BRPI0711429A2 - compostos e métodos para modulas expressão de gccr - Google Patents

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Richard S Geary
Robert Mckay
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Punit P Seth
Andrew M Siwkowski
Eric E Swayze
Edward Wancewicz
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Abstract

COMPOSTOS E MéTODOS PARA MODULAR EXPRESSãO DE GCCR. A presente invenção refere-se a compostos anti-sendito curtos, incluindo os compostos referidos compreendendo monómeros de alta afinidade quimicamente modificados de 8 a 16 monómeros de extensão. Alguns dos compostos anti-sentido curtos referidos são úteis para a redução de ácidos nucléicos e/ou proteínas-alvo em células, tecidos, e animais com aumentada potência e aprimorado indice terapêutico. Portanto, são proporcionados aqui, compostos anti-sentido curtos compreendendo modificações de nucleotídeo de alta afinidade úteis para reduzir um RNA-alvo in vivo. Os compostos anti-sentido curtos referidos são eficazes em doses menores do que os compostos anti-sentido previamente descritos, possibilitando uma redução na toxicidade e no custo do tratamento. Além disso, os compostos anti-sentido curtos descritos têm maior potencial para dosagem oral.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "COMPOS- TOS E MÉTODOS PARA MODULAR EXPRESSÃO DE GCCR".
LISTAGEM DE SEQÜÊNCIA
O presente pedido está sendo depositado junto com uma Lista- gem de Seqüências em formato eletrônico. A Listagem de Seqüências é proporcionada como um depósito intitulado CORE0061W012SEQ.TXT, cri- ado em 7 de maio de 2007 o qual tem 700 Kb de tamanho. As informações no formato eletrônicoda listagem de seqüências são incorporadas aqui, a este requerimento de patente, por meio de referência em sua totalidade.
ANTECEDENTES
Ter por alvo seqüências genéticas que causam doenças foi pri- meiro sugerido quase 40 anos atrás (Belikova et al., Tet. Lett., 1967, 37, 3557-3562), e foi demonstrada atividade anti-sentido em cultura celular uma década depois (Zamecnik et al., Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A., 1978, 75, 280- 284). Uma vantagem da tecnologia anti-sentido no tratamento de uma doen- ça ou condição que deriva de um gene que causa doença é que é uma a- bordagem genética direta que tem a capacidade de modular a expressão de genes que causam doença específicos.
De modo geral, o princípio por trás da tecnologia anti-sentido é que um composto anti-sentido hibridiza a um ácido nucléico alvo e realiza modulação da atividade de expressão genética ou função, tal como transcri- ção, translação ou junção. A modulação da expressão genética pode ser realizada, por exemplo, por degradação alvo ou inibição baseada em ocupa- ção. Um exemplo de modulação de função alvo de RNA por degradação é degradação à base de RNase H do RNA-alvo na hibridização com um com- posto anti-sentido semelhante a DNA. Outro exemplo de modulação da ex- pressão genética por degradação alvo é interferência de RNA (RNAi). RNAi é uma forma de silenciamento genético mediado por anti-sentido envolvendo a introdução de dsRNA levando à redução seqüência-específica de níveis de RNAm endógeno alvo. Especificidade de seqüência torna compostos anti- sentido extremamente atraentes como ferramentas para validação alvo e funcionalização genética, bem como ferramentas de pesquisa para identifi- car e caracterizar riucleases e como terapêuticos para modular seletivamen- te a expressão de genes envolvidos na patogênese de qualquer uma de uma variedade de doenças.
Tecnologia anti-sentidc é um meio eficaz para reduzir a expres- são de um ou mais produtos genéticos específicos e portanto pode se com- provar ser unicamente útila em uma série de aplicações terapêuticas, diag- nosticas, e de pesquisa. Nucleosídeoos quiemicamente modificados são ro- tineiramente usados para incorporação em compostos anti-sentido para re- forçar uma ou mais propriedades, tais como resistência à nuclease, farma- cocinética ou afinidade para um RNA-alvo.
Apesar da expansão de conhecimento desde a descrição da tecnologia anti-sentido, permanece uma necessidade não satisfeita de com- postos anti-sentido com maior eficácia, reduzida toxicidade e menor custo. Até a presente descrição, modificações de alta afinidade não foram empre- gadas no desenho de compostos anti-sentido curtos para reduzir RNA-alvo in vivo. Isto é devido a preocupações relativas ao grau de especificidade alvo que uma seqüência de 15 nucleotídeos ou mais curta teria quando empre- gada para reduzir alvo em um sistema vivo. Estudos anteriores descreveram que maior especificidade, e portanto maior potencial para potência, é obtida por compostos anti-sentido entre 16 e 20 nucleobases de extensão.
A presente descrição descreve que a incorporação de nucleotí- deos de alta afinidade quimicamente modificados em compostos anti-sentido possibilita compostos anti-sentido curtos de cerca de 8 a 16 nucleobases de extensão úteis na redução de RNAs alvo em animais com aumentada potên- cia e aprimorado índice terapêutico. Portanto, são proporcionados aqui, nes- te requerimento de patente, compostos anti-sentido curtos compreendendo modificações de nucleotídeos de alta afinidade úteis para reduzir um RNA- alvo in vivo. Os compostos anti-sentido curtos referidos são eficazes em me- nores doses do que o composto anti-sentido previamente descrito, possibili- tando uma redução na toxicidade e no custo do tratamento. SUMÁRIO
São revelados aqui, neste requerimento de patente, compostos anti-sentido curtos e métodos de uso dos referidos compostos para reduzir a expressão de RNA-alvo em células ou tecidos. Em algumas modalidades, é proporcionado aqui, neste requerimento de patente, um método para reduzir a expressão de um alvo em um animal, compreendendo administrar ao ani- mal um composto anti-sentido curto dirigido para um ácido nucléico de se- melhante alvo. Em algumas modalidades, compostos anti-sentido curtos são compostos de oligonucleotídeos. Em algumas modalidades, oligonucleotí- deos anti-sentido curtos têm cerca de 8 a 16, preferencialmente 9 a 15, mais preferencialmente 9 a 14, mais preferencialmente 10 a 14 nucleotídeos de extensão e compreendem uma região de gap flanqueada sobre cada lado por uma asa, em que cada asa consiste independentemente em 1 a 3 nucle- otídeos. Motivos preferenciais incluem mas não estão limitados à motivos de asa - gap deóxi -asa selecionados entre 3-10-3, 2-10-3, 2-10-2, 1 -10-1, 2-8-2, 1-8-1, 3-6-3 ou 1-6-1. Em uma modalidade preferencial, o oligonucleotídeo anti-sentido curto compreende no mínimo uma modificação de alta afinidade. Em uma modalidade adicional, a modificação de alta afinidade inclui nucleo- tídeos de alta afinidade quimicamente modificados. Em uma modalidade pre- ferencial, cada asa consiste independentemente em 1 a 3 nucleotídeos mo- dificados de alta afinidade. Em uma modalidade os nucleotídeos modificados de alta afinidade são nucleotídeos modificados com açúcar.
Em algumas modalidades, compostos anti-sentido curtos apre- sentam maior captação no intestino comparados com compostos anti- sentido de maior extensão. Portanto, também são proporcionados aqui, nes- te requerimento de patente, métodos para reduzir um alvo em um animal, compreendendo administrar por via oral os compostos anti-sentido curtos da presente invenção.
Em algumas modalidades, compostos anti-sentido curtos são dirigidos para um ácido nucléico codificando uma proteína selecionada entre ApoB, SGLT2, PCSK9, SOD1, CRP, GCCR1 GCGR, DGAT2, PTP1B e PTEN.
São adicionalmente proporcionados métodos para tratar um dis- túrbio metabólico em um animal, compreendendo administrar a um animal que necessite de semelhante terapia um composto anti-sentido curto dirigido para um ácido nucléico envolvido em regular o metabolismo ou desobstru- ção da glicose, o metabolismo dos lipídeos, o metabolismo do colesterol, ou a sinalização da insulina.
Também são proporcionados métodos para aumentar sensibili- dade à insulina, reduzir a glicose sangüínea ou reduzir a HbA1c em um ani- mal, compreendendo administrar ao referido animal um composto anti- sentido curto dirigido para um ácido nucléico codificando um alvo envolvido em regular o metabolismo ou desobstrução da glicose, o metabolismo dos lipídeos, o metabolismo do colesterol, ou a sinalização da insulina.
São adicionalmente proporcionados métodos para reduzir o co- lesterol sérico total, o LDL sérico, o VLDL sérico, o HDL sérico, os triglicerí- deos séricos, a apolipoproteína(a) sérica ou ácidos graxos livres em um a- nimal, compreendendo administrar ao referido animal um composto anti- sentido curto dirigido para um ácido nucléico codificando um alvo que está envolvido em regular o metabolismo ou desobstrução da glicose, o metabo- lismo dos lipídeos, o metabolismo do colesterol, ou a sinalização da insulina, em que o referido composto anti-sentido curto tem 8 a 16 nucleotídeos de extensão e compreende uma região de gap flanqueada sobre cada lado por uma asa, em que cada asa consiste independentemente em 1 a 3 nucleotí- deos modificados de alta afinidade.
Alguns alvos envolvidos em regular o metabolismo ou desobs- trução da glicose, o metabolismo dos lipídeos, o metabolismo do colesterol, ou a sinalização da insulina incluem, mas não estão limitados a, GCGR e ApoB-100. Portanto, são proporcionados compostos anti-sentido curtos ten- do por alvo ácidos nucléicos codificando GCGR e ApoB-100 e métodos para reduzir a expressão dos referidos alvos e/ou ácidos nucléicos alvo em ani- mal. Além disso, é proporcionado o uso de compostos anti-sentido curtos tendo por alvo ácidos nucléicos codificando GCGR, e ApoB-100 para o tra- tamento de uma doença ou condição metabólica ou cardiovascular.
Em algumas modalidades, compostos anti-sentido curtos adicio- nalmente compreendem um grupo conjugado. Grupamentos conjugados in- cluem, mas não estão limitados a, Ci6 e colesteroi.
Em algumas modalidades, compostos anti-sentido curtos com- preendem no mínimo uma nucleobase modificada, ligação internucleosí- deoss ou porção açúcar. Em algumas modalidades, a ligação internucleosí- deoss modificada referida é uma ligação internucleosídeoss fosforotioato. Em algumas modalidades, cada uma ligação internucleosídeoss é uma liga- ção internucleosídeoss fosforotioato.
Em algumas modalidades, compostos anti-sentido curtos com- preendem no mínimo uma modificação de alta afinidade. Em algumas moda- Iidades referidas, a modificação de alta afinidade é um nucleotídeo de alta afinidade quimicamente modificado. Em algumas modalidades, nucleotídeos de alta afinidade quimicamente modificados são nucleotídeos modificados com açúcar. Em algumas modalidades, no mínimo um dos nucleotídeos mo- dificados com açúcar compreende uma ponte entre a posição 4' e a 2' do açúcar. Cada um dos nucleotídeos modificados com açúcar está, indepen- dentemente, na conformação de açúcar β-D ou α-L. Em algumas modalida- des, cada um dos referidos nucleotídeos modificados de alta afinidade con- fere uma ATm de no mínimo 1 a 4 graus por nucleotídeo. Em algumas moda- lidades, cada um dos referidos nucleotídeos modificados com açúcar com- preende um grupo 2'-substituinte que é ou than H ou OH. Os referidos nu- cleotídeos modificados com açúcar incluem aqueles tendo uma porção açú- car bicíclico ligada por ponte 4' a 2'. Em algumas modalidades, cada um dos grupamentos 2'-substituintes é, independentemente, alcóxi, alcóxi substituí- do, ou halogeno. Em algumas modalidades, cada um dos grupamentos 2'- substituintes é OCH2CH2OCH3(2-MOE).
Em algumas modalidades, compostos anti-sentido curtos têm um ou mais nucleotídeos modificados com açúcar compreendendo uma pon- te entre a posição 4' e 2' do açúcar, em que cada uma das referidas pontes independentemente compreende de 2 a 4 grupamentos ligados selecionados independentemente entre -[C(Ri)(R2)]n-, -C(Ri)=C(R2)-, -C(Ri)=N-, -Ci=NR1)-, -C(=0)-, -C(=S)-, -O-, -Si(Ri)2-, -S(=0)x- e -N(R1)-; em que x é Ο, 1, ou 2;
η é 1, 2, 3, ou 4;
cada R-i e R2 é, independentemente, Η, um grupo protetor, oxidrila, C1-C12 alquila, C2-C12 alquila substituída, C2-C12 alquenila, C2-C12 alquenila substitu- ida, C2The-Ci2 alquinila, C2-C12 alquinila substituída, C5-C20 arila, C5-C2O arila substituída, radical heterociclo, radical heterociclo substituída, heteroarila, heteroarila substituída, radical C5-C7 alicíclico, radical C5-C7 alicíclico substi- tuída, halogeno, OJ1, NJ1J2, SJ1, N3, COOJ1, acila (C(=0)-H), acila substituí- da, CN, sulfonila (S(=0)2-Ji), ou sulfoxila (St=O)-J1); e cada J1 e J2 é, independentemente, H, C1-C12 alquila, C1-C12 alquila substitu- ída, C2-C12 alquenila, C2-C12 alquenila substituída, C2-C12 alquinila, C2-C12 alquinila substituída, C5-C20 arila, C5-C20 arila substituída, acila (C(=0)-H), acila substituída, um radical heterociclo, um radical heterociclo substituído, C1-C12 aminoalquila, C1-C12 aminoalquila substituída ou um grupo protetor.
Em um aspecto, cada uma das pontes referidas é, independen- temente, -[C(R1)(R2)Jn-, -[C(R1)(R2)In-O-, -C(R1R2)-N(R1)-O- ou -C(R1R2)-O- N(R1)-. Em outro aspecto, cada uma das pontes referidas é, independente- mente, 4'-(CH2)3-2i, 4'-(CH2)2-2', 4'-CH2-0-2\ 4'-(CH2)2-0-2', 4'-CH2-0-N(R1)- 2' e 4'-CH2-N(R1)-0-2'- em que cada R1 é, independentemente, H, um grupo protetor ou Ci-C12 alquila.
Em algumas modalidades, são proporcionados aqui, neste re- querimento de patente, compostos anti-sentido curtos úteis na redução de alvos e/ou RNAs alvo associados com estados de doença em animais. Em algumas modalidades, são proporcionados métodos para usar os compostos anti-sentido curtos para reduzir a expressão de um RNA-alvo em um animal. Em algumas modalidades, é proporcionado aqui, neste requerimento de pa- tente, o uso de um composto anti-sentido curto na preparação de um medi- camento para o tratamento de um distúrbio metabólico em um animal. Em algumas modalidades, é proporcionado aqui, neste requerimento de patente, o uso de um composto anti-sentido curto na preparação de um medicamento para aumentar a sensibilidade à insulina, reduzir a glicose sangüínea ou re- duzir a HbA1c em um animal. Também é proporcionado o uso de um com- posto anti-sentido curto na preparação de um medicamento para reduzir o co I este rol sérico total, o LDL sérico, o VLDL sérico, o HDL sérico, os triglice- rídeos séricos, a apolipoproteína(a) sérica ou ácidos graxos livres em um animal.
Em algumas modalidades, compostos anti-sentido curtos pro- porcionados aqui, neste requerimento de patente, apresentam igual ou maior potência com respeito a knockdown de RNA-alvo comparados com oligonu- cleotídeo anti-sentido precursor mais longo de no mínimo 20 nucleotídeos de extensão. Em algumas modalidades, compostos anti-sentido curtos apresen- tam um início de ação mais rápido (redução do RNA-alvo) comparados com o oligonucleotídeo anti-sentido precursor. Em algumas modalidades, a po- tência aumentada é no rim. Em algumas modalidades, o RNA-alvo é predo- minantemente expressado no rim. Em algumas modalidades, a potência aumentada é no fígado. Em algumas modalidades, o RNA-alvo é predomi- nantemente expressado no fígado.
DESCRIÇÃO DETALHADA
Deve ser entendido que tanto a descrição geral precedente quanto a descrição geral que se segue são exemplares e explanatórias so- mente e não são restritivas da invenção, conforme reivindicada. Aqui, neste requerimento de patente, o uso do singular inclui o plural a menos que espe- cificamente determinado de modo diverso. Conforme usado aqui, neste re- querimento de patente, o uso de "ou" significa "e/ou" a menos que determi- nado de modo diverso. Além disso, o uso do termo "incluindo" bem como outras formas, tal como "inclui" e "incluído", não é limitante. Além disso, ter- mos tais como "elemento" ou "componente" engloba tanto elementos quanto componentes compreendendo uma unidade e elementos e componentes que compreendem mais de uma subunidade, a menos que especificamente determinado de modo diverso.
Os títulos das seções usados aqui, neste requerimento de paten- te, são para fins organizacionais somente e não devem ser considerados como Iimitantes do assunto descrito. Todos os documentos, ou porções de documentos, citados neste requerimento, incluindo, mas não limitados a, patentes, requerimentos de patente, artigos, livros, e tratados, são por este expressamente incorporados por meio de referência em sua totalidade para qualquer finalidade. Os requerimentos de patente dos Estados Unidos serial nos 10/712.795 e 10/200.710 são por este expressamente incorporados por meio de referência em sua totalidade para qualquer finalidade. A. Definições
A menos que sejam proporcionadas definições específicas, a nomenclatura utilizada em associação com, e os procedimentos e técnicas de, química analítica, química orgânica sintética, e química medicinal e far- macêutica descritos aqui, neste requerimento de patente, são aqueles de conhecimento geral e comumente usados na arte. Técnicas de rotina podem ser usadas para síntese química, análise química, preparação farmacêutica, formulação e liberação, e tratamento de sujeitos. Algumas técnicas e alguns procedimentos semelhantes podem ser encontrados, por exemplo, em "Car- bohydrate Modifications in Antisense Research" Editado por Sangvi and Co- ok, American Chemical Society, Washington D.C., 1994; e "Remington1S Pharmaceutical Sciences," Mack Publishing Co., Easton, Pa., 18th edition,1990; e o qual é por este incorporado por meio de referência para qualquer fim. Onde permitido, todas as patentes, requerimentos, requerimentos publi- cados e outras publicações e seqüências da GenBank e outras bases de dados referidos do início ao fim desta descrição aqui, neste requerimento de patente, são incorporados por meio de referência em sua totalidade.
A menos que indicado de modo diverso, os seguintes termos têm os seguintes significados:
Conforme usado aqui, neste requerimento de patente, o termo "nucleosídeo" significa uma glicosilamina compreendendo uma nucleobase e um açúcar. Nucleosídeos inclui, mas não estão limitados a, nucleosídeos que ocorrem naturalmente, nucleosídeos abásicos, nucleosídeos modifica- dos, e nucleosídeos tendo bases miméticas e/ou grupamentos de açúcar. Conforme usado aqui, neste requerimento de patente, o termo "nucleotídeo" se refere a uma glicosomina compreendendo uma nucleobase e um açúcar tendo um grupo fosfato ligado de modo covalente ao açúcar. Nucleotídeos podem ser modificados com qualquer um de uma variedade de substituintes.
Conforme usado aqui, neste requerimento de patente, o termo "nucleobase" se refere à porção de base de um nucleosídeo ou nucleotídeo. Uma nucleobase pode compreender qualquer átomo ou grupo de átomos capaz de ligação de hidrogênio a uma base de outro ácido nucléico.
Conforme usado aqui, neste requerimento de patente, o termo "porção de base heterocíclica" se refere a uma nucleobase compreendendo um heterociclo.
Conforme usado aqui, neste requerimento de patente, o termo "desoxirribonucleotídeo" significa um nucleotídeo tendo um hidrogênio na posição 2' da porção açúcar do nucleotídeo. Desoxirribonucleotídeos podem ser modificados com qualquer um de uma variedade de substituintes.
Conforme usado aqui, neste requerimento de patente, o termo "ribonucleotídeo" significa um nucleotídeo tendo um hidróxi na posição 2' da porção açúcar do nucleotídeo. Ribonucleotídeos podem ser modificados com qualquer um de uma variedade de substituintes.
Conforme usado aqui, neste requerimento de patente, o termo "composto oligomérico" se refere a uma estrutura polimérica compreenden- do duas ou mais e capaz de hibridizar a uma região de uma molécula de ácido nucléico. Em algumas modalidades, compostos oligoméricos são oli- gonucleosídeos. Em algumas modalidades, compostos oligoméricos são oligonucleotídeos. Em algumas modalidades, compostos oligoméricos são compostos anti-sentido. Em algumas modalidades, compostos oligoméricos são oligonucleotídeos anti-sentido. Em algumas modalidades, compostos oligoméricos são compostos anti-sentido curtos. Em algumas modalidades, compostos oligoméricos são oligonucleotídeos anti-sentido curtos. Em algu- mas modalidades, compostos oligoméricos são oligonucleotídeos quiméri- cos.
Conforme usado aqui, neste requerimento de patente, o termo "monômero" se refere a uma única unidade de um oligômero. Monômeros incluem, mas não estão limitados a, nucleosídeos e nucleotídeos, quer ocorram naturalmente ou modificados.
Conforme usado aqui, neste requerimento de patente, "oligonucleosídeo" se refere a um oligonucleotídeo no qual as ligações internucleosídeos não contêm um átomo de fósforo.
Conforme usado aqui, neste requerimento de patente, o termo "oligonucleotídeo" se refere a um composto oligomérico compreendendo uma pluralidade de ligado nucleotídeos. Em determinada modalidade, um ou mais nucleotídeos de um oligonucleotídeo é modificado. Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo compreende ácido ribonucléico (RNA) ou ácido desoxirribonucleico (DNA). Em algumas modalidades, oligonucleotí- deos são compostos de nucleobases que ocorrem naturalmente e/ou não naturalmente, açúcares e ligações internucleotídeos covalentes, e podem incluir adicionalmente conjugados não ácido nucléico.
Conforme usado aqui, neste requerimento de patente, "ligação internucleotídeos" se refere a uma ligação covalente entre nucleotídeos adjacentes.
Conforme usado aqui, neste requerimento de patente, o termo "ligação monomérica" se refere a uma ligação covalente entre dois monômeros. Ligações monoméricas incluem, mas não estão limitadas à ligações internucleotídeos e ligações internucleosídeos.
Conforme usado aqui, neste requerimento de patente, "ligação internucleotídeos que ocorre naturalmente" se refere a uma ligação fosfodiéster 3' a 5'.
Conforme usado aqui, neste requerimento de patente, o termo "composto anti-sentido" se refere a um composto oligomérico que é no mí- nimo parcialmente complementar a uma molécula de ácido nucléico alvo à qual hibridiza. Em algumas modalidades, um composto anti-sentido modula (aumenta ou reduz) a expressão de um ácido nucléico alvo. Compostos anti- sentido incluem, mas não estão limitados a, compostos que são oligonucleo- tídeos, oligonucleosídeos, análogos de oligonucleotídeos, miméticos de oli- gonucleotídeos, e combinações quiméricas destes. Conseqüentemente, a- pesar de todos os compostos anti-sentido serem compostos oligoméricos, nem todos os compostos oligoméricos são compostos anti-sentido.
Conforme usado aqui, neste requerimento de patente, o termo "oligonucleotídeo anti-sentido" se refere a um composto anti-sentido que é um oligonucleotídeo.
Conforme usado aqui, neste requerimento de patente, o termo "oligonucleotídeo anti-sentido precursor" se refere a um oligonucleotídeo de .20 nucleotídeos de extensão tendo uma região de gap deóxi tendo dez 2'- desoxirribonucleotídeos, flanqueada por uma primeira e uma segunda região de asa cada uma tendo cinco ribonucleotídeos 2'-0-(2-metoxietila) (um gápmero 5-10-5 MOE) e compreendendo a seqüência do composto anti- sentido curto correspondente ao qual é um precursor.
Conforme usado aqui, neste requerimento de patente, o termo "composto anti-sentido curto" se refere a um composto anti-sentido de cerca de 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 ou 16 monômeros de extensão. Em algumas modalidades, um composto anti-sentido curto tem no mínimo uma modifica- ção de alta afinidade.
Conforme usado aqui, neste requerimento de patente, o termo "oligonucleotídeo anti-sentido curto" ou se refere a um oligonucleotídeo anti- sentido de cerca de 8, 9, 10, 11,12, 13, 14, 15 ou 16 nucleotídeos de exten- são. Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo anti-sentido curto tem no mínimo uma modificação de alta afinidade.
Conforme usado aqui, neste requerimento de patente, o termo "gápmero curto" se refere a um oligonucleotídeo anti-sentido curto tendo uma primeira e uma segunda região de asa cada uma independentemente em 1 a 3 nucleotídeos de extensão e uma região de gap de 2 a 14 nucleo- bases de extensão.
Conforme usado aqui, neste requerimento de patente, o termo "motivo" se refere ao padrão de nucleotídeos não modificados e modificados em um composto anti-sentido curto Conforme usado aqui, neste requerimento de patente, o termo "oligômero anti-sentido quimérico" se refere a um composto oligomérico anti- sentido, tendo no mínimo um açúcar, nucleobase ou ligação internucleosí- deoss que é diferencialmente modificado comparado com no mínimo um outro açúcar, nucleobase ou ligação internucleosídeoss dentro do mesmo composto oligomérico anti-sentido. O restante dos açúcares, nucleobases e ligações internucleosídeos podem ser independentemente modificados ou não modificados, os mesmos ou diferentes.
Conforme usado aqui, neste requerimento de patente, o termo "oligonucleotídeo quiméricoo anti-sentido" se refere a um oligonucleotídeo anti-sentido, tendo no mínimo um açúcar, nucleobase ou ligação internucle- osídeoss que é diferencialmente modificado comparados com no mínimo ou açúcar, nucleobase ou ligação internucleosídeoss dentro do mesmo oligonu- cleotídeo anti-sentido. O restante dos açúcares, nucleobases e ligações in- ternucleosídeos podem ser independentemente modificados ou não modifi- cados, os mesmos ou diferentes.
Conforme usado aqui, neste requerimento de patente, o termo "oligonucleotídeo anti-sentido de espinha dorsal mista" se refere a um oligo- nucleotídeo anti-sentido em que no mínimo uma ligação internucleosídeoss do oligonucleotídeo anti-sentido é diferente de no mínimo uma outra ligação internucleotídeos do oligonucleotídeo anti-sentido.
Conforme usado aqui, neste requerimento de patente, o termo "alvo" se refere a uma proteína, cuja modulação é desejada.
Conforme usado aqui, neste requerimento de patente, o termo "gene alvo" se refere a um gene codificando um alvo.
Conforme usado aqui, neste requerimento de patente, os termos "ácido nucléico alvo" e "molécula de ácido nucléico codificando um alvo" se referem a qualquer molécula de ácido nucléico cuja expressão ou atividade é capaz de ser modulada por um composto anti-sentido. Ácidos nucléicos alvo incluem, mas não estão limitados a, RNA (incluindo, mas não limitado a pré- RNAm e RNAm ou porções dos mesmos) transcrito de DNA codificando um alvo, e também cDNA derivado de semelhante RNA1 e miRNA. Por exemplo, o ácido nucléico alvo pode ser um gene celular (ou RNAm transcrito do ge- ne) cuja expressão é associada com um estado de doença ou distúrbio em particular, ou uma molécula de ácido nucléico de um agente infeccioso. Conforme usado aqui, neste requerimento de patente, o termo "tendo por alvo" ou "dirigido para" se refere à associação de um composto anti-sentido a uma molécula de ácido nucléico alvo em particular ou uma região particular de nucleotídeos dentro de uma molécula de ácido nucléico alvo.
Conforme usado aqui, neste requerimento de patente, o termo "sítio 5' alvo" se refere ao nucleotídeo de um ácido nucléico alvo o qual é complementar ao nucleotídeo 5'-most de um composto anti-sentido em parti- cular.
Conforme usado aqui, neste requerimento de patente, o termo "sítio 3' alvo" se refere ao nucleotídeo de um ácido nucléico alvo o qual é complementar ao nucleotídeo 3'-most de um composto anti-sentido em parti- cular.
Conforme usado aqui, neste requerimento de patente, o termo "região alvo," se refere a uma porção de um ácido nucléico alvo ao qual um ou mais compostos anti-sentido é complementar.
Conforme usado aqui, neste requerimento de patente, o termo "segmento alvo" se refere a uma menor ou subporções de uma região dentro de um ácido nucléico alvo.
Conforme usado aqui, neste requerimento de patente, o termo "complementaridade de nucleobase" se refere a uma nucleobase que é ca- paz de pareamento de base com outra nucleobase. Por exemplo, em DNA, adenina (A) é complementar a timina (T). Por exemplo, em RNA1 adenina (A) é complementar à uracila (U). Em algumas modalidades, nucleobase com- plementar se refere a uma nucleobase de um composto anti-sentido que é capaz de pareamento de base com uma nucleobase de seu ácido nucléico alvo. Por exemplo, se uma nucleobase em uma certa posição de um com- posto anti-sentido é capaz de ligação de hidrogênio com uma nucleobase em uma certa posição de um ácido nucléico alvo, então a posição de ligação de hidrogênio entre o oligonucleotídeo e o ácido nucléico alvo é considerada como sendo complementar a este par de nucleobase.
Conforme usado aqui, neste requerimento de patente, o termo "nucleobase não-complementar" se refere a um par de nucleobases que não formam ligações de hidrogênio uma com a outra ou de modo diverso supor- tam hibridização.
Conforme usado aqui, neste requerimento de patente, o termo "complementar" se refere à capacidade de um composto oligomérico para hibridizar a outro composto oligomérico ou ácido nucléico através de com- plementaridade de nucleobase. Em algumas modalidades, um composto anti-sentido e seu alvo são complementares um ao outro quando um número suficiente de posições correspondentes em cada molécula são ocupadas por nucleobases que podem ligar uma com a outra para possibilitar associação estável entre o composto anti-sentido e o alvo. Uma pessoa versada na téc- nica reconhece que a inclusão de combinações inadequadas é possível sem eliminar a capacidade dos compostos oligoméricos para permanecer em as- sociação. Portanto, são descritos aqui, neste requerimento de patente, com- postos anti-sentido que podem compreender até cerca de 20% de nucleotí- deos que são combinados de modo inadequado (isto é, não são nucleobase complementar aos nucleotídeos correspondentes do alvo). Preferencialmen- te os compostos anti-sentido contêm não mais de cerca de 15%, mais prefe- rencialmente não mais de cerca de 10%, o mais preferencialmente não mais de 5% ou nenhuma combinação inadequada. Os nucleotídeos restantes são nucleobase complementar ou de modo diverso não rompem hibridização (por exemplo, bases universais). Uma pessoa com conhecimento regular da técnica reconheceria que os compostos são proporcionados aqui, neste re- querimento de patente, no mínimo 80%, no mínimo 85%, no mínimo 90%, no mínimo 95%, no mínimo 96%, no mínimo 97%, no mínimo 98%, no mínimo 99% ou 100% complementares a um ácido nucléico alvo. Conforme usado aqui, neste requerimento de patente, o termo "combinação inadequada" se refere a uma nucleobase não-complementar dentro de um composto oligomérico complementar. Conforme usado aqui, neste requerimento de patente, "hibridiza- ção" significa o pareamento de compostos oligoméricos complementares (por exemplo, um composto anti-sentido e seu ácido nucléico alvo). Apesar de não limitado a um mecanismo em particular, o mecanismo de pareamento mais comum envolve ligação de hidrogênio, a qual pode ser ligação de hi- drogênio de Watson-Crick, de Hoogsteen ou de Hoogsteen reversa, entre bases de nucleotídeos ou nucleosídeos complementares (nucleobases). Por exemplo, a base natural adenina é nucleobase complementar às nucleoba- ses naturais timidina e uracila as quais paream através da formação de liga- ção de hidrogênio. A base natural guanina é nucleobase complementar às bases naturais citosina e 5-metila citosina. Pode ocorrer hibridização sob circunstâncias variáveis.
Conforme usado aqui, neste requerimento de patente, o termo "hibridiza especificamente" se refere à capacidade de um composto oligomé- rico para hibridizar a um sítio de ácido nucléico com maior afinidade do que hibridiza a outro sítio de ácido nucléico. Em algumas modalidades, um oligo- nucleotídeo anti-sentido hibridiza especificamente a mais de um sítio alvo.
Conforme usado aqui, neste requerimento de patente, "designar" ou "designada para" se referem ao processo de designar um composto oli- gomérico que hibridiza especificamente com uma molécula de ácido nucléico selecionada.
Conforme usado aqui, neste requerimento de patente, o termo "modulação" se refere a uma perturbação da função ou atividade comparado com o nível da função ou atividade antes de modulação. Por exemplo, mo- dulação inclui a alteração, ou um aumento (estimulação ou indução) ou uma redução (inibição ou redução) na expressão genética. Como exemplo adi- cional, modulação da expressão pode incluir perturbar a seleção de sítio de junção de processamento de pré-RNAm.
Conforme usado aqui, neste requerimento de patente, o termo "expressão" se refere a todas as funções e etapas pelas quais uma informa- ção codificada por gene é convertida em estruturas presentes e operantes em uma célula. As estruturas referidas incluem, mas não estão limitadas aos produtos de transcrição e translação.
Conforme usado aqui, neste requerimento de patente, "variante" se refere a um transcripto de RNA alternativo que pode ser produzido a partir da mesma região genômica de DNA. Variantes incluem, mas não estão limi- tadas à "variantes pré-RNAm" as quais são transcriptos produzidos a partir do mesmo DNA genômico que diferem de outros transcriptos produzidos a partir do mesmo DNA genômico ou em sua posição de início ou de término e contêm tanto seqüência intrônica quanto exônica. Variantes também inclu- em, mas não estão limitados a, as com junções de junção alternada, ou có- dons de iniciação e terminação alternada.
Conforme usado aqui, neste requerimento de patente, "monôme- ro modificado de alta afinidade" se refere a um monómero tendo no mínimo uma nucleobase modificada, ligação internucleosídeoss ou porção açúcar, comparado com monômeros que ocorrem naturalmente, de tal modo que a modificação aumenta a afinidade de um composto anti-sentido compreen- dendo o monômero modificado de alta afinidade a seu ácido nucléico alvo. Modificações de alta afinidade incluem, mas não estão limitadas a, monôme- ros (por exemplo, nucleosídeos e nucleotídeos) compreendendo açúcares 2'-modificados.
Conforme usado aqui, neste requerimento de patente, o termo "2'-modificado" ou "2'-substituído" significa um açúcar compreendendo subs- tituinte na posição 2' diferente de H ou OH. Monômeros 2'-modificados, in- cluem, mas não estão limitados a, BNA1S e monômeros (por exemplo, nucle- osídeos e nucleotídeos) com 2'- substituintes, tais como alila, amino, azido, tio, O-alila, O-CrCi0 alquila, -OCF3, O-(CH2)2-O-CH3, 2'-0(CH2)2SCH3, O- (CH2)2-O-N(Rm)(Rn), ou 0-CH2-C(=0)-N(Rm)(Rn), onde cada Rm e Rn é, in- dependentemente, H ou CrCio alquila substituída ou não-substituída. Em algumas modalidades, compostos anti-sentido curtos compreendem um mo- nômero 2'-modificado que não tem a fórmula 2'-0(CH2)nH, em que η é um a seis. Em algumas modalidades, compostos anti-sentido curtos compreen- dem um monômero 2'-modificado que não tem a fórmula 2'-OCH3. Em algu- mas modalidades, compostos anti-sentido curtos compreendem um monô- mero 2'-modificado que não tem a fórmula ou, na alternativa, 2'- O(CH2)2OCH3.
Conforme usado aqui, neste requerimento de patente, o termo "ácido nucléico bicíclico" ou "BNA" ou "nucleosídeo bicíclico" ou "nucleotídeo bicíclico" se refere a um nucleosídeo ou nucleotídeo em que a porção fura- nose do nucleosídeo inclui uma ponte conectando dois átomos de carbono sobre o anel furanose, formando deste modo um sistema de anel bicíclico.
Conforme usado aqui, neste requerimento de patente, a menos que indicado de modo diverso, o termo "metilenoóxi BNA" se refere a β-D- metilenoóxi BNA.
Conforme usado aqui, neste requerimento de patente, o termo "MOE" se refere a um substituinte 2'-metoxietila.
Conforme usado aqui, neste requerimento de patente, o termo "gápmero" se refere a um quiméricos composto oligomérico compreendendo uma região central (um "gap") e uma região sobre qualquer lado da região central (as "asas"), em que o gap compreende no mínimo uma modificação que é diferente daquela de cada asa. As modificações referidas incluem nu- cleobase, ligação monomérica, e modificações de açúcar bem como a au- sência de modificação (não modificado). Portanto, em determinadas modali- dades, as ligações de nucleotídeos em cada uma das asas são diferentes das ligações de nucleotídeos no gap. Em algumas modalidades, cada asa compreende nucleotídeos com modificações de alta afinidade e o gap com- preende nucleotídeos que não compreendem esta modificação. Em algumas modalidades os nucleotídeos no gap e os nucleotídeos nas asas todos com- preendem modificações de alta afinidade, mas as modificações de alta afini- dade no gap são diferentes das modificações de alta afinidade nas asas. Em algumas modalidades, as modificações nas asas são as mesmas que na outra. Em algumas modalidades, as modificações nas asas são diferentes uma da outra. Em algumas modalidades, nucleotídeos no gap são não modi- ficados e nucleotídeos nas asas são modificados. Em algumas modalidades, as modíficação(ções) em cada asa são as mesmas. Em algumas modalida- des, a(s) modificação(ções) em uma asa são diferentes das modifica- ção(ções) na outra asa. Em algumas modalidades, compostos anti-sentido curtos são gápmeros tendo 2'-desoxinucleotídeos no gap e nucleotídeos com modificações de alta afinidade na asa. Conforme usado aqui, neste requerimento de patente, o termo "pró-droga" se refere a um agente terapêutico que é preparado em uma forma inativa que é convertido para uma forma ativa (isto é, fármaco) dentro do corpo ou células do mesmo pela ação de enzimas endógenas ou outros produtos químicos e/ou condições.
Conforme usado aqui, neste requerimento de patente, o termo "sais farmaceuticamente aceitáveis" se refere a sais de compostos ativos que conservam a atividade biológica desejada do composto ativo e não conferem efeitos toxicológicos indesejados aos mesmos.
Conforme usado aqui, neste requerimento de patente, o termo "estrutura de cap" ou "porção de cap terminal" se refere a modificações quí- micas, as quais foram incorporadas em seu término de um composto anti- sentido.
Conforme usado aqui, neste requerimento de patente, o termo "prevenção" se refere a retardar ou impedir o início ou desenvolvimento de uma condição ou doença por um período de tempo de horas a dias, prefe- rencialmente semanas a meses.
Conforme usado aqui, neste requerimento de patente, o termo "melhora" se refere a uma redução de no mínimo um indicador da gravidade de uma condição ou doença. A gravidade dos indicadores pode ser determi- nada por medidas subjetivas ou objetivas as quais são de conhecimento da- queles versados na técnica.
Conforme usado aqui, neste requerimento de patente, o termo "tratamento" se refere a administrar uma composição da invenção para efe- tuar uma alteração ou melhora da doença ou condição. Prevenção, melhora, e/ou tratamento pode requerer a administração de múltiplas doses em inter- valos regulares, ou antes do início da doença ou condição para alterar o cur- so da doença ou condição. Além disso, um único agente pode ser usado em um único indivíduo para cada uma prevenção, melhora, e tratamento de uma condição ou doença seqüencialmente, ou simultaneamente.
Conforme usado aqui, neste requerimento de patente, o termo "agente farmacêutico" se refere a uma substância proporcionando um bene- íício terapêutico quando administrada a um sujeito.
Conforme usado aqui, neste requerimento de patente, o termo "quantidade terapeuticamente eficaz" se refere a uma quantidade de um a- gente farmacêutico que proporciona um benefício terapêutico a um animal.
Conforme usado aqui, neste requerimento de patente, "adminis- trar" significa proporcionar um agente farmacêutico a um animal, e inclui, mas não está limitado a administração por um profissional médico e auto- administração.
Conforme usado aqui, neste requerimento de patente, o termo "co-administração" se refere a administração de dois ou mais agentes far- macêuticos a um animal. Os dois ou mais agentes farmacêuticos podem es- tar em uma única composição farmacêutica, ou podem estar em composi- ções farmacêuticas separadas. Cada um dos dois ou mais agentes farma- cêuticos podem ser administrados através das mesmas ou por diferentes vias de administração. Co-administração engloba administração em paralelo ou seqüencialmente.
Conforme usado aqui, neste requerimento de patente, o termo "composição farmacêutica" se refere a uma mistura de substâncias adequa- das para administração a um indivíduo. Por exemplo, uma composição far- macêutica pode compreender um oligonucleotídeo anti-sentido e uma solu- ção aquosa estérila.
Conforme usado aqui, neste requerimento de patente, o termo "indivíduo" se refere a um ser humano ou animal não-humano selecionado para tratamento ou terapia.
Conforme usado aqui, neste requerimento de patente, o termo "animal" se refere a um ser humano ou animal não-humano, incluindo, mas não limitado a, camundongos, ratos, coelhos, cães, gatos, porcos, e prima- tas não-humanos, incluindo, mas não limitados a, macacos e chimpanzés.
Conforme usado aqui, neste requerimento de patente, o termo "sujeito" se refere a um animal, incluindo, mas não limitado a um ser huma- no, ao qual uma composição farmacêutica é administrada.
Conforme usado aqui, neste requerimento de patente, o termo "duração" se refere ao período de tempo durante o qual uma atividade ou evento continua. Em algumas modalidades, a duração do tratamento é o período de tempo durante o qual doses de um agente farmacêutico são ad- ministradas.
Conforme usado aqui, neste requerimento de patente, o termo "administração parenteral," se refere a administração através de injeção ou infusão. Administração parenteral inclui, mas não está limitada a, administra- ção subcutânea, administração intravenosa, ou administração intramuscular.
Conforme usado aqui, neste requerimento de patente, o termo "administração subcutânea" se refere a administração logo abaixo da pele. "Administração intravenosa" significa administração dentro de uma veia.
Conforme usado aqui, neste requerimento de patente, o termo "dose" se refere a um quantidade especificada de um agente farmacêutico proporcionada em uma única administração. Em algumas modalidades, uma dose pode ser administrada em dois ou mais bolo, comprimidos, ou injeções. Por exemplo, em determinadas modalidades, onde se deseja administração subcutânea, a dose desejada requer um volume não facilmente acomodado por uma única injeção. Em semelhantes modalidades, podem ser usadas duas ou mais injeções para obter a dose desejada. Em algumas modalida- des, uma dose pode ser administrada em duas ou mais injeções para mini- mizar a reação no local da injeção em um indivíduo.
Conforme usado aqui, neste requerimento de patente, o termo "unidade de dosagem" se refere a uma forma na qual um agente farmacêuti- co é proporcionado. Em algumas modalidades, uma unidade de dosagem é um frasco compreendendo oligonucleotídeo anti-sentido liofilizado. Em al- gumas modalidades, uma unidade de dosagem é um frasco compreendendo oligonucleotídeo anti-sentido reconstituído.
Conforme usado aqui, neste requerimento de patente, o termo "agente farmacêutico" se refere a uma substância proporcionando um bene- fício terapêutico quando administrada a um indivíduo. Por exemplo, em de- terminadas modalidades, um oligonucleotídeo anti-sentido é um agente far- macêutico. Conforme usado aqui, neste requerimento de patente, o termo "ingrediente farmacêutico ativo" se refere à substância em uma composição farmacêutica que proporciona um efeito desejado.
Conforme usado aqui, neste requerimento de patente, o termo "quantidade terapeuticamente eficaz" se refere a uma quantidade de um a- gente farmacêutico que proporciona um benefício terapêutico a um indiví- duo. Em algumas modalidades, uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto anti-sentido é quantidade que precisa ser administrada para resultar em um benefício observável.
Conforme usado aqui, neste requerimento de patente, o termo
"hipercolesterolemia" se refere a uma condição caracterizada por colesterol sérico elevado.
Conforme usado aqui, neste requerimento de patente, o termo "hiperlipidemia" se refere a uma condição caracterizada por lipídeos séricos elevados.
Conforme usado aqui, neste requerimento de patente, o termo "hipertrigliceridemia" se refere a uma condição caracterizada por níveis de triglicerídeos elevados.
Conforme usado aqui, neste requerimento de patente, o termo "hipercolesterolemia não-familiar" se refere a uma condição caracterizada por colesterol elevado que não é o resultado de uma única mutação genética hereditária.
Conforme usado aqui, neste requerimento de patente, o termo "hipercolesterolemia poligênica" se refere a uma condição caracterizada por colesterol elevado que resulta da influência de uma variedade de fatores ge- néticos. Em algumas modalidades, a hipercolesterolemia poligênica pode ser exacerbada por consumo dietético de lipídeos.
Conforme usado aqui, neste requerimento de patente, o termo "hipercolesterolemia familiar (FH)" se refere a um distúrbio metabólico auto- sômico dominante caracterizado por uma mutação no gene LDL-receptor (LDL-R), colesterol LDL acentuadamente elevado e inicio prematuro de ate- rosclerose. Um diagnóstico de hipercolesterolemia familiar é feito quando u indivíduo satisfaz um ou mais dos seguintes critérios: teste genético confir- mando 2 genes LDL-receptores mutados; teste genético confirmando um gene LDL-receptor mutado; histórico documentado de colesterol LDL sérico não tratado maior do que 500 mg/dL; xantoma tendinoso e/ou cutâneo antes da idade de 10 anos; ou, ambos os pais tendo colesterol LDL sérico elevado documentado antes de terapia de redução de lipídeo consistente com hiper- colesterolemia familiar heterozigótica.
Conforme usado aqui, neste requerimento de patente, o termo "hipercolesterolemia familiar homozigótica" ou "HoFH" se refere a uma con- dição caracterizada por uma mutação tanto no gene LDL-R materno quanto paterno.
Conforme usado aqui, neste requerimento de patente, o termo "hipercolesterolemia familiar heterozigótica" ou "HeFH" se refere a uma con- dição caracterizada por uma mutação ou no gene LDL-R materno ou pater- no.
Conforme usado aqui, neste requerimento de patente, o termo "dislipidemia mista" se refere a uma condição caracterizada por colesterol sérico elevado e triglicerídeos séricos elevados.
Conforme usado aqui, neste requerimento de patente, o termo "dislipidemia diabética" ou "diabetes Tipo Il com dislipidemia" se refere a uma condição caracterizada por diabetes Tipo II, colesterol HDL reduzido, triglicerídeos séricos elevados, e densas partículas de LDL pequenas eleva- das.
Conforme usado aqui, neste requerimento de patente, o termo "equivalentes de risco de doença cardíaca coronária," se refere a indicado- res de doença clínica aterosclerótica que conferem um alto risco para doen- ça cardíaca coronária. Por exemplo, em determinadas modalidades, equiva- lentes de risco de doença cardíaca coronária incluem, sem limitação, doença cardíaca coronária clínica, doença da artéria carótida sintomática, doença arterial periférica, e/ou aneurisma aórtico abdominal.
Conforme usado aqui, neste requerimento de patente, o termo "doença de fígado gorduroso não-alcoólico (DFGNA)" se refere a uma con- dição caracterizada por inflamação gordurosa do fígado que não é devida a uso excessivo de álcool (por exemplo, consumo de álcool acima de 20 g/dia). Em algumas modalidades, doença de fígado gorduroso não-alcoólico está relacionada com resistência à insulina e a síndrome metabólica.
Conforme usado aqui, neste requerimento de patente, o termo "esteatohepatite não-alcoólica (EHNA)" se refere a uma condição caracteri- zada por inflamação e o acúmulo de gordura e tecido fibroso no fígado, que não é devida a uso excessivo de álcool. Esteatohepatite não-alcoólica é uma forma extrema de doença de fígado gorduroso não-alcoólico. Conforme usado aqui, neste requerimento de patente, o termo "fatores de risco principais" se refere a fatores que contribuem para um alto risco para uma doença ou condição em particular. Em algumas modalidades, fatores de risco principais para doença cardíaca coronária incluem, sem limi- tação, fumar cigarro, hipertensão, baixo colesterol HDL, histórico familiar de doença cardíaca coronária, e idade.
Conforme usado aqui, neste requerimento de patente, o termo "fatores de risco de doença cardíaca coronária" se refere a fatores de risco principais e equivalentes de risco de doença cardíaca coronária.
Conforme usado aqui, neste requerimento de patente, o termo "doença cardíaca coronária (DCC)" se refere a um estreitamento de vasos sangüíneos pequenos que fornecem sangue e oxigênio ao coração, o qual é freqüentemente uma conseqüência de aterosclerose.
Conforme usado aqui, neste requerimento de patente, o termo "risco reduzido de doença cardíaca coronária" se refere a uma redução na probabilidade de que um indivíduo venha a desenvolver doença cardíaca coronária. Em algumas modalidades, uma redução no risco de doença car- díaca coronária é medida por uma melhora em um ou mais fatores de risco de doença cardíaca coronária, por exemplo, uma redução nos níveis de co- lesterol LDL.
Conforme usado aqui, neste requerimento de patente, o termo "aterosclerose" se refere a um endurecimento das artérias afetando artérias de tamanho grande e médio e se caracteriza pela presença de depósitos de gordura. Os depósitos de gordura são denominados "ateromas" ou "placas," os quais consistem essencialmente de colesterol e outras gorduras, cálcio e tecido de cicatrização, e prejudicam o revestimento das artérias.
Conforme usado aqui, neste requerimento de patente, o termo "histórico de doença cardíaca coronária" se refere à ocorrência de doença cardíaca coronária clinicamente evidente no histórico médico de um indiví- duo ou de um membro da família do indivíduo.
Conforme usado aqui, neste requerimento de patente, o termo "doença cardíaca coronária de início precoce" se refere a um diagnóstico de doença cardíaca coronária antes da idade de 50.
Conforme usado aqui, neste requerimento de patente, o termo "indivíduo intolerante à estatina" se refere a um indivíduo o qual em conse- qüência da terapia de estatina experimenta um ou mais entre aumentos da creatina quinase, anormalidades de teste da função hepática, dores muscu- lares, ou efeitos colaterais do sistema nervoso central.
Conforme usado aqui, neste requerimento de patente, o termo "eficácia" se refere à capacidade para produzir um efeito desejado. Por e- xemplo, eficácia de uma terapia de redução de lipídeo pode ser redução na concentração de um ou mais de colesterol LDL, colesterol VLDL, colesterol IDL, colesterol não HDL, ApoB, lipoproteína(a), ou triglicerídeos.
Conforme usado aqui, neste requerimento de patente, o termo "perfila de segurança aceitável" se refere a um padrão de efeitos colaterais que está dentro de limites clinicamente aceitáveis.
Conforme usado aqui, neste requerimento de patente, o termo "efeitos colaterais" se refere a reações fisiológicas atribuíveis a um tratamen- to diferentes de efeitos desejados. Em algumas modalidades, efeitos colate- rais incluem, sem limitação, reações no local da injeção, anormalidades do teste de função hepática, anormalidades da função renal, toxicidade hepáti- ca, toxicidade renal, anormalidades do sistema nervoso central, e miopatias. Por exemplo, aumento dos níveis séricos de aminotransferase podem indicar toxicidade hepática ou anormalidade da função hepática. Por exemplo, au- mento da bilirrubina pode indicar toxicidade hepática ou anormalidade da função hepática.
Conforme usado aqui, neste requerimento de patente, o termo "reação no local da injeção" se refere a inflamação ou vermelhidão anormal da pele em um local de injeção em um indivíduo.
Conforme usado aqui, neste requerimento de patente, o termo "aceitação individual" se refere a aderência a uma terapia recomendada ou prescrita por um indivíduo.
Conforme usado aqui, neste requerimento de patente, o termo "terapia de redução de lipídeos" se refere a um regime terapêutico propor- cionado a um indivíduo para reduzir um ou mais lipídeos em um indivíduo. Em algumas modalidades, uma terapia de redução de lipídeo é proporciona- da para reduzir um ou mais de ApoB, colesterol total, colesterol LDL, coles- terol VLDL, colesterol IDL, colesterol não HDL, triglicerídeos, partículas de LDL densas pequenas, e Lp(a) em um indivíduo.
Conforme usado aqui, neste requerimento de patente, o termo "agente de redução de lipídeos" se refere a um agente farmacêutico propor- cionado a um indivíduo para obter uma redução de lipídeos no indivíduo. Por exemplo, em determinadas modalidades, um agente de redução de lipídeo é proporcionado a um indivíduo para reduzir um ou mais de ApoB1 colesterol LDL, colesterol total, e triglicerídeos.
Conforme usado aqui, neste requerimento de patente, o termo "colesterol LDL alvo" se refere a um nível de colesterol LDL que é desejado depois de terapia de redução de lipídeo.
Conforme usado aqui, neste requerimento de patente, o termo "aceitar" se refere à aderência a uma terapia recomendada por um indivíduo.
Conforme usado aqui, neste requerimento de patente, o termo "terapia recomendada" se refere a um regime terapêutico recomendado por um profissional médico para o tratamento, a melhora, ou prevenção de uma doença.
Conforme usado aqui, neste requerimento de patente, o termo "baixa atividade de LDL-receptor" se refere a atividade de LDL-receptor que não é suficientemente elevado para manter níveis clinicamente aceitáveis de colesterol LDL na corrente sangüínea.
Conforme usado aqui, neste requerimento de patente, o termo "resultado cardiovascular" se refere à ocorrência de eventos cardiovascula- res adversos importantes.
Conforme usado aqui, neste requerimento de patente, o termo "resultado cardiovascular aprimorado" se refere a uma redução na ocorrên- cia de eventos cardiovasculares adversos importantes, ou o risco dos mes- mos. Exemplos de eventos cardiovasculares adversos importantes incluem, sem limitação, morte, reenfarte, derrame, choque cardiogênico, edema pul- monar, parada cardíaca, e disritmia atrial.
Conforme usado aqui, neste requerimento de patente, o termo "marcadores substitutos do resultado cardiovascular" se refere a indicadores indiretos de eventos cardiovasculares, ou o risco dos mesmos. Por exemplo, marcadores substitutos do resultado cardiovascular incluem espessura mé- dia da íntima da carótida (N.T.: em inglês, CIMT). Outro exemplo de um marcador substituto do resultado cardiovascular inclui tamanho do ateroma. O tamanho do ateroma pode ser determinado por ultra-som intravascular.
Conforme usado aqui, neste requerimento de patente, o termo "colesterol HDL aumentado" se refere a um aumento no colesterol HDL séri- co em um indivíduo com o tempo.
Conforme usado aqui, neste requerimento de patente, o termo "redução de lipídeos" se refere a uma redução em um ou mais lipídeos séri- cos em um indivíduo com o tempo.
Conforme usado aqui, neste requerimento de patente, o termo "distúrbio metabólico" se refere a uma condição caracterizada por uma alte- ração ou distúrbio na função metabólica. "Metabólico" e "metabolismo" são termos de conhecimento geral na técnica e incluem de modo geral toda a faixa de processos bioquímicos que ocorrem dentro de um organismo vivo. Distúrbios metabólicos incluem, mas não estão limitados a, hiperglicemia, pré-diabetes, diabetes (tipo I e tipo II), obesidade, resistência à insulina e síndrome metabólica.
Conforme usado aqui, neste requerimento de patente, o termo "síndrome metabólica" se refere a um conjunto de fatores de risco cardio- vascular lipídicos e não-lipídicos de origem metabólica. Tem sido intimamen- te ligado ao distúrbio metabólico generalizado conhecido como resistência à insulina. O Terceiro Painel de Tratamento de Adultos do Programa Nacional de Edução sobre Cclesterol dos Estados Unidos [National Cholesterol Edu- cation Program (NCEP) Adult Treatment Panei Ill (ATPIII)] estabeleceu crité- rios para diagnóstico de síndrome metabólica quando três ou mais de cinco determinantes de risco estão presentes. Os cinco determinantes de risco são obesidade abdominal definida como circunferência da cintura de mais de 102 cm para homens ou mais de 88 cm para mulheres, níveis de triglicerí- deos maiores do que ou iguais a 150 mg/dL, níveis de colesterol HDL de menos de 40 mg/dL para homens e menos de 50 mg/dL para mulheres, pressão sangüínea maior do que ou igual a 130/85 mm Hg e níveis de glico- se em jejum maiores do que ou iguais a 110 mg/dL. Estes determinantes podem ser prontamente medidos na prática clínica (JAMA, 2001, 285: 2486- 2497).
O termo "alquila," conforme usado aqui, neste requerimento de patente, se refere a um radical hidrocarboneto reto ou ramificado saturado contendo até vinte e quatro átomos de carbono. Exemplos de grupamentos alquila incluem, mas não estão limitados a, metila, etila, propila, butila, iso- propila, n-hexila, octila, decila, dodecila e semelhantes. Grupamentos alquila tipicamente incluem a partir de 1 até cerca de 24 átomos de carbono, more tipicamente a partir de 1 até cerca de 12 átomos de carbono (C1-C12 alquila) com a partir de 1 até cerca de 6 átomos de carbono sendo mais preferencial.
O termo "alquila inferior" conforme usado aqui, neste requerimento de paten- te, inclui a partir de 1 até cerca de 6 átomos de carbono. Grupamentos alqui- la conforme usado aqui, neste requerimento de patente, podem incluir op- cionalmente um ou mais grupamentos substituintes adicionais.
O termo "alquenila," conforme usado aqui, neste requerimento de patente, se refere a um radical de cadeia hidrocarboneto reta ou ramifica- da contendo até vinte e quatro átomos de carbono e tendo no mínimo uma ligação dupla carbono-carbono. Exemplos de grupamentos alquenila inclu- em, mas não estão limitados a, etenila, propenila, butenila, 1-metila-2-buten- .1-ila, dienos tais como 1,3-butadieno e semelhantes. Grupamentos alquenila tipicamente incluem a partir de 2 até cerca de 24 átomos de carbono, mais tipicamente a partir de 2 até cerca de 12 átomos de carbono com a partir de .2 até cerca de 6 átomos de carbono sendo mais preferencial. Grupamentos alquenila conforme usado aqui, neste requerimento de patente, pode incluir opcionalmente um ou mais grupamentos substituintes adicionais.
O termo "alquinila," conforme usado aqui, neste requerimento de patente, se refere a um radical hidrocarboneto reto ou ramificado contendo até vinte e quatro átomos de carbono e tendo no mínimo uma ligação tripla carbono-carbono. Exemplos de grupamentos alquinila incluem, mas não es- tão limitados a, etinila, 1-propinila, 1-butinila, e semelhantes. Grupamentos alquinila tipicamente incluem a partir de 2 até cerca de 24 átomos de carbo- no, mais tipicamente a partir de 2 até cerca de 12 átomos de carbono com a partir de 2 até cerca de 6 átomos de carbono sendo mais preferencial. Gru- pamentos alquinila conforme usado aqui, neste requerimento de patente, pode incluir opcionalmente um ou mais grupamentos substituintes adicio- nais.
O termo "aminoalquila" conforme usado aqui, neste requerimen- to de patente, se refere a um radical alquila substituída com amino. Este termo pretende incluir grupamentos C1-C12 alquila tendo um substituinte a- mino em qualquer posição e em que o grupo alquila fixa o grupo aminoalqui- la à molécula precursora. As porções alquila e/ou amino do grupo aminoal- quila podem ser adicionalmente substituídas com grupamentos substituintes.
O termo "alifático," conforme usado aqui, neste requerimento de patente, se refere a um radical hidrocarboneto reto ou ramificado contendo até vinte e quatro átomos de carbono em que a saturação entre quaisquer dois átomos de carbono é uma ligação única, dupla ou tripla. Um grupo alifá- tico preferencialmente contém a partir de 1 a cerca de 24 átomos de carbo- no, mais tipicamente a partir de 1 a cerca de 12 átomos de carbono com a partir de 1 a cerca de 6 átomos de carbono sendo mais preferencial. A ca- deia reta ou ramificada de um grupo alifático pode ser interrompida com um ou mais heteroátomos que incluem nitrogênio, oxigênio, enxofre e fósforo. Os grupamentos alifáticos referidos interrompidos por heteroátomos incluem sem limitação polialcóxis, tais como polialquileno glicóis, poliaminas, e polii- minas. Grupamentos alifáticos conforme usado aqui, neste requerimento de patente, pode incluir opcionalmente grupamentos substituintes adicionais.
O termo "alicíclico" ou "aliciclila" se refere a um sistema de anel cíclico em que o anel é alifático. O sistema de anel pode compreender um ou mais anéis em que no mínimo um anel é alifático. Alicíclicos preferenciais incluem anéis tendo a partir de cerca de 5 a cerca de 9 átomos de carbono no anel. Alicíclico conforme usado aqui, neste requerimento de patente, po- de incluir opcionalmente grupamentos substituintes adicionais.
O termo "alcóxi," conforme usado aqui, neste requerimento de patente, se refere a um radical formado entre um grupo alquila e um átomo de oxigênio em que o átomo de oxigênio é usado para fixar o grupo alcóxi a uma molécula precursora. Exemplos de grupamentos alcóxi incluem, mas não estão limitados a, metóxi, etóxi, propóxi, isopropóxi, />butóxi, sec-butóxi, terc-butóxi, n-pentóxi, neopentóxi, n-hexóxi e semelhantes. Grupamentos alcóxi conforme usado aqui, neste requerimento de patente, pode incluir op- cionalmente grupamentos substituintes adicionais.
Os termos "halo" e "halogeno," conforme usado aqui, neste re- querimento de patente, se referem a um átomo selecionado entre flúor, clo- ro, bromo e iodo.
Os termos "arila" e "aromático," conforme usado aqui, neste re- querimento de patente, se referem a alguns radicais de sistema de anel car- bocíclico mono- ou policíclico tendo um ou mais anéis aromáticos. Exemplos de grupamentos arila incluem, mas não estão limitados a, fenila, naftila, te- traidronaftila, indanila, idenila e semelhantes. Sistemas de anéis arila prefe- renciais têm de cerca de 5 a cerca de 20 átomos de carbono em um ou mais anéis. Grupamentos arila conforme usado aqui, neste requerimento de pa- tente, pode incluir opcionalmente grupamentos substituintes adicionais.
Os termos "aralquila" e "arilalquila," conforme usado aqui, neste requerimento de patente, se referem a um radical formado entre um grupo alquila e um grupo arila em que o grupo alquila é usado para fixar o grupo aralquila a uma molécula precursora. Exemplos incluem, mas não estão limi- tados a, benzila, fenetila e semelhantes. Grupamentos aralquila conforme usado aqui, neste requerimento de patente, pode incluir opcionalmente gru- pamentos substituintes adicionais fixados aos grupamentos alquila, o arila ou ambos que formam o grupo radical.
O termo "radical heterocíclico" conforme usado aqui, neste re- querimento de patente, se refere a um sistema de anéis mono-, ou policícli- cos radical que inclui no mínimo um heteroátomo e é insaturado, parcialmen- te saturado ou totalmente saturado, deste modo incluindo grupamentos hete- roarila. Heterocíclico também pretende incluir sistemas de anéis fundidos em que um ou mais dos anéis fundidos contêm no mínimo um heteroátomo e os outros anéis podem conter um ou mais heteroátomos ou opcionalmente não contêm heteroátomos. Um grupo heterocíclico tipicamente inclui no mínimo um átomo selecionado entre enxofre, nitrogênio ou oxigênio. Exemplos de grupamentos heterocíclico incluem, [1,3]dioxolano, pirrolidinila, pirazolinila, pirazolidinila, imidazolinila, imidazolidinila, piperidinila, piperazinila, oxazolidi- nila, isoxazolidinila, morfolinila, tiazolidinila, isotiazolidinila, quinoxalinila, piri- dazinonila, tetrahidrofurila e semelhantes. Grupamentos heterocíclicos con- forme usado aqui, neste requerimento de patente, pode incluir opcionalmen- te grupamentos substituintes adicionais.
Os termos "heteroarila" e "heteroaromático," conforme usado aqui, neste requerimento de patente, se referem a um radical compreenden- do um anel aromático mono- ou poli-cíclico, sistema de anéis ou sistema de anéis fundidos em que no mínimo um dos anéis é aromático e inclui um ou mais heteroátomos. Heteroarila também pretende incluir sistemas de anéis fundidos incluindo sistemas onde um ou mais dos anéis fundidos não con- têm heteroátomos. Grupamentos heteroarila tipicamente incluem um átomo do anel selecionado entre enxofre, nitrogênio ou oxigênio. Exemplos de gru- pamentos heteroarila incluem, mas não estão limitados a, piridinila, pirazini- la, pirimidinila, pirrolila, pirazolila, imidazolila, tiazolila, oxazolila, isooxazolila, tiadiazolila, oxadiazolila, tiofenila, furanila, quinolinila, isoquinolinila, benzimi- dazolila, benzooxazolila, quinoxalinila, e semelhantes. Radicais heteroarila podem ser fixados a uma molécula precursora diretamente ou através de uma porção de ligação tal como um grupo alifático ou heteroátomo. Grupa- mentos heteroarila conforme usado aqui, neste requerimento de patente, pode incluir opcionalmente grupamentos substituintes adicionais.
O termo "heteroarilalquila" conforme usado aqui, neste requeri- mento de patente, se refere a um grupo heteroarila conforme previamente definido tendo um radical alquila que pode fixar o grupo heteroarilalquila a uma molécula precursora. Exemplos incluem, mas não estão limitados a, piridinilmetila, pirimidiniletila, naptiridinilpropila e semelhantes. Grupamentos heteroarilalquila conforme usado aqui, neste requerimento de patente, pode incluir opcionalmente grupamentos substituintes adicionais sobre uma ou ambas das porções heteroarila ou alquila.
O termo "estrutura mono- ou poli cíclica" conforme usado na presente invenção inclui todos os sistemas de anéis que são únicos ou poli- cíclicos tendo anéis que são fundidos ou ligados e pretende ser inclusivo de sistemas de anel único e mistos selecionados individualmente entre alifático, alicíclico, arila, heteroarila, aralquila, arilalquila, heterocíclico, heteroarila, heteroaromático, heteroarilalquila. As estruturas mono- e policíclicas referi- das podem conter anéis que são uniformes ou têm graus variáveis de satu- ração incluindo totalmente saturados, parcialmente saturados ou totalmente insaturados. Cada anel pode compreender átomos do anel selecionados en- tre C, N, O e S para dar origem a anéis heterocíclicos bem como anéis com- preendendo somente átomos do anel de C os quais podem estar presentes em um motivo misto tal como, por exemplo, benzimidazol em que um anel tem somente átomos do anel de carbono e o anel fundido tem dois átomos de nitrogênio. As estruturas mono- e policíclicas podem ser adicionalmente substituídas com grupamentos substituintes tais como, por exemplo, ftalimi- da o qual tem dois grupamentos =O fixados a um dos anéis. Em outro as- pecto, estruturas mono- e policíclicas podem ser fixadas a uma molécula precursora diretamente através de um átomo do anel, através de um grupo substituinte ou uma porção de ligação bifuncional. O termo "acila," conforme usado aqui, neste requerimento de patente, se refere a um radical formado por remoção de um grupo oxidrila de um ácido orgânico e tem a fórmula geral -C(O)-X onde X é tipicamente alifá- tico, alicíclico ou aromático. Exemplos incluem carbonilas alifáticas, carboni- Ias aromáticas, sulfonilas alifáticas, sulfinilas aromáticas, sulfinilas alifáticas, fosfatos aromáticos, fosfatos alifáticos e semelhantes. Grupamentos acila conforme usado aqui, neste requerimento de patente, pode incluir opcional- mente grupamentos substituintes adicionais.
O termo "hidrocarbila" inclui grupamentos compreendendo C, O e H. São incluídos grupamentos retos, ramificados e cíclicos tendo qualquer grau de saturação. Os grupamentos hidrocarbila referidos podem incluir um ou mais heteroátomos selecionados entre N, O e S e podem ser adicional- mente mono- ou polissubstituídos com um ou mais grupamentos substituin- tes.
Os termos "substituinte" e "grupo substituinte" conforme usado aqui, neste requerimento de patente, incluem grupamentos que são tipica- mente adicionados a outros grupamentos ou compostos precursores para reforçar propriedades desejadas ou dar efeitos desejados. Grupamentos substituintes podem ser protegidos ou não protegidos e podem ser adiciona- dos a um sítio disponível ou a muitos sítios disponíveis em um composto precursor. Grupamentos substituintes também podem ser adicionalmente substituídos com outros grupamentos substituintes e podem ser fixados dire- tamente ou através de um grupo de ligação tal como um grupo alquila ou hidrocarbila a um composto precursor. Os grupamentos referidos incluem sem limitação halogeno, oxidrila, alquila, alquenila, alquinila, acila (- C(O)Raa), carboxila (-C(O)O-Raa), grupamentos alifáticos, grupamentos alicí- clicos, alcóxi, oxo (-O-Raa) substituído, arila, aralquila, heterocíclico, heteroa- rila, heteroarilalquila, amino (-NRbbRcc), imino (=NRbb), amido (-C(O)NRbbRcc ou -N(Rbb)C(O)Raa), azido (-N3), nitro (-NO2), ciano (-CN), carbamido (-OC(O)NRbbRcc ou -N(Rbb)C(O)ORaa), ureído (-N(Rbb)C(O)NRbbRcc), tioureí- do (-N(Rbb)C(S)NRbbRcc), guanidinila (-N(Rbb)C(=NRbb)NRbbRcc), amidinila (- C(=NRbb)NRbbRcc ou -N(Rbb)C(NRbb)Raa), tiol (-SRbb), sulfinila (-S(O)Rbb), sulfonila (-S(O)2Rbb), sulfonamidila (-S(O)2NRbbRcc ou -N(Rbb)S(O)2Rbb) e grupamentos conjugados. Em que cada Raa, Rbb e Rcc é, independentemen- te, H, um grupo químico funcional opcionalmente ligado ou um grupo substi- tuinte adicional com uma lista preferencial incluindo sem limitação H, alquila, alquenila, alquinila, alifático, alcóxi, acila, arila, aralquila, heteroarila, alicícli- co, heterocíclico e heteroarilalquila. B. Alguns Compostos Oliqoméricos
Em algumas modalidades, é desejável modificar quimicamente compostos oligoméricos, comparados com oligômeros que ocorrem natural- mente, tais como DNA ou RNA. Algumas das modificações referidas alteram a atividade do composto oligomérico. Algumas das modificações químicas referidas podem alterar a atividade, por exemplo: aumentando a atividade de um composto anti-sentido por seu ácido nucléico alvo, aumentando sua re- sistência à uma ou mais nucleases, e/ou alterando a farmacocinética ou dis- tribuição tecidual do composto oligomérico. Em alguns casos, o uso de quí- micas que aumentarm a afinidade de um composto oligomérico por seu alvo pode possibilitar o uso de compostos oligoméricos mais curtos.
1. Alguns Monômeros Em determinada modalidade, compostos oligoméricos compre- endem um ou mais monômeros modificados. Em algumas modalidades refe- ridas, compostos oligoméricos compreendem um ou mais monômeross de alta afinidade. Em algumas modalidades, o monômero de alta afinidade refe- rido é selecionado entre monômeros (por exemplo, nucleosídeos e nucleotí- deos) compreendendo açúcares 2'-modificados, incluindo, mas não limitados a: BNA's e monômeros (por exemplo, nucleosídeos e nucleotídeos) com 2'- substituintes tais como alila, amino, azido, tio, O-alila, O-C1-Ci0 alquila, - OCF3, O-(CH2)2-O-CH3, 2'-0(CH2)2SCH3, O-(CH2)2-O-N(Rm)(Rn), ou O-CH2- C(=0)-N(Rm)(Rn), onde cada Rm e Rn é, independentemente, H ou C1-Ci0 alquila substituída ou não-substituída.
Em algumas modalidades, os compostos oligoméricos incluindo, mas não limitados à compostos anti-sentido curtos da presente invenção, compreendem um ou mais monômeros de alta afinidade contanto que o composto oligomérico não compreenda um nucleotídeo compreendendo um 2'-0(CH2)nH, em que η é um a seis.
Em algumas modalidades, os compostos oligoméricos incluindo, mas não limitados à compostos anti-sentido curtos da presente invenção, compreendem um ou mais de alta afinidade contanto que o composto oligo- mérico não compreenda um nucleotídeo compreendendo um 2'-OCH3 ou um 2'-0(CH2)20CH3.
Em algumas modalidades, os compostos oligoméricos incluindo, mas não limitados à compostos anti-sentido curtos da presente invenção, compreendem um ou mais de alta afinidade contanto que o composto oligo- mérico não compreenda um α-L-Metilenoóxi (4'-CH2-0-2') BNA.
Em algumas modalidades, os compostos oligoméricos incluindo, mas não limitados à compostos anti-sentido curtos da presente invenção, compreendem um ou mais de alta afinidade contanto que o composto oligo- mérico não compreenda um β-D-Metilenoóxi (4'-CH2-0-2') BNA.
Em algumas modalidades, os compostos oligoméricos incluindo, mas não limitados à compostos anti-sentido curtos da presente invenção, compreendem um ou mais de alta afinidade contanto que o composto oligo- mérico não compreenda um α-L-Metilenoóxi (4'-CH2-0-2') BNA ou um β-D- Metilenoóxi (4'-CH2-0-2') BNA. a. Algumas Nucleobases
A porção base que ocorre naturalmente de um nucleosídeo é tipicamente uma base heterocíclica. As duas classes mais comuns de seme- lhantes bases heterocíclicas são as purinas e as pirimidinas. Para os nucle- osídeos que incluem um açúcar pentofuranosila, um grupo fosfato pode ser ligado à porção 2', 3' ou 5' oxidrila do açúcar. Ao formar oligonucleotídeos, os grupamentos fosfato ligam de modo covalente nucleosídeos adjacentes uns aos outros para formar um composto polimérico linear. Dentro de oligo- nucleotídeos, os grupamentos fosfato são referidos comumente como for- mando a espinha dorsal internucleotídeo do oligonucleotídeo. A ligação que ocorre naturalmente ou espinha dorsal de RNA e de DNA é uma ligação fos- fodiéster 3' a 5'. Além de nucleobases "não modificadas" ou "naturais" tais como as nucleobases de purina adenina (A) e guanina (G), e as nucleobases de pirimidina timina (T), citosina (C) e uracila (U), muitas nucleobases modifica- das ou miméticos de nucleobase de conhecimento daqueles versados na técnica são receptivas com os compostos descritos aqui, neste requerimento de patente. Em algumas modalidades, uma nucleobase modificada é uma nucleobase que é bastante similar em estrutura à nucleobase precursora, tal como por exemplo uma 7-deaza purina, uma 5-metila citosina, ou um G- clamp. Em algumas modalidades, mimético de nucleobase inclui estruturas mais complicadas, tais como, por exemplo, um mimético de nucleobase de fenoxazina tricíclica. Métodos para preparação das nucleobases modificadas mencionadas acima são de conhecimento geral daqueles versados na técni- ca. b. Alguns Açúcares
Compostos oligoméricos proporcionados aqui, neste requeri-
mento de patente, podem compreender um ou mais monômeros, incluindo um nucleosídeo ou nucleotídeo, tendo uma porção açúcar modificada. Por exemplo, o anel de açúcar furanosila de um nucleosídeo pode ser modifica- do em uma série de modos incluindo, mas não limitados a, adição de um grupo substituinte, ligação de dois átomos de anel não-geminal para formar um ácido nucléico bicíclico (BNA).
dem um ou mais monômeros que é um BNA. Em algumas modalidades refe- ridas, BNAs incluem, mas não estão limitados a, (A) α-L-Metilenoóxi (4'-CH2- 0-2') BNA1 (B) β-D-Metilenoóxi (4'-CH2-0-2') BNA, (C) Etilenoóxi (4'-(CH2)2- 0-2') BNA, (D) Aminoóxi (4'-CH2-0-N(R)-2') BNA e (E) Oxiamino (4'-CH2- N(R)-0-2') BNA, conforme representado na Figura 1.
Em algumas modalidades, compostos oligoméricos compreen-
<formula>formula see original document page 36</formula>
Figura 1. Algumas Estruturas de BNA
Em algumas modalidades, compostos de BNA incluem, mas não estão limitados a, compostos tendo no mínimo uma ponte entre a posição 4' e a 2' do açúcar em que cada uma dsa pontes independentemente compre- ende 1 ou de 2 a 4 grupamentos ligados independentemente selecionados entre -[C(R1)(R2)In-, -C(R1)=C(R2)-, -C(Ri)=N-, -Ci=NR1)-, -C(=0)-, -C(=S)-, - O-, -Si(R1)2-, -S(=0)x- e -N(R1)-; em que: χ é O, 1, ou 2; η é 1, 2, 3, ou 4;
cada R1 e R2 é, independentemente, H, um grupo protetor, oxidrila, C1-C12 alquila, C1-C12 alquila substituída, C2-C12 alquenila, C2-C12 alquenila substitu- ída, C2-C12 alquinila, C2-C12 alquinila substituída, C5-C20 arila, C5-C20 arila substituída, radical heterociclo, radical heterociclo substituído, heteroarila, heteroarila substituído, radical C5-C7 alicíclico, radical C5-C7 alicíclico substi- tuído, halogeno, OJ1, NJ1J2, SJ1, N3, COOJi, acila (C(=0)-H), acila substituí- da, CN, sulfonila (Si=O)2-J1), ou sulfoxila (Si=O)-J1); e cada J1 e J2 é, independentemente, H, Ci-Ci2 alquila, C1-C12 alquila substitu- ída, C2-Ci2 alquenila, C2-C12 alquenila substituída, C2-Ci2 alquinila, C2-C12 alquinila substituída, C5-C20 arila, C5-C20 arila substituída, acila (C(=0)-H), acila substituída, um radical heterociclo, um radical heterociclo substituído, C1-C12 aminoalquila, C1-Ci2 aminoalquila substituída ou um grupo protetor.
Em uma modalidade, cada uma das pontes dos compostos de BNA é, independentemente, -[C(R1)(R2)Jn-, -[C(Ri)(R2)Jn-O-, -C(R1R2)-N(R1)- O- ou -C(R1R2)-O-N(R1)-. Em outra modalidade, cada uma das referidas pontes é, independentemente, 4'-CH2-2', 4'-(CH2)2-2', 4,-(CH2)3-2', 4'-CH2-0- .2', 4'-(CH2)2-0-2', 4'-CH2-0-N(R1)-2' e 4'-CH2-N(R1)-0-2'- em que cada R1 é, independentemente, H, um grupo protetor ou Ci-C12 alquila.
Alguns BNA's foram preparados e revelados na literatura de pa- tente bem como em literatura científica (Singh et al., Chem. Commun., 1998, .4, 455-456; Koshkin et al., Tetrahedron, 1998, 54, 3607-3630; Wahlestedt et al., Proc. Natl. Acad. Sei. U. S. A., 2000, 97, 5633-5638; Kumar et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 1998, 8, 2219-2222; patente internacional Ng WO .94/14226; patente internacional N5 WO 2005/021570; Singh et al., J. Org. Chem., 1998, 63, 10035-10039; Exemplos de patentes dos Estados Unidos emitidas e requerimentos publicados que revelam BNAs incluem, por exem- plo, as Patentes dos Estados Unidos Nos. 7.053.207; 6.268.490; 6.770.748; 6.794.499; 7.034.133; e 6.525.191; e a Publicação Pré-Concessão de Paten- te dos Estados Unidos Nos. 2004-0171570; 2004-0219565; 2004-0014959; 2003-0207841; 2004-0143114; e 20030082807.
Também são proporcionados aqui, neste requerimento de paten- te, BNAs nos quais o grupo 2'-hidroxila do anel de açúcar ribosila é ligado ao átomo de carbono 4' do anel de açúcar deste modo formando uma ligação metilenoóxi (4'-CH2-0-2') para formar a porção açúcar bicíclica (revisada em Elayadi et ai., Curr. Opinion Invens. Drugs, 2001, 2, 558-561; Braasch et al., Chem. Bioi., 2001, 8 1-7; e Orum et ai., Curr. Opinion MoL Ther., 2001, 3, 239-243; vide também as Patentes dos Estados Unidos: N2s 6.268.490 e 6.670.461). A ligação pode ser um grupo metileno (-CH2-) ligado o átomo de oxigênio 2' e o átomo de carbono 4', para o qual o termo metilenoóxi (4'-CH2- 0-2') BNA é usado para a porção bicíclica; no caso de um grupo etileno nes- ta posição, é usado o termo etilenoóxi (4'-CH2CH2-0-2') BNA (Singh et al., Chem. Commun., 1998, 4, 455-456: Morita et al., Bioorganic Medicinal Che- mistry, 2003, 11, 2211-2226). Metilenoóxi (4'-CH2-0-2') BNA e outros análo- gos de açúcares bicíclicos apresentam estabilidades térmicas dúplex muito elevadas com DNA e RNA complementares (Tm = +3 a +10e C), estabilidade para degradação 3'-exonucleolítica e boas propriedades de solubilidade. Fo- ram descritos oligonucleotídeos anti-sentido potentes e não tóxicos compre- endendo BNAs (Wahlestedt et al., Proc. NatL Acad. Sei. U. S. A, 2000, 97, 5633-5638).
Um isômero de metilenoóxi (4'-CH2-0-2') BNA que também foi discutido é alfa-L- metilenoóxi (4'-CH2-0-2') BNA o qual se mostrou que tem estabilidade superior contra uma 3'-exonuclease. Os alfa-L- metilenoóxi (4'- CH2-0-2') BNA's foram incorporados em gápmeros anti-sentido e quimeras que apresentaram potente atividade anti-sentido (Frieden et al., Nucleic A- cids Research, 2003, 21, 6365-6372).
A síntese e a preparação de monômeros de metilenoóxi (4'-CH2- O-2') BNA adenina, citosina, guanina, 5-metila-citosina, timina e uracila, jun- to com sua oligomerização, e propriedades de reconhecimento de ácido nu- cléico foram descritas (Koshkin et al., Tetrahedron, 1998, 54, 3607-3630). BNAs e preparação dos mesmos também estão descritos na patente inter- nacional Ns WO 98/39352 e na patente internacional Ng WO 99/14226.
Também foram preparados análogos de metilenoóxi (4'-CH2-0-2') BNA1 fosforotioato- metilenoóxi (4'-CH2-0-2') BNA e 2'-tio-BNAs (Kumar et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 1998, 8, 2219-2222). A preparação de aná- logos de nucleosídeos entrelaçados compreendendo dúplices oligodesoxirri- bonucleotídicos como substratos para ácido nucléico polimerases também foi descrita (Wengel et al., WO 99/14226). Além disso, a síntese de 2'-amino- BNA, um novo análogo de oligonucleotídeo de alta afinidade restrito confor- macionalmente foi descrita na técnica (Singh et al., J. Org. Chem., 1998, 63,10035-10039). Além disso, 2'-Amino- e 2'-metilamino-BNA's foram prepara- dos e a estabilidade térmica de seus dúplices com filamentos de RNA e DNA complementares foi previamente reportada.
Porções açúcares modificados são de conhecimento geral e po- dem ser usadas para alterar, tipicamente aumentar, a afinidade do composto anti-sentido por seu alvo e/ou aumentar a resistência à nuclease. Uma lista típica de açúcares modificados preferenciais inclui mas não está limitada a açúcares modificados bicíclicos (BNA's), incluindo metilenoóxi (4'-CH2-0-2') BNA e etilenoóxi (ponte 4'-(CH2)2-0-2') BNA; açúcares substituídos, especi- almente açúcares 2'-substituídos tendo um grupo substituinte 2'-F, 2'-OCH3 ou um 2'-0(CH2)2-0CH3; e açúcares 4'-tio modificados. Açúcares também podem ser substituídos com grupamentos açúcar-miméticos entre outros. Métodos para a preparação de açúcares modificados são de conhecimento geral daqueles versados na técnica. Algumas patentes e publicações repre- sentativas que ensinam a preparação de semelhantes açúcares modificados incluem, mas não estão limitadas a, as Patentes dos Estados Unidos N—
.4.981.957 .5.466.786 .5.597.909
.5.118.800 .5.514.785 .5.610.300
.5.319.080 .5.519.134 .5.627.053
.5.359.044; 5.393.878 .5.567.811; 5.576.427 .5.639.873: 5.646.265
.5.446.137 .5.591.722 .5.658.873 .5.670.633; 5.792.747; 5.700.920; 6.531.584; e 6.600.032; e a patente inter- nacional Nq WO 2005/121371.
Em algumas modalidades, BNA's incluem nucleosídeo bicíclico tendo a fórmula:
<formula>formula see original document page 40</formula> em que:
Bx é uma porção de base heterocíclica;
T1 é H ou um grupo protetor oxidrila;
T2 é H1 um grupo protetor oxidrila ou um grupo fósforo reativo;
Z é C1-C6 alquila, C2-C6 alquenila, C2-C6 alquinila, CrC6 alquila substituída, C2-C6 alquenila substituída, C2-C6 alquinila substituída, acila, acila substituída, ou amida substituída.
Em uma modalidade, cada um dos grupamentos substituídos, é, independentemente, mono- ou polissubstituído com grupamentos substituin- tes opcionalmente protegidos selecionados independentemente entre halo- geno, oxo, oxidrila, OJ1, NJ1J2, SJ1, N3, OC(=X)Ji, OC(=X)NJ1J2, NJ3C(=X)NJ1J2 e CN, em que cada J1, J2 e J3 é, independentemente, H ou Ci-C6 alquila, e X é O, S ou NJ1.
Em algumas modalidades referidas, cada um dos grupamentos
a
substituídos, é, independentemente, mono- ou polissubstituído com grupa- mentos substituintes selecionados independentemente entre halogeno, oxo, oxidrila, OJ1, NJ1J2, SJ1, N3, OC(=X)Ji, e NJ3C(=X)NJiJ2l em que cada uma J1, J2 e J3 é, independentemente, H, C1-C6 alquila, ou C1-C6 alquila substituí- da e X é O ou NJ1.
Em algumas modalidades, o grupo Z é C1-C6 alquila substituída com um ou mais Xx, em que cada Xx é independentemente OJ1, NJ1J2, SJ-i, N3, OC(=X)Ji, OC(=X)NJ-iJ2, NJ3C(=X)NJiJ2 ou CN; em que cada uma J1, J2 e J3 é, independentemente, H ou Ci-C6 alquila, e X é O, S ou NJ1. Em outra modalidade, o grupo Z é C1-C6 alquila substituída com um ou mais Xx, em que cada Xx é independentemente halo (por exemplo, fluoro), oxidrila, alcóxi (por exemplo, CH3O-), alcóxi substituído ou azidc.
