PT739898E - Mono-esteres de acidos fosfonucleicos processo para a sua preparacao e sua utilizacao - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO "MONO-ÉSTERES DE ÁCIDOS FOSFONONUCLEICOS, PROCESSO PARA A SUA PREPARAÇÃO E SUA UTILIZAÇÃO" A presente invenção refere-se a novos análogos de oligonucleotideos com caractarísticas muito efectivas do ponto de vista físico, biológico e farmacológico, bem como a um processo para a sua preparação. A sua aplicação assenta na utilização como inibidores da expressão genética ("antisense" oligonucleotideos, bibozimas, "sense" oligonucleotideos e oligonucleotideos de formção tripla), como sondas para determinar ácidos nucleicos e como agentes auxiliares na biologia molecular.

Os oligonucleotideos encontram crescente utilização como inibidores da expressão genética (J.F. Milligan, M.D. Matteucci e J.C. Martin, J. Med. Chem., 36 (1993) 1923; E. Uhlmann e A. Peyman, Chemical Reviews 90 (1990) 543; S. T. Crooke, Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32 (1992) 329).

Os oligonucleotideos "antidense" são fragmentos de ácidos nucleicos, cuja sequência de bases é complementar a um inibidor do mARN. Este mARN alvo pode ser de origem celular, virai ou possuir outra origem patogénica. Como sequência-alvo celular, sugerem-se por exemplo, receptores, enzimas, factores de crescimento, modeladores imunológicos, canais de iões ou oncogénes. Os inibidores do virus multiplicam-se com o auxílio dos oligonucleotideos "antisense", sendo este facto descrito por exemplo para RGV (virus do sarcoma de Rous), HSV-1 e 2 (virus de herpes simples tipo I e II), HIV (virus da imunodeficiência humana) e virus de gripe. Aqui utilizam-se oligonucleotideos que são complementares para os ácidos nucleicos virais. 1

Vi-

Os oligonucleotídeos "sense" são, em contrapartida, concebidos de tal forma na sua sequência, por exemplo, que se ligam (prendem) a proteínas ligadas aos ácidos nucleicos ou enzimas de processo de ácidos nucleicos, de forma a inibirem a sua actividade biológica (C. Hélène e J.J. Toulmé, Biochim. Biophys. AcLa 1049 (1990) 99). Como alvos virais designam-se aqui a transcriptase reversa, a polimerase do ADN e a proteína de transactivação. Os oligonucleotídeos de formação tripla têm em geral, o ADN como alvo, e formam após se ligarem a este, uma estrutura em tripla hélice.

Enquanto com o auxílio de oligonucleotídeos "antisense" se inibe, em geral, o processamento (entraçamento) do mARN ou a sua tradução na proteína, os oligonucleotídeos de formação tripla inibem a transcripção ou a replicação do AND (N. T. Thuong e C. Hélène, Angew. Chem. 105 (1993) 697; Uhlmann e Peyman, Chemical Reviews 90 (1990) 543). Também é possível, formar uma cadeia de ácido nucleicos numa primeira hibridação com poligonucleotídeos "antisense" com a formação de uma cadeia dupla, que então numa segunda hibridação forma uma estrutura tripla com oligonucleotídeos de formação tripla. As regiões de ligação para o "antisense" e de formção tripla podem ser albergadas assim, ou em dois oligonucleotídeos separados ou num oligonucleotídeo.

Uma outra utilização de oligonucleotídeos sintéticos são as designadas ribozimas, que destroem os ARN alvo em consequência da actividade da ribonuclease (D. Castanotto, J.J. Rossi, J.O. Deshler, Criticai Rev. Eukar. Gene Expr. 2 (1992) 331).

No diagnóstico por ADN os fragmentos de ácidos nucleicos com as marcações adequadas, formando as designadas sondas de ADN ou "probes" de AND para uma hibridação específica, são utilizados para uma determinação de ácidos 2

'À,A.v'·

:-C nucleicos. A formação específica das novas estruturas duplas é assim seguida, com auxílio da marcação, que de preferência não é radioactiva. Desta forma é possível determinar doenças genéticas, malignas e virais ou outras doenças de origem patogénica.

Para a maioria da aplicações, os oligonucleotídeos são pouco adequados ou completamente inadequados quando se encontram na sua forma habitual. Eles têm de ser quimicamente modificados, de forma a possuírem as especiais características exigidas. Assim, os oligonucleotídeos, para poderem ser utilizados em sistemas biológicos, por exemplo para a inibição da multiplicação de virus, devem preencher os seguintes requisitos: 1. Devem em condições in vivo, quer no soro quer intracelularmente, possuir uma suficientemente grande estabilidade. 2. Devem estar em condições de passarem a membrana da célula e do núcleo. 3. Devem, sob condições fisiológicas, ligar-se especificamente à base no seu ácido nucleico alvo, de forma a permitirem alcançar o efeito inibidor.

Para as sondas de ADN, estas exigências não são indissociáveis; todavia os oligonucleotídeos devem ser derivatizados de tal forma que permitam a sua determinação, por exemplo através de fluorescência, quimiluminiscência, colorimetria ou coloração específica (Beck e Koester, Ana. Chem., 62 (1990) 2248). São conhecidas um inúmero conjunto de variações de oligonucleotídeos, que foram sintetizados com o objectivo de preencherem melhor os resquisitos acima mencionados, que os oligonucleotídeos não modificados. A modificação 3

química dos oligonucleotídeos decorre na maioria dos casos, em que a coluna vertebral de fosfato, a unidade de ribose ou a base nucleotídica são correspondentemente modificadas (Uhlmann e Peyman, Chemical Review 90 (1990) 543). Entre as modificações, encontram-se também aquelas em que, quer a ponte de fosfato, quer Lambém a unidade de açúcar, são substituídas por outros grupos, por exemplo, através de oligómeros morfolinonucleosídeos (E.P. Stirchak et al., Nucleic Acids Res. 17 (1989) 6129) ou APN (P.E. Nielsen et al., Bioconj. Chem. 5 (1994) 3). Os APN em especial destacam-se por possuir uma afinidade pouco habitual para o ARN alvo, possuindo infelizmente outras características desvantajosas como a baixa solubilidade ou deficiente penetração celular (W. Wang et al., Tetrahedron Letters 36 (1995) 1181; M.

Egholm et al., em "Innovation and Perspectives in Solid Phase Sinthesis, Peptides, Proteins, Nucleic Acids", Roger Epton, Ed. Mayflower Worldwide Limited, Birminghan, 1994, 145-148). O documento WO-A-9422864 descreve um oligonucleotídeo "antisense" que se encontra modificado através de grupos 2-metilo-1,3-di-hidróxilpropilo. O grupo 2-metilo está substituído por Q-X, em que X significa O, S ou grupos NR6, e Q significa uma base de oligonucleotídeo. Os oligonucleotídeos são preparados a partir de uma cadeia de produtos intermediários R1-OCH2CR2(CH2-X-Q)-(CH2)nOR3 (em que RI significa H ou um grupo de protecção, como tritilo, R3 significa H ou P(R4)OR5, R4 significa um grupo amina e R5 de preferência significa 2-ciano-etilo). O nbjectivo é assim, encontrar novos análogos de oligonucleotídeos com características mais vantajosas.

0 objectivo da presente invenção são assim compostos de fórmula I 4

em que n significa um número entre zero e 100; B significa, independentemente uns dos outros, hidrogénio, hidróxilo, (C1-C20) -alquilo, (Ci-C20) -alcóxilo, (Ci-C20) -alquiltio, (C6-C20) -arilo, (C6-C20) -arilo- (Ci-C6) -alquilo, (C6-C2o) -arilo- (Ci-C6) -alcóxilo, (C6-C20) -arilo- (Ci-C6) - alquiltio, um grupo aromático ou um grupo heterociclico, em que alquilo, arilo e/ou os grupos aromáticos ou heterocíclicos podem ser eventualmente substituídos uma ou mais vezes por grupos (Ci~C4)-alcóxilo, -NR*R10, C (O) OH, 0X0, -C (0) 0R8, -C(0)NR9R10, -CN, -F, -Br, -N02, (c2-c6) _alcóxialquilo, -S(0)mR8, - (Ca-C6) -alquilo-S (0) mR8, -NHC (=NH) NHR8, -C (=NH) NHR8, -NR9C(=0)Rs, =N0R8, NR9C (=0) OR10, -0C(=0)NR9R10 e -NR9C (=0) NR9R10, ou B significa, independentemente uns dos outros, uma nucleobase natural, uma nucleobase não natural ou um ligando "Repórter"; A-B pode ser constituído por um aminoácido D ou L condensado através do grupo carboxílico ou um peptídeo, nos quais os aminoácidos constituem um grupo até um comprimento de 5 aminoácidos, 5

L significa, independentementa entre si, N ou RJN:, e R1 significa hidrogénio ou um grupo (Ci-C6)-alquilo, que pode estar substituído por hidróxilo, (Ci~C6)-alcóxilo, (Ci-Ce)-alquiltio ou amina, de preferência hidrogénio ou metilo; A significa, independentemente uns dos outros, uma ligação simples, um grupo metileno ou um grupo da familia das fórmula lia ou Ilb;

’ f R2 I P O I 3 R3 W I 3 R3 L J P (Ha)

é Y' significa =0, =S, =CH2, =C(CH3)2 ou =ΝΚΧ, em que R1 definido como acima; M significa uma ligação simples, -0-, -S- ou NR1, em que que R1 é definido como acima; R2 e R3 significam, independentemente uns dos outros, hidrogénio, (Ci-C6) -alcóxilo, (Ci-C6)-alquiltio, amino, halogéneo, como F, Cl, Br ou (Ci-Ce) -alquilo, que eventualmente pode estar substituído por hidróxilo, (Ci-C6) -alcóxilo ou (Ci-C6)alquiltio, de preferência hidrogénio; p e q significam, independentemente uns dos outros, zero a 5; r e s significam, independentemente uns dos outros, zero a 5; ... *5;'·· :W!· 6

D e G

significam, independentemente uns dos outros CR5Re; R6, significam, independentemente uns dos outros, hidrogénio, (Ci-C6) -alquilo, (C6-C2o) -arilo, (C6-C20)-arilo- (Ci-Ce) - alquilo, hidróxilo, (Ci~Cb) - alcóxilo, (C1-C6) -alquiltio, alquilo e arilo, podem estar substituídos eventualmente com SR1 ou NR^1’, em que R1 possui os significados acima mencionados e R1' independentemente de R1, possui o mesmo significado que R1, R5 e R6 são contudo de preferência hidrogénio; X significa -0-, -S- ou NR1, em que R1 possui os significados acima mencionados Y significa =0 ou =S; Z significa -0R8, -NR9R10 ou X'Q'', em que X' significa o mesmo que X e Q'' significa o mesmo que Q;

siginifca hidrogénio, (Ci-Cie) -alquilo, (C2-Ci8)-alquenílo, (C3-Ci8) -alquinilo, (C6-C12) -arilo, (C6-Ci2)-arilo- (Ci~C6) -alquilo, em que alquilo pode estar uma ou mais vezes substituído por grupos hidróxilo, (C1-C4)-alcóxilo, F, Cl, Br, e arilo substituído 1-3 vezes por hidróxilo, (C1-C4) -alcóxilo, (Ci-C4)-alquilo, F, Cl, Br, N02, NR9R10, -C(0)0H, -C (0)0-(Ci-C6) -alquilo, -C (0)NR9R10, , de preferência contudo por hidrogénio, (Ci-C6)-alquilo, (Cc-Ci2)-arilo ou (Cs-C12) -a ri 1 o- (C^-Cs) -alquilo, em que arilo pode ser substituído uma vez por (C1-C4)-alcóxilo, (C1-C4)-alquilo, F, Cl, Br, N02, sendo especialmente preferido hidrogénio, (Ci-C6)-alquilo, fenilo ou 2-(4-nitrofenilo)etilo 7

Ql R9 e R10, significam, independentemente uns dos outros, hidrogénio, (Ci~Ci8)-alquilo, (Ci-Cie) -alquenilo, (C-.-Ci8)-alquinilo, (C6-C12) -arilo, (C6—C12) -arilo- (Ci-Cg)-alquilo, em que alquilo pode estar uma ou mais vezes substituído por hidróxilo, (C1-C4)-alquilo, F, Cl, Br, , ou R9 e RIO podem formar em conjunto com σ átomo de N que possuem um anel de 4-7 membros. Q e Q', significam, independentemente uns dos outros, hidrogénio ou R&, e significam, conjugados, que influenciam de forma vantajosa as características de oligonucleotídeos "antisense" ou dos oligonucleotídeos formadores das triplas hélices ou servem como sondas de marcação de um ADN, ou que se agarram durante a hibridação dos análogos de oligonucleotídeos aos ácidos nucleicos alvos durante a ligação ou reticulação, ou significam oligonucleotídeos, que podem não ser modificados ou ser modificados, em que as seguintes variantes constituem exemplos para algumas modificações (por exemplo, descritas em E. Uhlmann e A. Peyman, Chemical Reviwes 90 (1990) 543; "Protocols for oligonucleotides and Analogs", Synthesis and Properties & Synthesis and Analytical Techniques and Analogs", Sinthesis and Properties & Sinthesis and Analytical Techniques, S. Agrawal, Ed. Human Press, Totowa, USA, 1993): a) Substituição total ou parcial das pontes de diéster de ácido fosfórico em 3'- e/ou 5' -, por exemplo através de pontes de tioato de fósforo, ditioato de fósforo, NR4R4'amidato de fósforo, fosfato de borano, fosfato de (C*-C21)-O-éster alquílico, [éster O alquílico de fosfato-(Cfc-C12) arilo-(C1-C21)], fosfonato de 2,2,2-triclorodimetiletilo, fosfonato de (Ci-Ce) -alquilo, fosfonato de arilo (C6-Ci2) . R4 e R4', significam, independentemente entre si, hidrogénio, (Ci-Cio) -alqui. 1 o, (Ce-C-so) -arilo, (C6-Cn) -a ri lo- (Cj-Cg) -a 1 qni lo, 8

ou - (CH2) c-[NH (CH2) C]d-NR7R7/ em que c significa um número de 2 a 6 e d significa um número de 0 a 6, e R1 independentemente entre si, significa hidrogénio, (Ci~C6) -alquilo, ou (C1-C4)-alcóxilo- (Ci-C6) -alquilo, de preferência R4 e R4' significam hidrogénio, (Ci-C8)-alquilo, ou metóxietilo, sendo especialmente preferido o significado de hidrogénio, (C1-C4)-alquilo, ou metóxietilo ou R4 e R4' podem em conjunto, com um átomo de azoto que possuem, formar um anel heterociclico de 5-6 membros, que adicionalemnete possui um outro heteroátomos do conjunto formado por 0, S, N; b) Substituição total ou parcial das pontes de diéster de ácido fosfórico nas posições 3'- ou 5'- através de pontes de "defosfo" (ver por exemplo, Uhlmann e Peyman em "Methods in Molecular Biology", Vol. 20: "Protocols for Oligonucleotides and Analogs", S. Agrawal, ED., Humana Press, Totowa 1993, capitulo 16, 355 e seguintes), por exemplo através de acetal fórmico, 3'-tioacetalfórmico, metil-hidroxilamina, oxima, hidrazo de metilenodimetilo, sulfona de dimetileno ou grupos sililo; c) Substituição total ou parcial da coluna de açúcar-fosfato, por exemplo através de oligómeros de "morfolinonucleosídeos" (E.P. Stirchak et al., Nucleic Acids Res., 17: (1989) 6129) ou "Peptide Nucleic Acids" (PNA's) (P.E.Nielsen et al., Bioconj . Chem. 5: (1994) 3) ou hidretos de PNA/ADN, como se encontra descrito na patente alemã P 44 08 528.1, em particular EP-A 0 672 677 (HOE 94/F 057; d) Substituição total ou parcial de unidades de β-ΰ-2'-desóxiribose, por exemplo através de a-D-2'-desóxiribose, L-2’-desóxiribose, 2’-F-2'-desóxiribose, 2'-0-(Ci- C$) alquilribose, 2'-0-(C2-C6) alquenilribose, 2'-NH2-2'-desóxiribose, β-D-xilofuranose, a-arabinofuranose, 2,4- 9

dideóxi-3-D-eritro-hexopiranose e análogos de açúcares carbocíclicos [por exemplo, Froehler, J. Am. Chem Soc., 114, (1992) 8320), e de cadeia aberta (por exemplo, Vandendriessche et al., Tetrahedron 49 (1993) 7223), análogos de açúcares biciclicos [por exemplo, M. Tarkov et al-, Helv. Chim. Acta 76 (1993) 481. e) Substituição total ou parcial das bases nucleosidicas naturais, por exemplo através de 5-(hidróximetilo)uracilo, 5-aminouracilo, pseudouracilo, di-hidrouracilo, 5-(Ci-Ce)-alquilo-uracilo, 5- (C2-C6) -alquenilo-uracilo, 5- (C2-Cs) -alquinilo-uracilo (por exemplo descrito por Gutierrez et al., J. A. Chem Soc. 116 (1994) 540 ou Sagi et al., Tetrahedron Lett. 34 (1993) 2191), 5- (Ci-C6) -alquilo-citosina, 5-(C2-C6)-alquenilo-citosina, 5-(C2-C6)-alquinilo-citosina (Gutierrez et al., J. A. Chem Soc. 116 (1994) 540 ou Sagi et al., Tetrahedron Lett. 34 (1993) 2191), 5-fluorouracilo, 5-fluorocitosina, 5-clorouracilo, 5-clorocitosina, 5-bromouracilo, 5-bromocitosina, 7-deaza-purina substituída em 7 (por exemplo descrita em Seela, Nucl. Acids Res. 20 (1992) 2297; Heterocycles 34 (1992) 229) . Q e Q' , podem também significar conjugados, que influenciam de forma vantajosa as caracteristicas de oligonucleotídeos "antisense" ou dos oligonucleotídeos formdores das triplas hélices ( como por exemplo penetração celular, hidrólise de nucleases, afinidade para o alvo ARN/ADN, farmacocinética) ou que servem como sondas de marcação de um ADN, ou que se agarram durante a hibridação dos análogos de oligonucleotídeos aos ácidos nucleicos alvos durante a ligação ou reticulação. Exemplos são conjugados com poli-Lys com interquelantes como pireno, acridina, fenazina, fenantridina, com compostos fluorescentes como fluoresceína, com reticuladores como psorais, azidoproflavina, com 10

moléculas lipofílicas como (Ci2-C2o) -alquilo, com lípidos como 1,2-di-hexadecil-rac-glicerina com esteróides como colesterol ou testosterona, com vitaminas como vitamina E, com poli-, em particular, oligo-etilenoglicol, com ésteres de difosfato de (Ci2-Ci8) -alquilo, com -0-CH2-CH (OH) -0- (Ci2-Ci8) -alquilo. De preferência sSo conjugados com moléculas lipofílicas como (Ci2-Ci8) -alquilo, com esteróides como colesterol ou testosterona, com poli-, em particular, oligo-etilenoglicol, com vitamina E, com interqualatores como pireno, com ésteres de difosfato de (Ci4-Ci8)-alquilo, com -0-CH2-CH (OH) -0- (C12-C16) -alquilo. A preparação deste tipo de conjugados é conhecida dos especialistas (ver por exempo, Uhlmann & Peyman, Chem. Rev. 90 (1990) 543; M. Manoharan em "Antisense Research and Applications", Crooke and Lebleu, Eds., CRC Press, Boca Raton, 1993, capítulo 17, página 303 e seguintes e EP-A 0552 7 66) . Para além disso os oligonucleotídeos podem possuir inversões em nas zonas terminais 3' ou em 5' 3-3-' e 5-5-' (descritos, por exemplo, em M. Koga et al., J. Org. Chem 56 (1991) 3757).

Grupos aromáticos são por exemplo, fenilo, naftilo, pirenilo, antracenilo, fenatrilo, bifenilo, binaftilo, tetracenilo, pentacenilo, hexacenilo, trifenilenilo, crisenilo ou benzopirenilo.

Sob a designação de grupos heterocíclicos, encontram-se por exemplo, cromanilo, cromanélio-1-ilo, furanilo, isocromanilo, isocromenilo, isoquinolilo, piperazinilo, quinolilo, piridinilo, pirrolidinilo, imidazilo, tetra-hidrofuranilo, aziranilo, oxiranilo, tiofenilo, pirimidinilo, tielanilo, azepinilo, pirrolilo, tetra-hidropirrolilo, benzofuranilo, indolilo, isoindolilo, isatinilo, dioxindolilo, indoxililo, coumarinilo, coumaronilo, carbazolilo, pirazolilo, pirrolilo, indazolilo, 11

oxazolilo, isoxazolilo, tiazolilo, 1,2,4-triazolilo, 1,2,3-triazolilo, tetrazolilo, pentazolilo, piperidinilo, piradizinilo, fenazililo, fenoxazinilo, fenotiazinilo, morfolinilo, tiazinilo, benzodiazepinilo, purínílo, xantinilo, hipoxantinilo, teofilinilo, teobromonilo, cafeinilo, pleridinilo, pterinilo, pteridinilo, aloxazinilo e nortropinilo.

Sob a designação de nucleobases naturais entendem-se, por exemplo, uracilo, citosina, 5-metiluracilo, adenina e guanina e sob a designação de nucleobases não naturais entendem-se, por exemplo, 5-nitroindolo, 5-(hidróximetilo)-uracilo, 5-aminouracilo, pseudouracilo, di-hidrouracilo, 5-(Ci-C6)-alquilo-uracilo, 5- (C2-C6) -alquenilo-uracilo, 5-(C2-Cs)-alquinilo-uracilo, 5-fluorouracilo, 5-fluorocitosina, 5-clorouracilo, 5-clorocitosina, 5-bromouracilo, 5-bromocitosina, 7-deaza-purina substituída em 7, como 7-deaza-7-(C3-C7)-alquinilguanina, 7-deaza-7-(C3-C7)-alquiniladenina, 7-deaza-7- (C2-C7) -alquenilguanina, 7-deaza-7- (C2-C7) -alqueniladenina, 7-deaza-7-(Ci-C7)-alquilguanina, 7-deaza-7-(C1-C7)-alquiladenina, 7-deaza-7-bromoguanina e 7-deaza-7-bromoadenina.

