CN110520532A - 阻碍硫酸软骨素生物合成的反义核酸 - Google Patents

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Abstract

提供一种阻碍硫酸软骨素生物合成的反义寡核苷酸。反义寡核苷酸具有至少1个抑制硫酸软骨素N‑乙酰氨基半乳糖转移酶‑1(CSGalNAcT1)基因及硫酸软骨素N‑乙酰氨基半乳糖转移酶‑2(CSGalNAcT2)基因中的一方或双方的表达的修饰核苷酸。

Description

阻碍硫酸软骨素生物合成的反义核酸
技术领域
本发明涉及一种阻碍硫酸软骨素生物合成的反义寡核苷酸。
背景技术
脊髓损伤(SCI)主要是指由于脊柱被施加较强的外压而导致脊髄受到损伤的临床状态。包含脊髄的中枢神经系统一旦损伤将不会修复及再生，因此，具有脊髓损伤的患者多患有重度的运动功能障碍等。
硫酸软骨素(CS)是广泛分布在动物的细胞外基质中的糖胺聚糖的一种。硫酸软骨素具有在D-葡萄糖醛酸(GlcA)和N-乙酰基-D-半乳糖胺(GalNAc)的2糖重复的糖链上键合有硫酸而成的构造。我们知道，脊髓损伤后，脊髄中会生成硫酸软骨素，而所生成的硫酸软骨素是神经轴突再生的强效抑制因子。
硫酸软骨素N-乙酰氨基半乳糖转移酶-1(CSGalNAcT1)及硫酸软骨素N-乙酰氨基半乳糖转移酶-2(CSGalNAcT2)是参与硫酸软骨素生物合成的酶。
本发明人等报告了：在CSGalNAcT1敲除小鼠中，脊髓损伤后的硫酸软骨素合成降低的事情及脊髓损伤的恢复得到促进的事情(非专利文献1及2)。
现有技术文献
非专利文献
非专利文献1：Watanabe,T.,et al.,Chondroitin sulfate N-acetylgalactosaminyltransferase-1 is required for normal cartilagedevelopment.Biochem.J.,2010,432:47-55
非专利文献2：Takeuchi,K.,et al.,Chondroitin sulphate N-acetylgalactosaminyltransferase-1 inhibits recovery from neural injury.NatureCommunication,2013,4:2740。
发明内容
发明要解决的课题
本发明的课题在于提供一种阻碍硫酸软骨素生物合成的反义寡核苷酸。
用于解决课题的手段
本发明人等为了解决上述课题，反复进行了深入探讨，结果发现，抑制CSGalNAcT1基因及CSGalNAcT2基因中的一方或双方的反义寡核苷酸会阻碍硫酸软骨素生物合成，降低硫酸软骨素量，能够用于脊髓损伤等与硫酸软骨素的增加相关的疾病或病症的治疗，从而完成了本发明。
即，本发明包括以下内容。
[1]一种反义寡核苷酸，所述反义寡核苷酸具有至少1个抑制硫酸软骨素N-乙酰氨基半乳糖转移酶-1(CSGalNAcT1)基因及硫酸软骨素N-乙酰氨基半乳糖转移酶-2(CSGalNAcT2)基因中的一方或双方的表达的修饰核苷酸。
[2]根据[1]所述的反义寡核苷酸，其中，
所述反义寡核苷酸包含选自由序列号1～3、5～111、113、115、116、119～123、125、131～137、139～145、148～151、153、154、161、及162构成的组的序列中的11～15个连续的核酸碱基序列或在上述核酸碱基序列中1个或者2个核酸碱基被取代、缺失或者插入而得到的核酸碱基序列。
[3]根据[2]所述的反义寡核苷酸，其中，
所述反义寡核苷酸包含选自由序列号1、9、16、18、21～30、35、37、39、40、49～52、54、55、57～59、62、63、67、88、89、102、107、108、113、115、134、140、141、144、154、161、及162构成的组的序列中的11～15个连续的核酸碱基序列或在所述核酸碱基序列中1个或者2个核酸碱基被取代、缺失或者插入而得到的核酸碱基序列。
[4]根据[1]所述的反义寡核苷酸，其中，
所述反义寡核苷酸包含选自由序列号18、35、52、57、88、108、113、115、134、140、141、142、154、155、156、161及162构成的组的序列中的11～15个连续的核酸碱基序列或在上述核酸碱基序列中1个或者2个核酸碱基被取代、缺失或者插入而得到的核酸碱基序列。
[5]根据[1]所述的反义寡核苷酸，其中，
所述反义寡核苷酸由相对于CSGalNAcT1 mRNA的一部分没有错配或具有1个～4个错配且相对于CSGalNAcT2 mRNA的一部分没有错配或具有1个～4个错配的核酸碱基序列构成。
[6]根据[5]所述的反义寡核苷酸，其中，
所述反义寡核苷酸由相对于CSGalNAcT1 mRNA的一部分没有错配且相对于CSGalNAcT2 mRNA的一部分具有1个～4个错配的核酸碱基序列构成。
[7]根据[5]所述的反义寡核苷酸，其中，
所述反义寡核苷酸由相对于CSGalNAcT1 mRNA的一部分具有1个～4个错配且相对于CSGalNAcT2 mRNA的一部分没有错配的核酸碱基序列构成。
[8]根据[5]所述的反义寡核苷酸，其中，
所述反义寡核苷酸由相对于CSGalNAcT1 mRNA的一部分没有错配且相对于CSGalNAcT2 mRNA的一部分没有错配的核酸碱基序列构成。
[9]根据[2]所述的反义寡核苷酸，其中，
所述反义寡核苷酸包含选自由序列号1～3、5～58、108～111、113、115、116、119～123、125、161及162构成的组的序列中的11～15个连续的核酸碱基序列或在上述核酸碱基序列中1个或者2个核酸碱基被取代、缺失或者插入而得到的核酸碱基序列，且由相对于序列号164所示的序列的一部分没有错配或具有1个～4个错配的核酸碱基序列构成。
[10]根据[2]所述的反义寡核苷酸，其中，
所述反义寡核苷酸包含选自由序列号49～107、131～137、139～145、148～151、153及154构成的组的序列中的11～15个连续的核酸碱基序列或在上述核酸碱基序列中1个或者2个核酸碱基被取代、缺失或者插入而得到的核酸碱基序列，且由相对于序列号165所示的序列的一部分没有错配或具有1个～4个错配的核酸碱基序列构成。
[11]根据[1]～[10]中任一项所述的反义寡核苷酸，其中，
所述反义寡核苷酸抑制CSGalNAcT1基因及CSGalNAcT2基因中的一方或双方的表达的20％以上。
[12]根据[1]～[11]中任一项所述的反义寡核苷酸，其中，
所述反义寡核苷酸为11～20碱基长度。
[13]根据[1]～[12]中任一项所述的反义寡核苷酸，其中，
修饰核苷酸包含双环糖。
[14]根据[1]～[13]中任一项所述的反义寡核苷酸，其中，
至少1个核苷间连接键为硫代磷酸酯键。
[15]根据[1]～[14]中任一项所述的反义寡核苷酸，其中，
修饰核苷酸包含5-甲基胞嘧啶。
[16]根据[1]～[15]中任一项所述的反义寡核苷酸，其中，
所述反义寡核苷酸为缺口聚体。
[17]一种药物组合物，所述药物组合物包含用于治疗与硫酸软骨素的增加相关的疾病或病症的[1]～[16]中任一项所述的反义寡核苷酸。
[18]根据[17]所述的药物组合物，其中，
所述疾病或病症为脊髓损伤。
本说明书包括作为本申请的优先权的基础的日本国专利申请第2017-072315号的公开内容。
发明的效果
根据本发明，提供一种阻碍硫酸软骨素生物合成的反义寡核苷酸。
附图说明
图1为表示反义寡核苷酸对于人YKG-1细胞中的CSGalNAcT1及CSGalNAcT2基因的表达抑制活性的图表。
图2为表示反义寡核苷酸对于小鼠3T3N细胞中的CSGalNAcT1及CSGalNAcT2基因的浓度依赖性表达抑制活性的图表。
图3为表示反义寡核苷酸对于人SKOV-3细胞中的CSGalNAcT1及CSGalNAcT2基因的浓度依赖性表达抑制活性的图表。
图4为表示反义寡核苷酸对于人SKOV-3细胞中的CSGalNAcT1及CSGalNAcT2基因的浓度依赖性表达抑制活性的图表。
图5为表示反义寡核苷酸对于人U251细胞中的CSGalNAcT1及CSGalNAcT2基因的表达抑制活性的图表。
图6为表示反义寡核苷酸对于人U251细胞中的CSGalNAcT1及CSGalNAcT2基因的浓度依赖性表达抑制活性的图表。
图7为表示反义寡核苷酸对硫酸软骨素及硫酸乙酰肝素量的影响的图表。
图8为表示反义寡核苷酸对硫酸乙酰肝素量的影响的图表。
图9为表示反义寡核苷酸对瘢痕形成的影响的图表。
图10为表示反义寡核苷酸对脊髓损伤模型小鼠的后肢运动功能的影响的图表。
图11为表示反义寡核苷酸对脊髓损伤模型小鼠的糖链量的影响的图表。
图12为表示反义寡核苷酸对脊髓损伤模型大鼠的后肢运动功能的影响的图表。
图13为表示反义寡核苷酸对脊髓损伤模型小鼠的后肢运动功能的影响的图表。
具体实施方式
下面，详细地说明本发明。
(反义寡核苷酸)
本发明涉及反义寡核苷酸。更具体而言，本发明涉及阻碍硫酸软骨素生物合成的反义寡核苷酸，特别是抑制硫酸软骨素N-乙酰氨基半乳糖转移酶-1(CSGalNAcT1)基因及硫酸软骨素N-乙酰氨基半乳糖转移酶-2(CSGalNAcT2)基因中的一方或双方的表达的反义寡核苷酸。
在本说明书中，CSGalNAcT1基因及CSGalNAcT2基因是指编码具有把N-乙酰基半乳糖胺(GalNAc)从UDP-GalNAc转移至葡萄糖醛酸的非还原末端这一活性的酶的基因。比脊椎动物门更原始的动物(观察到中枢神经再生的动物)中不存在CSGalNAcT1基因及CSGalNAcT2基因，CSGalNAcT1基因及CSGalNAcT2基因是在能够受到中枢神经损伤的脊椎动物门中最先出现的基因。一般认为，CSGalNAcT2基因是CSGalNAcT1基因的种内同源物。CSGalNAcT1基因及CSGalNAcT2基因的来源没有特别限制，例如哺乳动物，例如灵长类(例如，长尾猕猴、黑猩猩及人)及非灵长类(例如，牛、猪、绵羊、马、猫、狗、豚鼠、大鼠及小鼠)，更优选人。被1个反义寡核苷酸用作标靶的CSGalNAcT1基因及CSGalNAcT2基因能够来源于同一生物种。CSGalNAcT1基因及CSGalNAcT2基因的碱基序列能够从美国国立生物技术信息中心(NCBI)数据库获得。人CSGalNAcT1 mRNA序列示于序列号164(其中，对RNA的序列示作DNA的序列)。人CSGalNAcT2 mRNA序列示于序列号165(其中，对RNA的序列示作DNA的序列)。小鼠CSGalNAcT1 mRNA序列示于序列号166(其中，对RNA的序列示作DNA的序列)。小鼠CSGalNAcT2 mRNA序列示于序列号167(其中，对RNA的序列示作DNA的序列)。大鼠CSGalNAcT1 mRNA序列示于序列号168(其中，对RNA的序列示作DNA的序列)。大鼠CSGalNAcT2 mRNA序列示于序列号169(其中，对RNA的序列示作DNA的序列)。在本发明中，只要被翻译的蛋白质具有相同的活性，则编码上述序列的变体的基因也属于CSGalNAcT1基因及CSGalNAcT2基因的范围内。
在本说明书中，“反义核酸”或“反义寡核苷酸”是指单链寡核苷酸，该单链寡核苷酸包含能够杂交至靶基因CSGalNAcT1及CSGalNAcT2的一方或双方的mRNA的一部分的(即互补的)核酸碱基序列。在本发明中，反义核酸或反义寡核苷酸形成靶RNA及DNA-RNA杂交体，并通过利用RNase H切割而分解靶RNA，从而能够抑制靶基因的表达，这一点理论上不受约束。能够供反义寡核苷酸杂交的靶基因的mRNA的区域能够包含3'UTR、5'UTR、外显子、内含子、编码区、翻译起始区、翻译终止区或其它核酸区。
在一种实施方式中，反义寡核苷酸能够抑制CSGalNAcT1基因的表达。在另一种实施方式中，反义寡核苷酸能够抑制CSGalNAcT2基因的表达。在再一种实施方式中，反义寡核苷酸能够抑制CSGalNAcT1基因及CSGalNAcT2基因的双方的表达。若抑制CSGalNAcT1基因及CSGalNAcT2基因的双方的表达，则能够有效地阻碍硫酸软骨素生物合成，故优选。
在本说明书中，与基因的表达相关的“抑制”是指降低因基因的转录而产生的mRNA的量(存在量)。所谓抑制包含：与对照相比抑制20％以上、30％以上或者40％以上、优选50％以上、更优选80％以上、90％以上或95％以上mRNA量。基因表达的抑制可以通过本技术领域中公知的任意方法来确定，特别是能够使用人或小鼠细胞等细胞通过基于实时PCR等PCR的方法来确定。
本发明中的反义寡核苷酸能够降低硫酸软骨素量。例如，如后述的实施例所记载那样，硫酸软骨素量的降低能够通过利用抗硫酸软骨素抗体的细胞内ELISA测定法来确定。与对照相比，本发明中的反义寡核苷酸能够降低硫酸软骨素量10％以上、20％以上、30％以上、40％以上或50％以上。
在一种优选实施方式中，本发明中的反义寡核苷酸不会降低硫酸乙酰肝素量。有报告指出，硫酸乙酰肝素会促进神经轴突再生(Takeuchi,K.,et al.,2013、上述)。例如，如后述的实施例所记载那样，硫酸乙酰肝素能够通过利用抗硫酸乙酰肝素抗体的细胞内ELISA测定法来确定。本发明中的反义寡核苷酸也可以较对照而增加(例如，增加10％以上)硫酸乙酰肝素量。
在一种实施方式中，反义寡核苷酸可以包含后述实施例1的表1A～1G(序列号1～163)的任意一个表中所示的核酸碱基序列。
在本说明书中，“核酸碱基”或“碱基”为核酸的碱基成分，它是指能够与其它核酸的碱基配对的杂环部分。在本说明书中，“核酸碱基序列”表示未把构成核酸的糖、核苷间连接键或核酸碱基修饰考虑在内的连续的核酸碱基的序列。
在一种实施方式中，反义寡核苷酸的核酸碱基序列可以选自由序列号1～163构成的组。
在一种优选实施方式中，核酸碱基序列可以选自由后述的表1A的序列号1～3及5～48；表1B的序列号49～58；表1C的序列号59～107；表1D的序列号108～111、115、116、119～123、及125；以及表1E的序列号131～137、139～145、148～151、153及154构成的组。在后述的实施例2(表2A～2E)中显示出：由这些核酸碱基序列构成的反义寡核苷酸抑制CSGalNAcT1基因及CSGalNAcT2基因中的一方或双方的表达的20％以上。
在一种更优选实施方式中，核酸碱基序列可以选自由表1A的序列号1～3、5～30、32、33、及35～48；表1B的序列号49～58；表1C的序列号59～79、81～91及93～107；表1D的序列号108、111、115、121、122、及125；以及表1E的序列号131～134、136、137、139～145、148、149及154构成的组。在实施例2(表2A～2E)中显示出：由这些核酸碱基序列构成的反义寡核苷酸抑制CSGalNAcT1基因及CSGalNAcT2基因中的一方或双方的表达的50％以上。
在更进一步优选实施方式中，核酸碱基序列可以选自由表1A的序列号1～3、5～7、9～30、32、及35～48；表1B的序列号49～58；表1C的序列号59、60、62～65、67～79、82～91、及94～107；表1D的序列号108、111、115、121及122；以及表1E的序列号131～134、136、137、140～142、144、145、149及154构成的组。在实施例2(表2A～2E)中显示出：由这些核酸碱基序列构成的反义寡核苷酸抑制CSGalNAcT1基因及CSGalNAcT2基因中的一方或双方的表达的70％以上。
在更进一步优选实施方式中，核酸碱基序列可以选自由表1A的序列号1、9、16、18、21～30、35、37、39及40；表1B的序列号49～52、54、55、57及58；表1C的序列号59、62、63、67、88、89、102及107；以及表1E的序列号144构成的组。在实施例2(表2A～2E)中显示出：由这些核酸碱基序列构成的反义寡核苷酸抑制CSGalNAcT1基因及CSGalNAcT2基因的双方的表达的70％以上。
在另一种实施方式中，核酸碱基序列可以选自表1A的序列号18及35；表1B的序列号52及57；表1C的序列号88；表1D的序列号108、113、及115；表1E的序列号134、140、141、142及154；表1E的序列号155及156；以及表1G的序列号161及162。在实施例3～7(图2～7)等中显示出：由这些核酸碱基序列构成的反义寡核苷酸大幅度抑制CSGalNAcT1基因及CSGalNAcT2基因中的一方或双方的表达及/或降低硫酸软骨素量等。更具体而言，核酸碱基序列还可以为序列号52或155。在实施例13及14中显示出：由序列号52或155所示的核酸碱基序列构成的反义寡核苷酸促进脊髓损伤的运动功能恢复。
在一种实施方式中，反义寡核苷酸可以包含上述的核酸碱基序列的11～15个连续的核酸碱基序列。连续的核酸碱基序列可以为11个以上、12个以上、13个以上、14个以上或15个。反义寡核苷酸还可以由上述的核酸碱基序列的11～15个连续的核酸碱基序列构成。
在另一种实施方式中，反义寡核苷酸可以包含上述的核酸碱基序列的11～15个连续的核酸碱基序列中取代、缺失或者插入(特别是取代)1个或者2个核酸碱基而成的核酸碱基序列。
在本发明中，反义寡核苷酸的核酸碱基序列可以相对于CSGalNAcT1 mRNA的一部分没有错配或具有1个～4个(或1个～3个或者1个～2个)错配。在本发明中，反义寡核苷酸的核酸碱基序列可以相对于CSGalNAcT2 mRNA的一部分没有错配或具有1个～4个(或1个～3个或者1个～2个)错配。mRNA的“一部分”是指能够供反义寡核苷酸通过碱基配对而杂交的mRNA中的靶区域，该靶区域能够具有与反义寡核苷酸相同的碱基长度。“错配”是指第一核酸的核酸碱基不能与第二核酸的相应核酸碱基进行碱基配对(不互补)。
在优选实施方式中，反义寡核苷酸的核酸碱基序列相对于CSGalNAcT1 mRNA的一部分没有错配或具有1个～4个(或1个～3个或者1个～2个)错配，且相对于CSGalNAcT2mRNA的一部分没有错配或具有1个～4个(或1个～3个或者1个～2个)错配。这样的核酸碱基序列能够通过在CSGalNAcT1 mRNA和CSGalNAcT2 mRNA之间选择同源性较高的区域而设计。序列同源性能够使用例如BLAST分析等本技术领域中公知的算法来进行分析(例如，参见Altschul,S.F.,et al.,Basic local alignment search tool.1990,J.Mol.Biol.215:403-410)。
反义寡核苷酸的核酸碱基序列也可以相对于CSGalNAcT1 mRNA的一部分没有错配，且相对于CSGalNAcT2 mRNA的一部分具有1个～4个(或1个～3个或者1个～2个)错配。这样的核酸碱基序列的例子示于后述的实施例1的表1A。
反义寡核苷酸的核酸碱基序列也可以相对于CSGalNAcT1 mRNA的一部分具有1个～4个(或1个～3个或者1个～2个)错配，且相对于CSGalNAcT2 mRNA的一部分没有错配。这样的核酸碱基序列的例子示于后述的实施例1的表1C。
在进一步优选实施方式中，反义寡核苷酸的核酸碱基序列相对于CSGalNAcT1mRNA的一部分没有错配，且相对于CSGalNAcT2 mRNA的一部分没有错配。后述的实施例1的表1B示出了相对于人CSGalNAcT1 mRNA的一部分没有错配，且相对于人CSGalNAcT2 mRNA的一部分没有错配的核酸碱基序列。在实施例2(图1及表2B)中显示出：具有这些核酸碱基序列的反义寡核苷酸大幅度抑制CSGalNAcT1基因及CSGalNAcT2基因的双方的表达。
在一种实施方式中，包含后述的实施例1的表1A(序列号1～48)、表1B(序列号49～58)及表1D(序列号108～130)的任意一个中所示的核酸碱基序列的11～15个连续的核酸碱基序列或在上述核酸碱基序列中1个或者2个核酸碱基被取代、缺失或者插入而得到的核酸碱基序列的反义寡核苷酸可以相对于人CSGalNAcT1 mRNA(序列号164)的一部分没有错配或具有1个～4个(或1个～3个或者1个～2个)错配。
在另一种实施方式中，包含后述的实施例的表1B(序列号49～58)、表1C(序列号59～107)及表1E(序列号131～154)的任意一个中所示的核酸碱基序列的11～15个连续的核酸碱基序列或在上述核酸碱基序列中1个或者2个核酸碱基被取代、缺失或者插入而得到的核酸碱基序列的反义寡核苷酸可以相对于人CSGalNAcT2 mRNA(序列号165)的一部分没有错配或具有1个～4个(或1个～3个或者1个～2个)错配。
在一种实施方式中，包含选自后述的实施例的表1G的序列号159～162的核酸碱基序列的11～15个连续的核酸碱基序列或在上述核酸碱基序列中1个或者2个核酸碱基被取代、缺失或者插入而得到的核酸碱基序列的反义寡核苷酸可以相对于小鼠CSGalNAcT1mRNA(序列号166)或人CSGalNAcT1 mRNA(序列号164)的一部分没有错配或具有1个～4个(或1个～3个或者1个～2个)错配。
在另一种实施方式中，包含后述的实施例的表1G的序列号163所示的核酸碱基序列的11～15个连续的核酸碱基序列或在上述核酸碱基序列中1个或者2个核酸碱基被取代、缺失或者插入而得到的核酸碱基序列的反义寡核苷酸可以相对于小鼠CSGalNAcT2 mRNA(序列号167)或人CSGalNAcT2 mRNA(序列号165)的一部分没有错配或具有1个～4个(或1个～3个或者1个～2个)错配。
本发明的反义寡核苷酸可以为11～20碱基长度、12～19碱基长度、13～18碱基长度、14～17碱基长度或14～16碱基长度。
在本发明中，反义寡核苷酸能够包括天然(非修饰)核苷酸(脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸或者两者)及/或非天然(修饰)核苷酸。
通常，“核苷”为糖及核酸碱基的组合。“核苷酸”进一步包含共价键和于核苷的糖部分的磷酸基。通常，磷酸基形成寡核苷酸的核苷间连接键。寡核苷酸通过彼此相邻的核苷的共价键而形成，它形成线性聚合物寡核苷酸。
在本说明书中，“修饰核苷”表示独立地具有修饰糖及/或修饰核酸碱基的核苷。“修饰核苷酸”表示独立地具有修饰核苷间连接键、修饰糖及/或修饰核酸碱基的核苷酸。包含修饰核苷酸的寡核苷酸因对靶核酸的亲和性强化及核酸酶抗性增加等所需的特性而较非修饰型更为优选。
在本说明书中，“修饰核苷间连接键”是指与天然存在的核苷间连接键(即，磷酸二酯键)相比具有取代或一些变化的核苷间连接键。作为修饰核苷间连接键，没有限制，可列举：硫代磷酸酯键、二硫代磷酸酯键、二氨基磷酸酯键及氨基磷酸酯键等。硫代磷酸酯键是指磷酸二酯键的非交联氧原子取代为硫原子的核苷间连接键。修饰核苷间连接键优选为核酸酶抗性较天然存在的核苷间连接键更高的键。
