 폴리뉴클레오티드의 발현을 억제하는 뉴클레오티드가 도입된 동물 세포주 - Google Patents

디스트로핀 폴리뉴클레오티드의 발현을 억제하는 뉴클레오티드가 도입된 동물 세포주 Download PDF

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Abstract

본 발명은 디스트로핀 폴리뉴클레오티드의 발현을 억제하는 뉴클레오티드가 도입된 동물 세포주 및 상기 세포주를 이용한 근위축증의 예방 또는 치료 물질의 스크리닝 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 세포주는 디스트로핀 mRNA 및 단백질의 발현 억제를 유지하고, 근관이 가늘며 근관이 형성되는 시간이 지연되고, 디스트로핀 복합 단백질의 발현이 감소하였는바, 근위측증과 유사한 세포생리학적, 생화학적인 특성을 가지므로 근위측증의 예방 또는 치료 물질의 스크리닝 방법에 효과적으로 사용할 수 있다.

Description

디스트로핀 폴리뉴클레오티드의 발현을 억제하는 뉴클레오티드가 도입된 동물 세포주 {Animal cell transfected with nucleotide which suppress expression of dystrophin polynucleotide}
본 발명은 디스트로핀 폴리뉴클레오티드의 발현을 억제하는 뉴클레오티드가 도입된 동물 세포주, 및 상기 세포주를 이용한 근위축증의 예방 또는 치료 물질의 스크리닝 방법에 관한 것이다.
근위측증이란 유전적인 요인으로 진행성 근력 저하 및 위축을 보이고, 병리학적으로 근육섬유의 괴사 및 재생을 특징으로 하는 퇴행성 근육병증을 말한다. 이는 디스트로핀 (dystrophin) 유전자 등 유전자 돌연변이에 의해 근세포막에 존재하는 특정 단백질이 소실되어 근세포막의 안정성에 관여한다고 알려져 있는 구성 단백질인 디스트로핀-당단백질 복합체 (dystrophin-glycoprotein complex) 등이 제대로 형성되지 못하여 근세포막의 손상으로 근육섬유의 괴사와 퇴행과정을 거쳐 결국 근력저하 및 위축이 발생하게 되는 질환이다.
특히, 듀센근위축증 (Duchenne Muscular Dystrophy, DMD)은 X 염색체 (Xp21)에 존재하고 있는 디스트로핀 (dystrophin) 유전자의 돌연변이로 디스트로핀 단백질이 발현하지 않아서 발병하는 근육 질환이다. 1968년 Duchenne에 의하여 처음으로 기술되었으며, UN이 지정한 5대 중증진행성 희귀난치성질환인 근육 디스트로피 중 가장 높은 빈도로 발생하고 있는 유전성 질환이다. 세계적으로 남자 신생아 3,500명당 한 명꼴로 발병하는 것으로 알려져 있다.
보통 5세 이전에 처음 증상이 나타나며, 점차 다리, 엉덩이, 골반 그리고 어깨의 근육이 소실되고 나중에는 팔과 목 그리고 다른 곳의 근육도 소실되어 간다. 병이 더 진행되면 심장이나 호흡계의 이상으로 결국 사망하게 된다. 초기 증상은 지구력이 떨어져 혼자 서는 것이 어렵고, 계단을 올라가지 못하며 발끝으로 걷는 등 걷고 뛰는 것이 부자연스러우며 자주 넘어진다. 근육이 약해져 일어날 때 무릎을 짚고 일어나는 Gower’s sign이 나타난다. 근육이 소실되면서 근육이 존재하던 부위가 지방과 섬유조직으로 대체되면서 종아리 근육이 비대해진다. 환자에 따라 진행속도에 차이가 있지만 보통 10세까지는 보조기의 도움으로 걸을 수 있으나 대부분 12세가 되면 휠체어가 필요하게 된다. 근육의 이상으로 인해 뼈가 비정상적으로 발달하여 척추가 휘는 척추 기형이 나타나고 나중에는 움직일 수 없게 된다. 일반적으로 지능장애는 일어나지 않지만, 경우에 따라서는 약한 지능장애가 일어날 수도 있다.