De preferência as nucleobases não naturais são 5- (Ci-Ci) -alquilo-uracilo, 5- (C2~C6) -alquenilo-uracilo, 5-(C2-C6)-alquinilo-uracilo, 5- (Ci-Cs) -alquilo-citosina, 5-(C2-C6)-alquenilo-citosina, 5- (C2-C6)-alquinilo-citosina, 5- fluorouracilo, 5-fluorocitosina, 5-clorouracilo, 5-clorocitosina, 5-bromouracilo, 5-bromocitosina ou 7-deaza-purina substituída em 7 como 7-deaza-7-(C3-C7)-alquinilguanina, 7-deaza-7- (C3-C7) -alquiniladenina, 7-deaza-7- (C2-C7) -alquenilguanina, 7-deaza-7- (C2-C7) -alqueniladenina, 7-deaza-7- (Ci-C?) -alquilguanina, 7-deaza-7- (Ci~C7) - alquiladenina, 7-deaza-7-bromoguanina e 7-deaza-7-bromoadenina, especialmente prefridas são 5-(Ci-C6)- 12

alquilo-uracilo, 5- (C2-Ce) -alquenilo-uracilo, 5-(C2-C6) ~ alquinilo-uracilo, 5- (Ci-C6) -alquilo-citosina, 5-(C2-C6)-alquenilo-citosina, 5-(C2-C6)-alquinilo-citosina ou 7-deaza-purina substituída em 7, e muito especialmente preferidas são 5-pentilcitosina, 5-hexiniluracilo, 5-hexinilcitosina, 7-deaza-7-propinilyuanina, 7-deaza-7-propiniladenina, 7-deaza-7-metlguanina, 7-deaza-7-metiladenina, 7-deaza-7-propiniladenina, 7-deaza-7-bromoguanidina, 7-deaza-7-bromoadenina.

Ligandos "Repórter" são por exemplo, fluoresceina, biotina, acridina, fenantrolina, fenantridina e eosina.

Sob a designação de aminoácidos L- encontram-se, desde que não se diga nada em contrário, os mencionados seguidamente (ver Schroeder, Luebke, Peptides, Volume 1, New York 1965, páginas XXII-XXIII; Houben-Weyl, Methoden der Organischen Chemie, volume XV/1 e 2, Stuttgart, 1974):

Aad, Abu, yAbu, ABz, 2abz, sAca, Ach, Acp, Adpd, Ahb, Aib, PAib, Ala, βΑΙβ, AAla, Alg, All, Ama, Amt, Ape, Apm, Apr, Arg, Asn, Asp, Asu, Aze, Azi, Bai, Bph, Can, Cit, Cys, Cyta, Daad, Dab, Dadd, Dap, Dapm, Dasu, Djen, Dpa, Dtc, Fel, Gin, Glu, Gly, Guv, hAla, hCys, hGln, hGlu, His, hLeu, hLys, hMet, hPhe, hPro, hSer, hThr, hTrp, hTyr, Hyl, Hyp, 3Hyp, Ile, Ise,

Iva, Kyn, Lant, Lcn, Leu , Lsg, Lys , PLy ’s, ALys, Met, Mim, Min, hArg, Nle, Nva, Oly, Orn, Pan, Pec, Pen, Phe, Phg, Pic, Pro, ÁPro, Pse, Pya, Pyr, Pza, Qin, Ros, Sar, Sec, Sem, Ser, Thi, pThi, Thr, Thy, Thx, Tia, Tle, Tly, Trp, Trta , Tyr, Vai etc, cujas abreviaturas sem descriptor estéreo significam um grupo na forma L, ou também aminoácidos cíclicos , como por exemplo Ácido pirrolino-2-carboxílico; ácido piperidino-2- 13 *7

Γ~\

ácido carboxílico; ácido 1,2,3,4-tetra-hidroisoquinolino-3-carboxílico; ácido deca-hidroisoquinolino-3-carboxílico; ácido octa-hidroindolo-2-carboxílico; ácido deca-hidroquinolimo-2-carboxílico; ácido octa-hidrocicplopenta[b]pirrolo-2-carboxílico; ácido 2-azabiciclo[2.2.2]octano-3-carboxílico; ácido 2-azabiciclo[2.2.1]heptano-3-carboxílico; ácido 2-azabiciclo[3.1.0]hexano-3-carboxílico; ácido 2-azaspiro[4.4]nonano-3-carboxilico; ácido 2-azaspiro[4.5]decano-3-carboxílico; ácido spiro[ (biciclo[2.2, l]heptano]-2, 3-pirrolidino-5-carboxilico; ácido carboxílico; carboxílico; carboxílico; carboxílico; carboxílico; spiro[ (biciclo[2.2.2]octano]-2/ 3-pirrolidino-5- ácido ácido ácido ácido 2-azatriciclo[4.3.0. l6,9]decano-3-deca-hidrociclo-hepta[b]pirrolo-2-deca-hidrociclo-octa[b]pirrolo-2-deca-hidrociclo-penta[b]pirrolo-2-ácido 2,3,3a,4,6a-hexa- hidrociclopenta[b]pirrolo-2-carboxílico; 2,3,3a,4,5,7a-hexa-hidroindolo-2-carboxílico; ácido tetra-hidrotiazolo-4- carboxílico; ácido isoxazolidino-3-carboxílico; ácido pirazolidino-3-carboxílico; ácido hidroxipirrolidino-2- carboxílico; que podem todos eventualmente ser substituídos:

US-A 4,344,949; US-A 4,374,847; US-A 4,350,704; EP-A 29 488; EP-A 31 741; EP-A 46 953; EP-A 49 605; EP-A 49 658; EP-A 50 800; EP-A 51 020; EP-A 52870; EP-A 79 022; EP-A 84 164; EP-A 89 637; Ep-A 90 341; Ep-A 90 362; EP-A 101 102; Ep-A 109 020; EP-A 111 873; EP-A 271 865 e EP-A 344 682.

Grupos alquilo e grupos derivados destes, como por exemplo, alcóxilo e alquiltio podem ser ramificados, não ramificados ou cíclicos, saturados ou uma ou mais vezes insaturados.

Os compostos de fórmula I são de preferência, tal que 15

JU -r n significa um número entre zero e 50; B significa, independentemente entre si, uma nucleobase natural ou uma nucleobase não natural; l significa n; A significa um grupo da fórmula Iib, em que r = 1 e s é zero, e R2, R3=HeY' = 0eM uma ligação simples; D e G significam, independentemente entre si, CHR5; R5 significa hidrogénio; X significa -0-; Y significa =0; Z significa hidróxilo, metóxilo, etóxilo, (4- nitrofenol)etóxilo, prpóxilo, isopropóxilo, butóxilo, pentóxilo, fenóxilo ou allilóxilo; Q e Q', significam, independentemente entre si, hidrogénio ou R8, ou oligonucleotideos, que podem ser não modificados ou midificados, em que a) as pontes de diéster de ácido fosfórico em 3'- e/ou 5'-, podem estar total ou parcialmente substituídas através de pontes de tioato de fósforo, ditioato de fósforo, NR4R4'amidato de fósforo, NR3' -P5' amidato de fósforo (descritos por exemplo em Gryaznov et al., J. Am. Chem. Soc., 116 (1994) 3142), O-éster metílico de fosfato, O-éster etílico de fosfato, O-éster isopropílico de fosfato, fosfonato de metilo ou fenilfosfonato de fenilo; 16 !-,· ifcr

Γ\

b) uma ou duas pontes de diéster de ácido fosfórico nas posições 3ou 5r- se encontram substituídas através das posições de pirimidina e se encontram substituídas nas zonas terminais 5'- e/ou 3' através de acetal fórmico e/ou 3'-tioformoacetal; c) a coluna de açúcar-fosfato encontra-se total ou parcialmente substituída através de "PNAs" ou híbridos PNA-ADN; d) as unidades de β-ϋ-2'-desóxiribose, encontram-se total ou parcialmente substituída através de 2'-F-2'-desoxiribose, 2’-0-(Ci-C6) alquilribose; 2'-0-(C2-C6) alquenilribose, 2'-NH2-2'-desoxiribose; e) as bases nucleosídicas naturais, encontram-se total ou parcialmente substituídas através de 5-(Ci-C6)-alquilo-uracilo, 5- (C2-C6) -alquenilo-uracilo, 5- (C2-C6) -alquinilo-uracilo, 5-(Ci-C6)-alquilo-cítosina, 5- (C2-Cs) -alquenilo-citosina, 5- (C2-C6)-alquinilo-citosina, 5-fluorouracilo, 5-fluorocitosina, 5-clorouracilo, 5-clorocitosina, 5-bromouracilo, 5-bromocitosina, 7-deaza-7-(C2-C7) -alquinilguanina, 7-deaza-7-(C2-C7)-alqueniladenina, 7-deaza-7-(C1-C7)-alquilguanina, 7-deaza-7- (C1-C7) -alquiladenina, 7-deaza-7-bromoguanidina, 7-deaza-7-bromoadenina. São especialmente preferidos os compostos de fórmula I em que n significa um número entre 0 e 30; Q e Q', significam, independentemente entre si, hidrogénio ou R8, em que Rs significa H, (Ci-C6) -alquilo, fenilo ou 2— (4 — nitrofeniletilo) ou oligonucleotídeos, que podem ser não modificados ou midificados, em que 17

a) as pontes de diéster de ácido fosfórico em 3'- e/ou 5'-, estão total ou parcialmente substituídas através de pontes de tioato de fósforo, ditioato de fósforo ou fosfonato de metilo; b) uma ou duas pontes de diéster de ácido fosfórico nas posições 3'- ou 5'- se encontram substituídas nas zonas terminais 5'- e 3'; encontra-se total ou "PNAs" ou híbridos PNA- c) a coluna de açúcar-fosfato parcialmente substituída através de ADN; d) as unidades de β-ϋ-2'-desóxiribose, encontram-se total ou parcialmente substituída através de 2'-F-2'-desoxiribose, 2'-0- (Ci-C4) alquilribose; 2' -O- (C2-C4) alquenilribose, 2'-NH2-2'-desoxiribose; e) as bases nucleosídicas naturais, encontram-se total ou parcialmente substituídas através de 5-(C3-C6)-alquilo- uracilo, 5- (C2~C6) -alquenílo-uracilo, 5-(C2-C5)-alquinilo- uracilo, 5- (Ci-C6) -alquilo-citosina, 5- (C2-C6) -alquenilo- citosina, 5- (C2-C6) -alquinilo-citosina, 7-deaza-7-(C2-C7) -alquenilguanina, 7-deaza-7-(C2-C7) -alqueniladenina, 7-deaza-7- (C1-C7) -alquilguanina, 7-deaza-7- (Ca-C7) -alquiladenina, 7-deaza-7-bromoguanidina, 7-deaza-7-bromoadenina.

Muito especialmente preferidos são os compostos de fórmula I em que n significa um número entre 0 e 25; B significa, independentemente entre si, uma nucleobase natural; 18

Z significa hidróxilo, etóxilo, (4-nitrofenol)etóxilo ou fenóxilo; Q e Q', significam, independentemente uns dos outros, hidrogénio ou R8, em que R8 significa H, (Ci-C6) -alquilo, fenilo ou 2-(4_nitrofeniletilo), ou oligonucleotideos, que podem ser não modificados ou modificados, em que a) as pontes de diéster de ácido fosfórico em 3'- e/ou 5r-, estão total ou parcialmente substituídas através de pontes de tioato de fósforo; c) a coluna de açúcar-fosfato encontra-se total ou parcialmente substituída através de "PNAs" ou híbridos PNA-ADN; d) as unidades de β-ϋ-2'-desóxiribose, encontram-se total ou parcialmente substituída através de 2'-O-metilreibose, 2'-0-alilribose, 2'-O-butilribose; e) as bases nucleosídicas naturais, encontram-se total ou parcialmente substituídas através 5-hexinilcitosina, 5-hexiniluracilo, 5-hexinilcitosina, 7-deaza-7-propinilguanina, 7-deaza-7-propiniladenina, 7-deaza-7-metilguanina, 7-deaza-7-metiladenina, deaza-7-bormoguanina, 7-deaza-7-bromoadenina.

Um outro objectivo da invenção são compostos de fórmula I cujos Q e Qf se encontram ligados, isto é, formam uma molécula cíclica, em que possuem a possibilidade de Q e Q' em conjunto formarem uma ligação simples. A síntese deste tipo de compostos pode decorrer de acordo com métodos conhecidos, como por exemplo, Gao et al., Nucl. Acids Res. 23 (1995) 2025 ou Wang e Kool, Nucl. Acids Res. 22 (1994) 2326. 19 kwSjplfe ···«... -iiJsíí-í:

r \ JT 'S V >

Um outro objectivo da invenção são oligonucleotideos, em particular, nucleotídeos modificados, por exemplo PNA's, que se encontram ligados a compostos de fórmula I através das zonas terminais 3' ou 5' ou 5' e 3' . A ligaçSo dos oliyonuleotideos com os compostos de fórmula I decorre de preferência através dos grupos hidróxilo em 5' ou 3' do esqueleto de nucleotídeos, também através de uma ligação de monoéster do ácido fosfónico. Nas fórmulas XVIII e XIX é ilustrada e titulo de exemplo uma ligação com

(XVIII) (XIX) oligonucelotídeos. R1' significa H, OH, F, 2'-0-(Ci-C6)-alquilo, 2'-0-{C2-C6)alquenilo, de preferência significa H ou metóxilo ou 0-alilo, e significa de forma muito especialmente preferida H. Todas as outras variáveis são esclarecidas acima. A fórmula XX e a fórmula XXI, em que as variáveis possuem os significados acima referidos exemplificam claramente a ligação com PNAfs. V “—m"....... x-d

γ ?-x- z (XX)

NH~~ (XX0 20

As combinações dos compostos de fórmula I de acordo com a presente invenção (abreviatura ΡΝΕΜΆ caso Q e Q' = H) com oligonucleotideos ou oligonucleotideos modificados, como por exemplo PNA's ou outras modificações, como se descrevem acima, devem ser outra vez esquematicamente exemplifivadas (OLIGO significa oligonucleotideo não modificado ou modificado):

Exemplos para este tipo de combinações:

5'-OLIGO-PMENA 5'-PMENA-OLIGO 5'-OLIGO-PMENA-OLIGO para além disso conhecem-se: 5'-OLIGO-(PMENA-OLIGO)a (a = 1-20)

5'-PMENA-OLIGO - PMENA 5'-PMENA-(OLIGO-PMENA)a (a = 1-20) A síntese destes compostos combinados decorre de tal forma que, de acordo com cada molécula, em primeiro lugar começa-se a síntese do esqueleto de PMENA, que é descrito de seguida, que depois é acoplado ao esqueleto de oligonucleotideos. Procede-se ao acoplamento através de métodos conhecidos dos especialistas (Sonveaux, Biorganic Chemistry 14 (1986) 274 e seguintes) através de síntese em fase sólida ou através de síntese em solução como esqueleto monomérico ou através de condensação em bloco. As condensações decorrem, ou através do método de amidito, do método de H-fosfonato ou através do processo do triéster de fósforo (Sonveaux, Biorganic Chemistry 14 (1986) 274 e seguintes). Se pelo contrário se acoplar o esqueleto de PMENA sobre o esqueleto OLIGO, então este decorre de preferência 21

Γ\

de acordo com o método descrito em fi) . A conjugação com os esqueletos de PNA decorre de forma similar, se (monómeros ou oligómeros) o esqueleto de PNA for acoplado ao esqueleto de PMENA através de métodos conhecidos do especialista de síntese de peptídeos ou da síntese de éster. 0 objectivo da invenção é para além disso um processo para a preparação de compostos de fórmula I, que é caracterizado por 3-1

compostos de fórmula III

H2L-D G

(lll) em que D, G, L e X possuem os significados acima mencionados e S1 significa um grupo de protecção adequado, como por exemplo, dimetóxitritilo, moniometóxitritilo, tritilo, pixilo, tert-butóxocarbonilo, ou fluorenilmetiloxicarbonilo, de preferência monometóxitritilo ou tert-butóxicarbonilo,

serem transformados com compostos de fórmula IV

(IV) em que R5 e R6 possuem os significados acima mencionados, num solvente orgânico adequado, por exemplo, metanol, etanol, iso-propanol, butanol, acetonitrilo, diclorometano, (DCM), clorofórmio, benzeno, dimetilformamida (DMF), dimetilsulfóxido (DMSO), éter dietílico, acetato de etilo 22

(ΕΕ) , tetra-hidrofurano (THF), N-metilpirrolidona, éter de petróleo, xileno ou tolueno ou misturas adequadas de solventes, de preferência em metanol ou etanol, a temperaturas entre 0°C e 100°C, de preferência de 10 a 50°c, resultando compostos de fórmula Va ou Vb

em que a escolha das condições reaccionais, que são conhecidas do especialista (por exemplo, em S.R. Sandler, W. Karo "Organic Functional Group preparations", Vol. II, segunda edição, Academic Press, London, 1986, capitulo 12 ("imines") ) são para ter em atenção, de forma que sejam compatíveis com o grupo de protecção S1, isto é, se for escolhido, por exemplo, um grupo de protecção lábil em meio ácido, como o grupo de protecção de monometóxitritilo, então deve-se evitar a adição de ácido na reacção. bi) Compostos de fórmula Va ou Vb com compostos de fórmula Via ou VIb, de preferência com compostos de fórmula Via 2 Ys—xm/ s—x; s—xu/

P-Y-L 1 (Via) (VIb) em que Y como se define acima

X'e X'' independentemente entre si, como se define X 23

S2 e S3 independentemente entre si, significam grupos de protecção como por exemplo metilo, etilo, fenilo, 2-clorofenilo, 2,5-diclorofenilo, 2,4-diclorofenilo, 4-nitrofenilo, 4-metóxifenilo, 2-cianoetilo, 2-(4-nitrofenilo)etilo, alilo, benzilo, 2,2,2-tricloro-l,1- dimetiletilo, 4-metóxibenzilo, 2,2,2-tricloroetilo, 8- hidróxiquinolina ou outros grupos protectores de fosfato, que são conhecidos do especialista (Sonveaux, Biorganic Chemistry 14 (1986) 274 e seguintes), de preferência contudo metilo, etilo, fenilo, 2-(4-nitrofenilo)etilo, alilo, 2,2,2-tricloroetilo, e L1 significa um grupo abandonante, de preferência (Ci-C4)- alquilo, num solvente orgânico adequado, por exemplo, metanol, etanol, iso-propanol, butanol, acetonitrilo, benzeno, DMF, DMSO, DCM, EE, clorofórmio, éter dietílico, THF, N-metilpirrolidona, éter de petróleo, xileno, ou tolueno ou uma mistura de solventes adequados, de preferência em THF, a temperaturas de 0°C a 100°C, de preferência 50 a 80°C, eventualmente sob adição de bases, como por exemplo, tri- (Ci-Ce) -alquilamina, N-alquilmorfolina, piridina, N,N-dimetilaminopiridina, butilítio, di-isopropilamida de lítio (LDA), hidreto de sódio, amida de sódio, carbonato de potássio, carbonato de césio, tert-butilato de potássio ou complexos de bases como amida de sódio-Rn0Na, em que Ru significa (C2-C6)-alquilo ou CH3CH2-O-CH2CH3, ou bases peralquiladas de poliamino-fosfases transferidas (Schwessinger, Nachr. Chem. Techn. Lab. 38 (1990) 1214; Angew. Chem. 99 (1987) 1212), de preferência 24

contudo sem adição de base

que se transforma nos compostos de fórmula VII

Sf _3

-XI

Y

H -X "y 5 R5

(VII) em que D, G, L, R5, R6, Sl, S2, S3, X, X', X" e Y significam o que acima se definiu

Ci) Compostos de fórmula VII com compostos de fórmula VIII,

d PR

A-B ^2 (VIII) cuja sintese, por exemplo, é descrita em Dueholm et al., J. Org. Chem., 59 (1984), 5767 em que A significa o que acima se definiu

Bpr possui o mesmo significado que B, eventualmente contudo encontrando-se na forma protegida, isto é, caso B seja uma nucleobase natural ou não natural, então Bpr significa uma nucleobase cujos grupos amina, em particualr, hidróxilos se encontram protegidos por grupos protectores conhecidos adequados, como por exemplo, o grupo para-nitrofeniletilo, o grupo benzoílo, o grupo alilo, e o grupo para-(t-butil)benzoílo para o grupo hidróxilo e o grupo acetilo, grupo benzoílo, grupo para-(t-butil)benzoílo, grupo para-(metóxi)benzoílo, grupo para-(nitrofeniletilóxicarbonilo, ísobutirilo, grupo para-(t-butil)fenilacetilo, grupo N,N-dimetilformamidino, grupo fluorometilóxicarbonilo, grupo benzilóxicarbonilo, grupo fenóxiacetilo para o grupo 25

amina, ou outros grupos de protecção habituais, para as nucleobases, na química de oligonucleotídeos (Sonveaux, Biorganic Chemistry 14 (1986) 274 e seguintes; Beaucage, Tetrahedron 49 (1993) 2223 e seguintes), sendo de preferência BPR:

em que R12 significa hidrogénio, 1-propinilo, 1-butinilo, 1- pentinilo ou 1-hexinilo, em especial hidrogénio, 1-propinilo ou 1 -hexinilo; e R13 significa hidrogénio, difenilcarbamoílo ou 2 —{4— nitrofenil)etilo e R14 significa acetilo, benzoílo, para-(t-butil)benzoílo, para-(metóxi)benzoílo, para-(nitrofeniletilóxicarbonilo, isobutirilo, para-(t-butil)fenilacetilo, benzilóxicarbonilo ou fenóxiacetilo, e

Ir significa um grupo abandonante, como por exemplo, Cl,

Br, 0-S02Metilo, 0-S02trifluorometilo, Otosilato, 0-C6F5, ou caso A possua o significado da fórmula Iib, pode significar OII; 26

num solvente orgânico adequado, por exemplo, acetonitrilo, benzeno, DMF, DMSO, DCM, EE, clorofórmio, éter dietilico, tetrametilureia, THF, N-metilpirrolidona, éter de petróleo, xileno, ou tolueno ou misturas de solventes adequados, de preferência em DMF, a uma Lemperatura de -20°C a 100°C, de preferência de 0 a 50°C, eventualmente sob adição de bases, como por exemplo, tri-(Ci~ C6)-alquilamina, N-alquilmorfolina, piridina, N,N-dimetilaminopiridina, butilítio, di-isopropilamida de litio (LDA) , hidreto de sódio, amida de sódio, carbonato de potássio, carbonato de césio, tert-butilato de potássio ou complexos de bases como amida de sódio-RnONa, em que R11 significa (C2-C6) -alquilo ou CH3CH2-0-CH2CH3, ou bases peralquiladas de poliamino-fosfases transferidas (Schwessinger, Nachr. Chem. Techn. Lab. 38 (1990) 1214;