在本说明书中，“修饰核酸碱基”是指除腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、胸腺嘧啶或尿嘧啶以外的任意的核酸碱基。“非修饰核酸碱基”或“天然核酸碱基”是指作为嘌呤碱基的腺嘌呤(A)及鸟嘌呤(G)以及作为嘧啶碱基的胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)及尿嘧啶(U)。作为修饰核酸碱基的例子，可列举：5-甲基胞嘧啶、5-氟胞嘧啶、5-溴胞嘧啶或者5-碘胞嘧啶；5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-碘尿嘧啶或者5-羟基尿嘧啶；2-硫代胸腺嘧啶；N6-甲基腺嘌呤或者8-溴腺嘌呤；以及N2-甲基鸟嘌呤或者8-溴鸟嘌呤等，但不限制于这些。
在本说明书中，“修饰糖”是指与天然糖部分(即，在DNA(2'-H)或RNA(2'-OH)中可见的糖部分)相比具有取代或一些变化的糖。修饰糖能够付与寡核苷酸对于靶核酸的亲和性强化及对核酸酶抗性的增加等性质。作为修饰糖的例子，例如，可列举：双环糖、5'-乙烯基、5'-甲基、4'-S、2'-F、2'-OCH3(2'-甲氧基或者2'-O-甲基)、及2'-O(CH2)2OCH3取代基等。
在本说明书中，“双环糖”是指具有两个环的糖。包含双环糖部分的核酸通常被称为交联核酸(bridged nucleic acid、BNA)。双环糖可以为2'位的碳原子及4'位的碳原子通过两个以上原子交联而成的糖。作为双环糖的例子，没有限制，可列举：具有亚甲基氧基(4'-CH2-O-2')交联的糖(LNA(商标)、也称为2',4'-BNA)、具有亚乙基氧基(4'-(CH2)2-O-2')交联的糖(也称为ENA)、具有4'-CH(CH3)-O-2'交联的糖(cEt、constrained ethyl(受了约束的乙基))、具有4'-CH(CH2OCH3)-O-2'交联的糖(cMOE、constrained MOE(受了约束的MOE))、具有酰胺交联的糖(AmNA、Amido-bridged nucleic acid(具有酰胺交联的核酸))等。作为具有酰胺交联的糖的一例，可列举具有4'-C(O)-N(CH3)-2'交联的糖。关于具有酰胺交联的糖的构造及制备方法，例如，参见Yahara,A.,et al.,Amido-bridged nucleicacids(AmNAs):synthesis,duplex stability,nuclease resistance,and in vitroantisense potency,ChemBioChem,2012,13(7):2513-2516，Yamamoto,T.,et al.,Amido-bridged nucleic acids with small hydrophobic residues enhance hepatic tropismof antisense oligonucleotides in vivo,Org.Biomol.Chem.,2015,13:3757-3765及国际公开第WO2011/052436号。关于具有4'-CH(CH3)-O-2'交联的糖(cEt)及具有4'-CH(CH2OCH3)-O-2'交联的糖(cMOE)，参见Punit,P.S.,et al.,Short antisenseoligonucleotides with novel 2'-4'conformationaly restricted nucleosideanalogues show improved potency without increased toxicity in animals,J.Med.Chem.,2009,52(1):10-13。
在本发明中，反义寡核苷酸可以包含肽核酸、吗啉代核酸等核苷酸模拟物。
通常，同一链中的不同核苷酸能够独立地接受不同的修饰。另外，例如为了增强核酸酶抗性，同一核苷酸能够具有修饰核苷间连接键(例如，硫代磷酸酯键)，并进一步具有修饰糖(例如，双环糖)。同一核苷酸还能够具有修饰核酸碱基(例如，5-甲基胞嘧啶)，并进一步具有修饰糖(例如，双环糖)。
在一种实施方式中，反义寡核苷酸可以包含至少1个修饰核苷酸。修饰核苷酸能够包含修饰核苷间连接键、修饰糖部分及/或修饰核酸碱基。
在一种实施方式中，反义寡核苷酸的核苷间连接键的至少1个可能为修饰核苷间连接键。反义寡核苷酸的核苷间连接键的至少70％、至少80％、至少90％或100％可以为修饰核苷间连接键。修饰核苷间连接键可以为硫代磷酸酯键。
在一种实施方式中，反义寡核苷酸的糖部分的至少1个可以为双环糖。双环糖可以具有亚甲基氧基(4'-CH2-O-2')交联或酰胺交联(例如4'-C(O)-N(CH3)-2'交联)。
在一种实施方式中，反义寡核苷酸的核酸碱基的至少1个可以为修饰核酸碱基。修饰核酸碱基可以为5-甲基胞嘧啶。
在特定的实施方式中，反义寡核苷酸可以为缺口聚体(gapmer)。在本说明书中，“缺口聚体”是指由包含至少4个连续脱氧核糖核苷的中心区(DNA缺口区)、包含配置于其5'端侧及3'端侧的非天然核苷的区域(5'侧翼区及3'侧翼区)构成的寡核苷酸。DNA缺口区的长度可以为4～16碱基长度、5～14碱基长度、6～12碱基长度或8～10碱基长度。5'侧翼区及3'侧翼区的长度可以独立地为1～6碱基长度、1～5碱基长度或2～4碱基长度。5'侧翼区及3'侧翼区包含至少1个非天然核苷即可，也可以包含天然核苷。5'侧翼区及3'侧翼区可以分别包含一种或多种非天然核苷。5'侧翼区及3'侧翼区的全部核苷可以为非天然核苷。或者，缺口聚体的5'端及3'端的一方或双方(特别是3'端)的核苷可以为天然核苷(特别是脱氧核糖核苷)。5'侧翼区及3'侧翼区所含的非天然核苷可以为具有双环糖的核苷。双环糖能够为具有亚甲基氧基(4'-CH2-O-2')交联的糖或具有酰胺交联(例如4'-C(O)-N(CH3)-2'交联)的糖。5'侧翼区及3'侧翼区所含的非天然核苷可以包含修饰核酸碱基(例如，5-甲基胞嘧啶)。
本发明的反义寡核苷酸能够通过本技术领域公知的方法来制造。例如，反义寡核苷酸能够通过使用市售的自动核酸合成装置合成，然后，使用反相柱等进行精制而制造。或者，反义寡核苷酸也能够指定核酸碱基序列以及修饰部位及种类并向制造商(例如，基因设计株式会社(GeneDesign Inc.))订购而获得。
本发明的反义寡核苷酸能够通过抑制CSGalNAcT1基因及CSGalNAcT2基因中的一方或双方的表达来阻碍软骨素生物合成，从而降低硫酸软骨素量。脊髓损伤后硫酸软骨素增加会阻碍神经轴突再生，进而妨碍脊髓损伤的恢复。能够通过利用本发明的反义寡核苷酸降低硫酸软骨素量来治疗脊髓损伤(促进脊髓损伤的恢复)。另一方面，有报告指出，硫酸乙酰肝素会促進神经轴突再生(Takeuchi,K.,et al.,2013、上述)。本发明的反义寡核苷酸能够降低硫酸软骨素量而不会降低硫酸乙酰肝素量，因此，能够有效地治疗脊髓损伤。
(药物组合物)
本发明提供包含本发明的一种实施方式中的反义寡核苷酸的药物组合物。药物组合物能够用于治疗与硫酸软骨素的增加相关的疾病或病症。
作为与硫酸软骨素的增加相关的疾病或病症，没有限制，可列举：脊髓损伤、脑血管疾病(例如，脑损伤及脑缺血)、消化系统疾病(例如，炎性大肠炎)以及皮肤损伤或者炎症。
在本说明书中，脊髓损伤是指脊髄受到损伤的临床状态。脊髓损伤的原因没有限制。脊髓损伤可以为外伤性的脊髓损伤。脊髓损伤包括完全脊髓损伤及不完全脊髓损伤。完全脊髓损伤是指脊髄以横断方式断开的病症。不完全脊髓损伤是指脊髄的一部分损伤的病症。因脊髓损伤会产生运动功能障碍、感觉障碍、自主神经障碍等各种障碍。
在本说明书中，“治疗”能够包含：在具有脊髓损伤的实验者中，减轻或者治愈因脊髓损伤而产生的症状(例如运动功能障碍)。
通常认为，脊髓损伤后作为组织修复的结果而产生的瘢痕会阻碍神经的再生。因此，能够通过抑制瘢痕的形成来促进脊髓损伤的恢复。本发明中的药物组合物也可以用于抑制或降低脊髓损伤后的瘢痕形成。
药物组合物可以进一步包含制剂领域常用的任意的制剂辅助剂。在本说明书中，作为制剂辅助剂，能够使用药学上可接受的各种载体或添加剂，例如，载体(固体或液体载体)、赋形剂、稳定剂、崩解剂、表面活性剂、结合剂、润滑剂、乳化剂、悬浮剂、抗氧化剂、矫气味剂、填充剂、溶解辅助剂、涂布剂、着色剂、矫味剂、保存剂、缓冲剂等。具体而言，作为制剂辅助剂，可列举：水、生理盐水、其它水性溶剂、药学上可接受的有机溶剂、甘露醇、乳糖、淀粉、微晶纤维素、葡萄糖、钙、聚乙烯基醇、胶原蛋白、聚乙烯基吡咯烷酮、羧基乙烯基聚合物、海藻酸钠、水溶性葡聚糖、水溶性糊精、羧甲基淀粉钠、果胶、阿拉伯胶、黄原胶、酪蛋白、明胶、琼脂、丙二醇、聚乙二醇、凡士林、石蜡、甘油、硬脂醇、硬脂酸、山梨糖醇等。制剂辅助剂能够根据制剂的剂形适当地选择或组合后选择。
药物组合物能够口服或非口服给药实验者。作为非口服给药，没有限制，可列举髄腔内给药及局部给药等。为了有效地获得治疗效果，药物组合物优选直接向损伤部局部给药。另外，也能够使用连续输液泵，向损伤部持续给药药物组合物。另外，也可以使药物组合物保持于海绵并留置于损伤部。药物组合物可以采用注射剂、点滴剂等制剂。本领域技术人员能够通过惯用的方法来制造这些制剂。
药物组合物可以以治疗有效量来给药。药物组合物的具体给药量根据每个实验者，基于疾病的严重程度、全身的健康状态、年龄、性别、体重及对治疗的耐受性等，通过例如医师的判断来确定。例如，药物组合物可以按照反义寡核苷酸达到0.000001mg/体重kg/日～1000mg/体重kg/日、或0.001mg/体重kg/日～1mg/体重kg/日、或0.005mg/体重kg/日～0.5mg/体重kg/日或0.01mg/体重kg/日～0.1mg/体重kg/日的量来给药。药物组合物能够单次给药或多次给药，例如，按照规定时间间隔，例如，1天、2天、3天、4天、5天、6天、1周、2周、3周、1个月等间隔，对实验者给药数次或数十次。或者，药物组合物也可以如上所述那样使用连续输液泵持续给药。持续给药时的给药量(速度)、周期等能够由本领域技术人员适当设置。
给药药物组合物的实验者为哺乳动物，例如灵长类(例如，长尾猕猴、黑猩猩及人)及非灵长类(例如，牛、猪、绵羊、马、猫、狗、豚鼠、大鼠及小鼠)，更优选为人。实验者可以为具有脊髓损伤的实验者。
本发明还提供一种与硫酸软骨素的增加相关的疾病或病症的治疗方法，该方法包括向所需实验者给药本发明的一种实施方式中的反义寡核苷酸或药物组合物。
本发明还提供本发明的一种实施方式中的反义寡核苷酸在制造用于治疗与硫酸软骨素的增加相关的疾病或病症的药物中的使用。
下面，使用实施例对本发明进行更具体地说明。其中，本发明的技术范围不限制于这些实施例。
[实施例1]
(反义寡核苷酸的设计及合成)
设计能够抑制CSGalNAcT1基因及CSGalNAcT2基因的双方的表达的反义寡核苷酸。通过BLAST分析选定在人CSGalNAcT1 mRNA(序列号164)和人CSGalNAcT2 mRNA(序列号165)之间同源性较高的区域。接着，在该区域内，利用mfold程序(M.Zuker,Mfold web serverfor nucleic acid folding and hybridization prediction.Nucleic Acids Res.31(13),3406-15,(2003))预测高级结构或除去毒性表达序列，从而设计107种的核酸碱基序列(表1A、1B及1C)。表1A中所示的序列为相对于人CSGalNAcT1 mRNA的一部分没有错配(完全互补)且相对于人CSGalNAcT2 mRNA的一部分具有1～4个错配的序列。表1B中所示的序列为相对于人CSGalNAcT1 mRNA的一部分没有错配且相对于人CSGalNAcT2 mRNA的一部分没有错配的序列。表1C中所示的序列为相对于人CSGalNAcT1 mRNA的一部分具有1～4个错配且相对于人CSGalNAcT2 mRNA的一部分没有错配的序列。
接着，不考虑CSGalNAcT1 mRNA和CSGalNAcT2 mRNA的同源性，设计能够抑制CSGalNAcT1基因及CSGalNAcT2基因中的一方的表达的反义寡核苷酸(表1D及1E)。表1D中所示的序列为相对于人CSGalNAcT1 mRNA的一部分没有错配的序列。表1E中所示的序列为相对于人CSGalNAcT2 mRNA的一部分没有错配的序列。
合成表1A～1E中所示的反义寡核苷酸。反义寡核苷酸的合成从基因设计株式会社(GeneDesign Inc.)订购来进行。表1A～1E中所示的反义寡核苷酸采用15碱基长度的缺口聚体，该缺口聚体由下述构成：由3个LNA核苷构成的5'侧翼区、由9个脱氧核糖核苷构成的DNA缺口区以及由2个LNA核苷和3'端的1个脱氧核糖核苷构成的3'侧翼区。LNA核苷为具备具有亚甲基氧基(4'-CH2-O-2')交联的糖的核苷。表1A～1E中所示的反义寡核苷酸的全部核苷间连接键采用硫代磷酸酯键。表1A～1E中所示的反义寡核苷酸的LNA核苷中的胞嘧啶采用5-甲基胞嘧啶。
【表1A】
表1A：具有相对于人CSGalNAcT1 mRNA的一部分没有错配、且相对于人CSGalNAcT2mRNA的一部分具有1～4个错配的核酸碱基序列的反义寡核苷酸
名称 核酸碱基序列(5’→3’) 序列号 错配数量
hT1-1475-LNA(15) TCTGTGGCCAGCTTG 1 4
hT1-1483-LNA(15) CTGCATTACTCTGTGG 2 4
hT1-1509-LNA(15) TAGAGTAAAGCTATC 3 4
hT1-1547-LNA(15) TGGCGGGTAAGGCCA 4 4
hT1-1556-LNA(15) TCCTCGGGGTGGCGG 5 4
hT1-1593-LNA(15) CACCAACTCATCCCG 6 2
hT1-1595-LNA(15) TCCACCAACTCATCC 7 2
hT1-1596-LNA(15) TTCCACCAACTCATC 8 1
hT1-1597-LNA(15) CTTCCACCAACTCAT 9 1
hT1-1603-LNA(15) CAATGGCTTCCACCA 10 1
hT1-1613-LNA(15) AAGGCTGATTCAATG 11 4
hT1-1614-LNA(15) CAAGGCTGATTCAAT 12 3
hT1-1789-LNA(15) GGCCGAATGGTCGAA 13 4
hT1-1800-LNA(15) TTTCATGATGGGGCC 14 3
hT1-1801-LNA(15) CTTTCATGATGGGGC 15 3
hT1-1802-LNA(15) ACTTTCATGATGGGG 16 3
hT1-1803-LNA(15) CACTTTCATGATGGG 17 2
hT1-1804-LNA(15) TCACTTTCATGATTGG 18 2
hT1-1807-LNA(15) TTTTCACTTTCATGA 19 1
hT1-1865-LNA(15) CTTTTTGCTAGAGGC 20 4
hT1-1959-LNA(15) TTTCCCAAAGTAAAC 21 3
hT1-2125-LNA(15) CATCACAGAAAAAGA 22 1
hT1-2141-LNA(15) GTGAAGTAGATGTCC 23 4
hT1-2156-LNA(15) TTGAGGAATTCAGAT 24 3
hT1-2158-LNA(15) TATTGAGGAATTCAG 25 3
hT1-2210-LNA(15) AAAAGAACTGGATAA 26 4
hT1-2227-LNA(15) CAGGATTGTACTGAC 27 2
hT1-2228-LNA(15) CCAGGATTGTACTGA 28 3
hT1-2278-LNA(15) CCAGCTGCTGTTCCA 29 1
hT1-2279-LNA(15) ACCAGCTGCTGTTCC 30 1
hT1-2320-LNA(15) CAAATCCAAAGTCTC 31 2
hT1-2321-LNA(15) CCAAATCCAAAGTCT 32 2
hT1-2323-LNA(15) TCCCAAATCCAAAGT 33 3
hT1-2324-LNA(15) ATCCCAAATCCAAAG 34 3
hT1-2327-LNA(15) GTCATCCCAAATCCA 35 2
hT1-2331-LNA(15) ACACGTCATCCCAAA 36 2
hT1-2332-LNA(15) GACACGTCATCCCAA 37 2
hT1-2337-LNA(15) ATACTGACACGTCAT 38 1
hT1-2338-LNA(15) GATACTGACACGTCA 39 1
hT1-2339-LNA(15) CGATACTGACACGTC 40 1
hT1-2341-LNA(15) ACCGATACTGACACG 41 2
hT1-2343-LNA(15) TGACCGATACTGACA 42 1
hT1-2344-LNA(15) CTGACCGATACTGAC 43 1
hT1-2345-LNA(15) TCTGACCGATACTGA 44 1
hT1-2386-LNA(15) AGCCTTTGATGTCCA 45 4
hT1-2446-LNA(15) GTACCACTATGAGGT 46 3
hT1-2450-LNA(15) GTCCGTACCACTATG 47 3
hT1-2549-LNA(15) TTCATGGCCTTGGAC 48 2
错配数量表示相对于人CSGalNAcT2 mRNA的错配数量。
【表1B】
表1B：具有相对于人CSGalNAcT1 mRNA的一部分没有错配、且相对于人CSGalNAcT2mRNA的一部分没有错配的核酸碱基序列的反义寡核苷酸
名称 核酸碱基序列(5’→3’) 序列号
hT1-2481-LNA(15) ATGCCAGAGGTGGAA 49
hT1-2482-LNA(15) CATGCCAGAGGTGGA 50
hT1-2483-LNA(15) TCATGCCAGAGGTGG 51
hT1-2514-LNA(15) CTCGGGGGTCAGCTC 52
hT1-2515-LNA(15) GCTCGGGGGTCAGCT 53
hT1-2516-LNA(15) TGCTCGGGGGTCAGC 54
hT1-2517-LNA(15) CTGCTCGGGGGTCAG 55
hT1-2518-LNA(15) ACTGCTCGGGGGTCA 56
hT1-2519-LNA(15) TACTGCTCGGGGGTC 57
hT1-2520-LNA(15) GTACTGCTCGGGGGT 58
【表1C】
表1C：具有相对于人CSGalNAcT1 mRNA的一部分具有1～4个错配、且相对于人CSGalNAcT2 mRNA的一部分没有错配的核酸碱基序列的反义寡核苷酸
名称 核酸碱基序列(5’→3’) 序列号 错配数量
hT2-787-LNA(15) TCACTGGGTAGTTTG 59 4
hT2-795-LNA(15) CCCCATACTCACTGG 60 4
hT2-821-LNA(15) TAAGGTAAAACTTTC 61 4
hT2-859-LNA(15) TGGCGAGTGAGACCC 62 4
hT2-868-LNA(15) TCTTCAGGATGGCGA 63 4
hT2-905-LNA(15) CACCAATTCATCTCG 64 2
hT2-907-LNA(15) TCCACCAATTCATCT 65 2
hT2-908-LNA(15) TTCCACCAATTCATC 66 1
hT2-909-LNA(15) CTTCCACCAATTCAT 67 1
hT2-915-LNA(15) CAATAACTTCCACCA 68 1
hT2-925-LNA(15) AAGCCCGCTTCAATA 69 4
hT2-926-LNA(15) CAAGCCCGCTTCAAT 70 2
hT2-1128-LNA(15) GTCCAAAAGGGCGGA 71 4
hT2-1139-LNA(15) TTTCATGAGAGGTCC 72 3
hT2-1140-LNA(15) CTTTCATGAGAGGTC 73 3
hT2-1141-LNA(15) ACTTTCATGAGAGGT 74 3
hT2-1142-LNA(15) CACTTTCATGAGAGG 75 2
hT2-1143-LNA(15) TCACTTTCATGAGAG 76 2
hT2-1146-LNA(15) TCTTCACTTTCATGA 77 1
hT2-1204-LNA(15) CTTTCAGCAAGTGGC 78 4
hT2-1298-LNA(15) TTTACCAAAATACAC 79 3
hT2-1464-LNA(15) CATCACAGAAAAACA 80 1
hT2-1465-LNA(15) ACATCACAGAAAAAC 81 1
hT2-1480-LNA(15) GAGAAATAGATATCA 82 4
hT2-1495-LNA(15) TTAAGGAATTCGGCT 83 3
hT2-1497-LNA(15) TGTTAAGGAATTCGG 84 3
hT2-1549-LNA(15) AACACCACAGGGTAA 85 4
hT2-1566-LNA(15) CAGGATTGTAAAGAC 86 2
hT2-1567-LNA(15) GCAGGATTGTAAAGA 87 3
hT2-1617-LNA(15) CCAGCTGCTGCTCCA 88 1
hT2-1618-LNA(15) ACCAGCTGCTGCTCC 89 1
hT2-1659-LNA(15) CAAAGCCAAAATCTC 90 2
hT2-1660-LNA(15) CCAAAGCCAAAATCT 91 2
hT2-1662-LNA(15) TTCCAAAGCCAAAAT 92 3
hT2-1663-LNA(15) ATTCCAAAGCCAAAA 93 3
hT2-1666-LNA(15) GTCATTCCAAAGCCA 94 2
hT2-1670-LNA(15) ACAAGTCATTCCAAA 95 2
hT2-1671-LNA(15) GACAAGTCATTCCAA 96 2
hT2-1676-LNA(15) ATACTGACAAGICAT 97 1
hT2-1677-LNA(15) GATACTGACAAGTCA 98 1
hT2-1678-LNA(15) CGATACTGACAAGTC 99 1
hT2-1680-LNA(15) AACGATACTGACAAG 100 2
hT2-1682-LNA(15) TGAACGATACTGACA 101 1
hT2-1683-LNA(15) CTGAACGATACTGAC 102 1
hT2-1684-LNA(15) TCTGAACGATACTGA 103 1
hT2-1725-LNA(15) AACCTTTCACTTCCA 104 4
hT2-1785-LNA(15) GAATCACAATGAGGT 105 3
hT2-1789-LNA(15) GTCCGAATCACAATG 106 3
hT2-1888-LNA(15) TTCATGGCTTTAGAC 107 2
错配数量表示相对于人CSGalNAcT1 mRNA的错配数量。
【表1D】
表1D：具有相对于人CSGalNAcT1 mRNA的一部分没有错配的核酸碱基序列的反义寡核苷酸