근위축증의 원인이 되는 디스트로핀 유전자는 79개의 엑손과 8개의 조직 특이적 프로모터로 구성되어 있다. 디스트로핀 유전자의 크기는 2.4 Mb로 사람의 전체 유전자의 0.08%를 차지하며, 지금까지 보고된 사람의 유전자 중에서 가장 큰 것으로 알려져 있다. 유전자 산물인 디스트로핀 단백질의 분자량은 427 kDa인 거대단백질이며, 근소포막 (sarcolemma)에 막대 모양의 구조로 존재하고 있으며, N-말단에 있는 액틴-결합 도메인, 24개의 스펙트린-유사 rod 반복과 4개의 힌지 (hinge)로 구성된 rod 도메인, 디스트로글리칸 (dystroglycan) 이나 사코글리칸 (sarcoglycan) 등과 결합할 수 있는 시스테인-풍부 도메인 및 신트로핀 (syntrophin)이나 사코글리칸과 결합할 수 있는 C-말단 도메인으로 구성되어 있다.
디스트로핀은 다양한 당단백질들과 결합하여 디스트로핀 복합체를 형성하고 있다. 이 복합체는 근소포막을 사이에 두고 근육 섬유의 세포골격 단백질들과 세포외기질을 연결시켜 주는 역할을 하고 있다. 또한 디스트로핀 복합체는 근육이 수축할 때 세포막의 안정성을 유지시켜주며, 세포외기질로부터의 신호를 세포 내의 신호전달물질로 전달하는 역할도 하는 것으로 추정하고 있다. 디스트로핀이 발현되지 않으면 디스트로핀에 결합하는 당단백질들의 발현량도 감소하는 것으로 알려져 있다.
본 발명자들은 치명적인 근육질환인 근위축증의 활발한 연구를 위한 세포주를 확립하기 위하여 예의 노력한 결과, 디스트로핀 폴리뉴클레오티드의 발현을 억제하는 뉴클레오티드가 도입된 동물 세포주가 근위축증과 유사한 세포생리학적, 생화학적인 특성을 갖는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 일 양상은 디스트로핀 폴리뉴클레오티드의 발현을 억제하는 뉴클레오티드가 도입된 동물 세포주를 제공하는 것이다.
또한 본 발명의 다른 양상은 상기 세포주를 이용하여 근위축증의 예방 또는 치료 물질을 스크리닝하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 일 양상은 디스트로핀 폴리뉴클레오티드의 발현을 억제하는 뉴클레오티드가 도입된 동물 세포주를 제공한다.
이하 본 발명을 상세하게 설명한다.
본 발명에서 디스트로핀은 근세포막 세포골격단백질의 일종에 해당하며, 이 디스트로핀의 유전자는 X d 유전자로, X염색체 단완 21영역에 존재하며 3Mbp로 구성된다. 상기 디스트로핀 폴리뉴클레오티드는 디스트로핀의 유전자 또는 mRNA일 수 있다.
본 발명에서 상기 디스트로핀 폴리뉴클레오티드의 발현을 억제하는 것은 뉴클레오티드를 사용할 수 있으며, 바람직하게는 디스트로핀 유전자의 mRNA에 대한 안티센스 뉴클레오티드, 앱타머, 작은 간섭 RNA (siRNA), 짧은 헤어핀 RNA (shRNA), 마이크로 RNA (miRNA) 및 RNA 간섭 (RNAi) 일 수 있다.