Angew. Chem. 99 (1987) 1212), caso A signifique a fórmula Iib e L2 signifique OH, de preferência sob adição de trietilamina, di-isopropiletilamina ou N-Etilmorfolina ou sem adição de bases com um reagente de acoplamento para ligações de peptideos,

transformando-se em compostos de fórmula IX

(IX) em que A, Bpr,D, G, L, R5, R6, S1, S2, S3, X, X', X" e Y significam o que acima se definiu 27

di) a partir de compostos de fórmula IX os grupos de protecção SJ são hidrolizados por processos conhecidos (por exemplo, Greene, Wuts, Protective Groups in Organic Chemistry Synthesis, J. Wiley & Sons, New York 1991), assim por exemplo para compostos de fórmula IX, nos quais S2 e S3 significam 2-(4-nitrofenil)etilo, através de tratamento com 0,1 M de 1,0- diazabiciclo[5,4,0]undecano-7-eno (DBU) em piridina ou acetonitrilo à temperatura ambiente ou compostos de fórmula IX nos quais S2 e S3 significam fenilo ou etilo, através de tratamento com solução aquosa de amoníaco ou para compostos de fórmula IX, nos quais S2 significa 2-(4-nitrofenil)etilo e S3 significa alilo, através de tratamento com Pd[P (C6H5) 3]4 e trif enilfosf ina em DCM (Hayakawa et al., J. Org. Chem., 58 (1993) 5551), ou compostos de fórmula IX, nos quais S2 significa 2-(4-nitrofenil)etilo e S3 significa alilo através de tratamento com 0,5 M de DBU em piridina ou acetonitrilo ou compostos de fórmula IX nos quais S2 significa 2-cianoetilo e S3 significa alilo através de tratamento com trietilamina em piridina ou compostos de fórmula IX nos quais S2 significa 2-(4-nitrofenil)etilo e S3 significa 2,2,2-tricloro-l,1-dimetiletilo através de tratamento com tributilfosfina, onde se obtêm compostos de fórmula X B™2 γ f S—XI J1 3-Λν 1' 1;p^un^_s1 H-X’"! 5>Cr6 D x (X) R em que A, BrR,D, G, L, R5, Rs, S1, S2, X', X' acima se definiu e Y significam o que ei) a partir de compostos de fórmula IX os grupos de protecção S1 são hidrolizados por processos conhecidos (por 28 'ν'"í \

1 *7

exemplo, Greene, Wuts, Protective Groups in Organic Chemistry Synthesis, J. Wiley & Sons, New York 1991, Sonveuax, Biorganic Chemistry 14 (1986) 274 e seguintes), assim hidroliza-se por exemplo o grupo de protecção monometóxitritilo através de tratamento com ácido, por exemplo, através de tratamento com ácido acético a 80%, com ácido 1,4-dícloroacético em diclorometano ou clorofórmio, com 2% de ácido p-toluenosulfónico em DCM/metanol ou através de tratamento com 1% de ácido trifluoroacético em clorofórmio, onde se obtêm compostos de fórmula XI

PR ,B' (XI)

S—Χ'νϊ I

, vRw A JA S—X" em que A, BPR, D, G, L, R5, R6, S2, S3, X, X', X'' e Y significam o que acima se definiu fi) compostos de fórmula XI com compostos X de acordo com a química de oligonucleotídeos (Sonveuax, Biorganic Chemistry 14 (1986) 274 e seguintes, Reese, J. Chem Soc. Perkin Trans. 1993, 2291 e seguintes) são submetidos ao processo conhecido de "processo de triester de fósforo" num solvente adequado, como acetonitrilo, benzeno, DMF, DMSO, DCM, EE, clorofórmio, éter dietílico, tetrametilureia, THF, N-metilpirrolidona, éter de petróleo, xileno, ou tolueno ou misturas de solventes adequados, de preferência em pi ridina, a temperaturas entre -20°C e 100°C, de preferência de 0 a 50°C, sob adição de um reagente de acoplamento, como por exemplo hexafluorofosfato de 6-nitrobenzotriazolo-l-ilóxitris(dimetilamino)-fosfónio (NBOP, Hashmi, Nucleosides & Nucleotides 13 (1994) 1059), hexafluorofosfato de benzotriazolo-1- 29 V Γ\

ilóxitris(dimetilamino)fosfónio (BOP, B. Castro, J.R. Dormoy, G. Evin e C. Selve, Tetrahedron Lett. 1975, 1212-1222), hexafluorofosfato de benmzotriazolo-l-ilóxo-tripirrolidino-fosfónio (PyBOP, J. Coste, D. LeNguyen e B. Castro,

Tetrahedron Lett. 1990, 205-208), hexafluorofosfato de 0-(7-aza)benzoLriazolo-l-llLetrameLilurónio (HATU, L. Carpino, J. Am. Chem. Soc. 1993, 115, 4397), cloreto de N, N-bis[2-oxo-3-oxazolidinilo]fosfodiamida (Katti, Tetrahedron Lett. 26 (1985) 2547), 2-cloro-5,5-diemtilo-2-oxo-l,3,2-

dioxafosforiano (Stavinsky, Nucl. Acids Res., Symp. Ser. 24, 1991, 229) ou um composto de fórmula XII

R—S-R16

II

O em que R15 significa (C6-Ci2)-arilo, eventualmente uma a quatro vezes substituído através de (Ci-C6) -alquilo, (Ci-C6)~ alcóxilo, nitro, cloro, bromo e em que eventualmente 1 a 3 átomos de C estão substituídos por heteroátomos, de preferência azoto, isto é por exemplo, fenilo, tolilo, 2.4.6- trimetilfenilo, 2,4,6-tri-isopropilfenilo, 2.3.5.6- tetra,etilbenzeno (Losse, Liebigs Ann. Chem. 1989, 19 e seguintes), 4-bromobenzeno, 2-nitrofenol, 4-nitrofenol, 4-nitrofenol, 8-quinolilo, de preferência significa 2,4,6-trimetilfenilo ou 2,4,6-tri-isopropilfenilo, e R10 significa um grupo abandonante como por exemplo, cloro, bromo, imidazolo, triazolo, 4-nitroimidazolo, 1,2,3,4-tetrazolo, 3-nitro,-1,2,4-triazolo, de preferência sob adição de um reagente de acoplamento do 30

i - *

O, £ t? / composto de fórmula XII ou BOP, PyBOP ou HATU eventualmente sob adição de um catalisador (Reese, J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1993, 2291 e seguintes), como por exemplo, N-metilimidazolo, N-óxidos de piridina, como N-óxido de 4-metóxipiridina, ou N óxido de 4-etóxipiridina,4,6-dinitro-l-hidróxibenzotriazolo, l-hidróxi-5-feniltetrazolo, 1-hidróxi-(5-(4-mitrofenil)tetrazolo, 3-nitro-lH-l,2,4-triazolo, 5— (3— nitrofenil)-lH-tetrazolo, 5-(3,5-dinitrofenil)-lH-tetrazolo, 5-(l-metilimidazolo-2-ilo)-lH-tetrazolo, 5-[(1-metilimidazolo-2-ilo)metilo]lH-tetrazolo ou l-hidróxi-4-nitro-6-(trifluorometilo)benzotriazolo, de preferência com N-óxido de 4-etóxipiridina ou N-óxido de 4-metóxipiridina como catalisador, em que a preparação dos reagentes de acoplamento decorre in situ, podendo contudo decorrer separadamente e a solução das espécies activas (composto de fórmula X + reagente de acoplamento) podem ser adicionados num solvente adequado

a compostos de fórmula XIII BPR s2 i bpr S2-X'J I „ V r n

Y A'

CXIJO R ' R“ em que A, BPR, D, G, L, R5, R6, S1, S2, S3, X, X7, X" e Y significam o que acima se definiu gi) partindo de compostos de fórmula XIII repetindo os passos ei) e fi) até ao tamanho de cadeia desejado, em que resultam os compostos de fórmula XIV, 31

(XIV)S~X'4 l α S—Χ'^^ρβ0" X' s 1 BrX\ / f o-pv L-JK,

3 PR VLr°' 5/^R6 -ti em que X' n A, Bpr, D, G, L, R5, R6, S1, S2, S3, X, significam o que acima se definiu hi) os grupo s de protecção S1, S2 e S3 e os grupos de protecção em BPR são hidrolisados por processos conhecidos (por exemplo, Greene, Wuts, Protective Groups in Organic Chemistry Synthesis, J. Wiley & Sons, New York 1991), isto é por exemplo, os grupos de protecção S1 como se descreve em ei) , os grupos S2 e S3, caso signifiquem 2— (4— nitrofenil)etilo, através de tratamento com 0,5 M de 1,8- diazabiciclo[5,4,0]undecano-7-eno (DBU) em piridina ou acetonitrilo à temperatura ambiente, caso S2 e S3 signifiquem fenilo, através de tratamento com solução aquosa de amoníaco, caso S2 e S3 signifiquem alilo, através de tratanmento com com Pd[P (C6H5) 3]4 e trifenilfosf ina em DCM (Hayakawa et al., J. signifiquem

Org. Chem., 58 (1993) 5551), caso cianoetilo, através de tratamento com trietilamina em piridina, ou caso S2 e S3 signifiquem 2,2,2-tricloro-l,1-dimetiletilo, através de tratamento com tributilfosfina, e os grupos de protecção em BPR, por exemplo caso R14 signifique para-nitrofeniletilóxicarbonilo, através de 0,5 M de DBU em piridina, caso R14 signifique isobutirilo ou benzoílo ou (metóxi)benzoílo, através de NH40H concentrado de 20 a 6U°C, ou caso R13 signifique 2-(4-nitrofenil)etilo, através de tratamento com 0,5M DBU em piridina ou acetonitrilo, de preferência, se S1 fôr igual a monometóxitritilo e S2 igual a 2-(para-nitrofenί1)eti1 o, remove-se de preferência o grupo 32

monometóxitritilo em primeiro lugar, de acordo com o descrito em ei), e de seguida S2 é removido como se descreve, e de seguida os restantes grupos de protecção, por exemplo nas nucleobases; e eventualmenle os grupas Q e Q' são introduzidos por processos conhecidos do especialista (ver, por exemplo, Uhlmann & Peyman, Chem Rev., 90 (1990) 543; M. Manoharan in "Antisense Research and Applications", Croocke e Lebelu, Eds., CRC Press, Boca Raton, 1993, Capítulo 17, página 303 e seguintes; EP-A 0 552 766; S. Agrawal em Methods in Molecular Biology, Volume 26, página 93 e seguintes, Human Press, Totowa 1994), e eventualmente os compostos resultantes são ciclizados de acordo com Wang, Nucl. Acids Res. 22 (1994) 2326, resultando compostos de fórmula I.

Alternativamente também podem ser colocados os conjugados Q' de acordo com processos conhecidos do especialista (J. March, "Advanced Organic Chemistry", quarta edição., J. Wiley & Sons, 1992) no esqueleto de monómero de fórmula XXII, que então de forma correspondente pode ser colocado por processos mencionados nos compostos de fórmula I

B1 PR

(XXII)

Compostos de fórmula XXII podem ser preparados por exemplo para Q'=alquilo, através de transformação de compostos de fórmula XXIII com compostos de fórmulas Via ou VIb e transformações subsequentes como se descreverem para as fórmula Va, em particualr, Vb. 33

(XXIII)

Compostos de fórmula XXII podem ser preparados a partir de compostos de fórmula IX através de hidrólise dos grupos de protecção S1 e introdução do grupo Q' de acordo com processos conhecidos(J. March, "Advanced Organic Chemistry", quarta edição., J. Wiley & Sons, 1992).

Alternativamente também podem ser colocados os conjugados Q e Q'' de acordo com processos conhecidos do especialista (J. March, "Advanced Organic Chemistry'·', quarta edição., J. Wiley & Sons, 1992) no esqueleto de monómero de fórmula XXIV, que então de forma correspondente pode ser colocado por processos mencionados nos compostos de fórmula I.

Q—X'4 i G Q-X·./· ;>OD' 'X-S1 (XXIV)

R R

Os reagentes de acoplamento para efectuar as ligações de peptídeoa (ver ci) ) são descritos em literatura correspondente, por exemplo, em Houben-Weyl, Methoden der organishen Chemie, Volume 15/2 Georg Thieme Verlag Stuttgart 1974 e outros reagentes como por exemplo BOP (B. Castro, J.R.Dormoy, G. Evin e C. Selve, tetrahedron Lett. 1975, 1219-1222), PyBOP (J. Coste, D. Le-Nguyen e B. Castro, Tetrahedron Lett., 1990, 205-208), BroO (J. Coste, M.-N. Dufour, A. Pantaloni e B. Castro, Tetrahedron Lett., 1990, 669-672); PyBroP (J. Coste, E. Frerot, P. Jouin e B. Castro, Tetrahedron Lett. 1991, 1967- 1970) e reagentes de urónio, 34

rtSlitiÉfe' ·' ! ί'ΑΒΚΙ:, ; (,1·,:ίΒ^ίί·;ί;ί·'ίί?η^»;;·:... tlur.iA.-, E-.jàt.jÍÁsfrnfcaS ._____

como por exemplo, HBTU (V. Dourtoglou, B. Gross, V. Lambropoulou, C. Zioudrou, Synthesis 1984, 572-574), TBTU, TPTU, TSTU, TNTU (R. Knorr, A. Trzeciak, W. Bannwarth e D. Gillessen, Tetrahedron Lett. 1989, 1972-1930), TOTU (EP-A-0 460 446), HATU (L.A. Carpino, J. Am. Chem. Soc., 1993, 115, 4397-4398), HAPyU, TAPipU (A. Ehrlich, 3. Rothemund, M. Brudel, M. Beyermann, L.A. Carpino e M. Biernet, Tetrahedron Lett. 1993, 4781-4784), BOI (K. Akaji, N. Kuriyama, T. Kimura, Y. Fujiwara e Y. Kiso, Tetrahedron Lett. 1992, 3177-3180) ou cloreto de ácido, em particular, fluoreto de ácido (L.A. Carpino, H.G. Chao, M. Beyermann e M. Biernet, J. Org. Chem., 56 (1991), 2635; J. -N. Bertho, A. Loffet, C. Pinei, F. Reuther e G. Sennyey em E. Giralt e D. Andreu (Editores) Peptides 1990, Escom Science Publishers B.V. 1991, página 53-54; J. Green e K. Bradley, Tetrahedron 1993, 4141-4146), 2,4,6-mesitilenosulfonilo-3-nitro-l,2,4-triazolido (MSNT) (B. Blankmeyer- menge, M. Mimitz e R. Frank, Tetrahedron Lett. 1990, 1701-1704), dióxido de 2,5-difenilo-2,3-di-hidro-3-oxo-4-hidróxitiofeno (TDO) (R. Kirstgen, R.C. Sheppard, W.Steglich, J. Chem. Soc. Chem. Commun. 1987, 1870-1871) ou ésteres activados (D. Hudson, Peptide Res. 1990, 51-55).

Para além disso é preferida a utilização de carbodi-ímidas, por exemplo, diciclo-hexilcarbodi-imida ou di-isopropilcarbodi-imída. São também preferidos para utilização reagentes de fosfónio, como por exemplo, PyBOP ou PyBroP, reagentes de urónio, como por exemplo, HBTU, TBTU, TPTU, TSTU, TNTU, TOTU ou HATU, BOI.

Aqu.i, o acoplamento pode decorrer directamente através da adição de compostos de fórmula VIII com os reagentes de activação e eventualmente sob adição de aditivos, como por exemplo, 1-hidróxibenzotriazolo (HOBt) (W. Koenig, R. Geiger, Chem. Ber. 103, 788 (1970)) ou 3-hidróxi-4-oxo-3,4—di- hidrobenzotriazina (HOObt) (W. Koenig, R. Geiger, Chem. Ber. 103, 2034 (1970) ) ou então a pré-activação do esqueleto na forma de éster activo pode decorrer separadamente e a 35

solução das espécies activas serem adicionadas num solvente adequado. 0 objectivo da presente invenção é para além disso um processo para a preparação de compostos de fórmula I, em que n significa 1 a 100, que é caracterizado por compostos de fórmula XV e XVI,

B PR (XV) v a s-X'J J G.

X- s

IP (XVI) em que A, BPR,D, G, L, R5, R6, S1, S2, S3, X, X', X" e Y significam o que acima se definiu, o e p são independentes entre si e significam zero a 50, de preferência de zero a 20 e o+p+l=n; a2) nos compostos de fórmula XV os grupos de protecçâo S1 são hidrolisados como se descreve em ei) , b2) nos compostos de fórmula XVI os grupos de protecçâo são hidrolisados como se descreve em di),

c2) os compostos correspondentes são acoplados como se descreve em f2), em que resultam os compostos de fórmula XIV

PR

B S~X^ U O. S—X-^sXrS0" x' X- s' (XV) R' ri 36

: ¢:1

~7

em que

significam o que acima se definiu, C2) e estes tranformados em compostos de fórmula I, como se descreve em hi) . 0 objectivo da presente invenção consiste para além disso num processo para a preparação de compostos de fórmula I, caracterizado por

a3) compostos de fórmula X

B

PR

(X) em que A, Bpr,D, G, L, R5, R6, S1, S2, X, X', X" e Y significam o que acima se definiu,

se acopla através de um SPACER, de acordo com processos conmhecidos, a um suporte sólido, originando um composto de fórmula XVII

B PR SS

em que A, Bpr,D, G, L, R5, R6, s1, S2, X, X', X" e Y significam o que acima se definiu 37

SS significa um suporte sólido adequado para síntese em

fase sólida/ como por exemplo, aminopropilo-CPG (CPG=®Controled Pore Glass) ou ®Tentagel, e SPACER significa um grupo hidrolisável do suporte, após ter decorrido a síntese, como é conhecido do especialista (Sonveaux, Biorganbic Chemistry 14 (1986) 274 e seguintes), por exemplo o grupo bis(hidróxietilo)sulfonilo, como se descreve em EP-A 0 552 766 (HOE 92/F012) ou SPACER significa uma molécula conjugada bisfuncional Q, que são ligados através de grupos hidrolisáveis a suportes sólidos, por exemplo, nucleosídeos ou oligonucleotídeos, que são ligados através de uma grupo de ácido succinico ao suporte sólido (Sonveaux, Biorganbic Chemistry 14 (1986) 274 e seguintes), ou poli, em particular, oligoetilenoglicóis, que são ligados através de uma grupo de ácido succinico ao suporte sólido (Jaeschke, Tetrahedron Lett. 34 (1993) 301) ou por exemplo, através de derivados de colesterol, que são ligados através de uma grupo de ácido succinico ao suporte sólido (MacKellar, Nucl. Acids Res. 20 (1992) 3411);

b3) a partir de compostos de fórmula XVII

em que A, Bpr,D, G, L, R5, R6, S1, S2, SS, SPACER, X, X', X" e Y significam o que acima se definiu, o yrupo de protecção SI é hidrolisado como se descreve em

c3) o composto resultante é transformado, de acordo com o descrito em fx) com compostos de fórmula X 38

Β PR 2 Υ s ^ρ. H-X"' « R ' 'R6 G.r.S'(X)

5XPeD—X em que A, Bpr,D, G, L, R5, R6, S1, S2, X, X', X'' e Y significam o que acima se definiu; d3) os passos b3) e c3) são repetidos de acordo com o tamanho da cadeia que se deseja; e3) eventualmente acoplamento do conjugado Q' através de processos conhecidos (ver, por exemplo, Uhlmann & Peyman, Chem Rev. 90 (1990) 543; M. Manoharan em "Antisense Research and Applications", Crooke e Lebelu, Editores., CRC Press, Boca Raton, 1993, Capitulo 17, página 303 e seguintes; EP-A 0 552 766; S. Agrawal em "Methods in Molecular Biology", Volume 26, página 93 e seguintes, Humana Press, Totowa 1994); f3) os compostos assim obtidos de acordo com processos conhecidos, são hidrolisadps do suporte sólido, por exemplo o ligante-bis(hidróxietil)sulfonilo, como se descreve em EP-A 552 766 (HOE 92/F 012), através de tratamento com DBU, o ligante ácido succinico através de tratamento com solução aquosa de amoníaco e os grupos de protecção como se descreve no passo hx), em que a hidrólise dos grupos de protecção podem decorrer também antes da hidrólise do suporte, e eventualmente o conjugado Q acoplado de acordo com processos conhecidos, em que a ordem do acoplamento de Q, em particular Q' (e3, f3) também pode ser mudada, e ventualmente ciclização dos compostos obtidos.

Os compostos de fórmula I encontram utilização como 39

Γ\

ÍA,A..iV' inibidores da expressão genética. O objectivo da invenção consiste assim na utilização de compostos activos farmaceuticamente de acordo com a presente invenção para a preparação de medicamentos, bem como processos para a preparação de medicamentos, que são caracterizados por os compostos de acordo com a presente invenção serem misturados com agentes veiculares fisiologicamente campativeis bem como eventualmente com agentes de adição e/ou auxiliares adequados.

Como compostos activos terapeuticamente, entende-se em geral, os compostos que devido à sequência do esqueleto B, que correspondem às nucleobases possuem uma função como análogos de oligonucleotídeos "antisense", oligobucleotideos formadores de tripla hélice, aptâmaros (moléculas de ARN ou AND que podem estar ligadas a moléculas alvo especificas, por exemplo, proteinas ou receptores, por exemplo L.C. Bock et al., Nature 1992, 355, 564) ou ribozimas (ARN catalítico, ver por exemplo, Castanetto et al., Criticai Rev. Eukar. Gene Expr. 1992, 2, 331), em especial como análogos de oligonucleotídeos "antisense" e oligonucleotídeos formadores de tipla hélice.

Para além disso, constituiu um outro objectivo da presente invenção, a utilização dos compostos de acordo com a presente invenção como diagnóstico, por exemplo, na detecção da presença ou ausência de quantidades específicas de moléculas de ácidos nucleicos de cadeia dupla ou cadeia simples em amostras biológicas.

