JP7141621B2 - コンドロイチン硫酸生合成を阻害するアンチセンス核酸 - Google Patents

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Description

本発明は、コンドロイチン硫酸生合成を阻害するアンチセンスオリゴヌクレオチドに関する。
脊髄損傷(SCI)は、主として脊柱に強い外圧が加えられることによって脊髄に損傷を受けた病態をいう。脊髄を含む中枢神経系は、一度損傷すると修復及び再生することはないため、脊髄損傷を有する患者は、重度の運動機能障害などを患うことが多い。
コンドロイチン硫酸(CS)は、動物の細胞外マトリックスに広く分布するグリコサミノグリカンの一種である。コンドロイチン硫酸は、D-グルクロン酸(GlcA)とN-アセチル-D-ガラクトサミン(GalNAc)の2糖が反復する糖鎖に、硫酸が結合した構造を有する。脊髄損傷後、脊髄でコンドロイチン硫酸が生成され、生成されたコンドロイチン硫酸は軸索再生の強力な阻害因子となることが知られている。
コンドロイチン硫酸N-アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ-1(CSGalNAcT1)及びコンドロイチン硫酸N-アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ-2(CSGalNAcT2)は、コンドロイチン硫酸生合成に関与する酵素である。
本発明者らは、CSGalNAcT1ノックアウトマウスにおいて、脊髄損傷後のコンドロイチン硫酸合成が低下すること、及び脊髄損傷からの回復が促進されることを報告している(非特許文献1及び2)。
Watanabe, T., et al., Chondroitin sulfate N-acetylgalactosaminyltransferase-1 is required for normal cartilage development. Biochem. J., 2010, 432: 47-55 Takeuchi, K., et al., Chondroitin sulphate N-acetylgalactosaminyltransferase-1 inhibits recovery from neural injury. Nature Communication, 2013, 4: 2740
本発明は、コンドロイチン硫酸生合成を阻害するアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供することを課題とする。
本発明者らは、上記課題を解決するため、鋭意検討を重ねた結果、CSGalNAcT1遺伝子及びCSGalNAcT2遺伝子の一方又は両方を抑制するアンチセンスオリゴヌクレオチドがコンドロイチン硫酸生合成を阻害し、コンドロイチン硫酸量を低下させ、脊髄損傷等のコンドロイチン硫酸の増加と関連する疾患又は状態の治療に用い得ることを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち本発明は以下を包含する。
[１]コンドロイチン硫酸N-アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ-1(CSGalNAcT1)遺伝子及びコンドロイチン硫酸N-アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ-2(CSGalNAcT2)遺伝子の一方又は両方の発現を抑制する、少なくとも1つの修飾ヌクレオチドを有する、アンチセンスオリゴヌクレオチド。
[２]配列番号1～3、5～111、113、115、116、119～123、125、131～137、139～145、148～151、153、154、161、及び162からなる群から選択される配列の11～15個の連続した核酸塩基配列、又はこれにおいて1個若しくは2個の核酸塩基が置換、欠失若しくは挿入された核酸塩基配列を含む、[１]に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
[３]配列番号1、9、16、18、21～30、35、37、39、40、49～52、54、55、57～59、62、63、67、88、89、102、107、108、113、115、134、140、141、144、154、161、及び162からなる群から選択される配列の11～15個の連続した核酸塩基配列、又はこれにおいて1個若しくは2個の核酸塩基が置換、欠失若しくは挿入された核酸塩基配列を含む、[２]に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
[４]配列番号18、35、52、57、88、108、113、115、134、140、141、142、154、155、156、161及び162からなる群から選択される配列の11～15個の連続した核酸塩基配列、又はこれにおいて1個若しくは2個の核酸塩基が置換、欠失若しくは挿入された核酸塩基配列を含む、[１]に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
[５]CSGalNAcT1 mRNAの一部に対してミスマッチがないか又は1個～4個のミスマッチを有し、かつCSGalNAcT2 mRNAの一部に対してミスマッチがないか又は1個～4個のミスマッチを有する核酸塩基配列からなる、[１]に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
[６]CSGalNAcT1 mRNAの一部に対してミスマッチがなく、かつCSGalNAcT2 mRNAの一部に対して1個～4個のミスマッチを有する核酸塩基配列からなる、[５]に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
[７]CSGalNAcT1 mRNAの一部に対して1個～4個のミスマッチを有し、かつCSGalNAcT2 mRNAの一部に対してミスマッチがない核酸塩基配列からなる、[５]に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
[８]CSGalNAcT1 mRNAの一部に対してミスマッチがなく、かつCSGalNAcT2 mRNAの一部に対してミスマッチがない核酸塩基配列からなる、[５]に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
[９]配列番号1～3、5～58、108～111、113、115、116、119～123、125、161、及び162からなる群から選択される配列の11～15個の連続した核酸塩基配列、又はこれにおいて1個若しくは2個の核酸塩基が置換、欠失若しくは挿入された核酸塩基配列を含み、かつ、配列番号164に示される配列の一部に対してミスマッチがないか又は1個～4個のミスマッチを有する核酸塩基配列からなる、[２]に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
[１０]配列番号49～107、131～137、139～145、148～151、153、及び154からなる群から選択される配列の11～15個の連続した核酸塩基配列、又はこれにおいて1個若しくは2個の核酸塩基が置換、欠失若しくは挿入された核酸塩基配列を含み、かつ、配列番号165に示される配列の一部に対してミスマッチがないか又は1個～4個のミスマッチを有する核酸塩基配列からなる、[２]に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
[１１]CSGalNAcT1遺伝子及びCSGalNAcT2遺伝子の一方又は両方の発現を20％以上抑制する、[１]～[１０]のいずれかに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
[１２]11～20塩基長である、[１]～[１１]のいずれかに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
[１３]修飾ヌクレオチドが、二環式糖を含む、[１]～[１２]のいずれかに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
[１４]少なくとも1つのヌクレオシド間結合が、ホスホロチオエート結合である、[１]～[１３]のいずれかに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
[１５]修飾ヌクレオチドが、5-メチルシトシンを含む、[１]～[１４]のいずれかに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
[１６]ギャップマーである、[１]～[１５]のいずれかに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
[１７]コンドロイチン硫酸の増加と関連する疾患又は状態を治療するための、[１]～[１６]のいずれかに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む、医薬組成物。
[１８]前記疾患又は状態が、脊髄損傷である、[１７]に記載の医薬組成物。
本明細書は本願の優先権の基礎となる日本国特許出願番号2017-072315号の開示内容を包含する。
本発明により、コンドロイチン硫酸生合成を阻害するアンチセンスオリゴヌクレオチドが提供される。
アンチセンスオリゴヌクレオチドのヒトYKG-1細胞におけるCSGalNAcT1及びCSGalNAcT2遺伝子に対する発現抑制活性を示すグラフである。 アンチセンスオリゴヌクレオチドのマウス3T3N細胞におけるCSGalNAcT1及びCSGalNAcT2遺伝子に対する濃度依存的発現抑制活性を示すグラフである。 アンチセンスオリゴヌクレオチドのヒトSKOV-3細胞におけるCSGalNAcT1及びCSGalNAcT2遺伝子に対する濃度依存的発現抑制活性を示すグラフである。 アンチセンスオリゴヌクレオチドのヒトSKOV-3細胞におけるCSGalNAcT1及びCSGalNAcT2遺伝子に対する濃度依存的発現抑制活性を示すグラフである。 アンチセンスオリゴヌクレオチドのヒトU251細胞におけるCSGalNAcT1及びCSGalNAcT2遺伝子に対する発現抑制活性を示すグラフである。 アンチセンスオリゴヌクレオチドのヒトU251細胞におけるCSGalNAcT1及びCSGalNAcT2遺伝子に対する濃度依存的発現抑制活性を示すグラフである。 アンチセンスオリゴヌクレオチドのコンドロイチン硫酸及びへパラン硫酸量への影響を示すグラフである。 アンチセンスオリゴヌクレオチドのへパラン硫酸量への影響を示すグラフである。 アンチセンスオリゴヌクレオチドの瘢痕形成への影響を示すグラフである。 アンチセンスオリゴヌクレオチドの脊髄損傷モデルマウスにおける後肢運動機能への影響を示すグラフである。 アンチセンスオリゴヌクレオチドの脊髄損傷モデルマウスにおける糖鎖量への影響を示すグラフである。 アンチセンスオリゴヌクレオチドの脊髄損傷モデルラットにおける後肢運動機能への影響を示すグラフである。 アンチセンスオリゴヌクレオチドの脊髄損傷モデルマウスにおける後肢運動機能への影響を示すグラフである。
以下、本発明を詳細に説明する。
(アンチセンスオリゴヌクレオチド)
本発明は、アンチセンスオリゴヌクレオチドに関する。より具体的には、本発明は、コンドロイチン硫酸生合成を阻害するアンチセンスオリゴヌクレオチド、特に、コンドロイチン硫酸N-アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ-1(CSGalNAcT1)遺伝子及びコンドロイチン硫酸N-アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ-2(CSGalNAcT2)遺伝子の一方又は両方の発現を抑制するアンチセンスオリゴヌクレオチドに関する。
本明細書において、CSGalNAcT1遺伝子及びCSGalNAcT2遺伝子は、N-アセチルガラクトサミン(GalNAc)を、UDP-GalNAcから、グルクロン酸の非還元末端に転移する活性を有する酵素をコードする遺伝子を指す。CSGalNAcT1遺伝子及びCSGalNAcT2遺伝子は、脊椎動物門よりも原始的な動物(中枢神経再生が認められる動物)には存在せず、中枢神経損傷を受け得る脊椎動物門になって初めて出現した遺伝子である。CSGalNAcT2遺伝子は、CSGalNAcT1遺伝子のパラログであると考えられている。CSGalNAcT1遺伝子及びCSGalNAcT2遺伝子の由来は、特に限定されないが、例えば哺乳動物、例えば霊長類(例えば、カニクイザル、チンパンジー及びヒト)及び非霊長類(例えば、ウシ、ブタ、ヒツジ、ウマ、ネコ、イヌ、モルモット、ラット及びマウス)であり、より好ましくはヒトである。1つのアンチセンスオリゴヌクレオチドが標的とするCSGalNAcT1遺伝子及びCSGalNAcT2遺伝子は同一生物種由来であり得る。CSGalNAcT1遺伝子及びCSGalNAcT2遺伝子の塩基配列は、米国国立生物工学情報センター(NCBI)データベースから入手できる。ヒトCSGalNAcT1 mRNA配列を、配列番号164に示す(但し、RNAの配列をDNAの配列として示す)。ヒトCSGalNAcT2 mRNA配列を、配列番号165に示す(但し、RNAの配列をDNAの配列として示す)。マウスCSGalNAcT1 mRNA配列を、配列番号166に示す(但し、RNAの配列をDNAの配列として示す)。マウスCSGalNAcT2 mRNA配列を、配列番号167に示す(但し、RNAの配列をDNAの配列として示す)。ラットCSGalNAcT1 mRNA配列を、配列番号168に示す(但し、RNAの配列をDNAの配列として示す)。ラットCSGalNAcT2 mRNA配列を、配列番号169に示す(但し、RNAの配列をDNAの配列として示す)。本発明においては、翻訳されたタンパク質が同様の活性を有する限り、上記配列の改変体をコードする遺伝子もまた、CSGalNAcT1遺伝子及びCSGalNAcT2遺伝子の範囲内に入る。
本明細書において、「アンチセンス核酸」又は「アンチセンスオリゴヌクレオチド」は、標的遺伝子であるCSGalNAcT1及びCSGalNAcT2の一方又は両方のmRNAの一部にハイブリダイズすることが可能な(すなわち、相補的な)核酸塩基配列を含む、一本鎖オリゴヌクレオチドを指す。理論に拘束されるものではないが、本発明において、アンチセンス核酸又はアンチセンスオリゴヌクレオチドは、標的RNAとDNA-RNAハイブリッドを形成し、RNase Hによって切断されることによって標的RNAを分解し、その結果、標的遺伝子の発現を抑制し得る。アンチセンスオリゴヌクレオチドがハイブリダイズし得る標的遺伝子のmRNAの領域は、3'UTR、5'UTR、エキソン、イントロン、コード領域、翻訳開始領域、翻訳終結領域又は他の核酸領域を含み得る。
一実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、CSGalNAcT1遺伝子の発現を抑制し得る。別の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、CSGalNAcT2遺伝子の発現を抑制し得る。さらなる実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、CSGalNAcT1遺伝子及びCSGalNAcT2遺伝子の両方の発現を抑制し得る。CSGalNAcT1遺伝子及びCSGalNAcT2遺伝子の両方の発現を抑制すると、コンドロイチン硫酸生合成が効率的に阻害されるため好ましい。