이러한 안티센스 뉴클레오티드는 디스트로핀을 코딩하는 센스 뉴클레오티드의 전체 또는 일부에 상보적인, 예를 들면 두 가닥 사슬 cDNA 분자의 코딩 가닥에 상보적이거나 mRNA 서열에 상보적인 핵산 서열을 포함한다. 따라서, 안티센스 뉴클레오티드는 센스 뉴클레오티드와 수소 결합을 형성할 수 있다. 상기 안티센스 뉴클레오티드는 전체 디스트로핀 코딩가닥 또는 그들의 일부에 상보적일 수 있다. 상기 안티센스 뉴클레오티드는 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 상기 안티센스 뉴클레오티드 분자는 디스트로핀 mRNA의 전체 코딩 영역에 상보적일 수 있으나, 디스트로핀 mRNA의 코딩 또는 비코딩 영역의 일부 (예: 번역 개시부)에만 안티센스인 올리고뉴클레오티드가 더 바람직하다. 안티센스 올리고뉴클레오티드는 예를 들면 약 5 내지 50 뉴클레오티드의 길이일 수 있다. 안티센스 뉴클레오티드는 공지의 방법을 이용한 화합 합성 및 효소 결합 반응을 이용하여 구성할 수 있다. 화학 합성법, 예를 들어 문헌[Tetrahedron Lett., 1991, 32, 30005-30008]에 기재된 바와 같이 아세토니트릴 중에서 테트라에틸티우람 디술파이드로 황화시키는 포스포아미다이트 화학과 같은 방법에 의해 매우 용이하게 제조할 수 있다. 상기 안티센스 뉴클레오티드의 생성에 사용될 수 있는 변형 뉴클레오티드의 예로는 5-플루오로우라실, 5-브로모우라실, 5-클로로우라실, 5-요오드우라실, 하이포크산틴, 크산틴, 4-아세틸사이토신, 5-(카복시히드록실메틸)우라실, 1-메틸이노신, 2,2-디메틸구아닌, 2-메틸아데닌, 2-메틸구아닌, 3-메틸사이토신, 5-메틸사이토신, N6-아데닌, 5-카복실메틸아미노메틸-2-티오우리딘, 3-(3-아미노-3-N-2-카복시프로필)우라실, 5'-메톡시카복시메틸우라실, 5-메톡시우라실, 2-메틸티오-N6-이소펜테닐아데닌, 1-메틸구아닌, 7-메틸구아닌, 5-메틸아미노메틸우라실, 5-메톡시아미노 메틸-2-티오우라실, 베타-D-만노실퀘오신, 2-티오우라실, 4-티오우라실, 5-메틸우라실, 우라실-5-옥시아세트산 메틸에스테르, 우라실-5-옥시아세트산(v), 2,6-디아미노푸린, 5-메틸-2-티오우라실, 우라실-5-옥시아세트산(v), 슈도우라실, 퀘오신, 2-티오사이토신, 5-카복시메틸아미노메틸우라실, 디하이드로우라실, 베타-D-갈락토실퀘오신, 이노신, N6-이소펜테닐아데닐, 5-메틸-2-티오우라실, (acp3)w 및 와이부톡소신일 수 있다. 필요에 따라서, 상기 안티센스 뉴클레오티드는 발현 벡터를 사용하여 생물학적으로 생성할 수 있다.
상기 디스트로핀 폴리뉴클레오티드의 발현을 억제하는 안티센스 뉴클레오티드는 바람직하게는 shRNA일 수 있다.
또한, 상기 안티센스 뉴클레오티드는 상기 shRNA를 구성하는 핵산서열과 90 % 이상 100 % 미만의 상동성을 가지는 핵산서열을 포함할 수 있다. 90 % 이상 100 % 미만의 상동성을 가지는 핵산서열이란 일 내지 수개의 뉴클레오티드가 추가, 결실 또는 치환되어 90 % 이상 100 % 미만의 서열에 공통성이 있는 것으로서, 디스트로핀의 폴리뉴클레오티드에 상보적으로 결합할 수 있는 핵산서열을 의미한다.
본 발명에서 동물은 개과 동물, 멧돼지과 동물, 소과 동물, 말과 동물, 고양이과 동물, 영장류 또는 설치류일 수 있으며, 바람직하게는 설치류일 수 있고, 더욱 바람직하게는 마우스일 수 있다.