Em algumas modalidades, o grupo Z é -CH2Xx, em que Xx é OJ1, NJ1J2, SJ1, N3, OC(=X)Ji, 0C(=X)NJiJ2, NJ3C(=X)NJ1J2 ou CN; em que cada uma J1, J2 e J3 é, independentemente, H ou Ci-C6 alquila, e X é O, S ou NJ1. Em outra modalidade, o grupo Z é -CH2Xx, em que Xx é halo (por exemplo, fluoro), oxidrila, alcóxi (por exemplo, CH3O-) ou azido.
Em algumas modalidades referidas, o grupo Z está na (R)- configuração:
<formula>formula see original document page 41</formula>
Em algumas modalidades referidas, o grupo Z está na (S)- configuração: <formula>formula see original document page 41</formula>
Em algumas modalidades, cada T1 e T2 é um grupo protetor oxi- drila. Uma lista preferencial de grupamentos protetores oxidrila inclui benzila, benzoíla, 2,6-diclorobenzila, t-butildimetilsilila, t-butildifenilsilila, mesilato, to- silato, dimetoxitritila (DMT), 9-fenilxantina-9-ila (PixiIa) e 9-(p- metoxifenila)xantina-9-ila (MOX). Em algumas modalidades, T1 é um grupo protetor oxidrila selecionado entre acetila, benzila, t-butildimetilsilila, t- butildifenilsilila e dimetoxitritila em que um grupo protetor oxidrila mais prefe- rencial é T-i é 4,4'-dimetoxitritila.
Em algumas modalidades, T2 é um grupo fósforo reativo em que grupamentos fósforo reativos preferenciais incluem diisopropilcianoetóxi fos- foramidita e H-fosfonato. Em algumas modalidades T1 é 4,4'-dimetoxitritila e T2 é diisopropilcianoetóxi fosforamidita.
Em algumas modalidades, compostos oligoméricos têm no mí- nimo um monômero da fórmula: ou da fórmula:<formula>formula see original document page 42</formula>
ou da fórmula:<formula>formula see original document page 42</formula>
em que
Bx é uma porção de base heterocíclica;
T3 é H, um grupo protetor oxidrila, um grupo conjugado ligado ou
um grupo de ligação internucleosídeos fixado a um nucleosídeo, um nucleo- tídeo, um oligonucleosídeo, um oligonucleotídeo, uma subunidade monomé- rica ou um composto oligomérico;
T4 é H, um grupo protetor oxidrila, um ligado grupo conjugado ou um grupo de ligação internucleosídeos fixado a um nucleosídeo, um nucleo- tídeo, um oligonucleosídeo, um oligonucleotídeo, uma subunidade monomé- rica ou um composto oligomérico;
em que no mínimo um de T3 e T4 é um grupo de ligação internu- cleosídeos fixado a um nucleosídeo, um nucleotídeo, um oligonucleosídeo, um oligonucleotídeo, uma subunidade monomérica ou um composto oligo- mérico; e
Z é CrC6 alquila, C2-C6 alquenila, C2-C6 alquinila, CrC6 alquila substituída, C2-C6 alquenila substituída, C2-C6 alquinila substituída, acila, acila substituída, ou amida substituída. Em uma modalidade, cada um dos grupamentos substituídos, é,
independentemente, mono- ou polissubstituído com grupamentos substituin- tes opcionalmente protegidos selecionados independentemente entre halo- geno, oxo, oxidrila, OJ1, NJ1J2, SJ1, N3, OC(=X)Ji, OC(^X)NJ1J2,
k/VW NJ3C(=X)NJ1J2 e CN, em que cada J1l J2 e J3 é, independentemente, H ou CrC6 alquila, e X é O, S ou NJi.
Em uma modalidade, cada um dos grupamentos substituídos, é, independentemente, mono- ou polissubstituído com grupamentos substituin- tes selecionados independentemente entre halogeno, oxo, oxidrila, OJ-i, NJ1J2, SJ1, N3, OC(=X)Ji, e NJ3C(=X)NJ1J2, em que cada J1, J2 e J3 é, inde- pendentemente, H ou C1-C6 alquila, e X é O ou NJ1.
Em algumas modalidades referidas, no mínimo um Z é Ci-C6 alquila ou Ci-C6 alquila substituída. Em algumas modalidades, cada Z é, in- dependentemente, C1-C6 alquila ou C1-C6 alquila substituída. Em algumas modalidades, no mínimo um Z é C1-C6 alquila. Em algumas modalidades, cada Z é, independentemente, C1-C6 alquila. Em algumas modalidades, no mínimo um Z é metila. Em algumas modalidades, cada Z é metila. Em algu- mas modalidades, no mínimo um Z é etila. Em algumas modalidades, cada Z é etila. Em algumas modalidades, no mínimo um Z é Ci-C6 alquila substituí- da. Em algumas modalidades, cada Z é, independentemente, C1-C6 alquila substituída. Em algumas modalidades, no mínimo um Z é metila substituída. Em algumas modalidades, cada Z é metila substituída. Em algumas modali- dades, no mínimo um Z é etila substituída. Em algumas modalidades, cada Z é etila substituída.
Em algumas modalidades, no mínimo um grupo substituinte é C1-C6 alcóxi (por exemplo, no mínimo um Z é C1-C6 alquila substituída com um ou mais C1-C6 alcóxi). Em outra modalidade, cada grupo substituinte é, independentemente, C1-Cealcoxi (por exemplo, cada Z é, independentemen- te, C1-Cealquila substituída com um ou mais C1-Cealcoxi).
Em algumas modalidades, no mínimo um grupo substituinte C1- C6 alcóxi é CH3O- (por exemplo, no mínimo um Z é CH3OCH2-). Em outra modalidade, cada grupo substituinte C1-C6 alcóxi é CH3O- (por exemplo, ca- da Z é CH3OCH2-).
Em algumas modalidades, no mínimo um grupo substituinte é halogeno (por exemplo, no mínimo um Z é Ci-C6 alquila substituída com um ou mais halogeno). Em algumas modalidades, cada um grupo substituinte é, independentemente, halogeno (por exemplo, cada Z é, independentemente, CrC6alquila substituída com um ou mais halogeno). Em algumas modalida- des, no mínimo um grupo substituinte halogeno é fluoro (por exemplo, no mínimo um Z é CH2FCH2-, CHF2CH2- ou CF3CH2-). Em algumas modalida- des, cada grupo substituinte halo é fluoro (por exemplo, cada Z é, indepen- dentemente, CH2FCH2-, CHF2CH2- ou CF3CH2-).
Em algumas modalidades, no mínimo um grupo substituinte é oxidrila (por exemplo, no mínimo um Z é Ci-C6 alquila substituída com uma ou mais oxidrilas). Em algumas modalidades, cada um grupo substituinte é, independentemente, oxidrila (por exemplo, cada Z é, independentemente, Ci-C6 alquila substituída com uma ou mais oxidrilas). Em algumas modalida- des, no mínimo um Z é HOCH2-. Em outra modalidade, cada Z é HOCH2-.
Em algumas modalidades, no mínimo um Z é CH3-, CH3CH2-, CH2OCH3-, CH2F- ou HOCH2-. Em algumas modalidades, cada Z é, inde- pendentemente, CH3-, CH3CH2-, CH2OCH3-, CH2F- ou HOCH2-.
Em algumas modalidades, no mínimo um grupo Z é CrC6 alquila substituída com um ou mais Xx, em que cada Xx é, independentemente, OJ1, NJ1J2, SJ1, N3, OC(=X)J1f OC(=X)NJ1J2, NJ3Ci=XjNJ1J2 ou CN; em que cada J1, J2 e J3 é, independentemente, H ou C1-C6 alquila, e X é O, S ou NJ1. Em outra modalidade, no mínimo um grupo Z é C1-Cealquila substituída com um ou mais Xx, em que cada Xx é, independentemente, halo (por exemplo, fluo- ro), oxidrila, alcóxi (por exemplo, CH3O-) ou azido.
Em algumas modalidades, cada grupo Z é, independentemente, C1-C6 alquila substituída com um ou mais Xx, em que cada Xx é independen- temente OJ1, NJ1J2, SJ1, N3, OC(=X)Ji, OC(=X)NJ1J2, NJ3Ci=XJNJ1J2 ou CN; em que cada uma J1, J2 e J3 é, independentemente, H ou Ci-C6 alquila, e X é O, S ou NJ1. Em outra modalidade, cada grupo Z é, independentemente, C1-C6 alquila substituída com um ou mais Xx, em que cada Xx é independen- temente halo (por exemplo, fluoro), oxidrila, alcóxi (por exemplo, CH3O-) ou azido.
Em algumas modalidades, no mínimo um grupo Z é -CH2Xx1 em que Xx é OJ1, NJ1J2, SJ1, N3, OC(=X)Ji, OC(=X)NJiJ2, NJ3C(^X)NJ1J2 ou CN; em que cada uma J1, J2 e J3 é, independentemente, H ou C1-C6 alquila, e X é O, S ou NJ1 Em algumas modalidades, no mínimo um grupo Z é - CH2Xx, em que Xx é halo (por exemplo, fluoro), oxidrila, alcóxi (por exemplo, CH3O-) ou azido,
Em algumas modalidades, cada grupo Z é, independentemente, -CH2Xx, em que cada Xx é, independentemente, OJi, NJ1J2, SJ1, N3, OC(=X)J1, OC(=X)NJ1J2, NJ3C(=X)NJ1J2 ou CN; em que cada uma J1f J2 e J3 é, independentemente, H ou C1-C6 alquila, e X é O, S ou NJ1. Em outra mo- dalidade, cada grupo Z é, independentemente, -CH2Xx, em que cada Xx é, independentemente, halo (por exemplo, fluoro), oxidrila, alcóxi (por exemplo, CH3O-) ou azido.
Em algumas modalidades, no mínimo um Z é CH3-. Em outra modalidade, cada Z é, CH3-.
Em algumas modalidades, o grupo Z de no mínimo um monôme- ro está na (R)- configuração representada pela fórmula:
<formula>formula see original document page 45</formula>
ou a fórmula: <formula>formula see original document page 45</formula> ou a fórmula:
<formula>formula see original document page 45</formula>
Em algumas modalidades, o grupo Z de cada uma monômero da fórmula está na (R)- configuração. Em algumas modalidades, o grupo Z de no mínimo um monôme- ro está na (S)- configuração representada pela fórmula: <formula>formula see original document page 46</formula>
ou a fórmula:
<formula>formula see original document page 46</formula>
ou a fórmula:
<formula>formula see original document page 46</formula>
Em algumas modalidades, o grupo Z de cada monômero da fór- mula está na (S)- configuração.
Em algumas modalidades, T3 é H ou um grupo protetor oxidrila. Em algumas modalidades, T4 é H ou um grupo protetor oxidrila. Em uma modalidade adicional T3 é um grupo de ligação internucleosídeos fixado a um nucleosídeo, um nucleotídeo ou uma subunidade monomérica. Em al- gumas modalidades, T4 é um grupo de ligação internucleosídeos fixado a um 10 nucleosídeo, um nucleotídeo ou uma subunidade monomérica. Em algumas modalidades, T3 é um grupo de ligação internucleosídeos fixado a um oligo- nucleosídeo ou um oligonucleotídeo. Em algumas modalidades, T4 é um grupo de ligação internucleosídeos fixado a um oligonucleosídeo ou um oli- gonucleotídeo. Em algumas modalidades, T3 é um grupo de ligação internu- cleosídeos fixado a um composto oligomérico. Em algumas modalidades, T4 é um grupo de ligação internucleosídeos fixado a um composto oligomérico.
Em algumas modalidades, no mínimo um de T3 e T4 compreende um grupo de ligação internucleosídeos selecionado entre fosfodiéster ou fosforotioato.
Em algumas modalidades, compostos oligoméricos têm no mí- nimo uma região de no mínimo dois monômeros contíguos da fórmula:
<formula>formula see original document page 46</formula> ou da fórmula:<formula>formula see original document page 47</formula>
ou da fórmula:<formula>formula see original document page 47</formula>
I
Em algumas modalidades, o composto oligomérico compreende no mínimo duas regiões de no mínimo dois monômeros contíguos da fórmu- Ia acima. Em algumas modalidades, o composto oligomérico compreende um composto oligomérico com gap. Em algumas modalidades, o composto oligomérico compreende no mínimo uma região de a partir de cerca de 8 a cerca de 14 β-Ο^'^βοχίΓπόοίυΓβηοεΐΙβ nucleosídeos contíguos. Em algumas modalidades, o composto oligomérico compreende no mínimo uma região de a partir de cerca de 9 a cerca de 12 p-D-2'-deoxirribofuranosila nucleosídeos contíguos.
Em algumas modalidades, monômeros incluem miméticos de açúcares. Em algumas modalidades referidas, um mimético é usado ao in- vés do açúcar ou combinação de açúcar-ligação internucleosídeos, e a nu- . cieobase é mantida para hibridização a um alvo selecionado. Exemplos típi- cos de alguns miméticos de açúcares incluem, mas não estão limitados a, ciclohexenila ou morfolino. Exemplos típicos de um mimético para uma com- binação de açúcar-ligação internucleosídeos incluem, mas não estão limita- dos a, ácidos nucléicos peptídicos (PNA) e grupamentos morfolino ligados por ligações aquirais não carregadas. Em alguns casos um mimético é usa- do ao invés da nucleobase. Miméticos de nucleobases típicos são de conhe- cimento geral na técnica e incluem, mas não estão limitados a, análogos de fenoxazina tricíclicos e bases universais (Berger et al., Nuc Acid Res. 2000,28:2911-14, incorporado aqui, a este requerimento de patente, por meio de referência). Métodos de síntese de miméticos de açúcares, nucleosídeos e nucleobases são de conhecimento geral daqueles versados na técnica.
3. Ligações Monoméricas
São descritos aqui, neste requerimento de patente, grupamentos de ligação que ligam monômeros (incluindo, mas não limitados a, nucleosí- deos e nucleotídeos modificados e não modificados) juntos, deste modo formando um composto oligomérico. As duas classes principais de grupa- mentos de ligação são definidas pela presença ou ausência de um átomo de fósforo. Ligações contendo fósforo típicas incluem, mas não estão limitadas a, fosfodiésteres (P=O), fosfotriésteres, metilfosfonatos, fosforamidato, e fos- forotioatos (P=S). Grupamentos de ligação não contendo fósforo típicos in- cluem, mas não estão limitados a, metilenometilimino (-CH2-N(CH3)-O-CH2-), tiodiéster (-O-C(O)-S-), tionocarbamato (-O-C(O)(NH)-S-); siloxano (-O- Si(H)2-0-); e Ν,Ν'-dimetilhidrazina (-CH2-N(CH3)-N(CH3)-). Compostos oli- goméricos tendo grupamentos de ligação não-fósforo são referidos como oligonucleosídeos. Ligações modificadas, comparadas com ligações fosfodi- ésteres naturais, podem ser usadas para alterar, tipicamente aumentar, a resistência à nuclease do composto oligomérico. Em algumas modalidades, ligações tendo um átomo quiral podem ser preparadas algumas misturas racêmicas, como enantiômeros separados. Ligações quirais típicas incluem, mas não estão limitadas a, alquilfosfonatos e fosforotioatos. Métodos de preparação de ligações contendo fósforo e não contendo fósforo são de co- nhecimento geral daqueles versados na técnica.
Os compostos oligoméricos descritos aqui, neste requerimento de patente, contêm um ou mais centros assimétricos e deste modo dão ori- gem a enantiômeros, diastereômeros, e outras configurações estereoisomé- ricas que podem ser definidas, em termos de estereoquímica absoluta, como (R) ou (S), I ou L tal como para anômeros de açúcares, ou como (D) ou (L) tal como para aminoácidos et al. Incluídos nos compostos anti-sentido são proporcionados aqui, neste requerimento de patente, todos os isômeros possíveis referidos, bem como suas formas racêmicas e oticamente puras.
4. Compostos Oligoméricos
Em algumas modalidades, são proporcionados aqui, neste re- querimento de patente, compostos oligoméricos tendo grupamentos fósforo reativos úteis para formar ligações incluindo por exemplo ligações internu- cleosídeos fosforotioato e fosfodiéster. Métodos de preparação e/ou purifica- ção de precursores ou compostos oligoméricos não são uma limitação das composições ou métodos proporcionados aqui, neste requerimento de pa- tente. Métodos síntese e purificação de compostos oligoméricos incluindo DNA, RNA, oligonucleotídeos, oligonucleosídeos, e compostos anti-sentido são de conhecimento geral daqueles versados na técnica.
De modo geral, compostos oligoméricos compreendem uma plu- ralidade de subunidades monoméricas encadeadas juntas por grupamentos de ligação. Exemplos não Iimitantes de compostos oligoméricos incluem primers, sondas, compostos anti-sentido, oligonucleotídeos anti-sentido, oli- gonucleotídeos de seqüências guias externas (EGS), unidores alternados, e siRNAs. Deste modo, estes compostos podem ser introduzidos sob a forma de filamento único, de filamento duplo, circular, ramificado ou hairpinas e podem conter elementos estruturais tais como saliências ou Ioops internos ou terminais. Compostos oligoméricos de filamento duplo podem ser dois filamentos hibridizados para formar compostos de filamento duplo ou um único filamento com suficiente auto complementaridade para possiblitar hi- bridização e formação de um composto totalmente ou parcialmente de fila- mento duplo.
Em algumas modalidades, a presente invenção proporciona quiméricos compostos oligoméricos. Em algumas modalidades referidas, quiméricos compostos oligoméricos são oligonucleotídeos quiméricos. Em algumas modalidades referidas, os oligonucleotídeos quiméricos compreen- dem nucleotídeos diferentemente modificados. Em algumas modalidades, oligonucleotídeos quiméricos são oligonucleotídeos anti-sentido de espinha dorsal mista.
Em geral, um quimérico composto oligomérico terá nucleosídeos modificados que podem estar em posições isolada ou agrupados juntos em regiões que definirão um motivo particular. Qualquer combinação de modifi- cações e/ou grupamentos miméticos pode compreender um composto oli- gomérico quimérico conforme descrito aqui, neste requerimento de patente.
Em algumas modalidades, compostos oligoméricos quiméricos tipicamente compreendem no mínimo uma região modificada de modo a conferir resistência aumentada a degradação de nuclease, aumentada cap- tação celular, e/ou aumentada afinidade de ligação para o ácido nucléico alvo. Em algumas modalidades, uma região adicional do composto oligomé- rico pode servir como um substrato para enzimas capazes de clivar híbridos de RNA:DNA ou RNA:RNA. A título de exemplo, RNase H é uma endonu- clease celular que cliva o filamento de RNA de um dúplex RNA:DNA. A ati- vação da RNase H, portanto, resulta em clivagem do alvo de RNA, deste modo aumentando muito a eficiência de inibição da expressão genética. Conseqüentemente, resultados comparáveis podem freqüentemente ser ob- tidos com compostos oligoméricos mais curtos quando são usadas quime- ras, comparadas com, por exemplo, desoxioligonucleotídeos de fosforotioato hibridizando à mesma região alvo. A clivagem do alvo de RNA pode ser de- tectada rotineiramente por eletroforese por gel e, caso necessário, técnicas de hibridização de ácido nucléico associadas de conhecimento na arte.
Em algumas modalidades, compostos oligoméricos quiméricos são gápmeros. Em algumas modalidades, quiméricos compostos são com- postos anti-sentido curtos. Em algumas modalidades, compostos anti- sentido curtos são gápmeros. Em algumas modalidades referidas, um oligô- mero anti-sentido de espinha dorsal mista tem um tipo de ligações internu- cleotídeos em uma ou ambas as asas e um tipo diferente de ligações inter- nucleotídeos no gap. Em algumas modalidades referidas, o oligonucleotídeo anti-sentido de espinha dorsal mista tem ligações fosfodiéster nas asas e ligações fosforotioato no gap. Em algumas modalidades nas quais as liga- ções internucleotídeos em uma asa são diferentes das ligações internucleo- tídeos no gap, a ligação internucleotídeos ligando esta asa e o gap é a mesma que a ligação internucleotídeos na asa. Em algumas modalidades nas quais as ligações internucleotídeos em uma asa é diferente das ligações internucleotídeos no gap, a ligação internucleotídeos ligando esta asa e o gap é a mesma que a ligação internucleotídeos no gap. C. Alguns Compostos Anti-sentido Curtos
São revelados aqui, neste requerimento de patente, compostos anti-sentido curtos de 8 a 16, preferencialmente de 9 a 15, mais preferenci- almente de 9 a 14, mais preferencialmente de 10 a 14 nucleotídeos de ex- tensão. Em algumas modalidades, compostos anti-sentido curtos têm 9 a 14 nucleotídeos de extensão. Em algumas modalidades, compostos anti- sentido curtos têm 10 a 14 nucleotídeos de extensão. Em algumas modali- dades, os compostos anti-sentido curtos referidos são oligonucleotídeos anti- sentido curtos.
Em algumas modalidades, compostos anti-sentido curtos com- preendem uma ou mais modificações químicas. Em algumas modalidades referidas, compostos anti-sentido curtos compreendem no mínimo um nucle- otídeo modificado. Em algumas modalidades compostos anti-sentido curtos compreendem no mínimo dois ou mais nucleotídeos modificados. Em algu- mas modalidades, compostos anti-sentido curtos compreendem no mínimo uma ligação internucleotídeos modificada. Em algumas modalidades, com- postos anti-sentido curtos são oligonucleotídeos de espinha dorsal mista. Em algumas modalidades, compostos anti-sentido curtos são oligonucleotídeos quiméricos. Em algumas modalidades, oligonucleotídeos anti-sentido curtos são uniformemente modificados. Em algumas modalidades, oligonucleotí- deos anti-sentido curtos compreendem modificações selecionadas indepen- dentemente em cada nucleobase e em cada ligação.
Em algumas modalidades, compostos anti-sentido curtos são gápmeros curtos. Em algumas modalidades referidas, gápmeros curtos compreendem no mínimo uma modificação de alta afinidade em uma ou mais asas do composto. Em algumas modalidades, compostos anti-sentido curtos compreendem 1 a 3 modificações de alta afinidade em cada asa. Em algumas modalidades, modificações de alta afinidade dos compostos anti- sentido curtos possibilitam uma afinidade alvo similar a, ou mesmo maior do que, a afinidade alvo de compostos anti-sentido mais longos. Em algumas modalidades, os nucleotídeos modificados de alta afinidade são nucleotí- deos modificados com açúcar. Os nucleotídeos modificados com açúcar re- feridos incluem aqueles compreendendo uma ponte entre a posição 4' e 2' do açúcar. Modificações de alta afinidade típicas de açúcar incluem, mas não estão limitadas a, BNAs e outras modificações 2' tais como 2'-MOE. Em uma modalidade alternativa da invenção, a modificação de alta afinidade não é um nucleotídeo modificado com açúcar 2'-0-(CH2)nH (n=1-6). Em uma modalidade alternativa adicional, o nucleotídeo modificado de alta afinidade não é um nucleotídeo 2'-OCH3 ou um 2'-OCH2CH2OCH3. Em algumas moda- lidades, os nucleotídeos modificados de alta afinidade conferem uma ATm de no mínimo 1, no mínimo 1,5, no mínimo 2, no mínimo 2,5, no mínimo 3.0, no mínimo 3,5 ou no mínimo 4,0 graus por nucleotídeo. Algumas modificações de alta afinidade de nucleotídeos são de conhecimento na técnica para au- mentar a toxicidade. Conforme mostrado aqui, neste requerimento de paten- te, compostos anti-sentido curtos tendo um número limitado (geralmente 2 a6) de modificações de alta afinidade apresentam pouco a nenhum aumento na toxicidade, mas conservam ou aumentam a afinidade para o RNA-alvo, ao mesmo tempo que também reduzindo significativamente a expressão do alvo de RNA. Compostos anti-sentido curtos da invenção podem compreen- der opcionalmente um grupo conjugado, tal como, por exemplo, colesterol ou C-I6·
.1. Algumas Asas
Em algumas modalidades, os compostos anti-sentido curtos compreendem uma asa 5' e/ou uma asa 3'. Em semelhantes modalidades, as características da asa 3' e as características da asa 5' são selecionadas independentemente. Portanto, em semelhantes modalidades, o número de monômeros na asa 5' e o número de monômeros (extensão) na asa 3' po- dem ser os mesmos ou podem ser diferentes; as modificações, se houver, na asa 5' podem ser as mesmas que as modificações, se houver, na asa 3' ou semelhantes modificações, se houver, podem ser diferentes; e as liga- ções monoméricas na asa 5' e as ligações monoméricas na asa 3' podem ser as mesmas ou podem ser diferentes.
Em algumas modalidades uma asa compreende um, dois ou três monômeros (isto é, tem uma extensão de 1, 2, ou 3). Em algumas modalida- des, os monômeros de uma asa são modificados. Em algumas modalidades referidas, os monômeros da asa são modificado para aumentar a afinidade do composto anti-sentido para seu ácido nucléico alvo. Em algumas modali- dades, os monômeros de uma asa são nucleosídeos ou nucleotídeos. Em algumas modalidades referidas, os nucleosídeos ou nucleotídeos da asa compreendem uma modificação 2'. Em algumas modalidades referidas, os monômeros (nucleosídeos ou nucleotídeos) da asa são BNA's. Em algumas modalidades referidas, os monômeros da asa são selecionados entre a-L- Metilenoóxi (4'-CH2-0-2') BNA, β-D-Metilenoóxi (4'-CH2-0-2') BNA, Etilenoó- xi (4'-(CH2)2-0-2') BNA, Aminoóxi (4'-CH2-0-N(R)-2') BNA e Oxiamino (4'- CH2-N(R)-0-2') BNA. Em algumas modalidades, os monômeros de uma asa compreendem um substituinte na posição 2' selecionada entre alila, amino, azido, tio, O-alila, O-CrC10 alquila, -OCF3, O-(CH2)2-O-CH3, 2'-0(CH2)2SCH3, O-(CH2)2-O-N(Rm)(Rn), e 0-CH2-C(=0)-N(Rm)(Rn), onde cada Rm e Rn é, in- dependentemente, H ou CrC10 alquila substituída ou não-substituída. Em algumas modalidades, os monômeros de uma asa são nucleotídeos 2'MOE.
Em algumas modalidades, as ligações monoméricas em uma asa são ligações internucleotídeos que ocorrem naturalmente. Em algumas modalidades, as ligações monoméricas em uma asa são ligações internu- cleotídeos ou internucleosídeos que não ocorrem naturalmente. Em algumas modalidades referidas, as ligações monoméricas na asa são mais resisten- tes à uma ou mais nucleases do que ligações internucleotídeos que ocorrem naturalmente. Em algumas modalidades referidas, as ligações monoméricas na asa são ligações fosforotioato (P=S). Em algumas modalidades onde uma asa tem mais de uma ligação monomérica, as ligações monoméricas são as mesmas que as outras. Em algumas modalidades onde uma asa tem mais de uma ligação de monômeros, as ligações de monômeros são diferen- tes umas das outras.
Uma pessoa com conhecimento regular na técnica reconhecerá que as características e modificações discutidas acima podem ser usadas em qualquer combinação para preparar uma asa. A tabela abaixo proporcio- na exemplos não Iimitantes mostrando como se pode preparar uma asa se- lecionando um certo número de monômeros, modificações monoméricas (se houver), e ligações monoméricas ambas dentro da asa.
Extensão Tipo de monômero/ modificações Ligações monoméricas dentro da asa <table>table see original document page 54</column></row><table>
Em algumas modalidades nas quais uma asa compreende dois, três ou quatro monômeros, destes dois, três ou quatro monômeros todos compreendem as mesmas modificações, se houver. Em algumas modalida- des nas quais uma asa compreende dois, três ou quatro monômeros, uma ou mais destas duas, três ou quatro nucleobases compreendem uma ou mais modificações que é diferente de uma ou mais das modificações de um ou mais dos monômeros remanescentes.
2. Alguns Gaps
Em algumas modalidades, os compostos anti-sentido curtos compreendem um gap entre a asa 5' e a asa 3'. Em algumas modalidades o gap compreende cinco, seis, sete, oito, nove, dez, onze, doze, treze, ou qua- torze monômeros. Em algumas modalidades, os monômeros do gap são desoxirribonucleotídeos não modificados. Em algumas modalidades, os mo- nômeros do gap são ribonucleotídeos não modificados. Em algumas modali- dades, gap de modificações de gap (se houver) resultam em um composto anti-sentido que, quando ligado a seu ácido nucléico alvo, suporta clivagem por uma RNase, incluindo, mas não limitada a, RNase H.
Em algumas modalidades, as ligações monoméricas no gap são ligações internucleotídeos que ocorrem naturalmente. Em algumas modali- dades, as ligações monoméricas no gap são ligações que não ocorrem natu- ralmente. Em algumas modalidades referidas, as ligações monoméricas no gap são mais resistentes à uma ou mais nuclease do que ligações internu- cleotídeos que ocorrem naturalmente. Em algumas modalidades referidas, as ligações monoméricas no gap são ligações fosforotioato (P=S). Em algu- mas modalidades, as ligações monoméricas no gap são todas as mesmas que as outras. Em algumas modalidades, as ligações monoméricas dentro do gap não são todas as mesmas.
Uma pessoa com conhecimento regular da técnica reconhecerá que as características e modificações discutidas acima podem ser usadas em qualquer combinação para preparar um gap. A tabela abaixo proporciona exemplos não-limitantes mostrando como se pode preparar um gap selecio- nando um certo número de monômeros, modificações monoméricas, e liga- ções monoméricas dentro da região de gap.
<table>table see original document page 55</column></row><table> <table>table see original document page 56</column></row><table> .3. Alguns Compostos Oliqoméricos Anti-sentido com Gap
Uma pessoa com conhecimento regular da técnica reconhecerá
que as asas e os gaps discutidos acima podem ser selecionados e em se- guida combinados em uma variedade de combinações para gerar compostos oligoméricos com gap, incluindo, mas não limitados a, compostos oligoméri- cos anti-sentido com ga, e oligonucleotídeos anti-sentido com gap. As carac- terísticas (extensão, modificações, ligações) da asa 5' e da asa 3' podem ser selecionadas independentemente uma da outra. As características do gap incluem no mínimo uma diferença em modificação comparadas com as ca- racterísticas da asa 5' e no mínimo uma diferença comparadas com as ca- racterísticas da asa 3' (isto é, deve haver no mínimo uma diferença em modi- ficação entre regiões vizinhas para distinguir as regiões vizinhas uma da ou- tra). As características do gap de modo diverso podem ser selecionadas in- dependentemente.
Em algumas modalidades, as ligações monoméricas dentro de uma asa e as ligações monoméricas dentro do gap são as mesmas. Em al- gumas modalidades, as ligações monoméricas dentro de uma asa e as liga- ções monoméricas dentro do gap são diferentes. Em algumas modalidades referidas, a ligação monomérica ligando a asa e o gap são as mesmas que as ligações monoméricas na asa. Em algumas modalidades, a ligação mo- nomérica ligando a asa e o gap são as mesmas que as ligações monoméri- cas no gap. Em algumas modalidades, compostos anti-sentido curtos têm ligações uniformes por todo o composto. Em algumas modalidades referidas, todas as ligações são ligações fosforotioato (P=S). Uma pessoa com conhecimento regular da técnica reconhecerá que as asas 3', asas 5', gaps, e ligações discutidos acima podem ser usados em qualquer combinação para preparar um gápmero. A tabela abaixo pro- porciona exemplos não-limitanets mostrando como se pode preparar um gápmero selecionando uma determinada asa 5', um gap, uma asa 3' e algu- mas ligações ligando o gap e cada asa.
<table>table see original document page 57</column></row><table>
Em algumas modalidades, os compostos oligoméricos revelados aqui, neste requerimento de patente, podem compreender a partir de cerca de 8 a cerca de 16, preferencialmente 9 a 15, mais preferencialmente 9 a 14, mais preferencialmente 10 a 14 monômeros (isto é, a partir de cerca de 8 a cerca de 16 monômeros ligados). Uma pessoa de conhecimento regular da técnica reconhecerá que isto compreende compostos anti-sentido de 8, S, .10, 11, 12, 13, 14, 15 ou 16 nucleobases. Em algumas modalidades, com- postos oligoméricos são compostos anti-sentido.
Em algumas modalidades, compostos anti-sentido curtos têm 8 nucleobases de extensão.
Em algumas modalidades, compostos anti-sentido curtos têm S nucleobases de extensão.
Em algumas modalidades, compostos anti-sentido curtos têm 10 nucleobases de extensão.
Em algumas modalidades, compostos anti-sentido curtos têm 11 nucleobases de extensão.
Em algumas modalidades, compostos anti-sentido curtos têm 12 nucleobases de extensão. Em algumas modalidades, compostos anti-sentido curtos têm 13 nucleobases de extensão.
Em algumas modalidades, compostos anti-sentido curtos têm 14 nucleobases de extensão.
Em algumas modalidades, compostos anti-sentido curtos têm 15 nucleobases de extensão.
Em algumas modalidades, compostos anti-sentido curtos têm 16 nucleobases de extensão.
Em algumas modalidades, compostos anti-sentido curtos têm 8 monômeros de extensão. Em algumas modalidades, compostos anti-sentido curtos têm 9 monômeros de extensão. Em algumas modalidades, compostos anti-sentido curtos têm 10 monômeros de extensão. Em algumas modalida- des, compostos anti-sentido curtos têm 11 monômeros de extensão. Em al- gumas modalidades, compostos anti-sentido curtos têm monômeros de ex- tensão. Em algumas modalidades, compostos anti-sentido curtos têm 13 monômeros de extensão. Em algumas modalidades, compostos anti-sentido curtos têm 14 monômeros de extensão. Em algumas modalidades, compos- tos anti-sentido curtos têm 15 monômeros de extensão. Em algumas moda- lidades, compostos anti-sentido curtos têm 16 monômeros de extensão. Em algumas modalidades, compostos anti-sentido curtos compreendem 9 a 15 monômeros. Em algumas modalidades, compostos anti-sentido curtos com- preendem 10 a 15 monômeros. Em algumas modalidades, compostos anti- sentido curtos compreendem 12 a 14 monômeros. Em algumas modalida- des, compostos anti-sentido curtos compreendem 12 a 14 nucleotídeos ou nucleosídeos.
Uma pessoa tendo conhecimento da técnica e informado pelos compostos anti-sentido curtos ilustrados aqui, neste requerimento de paten- te, será capaz, sem indevida experimentação, de identificar compostos anti- sentido curtos adicionais.
Em algumas modalidades, compostos anti-sentido curtos com- preendem um gap flanqueado por mais de uma asa sobre qualquer um ou ambos os lados. Portanto, em determinadas modalidades, um composto an- ti-sentido curto compreende duas ou mais asas 5' e duas ou mais asas 3'. Em algumas modalidades, um composto anti-sentido curto compreende uma asa 5' e duas ou mais asas 3'. Em algumas modalidades, um composto anti- sentido curto compreende uma asa 3' e duas ou mais asas 5'. Algumas mo- dalidades referidas compreendem, por exemplo, as seguintes regiões: uma primeira asa 5' - uma ponte - uma segunda asa 5' - uma ponte - um gap - uma ponte - uma segunda asa 3' - uma ponte - uma primeira asa 3'. Em semelhantes modalidades, cada uma região tem no mínimo uma diferença na modificação quando comparada com sua região vizinha. Portanto, em semelhantes modalidades, a segunda asa 5' e a segunda asa 3' cada uma independentemente compreende uma ou mais diferenças na modificação comparada com o gap e comparada com a primeira asa 5' e a primeira asa .3'. Em semelhantes modalidades, as modificações da primeira asa 3' e a primeira asa 5' podem ser cada uma ou ambas as mesmas ou diferentes das modificações do gap, se houver. . 4. Alguns Grupos de Conjugados
Em um aspecto, compostos oligoméricos são modificados por fixação covalente de um ou mais grupamentos conjugados. Em geral, gru- pamentos conjugados modificam uma ou mais propriedades do composto oligomérico fixado incluindo mas não-limitadas à farmacodinâmica, farmaco- cinética, ligação, absorção, distribuição celular, captação celular, carga e desobstrução. Grupamentos conjugados são rotineiramente usados nas ar- , tes químicas e são ligados diretamente ou através de uma porção de ligação ou grupo de ligação opcional a um composto precursor tal como um compos- to oligomérico. Uma lista preferencial de grupamentos conjugados inclui sem limitação, intercalantes, moléculas repórter, poliaminas, poliamidas, polietile- no glicóis, tioéteres, poliéteres, colesteróis, tiocolesteróis, porções ácido cóli- co, folato, lipídeos, fosfolipídeos, biotina, fenazina, fenantridina, antraquino- na, adamantano, acridina, fluoresceínas, rodaminas, cumarinas e corantes.
Grupamentos conjugados preferenciais receptivos à presente invenção incluem porções Iipidicas tais como uma porção colesterol (Letsin- ger et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 1989, 86, 6553); ácido cóIico (Manoha- ran et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 1994, 4, 1053); um tioéter, por exemplo, hexila-S-tritiltiol (Manoharan et al., Ann. N.Y. Acad. Sci., 1992, 660, 306; Ma- noharan et al., Bioorg. Med. Chem. Let., 1993, 3, 2765); um tiocolesterol (O- berhauser et al., Nucl. Acids Res., 1992, 20, 533); uma cadeia alifática, por exemplo, resíduos dodecandiol ou undecila (Saison-Behmoaras et al., EM- BOJ., 1991, 10, 111; Kabanovetal., FEBS Lett., 1990, 259, 327; Svinarchuk et al., Biochimie, 1993, 75, 49); um fosfolipídeo, por exemplo, di-hexadecila- rac-glicerol ou trietilamônio-1,2-di-0-hexadecila-rac-glicero-3-H-fosfonato (Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36, 3651; Shea et al., Nucl. Acids Res., 1990, 18, 3777); uma poliamina ou uma cadeia polietileno glicol (Ma- noharan et al., Nucleosides & Nucleotides, 1995, 14, 969); ácido acético de adamantano (Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36, 3651); uma por- ção palmitila (Mishra et al., Biochim. Biophys. Acta, 1995, 1264, 229); ou uma porção octadecilamina ou hexilamino-carbonila-oxicolesterol (Crooke et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 1996, 277, 923). Grupamentos de ligação ou porções de ligação bifuncionais tais
como os de conhecimento na técnica são receptivos aos compostos propor- cionados aqui, neste requerimento de patente. Grupamentos de ligação são úteis para fixação de grupamentos funcionais químicos, grupamentos conju- gados, grupamentos repórter e outros grupamentos a sítios seletivos em um composto precursor tal como, por exemplo, um composto oligomérico. Em geral uma porção de ligação bifuncional compreende uma porção hidrocarbi- Ia tendo dois grupamentos funcionais. Um dos grupamentos funcionais é selecionado para ligar a uma molécula precursora ou composto de interesse e o outro é selecionado para ligar essencialmente qualquer grupo seleciona- do tal como grupo funcional químico ou um grupo conjugado. Em algumas modalidades, o ligante compreende uma estrutura de cadeia ou um oligôme- ro de unidades de repetição tal como unidades de etileno glicol ou aminoáci- do. Exemplos de grupamentos funcionais que são usados rotineiramente em uma porção de ligação bifuncional incluem, mas não estão limitados a, ele- trófilos para reagir com grupamentos nucleofílicos e nucleófilos para reagir com grupamentos eletrofílicos. Em algumas modalidades, porções de Iiga- ção bifuncionais incluem amino, oxidrila, ácido carboxílico, tiol, insaturações (por exemplo, ligações duplas ou triplas), e semelhantes. Alguns exemplos não Iimitantes de porções de ligação bifuncionais incluem ácido 8-amino-3,6- dioxaoctanóico (ADO), succinimidila 4-(N-maleimidometila) ciclohexano-1- carboxilato (SMCC) e ácido 6-aminohexanóico (AHEX ou AHA). Outros gru- pamentos de ligação incluem, mas não estão limitados a, C1-C10 alquila substituída, C2-Ci0 alquenila substituída ou não-substituída ou C2-Ci0 alquini- Ia substituída ou não-substituída, em que uma lista não Iimitante de grupa- mentos substituintes preferenciais inclui oxidrila, amino, alcóxi, carbóxi, ben- zila, fenila, nitro, tiol, tioalcóxi, halogeno, alquila, arila, alquenila e alquinila. .5. Síntese, Purificação e Análise
Pode ser realizada oligomerização de nucleosídeos e nucleotí- deos modificados e não modificados rotineiramente de acordo com procedi- mentos da literatura para DNA (Protocols for Oligonucleotides and Analogs, Ed. Agrawal (1993), Humana Press) e/ou RNA (Scaringe, Methods (2001),23, 206-217. Gait et al., Applications of Chemically synthesized RNA in RNA: Protein lnteractions, Ed. Smith (1998), 1-36. Gallo et al., Tetrahedron (2001),57, 5707-5713). Compostos oligoméricos proporcionados aqui, neste requeri- mento de patente, podem ser preparados convenientemente e rotineiramen- te através da técnica de conhecimento geral de síntese de fase sólida. Equi- pamento para semelhante síntese é vendido por vários vendedores incluin- do, por exemplo, Applied Biosystems (Foster City, CA). Quaisquer outros meios para semelhante síntese de conhecimento na técnica podem ser em- pregados adicionalmente ou alternativamente. É de conhecimento geral usar técnicas similares para preparar oligonucleotídeos tais como os fosforotioa- tos e derivados alquilados. A invenção não é limitada pelo método de síntese compostos anti-sentido.
Métodos de purificação e análise de compostos oligoméricos são de conhecimento daqueles versados na técnica. Métodos de análise incluem eletroforese capilar (CE) e espectroscopia de massa por eletrospray. Os mé- todos de síntese e análise referidos podem ser realizados em lâminas multi- cavidades. O método da invenção não é limitado pelo método de purificação de oligômeros. D. Anti-sentido
Mecanismos anti-sentido são todos aqueles envolvendo a hibri- dização de um composto com ácido nucléico alvo, em que o resultado ou efeito da hibridização é ou degradação alvo ou ocupação alvo com bloqueio concomitante do mecanismo celular envolvendo, por exemplo, transcrição ou junção.
Um tipo de mecanismo anti-sentido envolvendo degradação alvo inclui uma RNase H. RNase H é uma endonuclease celular a qual cliva o filamento de RNA de um dúplex RNA:DNA. É de conhecimento na técnica que compostos anti-sentido de filamento único os quais são "semelhantes a DNA" provocam atividade de RNAse H em células mamíferas. A ativação da RNase H, portanto, resulta em clivagem do alvo de RNA, deste modo au- mentando muito a eficiência de inibição da expressão genética mediada por oligonucleotídeos semelhantes a DNA.
Em algumas modalidades, compostos anti-sentido quimicamente modificados têm uma maior afinidade para RNAs alvo do que tem DNA não- modificado. Em algumas modalidades referidas, esta maior afinidade por sua vez proporciona aumento da potência possibilitando a administração de do- ses menores de semelhantes compostos, reduzido potencial para toxicidade e aumento do índice terapêutico e reduzido custo total da terapia.
A presente descrição demonstra que a incorporação de nucleo-
sídeos e nucleotídeos de alta afinidade quimicamente modificados em com- postos anti-sentido possibilita o desenho de compostos anti-sentido curtos de 8 a 16 nucleobases de extensão úteis para a redução de RNAs alvo e/ou proteínas-alvo em células, tecidos, e animais, incluindo, mas não limitados a, seres humanos com potência aumentada e índice terapêutico aprimorado. Portanto, em determinadas modalidades, são proporcionados aqui, neste requerimento de patente, compostos anti-sentido curtos compreendendo modificações de nucleotídeos de alta afinidade úteis para reduzir um RNA- alvo in vivo. Alguns dos compostos anti-sentido curtos referidos são eficazes em menores doses do que compostos anti-sentido previamente descritos, possibilitanto uma redução na toxicitade e no custo do tratamento. Além dis- so, alguns compostos anti-sentido curtos têm maior potencial para dosagem oral.
Para tratar a necessidade de compostos anti-sentido mair poten- tes, são proporcionados aqui, neste requerimento de patente, compostos anti-sentido curtos (8 a 16, preferencialmente 9 a 15, mais preferencialmente9 a 14, mais preferencialmente 10 a 14 nucleotídeos de extensão) com au- mentada atividade in vivo em relação a compostos mais longos. Alguns compostos anti-sentido curtos são compostos de gápmero compreendendo nucleotídeos quimicamente modificados de alta afinidade sobre as extremi- dades 3' e 5' (asas) do composto. Em algumas modalidades, a adição de nucleotídeos modificados de alta afinidade possibilita que compostos anti- sentido sejam ativos contra, e específicos para, seu RNA-alvo pretendido in vivo apesar de serem mais curtos de extensão. São contemplados aqui, nes- te requerimento de patente, compostos anti-sentido curtos em que cada uma das asas independentemente compreende 1 a 3 nucleotídeos modificados de alta afinidade. Em algumas modalidades, as modificações de alta afinida- de são modificações de açúcar. Nucleotídeos modificados de alta afinidade incluem, mas não estão limitados a, BNAs ou outros nucleotídeos 2'- modificados, tais como nucleotídeos 2'-MOE. Também são contemplados compostos anti-sentido curtos tendo no mínimo uma ligação internucleotí- E deos modificada, tal como uma ligação internucleotídeos fosforotioato. Em algumas modalidades, os compostos anti-sentido curtos da presente inven- ção podem ter todas as ligações internucleosídeos fosforotioato. Os compos- tos anti-sentido curtos opcionalmente compreendem um grupo conjugado. Conforme mostrado aqui, neste requerimento de patente, compostos anti- sentido curtos têm maior afinidade para RNA-alvo do que têm para DNA e são significativamente mais potentes in vivo conforme mostrado por redução do RNAm-alvo bem como por melhora de uma variedade de indicações de doenças.
Conforme usado aqui, neste requerimento de patente, um RNA o qual está envolvido em regular o metabolismo ou desobstrução da glicose, o metabolismo dos lipídeos, o metabolismo do colesterol, ou o metabolismo da insulina é qualquer RNA envolvido nos caminhos bioquímicos que regulam estes processos. Os RNAs referidos são de conhecimento geral na técnica. Exemplos de genes alvo incluem, mas não estão limitados a, ApoB-100 (também conhecido como APOB; antígeno Ag(x); apoB-48; apolipoproteína B; apolipoproteína B-100; apolipoproteína B-48) e GCGR (também conheci- do como receptor de glucagon; GR), CRP, DGAT2, GCCR, PCSK9, PTEN, PTP1B, SGLT2, e SOD1.
1. Modulação da Expressão Alvo Em algumas modalidades, um alvo é identificado e oligonucleotídeos anti- sentido são designados para modular o alvo ou sua expressão. Em algumas modalidades, designar um composto oligomérico para uma molécula de áci- do nucléico alvo pode ser um processo multietapa. Tipicamente, o processo se inicia com a identificação de uma proteína alvo, cuja atividade deve ser modulada, e em seguida identificando o ácido nucléico cuja expressão pro- duz a proteína alvo. Em algumas modalidades, a designação de um compos- to anti-sentido resulta em um composto anti-sentido que é hibridizável à mo- lécula de ácido nucléico alvo. Em algumas modalidades, o composto anti- sentido é um oligonucleotídeo anti-sentido ou oligonucleosídeo anti-sentido. Em algumas modalidades, um composto anti-sentido e um ácido nucléico alvo são complementares um ao outro. Em algumas modalidades referidas, um composto anti-sentido é perfeitamente complementar a um ácido nucléi- co alvo. Em algumas modalidades, um composto anti-sentido inclui uma combinação inadequada. Em algumas modalidades, um composto anti- sentido inclui duas combinações inadequadas. Em algumas modalidades, um composto anti-sentido inclui três ou mais combinações inadequadas. A modulação da expressão de um ácido nucléico alvo pode ser
realizada através de alteração de qualquer número de funções de ácido nu- cléico. Em algumas modalidades, as funções de RNA a serem moduladas incluem, mas não estão limitadas a, funções de translocação, as quais inclu- em, mas não estão limitadas a, translocação do RNA a um sítio de transla- ção de proteína, translocação do RNA a sítios dentro da célula os quais es- tão distantes do sítio de síntese de RNA1 e translação de proteína do RNA. Funções de processamento de RNA que podem ser moduladas incluem, mas não estão limitadas a, junção do RNA para produzir uma ou mais espé- cies de RNA, capeamento do RNA, maturação 3' do RNA e atividade catalí- tica ou formação de complexo envolvendo o RNA o qual pode ser compro- metido em ou facilitado pelo RNA. A modulação da expressão pode resultar no aumento do nível de uma ou mais espécies de ácido nucléico ou na redu- ção do nível de uma ou mais espécies de ácido nucléico, quer temporalmen- te ou por nível de estado estável líquido. Portanto, em uma modalidade a modulação da expressão pode significar aumento ou redução nos níveis de RNA ou proteína alvo. Em outra modalidade a modulação da expressão po- de significar um aumento ou redução de um ou mais produtos de junção de RNA, ou uma alteração na proporção de dois ou mais produtos de junção.
Em algumas modalidades, a expressão de um gene alvo é mo- dulada usando um composto oligomérico compreendendo a partir de cerca de 8 a cerca de 16, preferencialmente 9 a 15, mais preferencialmente 9 a 14, mais preferencialmente 10 a 14 monômeros (isto é, a partir de cerca de 8 a cerca de 16 monômeros ligados). Uma pessoa com conhecimento regular da técnica reconhecerá que isto compreende métodos para modular a expres- são de um gene alvo usando um ou mais compostos anti-sentido de 8, 9, 10, .11, 12, 13, 14, 15 ou 16 nucleobases.
Em algumas modalidades, métodos para modular um gene alvo compreendem o uso de um composto anti-sentido curto que tem 8 nucleo- bases de extensão. Em algumas modalidades, métodos para modular um gene alvo compreendem o uso de um composto anti-sentido curto que tem 9 nucleobases de extensão. Em algumas modalidades, métodos para modular um gene alvo compreendem o uso de um composto anti-sentido curto que tem 8 nucleobases de extensão. Em algumas modalidades, métodos para modular um gene alvo compreendem o uso de um composto anti-sentido curto que tem 10 nucleobases de extensão. Em algumas modalidades, mé- todos para modular um gene alvo compreendem o uso de um composto anti- sentido curto que tem 10 nucleobases de extensão. Em algumas modalida- des, métodos para modular um gene alvo compreendem o uso de um com- posto anti-sentido curto que tem 11 nucleobases de extensão. Em algumas modalidades, métodos para modular um gene alvo compreendem o uso de um composto anti-sentido curto que tem 12 nucleobases de extensão. Em algumas modalidades, métodos para modular um gene alvo compreendem o uso de um composto anti-sentido curto que tem 13 nucleobases de exten- são. Em algumas modalidades, métodos para modular um gene alvo com- preendem o uso de um composto anti-sentido curto que tem 14 nucleobases de extensão. Em algumas modalidades, métodos para modular um gene alvo compreendem o uso de um composto anti-sentido curto que tem 15 nu- cleobases de extensão. Em algumas modalidades, métodos para modular um gene alvo compreendem o uso de um composto anti-sentido curto que tem 16 nucleobases de extensão.
Em algumas modalidades, métodos para modular a expressão de um gene alvo compreendem uso de um composto anti-sentido curto compreendendo 9 a 15 monômeros. Em algumas modalidades, métodos para modular a expressão de um gene alvo compreendem uso de um com- posto anti-sentido curto compreendendo 10 a 15 monômeros. Em algumas modalidades, métodos para modular a expressão de um gene alvo compre- endem uso de um composto anti-sentido curto compreendendo 12 a 14 mo- nômeros. Em algumas modalidades, métodos para modular a expressão de um gene alvo compreendem uso de um composto anti-sentido curto com- preendendo 12 ou 14 nucleotídeos ou nucleosídeos.
.2. Hibridizacão
Em algumas modalidades, compostos anti-sentido especifica- mente hibridizam quano há um grau suficiente de complementaridade para evitar ligação não-específica do composto anti-sentido a seqüências de áci- do nucléico não-alvo sob condições nas quais se deseja ligação específica, isto é, sob condições fisiológicas no caso de testes in vivo ou tratamento te- rapêutico, e sob condições nas quais são realizados testes no caso de testes in vitro.
Conforme usado aqui, neste requerimento de patente, "condi- ções de estringente hibridização" ou "condições estringentes" se refere a condições sob as quais um composto anti-sentido hibridizará a sua seqüên- cia alvo, mas a um número mínimo de outras seqüências. Condições estrin- gentes são seqüência-dependentes e serão diferentes em diferentes circuns- tâncias, e "condições estringentes" sob as quais compostos anti-sentido hi- bridizam a uma seqüência alvo são determinadas pela natureza e composi- ção dos compostos anti-sentido e os testes nos quais estão sendo investiga- dos.
.3. Complementaridade
É entendido na técnica que a incorporação de modificações de afinidade de nucleotídeo podem permitir um maior número de combinações inadequadas comparadas com um composto não modificado. Similarmente, algumas seqüências de oligonucleotídeos podem ser mais tolerantes a com- binações inadequadas do que outras seqüências de oligonucleotídeos. Uma pessoa com conhecimento regular da técnica é capaz de determinar um nú- mero apropriado de combinações inadequadas entre oligonucleotídeos, ou entre um oligonucleotídeo e um ácido nucléico alvo, tal como determinar a temperatura de fusão (Tm). Tm ou ATm podem ser calculadas por técnicas que são familiares a uma pessoa com conhecimento regular da arte. Por exemplo, técnicas descritas por Freier et al. (Nucleic Acids Research, 1997, .25, 22: 4429-4443) possibilitam que uma pessoa com conhecimento regular da arte avalie modificações de nucleotídeos por sua capacidade para au- mentar a temperatura de fusão de um dúplex RNA:DNA. .4. Identidade
Compostos anti-sentido, ou uma porção dos mesmos, podem ter uma percentagem de identidade definida por um NO de SEQ ID1 ou um composto tendo um número Isis específico. Conforme usado aqui, neste re- querimento de patente, uma seqüência é idêntica à seqüência revelada aqui, neste requerimento de patente, se tiver a mesma capacidade de pareamento de nucleobase. Por exemplo, um RNA o qual contém uracila ao invés de ti- midina nas seqüências reveladas dos compostos descritos aqui, neste re- querimento de patente, seria considerado idêntico uma vez que ambas pa- reiam com adenina. Esta identidade pode ser sobre toda a extensão do composto oligomérico, ou em uma porção do composto anti-sentido (por e- xemplo, nucleobases 1-20 de um 27-mero podem ser comparadas com um .20-mero para determinar a percentagem de identidade do composto oligo- mérico com o NO de SEQ ID. Deve ser entendido por aqueles versados na técnica que um composto anti-sentido não precisa ter uma seqüência idênti- ca àquelas descritas aqui, neste requerimento de patente, para funcionar de modo similar ao composto anti-sentido descrito aqui, neste requerimento de patente. Versões encurtadas de compostos anti-sentido ensinadas aqui, nes- te requerimento de patente, ou versões não-idênticas dos compostos anti- sentido ensinados aqui, neste requerimento de patente, também são propor- cionadas aqui, neste requerimento de patente. Versões não-idênticas são aquelas em que cada base não tem a mesma atividade de pareamento que os compostos anti-sentido revelados aqui, neste requerimento de patente. Bases não têm a mesma atividade de pareamento sendo mais curtas ou tendo no mínimo um sítio abásico. Alternativamente, uma versão não- idêntica pode incluir no mínimo uma base substituída com uma diferente ba- se com atividade de pareamento diferente (por exemplo, G pode ser substi- tuída por C, A, ou Τ). A percentagem de identidade é calculada de acordo com o número de bases que têm pareamento de base idêntico correspon- dendo ao NO de SEQ ID ou composto anti-sentido ao qual está sendo com- parada. As bases não-idênticas podem estar adjacentes umas às outras, dispersadas através do oligonucleotídeo, ou ambas.
Por exemplo, um 16-mero tendo uma mesma seqüência que nucleobases 2-17 de um 20-mero é 80% idêntico ao 20-mero. Alternativa- mente, um 20-mero contendo quatro nucleobases não idênticas ao 20-mero também é 80% idêntico ao 20-mero. Um 14-mero tendo uma mesma se- qüência que nucleobases 1-14 de um 18-mero é 78% idêntico ao 18-mero. Semelhantes cálculos estão bem dentro da capacidade daqueles versados na técnica.
A percentagem de identidade se baseia na percentagem de nu- cleobases na seqüência original presente em uma porção da seqüência mo- dificada. Portanto, um composto anti-sentido de 30 nucleobases compreen- dendo a seqüência inteira do complemento de um segmento alvo ativo de 20 nucleobase teria uma porção de 100% de identidade com o complemento do segmento alvo ativo de 20 nucleobases, enquanto adicionalmente compre- endendo uma porção de 10 nucleobases adicional. No contexto da presente descrição, o complemento de um segmento alvo ativo pode constituir uma única porção. Em modalidades preferenciais, os oligonucleotídeos são pro- porcionados aqui, neste requerimento de patente, no mínimo 80%, no míni- mo 85%, no mínimo 90%, no mínimo 95%, no mínimo 96%, no mínimo 97%, no mínimo 98%, no mínimo 99% ou 100% idêntico a no mínimo uma porção do complemento dos segmentos alvo ativos apresentados aqui, neste reque- rimento de patente.
E. Ácidos Nucléicos Alvo, Regiões e Segmentos
Em algumas modalidades, compostos anti-sentido curtos podem ser designados para ter por alvo qualquer ácido nucléico alvo. Em algumas modalidades, o ácido nucléico alvo codifica um alvo que é clinicamente rele- vante. Em semelhantes modalidades, modulação do ácido nucléico alvo re- sulta em benefício clínico. Alguns ácidos nucléicos alvo incluem, mas não estão limitados a, os ácidos nucléicos alvo ilustrados na Tabela 1.
Em algumas modalidades, um ácido nucléico alvo é uma molé- cula de ácido nucléico codificando ApoB. Moléculas de ácido nucléico que codificam ApoB incluem, sem limitação, SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 2.
Em algumas modalidades, um ácido nucléico alvo é uma molé- cula de ácido nucléico codificando SGLT2. Moléculas de ácido nucléico que codificam SGLT2 incluem, sem limitação, SEQ ID NO: 3.
Em algumas modalidades, um ácido nucléico alvo é uma molé- cuia de ácido nucléico codificando PCSK9. Moléculas de ácido nucléico que codificam PCSK9 incluem, sem limitação, SEQ ID NO: 4.
Em algumas modalidades, um ácido nucléico alvo é uma molé- cula de ácido nucléico codificando SOD1. Moléculas de ácido nucléico que codificam SOD1 incluem, sem limitação, SEQ ID NO: 5. Em algumas modalidades, um ácido nucléico alvo é uma molé-
cula de ácido nucléico codificando CRP. Moléculas de ácido nucléico que codificam CRP incluem, sem limitação, SEQ ID NO: 6.
Em algumas modalidades, um ácido nucléico alvo é uma molé- cula de ácido nucléico codificando GCCR. Moléculas de ácido nucléico que codificam GCCR incluem, sem limitação, SEQ ID NO: 7 e SEQ ID NO: 8.
Em algumas modalidades, um ácido nucléico alvo é uma molé- cula de ácido nucléico codificando GCGR. Moléculas de ácido nucléico que codificam GCGR incluem, sem limitação, SEQ ID NO: 9.
Em algumas modalidades, um ácido nucléico alvo é uma molé- cuia de ácido nucléico codificando DGAT2. Moléculas de ácido nucléico que codificam DGAT2 incluem, sem limitação, SEQ ID NO: 10.
Em algumas modalidades, um ácido nucléico alvo é uma molé- cula de ácido nucléico codificando PTP1B. Moléculas de ácido nucléico que codificam PTP1B incluem, sem limitação, SEQ ID NO: 11 e SEQ ID NO: 12. Em algumas modalidades, um ácido nucléico alvo é uma molé-
cula de ácido nucléico codificando PTEN. Moléculas de ácido nucléico que codificam PTEN incluem, sem limitação, SEQ ID NO: 14 ou SEQ ID NO: 15. Tabela 1: Alguns Ácidos Nucléicos Alvo
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O processo de direcionamento geralmente inclui determinação de no mínimo uma região, segmento, ou sítio alvo dentro do ácido nucléico alvo para a interação anti-sentido ocorrer de tal modo que o efeito desejado venha a resultar.
Em algumas modalidades, o nucleotídeo 5'-most de uma região alvo é o sítio alvo 5' de um composto anti-sentido curto e o nucleotídeo 3'- most de uma região alvo é o sítio alvo 3' do mesmo composto anti-sentido curto. Em algumas modalidades, o nucleotídeo 5'-most de uma região alvo é o sítio alvo 5' de um composto anti-sentido curto e o nucleotídeo 3'-most de uma região alvo é o sítio alvo 3' de um composto anti-sentido curto diferente. Em algumas modalidades, uma região alvo compreende uma seqüência de nucleotídeos dentro de 10, 15, ou 20 nucleotídeos de um sítio alvo 5' ou um sítio alvo 3'. Em algumas modalidades, uma região alvo é uma região estru- turalmente definida do ácido nucléico. Por exemplo, em algumas modalida- des semelhantes, uma região alvo pode englobar uma UTR 3', uma UTR 5', um éxon, um íntron, uma região codificante, uma região de iniciação de translação, região de terminação de translação, ou outra região de ácido nu- cléico definida.
As localizações sobre o ácido nucléico alvo definido por ter um ou mais compostos anti-sentido curtos ativos dirigidos para este são referi- das como "segmentos alvo ativos." Em algumas modalidades, o ácido nu- cléico alvo tendo um ou mais compostos anti-sentido curtos ativos dirigidos para este é um RNA-alvo. Quando um segmento alvo ativo é definido por compostos anti-sentido curtos múltiplos, os compostos são preferencialmen- te separados por não mais de cerca de 10 nucleotídeos sobre a seqüência alvo, mais preferencialmente não mais de cerca de 5 nucleotídeos sobre a seqüência alvo, ainda mais preferencialmente os compostos anti-sentido curtos são contíguos, o mais preferencialmente os compostos anti-sentido curtos estão se sobrepondo. Pode haver substancial variação na atividade (por exemplo, conforme definido por percentagem de inibição) dos compos- tos anti-sentido curtos dentro de um segmento alvo ativo. Compostos anti- sentido curtos ativos são aqueles que modulam a expressão de seu ácido nucléico alvo, incluindo mas não limitados à um RNA-alvo. Compostos anti- sentido curtos ativos inibem a expressão de seu RNA-alvo no mínimo 10%, preferencialmente 20%. Em uma modalidade preferencial, no mínimo cerca de 50%, preferencialmente cerca de 70% dos compostos anti-sentido curtos dirigidos para o segmento alvo ativo modula a expressão de seu RNA-alvo no mínimo 40%. Em uma modalidade mais preferencial, o nível de inibição requerido para definir um composto anti-sentido curto ativo é definido com base nos resultados da triagem usada para definir os segmentos alvo adi- cionais.
Um segmento alvo adequado é no mínimo cerca de uma porção de 8 nucleobases de uma região alvo para a qual um composto anti-sentido curto ativo é dirigido. Segmentos alvo podem incluir seqüências de DNA ou de RNA que compreendem no mínimo as 8 nucleobases consecutivas do término 5' de um dos segmentos alvo ilustrativos (as nucleobases remanes- centes sendo um trecho consecutivo do mesmo DNA ou RNA inicinando i- mediatamente a montante do término 5' do segmento alvo e continuando até o DNA ou RNA compreender cerca de 8 a cerca de 16 nucleobases). Seg- mentos alvo também são representados por seqüências de DNA ou RNA que compreendem no mínimo as 8 nucleobases consecutivas do término 3' de um dos segmentos alvo ilustrativos (as nucleobases remanescentes sen- do um trecho consecutivo do mesmo DNA ou RNA inicinando imediatamente a jusante do término 3' do segmento alvo e continuando até o DNA ou RNA compreender cerca de 8 a cerca de 16 nucleobases). Também é entendido que segmentos alvo anti-sentido podem ser representados por seqüências de DNA ou RNA que compreendem no mínimo 8 nucleobases consecutivas de uma porção interna da seqüência de um segmento alvo ilustrativo, e po- dem se estender em qualquer uma ou em ambas as direções até o compos- to anti-sentido curto compreender cerca de 8 a cerca de 16 nucleobases. Uma pessoa tendo conhecimento da técnica equipada com os segmentos alvo ilustrados aqui, neste requerimento de patente, será capaz, sem indevi- da experimentação, de identificar segmentos alvo adicionais.
Uma vez que uma ou mais regiões, segmentos ou sítios alvo tenham sido identificados, são escolhidos compostos anti-sentido curtos os quais são suficientemente complementares ao alvo, isto é, hibridizam sufici- entemente bem e com suficiente especificidade, para dar o efeito desejado.
Os compostos anti-sentido curtos também podem ser dirigidos para regiões da seqüência de nucleobases alvo compreendendo quaisquer nucleobases consecutivas de 8 a 16 nucleobases de extensão ao longo da molécula de ácido nucléico alvo.
Segmentos alvo de 8 a 16 nucleobases de extensão compreen- dendo um trecho de no mínimo oito (8) nucleobases consecutivas seleciona- das entre dentro dos segmentos alvo ilustrativos são considerados como sendo adequados para direcionamento também. Portanto, os compostos anti-sentido curtos também podem englovar 8 a 16 nucleobases dentro dos segmentos identificados aqui, neste requerimento de patente, como inician- do em um sítio alvo 5' em particular. Qualquer segmento de 8, 9, 10, 11, ou mais preferencialmente 12. 13, 14, 15 ou 16 nucleobases contíguas em um perímetro de 50, preferencialmente 25, mais preferencialmente 16 nucleoba- ses em torno destas regiões também são considerados como sendo ade- quados para direcionamento.
Em uma modalidade adicional, os "segmentos alvo adequados" identificados aqui, neste requerimento de patente, podem ser empregados em uma triagem para compostos anti-sentido curtos adicionais que modulam a expressão de um ácido nucléico alvo. "Moduladores" são os compostos que reduzem ou aumentam a expressão de um ácido nucléico alvo e os quais compreendem no mínimo uma porção de 8 nucleobases a qual é com- plementar a um segmento alvo. O método de triagem compreende as etapas de contactar um segmento alvo de um ácido nucléico com um ou mais mo- duladores candidatos, e selecionar um ou mais moduladores candidatos os quais reduzem ou aumentam a expressão de um ácido nucléico alvo. Uma vez que se mostra que o modulador candidato ou os moduladores candida- tos são capazes de modular (por exemplo, ou reduzir ou aumentar) a ex- pressão de um ácido nucléico alvo, o modulador pode ser então empregado em estudos investigativos adicionais da função do alvo, ou para uso como um agente de pesquisa, diagnóstico, ou terapêutico de acordo com a pre- sente invenção.
Para todos os compostos anti-sentido curtos discutidos aqui, neste requerimento de patente, seqüência, monômero, modificação mono- mérica, e ligação monomérica podem cada ser selecionados independente- mente. Em algumas modalidades, compostos anti-sentido curtos são descri- tos por um motivo. Em semelhantes modalidades, qualquer motivo pode ser usado com qualquer seqüência, quer ou não a seqüência e/ou o motivo seja especificamente revelado aqui, neste requerimento de patente. Em algumas modalidades, compostos anti-sentido curtos compreendem modificações que não são receptivas a descrição por motivo (por exemplo, compostos anti- sentido curtos compreendendo várias modificações e/ou ligações diferentes em várias posições em todo o composto). As combinações referidas podem ser incorporadas a qualquer seqüência, que ou não seja revelada aqui, neste requerimento de patente. A listagem de seqüência acompanhando este ar- quivamento proporciona algumas seqüências de ácidos nucléicos indepen- dentes de modificação química. Embora esta listagem identifique cada se- qüência como ou "RNA" ou "DNA" conforme requerido, na realidade, estas seqüências podem ser modificadas com qualquer combinação de motivos e/ou modificações químicas.
Em algumas modalidades, compostos anti-sentido curtos com- preendem no mínimo um monômero modificado de alta afinidade. Em algu- mas modalidades, são proporcionados compostos anti-sentido curtos dirigi- dos para moléculas de ácido nucléico codificando alvos incluindo, mas não- Iimitadas a, ApoB-100 (também conhecida como APOB; antígeno Ag(x); a- poB-48; apolipoproteína B; apolipoproteína B-100; apolipoproteína B-48), GCGR (também conhecido como receptor de glucagon; GR), CRP, DGAT2, GCCR, PCSK9, PTEN, PTP1B, SGLT2, e SOD1. Em algumas modalidades referidas, os compostos anti-sentido curtos referidos são dirigidos para um molécula de ácido nucléico codificando quaisquer destes alvos. F. Alguns Alvos
Em algumas modalidades, compostos anti-sentido curtos podem ser designados para modular qualquer alvo. Em algumas modalidades, o alvo é clinicamente relevante. Em semelhantes modalidades, modulação do alvo resulta em benefício clínico. Alguns alvos são preferencialmente ex- pressados no rim. Alguns alvos são preferencialmente expressados no fíga- do. Alguns alvos são associados com um distúrbio metabólico. Alguns alvos são associados com um distúrbio cardiovascular. Em algumas modalidades, um alvo é selecionado entre: ApoB, SGLT2, PCSK9, SOD1, CRP, GCCR, GCGR, DGAT2, PTP1B, e PTEN. Em algumas modalidades, um alvo é sele- cionado entre: ApoB, SGLT2, PCSK9, SOD1, CRP, GCCR, GCGR, DGAT2, e PTP1B. Em algumas modalidades, um alvo é qualquer proteína diferente de SGLT2.
Em algumas modalidades, compostos anti-sentido curtos apre- sentam redução de RNA-alvo específico do fígado e do rim in vivo. As pro- priedade referidas tornam estes compostos anti-sentido curtos particular- mente úteis para inibição de muitos RNAs alvo envolvidos em doenças me- tabólicas e cardiovasculares. Portanto, são proporcionados aqui, neste re- querimento de patente, métodos para tratar metabólicos cardiovasculares ou distúrbios contactando os referidos tecidos do rim ou do fígado com compos- tos anti-sentido curtos dirigidos para RNAs associados com os referidos dis- túrbios. Portanto, também são proporcionados métodos para melhorar quaisquer de uma variedade de indicações de doenças metabólicas ou car- diovasculares com os compostos anti-sentido curtos da presente invenção. .1. ApoB
ApoB (também conhecida como apolipoproteína B-100; ApoB-100, apolipoproteína B-48; ApoB-48 e antígeno Ag(x)), é uma grande glico- proteína que serve a uma função indispensável na montagem e secreção de lipídeos e no transporte e captação mediada por receptores e liberação de classes distintas de lipoproteínas. ApoB realiza uma variedade de atividades, da absorção e processamento de lipídeos dietéticos à regulação dos níveis de lipoproteínas circulantes. Esta última propriedade fundamenta sua rele- vância em termos de suscetibilidade a aterosclerose, a qual é altamente cor- relacionada com a concentração ambiente de lipoproteínas contendo ApoB. ApoB-100 é o principal componente protéico de colesterol LDL e contém o domínio requerido para interação desta especie de lipoproteína com o recep- tor de LDL. Níveis elevados de colesterol LDL são um fator de risco para doença cardiovascular, inclusive aterosclerose. Definições
"ApoB" é o produto genético ou proteína cuja expressão deve ser modulada por administração de um composto anti-sentido curto.
"Ácido nucléico ApoB" significa qualquer ácido nucléico codifi- cando ApoB. Por exemplo, em determinadas modalidades, um ácido nucléi- co ApoB inclui, sem limitação, uma seqüência de DNA codificando ApoB, uma seqüência de RNA transcrita de DNA codificando ApoB, e uma seüên- cia de RNAm codificando ApoB. "RNAm ApoB" significa um RNAm codificando ApoB. Indicações Terapêuticas de ApoB
Em algumas modalidades, a invenção proporciona métodos para modular a expressão de ApoB em um indivíduo compreendendo administrar um composto anti-sentido curto dirigido para um ácido nucléico ApoB. Em algumas modalidades, a invenção proporciona métodos para tratar um indi- víduo compreendendo administrar uma ou mais composições farmacêuticas compreendendo um composto anti-sentido curto dirigido para um ácido nu- cléico ApoB. Em algumas modalidades, o indivíduo tem hipercolesterolemia, hipercolesterolemia não-familiar, hipercolesterolemia familiar, hipercolestero- lemia familiar heterozigótica, hipercolesterolemia familiar homozigótica, disli- pidemia mista, aterosclerose, um risco de desenvolver aterosclerose, doença cardíaca coronária, um histórico de doença cardíaca coronária, doença car- díaca coronária de início precoce, um ou mais fatores de risco para doença cardíaca coronária, diabetes tipo II, diabetes tipo Il com dislipidemia, dislipi- demia, hipertrigliceridemia, hiperlipidemia, acidemia hipergraxa, esteatose hepática, esteatohepatite não-alcoólica, ou doença hepática graxa não- alcoólica.
Diretrizes para terapia de redução de lipídeo foram estabeleci- das em 2001 pelo Terceiro Painel de Tratamento de Adulto (ATP III) do Pro- grama Nacional de Educação sobre o Colesterol (NCEP), e atualizadas em .2004 (Grundy et al., Circulation, 2004, 110, 227-239). As diretrizes incluem obter um perfila de lipoproteína completo, tipicamente depois de um jejum de .9 a 12 horas, para determinação dos níveis de colesterol LDL, colesterol to- tal, e colesterol HDL. De acordo com as diretrizes mais recentemente esta- belecidas, níveis de colesterol LDL de 130 a 159 mg/dL, de 160 a 189 mg/dL, e maiores do que ou iguais a 190 mg/dL são considerados limítrofe alto, alto, e muito alto, respectivamente. Níveis de colesterol total de 200 a .239 e maior do que ou igual a 240 mg/dL são considerados limítrofe alto e alto, respectivamente. Níveis de colesterol HDL de menos de 40 mg/dL são considerados baixos.
Em algumas modalidades, o indivíduo foi identificado como ne- 77
cessitando de terapia de redução de lipídeo. Em algumas modalidades refe- ridas, o indivíduo foi identificado como necessitando de terapia de redução de lipídeo de acordo com as diretrizes estabelecidas em 2001 pelo Terceiro Painel de Tratamento do Adulto (ATP III) do Programa Nacional de Educa- ção sobre o Colesterol (NCEP), e atualizado em 2004 (Grundy et al., Circula- tion, 2004, 110, 227-239). Em algumas modalidades referidas, o indivíduo que necessita de terapia de redução de lipídeo tem colesterol LDL acima de .190 mg/dL. Em algumas modalidades referidas, o indivíduo que necessita de terapia de redução de lipídeo tem colesterol LDL acima de 160 mg/dL. Em algumas modalidades referidas, o indivíduo que necessita de terapia de re- dução de lipídeo tem colesterol LDL acima de 130 mg/dL. Em algumas mo- dalidades referidas, o indivíduo que necessita de terapia de redução de lipí- deo tem colesterol LDL acima de 100 mg/dL. Em algumas modalidades refe- ridas, o indivíduo que necessita de terapia de redução de lipídeo deve man- ter o colesterol LDL abaixo de 160 mg/dL. Em algumas modalidades referi- das, o indivíduo que necessita de terapia de redução de lipídeo deve manter o colesterol LDL abaixo de 130 mg/dL. Em algumas modalidades referidas, o indivíduo que necessita de terapia de redução de lipídeo deve manter o co- lesterol LDL abaixo de 100 mg/dL. Em algumas modalidades referidas, o indivíduo deve manter o colesterol LDL abaixo de 70 mg/dL.
Em algumas modalidades, a invenção proporciona métodos para reduzir ApoB em um indivíduo. Em algumas modalidades, a invenção pro- porciona métodos para reduzir lipoproteína contendo ApoB em um indivíduo. Em algumas modalidades a invenção proporciona métodos para reduzir co- Iesterol LDL em um indivíduo. Em algumas modalidades a invenção propor- ciona métodos para reduzir colesterol VLDL em um indivíduo. Em algumas modalidades a invenção proporciona métodos para reduzir colesterol IDL em um indivíduo. Em algumas modalidades a invenção proporciona métodos para reduzir colesterol não HDL em um indivíduo. Em algumas modalidades a invenção proporciona métodos para reduzir Lp(a) em um indivíduo. Em algumas modalidades a invenção proporciona métodos para reduzir triglice- rídeo sérico em um indivíduo. Em algumas modalidades a invenção propor- ciona métodos para reduzir triglicerídeo hepático em um indivíduo. Em al- gumas modalidades a invenção proporciona métodos para reduzir o coleste- rol LDL oxidado em um indivíduo. Em algumas modalidades a invenção pro- porciona métodos para reduzir pequenas partículas de LDL em um indivíduo.
Em algumas modalidades a invenção proporciona métodos para reduzir pe- quenas partículas de VLDL em um indivíduo. Em algumas modalidades a invenção proporciona métodos para reduzir fosfolipídeos em um indivíduo. Em algumas modalidades a invenção proporciona métodos para reduzir fos- folipídeos oxidados em um indivíduo.
Em algumas modalidades a invenção proporciona métodos para reduzir a concentração de colesterol LDL oxidado em um sujeito. Em algu- mas modalidades referidas, a redução de ApoB, colesterol LDL, colesterol VLDL, colesterol IDL, colesterol total, colesterol não HDL, Lp(a), triglicerí- deos, ou colesterol LDL oxidado é, independentemente, selecionada entre no mínimo 10%, no mínimo 15%, no mínimo 20%, no mínimo 25%, no míni- mo 30%, no mínimo 35%, no mínimo 40%, no mínimo 45%, no mínimo 50%, no mínimo 55%, no mínimo 60%, no mínimo 65%, no mínimo 70%, no míni- mo 75%, no mínimo 80%, no mínimo 85%, no mínimo 90%, no mínimo 95%, e no mínimo 100%. Em algumas modalidades referidas, a redução de ApoB, colesterol LDL, colesterol VLDL, colesterol IDL, colesterol total, colesterol não HDL, Lp(a), triglicerídeos, ou colesterol LDL oxidado é, independente- mente, selecionada entre no mínimo 20%, no mínimo 30%, no mínimo 40%, no mínimo 50%, no mínimo 60%, e no mínimo 70%. Em algumas modalida- des referidas, a redução de ApoB, colesterol LDL, colesterol VLDL, coleste- rol IDL, colesterol total, colesterol não HDL, Lp(a), triglicerídeos, ou coleste- rol LDL oxidado é, independentemente, selecionada entre no mínimo 40%, no mínimo 50%, no mínimo 60%, e no mínimo 70%.
Em algumas modalidades, a invenção proporciona método para aumentar a concentração de colesterol HDL em um sujeito.
Em algumas modalidades, os métodos proporcionados pela pre- sente invenção não reduzem o colesterol HDL. Em algumas modalidades, os métodos proporcionados pela presente invenção não resultam em acúmulo de lipídeos no fígado. Em algumas modalidades, os métodos proporcionados pela presente invenção não causam esteatose hepática.
Em algumas modalidades, a invenção proporciona métodos para reduzir a concentração de ApoB em um sujeito ao mesmo tempo que redu- zindo efeitos colaterais associados com o tratamento. Em algumas modali- dades referidas, um efeito colateral é toxicidade hepática. Em algumas mo- dalidades referidas, um efeito colateral é função hepática anormal. Em al- gumas modalidades referidas, um efeito colateral é alanina aminotransferase elevada (ALT). Em algumas modalidades referidas, um efeito colateral é as- partato aminotransferase elevada (AST).
Em algumas modalidades, a invenção proporciona métodos para reduzir a concentração de ApoB em um sujeito que não esteja atingindo ní- veis alvo de colesterol LDL como um resultado da terapia de redução de lipí- deo. Em algumas modalidades referidas, um composto anti-sentido curto dirigido para um ácido nucléico ApoB é o único agente de redução de lipídeo administrado ao sujeito. Em algumas modalidades referidas, o sujeito não cumpriu a terapia de redução de lipídeo recomendada. Em algumas modali- dades referidas, uma composição farmacêutica da invenção é co- administrada com uma terapia de redução de lipídeo diferente adicional. Em algumas modalidades referidas, uma terapia adicional de redução de lipídeo é aferese de LDL. Em algumas modalidades referidas, uma terapia adicional de redução de lipídeo é uma estatina. Em algumas modalidades referidas, uma terapia adicional de redução de lipídeo é ezetimibe.
Em algumas modalidades, a invenção proporciona métodos para reduzir a concentração de ApoB em um sujeito intolerante à estatina. Em algumas modalidades referidas, o sujeito tem aumentos da concentração de creatina quinase como um resultado da administração de estatina. Em algu- mas modalidades referidas, o sujeito tem anormalidades da função hepática como um resultado da administração de estatina. Em algumas modalidades referidas, o sujeito tem dores musculares como um resultado da administra- ção de estatina. Em algumas modalidades referidas, o sujeito tem efeitos colaterais do sistema nervoso central como um resultado da administração de estatina. Em algumas modalidades, o sujeito não cumpriu a administra- ção de estatina recomendada.
Em algumas modalidades, a invenção proporciona métodos para reduzir os triglicerídeos hepáticos em um sujeito. Em algumas modalidades referidas, o sujeito tem triglicerídeos hepáticos elevados. Em algumas moda- lidades referidas, o sujeito tem esteatohepatite. Em algumas modalidades referidas, o sujeito tem esteatose. Em algumas modalidades referidas, os níveis de triglicerídeos hepáticos são medidos por eatudo por imagens de ressonância magnética.
Em algumas modalidades, a invenção proporciona métodos para reduzir o risco de doença cardíaca coronária em um sujeito. Em algumas modalidades a invenção proporciona métodos para retardar a progressão de aterosclerose em um sujeito. Em algumas modalidades referidas, a invenção proporciona métodos para interromper a progressão de aterosclerose em um sujeito. Em algumas modalidades referidas, a invenção proporciona métodos para reduzir o tamanho e/ou a prevalência de placas ateroscleróticas em um sujeito. Em algumas modalidades os métodos proporcionados reduzem o risco de desenvolver aterosclerose de um sujeito.
Em algumas modalidades os métodos proporcionados melhoram o resultado cardiovascular em um sujeito. Em algumas modalidades referi- das, o resultado cardiovascular aprimorado é a redução do risco de desen- volver doença cardíaca coronária. Em algumas modalidades referidas, o re- sultado cardiovascular aprimorado é uma redução na ocorrência de um ou mais eventos cardiovasculares importantes, os quais incluem, mas não es- tão limitados a, morte, enfarte do miocárdio, reenfarte, derrame, choque car- diogênico, edema pulmonar, parada cardíaca, e disritmia atrial. Em algumas modalidades referidas, o resultado cardiovascular aprimorado é evidenciado por melhora da espessura média da íntima da carótida. Em algumas modali- dades referidas, melhora da espessura média da íntima da carótida é uma redução da espessura. Em algumas modalidades referidas, melhora da es- pessura média da íntima da carótida é uma prevenção de um aumento da espessura média da íntima. Em algumas modalidades uma composição farmacêutica com- preendendo um composto anti-sentido curto dirigido para um ácido nucléico ApoB é para uso em terapia. Em algumas modalidades, a terapia é a redu- ção de colesterol LDL1 ApoB, colesterol VLDL, colesterol IDL, colesterol não HDL, Lp(a), triglicerídeo sérico, triglicerídeo hepático, colesterol LDL oxida- do, partículas pequenas de LDL, partículas pequenas de VLDL, fosfolipí- deos, ou fosfolipídeos oxidados em um indivíduo. Em algumas modalidades, a terapia é o tratamento de hipercolesterolemia, hipercolesterolemia não- familiar, hipercolesterolemia familiar, hipercolesterolemia familiar heterozigó- tica, hipercolesterolemia familiar homozigótica, dislipidemia mista, ateroscle- rose, um risco de desenvolver aterosclerose, doença cardíaca coronária, um histórico de doença cardíaca coronária, doença cardíaca coronária de início precoce, um ou mais fatores de risco para doença cardíaca coronária, diabe- tes tipo II, diabetes tipo Il com dislipidemia, dislipidemia, hipertrigliceridemia, hiperlipidemia, acidemia hipergraxa, esteatose hepática, esteatohepatite não-alcoólica, ou doença hepática graxa não-alcoólica. Em modalidades adi- cionais, a terapia é a redução do risco de doença cardíaca coronária. Em algumas modalidades a terapia é a prevenção de aterosclerose. Em algu- mas modalidades, a terapia é a prevenção de doença cardíaca coronária.
Em algumas modalidades uma composição farmacêutica com- preendendo um composto anti-sentido curto dirigido para um ácido nucléico ApoB é usado para a preparação de um medicamento para reduzir colesterol LDL, ApoB, colesterol VLDL, colesterol IDL, colesterol não HDL, Lp(a), trigli- cerídeo sérico, triglicerídeo hepático, colesterol LDL oxidado, partículas pe- quenas de LDL, partículas pequenas de VLDL, fosfolipídeos, ou fosfolipídeos oxidados em um indivíduo. Em algumas modalidades, composição farma- cêutica compreendendo um composto anti-sentido curto dirigido para um ácido nucléico ApoB é usado para a preparação de um medicamento para reduzir o risco de doença cardíaca coronária. Em algumas modalidades um composto anti-sentido curto dirigido para um ácido nucléico ApoB é usado para a preparação de um medicamento para o tratamento de hipercolestero- lemia, hipercolesterolemia não-familiar, hipercolesterolemia familiar, hiperco- Iesterolemia familiar heterozigótica, hipercolesterolemia familiar homozigóti- ca, dislipidemia mista, aterosclerose, um risco de desenvolver aterosclerose, doença cardíaca coronária, um histórico de doença cardíaca coronária, do- ença cardíaca coronária de início precoce, um ou mais fatores de risco para doença cardíaca coronária, diabetes tipo II, diabetes tipo Il com dislipidemia, dislipidemia, hipertrigliceridemia, hiperlipidemia, acidemia hipergraxa, estea- tose hepática, esteatohepatite não-alcoólica, ou doença hepática graxa não- alcoólica.
Terapias de Combinação de ApoB Em algumas modalidades, uma ou mais composições farmacêu- ticas compreendendo um composto anti-sentido curto dirigido para um ácido nucléico ApoB são co-administradas com um ou mais outros agentes farma- cêuticos. Em algumas modalidades, um ou mais outros agentes farmacêuti- cos referidos são designados para tratar a mesma doença ou condição que a uma ou mais composições farmacêuticas da presente invenção. Em algu- mas modalidades referidas, um ou mais agentes farmacêuticos são agentes de redução de lipídeo. Em algumas modalidades, um ou mais outros agen- tes farmacêuticos referidos são designados para tratar uma doença ou con- dição diferentes como a uma ou mais composições farmacêuticas da pre- sente invenção. Em algumas modalidades, um ou mais outros agentes far- macêuticos referidos são designados para tratar um efeito indesejado de uma ou mais composições farmacêuticas da presente invenção. Em algu- mas modalidades, uma ou mais composições farmacêuticas da presente invenção são co-administradas com outro agente farmacêutico para tratar um efeito indesejado deste outro agente farmacêutico. Em algumas modali- dades, uma ou mais composições farmacêuticas da presente invenção e um ou mais outros agentes farmacêuticos são administrados ao mesmo tempo. Em algumas modalidades, uma ou mais composições farmacêuticas da pre- sente invenção e um ou mais outros agentes farmacêuticos são administra- dos em momentos diferentes. Em algumas modalidades, uma ou mais com- posições farmacêuticas da presente invenção e um ou mais outros agentes farmacêuticos são preparados juntos em uma única formulação. Em algu- mas modalidades, uma ou mais composições farmacêuticas da presente invenção e um ou mais outros agentes farmacêuticos são preparados sepa- radamente.
