JP7141621B2 - コンドロイチン硫酸生合成を阻害するアンチセンス核酸 - Google Patents
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Description
[1]コンドロイチン硫酸N-アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ-1(CSGalNAcT1)遺伝子及びコンドロイチン硫酸N-アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ-2(CSGalNAcT2)遺伝子の一方又は両方の発現を抑制する、少なくとも1つの修飾ヌクレオチドを有する、アンチセンスオリゴヌクレオチド。
[2]配列番号1~3、5~111、113、115、116、119~123、125、131~137、139~145、148~151、153、154、161、及び162からなる群から選択される配列の11~15個の連続した核酸塩基配列、又はこれにおいて1個若しくは2個の核酸塩基が置換、欠失若しくは挿入された核酸塩基配列を含む、[1]に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
[3]配列番号1、9、16、18、21~30、35、37、39、40、49~52、54、55、57~59、62、63、67、88、89、102、107、108、113、115、134、140、141、144、154、161、及び162からなる群から選択される配列の11~15個の連続した核酸塩基配列、又はこれにおいて1個若しくは2個の核酸塩基が置換、欠失若しくは挿入された核酸塩基配列を含む、[2]に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
[4]配列番号18、35、52、57、88、108、113、115、134、140、141、142、154、155、156、161及び162からなる群から選択される配列の11~15個の連続した核酸塩基配列、又はこれにおいて1個若しくは2個の核酸塩基が置換、欠失若しくは挿入された核酸塩基配列を含む、[1]に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
[5]CSGalNAcT1 mRNAの一部に対してミスマッチがないか又は1個~4個のミスマッチを有し、かつCSGalNAcT2 mRNAの一部に対してミスマッチがないか又は1個~4個のミスマッチを有する核酸塩基配列からなる、[1]に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
[6]CSGalNAcT1 mRNAの一部に対してミスマッチがなく、かつCSGalNAcT2 mRNAの一部に対して1個~4個のミスマッチを有する核酸塩基配列からなる、[5]に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
[7]CSGalNAcT1 mRNAの一部に対して1個~4個のミスマッチを有し、かつCSGalNAcT2 mRNAの一部に対してミスマッチがない核酸塩基配列からなる、[5]に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
[8]CSGalNAcT1 mRNAの一部に対してミスマッチがなく、かつCSGalNAcT2 mRNAの一部に対してミスマッチがない核酸塩基配列からなる、[5]に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
[9]配列番号1~3、5~58、108~111、113、115、116、119~123、125、161、及び162からなる群から選択される配列の11~15個の連続した核酸塩基配列、又はこれにおいて1個若しくは2個の核酸塩基が置換、欠失若しくは挿入された核酸塩基配列を含み、かつ、配列番号164に示される配列の一部に対してミスマッチがないか又は1個~4個のミスマッチを有する核酸塩基配列からなる、[2]に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
[10]配列番号49~107、131~137、139~145、148~151、153、及び154からなる群から選択される配列の11~15個の連続した核酸塩基配列、又はこれにおいて1個若しくは2個の核酸塩基が置換、欠失若しくは挿入された核酸塩基配列を含み、かつ、配列番号165に示される配列の一部に対してミスマッチがないか又は1個~4個のミスマッチを有する核酸塩基配列からなる、[2]に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
[11]CSGalNAcT1遺伝子及びCSGalNAcT2遺伝子の一方又は両方の発現を20%以上抑制する、[1]~[10]のいずれかに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
[12]11~20塩基長である、[1]~[11]のいずれかに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
[13]修飾ヌクレオチドが、二環式糖を含む、[1]~[12]のいずれかに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
