KR101914309B1 - 전압 작동 나트륨 통로, 알파 소단위(scna)에 대한 자연 안티센스 전사체의 저해에 의한 전압 작동 나트륨 통로, 알파 소단위(scna) 관련된 질환의 치료 - Google Patents

전압 작동 나트륨 통로, 알파 소단위(scna)에 대한 자연 안티센스 전사체의 저해에 의한 전압 작동 나트륨 통로, 알파 소단위(scna) 관련된 질환의 치료 Download PDF

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Abstract

본 발명은 특히, 전압 작동 나트륨 통로, 알파 소단위(SCNA)의 자연 안티센스 폴리뉴클레오티드를 표적으로 함으로써, 전압 작동 나트륨 통로, 알파 소단위(SCNA)의 발현 및/또는 기능을 조정하는 안티센스 올리고뉴클레오티드에 관계한다. 본 발명은 또한, 이들 안티센스 올리고뉴클레오티드의 확인 및 SCNA의 발현과 연관된 질환과 장애의 치료에서 그들의 용도에 관계한다.

Description

전압 작동 나트륨 통로, 알파 소단위(SCNA)에 대한 자연 안티센스 전사체의 저해에 의한 전압 작동 나트륨 통로, 알파 소단위(SCNA) 관련된 질환의 치료{TREATMENT OF SODIUM CHANNEL VOLTAGE-GATED, ALPHA SUBUNIT (SCNA) RELATED DISEASES BY INHIBITION OF NATURAL ABTISENSE TRANSCRIPT TO SCNA}
본 발명의 기술분야
본 출원은 2010년 6월 23일 제출된 U.S. 특허가출원 No. 61/357,774에 우선권을 주장하고, 이의 내용은 본 발명에 순전히 참조로서 편입된다.
본 발명의 구체예는 SCNA 및 연관된 분자의 발현 및/또는 기능을 조정하는 올리고뉴클레오티드를 포함한다.
배경기술
DNA-RNA 및 RNA-RNA 혼성화는 DNA 복제, 전사, 그리고 번역을 비롯한 핵산 기능의 많은 측면에 중요하다. 혼성화 역시 특정 핵산을 검출하거나, 또는 이의 발현을 변경시키는 다양한 기술에 중심적이다. 안티센스 뉴클레오티드는 가령, 표적 RNA에 혼성화되어 RNA 절단접합, 전사, 번역, 그리고 복제를 간섭함으로써 유전자 발현을 교란시킨다. 안티센스 DNA는 DNA-RNA 하이브리드 (hybrid)가 대부분의 세포 유형에서 존재하는 활성인 리보뉴클레아제 H에 의한 절단을 위한 기질 (substrate)로서 기능하는 부가된 특징을 갖는다. 안티센스 분자는 올리고데옥시뉴클레오티드 (ODN)의 경우에서처럼 세포 내로 전달될 수 있고, 또는 이들은 내생적 유전자로부터 RNA 분자로서 발현될 수 있다. FDA는 최근에, 안티센스 약물, VITRAVENE™ (거대세포바이러스 망막염의 치료용)를 승인하였는데, 이는 안티센스가 치료 유용성 (therapeutic utility)을 갖는다는 것을 반영한다.
요약
본 요약은 본 발명의 성격과 내용을 간단하게 나타내기 위한 본 발명의 요약을 제시하기 위하여 제공된다. 이것은 특허청구범위의 범위 또는 의미를 해석하거나 한정하는데 이용되지 않는 것으로 이해된다.
한 구체예에서, 본 발명에서는 상응하는 센스 유전자의 상향-조절을 유발하는 자연 안티센스 전사체의 임의의 영역에 표적화된 안티센스 올리고뉴클레오티드(들)를 이용함으로써, 자연 안티센스 전사체의 작용을 저해하는 방법을 제시하는데, 이때, 상기 센스 유전자는 SCNA 유전자 족(family)중 최소한 하나의 구성부 및이의 변이체들로부터 선택된다. 또한, 자연 안티센스 전사체의 저해는 siRNA, 리보자임 및 소형 분자에 의해 달성될 수 있을 것으로 기대되고, 이들은 본 발명의 범위 내에 있는 것으로 간주된다.
한 구체예에서 생체내에서 또는 시험관내에서 환자 세포 또는 조직에서 SCNA 폴리뉴클레오티드의 기능 및/또는 발현을 조정하는 방법을 제시하고, 상기 방법은 상기 세포 또는 조직을 5개 내지 30개 뉴클레오티드 길이의 안티센스 올리고뉴클레오티드와 접촉시키는 단계, 여기서 상기 올리고뉴클레오티드는 서열 번호: 12의 뉴클레오티드 1 내지 1123 그리고 서열 번호:13의 뉴클레오티드 1 내지 2352, 서열 번호:14의 뉴클레오티드 1 내지 267, 서열 번호:15의 뉴클레오티드 1 내지 1080, 서열 번호:16의 뉴클레오티드 1 내지 173, 서열 번호:17의 뉴클레오티드 1 내지 618, 서열 번호:18의 뉴클레오티드 1 내지 871, 서열 번호:19의 뉴클레오티드 1 내지 304, 서열 번호:20의 뉴클레오티드 1 내지 293, 서열 번호:21의 뉴클레오티드 1 내지 892, 서열 번호:22의 뉴클레오티드 1 내지 260, 서열 번호:23의 뉴클레오티드 1 내지 982, 서열 번호:24의 뉴클레오티드 1 내지 906, 서열 번호:25의 뉴클레오티드 1 내지 476, 서열 번호:26의 뉴클레오티드 1 내지 285, 서열 번호:27의 뉴클레오티드 1 내지 162 그리고 서열 번호:28의 뉴클레오티드 1 내지 94 내에 5개 내지 30개의 연속 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드의 역보체에 최소한 50% 서열 동일성을 갖고; 그리고 생체내에서 또는 시험관내에서 환자 세포 또는 조직에서 SCNA 폴리뉴클레오티드의 기능 및/또는 발현을 조정하는 단계를 포함한다.
한 구체예에서, 올리고뉴클레오티드는 SCNA 폴리뉴클레오티드의 자연 안티센스 서열, 예를 들면, 서열 번호: 12 내지 28에 진술된 뉴클레오티드, 그리고 이들의 임의의 변이체, 대립유전자, 동족체, 돌연변이체, 유도체, 단편 및 상보성 서열을 표적으로 한다. 안티센스 올리고뉴클레오티드의 실례는 서열 번호: 29 내지 94로 진술된다.
다른 구체예에서 생체내에서 또는 시험관내에서 환자 세포 또는 조직에서 SCNA 폴리뉴클레오티드의 기능 및/또는 발현을 조정하는 방법을 제시하고, 상기 방법은 상기 세포 또는 조직을 5개 내지 30개 뉴클레오티드 길이의 안티센스 올리고뉴클레오티드와 접촉시키는 단계, 여기서 상기 올리고뉴클레오티드는 SCNA 폴리뉴클레오티드의 안티센스의 역보체에 최소한 50% 서열 동일성을 갖고; 그리고 생체내에서 또는 시험관내에서 환자 세포 또는 조직에서 SCNA 폴리뉴클레오티드의 기능 및/또는 발현을 조정하는 단계를 포함한다.
다른 구체예에서 생체내에서 또는 시험관내에서 환자 세포 또는 조직에서 SCNA 폴리뉴클레오티드의 기능 및/또는 발현을 조정하는 방법을 제시하고, 상기 방법은 상기 세포 또는 조직을 5개 내지 30개 뉴클레오티드 길이의 안티센스 올리고뉴클레오티드와 접촉시키는 단계, 여기서 상기 올리고뉴클레오티드는 SCNA 폴리뉴클레오티드에 대한 안티센스 올리고뉴클레오티드에 최소한 50% 서열 동일성을 갖고; 그리고 생체내에서 또는 시험관내에서 환자 세포 또는 조직에서 SCNA 폴리뉴클레오티드의 기능 및/또는 발현을 조정하는 단계를 포함한다.
한 구체예에서, 조성물은 센스 및/또는 안티센스 SCNA 폴리뉴클레오티드에 결합하는 하나 이상의 안티센스 올리고뉴클레오티드를 포함하며, 이때 상기 폴리뉴클레오티드들은 SCNA 내지 SCN12A 그리고 이의 변이체들로 구성된 군으로부터 선택된다. 바람직한 구체예에서, 표적 폴리뉴클레오티드는 SCNA으로부터 선택된다.
한 구체예에서, 올리고뉴클레오티드들은 하나 이상의 변형된 또는 치환된 뉴클레오티드를 포함한다.
또다른 구체예에서, 올리고뉴클레오티드는 하나 이상의 변형된 결합을 포함한다.
또 다른 구체예에서, 변형된 뉴클레오티드는 포스포로티오에이트, 메틸포스포네이트, 펩티드 핵산, 2'-O-메틸, 플루오르- 또는 탄소, 메틸렌 또는 다른 잠금된 핵산 (LNA) 분자를 보유하는 변형된 염기를 포함한다. 바람직하게는, 변형된 뉴클레오티드는 α-L-LNA를 비롯한 잠금된 핵산 분자이다.
또다른 구체예에서, 올리고뉴클레오티드는 환자에 피하, 근육내, 정맥내 또는 복막내 투여된다.
또다른 구체예에서, 올리고뉴클레오티드는 제약학적 조성물에 담겨 투여된다. 치료 섭생 (treatment regimen)은 안티센스 화합물을 환자에게 최소한 1회 투여하는 것을 포함한다; 하지만, 이러한 치료는 일정한 기간 동안 복수 약액주입을 포함하도록 변형될 수 있다. 상기 치료는 한 가지 이상의 다른 유형의 요법과 복합될 수 있다.
또다른 구체예에서, 올리고뉴클레오티드는 리포좀 내에 캡슐화 (encapsulation)되거나, 또는 담체 분자 (가령, 콜레스테롤, TAT 펩티드)에 부착된다.
다른 측면은 하기에 기술된다.
상세한 설명
본 발명의 여러 측면은 예시를 위한 실례 적용과 관련하여 하기에 기술된다. 다수의 특정한 상세, 상관관계, 그리고 방법은 본 발명의 완전한 이해를 제공하기 위하여 설명되는 것으로 이해되어야 한다. 하지만, 당업자가 이의 없이 인지하는 바와 같이, 본 발명은 하나 이상의 특정한 상세 없이, 또는 다른 방법으로 실시될 수 있다. 본 발명은 행위 또는 현상의 순서에 의해 한정되지 않는데, 그 이유는 일부 행위가 다른 행위 또는 현상과 상이한 순서로 및/또는 이들과 동시에 발생할 수 있기 때문이다. 게다가, 모든 예시된 행위 또는 현상이 본 발명에 따른 방법을 실행하는데 요구되지는 않는다.
본 명세서에서 개시된 모든 유전자, 유전자 명칭, 그리고 유전자 산물은 본 명세서에서 개시된 조성물과 방법이 적용될 수 있는 임의의 종으로부터 동족체에 상응하는 것으로 의도된다. 따라서 상기 용어에는 인간 및 생쥐로부터 유전자와 유전자 산물이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 특정 종으로부터 유전자 또는 유전자 산물이 개시될 때, 이러한 개시는 단지 실례인 것으로 의도되고, 그리고 해당 문맥에서 달리 명시되지 않으면 한정으로서 해석되지 않는 것으로 이해된다. 따라서 예로써, 본 명세서에서 개시된 유전자의 경우에, 이들은 일부 구체예에서, 포유동물 핵산에 관계하고, 그리고 아미노산 서열은 다른 포유동물, 어류, 양서류, 파충류, 그리고 조류가 포함되지만 이들에 국한되지 않는 다른 동물로부터 상동 (homologous) 및/또는 병렬상동 (orthologous) 유전자 및 유전자 산물을 포함하는 것으로 의도된다. 한 구체예들에서, 이들 유전자 또는 핵산 서열은 인간 유래이다.
정의
본 명세서에서 이용된 용어는 단지 특정 구체예를 설명하는 것을 목적으로 하고, 그리고 본 발명을 한정하는 것으로 의도되지 않는다. 본 명세서에서, 단수 형태는 해당 문맥에서 달리 명시되지 않으면, 복수 형태 역시 포괄하는 것으로 의도된다. 게다가, 용어 "내포하는", "내포한다", "보유하는", "보유한다", "갖는", 또는 이들의 변이체가 상세한 설명 및/또는 특허청구범위에 이용되는 한에는, 이들 용어는 용어 "포함하는"과 유사한 방식으로 포괄적인 것으로 의도된다.
용어 "약" 또는 "대략"은 당업자에 의해 결정되는, 특정 값에 대한 허용되는 오차 범위 이내를 의미하고, 이는 상기 값이 어떻게 측정되거나 결정되는 지, 다시 말하면, 측정 체계 (measurement system)의 한계에 부분적으로 좌우될 것이다. 가령, "약"은 당분야에서 실시 (practice)에 대해 1 또는 1 이상의 표준 편차 이내를 의미할 수 있다. 대안으로, "약"은 소정의 값의 최대 20%, 바람직하게는 최대 10%, 더욱 바람직하게는 최대 5%, 그리고 더욱 바람직하게는 최대 1%의 범위를 의미할 수 있다. 대안으로, 특히 생물학적 시스템 또는 공정에 대하여, 상기 용어는 소정의 값의 1 크기 자릿수 (order of magnitude) 이내, 바람직하게는 5-배 이내, 그리고 더욱 바람직하게는 2-배 이내를 의미할 수 있다. 특정 값이 명세서 및 특허청구범위에서 기술될 때, 달리 명시되지 않으면 특정 값에 대한 허용되는 오차 범위 이내를 의미하는 용어 "약"이 가정되어야 한다.
본 명세서에서, 용어 "mRNA"는 표적화된 유전자의 현재 공지된 mRNA 전사체(들), 그리고 석명될 수 있는 임의의 다른 전사체를 의미한다.
"안티센스 올리고뉴클레오티드" 또는 "안티센스 화합물"은 다른 RNA 또는 DNA (표적 RNA, DNA)에 결합하는 RNA 또는 DNA 분자를 의미한다. 가령, RNA 올리고뉴클레오티드이면, 이는 RNA-RNA 상호작용에 의해 다른 RNA 표적에 결합하고 표적 RNA의 활성을 변경시킨다. 안티센스 올리고뉴클레오티드는 특정 폴리뉴클레오티드의 발현 및/또는 기능을 상향 조절 또는 하향 조절할 수 있다. 이러한 정의에는 치료적 관점, 진단적 관점, 또는 다른 관점에서 유용한 임의의 외래 RNA 또는 DNA 분자가 포함되는 것으로 의도된다. 이런 분자에는 예로써, 안티센스 RNA 또는 DNA 분자, 간섭 RNA (RNAi), 마이크로 RNA, 미끼 RNA 분자, siRNA, 효소 RNA, 치료 편집 RNA 및 작동약과 길항약 RNA, 안티센스 올리고머 화합물, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 외부 가이드 서열 (external guide sequence, EGS) 올리고뉴클레오티드, 교대 접합기 (alternate splicer), 프라이머, 프로브, 그리고 표적 핵산의 최소한 일부분에 혼성화되는 다른 올리고머 화합물이 포함된다. 따라서 이들 화합물은 단일-가닥, 이중-가닥, 부분적으로 단일-가닥, 또는 원형 올리고머 화합물의 형태로 도입될 수 있다.
본 발명의 맥락에서, 용어 "올리고뉴클레오티드"는 리보핵산 (RNA) 또는 데옥시리보핵산 (DNA)의 올리고머 또는 폴리머, 또는 이의 모방체를 지칭한다. 용어 "올리고뉴클레오티드"에는 또한, 데옥시리보뉴클레오시드, 리보뉴클레오시드, 이들의 치환된 및 알파-아노머 (alpha-anomeric) 형태, 펩티드 핵산 (PNA), 잠금된 핵산 (LNA), 포스포로티오에이트, 메틸포스포네이트 등을 비롯한 자연 및/또는 변형된 단량체 또는 연쇄의 선형 또는 원형 올리고머가 포함된다. 올리고뉴클레오티드는 단량체-단량체 상호작용의 규칙적인 패턴, 예를 들면, Watson-Crick 유형의 염기 대합 (base pairing), Hoogsteen 또는 역 Hoogsteen 유형의 염기 대합 등에 의해, 표적 폴리뉴클레오티드에 특이적으로 결합할 수 있다.
올리고뉴클레오티드는 "키메라"일 수 있다, 다시 말하면, 서로 다른 영역으로 구성될 수 있다. 본 발명의 맥락에서, "키메라" 화합물은 2개 이상의 화학적 영역, 예를 들면, DNA 영역(들), RNA 영역(들), PNA 영역(들) 등을 보유하는 올리고뉴클레오티드이다. 각각의 화학적 영역은 최소한 하나의 단량체 단위, 다시 말하면, 올리고뉴클레오티드 화합물의 경우에 뉴클레오티드로 구성된다. 이들 올리고뉴클레오티드는 전형적으로, 최소한 하나의 영역을 포함하고, 여기서 올리고뉴클레오티드는 한 가지 이상의 요망되는 특성을 나타내기 위하여 변형된다. 올리고뉴클레오티드의 요망되는 특성에는 예로써, 뉴클레아제 분해에 증가된 내성, 증가된 세포 흡수, 및/또는 표적 핵산에 대한 증가된 결합 친화성 (binding affinity)이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 이런 이유로, 상기 올리고뉴클레오티드의 서로 다른 영역은 상이한 특성을 가질 수 있다. 본 발명의 키메라 올리고뉴클레오티드는 2개 이상의 올리고뉴클레오티드, 변형된 올리고뉴클레오티드, 올리고뉴클레오시드 및/또는 앞서 기술된 바와 같은 올리고뉴클레오티드 유사체의 혼성 구조로서 형성될 수 있다.
올리고뉴클레오티드는 "레지스터 (register)"에서, 다시 말하면, 단량체가 고유 DNA에서처럼 연속적으로 연결되거나, 또는 스페이서를 통해 연결될 때, 연결될 수 있는 영역으로 구성될 수 있다. 이들 스페이서는 이들 영역 간에 공유 "가교"를 구성하고 바람직한 경우에, 대략 100개의 탄소 원자를 초과하지 않는 길이를 갖도록 의도된다. 이들 스페이서는 예로써, 양 또는 음 전하를 보유하고, 특정한 핵산 결합 특성 (삽입물, 그루브 접합제 (groove binder), 독소, 형광단 등)을 갖고, 친유성이고, 예로써 알파-나선 (alpha-helix)을 유도하는 알라닌-보유 펩티드와 같은 특수한 이차 구조를 유도하는 상이한 기능기 (functionality)를 보유할 수 있다.
본 명세서에서, "SCN1A"에는 모든 집단 구성원, 돌연변이체, 대립유전자, 단편, 종, 코딩과 비-코딩 서열, 센스 및 안티센스 폴리뉴클레오티드 가닥 등이 포함된다. 유사하게, SCN2A-SCN12A에는 모든 돌연변이체, 대립유전자, 단편들이 포함된다.
본 명세서에서, '전압 작동 나트륨 통로, 유형 I, 알파 소단위', SCN1A, FEB3, FEB3A, GEFSP2, HBSCI, NAC1, Nav1.1, SCN1, SMEI, 나트륨 통로 단백질 뇌 I 소단위 알파, 나트륨 통로 단백질 유형 I 소단위 알파, 나트륨 통로 단백질 유형 I 소단위 알파와 전압 작동 나트륨 통로 소단위 알파 Nav1.1은 기존 문헌에서와 동일한 것으로 간주되고, 그리고 본 출원에서 동의어로서 이용된다.
본 명세서에서, 용어 "특이적인 올리고뉴클레오티드" 또는 "표적으로 하는 올리고뉴클레오티드"는 (i) 표적화된 유전자의 일부와 안정된 복합체를 형성할 수 있거나, 또는 (ii) 표적화된 유전자의 mRNA 전사체의 일부와 안정된 이중나선을 형성할 수 있는 서열을 보유하는 올리고뉴클레오티드를 지칭한다. 이들 복합체 및 이중나선의 안정성은 이론적 계산 및/또는 시험관내 분석에 의해 결정될 수 있다. 혼성화 복합체 및 이중나선의 안정성을 결정하는 대표적인 분석법은 하기 실시예에서 기술된다.
본 명세서에서, 용어 "표적 핵산"은 DNA, 이런 DNA로부터 전사된 RNA (premRNA 및 mRNA 포함), 그리고 비-코딩 서열, 센스 또는 안티센스 폴리뉴클레오티드를 코딩하는, 이런 RNA로부터 유래된 cDNA를 포괄한다. 올리고머 화합물의 표적 핵산과의 특이적인 혼성화는 상기 핵산의 정상적인 기능을 간섭한다. 표적 핵산에 특이적으로 혼성화되는 화합물에 의한 상기 표적 핵산의 기능의 이러한 조정은 일반적으로, "안티센스"로 지칭된다. 간섭되는 DNA의 기능에는 예로써, 복제 및 전사가 포함된다. 간섭되는 RNA의 기능에는 예로써, RNA의 단백질 번역 부위로의 전좌, RNA로부터 단백질의 번역, 하나 이상의 mRNA 종을 산출하기 위한 RNA의 절단접합, 그리고 RNA에 관련되거나 RNA에 의해 촉진될 수 있는 촉매 활성과 같은 생명 유지에 필요한 모든 기능이 포함된다. 표적 핵산 기능으로 이런 간섭의 전반적인 효과는 인코딩된 산물 또는 올리고뉴클레오티드의 발현의 조정이다.
RNA 간섭 "RNAi"는 "표적" 핵산 서열에 서열-특이적 상동성 (homology)을 갖는 이중 가닥 RNA (dsRNA) 분자에 의해 매개된다. 본 발명의 일정한 구체예에서, 매개자 (mediator)는 5-25개 뉴클레오티드 "작은 간섭" RNA 이중나선 (siRNA)이다. 이들 siRNA는 Dicer로 알려져 있는 RNase 효소에 의한 dsRNA의 가공으로부터 유래된다. siRNA 이중나선 산물은 RISC (RNA Induced Silencing Complex)로 명명된 다중-단백질 siRNA 복합체 내로 동원된다. 특정 이론에 한정됨 없이, RISC는 이후, 표적 핵산 (적절하게는 mRNA)로 안내되는 것으로 생각되고, 여기서 siRNA 이중나선은 서열-특이적 방식으로 상호작용하여 촉매 방식으로 절단을 매개한다. 본 발명에 따라서 이용될 수 있는 작은 간섭 RNA는 당분야에 널리 공지되고 당업자에게 익숙한 절차에 따라서 합성되고 이용될 수 있다. 본 발명의 방법에 이용되는 작은 간섭 RNA는 적절하게는, 대략 1개 내지 대략 50개의 뉴클레오티드 (nt)를 포함한다. 무제한적 구체예의 실례에서, siRNA는 대략 5개 내지 대략 40개 nt, 대략 5개 내지 대략 30개 nt, 대략 10개 내지 대략 30개 nt, 대략 15개 내지 대략 25개 nt, 또는 대략 20-25개 뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
적절한 올리고뉴클레오티드의 선별은 핵산 서열을 자동적으로 정렬하고 동일성 또는 상동성의 영역을 표시하는 컴퓨터 프로그램을 이용함으로써 조장된다. 이들 프로그램은 예로써, GenBank와 같은 데이터베이스를 검색하거나, 또는 PCR 산물을 서열화함으로써, 획득된 핵산 서열을 비교하는데 이용된다. 일정한 범위의 종으로부터 핵산 서열의 비교는 종 간에 적절한 정도의 동일성을 보이는 핵산 서열의 선별을 가능하게 한다. 서열화되지 않은 유전자의 경우에, 표적 종 및 다른 종에서 유전자 간에 동일성 정도를 결정하기 위하여 서던 블롯 (Southern blot)이 수행된다. 당분야에 널리 공지된 바와 같이, 다양한 정도의 엄격함 (stringency)에서 서던 블롯을 수행함으로써, 동일성의 근사 측정 (approximate measure)을 달성하는 것이 가능하다. 이들 절차는 통제되는 개체에서 표적 핵산 서열에 높은 정도의 상보성 (complementarity), 그리고 다른 종에서 상응하는 핵산 서열에 더욱 낮은 정도의 상보성을 나타내는 올리고뉴클레오티드의 선별을 가능하게 한다. 당업자는 본 발명에서 이용을 위한 유전자의 적절한 영역을 선별하는데 상당한 허용 범위 (latitude)가 존재한다는 것을 인지할 것이다.
"효소 RNA"는 효소 활성을 갖는 RNA 분자를 의미한다 (Cech, (1988) J. American . Med . Assoc. 260, 3030-3035). 효소 핵산 (리보자임)은 먼저, 표적 RNA에 결합함으로써 작용한다. 이런 결합은 표적 RNA를 절단하는 작용을 하는 분자의 효소 부분에 매우 가깝게 유지되는 효소 핵산의 표적 결합 부분을 통하여 발생한다. 따라서 효소 핵산은 먼저, 표적 RNA를 인식하고, 이후 염기 대합을 통하여 표적 RNA에 결합하고, 그리고 일단 정확한 부위에 결합되면, 표적 RNA을 절단하는데 효소적으로 작용한다.
"미끼 RNA"는 리간드에 대한 자연 결합 도메인을 모방하는 RNA 분자를 의미한다. 이런 이유로, 미끼 RNA는 특정 리간드의 결합에 대하여 자연 결합 표적과 경쟁한다. 가령, HIV 횡단-활성화 반응 (trans-activation response, TAR) RNA의 과다-발현은 "미끼"로서 작용할 수 있고 HIV tat 단백질에 효율적으로 결합하고, 따라서 상기 단백질이 HIV RNA에 인코딩된 TAR 서열에 결합하는 것을 예방하는 것으로 밝혀졌다. 이는 특정한 실례인 것으로 의도된다. 당업자는 이것이 단지 하나의 실례이고, 그리고 다른 구체예가 당분야에 널리 공지된 기술을 이용하여 쉽게 산출될 수 있다는 것을 인지할 것이다.
본 명세서에서, 용어 "단량체"는 전형적으로, 포스포디에스테르 결합 또는 이들의 유사체에 의해 연결되어 수개의 단량체 단위, 예를 들면, 대략 3-4개 내지 대략 수백 개의 단량체 단위 범위의 크기를 갖는 올리고뉴클레오티드를 형성하는 단량체를 지시한다. 포스포디에스테르 연쇄의 유사체에는 하기에 더욱 상세하게 기술된 바와 같이, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 메틸포스포네이트, 포스포로셀레노에이트, 포스포라미데이트 등이 포함된다.
용어 "뉴클레오티드"에는 자연 발생 뉴클레오티드 및 비-자연 발생 뉴클레오티드가 포함된다. 이전에 "비-자연 발생" 인 것으로 간주되었던 다양한 뉴클레오티드가 차후에, 자연에서 발견되고 있음은 당업자에게 명백할 것이다. 따라서 "뉴클레오티드"에는 공지된 퓨린과 피리미딘 헤테로환-보유 분자뿐만 아니라 이들의 헤테로환상 유사체 및 호변체 (tautomer) 역시 포함된다. 다른 유형의 뉴클레오티드의 예시적인 실례는 아데닌, 구아닌, 티민, 시토신, 우라실, 퓨린, 잔틴, 디아미노퓨린, 8-옥소-N6-메틸아데닌, 7-데아자잔틴, 7-데아자구아닌, N4,N4-에타노시토신, N6,N6-에타노-2,6-디아미노퓨린, 5-메틸시토신, 5-(C3-C6)-알키닐시토신, 5-플루오르우라실, 5-브로모우라실, 슈도이소시토신, 2-히드록시-5-메틸-4-트리아졸로피리딘, 이소시토신, 이소구아닌, 이노신, 그리고 Benner et al ., U.S. Pat No. 5,432,272에서 설명된 "비-자연 발생" 뉴클레오티드를 보유하는 분자이다. 용어 "뉴클레오티드"에는 이들 실시예 모두, 그리고 이들의 유사체 및 호변체가 포함되는 것으로 의도된다. 특히 흥미로운 뉴클레오티드는 아데닌, 구아닌, 티민, 시토신, 그리고 우라실을 보유하는 것들인데, 이들은 인간에서 치료적 및 진단적 적용에 관하여 자연 발생 뉴클레오티드로서 간주된다. 뉴클레오티드는 예로써, Kornberg and Baker, DNA Replication, 2nd Ed. (Freeman, San Francisco, 1992)에서 설명된 바와 같은 자연 2'-데옥시 및 2'-히드록실 당, 그리고 이들의 유사체를 포함한다.
뉴클레오티드와 관련하여 "유사체"에는 변형된 염기 모이어티 및/또는 변형된 당 모이어티를 보유하는 합성 뉴클레오티드가 포함된다 (예로써, Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York, 1980; Freier & Altmann, (1997) Nucl . Acid . Res., 25(22), 4429-4443, Toulme J.J., (2001) Nature Biotechnology 19:17-18; Manoharan M., (1999) Biochemica et Biophysica Acta 1489:117-139; Freier S. M., (1997) Nucleic Acid Research, 25:4429-4443, Uhlman, E., (2000) Drug Discovery & Development, 3: 203-213, Herdewin P., (2000) antisense & Nucleic Acid Drug Dev ., 10:297-310); 2'-O, 3`-C-linked [3.2.0] bicycloarabinonucleosides에 의해 전반적으로 기술됨). 이런 유사체에는 결합 특성, 예를 들면, 이중나선 또는 삼중나선 안정성, 특이성 등을 증강시키도록 설계된 합성 뉴클레오티드가 포함된다.
본 명세서에서, "혼성화"는 올리고머 화합물의 실질적으로 상보성 가닥의 대합을 의미한다. 대합의 한 가지 기전은 수소 결합을 수반하고, 이는 올리고머 화합물의 가닥의 상보성 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 염기 (뉴클레오티드) 간에 Watson-Crick, Hoogsteen 또는 역 Hoogsteen 수소 결합일 수 있다. 가령, 아데닌 및 티민은 수소 결합의 형성을 통하여 대합하는 상보성 뉴클레오티드이다. 혼성화는 다양한 조건 하에 발생할 수 있다.
안티센스 화합물은 표적 핵산에 상기 화합물의 결합이 표적 핵산의 정상적인 기능을 간섭하여 기능 및/또는 활성의 조정을 유발하고, 그리고 특정한 결합이 요망되는 조건 하에, 다시 말하면, 생체내 분석 또는 치료적 처리의 경우에 생리학적 조건 하에, 그리고 시험관내 분석의 경우에 이들 분석이 수행되는 조건 하에 비-표적 핵산 서열에 안티센스 화합물의 비-특이적 결합을 회피할 수 있을 만큼 충분한 정도의 상보성이 존재할 때, "특이적으로 혼성화가능"하다.
본 명세서에서, 구(句) "엄격한 혼성화 조건" 또는 "엄격한 조건"은 본 발명의 화합물이 표적 서열에 혼성화되지만, 최소 숫자의 다른 서열에 혼성화되는 조건을 지칭한다. 엄격한 조건은 서열-의존성이고 서로 다른 환경에서 상이할 것이고, 그리고 본 발명의 맥락에서, 올리고머 화합물이 표적 서열에 혼성화되는 "엄격한 조건"은 이들 올리고머 화합물의 본성과 조성 및 이들이 조사되는 분석법에 의해 결정된다. 일반적으로, 엄격한 혼성화 조건은 무기 양이온, 예를 들면, Na++ 또는 K++를 갖는 낮은 농도 (<0.15M)의 염 (즉, 낮은 이온 강도), 올리고머 화합물:표적 서열 복합체의 Tm 미만에서 20℃ - 25℃보다 높은 온도, 그리고 변성제, 예를 들면, 포름아미드, 디메틸포름아미드, 디메틸 설폭시드, 또는 세정제 나트륨 도데실 설페이트 (SDS)의 존재를 포함한다. 가령, 혼성화 속도는 각 1% 포름아미드에 대하여 1.1% 감소한다. 높은 엄격한 혼성화 조건의 실례는 60℃에서 30분 동안 0.1X 염화나트륨-구연산나트륨 완충액 (SSC)/0.1% (w/v) SDS이다.
본 명세서에서, "상보성"은 1개 또는 2개의 올리고머 가닥에서 2개의 뉴클레오티드 간에 정확한 대합의 능력을 지칭한다. 가령, 안티센스 화합물의 일정한 위치에서 핵염기 (nucleobase)가 표적 핵산의 일정한 위치에서 핵염기와 수소 결합을 형성할 수 있고, 상기 표적 핵산이 DNA, RNA, 또는 올리고뉴클레오티드 분자이면, 상기 올리고뉴클레오티드 및 표적 핵산 사이에 수소 결합의 위치는 상보성 위치인 것으로 간주된다. 올리고머 화합물 및 추가의 DNA, RNA, 또는 올리고뉴클레오티드 분자는 각 분자 내에서 충분한 숫자의 상보성 위치가 서로에 수소 결합될 수 있는 뉴클레오티드에 의해 점유될 때, 서로에 상보성이다. 따라서 "특이적으로 혼성화가능" 및 "상보성"은 올리고머 화합물 및 표적 핵산 사이에 안정되고 특정한 결합이 발생할 만큼 충분한 숫자의 뉴클레오티드에 걸쳐 충분한 정도의 정확한 대합 또는 상보성을 지시하는데 이용되는 용어이다.
당분야에서, 올리고머 화합물의 서열은 특이적으로 혼성화되기 위하여, 표적 핵산의 서열에 100% 상보성일 필요가 없는 것으로 이해된다. 게다가, 올리고뉴클레오티드는 개재성 또는 인접 분절 (segment)이 혼성화 현상에 관련되지 않도록 하나 이상의 분절에 걸쳐 혼성화될 수 있다 (가령, 루프 (loop) 구조, 미스매치 (mismatch) 또는 헤어핀 (hairpin) 구조). 본 발명의 올리고머 화합물은 그들이 표적화되는 표적 핵산 서열 내에 표적 영역에 최소한 대략 70%, 또는 최소한 대략 75%, 또는 최소한 대략 80%, 또는 최소한 대략 85%, 또는 최소한 대략 90%, 또는 최소한 대략 95%, 또는 최소한 대략 99% 서열 상보성을 포함한다. 가령, 안티센스 화합물의 20개 뉴클레오티드 중에서 18개가 표적 영역에 상보성이고, 따라서 특이적으로 혼성화되는 안티센스 화합물은 90% 상보성을 나타낼 것이다. 이러한 실례에서, 나머지 비-상보성 뉴클레오티드는 상보성 뉴클레오티드와 함께 군집되거나, 또는 상보성 뉴클레오티드가 군데군데 산재될 수 있고, 그리고 서로에 또는 상보성 뉴클레오티드에 인접할 필요가 없다. 따라서 표적 핵산과 완전 상보성의 두 영역이 측면에서 접하는 4개의 비-상보성 뉴클레오티드를 보유하는 18개 뉴클레오티드 길이를 갖는 안티센스 화합물은 표적 핵산과 77.8% 전체 상보성을 가질 것이고, 따라서 본 발명의 범위 내에 속할 것이다. 안티센스 화합물의 표적 핵산의 영역과의 상보성 비율은 당분야에 공지된 BLAST (basic local alignment search tools) 프로그램 및 PowerBLAST 프로그램을 이용하여 일과적으로 결정될 수 있다. 상동성, 서열 동일성 또는 상보성 비율은 예로써, 디폴트 설정을 이용한 Gap 프로그램 (Wisconsin Sequence Analysis Package, Version 8 for Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, Madison Wis.)에 의해 결정될 수 있고, Smith and Waterman, Adv . Appl . Math., (1981) 2, 482-489의 알고리즘을 이용한다.
본 명세서에서, 용어 "열 융점 (Tm)"은 표적 서열에 상보성인 올리고뉴클레오티드 중에서 50%가 평형에서 표적 서열에 혼성화되는 규정된 이온 강도, pH, 그리고 핵산 농도 하에 온도를 지칭한다. 전형적으로, 엄격한 조건은 염 농도가 pH 7.0 내지 8.3에서 최소한 대략 0.01 내지 1.0 M Na 이온 농도 (또는 다른 염)이고, 그리고 온도가 짧은 올리고뉴클레오티드 (가령, 10개 내지 50개 뉴클레오티드)의 경우에 최소한 대략 30℃인 조건일 것이다. 엄격한 조건은 또한, 불안정화제 (destabilizing agent), 예를 들면, 포름아미드의 첨가로 달성될 수도 있다.
본 명세서에서, "조정"은 유전자의 발현에서 증가 (촉진) 또는 감소 (저해)를 의미한다.