또한, 상기 동물 세포주는 바람직하게는 근원세포에서부터 유래된 세포주일 수 있다.
또한, 상기 동물 세포주는 바람직하게는 수탁번호 KCTC 12475BP로 수탁된 세포주 일 수 있다.
또한, 본 발명의 일 양상은 (1) 상기 세포주에 피검 물질을 처리하는 단계; 및 (2) 상기 세포주의 활성을 측정하는 단계를 포함하는, 근위축증의 예방 또는 치료 물질 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명의 세포주는 디스트로핀 mRNA 및 단백질의 발현 억제를 유지하고, 근관이 가늘며 근관이 형성되는 시간이 지연되고, 디스트로핀 복합 단백질의 발현이 감소하였는바, 근위측증과 유사한 세포생리학적, 생화학적인 특성을 가지므로 근위측증의 예방 또는 치료 물질의 스크리닝 방법에 효과적으로 사용할 수 있다.
본 발명에서 상기 근위측증은 근위축성 측삭경화증, 척수성 근위축증, 진행성 근위축증, 강직성근위축증, 루게릭병, 신경원성 근위축증, 듀센 근위축증, 벡커 근위축증, 지대형 근위축증, 안면갑상완 근위축증, 눈인두 근위측증, 또는 근육 긴장일 수 있으며, 바람직하게는 듀센 근위축증일 수 있다.
또한, 본 발명에서 세포주의 활성은 세포의 분화 여부 및 정도, 세포 융합의 여부 및 정도, 유전자 발현 또는 단백질 활성 정도일 수 있으며, 그에 제한되지 않는다.
본 발명에 따른 세포주는 디스트로핀 mRNA 및 단백질의 발현 억제를 유지하고, 근관이 가늘며 근관이 형성되는 시간이 지연되고, 디스트로핀 복합 단백질의 발현이 감소하였는바, 근위측증과 유사한 세포생리학적, 생화학적인 특성을 가지므로 근위측증의 예방 또는 치료 물질의 스크리닝 방법에 효과적으로 사용할 수 있다.
도 1은 디스트로핀 발현이 억제된 세포 콜로니에서 디스트로핀 mRNA 발현을 나타낸 도이다.
도 2는 디스트로핀 발현이 억제된 세포에서 배양 계대 (culture passage)에 따른 디스트로핀 단백질 발현을 확인한 도이다.
도 3은 대조 shRNA와 디스트로핀 shRNA를 형질전환시킨 세포의 분화를 나타낸 도이다.
도 4는 C2 세포와 C2-dmd 세포의 분화 시간별 세포 융합지수와 형태를 비교한 도이다.
도 5는 C2 대조 세포와 C2-dmd 세포에서 분화 표지 단백질의 발현 양상을 비교한 도이다.
도 6은 C2 세포와 C2-dmd에서 디스트로핀 복합체 단백질들의 발현양상을 나타낸 도이다.
도 7은 C2와 C2-dmd 근관에서의 산화스트레스에 대한 민감도 확인을 위한 WST 어세이 결과를 나타낸 도이다.
도 8은 산화스트레스 하에서 IL-6, TNF-α 사이토카인의 mRNA 발현을 나타낸 도이다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 실험 재료의 준비
세포 배양에서 사용된 FBS (fetal bovine serum) 과 DMEM 은 Hyclone (Logan, UT, USA)에서 구입하였고, 근육 세포 분화 유도를 위해 사용한 말 혈청 (horse serum, HS)은 Gibco (Carlsbad, CA, USA)에서 구입하였다.
디스트로핀 단백질 발현을 억제하기 위한 디스트로핀 shRNA (cat# sc-35241-v) 렌티바이러스 파티클과 디스트로핀 단백질 발현의 음성 대조군으로 사용한 대조 shRNA 렌티바이러스 파티클은 Santa Cruz (CA, USA) 에서 구입하였다. 형질전환 실험의 조건을 잡기 위해서 사용한 copGFP 대조 렌티바이러스 파티클과 폴리브렌 (polybrene)과 푸로마이신 (puromycin)은 Santa Cruz (CA, USA) 에서 구입하였다.