Os compostos de acordo com a presente invenção, possuem, para as utilizações de acordo com a presente invenção de uma comprimento (n-1) de cerca de 6-100, de preferência de cerca de 10-40, e especialmente preferido de 12-31 nucleotídeos. Para além disso servem também aqui as gamas de derivados, 40

modificações, em particular conjugações.

Os medicamentos da presente invenção podem, por exemplo, ser utilizados para o tratamento de doenças que são originadas por vírus, por exemplo, através de HIV, HSV-l, HSV-2, gripe, vsv, hepatite B ou papilloma vírus.

As sequências de acordo com a presente invenção (sequências de bases), que são efectivas relativamente a estes alvos, são por exemplo: a) contra HIV, por exemplo

ACACCCAATTCTGAAAATGG SEQ ID N°:1 AGGTCCCTGTTCGGGCGCCA SEQ ID N° : 2 GGTCCCTGTTCGGGCGCCA SEQ ID N° : 26 GTCGACACCCAATTCTGAAAATGGATAA SEQ ID N° : 3 GCTATGTCGACACCCAATTCTGAAA SEQ ID N° :4 GTCGCTGTCTCCGCTTCTTCTTCCTG SEQ ID N° : 5 GTCTCCGCTTCTTCTTCCTGCCATAGG SEQ ID N° : 6 b) contra HSV-l, por exemplo GCGGGGCTCCATGGGGGTCG SEQ ID N° : 7 GGAGGATGCTGAGGAGG SEQ ID N° : : 28 GGAGGATGCTGAGG SEQ ID N° : 29 CAGGAGGATGC T GAGGAGG SEQ ID N° : 30

Os medicamentos da presente invenção são adequados por exemplo também para o tratamento de cancro ou restenose. Por exemplo, podem ser utilizadas sequências (sequências de bases), que se direccionam contra alvos, que são responsáveis pelo aparecimento de cancro, em particualr, crescimento de cancro. Esses alvos são, por exemplo: 41

1) Oncoproteínas nucleares como por exemplo c-myc, c-myb, c-fos, c-fos/jun, PCNA, pl20 2) Oncoproteínas citoplasmática associada à membrana como por exemplo EJ-ras, c-Ha-ras, N-ras, rrg, bcl-2, cdc-2, c-raf-1, c-mos, c-src, c-abl 3) Receptores celulares, como por exemplo, o receptor EGF, c-erbA, receptores/retinoide, subunidade reguladora da quinase da proteína, c-fms 4) Citoquina, factores de crescimento, matriz extracelular, como por exemplo, CSF-1, IL-6, IL-la, IL-lb, IL-2, IL-4, bFGF, mieloblastina, fibronectína, as sequências de acordo com a presente invenção (sequências de bases), que são efectivas relativamente a estes alvos, são por exemplo: a) contra c-Ha-ras, por exemplo

CAGCTGCAACCCAGC SEQ ID N°:8

c) c-myc, por exemplo GGCTGCTGGAGGCGGGGCACAC AACGTTGAGGGGCAT d) c-myb, por exemplo GTGCCGGGGTCTTCGGGC GTGCCGGGGTCTTCGGG SEQ ID N°:9 SEQ ID N°:10 SEQ ID N°:11 SEQ ID N°:27 42

e) c-fos, por exemplo SEQ ID N°:12 SEQ ID N°:13 SEQ ID N°:14 SEQ ID N°:15

GGAGAACATCATGGTCGAAAG

CCCGAGAACATCATGGTCGAAG

GGGGAAAGCCCGGCAAGGGG

f) pl20, por exemplo CACCCGCCTTGGCCTCCCAC g) Receptores EGF, por exemplo GGGACTCCGGCGCAGCGC SEQ ID N°:16 GGCAAACTTTCTTTTCCTCC SEQ ID N°:17 h) Supressor tumoral p53, por exemplo SEQ ID N :18 SEQ ID N°:19

GGGAAGGAGGAGGATGAGG GGCAGTCATCCAGCTTCGGAG I) bFGF, por exemplo GGCTGCCATGGTCCC SEQ ID N°:31

Os medicamentos da presente invenção são adequados, por exemplo, para além disso, para o tratamento de doenças, que são influenciadas através de receptores de adesão de integrina ou célula-célula, por exemplo através de VLA-4, VLA-2, ICAM ou ELAM.

As sequências de acordo com a presente invenção (sequências de bases), que são efectivas relativamente a estes alvos, são por exemplo: 43 a) VLA-4, por exemplo GCAG T AAGCATC CAT AT C SEQ ID N° : 20 b) ICAM, por exemplo CCCCCACCACTTCCCCTCTC SEQ ID N° : 21 CTCCCCCACCACTTCCCCTC SEQ ID N° : 22 GCTGGGAGCCATAGCGAGG SEQ ID N° : 23 c) ELAM-1 ACTGCTGCCTCTTGTCTCAGG SEQ ID N° : 24 CAAT CAATGACT TCAAGAGT T C SEQ ID N° : 25

Para além disso, os medicamentos da presente invenção, são adequados, por exemplo, para o tratamento de doenças que decorrer através de factores como TNF alfa.

As sequências de acordo com a presente invenção (sequências de bases), que são efectivas relativamente a estes alvos, são por exemplo: a) TNF-alfa, por exemplo SEQ ID N°:32 SEQ ID N°:33

TCATGGTGTCCTTTGCAGCC

TCATGGTGTCCTTTGCAG

Os medicamentos podem, por exemplo, ser utilizados na forma de preparados farmacêuticos, que podem ser administrados tópica ou oralmente, por exemplo na forma de comprimidos, drageias, cápsulas de gelatina rígida ou mole, soluções, emulsões ou suspensões. Podem também ser administradas na forma rectal, por exemplo, em supositórios, ou parenteralmente, por exemplo na forma de soluções injectáveis. Para a preparação de preparados farmacêuticos, 44

estes compostos podem ser manipulados em agentes veiculares orgânicos e inorgânicos inertes. Exemplos para este tipo de agentes veiculares para comprimidos, drageias e cápsulas de gelatina rígida são a lactose, amido de milho, ou derivados destes, talco, ácido esteárico ou sais. Os agentes veiculares adequados para a preparação de soluções são, água, polióis, sacarose, açucares invertidos, e glucose. Agentes veiculares para as soluções injectáveis são água, álcoois, polióis, glicerol e óleos vegetais. Agentes veiculares adequados para supositórios são óleos de origem vegetal e viscosos, ceras, gordura e polióis semi-líquidos. Os preparados farmacêuticos podem também conter conservantes, solvente, estabilizadores, agentes reticuladores, emulsionantes, edulcorantes, corantes, agentes de paladar, sais e modificadores da pressão osmótica, tampão, agentes de revestimento, anti-oxidantes, bem como, eventualmente, outros agentes terapeuticamente activos. É preferida a administração oral Outra forma preferida de administração é a injecção. Aqui, formulam-se os oligonucliotídeos "antisense" numa solução líquida, de preferência num tampão fisiologicamente ingerivel, como por exemplo solução de Hank ou solução de Ringer. Os compostos activos terapeuticamente de acordo com a presente invençãio podem também ser formulados na forma sólida, e antes da administração serem dissolvidos ou suspendidos. As doses preferidas para uma administração sistemática são de 0,01 mg/kg até cerca de 50 mg/kg de peso de corpo e diariamente.

ACAC C CAAT T C T GAAAAT GG SEQ ID N° : 1 AGGTCCCTGTTCGGGCGCCA SEO ID N° : 2 GTCGACACCCAATTCTGAAAATGGATAA SEQ ID N° : 3 GCTATGTCGACACCCAATTCTGAAA SEQ ID N° : 4 GTCGCTGTCTCCGCTTCTTCTTCCTG SEQ ID N° : 5 GTCTCCGCTTCTTCTTCCTGCCATAGG SEQ ID N° : 6 45

GCGGGGCTCCATGGGGGTCG SEQ ID N° : 7 CAGCTGCAACCCAGC SE Q ID N° : 8 GGCTGCTGGAGGCGGGGCACAC SEQ ID N° : 9 AACGTTGAGGGGCAT SEQ ID N° : 10 GTGCCGGGGTCTTCGGGC SEQ ID N° : 11 GGAGAACAT C AT GG T CGAAAG SEQ ID N° : 12 CCCGAGAACATCATGGT CGAAG SEQ ID N° : 13 GGGGAAAGCCCGGCAAGGGG SEQ ID N° :14 CACCCGCCTTGGCCTCCCAC SEQ ID N° : 15 GGGACTCCGGCGCAGCGC SEQ ID N° : 16 GGCAAACTTTCTTTTCCTCC SEQ ID N° : 17 GGGAAGGAGGAGGAT GAGG SEQ ID N° : 18 GGCAGTCATCCAGCTTCGGAG SEQ ID N° : 19 GCAGTAAGCAT C CATAT C SEQ ID N° : 20 CCCCCACCACTTCCCCTCTC SEQ ID N° : 21 CTCCCCCACCACTTCCCCTC SEQ ID N° : 22 GCTGGGAGCCATAGCGAGG SEQ ID N° : 23 ACTGCTGCCTCTTGTCTCAGG SEQ ID N° : 24 CAATCAATGACTTCAAGAGTTC SEQ ID N° : 25 GGTCCCTGTTCGGGCGCCA SEQ ID N° :26 GTGCCGGGGTCTTCGGG SEQ ID N° : 27 GGAGGATGCTGAGGAGG SEQ ID N° : 28 GGAGGATGC TGAGG SEQ ID N° : 29 CAGGAGGAT GCT GAGGAGG SEQ ID N° : 30 GGCTGCCATGGTCCC SEQ ID N° : 31 TCATGGTGTCCTTTGCAGCC SEQ ID N° : 32 TCATGGTGTCCTTTGCAG SEQ ID N° : 33 AAGTTCATGGTTTCGG SEQ ID N° : 34

Exemplos 1) Éster 2-(p-nitrofenil)etilo do ácido N-(4- metóxitrifenilmetóxilo)etilaminometanofosfónico 46

1Ί *7 la) N-Fluorenilmetilóxicarbonilo-2-aminoetanol 8,61 g (0,141 mole) de 2-aminoetanol foram dissolvidos em 250 mL de dioxano e 150 mL de H20. A 15-20°C, foram, em primeiro lugar, adicionados 17,79 g (0,212 mole) de NaHC03, e depois em porções, 50 g (0,148 mole) de fluorenilmetilóxicarbonilo-N-succinimida. Agitou-se durante 1 hora à temperatura ambiente, e evaporou-se a seguir à secura. O resíduo foi particionado entre diclorometano (DCM) e H20, a fase orgânica seca sobre Na2S04 e o solvente evaporado em vácuo. O resíduo foi agitado com 100 mL de éter, o produto filtrado e bem lavado com éter. O rendimento foi de 38,77 g (97%). MS (ES+) 284,2 (M+H)+; 1H-RMN (200 Mhz, DMSO, TMS) : δ = 3,05 (dd, 2H; CH2OH) ; 3,39 (dd, 2H, N-CH2) ; 4,25 (m, 3H, Ar-CH-CH2) ; 4,61 (t, 1H, OH); 7,14-7,98 (m, 15H, Ar-H, NH) . lb) N-Fluorenilmetilóxicarbonilo-2-amino-l-(4-metóxitrifenilmetóxilo)etano 10 g (35,3 mmole) de N-fluorenilmetilóxicarbonilo-2- aminoetanol (do Exemplo la) foram dissolvidos em 100 mL de N,N-dimetilformamida (DMF) e foram adicionados a 0°C de 5,93 (45,93 mmole) de di-isopropiletilamina (DIPEA) e 10,01 g (35,3 mmole) de cloreto de 4-metóxitrifenilmetilo e em primeiro lugar agitados 1 hora a 0°C e depois 1 hora à temperatura ambiente. A mistura reaccional foi evaporada e particionada entre DCM e uma solução aquosa saturada de NaHC03. A fase orgânica foi lavada com H20 e seca sobre Na2S04, sendo o solvente evaporado a vácuo. Para a purificação efectuou-se cromatografia em sílica-gel (em primeiro lugar n-heptano/acetato de etilo (EE)/trietilamina (TEA) 70/29/1; depois EE/TEA 99/1). O rendimento foi de 14,4 g (73%). 47 ••-O - v. . ‘T-'fíg

MS(FAB): 562,3 (M+Li)+; ^-RMN (200 Mhz, DMSO, TMS) : δ = 2,95 (t, 2H, CH20-MMTr) ; 3,21 (dd, 2H, N-CH2) ; 3,75 (s, 3H, OCH3) ; 4,25 (m, 3H, Ar-CH-CH2); 4,61 (t, 1H, OH); 6,80-7,96 (m, 23H, Ar-H, NH) . lc) 2-Amino-l- (4-metóxitrifenilmetóxiulo)etano 5,0 g (9 mmole) de N-fluorenilmetilóxicarbonilo-2-amino-l-(4-metóxitrifenilmetóxilo)etano (do Exemplo lb) foram dissolvidos em 50 mL de DMF absoluto e adicionados de 6,55 g (90 mmole) de dietilamina sendo agitados 2 horas. Para a purificação cromatografou-se em sílica-gel (em primeiro lugar n-heptano/EE/TEA 50/49/1; depois EE/metanol/TEA 79/20/1). O rendimento foi de 2,96 g (98,7%). MS (ES+) : 340, 3 (M+Li)1H-RMN (200 Mhz, DMSO, TMS): 6 = 2,75 (t, 2H, ÇH20-MMTr) ; 2,93 (dd, 2H, N-CH2) ; 3,75 (s, 3H, OCH3) ; 6,83-7,47 (m, 14H, Ar-H). ld) 2-Metilimino-l-(4-metóxitrifenilmetóxilo)etano (trimero) 2-Amino-l-(4-Exemplo lc) foram foram adicionados sob 2,96 (8,9 mmole) de metóxitrifenilmetóxiulo)etano (do dissolvidos em 10 mL de metanol e arrefecimento em gelo com 1,08 g (13,22 mmole) de 37% de formaldeído e agitados durante 4 horas à temperatura amibient, formando-se um precipitado viscoso. A mistura reaccional foi evaporada e purificado por cromatografia em sílica-gel (n-heptano/EE/TEA 50/49/1). O rendimento foi de 1,7 g (55%). MS(FAB): 1042,8 (M+Li)+; 1034,8 (M-H)+. 1H-RMN (200 Mhz, DMSO, TMS): δ = 2, 60 (t, 6H, CH20) ; 2,99 (t, 6H, N-CH2) ; 3,69 (s, 911, OCII3) ; 6, 78-7,42 (m, 42H, Ar-H). 48 /-· ~t- "yí! le) Fosfito de di(2-(4-nitrofenilo)etilo) 23,42 g (0,1 mole) de difenilfosfito foram aquecidos em conjunto com 33,43 g (0,2 mole) de p-nitrofeniletanol sob atmosfera de áyon durante 14 horas a 100°C, sendo que para a purificação se tenha utilizado cromatografia em silica-gel (n-heptano/EE 50/50; e depois EE/metanol 80/20). Rendimento 55%. MS (FAB); 403,1 (M+Na) + ; 381,1 (M-H) + . 1H-RMN (200 Mhz, DMSO, TMS) : δ = 3,03 (t, 4H, Ar-CH2) ; 4,20 (4H, dt, 0-CH2) ; 6,71 (d, J=140Hz, 1H, PH); 7,52 (d, 4H, Ar-H); 8,17 (d, 4H, Ar-H). lf) Éster di (2-(p-nitrofenilo)etilo) de ácido N-(4-metóxitrifenilmetóxilo)etilaminometanofosfónico A 500 mg (1,32 mmole) de fosfito de di(2-(4- nitrofenilo)etilo) (do Exemplo le) foram dissolvidos em 2 mL de tetra-hidrofurano absoluto (THF), sendo adicionados 341 mg (0,329 mmole) de 2-metilimino-l-(4- metóxitrifenilmetóxilo)etano (trimero) (do Exemplo ld) e a mistura agitada durante 3 horas a 80°C. O solvente foi evaporado e agitada por mais 30 minutos a 100°C. Para a purificação efectuou-se cromatografia em silica-gel (em primeiro lugar EE/TEA 99/1; depois EE/metanol/TEA 90/9//1). O rendimento foi de 83%. MS (FAB) : 732, 3 (M+Li) + . 1H-RMN (200 Mhz, DMSO, TMS): δ = 2, 64-3, 06 (m, 10H, Ar-CH2 + P-CH2 + CH2-0MMtr + N-CH2) ; ; 3,73 (s, 3H, 0-CH2); 4,16 (dt, 4H, PO-CH2) ; 6, 78-8, 08 (m, 22H,

Ar-H). 49 ‘ ...

2) Diéster di(2-(p-nitrofenil)etilo de ácido N-(N6-anisolilo)citosina-l-ilo-acetilo-N-(4-metóxitrifenilmetóxilo)etilamino-metanofosfónico 2a) A 2,00 g (2,76 mmole) de éster di(2-(p-nitrofenilo)etilo) de ácido N-(4-metóxitrifenilinelóxilo) etilaminoxaetanofosfónico (do Exemplo 1), dissolvidos em 60 mL de DMF absoluto, adicionaram-se 0,952 g (8,27 mmole) de N-etilmorfolina (NEM), 0,834 g (2,76 mmole) de ácido (Ns-anisolilo)citosina-l-ilo-acético e 1,153 g (3,03 mmole) de hexafluorofosfato de O-(7-aza)benzotriazolo-l-ilotetrametilurónio (HATU, L. Carpino, J. Am. Chem. Soc. 1993, 115, 4397) e agitaram-se durante 12 horas à temperatura ambiente. De seguida adicionou-se igual quantidade de HATU e agitou-se por mais 3 horas à temperatura ambiente. Para a purificação, cromatografou-se em sílica-gel (DCM/metanol/TEA 95/4/1). O rendimento foi de 2,7 g (97%). MS(ES+): 1012,0 (M+H)+. ^-RMN (200 Mhz, DMSO, TMS): δ = 2,94 (t, 4H, P-0-CH2-CH2-Ar) ; 3,06 (t, 2H, MMTr-0-ÇH2) ; 3,23-3,63 (m, 4H, P-CH2 + N-CH2) ; 3,75 (s, 3H, OCH3) ; 3,83 (s, 3H, OCH3) ; 4,10 (dt, 4H, P-0-CH2) ; 4,79 (s largo, 2H, C0-CH2) ; 6,80-8,18 (m, 28H, Ar-H, citosinilo-H) ; 11,03 (s. largo, 1H, NH) . 2b) Mistura como no Exemplo 2a) , contudo com utilização de tetrafluoroborato de O-(ciano(etóxicarbonilo)metilenoamino)-1,1,3,3-tetrametilurónio (TOTU, EP 0460446) em lugar de HATU. 0 rendimento foi de 57%. Dados espectroscópicos: ver Exemplo 2a) . 3) (Sal de terietilamónio) de mono éster (2-(p-nitrofeníl)etilo de ácido N-(N°-anisolilo)citosina-l-ilo-acetilo-N- (4-metóxitrifenilmetóxilo)etilamino-metanofosfónico 1 g de diéster di(2-(p- nitrofenil)etilo de ácido N- 50

(Ntt-anisolilo)citosina-l-ilo-acetilo-N-(4- metóxitrifenilmetóxilo)etilamino-metanofosfónico (do Exemplo 2) foram dissolvidos em 20 mL de uma solução a 0,1 M de 1,8-diazabiciclo[5,4,0]undecano-7-eno (DBU) em acetonitrilo absoluto e agitados durante 4 horas à temperatura ambiente. A mistura reaccional foi particionada entre DCM e uma solução aquosa de KH2P04 (pH 7), a fase orgânica foi seca sobre Na2S04 e o solvente evaporado em vácuo. Para a purificação, cromatografou-se em sílica-gel (DCM/metanol/TEA 70/29/1). 0 rendimento foi de 540 mg (57%). MS (FAB) : 906,5 (M-H + 2Na) + . 884, 6 (M+Na) + . 862,5 (M+H) + . Hí-RMN (200 Mhz, DMSO, TMS) : δ = 3,00 (m, 4H, P-0-CH2-ÇH2-Ar + MMTr-0-ÇH2) ; 3, 38-3, 60 (m, 4H, P-CH2 + N-CH2) ; 3,73 (s, 3H, OCH3); 3,82 (s, 3H, 0CH3) ; 4,01 (dt, 4H, P-0-CH2) ; 4,79 & 5,03 (ambos s largos, 2H, CO-CH2) ; 6,78-8,20 (m, 24H, Ar-H, citosinilo-H); 11,00 (s. largo, 1H, NH) . 4) Diéster di(2-(p-nitrofenil)etilo de ácido N-(N6-anisolilo)citosina-l-ilo-acetilo-N-(2-(hidróxi)etilaminometanofosfónico 1,00 g (0,99 mmole) de diéster di(2-(p-nitrofenil)etilo de ácido N- (N°-anisolilo)citosina-l-ilo-acetilo-N-(4- metóxitrifenilmetóxilo)etilamino-metanofosfónico (do Exemplo 2) foram dissolvidos em 80 mL de ácido acético a 80% e agitados à temperatura ambiente durante 4 horas. O solvente foi evaporado e coevaporou-se depois duas vezes com tolueno. Para a purificação, cromatografou-se em sílica-gel (DCM/metanol/TEA 85/14/1) . 0 rendimento foi de 522 mg (71%). MS (FAB): 761,2 (M+Na) + ; 739,3 (M+H)\ 1H-RMN (200 Mhz, DMSO, TMS): δ = 2,98 (m, 4H, P-0-CH2-CH2-Ar + MMTr-0-CH2) ; 3,38-3,67 (m, 4H, N-CH2CH2-OH) ; 3, 80-3, 89 (m, 2H, P-CH2) ; 3,91 (s, 3H, 51