Em algumas modalidades, agentes farmacêuticos que podem ser co-administrados com uma composição farmacêutica compreendendo um composto anti-sentido curto dirigido para um ácido nucléico ApoB inclu- em agentes de redução de lipídeo. Em algumas modalidades referidas, a- gentes farmacêuticos que podem ser co-administrados com uma composi- ção farmacêutica da presente invenção incluem, mas não estão limitados uma atorvastatina, sinvastatina, rosuvastatina, e ezetimibe. Em algumas modalidades referidas, o agente de redução de lipídeo é administrado antes da administração de uma composição farmacêutica da presente invenção. Em algumas modalidades referidas, o agente de redução de lipídeo é admi- nistrado depois da administração de uma composição farmacêutica da pre- sente invenção. Em algumas modalidades referidas, o agente de redução de lipídeo é administrado ao mesmo tempo que uma composição farmacêutica da presente invenção. Em algumas modalidades referidas, a dose de um agente de redução de lipídeo co-administrado é a mesma que a dose que seria administrada se o agente de redução de lipídeo fosse administrado sozinho. Em algumas modalidades referidas, a dose de um agente de redu- ção de lipídeo co-administrado é menor do que a dose que seria administra- da se o agente de redução de lipídeo fosse administrado sozinho. Em algu- mas modalidades referidas, a dose de um agente de redução de lipídeo co- administrado é maior do que a dose que seria administrada se o agente de redução de lipídeo fosse administrado sozinho.
Em algumas modalidades, um agente de redução de lipídeo co- administrado é um inibidor da HMG-CoA redutase. Em algumas modalidades referidas, o inibidor da HMG-CoA redutase é uma estatina. Em algumas mo- dalidades referidas, a estatina é selecionada entre atorvastatina, sinvastati- na, pravastatina, fluvastatina, e rosuvastatina.
Em algumas modalidades, um agente de redução de lipídeo co- administrado é um inibidor da absorção de colesterol. Em algumas modali- dades referidas, inibidor da absorção de colesterol é ezetimibe.
Em algumas modalidades, um agente de redução de lipídeo co- administrado é um inibidor da HMG-CoA redutase co-formulado e inibidor da absorção de colesterol. Em algumas modalidades referidas, o agente de re- dução de lipídeo co-formulado é ezetimibe/sinvastatina.
Em algumas modalidades, um agente de redução de lipídeo co- administrado é um inibidor protéico de transferência de triglicerídeos micros- sômicos (MTP inibidor).
Em algumas modalidades, um agente farmacêutico co- administrado é um seqüestrante de ácidos biliares. Em algumas modalida- des referidas, o seqüestrante de ácidos biliares é selecionado entre colesti- ramina, colestipol, e colesevelam.
Em algumas modalidades, um agente farmacêutico co- administrado é um ácido nicotínico. Em algumas modalidades referidas, o ácido nicotínico é selecionado entre ácido nicotínico de liberação imediata, ácido nicotínico de liberação prolongada, e ácido nicotínico de liberação gra- dual.
Em algumas modalidades, um agente farmacêutico co- administrado é um ácido fíbrico. Em algumas modalidades referidas, um áci- do fíbrico é selecionado entre genfibrozila, fenofibrato, clofibrato, bezafibrato, e ciprofibrato.
Exemplos adicionais de agentes farmacêuticos que podem ser co-administrados com uma composição farmacêutica compreendendo um composto anti-sentido curto dirigido para um ácido nucléico ApoB incluem, mas não estão limitados a, corticosteróides, incluindo mas não limitados à prednisona; imunoglobulinas, incluindo, mas não-limitadas à imunoglobulina intravenosa (IVIg); analgésicos (por exemplo, acetaminofen); agentes antiin- flamatórios, incluindo, mas não limitados à drogas antiinflamatórias não- esteróides (por exemplo, ibuprofeno, inibidores de COX-1, e inibidores de COX-2); salicilatos; antibióticos; antivirais; agentes antifúngicos; agentes an- tidiabéticos (por exemplo, biguanidas, inibidores de glucosidase, insulinas, sulfoniluréias, e tiazolidenodionas); modificadores adrenérgicos; diuréticos; hormônios (por exemplo, esteróides anabólicos, androgênio, estrogênio, cal- citonina, progestina, somatostan, e hormônios tiroidianos); imunomodulado- res; relaxantes musculares; antihistamínicos; agentes contra osteoporose (por exemplo, bifosfonatos, calcitonina, e estrogênios); prostaglandinas, a- gentes antineoplásicos; agentes psicoterápicos; sedativos; produtos de ar- busto venenoso dos Estados Unidos, semelhante ao sumagre venenoso ou espécie de sumagre venenoso; anticorpos; e vacinas.
Em algumas modalidades, uma composição farmacêutica com- preendendo um composto anti-sentido curto dirigido para um ácido nucléico ApoB pode ser administrada em combinação com uma terapia de redução de lipídeo. Em algumas modalidades referidas, uma terapia de redução de Iipideo é alteração terapêutica do estilo de vida. Em algumas modalidades referidas, uma terapia de redução de lipídeo é aferese de LDL.
Em uma modalidade, os compostos anti-sentido proporcionados aqui, neste requerimento de patente, podem ser usados para reduzir o nível de lipoproteínas contendo apolipoproteína B em um indivíduo humano. Con- forme usado aqui, neste requerimento de patente, "lipoproteína contendo apolipoproteína B" se refere a qualquer lipoproteína que tem apolipoproteína B como seu componente protéico, e entende-se que inclui LDL, VLDL, IDL, e lipoproteína(a). LDL, VLDL, IDL e Iipoproteína(a) cada contêm uma molécula de apolipoproteína B, portanto uma medida da apolipoproteína B sérica refle- te o número total destas lipoproteínas. Conforme é de conhecimento na téc- nica, cada uma das lipoproteínas supracitadas é aterogênica. Portanto, a redução de uma ou mais lipoproteínas contendo apolipoproteína B no soro pode proporcionar um benefício terapêutico a um indivíduo humano. Partícu- las de LDL pequenas são consideradas como sendo particularmente atero- gênicas em relação a partículas de LDL grandes, portanto a redução das partículas de LDL pequenas pode proporcionar um benefício terapêutico a um indivíduo humano. Parâmetros lipídicos adicionais também podem ser determinados em um sujeito. A redução da proporção colesterol total:HDL ou proporção LDL:HDL é uma aprimoramento clinicamente desejável na pro- porção do colesterol. Similarmente, é clinicamente desejável reduzir os trigli- cerídeos séricos em humanos que apresentam níveis lipídicos elevados.
Outras indicações de doença cardiovascular que podem ser me- didas em um sujeito incluem tamanho de partícula de LDL sérico; concentra- ção de ésteres colesterílicos de LDL sérico; composição de ésteres coleste- rílicos de LDL sérico; a extensão de poliinsaturação de de ésteres colesteríli- cos de LDL sérico; e serum HDL colesterol níveis. Conforme usado aqui, neste requerimento de patente, "tamanho de partícula de LDL sérico" se re- fere à classificação do tamanho de partícula de LDL sérico, que pode ser muito pequeno, pequeno, médio, ou grande, e é tipicamente expresso em g/pmol. No contexto da presente invenção, "concentração de ésteres coles- terílicos de LDL sérico" significa a quantidade de ésteres colesterílicos pre- sentes em partículas de LDL, e é tipicamente medida como mg/dL. No con- texto da presente invenção, "composição de ésteres colesterílicos de LDL sérico" é uma medida da percentagem de ácidos graxos de ésteres coleste- rílicos saturados, monoinsaturados e poliinsaturados presentes em partícu- las de LDL sérico. "Poliinsaturação de de ésteres colesterílicos de LDL séri- co" significa a percentagem de ácidos graxos de ésteres colesterílicos poliin- saturados em partículas de LDL sérico.
Métodos para obter amostras de soro ou plasma para análise e métodos de preparação das amostras de soro para permitir análise são de conhecimento geral daqueles versados na técnica. Com respeito a medições de lipoproteínas, colesterol, triglicerídeo e ésteres colesterílicos, os termos "soro" e "plasma" são usados aqui, neste requerimento de patente, de modo intercambiável.
Em outra modalidade, os compostos anti-sentido proporcionados aqui, neste requerimento de patente, podem ser usados para tratar distúr- bios metabólicos. Uma variedade de biomarcadores podem ser usados para avaliar doença metabólica. Por exemplo, os níveis de glicose sangüínea po- dem ser determinados por um médico ou mesmo pelo paciente usando um kit de teste ou glucômetro disponível comumente (por exemplo, o kit Ascen- sia ELITE®, Ascensia (Bayer), Tarrytown NY, ou Accucheck, Roche Diagnos- tics). Também pode ser medida a hemoglobina glicada (HbA1c). HbA1c é uma variante de hemoglobina menor estável formada in vivo através de modifica- ção pós-translacional por glicose, e contém predominantemente cadeias β de terminal de NH2 glicadas. Há uma forte correlação entre os níveis de HbA1c e os níveis médios de glicose sangüínea durante os 3 meses anterio- res. Portanto HbA1c é freqüentemente visualizada como o "padrão de ouro" para medir o controle da glicose sangüínea sustentada (Bunn, H.F. et al.,1978, Science. 200, 21-7). A HbA1c pode ser medida por HPLC de permuta iônica ou imunoensaio; kits de coleta de sangue doméstica e remessa para medição da HbAic estão atualmente amplamente disponíveis. A frutosamina sérica é outra medida de controle de glicose estável e pode ser medida por um método colorimétrico (Cobas Integra, Roche Diagnostics). Alguns Compostos Anti-sentido Curtos Dirigidos para um Ácido Nucléico A- po B
Em algumas modalidades, compostos anti-sentido curtos são dirigidos para um ácido nucléico ApoB tendo a seqüência do GENBANK® de Acesso Ne NM_000384.1, incorporada aqui, a este requerimento de patente, como SEQ ID NO: 1. Em algumas modalidades referidas, um composto anti- sentido curto dirigido para SEQ ID NO: 1 é no mínimo 90% complementar à SEQ ID NO: 1. Em algumas modalidades referidas, um composto anti- sentido curto dirigido para SEQ ID NO: 1 é no mínimo 95% complementar à SEQ ID NO: 1. Em algumas modalidades referidas, um composto anti- sentido curto dirigido para SEQ ID NO: 1 é 100% complementar à SEQ ID NO: 1. Em algumas modalidades, um composto anti-sentido curto dirigido para SEQ ID NO: 1 compreende uma seqüência de nucleotídeos seleciona- da entre as seqüências de nucleotídeos determinadas na Tabela 2 e na Ta- bela 3.
A seqüência de nucleotídeos determinada em cada NO de SEQ ID nas Tabelas 2 e 3 é independente de qualquer modificação para uma porção açúcar, um ligação monomérica, ou uma nucleobase. Deste modo, compostos anti-sentido curtos definidos por um NO de SEQ ID pode com- preender, independentemente, uma ou mais modificações para uma porção açúcar, uma ligação internucleosídeos, ou uma nucleobase. Compostos anti- sentido descrito pelo Número Isis (Isis NO.) indicam uma combinação de seqüência de nucleobases e uma ou mais modificações para uma porção açúcar, uma ligação internucleosídeos, ou uma nucleobase.
As Tabelas 2 e 3 ilustram exemplos de compostos anti-sentido curtos dirigidos para SEQ ID NO: 1. A Tabela 2 ilustra compostos anti- sentido curtos que são 100% complementares à SEQ ID NO: 1. A Tabela 3 ilustra compostos anti-sentido curtos que têm uma ou duas combinações inadequadas com respeito à SEQ ID NO: 1. A coluna com título 'motivo de gápmero' indica o motivo asa-gap-asa de cada um dos compostos anti- sentido curtos. O segmento de gap compreende 2'-desoxinucleotídeos e ca- da nucleotídeo de cada segmento de asa compreende um açúcar 2'- modificado. O açúcar 2'-modificado em particular também é indicado na co- luna de 'motivo de gápmero'. Por exemplo, '2-10-2 MOE' significa um motivo de gápmero 2-10-2, onde um segmento de gap de dez 2'-desoxinucleotídeos é flanqueado por segmentos de asa de dois nucleotídeos, onde os nucleotí- deos dos segmentos de asa são nucleotídeos 2'-MOE. Ligações internucleo- sídeos são fosforotioato. Os compostos anti-sentido curtos compreendem 5- metilcitidina ao invés de citosina não modificada, a menos que "citosina não modificada" esteja listada na coluna de motivo de gápmero, em cujo caso as citosinas indicadas são citosinas não modificadas. Por exemplo, "5-mC em gap somente" indica que o segmento de gap tem 5-metilcitosinas, ao passo que os segmentos de asa têm citosinas não modificadas.
Tabela 2: Compostos Anti-sentido Curtos dirigidos para SEQ ID NO: 1
<table>table see original document page 89</column></row><table> <table>table see original document page 90</column></row><table> <table>table see original document page 91</column></row><table> <table>table see original document page 92</column></row><table> <table>table see original document page 93</column></row><table> <table>table see original document page 94</column></row><table> <table>table see original document page 95</column></row><table> <table>table see original document page 96</column></row><table> <table>table see original document page 97</column></row><table> <table>table see original document page 98</column></row><table> Tabela 3: Compostos anti-sentido curtos dirigidos para SEQ ID NO: 1 e ten-
do 1 ou 2 combinações inadequadas
<table>table see original document page 98</column></row><table> <table>table see original document page 99</column></row><table> <table>table see original document page 100</column></row><table> <table>table see original document page 101</column></row><table>
Em algumas modalidades, uma região alvo é nucleotídeos 263- 278 de SEQ ID NO: 1. Em algumas modalidades referidas, compostos anti- sentido curtos dirigidos para nucleotídeos 263-278 de SEQ ID NO: 1 com- preendem uma seqüência de nucleotídeos selecionada entre SEQ ID NO: 16 ou 17. Em algumas modalidades referidas, um composto anti-sentido curto dirigido para nucleotídeos 263-278 de SEQ ID NO: 1 é selecionado entre o Ne ISIS 372816 ou 372894.
Em algumas modalidades, uma região alvo é nucleotídeos 428- 483 de SEQ ID NO: 1. Em algumas modalidades referidas, um composto anti-sentido curto dirigido para nucleotídeos 428-483 de SEQ ID NO: 1 com- preende uma seqüência de nucleotídeos selecionada entre SEQ ID NO 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, ou 27. Em algumas modalidades referidas, um composto anti-sentido curto dirigido para nucleotídeos 428-483 de SEQ ID NO: 1 é selecionado entre o N5 ISIS 372817, 372895, 372818, 372896, 372819, 372897, 372820, 372898, 372821, ou 372899.
Em algumas modalidades, uma região alvo é nucleotídeos 428- 458 de SEQ ID NO: 1. Em algumas modalidades referidas, um composto anti-sentido curto dirigido para nucleotídeos 428-458 de SEQ ID NO: 1 com- preende uma seqüência de nucleotídeos selecionada entre SEQ ID NO 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, ou 25. Em algumas modalidades referidas, um com- posto anti-sentido curto dirigido para nucleotídeos 428-458 de SEQ ID NO: 1 é selecionado entre o Nq ISIS 372817, 372895, 372818, 372896, 372819, 372897, 372820, ou 372898.
Em algumas modalidades, uma região alvo é nucleotídeos 468- 483 de SEQ ID NO: 1. Em algumas modalidades referidas, um composto anti-sentido curto dirigido para nucleotídeos 468-483 de SEQ ID NO: 1 com- preende uma seqüência de nucleotídeos selecionada entre SEQ ID NO 26 ou 27. Em algumas modalidades referidas, um composto anti-sentido curto dirigido para nucleotídeos 468-483 de SEQ ID NO: 1 é selecionado entre o Ne ISIS 372821 ou 372899.
Em algumas modalidades, uma região alvo é nucleotídeos 587- 607 de SEQ ID NO: 1. Em algumas modalidades referidas, um composto anti-sentido curto dirigido para nucleotídeos 587-607 de SEQ ID NO: 1 com- preende uma seqüência de nucleotídeos selecionada entre SEQ ID NO 28, 29, 30, ou 31. Em algumas modalidades referidas, um composto anti-sentido curto dirigido para nucleotídeos 587-607 de SEQ ID NO: 1 é selecionado entre o N5 ISIS 372822, 372900, 372823, ou 372901.
Em algumas modalidades, uma região alvo é nucleotídeos 715- 736 de SEQ ID NO: 1. Em algumas modalidades referidas, um composto anti-sentido curto dirigido para nucleotídeos 715-736 de SEQ ID NO: 1 com- preende uma seqüência de nucleotídeos selecionada entre SEQ ID NO 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, ou 40. Em algumas modalidades referidas, um composto anti-sentido curto dirigido para nucleotídeos 715-736 de SEQ ID NO: 1 é selecionado entre o N3 ISIS 346583, 346584, 346585, 346586, 346587, 346588, 346589, 346590, ou 346591.
Em algumas modalidades, uma região alvo é nucleotídeos 929- 944 de SEQ ID NO: 1. Em algumas modalidades referidas, um composto anti-sentido curto dirigido para nucleotídeos 929-944 de SEQ ID NO: 1 com- preende uma seqüência de nucleotídeos selecionada entre SEQ ID NO 41 ou 42. Em algumas modalidades referidas, um composto anti-sentido curto dirigido para nucleotídeos 929-944 de SEQ ID NO: 1 é selecionado entre o Nq ISIS 372824 ou 372902.
Em algumas modalidades, uma região alvo é nucleotídeos 1256- 1319 de SEQ ID NO: 1. Em algumas modalidades referidas, um composto anti-sentido curto dirigido para nucleotídeos 1256-1319 de SEQ ID NO: 1 compreende uma seqüência de nucleotídeos selecionada entre SEQ ID NO 43, 44, 45, ou 46. Em algumas modalidades referidas, um composto anti- sentido curto dirigido para nucleotídeos 1256-1319 de SEQ ID NO: 1 é sele- cionado entre o Ns ISIS 372825, 372903, 372826, ou 372904.
Em algumas modalidades, uma região alvo é nucleotídeos 1256- 1271 de SEQ ID NO: 1. Em algumas modalidades referidas, um composto anti-sentido curto dirigido para nucleotídeos 1256-1271 de SEQ ID NO: 1 compreende uma seqüência de nucleotídeos selecionada entre SEQ ID NO 43 ou 44. Em algumas modalidades referidas, um composto anti-sentido cur- to dirigido para nucleotídeos 1256-1271 de SEQ ID NO: 1 é selecionado en- tre o N2 ISIS 372825 ou 372903.
Em algumas modalidades, uma região alvo é nucleotídeos 1304- 1319 de SEQ ID NO: 1. Em algumas modalidades referidas, um composto anti-sentido curto dirigido para nucleotídeos 1304-1319 de SEQ ID NO: 1 compreende uma seqüência de nucleotídeos selecionada entre SEQ ID NO 45 ou 46. Em algumas modalidades referidas, um composto anti-sentido cur- to dirigido para nucleotídeos 1304-1319 de SEQ ID NO: 1 é selecionado en- tre ο Ns ISIS 372826 ou 372904.
Em algumas modalidades, uma região alvo é nucleotídeos 2135-2150 de SEQ ID NO: 1. Em algumas modalidades referidas, um composto anti-sentido curto dirigido para nucleotídeos 2135-2150 de SEQ ID NO: 1 compreende uma seqüência de nucleotídeos selecionada entre SEQ ID NO .47 ou 48. Em algumas modalidades referidas, um composto anti-sentido cur- to dirigido para nucleotídeos 2135-2150 de SEQ ID NO: 1 é selecionado en- tre o N8 ISIS 372829 ou 372907.
Em algumas modalidades, uma região alvo é nucleotídeos 2774- .2794 de SEQ ID NO: 1. Em algumas modalidades referidas, um composto anti-sentido curto dirigido para nucleotídeos 2774-2794 de SEQ ID NO: 1 compreende uma seqüência de nucleotídeos selecionada entre SEQ ID NO .49, 50, 51, ou 52. Em algumas modalidades referidas, um composto anti- sentido curto dirigido para nucleotídeos 2774-2794 de SEQ ID NO: 1 é sele- cionado entre o Ng ISIS 372832, 372910, 372833, ou 372911.
Em algumas modalidades, uma região alvo é nucleotídeos 2961-2976 de SEQ ID NO: 1. Em algumas modalidades referidas, um composto anti-sentido curto dirigido para nucleotídeos 2961-2976 de SEQ ID NO: 1 compreende uma seqüência de nucleotídeos selecionada entre SEQ ID NO .53 ou 54. Em algumas modalidades referidas, um composto anti-sentido cur- to dirigido para nucleotídeos 2961-2976 de SEQ ID NO: 1 é selecionado en- tre o Nq ISIS 372835 ou 372913.
Em algumas modalidades, uma região alvo é nucleotídeos 3248-3269 de SEQ ID NO: 1. Em algumas modalidades referidas, um composto anti-sentido curto dirigido para nucleotídeos 3248-3269 de SEQ ID NO: 1 compreende uma seqüência de nucleotídeos selecionada entre SEQ ID NO .55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, ou 63. Em algumas modalidades referidas, um composto anti-sentido curto dirigido para nucleotídeos 3248-3269 de SEQ ID NO: 1 é selecionado entre o Ns ISIS 346592, 346593, 346594, 346595, 346596, 346597, 346598, 346599, ou 346600.
Em algumas modalidades, uma região alvo é nucleotídeos 3350- .3375 de SEQ ID NO: 1. Em algumas modalidades referidas, um composto anti-sentido curto dirigido para nucleotídeos 3350-3375 de SEQ ID NO: 1 compreende uma seqüência de nucleotídeos selecionada entre SEQ ID NO .64, 65, 66, 67, 68, ou 69. Em algumas modalidades referidas, um composto anti-sentido curto dirigido para nucleotídeos 3350-3375 de SEQ ID NO: 1 é selecionado entre o Ne ISIS 372836, 372914, 372837, 372915, 372838, ou .372916.
Em algumas modalidades, uma região alvo é nucleotídeos 3409- .3424 de SEQ ID NO: 1. Em algumas modalidades referidas, um composto anti-sentido curto dirigido para nucleotídeos 3409-3424 de SEQ ID NO: 1 compreende uma seqüência de nucleotídeos selecionada entre SEQ ID NO .70 ou 73. Em algumas modalidades referidas, um composto anti-sentido cur- to dirigido para nucleotídeos 3409-3424 de SEQ ID NO: 1 é selecionado en- tre o Nº ISIS 372839, 387461, 380147, ou 372917.
Em algumas modalidades, uma região alvo é nucleotídeos 3573- .3588 de SEQ ID NO: 1. Em algumas modalidades referidas, um composto anti-sentido curto dirigido para nucleotídeos 3573-3588 de SEQ ID NO: 1 compreende uma seqüência de nucleotídeos selecionada entre SEQ ID NO .74 ou 75. Em algumas modalidades referidas, um composto anti-sentido cur- to dirigido para nucleotídeos 3573-3588 de SEQ ID NO: 1 é selecionado en- tre o Nº ISIS 372840 ou 372918.
Em algumas modalidades, uma região alvo é nucleotídeos 3701- .3716 de SEQ ID NO: 1. Em algumas modalidades referidas, um composto anti-sentido curto dirigido para nucleotídeos 3701-3716 de SEQ ID NO: 1 compreende uma seqüência de nucleotídeos selecionada entre SEQ ID NO .76 ou 77. Em algumas modalidades referidas, um composto anti-sentido cur- to dirigido para nucleotídeos 3701-3716 de SEQ ID NO: 1 é selecionado en- tre O Nq ISIS 372841 OU 372919.
Em algumas modalidades, uma região alvo é nucleotídeos 4219- .4234 de SEQ ID NO: 1. Em algumas modalidades referidas, um composto anti-sentido curto dirigido para nucleotídeos 4219-4234 de SEQ ID NO: 1 compreende uma seqüência de nucleotídeos selecionada entre SEQ ID NO .78 ou 79. Em algumas modalidades referidas, um composto anti-sentido cur- to dirigido para nucleotídeos 4219-4234 de SEQ ID NO: 1 é selecionado en- tre o Nq ISIS 372843 ou 372921.
Em algumas modalidades, uma região alvo é nucleotídeos 4301- 4323 de SEQ ID NO: 1. Em algumas modalidades referidas, um composto anti-sentido curto dirigido para nucleotídeos 4301-4323 de SEQ ID NO: 1 compreende uma seqüência de nucleotídeos selecionada entre SEQ ID NO 80, 81, 82, ou 83. Em algumas modalidades, um composto anti-sentido curto dirigido para nucleotídeos 4301-4323 de SEQ ID NO: 1 é selecionado entre o Nq ISIS 372844, 372922, 372845, ou 372923.
Em algumas modalidades, uma região alvo é nucleotídeos 5588- 5609 de SEQ ID NO: 1. Em algumas modalidades referidas, um composto anti-sentido curto dirigido para nucleotídeos 5588-5609 de SEQ ID NO: 1 compreende uma seqüência de nucleotídeos selecionada entre SEQ ID NO 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, ou 92. Em algumas modalidades referidas, um composto anti-sentido curto dirigido para nucleotídeos 5588-5609 de SEQ ID NO: 1 é selecionado entre o Nq ISIS 346601, 346602, 346603, 346604, 346605, 346606, 346607, 346608, ou 346609.
Em algumas modalidades, uma região alvo é nucleotídeos 5924- 5939 de SEQ ID NO: 1. Em algumas modalidades referidas, um composto anti-sentido curto dirigido para nucleotídeos 5924-5939 de SEQ ID NO: 1 compreende uma seqüência de nucleotídeos selecionada entre SEQ ID NO 93 ou 94. Em algumas modalidades referidas, um composto anti-sentido cur- to dirigido para nucleotídeos 5924-5939 de SEQ ID NO: 1 é selecionado en- tre o N9 ISIS 372851 ou 372929.
Em algumas modalidades, uma região alvo é nucleotídeos 6664- 6679 de SEQ ID NO: 1. Em algumas modalidades referidas, um composto anti-sentido curto dirigido para nucleotídeos 6664-6679 de SEQ ID NO: 1 compreende uma seqüência de nucleotídeos selecionada entre SEQ ID NO 95 ou 96. Em algumas modalidades referidas, um composto anti-sentido cur- to dirigido para nucleotídeos 6664-6679 de SEQ ID NO: 1 é selecionado en- tre o N9 ISIS 372854 ou 372932.
Em algumas modalidades, uma região alvo é nucleotídeos 6908- 6923 de SEQ ID NO: 1. Em algumas modalidades referidas, um composto anti-sentido curto dirigido para nucleotídeos 6908-6923 de SEQ ID NO: 1 compreende uma seqüência de nucleotídeos selecionada entre SEQ ID NO 97 ou 98. Em algumas modalidades referidas, um composto anti-sentido cur- to dirigido para nucleotídeos 6908-6923 de SEQ ID NO: 1 é selecionado en- tre o Ne ISIS 372855 ou 372933.
Em algumas modalidades, uma região alvo é nucleotídeos 7190- 7205 de SEQ ID NO: 1. Em algumas modalidades referidas, um composto anti-sentido curto dirigido para nucleotídeos 7190-7205 de SEQ ID NO: 1 compreende uma seqüência de nucleotídeos selecionada entre SEQ ID NO 99 ou 100. Em algumas modalidades referidas, um composto anti-sentido curto dirigido para nucleotídeos 7190-7205 de SEQ ID NO: 1 é selecionado entre o N5 ISIS 372856 ou 372934.
Em algumas modalidades, uma região alvo é nucleotídeos 7817- 7839 de SEQ ID NO: 1. Em algumas modalidades referidas, um composto anti-sentido curto dirigido para nucleotídeos 7817-7839 de SEQ ID NO: 1 compreende uma seqüência de nucleotídeos selecionada entre SEQ ID NO 101, 102, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, ou 111. Em algumas modalida- des referidas, um composto anti-sentido curto dirigido para nucleotídeos 7817-7839 de SEQ ID NO: 1 é selecionado entre o N5 ISIS 372858, 372936, 346610, 346611, 346612, 346613, 346614, 346615, 346616, 346617, ou 346618.
Em algumas modalidades, uma região alvo é nucleotídeos 7995- 8010 de SEQ ID NO: 1. Em algumas modalidades referidas, um composto anti-sentido curto dirigido para nucleotídeos 7995-8010 de SEQ ID NO: 1 compreende uma seqüência de nucleotídeos selecionada entre SEQ ID NO 112 ou 113. Em algumas modalidades referidas, um composto anti-sentido curto dirigido para nucleotídeos 7995-8010 de SEQ ID NO: 1 é selecionado entre o Ne ISIS 372859 ou 372937.
Em algumas modalidades, uma região alvo é nucleotídeos 8336- 8356 de SEQ ID NO: 1. Em algumas modalidades referidas, um composto anti-sentido curto dirigido para nucleotídeos 8336-8356 de SEQ ID NO: 1 compreende uma seqüência de nucleotídeos selecionada entre SEQ ID NO 114, 115, 116, ou 117. Em algumas modalidades referidas, um composto anti-sentido curto dirigido para nucleotídeos 8336-8356 de SEQ ID NO: 1 é selecionado entre o N9 ISIS 372861, 372939, 372862, ou 372940.
Em algumas modalidades, uma região alvo é nucleotídeos 8539- 8554 de SEQ ID NO: 1. Em algumas modalidades referidas, um composto anti-sentido curto dirigido para nucleotídeos 8539-8554 de SEQ ID NO: 1 compreende uma seqüência de nucleotídeos selecionada entre SEQ ID NO 118 ou 119. Em algumas modalidades referidas, um composto anti-sentido curto dirigido para nucleotídeos 8539-8554 de SEQ ID NO: 1 é selecionado entre o Ne ISIS 372863 ou 372941.
Em algumas modalidades, uma região alvo é nucleotídeos 9344- 9359 de SEQ ID NO: 1. Em algumas modalidades referidas, um composto anti-sentido curto dirigido para nucleotídeos 9344-9359 de SEQ ID NO: 1 compreende uma seqüência de nucleotídeos selecionada entre SEQ ID NO 120 ou 121. Em algumas modalidades referidas, um composto anti-sentido curto dirigido para nucleotídeos 9344-9359 de SEQ ID NO: 1 é selecionado entre o Nq ISIS 372871 ou 372949.
Em algumas modalidades, uma região alvo é nucleotídeos 9515- 9530 de SEQ ID NO: 1. Em algumas modalidades referidas, um composto anti-sentido curto dirigido para nucleotídeos 9515-9530 de SEQ ID NO: 1 compreende uma seqüência de nucleotídeos selecionada entre SEQ ID NO 122 ou 123. Em algumas modalidades referidas, um composto anti-sentido curto dirigido para nucleotídeos 9515-9530 de SEQ ID NO: 1 é selecionado entre o Ne ISIS 372872 ou 372950.
Em algumas modalidades, uma região alvo é nucleotídeos 9794- 9809 de SEQ ID NO: 1. Em algumas modalidades referidas, um composto anti-sentido curto dirigido para nucleotídeos 9794-9809 de SEQ ID NO: 1 compreende uma seqüência de nucleotídeos selecionada entre SEQ ID NO 124 ou 125. Em algumas modalidades referidas, um composto anti-sentido curto dirigido para nucleotídeos 9794-9809 de SEQ ID NO: 1 é selecionado entre o Ng ISIS 372875 ou 372953. Em algumas modalidades, uma região alvo é nucleotídeos 10157-10187 de SEQ ID NO: 1. Em algumas modalidades referidas, um composto anti-sentido curto dirigido para nucleotídeos 10157-10187 de SEQ ID NO: 1 compreende uma seqüência de nucleotídeos selecionada entre SEQ ID NO 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, ou 133. Em algumas modali- dades referidas, um composto anti-sentido curto dirigido para nucleotídeos 10157-10187 de SEQ ID NO: 1 é selecionado entre o N5 ISIS 372877, 372955, 372878, 372956, 372879, 372957, 372880, ou 372958.
Em algumas modalidades, uma região alvo é nucleotídeos 10838-10859 de SEQ ID NO: 1. Em algumas modalidades referidas, um composto anti-sentido curto dirigido para nucleotídeos 10838-10859 de SEQ ID NO: 1 compreende uma seqüência de nucleotídeos selecionada entre SEQ ID NO 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, ou 142. Em algumas modalidades referidas, um composto anti-sentido curto dirigido para nucleo- tídeos 10838-10859 de SEQ ID NO: 1 é selecionado entre o Ne ISIS 346619, 346620, 346621, 346622, 346623, 346624, 346625, 346626, OU 346627.
Em algumas modalidades, uma região alvo é nucleotídeos 13689-13714 de SEQ ID NO: 1. Em algumas modalidades referidas, um composto anti-sentido curto dirigido para nucleotídeos 13689-13714 de SEQ ID NO: 1 compreende uma seqüência de nucleotídeos selecionada entre SEQ ID NO 143, 144, 145, 146, 147, ou 148. Em algumas modalidades refe- ridas, um composto anti-sentido curto dirigido para nucleotídeos 13689- 13714 de SEQ ID NO: 1 é selecionado entre o Ng ISIS 372890, 372968, 372891, 372969, 372892, ou 372970.
Em algumas modalidades, uma região alvo é nucleotídeos 13907-13928 de SEQ ID NO: 1. Em algumas modalidades referidas, um composto anti-sentido curto dirigido para nucleotídeos 13907-13928 de SEQ ID NO: 1 compreende uma seqüência de nucleotídeos selecionada entre SEQ ID NO 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, ou 157. Em algumas modalidades referidas, um composto anti-sentido curto dirigido para nucleo- tídeos 13907-13928 de SEQ ID NO: 1 é selecionado entre o Ne ISIS 346628, 346629, 346630, 346631, 346632, 346633, 346634, 346635, ou 346636. Em algumas modalidades, uma região alvo é nucleotídeos 13963-13984 de SEQ ID NO: 1. Em algumas modalidades referidas, um composto anti-sentido curto dirigido para nucleotídeos 13963-13984 de SEQ ID NO: 1 compreende uma seqüência de nucleotídeos selecionada entre SEQ ID NO 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, ou 166. Em algumas modalidades referidas, um composto anti-sentido curto dirigido para nucleo- tídeos 13963-13984 de SEQ ID NO: 1 é selecionado entre o Ns ISIS 346637, 346638, 346639, 346640, 346641, 346642, 346643, 346644, ou 346645.
Em algumas modalidades, uma região alvo é nucleotídeos 14051-14072 de SEQ ID NO: 1. Em algumas modalidades referidas, um composto anti-sentido curto dirigido para nucleotídeos 14051-14072 de SEQ ID NO: 1 compreende uma seqüência de nucleotídeos selecionada entre SEQ ID NO 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, ou 175. Em algumas modalidades referidas, um composto anti-sentido curto dirigido para nucleo- tídeos 14051-14072 de SEQ ID NO: 1 é selecionado entre o N2 ISIS 346646, 346647, 346648, 346649, 346650, 346651, 346652, 346653, ou 346654.
Em algumas modalidades, compostos anti-sentido curtos dirigi- dos para um ácido nucléico ApoB têm 8 a 16, preferencialmente 9 a 15, mais preferencialmente 9 a 14, ma\é preferencialmente 10 a 14 nucleotídeos de extensão. Em algumas modalidades, compostos anti-sentido curtos dirigidos para um ácido nucléico ApoB têm 9 a 14 nucleotídeos de extensão. Em al- gumas modalidades, compostos anti-sentido curtos dirigidos para um ácido nucléico ApoB têm 10 a 14 nucleotídeos de extensão. Em algumas modali- dades, os compostos anti-sentido curtos referidos são oligonucleotídeos anti- sentido curtos.
Em algumas modalidades, compostos anti-sentido curtos dirigi- dos para um ácido nucléico ApoB são gápmeros curtos. Em algumas moda- lidades referidas, gápmeros curtos dirigidos para um ácido nucléico ApoB compreendem no mínimo uma modificação de alta afinidade em uma ou mais asas do composto. Em algumas modalidades, compostos anti-sentido curtos dirigidos para um ácido nucléico ApoB compreendem 1 a 3 modifica- ções de alta afinidade em cada asa. Em algumas modalidades referidas, os nucleosídeos ou nucleotídeos da asa compreendem uma modificação 2'. Em algumas modalidades referidas, os monômeros da asa são BNA's. Em al- gumas modalidades referidas, os monômeros da asa são selecionados entre α-L-Metilenoóxi (4'-CH2-0-2') BNA1 β-D-Metilenoóxi (4'-CH2-0-2') BNA, Etile- - 5 noóxi (4'-(CH2)2-0-2') BNA, Aminoóxi (4'-CH2-0-N(R)-2') BNA e Oxiamino (4'-CH2-N(R)-0-2') BNA. Em algumas modalidades, os monômeros de uma asa compreendem um substituinte na posição 2' selecionado entre alila, a- mino, azido, tio, O-alila, O-C1-C10 alquila, -OCF3, O-(CH2)2-O-CH3, 2'- O(CH2)2SCH3, O-(CH2)2-O-N(Rm)(Rn), e 0-CH2-C(=0)-N(Rm)(Rn), onde cada Rm e Rn é, independentemente, H ou C1-C10 alquila substituída ou não- substituída. Em algumas modalidades, os monômeros de uma asa são nu- cleotídeos 2'MOE.
Em algumas modalidades, compostos anti-sentido curtos dirigi- dos para um ácido nucléico ApoB compreendem um gap entre a asa 5' e a asa 3'. Em algumas modalidades, o gap compreende cinco, seis, sete, oito, nove, dez, onze, doze, treze, ou quatorze monômeros. Em algumas modali- dades, os monômeros do gap são desoxirribonucleotídeos não modificados. Em algumas modalidades, os monômeros do gap são ribonucleotídeos não modificados. Em algumas modalidades, gap de modificações de gap (se houver) resultam em um composto anti-sentido que, quando ligado a seu ácido nucléico alvo, suporta clivagem por uma RNase, incluindo, mas não limitada a, RNase H.
Em algumas modalidades, compostos anti-sentido curtos dirigi- dos para um ácido nucléico ApoB têm ligações monoméricas uniformes. Em algumas modalidades referidas, estas ligações são todas ligações fosforoti- oato. Em algumas modalidades, as ligações são todas ligações fosfodiéster. Em algumas modalidades, compostos anti-sentido curtos dirigidos para um ácido nucléico ApoB têm espinhas dorsais mistas.
Em algumas modalidades, compostos anti-sentido curtos dirigi- dos para um ácido nucléico ApoB têm 8 monômeros de extensão. Em algu- mas modalidades, compostos anti-sentido curtos dirigidos para um ácido nucléico ApoB têm 9 monômeros de extensão. Em algumas modalidades, compostos anti-sentido curtos dirigidos para um ácido nucléico ApoB têm 10 monômeros de extensão. Em algumas modalidades, compostos anti-sentido curtos dirigidos para um ácido nucléico ApoB têm 11 monômeros de exten- são. Em algumas modalidades, compostos anti-sentido curtos dirigidos para um ácido nucléico ApoB têm monômeros de extensão. Em algumas modali- dades, compostos anti-sentido curtos dirigidos para um ácido nucléico ApoB têm 13 monômeros de extensão. Em algumas modalidades, compostos anti- sentido curtos dirigidos para um ácido nucléico ApoB têm 14 monômeros de extensão. Em algumas modalidades, compostos anti-sentido curtos dirigidos para um ácido nucléico ApoB têm 15 monômeros de extensão. Em algumas modalidades, compostos anti-sentido curtos dirigidos para um ácido nucléico ApoB têm 16 monômeros de extensão. Em algumas modalidades, compos- tos anti-sentido curtos dirigidos para um ácido nucléico ApoB compreendem 9 a 15 monômeros. Em algumas modalidades, compostos anti-sentido curtos dirigidos para um ácido nucléico ApoB compreendem 10 a 15 monômeros. Em algumas modalidades, compostos anti-sentido curtos dirigidos para um ácido nucléico ApoB compreendem 12 a 14 monômeros. Em algumas moda- lidades, compostos anti-sentido curtos dirigidos para um ácido nucléico A- poB compreendem 12 a 14 nucleotídeos ou nucleosídeos.
Em algumas modalidades, a invenção proporciona métodos para modular a expressão de ApoB. Em algumas modalidades, os métodos referidos compreendem uso de um ou mais compostos anti-sentido curtos dirigidos para um ácido nucléico ApoB, em que o composto anti-sentido cur- to dirigido para um ácido nucléico ApoB tem a partir de cerca de 8 a cerca de 16, preferencialmente 9 a 15, mais preferencialmente 9 a 14, mais preferen- cialmente 10 a 14 monômeros (isto é, a partir de cerca de 8 a cerca de 16 monômeros ligados). Uma pessoa com conhecimento regular da técnica re- conhecerá que isto compreende métodos para modular a expressão de A- poB usando um ou mais compostos anti-sentido curtos dirigidos para um ácido nucléico ApoB de 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 ou 16 monômeros.
Em algumas modalidades, métodos para modular ApoB com- preendem uso de um composto anti-sentido curto dirigido para um ácido nu- cléico ApoB que tem 8 monômeros de extensão. Em algumas modalidades, métodos para modular ApoB compreendem uso de um composto anti- sentido curto dirigido para um ácido nucléico ApoB que tem 9 monômeros de extensão. Em algumas modalidades, métodos para modular ApoB compre- endem uso de um composto anti-sentido curto dirigido para um ácido nucléi- co ApoB que tem 10 monômeros de extensão. Em algumas modalidades, métodos para modular ApoB compreendem uso de um composto anti- sentido curto dirigido para um ácido nucléico ApoB que tem 11 monômeros de extensão. Em algumas modalidades, métodos para modular ApoB com- preendem uso de um composto anti-sentido curto dirigido para um ácido nu- cléico ApoB que tem 12 monômeros de extensão. Em algumas modalidades, métodos para modular ApoB compreendem uso de um composto anti- sentido curto dirigido para um ácido nucléico ApoB que tem 13 monômeros de extensão. Em algumas modalidades, métodos para modular ApoB com- preendem uso de um composto anti-sentido curto dirigido para um ácido nu- cléico ApoB que tem 14 monômeros de extensão. Em algumas modalidades, métodos para modular ApoB compreendem uso de um composto anti- sentido curto dirigido para um ácido nucléico ApoB que tem 15 monômeros de extensão. Em algumas modalidades, métodos para modular ApoB com- preendem uso de um composto anti-sentido curto dirigido para um ácido nu- cléico ApoB que tem 16 monômeros de extensão.
Em algumas modalidades, métodos para modular a expressão de ApoB compreendem uso de um composto anti-sentido curto dirigido para um ácido nucléico ApoB compreendendo 9 a 15 monômeros. Em algumas modalidades, métodos para modular a expressão de ApoB compreendem uso de um composto anti-sentido curto dirigido para um ácido nucléico ApoB compreendendo 10 a 15 monômeros. Em algumas modalidades, métodos para modular a expressão de ApoB compreendem uso de um composto anti- sentido curto dirigido para um ácido nucléico ApoB compreendendo 12 a 14 monômeros. Em algumas modalidades, métodos para modular a expressão de ApoB compreendem uso de um composto anti-sentido curto dirigido para um ácido nucléico ApoB compreendendo 12 ou 14 nucleotídeos ou núcleo- sídeos.
Em algumas modalidades, compostos anti-sentido curtos tendo por alvo um ácido nucléico ApoB podem ter qualquer uma ou mais proprie- dades ou características dos compostos anti-sentido curtos descritos de mo- do geral aqui, neste requerimento de patente. Em algumas modalidades, compostos anti-sentido curtos tendo por alvo um ácido nucléico ApoB têm um motivo (asa - gap desóxi - asa) selecionado entre 1-12-1, 1-1-10-2, 2- 10-1-1, 3-10-3, 2-10-3, 2-10-2, 1-10-1,1-10-2, 3-8-3, 2-8-2, 1-8-1, 3-6-3 ou 1- 6-1, mais preferencialmente 1-10-1, 2-10-2, 3-10-3, e 1-9-2. 2. SGLT-2
Transportador de glicose dependente de sódio 2 (SGLT-2) é ex- pressado nas células epiteliais dos túbulos proximais renais, e funciona re- absorvendo glicose evitando perda de glicose na urina. Para o genoma hu- mano SGLT-2 é um membro uma família de 11 membros de co- transportadores de substrato de sódio. Muitos dos membros desta família partilham homologia de seqüência, por exemplo SGLT-1 partilha cerca de 59% de identidade de seqüência com SGLT-2 e cerca de 70% de identidade de seqüência com SGLT-3. SGLT-1 é um transportador de glicose encontra- do no coração e no sistema nervoso central. SGLT-3 é um canal de sódio sensível a glicose no intestino delgado. Os padrões de localização separa- dos para estes SGLTs é um ponto de distinção entre os membros de famí- lias homólogas. (Handlon, A.L., Expert Opin. Ther. Patents (2005) 15(11):1532-1540; Kanai et al., J. Clin. Invest., 1994, 93, 397-404; Wells et al., Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab., 1992, 263, F459-465).
Estudos de SGLT2 humano injetado em oócitos de Xenopus demonstraram que esta proteína media transporte sódio-dependente de D- glicose e .alfa.-metila-D-glucopiranosídeo (.alfa.-MeGlc; um análogo de gli- cose) com um valor Km de 1,6 mM para .alfa.-MeGlc e uma proporção de ligação de sódio para glicose de 1:1 (Kanai et al., J. Clin. Invest., 1994, 93, 397-404; You et al., J. Biol. Chem., 1995, 270, 29365-29371). Esta atividade de transporte foi suprimida por florizin, um glicosídeo vegetal que Iigao ao sítio de glicose dos SGLTs mas não é transportado e portanto inibe a ação de SGLT (You et al., J. Biol. Chem., 1995, 270, 29365-29371).
Diabetes é um distúrbio caracterizado por hiperglicemia devido a ação de insulina deficiente. Hiperglicemia crônica é um fator de risco impor- tante para complicações associadas com diabetes, incluindo doença do co- ração, retinopatia, nefropatia e neuropatia. Como o rim tem um papel impor- tante na regulação dos níveis de glicose plasmática, transportadores de gli- cose renal estão se tornando alvos de fármacos atraentes (Wright, Am. J. Physiol. Renal Physiol., 2001, 280, F10-18). Nefropatia diabética é a causa mais comum de doença renal em estágio final que se desenvolve em muitos pacientes com diabetes. Glicotoxicidade, a qual resulta de hiperglicemia de longo termo, induz resistência à insulina tecido-dependente em pacientes diabéticos (Nawano et al., Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab., 2000, 278, E535-543).
Definições
"Transportador de glicose dependente de sódio 2" é o produto genético ou proteína cuja expressão deve ser modulada por administração de um composto anti-sentido curto. Transportador de glicose dependente de sódio 2 é geralmente referido como SGLT2 mas também pode ser referido como SLC5A2; transportador de sódio-glicose 2; co-transportador de sódio- glicose, de baixa afinidade renal; co-transportador de sódio-glicose, renal; família de veículo de solutos 5 (co-transportador de sódio-glicose), membro 2; SL52.
"Ácido nucléico SGLT2" significa qualquer ácido nucléico codifi- cando SGLT2. Por exemplo, em determinadas modalidades, um ácido nu- cléico SGLT2 inclui, sem limitação, uma seqüência de DNA codificando S- GLT2, uma seqüência de RNA transcrita de DNA codificando SGLT2, e uma seqüência de RNAm codificando SGLT2. "RNAm SGLT2" significa um RNAm codificando uma proteína SGLT2.
Indicações Terapêuticas
Em algumas modalidades, compostos anti-sentido curtos são usados para modular a expressão de SGLT-2 e proteínas relacionadas. Em algumas modalidades, a modulação referida é realizada proporcionando compostos anti-sentido curtos que hibridizam com uma ou mais moléculas alvo de ácido nucléico codificando SGLT-2, incluindo, mas não limitado a, SGLT2, SL52, SLC5A2, Co-Transportador de Sódio-Glicose, Co- Transportador de Sódio-Glicose de Baixa Afinidade Renal, Co-Transportador de Sódio-Glicose Renal 2 e Membro 2 Co-Transportador de Sódio-Glicose da Família 5 de Veículo de Soluto. Também são proporcionados métodos para tratar doença e distúrbios metabólicos e/ou cardiovasculares conforme descrito aqui, neste requerimento de patente. Em modalidades particulares, compostos anti-sentido curtos que inibem a expressão de SGLT2 são usa- 10 dos em métodos para reduzir os níveis de glicose sangüínea em um animal e métodos para retardar ou prevenir o início do diabetes Tipo 2. Os métodos referidos compreendem administrar uma quantidade terapeuticamente ou profilaticamente eficaz de um ou mais dos compostos da invenção ao ani- mal, o qual pode necessitar de tratamento. O um ou mais compostos pode ser um composto anti-sentido curto tendo por alvo um ácido nucléico codifi- cando SGLT2. São proporcionados aqui, neste requerimento de patente, métodos para reforçar inibição da expressão de SGLT2 em células do rim ou tecidos renais, compreendendo contactar as células ou tecidos com um ou mais dos compostos da invenção, tais como compostos anti-sentido curtos tendo por alvo um ácido nucléico codificando SGLT2.
Apesar de alguns compostos, composições e métodos terem sido descritos com especificidade de acordo com algumas modalidades, os seguintes exemplos servem somente para ilustrar os compostos da invenção não se pretende que limitem a mesma.
Em algumas modalidades, compostos anti-sentido curtos são compostos oligoméricos quiméricos tendo espinhas dorsais fosforotioato e fosfodiéster mistas. Alguns Compostos anti-sentido curtos de espinha dorsal mista têm um gap central compreendendo no mínimo 5 2'-desóxi nucleosí- deos contíguos flanqueados por duas asas cada uma das quais compreende no mínimo um 2'-0-metoxietila nucleosídeo. Em algumas modalidades, as ligações internucleosídeos dos compostos de espinha dorsal mista são liga- ções fosforotioato no gap e ligações fosfodiéster nas duas asas. Em algu- mas modalidades, compostos de espinha dorsal mista têm ligações fosforo- tioato nas asas, exceto por uma ligação fosfodiéster em uma ou ambas as extremidades 5' e 3' extremas dos oligonucleotídeo. Em algumas modalida- des compostos anti-sentido curtos dirigidos para SGLT2 têm um motivo (asa - gap desóxi - asa) selecionado entre 3-10-3, 2-10-3, 2-10-2, 1-10-1,1-10-2,2-8-2, 1-9-2, 1-8-1, 3-6-3 ou 1-6-1. Em algumas modalidades compostos an- ti-sentido curtos dirigidos para SGLT2 têm um motivo (asa - gap desóxi - asa) selecionado entre 1-10-1, 1-10-2, 2-8-2, 1 -9-2, 1 -8-1, 3-6-3 ou 1 -6-1.
Em algumas modalidades, compostos anti-sentido curtos dirigi- dos para um ácido nucléico SGLT2 e tendo uma espinha dorsal mista são liberados de modo eficaz para o rim. Em algumas modalidades, administra- ção de compostos anti-sentido curtos dirigidos para um ácido nucléico S- GLT2 e tendo uma espinha dorsal mista resulta em modulação de expressão genética alvo no rim. Em algumas modalidades referidas, há pouca ou ne- nhuma toxicidade hepática ou renal. Em algumas modalidades, compostos anti-sentido curtos dirigidos para um ácido nucléico SGLT2 e tendo uma es- pinha dorsal mista são mais potentes para reduzir RNAm SGLT-2 e têm um início mais rápido comparadps com um composto anti-sentido curto que não tem uma espinha dorsal mista, mas é idêntico de outrou modo. Em algumas modalidades referidas, o aumento de potência e/ou reduzida toxicidade refe- ridos é em camundongo e/ou rato. Em algumas modalidades referidas, o aumento de potência e/ou reduzida toxicidade referidos é em um ser huma- no.
A título de exemplo, e somente para fins ilustrativos, ISIS 25 145733, o qual compreende ligações fosforotioato uniformes e ISIS 257016 o qual compreende ligação fosfodiéster nas asas e ligações fosforotioato no gap, são idênticos de modo diverso. Ambos compreendem a seqüência GA- AGTAGCCACCAACTGTGC (SEQ ID N2 1572). Ambos os oligonucleotídeos adicionalmente compreendem um gap consistindo em dez 2'- 30 desoxinucleotídeos, flanqueados sobre cada lado por nucleotídeos "2'- metoxietila" (2'-MOE) de cinco nucleotídeos. Todos os resíduos citidina são 5-metilcitidinas. O composto de espinha dorsal mista, ISIS 257016, foi cerca de 50 vezes mais potentes para reduzir RNAm SGLT-2 comparados com o composto precursor não-misto, ISIS 145733 (vide o EXEMPLO 9).
Estudos farmacocinéticos de determinado composto de espinha dorsal mista ISIS 257016 indicam que em determinadas modalidades, o composto age como uma pró-droga que é metabolizada para um farmacófo- ro de 12 nucleobases. Estudos com ISIS 370717, um composto anti-sentido curto de 12 nucleobases correspondente a ISIS 257016, mostram que o composto tem um perfila farmacológico similar a ISIS 257016 mas com um início de ação mais rápido. ISIS 370717 é um oligonucleotídeo anti-sentido de 12 nucleobases dirigido para SGLT-2 compreendendo a seqüência TAGCCACCAACT (SEQ ID Ng 1554), compreendendo adicionalmente um gap consistindo em dez 2'-desoxinucleotídeos, flanqueado em ambos os lados por asas de um nucleotídeo. As asas são compostas de nucleotídeos .2'-metoxietila (2'-MOE). Todos os resíduos citidina são 5-metilcitidinas. As ligações internucleosídeos são fosforotioato (P=S) em todo o oligonucleotí- deo. A similaridade na atividade farmacológica de ISIS 257016 e ISIS .370717 corrobora os estudos farmacocinéticos indicando que ISIS 257016 era uma pró-droga tendo um farmacóforo de 12 nucleotídeos (vide o EXEM- PLO 10). Além disso, estudos com versões estabilizadas (de extremidade capeada) de ISIS 257016 apresentam dramática perda de atividade.
Em algumas modalidades, compostos anti-sentido curtos com- preendendo 2' MOE monômeros nas asas são liberados de modo eficaz pa- ra o rim e tratamento com semelhantes compostos resulta em modulação eficaz de expressão genética alvo no rim sem toxicidade hepática ou renal. E adicionalmente mostrado aqui, neste requerimento de patente, que em de- terminadas modalidades, compostos anti-sentido curtos são mais potentes para reduzir o RNAm SGLT-2 e têm um início mais rápido comparados com oligonucleotídeos precursores dirigidos para RNAm SGLT-2 em camundon- go e rato. É demostrado aqui, neste requerimento de patente, que shortmers de gap 2' MOE aumentam a potência e a biodisponibilidade em relação aos compostos precursores.
A título de exemplo, e somente para fins ilustrativos estudos com ISIS 370717 revelam acumulação significativamente maior do composto anti- sentido curto no tecido renal (aproximadamente 500 microgramas por grama de tecido) comparado com o precursor mais longo. Além disso, RNAm S- GLT-2 foi reduzido por mais de 80% em relação aos controles (vide o E- XEMPLO 11). Gápmero 1-10-1 ISIS 370717 foi usado como um modelo para produzir oligos seqüência relacionados com motivos variáveis. Estudos ava- liando variações de asa, gap e da extensão total em torno dos oligonucleotí- deo de 12 meros ISIS 370717 podem ser vistos no EXEMPLO 12. Alguns motivos avaliados incluíram 1-10-1, 2-8-2, 1-8-1, 3-6-3, e 1-6-1 (vide a Tabe- la 60 no EXEMPLO 12). Os compostos foram analisados para seu efeito so- bre os níveis de RNAm SGLT2. Todos os motivos inibiram a expressão de SGLT2 in vivo em uma maneira dose-dependente. Os gápmeros 1-10-1, 2-8- 2 e 1-8-1 foram considerados particularmente potentes. RNAm SGLT-2 foi reduzido por mais de 80% em relação aos controles usando estes motivos.
Em algumas modalidades, a invenção proporciona compostos anti-sentido curtos dirigidos para um ácido nucléico SGLT2 e tendo um moti- vo selecionado entre: gápmero 1-10-1 e 1-10-2 MOE. (vide a Tabela 62 no EXEMPLO 13). Alguns compostos semelhantes foram analisados para seu efeito sobre RNAm SGLT2 de rato. Os resultados na Tabela 63 ilustram que tantos os gápmeros 1-10-1 e 1-10-2 MOE inibem a expressão de SGLT2 in vivo em uma maneira dose-dependente e pode ser obtida mais de 80% de redução do RNAm SGLT-2.
Alguns gápmeros 1-10-1 e 2-8-2 MOE adicionais foram avalia- dos em modelos in vivo tanto de camundongo quanto de rato (vide, por e- xemplo, EXEMPLO 14 e 15). Foi obtido mais de 80% de redução no RNAm SGLT-2 com muitos dos gápmeros 1-10-1 e 2-8-2 MOE em concentrações relativamente baixas de oligo e na ausência de quaisquer efeitos de toxici- dade.
Em outro exemplo não-limitante, o efeito de ISIS 388625 sobre os níveis de RNAm SGLT2 de cachorro também foi analisado. Estudos com cães ilustram que mais de 80% de inibição da expressão de SGLT2 pode ser obtido em uma dose de 1 mg/kg/semana. Pode ser obtida ainda maior inibi- ção em doses ligeiramente maioares. Também foi demostrado que a admi- nistração de ISIS 388625 em cão aumentou a tolerância à glicose. Os níveis máximos de glicose plasmática foram reduzidos por mais de 50% em média e a queda subseqüente na glicose foi reduzida comparada com controles de salina em um teste de tolerância à glicose de rotina (vide o EXEMPLO 17). Além disso, em um modelo de diabetes em rato, foi mostrado que compos- tos anti-sentido curtos reduzem significativamente os níveis de glicose plas- mática e HbAIC com o tempo comparados com animais tratados com PBS e controle (Vide o Exemplo 16).
Os animais em tyodos os estudos foram adicionalmente avalia- dos para toxicidade. Por exemplo, foram avaliados o peso corporal total, o peso do fígado, baço e rim. Alterações significativas no peso do baço, fígado ou corporal podem indicar que um composto particular causa efeitos tóxicos. Todas as alterações foram consideradas como estando dentro da margem 15 de erro. Não foram observadas alterações significativas no peso corporal durante o tratamento ou no término do estudo. Não foram observadas alte- rações significativas nos pesos do fígado ou baço.
Alguns Compostos Anti-sentido Curtos Dirigidos para um Ácido Nucléico SGLT2
Em algumas modalidades, compostos anti-sentido curtos são dirigidos para um ácido nucléico SGLT2 tendo a seqüência do GENBANK® de Acesso N9 NM_003041.1, incorporada aqui, a este requerimento de pa- tente, como SEQ ID NO: 2. Em algumas modalidades referidas, um compos- to anti-sentido curto dirigido para SEQ ID NO: 3 é no mínimo 90% comple- mentar à SEQ ID NO: 3. Em algumas modalidades referidas, um composto anti-sentido curto dirigido para SEQ ID NO: 3 é no mínimo 95% complemen- tar à SEQ ID NO: 3. Em algumas modalidades referidas, um composto anti- sentido curto dirigido para SEQ ID NO: 3 é 100% complementar à SEQ ID NO: 1. Em algumas modalidades, um composto anti-sentido curto dirigido para SEQ ID NO: 3 compreende uma seqüência de nucleotídeos seleciona- da entre as seqüências de nucleotídeos determinadas nas Tabelas 4 e 5.
A seqüência de nucleotídeos determinada em cada NO de SEQ ID determinado nas Tabelas 4 e 5 é independente de qualquer modificação para uma porção açúcar, um ligação monomérica, ou uma nucleobase. Des- te modo, compostos anti-sentido curtos definidos por um NO de SEQ ID po- dem compreender, independentemente, uma ou mais modificações para uma porção açúcar, uma ligação internucleosídeos, ou uma nucleobase. Compostos anti-sentido descritos pelo Número Isis (N9 ISIS) indicam uma combinação de seqüência de nucleobases e uma ou mais modificações para uma porção açúcar, uma ligação internucleosídeos, ou uma nucleobase.
As Tabelas 4 e 5 ilustram exemplos de compostos anti-sentido curtos dirigidos para SEQ ID NO: 3. A Tabela 4 ilustra compostos anti- sentido curtos que são 100% complementares à SEQ ID NO: 3. A Tabela 5 ilustra compostos anti-sentido curtos que têm uma ou duas combinações inadequadas com respeito à SEQ ID NO: 3. A coluna com o título 'motivo de gápmero' indica o motivo asa-gap-asa de cada compostos anti-sentido cur- tos. O segmento de gap compreende 2'-desoxinucleotídeos e cada nucleotí- deo de cada segmento de asa compreende um açúcar 2'-modificado. O açú- car 2'-modificado em particular também é indicado na coluna de 'motivo de gápmero1. Por exemplo, '2-10-2 MOE' significa um motivo de gápmero 2-10- 2, onde um segmento de gap de dez 2'-desoxinucleotídeos é flanqueado por segmentos de asa de dois nucleotídeos, onde os nucleotídeos dos segmen- tos de asa são nucleotídeos 2'-MOE. Ligações internucleosídeos são fosfo- rotioato. Os compostos anti-sentido curtos compreendem 5-metilcitidina ao invés de citosina não modificadas, a menos que "citosina não modificada" esteja listada na coluna de motivo de gápmero, em cujo caso as citosinas indicadas são citosinas não modificadas. Por exemplo, "5-mC em gap so- mente" indica que o segmento de gap tem 5-metilcitosinas, ao passo que os segmentos de asa têm citosinas não modificadas.
Tabela 4: Compostos Anti-sentido Curtos Dirigidos para SEQ ID NO: 3
<table>table see original document page 121</column></row><table> <table>table see original document page 122</column></row><table> <table>table see original document page 123</column></row><table> <table>table see original document page 124</column></row><table> <table>table see original document page 125</column></row><table> <table>table see original document page 126</column></row><table>
Tabela 5: Compostos anti-sentido curtos dirigidos para SEQ ID NO: 3 e ten- do 1 ou 2 combinações inadequadas
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Em algumas modalidades, uma região alvo é nucleotídeos 85- .184 de SEQ ID NO: 3. Em algumas modalidades, um composto anti-sentido curto é dirigido para nucleotídeos 85-184 de SEQ ID NO: 3. Em algumas modalidades referidas, um composto anti-sentido curto dirigido para nucleo- tídeos 85-184 compreende uma seqüência de nucleotídeos selecionada en- tre SEQ ID NO 214, 215, 216, 217, 218, 219, 221, 222, 223, 224, 225, ou .227. Em algumas modalidades referidas, um composto anti-sentido curto dirigido para nucleotídeos 85-184 de SEQ ID NO: 3 é selecionado entre o Ne Isis 379684, 405193, 405194, 405195, 405196, 405197, 379685, 405198, .405199, 405200, 405201, 379686, 379711 ou 388628.
Em algumas modalidades, uma região alvo é nucleotídeos 113- 132 de SEQ ID NO: 3. Em algumas modalidades, um composto anti-sentido curto é dirigido para nucleotídeos 113-132 de SEQ ID NO: 3. Em algumas modalidades referidas, um composto anti-sentido curto dirigido para nucleo- tídeos 113-132 compreende uma seqüência de nucleotídeos selecionada entre SEQ ID NO 215, 216, 217, 218, 219, 221, 222, 223, ou 224. Em algu- mas modalidades referidas, um composto anti-sentido curto dirigido para nucleotídeos 113-132 de SEQ ID NO: 3 é selecionado entre o Ns Isis 405193, 405194, 405195, 405196, 405197, 379685, 405198, 405199, 405200, ou 405201.
Em algumas modalidades, uma região alvo é nucleotídeos 207- 329 de SEQ ID NO: 3. Em algumas modalidades, um composto anti-sentido curto é dirigido para nucleotídeos 207-329 de SEQ ID NO: 3. Em algumas
Em algumas modalidades, uma região alvo é nucleotídeos 207- 219 de SEQ ID NO: 3. Em algumas modalidades, um composto anti-sentido curto é dirigido para nucleotídeos 207-219 de SEQ ID NO: 3. Em algumas modalidades referidas, um composto anti-sentido curto dirigido para nucleo- tídeos 207-219 compreende uma seqüência de nucleotídeos selecionada entre SEQ ID NO 228 ou 229. Em algumas modalidades referidas, um com- posto anti-sentido curto dirigido para nucleotídeos 207-219 de SEQ ID NO: 3 é selecionado entre o N- ISIS. 405202 ou 405203.
Em algumas modalidades, uma região alvo é nucleotídeos 236-252 de SEQ ID NO: 3. Em algumas modalidades, um composto anti-sentido curto é dirigido para nucleotídeos 236-252 de SEQ ID NO: 3. Em algumas modalidades referidas, um composto anti-sentido curto dirigido para nucleo- tídeos 236-252 compreende uma seqüência de nucleotídeos selecionada entre SEQ ID NO 230, 232, 233, 234, 235, ou 236. Em algumas modalidades referidas, um composto anti-sentido curto dirigido para nucleotídeos 236-252 de SEQ ID NO: 3 é selecionado entre o N5 ISIS 405204, 379687, 405205,405206, 405207, 405208, ou 405209.
Em algumas modalidades, uma região alvo é nucleotídeos 260-273 de SEQ ID NO: 3. Em algumas modalidades, um composto anti-sentido curto é dirigido para nucleotídeos 260-273 de SEQ ID NO: 3. Em algumas modalidades referidas, um composto anti-sentido curto dirigido para nucleo- tídeos 260-273 compreende uma seqüência de nucleotídeos selecionada entre SEQ ID NO 237, 238, ou 239. Em algumas modalidades referidas, um composto anti-sentido curto dirigido para nucleotídeos 260-273 de SEQ ID NO: 3 é selecionado entre o Ns ISIS 405210, 405211, ou 405212.
Em algumas modalidades, uma região alvo é nucleotídeos 435-640 de SEQ ID NO: 3. Em algumas modalidades, um composto anti-sentido curto é dirigido para nucleotídeos 435-640 de SEQ ID NO: 3. Em algumas modalidades referidas, um composto anti-sentido curto dirigido para nucleo- tídeos 435-640 compreende uma seqüência de nucleotídeos selecionada entre SEQ ID NO 242, 243, 245, 246, 251, 252, 253, 254, 256, 257, 258,259, 260, 261, 262, 263, ou 264. Em algumas modalidades referidas, um composto anti-sentido curto dirigido para nucleotídeos 435-640 de SEQ ID NO: 3 é selecionado entre o Nq ISIS 379690, 405248, 379691, 389780, .379692, 382676, 388625, 392170, 392173, 405213, 405214, 405215, 405216, 379693, 405217, 405218, 405219, 405220, 405221, 405222, 405223, 405224, ou 379694.
Em algumas modalidades, uma região alvo é nucleotídeos 527- 540 de SEQ ID NO: 3. Em algumas modalidades, um composto anti-sentido curto é dirigido para nucleotídeos 527-540 de SEQ ID NO: 3. Em algumas modalidades referidas, um composto anti-sentido curto dirigido para nucleo- tídeos 527-540 compreende uma seqüência de nucleotídeos selecionada entre SEQ ID NO 245, 246, ou 251. Em algumas modalidades referidas, um composto anti-sentido curto dirigido para nucleotídeos 527-540 de SEQ ID NO: 3 é selecionado entre o Nq ISIS 389780, 379692, 382676, 388626, 392170, 392173, ou 405213.
Em algumas modalidades, uma região alvo é nucleotídeos 564- 603 de SEQ ID NO: 3. Em algumas modalidades, um composto anti-sentido curto é dirigido para nucleotídeos 564-603 de SEQ ID NO: 3. Em algumas modalidades referidas, um composto anti-sentido curto dirigido para nucleo- tídeos 564-603 compreende uma seqüência de nucleotídeos selecionada entre SEQ ID NO 252, 253, 254, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, ou 263. Em algumas modalidades referidas, um composto anti-sentido curto dirigido para nucleotídeos 564-603 de SEQ ID NO: 3 é selecionado entre o Ns ISIS 405214, 405215, 405216, 379693, 405217, 405218, 405219, 405220, 405221, 405222, 405223, OU 405224.
Em algumas modalidades, uma região alvo é nucleotídeos 564- 579 de SEQ ID NO: 3. Em algumas modalidades, um composto anti-sentido curto é dirigido para nucleotídeos 564-579 de SEQ ID NO: 3. Em algumas modalidades referidas, um composto anti-sentido curto dirigido para nucleo- tídeos 564-579 compreende uma seqüência de nucleotídeos selecionada entre SEQ ID NO 252, 253, 254, 256, ou 257. Em algumas modalidades re- feridas, um composto anti-sentido curto dirigido para nucleotídeos 564-579 de SEQ ID NO: 3 é selecionado entre o Ne ISIS 405214, 405215, 405216, 379693, 405217, ou 405218.
Em algumas modalidades, uma região alvo é nucleotídeos 587- 603 de SEQ ID NO: 3. Em algumas modalidades, um composto anti-sentido curto é dirigido para nucleotídeos 587-603 de SEQ ID NO: 3. Em algumas modalidades referidas, um composto anti-sentido curto dirigido para nucleo- tídeos 587-603 compreende uma seqüência de nucleotídeos selecionada entre SEQ ID NO 258, 259, 260, 261, 262, ou 263. Em algumas modalidades referidas, um composto anti-sentido curto dirigido para nucleotídeos 587-603 de SEQ ID NO: 3 é selecionado entre o Ng ISIS 405219, 405220, 405221, 405222, 405223, ou 405224.
Em algumas modalidades, uma região alvo é nucleotídeos 974- 1014 de SEQ ID NO: 3. Em algumas modalidades, um composto anti-sentido curto é dirigido para nucleotídeos 974-1014 de SEQ ID NO: 3. Em algumas modalidades referidas, um composto anti-sentido curto dirigido para nucleo- tídeos 974-1014 compreende uma seqüência de nucleotídeos selecionada entre SEQ ID NO 267, 268, 269, 270, 271, 272, ou 274. Em algumas moda- lidades referidas, um composto anti-sentido curto dirigido para nucleotídeos 974-1014 de SEQ ID NO: 3 é selecionado entre o Ne ISIS 379696, 405226, 405227, 405228, 405229, 405230, 379697, ou 405231.
Em algumas modalidades, uma região alvo é nucleotídeos 998- 1014 de SEQ ID NO: 3. Em algumas modalidades, um composto anti-sentido curto é dirigido para nucleotídeos 998-1014 de SEQ ID NO: 3. Em algumas modalidades referidas, um composto anti-sentido curto dirigido para nucleo- tídeos 998-1014 compreende uma seqüência de nucleotídeos selecionada entre SEQ ID NO 268, 269, 270, 271, 272, ou 274. Em algumas modalidades referidas, um composto anti-sentido curto dirigido para nucleotídeos 998- 1014 de SEQ ID NO: 3 é selecionado entre o N9 ISIS 405226, 405227, 405228, 405229, 405230, 379697, ou 405231.
Em algumas modalidades, uma região alvo é nucleotídeos 1091- 1170 de SEQ ID NO: 3. Em algumas modalidades, um composto anti-sentido curto é dirigido para nucleotídeos 1091-1170 de SEQ ID NO: 3. Em algumas modalidades referidas, um composto anti-sentido curto dirigido para nucleo- tídeos 1091-1170 compreende uma seqüência de nucleotídeos selecionada entre SEQ ID NO 275, 276, 277, 278, 279, 280, 281, 283, 284, 285, 286, ou 287. Em algumas modalidades referidas, um composto anti-sentido curto dirigido para nucleotídeos 1091-1170 de SEQ ID NO: 3 é selecionado entre O Ns ISIS 379698, 405232, 405233, 405234, 405235, 388626, 379699, .382677, 405236, 405237, 405238, 379700, ou 405239.
Em algumas modalidades, uma região alvo é nucleotídeos 1091- .1104 de SEQ ID NO: 3. Em algumas modalidades, um composto anti-sentido curto é dirigido para nucleotídeos 1091-1104 de SEQ ID NO: 3. Em algumas modalidades referidas, um composto anti-sentido curto dirigido para nucleo- tídeos 1091-1104 compreende uma seqüência de nucleotídeos selecionada entre SEQ ID NO 275, 276, ou 277. Em algumas modalidades referidas, um composto anti-sentido curto dirigido para nucleotídeos 1091-1104 de SEQ ID NO: 3 é selecionado entre o Nq ISIS 379698, 405232, ou 405233.
Em algumas modalidades, uma região alvo é nucleotídeos 1130- .1144 de SEQ ID NO: 3. Em algumas modalidades, um composto anti-sentido curto é dirigido para nucleotídeos 1130-1144 de SEQ ID NO: 3. Em algumas modalidades referidas, um composto anti-sentido curto dirigido para nucleo- tídeos 1130-1144 compreende uma seqüência de nucleotídeos selecionada entre SEQ ID NO 278, 279, 280, 281, ou 283. Em algumas modalidades re- feridas, um composto anti-sentido curto dirigido para nucleotídeos 1130- .1144 de SEQ ID NO: 3 é selecionado entre o N5 ISIS 405234, 405235, .388626, 379699, 382677, ou 405236.
Em algumas modalidades, uma região alvo é nucleotídeos 1157- .1170 de SEQ ID NO: 3. Em algumas modalidades, um composto anti-sentido curto é dirigido para nucleotídeos 1157-1170 de SEQ ID NO: 3. Em algumas modalidades referidas, um composto anti-sentido curto dirigido para nucleo- tídeos 1157-1170 compreende uma seqüência de nucleotídeos selecionada entre SEQ ID NO 284, 285, ou 287. Em algumas modalidades referidas, um composto anti-sentido curto dirigido para nucleotídeos 1157-1170 de SEQ ID NO: 3 é selecionado entre o N9 ISIS 405237, 405238, 379700, ou 405239.
Em algumas modalidades, uma região alvo é nucleotídeos 1542- 30 1556 de SEQ ID NO: 3. Em algumas modalidades, um composto anti-sentido curto é dirigido para nucleotídeos 1542-1556 de SEQ ID NO: 3. Em algumas modalidades referidas, um composto anti-sentido curto dirigido para núcleo- tídeos 1542-1556 compreende uma seqüência de nucleotídeos selecionada entre SEQ ID NO 289, 290, 291, 292, ou 293. Em algumas modalidades re- feridas, um composto anti-sentido curto dirigido para nucleotídeos 1542-1556 de SEQ ID NO: 3 é selecionado entre o Ng ISIS 405240, 405241,405242, 388629, 379702, ou 382678.
Em algumas modalidades, uma região alvo é nucleotídeos 1976-1991 de SEQ ID NO: 3. Em algumas modalidades, um composto anti-sentido curto é dirigido para nucleotídeos 1976-1991 de SEQ ID NO: 3. Em algumas modalidades referidas, um composto anti-sentido curto dirigido para nucleo- tídeos 1976-1991 compreende uma seqüência de nucleotídeos selecionada entre SEQ ID NO 296, 297, 298, 299, ou 300. Em algumas modalidades re- feridas, um composto anti-sentido curto dirigido para nucleotídeos 1976-1991 de SEQ ID NO: 3 é selecionado entre o Ng ISIS 405243, 405244,405245, 405246, ou 405247. Em algumas modalidades, compostos anti-sentido curtos dirigi- dos para um ácido nucléico SGLT2 têm 8 a 16, preferencialmente 9 a 15, mais preferencialmente 9 a 14, mais preferencialmente 10 a 14 nucleotídeos de extensão. Em algumas modalidades, compostos anti-sentido curtos diri- gidos para um ácido nucléico SGLT2 têm 9 a 14 nucleotídeos de extensão. Em algumas modalidades, compostos anti-sentido curtos dirigidos para um ácido nucléico SGLT2 têm 10 a 14 nucleotídeos de extensão. Em algumas modalidades, os compostos anti-sentido curtos referidos são oligonucleotí- deos anti-sentido curtos.
Em algumas modalidades, compostos anti-sentido curtos dirigi- dos para um ácido nucléico SGLT2 são gápmeros curtos. Em algumas mo- dalidades referidas, gápmeros curtos dirigidos para um ácido nucléico S- GLT2 compreendem no mínimo uma modificação de alta afinidade em uma ou mais asas do composto. Em algumas modalidades, compostos anti- sentido curtos dirigidos para um ácido nucléico SGLT2 compreendem 1 a 3 modificações de alta afinidade em cada asa. Em algumas modalidades refe- ridas, os nucleosídeos ou nucleotídeos da asa compreendem uma modifica- ção 2'. Em algumas modalidades referidas, os monômeros da asa são BNA's. Em algumas modalidades referidas, os monômeros da asa são sele- cionados entre α-L-Metilenoóxi (4'-CH2-0-2') BNA, β-D-Metilenoóxi (4'-CH2- 0-2') BNA, Etilenoóxi (4'-(CH2)2-0-2') BNA, Aminoóxi (4'-CH2-0-N(R)-2') BNA e Oxiamino (4'-CH2-N(R)-0-2') BNA. Em algumas modalidades, os mo- nômeros de uma asa compreendem um substituinte na posição 2' selecio- nada entre alila, amino, azido, tio, O-alila, O-Ci-Cioalquila, -OCF3, O-(CH2)2- nucleotídeos 2'MOE.
Em algumas modalidades, compostos anti-sentido curtos dirigi- dos para um ácido nucléico SGLT2 compreendem um gap entre a asa 5' e a asa 3'. Em algumas modalidades, o gap compreende cinco, seis, sete, oito, nove, dez, onze, doze, treze, ou quatorze monômeros. Em algumas modali- dades, os monômeros do gap são desoxirribonucleotídeos não modificados. Em algumas modalidades, os monômeros do gap são ribonucleotídeos não modificados. Em algumas modalidades, gap de modificações de gap (se houver) resultam em um composto anti-sentido que, quando ligado a seu ácido nucléico alvo, suporta clivagem por uma RNase, incluindo, mas não limitada a, RNase H.
Em algumas modalidades, compostos anti-sentido curtos dirigi- dos para um ácido nucléico SGLT2 têm ligações monoméricas uniformes. Em algumas modalidades referidas, estas ligações são todas ligações fosfo- rotioato. Em algumas modalidades, as ligações são todas ligações fosfodiés- ter. Em algumas modalidades, compostos anti-sentido curtos dirigidos para um ácido nucléico SGLT2 têm espinhas dorsais mistas.
Em algumas modalidades, compostos anti-sentido curtos dirigi- dos para um ácido nucléico SGLT2 têm 8 monômeros de extensão. Em al- gumas modalidades, compostos anti-sentido curtos dirigidos para um ácido nucléico SGLT2 têm 9 monômeros de extensão. Em algumas modalidades, compostos anti-sentido curtos dirigidos para um ácido nucléico SGLT2 têm 10 monômeros de extensão. Em algumas modalidades, compostos anti- sentido curtos dirigidos para um ácido nucléico SGLT2 têm 11 monômeros de extensão. Em algumas modalidades, compostos anti-sentido curtos diri- gidos para um ácido nucléico SGLT2 têm monômeros de extensão. Em al- gumas modalidades, compostos anti-sentido curtos dirigidos para um ácido nucléico SGLT2 têm 13 monômeros de extensão. Em algumas modalidades, compostos anti-sentido curtos dirigidos para um ácido nucléico SGLT2 têm .14 monômeros de extensão. Em algumas modalidades, compostos anti- sentido curtos dirigidos para um ácido nucléico SGLT2 têm 15 monômeros de extensão. Em algumas modalidades, compostos anti-sentido curtos diri- gidos para um ácido nucléico SGLT2 têm 16 monômeros de extensão. Em algumas modalidades, compostos anti-sentido curtos dirigidos para um ácido nucléico SGLT2 compreendem 9 a 15 monômeros. Em algumas modalida- des, compostos anti-sentido curtos dirigidos para um ácido nucléico SGLT2 compreendem 10 a 15 monômeros. Em algumas modalidades, compostos anti-sentido curtos dirigidos para um ácido nucléico SGLT2 compreendem 12 a 14 monômeros. Em algumas modalidades, compostos anti-sentido curtos dirigidos para um ácido nucléico SGLT2 compreendem 12 a 14 nucleotídeos ou nucleosídeos.
Em algumas modalidades, a invenção proporciona métodos para modular a expressão de SGLT2. Em algumas modalidades, os métodos re- feridos compreendem uso de um ou mais composto anti-sentido curto dirigi- do para um ácido nucléico SGLT2, em que o composto anti-sentido curto dirigido para um ácido nucléico SGLT2 tem a partir de cerca de 8 a cerca de .16, preferencialmente 9 a 15, mais preferencialmente 9 a 14, mais preferen- cialmente 10 a 14 monômeros (isto é, a partir de cerca de 8 a cerca de 16 monômeros ligados). Uma pessoa com conhecimento regular da técnica re- conhecerá que isto compreende métodos para modular a expressão de S- GLT2 usando um ou mais compostos anti-sentido curtos dirigidos para um ácido nucléico SGLT2 de 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 ou 16 monômeros. Em algumas modalidades, métodos para modular SGLT2 com- preendem uso de um composto anti-sentido curto dirigido para um ácido nu- cléico SGLT2 que tem 8 monômeros de extensão. Em algumas modalida- des, métodos para modular SGLT2 compreendem uso de um composto anti- sentido curto dirigido para um ácido nucléico SGLT2 que tem 9 monômeros de extensão. Em algumas modalidades, métodos para modular SGLT2 com- preendem uso de um composto anti-sentido curto dirigido para um ácido nu- cléico SGLT2 que tem 10 monômeros de extensão. Em algumas modalida- des, métodos para modular SGLT2 compreendem uso de um composto anti- sentido curto dirigido para um ácido nucléico SGLT2 que tem 11 monômeros de extensão. Em algumas modalidades, métodos para modular SGLT2 com- preendem uso de um composto anti-sentido curto dirigido para um ácido nu- cléico SGLT2 que tem 12 monômeros de extensão. Em algumas modalida- des, métodos para modular SGLT2 compreendem uso de um composto anti- sentido curto dirigido para um ácido nucléico SGLT2 que tem 13 monômeros de extensão. Em algumas modalidades, métodos para modular SGLT2 com- preendem uso de um composto anti-sentido curto dirigido para um ácido nu- cléico SGLT2 que tem 14 monômeros de extensão. Em algumas modalida- des, métodos para modular SGLT2 compreendem uso de um composto anti- sentido curto dirigido para um ácido nucléico SGLT2 que tem 15 monômeros de extensão. Em algumas modalidades, métodos para modular SGLT2 com- preendem uso de um composto anti-sentido curto dirigido para um ácido nu- cléico SGLT2 que tem 16 monômeros de extensão.
Em algumas modalidades, métodos para modular a expressão de SGLT2 compreendem uso de um composto anti-sentido curto dirigido para um ácido nucléico SGLT2 compreendendo 9 a 15 monômeros. Em al- gumas modalidades, métodos para modular a expressão de SGLT2 compre- endem uso de um composto anti-sentido curto dirigido para um ácido nucléi- co SGLT2 compreendendo 10 a 15 monômeros. Em algumas modalidades, métodos para modular a expressão de SGLT2 compreendem uso de um composto anti-sentido curto dirigido para um ácido nucléico SGLT2 compre- endendo 12 a 14 monômeros. Em algumas modalidades, métodos para mo- dular a expressão de SGLT2 compreendem uso de um composto anti- sentido curto dirigido para um ácido nucléico SGLT2 compreendendo 12 ou 14 nucleotídeos ou nucleosídeos. .3. PCSK9
Em indivíduos com hipercolesterolemia auto-sômica dominante (ADH)1 níveis elevados de colesterol LDL têm sido ligados a mutações nos genes codificando LDL-receptor (LDL-R), apolipoproteína B (apoB), ou pró- proteína convertase subtilisina/cexina tipo 9 (PCSK9) (Abifadel et al., Nat. Genet., 2003, 34:154-156). PCSK9 foi identificado como um terceiro lócus associado com ADH quando fio visto que mutações de ganho-de-função em PCSK9 estavam ligadas a níveis elevados de colesterol LDL. A ApoB parti- cipa na montagem e secreção intracelular de lipoproteínas ricas em triglice- rídeos e é um Iigante para o LDL-R. PCSK9 é proposto para reduzir os ní- veis de expressão de LDL-R no fígado. A expressão reduzida de LDL-R re- sulta em reduzida captação hepática de lipoproteínas contendo ApoB circu- lantes, que por sua vez leva a colesterol elevado. Definições
"PCSK9" é o produto genético ou proteína cuja expressão deve ser modulada por administração de um composto anti-sentido curto.
"Ácido nucléico PCSK9" significa qualquer ácido nucléico codifi- cando PCSK9. Por exemplo, em determinadas modalidades, um ácido nu- cléico PCSK9 inclui, sem limitação, uma seqüência de DNA codificando PCSK9, uma seqüência de RNA transcrita de DNA codificando PCSK9, e uma seqüência de RNAm codificando PCSK9.
"RNAm PCSK9" significa um RNAm codificando PCSK9. Indicações Terapêuticas de PCSK9
Em algumas modalidades, a invenção proporciona métodos para modular a expressão de PCSK9 em um indivíduo compreendendo adminis- trar um composto anti-sentido curto dirigido para um ácido nucléico PCSK9. Em algumas modalidades, a invenção proporciona métodos para tratar um indivíduo compreendendo administrar uma ou mais composições farmacêu- ticas da presente invenção. Em algumas modalidades, o indivíduo tem hi- percolesterolemia, dislipidemia mista, aterosclerose, um risco de desenvol- ver aterosclerose, doença cardíaca coronária, um histórico de doença cardí- aca coronária, doença cardíaca coronária de início precoce, um ou mais fa- tores de risco para doença cardíaca coronária, diabetes tipo II, diabetes tipo Il com dislipidemia, dislipidemia, hipertrigliceridemia, hiperlipidemia, acidemia hipergraxa, esteatose hepática, esteatohepatite não-alcoólica, ou doença hepática graxa não-alcoólica.
