JP4579911B2 - スルビビン発現の調節 - Google Patents
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Description
本発明はスルビビン発現を調節する組成物および方法を提供する。特に、本発明はアンチセンス化合物、具体的にはヒトスルビビンをコード化する核酸とのハイブリッド形成が可能な二本鎖オリゴヌクレオチドに関する。このようなオリゴヌクレオチドは、スルビビン発現を調節することが証明されている。
癌性細胞の顕著な特徴は無制限に増殖することである。腫瘍と正常細胞の違いとして、アポトーシスとしても知られるプログラム細胞死のプロセスに対する抵抗力が確認されている(アンブロシーニ(Ambrosini)ら、ネイチャーメディスン(Nat.Med.)、1997、3、917-921)。アポトーシスは、多細胞生物が細胞の無制限増殖を避け、疾患細胞、有害細胞、または必要でなくなった細胞を排除するために発達させたプロセスである。アポトーシスのプロセスは、タンパク質分解酵素およびDNAエンドヌクレアーゼの協奏的作用を通じて細胞がその内部から分解され、その結果アポトーシス体が形成され、その後スカベンジャー細胞によってアポトーシス体が除去されるという多段階カスケードを含む。今日までの研究で、大部分の細胞内分解が、アスパラギン酸塩の残基付近で開裂するタンパク質分解酵素群系カスパーゼの作用を通じて行われることが証明されている(コーヘン(Cohen)、バイオケミストリージャーナル(Biochemistry Journal)、1997、326、1-16)。
本発明はオリゴマー化合物、特にスルビビンをコード化する核酸をターゲットとし、スルビビンの発現を調節する一本鎖および二本鎖アンチセンス化合物を対象とする。幾つかの実施態様において、当該アンチセンス化合物はオリゴヌクレオチドである。幾つかの実施態様において、当該オリゴヌクレオチドはRNAiオリゴヌクレオチド(主にRNAまたはRNA様)である。他の実施態様において、当該オリゴヌクレオチドはRNase Hオリゴヌクレオチド(主にDNAまたはDNA様)である。さらに他の実施態様において、当該オリゴヌクレオチドは化学的に修飾されていてもよい。本発明のアンチセンス化合物を含む医薬組成物および他の組成物も提供される。さらに、細胞または組織を、1つまたは複数の本発明のアンチセンス化合物または組成物と接触させることを含む、前記細胞または組織におけるスルビビンの発現を調節する方法も提供される。さらに、スルビビンの発現に関連する病気または症状を持つ、またはそれらが起こりやすいと疑われる動物、特にヒトを、治療上または予防上効果のある量の1つまたは複数の本発明のオリゴヌクレオチドまたは組成物を投与することによって処置する方法も提供する。別の実施態様において、本発明は、ここに開示する任意且つすべての病状について処置するための医薬物の製造に使用するために、本発明の化合物を提供する。
本発明は、二本鎖および一本鎖オリゴマーアンチセンス化合物、特にRNAまたはRNA様の一本鎖または二本鎖オリゴヌクレオチド、およびDNAまたはDNA様の一本鎖または二本鎖オリゴヌクレオチドを、スルビビンをコード化する核酸分子の機能の調節、ひいては生成されるスルビビン量の調節に使用する。これは、特にスルビビンをコード化する1つまたは複数の核酸とハイブリッド形成するアンチセンス化合物を提供することによって実現できる。ここで使用する「ターゲット核酸」および「スルビビンをコード化する核酸」という用語は、スルビビンをコード化するDNA、そのようなDNAから転写されたRNA(mRNA前駆体およびmRNAまたはその一部を含む)、またそのようなRNAから派生するcDNAを含む。オリゴマー化合物とその相補的なセンス方向ターゲット核酸と特異的なハイブリッド形成は、核酸の正常機能に干渉する。ターゲット核酸を特異的にハイブリッド形成する化合物によるターゲット核酸の機能調節を一般に「アンチセンス」といい、かかる化合物はターゲットに関して「アンチセンス方向」にあると表現することができる。
本発明との関連において、「オリゴマー化合物」という用語は核酸分子の領域に対してハイブリッド形成できるポリマー構造を示す。この用語は、オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオシド、オリゴヌクレオチド類似体、オリゴヌクレオチド模倣体、およびこれらのキメラ化合物を含む。オリゴマー化合物は、通常線形に生成されるが、結合するか、または円状に生成することができ、また分岐を含んでもよい。オリゴマー化合物は二本鎖構造、例えば、二本鎖化合物を形成するようにハイブリッド形成された二本の鎖、あるいは完全または部分的な二本鎖化合物のハイブリッド形成および形成に十分な自己相補性を持つ一本鎖を含む。本発明の一実施態様において、二本鎖アンチセンス化合物は、短鎖干渉RNA(siRNA)を包含する。ここで使用する「siRNA」は、第一鎖および第二鎖を持つ二本鎖化合物として定義され、前記第一鎖、第二鎖の間に中央相補部を備え、前記第一鎖、第二鎖の間またはターゲットmRNAと任意の相補性を持つ末端部を備える。各鎖は、約8から約80核酸塩基長、10から50核酸塩基長、12から30核酸塩基長、12から24核酸塩基長または19から23核酸塩基長であってよい。当該中央相補部位は、約8から約80核酸塩基長、10から50核酸塩基長、12から30核酸塩基長、12から24核酸塩基長または19から23核酸塩基長であってよい。末端部分は、1から6核酸塩基長となる。当該siRNAは末端部を持たなくてもよい。siRNAの二本の鎖は、フリーな3’または5’末端を残して内的に結合するか、または連続的なヘアピン構造またはループを形成するように結合できる。当該ヘアピン構造は、一本鎖形質を延長して、5’または3’末端のいずれかにオーバーハングを含んでよい。
オリゴマー化合物のすべての位置が一様に修飾される必要はない。実際、1つ以上の前記修飾を単一のオリゴマー化合物またはオリゴマー化合物内のヌクレオシドのような単一の単量体サブユニットにさえも組み込むことができる。本発明は、キメラオリゴマー化合物であるオリゴマー化合物も含む。本発明との関連において、「キメラ」オリゴマー化合物または「キメラ」は、2つ以上の化学的に異なる領域を含むオリゴマー化合物である。各領域は、少なくとも1つの単量体ユニット(すなわち、核酸塩基オリゴマーの場合はヌクレオチド)を含んで構成される。
本発明に基づく別のオリゴマー化合物グループは、オリゴヌクレオチド模倣体を含む。模倣体という用語は、オリゴヌクレオチドに適用されるため、オリゴマー化合物を含むことを意図している。ここで、フラノース環または当該フラノース環とインターヌクレオチドの結合は、新規のグループと置き換えられる。フラノース環のみの置換は、当該技術分野において、糖の代理を意味する。複素環塩基部分または修飾複素環塩基部分は、適切なターゲット核酸とのハイブリダイゼーションのために維持される。
Bxは、複素環塩基部分であり、
T4は、水素、アミノ保護基、-C(O)R5、置換または非置換C1-C10アルキル、置換または非置換C2-C10アルケニル、置換または非置換C2-C10アルキニル、アルキルスルホニル、アリールスルホニル、化学的官能基、レポーター基、共役基、α-カルボキシル基を介するか、または所望によりアミノ酸がアスパラギン酸、またはグルタミン酸である場合にω-カルボキシル基を介して結合されるDまたはLα-アミノ酸、またはカルボキシル基を介して結合されるD、L、またはDおよびLの混合アミノ酸から派生したペプチドであり、ここで該置換基はヒドロキシル、アミノ、アルコキシ、カルボキシ、ベンジル、フェニル、ニトロ、チオール、チオアルコキシ、ハロゲン、アルキル、アリール、アルケニル、およびアルキニルから選択される、
T5は、-OH、-N(Z1)Z2、R5、α-アミノ基を介するか、または所望により、該アミノ酸がリジンまたはオルニチンである場合に、ω-アミノ基を介して結合されるDまたはLα-アミノ酸、またはアミノ基を介して結合されるD、L、またはDおよびLの混合アミノ酸から派生したペプチド、化学的官能基、レポーター基または共役基であり;Z1は水素、C1-C6アルキルまたはアミノ保護基であり;Z2は水素、C1-C6アルキル、アミノ保護基、-C(=O)-(CH2)n-J-Z3、α-カルボキシル基を介して、または所望により該アミノ酸がアスパラギン酸またはグルタミン酸である場合に、ω-カルボキシル基を介して結合されるDまたはLα-アミノ酸、またはカルボキシル基を介して結合されるD、LまたはDとLの混合アミノ酸から派生するペプチドであり;Z3は水素、アミノ保護基、-C1-C6アルキル、-C(=O)-CH3、ベンジル、ベンゾイルまたは-(CH2)n-N(H)Z1であり;各JはO、SまたはNHであり;R5はカルボニル保護基であり、
nは7から約79である。
T1は水素、ヒドロキシル、保護ヒドロキシル、結合ヌクレオシドまたは結合オリゴマー化合物であり