本明細書において、遺伝子の発現に関する「抑制」とは、遺伝子の転写によって生じるmRNAの量(存在量)を低下させることを指す。抑制は、対照と比較して、mRNA量を20％以上、30％以上若しくは40％以上、好ましくは50％以上、より好ましくは80％以上、90％以上又は95％以上抑制することを含む。遺伝子発現の抑制は、当技術分野で公知のいずれの方法で決定してもよいが、特に、ヒト又はマウス細胞などの細胞を用いて、リアルタイムPCRなどのPCRに基づく方法で決定することができる。
本発明に係るアンチセンスオリゴヌクレオチドは、コンドロイチン硫酸量を低下させることができる。コンドロイチン硫酸量の低下は、例えば、後述の実施例に記載されるように、抗コンドロイチン硫酸抗体を用いたIn Cell ELISAアッセイによって決定できる。本発明に係るアンチセンスオリゴヌクレオチドは、コンドロイチン硫酸量を、対照と比較して、10％以上、20％以上、30％以上、40％以上、又は50％以上低下させ得る。
好ましい一実施形態では、本発明に係るアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ヘパラン硫酸量を低下させない。ヘパラン硫酸は、軸索再生を促進することが報告されている(Takeuchi, K., et al., 2013、上掲)。ヘパラン硫酸は、例えば、後述の実施例に記載されるように、抗ヘパラン硫酸抗体を用いたIn Cell ELISAアッセイによって決定できる。本発明に係るアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ヘパラン硫酸量を、対照と比較して、増加(例えば、10％以上増加)させてもよい。
一実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、後述の実施例1の表1A～1G(配列番号1～163)のいずれかに示される核酸塩基配列を含んでよい。
本明細書において、「核酸塩基」又は「塩基」は、核酸の塩基成分であり、別の核酸の塩基と対合することができる複素環部分を指す。本明細書において、「核酸塩基配列」は、核酸を構成する糖、ヌクレオシド間結合、又は核酸塩基修飾を考慮に入れない連続した核酸塩基の配列を意味する。
一実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドの核酸塩基配列は、配列番号1～163からなる群から選択されてもよい。
好ましい一実施形態では、核酸塩基配列は、後述の表1Aの配列番号1～3及び5～48；表1Bの配列番号49～58；表1Cの配列番号59～107；表1Dの配列番号108～111、115、116、119～123、及び125；並びに表1Eの配列番号131～137、139～145、148～151、153及び154からなる群から選択されてもよい。これらの核酸塩基配列からなるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、後述の実施例2(表2A～2E)において、CSGalNAcT1遺伝子及びCSGalNAcT2遺伝子の一方又は両方の発現を20％以上抑制することが示されている。
より好ましい一実施形態では、核酸塩基配列は、表1Aの配列番号1～3、5～30、32、33、及び35～48；表1Bの配列番号49～58；表1Cの配列番号59～79、81～91及び93～107；表1Dの配列番号108、111、115、121、122、及び125；並びに表1Eの配列番号131～134、136、137、139～145、148、149及び154からなる群から選択されてもよい。これらの核酸塩基配列からなるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、実施例2(表2A～2E)において、CSGalNAcT1遺伝子及びCSGalNAcT2遺伝子の一方又は両方の発現を50％以上抑制することが示されている。
さらにより好ましい一実施形態では、核酸塩基配列は、表1Aの配列番号1～3、5～7、9～30、32、及び35～48；表1Bの配列番号49～58；表1Cの配列番号59、60、62～65、67～79、82～91、及び94～107；表1Dの配列番号108、111、115、121及び122；並びに表1Eの配列番号131～134、136、137、140～142、144、145、149及び154からなる群から選択されてもよい。これらの核酸塩基配列からなるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、実施例2(表2A～2E)において、CSGalNAcT1遺伝子及びCSGalNAcT2遺伝子の一方又は両方の発現を70％以上抑制することが示されている。
さらにより好ましい一実施形態では、核酸塩基配列は、表1Aの配列番号1、9、16、18、21～30、35、37、39及び40；表1Bの配列番号49～52、54、55、57及び58；表1Cの配列番号59、62、63、67、88、89、102及び107；並びに表1Eの配列番号144からなる群から選択されてもよい。これらの核酸塩基配列からなるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、実施例2(表2A～2E)において、CSGalNAcT1遺伝子及びCSGalNAcT2遺伝子の両方の発現を70％以上抑制することが示されている。
別の一実施形態では、核酸塩基配列は、表1Aの配列番号18及び35；表1Bの配列番号52及び57；表1Cの配列番号88；表1Dの配列番号108、113、及び115；表1Eの配列番号134、140、141、142及び154；表1Eの配列番号155及び156；並びに表1Gの配列番号161及び162から選択されてもよい。これらの核酸塩基配列からなるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、実施例3～7(図2～7)等において、CSGalNAcT1遺伝子及びCSGalNAcT2遺伝子の一方又は両方の発現を大きく抑制すること及び/又はコンドロイチン硫酸量を低下させること等が示されている。より具体的には、核酸塩基配列は、配列番号52又は155であってもよい。配列番号52又は155に示される核酸塩基配列からなるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、実施例13及び14において、脊髄損傷における運動機能回復を促進することが示されている。
一実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、上記の核酸塩基配列の11～15個の連続した核酸塩基配列を含んでもよい。連続した核酸塩基配列は、11個以上、12個以上、13個以上、14個以上又は15個であってよい。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、上記の核酸塩基配列の11～15個の連続した核酸塩基配列からなってもよい。
別の一実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、上記の核酸塩基配列の11～15個の連続した核酸塩基配列において、1個若しくは2個の核酸塩基が置換、欠失若しくは挿入された(特に、置換された)核酸塩基配列を含んでもよい。
本発明において、アンチセンスオリゴヌクレオチドの核酸塩基配列は、CSGalNAcT1 mRNAの一部に対してミスマッチがないか又は1個～4個(又は1個～3個若しくは1個～2個)のミスマッチを有してもよい。本発明において、アンチセンスオリゴヌクレオチドの核酸塩基配列は、CSGalNAcT2 mRNAの一部に対してミスマッチがないか又は1個～4個(又は1個～3個若しくは1個～2個)のミスマッチを有してもよい。mRNAの「一部」とは、アンチセンスオリゴヌクレオチドが塩基対合によってハイブリダイズし得る、mRNA中の標的領域を指し、当該標的領域はアンチセンスオリゴヌクレオチドと同じ塩基長を有し得る。「ミスマッチ」とは、第一の核酸の核酸塩基が第二の核酸の対応する核酸塩基と塩基対合できない(相補的でない)ことを指す。
好ましい実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドの核酸塩基配列は、CSGalNAcT1 mRNAの一部に対してミスマッチがないか又は1個～4個(又は1個～3個若しくは1個～2個)のミスマッチを有し、かつCSGalNAcT2 mRNAの一部に対してミスマッチがないか又は1個～4個(又は1個～3個若しくは1個～2個)のミスマッチを有する。このような核酸塩基配列は、CSGalNAcT1 mRNAとCSGalNAcT2 mRNAとの間で相同性の高い領域を選定することによって設計できる。配列相同性は、当技術分野で公知のアルゴリズムを用いて、例えばBLAST解析によって解析できる(例えば、Altschul, S.F., et al., Basic local alignment search tool. 1990, J. Mol. Biol. 215: 403-410を参照)。
アンチセンスオリゴヌクレオチドの核酸塩基配列は、CSGalNAcT1 mRNAの一部に対してミスマッチがなく、かつCSGalNAcT2 mRNAの一部に対して1個～4個(又は1個～3個若しくは1個～2個)のミスマッチを有していてもよい。このような核酸塩基配列の例は、後述の実施例1の表1Aに示されている。
アンチセンスオリゴヌクレオチドの核酸塩基配列は、CSGalNAcT1 mRNAの一部に対して1個～4個(又は1個～3個若しくは1個～2個)のミスマッチを有し、かつCSGalNAcT2 mRNAの一部に対してミスマッチがなくてもよい。このような核酸塩基配列の例は、後述の実施例1の表1Cに示されている。
さらに好ましい一実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドの核酸塩基配列は、CSGalNAcT1 mRNAの一部に対してミスマッチがなく、かつCSGalNAcT2 mRNAの一部に対してミスマッチがない。後述の実施例1の表1Bは、ヒトCSGalNAcT1 mRNAの一部に対してミスマッチがなく、かつヒトCSGalNAcT2 mRNAの一部に対してミスマッチがない核酸塩基配列を示している。これらの核酸塩基配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドは、実施例2(図1及び表2B)において、CSGalNAcT1遺伝子及びCSGalNAcT2遺伝子の両方の発現を大きく抑制することが示されている。
一実施形態では、後述の実施例1の表1A(配列番号1～48)、表1B(配列番号49～58)及び表1D(配列番号108～130)のいずれかに示される核酸塩基配列の11～15個の連続した核酸塩基配列、又はこれにおいて1個若しくは2個の核酸塩基が置換、欠失若しくは挿入された核酸塩基配列を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ヒトCSGalNAcT1 mRNA(配列番号164)の一部に対してミスマッチがないか又は1個～4個(又は1個～3個若しくは1個～2個)のミスマッチを有してもよい。
別の一実施形態では、後述の実施例の表1B(配列番号49～58)、表1C(配列番号59～107)及び表1E(配列番号131～154)のいずれかに示される核酸塩基配列の11～15個の連続した核酸塩基配列、又はこれにおいて1個若しくは2個の核酸塩基が置換、欠失若しくは挿入された核酸塩基配列を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ヒトCSGalNAcT2 mRNA(配列番号165)の一部に対してミスマッチがないか又は1個～4個(又は1個～3個若しくは1個～2個)のミスマッチを有してもよい。
一実施形態では、後述の実施例の表1Gの配列番号159～162から選択される核酸塩基配列の11～15個の連続した核酸塩基配列、又はこれにおいて1個若しくは2個の核酸塩基が置換、欠失若しくは挿入された核酸塩基配列を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドは、マウスCSGalNAcT1 mRNA(配列番号166)又はヒトCSGalNAcT1 mRNA(配列番号164)の一部に対してミスマッチがないか又は1個～4個(又は1個～3個若しくは1個～2個)のミスマッチを有してもよい。
別の一実施形態では、後述の実施例の表1Gの配列番号163に示される核酸塩基配列の11～15個の連続した核酸塩基配列、又はこれにおいて1個若しくは2個の核酸塩基が置換、欠失若しくは挿入された核酸塩基配列を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドは、マウスCSGalNAcT2 mRNA(配列番号167)又はヒトCSGalNAcT2 mRNA(配列番号165)の一部に対してミスマッチがないか又は1個～4個(又は1個～3個若しくは1個～2個)のミスマッチを有してもよい。
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、11～20塩基長、12～19塩基長、13～18塩基長、14～17塩基長又は14～16塩基長であってよい。
本発明において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、天然(非修飾)ヌクレオチド(デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、若しくは両者)及び/又は非天然(修飾)ヌクレオチドを含み得る。
一般に、「ヌクレオシド」は、糖及び核酸塩基の組み合わせである。「ヌクレオチド」は、ヌクレオシドの糖部分に共有結合したリン酸基をさらに含む。リン酸基は、一般に、オリゴヌクレオチドのヌクレオシド間結合を形成する。オリゴヌクレオチドは、互いに隣接するヌクレオシドの共有結合によって形成され、直鎖ポリマーオリゴヌクレオチドを形成する。
本明細書において「修飾ヌクレオシド」とは、独立して、修飾糖及び/又は修飾核酸塩基を有するヌクレオシドを意味する。「修飾ヌクレオチド」とは、独立して、修飾ヌクレオシド間結合、修飾糖及び/又は修飾核酸塩基を有するヌクレオチドを意味する。修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドは、標的核酸への親和性の強化、及びヌクレアーゼ耐性の増加等の望ましい特性により、非修飾型よりも好ましい。
本明細書において「修飾ヌクレオシド間結合」は、天然に存在するヌクレオシド間結合(すなわち、ホスホジエステル結合)からの置換又は何らかの変化を有するヌクレオシド間結合を指す。修飾ヌクレオシド間結合としては、限定するものではないが、ホスホロチオエート結合、ホスホロジチオエート結合、ホスホロジアミデート結合及びホスホロアミデート結合などが挙げられる。ホスホロチオエート結合は、ホスホジエステル結合の非架橋酸素原子を硫黄原子に置換したヌクレオシド間結合を指す。修飾ヌクレオシド間結合は、ヌクレアーゼ耐性が天然に存在するヌクレオシド間結合よりも高い結合であることが好ましい。