* — OCH3) ; 4,12 (dt, 4H, P-0-CH2) ; 4,78 & 4,87 (ambos s largos, 2H, CO-CH2) ; 6,98-8,19 (m, 14H, Ar-H, citosinilo-H); 11,02 (s. largo, 1H, NH). 5) 5' -MMTr-CAn-P (ONPE) -C^-P (ONPE) 2 A síntese decorre de acordo com o Exemplo 17 a partir de (sal de terietilamónio) de mono éster (2-(p-nitrofenil)etilo de ácido N- (N6-anisolilo)citosina-l-ilo-acetilo-N-(4- metóxitrifenilmetóxilo)etilamino-metanofosfónico (Exemplo 3) e diéster di(2-(p-nitrofenil)etilo de ácido N-(N6-anisolilo)citosina-l-ilo-acetilo-N-(2- (hidróxi)etilaminometanofosfónico (Exemplo 4). Para a purificação, cromatografou-se em sílica-gel (DCM/metanol/TEA 85/14/1). O rendimento foi de 73%. MS (FAB) : 1605 (M+Na)+; 1583 (M+H)+. ^-RMN (200 Mhz, DMSO, TMS) : 5 = 2,94-3,18 (m, 6H, P-0-CH2-CH2-Ar) ; 3,26-3,95 (m, 10H); 3,75 (s, 3H OCH3) ; 3,99-4, 36 (m, 8H, P-0-CH2) ; 4,75- 4,92 (m largo, 4H, CO-CH2) ; 6,38-8,18 (m, 38H, Ar-H, citosinilo-H); 10,98 & 11,03 (ambos s. largos, 2H, NH). 6) 5' -HO-CAn-P (ONPE) -CAn-P (ONPE) 2 A síntese decorre de forma análoga ao Exemplo 4 a partir de 5) 5' -MMTr-C^-P (ONPE) -CAn-P (ONPE)2 (Exemplo 5). Para a purificação, cromatografou-se em sílica-gel (DCM/metanol/TEA 85/14/1). O rendimento foi de 74%. MS(FAB) : 1332,4 (M+Na)+; 1310,3 (MiH) + . 7) Éster dietílico do ácido N-(4- metóxitrifenilmetóxilo)etilaminometanofosfónico A síntese de corre de forma análoga ao Exemplo If) , 52

-r\ .Ar**

jT

contudo com fosfito de dietilo. Rendimento: 87,5% MS (FAB): 490,2 (M+Li) + . 1H-RMN (200 Mhz, DMSO, TMS) : δ = 1,22 (t, 6H, CH2-ÇH3) ; 2,80 (t, 2H, N-CH2) ; 2,91 (d, J=12,5Hz, 2H, P-CH2) ; 3,02 (t, 2H, CH2-OMMTr) ; 3,75 (s, 3H, OCH3) ; 4,01 (dq, 4H, PO-CHz); 6,84-7,45 (m, 14H, Ar-H). 8) Éster dietílico do ácido N-timino-l-ilo-acetilo-N-(4-metóxiltrifenilmetóxilo)etilaminometanofosfónico A 2,04 g (4,22 mitiole) de éster dietílico do ácido N-(4-metóxitrifenilmetóxilo)etilaminometanofosfónico dissolvidos em 50 mL de DMF absoluto, foram adicionados 570,3 mg (4,22 mmole) de hidróxibenzotriazolo (HOBT), 972,1 mg (5,05 mmole) de di-isopropilcarbodi-ímida. Agitou-se durante 16 horas à temperatura ambiente, evaporou-se o solvente, o resíduo foi dissolvido em DCM e extraído com solução aquosa de NaHC03, e depois com solução saturada aquosa de NaCl. Secou-se sobre sulfato de sódio, e evaporou-se o solvente. Para a purificação, cromatografou-se em sílica-gel (DCM/metanol/TEA 98/2/1). O rendimento foi de 2,47 g (90%). MS(FAB): 662, 3 (M+Na)+; 656,3 (M+H)+. 1H-RMN (200 Mhz, DMSO, TMS): δ = 1,12-1,32 (m, 6H, CH2-ÇH3) ; 1,68 & 1,75 (cada s, 3H, T-CH3) ; 3,10-3,40 (m, 2H, CH2-0MMTr) ; 3,53-3,70 (m, 4H, P-CH2 + N-CH2) ; 3,75 (s, 3H, 0CH3) ; 3,83-4,16, (m, 4H, P-O-CH2); 4,62 & 4,72 (cada s, 2H, CO-CH2) ; 6, 83-7,42 (m, 15H, Ar-H, T-H); 11,28 (ambos s. largos, 1H, NH). 9) (Sal de trietilamónio) de éster dietílico do ácido N-timino-l-ilo-acetilo-N-(4- metóxiltrifenilmetóxilo)etilaminometanofosfónico 811 mg (1,25 mmole) de éster dietílico do ácido N-timino-1- 53

i \

I

ilo-acetilo-N-(4-metóxiltrifenilmetóxilo)etilamino-metanofosfónico (Exemplo 8) foram suspensos em 3,75 mL de IN de NaOH. Agitou-se durante 6 horas a 50°C. A mistura reaccional foi concentrada em vácuo, o resíduo cromatografado em sílica ge (EE/metanol/TEA 100/10/10 e depois 100/40/10) . O rendiiuenlo foi de 827 mg (99,5%) . MS(ES-): 620, 4 (Μ-ΗΓ; 656,3 (M+H)\ 1H-RMN (200 Mhz, DMSO, TMS) : 8 = 1,18 (t, 9H, N-CH2-CH3) ; 1,68 & 1,74 (cada s, 3H, T-CH3) ; 2, 96-3, 08 (q, 6H, N-CH2-ÇH3) ; 3,35 (m, 2H, N-CH2) ; 3, 43-3,70 (d, J=llHz, 2H, P-ÇH2) ; 3,63 (t, 2H, CH2-OMMTr) / 3,75 (s, 3H, OCH3) ; 3,78, (dq, 2H, P-0-CH2) ; 4,60 & 4,86 (cada s, 2H, CO-CH2) ; 6,82-7,41 (m, 15H, Ar-H, T-H) ; 11,24 (s, 1H, NH) . 10) Éster dietílico do ácido N-timino-l-ilo-acetilo-N-(2-hidróxi)etilaminometanofosfónico A síntese decorre de acordo com o Exemplo 4 a partir de éster dietílico do ácido N-timino-l-ilo-acetilo-N-(4- metóxiltrifenilmetóxilo)etilaminometanofosfónico (Exemplo 8). Para a purificação, cromatografou-se em sílica-gel (EE/metanol 90/10). O rendimento: 80% MS (FAB) : 400,1 (M+Na) + ; 378,1 (M+H) + . 1H-RMN (200 Mhz, DMSO, TMS): δ = 1,17-1,32 (m, 6H, CH2-ÇH3) ; 1,78 (s, 3H, T-ÇH3) ; 3,40-3, 69 (m, 4H, CH2-0H + N-CH2) ; 3,89 (d, J=llHz, 2H, P- CH2) ; 3,92-4,19 (m, 4H, 3,75 (s, 3H, OCH3) / 3,83-4, 19, (m, 4H, P-0-CH2) ; 4,70 (s, 2H, C0-ÇH2) ; 4,98 (t, 1H, OH); 7,22 & 7,30 (cada s., 1H, T-H); 11,25 (s, 1H, NH). 11) Éster difenílico de ácido N-(4- metóxiltrifenilmetóxilo)etilaminometanofosfónico 54

A síntese decorre de acordo com o Exemplo lf, contudo utilizando fosfito de dietilo. Rendimento: 100% MS (FAB): 58,2 (M+Li)\ 12) (Sal de trietilamónio) de éster monofenílico do ácido N-timino-l-ilo-acetilo-N-(4- metóxiltrifenilmetóxilo)etilaminometanofosfónico A síntese decorre de acordo com o Exemplo 8 a partir de éster difenílico de ácido N-(4-metóxiltrifenilmetóxilo)etilaminometanofosfónico (Exemplo 11) e ácido timidino-l-ilo-acêtico. Para a purificação, cromatografou-se em sílica-gel (EE/metanol/TEA(H20 90/10/5/0,5). O rendimento: 47%. MS (FAB) : 682,3 (M+2Li-H) + . 1H-RMN (200 Mhz, DMSO, TMS) : Ô = 1,16 (t, 9H, N-CH2-CH3) ,* 1,67 & 1,72 (cada s, 3H, T-CH3) ; 2, 96-3,79 (m, 2H, N-CH2-CH3 + N-CH2 + P-CH2 + CH2-0MMTr) ; 3,75 (s, 3H, OCH3) ; 4,58 & 4,88 (cada s, 2H, C0-ÇH2) ; 6,74-7,46 (m, 20H, Ar-H, T-H); 11,23 (s, 1H, NH). 13) Diéster fenilo-(4-nitrofeniletilo) do ácido N-timino-1-ilo-acetilo-N-(4- metóxiltrifenilmetóxilo)etilaminometanofosfónico 385 mg (0,5 mmole) de (sal de trietilamónio) de éster monofenílico do ácido N-timino-l-ilo-acetilo-N-(4-metóxiltrifenilmetóxilo)etilaminometanofosfónico (Exemplo 12) e 92 mg (0,55 minole) de (4 nitrofeniletanol) foram coevaporados três vezes com piridina absoluta, e de seguida dissolvidos em 15 mL de piridina absoluta. A 0°C foram adicionados 403,4 mg (0,15 mmole) de 3-nitro-l-(p-toluenosulfonilo)-1H-1,2,4-triazolo (TSNT), e de seguida agitados 16 horas a 0-5°C, a piridina foi evaporada em 55

7 Γ\ 7 Γ\

......fp vácuo, o resíduo retomado em EE e de seguida lavado sucessivamente com uma solução aquosa saturada de NaHC03 e solução aquosa de NaCl. Para a purificação, cromatografou-se em sílica-gel (EE/TEA 100/2) . O rendimento foi de 162 mg. MG (FAB) : 031,1 (M+2Li-II)+; (M+Li)*. 14) Diéster (2-(p-nitrofenilo)etilo do ácido N-timino-l-ilo-acetilo-N-(4-metóxiltrifenilmetóxilo)etilaminometanofosfónico A síntese decorre de acordo com o Exemplo 8 a partir de éster di(2-(p-nitrofenilo)etilo) de ácido N-(4- metóxitrifenilmetóxilo)etilaminometanofosfónico (Exemplo lf) e ácido tmidino-l-ilo-acético. MS (ES+) : 898, 4 (M+Li)\ ^-RMN (200 Mhz, DMSO, TMS) : δ = 1,65 & 1,72 (cada um s., 3H, T-CH3) ; 2,96 (t, 4H, P-0-CH2-CH2-Ar) ; 3,06 (t, 2H, N-CH2) ; 3,67 (d, J=llHz, 2H, P~CH2) ; 3,70 (m, 2H, MMTr-0-CH2) ; 3,75 (s, 3H, OCH3) ; 3,83 (s, 3H, OCH3) ; 4,10 (dt, 4h; P-0-CH2) ; 4,59 & 4,62 (cada um s., largo, 2H, CO-CH2); 6,83-8,18 (m, 23H, Ar-H, T-H); 11,30 (s largo, 1H, NH). 15) (Sal de trietilamónio) de diéster fenilo-(4-nitrofeniletilo) do ácido N-timino-l-ilo-acetilo-N-(4-metóxiltrifenilmetóxilo)etilaminometanofosfónico 15a) A partir de diéster fenilo-(4-nitrofeniletilo) do ácido N-timino-l-ilo-acetilo-N-(4- metóxiltrifenilmetóxilo)etilaminometanofosfónico (Exemplo 13) 30 mg de diéster fenilo-(4-nitrofeniletilo) do ácido N-timino-l-ilo-acetilo-N-(4- metóxiltrifenilmetóxilo)etilaminometanofosfónico (Exemplo 13) foram dissolvidos numa mistura de 1 mL de TEA, 1 mL de dioxano e 80 mg de p- nictobenzaldoxima e agitados 56 \ \ p-? durante 3 horas à temperatura ambiente. 0 solvente foi evaporado em vácuo, o resíduo coevaporado três vezes em piridina e duas vezes em tolueno. 0 resíduo foi cromatografado em sílica-gel (EE/TEA/ 100/2 e depois EE/metanol/TEA 60/40/2). 0 rendimento foi de 23 mg. MS (ES+) : 755,3 (M+2Li-H) + . 1H-RMN (250 Mhz, DMSO, TMS) : δ = 1,15 (t, 9H, N-CH2-CH3) ; 1,60 & 1,79 (m, 3H, T-CH3) ; 2,80- 3,3,60 (m, 14H, N-CH2-CH3 + N-CH2 + P-CH2 + CH2-OMMTr + Ar- CH2) (m, 1H, ; 3,73 (s, 3H, OCH3) ; 4,01 2H, CO-CH2) ; 6,82-8,18 (m, NH) . (dt, 2H, P-0-CH2) ; 19H, Ar-H, T-H) ; 4,58 & 11, 30 4, 92 (s, 15b) A partir de diéster (2-(p-nitrofenilo)etilo do ácido N-timino-l-ilo-acetilo-N-(4- metóxiltrifenilmetóxilo)etilaminometanofosfónico (Exemplo 14) A síntese de corre de acordo com o Exemplo 3 a partir de diéster (2-(p-nitrofenilo)etilo do ácido N-timino-l-ilo-acetilo-N-(4-metóxiltrifenilmetóxilo)etilaminometanofosfónico (Exemplo 14), contudo em piridina como solvente. Rendimento: 82%: Dados espectroscópicos, ver Exemplo 15a. 16) Ácido N-timino-l-ilo-acetilo-N-(4- metóxiltrifenilmetóxilo)etilaminometanofosfónico A síntese decorre de acordo com o Exemplo 15b. Como produto lateral forma-se 18% de ácido N-timino-l-ilo-acetilo-N-(4-metóxiltrifenilmetóxilo)etilaminometanofosfónico. MS(ES-): 592,1 (M-H)'. 17) 5'-MMTr-T-P(OEtilo)-T-P(OEtilo)2 de éster 361 mg (0,5 mmole) de (sal de trietilamónio) 57

ácido dietílico do ácido N-timino-l-ilo-acetilo-N-(4-metóxitrifenilmetóxilo)etilaminometanofosfónico (IX) e 188,7 mg (0,5 mmole) de éster dietílico do ácido N-timino-l-ilo-acetilo-N- (2-hidróxi)etilaminometanofosfónico (X) foram dissolvidos em coevaporados em piridina absoluta, e depois dissolvidos em 10 mL de piridina. A S-IO^C foram adicionados 1,5 mmole de TSNT e agitou-se à temperatura ambiente durante 16 horas. A piridina foi evaporada em vácuo, o resíduo foi dissolvido em EE e de seguida lavada sussecivamente com solução aquosa saturada de NaHC03, e depois com solução aquosa de NaCl. Secou-se sobre Na2S04, concentrou-se e purificou-se por cromatografia em sílica gel (EE/metanol/TEA 92/8/2). O rendimento foi de 223 mg (46%). MS(FAB): 987,5 (M+Li)+. ^-RMN (200 Mhz, DMSO, TMS): os sinais característicos são: Ar-H & timina-H: 6,82-7,43 (m, 16H); CO-CH2: 4, 59-4,78 (m, 4H) ; Timina-CH3: 1, 63-1, 80 (m, 6H) . 18) 5' -HO-T-P(OEtilo)-T-P (OEtilo)2 A síntese decorre de acordo com o Exemplo 4 a partir de 5'-MMTr-T-P(OEtilo)-T-P(OEtilo)2 (Exemplo 17). Para a purificação, cromatografou-se em sílica-gel (EE/metanol/TEA 85/15/2 e depois 100/50/1,5). 0 rendimento foi de 95%. MS (FAB) : 731,2 (M+Na)+; 709, 1 (M+H) + . ^-RMN (200 Mhz, DMSO, TMS): os sinais característicos são: timina-H: 7,21-7,36 (m, 2H); CO-CH2: 4, 60-4,76 (m, 4H) ; Timina-CH3: 1, 63-1, 79 (m, 6H) . 19) 5' -MMTr-T-P(OFenilo)-T-P(OEtilo)2 A síntese decorre de acordo com o Exemplo 17 a partir de éster dietílico do ácido N-timino-l-ilo-acetilo-N-(2-hidróxi) etilaminometanofosfóni co (Exemplo 10) e (sal de 58

--

\ $ -Γ ^FX. trietilamónio) de éster monofenilico do ácido N-timino-l-ilo-acetilo-N- (4-metóxiltrifenilmetóxilo)etilaminometanofosfónico (Exemplo 12). Para a purificação, cromatografou-se em sílica-gel (EE/metanol/TEA 93/7/2). 0 rendimento foi de 58%. MS (FAB) : 1051,4 (MiNa)\· 1029,5 (MiH) + . 1H-RMN (200 Mhz, DMSO, TMS) : os sinais característicos são: Ar-H & timina-H: 6,82-7,53 (m, 21H); C0-CH2: 4,52-4,82 (m, 4H); Timina-CH3: 1,62-1,80 (m, 6H). 20) Diéster (4-nitrofeniletilo) do ácido N-timino-l-ilo-acetilo-N- (2-hidróxietilo)etilaminometanofosfónico A síntese decorre de acordo com o Exemplo 4 a partir de diéster (2-(p-nitrofenilo)etilo do ácido N-timino-l-ilo-acetilo-N-(4- metóxiltrifenilmetóxilo)etilaminometanofosfónico. Para a purificação, cromatografou-se em sílica-gel (EE/metanol 90/10). O rendimento foi de 85%. MS (ES+) : 620,3 (M+H) + . 1H-RMN (500 Mhz, DMSO, TMS): δ= 1,73 (s, 3H, T-CH3); 2,97 (t, 4H, P-0-CH2-ÇH2-Ar) ; 3,41 (m, 2H, N-CH2) ; 3,59 (m, 2H, CH2-OH) ; 3,83 (d, 2H, J=llHz, P-CH2) ; 4,08-4,30 (m, 4H, P-0-CH2) ; 4,54 & 4,78 (cada um s. largo, 2H, CO-CH2) ; 4,99 (t, 1H, OH); 7,14-8,19 (m, 9H, Ar-H, Timidinilo-H); 11,30 (s largo, 1H, NH) . 21) 5'-MMTr-T-P(ONPE)-T-P(OEtilo)2 A cíntece decorre de acordo com o Exemplo 17 α partir dc (cal de trietilamónio) de diéster fenilo-(4-nitrofeniletilo) do ácido N-timino-l-ilo-acetilo-N-(4-metóxiltrifenilmetóxilo)etilaminometanofosfónico (Exemplo 15). Em lugar de TSNT utilizou-se 3-nitro-l-(2,4,6-tri-isopropilfenilo)-sulfonilo)- 1H-1,2,4-triazolo (TIPSNT) 59

Pr? para o acoplamento. Para a purificação, cromatografou-se em sílica-gel (EE/metanol/TEA 95/5/2 e depois 90/10/2) . o rendimento foi > 90%. MS (ES+) : 1109,0 (M+Li)+; 1029,5 (M+H) \ ^-RMN (200 Mhz, DMSO, TMS) : os sinais caracteristicos são: Ar-H & timina-H: 6,02- 8,18 (m, 20H); C0-CH2: 4,51-4,76 (m, 4H) ; Timina-CH3: 1,61- 1,78 (m, 6H). 22) 5'-MMTr-T-P(ONPE)-T-P(OEt)2 A síntese decorreu de acordo com o Exemplo 21 a partir de éster dietílico do ácido N-timino-l-ilo-acetilo-N-(2-hidróxi)etilaminometanofosfónico (Exemplo 10) e de (sal de trietilamónio) de diéster fenilo-(4-nitrofeniletilo) do ácido N-timino-l-ilo-acetilo-N-(4- metóxiltrifenilmetóxilo)etilaminometanofosfónico (Exemplo 15). Em lugar de TSNT utilizou-se 3-nitro-l-(2,4,6-tri- isopropilfenilo)-sulfonilo)-1H-1,2,4-triazolo (TIPSNT) para o acoplamento. Para a purificação, cromatografou-se em sílica-gel (EE/metanol/TEA 95/5/2 e depois 90/10/2) . O rendimento foi > 90%.