폴리뉴클레오티드 서열의 맥락에서 이용될 때, 용어 "변이체-"에는 야생형 유전자에 관련된 폴리뉴클레오티드 서열이 포함될 수 있다. 이러한 정의에는 또한, 예로써 "대립유전자", "절단접합", "종", 또는 "다형성" 변이체가 포함될 수 있다. 절단접합 변이체는 참고 분자에 현저한 동일성을 가질 수도 있지만, 일반적으로 mRNA 가공 동안 엑손의 교대성 절단접합 (alternate splicing)으로 인하여 더욱 많은 또는 더욱 적은 숫자의 폴리뉴클레오티드를 보유할 것이다. 상응하는 폴리펩티드는 추가의 기능적 도메인을 보유하거나, 또는 도메인이 부재할 수 있다. 종 변이체는 종에 따라 달라지는 폴리뉴클레오티드 서열이다. 야생형 유전자 산물의 변이체가 본 발명에 특히 유용하다. 변이체는 핵산 서열 내에서 최소한 하나의 돌연변이로부터 유래할 수 있고, 그리고 변경된 mRNA, 또는 구조 또는 기능이 변경되거나 변경되지 않은 폴리펩티드를 결과할 수 있다. 임의의 소정의 자연 또는 재조합 유전자는 대립유전자 형태를 보유하지 않거나, 또는 1개 또는 다수의 대립유전자 형태를 보유할 수 있다. 변이체를 발생시키는 공통의 돌연변이 변화는 일반적으로, 뉴클레오티드의 자연적인 결실, 부가, 또는 치환에 기인하는 것으로 생각된다. 이들 유형의 변화는 각각, 소정의 서열 내에서 단독으로, 또는 다른 것들과 공동으로, 1회 이상 발생할 수 있다
결과의 폴리펩티드는 일반적으로, 서로에 대하여 현저한 아미노산 동일성을 가질 것이다. 다형성 변이체는 소정의 종의 개체 간에 특정 유전자의 폴리뉴클레오티드 서열에서 변형물이다. 다형성 변이체에는 또한, "단일 뉴클레오티드 다형성" (single nucleotide polymorphism, SNP), 또는 폴리뉴클레오티드 서열이 1개 염기에 의해 달라지는 단일 염기 돌연변이 (single base mutations)가 포함될 수 있다. SNP의 존재는 예로써, 질환 상태에 대한 경향, 다시 말하면, 내성 (resistance)과 대비하여 감수성 (susceptibility)을 갖는 일정한 개체군을 지시할 수 있다.
유도체 폴리뉴클레오티드는 화학적 변형, 예를 들면, 알킬, 아실, 또는 아미노 기에 의한 수소의 대체에 종속되는 핵산을 포함한다. 유도체, 예를 들면, 유도체 올리고뉴클레오티드는 비-자연-발생 부분, 예를 들면, 변경된 당 모이어티 또는 당내 (inter-sugar) 연쇄를 포함할 수 있다. 포스포로티오에이트 및 당분야에 공지되어 있는 다른 황-보유 종이 이들 중에서 대표적이다. 유도체 핵산은 또한, 방사성뉴클레오티드, 효소, 형광제, 화학발광제, 발색제 (chromogenic agent), 기질, 보조인자, 저해물질, 자기 입자 등을 비롯한 라벨을 보유할 수 있다.
"유도체" 폴리펩티드 또는 펩티드는 예로써, 당화 (glycosylation), 페길화 (pegylation), 인산화 (phosphorylation), 설파화 (sulfation), 환원 (reduction)/알킬화 (alkylation), 아실화 (acylation), 화학적 커플링, 또는 순한 포르말린 처리에 의해 변형된 것이다. 유도체는 또한, 방사성동위원소, 형광, 그리고 효소 라벨이 포함되지만 이들에 국한되지 않는 검출가능 라벨을 직접적으로 또는 간접적으로 보유하도록 변형될 수 있다.
본 명세서에서, 용어 "동물" 또는 "환자"에는 예로써, 인간, 양, 엘크, 사슴, 뮬 사슴, 밍크, 포유동물, 원숭이, 말, 소, 돼지, 염소, 개, 고양이, 쥐, 생쥐, 조류, 닭, 파충류, 어류, 곤충 및 거미류 동물이 포함되는 것으로 의도된다.
"포유동물"에는 전형적으로, 건강 관리를 받고 있는 온혈 포유동물 (가령, 인간 및 가축)이 포함된다. 실례에는 인간뿐만 아니라 고양이, 개, 말, 소 등이 포함된다.
"치료하는" 또는 "치료"는 포유동물에서 질환-상태의 치료를 커버하고, 그리고 (a) 포유동물에서, 특히 이런 포유동물이 질환-상태의 성향이 있지만 아직 발병된 것으로 진단되지 않았을 때 질환-상태가 발생하는 것을 예방하고; (b) 질환-상태를 저해하고, 예를 들면, 이의 발생을 중지시키고; 및/또는 (c) 질환-상태를 완화하는, 예를 들면, 원하는 종점에 도달될 때까지 질환 상태의 퇴보를 유발하는 것을 포함한다. 치료는 또한, 질환의 증상의 개선 (가령, 통증 또는 불쾌감 경감)을 포함하고, 여기서 이런 개선은 질환 (가령, 원인, 전염, 표현 등)에 직접적으로 영향을 주거나 주지 않을 수 있다.
"신경 질환이나 장애"는 신경계 및/또는 시계의 임의의 질환이나 장애를 지칭한다. "신경 질환이나 장애"는 중추 신경계 (뇌, 뇌간 및 소뇌), 말초 신경계 (뇌신경 포함), 그리고 자율 신경계 (중추신경계 및 말초 신경계 둘 모두에 위치하는 부분)가 관련된 질환이나 장애를 포함한다. 신경 질환 또는 장애는 후천성 간질 실어; 급성 파종성 뇌척수염; 부신백질이영양증; 노인성 황반 변성; 뇌량의 발육부진; 인지불능; Aicardi 증후군; Alexander 질환; Alpers 질환; 교대성 반신마비; Alzherimer 질환; 혈관성 치매; 근위축성 측삭 경화증; 무뇌증; Angelman 증후군; 혈관종(angiomatosis); 산소결핍; 실어증; 운동불능; 거미집모양의 낭종; 거미집모양의 염증(arachnoiditis); Anronl-Chiari 변형; 동정맥 기형; Asperger 증후군; 기능장애 운동실조; 주의력 결핍 과다행동 장애; 자폐증; 자율 장애; 등 통증; Batten 질환; Behcet 질환; Bell 마비; 양성 필수 안검경련; 양성 병소; 근위축증; 양성 두개내 고혈압; Binswanger 질환; 안검경련; Bloch Sulzberger 증후군; 상완 신경 얼기 부상; 뇌 종기; 뇌 손상; 뇌 종양(교아종 다형 포함); 척추 종양; Brown-Sequard 증후군; Canavan 질환; 손목관절 터널 증후군; 작열통; 중앙 통증 증후군; 중심성교뇌수초용해; 두부 장애; 대뇌 동맥류; 대뇌 동맥경화증; 대뇌 위축; 대뇌 거대증; 대뇌 마비; Charcot-Marie-Tooth 질환; 화학요법-유도된 신경병증 및 신경병증 통증; Chiari 기형; 무도병; 만성 염증성 탈수초화 다발신경병증; 만성통증; 만성 국부 통증 증후군; Coffin Lowry 증후군; 지속적인 발육 상태를 비롯한 혼수; 선천적 안면 양측마비; 피질기저 퇴화; 두개 동맥염; 두개골유합증; Creutzfeldt-Jakob 질환; 누적성 외상 장애; Cushing 증후군; 세포 거대 봉입체 질환; 사이토메갈로바이러스 감염; 춤추는 눈-춤추는 발 증후군; DandyWalker 증후군; Dawson 질환; De Morsier 증후군; Dejerine-Klumke 마비; 치매; 피부근염; 당뇨성 신경병증; 미만성 경화증; 자율신경실조증; 난서증; 난독증; 긴장이상; 조기 유아 간질 뇌증; 빈 Sella 증후군; 뇌염; 뇌류(encephaloceles); 뇌삼차 신경성 혈관종증; 간질; Erb 마비; 본태성 진전증; Fabry 질환; Fahr 증후군; 기절; 가족성 강직성 마비; 열병 발작; Fisher 증후군; Friedreich 운동실조; 전두측엽 치매 및 기타 "타우병증"; Gaucher 질환; Gerstmann 증후군; 거대 세포 동맥염; 거대 세포 함유 질환; 구상세포 대뇌피질이영양증; Guillain-Barre 증후군; HTLV-1-관련된 골수증; Hallervorden-Spatz 질환; 두부 손상; 두통; 반측안면 경련증; 유전성 강직성 대마비; 유전성 다발성 신경염증 실조; 이성대상포진; 대상포진; Hirayama 증후군; HIV-관련된 치매 및 신경병증 (또한 AIDS의 신경성 현시); 전전뇌증; Huntington 질환 및 기타 폴리글루타민 반복 질환; 수두무뇌증; 물뇌증; 과콜리졸혈증; 혈중산소감소증; 면역-중재된 뇌척수염; 봉입체 근염; 색조 실조증; 영아 피틴산 축적 질환; 영아 레프슘 질환; 영아 경련; 염증성 근질환; 두개내 낭종; 두개내 고혈압; Joubert 증후군; Keams-Sayre 증후군; Kennedy 질환 Kinsboume 증후군; Klippel Feil 증후군; Krabbe 질환; Kugelberg-Welander 질환; 쿠루병; Lafora 질환; Lambert-Eaton 근무력 증후군; Landau-Kleffner 증후군; 측면 수질 (Wallenberg) 증후군; 학습 장애; Leigh 질환; Lennox-Gustaut 증후군; Lesch-Nyhan 증후군; 백질이영양증; 루이 소체 치매; 뇌회결손; 감금 증후군; 루게릭병 (가령, 운동 신경 질환 또는 근위축성 측삭 경화증); 요추간반 질환; 라임병--신경 후유증; Machado-Joseph 질환; 큰뇌증; 거대뇌증; Melkersson-Rosenthal 증후군; Menieres 질환; 뇌막염; Menkes 질환; 이염백질이영양증; 소두증; 편두통; Miller Fisher 증후군; 미니-뇌졸증; 미토콘드리아 근병증; Mobius 증후군; 일지성 근위축증; 운동 신경 질환; Moyamoya 질환; 뮤코다당증; 다발경색 치매; 다병소성 운동 신경병증; 다발성 경화증 및 기타 탈수초화 장애; 체위성 저혈압을 동반하는 다계통 위축증; 근육 영양실조; 중증근무기증; 말이집탈락성 미만성 경화증; 유아의 근간대성 뇌병증; 근질환; 본태성 근긴장; 기면발작; 신경섬유종증; 신경이완성 악성 증후군; AIDS의 신경성 현시; 낭창의 신경 후유증; 신경근육긴장증; 신경 세로이드 리포푸신증; 신경이동 장애; Niemann-Pick 질환; O'Sullivan-McLeod 증후군; 후두 신경통; 구속성 척추 증후군; Ohtahara 증후군; 올리브교 소뇌 위축증; 안구간대경련-근간대경련; 시신경염; 기립성 저혈압; 과사용 증후군; 이상 감각; 신경퇴행성 질환이나 장애 (파킨슨씨병, 헌팅턴병, 알츠하이머병, 근위축성 측삭 경화증 (ALS), 치매, 다발성 경화증 그리고 신경 세포 사멸과 관련된 기타 질환 및 장애); 선천 이상근육근긴장; 종양연관 질환; 돌발 발작; Parry Romberg 증후군; Pelizaeus-Merzbacher 질환; 주기적 마비; 말초 신경병증; 통증 있는 신경병증 및 신경병증 통증; 지속적인 성장 상태; 전반적 발달 장애; 빛 재채기 반사; 피탄산 축적 질환; Pick 질환; 신경 압박; 뇌하수체 종양; 다발성근염; 공뇌증; 소아마비 증후군; 대상포진후 신경통; 감염후 뇌척수염; 체위성 저혈압; Prader-Willi 증후군; 원발성 측삭 경화증; 프리온 질환; 진행성 반얼굴 위축; 진행성 다초점 백색질뇌증; 진행성 경화 회백질위축증; 진행성 핵상 마비; 가성뇌종양; Ramsay-Hunt 증후군 (유형 I 및 II); Rasmussen 뇌염; 반사성 교감신경 이영양증 증후군; Refsum 질환; 반복성 운동 장애; 반복성 스트레스 손상; 하지 불안 증후군; 레트로바이러스-연관 골수증; Rett 증후군; Reye 증후군; Saint Vitus 댄스; Sandhoff 질환; Schilder 질환; 뇌갈림증; 중격-시신경 형성장애; 흔들린 아이 증후군; 대상포진; Shy-Drager 증후군; Sjogren 증후군; 수면 무호흡; Soto 증후군; 경련성 마비; 척추 파열; 척수 손상; 척수 종양; 척추 근위축; Stiff-Person 증후군; 발작; Sturge-Weber 증후군; 아급성 경화성 범뇌염; 피질하부 동맥경화성 뇌병; Sydenham 무도병; 실신; 척수공동증; 지연성 운동장애; Tay-Sachs 질환; 일시적 동맥염; 계류 척추 증후군; Thomsen 질환; 흉곽 출구 증후군; 동통성 틱; Todd 마비; Tourette 증후군; 일과성 허혈 발작; 전염성 해면상뇌증; 횡단성 척추염; 외상성 뇌 손상; 진전; 삼차 신경통; 열대 경직 하반신 마비; 결절성 경화증; 혈관성 치매 (다발-경색 치매); 일시적 동맥염을 비롯한 혈관염; Von Hippel-Lindau 질환; Wallenberg 증후군; Werdnig-Hoffman 질환; West 증후군; 편달; Williams 증후군; Wildon 질환; 그리고 Zellweger 증후군이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다.
심혈관 질환이나 장애는 허혈을 일으킬 수 있는, 또는 심장의 재관류에 의해 유발되는 질환을 포함한다. 실례에는 죽상동맥경화증, 관상 동맥 질환, 육아종성 심근염, 만성 심근염 (비-육아종성), 일차성 비대성 심근증, 말초 동맥 질환 (PAD), 말초 혈관 질환, 정맥 혈전 색전증, 폐색전(pulmonary embolism), 발작, 협심증, 심근 경색, 심장 마비에 의한 심혈관 조직 손상, 심폐 바이패스에 의해 유발된 심혈관 조직 손상, 심장 쇼크, 그리고 특히 SCNA 활성화와 관련된 조직 손상이 포함되지만 이에 국한되지 않는, 당업자에게 공지되거나, 또는 심장 또는 맥관구조의 부전 또는 조직 손상과 관련된 이상이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. CVS 질환에는 죽상동맥경화증, 육아종성 심근염, 심근 경색, 판 모양의 심장 질환에 부차적인 심근 섬유증, 경색 없는 심근 섬유증, 일차성 비대성 심근증, 그리고 만성 심근염 (비-육아종증)이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다.
나트륨 통로 기능이상과 연관된 질환 또는 장애의 예로는 악성 고체온(malignant hyperthermia), 근무력증(myasthenia), 간헐적 운동실조(episodic ataxia), 신경병증 및 염증성 통증, Alzheimer 질환, Parkinson 질환, 정신분열증, 병적 놀람증(hyperekplexia), 저- 및 고-칼슘혈증성 주기성 마비와 같은 근경직증, 선천 이상근육긴장증(paramyotonia congenita) 및 칼륨 악화 근육긴장증 뿐만 아니라 긴 QT 증후군과 같은 심장 부정맥을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
폴리뉴클레오티드와 올리고뉴클레오티드 조성물 및 분자
표적 : 한 구체예에서, 이들 표적은 SCNA와 연관된 센스 및/또는 안티센스 비-코딩 및/또는 코딩 서열을 비롯하여, 전압 작동 나트륨 통로, 알파 소단위(SCNA)의 핵산 서열을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
전압-민감성 이온 통로들은 이온-발생되는 막 전위를 경유하여 정보를 전달하기 위한 세포의 감수성 및 정보에 대한 기초를 제공하는 막통과 단백질 종류이다. 막 전위에서 변화들에 반응하여, 이들 분자들은 세포 막에서 선택성 통로들을 통하여 이온 유동을 중개한다. 통로 밀도가 충분히 높다면, 재생성 소극(regenerative depolarization)이 발생되며, 이는 활동 전위(action potential)라고 부른다.
전압-작동 나트륨 통로는 신경, 심장 세포들 및 근육을 포함하는 대부분 전기적으로 흥분될 수 있는 세포들에서 활동 전위의 생성 및 보급을 담당한다. 전기적 활동은 막의 소극에 의해 촉발되어, 나트륨 이온에 대해 선택성이 높은 막을 통하여 통로들을 개방한다. 그 다음 이온들은 전기화학적 경사에 의해 개방 통로들을 통하여 세포내로 몰리게 된다. 비록 상이한 조직들에서 나트륨-기반 활동 전위가 유사하지만, 전기생리학적 연구에서 다중의 구조적 그리고 기능적으로 구별되는 나트륨 통로들이 존재하며, 그리고 나트륨 통로들을 인코드하는 다수의 유전자들이 클론되었다고 설명하고 있다. SCNA 유전자는 전압 작동 나트륨 통로의 유전자 족(family)에 속한다.
전압 작동 나트륨 통로들은 Goldin , et al . (2000) Neuron 28:365-368에서 제시한 명명법으로부터 표준화된 형태로 이름을 붙일 수 있다. 이 시스템에 따라, 전압 작동 나트륨 통로들은 한 가지 족으로 묶고, 이로부터 9가지 포유동물 이소폼을 확인하고 발현시켰다. 이들 9가지 이소폼은 Navl.1부터 Navl.9로 명명한다. 또한 다양한 이소폼의 절단접합 변이체들은 숫자 다음에 소문자를 이용하여 구별한다 (예를 들면, "Navl.1a").
전압 작동 나트륨 통로들은 신경 세포들과 근육에서 활동 전위의 생성에 중요한 역할을 한다. 알파 소단위(SCNA)는 이 통로의 주요 성분이며, 그리고 시험관에서 세포들 안에서 발현될 때 효과적인 통로를 생성하는데 충분할 것이다. 다음에는, 베타-1 및 2 소단위는 효과적인 통로를 제공하는데 알파 소단위를 필요로 한다. 이들 소단위들의 역할은 나트륨 전류의 신속한 비활성화에 의해 통로의 동역학적 성질을 변형시키는 것일 것이다. SCN1B 유전자에서 GEFS 증후군에서 발견되는 돌연변이는 알파 소단위와 함께 공동-발현될 때, 정상적인 SCNB1과 비교하여 나트륨 통로들의 신속한 비활성화를 감소시키는 것으로 나타난다.
한 구체예들에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 SCNA 족 구성요소들과 연관된 질환 또는 장애들을 예방 또는 치료하는데 이용한다. 안티센스 화합물들을 이용하여 수득한 줄기 세포들에서 생성된 세포/조직으로 치료할 수 있는 예시적인 전압 작동 나트륨 통로, 알파 소단위(SCNA) 중개된 질환 및 장애들은 다음을 포함한다: SCNA의 비정상적 기능 및/또는 발현과 관련된 질환 또는 장애, 신경 질환 또는 장애, 경련, 통증(만성 통증을 포함), 나트륨 통로 기능이상과 관련된 손상된 전기적 감수성, 나트륨 통로 기능이상과 관련된 질환 또는 장애, 전압 작동 나트륨 통로 알파 소단위 활성의 오조절(misregulation)과 관련된 질환 또는 장애(가령, 마비, 과칼륨 주기성 마비, 선천 이상근육긴장증, 칼륨-악화 근육긴장증, 긴 Q-T 증후군 3, 운동 종말판 질환, 운동실조 등), 장의 신경계의 기능이상으로 인한 위장관 질환(가령, 결장염, 회장염, 염증성 장 증후군 등), 심혈관 질환 또는 장애(가령, 고혈압, 울혈성 심부전 등); 교감 및 부교감 신경분포와 관련된 비뇨생식기관의 질환 또는 장애(가령, 양성 전립선 비대증, 발기부전); 신경근계와 연관된 질환 또는 장애(가령, 근위축증, 다발성 경화증, 간질, 편두통(가령, 산발적, 가족성 편마비편두통 등), 영아기 중증 근간대성 간질(SMEI 또는 Dravet 증후군), 발열성 뇌졸중 플러스 전신 간질(GEFS+) 등) 그리고 SCNA-관련된 뇌졸중 장애들.
본 발명은 추가로 SCN1A 내지 SCN12A 유전자들 또는 이의 mRNAs 또는 이소폼 또는 변이체들로 구성된 군으로부터 선택된 최소한 하나 이상의 표적에 대한 천연 안티센스 전사체를 표적으로 하는 최소한 하나의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 제약학적 조성물에 관계한다. 본 발명은 추가로 mRNA SCN1A, SCN2A, SCN3A, SCN4A, SCN5A, SCN6A, SCN7A, SCN8A, SCN9A, SCN1OA, SCN11A 및 SCN12A 또는 이의 변이체로 구성된 군으로부터 선택된 최소한 하나 이상의 표적의 천연 안티센스 전사체를 표적으로 하는 올리고뉴클레오티드를 투여하는 것을 포함하는 신경 질환 또는 장애를 치료하는 방법에 관계한다. 바람직한 구체예에서, 올리고들은 전술한 SCNA 족의 완전한 기능을 하는 발현 산물의 발현을 상향조절하기 위하여 선택된다. 바람직한 구체예에서, 본 발명의 올리고들은 이러한 치료를 요하는 환자에서 온전한 기능을 하는 나트륨 통로들을 제공하기 위하여 SCNXA 족의 유전자들의 mRNA중 임의의 하나의 전사 또는 해독을 상향조절한다. 돌연변이된 형태의 전압 작동 나트륨 통로와 연관된 질환 또는 장애를 가진 환자들에서, 바람직한 구체예에서 전압 작동 나트륨 통로 알파 유전자 또는 이러한 유전자의 mRNA의 천연 안티센스 전사체를 표적으로 하는 올리고뉴클레오티드를 포함하는 제약학적 조성물의 투여 또는 이를 이용한 치료는 돌연변이된 형태의 이러한 유전자로부터 유도된 발현 산물의 상향 조절보다 더 큰 비율로 온전하게 기능을 하는 발현 산물을 상향조절한다. 또다른 구체예에서, 본 발명은 최소한 2개의 SCNXA 족 구성요소들의 최소한 하나의 천연 안티센스 전사체를 표적으로 하는 올리고뉴클레오티드의 조합에 관계하며, 이때 X는 1-12로부터 선택한다. 예를 들면, Dravett 증후군의 치료에서, 올리고뉴클레오티드의 조합을 이용하여 발현 산물, 예를 들면, SCN1A 및 SCN9A의 발현 산물들을 상향조절할 수 있다. 또다른 구체예에서, 최소한 하나의 올리고뉴클레오티드는 SCN1A 내지 SCN12A중 임의의 하나로부터 선택된 최소한 2개 유전자의 천연 안티센스 전사체를 표적하도록 선택할 수 있다. 본 발명의 바람직한 올리고뉴클레오티드는 길이가 약 5 내지 약 30개 뉴클레오티드 사이이며, 그리고 NAT의 5 내지 약 30개 뉴클레오티드 분절에 최소한 50% 상보성이 있다. SCNA 유전자들중 임의의 하나 또는 이의 전사 산물의 바람직한 NTAT는 본 발명의 올리고뉴클레오티드에 의해 표적화될 때 전술한 mRNA의 발현 및/또는 mRNA의 해독 산물을 간섭하고 조정한다. 바람직한 구체예에서, 이 올리고뉴클레오티드는 SCNA 연관된 질환을 치료 또는 완화시키기 위하여 표적의 기능을 하는 단백질의 발현을 상향조절한다. 바람직한 구체예에서, 이 "상향조절(upregulation)"은 암과 같은 질환의 원인 또는 촉진과 연관되지 않는다.
SCNA 유전자에서 대안은 유전자의 코딩 및/또는 넌-코딩 영역에서 삽입, 결손, 재배열 및/또는 점 돌연변이를 포함하는 유전자 돌연변이중 많은 또는 모든 형태를 포함하거나 또는 망라할 수 있다. 전제 유전자 또는 이 유전자의 일부분이 결손될 수 있다. 점 돌연변이는 아미노산 치환, 프레임 이전 또는 중지 코돈을 초래할 수 있다. 점 돌연변이들은 또한 프로모터와 같이 SCNA 유전자의 조절 영역에서 발생하여 mRNA의 발현의 상실 또는 감소를 초래하거나 또는 이러한 mRNA의 부적절한 프로세싱을 초래하여 안전성 또는 해독 효율의 감소로 이어질 수 있다. 인간에서의 이러한 변경은 다양한 형태의 질환으로 이어질 수 있고, SCNA 유전자에서의 변경은 예를 들면 간질 또는 SMEI와 연관될 수 있음을 설명하는 많은 출판물이 있다. 이러한 변경은 새로운 것("de novo")이거나 유전된 것일 수 있다. 본 발명은 SCNA 유전자에서 변경과 관련된 질환들을 치료하는데 국한되지 않으며, 또한 SCNA 연관된 질환 또는 이상의 치료를 또한 포함하며, 이때 환자는 SCNA 유전자에서 변경 또는 돌연변이를 반드시 보유하지는 않는다. 기능을 하는 전압 작동 나트륨 통로 발현 산물들의 임의의 조정 또는 상향조절은 치료를 요하는 환자에서 관련된 SCNA 질환 또는 상태의 완화 또는 치료할 수 있을 것으로 본다. 이러한 완화는 수가 감소된 뇌졸증, 덜 빈번한 뇌졸증, 심각성이 덜한 뇌졸증, 더 적은 유형의 뇌졸중 발달 또는 신경 발달의 개선 또는 임의의 기타 치료 잇점을 포함한 임상적 개선의 최소한 하나의 측정가능한 지표를 또한 포함할 수 있다.
한 구체예에서, 하나 이상의 안티센스 올리고뉴클레오티드에 의한 SCNA의 조정은 정상 대조와 비교하여 SCNA 비정상 발현, 기능, 활성에 관련된 임의의 질환이나 장애를 예방하거나 치료하기 위하여, 필요 환자에 제공된다.
한 구체예에서, 올리고뉴클레오티드는 SCNA의 폴리뉴클레오티드에 특이적이고, 여기에는 제한 없이 비-코딩 영역이 포함된다. SCNA 표적은 SCNA의 변이체; SNP를 비롯한 SCNA의 돌연변이체; SCNA의 비-코딩 서열; 대립유전자, 단편 등을 포함한다. 바람직하게는, 올리고뉴클레오티드는 안티센스 RNA 분자이다.
본 발명의 구체예들에 따라서, 표적 핵산 분자는 SCNA 폴리뉴클레오티드 단독에 한정되지 않고 SCNA의 임의의 동종형, 수용체, 동족체, 비-코딩 영역 등으로 확장된다.
한 구체예에서, 올리고뉴클레오티드는 제한 없이 SCNA 표적의 변이체, 대립유전자, 동족체, 돌연변이체, 유도체, 단편 및 상보성 서열을 비롯하여, 이들 표적의 자연 안티센스 서열 (코딩과 비-코딩 영역에 자연 안티센스)을 표적으로 한다. 바람직하게는, 올리고뉴클레오티드는 안티센스 RNA 또는 DNA 분자이다.
한 구체예에서, 본 발명의 올리고머 화합물에는 상기 화합물 내에서 하나 이상의 뉴클레오티드 위치에 상이한 염기가 존재하는 변이체 역시 포함된다. 가령, 첫 번째 뉴클레오티드가 아데닌이면, 상기 위치에서 티미딘, 구아노신, 시티딘 또는 다른 자연 또는 비-자연 뉴클레오티드를 보유하는 변이체가 생산될 수 있다. 이는 안티센스 화합물의 임의의 위치에서 수행될 수 있다. 이들 화합물은 이후, 표적 핵산의 발현을 저해하는 그들의 능력을 결정하기 위하여 본 명세서에서 기술된 방법을 이용하여 조사된다.
일부 구체예들에서, 안티센스 화합물 및 표적 사이에 상동성, 서열 동일성 또는 상보성은 대략 50% 내지 대략 60%이다. 일부 구체예에서, 상동성, 서열 동일성 또는 상보성은 대략 60% 내지 대략 70%이다. 일부 구체예에서, 상동성, 서열 동일성 또는 상보성은 대략 70% 내지 대략 80%이다. 일부 구체예에서, 상동성, 서열 동일성 또는 상보성은 대략 80% 내지 대략 90%이다. 일부 구체예에서, 상동성, 서열 동일성 또는 상보성은 대략 90%, 대략 92%, 대략 94%, 대략 95%, 대략 96%, 대략 97%, 대략 98%, 대략 99% 또는 대략 100%이다.
안티센스 화합물은 표적 핵산에 상기 화합물의 결합이 표적 핵산의 정상적인 기능을 간섭하여 활성의 상실을 유발하고, 그리고 특정한 결합이 요망되는 조건 하에, 비-표적 핵산 서열에 안티센스 화합물의 비-특이적 결합을 회피할 수 있을 만큼 충분한 정도의 상보성이 존재할 때, 특이적으로 혼성화가능하다. 이런 조건에는 예로써, 생체내 분석 또는 치료적 처리의 경우에 생리학적 조건, 그리고 시험관내 분석의 경우에 이들 분석이 수행되는 조건이 포함된다.
안티센스 화합물은 DNA, RNA, 키메라, 치환된 등인 지에 상관없이, 표적 DNA 또는 RNA 분자에 상기 화합물의 결합이 표적 DNA 또는 RNA의 정상적인 기능을 간섭하여 유용성의 상실을 유발하고, 그리고 특정한 결합이 요망되는 조건, 다시 말하면, 생체내 분석 또는 치료적 처리의 경우에 생리학적 조건, 그리고 시험관내 분석의 경우에 이들 분석이 수행되는 조건 하에, 비-표적 서열에 안티센스 화합물의 비-특이적 결합을 회피할 수 있을 만큼 충분한 정도의 상보성이 존재할 때, 특이적으로 혼성화가능하다.
한 구체예에서, 제한 없이, 예로써 PCR, 혼성화 등을 이용하여 확인되고 확장되는 안티센스 서열, 서열 번호:12 내지 28로서 진술된 하나 이상의 서열 등을 비롯한 SCNA의 표적화는 SCNA의 발현 또는 기능을 조정한다. 한 구체예에서, 발현 또는 기능은 대조와 비교하여 상향 조절된다. 한 구체예에서, 발현 또는 기능은 대조와 비교하여 하향 조절된다.
한 구체예에서, 올리고뉴클레오티드는 예로써 PCR, 혼성화 등을 이용하여 확인되고 확장되는 안티센스 서열을 비롯하여, 서열 번호: 29 내지 94로서 진술된 핵산 서열을 포함한다. 이들 올리고뉴클레오티드는 하나 이상의 변형된 뉴클레오티드, 더욱 짧은 또는 더욱 긴 단편, 변형된 결합 등을 포함할 수 있다. 변형된 결합 또는 뉴클레오티드간 연쇄의 실례에는 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등이 포함된다. 한 구체예에서, 뉴클레오티드는 인 유도체를 포함한다. 본 발명의 변형된 올리고뉴클레오티드 내에서 당 또는 당 유사체 모이어티에 부착될 수 있는 인 유도체 (또는 변형된 포스페이트 기)는 모노포스페이트, 디포스페이트, 트리포스페이트, 알킬포스페이트, 알칸포스페이트, 포스포로티오에이트 등일 수 있다. 앞서 언급된 포스페이트 유사체의 제조, 그리고 뉴클레오티드, 변형된 뉴클레오티드 및 올리고뉴클레오티드 내로 그들의 통합은 그 자체로, 공지되어 있고 본 명세서에서 기술될 필요가 없다.
안티센스의 특이성 및 민감성 역시 치료 용도를 위하여 당업자에 의해 이용된다. 안티센스 올리고뉴클레오티드는 동물 및 인간에서 질환 상태의 치료에서 치료 모이어티로서 이용되고 있다. 안티센스 올리고뉴클레오티드는 인간에 안전하고 효과적으로 투여되고 있고, 그리고 다수의 임상 시험이 현재 진행 중에 있다. 따라서 올리고뉴클레오티드는 세포, 조직 및 동물, 특히 인간의 치료를 위한 치료 섭생에서 유용하도록 형성될 수 있는 유용한 치료 양식 (therapeutic modality)일 수 있는 것으로 확립된다.
본 발명의 구체예들에서, 올리고머 안티센스 화합물, 특히 올리고뉴클레오티드는 표적 핵산 분자에 결합하고 표적 유전자에 의해 인코딩된 분자의 발현 및/또는 기능을 조정한다. 간섭되는 DNA의 기능에는 예로써, 복제 및 전사가 포함된다. 간섭되는 RNA의 기능에는 예로써, RNA의 단백질 번역 부위로의 전좌, RNA로부터 단백질의 번역, 하나 이상의 mRNA 종을 산출하기 위한 RNA의 절단접합, 그리고 RNA에 관련되거나 RNA에 의해 촉진될 수 있는 촉매 활성과 같은 생명 유지에 필요한 모든 기능이 포함된다. 이들 기능은 요망되는 기능에 따라서, 상향 조절되거나 저해될 수 있다.
안티센스 화합물에는 안티센스 올리고머 화합물, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 외부 가이드 서열 (external guide sequence, EGS) 올리고뉴클레오티드, 교대 접합기 (alternate splicer), 프라이머, 프로브, 그리고 표적 핵산의 최소한 일부분에 혼성화되는 다른 올리고머 화합물이 포함된다. 따라서 이들 화합물은 단일-가닥, 이중-가닥, 부분적으로 단일-가닥, 또는 원형 올리고머 화합물의 형태로 도입될 수 있다.
본 발명의 맥락에서, 특정 핵산 분자에 안티센스 화합물의 표적화는 다단계 과정일 수 있다. 이러한 과정은 통상적으로, 기능이 조절되어야 하는 표적 핵산의 확인으로 시작된다. 표적 핵산은 예로써, 발현이 특정 장애 또는 질환 상태, 또는 감염성 병원체로부터 핵산 분자와 연관되는 세포 유전자 (또는 상기 유전자로부터 전사된 mRNA)일 수 있다. 본 발명에서, 표적 핵산은 전압 작동 나트륨 통로, 알파 소단위(SCNA)를 인코딩한다.
표적화 과정은 통상적으로, 요망되는 효과, 예를 들면, 발현의 조정이 결과되도록 안티센스 상호작용이 발생하는 표적 핵산 내에서 최소한 하나의 표적 영역, 분절, 또는 부위의 결정 역시 포함한다. 본 발명의 맥락에서, 용어 "영역"은 최소한 하나의 확인가능 구조, 기능, 또는 특징을 갖는 표적 핵산의 부분으로서 정의된다. 분절은 표적 핵산의 영역 내에 있다. "분절"은 표적 핵산 내에 영역의 더욱 작은 또는 하위 부분으로서 정의된다. 본 발명에서, "부위"는 표적 핵산 내에 위치로서 정의된다.
한 구체예에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 전압 작동 나트륨 통로, 유형 I 알파 소단위(SCNA)의 자연 안티센스 서열에 결합하고 SCNA(서열 번호: 1 내지 11)의 발현 및/또는 기능을 조정한다. 천연 안티센스 서열의 예로는 서열 번호:12 내지 28을 포함한다. 안티센스 올리고뉴클레오티드들의 실례에는 서열 번호: 29 내지 94가 포함된다.
한 구체예에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 전압 작동 나트륨 통로, 알파 소단위(SCNA) 폴리뉴클레오티드의 하나 이상의 분절에 결합하고, SCNA의 발현 및/또는 기능을 조정한다. 이들 분절은 SCNA 센스 또는 안티센스 폴리뉴클레오티드의 최소한 5개의 연속 뉴클레오티드를 포함한다.
한 구체예에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 SCNA의 자연 안티센스 서열에 특이적이고, 여기서 SCNA의 자연 안티센스 서열에 이들 올리고뉴클레오티드의 결합은 SCNA의 발현 및/또는 기능을 조정한다.