T5は、水素またはリン酸塩、リン酸塩誘導体、結合ヌクレオシドまたは結合オリゴマー化合物であり、
L2は、キラルからアキラル、帯電からニュートラルに変えることができる連結基[米国特許5,166,315では-O-P(=O)(N(CH3)2)-O-を含む連結を開示している;米国特許5,034,506では、アキラルインターモルホリノ結合、例えば-S(=O)-X-(XはNH、NCH3、O、SまたはCH2である)、-C(=Y)-O-(YはOまたはSである)、-S(=O)(OH)-CH2-、-S(=O)(OH)-N(R)-CH2-(RはHまたはCH3である)を開示している;また米国特許5,185,444では、キラルインターモルホリノ結合、例えば-P(=O)(-X)-O-(Xは、F、CH2R、S-CH2RまたはNR1R2であって、各々R、R1およびR2は、H、CH3または塩基特異的な水素結合と干渉しないその他の部分である)を含むリンを開示している]であり、
nは7から約79である。
ここで、
各々Bxは、複素環塩基部分であり、
L3は、例えばホスホジエステル結合またはホスホロチオエート結合などの内部シクロヘキセニル結合であり、
T1は、水素、ヒドロキシル、保護ヒドロキシル、結合ヌクレオシドまたは結合オリゴマー化合物であり、
T2は、水素またはリン酸塩、リン酸塩誘導体、結合ヌクレオシドまたは結合オリゴマー化合物である。
各々Bxは、複素環塩基部分であり、
Lは、例えばホスホジエステルまたはホスホロチオエート結合などの内部無水ヘキシトール結合であり、
T1は、水素、ヒドロキシル、保護ヒドロキシル、結合ヌクレオシドまたは結合オリゴマー化合物であり、
T2は、水素またはリン酸塩、リン酸塩誘導体、結合ヌクレオシドまたは結合オリゴマー化合物である。
ここで、
T1およびT2は、それぞれ独立して、水素、ヒドロキシル保護基、結合ヌクレオシドまたは結合オリゴマー化合物であり、
各々Z1は、例えばホスホジエステルまたはホスホロチオエートなどのインターヌクレオシド連結基である。
本発明において有効なアンチセンスオリゴマー化合物の修飾インターヌクレオシド結合の特定例は、修飾された(例えば非天然の)インターヌクレオシド結合を含むオリゴヌクレオチドを含む。本明細書で定義するように、修飾インターヌクレオシド結合を持つオリゴヌクレオチドは、リン原子を保持するインターヌクレオシド結合、およびリン原子を持たないインターヌクレオシド結合を含む。本明細書の目的において、また当該技術分野においてしばしば参照されるように、そのインターヌクレオシド骨格にリン原子を持たない修飾オリゴヌクレオチドもオリゴヌクレオシドとして考慮できる。
本発明のオリゴマー化合物は、1つまたは複数の置換糖部分または修飾糖部分も含む。リボシルおよび関連する糖部分は通常、結合に関与しない任意の反応部位で修飾される。従って、糖置換基の適切な位置は2’-位であり、通常、自然な3’−5’−インターヌクレオシド結合では使用されない。他の適切な位置は3’および5’-末端である。3’-糖位は、2つの隣接糖ユニット間の結合が2’,5’-結合である場合、自由に修飾することができる。糖置換基は、OH;F;O-、S-、またはN-アルキル;O-、S-、またはN-アルケニル;O-、S-、またはN-アルキニル;またはO-アルキル-O-アルキルを含む。ここで、アルキル、アルケニルおよびアルキニルは、置換または非置換C1からC10アルキルまたはC2からC10アルケニルおよびアルキニルであってよい。特に適しているのは、O((CH2)nO)mCH3、O(CH2)nOCH3、O(CH2)nNH2、O(CH2)nCH3、O(CH2)nONH2、およびO(CH2)nON((CH2)nCH3)2である。ここで、nおよびmは1〜約10である。他の適切なオリゴヌクレオチドは、C1からC10低アルキル、置換低アルキル、アルケニル、アルキニル、アルカリル(alkaryl)、アラルキル、O-アルカリルまたはO-アラルキル、SH、SCH3、OCN、Cl、Br、CN、CF3、OCF3、SOCH3、SO2CH3、ONO2、NO2、N3、NH2、複素環アルキル、複素環アルカリル、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリル、RNA開裂基、レポーター基、挿入剤、オリゴヌクレオチドの薬物動態特性を改善する基、またはオリゴヌクレオチドの薬理学的特性を改善する基、および同様の特性を持つ他の置換基から選択した糖置換基で構成される。
Rbは、O、SまたはNHであり、
Rdは、単結合、O、SまたはC(=O)であり、
Reは、C1−C10アルキル、N(Rk)(Rm)、N(Rk)(Rn)、N=C(Rp)(Rq)、N=C(Rp)(Rr)であるか、または化学式IIIa
RpおよびRqは、独立して、水素またはC1−C10アルキルであり、
Rrは-Rx-Ryであり、
各々Rs、Rt、RuおよびRvは、独立して水素、C(O)Rw、置換または非置換C1-C10アルキル、置換または非置換C2-C10アルケニル、置換または非置換C2-C10アルキニル、アルキルスルホニル、アリールスルホニル、化学的官能基または共役基であって、該置換基はヒドロキシル、アミノ、アルコキシ、カルボキシ、ベンジル、フェニル、ニトロ、チオール、チオアルコキシ、ハロゲン、アルキル、アリール、アルケニルおよびアルキニルから選択されるか、または所望により、RuおよびRvは、一体となってそれらが結合している窒素と共にフタルイミド部分を形成し、各々Rwは、独立して、置換または非置換C1−C10アルキル、トリフルオロメチル、シアノエチルオキシ、メトキシ、エトキシ、t-ブトキシ、アリルオキシ、9-フルオレニルメトキシ、2-(トリメチルシリル)-エトキシ、2,2,2−トリクロロエトキシ、ベンジルオキシ、ブチリル、イソ-ブチリル、フェニルまたはアリールである]であり、
Rkは、水素、窒素保護基または-Rx-Ry
[Rxは、結合または連結部分であり、
Ryは、化学的官能基、共役基または固定支持媒体であり、各々RmおよびRnは、水素、窒素保護基、置換または非置換C1-C10アルキル、置換または非置換C2-C10アルケニル、置換または非置換C2-C10アルキニル(ここで該置換基は、ヒドロキシル、アミノ、アルコキシ、カルボキシ、ベンジル、フェニル、ニトロ、チオール、チオアルコキシ、ハロゲン、アルキル、アリール、アルケニル、アルキニルである)、NH3+、N(Ru)(Rv)、グアニジノおよびアシルであり、前記アシルは酸アミドまたはエステルである]であるか、または
RkおよびRmが、一緒に、窒素保護基であるか、NおよびOから選択される追加ヘテロ原子を所望により含む環構造に結合されているか、または化学的官能基である、
Riは、ORz、SRz、またはN(Rz)2であり、各々Rzは、水素、C1-C8アルキル、C1-C8ハロアルキル、C(=NH)N(H)Ru、C(=O)N(H)RuまたはOC(=O)N(H)Ruであり、
Rf、RgおよびRhは、約4から約7の炭素原子または約3から約6の炭素原子を有する環系、および1または2のヘテロ原子を含み、該ヘテロ原子は酸素、窒素および硫黄から選択され、前記環系は脂肪族、不飽和脂肪族、芳香族、または飽和あるいは不飽和複素環である、
Rjは、1から約10個の炭素原子を持つアルキルまたはハロアルキル、2から約10個の炭素原子を持つアルケニル、2から約10個の炭素原子を持つアルキニル、6から約14個の炭素原子を持つアリール、N(Rk)(Rm)ORk、ハロ、SRkまたはCNであり、
maは1〜約10であり、
各mbはそれぞれ0または1であり、
mcは0または1から10の整数であり、
mdは1から10の整数であり、
meは0、1または2である、ただしmcが0である場合、mdは1より大きい。
オリゴマー化合物は、核酸塩基(当該技術分野において、しばしば単に「塩基」または「複素環塩基部分」と呼ばれる)、修飾または置換も含む。ここで使用する「未修飾」または「天然」核酸塩基は、プリン塩基アデニン(A)およびグアニン(G)、およびピリミジン塩基チミン(T)、シトシン(C)およびウラシル(U)を含む。ここで複素環塩基部分と呼ばれる修飾核酸塩基は、5-メチルシトシン(5-me-C)、5-ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ハイポキサンチン、2-アミノアデニン、6-メチル、アデニンおよびグアニンの他のアルキル誘導体、2-プロピルおよびアデニンとグアニンの他のアルキル誘導体、2-チオウラシル、2-チオチミンおよび2-チオシトシン、5-ハロウラシルおよびシトシン、5-プロピニル(-C=C-CH3)ウラシルおよびシトシンおよびピリミジン塩基の他のアルキニル誘導体、6-アゾウラシル、シトシンおよびチミン、5-ウラシル(偽ウラシル)、4-チオウラシル、8-ハロ、8-アミノ、8-チオール、8-チオアルキル、8-ヒドロキシルおよび他の8-置換アデニンおよびグアニン、5-ハロ、特に5-ブロモ、5-トリフルオロメチルおよび他の5-置換ウラシルおよびシトシン、7-メチルグアニンおよび7-メチルアデニン、2-F-アデニン、2-アミノ-アデニン、8-アザグアニンおよび8-アザアデニン、7-デアザグアニンおよび7-デアザアデニンおよび3-デアザグアニンおよび3-デアザアデニン等、他の合成および天然核酸塩基も含む。