名称 核酸碱基序列(5’→3’) 序列号 错配数量
hT1-1831-LNA(15) TGTTGGCCATGTTGA 108 8
hT1-1847-LNA(15) ATAACATTGATAAGC 109 5
hT1-1971-LNA(15) ATTTATTTCTTCTTT 110 5
hT1-1974-LNA(15) TTCATTTATTTCTTC 111 6
hT1-1806-LNA(15) TTTCACTTTCATGAT 112 2
hT1-2126-LNA(15) ACATCACAGAAAAAG 113 1
hT1-2390-LNA(15) CCCCAGCCTTTGATG 114 4
hT1-2479-LNA(15) GCCAGAGGTGGAAGA 115 1
hT1-3716-LNA(15) GGTTTATTTAAACAG 116 15
hT1-3717-LNA(15) TGGTTTATTTAAACA 117 15
hT1-3719-LNA(15) TTTGGTTTATTTAAA 118 15
hT1-3720-LNA(15) CTTTGGTTTATTTAA 119 15
hT1-3723-LNA(15) ATACTTTGGTTTATT 120 15
hT1-3745-LNA(15) GAGATTGTTTGGTTC 121 15
hT1-3748-LNA(15) AAAGAGATTGTTTGG 122 15
hT1-3751-LNA(15) TGAAAAGAGATTGTT 123 15
hT1-3754-LNA(15) TTTTGAAAAGAGATT 124 15
hT1-4197-LNA(15) TTTCATAAACTACCA 125 15
hT1-4200-LNA(15) AAATTTCATAAACTA 126 15
hT1-4203-LNA(15) ATTAAATTTCATAAA 127 15
hT1-4206-LNA(15) TTAATTAAATTTCAT 128 15
hT1-4210-LNA(15) TGTTTTAATTAAATT 129 15
hT1-4213-LNA(15) CTGTGTTTTAATTAA 130 15
错配数量表示相对于人CSGalNAcT2 mRNA的错配数量。
【表1E】
表1E：具有相对于人CSGalNAcT2 mRNA的一部分没有错配的核酸碱基序列的反义寡核苷酸
名称 核酸碱基序列(5’→3’) 序列号 错配数量
hT2-175-LNA(15) TGTTACCATGATATC 131 15
hT2-178-LNA(15) TATTGTTACCATGAT 132 15
hT2-222-TNA(15) AGTCATGACTACTTG 133 15
hT2-420-LNA(15) CAAGGCCCAACAGCA 134 15
hT2-524-LNA(15) TTTACCATAATTTTC 135 15
hT2-630-LNA(15) TCATTTCTTGTAATT 136 15
hT2-639-LNA(15) TCTTCTCACTCATTT 137 15
hT2-735-LNA(15) GAAGAAACTCTAAAA 138 15
hT2-813-LNA(15) AACTTTCAAAGGGAA 139 5
hT2-872-LNA(15) CTTTTCTTCAGGATG 140 4
hT2-891-LNA(15) GTTTGTCTTTTCTAA 141 4
hT2-941-LNA(15) ATTATTAATGACCTC 142 6
hT2-947-LNA(15) ATCAGGATTATTAAT 143 15
hT2-1004-LNA(15) ATTAAATATCAGTTT 144 15
hT2-1113-LNA(15) AGAGGGTCACATGTC 145 15
hT2-1183-LNA(15) ATATTAATAATTGAT 146 6
hT2-1188-LNA(15) CAATGATATTAATAA 147 4
hT2-1261-LNA(15) TCTTGATGAATACAA 148 5
hT2-1372-LNA(15) ACCAAGGTGTAATTG 149 6
hT2-1460-LNA(15) ACAGAAAAACATCAA 150 4
hT2-1561-LNA(15) TTGTAAAGACTGAAC 151 3
hT2-1750-LNA(15) TAAAGATGAACATCT 152 3
hT2-1814-LNA(15) GAGGTGGAAAAGACC 153 2
hT2-1893-LNA(15) CCTCATTCATGGCTT 154 2
错配数量表示相对于人CSGalNAcT1 mRNA的错配数量。
接下里，合成具有表1F中所示的AmNA核苷的反义寡核苷酸。hT2-1617-AmNA(15)、hT1-2519-AmNA(15)、hT1-1831-AmNA(15)及hT1-2514-AmNA(15)分别具有与表1A～1E中所示的hT2-1617-LNA(15)、hT1-2519-LNA(15)、hT1-1831-LNA(15)及hT1-2514-LNA(15)相同的核酸碱基序列。反义寡核苷酸的合成从基因设计株式会社(GeneDesign Inc.)来进行。表1F中所示的反义寡核苷酸采用15碱基长度的缺口聚体，该缺口聚体由下述构成：由3个AmNA核苷构成的5′侧翼区、由9个脱氧核糖核苷构成的DNA缺口区以及由2个AmNA核苷和3′端的1个脱氧核糖核苷构成的3′侧翼区。表1F中所示的反义寡核苷酸的全部核苷间连接键采用硫代磷酸酯键。表1F中所示的反义寡核苷酸的AmNA核苷中的胞嘧啶采用5-甲基胞嘧啶。AmNA核苷采用具备具有4′-C(O)-N(CH3)-2′交联的糖的修饰核苷。
【表1F】
表1F：具有AmNA核苷的反义核苷酸
名称 核酸碱基序列(5’→3’) 序列号
hT2-1617-AmNA(15) CCAGCTGCTGCTCCA 155
hT1-2519-AmNA(15) TACTGCTCGGGGGTC 156
hT1-1831-AmNA(15) TGTTGGCCATGTTGA 157
hT1-2514-AmNA(15) CTCGGGGGTCAGCTC 158
接下来，合成表1G中所示的以小鼠CSGalNAcT1基因或小鼠CSGalNAcT2基因为标靶的反义寡核苷酸。mT1-2120-LNA(15)、mT1-2151-LNA(15)、mT1-2156-LNA(15)及mT1-1915-LNA(15)具有相对小鼠CSGalNAcT1 mRNA(序列号166)没有错配的核酸碱基序列。mT2-1623-LNA(15)具有相对于小鼠CSGalNAcT2 mRNA(序列号167)没有错配的核酸碱基序列。mT1-2156-LNA(15)的核酸碱基序列(序列号161)为在hT1-2519-LNA(15)的核酸碱基序列(序列号57)中取代了1个核酸碱基的核酸碱基序列。mT1-1915-LNA(15)的核酸碱基序列(序列号162)为在hT1-2278-LNA(15)的核酸碱基序列(序列号29)中取代了2个核酸碱基的核酸碱基序列。反义寡核苷酸的合成从基因设计株式会社(GeneDesign Inc.)来进行。表1G中所示的反义寡核苷酸采用15碱基长度的缺口聚体，该缺口聚体由下述构成：由3个LNA核苷构成的5′侧翼区、由9个脱氧核糖核苷构成的DNA缺口区以及由2个LNA核苷和3′端的1个脱氧核糖核苷构成的3′侧翼区。表1G中所示的反义寡核苷酸的全部核苷间连接键采用硫代磷酸酯键。表1G中所示的反义寡核苷酸的LNA核苷中的胞嘧啶采用5-甲基胞嘧啶。
【表1G】
表1G：以小鼠CSGalNAcT1基因或小鼠CSGalNAcT2基因为标靶的反义寡核苷酸
名称 核酸碱基序列(5’→3’) 序列号
mT1-2120-LNA(15) TCATGCCACAGGTGG 159
mT1-2151-LNA(15) CTCAGGGGTCAGTTC 160
mT1-2156-LNA(15) TACTGCTCAGGGGTC 161
mT1-1915-LNA(15) CCAGCTGCTGTCCTA 162
mT2-1623-LNA(15) CCAGCTGCTGCTCCA 163
表1A～1G中所示的反义寡核苷酸的名称表示人(h)或小鼠(m)的CSGalNAcT1 mRNA(T1)或CSGalNAcT2 mRNA(T2)中的靶区域的位置及修饰核苷的种类以及碱基长度。例如，hT1-1475-LNA(15)表示以从人CSGalNAcT1 mRNA的1475位开始的区域为标靶，且包含LNA核苷，为15碱基长度。例如，hT2-1617-AmNA(15)表示以从人CSGalNAcT2 mRNA的1617位开始的区域为标靶，且包含AmNA核苷，为15碱基长度。
[实施例2]
(人YKG-1细胞中的反义寡核苷酸的表达抑制活性)
将数个实施例1中合成的反义寡核苷酸转染至人YKG-1细胞，并定量CSGalNAcT1mRNA及CSGalNAcT2 mRNA，由此调查反义寡核苷酸在人YKG-1细胞中的CSGalNAcT1及CSGalNAcT2基因表达抑制活性。
从国立研究开发法人医药基盘·健康·营养研究所JCRB细胞库中以细胞注册号JCRB0746获取人YKG-1细胞。如下进行细胞的解冻。向50mL离心管中添加9mL补充有10％血清(胎牛血清、biowest公司)及1％抗生素(青霉素-链霉素混合溶液(稳定)、NacalaiTesque株式会社)的DMEM培养基(DMEM(低葡萄糖)、Nacalai Tesque株式会社)。将37℃下溶解了80％的细胞添加到离心管中。使用冷却离心分离机(VERSATILE REFRIGERATEDCENTRIFUGE、株式会社Tomy Seiko(Tomy Seiko Co.,Ltd.))，以1000rpm在室温下离心分离细胞2分钟。吸除上清液，使细胞重悬浮在新的培养基中(补充有上述10％血清及1％抗生素的DMEM培养基)，将5～10×105个细胞接种于10cm培养皿(100mm/组织培养用培养皿、IWAKI公司)。在37℃、5％CO2环境下培养细胞。
如上所述那样解冻细胞后的第二天，吸除培养上清液，向细胞中添加10mL新的培养基(补充有10％血清及1％抗生素的DMEM培养基)，由此更换培养基。
如下进行细胞的传代培养。在达到半汇合时传代细胞。从10cm培养皿中吸除培养培养基，利用4mL PBS清洗细胞后，向细胞中添加2mL胰蛋白酶(0.25％胰蛋白酶/1mM-EDTA溶液、Nacalai Tesque株式会社)，在37℃、5％CO2的环境下静置3分钟。添加8mL新的培养基(补充有10％血清及1％抗生素的DMEM培养基)后，进行吹打，并将细胞转移至50mL离心管。以1000rpm在室温下离心分离细胞2分钟。吸除上清液，加入5～10mL新的培养基(补充有10％血清及1％抗生素的DMEM培养基)以重新悬浮细胞。计数细胞，并将2～7×105个细胞接种至新的10cm培养皿。在37℃、5％CO2环境下培养细胞。
如下接种用于转染反义寡核苷酸的细胞。从达到半汇合的细胞的10cm培养皿中吸除培养培养基，利用4mL PBS清洗细胞后，向细胞中添加2mL胰蛋白酶，并在37℃、5％CO2环境下静置3分钟。添加补充有10％FBS的DMEM培养基并吹打，将细胞转移至50mL离心管。以1000rpm在室温下离心分离2分钟后，吸除上清液，加入5～10mL补充有10％FBS的新的DMEM培养基，使细胞重新悬浮。计数细胞，向96孔板(Corning(注册商标)Costar(注册商标)、带有平底盖的96孔多孔板(低蒸发))中每孔接种12,500个(100μL中)细胞。在37℃、5％CO2环境下培养细胞24小时。
通过CEM法如下向细胞中转染反义寡核苷酸。向补充有10％FBS的DMEM培养基中添加900mM的氯化钙以达到100倍稀释，得到含氯化钙的培养基。向45μL得到的含氯化钙的培养基中混合5μL规定浓度的反义寡核苷酸，得到核酸溶液。作为反义寡核苷酸，使用实施例1中合成的反义寡核苷酸中的以下的表2A～2E(与表1A～1E中所示的反义寡核苷酸相对应)中所示的反义寡核苷酸。除去96孔板中的培养培养基，利用120μL PBS清洗细胞后，每孔添加50μL含氯化钙培养基。接下来，向孔中添加50μL核酸溶液(反义寡核苷酸的最终浓度为200nM)。在37℃、5％CO2环境下培养细胞24小时。作为对照，准备利用核酸NEG#L1转染后的细胞及未处理细胞。核酸NEG#L1具有5'-GAAAACTAAAATGAG-3'(序列号186)的核酸碱基序列。NEG#L1采用15碱基长度的缺口聚体，该缺口聚体由下述构成：由3个LNA核苷构成的5'侧翼区、由9个脱氧核糖核苷构成的DNA缺口区以及由2个LNA核苷和3'端的1个脱氧核糖核苷构成的3'侧翼区。NEG#L1的全部核苷间连接键采用硫代磷酸酯键。
如下由细胞制备cDNA。使用Super Prep(商标)用于qPCR的细胞溶解和逆转录试剂盒(东洋纺公司)从转染后的细胞中提取RNA并逆转录至cDNA。具体而言，培养细胞24小时后，除去96孔板的培养上清液，向细胞中添加120μL PBS之后，除去PBS。每孔添加24.85μL溶解溶液(Lysis Solution)及0.15μL gDNA除去剂(gDNA Remover)的混合液，静置5分钟(最初30秒进行搅拌)。5分后，在显微镜下确认细胞溶解，每孔添加4.75μL停止溶液(StopSolution)及0.25μL RNase抑制剂的混合液，静置2分钟(最初的30秒进行搅拌)。2分后，吹打细胞裂解物，将6μL细胞裂解物添加至加入有4μL 5×RT预混物及10μL无核酸酶水的混合液的PCR板(96孔PCR板(非裙边(Non-Skirted))、VIOLAMO公司)。在板上加盖(8联排PCR管盖(8strips PCR Tube Cap)(圆顶(Dome))、VIOLAMO公司)，以3200rpm在4℃下离心分离2分钟。将PCR板置于热循环仪(ABI Veriti(注册商标)孔热循环仪、Thermo FisherScientific公司)，进行逆转录反应(37℃下20分钟、50℃下5分钟、98℃下5分钟及4℃)。通过逆转录反应得到的cDNA及细胞板在-80℃储存。
使用cDNA，如下进行实时PCR(RT-PCR)。使10μL 2×预混物(ABI(商标)快速SYBR(商标)绿色预混物(Green Master Mix)、Thermo Fisher Scientific公司)、1μL引物组、2μL cDNA及7μL大冢蒸馏水(株式会社大冢制药工厂)(总量20μL)混合，分装于实时PCR96孔板(ABI,MicroAmp(注册商标)快速96孔反应板(0.1mL)、Thermo Fisher Scientific公司)。
使用下面的引物组。引物从Thermo Fisher Scientific公司获取。
对照引物组：50nM hGAPDH-F(5'-GAGTCAACGGATTTGGTCGT-3'、序列号170)及50nMhGAPDH-R(5'-GACAAGCTTCCCGTTCTCAG-3'、序列号171)
hCSGalNAcT1组1：100nM hT1-F1(5'-TCAGGGAGATGTGCATTGAG-3'、序列号172)及100nM hT1-R1(5'-AGTTGGCAGCTTTGGAAGTG-3'、序列号173)
hCSGalNAcT1组2：200nM hT1-F2(5'-GGAGACCCTGAACAGTCCTG-3'、序列号174)及200nM hT1-R2(5'-GCCGTTTGAATTCGTGTTTG-3'、序列号175)
hCSGalNAcT2组1：200nM hT2-F1(5'-GCCATTGTTTATGCCAACCA-3'、序列号176)及200nM hT2-R1(5'-ATCCACCAATGGTCAGGAAA-3'、序列号177)
hCSGalNAcT2组2：200nM hT2-F2(5'-TCCTAGAATCTGTCACCAGTGAG-3'、序列号178)及200nM hT2-R2(5'-ACATCAAGACCTCTCCCTTGTC-3'、序列号179)
引物的浓度表示在PCR反应液(20μL)中的浓度。
对照引物组为相对于人GAPDH(甘油醛-3-磷酸脱氢酶)基因(持家基因)的引物组。hCSGalNAcT1组1及hCSGalNAcT1组2为相对于人CSGalNAcT1基因的引物组。hCSGalNAcT2组1及hCSGalNAcT2组2为相对于人CSGalNAcT2基因的引物组。PCR反应液中使用下面引物组中任意一种：对照引物组(用于测定人GAPDH)；hCSGalNAcT1组1或者hCSGalNAcT1组2(用于测定人CSGalNAcT1)；或hCSGalNAcT2组1或者hCSGalNAcT2组2(用于测定人CSGalNAcT2)。
密封PCR板(ABI,MicroAmp(商标)透明胶膜(Optical Adhesive Film)、ThermoFisher Scientific公司)。以3200rpm在4℃下离心分离PCR板2分钟。将PCR板置于热循环仪(ABI StepOne Plus(商标)实时PCR系统、Thermo Fisher Scientific公司)，在95℃下30秒之后，在95℃、3秒及60℃、30秒45次循环的温度条件进行实时PCR。
人CSGalNAcT1 mRNA相对量及人CSGalNAcT1 mRNA相对量使用ΔΔCt法而算出。具体而言，从在转染有反义寡核苷酸的细胞中所测得的人CSGalNAcT1或人CSGalNAcT2的阈值循环(Ct)值中减去GAPDH的Ct值，从而算出ΔCt。再减去同样地算出的未处理细胞中的ΔCt从而算出ΔΔCt算出。通过2-ΔΔCt算出人CSGalNAcT1 mRNA及人CSGalNAcT2 mRNA相对量。针对各样品制备两份PCR反应液，并算出由每份PCR反应液算得的相对量的平均值及标准偏差。
结果示于图1及表2A～2E。图1为表2A～2E中所示的CSGalNAcT1 mRNA相对量及CSGalNAcT2 mRNA相对量的绘制图。另外，转染了对照核酸NEG#L1时的CSGalNAcT1 mRNA相对量及CSGalNAcT2 mRNA相对量分别为0.893及0.973。反义寡核苷酸的CSGalNAcT1及CSGalNAcT2基因表达抑制活性越高，CSGalNAcT1 mRNA相对量及CSGalNAcT2 mRNA相对量越小。
【表2A】
表2A：人CSGalNAcT1 mRNA相对量及人CSGalNAcT2 mRNA相对量
名称 T1 T2 序列号
hT1-1475-LNA(15) 0.008 0.099 1
hT1-1483-LNA(15) 0.029 1.144 2
hT1-1509-LNA(15) 0.027 1.022 3
hT1-1556-LNA(15) 0.018 2.842 5
hT1-1593-LNA(15) 0.049 1.198 6
hT1-1595-LNA(15) 0.143 0.718 7
hT1-1596-LNA(15) 0.385 1.109 8
hT1-1597-LNA(15) 0.004 0.111 9
hT1-1603-LNA(15) 0.009 1.217 10
hT1-1613-LNA(15) 0.000 1.347 11
hT1-1614-LNA(15) 0.019 1.562 12
hT1-1789-LNA(15) 0.073 0.942 13
hT1-1800-LNA(15) 0.002 1.209 14
hT1-1801-LNA(15) 0.008 0.840 15
hT1-1802-LNA(15) 0.015 0.294 16
hT1-1803-LNA(15) 0.036 0.803 17
hT1-1804-LNA(15) 0.011 0.170 18
hT1-1807-LNA(15) 0.042 0.305 19
hT1-1865-LNA(15) 0.005 0.333 20
hT1-1959-LNA(15) 0.062 0.166 21
hT1-2125-LNA(15) 0.234 0.157 22
hT1-2141-LNA(15) 0.006 0.198 23
hT1-2156-LNA(15) 0.032 0.127 24
hT1-2158-LNA(15) 0.123 0.161 25
hT1-2210-LNA(15) 0.245 0.191 26
hT1-2227-LNA(15) 0.009 0.174 27
hT1-2228-LNA(15) 0.001 0.222 28
hT1-2278-LNA(15) 0.232 0.095 29
hT1-2279-LNA(15) 0.242 0.168 30
hT1-2320-LNA(15) 0.634 1.322 31
hT1-2321-LNA(15) 0.221 1.115 32
hT1-2323-LNA(15) 0.456 1.119 33
hT1-2324-LNA(15) 0.578 1.289 34
hT1-2327-LNA(15) 0.053 0.090 35
hT1-2331-LNA(15) 0.105 0.914 36
hT1-2332-LNA(15) 0.068 0.290 37
hT1-2337-LNA(15) 0.181 0.506 38
hT1-2338-LNA(15) 0.291 0.275 39
hT1-2339-LNA(15) 0.109 0.197 40
hT1-2341-LNA(15) 0.147 0.865 41
hT1-2343-LNA(15) 0.118 0.709 42
hT1-2344-LNA(15) 0.110 0.370 43
hT1-2345-LNA(15) 0.075 0.439 44
hT1-2386-LNA(15) 0.036 0.827 45
hT1-2446-LNA(15) 0.076 0.698 46
hT1-2450-LNA(15) 0.016 1.054 47
hT1-2549-LNA(15) 0.043 0.358 48
【表2B】
表2B：人CSGalNAcT1 mRNA相对量及人CSGGalNAcT2 mRNA相对量
名称 T1 T2 序列号
hT1-2481-LNA(15) 0.100 0.069 49
hT1-2482-LNA(15) 0.046 0.051 50
hT1-2483-LNA(15) 0.027 0.031 51
hT1-2514-LNA(15) 0.027 0.119 52
hT1-2515-LNA(15) 0.215 0.391 53
hT1-2516-LNA(15) 0.120 0.227 54
hT1-2517-LNA(15) 0.249 0.180 55
hT1-2518-LNA(15) 0.226 0.624 56
hT1-2519-LNA(15) 0.100 0.112 57
hT1-2520-LNA(15) 0.069 0.043 58
【表2C】
表2C：人CSGalNAcT1 mRNA相对量及人CSGalNAcT2 mRNA相对量
名称 T1 T2 序列号
hT2-787-LNA(15) 0.123 0.010 59