Diretrizes para terapia de redução de lipídeo foram estabeleci- das em 2001 pelo Terceiro Painel de Tratamento de Adulto (ATP III) do Pro- grama Nacional de Educação sobre o Colesterol (NCEP), e atualizadas em .2004 (Grundy et al., Circulation, 2004, 110, 227-239). As diretrizes incluem obter um perfila lipoprotéico completo, tipicamente depois de um jejum de 9 a 12 horas, para determinação dos níveis de colesterol LDL, colesterol total, e colesterol HDL. De acordo com as diretrizes estabelecidas mais recente- mente, níveis de colesterol LDL de 130 a 159 mg/dL, 160 a 189 mg/dL, e maiores do que ou iguais a 190 mg/dL são considerados elevados limítrofes, elevados, e muito elevados, respectivamente. Níveis de colesterol total de . 200 a 239 e maiores do que ou iguais a 240 mg/dL são considerados eleva- dos limítrofes e elevados, respectivamente. Níveis de colesterol HDL de me- nos de 40 mg/dL são considerados baixos.
Em algumas modalidades, o indivíduo foi identificado como ne- cessitando de terapia de redução de lipídeo. Em algumas modalidades refe- ridas, o indivíduo foi identificado como necessitando de terapia de redução de lipídeo de acordo com as diretrizes estabelecidas em 2001 pelo Terceiro Painel de Tratamento de Adulto (ATP III) do Programa Nacional de Educa- ção sobre o Colesterol (NCEP), e atualizadas em 2004 (Grundy et al., Circu- lation, 2004, 110, 227-239). Em algumas modalidades referidas, o indivíduo que necessita de terapia de redução de lipídeo tem colesterol LDL acima de .190 mg/dL. Em algumas modalidades referidas, o indivíduo que necessita de terapia de redução de lipídeo tem colesterol LDL acima de 160 mg/dL. Em algumas modalidades referidas, o indivíduo que necessita de terapia de re- dução de lipídeo tem colesterol LDL acima de 130 mg/dL. Em algumas mo- dalidades referidas, o indivíduo que necessita de terapia de redução de lipí- deo tem colesterol LDL acima de 100 mg/dL. Em algumas modalidades refe- ridas, o indivíduo que necessita de terapia de redução de lipídeo deve man- ter o colesterol LDL abaixo de 160 mg/dL. Em algumas modalidades referi- das, o indivíduo que necessita de terapia de redução de lipídeo deve manter o colesterol LDL abaixo de 130 mg/dL. Em algumas modalidades referidas, o indivíduo que necessita de terapia de redução de lipídeo deve manter o co- lesterol LDL abaixo de 100 mg/dL. Em algumas modalidades referidas, o indivíduo deve manter o colesterol LDL abaixo de 70 mg/dL.
Em algumas modalidades, a invenção proporciona métodos para reduzir ApoB em um indivíduo. Em algumas modalidades, a invenção pro- porciona métodos para reduzir Iipoproteína contendo ApoB em um indivíduo. Em algumas modalidades, a invenção proporciona métodos para reduzir co- lesterol LDL em um indivíduo. Em algumas modalidades, a invenção propor- ciona métodos para reduzir colesterol VLDL em um indivíduo. Em algumas modalidades, a invenção proporciona métodos para reduzir colesterol IDL em um indivíduo. Em algumas modalidades, a invenção proporciona méto- dos para reduzir colesterol não HDL em um indivíduo. Em algumas modali- dades, a invenção proporciona métodos para reduzir Lp(a) em um indivíduo. Em algumas modalidades, a invenção proporciona métodos para reduzir tri- glicerídeo sérico em um indivíduo. Em algumas modalidades, a invenção proporciona métodos para reduzir o triglicerídeo hepático em um indivíduo. Em algumas modalidades, a invenção proporciona métodos para reduzir o colesterol LDL oxidado em um indivíduo. Em algumas modalidades, a inven- ção proporciona métodos para reduzir partículas pequenas de LDL em um indivíduo. Em algumas modalidades, a invenção proporciona métodos para reduzir partículas pequenas de VLDL em um indivíduo. Em algumas modali- dades, a invenção proporciona métodos para reduzir fosfolipídeos em um indivíduo. Em algumas modalidades, a invenção proporciona métodos para reduzir fosfolipídeos oxidados em um indivíduo.
Em algumas modalidades, os métodos proporcionados pela pre- sente invenção não reduzem o colesterol HDL. Em algumas modalidades, os métodos proporcionados pela presente invenção não resultam em acumula- ção de lipídeos no fígado.
Em algumas modalidades, uma composição farmacêutica com- preendendo um composto anti-sentido curto dirigido para um ácido nucléico PCSK9 é para uso em terapia. Em algumas modalidades, a terapia é a redu- ção de colesterol LDL1 ApoB, colesterol VLDL, colesterol IDL, colesterol não HDL, Lp(a), triglicerídeo sérico, triglicerídeo hepático, colesterol LDL oxida- do, pequenas partículas de LDL, pequenas partículas de VLDL, fosfolipí- deos, ou fosfolipídeos oxidados em um indivíduo. Em algumas modalidades, a terapia é o tratamento de hipercolesterolemia, dislipidemia mista, ateros- clerose, um risco de desenvolver aterosclerose, doença cardíaca coronária, um histórico de doença cardíaca coronária, doença cardíaca coronária de início precoce, um ou mais fatores de risco para doença cardíaca coronária, diabetes tipo II, diabetes tipo Il com dislipidemia, dislipidemia, hipertrigliceri- demia, hiperlipidemia, acidemia hipergraxa, esteatose hepática, esteatohe- patite não-alcoólica, ou doença hepática graxa não-alcoólica. Em modalida- des adicionais, a terapia é a redução do risco de doença cardíaca coronária. Em algumas a terapia é a prevenção de aterosclerose. Em algumas modali- dades, a terapia é a prevenção de doença cardíaca coronária.
Em algumas modalidades, uma composição farmacêutica com- preendendo um composto anti-sentido curto dirigido para um ácido nucléico PCSK9 é usado para a preparação de um medicamento para reduzir coles- te rol LDL, ApoB, colesterol VLDL, colesterol IDL, colesterol não HDL, Lp(a), triglicerídeo sérico, triglicerídeo hepático, colesterol LDL oxidado, pequenas partículas de LDL, pequenas partículas de VLDL, fosfolipídeos, ou fosfolipí- deos oxidados em um indivíduo. Em algumas modalidades, composição farmacêutica compreendendo um composto anti-sentido curto dirigido para PCKS9 é usado para a preparação de um medicamento para reduzir o risco de doença cardíaca coronária. Em algumas modalidades, um composto anti- sentido curto dirigido para um ácido nucléico PCSK9 é usado para a prepa- ração de um medicamento para o tratamento de hipercolesterolemia, dislipi- demia mista, aterosclerose, um risco de desenvolver aterosclerose, doença cardíaca coronária, um histórico de doença cardíaca coronária, doença car- díaca coronária de início precoce, um ou mais fatores de risco para doença cardíaca coronária, diabetes tipo II, diabetes tipo Il com dislipidemia, dislipi- demia, hipertrigliceridemia, hiperlipidemia, acidemia hipergraxa, esteatose hepática, esteatohepatite não-alcoólica, ou doença hepática graxa não- alcoólica.
Terapias de Combinação de PCSK9
Em algumas modalidades, uma ou mais composições farmacêu- ticas da presente invenção são co-administradas com um ou mais outros agentes farmacêuticos. Em algumas modalidades, um ou mais outros agen- tes farmacêuticos referidos são designados para tratar a mesma doença ou condição que a uma ou mais composições farmacêuticas da presente inven- ção. Em algumas modalidades, um ou mais outros agentes farmacêuticos referidos são designados para tratar uma doença ou condição diferente que a uma ou mais composições farmacêuticas da presente invenção. Em algu- mas modalidades, um ou mais outros agentes farmacêuticos referidos são designados para tratar um efeito indesejado de uma ou mais composições farmacêuticas da presente invenção. Em algumas modalidades, uma ou mais composições farmacêuticas da presente invenção são co- administradas com outro agente farmacêutico para tratar um efeito indeseja- do deste outro agente farmacêutico. Em algumas modalidades, uma ou mais composições farmacêuticas da presente invenção e um ou mais outros a- gentes farmacêuticos são administrados ao mesmo tempo. Em algumas mo- dalidades, uma ou mais composições farmacêuticas da presente invenção e um ou mais outros agentes farmacêuticos são administrados em momentos diferentes. Em algumas modalidades, uma ou mais composições farmacêu- ticas da presente invenção e um ou mais outros agentes farmacêuticos são preparados juntos em uma única formulação. Em algumas modalidades, uma ou mais composições farmacêuticas da presente invenção e um ou mais outros agentes farmacêuticos são preparados separadamente.
Em algumas modalidades, agentes farmacêuticos que podem ser co-administrados com uma composição farmacêutica da presente inven- ção incluem agentes de redução de lipídeo. Em algumas modalidades referi- das, agentes farmacêuticos que podem ser co-administrados com uma com- posição farmacêutica da presente invenção incluem, mas não estão limita- dos uma atorvastatina, sinvastatina, rosuvastatina, e ezetimibe. Em algumas modalidades referidas, o agente de redução de lipídeo é administrado antes nistrado depois da administração de uma composição farmacêutica da pre- sente invenção. Em algumas modalidades referidas, o agente de redução de lipídeo é administrado ao mesmo tempo como uma composição farmacêuti- ca da presente invenção. Em algumas modalidades referidas, a dose de um agente de redução de lipídeo co-administrado é a mesma que a dose que seria administrada se o agente de redução de lipídeo fosse administrado sozinho. Em algumas modalidades referidas, a dose de um agente de redu- ção de lipídeo co-administrado é menor do que a dose que seria administra- da se o agente de redução de lipídeo fosse administrado sozinho. Em algu- mas modalidades referidas, a dose de um agente de redução de lipídeo co- administrado é maior do que a dose que seria administrada se o agente de redução de lipídeo fosse administrado sozinho.
Em algumas modalidades, um agente de redução de lipídeo co- administrado é um inibidor da HMG-CoA redutase. Em algumas modalidades referidas, o inibidor da HMG-CoA redutase é uma estatina. Em algumas mo- dalidades referidas, a estatina é selecionada entre atorvastatina, sinvastati- na, pravastatina, fluvastatina, e rosuvastatina.
Em algumas modalidades, um agente de redução de lipídeo co- administrado é um inibidor da absorção de colesterol. Em algumas modali- dades referidas, inibidor da absorção de colesterol é ezetimibe.
Em algumas modalidades, um agente de redução de lipídeo co- administrado é um inibidor da HMG-CoA redutase e inibidor da absorção de colesterol co-formulado. Em algumas modalidades referidas, o agente de redução de lipídeo co-formulado é ezetimibe/sinvastatina.
Em algumas modalidades, um agente de redução de lipídeo co- administrado é um inibidor da proteína de transferência de triglicerídeo mi- crossômico (inibidor da MTP).
Em algumas modalidades, um agente de redução de lipídeo co- administrado é um oligonucleotídeo dirigido para um ácido nucléico ApoB.
Em algumas modalidades, um agente farmacêutico co- administrado é um seqüestrante de ácidos biliares. Em algumas modalida- des referidas, o seqüestrante de ácidos biliares é selecionado entre colesti- ramina, colestipol, e colesevelam.
Em algumas modalidades, um agente farmacêutico co- administrado é um ácido nicotínico. Em algumas modalidades referidas, o ácido nicotínico é selecionado entre ácido nicotínico de liberação imediata, ácido nicotínico de liberação prolongada, e ácido nicotínico de liberação gra- dual.
Em algumas modalidades, um agente farmacêutico co- administrado é um ácido fíbrico. Em algumas modalidades referidas, um áci- do fíbrico é selecionado entre genfibrozila, fenofibrato, clofibrato, bezafibrato, e ciprofibrato.
Exemplos adicionais de agentes farmacêuticos que podem ser co-administrados com uma composição farmacêutica da presente invenção incluem, mas não estão limitados a, corticosteróides, incluindo mas não limi- tados à prednisona; imunoglobulinas, incluindo, mas não-limitadas à imuno- globulina intravenosa (IVIg); analgésicos (por exemplo, acetaminofen); agen- tes antiinflamatórios, incluindo, mas não limitados à drogas antiinflamatórias não-esteróides (por exemplo, ibuprofeno, inibidores de COX-1, e inibidores de COX-2); salicilatos; antibióticos; antivirais; agentes antifúngicos; agentes antidiabéticos (por exemplo, biguanidas, inibidores de glucosidase, insulinas, sulfoniluréias, e tiazolidenodionas); modificadores adrenérgicos; diuréticos; hormônios (por exemplo, esteróides anabólicos, androgênio, estrogênio, cal- citonina, progestina, somatostan, e hormônios tiroidianos); imunomodulado- res; relaxantes musculares; antihistamínicos; agentes contra osteoporose (por exemplo, bifosfonatos, calcitonina, e estrogênios); prostaglandinas, a- gentes antineoplásicos; agentes psicoterápicos; sedativos; produtos de poi- son oak ou poison sumac; anticorpos; e vacinas.
Em algumas modalidades, as composições farmacêuticas da presente invenção podem ser administradas em combinação com uma tera- pia de redução de lipídeo. Em algumas modalidades referidas, uma terapia de redução de lipídeo é alteração terapêutica do estilo de vida. Em algumas modalidades referidas, uma terapia de redução de lipídeo é aferese de LDL. Alguns Compostos Anti-sentido Curtos Dirigidos para um Ácido Nucléico PCSK9
Em algumas modalidades, compostos anti-sentido curtos são dirigidos para um ácido nucléico PCSK9 tendo a seqüência do GENBANK® de Acesso N6 NM_174936.2, incorporada aqui, a este requerimento de pa- tente, como SEQ ID NO: 4. Em algumas modalidades referidas, um compos- to anti-sentido curto dirigido para SEQ ID NO: 4 é no mínimo 90% comple- mentar à SEQ ID NO: 4. Em algumas modalidades referidas, um composto anti-sentido curto dirigido para SEQ ID NO: 4 é no mínimo 95% complemen- tar à SEQ ID NO: 4. Em algumas modalidades referidas, um composto anti- sentido curto dirigido para SEQ ID NO: 4 é 100% complementar à SEQ ID NO: 4. Em algumas modalidades, um composto anti-sentido curto dirigido para SEQ ID NO: 4 compreende uma seqüência de nucleotídeos seleciona- da entre as seqüências de nucleotídeos determinadas na Tabela 6 ou Tabe- la 7.
A seqüência de nucleotídeos determinada em cada NO de SEQ ID nas Tabelas 6 e 7 é independente de qualquer modificação para uma porção açúcar, uma ligação internucleosídeos, ou uma nucleobase. Deste modo, compostos anti-sentido curtos definidos por um NO de SEQ ID podem compreender, independentemente, uma ou mais modificações para uma porção açúcar, uma ligação internucleosídeos, ou uma nucleobase. Com- postos anti-sentido curtos descrito pelo Número Isis (NQ ISIS) indicam uma combinação de seqüência de nucleobases e uma ou mais modificações para uma porção açúcar, uma ligação internucleosídeos, ou uma nucleobase.
As Tabelas 6 e 7 ilustram exemplos de compostos anti-sentido curtos dirigidos para SEQ ID NO: 4. A Tabela 6 ilustra compostos anti- sentido curtos que são 100% complementares à SEQ ID NO: 4. A Tabela 7 ilustra compostos anti-sentido curtos que têm uma ou duas combinações inadequadas com respeito à SEQ ID NO: 4. A coluna com o título 'motivo de gápmero' indica o motivo asa-gap-asa de cada compostos anti-sentido cur- tos. O segmento de gap compreende 2'-desoxinucleotídeos e cada nucleotí- deo de cada segmento de asa compreende um açúcar 2'-modificado. O açú- car 2'-modificado em particular também é indicado na coluna de 'motivo de gápmero'. Por exemplo, '2-10-2 MOE1 significa um motivo de gápmero 2-10- 2, onde um segmento de gap de dez 2'-desoxinucleotídeos é flanqueado por segmentos de asa de dois nucleotídeos, onde os nucleotídeos dos segmen- tos de asa são nucleotídeos 2'-MOE. Ligações internucleosídeos são fosfo- rotioato. Os compostos anti-sentido curtos compreendem 5-metilcitidina ao invés de citosina não modificada, a menos que "citosina não modificada" esteja listada na coluna de motivo de gápmero, em cujo caso as citosinas indicadas são citosinas não modificadas. Por exemplo, "5-mC em gap so- mente" indica que o segmento de gap tem 5-metilcitosinas, ao passo que os segmentos de asa têm citosinas não modificadas.
Tabela 6: Compostos Anti-sentido Curtos dirigidos para SEQ ID NO: 4
<table>table see original document page 145</column></row><table> <table>table see original document page 146</column></row><table> <table>table see original document page 147</column></row><table> Nq ISIS Sítio Alvo 5' Sítio Alvo 3' Seqüência (5'-3') Motivo de Gáp- mero SEQ ID NO Metilenoóxi BNA 403740 1455 1468 CCACGTGGGCAGCA 2-10-2 (6'S)-6'-metila- Metilenoóxi BNA 362 Tabela 7: Compostos anti-sentido curtos dirigidos para SEQ ID NO: 4 e ten- do 1 ou 2 combinações inadequadas <table>table see original document page 148</column></row><table>
Em algumas modalidades, uma região alvo é nucleotídeos 695- 710 de SEQ ID NO: 4. Em algumas modalidades referidas, compostos anti- sentido curtos dirigidos para nucleotídeos 695-710 de SEQ ID NO: 4 com- preendem uma seqüência de nucleotídeos selecionada entre SEQ ID NO: 329, 330, ou 331. Em algumas modalidades referidas, um composto anti- sentido curto dirigido para nucleotídeos 695-710 de SEQ ID NO: 4 é selecio- nado entre o N9 ISIS 400297, 400298, ou 400299.
Em algumas modalidades, uma região alvo é nucleotídeos 742- 770 de SEQ ID NO: 4. Em algumas modalidades referidas, um composto anti-sentido curto dirigido para nucleotídeos 742-770 de SEQ ID NO: 4 com- preende uma seqüência de nucleotídeos selecionada entre SEQ ID NO 332 ou 333. Em algumas modalidades referidas, um composto anti-sentido curto dirigido para nucleotídeos 742-770 de SEQ ID NO: 4 é selecionado entre o N2 ISIS 400300 ou 400301.
Em algumas modalidades, uma região alvo é nucleotídeos 828- 843 de SEQ ID NO: 4. Em algumas modalidades referidas, um composto anti-sentido curto dirigido para nucleotídeos 828-843 de SEQ ID NO: 4 com- preende uma seqüência de nucleotídeos selecionada entre SEQ ID NO 334, 335, ou 336. Em algumas modalidades referidas, um composto anti-sentido curto dirigido para nucleotídeos 828-843 de SEQ ID NO: 4 é selecionada entre Ne ISIS 400302, 400303, ou 400304.
Em algumas modalidades, uma região alvo é nucleotídeos 937- 1007 de SEQ ID NO: 4. Em algumas modalidades referidas, um composto anti-sentido curto dirigido para nucleotídeos 937-1007 de SEQ ID NO: 4 compreende uma seqüência de nucleotídeos selecionada entre SEQ ID NO 337, 338, 339, 340, 341, 342, 343, 344, ou 345. Em algumas modalidades referidas, um composto anti-sentido curto dirigido para nucleotídeos 937- 1007 de SEQ ID NO: 4 é selecionado entre o Nq ISIS 400305, 400306, 400307, 400308, 400309, 400310, 400311, 400312, 400313, ou 403739.
Em algumas modalidades, uma região alvo é nucleotídeos 937- 965 de SEQ ID NO: 4. Em algumas modalidades referidas, um composto anti-sentido curto dirigido para nucleotídeos 937-965 de SEQ ID NO: 4 com- preende uma seqüência de nucleotídeos selecionada entre SEQ ID NO 337 ou 338. Em algumas modalidades referidas, um composto anti-sentido curto dirigido para nucleotídeos 937-965 de SEQ ID NO: 4 é selecionado entre o Nq ISIS 400305 ou 400306.
Em algumas modalidades, uma região alvo é nucleotídeos 988- 1007 de SEQ ID NO: 4. Em algumas modalidades referidas, um composto anti-sentido curto dirigido para nucleotídeos 988-1007 de SEQ ID NO: 4 compreende uma seqüência de nucleotídeos selecionada entre SEQ ID NO .339, 340, 341, 342, 343, 344, ou 345. Em algumas modalidades referidas, um composto anti-sentido curto dirigido para nucleotídeos 937-1007 de SEQ ID NO: 4 é selecionado entre o Nq ISIS 400307, 400308, 400309, 400310,400311, 400312, 4003313, ou 403739.
Em algumas modalidades, uma região alvo é nucleotídeos 1057-1160 de SEQ ID NO: 4. Em algumas modalidades referidas, um compostoanti-sentido curto dirigido para nucleotídeos 1057-1160 de SEQ ID NO: 4 compreende uma seqüência de nucleotídeos selecionada entre SEQ ID NO 346, 347, 348, 349, 350, 351, 352, 353, 354, ou 355. Em algumas modalida- des referidas, um composto anti-sentido curto dirigido para nucleotídeos 1057-1160 de SEQ ID NO: 4 é selecionado entre o Nq ISIS 400314, 400315,400316,400317,400318, 400319, 400320, 400321, 400322, ou 400323.
Em algumas modalidades, uma região alvo é nucleotídeos 1057-1109 de SEQ ID NO: 4. Em algumas modalidades referidas, um composto anti-sentido curto dirigido para nucleotídeos 1057-1109 de SEQ ID NO: 4 compreende uma seqüência de nucleotídeos selecionada entre SEQ ID NO 346, 347, 348, 349, 350, 351, 352, 353, ou 354. Em algumas modalidades referidas, um composto anti-sentido curto dirigido para nucleotídeos 1057-1109 de SEQ ID NO: 4 é selecionado entre o Nq ISIS 400314, 400315,400316, 400317, 400318, 400319, 400320, 400321, ou 400322.
Em algumas modalidades, uma região alvo é nucleotídeos 1057-1091 de SEQ ID NO: 4. Em algumas modalidades referidas, um composto anti-sentido curto dirigido para nucleotídeos 1057-1091 de SEQ ID NO: 4 compreende uma seqüência de nucleotídeos selecionada entre SEQ ID NO 346, 347, 348, 349, ou 350. Em algumas modalidades referidas, um compos- to anti-sentido curto dirigido para nucleotídeos 1057-1091 de SEQ ID NO: 4 é selecionado entre o N2 ISIS 400314, 400315, 400316, 400317, ou 400318.
Em algumas modalidades, uma região alvo é nucleotídeos 1093-1109 de SEQ ID NO: 4. Em algumas modalidades referidas, um composto anti-sentido curto dirigido para nucleotídeos 1093-1109 de SEQ ID NO: 4 compreende uma seqüência de nucleotídeos selecionada entre SEQ ID NO 351, 352, 353, ou 354. Em algumas modalidades referidas, um composto anti-sentido curto dirigido para nucleotídeos 1057-1109 de SEQ ID NO: 4 é selecionado entre o N2 ISIS 400319, 400320, 400321, ou 400322.
Em algumas modalidades, uma região alvo é nucleotídeos 1334- 1349 de SEQ ID NO: 4. Em algumas modalidades referidas, um composto anti-sentido curto dirigido para nucleotídeos 1334-1349 de SEQ ID NO: 4 compreende uma seqüência de nucleotídeos selecionada entre SEQ ID NO 357, 358, ou 359. Em algumas modalidades referidas, um composto anti- sentido curto dirigido para nucleotídeos 1334-1349 de SEQ ID NO: 4 é sele- cionada entre o N2 Isis 400325, 400326, ou 400327.
Em algumas modalidades, uma região alvo é nucleotídeos 1453- 1469 de SEQ ID NO: 4. Em algumas modalidades referidas, um composto anti-sentido curto dirigido para nucleotídeos 1453-1469 de SEQ ID NO: 4 compreende uma seqüência de nucleotídeos selecionada entre SEQ ID NO 360, 361, 362, ou 363. Em algumas modalidades referidas, um composto anti-sentido curto dirigido para nucleotídeos 1453-1469 de SEQ ID NO: 4 é selecionada entre o Ns Isis 400328, 400329, 400330, 400331, ou 403470.
Em algumas modalidades, uma região alvo é nucleotídeos 1569- 1591 de SEQ ID NO: 4. Em algumas modalidades referidas, um composto anti-sentido curto dirigido para nucleotídeos 1569-1591 de SEQ ID NO: 4 compreende uma seqüência de nucleotídeos selecionada entre SEQ ID NO 364, 365, 366, 367, 368, 369, 370, 371, 372, ou 373. Em algumas modalida- des referidas, um composto anti-sentido curto dirigido para nucleotídeos 1569-1591 de SEQ ID NO: 4 é selecionada entre o Ns Isis 400332, 400333, 400334, 400335, 400336, 400337, 400338, 400339, 400340, ou 400341.
Em algumas modalidades, uma região alvo é nucleotídeos 1621- 1637 de SEQ ID NO: 4. Em algumas modalidades referidas, um composto anti-sentido curto dirigido para nucleotídeos 1621-1637 de SEQ ID NO: 4 compreende uma seqüência de nucleotídeos selecionada entre SEQ ID NO 374, 375, 376, ou 377. Em algumas modalidades referidas, um composto anti-sentido curto dirigido para nucleotídeos 1621-1637 de SEQ ID NO: 4 é selecionada entre o N2 Isis 400342, 400343, 400344, ou 400345.
Em algumas modalidades, uma região alvo é nucleotídeos 1738- .1754 de SEQ ID NO: 4. Em algumas modalidades referidas, um composto anti-sentido curto dirigido para nucleotídeos 1738-1754 de SEQ ID NO: 4 compreende uma seqüência de nucleotídeos selecionada entre SEQ ID NO .378, 379, 380, ou 381. Em algumas modalidades referidas, um composto anti-sentido curto dirigido para nucleotídeos 1738-1754 de SEQ ID NO: 4 é selecionada entre o N2 Isis 400346, 400347, 400348, ou 400349.
Em algumas modalidades, uma região alvo é nucleotídeos 1834- .1853 de SEQ ID NO: 4. Em algumas modalidades referidas, um composto anti-sentido curto dirigido para nucleotídeos 1834-1853 de SEQ ID NO: 4 compreende uma seqüência de nucleotídeos selecionada entre SEQ ID NO .382, 383, 384, 385, 386, 387, ou 388. Em algumas modalidades, um com- posto anti-sentido curto dirigido para nucleotídeos 1834-1853 de SEQ ID NO: 4 é selecionada entre o N5 Isis 400350, 400351, 400352, 400353, .400354, 400355, ou 400356. Em algumas modalidades, uma região alvo é nucleotídeos 2083- .2099 de SEQ ID NO: 4. Em algumas modalidades referidas, um composto anti-sentido curto dirigido para nucleotídeos 2083-2099 de SEQ ID NO: 4 compreende uma seqüência de nucleotídeos selecionada entre SEQ ID NO .389, 390, 391, ou 392. Em algumas modalidades referidas, um composto anti-sentido curto dirigido para nucleotídeos 2083-2099 de SEQ ID NO: 4 é selecionada entre o N2 Isis 400357, 400358, 400359, ou 400360.
Em algumas modalidades, uma região alvo é nucleotídeos 2316- .2338 de SEQ ID NO: 4. Em algumas modalidades referidas, um composto anti-sentido curto dirigido para nucleotídeos 2316-2338 de SEQ ID NO: 4 compreende uma seqüência de nucleotídeos selecionada entre SEQ ID NO .393, 394, 395, 396, 397, 398, 399, 400, 401, ou 402. Em algumas modalida- des referidas, um composto anti-sentido curto dirigido para nucleotídeos .2316-2338 de SEQ ID NO: 4 é selecionada entre o N9 Isis 400361, 400362, .400363, 400364, 400365, 400366, 400367, 400368, 400369, ou 400370. Em algumas modalidades, compostos anti-sentido curtos dirigi- dos para um ácido nucléico PCSK9 têm 8 a 16, preferencialmente 9 a 15, mais preferencialmente 9 a 14, mais preferencialmente 10 a 14 nucleotídeos de extensão. Em algumas modalidades, compostos anti-sentido curtos diri- gidos para um ácido nucléico PCSK9 têm 9 a 14 nucleotídeos de extensão. Em algumas modalidades, compostos anti-sentido curtos dirigidos para um ácido nucléico PCSK9 têm 10 a 14 nucleotídeos de extensão. Em algumas modalidades, os compostos anti-sentido curtos referidos são oligonucleotí- deos anti-sentido curtos.
Em algumas modalidades, compostos anti-sentido curtos dirigi- dos para um ácido nucléico PCSK9 são gápmeros curtos. Em algumas mo- dalidades referidas, gápmeros curtos dirigidos para um ácido nucléico PCSK9 compreendem no mínimo uma modificação de alta afinidade em uma ou mais asas do composto. Em algumas modalidades, compostos anti- sentido curtos dirigidos para um ácido nucléico PCSK9 compreendem 1 a 3 modificações de alta afinidade em cada asa. Em algumas modalidades refe- ridas, os nucleosídeos ou nucleotídeos da asa compreendem uma modifica- ção 2'. Em algumas modalidades referidas, os monômeros da asa são BNA's. Em algumas modalidades referidas, os monômeros da asa são sele- cionados entre α-L-Metilenoóxi (4'-CH2-0-2') BNA, β-D-Metilenoóxi (4'-CH2- 0-2') BNA, Etilenoóxi (4'-(CH2)2-0-2') BNA, Aminoóxi (4'-CH2-0-N(R)-2') BNA e Oxiamino (4'-CH2-N(R)-0-2') BNA. Em algumas modalidades, os mo- nômeros de uma asa compreendem um substituinte na posição 2' selecio- nada entre alila, amino, azido, tio, O-alila, O-Ci-Ci0alquila, -OCF3, O-(CH2)2- O-CH3, 2'-0(CH2)2SCH3, O-(CH2)2-O-N(Rm)(Rn), e 0-CH2-C(=0)-N(Rm)(Rn), onde cada Rm e Rn é, independentemente, H ou C1-Ci0 alquila substituída ou não-substituída. Em algumas modalidades, os monômeros de uma asa são nucleotídeos 2'MOE.
Em algumas modalidades, compostos anti-sentido curtos dirigi- dos para um ácido nucléico PCSK9 compreendem um gap entre a asa 5' e a asa 3'. Em algumas modalidades o gap compreende cinco, seis, sete, oito, nove, dez, onze, doze, treze, ou quatorze monômeros. Em algumas modali- dades, os monômeros do gap são desoxirribonucleotídeos não modificados. Em algumas modalidades, os monômeros do gap são ribonucleotídeos não modificados. Em algumas modalidades, gap de modificações de gap (se houver) resultam em um composto anti-sentido que, quando ligado a seu ácido nucléico alvo, suporta clivagem por uma RNase, incluindo, mas não limitada a, RNase H.
Em algumas modalidades, compostos anti-sentido curtos tendo por alvo um ácido nucléico PCSK9 podem ter qualquer uma ou mais propri- edades ou características dos compostos anti-sentido curtos descritos de modo geral aqui, neste requerimento de patente. Em algumas modalidades, compostos anti-sentido curtos tendo por alvo um ácido nucléico PCSK9 têm um motivo (asa - gap desóxi - asa) selecionado entre 1-12-1, 1-1-10-2, 2- 10-1-1,3-10-3, 2-10-3, 2-10-2, 1-10-1,1-10-2, 3-8-3, 2-8-2, 1-8-1,3-6-3 ou 1- 6-1, mais preferencialmente 1-10-1, 2-10-2, 3-10-3, e 1-9-2.
Em algumas modalidades, compostos anti-sentido curtos dirigi- dos para um ácido nucléico PCSK9 têm ligações monoméricas uniformes. Em algumas modalidades referidas, estas ligações são todas ligações fosfo- rotioato. Em algumas modalidades, as ligações são todas ligações fosfodiés- ter. Em algumas modalidades, compostos anti-sentido curtos dirigidos para um ácido nucléico PCSK9 têm espinhas dorsais mistas.
Em algumas modalidades, compostos anti-sentido curtos dirigi- dos para um ácido nucléico PCSK9 têm 8 monômeros de extensão. Em al- gumas modalidades, compostos anti-sentido curtos dirigidos para um ácido nucléico PCSK9 têm 9 monômeros de extensão. Em algumas modalidades, compostos anti-sentido curtos dirigidos para um ácido nucléico PCSK9 têm 10 monômeros de extensão. Em algumas modalidades, compostos anti- sentido curtos dirigidos para um ácido nucléico PCSK9 têm 11 monômeros de extensão. Em algumas modalidades, compostos anti-sentido curtos diri- gidos para um ácido nucléico PCSK9 têm 12 monômeros de extensão. Em algumas modalidades, compostos anti-sentido curtos dirigidos para um ácido nucléico PCSK9 têm 13 monômeros de extensão. Em algumas modalidades, compostos anti-sentido curtos dirigidos para um ácido nucléico PCSK9 têm 14 monômeros de extensão. Em algumas modalidades, compostos anti- sentido curtos dirigidos para um ácido nucléico PCSK9 têm 15 monômeros de extensão. Em algumas modalidades, compostos anti-sentido curtos diri- gidos para um ácido nucléico PCSK9 têm 16 monômeros de extensão. Em algumas modalidades, compostos anti-sentido curtos dirigidos para um ácido nucléico PCSK9 compreendem 9 a 15 monômeros. Em algumas modalida- des, compostos anti-sentido curtos dirigidos para um ácido nucléico PCSK9 compreendem 10 a 15 monômeros. Em algumas modalidades, compostos anti-sentido curtos dirigidos para um ácido nucléico PCSK9 compreendem .12 a 14 monômeros. Em algumas modalidades, compostos anti-sentido cur- tos dirigidos para um ácido nucléico PCSK9 compreendem 12 a 14 nucleotí- deos ou nucleosídeos.
Em algumas modalidades, a invenção proporciona métodos para modular a expressão de PCSK9. Em algumas modalidades, os métodos re- feridos compreendem uso de um ou mais composto anti-sentido curto dirigi- do para um ácido nucléico PCSK9, em que o composto anti-sentido curto dirigido para um ácido nucléico PCSK9 tem a partir de cerca de 8 a cerca de .16, preferencialmente 9 a 15, mais preferencialmente 9 a 14, mais preferen- cialmente 10 a 14 monômeros (isto é, a partir de cerca de 8 a cerca de 16 monômeros ligados). Uma pessoa com conhecimento regular da técnica re- conhecerá que isto compreende métodos para modular a expressão de PCSK9 usando um ou mais compostos anti-sentido curtos dirigidos para um ácido nucléico PCSK9 de 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 ou 16 monômeros.
Em algumas modalidades, métodos para modular PCSK9 com- preendem uso de um composto anti-sentido curto dirigido para um ácido nu- cléico PCSK9 que tem 8 monômeros de extensão. Em algumas modalida- des, métodos para modular PCSK9 compreendem uso de um composto anti- sentido curto dirigido para um ácido nucléico PCSK9 que tem 9 monômeros de extensão. Em algumas modalidades, métodos para modular PCSK9 compreendem uso de um composto anti-sentido curto dirigido para um ácido nucléico PCSK9 que tem 10 monômeros de extensão. Em algumas modali- dades, métodos para modular PCSK9 compreendem uso de um composto anti-sentido curto dirigido para um ácido nucléico PCSK9 que tem 11 monô- meros de extensão. Em algumas modalidades, métodos para modular PCSK9 compreendem uso de um composto anti-sentido curto dirigido para um ácido nucléico PCSK9 que tem 12 monômeros de extensão. Em algumas modalidades, métodos para modular PCSK9 compreendem uso de um com- posto anti-sentido curto dirigido para um ácido nucléico PCSK9 que tem 13 monômeros de extensão. Em algumas modalidades, métodos para modular PCSK9 compreendem uso de um composto anti-sentido curto dirigido para um ácido nucléico PCSK9 que tem 14 monômeros de extensão. Em algumas modalidades, métodos para modular PCSK9 compreendem uso de um com- posto anti-sentido curto dirigido para um ácido nucléico PCSK9 que tem 15 monômeros de extensão. Em algumas modalidades, métodos para modular PCSK9 compreendem uso de um composto anti-sentido curto dirigido para um ácido nucléico PCSK9 que tem 16 monômeros de extensão.
Em algumas modalidades, métodos para modular a expressão de PCSK9 compreendem uso de um composto anti-sentido curto dirigido para um ácido nucléico PCSK9 compreendendo 9 a 15 monômeros. Em al- gumas modalidades, métodos para modular a expressão de PCSK9 com- preendem uso de um composto anti-sentido curto dirigido para um ácido nu- cléico PCSK9 compreendendo 10 a 15 monômeros. Em algumas modalida- des, métodos para modular a expressão de PCSK9 compreendem uso de um composto anti-sentido curto dirigido para um ácido nucléico PCSK9 compreendendo 12 a 14 monômeros. Em algumas modalidades, métodos para modular a expressão de PCSK9 compreendem uso de um composto anti-sentido curto dirigido para um ácido nucléico PCSK9 compreendendo 12 ou 14 nucleotídeos ou nucleosídeos.
4. Enzima Superóxido Dismutase 1 (SOD1)
As enzimas conhecidas como as superóxido dismutases (SODs) proporcionam defesa contra lesão oxidativa de biomoléculas catalisando a dismutação de superóxido para peróxido de hidrogênio (H2O2) (Fridovich, Annu. Rev. Biochem., 1995, 64, 97-112). Existem duas classes principais de superóxido dismutases. Uma consiste em um grupo de enzimas com sítios ativos contendo cobre e zinco enquanto a outra classe tem ou manganês ou ferro no sítio ativo (Fridovich, Annu. Rev. Biochem., 1995, 64, 97-112).
Mutações no gene superóxido dismutase 1 estão associadas com uma forma hereditária dominante de esclerose lateral amiotrófica (ELA, também conhecida como doença de Lou Gehrig) um distúrbio caracterizado por uma degeneração seletiva de neurônios motores superiores e inferiores (Cleveland e Liu, Nat. Med., 2000, 6, 1320-1321). Os efeitos deletérios de várias mutações sobre a superóxido dismutase 1 são mais provavelmente mediados através de um ganho de função tóxica ao invés de uma perda de atividade da superóxido dismutase 1, como a completa ausênia de superóxi- do dismutase 1 em camundongos nem diminui a vida nem provoca doença patente (Al-Chalabi and Leigh, Curr. Opin. Neurol., 2000, 13, 397-405; Alisky and Davidson, Hum. Gene Ther., 2000, 11, 2315-2329).
Foram identificadas mais de 100 mutações do gene SOD1 hu- mano, e juntas são responsáveis por aproximadamente 20% dos casos de esclerose lateral amiotrófica familiar (ELA). Algumas mutações, tais como a mutação A4V mais comumente encontrada nos Estados Unidos, são alta- mente letais e resultam em sobrevida de somente nove meses a partir do início dos sintomas da doença. Outras mutações do SOD1 se manifestam em um curso de doença mais lento. Definições
"SOD1" significa o produto genético ou proteína cuja expressão deve ser modulada por administração de um composto anti-sentido curto.
"Ácido nucléico SOD1" significa qualquer ácido nucléico codifi- cando SOD1. Por exemplo, em determinadas modalidades, um ácido nucléi- co SOD1 inclui, sem limitações, uma seqüência de DNA codificando SOD1, uma seqüência de RNA transcrita de DNA codificando SOD1, e uma se- qüência de RNAm codificando SOD1.
"RNAm SOD1" significa um RNAm codificando SOD1. Indicações Terapêuticas de SOD1
Foi descoberto que a inibição anti-sentido de superóxido dismu- tase 1 (SOD1) em um modelo animal de esclerose lateral amiotrófica familiar reduz tanto RNAm quanto proteína de SOD1, e resulta adicionalmente em um retardamento da progressão da doença e, de modo importante, aumento do tempo de sobrevida. Por conseguinte, em determinadas modalidades, a invenção proporciona métodos para o retardamento da progressão da doen- ça em um indivíduo sofrendo de esclerose lateral amiotrófica familiar admi- nistrando a um indivíduo semelhante um composto anti-sentido curto dirigido para um ácido nucléico SOD1. Em algumas modalidades referidas, um com- posto anti-sentido curto dirigido para SOD1 é liberado diretamente no fluido cerebrospinal do indivíduo. Em algumas modalidades referidas, métodos adicionalmente compreendem aumentar o tempo de sobrevida de um indiví- duo sofrendo de esclerose lateral amiotrófica familiar. O retardamento da progressão da doença é indicado por uma melhora em um ou mais indicado- res da progressão da doença esclerose lateral amiotrófica, incluindo, sem limitação, a escala de classificação funcional de esclerose lateral amiotrófica revisada, testes da função pulmonar, e medições da força muscular. Terapias de Combinação de SOD1
Em algumas modalidades, uma ou mais composições farmacêu- ticas compreendendo um composto anti-sentido curto dirigido para um ácido nucléico SOD1 é co-administrada com um ou mais outros agentes farmacêu- ticos. Em algumas modalidades, um ou mais outros agentes farmacêuticos referidos são designados para tratar a mesma doença ou condição que a uma ou mais composições farmacêuticas da presente invenção. Em algu- mas modalidades, um ou mais outros agentes farmacêuticos referidos são designados para tratar uma doença ou condição diferentes como a uma ou mais composições farmacêuticas da presente invenção. Em algumas moda- lidades, um ou mais outros agentes farmacêuticos referidos são designados para tratar um efeito indesejado de uma ou mais composições farmacêuticas da presente invenção. Em algumas modalidades, uma ou mais composições farmacêuticas da presente invenção são co-administradas com outro agente farmacêutico para tratar um efeito indesejado deste outro agente farmacêuti- co. Em algumas modalidades, uma ou mais composições farmacêuticas da presente invenção e um ou mais outros agentes farmacêuticos são adminis- trados ao mesmo tempo. Em algumas modalidades, uma ou mais composi- ções farmacêuticas da presente invenção e um ou mais outros agentes far- macêuticos são administrados em momentos diferentes. Em algumas moda- lidades, uma ou mais composições farmacêuticas da presente invenção e um ou mais outros agentes farmacêuticos são preparados juntos em uma única formulação. Em algumas modalidades, uma ou mais composições farmacêuticas da presente invenção e um ou mais outros agentes farmacêu- ticos são preparados separadamente.
Em algumas modalidades, um agente farmacêutico co- administrado é um ácido nicotínico. Em algumas modalidades referidas, o ácido nicotínico é selecionado entre ácido nicotínico de liberação imediata, ácido nicotínico de liberação prolongada, e ácido nicotínico de liberação gra- dual.
Em algumas modalidades, um agente farmacêutico co- administrado é um ácido fíbrico. Em algumas modalidades referidas, um áci- do fíbrico é selecionado entre genfibrozila, fenofibrato, clofibrato, bezafibrato, e ciprofibrato.
Exemplos adicionais de agentes farmacêuticos que podem ser co-administrados com uma composição farmacêutica compreendendo um composto anti-sentido curto dirigido para SOD1 incluem, mas não estão limi- tados a, corticosteróides, incluindo mas não limitados à prednisona; imuno- globulinas, incluindo, mas não-limitadas à imunoglobulina intravenosa (IVIg); analgésicos (por exemplo, acetaminofen); agentes antiinflamatórios, incluin- do, mas não limitados à drogas antiinflamatórias não-esteróides (por exem- plo, ibuprofeno, inibidores de COX-1, e inibidores de COX-2); salicilatos; an- tibióticos; antivirais; agentes antifúngicos; agentes antidiabéticos (por exem- plo, biguanidas, inibidores de glucosidase, insulinas, sulfoniluréias, e tiazoli- denodionas); modificadores adrenérgicos; diuréticos; hormônios (por exem- plo, esteróides anabólicos, androgênio, estrogênio, calcitonina, progestina, somatostan, e hormônios tiroidianos); imunomoduladores; relaxantes muscu- lares; antihistamínicos; agentes contra osteoporose (por exemplo, bifosfona- tos, calcitonina, e estrogênios); prostaglandinas, agentes antineoplásicos; agentes psicoterápicos; sedativos; produtos de poison oak ou poison sumac, anticorpos; e vacinas.
Alguns Compostos Anti-sentido Curtos Dirigidos para um Ácido Nucléico Em algumas modalidades, compostos anti-sentido curtos são dirigidos para um ácido nucléico SOD1 tendo a seqüência do GENBANK® de Acesso N2 NM_X02317.1, incorporada aqui, a este requerimento de patente, como SEQ ID NO: 5. Em algumas modalidades referidas, um composto anti- sentido curto dirigido para SEQ ID NO: 5 é no mínimo 90% complementar à SEQ ID NO: 5. Em algumas modalidades referidas, um composto anti- sentido curto dirigido para SEQ ID NO: 5 é no mínimo 95% complementar à SEQ ID NO: 5. Em algumas modalidades referidas, um composto anti- sentido curto dirigido para SEQ ID NO: 5 é 100% complementar à SEQ ID NO: 5. Em algumas modalidades, um composto anti-sentido curto dirigido para SEQ ID NO: 5 compreende uma seqüência de nucleotídeos seleciona- da entre the nucleotídeo seqüências determinado na Tabela 8 ou Tabela 9.
A seqüência de nucleotídeos determinada em cada NO de SEQ ID nas Tabelas 8 e 9 é independente de qualquer modificação para uma porção açúcar, uma ligação internucleosídeos, ou uma nucleobase. Deste modo, compostos anti-sentido curtos definidos por um NO de SEQ ID podem compreender, independentemente, uma ou mais modificações para uma porção açúcar, uma ligação internucleosídeos, ou uma nucleobase. Com- postos anti-sentido curtos descritos pelo Número Isis (Ne ISIS) indicam uma combinação de seqüência de nucleobases e uma ou mais modificações para uma porção açúcar, uma ligação internucleosídeos, ou uma nucleobase.
A Tabela 8 ilustra exemplos de compostos anti-sentido curtos dirigidos para SEQ ID NO: 5. A Tabela 8 ilustra compostos anti-sentido cur- tos que são 100% complementares à SEQ ID NO: 5. A coluna com o título 'motivo de gápmero' indica o motivo asa-gap-asa de cada compostos anti- sentido curtos. O segmento de gap compreende 2'-desoxinucleotídeos e ca- da nucleotídeo de cada segmento de asa compreende um açúcar 2'- modificado. O açúcar 2'-modificado em particular também é indicado na co- luna de 'motivo de gápmero'. Por exemplo, '2-10-2 MOE1 significa um motivo de gápmero 2-10-2, onde um segmento de gap de dez 2'-desoxinucleotídeos é flanqueado por segmentos de asa de dois nucleotídeos, onde os nucleotí- deos dos segmentos de asa são nucleotídeos 2'-MOE. Ligações internucleo- sídeos são fosforotioato. Os compostos anti-sentido curtos compreendem 5- metilcitidina ao invés de citosina não modificada, a menos que "citosina não modificada" esteja listada na coluna de motivo de gápmero, em cujo caso as citosinas indicadas são citosinas não modificadas. Por exemplo, "5-mC em gap somente" indica que o segmento de gap tem 5-metilcitosinas, ao passo que os segmentos de asa têm citosinas não não modificadas.
Em algumas modalidades, compostos anti-sentido curtos tendo por alvo um ácido nucléico SOD1 podem ter qualquer uma ou mais proprie- dades ou características dos compostos anti-sentido curtos descritos de mo- do geral aqui, neste requerimento de patente. Em algumas modalidades, compostos anti-sentido curtos tendo por alvo um ácido nucléico SOD1 têm um motivo (asa - gap desóxi - asa) selecionado entre 1-12-1, 1-1-10-2, 2- 10-1-1, 3-10-3, 2-10-3, 2-10-2, 1-10-1,1-10-2, 3-8-3, 2-8-2, 1-8-1, 3-6-3 ou 1- 6-1, mais preferencialmente 1 -10-1, 2-10-2, 3-10-3, e 1 -9-2.
Tabela 8: Compostos Anti-sentido Curtos dirigidos para SEQ ID NO: 5
<table>table see original document page 161</column></row><table>
Em algumas modalidades, uma região alvo é nucleotídeos 85- 100 de SEQ ID NO: 5. Em algumas modalidades referidas, compostos anti- sentido curtos dirigidos para nucleotídeos 85-100 de SEQ ID NO: 5 compre- endem uma seqüência de nucleotídeos selecionada entre SEQ ID NO: 406, 407, ou 408. Em algumas modalidades referidas, um composto anti-sentido curto dirigido para nucleotídeos 85-100 de SEQ ID NO: 5 é selecionada en- tre Nq ISIS 387541, 387540, ou 387539.
Em algumas modalidades, compostos anti-sentido curtos dirigi- dos para um ácido nucléico SOD1 têm 8 a 16, preferencialmente 9 a 15, mais preferencialmente 9 a 14, mais preferencialmente 10 a 14 nucleotídeos de extensão. Em algumas modalidades, compostos anti-sentido curtos diri- gidos para um ácido nucléico SOD1 têm 9 a 14 nucleotídeos de extensão.
Em algumas modalidades, compostos anti-sentido curtos dirigidos para um ácido nucléico SOD1 têm 10 a 14 nucleotídeos de extensão. Em algumas modalidades, os compostos anti-sentido curtos referidos são oligonucleotí- deos anti-sentido curtos.
Em algumas modalidades, compostos anti-sentido curtos dirigi- dos para um ácido nucléico SOD1 são gápmeros curtos. Em algumas moda- lidades referidas, gápmeros curtos dirigidos para um ácido nucléico SOD1 compreendem no mínimo uma modificação de alta afinidade em uma ou mais asas do composto. Em algumas modalidades, compostos anti-sentido curtos dirigidos para um ácido nucléico SOD1 compreendem 1 a 3 modifica- ções de alta afinidade em cada asa. Em algumas modalidades referidas, os nucleosídeos ou nucleotídeos da asa compreendem uma modificação 2'. Em algumas modalidades referidas, os monômeros da asa são BNA1S. Em al- gumas modalidades referidas, os monômeros da asa são selecionados entre α-L-Metilenoóxi K-CH2-O-?) BNA, β-D-Metilenoóxi (4'-CH2-0-2') BNA, Etile- noóxi K-(CH2)2-O^') BNA, Aminoóxi (4'-CH2-0-N(R)-2') BNA e Oxiamino (4'-CH2-N(R)-0-2') BNA. Em algumas modalidades, os monômeros de uma asa compreendem um substituinte na posição 2' selecionada entre alila, a- mino, azido, tio, O-alila, O-CrC10 alquila, -OCF3, O-(CH2)2-O-CH3, 2'- O(CH2)2SCH3, O-(CH2)2-O-N(Rm)(Rn), e 0-CH2-C(=0)-N(Rm)(Rn), onde cada Rm e Rn é, independentemente, H ou CrC10 alquila substituída ou não- substituída. Em algumas modalidades, os monômeros de uma asa são nu- cleotídeos 2'MOE.
Em algumas modalidades, compostos anti-sentido curtos dirigi- dos para um ácido nucléico SOD1 compreendem um gap entre a asa 5' e a asa 3'. Em algumas modalidades o gap compreende cinco, seis, sete, oito, nove, dez, onze, doze, treze, ou quatorze monômeros. Em algumas modali- dades, os monômeros do gap são desoxirribonucleotídeos não modificados. Em algumas modalidades, os monômeros do gap são ribonucleotídeos não modificados. Em algumas modalidades, gap de modificações de gap (se houver) resultam em um composto anti-sentido que, quando ligado a seu ácido nucléico alvo, suporta clivagem por uma RNase, incluindo, mas não limitada a, RNase H.
Em algumas modalidades, compostos anti-sentido curtos dirigi- dos para um ácido nucléico SOD1 têm ligações monoméricas uniformes. Em algumas modalidades referidas, estas ligações são todas ligações fosforoti- oato. Em algumas modalidades, as ligações são todas ligações fosfodiéster.
Em algumas modalidades, compostos anti-sentido curtos dirigidos para um ácido nucléico SOD1 têm espinhas dorsais mistas.
Em algumas modalidades, compostos anti-sentido curtos dirigi- dos para um ácido nucléico SOD1 têm 8 monômeros de extensão. Em al- gumas modalidades, compostos anti-sentido curtos dirigidos para um ácido nucléico SOD1 têm 9 monômeros de extensão. Em algumas modalidades, compostos anti-sentido curtos dirigidos para um ácido nucléico SOD1 têm 10 monômeros de extensão. Em algumas modalidades, compostos anti-sentido curtos dirigidos para um ácido nucléico SOD1 têm 11 monômeros de exten- são. Em algumas modalidades, compostos anti-sentido curtos dirigidos para um ácido nucléico SOD1 têm monômeros de extensão. Em algumas modali- dades, compostos anti-sentido curtos dirigidos para um ácido nucléico SOD1 têm 13 monômeros de extensão. Em algumas modalidades, compostos anti- sentido curtos dirigidos para um ácido nucléico SOD1 têm 14 monômeros de extensão. Em algumas modalidades, compostos anti-sentido curtos dirigidos para um ácido nucléico SOD1 têm 15 monômeros de extensão. Em algumas modalidades, compostos anti-sentido curtos dirigidos para um ácido nucléico SOD1 têm 16 monômeros de extensão. Em algumas modalidades, compos- tos anti-sentido curtos dirigidos para um ácido nucléico SOD1 compreendem 9 a 15 monômeros. Em algumas modalidades, compostos anti-sentido curtos dirigidos para um ácido nucléico SOD1 compreendem 10 a 15 monômeros. Em algumas modalidades, compostos anti-sentido curtos dirigidos para um ácido nucléico SOD1 compreendem 12 a 14 monômeros. Em algumas mo- dalidades, compostos anti-sentido curtos dirigidos para um ácido nucléico SOD1 compreendem 12 a 14 nucleotídeos ou nucleosídeos.
Em algumas modalidades, a invenção proporciona métodos para modular a expressão de S0D1. Em algumas modalidades, os métodos refe- ridos compreendem uso de um ou mais composto anti-sentido curto dirigido para um ácido nucléico SOD1, em que o composto anti-sentido curto dirigido para um ácido nucléico S0D1 é a partir de cerca de 8 a cerca de 16, prefe- rencialmente 9 a 15, mais preferencialmente 9 a 14, mais preferencialmente 10 a 14 monômeros (isto é, a partir de cerca de 8 a cerca de 16 monômeros ligados). Uma pessoa com conhecimento regular da técnica reconhecerá que isto compreende métodos para modular a expressão de SOD1 usando um ou mais compostos anti-sentido curtos dirigidos para um ácido nucléico SOD1 de 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 ou 16 monômeros.
Em algumas modalidades, métodos para modular SOD1 com- preendem uso de um composto anti-sentido curto dirigido para um ácido nu- cléico SOD1 que tem 8 monômeros de extensão. Em algumas modalidades, métodos para modular SOD1 compreendem uso de um composto anti- sentido curto dirigido para um ácido nucléico SOD1 que tem 9 monômeros de extensão. Em algumas modalidades, métodos para modular SOD1 com- preendem uso de um composto anti-sentido curto dirigido para um ácido nu- cléico SOD1 que tem 10 monômeros de extensão. Em algumas modalida- des, métodos para modular SOD1 compreendem uso de um composto anti- sentido curto dirigido para um ácido nucléico SOD1 que tem 11 monômeros de extensão. Em algumas modalidades, métodos para modular SOD1 com- preendem uso de um composto anti-sentido curto dirigido para um ácido nu- cléico SOD1 que tem 12 monômeros de extensão. Em algumas modalida- des, métodos para modular SOD1 compreendem uso de um composto anti- sentido curto dirigido para um ácido nucléico SOD1 que tem 13 monômeros de extensão. Em algumas modalidades, métodos para modular SOD1 com- preendem uso de um composto anti-sentido curto dirigido para um ácido nu- cléico SOD1 que tem 14 monômeros de extensão. Em algumas modalida- des, métodos para modular SOD1 compreendem uso de um composto anti- sentido curto dirigido para um ácido nucléico SOD1 que tem 15 monômeros de extensão. Em algumas modalidades, métodos para modular SOD1 com- preendem uso de um composto anti-sentido curto dirigido para um ácido nu- cléico SOD1 que tem 16 monômeros de extensão.
Em algumas modalidades, métodos para modular a expressão de SOD1 compreendem uso de um composto anti-sentido curto dirigido para um ácido nucléico S0D1 compreendendo 9 a 15 monômeros. Em algumas modalidades, métodos para modular a expressão de SOD1 compreendem uso de um composto anti-sentido curto dirigido para um ácido nucléico S0D1 compreendendo 10 a 15 monômeros. Em algumas modalidades, mé- todos para modular a expressão de SOD1 compreendem uso de um com- posto anti-sentido curto dirigido para um ácido nucléico SOD1 compreen- dendo 12 a 14 monômeros. Em algumas modalidades, métodos para modu- lar a expressão de SOD1 compreendem uso de um composto anti-sentido curto dirigido para um ácido nucléico SOD1 compreendendo 12 ou 14 nucle- otídeos ou nucleosídeos. .5. CRP
CRP (também conhecida como proteína C-reativa e PTX1) é um reagente de fase aguda humano essencial produzido no fígado em resposta à uma variedade de citocinas inflamatórias. A proteína, identificada pela pri- meira vez em 1930, é altamente conservada e considerada um indicador precoce de condições infecciosas ou inflamatórias. Os níveis plasmáticos de CRP aumentam 1.000 vezes em resposta à infecção, isquemia, trauma, queimaduras, e condições inflamatórias. Em provas clínicas onde os pacien- tes recebem terapia de redução de lipídeo, tal como terapia de estatina, foi demonstrado que os pacientes tendo reduções tanto no colesterol LDL quan- to na CRP têm um risco reduzido de eventos coronários futuros em relação a pacientes experimentando somente reduções no colesterol LDL. Definições
"CRP" significa o produto genético ou proteína cuja expressão deve ser modulado por um composto anti-sentido curto.
"Ácido nucléico CRP" significa qualquer ácido nucléico codifi- cando CRP. Por exemplo, em determinadas modalidades, um ácido nucléico CRP inclui, sem limitações, uma seqüência de DNA codificando CRP, uma seqüência de RNA transcrita de DNA codificando CRP, e uma seqüência de RNAm codificando CRP.
"RNAm CRP" significa um RNAm codificando CRP. Indicações Terapêuticas de CRP
Em algumas modalidades, a invenção proporciona métodos para modular a expressão de CRP em um indivíduo compreendendo administrar ao indivíduo um composto anti-sentido curto dirigido para um ácido nucléico CRP. Em algumas modalidades, a invenção proporciona métodos para tratar um indivíduo compreendendo administrar uma ou mais composições farma- cêuticas compreendendo um composto anti-sentido curto dirigido para um ácido nucléico CRP. Em algumas modalidades, o indivíduo tem hipercoleste- rolemia, hipercolesterolemia não-familiar, hipercolesterolemia familiar, hiper- colesterolemia familiar heterozigótica, hipercolesterolemia familiar homozigó- tica, dislipidemia mista, aterosclerose, um risco de desenvolver aterosclero- se, doença cardíaca coronária, um histórico de doença cardíaca coronária, doença cardíaca coronária de início precoce, um ou mais fatores de risco para doença cardíaca coronária. Em algumas modalidades, o indivíduo tem síndrome coronária aguda, lesão vascular, oclusão arterial, angina instável, pós-doença vascular periférica, pós-enfarte do miocárdio (EM), trombose, trombo venoso profundo, doença renal em estágio terminal (DRET), falência renal crônica, ativação do complemento, falência cardíaca congestiva, ou vasculite sistêmica. Em algumas modalidades, o indivíduo teve um derrame. Em algumas modalidades, o indivíduo sofreu um procedimento selecionado entre colocação eletiva de stent, angioplastia, pós angioplastia transluminal percutânea (PTCA), transplante cardíaco, diálise renal ou by- pass cardiopulmonar.
Em algumas modalidades, o indivíduo tem uma doença inflama- tória. Em algumas modalidades referidas, a doença inflamatória é seleciona- da entre doença intestinal inflamatória, colite ulcerativa, artrite reumatóide, ou osteoartrite. Diretrizes para terapia de redução de lipídeo foram estabeleci- das em 2001 pelo Terceiro Painel de Tratamento de Adulto (ATP III) do Pro- grama Nacional de Educação sobre o Colesterol (NCEP), e atualizadas em 2004 (Grundy et al., Circulation, 2004, 110, 227-239). As diretrizes incluem obter um perfila lipoprotéico completo, tipicamente depois de um jejum de 9 a 12 horas, para determinação dos níveis de colesterol LDL1 colesterol total, e colesterol HDL. De acordo com as diretrizes estabelecidas mais recente- mente, níveis de colesterol LDL de 130 a 159 mg/dL, 160 a 189 mg/dL, e maiores do que ou iguais a 190 mg/dL são considerados elevados limítrofes, elevados, e muito elevados, respectivamente. Níveis de colesterol total de 200 a 239 e maiores do que ou iguais a 240 mg/dL são considerados eleva- dos limítrofes e elevados, respectivamente. Níveis de colesterol HDL de me- nos de 40 mg/dL são considerados baixos.
Em algumas modalidades, o indivíduo foi identificado como ne- cessitando de terapia de redução de lipídeo. Em algumas modalidades refe- ridas, o indivíduo foi identificado como necessitando de terapia de redução de lipídeo de acordo com as diretrizes estabelecidas em 2001 pelo Terceiro Painel de Tratamento de Adulto (ATP III) do Programa Nacional de Educa- ção sobre o Colesterol (NCEP), e atualizado em 2004 (Grundy et al., Circula- tion, 2004, 110, 227-239). Em algumas modalidades referidas, o indivíduo que necessita de terapia de redução de lipídeo tem colesterol LDL acima de 190 mg/dL. Em algumas modalidades referidas, o indivíduo que necessita de terapia de redução de lipídeo tem colesterol LDL acima de 160 mg/dL. Em algumas modalidades referidas, o indivíduo que necessita de terapia de re- dução de lipídeo tem colesterol LDL acima de 130 mg/dL. Em algumas mo- dalidades referidas, o indivíduo que necessita de terapia de redução de lipí- deo tem colesterol LDL acima de 100 mg/dL. Em algumas modalidades refe- ridas, o indivíduo que necessita de terapia de redução de lipídeo deve man- ter o colesterol LDL abaixo de 160 mg/dL. Em algumas modalidades referi- das, o indivíduo que necessita de terapia de redução de lipídeo deve manter o colesterol LDL abaixo de 130 mg/dL. Em algumas modalidades referidas, o indivíduo que necessita de terapia de redução de lipídeo deve manter o co- Iesterol LDL abaixo de 100 mg/dL. Em algumas modalidades referidas, o indivíduo deve manter o colesterol LDL abaixo de 70 mg/dL.
Em algumas modalidades, a invenção proporciona métodos para reduzir a CRP em um indivíduo. Em algumas modalidades referidas, a redu- ção na CRP é de no mínimo 10%, no mínimo 15%, no mínimo 20%, no mí- nimo 25%, no mínimo 30%, no mínimo 35%, no mínimo 40%, no mínimo 45%, no mínimo 50%, no mínimo 55%, no mínimo 60%, no mínimo 65%, no mínimo 70%, no mínimo 75%, no mínimo 80%, no mínimo 85%, no mínimo .90%, no mínimo 95%, e no mínimo 100%.
Em algumas modalidades, os métodos proporcionados pela pre- sente invenção não reduzem o colesterol HDL. Em algumas modalidades, os métodos proporcionados pela presente invenção não resultam em acúmulo de lipídeos no fígado. Em algumas modalidades, os métodos proporcionados pela presente invenção não causam esteatose hepática.
Em algumas modalidades, a invenção proporciona métodos para reduzir a concentração de CRP em um sujeito ao mesmo tempo que redu- zindo efeitos colaterais associados com o tratamento. Em algumas modali- dades referidas, um efeito colateral é toxicidade hepática. Em algumas mo- dalidades referidas, um efeito colateral é função hepática anormal. Em al- gumas modalidades referidas, um efeito colateral é alanina aminotransferase elevada (ALT). Em algumas modalidades referidas, um efeito colateral é as- partato aminotransferase elevada (AST).
Em algumas modalidades, a invenção proporciona métodos para reduzir a concentração de CRP em um sujeito que não esteja atingindo ní- veis alvo de colesterol LDL como um resultado da terapia de redução de lipí- deo. Em algumas modalidades referidas, um composto anti-sentido curto dirigido para um ácido nucléico CRP é o único agente farmacêutico adminis- trado ao sujeito. Em algumas modalidades referidas, o sujeito não cumpriu a terapia de redução de lipídeo recomendada. Em algumas modalidades refe- ridas, uma composição farmacêutica da invenção é co-administrada com uma terapia de redução de lipídeo diferente adicional. Em algumas modali- dades referidas, uma terapia adicional de redução de lipídeo é aferese de LDL. Em algumas modalidades referidas, uma terapia adicional de redução de lipídeo é uma estatina. Em algumas modalidades referidas, uma terapia adicional de redução de lipídeo é ezetimibe.
Em algumas modalidades, a invenção proporciona métodos para reduzir a concentração de CRP em um sujeito intolerante à estatina. Em al- gumas modalidades referidas, o sujeito tem aumentos da concentração de creatina quinase como um resultado da administração de estatina. Em algu- mas modalidades referidas, o sujeito tem anormalidades da função hepática como um resultado da administração de estatina. Em algumas modalidades referidas, o sujeito tem dores musculares como um resultado da administra- ção de estatina. Em algumas modalidades referidas, o sujeito tem efeitos colaterais do sistema nervoso central como um resultado da administração de estatina. Em algumas modalidades, o sujeito não cumpriu a administra- ção de estatina recomendada.
Em algumas modalidades, a invenção proporciona métodos para reduzir o risco de doença cardíaca coronária em um sujeito. Em algumas modalidades, a invenção proporciona métodos para retardar a progressão de aterosclerose em um sujeito. Em algumas modalidades referidas, a in- venção proporciona métodos para interromper a progressão de aterosclero- se em um sujeito. Em algumas modalidades referidas, a invenção proporcio- na métodos para reduzir o tamanho e/ou a prevalência de placas ateroscle- róticas em um sujeito. Em algumas modalidades os métodos proporcionados reduzem o risco de desenvolver aterosclerose um sujeito.
Em algumas modalidades, os métodos proporcionados melho- ram o resultado cardiovascular em um sujeito. Em algumas modalidades referidas, resultado cardiovascular aprimorado é a redução do risco de de- senvolver doença cardíaca coronária. Em algumas modalidades referidas, resultado cardiovascular aprimorado é uma redução na ocorrência de um ou mais eventos cardiovasculares principais, os quais incluem, mas não estão limitados a, morte, enfarte do miocárdio, reenfarte, derrame, choque cardio- gênico, edema pulmonar, parada cardíaca, e disritmia atrial. Em algumas modalidades referidas, o resultado cardiovascular aprimorado é evidenciado por espessura média da íntima da carótida aprimorada. Em algumas modali- dades referidas, espessura média da íntima da carótida aprimorada é uma redução na espessura. Em algumas modalidades referidas, espessura mé- dia da íntima da carótida aprimorada é uma prevenção de um aumento da espessura média da íntima.
Em algumas modalidades, uma composição farmacêutica com- preendendo um composto anti-sentido curto dirigido para um ácido nucléico CRP é para uso em terapia. Em algumas modalidades, a terapia é a redução de CRP em um indivíduo. Em algumas modalidades, a terapia é o tratamen- to de hipercolesterolemia, hipercolesterolemia não-familiar, hipercolestero- Iemia familiar, hipercolesterolemia familiar heterozigótica, hipercolesterole- mia familiar homozigótica, dislipidemia mista, aterosclerose, um risco de de- senvolver aterosclerose, doença cardíaca coronária, um histórico de doença cardíaca coronária, ou doença cardíaca coronária de início precoce. Em mo- dalidades adicionais, a terapia é a redução do risco de doença cardíaca co- ronária. Em algumas a terapia é a prevenção de aterosclerose. Em algumas modalidades, a terapia é a prevenção de doença cardíaca coronária. Em algumas modalidades, a terapia é o tratamento de síndrome coronária agu- da, falência renal crônica, lesão vascular, oclusão arterial, aterotrombose, angina instável, pós-doença vascular periférica, pós-enfarte do miocárdio (EM), trombose, trombo venoso profundo, doença renal em estágio terminal (DRET), ativação do complemento, falência cardíaca congestiva, ou vasculi- te sistêmica. Em algumas modalidades a terapia é o tratamento de um indi- víduo que tenha sofrido um procedimento selecionado entre colocação eleti- va de stent, angioplastia, pós angioplastia transluminal percutânea (PTCA), transplante cardíaco, diálise renal ou bypass cardiopulmonar. Em algumas modalidades, a terapia é o tratamento de um distúrbio inflamatório.
Em algumas modalidades, uma composição farmacêutica com- preendendo um composto anti-sentido curto dirigido para um ácido nucléico CRP é usado para a preparação de um medicamento para reduzir CRP em um indivíduo. Em algumas modalidades composição farmacêutica compre- endendo um composto anti-sentido curto dirigido para um ácido nucléico CRP é usado para a preparação de um medicamento para reduzir o risco de doença cardíaca coronária. Em algumas modalidades um composto anti- sentido curto dirigido para um ácido nucléico CRP é usado para a prepara- ção de um medicamento para o tratamento de hipercolesterolemia, hiperco- Iesterolemia não-familiar, hipercolesterolemia familiar, hipercolesterolemia familiar heterozigótica, hipercolesterolemia familiar homozigótica, dislipide- mia mista, aterosclerose, um risco de desenvolver aterosclerose, doença cardíaca coronária, um histórico de doença cardíaca coronária, doença car- díaca coronária de início precoce, ou um ou mais fatores de risco para doen- ça cardíaca coronária.
Em algumas modalidades, um composto anti-sentido curto diri- gido para um ácido nucléico CRP é usado para a preparação de um medi- camento para o tratamento de síndrome coronária aguda, falência renal crô- nica, lesão vascular, oclusão arterial, aterotrombose, angina instável, doença vascular pós periférica, pós-enfarte do miocárdio (EM), trombose, trombo venoso profundo, doença renal em estágio terminal (DRET), ativação do complemento, falência cardíaca congestiva, ou vasculite sistêmica. Em al- gumas modalidades, um composto anti-sentido curto dirigido para um ácido nucléico CRP é usado para a preparação de um medicamento para o trata- mento de um indivíduo que teve um derrame.
Em algumas modalidades, um composto anti-sentido curto diri- gido para um ácido nucléico CRP é usado para a preparação de um medi- camento para o tratamento em um indivíduo que tenha sofrido um procedi- mento selecionado entre colocação eletiva de stent, angioplastia, pós angio- plastia transluminal percutânea (PTCA), transplante cardíaco, diálise renal ou bypass cardiopulmonar.
Em algumas modalidades, um composto anti-sentido curto diri- gido para um ácido nucléico CRP é usado para a preparação de um medi- camento para o tratamento de uma doença inflamatória. Em algumas moda- lidades referidas, um composto anti-sentido curto dirigido para um ácido nu- cléico CRP é usado para a preparação de um medicamento para o tratamen- to de doença intestinal inflamatória, colite ulcerativa, artrite reumatóide, ou osteoartrite.
Terapias de Combinação de CRP
Em algumas modalidades, uma ou mais composições farmacêu- ticas compreendendo um composto anti-sentido curto dirigido para um ácido nucléico CRP são co-administradas com um ou mais outros agentes farma- cêuticos. Em algumas modalidades, um ou mais outros agentes farmacêuti- cos é um agente de redução de lipídeo. Em algumas modalidades, um ou mais outros agentes farmacêuticos referidos são designados para tratar a mesma doença ou condição que a uma ou mais composições farmacêuticas da presente invenção. Em algumas modalidades, um ou mais outros agentes farmacêuticos referidos são designados para tratar uma doença ou condição diferentes como a uma ou mais composições farmacêuticas da presente in- venção. Em algumas modalidades, um ou mais outros agentes farmacêuti- cos referidos são designados para tratar um efeito indesejado de uma ou mais composições farmacêuticas da presente invenção. Em algumas moda- lidades, uma ou mais composições farmacêuticas da presente invenção são co-administradas com outro agente farmacêutico para tratar um efeito inde- sejado deste outro agente farmacêutico. Em algumas modalidades, uma ou mais composições farmacêuticas da presente invenção e um ou mais outros agentes farmacêuticos são administrados ao mesmo tempo. Em algumas modalidades, uma ou mais composições farmacêuticas da presente inven- ção e um ou mais outros agentes farmacêuticos são administrados em mo- mentos diferentes. Em algumas modalidades, uma ou mais composições farmacêuticas da presente invenção e um ou mais outros agentes farmacêu- ticos são preparados juntos em uma única formulação. Em algumas modali- dades, uma ou mais composições farmacêuticas da presente invenção e um ou mais outros agentes farmacêuticos são preparados separadamente.
Em algumas modalidades, agentes farmacêuticos que podem ser co-administrados com uma composição farmacêutica compreendendo um composto anti-sentido curto dirigido para um ácido nucléico CRP incluem agentes de redução de lipídeo. Em algumas modalidades referidas, agentes farmacêuticos que podem ser co-administrados com uma composição far- macêutica da presente invenção incluem, mas não estão limitados uma ator- vastatina, sinvastatina, rosuvastatina, e ezetimibe. Em algumas modalidades referidas, o agente de redução de lipídeo é administrado antes da adminis- tração de uma composição farmacêutica da presente invenção. Em algumas modalidades referidas, o agente de redução de lipídeo é administrado depois da administração de uma composição farmacêutica da presente invenção. Em algumas modalidades referidas, o agente de redução de lipídeo é admi- nistrado ao mesmo tempo que uma composição farmacêutica da presente invenção. Em algumas modalidades referidas, a dose de um agente de re- dução de lipídeo co-administrado é a mesma que a dose que seria adminis- trada se o agente de redução de lipídeo fosse administrado sozinho. Em al- gumas modalidades referidas, a dose de um agente de redução de lipídeo co-administrado é menor do que a dose que seria administrada se o agente de redução de lipídeo fosse administrado sozinho. Em algumas modalidades referidas, a dose de um agente de redução de lipídeo co-administrado é maior do que a dose que seria administrada se o agente de redução de lipí- deo fosse administrado sozinho.
Em algumas modalidades, um agente de redução de lipídeo co- administrado é um inibidor da HMG-CoA redutase. Em algumas modalidades referidas, o inibidor da HMG-CoA redutase é uma estatina. Em algumas mo- dalidades referidas, a estatina é selecionada entre atorvastatina, sinvastati- na, pravastatina, fluvastatina, e rosuvastatina.
Em algumas modalidades, um agente de redução de lipídeo co- administrado é ISIS 301012.
Em algumas modalidades, um agente de redução de lipídeo co- administrado é um inibidor da absorção de colesterol. Em algumas modali- dades referidas, o inibidor da absorção de colesterol é ezetimibe.
Em algumas modalidades, um agente de redução de lipídeo co- administrado é um inibidor de HMG-CoA redutase co-formulado e inibidor da absorção de colesterol. Em algumas modalidades referidas, o agente de re- dução de lipídeo co-formulado é ezetimibe/sinvastatina.
Em algumas modalidades, um agente de redução de lipídeo co- administrado é um inibidor da proteína de transferência de triglicerídeo mi- crossômico (MTP inibidor).
Em algumas modalidades, um agente farmacêutico co- administrado é um seqüestrante de ácidos biliares. Em algumas modalida- des referidas, o seqüestrante de ácidos biliares é selecionado entre colesti- ramina, colestipol, e colesevelam.
Em algumas modalidades, um agente farmacêutico co- administrado é um ácido nicotínico. Em algumas modalidades referidas, o ácido nicotínico é selecionado entre ácido nicotínico de liberação imediata, ácido nicotínico de liberação prolongada, e ácido nicotínico de liberação gra- dual.
Em algumas modalidades, um agente farmacêutico co- administrado é um ácido fíbrico. Em algumas modalidades referidas, um áci- do fíbrico é selecionado entre genfibrozila, fenofibrato, clofibrato, bezafibrato, e ciprofibrato.
Exemplos adicionais de agentes farmacêuticos que podem ser co-administrados com uma composição farmacêutica compreendendo um composto anti-sentido curto dirigido para um ácido nucléico CRP incluem, mas não estão limitados a, corticosteróides, incluindo mas não limitados à prednisona; imunoglobulinas, incluindo, mas não-limitadas à imunoglobulina intravenosa (IVIg); analgésicos (por exemplo, acetaminofen); agentes antiin- flamatórios, incluindo, mas não limitados à drogas antiinflamatórias não- esteróides (por exemplo, ibuprofeno, inibidores de COX-1, e inibidores de COX-2); salicilatos; antibióticos; antivirais; agentes antifúngicos; agentes an- tidiabéticos (por exemplo, biguanidas, inibidores de glucosidase, insulinas, sulfoniluréias, e tiazolidenodionas); modificadores adrenérgicos; diuréticos; hormônios (por exemplo, esteróides anabólicos, androgênio, estrogênio, cal- citonina, progestina, somatostan, e hormônios tiroidianos); imunomodulado- res; relaxantes musculares; antihistamínicos; agentes contra osteoporose (por exemplo, bifosfonatos, calcitonina, e estrogênios); prostaglandinas, a- gentes antineoplásicos; agentes psicoterápicos; sedativos; produtos de poi- son oak ou poison sumac; anticorpos; e vacinas. Em algumas modalidades, uma composição farmacêutica com- preendendo um composto anti-sentido curto dirigido para um ácido nucléico CRP pode ser administrada em combinação com uma terapia de redução de lipídeo. Em algumas modalidades referidas, uma terapia de redução de lipí- deo é alteração terapêutica do estilo de vida. Em algumas modalidades refe- ridas, uma terapia de redução de lipídeo é aferese de LDL. Alguns Compostos Anti-sentido Curtos Dirigidos para um Ácido Nucléico CRP
Em algumas modalidades, compostos anti-sentido curtos são dirigidos para um ácido nucléico CRP tendo a següência do GENBANK® de Acesso Nq NM_000567.1, incorporada agui, a este reguerimento de patente, como SEQ ID NO: 6. Em algumas modalidades referidas, um composto anti- sentido curto dirigido para SEQ ID NO: 6 é no mínimo 90% complementar à SEQ ID NO: 6. Em algumas modalidades referidas, um composto anti- sentido curto dirigido para SEQ ID NO: 6 é no mínimo 95% complementar à SEQ ID NO: 6. Em algumas modalidades referidas, um composto anti- sentido curto dirigido para SEQ ID NO: 6 é 100% complementar à SEQ ID NO: 6. Em algumas modalidades, um composto anti-sentido curto dirigido para SEQ ID NO: 6 compreende uma següência de nucleotídeos seleciona- da entre as següências de nucleotídeos determinadas na Tabela 9.
A següência de nucleotídeos determinada em cada NO de SEQ ID na Tabela 9 é independente de gualguer modificação para uma porção açúcar, uma ligação internucleosídeos, ou uma nucleobase. Deste modo, compostos anti-sentido curtos definidos por um NO de SEQ ID podem com- preender, independentemente, uma ou mais modificações para uma porção açúcar, uma ligação internucleosídeos, ou uma nucleobase. Compostos anti- sentido curtos descritos pelo Número Isis (N2 ISIS) indicam uma combinação de seqüência de nucleobases e uma ou mais modificações para uma porção açúcar, uma ligação internucleosídeos, ou uma nucleobase.
A Tabela 9 ilustra exemplos de compostos anti-sentido curtos dirigidos para SEQ ID NO: 6. A Tabela 9 ilustra compostos anti-sentido cur- tos que são 100% complementares à SEQ ID NO: 6. A coluna com o título 'motivo de gápmero' indica o motivo asa-gap-asa de cada compostos anti- sentido curtos. O segmento de gap compreende 2'-desoxinucleotídeos e ca- da nucleotídeo de cada segmento de asa compreende um açúcar 2'- modificado. O açúcar 2'-modificado em particular também é indicado na co- luna de 'motivo de gápmero'. Por exemplo, '2-10-2 MOE1 significa um motivo de gápmero 2-10-2, onde um segmento de gap de dez 2'-desoxinucleotídeos é flanqueado por segmentos de asa de dois nucleotídeos, onde os nucleotí- deos dos segmentos de asa são nucleotídeos 2'-MOE. Ligações internucleo- sídeos são fosforotioato. Os compostos anti-sentido curtos compreendem 5- metilcitidina ao invés de citosina não modificada, a menos que "citosina não modificada" seja listada na coluna de motivo de gápmero, em cujo caso as citosinas indicadas são citosinas não modificadas. Por exemplo, "5-mC em gap somente" indica que o segmento de gap tem 5-metilcitosinas, ao passo que os segmentos de asa têm citosinas não modificadas.
Em algumas modalidades, compostos anti-sentido curtos tendo por alvo um ácido nucléico CRP podem ter qualquer uma ou mais proprieda- des ou características dos compostos anti-sentido curtos descritos de modo geral aqui, neste requerimento de patente. Em algumas modalidades, com- postos anti-sentido curtos tendo por alvo um ácido nucléico CRP têm um motivo (asa - gap desóxi - asa) selecionado entre 1 -12-1, 1-1-10-2, 2-10-1 - 1, 3-10-3, 2-10-3, 2-10-2, 1-10-1,1-10-2, 3-8-3, 2-8-2, 1-8-1, 3-6-3 ou 1-6-1, mais preferencialmente 1-10-1, 2-10-2, 3-10-3, e 1-9-2.
Tabela 9: Compostos Anti-sentido Curtos dirigidos para SEQ ID NO: 6
<table>table see original document page 176</column></row><table> Em algumas modalidades, uma região alvo é nucleotídeos 1305-1320 de NM_000567.1. Em algumas modalidades referidas, compostos anti-sentido curtos dirigidos para nucleotídeos 1305-1320 de NM_000567.1 com- preendem uma seqüência de nucleotídeos selecionada entre SEQ ID NO:1305 ou 1306. Em algumas modalidades referidas, um composto anti-sentido curto dirigido para nucleotídeos 263-278 de NM_000567.1 é selecio- nado entre o Ng ISIS 353484 ou 353485.
Em algumas modalidades, uma região alvo é nucleotídeos 1257-1272 de NM_000567.1. Em algumas modalidades referidas, um composto anti-sentido curto dirigido para nucleotídeos 1257-1272 de NM_000567.1 compreende uma seqüência de nucleotídeos selecionada entre SEQ ID NO 1257 ou 1258. Em algumas modalidades referidas, um composto anti-sentido curto dirigido para nucleotídeos 428-483 de NM_000567.1 é selecio- nado entre o N2 ISIS 353506 ou 353507.
Em algumas modalidades, compostos anti-sentido curtos dirigi- dos para um ácido nucléico CRP têm 8 a 16, preferencialmente 9 a 15, mais preferencialmente 9 a 14, mais preferencialmente 10 a 14 nucleotídeos de extensão. Em algumas modalidades, compostos anti-sentido curtos dirigidos para um ácido nucléico CRP têm 9 a 14 nucleotídeos de extensão. Em al- gumas modalidades, compostos anti-sentido curtos dirigidos para um ácido nucléico CRP têm 10 a 14 nucleotídeos de extensão. Em algumas modali- dades, os compostos anti-sentido curtos referidos são oligonucleotídeos anti- sentido curtos.
Em algumas modalidades, compostos anti-sentido curtos dirigi- dos para um ácido nucléico CRP são gápmeros curtos. Em algumas modali- dades referidas, gápmeros curtos dirigidos para um ácido nucléico CRP compreendem no mínimo uma modificação de alta afinidade em uma ou mais asas do composto. Em algumas modalidades, compostos anti-sentido curtos dirigidos para um ácido nucléico CRP compreendem 1 a 3 modifica- ções de alta afinidade em cada asa. Em algumas modalidades referidas, os nucleosídeos ou nucleotídeos da asa compreendem uma modificação 2'. Em algumas modalidades referidas, os monômeros da asa são BNA1S. Em al- gumas modalidades referidas, os monômeros da asa são selecionados entre α-L-Metilenoóxi (4'-CH2-0-2') BNA1 β-D-Metilenoóxi (4'-CH2-0-2') BNA, Etile- asa compreendem um substituinte na posição 2' selecionada entre alila, a- mino, azido, tio, O-alila, O-C1-C10 alquila, -OCF3, O-(CH2)2-O-CH3, 2'- O(CH2)2SCH3, O-(CH2)2-O-N(Rm)(Rn), e 0-CH2-C(=0)-N(Rm)(Rn), onde cada Rm e Rn é, independentemente, H ou C1-Ci0 alquila substituída ou não- substituída. Em algumas modalidades, os monômeros de uma asa são nu- cleotídeos 2'MOE.
Em algumas modalidades, compostos anti-sentido curtos dirigi- dos para um ácido nucléico CRP compreendem um gap entre a asa 5' e a asa 3'. Em algumas modalidades o gap compreende cinco, seis, sete, oito, nove, dez, onze, doze, treze, ou quatorze monômeros. Em algumas modali- dades, os monômeros do gap são desoxirribonucleotídeos não modificados. Em algumas modalidades, os monômeros do gap são ribonucleotídeos não modificados. Em algumas modalidades, gap de modificações de gap (se houver) resultam em um composto anti-sentido que, quando ligado a seu ácido nucléico alvo, suporta clivagem por uma RNase, incluindo, mas não limitada a, RNase H.
Em algumas modalidades, compostos anti-sentido curtos dirigi- dos para um ácido nucléico CRP têm ligações monoméricas uniformes. Em algumas modalidades referidas, estas ligações são todas ligações fosforoti- oato. Em algumas modalidades, as ligações são todas ligações fosfodiéster.
Em algumas modalidades, compostos anti-sentido curtos dirigidos para um ácido nucléico CRP têm espinhas dorsais mistas.
Em algumas modalidades, compostos anti-sentido curtos dirigi- dos para um ácido nucléico CRP têm 8 monômeros de extensão. Em algu- mas modalidades, compostos anti-sentido curtos dirigidos para um ácido nucléico CRP têm 9 monômeros de extensão. Em algumas modalidades, compostos anti-sentido curtos dirigidos para um ácido nucléico CRP têm 10 monômeros de extensão. Em algumas modalidades, compostos anti-sentido curtos dirigidos para um ácido nucléico CRP têm 11 monômeros de exten- são. Em algumas modalidades, compostos anti-sentido curtos dirigidos para um ácido nucléico CRP têm monômeros de extensão. Em algumas modali- dades, compostos anti-sentido curtos dirigidos para um ácido nucléico CRP têm 13 monômeros de extensão. Em algumas modalidades, compostos anti- sentido curtos dirigidos para um ácido nucléico CRP têm 14 monômeros de extensão. Em algumas modalidades, compostos anti-sentido curtos dirigidos para um ácido nucléico CRP têm 15 monômeros de extensão. Em algumas modalidades, compostos anti-sentido curtos dirigidos para um ácido nucléico CRP têm 16 monômeros de extensão. Em algumas modalidades, compostos anti-sentido curtos dirigidos para um ácido nucléico CRP compreendem 9 a monômeros. Em algumas modalidades, compostos anti-sentido curtos dirigidos para um ácido nucléico CRP compreendem 10 a 15 monômeros. Em algumas modalidades, compostos anti-sentido curtos dirigidos para um ácido nucléico CRP compreendem 12 a 14 monômeros. Em algumas moda- lidades, compostos anti-sentido curtos dirigidos para um ácido nucléico CRP compreendem 12 a 14 nucleotídeos ou nucleosídeos.