Dados espectroscópicos ver Exemplo 21. 23) 5'-HO-T-P(ONPE)-T-P(OEt)2 A síntese decorreu de acordo com o Exemplo 4 a partir de "5'-MMTr-T-P(ONPE)-T-P(OEt) 2" (Exemplo 22). Para a purificação, cromatografou-se em sílica-gel (EE/metanol/TEA 95/5/2 e depois 90/10/2 e depois 80/20/2). O rendimento foi de 75%. MS (ES+) : 836, 3 M+Li) + . 1H-EMN (200 Mhz, DMSO, TMS): os sinais caracteristicos são: Ar-H & timina-H: 7,11-8,22 (m, 6H); CO-CH2: 4,55-4,77 (m, 4H) ; Timina-CH3: 1,71 (s largo, 60

6Η) . 24) 5'-HO-T-P(OH)-Τ-Ρ(OEtilo)2 10 mg (0,012 mmole) de "5'-HO-T-P(ONPE)-T-P(OEt) 2" (Exemplo 23) em 1 mL de uma solução de 0, 5M de DBU em piridina foram em primeiro lugar agitados 24 horas a 4°C e depois 24 horas à temperatura ambiente. 0 solvente foi evaporado em vácuo, o resíduo digerido duas vezes com penatno e depois duas vezes com éter, e depois a purificação sobre sílica gel por cromatografia (EE/metanol/TEA 9/1/0,2 e depois 70/30/2 e depois 60/40/2). Rendimento: 10,2 mg. MS (FAB) : 725,3 (M+2Na-H) + ; 703 (M+Na) + . 1H-KMN (200 Mhz, DMSO, TMS) : os sinais característicos são: timina-H: 7,15-7,70 (m, 2H) ; C0-CH2: 4, 67-4, 92 (m, 4H) ; Timina-CH3: 1,67-1,81 (m, 6H) . 25) 5'-MMTr-T-P(ONPE)-T-P(ONPE)-T-P(OEt) 2 A síntese decorreu de acordo com o Exemplo 17 a partir de "5' -MMTr-T-P (ONPE) -T-P (OEt) 2" (Exemplo 22) e de (sal de trietilamónio) de diéster fenilo-(4-nitrofeniletilo) do ácido N-timino-l-ilo-acetilo-N-(4- metóxiltrifenilmetóxilo)etilaminometanofosfónico (Exemplo 15), sob adição de 1,5 eq (em relação ao Exemplo 23) de N-óxido de 4-metóxipiridina. Para a purificação, cromatografouse em sílica-gel (EE/metanol/TEA 90/10/2 e depois 85/15/2). O rendimento foi de 60%. MS(ES+): 1555,8 (M+H)+. 1H-RMN (200 Mhz, DMSO, TMS): os sinais característicos são: Ar-H & timina-H: 6,83-8,20 (m, 25H) ; C0-CH2: 4, 52-4,75 (m, 6H) ; Timina-CH3: 1,61-1,78 (m, 9H) . 61 ........

tir

----r~i

2 6) 5'-ΗΟ-Τ-Ρ(ΟΝΡΕ)-Τ-Ρ(ΟΝΡΕ)-Τ-Ρ(OEt)2 A síntese decorreu de acordo com o Exemplo 4 a partir de "5r-MMTr-T-P(ΟΝΡΕ)-Τ-Ρ(ΟΝΡΕ)-T-P(OEt) 2" · Para a purificação, cromatografou-se em sílica-gel (EE/metanol/TEA 70/30/2). O rendimento foi de 89%. MS (ES+) : 1283, 1 (M+H)+; 1305, 0 (M+Na+) 27) 5'-MMTr-T-P(ΟΝΡΕ)-Τ-Ρ(ΟΝΡΕ)-Τ-Ρ(ONPE)-T-P(OEt)2 A síntese decorreu de acordo com o Exemplo 17 a partir de "5'-HO-T-P(ONPE)-T-P(ONPE)-T-P(OEt) 2" (Exemplo 25) e de (sal de trietilamónio) de diéster fenilo-(4-nitrofeniletilo) do ácido N-timino-l-ilo-acetilo-N-(4-metóxiltrifenilmetóxilo)etilaminometanofosfónico (Exemplo 15) sob adição de 1,5 eq. (em relação ao Exemplo 23) de N-óxido de 4-metóxipiridina. Para a purificação, cromatografou-se em sílica-gel (EE/metanol/TEA 90/10/2 e depois 85/20/2). O rendimento foi de 15%. MS(ES+): TMS): os 8,21 (m, 1,89 (m, 2007 (M+H)+; 2029 (M+Na) + . sinais característicos são: 30H) ; CO-CH2: 4,53-4,87 (m, 12H) . 1H-RMN (200 Mhz, Ar-H & timina-H: 8H) ; Timina-CH3: DMSO, 6, 79-1,58- 28) 5'-HO-T-P(ONPE)-T-P(ONPE)-T-P(ONPE)-T-P(OEt)2 A síntese decorreu de acordo com o Exemplo 4 a partir de "5'-MMTr-T-P(ONPE)-T-P(ONPE)-T-P(ONPE)-T-P(OEt)2" (Exemplo 27). Para a purificação, cromatografou-se em sílica-gel (EE/metanol/TEA 70/30/2). O rendimento foi de 55%. MS (FAB) : 1735 (M+H)+; 1757 (M+Na)\ 62

29) 5'-MMTr-T-P(ONPE)-T-P(ONPE)2 A síntese decorreu de acordo com o Exemplo 17 a partir de diéster (4-nitrofeniletilo) do ácido N-timino-l-ilo-acetilo-N-(2-hidróxietilo)etilaminometanofosfónico (Exemplo 20) e de diéster fenilo-(4-nitrofeniletilo) do ácido N-timino-l-ilo-acetilo-N- (4-metóxiltrifenilmetóxilo)etilaminometanofosfónico (Exemplo 15). Para a purificação, cromatografou-se em sílica-gel (EE/metanol/TEA 100/0/1 e depois 90/10/1). 0 rendimento foi de 87%. MS (FAB) : 1356,2 (M+2Li-H) + . 1H-RMN (200 Mhz, DMSO, TMS) : os sinais característicos são: Ar-H & timina-H: 6,82-8,18 (m, 28H) ; CO-CH2: 4,50-4,71 (m, 4H); Timina-CH3; 1, 59-1,78 (m, 6H) . 30) 5'-HO-T-P(ONPE)-T-P(ONPE)2 A síntese decorreu de acordo com o Exemplo 4 a partir de "5'-MMTr-T-P(ONPE)-T-P(ONPE)2" (Exemplo 29). Para a purificação, cromatografou-se em sílica-gel (EE/metanol/TEA 85/15/1 e depois 80/20/1). 0 rendimento foi de 78%. MS (ES+) : 1072,7 (M+H)\ 1H-RMN (200 Mhz, DMSO, TMS): os sinais característicos são: Ar-H & timina-H: 7,08-8,20 (m, 14H) ; CO-CH2: 4,52-4,80 (m, 4H) ; Timina-CH3: 1,70 (m, 6H) . 31) 5' -MMTr-CAn-P (ONPE) -C^-P (ONPE) -C^-P (ONPE) 2 A s.íntese decorreu de acordo com o Exemplo 17 a partir de (sal de terietilamónio) de mono éster (2-(p-nitrofenil)etilo de ácido N- (N6-anisolilo)citosina-l-ilo-acetilo-N-(4- metóxitrifenilmetóxilo)etilamino-metanofosfónico (Exemplo 3) e "5' -HO-CAn-P (ONPE) -CAn-P (ONPE) 2" (Exemplo 6). Para a

purificação, cromatografou-se em sílica-gel (EE/metanol/TEA 63 ___p . f 80/19/1). O rendimento foi de 66%. MS (FAB) : 2155 (M+H)+; 2161 (M+Li)+; 2177 (M+Na)\ 32) 5' -HO-CAn-P (ONPE) -CAn-P (ONPE) -CAn-P (ONPE) 2 A síntese decorreu de acordo com o Exemplo IV a partir de "5' -MMTr-C^-P (ONPE) -CAn-P (ONPE) -CAn-P (ONPE) 2" (Exemplo 31) Para a purificação, cromatografou-se em sílica-gel (EE/metanol/TEA 80/20/1). O rendimento foi de 70%. MS(FAB): 1822 (M+H)+; 1904 (M+Na} + . 33) Diéster alilo-(2-(p-nitrofenil)etilo) do ácido N-(N6-Anisoílo)citosina-l-ilo-acetilo-N-(4- metóxitrifenilmetóxilo)etilo-aminometanofosfónico A síntese decorreu de acordo com o Exemplo 17 a partir de monoéster (2-(p-nitrofenil)etilo de ácido N-(N6-anisolilo)citosina-l-ilo-acetilo-N-(4- metóxitrifenilmetóxilo)etilamino-metanofosfónico {Exemplo 3) e álcoolo alílico. Para a purificação, cromatografou-se em sílica-gel (EE/metanol/TEA 95/5/1). MS (ES+) : 902, 1 (M+H) 924,1 (M+Na) + . 1H-KMN (200 Mhz, DMSO, TMS) : δ = 2,94-3,70 (m, 8H, P-0-CH2-CH2-Ar + Ar-H + MMTr-0-ÇH2 + N-CH2 + P-CH2) ; 3,86 (s, 3H, OCH3) ; 4,10-4,60 (m, 4H, P-0-CH2) ; 4,79 & 4,84 (cada s largo, 2H, CO-CH2) ; 5, 09-5,39 (m, 2H, H2C=CH-); 5,71-6,00 (m, 1H, H2C=CH-) ; 6,83-8,19 (m, 24H,

Ar-H, citosinilo-H) ; 11,03 (s largo, III, NH) . 34) Diéster alilo-(2-(p-nitrofenil)etilo) do ácido N-(N6-

Anisoílo)citosina-l-ilo- acetilo-N-(2-hidróxi)etilo- 64

(t I > ,aà/· λ/· ^ fi1 7 aminometanofosfónico A síntese decorreu de acordo com o Exemplo 4 a partir de diéster alilo-(2-(p-nitrofenil) etilo) do ácido N-(N°-Anisoílo)citosina-l-ilo-acetilo-N-(4- metóxitrifenilmetóxilo)etilo-aminometanofosfónico (Exemplo 33). Para a purificação, cromatografou-se em sílica-gel (EE/metanol/TEA 94/5/1). 0 rendimento foi de 83%. MS (ES+) : 630,2 (M+H)+. ^-RMN (200 Mhz, DMSO, TMS) : δ = 3,02 (t, 2H, P-0-CH2-CH2-Ar) ; 3,37-3,72 (m, 4H, HO-ÇH2-ÇH2) ; 3,86 (s, 3H, OCH3) ; 3,91 (d, J=llHz, 2H, P-ÇH2) ; 4,22 (dt, 2H, P- ÇH2-CH2-Ar); 4,40 (dd, 2H, 0-ÇH2-CH=CH2) ; 4,78 & 5,01 (m, 2H, CO-CH2) ; 5,11-5,33 (m, 2H, H2Ç=CH~); 5,71-6,00 (m, 1H, H2C=ÇH-); 6,99-8,21 (m, 14H, Ar-H, citosinilo-H); 11,03 (s largo, 1H, NH). 35) Diéster alilo-(2-(p-nitrofenil)etilo) do ácido N-timino-1-ilo-acetilo-N-(4-metóxitrifenilmetóxilo)etilo-aminometanofosfónico A síntese decorreu de acordo com o Exemplo 17 a partir de (sal de trietilamónio) de diéster fenilo-(4-nitrofeniletilo) do ácido N-timino-l-ilo-acetilo-N-(4-metóxiltrifenilmetóxilo)etilaminometanofosfónico (Exemplo 15) e álcool alilico. Para a purificação, cromatografou-se em sílica-gel (EE/metanol/TEA 97/3/2). O rendimento foi de 100%. MS (FAB): 805,3 (M+Na+) . 36) Diéster alilo-(2-(p-nitrofenil)etilo) do ácido N-timino-l-ilo-acetilo-N- (2-hidróxi)etilo-aminometanofosfónico A síntese decorreu de acordo com o Exemplo 4 a partir de diéster alilo-(2-(p- nitrofenil)etilo) do ácido N- 65

uT \~j :n 7 timino-l-ilo-acetilo-N-(4-metóxitrifenilmetóxilo)etilo-aminometanofosfónico (Exemplo 35) . Para a purificação, cromatografou-se em silica-gel (EE/metanol/TEA 90/10/2). o rendimento foi de 86%. MS (ES+) : 511,1 (M+Na+) . 37) 5'-MMTr-T-P(ONPE)-T-P(ONPE)(OAlilo) A síntese decorreu de acordo com o Exemplo 17 a partir de (sal de trietílamónio) de Diéster alilo-(2-(p-nitrofenil)etilo) do ácido N-timino-l-ilo-acetilo-N-(2-hidróxi)etilo-aminometanofosfónico (Exemplo 36) e de diéster fenilo-(4-nitrofeniletilo) do ácido N-timino-l-ilo-acetilo-N-(4-metóxiltrifenilmetóxilo)etilaminometanofosfónico (Exemplo 15). Para a purificação, cromatografou-se em sílica-gel (EE/metanol/TEA 90/10/2). O rendimento foi de 90%. MS (FAB): 1257,3 (M+Na+) . 38) 5'-MMTr-T-P(ONPE)-T-P(ONPE) T-P(ONPE)- T-P(ONPE)- T- P(OEt)2 A síntese decorreu de acordo com o Exemplo 17 a partir de "5'-HO-T-P(ONPE)-T-P(ONPE)-T-P(ONPE)-T-P(OEt) 2" (Exemplo 28) e de diéster fenilo-(4-nitrofeniletilo) do ácido N-timino-l-ilo-acetilo-N- (4- metóxiltrifenilmetóxilo)etilaminometanofosfónico (Exemplo 15). Para a purificação, cromatografou-se em silica-gel (EE/metanol/TEA 80/20/2) . O rendimento foi de 57%. MS (FAB) : 2460 (M+Na+) ; 2482 (M+Na) + . 39) 5'-HO-T-P(ONPE)-T-P(ONPE) T-P(ONPE)- T-P(ONPE)- T-P(OEt)2 66

>·: f—}? ? / a Síntese decorreu de acordo com o Exemplo 4 a partir de "5'-MMTr-T-P(ONPE)-T-P(ONPE) T-P(ONPE)- T-P(ONPE)- T-P(OEt) 2". Para a purificação, cromatografou-se em sílica-gel (EE/metanol/TEA 70/30/2). O rendimento foi de 55%. MS (FAB): 2209 (MiNa+). 40) 5'-HO-T-P(OH)-T-P(OH) T-P(OH)- T-P(OH)- T-P(0Et)2 4,0 mg (0,00183 mmole) de "5'-HO-T-P(ONPE)-T-P(ONPE) T-P(ONPE)- T-P(ONPE)- T-P(OEt) 2" (Exemplo 39) foram dissolvidos em 1,1 mL de solução a 0,5 molar de DBU em piridina e agitou.se durante 24 horas à temperatura ambiente. A mistura reaccional foi evaporada a vácuo, o resíduo foi agitadao várias vezes com tolueno. O solvente foi removido com uma seringa, e o resíduo agitado várias vezes com pentanbo, sendo de novo o solvente removido com uma seringa. O produto foi seco a vácuo. O rendimento foi de 4 mg de um pó fortemente higroscópico. MS(ES-): 1589,7 (M-H-)-; 1611,8 (M+Na-2H)‘. 40) 5'-MMTr-T-P(ONPE)-T-P(ONPE) T-P(ONPE)- T-P(ONPE)- T-P(ONPE)- P(OEt)2 a) A síntese decorreu de acordo com o Exemplo 17 a partir de "5'-HO-T-P(ONPE)-T-P(ONPE) T-P(ONPE)- T-P(ONPE)- T-P(OEt) 2" (Exemplo 39) e de diéster fenilo-(4-nitrofeniletilo) do ácido N-timino-l-ilo-acetilo-N-(4- metóxiltrifenilmetóxilo)etilaminometanofosfónico (Exemplo 15). Para a purificação, cromatografou-se em sílica-gel (EE/metanol/TEA 80/20/2 e depois 70/30/2) . MS (FAB) : 2934 (M+Na+) ; 29572 (M+2Na-H)+; 2878 (M+3Na-2H)\ 67

b) Síntese decorreu de acordo com o Exemplo 17 a partir de "5' -HO-T-P (ONPE) -T-P (ONPE) -T-P (ONPE) -T-P (OEt) 2" e de "5'-MMTr-T-P (ONPE) -T-P (ONPE) (OH)" (Exemplo 42). Para a purificação, cromatografou-se em sílica-gel (EE/metanol/TEA 80/20/2 e depois 70/30/2). A fracção objectivo foi evaporada em vácuo e depois lavada com pentano e éter. MS como se menciona acima. 42) 5'-MMTr-T-P(ONPE)-T-P(ONPE)(OH) 24,7 mg (0,02 mmole) de "5'-MMTr-T-P(ONPE)-T-P(ONPE)(OAlilo)" (Exemplo 37) foram dissolvidos em conjunto com 16,2 mg (0,12 mmole) de hidrogenocarbonato de dietilamónio em 2 mL de DCM absoluto. A 15-20°C adicionou-se gota-a-gota durante 2 minutos, uma solução de 13,9 mg (0,012 mmole) de tetraquis(trifenilfosfina)-páládio (0) e 2,1 mg (0,008 mmole) de trifenilfosfina em 2 mL de DCM absoluto. Agitou-se durante 30 minutos à temperatura ambiente. Para a purificação cromatografou-se a mistura reaccional sobre sílica-gel (EE/metanol/TEA 80/20/1 e depois 60/40/1). A fracção com o produto foi evaporada em vácuo, o resíduo lavado com pentano e depois com EE/éter e depois outra vez com pentano e seca em vácuo. Rendimento: 57%. MS(ES-): 1193,6 (M-H)'. 1H-RMN (200 Mhz, DMSO, TMS): os sinais característicos são: Ô= 1,67 & 1,72 (cada s., 3H, T-CH3) ; 4, 60-4, 82 (cada s. 2H, CO-CH2: 6,83 & 8,19 (m, 24H, Ar-H, T-H). 43) 5'-OH-T-P(ONPE)-T-P(ONPE) T-P(ONPE)- T-P (ONPE)- T-P(ONPE)- P(OEt)2 A síntese de correu de acordo com o Exemplo 4 a partir de 68

"5' -MMTr-T-P(ONPE)-T-P(ONPE) T-P(ONPE)- T-P(ONPE)- T-P(ONPE)- P(OEt)2" (Exemplo 41). Após se efectuar a reacção a mistura reaccional foi concentrada, o resíduo foi coevaporado três vezes com tolueno, e depois agitada primeiro com EE/éter, de seguida com pentano. 0 resíduo foi seco a vácuo. MS(FAB): 2662 (M+Na)+. 44) 5'-OH-T-P(ONPE)-T-P(ONPE)(OAlilo) A síntese decorreu de acordo com o Exemplo 4 a partir de "5'-MMTr-T-P(ONPE)-T-P(ONPE)(OAlilo)". Para a purificação, cromatografou-se em sílica-gel (EE/metanol/TEA 90/10/1 e depois 80/20/1). O rendimento foi de 87%. MS (FAB) : 963,0 (M+H+) ; 985,1 (M+Na)+. 45) 5'-MMTr-T-P(ONPE)-T-P(ONPE) T-P(ONPE)(OH) a) 5'-MMTr-T-P(ONPE)-T-P(ONPE) T-P(ONPE)(OAlilo) A síntese decorreu de acordo com o Exemplo 17 a partir de "5'-OH-T-P(ONPE)-T-P(ONPE) (OAlilo)" e de diéster fenilo-(4-nitrofeniletilo) do ácido N-timino-l-ilo-acetilo-N-(4- metóxiltrifenilmetóxilo)etilaminometanofosfónico (Exemplo 15). Para a purificação, cromatografou-se em sílica-gel (EE/metanol/TEA 85/15/1). O rendimento: 55%. b) 5'-MMTr-T-P(ONPE)-T-P(ONPE) T-P(ONPE)(OH) "5r-MMTr-T-P(ONPE)-T-P(ONPE) T-P(ONPE)(OAlilo)" (Exemplo 45) foi convertido com tetraquis(trífenilfosfina)paládio (0) de acordo com 0 Exemplo 42. Para a purificação, cromatografou- 69

jr

KV se em sílica-gel (EE/metanol/TEA 80/20/2 e depois 70/30/2). A fracção de produto foi evaporada a vácuo, o resíduo foi lavado com pentano e étrer.O rendimento: 55%. MS (ES+; LiCl)): 1654,1 (M+Li) + . 46) 5'-MMTr-T-P(ONPE)-T-P(ONPE) T-P(ONPE)-T-P(OEt)2 A síntese decorreu de acordo com o Exemplo 17 a partir de éster dietílico do ácido N-timino-l-ilo-acetilo-N-(2-hidróxi)etilaminometanofosfónico (Exemplo 10) e de "5'-MMTr-T-P (ONPE)-T-P(ONPE) T-P(ONPE)(OH)" (Exemplo 45b). Para a purificação, cromatografou-se em sílica-gel (EE/metanol/TEA 90/10/2 e depois 80/20/2). Tratamento, purificação e caracterização como no Exemplo 27. 47) 5'-MMTr-T-P(ONPE)-T-P(ONPE) T-P(ONPE)- T-P(ONPE)- T-P(ONPE)-T-P(OEt)2 A síntese decorreu de acordo com o Exemplo 17 a partir de "5'-HO-T-P(ONPE)-T-P(ONPE)-T-P(OEt) 2" (Exemplo 2 6) e "5'-MMTr-T-P(ONPE)-T-P(ONPE) T-P(ONPE)(OH)" (Exemplo 45b). Para a purificação, cromatografou-se em sílica-gel (EE/metanol/TEA 80/20/2). A fracção de produto foi evaporada a vácuo, coevaporado com tolueno e purificado por cromatografia através de HPLC preparativo (Cromatografia líquida de alta eficiência): RP8 LiChrospher 60, água/acetonitrilo 1/1; 0,1% de acetato de amónio; 1 mL/min Rf= 12,97 min. 48) 5'-OH-T-P(OH)-T-P(OH) T-P(OH)- T-P(OH)- T- P(OH)-T-P(OEt)2 a) 5'-HO-T-P(ONPE)-T-P(ONPE) T-P(ONPE)- T-P(ONPE)- T-P(ONPE)-T-P(OEt)2 70 ..... - ... ,. '

—-γ£

A síntese decorreu de acordo com o Exemplo 4 a partir de "5'-MMTr-T-P(ONPE)-T-P(ONPE) T-P(ONPE)- T-P(ONPE)- T- P(ONPE)-T-P(OEt)2" (Exemplo 47). Para a purificação, cromatografou-se em sílica-gel (EE/metanol/TEA 70/30/2 e depois 60/40/2). O produto da fracção foi evaporado a vácuo, o resíduo foi primeiro lavado com pentano e depois com éter e seco a vácuo. Rendimento: 100% MS(FAB): 2662 (M+Na)+; 2684 (M+2Na-H)+; 2706 (M+3Na-2H)\ b) 5'-OH-T-P(OH)-T-P(OH) T-P(OH)- T-P(OH)- T- P(OH)-T-P(OEt)2 "5'-HO-T-P(ONPE)-T-P(ONPE) T-P(ONPE)- T-P(ONPE) - T- P(ONPE)-T-P(OEt) 2" (Exemplo 48a) foi convertido de forma análoga ao Exemplo 40 com DBU, e depois tratado. MS(ES-): 1892 (M+H“)'; 1915 (M+Na-2H)'. 49) 5'-MMTr-T-P(ONPE)-T-P(ONPE) T-P(ONPE)- T-P(ONPE)- T-P(ONPE)-T-P(ONPE)-T-P(OEt)2

Sintese decorreu de acordo com o Exemplo 17 a partir de "5'-HO-T-P(ONPE)-T-P(ONPE)-T-P(ONPE)-T-P(OEt) 2" (Exemplo 28) e de "5'-MMTr-T-P(ONPE)-T-P(ONPE) T-P(ONPE)(OH)" (Exemplo 45b). Para a purificação, cromatografou-se em sílica-gel (EE/metanol/TEA 80/20/2 e depois 70/30/2). A fracção de produto foi evaporada a vácuo, coevaporado com tolueno e purificado por cromatografia através de HPLC preparativo (Cromatografia líquida de alta eficiência): RP8 LiChrospher 60, água/acetonitrilo 1/1; 0,1% de acetato de amónio; 1 mL/min Rf= 15,24 min. MS (FAB) : 3386 (M+Na)+; 3409 (M+2Na-H)\ 71 --rr*4