本明細書において「修飾核酸塩基」は、アデニン、シトシン、グアニン、チミン、又はウラシル以外の任意の核酸塩基を指す。「非修飾核酸塩基」又は「天然核酸塩基」は、プリン塩基であるアデニン(A)及びグアニン(G)、並びにピリミジン塩基であるチミン(T)、シトシン(C)、及びウラシル(U)を指す。修飾核酸塩基の例としては、5-メチルシトシン、5-フルオロシトシン、5-ブロモシトシン、若しくは5-ヨードシトシン；5-フルオロウラシル、5-ブロモウラシル、5-ヨードウラシル、若しくは5-ヒドロキシウラシル；2-チオチミン；N6-メチルアデニン若しくは8-ブロモアデニン；並びにN2-メチルグアニン若しくは8-ブロモグアニン等が挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書において「修飾糖」とは、天然糖部分(すなわち、DNA(2'-H)又はRNA(2'-OH)中に見られる糖部分)からの置換又は何らかの変化を有する糖を指す。修飾糖は、標的核酸への親和性の強化、及びヌクレアーゼ耐性の増加等をオリゴヌクレオチドに付与し得る。修飾糖の例としては、例えば、二環式糖、5'-ビニル、5'-メチル、4'-S、2'-F、2'-OCH3(2'-メトキシ若しくは2'-O-メチル基)、及び2'-O(CH2)2OCH3置換基等が挙げられる。
本明細書において「二環式糖」は、2つの環を持つ糖を指す。二環式糖部分を含む核酸は、一般に架橋核酸(bridged nucleic acid、BNA)と称される。二環式糖は、2'位の炭素原子及び4'位の炭素原子が2つ以上の原子によって架橋されている糖であってよい。二環式糖の例としては、限定されないが、メチレンオキシ(4'-CH2-O-2')架橋を有する糖(LNA(商標)、2',4'-BNAとしても知られている)、エチレンオキシ(4'-(CH2)2-O-2')架橋を有する糖(ENAとしても知られている)、4'-CH(CH3)-O-2'架橋を有する糖(cEt、constrained ethyl)、4'-CH(CH2OCH3)-O-2'架橋を有する糖(cMOE、constrained MOE)、アミド架橋を有する糖(AmNA、Amido-bridged nucleic acid)などが挙げられる。アミド架橋を有する糖の一例としては、4'-C(O)-N(CH3)-2'架橋を有する糖が挙げられる。アミド架橋を有する糖の構造及び調製方法については、例えば、Yahara, A., et al., Amido-bridged nucleic acids (AmNAs): synthesis, duplex stability, nuclease resistance, and in vitro antisense potency, ChemBioChem, 2012, 13(7): 2513-2516、Yamamoto, T., et al., Amido-bridged nucleic acids with small hydrophobic residues enhance hepatic tropism of antisense oligonucleotides in vivo, Org. Biomol. Chem., 2015, 13: 3757-3765、及び国際公開第WO2011/052436号を参照のこと。4'-CH(CH3)-O-2'架橋を有する糖(cEt)及び4'-CH(CH2OCH3)-O-2'架橋を有する糖(cMOE)については、Punit, P.S., et al., Short antisense oligonucleotides with novel 2'-4' conformationaly restricted nucleoside analogues show improved potency without increased toxicity in animals, J. Med. Chem., 2009, 52(1): 10-13を参照のこと。
本発明では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ペプチド核酸、モルホリノ核酸などのヌクレオチド模倣体を含んでもよい。
一般に、同一鎖中の異なるヌクレオチドは、独立して異なる修飾を受けることできる。また、例えばヌクレアーゼ耐性を増強するため、同一のヌクレオチドは、修飾ヌクレオシド間結合(例えば、ホスホロチオエート結合)を有し、さらに、修飾糖(例えば、二環式糖)を有することができる。同一のヌクレオチドはまた、修飾核酸塩基(例えば、5-メチルシトシン)を有し、さらに、修飾糖(例えば、二環式糖)を有することができる。
一実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、少なくとも1つの修飾ヌクレオチドを含んでよい。修飾ヌクレオチドは、修飾ヌクレオシド間結合、修飾糖部分及び/又は修飾核酸塩基を含み得る。
一実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドのヌクレオシド間結合の少なくとも1つは、修飾ヌクレオシド間結合であってよい。アンチセンスオリゴヌクレオチドのヌクレオシド間結合の少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、又は100％は、修飾ヌクレオシド間結合であってよい。修飾ヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエート結合であってよい。
一実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドの糖部分の少なくとも1つは、二環式糖であってよい。二環式糖は、メチレンオキシ(4'-CH2-O-2')架橋又はアミド架橋(例えば4'-C(O)-N(CH3)-2'架橋)を有してよい。
一実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドの核酸塩基の少なくとも1つは、修飾核酸塩基であってよい。修飾核酸塩基は、5-メチルシトシンであってよい。
特定の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ギャップマー(gapmer)であってもよい。本明細書において「ギャップマー」とは、少なくとも4個の連続デオキシリボヌクレオシドを含む中央領域(DNAギャップ領域)、その5'末端側及び3'末端側に配置された非天然ヌクレオシドを含む領域(5'ウイング領域及び3'ウイング領域)からなるオリゴヌクレオチドを指す。DNAギャップ領域の長さは、4～16塩基長、5～14塩基長、6～12塩基長、又は8～10塩基長であってよい。5'ウイング領域及び3'ウイング領域の長さは、独立して、1～6塩基長、1～5塩基長、又は2～4塩基長であってよい。5'ウイング領域及び3'ウイング領域は、非天然ヌクレオシドを少なくとも1個含んでいればよく、天然ヌクレオシドを含んでいてもよい。5'ウイング領域及び3'ウイング領域は、それぞれ、一種類の又は複数の種類の非天然ヌクレオシドを含んでいてもよい。5'ウイング領域及び3'ウイング領域の全てのヌクレオシドは、非天然ヌクレオシドであってもよい。あるいは、ギャップマーの5'末端及び3'末端の一方又は両方(特に3'末端)のヌクレオシドは、天然ヌクレオシド(特に、デオキシリボヌクレオシド)であってもよい。5'ウイング領域及び3'ウイング領域に含まれる非天然ヌクレオシドは、二環式糖を有するヌクレオシドであってよい。二環式糖は、メチレンオキシ(4'-CH2-O-2')架橋を有する糖、又はアミド架橋(例えば4'-C(O)-N(CH3)-2'架橋)を有する糖であってよい。5'ウイング領域及び3'ウイング領域に含まれる非天然ヌクレオシドは、修飾核酸塩基(例えば、5-メチルシトシン)を含んでいてもよい。
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、当技術分野で公知の方法によって、製造することができる。例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、市販の自動核酸合成装置を使用して合成し、その後、逆相カラムなど用いて精製することにより製造することができる。あるいは、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、核酸塩基配列並びに修飾部位及び種類を指定して、製造業者(例えば、株式会社ジーンデザイン)に注文し、入手することもできる。
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、CSGalNAcT1遺伝子及びCSGalNAcT2遺伝子の一方又は両方の発現を抑制することにより、コンドロイチン生合成を阻害し、その結果、コンドロイチン硫酸量を低下させることができる。脊髄損傷後のコンドロイチン硫酸の増加は、軸索再生を阻害し、脊髄損傷からの回復を妨げる。本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドにより、コンドロイチン硫酸量を低下させることによって、脊髄損傷を治療(脊髄損傷からの回復を促進)することができる。一方、ヘパラン硫酸は、軸索再生を促進することが報告されている(Takeuchi, K., et al., 2013、上掲)。本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ヘパラン硫酸量を低下させずにコンドロイチン硫酸量を低下させることができるため、脊髄損傷を効果的に治療することができる。
(医薬組成物)
本発明は、本発明の一実施形態に係るアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む医薬組成物を提供する。医薬組成物は、コンドロイチン硫酸の増加と関連する疾患又は状態を治療するために使用できる。
コンドロイチン硫酸の増加と関連する疾患又は状態としては、限定されないが、脊髄損傷、脳血管障害(例えば、脳損傷及び脳虚血)、消化器系疾患(例えば、炎症性大腸炎)、並びに皮膚損傷若しくは炎症が挙げられる。
本明細書において、脊髄損傷は、脊髄に損傷を受けた病態をいう。脊髄損傷の原因は問わない。脊髄損傷は、外傷性の脊髄損傷であってもよい。脊髄損傷は、完全脊髄損傷及び不完全脊髄損傷を含む。完全脊髄損傷は、脊髄が横断的に離断した状態を指す。不完全脊髄損傷は、脊髄の一部が損傷した状態を指す。脊髄損傷によって、運動機能障害、感覚障害、自律神経障害などの様々な障害が生じる。
本明細書において、「治療」は、脊髄損傷を有する被験体において、脊髄損傷によって生じた症状(例えば運動機能障害)を軽減若しくは治癒することを含み得る。
脊髄損傷後に組織修復の結果として生じる瘢痕は、神経の再生を阻害すると一般に考えられている。そのため、瘢痕の形成を抑制することにより、脊髄損傷の回復を促進することができる。本発明に係る医薬組成物は、脊髄損傷後の瘢痕形成を抑制又は低下させるために使用してもよい。
医薬組成物は、製剤分野で通常使用される任意の製剤補助剤をさらに含んでもよい。本明細書において、製剤補助剤としては、製薬上許容される、担体（固体又は液体担体）、賦形剤、安定化剤、崩壊剤、界面活性剤、結合剤、滑沢剤、乳化剤、懸濁剤、抗酸化剤、矯臭剤、充填剤、溶解補助剤、コーティング剤、着色剤、矯味剤、保存剤、緩衝剤などの、様々な担体又は添加剤を用いることができる。具体的には、製剤補助剤としては、水、生理食塩水、他の水性溶媒、製薬上許容される有機溶媒、マンニトール、ラクトース、デンプン、微結晶セルロース、ブドウ糖、カルシウム、ポリビニルアルコール、コラーゲン、ポリビニルピロリドン、カルボキシビニルポリマー、アルギン酸ナトリウム、水溶性デキストラン、水溶性デキストリン、カルボキシメチルスターチナトリウム、ペクチン、アラビアゴム、キサンタンガム、カゼイン、ゼラチン、寒天、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、ワセリン、パラフィン、グリセリン、ステアリルアルコール、ステアリン酸、ソルビトールなどが挙げられる。製剤補助剤は、製剤の剤形に応じて適宜又は組み合わせて選択され得る。
医薬組成物は、経口的又は非経口的に被験体に投与できる。非経口的投与としては、限定されないが、髄腔内投与及び局所投与などが挙げられる。効率的に治療効果をもたらすため、医薬組成物は、損傷部へ局所的に直接投与することが好ましい。また、持続注入ポンプを用いて、医薬組成物を持続的に損傷部へ投与することもできる。また、医薬組成物をスポンジに担持させて損傷部に留置してもよい。医薬組成物は、注射剤、点滴剤などの製剤としてよい。当業者は、慣用の方法でこれらの製剤を製造することができる。
医薬組成物は、治療上有効な量で投与されてよい。医薬組成物の具体的な投与量は、個々の被験体に応じて、疾患の重症度、全身の健康状態、年齢、性別、体重及び治療に対する忍容性などに基づき、例えば医師の判断により決定される。例えば、医薬組成物は、アンチセンスオリゴヌクレオチドが0.000001mg/体重ｋｇ/日～1000mg/体重kg/日、又は0.001mg/体重kg/日～1mg/体重kg/日、又は0.005mg/体重kg/日～0.5mg/体重kg/日、又は0.01mg/体重kg/日～0.1mg/体重kg/日となる量で投与してもよい。医薬組成物は、単回投与又は複数回投与することができ、例えば一定の時間間隔、例えば、1日、2日、3日、4日、5日、6日、1週間、2週間、3週間、1ヶ月などの間隔で、被験体に対して、数回又は数十回投与してもよい。あるいは、医薬組成物は、上述のように持続注入ポンプを用いて持続的に投与してもよい。持続投与する場合の投与量(速度)、期間などは当業者であれば適宜設定できる。
医薬組成物を投与する被験体は、哺乳動物、例えば霊長類(例えば、カニクイザル、チンパンジー及びヒト)及び非霊長類(例えば、ウシ、ブタ、ヒツジ、ウマ、ネコ、イヌ、モルモット、ラット及びマウス)であり、より好ましくはヒトである。被験体は、脊髄損傷を有する被験体であってよい。
本発明はまた、コンドロイチン硫酸の増加と関連する疾患又は状態の治療方法であって、それを必要とする被験体に、本発明の一実施形態に係るアンチセンスオリゴヌクレオチド又は医薬組成物を投与することを含む、方法を提供する。
本発明はまた、コンドロイチン硫酸の増加と関連する疾患又は状態を治療するための医薬の製造における、本発明の一実施形態に係るアンチセンスオリゴヌクレオチドの使用を提供する。
以下、実施例を用いて本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明の技術的範囲はこれら実施例に限定されるものではない。
[実施例1]
(アンチセンスオリゴヌクレオチドの設計及び合成)
CSGalNAcT1遺伝子及びCSGalNAcT2遺伝子の両方の発現を抑制し得るアンチセンスオリゴヌクレオチドを設計した。ヒトCSGalNAcT1 mRNA(配列番号164)とヒトCSGalNAcT2 mRNA(配列番号165)との間で、BLAST解析によって相同性の高い領域を選定した。次いで、この領域内において、mfoldプログラム(M. Zuker, Mfold web server for nucleic acid folding and hybridization prediction. Nucleic Acids Res. 31 (13), 3406-15, (2003))による高次構造予測又は毒性発現配列の除外により、107種の核酸塩基配列を設計した(表1A、1B及び1C)。表1Aに示される配列は、ヒトCSGalNAcT1 mRNAの一部に対してミスマッチがなく(完全に相補的であり)、かつヒトCSGalNAcT2 mRNAの一部に対して1～4個のミスマッチを有する配列である。表1Bに示される配列は、ヒトCSGalNAcT1 mRNAの一部に対してミスマッチがなく、かつヒトCSGalNAcT2 mRNAの一部に対してミスマッチがない配列である。表1Cに示される配列は、ヒトCSGalNAcT1 mRNAの一部に対して1～4個のミスマッチを有し、かつヒトCSGalNAcT2 mRNAの一部に対してミスマッチがない配列である。
次に、CSGalNAcT1 mRNAとCSGalNAcT2 mRNAとの相同性を考慮せずに、CSGalNAcT1遺伝子及びCSGalNAcT2遺伝子の一方の発現を抑制し得るアンチセンスオリゴヌクレオチドを設計した(表1D及び1E)。表1Dに示す配列は、ヒトCSGalNAcT1 mRNAの一部に対してミスマッチがない配列である。表1Eに示す配列は、ヒトCSGalNAcT2 mRNAの一部に対してミスマッチがない配列である。