本発明の組成物で使用される共役オリゴマー化合物は、結果として生じるオリゴマー化合物の活性、細胞分配または細胞取り込みを強化するため、1つまたは複数の部分または共役体を持つように修飾することもできる。一実施態様において、そのような修飾オリゴマー化合物は、共役基をヒドロキシルまたはアミノ基などの官能基に共有結合することによって生成される。本発明の共役基は、挿入剤、レポーター分子、ポリアミン、ポリアミド、ポリエチレングリコール、ポリエーテル、オリゴマーの薬理学的特性を強化する基、およびオリゴマーの薬物動態を強化する基を含む。典型的な共役基は、コレステロール、脂質、リン脂質、ビオチン、フェナジン、フォレート、フェナンスリジン、アントラキン、アクリジン、フルオレセイン、ローダミン、クマリン、およびCy3およびAlexaを含むような色素を含む。本発明との関連において、薬理学的特性を強化する基は、オリゴマーの取り込みを改善し、分解に対するオリゴマー抵抗を強化して、および/またはRNAとの配列特異的ハイブリッド形成を強化する基を含む。本発明との関連において、薬物動態特性を強化する基は、オリゴマーの取り込み、分配、代謝または排出を改善する基を含む。代表的な共役基は1992年10月23日出願の国際特許出願PCT/US92/09196において開示されている。参照することによりその開示内容全体が本書に組み込まれる。
3’-エンド修飾
(配座スキーム)
ここに別段の定義がない限り、C1-C12、C1-C8、またはC1-C6、直鎖または(可能であれば)分岐鎖脂肪族炭化水素を意味する。
修飾および未修飾ヌクレオシドのオリゴマー化はDNA(オリゴヌクレオチドおよびアナログのプロトコル(Protocols for Oligonucleotides and Analogs)、編.Agrawal(1993)、Humana Press)および/またはRNA(スカリンジ(Scaringe)、メソッド(Methods)(2001)、23、206-217.ゲイト(Gait)ら、RNAにおける化学生成RNAの応用:タンパク質相互作用(Applications of Chemically synthesized RNA in RNA:Protein Interactions)、編.スミス(Smith)(1998)、1-36、ガロ(Gallo)ら、テトラヒドロン(Tetrahedron)(2001)、57、5707-5713)合成の文献手順に適宜従って実施される。さらに、本発明のオリゴマー化合物の合成に対する特定のプロトコルは、以下の例に示されている。
本発明のオリゴマー化合物は任意の医薬的に許容し得る塩、エステル、またはそのようなエステルの塩、またはヒトを含む動物に投与する際に、生物学的活性代謝物またはその残基を(直接的または間接的に)提供できる任意の他の化合物を含む。従って、本発明の化合物のプロドラッグおよび医薬的に許容し得る塩、そのプロドラッグの医薬的に許容し得る塩、および他の生物学的同等物も開示される。
(実施例)
2’-デオキシおよび2’-メトキシβ-シアノエチルジイソプロピルホスホルアミダイトは、製造販売元から購入した(例えば、マサチューセッツ州ニードハンのケムジーン社(Chemgenes)社、またはバージニア州スターリングのグレンリサーチ(Glen Research,Inc.)社)。他の2’-O-アルコキシ置換ヌクレオシドアミダイトは、米国特許5,506,351に記載のとおり生成される。この特許は、参照することによりここに組み込まれる。2’-アルコキシアミダイトを使用して合成されたオリゴヌクレオチドの場合、テトラゾールおよび塩基のパルス送達後の待機段階が360秒まで増加することを除いて、未修飾オリゴヌクレオチドの標準周期が使用される。
2’-フルオロデオキシアデノシンアミダイト
2’-フルオロオリゴヌクレオチドは、前述の(カワサキ(Kawasaki)ら、ジャーナル・オブ・メディカル・ケミストリー(J。 Med.Chem.)、1993、36、831-841)および米国特許5,670,633に記載のとおり合成した。これらは参照することによりここに組み込まれる。つまり、保護ヌクレオシドN6-ベンゾイル-2’-デオキシ-2’-フルオロアデノシンは、購入可能な9-β-D-アラビノフラノシルアデニンを出発物質として使用し、文献の手順を修飾することによって合成される。ここで、2’-α-フルオロ原子が2’-β-トリチル基のSN2-置換に導入される。このため、N6-ベンゾイル-9-β-D-アラビノフラノシルアデニンが、3’、5’-ジテトラヒドロピラニル(THP)中間体として中間収率において選択的に保護される。THPおよびN6-ベンゾイル基の脱保護は、標準的な方法を使用して行った。また標準な方法を使用して、5’-ジメトキシトリチル-(DMT)および5’-DMT-3’-ホスホラミダイト中間体を得た。
2’-デオキシ-2’-フルオログアノシンの合成は、テトライソプロピルジシロキサニル(TPDS)保護9-β-D-アラビノフラノシルグアニンを出発物質として、また中間ジイソブチリルアラビノフラノシルグアノシンへの転換を使用して行った。THPを持つヒドロキシル基の保護に続いてTPDS基を脱保護し、ジイソブチリル2-THP保護アラビノフラノシルグアニンを得た。
2’-デオキシ-2’-フルオロウリヂンの合成は、文献の手順を修飾することによって行った。ここで、2,2’-無水素-1-β-D-アラビノフラノシルウラシルは、70%水素フッ化ピリジンで処理される。標準的な手順を使用して、5’-DMTおよび5’-DMT-3’ホスホラミダイトを得た。
2’-デオキシ-2’-フルオロウリジンのアミノ化を介して2’-デオキシ-2’-フルオロシチジンを合成した後、選択的保護によってN4-ベンゾイル-2’-デオキシ-2’-フルオロシチジンを得た。標準的な手順を使用して、5’-DMTおよび5’-DMT-3’ホスホラミダイトを得た。
2’-O-メトキシエチル-置換ヌクレオシドアミダイトは、以下のように生成するか、または代替としてマーティン、P(Martin,P.)、ヘルベチカ・シミカ・アクタ(Helvetica Chimica Scta)、1995、78、486-504の方法に従って生成した。
5-メチルウリジン(リボシルチミン、銚子市ヤマサ(Yamasa)社を通じて商業的に入手可能)(72.0g、0.279M)、ジフェニル炭酸塩(90.0g、0.420M)および重炭酸ナトリウム(2.0g、0.024M)をDMF(300mL)に加えた。その混合液を加熱し、攪拌しながら還流させた。これによって発生する二酸化炭素ガスを統制下で放出した。1時間後、わずかに暗くなった溶液を減圧下で濃縮した。結果として得られたシロップをジエチルエーテル(2.5L)に攪拌しながら注いだ。ガムが形成された。エーテルを静かに移し、残留物を最小量のメタノール(ca.400mL)に溶解した。この溶液を新たなエーテル(2.5L)に注ぎ、固いガムを生成した。このエーテルを静かに移し、ガムを真空オーブンで乾燥させた(1mmHgで60℃、24時間)。その結果、明るい黄褐色の粉末状に砕かれた固体が生成された(57g、粗製収率85%)。NMRスペクトラムは構造と一致し、そのナトリウム塩であるフェノールで汚染された(ca.5%)。この物質を、さらなる反応に使用した(または酢酸エチル中のメタノール勾配(10-25%)を使用し、カラムクロマトグラフィーによってさらに精製して、白色固体を得た。mp222-4℃)。
2,2’-無水-5-メチルウリジン(195g、0.81M)、トリス(2-メトキシエチル)ホウ酸塩(231g、0.98M)および2-メトキシエタノール(1.2L)を2Lステンレス鋼圧力容器に入れ、160℃に予熱したオイルバスに入れた。155から160℃で48時間加熱した後、容器を開けて溶液を蒸発乾固させ、MeOH(200mL)で磨砕した。残留物を熱いアセトン(1L)で懸濁した。不溶性の塩をろ過し、アセトン(150mL)で洗浄して、そのろ液を蒸発させた。その残留物(280g)をCH3CN(600mL)に溶解して蒸発させた。シリカゲルカラム(3kg)を0.5%Et3NHを含むCH2Cl2/アセトン/MeOH(20:5:3)に詰めた。その残留物をCH2Cl2(250mL)に溶解し、シリカ(150g)上に吸収させた後、カラムに乗せた。生成物をパッキング溶液とともに溶出し、160g(63%)の生成物を生じた。不純画分を再度処理することによって追加の物質が得られた。