[14]少なくとも1つのヌクレオシド間結合が、ホスホロチオエート結合である、[1]~[13]のいずれかに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
[15]修飾ヌクレオチドが、5-メチルシトシンを含む、[1]~[14]のいずれかに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
[16]ギャップマーである、[1]~[15]のいずれかに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
[17]コンドロイチン硫酸の増加と関連する疾患又は状態を治療するための、[1]~[16]のいずれかに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む、医薬組成物。
[18]前記疾患又は状態が、脊髄損傷である、[17]に記載の医薬組成物。
本発明は、アンチセンスオリゴヌクレオチドに関する。より具体的には、本発明は、コンドロイチン硫酸生合成を阻害するアンチセンスオリゴヌクレオチド、特に、コンドロイチン硫酸N-アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ-1(CSGalNAcT1)遺伝子及びコンドロイチン硫酸N-アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ-2(CSGalNAcT2)遺伝子の一方又は両方の発現を抑制するアンチセンスオリゴヌクレオチドに関する。
本発明は、本発明の一実施形態に係るアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む医薬組成物を提供する。医薬組成物は、コンドロイチン硫酸の増加と関連する疾患又は状態を治療するために使用できる。
(アンチセンスオリゴヌクレオチドの設計及び合成)
CSGalNAcT1遺伝子及びCSGalNAcT2遺伝子の両方の発現を抑制し得るアンチセンスオリゴヌクレオチドを設計した。ヒトCSGalNAcT1 mRNA(配列番号164)とヒトCSGalNAcT2 mRNA(配列番号165)との間で、BLAST解析によって相同性の高い領域を選定した。次いで、この領域内において、mfoldプログラム(M. Zuker, Mfold web server for nucleic acid folding and hybridization prediction. Nucleic Acids Res. 31 (13), 3406-15, (2003))による高次構造予測又は毒性発現配列の除外により、107種の核酸塩基配列を設計した(表1A、1B及び1C)。表1Aに示される配列は、ヒトCSGalNAcT1 mRNAの一部に対してミスマッチがなく(完全に相補的であり)、かつヒトCSGalNAcT2 mRNAの一部に対して1~4個のミスマッチを有する配列である。表1Bに示される配列は、ヒトCSGalNAcT1 mRNAの一部に対してミスマッチがなく、かつヒトCSGalNAcT2 mRNAの一部に対してミスマッチがない配列である。表1Cに示される配列は、ヒトCSGalNAcT1 mRNAの一部に対して1~4個のミスマッチを有し、かつヒトCSGalNAcT2 mRNAの一部に対してミスマッチがない配列である。
(ヒトYKG-1細胞におけるアンチセンスオリゴヌクレオチドの発現抑制活性)
実施例1で合成したアンチセンスオリゴヌクレオチドのいくつかをヒトYKG-1細胞にトランスフェクトし、CSGalNAcT1 mRNA及びCSGalNAcT2 mRNAを定量することによって、アンチセンスオリゴヌクレオチドの、ヒトYKG-1細胞におけるCSGalNAcT1及びCSGalNAcT2遺伝子発現抑制活性を調べた。
対照プライマーセット:50nM hGAPDH-F (5'-GAGTCAACGGATTTGGTCGT-3'、配列番号170)及び50nM hGAPDH-R (5'-GACAAGCTTCCCGTTCTCAG-3'、配列番号171)
hCSGalNAcT1セット1:100nM hT1-F1 (5'-TCAGGGAGATGTGCATTGAG-3'、配列番号172)及び100nM hT1-R1 (5'-AGTTGGCAGCTTTGGAAGTG-3'、配列番号173)
hCSGalNAcT1セット2:200nM hT1-F2 (5'-GGAGACCCTGAACAGTCCTG-3'、配列番号174)及び200nM hT1-R2 (5'-GCCGTTTGAATTCGTGTTTG-3'、配列番号175)
hCSGalNAcT2セット1:200nM hT2-F1(5'-GCCATTGTTTATGCCAACCA-3'、配列番号176)及び200nM hT2-R1 (5'-ATCCACCAATGGTCAGGAAA-3'、配列番号177)
hCSGalNAcT2セット2:200nM hT2-F2 (5'-TCCTAGAATCTGTCACCAGTGAG-3'、配列番号178)及び200nM hT2-R2 (5'-ACATCAAGACCTCTCCCTTGTC-3'、配列番号179)
プライマーの濃度はPCR反応液(20μL)中の濃度を示す。
(マウス3T3N細胞におけるアンチセンスオリゴヌクレオチドの濃度依存的発現抑制活性)