한 구체예에서, 올리고뉴클레오티드 화합물은 예로써, PCR, 혼성화 등을 이용하여 확인되고 확장되는 안티센스 서열, 서열 번호: 29 내지 94로서 진술된 서열을 포함한다. 이들 올리고뉴클레오티드는 하나 이상의 변형된 뉴클레오티드, 더욱 짧은 또는 더욱 긴 단편, 변형된 결합 등을 포함할 수 있다. 변형된 결합 또는 뉴클레오티드간 연쇄의 실례에는 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등이 포함된다. 한 구체예에서, 뉴클레오티드는 인 유도체를 포함한다. 본 발명의 변형된 올리고뉴클레오티드 내에서 당 또는 당 유사체 모이어티에 부착될 수 있는 인 유도체 (또는 변형된 포스페이트 기)는 모노포스페이트, 디포스페이트, 트리포스페이트, 알킬포스페이트, 알칸포스페이트, 포스포로티오에이트 등일 수 있다. 앞서 언급된 포스페이트 유사체의 제조, 그리고 뉴클레오티드, 변형된 뉴클레오티드 및 올리고뉴클레오티드 내로 그들의 통합은 그 자체로, 공지되어 있고 본 명세서에서 기술될 필요가 없다.
당분야에 공지된 바와 같이, 번역 개시 코돈이 전형적으로, 5'-AUG (전사된 mRNA 분자에서; 상응하는 DNA 분자에서 5'-ATG)이기 때문에, 상기 번역 개시 코돈은 "AUG 코돈", "시작 코돈", 또는 "AUG 시작 코돈"으로도 지칭된다. 소수의 유전자는 RNA 서열 5'-GUG, 5'-UUG 또는 5'-CUG를 갖는 번역 개시 코돈을 보유한다; 그리고 5'-AUA, 5'-ACG 및 5'-CUG는 생체내에서 기능하는 것으로 밝혀졌다. 따라서 용어 "번역 개시 코돈" 및 "시작 코돈"은 각 경우에 개시자 아미노산이 전형적으로, 메티오닌 (진핵생물에서) 또는 포르밀메티오닌 (원핵생물에서)이긴 하지만, 많은 코돈 서열을 포함할 수 있다. 진핵 및 원핵 유전자는 2개 이상의 대안적 시작 코돈을 보유할 수도 있는데, 이들 중에서 임의의 하나가 특정 세포 유형 또는 조직에서, 또는 특정한 일단의 조건 하에 번역 개시에 우선적으로 이용될 수 있다. 본 발명의 맥락에서, "시작 코돈" 및 "번역 개시 코돈"은 이런 코돈의 서열(들)에 상관없이, 전압 작동 나트륨 통로, 알파 소단위(SCNA)를 인코딩하는 유전자로부터 전사된 mRNA의 번역을 개시하기 위하여 생체내에서 이용되는 코돈(들)을 지칭한다. 유전자의 번역 종결 코돈 (또는 "종결 코돈")은 3가지 서열, 다시 말하면, 5'-UAA, 5'-UAG 및 5'-UGA (상응하는 DNA 서열은 각각, 5'-TAA, 5'-TAG 및 5'-TGA이다) 중에서 하나를 가질 수 있다.
용어 "시작 코돈 영역" 및 "번역 개시 코돈 영역"은 번역 개시 코돈으로부터 어느 한쪽 방향 (즉, 5' 또는 3')으로 대략 25개 내지 대략 50개 연속 뉴클레오티드를 포함하는 이런 mRNA 또는 유전자의 일부분을 지칭한다. 유사하게, 용어 "종결 코돈 영역" 및 "번역 종결 코돈 영역"은 번역 종결 코돈으로부터 어느 한쪽 방향 (즉, 5' 또는 3')으로 대략 25개 내지 대략 50개 연속 뉴클레오티드를 포함하는 이런 mRNA 또는 유전자의 일부분을 지칭한다. 결과적으로, "시작 코돈 영역" (또는 "번역 개시 코돈 영역") 및 "종결 코돈 영역" (또는 "번역 종결 코돈 영역")은 본 발명의 안티센스 화합물로 효과적으로 표적화될 수 있는 최대 영역이다.
당분야에서 번역 개시 코돈 및 번역 종결 코돈 사이에 영역을 지칭하는 것으로 알려져 있는 개방 해독틀 (ORF) 또는 "코딩 영역" 역시 효과적으로 표적화될 수 있는 영역이다. 본 발명의 맥락에서, 표적화된 영역은 유전자의 개방 해독틀 (ORF)의 번역 개시 또는 종결 코돈을 포함하는 유전자내 (intragenic) 영역이다.
다른 표적 영역에는 당분야에서 번역 개시 코돈으로부터 5' 방향으로 mRNA의 일부분을 지칭하는 것으로 알려져 있고, 따라서 mRNA (또는 유전자 상에서 상응하는 뉴클레오티드)의 5' 캡 부위 및 번역 개시 코돈 사이에 뉴클레오티드를 포함하는 5' 비번역 영역 (5'UTR)이 포함된다. 또 다른 표적 영역에는 당분야에서 번역 종결 코돈으로부터 3' 방향으로 mRNA의 일부분을 지칭하는 것으로 알려져 있고, 따라서 mRNA (또는 유전자 상에서 상응하는 뉴클레오티드)의 번역 종결 코돈 및 3' 말단 사이에 뉴클레오티드를 포함하는 3' 비번역 영역 (3'UTR)이 포함된다. mRNA의 5' 캡 부위는 5'-5' 트리포스페이트 연쇄를 통하여 상기 mRNA의 5'-최말단 잔기에 결합된 N7-메틸화된 구아노신 잔기를 포함한다. mRNA의 5' 캡 영역은 캡 부위에 인접한 첫 50개의 뉴클레오티드뿐만 아니라 5' 캡 구조 자체를 포함하는 것으로 간주된다. 본 발명을 위한 다른 표적 영역은 5' 캡 영역이다.
일부 진핵 mRNA 전사체는 직접적으로 번역되지만, 대부분은 "인트론"으로 알려져 있는 하나 이상의 영역을 포함하는데, 이들은 번역되기 전에 전사체로부터 잘려나간다. 나머지 (따라서 번역된) 영역은 "엑손"으로 알려져 있으며, 함께 절단접합되어 연속 mRNA를 형성한다. 한 구체예에서, 절단접합 부위, 다시 말하면, 인트론-엑손 접합 또는 엑손-인트론 접합 부위를 표적으로 하는 것은 이상 절단접합이 질환에 연관되거나, 또는 특정 절단접합 산물의 과다 생산이 질환과 연관되는 상황에서 특히 유용하다. 재배열 또는 결실로 인한 이상 융합 접합은 표적 부위의 다른 구체예이다. 상이한 유전자 소스로부터 2개 (또는 그 이상)의 mRNA의 절단접합 과정을 통하여 생산된 mRNA 전사체는 "융합 전사체"로 알려져 있다. 인트론은 예로써, DNA 또는 pre-mRNA를 표적으로 하는 안티센스 화합물을 이용하여 효과적으로 표적화될 수 있다.
한 구체예에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 표적 폴리뉴클레오티드의 코딩 및/또는 비-코딩 영역에 결합하고 표적 분자의 발현 및/또는 기능을 조정한다.
한 구체예에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 자연 안티센스 폴리뉴클레오티드에 결합하고 표적 분자의 발현 및/또는 기능을 조정한다.
한 구체예에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 센스 폴리뉴클레오티드에 결합하고 표적 분자의 발현 및/또는 기능을 조정한다.
대안적 RNA 전사체는 DNA의 동일한 게놈 영역으로부터 만들어질 수 있다. 이들 대안적 전사체는 일반적으로 "변이체"로 알려져 있다. 더욱 특이적으로, "pre-mRNA 변이체"는 그들의 시작 또는 종결 위치에서 동일한 게놈 DNA로부터 만들어진 다른 전사체와 상이하며 인트론 및 엑손 서열을 모두 포함하는 동일한 게놈 DNA로부터 생산된 전사체이다.
절단접합 동안 하나 이상의 엑손 또는 인트론 영역, 또는 이들의 일부분을 잘라낼 때, pre-mRNA 변이체는 더욱 작은 "mRNA 변이체"를 만든다. 결과적으로, mRNA 변이체는 가공된 pre-mRNA 변이체이고, 각 독특한 pre-mRNA 변이체는 절단접합의 결과로 독특한 mRNA 변이체를 항상 만들어낸다. 이와 같은 mRNA 변이체는 또한 "대안적 절단접합 변이체들"로 알려져 있다. pre-mRNA 변이체의 절단접합이 발생되지 않으면, pre-mRNA 변이체는 mRNA 변이체와 동일하게 된다.
변이체는 전사의 시작 또는 종결에 대한 대안적 신호를 이용하여 만들어질 수 있다. Pre-mRNA 및 mRNA는 하나 이상의 시작 코돈 또는 종결 코돈을 보유할 수 있다. 대안적 시작 코돈을 이용하는 pre-mRNA 또는 mRNA으로부터 기원하는 변이체는 pre-mRNA 또는 mRNA의 "대안적 시작 변이체"로 알려져 있다. 대안적 종결 코돈을 이용하는 이들 전사체는 pre-mRNA 또는 mRNA의 "대안적 종결 변이체"로 알려져 있다. 대안적 종결 변이체중 한 가지 특정 유형은 "폴리A 변이체"이며, 여기서 만들어진 다중 전사체는 전사 기전에 의해 "폴리A 종결 신호"중 하나의 대안적 선별에 기인하고, 따라서 독특한 폴리A 부위에서 종결되는 전사체가 만들어진다. 본 발명의 맥락에서, 본 명세서에서 기술된 변이체의 이들 유형 역시 표적 핵산의 구체예이다.
안티센스 화합물이 혼성화되는 표적 핵산 상의 위치는 활성 안티센스 화합물이 표적화되는 표적 영역의 최소한 5개 뉴클레오티드 길이 부분으로 정의된다.
일정한 예시적인 표적 분절의 특정한 서열이 본 명세서에서 제시되긴 하지만, 당업자는 이들이 본 발명의 범위 내에서 특정 구체예를 예시하고 기술한다는 것을 인지할 것이다. 추가적인 표적 단편은 본 내용을 근거하여 당업자에 의해 용이하게 인지될 수 있다.
예시된 바람직한 표적 분절로부터 선택된 최소한 5개의 연속 뉴클레오티드 스트레치를 포함하는 5-100개 뉴클레오티드 길이의 표적 분절은 표적화에도 적합한 것으로 간주된다.
표적 분절은 예시된 바람직한 표적 분절 중에서 하나의 5'-말단으로부터 최소한 5개 연속 뉴클레오티드 (나머지 뉴클레오티드는 표적 분절의 5' 말단의 직상류에서 시작하고, DNA 또는 RNA가 대략 5 내지 대략 100개 뉴클레오티드를 포함할 때까지 연속되는 동일한 DNA 또는 RNA의 연속 스트레치이다)를 포함하는 DNA 또는 RNA 서열을 포함할 수 있다. 유사하게, 바람직한 표적 분절은 예시된 바람직한 표적 분절 중에서 하나의 3'-말단으로부터 최소한 5개 연속 뉴클레오티드 (나머지 뉴클레오티드는 표적 분절의 3' 말단의 직하류에서 시작하고, DNA 또는 RNA가 대략 5 내지 대략 100개 뉴클레오티드를 포함할 때까지 연속되는 동일한 DNA 또는 RNA의 연속 스트레치이다)를 포함하는 DNA 또는 RNA 서열로 대표된다. 본 명세서에 예시된 표적 분절로 무장된 당업자는 과도한 실험 없이, 더욱 바람직한 표적 분절을 확인할 수 있을 것이다.
일단 하나 이상의 표적 영역, 분절 또는 부위가 확인되면, 표적에 충분한 상보성을 가진, 다시 말하면, 원하는 효과를 제공할 만큼 충분히 잘 혼성화되고 충분한 특이성을 갖는 안티센스 화합물이 선택된다.
본 발명의 구체예들에서, 올리고뉴클레오티드는 특정 표적의 안티센스 가닥에 결합한다. 올리고뉴클레오티드는 길이가 최소한 5개 뉴클레오티드이고, 그리고 전체 길이의 표적 뉴클레오티드를 수용하는 올리고뉴클레오티드가 합성되도록 위하여, 각 올리고뉴클레오티드가 중복 서열을 표적으로 하도록 합성될 수 있다. 표적은 또한 코딩뿐만 아니라 비-코딩 영역을 포함한다.
한 구체예에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드로 특정 핵산을 표적으로 하는 것이 바람직하다. 특정 핵산에 안티센스 화합물의 표적화는 다단계 과정이다. 이러한 과정은 통상적으로, 기능이 조정되는 핵산 서열의 확인으로 시작된다. 이는 예로써, 발현이 특정 질환 또는 질환 상태와 연관되는 세포 유전자 (또는 상기 유전자로부터 전사된 mRNA), 또는 비-코딩 RNA (ncRNA)와 같은 비-코딩 폴리뉴클레오티드일 수 있다.
RNA는 (1) 메신저 RNA (mRNA), 이는 단백질로 번역되고, 그리고 (2) 비-단백질-코딩 RNA (ncRNA)로 분류될 수 있다. ncRNA는 마이크로 RNA, 안티센스 전사체 및 고밀도의 종결 코돈을 포함하고 임의의 광범위한 "개방 해독틀"이 부족한 다른 전사 단위 (TU)를 포함한다. 많은 ncRNA는 단백질-코딩 좌위의 3' 비번역 영역 (3'UTR)에서 개시 부위로부터 시작되는 것으로 보인다. ncRNA는 아주 드물고, 그리고 FANTOM 협회에 의해 서열화된 ncRNA의 최소한 절반은 폴리아데닐화되지 않는 것으로 보인다. 대부분의 조사자들은 분명한 이유로, 가공되고 세포질로 배출되는 폴리아데닐화된 mRNA에 초점을 맞추었다. 최근에, 비-폴리아데닐화된 핵 RNA 세트는 매우 크고, 그리고 이와 같은 많은 전사체가 소위 유전자내 영역 (intergenic region)에서 생성되는 것으로 밝혀졌다. ncRNA가 유전자 발현을 조정할 수 있는 기전은 표적 전사체와의 염기 대합에 의한 것이다. 염기 대합에 의해 기능하는 RNA는 (1) 동일한 유전적 위치에서, 그러나 그들이 작용하는 RNA에 반대 가닥 상에 인코딩되고, 따라서 그들의 표적에 대해 완벽한 상보성을 나타내는 cis-인코딩된 RNA, 그리고 (2) 그들이 작용하는 RNA와는 별개의 염색체 위치에서 인코딩되며, 일반적으로 그들의 표적과 완벽한 염기-대합 잠재력을 나타내지 않는 trans-인코딩된 RNA로 분류될 수 있다.
이론에 한정됨 없이, 본 명세서에서 기술된 안티센스 올리고뉴클레오티드에 의한 안티센스 폴리뉴클레오티드의 혼란은 상응하는 센스 메신저 RNA의 발현을 변경시킬 수 있다. 하지만, 이와 같은 조절은 부조화적(discordant) (안티센스 녹다운은 메신저 RNA 상승을 결과한다) 또는 조화적(concordant) (안티센스 녹다운은 수반되는 메신저 RNA 감소를 결과한다)일 수 있다. 이들 경우에, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 안티센스 전사체의 중복 또는 비-중복 부위로 표적화되어, 이의 녹다운 또는 제거를 초래할 수 있다. 코딩뿐만 아니라 비-코딩 안티센스는 동일한 방식으로 표적화될 수 있고, 그리고 어느 종류든 조화 또는 비조화 방식으로 상응하는 센스 전사체를 조절할 수 있다. 표적에 대항하여 이용되는 새로운 올리고뉴클레오티드를 확인하는데 사용되는 전략은 안티센스 올리고뉴클레오티드에 의한 안티센스 RNA 전사체의 녹다운 또는 원하는 표적을 조정하는 임의의 다른 수단에 기초될 수 있다.
전략 1 : 부조화적 조절의 경우, 안티센스 전사체의 녹다운은 통상적(센스) 유전자의 발현을 상승시킨다. 후자 유전자가 공지의 또는 가상 약물 표적을 인코딩하면, 이의 안티센스 대응물의 녹다운은 수용체 작동약 또는 효소 자극물질의 작용을 의식적으로 모방할 수 있다.
전략 2 : 조화적 조절의 경우, 안티센스 및 센스 전사체 둘 모두를 동시에 녹다운 시킬 수 있고, 따라서 통상의(센스) 유전자 발현의 상승적 감소를 얻을 수 있다. 가령, 안티센스 올리고뉴클레오티드가 녹다운을 달성하는데 이용되면, 이러한 전략은 센스 전사체를 표적으로 하는 하나의 안티센스 올리고뉴클레오티드 및 상응하는 안티센스 전사체를 표적으로 하는 다른 안티센스 올리고뉴클레오티드, 또는 중복 센스 및 안티센스를 동시에 표적으로 하는 단일 대칭적 안티센스 올리고뉴클레오티드에 적용하는데 이용될 수 있다.
본 발명에 따르면, 안티센스 화합물들에는 안티센스 올리고뉴클레오티드, 리보자임, 외부 가이드 서열 (EGS) 올리고뉴클레오티드, siRNA 화합물, 단일 또는 이중-가닥 RNA 간섭 (RNAi) 화합물, 예를 들면, siRNA 화합물, 그리고 표적 핵산의 최소한 일부분에 혼성화되고 이의 기능을 조정하는 기타 올리고머 화합물이 포함된다. 따라서 안티센스 화합물들은 DNA, RNA, DNA-유사, RNA-유사, 또는 이들의 혼합물이거나, 또는 이들 중에서 하나 이상의 모방체일 수 있다. 이들 화합물은 단일-가닥, 이중-가닥, 원형 또는 헤어핀 올리고머 화합물일 수 있고, 그리고 내부 또는 말단 중배 (bulge), 미스매치 또는 루프와 같은 구조적 요소를 포함할 수 있다. 안티센스 화합물은 일과적으로 선형으로 제조되지만, 결합되거나, 또는 원형 및/또는 분지형으로 제조될 수 있다. 안티센스 화합물은 혼성화되면 전체적으로 또는 부분적으로 이중-가닥 화합물을 형성하는 2개의 가닥, 또는 혼성화 및 전체적으로 또는 부분적으로 이중-가닥 화합물의 형성을 가능하게 할 만큼 충분한 자가-상보성을 갖는 단일 가닥과 같은 구조체를 포함할 수 있다. 2개 가닥은 내부에서 연결되어 3' 또는 5' 말단이 자유로운 상태로 남아 있거나, 또는 연결되어 연속적인 헤어핀 구조 또는 루프를 형성할 수 있다. 헤어핀 구조는 단일 가닥 특성의 연장부를 발생시키는 5' 또는 3' 말단 상에 오버행(overhang)을 포함할 수 있다. 이중 가닥 화합물은 선택적으로 이들 말단에 오버행 (overhang)을 포함할 수 있다. 추가 변형에는 말단 중의 한쪽, 선택된 뉴클레오티드 위치, 당 위치, 또는 뉴클레오티드간 연쇄 중의 하나에 부착된 접합체 (conjugate) 군을 포함할 수 있다. 대안으로, 2개 가닥은 비-핵산 모이어티 또는 링커 기를 통하여 연결될 수 있다. 한 개 가닥으로부터만 형성될 때, dsRNA는 이중나선을 형성하기 위하여 자체적으로 둘로 접히는 자가-상보성 헤어핀 유형 분자의 형태를 취할 수 있다. 따라서 이들 dsRNA는 완전히 또는 부분적으로 이중 가닥이 될 수 있다. 유전자 발현의 특이적 조정은 유전자도입 세포주에서 dsRNA 헤어핀의 안정된 발현에 의해 달성될 수 있지만, 일부 구체예에서, 유전자 발현 또는 기능은 상향 조정된다. 2개 가닥, 또는 이중나선을 형성하기 위하여 자체적으로 둘로 접히는 자가-상보성 헤어핀 유형 분자의 형태를 취하는 단일 가닥으로부터 형성될 때, 이들 2개 가닥 (또는 단일 가닥의 이중나선 형성 영역)은 Watson-Crick 방식으로 염기쌍을 이루는 상보성 RNA 가닥이다.
일단 시스템내로 도입되면, 본 발명의 화합물은 표적 핵산의 절단 또는 다른 변형을 달성하기 위하여 하나 이상의 효소 또는 구조적 단백질의 작용을 유도하거나, 또는 점유-기반 기전 (occupancy-based mechanisms)을 통하여 작용할 수 있다. 일반적으로, 핵산 (올리고뉴클레오티드 포함)은 "DNA-유사" (즉, 일반적으로, 하나 이상의 2'-데옥시 당, 그리고 U 염기 대신 T를 보유함) 또는 "RNA-유사" (즉, 일반적으로, 하나 이상의 2'-히드록실 또는 2'-변형된 당, 그리고 T 염기 대신 U 염기를 보유함)로 기술될 수 있다. 핵산 나선은 한 가지 이상의 구조 유형을 채택할 수 있지만, 가장 일반적으로 A- 및 B-형이다. 일반적으로, B-형-유사 구조를 가지는 올리고뉴클레오티드는 "DNA-유사"이며, 그리고 A-형-유사 구조를 가지는 올리고뉴클레오티드는 "RNA-유사"이다. 일부 (키메라) 구체예에서, 안티센스 화합물은 A- 및 B-형 영역을 모두 포함할 수 있다.
한 구체예에서, 바람직한 올리고뉴클레오티드 또는 안티센스 화합물은 안티센스 RNA, 안티센스 DNA, 키메라 안티센스 올리고뉴클레오티드, 변형된 연쇄를 포함하는 안티센스 올리고뉴클레오티드, 간섭 RNA (RNAi), 짧은 간섭 RNA (siRNA); 마이크로 간섭 RNA (miRNA); 작은, 일시적 RNA (stRNA); 또는 짧은 헤어핀 RNA (shRNA); 작은 RNA-유도된 유전자 활성화 (RNAa); 작은 활성화 RNA (saRNA), 또는 이들의 조합 중에서 최소한 하나를 포함한다.
dsRNA는 또한 "작은 RNA-유도된 유전자 활성화" 또는 RNAa로 명명된 기전인 유전자 발현을 활성화시킬 수 있다. dsRNA 표적화 유전자 프로모터는 관련 유전자의 강력한 전사 활성화를 유도한다. RNAa는 "작은 활성화 RNA (saRNA)"로 불리는 합성 dsRNA를 이용하여 인간 세포에서 설명되었다. 현재, RNAa가 다른 생물체에서 보존되는 지는 알려져 있지 않다.
작은 이중-가닥 RNA (dsRNA), 예를 들면, 작은 간섭 RNA (siRNA) 및 마이크로RNA (miRNA)는 RNA 간섭 (RNAi)으로 알려져 있는 진화론적으로 보존된 기전의 촉발자인 것으로 밝혀졌다. RNAi는 염색질을 재형성하여 전사를 억제하거나, 상보성 mRNA를 분해시키거나, 또는 단백질 번역을 차단함으로써 유전자 침묵을 일관되게 유도한다. 하지만, 하기 실시예 부분에서 상세하게 설명된 경우에서, 올리고뉴클레오티드는 전압 작동 나트륨 통로, 알파 소단위(SCNA) 폴리뉴클레오티드 및 이들의 인코딩된 산물의 발현 및/또는 기능을 증가시키는 것으로 보인다. dsRNA는 또한, 작은 활성화 RNA (saRNA)로 작용할 수 있다. 이론에 한정됨 없이, 유전자 프로모터 내에 서열을 표적으로 함으로써, saRNA는 dsRNA-유도된 전사 활성화 (RNAa)로 지칭되는 현상에서 표적 유전자 발현을 유도할 것이다.
추가 구체예에서, 본 발명에서 확인된 "바람직한 표적 분절"은 전압 작동 나트륨 통로, 알파 소단위(SCNA) 폴리뉴클레오티드의 발현을 조정하는 추가 화합물을 스크리닝하는데 이용될 수 있다. "조정물질 (modulator)"은 SCNA를 인코딩하는 핵산 분자의 발현을 감소 또는 증가시키는 화합물이며, 바람직한 표적 분절에 상보성인 최소한 5개-뉴클레오티드 부분을 포함한다. 스크리닝 방법은 SCNA의 센스 또는 자연 안티센스 폴리뉴클레오티드를 인코딩하는 핵산 분자의 바람직한 표적 분절을 하나 이상의 후보 조정물질과 접촉시키는 단계, 그리고 SCNA 폴리뉴클레오티드, 예를 들면, 서열 번호: 29 내지 94를 인코딩하는 핵산 분자의 발현을 감소 또는 증가시키는 하나 이상의 후보 조정물질을 선별하는 단계를 포함한다. 일단 SCNA 폴리뉴클레오티드를 인코딩하는 핵산 분자의 발현을 조정 (가령, 감소 또는 증가)시킬 수 있는 것으로 확인되면, 후보 조정물질(들)은 이후, SCNA 폴리뉴클레오티드의 기능의 추가 연구, 또는 본 발명에 따른 연구, 진단 또는 치료 물질로서 용도에 이용될 수 있다.
자연 안티센스 서열의 표적화는 바람직하게는, 표적 유전자, 예를 들면, SCNA (가령, 수탁번호 NM_001165963, NM_021007, NM_006922, NM 000334, NM_198056, NM_002976, NM_014191, NM_002977, NM_006514, NM_014139, AF109737)의 기능을 조정한다. 한 구체예에서, 표적은 SCNA의 안티센스 폴리뉴클레오티드이다. 한 구체예에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 SCNA 폴리뉴클레오티드 (가령, 수탁번호 NM_001165963, NM_021007, NM_006922, NM 000334, NM_198056, NM_002976, NM_014191, NM_002977, NM_006514, NM_014139, AF109737)의 센스 및/또는 자연 안티센스 서열, 변이체, 대립유전자, 동종형, 동족체, 돌연변이체, 유도체, 단편 및 이들의 상보성 서열을 표적으로 한다. 바람직하게는, 올리고뉴클레오티드는 안티센스 분자이고, 그리고 표적은 안티센스 및/또는 센스 SCNA 폴리뉴클레오티드의 코딩 및 비-코딩 영역을 포함한다.
본 발명의 바람직한 표적 분절은 본 발명의 개별 상보성 안티센스 화합물과 복합되어 안정화된 이중-가닥 (duplexed) 올리고뉴클레오티드를 형성할 수도 있다.
이와 같은 이중 가닥 올리고뉴클레오티드 모이어티는 당분야에서 표적 발현을 조정하고, 그리고 안티센스 기전을 통하여 번역뿐만 아니라 RNA 가공을 조절하는 것으로 알려져 있다. 게다가, 이들 이중-가닥 모이어티는 화학적 변형을 받을 수도 있다. 가령, 이와 같은 이중-가닥 모이어티는 표적에 대한 이중나선의 안티센스 가닥의 고전적인 혼성화에 의해 표적을 저해하여, 표적의 효소적 분해를 촉발시키는 것으로 밝혀졌다.
한 구체예에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 전압 작동 나트륨 통로, 알파 소단위(SCNA) 폴리뉴클레오티드 (가령, 수탁번호 NM_001165963, NM_021007, NM_006922, NM 000334, NM_198056, NM_002976, NM_014191, NM_002977, NM_006514, NM_014139, AF109737), 변이체, 대립유전자, 동종형, 동족체, 돌연변이체, 유도체, 단편 및 이들의 상보성 서열을 표적으로 한다. 바람직하게는, 올리고뉴클레오티드는 안티센스 분자이다.
본 발명의 구체예들에 따르면, 표적 핵산 분자는 SCNA에만 국한되지 않으며, SCNA 분자의 임의의 동종형, 수용체, 동족체 등까지 확장된다.
한 구체예에서, 올리고뉴클레오티드는 SCNA 폴리뉴클레오티드의 자연 안티센스 서열, 예를 들면, 서열 번호: 12 내지 28로서 진술된 폴리뉴클레오티드 및 임의의 변이체, 대립유전자, 동족체, 돌연변이체, 유도체, 단편 및 이들의 상보성 서열을 표적으로 한다. 안티센스 올리고뉴클레오티드의 실례는 서열 번호: 29 내지 94로서 진술된다.
한 구체예에서, 올리고뉴클레오티드는 제한 없이, SCNA 폴리뉴클레오티드와 연관된 비-코딩 센스 및/또는 안티센스 서열이 포함되지만 이들에 국한되지 않는 SCNA 안티센스의 핵산 서열에 상보성이거나 또는 이들에 결합하고, 그리고 SCNA 분자의 발현 및/또는 기능을 조정한다.
한 구체예에서, 올리고뉴클레오티드는 서열 번호: 12 내지 28로서 진술된 SCNA 자연 안티센스의 핵산 서열에 상보성이거나 또는 이들에 결합하고, 그리고 SCNA 분자의 발현 및/또는 기능을 조정한다.
한 구체예에서, 올리고뉴클레오티드는 서열 번호: 29 내지 94의 최소한 5개의 연속 뉴클레오티드 서열을 포함하고, SCNA 분자의 발현 및/또는 기능을 조정한다.
폴리뉴클레오티드 표적은 SCNA의 집단 구성원, SCNA의 변이체; SNP를 비롯한 SCNA의 돌연변이체; SCNA의 비-코딩 서열; SCNA의 대립유전자; 종 변이체, 단편 등을 비롯한 SCNA를 포함한다. 바람직하게는, 올리고뉴클레오티드는 안티센스 분자이다.
한 구체예에서, SCNA 폴리뉴클레오티드를 표적으로 하는 올리고뉴클레오티드는 안티센스 RNA, 간섭 RNA (RNAi), 짧은 간섭 RNA (siRNA); 마이크로 간섭 RNA (miRNA); 작은, 일시적 RNA (stRNA); 또는 짧은 헤어핀 RNA (shRNA); 작은 RNA-유도된 유전자 활성화 (RNAa); 또는 작은 활성화 RNA (saRNA)를 포함한다.
한 구체예에서, 전압 작동 나트륨 통로, 알파 소단위(SCNA) 폴리뉴클레오티드, 예를 들면, 서열 번호: 1 내지 11의 표적화는 이들 표적의 발현 또는 기능을 조정한다. 한 구체예에서, 발현 또는 기능은 대조와 비교하여 상향 조절된다. 한 구체예에서, 발현 또는 기능은 대조와 비교하여 하향 조절된다. 추가 구체예에서, 천연 안티센스 전사체(가령, 서열 번호:12 내지 28)의 표적화 뿐만 아니라 이러한 표적 폴리뉴클레오티드들의 임의의 다른 표적 NATs는 전술한 표적 mRNA 및 대응하는 단백질의 상향조절을 초래한다.
한 구체예에서, 안티센스 화합물은 서열 번호: 29 내지 94로서 진술된 서열을 포함한다. 이들 올리고뉴클레오티드는 하나 이상의 변형된 뉴클레오티드, 더욱 짧은 또는 더욱 긴 단편, 변형된 결합 등을 포함할 수 있다.
한 구체예에서, 서열 번호: 29 내지 94는 하나 이상의 LNA 뉴클레오티드를 포함한다. 표 1에서는 본 발명의 방법에 유용한 대표적인 안티센스 올리고뉴클레오티드를 도시한다.
Figure 112013006396103-pct00001
Figure 112013006396103-pct00002
*는 포스포티오에이트 결합을 나타내고, +는 LNA를 나타내고, 'r'은 RNA를 나타내고, 그리고 'm'은 올리고뉴클레오티드의 지정된 슈가 모이어티상에 2' 산소 원자에 있는 메틸기를 나타낸다. 모호함을 없애기 위하여, LNA는 다음의 구조석을 갖는다:
Figure 112013006396103-pct00003
이때 B는 특정 지정된 염기다.
Figure 112013006396103-pct00004
Figure 112013006396103-pct00005

원하는 표적 핵산, 예를 들면, 안티센스 올리고뉴클레오티드, siRNA 등의 조정은 당분야에 공지된 몇 가지 방식으로 실행될 수 있다. 효소적 핵산 분자 (가령, 리보자임)는 뉴클레오티드 염기 서열-특이적 방식으로 다른 별도의 핵산 분자를 반복적으로 절단하는 능력을 비롯하여, 다양한 반응 중에서 하나 이상을 촉매할 수 있는 핵산 분자이다. 이러한 효소적 핵산 분자는 예로써, 실질적으로 임의의 RNA 전사체를 표적으로 하는데 이용될 수 있다.
서열-특이성 때문에, trans-절단 효소적 핵산 분자는 인간 질환에 대한 치료 물질로서 가능성을 보여준다. 효소적 핵산 분자는 세포성 RNA의 배경 내에 특이적 RNA 표적을 절단하도록 설계될 수 있다. 이러한 절단 이벤트는 mRNA를 비-기능성으로 만들고, 상기 RNA로부터 단백질 발현을 폐기시킨다. 이러한 방식에서, 질환 상태와 연관된 단백질의 합성이 선택적으로 억제될 수 있다.
일반적으로, RNA 절단 활성을 가진 효소적 핵산은 먼저, 표적 RNA에 결합함으로써 작용한다. 이와 같은 결합은 표적 RNA를 절단하는 작용을 하는 분자의 효소적 부분에 근접하게 유지되는 효소적 핵산의 표적 결합 부분을 통하여 일어난다. 따라서 효소적 핵산은 먼저 표적 RNA를 인지하고, 그 다음 상보성 염기 대합을 통하여 표적 RNA에 결합하고, 그리고 정확한 부위에 일단 결합되면, 효소적으로 작용하여 표적 RNA를 절단한다. 이러한 표적 RNA의 전략적 절단은 인코딩된 단백질의 합성을 지시하는 능력을 파괴시킬 것이다. 효소적 핵산은 RNA 표적에 결합하여 이를 절단시킨 후, 다른 표적을 찾기 위하여 RNA로부터 방출되고, 그리고 새로운 표적에 반복적으로 결합하여 이들을 절단할 수 있다.
시험관내 선별 (진전) 전략과 같은 여러 전략 (Orgel, (1979) Proc . R. Soc . London , B 205, 435)이 포스포디에스테르 연쇄와 아미드 연쇄의 절단 및 결찰과 같은 다양한 반응을 촉매할 수 있는 새로운 핵산 촉매를 개발하는데 이용되고 있다.
촉매 활성에 최적인 리보자임의 개발은 유전자 발현을 조절하기 위한 목적으로 RNA-절단 리보자임을 이용하는 임의의 전략에 상당히 기여할 것이다. 가령, 해머머리 (hammerhead) 리보자임은 Mg2 + 보조인자의 포화 농도 (10mM)의 존재에서 대략 1min-1의 촉매 속도(kcat)로 기능한다. 인공 "RNA 리가아제" 리보자임은 대략 100 min-1의 속도로 상응하는 자가-변형 반응을 촉매하는 것으로 나타났다. 또한, DNA로 구성된 기질 결합 팔(arm)을 가지고 있는 일정한 변형된 해머머리 리보자임은 100 min-1에 근접하는 다중 턴-오버 속도로 RNA 절단을 촉매한다. 최종적으로, 일정한 뉴클레오티드 유사체로 해머머리의 촉매 코어 내에 특이적 잔기의 대체는 촉매 속도에서 많게는 10배 향상을 보이는 변형된 리보자임을 제공한다. 이들 발견은 리보자임이 대부분의 자연 자가-절단 리보자임에 의해 시험관내에서 나타나는 것보다 훨씬 큰 촉매 속도로 화학적 변형을 촉진할 수 있다는 것을 설명한다. 그 다음, 최대 촉매 활성을 제공하기 위하여 일정한 자가-절단 리보자임의 구조를 최적화하거나, 또는 RNA 포스포디에스테르 절단에 대해 훨씬 빠른 속도를 보여주는 완전히 새로운 RNA 모티프를 만드는 것이 가능하다.
"해머머리" 모델에 적합한 RNA 촉매에 의한 RNA 기질의 분자내 절단은 1987년에 처음 밝혀졌다(Uhlenbeck, O.C.(1987), Nature, 328:596-600). RNA 촉매가 회수되고 다중 RNA 분자와 반응되었는데, 이는 상기 촉매가 진정한 촉매성임을 증명하였다.
"해머머리" 모티프에 기초하여 설계된 촉매 RNA은 표적 서열과의 필수적인 염기 대합을 유지하기 위하여 촉매 RNA 내에 적절한 염기 변화를 만듦으로써 특이적 표적 서열을 절단하는데 이용되고 있다. 이것은 특이적 표적 서열을 절단하기 위하여 촉매 RNA의 사용을 가능하게 하고, 그리고 "해머머리" 모델에 따라 설계된 촉매 RNA가 생체내에서 특이적 기질 RNA를 절단하는 것이 가능하다는 것을 나타낸다.
RNA 간섭 (RNAi)은 포유류 및 포유류 세포에서 유전자 발현을 조정하는 강력한 도구가 되고 있다. 이와 같은 방식은 발현 플라스미드 또는 바이러스, 그리고 siRNA로 가공되는 작은 헤어핀 RNA에 대한 코딩 서열을 이용하여 RNA 자체로 또는 DNA로서 작은 간섭 RNA (siRNA) 운반을 요구한다. 이 시스템은 pre-siRNA를 세포질로 효과적으로 운반할 수 있는데, 세포질에서 이들 RNA는 활동적이고 유전자 발현을 위한 조절된 조직 특이적인 프로모터의 사용을 허용한다.