2’-O-メトキシエチル-5-メチルウリジン(160g、0.506M)をピリジン(250mL)でと共に蒸発し、その乾燥残留物をピリジン(1.3L)に溶解した。ジメトキシトリチル塩化物の第一アリコート(94.3g、0.278M)を添加し、その混合物を室温で1時間攪拌した。ジメトキシトリチル塩化物の第二アリコート(94.3g、0.278M)を添加し、その反応液をさらに1時間攪拌した。次にメタノール(170mL)を加えて反応を止めた。HPLCは約70%の生成物の存在を示した。溶媒を蒸発させて、CH3CN(200mL)と共に磨砕した。残留物をCHCl3(1.5L)に溶解し、2x500mLの飽和NaHC03および2x500mLの飽和NaClで抽出した。有機相をNa2SO4で乾燥し、ろ過して蒸発させた。残留物275gを得た。この残留物を3.5kgシリカゲルカラム上で精製し、パックして、0.5% Et3NHを含むEtOAc/ヘキサン/アセトン(5:5:1)で溶出した。純粋画分を蒸発させ、164gの生成物を得た。不純画分からさらに約20gが得られ、合計収量は183g(57%)であった。
2’-O-メトキシエチル-5’-O-ジメトキシトリチル-5-メチルウリジン(106g、0.167M)、DMF/ピリジン(DMF562mLおよびピリジン188mLから生成した3:1混合物750mL)および無水酢酸(24.38mL、0.258M)を混合し、室温で24時間攪拌した。この反応を、MeOHの添加によりtlcサンプルをまず停止させ、tlcでモニターした。tlcから、反応が終了したと判断されたら、MeOH(50mL)を加え、混合液を35℃で蒸発させた。残留物をCHCl3(800mL)に溶解し、飽和重炭酸ナトリウム(2x200mL)および飽和NaCl(2x200mL)で抽出した。200mLのCHC13で水層を逆抽出した。合わせた有機体を硫酸ナトリウムで乾燥し、蒸発させて122gの残留物を得た(約90%の生成物)。残留物を3.5kgシリカゲルカラム上で精製し、EtOAc/ヘキサン(4:1)を使用して溶出した。純粋な生成物画分を蒸発させて96g(84%)を産出した。後者の画分からさらに1.5gが得られた。
最初の溶液を、CH3CN(700mL)に3’-O-アセチル-2’-O-メトキシエチル-5’-O-ジメトキシトリチル-5-メチルウリジン(96g、0.144M)を溶解することによって調製し、置いておく。
3’-O-アセチル-2’-O-メトキシエチル-5’-O-ジメトキシトリチル-5-メチル-4-トリアゾールウリジン(103g、0.141M)をジオキサン(500mL)およびNH40H(30mL)に加えた溶液を室温で2時間攪拌した。このジオキサン溶液を蒸発させ、その残留物をMeOH(2x200mL)で共沸混合した。この残留物をMeOH(300mL)に溶解し、2Lステンレス鋼圧力容器に移した。NH3ガスで飽和したMeOH(400mL)を加え、容器を2時間100℃まで加熱した(tlcは完全変換を示した)。容器の内容物を蒸発乾固させ、残留物をEtOAc(500mL)に溶解して、飽和NaCl(200mL)で一度洗浄した。有機物を硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶媒を蒸発させて85g(95%)の表題化合物を得た。
2’-O-メトキシエチル-5’-O-ジメトキシトリチル-5-メチルシチジン(85g、0.134M)をDMF(800mL)に溶解し、無水ベンゾイン(37.2g、0.165M)を加えて攪拌した。3時間攪拌した後、tlcは反応が約95%完了したことを示した。この溶媒を蒸発させて、残留物をMeOH(200mL)で共沸混合した。残留物をCHC13(700mL)でインキュベートし、飽和NaHCO3(2x300mL)および飽和NaCl(2x300mL)で抽出し、MgSO4で乾燥、蒸発させて残留物(96g)を得た。溶出溶媒として0.5% Et3NHを含むEtOAc/ヘキサン(1:1)を使用して、この残留物を1.5kgシリカカラムでクロマトグラフにかけた。純粋生成物の画分を蒸発させて90g(90%)の表題化合物を得た。
N4-ベンゾイル-2’-O-メトキシエチル-5’-O-ジメトキシトリチル-5-メチルシチジン(74g、0.10M)をCH2Cl2(1L)に溶解する。テトラゾールジイソプロピルアミン(7.1g)および2-シアノエトキシテトラ(イソプロピル)亜リン酸塩(40.5mL、0.123M)を窒素雰囲気下で攪拌しながら加えた。その結果生じる混合液を室温で20時間攪拌した(tlcは反応が95%完了したことを示した)。この反応混合液を飽和NaHCO3(1x300mL)および飽和NaCl(3x300mL)で抽出した。水性洗液をCH2Cl2(300mL)で逆抽出し、該抽出液を合わせてMgSO4で乾燥、濃縮した。溶出溶媒としてEtOAc/ヘキサン(3:1)を使用して、得られた残留物を1.5kgシリカカラムでクロマトグラフにかけた。純粋な画分を合わせて、90.6g(87%)の表題化合物を得た。
アミノオキシエチルおよびジメチルアミノオキシエチルアミダイトを米国特許6,127,533の方法に従って生成する。この特許は、参照することによりここに組み込まれる。
ヨウ素による酸化を用いた標準ホスホロアミダイト化学反応を使用して、未置換および置換リン酸ジエステル(P=O)オリゴヌクレオチドを自動DNAシンセサイザー(アプライド・バイオシステムズ(Applied Biosystems)モデル380B)で合成した。
MMI結合オリゴヌクレオシドとしても同定されたメチレンメチルイミノ結合オリゴヌクレシド、アミド-3結合オリゴヌクレオシドとしても同定されたメチレンジメチルヒドラゾ結合オリゴヌクレオシド、およびアミド-3結合オリゴヌクレオシドとしても同定されたメチレンカルボニルアミノ結合オリゴヌクレオシド、アミド-4結合オリゴヌクレオシドとしても同定されたメチレンアミノカルボニル結合オリゴヌクレオシド、さらにMMIの代わりにP=OまたはP=S結合を持つ混合骨格化合物は、米国特許5,378,825、5,386,023、5,489,677、5,602,240、および5,610,289に記載のとおり生成される。これらの特許は、すべてを参照することによりここに組み込まれる。本発明のオリゴマー化合物は、混合結合を構成してもよい。その混合結合において、任意の数の複数の型の結合が、例えば、ホスホロチオエート結合を含む5’ハーフの化合物およびホスホジエステル結合を含む3’ハーフ等のオリゴマー化合物内の任意の位置に任意の順序で存在する。これらは混合ホスホロチオエートおよびホスホジエステル結合と呼ばれる。
ペプチド核酸(PNA)は、ペプチド核酸(PNA):合成、特性、およびポテンシャルアプリケーション、バイオオーガニック・アンド・メディカル・ケミストリー(Bioorganic&Medicinal Chemistry)、1996、4、5-23において参照される様々な手順に従って生成される。また米国特許5,539,082、5,700,922、および5,719,262に従って生成してもよい。これらの特許は、参照することによりここに組み込まれる。
本発明のキメラオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオシドまたは混合オリゴヌクレオチド/オリゴヌクレオシドには、幾つかの異なるタイプがある。結合ヌクレオシドの「ギャップ」セグメントが結合ヌクレオシドの5’「翼」セグメントと3’「翼」セグメントの間に位置する第一タイプと「ギャップ」セグメントがオリゴマー化合物の3’または5’末端のいずれかに位置する第二「オープンエンド」タイプがある。第一タイプのオリゴヌクレオチドは、当該技術分野において「ギャップマー」またはギャップトオリゴヌクレオチドとして知られている。第二タイプのオリゴヌクレオチドは、当該技術分野において「ヘミマー」または「ウィングマー」として知られている。
2’-O-アルキルホスホロチオエートおよび2’-デオキシホスホロチオエートオリゴヌクレオチドセグメントを持つキメラオリゴヌクレオチドは、上記のアプライド・バイオシステムズ(Applied Biosystems)社製自動DNAシンセサイザーモデル380Bを使用して合成される。オリゴヌクレオチドは自動シンセサイザーを使用して、DNA部分の2’-デオキシ-5’-ジメトキシトリチル-3’-O-ホスホラミダイトおよび2’-MOE修飾ヌクレオチドの5’-ジメトキシトリチル-2’-O-メチル-3’-O-ホスホラミダイトで合成される。標準的な合成周期は、テトラゾールおよび塩基送達後の待機段階を、RNAの場合の4倍、2’-O-メチルの場合の2倍の時間である600秒まで増加させることによって修飾する。完全に保護されたオリゴヌクレオチドを支持体から切断し、リン酸基をアンモニア/エタノール(3:1)において室温で一晩脱保護した後、凍結乾燥した。メタノールアンモニアにおいて室温で24時間処理して脱保護した後、すべての塩基およびサンプルを再度凍結乾燥した。ペレットを1M TBAFのTHFにおいて室温で24時間懸濁して2’位を脱保護した。この反応を1M TEAAで停止させ、サンプルをロトバックによって半量まで減量した後、G25サイズ排除カラムで脱塩した。キャピラリー電気泳動および質量分析によって、回収されたオリゴの収率および純度を分光光度法的に分析した。