50) 5'-ΗΟ-Τ-Ρ(ΟΝΡΕ)-Τ-Ρ(ΟΝΡΕ) Τ-Ρ(ΟΝΡΕ)- Τ-Ρ(ΟΝΡΕ)- Τ-Ρ(ΟΝΡΕ)-Τ-Ρ(ΟΝΡΕ)-Τ-Ρ(OEt)2 A síntese decorreu de forma análoga ao Exemplo 4 a partir de "5' -MMTr-T-P(ΟΝΡΕ)-Τ-Ρ(ΟΝΡΕ) Τ-Ρ(ΟΝΡΕ)- T-P(ONPE)- Τ-Ρ (ΟΝΡΕ)-Τ-Ρ(ΟΝΡΕ)-Τ-Ρ(OEt) 2" (Exemplo 49). Para a purificação, evaporou-se a vácuo, coevaporou-se com tolueno três vezes, o resíduo foi lavado em primeiro lugar com pentano e depois com éter e secou-se a vácuo. Rendimento > 90%. MS(FAB): 3114 (M+Na)+ 51) 5'-HO-T-P(OH)-T-P(OH) T-P(OH)- T-P(OH)-T-P(OH)-T-P(OEt)2 "5'-ΗΟ-Τ-Ρ(ΟΝΡΕ)-Τ-Ρ(ΟΝΡΕ) T-P(ONPE)- T-P(ΟΝΡΕ)- T- P(ONPE)-T-P(ONPE)-T-P(OEt) 2" (Exemplo 50 foi convertido de acordo com o Exemplo 40 com DBU e tratado. MS(ES-): 2196 (M+H“) 2218 (M+Na-2H)~. 52) 5'-MMTr-T-P(ΟΝΡΕ)-T-P(ΟΝΡΕ) T-P(ΟΝΡΕ)- T-P(ΟΝΡΕ)- Τ-Ρ (ΟΝΡΕ)-T-P(ΟΝΡΕ)-T-P(ΟΝΡΕ)-T-P(ΟΝΡΕ)-T-P(OEt)2 A síntese decorreu de acordo com o Exemplo 17 a partir de "5f-ΗΟ-Τ-Ρ(ΟΝΡΕ)-T-P(ΟΝΡΕ) T-P(ΟΝΡΕ)- T-P(ΟΝΡΕ)- T- P(ONPE)-T-P(OEt) 2" (Exemplo 48a) e "5'-MMTr-T-P(ΟΝΡΕ)-T-P(ΟΝΡΕ) Τ-Ρ (ONPE) (OH)" (Exemplo 45b). Para a purificação, cromatografou-se em sílica-gel (EE/metanol/TEA 70/30/2 e depois 60/40/2). A fracção de produto foi evaporada a vácuo, coevaporado com tolueno e purificado por cromatografia através de HPLC preparativo (Cromatografia líquida de alta eficiência): RP8 LiChrospher 60, água/acetonitrilo 1/1; 0,1% de àcetato de amónio; 1 mL/min Rf= 23,95 min. 72

53) 5'-HO-T-P(OH)-Τ-Ρ(ΟΗ) Τ-Ρ(ΟΗ)- Τ-Ρ(ΟΗ)- Τ- Ρ(OH)-Τ-Ρ(ΟΗ)-Τ-Ρ(ΟΗ)-Τ-Ρ(ΟΗ)-Τ-Ρ(OEt)2 a) 5'-ΗΟ-Τ-Ρ(ΟΝΡΕ)-Τ-Ρ(ΟΝΡΕ) Τ-Ρ(ΟΝΡΕ)- Τ-Ρ(ΟΝΡΕ)- Τ-Ρ (ΟΝΡΕ)-Τ-Ρ(ΟΝΡΕ)-Τ-Ρ(ΟΝΡΕ)-Τ-Ρ(ΟΝΡΕ)-Τ-Ρ(OEt)2 A síntese decorreu de acordo com o Exemplo 4 a partir de "5'-MMTr-T-P(ΟΝΡΕ)-Τ-Ρ(ΟΝΡΕ) T-P(ONPE)- T-P(ONPE)- T- P(ONPE)-T-P (ΟΝΡΕ) -Τ-Ρ (ΟΝΡΕ) -Τ-Ρ (ΟΝΡΕ) -T-P (OEt) 2" (Exemplo 52). Para a purificação, evaporou-se a vácuo, coevaporou-se com tolueno três vezes, o resíduo foi lavado em primeiro lugar com pentano e depois com éter e secou-se a vácuo. Rendimento > 90%. b) 5'-HO-T-P(OH)-Τ-Ρ(OH) Τ-Ρ(OH)- Τ-Ρ(OH)- T- P(OH)-T-P(OH)-T-P(OH)-T-P(OH)-T-P(OEt)2 "5'-HO-T-P(ΟΝΡΕ)-Τ-Ρ(ΟΝΡΕ) T-P(ONPE)- T-P(ONPE)- T- P(ONPE)-T-P(ΟΝΡΕ)-T-P(ΟΝΡΕ)-T-P(ONPE)-T-P(OEt) 2" (Exemplo 53a) foi convertido de acordo com o Exemplo 40 com DBU e tratado. MS(ES-): 2802 (Μ+Η"Γ; 2825 (H+Na-2H)‘. 54) Diéster (2-(p-nitrofenil)etilo do ácido (Ν'-tert-butóxicarbonilamino)etilaminometanofosfónico a) l-Metilimino-2-(Ν'-tert-butóxicarbonilamino)etano (trímero) 2,0 g (12,5 mmole) de 2-amino-1-(Ν'-tert- butóxicarbonilamino) etano, dissolvidos em 8 mL de metanol foram adicionados sob arrefecimento com gelo com 15,2 mL (18,72 mmole) de formaldeído a 37% e agitou-se 1 hora à temperatura ambiente. O resíduo foi retomado em EE, lavado duas vezes com solução aquosa saturada de NaHC03 e depois 73 r-~ :rr:

;::r: ::: iXTr.: 23B85L.

;7 com solução de NaCl, secou-se filtrou-se e evaporo~u-se em vácuo. Para a purificação, cromatografou-se em sílica-gel (EE/TEA 100/0, e depois EE/metanol/TEA 90/10/0,2). 0 rendimento foi de 0,8 g. MS (FAB/LiCl) : 523,4 (M+2Li-H)++. aH-RMN (200 Mhz, DMSO, TMS): δ = 1,38 (s, 27H, tBu-H) ; 2,40 (t, 6H, N-CH2) ; 2,99 (t, 6H, N-CH2) ; 3,25 (t, 6H, N-CH2); 6,81 (t, largo, 3H, NH) . b) Diéster (2-(p-nitrofenil)etilo do ácido (Ν'-tert-butóxicarbonilamino)etilaminometanofosfónico l-Metilimino-2-(Ν'-tert-butóxicarbonilamino)etano (trimero) (Exemplo 54a) foi convertido de acordo com o Exemplo lf com fosfito de di(2-(4-nitrofenilo)etilo) (Exemplo le) . Para a purificação cromatografou-se em silica-gel (primeiro tolueno/EE/TEA 20/80/0,2 e depois EE/TEA 100/0,2 e depois EE/metanol/TEA 0,5/5/0,2). Rendimento: 25% MS(ES+/LÍC1): 553,3 (M+H)+; 559,3 (M+Li)+. 1H-RMN (200 Mhz, DMSO, TMS): δ = 1,37 (s, 9H, tBu-H); 2,83 (d, J=12Hz, 2H, P-

4,16 (dt, 4H, PO-CH2); 7,52 & 8,15 (cada d, 8H, Ar-H). 55) Diéster (2-(p-nitrofenil)etilo de ácido (2-N'-tert-butilóxicarbonilamino)etilaminometanofosfónico A síntese decorreu de acordo com o Exemplo 8 a partir de diéster (2-(p-nitrofenil)etilo do ácido (Ν'-tert-butóxicarbonilamino) etilaminometanotosfónico (Exemplo 54b) e ácido timidinino-l-ilo-acético.

Rendimento: 86% MS (FAB/LiCl) : 725,3 (M+H)+; 559,3 (M+Li) + . 1H-RMN (200 Mhz, 74

DMSO, TMS) : δ = 1,42 (s, 9H, tBu-H) ; 1,91 (s, 3H, T-CH3) ; 2,99-3,58 (m, 8H, P-0-CH2-CH2-Ar & N-CH2-CH2-N) ; 3,75 (d, J=12Hz, 2H, P-CH2) ; 4,06-4,38 (m, 4H, PO-CH2) ; 7,37 & 8,15 (cada d, 8H, Ar-H).

56) Actividade de permuta com DNA: curva de fusãode UV A acividade de permuta dos compostos de acordo com a presente invenção com os ácidos nucleicos complementares foi demonstrada através da representação da curva de fusão de UV de "5'-HO-T-P(OH)-T-P(OH) T-P(OH)- T-P(OH)- T- P(OH)-T-P(OH)-T-P (OH)-T-P (OH) -T-P (OEt) 2" (Exemplo 53b) com (dA)9. Para esse efeito prepararam-se "5'-HO-T-P(OH)-T-P(OH) T-P(OH)- T-P(OH)-T- P(OH)-T-P(OH)-T-P(OH)-T-P(OH)-T-P(OEt) 2" e (dA)9 com 0,3 OD cada um em 1 mL de tampão (1 M de NaCl, 20 mM de MgCl2, 10 mM de HEPES, a pH 7,5) e a variação do coeficiente de extinção molar em função da temperatura (0 atéao representado) monitorado a 260 mti. O resultado está ilustrado na Figura 1. Da curva de fusão obtida foi determinado o valor Tm para cerca de 23°C. 57) Actividade de permuta com DNA: ExpEriência de "Gelshift' A acividade de permuta dos compostos de acordo com a presente invenção com os ácidos nucleicos complementares foi, por exemplo, determinada através da hibridação de "5'-HO-T-P(OH)-T-P(OH) T-P(OH)- T-P(OH)- T- P (OH)-T-P (OH)-T-P (OH)-T-P (OH)-T-P(OEt)2" (Exemplo 53b) com (dA)9 numa experiência de "gelshift". Para esse efeito "5'-HO-T-P(OH)-T-P(OH) T-P(OH)-T-P(OH)- T- P(OH)-T-P(OH)-T-P(OH)-T~P(OH)-T-P(OEt) 2" e (dA) 9 cada um isoladamente ou em mistura numa relação de 1:1, 1:2, 1:5 e 1:10, foram colocados numa placa de gel de poliacrilamida não desnaturante (20% de tampão de eluição 1 x TBE, 10 mM de MgCl2) , e comportamento de eluição foi determinado. O resultado está ilustrado na Figura 2: (dA)9 75

elui mais depressa que o "5'-HO-T-P(OH)-T-P(OH) T-P(OH)- T-P(OH)- T- P(OH)-T-P(OH)-T-P(OH)-T-P(OH)-T-P(OEt) 2", na mistura 1:1 observam-se ambos de uma forma muito fraca, onde se observa uma banda muito lenta que correponde ao complexo entre ambos os componentes. Na mistura 1:2 o (dA)g não de observa mais, sendo a nova banda mais intensa. O mesmo é válido para as misturas 5:1 em particular para 10:1, em que adicionalmente é claramente observável o excesso de "5'-HO-T-P (OH) -T-P (OH) T-P(OH)- T-P(OH)- T- P(OH)-T-P(OH)-T-P(OH)-T-P(OH)-T-P(OEt) 2". 58) 5'-MMTr-T-P(ONPE)-T-P(OEtilo)2 [ver também Exemplo 21, sínteses alternativas]

I a) 8,44 mg (pmole) de diéster fenilo-(4-nitrofeniletilo) do ácido N-timino-l-ilo-acetilo-N-(4-metóxiltrifenilmetóxilo)etilaminometanofosfónico (Exemplo 15), 3,77 mg (10 μιηοΐθ) de éster dietílico do ácido N-timino-l-ilo-acetilo-N- (2-hidróxi)etilaminometanofosfónico (Exemplo 10) e 6,46 mg (500 gmole) de N-etildi-isopropilamina (DIPEA) foram dissolvidos em 0,3 mL de DMF absoluto. Adicionaram-se 44,2 mg (100 pmole) de hexafluorofosfato de (benzotriazolo-ilóxilo)tris(dimetilamino)fosfónio (BOP). Agitou-se 24 horas à temperatura ambiente. Após CCD (cromatografia em camada delgada) (EE/metanol/TEA 100/20/2; Rf = 0,5 ) obtiveram-se 70% de rendimento. b) De forma análoga ao Exemplo 58 a, contudo com 30 pmole de hatu (hexafluorofosfato de o-(7-aza)benzotriazolo-l-iltetrametilurónio) em lugar de 100 μιαοΐθ de BOP. Após DCC obtiveram-se 65% de rendimento. 76

i i

59) Diéster [2-(p-nitrofenil)etilo]-[5'-(3'-levuloílo-timidino] do ácido N-timino-l-ilo-acetilo-N-(4-metóxitrifenilmetóxilo)etilaminometanofosfónico A síntese decorreu de acordo com o Exemplo 17 a partir de diéster fenilo-(4-nitrofeniletilo) do ácido N-timino-l-ilo-acetilo-N- (4-metóxiltrifenilmetóxilo)etilaminometanofosfónico (Exemplo 15), e 3'-levuloílo-timidino. Para a purificação cromatpgrafou-se sobre sílica-gel (DCM/metanol/TEA 98/2/0,25). O rendimento foi de 46%. MS(FAB/LiCl): 1071,4 (M+Li)\ 60) Diéster [2-(p-nitrofenil)etilo]-[5'-timidino] do ácido N-timino-l-ilo-acetilo-N-(4- metóxitrifenilmetóxilo)etilaminometanofosfónico 64 mg (0,06 mmole) de diéster [2- (p-nitrofenil) etilo]-[5' - (3' -levuloílo-timidino] do ácido N-timino-l-ilo-acetilo-N-(4-metóxitrifenilmetóxilo)etilaminometanofosfónico (Exemplo 59) foram dissolvidos em 0,5 mL de dioxano. Adicionaram-se 9 mg (0,23 mmole) de NaBH4 em 0,12 mL de água. O solvente foi evaporado sob vácuo, o resíduo retomado em DCM, extraiu-se com água e secou-se. Para a purificação cromatografou-se sobre sílica-gel (DCM/metanol/TEA 98/8/0,5). O rendimento foi de 72%. MS(FAB/LiCl): 1071,4 (M+Li)+; 979,4 (M+2LÍ-H)*; 985,4 (M+3LÍ- ?H)+. 61) Diéster [2-(p-nitrofenil) etilo]-[5'-timidino-(3'- (cianoetilo-N,N-di-isopropilfósforoamidite] do ácido N-timino-l-ilo-acetilo-N-(4- 77

metóxitrifenilmetóxilo)etilaminometanofosfónico 31 mg (0,032 mmole) de diéster [2-(p-nitrofenil) etilo]-[5'- timidino] do ácido N-timino-l-ilo-acetilo-N- (4- metóxitrifenilmetóxilo)etilaminometanofosfónico (Exemplo 60) foi duas vezes coevaporado com CH3CN absoluto, e dissolvido em 0,4 mL de THF absoluto. Adicionaram-se em primeiro lugar 12,4 mg (0,096 mmole) de di-isopropiletilamina, e depois 9,8 mg (0,045 mmole) de cloro-di-isopropilfósforoamidite de cianoetilo. Agitou-se durante 3 horas, filtrou-se e evaporou-se em vácuo. 0 rendimento foi de 63%. MS(FAB/LiCl): 1173,3 (M+Li)+; 1180,4 (M+2Li-H)+; 1186,4 (M+3LÍ-2H)+. 62) Diéster 2-(p-nitrofenil)etilo do ácido N-[N9-(06- difenilcarbamoílo-N2-acetilguanina]-acetilo-N- (4-metóxitrifenilmetóxilo)etilaminometanofosfónico A síntese decorreu de acordo com o Exemplo 2 a partir de éster di(2-(p-nitrofenilo)etilo) de ácido N-(4-metóxitrifenilmetóxilo)etilaminometanofosfónico (Exemplo lf) e ácido 06-difenilcarbamoílo-N2-acetilguanina-acético. Para a purificação cromatografou-se sobre silica-gel (EE/TEA 98/2). Rendimento: 87%. MS(FAB/LiCl): 1154,8 (M+H)+; 1160,7 (M+Li)+. 63) Diéster 2-(p-nitrofenil)etilo do ácido N-[N9-(N4- anisoíladenina]-acetilo-N- (4- metóxitrifenilmetóxilo)etilaminometanofosfónico A síntese decorreu de acordo com o Exemplo 2 a partir de ácido N-(4- metóxitrifenilmetóxilo)etilam 78

Ph r, . W ' inometanofosfónico (Exemplo lf). Para a purificação cromatografou-se sobre silica-gel (DCM/metanol/TEA 95/4/1). Rendimento: 82%. MS(ES+): 1035,7 (M+H)+. 1H-RMN (200 Mhz, DMSO, TMS): δ = 2,93 (t, 4H, P-0-CH2-CH2-Ar) ; 3,09 (t, 2H, MMTr-0-ÇH2) , 3,23-3,75 (m, 4H, P-CH2 + N-CH2); 3,75 (s, 3H, OCH3) ,* 3,87 (S, 3H, OCH3) ; 4,08 (dt, 4H, P-0-CH2) ; 5,28-5,42 (m, 2H, CO-CH2) ; 6,81-8,20 (m, 28H, Ar-H, Ar-H); 11,00 (s largo, 1H, NH) . 64) Monoéster 2-(p-nitrofenil)etilo do ácido N-[N9-(N4-anisoíladenina]-acetilo-N- (4- metóxitrifenilmetóxilo)etilaminometanofosfónico A síntese decorreu de acordo com o Exemplo 3 a partir de diéster 2-(p-nitrofenil)etilo do ácido N-[N9-(N4-anisoíladenina]-acetilo-N- (4- metóxitrifenilmetóxilo)etilaminometanofosfónico (Exemplo 63). Para a purificação cromatografou-se sobre sílica-gel (EE/metanol/TEA 65/35/2). Rendimento: 52%. N-timino-l-ilo- 65) Diéster 2-(p-nitrofenil)etilo do ácido acetilo-N-(2-metóxi)etiloaminometanofosfónico A síntese decorreu de acordo com o Exemplo 2 a partir de diéster 2-(p-nitrofenil)etilo do ácido N-timino-l-ilo-acetilo-N-(2-metóxi)etiloaminometanofosfónico (preparado de acordo com o Exemplo 1 partindo de 2 metóxietilamina através de conversão com formaldeído e fosfito de di(2-(4-nitrofenil)etilo e ácido timidino-l-ilo-acético. Para a purificação cromatografou-se sobre sílica-gel (EE/metanol 90/10). Rendimento: 64%. MS(FAB/LiCl): 640,3 (M+Li)+. 79

66) 5'-MMTr-C^-P(0NPE)-CAn--P(0NPE) (OAlilo) A síntese decorreu de acordo com o Exemplo 17 a partir de (sal de terietilamónio) de mono éster (2-(p-nitrofenil)etilo de ácido N-(N6-anisolilo)citosina-l-ilo-acetilo-N-(4- metóxitrifenilmetóxilo)etilamlno-metanofosfónico (Exemplo 3) e diéster alilo-(2-(p-nitrofenil)etilo) do ácido N-(N6-Anisoílo)citosina-l-ilo-acetilo-N-(2-hidróxi)etilo-aminometanofosfónico (Exemplo 34) . Para a purificação cromatografou-se sobre sílica-gel (EE/metanol/TEA 85/14/1). Rendimento: 36%. MS (FAB) : 1474 (M+H)+; 1496 (M+Na)\ 67) 5' -HO-C*”—P (ONPE) -C^-P (ONPE) (OAlilo) A síntese decorreu de acordo com o Exemplo 4 a partir de "5'-MMTr-CAn-P (ONPE) -CAn-P (ONPE) (OAlilo)" (Exemplo 66). Para a purificação cromatografou-se sobre sílica-gel (EE/metanol/TEA 80/19/1). Rendimento: 55%. MS(FAB): 1201,3 (M+H)+; 1223,3 (M+Na) \ 68) 5'-MMTr-C^-P (ONPE)-CAn-P (ONPE)-CAn-P (ONPE) (OAlilo) A síntese decorreu de acordo com o Exemplo 17 a partir de mono éster (2-(p-nitrofenil)etilo de ácido N-(N6-anisolilo)citosina-l-ilo-acetilo-N-(4- metóxitrifenilmetóxilo)etilamino-metanofosfónico (Exemplo 3) e "5'-HO-CAn-P (ONPE)-CAn-P (ONPE) (OAlilo) " (Exemplo 67). Para a purificação cromatografou-se sobre silica-gel (EE/metanol/TEA 80/20/1). Rendimento: 58%. MS(FAB): 2046 (M+H)+; 2068 (M+Na)+. 80

Ο , rrXZc^J^ ο7 ,7 69) 5' -MMTr-CAn-P (ΟΝΡΕ) -CAn-P (ΟΝΡΕ) -C^-P (ΟΝΡΕ) (ΟΗ) A síntese decorreu de acordo com o Exemplo 42 a partir de "5' -MMTr-C^-P (ONPE) -CAn-P (ONPE) -CAn-P (ONPE) (OAlilo) " (Exemplo 68). Para a purificação cromatografou-se sobre sílica-gel (EE/metanol/TEA 60/38/2). Rendimento: 66%. MS(FAB): 2027 (M+Na)+; 2049 (M+2Na-H)+. 70) 5' -MMTr-C^-P (ONPE) -CAn-P (ONPE) -CAn-P (ONPE) CAn-P (ONPE) -CAn- P (ONPE) -CAn-P (ONPE) 2 A síntese decorreu de acordo com o Exemplo 17 a partir de "5'-MMTr-CAn-P (ONPE)-CAn-P (ONPE)-CAn-P (ONPE) (OH)" (Exemplo 69) e "5' -HO-C^-P (ONPE) -CAn-P (ONPE) -CAn-P (ONPE) 2" (Exemplo 32). Para a purificação cromatografou-se sobre sílica-gel (EE/metanol/TEA 70/30/2). Rendimento: 58%. MS(FAB): 3892 (M+Na)+; 3914 (M+2Na-H)+. 71) 5' -MMTr-T-P (ONPE) -T-P (ONPE) -T-P (ONPE) C^-P (ONPE) -CAn- P (ONPE) —CAn—P (ONPE) 2 A síntese decorreu de acordo com o Exemplo 17 a partir de "5'-MMTr-T-P(ONPE)-T-P(ONPE) T-P(ONPE) (OH)" (Exemplo 45) e " 5' -HO-Cta-P( ONPE )-CAn-P( ONPE)-CAn-P (ONPE) 2" (Exemplo 32). Para a purificação cromatografou-se sobre sílica-gel (EE/metanol/TEA 60/40/2). Rendimento: 58%. A fracção de produto foi evaporada a vácuo, e purificado por cromatografia através de HPLC preparativo (Cromatografia liquida de alta eficiência): RP8 LiChrospher 60, água/acetonitrilo 1/1; 0,1% de acetato de amónio; 1 mL/min Rf= 16,6 min. MS (FAB): 3534 (M+Na)+; 3556 (M+2Na-H)\ 81