한 구체예에서, 올리고뉴클레오티드 또는 안티센스 화합물은 리보핵산 (RNA) 및/또는 데옥시리보핵산 (DNA)의 올리고머 또는 폴리머, 또는 이의 모방체, 키메라, 유사체 또는 동족체를 포함한다. 상기 용어는 자연 발생 뉴클레오티드, 당 및 공유적 뉴클레오시드간 (골격) 연쇄로 구성된 올리고뉴클레오티드 뿐만 아니라 유사하게 기능하는 비-자연 발생 부분을 보유하는 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 이와 같은 변형된 또는 치환된 올리고뉴클레오티드는 예로써, 증강된 세포 취입, 표적 핵산에 대한 증강된 친화력 및 뉴클레아제의 존재에서 증가된 안정성과 같은 바람직한 성질로 인하여, 고유 형태 비하여 종종 요망된다.
본 발명에 따르면, 올리고뉴클레오티드 또는 "안티센스 화합물"에는 안티센스 올리고뉴클레오티드 (가령 RNA, DNA, 이의 모방체, 키메라, 유사체 또는 동족체), 리보자임, 외부 가이드 서열 (EGS) 올리고뉴클레오티드, siRNA 화합물, 단일- 또는 이중-가닥 RNA 간섭 (RNAi) 화합물, 예를 들면, siRNA 화합물, saRNA, aRNA, 그리고 표적 핵산의 최소한 일부분에 혼성화되어 이의 기능을 조정하는 기타 올리고머 화합물이 포함된다. 따라서 이들은 DNA, RNA, DNA-유사, RNA-유사, 또는 이들의 혼합물이거나, 또는 이들 중에서 하나 이상의 모방체일 수 있다. 이들 화합물은 단일-가닥, 이중-가닥, 원형 또는 헤어핀 올리고머 화합물일 수 있고, 그리고 내부 또는 말단 중배 (bulge), 미스매치 또는 루프와 같은 구조적 요소를 포함할 수 있다. 안티센스 화합물은 일과적으로 선형으로 제조되지만, 결합되거나, 또는 원형 및/또는 분지형으로 제조될 수 있다. 안티센스 화합물은 혼성화되면 전체적으로 또는 부분적으로 이중-가닥 화합물을 형성하는 2개의 가닥, 또는 혼성화 및 전체적으로 또는 부분적으로 이중-가닥 화합물의 형성을 가능하게 할 만큼 충분한 자가-상보성을 갖는 단일 가닥과 같은 구조체를 포함할 수 있다. 2개 가닥은 내부에서 연결되어 3' 또는 5' 말단이 자유로운 상태로 남아 있거나, 또는 연결되어 연속적인 헤어핀 구조 또는 루프를 형성할 수 있다. 헤어핀 구조는 단일 가닥 특성의 연장부를 발생시키는 5' 또는 3' 말단 상에 오버행(overhang)을 포함할 수 있다. 이중 가닥 화합물은 선택적으로 이들 말단에 오버행 (overhang)을 포함할 수 있다. 추가 변형에는 말단 중의 한쪽, 선택된 뉴클레오티드 위치, 당 위치, 또는 뉴클레오티드간 연쇄 중의 하나에 부착된 접합체 (conjugate) 군을 포함할 수 있다. 대안으로, 2개 가닥은 비-핵산 모이어티 또는 링커 기를 통하여 연결될 수 있다. 한 개 가닥으로부터만 형성될 때, dsRNA는 이중나선을 형성하기 위하여 자체적으로 둘로 접히는 자가-상보성 헤어핀 유형 분자의 형태를 취할 수 있다. 따라서 이들 dsRNA는 완전히 또는 부분적으로 이중 가닥이 될 수 있다. 유전자 발현의 특이적 조정은 유전자도입 세포주에서 dsRNA 헤어핀의 안정된 발현에 의해 달성될 수 있다. 2개 가닥, 또는 이중나선을 형성하기 위하여 자체적으로 둘로 접히는 자가-상보성 헤어핀 유형 분자의 형태를 취하는 단일 가닥으로부터 형성될 때, 이들 2개 가닥 (또는 단일 가닥의 이중나선 형성 영역)은 Watson-Crick 방식으로 염기쌍을 이루는 상보성 RNA 가닥이다.
일단 시스템내로 도입되면, 본 발명의 화합물은 표적 핵산의 절단 또는 다른 변형을 달성하기 위하여 하나 이상의 효소 또는 구조적 단백질의 작용을 유도하거나, 또는 점유-기반 기전 (occupancy-based mechanisms)을 통하여 작용할 수 있다. 일반적으로, 핵산 (올리고뉴클레오티드 포함)은 "DNA-유사" (즉, 일반적으로, 하나 이상의 2'-데옥시 당, 그리고 U 염기 대신 T를 보유함) 또는 "RNA-유사" (즉, 일반적으로, 하나 이상의 2'-히드록실 또는 2'-변형된 당, 그리고 T 염기 대신 U 염기를 보유함)로 기술될 수 있다. 핵산 나선은 한 가지 이상의 구조 유형을 채택할 수 있지만, 가장 일반적으로 A- 및 B-형이다. 일반적으로, B-형-유사 구조를 가지는 올리고뉴클레오티드는 "DNA-유사"이며, 그리고 A-형-유사 구조를 가지는 올리고뉴클레오티드는 "RNA-유사"이다. 일부 (키메라) 구체예에서, 안티센스 화합물은 A- 및 B-형 영역을 모두 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 안티센스 화합물은 길이가 대략 5개 내지 대략 80개 뉴클레오티드 (즉, 대략 5개 내지 대략 80개의 연결된 뉴클레오시드)의 안티센스 부분을 포함할 수 있다. 이는 안티센스 화합물의 안티센스 가닥 또는 부분의 길이를 지칭한다. 환언하면, 본 발명의 단일-가닥 안티센스 화합물은 5개 내지 대략 80개 뉴클레오티드를 포함하고, 그리고 본 발명의 이중-가닥 안티센스 화합물 (가령, dsRNA)은 길이가 5개 내지 대략 80개 뉴클레오티드인 센스 및 안티센스 가닥 또는 부분을 포함한다. 이것은 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개, 25개, 26개, 27개, 28개, 29개, 30개, 31개, 32개, 33개, 34개, 35개, 36개, 37개, 38개, 39개, 40개, 41개, 42개, 43개, 44개, 45개, 46개, 47개, 48개, 49개, 50개, 51개, 52개, 53개, 54개, 55개, 56개, 57개, 58개, 59개, 60개, 61개, 62개, 63개, 64개, 65개, 66개, 67개, 68개, 69개, 70개, 71개, 72개, 73개, 74개, 75개, 76개, 77개, 78개, 79개, 또는 80개 뉴클레오티드 길이, 또는 그 내에 임의의 범위의 안티센스 부분을 포함한다는 것을 당업자는 이해할 것이다.
한 구체예에서, 본 발명의 안티센스 화합물은 10개 내지 50개 뉴클레오티드 길이의 안티센스 부분을 보유한다. 이것은 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개, 25개, 26개, 27개, 28개, 29개, 30개, 31개, 32개, 33개, 34개, 35개, 36개, 37개, 38개, 39개, 40개, 41개, 42개, 43개, 44개, 45개, 46개, 47개, 48개, 49개, 또는 50개 뉴클레오티드 길이, 또는 그 내에 임의의 범위의 안티센스 부분을 보유하는 올리고뉴클레오티드를 구현한다는 것을 당업자는 이해할 것이다. 일부 구체예들에서, 올리고뉴클레오티드들은 15개 뉴클레오티드이다.
한 구체예에서, 본 발명의 안티센스 또는 올리고뉴클레오티드 화합물은 12개 또는 13개 내지 30개 뉴클레오티드 길이의 안티센스 부분을 보유한다. 이것은 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개, 25개, 26개, 27개, 28개, 29개, 또는 30개 뉴클레오티드 길이, 또는 그 내에 임의의 범위의 안티센스 부분을 보유하는 안티센스 화합물을 구현한다는 것을 당업자는 이해할 것이다.
한 구체예에서, 본 발명의 올리고머 화합물은 화합물 내에 하나 이상의 뉴클레오티드 위치에 상이한 염기가 존재하는 변이체를 포함한다. 가령, 첫 번째 뉴클레오티드가 아데노신이면, 이 위치에 티미딘, 구아노신 또는 시티딘을 포함하는 변이체가 만들어질 수 있다. 이것은 안티센스 또는 dsRNA 화합물의 임의의 위치에서 일어날 수 있다. 이들 화합물은 표적 핵산의 발현을 저해하는 능력을 측정하기 위하여 본 명세서에서 기술된 방법을 이용하여 조사된다.
일부 구체예에서, 안티센스 화합물과 표적 사이에 상동성, 서열 동일성 또는 상보성은 대략 40% 내지 대략 60%이다. 일부 구체예에서, 안티센스 화합물과 표적 사이에 상동성, 서열 동일성 또는 상보성은 대략 60% 내지 대략 70%이다. 일부 구체예에서, 안티센스 화합물과 표적 사이에 상동성, 서열 동일성 또는 상보성은 대략 70% 내지 대략 80%이다. 일부 구체예에서, 안티센스 화합물과 표적 사이에 상동성, 서열 동일성 또는 상보성은 대략 80% 내지 대략 90%이다. 일부 구체예에서, 안티센스 화합물과 표적 사이에 상동성, 서열 동일성 또는 상보성은 대략 90%, 대략 92%, 대략 94%, 대략 95%, 대략 96%, 대략 97%, 대략 98%, 대략 99% 또는 대략 100%이다.
한 구체예에서, 서열 번호: 29 내지 94에서 진술된 핵산 분자와 같은 안티센스 올리고뉴클레오티드는 하나 이상의 치환 또는 변형을 포함한다. 한 구체예에서, 뉴클레오티드는 잠금 핵산 (LNA)으로 치환된다.
한 구체예에서, 올리고뉴클레오티드는 SCNA 및 서열 번호: 1 내지 28로서 진술된 서열과 연관된 코딩 및/또는 비-코딩 서열의 핵산 분자 센스 및/또는 안티센스의 하나 이상의 영역을 표적으로 한다. 올리고뉴클레오티드는 또한, 서열 번호: 1 내지 28의 중복 영역을 표적으로 한다.
본 발명의 일정한 바람직한 올리고뉴클레오티드는 키메라 올리고뉴클레오티드이다. 본 발명의 맥락에서, "키메라 올리고뉴클레오티드" 또는 "키메라"는 2개 이상의 화학적으로 별개의 영역을 포함하는 올리고뉴클레오티드이며, 각 영역은 최소 한 개의 뉴클레오티드로 구성된다. 이와 같은 올리고뉴클레오티드는 전형적으로, 하나 이상의 유익한 성질 (가령, 증가된 뉴클레아제 내성, 세포내로의 증가된 취입, 표적에 대한 증가된 결합 친화성)을 부여하는 변형된 뉴클레오티드의 최소한 하나의 영역 및 RNA:DNA 또는 RNA:RNA 하이브리드를 절단할 수 있는 효소에 대한 기질이 되는 영역을 포함한다. 가령, RNase H는 RNA:DNA 이중나선의 RNA 가닥을 절단하는 세포성 엔도뉴클레아제이다. 따라서 RNase H의 활성화는 RNA 표적의 절단을 유발하여, 유전자 발현의 안티센스 조정의 효과를 강화시킨다. 결과적으로, 동일한 표적 영역에 혼성화되는 포스포로티오에이트 데옥시올리고뉴클레오티드와 비교하여, 키메라 올리고뉴클레오티드가 사용될 때 더욱 짧은 올리고뉴클레오티드로 필적하는 결과가 종종 획득될 수 있다. RNA 표적의 절단은 겔 전기영동에 의해, 그리고 필요하다면, 당분야에 공지된 연관된 핵산 혼성화 기술에 의해 일과적으로 검출될 수 있다. 한 구체예에서, 키메라 올리고뉴클레오티드는 표적 결합 친화력을 증가시키도록 변형된 최소한 하나의 영역, 그리고 통상적으로, RNAse H에 대한 기질로서 기능하는 영역을 포함한다. 표적 (본 발명의 경우에, ras를 인코딩하는 핵산)에 대한 올리고뉴클레오티드 친화성은 올리고뉴클레오티드/표적 쌍의 Tm을 측정함으로써 일과적으로 결정되는데, 이는 상기 올리고뉴클레오티드와 표적이 해리되는 온도이다; 해리는 분광광도법으로 검출된다. Tm이 높을수록, 표적에 대한 올리고뉴클레오티드의 친화성이 커진다.
본 발명의 키메라 안티센스 화합물은 상기에서 설명된 것과 같이 2개 이상의 올리고뉴클레오티드, 변형된 올리고뉴클레오티드, 올리고뉴클레오시드 및/또는 올리고뉴클레오티드 모방체의 혼성 구조로 형성될 수 있다. 이와 같은 화합물은 또한, 당분야에서 하이브리드 (hybrid) 또는 갭머 (gapmer)로 지칭된다. 이와 같은 하이브리드 구조의 제조에 대해 교시하는 대표적인 U.S. 특허에는 US 특허 제5,013,830호; 제5,149,797호; 제5,220,007호; 제5,256,775호; 제5,366,878호; 제5,403,711호; 제5,491,133호; 제5,565,350호; 제5,623,065호; 제5,652,355호; 제5,652,356호; 및 제5,700,922호가 포함되지만 이들에 국한되지 않고, 이들 각각은 참조로서 편입된다.
한 구체예에서, 변형된 올리고뉴클레오티드의 영역은 당의 2' 위치에서 변형된 최소한 하나의 뉴클레오티드, 바람직하게는 2'-O알킬, 2'-O-알킬-O-알킬 또는 2'-플루오르-변형된 뉴클레오티드를 포함한다. 다른 한 구체예에서, RNA 변형은 피리미딘의 리보즈, 염기소실 잔기 (abasic residues) 또는 RNA의 3' 말단에서 역전된 염기 상에 2'-플루오르, 2'-아미노 및 2' O-메틸 변형을 포함한다. 이와 같은 변형은 올리고뉴클레오티드에 일과적으로 통합되고, 그리고 이들 올리고뉴클레오티드는 소정의 표적에 대해 2'-데옥시올리고뉴클레오티드보다 높은 Tm (즉, 더욱 높은 표적 결합 친화성)을 가지는 것으로 밝혀졌다. 이런 증가된 친화성의 효과는 유전자 발현의 RNAi 올리고뉴클레오티드 저해를 상당히 증강시키는 것이다. RNAse H는 RNA:DNA 이중나선의 RNA 가닥을 절단하는 세포성 엔도뉴클레아제이다; 따라서 상기 효소의 활성화는 RNA 표적의 절단을 유발하여, RNAi 저해의 효과를 상당히 증강시킬 수 있다. RNA 표적의 절단은 겔 전기영동에 의해 일과적으로 증명될 수 있다. 한 구체예에서, 키메라 올리고뉴클레오티드는 또한, 뉴클레아제 내성을 증강시키기 위하여 변형된다. 세포는 핵산을 분해시킬 수 있는 다양한 엑소- 및 엔도-뉴클레아제를 포함한다. 다수의 뉴클레오티드 및 뉴클레오시드 변형은 그들이 통합된 올리고뉴클레오티드가 고유한 올리고데옥시뉴클레오티드보다 뉴클레아제 절단에 더욱 강한 내성을 갖도록 만드는 것으로 밝혀졌다. 뉴클레아제 내성은 올리고뉴클레오티드를 세포 추출물 또는 분리된 뉴클레아제 용액과 함께 항온처리하고, 그리고 통상적으로 겔 전기영동에 의해 시간의 흐름 동안 남아있는 본래 올리고뉴클레오티드의 수준을 측정함으로써 일과적으로 결정된다. 뉴클레아제 내성을 증강시키도록 변형된 올리고뉴클레오티드는 변형되지 않은 올리고뉴클레오티드보다 더욱 긴 시간 동안 본래 상태로 존재한다. 다양한 올리고뉴클레오티드 변형이 뉴클레아제 내성을 증강시키거나 부여하는 것으로 증명되었다. 최소한 하나의 포스포로티오에이트 변형을 포함하는 올리고뉴클레오티드가 더욱 바람직하다. 일부 경우, 표적 결합 친화성이 증강된 올리고뉴클레오티드 변형은 독립적으로 뉴클레아제 내성을 증강시킬 수 있다.
본 발명에서 구상된 일부 바람직한 올리고뉴클레오티드의 특정 실례에는 변형된 골격을 포함하는 것들, 예를 들면, 포스포로티오에이트, 포스포트리에스테르, 메틸 포스포네이트, 짧은 사슬 알킬 또는 사이클로알킬 당간 (intersugar) 연쇄 또는 짧은 사슬 헤테로원자 또는 헤테로환상 당간 연쇄가 포함된다. 가장 바람직한 것은 포스포로티오에이트 골격을 가진 올리고뉴클레오티드 및 헤테로원자 골격, 특히, CH2--NH--O--CH2, CH,--N(CH3)--O--CH2 [메틸렌(메틸이미노) 또는 MMI 골격으로 공지됨], CH2--O--N(CH3)--CH2, CH2--N(CH3)--N(CH3)--CH2 및 O--N (CH3)--CH2--CH2 골격을 가진 올리고뉴클레오티드이고, 이때 고유 포스포디에스테르 골격은 O--P--O--CH로 표시된다). De Mesmaeker et al . (1995) Acc . Chem . Res . 28:366-374에서 설명된 아미드 골격 역시 바람직하다. 모르폴리노 골격 구조를 가진 올리고뉴클레오티드 역시 바람직하다 (Summerton and Weller , U.S. 특허 제5,034,506호). 다른 한 구체예, 예를 들면, 펩티드 핵산 (PNA) 골격에서, 올리고뉴클레오티드의 포스포디에스테르 골격은 폴리아미드 골격으로 대체되며, 뉴클레오티드는 폴리아미드 골격의 아자 질소 원자에 직간접적으로 결합된다. 올리고뉴클레오티드는 하나 이상의 치환된 당 모이어티를 또한 포함할 수 있다. 바람직한 올리고뉴클레오티드는 2' 위치에 다음중 하나를 포함한다: OH, SH, SCH3, F, OCN, OCH3 OCH3, OCH3 O(CH2)n CH3, O(CH2)n NH2 또는 O(CH2)nCH3, 이때 n은 1 내지 대략 10이다; C1 내지 C10 저급 알킬, 알콕시알콕시, 치환된 저급 알킬, 알크아릴 또는 아르알킬; Cl; Br; CN; CF3; OCF3; O--, S--, 또는 N-알킬; O--, S--, 또는 N-알케닐; SOCH3; SO2 CH3; ONO2; NO2; N3; NH2; 헤테로사이클로알킬; 헤테로사이클로알크아릴; 아미노알킬아미노; 폴리알킬아미노; 치환된 실릴; RNA 절단기; 리포터 기; 삽입기 (intercalator); 올리고뉴클레오티드의 약역학적 성질을 개선하는 기; 또는 올리고뉴클레오티드 및 유사한 성질을 가진 다른 치환기의 약동학적 성질을 개선하는 기. 바람직한 변형은 2'-메톡시에톡시[2'-O-CH2CH2OCH3, 또한 2'-O-(2-메톡시에틸)로 공지됨]을 포함한다. 다른 바람직한 변형은 2'-메톡시 (2'-O--CH3), 2'-프로폭시 (2'-OCH2 CH2CH3) 및 2'-플루오르 (2'-F)를 포함한다. 올리고뉴클레오티드 상에서 다른 위치, 특히 3' 말단 뉴클레오티드 상에서 당의 3' 위치 및 5' 말단 뉴클레오티드의 5'위치에서 유사한 변형이 만들어 질 수 있다. 올리고뉴클레오티드는 또한 펜토푸라노실 기 대신에 사이클로부틸과 같은 당 모방체를 보유할 수 있다.
올리고뉴클레오티드는 또한 추가적으로 또는 대안으로, 핵염기 (당분야에서 종종 간단히 "염기"로 지칭됨) 변형 또는 치환을 포함할 수 있다. 본 명세서에서, "변형되지 않은" 또는 "자연" 뉴클레오티드는 아데닌 (A), 구아닌 (G), 티민 (T), 시토신 (C) 및 우라실 (U)을 포함한다. 변형된 뉴클레오티드에는 자연 핵산에 드물게 또는 일시적으로 발견되는 뉴클레오티드, 예를 들면, 하이포산틴, 6-메틸아데닌, 5-Me 피리미딘, 특히 5-메틸시토신 (또한, 5-메틸-2'데옥시시토신, 그리고 종종 당분야에서 5-Me-C로 지칭됨), 5-히드록시메틸시토신 (HMC), 글리코실 HMC 및 겐토바이오실 HMC, 그리고 합성 뉴클레오티드, 예를 들면, 2-아미노아데닌, 2-(메틸아미노)아데닌, 2-(이미다졸일알킬)아데닌, 2-(아미노알킬아미노)아데닌 또는 다른 헤테로치환된 알킬아데닌, 2-티오우라실, 2-티오티민, 5-브로모우라실, 5-히드록시메틸우라실, 8-아자구아닌, 7-데아자구아닌, N6(6-아미노헥실)아데닌 및 2,6-디아미노퓨린이 포함된다. 당분야에 공지된 "범용 (universal)" 염기, 예를 들면, 이노신이 포함될 수 있다. 5-Me-C 치환은 핵산 이중나선 안정성을 0.6-1.2℃ 증가시키는 것으로 밝혀졌고, 그리고 현재 바람직한 염기 치환이다.
본 발명의 올리고뉴클레오티드의 다른 변형은 올리고뉴클레오티드의 활성 또는 세포 취입을 강화시키는 하나 이상의 모이어티 또는 접합체를 올리고뉴클레오티드에 화학적으로 연결하는 것을 수반한다. 이러한 모이어티에는 지질 모이어티, 예를 들면, 콜레스테롤 모이어티, 콜레스테릴 모이어티, 알파 사슬, 예를 들면, 도데칸디올 또는 운데실 잔기, 폴리아민 또는 폴리에틸렌 글리콜 사슬, 또는 아다만탄 아세트산이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 친지성 모이어티를 포함하는 올리고뉴클레오티드, 그리고 이와 같은 올리고뉴클레오티드를 제조하는 방법은 당분야에서, 예를 들면, U.S. 특허 제5,138,045호, 제5,218,105호 및 제5,459,255호에서 공지되어 있다.
소정의 올리고뉴클레오티드 내에 모든 위치가 균일하게 변형될 필요는 없고, 그리고 실제로, 전술한 변형중 하나 이상이 단일 올리고뉴클레오티드에 통합되거나, 또는 심지어 올리고뉴클레오티드내 단일 뉴클레오시드에 통합될 수 있다. 본 발명은 또한, 상기에서 정의된 바와 같은 키메라 올리고뉴클레오티드인 올리고뉴클레오티드를 포함한다.
다른 구체예에서, 본 발명의 핵산 분자는 염기소실 (abasic) 뉴클레오티드, 폴리에테르, 폴리아민, 폴리아미드, 펩티드, 탄수화물, 지질 또는 폴리하이드로카본 화합물이 포함되지만 이들에 국한되지 않는 다른 모이어티와 접합된다. 이들 분자가 당, 염기 또는 인산염 기 상에서 여러 위치에서 핵산 분자를 포함하는 하나 이상의 임의의 뉴클레오티드에 연결될 수 있다는 것을 당업자는 인지할 것이다.
본 발명에 이용된 올리고뉴클레오티드는 널리 공지된 고형상 합성 기술을 통하여 통상적으로 및 일과적으로 만들어질 수 있다. 이와 같은 합성을 위한 장비는 Applied Biosystems를 비롯한 여러 업체에 의해 판매된다. 이와 같은 합성을 위하여 임의의 다른 수단 역시 이용될 수 있다; 올리고뉴클레오티드의 실제 합성은 당업자의 능력 범위 내에 있다. 포스포로티오에이트 및 알킬화된 유도체와 같은 다른 올리고뉴클레오티드를 제조하기 위하여 유사한 기술을 이용하는 것 역시 공지되어 있다. 형광 표지된, 바이오틴화된 또는 기타 변형된 올리고뉴클레오티드, 예를 들면, 콜레스테롤-변형된 올리고뉴클레오티드를 합성하기 위하여 유사한 기술 및 상업적으로 가용한 변형된 아미디트 (amidite) 및 조정된 포어 글라스 (CPG) 산물, 예를 들면, 바이오틴, 플루오레세인, 아크리딘 또는 프소랄렌 (psoralen)-변형된 아미디트 및/또는 CPG (Glen Research, Sterling VA)로부터 구입가능)을 이용하는 것 역시 공지되어 있다.
본 발명에 따르면, 올리고뉴클레오티드의 효능, 특이성 및 작용 기간을 증강시키고 투여 경로를 확장시키기 위한 LNA 단량체와 같은 변형의 이용은 MOE, ANA, FANA, PS 등과 같은 현재 화학물질로 구성되었다. 이것은 현재 올리고뉴클레오티드에서 일부 단량체를 LNA 단량체로 치환함으로써 달성될 수 있다. LNA 변형된 올리고뉴클레오티드는 부모 화합물과 유사한 크기를 갖거나, 또는 더욱 큰, 또는 바람직하게는 더욱 작은 크기를 가질 수 있다. 이와 같은 LNA-변형된 올리고뉴클레오티드는 대략 70% 미만, 더욱 바람직하게는 대략 60% 미만, 가장 바람직하게는 대략 50% 미만의 LNA 단량체를 포함하고, 그리고 그들의 크기는 대략 5개 내지 25개 뉴클레오티드, 더욱 바람직하게는 대략 12개 내지 20 개 뉴클레오티드 사이이다.
바람직한 변형된 올리고뉴클레오티드 골격에는 포스포로티오에이트, 키랄 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 포스포트리에스테르, 아미노알킬포스포트리에스테르, 메틸 및 3' 알킬렌 포스포네이트와 키랄 포스포네이트를 포함하는 기타 알킬 포스포네이트, 포스피네이트, 3'-아미노 포스포르아미데이트와 아미노알킬포스포르아미데이트를 포함하는 포스포르아미데이트, 티오노포스포르아미데이트, 티오노알킬포스포네이트, 티오노알킬포스포트리에스테르, 그리고 정상적인 3'-5' 연쇄를 가진 보라노포스페이트, 이들의 2'-5' 연결된 유사체, 그리고 역전된 극성을 가진 것들 (여기서, 뉴클레오시드 단위의 인접 쌍은 3'-5'에서 5'-3'으로, 또는 2'-5'에서 5'-2'로 연결된다)이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 다양한 염, 혼합된 염 및 유리 산 형태 역시 포함된다.
상기 인-함유 연쇄의 제조를 교시하는 대표적인 U.S. 특허에는 US 특허 제3,687,808호; 제4,469,863호; 제4,476,301호; 제5,023,243호; 제5,177,196호; 제5,188,897호; 제5,264,423호; 제5,276,019호; 제5,278,302호; 제5,286,717호; 제5,321,131호; 제5,399,676호; 제5,405,939호; 제5,453,496호; 제5,455,233호; 제5,466,677호; 제5,476,925호; 제5,519,126호; 제5,536,821호; 제5,541,306호; 제5,550,111호; 제5,563,253호; 제5,571,799호; 제5,587,361호; 및 제5,625,050호가 포함되지만 이들에 국한되지 않고, 이들 각각은 참조로서 편입된다.
인 원자를 포함하지 않는 바람직한 변형된 올리고뉴클레오티드 골격은 짧은 사슬 알킬 또는 사이클로알킬 뉴클레오시드간 연쇄, 혼성 헤테로원자 및 알킬 또는 사이클로알킬 뉴클레오시드간 연쇄, 또는 하나 이상의 짧은 사슬 헤테로원자 또는 헤테로환상 뉴클레오시드간 연쇄에 의해 형성된 골격을 보유한다. 이들은 모르폴리노 연쇄 (뉴클레오시드의 당 부분으로부터 부분적으로 형성됨); 실록산 골격; 설파이드, 설폭시드 및 설폰 골격; 포름아세틸 및 티오포름아세틸 골격; 메틸렌 포름아세틸 및 티오포름아세틸 골격; 알켄 포함 골격; 설파메이트 골격; 메틸렌이미노 및 메틸렌히드라지노 골격; 설포네이트 및 설폰아미드 골격; 아미드 골격; 그리고 N, O, S 및 CH2 성분 부분이 혼합된 것을 보유하는 것들을 포함한다.
상기 올리고뉴클레오시드의 제조를 교시하는 대표적인 U.S. 특허에는 U.S. 특허 제5,034,506호; 제5,166,315호; 제5,185,444호; 제5,214,134호; 제5,216,141호; 제5,235,033호; 제5,264,562호; 제5,264,564호; 제5,405,938호; 제5,434,257호; 제5,466,677호; 제5,470,967호; 제5,489,677호; 제5,541,307호; 제5,561,225호; 제5,596,086호; 제5,602,240호; 제5,610,289호; 제5,602,240호; 제5,608,046호; 제5,610,289호; 제5,618,704호; 제5,623,070호; 제5,663,312호; 제5,633,360호; 제5,677,437호; 및 제5,677,439호가 포함되지만 이들에 국한되지 않고, 이들 각각은 참조로서 편입된다.
기타 바람직한 올리고뉴클레오티드 모방체에서, 당 및 뉴클레오시드간 연쇄, 다시 말하면, 뉴클레오티드 단위의 골격은 신규한 기로 대체된다. 염기 단위는 적합한 핵산 표적 화합물과의 혼성화를 위해 유지된다. 이와 같은 올리고머 화합물중 하나인, 우수한 혼성화 성질을 가진 것으로 확인된 올리고뉴클레오티드 모방체는 펩티드 핵산 (PNA)으로 지칭된다. PNA 화합물에서, 올리고뉴클레오티드의 당-골격은 아미드 포함 골격, 특히 아미도에틸글리신 골격으로 치환된다. 핵염기는 보유되며, 골격의 아미드 부분의 아자 질소 원자에 직간접적으로 결합된다. PNA 화합물의 제조를 교시하는 대표적인 U.S. 특허에는 US 특허 제5,539,082호; 제5,714,331호; 및 제5,719,262호가 포함되지만 이들에 국한되지 않고, 이들 각각은 참조로서 편입된다. PNA 화합물의 추가 교시는 Nielsen et al ., (1991) Science , 254, 1497-1500에서 찾아볼 수 있다.
본 발명의 한 구체예에서, 포스포로티오에이트 골격을 가진 올리고뉴클레오티드, 그리고 헤테로원자 골격, 특히, CH2-NH-O-CH2-, -CH2-N(CH3)-O-CH2-(메틸렌(메틸이미노) 또는 MMI 골격으로 공지됨), -CH2-O-N(CH3)-CH2-, -CH2N(CH3)-N(CH3) CH2- 및 -O-N(CH3)-CH2-CH2-를 가진 올리고뉴클레오시드이고, 이때 고유 포스포디에스테르 골격은 상기 언급된 US 특허 제5,489,677호의 -O-P-O-CH2-, 그리고 상기 언급된 US 특허 제5,602,240호의 아미드 골격으로서 표시된다. 또한, 상기 언급된 US 특허 제5,034,506호의 모르폴리노 골격 구조를 가진 올리고뉴클레오티드가 바람직하다.
변형된 올리고뉴클레오티드는 또한, 하나 이상의 치환된 당 모이어티를 포함할 수 있다. 바람직한 올리고뉴클레오티드는 2' 위치에 다음중 하나를 포함한다: OH; F; O-, S-, 또는 N-알킬; O-, S-, 또는 N-알케닐; O-, S- 또는 N-알키닐; 또는 O 알킬-O-알킬, 이때, 알킬, 알케닐 및 알키닐은 치환되거나 치환되지 않은 C 내지 CO 알킬 또는 C2 내지 CO 알케닐 및 알키닐이다. 특히 바람직한 것은 O(CH2)nOmCH3, O(CH2)n, OCH3, O(CH2)nNH2, O(CH2)nCH3, O(CH2)nONH2, 그리고 O(CH2n)ON(CH2)nCH3)2이며, 이때 n과 m은 1 내지 대략 10일 수 있다. 다른 바람직한 올리고뉴클레오티드는 2' 위치에 다음중 하나를 포함한다: C 내지 CO, (저급 알킬, 치환된 저급 알킬, 알크아릴, 아르알킬, O-알크아릴 또는 O-아르알킬, SH, SCH3, OCN, Cl, Br, CN, CF3, OCF3, SOCH3, SO2CH3, ONO2, NO2, N3, NH2, 헤테로사이클로알킬, 헤테로사이클로알크아릴, 아미노알킬아미노, 폴리알킬아미노, 치환된 실릴, RNA 절단기, 리포터 기, 삽입기 (intercalator), 올리고뉴클레오티드의 약역학적 성질을 개선하는 기, 또는 올리고뉴클레오티드의 약동학적 성질을 개선하는 기, 그리고 유사한 성질을 가진 다른 치환기. 바람직한 변형은 2'-메톡시에톡시 (2'-O-CH2CH2OCH3, 또한 2'-O-(2-메톡시에틸) 또는 2'-MOE로 공지됨), 다시 말하면, 알콕시알콕시 기를 포함한다. 다른 바람직한 변형은 하기 실시예에서 설명된 바와 같은 2'-디메틸아미노옥시에톡시, 다시 말하면, O(CH2)2ON(CH3)2 기, 일명 2'-DMAOE, 그리고 2'-디메틸아미노에톡시에톡시 (당분야에서 2'-O-디메틸아미노에톡시에틸 또는 2'-DMAEOE), 다시 말하면, 2'-O-CH2-O-CH2-N (CH2)2을 포함한다.
다른 바람직한 변형은 2'-메톡시(2'-OCH3), 2'-아미노프로폭시(2'-O CH2CH2CH2NH2) 및 2'-플루오르 (2'-F)을 포함한다. 또한, 올리고뉴클레오티드 상에서 다른 위치, 특히 3' 말단 뉴클레오티드 상에서 또는 2'-5' 연결된 올리고뉴클레오티드에서 당의 3' 위치, 그리고 5' 말단 뉴클레오티드의 5' 위치에서 유사한 변형이 만들어질 수 있다. 올리고뉴클레오티드는 또한 펜토푸라노실 당 대신에 사이클로부틸 모이어티와 같은 당 모방체를 보유할 수 있다. 이와 같은 변형된 당 구조의 제조를 교시하는 대표적인 U.S. 특허에는 US 특허 제4,981,957호; 제5,118,800호; 제5,319,080호; 제5,359,044호; 제5,393,878호; 제5,446,137호; 제5,466,786호; 제5,514,785호; 제5,519,134호; 제5,567,811호; 제5,576,427호; 제5,591,722호; 제5,597,909호; 제5,610,300호; 제5,627,053호; 제5,639,873호; 제5,646,265호; 제5,658,873호; 제5,670,633호; 및 제5,700,920호가 포함되지만 이들에 국한되지 않고, 이들 각각은 참조로서 편입된다.
올리고뉴클레오티드는 또한 핵염기 (당분야에서 종종 간단히 "염기"로 지칭됨) 변형 또는 치환을 포함할 수 있다. 본 명세서에서, "변형되지 않은" 또는 "자연" 뉴클레오티드는 퓨린 염기 아데닌 (A) 및 구아닌 (G), 그리고 피리미딘 염기 티민 (T), 시토신 (C) 및 우라실 (U)을 포함한다. 변형된 뉴클레오티드에는 다른 합성 및 자연 뉴클레오티드, 예를 들면, 5-메틸시토신 (5-me-C), 5-히드록시메틸 시토신, 산틴, 하이포산틴, 2-아미노아데닌, 아데닌과 구아닌의 6-메틸 및 다른 알킬 유도체, 아데닌과 구아닌의 2-프로필 및 다른 알킬 유도체, 2-티오우라실, 2-티오티민 및 2-티오시토신, 5-할로우라실 및 시토신, 5-프로피닐 우라실 및 시토신, 6-아조 우라실, 시토신 및 티민, 5-우라실 (슈도-우라실), 4-티오우라실, 8-할로, 8-아미노, 8-티올, 8-티오알킬, 8-히드록실 및 다른 8-치환된 아데닌 및 구아닌, 5-할로, 특히 5-브로모, 5-트리플루오르메틸 및 다른 5-치환된 우라실 및 시토신, 7-메틸구아닌 및 7-메틸아데닌, 8-아자구아닌 및 8-아자아데닌, 7-데아자구아닌 및 7-데아자아데닌, 그리고 3-데아자구아닌 및 3-데아자아데닌이 포함된다.