단백질 정량에서 사용된 Bradford reagent 는 Bio-rad (Hercules, CA, USA)에서 구입하였고, RNeasy® Plus Mini kit 는 QIAGEN (Hilden, Germany)에서 구입하였고, GoScriptTM 역전사효소는 Promega (Madison, WI, USA) 에서 구입하였고, SYBR® Green PCR master mix 는 Biosystems (Carsbad, CA, USA) 에서 구입하였다. 산화스트레스에 의한 세포 생존율 측정을 위해 사용한 WST 어세이 용액 EZ-Cytox 는 IT’s Bio (Seoul, Korea)에서 구입하였다.
액틴 항체는 Santa Cruz (CA, USA)에서 구입하였고, 디스트로핀 단백질 항체는 미국 시애틀 워싱턴대학의 Stanley C. Froehner 교수로부터 제공 받았다.
실시예 2: 디스트로핀 단백질 발현의 억제
C2 마우스 근육 세포를 항생제가 없는 배양액에 키운 뒤에 폴리브렌과 푸로마이신을 각각 0~10 ug/ml 농도별로 배지에 희석하여 처리한 뒤 copGFP shRNA 렌티바이러스 파티클을 넣어 24 시간 배양하여 폴리브렌의 처리 농도를 8 ug/ml, 푸로마이신의 경우 3 ug/ml 로 결정하였다. 렌티바이러스 파티클은 20 ul 를 상온에서 감염시켜서 copGFP 형광을 확인하여 바이러스 감염 조건을 확정하였다. 바이러스 감염 조건을 확정한 후 대조 shRNA 와 디스트로핀 shRNA 렌티바이러스 파티클을 각각 감염시켰다. 바이러스 감염 후에는 폴리브렌이 없는 배양액으로 바꿔준 뒤 푸로마이신을 3 ug/ml으로 희석하여 바이러스가 감염된 세포 군집을 선택하였다.
실시예 3: 콜로니 별 디스트로핀 발현 억제의 비교
3-1: 디스트로핀 발현이 억제된 세포 콜로니에서 디스트로핀 mRNA 발현양 확인
디스트로핀 shRNA를 처리한 C2 마우스 근육 세포를 콜로니별로 배양하여서 얻은 #1~#8 콜로니의 세포에서 디스트로핀 mRNA를 확인하였다.
디스트로핀 mRNA 발현은 2% 말 혈청 배양액으로 분화 유도한 근관 각 세포군집의 RNA를 추출하여 mRNA 발현 정도를 SYBR Green probe 를 사용하여 real-time PCR 로 확인하였다. RNA 추출은 QIAGEN 회사의 RNeasy® Plus Mini kit 의 프로토콜을 참고하였다. 추출한 RNA는 역전사효소를 사용하여 cDNA로 합성하고 real-time PCR 에 사용하였다. 디스트로핀 mRNA 발현을 확인하기 위해서 Primer designer 4 program 을 사용하여 디스트로핀 프라이머를 제작하였다. 프라이머 서열은 Forward primer 5'-CAACTCGCTCACTCACAT-3', Reverse primer 5'-AACAATCCAGCGGTCTTC-3'이었다.
디스트로핀 mRNA 양을 대조군으로 사용된 GAPDH의 mRNA의 양과 비교하여 상대값을 구한 후 대조 세포의 디스트로핀 mRNA 양을 1로 하여 상대값을 그래프로 나타내었으며, 그 결과를 도 1에 나타내었다.
도 1에 나타난 바와 같이, 디스트로핀 mRNA의 수준이 차단됨을 확인하였으며, 가장 mRNA 수준이 낮은 #2 콜로니를 C2-dmd로 선택하였다.
3-2: 디스트로핀 발현이 억제된 세포의 배양 계대에 따른 디스트로핀 단백질 발현 확인
상기 3-1에서 선택한 디스트로핀 발현이 억제된 세포와 C2 세포를 각 배양 계대 별로 분화를 유도한 후 수확하여 각 계대 별 디스트로핀 단백질 발현 여부를 디스트로핀 항체를 이용하여 확인하였다.