72) 5' -MMTr-T-P (ONPE) -T-P (ONPE) -T-P (ONPE) C^-P (ONPE) -CAn-P (ONPE) -CAn-P (OH) 2 A síntese decorreu de acordo com o Exemplo 40 a partir de "5' -MMTr-T-P (ONPE) -T-P (ONPE) -T-P (ONPE) CAn-P (ONPE) -CAn-P (ONPE) -CAn-P (ONPE) 2" (2 mg) (Exemplo 71) MS(ES-): 2466,4(M-H). 73) 5' -MMTr-T-P (OH) -T-P (OH) -T-P (OH) C-P (OH) -C-P (OH) -C-P (OH) 2

Cerca de 1 mg de "5'-MMTr-T-P(ONPE)-T-P(ONPE)-T-P(ONPE)CAn-P (ONPE)-CAn-P (ONPE)-CAn-P (OH) 2" (Exemplo 72) foram misturados com 3 mL de solução aquosa a 33% de NH4OH e agitados durante 24 horas à temperatura ambiente. A mistura reaccional foi evaporada a vácuo. Rendimento: cerca de 0,6 mg (19 OD). MS(ES-): 2064,5 (M-H)". 74) 5'-HO-T-P(OH)-T-P(OH)-T-P(OH)C-P(OH)-C-P(OH)-C-P(OH)2 8 OD de "5'-MMTr-T-P(OH)-T-P(OH)-T-P(OH)C-P(OH)-C-P(OH)-C-P (OH) 2" (Exemplo 73) foram dissolvidos em 0,5 mL de água e lançados sobre PolyPack™ (Glen Research, #60-1100-10). O grupo MMTr foi hidrolisado de acordo com as indicações do fabricante (Glen Research User Guide). Rendimento: cerca de 0,35 mg (11 OD). MS(ES-): 1792, 6 (M-H)". 75) 5' -MMTr-CAn-P (ONPE) -CAn-P (ONPE) -CAn-P (ONPE) -T-P (ONPE) -T-P(ONPE)-T-P(ONPE)2 A síntese decorreu de acordo com o Exemplo 17 a partir de "5' -MMTr-C^-P (ONPE) -CAn- P (ONPE) -C^-P (ONPE) (OH) " 82

r%llislÉÉgÍ

(Exemplo 69 e de "5'-HO-T-P(ONPE)-T-P(ONPE)-T-P(OEt) 2" . Para a purificação cromatografou-se sobre silica-gel (EE/metanol/TEA 80/20/2 e depois 70/30/2} . O produto da fracção foi coevaporado com tolueno, evaporado em vácuo e lavado com pentano. Rendimento: 48%. MS(FAB): 3744 (M+Na)+; 3766 (M+2Na-H)\

Lisboa 18 de Dezembro de 2001 (agente oficial da propriedade industrial 83

Claims (9)

1. Λα7 REIVINDICAÇÕES 1. Compostos de fórmula I

   em que n significa um número entre zero e 100; B significa, independentemente uns dos outros, uma nucleobase natural, uma nucleobase não natural ou um ligando "Repórter";

   A-B pode ser constituído por um aminoácido D ou L condensado através do grupo carboxílico ou um peptídeo, nos quais os aminoácidos constituem um grupo até um comprimento de 5 aminoácidos, L significa, independentementa entre si, N ou R1^, e R1 significa hidrogénio ou um grupo (Ci-C6) -alquilo, que pode estar substituído por hidróxilo, (Ci-C6)-alcóxilo, (Ci-C6)-alquiltio ou amina, de preferência hidrogénio ou metilo; 1 \ X

   j.mj XÁ .V A significa, independentemente uns dos outros, uma ligação simples, um grupo metileno ou um grupo da familia das fórmula lia ou Ilb;

   Y' significa =0, =S, =CH2, =C(CH3)2 ou =NR*, em que R1 é definido como acima; M significa uma ligação simples, -0-, -S- ou NR1, em que que R1 é definido como acima; R2 e R3 significam, independentemente uns dos outros, hidrogénio, (Ci-C6) -alcóxilo, (Ci-C6)-alquiltio, amino, halogéneo, como F, Cl, Br ou (Ci-Cs)-alquilo, que eventualmente pode estar substituído por hidróxilo, (Ci-Οε) -alcóxilo ou (Οτ,-Οε) alquiltio; p e q significam, independentemente uns dos outros, zero a 5; r e s significam, independentemente uns dos outros, zero a 5; D e G significam, independentemente uns dos outros CR5R6; R5 e R6, significam, independentemente uns dos outros, hidrogénio, (Cj-Ce) -alquilo, (C6-C2o) -arilo, (C6-C20) -arilo-(Ci~C6)-alquilo, hidróxilo, (Ci~Cs)-alcóxilo, (Ci— Cg)-alquiltio, alquilo e arilo, podem estar substituídos 2

   eventualmente com SR1 ou NR^1', em que R1 possui os significados acima mencionados e Rr, independentemente de R1, possui o mesmo significado que R1; X significa -0-, -S- ou NR1, em que R1 possui os significados acima mencionados Y significa =0 ou =S; Z significa -0Re, -NR9R10 ou X'Q", em que X' significa o mesmo que X e Q'' significa o mesmo que Q; R8 significa hidrogénio, (Q-Cie)-alquilo, (C2-C18)-alquenilo, (C3-Ci8) -alquinilo, (C6-Ci2) -arilo, (C6-Ci2)-arilo- (Ci-C6) -alquilo, em que alquilo pode estar uma ou mais vezes substituído por grupos hidróxilo, (C1-C4)-alcóxilo, F, Cl, Br, e arilo pode estar substituído 1-3 vezes por hidróxilo, (C1-C4) -alcóxilo, (C1-C4) -alquilo, F, Cl, Br, N02, NR9R10, -C(0)0H, -C (0) 0- (Ci~C6) -alquilo, -C (0) NR9R10, , de preferência contudo por hidrogénio, (Cj-C6)-alquilo, (C6-Ci2)-arilo ou (C6-Ci2)-arilo-(Ci-C6) -alquilo, em que arilo pode ser substituído uma vez por (C1-C4) -alcóxilo, (Ci-C4) -alquilo, F, Cl, Br, N02, sendo especialmente preferido hidrogénio, (Ci-Ce)-alquilo, fenilo ou 2-(4-nitrofenilo)etilo R9 e R10, significam, independentemente uns dos outros, hidrogénio, (Ci-Ci8) -alquilo, (Ci-C18) -alquenilo, (Ci-Cis)-alquinilo, (C6-C12)-arilo, (C6-Ci2) -arilo- (Ci-C6) -alquilo, em que alquilo pode estar uma ou mais vezes substituído por hidróxilo, (C1-C4)-alquilo, F, Cl, Br,, ou R9 e R10 podem formar em conjunto com o átomo de N que possuem um anel de 4-7 membros.

   tf?

   . ,ΛΚ-

   1

   Q e Q', significam, independentemente uns dos outros, hidrogénio ou R8, e significam, conjugados, que influenciam de forma vantajosa as caracteristicas de oligonucleotideos "antisense" ou dos oligonucleotideos formadores das triplas hélices ou servem como sondas de marcação de um ADN, ou que se agarram durante a hibridação dos análogos de oligonucleotideos aos ácidos nucleicos alvos durante a ligação ou reticulação, ou significam oligonucleotideos, que podem não ser modificados ou ser modificados.
2. 2. Compostos de fórmula I de acordo com a reivindicação 1, em que n significa um número de zero a 50; B significa, independentemente uma da outra, uma nucleobase natural ou uma base não natural; A significa um grupo de fórmula Ilb, em que r = 1 e s = zero, e R2,R3 = H e Y' =0eM significa uma ligação simples; D e G independentemente um do outro significam CHR5; R5 significa hidrogénio; X significa -0-; Y significa =0; Z significa hidróxilo, metóxilo, etóxilo, (4- nitrofenol)etóxilo, propóxilo, isopropóxilo, butóxilo, pentóxilo, fenóxilo ou alilóxilo; 4

   \i ><r' -f Q e Q' significar independentemente um do outro, hidrogénio, R8 ou um oligonucleotideo, que pode ser não modificado ou pode ser modificado, em que a) as pontes de diéster de ácido fosfórico em 3'- e/ou 5', estão total ou parcialmente substiluidas por pontes de tioato de fósforo, ditioato de fósforo, NR4R4'amidato de fósforo, fosfato de O-éster metilico, fosfato de O-éster etílico, fosfato de O-éster isopropílico, metilfosfonato ou fenilfosfonato; b) as pontes de diéster de ácido fosfórico nas posições 3'- ou 5'- estão substituídas nas posições pirimidínicas e nas posições 5'-terminais e/ou 3'-terminais através de acetais fórmicos e/ou 3'-tioformoacetais; c) a coluna de açúcar-fosfato está substituída total ou parcialmente através de "PNA' s ou de híbridos PNA-ADN; d) as unidades β-ϋ-2'-desóxiribose estão substituídas total ou parcialmente através de 2'-F-2'-desóxiribose, 2'-O-(Ci-C6) alquilribose, 2'-0- (C2-C6) alquenilribose, 2'-NH2-2'-desóxiribose; e) as bases nucleosídicas naturais estão substituídas total ou parcialmente através de 5-(Ci-C6)-alquilo-uracilo, 5-(C2-C6)-alquenilo-uracilo, 5-(C2-Cg)-alquinilo-uracilo, 5-(Οι-Οε)-alquilo-citosina, 5-(C2-C6)-alquenilo-citosina, 5-(C2-C6)-alquinilo-citosina, 5-fluorouracilo, 5-fluorocilosina, 5-clorouracilo, 5-clorocitosina, 5-bromouracilo, 5-bromocitosina, 7-deaza-7- (C3-C7) -alquinilguanina, 7-deaza-7- (C2-C7) -alquiniladenina, 7-deaza-7- (C2-C7) -alquenilguanina, 7-deaza-7- (C2-C7) -alqueniladenina, 7-deaza-7- (C1-C7) - alquilguanina, 7-deaza-7- (C1-C7)-alquiladenina, 7- 5

   deaza- 7-bromoguanina e 7-deaza-7-bromoadenina.
3. 3. Compostos de fórmula I de acordo com as reivindicações 1 ou 2, caracterizados por n significar um número de zero a 30; Q e Q' serem, independentemente um do outro, hidrogénio, Ra, em que R8 significa hidrogénio, (Ci~C6) alquilo, fenilo ou 2-(4-nitrofeniletilo), ou significa oligonucleotideos que podem ser não modificados ou podem ser modificados, em que a) as pontes de diéster de ácido fosfórico em 3'- e/ou 5', estão total ou parcialmente substituídas por pontes de tioato de fósforo, ditioato de fósforo, ou metilfosfonato; b) uma, duas ou três pontes de diéster de ácido fosfórico nas posições 3'- ou 5'- estão substituídas nas posições terminais 5'- e 3'-; c) a coluna de açúcar-fosfato substituída total ou parcialmente através de "PNA" ou híbridos PNA-ADN; d) as unidades de β-ϋ-2'-desóxiribose estão substituídas total ou parcialmente através de 2'-F-2'-desóxiribose, 2' -0- (C1-C4) alquilribose, 2' -0- (C2-C4) alquenilribose, 2'-NH2-2'-desóxiribose; e) as bases nucleosídicas naturais estão substituídas total ou parcialmente através de 5-(C3-C6)-alquilo- uracílo, 5-(C2-C6)-alquenilo-uracilo, 5-(C2-C6)- alquinilo-uracilo, 5- (Ci-Cs) -alquilo-citosina, 5- (C2-C6) - alquenilo-citosina, 5- (C2-C6)-alquinilo-citosina, 7- 6

   deaza-7-(C2-C7)-alquinilguanina, 7-deaza-7-(C2-C7)-alquiniladenina, 7-deaza-7-(C2-C7)-alquenilguanina, 7-deaza-7-(C2-C7)-alqueniladenina, 7-deaza-7-(Ci-C7) -alquilguanina, 7-deaza-7~(Ci-C7)-alquiladenina, 7-deaza-7-bromoguanina e 7-deaza-7-bromoadenina.
4. 4. Compostos de fórmula I de acordo com as reivindicações 1 a 3, caracterizados por

   n significar um número de zero a 25; B significar, independentemente entre si, uma nucleobase natural; Z significar hidróxilo, etóxilo, (4-nitrofenol)etóxilo ou fenóxilo; Q e Q' serem, independentemente um do outro, hidrogénio,

   R8, em que R8 significa hidrogénio, (Ci-C6) alquilo, fenilo ou 2-(4-nitrofeniletilo), ou significa oligonucleotideos que podem ser não modificados ou podem ser modificados, em que a) as pontes de diéster de ácido fosfórico em 3'- e/ou 5', estarem total ou parcialmente substituídas por pontes de tíoato de fósforo; c) a coluna de açúcar-fosfato estar substituída total ou parcialmente através de "PNA" ou híbridos PNA-ADN; d) as unidades β-ϋ-2'-desóxiribose estão substituídas total ou parcialmente através de 2'-O-metilribose, 2'~0-O-alilribose, 2'-O-butilribose; e) as bases nucleosídicas naturais estarem substituídas 7

   ^CV<>-7 total ou parcialmente através de 5-hexinilcitosina, 5-hexiniluracílo, 5-hexinilcitosina, 7-deaza-propinilguanina, 7-deaza-7-metilguanina, 7-deaza-7-metiladenina, 7-deaza-7-bromoguanina e 7-deaza-7-bromoadenina.
5. 5. Processo para a preparação de compostos de fórmula I, caracterizado por ai) compostos de fórmula III h2l-dv G

   (HO em que D, G, L e X possuem os significados acima mencionados e S1 significa um grupo de protecção adequado, como por exemplo, dimetóxitritilo, moniometóxitritilo, tritilo, pixilo, tert-butilóxocarbonilo, ou fluorenilmetiloxicarbonilo; serem transformados com compostos de fórmula IV

   em que Rs e R6 possuem os significados mencionados nas reivindicações 1-4, num solvente orgânico adequado, a uma temperatura de 0°C a 100°C em compostos de fórmula Va ou Vb 8

   R

   (Va)

   bx) Compostos de fórmula Va ou Vb com compostos de fórmula Via ou VIb, .2 Y II S—XU s—xm/

   (Via) (VIb) em que se definem Y como nas reivindicações de 1-4 X'e X'' independentemente um do outro, como se define X S2 e S3 independentemente um do outro, significam grupos de protecção, e L1 significa um grupo abandonante; num solvente orgânico adequado, a temperaturas de 0°C a 100°C, eventualmente sob adição de bases, de complexos de bases ou bases peralquiladas de poliamino-fosfases não carregadas que se transformam nos compostos de fórmula VII

   em que 9 (VII) D, G, L, R5, R6, S1, S2, S3, X, X', X" e Y significam o que se definiu nas reivindicações 1-4; ci) Compostos de fórmula VII com compostos de fórmula VIII,

   (VIII) em que A significa o que se definiu nas reivindicações 1-4; Bpr possui o mesmo significado que B, eventualmente contudo encontrando-se na forma protegida, L2 significa um grupo abandonante conhecido do especialistas; caso A possua o significado da fórmula Ilb significa também OH; num solvente orgânico adequado,a uma temperatura de -20°C a 100°C,eventualmente sob adição de bases, ou complexos de bases ou bases peralquiladas de poliamino-fosfases não carregadas ou sem adição de bases ou sob a adição de um reagente de acoplamento para ligações de peptídeos, transformando-se em compostos de fórmula IX

   (IX) em que A, Bpr,D, G, L, Rs, R6, S1, S2, S3, X, X', X" e Y significam o que acima se definiu 10 di) a partir de compostos de fórmula IX os grupos de protecção S3 são hidrolizados por processos conhecidos obtendo-se compostos de fórmula X

   S1 (X) em que A, bpr,d, g, l, R5, R6, S1, S2, X, X', X" e Y significam o que acima se definiu ea) a partir de compostos de fórmula IX os grupos de protecção S1 são hidrolisados, obtendo-se os compostos de fórmula XI

   (XI) em que A, Bpr,D, G, L, R5, R6, S2, S3, X, X', X" e Y significam o que acima se definiu fi) compostos de fórmula XI com compostos X de acordo com a química de oligonucleotídeos são submetidos ao processo conhecido de "processo de triester de fósforo" num solvente adequado, a temperaturas entre -20°C e 100°C,sob adição de um reagente de acoplamento, ou de um composto de fórmula XII 11

   \

   em que R15 significa (C6-Ci2)-arilo, eventualmente uma a quatro vezes substituído através de (Ci-Cs)-alquilo, (Cj — C6)-alcóxilo, nitro, cloro, bromo e em que eventualmente 1 a 3 átomos de C estão substituídos por heteroátomos; R16 significa um grupo abandonante; eventualmente sob adição de um catalisador, em que a preparação dos reagentes de acoplamento decorre in situ, podendo contudo decorrer separadamente e a solução das espécies activas ser adicionada num solvente adequado a compostos de fórmula XIII

   em que A, BP\D, G, L, R5, R6, S1, S2, S3, X, X', X" e Y significam o que acima se definiu gi) partindo de compostos de fórmula XIII repetindo os passos ei) e fi) até ao tamanho de cadeia desejado, em que resultam os compostos de fórmula XIV, 12

   s^x S—X"

   Gv

   x-s (XIV) -ti em que A, BPR,D, G, L, R\ R6, S1, S2, S3, X, X', X" e Y significam o que acima se definiu hj os grupos de protecção S1, S2 e S3 e os grupos de protecção em BPR são hidrolisados por processos conhecidos; e eventualmente os grupos Q e Q' são introduzidos por processos conhecidos do especialistas, e eventualmente os compostos resultantes são ciclizados resultando compostos de fórmula I.

   Processo para a preparação de compostos de fórmula I, de acordo com as reivindicações de 1-4, em que n significa 1 a 100, que é caracterizado por compostos de fórmula XV e XVI, ,PR xv/ f £ 'x-s1 (XV) rpr Y A'S-KP L. a.S^-X^X^0' x' ? Bpf3/ f 'x-s1 (XVI) em que 13

   V

   A, BPS,D, G, L, R5, R6, S1, S2, S3, X, X', X" e Y significam o definido nas reivindicações de 1-4, o e p são independentes um do outro e significam zero a 50, e o+p+l=n; a2) nos compostos de fórmula XV os grupos de protecção S1 são hidrolisados, de acordo com a reivindicação 5, como se descreve em ei), b2) nos compostos de fórmula XVI os grupos de protecção S3 são hidrolisados, de acordo com a reivindicação 5 como se descreve em di) , c2) os compostos correspondentes, de acordo com a reivindicação 5, são acoplados como se descreve em fi), em que resultam os compostos de fórmula XIV

   X-S (XIV) em que

   significam o que acima se definiu, d2) e estes tranformados, de acordo com a reivindicação 5 em compostos de fórmula I, como se descreve em Ih) .
6. 7. Processo para a preparação de compostos de fórmula I, de acordo com as reivindicações de 1-4, caracterizado por a3) compostos de fórmula X 14

   em que A, BPR, D, G, L, R5, Rs, S1, S2, X, X', X'' e Y significam o que acima nas reivindicações de 1-4 se definiu, se acoplam através de um SPACER, de acordo com processos conhecidos, a um suporte sólido, originando um composto de fórmula XVII SS

   em que A, Bpr,D, G, L, R5, R6, S1, S2, X, X', X" e Y significam o que acima se definiu, SS significa um suporte sólido adequado para síntese em fase sólida, e SPACER significa um grupo hidrolisável de suporte, após ter decorrido a síntese, como é conhecido do especialistas, ou SPACER significa uma molécula conjugada bisfuncional Q, que são ligados através de grupos hidrolisáveis a suportes sólidos; b3) a partir de compostos de fórmula XVII 15 SS — SPACER

   (XVII) em que A, BPR,D, G, L, R5, R6, S1, S2, SS, SPACER, X, X', X" e Y significam o que acima se definiu, o grupo de protecção S1 é hidrolisado, de acordo com a reivindicação 5, como se descreve em ei) ; c3) o composto resultante é transformado, de acordo com a reivindicação 5, como se descreve em ί3) com compostos de fórmula X B PR

   (X) em que A, Bpr, D, G, L, R5, Re, S1, S2, X, Xf , X'' e Y significam o que acima se definiu; d3) os passos b3) e c3) são repetidos de acordo com o tamanho da cadeia que se deseja; e3) eventualmente acoplamento do conjugado Q' através de processos conhecidos; f3) os compostos assim obtidos de acordo com processos conhecidos, são hidrolisadps do suporte sólido, como se descreve no passo h3), em que a hidrólise 16 dos grupos de protecção podem decorrer também antes da hidrólise do suporte, e eventualmente o conjugado Q acoplado de acordo com processos conhecidos, em que a ordem do acoplamento de Q, em particular Q' (e3) (f3) também pode ser mudada, e eventualmente ciclizados os composlos obtidos.
7. 8. Utilização de compostos de fórmula 1 de acordo com as reivindicações de 1 a 4 como inibidores da expressão genética.
8. 9. Utilização de compostos de fórmula I de acordo com as reivindicações de 1 a 4 como agentes de diagnóstico, para o tratamento de doenças que são originadas por virus, que são influenciadas através de integrina ou através dos receptores de adesão célula-célula ou que surgem através de factores como TNF alfa, para o tratamento de câncro ou restenose.
9. 10. Um composto com a seguinte fórmula 5'-OLIGO-PMENA; 5'-PMENA-OLIGO; 5'-OLIGO-PMENA-OLIGO; 5'-OLIGO-(PMENA-OLIGO) a; 5'-PMENA-OLIGO-PMENA; ou 5'-PMENA-(OLIGO-PMENA)a em que a significa de 1-20, OLIGO significa eveNtualmente um oligonucleotideo modificado e PMENA um composto de fórmula I de acordo com as reivindicações de 1-4, em que Q e Q' significam hidrogénio. Lisboa, 18 de Dezembro de 2001

   L. 17