또한, 뉴클레오티드에는 U.S. 특허 No. 3,687,808호, 'The Concise Encyclopedia of Polymer Science And Engineering' , pages 858-859, Kroschwitz , J.I., ed . John Wiley & Sons , 1990, Englisch et al ., ' Angewandle Chemie , International Edition' , 1991, 30, page 613, 그리고 Sanghvi, Y.S., Chapter 15, 'Antisence Research and Applications' , pages 289-302, Crooke , S.T. and Lebleu , B. ea ., CRC Press , 1993에서 설명된 것들이 포함된다. 이와 같은 일정한 뉴클레오티드는 본 발명의 올리고머 화합물의 결합 친화성을 증가시키는데 특히 유용하다. 이들에는 2-아미노프로필아데닌, 5-프로피닐우라실 및 5-프로피닐시토신을 포함하는 5-치환된 피리미딘, 6-아자피리미딘 및 N-2, N-6과 0-6 치환된 퓨린이 포함된다. 5-메틸시토신 치환은 핵산 이중나선 안정도를 0.6-1.2℃ 증가시키는 것으로 밝혀졌고 (Sanghvi , Y.S., Crooke , S.T. and Lebleu , B., eds , ' Antisence Research and Applications', CRC Press , Boca Raton , 1993, pp . 276-278), 그리고 2'-O메톡시에틸 당 변형과 복합될 때 특히 바람직한 염기 치환이다.
상기 변형된 뉴클레오티드 및 기타 변형된 뉴클레오티드의 제조를 교시하는 대표적인 U.S. 특허에는 US 특허 제3,687,808호, 제4,845,205호; 제5,130,302호; 제5,134,066호; 제5,175,273호; 제5,367,066호; 제5,432,272호; 제5,457,187호; 제5,459,255호; 제5,484,908호; 제5,502,177호; 제5,525,711호; 제5,552,540호; 제5,587,469호; 제5,596,091호; 제5,614,617호; 제5,750,692호, 및 제5,681,941호가 포함되지만 이들에 국한되지 않고, 이들 각각은 참조로서 편입된다.
본 발명의 올리고뉴클레오티드의 기타 변형은 하나 이상의 모이어티 또는 접합체를 올리고뉴클레오티드에 화학적으로 연결하는 것을 수반하는데, 이는 올리고뉴클레오티드의 활성, 세포 분포 또는 세포 취입을 증강시킨다.
이와 같은 모이어티에는 지질 모이어티, 예를 들면, 콜레스테롤 모이어티, 담즙산, 티오에테르, 예를 들면, 헥실-S-트리릴티올, 티오콜레스테롤, 지방족 사슬, 예를 들면, 도데칸디올 또는 운데실 잔기, 인지질, 예를 들면, 디-헥사데실-rac-글리세롤 또는 트리에틸암모늄 1,2-디-O-헥사데실-rac-글리세로-3-H-포스포네이트, 폴리아민 또는 폴리에틸렌 글리콜 사슬, 또는 아다만탄 아세트산, 팔미틸 모이어티, 또는 옥타데실아민 또는 헥실아미노-카르보닐-t 옥시콜레스테롤 모이어티가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다.
이와 같은 올리고뉴클레오티드 접합체의 제조를 교시하는 대표적인 U.S. 특허에는 US 특허 제4,828,979호; 제4,948,882호; 제5,218,105호; 제5,525,465호; 제5,541,313호; 제5,545,730호; 제5,552,538호; 제5,578,717호, 제5,580,731호; 제5,580,731호; 제5,591,584호; 제5,109,124호; 제5,118,802호; 제5,138,045호; 제5,414,077호; 제5,486,603호; 제5,512,439호; 제5,578,718호; 제5,608,046호; 제4,587,044호; 제4,605,735호; 제4,667,025호; 제4,762,779호; 제4,789,737호; 제4,824,941호; 제4,835,263호; 제4,876,335호; 제4,904,582호; 제4,958,013호; 제5,082,830호; 제5,112,963호; 제5,214,136호; 제5,082,830호; 제5,112,963호; 제5,214,136호; 제5,245,022호; 제5,254,469호; 제5,258,506호; 제5,262,536호; 제5,272,250호; 제5,292,873호; 제5,317,098호; 제5,371,241호; 제5,391,723호; 제5,416,203호; 제5,451,463호; 제5,510,475호; 제5,512,667호; 제5,514,785호; 제5,565,552호; 제5,567,810호; 제5,574,142호; 제5,585,481호; 제5,587,371호; 제5,595,726호; 제5,597,696호; 제5,599,923호; 제5,599,928호 및 제5,688,941호가 포함되지만 이들에 국한되지 않고, 이들 각각은 참조로서 편입된다.
약물 발견 : 본 발명의 화합물은 약물 발견 및 표적 검증 분야에도 적용될 수 있다. 본 발명은 전압 작동 나트륨 통로, 알파 소단위(SCNA) 폴리뉴클레오티드 및 질환 상태, 표현형 또는 장애 사이에 존재하는 상관관계를 석명하기 위한 약물 발견 노력에서, 본 발명에서 확인된 화합물 및 바람직한 표적 분절의 이용을 포함한다. 이들 방법은 SCNA 폴리뉴클레오티드를 검출 또는 조정하는 것을 포함하며, 샘플, 조직, 세포 또는 생명체를 본 발명의 화합물과 접촉시키는 단계, SCNA 폴리뉴클레오티드의 핵산 또는 단백질 수준 및/또는 처치후 일정 시점에 관련된 표현형 또는 화학적 종점을 측정하는 단계, 그리고 선택적으로, 측정된 값을 처리되지 않은 샘플 또는 본 발명의 다른 화합물로 처리된 샘플에 비교하는 단계를 포함한다. 이들 방법은 표적 검증 과정을 위한 미지의 유전자 기능을 결정하기 위하여, 또는 특정 질환, 상태 또는 표현형의 치료 또는 예방을 위한 표적으로서 특정 유전자 산물의 유효성을 결정하기 위하여 다른 실험과 병렬과 또는 공동으로 실행될 수 있다.
유전자 발현의 상향 조절 또는 저해의 평가 :
외인성 핵산의 숙주 세포 또는 생명체 내로의 전달은 세포 또는 생명체내 핵산이 존재하는 것을 직접적으로 검출함으로써 평가될 수 있다. 이와 같은 검출은 당분야에 공지된 여러 방법에 의해 달성될 수 있다. 가령, 외인성 핵산의 존재는 서든 블롯에 의해, 또는 핵산과 연관된 뉴클레오티드 서열을 특이적으로 증폭시키는 프라이머를 이용한 중합효소 연쇄 반응 (PCR) 기술에 의해 검출될 수 있다. 외인성 핵산의 발현은 유전자 발현 분석을 비롯한 통상적인 방법을 이용하여 측정될 수 있다. 가령, 외인성 핵산으로부터 생성된 mRNA는 노던 블롯 및 역전사 PCR (RT-PCR)을 이용하여 검출되고 정량화될 수 있다.
외인성 핵산으로부터의 RNA 발현 역시 효소적 활성 또는 리포터 단백질 활성을 측정함으로써 검출될 수 있다. 가령, 안티센스 조정 활성은 외인성 핵산이 효과물질 RNA를 생산하고 있다는 표시로서 표적 핵산 발현에서 증가 또는 감소로서 간접적으로 측정될 수 있다. 서열 보존에 근거하여, 프라이머가 설계되고 표적 유전자의 코딩 영역을 증폭하는데 이용될 수 있다. 초기에, 각 유전자로부터 가장 많이 발현된 코딩 영역은 비록 임의의 코딩 또는 비-코딩 영역이 이용될 수 있긴 하지만, 모델 기준 유전자를 구축하는데 이용될 수 있다. 각 기준 유전자는 리포터 코딩 영역 및 이의 폴리(A) 신호 사이에 각 코딩 영역을 삽입함으로써 어셈블리된다. 이와 같은 플라스미드는 유전자의 상류 부분에 리포터 유전자, 그리고 3' 비-코딩 영역에 잠재적인 RNAi 표적을 보유하는 mRNA를 생산할 것이다. 개별 안티센스 올리고뉴클레오티드의 효능은 리포터 유전자를 조정함으로써 평가될 것이다. 본 발명의 방법에 유용한 리포터 유전자에는 아세토히드록시산 합성효소 (AHAS), 알칼리 포스파타제 (AP), 베타 갈락토시다아제 (LacZ), 베타 글루코로니다제 (GUS), 클로람페니콜 아세틸전이효소 (CAT), 녹색 형광 단백질 (GFP), 적색 형광 단백질 (RFP), 황색 형광 단백질 (YFP), 청록색 형광 단백질 (CFP), 양고추냉이 과산화효소 (HRP), 루시페라제 (Luc), 노팔린 합성효소 (NOS), 옥토파인 합성효소 (OCS), 그리고 이들의 유도체가 포함된다. 암피실린, 블레오마이신, 클로람페니콜, 젠타마이신, 하이그로마이신, 카나마이신, 린코마이신, 메토트렉세이트, 포스피노트리친, 퓨로마이신 및 테트라사이클린에 내성을 부여하는 다중 선택성 마커가 이용된다. 리포터 유전자의 조정을 결정하는 방법은 당분야에 공지되어 있으며, 이들 방법에는 형광 측정법 (가령, 형광 분광학, 형광 활성화된 세포 분류 (FACS), 형광 현미경), 항생제 내성 결정이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다.
세포 기반 분석에서 표적 핵산 분획을 또한 탐지할 수 있다. Dravet 증후군-연관된 돌연변이를 나르는 주요 인간 섬유아세포들 그리고 또한 인간의 고환에서 Scnla 천연 안티센스 BG724147을 탐지하는 실험들을 실행한다. HepG2 뿐만 아니라 Dravet 증후군-연관된 돌연변이를 나르는 주요 인간 섬유아세포들의 경우, 세포들을 성장시키고, RNA를 추출한다. 인간 고환의 경우, 폴리 A 단리된 RNA를 구입하여 이용한다. 이 실험을 RACE (Rapid Amplification of cDNA Ends)이라고 하고, BG724147 RNA 전사체용 특이적인 프라이머들을 이용한다.
HepG2의 polyA 단리된 RNA와 Dravet 증후군-연관된 돌연변이를 나르는 주요 인간 섬유아세포로부터 polyA 단리된 RNA에서 매우 유사한 PCR 산물이 탐지되었지만, 이 산물은 인간 고환의 polyA 단리된 RNA에서 탐지되지 않았다. 더욱이, PCR 산물은 HepG2 세포의 총 RNA와 Dravet 증후군-연관된 돌연변이를 나르는 주요 인간 섬유아세포의 총 RNA에서 탐지되지 않았다(또는 매우 매우 낮은 양으로 탐지된다). BG724147로 불리는 Scnla에 대한 천연 안티센스는 HepG2 세포들과 Dravet 증후군-연관된 돌연변이를 나르는 주요 인간 섬유아세포들에는 존재하지만, 인간 고환에는 존재하지 않음을 이 결과들은 암시한다.
SCNA 단백질 및 mRNA 발현은 당업자에게 공지되고 본 명세서에서 설명된 방법을 이용하여 평가될 수 있다. 가령, 면역분석법, 예를 들면, ELISA가 단백질 수준을 측정하는데 이용될 수 있다. SCNA ELISA 분석 키트는 예로써, R&D Systems (Minneapolis, MN)로부터 상업적으로 가용하다.
구체예들에서, 본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오티드를 이용하여 처리된 샘플 (가령, 생체내에서 또는 시험관내에서 세포 또는 조직)에서 SCNA 발현 (가령, mRNA 또는 단백질)은 대조 샘플에서 SCNA 발현과의 비교에 의해 평가된다. 가령, 단백질 또는 핵산의 발현은 당업자에게 공지된 방법을 이용하여, 모의-처리된 또는 처리되지 않은 샘플에서 발현과 비교될 수 있다. 대안으로, 대조 안티센스 올리고뉴클레오티드 (가령, 변경된 또는 상이한 서열을 보유하는 것)로 처리된 샘플과의 비교는 요망되는 정보에 따라 수행될 수 있다. 다른 구체예에서, 처리된 샘플 대(對) 처리되지 않은 샘플에서 SCNA 단백질 또는 핵산의 발현에서 차이는 처리된 샘플 대(對) 처리되지 않은 샘플에서 상이한 핵산 (연구자에 의해 적절한 것으로 간주되는 임의의 표준, 예를 들면, 가사 유전자 (housekeeping gene) 포함)의 발현에서 차이와 비교될 수 있다.
관찰된 차이는 대조와의 비교에서 이용을 위하여, 원하는 대로, 예를 들면, 비율 (ratio) 또는 분율 (fraction)의 형태로 표시될 수 있다. 구체예에서, 본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오티드로 처리된 샘플에서 SCNA mRNA 또는 단백질의 수준은 처리되지 않은 샘플, 또는 대조 핵산으로 처리된 샘플과 비교하여, 대략 1.25-배 내지 대략 10-배 또는 그 이상 증가되거나 감소된다. 구체예에서, SCNA mRNA 또는 단백질의 수준은 최소한 대략 1.25-배, 최소한 대략 1.3-배, 최소한 대략 1.4-배, 최소한 대략 1.5-배, 최소한 대략 1.6-배, 최소한 대략 1.7-배, 최소한 대략 1.8-배, 최소한 대략 2-배, 최소한 대략 2.5-배, 최소한 대략 3-배, 최소한 대략 3.5-배, 최소한 대략 4-배, 최소한 대략 4.5-배, 최소한 대략 5-배, 최소한 대략 5.5-배, 최소한 대략 6-배, 최소한 대략 6.5-배, 최소한 대략 7-배, 최소한 대략 7.5-배, 최소한 대략 8-배, 최소한 대략 8.5-배, 최소한 대략 9-배, 최소한 대략 9.5-배, 또는 최소한 대략 10-배 또는 그 이상 증가되거나 감소된다.
키트 , 연구 시약, 진단제 및 치료제
본 발명의 화합물은 진단, 치료 및 예방용으로 이용되거나, 또는 연구 시약 및 키트 성분으로 이용될 수 있다. 게다가, 정교한 특이성으로 유전자 발현을 저해할 수 있는 안티센스 올리고뉴클레오티드는 특정 유전자의 기능을 밝히거나, 또는 생물학적 경로의 다양한 구성원의 기능을 구별하기 위하여 당업자에 의해 종종 이용된다.
키트 및 진단제에서, 그리고 다양한 생물학적 시스템에서 사용을 위하여, 본 발명의 화합물은 단독으로 또는 다른 화합물 또는 치료제와 공동으로, 세포 및 조직 내에서 발현되는 유전자의 일부 또는 전체 보체의 발현 패턴을 밝히기 위한 차등적 및/또는 복합적 분석에서 도구로서 유용하다.
본 명세서에서, 용어 "생물학적 시스템" 또는 "시스템"은 전압 작동 나트륨 통로, 알파 소단위(SCNA) 유전자의 산물을 발현하는, 또는 이들을 발현하는데 적격인 임의의 생명체, 세포, 세포 배양액 또는 조직으로 정의된다. 이들에는 인간, 유전자도입 동물, 세포, 세포 배양액, 조직, 이종이식편, 이식물 및 이들의 조합이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다.
무제한적 실례로써, 하나 이상의 안티센스 화합물로 처리된 세포 또는 조직 내에서 발현 패턴은 안티센스 화합물로 처리되지 않은 대조 세포 또는 조직과 비교되고, 그리고 생성된 패턴은 검사되는 유전자의 질환 연관성, 신호전달 경로, 세포 국부화, 발현 수준, 크기, 구조 또는 기능에 관련되기 때문에 차등적인 유전자 발현 수준에 대해 분석된다. 이들 분석은 자극된 또는 자극되지 않은 세포 상에서, 그리고 발현 패턴에 영향을 주는 다른 화합물의 존부하에 실행될 수 있다.
당분야에 공지된 유전자 발현 분석 방법의 실례에는 DNA 어레이 또는 마이크로어레이, SAGE (유전자 발현의 일련의 분석), READS (절단된 cDNA의 제한 효소 증폭), TOGA (전체 유전자 발현 분석), 단백질 어레이 및 단백체학 (proteomics), 발현된 서열 tag (EST) 염기서열분석, 차감성 RNA 핑거프린팅 (SuRF), 차감성 클로닝, 차등적 디스플레이(DD), 비교 게놈 혼성화, FISH (형광 원위치 혼성화) 기술 (Going and Gusterson, (1999) Eur . J. Cancer , 35, 1895-904) 및 질량 분석 방법이 포함된다.
본 발명의 화합물은 이들 화합물이 전압 작동 나트륨 통로, 알파 소단위(SCNA)를 인코딩하는 핵산에 혼성화되기 때문에, 연구 및 진단에 유용하다. 가령, 효과적인 SCNA 조정물질이 될 수 있을 만큼, 본 명세서에서 기술된 조건 하에 충분한 효율로 혼성화되는 올리고뉴클레오티드는 각각, 유전자 증폭 또는 검출에 유리한 조건하에 효과적인 프라이머 또는 프로브이다. 이들 프라이머 및 프로브는 SCNA를 인코딩하는 핵산 분자의 특이적 검출을 요구하는 방법에서, 그리고 SCNA의 검출 또는 추가 연구에 이용을 위한 이들 핵산 분자의 증폭에서 유용하다. 본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오티드, 특히, 프라이머 및 프로브와 SCNA를 인코딩하는 핵산의 혼성화는 당분야에 공지된 방법에 의해 검출될 수 있다. 이와 같은 수단에는 올리고뉴클레오티드에 효소의 접합 (conjugation), 올리고뉴클레오티드의 방사성라벨링, 또는 임의의 다른 적합한 검출 수단이 포함될 수 있다. 샘플에서 SCNA의 수준을 검출하기 위하여 이와 같은 검출 수단을 이용하는 키트 역시 만들어질 수 있다.
안티센스의 특이성 및 민감성 역시 치료요법적 용도를 위하여 당업자에 의해 이용된다. 인간을 비롯한 동물의 질환 상태의 치료에서 치료요법적 모이어티로서 안티센스 화합물이 이용되고 있다. 안티센스 올리고뉴클레오티드 약물은 인간에게 안전하고 효과적으로 투여되고 있고, 그리고 다수의 임상 시험이 현재 진행중이다. 따라서 안티센스 화합물은 세포, 조직 및 동물, 특히 인간의 치료를 위한 치료 섭생에서 유용하도록 설정되는 유용한 치료 양식이 될 수 있는 것으로 확립된다.
치료를 위하여, SCNA 폴리뉴클레오티드의 발현을 조정함으로써 치료될 수 있는 질환이나 장애를 앓는 것으로 의심되는 동물, 바람직하게는 인간은 본 발명에 따른 안티센스 화합물을 투여함으로써 치료된다. 가령, 한 가지 무제한적인 구체예에서, 이들 방법은 치료를 요하는 동물에 SCNA 조정물질의 치료 효과량을 투여하는 단계를 포함한다. 본 발명의 SCNA 조정물질은 SCNA의 활성을 효과적으로 조정하거나, 또는 SCNA 단백질의 발현을 효과적으로 조정한다. 한 구체예에서, 동물에서 SCNA의 활성 또는 발현은 대조와 비교하여 대략 10% 저해된다. 바람직하게는, 동물에서 SCNA의 활성 또는 발현은 대략 30% 저해된다. 더욱 바람직하게는, 동물에서 SCNA의 활성 또는 발현은 대략 50% 또는 그 이상 저해된다. 따라서 이들 올리고머 화합물은 전압 작동 나트륨 통로, 알파 소단위(SCNA) mRNA의 발현을 대조와 비교하여, 최소한 10%, 최소한 50%, 최소한 25%, 최소한 30%, 최소한 40%, 최소한 50%, 최소한 60%, 최소한 70%, 최소한 75%, 최소한 80%, 최소한 85%, 최소한 90%, 최소한 95%, 최소한 98%, 최소한 99%, 또는 100% 조정한다.
한 구체예에서, 동물에서 전압 작동 나트륨 통로, 알파 소단위(SCNA)의 활성 또는 발현은 대조와 비교하여 대략 10% 증가된다. 바람직하게는, 동물에서 SCNA의 활성 또는 발현은 대략 30% 증가된다. 더욱 바람직하게는, 동물에서 SCNA의 활성 또는 발현은 50% 또는 그 이상 증가된다. 따라서 올리고머 화합물은 SCNA mRNA의 발현을 대조와 비교하여, 최소한 10%, 최소한 50%, 최소한 25%, 최소한 30%, 최소한 40%, 최소한 50%, 최소한 60%, 최소한 70%, 최소한 75%, 최소한 80%, 최소한 85%, 최소한 90%, 최소한 95%, 최소한 98%, 최소한 99%, 또는 100% 조정한다.
가령, 전압 작동 나트륨 통로, 알파 소단위(SCNA)의 발현 감소는 동물의 혈청, 혈액, 지방 조직, 간 또는 임의의 기타 체액, 조직 또는 기관에서 측정될 수 있다. 바람직하게는, 분석되는 체액, 조직 또는 기관 내에 포함된 세포는 SCNA 펩티드를 인코딩하는 핵산 분자 및/또는 SCNA 단백질 자체를 포함한다.
본 발명의 화합물은 적절한 제약학적으로 허용되는 희석제 또는 담체에 효과량의 화합물을 첨가함으로써 제약학적 조성물에 이용될 수 있다. 본 발명의 화합물 및 방법의 이용은 또한, 예방학적으로 유용하다.
접합체 ( conjugate )
본 발명의 올리고뉴클레오티드의 다른 변형은 올리고뉴클레오티드의 활성, 세포 분포 또는 세포 취입을 증강시키는 하나 이상의 모이어티 또는 접합체를 올리고뉴클레오티드에 화학적으로 연결시키는 것을 수반한다. 이들 모이어티 또는 접합체는 1차 또는 2차 히드록실 기와 같은 기능기에 공유 결합된 접합체 기를 포함할 수 있다. 본 발명의 접합체 기에는 삽입기, 리포터 분자, 폴리아민, 폴리아미드, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리에테르, 올리고머의 약역학적 성질을 강화시키는 기, 그리고 올리고머의 약동학적 성질을 강화시키는 기가 포함된다. 전형적인 접합체 기에는 콜레스테롤, 지질, 인지질, 바이오틴, 페나진, 폴레이트, 페난트리딘, 안트라퀴논, 아크리딘, 플루오레세인, 로다민, 쿠마린 및 염료가 포함된다. 본 발명의 맥락에서, 약역학적 성질을 강화시키는 기에는 취입을 개선하고, 분해에 대한 내성을 강화시키고, 및/또는 표적 핵산과의 서열 특이적 혼성화를 강화시키는 기가 포함된다. 본 발명의 맥락에서, 약동학적 성질을 강화시키는 기에는 본 발명의 화합물의 취입, 분포, 대사 또는 배출을 개선하는 기가 포함된다. 대표적인 접합체 기는 국제 특허 출원 PCT/US92/09196 (1992년 10월 23일 출원) 및 U.S. 특허 제6,287,860호에서 설명되고, 이들은 본 발명에 참조로서 편입된다. 접합체 모이어티에는 지질 모이어티, 예를 들면, 콜레스테롤 모이어티, 콜린산, 티오에테르, 예를 들면, 헥실-5-트리틸티올, 티오콜레스테롤, 지방족 사슬, 예를 들면, 도데칸디올 또는 운데실 잔기, 인지질, 예를 들면, 디-헥사데실-rac-글리세롤 또는 트리에틸암모늄 1,2-디-O-헥사데실-rac-글리세로-3-H포스포네이트, 폴리아민 또는 폴리에틸렌 글리콜 사슬, 또는 마다만탄 아세트산, 팔미틸 모이어티, 또는 옥타데실아민 또는 헥실아미노-카르보닐-옥시콜레스테롤 모이어티가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 활성 약물 물질, 예를 들면, 아스피린, 와파린, 페닐부타존, 이부프로펜, 수프로펜, 펜부펜, 케토프로펜, (S)-(+)-프라노프로펜, 카르프로펜, 단실사르코신, 2,3,5-트리요오드벤조산, 풀루페남산, 폴린산, 벤조티아디아지드, 클로로티아지드, 디아제핀, 인도메티신, 바르비투레이트, 세팔로스포린, 설파 약물, 당뇨병치료제, 항균제 또는 항생제에 접합될 수도 있다.
이와 같은 올리고뉴클레오티드 접합체의 제조를 교시하는 대표적인 U.S. 특허에는 U.S. 특허 제4,828,979호; 제4,948,882호; 제5,218,105호; 제5,525,465호; 제5,541,313호; 제5,545,730호; 제5,552,538호; 제5,578,717호; 제5,580,731호; 제5,580,731호; 제5,591,584호; 제5,109,124호; 제5,118,802호; 제5,138,045호; 제5,414,077호; 제5,486,603호; 제5,512,439호; 제5,578,718호; 제5,608,046호; 제4,587,044호; 제4,605,735호; 제4,667,025호; 제4,762,779호; 제4,789,737호; 제4,824,941호; 제4,835,263호; 제4,876,335호; 제4,904,582호; 제4,958,013호; 제5,082,830호; 제5,112,963호; 제5,214,136호; 제5,082,830호; 제5,112,963호; 제5,214,136호; 제5,245,022호; 제5,254,469호; 제5,258,506호; 제5,262,536호; 제5,272,250호; 제5,292,873호; 제5,317,098호; 제5,371,241호; 제5,391,723호; 제5,416,203호, 제5,451,463호; 제5,510,475호; 제5,512,667호; 제5,514,785호; 제5,565,552호; 제5,567,810호; 제5,574,142호; 제5,585,481호; 제5,587,371호; 제5,595,726호; 제5,597,696호; 제5,599,923호; 제5,599,928호 및 제5,688,941호가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다.
제제 ( formulations )
본 발명의 화합물은 취입, 분포 및/또는 흡수를 지원하기 위한 화합물의 다른 분자, 분자 구조 또는 혼합물, 예를 들면, 리포좀, 수용체-표적화된 분자, 경구, 직장, 국소 또는 기타 제제와 혼합되거나, 포집되거나, 접합되거나 또는 연합될 수 있다. 이와 같은 취입, 분포 및/또는 흡수-지원 제제의 제조를 교시하는 대표적인 U.S. 특허에는 U.S. 특허 제5,108,921호; 제5,354,844호; 제5,416,016호; 제5,459,127호; 제5,521,291호; 제5,543,165호; 제5,547,932호; 제5,583,020호; 제5,591,721호; 제4,426,330호; 제4,534,899호; 제5,013,556호; 제5,108,921호; 제5,213,804호; 제5,227,170호; 제5,264,221호; 제5,356,633호; 제5,395,619호; 제5,416,016호; 제5,417,978호; 제5,462,854호; 제5,469,854호; 제5,512,295호; 제5,527,528호; 제5,534,259호; 제5,543,152호; 제5,556,948호; 5,580,575호; 및 5,595,756호가 포함되지만 이들에 국한되지 않고, 이들 각각은 참조로서 편입된다.
비록 안티센스 올리고뉴클레오티드가 표적 발현 및/또는 기능을 조정하기 위하여 벡터로 투여될 필요는 없지만, 본 발명의 구체예는 안티센스 올리고뉴클레오티드의 발현을 위한 발현 벡터 구조체에 관계하고, 이들 벡터 구조체는 프로모터, 하이브리드 프로모터 유전자 서열을 포함하고, 그리고 강한 구조성 프로모터 활성, 또는 원하는 경우 유도될 수 있는 프로모터 활성을 갖는다.
한 구체예에서, 본 발명의 실시는 적절한 핵산 운반 시스템으로 전술한 안티센스 올리고뉴클레오티드 중에서 최소한 하나를 투여하는 것을 수반한다. 한 구체예에서, 상기 시스템은 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결된 비-바이러스 벡터를 포함한다. 이와 같은 비-바이러스 벡터의 실례는 단독으로, 또는 적합한 단백질, 폴리사카라이드 또는 지질 제제와 공동으로 올리고뉴클레오티드 (가령 서열 번호: 29 내지 94 중에서 임의의 하나 이상)를 포함한다.
추가로 적합한 핵산 운반 시스템에는 바이러스 벡터, 전형적으로 아데노바이러스, 아데노바이러스-연합된 바이러스 (AAV), 헬퍼-의존성 아데노바이러스, 레트로바이러스 또는 Japan-리포좀의 헤마글루티닌 바이러스 (HVJ) 복합체 중에서 최소한 하나로부터 서열이 포함된다. 바람직하게는, 바이러스 벡터는 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결된 강한 진핵 프로모터, 예를 들면, 사이토메갈로바이러스 (CMV) 프로모터가 포함된다.
추가적으로 바람직한 벡터에는 바이러스 벡터, 융합 단백질 및 화학적 접합체가 포함된다. 레트로바이러스 벡터에는 Moloney 뮤린 백혈병 바이러스 및 HIV-계 바이러스가 포함된다. 한 가지 바람직한 HIV-계 바이러스 벡터는 최소한 2개 벡터를 포함하고, 여기서 gag 및 pol 유전자는 HIV 게놈으로부터 유래되고, env 유전자는 다른 바이러스로부터 유래된다. DNA 바이러스 벡터가 바람직하다. 이들 벡터에는 폭스 벡터, 예를 들면, 오르토폭스 (orthopox) 또는 아비폭스 (avipox) 벡터, 헤르페스바이러스 벡터, 예를 들면, 헤르페스 심플렉스 I 바이러스 (HSV) 벡터, 아데노바이러스 벡터 및 아데노-연합된 바이러스 벡터가 포함된다.
본 발명의 안티센스 화합물은 임의의 제약학적으로 허용되는 염, 에스테르 또는 이와 같은 에스테르의 염, 또는 인간을 비롯한 동물에 투여시 생물학적 활성 대사물질 또는 이의 잔기를 직간접적으로 제공할 수 있는 임의의 다른 화합물을 포함한다.
용어 "약리학적으로 허용되는 염"은 본 발명의 화합물의 생리학적으로 및 제약학적으로 허용되는 염, 다시 말하면, 부모 화합물의 바람직한 생물학적 활성을 보유하지만 여기에 바람직하지 않은 독성 효과를 부여하지 않는 염을 지칭한다. 올리고뉴클레오티드의 경우, 제약학적으로 허용되는 염의 바람직한 실례 및 이들의 용도는 U.S. 특허 제6,287,860호에서 더욱 설명되고, 이는 참조로서 편입된다.
본 발명은 또한, 본 발명의 안티센스 화합물을 포함하는 제약학적 조성물 및 제제를 포함한다. 본 발명의 제약학적 조성물은 국소 또는 전신 치료가 바람직한지 그리고 치료되는 부위에 따라 여러 방법으로 투여될 수 있다. 투여는 국소 (눈, 그리고 질 및 직장 운반을 비롯한 점막 포함), 예로써 분무기를 비롯하여 분말 또는 에어로졸의 흡입 또는 통기에 의해 폐; 기관내 (intratracheal), 비내, 상피 또는 경피, 구강 또는 비경구일 수 있다. 비경구 (parenteral) 투여에는 정맥내, 동맥내, 피하, 복막내 또는 근육내 주사 또는 주입; 또는 두개내 (intracranial), 예를 들면, 수막강내 또는 뇌실내 투여가 포함된다.
중추신경계 내에 조직을 치료하기 위하여, 투여는 예로써, 뇌척수액 (cerebrospinal fluid) 내로 주사 또는 주입에 의해 수행될 수 있다. 뇌척수액 내로 안티센스 RNA의 투여는 예로써, U.S. 특허 출원 공개 번호 제2007/0117772호, "Methods for slowing familial ALS disease progression"에서 설명되고, 이는 본 발명에 순전히 참조로서 편입된다.
본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오티드가 중추신경계 내에 세포에 투여되는 것으로 의도될 때, 투여는 뇌-혈관 장벽 (blood-brain barrier)을 교차하여 본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오티드의 침투를 촉진할 수 있는 하나 이상의 작용제로 수행될 수 있다. 주사는 예로써, 내후각뇌피질 (entorhinal cortex) 또는 해마(hippocampus)에서 수행될 수 있다. 근육 조직 내에 운동 뉴런 (motor neuron)에 아데노바이러스 벡터의 투여에 의한 신경영양성 인자의 운반은 예로써, U.S. 특허 제6,632,427호, "Adenoviral-vector-mediated gene transfer into medullary motor neurons"에서 설명되고, 이는 본 발명에 참조로서 편입된다. 뇌, 예를 들면, 선조체 (striatum), 시상 (thalamus), 해마 (hippocampus), 또는 흑색질 (substantia nigra)에 직접적으로 벡터의 전달은 당분야에 공지되어 있고, 그리고 예로써, 본 발명에서 참조로서 편입되는 U.S. 특허 제6,756,523호, "Adenovirus vectors for the transfer of foreign genes into cells of the central nervous system particularly in brain"에서 설명된다. 투여는 주사와 같이 신속하게 수행되거나, 또는 느린 방출 제제 (slow release formulation)의 느린 주입 또는 투여와 같이 장기간 동안 수행될 수 있다.
본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오티드는 또한, 바람직한 제약학적 또는 약역학적 성질을 제공하는 작용제와 연결되거나 접합될 수 있다. 가령, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 뇌-혈관 장벽을 교차하여 침투 또는 운반을 증진하는 당분야에 공지된 임의의 물질, 예를 들면, 트랜스페린 수용체에 대한 항체에 결합되고, 그리고 정맥내 주사에 의해 투여될 수 있다. 안티센스 화합물은 바이러스 벡터, 예를 들면, 안티센스 화합물을 더욱 효과적으로 만들고 및/또는 뇌-혈관 장벽을 교차하여 안티센스 화합물의 운반을 증가시키기 위하여 바이러스 벡터와 연결될 수 있다. 또한, 삼투성 뇌-혈관 장벽 파괴는 예로써, 메소 에리트리톨 (meso erythritol), 자일리톨 (xylitol), D(+) 갈락토오스 (galactose), D(+) 락토오스 (lactose), D(+) 자일로오스 (xylose), 둘시톨 (dulcitol), 미오-이노시톨 (myo-inositol), L(-) 프럭토오스 (fructose), D(-) 만니톨 (mannitol), D(+) 글루코오스 (glucose), D(+) 아라비노스 (arabinose), D(-) 아라비노스, 셀로비오스 (cellobiose), D(+) 말토오스 (maltose), D(+) 라피노오스 (raffinose), L(+) 람노스 (rhamnose), D(+) 멜리비오스 (melibiose), D(-) 리보오스 (ribose), 아도니톨 (adonitol), D(+) 아라비톨 (arabitol), L(-) 아라비톨, D(+) 푸코오스 (fucose), L(-) 푸코오스, D(-) 릭소스 (lyxose), L(+) 릭소스, 그리고 L(-) 릭소스가 포함되지만 이들에 국한되지 않는 당, 또는 글루타민 (glutamine), 리신 (lysine), 아르기닌 (arginine), 아스파라긴 (asparagine), 아스파르트산 (aspartic acid), 시스테인 (cysteine), 글루타민산 (glutamic acid), 글리신 (glycine), 히스티딘 (histidine), 류신 (leucine), 메티오닌 (methionine), 페닐알라닌 (phenylalanine), 프롤린 (proline), 세린 (serine), 트레오닌 (threonine), 티로신 (tyrosine), 발린 (valine), 그리고 타우린 (taurine)이 포함되지만 이들에 국한되지 않는 아미노산의 주입에 의해 달성될 수 있다. 뇌-혈관 장벽 침투를 증강시키기 위한 방법과 물질은 예로써, U.S. 특허 제4,866,042호, "Method for the delivery of genetic material across the blood brain barrier", 제6,294,520호, "Material for passage through the blood-brain barrier", 그리고 제6,936,589호, "Parenteral delivery systems"에서 설명되고, 이들 모두 본 발명에 순전히 참조로서 편입된다.
본 발명의 안티센스 화합물은 취입, 분포 및/또는 흡수를 지원하기 위한 화합물의 다른 분자, 분자 구조 또는 혼합물, 예를 들면, 리포좀, 수용체-표적화된 분자, 경구, 직장, 국소 또는 기타 제제와 혼합되거나, 포집되거나, 접합되거나 또는 연합될 수 있다. 가령, 양이온성 지질이 올리고뉴클레오티드 취입을 용이하게 하기 위하여 제제 내에 포함될 수 있다. 취입을 용이하게 하는 것으로 밝혀진 이와 같은 한 가지 조성물은 LIPOFECTIN (GIBCO-BRL, Bethesda, MD)이다.