(2’-O-(2-メトキシエチル))-(2’-デオキシ)-(-2’-O-(メトキシエチル))キメラホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは、2’-O-メチルキメラオリゴヌクレオチドの場合、2’-O-メチルアミダイトの2’-O-(メトキシエチル)の置換基を用いて、上記の手順に従って生成する。
(2’-O-(2-メトキシエチル)ホスホジエステル)-(2’-デオキシホスホロチオエート)-(2’-O-(メトキシエチル)ホスホジエステル)キメラオリゴヌクレオチドは、2’-O-メチルアミダイトの2’-O-(メトキシエチル)アミダイト置換基を用いて2’−O-メチルキメラオリゴヌクレオチドの上記の手順に従って生成し、ヨウ素で酸化して、キメラ構造の翼部分にホスホジエステルインターヌクレオチド結合を生成する、また3,H-1,2ベンゾジチオール-3-オン 1,1ジオキサイド(ヴューケージ試薬(Beaucage Reagent))を使用して硫化し、中心ギャップのホスホロチオエートインターヌクレオチド結合を生成する。
一般に、RNA合成の化学的性質は、戦略的な中間体反応時に様々な保護基を選択的に組み込むことに基づく。当該技術分野における従来技術を有する者であれば、有機合成における保護基の使用を理解すると考えられるが、有効な保護基群はシリルエーテルを含む。特に、大量のシリルエーテルを使用して、2’-ヒドロキシル上にある酸に不安定なオルトエステル保護基と組み合わせて5’-ヒドロキシルを保護する。この保護基の組み合わせは、標準的な固相合成技術で使用される。他の合成段階がすべて終了した後、酸に不安定なオルトエステル保護基を最後に除去することが重要である。さらに、合成中にシリル保護基を早期使用することによって、必要な場合は、2’ヒドロキシルの望ましくない脱保護なしに容易に除去することができる。
制御されたコアガラスカラム(アプライド・バイオシステムズ(Applied Biosystems)社)から切断し、濃縮水酸化アンモニウムにおいて55℃で18時間脱ブロック化した後、2.5量エタノールを加えた0.5M NaClから二度沈殿させることによって、オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオシドを精製する。合成オリゴヌクレオチドをポリアクリルアミドゲル電気泳動によって、ゲルを変性しながら分析したところ、全長が少なくとも85%であると判定された。合成で得られたホスホロチオエートおよびホスホジエステル結合の相対量を、31P核磁気共鳴分光学によって定期的にチェックした。幾つかの研究では、チャン(Chiang)ら、ジャーナル・オブ・バイオケミカル(J.Biol.Chem.)1991、266、18162-18171に記載のように、オリゴヌクレオチドをHPLCによって精製した。HPLC精製物質で得られた結果は、非HPLC精製物質で得られた結果と類似していた。
オリゴヌクレオチドを固相P(III)ホスホラミダイト化学反応を介して、96配列を標準96ウェル形式で同時に組み立てることができる自動シンセサイザーで合成した。ホスホジエステルインターヌクレオチド結合は、水性ヨウ素を用いる酸化によって提供される。ホスホルチオエートインターヌクレオチド結合は、無水アセトニトリル中で3,H-1,2ベンゾジチオール-3-one 1,1ジオキサイド(ヴューケージ試薬(Beaucage Reagent))を使用して、硫化することによって生成した。標準的な塩基保護βシアノエチルジイソプロピルホスホラミダイトは、製造元から購入した(例えば、PE-アプライド・バイオシステムズ(PE-Applied Biosystems)社、カリフォルニア州フォスター市、またはファーマシア(Pharmacia)社、ニュージャージー州ピスカッタウェイ)。非標準ヌクレオシドは、周知の文献または特許された方法に従って合成される。これらを塩基保護βシアノエチルジイソプロピルホスホラミダイトとして使用する。
各ウェルにおけるオリゴヌクレオチドの濃度をサンプルの希釈およびUV光吸光度法によって検査した。個別の生成物の完全統合は、キャピラリー電気泳動(CE)によって、96ウェル形式で(ベックマン P(Beckman P)/ACEJ MDQ)または個別に生成されたサンプルの場合は、商業的CE装置(例えば、ベックマン P(Beckman P)/ACEJ5000、ABI270)のいずれかによって評価した。塩基および骨格の組成は、化合物の質量分析によって、エレクトロスプレー電気質量計を使用して確認した。すべてのアッセイテストプレートを単一および複数チャンネル自動分注器を使用してマスタープレートから希釈した。プレートについては、プレート上の化合物の少なくとも85%が、全長の少なくとも85%である場合に許容できると判断した。
アンチセンス化合物がターゲット核酸の発現に与える影響は、ターゲット核酸が測定可能なレベルで存在するなら、あらゆる様々な細胞型でテストできる。これは通常、例えばPCRまたはノーザンブロット分析を使用して判断される。説明目的で以下の細胞型を提示するが、他の細胞型も通常使用できる。
ヒト乳癌細胞線MCF-7は、アメリカンタイプカルチャーコレクション(ATCC)(バージニア州マナサス)から入手した。MCF-7細胞は通常どおり、10%ウシ胎仔血清(インビトロゲン・ライフ・テクノロジーズ(Invitrogen Life Technologies)社、カリフォルニア州カールスバッド)で補完されたDMEM低グルコース(インビトロゲン・ライフ・テクノロジーズ(Invitrogen Life Technologies)社、カリフォルニア州カールスバッド)において培養した。約90%コンフルエンスに達した後、細胞を通常どおりトリプシン処理および希釈によって継代した。細胞を約7,000細胞/ウェル密度で96-ウェルプレート(ファルコン-プリマリア(Falcon-Primaria)社#3872)に播種してRT-PCR分析に使用した。ノーザンブロットまたは他の分析の場合、適切な量の培地およびオリゴヌクレオチドを使用して、細胞を100mmまたは他の標準細胞培養プレートに播種して同様に処理してもよい。
ヒト類上皮性肉芽腫HeLaは、アメリカンタイプカルチャーコレクション(バージニア州マナサス)から入手した。HeLa細胞は通常どおり、10%ウシ胎仔血清(インビトロゲン・コーポレーション(Invitrogen Corporation)社、カリフォルニア州カールスバッド)で補完されたDMEM高グルコース(インビトロゲン・コーポレーション(Invitrogen Corporation)社、カリフォルニア州カールスバッド)において培養した。約90%コンフルエンスに達した後、細胞を通常どおりトリプシン処理および希釈によって継代した。細胞を約50,000細胞/ウェル密度で24-ウェルプレート(ファルコン-プリマリア(Falcon-Primaria)社#3846)に播種するか、または約5,000細胞/ウェル密度で96-ウェルプレートに播種して、RT-PCR分析に使用した。ノーザンブロットまたは他の分析の場合、約90%コンフルエンスに達した時点で細胞を収穫した。
ヒトグリア芽腫U-87MG細胞株は、アメリカンタイプカルチャーコレクション(バージニア州マナサス)から入手した。U-87 MG細胞は、10%ウシ胎仔血清(インビトロゲン・ライフ・テクノロジーズ(Invitrogen Life Technologies)社、カリフォルニア州カールスバッド)で補完されたDMEM(インビトロゲン・ライフ・テクノロジーズ(Invitrogen Life Technologies)社、カリフォルニア州カールスバッド)において培養した。約90%コンフルエンスに達した時点で、細胞を通常どおりトリプシン処理および希釈によって継代した。細胞を約10,000細胞/ウェル密度で96-ウェルプレート(ファルコン-プリマリア(Falcon-Primaria)社#3872)に播種してRT-PCR分析に使用した。
HUVECはATCCから取得し、SingleQuotsで補完されたEBM(クロネティクス(Clonetics Corp)社、メリーランド州ウォーカーシル)で培養した。約90%コンフルエンスに達した時点で、細胞を通常どおりトリプシン処理および希釈によって継代し、最高15代まで維持した。96-ウェルプレート(10,000細胞/ウェル)で成長した細胞の場合、ウェルを200μL OPTI-MEM-1(登録商標)血清低減培地(ギブコ BRL(Gibco BRL))で一度洗浄し、次に12μg/mL LIPOFECTIN(登録商標)(ギブコ BRL(Gibco BRL)および最終濃度25nMの望ましい二本鎖化合物を含むOPTI-MEM-1(登録商標)130μLで処理する。処理の5時間後、培地を新しい培地と置き換える。dsRNA処理の16時間後に細胞を収集した。この時点で、RNAが分離され、RT-PCRによってターゲット低下が測定される。