Em algumas modalidades, a invenção proporciona métodos para modular a expressão de CRP. Em algumas modalidades, os métodos referi- dos compreendem uso de um ou mais composto anti-sentido curto dirigido para um ácido nucléico CRP, em que o composto anti-sentido curto dirigido para um ácido nucléico CRP é a partir de cerca de 8 a cerca de 16, prefe- rencialmente 9 a 15, mais preferencialmente 9 a 14, mais preferencialmente .10 a 14 monômeros (isto é, a partir de cerca de 8 a cerca de 16 monômeros ligados). Uma pessoa com conhecimento regular da técnica reconhecerá que isto compreende métodos para modular a expressão de CRP usando um ou mais compostos anti-sentido curtos dirigidos para um ácido nucléico CRP de 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 ou 16 monômeros.
Em algumas modalidades, métodos para modular CRP compre- endem uso de um composto anti-sentido curto dirigido para um ácido nucléi- co CRP que tem 8 monômeros de extensão. Em algumas modalidades, mé- todos para modular CRP compreendem uso de um composto anti-sentido curto dirigido para um ácido nucléico CRP que tem 9 monômeros de exten- são. Em algumas modalidades, métodos para modular CRP compreendem uso de um composto anti-sentido curto dirigido para um ácido nucléico CRP que tem 10 monômeros de extensão. Em algumas modalidades, métodos para modular CRP compreendem uso de um composto anti-sentido curto dirigido para um ácido nucléico CRP que tem 11 monômeros de extensão. Em algumas modalidades, métodos para modular CRP compreendem uso de um composto anti-sentido curto dirigido para um ácido nucléico CRP que tem 12 monômeros de extensão. Em algumas modalidades, métodos para modular CRP compreendem uso de um composto anti-sentido curto dirigido para um ácido nucléico CRP que tem 13 monômeros de extensão. Em al- gumas modalidades, métodos para modular CRP compreendem uso de um composto anti-sentido curto dirigido para um ácido nucléico CRP que tem 14 monômeros de extensão. Em algumas modalidades, métodos para modular CRP compreendem uso de um composto anti-sentido curto dirigido para um ácido nucléico CRP que tem 15 monômeros de extensão. Em algumas mo- dalidades, métodos para modular CRP compreendem uso de um composto anti-sentido curto dirigido para um ácido nucléico CRP que tem 16 monôme- ros de extensão.
Em algumas modalidades, métodos para modular a expressão de CRP compreendem uso de um composto anti-sentido curto dirigido para um ácido nucléico CRP compreendendo 9 a 15 monômeros. Em algumas modalidades, métodos para modular a expressão de CRP compreendem uso de um composto anti-sentido curto dirigido para um ácido nucléico CRP compreendendo 10 a 15 monômeros. Em algumas modalidades, métodos para modular a expressão de CRP compreendem uso de um composto anti- sentido curto dirigido para um ácido nucléico CRP compreendendo 12 a 14 monômeros. Em algumas modalidades, métodos para modular a expressão de CRP compreendem uso de um composto anti-sentido curto dirigido para um ácido nucléico CRP compreendendo 12 ou 14 nucleotídeos ou nucleosí- deos.
6. Receptor de Glicocorticóide (GCCR) Os glicocorticóides estavam entre os primeiros hormônios este- róides a serem identificados e são responsáveis por uma série de funções fisiológicas, incluindo a estimulação da gliconeogênese, redução da capta- ção de glicose e utilização em tecidos periféricos, aumento da deposição de glicogênio, supressão de reações imunes e inflamatórias, inibição da síntese de citocinas e aceleração de vários eventos relativos ao desenvolvimento. Os glicocorticóides também são especialmente importantes para combater o stress. A elevação induzida por stress da síntese e liberação de glicocorti- cóides leva, entre outra respostas, a aumento da carga de trabalho ventricu- lar, inibição de mediadores inflamatórios, inibição da síntese de citocina e aumento da produção de glicose (Karin, Cell, 1998, 93, 487-490).
Tanto glicocorticóides naturais quanto seus derivados sintéticos exercem sua ação através do receptor de glicocorticóide, um membro cito- plasmático expressado ubíqüamente da superfamília de receptor nuclear hormonal. O receptor de glicocorticóide humano também é conhecido como subfamília 3 de receptor nuclear, grupo C, membro 1; NR3C1; GCCR; GCR; GRL; Receptor de glicocorticóide, linfócito. O gene está localizado sobre o cromossoma humano 5q11-q13 e consiste em 9 éxons (Encio e Detera- Wadleigh, J Biol Chem, 1991, 266, 7182-7188; Gehring et al., Proc NatIAcad Sci USA, 1985, 82, 3751-3755). Existem múltiplas formas de RNAm recep- tor de glicocorticóide humano: um α cDNA receptor de glicocorticóide huma- no de 5,5 kb contendo os éxons 1 a 8 e o éxon 9a; um β cDNA receptor de glicocorticóide humano de 4,3 kb contendo os éxons 1 a 8 e o éxon 9β; e um α cDNA receptor de glicocorticóide humano de 7,0 kb contendo os éxons 1 a 8 e todo o éxon 9, o qual inclui o éxon 9α, o éxon 9β e a 'região J', a qual é flanqueada pelos éxons 9a e 9β (Hollenberg et al., Nature, 1985, 318, 635- 641; Oakley et al., J Biol Chem, 1996, 271, 9550-9559). O α receptor de gli- cocorticóide humano é a isoforma predominante do receptor e a forma que apresenta atividade de ligação de esteróides (Hollenberg et al., Nature, 1985, 318, 635-641). Adicionalmente, através do uso de três promotores di- ferentes três variantes do éxon 1 diferentes podem ser transcritas, e junção alternativa de uma variante do éxon 1 pode resultar em três versões diferen- tes deste éxon. Portanto, RNAm receptor de glicocorticóide humano pode conter 5 versões diferentes do éxon 1 (Breslin et al., Mol Endocrinol, 2001, .15, 1381-1395).
O exame dos padrões de expressão das isoformas α e β de RNAm receptor de glicocorticóide humano revela que a isoforma α é expres- sada mais abundantemente. Ambas as isoformas são expressadas em teci- dos e tipos celulares similares, incluindo pulmão, rim, coração, fígado, mús- culo esquelético, macrófagos, neutrófilos e células mononucleares do san- gue periférico. Somente o α receptor de glicocorticóide humano é expressa- do no cólon. No nível de proteína, enquanto a isoforma α é detectada em todos os tecidos examinados, a isoforma β é indetectável, sugerindo que sob condições fisiológicas, o caminho de junção default é o caminho que produz a isoforma α (Pujols et al., Am J Physiol Cell Physiol, 2002, 283, C1324- .1331). A isoforma β de receptor de glicocorticóide não liga nem um agonista nem um antagonista de glicocorticóide. Além disso, a isoforma β está locali- zada essencialmente no núcleo em células transfectadas, independente de estimulação hormonal. Quando ambas as isoformas são expressadas na mesma célula, o receptor de glicocorticóide β inibe a estimulação de expres- são genética mediada por receptor de glicocorticóide a, induzida por hormô- nios, sugerindo que a isoforma β funciona como um inibidor da atividade de receptor de glicocorticóide α (Oakley et al., J Biol Chem1 1996, 271, 9550- .9559). A menos que mencionado de modo diverso, o receptor de glicocorti- cóide humano descrito aqui, neste requerimento de patente, é definido como o um ou mais produtos ubíquos do gene localizado no cromossoma 5q11- q13.
Linhagens celulares transfectadas com um filamento de RNA anti-sentido receptor de glicocorticóide complementar apresentaram uma redução nos níveis de RNAm receptor de glicocorticóide e uma resposta re- duzida à dexametasona agonista de receptor de glicocorticóide (Pepin e Barden, Mol Cell Biol, 1991, 11, 1647-1653). Camundongos transgênicos portando um constructo genético receptor de glicocorticóide anti-sentido fo- ram usados para estudar o efeito de retomo de glicocorticóides sobre o eixo hipotálamo-pituitária-adrenal (Pepin et al., Nature, 1992, 355, 725-728). Em outro estudo de camundongos produzidos por engenharia genética de modo similar, o consumo e gasto de energia, a atividade da lipoproteína Iipase do coração e do músculo vastus lateralis, e a norepinefrina do tecido do cora- ção e adiposo marrom foram menores do que em animais controle. De modo oposto, o teor de gordura e a energia corporal total foram significativamente maiores do que em animais controle. Estes resultados sugerem que um sis- tema receptor de glicocorticóide defeituoso pode afetar o balanço de energia através de aumento da eficiência energética, e enfatizam os efeitos modula- tórios de alterações do eixo hipotalâmico-pituitária-adrenal sobre a atividade da lipoproteína Iipase muscular (Richard et al., Am J Physiol, 1993, 265, R146-150).
Efeitos comportamentais de antagonistas de receptores de gIi- cocorticóides foram medidos em modelos animais designados para avaliar a ansiedade, o aprendizado e a memória. Reduzida expressão de receptor de glicocorticóide em ratos infundidos por via intracerebroventricular de longo termo com oligodesoxinucleotídeos anti-sentido tendo por alvo RNAm recep- tor de glicocorticóide não interferiu com a navegação espacial no teste do labirinto de água de Morris (Engelmann et al., Eur J Pharmacol, 1998, 361, 17-26). Infusão bilateral de um oligodesoxinucleotídeo anti-sentido tendo por alvo o RNAm receptor de glicocorticóide dentro do giro dentado do hipocam- po do rato reduziu a imobilidade de ratos no teste de nado forçado de Porsolt (Korte et al., Eur J Pharmacol, 1996, 301, 19-25).
Glicocorticéides são freqüentemente usados por seus efeitos imunossupressivos, antiinflamatórios no tratamento de doenças tais como alergias, asma, artrite reumatóide, AIDS, lúpus eritematoso sistêmico e oste- oartrite degenerativa. Foi proposto que a regulação negativa da expressão genética, tal como a causada pela interação de receptor de glicocorticóide com NF-kB, é no mínimo parcialmente responsável pela ação anti- inflamatória de glicocorticóides in vivo. lnterleucina-6, fator α de necrose tu- moral e interleucina-1 são as três citocinas que são responsáveis pela maio- ria da estimulação do eixo hipotalâmico-pituitária-adrenal (HPA) durante o stress da inflamação. O eixo HPA e o sistema simpático sistêmico e adre- nomedular são os componentes periféricos do sistema de stress, responsá- veis por manter a homeostase basal e relacionada com stress. Os glicocorti- cóides, os produtos finais do eixo ΗΡΑ, inibem a produção de todas as três citocinas inflamatórias e também inibem seus efeitos sobre tecidos alvo, com a exceção da interleucina-6, a qual age sinergicamente com os glicocorticói- des estimulando a produção de reagentes da fase aguda. O tratamento com glicocorticóides reduz a atividade do eixo HPA (Chrousos, N Engl J Med,1995, 332, 1351-1362). Em alguns casos, os pacientes são refratários a tratamento com glicocorticóides. Uma razão para esta resistência à esteróides se baseia em mutações ou polimorfismos presentes no gene receptor de glicocorticóides. Um total de 15 mutações com sentido, três sem sentido, três modificações de estrutura (frameshift), um sítio de junção, e duas mutações unidas alter- nativas, bem como 16 polimorfismos, foram reportados no gene NR3C1 em associação com resistência à glicocorticóide (Bray e Cotton, Hum Mutat,2003, 21, 557-568). Estudos adicionais em humanos sugeriram uma associ- ação positiva entre a incidência e progressão de síndrome metabólica, com alelos no gene receptor de glicocorticóide (GR) (Rosmond, Obes Res, 2002,10, 1078-1086).
Outros casos de insensibilidade a glicocorticóides estão associ- ados com expressão alterada de isoformas de receptor de glicocorticóides. Um estudo da expressão de RNAm da isoforma β de receptor de glicocorti- cóide humano em pacientes com colite ulcerativa resistente a glicocorticói- des revelou que a presença deste RNAm foi significativamente maior do que em pacientes sensíveis a glicocorticóides, sugerindo que a expressão de RNAm de receptor de glicocorticóide humano β nas células mononucleares do sangue periférico pode servir como um prognosticador da resposta à gli- cocorticóides na colite ulcerativa (Honda et al., Gastroenterology, 2000, 118, 859-866). A expressão aumentada de receptor de glicocorticóides β também é observada em um número significativamente elevado de asmáticos insen- síveis a glicocorticóides. Adicionalmente, anormalidades, induzidas por cito- cina, na capacidade de ligação de DNA do receptor de giicocorticóide foram encontradas em células mononucleares do sangue periférico de transfecção de pacienntes insensíveis a giicocorticóide, e células HepG2 com o gene receptor de giicocorticóide □ resultaram em uma redução significativa da capacidade de ligação de DNA do receptor de giicocorticóide □ (Leung et al., J Exp Med, 1997, 186, 1567-1574). Estudos de ligação de dexametasona demonstram que o receptor de giicocorticóide humano _ não altera a afini- dade do receptor de giicocorticóide _ para Iigantes hormonais, mas ao invés sua capacidade para ligar ao GRE (Bamberger et al., J Clin Invest, 1995, 95, 2435-2441). Tomados juntos, estes resultados ilustram que o receptor de giicocorticóide β, através de competição com o receptor de giicocorticóide α para sítios alvo de GRE, pode funcionar como um inibidor endógeno fisiolo- gicamente e patofisiologicamente relevante da ação de glicocorticóides.
No fígado, agonistas de glicocorticóides aumentam a produção de glicose hepática ativando o receptor de giicocorticóide, o qual subseqüen- temente leva a aumento da expressão das enzimas gliconeogênicas fosfoe- nolpiruvato carboxiquinase (PEPCK) e glicose-6-fosfatase. Através da glico- neogênese, forma-se glicose através de não-precursores de hexose, tais como lactato, piruvato e alanina (Link, Curr Opin Investig Drugs, 2003, 4, 421-429). Antagonistas de receptores de glicocorticóides esteróides tais co- mo RU 486 têm sido testados em modelos de diabetes em roedores. Ca- mundongos deficientes no gene receptor de leptina, denominados camun- dongos db/db, são geneticamente obesos, diabéticos e hiperinsulinêmicos. O tratamento de camundongos hiperglicêmicos db/db com RU 486 reduziu os níveis de glicose sangüínea por aproximadamente 49%, sem afetar os níveis de insulina plasmática. Adicionalmente, tratamento com RU 486 redu- ziu a expressão de genes responsivos a receptor de glicocorticóides PEPCK, glicose-6-fosfatase, transportador de glicose tipo 2 e tirosina aminotransfera- se em camundongos db/db comparados com animais não tratados (Friedman et al., J Biol Chem, 1997, 272, 31475-31481). RU 486 também melhora o diabetes no modelo de camundongo ob/ob de diabetes, obesida- de e hiperinsulinemia, através de uma redução nos níveis de insulina sérica e de glicose sangüínea (Gettys et al., Int J Obes Relat Metab Disord, 1997, 21, 865-873).
Como o aumento da gluconeogênese é considerado a fonte principal de aumento da produção de glicose no diabetes, têm sido investi- gados uma série de alvos terapêuticos para a inibição da produção de glico- se hepática. Devido à capacidade de antagonists do receptor de glicocorti- cóide para melhorar o diabetes em modelos animais, os compostos referidos estão entre as terapias potenciais sendo exploradas. No entanto, há efeitos sistêmicos prejudiciais de antagonistas de receptores de glicocorticóides, incluindo ativação do eixo HPA (Link, Curr Opin Investig Drugs, 2003, 4, 421 - 429). O aumento da atividade do eixo HPA está associado com supressão de ação inflamatória imuno-relacionada, a qual pode aumentar a suscetibili- dade a agentes infecciosos e neoplasmas. Condições associadas com su- pressão de inflamação imuno-mediada através de defeitos no eixo ΗΡΑ, ou seu tecidos alvo, incluem síndrome de Cushing, stress crônico, alcoolismo crônico e depressão melancólica (Chrousos, N Engl J Med, 1995, 332, 1351- 1362). Portanto, é de gande valor desenvolver antagonistas de receptores de glicocorticóides hepato-específicos. Antagonistas de receptores de glico- corticóides esteróides foram conjugados a ácidos biliares para o fim de dire- cionamento destes para o fígado (Apelqvist et al., 2000). Atualmente, não há agentes terapêuticos conhecidos que tenham por alvo o receptor de glicocor- ticóide sem efeitos periféricos indesejáveis (Link, Curr Opin Investig Drugs, 2003, 4, 421-429). Conseqüentemente, permanece uma necessidade senti- da há muito tempo por agentes capazes de inibir de modo eficaz receptor de glicocorticóide hepático.
Definições
"Receptor de glicocorticóide" é o produto genético ou proteína cuja expressão deve ser modulada por administração de um composto anti- sentido curto. Receptor de glicocorticóide é geralmente referido como GC-CR.
"Ácido nucléico GCCR" significa qualquer ácido nucléico codifi- cando GCCR. Por exemplo, em determinadas modalidades, um ácido nu- cléico GCCR inclui, sem limitação, uma seqüência de DNA codificando GC- CR, uma seqüência de RNA transcrita de DNA codificando GCCR, e uma seqüência de RNAm codificando GCCR. "RNAm GCCR" significa um RNAm codificando GCCR.
Indicações Terapêuticas
Tecnologia anti-sentido é um meio eficaz para reduzir a expres- são de produtos genéticos específicos e portanto é útila em uma série de aplicações terapêuticas, diagnosticas e de pesquisa para a modulação da expressão de receptores de glicocorticóide. Além disso, em determinadas modalidades, o fígado é um dos tecidos nos quais são encontradas as maio- res concentrações de oligonucleotídeos anti-sentido depois da administração (Geary et al., Curr. Opin. Investig. Drugs, 2001, 2, 562-573). Portanto, em semelhantes modalidades, tecnologia anti-sentido representa um método atraente para a inibição fígado-específica de receptores de glicocorticóides.
Em algumas modalidades, compostos anti-sentido curtos dirigi- dos para um ácido nucléico codificando receptor de glicocorticóides são pre- ferencialmente distribuídos para o fígado. Em algumas modalidades, com- postos anti-sentido curtos têm aumentada potência no fígado quando com- parados com um composto precursor mais longo. Em algumas modalidades, RNA-alvo é predominantemente expressado no fígado.
Para terapêuticos, um sujeito, suspeito de ter uma doença ou distúrbio o qual pode ser tratado modulando a expressão de GCCR é tratado administrando um ou mais composto anti-sentido curto. Em um exemplo não-límitante, os métodos compreendem a etapa de administrar a um animal uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto anti-sentido curto. Alguns compostos anti-sentido curtos inibem a atividade de GCCR e/ ou ini- bem a expressão de GCCR. Em algumas modalidades, a atividade ou ex- pressão de GCCR em um sujeito é inibida por no mínimo 10%, por no míni- mo 20%, por no mínimo 25%, por no mínimo 30%, por no mínimo 40%, por no mínimo 50%, por no mínimo 60%, por no mínimo 70%, por no mínimo .75%, por no mínimo 80%, por no mínimo 85%, por no mínimo 90%, por no mínimo 95%, por no mínimo 98%, por no mínimo 99%, ou por 100%. Em algumas modalidades, a atividade ou expressão de GCCR em um sujeito é inibida por no mínimo 30%. Em algumas modalidades, a atividade ou ex- pressão de GCCR em um sujeito é inibida por no mínimo 50% ou mais.
A redução da expressão de GCCR pode ser medida, por exem- pio, no sangue, plasma, soro, tecido adiposo, fígado ou qualquer outro fluido corporal, tecido ou órgão do animal. Em algumas modalidades, células con- tidas dentro dos referidos fluidos, tecidos ou órgãos sendo analisados com- preendem ácidos nucléicos codificando GCCR e/ou contêm a própria proteí- na GCCR.
Alguns farmacêuticos e outras composições compreendendo compostos antí-sentido curtos também são proporcionados. Em algumas modalidades, compostos anti-sentido curtos são utilizados em composições farmacêuticas adicionando às mesmas uma quantidade eficaz de um com- posto a um diluente ou veículo farmaceuticamente aceitável adequado. Em algumas modalidades, compostos anti-sentido curtos tendo por alvo um ácido nucléico GCCR têm qualquer uma ou mais propriedades ou características dos compostos anti-sentido curtos descritos de modo geral aqui, neste requerimento de patente. Em algumas modalidades, compostos anti-sentido curtos tendo por alvo um ácido nucléico GCCR têm um motivo (asa - gap desóxi - asa) selecionado entre 1-12-1,1-1-10-2, 2-10-1 -1, 3-10-3,2-10-3, 2-10-2, 1-10-1,1-10-2, 3-8-3, 2-8-2, 1-8-1, 3-6-3 ou 1-6-1. Em algu-mas modalidades, compostos anti-sentido curtos tendo por alvo um ácido r.^cléico GCCR têm um motivo (asa - gap desóxi - asa) selecionado entre 1-10-1, 2-10-2, 3-10-3, e 1-9-2. . Em algumas modalidades, compostos anti- sentido curtos tendo por alvo um ácido nucléico GCCR têm um motivo (asa - gap desóxi - asa) selecionado entre 3-10-3, 2-10-3, 2-10-2, 1-10-1,1-10-2, 2-8-2, 1-8-1, 3-6-3 ou 1-6-1, mais preferencialmente 2-10-2 e 2-8-2.
Em algumas modalidades, são proporcionados aqui, neste re- querimento de patente, métodos para tratar um indivíduo administrando um ou mais composto anti-sentido curto dirigido para um ácido nucléico GCCR ou uma composição farmacêutica compreendendo o composto referido. São adicionalmente proporcionados métodos para tratar um sujeito tendo uma doença ou condições associadas com atividade de GCCR administrando um composto anti-sentido curto dirigido para um ácido nucléico GCCR. Além de diabetes, particularmente diabetes Tipo 2, doenças e condições associadas com GCCR incluem mas não estão limitadas à, obesidade, síndrome Meta- bólica X, Síndrome de Cushing, doença de Addison, doenças inflamatórias tal como asma, rinite e artrite, alergia, doença auto-imune, imunodeficiência, anorexia, caquexia, perda óssea ou fragilidade óssea, e cura de ferimento. Síndrome metabólica, síndrome metabólica X ou simplesmente Síndrome X se refere a um conjunto de fatores de risco que incluem obesidade, dislipi- demia, particularmente triglicerídeos sangüíneos elevados, intolerância à glicose, açúcar sangüíneo elevado e pressão sangüínea elevada. Em algu- mas modalidades, compostos anti-sentido curtos dirigidos para GCCR são usados para melhora de hiperglicemia induzida por terapia com esteróide sistêmica. Além disso, tecnologia anti-sentido proporciona um meio para ini- bir a expressão da isoforma β de receptores de glicocorticóides, que se de- monstrou ser suprexpressada em pacientes refratários a tratamento com glicocorticóides.
Em algumas modalidades, a invenção proporciona compostos anti-sentido curtos dirigidos para um ácido nucléico codificando GCGR, e os quais modulam a expressão de receptor de glicocorticóide. Também são proporcionados produtos farmacêuticos e outras composições compreen- dendo os compostos da invenção. São adicionalmente proporcionados mé- todos para triagem de moduladores de receptor de glicocorticóide e métodos para modular a expressão de receptor de glicocorticóide em células, tecidos ou animais compreendendo contactar as células, tecidos ou animais referi- dos com um ou mais dos compostos ou composições da invenção. Métodos para tratar um animal, particularmente um ser humano, suspeito de ter ou ser propenso a uma doença ou condição associada com expressão de re- ceptor de glicocorticóide também são determinados aqui, neste requerimento de patente. Os métodos referidos compreendem administrar uma quantidade terapeuticamente ou profilaticamente eficaz de um ou mais dos compostos ou composições da invenção à pessoa que necessite de tratamento. Alguns Compostos Anti-sentido Curtos Dirigidos para um Ácido Nucléico GCCR
Em algumas modalidades, compostos anti-sentido curtos são dirigidos para um ácido nucléico GCCR tendo a seqüência de nucleotídeos 1 a 106000 do GENBANK® de Acesso No. AC012634, incorporada aqui, a es- te requerimento de patente, como SEQ ID NO: 8. Em algumas modalidades, referidas, um composto anti-sentido curto dirigido para SEQ ID NO: 8 é no mínimo 90% complementar à SEQ ID NO: 8. Em algumas modalidades, refe- ridas, um composto anti-sentido curto dirigido para SEQ ID NO: 8 é no míni- mo 95% complementar à SEQ ID NO: 8. Em algumas modalidades, referi- das, um composto anti-sentido curto dirigido para SEQ ID NO: 8 é 100% complementar à SEQ ID NO: 8. Em algumas modalidades, um composto anti-sentido curto dirigido para SEQ ID NO: 8 inclui uma seqüência de nucle- otídeos selecionada entre a seqüências de nucleotídeos determinada nas Tabelas 10 e 11.
A seqüência de nucleotídeos determinada em cada NO de SEQ ID nas Tabelas 10 e 11 é independente de qualquer modificação para uma porção açúcar, uma ligação internucleosídeos, ou uma nucleobase. Deste modo, compostos anti-sentido curtos definidos por um NO de SEQ ID podem compreender, independentemente, uma ou mais modificações para uma porção açúcar, uma ligação internucleosídeos, ou uma nucleobase. Com- postos anti-sentido curtos descritos pelo Número Isis (NQ ISIS) indicam uma combinação de seqüência de nucleobases e uma ou mais modificações para uma porção açúcar, uma ligação internucleosídeos, ou uma nucleobase.
Em algumas modalidades, compostos anti-sentido curtos dirigi- dos para um ácido nucléico GCCR compreendem um motivo de gápmero. Em algumas modalidades, um composto anti-sentido curto dirigido para um ácido nucléico GCCR compreende um motivo de gápmero 2-10-2.
As Tabelas 10 e 11 ilustram exemplos de compostos anti-sentido curtos dirigidos para SEQ ID NO: 8. A Tabela 10 ilustra compostos anti- sentido curtos que são 100% complementares à SEQ ID NO: 8. A Tabela 11 ilustra compostos anti-sentido curtos que têm uma ou duas combinações inadequadas com respeito à SEQ ID NO: 8. A coluna de título 'motivo de gápmero' indica o motivo asa-gap-asa de cada compostos anti-sentido cur- tos. O segmento de gap compreende 2'-desoxinucleotídeos e cada nucleotí- deo de cada segmento de asa compreende um açúcar 2'-modificado. O açú- car 2'-modificado em particular também é indicado na coluna de 'motivo de gápmero'. Por exemplo, '2-10-2 MOE' significa um motivo de gápmero 2-10- 2, onde um segmento de gap de dez 2'-desoxinucleotídeos é flanqueado por segmentos de asa de dois nucleotídeos, onde os nucleotídeos dos segmen- tos de asa são nucleotídeos 2'-MOE. Ligações internucleosídeos são fosfo- rotioato. Os compostos anti-sentido curtos compreendem 5-metilcitidina ao invés de citosina não modificada, a menos que "citosina não modificada" seja listada na coluna de motivo de gápmero, caso no qual as citosinas indi- cadas são citosinas não modificadas. Por exemplo, "5-mC em gap somente" indica que o segmento de gap tem 5-metilcitosinas, ao passo que os seg- mentos de asa têm citosinas não modificadas.
Tabela 10: Compostos Anti-sentido Curtos dirigidos para SEQ ID NO: 8
<table>table see original document page 191</column></row><table> Tabela 11: Compostos anti-sentido curtos dirigidos para SEQ ID NO: 8 e tendo 1 ou 2 combinações inadequadas
<table>table see original document page 192</column></row><table> <table>table see original document page 193</column></row><table> <table>table see original document page 194</column></row><table>
Em algumas modalidades, uma região alvo é nucleotídeos 88142-88269 de SEQ ID NO: 8. Em algumas modalidades, um composto anti-sentido curto é dirigido para nucleotídeos 88142-88269 de SEQ ID NO: 8. Em algumas modalidades, referidas, um composto anti-sentido curto diri- 5 gido para nucleotídeos 88142-88269 compreende uma seqüência de nucleo- tídeos selecionada entre SEQ ID NO 413, 414, 415, 416, 417, ou 418. Em algumas modalidades, referidas, um composto anti-sentido dirigido para nu- cleotídeos 88142-88269 de SEQ ID NO: 8 é selecionado entre o N2 ISIS 371644, 371645, 371649, 371651, 371652, ou 371653.
Em algumas modalidades, uma região alvo é nucleotídeos 88142-88169 de SEQ ID NO: 8. Em algumas modalidades, um composto anti-sentido curto é dirigido para nucleotídeos 88142-88169 de SEQ ID NO: 8. Em algumas modalidades, referidas, um composto anti-sentido curto diri- gido para nucleotídeos 88142-88169 compreende uma seqüência de nucleo- tídeos selecionada entre SEQ ID NO 413 ou 414. Em algumas modalidades, referidas, um composto anti-sentido dirigido para nucleotídeos 88142-88169 de SEQ ID NO: 8 é selecionado entre o Nq ISIS 371644 ou 371645.
Em algumas modalidades, uma região alvo é nucleotídeos 88242-88269 de SEQ ID NO: 8. Em algumas modalidades, um composto anti-sentido curto é dirigido para nucleotídeos 88242-88269 de SEQ ID NO: .8. Em algumas modalidades, referidas, um composto anti-sentido curto diri- gido para nucleotídeos 88242-88269 compreende uma seqüência de nucleo- tídeos selecionada entre SEQ ID NO 416, 417, ou 418. Em algumas modali- dades, referidas, um composto anti-sentido dirigido para nucleotídeos .88242-88269 de SEQ ID NO: 8 é selecionado entre o N2 ISIS 371651,371652, ou 371653.
Em algumas modalidades, uma região alvo é nucleotídeos .92037-92155 de SEQ ID NO: 8. Em algumas modalidades, um composto anti-sentido curto é dirigido para nucleotídeos 92037-92155 de SEQ ID NO: . 8. Em algumas modalidades, referidas, um composto anti-sentido curto diri- gido para nucleotídeos 92037-92155 compreende uma seqüência de nucleo- tídeos selecionada entre SEQ ID NO 419, 420, 421, ou 422. Em algumas modalidades, referidas, um composto anti-sentido dirigido para nucleotídeos .92037-92155 de SEQ ID NO: 8 é selecionado entre o Nq ISIS 371665, 371669, 371671, ou 171673.
Em algumas modalidades, uma região alvo é nucleotídeos .92114-92155 de SEQ ID NO: 8. Em algumas modalidades, um composto anti-sentido curto é dirigido para nucleotídeos 92114-92155 de SEQ ID NO: .8. Em algumas modalidades, referidas, um composto anti-sentido curto diri- gido para nucleotídeos 92114-92155 compreende uma seqüência de nucleo- tídeos selecionada entre SEQ ID NO 421 ou 422. Em algumas modalidades, referidas, um composto anti-sentido dirigido para nucleotídeos 92114-92155 de SEQ ID NO: 8 é selecionado entre o N9 ISIS 371671 ou 171673.
Em algumas modalidades, compostos anti-sentido curtos dirigi- dos para um ácido nucléico GCCR têm 8 a 16, preferencialmente 9 a 15, mais preferencialmente 9 a 14, mais preferencialmente 10 a 14 nucleotídeos de extensão. Em algumas modalidades, compostos anti-sentido curtos diri- gidos para um ácido nucléico GCCR têm 9 a 14 nucleotídeos de extensão. Em algumas modalidades, compostos anti-sentido curtos dirigidos para um ácido nucléico GCCR têm 10 a 14 nucleotídeos de extensão. Em algumas modalidades, os compostos anti-sentido curtos referidos são oligonucleotí- deos anti-sentido curtos. Em algumas modalidades, compostos anti-sentido curtos dirigi- dos para um ácido nucléico GCCR são gápmeros curtos. Em algumas moda- lidades, referidas, gápmeros curtos dirigidos para um ácido nucléico GCCR compreendem no mínimo uma modificação de alta afinidade em uma ou mais asas do composto. Em algumas modalidades, compostos anti-sentido curtos dirigidos para um ácido nucléico GCCR compreendem 1 a 3 modifica- ções de alta afinidade em cada asa. Em algumas modalidades, referidas, os nucleosídeos ou nucleotídeos da asa compreendem uma modificação 2'. Em algumas modalidades, referidas, os monômeros da asa são BNA's. Em al- gumas modalidades, referidas, os monômeros da asa são selecionados en- tre α-L-Metilenoóxi (4'-CH2-0-2') BNA, β-D-Metilenoóxi (4,-CH2-0-2') BNA, Etilenoóxi (4'-(CH2)2-0-2') BNA, Aminoóxi (4'-CH2-0-N(R)-2') BNA e Oxiami- no (4'-CH2-N(R)-0-2') BNA. Em algumas modalidades, os monômeros de uma asa compreendem um substituinte na posição 2' selecionada entre alila, amino, azido, tio, O-alila, O-C1-C10 alquila, -OCF3, O-(CH2)2-O-CH3, 2'- O(CH2)2SCH3, O-(CH2)2-O-N(Rm)(Rn), e 0-CH2-C(=0)-N(Rm)(Rn), onde cada Rm e Rn é, independentemente, H ou C1-C10 alquila substituída ou não- substituída. Em algumas modalidades, os monômeros de uma asa são nu- cleotídeos 2'MOE.
Em algumas modalidades, compostos anti-sentido curtos dirigi- dos para um ácido nucléico GCCR compreendem um gap entre a asa 5' e a asa 3'. Em algumas modalidades, o gap compreende cinco, seis, sete, oito, nove, dez, onze, doze, treze, ou quatorze monômeros. Em algumas modali- dades, os monômeros do gap são desoxirribonucleotídeos não modificados.
Em algumas modalidades, os monômeros do gap são ribonucleotídeos não modificados. Em algumas modalidades, gap de modificações de gap (se houver) resultam em um composto anti-sentido que, quando ligado a seu ácido nucléico alvo, suporta clivagem por uma RNase, incluindo, mas não limitada a, RNase H.
Em algumas modalidades, compostos anti-sentido curtos dirigi- dos para um ácido nucléico GCCR têm ligações monoméricas uniformes. Em algumas modalidades, referidas, estas ligações são todas ligações fosfo- rotioato. Em algumas modalidades, as ligações são todas ligações fosfodiés- ter. Em algumas modalidades, compostos anti-sentido curtos dirigidos para um ácido nucléico GCCR têm espinhas dorsais mistas.
Em algumas modalidades, compostos anti-sentido curtos dirigi- dos para um ácido nucléico GCCR têm 8 monômeros de extensão. Em al- gumas modalidades, compostos anti-sentido curtos dirigidos para um ácido nucléico GCCR têm 9 monômeros de extensão. Em algumas modalidades, compostos anti-sentido curtos dirigidos para um ácido nucléico GCCR têm .10 monômeros de extensão. Em algumas modalidades, compostos anti- sentido curtos dirigidos para um ácido nucléico GCCR têm 11 monômeros de extensão. Em algumas modalidades, compostos anti-sentido curtos diri- gidos para um ácido nucléico GCCR têm monômeros de extensão. Em al- gumas modalidades, compostos anti-sentido curtos dirigidos para um ácido nucléico GCCR têm 13 monômeros de extensão. Em algumas modalidades, compostos anti-sentido curtos dirigidos para um ácido nucléico GCCR têm .14 monômeros de extensão. Em algumas modalidades, compostos anti- sentido curtos dirigidos para um ácido nucléico GCCR têm 15 monômeros de extensão. Em algumas modalidades, compostos anti-sentido curtos diri- gidos para um ácido nucléico GCCR têm 16 monômeros de extensão. Em algumas modalidades, compostos anti-sentido curtos dirigidos para um ácido nucléico GCCR compreendem 9 a 15 monômeros. Em algumas modalida- des, compostos anti-sentido curtos dirigidos para um ácido nucléico GCCR compreendem 10 a 15 monômeros. Em algumas modalidades, compostos anti-sentido curtos dirigidos para um ácido nucléico GCCR compreendem 12 a 14 monômeros. Em algumas modalidades, compostos anti-sentido curtos dirigidos para um ácido nucléico GCCR compreendem 12 a 14 nucleotídeos ou nucleosídeos.
Em algumas modalidades, a invenção proporciona métodos para modular a expressão de GCCR. Em algumas modalidades, os métodos refe- ridos compreendem uso de um ou mais composto anti-sentido curto dirigido para um ácido nucléico GCCR, em que o composto anti-sentido curto dirigi- do para um ácido nucléico GCCR é a partir de cerca de 8 a cerca de 16, pre- ferencialmente 9 a 15, mais preferencialmente 9 a 14, mais preferencialmen- te 10 a 14 monômeros (isto é, a partir de cerca de 8 a cerca de 16 monôme- ros ligados). Uma pessoa com conhecimento regular da técnica reconhecerá que isto compreende métodos para modular a expressão de GCCR usando um ou mais compostos anti-sentido curtos dirigidos para um ácido nucléico GCCR de 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 ou 16 monômeros.
Em algumas modalidades, métodos para modular GCCR com- preendem uso de um composto anti-sentido curto dirigido para um ácido nu- cléico GCCR que tem 8 monômeros de extensão. Em algumas modalidades, métodos para modular GCCR compreendem uso de um composto anti- sentido curto dirigido para um ácido nucléico GCCR que tem 9 monômeros de extensão. Em algumas modalidades, métodos para modular GCCR com- preendem uso de um composto anti-sentido curto dirigido para um ácido nu- cléico GCCR que tem 10 monômeros de extensão. Em algumas modalida- des, métodos para modular GCCR compreendem uso de um composto anti- sentido curto dirigido para um ácido nucléico GCCR que tem 11 monômeros de extensão. Em algumas modalidades, métodos para modular GCCR com- preendem uso de um composto anti-sentido curto dirigido para um ácido nu- cléico GCCR que tem 12 monômeros de extensão. Em algumas modalida- des, métodos para modular GCCR compreendem uso de um composto anti- sentido curto dirigido para um ácido nucléico GCCR que tem 13 monômeros de extensão. Em algumas modalidades, métodos para modular GCCR com- preendem uso de um composto anti-sentido curto dirigido para um ácido nu- cléico GCCR que tem 14 monômeros de extensão. Em algumas modalida- des, métodos para modular GCCR compreendem uso de um composto anti- sentido curto dirigido para um ácido nucléico GCCR que tem 15 monômeros de extensão. Em algumas modalidades, métodos para modular GCCR com- preendem uso de um composto anti-sentido curto dirigido para um ácido nu- cléico GCCR que tem 16 monômeros de extensão.
Em algumas modalidades, métodos para modular a expressão de GCCR compreendem uso de um composto anti-sentido curto dirigido pa- ra um ácido nucléico GCCR compreendendo 9 a 15 monômeros. Em algu- mas modalidades, métodos para modular a expressão de GCCR compreen- dem uso de um composto anti-sentido curto dirigido para um ácido nucléico GCCR compreendendo 10 a 15 monômeros. Em algumas modalidades, mé- todos para modular a expressão de GCCR compreendem uso de um com- posto anti-sentido curto dirigido para um ácido nucléico GCCR compreen- dendo 12 a 14 monômeros. Em algumas modalidades, métodos para modu- lar a expressão de GCCR compreendem uso de um composto anti-sentido curto dirigido para um ácido nucléico GCCR compreendendo 12 ou 14 nu- cleotídeos ou nucleosídeos. .7. Receptor de Glucaaon (GCGR)
A manutenção de glicemia normal é um evento metabólico cui- dadosamente regulado. Glucagon, o peptídeo de 29 aminoácidos responsá- vel por manter níveis de glicose sangüínea no estado pós-absortivo, aumen- ta a liberação de glicose pelo fígado ativando a glicogenólise hepática, a gli- coneogênese, estimulando a lipólise em tecido adiposo, e estimulando a se- creção de insulina. Durante altos níveis de glicose sangüínea, a insulina re- verte o reforço da glicogenólise e da gliconeogênese mediado por glucagon. Em pacientes com diabetes, ou a insulina é não está disponível ou não é totalmente eficaz. Enquanto o tratamento para diabetes tem enfocado tradi- cionalmente o aumento dos níveis de insulin, o antagonismo da função do glucagon tem sido considerado como uma terapia alternativa. Como o glu- cagon exerce seus efeitos fisiológicos por sinalização através do receptor de glucagon, o receptor de glucagon tem sido proposto como um alvo terapêuti- co potencial para diabetes (Madsen et al., Curr. Pharm. Des., 1999, 5, 683- .691).
O receptor de glucagon pertence à superfamília de receptores ligados à proteína G tendo sete domínios de transmembrana. Também é um membro da subfamília menor de receptores homólogos os quais ligam pep- tídeos que são estruturalmente similares a glucagon. O gene codificando receptor de glucagon humano foi clonado em 1994 e análise da seqüência genômica revelou múltiplos íntrons e uma identidade de 82% com o gene receptor de glucagon de rato gene (Lok et al., Gene, 1994, 140, 203-209.; MacNeiIa et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 1994, 198, 328-334). A clonagem do gene receptor de glucagon de rato também levou à descrição de múltiplas variantes de junção alternativas (Maget et al., FEBS Lett., 1994,351, 271-275). O gene receptor de glucagon humano está localizado no cromossoma 17q25 (Menzel et al., Genomics, 1994, 20, 327-328). Uma mu- tação com sentido de Gly para Ser no codon 40 no gene receptor de gluca- gon leva a uma afinidade 3 vezes menor por glucagon (Fujisawa et al., Dia- betologia, 1995, 38, 983-985) e esta mutação foi ligada a vários estados de doença, incluindo diabetes melito não-insulino-dependente (Fujisawa et al., Diabetologia, 1995, 38, 983-985), hipertensão (Chambers e Morris, Nat. Ge- net., 1996, 12, 122), e adiposi central (Siani et al., Obes. Res., 2001, 9, 722-726).
Definições
"Receptor de glucagon" é o produto genético ou proteína cuja 15 expressão deve ser modulada por administração de um composto anti- sentido curto. Receptor de glucagon é geralmente referido como GCGR mas também pode ser referido como GR, GGR, MGC138246, MGC93090.
"Ácido nucléico GCGR" significa qualquer ácido nucléico codifi- cando GCGR. Por exemplo, em determinadas modalidades, um ácido nu- cléico GCGR inclui, sem limitação, uma seqüência GCGR codificando GC- GR, uma seqüência de RNA transcrita de DNA codificando GCGR, e uma seqüência de RNAm codificando GCGR. "RNAm GCGR" significa um RNAm codificando uma proteína GCGR. Indicações Terapêuticas Tecnologia anti-sentido é um meio eficaz para reduzir a expres- são de receptores de glucagon (GCGR) e se comprovou ser unicamente úti- Ia em uma série de aplicações terapêuticas, diagnosticas, e de pesquisa. Deste modo, em determinadas modalidades, a presente invenção proporcio- na compostos anti-sentido curtos dirigidos para um ácido nucléico codifican- do receptor de glucagon, e os quais modulam a expressão de receptor de glucagon. Adicionalmente são proporcionados aqui, neste requerimento de patente, compostos anti-sentido curtos capazes de inibir a expressão de GCGR. Também são proporcionados aqui, neste requerimento de patente, métodos para tratar um indivíduo compreendendo administrar uma ou mais composições farmacêuticas compreendendo um composto anti-sentido curto dirigido para um ácido nucléico GCGR. Em algumas modalidades, como compostos anti-sentido curtos dirigidos para um ácido nucléico GCGR ini- bem a expressão de GCGR, são proporcionados aqui, neste requerimento de patente, métodos para tratar um sujeito tendo uma doença ou condição associada com atividade de GCGR administrando uma ou mais composi- ções farmacêuticas compreendendo um composto anti-sentido curto dirigido para um ácido nucléico GCGR. Por exemplo, são proporcionados aqui, neste requerimento de patente, métodos para tratar um sujeito tendo elevada gli- cose sangüínea, hiperglicemia, pré-diabetes, diabetes, diabetes Tipo 2, sín- drome metabólica, obesidade e/ou resistência à insulina.
Também são contempladas aqui, neste requerimento de paten- te, composições farmacêuticas compreendendo um ou mais compostos anti- sentido curtos dirigidos para GCGR e opcionalmente um veículo, diluente, reforçador ou excipiente farmaceuticamente aceitáveis. Alguns compostos da invenção também podem ser usados na fabricação de um medicamento para o tratamento de doenças e distúrbios relacionados com efeitos do glu- cagon mediados por GCGR.
Algumas modalidades da presente invenção incluem métodos para reduzir a expressão de GCGR em tecidos ou células compreendendo os tecidos ou células referidos com um composto anti-sentido curto dirigido para um ácido nucléico codificando GCGR ou composição farmacêutica compreendendo um composto anti-sentido curto semelhante. Em algumas modalidades, referidas, a invenção proporciona métodos para reduzir os ní- veis de glicose sangüínea, os níveis sangüíneos de triglicerídeo níveis, ou os níveis sangüíneos de colesterol em um sujeito compreendendo administrar ao sujeito um composto anti-sentido curto ou uma composição farmacêutica.
Os níveis sangüíneos podem ser níveis plasmáticos ou níveis séricos. Tam- bém são contemplados métodos para melhorar a sensibilidade à insulina, métodos para aumentar os níveis de GLP-1 e métodos para inibir a produ- ção de glicose hepática em um animal compreendendo administrar ao referi- do animal um oligonucleotídeo anti-sentido ou uma composição farmacêutica da invenção. Um aprimoramento na sensibilidade à insulina pode ser indica- do por uma redução nos níveis de insulina circulante.
Em algumas modalidades, a invenção proporciona métodos para tratar um sujeito tendo uma doença ou condição associada com atividade de glucagon através de GCGR compreendendo administrar ao sujeito uma quantidade terapeuticamente ou profilaticamente eficaz de um composto anti-sentido curto ou uma composição farmacêutica. Em algumas modalida- des, a doença ou condição referida pode ser uma doença ou condição me- tabólica. Em algumas modalidades, a doença ou condição metabólica é dia- betes, hiperglicemia, hiperlipidemia, síndrome metabólica X, obesidade, hi- perglucagonemia primária, deficiência de insulina, ou resistência à insulina. Em algumas modalidades, o diabetes é diabetes Tipo 2. Em algumas moda- lidades, a obesidade é induzida pela dieta. Em algumas modalidades, hiper- lipidemia é associada com níveis sangüíneos de lipídeos elevados. Lipídeos incluem colesterol e triglicerídeos. Em uma modalidade, a condição é estea- tose hepática. Em algumas modalidades, a esteatose é esteatohepatite ou esteatohepatite não-alcoólica.
Em algumas modalidades, a invenção proporciona métodos para prevenir ou retardar o início de níveis elevados de glicose sangüínea em um animal bem como métodos para preservar a função de células beta em um animal usando os compostos oligoméricos delineados aqui, neste requeri- mento de patente.
Alguns compostos anti-sentido curtos dirigidos para GCGR po- dem ser usados para modular a expressão de GCGR em um sujeito que ne- cessite dos mesmos, tal como um animal, incluindo, mas não limitado a, um ser humano. Em algumas modalidades, os métodos referidos compreendem a etapa de administrar ao referido animal uma quantidade eficaz de um composto anti-sentido curto que reduz a expressão de RNA GCGR. Em al- gumas modalidades, compostos anti-sentido curtos reduzem de modo eficaz os níveis ou expressão de RNA GCGR. Como a redução nos níveis de RNAm GCGR pode levar a alteração nos produtos de expressão de proteína GCGR também, as alterações resultantes referidas também podem ser me- didas. Alguns compostos anti-sentido que reduzem de modo eficaz os níveis ou função de RNA GCGR ou produtos de expressão de proteína são consi- derados um composto anti-sentido ativo. Em algumas modalidades, compos- tos anti-sentido curtos reduzem a expressão de GCGR causando uma redu- ção de RNA por no mínimo 10%, por no mínimo 20%, por no mínimo 25%, por no mínimo 30%, por no mínimo 40%, por no mínimo 50%, por no mínimo 60%, por no mínimo 70%, por no mínimo 75%, por no mínimo 80%, por no mínimo 85%, por no mínimo 90%, por no mínimo 95%, por no mínimo 98%, por no mínimo 99%, ou por 100%.
São adicionalmente proporcionados métodos para triagem de moduladores de receptor de glucagon e métodos para modular a expressão de receptor de glucagon em células, tecidos ou animais compreendendo contactar as células, tecidos ou animais referidos com um ou mais compos- tos anti-sentido curtos dirigidos para GCGR ou com composições compre- endendo os compostos referidos. Métodos para tratar um animal, particular- mente um ser humano, suspeito de ter ou ser propenso a uma doença ou condição associada com expressão de receptor de glucagon também são determinados aqui, neste requerimento de patente. Alguns métodos seme- lhantes compreendem administrar uma quantidade terapeuticamente ou pro- filaticamente eficaz de um ou mais dos compostos ou composições da in- venção à pessoa que necessite de tratamento.
A redução da expressão de receptor de glucagon pode ser me- dida, por exemplo, no sangue, plasma, soro, tecido adiposo, fígado ou qual- quer outro fluido corporal, tecido ou órgão do animal. Preferencialmente, as células contidas dentro dos fluidos, tecidos ou órgãos referidos sendo anali- sados contêm uma molécula de ácido nucléico codificando a proteína recep- tora de glucagon e/ou a própria proteína receptora de glucagon.
Composições farmacêuticas e outras composições compreen- dendo compostos anti-sentido curtos também são proporcionadas. Em al- gumas modalidades, compostos anti-sentido curtos dirigidos para um ácido nucléico codificando GCGR são utilizados em composições farmacêuticas adicionando uma quantidade eficaz de um composto a um diluente ou veícu- lo farmaceuticamente aceitável adequado.
Os compostos anti-sentido curtos tendo por alvo um ácido nu- cléico GCGR podem ter qualquer uma ou mais propriedades ou característi- cas dos compostos anti-sentido curtos descritos de modo geral aqui, neste requerimento de patente. Em algumas modalidades, compostos anti-sentido curtos tendo por alvo um ácido nucléico GCGR têm um motivo (asa - gap desóxi - asa) selecionado entre 1-12-1, 1-1-10-2, 2-10-1-1, 3-10-3, 2-10-3, 2-10-2, 1-10-1,1-10-2, 3-8-3, 2-8-2, 1 -8-1, 3-6-3 ou 1 -6-1. Em algumas modali- dades, compostos anti-sentido curtos tendo por alvo um ácido nucléico GC- GR têm um motivo (asa - gap desóxi - asa) selecionado entre 1-12-1, 2-10-2,3-10-3, 3-8-3, 1-1-10-2.
Alguns Compostos Anti-sentido Curtos Dirigidos para um Ácido Nucléico GCGR
Em algumas modalidades, compostos anti-sentido curtos são dirigidos para um ácido nucléico GCGR tendo a seqüência do GENBANK® de Acesso No. NM_000160.1, incorporada aqui, a este requerimento de pa- tente, como SEQ ID NO: 9. Em algumas modalidades, referidas, um com- posto anti-sentido curto dirigido para SEQ ID NO: 9 é no mínimo 90% com- plementar à SEQ ID NO: 9. Em algumas modalidades, referidas, um com- posto anti-sentido curto dirigido para SEQ ID NO: 9 é no mínimo 95% com- plementar à SEQ ID NO: 9. Em algumas modalidades, referidas, um com- posto anti-sentido curto dirigido para SEQ ID NO: 9 é 100% complementar à SEQ ID NO: 9. Em algumas modalidades, um composto anti-sentido curto dirigido para SEQ ID NO: 9 inclui uma seqüência de nucleotídeos seleciona- da entre as seqüências de nucleotídeos determinada nas Tabelas 12 e 13.
As seqüências de nucleotídeos determinadas em cada NO de SEQ ID nas Tabelas 12 e 13 são independentes de qualquer modificação para uma porção açúcar, uma ligação internucleosídeos, ou uma nucleoba- se. Deste modo, compostos anti-sentido curtos definidos por um NO de SEQ ID podem compreender, independentemente, uma ou mais modificações para uma porção açúcar, uma ligação internucleosídeos, ou uma nucleoba- se. Compostos anti-sentido curtos descrito pelo Númeo Isis (N2 ISIS) indi- cam uma combinação de seqüência de nucleobases e uma ou mais modifi- cações para uma porção açúcar, uma ligação internucleosídeos, ou uma nucleobase.
Em algumas modalidades, compostos anti-sentido curtos dirigi- dos para um ácido nucléico GCCR compreendem um motivo de gápmero. Em algumas modalidades, um composto anti-sentido curto dirigido para um ácido nucléico GCCR compreende um motivo de gápmero 3-10-3. Em algu- mas modalidades, compostos anti-sentido curtos dirigidos para um ácido nucléico GCCR compreendem um motivo de gápmero. Em algumas modali- dades, um composto anti-sentido curto dirigido para um ácido nucléico GC- CR compreende um motivo de gápmero 3-8-3. Em algumas modalidades, compostos anti-sentido curtos dirigidos para um ácido nucléico GCCR com- preendem um motivo de gápmero. Em algumas modalidades, um composto anti-sentido curto dirigido para um ácido nucléico GCCR compreende um motivo de gápmero 2-10-2.
As Tabelas 12 e 13 ilustram exemplos de compostos anti-sentido curtos dirigidos para SEQ ID NO: 9. A Tabela 12 ilustra compostos anti- sentido curtos que são 100% complementares à SEQ ID NO: 9. A Tabela 13 ilustra compostos anti-sentido curtos quet êm uma ou duas combinações inadequadas com respeito à SEQ ID NO: 9. A coluna com o título 'motivo de gápmero' indica o motivo asa-gap-asa de cada compostos anti-sentido cur- tos. O segmento de gap compreende 2'-desoxinucleotídeos e cada nucleotí- deo de cada segmento de asa compreende um açúcar 2'-modificado. O açú- car em 2'-modificado em particular também é indicado na coluna de 'motivo de gápmero'. Por exemplo, '2-10-2 MOE1 significa um motivo de gápmero 2-10-2, onde um segmento de gap de dez 2'-desoxinucleotídeos é flanqueado por segmentos de asa de dois nucleotídeos, onde os nucleotídeos dos seg- mentos de asa são nucleotídeos 2'-MOE. Ligações internucleosídeos são fosforotioato. Os compostos anti-sentido curtos compreendem 5-metilcitidina ao invés de citosina não modificada, a menos que "citosina não modificada" seja listada na coluna de motivo de gápmero, em cujo caso as citosinas indi- cadas são citosinas não modificadas. Por exemplo, "5-mC em gap somente" indica que o segmento de gap tem 5-metilcitosinas, ao passo que os seg- mentos de asa têm citosinas não modificadas.
Tabela 12: Compostos Anti-sentido Curtos dirigidos para SEQ ID NO: 9
<table>table see original document page 206</column></row><table> <table>table see original document page 207</column></row><table> <table>table see original document page 208</column></row><table> <table>table see original document page 209</column></row><table>
Tabela 13: Compostos anti-sentido curtos dirigidos para SEQ ID NO: 1 e tendo 1 ou 2 combinações inadequadas
<table>table see original document page 209</column></row><table> <table>table see original document page 210</column></row><table> <table>table see original document page 211</column></row><table> <table>table see original document page 212</column></row><table> Em algumas modalidades, uma região alvo é nucleotídeos 378-391 de SEQ ID NO: 9. Em algumas modalidades, um composto anti-sentido curto é dirigido para nucleotídeos 378-391 de SEQ ID NO: 9. Em algumas modalidades, referidas, um composto anti-sentido curto dirigido para nucleo- tídeos 378-391 compreende uma seqüência de nucleotídeos selecionada entre SEQ ID NO 486 ou 487. Em algumas modalidades, referidas, um com- posto anti-sentido curto dirigido para nucleotídeos 378-391 de SEQ ID NO: 9 é selecionado entre o No. Isis 338463 ou 338534.
Em algumas modalidades, uma região alvo é nucleotídeos 499- 521 de SEQ ID NO: 9. Em algumas modalidades, um composto anti-sentido curto é dirigido para nucleotídeos 499-521 de SEQ ID NO: 9. Em algumas modalidades, referidas, um composto anti-sentido curto dirigido para nucleo- tídeos 499-521 compreende uma seqüência de nucleotídeos selecionada entre SEQ ID NO 488, 489, 490, 491, 492, 493, 494, 495, 496, ou 497. Em algumas modalidades, referidas, um composto anti-sentido curto dirigido pa- ra nucleotídeos 499-521 de SEQ ID NO: 9 é selecionado entre o No. Isis .327130, 327131, 327132, 327133, 327134, 327135, 327136, 327137,327138, ou 327139.
Em algumas modalidades, uma região alvo é nucleotídeos 531-553 de SEQ ID NO: 9. Em algumas modalidades, um composto anti-sentido curto é dirigido para nucleotídeos 531-553 de SEQ ID NO: 9. Em algumas modalidades, referidas, um composto anti-sentido curto dirigido para nucleo- tídeos 531-553 compreende uma seqüência de nucleotídeos selecionada entre SEQ ID NO 498, 499, 500, 501, 502, 503, 504, 505, 506, ou 507. Em algumas modalidades, referidas, um composto anti-sentido curto dirigido pa- ra nucleotídeos 531-553 de SEQ ID NO: 9 é selecionado entre o No. Isis .327140, 327141, 327142, 327143, 327144, 327145, 327146, 327147,327148, ou 327149.
Em algumas modalidades, uma região alvo é nucleotídeos 545- 567 de SEQ ID NO: 9. Em algumas modalidades, um composto anti-sentido curto é dirigido para nucleotídeos 545-567 de SEQ ID NO: 9. Em algumas modalidades, referidas, um composto anti-sentido curto dirigido para núcleo- tídeos 545-567 compreende uma seqüência de nucleotídeos selecionada entre SEQ ID NO 508, 509, 510, 511, 512, 513, 514, 515, 516, ou 517. Em algumas modalidades, referidas, um composto anti-sentido curto dirigido pa- ra nucleotídeos 545-567 de SEQ ID NO: 9 é selecionado entre o No. Isis 327150, 327151, 327152, 327153, 327154, 327155, 327156, 327157,
327158, ou 327159.
Em algumas modalidades, uma região alvo é nucleotídeos 531- 567 de SEQ ID NO: 9. Em algumas modalidades, um composto anti-sentido curto é dirigido para nucleotídeos 531-567 de SEQ ID NO: 9. Em algumas modalidades, referidas, um composto anti-sentido curto dirigido para nucleo- tídeos 531-567 compreende uma seqüência de nucleotídeos selecionada entre SEQ ID NO 498, 499, 500, 501, 502, 503, 504, 505, 506, 507, 508, 509, 510, 511, 512, 513, 514, 515, 516, ou 517. Em algumas modalidades, referidas, um composto anti-sentido curto dirigido para nucleotídeos 531-567 de SEQ ID NO: 9 é selecionado entre o No. Isis 327140, 327141, 327142, 327143, 327144, 327145, 327146, 327147, 327148, 327149, 327150, 327151, 327152, 327153, 327154, 327155, 327156, 327157, 327158, ou 327159.
Em algumas modalidades, uma região alvo é nucleotídeos 684- 714 de SEQ ID NO: 9. Em algumas modalidades, um composto anti-sentido curto é dirigido para nucleotídeos 684-714 de SEQ ID NO: 9. Em algumas modalidades, referidas, um composto anti-sentido curto dirigido para nucleo- tídeos 684-714 compreende uma seqüência de nucleotídeos selecionada entre SEQ ID NO 518, 520, 521, 522, 523, 524, 525, 526, 527, 528, 529, 530, 531, 532, 533, 534, 535, ou 536. Em algumas modalidades, referidas, um composto anti-sentido curto dirigido para nucleotídeos 684-714 de SEQ ID NO: 9 é selecionado entre o No. Isis 345897, 327160, 327161, 327162, 327163, 327164, 327165, 327166, 327167, 327168, 327169, 327170, 327171, 327172, 327173, 327174, 327175, 327176, ou 327177.
Em algumas modalidades, uma região alvo é nucleotídeos 869- 891 de SEQ ID NO: 9. Em algumas modalidades, um composto anti-sentido curto é dirigido para nucleotídeos 869-891 de SEQ ID NO: 9. Em algumas modalidades, referidas, um composto anti-sentido curto dirigido para nucleo- tídeos 869-891 compreende uma seqüência de nucleotídeos selecionada entre SEQ ID NO 537, 538, 539, 540, 541, 542, 543, 544, 545, ou 546. Em algumas modalidades, referidas, um composto anti-sentido curto dirigido pa- ra nucleotídeos 869-891 de SEQ ID NO: 9 é selecionado entre o No. Isis .327178, 327179, 327180, 327181, 327182, 327183, 327184, 327185, .327186, ou 327187.
Em algumas modalidades, uma região alvo é nucleotídeos 955- .977 de SEQ ID NO: 9. Em algumas modalidades, um composto anti-sentido curto é dirigido para nucleotídeos 955-977 de SEQ ID NO: 9. Em algumas modalidades, referidas, um composto anti-sentido curto dirigido para nucleo- tídeos 955-977 compreende uma seqüência de nucleotídeos selecionada entre SEQ ID NO 547, 548, 549, 550, 551, 552, 553, 554, 555, ou 556. Em algumas modalidades, referidas, um composto anti-sentido curto dirigido pa- ra nucleotídeos 955-977 de SEQ ID NO: 9 é selecionado entre o No. Isis .327188, 327189, 327190, 327191, 327192, 327193, 327194, 327195, .327196, ou 327197.
Em algumas modalidades, uma região alvo é nucleotídeos 1019- .1041 de SEQ ID NO: 9. Em algumas modalidades, um composto anti-sentido curto é dirigido para nucleotídeos 1019-1041 de SEQ ID NO: 9. Em algumas modalidades, referidas, um composto anti-sentido curto dirigido para nucleo- tídeos 1019-1041 compreende uma seqüência de nucleotídeos selecionada entre SEQ ID NO 557, 558, 559, 560, 561, 562, 563, 564, 565, ou 566. Em algumas modalidades, referidas, um composto anti-sentido curto dirigido pa- ra nucleotídeos 1019-1041 de SEQ ID NO: 9 é selecionado entre o No. Isis .327198, 327199, 327200, 327201, 327202, 327203, 327204, 327205, .327206, ou 327207.
Em algumas modalidades, uma região alvo é nucleotídeos 1160- .1175 de SEQ ID NO: 9. Em algumas modalidades, um composto anti-sentido curto é dirigido para nucleotídeos 1160-1175 de SEQ ID NO: 9. Em algumas modalidades, referidas, um composto anti-sentido curto dirigido para nucleo- tídeos 1160-1175 compreende uma seqüência de nucleotídeos selecionada entre SEQ ID NO 567 ou 568. Em algumas modalidades, referidas, um com- posto anti-sentido curto dirigido para nucleotídeos 1160-1175 de SEQ ID NO: 9 é selecionado entre o No. Isis 338491 ou 338562.
Em algumas modalidades, uma região alvo é nucleotídeos 1307-1377 de SEQ ID NO: 9. Em algumas modalidades, um composto anti-sentido curto é dirigido para nucleotídeos 1307-1377 de SEQ ID NO: 9. Em algumas modalidades, referidas, um composto anti-sentido curto dirigido para nucleo- tídeos 1307-1377 compreende uma seqüência de nucleotídeos selecionada entre SEQ ID NO 569, 570, 571, 572, ou 573. Em algumas modalidades, referidas, um composto anti-sentido curto dirigido para nucleotídeos 1307-1377 de SEQ ID NO: 9 é selecionado entre o No. Isis 338498, 338569,338499, 338570, ou 385067.
Em algumas modalidades, uma região alvo é nucleotídeos 1307-1414 de SEQ ID NO: 9. Em algumas modalidades, um composto anti-sentido curto é dirigido para nucleotídeos 1307-1414 de SEQ ID NO: 9. Em algumas modalidades, referidas, um composto anti-sentido curto dirigido para nucleo- tídeos 1307-1414 compreende uma seqüência de nucleotídeos selecionada entre SEQ ID NO 569, 570, 571, 572, 573, ou 574. Em algumas modalida- des, referidas, um composto anti-sentido curto dirigido para nucleotídeos . 1307-1414 de SEQ ID NO: 9 é selecionado entre o No. Isis 338498, 338569,338499, 338570, 385067, ou 338573.
Em algumas modalidades, compostos anti-sentido curtos dirigi- dos para um ácido nucléico GCGR têm 8 a 16, preferencialmente 9 a 15, mais preferencialmente 9 a 14, mais preferencialmente 10 a 14 nucleotídeos de extensão. Em algumas modalidades, compostos anti-sentido curtos diri- gidos para um ácido nucléico GCGR têm 9 a 14 nucleotídeos de extensão. Em algumas modalidades, compostos anti-sentido curtos dirigidos para um ácido nucléico GCGR têm 10 a 14 nucleotídeos de extensão. Em algumas modalidades, os compostos anti-sentido curtos referidos são oligonucleotí- deos anti-sentido curtos.
Em algumas modalidades, compostos anti-sentido curtos dirigi- dos para um ácido nucléico GCGR são gápmeros curtos. Em algumas mo- dalidades, referidas, gápmeros curtos dirigidos para um ácido nucléico GC- GR compreendem no mínimo uma modificação de alta afinidade em uma ou mais asas do composto. Em algumas modalidades, compostos anti-sentido curtos dirigidos para um ácido nucléico GCGR compreendem 1 a 3 modifica- ções de alta afinidade em cada asa. Em algumas modalidades, referidas, os nucleosídeos ou nucleotídeos da asa compreendem uma modificação 2". Em algumas modalidades, referidas, os monômeros da asa are BNA's. Em al- gumas modalidades, referidas, os monômeros da asa são selecionados en- tre α-L-Metilenoóxi (4'-CH2-0-2') BNA, β-D-Metilenoóxi (4'-CH2-0-2') BNA, Etilenoóxi (4'-(CH2)2-0-2') BNA, Aminoóxi (4'-CH2-0-N(R)-2') BNA e Oxiami- no (4'-CH2-N(R)-0-2') BNA. Em algumas modalidades, os monômeros de uma asa compreendem um substituinte na posição 2' selecionada entre alila, amino, azido, tio, O-alila, O-C1-C10 alquila, -OCF3, O-(CH2)2-O-CH3, 2'- O(CH2)2SCH3, O-(CH2)2-O-N(Rm)(Rn), e 0-CH2-C(=0)-N(Rm)(Rn), onde cada Rm e Rn é, independentemente, H ou CrC10 alquila substituída ou não- substituída. Em algumas modalidades, os monômeros de uma asa são nu- cleotídeos 2'MOE.
Em algumas modalidades, compostos anti-sentido curtos dirigi- dos para um ácido nucléico GCGR compreendem um gap entre a asa 5' e a asa 3'. Em algumas modalidades, o gap compreende cinco, seis, sete, oito, nove, dez, onze, doze, treze, ou quatorze monômeros. Em algumas modali- dades, os monômeros do gap são desoxirribonucleotídeos não modificados. Em algumas modalidades, os monômeros do gap são ribonucleotídeos não modificados. Em algumas modalidades, gap de modificações de gap (se houver) resultam em um composto anti-sentido que, quando ligado a seu ácido nucléico alvo, suporta clivagem por uma RNase, incluindo, mas não limitada a, RNase H.
Em algumas modalidades, compostos anti-sentido curtos dirigi- dos para um ácido nucléico GCGR têm ligações monoméricas uniformes.
Em algumas modalidades, referidas, estas ligações são todas ligações fosfo- rotioato. Em algumas modalidades, as ligações são todas ligações fosfodiés- ter. Em algumas modalidades, compostos anti-sentido curtos dirigidos para um ácido nucléico GCGR têm espinhas dorsais mistas.
Em algumas modalidades, compostos anti-sentido curtos dirigi- dos para um ácido nucléico GCGR têm 8 monômeros de extensão. Em al- gumas modalidades, compostos anti-sentido curtos dirigidos para um ácido nucléico GCGR têm 9 monômeros de extensão. Em algumas modalidades, compostos anti-sentido curtos dirigidos para um ácido nucléico GCGR têm 10 monômeros de extensão. Em algumas modalidades, compostos anti- sentido curtos dirigidos para um ácido nucléico GCGR têm 11 monômeros de extensão. Em algumas modalidades, compostos anti-sentido curtos diri- gidos para um ácido nucléico GCGR têm monômeros de extensão. Em al- gumas modalidades, compostos anti-sentido curtos dirigidos para um ácido nucléico GCGR têm 13 monômeros de extensão. Em algumas modalidades, compostos anti-sentido curtos dirigidos para um ácido nucléico GCGR têm 14 monômeros de extensão. Em algumas modalidades, compostos anti- sentido curtos dirigidos para um ácido nucléico GCGR têm 15 monômeros de extensão. Em algumas modalidades, compostos anti-sentido curtos diri- gidos para um ácido nucléico GCGR têm 16 monômeros de extensão. Em algumas modalidades, compostos anti-sentido curtos dirigidos para um ácido nucléico GCGR compreendem 9 a 15 monômeros. Em algumas modalida- des, compostos anti-sentido curtos dirigidos para um ácido nucléico GCGR compreendem 10 a 15 monômeros. Em algumas modalidades, compostos anti-sentido curtos dirigidos para um ácido nucléico GCGR compreendem 12 a 14 monômeros. Em algumas modalidades, compostos anti-sentido curtos dirigidos para um ácido nucléico GCGR compreendem 12 a 14 nucleotídeos ou nucleosídeos.
Em algumas modalidades, a invenção proporciona métodos para modular a expressão de GCGR. Em algumas modalidades, os métodos refe- ridos compreendem uso de um ou mais composto anti-sentido curto dirigido para um ácido nucléico GCGR, em que o composto anti-sentido curto dirigi- do para um ácido nucléico GCGR é a partir de cerca de 8 a cerca de 16, pre- ferencialmente 9 a 15, mais preferencialmente 9 a 14, mais preferencialmen- te 10 a 14 monômeros (isto é, a partir de cerca de 8 a cerca de 16 monôme- ros ligados). Uma pessoa com conhecimento regular da técnica reconhecerá que isto compreende métodos para modular a expressão de GCGR usando um ou mais compostos anti-sentido curtos dirigidos para um ácido nucléico GCGR de 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 ou 16 monômeros.
Em algumas modalidades, métodos para modular GCGR com- preendem uso de um composto anti-sentido curto dirigido para um ácido nu- cléico GCGR que tem 8 monômeros de extensão. Em algumas modalidades, métodos para modular GCGR compreendem uso de um composto anti- sentido curto dirigido para um ácido nucléico GCGR que tem 9 monômeros de extensão. Em algumas modalidades, métodos para modular GCGR com- preendem uso de um composto anti-sentido curto dirigido para um ácido nu- cléico GCGR que tem 10 monômeros de extensão. Em algumas modalida- des, métodos para modular GCGR compreendem uso de um composto anti- sentido curto dirigido para um ácido nucléico GCGR que tem 11 monômeros de extensão. Em algumas modalidades, métodos para modular GCGR com- preendem uso de um composto anti-sentido curto dirigido para um ácido nu- cléico GCGR que tem 12 monômeros de extensão. Em algumas modalida- des, métodos para modular GCGR compreendem uso de um composto anti- sentido curto dirigido para um ácido nucléico GCGR que tem 13 monômeros de extensão. Em algumas modalidades, métodos para modular GCGR com- preendem uso de um composto anti-sentido curto dirigido para um ácido nu- cléico GCGR que tem 14 monômeros de extensão. Em algumas modalida- des, métodos para modular GCGR compreendem uso de um composto anti- sentido curto dirigido para um ácido nucléico GCGR que tem 15 monômeros de extensão. Em algumas modalidades, métodos para modular GCGR com- preendem uso de um composto anti-sentido curto dirigido para um ácido nu- cléico GCGR que tem 16 monômeros de extensão.
Em algumas modalidades, métodos para modular a expressão de GCGR compreendem uso de um composto anti-sentido curto dirigido pa- ra um ácido nucléico GCGR compreendendo 9 a 15 monômeros. Em algu- mas modalidades, métodos para modular a expressão de GCGR compreen- dem uso de um composto anti-sentido curto dirigido para um ácido nucléico GCGR compreendendo 10 a 15 monômeros. Em algumas modalidades, mé- todos para modular a expressão de GCGR compreendem uso de um com- posto anti-sentido curto dirigido para um ácido nucléico GCGR compreen- dendo 12 a 14 monômeros. Em algumas modalidades, métodos para modu- lar a expressão de GCGR compreendem uso de um composto anti-sentido curto dirigido para um ácido nucléico GCGR compreendendo 12 ou 14 nu- cleotídeos ou nucleosídeos.
8. DGAT2
Diacilglicerol transferase 2 (também conhecido como DGAT2, diacilglicerol O-transferase 2, acila-CoA:diacilglicerol aciltransferase 2), foi mostrado que Diacilglicerol transferase está implicada no processo de ab- sorção de triglicerídeos (também denominados triacilgliceróis) do alimento.
A absorção de triglicerídeos do alimento é um processo muito eficiente que ocorre por uma série de etapas em que os triacilgliceróis da dieta são hidrolisados na luz intestinal e em seguida ressintetizados dentro dos enterócitos. A ressíntese de triacilgliceróis pode ocorrer através do da- minho do monoacilglicerol o qual começa com monoacilglicerol aciltransfera- se (MGAT) catalisando a síntese de diacilglicerol a partir de monoacilglicerol e acila-CoA graxa. Uma síntese alternativa de diacilgliceróis é proporcionada pelo caminhodo glicerol-fosfato o qual descreve a ligação de duas moléculas de acila-CoA graxa a glicerol-3-fosfato. Em qualquer caso, diacilglicerol é em seguida acilado com outra molécula de acila-CoA graxa em uma reação ca- talisada por uma de duas enzimas diacilglicerol aciltransferase para formar o triglicerídeo (Farese et al., Curr. Opin. Lipidol., 2000, 11, 229-234).
A reação catalisada por diacilglicerol aciltransferase é a etapa final e somente envolvida com a síntese de triglicerídeos. Deste modo, dia- cilglicerol aciltransferase está envolvida na absorção de gordura intestinal, montagem de lipoproteínas, regulação das concentrações de triglicerídeos plasmáticos, e armazenamento de gordura nos adipócitos. A primeira diacil- glicerol aciltransferase, diacilglicerol transferase 1, foi identificada em 1960 e os genes humanos e de camundongo codificando esta proteína foram isola- dos em 1998 (Cases et al., Proc. Natl. Acad. Sei. U. S. A., 1998, 95, 13018- .13023; Oelkers et al., J. Biol. Chem., 1998, 273, 26765-26771). Camundon- gos carecendo de diacilglicerol aciltransferase 1 são viáveis e ainda podem sintetizar triglicerídeos através de outras vias biológicas, sugerindo a exis- tência de múltiplos mecanismos para síntese de triglicerídeos (Smith et al., Nat. Genet., 2000, 25, 87-90).
Uma segunda diacilglicerol transferase, diacilglicerol transferase .2 (também conhecida como DGAT2, diacilglicerol O-transferase 2, acila- CoA:diacilglicerol aciltransferase 2), foi em seguida identificada no fungo Mortierella, seres humanos e camundongos. Provas enzimáticas indicam que esta proteína recentemente identificada possui atividade de diacilglicerol transferase que utiliza uma ampla gama de substratos de acila-CoA graxa de cadeia longa (Cases et al., J. Biol. Chem., 2001, 276, 38870-38876).
Diacilglicerol transferase 2 é um membro de uma família de ge- nes cujas seqüências não estão relacioandas com diacilglicerol transferase .1. Além de diferir em seqüência comparada com diacilglicerol transferase 1, provas in vitro ilustram que diacilglicerol transferase 2 tem maior atividade em menores concentrações de cloreto de magnésio e oleoila-CoA (Cases et al., J. Biol. Chem., 2001, 276, 38870-38876). A seqüência protéica prevista de diacilglicerol transferase 2 contém no mínimo um domínio transmembrana putativo, três sítios de glicosilação N-Iigados potenciais, seis sítios de con- senso de fosforilação de proteína quinase C potenciais, bem como seqüên- cias em comum com um sítio de fosforilação de glicerol putativo encontrado em enzimas aciltransferase (Cases et al., J. Biol. Chem., 2001, 276, 38870-38876). O International Radiation Hybrid Mapping Consortium (N.T.: Consór- cio de Mapeamento de Híbridos por Radiação Internacional) mapeou diacil- glicerol transferase 2 humana para cromossomo 11q13.3.
Em tecidos humanos, os maiores níveis de diacilglicerol transfe- rase 2 são detectados no fígado e tecidos adiposos brancos, com menores níveis encontrados nas glândulas mamárias, testículos e leucócitos do san- gue periférico (Cases et al., J. Biol. Chem., 2001, 276, 38870-38876). Duas espécies de RNAm de 2,4 e 1,8 quilobases são detectadas em tecidos hu- manos, ao passo que as principais espécies de RNAm de diacilglicerol trans- ferase 2 em tecidos de camundongo tem 2,4 quilobases. Além de tecidos do fígado e adiposo branco, diacilglicerol transferase 2 é expressado em todos os segmentos do intestino delgado em camundongos, com maior expressão no intestino proximal e menor expressão no intestino distai (Cases et al., J.
Biol. Chem., 2001, 276, 38870-38876).
A atividade de diacilglicerol transferase apresenta padrões distin- tos durante o desenvolvimento pós-natal do fígado de rato. Como não há correlação entre os padrões de expressão e atividade de RNAm1 modifica- ções pós-translacionais podem participar da regulação da atividade de dia- cilglicerol transferase 2 durante o desenvolvimento do rato (Waterman et al., J. Lipid. Res., 2002, 43, 1555-1562).
RNAm de diacilglicerol transferase 2 é preferencialmente regula- do para cima por tratamento com insulina, conforme mostrado por testes in vitro medindo a atividade de diacilglicerol da fração de membrana de adipó- citos de camundongo cultivados (Meegalla et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 2002, 298, 317-323). Em camundongos em jejum, a expressão de diacilglicerol transferase 2 é grandamente reduzida, e aumenta dramatica- mente na realimentação. Os padrões de expressão de duas enzimas que participam na síntese de ácidos graxos, acetila-CoA carboxilase e ácidos graxos sintase, respondem a jejum e realimentação em um modo similar. Estes resultados, combinado com a observação de que a diacilglicerol trans- ferase 2 é expressada abundantemente no fígado, sugerem que a diacilgli- cerol transferase 2 é firmemente ligada ao caminho de síntese endógena de ácidos graxos (Meegalla et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 2002, 298, 317-323).
Estudos com camundongos portando uma disrupção no gene diacilglicerol aciltransferase 1 proporiconam evidência de que a diacilglicerol aciltransferase 2 contribui para a síntese de triglicerídeos. Os níveis de ex- pressão de RNAm de diacilglicerol transferase 2 são similares em segmen- tos intestinais tanto de camundongos selvagens quanto deficientes de diacil- glicerol transferase 1 (Buhman et al., J. BioL Chem., 2002, 277, 25474- 25479). Usando cloreto de magnésio para distinguir entre atividade de dia- cilglicerol transferase 1 e 2, Buhman, et al. observaram que, em camundon- gos deficientes de diacilglicerol transferase 1, a atividade de diacilglicerol transferase é reduzida para 50% no intestino proximal e para 10 a 15% no intestino distai (Buhman et al., J. Biol. Chem., 2002, 277, 25474-25479).
Adicionalmente, os níveis de RNAm de diacilglicerol transferase .2 não estão regulados para cima nos tecidos do fígado ou adiposo de ca- mundongos deficientes de diacilglicerol transferase 1, mesmo depois de se- manas de dieta de alto teor de gordura (Cases et al., J. Biol. Chem., 2001, .276, 38870-38876; Chen et al., J. Clin. Invest., 2002, 109, 1049-1055). No entanto, em camundongos ob/ob, os quais têm uma mutação no gene Iepti- na que resulta em obesidade, diacilglicerol transferase 2 é mais altamente expressado do que em camundongos selvagens, sugerindo que diacilglicerol transferase 2 pode ser parcialmetne responsável pela massa de gordura al- tamente acumulada vista nestes camundongos. Além disso, as mutações combinadas de Ieptina e diacilglicerol transferase 1 leva a uma elevação tri- pla na expressão de diacilglicerol transferase 2 em tecido adiposo branco, comparada com os níveis no mesmo tecido de camundongos deficientes de diacilglicerol transferase 1 (Chen et al., J. Clin. Invest., 2002, 109, 1049- .1055). RNAm de diacilglicerol transferase 2 também está regulado para cima na pele destes camundongos (Chen et al., J. Clin. Invest., 2002, 109, 175- .181). Estes dados sugerem que Ieptina normalmente regula para baixo a expressão de diacilglicerol transferase 2, e que a regulação para cima de diacilglicerol transferase 2 em tecido adiposo branco nestes camundongos pode proporcionar um caminho alternativo para a síntese de triglicerídeos que ainda ocorre em camundongos deficientes de Ieptina / deficientes de diacilglicerol transferase 1 (Chen et al., J. Clin. Invest., 2002, 109, 1049- .1055).
Camundongos de nocaute de diacilglicerol aciltransferase 1 a- presentam fenóticos interessantes em que eles são magros, resistentes à obesidade induzida pela dieta, têm níveis reduzidos de triglicerídeos tecidu- ais e aumentada sensibilidade a insulina e Ieptina (Chen et al., J. Clin. In- vest., 2002, 109, 1049-1055; Smith et al., Nat. Genet., 2000, 25, 87-90). Co- mo diacilglicerol transferase 2 também participa na síntese de triglicerídeos, interferir com diacilglicerol transferase 2 pode levar similarmente a reduzido teor de gordura corporal. Definições
"DGAT2" significa o produto genético ou proteína cuja expressão deve ser modulada por administração de um composto anti-sentido curto.
"Ácido nucléico DGAT2" significa qualquer ácido nucléico codifi- cando DGAT2. Por exemplo, em determinadas modalidades, um ácido nu- cléico DGAT2 inclui, sem limitação, uma seqüência de DNA codificando DGAT2, uma seqüência de RNA transcrita de DNA codificando DGAT2, e uma seqüência de RNAm codificando DGAT2. "RNAm DGAT2" significa um RNAm codificando DGAT2. Indicações Terapêuticas
Tecnologia anti-sentido é um meio eficaz para reduzir a expres- são de DGAT2 e se comprovou ser unicamente útila em uma série de apli- cações terapêuticas, diagnosticas, e de pesquisa. Deste modo, em determi- nadas modalidades, a presente invenção proporciona compostos dirigidos para ácido nucléico codificando DGAT2, os quais modulam a expressão de DGAT2. Adicionalmente são proporcionados aqui, neste requerimento de patente, compostos anti-sentido curtos capazes de inibir de modo eficaz a expressão de DGAT2.
Em algumas modalidades, um sujeito, suspeito de ter uma do- ença ou condição associada com DGAT2 é tratado administrando um ou mais compostos anti-sentido curtos dirigidos para um ácido nucléico codifi- cando DGAT2. Por exemplo, em uma modalidade não-limitante, os métodos referidos compreendem a etapa de administrar a um animal uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto anti-sentido curto. Em algumas modalidades, referidas, compostos anti-sentido curtos inibem de modo eficaz a atividade de DGAT2 ou inibem a expressão de DGAT2. Em uma modali- dade, a atividade ou expressão de DGAT2 em um sujeito é inibida por no mínimo 10%, por no mínimo 20%, por no mínimo 25%, por no mínimo 30%, por no mínimo 40%, por no mínimo 50%, por no mínimo 60%, por no mínimo 70%, por no mínimo 75%, por no mínimo 80%, por no mínimo 85%, por no mínimo 90%, por no mínimo 95%, por no mínimo 98%, por no mínimo 99%, ou por 100%. Em algumas modalidades, a atividade ou expressão de DGAT2 em um sujeito é inibida por cerca de 30%. Mais preferencialmente, a atividade ou expressão de DGAT2 em um sujeito é inibida por 50% ou mais.
A redução da expressão de DGAT2 pode ser medida, por exem- plo, no sangue, plasma, soro, tecido adiposo, fígado ou qualquer outro fluido corporal, tecido ou órgão do animal. Preferencialmente, as céluas contidas dentro dos referidos fluidos, tecidos ou órgãos sendo analisados contêm uma molécula de ácido nucléico codificando DGAT2 e/ou a própria proteína DGAT2.
Em algumas modalidades, também são proporcionadas compo- sições farmacêuticas e outras composições compreendendo os compostos da invenção. Por exemplo, compostos anti-sentido curtos dirigidos para um ácido nucléico DGAT2 podem ser utilizados em composições farmacêuticas adicionando uma quantidade eficaz de um composto a um diluente ou veícu- lo farmaceuticamente aceitável adequado.
Alguns compostos anti-sentido curtos tendo por alvo DGAT2 po- dem ter qualquer uma ou mais propriedades ou características dos compos- tos anti-sentido curtos descritos de modo geral aqui, neste requerimento de patente. Em algumas modalidades, compostos anti-sentido curtos tendo por alvo um ácido nucléico DGAT2 têm um motivo (asa - gap desóxi - asa) sele- cionado entre 1-12-1, 1-1-10-2, 2-10-1-1, 3-10-3, 2-10-3, 2-10-2, 1-10-1,1- 10-2, 3-8-3, 2-8-2, 1-8-1, 3-6-3 ou 1-6-1. Em algumas modalidades, compos- tos anti-sentido curtos tendo por alvo um ácido nucléico DGAT2 têm um mo- tivo (asa - gap dexóxi - asa) selecionado entre 1-10-1, 2-10-2 e 3-10-3.