최소한 하나의 2'-O-메톡시에틸 변형을 가진 올리고뉴클레오티드는 경구 투여용으로 특히 유용한 것으로 생각된다. 국소 투여를 위한 제약학적 조성물 및 제제에는 경피 패치, 연고, 로션, 크림, 겔, 드롭, 좌약, 스프레이, 액상 및 분말이 포함된다. 통상적인 약리학적 담체, 수성, 분말 또는 오일 베이스, 농후제 등이 필수적이거나 바람직할 수 있다. 또한, 피복된 콘돔, 장갑 등이 유용할 수 있다.
본 발명의 제약학적 제제는 통상적으로 단위 약형 (unit dosage form)으로 제공될 수 있고, 그리고 제약 산업에서 공지된 전통적인 기술에 따라 제조될 수 있다. 이와 같은 기술은 활성 성분을 제약학적 담체 또는 부형제와 연합시키는 단계를 포함한다. 일반적으로, 제제는 활성 성분을 액상 담체 또는 미세하게 분할된 고형 담체 또는 둘 모두와 균일하게 및 친밀하게 연합시키고, 이후 필요에 따라 산물의 모양을 만듦으로써 제조된다.
본 발명의 조성물은 정제, 캡슐, 겔 캡슐, 액체 시럽, 연성 겔, 좌약 및 관장제가 포함되지만 이들에 국한되지 않는 많은 가능한 약형으로 제조될 수 있다. 본 발명의 조성물은 수성, 비-수성 또는 혼성 매체에서 현탁액으로 조제될 수도 있다. 수성 현탁액은 나트륨 카르복시메틸셀룰로오스, 소르비톨 및/또는 덱스트란을 포함하는 현탁액의 점성을 증가시키는 물질을 더욱 포함할 수 있다. 현탁액은 또한, 안정화제를 포함할 수 있다.
본 발명의 제약학적 조성물은 용액, 에멀젼, 거품 및 리포좀-함유 조제물이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 본 발명의 제약학적 조성물 및 제제는 하나 이상의 침투 강화제, 담체, 부형제 또는 기타 활성 또는 비활성 성분을 포함할 수 있다.
에멀젼은 전형적으로, 0.1 ㎛ 직경을 초과하는 액적의 형태로 서로 분산된 하나의 액체의 이종 (heterogeneous) 시스템이다. 에멀젼은 분산된 상에 추가하여 추가 성분, 그리고 수성 상, 오일상 또는 별도의 상으로서 그 자체 내에 용액으로서 존재하는 활성 성분을 포함할 수 있다. 본 발명의 구체예로서 마이크로에멀젼이 포함된다. 에멀젼 및 이들의 용도는 당분야에 공지되어 있으며, U.S. 특허 제6,287,860호에서 더욱 설명된다.
본 발명의 제제는 리포좀 제제를 포함한다. 본 발명에서, 용어 "리포좀"은 구형 이중층 또는 이중층에 배열된 양쪽성 지질로 구성된 소포를 의미한다. 리포좀은 단층라멜라 또는 다층라멜라 소포 (vesicle)이고, 이들은 친지성 물질로부터 형성된 막 및 운반되는 조성물을 포함하는 수성 내부를 가진다. 양이온성 리포좀은 안정된 복합체를 형성하기 위하여 음전하를 띈 DNA 분자와 상호작용하는 것으로 생각되는 양전하를 띈 리포좀이다. pH-민감성 또는 음전하를 띈 리포좀은 DNA와 복합체를 형성하기 보다는 DNA를 포집하는 것으로 생각된다. 양이온성 및 비-양이온성 리포좀은 DNA를 세포로 운반하는데 이용된다.
리포좀은 또한 "공간적으로 안정화된" 리포좀을 포함하는데, 본 명세서에서 상기 용어는 하나 이상의 특화된 지질을 포함하는 리포좀을 지칭한다. 리포좀에 통합될 때, 이와 같은 특화된 지질은 이들 특화된 지질이 없는 리포좀과 비교하여 순환 반감기가 강화된 리포좀을 발생시킨다. 공간적으로 안정화된 리포좀의 실례는 리포좀의 소포-형성 지질 부분의 일부가 하나 이상의 글리코리피드를 포함하거나, 또는 하나 이상의 친수성 폴리머, 예를 들면, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 모이어티로 유도화된 것들이다. 리포좀 및 이들의 용도는 U.S. 특허 제6,287,860호에서 더욱 설명된다.
본 발명의 제약학적 제제 및 조성물은 계면활성제를 또한 포함할 수 있다. 약물 산물, 제제 및 에멀젼에서 계면활성제의 이용은 당분야에 잘 공지되어 있다. 계면활성제 및 이들의 용도는 U.S. 특허 제6,287,860호에서 더욱 설명되고, 이는 참조로서 편입된다.
한 구체예에서, 본 발명은 핵산, 특히 올리고뉴클레오티드의 효과적인 운반을 달성하기 위하여 다양한 침투 강화제를 이용한다. 세포 막을 교차하여 비-친지성 약물의 확산을 지원하는 것에 추가하여, 침투 강화제는 또한 친지성 약물의 침투성을 강화시킨다. 침투 강화제는 5가지 넓은 범주, 다시 말하면, 계면활성제, 지방산, 담즙산, 킬레이트화제 그리고 비-킬레이트화 비-계면활성제 중의 하나에 속하는 것으로 분류될 수 있다. 침투 강화제 및 이들의 용도는 U.S. 특허 제6,287,860호에서 더욱 설명되고, 이는 참조로서 편입된다.
당업자는 제제가 그들의 의도된 용도, 다시 말하면, 투여 경로에 따라 일과적으로 설계된다는 것을 인지할 것이다.
국소 투여에 바람직한 제제는 본 발명의 올리고뉴클레오티드가 국소 운반제, 예를 들면, 지질, 리포좀, 지방산, 지방산 에스테르, 스테로이드, 킬레이트화제 및 계면활성제와 혼합되는 것들이다. 바람직한 지질 및 리포좀에는 중성 (가령, 디올레일-포스파티딜 DOPE 에탄올아민, 디미리스토일포스파티딜 콜린 DMPC, 디스테아로일포스파티딜 콜린), 음성 (가령, 디미리스토일포스파티딜 글리세롤 DMPG) 및 양이온 (가령, 디올레일테트라메틸아미노프로필 DOTAP 및 디올레일-포스파티딜 에탄올아민 DOTMA)이 포함된다.
국소 또는 기타 투여를 위하여, 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 리포좀 내에 포집되거나, 또는 특히 양이온 리포좀에 복합체를 형성할 수 있다. 대안으로, 올리고뉴클레오티드는 지질, 특히 양이온 지질에 복합될 수 있다. 바람직한 지방산 및 에스테르, 이들의 제약학적으로 허용되는 염, 그리고 이들의 용도는 U.S. 특허 제6,287,860호에서 더욱 설명된다.
경구 투여용 조성물 및 제제에는 분말 또는 과립, 미립자, 나노입자, 물 또는 비-수성 매체에서 현탁액 또는 용액, 캡슐, 겔 캡슐, 향낭, 정제 또는 미니정제가 포함된다. 농후제, 향료, 희석제, 유화제, 분산 보조제 또는 결합제가 바람직할 수 있다. 바람직한 경구 제제는 본 발명의 올리고뉴클레오티드가 하나 이상의 침투 강화제, 계면활성제 및 킬레이터와 함께 투여되는 것들이다. 바람직한 계면활성제에는 지방산 및/또는 이들의 에스테르 또는 염, 담즙산 및/또는 이들의 염이 포함된다. 바람직한 담즙산/염 및 지방산, 그리고 이들의 용도는 U.S. 특허 제 6,287,860호에서 더욱 설명되고, 이는 참조로서 편입된다. 침투 강화제의 조합, 예를 들면, 담즙산/염과 공동으로 지방산/염 역시 바람직하다. 특히 바람직한 조합은 라우르산, 카프르산 및 UDCA의 나트륨염이다. 추가 침투 강화제에는 폴리옥시에틸렌-9-라우릴 에테르, 폴리옥시에틸렌-20-세틸 에테르가 포함된다. 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 분무된 건조 입자를 비롯한 과립형으로 경구 운반되거나, 또는 미립자 또는 나노입자를 형성하기 위하여 복합될 수 있다. 올리고뉴클레오티드 착화제 및 이들의 용도는 U.S. 특허 제6,287,860호에서 더욱 설명되고, 이는 참조로서 편입된다.
비경구, 기관내 또는 심실내 투여를 위한 조성물 및 제제에는 완충액, 희석액 및 기타 적합한 첨가제 (침투 강화제, 담체 화합물 및 기타 제약학적으로 허용되는 담체 또는 부형제가 포함되지만 이들에 국한되지 않음)를 포함하는 무균 수용액이 포함될 수 있다.
본 발명의 일정한 구체예는 하나 이상의 올리고머 화합물 및 비-안티센스 기전에 의해 기능하는 하나 이상의 다른 화학요법제를 포함하는 제약학적 조성물을 제시한다. 이와 같은 화학요법제의 실례에는 다우노루비신, 다우노마이신, 닥티노마이신, 독소루비신, 에피루비신, 이다루비신, 에소루비신, 블레오마이신, 마포스파미드, 이포스파미드, 시토신 아라비노시드, 비스클로로에틸-니트로소우레아, 부설판, 미토마이신 C, 악티노마이신 D, 미트라마이신, 프레드니손, 히드록시프로게스테론, 테스토스테론, 타목시펜, 다카르바진, 프로카르바진, 헥사메틸멜라민, 펜타메틸멜라민, 미톡산트론, 암사크린, 클로람부실, 메틸사이클로헥실니트로소우레아, 질소 겨자, 멜파란, 사이클로포스파미드, 6-멀캅토퓨린, 6-티오구아닌, 시타라빈, 5-아자시티딘, 히드록시우레아, 데옥시코포르마이신, 4-히드록시퍼옥시사이클로-포스포라미드, 5-플루오르우라실 (5-FU), 5-플루오르데옥시우리딘 (5-FUdR), 메토트렉세이트(MTX), 콜히친, 탁솔, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 에토포시드 (VP-16), 트리메트렉세이트, 이리노테칸, 토포테칸, 젬시타빈, 테니포시드, 시스플라틴 및 디에틸스틸베스트롤(DES)이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 본 발명의 화합물과 함께 이용될 때, 이와 같은 화학요법제는 개별적으로 (가령, 5-FU 및 올리고뉴클레오티드), 순차적으로 (가령, 일정 기간 동안 5-FU 및 올리고뉴클레오티드, 그 이후에 MTX 및 올리고뉴클레오티드), 또는 하나 이상의 다른 화학요법제 (가령, 5-FU, MTX 및 올리고뉴클레오티드, 또는 5-FU, 방사능요법 및 올리고뉴클레오티드)와 함께 이용될 수 있다. 비-스테로이드성 소염제 및 코르티코스테로이드가 포함되지만 이들에 국한되지 않는 소염제 약물, 그리고 리비비린, 비다라빈, 아시클로비르 및 강시클로비르가 포함되지만 이들에 국한되지 않는 항바이러스 약물 역시 본 발명의 조성물에 복합될 수 있다. 안티센스 화합물 및 다른 비-안티센스 약물의 복합 역시 본 발명의 범위 내에 있다. 2개 이상의 복합 화합물이 함께 또는 순차적으로 이용될 수 있다.
다른 관련된 구체예에서, 본 발명의 조성물은 제 1 핵산을 표적으로 하는 하나 이상의 안티센스 화합물, 특히 올리고뉴클레오티드, 그리고 제 2 핵산 표적을 표적으로 하는 하나 이상의 추가 안티센스 화합물을 포함한다. 가령, 제 1 표적은 전압 작동 나트륨 통로, 알파 소단위(SCNA)의 특정 안티센스 서열일 수 있고, 그리고 제 2 표적은 다른 뉴클레오티드 서열로부터 영역일 수 있다. 대안으로, 본 발명의 조성물은 동일한 전압 작동 나트륨 통로, 알파 소단위(SCNA) 핵산 표적의 상이한 영역을 표적으로 하는 2개 이상의 안티센스 화합물을 포함할 수 있다. 안티센스 화합물의 다양한 실례가 본 명세서에서 예시되고, 그리고 기타 화합물은 당분야에 공지된 적합한 화합물 중에서 선택될 수 있다. 2개 이상의 복합 화합물이 함께 또는 순차적으로 이용될 수 있다.
약액주입 ( dosing ):
치료 조성물의 조제 및 이들의 후속 투여 (약액주입)는 당분야의 기술에 속한다. 약액주입은 수 일 내지 수개월간, 또는 치료 효과 또는 질환 상태의 감소가 달성될 때까지 지속되는 치료 과정과 함께, 치료되는 질환 상태의 중증도와 반응성에 좌우된다. 최적의 약액주입 일정은 환자의 신체에 약물 축적의 측량으로부터 계산될 수 있다. 당업자는 최적 용량, 약액주입 방법 및 반복률을 용이하게 결정할 수 있다. 최적 용량은 개별 올리고뉴클레오티드의 상대적 효능에 따라 달라질 수 있고, 그리고 일반적으로, 시험관내 및 생체내 동물 모델에서 효과적인 것으로 밝혀진 EC50에 근거하여 예측될 수 있다. 일반적으로, 용량은 체중 kg당 0.01㎍ 내지 100mg이고, 일일, 매주, 매월 또는 매년 1회 이상, 또는 심지어 2 내지 20년 마다 1회 제공될 수 있다. 당업자는 측정된 잔류 시간 및 체액 또는 조직 내에 약물의 농도에 근거하여 약액주입을 위한 반복률을 용이하게 예측할 수 있다. 성공적인 치료후, 질환 상태의 재발을 방지하기 위하여 환자가 유지요법을 받도록 하는 것이 바람직하며, 이때 올리고뉴클레오티드는 체중 kg당 0.01 ㎍ 내지 100mg 범위의 유지 용량으로, 일일 1회 이상 내지 20년마다 1회 투여된다.
구체예에서, 환자는 체중 ㎏당 최소한 대략 1, 최소한 대략 2, 최소한 대략 3, 최소한 대략 4, 최소한 대략 5, 최소한 대략 6, 최소한 대략 7, 최소한 대략 8, 최소한 대략 9, 최소한 대략 10, 최소한 대략 15, 최소한 대략 20, 최소한 대략 25, 최소한 대략 30, 최소한 대략 35, 최소한 대략 40, 최소한 대략 45, 최소한 대략 50, 최소한 대략 60, 최소한 대략 70, 최소한 대략 80, 최소한 대략 90, 또는 최소한 대략 100mg 인 약물의 용량으로 치료된다. 안티센스 올리고뉴클레오티드의 일정한 주사 용량은 예로써, U.S. 특허 제7,563,884호, "Antisense modulation of PTP1B expression"에서 설명되고, 이는 본 발명에 참조로서 편입된다.
본 발명의 다양한 구체예들이 상기에서 설명되긴 했지만, 이들은 단지 예시로써 제공되고 제한으로서 간주되지 않는 것으로 이해되어야 한다. 본 발명의 범위 또는 사상을 벗어나지 않으면서, 본 발명의 개시에 따라서 이들 설명된 구체예에 대해 다양한 변화가 만들어질 수 있다. 따라서 본 발명의 범위는 상기 설명된 임의의 구체예에 의해 한정되지 않는다.
본 명세서에서 언급된 모든 문헌은 본 발명에 참조로서 편입된다. 본 출원에서 인용된 모든 간행물 및 특허 문헌은 각 간행물 또는 특허 문헌이 개별적으로 그렇게 언급된 것처럼, 순전히 참조로서 편입된다. 본 문서에서 다양한 참고문헌의 인용에 의해, 임의의 특정한 참고문헌이 본 발명에 대한 "선행 기술"로 인정되지는 않는다. 본 발명의 조성물 및 방법의 구체예는 하기 실시예에서 예시된다.
도 1은 대조와 비교하여, Lipofectamine 2000을 이용하여 도입된 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드로 HepG2 세포의 처리후 48시간 후 SCN1A mRNA에서 배수적 변화 + 표준 편차를 보여준다. 실시간 PCR 결과는 HepG2 세포에서 SCN1A mRNA의 수준이 SCN1A 안티센스 BG724147에 대해 설계된 안티센스 올리고뉴클레오티드중 하나로 처리후 48시간 시점에 유의미하게 증가한다는 것을 증명한다. CUR-1624 내지 CUR-1627로 표시된 막대는 각각, 서열 번호: 30 내지 33으로 처리된 샘플에 상응한다.
도 2는 대조와 비교하여, Lipofectamine 2000을 이용하여 도입된 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드로 HepG2 세포의 처리후 48시간 후 SCN1A mRNA에서 배수적 변화 + 표준 편차를 보여준다. CUR-1628 내지 CUR-1631로 표시된 막대는 각각, 서열 번호: 34 내지 37로 처리된 샘플에 상응한다.
도 3은 대조와 비교하여, Lipofectamine 2000을 이용하여 도입된 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드로 HepG2 세포의 처리후 48시간 후 SCN1A mRNA에서 배수적 변화 + 표준 편차를 보여준다. CUR-1632 내지 CUR-1636으로 표시된 막대는 각각, 서열 번호: 38 내지 42로 처리된 샘플에 상응한다.
도 4는 Dravet 증후군-연관된 돌연변이를 나르는 주요 인간 피부 섬유아세포들에서 약량-의존적 방식으로 SCN1A mRNA의 상향 조절을 보여준다. CUR-1916, CUR-1740, CUR-1764 및 CUR-1770은 각각, 서열 번호: 70, 45, 52 및 57로 처리된 샘플에 상응한다.
도 5는 SK-N-AS 세포들에서 약량-의존적 방식으로 SCN1A mRNA의 상향 조절을 보여준다. CUR-1916, CUR-1740, CUR-1764 및 CUR-1770은 각각, 서열 번호: 70, 45, 52 및 57로 처리된 샘플에 상응한다.
도 6은 Vero76 세포들에서 약량-의존적 방식으로 SCN1A mRNA의 상향 조절을 보여준다. CUR-1916, CUR-1740, CUR-1764 및 CUR-1770은 각각, 서열 번호: 70, 45, 52 및 57로 처리된 샘플에 상응한다.
도 7은 안티센스 올리고뉴클레오티드의 비-특이적 독성에 의해 SCNIA mRNA의 상향 조절이 야기되지 않음을 보여준다. A CUR-1916에 의한 상향 조절; B - CUR-1770에 의한 상향 조절. CUR-1462는 유사한 화학성질의 비활성 대조 올리고뉴클레오티드이다.
도 8은 Dravet-연관된 돌연변이를 나르는 인간 섬유아세포들에서 SCN8A 및 SCN9A 통로의 발현은 SCN1A 천연 안티센스 전사체에 대하여 표적화된 안티센스 올리고뉴클레오티드들에 의한 처리에 심각하게 영향을 받지 않음을 보여준다. A - CUR-1770으로 처리; B - CUR-1916으로 처리.
도 9는 SCN1A-특이적 천연 안티센스 전사체를 표적으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오티드의 안전성을 보여준다. Vero 76 세포들은 실시예 2에서 설명한 것과 같이, 2010년 8월과 2011년 3월에 합성한 CUR-1916의 두 가지 상이한 배취로 처리하였다. 2010년 8월에 합성한 올리고뉴클레오티드는 4℃에서 1 mM 수성 용액으로 보관하였다. 2011년 3월에 합성한 올리고뉴클레오티드는 동결건조된 형태로 운반하였고, 도착시 바로 테스트하였다.
도 10은 SCN1A 천연 안티센스에 상보적인 안티센스 올리고뉴클레오티드로 처리된 Dravet 증후군 돌연변이를 나르는 섬유아세포들에서 SCN1A 단백질의 상향 조절을 보여준다. 섬유아세포들은 24 웰 플레이트에서 성장시키고, SCN1A 천연 안티센스에 상보적인 안티센스 올리고뉴클레오티드 20nM (패널 c: CUR-1740; d: CUR-1770; e: CUR-1916)와 0 nM (b)에서 처리하였다. 항-SCN1A 항체(Abeam cat# ab24820)를 이용한 간접 면역조직화학과 아비딘/바이오틴 방법(Vector Laboratories cat# SP-2001; Vector Laboratories cat# PK-6101; Vector Laboratories cat# S -4105)으로 2차 항체 착색/증폭으로 SCN1A에 대해 세포들을 착색하였다(b-c); 패널 a - 네가티브 대조, 토끼 항-마우스 항체는 패널 b-e와 동일한 착색 과정에 의해 1차 항체로 이용하였다.
도 11은 SCN1A 천연 안티센스에 상보적인 안티센스 올리고뉴클레오티드로 처리된 SK-N-AS 세포들에서 SCN1A 단백질의 상향 조절을 보여준다. SK-N-AS 세포들은 24 웰 플레이트에서 성장시키고, SCN1A 천연 안티센스에 상보적인 안티센스 올리고뉴클레오티드 20nM (c: CUR-1740; d: CUR-1764; e: CUR-1770; f: CUR-1916)와 (b: 0 nM)에서 처리하였다. 항-SCN1A 항체(Abeam cat# ab24820)를 이용한 간접 면역조직화학과 아비딘/바이오틴 방법(Vector Laboratories cat# SP-2001; Vector Laboratories cat# PK-6101; Vector Laboratories cat# S -4105)으로 2차 항체 착색/증폭으로 SCN1A에 대해 SK-N-AS 세포들을 착색하였고(b-f); 네가티브 대조, 토끼 항-마우스 항체는 패널 b-f와 동일한 착색 과정에 의해 1차 항체로 이용하였다(패널 a).
도 12는 SCN1A 천연 안티센스에 상보적인 안티센스 올리고뉴클레오티드로 처리된 Vero 76 세포들에서 SCN1A 단백질의 상향 조절을 보여준다. Vero 76 세포들은 24 웰 플레이트에서 성장시키고, SCN1A 천연 안티센스에 상보적인 안티센스 올리고뉴클레오티드 20nM (c: CUR-1740; d: CUR-1945; e: CUR-1770; f: CUR-1916; g: CUR-1924)와 0 nM (b)에서 처리하였다. 항-SCN1A 항체(Abeam cat# ab24820)를 이용한 간접 면역조직화학과 아비딘/바이오틴 방법(Vector Laboratories cat# SP-2001; Vector Laboratories cat# PK-6101; Vector Laboratories cat# S -4105)으로 2차 항체 착색/증폭으로 SCN1A에 대해 Vero 76 세포들을 착색하였고(b-f); 패널 a - 네가티브 대조, 토끼 항-마우스 항체는 패널 b-g와 동일한 착색 과정에 의해 1차 항체로 이용하였다.
도 13은 SCN1A mRNA를 상향조절하는 SCN1A-특이적인 천연 안티센스 전사체를 표적으로 하는 올리고뉴클레오티드가 Vero76 세포들에서 악틴을 상향조절하지 않는다는 것을 보여준다. SCN1A mRNA 및 단백질을 상향조절하기 위하여 실시예 5와 12에서 보여준 SCN1A-특이적 천연 안티센스 전사체를 표적으로 하는 동일한 안티센스 올리고뉴클레오티드 (CUR-1740, CUR-1838, CUR-1924)는 Vero 76 세포들에서 베타-악틴 mRNA 발현에 대한 효과를 테스트하였다. 데이터에서 SCN1A-특이적 천연 안티센스 전사체를 표적으로 하는 올리고뉴클레오티드는 악틴과 같인 비-관련 유전자를 상향조절하지 않음을 확인한다. CUR-1740, CUR-1838 및 CUR-1924로 표시된 막대들은 각각 서열 번호: 45, 62 및 78로 처리한 시료에 대응한다.
도 14는 SCN1A mRNA를 상향조절하는 것으로 보여진 SCN1A-특이적 천연 안티센스전사체를 표적으로 하는 올리고뉴클레오티드는 Dravet-연관된 돌연변이를 나르는 섬유아세포들에서 악틴을 상향조절하지 않음을 보여준다. SCN1A mRNA 및 단백질을 상향조절하기 위하여 실시예 2와 7에 보여준 SCN1A-특이적 천연 안티센스 전사체를 표적으로 하는 올리고뉴클레오티드는 Dravet-연관된 돌연변이를 나르는 섬유아세포들에서 악틴 mRNA 발현에 대한 효과를 테스트하였다. 하기 데이터에서 SCN1A-특이적 천연 안티센스 전사체를 표적으로 하는 올리고뉴클레오티드는 악틴과 같인 비-관련 유전자를 상향조절하지 않음을 확인한다. CUR-1916 및 CUR-1945로 표시된 막대들은 각각 서열 번호: 70 및 93로 처리한 시료에 대응한다.
도 15는 SCN1A mRNA를 상향조절하는 것으로 보여진 SCN1A-특이적 천연 안티센스전사체를 표적으로 하는 올리고뉴클레오티드는 SK-N-AS 세포들에서 악틴을 상향조절하지 않음을 보여준다. SCN1A mRNA 및 단백질을 상향조절하기 위하여 실시예들에서 보여준 동일한 안티센스 올리고뉴클레오티드(CUR-1740, CUR-1770, CUR-1916, CUR-1764, CUR-1838)는 SK-N-AS 세포들에서 악틴 mRNA 발현에 대한 효과를 테스트하였다. 데이터에서 SCN1A-특이적 천연 안티센스 전사체를 표적으로 하는 올리고뉴클레오티드는 악틴과 같인 비-관련 유전자를 상향조절하지 않음을 확인한다. CUR-1740, CUR-1770, CUR-1916, CUR-1764, CUR-1838로 표시된 막대들은 각각 서열 번호: 45, 57, 70, 52 및 62로 처리한 시료에 대응한다.
도 16은 SCN1A 천연 안티센스에 상보적인 안티센스 올리고뉴클레오티드로 처리된 SK-N-AS 세포들에서 악틴 단백질의 착색을 보여준다. SK-N-AS 세포들은 24 웰 플레이트에서 성장시키고, SCN1A 천연 안티센스에 상보적인 안티센스 올리고뉴클레오티드 20nM (b: CUR-1740; c: CUR-1764; d: CUR-1770; e: CUR-1916)와 0 nM(a)에서 처리하였다. 항-악틴 항체(Abeam cat# ab1801)를 이용한 간접 면역조직화학과 아비딘/바이오틴 방법(Vector Laboratories cat# SP-2001; Vector Laboratories cat# PK-6101; Vector Laboratories cat# S-4105)으로 2차 항체 착색/증폭으로 SCN1A에 대해 SK-N-AS 세포들을 착색하였다고(a-e).
도 17은 SCN1A 천연 안티센스에 상보적인 안티센스 올리고뉴클레오티드로 처리된 Vero 76 세포들에서 악틴 단백질의 착색을 보여준다. Vero 76 세포들은 24 웰 플레이트에서 성장시키고, SCN1A 천연 안티센스에 상보적인 안티센스 올리고뉴클레오티드 20nM (b: CUR-1740; c: CUR-1770; d: CUR-1916; e: CUR-1924; f: CUR-1945)와 0 nM(a)에서 처리하였다. 항-악틴 항체(Abeam cat# ab1801)를 이용한 간접 면역조직화학과 아비딘/바이오틴 방법(Vector Laboratories cat# SP-2001; Vector Laboratories cat# PK-6101; Vector Laboratories cat# S-4105)으로 2차 항체 착색/증폭으로 SCN1A에 대해 Vero 76 세포들을 착색하였고(b-f); 패널 a - 네가티브 대조, 토끼 항-마우스 항체는 패널 b-g와 동일한 착색 과정에 의해 1차 항체로 이용하였다.
도 18은 SCN1A 천연 안티센스에 상보적인 안티센스 올리고뉴클레오티드로 처리된 Dravet 증후군 돌연변이를 나르는 섬유아세포들에서 악틴 단백질의 상향조절을 보여준다. 섬유아세포들은 24 웰 플레이트에서 성장시키고, SCN1A 천연 안티센스에 상보적인 안티센스 올리고뉴클레오티드 20nM (패널 b: CUR-1740; c: CUR-1764; d: CUR-1770; e: CUR-1838 및 f: CUR-1916))와 0 nM(a)에서 처리하였다. 항-악틴 항체(Abeam cat# ab1801)를 이용한 간접 면역조직화학과 아비딘/바이오틴 방법(Vector Laboratories cat# SP-2001; Vector Laboratories cat# PK-6101; Vector Laboratories cat# S-4105)으로 2차 항체 착색/증폭으로 SCN1A에 대해 Vero 76 세포들을 착색하였다(a-f).
도 19는 ELISA를 이용하여 정량화된 SCN1A 천연 안티센스에 상보적인 안티센스 올리고뉴클레오티드로 처리된 Dravet 증후군 돌연변이를 나르는 섬유아세포들에서 SCN1A 단백질의 상향조절을 보여준다. 섬유아세포들은 0 또는 80nM에서 SCN1A 천연 안티센스에 상호적인 올리고뉴클레오티드로 처리하였다. 48 시간 후, 세포들은 24시간 동안 96 웰 플레이트로 옮겼고, 고정시키고, SCN1A 및 악틴 ELISA에 이용하였다. SCN1A 신호에 대한 OD 판독은 동일한 실험 조건에서 악틴 신호에 대해 표준화시켰다. 0 nM의 올리고뉴클레오티드를 투약한 세포들에서 표준화된 SCN1A 신호를 기선(100%)으로 삼았다. CUR-1740, CUR-1770 및 CUR-1916 으로 표시된 막대는 각각 서열 번호: 45, 57 및 70로 처리된 시료에 상응한다.
도 20은 ELISA를 이용하여 정량화된 SCN1A 천연 안티센스에 상보적인 안티센스 올리고뉴클레오티드로 처리된 Vero 76 세포들에서 SCN1A 단백질의 상향조절을 보여준다. Vero76 세포들은 0 또는 80nM에서 SCN1A 천연 안티센스에 상호적인 올리고뉴클레오티드로 처리하였다. 48 시간 후, 세포들은 24시간 동안 96 웰 플레이트로 옮겼고, 고정시키고, SCN1A 및 악틴 ELISA에 이용하였다. SCN1A 신호에 대한 OD 판독은 동일한 실험 조건에서 악틴 신호에 대해 표준화시켰다. 0 nM의 올리고뉴클레오티드를 투약한 세포들에서 표준화된 SCN1A 신호를 기선(100%)으로 삼았다. CUR-1740, CUR-1770, CUR-1916, CUR-1924, CUR-1945로 표시된 막대는 각각 서열 번호: 45, 57, 70, 78 및 93로 처리된 시료에 상응한다.
도 21은 ELISA를 이용하여 정량화된 SCN1A 천연 안티센스에 상보적인 안티센스 올리고뉴클레오티드로 처리된 SK-N-AS 세포들에서 SCN1A 단백질의 상향조절을 보여준다. SK-N-AS 세포들은 0 또는 20nM에서 SCN1A 천연 안티센스에 상호적인 올리고뉴클레오티드로 처리하였다. 48 시간 후, 세포들은 24시간 동안 96 웰 플레이트로 옮겼고, 고정시키고, SCN1A 및 악틴 ELISA에 이용하였다. SCN1A 신호에 대한 OD 판독은 동일한 실험 조건에서 악틴 신호에 대해 표준화시켰다. 0 nM의 올리고뉴클레오티드를 투약한 세포들에서 표준화된 SCN1A 신호를 기선(100%)으로 삼았다. CUR-1740, CUR-1770, CUR-1924, CUR-1945로 표시된 막대는 각각 서열 번호: 45, 57, 70, 78 및 93로 처리된 시료에 상응한다.
도 22는 SCN1A 천연 안티센스 전사체 BG724147의 3' RACE의 제 2 PCR 라운드로부터의 산물들을 보여준다. 3' RACE는 다음에서 실시하였다: a) 아데노신이 추가된 HepG2 세포들로부터 총 RNA; b - HepG2 세포들로부터 단리한 폴리 A RNA; c - 아데노신이 추가된 Dravet 증후군-연관된 돌연변이를 나르는 주요 인간 섬유아세포로부터 총 RNA; d - Dravet 증후군-연관된 돌연변이를 나르는 주요 인간 섬유아세포로부터 단리된 폴리 A RNA. 도면은 GelRed (GenScript, cat#M00120)로 착색된 1% 아가로즈겔/1xTAE의 네가티브를 나타낸다. 화살표는 HepG2 세포와 Dravet 증후군-연관된 돌연변이를 나르는 주요 인간 섬유아세포들에 공통인 밴드를 나타내며, 이는 이들 세포에서 BG724147 천연 안티센스 전사체의 존재를 설명한다.
서열 목록 설명
서열 번호: 1 : 호모 사피엔스 전압 작동 나트륨 통로, 유형 I, 알파 소단위(SCN1A), 전사체 변이체 1, mRNA (NCBI Accession No.: NM_001165963); 서열 번호: 2: 호모 사피엔스 전압 작동 나트륨 통로, 유형 II, 알파 소단위 (SCN2A), 전사체 변이체 1, mRNA (NCBI Accession No.: NM 021007); 서열 번호: 3: 호모 사피엔스 전압 작동 나트륨 통로, 유형 III, 알파 소단위 (SCN3A), 전사체 변이체 1, mRNA (NCBI Accession No.: NM_006922); 서열 번호: 4: 호모 사피엔스 전압 작동 나트륨 통로, 유형 IV, 알파 소단위 (SCN4A), mRNA (NCBI Accession No.: NM_000334); 서열 번호: 5: 호모 사피엔스 전압 작동 나트륨 통로, 유형 V, 알파 소단위 (SCN5A), 전사체 변이체 1, mRNA (NCBI Accession No.: NM_198056); 서열 번호: 6: 호모 사피엔스 전압 작동 나트륨 통로, 유형 VII, 알파 (SCN7A), mRNA (NCBI Accession No.: NM_002976); 서열 번호: 7: 호모 사피엔스 전압 작동 나트륨 통로, 유형 VIII, 알파 소단위 (SCN8A), 전사체 변이체 1, mRNA (NCBI Accession No.: NM_014191); 서열 번호: 8: 호모 사피엔스 전압 작동 나트륨 통로, 유형 IX, 알파 소단위 (SCN9A), mRNA (NCBI Accession No.: NM 002977); 서열 번호: 9: 호모 사피엔스 전압 작동 나트륨 통로, 유형 X, 알파 소단위 (SCN10A), mRNA (NCBI Accession No.: NM 006514); 서열 번호: 10: 호모 사피엔스 전압 작동 나트륨 통로, 유형 XI, 알파 소단위 (SCN11A), mRNA (NCBI Accession No.: NM 014139); 서열 번호: 11: 호모 사피엔스 전압 작동 나트륨 통로 알파 소단위 SCN12A (SCN12A) mRNA, 완전한 cds (NCBI Accession No.: AF109737); 서열 번호: 12: 천연 SCN1A 안티센스 서열 (BG724147 연장된); 서열 번호: 13: 천연 SCN1A 안티센스 서열 (Hs.662210); 서열 번호: 14: 천연 SCN1A 안티센스 서열 (AA383040); 서열 번호: 15: 천연 SCN1A 안티센스 서열 (BC029452); 서열 번호: 16: 천연 SCN1A 안티센스 서열 (AA630035); 서열 번호: 17: 천연 SCN1A 안티센스 서열 (BE566126); 서열 번호: 18: 천연 SCN1A 안티센스 서열 (BF673100); 서열 번호: 19: 천연 SCN1A 안티센스 서열 (BG181807); 서열 번호: 20: 천연 SCN1A 안티센스 서열 (BG183871); 서열 번호: 21: 천연 SCN1A 안티센스 서열 (BG215777); 서열 번호: 22: 천연 SCN1A 안티센스 서열 (BG227970); 서열 번호: 23: 천연 SCN1A 안티센스 서열 (BM905527); 서열 번호: 24: 천연 SCN1A 안티센스 서열 (BU180772); 서열 번호: 25: 마우스 천연 SCN1A 안티센스 서열 (BG724147 ExtMouse); 서열 번호: 26: 마우스 천연 SCN1A 안티센스 서열 (Hs.662210mouseAS1); 서열 번호: 27: 마우스 천연 SCN1A 안티센스 서열 (Hs.662210mouseAS2); 서열 번호: 28: 마우스 천연 SCN1A 안티센스 서열 (Hs.662210mouseAS3); 서열 번호: 29 내지 94: 안티센스 올리고뉴클레오티드. 서열 번호: 95 및 96는 각각 안티센스 올리고뉴클레오티드 서열 번호: 58 및 59의 역보체들이다. *는 포스포티오에이트 결합을 지시하고, +는 LNA를 나타내며, 'r'은 RNA를 나타내며 그리고 'm'은 올리고뉴클레오티드의 지정된 당 모이어티상의 2' 산소 원자에 있는 메틸 기를 나타낸다.