表1A～1Eに示すアンチセンスオリゴヌクレオチドを合成した。アンチセンスオリゴヌクレオチドの合成は、株式会社ジーンデザインに注文して行った。表1A～1Eに示すアンチセンスオリゴヌクレオチドは、3個のLNAヌクレオシドからなる5'ウイング領域、9個のデオキシリボヌクレオシドからなるDNAギャップ領域、並びに2個のLNAヌクレオシドと3'末端の1個のデオキシリボヌクレオシドとからなる3'ウイング領域からなる15塩基長のギャップマーとした。LNAヌクレオシドは、メチレンオキシ(4'-CH2-O-2')架橋を有する糖を有するヌクレオシドである。表1A～1Eに示すアンチセンスオリゴヌクレオチドの全てのヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエート結合とした。表1A～1Eに示すアンチセンスオリゴヌクレオチドのLNAヌクレオシド中のシトシンは、5-メチルシトシンとした。
Figure 0007141621000001
Figure 0007141621000002
Figure 0007141621000003
Figure 0007141621000004
Figure 0007141621000005
次いで、表1Fに示すAmNAヌクレオシドを有するアンチセンスオリゴヌクレオチドを合成した。hT2-1617-AmNA(15)、hT1-2519-AmNA(15)、hT1-1831-AmNA(15)及びhT1-2514-AmNA(15)は、それぞれ、表1A～1Eに示されるhT2-1617-LNA(15)、hT1-2519-LNA(15)、hT1-1831-LNA(15)及びhT1-2514-LNA(15)と同じ核酸塩基配列を有する。アンチセンスオリゴヌクレオチドの合成は、株式会社ジーンデザインに注文して行った。表1Fに示すアンチセンスオリゴヌクレオチドは、3個のAmNAヌクレオシドからなる5'ウイング領域、9個のデオキシリボヌクレオシドからなるDNAギャップ領域、並びに2個のAmNAヌクレオシドと3'末端の1個のデオキシリボヌクレオシドとからなる3'ウイング領域からなる15塩基長のギャップマーとした。表1Fに示すアンチセンスオリゴヌクレオチドの全てのヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエート結合とした。表1Fに示すアンチセンスオリゴヌクレオチドのAmNAヌクレオシド中のシトシンは、5-メチルシトシンとした。AmNAヌクレオシドは、4'-C(O)-N(CH3)-2'架橋を有する糖を有する修飾ヌクレオシドとした。
Figure 0007141621000006
次いで、表1Gに示すマウスCSGalNAcT1遺伝子又はマウスCSGalNAcT2遺伝子を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドを合成した。mT1-2120-LNA(15)、mT1-2151-LNA(15)、mT1-2156-LNA(15)、及びmT1-1915-LNA(15)は、マウスCSGalNAcT1 mRNA(配列番号166)に対してミスマッチがない核酸塩基配列を有する。mT2-1623-LNA(15)は、マウスCSGalNAcT2 mRNA(配列番号167)に対してミスマッチがない核酸塩基配列を有する。mT1-2156-LNA(15)の核酸塩基配列(配列番号161)は、hT1-2519-LNA(15)の核酸塩基配列(配列番号57)において1個の核酸塩基が置換した核酸塩基配列である。mT1-1915-LNA(15)の核酸塩基配列(配列番号162)は、hT1-2278-LNA(15)の核酸塩基配列(配列番号29)において2個の核酸塩基が置換した核酸塩基配列である。アンチセンスオリゴヌクレオチドの合成は、株式会社ジーンデザインに注文して行った。表1Gに示すアンチセンスオリゴヌクレオチドは、3個のLNAヌクレオシドからなる5'ウイング領域、9個のデオキシリボヌクレオシドからなるDNAギャップ領域、並びに2個のLNAヌクレオシドと3'末端の1個のデオキシリボヌクレオシドとからなる3'ウイング領域からなる15塩基長のギャップマーとした。表1Gに示すアンチセンスオリゴヌクレオチドの全てのヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエート結合とした。表1Gに示すアンチセンスオリゴヌクレオチドのLNAヌクレオシド中のシトシンは、5-メチルシトシンとした。
Figure 0007141621000007
表1A～1Gに示されるアンチセンスオリゴヌクレオチドの名称は、ヒト(h)又はマウス(m)のCSGalNAcT1 mRNA(T1)又はCSGalNAcT2 mRNA(T2)中の標的領域の位置、及び修飾ヌクレオシドの種類、並びに塩基長を示す。例えば、hT1-1475-LNA(15)は、ヒトCSGalNAcT1 mRNAの1475位から始まる領域を標的とし、かつ、LNAヌクレオシドを含み、15塩基長であることを示す。例えば、hT2-1617-AmNA(15)は、ヒトCSGalNAcT2 mRNAの1617位から始まる領域を標的とし、かつ、AmNAヌクレオシドを含み、15塩基長であることを示す。
[実施例2]
(ヒトYKG-1細胞におけるアンチセンスオリゴヌクレオチドの発現抑制活性)
実施例1で合成したアンチセンスオリゴヌクレオチドのいくつかをヒトYKG-1細胞にトランスフェクトし、CSGalNAcT1 mRNA及びCSGalNAcT2 mRNAを定量することによって、アンチセンスオリゴヌクレオチドの、ヒトYKG-1細胞におけるCSGalNAcT1及びCSGalNAcT2遺伝子発現抑制活性を調べた。
ヒトYKG-1細胞を国立研究開発法人 医薬基盤・健康・栄養研究所 JCRB細胞バンクから細胞登録番号 JCRB0746で入手した。細胞の解凍を次のように行った。10％血清(ウシ胎児血清、biowest社)及び1％抗生物質(ペニシリン-ストレプトマイシン混合溶液(安定化)、ナカライテスク株式会社)を補充したDMEM培地(DMEM(低グルコース)、ナカライテスク株式会社)9mLを50mL遠沈管に添加した。37℃で80％融解した細胞を遠沈管に添加した。冷却遠心分離機(VERSATILE REFRIGERATED CENTRIFUGE、株式会社トミー精工)を用いて、細胞を1000rpm、2分間、室温で遠心分離した。上清を吸引して除去し、細胞を新しい培地(上記の10％血清及び1％抗生物質を補充したDMEM培地)に再懸濁し、細胞5～10×105個を10cmディッシュ(100mm/組織培養用ディッシュ、IWAKI社)に播種した。細胞を、37℃、5％CO2環境下で培養した。
細胞を上記のように解凍した翌日に、培養上清を吸引して除去し、細胞に新しい培地(10％血清及び1％抗生物質を補充したDMEM培地)を10mL添加することによって、培地を交換した。
細胞の継代培養を次のように行った。セミコンフルエントに達した時に細胞を継代した。10cmディッシュから培養培地を吸引して除去し、PBS 4mLで細胞を洗浄後、細胞にトリプシン(0.25％-トリプシン/1mM-EDTA溶液、ナカライテスク株式会社)を2mL添加し、37℃、5％CO2環境下で3分間静置した。新しい培地(10％血清及び1％抗生物質を補充したDMEM培地)を8mL添加後、ピペッティングし、細胞を50mL遠沈管に移した。細胞を、1000rpm、2分間、室温で遠心分離した。上清を吸引して除去し、新しい培地(10％血清及び1％抗生物質を補充したDMEM培地)を5～10mL入れ細胞を再懸濁した。細胞をカウントし、細胞2～7×105個を新しい10cmディッシュに播種した。細胞を、37℃、5％CO2環境下で培養した。
アンチセンスオリゴヌクレオチドをトランスフェクトするための細胞を次のように播種した。セミコンフルエントに達した細胞の10cmディッシュから培養培地を吸引して除去し、PBS 4mLで細胞を洗浄後、細胞にトリプシン2mLを添加し37℃、5％CO2環境下で3分間静置した。10％FBSを補充したDMEM培地を添加してピペッティングし、細胞を50mL遠沈管に移した。1000rpm、2分間、室温で遠心分離した後、上清を吸引して除去し、10％FBSを補充した新しいDMEM培地5～10mLを入れ、細胞を再懸濁した。細胞をカウントし、1ウェルあたり細胞12,500個(100μL中)を96ウェルプレート(Corning(登録商標) Costar(登録商標)、96ウェルマルチプルウェルプレート平底フタ付き(低蒸発))に播種した。細胞を、37℃、5％CO2環境下で24時間培養した。
CEM法によって、次のように細胞にアンチセンスオリゴヌクレオチドをトランスフェクトした。10％FBSを補充したDMEM培地に900mMの塩化カルシウムを100倍希釈になるように添加し、塩化カルシウム含有培地を得た。得られた塩化カルシウム含有培地45μLに、所定の濃度のアンチセンスオリゴヌクレオチド5μLを混合し、核酸溶液を得た。アンチセンスオリゴヌクレオチドとしては、実施例1で合成したアンチセンスオリゴヌクレオチドのうち、以下の表2A～2E(表1A～1Eに示すアンチセンスオリゴヌクレオチドに対応する)に示すアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いた。96ウェルプレート中の培養培地を除去し、PBS 120μLで細胞を洗浄後、塩化カルシウム含有培地を1ウェルあたり50μL添加した。次いで、ウェルに核酸溶液を50μL添加した(アンチセンスオリゴヌクレオチドの最終濃度200nM)。細胞を37℃、5％CO2環境下で24時間培養した。対照として、核酸NEG#L1でトランスフェクトした細胞及び未処置細胞を準備した。核酸NEG#L1は、5'-GAAAACTAAAATGAG-3'(配列番号186)の核酸塩基配列を有する。NEG#L1は、3個のLNAヌクレオシドからなる5'ウイング領域、9個のデオキシリボヌクレオシドからなるDNAギャップ領域、並びに2個のLNAヌクレオシドと3'末端の1個のデオキシリボヌクレオシドとからなる3'ウイング領域からなる15塩基長のギャップマーとした。NEG#L1の全てのヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエート結合とした。
細胞からcDNAを次のように調製した。トランスフェクトした細胞から、Super Prep(商標) Cell Lysis & RT Kit for qPCR(東洋紡社)を用いて、RNAを抽出しcDNAに逆転写した。具体的には、細胞を24時間培養した後、96ウェルプレートの培養上清を除去し、PBS 120μLを細胞に添加後、PBSを除去した。1ウェルあたり溶解溶液(Lysis Solution)24.85μL及びgDNA除去剤(gDNA Remover)0.15μLの混合液を添加し、5分間静置した(最初の30秒間は撹拌した)。5分後、顕微鏡下で細胞溶解を確認し、1ウェルあたり停止溶液(Stop Solution)4.75μL及びRNaseインヒビター0.25μLの混合液を添加し、2分間静置した(最初の30秒間は撹拌した)。2分後、細胞ライセートをピペッティングし、6μLの細胞ライセートを、5×RTマスターミックス4μL及びヌクレアーゼフリー水10μLの混合液の入ったPCRプレート(96 well PCR Plate (Non-Skirted)、VIOLAMO社)に添加した。プレートにふた(8 strips PCR Tube Cap (Dome)、VIOLAMO社)をし、3200rpm、2分間、4℃で遠心分離した。PCRプレートを、サーマルサイクラー(ABI Veriti(登録商標) 96 well Thermal Cycler、Thermo Fisher Scientific社)にセットし、逆転写反応を行った(37℃で20分間、50℃で5分間、98℃で5分間、及び4℃)。逆転写反応により得られたcDNA、及び細胞プレートは-80℃で保存した。
cDNAを用いて、次のようにリアルタイムPCR(RT-PCR)を行った。2×マスターミックス10μL(ABI(商標) Fast SYBR(商標) Green Master Mix、Thermo Fisher Scientific社)、プライマーセット1μL、cDNA 2μL、及び大塚蒸留水(株式会社大塚製薬工場)7μL(総量20μL)を混合し、リアルタイムPCR96ウェルプレート(ABI, MicroAmp(登録商標) Fast 96-well Raection Plate (0.1mL)、Thermo Fisher Scientific社)に分注した。
以下のプライマーセットを用いた。プライマーは、Thermo Fisher Scientific社から入手した。
対照プライマーセット：50nM hGAPDH-F (5'-GAGTCAACGGATTTGGTCGT-3'、配列番号170)及び50nM hGAPDH-R (5'-GACAAGCTTCCCGTTCTCAG-3'、配列番号171)
hCSGalNAcT1セット1：100nM hT1-F1 (5'-TCAGGGAGATGTGCATTGAG-3'、配列番号172)及び100nM hT1-R1 (5'-AGTTGGCAGCTTTGGAAGTG-3'、配列番号173)
hCSGalNAcT1セット2：200nM hT1-F2 (5'-GGAGACCCTGAACAGTCCTG-3'、配列番号174)及び200nM hT1-R2 (5'-GCCGTTTGAATTCGTGTTTG-3'、配列番号175)
hCSGalNAcT2セット1：200nM hT2-F1(5'-GCCATTGTTTATGCCAACCA-3'、配列番号176)及び200nM hT2-R1 (5'-ATCCACCAATGGTCAGGAAA-3'、配列番号177)
hCSGalNAcT2セット2：200nM hT2-F2 (5'-TCCTAGAATCTGTCACCAGTGAG-3'、配列番号178)及び200nM hT2-R2 (5'-ACATCAAGACCTCTCCCTTGTC-3'、配列番号179)
プライマーの濃度はPCR反応液(20μL)中の濃度を示す。
対照プライマーセットはヒトGAPDH(グリセルアルデヒド3リン酸デヒドロゲナーゼ)遺伝子(ハウスキーピング遺伝子)に対するプライマーセットである。hCSGalNAcT1セット1及びhCSGalNAcT1セット2は、ヒトCSGalNAcT1遺伝子に対するプライマーセットである。hCSGalNAcT2セット1及びhCSGalNAcT2セット2は、ヒトCSGalNAcT2遺伝子に対するプライマーセットである。PCR反応液中に以下のプライマーセットのいずれかを用いた：対照プライマーセット(ヒトGAPDH測定用)；hCSGalNAcT1セット1若しくはhCSGalNAcT1セット2(ヒトCSGalNAcT1測定用)；又はhCSGalNAcT2セット1若しくはhCSGalNAcT2セット2(ヒトCSGalNAcT2測定用)。
PCRプレートにシールをした(ABI, MicroAmp(商標) Optical Adhesive Film、Thermo Fisher Scientific社)。PCRプレートを、3200rpm、2分間、4℃で遠心分離した。PCRプレートをサーマルサイクラー(ABI StepOne Plus(商標) Real-Time PCR System、Thermo Fisher Scientific社)にセットし、95℃で30秒間の後、45サイクルの95℃3秒間及び60℃30秒間の温度条件でリアルタイムPCRを行った。