São propocionados aqui, neste requerimento de patente, méto- dos para tratar um indivíduo administrando um ou mais composto anti- sentido curto dirigido para um ácido nucléico DGAT2 ou uma composição farmacêutica compreendendo o composto referido. São adicionalmente pro- porcionados métodos para tratar um sujeito tendo uma doença ou condições associadas com atividade de DGAT2 administrando um composto anti- sentido curto dirigido para um ácido nucléico DGAT2. Doenças e condições associadas com DGAT2 incluem, mas não estão limitadas à, distúrbios car- diovasculares, obesidade, diabetes, colesterolemia, e esteatose hepática. Alguns Compostos Anti-sentido Curtos Dirigidos para um Ácido Nucléico DGAT2
Em algumas modalidades, compostos anti-sentido curtos são dirigidos para um ácido nucléico DGAT2 tendo a seqüência do GENBANK® de Acesso No. NM_032564.2, incorporada aqui, a este requerimento de pa- tente, como SEQ ID NO: 10. Em algumas modalidades, referidas, um com- posto anti-sentido curto dirigido para SEQ ID NO: 10 é no mínimo 90% com- plementar à SEQ ID NO: 10. Em algumas modalidades, referidas, um com- posto anti-sentido curto dirigido para SEQ ID NO: 10 é no mínimo 95% com- plementar à SEQ ID NO: 10. Em algumas modalidades, referidas, um com- posto anti-sentido curto dirigido para SEQ ID NO: 10 é 100% complementar à SEQ ID NO: 10. Em algumas modalidades, um composto anti-sentido curto dirigido para SEQ ID NO: 10 inclui uma seqüência de nucleotídeos selecio- nada entre as seqüências de nucleotídeos determinadas nas Tabelas 14 e .15.
Cada seqüência de nucleotídeos determinada em cada uma das Tabelas 14 e 15 é independente de qualquer modificação para uma porção açúcar, uma ligação internucleosídeos, ou uma nucleobase. Deste modo, compostos anti-sentido curtos compreendendo uma seqüência de nucleotí- deos conforme determinado nas Tabelas 14 e 15 podem compreender, in- dependentemente, uma ou mais modificações para uma porção açúcar, uma ligação internucleosídeos, ou uma nucleobase. Compostos anti-sentido des- critos por Número Isis (lsis N9) indicam uma combinação de seqüência de nucleobases e uma ou mais modificações para uma porção açúcar, uma li- gação internucleosídeos, ou uma nucleobase.
As Tabelas 14 e 15 ilustram exemplos de compostos anti-sentido curtos dirigidos para SEQ ID NO: 10. A Tabela 14 ilustra compostos anti- sentido curtos que são 100% complementares à SEQ ID NO: 10. A Tabela .15 ilustra compostos anti-sentido curtos que têm uma ou duas combinações inadequadas com respeito à SEQ ID NO: 10. A coluna de título 'motivo de gápmero' indica o motivo asa-gap-asa de cada compostos anti-sentido cur- tos. O segmento de gap compreende 2'-desoxinucleotídeos e cada nucleotí- deo de cada segmento de asa compreende um açúcar 2'-modificado. O açú- car 2'-modificado em particular também é indicado na coluna de 'motivo de gápmero'. Por exemplo, '2-10-2 MOE' significa um motivo de gápmero 2-10- 2, onde um segmento de gap de dez 2'-desoxinucleotídeos é flanqueado por segmentos de asa de dois nucleotídeos, onde os nucleotídeos dos segmen- tos de asa são nucleotídeos 2'-MOE. Ligações internucleosídeos são fosfo- rotioato. Os compostos anti-sentido curtos compreendem 5-metilcitidina ao invés de uma citosina não modificada, a menos que "citosina não modifica- da" seja listada na coluna de motivo de gápmero, em cujo caso as citosinas indicadas são citosinas não modificadas. Por exemplo, "5-mC em gap so- mente" indica que o segmento de gap tem 5-metilcitosinas, ao passo que os segmentos de asa têm citosinas não modificadas.
Tabela 14: Compostos Anti-sentido Curtos dirigidos para SEQ ID NO: 10
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Tabela 15: Compostos anti-sentido curtos dirigidos para SEQ ID NO: 10 e tendo 1 ou 2 combinações inadequadas
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Em algumas modalidades, uma região alvo é nucleotídeos 231 -
267 de SEQ ID NO: 10. Em algumas modalidades, um composto anti-sentido curto é dirigido para nucleotídeos 231-267 de SEQ ID NO: 10. Em algumas modalidades, referidas, um composto anti-sentido curto dirigido para nucleo- tídeos 231-267 compreende uma seqüência de nucleotídeos selecionada entre SEQ ID NO 681, 682, 683, 684, 685, 686, ou 687. Em algumas moda- lidades, referidas, um composto anti-sentido curto dirigido para nucleotídeos .231-267 de SEQ ID NO: 10 é selecionado entre Isis No 372556, 372557, .382601, 372480, 372481, 372558, ou 372559.
Em algumas modalidades, uma região alvo é nucleotídeos 249- .267 de SEQ ID NO: 10. Em algumas modalidades, um composto anti-sentido curto é dirigido para nucleotídeos 249-267 de SEQ ID NO: 10. Em algumas modalidades, referidas, um composto anti-sentido curto dirigido para nucleo- tídeos 249-267 compreende uma seqüência de nucleotídeos selecionada entre SEQ ID NO 683, 684, 685, 686, ou 687. Em algumas modalidades, referidas, um composto anti-sentido curto dirigido para nucleotídeos 249-267 de SEQ ID NO: 10 é selecionado entre Isis No 382601, 372480, 372481, .372558, ou 372559.
Em algumas modalidades, uma região alvo é nucleotídeos 331- .493 de SEQ ID NO: 10. Em algumas modalidades, um composto anti-sentido curto é dirigido para nucleotídeos 331-493 de SEQ ID NO: 10. Em algumas modalidades, referidas, um composto anti-sentido curto dirigido para nucleo- tídeos 331-493 compreende uma seqüência de nucleotídeos selecionada entre SEQ ID NO 688, 689, 690, 691, 692, 693, ou 694. Em algumas moda- lidades, referidas, um composto anti-sentido curto dirigido para nucleotídeos .331-493 de SEQ ID NO: 10 é selecionado entre Isis No 382603, 382604, .372485, 372563, 382605, 372565, ou 382606.
Em algumas modalidades, uma região alvo é nucleotídeos 331- .427 de SEQ ID NO: 10. Em algumas modalidades, um composto anti-sentido curto é dirigido para nucleotídeos 331-427 de SEQ ID NO: 10. Em algumas modalidades, referidas, um composto anti-sentido curto dirigido para nucleo- tídeos 331-427 compreende uma seqüência de nucleotídeos selecionada entre SEQ ID NO 688, 689, 690, 691, 692, ou 693. Em algumas modalida- des, referidas, um composto anti-sentido curto dirigido para nucleotídeos .331-427 de SEQ ID NO: 10 é selecionado entre Isis No 382603, 382604, .372485, 372563, 382605, ou 372565.
Em algumas modalidades, uma região alvo é nucleotídeos 392- .408 de SEQ ID NO: 10. Em algumas modalidades, um composto anti-sentido curto é dirigido para nucleotídeos 392-408 de SEQ ID NO: 10. Em algumas modalidades, referidas, um composto anti-sentido curto dirigido para nucleo- tídeos 392-408 compreende uma seqüência de nucleotídeos selecionada entre SEQ ID NO 690, 691, ou 692. Em algumas modalidades, referidas, um composto anti-sentido curto dirigido para nucleotídeos 392-408 de SEQ ID NO: 10 é selecionado entre Isis No 372485, 372563, ou 382605.
Em algumas modalidades, uma região alvo é nucleotídeos 651- .707 de SEQ ID NO: 10. Em algumas modalidades, um composto anti-sentido curto é dirigido para nucleotídeos 651-707 de SEQ ID NO: 10. Em algumas modalidades, referidas, um composto anti-sentido curto dirigido para nucleo- tídeos 651-707 compreende uma seqüência de nucleotídeos selecionada entre SEQ ID NO 695, 696, 697, 698, 699, 700, 701, 702, 703, 704, 705, .706, 707, 708, 709, 710, 711, 712, 713, 714, 715, 716, 717, 718, 719, 720, .721, 722, 723, 724, 725, 726, 727, ou 728. Em algumas modalidades, referi- das, um composto anti-sentido curto dirigido para nucleotídeos 651-707 de SEQ ID NO: 10 é selecionado entre Isis No 372497, 372498, 372575, .372576, 382607, 372499, 372577, 372500, 372578, 372501, 372579, .372502, 372580, 372503, 372581, 372504, 372582, 372505, 372506, . 372583, 372584, 372507, 372585, 382608, 372508, 372586, 372509, .372587, 372510, 372588, 372511, 372512, 372589, ou 372590.
Em algumas modalidades, uma região alvo é nucleotídeos 724- .745 de SEQ ID NO: 10. Em algumas modalidades, um composto anti-sentido curto é dirigido para nucleotídeos 724-745 de SEQ ID NO: 10. Em algumas modalidades, referidas, um composto anti-sentido curto dirigido para nucleo- tídeos 724-745 compreende uma seqüência de nucleotídeos selecionada entre SEQ ID NO 729, 730, 731, 732, ou 733. Em algumas modalidades, referidas, um composto anti-sentido curto dirigido para nucleotídeos 724-745 de SEQ ID NO: 10 é selecionado entre Isis No 382609, 372514, 372592, .372515, ou 372593.
Em algumas modalidades, uma região alvo é nucleotídeos 651- .745 de SEQ ID NO: 10. Em algumas modalidades, um composto anti-sentido curto é dirigido para nucleotídeos 651-745 de SEQ ID NO: 10. Em algumas modalidades, referidas, um composto anti-sentido curto dirigido para nucleo- tídeos 651-745 compreende uma seqüência de nucleotídeos selecionada entre SEQ ID NO 695, 696, 697, 698, 699, 700, 701, 702, 703, 704, 705, 706, 707, 708, 709, 710, 711, 712, 713, 714, 715, 716, 717, 718, 719, 720, 721, 722, 723, 724, 725, 726, 727, 728, 729, 730, 731, 732, ou 733. Em al- gumas modalidades, referidas, um composto anti-sentido curto dirigido para nucleotídeos 651-745 de SEQ ID NO: 10 é selecionado entre Isis No 372497, 372498, 372575, 372576, 382607, 372499, 372577, 372500, 372578, 372501, 372579, 372502, 372580, 372503, 372581, 372504, 372582, 372505, 372506, 372583, 372584, 372507, 372585, 382608, 372508, 372586, 372509, 372587, 372510, 372588, 372511, 372512, 372589, 372590, 382609, 372514, 372592, 372515, ou 372593.
Em algumas modalidades, uma região alvo é nucleotídeos 851- 922 de SEQ ID NO: 10. Em algumas modalidades, um composto anti-sentido curto é dirigido para nucleotídeos 851-922 de SEQ ID NO: 10. Em algumas modalidades, referidas, um composto anti-sentido curto dirigido para nucleo- tídeos 851-922 compreende uma seqüência de nucleotídeos selecionada entre SEQ ID NO 734, 735, 736, ou 737. Em algumas modalidades, referi- das, um composto anti-sentido curto dirigido para nucleotídeos 851-922 de SEQ ID NO: 10 é selecionado entre Isis No 382610, 382611, 382602, ou 382612.
Em algumas modalidades, uma região alvo é nucleotídeos 851- 879 de SEQ ID NO: 10. Em algumas modalidades, um composto anti-sentido curto é dirigido para nucleotídeos 851-879 de SEQ ID NO: 10. Em algumas modalidades, referidas, um composto anti-sentido curto dirigido para nucleo- tídeos 851-879 compreende uma seqüência de nucleotídeos selecionada entre SEQ ID NO 734, 735, ou 736. Em algumas modalidades, referidas, um composto anti-sentido curto dirigido para nucleotídeos 851-879 de SEQ ID NO: 10 é selecionado entre Isis No 382610, 382611, ou 382602.
Em algumas modalidades, uma região alvo é nucleotídeos 965- 1007 de SEQ ID NO: 10. Em algumas modalidades, um composto anti- sentido curto é dirigido para nucleotídeos 965-1007 de SEQ ID NO: 10. Em algumas modalidades, referidas, um composto anti-sentido curto dirigido pa- ra nucleotídeos 965-1007 compreende uma seqüência de nucleotídeos sele- cionada entre SEQ ID NO 738, 739, 740, 741, 742, 743, 744, ou 745. Em algumas modalidades, referidas, um composto anti-sentido curto dirigido pa- ra nucleotídeos 965-1007 de SEQ ID NO: 10 é selecionado entre Isis No 372524, 372602, 382613, 382614, 372525, 372603,372526, ou 372604.
Em algumas modalidades, uma região alvo é nucleotídeos 965-979 de SEQ ID NO: 10. Em algumas modalidades, um composto anti-sentido curto é dirigido para nucleotídeos 965-979 de SEQ ID NO: 10. Em algumas modalidades, referidas, um composto anti-sentido curto dirigido para nucleo- tídeos 965-979 compreende uma seqüência de nucleotídeos selecionada entre SEQ ID NO 738, 739, ou 740. Em algumas modalidades, referidas, um composto anti-sentido curto dirigido para nucleotídeos 965-979 de SEQ ID NO: 10 é selecionado entre Isis No 372524, 372602, ou 382613.
Em algumas modalidades, uma região alvo é nucleotídeos 987-1007 de SEQ ID NO: 10. Em algumas modalidades, um composto anti-sentido curto é dirigido para nucleotídeos 987-1007 de SEQ ID NO: 10. Em algumas modalidades, referidas, um composto anti-sentido curto dirigido pa- ra nucleotídeos 987-1007 compreende uma seqüência de nucleotídeos sele- cionada entre SEQ ID NO 741, 742, 743, 744, ou 745. Em algumas modali- dades, referidas, um composto anti-sentido curto dirigido para nucleotídeos 987-1007 de SEQ ID NO: 10 é selecionado entre Isis No 382614, 372525,372603, 372526, ou 372604. Em algumas modalidades, uma região alvo é nucleotídeos 1106-1132 de SEQ ID NO: 10. Em algumas modalidades, um composto anti-sentido curto é dirigido para nucleotídeos 1106-1132 de SEQ ID NO: 10. Em algumas modalidades, referidas, um composto anti-sentido curto dirigido pa- ra nucleotídeos 1106-1132 compreende uma seqüência de nucleotídeos se- lecionada entre SEQ ID NO 746, 747, 748, 749, 750, 751, 752, 753, ou 754. Em algumas modalidades, referidas, um composto anti-sentido curto dirigido para nucleotídeos 1106-1132 de SEQ ID NO: 10 é selecionado entre Isis No .372530, 372608, 372531, 372609, 372532, 372610, 372533, 382615, ou .372611.
Em algumas modalidades, uma região alvo é nucleotídeos 1199- .1233 de SEQ ID NO: 10. Em algumas modalidades, um composto anti- sentido curto é dirigido para nucleotídeos 1199-1233 de SEQ ID NO: 10. Em algumas modalidades, referidas, um composto anti-sentido curto dirigido pa- ra nucleotídeos 1199-1233 compreende uma seqüência de nucleotídeos se- lecionada entre SEQ ID NO 755, 756, 757, 758, 759, 760, 761, 762, ou 763. Em algumas modalidades, referidas, um composto anti-sentido curto dirigido para nucleotídeos 1199-1233 de SEQ ID NO: 10 é selecionado entre Isis No .372536, 372614, 372537, 372615, 372538, 372616, 382616, 372539, ou .372617.
Em algumas modalidades, uma região alvo é nucleotídeos 1293- .1394 de SEQ ID NO: 10. Em algumas modalidades, um composto anti- sentido curto é dirigido para nucleotídeos 1293-1394 de SEQ ID NO: 10. Em algumas modalidades, referidas, um composto anti-sentido curto dirigido pa- ra nucleotídeos 1293-1394 compreende uma seqüência de nucleotídeos se- lecionada entre SEQ ID NO 764, 765, 766, 767, 768, 769, 770, 771, 772, .773, 774, 775, 776, ou 777. Em algumas modalidades, referidas, um com- posto anti-sentido curto dirigido para nucleotídeos 1293-1394 de SEQ ID NO: 10 é selecionado entre Isis No 372540, 372618, 382617, 372541, .372619, 372542, 372620, 372543, 372621, 372544, 372622, 382618, .382619, ou 382620.
Em algumas modalidades, uma região alvo é nucleotídeos 1293- .1336 de SEQ ID NO: 10. Em algumas modalidades, um composto anti- sentido curto é dirigido para nucleotídeos 1293-1336 de SEQ ID NO: 10. Em algumas modalidades, referidas, um composto anti-sentido curto dirigido pa- ra nucleotídeos 1293-1336 compreende uma seqüência de nucleotídeos se- lecionada entre SEQ ID NO 764, 765, 766, 767, 768, 769, 770, 771, 772, .773, 774, 775, ou 776. Em algumas modalidades, referidas, um composto anti-sentido curto dirigido para nucleotídeos 1293-1336 de SEQ ID NO: 10 é selecionado entre Isis No 372540, 372618, 382617, 372541, 372619, 372542, 372620, 372543, 372621, 372544, 372622, 382618, ou 382619.
Em algumas modalidades, uma região alvo é nucleotídeos 1293- 1324 de SEQ ID NO: 10. Em algumas modalidades, um composto anti- sentido curto é dirigido para nucleotídeos 1293-1324 de SEQ ID NO: 10. Em algumas modalidades, referidas, um composto anti-sentido curto dirigido pa- ra nucleotídeos 1293-1324 compreende uma seqüência de nucleotídeos se- lecionada entre SEQ ID NO 764, 765, 766, 767, 768, 769, 770, 771, 772, 773, 774, ou 775. Em algumas modalidades, referidas, um composto anti- sentido curto dirigido para nucleotídeos 1293-1324 de SEQ ID NO: 10 é se- lecionado entre Isis No 372540, 372618, 382617, 372541, 372619, 372542, 372620, 372543, 372621, 372544, 372622, ou 382618.
Em algumas modalidades, compostos anti-sentido curtos dirigi- dos para um ácido nucléico DGAT2 têm 8 a 16, preferencialmente 9 a 15, mais preferencialmente 9 a 14, mais preferencialmente 10 a 14 nucleotídeos de extensão. Em algumas modalidades, compostos anti-sentido curtos diri- gidos para um ácido nucléico DGAT2 têm 9 a 14 nucleotídeos de extensão. Em algumas modalidades, compostos anti-sentido curtos dirigidos para um ácido nucléico DGAT2 têm 10 a 14 nucleotídeos de extensão. Em algumas modalidades, os compostos anti-sentido curtos referidos são oligonucleotí- deos anti-sentido curtos.
Em algumas modalidades, compostos anti-sentido curtos dirigi- dos para um ácido nucléico DGAT2 são gápmeros curtos. Em algumas mo- dalidades, referidas, gápmeros curtos dirigidos para um ácido nucléico DGAT2 compreendem no mínimo uma modificação de alta afinidade em um ou mais asas do composto. Em algumas modalidades, compostos anti- sentido curtos dirigidos para um ácido nucléico DGAT2 compreendem 1 a 3 modificações de alta afinidade em cada asa. Em algumas modalidades, refe- ridas, os nucleosídeos ou nucleotídeos da asa compreendem uma modifica- ção 2'. Em algumas modalidades, referidas, os monômeros da asa são BNA's. Em algumas modalidades, referidas, os monômeros da asa são sele- cionados entre α-L-Metilenoóxi (4'-CH2-0-2') BNA1 β-D-Metilenoóxi (4'-CH2- Q-2') BNA, Etilenoóxi (4'-(CH2)2-0-2') BNA, Aminoóxi (4'-CH2-0-N(R)-2') BNA e Oxiamino (4'-CH2-N(R)-0-2') BNA. Em algumas modalidades, os mo- nômeros de uma asa compreendem um substituinte na posição 2' selecio- nada entre alila, amino, azido, tio, O-alila, O-Ci-Ci0alquila, -OCF3, O-(CH2)2- O-CH3, 2'-0(CH2)2SCH3, O-(CH2)2-O-N(Rm)(Rn), e 0-CH2-C(=0)-N(Rm)(Rn), ondee cada Rm e Rn é, independentemente, H ou CrCi0 alquila substituída ou não-substituída. Em algumas modalidades, os monômeros de uma asa são nucleotídeos 2'MOE.
Em algumas modalidades, compostos anti-sentido curtos dirigi- dos para um ácido nucléico DGAT2 compreendem um gap entre a asa 5' e a asa 3'. Em algumas modalidades, o gap compreende cinco, seis, sete, oito, nove, dez, onze, doze, treze, ou quatorze monômeros. Em algumas modali- dades, os monômeros do gap são desoxirribonucleotídeos não modificados. Em algumas modalidades, os monômeros do gap são ribonucleotídeos não modificados. Em algumas modalidades, gap de modificações de gap (se houver) resultam em um composto anti-sentido curto que, quando ligado a seu ácido nucléico alvo, suporta clivagem por uma RNase, incluindo, mas não limitados à, RNase H.
Em algumas modalidades, compostos anti-sentido curtos dirigi- dos para um ácido nucléico DGAT2 têm ligações monoméricas uniformes. Em algumas modalidades, referidas, estas ligações são todas ligações fosfo- rotioato. Em algumas modalidades, as ligações são todas ligações fosfodiés- ter. Em algumas modalidades, compostos anti-sentido curtos dirigidos para um ácido nucléico DGAT2 têm espinhas dorsais mistas.
Em algumas modalidades, compostos anti-sentido curtos dirigi- dos para um ácido nucléico DGAT2 têm 8 monômeros de extensão. Em al- gumas modalidades, compostos anti-sentido curtos dirigidos para um ácido nucléico DGAT2 têm 9 monômeros de extensão. Em algumas modalidades, compostos anti-sentido curtos dirigidos para um ácido nucléico DGAT2 têm .10 monômeros de extensão. Em algumas modalidades, compostos anti- sentido curtos dirigidos para um ácido nucléico DGAT2 têm 11 monômeros de extensão. Em algumas modalidades, compostos anti-sentido curtos diri- gidos para um ácido nucléico DGAT2 têm 12 monômeros de extensão. Em algumas modalidades, compostos anti-sentido curtos dirigidos para um ácido nucléico DGAT2 têm 13 monômeros de extensão. Em algumas modalidades, compostos anti-sentido curtos dirigidos para um ácido nucléico DGAT2 têm 14 monômeros de extensão. Em algumas modalidades, compostos anti- sentido curtos dirigidos para um ácido nucléico DGAT2 têm 15 monômeros de extensão. Em algumas modalidades, compostos anti-sentido curtos diri- gidos para um ácido nucléico DGAT2 têm 16 monômeros de extensão. Em algumas modalidades, compostos anti-sentido curtos dirigidos para um ácido nucléico DGAT2 compreendem 9 a 15 monômeros. Em algumas modalida- des, compostos anti-sentido curtos dirigidos para um ácido nucléico DGAT2 compreendem 10 a 15 monômeros. Em algumas modalidades, compostos anti-sentido curtos dirigidos para um ácido nucléico DGAT2 compreendem 12 a 14 monômeros. Em algumas modalidades, compostos anti-sentido cur- tos dirigidos para um ácido nucléico DGAT2 compreendem 12 a 14 nucleotí- deos ou nucleosídeos.
Em algumas modalidades, a invenção proporciona métodos para modular a expressão de DGAT2. Em algumas modalidades, os métodos re- feridos compreendem uso de um ou mais composto anti-sentido curto dirigi- do para um ácido nucléico DGAT2, em que o composto anti-sentido curto dirigido para um ácido nucléico DGAT2 tem a partir de cerca de 8 a cerca de 16, preferencialmente 9 a 15, mais preferencialmente 9 a 14, mais preferen- cialmente 10 a 14 monômeros (isto é, a partir de cerca de 8 a cerca de 16 monômeros ligados). Uma pessoa com conhecimento regular da técnica re- conhecerá que isto compreende métodos para modular a expressão de DGAT2 usando um ou mais compostos anti-sentido curtos dirigidos para um ácido nucléico DGAT2 de 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 ou 16 monômeros.
Em algumas modalidades, métodos para modular DGAT2 com- preendem uso de um composto anti-sentido curto dirigido para um ácido nu- cléico DGAT2 que tem 8 monômeros de extensão. Em algumas modalida- des, métodos para modular DGAT2 compreendem uso de um composto anti- sentido curto dirigido para um ácido nucléico DGAT2 que tem 9 monômeros de extensão. Em algumas modalidades, métodos para modular DGAT2 compreendem uso de um composto anti-sentido curto dirigido para um ácido nucléico DGAT2 que tem 10 monômeros de extensão. Em algumas modali- dades, métodos para modular DGAT2 compreendem uso de um composto anti-sentido curto dirigido para um ácido nucléico DGAT2 que tem 11 monô- meros de extensão. Em algumas modalidades, métodos para modular DGAT2 compreendem uso de um composto anti-sentido curto dirigido para um ácido nucléico DGAT2 que tem 12 monômeros de extensão. Em algu- mas modalidades, métodos para modular DGAT2 compreendem uso de um composto anti-sentido curto dirigido para um ácido nucléico DGAT2 que tem 13 monômeros de extensão. Em algumas modalidades, métodos para modu- lar DGAT2 compreendem uso de um composto anti-sentido curto dirigido para um ácido nucléico DGAT2 que tem 14 monômeros de extensão. Em algumas modalidades, métodos para modular DGAT2 compreendem uso de um composto anti-sentido curto dirigido para um ácido nucléico DGAT2 que tem 15 monômeros de extensão. Em algumas modalidades, métodos para modular DGAT2 compreendem uso de um composto anti-sentido curto diri- gido para um ácido nucléico DGAT2 que tem 16 monômeros de extensão.
Em algumas modalidades, métodos para modular a expressão de DGAT2 compreendem uso de um composto anti-sentido curto dirigido para um ácido nucléico DGAT2 compreendendo 9 a 15 monômeros. Em al- gumas modalidades, métodos para modular a expressão de DGAT2 com- preendem uso de um composto anti-sentido curto dirigido para um ácido nu- cléico DGAT2 compreendendo 10 a 15 monômeros. Em algumas modalida- des, métodos para modular a expressão de DGAT2 compreendem uso de um composto anti-sentido curto dirigido para um ácido nucléico DGAT2 compreendendo 12 a 14 monômeros. Em algumas modalidades, métodos para modular a expressão de DGAT2 compreendem uso de um composto anti-sentido curto dirigido para um ácido nucléico DGAT2 compreendendo 12 ou 14 nucleotídeos ou nucleosídeos. .9. PTP1B
PTP1B (também conhecido como proteína fosfatase 1B e PTPN1) é uma enzima associada com o retículo endoplasmático (ER) isola- da originalmente como a principal proteína tirosina fosfatase da placenta humana (Tonks et ai, J. Biol. Chem., 1988, 263, 6731-6737; Tonks et al., J. Biol. Chem., 1988, 263, 6722-6730).
Um papel regulatório essencial em sinalização mediada pelo re- ceptor de insulina foi estabelecido para PTP1B. Em alguns casos, PTP1B interage com e desfosforila o receptor de insulina ativado tanto in vitro quan- to em células intactas resultando na regulação para baixo do caminho de sinalização (Goldstein et al., Mol. Cell. Biochem., 1998, 182, 91-99; Seely et al., Diabetes, 1996, 45, 1379-1385). Além disso, PTP1B modula as ações mitogênicas da insulina (Goldstein et al., Mol. Cell. Biochem., 1998, 182, 91-99). Em células adiposas de rato superexpressando PTP1B, a translocação do transportador de glicose GLUT4 foi inibida, implicando PTP1B como um regulador negativo do transporte de glicose também (Chen et al., J. Biol. Chem., 1997, 272, 8026-8031).
Modelos de nocaute de camundongo carecendo do gene PTP1B também apontam em direção à regulação negativa de sinalização de insulina por PTP1B. Camundongos portando um gene PTP1B partido apresentaram aumentada sensibilidade à insulina e aumentada fosforilação do receptor de insulina. Quando colocados em uma dieta de alto teor de gordura, camun- dongos PTP1B -/- foram resistentes à ganho de peso e permaneceram sen- síveis a insulina (Elchebly et al., Science, 1999, 283, 1544-1548). Estes es- tudos claramente estabelecem PTP1B como um alvo terapêutico no trata- mento de diabetes e obesidade.
Diabetes e obesidade (algumas vezes atualmente referidos cole- tivamente como "diabesidade") estão interrelacionados. A maioria da obesi- dade humana está associada com resistência à insulina e resistência à Iepti- na. De fato a obesidade pode ter um impacto ainda maior sobre a ação da insulina do que a própria diabetes tem (Sindelka et al., Physiol Res., 2002,51, 85-91). Síndrome X ou síndrome metabólica é um novo termo para um conjunto de condições que, quando ocorrem juntas, podem indicar uma pre- disposição para diabetes e doença cardiovascular. Estes sintomas, incluindo alta pressão sangüínea, triglicerídeos elevados, HDL reduzido e obesidade, tendem a aparecem juntos em alguns indivíduos. Devido a seu papel tanto no diabetes quanto na obesidade, acredita-se que PTP1B seja um alvo tera- pêutico para uma série de condições metabólicas, incluindo diabetes, obesi- dade e síndrome metabólica. Melhorando o controle da glicose sangüínea, inibidores de PTP1B também podem ser úteis para retardar, prevenir, impe- dir ou melhorar as seqüelas do diabetes, as quais incluem retinopatia, neu- ropatia, complicações cardiovasculares e nefropatia.
PTP1B, o qual é regulado diferencialmente durante o ciclo celu- lar (Schievella et ai, Cell. Growth Differ., 1993, 4, 239-246), é expressado em tecidos sensíveis a insulina como duas isoíormas diferentes que surgem de junção alternada do pré-RNAm (Shifrin e Neel, J. Biol. Chem., 1993, 268, .25376-25384). A proporção dos produtos alternativamente unidos é afetada por fatores de crescimento, tais como insulina, e difere em vários tecidos examinados (Sell and Reese, Mol. Genet. Metab., 1999, 66, 189-192). Nes- tes estudos os níveis das variantes se correlacionou com a concentração de insulina plasmática e a percentagem de gordura corporal. Estas variantes podem portanto ser usadas como um biomarcador para pacientes com hipe- rinsulinemia crônica ou diabetes tipo 2. Definições
"Proteína tirosina fosfatase 1B" é o produto genético ou proteína cuja expressão deve ser modulada por administração de um composto anti- sentido curto. Proteína tirosina fosfatase 1B é geralmente referida como PTP1B mas também pode ser referida como proteína tirosina fosfatase; PTPN1; RKPTP; proteína tirosina fosfatase, não-receptor tipo 1.
"Ácido nucléico PTP1B" significa qualquer ácido nucléico codifi- cando PTP1B. Por exemplo, em determinadas modalidades, um ácido nu- cléico PTP1B inclui, sem limitação, uma seqüência de DNA codificando PTP1B, uma seqüência de RNA transcrita de DNA codificando PTP1B, e uma seqüência de RNAm codificando PTP1B. "RNAm PTP1B" significa um RNAm codificando uma proteína PTP1B. Indicações Terapêuticas
Tecnologia anti-sentido é um meio eficaz para reduzir a expres- são de PTP1B e se comprovou que é unicamente útila em uma série aplica- ções terapêuticas, diagnosticas, e de pesquisa. Deste modo, em determina- das modalidades, a presente invenção proporciona compostos dirigidos para um ácido nucléico codificando PTP1B, os quais modulam a expressão de PTP1B. Adicionalmente são proporcionados aqui, neste requerimento de patente, compostos anti-sentido curtos capazes de inibir de modo eficaz a expressão de PTP1B.
Em alguns terapêuticos, um sujeito, suspeito de ter uma doença ou distúrbio o qual pode ser tratado modulando a expressão de PTP1B é tratado administrando um ou mais compostos anti-sentido curtos dirigidos para um ácido nucléico codificando PTP1B. Por exemplo, em uma modali- dade não-limitante, os métodos compreendem a etapa de administrar a um animal uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto anti- sentido curto. Os compostos anti-sentido curtos da presente invenção inibem de modo efficaz a atividade de PTP1B ou inibem a expressão de PTP1B. Em uma modalidade, a atividade ou expressão de PTP1B em um sujeito é inibi- da por no mínimo 10%, por no mínimo 20%, por no mínimo 25%, por no mí- nimo 30%, por no mínimo 40%, por no mínimo 50%, por no mínimo 60%, por no mínimo 70%, por no mínimo 75%, por no mínimo 80%, por no mínimo .85%, por no mínimo 90%, por no mínimo 95%, por no mínimo 98%, por no mínimo 99%, ou por 100%. Em algumas modalidades, a atividade ou ex- pressão de PTP1B em um sujeito é inibida por cerca de 30%. Em algumas modalidades, a atividade ou expressão de PTP1B em um sujeito é inibida por 50% ou mais.
A redução da expressão de PTP1B pode ser medida, por exem- plo, no sangue, plasma, soro, tecido adiposo, fígado ou qualquer outro fluido corporal, tecido ou órgão do animal. Preferencialmente, as células contidas dentro dos referidos fluidos, tecidos ou órgãos sendo analisados contêm uma molécula de ácido nucléico codificando PTP1B e/ou a própria proteína PTP1B.
Alguns farmacêuticos e outras composições compreendendo os compostos da invenção também são proporcionadas. Em algumas modali- dades, compostos anti-sentido curtos dirigidos para um ácido nucléico PTP1B são utilizados em composições farmacêuticas adicionando uma quantidade eficaz de um composto a um diluente ou veículo farmaceutica- mente aceitável adequado.
Os compostos anti-sentido curtos tendo por alvo PTP1B podem ter qualquer uma ou mais propriedades ou características dos compostos anti-sentido curtos descritos de modo geral aqui, neste requerimento de pa- tente. Em algumas modalidades, compostos anti-sentido curtos tendo por alvo um ácido nucléico PTP1B têm um motivo (asa - gap desóxi - asa) sele- cionado entre 1-12-1, 1-1-10-2, 2-10-1-1, 3-10-3, 2-10-3, 2-10-2, 1-10-1,1- 10-2, 3-8-3, 2-8-2, 1-8-1, 3-6-3 ou 1-6-1, mais preferencialmente 1-10-1, 2- 10-2, 3-10-3, e 1-9-2.
Em algumas modalidades, são proporcionados aqui, neste re- querimento de patente, métodos para tratar um indivíduo administrando um ou mais composto anti-sentido curto dirigido para um ácido nucléico PTP1B ou uma composição farmacêutica compreendendo o referido composto. São adicionalmente proporcionados métodos para tratar um sujeito tendo uma doença ou condições associada com atividade de PTP1B administrando um composto anti-sentido curto dirigido para um ácido nucléico PTP1B. Doen- ças e condições associadas com PTP1B incluem, mas não estão Iimitadsa a glicose sangüínea elevada ou hiperglicemia, pré-diabetes, diabetes, diabetes Tipo 2, síndrome metabólica, obesidade e resistência à insulina. Portanto, são proporcionados aqui, neste requerimento de patente, métodos para tra- tar glicose sangüínea elevada ou hiperglicemia, pré-diabetes, diabetes, dia- betes Tipo 2, síndrome metabólica, obesidade e resistência à insulina admi- nistrando um composto anti-sentido curto dirigido para um ácido nucléico PTP1B.
Em algumas modalidades, a presente invenção proporciona composições e métodos para reduzir os níveis de glicose sangüínea em um sujeito ou para prevenir ou retardar o início de um aumento nos níveis de glicose sangüínea em um sujeito, administrando ao sujeito um inibidor anti- sentido curto da expressão de PTP1B. Em algumas modalidades, a presente invenção proporciona composições e métodos para aumentar a sensibilidade à insulina em um sujeito ou para prevenir ou retardar o início da resistência à insulina em um sujeito, administrando ao sujeito um inibidor anti-sentido curto da expressão de PTP1B.
Em algumas modalidades, a presente invenção proporciona composições e métodos para tratar uma condição metabólica em um sujeito ou para prevenir ou retardar o início de uma condição metabólica em um sujeito, administrando ao sujeito um composto anti-sentido curto dirigido pa- ra um ácido nucléico PTP1B. A condição metabólica referida pode ser qual- quer condição metabólica associada com expressão de PTP1B, incluindo mas não limitada a diabetes e obesidade. Também são proporcionados mé- todos para reduzir adiposidade. Também é proporcionado um método para tratar obesidade em que a taxa metabólica é aumentada. Em algumas modalidades, o sujeito tem diabetes Tipo 2. Em al- gumas modalidades, o sujeito apresenta níveis de HbAIc elevados. Em al- gumas modalidades, os níveis de HbAIc são no mínimo cerca de 6%, no mínimo cerca de 7%, no mínimo cerca de 8%, no mínimo cerca de 9%, no mínimo cerca de 10% ou no mínimo cerca de 11%. Em modalidade prefe- rencials, os níveis de HbA1c são reduzidos a cerca de 7% ou abaixo de cerca de 7%. Em algumas modalidades, o sujeito apresenta um índice de massa corporal elevado. Em algumas modalidades, o índice de massa corporal ele- vado é maior do que 25 kg/m2. Em algumas modalidades, o sujeito apresen- ta hiperglicemia ou níveis de glicose sangüínea elevados. Em uma modali- dade particular, os níveis de glicose sangüínea são níveis de glicose sangüí- nea em jejum. Em algumas modalidades, os níveis de glicose sangüínea em jejum elevados são no mínimo 130 mg/dl_. Em algumas modalidades, o su- jeito apresenta hiperglicemia antes do início do tratamento ou apresenta ní- veis de glicose sangüínea em jejum acima de cerca de 130 mg/dl_, níveis basais de HbAic de no mínimo cerca de 7%, ou índice de massa corporal de mais de 25 kg/m2 ou qualquer combinação dos mesmos.
Em algumas modalidades, é prorpocionado um método para re- duzir um ou mais dos níveis referidos administrando um composto anti- sentido curto dirigido para um ácido nucléico PTP1B. Por exemplo, é propor- cionado um método para reduzir os níveis da glicose em jejum, os níveis da HbAic ou, os níveis do índice massa corporal ou qualquer combinação dos mesmos em um sujeito administrando a um sujeito um composto anti-sentido curto tendo por alvo PTP1B. Glicose em jejum pode ser glicose sangüínea em jejum, glicose sérica em jejum, ou glicose plasmática em jejum. Em al- gumas modalidades, os níveis da glicose plasmática em jejum são reduzidos por no mínimo cerca de 25 mg/dl_ ou por no mínimo cerca de 10 mg/dL. Em algumas modalidades, determinadas, o sujeito referido não atinge níveis normais de glicose em um regime terapêutico de um agente de redução de glicose tal como insulina, sulfoniluréia, ou metformina.
Em algumas modalidades, a invenção proporciona métodos para alterar os níveis de lipídeos. Alguns dos métodos referidos reduzem os ní- veis de colesterol, LDL e/ou VLDL ou qualquer combinação dos mesmos em um sujeito administrando ao sujeito um composto anti-sentido curto dirigido para um ácido nucléico PTP1B. Em algumas modalidades, os níveis de HDL em um sujeito são aumentados administrando ao sujeito um composto anti- sentido curto dirigido para um ácido nucléico PTP1B. Em algumas modalida- des, a proporção LDL:HDL e/ou a proporção colesterol total:HDL em um su- jeito é reduzida administrando ao sujeito um composto anti-sentido curto di- rigido para um ácido nucléico PTP1B. Em algumas modalidades, a propor- ção HDL:LDL e/ou a proporção HDL: colesterol total em um sujeito aumen- tou administrando ao sujeito um composto anti-sentido curto dirigido para um ácido nucléico PTP1B. Em algumas modalidades, o perfila lipídico em um sujeito é aprimorado aumentando o HDL, reduzindo o LDL1 reduzindo o VL- DL, reduzindo os triglicerídeos, reduzindo os níveis da apolipoproteína B, ou reduzindo os níveis do colesterol total, ou uma combinação dos mesmos, administrando ao sujeito um composto anti-sentido curto dirigido para um ácido nucléico PTP1B . Em semelhantes modalidades, o sujeito é um ani- mal, incluindo um ser humano.
Terapia de Combinação Em algumas modalidades, uma ou mais composições farmacêu- ticas compreendendo um composto anti-sentido curto dirigido para um ácido nucléico PTP1B são co-administradas com um ou mais outros agentes far- macêuticos. Em algumas modalidades, um ou mais outros agentes farma- cêuticos referidos são designados para tratar a mesma doença ou condição que a uma ou mais composições farmacêuticas da presente invenção. Em algumas modalidades, um ou mais outros agentes farmacêuticos referidos são designados para tratar uma doença ou condição diferentes que a uma ou mais composições farmacêuticas da presente invenção. Em algumas modalidades, um ou mais outros agentes farmacêuticos referidos são desig- nados para tratar um efeito indesejado de uma ou mais composições farma- cêuticas da presente invenção. Em algumas modalidades, uma ou mais composições farmacêuticas da presente invenção são co-administradas com outro agente farmacêutico para tratar um efeito indesejado deste outro agen- te farmacêutico. Em algumas modalidades, uma ou mais composições far- macêuticas da presente invenção e um ou mais outros agentes farmacêuti- cos são administrados ao mesmo tempo. Em algumas modalidades, uma ou mais composições farmacêuticas da presente invenção e um ou mais outros agentes farmacêuticos são administrados em momentos diferentes. Em al- gumas modalidades, uma ou mais composições farmacêuticas da presente invenção e um ou mais outros agentes farmacêuticos são preparados juntos em uma única formulação. Em algumas modalidades, uma ou mais compo- sições farmacêuticas da presente invenção e um ou mais outros agentes farmacêuticos são preparados separadamente. Em algumas modalidades, agentes farmacêuticos que podem ser co-administrados com uma composição farmacêutica compreendendo um composto anti-sentido curto dirigido para um ácido nucléico PTP1B in- cluem agentes e terapias de redução de glicose. Em algumas modalidades, o agente de redução de glicose é um PPAR agonista (gama, duplo, ou pan), um inibidor da dipeptidila peptidase (IV), um análogo de GLP-1, insulina ou um análogo de insulina, um secretagogo de insulina, um SGLT2 inibidor, um análogo de amilina humana, uma biguanida, um inibidor da alfa-glucosidase, uma meglitinida, uma tiazolidinadiona, ou uma sulfoniluréia.
Em algumas modalidades, o terapêutico de redução de glicose é um análogo de GLP-1. Em algumas modalidades, o análogo de GLP-1 é e- xendin-4 ou liraglutida.
Em outras modalidades, o terapêutico de redução de glicose é uma sulfoniluréia. Em algumas modalidades, a sulfoniluréia é acetohexami- da, clorpropamida, tolbutamida, tolazamida, glimepirida, uma glipizida, uma gliburida, ou uma gliclazida.
Em algumas modalidades, o fármaco de redução de glicose é uma biguanida. In some modalidades, the biguanida é metformina, e em al- gumas modalidades, os níveis de glicose sangüínea são reduzidos sem au- mento da acidose láctica comparados com a acidose láctica observada de- pois de tratamento com metformina somente.
Em algumas modalidades, o fármaco de redução de glicose é uma meglitinida. Em algumas modalidades, a meglitinida é nateglinida ou repaglinida.
Em algumas modalidades, o fármaco de redução de glicose é uma tiazolidinadiona. Em algumas modalidades, a tiazolidinadiona é pioglita- zona, rosiglitazona, ou troglitazona. Em algumas modalidades, os níveis de glicose sangüínea são reduzidos sem maior ganho de peso do que o obser- vado com tratamento com rosiglitazona somente.
Em algumas modalidades, o fármaco de redução de glicose é um inibidor da alfa-glucosidase. Em algumas modalidades, o inibidor da alfa- glucosidase é acarbose ou miglitol.
Em uma determinada modalidade, um agente de redução de glicose co-administrado é ISIS 113715.
Em uma determinada modalidade, terapia de redução de glicose é alteração terapêutica do estilo de vida.
Em algumas modalidades, referidas, o agente de redução de 30 glicose é administrado antes da administração de uma composição farma- cêutica da presente invenção. Em algumas modalidades, referidas, o agente de redução de glicose é administrado depois da administração de uma com- posição farmacêutica da presente invenção. Em algumas modalidades, refe- ridas, o agente de redução de glicose é administrado ao mesmo tempo que uma composição farmacêutica da presente invenção. Em algumas modali- dades, referidas, a dose de um agente de redução de glicose co- administrado é a mesma que a dose que seria administrada se o agente de redução de glicose fosse administrado sozinho. Em algumas modalidades, referidas, a dose de um agente de redução de glicose co-administrado é menor do que a dose que seria administrada se o agente de redução de gli- cose fosse administrado sozinho. Em algumas modalidades, referidas, a do- se de um agente de redução de glicose co-administrado é maior do que a dose que seria administrada se o agente de redução de glicose fosse admi- nistrado sozinho.
Em algumas modalidades, agentes farmacêuticos que podem ser co-administrados com uma composição farmacêutica compreendendo um composto anti-sentido curto dirigido para um ácido nucléico PTP1B inclui agentes de redução de lipídeo. Os agentes de redução de glicose referidos são discutidos alhures no requerimento e são incluídos aqui com respeito a PTP1B. Os agentes de redução de glicose referidos podem ser administra- dos conforme descrito acima para agentes de redução de glicose. Em algumas modalidades, agentes farmacêuticos que podem ser co-administrados com uma composição farmacêutica compreendendo um composto anti-sentido curto dirigido para um ácido nucléico PTP1B in- cluem terapêuticos de agentes antiobesidade. Os terapêuticos de agentes antiobesidade referidos podem ser administrados conforme descrito acima para agentes redutores de glicose.
Adicionalmente é proporcionado um método para administrar um composto anti-sentido curto dirigido para um ácido nucléico PTP1B através de injeção e incluindo adicionalmente administrar um esteróide topico no local da injeção. Medicamentos
Também são são proporcionados aqui, neste requerimento de patente, usos de um composto anti-sentido curto o qual é dirigido para um ácido nucléico PTP1B para a preparação de um medicamento para reduzir os níveis de glicose sangüínea incluindo os níveis de glicose em jejum, e níveis de HbAic, níveis do índice massa corporal ou qualquer combinação dos mesmos. O medicamento pode ser administrado durante um período de carga e um período de manutenção. Em algumas modalidades, o medica- mento é administrado por via subcutânea ou por via intravenosa. Em outras modalidades, a administração do referido medicamento ocorre no mínimo uma vez ao dia, no mínimo uma vez por semana, ou no mínimo uma vez ao mês. Em uma modalidade particular o composto anti-sentido curto presente no medicamento é administrado em uma dose menor do que um composto anti-sentido curto com uma seqüência mais Ionta e particularmente uma se- qüência de 20 ou mais nucleobases. O medicamento pode ser administrado a um sujeito que apresenta glicose sangüínea elevada ou hiperglicemia, pré- diabetes, diabetes, diabetes Tipo 2, síndrome metabólica, obesidade e resis- tência à insulina.
Outros aspectos e vantagens de compostos anti-sentido curtos são proporcionadas aqui, neste requerimento de patente. Todos os aspectos e vantagens revelados aqui, neste requerimento de patente, e especifica- mente com respeito a outros alvos é aplicável com respeito a composições incluindo compostos anti-sentido curtos dirigidos para um ácido nucléico PTP1B e métodos de seu uso.
Alguns Compostos Anti-sentido Curtos Dirigidos para um Ácido Nucléico PTP1B
Em algumas modalidades, compostos anti-sentido curtos são dirigidos para um ácido nucléico PTP1B tendo a seqüência do GENBANK® de Acesso No. NM_002827.2, incorporada aqui, a este requerimento de pa- tente, como SEQ ID NO: 11 ou os nucleotídeos 14178000 a 1425600 da se- qüência do GENBANK® de Acesso Ne NT_011362.9, incorporada aqui, a este requerimento de patente, como SEQ ID NO: 12. Em algumas modalida- des, referidas, um composto anti-sentido curto dirigido para SEQ ID NO: 11 é no mínimo 90% complementar à SEQ ID NO: 11. Em algumas modalida- des, referidas, um composto anti-sentido curto dirigido para SEQ ID NO: 11 é no mínimo 95% complementar à SEQ ID NO: 11. Em algumas modalida- des, referidas, um composto anti-sentido curto dirigido para SEQ ID NO: 12 é 100% complementar à SEQ ID NO: 12. Em algumas modalidades, referi- das, um composto anti-sentido curto dirigido para SEQ ID NO: 12 é no míni- mo 90% complementar à SEQ ID NO: 12. Em algumas modalidades, referi- das, um composto anti-sentido curto dirigido para SEQ ID NO: 12 é no míni- mo 95% complementar à SEQ ID NO: 12. Em algumas modalidades, referi- das, um composto anti-sentido curto dirigido para SEQ ID NO: 12 é 100% complementar à SEQ ID NO: 12.
Em algumas modalidades, um composto anti-sentido curto diri- gido para SEQ ID NO: 11 compreende uma seqüência de nucleotídeos sele- cionada entre as seqüências de nucleotídeos determinadas nas Tabelas 16 e 17. Em algumas modalidades, um composto anti-sentido curto dirigido pa- ra SEQ ID NO: 12 compreende uma seqüência de nucleotídeos selecionada entre as seqüências de nucleotídeos determinadas nas Tabelas 18 e 19.
Cada seqüência de nucleotídeos determinada em cada uma Ta- belas 16, 17, 18, e 19 é independente de qualquer modificação para uma porção açúcar, uma ligação internucleosídeos, ou uma nucleobase. Deste modo, compostos anti-sentido curtos compreendendo uma seqüência de nucleotídeos conforme determinado nas Tabelas 16, 17, 18, e 19 podem compreender, independentemente, uma ou mais modificações para uma porção açúcar, uma ligação internucleosídeos, ou uma nucleobase. Com- postos anti-sentido descrito pelo número Isis (lsis N5) indicaem uma combi- nação de seqüência de nucleobases e uma ou mais modificações para uma porção açúcar, uma ligação internucleosídeos, ou uma nucleobase.
A Tabelas 16 e 17 ilustra exemplos de compostos anti-sentido curtos dirigidos para SEQ ID NO: 11. A Tabela 16 ilustra compostos anti- sentido curtos que são 100% complementares à SEQ ID NO: 11. A Tabela 17 ilustra compostos anti-sentido curtos que têm uma ou duas combinações inadequadas com respeito à SEQ ID NO: 11. A Tabela 18 ilustra compostos anti-sentido curtos que são 100% complementares à SEQ ID NO: 12. A Ta- bela 19 ilustra compostos anti-sentido curtos que têm 1 ou 2 combinações inadequadas com respeito à SEQ ID NO: 12. A coluna com título 'motivo de gápmero1 indica o motivo asa-gap-asa de cada compostos anti-sentido cur- tos. O segmento de gap compreende 2'-desoxinucleotídeos e cada nucleotí- deo de cada segmento de asa compreende um açúcar 2'-modificado. O açú- car 2'-modificado em particular também é indicado na coluna de 'motivo de gápmero'. Por exemplo, '2-10-2 MOE' significa um motivo de gápmero 2-10-2, onde um segmento de gap de dez 2'-desoxinucleotídeos é flanqueado por segmentos de asa de dois nucleotídeos, onde os nucleotídeos dos segmen- tos de asa são nucleotídeos 2'-MOE. Ligações internucleosídeos são fosfo- rotioato. Os compostos anti-sentido curtos compreendem 5-metilcitidina ao invés de citosina não modificada, a menos que "citosina não modificada" seja listada na coluna de motivo de gápmero, em cujo caso as citosinas indi- cadas são citosinas não modificadas. Por exemplo, "5-mC em gap somente" indica que o segmento de gap tem 5-metilcitosinas, ao passo que os seg- mentos de asa têm citosinas não modificadas.
Tabela 16: Compostos Anti-sentido Curtos dirigidos para SEQ ID NO: 11 <table>table see original document page 254</column></row><table> <table>table see original document page 255</column></row><table> <table>table see original document page 256</column></row><table> <table>table see original document page 257</column></row><table> <table>table see original document page 258</column></row><table> <table>table see original document page 259</column></row><table> <table>table see original document page 260</column></row><table> <table>table see original document page 261</column></row><table> <table>table see original document page 262</column></row><table> <table>table see original document page 0</column></row><table> <table>table see original document page 264</column></row><table> <table>table see original document page 265</column></row><table> <table>table see original document page 266</column></row><table> <table>table see original document page 267</column></row><table> <table>table see original document page 268</column></row><table> <table>table see original document page 269</column></row><table> <table>table see original document page 270</column></row><table> <table>table see original document page 271</column></row><table> <table>table see original document page 272</column></row><table> <table>table see original document page 273</column></row><table> <table>table see original document page 274</column></row><table> <table>table see original document page 275</column></row><table> Tabela 17: Compostos anti-sentido curtos dirigidos para SEQ ID NO: 11 e tendo 1 ou 2 combinações inadequadas
<table>table see original document page 275</column></row><table> <table>table see original document page 276</column></row><table> <table>table see original document page 277</column></row><table> <table>table see original document page 278</column></row><table> <table>table see original document page 279</column></row><table> <table>table see original document page 280</column></row><table>
Tabela 18: Compostos Anti-sentido Curtos dirigidos para SEQ ID NO: 12
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Tabela 19: Compostos anti-sentido curtos dirigidos para SEQ ID NO: 12 e tendo 1 ou 2 combinações inadequadas
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Em algumas modalidades, uma região alvo é nucleotídeos 177-
.190 de SEQ ID NO: 11. Em algumas modalidades, um composto anti-sentido curto é dirigido para nucleotídeos 177-190 de SEQ ID NO: 11. Em algumas modalidades referidas, um composto anti-sentido curto dirigido para nucleo- tídeos 177-190 compreende uma seqüência de nucleotídeos selecionada entre SEQ ID NO 886, 859, ou 853. Em algumas modalidades referidas, um composto anti-sentido curto dirigido para nucleotídeos 177-190 de SEQ ID NO: 11 é selecionado entre Isis No 147022, 147023, ou 147024.
Em algumas modalidades, uma região alvo é nucleotídeos 195- .228 de SEQ ID NO: 11. Em algumas modalidades, um composto anti-sentido curto é dirigido para nucleotídeos 195-228 de SEQ ID NO: 11. Em algumas modalidades referidas, um composto anti-sentido curto dirigido para nucleo- tídeos 195-228 compreende uma seqüência de nucleotídeos selecionada entre SEQ ID NO 877, 868, 882, 886, 859, 853, 865, 835, 843, 846, 842, 848, 874, 849, 863, 855, 850, 864, ou 834. Em algumas modalidades referi- das, um composto anti-sentido curto dirigido para nucleotídeos 195-228 de SEQ ID NO: 11 é selecionado entre Isis No 147019, 147020, 147021, 147022, 147023, 147024, 147025, 147026, 147027, 147028, 147073, 147029, 147030, 147036, 147037, 147038, 147039, 147040, OU 147041.
Em algumas modalidades, uma região alvo é nucleotídeos 323- 353 de SEQ ID NO: 11. Em algumas modalidades, um composto anti-sentido curto é dirigido para nucleotídeos 323-353 de SEQ ID NO: 11. Em algumas modalidades referidas, um composto anti-sentido curto dirigido para nucleo- tídeos 323-353 compreende uma seqüência de nucleotídeos selecionada entre SEQ ID NO 866, 881, 869, 883, 858, 833, 875, 837, 829, 871, 884, 887, 839, 830, 840, 861, ou 879. Em algumas modalidades referidas, um composto anti-sentido curto dirigido para nucleotídeos 323-353 de SEQ ID NO: 11 é selecionado entre Isis No 147042, 147043, 147044, 147045, 147046, 147047, 147051, 147052, 147053, 147054, 147055, 147056, 147057, 147058, 147059, 147060, OU 147061.
Em algumas modalidades, uma região alvo é nucleotídeos 322- 353 de SEQ ID NO: 11. Em algumas modalidades, um composto anti-sentido curto é dirigido para nucleotídeos 322-353 de SEQ ID NO: 11. Em algumas modalidades referidas, um composto anti-sentido curto dirigido para nucleo- tídeos 322-353 compreende uma seqüência de nucleotídeos selecionada entre SEQ ID NO 842, 866, 881, 869, 883, 858, 833, 875, 837, 829, 871, 884, 887, 839, 830, 840, 861, ou 879. Em algumas modalidades referidas, um composto anti-sentido curto dirigido para nucleotídeos 322-353 de SEQ ID NO: 11 é selecionado entre Isis No 147073, 147042, 147043, 147044, 147045, 147046, 147047, 147051, 147052, 147053, 147054, 147055, 147056, 147057, 147058, 147059, 147060, ou 147061.
Em algumas modalidades, uma região alvo é nucleotídeos 679- 799 de SEQ ID NO: 11. Em algumas modalidades, um composto anti-sentido curto é dirigido para nucleotídeos 679-799 de SEQ ID NO: 11. Em algumas modalidades referidas, um composto anti-sentido curto dirigido para núcleo- tídeos 679-799 compreende uma seqüência de nucleotídeos selecionada entre SEQ ID NO 883, 858, 883, ou 858. Em algumas modalidades referidas, um composto anti-sentido curto dirigido para nucleotídeos 679-799 de SEQ ID NO: 11 é selecionado entre Isis No 147045, 147046, 147045, ou 147046.
Em algumas modalidades, uma região alvo é nucleotídeos 679- .827 de SEQ ID NO: 11. Em algumas modalidades, um composto anti-sentido curto é dirigido para nucleotídeos 679-827 de SEQ ID NO: 11. Em algumas modalidades referidas, um composto anti-sentido curto dirigido para nucleo- tídeos 679-827 compreende uma seqüência de nucleotídeos selecionada entre SEQ ID NO 883, 858, 883, 858, ou 851. Em algumas modalidades re- feridas, um composto anti-sentido curto dirigido para nucleotídeos 679-827 de SEQ ID NO: 11 é selecionado entre Isis No 147045, 147046, 147045, .147046, ou 147066.
Em algumas modalidades, uma região alvo é nucleotídeos 1024- .1046 de SEQ ID NO: 11. Em algumas modalidades, um composto anti- sentido curto é dirigido para nucleotídeos 1024-1046 de SEQ ID NO: 11. Em algumas modalidades referidas, um composto anti-sentido curto dirigido para nucleotídeos 1024-1046 compreende uma seqüência de nucleotídeos sele- cionada entre SEQ ID NO 841, 862, 880, 857, 851, 876, 838, 860, 878, 856, .832, ou 842. Em algumas modalidades referidas, um composto anti-sentido curto dirigido para nucleotídeos 1024-1046 de SEQ ID NO: 11 é selecionado entre Isis No 147062, 147063, 147064, 147065, 147066, 147067, 147068, .147069, 147070, 147071, 147072, OU 147073.
Em algumas modalidades, uma região alvo é nucleotídeos 992- .1046 de SEQ ID NO: 11. Em algumas modalidades, um composto anti- sentido curto é dirigido para nucleotídeos 992-1046 de SEQ ID NO: 11. Em algumas modalidades referidas, um composto anti-sentido curto dirigido para nucleotídeos 992-1046 compreende uma seqüência de nucleotídeos sele- cionada entre SEQ ID NO 831, 841, 862, 880, 857, 851, 876, 838, 860, 878, .856, 832, ou 842. Em algumas modalidades referidas, um composto anti- sentido curto dirigido para nucleotídeos 992-1046 de SEQ ID NO: 11 é sele- cionado entre Isis No 404131, 147062, 147063, 147064, 147065, 147066, .147067, 147068, 147069, 147070, 147071, 147072, ou 147073.
Em algumas modalidades, uma região alvo é nucleotídeos 1868-1881 de SEQ ID NO: 11. Em algumas modalidades, um composto anti- sentido curto é dirigido para nucleotídeos 1868-1881 de SEQ ID NO: 11. Em algumas modalidades referidas, um composto anti-sentido curto dirigido para nucleotídeos 1868-1881 compreende uma seqüência de nucleotídeos sele- cionada entre SEQ ID NO 886, 859, ou 853. Em algumas modalidades refe- ridas, um composto anti-sentido curto dirigido para nucleotídeos 1868-1881 de SEQ ID NO: 11 é selecionado entre Isis No 147022, 147023, ou 147024. Em algumas modalidades, uma região alvo é nucleotídeos 1886-1919 de SEQ ID NO: 11. Em algumas modalidades, um composto anti-sentido curto é dirigido para nucleotídeos 1886-1919 de SEQ ID NO: 11. Em algumas modalidades referidas, um composto anti-sentido curto dirigido para nucleotídeos 1886-1919 compreende uma seqüência de nucleotídeos sele- cionada entre SEQ ID NO 877, 868, 882, 886, 859, 865, 843, 846, 874, 863,855, 864, ou 834. Em algumas modalidades referidas, um composto anti- sentido curto dirigido para nucleotídeos 1886-1919 de SEQ ID NO: 11 é se- lecionado entre Isis No 147019, 147020, 147021, 147022, 147023, 147025,147027, 147028, 147030, 147037, 147038, 147040, ou 147041.
Em algumas modalidades, uma região alvo é nucleotídeos 1869-1919 de SEQ ID NO: 11. Em algumas modalidades, um composto anti- sentido curto é dirigido para nucleotídeos 1869-1919 de SEQ ID NO: 11. Em algumas modalidades referidas, um composto anti-sentido curto dirigido para nucleotídeos 1869-1919 compreende uma seqüência de nucleotídeos sele- cionada entre SEQ ID NO 859, 853, 877, 868, 882, 886, 859, 865, 843, 846,874, 863, 855, 864, ou 834. Em algumas modalidades referidas, um compos- to anti-sentido curto dirigido para nucleotídeos 1869-1919 de SEQ ID NO: 11 é selecionado entre Isis No 147023, 147024, 147019, 147020, 147021,147022, 147023, 147025, 147027,147028,147030,147037,147038,147040, ou 147041.
Em algumas modalidades, uma região alvo é nucleotídeos 1976-1989 de SEQ ID NO: 11. Em algumas modalidades, um composto anti- sentido curto é dirigido para nucleotídeos 1976-1989 de SEQ ID NO: 11. Em algumas modalidades referidas, um composto anti-sentido curto dirigido para nucleotídeos 1976-1989 compreende uma seqüência de nucleotídeos sele- cionada entre SEQ ID NO 886, 859, ou 853. Em algumas modalidades refe- ridas, um composto anti-sentido curto dirigido para nucleotídeos 1976-1989 de SEQ ID NO: 11 é selecionado entre Isis No 147022, 147023, ou 147024.
Em algumas modalidades, uma região alvo é nucleotídeos 1995- 2027 de SEQ ID NO: 11. Em algumas modalidades, um composto anti- sentido curto é dirigido para nucleotídeos 1995-2027 de SEQ ID NO: 11. Em algumas modalidades referidas, um composto anti-sentido curto dirigido para nucleotídeos 1995-2027 compreende uma seqüência de nucleotídeos sele- cionada entre SEQ ID NO 868, 882, 886, 859, 853, 865, 835, 843, 846, 848, 874, 849, 863, 855, 850, 864, ou 834. Em algumas modalidades referidas, um composto anti-sentido curto dirigido para nucleotídeos 1995-2027 de SEQ ID NO: 11 é selecionado entre Isis No 147020, 147021, 147022, 147023, 147024, 147025, 147026, 147027, 147028, 147029, 147030, 147036, 147037, 147038, 147039, 147040, OU 147041.
Em algumas modalidades, uma região alvo é nucleotídeos 2366- 2382 de SEQ ID NO: 11. Em algumas modalidades, um composto anti- sentido curto é dirigido para nucleotídeos 2366-2382 de SEQ ID NO: 11. Em algumas modalidades referidas, um composto anti-sentido curto dirigido para nucleotídeos 2366-2382 compreende uma seqüência de nucleotídeos sele- cionada entre SEQ ID NO 867 ou 873. Em algumas modalidades referidas, um composto anti-sentido curto dirigido para nucleotídeos 2366-2382 de SEQ ID NO: 11 é selecionado entre Isis No 404199 ou 404134.
Em algumas modalidades, uma região alvo é nucleotídeos 6220- 6233 de SEQ ID NO: 11. Em algumas modalidades, um composto anti- sentido curto é dirigido para nucleotídeos 6220-6233 de SEQ ID NO: 11. Em algumas modalidades referidas, um composto anti-sentido curto dirigido para nucleotídeos 6220-6233 compreende uma seqüência de nucleotídeos sele- cionada entre SEQ ID NO 870, 836, ou 844. Em algumas modalidades refe- ridas, um composto anti-sentido curto dirigido para nucleotídeos 6220-6233 de SEQ ID NO: 11 é selecionado entre Isis No 147032, 147033, ou 147034.
Em algumas modalidades, uma região alvo é nucleotídeos 6288- 6300 de SEQ ID NO: 11. Em algumas modalidades, um composto anti- sentido curto é dirigido para nucleotídeos 6288-6300 de SEQ ID NO: 11. Em algumas modalidades referidas, um composto anti-sentido curto dirigido para nucleotídeos 6288-6300 compreende uma seqüência de nucleotídeos sele- cionada entre SEQ ID NO 869 ou 883. Em algumas modalidades referidas, um composto anti-sentido curto dirigido para nucleotídeos 6288-6300 de SEQ ID NO: 11 é selecionado entre Isis No 147044 ou 147045.
Em algumas modalidades, uma região alvo é nucleotídeos 6329- 6342 de SEQ ID NO: 11. Em algumas modalidades, um composto anti- sentido curto é dirigido para nucleotídeos 6329-6342 de SEQ ID NO: 11. Em algumas modalidades referidas, um composto anti-sentido curto dirigido para nucleotídeos 6329-6342 compreende uma seqüência de nucleotídeos sele- cionada entre SEQ ID NO 870, 836, ou 844. Em algumas modalidades refe- ridas, um composto anti-sentido curto dirigido para nucleotídeos 6329-6342 de SEQ ID NO: 11 é selecionado entre Isis No 147032, 147033, ou 147034.
Em algumas modalidades, uma região alvo é nucleotídeos 6397- 6409 de SEQ ID NO: 11. Em algumas modalidades, um composto anti- sentido curto é dirigido para nucleotídeos 6397-6409 de SEQ ID NO: 11. Em algumas modalidades referidas, um composto anti-sentido curto dirigido para nucleotídeos 6397-6409 compreende uma seqüência de nucleotídeos sele- cionada entre SEQ ID NO 869 ou 883. Em algumas modalidades referidas, um composto anti-sentido curto dirigido para nucleotídeos 6397-6409 de SEQ ID NO: 11 é selecionado entre Isis No 147044 ou 147045.
Em algumas modalidades, uma região alvo é nucleotídeos 7057- 7178 de SEQ ID NO: 11. Em algumas modalidades, um composto anti- sentido curto é dirigido para nucleotídeos 7057-7178 de SEQ ID NO: 11. Em algumas modalidades referidas, um composto anti-sentido curto dirigido para 7057-7178 compreende uma seqüência de nucleotídeos selecionada entre SEQ ID NO 830, 840, 861, 830, ou 840. Em algumas modalidades referidas, um composto anti-sentido curto dirigido para nucleotídeos 7057-7178 de SEQ ID NO: 11 é selecionado entre Isis No 147058, 147059, 147060,147058, ou 147059.
Em algumas modalidades, uma região alvo é nucleotídeos 8630-8750 de SEQ ID NO: 11. Em algumas modalidades, um composto anti-sentido curto é dirigido para nucleotídeos 8630-8750 de SEQ ID NO: 11. Em algumas modalidades referidas, um composto anti-sentido curto dirigido para .8630-8750 compreende uma seqüência de nucleotídeos selecionada entre SEQ ID NO 843, 846, 843, ou 846. Em algumas modalidades referidas, um composto anti-sentido curto dirigido para nucleotídeos 8630-8750 de SEQ ID NO: 11 é selecionado entre Isis No 147027, 147028, 147027, ou 147028.
Em algumas modalidades, uma região alvo é nucleotídeos .10957-11077 de SEQ ID NO: 11. Em algumas modalidades, um composto anti-sentido curto é dirigido para nucleotídeos 10957-11077 de SEQ ID NO: .11. Em algumas modalidades referidas, um composto anti-sentido curto diri- gido para 10957-11077 compreende uma seqüência de nucleotídeos sele- cionada entre SEQ ID NO 881, 869, 881, ou 869. Em algumas modalidades referidas, um composto anti-sentido curto dirigido para nucleotídeos 10957-11077 de SEQ ID NO: 11 é selecionado entre Isis No 147043, 147044,147043, ou 147044.
Em algumas modalidades, uma região alvo é nucleotídeos .11605-11623 de SEQ ID NO: 11. Em algumas modalidades, um composto anti-sentido curto é dirigido para nucleotídeos 11605-11623 de SEQ ID NO: 11. Em algumas modalidades referidas, um composto anti-sentido curto diri- gido para 11605-11623 compreende uma seqüência de nucleotídeos sele- cionada entre SEQ ID NO 856, 878, ou 856. Em algumas modalidades refe- ridas, um composto anti-sentido curto dirigido para nucleotídeos 11605-11623 de SEQ ID NO: 11 é selecionado entre Isis No147071, 147070, ou .147071.
Em algumas modalidades, uma região alvo é nucleotídeos .12805-12817 de SEQ ID NO: 11. Em algumas modalidades, um composto anti-sentido curto é dirigido para nucleotídeos 12805-12817 de SEQ ID NO: .11. Em algumas modalidades referidas, um composto anti-sentido curto diri- gido para 12805-12817 compreende uma seqüência de nucleotídeos sele- cionada entre SEQ ID NO 874 ou 885. Em algumas modalidades referidas, um composto anti-sentido curto dirigido para nucleotídeos 12805-12817 de SEQ ID NO: 11 é selecionado entre Isis No 147030 ou 147031.
Em algumas modalidades, uma região alvo é nucleotídeos 12986-12998 de SEQ ID NO: 11. Em algumas modalidades, um composto anti-sentido curto é dirigido para nucleotídeos 12986-12998 de SEQ ID NO: 11. Em algumas modalidades referidas, um composto anti-sentido curto diri- gido para 12986-12998 compreende uma seqüência de nucleotídeos sele- cionada entre SEQ ID NO 874 ou 885. Em algumas modalidades referidas, um composto anti-sentido curto dirigido para nucleotídeos 12986-12998 de SEQ ID NO: 11 é selecionado entre Isis No 147030 ou 147031.
Em algumas modalidades, uma região alvo é nucleotídeos 15560-15572 de SEQ ID NO: 11. Em algumas modalidades, um composto anti-sentido curto é dirigido para nucleotídeos 15560-15572 de SEQ ID NO: 11. Em algumas modalidades referidas, um composto anti-sentido curto diri- gido para 15560-15572 compreende uma seqüência de nucleotídeos sele- cionada entre SEQ ID NO 876 ou 838. Em algumas modalidades referidas, um composto anti-sentido curto dirigido para nucleotídeos 15560-15572 de SEQ ID NO: 11 é selecionado entre Isis No 147067 ou 147068.
Em algumas modalidades, uma região alvo é nucleotídeos 17787-17941 de SEQ ID NO: 11. Em algumas modalidades, um composto anti-sentido curto é dirigido para nucleotídeos 17787-17941 de SEQ ID NO: 11. Em algumas modalidades referidas, um composto anti-sentido curto diri- gido para 17787-17941 compreende uma seqüência de nucleotídeos sele- cionada entre SEQ ID NO 874 ou 880. Em algumas modalidades referidas, um composto anti-sentido curto dirigido para nucleotídeos 17787-17941 de SEQ ID NO: 11 é selecionado entre Isis No 147030 ou 147064.
Em algumas modalidades, uma região alvo é nucleotídeos 21190-21202 de SEQ ID NO: 11. Em algumas modalidades, um composto anti-sentido curto é dirigido para nucleotídeos 21190-21202 de SEQ ID NO: 11. Em algumas modalidades referidas, um composto anti-sentido curto diri- gido para 21190-21202 compreende uma seqüência de nucleotídeos sele- cionada entre SEQ ID NO 843 ou 846. Em algumas modalidades referidas, um composto anti-sentido curto dirigido para nucleotídeos 21190-21202 de SEQ ID NO: 11 é selecionado entre Isis No 147027 ou 147028.
Em algumas modalidades, uma região alvo é nucleotídeos .21358-21370 de SEQ ID NO: 11. Em algumas modalidades, um composto anti-sentido curto é dirigido para nucleotídeos 21358-21370 de SEQ ID NO: .11. Em algumas modalidades referidas, um composto anti-sentido curto diri- gido para 21358-21370 compreende uma seqüência de nucleotídeos sele- cionada entre SEQ ID NO 843 ou 846. Em algumas modalidades referidas, um composto anti-sentido curto dirigido para nucleotídeos 21358-21370 de SEQ ID NO: 11 é selecionado entre Isis No 017027 ou 147028.
Em algumas modalidades, uma região alvo é nucleotídeos .24318-24332 de SEQ ID NO: 11. Em algumas modalidades, um composto anti-sentido curto é dirigido para nucleotídeos 24318-24332 de SEQ ID NO: .11. Em algumas modalidades referidas, um composto anti-sentido curto diri- gido para 24318-24332 compreende uma seqüência de nucleotídeos sele- cionada entre SEQ ID NO 881, 869, 883, ou 858. Em algumas modalidades referidas, um composto anti-sentido curto dirigido para nucleotídeos 24318- .24332 de SEQ ID NO: 11 é selecionado entre Isis No 147043, 147044, .147045, ou 147046.
Em algumas modalidades, uma região alvo é nucleotídeos .24486-24501 de SEQ ID NO: 11. Em algumas modalidades, um composto anti-sentido curto é dirigido para nucleotídeos 24486-24501 de SEQ ID NO: .11. Em algumas modalidades referidas, um composto anti-sentido curto diri- gido para 24486-24501 compreende uma seqüência de nucleotídeos sele- cionada entre SEQ ID NO 881, 869, 858, ou 833. Em algumas modalidades referidas, um composto anti-sentido curto dirigido para nucleotídeos 24486- .24501 de SEQ ID NO: 11 é selecionado entre Isis No 147043, 147044, .147046, ou 147047.
Em algumas modalidades, uma região alvo é nucleotídeos .25065-25077 de SEQ ID NO: 11. Em algumas modalidades, um composto anti-sentido curto é dirigido para nucleotídeos 25065-25077 de SEQ ID NO: 11. Em algumas modalidades referidas, um composto anti-sentido curto diri- gido para 25065-25077 compreende uma seqüência de nucleotídeos sele- cionada entre SEQ ID NO 864 ou 834. Em algumas modalidades referidas, um composto anti-sentido curto dirigido para nucleotídeos 25065-25077 de SEQ ID NO: 11 é selecionado entre Isis No 147040 ou 147041.
Em algumas modalidades, uma região alvo é nucleotídeos 25232-25245 de SEQ ID NO: 11. Em algumas modalidades, um composto anti-sentido curto é dirigido para nucleotídeos 25232-25245 de SEQ ID NO: 11. Em algumas modalidades referidas, um composto anti-sentido curto diri- gido para 25232-25245 compreende uma seqüência de nucleotídeos sele- cionada entre SEQ ID NO 850, 864, ou 834. Em algumas modalidades refe- ridas, um composto anti-sentido curto dirigido para nucleotídeos 25232- 25245 de SEQ ID NO: 11 é selecionado entre Isis No 147039, 147040, ou 147041.
Em algumas modalidades, uma região alvo é nucleotídeos 25508-25523 de SEQ ID NO: 11. Em algumas modalidades, um composto anti-sentido curto é dirigido para nucleotídeos 25508-25523 de SEQ ID NO: 11. Em algumas modalidades referidas, um composto anti-sentido curto diri- gido para 25508-25523 compreende uma seqüência de nucleotídeos sele- cionada entre SEQ ID NO 839 ou 879. Em algumas modalidades referidas, um composto anti-sentido curto dirigido para nucleotídeos 25508-25523 de SEQ ID NO: 11 é selecionado entre Isis No 147057 ou 147061.
Em algumas modalidades, uma região alvo é nucleotídeos 25676-28890 de SEQ ID NO: 11. Em algumas modalidades, um composto anti-sentido curto é dirigido para nucleotídeos 25676-28890 de SEQ ID NO: 11. Em algumas modalidades referidas, um composto anti-sentido curto diri- gido para 25676-28890 compreende uma seqüência de nucleotídeos sele- cionada entre SEQ ID NO 839, 860, ou 878. Em algumas modalidades refe- ridas, um composto anti-sentido curto dirigido para nucleotídeos 25676- 28890 de SEQ ID NO: 11 é selecionado entre Isis No 147057, 147069, ou 147070. Em algumas modalidades, uma região alvo é nucleotídeos 33056-33069 de SEQ ID NO: 11. Em algumas modalidades, um composto anti-sentido curto é dirigido para nucleotídeos 33056-33069 de SEQ ID NO: 11. Em algumas modalidades referidas, um composto anti-sentido curto diri- gido para 33056-33069 compreende uma seqüência de nucleotídeos sele- cionada entre SEQ ID NO 860, 878, ou 856. Em algumas modalidades refe- ridas, um composto anti-sentido curto dirigido para nucleotídeos 33056- 33069 de SEQ ID NO: 11 é selecionado entre Isis No 147069, 147070, ou 147071.
Em algumas modalidades, uma região alvo é nucleotídeos 33205-33217 de SEQ ID NO: 11. Em algumas modalidades, um composto anti-sentido curto é dirigido para nucleotídeos 33205-33217 de SEQ ID NO: 11. Em algumas modalidades referidas, um composto anti-sentido curto diri- gido para 33205-33217 compreende uma seqüência de nucleotídeos sele- cionada entre SEQ ID NO 878 ou 856. Em algumas modalidades referidas, um composto anti-sentido curto dirigido para nucleotídeos 33205-33217 de SEQ ID NO: 11 é selecionado entre Isis No 14707 ou 147071.
Em algumas modalidades, uma região alvo é nucleotídeos 33318-33334 de SEQ ID NO: 11. Em algumas modalidades, um composto anti-sentido curto é dirigido para nucleotídeos 33318-33334 de SEQ ID NO: 11. Em algumas modalidades referidas, um composto anti-sentido curto diri- gido para 33318-33334 compreende uma seqüência de nucleotídeos sele- cionada entre SEQ ID NO 858, 854, ou 875. Em algumas modalidades refe- ridas, um composto anti-sentido curto dirigido para nucleotídeos 33318- 33334 de SEQ ID NO: 11 é selecionado entre Isis No 147046, 147049, ou 147051.
Em algumas modalidades, uma região alvo é nucleotídeos 33466-33482 de SEQ ID NO: 11. Em algumas modalidades, um composto anti-sentido curto é dirigido para nucleotídeos 33466-33482 de SEQ ID NO: 11. Em algumas modalidades referidas, um composto anti-sentido curto diri- gido para 33466-33482 compreende uma seqüência de nucleotídeos sele- cionada entre SEQ ID NO 858, 833, ou 875. Em algumas modalidades refe- ridas, um composto anti-sentido curto dirigido para nucleotídeos 33466- .33482 de SEQ ID NO: 11 é selecionado entre Isis No 147046, 147047, ou .147051.
Em algumas modalidades, uma região alvo é nucleotídeos .33640-33656 de SEQ ID NO: 11. Em algumas modalidades, um composto anti-sentido curto é dirigido para nucleotídeos 33640-33656 de SEQ ID NO: .11. Em algumas modalidades referidas, um composto anti-sentido curto diri- gido para 33640-33656 compreende uma seqüência de nucleotídeos sele- cionada entre SEQ ID NO 858 ou 875. Em algumas modalidades referidas, um composto anti-sentido curto dirigido para nucleotídeos 33640-33656 de SEQ ID NO: 11 é selecionado entre Isis No 147046 ou 147051.
Em algumas modalidades, uma região alvo é nucleotídeos .33788-33804 de SEQ ID NO: 11. Em algumas modalidades, um composto anti-sentido curto é dirigido para nucleotídeos 33788-33804 de SEQ ID NO: .11. Em algumas modalidades referidas, um composto anti-sentido curto diri- gido para 33788-33804 compreende uma seqüência de nucleotídeos sele- cionada entre SEQ ID NO 858 ou 875. Em algumas modalidades referidas, um composto anti-sentido curto dirigido para nucleotídeos 33788-33804 de SEQ ID NO: 11 é selecionado entre Isis No 147046 ou 147051.
Em algumas modalidades, uma região alvo é nucleotídeos .35437-35449 de SEQ ID NO: 11. Em algumas modalidades, um composto anti-sentido curto é dirigido para nucleotídeos 35437-35449 de SEQ ID NO: .11. Em algumas modalidades referidas, um composto anti-sentido curto diri- gido para 35437-35449 compreende uma seqüência de nucleotídeos sele- cionada entre SEQ ID NO 840 ou 861. Em algumas modalidades referidas, um composto anti-sentido curto dirigido para nucleotídeos 35437-35449 de SEQ ID NO: 11 é selecionado entre Isis No 147059 ou 147060.
Em algumas modalidades, uma região alvo é nucleotídeos .40353-40373 de SEQ ID NO: 11. Em algumas modalidades, um composto anti-sentido curto é dirigido para nucleotídeos 40353-40373 de SEQ ID NO: .11. Em algumas modalidades referidas, um composto anti-sentido curto diri- gido para 40353-40373 compreende uma seqüência de nucleotídeos sele- cionada entre SEQ ID NO 879 ou 881. Em algumas modalidades referidas, um composto anti-sentido curto dirigido para nucleotídeos 40353-40373 de SEQ ID NO: 11 é selecionado entre Isis No 147061 ou 147043.
Em algumas modalidades, uma região alvo é nucleotídeos .42527-42541 de SEQ ID NO: 11. Em algumas modalidades, um composto anti-sentido curto é dirigido para nucleotídeos 42527-42541 de SEQ ID NO: .11. Em algumas modalidades referidas, um composto anti-sentido curto diri- gido para 42527-42541 compreende uma seqüência de nucleotídeos sele- ridas, um composto anti-sentido curto dirigido para nucleotídeos 42527- .42541 de SEQ ID NO: 11 é selecionado entre Isis No 147031, 147032, ou .147034.
Em algumas modalidades, uma região alvo é nucleotídeos .42675-42689 de SEQ ID NO: 11. Em algumas modalidades, um composto anti-sentido curto é dirigido para nucleotídeos 42675-42689 de SEQ ID NO: .11. Em algumas modalidades referidas, um composto anti-sentido curto diri- gido para 42675-42689 compreende uma seqüência de nucleotídeos sele- cionada entre SEQ ID NO 885, 870, 836, ou 844. Em algumas modalidades referidas, um composto anti-sentido curto dirigido para nucleotídeos 42675- . 42689 de SEQ ID NO: 11 é selecionado entre Isis No 147031, 147032, .147033, ou 147034.
Em algumas modalidades, uma região alvo é nucleotídeos .46313-46328 de SEQ ID NO: 11. Em algumas modalidades, um composto anti-sentido curto é dirigido para nucleotídeos 46313-46328 de SEQ ID NO: . 11. Em algumas modalidades referidas, um composto anti-sentido curto diri- gido para 46313-46328 compreende uma seqüência de nucleotídeos sele- cionada entre SEQ ID NO 839, 830, 840, ou 879. Em algumas modalidades referidas, um composto anti-sentido curto dirigido para nucleotídeos 46313- .46328 de SEQ ID NO: 11 é selecionado entre Isis No 147057, 147058, . 147059, ou 147061.
Em algumas modalidades, uma região alvo é nucleotídeos .46461-46476 de SEQ ID NO: 11. Em algumas modalidades, um composto anti-sentido curto é dirigido para nucleotídeos 46461-46476 de SEQ ID NO: .11. Em algumas modalidades referidas, um composto anti-sentido curto diri- gido para 46461-46476 compreende uma seqüência de nucleotídeos sele- cionada entre SEQ ID NO 839, 840, ou 879. Em algumas modalidades refe- ridas, um composto anti-sentido curto dirigido para nucleotídeos 46461- .46476 de SEQ ID NO: 11 é selecionado entre Isis No 147057, 147059, ou .147061.
Em algumas modalidades, uma região alvo é nucleotídeos .48369-48381 de SEQ ID NO: 11. Em algumas modalidades, um composto anti-sentido curto é dirigido para nucleotídeos 48369-48381 de SEQ ID NO: .11. Em algumas modalidades referidas, um composto anti-sentido curto diri- gido para 48369-48381 compreende uma seqüência de nucleotídeos sele- cionada entre SEQ ID NO 842 ou 845. Em algumas modalidades referidas, um composto anti-sentido curto dirigido para nucleotídeos 48369-48381 de SEQ ID NO: 11 é selecionado entre Isis No 147073 ou 147074.
Em algumas modalidades, uma região alvo é nucleotídeos .48714-48726 de SEQ ID NO: 11. Em algumas modalidades, um composto anti-sentido curto é dirigido para nucleotídeos 48714-48726 de SEQ ID NO: .11. Em algumas modalidades referidas, um composto anti-sentido curto diri- gido para 48714-48726 compreende uma seqüência de nucleotídeos sele- cionada entre SEQ ID NO 843 ou 846. Em algumas modalidades referidas, um composto anti-sentido curto dirigido para nucleotídeos 48714-48726 de SEQ ID NO: 11 é selecionado entre Isis No 147027 ou 147028.
Em algumas modalidades, uma região alvo é nucleotídeos .49050-49062 de SEQ ID NO: 11. Em algumas modalidades, um composto anti-sentido curto é dirigido para nucleotídeos 49050-49062 de SEQ ID NO: .11. Em algumas modalidades referidas, um composto anti-sentido curto diri- gido para 49050-49062 compreende uma seqüência de nucleotídeos sele- cionada entre SEQ ID NO 876 ou 838. Em algumas modalidades referidas, um composto anti-sentido curto dirigido para nucleotídeos 49050-49062 de SEQ ID NO: 11 é selecionado entre Isis No 147067 ou 147068.
Em algumas modalidades, uma região alvo é nucleotídeos 49672-49684 de SEQ ID NO: 11. Em algumas modalidades, um composto anti-sentido curto é dirigido para nucleotídeos 49672-49684 de SEQ ID NO: 11. Em algumas modalidades referidas, um composto anti-sentido curto diri- gido para 49672-49684 compreende uma seqüência de nucleotídeos sele- cionada entre SEQ ID NO 842 ou 845. Em algumas modalidades referidas, um composto anti-sentido curto dirigido para nucleotídeos 49672-49684 de SEQ ID NO: 11 é selecionado entre Isis No 147073 ou 147074.
Em algumas modalidades, uma região alvo é nucleotídeos 52292-52304 de SEQ ID NO: 11. Em algumas modalidades, um composto anti-sentido curto é dirigido para nucleotídeos 52292-52304 de SEQ ID NO: 11. Em algumas modalidades referidas, um composto anti-sentido curto diri- gido para 52292-52304 compreende uma seqüência de nucleotídeos sele- cionada entre SEQ ID NO 849 ou 863. Em algumas modalidades referidas, um composto anti-sentido curto dirigido para nucleotídeos 52292-52304 de SEQ ID NO: 11 é selecionado entre Isis No 147036 ou 147037.
Em algumas modalidades, uma região alvo é nucleotídeos 52438-52450 de SEQ ID NO: 11. Em algumas modalidades, um composto anti-sentido curto é dirigido para nucleotídeos 52438-52450 de SEQ ID NO: 11. Em algumas modalidades referidas, um composto anti-sentido curto diri- gido para 52438-52450 compreende uma seqüência de nucleotídeos sele- cionada entre SEQ ID NO 849 ou 863. Em algumas modalidades referidas, um composto anti-sentido curto dirigido para nucleotídeos 52438-52450 de SEQ ID NO: 11 é selecionado entre Isis No 147036 ou 147037.