실시예
아래의 무제한적 실시예는 본 발명의 선택된 구체예를 예시하기 위한 것이다. 제시된 성분의 비율에서 변화 및 대안적 성분은 당업자에 자명하고 본 발명의 구체예의 범위 내에 있다.
실시예 1: 전압 작동 나트륨 통로, 알파 소단위( SCNA )에 대한 핵산 분자 안티센스 및/또는 SCNA 폴리뉴클레오티드의 센스 가닥에 특이적인 안티센스 올리고뉴클레오티드의 설계
앞서 지시된 바와 같이, 용어 "특이적인 올리고뉴클레오티드" 또는 "표적으로 하는 올리고뉴클레오티드"는 (i) 표적화된 유전자의 일부와 안정된 복합체를 형성할 수 있거나, 또는 (ii) 표적화된 유전자의 mRNA 전사체의 일부와 안정된 이중나선을 형성할 수 있는 서열을 보유하는 올리고뉴클레오티드를 지칭한다.
적절한 올리고뉴클레오티드의 선별은 원하는 용융 온도 (melting temperature) (일반적으로, 50-60℃)을 갖는 표적 폴리뉴클레오티드 서열과 하이브리드를 형성하고 자가-이합체 (self-dimer) 또는 다른 복잡한 이차 구조를 형성하지 않는 19-25개 뉴클레오티드의 하위서열을 각 소정의 서열에서 자동적으로 확인하는 컴퓨터 프로그램 (가령, IDT AntisenseDesign, IDT OligoAnalyzer)을 이용함으로써 조장된다.
적절한 올리고뉴클레오티드의 선별은 핵산 서열을 자동적으로 정렬하고 동일성 또는 상동성의 영역을 표시하는 컴퓨터 프로그램을 이용함으로써 조장된다. 이들 프로그램은 예로써, GenBank와 같은 데이터베이스를 검색하거나, 또는 PCR 산물을 서열화함으로써, 획득된 핵산 서열을 비교하는데 이용된다. 주어진 게놈의 유전자들 범위 및 유전자간 구역(intergenic regions)으로부터 핵산 서열을 비교하면 관심 유전자에 적절한 정도의 특이성을 나타내는 핵산 서열의 선별이 허용된다. 이들 절차는 표적 핵산 서열에 높은 정도의 상보성 (complementarity), 그리고 주어진 게놈내 다른 핵산 서열들에 대해 더욱 낮은 정도의 상보성을 나타내는 올리고뉴클레오티드의 선별을 가능하게 한다. 당업자는 본 발명에서 이용을 위한 유전자의 적절한 영역을 선별하는데 상당한 허용 범위 (latitude)가 존재한다는 것을 인지할 것이다.
안티센스 화합물은 표적 핵산에 상기 화합물의 결합이 표적 핵산의 정상적인 기능을 간섭하여 기능 및/또는 활성의 조정을 유발하고, 그리고 특정한 결합이 요망되는 조건 하에, 다시 말하면, 생체내 분석 또는 치료적 처리의 경우에 생리학적 조건 하에, 그리고 시험관내 분석의 경우에 이들 분석이 수행되는 조건 하에 비-표적 핵산 서열에 안티센스 화합물의 비-특이적 결합을 회피할 수 있을 만큼 충분한 정도의 상보성이 존재할 때, "특이적으로 혼성화가능"하다.
본 명세서에서 기술된 올리고뉴클레오티드의 혼성화 성질은 당분야에 공지된 하나 이상의 시험관내 분석에 의해 결정될 수 있다. 가령, 본 명세서에서 기술된 올리고뉴클레오티드의 성질은 용융 곡선 분석 (melting curve assay)을 이용하여 표적 자연 안티센스와 잠재적인 약물 분자 사이에 결합 강도를 측정함으로써 획득될 수 있다.
표적 자연 안티센스와 잠재적인 약물 분자 (Molecule) 사이에 결합 강도는 용융 곡선 분석과 같은 분자간 상호작용의 강도를 측정하는 임의의 확립된 방법을 이용하여 예측될 수 있다.
용융 곡선 분석은 자연 안티센스/Molecule 복합체에서 이중 가닥으로부터 단일 가닥 형태로 신속한 전이가 일어나는 온도를 결정한다. 상기 온도는 이들 두 분자 사이에 상호작용 강도의 신뢰성 있는 척도로서 폭넓게 인정된다.
용융 곡선 분석은 실제 자연 안티센스 RNA 분자 또는 Molecule의 결합 부위에 상응하는 합성 DNA 또는 RNA 뉴클레오티드의 cDNA 사본을 이용하여 실행될 수 있다. 이러한 분석을 실행하기 위하여 모든 필수 시약을 포함하는 다중 키트가 가용하다 (가령, Applied Biosystems Inc . MeltDoctor kit). 이들 키트는 이중 가닥 DNA (dsDNA) 결합 염료 (가령, ABI HRM 염료, SYBR Green, SYTO 등) 중에서 하나를 포함하는 적절한 완충액을 포함한다. dsDNA 염료의 성질은 그들이 자유 형태에서는 형광을 거의 방출하지 않지만, dsDNA에 결합될 때 상당한 형광성이다.
상기 분석을 실행하기 위하여, cDNA 또는 대응하는 올리고뉴클레오티드는 특정 제조업체의 프로토콜에 의해 규정된 농도에서 Molecule와 혼합된다. 혼합물은 95℃로 가열되어 모든 미리-형성된 dsDNA 복합체가 해리되고, 이후 실온 또는 키트 제조업체에 의해 규정된 더욱 낮은 온도로 서서히 냉각되어 DNA 분자가 어닐링 (annealing)되도록 한다. 이후, 새로 형성된 복합체는 95℃로 천천히 가열되고, 반응에 의해 생성된 형광의 양에 대한 데이터가 동시에 연속적으로 수집된다. 형광 강도는 반응물 내에 존재하는 dsDNA의 양에 반비례한다. 데이터는 키트에 적합한 실시간 PCR 장비 (가령 ABI의 StepOne Plus 실시간 PCR 시스템 또는 lightTyper 기구, Roche Diagnostics, Lewes, UK)를 이용하여 수집될 수 있다.
용융 피크는 적합한 소프트웨어 (가령, lightTyper (Roche) 또는 SDS Dissociation Curve, ABI)를 이용하여 온도 (x-축)에 대하여 온도에 관련된 형광의 네거티브 도함수 (negative derivative) (y축에서 -d(형광)/dT)를 플롯팅 (plotting)함으로써 구축된다. 획득된 데이터는 dsDNA 복합체에서 단일 가닥 분자로의 신속한 전이 온도를 확인하기 위하여 분석된다. 상기 온도는 Tm으로 불리고, 그리고 두 분자간의 상호작용 강도에 직접적으로 비례한다. 전형적으로, Tm은 40℃를 초과할 것이다.
실시예 2: SCNA 폴리뉴클레오티드의 조정
안티센스 올리고뉴클레오티드로 HEPG2 세포의 처리 :
ATCC로부터 HepG2 세포 (cat# HB-8065)를 37℃ 및 5% CO2에서 성장 배지 (MEM/EBSS (Hyclone cat #SH30024, 또는 Mediatech cat # MT-10-010-CV) +10% FBS (Mediatech cat# MT35-011-CV)+ 페니실린/스트렙토마이신 (Mediatech cat# MT30-002-CI))에서 성장시켰다. 실험 하루전, 이들 세포를 1.5x105/㎖의 밀도로 6개 웰 평판에 재도말하고 37℃ 및 5% CO2에서 하룻밤동안 배양하였다. 실험 당일, 6개 웰 평판에 있는 배지를 새로운 성장 배지로 교체하였다. 모든 안티센스 올리고뉴클레오티드들은 20 μM의 농도로 희석하였다. 상기 용액 2 ㎕를 400 ㎕의 Opti-MEM 배지 (Gibco cat#31985-070) 및 4 ㎕의 Lipofectamine 2000 (Invitrogen cat# 11668019)과 함께 실온에서 20분간 배양하고, HepG2 세포가 있는 6개 웰 평판의 각 웰에 제공하였다. 올리고뉴클레오티드 용액 대신에 물 2㎕를 포함하는 유사한 혼합물은 모의-형질감염된 대조에 이용되었다. 37℃ 및 5% CO2에서 3-18시간 배양후, 배지를 새로운 성장 배지로 교체하였다. 안티센스 올리고뉴클레오티드의 첨가후 48시간 시점에, 배지를 제거하고, 그리고 SV Total RNA Isolation 시스템 (Promega (cat # Z3105)) 또는 RNeasy Total RNA Isolation 키트 (Qiagen (cat# 74181))를 이용하여 제조업체의 지시에 따라 세포로부터 RNA를 추출하였다. 600 ng의 RNA를 Verso cDNA 키트 (Thermo Scientific (cat#AB1453B)) 또는 High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (cat# 4368813)를 이용하여, 제조업체의 프로토콜에 따라 실행된 역전사 반응에 첨가하였다. 이와 같은 역전사 반응으로부터 cDNA를 이용하여 ABI Taqman Gene Expression Mix (cat#4369510) 및 ABI에 의해 설계된 프라이머/프로브 (Applied Biosystems Inc. (Foster City CA)에 의한 Applied Biosystems Taqman Gene Expression Assay: 인간 SCNA용 Hs00374696_m1, Hs00897350_ml, 또는 Hs_..897341)를 이용한 실시간 PCR에 의해 유전자 발현을 모니터링하였다. StepOne Plus Real Time PCR Machine (Applied Biosystems)을 이용하여, 아래의 PCR 주기가 이용되었다: 2분 동안 50℃, 10분 동안 95℃, 40회 사이클의 (15초 동안 95℃, 1분 동안 60℃).
처리된 샘플 및 모의-형질감염된 샘플 사이에 18S-표준화된 dCt 값에서 차이에 근거하여, 안티센스 올리고뉴클레오티드로 처리후 유전자 발현에서 배수적 변화가 계산되었다.
결과: 실시간 PCR 결과는 HepG2 세포에서 SCN1A mRNA의 수준은 SCN1A 안티센스 BG724147에 대한 안티센스 올리고뉴클레오티드로 처리후 48시간 시점에 유의미하게 증가한다는 것을 증명한다 (도 1, 4). SCN1A 안티센스 BG724147 및 Hs.662210에 대해 기획된 다른 올리고뉴클레오티드들은 SCN1A 수준을 상승시키지 않았다(도 2, 3).
실시예 3: SCNA -특이적 천연 안티센스 전사체를 표적으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오티드들로 처리함으로써 상이한 세포계들에서 SCNA mRNA 의 상향조절
실시예 3에서 SCN1A-특이적인 천연 안티센스 전사체를 표적으로 하는 상이한 화학성질의 안티센스 올리고뉴클레오티드는 최종 농도 20 nM에서 다양한 세포계 패널상에서 스크리닝하였다. 이용된 세포계들은 상이한 기관들과 상이한 동물 종으로부터 유래된다. SCN1A-특이적 천연 안티센스 전사체의 기능 조절을 통한 SCN1A mRNA/단백질의 상향조절은 단일 올리고뉴클레오티드, 조직 또는 종들에 한정되지 않으며, 따라서 총체적인 현상을 나타낸다는 것을 하기 데이터들로부터 확인한다.
재료 및 방법들
Dravet 증후군-연관된 돌연변이를 나르는 주요 인간 섬유아세포들 . Dr. N.Kenyon (University of Miami)에 의해 배양물 안으로 도입된 Dravet 증후군-연관된 돌연변이 E1099X를 나르는 주요 인간 피부 섬유아세포들은 37℃ 및 5% CO2에서 a-MEM(Gibco, cat:12561-056)+10% FBS (Mediatech cat: 35-015-CV)+ 1% 항진균성 항생제(Gibco, cat: 15240-062)로 구성된 성장 배지(Growth Media)에서 성장시켰다. 세포들은 다음의 방법들중 하나를 이용하여 안티센스 올리고뉴클레오티드로 처리하였다. 다음날 방법(Next Day Method)의 경우, 실험 하루 전, 이들 세포를 대략 2.5x105/㎖의 밀도로 성장 배지에서 6개 웰 평판에 재도말하고, 37℃ 및 5% CO2에서 하룻밤동안 항온처리하였다. 다음 날, 6개 웰 평판에 있는 배지를 새로운 성장 배지로 교체하였고(웰당 1.5ml), 그리고 세포들에게 안티센스 올리고뉴클레오티드들을 투약하였다. 모든 안티센스 올리고뉴클레오티드들은 IDT Inc. (Coralville, IA) 또는 Exiqon (Vedbaek, Denmark)에 의해 제조되었다. 모든 올리고뉴클레오티드들에 대한 서열은 표 1에 도시한다. 올리고뉴클레오티드들의 저장(Stock) 용액을 DNAse/RNAse-없는 살균수에서 20 μM의 농도로 희석시켰다. 한 개 웰에 투약하기 위하여, 상기 용액 2 ㎕를 400 ㎕의 Opti-MEM 배지 (Gibco cat#31985-070) 및 4 ㎕의 Lipofectamine 2000 (Invitrogen cat# 11668019)과 함께 실온에서 20분간 배양하고, 세포들이 있는 6개 웰 평판의 한 개 웰에 점적(dropwise)으로 제공하였다. 올리고뉴클레오티드 용액 대신에 물 2㎕를 포함하는 유사한 혼합물은 모의-형질감염된 대조에 이용되었다. 추가적으로, 동일한 농도의 비활성 올리고뉴클레오티드 CUR-1462는 대조로 이용하였다. 37℃ 및 5% CO2에서 대략 18시간 항온처리후, 배지를 새로운 성장 배지로 교체하였다. 안티센스 올리고뉴클레오티드의 첨가후 48시간 시점에, 배지를 제거하고, 그리고 SV Total RNA Isolation System (Promega (cat # Z3105))을 이용하여 제조업체의 지시에 따라 세포로부터 RNA를 추출하였다. 600 ng의 정제된 총 RNA를 Superscript VILO cDNA Synthesis Kit(Invitrogen (cat#11754-250))를 이용하여, 제조업체의 프로토콜에 따라 실행된 역전사 반응에 첨가하였다. 이와 같은 역전사 반응으로부터 cDNA를 이용하여 ABI Taqman Gene Expression Mix (cat#4369510) 및 ABI에 의해 설계된 프라이머/프로브 (인간 SCN1A의 경우, 분석 Hs00374696_ml, Hs00897350_ml 또는 Hs00897341_ml)를 이용한 실시간 PCR에 의해 유전자 발현을 모니터링하였다. 세 가지 분석 모두를 이용하여 수득한 결과들은 매우 유사하였다. StepOne Plus Real Time PCR 시스템(Applied Biosystems)을 이용하여, 아래의 PCR 주기가 이용되었다: 2분 동안 50℃, 10분 동안 95℃, 40회 사이클의 (15초 동안 95℃, 1분 동안 60℃). 18S 분석은 ABI(cat# 4319413E)에 의해 제조되었다. 처리된 샘플 및 모의-형질감염된 샘플 사이에 18S-표준화된 dCt 값에서 차이에 근거하여, 안티센스 올리고뉴클레오티드로 처리후 유전자 발현에서 배수적 변화가 계산되었다. 대안인 동일자 방법(alternative Same Day Method)의 경우, 모든 과정들이 유사하게 실시되었지만, 세포들을 6개-웰 플레이트상에 분포시킨 후 곧, 첫 날에 안티센스 올리고뉴클레오티드를 투약하였다.
SK -N- AS 세포계 . ATCC로부터 SK-N-AS 인간 신경아종 세포 (cat# CRL-2137)를 37℃ 및 5% CO2에서 성장 배지 DMEM (Mediatech cat# 10-013-CV) +10% FBS (Mediatech cat# MT35-011-CV)+ 페니실린/스트렙토마이신 (Mediatech cat# MT30-002-CI))+비-필수 아미노산 (NEAA)(HyClone SH30238.01)에서 성장시켰다. 세포들은 다음의 방법들중 하나를 이용하여 안티센스 올리고뉴클레오티드로 처리하였다. 다음날 방법(Next Day Method)의 경우, 실험 하루 전, 이들 세포를 대략 3x105/㎖의 밀도로 성장 배지에서 6개 웰 평판에 재도말하고, 37℃ 및 5% CO2에서 하룻밤동안 항온처리하였다. 다음 날, 6개 웰 평판에 있는 배지를 새로운 성장 배지로 교체하였고(웰당 1.5ml), 그리고 세포들에게 안티센스 올리고뉴클레오티드들을 투약하였다. 모든 안티센스 올리고뉴클레오티드들은 IDT Inc. (Coralville, IA) 또는 Exiqon (Vedbaek, Denmark)에 의해 제조되었다. 모든 올리고뉴클레오티드들에 대한 서열은 표 1에 도시한다. 올리고뉴클레오티드들의 저장(Stock) 용액을 DNAse/RNAse-없는 살균수에서 20 μM의 농도로 희석시켰다. 한 개 웰에 투약하기 위하여, 상기 용액 2 ㎕를 400 ㎕의 Opti-MEM 배지 (Gibco cat#31985-070) 및 4 ㎕의 Lipofectamine 2000 (Invitrogen cat# 11668019)과 함께 실온에서 20분간 배양하고, 세포들이 있는 6개 웰 평판의 한 개 웰에 점적으로 제공하였다. 올리고뉴클레오티드 용액 대신에 물 2㎕를 포함하는 유사한 혼합물은 모의-형질감염된 대조에 이용되었다. 추가적으로, 동일한 농도의 비활성 올리고뉴클레오티드 CUR-1462는 대조로 이용하였다. 37℃ 및 5% CO2에서 대략 18시간 항온처리후, 배지를 새로운 성장 배지로 교체하였다. 안티센스 올리고뉴클레오티드의 첨가후 48시간 시점에, 배지를 제거하고, 그리고 SV Total RNA Isolation System (Promega (cat # Z3105))를 이용하여 제조업체의 지시에 따라 세포로부터 RNA를 추출하였다. 600 ng의 정제된 총 RNA를 Superscript VILO cDNA Synthesis Kit(Invitrogen (cat#11754-250))를 이용하여, 제조업체의 프로토콜에 따라 실행된 역전사 반응에 첨가하였다. 이와 같은 역전사 반응으로부터 cDNA를 이용하여 ABI Taqman Gene Expression Mix (cat#4369510) 및 ABI에 의해 설계된 프라이머/프로브 (인간 SCN1A의 경우, 분석 Hs00374696_ml, Hs00897350_ml 또는 Hs00897341_ml)를 이용한 실시간 PCR에 의해 유전자 발현을 모니터링하였다. 세 가지 분석 모두를 이용하여 수득한 결과들은 매우 유사하였다. StepOne Plus Real Time PCR 시스템(Applied Biosystems)을 이용하여, 아래의 PCR 주기가 이용되었다: 2분 동안 50℃, 10분 동안 95℃, 40회 사이클의 (15초 동안 95℃, 1분 동안 60℃). 18S 분석은 ABI(cat# 4319413E)에 의해 제조되었다. 처리된 샘플 및 모의-형질감염된 샘플 사이에 18S-표준화된 dCt 값에서 차이에 근거하여, 안티센스 올리고뉴클레오티드로 처리후 유전자 발현에서 배수적 변화가 계산되었다. 대안인 동일자 방법(alternative Same Day Method)의 경우, 모든 과정들이 유사하게 실시되었지만, 세포들을 6개-웰 플레이트상에 분포시킨 후 곧, 첫 날에 안티센스 올리고뉴클레오티드를 투약하였다.
CHP -212 세포계 . ATCC로부터 CHP-212 인간 신경아종 세포 (cat# CRL-2273)를 37℃ 및 5% CO2에서 성장 배지 (1: MEM 및 F12의 혼합물 (차례로 ATCC cat #30-2003 및 Mediatech cat# 10-080-CV) +10% FBS (Mediatech cat# MT35-011-CV)+ 페니실린/스트렙토마이신(Mediatech cat# MT30-002-CI))에서 성장시켰다. 세포들은 다음의 방법들중 하나를 이용하여 안티센스 올리고뉴클레오티드로 처리하였다. 다음날 방법(Next Day Method)의 경우, 실험 하루 전, 이들 세포를 대략 2x105/㎖의 밀도로 성장 배지에서 6개 웰 평판에 재도말하고, 37℃ 및 5% CO2에서 하룻밤동안 항온처리하였다. 다음 날, 6개 웰 평판에 있는 배지를 새로운 성장 배지로 교체하였고(웰당 1.5ml), 그리고 세포들에게 안티센스 올리고뉴클레오티드들을 투약하였다. 모든 안티센스 올리고뉴클레오티드들은 IDT Inc. (Coralville, IA) 또는 Exiqon (Vedbaek, Denmark)에 의해 제조되었다. 모든 올리고뉴클레오티드들에 대한 서열은 표 1에 도시한다. 올리고뉴클레오티드들의 저장(Stock) 용액을 DNAse/RNAse-없는 살균수에서 20 μM의 농도로 희석시켰다. 한 개 웰에 투약하기 위하여, 상기 용액 2 ㎕를 400 ㎕의 Opti-MEM 배지 (Gibco cat#31985-070) 및 4 ㎕의 Lipofectamine 2000 (Invitrogen cat# 11668019)과 함께 실온에서 20분간 배양하고, 세포들이 있는 6개 웰 평판의 한 개 웰에 점적으로 제공하였다. 올리고뉴클레오티드 용액 대신에 물 2㎕를 포함하는 유사한 혼합물은 모의-형질감염된 대조에 이용되었다. 추가적으로, 동일한 농도의 비활성 올리고뉴클레오티드 CUR-1462는 대조로 이용하였다. 37℃ 및 5% CO2에서 대략 18시간 항온처리후, 배지를 새로운 성장 배지로 교체하였다. 안티센스 올리고뉴클레오티드의 첨가후 48시간 시점에, 배지를 제거하고, 그리고 SV Total RNA Isolation System (Promega (cat # Z3105))를 이용하여 제조업체의 지시에 따라 세포로부터 RNA를 추출하였다. 600 ng의 정제된 총 RNA를 Superscript VILO cDNA Synthesis Kit(Invitrogen (cat#11754-250))를 이용하여, 제조업체의 프로토콜에 따라 실행된 역전사 반응에 첨가하였다. 이와 같은 역전사 반응으로부터 cDNA를 이용하여 ABI Taqman Gene Expression Mix (cat#4369510) 및 ABI에 의해 설계된 프라이머/프로브 (인간 SCN1A의 경우, 분석 Hs00374696_ml, Hs00897350_ml 또는 Hs00897341_ml)를 이용한 실시간 PCR에 의해 유전자 발현을 모니터링하였다. 세 가지 분석 모두를 이용하여 수득한 결과들은 매우 유사하였다. StepOne Plus Real Time PCR 시스템(Applied Biosystems)을 이용하여, 아래의 PCR 주기가 이용되었다: 2분 동안 50℃, 10분 동안 95℃, 40회 사이클의 (15초 동안 95℃, 1분 동안 60℃). 18S 분석은 ABI(cat# 4319413E)에 의해 제조되었다. 처리된 샘플 및 모의-형질감염된 샘플 사이에 18S-표준화된 dCt 값에서 차이에 근거하여, 안티센스 올리고뉴클레오티드로 처리후 유전자 발현에서 배수적 변화가 계산되었다. 대안인 동일자 방법(alternative Same Day Method)의 경우, 모든 과정들이 유사하게 실시되었지만, 세포들을 6개-웰 플레이트상에 분포시킨 후 곧, 첫 날에 안티센스 올리고뉴클레오티드를 투약하였다.
Vero76 세포계 . ATCC로부터 Vero76 아프리카 녹색 원숭이 배 신장 세포(cat# CRL-1587)를 37℃ 및 5% CO2에서 성장 배지 (Dulbecco's Modified Eagle's Medium (Cellgrow 10-013-CV)+ 5% FBS (Mediatech cat# MT35-011-CV)+ 페니실린/스트렙토마이신(Mediatech cat# MT30-002-CI))에서 성장시켰다. 세포들은 다음의 방법들중 하나를 이용하여 안티센스 올리고뉴클레오티드로 처리하였다. 다음날 방법(Next Day Method)의 경우, 실험 하루 전, 이들 세포를 대략 105/㎖의 밀도로 성장 배지에서 6개 웰 평판에 재도말하고, 37℃ 및 5% CO2에서 하룻밤동안 항온처리하였다. 다음 날, 6개 웰 평판에 있는 배지를 새로운 성장 배지로 교체하였고(웰당 1.5ml), 그리고 세포들에게 안티센스 올리고뉴클레오티드들을 투약하였다. 모든 안티센스 올리고뉴클레오티드들은 IDT Inc. (Coralville, IA) 또는 Exiqon (Vedbaek, Denmark)에 의해 제조되었다. 모든 올리고뉴클레오티드들에 대한 서열은 표 1에 도시한다. 올리고뉴클레오티드들의 저장(Stock) 용액을 DNAse/RNAse-없는 살균수에서 20 μM의 농도로 희석시켰다. 한 개 웰에 투약하기 위하여, 상기 용액 2 ㎕를 400 ㎕의 Opti-MEM 배지 (Gibco cat#31985-070) 및 4 ㎕의 Lipofectamine 2000 (Invitrogen cat# 11668019)과 함께 실온에서 20분간 배양하고, 세포들이 있는 6개 웰 평판의 한 개 웰에 점적으로 제공하였다. 올리고뉴클레오티드 용액 대신에 물 2㎕를 포함하는 유사한 혼합물은 모의-형질감염된 대조에 이용되었다. 추가적으로, 동일한 농도의 비활성 올리고뉴클레오티드 CUR-1462는 대조로 이용하였다. 37℃ 및 5% CO2에서 대략 18시간 항온처리후, 배지를 새로운 성장 배지로 교체하였다. 안티센스 올리고뉴클레오티드의 첨가후 48시간 시점에, 배지를 제거하고, 그리고 SV Total RNA Isolation System (Promega (cat # Z3105))을 이용하여 제조업체의 지시에 따라 세포로부터 RNA를 추출하였다. 600 ng의 정제된 총 RNA를 Superscript VILO cDNA Synthesis Kit(Invitrogen (cat#11754-250))를 이용하여, 제조업체의 프로토콜에 따라 실행된 역전사 반응에 첨가하였다. 이와 같은 역전사 반응으로부터 cDNA를 이용하여 ABI Taqman Gene Expression Mix (cat#4369510) 및 ABI에 의해 설계된 프라이머/프로브 (인간 SCN1A의 경우 분석 Hs00374696_ml, Hs00897350_ml 또는 Hs00897341_ml)를 이용한 실시간 PCR에 의해 유전자 발현을 모니터링하였다. StepOne Plus Real Time PCR 시스템(Applied Biosystems)을 이용하여, 아래의 PCR 주기가 이용되었다: 2분 동안 50℃, 10분 동안 95℃, 40회 사이클의 (15초 동안 95℃, 1분 동안 60℃). 18S 분석은 ABI(cat# 4319413E)에 의해 제조되었다. 처리된 샘플 및 모의-형질감염된 샘플 사이에 18S-표준화된 dCt 값에서 차이에 근거하여, 안티센스 올리고뉴클레오티드로 처리후 유전자 발현에서 배수적 변화가 계산되었다. 대안인 동일자 방법(alternative Same Day Method)의 경우, 모든 과정들이 유사하게 실시되었지만, 세포들을 6개-웰 플레이트상에 분포시킨 후 곧, 첫 날에 안티센스 올리고뉴클레오티드를 투약하였다.
3 T3 세포계 . ATCC로부터 3T3 마우스 배 섬유아세포(cat# CRL-1658)를 37℃ 및 5% CO2에서 성장 배지 (Dulbecco's Modified Eagle's Medium (Cellgrow 10-013-CV)+ 10% 태아 송아지 혈청(Cellgrow 35-22-CV)+ 페니실린/스트렙토마이신(Mediatech cat# MT30-002-CI))에서 성장시켰다. 세포들은 다음의 방법들중 하나를 이용하여 안티센스 올리고뉴클레오티드로 처리하였다. 다음날 방법(Next Day Method)의 경우, 실험 하루 전, 이들 세포를 대략 105/㎖의 밀도로 성장 배지에서 6개 웰 평판에 재도말하고, 37℃ 및 5% CO2에서 하룻밤동안 항온처리하였다. 다음 날, 6개 웰 평판에 있는 배지를 새로운 성장 배지로 교체하였고(웰당 1.5ml), 그리고 세포들에게 안티센스 올리고뉴클레오티드들을 투약하였다. 모든 안티센스 올리고뉴클레오티드들은 IDT Inc. (Coralville, IA) 또는 Exiqon (Vedbaek, Denmark)에 의해 제조되었다. 모든 올리고뉴클레오티드들에 대한 서열은 표 1에 도시한다. 올리고뉴클레오티드들의 저장(Stock) 용액을 DNAse/RNAse-없는 살균수에서 20 μM의 농도로 희석시켰다. 한 개 웰에 투약하기 위하여, 상기 용액 2 ㎕를 400 ㎕의 Opti-MEM 배지 (Gibco cat#31985-070) 및 4 ㎕의 Lipofectamine 2000 (Invitrogen cat# 11668019)과 함께 실온에서 20분간 배양하고, 세포들이 있는 6개 웰 평판의 한 개 웰에 점적으로 제공하였다. 올리고뉴클레오티드 용액 대신에 물 2㎕를 포함하는 유사한 혼합물은 모의-형질감염된 대조에 이용되었다. 추가적으로, 동일한 농도의 비활성 올리고뉴클레오티드 CUR-1462는 대조로 이용하였다. 37℃ 및 5% CO2에서 대략 18시간 항온처리후, 배지를 새로운 성장 배지로 교체하였다. 안티센스 올리고뉴클레오티드의 첨가후 48시간 시점에, 배지를 제거하고, 그리고 SV Total RNA Isolation System (Promega (cat # Z3105))을 이용하여 제조업체의 지시에 따라 세포로부터 RNA를 추출하였다. 600 ng의 정제된 총 RNA를 Superscript VILO cDNA Synthesis Kit(Invitrogen (cat#11754-250))를 이용하여, 제조업체의 프로토콜에 따라 실행된 역전사 반응에 첨가하였다. 이와 같은 역전사 반응으로부터 cDNA를 이용하여 ABI Taqman Gene Expression Mix (cat#4369510) 및 ABI에 의해 설계된 프라이머/프로브 (인간 SCN1A의 경우, 분석 Hs00374696_ml, Hs00897350_ml 또는 Hs00897341_ml)를 이용한 실시간 PCR에 의해 유전자 발현을 모니터링하였다. 세 가지 분석 모두를 이용하여 얻은 결과들은 매우 유사하였다. StepOne Plus Real Time PCR 시스템(Applied Biosystems)을 이용하여, 아래의 PCR 주기가 이용되었다: 2분 동안 50℃, 10분 동안 95℃, 40회 사이클의 (15초 동안 95℃, 1분 동안 60℃). 18S 분석은 ABI(cat# 4319413E)에 의해 제조되었다. 처리된 샘플 및 모의-형질감염된 샘플 사이에 18S-표준화된 dCt 값에서 차이에 근거하여, 안티센스 올리고뉴클레오티드로 처리후 유전자 발현에서 배수적 변화가 계산되었다. 대안인 동일자 방법(alternative Same Day Method)의 경우, 모든 과정들이 유사하게 실시되었지만, 세포들을 6개-웰 플레이트상에 분포시킨 후 곧, 첫 날에 안티센스 올리고뉴클레오티드를 투약하였다.
HepG2 세포계 . ATCC로부터 HepG2 인간 간세포 암종 세포(cat# HB-8065)를 37℃ 및 5% CO2에서 성장 배지 (MEM EBSS (Hyclone cat#SH30024, 또는 Mediated, cat#MT-10-OlO-CV) +10% FBS (Mediated. cat# MT35-011-CV)+ 페니실린/스트렙토마이신(Mediatech cat# MT30-002-CI))에서 성장시켰다. 세포들은 다음의 방법들중 하나를 이용하여 안티센스 올리고뉴클레오티드로 처리하였다. 다음날 방법(Next Day Method)의 경우, 실험 하루 전, 이들 세포를 대략 3x105/㎖의 밀도로 성장 배지에서 6개 웰 평판에 재도말하고, 37℃ 및 5% CO2에서 하룻밤동안 항온처리하였다. 다음 날, 6개 웰 평판에 있는 배지를 새로운 성장 배지로 교체하였고(웰당 1.5ml), 그리고 세포들에게 안티센스 올리고뉴클레오티드들을 투약하였다. 모든 안티센스 올리고뉴클레오티드들은 IDT Inc. (Coralville, IA) 또는 Exiqon (Vedbaek, Denmark)에 의해 제조되었다. 모든 올리고뉴클레오티드들에 대한 서열은 표 1에 도시한다. 올리고뉴클레오티드들의 저장(Stock) 용액을 DNAse/RNAse-없는 살균수에서 20 μM의 농도로 희석시켰다. 한 개 웰에 투약하기 위하여, 상기 용액 2 ㎕를 400 ㎕의 Opti-MEM 배지 (Gibco cat#31985-070) 및 4 ㎕의 Lipofectamine 2000 (Invitrogen cat# 11668019)과 함께 실온에서 20분간 배양하고, 세포들이 있는 6개 웰 평판의 한 개 웰에 점적으로 제공하였다. 올리고뉴클레오티드 용액 대신에 물 2㎕를 포함하는 유사한 혼합물은 모의-형질감염된 대조에 이용되었다. 추가적으로, 동일한 농도의 비활성 올리고뉴클레오티드 CUR-1462는 대조로 이용하였다. 37℃ 및 5% CO2에서 대략 18시간 항온처리후, 배지를 새로운 성장 배지로 교체하였다. 안티센스 올리고뉴클레오티드의 첨가후 48시간 시점에, 배지를 제거하고, 그리고 SV Total RNA Isolation System (Promega (cat # Z3105))을 이용하여 제조업체의 지시에 따라 세포로부터 RNA를 추출하였다. 600 ng의 정제된 총 RNA를 Superscript VILO cDNA Synthesis Kit(Invitrogen (cat#11754-250))를 이용하여, 제조업체의 프로토콜에 따라 실행된 역전사 반응에 첨가하였다. 이와 같은 역전사 반응으로부터 cDNA를 이용하여 ABI Taqman Gene Expression Mix (cat#4369510) 및 ABI에 의해 설계된 프라이머/프로브 (인간 SCN1A의 경우, 분석 Hs00374696_ml, Hs00897350_ml 또는 Hs00897341_ml)를 이용한 실시간 PCR에 의해 유전자 발현을 모니터링하였다. 세 가지 분석 모두를 이용하여 얻은 결과들은 매우 유사하였다. StepOne Plus Real Time PCR 시스템(Applied Biosystems)을 이용하여, 아래의 PCR 주기가 이용되었다: 2분 동안 50℃, 10분 동안 95℃, 40회 사이클의 (15초 동안 95℃, 1분 동안 60℃). 18S 분석은 ABI(cat# 4319413E)에 의해 제조되었다. 처리된 샘플 및 모의-형질감염된 샘플 사이에 18S-표준화된 dCt 값에서 차이에 근거하여, 안티센스 올리고뉴클레오티드로 처리후 유전자 발현에서 배수적 변화가 계산되었다. 대안인 동일자 방법(alternative Same Day Method)의 경우, 모든 과정들이 유사하게 실시되었지만, 세포들을 6개-웰 플레이트상에 분포시킨 후 곧, 첫 날에 안티센스 올리고뉴클레오티드를 투약하였다.
결과 . 허위-형질감염된 대조군과 비교하여 20 nM의 안티센스 올리고뉴클레오티드로 처리한 후 상이한 세포계들에서 SCN1A mRNA 수준을 표 2에 제공한다. 20 nM으로 제공하였을 때 이들 올리고뉴클레오티드중 일부에서 볼 수 있는 것과 같이, SCNIA mRNA의 수준을 상향조절하는데 매우 적극적이었고, 그리고 몇 가지 종(인간, 아프리카 녹색 원숭이 및 마우스)의 상이한 장기/세포 유형들(간, 신장, 뇌, 배아 섬유아세포들)로부터 유도된 세포계에서 그리고 주로 SCN1A 돌연변이를 나르는 일차 피부 섬유아세포들에서 일관되게 상향조절하는 것을 보여주었다. Dravet 돌연변이를 나르는 세포들에서 SCN1A 단백질의 상향조절은 SCN1A 유전자에서 돌연변이들과 연관된 질환들의 치료를 위한 방법의 적합성을 지지한다. 천연 안티센스 서열에 대항하여 기획된 올리고뉴클레오티드들중 일부는 테스트한 모든 또는 일부 세포계에서 SCN1A mRNA 수준에 영향을 주지않거나 또는 단지 조금 영향을 주었다. 이러한 차이들은 올리고뉴클레오티드의 결합이 올리고뉴클레오티드의 표적 서열의 2차 및 3차 구조에 따라 달라질 수 있음을 나타낸 문헌과 일치한다. 특히, SCNIA 천연 안티센스 서열에 상동성은 없지만 유사한 화학성질을 가진 올리고뉴클레오티드(CUR-1462)로 처리한 세포들에서 SCN1A 수준은 허위 형질감염된 대조군과 유의미적으로 차이가 없으며, 이는 표적된 올리고뉴클레오티드의 영향이 이들 분자의 비-특이적 독성에 의존적이지 않음을 확인시킨다.