細胞が80%コンフルエンスに達した時点で、細胞をオリゴヌクレオチドで処理した。96-ウェルプレートで成長した細胞の場合、ウェルを200μL OPTI-MEM-1血清低減培地(ギブコ BRL(Gibco BRL))で一度洗浄し、次に3.75μg/mL LIPOFECTINJ(ギブコ BRL(Gibco BRL))および最終濃度150nMの望ましいオリゴヌクレオチドを含むOPTI-MEM-1(130μL)で処理する。dsRNA化合物の場合、2x130μLのOPTI-MEM-1を使用した。処理の4時間後、培地を新しい培地と置き換えた。オリゴヌクレオチド処理の16時間後に細胞を収穫した。使用したオリゴヌクレオチドの濃度は細胞株ごとに異なる。特定の細胞株に最適なオリゴヌクレオチド濃度を判断するため、一連の濃度の実対照オリゴヌクレオチドで細胞を処理する。ヒト細胞の場合、RNAse Hオリゴヌクレオチドの実対照は、ヒトH-rasをターゲットとするホスホロチオエート骨格を持つISIS13920、TCCGTCATCGCTCCTCAGGG、配列番号:1、2’-O-メトキシエチルギャップマー(太字で示す2’-O-メトキシエチル)である。マウスまたはラット細胞の場合、実対照オリゴヌクレオチドは、マウスおよびラットc-rafの両方を標的とするホスホロチオエート骨格を持つISIS15770、ATGCATTCTGCCCCAAGGA、配列番号:2、2’-O-メトキシエチルギャップマー(太字で示す2’-O-メトキシエチル)である。H-ras(ISIS13920の場合)またはc-raf(ISIS15770の場合)を80%抑制する実対照オリゴヌクレオチドの濃度は、当該細胞株の次の実験における新しいオリゴヌクレオチドのスクリーニング濃度として使用される。80%の抑制が達成されない場合、H-rasまたはc-raf mRNAを60%抑制する実対照オリゴヌクレオチドの最低濃度が、当該細胞株の次の実験におけるオリゴヌクレオチドのスクリーニング濃度として使用される。60%の抑制が達成されない場合、その特定の細胞株はオリゴヌクレオチドのトランスフェクション実験に適していないと判断される。
スルビビン発現のアンチセンス調節は、当該技術分野において周知の様々な方法で試験できる。例えば、スルビビンmRNAレベルは、ノーザンブロット分析、競合ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、または実時間PCR(RT-PCR)などで計量できる。現行では、実時間定量PCRが好まれている。RNA分析は総細胞RNAまたはポリ(A)+mRNAで実施される。RNA分離方法は、例えばオースベル、F.M.(Ausubel,F.M.)ら、分子生物学最新プロトコル(Current Protocols in Molecular Biology)、第1巻、pp.4.1.1-4.2.9、ジョンワイリー・アンド・サンズ(John Wiley&Sons,Inc.)、1996で説明されている。ノーザンブロット分析は、当該技術分野において周知であり、例えばオースベル、F.M.(Ausubel,F.M.)ら、分子生物学最新プロトコル(Current Protocols in Molecular Biology)、第1巻、pp.4.2.1-4.2.9、ジョンワイリー・アンド・サンズ(John Wiley&Sons,Inc.)、1996で説明されている。実時間定量(PCR)は、PE-アプライド・バイオシステムズ(PE-Applied Biosystems)社(カリフォルニア州フォスター市)から購入可能なABI PRISM7700配列検出システムを製造者の指示に従って使用して便利に実施できる。他のPCR手段も当該技術分野において周知である。
ポリ(A)+mRNAは、ミウラ(Miura)ら、臨床化学(Clin.Chem.)、1996、42、1758-1764に従って分離される。ポリ(A)+mRNA分離の他の方法は、例えばオースベル、F.M.(Ausubel,F.M.)ら、分子生物学最新プロトコル(Current Protocols in Molecular Biology)、第1巻、pp.4.5.1-4.5.3、ジョンワイリー・アンド・サンズ(John Wiley&Sons,Inc.)、1993で説明されている。つまり、96-ウェルプレートで成長した細胞の場合、成長培地を細胞から除去し、各ウェルを200μLの冷たいPBSで洗浄した。60μLの溶解バッファー(10mM Tris-HCl、pH7.6、1mM EDTA、0.5M NaCl、0.5% NP-40、20mM バナジルリボヌクレオシド複合体)を各ウェルに加え、プレートをやさしく振とうし、室温で5分間培養した。55μLの溶解物をオリゴd(T)でコーティングした96-ウェルプレート(AGCT Inc.カリフォルニア州アーバイン)に移した。プレートを室温で60分間培養し、200μLの洗浄バッファー(10mM Tris-Cl pH7.6、1mM EDTA、0.3M NaCl)で3回洗浄した。最後の洗浄後、ペーパータオルでプレートの余分な洗浄バッファーを拭き取り、次に5分間空気乾燥させる。70℃に予熱した60μLの溶出バッファー(5mM Tris-Cl pH7.6)を各ウェルに加え、そのプレートを90℃のホットプレートで5分間培養した。次に、溶出液を新たな96-ウェルプレートに移した。
総mRNAをキアゲン(Qiagen,Inc.)社(カリフォルニア州バレンシア)から購入したRNEASY96キットおよびバッファーを製造者が推奨する手順に従って使用して分離した。つまり、96-ウェルプレートで成長した細胞の場合、成長培地を細胞から除去し、各ウェルを200μLの冷たいPBSで洗浄した。100μLバッファーRLTを各ウェルに加え、プレートを20秒間激しく振とうした。次に、100μLの70%エタノールを各ウェルに加え、その内容物をピペットによって3回上下に振り混ぜた。その後、廃棄物収集トレイを備えたQIAVAC連結管および真空ソースに取り付けられたRNEASY 96ウェルプレートに当該サンプルを移した。15秒間真空処理した。1mLのバッファーRW1をRNEASY 96プレートの各ウェルに添加し、再度15秒間真空処理を行った。バッファーRPE洗浄を繰り返し、さらに10秒間真空処理を行った。その後プレートをQIAVAC連結管から取り外し、ペーパータオルで拭き乾かした。1.2mL収集チューブを含む収集チューブラックを備えたQIAVAC連結管に再度プレートを取り付けた。次に60μLの水をピペットし、1分間インキュベートして30秒間真空処理を行うことによって、RNAを各ウェルに溶出した。当該溶出ステップをさらに60μLの水で繰り返した。
スルビビンmRNAレベルの定量は、ABI PRISM7700 配列検出システム(PE-アプライド・バイオシステムズ(PE-Applied Biosystems)社、カリフォルニア州フォスター市)を製造者の指示に従って使用し、実時間定量PCRによって判定した。これは、実時間でポリメラーゼ連鎖反応(PCR)生成物の高性能定量が可能な閉管で非ゲルベースの蛍光検出システムである。PCR完了後に増幅産物が定量される標準的なPCRに対して、実時間定量PCRの生成物は、累積途中で定量される。これは、PCR反応において、特に前進PCRと後進PCRプライマーの間にアニール化するオリゴヌクレオチドプローブを組み込み、2つの蛍光染料を含めることによって行う。レポーター染料(例えば、オペロン・テクノロジーズ(Operon Technlogies Inc.)社、カリフォルニア州アラメダ、またはPE-アプライド・バイオシステムズ(PE-Applied Biosystems)カリフォルニア州フォスターのいずれかから入手可能なJOEまたはFAM)は、当該プローブの5’端に取り付けられ、消光染料(例えば、オペロン・テクノロジーズ(Operon Technlogies Inc.)社、カリフォルニア州アラメダ、またはPE-アプライド・バイオシステムズ(PE-Applied Biosystems)カリフォルニア州フォスターのいずれかから入手可能なTAMRA)は、当該プローブの3’端に取り付けられる。プローブおよび染料が正常な場合、レポーター染料の放出は、近接の3’消光染料によって抑制される。増幅中、ターゲット配列に対する当該プローブのアニールによって、Taqポリメラーゼの5’-エクソヌクレアーゼ活性によって開裂できる置換基が生成される。PCR増幅周期の拡張相の間、Taqポリメラーゼによるプローブの開裂によってプローブの残りの部分(つまり消光部分)からレポーター染料が放出され、配列特異的な蛍光シグナルが生成される。各周期において、追加のレポーター染料分子が各プローブから切断され、ABI PRISM7700配列検出システムに内蔵されているレーザー光学によって、蛍光濃度が標準的な(6秒)間隔でモニターされる。各試験において、未処理対象サンプルからのmRNAの連続希釈を含む一連の平行反応によって、標準的な曲線が生成される。これは、テストサンプルのアンチセンスオリゴヌクレオチド処理後の抑制率を定量するのに使用される。