ヒトCSGalNAcT1 mRNA相対量及びヒトCSGalNAcT1 mRNA相対量はΔΔCt法を用いて算出した。具体的には、アンチセンスオリゴヌクレオチドをトランスフェクトした細胞で測定したヒトCSGalNAcT1又はヒトCSGalNAcT2の閾値サイクル(Ct)値からGAPDHのCt値を差し引くことによってΔCtを算出した。さらに、同様に算出した未処置細胞でのΔCtを差し引くことによってΔΔCtを算出した。ヒトCSGalNAcT1 mRNA及びヒトCSGalNAcT2 mRNA相対量を2-ΔΔCtによって算出した。各サンプルについて2つのPCR反応液を調製し、それぞれから算出された相対量の平均値及び標準偏差を算出した。
結果を図1及び表2A～2Eに示す。図1は、表2A～2Eに示すCSGalNAcT1 mRNA相対量及びCSGalNAcT2 mRNA相対量のプロット図である。また、対照核酸NEG#L1をトランスフェクトした場合のCSGalNAcT1 mRNA相対量及びCSGalNAcT2 mRNA相対量は、それぞれ、0.893及び0.973だった。アンチセンスオリゴヌクレオチドのCSGalNAcT1及びCSGalNAcT2遺伝子発現抑制活性が高いほどCSGalNAcT1 mRNA相対量及びCSGalNAcT2 mRNA相対量は小さくなる。
Figure 0007141621000008
Figure 0007141621000009
Figure 0007141621000010
Figure 0007141621000011
Figure 0007141621000012
実施例1で合成したアンチセンスオリゴヌクレオチドが、ヒトCSGalNAcT1遺伝子及びヒトCSGalNAcT2遺伝子の一方又は両方の発現を抑制することが示された(表2A～2E)。特に、ヒトCSGalNAcT1 mRNAに対してミスマッチがなく、かつヒトCSGalNAcT2 mRNAに対してミスマッチがない核酸塩基配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドは、全て、ヒトCSGalNAcT1遺伝子とヒトCSGalNAcT2遺伝子の両方の発現を大きく抑制することが示された(図1の黒丸及び表2B)。
[実施例3]
(マウス3T3N細胞におけるアンチセンスオリゴヌクレオチドの濃度依存的発現抑制活性)
実施例1で合成したアンチセンスオリゴヌクレオチドのいくつかを様々な濃度でマウス3T3N細胞にトランスフェクトし、CSGalNAcT1 mRNA及びCSGalNAcT2 mRNAを定量することによって、アンチセンスオリゴヌクレオチドの、マウス3T3N細胞におけるCSGalNAcT1及びCSGalNAcT2遺伝子の濃度依存的発現抑制活性を調べた。
マウス3T3N細胞を国立研究開発法人 医薬基盤・健康・栄養研究所 JCRB細胞バンクから細胞登録番号 JCRB0615で入手した。実施例2に記載したように、細胞の解凍及び培地の交換を行った。
細胞の継代培養を次のように行った。セミコンフルエントに達した時に細胞を継代した。10cmディッシュから培養培地を吸引して除去し、PBS 4mLで細胞を洗浄後、細胞に0.125％トリプシン(0.25％-トリプシン/1mM-EDTA溶液(ナカライテスク株式会社)をPBSで2倍に希釈することによって調製した)を2mL添加し、37℃、5％CO2環境下で1分間静置した。新しい培地(実施例2に記載の10％血清及び1％抗生物質を補充したDMEM培地)を8mL添加後、ピペッティングし、細胞を50mL遠沈管に移した。細胞を、1000rpm、2分間、室温で遠心分離した。上清を吸引して除去し、新しい培地(10％血清及び1％抗生物質を補充したDMEM培地)を5～10mL入れ細胞を再懸濁した。細胞をカウントし、細胞1～5×105個を新しい10cmディッシュに播種した。細胞を、37℃、5％CO2環境下で培養した。
アンチセンスオリゴヌクレオチドをトランスフェクトするための細胞を次のように播種した。セミコンフルエントに達した細胞の10cmディッシュから培養培地を吸引して除去し、PBS 4mLで細胞を洗浄後、細胞に0.125％トリプシン2mLを添加し37℃、5％CO2環境下で1分間静置した。10％FBSを補充したDMEM培地を添加してピペッティングし、細胞を50mL遠沈管に移した。1000rpm、2分間、室温で遠心分離した後、上清を吸引して除去し、10％FBSを補充した新しいDMEM培地5mLを入れ、細胞を再懸濁した。細胞をカウントし、1ウェルあたり細胞15,000個(100μL中)を96ウェルプレート(Corning(登録商標) Costar(登録商標)、96ウェルマルチプルウェルプレート平底フタ付き(低蒸発))に播種した。細胞を、37℃、5％CO2環境下で24時間培養した。
CEM法及びリポフェクション法の併用によって、次のように細胞にアンチセンスオリゴヌクレオチドをトランスフェクトした。10％FBSを補充したDMEM培地に900mMの塩化カルシウムを100倍希釈になるように添加し、塩化カルシウム含有培地を得た。得られた塩化カルシウム含有培地にリポフェクタミン(Lipofectamine(登録商標)3000 Transfection Kit、Thermo Fisher Scientific社)を91倍希釈になるように添加し、リポフェクタミン溶液を得た。得られたリポフェクタミン溶液45μLに、所定の濃度のアンチセンスオリゴヌクレオチド5μLを混合し、核酸溶液を得た。アンチセンスオリゴヌクレオチドとしては、実施例1で合成した核酸のうち、hT1-2514-LNA(15)、hT2-1617-AmNA(15)、hT1-1831-LNA(15)、hT1-2126-LNA(15)、hT2-420-LNA(15)、hT2-872-LNA(15)及びhT2-891-LNA(15)を用いた。96ウェルプレート中の培養培地を除去し、PBS 120μLで細胞を洗浄後、塩化カルシウム含有培地を1ウェルあたり50μL添加した。次いで、ウェルに核酸溶液を50μL添加した(アンチセンスオリゴヌクレオチドの最終濃度30、60、120又は240nM)。細胞を37℃、5％CO2環境下で24時間培養した。対照として、核酸NEG#L1でトランスフェクトした細胞及び未処置細胞を準備した。
次いで、実施例2に記載したように、細胞からcDNAを調製した。
cDNAを用いて、リアルタイムPCR(RT-PCR)を行った。リアルタイムPCRは、以下のプライマーセットを用いること、及び温度条件として95℃で30秒間の後、45サイクルの95℃3秒間及び62℃30秒間を用いることを除き、実施例2に記載したように行った。
対照プライマーセット：200nM mGAPDH-F (5'-TGCACCACCAACTGCTTAG-3'、配列番号180)及び200nM mGAPDH-R (5'-GATGCAGGGATGATGTTC-3'、配列番号181)
mCSGalNAcT1セット：200nM mT1-F1 (5'-CCAATTTCAGAAACTTCACCTTCAT-3'、配列番182)及び200nM mT1-R1 (5'-TGTTCAGCCTACAAGTGTTGAG-3'、配列番号183)
mCSGalNAcT2セット：200nM mT2-F1(5'-TTAATATCATTGTGCCACTTGCG-3'、配列番号184)及び200nM mT2-R1 (5'-TAGAATAGACTTGACTTTAGATAGTCCTT-3'、配列番号185)
対照プライマーセットはマウスGAPDH(グリセルアルデヒド3リン酸デヒドロゲナーゼ)遺伝子(ハウスキーピング遺伝子)に対するプライマーセットである。mCSGalNAcT1セットは、マウスCSGalNAcT1遺伝子に対するプライマーセットである。mCSGalNAcT2セットは、マウスCSGalNAcT2遺伝子に対するプライマーセットである。PCR反応液中に以下の3種類のプライマーセットのいずれかを用いた：対照プライマーセット(マウスGAPDH測定用)；mCSGalNAcT1セット(マウスCSGalNAcT1測定用)；又はmCSGalNAcT2セット(マウスCSGalNAcT2測定用)。
リアルタイムPCRによって得られたCt値を用いてΔΔCt法によって、アンチセンスオリゴヌクレオチドをトランスフェクトした細胞におけるマウスCSGalNAcT1 mRNA及びマウスCSGalNAcT2 mRNAの未処置細胞に対する相対量を算出した。
図2Aに、アンチセンスオリゴヌクレオチドをトランスフェクトしたマウス3T3N細胞におけるマウスCSGalNAcT1 mRNAの相対量を示す。図2Bに、アンチセンスオリゴヌクレオチドをトランスフェクトしたマウス3T3N細胞におけるマウスCSGalNAcT2 mRNAの相対量を示す。試験したアンチセンスオリゴヌクレオチド(hT1-2514-LNA(15)、hT2-1617-AmNA(15)、hT1-1831-LNA(15)、hT1-2126-LNA(15)、hT2-420-LNA(15)、hT2-872-LNA(15)及びhT2-891-LNA(15))は、マウスCSGalNAcT1遺伝子とマウスCSGalNAcT2遺伝子の両方の発現を濃度依存的に抑制する傾向があることが示された。
[実施例4]
(ヒトSKOV-3細胞におけるアンチセンスオリゴヌクレオチドの濃度依存的発現抑制活性)
実施例1で合成したアンチセンスオリゴヌクレオチドのいくつかを様々な濃度でヒトSKOV-3細胞にトランスフェクトし、CSGalNAcT1 mRNA及びCSGalNAcT2 mRNAを定量することによって、アンチセンスオリゴヌクレオチドの、ヒトSKOV-3細胞におけるCSGalNAcT1及びCSGalNAcT2遺伝子の発現抑制活性を調べた。
ヒトSKOV-3細胞を住商ファーマインターナショナル株式会社よりカタログ番号EC91091004-F0で入手した。細胞の解凍を次のように行った。10％血清(ウシ胎児血清、biowest社)及び1％抗生物質(ペニシリン-ストレプトマイシン混合溶液(安定化)、ナカライテスク株式会社)を補充したMcCoy's5A培地(GIBCO社)9mLを50mL遠沈管に添加した。37℃で80％融解した細胞を遠沈管に添加した。冷却遠心分離機(VERSATILE REFRIGERATED CENTRIFUGE、株式会社トミー精工)を用いて、細胞を1000rpm、3分間、室温で遠心分離した。上清を吸引して除去し、細胞を新しい培地(10％血清及び1％抗生物質を補充したMcCoy's5A培地)に再懸濁し、細胞3～10×105個を10cmディッシュ(100mm/組織培養用ディッシュ、IWAKI社)に播種した。細胞を、37℃、5％CO2環境下で培養した。
細胞を上記のように解凍した翌日に、培養上清を吸引して除去し、細胞に新しい培地(10％血清及び1％抗生物質を補充したMcCoy's5A培地)を10mL添加することによって、培地を交換した。
細胞の継代培養を次のように行った。セミコンフルエントに達した時に細胞を継代した。10cmディッシュから培養培地を吸引して除去し、PBS 4mLで細胞を洗浄後、細胞にトリプシン(0.25％-トリプシン/1mM-EDTA溶液、ナカライテスク株式会社)を2mL添加し、37℃、5％CO2環境下で1分間静置した。新しい培地(10％血清及び1％抗生物質を補充したMcCoy's5A培地)を8mL添加後、ピペッティングし、細胞を50mL遠沈管に移した。細胞を、1000rpm、3分間、室温で遠心分離した。上清を吸引して除去し、新しい培地(10％血清及び1％抗生物質を補充したMcCoy's5A培地)を5～10mL入れ細胞を再懸濁した。細胞をカウントし、細胞2～7×105個を新しい10cmディッシュに播種した。細胞を、37℃、5％CO2環境下で培養した。
アンチセンスオリゴヌクレオチドをトランスフェクトするための細胞を次のように播種した。セミコンフルエントに達した細胞の10cmディッシュから培養培地を吸引して除去し、PBSで細胞を洗浄後、細胞にトリプシン2mLを添加し37℃、5％CO2環境下で1分間静置した。10％FBSを補充したMcCoy's5A培地を添加してピペッティングし、細胞を50mL遠沈管に移した。1000rpm、3分間、室温で遠心分離した後、上清を吸引して除去し、10％FBSを補充した新しいMcCoy's5A培地5～10mLを入れ、細胞を再懸濁した。細胞をカウントし、1ウェルあたり細胞20,000個(500μL中)を24ウェルプレート(24ウェル細胞培養用マイクロプレート、IWAKI社)に播種した。細胞を、37℃、5％CO2環境下で24時間培養した。
CEM法によって、次のように細胞にアンチセンスオリゴヌクレオチドをトランスフェクトした。10％FBSを補充したMcCoy's5A培地に900mMの塩化カルシウムを100倍希釈になるように添加し、塩化カルシウム含有培地を得た。得られた塩化カルシウム含有培地225μLに、所定の濃度のアンチセンスオリゴヌクレオチド25μLを混合し、核酸溶液を得た。アンチセンスオリゴヌクレオチドとしては、実施例1で合成した核酸のうち、hT1-2514-LNA(15)、hT1-2519-AmNA(15)、及びhT2-1617-AmNA(15)を用いた。24ウェルプレート中の培養培地を除去し、PBS 600μLで細胞を洗浄後、塩化カルシウム含有培地を1ウェルあたり250μL添加した。次いで、ウェルに核酸溶液を250μL添加した(アンチセンスオリゴヌクレオチドの最終濃度100又は200nM)。細胞を37℃、5％CO2環境下で24時間培養した。対照として、核酸NEG#L1でトランスフェクトした細胞及び未処置細胞を準備した。
細胞からcDNAを次のように調製した。まず、QIAGEN RNeasy(登録商標) Mini Kitを用いてRNAを抽出した。具体的には、トランスフェクトした細胞をPBS 600μLで洗浄後、トリプシンを200μL添加し37℃、5％CO2環境下で3分間静置した。細胞に、10％FBSを補充したMcCoy's5A培地400μLを添加後、ピペッティングし、細胞を新しい1.5mLチューブに回収した。10％FBSを補充した新しいMcCoy's5A培地500μLをウェルに添加後ピペッティングし、細胞を上記チューブに回収した。チューブを1000rpm、3分間、室温で遠心分離した(centrifuge 5430R、eppendolf社)。上清を除去し、チューブにPBS 1mLを加えた。チューブを1000rpm、3分間、室温で遠心分離した。上清を除去した。RLTバッファー980μLに2M DTT 20μLを加えよく混ぜて混合液を得て、この混合液350μLを上記チューブに加えてボルテックスした。等量の70％エタノールをチューブに加えゆっくりとピペッティングした。2mLコレクションチューブにスピンカラムを入れ、上記チューブ中の溶液700μLをスピンカラムに入れた。スピンカラムを10000rpm、15秒間、室温で遠心分離し、ろ液を捨てた。RW1バッファー700μLをスピンカラムに入れた。スピンカラムを10000rpm、15秒間、室温で遠心分離し、ろ液を捨てた。RPEバッファー500μLをスピンカラムに入れた。スピンカラムを10000rpm、15秒間、室温で遠心分離し、ろ液を捨てた。RPEバッファー500μLをスピンカラムに入れた。スピンカラムを10000rpm、15秒間、室温で遠心分離し、ろ液を捨てた。スピンカラムを新しい2mLコレクションチューブにセットした。スピンカラムを13200rpm、1分間、室温で遠心分離し、ろ液を捨てた。スピンカラムを新しい1.5mLチューブにセットした。RNaseフリー水を36μLスピンカラムに入れた。スピンカラムを10000rpm、1分間、室温で遠心分離し、RNAを溶出した。カラムを外し1.5mLチューブを氷上に移した。2μLのRNA溶出液を吸光度測定に用いた(DS-11 Spectrophotometer、DeNOVIX社)。次に、ABI High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit(Thermo Fisher Scientific社)を用いてRNAをcDNAに逆転写した。具体的には、新しい0.5mLチューブに、10×RTバッファー4μL、100mM dNTPs 1.6μL、10×RT Ramdom(商標)プライマー4μL、MultiScribe(商標)逆転写酵素(50U/μL)2μL、及びRNA溶液28μL(4μgのRNAを含み、ヌクレアーゼフリー水で体積を調整した)を入れた(総体積39.6μL)。チューブをサーマルサイクラー(WK-0518、和光純薬工業株式会社)にセットした。25℃で10分間、37℃で120分間、85℃で5分間、及び4℃の温度条件で逆転写反応を行い、cDNAを得た。cDNAは-80℃で保存した。