実施例1で合成したアンチセンスオリゴヌクレオチドのいくつかを様々な濃度でマウス3T3N細胞にトランスフェクトし、CSGalNAcT1 mRNA及びCSGalNAcT2 mRNAを定量することによって、アンチセンスオリゴヌクレオチドの、マウス3T3N細胞におけるCSGalNAcT1及びCSGalNAcT2遺伝子の濃度依存的発現抑制活性を調べた。
cDNAを用いて、リアルタイムPCR(RT-PCR)を行った。リアルタイムPCRは、以下のプライマーセットを用いること、及び温度条件として95℃で30秒間の後、45サイクルの95℃3秒間及び62℃30秒間を用いることを除き、実施例2に記載したように行った。
mCSGalNAcT1セット:200nM mT1-F1 (5'-CCAATTTCAGAAACTTCACCTTCAT-3'、配列番182)及び200nM mT1-R1 (5'-TGTTCAGCCTACAAGTGTTGAG-3'、配列番号183)
mCSGalNAcT2セット:200nM mT2-F1(5'-TTAATATCATTGTGCCACTTGCG-3'、配列番号184)及び200nM mT2-R1 (5'-TAGAATAGACTTGACTTTAGATAGTCCTT-3'、配列番号185)
(ヒトSKOV-3細胞におけるアンチセンスオリゴヌクレオチドの濃度依存的発現抑制活性)
実施例1で合成したアンチセンスオリゴヌクレオチドのいくつかを様々な濃度でヒトSKOV-3細胞にトランスフェクトし、CSGalNAcT1 mRNA及びCSGalNAcT2 mRNAを定量することによって、アンチセンスオリゴヌクレオチドの、ヒトSKOV-3細胞におけるCSGalNAcT1及びCSGalNAcT2遺伝子の発現抑制活性を調べた。
(ヒトU251細胞におけるアンチセンスオリゴヌクレオチドの発現抑制活性)
実施例1で合成したアンチセンスオリゴヌクレオチドのいくつかをヒトU251細胞にトランスフェクトし、CSGalNAcT1 mRNA及びCSGalNAcT2 mRNAを定量することによって、アンチセンスオリゴヌクレオチドの、ヒトU251細胞におけるCSGalNAcT1及びCSGalNAcT2遺伝子の濃度依存的発現抑制活性を調べた。
(ヒトU251細胞におけるアンチセンスオリゴヌクレオチドの濃度依存的発現抑制活性)
実施例1で合成したアンチセンスオリゴヌクレオチドのいくつかを様々な濃度でヒトU251細胞にトランスフェクトし、CSGalNAcT1 mRNA及びCSGalNAcT2 mRNAを定量することによって、アンチセンスオリゴヌクレオチドの、ヒトU251細胞におけるCSGalNAcT1及びCSGalNAcT2遺伝子の濃度依存的発現抑制活性を調べた。
(アンチセンスオリゴヌクレオチドのコンドロイチン硫酸及びへパラン硫酸量への影響)
実施例1で合成したアンチセンスオリゴヌクレオチドのいくつかをヒトYKG-1細胞及びヒトU251細胞にトランスフェクトし、細胞中のコンドロイチン硫酸及びへパラン硫酸量をIn Cell ELISAアッセイによって定量することによって、アンチセンスオリゴヌクレオチドのコンドロイチン硫酸及びへパラン硫酸量への影響を調べた。
(アンチセンスオリゴヌクレオチドのへパラン硫酸量への影響)
実施例1で合成したアンチセンスオリゴヌクレオチド(hT1-2126-LNA(15))をC6細胞(ラットグリア腫由来)及びU251細胞(ヒトアストロサイトーマ由来)に導入し、細胞中のへパラン硫酸量をIn Cell ELISAアッセイによって定量することによって、アンチセンスオリゴヌクレオチドのへパラン硫酸量への影響を調べた。
(アンチセンスオリゴヌクレオチドの瘢痕形成への影響)
In vitro瘢痕形成を定量することによって、アンチセンスオリゴヌクレオチドの瘢痕形成への影響を調べた。本発明者らは、繊維芽細胞とグリア細胞を混合し、増殖因子(TGFβ及びPDGF)を加えた培地中で培養すると繊維性瘢痕が形成される、in vitro瘢痕形成系を開発した。脊髄損傷後に組織修復の結果として生じる瘢痕は、神経の再生を阻害すると一般に考えられている。そのため、瘢痕の形成を抑制することにより、脊髄損傷の回復を促進することができる。
(脊髄損傷モデルマウスの作製及びアンチセンスオリゴヌクレオチドの投与)
C57BL/6J系統のマウス(野生型)を日本クレア株式会社から購入し、繁殖させて、実験に使用した。8~10週齢の雄性マウスを原則として実験に用いた。
(アンチセンスオリゴヌクレオチドの脊髄損傷モデルマウスにおける後肢運動機能への影響)
実施例10に記載したように脊髄損傷を生じさせ、薬剤で処理した後、マウスは週に1回、6週まで後肢運動機能について解析した。
(アンチセンスオリゴヌクレオチドの脊髄損傷モデルマウスにおける糖鎖量への影響)
実施例10に記載したようにアンチセンスオリゴヌクレオチドを投与した脊髄損傷マウスにおいて糖鎖量を定量することによって、アンチセンスオリゴヌクレオチドの脊髄損傷モデルマウスにおける糖鎖量への影響を調べた。
(髄腔内投与したアンチセンスオリゴヌクレオチドの脊髄損傷モデルラットにおける後肢運動機能への影響)
脊髄損傷モデルラットに、実施例1で合成したアンチセンスオリゴヌクレオチドを髄腔内投与し、後肢運動機能回復を調べた。
アンチセンスオリゴヌクレオチド(hT1-2514-LNA(15)又はhT2-1617-AmNA(15))の投与により、対照核酸と比較して、脊髄損傷を生じさせたラットにおいて後肢運動機能の回復が有意に促進されることが示された。