Em algumas modalidades, uma região alvo é nucleotídeos 53445-53458 de SEQ ID NO: 11. Em algumas modalidades, um composto anti-sentido curto é dirigido para nucleotídeos 53445-53458 de SEQ ID NO: 11. Em algumas modalidades referidas, um composto anti-sentido curto diri- gido para 53445-53458 compreende uma seqüência de nucleotídeos sele- cionada entre SEQ ID NO 866, 881, ou 869. Em algumas modalidades refe- ridas, um composto anti-sentido curto dirigido para nucleotídeos 53445- 53458 de SEQ ID NO: 11 é selecionado entre Isis No 147042, 147043, ou 147044. Em algumas modalidades, uma região alvo é nucleotídeos .53591-53604 de SEQ ID NO: 11. Em algumas modalidades, um composto anti-sentido curto é dirigido para nucleotídeos 53591-53604 de SEQ ID NO: .11. Em algumas modalidades referidas, um composto anti-sentido curto diri- gido para 53591-53604 compreende uma seqüência de nucleotídeos sele- cionada entre SEQ ID NO 866, 874, 881, 885, ou 869. Em algumas modali- dades referidas, um composto anti-sentido curto dirigido para nucleotídeos .53591-53604 de SEQ ID NO: 11 é selecionado entre Isis No 147042, .147030, 147043, 147031, ou 147044.
Em algumas modalidades, uma região alvo é nucleotídeos .53738-53750 de SEQ ID NO: 11. Em algumas modalidades, um composto anti-sentido curto é dirigido para nucleotídeos 53738-53750 de SEQ ID NO: .11. Em algumas modalidades referidas, um composto anti-sentido curto diri- gido para 53738-53750 compreende uma seqüência de nucleotídeos sele- cionada entre SEQ ID NO 874 ou 885. Em algumas modalidades referidas, um composto anti-sentido curto dirigido para nucleotídeos 53738-53750 de SEQ ID NO: 11 é selecionado entre Isis No 147030 ou 147031.
Em algumas modalidades, uma região alvo é nucleotídeos .53783-53795 de SEQ ID NO: 11. Em algumas modalidades, um composto anti-sentido curto é dirigido para nucleotídeos 53783-53795 de SEQ ID NO: .11. Em algumas modalidades referidas, um composto anti-sentido curto diri- gido para 53783-53795 compreende uma seqüência de nucleotídeos sele- cionada entre SEQ ID NO 864 ou 834. Em algumas modalidades referidas, um composto anti-sentido curto dirigido para nucleotídeos 53783-53795 de SEQ ID NO: 11 é selecionado entre Isis No 147040 ou 147041.
Em algumas modalidades, uma região alvo é nucleotídeos .55008-55020 de SEQ ID NO: 11. Em algumas modalidades, um composto anti-sentido curto é dirigido para nucleotídeos 55008-55020 de SEQ ID NO: .11. Em algumas modalidades referidas, um composto anti-sentido curto diri- gido para 55008-55020 compreende uma seqüência de nucleotídeos sele- cionada entre SEQ ID NO 866 ou 881. Em algumas modalidades referidas, um composto anti-sentido curto dirigido para nucleotídeos 55008-55020 de SEQ ID NO: 11 é selecionado entre Isis No 147042 ou 147043.
Em algumas modalidades, uma região alvo é nucleotídeos 55154-55166 de SEQ ID NO: 11. Em algumas modalidades, um composto anti-sentido curto é dirigido para nucleotídeos 55154-55166 de SEQ ID NO: 11. Em algumas modalidades referidas, um composto anti-sentido curto diri- gido para 55154-55166 compreende uma seqüência de nucleotídeos sele- cionada entre SEQ ID NO 866 ou 881. Em algumas modalidades referidas, um composto anti-sentido curto dirigido para nucleotídeos 55154-55166 de SEQ ID NO: 11 é selecionado entre Isis No 147042 ou 147043.
Em algumas modalidades, uma região alvo é nucleotídeos 55682-55695 de SEQ ID NO: 11. Em algumas modalidades, um composto anti-sentido curto é dirigido para nucleotídeos 55682-55695 de SEQ ID NO: 11. Em algumas modalidades referidas, um composto anti-sentido curto diri- gido para 55682-55695 compreende uma seqüência de nucleotídeos sele- cionada entre SEQ ID NO 877 ou 882. Em algumas modalidades referidas, um composto anti-sentido curto dirigido para nucleotídeos 55682-55695 de SEQ ID NO: 11 é selecionado entre Isis No 147019 ou 147021.
Em algumas modalidades, uma região alvo é nucleotídeos 56275-56293 de SEQ ID NO: 11. Em algumas modalidades, um composto anti-sentido curto é dirigido para nucleotídeos 56275-56293 de SEQ ID NO: 11. Em algumas modalidades referidas, um composto anti-sentido curto diri- gido para 56275-56293 compreende uma seqüência de nucleotídeos sele- cionada entre SEQ ID NO 871, 884, 887, 830, 840, 861, ou 879. Em algu- mas modalidades referidas, um composto anti-sentido curto dirigido para nucleotídeos 56275-56293 de SEQ ID NO: 11 é selecionado entre Isis No 147054, 147055, 147056, 147058, 147059, 147060, ou 147061.
Em algumas modalidades, uma região alvo é nucleotídeos 56418-56439 de SEQ ID NO: 11. Em algumas modalidades, um composto anti-sentido curto é dirigido para nucleotídeos 56418-56439 de SEQ ID NO: 11. Em algumas modalidades referidas, um composto anti-sentido curto diri- gido para 56418-56439 compreende uma seqüência de nucleotídeos sele- cionada entre SEQ ID NO 875, 829, 871, 884, 887, 839, 830, ou 879. Em algumas modalidades referidas, um composto anti-sentido curto dirigido para nucleotídeos 56418-56439 de SEQ ID NO: 11 é selecionado entre Isis No 147051, 147053, 147054, 147055, 147056, 147057, 147058, ou 147061.
Em algumas modalidades, uma região alvo é nucleotídeos 57264-57276 de SEQ ID NO: 11. Em algumas modalidades, um composto anti-sentido curto é dirigido para nucleotídeos 57264-57276 de SEQ ID NO: 11. Em algumas modalidades referidas, um composto anti-sentido curto diri- gido para 57264-57276 compreende uma seqüência de nucleotídeos sele- cionada entre SEQ ID NO 883 ou 858. Em algumas modalidades referidas, um composto anti-sentido curto dirigido para nucleotídeos 57264-57276 de SEQ ID NO: 11 é selecionado entre Isis No 147045 ou 147046.
Em algumas modalidades, uma região alvo é nucleotídeos 61276-61293 de SEQ ID NO: 11. Em algumas modalidades, um composto anti-sentido curto é dirigido para nucleotídeos 61276-61293 de SEQ ID NO: 11. Em algumas modalidades referidas, um composto anti-sentido curto diri- gido para 61276-61293 compreende uma seqüência de nucleotídeos sele- cionada entre SEQ ID NO 856, 847, 849, 863, 855, 850, ou 864. Em algu- mas modalidades referidas, um composto anti-sentido curto dirigido para nucleotídeos 61276-61293 de SEQ ID NO: 11 é selecionado entre Isis No 147071, 147035, 147036, 147037, 147038, 147039, ou 147040.
Em algumas modalidades, uma região alvo é nucleotídeos 61257-61320 de SEQ ID NO: 11. Em algumas modalidades, um composto anti-sentido curto é dirigido para nucleotídeos 61257-61320 de SEQ ID NO: 11. Em algumas modalidades referidas, um composto anti-sentido curto diri- gido para 61257-61320 compreende uma seqüência de nucleotídeos sele- cionada entre SEQ ID NO 881, 856, 847, 849, 863, 855, 850, 864, ou 886. Em algumas modalidades referidas, um composto anti-sentido curto dirigido para nucleotídeos 61257-61320 de SEQ ID NO: 11 é selecionado entre Isis No 147043, 147071, 147035, 147036, 147037, 147038, 147039, 147040, ou 147071.
Em algumas modalidades, uma região alvo é nucleotídeos 61422-61439 de SEQ ID NO: 11. Em algumas modalidades, um composto anti-sentido curto é dirigido para nucleotídeos 61422-61439 de SEQ ID NO: 11. Em algumas modalidades referidas, um composto anti-sentido curto diri- gido para 61422-61439 compreende uma seqüência de nucleotídeos sele- cionada entre SEQ ID NO 844, 847, 849, 863, 855, ou 864. Em algumas modalidades referidas, um composto anti-sentido curto dirigido para nucleo- tídeos 61422-61439 de SEQ ID NO: 11 é selecionado entre Isis No 147034, 147035, 147036, 147037, 147038, ou 147040.
Em algumas modalidades, uma região alvo é nucleotídeos 61422-61466 de SEQ ID NO: 11. Em algumas modalidades, um composto anti-sentido curto é dirigido para nucleotídeos 61422-61466 de SEQ ID NO: 11. Em algumas modalidades referidas, um composto anti-sentido curto diri- gido para 61422-61466 compreende uma seqüência de nucleotídeos sele- cionada entre SEQ ID NO 844, 847, 849, 863, 855, 864, ou 856. Em algu- mas modalidades referidas, um composto anti-sentido curto dirigido para nucleotídeos 61422-61466 de SEQ ID NO: 11 é selecionado entre Isis No 147034, 147035, 147036, 147037, 147038, 147040, OU 147071.
Em algumas modalidades, uma região alvo é nucleotídeos 63065-63078 de SEQ ID NO: 11. Em algumas modalidades, um composto anti-sentido curto é dirigido para nucleotídeos 63065-63078 de SEQ ID NO: 11. Em algumas modalidades referidas, um composto anti-sentido curto diri- gido para 63065-63078 compreende uma seqüência de nucleotídeos sele- cionada entre SEQ ID NO 851 ou 838. Em algumas modalidades referidas, um composto anti-sentido curto dirigido para nucleotídeos 63065-63078 de SEQ ID NO: 11 é selecionado entre Isis No 147066 ou 147068.
Em algumas modalidades, uma região alvo é nucleotídeos 63207-63222 de SEQ ID NO: 11. Em algumas modalidades, um composto anti-sentido curto é dirigido para nucleotídeos 63207-63222 de SEQ ID NO: 11. Em algumas modalidades referidas, um composto anti-sentido curto diri- gido para 63207-63222 compreende uma seqüência de nucleotídeos sele- cionada entre SEQ ID NO 841 ou 851. Em algumas modalidades referidas, um composto anti-sentido curto dirigido para nucleotídeos 63207-63222 de SEQ ID NO: 11 é selecionado entre Isis No 147062 ou 147066. Em algumas modalidades, uma região alvo é nucleotídeos .64538-64550 de SEQ ID NO: 11. Em algumas modalidades, um composto anti-sentido curto é dirigido para nucleotídeos 64538-64550 de SEQ ID NO: .11. Em algumas modalidades referidas, um composto anti-sentido curto diri- gido para 64538-64550 compreende uma seqüência de nucleotídeos sele- cionada entre SEQ ID NO 849 ou 863. Em algumas modalidades referidas, um composto anti-sentido curto dirigido para nucleotídeos 64538-64550 de SEQ ID NO: 11 é selecionado entre Isis No 147036 ou 147037.
Em algumas modalidades, uma região alvo é nucleotídeos .64864-64876 de SEQ ID NO: 11. Em algumas modalidades, um composto anti-sentido curto é dirigido para nucleotídeos 64864-64876 de SEQ ID NO: .11. Em algumas modalidades referidas, um composto anti-sentido curto diri- gido para 64864-64876 compreende uma seqüência de nucleotídeos sele- cionada entre SEQ ID NO 851 ou 876. Em algumas modalidades referidas, um composto anti-sentido curto dirigido para nucleotídeos 64864-64876 de SEQ ID NO: 11 é selecionado entre Isis No 147066 ou 147067.
Em algumas modalidades, uma região alvo é nucleotídeos .65010-65028 de SEQ ID NO: 11. Em algumas modalidades, um composto anti-sentido curto é dirigido para nucleotídeos 65010-65028 de SEQ ID NO: .11. Em algumas modalidades referidas, um composto anti-sentido curto diri- gido para 65010-65028 compreende uma seqüência de nucleotídeos sele- cionada entre SEQ ID NO 851, 876, ou 883. Em algumas modalidades refe- ridas, um composto anti-sentido curto dirigido para nucleotídeos 65010- .65028 de SEQ ID NO: 11 é selecionado entre Isis No 147066, 147067, ou .147045.
Em algumas modalidades, uma região alvo é nucleotídeos .65163-65175 de SEQ ID NO: 11. Em algumas modalidades, um composto anti-sentido curto é dirigido para nucleotídeos 65163-65175 de SEQ ID NO: .11. Em algumas modalidades referidas, um composto anti-sentido curto diri- gido para 65163-65175 compreende uma seqüência de nucleotídeos sele- cionada entre SEQ ID NO 883 ou 858. Em algumas modalidades referidas, um composto anti-sentido curto dirigido para nucleotídeos 65163-65175 de SEQ ID NO: 11 é selecionado entre Isis No 147045 ou 147046.
Em algumas modalidades, uma região alvo é nucleotídeos 65408-65422 de SEQ ID NO: 11. Em algumas modalidades, um composto anti-sentido curto é dirigido para nucleotídeos 65408-65422 de SEQ ID NO: 11. Em algumas modalidades referidas, um composto anti-sentido curto diri- gido para 65408-65422 compreende uma seqüência de nucleotídeos sele- cionada entre SEQ ID NO 883 ou 856. Em algumas modalidades referidas, um composto anti-sentido curto dirigido para nucleotídeos 65408-65422 de SEQ ID NO: 11 é selecionado entre Isis No 147068 ou 147071.
Em algumas modalidades, uma região alvo é nucleotídeos 65549-65568 de SEQ ID NO: 11. Em algumas modalidades, um composto anti-sentido curto é dirigido para nucleotídeos 65549-65568 de SEQ ID NO: 11. Em algumas modalidades referidas, um composto anti-sentido curto diri- gido para 65549-65568 compreende uma seqüência de nucleotídeos sele- cionada entre SEQ ID NO 860, 838, ou 856. Em algumas modalidades refe- ridas, um composto anti-sentido curto dirigido para nucleotídeos 65549- 65568 de SEQ ID NO: 11 é selecionado entre Isis No 147069, 147068, ou 147071.
Em algumas modalidades, uma região alvo é nucleotídeos 67741-67754 de SEQ ID NO: 11. Em algumas modalidades, um composto anti-sentido curto é dirigido para nucleotídeos 67741-67754 de SEQ ID NO: 11. Em algumas modalidades referidas, um composto anti-sentido curto diri- gido para 67741-67754 compreende uma seqüência de nucleotídeos sele- cionada entre SEQ ID NO 848, 874, ou 885. Em algumas modalidades refe- ridas, um composto anti-sentido curto dirigido para nucleotídeos 67741- 67754 de SEQ ID NO: 11 é selecionado entre Isis No 147029, 147030, ou 147031.
Em algumas modalidades, uma região alvo é nucleotídeos 67886-67900 de SEQ ID NO: 11. Em algumas modalidades, um composto anti-sentido curto é dirigido para nucleotídeos 67886-67900 de SEQ ID NO: 11. Em algumas modalidades referidas, um composto anti-sentido curto diri- gido para 67886-67900 compreende uma seqüência de nucleotídeos sele- cionada entre SEQ ID NO 846, 848, 874, ou 885. Em algumas modalidades referidas, um composto anti-sentido curto dirigido para nucleotídeos 67886- 67900 de SEQ ID NO: 11 é selecionado entre Isis No 147028, 147029, 147030, ou 147031.
Em algumas modalidades, uma região alvo é nucleotídeos 68867-68880 de SEQ ID NO: 11. Em algumas modalidades, um composto anti-sentido curto é dirigido para nucleotídeos 68867-68880 de SEQ ID NO: 11. Em algumas modalidades referidas, um composto anti-sentido curto diri- gido para 68867-68880 compreende uma seqüência de nucleotídeos sele- cionada entre SEQ ID NO 881, 869, ou 883. Em algumas modalidades refe- ridas, um composto anti-sentido curto dirigido para nucleotídeos 68867- 68880 de SEQ ID NO: 11 é selecionado entre Isis No 147043, 147044, ou 147045.
Em algumas modalidades, uma região alvo é nucleotídeos 69013-69532 de SEQ ID NO: 11. Em algumas modalidades, um composto anti-sentido curto é dirigido para nucleotídeos 69013-69532 de SEQ ID NO: 11. Em algumas modalidades referidas, um composto anti-sentido curto diri- gido para 69013-69532 compreende uma seqüência de nucleotídeos sele- cionada entre SEQ ID NO 881, 869, 883, 858, 856, 832, ou 842. Em algu- 20 mas modalidades referidas, um composto anti-sentido curto dirigido para nucleotídeos 69013-69532 de SEQ ID NO: 11 é selecionado entre Isis No 147043, 147044, 147045, 147046, 147071, 147072, ou 147073.
Em algumas modalidades, uma região alvo é nucleotídeos 69665-69880 de SEQ ID NO: 11. Em algumas modalidades, um composto anti-sentido curto é dirigido para nucleotídeos 69665-69880 de SEQ ID NO: 11. Em algumas modalidades referidas, um composto anti-sentido curto diri- gido para 69665-69880 compreende uma seqüência de nucleotídeos sele- cionada entre SEQ ID NO 856, 832, 842, 845, ou 851. Em algumas modali- dades referidas, um composto anti-sentido curto dirigido para nucleotídeos 69665-69880 de SEQ ID NO: 11 é selecionado entre Isis No 147071, 147072, 147073, 147074, ou 147066.
Em algumas modalidades, uma região alvo é nucleotídeos .70611-70630 de SEQ ID NO: 11. Em algumas modalidades, um composto anti-sentido curto é dirigido para nucleotídeos 70611-70630 de SEQ ID NO: .11. Em algumas modalidades referidas, um composto anti-sentido curto diri- gido para 70611-70630 compreende uma seqüência de nucleotídeos sele- cionada entre SEQ ID NO 859, 841, 862, 880, 857, ou 851. Em algumas modalidades referidas, um composto anti-sentido curto dirigido para nucleo- tídeos 70611-70630 de SEQ ID NO: 11 é selecionado entre Isis No 147023, .147062, 147063, 147064, 147065, ou 147066.
Em algumas modalidades, uma região alvo é nucleotídeos .70762-70776 de SEQ ID NO: 11. Em algumas modalidades, um composto anti-sentido curto é dirigido para nucleotídeos 70762-70776 de SEQ ID NO: .11. Em algumas modalidades referidas, um composto anti-sentido curto diri- gido para 70762-70776 compreende uma seqüência de nucleotídeos sele- cionada entre SEQ ID NO 862, 880, 857, ou 851. Em algumas modalidades referidas, um composto anti-sentido curto dirigido para nucleotídeos 70762- .70776 de SEQ ID NO: 11 é selecionado entre Isis No 147063, 147064, .147065, OU 147066.
Em algumas modalidades, uma região alvo é nucleotídeos .70998-71010 de SEQ ID NO: 11. Em algumas modalidades, um composto anti-sentido curto é dirigido para nucleotídeos 70998-71010 de SEQ ID NO: .11. Em algumas modalidades referidas, um composto anti-sentido curto diri- gido para 70998-71010 compreende uma seqüência de nucleotídeos sele- cionada entre SEQ ID NO 832 ou 842. Em algumas modalidades referidas, um composto anti-sentido curto dirigido para nucleotídeos 70998-71010 de SEQ ID NO: 11 é selecionado entre Isis No 147072 ou 147073.
Em algumas modalidades, uma região alvo é nucleotídeos .71144-714364 de SEQ ID NO: 11. Em algumas modalidades, um composto anti-sentido curto é dirigido para nucleotídeos 71144-714364 de SEQ ID NO: .11. Em algumas modalidades referidas, um composto anti-sentido curto diri- gido para 71144-714364 compreende uma seqüência de nucleotídeos sele- cionada entre SEQ ID NO 832, 842, 845, 863, 855, ou 850. Em algumas modalidades referidas, um composto anti-sentido curto dirigido para núcleo- tídeos 71144-714364 de SEQ ID NO: 11 é selecionado entre Isis No 147072,147073, 147074, 147037, 147038, ou 147039.
Em algumas modalidades, uma região alvo é nucleotídeos 71497-71652 de SEQ ID NO: 11. Em algumas modalidades, um composto anti-sentido curto é dirigido para nucleotídeos 71497-71652 de SEQ ID NO: 11. Em algumas modalidades referidas, um composto anti-sentido curto diri- gido para 71497-71652 compreende uma seqüência de nucleotídeos sele- cionada entre SEQ ID NO 863, 855, 850, ou 879. Em algumas modalidades referidas, um composto anti-sentido curto dirigido para nucleotídeos 71497-71652 de SEQ ID NO: 11 é selecionado entre Isis No 147037, 147038,147039, ou 147061.
Em algumas modalidades, compostos anti-sentido curtos dirigi- dos para um ácido nucléico PTP1B têm 8 a 16, preferencialmente 9 a 15, more preferencialmente 9 a 14, mais preferencialmente 10 a 14 nucleotídeos de extensão. Em algumas modalidades, compostos anti-sentido curtos diri- gidos para um ácido nucléico PTP1B têm 9 a 14 nucleotídeos de extensão. Em algumas modalidades, compostos anti-sentido curtos dirigidos para um ácido nucléico PTP1B têm 10 a 14 nucleotídeos de extensão. Em algumas modalidades, os compostos anti-sentido curtos referidos são oligonucleotí- deos anti-sentido curtos.
Em algumas modalidades, compostos anti-sentido curtos dirigi- dos para um ácido nucléico PTP1B são gápmeros curtos. Em algumas mo- dalidades referidas, gápmeros curtos dirigidos para um ácido nucléico PTP1B compreendem no mínimo uma modificação de alta afinidade em um ou mais asas do composto. Em algumas modalidades, compostos anti- sentido curtos dirigidos para um ácido nucléico PTP1B compreendem 1 a 3 modificações de alta afinidade em cada asa. Em algumas modalidades refe- ridas, os nucleosídeos ou nucleotídeos da asa compreendem uma modifica- ção 2'. Em algumas modalidades referidas, os monômeros da asa são BNA1S. Em algumas modalidades referidas, os monômeros da asa são sele- cionados entre α-L-Metilenoóxi (4'-CH2-0-2') BNA, β-D-Metilenoóxi (4'-CH2- o-2') BNA, Etilenoóxi K-(CH2)2-O^1) BNA, Aminoóxi (4'-CH2-0-N(R)-2') BNA e Oxiamino (4'-CH2-N(R)-0-2') BNA. Em algumas modalidades, os mo- nômeros de uma asa compreendem um substituinte na posição 2' selecio- nado entre alila, amino, azido, tio, O-alila, O-C1-C10 alquila, -OCF3, O-(CH2)2- O-CH3, 2'-0(CH2)2SCH3, O-(CH2)2-O-N(Rm)(Rn)1 e 0-CH2-C(=0)-N(Rm)(Rn), onde cada Rm e Rn é, independentemente, H ou C1-Cio alquila substituída ou não-substituída. Em algumas modalidades, os monômeros de uma asa são nucleotídeos 2'MOE.
Em algumas modalidades, compostos anti-sentido curtos dirigi- dos para um ácido nucléico PTP1B compreendem um gap entre a asa 5' e a asa 3'. Em algumas modalidades o gap compreende cinco, seis, sete, oito, nove, dez, onze, doze, treze, ou quatorze monômeros. Em algumas modali- dades, os monômeros do gap são desoxirribonucleotídeos não modificados. Em algumas modalidades, os monômeros do gap são ribonucleotídeos não modificados. Em algumas modalidades, gap de modificações de gap (se houver) resultam em um composto anti-sentido que, quando ligado a seu ácido nucléico alvo, suporta clivagem por uma RNase, incluindo, mas não limitada a, RNase H.
Em algumas modalidades, compostos anti-sentido curtos dirigi- dos para um ácido nucléico PTP1B têm ligações monoméricas uniformes. Em algumas modalidades referidas, estas ligações são todas ligações fosfo- rotioato. Em algumas modalidades, as ligações são todas ligações fosfodies- ter. Em algumas modalidades, compostos anti-sentido curtos dirigidos para um ácido nucléico PTP1B têm espinhas dorsais mistas.
Em algumas modalidades, compostos anti-sentido curtos dirigi- dos para um ácido nucléico PTP1B têm 8 monômeros de extensão. Em al- gumas modalidades, compostos anti-sentido curtos dirigidos para um ácido nucléico PTP1B têm 9 monômeros de extensão. Em algumas modalidades, compostos anti-sentido curtos dirigidos para um ácido nucléico PTP1B têm .10 monômeros de extensão. Em algumas modalidades, compostos anti- sentido curtos dirigidos para um ácido nucléico PTP1B têm 11 monômeros de extensão. Em algumas modalidades, compostos anti-sentido curtos diri- gidos para um ácido nucléico PTP1B têm monômeros de extensão. Em al- gumas modalidades, compostos anti-sentido curtos dirigidos para um ácido nucléico PTP1B têm 13 monômeros de extensão. Em algumas modalidades, compostos anti-sentido curtos dirigidos para um ácido nucléico PTP1B têm 14 monômeros de extensão. Em algumas modalidades, compostos anti- sentido curtos dirigidos para um ácido nucléico PTP1B têm 15 monômeros de extensão. Em algumas modalidades, compostos anti-sentido curtos diri- gidos para um ácido nucléico PTP1B têm 16 monômeros de extensão. Em algumas modalidades, compostos anti-sentido curtos dirigidos para um ácido nucléico PTP1B compreendem 9 a 15 monômeros. Em algumas modalida- des, compostos anti-sentido curtos dirigidos para um ácido nucléico PTP1B compreendem 10 a 15 monômeros. Em algumas modalidades, compostos anti-sentido curtos dirigidos para um ácido nucléico PTP1B compreendem 12 a 14 monômeros. Em algumas modalidades, compostos anti-sentido curtos dirigidos para um ácido nucléico PTP1B compreendem 12 a 14 nucleotídeos ou nucleosídeos.
Em algumas modalidades, a invenção proporciona métodos para modular a expressão de PTP1B. Em algumas modalidades, os métodos re- feridos compreendem uso de um ou mais composto anti-sentido curto dirigi- do para um ácido nucléico PTP1B, em que o composto anti-sentido curto dirigido para um ácido nucléico PTP1B tem a partir de cerca de 8 a cerca de 16, preferencialmente 9 a 15, mais preferencialmente 9 a 14, mais preferen- cialmente 10 a 14 monômeros (isto é, a partir de cerca de 8 a cerca de 16 monômeros ligados). Uma pessoa com conhecimento regular da técnica re- conhecerá que isto compreende métodos para modular a expressão de PTP1B usando um ou mais compostos anti-sentido curtos dirigidos para um ácido nucléico PTP1B de 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 ou 16 monômeros.
Em algumas modalidades, métodos para modular PTP1B com- preendem uso de um composto anti-sentido curto dirigido para um ácido nu- cléico PTP1B que tem 8 monômeros de extensão. Em algumas modalida- des, métodos para modular PTP1B compreendem uso de um composto anti- sentido curto dirigido para um ácido nucléico PTP1B que tem 9 monômeros de extensão. Em algumas modalidades, métodos para modular PTP1B com- preendem uso de um composto anti-sentido curto dirigido para um ácido nu- cléico PTP1B que tem 10 monômeros de extensão. Em algumas modalida- des, métodos para modular PTP1B compreendem uso de um composto anti- sentido curto dirigido para um ácido nucléico PTP1B que tem 11 monômeros de extensão. Em algumas modalidades, métodos para modular PTP1B com- preendem uso de um composto anti-sentido curto dirigido para um ácido nu- cléico PTP1B que tem 12 monômeros de extensão. Em algumas modalida- des, métodos para modular PTP1B compreendem uso de um composto anti- sentido curto dirigido para um ácido nucléico PTP1B que tem 13 monômeros de extensão. Em algumas modalidades, métodos para modular PTP1B com- preendem uso de um composto anti-sentido curto dirigido para um ácido nu- cléico PTP1B que tem 14 monômeros de extensão. Em algumas modalida- des, métodos para modular PTP1B compreendem uso de um composto anti- sentido curto dirigido para um ácido nucléico PTP1B que tem 15 monômeros de extensão. Em algumas modalidades, métodos para modular PTP1B com- preendem uso de um composto anti-sentido curto dirigido para um ácido nu- cléico PTP1B que tem 16 monômeros de extensão.
Em algumas modalidades, métodos para modular a expressão de PTP1B compreendem uso de um composto anti-sentido curto dirigido para um ácido nucléico PTP1B compreendendo 9 a 15 monômeros. Em al- gumas modalidades, métodos para modular a expressão de PTP1B compre- endem uso de um composto anti-sentido curto dirigido para um ácido nucléi- co PTP1B compreendendo 10 a 15 monômeros. Em algumas modalidades, métodos para modular a expressão de PTP1B compreendem uso de um composto anti-sentido curto dirigido para um ácido nucléico PTP1B compre- endendo 12 a 14 monômeros. Em algumas modalidades, métodos para mo- dular a expressão de PTP1B compreendem uso de um composto anti- sentido curto dirigido para um ácido nucléico PTP1B compreendendo 12 ou .14 nucleotídeos ou nucleosídeos. .10. PTEN
Em algumas modalidades, a invenção proporciona compostos anti-sentido curtos dirigidos para um ácido nucléico codificando PTEN. Em algumas modalidades, os compostos referidos são usados para modular a expressão de PTEN //células. Em algumas modalidades referidas, compos- tos anti-sentido curtos dirigidos para um ácido nucléico PTEN são adminis- trados a um animal. Em algumas modalidades, compostos anti-sentido cur- tos dirigidos para um ácido nucléico PTEN são úteis para estudar PTEN1 para estudar algumas nucleases e/ou para avaliar atividade anti-sentido. Em algumas modalidades referidas, compostos anti-sentido curtos dirigidos para ácidos nucléicos PTEN são úteis para avaliar alguns motivos e/ou modifica- ções químcias. Em algumas modalidades, a administração de um composto anti-sentido curto dirigido para ácido nucléico PTEN a um animal resulta em uma alteração fenotípica mensurável.
Os compostos anti-sentido curtos tendo por alvo PTEN podem ter qualquer uma ou mais propriedades ou características dos compostos anti-sentido curtos descritos de modo geral aqui, neste requerimento de pa- tente. Em algumas modalidades, compostos anti-sentido curtos tendo por alvo um ácido nucléico PTP1B têm um motivo (asa - gap deóxi -asa) sele- cionado entre 1-12-1, 1-1-10-2, 2-10-1-1, 3-10-3, 2-10-3, 2-10-2, 1-10-1,1- 10-2, 3-8-3, 2-8-2, 1-8-1, 3-6-3 ou 1-6-1, mais preferencialmente 1-10-1, 2- 10-2, 3-10-3, e 1-9-2.
Alguns Compostos Anti-sentido Curtos Dirigidos para um Ácido Nucléico PTEN
Em algumas modalidades, compostos anti-sentido curtos são dirigidos para um ácido nucléico PTEN tendo a seqüência do GENBANK® de Acesso N5 NM_000314.4, incorporada aqui, a este requerimento de patente, como SEQ ID NO: 14. Em algumas modalidades, compostos anti-sentido curtos são dirigidos para um ácido nucléico PTEN tendo a seqüência de nu- cleotídeos 8063255 a 8167140 da seqüência do GENBANK® de Acesso Ne NT_033890.3, incorporada aqui, a este requerimento de patente, como SEQ ID NO: 15. Em algumas modalidades referidas, um composto anti-sentido curto dirigido para SEQ ID NO: 14 é no mínimo 90% complementar à SEQ ID NO: 14. Em algumas modalidades referidas, um composto anti-sentido curto dirigido para SEQ ID NO: 14 é no mínimo 95% complementar à SEQ ID NO: 14. Em algumas modalidades referidas, um composto anti-sentido curto dirigido para SEQ ID NO: 15 é 100% complementar à SEQ ID NO: 15. Em algumas modalidades referidas, um composto anti-sentido curto dirigido para SEQ ID NO: 15 é no mínimo 90% complementar à SEQ ID NO: 15. Em algumas modalidades referidas, um composto anti-sentido curto dirigido para SEQ ID NO: 15 é no mínimo 95% complementar à SEQ ID NO: 15. Em al- gumas modalidades referidas, um composto anti-sentido curto dirigido para SEQ ID NO: 15 é 100% complementar à SEQ ID NO: 15.
Em algumas modalidades, um composto anti-sentido curto diri- gido para SEQ ID NO: 14 compreende uma seqüência de nucleotídeos sele- cionada entre as seqüências de nucleotídeos determinadas nas Tabelas 20 e 21. Em algumas modalidades, um composto anti-sentido curto dirigido pa- ra SEQ ID NO: 15 compreende uma seqüência de nucleotídeos selecionada entre as seqüências de nucleotídeos determinadas nas Tabelas 22 e 23. Cada seqüência de nucleotídeo determinada nas Tabelas 20,21, 22, e 23 é independente de qualquer modificação para uma porção açú- car, uma ligação internucleosídeos, ou uma nucleobase. Deste modo, com- postos anti-sentido curtos compreendendo uma seqüência de nucleotídeos conforme determinado nas Tabelas 20, 21, 22, e 23 podem compreender, independentemente, uma ou mais modificações para uma porção açúcar, uma ligação internucleosídeos, ou uma nucleobase. Compostos anti-sentido descritos pelo número Isis (Isis NO.) indicam uma combinação de seqüência de nucleobase e uma ou mais modificações para uma porção açúcar, uma ligação internucleosídeos, ou uma nucleobase. A Tabela 20 ilustra compostos anti-sentido curtos que são 100% complementares à SEQ ID NO: 14. A Tabela 22 ilustra compostos anti- sentido curtos que são 100% complementares à SEQ ID NO: 15. A coluna com o título 'motivo de gápmero' indica o motivo asa-gap-asa de cada com- postos anti-sentido curtos. O segmento de gap compreende 2'- desoxinucleotídeos e cada nucleotídeo de cada segmento de asa compre- ende um açúcar 2'-modificado. O açúcar 2'-modificado em particular também é indicado na coluna de 'motivo de gápmero'. Por exemplo, '2-10-2 MOE' significa um motivo de gápmero 2-10-2, onde um segmento de gap de dez .2'-desoxinucleotídeos é flanqueado por segmentos de asa de dois nucleotí- deos, onde os nucleotídeos dos segmentos de asa são nucleotídeos 2'- MOE. Ligações internucleosídeos são fosforotioato. Os compostos anti- sentido curtos compreendem 5-metilcitidina ao invés de citosina não modifi- cada, a menos que "citosina não modificada" seja listada na coluna de moti- vo de gápmero, em cujo caso as citosinas indicadas são citosinas não modi- ficadas. Por exemplo, "5-mC em gap somente" indica que o segmento do gap tem 5-metilcitosinas, ao passo que os segmentos de asa têm citosinas não modificadas.
Os nucleotídeos 2'-modificados e abreviações incluem: 2'-0- metoxietila (MOE); 2'-0-metila (OMe); 2'-0-(2,2,3,3,3-pentafluoropropila) (PentaF); 2'-0-[(2-metoxi)etila]-4'-tio (2'-MOE-4'-tio);. (FO-CMOE-BNA. Con- forme ilustrado nas Tabelas 20 e 22, uma asa pode compreender monôme- ros compreendendo mais de tipo de substituinte 2'. Por exemplo, 1-2-10-2 MOE/PentaF/MOE indica um nucleotídeo MOE-modificado, seguido por dois nucleotídeos PentaF-modificados, seguido por um gap de dez desoxinucleo- tídeos, seguido por dois nucleotídeos PentaF-modificados. Por exemplo, 1-1- .10-2 2'-(butilacetomido)-palmitamida Metilenoóxi BNA/Metilenoóxi BNA indi- ca que o 5'-most nucleotídeo é 2'-(butilacetomida)-palmitamida, o segundo nucleotídeo é um nucleotídeo metilenoóxi BNA, e a asa 3' é metilenoóxi BNA. A menos que indicado de modo diverso, citosinas são 5-metilcitosinas e ligações internucleosídeos são fosforotioato.
Tabela 20: Compostos Anti-sentido Curtos Dirigidos para SEQ ID NO: 14 <table>table see original document page 407</column></row><table> <table>table see original document page 408</column></row><table> <table>table see original document page 409</column></row><table> <table>table see original document page 410</column></row><table> <table>table see original document page 411</column></row><table> <table>table see original document page 412</column></row><table> <table>table see original document page 413</column></row><table> <table>table see original document page 414</column></row><table> <table>table see original document page 415</column></row><table> <table>table see original document page 416</column></row><table> <table>table see original document page 417</column></row><table> <table>table see original document page 418</column></row><table> <table>table see original document page 419</column></row><table> <table>table see original document page 420</column></row><table> <table>table see original document page 421</column></row><table> <table>table see original document page 422</column></row><table> <table>table see original document page 423</column></row><table> <table>table see original document page 424</column></row><table> <table>table see original document page 425</column></row><table> <table>table see original document page 426</column></row><table> <table>table see original document page 427</column></row><table> <table>table see original document page 428</column></row><table> <table>table see original document page 429</column></row><table> <table>table see original document page 430</column></row><table> <table>table see original document page 431</column></row><table> <table>table see original document page 432</column></row><table> <table>table see original document page 433</column></row><table> <table>table see original document page 434</column></row><table>
Tabela 22: Compostos Anti-sentido Curtos dirigidos para SEQ ID NO: 15
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Sais1 pró-drogas e bioequivalentes
Os compostos anti-sentido proporcionados aqui, neste requeri- mento de patente, compreendem qualquer sais, ésteres, ou sais de seme- lhantes ésteres farmaceuticamente aceitáveis, ou qualquer outro equivalente químico funcional o qual, na administração a um animal incluindo um ser humano, é capaz de proporcionar (diretamente ou indiretamente) o metabóli- to biologicamente ativo ou resíduo do mesmo. Por conseguinte, por exem- plo, a descrição também é dirigida para pró-drogas e sais farmaceuticamen- te aceitáveis dos compostos anti-sentido, sais farmaceuticamente aceitáveis de semelhantes pró-drogas, e outros bioequivalentes.
O termo "pró-droga" indica um agente terapêutico que é prepa- rado em uma forma inativa ou menos ativa que é convertida para uma forma ativa (isto é, fármaco) dentro do corpo ou células do mesmo pela ação de enzimas endógenas, produtos químicos, e/ou condições. Em particular, ver- sões de pró-droga dos oligonucleotídeos são preparadas como derivados de SATE ((S-acetila-2-tioetila) fosfato) de acordo com os métodos revelados na patente internacional Ns WO 93/24510 ou na patente internacional Nq WO 94/26764. Pró-drogas também podem incluir compostos anti-sentido em que uma ou ambas as extremidades compreendem nucleobases que são cliva- das (por exemplo, incorporando ligações de espinha dorsal fosfodiéster nas extremidades) para produzir o composto ativo. Em algumas modalidades, uma ou mais porções não-fármacos são clivadas a partir de uma pró-droga para produzir a forma ativa. Em algumas modalidades referidas, as porções não-fármaco referidas são um nucleotídeo ou oligonucleotídeo.
O termo "sais farmaceuticamente aceitáveis" se refere a sais fisiologicamente e farmaceuticamente aceitáveis dos compostos descrito aqui, neste requerimento de patente: isto é, sais que conservam a atividade biológica desejada do composto precursor e não conferem efeitos toxicológi- cos indesejáveis ao mesmo. Sais de sódio de oligonucleotídeos anti-sentido são úteis e são bem aceitos para administração terapêutica a humanos.
Em algumas modalidades, sais, incluindo, mas não limitados à sais de sódio, de ácidos nucléicos de filamento duplo (incluindo mas não limitados à compostos de dsRNA) também são proporcionados. G. Algumas Composições Farmacêuticas
Em algumas modalidades, composições farmacêuticas da pre- sente invenção compreendem um ou mais composto anti-sentido curto e um ou mais excipientes. Em algumas modalidades referidas, excipientes são selecionados entre água, soluções salinas, álcool, polietileno glicóis, gelati- na, lactose, amilase, estearato de magnésio, talco, ácido silícico, parafina viscosa, hidroximetilcelulose e polivinilpirrolidona.
Em algumas modalidades, uma composição farmacêutica da presente invenção é preparada usando técnicas conhecidas, incluindo, mas não-limitadas à processos de misturação, dissolução, granulação, fabricação de drágeas, levigação, emulsificação, encapsulação, atração ou formação de tabletes.
Em algumas modalidades, uma composição farmacêutica da presente invenção é um líquido (por exemplo, uma suspensão, um elixir e/ou uma solução). Em algumas das modalidades referidas, uma composição farmacêutica líquida é preparada usando ingredientes de conhecimento na técnica, incluindo, mas não limitados a, água, glicóis, óleos, álcoois, agentes aromatizantes, conservantes, e agentes colorantes.
Em algumas modalidades, uma composição farmacêutica da presente invenção é um sólido (por exemplo, um pó, comprimido, e/ou cáp- sula). Em algumas das modalidades referidas, uma composição farmacêuti- ca sólida compreendendo um ou mais oligonucleotídeos é preparada usando ingredientes de conhecimento na técnica, incluindo, mas não limitados a, amidos, açúcares, diluentes, agentes de granulação, lubrificantes, aglutinan- tes, e agentes desintegrantes.
Em algumas modalidades, uma composição farmacêutica da presente invenção é formulada como uma preparação de depósito. Algumas das preparações de depósito referidas são tipicamente de ação mais longa do que preparações não de depósito. Em algumas modalidades, as prepara- ções referidas são administradas por implantação (por exemplo, subcutane- amente ou intramuscularmente) ou por injeção intramuscular. Em algumas modalidades, preparações de depósito são preparadas usando materiais poliméricos ou hidrofóbicos adequados (por exemplo, uma emulsão em um óleo aceitável) ou resinas de permuta iônica, ou como derivados parcamente solúveis, por exemplo, como um sal parcamente solúvel.
Em algumas modalidades, uma composição farmacêutica da presente invenção compreende um sistema de liberação. Exemplos de sis- temas de liberação incluem, mas não estão limitados a, Iipossomas e emul- sões. Alguns sistemas de liberação são úteis para preparar algumas compo- sições farmacêuticas incluindo aquelas compreendendo compostos hidrofó- bicos. Em algumas modalidades, alguns solventes orgânicos tais como di- metilsulfóxido são usados.
Em algumas modalidades, uma composição farmacêutica da presente invenção compreende uma ou mais moléculas de liberação tecido- específica designadas para liberar o um ou mais agentes farmacêuticos da presente invenção em tipos de células ou tecidos específicis. Por exemplo, em determinadas modalidades, composições farmacêuticas incluem Iipos- somas revestidos com um anticorpo tecido-específico.
Em algumas modalidades, uma composição farmacêutica da presente invenção compreende um sistema co-solvente. Alguns dos siste- mas co-solventes referidos compreendem, por exemplo, álcool benzílico, um tensoativo não polar, um polímero orgânico miscível em água, e uma fase aquosa. Em algumas modalidades, os sistemas co-solventes referidos são usados para compostos hidrofóbicos. Um exemplo não-limitante de um sis- tema co-solvente semelhante é o sistema co-solvente VPD, o qual é uma solução de etanol absoluto compreendendo 3% em peso/ vol de álcool ben- zílico, 8% em peso/ vol do tensoativo não polar Polysorbate 80.TM., e 65% em peso/ vol de polietileno glicol 300. As proporções de semelhantes siste- mas co-solventes pode ser variada consideravelmente sem alterar significa- tivamente suas características de solubilidade e toxicidade. Além disso, a identidade de componentes co-solventes pode ser variada: por exemplo, outros tensoativos podem ser usados ao invés de Polysorbate 80.TM.; o ta- compatíveis podem substituir polietileno glicol, por exemplo, polivinila pirroli- dona; e outros açúcares ou polissacarídeos podem substituir dextrose.
Em algumas modalidades, uma composição farmacêutica da presente invenção compreende um sistema de liberação gradual. Um exem- pio não-limitante de um sistema de liberação gradual semelhante é uma ma- triz semipermeável de polímeros hidrofóbicos sólidos. Em algumas modali- dades, sistemas de liberação gradual podem, dependendo de sua natureza química, liberar agentes farmacêuticos durante um período de horas, dias, semanas ou meses.
Em algumas modalidades, uma composição farmacêutica da presente invenção é preparada para administração oral. Em algumas de se- melhantes modalidades, uma composição farmacêutica é formulada combi- nando um ou mais oligonucbotídeos com um ou mais veículos farmaceuti- camente aceitáveis. Alguns de semelhantes veículos permitem que compo- sições farmacêuticas sejam formuladas como comprimidos, pílulas, drágeas, cápsulas, líquidos, géis, xaropes, pastas semifluidas, suspensões e seme- lhantes, para ingestão oral por um sujeito. Em algumas modalidades, com- posições farmacêuticas para uso oral são obtidas misturando oligonucleotí- deo e um ou mais excipientes sólidos. Excipientes adequados incluem, mas não estão limitados a, enchimentos, tais como açúcares, incluindo lactose, sacarose, manitol, ou sorbitol; preparações de celulose tais como, por e- xemplo, amido de milho, amido de trigo, amido de arroz, amido de batata, gelatina, goma tragacanto, metila celulose, hidroxipropilmetila-celulose, car- boximetilcelulose de sódio, e/ou polivinilpirrolidona (PVP). Em algumas mo- dalidades, uma mistura semelhante é opcionalmente triturada e auxiliares são opcionalmente adicionados. Em algumas modalidades, composições farmacêuticas são modeladas para obter tabletes ou núcleos de drágeas. Em algumas modalidades, agentes desintegrantes (por exemplo, polivinila pirrolidona reticulada, ágar, ou ácido algínico ou um sal do mesmo, tal como alginato de sódio) são adicionados.
Em algumas modalidades, núcleos de drágeas são proporciona- dos com revestimentos. Em algumas modalidades referidas, podem ser usa- das soluções concentradas de açúcar, as quais podem compreender opcio- nalmente goma arábica, talco, polivinila pirrolidona, gel carbopol, polietileno glicol, e/ou dióxido de titânio, soluções de laca, e solventes orgânicos ade- quados ou misturas de solventes. Matérias corantes ou pigmentos podem ser adicionados a revestimentos de drágeas ou comprimidos.
Em algumas modalidades, composições farmacêuticas para ad- ministração oral são cápsulas push-fit compostas de gelatina. Algumas das cápsulas push-fit referidas compreendem um ou mais agentes farmacêuticos da presente invenção em mistura com um ou mais enchimentos tais como lactose, aglutinantes tais como amidos, e/ou lubrificantes tais como talco ou estearato de magnésio e, opcionalmente, estabilizantes. Em algumas moda- lidades, composições farmacêuticas para administração oral são cápsulas seladas moles, feitas de gelatina e um plastificante, tal como glicerol ou sor- bitol. Em algumas cápsulas moles, um ou mais agentes farmacêuticos da presente invenção são dissolvidos ou suspendidos em líquidos adequados, tais como óleos graxos, parafina líquida, ou polietileno glicóis líquidos. Além disso, podem ser adicionados estabilizantes.
Em algumas modalidades, composições farmacêuticas são pre- paradas para administração bucal. Algumas das composições farmacêuticas referidas são comprimidos ou pastilhas formulados em maneira convencio- nal.
Em algumas modalidades, uma composição farmacêutica é pre- parada para administração por injeção (por exemplo, intravenosa, subcutâ- nea, intramuscular, e etc.)· Em algumas das modalidades referidas, uma composição farmacêutica compreende um veículo e é formulada em solução aquosa, tal como água ou tampões fisiologicamente compatíveis tais como solução de Hanks, solução de Ringer, ou tampão de salina fisiológica. Em algumas modalidades, outros ingredientes são incluídos (por exemplo, in- gredientes que ajudam na solubilidade ou servem como conservantes). Em algumas modalidades, suspensões injetáveis são preparadas usando veícu- los líquidos apropriados, agentes de suspensão e semelhantes. Algumas composições farmacêuticas para injeção são apresentadas em forma de do- sagem unitária, por exemplo, em ampolas ou em recipientes multidose. Al- gumas composições farmacêuticas para injeção são suspensões, soluções ou emulsões em veículos oleosos ou aquosos, e podem compreender agen- tes formulatórios tais como agentes de suspensão, estabilizantes e/ou dis- persantes. Alguns solventes adequados para uso em composições farma- cêuticas para injeção incluem, mas não estão limitados a, solventes lipofíli- cos e óleos graxos, tal como óleo de gergelim, ésteres de ácidos graxos sin- téticos, tais como etila oleato ou triglicerídeos, e lipossomas. Suspensões para injeção aquosa podem compreender substâncias qua aumentam a vis- cosidade da suspensão, tais como carboximetila celulose de sódio, sorbitol, ou dextrano. Opcionalmente, as suspensões referidas também podem com- preender estabilizantes adequados ou agentes que aumentam a solubilidade dos agentes farmacêuticos para permitir a preparação de soluções altamen- te concentradas.
Em algumas modalidades, uma composição farmacêutica é pre- parada para administração transmucosa. Em algumas de semelhantes mo- dalidades penetrantes apropriados para a barreira a ser permeada são usa- dos na formulação. Os penetrantes referidos são de conhecimento geral na técnica.
Em algumas modalidades, uma composição farmacêutica é pre- parara para administração por inalação. Algumas de semelhantes composi- ções farmacêuticas para inalação são preparadas sob a forma de um spray de aerossol em um pacote pressurizado ou um nebulizador. Algumas de semelhantes composições farmacêuticas compreendem um propelente, por exemplo, diclorodifluorometano, triclorofluorometano, diclorotetrafluoroetano, dióxido de carbono ou outro gás adequado. Em algumas modalidades usan- do um aerossol pressurizado, a unidade de dosagem pode ser determinada com uma válvula que libera uma quantidade dosada. Em algumas modalida- des, cápsulas e cartuchos para uso em um inalador ou insuflador podem ser formuladas. Algumas de semelhantes formulations compreendem uma mis- tura de pó de um agente farmacêutico da invenção e uma base em pó ade- quada tal como Iactose ou amido.
Em algumas modalidades, uma composição farmacêutica é pre- parada para administração retal, tal como um enema de retenção ou suposi- tórios. Algumas de semelhantes composições farmacêuticas compreendem ingredientes conhecidos, tais como manteiga de cacau e/ou outros glicerí- deos.
Em algumas modalidades, uma composição farmacêutica é pre- parada para administração tópica. Algumas de semelhantes composições farmacêuticas compreendem bases umidificantes brandas, tais como poma- das ou cremes. Bases de pomadas adequadas típicas incluem, mas não es- tão limitadas a, petrolato, petrolato mais silicones voláteis, Ianolina e emul- sões de água em óleo tais como Eucerin.TM., disponível na Beiersdorf (Cin- cinnati, Ohio). Bases de creme adequadas típicas incluem, mas não estão limitadas a, Nivea.TM. Cream, disponível na Beiersdorf (Cincinnati, Ohio), creme a frio (Farmacopéia dos Estados Unidos), Purpose Cream.TM., dis- ponível na Johnson & Johnson (New Brunswick, N.J.), pomada hidrofílica (Farmacopéia dos Estados Unidos) e Lubriderm.TM., disponível na Pfizer (Morris Plains, N.J.).
Em algumas modalidades, uma composição farmacêutica da presente invenção compreende um oligonucleotídeo em uma quantidade terapeuticamente eficaz. Em algumas modalidades, a quantidade terapeuti- camente eficaz é suficiente para prevenir, aliviar ou melhorar sintomas de uma doença ou para prolongar a sobrevida do sujeito sendo tratado. A de- terminação de uma quantidade terapeuticamente eficaz está bem dentro da capacidade daqueles versados na técnica.
Em algumas modalidades, um ou mais composto anti-sentido curto da presente invenção é formulada como uma pró-droga. Em algumas modalidades, na administração in vivo, uma pró-droga é quimicamente con- vertida para a forma biologicamente, farmaceuticamente ou terapeuticamen- te mais ativa do composto anti-sentido curto. Em algumas modalidades, pró- drogas são úteis porque são mais fáceis de administrar do que a forma ativa correspondente. Por exemplo, em alguns casos, uma pró-droga pode ser mais biodisponível (por exemplo, através de administração oral) do que é a forma ativa correspondente. Em alguns casos, uma pró-droga pode ter apri- morada solubilidade comparada com a forma ativa correspondente. Em al- gumas modalidades, pró-drogas são menos solúveis em água do que a for- ma ativa correspondente. Em alguns casos, as pró-drogas referidas possu- em transmissão superior através das membranas celulares, onde a solubili- dade em água é prejudicial para a mobilidade. Em algumas modalidades, uma pró-droga é um éster. Em algumas modalidades referidas, o éster é metabolicamente hidrolisado para ácido carboxílico na administração. Em alguns casos o composto contendo ácido carboxílico é a forma ativa corres- pondente. Em algumas modalidades, uma pró-droga compreende um peptí- deo curto (poliaminoácido) ligado a um grupo ácido. Em algumas de seme- lhantes modalidades, o peptídeo é clivado na administração para formar a forma ativa correspondente.
Em algumas modalidades, uma pró-droga é produzida modifi- cando um composto farmaceuticamente ativo de tal modo que o composto ative será regenerado na administração in vivo. A pró-droga pode ser desig- nada para alterar a estabilidade metabólica ou as características de trans- porte de um fármaco, para mascarar efeitos colaterais ou toxicidade, para melhorar o sabor de um fármaco ou para alterar outras características ou propriedades de um fármaco. Em virtude do conhecimento de processos farmacodinâmicos e do metabolismo de fármacos in vivo, os versados nesta técnica, uma vez que um composto farmaceuticamente ativo seja conhecido, podem desenhar pró-drogas do composto (vide, por exemplo, Nogrady (1985) Medicinal Chemistry A Biochemical Approach1 Oxford University Press, New York, pp. 388-392).
Em algumas modalidades, uma composição farmacêutica com- preendendo um ou mais agentes farmacêuticos da presente invenção é útila para tratar algumas condições ou distúrbios em um mamífero, e particular- mente em um indivíduo humano. Vias de administração adequadas incluem, mas não estão limitadas a, oral, retal, transmucosa, intestinal, enteral, tópica, supositório, através de inalação, intratecal, intraventricular, intraperitoneal, intranasal, intraocular e parenteral (por exemplo, intravenosa, intramuscular, intramedular, e subcutânea). Em algumas modalidades, intratecais farma- cêuticos são administrados para obter exposições locais ao invés de sistê- micas. Por exemplo, composições farmacêuticas podem ser injetadas dire- tamente na área do efeito desejado (por exemplo, na área renal ou cardía- ca).
Em algumas modalidades, compostos anti-sentido curtos, com- parados com seus oligonucleotídeos precursores, os tornam particularmente adequados para administração oral. Em algumas modalidades, compostos anti-sentido curtos são mais adequados para administração oral do que seus oligonucleotídeos precursores porque têm aumentada potência comparados com os oligonucleotídeos precursores. Em algumas modalidades, compos- tos anti-sentido curtos são mais adequados para administração oral do que seus oligonucleotídeos precursores porque têm melhores propriedades de estabilidade, disponibilidade ou solubilidade comparados com os oligonucle- otídeos precursores.
Em um aspecto adicional, um agente farmacêutico é oligonu- cleotídeo Iiofilizado estérila que é reconstituído com um diluente adequado, por exemplo, água estérila para injeção. O produto reconstituído é adminis- trado como uma injeção subcutânea ou como uma infusão intravenosa de- pois de diluição em salina. O produto do fármaco Iiofilizado consiste do oli- gonucleotídeo o qual foi preparado em água para injeção, ajustado para pH .7.0-9.0 com ácido ou base durante a preparação, e em seguida liofilizado. O oligonucleotídeo Iiofilizado pode ser 25 a 800 mg do oligonucleotídeo. En- tende-se que isto engloba 25, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 425, 450, 475, 500, 525, 550, 575, 600, 625, 650, 675, 700, 725, 750, 775, e 800 mg de oligonucleotídeo liofilizado. O produto do fármaco liofilizado pode ser embalado em um frasco de vidro claro de 2 mL Tipo I, (tratado com sulfato de amônio), arrolhado com um fechamento de borracha de bromobutila e selado com um lacre de alumínio FLIP-OFF®.
As composições da presente invenção podem compreender adi- cionalmente outros componentes adjuntos encontrados convencionalmente em composições farmacêuticas, em seus níveis de uso estabelecidos na técnica. Portanto, por exemplo, as composições podem compreender mate- riais farmaceuticamente ativos, compatíveis adicionais, tais como, por exem- plo, antipruríticos, adstringentes, anestésicos locais ou agentes antiinflama- tórios, ou podem compreender materiais adicionais úteis em formular fisica- mente várias formas de dosagens das composições da presente invenção, tais como pigmentos, agentes aromatizantes, conservantes, antioxidantes, opacificantes, agentes espessantes e estabilizantes. No entanto, os materi- ais referidos, quando adicionados, não devem interferir indevidamente com as atividades biológicas dos componentes das composições da presente invenção. As formulações podem ser esterilizadas e, caso desejado, mistu- radas com agentes auxiliares, por exemplo, lubrificantes, conservantes, es- tabilizantes, agentes umectantes, emulsificantes, sais para influenciar a pressão osmótica, tampões, colorantes, flavorizantes e/ou substâncias aro- máticas e semelhantes os quais não interagem prejudicialmente com o(s) oligonucleotídeo(s) da formulação.
Os compostos anti-sentido proporcionados aqui, neste requeri- mento de patente, também podem ser misturados, encapsulados, conjuga- dos ou associados de modo diverso com outras moléculas, estruturas mole- culares ou misturas de compostos.
Também são descritas aqui, neste requerimento de patente, composições farmacêuticas e formulações as quais incluem os compostos anti-sentido proporcionados aqui, neste requerimento de patente. As compo- sições farmacêuticas podem ser administradas em uma série de modos de- pendendo de se é desejado tratamento local ou sistêmico e da área a ser tratada. Em uma modalidade preferencial, a administração é tópica para a superfície do trato respiratório, particularmente pulmonar, por exemplo, por nebulização, inalação, ou insuflação de pós ou aerosóis, pela boca e/ou na- riz.
As formulações farmacêuticas descritas aqui, neste requerimen- to de patente, as quais podem ser convenientemente apresentadas em for- ma de dosagem unitária, podem ser preparadas de acordo com técnicas convencionais de conhecimento geral na indústria farmacêutica. As técnicas referidas incluem a etapa de trazer em associação os ingredientes ativos com o um ou mais veículos farmacêuticos ou um ou mais excipientes. Em geral, as formulações são preparadsa trazendo uniformemente e intimamen- te em associação os ingredientes ativos com veículos líquidos, veículos sóli- dos finamente divididos, ou ambos, e em seguida, caso necessário, mode- lando o produto (por exemplo, em um tamanho de partícula específico para liberação). Em uma modalidade preferencial, as formulações farmacêuticas são preparadas para administração pulmonar em um solvente apropriado, por exemplo, água ou salina normal, possivelmente em uma formulação es- térila, com veículos ou outros agentes para permitir a formação de gotículas do diâmetro desejado para liberação usando inaladores, dispositivos para liberação nasal, nebulizadores, e outros dispositivos para liberação pulmo- nar. Alternativamente, as formulações farmacêuticas podem ser formuladas como pós secos para uso em inaladores de pó seco.
Um "veículo farmacêutico" ou "excipiente" pode ser um solvente farmaceuticamente aceitável, agente de suspensão ou qualquer outro veícu- lo farmacologicamente inerte para liberar um ou mais ácidos nucléicos a um indivíduo e são de conhecimento na técnica. O excipiente pode ser líquido ou sólido e é selecionado, com a maneira planejada de administração em mente, de modo a proporcionar a desejada massa, consistência, e etc., quando combinado com um ácido nucléico e os outros componentes de uma dada composição farmacêutica. Η. Alguns Usos Terapêuticos
Em algumas modalidades, compostos anti-sentido são usados para modular a expressão de um gene alvo em um animal, tal como um ser humano. Em algumas modalidades, os compostos referidos podem ser usa- dos para tratar distúrbios metabólicos ou modular uma ou mais indicações de doença. Por exemplo, os métodos compreendem a etapa de administrar ao referido animal que necessite de terapia para uma doença ou condição associada com um gene alvo uma quantidade eficaz de um composto anti- sentido que modula a expressão do gene alvo. Compostos anti-sentido pro- porcionados aqui, neste requerimento de patente, os quais efetivamente modulam a expressão de um RNA-alvo ou produtos protéicos de expressão são considerados compostos anti-sentido ativos. Compostos anti-sentido ativos também incluem compostos os quais efetivamente modulam uma ou mais de uma série de indicações de doença, incluindo indicações de doen- ças metabólicas e cardiovasculares, cujos exemplos são descritos abaixo.
A modulação da expressão de um gene alvo pode ser medida em um fluido corporal, o qual pode ou não conter células; tecido; ou órgão do animal. Métodos para obter amostras para análise, tais como fluidos cor- porais (por exemplo, escarro, soro, urina), tecidos (por exemplo, biópsia), ou órgãos, e métodos de preparação das amostras para permitir análise são de conhecimento geral daqueles versados na técnica. Métodos para análise dos níveis de RNA e proteína são discutidos acima e são de conhecimento geral daqueles versados na técnica. Os efeitos do tratamento podem ser avaliados medindo biomarcadores, ou indicações de doença, associados com a ex- pressão genética alvo nos fluidos, tecidos ou órgãos supracitados, coletados de um animal contactado com um ou mais compostos descrito aqui, neste requerimento de patente, por métodos clínicos de rotina de conhecimento na técnica. Estes biomarcadores incluem mas não estão limitados a: transami- nases hepáticas, bilirrubina, albumina, nitrogênio uréico sangüíneo, creatina e outros marcadores da função renal e hepática; interleucinas, fatores de necrose tumoral, moléculas de adesão intracelular, proteína C-reativa, qui- mocinas, citocinas, e outros marcadores de inflamação. Os compostos anti-sentido proporcionados aqui, neste requeri- mento de patente, podem ser utilizados em composições farmacêuticas adi- cionando uma quantidade eficaz de um composto a um diluente ou veículo farmaceuticamente aceitável adequado. Veículos e diluentes aceitáveis são de conhecimento geral daqueles versados na técnica. A seleção de um dilu- ente ou veículo se baseia em uma série de fatores, incluindo, mas não limi- tados a, a solubilidade do composto e a via de administração. Semelhantes considerações são de conhecimento geral daqueles versados na técnica. Em um aspecto, os compostos anti-sentido descrito aqui, neste requerimento de patente, inibem a expressão de um gene alvo. Os compostos também podem ser usados na fabricação de um medicamento para o tratamento de doenças e distúrbios relacionados com um gene alvo.
Métodos pelos quais fluidos corporais, órgãos ou tecidos são contactados com uma quantidade eficaz de um ou mais dos compostos anti- sentido ou composições são proporcionados aqui, neste requerimento de patente, também contemplados. Fluidos corporais, órgãos ou tecidos podem ser contactados com um ou mais dos compostos resultando em modulação da expressão genética alvo nas células de fluidos corporais, órgãos ou teci- dos. Uma quantidade eficaz pode ser determinada monitorando o efeito mo- dulador do composto anti-sentido ou compostos ou composições sobre áci- dos nucléicos alvo ou seus produtos por métodos de rotina do técnico versa- do.
Co-administração
Em algumas modalidades, dois ou mais compostos anti-sentido são co-administrados. Em algumas modalidades, composições farmacêuti- cas incluem um ou mais compostos anti-sentido, particularmente oligonucle- otídeos, dirigidos para um primeiro ácido nucléico e um ou mais compostos anti-sentido dirigidos para um segundo alvo de ácido nucléico. Um ou mais destes compostos anti-sentido podem ser um composto anti-sentido curto. Em algumas modalidades, composições farmacêuticas incluem dois ou mais compostos anti-sentido dirigidos para diferentes regiões do mesmo alvo de ácido nucléico. Um ou mais de semelhantes compostos anti-sentido podem ser um composto anti-sentido curto. Dois ou mais compostos combinados podem ser usados juntos ou seqüencialmente.
Em algumas modalidades, uma ou mais composições farmacêu- ticas são co-administradas com um ou mais agentes farmacêuticos diferen- tes. Em algumas modalidades, um ou mais outros agentes farmacêuticos referidos são designados para tratar a mesma doença ou condição que a uma ou mais composições farmacêuticas da presente invenção. Em algu- mas modalidades, um ou mais outros agentes farmacêuticos referidos são designados para tratar uma doença ou condição diferentes como a uma ou mais composições farmacêuticas da presente invenção. Em algumas moda- lidades, um ou mais outros agentes farmacêuticos referidos são designados para tratar um efeito indesejado de uma ou mais composições farmacêuticas da presente invenção. Em algumas modalidades, uma ou mais composições farmacêuticas da presente invenção são co-administradas com outro agente farmacêutico para tratar um efeito indesejado deste outro agente farmacêuti- co. Em algumas modalidades, uma ou mais composições farmacêuticas da presente invenção e um ou mais outros agentes farmacêuticos são adminis- trados ao mesmo tempo. Em algumas modalidades, uma ou mais composi- ções farmacêuticas da presente invenção e um ou mais outros agentes far- macêuticos são administrados em momentos diferentes. Em algumas moda- lidades, uma ou mais composições farmacêuticas da presente invenção e um ou mais outros agentes farmacêuticos são preparados juntos em uma única formulação. Em algumas modalidades, uma ou mais composições farmacêuticas da presente invenção e um ou mais outros agentes farmacêu- ticos são preparados separadamente.
Em algumas modalidades, agentes farmacêuticos que podem ser co-administrados com uma composição farmacêutica da presente inven- ção incluem agentes de redução de lipídeo. Em algumas modalidades referi- das, agentes farmacêuticos que podem ser co-administrados com uma com- posição farmacêutica da presente invenção incluem, mas não estão limita- dos uma atorvastatina, sinvastatina, rosuvastatina, e ezetimibe. Em algumas modalidades referidas, o agente de redução de lipídeo é administrado antes da administração de uma composição farmacêutica da presente invenção. Em algumas modalidades referidas, o agente de redução de lipídeo é admi- nistrado depois da administração de uma composição farmacêutica da pre- sente invenção. Em algumas modalidades referidas, o agente de redução de lipídeo é administrado ao mesmo tempo como uma composição farmacêuti- ca da presente invenção. Em algumas modalidades referidas, a dose de um agente de redução de lipídeo co-administrado é a mesma que a dose que seria administrada se o agente de redução de lipídeo fosse administrado sozinho. Em algumas modalidades referidas, a dose de um agente de redu- ção de lipídeo co-administrado é menor do que a dose que seria administra- da se o agente de redução de lipídeo fosse administrado sozinho. Em algu- mas modalidades referidas, a dose de um agente de redução de lipídeo co- administrado é maior do que a dose que seria administrada se o agente de redução de lipídeo fosse administrado sozinho.
Em algumas modalidades, um agente de redução de lipídeo co- administrado é um inibidor da HMG-CoA redutase. Em algumas modalidades referidas, o inibidor da HMG-CoA redutase é uma estatina. Em algumas mo- dalidades referidas, a estatina é selecionada entre atorvastatina, sinvastati- na, pravastatina, fluvastatina, e rosuvastatina. Em algumas modalidades, um agente de redução de lipídeo co-administrado é um inibidor da absorção de colesterol. Em algumas modalidades referidas, o inibidor da absorção de colesterol é ezetimibe. Em algumas modalidades, um agente de redução de lipídeo co-administrado é um inibidor da HMG-CoA redutase e inibidor da absorção de colesterol co-formulado. Em algumas modalidades referidas, o agente de redução de lipídeo co-formulado é ezetimibe/sinvastatina. Em al- gumas modalidades, um agente de redução de lipídeo co-administrado é um inibidor da proteína de transferência de triglicerídeos microssômicos.
Em algumas modalidades, um agente farmacêutico co- administrado é um seqüestrante de ácido biliar. Em algumas modalidades referidas, o seqüestrante de ácido biliar é selecionado entre colestiramina, colestipol, e colesevelam.
Em algumas modalidades, um agente farmacêutico co- administrado é um ácido nicotínico. Em algumas modalidades referidas, o ácido nicotínico é selecionado entre ácido nicotínico de liberação imediata, ácido nicotínico de liberação prolongada, e ácido nicotínico de liberação gra- dual.
Em algumas modalidades, um agente farmacêutico co- administrado é um ácido fíbrico. Em algumas modalidades referidas, um áci- do fíbrico é selecionado entre genfibrozila, fenofibrato, clofibrato, bezafibrato, e ciprofibrato.
Exemplos adicionais de agentes farmacêuticos que podem ser co-administrados com uma composição farmacêutica da presente invenção incluem, mas não estão limitados a, corticosteróides, incluindo mas não limi- tados à prednisona; imunoglobulinas, incluindo, mas não-limitadas à imuno- globulina intravenosa (IVIg); analgésicos (por exemplo, acetaminofen); agen- tes antiinflamatórios, incluindo, mas não limitados à drogas antiinflamatórias não-esteróides (por exemplo, ibuprofeno, inibidores de COX-1, e inibidores de COX-2); salicilatos; antibióticos; antivirais; agentes antifúngicos; agentes antidiabéticos (por exemplo, biguanidas, inibidores de glucosidase, insulinas, sulfoniluréias, e tiazolidenodionas); modificadores adrenérgicos; diuréticos; hormônios (por exemplo, esteróides anabólicos, androgênio, estrogênio, cal- citonina, progestina, somatostan, e hormônios tiroidianos); imunomodulado- res; relaxantes musculares; antihistamínicos; agentes contra osteoporose (por exemplo, bifosfonatos, calcitonina, e estrogênios); prostaglandinas, a- gentes antineoplásicos; agentes psicoterápicos; sedativos; produtos de poi- son oak ou poison sumac; anticorpos; e vacinas.
Em algumas modalidades, as composições farmacêuticas da presente invenção podem ser administradas em combinação com uma tera- pia de redução de lipídeo. Em algumas modalidades referidas, uma terapia de redução de lipídeo é alteração terapêutica do estilo de vida. Em algumas modalidades referidas, uma terapia de redução de lipídeo é aferese de LDL.
I. Kits, Reagentes de Pesquisa e Diagnósticos
Os compostos anti-sentido proporcionados aqui, neste requeri- mento de patente, podem ser utilizados para diagnósticos, e como reagentes de pesquisa e kits. Além disso, compostos anti-sentido, os quais são capa- zes de inibir a expressão genética ou modular a expressão genética com especificidade, são freqüentemente usados por aqueles de conhecimento regular para elucidar a função de genes particulares ou para distinguir entre funções de vários membros de um caminho biológico.
Para uso em kits e diagnósticos, os compostos anti-sentido des- crito aqui, neste requerimento de patente, quer sozinhos ou em combinação com outros compostos ou terapêuticos, podem ser usados como ferramen- tas em análises diferenciais e/ou combinatoriais para elucidar padrões de expressão de uma porção ou todo o complemento de genes expressados dentro de células e tecidos. Métodos de análise da expressão genética são de conhecimento geral daqueles versados na técnica. J. Algumas Vantagens de Compostos Anti-sentido Curtos
Em algumas modalidades, compostos anti-sentido curtos têm vantagens quando comparados com seus oligonucleotídeos precursores. Por exemplo, em determinadas modalidades, compostos anti-sentido curtos têm maior afinidade para um ácido nucléico alvo do que seu oligonucleotídeo precursor. Em algumas modalidades, compostos anti-sentido curtos têm maior potência in vitro do que seu oligonucleotídeo precursor. Em algumas modalidades referidas, esta aumentada potência in vitro não é inteiramente explicada por aumentada afinidade. Em algumas modalidades, semelhante potência in vitro aumentada pode ser atribuível a aumentada capacidade dos compostos anti-sentido curtos para penetrar nas células e/ou aumentada capacidade para acessar ácidos nucléicos alvos em uma célula. Em algu- mas modalidades, compostos anti-sentido curtos têm maior potência in vivo do que seus oligonucleotídeos precursores. Em algumas modalidades, se- melhante maior potência in vivo não é atribuível a aumentada potência in vitro ou aumentada afinidade. Em algumas modalidades, compostos anti- sentido curtos têm ainda maior potência in vivo comparados com seus oligo- nucleotídeos precursores do que seria prevista com base nas potências ou nas afinidades in vitro. Em algumas modalidades, semelhante aumentada potência in vivo pode ser atribuível a aumentada biodisponibilidade, melhor penetração na célula, melhor acesso a ácido nucléico alvo uma vez na célu- la, ou outros fatores.
Em algumas modalidades, se esperaria que compostos anti- sentido curtos fossem menos específicos paa seu ácido nucléico alvo com- parados com seus oligonucleotídeos precursores. Em algumas modalidades referidas, se esperaria aumento dos efeitos colaterais, incluindo potencial para efeitos tóxicos, de compostos anti-sentido curtos. Em algumas modali- dades, não são observados os efeitos colaterais adicionais referidos. Em algumas modalidades, ácidos nucléicos não-alvo aos quais um composto anti-sentido curto em particular pode ligar não estão disponíveis para o com- posto anti-sentido curto. Em semelhantes modalidades, efeitos colaterais, incluindo toxicidade, são menos problemáticos do que seria previsto.
Em algumas modalidades, como eles são menores, os compos- tos anti-sentido curtos têm menos probabilidade de ligar proteínas. Em al- gumas modalidades referidas, semelhante menos ligação de proteínas resul- ta em menor toxicidade, uma vez que a ligação de proteínas pode ter conse- qüências indesejáveis. Em algumas modalidades, semelhante menos liga- ção de proteínas resulta em maior potência, uma vez que deixa mais com- posto anti-sentido disponível para efeito terapêutico. Em algumas modalida- des, menos ligação de proteínas resulta em reduzida toxicidade de interação fármaco-fármaco.
Descrição Não Limitante e Incorporação por Meio de Referência
Apesar de alguns compostos, composições e métodos descritos aqui, neste requerimento de patente, terem sido descritos com especificida- de de acordo com algumas modalidades, os exemplos seguintes servem somente para ilustrar os compostos descritos aqui, neste requerimento de patente, e não se pretende que limitem a mesma. Cada uma das referên- cias, números de acesso do GenBank, e semelhantes mencionados no pre- sente requerimento são incorporados aqui, neste requerimento de patente, por meio de referência em sua totalidade.
Exemplo 1
Cultura Celular e Tratamento com Compostos Anti-sentido Curtos O efeito de compostos anti-sentido curtos sobre a expressão de ácidos nucléicos alvo pode ser testado em qualquer um de uma série de li- nhagens celulares cultivadas ou primárias. As linhagens celulares podem ser obtidas a partir de fontes disponíveis publicamente, tais como a American Type Culture Collection (Manassas, VA). As células são culivadas de acordo com métodos de conhecimento geral daqueles com conhecimento regular da técnica.
Quando as células atingiram confluência apropriada, foram tra- tadas com oligonucleotídeo usando LIPOFECTIN® conforme descrito. Quan- do as células atingiram 65 a 75% de confluência, foram tratadas com oligo- nucleotídeo. Oligonucleotídeo foi misturado com LIPOFECTIN® (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA) em meio de soro reduzido Opti-MEM®-1 (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA) para obter a concentração de- sejada de oligonucleotídeo e uma concentração de LIPOFECTIN® de 2,5 ou .3 pg/mL por 100 nM de oligonucleotídeo. Esta mistura de transfecção foi in- cubada em temperatura ambiente por aproximadamente 0,5 horas. Para cé- lulas cultivadas em lâminas de 96 cavidades, as cavidades foram lavadas uma vez com 100 μί de OPTI-MEM®-1 e em seguida tratadas com 130 pL da mistura de transfecção. Células cultivadas em lâminas de 24 cavidades ou outras lâminas de cultura de tecido padrão foram tratadas de modo simi- lar, usando volumes apropriados de meio e oligonucleotídeo. As células fo- ram tratadas e os dados foram obtidos em duplicata ou triplicata. Depois de aproximadamente 4 a 7 horas de tratamento a 37°C, o meio contendo a mis- tura de transfecção foi substituído com meio de cultura fresco. As células foram colhidas 16 a 24 horas depois do tratamento com oligonucleotídeos.
Oligonucleotídeos controle são usados para determinar a con- centração ótima de composto oligomérico para uma linhagem celular particu- lar. Além disso, quando compostos oligoméricos são testados em experi- mentos de triagem de compostos oligoméricos ou provas fenotípicas, oligo- nucleotídeos controle são testados em paralelo.
A concentração de oligonucleotídeos usada varia de linhagem celular para linhagem celular. Para determinar a concentração de oligonu- cleotídeos ótima para uma linhagem celular particular, as células são trata- das com um oligonucleotídeo controle positivo em uma faixa de concentra- ções. A concentração de oligonucleotídeo controle positivo que resulta em .80% de inibição do RNAm-alvo é em seguida utilizado como a concentração de triagem para novos oligonucleotídeos em experimentos subseqüentes para esta linhagem celular. Se não forem obtidos 80% de inibição, a menor concentração de oligonucleotídeo controle positivo que resulta em 60% de inibição do RNAm-alvo é em seguida utilizada como a concentração de tria- gem de oligonucleotídeos em experimentos subseqüentes para esta Iinha- gem celular. Se não forem obtidos 60% de inibição, esta linhagem celular em particular é considerada como inadequada para experimentos de transfec- ção de oligonucleotídeos. As concentrações de oligonucleotídeos anti- sentido usadas aqui, neste requerimento de patente, são de 50 nM a 300 nM quando o oligonucleotídeo anti-sentido é transfectado usando um reagente de Iipossoma e 1 nM a 40 nM quando o oligonucleotídeo anti-sentido é trans- fectado por eletroporação.
Exemplo 2: Análise de PCR Quantitativo em Tempo Real dos Níveis de RNAm Alvo
Foi realizada quantificação dos níveis de RNAm-alvo por PCR quantitativo em tempo real usando o sistema de detecção de seqüência ABI PRISM® 7600, 7700, ou 7900 Sequence Detection System (PE-Applied Bi- osystems, Foster City, CA) de acordo com as instruções do fabricante.
Antes de análise por PCR quantitativo, séries de iniciador-sonda específicas para o gene alvo sendo medido foram avaliadas para sua capa- cidade para serem "multiplexadas" com uma reação de amplificação GAP- DH. Depois de isolamento o RNA é submetido à reação de transcriptase re- versa seqüencial (TA) e PCR em tempo real, ambas as quais são realizadas na mesma cavidade. Reagentes de TA e PCR foram obtidos da Invitrogen Life Technologies (Carlsbad, CA). TA, PCR em tempo real foi realizado na mesma adicionado 20 μΙ_ de coquetel de PCR (2,5x tampão de PCR menos MgCI2, 6,6 mM de MgCI2, 375 μΜ cada de dATP, dCTP, dCTP e dGTP, 375 nM cada de inciador dianteiro e primer reverso, 125 nM de sonda, 4 Unida- des de inibidor de RNAse1 1,25 Unidades de PLATINUM® Taq1 5 Unidades de transcriptase reversa MuLV1 e 2,5x de corante ROX) a lâminas de 96 ca- vidades contendo 30 μΙ_ de solução de RNA total (20 a 200 ng). A reação de TA foi realizada por incubação por 30 minutos a 48°C. Depois de uma incu- bação de 10 minutos a 95°C para ativar a PLATINUM® Taq1 foram realizados 40 ciclos de um protocolo de PCR de duas etapas: 95°C por 15 segundos (desnaturação) seguido por 60°C por 1,5 minutos (recozimento/extensão).
Quantidades alvo de gene obtidas por TA, PCR em tempo real foram normalizadas usando ou o nível de expressão de GAPDH, um gene cuja expressão é constante, ou por quantificação do RNA total usando Ri- boGreen® (Molecular Probes, Inc. Eugene, OU). A expressão de GAPDH foi quantificada por TA, PCR em tempo real, sendo realizada simultaneamente com o alvo, multiplexando, ou separadamente. RNA total foi quantificado usando reagente de quantificação de RNA RiboGreen® (Molecular Probes, Inc. Eugene, OU).
170 μL de reagente de operação RiboGreen® (reagente Ribo- Green® diluído a 1:350 em 10 mM de Tris-HCI, 1 mM de EDTA, pH 7.5) foi pipetado em uma lâmina de 96 cavidades contendo 30 μΙ_ de RNA celular purificado. A lâmina foi lida em um CytoFIuor® 4000 (PE Applied Biosystems) com excitação a 485 nm e emissão a 530nm.
As sondas de PCR GAPDH têm JOE ligado de modo covalente à extremidade 5' e TAMRA ou MGB ligado de modo covalente à extremidade 3', onde JOE é o corante repórter fluorescente e TAMRA ou MGB é o coran- te temperador. Em alguns tipos de células, primers e sonda designados para uma seqüência GAPDH de uma espécie diferente são usados para medir a expressão de GAPDH. Por exemplo, uma série de primers e sondas de GAPDH humano é usada para medir a expressão de GAPDH em células e linhagens celulares derivadas de macacos.
Sondas e primers para uso em PCR em tempo real foram desig- nados para hibridizar a ácidos nucléicos alvo usando métodos de rotina. Por exemplo, o programa PrimerExpress® (Applied Biosystems, Foster City, CA) é usado rotineiramente para designar sondas e primers para uso em PCR em tempo real. Exemplos de seqüências de primers e sondas e os ácidos nucléicos alvo aos quais hibridizam são apresentados na Tabela 24. As son- das de PCR alvo-específicas têm FAM ligado de modo covalente à extremi- dade 5' e TAMRA ou MGB ligados de modo covalente à extremidade 3', on- de FAM é o corante fluorescente e TAMRA ou MGB é o corante temperador. Tabela 24
Primers e Sondas Alvo-específicos para Uso em PCR em Tempo Real
<table>table see original document page 480</column></row><table> <table>table see original document page 481</column></row><table>
Exemplo 3: Compostos Anti-sentido Curtos Dirigidos para um ácido nucléico ApoB e tendo as modificações 2'-MOE ou metilenoóxi (4'-CH2-0-2') BNA
Camundongos machos Balb/c de seis semanas de idade (Jack- son Laboratory, Bar Harbor, ME) foram injetados intraperitonealmente (i.p.) com compostos anti-sentido dirigidos para ApoB1 em uma freqüência de du- as vezes por semana por três semanas. Doses de compostos anti-sentido incluíram 2,4, 1,2, 0,6, 0,3 e 0,15 pmol/kg. Para compostos anti-sentido de 14 nucleotídeos de extensão, estas doses eqüivalem a aproximadamente 12, 6, 3, 1,5 ou 0,75 mg/kg, respectivamente. São mostradas na Tabela 25 as seqüências e motivos dos compostos anti-sentido usados neste estudo. Os compostos anti-sentido têm ou 20 ou 14 nucleotídeos de extensão e têm uma região de "gap" central consistindo em dez 2'-desoxinucleotídeos flan- queados por asas tendo 2'-0-metoxietila (2'-MOE) ou "asas" modificadas com BNA. Por exemplo, o motivo de gápmero 2-10-2 MOE indica um com- posto anti-sentido com um gap de dez nucleotídeos flanqueado por asas de 2 nucleotídeo com modificações 2'-MOE. Resíduos em negrito indicam por- ções 2'-0-metoxietila e resíduos em itálico indicam metilenoóxi (4'-CH2-0-2') BNAs. As ligações internucleosídeos de cada composto são fosforotioato em toda parte. Todos os resíduos citosina de ISIS 147764 e ISIS 372938 são substituídos por 5-metila citosinas. Para ISIS 387462, somente o resíduo citosina na asa do composto é substituído por 5-metila citosina. Compostos anti-sentido ApoB são dirigidos para seqüências ApoB-100 disponíveis pu- blicamente, incluindo Nq de Acesso Genbank XM_137955.5 (SEQ ID NO: 2). Tabela 25: Compostos Anti-sentido Dirigidos para um ácido nucléico ApoB
<table>table see original document page 482</column></row><table>
Quarenta e oito horas depois da injeção final, os camundongos foram sacrificados para avaliar as transaminases (Tabela 26); peso hepático e renal (Tabela 27); os níveis de triglicerídeo, LDL, HDL e ácidos graxos li- vres (Tabela 28); o nível de RNAm-alvo no fígado (Tabela 29); o nível de proteína alvo no plasma; e a concentração tecidual de oligonucleotídeo (Ta- bela 30). Estes desfechos foram determinados usando métodos descritos aqui, neste requerimento de patente, e de conhecimento geral daqueles cojm conhecimento regular da técnica.
Tabela 26: Níveis de ALT e AST (ML)
<table>table see original document page 482</column></row><table> <table>table see original document page 483</column></row><table> Tabela 27: Peso do Fígado e do Rim (% de controle de salina)
<table>table see original document page 483</column></row><table>
O peso corporal total e o consumo de ração não diferiu significa- tivamente entre animais tratados com salina ou tratados com oligonucleotí- deo. Os níveis de glicose também foram similares entre todos os grupos de tratamento.
Tabela 28: Níveis de Triglicerídeos (TRIG), Colesterol Total (CHOL), HDL1 LDLe
Ácidos Graxos Livres (FFA)
<table>table see original document page 483</column></row><table> <table>table see original document page 484</column></row><table>
Tabela 29: % do Nível de RNAm ApoB (relativa a controle de salina)
<table>table see original document page 484</column></row><table>
Tratamento com ISIS 387462 resultou em uma redução significa- tiva e dose-dependente em triglicerídeos, colesterol total, HDL, LDL e ácidos graxos livres. De acordo com estes achados fenotípicos, tratamento com ISIS 387462 também levou a uma redução dose-dependente nos níveis de RNAm ApoB (Tabela 29) e de proteína (não mostrado) no plasma de ca- mundongo. Para determinar se o aumento observado na eficiência com o gápmero metilenoóxi (4'-CH2-0-2') BNA é devido a um aumento no acúmulo de oligonucleotídeos, foram determinadas a concentração de oligonucleotí- deos total e extensão total no fígado e no rim.
Tabela 30: Extensão Total e Concentração Tecidual Total de Composto Anti- sentido (μΜ) Relativa ao Nível de RNAm ApoB (% de controle de salina)
<table>table see original document page 484</column></row><table> <table>table see original document page 485</column></row><table>
Os níveis do gápmero 2-10-2 metilenoóxi (4'-CH2-0-2') BNA fo-
ram similares aos gápmeros 5-10-5 e 2-10-2 MOE no rim, mas significativa- mente reduzidos no fígado. A EC50 para ISIS 387462 no fígado foi determi- nada comparando a concentração de oligonucleotídeos no fígado para inibi- ção de RNAm ApoB. A EC50 aproximada para ISIS 387462 é 1 μΜ. Em con- traste, um composto de gápmero 5-10-5 MOE eficaz tipicamente tem uma EC50 de aproximadamente 15 μΜ no fígado.