hT2-795-LNA(15) 1.127 0.062 60
hT2-821-LNA(15) 1.204 0.498 61
hT2-859-LNA(15) 0.280 0.017 62
hT2-868-LNA(15) 0.079 0.024 63
hT2-905-LNA(15) 1.180 0.024 64
hT2-907-LNA(15) 0.847 0.139 65
hT2-908-LNA(15) 0.895 0.373 66
hT2-909-LNA(15) 0.258 0.041 67
hT2-915-LNA(15) 0.7448 0.106 68
hT2-925-LNA(15) 0.630 0.032 69
hT2-926-LNA(15) 0.714 0.035 70
hT2-1128-LNA(15) 0.851 0.049 71
hT2-1139-LNA(15) 1.137 0.007 72
hT2-1140-LNA(15) 1.117 0.014 73
hT2-1141-LNA(15) 0.721 0.011 74
hT2-1142-LNA(15) 1.140 0.021 75
hT2-1143-LNA(15) 0.941 0.186 76
hT2-1146-LNA(15) 1.306 0.188 77
hT2-1204-LNA(15) 0.512 0.003 78
hT2-1298-LNA(15) 0.865 0.221 79
hT2-1464-LNA(15) 0.769 0.819 80
hT2-1465-LNA(15) 0.310 0.797 81
hT2-1480-LNA(15) 1.135 0.125 82
hT2-1495-LNA(15) 1.066 0.008 83
hT2-1497-LNA(15) 1.913 0.012 84
hT2-1549-LNA(15) 1.113 0.048 85
hT2-1566-LNA(15) 0.769 0.062 86
hT2-1567-LNA(15) 0.704 0.114 87
hT2-1617-LNA(15) 0.017 0.175 88
hT2-1618-LNA(15) 0.074 0.221 89
hT2-1659-LNA(15) 0.428 0.156 90
hT2-1660-LNA(15) 0.523 0.159 91
hT2-1662-LNA(15) 0.681 0.535 92
hT2-1663-LNA(15) 0.762 0.470 93
hT2-1666-LNA(15) 1.413 0.030 94
hT2-1670-LNA(15) 1.233 0.147 95
hT2-1671-LNA(15) 1.538 0.058 96
hT2-1676-LNA(15) 1.171 0.240 97
hT2-1677-LNA(15) 1.255 0.092 98
hT2-1678-LNA(15) 0.857 0.088 99
hT2-1680-LNA(15) 0.718 0.161 100
hT2-1682-LNA(15) 1.369 0.053 101
hT2-1683-LNA(15) 0.289 0.063 102
hT2-1684-LNA(15) 1.056 0.147 103
hT2-1725-LNA(15) 1.092 0.119 104
hT2-1785-LNA(15) 1.109 0.119 105
hT2-1789-LNA(15) 0.788 0.118 106
hT2-1888-LNA(15) 0.057 0.060 107
【表2D】
表2D：人CSGalNAcT1 mRNA相对量及人CSGalNAcT2 mRNA相对量
名称 T1 T2 序列号
hT1-1831-LNA(15) 0.003 0.847 108
hT1-1847-LNA(15) 0.799 1.049 109
hT1-1971-LNA(15) 0.636 0.975 110
hT1-1974-LNA(15) 0.248 1.068 111
hT1-2479-LNA(15) 0.210 0.521 115
hT1-3716-LNA(15) 0.520 1.027 116
hT1-3720-LNA(15) 0.775 0.914 119
hT1-3723-LNA(15) 0.724 1.023 120
hT1-3745-LNA(15) 0.103 0.985 121
hT1-3748-LNA(15) 0.292 1.049 122
hT1-3751-LNA(15) 0.798 1.123 123
hT1-4197-LNA(15) 0.332 1.104 125
【表2E】
表2E：人CSGalNAcT1 mRNA相对量及人CSGalNAcT2 mRNA相对量
名称 T1 T2 序列号
hT2-175-LNA(15) 0.763 0.047 131
hT2-178-LNA(15) 0.881 0.044 132
hT2-222-LNA(15) 0.850 0.104 133
hT2-420-LNA(15) 1.073 0.178 134
hT2-524-LNA(15) 1.052 0.564 135
hT2-630-LNA(15) 0.318 0.288 136
hT2-639-LNA(15) 1.015 0.298 137
hT2-813-LNA(15) 0.910 0.302 139
hT2-872-LNA(15) 1.218 0.122 140
hT2-891-LNA(15) 1.140 0.140 141
hT2-941-LNA(15) 0.650 0.181 142
hT2-947-LNA(15) 0.742 0.461 143
hT2-1004-LNA(15) 0.112 0.163 144
hT2-1113-LNA(15) 0.757 0.047 145
hT2-1261-LNA(15) 0.822 0.496 148
hT2-1372-LNA(15) 0.759 0.191 149
hT2-1460-LNA(15) 0.504 0.535 150
hT2-1561-LNA(15) 0.969 0.672 151
hT2-1814-LNA(15) 0.935 0.746 153
hT2-1893-LNA(15) 0.400 0.281 154
显示出：实施例1中合成的反义寡核苷酸抑制人CSGalNAcT1基因及人CSGalNAcT2基因中的一方或双方的表达(表2A～2E)。特别是显示出：具有相对于人CSGalNAcT1 mRNA没有错配且相对于人CSGalNAcT2 mRNA没有错配的核酸碱基序列的反义寡核苷酸全部大幅度抑制人CSGalNAcT1基因和人CSGalNAcT2基因的双方的表达(图1的黑圆点及表2B)。
[实施例3]
(小鼠3T3N细胞中的反义寡核苷酸的浓度依赖性表达抑制活性)
以各种浓度下把数个实施例1中合成的反义寡核苷酸转染至小鼠3T3N细胞，定量CSGalNAcT1 mRNA及CSGalNAcT2 mRNA，由此调查反义寡核苷酸对小鼠3T3N细胞中的CSGalNAcT1及CSGalNAcT2基因的浓度依赖性表达抑制活性。
从国立研究开发法人医药基盘·健康·营养研究所JCRB细胞库中以细胞注册号JCRB0615获取小鼠3T3N细胞。如实施例2所记载那样，进行细胞的解冻及培养基的更换。
如下进行细胞的传代培养。在达到半汇合时传代细胞。从10cm培养皿中吸除培养培养基，利用4mL PBS清洗细胞后，向细胞中添加2mL0.125％胰蛋白酶(通过利用PBS将0.25％胰蛋白酶/1mM-EDTA溶液(Nacalai Tesque株式会社)稀释至2倍而制得)，在37℃、5％CO2环境下静置1分钟。添加8mL新的培养基(实施例2中记载的补充有10％血清及1％抗生素的DMEM培养基)后，进行吹打，将细胞转移至50mL离心管。以1000rpm在室温下离心分离细胞2分钟。吸除上清液，加入5～10mL新的培养基(补充有10％血清及1％抗生素的DMEM培养基)，使细胞重新悬浮。计数细胞，并将1～5×105个细胞接种至新的10cm培养皿。在37℃、5％CO2环境下培养细胞。
如下接种用于转染反义寡核苷酸的细胞。从达到半汇合的细胞的10cm培养皿中吸除培养培养基，利用4mL PBS清洗细胞后，向细胞中添加2mL 0.125％胰蛋白酶并在37℃、5％CO2环境下静置1分钟。添加补充有10％FBS的DMEM培养基并吹打，将细胞转移至50mL离心管。以1000rpm在室温下离心分离2分钟后，吸除上清液，加入5mL补充有10％FBS的新的DMEM培养基，使细胞重新悬浮。计数细胞，向96孔板(Corning(注册商标)Costar(注册商标)、带有平底盖的96孔多孔板(低蒸发))中每孔接种15,000个(100μL中)细胞。在37℃、5％CO2环境下培养细胞24小时。
通过并用CEM法及脂质转染法如下向细胞中转染反义寡核苷酸。向补充有10％FBS的DMEM培养基中添加900mM的氯化钙以达到100倍稀释，得到含氯化钙的培养基。向得到的含氯化钙的培养基添加脂质体(Lipofectamine(注册商标)3000转染试剂盒、ThermoFisher Scientific公司)以达到91倍稀释，得到脂质体溶液。向45μL得到的脂质体溶液中混合5μL规定浓度的反义寡核苷酸，得到核酸溶液。作为反义寡核苷酸，使用实施例1中合成的核酸中的hT1-2514-LNA(15)、hT2-1617-AmNA(15)、hT1-1831-LNA(15)、hT1-2126-LNA(15)、hT2-420-LNA(15)、hT2-872-LNA(15)及hT2-891-LNA(15)。除去96孔板中的培养培养基，利用120μL PBS清洗细胞后，每孔添加50μL含氯化钙的培养基。接下来，向孔中添加50μL核酸溶液(反义寡核苷酸的最终浓度为30、60、120或240nM)。在37℃、5％CO2环境下培养细胞24小时。作为对照，准备利用核酸NEG#L1转染后的细胞及未处理细胞。
接下来，如实施例2中记载那样，由细胞制备cDNA。
使用cDNA进行实时PCR(RT-PCR)。除使用下面的引物组及使用95℃下30秒之后在95℃、3秒及62℃、30秒进行45次循环作为温度条件之外，如实施例2所记载那样进行实时PCR。
对照引物组：200nM mGAPDH-F(5'-TGCACCACCAACTGCTTAG-3'、序列号180)及200nMmGAPDH-R(5'-GATGCAGGGATGATGTTC-3'、序列号181)
mCSGalNAcT1组：200nM mT1-F1(5'-CCAATTTCAGAAACTTCACCTTCAT-3'、序列号182)及200nM mT1-R1(5'-TGTTCAGCCTACAAGTGTTGAG-3'、序列号183)
mCSGalNAcT2组：200nM mT2-F1(5'-TTAATATCATTGTGCCACTTGCG-3'、序列号184)及200nM mT2-R1(5'-TAGAATAGACTTGACTTTAGATAGTCCTT-3'、序列号185)
对照引物组为相对于小鼠GAPDH(甘油醛-3-磷酸脱氢酶)基因(持家基因)的引物组。mCSGalNAcT1组为相对于小鼠CSGalNAcT1基因的引物组。mCSGalNAcT2组为相对于小鼠CSGalNAcT2基因的引物组。PCR反应液中使用下面三种引物组中的任意一种：对照引物组(用于测定小鼠GAPDH)；mCSGalNAcT1组(用于测定小鼠CSGalNAcT1)；或mCSGalNAcT2组(用于测定小鼠CSGalNAcT2)。
使用通过实时PCR得到的Ct值，通过ΔΔCt法算出转染有反义寡核苷酸的细胞中的小鼠CSGalNAcT1 mRNA及小鼠CSGalNAcT2 mRNA相对于未处理细胞的相对量。
图2A中示出了转染有反义寡核苷酸的小鼠3T3N细胞中的小鼠CSGalNAcT1 mRNA的相对量。图2B中示出了转染有反义寡核苷酸的小鼠3T3N细胞中的小鼠CSGalNAcT2 mRNA的相对量。经试验的反义寡核苷酸(hT1-2514-LNA(15)、hT2-1617-AmNA(15)，hT1-1831-LNA(15)、hT1-2126-LNA(15)、hT2-420-LNA(15)、hT2-872-LNA(15)及hT2-891-LNA(15))显示出具有以浓度依赖性的方式抑制小鼠CSGalNAcT1基因和小鼠CSGalNAcT2基因的双方的表达的倾向。
[实施例4]
(人SKOV-3细胞中的反义寡核苷酸的浓度依赖性表达抑制活性)
以各种浓度将数个实施例1中合成的反义寡核苷酸转染至人SKOV-3细胞，定量CSGalNAcT1 mRNA及CSGalNAcT2 mRNA，由此调查反义寡核苷酸对人SKOV-3细胞中的CSGalNAcT1及CSGalNAcT2基因的表达抑制活性。
从住商医药国际株式会社以目录号EC91091004-F0获取人SKOV-3细胞。如下进行细胞的解冻。向50mL离心管中添加9mL补充有10％血清(胎牛血清、biowest公司)及1％抗生素(青霉素-链霉素混合溶液(稳定)、Nacalai Tesque株式会社)的McCoy's5A培养基(GIBCO公司)。将在37℃下溶解了80％的细胞添加到离心管中。使用冷却离心分离机(VERSATILEREFRIGERATED CENTRIFUGE、株式会社Tomy Seiko)，以1000rpm在室温下离心分离细胞3分钟。吸除上清液，使细胞重新悬浮在新的培养基(补充有10％血清及1％抗生素的McCoy's5A培养基)中，将3～10×105个细胞接种于10cm培养皿(100mm/组织培养用培养皿、IWAKI公司)。在37℃、5％CO2环境下培养细胞。
如上所述那样解冻细胞后的第二天，吸除培养上清液，向细胞中添加10mL新的培养基(补充有10％血清及1％抗生素的McCoy's5A培养基)，由此更换培养基。
如下进行细胞的传代培养。在达到半汇合时传代细胞。从10cm培养皿中吸除培养培养基，利用4mL PBS清洗细胞后，向细胞中添加2mL胰蛋白酶(0.25％胰蛋白酶/1mM-EDTA溶液、Nacalai Tesque株式会社)，在37℃、5％CO2环境下静置1分钟。添加8mL新的培养基(补充有10％血清及1％抗生素的McCoy's5A培养基)后，进行吹打，并将细胞转移至50mL离心管。以1000rpm在室温下离心分离细胞3分钟。吸除上清液，加入5～10mL新的培养基(补充有10％血清及1％抗生素的McCoy's5A培养基)以重新悬浮细胞。计数细胞，并将2～7×105个细胞接种至新的10cm培养皿。在37℃、5％CO2环境下培养细胞。
如下接种用于转染反义寡核苷酸的细胞。从达到半汇合的细胞的10cm培养皿中吸除培养培养基，利用PBS清洗细胞后，向细胞中添加2mL胰蛋白酶，并在37℃、5％CO2环境下静置1分钟。添加补充有10％FBS的McCoy's5A培养基并吹打，将细胞转移至50mL离心管。以1000rpm在室温下离心分离3分钟后，吸除上清液，加入5～10mL补充有10％FBS的新的McCoy's5A培养基，使细胞重新悬浮。计数细胞，向24孔板(24孔细胞培养用微孔板、IWAKI公司)每孔接种20,000个(500μL中)细胞。在37℃、5％CO2环境下培养24小时细胞。
通过CEM法如下向细胞中转染反义寡核苷酸。向补充有10％FBS的McCoy's5A培养基中添加900mM的氯化钙以达到100倍稀释，得到含氯化钙的培养基。向225μL得到的含氯化钙的培养基中混合25μL规定浓度的反义寡核苷酸，得到核酸溶液。作为反义寡核苷酸，使用实施例1中合成的核酸中的hT1-2514-LNA(15)、hT1-2519-AmNA(15)及hT2-1617-AmNA(15)。除去24孔板中的培养培养基，利用PBS 600μL清洗细胞后，每孔添加250μL含氯化钙的培养基。接下来，向孔中添加250μL核酸溶液(反义寡核苷酸的最终浓度为100或200nM)。在37℃、5％CO2环境下培养细胞24小时。作为对照，准备利用核酸NEG#L1转染后的细胞及未处理细胞。
如下由细胞制备cDNA。首先，使用QIAGEN RNeasy(注册商标)迷你试剂盒提取RNA。具体而言，利用PBS 600μL清洗转染后的细胞后，添加200μL胰蛋白酶并在37℃、5％CO2环境下静置3分钟。向细胞中添加400μL补充有10％FBS的McCoy's5A培养基之后，进行吹打，将细胞回收至新的1.5mL管中。向孔中添加500μL补充有10％FBS的新的McCoy's5A培养基后进行吹打，将细胞回收至上述管。以1000rpm在室温下对管离心分离3分钟(离心机5430R、eppendolf公司)。除去上清液，向管中加入PBS 1mL。以1000rpm在室温下对管离心分离3分钟。除去上清液。向980μL RLT缓冲液中加入2M DTT 20μL并充分混合，得到混合液，将350μL该混合液加入上述管并进行涡流。将等量的70％乙醇加入管并缓慢吹打。向2mL收集管中放入离心柱，将上述管中的溶液700μL加入离心柱。以10000rpm、在室温下离心分离离心柱15秒，丢弃滤液。向离心柱中加入700μL RW1缓冲液。以10000rpm在室温下离心分离离心柱15秒，丢弃滤液。向离心柱中加入500μL RPE缓冲液。以10000rpm在室温下离心柱离心分离15秒，丢弃滤液。向离心柱中加入500μL RPE缓冲液。以10000rpm在室温下离心分离离心柱15秒，丢弃滤液。将离心柱置于新的2mL收集管。以13200rpm在室温下离心分离离心柱1分钟，丢弃滤液。将离心柱置于新的1.5mL管。向36μL离心柱中加入无RNase水。以10000rpm在室温下离心分离离心柱1分钟，洗脱RNA。拆下柱子并将1.5mL管转移至冰上。将2μL RNA洗脱液用于吸光度测定(DS-11光谱仪，DeNOVIX公司)。接着，使用ABI高容量cDNA逆转录试剂盒(Thermo Fisher Scientific公司)将RNA逆转录为cDNA。具体而言，向新的0.5mL管中加入4μL 10×RT缓冲液、1.6μL 100mM dNTPs、4μL 10×RT Ramdom(商标)引物、2μLMultiScribe(商标)逆转录酶(50U/μL)及28μLRNA溶液(包含4μg RNA，利用无核酸酶水调节体积)(总体积39.6μL)。将管置于热循环仪(WK-0518、和光纯药工业株式会社)。在25℃下10分钟、37℃下120分钟、85℃下5分钟及4℃的温度条件下进行逆转录反应，得到cDNA。cDNA在-80℃下储存。
使用cDNA，进行实时PCR(RT-PCR)。除引物的浓度及预混物以外，实时PCR如实施例2中记载那样进行。作为引物的浓度，hGAPDH-F及hGAPDH-R采用200nM。hT1-F1、hT1-R1、hT1-F2、hT1-R2、hT2-F1、hT2-R1、hT2-F2、及hT2-R2采用400nM。预混物使用ABI(商标)PowerUp(商标)SYBR(注册商标)绿色预混物(Green Master Mix)(Thermo Fisher Scientific公司)。
使用由实时PCR得到的Ct值，通过ΔΔCt法算出转染了反义寡核苷酸的细胞的人CSGalNAcT1 mRNA及人CSGalNAcT2 mRNA相对于未处理细胞的相对量。
图3A中示出了转染有hT1-2514-LNA(15)及hT1-2519-AmNA(15)的人SKOV-3细胞中的人CSGalNAcT1 mRNA的相对量。图3B中示出了转染有hT1-2514-LNA(15)及hT1-2519-AmNA(15)的人SKOV-3细胞中的人CSGalNAcT2 mRNA的相对量。图4A示出了转染有hT2-1617-AmNA(15)的人SKOV-3细胞中的人CSGalNAcT1 mRNA的相对量。图4B示出了转染有hT2-1617-AmNA(15)的人SKOV-3细胞中的人CSGalNAcT2 mRNA的相对量。经试验的反义寡核苷酸(hT1-2514-LNA(15)、hT1-2519-AmNA(15)及hT2-1617-AmNA(15))显示出具有浓度依赖性地抑制人CSGalNAcT1基因和人CSGalNAcT2基因的双方的表达的倾向。
[实施例5]
(人U251细胞中的反义寡核苷酸的表达抑制活性)
将数个实施例1中合成的反义寡核苷酸转染至人U251细胞，定量CSGalNAcT1 mRNA及CSGalNAcT2 mRNA，由此调查反义寡核苷酸对人U251细胞中的CSGalNAcT1及CSGalNAcT2基因的浓度依赖性表达抑制活性。
从国立研究开发法人医药基盘·健康·营养研究所JCRB细胞库中以细胞注册号IFO50288获取人U251细胞。如下进行细胞的解冻。向50mL离心管中添加9mL补充有10％血清(胎牛血清、biowest公司)及1％抗生素(青霉素-链霉素混合溶液(稳定)、Nacalai Tesque株式会社)的DMEM培养基(DMEM(低葡萄糖)、Nacalai Tesque株式会社)。将37℃下溶解了80％的细胞添加到离心管中。使用冷却离心分离机(VERSATILE REFRIGERATEDCENTRIFUGE、株式会社Tomy Seiko)，以1000rpm在室温下离心分离细胞3分钟。吸除上清液，使细胞重新悬浮在新的培养基中(补充有10％血清及1％抗生素的DMEM培养基)，将3～10×105个细胞接种于10cm培养皿(100mm/组织培养用培养皿、IWAKI公司)。在37℃、5％CO2环境下培养细胞。
如上解冻细胞的第二天，吸除培养上清液，向细胞中添加10mL新的培养基(补充有10％血清及1％抗生素的DMEM培养基)，由此更换培养基。
如下进行细胞的传代培养。在达到半汇合时传代细胞。从10cm培养皿中吸除培养培养基，利用4mL PBS清洗细胞后，向细胞中添加2mL胰蛋白酶(0.25％胰蛋白酶/1mM-EDTA溶液、Nacalai Tesque株式会社)，在37℃、5％CO2环境下静置1分钟。添加8mL新的培养基(补充有10％血清及1％抗生素的DMEM培养基)后，进行吹打，并将细胞转移至50mL离心管。以1000rpm在室温下离心分离细胞3分钟。吸除上清液，加入5～10mL新的培养基(补充有10％血清及1％抗生素的DMEM培养基)以重新悬浮细胞。计数细胞，并将3～7×105个细胞接种至新的10cm培养皿。在37℃、5％CO2环境下培养细胞。
如下接种用于转染反义寡核苷酸的细胞。从达到半汇合的细胞的10cm培养皿中吸除培养培养基，利用4mL PBS清洗细胞后，向细胞中添加2mL胰蛋白酶并在37℃、5％CO2环境下静置1分钟。添加补充有10％FBS的DMEM培养基并吹打，将细胞转移至50mL离心管。以1000rpm在室温下离心分离3分钟后，吸除上清液，加入5～10mL补充有10％FBS的新的DMEM培养基2，使细胞重新悬浮。计数细胞，向24孔板(24孔细胞培养用微孔板、IWAKI公司)每孔接种30,000个细胞(500μL中)。在37℃、5％CO2环境下培养细胞。