(損傷部に局所投与したアンチセンスオリゴヌクレオチドの脊髄損傷モデルマウスにおける後肢運動機能への影響)
脊髄損傷モデルマウスに、実施例1で合成したアンチセンスオリゴヌクレオチドを損傷部にて局所投与し、後肢運動機能回復を調べた。
Claims (7)
- コンドロイチン硫酸N-アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ-1(CSGalNAcT1)遺伝子及びコンドロイチン硫酸N-アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ-2(CSGalNAcT2)遺伝子の一方又は両方の発現を抑制する、アンチセンスオリゴヌクレオチドであって、配列番号1~3、5~7、9~30、32、35~48、49~58、59、60、62~65、67~71、78、79、82~91、94~106、108、111、115、121、122、131~134、136、137、140~142、144、145及び149からなる群から選択される核酸塩基配列からなり、3個のLNAヌクレオシドからなる5'ウイング領域、9個のデオキシリボヌクレオシドからなるDNAギャップ領域、並びに2個のLNAヌクレオシドと3'末端の1個のデオキシリボヌクレオシドとからなる3'ウイング領域からなり、LNAヌクレオシド中のシトシンは5-メチルシトシンであり、全てのヌクレオシド間結合はホスホロチオエート結合である、アンチセンスオリゴヌクレオチド。
- 配列番号121の核酸塩基配列からなる、請求項1に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
- コンドロイチン硫酸N-アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ-1(CSGalNAcT1)遺伝子及びコンドロイチン硫酸N-アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ-2(CSGalNAcT2)遺伝子の両方の発現を抑制する、アンチセンスオリゴヌクレオチドであって、配列番号1、9、16、18、21~30、35、37、39、40、49~52、54、55、57~59、62、63、67、88、89、102及び144からなる群から選択される核酸塩基配列からなり、3個のLNAヌクレオシドからなる5'ウイング領域、9個のデオキシリボヌクレオシドからなるDNAギャップ領域、並びに2個のLNAヌクレオシドと3'末端の1個のデオキシリボヌクレオシドとからなる3'ウイング領域からなり、LNAヌクレオシド中のシトシンは5-メチルシトシンであり、全てのヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエート結合である、アンチセンスオリゴヌクレオチド。
- コンドロイチン硫酸N-アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ-1(CSGalNAcT1)遺伝子及びコンドロイチン硫酸N-アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ-2(CSGalNAcT2)遺伝子の一方又は両方の発現を抑制する、アンチセンスオリゴヌクレオチドであって、配列番号18、35、52、57、88、108、113、115、134、140、141、142、155、156、161及び162からなる群から選択される核酸塩基配列からなり、3個のLNAヌクレオシドからなる5'ウイング領域、9個のデオキシリボヌクレオシドからなるDNAギャップ領域、並びに2個のLNAヌクレオシドと3'末端の1個のデオキシリボヌクレオシドとからなる3'ウイング領域からなり、LNAヌクレオシド中のシトシンは5-メチルシトシンであり、全てのヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエート結合である、アンチセンスオリゴヌクレオチド。
- コンドロイチン硫酸N-アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ-1(CSGalNAcT1)遺伝子及びコンドロイチン硫酸N-アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ-2(CSGalNAcT2)遺伝子の一方又は両方の発現を抑制する、アンチセンスオリゴヌクレオチドであって、配列番号52又は155の核酸塩基配列からなり、3個のLNAヌクレオシドからなる5'ウイング領域、9個のデオキシリボヌクレオシドからなるDNAギャップ領域、並びに2個のLNAヌクレオシドと3'末端の1個のデオキシリボヌクレオシドとからなる3'ウイング領域からなり、LNAヌクレオシド中のシトシンは5-メチルシトシンであり、全てのヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエート結合であるアンチセンスオリゴヌクレオチド。
- コンドロイチン硫酸の増加と関連する疾患又は状態を治療するための、請求項1~5のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む、医薬組成物。
- 前記疾患又は状態が、脊髄損傷である、請求項6に記載の医薬組成物。
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