cDNAを用いて、リアルタイムPCR(RT-PCR)を行った。リアルタイムPCRは、プライマーの濃度及びマスターミックスを除き、実施例2に記載したように行った。プライマーの濃度は、hGAPDH-F及びhGAPDH-Rは200nMとした。hT1-F1、hT1-R1、hT1-F2、hT1-R2、hT2-F1、hT2-R1、hT2-F2、及びhT2-R2は400nMとした。マスターミックスはABI(商標)PowerUp(商標) SYBR(登録商標) Green Master Mix(Thermo Fisher Scientific社)を用いた。
リアルタイムPCRによって得られたCt値を用いてΔΔCt法によって、アンチセンスオリゴヌクレオチドをトランスフェクトした細胞におけるヒトCSGalNAcT1 mRNA及びヒトCSGalNAcT2 mRNAの未処置細胞に対する相対量を算出した。
図3Aに、hT1-2514-LNA(15)及びhT1-2519-AmNA(15)をトランスフェクトしたヒトSKOV-3細胞におけるヒトCSGalNAcT1 mRNAの相対量を示す。図3Bに、hT1-2514-LNA(15)及びhT1-2519-AmNA(15)をトランスフェクトしたヒトSKOV-3細胞におけるヒトCSGalNAcT2 mRNAの相対量を示す。図4Aに、hT2-1617-AmNA(15)をトランスフェクトしたヒトSKOV-3細胞におけるヒトCSGalNAcT1 mRNAの相対量を示す。図4Bに、hT2-1617-AmNA(15)をトランスフェクトしたヒトSKOV-3細胞におけるヒトCSGalNAcT2 mRNAの相対量を示す。試験したアンチセンスオリゴヌクレオチド(hT1-2514-LNA(15)、hT1-2519-AmNA(15)及びhT2-1617-AmNA(15))は、ヒトCSGalNAcT1遺伝子とヒトCSGalNAcT2遺伝子の両方の発現を濃度依存的に抑制する傾向があることが示された。
[実施例5]
(ヒトU251細胞におけるアンチセンスオリゴヌクレオチドの発現抑制活性)
実施例1で合成したアンチセンスオリゴヌクレオチドのいくつかをヒトU251細胞にトランスフェクトし、CSGalNAcT1 mRNA及びCSGalNAcT2 mRNAを定量することによって、アンチセンスオリゴヌクレオチドの、ヒトU251細胞におけるCSGalNAcT1及びCSGalNAcT2遺伝子の濃度依存的発現抑制活性を調べた。
ヒトU251細胞を国立研究開発法人 医薬基盤・健康・栄養研究所 JCRB細胞バンクから細胞登録番号 IFO50288で入手した。細胞の解凍を次のように行った。10％血清(ウシ胎児血清、biowest社)及び1％抗生物質(ペニシリン-ストレプトマイシン混合溶液(安定化)、ナカライテスク株式会社)を補充したDMEM培地(DMEM(低グルコース)、ナカライテスク株式会社)9mLを50mL遠沈管に添加した。37℃で80％融解した細胞を遠沈管に添加した。冷却遠心分離機(VERSATILE REFRIGERATED CENTRIFUGE、株式会社トミー精工)を用いて、細胞を1000rpm、3分間、室温で遠心分離した。上清を吸引して除去し、細胞を新しい培地(10％血清及び1％抗生物質を補充したDMEM培地)に再懸濁し、細胞3～10×105個を10cmディッシュ(100mm/組織培養用ディッシュ、IWAKI社)に播種した。細胞を、37℃、5％CO2環境下で培養した。
細胞を上記のように解凍した翌日に、培養上清を吸引して除去し、細胞に新しい培地(10％血清及び1％抗生物質を補充したDMEM培地)を10mL添加することによって、培地を交換した。
細胞の継代培養を次のように行った。セミコンフルエントに達した時に細胞を継代した。10cmディッシュから培養培地を吸引して除去し、PBS 4mLで細胞を洗浄後、細胞にトリプシン(0.25％-トリプシン/1mM-EDTA溶液、ナカライテスク株式会社)を2mL添加し、37℃、5％CO2環境下で1分間静置した。新しい培地(10％血清及び1％抗生物質を補充したDMEM培地)を8mL添加後、ピペッティングし、細胞を50mL遠沈管に移した。細胞を、1000rpm、3分間、室温で遠心分離した。上清を吸引して除去し、新しい培地(10％血清及び1％抗生物質を補充したDMEM培地)を5～10mL入れ細胞を再懸濁した。細胞をカウントし、細胞3～7×105個を新しい10cmディッシュに播種した。細胞を、37℃、5％CO2環境下で培養した。
アンチセンスオリゴヌクレオチドをトランスフェクトするための細胞を次のように播種した。セミコンフルエントに達した細胞の10cmディッシュから培養培地を吸引して除去し、PBS 4mLで細胞を洗浄後、細胞にトリプシン2mLを添加し37℃、5％CO2環境下で1分間静置した。10％FBSを補充したDMEM培地を添加してピペッティングし、細胞を50mL遠沈管に移した。1000rpm、3分間、室温で遠心分離した後、上清を吸引して除去し、10％FBSを補充した新しいDMEM培地2を5～10mLを入れ、細胞を再懸濁した。細胞をカウントし、1ウェルあたり細胞30,000個(500μL中)を24ウェルプレート(24ウェル細胞培養用マイクロプレート、IWAKI社)に播種した。細胞を、37℃、5％CO2環境下で培養した。
CEM法及びリポフェクション法の併用によって、次のように細胞にアンチセンスオリゴヌクレオチドをトランスフェクトした。10％FBSを補充したDMEM培地に900mMの塩化カルシウムを100倍希釈になるように添加し、塩化カルシウム含有培地を得た。得られた塩化カルシウム含有培地にリポフェクタミン(Lipofectamine(登録商標)3000 Transfection Kit、Thermo Fisher Scientific社)を91倍希釈になるように添加し、リポフェクタミン溶液を得た。得られたリポフェクタミン溶液225μLに、所定の濃度のアンチセンスオリゴヌクレオチド25μLを混合し、核酸溶液を得た。アンチセンスオリゴヌクレオチドとしては、実施例1で合成した核酸のうち、mT1-1915-LNA(15)、hT1-1831-LNA(15)、hT1-2126-LNA(15)、mT1-2156-LNA(15)、hT1-2327-LNA(15)、hT1-2479-LNA(15)、hT1-2514-LNA(15)、hT2-420-LNA(15)、hT2-872-LNA(15)、hT2-891-LNA(15)、hT2-1617-AmNA(15)、hT2-1839-LNA(15)、hT1-2519-AmNA(15)、及びhT1-2519-LNA(15)を用いた。24ウェルプレート中の培養培地を除去し、PBS 600μLで細胞を洗浄後、塩化カルシウム含有培地を1ウェルあたり250μL添加した。次いで、ウェルに核酸溶液を250μL添加した(アンチセンスオリゴヌクレオチドの最終濃度200nM)。37℃、5％CO2環境下で24時間培養した。対照として、核酸NEG#L1でトランスフェクトした細胞及び未処置細胞を準備した。
実施例4に記載したのと同様の方法で細胞からcDNAの調製及びリアルタイムPCRを行った。リアルタイムPCRによって得られたCt値を用いてΔΔCt法によって、アンチセンスオリゴヌクレオチドをトランスフェクトした細胞におけるヒトCSGalNAcT1 mRNA及びヒトCSGalNAcT2 mRNAの未処置細胞に対する相対量を算出した。
図5Aに、アンチセンスオリゴヌクレオチドをトランスフェクトしたヒトU251細胞におけるヒトCSGalNAcT1 mRNAの相対量を示す。図5Bに、アンチセンスオリゴヌクレオチドをトランスフェクトしたヒトU251細胞におけるヒトCSGalNAcT2 mRNAの相対量を示す。試験したアンチセンスオリゴヌクレオチド(mT1-1915-LNA(15)、hT1-1831-LNA(15)、hT1-2126-LNA(15)、mT1-2156-LNA(15)、hT1-2327-LNA(15)、hT1-2479-LNA(15)、hT1-2514-LNA(15)、hT2-420-LNA(15)、hT2-872-LNA(15)、hT2-891-LNA(15)、hT2-1617-AmNA(15)、hT2-1839-LNA(15)、hT1-2519-AmNA(15)、及びhT1-2519-LNA(15))は、ヒトCSGalNAcT1遺伝子とヒトCSGalNAcT2遺伝子の一方又は両方の発現を抑制することが示された。
[実施例6]
(ヒトU251細胞におけるアンチセンスオリゴヌクレオチドの濃度依存的発現抑制活性)
実施例1で合成したアンチセンスオリゴヌクレオチドのいくつかを様々な濃度でヒトU251細胞にトランスフェクトし、CSGalNAcT1 mRNA及びCSGalNAcT2 mRNAを定量することによって、アンチセンスオリゴヌクレオチドの、ヒトU251細胞におけるCSGalNAcT1及びCSGalNAcT2遺伝子の濃度依存的発現抑制活性を調べた。
トランスフェクトするアンチセンスオリゴヌクレオチドの濃度及び種類を除いて、実施例5に記載したように、ヒトU251細胞にアンチセンスオリゴヌクレオチドをトランスフェクトし、細胞からcDNAを調製し、リアルタイムPCRを行った。リアルタイムPCRによって得られたCt値を用いてΔΔCt法によって、アンチセンスオリゴヌクレオチドをトランスフェクトした細胞におけるヒトCSGalNAcT1 mRNA及びヒトCSGalNAcT2 mRNAの未処置細胞に対する相対量を算出した。トランスフェクトするアンチセンスオリゴヌクレオチドの最終濃度は50、100又は200nMとした。アンチセンスオリゴヌクレオチドとしては、実施例1で合成した核酸のうち、hT1-2126-LNA(15)、hT1-2327-LNA(15)、hT1-2514-LNA(15)、hT2-891-LNA(15)、hT2-1617-AmNA(15)、hT2-1839-LNA(15)、及びhT1-2519-LNA(15)を用いた。
図6Aに、アンチセンスオリゴヌクレオチドをトランスフェクトしたヒトU251細胞におけるヒトCSGalNAcT1 mRNAの相対量を示す。図6Bに、アンチセンスオリゴヌクレオチドをトランスフェクトしたヒトU251細胞におけるヒトCSGalNAcT2 mRNAの相対量を示す。試験したアンチセンスオリゴヌクレオチド(hT1-2126-LNA(15)、hT1-2327-LNA(15)、hT1-2514-LNA(15)、hT2-891-LNA(15)、hT2-1617-AmNA(15)、hT2-1839-LNA(15)、及びhT1-2519-LNA(15))は、ヒトCSGalNAcT1遺伝子とヒトCSGalNAcT2遺伝子の両方の発現を濃度依存的に抑制する傾向があることが示された。
[実施例7]
(アンチセンスオリゴヌクレオチドのコンドロイチン硫酸及びへパラン硫酸量への影響)
実施例1で合成したアンチセンスオリゴヌクレオチドのいくつかをヒトYKG-1細胞及びヒトU251細胞にトランスフェクトし、細胞中のコンドロイチン硫酸及びへパラン硫酸量をIn Cell ELISAアッセイによって定量することによって、アンチセンスオリゴヌクレオチドのコンドロイチン硫酸及びへパラン硫酸量への影響を調べた。
YKG-1細胞(ヒトグリオブラストーマ由来)及びU251細胞(ヒトアストロサイトーマ由来、住商ファーマインターナショナル株式会社よりカタログ番号EC09063001-F0で入手)を、それぞれ、10-cmディッシュ中で80％コンフルエントになるまで培養した。実施例5に記載したCEM法及びリポフェクション法の併用と同様の方法により、培地に塩化カルシウム溶液を添加し、リポフェクタミン(Lipofectamine(登録商標)3000 Transfection Kit、Thermo Fisher Scientific社)を用いて、アンチセンスオリゴヌクレオチドを最終濃度100nMでYKG-1細胞及びU251細胞にトランスフェクトした。アンチセンスオリゴヌクレオチドとしては、hT1-1804-LNA(15)、hT1-2514-LNA(15)、hT1-2519-LNA(15)、hT2-1617-LNA(15)、hT1-2126-LNA(15)、hT2-891-LNA(15)、hT2-941-LNA(15)、及びhT2-1893-LNA(15)を用いた。対照として、核酸NEG#L1でトランスフェクトした細胞及び未処置細胞を準備した。
トランスフェクション68時間後に細胞をトリプシンを用いて剥離し、4mLの培地に懸濁した。細胞の一部をトリパンブルー(Gibco社)で染色し、ディスポーザブル血球計算盤C-Chipを用いて生細胞数をカウントした。96ウェル細胞培養プレート(BD Falcon社、製品番号353072)に、1ウェルあたり細胞1×104個(200μl中)になるように細胞を播種した。各細胞について、24～32ウェルに細胞を播種した。細胞を、37℃にて5％CO2環境下で1日培養した。
PBST(PBS中の0.05％Tween 20)を、1×PBS 40mL(50mLコニカルチューブ中)にTween 20を20μl加えることによって調製した。細胞を培養後、ウェルにPBST 200μl(1ウェルあたり)を加え、直ぐにPBSTを除去し、これをもう一度繰り返した。次いで、ウェルにPBST 200μl(1ウェルあたり)を加え、5分間置き、細胞を洗浄した。この洗浄をあと2回繰り返した。
ウェルに4％ PFA/PBS 100μl(1ウェルあたり)を加え、室温で20分間インキュベートすることによって、細胞を固定した。4％ PFA/PBSは以下のように調製した。15mLコニカルチューブに0.48g PFA(パラホルムアルデヒド粉末、ナカライテスク株式会社、コード番号26126-25)を入れ、次いで、チューブに滅菌水9mL及び4N NaOH 2.9μlを加え、チューブのキャップをパラフィルムで密封した。チューブを熱湯につけて激しく撹拌し、PFAを溶解した。チューブを氷上に置き、10×PBS 1.2mLを加えた後、滅菌水で12mLまで溶液をメスアップし、4％PFA/PBSを得た。4％ PFA/PBSは4℃で遮光保存した(1週間保存可能)。
ウェルにPBST 200μl(1ウェルあたり)を加え、直ぐにPBSTを除去し、これをもう一度繰り返した。次いで、ウェルにPBST 200μl(1ウェルあたり)を加え、5分間置き、細胞を洗浄した。この洗浄をあと2回繰り返した。
ウェルに3％ BSA/PBS 200μl(1ウェルあたり)を加え、室温で1時間インキュベートすることによって、細胞をブロッキングした。3％ BSA/PBSは、1×PBS 20mL(50mLコニカルチューブ中)に0.6g BSA(アルブミン(ウシ血清由来)、コーンフラクション(Cohn Fraction)(pH7.0)、和光純薬工業株式会社、カタログ番号017-23294)を加え、溶解することによって調製した。3％ BSA/PBSは、4℃で保存した。
ウェルにPBST 200μl(1ウェルあたり)を加え、5分間置き、細胞を洗浄した。この洗浄をあと2回繰り返した。