구체적으로, 디스트로핀 단백질 발현을 확인하기 위해서 푸로마이신 선별로 골라낸 세포 군집을 골라내어 2 %의 말 혈청이 희석된 배양액으로 바꾸어 96 시간 동안 배양함으로써 분화시킨 후 RIPA 완충액 (9.1 mM Na2HPO4, 1.7 mM NaH2PO4, 150 mM NaCl, 1% NP-40, 0.5% 데옥시콜산 (Deoxycholic acid), 0.1% SDS)을 첨가해서 4 ℃에서 30 분동안 처리하고 4 ℃ 에서 1000 x g 로 10 분간 원심 분리함으로써 수확하였다. 단백질량은 Bradford reagent 를 사용하여 정량하고, 4~15 % 구배 SDS-PAGE 겔을 사용하여 단백질 전기영동을 하였다. 이 후에 디스트로핀 단백질의 양은 면역 발색법으로 확인하였다. 디스트로핀 항체는 4% 탈지유에 희석하여서 4 ℃ 에서 하룻밤 동안 반응시키고, 단백질 밴드는 ECL (enhanced chemiluminescence) 방법을 사용하여 발색하였고, 화상은 LAS (Luminescence Analyser System) (Fujifilm, Japan)를 이용하여 얻었다.
그 결과를 도 2에 나타내었다.
도 2에 나타난 바와 같이, 7번 계대가 진행되는 동안 디스트로핀 발현의 억제가 지속되는 것을 확인하였다. 이 결과는 본 연구에서 제작한 C2-dmd 세포주가 mRNA 및 단백질 수준에서 디스트로핀의 발현이 억제되고 있음을 알 수 있다.
실시예 4: C2 - dmd 세포주의 분화 진행 양상과 세포 융합지수의 확인
디스트로핀 발현이 억제된 C2-dmd 세포와 대조 세포를 각각 5% 말혈청이 포함된 분화 배지를 이용하여 분화시킨 후 분화된 세포의 모양을 도립 현미경을 통하여 확인하였다. 또한, C2 세포와 C2-dmd 세포를 5% 말혈청을 포함하는 분화 배지를 이용하여 24, 72, 96 시간 동안 배양함으로써 분화를 유도하였다. 각 시간에 세포를 4% 파라포름알데히드를 이용하여 고정한 후 헤마톡실린을 이용하여 염색한 세포사진을 얻었다. 분화 시간별 세포 필드 (field) 10개를 선택하여 (근관 내 핵의 수/ 전체 세포 핵 수)로 세포 융합지수를 계산하였다.
그 결과를 도 3 및 도 4에 나타내었다.
도 3에 나타난 바와 같이, 대조 shRNA를 형질전환한 세포의 경우 정상적인 C2 세포와 비슷하여 48 시간에 근관을 형성하기 시작하여 96 시간에는 거의 모든 세포들이 융합함으로써 근관을 형성한 것을 확인할 수 있다. 반면, 디스트로핀 shRNA를 형질전환한 세포에서는 배양 48 시간이 지나도 근관이 거의 보이지 않았으며, 96 시간에서도 대조 shRNA 가 형질전환된 세포에 비하여 근관이 가늘고 작았으며 융합하지 않은 세포들이 많았다.
또한, 도 4에 나타난 바와 같이, 대조 shRNA를 형질전환한 세포와 C2-dmd 세포를 분화 유도시켜 0, 24, 48, 72, 96 시간별로 융합지수를 측정한 결과, 대조 세포는 분화 96시간 후 약 70%에 융합이 진행되었지만, C2-dmd 세포는 분화 96 시간 후 약 50%의 융합을 나타내었다.