ウェスタンブロット分析(免疫ブロット分析)は、標準的な方法で実施される。細胞はオリゴヌクレオチド処理の16から20時間後に収穫し、PBSで一度洗浄してLaemmliバッファー(100μl/ウェル)に懸濁した後、5分間沸騰させて16%SDS-PAGEゲル上で負荷する。150Vで1.5時間ゲルを流し、ウェスタンブロット用の膜に移した。スルビビンを対象とする適切な一次抗体は、その一次抗体種に対抗する放射性標識または蛍光標識二次抗体とともに使用される。バンドは、PHOSPHORIMAGERTM(登録商標)(モルキュラー・ダイナミクス(Molecular Dynamics)、カリフォルニア州サニーベール)を使用して視覚化される。
本発明によると、本発明のアンチセンス化合物およびその相補体から成る一連の二本鎖オリゴマー化合物(siRNA)は、スルビビンを標的とするように設計することができる。二本鎖のアンチセンス鎖の核酸塩基配列は、ここに記載するように、スルビビンを標的とする少なくとも1つのオリゴヌクレオチド部分から成る。1つまたは複数の天然または修飾核酸塩基を追加して重複部分を形成することによって、鎖の末端を修飾する場合がある。次に、dsRNAのセンス鎖をアンチセンス鎖の相補体として設計、合成する。各末端に対する修飾または追加を含んでもよい。例えば、ある実施例において、dsRNA二本鎖の両鎖は、それぞれ1つまたは両方の末端にオーバーハングを持ち、中央核酸塩基全体に対して相補性を持つ。
cgagaggcggacgggaccgTT アンチセンス(配列番号:11)
TTgctctccgcctgccctggc 相補(配列番号:12)
このように、この二本鎖化合物は、標準的なsiRNAを示す。
cgagaggcggacgggaccg アンチセンス(配列番号:10)
gctctccgcctgccctggc 相補(配列番号:13)
このように、この二本鎖化合物は平滑末端siRNAを示す。
本発明のdsRNAインビトロIC50のIC50値は、様々なインビトロ濃度のdsRNAをスルビビンの発現または過剰発現に関連する病理を示す適切な細胞株、組織、または器官と接触させることによって、またスルビビン病理学または発病機構の様々なステップ、段階、または側面を含むがそれらに制限されないパラメータに関して、そのような濃度におけるこれらdsRNAの定量効果を判断することによって決定することができる。検査できる代表的なパラメータは、例えば、スルビビンmRNAまたはスルビビンタンパク質合成の翻訳、代理マーカーへの影響、またはインビトロで便利に計測できるdsRNAの潜在的な治療効果を示すような任意の他のパラメータを含む。
総RNAは、推奨されるプロトコル(キアゲン(Qiagen)社)RNeasy(登録商標)96キットを使用して分離する。つまり、成長培地を除去した後、200μl PBSで細胞を洗浄する。各ウェルに、100μlの70%エタノールを添加し、ピペットで上下に3回振り混ぜる。次に、真空ソースに取り付けられたQIAvac96連結管のQIAvacトップベースに配置されたRNeasy 96プレートのウェルにサンプルを適用する。30秒間または移転が完了するまで真空処理を行う。各ウェルに、80μlのDNase I培養ミックス(20mM Tris-HCl、pH8.4、2mM MgCl2、50mM KClおよび225ユニット/mlのDNase I(インビトロゲン(Invitrogen)社)を加え、室温で30分間培養する。バッファーRW1(1ml/ウェル)を加え、30秒間真空処理する。バッファーRW1およびRPE1を用いた洗浄ステップを再度繰り返す。次に、プレートを連結管から取り外し、ペーパータオルで拭き乾かす。QIAvac連結管にプレートを戻し、10分間真空処理する。RNAを溶出するため、30μlのRNaseが含まれていない水を各ウェルの膜に直接添加し、1分間培養した後、30秒間真空処理する。総RNAの回収を最大限にするため、さらに30μl/ウェルのRNaseを含まない水を使用して溶出ステップを繰り返す。
表現型分析:スルビビンを標的とする活性オリゴマー化合物が、ここに開示する方法によって同定されてから、該化合物を1つまたは複数の表現型分析でさらに調査する。各表現型分析は、特定の病状または症状の処置の効果を予測する測定可能な評価項目を持つ。
本発明によると、本発明のアンチセンス化合物から成る一連の二本鎖オリゴマー化合物およびその相補体は、スルビビンmRNAを標的とするように設計されている。dsRNAのセンス鎖は、表1にリスト表示するアンチセンス鎖の逆相補体として設計および合成される。オリゴマー化合物はHeLa細胞において評価される。HeLa細胞に使用される培養方法は、例えばwww.atcc.orgで説明されている。
dsRNAオリゴマー化合物によるヒトスルビビンmRNAレベルの抑制
本発明に基づいて、表1(ISIS339045−339073)に示すアンチセンス化合物から成る一連の二本鎖オリゴマー化合物、5’-末端リン酸基を修飾した各化合物、およびその相補体はスルビビンmRNAを標的とするように設計した。対応するdsRNA化合物は、ISIS341201-341229である(表3)。当該dsRNAのセンス鎖はアンチセンス鎖の相補体として設計、合成した。そのリストを表2に示す。当該オリゴマー化合物は、HeLa細胞において評価した。HeLa細胞に使用した培養手段については、例えば、www.atcc.orgで参照される。
本発明によると、HeLa細胞におけるヒトスルビビンmRNAの抑制に対してISIS339048配列の置換が与える影響について調査した。ISIS343867(5’-UUUGAAAAUGUUGAUCUC-3’:配列番号:81)は、ISIS339048として、スルビビンmRNA上の同一部位に結合する平滑末端siRNAのアンチセンス鎖である。ISIS343867がISIS339048の5’-末端アデニン残基を持たない19量体化合物である点で異なる。ISIS341881(UUUGAAAAUGUUGAUCUCCTT、配列番号:82)は、ISIS3309048としてスルビビンmRNA上の同一部位に結合する標準siRNAのアンチセンス鎖である。ISIS341881が3’-末端(「dTdTオーバーハング」)にdTdT(デオキシチミジン-デオキシチミジン)を含むという点で異なる。ISIS343868は配列5’-GGAGAUCAACAUUUUCAAA-3’(配列番号:83)を持ち、ISIS343867に対応するセンス鎖である。ISIS341880(配列番号:84)は、ISIS341881に対応するセンス鎖である。最初にアンチセンス鎖、次にセンス鎖がともに5’から3’方向に示される構築体を表4に示す。表4はスルビビンsiRNA構築体の配列、表5は用量反応の結果を示す。
平滑末端siRNA(20-mer)339048_339078、0.28nM
平滑末端siRNA(19-mer)343867_343868、0.19nM
標準siRNA341881_341880、0.15nM
ヒトスルビビンを標的とする追加の平滑末端組成:修飾化合物
ISIS346272:全リボース、全P=O結合
ISIS346279-346281、346286、346287:全P=S結合
ISIS346282-346284、346289、346295および346296:代替P=O/P=S結合、P=Oで開始
ISIS 346291、346292、346294、346295および346296:代替P=S/P=O結合;P=Sで開始
ISIS34831:P=O骨格を持つ全リボース
ISIS352505:5、8、11、14および17-19位の2’-O-メチルリボース。P=O骨格。
ISIS 352506:6、7、10、11および17-19位の2’-O-メチルリボース。P=O骨格。
ISIS352507:1、3、5、7、9、11、13、15、17および19位の2’-O-メチルリボース。P=O骨格。
ISIS352508:5、8、11および14位の2’-MOE;17-19位の2’-O-メチル。P=O骨格。
ISIS 352509:4、9および18位の2’-MOE。P=O骨格。
ISIS 352510:1、3、5、7、9、11、13、15、17および19位の2’-MOE。P=O骨格。
ISIS 352511:2、4、6、8、10、12、14、16、および18位の2’-MOE。P=O骨格。
ISIS 352512:各位の2’-メチル。P=O骨格。
ISIS 352513:各位の2’-メチル。P=O骨格。
ISIS 352514:2、4、6、8、10、12、14、16、および18位の2’-MOE。P=O骨格。
ISIS 352515:15-19位の2’-O-メチルリボース。P=O骨格。
ISIS 352516:結合1−7のP=Sリンカー。8-18結合のP=Oリンカー。
ISIS 353537:1-3位および17-19位の4’-チオリボース。P=O骨格。
ISIS 353538:3、9、12および17-19位の4’-チオリボース。P=O骨格。
ISIS 353539:1-3、9および12位の4’-チオリボース。17-10位の2’-O-メチルリボース。P=O骨格。