通过并用CEM法及脂质转染法如下向细胞中转染反义寡核苷酸。向补充有10％FBS的DMEM培养基中添加900mM的氯化钙以达到100倍稀释，得到含氯化钙的培养基。向得到的含氯化钙的培养基添加脂质体(Lipofectamine(注册商标)3000逆转录试剂盒，ThermoFisher Scientific公司)以达到91倍稀释，得到脂质体溶液。向225μL得到的脂质体溶液中混合25μL规定浓度的反义寡核苷酸，得到核酸溶液。作为反义寡核苷酸、使用实施例1中合成的核酸中的mT1-1915-LNA(15)、hT1-1831-LNA(15)、hT1-2126-LNA(15)、mT1-2156-LNA(15)、hT1-2327-LNA(15)、hT1-2479-LNA(15)、hT1-2514-LNA(15)、hT2-420-LNA(15)、hT2-872-LNA(15)、hT2-891-LNA(15)、hT2-1617-AmNA(15)、hT2-1839-LNA(15)、hT1-2519-AmNA(15)、及hT1-2519-LNA(15)。除去24孔板中的培养培养基，利用PBS 600μL清洗细胞后，每孔添加250μL含氯化钙的培养基。接下来，向孔中添加250μL核酸溶液(反义寡核苷酸的最终浓度为200nM)。在37℃、5％CO2环境下培养24小时。作为对照，准备利用核酸NEG#L1转染后的细胞及未处理细胞。
与实施例4所记载的方法相同的方法由细胞制备cDNA及进行实时PCR。使用由实时PCR得到的Ct值，通过ΔΔCt法算出转染了反义寡核苷酸的细胞中的人CSGalNAcT1 mRNA及人CSGalNAcT2 mRNA相对于未处理细胞的相对量。
图5A示出了转染有反义寡核苷酸的人U251细胞中的人CSGalNAcT1 mRNA的相对量。图5B示出了转染有反义寡核苷酸的人U251细胞中的人CSGalNAcT2 mRNA的相对量。经试验的反义寡核苷酸(mT1-1915-LNA(15)、hT1-1831-LNA(15)、hT1-2126-LNA(15)、mT1-2156-LNA(15)、hT1-2327-LNA(15)、hT1-2479-LNA(15)、hT1-2514-LNA(15)、hT2-420-LNA(15)、hT2-872-LNA(15)、hT2-891-LNA(15)、hT2-1617-AmNA(15)、hT2-1839-LNA(15)、hT1-2519-AmNA(15)、及hT1-2519-LNA(15))显示出抑制人CSGalNAcT1基因和人CSGalNAcT2基因中的一方或双方的表达。
[实施例6]
(人U251细胞中的反义寡核苷酸的浓度依赖性表达抑制活性)
以各种浓度将数个实施例1中合成的反义寡核苷酸转染至人U251细胞，定量CSGalNAcT1 mRNA及CSGalNAcT2 mRNA，由此调查反义寡核苷酸对人U251细胞中的CSGalNAcT1及CSGalNAcT2基因的浓度依赖性表达抑制活性。
除转染的反义寡核苷酸的浓度及种类以外，如实施例5中记载那样，向人U251细胞中转染反义寡核苷酸，由细胞制备cDNA，并进行实时PCR。使用由实时PCR得到的Ct值，通过ΔΔCt法算出转染有反义寡核苷酸的细胞中的人CSGalNAcT1 mRNA及人CSGalNAcT2 mRNA相对于未处理细胞的相对量。转染的反义寡核苷酸的最终浓度采用50、100或200nM。作为反义寡核苷酸，使用实施例1中合成的核酸中的hT1-2126-LNA(15)、hT1-2327-LNA(15)、hT1-2514-LNA(15)、hT2-891-LNA(15)、hT2-1617-AmNA(15)、hT2-1839-LNA(15)、及hT1-2519-LNA(15)。
图6A中示出了转染有反义寡核苷酸的人U251细胞中的人CSGalNAcT1 mRNA的相对量。图6B中示出了转染有反义寡核苷酸的人U251细胞中的人CSGalNAcT2 mRNA的相对量。经试验的反义寡核苷酸(hT1-2126-LNA(15)、hT1-2327-LNA(15)、hT1-2514-LNA(15)、hT2-891-LNA(15)、hT2-1617-AmNA(15)、hT2-1839-LNA(15)、及hT1-2519-LNA(15))显示出具有浓度依赖性地抑制人CSGalNAcT1基因和人CSGalNAcT2基因的双方的表达的倾向。
[实施例7]
(反义寡核苷酸对硫酸软骨素及硫酸乙酰肝素量的影响)
将数个实施例1中合成的反义寡核苷酸转染至人YKG-1细胞及人U251细胞，通过细胞内ELISA测定法定量细胞中的硫酸软骨素及硫酸乙酰肝素量，由此调查反义寡核苷酸对硫酸软骨素及硫酸乙酰肝素量的影响。
在10cm培养皿中分别将YKG-1细胞(来自人胶质母细胞瘤)及U251细胞(来自人星形细胞瘤、从住商药学国际株式会社以目录号EC09063001-F0获取)培养至达到80％汇合。通过与实施例5所记载的并用CEM法及脂质转染法时相同的方法，向培养基中添加氯化钙溶液，使用脂质体(Lipofectamine(注册商标)3000逆转录试剂盒、Thermo FisherScientific公司)，按照最终浓度100nM将反义寡核苷酸转染至YKG-1细胞及U251细胞。作为反义寡核苷酸，使用hT1-1804-LNA(15)、hT1-2514-LNA(15)、hT1-2519-LNA(15)、hT2-1617-LNA(15)、hT1-2126-LNA(15)、hT2-891-LNA(15)、hT2-941-LNA(15)、及hT2-1893-LNA(15)。作为对照，准备利用核酸NEG#L1转染后的细胞及未处理细胞。
转染68小时后使用胰蛋白酶剥离细胞，并将其悬浮于4mL培养基。利用台盼蓝(Gibco公司)染色细胞的一部分，使用一次性血细胞计数盘C-Chip计数活细胞数。以每孔1×104个细胞(200μl中)的方式，向96孔细胞培养板(BD Falcon公司、产品编号353072)接种细胞。针对各细胞，向24～32孔中接种细胞。在37℃、5％CO2环境下培养细胞1天。
向1×PBS 40mL(50mL锥形管中)中加入20μl Tween 20，由此制备PBST(PBS中的0.05％Tween 20)。培养细胞后，向孔中加入PBST 200μl(每孔)，立刻除去PBST，并再次重复该操作。接下来，向孔中加入PBST200μl(每孔)，放置5分钟，清洗细胞。随后重复该清洗两次。
向孔中加入4％PFA/PBS 100μl(每孔)，在室温下孵育20分钟，由此固定细胞。4％PFA/PBS如下制备。向15mL锥形管中加入0.48g PFA(多聚甲醛粉末、Nacalai Tesque株式会社、代码26126-25)，接下来，向管中加入9mL无菌水及2.9μl 4N NaOH，利用封口膜密封管的盖帽。将管贴进热水并剧烈搅拌，从而溶解PFA。将管置于冰上，加入10×PBS 1.2mL之后，利用无菌水补足溶液至12mL，得到4％PFA/PBS。4％PFA/PBS在4℃下避光储存(能够储存一周)。
向孔中加入PBST 200μl(每孔)，立刻除去PBST，再次重复该操作。接下来，向孔中加入PBST 200μl(每孔)，放置5分钟，清洗细胞。随后重复该清洗两次。
向孔中加入3％BSA/PBS 200μl(每孔)，在室温下孵育1小时，由此封闭细胞。3％BSA/PBS通过向1×PBS 20mL(50mL锥形管中)中加入0.6g BSA(白蛋白(来自牛血清)、玉米组分(Cohn Fraction)(pH7.0)、和光纯药工业株式会社、目录号017-23294)并溶解而制备。3％BSA/PBS在4℃下储存。
向孔中加入PBST 200μl(每孔)，放置5分钟，清洗细胞。重复该清洗两次。
向孔中加入100μl(每孔)一抗(用于检测硫酸软骨素的抗体或用于检测硫酸乙酰肝素的抗体)的溶液或加入100μl(每孔)3％BSA/PBS作为阴性对照(抗体(-))，在4℃下孵育一晩或在室温下孵育1～2小时。孵育期间，用封口膜密封板，以防止板干燥，将板放入气密盒，向盒子中放置被MQ水(超纯水)润湿后的擦拭纸(Kimwipe)。作为用于检测硫酸软骨素的一抗，使用小鼠抗硫酸软骨素(CS)抗体(CS-56)(1.9mg/mL、Abcam公司、目录号ab11570)。作为用于检测硫酸乙酰肝素的一抗，使用抗硫酸乙酰肝素抗体3G10(生化学工业株式会社)。一抗在使用时于3％BSA/PBS 100μl中稀释1,000倍后使用(每孔)。
利用一抗孵育后，向孔中加入PBST 200μl(每孔)，立刻除去PBST，再次重复该操作。接下来，向孔中加入PBST 200μl(每孔)，放置5分钟，清洗细胞。随后重复该清洗两次。
向孔中加入二抗溶液100μl(每孔)，孵育1小时。孵育期间，将板放入气密盒中，以防止板干燥，向盒子中放置被MQ水湿润后的擦拭纸(Kimwipe)。另外，孵育期间，使板避光。作为二抗，使用山羊抗小鼠IgG+IgM(H+L)-AP(1mg/mL、人吸附(human absorbed)、KPL公司、目录号751-1809)。二抗在使用时于3％BSA/PBS 100μl中稀释2,000倍后使用(每孔)。
向孔中加入TBST 200μl(每孔)，放置5分钟，清洗细胞。再次重复该清洗。接下来，向孔中加入TBS 200μl(每孔)，放置5分钟，清洗细胞。再次重复该清洗。
如下制备pNPP溶液。使用利用碳酸钠及碳酸氢钠所制备的0.2M碳酸缓冲液(pH9.8)以及0.5M MgCl2·6H2O制备2×pNPP缓冲液(0.1M碳酸缓冲液(pH9.8)、1mM MgCl2)。以40mg/mL的浓度将对硝基苯磷酸二钠六水合物(p-Nitrophenyl phosphate disodiumsalt Hexahydrate(pNPP)、和光纯药工业株式会社、代码147-02343)溶解于MQ水。使0.5mL40mg/mL pNPP、5mL 2×pNPP缓冲液及4.5mL MQ水混合，从而在使用时制备10mL(50孔的量)的pNPP溶液。向细胞中添加200μl pNPP溶液(每孔)，30分后，使用激发波长405nm由iMark(商标)酶标仪(Bio-Rad公司)测定吸光度。与二抗键合的碱性磷酸酶将对硝基苯磷酸转换为对硝基苯酚。在上述方法中，测定生成物对硝基苯酚的吸光度。
作为405nm处的吸光度相对于未处理对照细胞中的吸光度的比率来表示硫酸软骨素或硫酸乙酰肝素的相对量。针对各组进行2次实验，从而算出平均值。
将反义寡核苷酸转染至YKG-1细胞时的硫酸软骨素及硫酸乙酰肝素的相对量示于图7A。将反义寡核苷酸转染至U251细胞时的硫酸软骨素及硫酸乙酰肝素的相对量示于图7B。
反义寡核苷酸hT1-1804-LNA(15)、hT1-2514-LNA(15)、hT1-2519-LNA(15)、hT2-1617-LNA(15)、hT1-2126-LNA(15)、hT2-891-LNA(15)、hT2-941-LNA(15)、及hT2-1893-LNA(15)显示出具有降低硫酸软骨素量的倾向。但是，这些反义寡核苷酸几乎不能降低硫酸乙酰肝素量。由此显示出，这些反义寡核苷酸特异性降低硫酸软骨素量。
另外，显著降低了硫酸软骨素量的反义寡核苷酸(例如，hT1-2514-LNA(15)、hT1-2519-LNA(15)及hT2-1617-LNA(15))反而会升高硫酸乙酰肝素量，这与以前的在由针对CSGalNAcT1的siRNA处理后的脊髓损伤模型小鼠患处可见硫酸乙酰肝素合成酶的表达升高的报告一致(Takeuchi,K.,et al.,2013、上述)。
[实施例8]
(反义寡核苷酸对硫酸乙酰肝素量的影响)
将实施例1中合成的反义寡核苷酸(hT1-2126-LNA(15))导入C6细胞(来自大鼠脑胶质瘤)及U251细胞(来自人星形细胞瘤)，通过细胞内ELISA测定法定量细胞中的硫酸乙酰肝素量，由此调查反义寡核苷酸对硫酸乙酰肝素量的影响。
从国立研究开发法人医药基盘·健康·营养研究所JCRB细胞库中以细胞注册号JCRB9096获取C6细胞(来自大鼠脑胶质瘤)。通过与实施例6中记载的方法相同的方法，向C6细胞或U251细胞中转染反义寡核苷酸(hT1-2126-LNA(15))，使用用于检测硫酸乙酰肝素的一抗，通过细胞内ELISA测定法来测定对硝基苯酚的吸光度(405nm)。作为对照，在未处理的细胞中，同样地通过细胞内ELISA测定法来测定对硝基苯酚的吸光度(405nm)。另外，利用木糖甙处理细胞，同样地通过细胞内ELISA测定法来测定对硝基苯酚的吸光度(405nm)。对各组进行五次实验，算出平均值及标准误差。
木糖甙从Sigma-Aldrich公司获取。木糖甙处理以50μM进行24小时。已知木糖甙会降低细胞中的硫酸乙酰肝素量。
大鼠C6细胞中的吸光度(405nm)示于图8A。人U251细胞中的吸光度(405nm)示于图8B。吸光度与硫酸乙酰肝素量相关。确认了通过木糖甙处理硫酸乙酰肝素量相比于对照降低了。
在大鼠C6细胞及人U251细胞中显示出，硫酸乙酰肝素量几乎不因反义寡核苷酸(hT1-2126-LNA(15))的转染而受到影响。
[实施例9]
(反义寡核苷酸对瘢痕形成的影响)
通过定量活体外瘢痕形成来调查反义寡核苷酸对瘢痕形成的影响。本发明人等开发了活体外瘢痕形成系统，该活体外瘢痕形成系统使成纤维细胞和胶质细胞混合，并在加入了生长因子(TGFβ及PDGF)的培养基中进行培养，从而形成纤维性瘢痕。通常认为，脊髓损伤后作为组织修复的结果而产生的瘢痕会阻碍神经的再生。因此，通过抑制瘢痕的形成，能够促进脊髓损伤的恢复。
U251细胞(来自脑胶质细胞、人星形细胞瘤)从国立研究开发法人医药基盘·健康·营养研究所JCRB细胞库中以细胞注册号IFO50288获取。HT1080细胞(来自成纤维细胞、人纤维肉瘤)从国立研究开发法人医药基盘·健康·营养研究所JCRB细胞库中以细胞注册号JCRB9113获取。
使5×104个U251细胞及5×104个HT1080细胞悬浮在50μl培养基(RPMI1640培养基、和光纯药工业株式会社)中并混合。将细胞混合液接种于96孔平底培养皿(已涂布PLL、Nunc公司)，在补充有15％FCS(Hyclone公司)的RPMI1640培养基中培养。
第二天，将培养基更换为补充有TGFβ及PDGF的培养基(5％FCS(Hyclone公司)、10ng/ml TGFβ及5ng/ml PDGF的RPMI1640培养基(使用时制备))。作为TGFβ(转化生长因子β)，使用能够从funakoshi株式会社(Funakoshi_Co.,Ltd)以商品代码100-21获取的TGF-β1(在人、重组体、HEK293细胞中产生)或能够从funakoshi株式会社以商品代码246-LP-025获取的LAP/TGF-β1(在人、重组体、Sf21细胞中产生)。作为PDGF(血小板衍生生长因子)，使用能够从和光纯药工业株式会社以代码166-19743获取的PDGF-B(人，重组体)或者能够以代码169-19733获取的PDGF-AA(人、重组体)或能够从东方酵母工业株式会社以产品编号NIB47083000获取的PDGF-BB(重组人血小板衍生生长因子BB)。
更换培养基时，通过与实施例5所记载的并用CEM法及脂质转染法时相同的方法，向培养基中添加氯化钙溶液，使用脂质体(Lipofectamine(注册商标)3000转染试剂盒、Thermo Fisher Scientific公司)，以最终浓度100nM将反义寡核苷酸转染至细胞。作为反义寡核苷酸，使用实施例1中合成的hT1-2327-LNA(15)、hT1-2514-LNA(15)、hT1-2519-LNA(15)、hT2-1617-LNA(15)、hT1-2126-LNA(15)、hT2-891-LNA(15)及hT2-1893-LNA(15)。作为对照，准备利用核酸NEG#L1转染后的细胞及未处理细胞。
在37℃下，于CO2培养箱内孵育细胞。
给药反义寡核苷酸72小时后，使用活细胞分析系统IncuCyte(注册商标)(Essenbioscience社)，按照制造商的手册，测量瘢痕数量及瘢痕面积(总面积)。瘢痕面积由图像像素细胞数量来表示。实验进行2次，算出瘢痕数量及瘢痕面积(总面积)的平均值。
需要指出，本发明人等已经确认：当使用LY-36497(TGFβ作用的抑制剂、sigma公司)时，瘢痕形成得以降低。
图9A中示出了转染有反义寡核苷酸时的瘢痕数量。图9B中示出了转染有反义寡核苷酸时的瘢痕面积。显示出，反义寡核苷酸hT1-2327-LNA(15)、hT1-2514-LNA(15)、hT1-2519-LNA(15)、hT2-1617-LNA(15)、hT1-2126-LNA(15)、hT2-891-LNA(15)、及hT2-1893-LNA(15)降低瘢痕数量及瘢痕面积。由此显示出，这些反义寡核苷酸能够通过抑制瘢痕的形成来促进脊髓损伤的恢复。
[实施例10]
(脊髓损伤模型小鼠的制作及反义寡核苷酸的给药)
从日本clea株式会社(Clea Japan,Inc.)购入C57BL/6J品系的小鼠(野生型)并使其繁殖，用于实验。以8～10周龄的雄性小鼠为原则用于实验。
针对深度麻醉下的小鼠，通过外科手术除去第十椎骨(Th10)的背侧部。使用脊髓损伤模型制作设备(Infinite Horizon Impactor、Precision Systems andInstrumentation公司、Lexington、NY)，通过70k达因的稳定的冲击力(impact force)使其产生脊髓损伤。对照的假手术小鼠仅除去Th10骨，然后缝合伤口。
向产生了脊髓损伤的小鼠给药反义寡核苷酸(hT1-2126-LNA(15))或软骨素酶ABC(ChABC)。反义寡核苷酸hT1-2126-LNA(15)相对于小鼠CSGalNAcT1 mRNA(序列号166)的2067-2081位的区域没有错配，能够将该区域作为标靶。软骨素酶ABC从生化学工业株式会社获取。已知通过软骨素酶ABC处理会促进脊髓损伤的恢复(Takeuchi,K.,et al.,Chondroitin sulphate N-acetylgalactosaminyltransferase-1inhibits recoveryfrom neural injury.Nature Communication,2013,4:2740)。
在损伤部的椎骨背侧部放置丝绸海绵，使用用于小动物的渗透泵(osmotic mini-pump(Model 2006(长期用200μl容量))、Alzet公司)向海绵持续给药反义寡核苷酸(100nM)或软骨素酶ABC(20μM)。给药按照每小时0.5μl的速度进行两周。另外，作为阴性对照，还制作了向脊髓损伤小鼠给药阴性对照核酸(NEG#L1)的组。
T1KO小鼠(CSGalNAcT1敲除小鼠)是使用来自C57BL/6N品系的胚胎干细胞株RENKA通过同源重组预先制成的(Watanabe,T.,et al.,Chondroitin sulfate N-acetylgalactosaminyltransferase-1is required for normal cartilagedevelopment.Biochem.J.,2010,432:47-55)。已知在T1KO小鼠中会促进脊髓损伤的恢复(Takeuchi,K.,et al.,2013、上述)。通过与上述相同的方法使T1KO小鼠产生脊髓损伤，并向损伤部持续给药反义寡核苷酸(hT1-2126-LNA(15))或阴性对照核酸。
[实施例11]
(反义寡核苷酸对脊髓损伤模型小鼠的后肢运动功能的影响)
如实施例10记载那样产生脊髓损伤，利用药剂处理后，对小鼠的后肢运动功能每周分析一次，分析六周。
后肢运动功能分析通过BMS旷场评分来进行(Basso,D.M.,et al.,Basso MouseScale for locomotion detects differences in recovery after spinal cord injuryin five common mouse strains.J Neurotrauma,2006,23(5):635-59.)。由最少2～3名评价者对每组6只小鼠打分。BMS提供运动能力整体的指标，并决定运动功能恢复期及运动的特征。BMS为9分制的试验，后肢完全麻痹设为0分，正常运动设为9分。BMS得分是对后肢的各个关节的运动、体重支撑、步伐、前后肢的协调性、躯干的稳定性、步行时尾巴的位置等赋分而得到的。算出每组的6只小鼠的得分的平均值及标准误差。
图10示出了使野生型小鼠产生脊髓损伤但未给药药剂的组(WT、SCI)、使野生型小鼠产生脊髓损伤并给药软骨素酶ABC的组(WT、SCI+ChABC)、使野生型小鼠产生脊髓损伤并给药反义寡核苷酸(hT1-2126-LNA(15))的组(WT、SCI+hT1-2126)、使T1KO小鼠产生脊髓损伤并给药反义寡核苷酸(hT1-2126-LNA(15))的组(T1KO、SCI+hT1-2126)、使T1KO小鼠产生脊髓损伤但未给药药剂的组(T1KO、SCI)及进行假手术的野生型小鼠的后肢运动功能分析的结果。得分越高，表示运动功能越高。
显示出，在产生了脊髓损伤并给药反义寡核苷酸的野生型小鼠中，与产生了脊髓损伤但未给药药剂的野生型小鼠相比，促进了后肢运动功能恢复。
确认了在产生了脊髓损伤的T1KO小鼠及产生了脊髓损伤并给药软骨素酶ABC的野生型小鼠中，如上所述(Takeuchi,K.,et al.,2013、上述)，与产生了脊髓损伤的野生型小鼠相比，促进后肢运动功能恢复。
另外还显示出，若向产生了脊髓损伤的T1KO小鼠给药反义寡核苷酸，则后肢运动功能修复至与产生了脊髓损伤但未给药药剂的T1KO小鼠相同的程度。由此显示出，反义寡核苷酸不具有脱靶效应等副作用。
[实施例12]
(反义寡核苷酸对脊髓损伤模型小鼠中的糖链量的影响)
在如实施例10中记载那样给药了反义寡核苷酸的脊髓损伤小鼠中定量糖链量，由此调查反义寡核苷酸对脊髓损伤模型小鼠中的糖链量的影响。
脊髓损伤三周后，利用碳酸气体迅速使深度麻醉下的小鼠安乐死，以损伤位置为中心按照3mm的长度摘出脊髄。并且从脊髓损伤但未给药药剂的野生型及T1KO小鼠中摘出大脑皮质部。
如下定量所摘出的组织(脊髄及大脑皮质部)中的糖链。将组织放入管中，利用1mL磷酸缓冲生理食盐水(PBS)清洗2次。接下来，向管中添加0.5mL PBS，利用生物粉碎机使组织均质化。向管中添加200μL软骨素酶ABC反应液(10mU软骨素酶ABC、50mM Tris-HCl pH8.0及60mM CH3COONa)，在37℃下孵育2小时。将管中的溶液以每管100μL分别装入2根管中，在95℃下加热5分钟。使用真空浓缩器(Speed-Vac、Thermo Fisher Scientific公司)使管中的溶液干燥(3小时以内)。接下来，向管中添加二甲基亚砜(DMSO)中的0.35M 2-氨基苯甲酰胺(用于标识糖链的荧光试剂)、1.0M NaCNBH4及25μL 30％醋酸溶液。在65℃下孵育管2小时，对糖链进行荧光标记。接下来，向50μL反应液中添加150μL纯净水，并将其转移至玻璃制造的离心管。向离心管中添加500μL氯仿(用于荧光分析)，利用涡旋混合器进行搅拌。以1,500rpm离心分离离心管1分钟。除去离心分离后的下层(氯仿)，从而除去过剩的荧光试剂。反复五次除去该利用氯仿的荧光试剂。最后，将上层(水层)加入离心分离式超滤过滤器(CENTRICUTmini、0.45μm过滤器)，以7,000rpm离心分离5分钟，得到溶液。通过阴离子交换高效液相色谱法(HPLC)分析得到的溶液。作为柱子，使用PA-G(4.6mm×150mm)及保护柱(4.0mm×10mm)(YMC公司)。流速设为0.5mL/分。作为溶剂，使用16mM NaH2PO4·2H2O及1MNaH2PO4·2H2O，使用16mM NaH2PO4·2H2O 10分钟后，使用16mM至0.53M的浓度梯度60分钟。通过激发光330nm及发光420nm进行检测。这样对每组的2～4只小鼠定量糖链，并算出平均值及标准误差。