Tomados juntos, estes resultados demonstram que o gápmero curto ApoB tendo metilenoóxi (4'-CH2-0-2') nas asas é um potente inibidor da expressão de RNAm-alvo e pode reduzir de modo eficaz os triglicerídeos, o colesterol e ácidos graxos livres. A potência do composto anti-sentido curto não parece ser um resultado de aumento da acumulação tecidual uma vez que níveis similares do composto foram observados no rim e níveis reduzi- dos foram encontrados no fígado, em relação ao gápmero 5-10-5 MOE. A- lém disso, o gápmero metilenoóxi (4'-CH2-0-2') BNA apresentou poucos ou nenhum efeitos colaterais adversos.
Exemplo 4: Compostos Anti-sentido Curtos Dirigidos para um ácido nucléico GCGR e tendo Modificações 2'-MOE
Camundongos machos C57/BL6 de oito semanas de idade (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME) foram administrados uma única dose de oligonucleotídeo GCGR por injeção intraperitoneal a uma concentração de 6,25, 12,5, 25 ou 50 mg. Cada grupo de dose consistiu em quatro ani- mais. São apresentadas na Tabela 31 as seqüências, motivos e conjugados dos compostos anti-sentido GCGR usados neste estudo. Resíduos em negri- to indicam por??es 2'-0-metoxietila (2'-MOE). Todos os compostos compre- endem liga??es internucleosídeos fosforotioato em toda parte e cada citosi- na é substituída com 5-metilcitosina. ISIS 386626, ISIS 386627 e ISIS 386628 adicionalmente compreendem um grupo Ci6 conjugado fixado à po- si??o 2'-0 do a?úcar através de uma liga??o diamida (2'- 0CH2C(=0)N(H)(CH2)4N(H)C(=0)-(CH2)i5CH3). Compostos anti-sentido GCGR têm por alvo seqüências GCGR publicadas, incluindo Genbank? Nq de Acesso BC031885.1 (SEQ ID NO: 7).
Tabela 31: Compostos anti-sentido curtos dirigidos para um ácido nucléico GCGR
<table>table see original document page 486</column></row><table>
Os camundongos foram sacrificados 48 horas depois de inje??o para determinar os níveis de transaminase sérica (Tabela 32); peso do fíga- do, de tecido adiposo branco (WAT), do ba?o e do rim (Tabela 33); os níveis de colesterol, triglicerídeo e glicose (Tabela 34); os níveis de RNAm GCGR (Tabelas 35-41); e a extens?o total e a concentra??o de oligonucleotídeos total no fígado e no rim (Tabela 42). Desfechos foram avaliados usando mé- todos descritos aqui e de conhecimento geral daqueles versados na técnica. S?o incluídos dados de uma sangria pré-tratamento (Pré-Sangria) e sangria pós-tratamento (Pós-Sangria).pós-tratamento (Pós-Sangria). Tabela 32: Níveis de ALT e AST (IU/L) <table>table see original document page 487</column></row><table>
Tabela 33: Pesos dos Órgãos (% de controle de salina) <table>table see original document page 487</column></row><table> <table>table see original document page 488</column></row><table>
No total, os compostos anti-sentido GCGR apresentaram poucos a nenhum efeitos colaterais adversos. Tabela 34: Níveis de Triglicerídeos (TRIG), Colesterol (CHOL) e Glicose
(IU/L)
<table>table see original document page 489</column></row><table>
Gápmeros GCGR 2-10-2 MOE apresentaram uma tendência para reduzir os níveis de triglicerídeos pós-sangria, em relação ao gápmero .5-10-5 MOE, com ISIS 386628 e ISIS 386594 tendo o maior efeito dose- dependente. Os níveis de glicose também foram reduzidos em uma maneira dose-dependente depois de tratamento com ISIS 386626 e ISIS 386627. Tratamento com ISIS 386628, ISIS 386593 e ISIS 386594 também levou geralmente a uma redução nos níveis de glicose pós-sangria. Os níveis de colesterol não pareceram diferir significativamente entre os grupos de trata- mento.
Para determinar se as alterações fenotípicas mostradas acima se correlacionam com uma redução no RNAm GCGR, animais tratados fo- ram avaliados para os níveis de RNAm-alvo no fígado por PCR em tempo real de acordo com métodos descritos aqui. As Tabelas 35 a 41 apresentam resultados de comparações diretas dos compostos anti-sentido tendo por alvo ácido nucléico GCGR para seu efeito sobre expressão-alvo. Resultados são expressados como percentagem de controle de salina. Tabela 35: Níveis de RNAm GCGR depois de tratamento com ISIS 148364 e ISIS 386626
<table>table see original document page 490</column></row><table>
Tabela 37: Níveis de RNAm GCGR depois de tratamento com ISIS 148364 e ISIS 386593
<table>table see original document page 490</column></row><table> Tabela 38: Níveis de RNAm GCGR depois de tratamento com ISIS 148364 e ISIS 386628
<table>table see original document page 491</column></row><table>
Tabela 39: Níveis de RNAm GCGR depois de tratamento com ISIS 148364 e ISIS 386594
<table>table see original document page 491</column></row><table>
Tabela 40: Níveis de RNAm GCGR depois de tratamento com ISIS 386627 e ISIS 386593
<table>table see original document page 491</column></row><table>
Tabela 41: Níveis de RNAm GCGR depois de tratamento com ISIS 386628 e ISIS 386594
<table>table see original document page 491</column></row><table>
Tratamento com os gápmeros 2-10-2 MOE levou a uma redução dose-dependente significativa na expressão de RNAm GCGR. ISIS 386626 apresentou a maior redução no RNAm-alvo. Para determinar se o aumento observado na eficiência com os compostos anti-sentido curtos é devido a um aumento no acúmulo de composto anti-sentido, foram determinadas a ex- tensão total e a concentração de composto anti-sentido total no fígado e no rim. Tabela 42: Concentrações de Compostos Anti-sentidos Totais e Extensão Total no Fígado e no Rim (μg/g) <table>table see original document page 492</column></row><table>
Os resultados mostrados na Tabela 42 demonstram que com- postos anti-sentido curtos compreendendo um conjugado Ci6 apresentam um aumento significativo no acúmulo de composto anti-sentido tanto no fí- gado quanto no rim. No entanto, ISIS 386593, o qual foi eficaz para reduzir os níveis de RNAm-alvo, triglicerídeos e glicose, acumula para um nível simi- lar ao gápmero 5-10-5 MOE no fígado e para um nível menor no rim. Estes resultados sugerem que apesar de conjugação com Ci6 poder aumentar a concentração de composto anti-sentido no fígado e no rim, não é responsá- vel inteiramente pela eficácia dos compostos anti-sentido curtos.
Tomados juntos, estes resultados demonstram que compostos anti-sentido curtos GCGR são capazes de inibir significativamente a expres- são de RNAm-alvo ao mesmo tempo que também reduzindo os níveis de triglicerídeos e glicose. Além disso, com a exceção de ISIS 386627, os gáp- meros MOE curtos apresentam poucos ou nenhum efeitos tóxicos. Exemplo 5: Compostos anti-sentido curtos tendo por alvo a um ácido nucléi- co GCGR e tendo modificações 2'-M0E e Metilenoóxi (4'-CH2-0-2') BNA
Camundongos machos C57/BL6 de oito semanas de idade (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME) foram administrados uma única dose de composto anti-sentido GCGR por injeção intraperitoneal (i.p.) a uma con- centração de 10, 3,2, 1, e 0,32 μιτιοΙ.Ι^. Cada grupo de dose consistiu em quatro animais. São mostrados na Tabela 43 as seqüências, motivos e con- jugados dos compostos anti-sentido GCGR usado neste estudo. Resíduos em negrito indicam modificações 2'-0-metoxietila (2'-M0E) e os resíduos em itálico indicam modificações metilenoóxi (4'-CH2-0-2') BNA. Todos os com- postos anti-sentido compreendem ligações internucleosídeos fosforotioato em toda parte e cada citosina é substituída com 5-metilcitosina. Compostos anti-sentido têm por alvo ácidos nucléicos GCGR publicados, incluindo Gen- bank N9 de Acesso BC031885.1 (SEQ ID NO: 7).
Tabela 43: Compostos Anti-sentido dirigidos para um ácido nucléico GCGR
<table>table see original document page 493</column></row><table>
Para determinar se as alterações fenotípicas mostradas acima se correlacionaram com uma redução no RNAm GCGR, animais tratados foram avaliados para níveis de RNAm-alvo no fígado por TA, PCR em tempo real de acordo com métodos descritos aqui. A Tabela 44 mostra resultados de comparações diretas dos compostos anti-sentido tendo por alvo ácido nucléico GCGR para seu efeito sobre a expressão-alvo. Os resultados são expressados como percentagem de controle de salina. Tabela 44: Níveis de RNAm GCGR
ISIS Nº 0,32 pmol/kg 1 pmol/kg 3,2 pmol/kg 10 pmol/kg 148364 105 106 73 38 <table>table see original document page 494</column></row><table>
Conforme mostrado na Tabela 44, cada composto anti-sentido curto tendo modificações metilenoóxi (4'-CH2-0-2') BNA demonstrou uma redução dose-dependente nos níveis de RNAm GCGR. Além disso, os com- postos anti-sentido curtos foram mais eficazes na redução-alvo do que o gápmero 5-10-5 MOE. Cada composto anti-sentido curto compreendendo metilenoóxi (4'-CH2-0-2') BNA nas asas resultou em uma redução significati- va na proteína GCGR em relação tanto a tratamento com controle de salina quanto com ISIS 148364. Em seguida, concentrações de ED50 estimadas para cada anti-sentido foram calculadas usando Graphpad Prism; ED50 é a dose na qual é observado 50% da redução de RNAm. Os resultados são mostrados abaixo na Tabela 45.
Tabela 45: Concentração da ED50 Estimada
<table>table see original document page 494</column></row><table>
Exemplo 6: Compostos Anti-sentido Curtos tendo por alvo um ácido nucléico PTEN e tendo Modificações metilenoóxi (4'-CH2-0-2') BNA
Camundongos machos Balb/c de seis semanas de idade (Jack- son Laboratory, Bar Harbor, ME) foram administrados uma única injeção i.p. de PTEN composto anti-sentido em uma dose de 8 Mmol/kg. Cada grupo de dose consistiu em quatro animais. São mostrados na Tabela 46 as seqüên- cias e motivos dos compostos anti-sentido PTEN usados neste estudo. Re- síduos em negrito indicam porções 2'-0-metoxietila (2'-MOE) e resíduos em itálico indicam nucleotídeos Metilenoóxi BNA. Cada composto anti-sentido compreende ligações fosforotioato em toda parte. Além disso, os resíduos citosina no gap de ISIS 384073 e nas asas de ISIS 392056, ISIS 392057, ISIS 392061 e ISIS 392063 são substituídos com 5-metilcitosinas. Compos- tos anti-sentido têm por alvo ácidos nucléicos PTEN publicados, incluindo Genbank N9 de Acesso U92437.1 (SEQ ID NO: 13).
Tabela 46: Compostos Anti-sentido dirigidos para um ácido nucléico PTEN
<table>table see original document page 495</column></row><table> <table>table see original document page 496</column></row><table>
Os camundongos foram sacrificados 72 horas depois de injeção para determinar os níveis séricos de transaminase (Tabela 47); pesos do fígado e do baço (Tabela 47); e os níveis de RNAm PTEN no fígado, rim e gordura (Tabela 48), de acordo com procedimentos descritos aqui e de co- nhecimento geral de uma pessoa versada na técnica.
Tabela 47: Níveis de Transaminase e Pesos dos Órgãos
<table>table see original document page 496</column></row><table>
No total, os compostos anti-sentido curtos com modificações me- tilenoóxi (4'-CH2-0-2') BNA apresentaram poucos a nenhum efeitos adver- sos. Além disso, o peso corporal total não diferiu significativamente entre os grupos de tratamento.
Tabela 48: % dos níveis de RNAm PTEN em Fígado, Rim e Gordura <table>table see original document page 496</column></row><table> <table>table see original document page 497</column></row><table>
Conforme mostrado na Tabela 48, cada composto anti-sentido dirigido para um ácido nucléico PTEN levou a uma redução significativa nos níveis de RNAm-alvo no fígado comparados com animais tratados com sali- na e tratados com controle. Os compostos anti-sentido tiveram vários efeitos sobre os níveis de RNAm-alvo no rim e em gordura.
Exemplo 7: Compostos Anti-sentido Curtos tendo por alvo um ácido nucléico PTEN e tendo Modificações de BNA
Camundongos machos Balb/c de seis semanas de idade (Jack- son Laboratory, Bar Harbor, ME) foram administrados uma única injeção in- traperitoneal (i.p.) de composto anti-sentido dirigido para um ácido nucléico PTEN em uma dose de 8, 4, 2 ou 1 pmol/kg. Cada grupo de dose consistiu em quatro animais. São mostrados na Tabela 49 a seqüência, química de asa e motivo de cada composto anti-sentido usado neste estudo. Resíduos em negrito indicam nucleotídeos modificados 2'-M0E, letras em itálico indi- cam modificações metilenoóxi (4'-CH2-0-2') BNA. Todos os compostos anti- sentido compreendem ligações fosforotioato em cada posição. Cada citosina de ISIS 116847 e os resíduos citosina nas asas metilenoóxi (4'-CH2-0-2') BNA de ISIS 392063 são substituídos com 5-metilcitosinas, com os resíduos timidina nas asas metilenoóxi (4'-CH2-0-2') BNA de ISIS 392745 sendo substituídos com 5-metila timidinas. Compostos anti-sentido têm por alvo ácidos nucléicos PTEN publicados, incluindo Genbank Nq de Acesso U92437.1 (SEQ ID NO: 13).
Tabela 49: Compostos Anti-sentido Dirigidos para um Ácido Nucléico PTEN
<table>table see original document page 497</column></row><table> <table>table see original document page 498</column></row><table>
Os camundongos foram sacrificados 72 horas depois de injeção para determinar os níveis séricos de transaminase (Tabela 50); os pesos do fígado, rim e baço (Tabela 50); os níveis de RNAm PTEN no fígado (Tabela .51); e a concentração de oligonucleotídeos da ED50 estimada (Tabela 52). Estes desfechos foram medidos usando métodos descritos aqui e de conhe- cimento geral daqueles versados na técnica. Tabela 50: Níveis de AST1 ALT e Bilirrubina e Pesos dos Órgãos
<table>table see original document page 498</column></row><table>
No total, os compostos anti-sentido PTEN não apresentaram sinais significativos de toxicidade. Os pesos do rim, fígado e baço estavam todos dentro de faixas normais. O peso corporal total não diferiu significati- vamente entre os grupos de tratamento. Tabela 51: % dos níveis de RNAm PTEN em Fígado (relativo a controle de salina)
Conforme mostrado na Tabela 51, cada composto anti-sentido curto tendo modificações metilenoóxi (4'-CH2-0-2') BNA demonstrou uma redução dose-dependente nos níveis de RNAm PTEN. Além disso, os com- postos anti-sentido curtos foram mais eficazes na redução-alvo do que o gápmero 5-10-5 MOE. Os níveis de proteína PTEN no fígado também foram determinados depois de administração de cada composto anti-sentido em uma dose de 8 pmol/kg. Cada composto anti-sentido curto compreendendo metilenoóxi (4'-CH2-0-2') BNA nas asas resultou em uma redução significati- va na proteína PTEN em relação tanto a controle de salina quanto tratamen- to com ISIS 116847. Em seguida, concentrações de ED50 estimadas para cada uma oligonucleotídeo foram calculadas usando Graphpad Prism. Os resultados são mostrados abaixo na Tabela 52. Tabela 52: Concentração de ED5Q Estimada
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Para investigar adicionalmente diferentes tipos de compostos de ácidos nucléicos bicíclicos, uma série adicional de compostos anti-sentido curtos tendo por alvo um ácido nucléico PTEN foi designada e testada. Ca- mundongos machos Balb/c de seis semanas de idade (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME) foram administrados uma única injeção intraperitoneal (i.p.) de composto anti-sentido em uma dose de 8, 4, 2 ou 1 pmol/kg. Cada grupo de dose consistiu em quatro animais. São mostrados na Tabela 53 a se- qüência, química de asa e motivo de cada composto anti-sentido usado nes- te estudo. Todos os compostos anti-sentido compreendem ligações fosforo- tioato em cada posição. Os resíduos citosina nas asas metilenoóxi (4'-CH2- o-2') BNA de ISIS 392063 são substituídos com 5-metilcitosinas. O compos- to anti-sentido tem por alvo ácidos nucléicos PTEN publicados, incluindo Genbank Ns de Acesso U92437.1 (SEQ ID NO: 13).
Tabela 53: Compostos Anti-sentido tendo por alvo um Ácido Nucléico PTEN
<table>table see original document page 500</column></row><table>
Os camundongos foram sacrificados 72 horas depois de injeção para determinar os níveis séricos de transaminase (Tabela 54); os pesos do fígado e do baço (Tabela 54); e os níveis de RNAm PTEN no fígado (Tabela 55), de acordo com métodos descritos aqui e de conhecimento geral daque- les versados técnica.
Tabela 54: Níveis de AST e ALT e Pesos dos Órgãos
<table>table see original document page 500</column></row><table> <table>table see original document page 501</column></row><table>
Tabela 55: % dos níveis de RNAm PTEN no Fígado (relativo a controle de salina)
<table>table see original document page 501</column></row><table>
Conforme mostrado acima, compostos anti-sentido curtos tendo modificações α-L-metilenoóxi (4'-CH2-0-2') BNA levaram a uma redução do- se-dependente nos níveis de RNAm-alvo. Tratamento com o composto anti- sentido curto tendo modificações oxiamino BNA levou a uma redução mo- desta na expressão-alvo.
Exemplo 8. Estudo de Resposta de Dose de Administração de Dose Única com Compostos Anti-sentido Curtos Tendo por alvo Ácidos Nucléicos ApoB e PTEN
Camundongos machos Balb/c de seis semanas de idade (Jack- son Laboratory, Bar Harbor, ME) foram administrados uma única injeção in- traperitoneal (i.p.) de composto anti-sentido em uma dose de 8, 4, 2 ou 1 pmol/kg. Cada grupo de dose consistiu em quatro animais. São mostrados na Tabela 56 a seqüência, química de asa e motivo de cada composto anti- sentido usado neste estudo. Resíduos em itálico indicam modificações meti- lenoóxi (4'-CH2-0-2') BNA, resíduos sublinhados indicam modificações N- metila-oxiamino (4'-CH2-N(CH3)-0-2') BNA, e resíduos envolvidos por caixa indicam modificações α-L-metilenoóxi (4'-CH2-0-2') BNA. Todos os compos- tos anti-sentido compreendem ligações fosforotioato em cada posição. Cada citosina de ISIS 116847 e os resíduos citosina nas asas metilenoóxi (4'-CH2- 0-2') BNA de ISIS 392063 são substituídos com 5-metilcitosinas, ao passo que resíduos tímidina nas asas metilenoóxi (4'-CH2-0-2') BNA de ISIS 392745 são substituídos com 5-metila timidinas. Compostos anti-sentido PTEN têm por alvo ácido nucléico PTEN publicado, incluindo Genbank Ns de Acesso U92437.1 (SEQ ID NO: 13). Compostos anti-sentido ApoB têm por alvo ácido nucléico ApoB publicado, incluindo Genbank N9 de Acesso XM_137955.5 (SEQ ID NO: 2).
Tabela 56: Compostos Anti-sentido Curtos Dirigidos para Ácidos Nucléicos ApoB e PTEN
<table>table see original document page 502</column></row><table>
Tabela 57: % de Redução de RNAm ApoB e PTEN (relativa a controle de salina)
<table>table see original document page 502</column></row><table> <table>table see original document page 503</column></row><table>
Conforme mostrado na Tabela 57, cada composto anti-sentido curto tendo modificações Metilenoóxi BNA demonstrara uma redução dose- dependente nos níveis de RNAm-alvo. Notavelmente, o composto anti- sentido curto com asas N-metila-oxiamino BNA (ISIS 396565) também de- monstrou redução dose-dependente na expressão de PTEN similar tanto aos compostos anti-sentido curtos β-D-metilenoóxi BNA quanto a-L- metilenoóxi BNA. Em seguida, as concentrações de ED50 estimadas para cada um anti-sentido foram calculadas usando Graphpad Prism. Os resulta- dos são mostrados abaixo na Tabela 58.
Tabela 58: Concentrações da ED50 Estimada <table>table see original document page 503</column></row><table>
EXEMPLO 9: Administração de um Composto Anti-sentido Precursor e de Espinha Dorsal Mista Precursor Tendo por Alvo RNAm SGLT-2.
ISIS 257016 foi administrado a camundongos db/db (Charles River Laboratories, Wilmington, MA) intraperitonealmente em uma dose de .1, 7,5, 14 ou 17 mg/kg duas vezes por semana. Grupos controle incluíram um grupo recebendo salina no mesmo esquema de dosagem e um grupo recebendo ISIS 145733. ISIS 257016 e ISIS 145733 compreendem ambos a seqüência GAAGTAGCCACCAACTGTGC (SEQ ID NO: 1572) compreen- dendo adicionalmente uma região de "gap" central consistindo em dez 2'- desoxinucleotídeos, a qual é flanqueada sobre ambos os lados (direções 5' e .3') por "asas" de cinco nucleotídeos. As asas são compostas de 2'- metoxietila (2'-MOE) nucleotídeos. Todos os resíduos citidina são 5- metilcitidinas. As ligações internucleosídeos (espinha dorsal) são fosforotioa- to (P=S) em todo o oligonucleotídeo para ISIS 145733; no entanto, ISIS .257016 tem uma espinha dorsal mista. As ligações internucleosídeos para ISIS 257016 são fosfodiéster (P=O) nas asas e fosforotioato no gap. Qua- renta e oito horas depois da administração da última dose os camundongos foram sacrificados e o tecido renal foi analisado para os níveis de RNAm SGLT-2. Os resultados são mostrados abaixo na Tabela 59.
Tabela 59: Inibição anti-sentido da expressão de RNAm SGLT2 in vivo por gápmeros 5-10-5 MOE
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Tanto ISIS 257016 quanto ISIS 145733 reduziram acentuada- mente os níveis de SGLT-2 comparados com controle de salina, (níveis de RNAm determinados usando TA, PCR em tempo real conforme descrito a- cima) No entanto, foi mostrado que ISIS 257016 é cerca de 20 a 50 vezes mais potente para reduzir o RNAm SGLT-2 comparado com ISIS 145733. Uma redução associada nos níveis de glicose plasmática foi vista para os grupos de tratamento (661 ± 14 para o grupo de salina comparado com 470 ± 23 para ο grupo recebendo ISIS 257016). O acúmulo de ISIS 257016 e ISIS 145733 no rim foi similar sobre a faixa de dose, no entanto pouco do anti-sentido 257016 de extensão total foi detectado no rim o que corrobora a teoria de que um produto da degradação é responsável pelo aumento da atividade. Além disso o início de ação depois de uma única dose de 25 mg/kg se correlacionou com um ponto de tempo onde pouco composto anti- sentido 257016 foi deixado intacto.
Estudos similares foram realizados em camundongos magros, camundongos ob/ob e em ratos ZDF (Charles Rivers Laboratories) usando ISIS 257016, ISIS 145733 ou salina em um mesmo esquema de dosagem similar conforme descrito acima. A seqüência do sítio de ligação para ISIS 145733 e ISIS 257016 é conservada entre camundongo e rato (vide a Tabe- la 60). A redução de RNAm SGLT-2 no rim foi similar à vista acima. Em um estudo utilizando ratos, em uma dose de 10 mg/kg administrada duas vezes por semana por duas semanas, foi mostrado que ISIS 145733 reduz os ní- veis de RNAm SGLT-2 por cerca de 40% ao passo que a redução obtida com ISIS 257016 foi maior do que 80%. ISIS 257016 reduz a expressão de SGLT2 maximamente em uma baixa dose de 12,5 mg/kg. Estudos adicionais em faixas de dosagem menores apresentam significativa redução dos níveis de RNAm SGLT2 com o composto anti-sentido de espinha dorsal misto em doses menores do que 1 mg/kg/semana.
EXEMPLO 10: Administração de um Composto Precursor e Composto Anti- sentido Curto tendo por alvo RNAm SGLT-2
Estudos farmacocinéticos indicaram que ISIS 257016 estava agindo como uma pró-droga que foi metabolizada para um farmacóforo de 12 nucleobases. Em um estudo seguinte, ratos ZDF foram dosados intraperi- tonealmente duas vezes por semana com 1,5 mg/kg de ou ISIS 257016 ou ISIS 370717, opu com salina em um esquema de dosagem similar. ISIS 370717 é um composto anti-sentido de 12 nucleobases dirigidos para ácido nucléico SGLT-2 compreendendo a seqüência TAGCCACCAACT (SEQ ID NO: 154) e compreendendo adicionalmente região de "gap" central consis- tindo em dez 2'-desoxinucleotídeos, a qual é flanqueada sobre ambos os lados (direções 5' e 3') por de "asas" um nucleotídeo. As asas são compos- tas de nucleotídeos 2'-metoxietila (2'-MOE). Todos os resíduos citidina são .5-metilcitidinas. As ligações internucleosídeos (espinha dorsal) são fosforoti- oato (P=S) em todo o oligonucleotídeo.
Depois de cinco semanas de dosagem os animais foram sacrifi- cados e tecido renal foi analisado para os níveis de RNAm SGLT-2. A ativi- dade farmacológica de ISIS 257016 e ISIS 370717 foram similares, no en- tanto, o composto anti-sentido de 12 nucleotídeos apresentou um início de ação mais rápido. ISIS 370717 apresentou quase 80% de inibição da ex- pressão de SGLT2 no rim no dia dois depois de uma única dose de 2,8 umo- les/kg ao passo que ISIS 257016 apresentou somente cerca de 25% de ini- bição no dia 2 depois da mesma administração de dose única. Os dados corroboram que ISIS 257016 é uma pró-droga tendo um farmacóforo de 12 nucleotídeos.
EXEMPLO 11: Potência e Biodisponibilidade de um Composto Anti-sentido Curto
A potência aprimorada apresentada por ISIS 370717 e a biodis- ponibilidade oral aprimorada para estes compostos anti-sentido curtos tor- nam estes compostos úteis para administração oral. Ratos normais recebe- ram ISIS 370717, ISIS 145733 ou salina a 100 mg/kg duas vezes por sema- na através de administração intrajejunal. Cerca de 48 horas depois da última dose, os animais foram sacrificados e tecido renal foi analisado para concen- tração de composto anti-sentido e níveis de RNAm SGLT-2. Houve um acú- mulo significativamente maior de ISIS 370717 no tecido renal (aproximada- mente 500 micro gramas por grama de tecido) comparados com os contro- les. Além disso, RNAm SGLT-2 foi reduzido por mais de 80% em relação aos controles.
EXEMPLO 12: Variações da Extensão de asa, Gap e Total em torno de um composto anti-sentido curto de 12 nucleotídeos
Gápmero ISIS 370717 1-10-1 MOE foi usado como um modelo para preparar seqüência relacionadas oligos com motivos variáveis. Estas variações são proporcionadas na Tabela 60. Os compostos anti-sentido fo- ram designados para ter por alvo diferentes regiões do ácido nucléico S- GLT2 de camundongo ou rato, usando seqüências publicadas (GenBank Acesso Ng U29881.1, incorporada aqui, a este requerimento de patente, co- mo SEQ ID NO: 1575, e GenBank Acesso Ns AJ292928.1, incorporada aqui, a este requerimento de patente, como SEQ ID NO: 1576, respectivamente).
Tabela 60: Compostos anti-sentido curtos tendo por alvo ácidos nucléicos SGLT2
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Os compostos anti-sentido foram analisados para seu efeito so- bre os níveis de RNAm SGLT2 de camundongo. Os dados são registros co- Ihidos de três experimentos nos quais camundongos foram dosados duas vezes por semana por três semanas com 2,5, 0,5 ou 0,1 umol/kg dos gáp- meros MOE acima administrados por injeção intraperitoneal. Os camundon- gos foram sacrificados 48 horas depois da última administração e avaliados para os níveis de SGLT2 no rim. Os níveis de RNAm SGLT2 foram determi- nados por TA, PCR em tempo real conforme descrito por outros exemplos aqui, neste requerimento de patente. Os resultados de PCR foram normali- zados para um controle de ISIS interno. Os resultados são mostrados abaixo na Tabela 61. Tabela 61: Inibição anti-sentido de SGLT2 in vivo por gápmeros 1-10-1 e 1- <table>table see original document page 508</column></row><table>
Estes resultados ilustram que todos os vários motivos testados inibem a expressão de SGLT2 in vivo em uma maneira dose-dependente. Foi visto que os gápmeros 1-10-1, 2-8-2 e 1-8-1 são particularmente poten- tes.
EXEMPLO 13: Inibição Anti-sentido de SGLT-2 de Rato por Gápmeros 1-1Ο-1 e 1-10-2 MOE
Compostos anti-sentido de gápmero 1-10-1 e 1-10-2 MOE1 pro- porcionados na Tabela 62, foram designados para diferentes regiões alvo do RNA SGLT2 de camundongo ou rato. Todos os compostos anti-sentido cur- tos na Tabela 62 são oligonucleotídeos quiméricos ("gápmeros") de ou 12 ou 13 nucleotídeos de extensão, compostos de um segmento de "gap" central consistindo em dez 2'-desoxinucleotídeos, os quais são flanqueados sobre o lado 5' por uma "aba" de um nucleosídeo e sobre o lado 3' por uma "aba" de dois ou um nucleotídeo. As asas são compostas de 2'-metoxietila (2'-MOE) nucleotídeos. As ligações internucleosídeos (espinha dorsal) são fosforotioa- to (P=S) em todo o oligonucleotídeo. Todos os resíduos citidina são 5- metilcitidinas. Tabela 62: Compostos anti-sentido tendo por alvo ácido nucléico SGLT2
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Os compostos anti-sentido curtos foram analisados para seu e- feito sobre os níveis de RNAm SGLT2 do rato. Os dados são registros colhi- dos de três experimentos nos quais Ratos Sprague-Dawley machos (170- .200g) foram dosados duas vezes por semana por três semanas com 450, .150 ou 50 nmol/kg de ou um gápmero 1-10-1 ou 1-10-2 MOE administrado por injeção intraperitoneal. Os ratos foram sacrificados 48 horas depois da última administração e avaliados para níveis de RNAm SGLT2 no rim. Níveis alvo foram determinados por TA, PCR em tempo real conforme descrito por outros exemplos aqui, neste requerimento de patente. Os resultados de PCR foram normalizados para um controle de ISIS interno. Os resultados são mostrados abaixo na Tabela 63. Tabela 63: Inibição anti-sentido de SGLT2 RNAm in vivo por gápmeros 1-10- 1 e 1-10-2 MOE
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Estes resultados ilustram que tanto os gápmeros 1-10-1 quanto
1-10-2 MOE reduzem RNAm SGLT2 in vivo em uma maneira dose- dependente.
Ratos foram adicionalmente avaliados para peso corporal total, peso do fígado, baço e rim. Alterações significativas no peso do baço, fígado ou corporal podem indicar que um composto particular causa efeitos tóxicos. Todas as alterações estavam dentro da margem de erro do experimento.
Não foram observadas alterações significativas no peso corporal durante o tratamento ou no término do estudo. Não foram observadas alterações signi- ficativas nos pesos do fígado ou baço.
Efeitos tóxicos de compostos anti-sentido curtos administrados in vivo também podem ser avaliados medindos os níveis de enzimas e prote- ínas associados com doença ou lesão do fígado ou rim. Elevações nos ní- veis das transaminases séricas aspartato aminotransferase (AST) e alanina aminotransferase (ALT) são freqüentemente indicadores de doença ou lesão hepática. Bilirrubina total sérica é um indicador da função hepática e biliar, e albumina e nitrogênio uréico sangüíneo (BUN) são indicadores da função renal. Os níveis de glicose e triglicerídeos são algumas vezes alterados de- vido à toxicidade de um tratamento. A glicose sérica também depende em parte da atividade de SGLT2. Os níveis de ALT, AST, bilirrubina total, albu- mina, BUN, glicose e triglicerídeos foram medidos em ratos tratados com os compostos anti-sentido curtos. Os níveis de indicadores clínicos de rotina de lesão e doença hepática e renal estavam dentro das faixas normais e não são significativamente alterados em relação a animais tratados com salina, demonstrando que os compostos anti-sentido curtos não afetam significati- vamente a função renal ou hepática. Os níveis de triglicerídeos e glicose não foram significativamente elevados em relação a animais tratados com salina.
EXEMPLO 14: Inibição Anti-sentido de SGLT2 de Camundongo e de Rato por Gápmeros 1-10-1 MOE
Compostos anti-sentido de gápmero 1-10-1 MOE designados para terem por alvo diferentes regiões de RNAm SGLT2 de camundongo são mostrados na Tabela 64.
Tabela 64: Composição de Compostos Anti-sentido tendo por alvo RNAm SGLT2
<table>table see original document page 511</column></row><table>
** indica 3 combinações inadequadas para uma seqüência alvo
Os compostos anti-sentido curtos foram analisados para seu e- feito sobre os níveis de RNAm SGLT2 de camundongo. Foram colhidos da- dos de três experimentos nos quais Camundongos Balb/c machos de seis semanas de idade foram dosados duas vezes por semana por duas sema- nas com 450, 150, ou 50 nmol/kg de um dos gápmeros 1-10-1 MOE acima administrados por injeção intraperitoneal. Os camundongos foram sacrifica- dos 48 horas depois da última administração e avaliados para os níveis de RNAm SGLT2 no rim. Os níveis alvo foram determinados por TA, PCR em tempo real conforme descrito por outros exemplos aqui, neste requerimento de patente. Os resultados de PCR foram normalizados para um controle de ISIS interno. Os resultados são mostrados abaixo na Tabela 65. Tabela 65: Inibição anti-sentido de RNAm SGLT2 in vivo por gápmeros 1-1 Ο- <table>table see original document page 512</column></row><table>
Estes resultados ilustram que todos os gápmeros 1-10-1 MOE exceto, ISIS 381408, inibem a expressão de SGLT2 in vivo em uma maneira dose-dependente em camundongo. A atividade de ISIS 381408 foi mostrada em estudos com Rato (Vide a Tabela 65). Avaliação de Gápmeros 1-10-1 em Rato
O efeito dos gápmeros 1-10-1 acima (vide a Tabela 64 acima) sobre os níveis de RNAm SGLT2 de rato. São colhidos dados de quatro ex- perimentos nos quais ratos Sprague-Dawley machos (170-200g) foram do- sados duas vezes por semana por três semanas com 250 nmol/kg adminis- trados por injeção intraperitoneal. Os ratos foram sacrificados 48 horas de- pois da última administração e avaliados para níveis de RNAm SGLT2 no rim. Níveis alvo foram determinados por TA, PCR em tempo real conforme descrito por outros exemplos aqui, neste requerimento de patente. Os resul- tados de PCR foram normalizados para um controle ISIS interno. Os resulta- dos são mostrados abaixo na Tabela 66. Tabela 66: Inibição anti-sentido de RNAm SGLT2 in vivo por gápmeros 1-1 Ο- Ι MOE
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Estes resultados ilustram que todos os gápmeros 1-10-1 MOE inibem a expressão de SGLT2 em estudos de rato in vivo.
EXEMPLO 15: Inibição Anti-sentido da Expressão de SGLT2 de Camundon- go e Rato por Gápmeros 1-10-1 e 2-8-2 MOE Adicionais
Compostos anti-sentido curtos de gápmero 1-10-1 e 2-8-2 MOE foram designados para terem por alvo diferentes regiões do RNA SGLT2 de camundongo mas têm complementaridade através das espécies. Os com- postos anti-sentido curtos são mostrados na Tabela 67. Todos os compostos anti-sentido curtos na Tabela 67 são gápmeros de 12 nucleotídeos de exten- são, compostos de um segmento de "gap" central consistindo em 2'- desoxinucleotídeos, os quais são flanqueados sobre ambos os lados (dire- ções 5' e 3') por segmentos de asa tendo 2'-modificações. As asas são com- postas de 2'-metoxietila (2'-M0E) nucleotídeos. As ligações internucleosí- deos (espinha dorsal) são fosforotioato (P=S) em todo o oligonucleotídeo. Todos os resíduos citidina são 5-metilcitidinas.
Tabela 67: Compostos Anti-sentido Curtos tendo por alvo Ácido Nucléico SGLT2
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Os compostos anti-sentido curtos foram analisados para seu e- feito sobre os níveis de RNAm SGLT2 de camundongo in vivo. Foram colhi- dos dados de três experimentos nos quais camundongos Balb/c machos de seis semanas de idade foram dosados duas vezes por semana por três se- manas com 0,5, 0,1, ou 0,02 umol/kg ou de um gápmero 1-10-1 ou de 2-8-2 MOE administrado por injeção intraperitoneal. Os camundongos foram sacri- ficados 48 horas depois da última administração e avaliados para os níveis de SGLT2 no rim. Níveis alvo foram determinados por TA, PCR em tempo real conforme descrito por outros exemplos aqui, neste requerimento de pa- tente. Os resultados de PCR foram normalizados para um controle de ISIS interno. Os resultados são mostrados abaixo na Tabela 68.
Tabela 68: Inibição anti-sentido de RNAm SGLT2 in vivo por gápmeros 1-1 Ο- .1 e 2-8-2 MOE
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Estes resultados ilustram que ambos os gápmeros 1-10-1 e 2-8- .2 MOE inibem a expressão de SGLT2 in vivo em uma maneira dose- dependente.
Os camundongos foram adicionalmente avaliados para peso corporal total, peso do fígado, baço e rim. Todas as alterações estavam den- tro da margem de erro do experimento. Não foram observadas alterações significativas no peso corporal durante o tratamento ou no término do estu- do. Não foram observadas alterações significativas nos pesos do fígado ou baço.
Os níveis de ALT, AST, BUN, transaminases, creatinina plasmá- tica, glicose e triglicerídeo foram medidos em camundongos tratados com os compostos anti-sentido curtos. Os níveis de indicadores clínicos de rotina de lesão e doença hepática e renal estavam dentro de faixas normais e não são significativamente alterados em relação a animais tratados com salina, de- monstrando que os compostos anti-sentido curtos não afetam significativa- mente a função renal ou hepática. Os níveis de triglicerídeo e glicose não foram significativamente elevados em relação a animais tratados com salina. Avaliação de Gápmero ISIS 379692 1-10-1 MOE. Gápmero ISIS 392170 1- .10-1 Metilenoóxi BNA, Gápmero ISIS 388625 2-8-2 MOE e Gápmero ISIS .392173 2-8-2 Metilenoóxi BNA em Camundongos
O efeito de gápmero ISIS 379692 1-10-1 MOE e gápmero ISIS .388625 2-8-2 MOE são comparados com o efeito de Gápmero ISIS 392170 .1-10-1 Metilenoóxi BNA e Gápmero ISIS 392173 2-8-2 Metilenoóxi BNA (vi- de a Tabela 69) sobre os níveis de RNAm SGLT2 de camundongo in vivo. São colhidos dados de três experimentos nos quais camundongos Balb/c machos de seis semanas de idade foram dosados duas vezes por semana por três semanas com 5, 25 e 125 nmol/kg de ou o gápmero ISIS 379692 1- .10-1 MOE ou o gápmero ISIS 388625 2-8-2 MOE administrados por injeção intraperitoneal. Os camundongos foram sacrificados 48 horas depois da úl- tima administração e avaliados para os níveis de RNAm SGLT2 no rim. Ní- veis alvo foram determinados por TA, PCR em tempo real conforme descrito por outros exemplos aqui, neste requerimento de patente. Os resultados de PCR foram normalizados para um controle de ISIS interno. Os dados são expressados como percentagem de alteração ("+" indica um aumento, "-" indica uma redução) em relação a animais tratados coim salina e são ilustra- dos na Tabela 69. Tabela 69: Inibição anti-sentido de RNAm SGLT2 in vivo por um gápmero 1- .10-1 e um 2-8-2 MOE
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Estes resultados ilustram que ambos os gápmero 1-10-1 e 2-8-2 MOE inibem a expressão de SGLT2 in vivo nas três maiores faixas de dosa- gem em uma maneira dose-dependente. Os resultados também ilustram que os constructos Metilenoóxi BNAsão mais potentes do que os constructos MOE. Não foram observadas alterações significativas no peso corporal du- rante o tratamento ou no término do estudo. Não foram observadas altera- ções significativas nos pesos do fígado ou baço. Os parâmetros de toxicida- de incluindo níveis de ALT, AST, BUN, e creatinina estavam dentro de faixas normais e não são significativamente alterados em relação a animais trata- dos com salina, demonstrando que os compostos não afetam significativa- mente a função renal ou hepática.
Avaliação do Gápmero ISIS 379692 1-10-1 MOE e do Gápmero ISIS 388625 .2-8-2 MOE em Rato
O efeito do gápmero ISIS 379692 1-10-1 MOE e do gápmero ISIS 388625 MOE 2-8-2 (vide a Tabela 70) sobre os níveis de RNAm SGLT2 de rato in vivo. São colhidos dados de quatro experimentos nos quais ratos Sprague-Dawley machos (170-200g) foram dosados duas vezes por semana por três semanas com 200, 50, 12,5, ou 3,125 nmols/kg de ou o gápmero ISIS 379692 1-10-1 MOE ou o gápmero ISIS 388625 2-8-2 MOE administra- dos por injeção intraperitoneal. Ratos foram sacrificados 48 horas depois da última administração e avaliados para os níveis de SGLT2 no rim. Níveis alvo foram determinados por TA, PCR em tempo real conforme descrito por outros exemplos aqui, neste requerimento de patente. Os resultados de PCR foram normalizados para um controle de ISIS interno. Os resultados são mostrados abaixo na Tabela 70.
Tabela 70: Inibição anti-sentido de RNAm SGLT2 in vivo por um gápmero 1- .10-1 e um 2-8-2 MOE
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Estes resultados ilustram que tanto o gápmero 1-10-1 quanto 2- .8-2 MOE inibem a expressão de SGLT2 in vivo nas três maiores faixas de dosagem em uma maneira dose-dependente.
Ratos foram adicionalmente avaliados para peso corporal total, peso do fígado, baço e rim. Todas as alterações estavam dentro da margem de erro do experimento. Não foram observadas alterações significativas no peso corporal durante o tratamento ou no término do estudo. Não foram ob- servadas alterações significativas nos pesos do fígado ou baço.
Os níveis de ALT, AST, BUN, colesterol, creatinina plasmática e triglicerídeos foram medidos em ratos tratados com os compostos anti- sentido curtos. Os níveis de indicadores clínicos de rotina de lesão e doença do fígado e do rim estavam dentro de faixas normais e não são significati- vamente alterados em relação a animais tratados com salina, demonstrando que os compostos anti-sentido curtos não afetam significativamente a função renal ou hepática.
EXEMPLO 16: Inibição Anti-sentido de Expressão de SGLT2 em rato ZDF
ISIS 388625, 388626 e controle oligo ISIS 388628 foram anali- sados para seu efeito sobre os níveis de glicose plasmática de rato ZDF e HbA1c. O rato gordo diabético Zucker deficiente de receptor de Ieptina (ZDF) é um modelo útila para a investigação de diabetes tipo 2. Diabetes se de- senvolve espontaneamente nestes ratos machos em idades de 8 a 10 se- manas, e está associada com hiperfagia, poliúria, polidipsia, e aumento do ganho de peso, sintomas os quais são paralelos aos sintomas clínicos de diabetes (Phillips MS, et al., 1996, Nat Genet 13, 18-19). Ratos ZDF de seis semanas de idade foram injetados intraperitonealmente com composto anti- sentido curto em uma dose de 400 nM/kg uma vez por semana por doze semanas. Os dados são ilustrados nas Tabelas 71 e 72. Tabela 71: Glicose plasmática
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Tabela 72: Status de HbAIc
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ISIS 388625 e 388626 reduziram significativamente os níveis de glicose plasmática e HbAIC comparados com animais tratados com PBS e controle. EXEMPLO 17: Inibição Anti-sentido da Expressão de SGLT2 em Rim de Cão (ISIS 388625) ISIS 388625 é um Gápmero 2-8-2 MOE com seqüência TGTTCCAGCCÇA (SEQ ID NO: 246) (por exemplo, vide a Tabela 71). O efeito de ISIS 388625 sobre os níveis de RNAm SGLT2 de cachorro. São colhidos dados de dois grupos de dosagem nos quais um total de nove cães beagle machos foram dosados com ou um ou dez mg/kg/semana de ISIS 388625 ou salina administrados por injeção subcutânea duas vezes por se- mana. No dia 46 do estudo, todos os cães foram sacrificados e avaliados para os níveis de SGLT2 no rima. Níveis alvo foram determinados por TA, PCR em tempo real quantitativo conforme descrito por outros exemplos aqui, neste requerimento de patente. Os resultados de PCR foram normalizados para um controle de ISIS interno. Os resultados são mostrados abaixo na Tabela 73.
Tabela 73: Inibição anti-sentido de RNAm SGLT2 in vivo por ISIS 388625
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Estes resultados ilustram que mais de 80% de redução de RNAm SGLT2 podem ser obtidos em uma dose de 1 mg/kg/semana de ISIS 388625. Mesmo maior redução pode ser obtida em doses ligeiramente maio- res. Também foi mostrado que a administração de ISIS 388625 em cão au- menta a tolerância à glicose. Os níveis de glicose plasmática máximo foram reduzidos por mais de 50% sobre a média e a queda subseqüente na glicose foi reduzida comparada com controles de salina em um teste de tolerância de glicose padrão. A excreção urinária de glicose também foi aumentada. EXEMPLO 18: Experimentação in vivo de compostos anti-sentido curtos diri- gidos para ácido nucléico SGLT2
Vinte gápmeros 1-10-1 MOE que são complementares a SGLT2 humano/ de macaco/ de camundongo/ de rato foram designados, sintetiza- dos e testados in vivo para supressão dos níveis de RNAm SGLT2 no rim. Sítios alvo para camundongo e rato são indicados na Tabela 74. Sítios alvo para humano são indicados nas Tabelas 4 e 5. Os dados são médias de dois experimentos nos quais camundongos Balb/c machos de seis semanas de idade foram administrados injeções intraperitoneais de 350 nmols/kg de oli- gonucleotídeo, duas vezes por semana, durante um período de duas sema- nas (um total de quatro injeções). Os camundongos foram sacrificados 48 horas depois da última administração e avaliados para os níveis de RNAm SGLT2 no rim. Os níveis de RNAm SGLT2 foram determinados por análise por PCR em tempo real quantitativo de acordo com procedimentos de rotina, usando duas séries de sondas de primers de PCR diferentes, série de sonda de primers (PPS) 534 e PPS 553. Os níveis de RNAm SGLT2 foram norma- lizados para os níveis de RNAm ciclofilina, os quais também foram medidos por PCR em tempo real quantitativo. Os resultados são mostrados abaixo na Tabela 74.
Tabela 74: Inibição anti-sentido de SGLT2 in vivo
<table>table see original document page 520</column></row><table> <table>table see original document page 521</column></row><table>
* indica 1 ou 2 combinações inadequadas para uma seqüência alvo
Exemplo 19: Inibição anti-sentido de PCSK9 human em células Hep3B
Compostos anti-sentido curtos dirigidos para um ácido nucléico PCSK9 foram testados para seus efeitos sobre RNAm PCSK9 in vitro. Os compostos anti-sentido curtos são apresentados na Tabela 6. O Nq Isis, mo- tivo de gápmero e NO de SEQ ID de cada composto anti-sentido curto são mostrados novamente na Tabela 75. Células Hep3B cultivadas foram trata- das com 100 nM de composto anti-sentido curto. Gápmeros 5-10-5 MOE dirigidos para um ácido nucléico PCSK9 foram usados como controles posi- tivos. Depois do período de tratamento, o RNA foi isolado das células e os níveis de RNAm PCSK9 foram medidos por PCR em tempo real quantitativo, conforme descrito aqui, neste requerimento de patente. Os níveis de RNAm PCSK9 foram ajustados de acordo com teor de RNA total conforme medido por RIBOGREEN®. Os resultados são apresentados na Tabela 75 como per- centagem de inibição de PCSK9 (% de Inib), em relação a células controle não tratadas. Na coluna de "% de Inib", um "0" indica que não foi observada redução de RNAm PCSK9 com aquele composto anti-sentido curto em parti- cular.
Tabela 75: Inibição anti-sentido de PCSK9 por compostos anti-sentido curtos
<table>table see original document page 522</column></row><table> <table>table see original document page 523</column></row><table> <table>table see original document page 524</column></row><table> Conforme ilustrado na Tabela 75, compostos anti-sentido curtos dirigidos para um ácido nucléico PCSK9, tendo um motivo de gápmero 2-10- .2 MOE1 RNAm PCSK9 reduzido em células cultivadas.
Compostos anti-sentido curtos dirigidos para um ácido nucléico PCSK9 foram testados em um experimento de dose resposta de células Hep3B. As células foram tratadas conforme descrito aqui, neste requerimen- to de patente, com concentrações em nM de composto anti-sentido curto conforme indicado nas Tabelas 76. Depois do período de tratamento, o RNA foi isolado das células e os níveis de RNAm PCSK9 foram medidos por PCR em tempo real quantitativo, conforme descrito aqui, neste requerimento de patente. Os níveis de RNAm PCSK9 foram normalizados para os níveis de RNAm de ciclofilina, conforme medido por PCR em tempo real usando uma série de sondas de primers ciclofilina-específicos. Os resultados são apre- sentados como percentagem de inibição de PCSK9, em relação a células controle não tratadas. Também é mostrada a EC5O (concentração na qual é observado 50% de redução de RNAm) para cada composto anti-sentido cur- to testado no experimento de dose resposta, conforme calculado usando Graphpad Prism. Conforme ilustrado na tabela seguinte, os níveis de RNAm PCSK9 foram reduzidos em uma maneira dose-dependente. Tabela 76: Inibição anti-sentido dose-dependente de PCSK9 por compostos anti-sentido curtos
<table>table see original document page 525</column></row><table> Exemplo 20: Inibição antí-sentido de PCSK9 por compostos anti-sentido cur- tos compreendendo BNAs
Compostos anti-sentido curtos dirigidos para um ácido nucléico PCSK9 foram testados em experimentos de dose resposta, tanto em células cultivadas de camundongo e humanas. Os compostos testados incluíram ISIS 403739 e ISIS 403740. ISIS 403739 é um composto anti-sentido curto consistindo da seqüência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 404 e tendo um motivo de gápmero 2-10-2, onde os nucleotídeos nas asas compreendem (6'S)-6'metila BNA. ISIS 403740 é um composto anti-sentido curto consistin- do da seqüência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 405 e tendo um motivo de gápmero 2-10-2, onde os nucleotídeos nas asas compreendem (6'S)-6'metila BNA. Também foi testado um gápmero 5-10-5 MOE dirigido para um ácido nucléico PCSK9.
Hepatócitos de camundongo foram laminados e tratados con- forme descrito aqui, neste requerimento de patente, com concentrações em nM de composto anti-sentido curto conforme indicado na Tabela 77. Depois do período de tratamento, o RNA foi isolado das células e os níveis de RNAm PCSK9 foram medidos por PCR em tempo real quantitativo, confor- me descrito aqui, neste requerimento de patente. Os níveis de RNAm PCSK9 foram normalizados para os níveis de RNAm de ciclofilina, conforme medido por PCR em tempo real usando uma série de sondas de primer ci- clofilina-específicas. Os resultados são apresentados como percentagem de inibição de PCSK9, em relação a células controle não tratadas. Onde pre- sente, "0" indica nenhuma redução observada em RNAm PCSK9. ISIS 403739 apresentou redução dose-dependente de RNAm PCSK9 de camun- dongo nas doses de 30 nM e maior. ISIS 403740 apresentou redução de RNAm PCSK9 de camundongo nas duas maiores doses de composto anti- sentido curto. Tabela 77: Inibição anti-sentido de PCSK9 de camundongo por compostos anti-sentido curtos compreendendo BNAs
<table>table see original document page 527</column></row><table>
Células Hep3B humanas foram tratadas com concentrações em nM de composto anti-sentido curto conforme descrito aqui, neste requeri- mento de patente. Depois do período de tratamento, o RNA foi isolado das células e os níveis de RNAm PCSK9 foram medidos por PCR em tempo real quantitativo, conforme descrito aqui, neste requerimento de patente. Os ní- veis de RNAm PCSK9 foram normalizados para os níveis de RNAm de ciclo- filina, conforme medido por PCR em tempo real usando uma série de sondas de primers ciclofilina-específicas. Os resultados são apresentados como per- centagem de inibição de PCSK9, em relação a células controle não tratadas. Os dados são mostrados na Tabela 78 e demonstram uma redução dose- dependente em RNAm PCSK9 humano depois de tratamento com ISIS .403740. ISIS 403739 apresentou redução dose-dependente em maiores do- ses.
Tabela 78: Inibição anti-sentido de PCSK9 de camundongo por compostos anti-sentido curtos compreendendo BNAs
<table>table see original document page 527</column></row><table>
Exemplo 21: Inibição anti-sentido de GCGR em células HepG2
Compostos anti-sentido curtos dirigidos para um ácido nucléico GCGR foram testados para seus efeitos sobre RNAm GCGR in vitro. Células HepG2
Células HepG2 cultivadas em uma densidade de 10000 células por cavidade em uma lâmina de 96 cavidades foram tratadas conforme des- crito aqui, neste requerimento de patente, com 25, 50, 100 ou 200 nM de oligonucleotídeo anti-sentido. Depois do período de tratamento, o RNA foi isolado das células e os níveis de RNAm GCGR foram medidos por PCR em tempo real quantitativo, conforme descrito aqui, neste requerimento de pa- tente. Os níveis de RNAm GCGR foram ajustados de acordo com o teor de RNA total conforme medido por RIBOGREEN®. Os resultados são apresen- tados como percentagem de redução no RNAm GCGR, em relação a células controle não tratadas.
A Tabela 79 apresenta dados depois de tratamento com as do- ses indicadas de ISIS 327161, um gápmero 3-10-3 MOE. ISIS 327161 redu- ziu RNAm GCGR em uma maneira dose-dependente. Tabela 79: Inibição anti-sentido de GCGR em células HepG2 por um com- posto anti-sentido curto
<table>table see original document page 528</column></row><table>
Hepatócitos de Macaco
Compostos anti-sentido curtos adicionais dirigidos para um ácido nucléico GCGR foram testados para seus efeitos sobre RNAm GCGR de macaco in vitro. Hepatócitos de macaco primários cultivados foram tratados conforme descrito aqui, neste requerimento de patente, com 25, 50, 100 ou .200 nM de composto anti-sentido curto. Depois do período de tratamento, o RNA foi isolado das células e os níveis de RNAm GCGR foram medidos por PCR em tempo real quantitativo, conforme descrito aqui, neste requerimento de patente. Os níveis de RNAm GCGR foram ajustados de acordo com o teor de RNA total conforme medido por RIBOGREEN®. Os resultados são apresentados na Tabela 80 como percentagem de redução no RNAm GC- GR, em relação a células controle não tratadas. Tabela 80: Inibição anti-sentido de GCGR em hepatócitos de macaco primá- rios por compostos anti-sentido curtos
<table>table see original document page 529</column></row><table>
Exemplo 22: Inibição anti-sentido de DGAT2 por compostos anti-sentido cur- tos
Compostos anti-sentido curtos dirigidos para um ácido nucléico DGAT2 foram testados para seus efeitos sobre RNAm DGAT2 in vitro. Célu- las A10 cultivadas em uma lâmina de 96 cavidades foram tratadas com 75 nM de composto anti-sentido curto. Depois de um período de tratamento de aproximadamente 24 horas, o RNA foi isolado das células e os níveis de RNAm DGAT2 foram medidos por PCR em tempo real quantitativo, confor- me descrito aqui, neste requerimento de patente. Os níveis de RNAm DGAT2 foram ajustados de acordo com o teor total de RNA conforme medi- do por RIBOGREEN®. Os resultados são apresentados como percentagem de inibição de DGAT2, em relação a células controle não tratadas na Tabela 81.
Tabela 81: Inibição anti-sentido de DGAT2 em células A10
<table>table see original document page 529</column></row><table> <table>table see original document page 530</column></row><table>
Compostos anti-sentido curtos adicionais dirigidos para RNAm DGAT2 foram testados in vitro em um experimento de dose-resposta. Célu- las A10 foram preparadas conforme descrito acima e tratadas com 6,25, .12,5, 25,0, 50,0, 100,0, e 200,0 nM de compostos anti-sentido curtos para determinar se ocorre inibição de DGAT2 em uma maneira dose-dependente. Os dados demonstram que cada um dos compostos anti-sentido curtos a- presentados na Tabela 82 reduz RNAm DGAT2 de rato em uma maneira dose-dependente. Os resultados são apresentados como percentagem de inibição, em relação a células controle não tratadas. Um "0" indica que o RNAm DGAT2 não foi reduzido.
Tabela 82: Ihibição Dose-Dependente de DGAT2 em células A10
<table>table see original document page 530</column></row><table> <table>table see original document page 531</column></row><table>
Compostos anti-sentido curtos adicionais dirigidos para RNAm DGAT2 foram testados in vitro. Células A10 foram preparadas conforme descrito acima e tratadas com 0,62, 1,85, 5,56, 16,67, 50,0, e 150,0 nM de compostos anti-sentido curtos para determinar se ocorre inibição de DGAT2 em uma maneira dose-dependente. O RNAm DGAT2 foi medido usando PCR em tempo real quantitativo, conforme descrito aqui, neste requerimento de patente. Os dados demonstram que cada um dos compostos anti-sentido curtos apresentados na Tabela 83 abaixo inibem RNAm DGAT2 de rato em uma maneira dose-dependente. Os resultados são apresentados como per- centagem de inibição de rato DGAT2, em relação a células controle não tra- tadas. Onde presente, "0" indica que não foi observada redução no RNAm DGAT2.
Tabela 83: Inibição Dose-Dependente de DGAT2 em células A10
<table>table see original document page 531</column></row><table> <table>table see original document page 532</column></row><table>
Exemplo 23: Inibição anti-sentido de PTP1B humano em células HuVEC
Compostos anti-sentido curtos dirigidos para um ácido nucléico PTP1B foram testados para seus efeitos sobre RNAm PTP1B in vitro. Célu- las HuVEC cultivadas em uma densidade de 5000 células por cavidade em uma lâmina de 96 cavidades foram tratadas conforme descrito aqui, neste requerimento de patente, com 3 nM de composto anti-sentido curto. Depois do período de tratamento, o RNA foi isolado das células e os níveis de RNAm PTP1B foram medidos por PCR em tempo real quantitativo, conforme descrito aqui, neste requerimento de patente. Os níveis de RNAm PTP1B foram ajustados de acordo com o teor de RNA total conforme medido por RIBOGREEN®. Os resultados são apresentados como percentagem de inibi- ção de PTP1B (% de Inib), em relação a células controle não tratadas. Os dados demonstrou que compostos anti-sentido curtos dirigidos para um áci- do nucléico PTP1B e tendo um motivo de gápmero 2-10-2 pode inibir PTP1B em células HuVEC na Tabela 84.
Tabela 84: Inibição anti-sentido de PTP1B em células HuVEC por compostos anti-sentido curtos
ISIS Ne SEQ ID NO Motivo de Gápmero % de Inib 399301 1542 2-10-2 OMe 55 404137 1053 2-10-2 MOE 76 404138 1054 2-10-2 MOE 76 404139 1052 2-10-2 MOE 80 404140 1051 2-10-2 MOE 73
Exemplo 24: Inibição anti-sentido de PTP1B humano em células HepG2
Compostos anti-sentido curtos dirigidos para um ácido nucléico PTP1B foram testados para seus efeitos sobre RNAm PTP1B in vitro. Célu- las HepG2 cultivadas em uma densidade de 10000 células por cavidade em uma lâmina de 96 cavidades foram tratadas com 25 nM de oligonucleotídeo anti-sentido. Depois do período de tratamento, o RNA foi isolado das células e os níveis de RNAm PTP1B foram medidos por PCR em tempo real quanti- tativo, conforme descrito aqui, neste requerimento de patente. Os níveis de RNAm PTP1B foram ajustados de acordo com o teor de RNA total conforme medido por RIBOGREEN®. Os resultados são apresentados como percenta- gem de inibição (% de Inib) de PTP1B, em relação a células controle não tratadas. Os dados demonstrou que compostos anti-sentido curtos dirigidos para um ácido nucléico PTP1B e tendo um motivo de gápmero 2-10-2 po- dem inibir PTP1B em células HepG2 na Tabela 85.
Tabela 85: Inibição anti-sentido de PTP1B em células HepG2 por compostos anti-sentido curtos
ISIS Nq SEQ ID NO Motivo de Gápmero % de Inib 399301 1542 2-10-2 OMe 43 404137 1053 2-10-2 MOE 71 404138 1054 2-10-2 MOE 86 404139 1052 2-10-2 MOE 45 404140 1051 2-10-2 MOE 93 Exemplo 25: Inibição anti-sentido de PTP1B em células HuVEC: Experimen- to de dose resposta
Células endoteliais vasculares humanas (HuVEC) foram lamina- das em uma densidade de 5000 células por cavidade e tratadas conforme descrito aqui, neste requerimento de patente, com concentrações em nM de composto anti-sentido curto conforme indicado na Tabela 86. Depois do pe- ríodo de tratamento, o RNA foi isolado das células e os níveis de RNAm PTP1B foram medidos por PCR em tempo real quantitativo, conforme descri- to aqui, neste requerimento de patente. Os níveis de RNAm PTP1B foram ajustados de acordo com o teor de RNA total conforme medido por RIBO- GREEN®. Duas séries de sondas de primers PTP1B humanas diferentes foram usadas para medir os níveis de RNAm. Resultados com Primer Probe Set (PPS) 198 são mostrados na Tabela 86, e resultados com Primer Probe Set (PPS) 3000 são mostrados na Tabela 87. Os resultados são apresenta- dos como percentagem de inibição da expressão de de RNAm PTP1B em relação a células controle não tratadas. Onde presente, "0" indica que não foi observada redução de RNAm PTP1B. Conforme ilustrado nas Tabelas 86 e 87, os níveis de RNAm PTP1B foram reduzidos em uma maneira dose- dependente.
Tabela 86: Dose Resposta para PTP1B Humano em células HuVEC, usando PPS 198
<table>table see original document page 534</column></row><table> <table>table see original document page 535</column></row><table>
Tabela 87: Dose Resposta para PTP1B Humano em células HuVEC, usando
<table>table see original document page 535</column></row><table>
Exemplo 26: Inibição anti-sentido de ApoB por compostos anti-sentido curtos
Os compostos anti-sentido curtos mostrado na Tabela 88 foram testados para seus efeitos in vivo. Camundongos machos Balb/c de seis semanas de idade (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME) foram administra- dos doses intraperitoneaus de 3,2, 1, 0,32, ou 0,1 umol/kg, duas vezes por semana por três semanas. Um gápmero 5-10-5 MOE foi usado para um tra- tamento controle. Os camundongos foram sacrificados aproximadamente 48 horas depois da dose final. Tecido do fígado foi coletado para isolamento de RNA, e foi colhido sangue para análises químicas do soro. Os níveis de RNAm ApoB foram medidos por PCR em tempo real conforme descrito aqui, neste requerimento de patente. Os níveis de RNAm ApoB foram normaliza- dos para os níveis de RNA conforme determinado por RIBOGREEN, e são apresentados na Tabela 89 como percentagem de inibição em relação aos níveis de RNAm ApoB em animais controle tratados com salina.
Tabela 88: Compostos Anti-sentido Curtos tendo por alvo um ácido nucléico ApoB
<table>table see original document page 536</column></row><table>
Tabela 89: Inibição anti-sentido de ApoB por Compostos Anti-sentido Curtos Compreendendo BNA
<table>table see original document page 536</column></row><table>
A Tabela 89 mostra que os níveis de RNAm ApoB foram reduzi- dos em uma maneira dose-dependente depois de tratamento com compos- tos anti-sentido curtos tendo um motivo de gápmero 2-10-2 e modificações de BNA nas asas. Na dose de 1 umol/kg, a inibição de ApoB pelos compos- tos anti-sentido curtos foi maior do que a observada com um gápmero 5-10-5 MOE em uma dose equivalente. O colesterol foi reduzido nas doses de 1 e .3,2 umol/kg de composto anti-sentido curto.
Os compostos anti-sentido curtos apresentaram poucos a ne- nhum efeitos colaterais adversos, conforme considerado por pesos dos ór- gãos e corporal, transaminases séricas, bilirrubina, nitrogênio uréico sangüí- neo, e creatinina.
Exemplo 27: Inibição anti-sentido de PTEN por compostos anti-sentido cur- tos
Os compostos anti-sentido curtos mostrado na Tabela 90 foram testados para seus efeitos in vivo. Camundongos machos Balb/c de seis semanas de idade (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME) foram administra- dos doses intraperitoneais de 3,2, 1, 0,32, ou 0,1 umol/kg, duas vezes por semana por três semanas. Um gápmero 5-10-5 MOE foi usado para um tra- tamento controle. Os camundongos foram sacrificados aproximadamente 48 horas depois da dose final. Tecido do fígado foi coletado para isolamento de RNA, e foi colhido sangue para análises químicas do soro. Os níveis de RNAm PTEN foram medidos por PCR em tempo real conforme descrito aqui, neste requerimento de patente. Os níveis de RNAm PTEN foram normaliza- dos para os níveis de RNA conforme determinado por RIBOGREEN, e são apresentados na Tabela 91 como percentagem de inibição em relação aos níveis de RNAm PTEN em animais controle tratados com salina.
Tabela 90: Compostos Anti-sentido Curtos dirigidos para um ácido nucléico PTEN
<table>table see original document page 537</column></row><table> Tabela 91: Inibição anti-sentido de PTEN por compostos anti-sentido curtos compreendendo modificações de BNA
<table>table see original document page 538</column></row><table>
A Tabela 91 mostra que os níveis de RNAm PTEN foram reduzi- dos em uma maneira dose-dependente depois de tratamento com compos- tos anti-sentido curtos tendo um motivo de gápmero 2-10-2 e modificações de BNA nas asas. Na dose de 1 umol/kg, a inibição de PTEN pelos compos- tos anti-sentido curtos foi maior do que a observada com um gápmero 5-10-5 MOE em uma dose equivalente.
Com a exceção da maior dose de ISIS 392063, não foram ob- servados aumentos significativos nas transaminases séricas. No total, os compostos anti-sentido curtos apresentaram poucos a nenhum efeitos cola- terais adversos.
Exemplo 28: Administração de dose única de compostos anti-sentido curtos compreendendo modificações de BNA Camundongos machos Balb/c de seis semanas de idade (Jack- son Laboratory, Bar Harbor, ME) foraom administrados uma única injeção intraperitoneal de composto anti-sentido curto em uma dose de 8, 4, 2 ou 1 pmol/kg. Os compostos anti-sentido curtos testados foram ISIS 387462 e ISIS 398296. Cada grupo de dose consistiu em quatro animais. Um gápmero .5-10-5 MOE foi usado para um tratamento controle. Os camundongos foram sacrificados aproximadamente 48 horas depois da dose final. O tecido do fígado foi coletado para isolamento de RNA, e foi colhido sangue para análi- ses químicas do soro. Os níveis de RNAm ApoB foram medidos por PCR em tempo real conforme descrito aqui, neste requerimento de patente. Os níveis de RNAm ApoB foram normalizados para os níveis de RNA conforme deter- minado por RIBOGREEN, e são apresentados na Tabela 92 como percenta- gem de inibição em relação aos níveis de RNAm ApoB em animais controle tratados com salina.
Tabela 92: Inibição anti-sentido de ApoB por Compostos Anti-sentido Curtos Compreendendo BNA
<table>table see original document page 539</column></row><table>
A Tabela 92 mostra que os níveis de RNAm ApoB foram reduzi- dos em uma maneira dose-dependente depois de uma única administração de compostos anti-sentido curtos tendo um motivo de gápmero 2-10-2 e mo- dificações de BNA nas asas. Na dose de 8 umol/kg, a inibição de ApoB pe- los compostos anti-sentido curtos foi maior do que a observada com um gápmero 5-10-5 MOE em uma dose equivalente. A ED50 de ISIS 387462 foi de 3,9 mg/kg, e a ED50 de ISIS 398296 foi 8,7 mg/kg. O colesterol também foi reduzido em uma maneira dose-dependente. Os triglicerídeos foram re- duzidos na maior dose.
Os compostos anti-sentido curtos apresentaram poucos a ne- nhum efeitos colaterais adversos, conforme considerado por pesos dos ór- gãos e corporal, transaminases séricas, bilirrubina, nitrogênio uréico sangüí- neo, e creatinina.
Em um estudo de administração de dose única similar, ISIS 392748, tendo SEQ ID NO: 1226, um motivo de gápmero 2-10-2, onde os nucleotídeos das asas compreendem modificações (6'R)-6'-metila metileno- óxi BNA, reduziram o RNAm PTEN em uma maneira dose-dependente. Adi- cionalmente, ISIS 392749, tendo SEQ ID NO: 1226, um motivo de gápmero 2-10-2, onde os nucleotídeos das asas compreendem modificações (6'S)-6'- metila metilenoóxi BNA, reduziram o RNAm PTEN em uma maneira dose- dependente. Um composto anti-sentido curto tendo motivos de gápmero 2- 10-2, a seqüência de SEQ ID NO: 1226, e modificações 6-(S)-CH2-0-CH3- BNA também reduziram o RNAm PTEN em um estudo similar in vivo. Um composto anti-sentido curto tendo motivos de gápmero 2-10-2, a seqüência de SEQ ID NO: 1226, e modificações 6-(R)-CH2-0-CH3-BNA também redu- ziram o RNAm PTEN em um estudo similar in vivo.
Exemplo 29: Administração de dose única de compostos anti-sentido curtos compreendendo modificações de BNA
Camundongos Balb/c machos de seis semanas de idade (Jack- son Laboratory, Bar Harbor, ME) receberam uma única injeção intraperito- neal de composto anti-sentido em uma dose de 8, 4, 2 ou 1 μηποΙ/kg. Cada grupo de dose consistiu em quatro animais. Os compostos testados foram ISIS 392063, ISIS 392749, e ISIS 366006. Um gápmero 5-10-5 MOE foi u- sado para um tratamento controle. Os camundongos foram sacrificados a- proximadamente 48 horas depois da dose final. Tecido do fígado foi coletado para isolamento de RNA, e foi colhido sangue para análises químicas séri- cas. Os níveis de RNAm ApoB foram medidos por PCR em tempo real con- forme descrito aqui, neste requerimento de patente. Os níveis de RNAm A- poB foram normalizados para níveis de RNA conforme determinado por Rl- BOGREEN, e são apresentados na Tabela 93 como percentagem de inibi- ção em relação aos níveis de RNAm ApoB em animais controle tratados com salina. Tabela 93: Inibição anti-sentido de PTEN por compostos anti-sentido curtos compreendendo modificações de BNA
<table>table see original document page 541</column></row><table>
A Tabela 93 mostra que os níveis de RNAm PTEN foram reduzi- dos em uma maneira dose-dependente depois de tratamento com compos- tos anti-sentido curtos tendo um motivo de gápmero 2-10-2 e modificações de BNA nas asas. Na dose de 8 umol/kg, a inibição de PTEN pelos compos- tos anti-sentido curtos foi maior do que a observada com um gápmero 5-10-5 MOE em uma dose equivalente. As ED50S estimadas foram de 7 mg/kg para ISIS 392063, 17,4 mg/kg para ISIS 396565, e 9,3 mg/kg para ISIS 396006.
Com a exceção da maior dose de ISIS 392063, não foram ob- servados aumentos significativos nas transaminases séricas. No total, os compostos anti-sentido curtos apresentaram nenhum a poucos efeitos cola- terais adversos.
Exemplo 30: Inibição anti-sentido de ApoB por compostos anti-sentido curtos compreendendo conjugados de ácido palmítico
Camundongos Balb/c machos de seis semanas de idade (Jack- son Laboratory, Bar Harbor, ME) receberam uma única injeção intraperito- neal de composto anti-sentido em uma dose de 2,5, 1,0. 0,4, e 0,16 umol/kg. Cada grupo de dose consistiu em quatro animais. Os compostos testados são mostrados na Tabela 94. Um gápmero 5-10-5 MOE foi usado para um tratamento controle. Os camundongos foram sacrificados aproximadamente .48 horas depois da dose final. Tecido hepático foi colhido para isolamento de RNA, e foi colhido sangue para análises químicas séricas. Os níveis de RNAm ApoB foram medidos por PCR em tempo real conforme descrito aqui, neste requerimento de patente. Os níveis de RNAm ApoB foram normaliza- dos para níveis de RNA conforme determinado por RIBOGREEN, e são a- presentados na Tabela 95 como percentagem de inibição em relação aos níveis de RNAm ApoB em animais controle tratados com salina.
Tabela 94: Compostos anti-sentido curtos compreendendo conjugados pal- míticos
<table>table see original document page 542</column></row><table> <table>table see original document page 543</column></row><table>
Tabela 95: Inibição anti-sentido por compostos anti-sentido curtos compre- endendo conjugados de ácido palmítico
<table>table see original document page 543</column></row><table>
A Tabela 95 mostra que os níveis de RNAm ApoB foram reduzi- dos em in uma maneira dose-dependente depois de tratamento com com- postos anti-sentido curtos tendo um conjugado de ácido palmítico (C16). Na dose de 2,5 umol/kg, a inibição de ApoB pelos compostos anti-sentido curtos foi maior do que a observada com um gápmero 5-10-5 MOE em uma dose equivalente. Neste estudo, as ED50S estimadas foram 1,5 mg/kg para ISIS 387462, 13,1 mg/kg para ISIS 391871, e 1,9 mg/kg para ISIS 391872. A ED50 estimada para o gápmero 5-10-5 MOE foi 17,4 mg/kg. Os triglicerídeos foram reduzidos nas doses de 2,5 e 1,0 mg/kg de ISIS 387462 e ISIS 391872. ISIS 387462 e ISIS 391872 reduziram acentuadamente o colesterol total, colesterol HDL e colesterol LDL em uma maneira dose-dependente; a redução em colesterol LDL foi tão acentuada que caiu abaixo do limite de detecção. No total, os compostos anti-sentido curtos apresentaram poucos a nenhum efeitos adversos.
Exemplo 31: Inibição anti-sentido de PCSK9 in vivo por compostos anti- sentido curtos compreendendo modificações de BNA
Camundongos machos Balb/c de seis semanas de idade (Jack- son Laboratory1 Bar Harbor, ME) foram administrados uma única injeção in- traperitoneal de composto anti-sentido em uma dose de 15, 4,7, 1,5 e 0,47 umol/kg de ISIS 403739 ou 403740. Cada grupo de dose consistiu em quatro animais. Um gápmero 5-10-5 MOE foi usado para um tratamento controle. Os camundongos foram sacrificados aproximadamente 72 horas depois da dose final. Tecido hepático foi coletado para isolamento de RNA, e foi colhi- do sangue para análisees químicas do soro. Os níveis de RNAm PCSK9 foram medidos por PCR em tempo real conforme descrito aqui, neste reque- rimento de patente. Os níveis de RNAm PCSK9 foram normalizados para os níveis de RNAm de ciclofilina conforme determinado por PCR em tempo re- al. ISIS 403739 reduziu o RNAm PCSK9 por aproximadamente 70%, em relação a controles de salina. ISIS 403740 reduziu o PCSK9 por aproxima- damente 13% em relação a controles de salina, no entanto, a redução não foi estatisticamente significativa. As menores doses não reduzem significati- vamente RNAm PCSK9. No total, os compostos anti-sentido curtos apresen- taram poucos a nenhum efeitos colaterais adversos.

Claims (52)

1. Composto anti-sentido curto de 8 a 16 monômeros de exten- são, compreendendo uma região de gap 2'-desoxirribonucleotídeo flanquea- da sobre cada lado por uma asa, em que cada asa independentemente compreende 1 a 3 monômeros modificados de alta afinidade e em que o composto anti-sentido curto é dirigido para um nucleotídeo codificando GC- CR.
2. Composto anti-sentido curto de acordo com a reivindicação 1, em que os referidos monômeros modificados de alta afinidade são nucleotí- deos modificados com açúcar.
3. Composto anti-sentido curto de acordo com a reivindicação 2, em que no mínimo um dos nucleotídeos modificados com açúcar compreen- de uma ponte entre a posição 4' e a 2' do açúcar.
4. Composto anti-sentido curto de acordo com a reivindicação 2, em que cada um dos referidos nucleotídeos modificados de alta afinidade confere uma ATm de 1 a 4 graus por nucleotídeo.
5. Composto anti-sentido curto de acordo com a reivindicação 2, em que cada um dos referidos nucleotídeos modificados com açúcar com- preende um grupo 2'-substituinte que é diferente de H ou OH.
6. Composto anti-sentido curto de acordo com a reivindicação 5, em que no mínimo um dos referidos nucleotídeos modificados com açúcar é um nucleotídeo bicíclico ligado por ponte 4' a 2'.
7. Composto anti-sentido curto de acordo com a reivindicação 5, em que cada um dos grupamentos 2'-substituintes é, independentemente, alcóxi, alcóxi substituído, ou halogênio.
8. Composto anti-sentido curto de acordo com a reivindicação 7, em que cada um dos grupamentos 2'-substituintes é OCH2CH2OCH3.
9. Composto anti-sentido curto de acordo com a reivindicação 3, em que a conformação de cada um dos referidos nucleotídeos modificados com açúcar é, independentemente, β-D ou a-L.
10. Composto anti-sentido curto de acordo com a reivindicação .5, em que cada uma das referidas pontes independentemente compreende 1 ou de 2 a 4 grupamentos ligados independentemente selecionados entre -[C(Ri)(R2)]n-, -C(R1)=C(R2)-, -C(R1)=N-, -Ci=NR1)-, -C(=0)-, -C(=S)-, -O-, - Si(R1)2-, -S(=0)x-e-N(R1)-; em que χ é O, 1, ou 2; η é 1, 2, 3, ou 4; cada R1 e R2 é, independentemente, H, um grupo protetor, hidroxila, C1-C12 alquila, C1-C12 alquila substituída, C2-C12 alquenila, C2-C12 alquenila substitu- ída, C2-Ci2 alquinila, C2-C12 alquinila substituída, C5-C20 arila, C5-C20 arila substituída, radical heterociclo, radical heterociclo substituído, heteroarila, heteroarila substituída, radical C5-C7 alicíclico, radical C5-C7 alicíclico substi- tuído, halogênio, OJ1, NJ1J2, SJ1, N3, COOJ1, acila (C(=0)-H), acila substitu- ída, CN, sulfonila (Si=O)2-J1), ou sulfoxila (Si=O)-J1); e cada J1 e J2 é, independentemente, H, C1-C12 alquila, C1-C12 alquila substitu- ida, C2-C12 alquenila, C2-C12 alquenila substituída, C2-Ci2 alquinila, C2-C12 alquinila substituída, C5-C20 arila, C5-C20 arila substituída, acila (C(=0)-H), acila substituída, um radical heterociclo, um radical heterociclo substituído, C1-C12 aminoalquila, C1-C12 aminoalquila substituída ou um grupo protetor.
11. Composto anti-sentido curto de acordo com a reivindicação 10, em que cada uma das referidas pontes é, independentemente, 4'-CH2-2',4'-(CH2)2-2', 4'-CH2-0-2', 4'-(CH2)2-0-2', 4'-CH2-0-N(R1)-2' e 4,-CH2-N(R1)-0-2'- em que cada R1 é, independentemente, H, um grupo protetor ou C1-C12 alquila.
12. Composto anti-sentido curto de acordo com a reivindicação 1, em que cada um do monômero modificado de alta afinidade é selecionado de modo independente entre nucleotídeos bicíclicos ou outros nucleotídeos 2'-modificados.
13. Composto anti-sentido curto de acordo com a reivindicação 12, em que os nucleotídeos 2'-modificados são selecionados entre halogê- nio, alila, amino, azido, tio, O-alila, O-C1-C1OaIquiIa, -OCF3, O-(CH2)2-O-CH3,2'-0(CH2)2SCH3, O-(CH2)2-O-N(Rm)(Rn) ou 0-CH2-C(=0)-N(Rm)(Rn), onde cada Rm e Rn é, independentemente, H ou C1-C10 alquila substituída ou não- substituída.
14. Composto anti-sentido curto de acordo com a reivindicação -13, em que o nucleotídeo 2'-modificado é um nucleotídeo 2'-OCH2CH2OCH3.
15. Composto anti-sentido curto de acordo com a reivindicação -1, em que no mínimo uma ligação monomérica é uma ligação monomérica modificada.
16. Composto anti-sentido de acordo com a reivindicação 15, em que a ligação monomérica modificada é uma ligação fosforotioato.
17. Composto anti-sentido curto de acordo com a reivindicação -1, em que cada ligação monomérica é uma ligação internucleosídeoss fosfo- rotioato.
18. Composto anti-sentido curto de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 17, que tem 8 a 15 monômeros de extensão.
19. Composto anti-sentido curto de acordo com a reivindicação -18 que tem 9 a 15 monômeros de extensão.
20. Composto anti-sentido curto de acordo com a reivindicação -18 que tem 10 a 15 monômeros de extensão.
21. Composto anti-sentido curto de acordo com a reivindicação -18 que tem 9 a 14 monômeros de extensão.
22. Composto anti-sentido curto de acordo com a reivindicação -18 que tem 10 a 14 monômeros de extensão.
23. Composto anti-sentido curto de acordo com a reivindicação -18 que tem 9 a 13 monômeros de extensão.
24. Composto anti-sentido curto de acordo com a reivindicação -18 que tem 10 a 13 monômeros de extensão.
25. Composto anti-sentido curto de acordo com a reivindicação -18 que tem 9 a 12 monômeros de extensão.
26. Composto anti-sentido curto de acordo com a reivindicação -18 que tem 10 a 12 monômeros de extensão.
27. Composto anti-sentido curto de acordo com a reivindicação -18 que tem 9 a 11 monômeros de extensão.
28. Composto anti-sentido curto de acordo com a reivindicação .18 que tem 10 a 11 monômeros de extensão.
29. Composto anti-sentido curto de acordo com a reivindicação .18 que tem 8 monômeros de extensão.
30. Composto anti-sentido curto de acordo com a reivindicação .18 que tem 9 monômeros de extensão.
31. Composto anti-sentido curto de acordo com a reivindicação .18 que tem 10 monômeros de extensão.
32. Composto anti-sentido curto de acordo com a reivindicação .18 que tem 11 monômeros de extensão.
33. Composto anti-sentido curto de acordo com a reivindicação .18 que tem 12 monômeros de extensão.
34. Composto anti-sentido curto de acordo com a reivindicação .18 que tem 13 monômeros de extensão.
35. Composto anti-sentido curto de acordo com a reivindicação .18 que tem 14 monômeros de extensão.
36. Composto anti-sentido curto de acordo com a reivindicação .18 que tem 15 monômeros de extensão.
37. Composto anti-sentido curto de acordo com a reivindicação .18 que tem 16 monômeros de extensão.
38. Composto anti-sentido curto de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 18, tendo um motivo selecionado entre 1-12-1; 3-10- .3; 2-10-3; 2-10-2; 1-10-1; 1-10-2; 3-8-3; 2-8-2; 1-8-1; 3-6-3; e 1-6-11 em que, o primeiro número representa o número de monômeros na asa 5', o segundo número representa o número de monômeros no gap, e o terceiro número representa o número de monômeros na asa 3'.
39. Composto anti-sentido curto de acordo com a reivindicação .38, em que o motivo é selecionado entre 1-10-1; 2-10-2; 3-10-3; e 1-9-2.
40. Composto anti-sentido curto de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 18 tendo um motivo selecionado entre 1-1-10-2, 1-1- .8-2, 1-1-6-3, e 1-2-8-2, em que o primeiro número representa o número de monômeros em uma primeira asa 5', o segundo número representa o núme- ro de monômeros em uma segunda asa 5', o terceiro número representa o número de monômeros no gap, e o quarto número representa o número de monômeros na asa 3'.
41. Composto anti-sentido curto de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 18 tendo um motivo selecionado entre 2-10-1-1, 2-8- -1-1, 3-6-1-1, e 2-8-2-1, em que o primeiro número representa o número de monômeros na asa 5', o segundo número representa o número de monôme- ros no gap, o terceiro número representa o número de monômeros em uma primeira asa 3', e o quarto número representa o número de monômeros em uma segunda asa 3'.
42. Composto anti-sentido curto de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 18, tendo um motivo selecionado entre 1-2-10-1-1; 1- -1-8-1-1; 2-1-6-1-1; e 1- 2-8-2-1, em que o primeiro número representa o nú- mero de monômeros em uma primeira asa 5', o segundo número representa o número de monômeros em uma segunda asa 5', o terceiro número repre- senta o número de monômeros no gap, o quarto número representa o núme- ro de monômeros em uma primeira asa 3' e o quinto número representa o número de monômeros em uma segunda asa 3'.
43. Método para modular a expressão de GCCR contactando um ácido nucléico GCCR com um composto anti-sentido curto.
44. Método de acordo com a reivindicação 43 em que o ácido nucléico GCCR está em uma célula.
45. Método de acordo com a reivindicação 44, em que o ácido nucléico GCCR está em um animal.
46. Método de acordo com a reivindicação 45, em que o animal é um ser humano.
47. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 43 a 46, em que o composto anti-sentido curto é o composto anti-sentido curto como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 38.
48. Uso do composto anti-sentido curto como definido com qual- quer uma das reivindicações 1 a 43 para a preparação de um medicamento para reduzir a expressão de GCCR RNA em um animal.
49. Uso de acordo com a reivindicação 50, em que o medica- mento trata um distúrbio metabólico em um animal.
50. Uso de acordo com a reivindicação 51, em que o medica- mento aumenta a sensibilidade a insulina, reduz a glicose sangüínea e/ou reduz a HbAic no animal.
51. Método para inibir a expressão de GCCR RNA em um ani- mal, compreendendo administrar ao referido animal o composto anti-sentido curto de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 43.
52. Método para tratar um distúrbio metabólico em um animal, compreendendo administrar a um animal que necessite de semelhante tera- pia o composto anti-sentido curto como definido em qualquer uma das rei- vindicações 1 a 43.
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