ウェルに1次抗体(コンドロイチン硫酸検出用抗体又はヘパラン硫酸検出用抗体)の溶液100μl(1ウェルあたり)又は陰性対照(抗体(-))として3％ BSA/PBS 100μl(1ウェルあたり)を加え、4℃で一晩又は室温で1～2時間インキュベートした。インキュベート中、プレートが乾燥しないように、プレートをパラフィルムで密封し、タイトボックスに入れ、ボックスの中にMQ水(超純水)で濡らしたキムワイプを置いた。コンドロイチン硫酸を検出するための1次抗体として、マウス抗コンドロイチン硫酸(CS)抗体(CS-56)(1.9mg/mL、Abcam社、カタログ番号ab11570)を用いた。ヘパラン硫酸を検出するための1次抗体として、抗ヘパラン硫酸抗体3G10(生化学工業株式会社)を用いた。1次抗体は、使用時に、3％ BSA/PBS 100μlに1,000倍希釈して用いた(1ウェルあたり)。
1次抗体でのインキュベート後、ウェルにPBST 200μl(1ウェルあたり)を加え、直ぐにPBSTを除去し、これをもう一度繰り返した。次いで、ウェルにPBST 200μl(1ウェルあたり)を加え、5分間置き、細胞を洗浄した。この洗浄をあと2回繰り返した。
ウェルに2次抗体溶液100μl(1ウェルあたり)を加え、1時間インキュベートした。インキュベート中、プレートが乾燥しないように、プレートをタイトボックスに入れ、ボックスの中にMQ水で濡らしたキムワイプを置いた。またインキュベート中、プレートを遮光した。2次抗体として、ヤギ抗マウスIgG+IgM(H+L)-AP(1mg/mL、ヒト吸着(human absorbed)、KPL社、カタログ番号751-1809)を用いた。2次抗体は、使用時に、3％BSA/PBS 100μlに2,000倍希釈して用いた(1ウェルあたり)。
ウェルにTBST 200μl(1ウェルあたり)を加え、5分間置き、細胞を洗浄した。この洗浄をもう一度繰り返した。次いで、ウェルにTBS 200μl(1ウェルあたり)を加え、5分間置き、細胞を洗浄した。この洗浄をもう一度繰り返した。
pNPP溶液を以下のように調製した。炭酸ナトリウム及び炭酸水素ナトリウムを用いて調製した0.2M 炭酸緩衝液(pH9.8)、並びに0.5M MgCl2・6H2Oを用いて、2×pNPPバッファー(0.1M 炭酸緩衝液(pH9.8)、1mM MgCl2)を調製した。p-ニトロフェニルりん酸二ナトリウム六水和物(p-Nitrophenyl phosphate disodium salt Hexahydrate(pNPP)、和光純薬工業株式会社、コード番号147-02343)をMQ水に40mg/mL濃度で溶解した。0.5mLの40mg/mL pNPP、5mLの2×pNPPバッファー、及び4.5mLのMQ水を混合することによって、10mL(50ウェル分)のpNPP溶液を使用時に調製した。細胞に、pNPP溶液200μl(1ウェルあたり)を添加し、30分後に、励起波長405nmを用いてiMark(商標)プレートリーダー(Bio-Rad社)によって吸光度を測定した。2次抗体に結合したアルカリホスファターゼは、p-ニトロフェニルりん酸をp-ニトロフェノールに変換する。上記方法では、生成物pニトロフェノールの吸光度を測定した。
コンドロイチン硫酸又はヘパラン硫酸の相対量を、405nmにおける吸光度の、未処置対照細胞における吸光度に対する割合として表した。各群について2回実験を行い、平均値を算出した。
アンチセンスオリゴヌクレオチドをYKG-1細胞にトランスフェクトした場合のコンドロイチン硫酸及びへパラン硫酸の相対量を図7Aに示す。アンチセンスオリゴヌクレオチドをU251細胞にトランスフェクトした場合のコンドロイチン硫酸及びへパラン硫酸の相対量を図7Bに示す。
アンチセンスオリゴヌクレオチドhT1-1804-LNA(15)、hT1-2514-LNA(15)、hT1-2519-LNA(15)、hT2-1617-LNA(15)、hT1-2126-LNA(15)、hT2-891-LNA(15)、hT2-941-LNA(15)、及びhT2-1893-LNA(15)は、コンドロイチン硫酸量を低下させる傾向があることが示された。しかし、これらのアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ヘパラン硫酸量をほとんど低下させなかった。このことから、これらのアンチセンスオリゴヌクレオチドは、コンドロイチン硫酸量を特異的に低下させることが示された。
また、コンドロイチン硫酸量を顕著に低下させたアンチセンスオリゴヌクレオチド(例えば、hT1-2514-LNA(15)、hT1-2519-LNA(15)、及びhT2-1617-LNA(15))はむしろヘパラン硫酸量を上昇させたが、これはCSGalNAcT1に対するsiRNAで処理した脊髄損傷モデルマウス患部において、ヘパラン硫酸合成酵素の発現の上昇がみられた以前の報告と一致する(Takeuchi, K., et al., 2013、上掲)。
[実施例8]
(アンチセンスオリゴヌクレオチドのへパラン硫酸量への影響)
実施例1で合成したアンチセンスオリゴヌクレオチド(hT1-2126-LNA(15))をC6細胞(ラットグリア腫由来)及びU251細胞(ヒトアストロサイトーマ由来)に導入し、細胞中のへパラン硫酸量をIn Cell ELISAアッセイによって定量することによって、アンチセンスオリゴヌクレオチドのへパラン硫酸量への影響を調べた。
C6細胞(ラットグリア腫由来)は、国立研究開発法人 医薬基盤・健康・栄養研究所 JCRB細胞バンクから細胞登録番号JCRB9096で入手した。実施例6に記載したのと同様の方法で、C6細胞又はU251細胞にアンチセンスオリゴヌクレオチド(hT1-2126-LNA(15))をトランスフェクトし、ヘパラン硫酸を検出するための1次抗体を用いてIn Cell ELISAアッセイによってpニトロフェノールの吸光度(405nm)を測定した。対照として、未処置の細胞において、同様にIn Cell ELISAアッセイによってpニトロフェノールの吸光度(405nm)を測定した。また、細胞をキシロシドで処理し、同様にIn Cell ELISAアッセイによってpニトロフェノールの吸光度(405nm)を測定した。各群について5回実験を行い、平均値及び標準誤差を算出した。
キシロシドはSigma-Aldrich社から入手した。キシロシド処理は、50μMで24時間行った。キシロシドは、細胞におけるヘパラン硫酸量を低下させることが知られている。
ラットC6細胞における吸光度(405nm)を図8Aに示す。ヒトU251細胞における吸光度(405nm)を図8Bに示す。吸光度はヘパラン硫酸量と相関する。ヘパラン硫酸量は、キシロシド処理により、対照と比較して低下することが確認された。
ラットC6細胞及びヒトU251細胞において、ヘパラン硫酸量は、アンチセンスオリゴヌクレオチド(hT1-2126-LNA(15))のトランスフェクションによって、ほとんど影響を受けないことが示された。
[実施例9]
(アンチセンスオリゴヌクレオチドの瘢痕形成への影響)
In vitro瘢痕形成を定量することによって、アンチセンスオリゴヌクレオチドの瘢痕形成への影響を調べた。本発明者らは、繊維芽細胞とグリア細胞を混合し、増殖因子(TGFβ及びPDGF)を加えた培地中で培養すると繊維性瘢痕が形成される、in vitro瘢痕形成系を開発した。脊髄損傷後に組織修復の結果として生じる瘢痕は、神経の再生を阻害すると一般に考えられている。そのため、瘢痕の形成を抑制することにより、脊髄損傷の回復を促進することができる。
U251細胞(グリア細胞、ヒトアストロサイトーマ由来)は、国立研究開発法人 医薬基盤・健康・栄養研究所 JCRB細胞バンクから細胞登録番号 IFO50288で入手した。HT1080細胞(繊維芽細胞、ヒト線維肉腫由来)は、国立研究開発法人 医薬基盤・健康・栄養研究所 JCRB細胞バンクから細胞登録番号 JCRB9113で入手した。
5×104個のU251細胞及び5×104個のHT1080細胞を50μlの培地(RPMI1640培地、和光純薬工業株式会社)中に懸濁して混合した。細胞混合液を、96ウェル平底ディッシュ(PLLコート済、Nunc社)に播種し、15％FCS(Hyclone社)を補充したRPMI1640培地中で培養した。
翌日、培地を、TGFβ及びPDGFを補充した培地(5％FCS(Hyclone社)、10ng/ml TGFβ、及び5ng/ml PDGFを補充したRPMI1640培地(使用時に調製した))に交換した。TGFβ(トランスフォーミング増殖因子β)としては、フナコシ株式会社から商品コード100-21で入手可能なTGF-β1(ヒト、組換え体、HEK293細胞で産生)又はフナコシ株式会社から商品コード246-LP-025で入手可能なLAP/TGF-β1(ヒト、組換え体、Sf21細胞で産生)を用いた。PDGF(血小板由来増殖因子)としては、和光純薬工業株式会社からコード番号166-19743で入手可能なPDGF-B(ヒト、組換え体)若しくはコード番号169-19733で入手可能なPDGF-AA(ヒト、組換え体)、又はオリエンタル酵母工業株式会社から製品番号NIB 47083000で入手可能なPDGF-BB(組換えヒト血小板由来増殖因子BB)を用いた。
培地交換の際、実施例5に記載したCEM法及びリポフェクション法の併用と同様の方法により、培地に塩化カルシウム溶液を添加し、リポフェクタミン(Lipofectamine(登録商標)3000 Transfection Kit、Thermo Fisher Scientific社)を用いて、アンチセンスオリゴヌクレオチドを最終濃度100nMで細胞にトランスフェクトした。アンチセンスオリゴヌクレオチドとしては、実施例1で合成したhT1-2327-LNA(15)、hT1-2514-LNA(15)、hT1-2519-LNA(15)、hT2-1617-LNA(15)、hT1-2126-LNA(15)、hT2-891-LNA(15)、及びhT2-1893-LNA(15)を用いた。対照として、核酸NEG#L1でトランスフェクトした細胞及び未処置細胞を準備した。
細胞を37℃にてCO2インキュベーター内でインキュベートした。
アンチセンスオリゴヌクレオチド投与72時間後に、ライブセル解析系IncuCyte(登録商標)(Essen bioscience社)を用いて、製造業者のマニュアルに従い、瘢痕数及び瘢痕面積(総面積)を計測した。瘢痕面積は、画像ピクセル数で表した。実験は2回行い、瘢痕数及び瘢痕面積(総面積)の平均値を算出した。
なお、LY-36497(TGFβの作用の阻害剤、sigma社)を用いた場合に、瘢痕形成が低下することを本発明者らはすでに確認している。
図9Aに、アンチセンスオリゴヌクレオチドをトランスフェクトした場合の瘢痕数を示す。図9Bに、アンチセンスオリゴヌクレオチドをトランスフェクトした場合の瘢痕面積を示す。アンチセンスオリゴヌクレオチドhT1-2327-LNA(15)、hT1-2514-LNA(15)、hT1-2519-LNA(15)、hT2-1617-LNA(15)、hT1-2126-LNA(15)、hT2-891-LNA(15)、及びhT2-1893-LNA(15)は、瘢痕数及び瘢痕面積を低下させることが示された。よって、これらのアンチセンスオリゴヌクレオチドは、瘢痕の形成を抑制することにより、脊髄損傷の回復を促進することができることが示された。
[実施例10]
(脊髄損傷モデルマウスの作製及びアンチセンスオリゴヌクレオチドの投与)
C57BL/6J系統のマウス(野生型)を日本クレア株式会社から購入し、繁殖させて、実験に使用した。8～10週齢の雄性マウスを原則として実験に用いた。
深麻酔下のマウスにおいて、10番目の脊椎骨(Th10)の背側部を外科手術にて除去した。脊髄損傷モデル作製機器(Infinite Horizon Impactor、Precision Systems and Instrumentation社、Lexington、NY)を用いて、70k-Dyneの安定した衝撃力(impact force)で脊髄損傷を生じさせた。対照の偽手術マウスは、Th10骨除去のみを行い、傷口を縫合した。
脊髄損傷を生じさせたマウスに、アンチセンスオリゴヌクレオチド(hT1-2126-LNA(15))又はコンドロイチナーゼABC(ChABC)を投与した。アンチセンスオリゴヌクレオチドhT1-2126-LNA(15)は、マウスCSGalNAcT1 mRNA(配列番号166)の2067-2081位の領域に対してミスマッチがなく、この領域を標的とすることができる。コンドロイチナーゼABCは、生化学工業株式会社から入手した。コンドロイチナーゼABC処理によって、脊髄損傷からの回復が促進されることが知られている(Takeuchi, K., et al., Chondroitin sulphate N-acetylgalactosaminyltransferase-1 inhibits recovery from neural injury. Nature Communication, 2013, 4: 2740)。
損傷部の脊椎骨背側部にシルクスポンジを置き、小動物用浸透圧ポンプ(osmotic mini-pump (Model 2006(長期用200μl容量))、Alzet社)を用いてスポンジにアンチセンスオリゴヌクレオチド(100nM)又はコンドロイチナーゼABC(20μM)を持続投与した。投与は、1時間あたり0.5μlの速度で、2週間行った。また、陰性対照として、陰性対照核酸(NEG#L1)を脊髄損傷マウスに投与した群も作製した。
T1KOマウス(CSGalNAcT1ノックアウトマウス)は、C57BL/6N系統に由来する胚性幹細胞株RENKAを用いて相同組換えによって以前に作製された(Watanabe, T., et al., Chondroitin sulfate N-acetylgalactosaminyltransferase-1 is required for normal cartilage development. Biochem. J., 2010, 432: 47-55)。T1KOマウスでは、脊髄損傷からの回復が促進されることが知られている(Takeuchi, K., et al., 2013、上掲)。T1KOマウスに、上記と同様の方法によって、脊髄損傷を生じさせ、アンチセンスオリゴヌクレオチド(hT1-2126-LNA(15))又は陰性対照核酸を損傷部に持続投与した。
[実施例11]
(アンチセンスオリゴヌクレオチドの脊髄損傷モデルマウスにおける後肢運動機能への影響)
実施例10に記載したように脊髄損傷を生じさせ、薬剤で処理した後、マウスは週に1回、6週まで後肢運動機能について解析した。
後肢運動機能解析は、BMSオープンフィールドスコアリングによって行った(Basso, D.M., et al., Basso Mouse Scale for locomotion detects differences in recovery after spinal cord injury in five common mouse strains. J Neurotrauma, 2006, 23(5): 635-59.)。最低2～3名の評価者により、各群について6匹のマウスをスコア付けした。BMSは、運動能力の全体的な指標を提供し、運動機能回復期及び運動の特徴を決定する。BMSは、9点スケールの試験であり、後肢の完全麻痺を0点、正常運動を9点とする。BMSスコアは、後肢の各関節の動き、体重支持、ステップ、前後肢の協調性、体幹の安定性、歩行時の尾の位置などを点数化したものである。各群の6匹のマウスのスコアの平均値及び標準誤差を算出した。
図10は、野生型マウスに脊髄損傷を生じさせ薬剤を投与していない群(WT、SCI)、野生型マウスに脊髄損傷を生じさせコンドロイチナーゼABCを投与した群(WT、SCI＋ChABC)、野生型マウスに脊髄損傷を生じさせアンチセンスオリゴヌクレオチド(hT1-2126-LNA(15))を投与した群(WT、SCI＋hT1-2126)、T1KOマウスに脊髄損傷を生じさせアンチセンスオリゴヌクレオチド(hT1-2126-LNA(15))を投与した群(T1KO、SCI＋hT1-2126)、T1KOマウスに脊髄損傷を生じさせ薬剤を投与していない群(T1KO、SCI)、及び偽手術した野生型マウスにおける、後肢運動機能解析の結果を示す。スコアが高いほど運動機能が高いことが示される。