图11针对野生型小鼠及T1KO小鼠分别示出了假手术后的组的脊髄、产生脊髓损伤但未给药药剂的组的脊髄(SCI)、产生脊髓损伤并给药阴性对照核酸的组的脊髄(SCI+阴性对照核酸)、产生脊髓损伤并给药反义寡核苷酸(hT1-2126-LNA(15))的组的脊髄(SCI+hT1-2126)及产生脊髓损伤但未给药药剂的组的大脑皮质部中的糖链量。
可知，大脑皮质部的糖链量未因脊髓损伤而受太大影响，并且，大脑皮质部的糖链量比脊髄的糖链量更多。因此，大脑皮质部的糖链量被作为阳性对照而定量。确认了野生型小鼠及T1KO小鼠能够在大脑皮质部中检测出糖链。
野生型小鼠中显示出，若使其产生脊髓损伤，则脊髄的糖链量增加。另一方面，还显示出，若向产生了脊髓损伤的野生型小鼠给药反义寡核苷酸，则与未药剂处理组相比，糖链量的增加的程度较小。由此显示出，当被给药机体内时，本发明的反义寡核苷酸降低硫酸软骨素量，并降低糖链量。
T1KO小鼠中也显示出，若使其产生脊髓损伤，则脊髄的糖链量稍微增加。但是还显示出，即使向产生了脊髓损伤的T1KO小鼠给药反义寡核苷酸，糖链量的增加的程度也与未药剂处理组相同。由此确认了反义寡核苷酸没有脱靶效应等副作用。
[实施例13]
(髄腔内给药的反义寡核苷酸对脊髓损伤模型大鼠的后肢运动功能的影响)
向脊髓损伤模型大鼠髄腔内给药实施例1中合成的反义寡核苷酸，从而调查后肢运动功能的恢复。
将大鼠(Wistar，12周龄以上，日本clea株式会社)用于实验。使用200k达因的冲击力，除此之外，如实施例10中所记载那样，使大鼠产生脊髓损伤。假手术大鼠也如实施例10所记载那样来制作。
在脊髓损伤后相同日期，向大鼠髄腔内给药实施例1中合成的反义寡核苷酸(hT1-2514-LNA(15)或hT2-1617-AmNA(15))或对照核酸NEG#L1(参见实施例2)。给药通过将100μg/μl浓度(总体积10μl)的核酸溶液(包含滂胺色素)以每30秒～1分钟1μl的速度注入大鼠的髄腔内来进行。通过滂胺色素确认了药剂的导入。
通过BBB得分评价大鼠的后肢运动功能(Basso,D.M.,et al.,A sensitive andreliable locomotor rating scale for open field testing in rats.J Neurotrauma,1995,12(1):1-21及Basso,D.M.,et al.,Graded histological and locomotor outcomesafter spinal cord contusion using the NYU weight-drop device versustransection.Experimental Neurology,1996,139(2):244-256)。BBB得分是通过目测观察动物的后肢的运动量、前肢后肢的协调性及尾部的状态等并按照21分制赋分而得到的。关于BBB得分，在脊髓损伤及药剂给药后，由2～3名观察者独立地每周评价一次。算出每组的9只大鼠的得分的平均值及标准误差。统计学检验通过ANOVA和post-hoc检验来进行(*P<0.01、相对于对照)。
图12示出了给药对照核酸的组、给药反义寡核苷酸hT1-2514-LNA(15)的组、给药反义寡核苷酸hT2-1617-AmNA(15)的组及假手术大鼠的后肢运动功能分析的结果。BBB得分越高，表示运动功能越高。
显示出，通过给药反义寡核苷酸(hT1-2514-LNA(15)或hT2-1617-AmNA(15))，与对照核酸相比，在产生了脊髓损伤的大鼠中，显著促进后肢运动功能的恢复。
[实施例14]
(损伤部局部给药的反义寡核苷酸对脊髓损伤模型小鼠的后肢运动功能的影响)
向脊髓损伤模型小鼠的损伤部局部给药实施例1中合成的反义寡核苷酸，从而调查后肢运动功能恢复。
将小鼠(C57BL/6J；16周龄以上)用于实验。使用100k达因的冲击力，除此之外，如实施例10中记载那样，使小鼠产生脊髓损伤。假手术小鼠也如实施例10记载那样来制作。
在脊髓损伤后相同的日期，向小鼠局部给药实施例1中合成的反义寡核苷酸(hT1-2514-LNA(15)或hT2-1617-AmNA(15))或对照核酸NEG#L1(参见实施例2)(明胶海绵给药)。给药通过使500μg/μl浓度的核酸溶液与缺端胶原(AteloGene(注册商标)、株式会社高研)混和(总体积20μl)，使混合溶液被丝素海绵吸附，并将海绵留置在脊髓损伤区域来进行。
如实施例11所记载那样，通过BMS得分评价小鼠的后肢运动功能。算出每组的12只小鼠的得分的平均值及标准误差。统计学检验通过ANOVA和post-hoc检验来进行(*P<0.01、相对于对照)。
图13示出了给药对照核酸的组、给药反义寡核苷酸hT1-2514-LNA(15)的组、给药反义寡核苷酸hT2-1617-AmNA(15)的组及假手术小鼠的后肢运动功能分析的结果。BMS得分越高，表示运动功能越高。
显示出通过给药反义寡核苷酸(hT1-2514-LNA(15)或hT2-1617-AmNA(15))，与对照核酸相比，在产生了脊髓损伤的小鼠中，以有意义的方式促进后肢运动功能的恢复。
本说明书中所引用的全部刊行物、专利及专利申请直接通过引用并入本说明书。
序列表
<110> 国立研究开发法人日本医疗研究开发机构
国立研究开发法人医药基盘健康营养研究所
<120> 抑制硫酸软骨素的生物合成的
反义寡核苷酸
<130> PH-7289-PCT
<150> JP 2017-072315
<151> 2017-03-31
<160> 186
<170> PatentIn 3.5版
<210> 1
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 1
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<210> 2
<211> 15
<212> DNA
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<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 2
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<210> 3
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 3
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<210> 4
<211> 15
<212> DNA
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<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 4
tggcgggtaa ggcca 15
<210> 5
<211> 15
<212> DNA
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<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 5
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<212> DNA
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<212> DNA
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<220>
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<400> 7
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<212> DNA
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<220>
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<400> 8
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<212> DNA
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<223> 合成寡核苷酸
<400> 9
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<400> 13
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<400> 14
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<400> 18
tcactttcat gatgg 15
<210> 19
<211> 15
<212> DNA
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<220>
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<400> 19
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<220>
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<212> DNA
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<212> DNA
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<220>
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<400> 22
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<212> DNA
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<220>
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<400> 23
gtgaagtaga tgtcc 15
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<212> DNA
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<220>
<223> 合成寡核苷酸
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tattgaggaa ttcag 15
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<220>
<223> 合成寡核苷酸
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<212> DNA
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<220>
<223> 合成寡核苷酸
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tcccaaatcc aaagt 15
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<223> 合成寡核苷酸
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<223> 合成寡核苷酸
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<400> 36
acacgtcatc ccaaa 15
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<223> 合成寡核苷酸
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gacacgtcat cccaa 15
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<212> DNA
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<223> 合成寡核苷酸
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atactgacac gtcat 15
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<212> DNA
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<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 39
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<212> DNA
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<212> DNA
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<223> 合成寡核苷酸
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accgatactg acacg 15
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<223> 合成寡核苷酸
<400> 42
tgaccgatac tgaca 15
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<223> 合成寡核苷酸
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<223> 合成寡核苷酸
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<223> 合成寡核苷酸
<400> 50
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<223> 合成寡核苷酸
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ctcgggggtc agctc 15
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<223> 合成寡核苷酸
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gctcgggggt cagct 15
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tgctcggggg tcagc 15
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<223> 合成寡核苷酸
<400> 55
ctgctcgggg gtcag 15
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actgctcggg ggtca 15
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<223> 合成寡核苷酸
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<212> DNA
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<400> 60
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<210> 61
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<223> 合成寡核苷酸
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taaggtaaaa ctttc 15
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<212> DNA
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<223> 合成寡核苷酸
<400> 62
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<212> DNA
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<223> 合成寡核苷酸
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<210> 64
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<223> 合成寡核苷酸
<400> 64
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<212> DNA
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<223> 合成寡核苷酸
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tccaccaatt catct 15
<210> 66
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 66
ttccaccaat tcatc 15
<210> 67
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> 合成寡核苷酸
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cttccaccaa ttcat 15
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> 合成寡核苷酸
<400> 68
caataacttc cacca 15
<210> 69
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 69
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<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 70
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 71
gtccaaaagg gcgga 15
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 72
tttcatgaga ggtcc 15
<210> 73
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 73
ctttcatgag aggtc 15
<210> 74
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 74
actttcatga gaggt 15
<210> 75
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 75
cactttcatg agagg 15
<210> 76
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 76
tcactttcat gagag 15
<210> 77
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 77
tcttcacttt catga 15
<210> 78
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 78
ctttcagcaa gtggc 15
<210> 79
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 79
tttaccaaaa tacac 15
<210> 80
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 80
catcacagaa aaaca 15
<210> 81
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 81
acatcacaga aaaac 15
<210> 82
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 82
gagaaataga tatca 15
<210> 83
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 83
ttaaggaatt cggct 15
<210> 84
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 84
tgttaaggaa ttcgg 15
<210> 85
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 85
aacaccacag ggtaa 15
<210> 86