실시예 5: 대조 세포와 C2 - dmd 세포의 분화 시간별 분화 단백질 발현 및 디스트로핀 복합체 단백질들의 양상 비교
5-1: C2 대조 세포와 C2 - dmd 세포에서 분화 표지 단백질의 발현 양상 비교
대조 세포와 C2-dmd 세포를 2% 말혈청을 포함하는 분화 배지를 이용하여 24, 48, 72, 96 시간 동안 분화를 유도하였다. 세포를 수확한 뒤 RIPA 용액을 넣고 초음파 분쇄하여 세포를 파쇄하였다. 30 ug 단백질을 정량하여 10% SDS-PAGE 전기영동을 사용하여 단백질을 분리하고 PVDF 막에 옮겨 항-미오게닌 항체, 항-크레아틴 키나아제 항체를 이용한 면역 발색법을 진행하여 각 단백질의 발현을 확인하였다. 액틴은 로딩 대조구조서 사용되었다.
그 결과를 도 5에 나타내었다.
도 5에 나타난 바와 같이, 분화 유도 후 대조 세포와 dmd 세포는 외형적으로 근관이 형성되는 데 소요되는 시간과 근관의 형태에는 많은 차이가 있는 반면, 근육단백질 분화 표지 단백질인 미오게닌과 크레아틴 키나아제 단백질의 발현에는 큰 차이가 나타나지 않았다. 두 세포 모두 분화유도 24시간 후부터 조기 분화 표지 단백질인 미오게닌의 발현이 나타나고, 이후에 후기 분화 표지 단백질인 크레아틴 키나아제 단백질의 발현이 나타났다.
5-2: C2 세포와 C2 - dmd 에서 디스트로핀 복합체 단백질들의 발현양상
C2 세포와 dmd 세포의 미분화 근원세포(MB)와 분화된 근관(MT)을 수확하여 디스트로핀 복합체 단백질들의 발현을 각각의 항체를 이용하여 알아보았다. 또한 근관으로의 분화가 성공적으로 이루어졌는지 알아보기 위하여 분화 표지 단백질인 크레아틴 키나아제 와 미오게닌의 발현을 확인하였으며, 그 결과를 도 6에 나타내었다.
듀센근위축증 환자 및 마우스모델인 mdx 마우스 근육은 디스트로핀을 발현하지 않기 때문에 정상 근육에 비해 디스트로핀 복합체 단백질들의 발현도 감소된다고 알려져 있다. 그러므로 본 연구에서 제작한 dmd 세포도 듀센근위축증 환자 및 mdx 마우스의 근육과 같이 디스트로핀 복합체 단백질들의 발현량에 영향이 있는지 확인하였다.
도 6에 나타난 바와 같이, C2-dmd 세포에서는 정상 C2 세포에 비해 디스트로브레빈 (dystrobrevin)과 α- 및 β1-신트로핀 (syntrophin)의 발현이 감소한 것을 확인할 수 있었다
또한, 유트로핀은 디스트로핀보다 크기가 작지만 디스트로핀과 구조적 상동성이 높은 단백질로 근육발생 초기 단계에서는 근소포막에 존재하지만, 근육의 분화 과정에서 디스트로핀이 발현됨에 따라 점차 사라진다. 디스트로핀을 발현하지 않는 듀센근위축증 모델인 mdx 쥐의 경우 유트로핀의 발현이 일부 증가된다는 보고가 있다. 그러나 본 연구 결과에서는 듀센근위축증 세포에서 유트로핀의 발현이 증가하지는 않았다.
실시예 6: 대조 세포와 C2 - dmd 세포를 분화 유도한 뒤 산화스트레스로 인한 세포 생존능 확인
C2 세포와 C2-dmd 세포를 각각 96 웰 플레이트에 시딩하여 24 시간 배양한 뒤 2 % 말혈청 배지로 바꾸어 분화를 유도한 다음 96 시간 동안 배양하였다. 근관 형성 이후에 말혈청이 없는 DMEM 으로 배지를 교체하고, 1 시간 동안 37 ℃에서 배양하였다. 산화스트레스를 유발하기 위해 메나디온 (Menadione)을 농도 별로 처리하고 5 시간 배양하였다. WST 용액을 20 ul/웰 씩 넣어 2 시간 동안 배양한 다음 A450 를 측정하였다.