脊髄損傷を生じさせアンチセンスオリゴヌクレオチドを投与した野生型マウスでは、脊髄損傷を生じさせ薬剤投与していない野生型マウスと比較して、後肢運動機能回復が促進されることが示された。
脊髄損傷を生じさせたT1KOマウス及び脊髄損傷を生じさせコンドロイチナーゼABCを投与した野生型マウスでは、以前に記載されたように(Takeuchi, K., et al., 2013、上掲)、脊髄損傷を生じさせた野生型マウスと比較して、後肢運動機能回復が促進されることが確認された。
また、脊髄損傷を生じさせたT1KOマウスにアンチセンスオリゴヌクレオチドを投与すると、脊髄損傷を生じさせ薬剤投与していないT1KOマウスと同程度に後肢運動機能が回復することが示された。このことから、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、オフターゲット効果などの副作用がないことが示された。
[実施例12]
(アンチセンスオリゴヌクレオチドの脊髄損傷モデルマウスにおける糖鎖量への影響)
実施例10に記載したようにアンチセンスオリゴヌクレオチドを投与した脊髄損傷マウスにおいて糖鎖量を定量することによって、アンチセンスオリゴヌクレオチドの脊髄損傷モデルマウスにおける糖鎖量への影響を調べた。
脊髄損傷の3週間後に、深麻酔下のマウスを速やかに炭酸ガスによって安楽死させ、脊髄を損傷箇所を中心に3mmの長さで摘出した。また、脊髄損傷させて薬剤を投与していない野生型及びT1KOマウスから大脳皮質部を摘出した。
摘出した組織(脊髄及び大脳皮質部)中の糖鎖を、以下のように定量した。組織をチューブに入れ、リン酸緩衝生理食塩水(PBS) 1 mLで2回洗浄した。次いで、PBS 0.5mLをチューブに添加し、バイオマッシャーで組織をホモジナイズした。チューブに200μLのコンドロイチナーゼABC反応液(10mU コンドロイチナーゼABC、50mM Tris-HCl pH 8.0、及び60mM CH3COONa)を添加し、37℃にて2時間インキュベートした。チューブ中の溶液を100μLずつ2本のチューブに分注し、95℃で5分間加熱した。チューブ中の溶液を真空濃縮器(Speed-Vac、Thermo Fisher Scientific社)を用いて乾燥させた(3時間以内)。次いで、ジメチルスルホキシド(DMSO)中の0.35M 2-アミノベンズアミド(糖鎖を標識する蛍光試薬)、1.0M NaCNBH4、及び30％酢酸の溶液25μLをチューブに添加した。チューブを65℃で2時間インキュベートし、糖鎖を蛍光標識した。次いで、反応液50μLに、精製水150μLを添加し、ガラス製遠沈管に移した。遠沈管にクロロホルム(蛍光分析用)500μLを添加し、ボルテックスミキサーで撹拌した。遠沈管を1,500rpmで1分間遠心分離した。遠心分離後の下層(クロロホルム)を除去し、過剰の蛍光試薬を除去した。このクロロホルムを用いた蛍光試薬の除去を5回繰り返した。最後に上層(水層)を遠心分離式限外ろ過フィルター(セントリカットミニ、0.45μmフィルター)に入れ、7,000rpmで5分間遠心分離して、溶液を得た。得られた溶液を陰イオン交換高速液体クロマトグラフィー(HPLC)によって解析した。カラムとしてPA-G(4.6mm×150 mm)及びガードカラム(4.0mm×10mm)(YMC社)を用いた。流速は0.5mL/分とした。溶媒としては、16mM NaH2PO4・2H2O及び1M NaH2PO4・2H2Oを用い、10分間16mM NaH2PO4・2H2Oの後、60分間で16mMから0.53Mの濃度勾配を用いた。励起光330nm及び発光420nmによって検出を行った。このようにして、それぞれの群の2～4匹のマウスについて糖鎖を定量し、平均値及び標準誤差を算出した。
図11は、野生型マウス及びT1KOマウスそれぞれについて、偽手術した群の脊髄、脊髄損傷を生じさせ薬剤を投与していない群の脊髄(SCI)、脊髄損傷を生じさせ陰性対照核酸を投与した群の脊髄(SCI+陰性対照核酸)、脊髄損傷を生じさせアンチセンスオリゴヌクレオチド(hT1-2126-LNA(15))を投与した群の脊髄(SCI+hT1-2126)、及び脊髄損傷を生じさせ薬剤を投与していない群の大脳皮質部における糖鎖量を示す。
大脳皮質部の糖鎖量は脊髄損傷によってあまり影響を受けず、また、脊髄の糖鎖量より多いことが分かっている。そのため、大脳皮質部の糖鎖量は陽性対照として定量した。大脳皮質部では野生型マウス及びT1KOマウスにおいて糖鎖を検出できることが確認された。
野生型マウスでは、脊髄損傷を生じさせると、脊髄の糖鎖量は増加することが示された。一方、脊髄損傷を生じさせた野生型マウスにアンチセンスオリゴヌクレオチドを投与すると、薬剤未処置群と比較して、糖鎖量の増加の程度は小さいことが示された。このことから、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、生体内に投与された場合に、コンドロイチン硫酸量を低下させ、糖鎖量を低下させることが示された。
T1KOマウスでも、脊髄損傷を生じさせると、脊髄の糖鎖量は少し増加することが示された。しかし、脊髄損傷を生じさせたT1KOマウスにアンチセンスオリゴヌクレオチドを投与しても、糖鎖量の増加の程度は、薬剤未処置群と同程度であることが示された。このことから、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、オフターゲット効果などの副作用がないことが確認された。
[実施例13]
(髄腔内投与したアンチセンスオリゴヌクレオチドの脊髄損傷モデルラットにおける後肢運動機能への影響)
脊髄損傷モデルラットに、実施例1で合成したアンチセンスオリゴヌクレオチドを髄腔内投与し、後肢運動機能回復を調べた。
ラット(Wistar; 12週齢以降; 日本クレア株式会社)を実験に用いた。200ｋ-Dyneの衝撃力を用いたことを除いて実施例10に記載したように、ラットに脊髄損傷を生じさせた。偽手術ラットも実施例10に記載したように作製した。
脊髄損傷後、同じ日に、ラットに、実施例1で合成したアンチセンスオリゴヌクレオチド(hT1-2514-LNA(15)又はhT2-1617-AmNA(15))又は対照核酸NEG#L1(実施例2を参照)を髄腔内投与した。投与は、100μg/μl濃度(全体積10μl)の核酸溶液(ポンタミン色素を含む)を、30秒～1分間当たり1μlの速度でラットの髄腔内に注入することによって行った。ポンタミン色素によって薬剤の導入を確認した。
ラットの後肢運動機能を、BBBスコアによって評価した(Basso, D.M., et al., A sensitive and reliable locomotor rating scale for open field testing in rats. J Neurotrauma, 1995, 12(1): 1-21及びBasso, D.M., et al., Graded histological and locomotor outcomes after spinal cord contusion using the NYU weight-drop device versus transection. Experimental Neurology, 1996, 139(2): 244-256)。BBBスコアは、動物の後肢の運動量、前肢後肢の協調性及び尾の状態等を目視で観察し、21点スケールで点数化したものである。BBBスコアは、脊髄損傷及び薬剤投与後、週に1回、2～3名の観察者により独立に評価した。各群の9匹のラットのスコアの平均値及び標準誤差を算出した。統計学的検定は、ANOVAとpost-hocテストにより行った(*P<0.01、対照に対して)。
図12は、対照核酸を投与した群、アンチセンスオリゴヌクレオチドhT1-2514-LNA(15)を投与した群、アンチセンスオリゴヌクレオチドhT2-1617-AmNA(15)を投与した群、及び偽手術ラットにおける、後肢運動機能解析の結果を示す。BBBスコアが高いほど運動機能が高いことが示される。
アンチセンスオリゴヌクレオチド(hT1-2514-LNA(15)又はhT2-1617-AmNA(15))の投与により、対照核酸と比較して、脊髄損傷を生じさせたラットにおいて後肢運動機能の回復が有意に促進されることが示された。
[実施例14]
(損傷部に局所投与したアンチセンスオリゴヌクレオチドの脊髄損傷モデルマウスにおける後肢運動機能への影響)
脊髄損傷モデルマウスに、実施例1で合成したアンチセンスオリゴヌクレオチドを損傷部にて局所投与し、後肢運動機能回復を調べた。
マウス(C57BL/6J; 16週齢以降)を実験に用いた。100ｋ-Dyneの衝撃力を用いたことを除いて実施例10に記載したように、マウスに脊髄損傷を生じさせた。偽手術マウスも実施例10に記載したように作製した。
脊髄損傷後、同じ日に、マウスに、実施例1で合成したアンチセンスオリゴヌクレオチド(hT1-2514-LNA(15)又はhT2-1617-AmNA(15))又は対照核酸NEG#L1(実施例2を参照)を局所投与(ゼルフォーム投与)した。投与は、500μg/μl濃度の核酸溶液を、アテロコラーゲン(AteloGene(登録商標)、株式会社高研)と混和し(全体積20μl)、混合溶液をフィブロインスポンジに吸着させ、スポンジを脊髄損傷領域に留置することによって行った。
マウスの後肢運動機能を、実施例11に記載したようにBMSスコアによって評価した。各群の12匹のマウスのスコアの平均値及び標準誤差を算出した。統計学的検定は、ANOVAとpost-hocテストにより行った(*P<0.01、対照に対して)。
図13は、対照核酸を投与した群、アンチセンスオリゴヌクレオチドhT1-2514-LNA(15)を投与した群、アンチセンスオリゴヌクレオチドhT2-1617-AmNA(15)を投与した群、及び偽手術マウスにおける、後肢運動機能解析の結果を示す。BMSスコアが高いほど運動機能が高いことが示される。
アンチセンスオリゴヌクレオチド(hT1-2514-LNA(15)又はhT2-1617-AmNA(15))の投与により、対照核酸と比較して、脊髄損傷を生じさせマウスにおいて後肢運動機能の回復が有意に促進されることが示された。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願はそのまま引用により本明細書に組み入れられるものとする。

Claims (7)

  1. コンドロイチン硫酸N-アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ-1(CSGalNAcT1)遺伝子及びコンドロイチン硫酸N-アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ-2(CSGalNAcT2)遺伝子の一方又は両方の発現を抑制する、アンチセンスオリゴヌクレオチドであって、配列番号1～3、5～7、9～30、32、35～48、49～58、59、60、62～65、67～71、78、79、82～91、94～106、108、111、115、121、122、131～134、136、137、140～142、144、145及び149からなる群から選択される核酸塩基配列からなり、3個のLNAヌクレオシドからなる5'ウイング領域、9個のデオキシリボヌクレオシドからなるDNAギャップ領域、並びに2個のLNAヌクレオシドと3'末端の1個のデオキシリボヌクレオシドとからなる3'ウイング領域からなり、LNAヌクレオシド中のシトシンは5-メチルシトシンであり、全てのヌクレオシド間結合はホスホロチオエート結合である、アンチセンスオリゴヌクレオチド。
  2. 配列番号121の核酸塩基配列からなる、請求項１に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
  3. コンドロイチン硫酸N-アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ-1(CSGalNAcT1)遺伝子及びコンドロイチン硫酸N-アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ-2(CSGalNAcT2)遺伝子の両方の発現を抑制する、アンチセンスオリゴヌクレオチドであって、配列番号1、9、16、18、21～30、35、37、39、40、49～52、54、55、57～59、62、63、67、88、89、102及び144からなる群から選択される核酸塩基配列からなり、3個のLNAヌクレオシドからなる5'ウイング領域、9個のデオキシリボヌクレオシドからなるDNAギャップ領域、並びに2個のLNAヌクレオシドと3'末端の1個のデオキシリボヌクレオシドとからなる3'ウイング領域からなり、LNAヌクレオシド中のシトシンは5-メチルシトシンであり、全てのヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエート結合である、アンチセンスオリゴヌクレオチド。
  4. コンドロイチン硫酸N-アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ-1(CSGalNAcT1)遺伝子及びコンドロイチン硫酸N-アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ-2(CSGalNAcT2)遺伝子の一方又は両方の発現を抑制する、アンチセンスオリゴヌクレオチドであって、配列番号18、35、52、57、88、108、113、115、134、140、141、142、155、156、161及び162からなる群から選択される核酸塩基配列からなり、3個のLNAヌクレオシドからなる5'ウイング領域、9個のデオキシリボヌクレオシドからなるDNAギャップ領域、並びに2個のLNAヌクレオシドと3'末端の1個のデオキシリボヌクレオシドとからなる3'ウイング領域からなり、LNAヌクレオシド中のシトシンは5-メチルシトシンであり、全てのヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエート結合である、アンチセンスオリゴヌクレオチド。
  5. コンドロイチン硫酸N-アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ-1(CSGalNAcT1)遺伝子及びコンドロイチン硫酸N-アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ-2(CSGalNAcT2)遺伝子の一方又は両方の発現を抑制する、アンチセンスオリゴヌクレオチドであって、配列番号52又は155の核酸塩基配列からなり、3個のLNAヌクレオシドからなる5'ウイング領域、9個のデオキシリボヌクレオシドからなるDNAギャップ領域、並びに2個のLNAヌクレオシドと3'末端の1個のデオキシリボヌクレオシドとからなる3'ウイング領域からなり、LNAヌクレオシド中のシトシンは5-メチルシトシンであり、全てのヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエート結合であるアンチセンスオリゴヌクレオチド。
  6. コンドロイチン硫酸の増加と関連する疾患又は状態を治療するための、請求項１～５のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む、医薬組成物。
  7. 前記疾患又は状態が、脊髄損傷である、請求項６に記載の医薬組成物。
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