ISIS 353540:1-3位の4’-チオリボース。17-19位の2’-O-メチルリボース。P=O骨格。
ISIS 355710:1-5位の2’-ara-フルオロ-2’-デオキシリボース。15-19位の2’-O-メチルリボース。P=O骨格。
ISIS 355711:1-5、8、9および12−16位の2’-ara-フルオロ-2’-デオキシリボース。6、7、10、11、17-19位の2’-O-メチルリボース。P=O骨格。
ISIS 355712:5、8、11、14位のLNA。17-19位の2’-O-メチル。P=O骨格。
ISIS 355713:2’-O-メチルリボース/2’-ara-フルオロ-2’-デオキシリボース置換、1位の2’OMe。P=O骨格。
ISIS 355715:4、9、18位のLNA。P=O骨格。
ISIS 355716:1、2、6、11、20位のLNA。P=O骨格。
一連の一本鎖オリゴマー化合物(asRNA)について、ヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)におけるヒトスルビビンの抑制能力を評価した。HUVECに使用する培養方法については、例えば、www.atcc.orgで説明されている。
ヒトスルビビンプライマープローブセット(配列番号186-188)を使用して上記のように様々なdsRNA組成をHeLa細胞においてテストし、ISIS 343867 19-mer(配列番号:81)、339048 20-mer(配列番号:23)上のPS置換の影響、および2’-O-メチル(2’-OMe)、2’-フルオロ(2’-F)、2’-O-メトキシエチル(2’-MOE)および4’-チオ(4’-S)化学反応の影響を判断した。表8および9はその結果を示す。最初のISIS番号はアンチセンス鎖、二番目のISIS番号はセンス鎖を示す。
糖に対する化学的修飾の影響
ISIS 352511は2、4、6、8、10、12、14、16および18位における2’-O-メチル修飾(下線)を含む。
ISIS 352512は、各2’位の2’-O-メチル修飾(下線)を含む。
ISIS 355714は、1、3、5、7、9、11、13、15、17および19位の2’-フルオロ修飾(太字)および2、4、6、8、10、12、14、16および18位の2’-O-メチル修飾を含む。
ISIS 352514は、2、4、6、8、10、12、14、16および18位の置換2’-MOE修飾を含む。
他の化合物はすべて天然のRNA化合物である。表10はその結果を示す。
用量反応試験において、HeLa細胞を100nMオリゴヌクレオチドごとに3μg/mLリポフェクチンと混合した0.02、0.2、2.0および20.0nMの表示されたdsRNAオリゴヌクレオチドを用いて、本明細書の他の例に記載のとおり処理した。未処理の細胞を対照として使用した。処理の16時間後、次の実時間PCR分析に使用するためのRNAを細胞から調製した。
用量反応実験において、本明細書の他の例に記載のとおり、100nMオリゴヌクレオチドごとに3μg/mLのリポフェクチンを混合した0.014、0.04、0.12、0.37、1.11、3.33、10および30nMの表示dsRNAオリゴヌクレオチドをHeLa細胞で処理した。未処理の細胞を対照として使用した。処理の16時間後、次の実時間PCR分析に使用するためのRNAを細胞から調製した。
上記の方法を使用して、二本鎖化合物を、U-87MG細胞におけるヒトスルビビンmRNA発現の抑制能力についてテストした。ヒトスルビビンを標的とする様々なdsRNA構築体を0.0019nM、0.0096nM、0.048nM、0.24nM、1.2nM、6.0nM、30.0nM、および150.0nMの濃度でテストした。表13はその結果の要約である。アンチセンス鎖のISIS番号を最初に示し、次にセンス鎖のISIS番号を示した(アンチセンス_センス)。
ヒトスルビビンを標的とする一連の標準siRNAを設計した。以下に示すスルビビンに特異的な各dsRNA配列はRNAオリゴヌクレオチド二本鎖の各鎖の3’末端に2つのデオキシチミジンヌクレオチドを含む(図示せず)。ダーマコン・リサーチ(Dharmacon Research Inc.)によって、遺伝子特異的なsiRNAの合成、二本鎖形成および精製を行った。表において、「位置」はdsRNAのアンチセンス鎖が結合する遺伝子の位置を示す。表における各配列は、アンチセンス鎖(トップ鎖)が5’から3’方向に書き込まれ、その相補センス鎖(ボトム鎖)も5’から3’方向に書き込まれるようにリストされている。
表15および16は、本明細書に記載の方法を使用して実施された様々なdsRNAを用いて、IC50値を概説している。テストした構築体は、5’から3’方向のアンチセンス鎖および5’から3’方向のセンス鎖を含む。表15において、「D」は用量反応(mRNAレベル)であり、「W」はウェスタンブロットである。すべてのインターヌクレオシド結合は、ホスホロチオエート結合を示す小文字の「s」による別段の定
義がない限り、ホスホジエステルである。
当該技術分野において知られる動物モデルにおいて、本明細書に記載の1つまたは複数のオリゴマー化合物を、その抗腫瘍活性についてテストする。2つの動物モデルは、(1)U-87MGヒトグリア芽腫異種移植腫瘍モデル(キアリス H、(Kiaris H)、シャリー AV(Schally AV)、ヴァルガ JL(Varga JL)、裸マウス新生物におけるU-87MGヒトグリア芽腫の成長を抑制する成長ホルモン放出ホルモンの抑制因子。2000年5月−6月、2(3):242-50)、および(2)YUSAC-2ヒト黒色腫異種移植腫瘍モデル(グロスマン D(Grossman D)、キム PJ(Kim PJ)、シェクナー JS(Schechner JS)、アルティエリ DC(Altieri DC)、スルビビンターゲッティングによるインビボ黒色腫腫瘍成長の抑制。全米科学アカデミー紀要(Proc Natl Acad Sci USA)。2001年1月16日;98(2):635-40)である。各グループに合計10 CD1nu/nu(チャールズリバー(Charles River))マウスを使用する。移植するため、腫瘍細胞をトリプシン処理し、PBSで洗浄して、同じくPBSで、DMEM中6X107細胞/ml(U-87MG)および4X107細胞/ml(YUSAC-2)で懸濁する。移植直前に、動物に放射線照射し(450TBI)、細胞をマトリゲル(1:1)に混合する。0.2ml量中合計6X106(U-87MG)および4X106(YUSAC-2)の腫瘍細胞を左後脇腹に経皮的(s.c.)に注入する。テストオリゴマー化合物(0.9%NaClに溶解、注入グレード)またはミスマッチ対照オリゴヌクレオチド(0.9%NaClに溶解)またはビヒクル(0.9%NaCl)を用いた処置を腫瘍細胞移植の3日後に開始する。U−87MGおよびYUSAC-2の研究の場合、化合物を腹腔内(i.p.)および静脈に(i.v.)それぞれ0.2ml量を一日おきに、U−87MG研究の場合は合計約12用量およびYUSAC-2研究の場合は約13用量投与する。腫瘍の長さおよび幅を週に2回計測し、腫瘍の体積を計算式:腫瘍の体積=(LXW2)X0.536を使用して計算する。腫瘍の体積を各処置グループの主要移植後の日数に対してプロットする。
前記の方法と同様に、抽出およびキャピラリー電気泳動方法を使用して、正常な二本鎖RNAを希釈したマウス血漿から分析した(リーズ、J.M.(Leeds、J.M.)ら、1996、生物科学分析(Anal.Biochem.)、235、36-43;ギアリー R.S.(Geary R.S.)ら、1999、生物科学分析(Anal.Biochem.)、274、241-248)。3-6ヶ月齢の雌Balb/cマウス(チャールズリバー研究所(Charles River Labs))から得たヘパリン処理したマウス血漿を−80℃から解凍し、リン酸バッファー生理食塩水(140mM NaCl、3mM KCl、2mMリン酸ナトリウム、10mMリン酸カリウム)を用いて25%(v/v)に希釈した。100μM濃度の約10nmolの事前アニール済siRNAを25%血漿に追加し、37℃で0、15、30、45、60、120、180、240、360および420分間培養した。指定の時間にアリコートを取出し、EDTAで最終濃度2mMになるまで処理して、キャピラリーゲル電気泳動(eCap DNAキャピラリーチューブを持つBeckman P/ACE MDQ-UV)で分析されるまで0℃の氷上に配置した。siRNA二本鎖のピーク領域を計測し、それを使用して残りのsiRNA正常比率を計算した。2.5mM濃度のアデノシン三リン酸(ATP)を内部検定基準として各注射液に添加した。リン酸バッファー生理食塩水でsiRNAを希釈することによってゼロ時点を取り、その後キャピラリー電気泳動を行った。時間に対して正常なsiRNA率をプロットすることによって、偽の一次半減を計算できた。表17に結果を示す。
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