그 결과를 도 7에 나타내었다. 도 7에 나타난 바와 같이, 메나디온을 농도 별로 처리하여 세포에 산화스트레스를 유발한 뒤 WST 어세이를 통해 세포 생존량을 비교해 본 결과, 메나디온 20 uM, 30 uM 을 5시간 처리했을 때, C2 근관에 비해 C2-dmd 근관의 세포 생존률이 약 20 % 감소하는 것을 관찰하였다.
실시예 7: C2 세포와 C2 - dmd 세포에서 산화스트레스로 인한 사이토카인 발현의 변화량
디스트로핀 단백질을 정상적으로 발현하는 C2 세포와 디스트로핀 발현을 억제한 dmd 세포를 각각 2% 말혈청 배지에서 배양하여 분화를 유도한 다음 96시간 동안 배양하였다. 이후 말혈청이 없는 배지로 바꾸어 1시간 동안 배양한 뒤, 메나디온 20 uM을 5시간 처리하였고, 항산화제로 알려진 EGCG (epigallocatechin gallate)는 분화 유도 72시간째에 1 ug/ml 농도로 선처리를 하고 24시간 뒤에 각각 DMSO 와 메나디온 20 uM 을 처리하였다. β-액틴은 mRNA 발현의 로딩 대조로 사용되었다.
그 결과를 도 8에 나타내었다.
도 8에 나타난 바와 같이, 대조 근관에서는 산화스트레스가 유발되었을 때 IL-6 나 TNF-α의 발현량은 유지되거나 소폭 증가한 반면, dmd 근관에서는 산화스트레스가 유발되었을 때 IL6 의 발현은 억제되었고 TNFα의 발현은 크게 차이가 없었다. 항산화제인 EGCG 를 선처리한 뒤 메나디온으로 산화스트레스를 유발시켰을 때에는 dmd 근관에서 발현억제 되었던 IL6의 발현이 다시 복귀되는 것을 확인하였다.
한국생명공학연구원 KCTC12475BP 20130816

Claims (9)

  1. 디스트로핀 폴리뉴클레오티드의 발현을 억제하는 shRNA가 도입된 동물세포 세포주로서,
    상기 동물세포는 수탁번호 KCTC 12475BP인 것인, 세포주.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 청구항 1에 있어서, 상기 동물세포는 마우스 유래 동물세포인 것을 특징으로 하는, 세포주.
  5. 청구항 1에 있어서, 상기 세포주는 근원세포 유래인 것을 특징으로 하는, 세포주.
  6. 삭제
  7. (1) 청구항 1, 4 내지 5 중 어느 한 항의 세포주에 피검 물질을 처리하는 단계; 및
    (2) 상기 세포주의 활성을 측정하는 단계를 포함하는, 근위축증의 예방 또는 치료 물질을 스크리닝하는 방법으로서,
    상기 세포주의 활성은 세포의 분화, 세포 융합, 유전자 발현 및 단백질 활성으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인, 방법.
  8. 청구항 7에 있어서, 상기 근위축증은 근위축성 측삭경화증, 척수성 근위축증, 진행성 근위축증, 강직성근위축증, 루게릭병, 신경원성 근위축증, 듀센 근위축증, 벡커 근위축증, 지대형 근위축증, 안면갑상완 근위축증, 눈인두 근위측증, 및 근육 긴장으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인, 근위축증의 예방 또는 치료 물질을 스크리닝하는 방법.
  9. 삭제
KR1020130097393A 2013-08-16 2013-08-16 디스트로핀 폴리뉴클레오티드의 발현을 억제하는 뉴클레오티드가 도입된 동물 세포주 KR101666618B1 (ko)

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Cell Calcium, 2001, Volume 29, Number 2, pages 85-96.
Journal of Neurochemistry. 1995, Volume 64, Issue 5, pages 2230-2238.*

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