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 86
caggattgta aagac 15
<210> 87
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 87
gcaggattgt aaaga 15
<210> 88
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 88
ccagctgctg ctcca 15
<210> 89
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 89
accagctgct gctcc 15
<210> 90
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 90
caaagccaaa atctc 15
<210> 91
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 91
ccaaagccaa aatct 15
<210> 92
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 92
ttccaaagcc aaaat 15
<210> 93
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 93
attccaaagc caaaa 15
<210> 94
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 94
gtcattccaa agcca 15
<210> 95
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 95
acaagtcatt ccaaa 15
<210> 96
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 96
gacaagtcat tccaa 15
<210> 97
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 97
atactgacaa gtcat 15
<210> 98
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 98
gatactgaca agtca 15
<210> 99
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 99
cgatactgac aagtc 15
<210> 100
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 100
aacgatactg acaag 15
<210> 101
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 101
tgaacgatac tgaca 15
<210> 102
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 102
ctgaacgata ctgac 15
<210> 103
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 103
tctgaacgat actga 15
<210> 104
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 104
aacctttcac ttcca 15
<210> 105
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 105
gaatcacaat gaggt 15
<210> 106
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 106
gtccgaatca caatg 15
<210> 107
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 107
ttcatggctt tagac 15
<210> 108
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 108
tgttggccat gttga 15
<210> 109
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 109
ataacattga taagc 15
<210> 110
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 110
atttatttct tcttt 15
<210> 111
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 111
ttcatttatt tcttc 15
<210> 112
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 112
tttcactttc atgat 15
<210> 113
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 113
acatcacaga aaaag 15
<210> 114
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 114
ccccagcctt tgatg 15
<210> 115
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 115
gccagaggtg gaaga 15
<210> 116
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 116
ggtttattta aacag 15
<210> 117
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 117
tggtttattt aaaca 15
<210> 118
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 118
tttggtttat ttaaa 15
<210> 119
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 119
ctttggttta tttaa 15
<210> 120
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 120
atactttggt ttatt 15
<210> 121
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 121
gagattgttt ggttc 15
<210> 122
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 122
aaagagattg tttgg 15
<210> 123
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 123
tgaaaagaga ttgtt 15
<210> 124
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 124
ttttgaaaag agatt 15
<210> 125
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 125
tttcataaac tacca 15
<210> 126
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 126
aaatttcata aacta 15
<210> 127
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 127
attaaatttc ataaa 15
<210> 128
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 128
ttaattaaat ttcat 15
<210> 129
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 129
tgttttaatt aaatt 15
<210> 130
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 130
ctgtgtttta attaa 15
<210> 131
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 131
tgttaccatg atatc 15
<210> 132
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 132
tattgttacc atgat 15
<210> 133
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 133
agtcatgact acttg 15
<210> 134
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 134
caaggcccaa cagca 15
<210> 135
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 135
tttaccataa ttttc 15
<210> 136
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 136
tcatttcttg taatt 15
<210> 137
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 137
tcttctcact cattt 15
<210> 138
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 138
gaagaaactc taaaa 15
<210> 139
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 139
aactttcaaa gggaa 15
<210> 140
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 140
cttttcttca ggatg 15
<210> 141
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 141
gtttgtcttt tctaa 15
<210> 142
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 142
attattaatg acctc 15
<210> 143
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 143
atcaggatta ttaat 15
<210> 144
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 144
attaaatatc agttt 15
<210> 145
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 145
agagggtcac atgtc 15
<210> 146
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 146
atattaataa ttgat 15
<210> 147
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 147
caatgatatt aataa 15
<210> 148
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 148
tcttgatgaa tacaa 15
<210> 149
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 149
accaaggtgt aattg 15
<210> 150
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 150
acagaaaaac atcaa 15
<210> 151
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 151
ttgtaaagac tgaac 15
<210> 152
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 152
taaagatgaa catct 15
<210> 153
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 153
gaggtggaaa agacc 15
<210> 154
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 154
cctcattcat ggctt 15
<210> 155
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 155
ccagctgctg ctcca 15
<210> 156
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 156
tactgctcgg gggtc 15
<210> 157
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 157
tgttggccat gttga 15
<210> 158
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 158
ctcgggggtc agctc 15
<210> 159
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 159
tcatgccaca ggtgg 15
<210> 160
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 160
ctcaggggtc agttc 15
<210> 161
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 161
tactgctcag gggtc 15
<210> 162
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 162
ccagctgctg tccta 15
<210> 163
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 163
ccagctgctg ctcca 15
<210> 164
<211> 4299
<212> DNA
<213> 人
<400> 164
gttctccctg gggagcggga ggctccaggc gcggctgggg cgctgtgggc agatgcgctc 60
ggtcctcacc agcggcgttg tgcggcgaac cctgcggtgc ttcgggaagg cggtcgttcc 120
tccctgctcc caccgttttc cagcgtgtgc gctcttacct tctctgggga aaaaaggaaa 180
ttttttattt tttaacattt catttcatga aaccgttttt tttaagtggt ggcgctgaac 240
acagtccttg cagagggggg cagcactttc cctcctgacc ccaacctgga aaccccagtg 300
tgacttcagc gctgtcagag cattggaagc agagctgcga gttaggaagc ggctcgctgg 360
cagctgggca cgtttctttc ctgcgagatc ggcttttttg atttgctctt tttcacatga 420
aaatgttcag cttcattttt agacaccttt agacatggtt atcactgttt aaagccttga 480
ttttttttta aacaaatagt ttgcatttta ttcattgaaa cagggagaga acaaatacca 540
tcctgctttt tgggctgcct tcctatttca aggaaagacg ccaaggtaat tttgacccag 600
aggagcaatg atgtagccac ctcctaacct tcccttcttg aacccccaga cataaaggga 660
gcagtaggca taaaatgtgg ggagctgacc atctgccggt ccggtcctga ccttccacta 720
gtagtgagac caatccagct cttgctgctg ctgtggcttt gtgaggaggt cccctcttgc 780
tgttggctgc acatcaggaa ggctgtgatg ggaatgaagg tgaaaacttg gagatttcac 840
ttcagtcatt gcttctgcct gcaagatcat cctttaaaag tagagaagct gctctgtgtg 900
gtggttaact ccaagaggca gaactcgttc tagaaggaaa tggatgcaag cagctccggg 960
ggccccaaac gcatgcttcc tgtggtctag cccagggaag cccttccgtg ggggccccgg 1020
ctttgaggga tgccaccggt tctggacgca tggctgattc ctgaatgatg atggttcgcc 1080
gggggctgct tgcgtggatt tcccgggtgg tggttttgct ggtgctcctc tgctgtgcta 1140
tctctgtcct gtacatgttg gcctgcaccc caaaaggtga cgaggagcag ctggcactgc 1200
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taaaaaaatg tacagattga atgctacttt aattgaaatg taaattatat taatgagaca 3060
agatgaataa gaaattatat tccagtagaa ctgtactata atatttatca cacatggata 3120
ttttatcatt gggtcattta ctagatccag aaattggaga taaaataaag gcatgcatag 3180
tttttttaac ccctgacttt taaagggacc tgctatttct atataaccca tgagaactca 3240
gaaaaagtca ttatttttgt tcagtaaatc ataccatctc aaaagttaca aatgccaaat 3300
ttctaggtgc taatgtgaat ccgattcaat aataactagt tgctgagggt tctacccggc 3360
atatcgttga ggtatttttt aagatgtata aagtgctttc tgcagaataa gcagagccag 3420
tatctccttt gtacacactt atttattgta aagaccagtg accatggtat ttaaaattag 3480
ggtacttaat gattttcaaa ggtgatttca gcttggtttt gagataatca aatgattttt 3540
actttaactc ctattttttt aaactagctt ttatttgaag atggaagcta agcaatgaaa 3600
gcattactat attttttaca ttaagtggta ccaataaagt attttgttac caaaagctaa 3660
aaaaaaaaaa aaaaaa 3676
<210> 168
<211> 2314
<212> DNA
<213> 大鼠
<400> 168
atggtccgac gcgggctggt ggggtggatt tcccgggtag tgattctgct ggtgctgctc 60
tgttgtgcca tctctgttct ctacatgtta gcctgcaccc caaaaggcga ccaagagcag 120
ctgggactgc cacgggccaa cggccccaca ggcaaagatg gctaccaagc ggtgctacag 180
gagcgtgagg aacagcatcg caactatgtg aatagtctta agcgacagat cgcgcagctc 240
aaggatgaac tgcaggcacg cagtgagcag ctccgcagtg ggcaggacca ggccagcgat 300
gccaccagcc tgcggtcagg ctgggaccct gaacccaaag cccaggctga tatactggcc 360
ttcctgcgtg ggcaggtgga caaggctgag gtccacgccg gtgtcaagct ggccaccgaa 420
tatgctgctg tgccttttga tagcttcact ctgcagaaag tataccagct ggagactggt 480
ctgacccgcc accctgagga gaaaccagtg aggaaggaca agcgagatga gctagtggaa 540
gctatcgaat cagccctgga gagtctaaac agccctgtgg aaagcagccc acaccagcgc 600
ccttacacgg ctgcagactt catagaaggg atctaccgaa cagaaaggga taaaggcact 660
ttgtatgagc tgaccttcaa aggggaccat aagcatgaat tccaacgact tgtcctattt 720
cgaccttttg gccccatcat gaaagtgaag aaggaaaagc tcaacatggc caacacactt 780
atcaacgtta tcgtgcccct agcgaggagg gtggacaagt tccggcactt catgcagaac 840
ttcagggaga tgtgcatcca acaagatggg agagttcatc ttaccgttgt ttattttggg 900
aaagaagaaa tgaatgaagt caaaggaata cttgaaaaca cttccaaggc tgccaatttt 960
agaaacttca ccttcatcca gctgaatgga gagttctccc ggggaaaggg actggatgtt 1020
ggagcccgct tctggaaggg aagtaatgtc gtgctctttt tctgtgatgt ggacatctac 1080
ttcacctctg agttcctcaa cacatgtagg ctgaacacac agccagggaa gaaggtattt 1140
tatccggttc ttttcagtca gtataaccct ggcataatct acggccatca tgatgctgtc 1200
cctgccctag aacagcagct ggtcataaag aaggaaacag gattttggag ggactttgga 1260
ttcggaatga cttgtcagta ccggtcagac ttcatcaaca taggtggatt tgacctggac 1320
atcaaaggct ggggcggtga agatgtgcac ctgtaccgga aatatctcca tagcaacctc 1380
atagtgatac gcacgcctgt acggggactt ttccaccttt ggcatgagaa gcactgtatg 1440
gatgaactga cccctgagca gtacaggatg tgcatgcaat caaaggctat gaatgaagca 1500
tcccacgggc agctgggaat gcttgtcttc cggcatgaaa tagaggctca ccttcgcaaa 1560
cagaagctca aagccagcag taaaaagaca tgacctccta ggtaaagatt agccaagacg 1620
tttaaatttt gtgcctttgg cagttactga agaagtagat gcaacaaggt atagacttcc 1680
acaaagggca acagagaatc tgactgatga gtgacagatg aatgaagagt ctcgggtttc 1740
tgttggctct gtgtatgctg gtgactctga ctgtgtttac agccaaatga gctctctggt 1800
ccctgctccc tgaaatagtc acaaccggtt tcagaaaacc agaaggagct gcaagcccac 1860
tgacttctct tctttggatt ggttacatca gagggctttg gtactactag gactaccaaa 1920
ggctcagatg gagctctcgg acggagcaga ggacctgtgt gaaaagtgga gctctgacat 1980
tagtgtcctc caccagaccg tgagcaaaat caaagggacc tggaaacaaa ccatccaaac 2040
tgtcatttcc ctagtattaa ctgaaaaaca aacaaacaaa caaacaaaaa ccctaaaaaa 2100
caaaaaaaag acaaaaacaa aaacaaaaaa caaagccaac aacaactaca acaaaaaccc 2160
ctctctttcc cattattgtt tagtcatctc tgttctaaaa atgcactttt tttgcttctg 2220
agcattatgc ttatttaatt acccatttcc aagccttagt aggagtacat tgtagtacac 2280
acatttttat gattttttta aagatttgtt ttta 2314
<210> 169
<211> 3636
<212> DNA
<213> 大鼠
<400> 169
catttcctcg cgcgcgccgg aagtggcggt gctccgcggc ggcgcgcggg gccagccagc 60
gcagggcgct ggccaggtgt acagctcccc agaggcggca gcgctgagcg gcgagcgcga 120
acagtcacca cccagataat ggattatata gaccagattg cgtagtgtgg atatcatggt 180
aacaatacag gaagtataaa tttctcactt ctgcaagtag tcatgactac tgaagaagga 240
atcttttaaa atgacagcag agctcatttg ggtacctctc atggaaatcc taattttgtt 300
tttaactttt ggtaactttt cgctgaagtc atgaacaagc aaagagcttg ccttgttagg 360
caaacacaca ctagtgagaa tgtctagaag aggaccgatt cttcacagcc ggacccagtg 420
gctgctggtg ggccttgctt tgcttttcag tctagtatta tttatgtacc tcctggaatg 480
tgccccccag actgatggaa atgcttctct ccctggtgtg gttagagaaa attatggtaa 540
agaatattac caagccctcc tgcaggagca agaagaacat taccaaacca gggcaaccag 600
tttgaaacgc cagattgccc agctaaagca agaactacaa gatatgagtg agaagatgag 660
agccttgcaa gagaggaaga agctaggggc taacggcata ggctatcagg gcaacagaga 720
gcagacaccc agcgacctct tagagtttct tcattcccag atcgacagag ctgaagtcag 780
cataggggcc aaactaccca gtgagtatgg agtcgttccc tttgaaagtt ttactttaat 840
gaaagtattt cagttggaaa tgggtctcac gcgccatcct gaagaaaagc cagttagaaa 900
agacaaacga gatgaattgg tagaagttat tgaagctggc ttggaggtca ttaataatcc 960
tgatgaagat gatgaacagg aagatgagga gggccccctt ggagagaaac tgatatttaa 1020
tgaaaatgac ttcatagaag gctattaccg cactgagaga gataaaggca cgcactatga 1080
gctgtttttt aagaaggcag accttatgga atacaggcat gtgaccctct tccgcccttt 1140
cggacctctc atgaaagtga agagcgagct gattgacatt acaagatcgg ttattaatat 1200
cattgtgccg cttgctgaga ggacagaagc cttttcacag tttatgcaga acttcagaga 1260
tgtttgtatt catcaagaca agagaattca tctcaccgtt gtgtattttg ggaaagaagg 1320
actatctaca gtcaagtcta ttctagaatc tgtctcaagt gagtctaatt ttcacaatta 1380
caccttggtc tcattgaacg aagaatttaa tcgtggacga ggactaaatg tgggtgcccg 1440
aacttgggac aagggagagg tcttgatgtt tttctgtgat gttgatatat atttctcagc 1500
tgaattcctt aacagctgcc ggttaaatgc tgagccaggt aaaaaagtgt tttaccccgt 1560
ggtgttcagt ctttacaacc ctgccatcgt ctatgccaac caggaagtgc cacctcccgt 1620
ggagcagcag ctggttcata aaaaggactc tggtttttgg agagattttg gctttgggat 1680
gacgtgtcaa tatcaatcag attttctgag tgtcggtgga ttcgacatgg aagtaaaagg 1740
ctggggtgga gaagatgttc atctttaccg aaagtactta catggtgatc ttattgtgat 1800
tcggactcca gttcctggcc ttttccacct ctggcatgag aaacactgtg cggacgagct 1860
gacccctgag caataccgaa tgtgcatcca atccaaagcc atgaacgagg cctctcactc 1920
ccacctggga atgatggtct tcagggagga aatagagatg cacctccgca aacaggcgta 1980
cagaaccaac agcgaggccg ctgggtgaca ggcagcgcat gggagtctga gccacaagcc 2040
agcactgttt attcagcctt aactccaact ctagattctg tgcctcttcc agagaaggct 2100
ttgcccatgt tctttctgaa ataatctgta gctcaacttg atgtaagaag aaaatgcagg 2160
cgtcttgatg gaaagcctgc gctgtgaagg tactgtggta tgcaccagtt gacaaagtga 2220
aattgatatt tgtccccaaa tcgtttgaat tagactctgc ctggtacctg tattctgatt 2280
ggtcgtggat gtgcgcaagg ctgatgttgg gttggctagc accctcctcc agggtacaga 2340
gtattggctg gtcatggtgt tcaggtggct atcacctgct gaccactaag ccagtcactc 2400
gacttgagtc tttaaatgaa gcttttattg atcatatgta gaaaattttt cacagagaat 2460
aattaacata tctgaaacct gcagtccttc atgaaggcat aaatctaaac cccttagttt 2520
tatgttgctt tacctctaaa tatattttta agcaaatgga tatagtacat ttaatttaga 2580
atttatggtt tgattataaa taaaatatat tgttatgtta ccaatgttca gaatgcatag 2640
tcaaactgtc atagattgtt ttgagcattt tattatattg gaatgcagga aagtagctgt 2700
gtttggaaca tcattttata taagccagat gtatcagaac cttcctgaag agacacagaa 2760
gatatgaaca ttatagcatg gttttgtatg cttttgtttg cactgtcttg tttagcatag 2820
ctacatatat atttattttc tagtatgtta atttttgcca caaatttgct agcatttgta 2880
ttatacttcc agttgaaaga gttttattga aaaaaaaacc aatttaatgt gttatataat 2940
aagatcaccc ttgatttaag aaaagtaatc tgataaaaat atgaattatg gagtacttta 3000
aaaaacatgt acagattaat gctattttaa ttgaaatgta aattatttta atgagacaag 3060
atgaataaga aattatgttc cggtagaact gtactataat atttatcaca catggatatt 3120
ttatcatccg gccatcactt gatcaggaac tggcactatg gcgagggcgg gcttgctttc 3180
atagcccttg actcttacag ggctatttgt atatagccca tgcgaactcg gaaagtcact 3240
gtttggttca gtaaatcagc cacctcagac gtgacaaatg ccaaatctct aggtgctaag 3300
gtgagtccac tccaatggta gctaactgct gagggctccg ggagtgcgag gtgttttaag 3360
atgtataaag tgctctctgc agaataagca gagccaatgt ctcctttgta cacacttatt 3420
tattgtaaag agcagtgacc atggtattta aagttagggt acttagtgat ttataaaggt 3480
ggtttcagct tggttttgag ataatcaaat gatttttact ttaactccta tttttttaaa 3540
actagctttt atttgaagat gggagctaag atttgaaagc attactatat tttttacatt 3600
aagtggtacc aataaagtat tttgttacca aaagcc 3636
<210> 170
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 170
gagtcaacgg atttggtcgt 20
<210> 171
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 171
gacaagcttc ccgttctcag 20
<210> 172
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 172
tcagggagat gtgcattgag 20
<210> 173
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 173
agttggcagc tttggaagtg 20
<210> 174
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 174
ggagaccctg aacagtcctg 20
<210> 175
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 175
gccgtttgaa ttcgtgtttg 20
<210> 176
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 176
gccattgttt atgccaacca 20
<210> 177
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 177
atccaccaat ggtcaggaaa 20
<210> 178
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 178
tcctagaatc tgtcaccagt gag 23
<210> 179
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 179
acatcaagac ctctcccttg tc 22
<210> 180
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 180
tgcaccacca actgcttag 19
<210> 181
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 181
gatgcaggga tgatgttc 18
<210> 182
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 182
ccaatttcag aaacttcacc ttcat 25
<210> 183
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 183
tgttcagcct acaagtgttg ag 22
<210> 184
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 184
ttaatatcat tgtgccactt gcg 23
<210> 185
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 185
tagaatagac ttgactttag atagtcctt 29
<210> 186
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 186
gaaaactaaa atgag 15

Claims (18)

1.一种反义寡核苷酸，所述反义寡核苷酸具有至少1个抑制硫酸软骨素N-乙酰氨基半乳糖转移酶-1即CSGalNAcT1基因及硫酸软骨素N-乙酰氨基半乳糖转移酶-2即CSGalNAcT2基因中的一方或双方的表达的修饰核苷酸。
2.根据权利要求1所述的反义寡核苷酸，其中，
所述反义寡核苷酸包含选自由序列号1～3、5～111、113、115、116、119～123、125、131～137、139～145、148～151、153、154、161、及162构成的组的序列中的11～15个连续的核酸碱基序列或在所述核酸碱基序列中1个或者2个核酸碱基被取代、缺失或者插入而得到的核酸碱基序列。
3.根据权利要求2所述的反义寡核苷酸，其中，
所述反义寡核苷酸包含选自由序列号1、9、16、18、21～30、35、37、39、40、49～52、54、55、57～59、62、63、67、88、89、102、107、108、113、115、134、140、141、144、154、161及162构成的组的序列中的11～15个连续的核酸碱基序列或在所述核酸碱基序列中1个或者2个核酸碱基被取代、缺失或者插入而得到的核酸碱基序列。
4.根据权利要求1所述的反义寡核苷酸，其中，
所述反义寡核苷酸包含选自由序列号18、35、52、57、88、108、113、115、134、140、141、142、154、155、156、161及162构成的组的序列中的11～15个连续的核酸碱基序列或在所述核酸碱基序列中1个或者2个核酸碱基被取代、缺失或者插入而得到的核酸碱基序列。
5.根据权利要求1所述的反义寡核苷酸，其中，
所述反义寡核苷酸由相对于CSGalNAcT1 mRNA的一部分没有错配或具有1个～4个错配且相对于CSGalNAcT2 mRNA的一部分没有错配或具有1个～4个错配的核酸碱基序列构成。
6.根据权利要求5所述的反义寡核苷酸，其中，
所述反义寡核苷酸由相对于CSGalNAcT1 mRNA的一部分没有错配且相对于CSGalNAcT2mRNA的一部分具有1个～4个错配的核酸碱基序列构成。
7.根据权利要求5所述的反义寡核苷酸，其中，
所述反义寡核苷酸由相对于CSGalNAcT1 mRNA的一部分具有1个～4个错配且相对于CSGalNAcT2 mRNA的一部分没有错配的核酸碱基序列构成。
8.根据权利要求5所述的反义寡核苷酸，其中，
所述反义寡核苷酸由相对于CSGalNAcT1 mRNA的一部分没有错配且相对于CSGalNAcT2mRNA的一部分没有错配的核酸碱基序列构成。
9.根据权利要求2所述的反义寡核苷酸，其中，
所述反义寡核苷酸包含选自由序列号1～3、5～58、108～111、113、115、116、119～123、125、161及162构成的组的序列中的11～15个连续的核酸碱基序列或在所述核酸碱基序列中1个或者2个核酸碱基被取代、缺失或者插入而得到的核酸碱基序列，且由相对于序列号164所示的序列的一部分没有错配或具有1个～4个错配的核酸碱基序列构成。
10.根据权利要求2所述的反义寡核苷酸，其中，
所述反义寡核苷酸包含选自由序列号49～107、131～137、139～145、148～151、153及154构成的组的序列中的11～15个连续的核酸碱基序列或在所述核酸碱基序列中1个或者2个核酸碱基被取代、缺失或者插入而得到的核酸碱基序列，且由相对于序列号165所示的序列的一部分没有错配或具有1个～4个错配的核酸碱基序列构成。
11.根据权利要求1～10中任一项所述的反义寡核苷酸，其中，
所述反义寡核苷酸抑制CSGalNAcT1基因及CSGalNAcT2基因中的一方或双方的表达的20％以上。
12.根据权利要求1～11中任一项所述的反义寡核苷酸，其中，
所述反义寡核苷酸为11～20碱基长度。
13.根据权利要求1～12中任一项所述的反义寡核苷酸，其中，
修饰核苷酸包含双环糖。
14.根据权利要求1～13中任一项所述的反义寡核苷酸，其中，
至少1个核苷间连接键为硫代磷酸酯键。
15.根据权利要求1～14中任一项所述的反义寡核苷酸，其中，
修饰核苷酸包含5-甲基胞嘧啶。
16.根据权利要求1～15中任一项所述的反义寡核苷酸，其中，
所述反义寡核苷酸为缺口聚体。
17.一种药物组合物，所述药物组合物包含用于治疗与硫酸软骨素的增加相关的疾病或病症的权利要求1～16中任一项所述的反义寡核苷酸。
18.根据权利要求17所示的药物组合物，其中，
所述疾病或病症为脊髓损伤。
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