실시예 4 : SCNA -특이적 천연 안티센스 전사체를 표적으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오티드로 처리함으로써 상이한 세포계들에서 SCNA mRNA 상향조절의 약량 -의존성.
실시예 4에서 SCNA-특이적 천연 안티센스 전사체를 표적으로 하는 상이한 화학성질의 안티센스 올리고뉴클레오티드는 5 내지 80 nM 범위의 최종 농도에서 다양한 세포계 패널에서 스크리닝하였다. 이용된 이들 세포계는 상이한 장기 및 상이한 동물 종으로부터 유래되었다. 하기 데이터로부터 SCNA-특이적인 천연 안티센스 전사체의 기능 조절을 통하여 SCNA mRNA의 상향조절 수준은 활성 올리고뉴클레오티드의 양을 다양하게 제공함으로써 조정할 수 있음을 확인한다.
재료 및 방법들: SK-N-AS, Vero 76 및 Dravet 돌연변이를 나르는 주요 인간 섬유아세포들은 웰을 처리하는데 이용된 올리고뉴클레오티드와 Lipofectamine 2000 농도를 제외하고 실시예 2에서 설명된 것과 같이 안티센스 올리고뉴클레오티드로 처리하였다. 올리고뉴클레오티드와 Lipofectamine 2000 농도는 올리고뉴클레오티드의 최종 농도가 5, 10, 20, 40 및 80 nM이 되며, 그리고 Lipofectamine 2000 대 20 μM 올리고뉴클레오티드 저장 용액의 비율이 2: 1 (v:v)이 되도록 조정하였다
결과들. 약량 반응 실험 결과로부터 SCN1A-특이적 천연 안티센스 RNA에 대해 표적화된 안티센스 올리고뉴클레오티드는 SCN1A mRNA의 약량-의존성 상향조절을 유도할 수 있음을 확인하였다(도 1-3). 일부 경우에 이러한 상향조절은 더 높은 약량에서 매우 강력하였다(최대 60-배)(도 1-3). 상이한 세포계에서 동일한 뉴클레오티드에 의해 유도된 상향조절 수준은 상이한 것으로 나타났는데, 예를 들면, 주요 섬유아세포들에서 40 nM에서 취한 상향조절은 10-40배였지만, Vero 76 세포들에서 동일한 농도의 동일한 올리고뉴클레오티드에 의한 상향조절은 2-6 배였다(도 1 대 도 3). 이러한 차이는 상이한 세포계의 상이한 형질감염 효율로 인한 것을 수 있고, 및/또는 이들에 의해 발현되는 다양한 피드백 경로들에 의한 것일 수도 있다. SCN1A 섬유아세포에서 CUR-1764 및 CUR-1770의 경우와 Vero 76 세포들에서 테스트한 모든 올리고뉴클레오티드를 제외한(이 경우 테스트한 최대 농도에서도 정체기에 도달하지 않음) 대부분의 올리고뉴클레오티드의 효과는 약 40 nM에서 정체기(plateau)에 도달하였다(도 1-3).
실시예 5 : SCNA -특이적인 천연 안티센스 전사체를 표적으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오티드에 의한 SCNA mRNA 상향조절의 서열 특이성
실시예 5에서 SCN1A-특이적 천연 안티센스 전사체를 표적으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오티드는 이용된 올리고뉴클레오티드와 연관된 비-특이적 독성으로부터 올리고뉴클레오티드에 의해 야기되는 SCN1A 상향조절은 독립적임을 확인하도록 기획된 실험들에서 테스트하였다. SCN1A-특이적 천연 안티센스 전사체의 기능 조절을 통한 SCN1A mRNA의 상향조절 정도는 오직 활성 올리고뉴클레오티드의 양에 의존하며, 유사한 화학성질의 전체 분자의 양에 의존하지 않음을 하기 데이터로부터 확인한다.
재료 및 방법들: Vero 76 및 Dravet 돌연변이를 나르는 주요 인간 섬유아세포들은 각 웰을 처리하는데 이용된 올리고뉴클레오티드 농도를 제외하고 실시예 2에서 설명한 것과 같이 안티센스 올리고뉴클레오티드로 처리하였다. 활성 올리고뉴클레오티드는 유사한 화학성질을 가진 그러나 인간 게놈에서 공지된 표적이 없으며, 그리고 테스트된 다중 유전자의 발현에 영향이 없는 비활성 올리고뉴클레오티드(CUR-1462)와 함께 공동-투여하였다(데이터 나타내지 않음). 올리고뉴클레오티드의 전체량과 Lipofectamine 2000의 양은 일정하게 유지하였고, 혼합물에서 활성 올리고뉴클레오티드의 비율은 다양하게 변화시켰다. 올리고뉴클레오티드 농도는 최종 활성 올리고뉴클레오티드 농도가 5, 10, 20 및 40 nM이 되도록 하고, 전체 올리고뉴클레오티드(활성+비활성)의 농도가 40 nM이 되도록 조정하였다.
데이터(도 7)로부터 볼 수 있는 것과 같이, SCN1A 천연 안티센스에 대항하여 표적화된 올리고뉴클레오티드의 약량-의존적 효과는 이러한 분자와 잠재적으로 관련된 비-특이적 독성으로 인한 것이 아니었다. SCN1A mRNA 수준은 이들을 처리하는데 이용된 활성 올리고뉴클레오티드의 약량에 의존적이다(도 7).
실시예 6 : SCNA -특이적인 천연 안티센스 전사체를 표적으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오티드에 의한 SCNA mRNA 상향조절의 표적 특이성
실시예 6에서, SCN1A-특이적인 천연 안티센스 전사체를 표적으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오티드는 이들의 표적, 가령, SCN1A의 특이성을 확인하기 위하여 기획된 실험들에서 테스트하였다. SCN1A-특이적인 천연 안티센스 전사체의 기능 조절을 통하여 SCN1A mRNA의 상향조절은 SCN1A mRNA에 국한되었으며, 그리고 관련된 나트륨 통로들 SCN9A, SCN8A, SCN7A, SCN3A 및 SCN2A에 영향을 주지 않았음을 하기 데어터들로부터 확인한다.
재료 및 방법들: Vero 76 및 Dravet 돌연변이를 나르는 주요 인간 섬유아세포들은 실시예 3에서 설명된 것과 같이 안티센스 올리고뉴클레오티드들로 처리하였다. 처리후, SCN9A, SCN8A, SCN7A, SCN3A 및 SCN2A 통로들에 대해 실시간 PCR 탐지된 mRNA를 이동시키는데 이용된 Taqman 유전자 발현 분석을 제외하고 실시예 2에서 설명한 것과 같이 단리된 RNA를 분석하였다. 인간 SCN9A, SCN8A, SCN7A, SCN3A 및 SCN2A 통로의 알파 소단위에 대한 분석은 ABI Inc. (차례로 cat# Hs00161567_ml, Hs00274075_ml, Hs00161546_ml, Hs00366902_ml, 및 Hs00221379_ml)로부터 구하였다.
결과 . 도 8에서 나타낸 것과 같이, 올리고뉴클레오티드 CUR-1916 및 CUR-1770으로 처리는 Dravet 돌연변이를 나르는 인간 섬유아세포에서 SCN8A 및 SCN9A 통로의 발현에 유의미적인 영향을 주지않았다. SCN7A, SCN3A 및 SCN2A 통로의 발현은 처리 전 또는 처리 후 이들 세포들에서 탐지할 수 없었다(데이터는 나타내지 않음). 이 데이터들은 주어진 유전자에 대한 천연 안티센스 RNA를 지향하는 올리고뉴클레오티드를 이용한 유전자 발현 조정의 특이성을 확인한다.
실시예 7: SCNA -특이적 천연 안티센스 전사체를 표적으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오티드의 안전성
실시예 7에서, SCN1A-특이적 천연 안티센스 전사체를 표적으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오티드의 두 개 배취(batch)는 4℃에서 희석 (1mM) 수성 용액에 저장한 후 이의 안전성을 점검하도록 기획한 실험들에서 테스트하였다. 이들 올리고뉴클레오티드는 활성의 심각한 상실없이 최소한 6개월의 기간 동안 이들 조건에서 안정적일 수 있음을 하기 데이터는 나타낸다.
재료 및 방법들: Vero 76 세포들은 실시예 2에서 설명한 것과 같이 두 가지 상이한 안티센스 올리고뉴클레오티드 배취로 처리하였다. 이들 배취는 2010년 8월과 2011년 3월에 합성하였다. 2010년 8월에 합성한 올리고뉴클레오티드는 4℃에서 1mM 수성 용액으로 보관하였다. 2011년 3월에 합성한 올리고뉴클레오티드는 합성후 3일 이내에 동결건조된 형으로 운반하였고, 도착하자마자 바로 테스트하였다.
결과 : 도 9에서 볼 수 있는 것과 같이, 4℃에서 수성 용액에 올리고뉴클레오티드를 6개월 장기간 보관한 후 생물학적 활성의 심각한 손실은 없었다.
실시예 8: SCNA -특이적 천연 안티센스 전사체를 표적으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오티드로 처리한 Dravet 증후군-연관된 돌연변이를 나르는 주요 인간 섬유아세포들에서 SCNA 단백질의 상향조절
이 실험의 목적은 Dravet 증후군-연관된 돌연변이를 나르는 섬유아세포들에서 SCNA 단백질 발현을 상향조절하는 능력에 따라 안티센스 올리고뉴클레오티드 CUR-1740, CUR-1770 및 CUR-1916를 등급화하는 것이다.
재료 및 방법들: Dr. N.Kenyon (University of Miami)에 의해 배양물로 도입된 Dravet 증후군-연관된 돌연변이를 나르는 섬유아세포들은 a-MEM (Gibco, cat: 12561-056)+10% FBS (Mediatech, cat: 35-015 CV) + 1% 항진균성-항생제(Gibco, cat: 15240-062)로 구성된 성장 배지에서 37℃ 및 5% CO2에서 성장시켰다. 세포들은 다음의 방법들중 하나를 이용하여 안티센스 올리고뉴클레오티드로 처리하였다. 다음날 방법(Next Day Method)의 경우, 실험 하루 전, 이들 세포를 대략 4x104/㎖의 밀도로 성장 배지에서 24개 웰 평판에 재도말하고, 37℃ 및 5% CO2에서 하룻밤동안 항온처리하였다. 다음 날, 24개 웰 평판에 있는 배지를 새로운 성장 배지로 교체하였고(웰당 1 ml), 그리고 세포들에게 안티센스 올리고뉴클레오티드 CUR-1740, CUR-1770 및 CUR-1916을 투약하였다. 모든 안티센스 올리고뉴클레오티드들은 IDT Inc. (Coralville, IA) 또는 Exiqon (Vedbaek, Denmark)에 의해 제조되었다. 올리고뉴클레오티드 CUR-1740, CUR-1770 및 CUR-1916에 대한 서열은 표 1에 도시한다. 올리고뉴클레오티드들의 저장(Stock) 용액을 DNAse/RNAse-없는 살균수에서 20 μM의 농도로 희석시켰다. 한 개 웰에 20nM의 최종 농도로 투약하기 위하여, 상기 20μM 올리고뉴클레오티드 저장 용액 1 ㎕를 200 ㎕의 Opti-MEM 배지 (Gibco cat#31985-070) 및 2 ㎕의 Lipofectamine 2000 (Invitrogen cat# 11668019)과 함께 실온에서 20분간 배양하고, 세포들이 있는 24개 웰 평판의 한 개 웰에 점적(dropwise)으로 제공하였다. 5, 10, 40 및 80nM의 최종 농도를 얻기 위하여, 이용된 20μM 올리고뉴클레오티드 저장 용액의 용적을 따라 조정하였다. Lipofectamine 2000에 대한 20μM 올리고뉴클레오티드 저장 용액의 비율은 1:2(v:v)이었다. 올리고뉴클레오티드 용액 대신에 물 8㎕를 포함하는 유사한 혼합물과 이에 대응하는 용적의 Lipofectamine 2000을 모의-형질감염된 대조로 이용하였다. 37℃ 및 5% CO2에서 대략 18시간 항온처리후, 배지를 새로운 성장 배지로 교체하였다. 안티센스 올리고뉴클레오티드의 첨가후 48시간 시점에, 배지를 제거하고, 세포들은 칼륨 및 마그네슘없는 Dulbecco의 인산염-완충된 염(PBS)(Mediateach cat#21-031-CV)로 3회 세척하였다. 그 다음 PBS를 버리고, 세포는 -20℃에서 15분간 300㎕의 100% 메탄올을 이용하여 24개 웰 플레이트에 고정시켰다. 메탄올을 제거하고, PBS로 세척한 후, 세포들은 3% 과산화수소(Fisher Chemical cat#H325-100)으로 21℃에서 5분간 항온처리하였다. 세포들을 PBS로 5분간 3회 세척하였고, 그 다음 PBS내 0.1%에서 300㎕의 소 혈청 알부민(BSA)(Sigma cat#A-9647)으로 21℃에서 30분간 항온처리하였다. 이들 세포는 PBS로 5분간 3회 세척하였고, 그 다음 300㎕의 아비딘 용액(Vector Laboratories cat#SP-2001)으로 21℃에서 30분간 항온처리하였다. 이들 세포는 PBS로 3차례 간단하게 세척하였고, 그 다음 바이오틴 용액(Vector Laboratories Cat#SP-2001)으로 21℃에서 30분간 항온처리하였다. 이들 세포들은 PBS로 3차례 세척하였고, 그 다음 PBS/BSA 0.1%에서 1:250으로 희석시킨 인간 SCN1A에 대항하는 토끼 항체(Abcam cat# ab24820)를 웰당 300㎕과 함께 4℃에서 하룻밤 동안 항온처리하였다. 플레이트를 21℃에서 5분간 균등화시킨 후, 이들 세포를 매회 PBS로 3차례 세척하였고, 그 다음 PBS/BSA 0.1%에서 1:200으로 희석시킨 염소 항-토끼 항체(Abcam cat# ab24820)와 함께 21℃에서 30분간 항온처리하였다. 이들 세포들은 PBS로 5분간 3회 세척하였고, 그 다음 300㎕의 Vectastain Elite ABC 시약 A+B 용액(Vector Laboratories cat#PK-6101)과 함께 30분 동안 항온처리하였다; Vectastain Elite ABC 시약 A+B 용액은 5 ml의 PBS에 시약 A 2방울과 그 다음 시약 B 2방울을 연속하여 첨가하고, 혼합함으로써 세포와 함께 항온처리하기 전 21℃에서 30분간 준비하였다. 이들 세포는 21℃에서 PBS로 각 5분씩 3회 세척하고, 그 다음 세포들이 착색될 때까지 디아미노벤지딘(DAB) 과산화효소 기질 용액(Vector Laboratories cat# SK-4105)와 항온처리하였고; DAB 과산화효소 기질 용액은 1 ml의 ImmPACT™ DAB 희석물과 30㎕의 ImmPACT™ DAB Chromogen 농축물과 혼합시킴으로써 세포에 추가하기 전 재구성한다. 이때 이들 세포는 PBS로 3회 간단하게 세척하고, 각 웰에는 300㎕의 PBS가 남는다. Dell Latitude D630 랩탑(laptop)의 스크린 상에서 Nikon Digital-Sight 장비에 결합된 Nikon DS-Ril 카메라가 갖추어진 Nikon Eclipse TS1OO 역상 현미경을 이용하여 24-웰 플레이트의 웰 내부에서 세포의 착색을 직접적으로 분석하였다. Nikon 카메라, NIS-Elements D3.0와 함께 제공된 소프트웨어를 이용하여 개별 웰의 사진을 찍었다.
결과. 테스트한 모든 안티센스 올리고뉴클레오티드는 SCN1A 단백질을 효과적으로 상향조절하였고, CUR-1770 및 CUR-1916 두 개가 최고이다(도 10).
실시예 9: SCNA -특이적 천연 안티센스 전사체를 표적으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오티드로 처리한 SK -N- AS 세포들에서 SCNA 단백질의 상향조절
이 실험의 목적은 SK-N-AS 세포들에서 SCN1A 단백질 발현을 조절하는 안티센스 올리고뉴클레오티드 CUR-1740, CUR-1764, CUR-1770 및 CUR-1916의 능력에 따라 이들의 등급을 매기는 것이었다. SK-N-AS는 인간 신경아종 세포계다.
재료 및 방법들 . ATCC로부터 SK-N-AS 인간 신경아종 세포(cat# CRL-2137)는 성장 배지(DMEM (Mediatech cat# 10-013-CV)+10% FBS (Mediatech cat# MT35-011-CV)+ 페니실린/스테렙토마이신(Mediatech cat# MT30-002-CI) + 비-필수 아미노산(NEAA)(HyClone SH30238.01))에서 37℃ 및 5% CO2에서 성장시켰다. 세포들은 다음의 방법들중 하나를 이용하여 안티센스 올리고뉴클레오티드로 처리하였다. 다음날 방법(Next Day Method)의 경우, 실험 하루 전, 이들 세포를 대략 5x104/㎖의 밀도로 성장 배지에서 24개 웰 평판에 재도말하고, 37℃ 및 5% CO2에서 하룻밤동안 항온처리하였다. 다음 날, 24개 웰 평판에 있는 배지를 새로운 성장 배지로 교체하였고(웰당 1 ml), 그리고 세포들에게 안티센스 올리고뉴클레오티드 CUR-1740, CUR-1764, CUR-1770 및 CUR-1916을 투약하였다. 모든 안티센스 올리고뉴클레오티드들은 IDT Inc. (Coralville, IA) 또는 Exiqon (Vedbaek, Denmark)에 의해 제조되었다. 올리고뉴클레오티드 CUR-1740, CUR-1764, CUR-1770 및 CUR-1916에 대한 서열은 표 1에 도시한다. 올리고뉴클레오티드들의 저장(Stock) 용액을 DNAse/RNAse-없는 살균수에서 20 μM의 농도로 희석시켰다. 한 개 웰에 20nM의 최종 농도로 투약하기 위하여, 상기 20μM 올리고뉴클레오티드 저장 용액 1 ㎕를 200 ㎕의 Opti-MEM 배지 (Gibco cat#31985-070) 및 2 ㎕의 Lipofectamine 2000 (Invitrogen cat# 11668019)과 함께 실온에서 20분간 배양하고, 세포들이 있는 24개 웰 평판의 한 개 웰에 점적(dropwise)으로 제공하였다. 5, 10, 40 및 80nM의 최종 농도를 얻기 위하여, 이용된 20μM 올리고뉴클레오티드 저장 용액의 용적을 따라 조정하였다. Lipofectamine 2000에 대한 20μM 올리고뉴클레오티드 저장 용액의 비율은 1:2(v:v)이었다. 올리고뉴클레오티드 용액 대신에 물 8㎕를 포함하는 유사한 혼합물과 이에 대응하는 용적의 Lipofectamine 2000을 모의-형질감염된 대조로 이용하였다. 37℃ 및 5% CO2에서 대략 18시간 항온처리후, 배지를 새로운 성장 배지로 교체하였다. 안티센스 올리고뉴클레오티드의 첨가후 48시간 시점에, 배지를 제거하고, 세포들은 칼륨 및 마그네슘없는 Dulbecco의 인산염-완충된 염(PBS)(Mediateach cat#21-031-CV)로 3회 세척하였다. 그 다음 PBS를 버리고, 세포는 -20℃에서 15분간 300㎕의 100% 메탄올을 이용하여 24개 웰 플레이트에 고정시켰다. 메탄올을 제거하고, PBS로 세척한 후, 세포들은 3% 과산화수소(Fisher Chemical cat#H325-100)으로 21℃에서 5분간 항온처리하였다. 세포들을 PBS로 5분간 3회 세척하였고, 그 다음 PBS내 0.1%에서 300㎕의 소 혈청 알부민(BSA)(Sigma cat#A-9647)으로 21℃에서 30분간 항온처리하였다. 이들 세포는 PBS로 5분간 3회 세척하였고, 그 다음 300㎕의 아비딘 용액(Vector Laboratories cat#SP-2001)으로 21℃에서 30분간 항온처리하였다. 이들 세포는 PBS로 3차례 간단하게 세척하였고, 그 다음 바이오틴 용액(Vector Laboratories Cat#SP-2001)으로 21℃에서 30분간 항온처리하였다. 이들 세포들은 PBS로 3차례 세척하였고, 그 다음 PBS/BSA 0.1%에서 1:250으로 희석시킨 인간 SCN1A에 대항하는 토끼 항체(Abcam cat# ab24820)를 웰당 300㎕과 함께 4℃에서 하룻밤 동안 항온처리하였다. 플레이트를 21℃에서 5분간 균등화시킨 후, 이들 세포를 매회 PBS로 3차례 세척하였고, 그 다음 PBS/BSA 0.1%에서 1:200으로 희석시킨 염소 항-토끼 항체(Abcam cat# ab24820)와 함께 21℃에서 30분간 항온처리하였다. 이들 세포들은 PBS로 5분간 3회 세척하였고, 그 다음 300㎕의 Vectastain Elite ABC 시약 A+B 용액(Vector Laboratories cat#PK-6101)과 함께 30분 동안 항온처리하였다; Vectastain Elite ABC 시약 A+B 용액은 5 ml의 PBS에 시약 A 2방울과 그 다음 시약 B 2방울을 연속하여 첨가하고, 혼합함으로써 세포와 함께 항온처리하기 전 21℃에서 30분간 준비하였다. 이들 세포는 21℃에서 PBS로 각 5분씩 3회 세척하고, 그 다음 세포들이 착색될 때까지 디아미노벤지딘(DAB) 과산화효소 기질 용액(Vector Laboratories cat# SK-4105)와 항온처리하였고; DAB 과산화효소 기질 용액은 1 ml의 ImmPACT™ DAB 희석물과 30㎕의 ImmPACT™ DAB Chromogen 농축물과 혼합시킴으로써 세포에 추가하기 전 재구성한다. 이때 이들 세포는 PBS로 3회 간단하게 세척하고, 각 웰에는 300㎕의 PBS가 남는다. Dell Latitude D630 랩탑(laptop)의 스크린 상에서 Nikon Digital-Sight 장비에 결합된 Nikon DS-Ril 카메라가 갖추어진 Nikon Eclipse TS1OO 역상 현미경을 이용하여 24-웰 플레이트의 웰 내부에서 세포의 착색을 직접적으로 분석하였다. Nikon 카메라, NIS-Elements D3.0와 함께 제공된 소프트웨어를 이용하여 개별 웰의 사진을 찍었다.
결과 . 테스트한 모든 안티센스 올리고뉴클레오티드는 SCN1A 단백질을 효과적으로 상향조절하였고, CUR-1764 및 CUR-1770 두 개가 최고이다(도 11).
실시예 10 : SCNA -특이적 천연 안티센스 전사체를 표적으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오티드로 처리한 Vero 76 세포들에서 SCNA 단백질의 상향조절
이 실험의 목적은 Vero 76 세포들에서 SCN1A 단백질 발현을 조절하는 안티센스 올리고뉴클레오티드 CUR-1740, CUR-1770, CUR-1916, CUR-1924 및 CUR-1945의 능력에 따라 이들의 등급을 매기는 것이었다. Vero76은 쎄르코피테쿠스 에티옵스(Cercopithecus aethiops)(베르베트 또는 아프리카 녹색 원숭이) 신장 세포계이다.
재료 및 방법들 . ATCC로부터 Vero76 아프리카 녹색 원숭이 배아 신장 세포(cat# CRL-1587)는 성장 배지(Dulbecco's Modified Eagle's Medium (Cellgrow 10-013-CV) + 5% FBS (Mediated. cat# MT35-011-CV) + 페니실린/스트렙토마이신 (Mediated. cat# MT30-002-CI))에서 37℃ 및 5% CO2에서 성장시켰다. 세포들은 다음의 방법들중 하나를 이용하여 안티센스 올리고뉴클레오티드로 처리하였다. 다음날 방법(Next Day Method)의 경우, 실험 하루 전, 이들 세포를 대략 4x104/㎖의 밀도로 성장 배지에서 24개 웰 평판에 재도말하고, 37℃ 및 5% CO2에서 하룻밤동안 항온처리하였다. 다음 날, 24개 웰 평판에 있는 배지를 새로운 성장 배지로 교체하였고(웰당 1 ml), 그리고 세포들에게 안티센스 올리고뉴클레오티드 CUR-1740, CUR-1770 및 CUR-1916을 투약하였다. 모든 안티센스 올리고뉴클레오티드들은 IDT Inc. (Coralville, IA) 또는 Exiqon (Vedbaek, Denmark)에 의해 제조되었다. 올리고뉴클레오티드 CUR-1740, CUR-1770, CUR-1916, CUR-1924 및 CUR-1945에 대한 서열은 표 1에 도시한다. 올리고뉴클레오티드들의 저장(Stock) 용액을 DNAse/RNAse-없는 살균수에서 20 μM의 농도로 희석시켰다. 한 개 웰에 20nM의 최종 농도로 투약하기 위하여, 상기 20μM 올리고뉴클레오티드 저장 용액 1 ㎕를 200 ㎕의 Opti-MEM 배지 (Gibco cat#31985-070) 및 2 ㎕의 Lipofectamine 2000 (Invitrogen cat# 11668019)과 함께 실온에서 20분간 배양하고, 세포들이 있는 24개 웰 평판의 한 개 웰에 점적(dropwise)으로 제공하였다. 5, 10, 40 및 80nM의 최종 농도를 얻기 위하여, 이용된 20μM 올리고뉴클레오티드 저장 용액의 용적을 따라 조정하였다. Lipofectamine 2000에 대한 20μM 올리고뉴클레오티드 저장 용액의 비율은 1:2(v:v)이었다. 올리고뉴클레오티드 용액 대신에 물 8㎕를 포함하는 유사한 혼합물과 이에 대응하는 용적의 Lipofectamine 2000을 모의-형질감염된 대조로 이용하였다. 37℃ 및 5% CO2에서 대략 18시간 항온처리후, 배지를 새로운 성장 배지로 교체하였다. 안티센스 올리고뉴클레오티드의 첨가 후 48시간 시점에, 배지를 제거하고, 세포들은 칼륨 및 마그네슘 없는 Dulbecco의 인산염-완충된 염(PBS)(Mediateach cat#21-031-CV)로 3회 세척하였다. 그 다음 PBS를 버리고, Vero 76 세포는 -20℃에서 15분간 300㎕의 100% 메탄올을 이용하여 24개 웰 플레이트에 고정시켰다. 메탄올을 제거하고, PBS로 세척한 후, 세포들은 3% 과산화수소(Fisher Chemical cat#H325-100)으로 21℃에서 5분간 항온처리하였다. 세포들을 PBS로 5분간 3회 세척하였고, 그 다음 PBS내 0.1%에서 300㎕의 소 혈청 알부민(BSA)(Sigma cat#A-9647)으로 21℃에서 30분간 항온처리하였다. 이들 세포는 PBS로 5분간 3회 세척하였고, 그 다음 300㎕의 아비딘 용액(Vector Laboratories cat#SP-2001)으로 21℃에서 30분간 항온처리하였다. 이들 세포는 PBS로 3차례 간단하게 세척하였고, 그 다음 바이오틴 용액(Vector Laboratories Cat#SP-2001)으로 21℃에서 30분간 항온처리하였다. 이들 세포들은 PBS로 3차례 세척하였고, 그 다음 PBS/BSA 0.1%에서 1:250으로 희석시킨 인간 SCN1A에 대항하는 토끼 항체(Abcam cat# ab24820)를 웰당 300㎕과 함께 4℃에서 하룻밤 동안 항온처리하였다. 플레이트를 21℃에서 5분간 균등화시킨 후, 이들 세포를 매회 5분간 PBS로 3차례 세척하였고, 그 다음 PBS/BSA 0.1%에서 1:200으로 희석시킨 염소 항-토끼 항체(Abcam cat# ab24820)와 함께 21℃에서 30분간 항온처리하였다. 이들 세포들은 PBS로 5분간 3회 세척하였고, 그 다음 300㎕의 Vectastain Elite ABC 시약 A+B 용액(Vector Laboratories cat#PK-6101)과 함께 30분 동안 항온처리하였다; Vectastain Elite ABC 시약 A+B 용액은 5 ml의 PBS에 시약 A 2방울과 그 다음 시약 B 2방울을 연속하여 첨가하고, 혼합함으로써 세포와 함께 항온처리하기 전 21℃에서 30분간 준비하였다. 이들 세포는 21℃에서 PBS로 각 5분씩 3회 세척하고, 그 다음 세포들이 착색될 때까지 디아미노벤지딘(DAB) 과산화효소 기질 용액(Vector Laboratories cat# SK-4105)와 항온처리하였고; DAB 과산화효소 기질 용액은 1 ml의 ImmPACT™ DAB 희석물과 30㎕의 ImmPACT™ DAB Chromogen 농축물과 혼합시킴으로써 세포에 추가하기 전 재구성한다. 이때 이들 세포는 PBS로 3회 간단하게 세척하고, 각 웰에는 300㎕의 PBS가 남는다. Dell Latitude D630 랩탑(laptop)의 스크린 상에서 Nikon Digital-Sight 장비에 결합된 Nikon DS-Ril 카메라가 갖추어진 Nikon Eclipse TS1OO 역상 현미경을 이용하여 24-웰 플레이트의 웰 내부에서 세포의 착색을 직접적으로 분석하였다. Nikon 카메라, NIS-Elements D3.0와 함께 제공된 소프트웨어를 이용하여 개별 웰의 사진을 찍었다.
결과 . 테스트한 모든 안티센스 올리고뉴클레오티드는 SCN1A 단백질을 효과적으로 상향조절하였고, CUR-1764 및 CUR-1770이 최고의 상향조절을 만든다(도 12).
실시예 11: SCNA mRNA 의 상향조절에서 강력한 SCNA -특이적 천연 안티센스 전사체를 표적으로 하는 올리고뉴클레오티드들은 Vero 76 세포들에서 악틴 mRNA 를 상향조절하지 않는다.
본 실험의 목적은 SCN1A mRNA 및 단백질을 상향조절하는 것으로 나타난 SCN1A-특이적 천연 안티센스 전사체를 표적으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오티드(CUR-1924, CUR-1740, CUR-1838)가 Vero 76 아프리카 녹색 원숭이 배아 신장 세포들에서 악틴과 같은 기타 무관한 유전자의 mRNA를 조절할 수 있는 지를 점검하는 것이었다.
재료 및 방법들 . ATCC로부터 Vero 76 아프리카 녹색 원숭이 배아 신장 세포 (cat# CRL-1587)를 실시예 2에서 설명한 것과 동일 조건에서 투약하였다. 악틴 mRNA는 실시예 2에서 설명한 것과 같이 실시간 PCR로 정량화하였는데, 단, ABI에 의해 기획된 이번 프라이머/프로브는 악틴에 특이적이다(cat# Hs99999903_ml). 데이터는 도 13에 제시한다.
결과 . 도 13에 나타낸 것과 같이, 실시예 3과 10에서 Vero 76 세포들에서 SCN1A mRNA 및 단백질을 상향조절하는 것으로 나타난 SCN1A-특이적 천연 안티센스 전사체를 표적으로 하는 올리고뉴클레오티드들 (CUR-1924, CUR-1740, CUR-1838)은 Vero 76 세포들에서 악틴 mRNA 발현에 있어서 이들 효과에 대하여 테스트하였다. 도 13의 데이터는 SCN1A-특이적 천연 안티센스 전사체를 표적으로 하는 올리고뉴클레오티드는 악틴과 같은 무관한 유전자를 상향조절하지 않음을 확인시킨다. 따라서, 이들 올리고뉴클레오티드는 SCN1A를 상향조절하는데 특이적이다.
실시예 12 : SCN1A mRNA 및 단백질을 상향조절하는 것으로 나타난 SCNA -특이적 천연 안티센스 전사체를 표적으로 하는 올리고뉴클레오티드들은 Dravet -연관된 돌연변이를 나르는 주요 섬유아세포들에서 악틴 mRNA 를 상향조절하지 않는다.
본 실험의 목적은 SCN1A mRNA 및 단백질을 상향조절하는 것으로 나타난 SCN1A-특이적 천연 안티센스 전사체를 표적으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오티드(CUR-1916, CUR-1945)가 Dravet 증후군-연관된 돌연변이 E1099X를 나르는 주요 인간 피부 섬유아세포들에서 악틴과 같은 기타 무관한 유전자의 mRNA를 조절할 수 있는 지를 점검하는 것이었다.
재료 및 방법들 . Dr. N. Kenyon (University of Miami)에 의해 배양물로 도입된 Dravet 증후군-연관된 돌연변이 E1099X를 나르는 주요 인간 피부 섬유아세포들은 실시예 3에서 설명한 것과 동일 조건에서 투약하였다. 악틴 mRNA는 실시예 3에서 설명한 것과 같이 실시간 PCR로 정량화하였는데, 단, ABI에 의해 기획된 이번 프라이머/프로브는 악틴에 특이적이다(cat# Hs99999903_ml). 데이터는 도 14에 제시한다.
결과 . 도 14에 나타낸 것과 같이, SCN1A-특이적 천연 안티센스 전사체를 표적으로 하는 올리고뉴클레오티드들은 악틴과 같은 무관한 유전자를 상향조절하지 않음을 확인시킨다. 따라서, 이들 올리고뉴클레오티드는 SCN1A를 상향조절하는데 특이적이다.
실시예 13 : SCNA -특이적 천연 안티센스 전사체를 표적으로 하는 올리고뉴클레오티드들은 SK -N- AS 세포들에서 악틴 mRNA 를 상향조절하지 않는다.
본 실험의 목적은 SCN1A mRNA 및 단백질을 상향조절하는 것으로 나타난 SCN1A-특이적 천연 안티센스 전사체를 표적으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오티드(CUR-1740, CUR-1764, CUR-1770, CUR-1838, CUR-1916)가 SK-N-AS 인간 신경아종 세포들에서 악틴과 같은 기타 무관한 유전자의 mRNA를 조절할 수 있는 지를 점검하는 것이었다.
재료 및 방법들 . ATCC로부터 SK-N-AS 인간 신경아종 세포들(cat# CRL-2137)을 실시예 2에서 설명한 것과 동일 조건에서 투약하였다. 악틴 mRNA는 실시예 2에서 설명한 것과 같이 실시간 PCR로 정량화하였는데, 단, ABI에 의해 기획된 이번 프라이머/프로브는 악틴에 특이적이다(cat# Hs99999903_ml). 데이터는 도 15에 제시한다.
결과 . 도 15에 나타낸 것과 같이, SCN1A-특이적 천연 안티센스 전사체를 표적으로 하는 올리고뉴클레오티드들은 악틴과 같은 무관한 유전자를 상향조절하지 않음을 확인시킨다. 따라서, 이들 올리고뉴클레오티드는 SCN1A를 상향조절하는데 특이적이다.
실시예 14: SCNA -특이적 천연 안티센스 전사체를 표적으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오티드들로 처리된 SK -N- AS 세포들에서 악틴 단백질은 상향조절되지 않는다.
본 실험의 목적은 SCN1A 단백질을 상향조절할 수 있는 SCN1A-특이적 천연 안티센스 전사체를 표적으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오티드(CUR-1740, CUR-1764, CUR-1770 및 CUR-1916)가 SK-N-AS 세포들에서 악틴과 같은 무관한 단백질의 발현을 또한 조절할 수 있는 지를 점검하는 것이었다. SK-N-AS는 인간 신경아종 세포계다.
재료 및 방법들 . ATCC로부터 SK-N-AS 인간 신경아종 세포들(cat# CRL-2137)은 실시예 9에서 설명한 것과 동일한 조건들에서 성장시켰다. 세포들은 실시예 8에서 설명한 것과 정확하게 동일한 조건에서 고정시키고, 착색시켰지만, 단, 제 1 항체는 1:500의 희석에 이용된 토끼 항-악틴(Abeam cat#abl801)이었다. 세포의 착색은 실시예 9에서 설명한 것과 동일한 과정을 이용하여 24개-웰 플레이트의 웰 내부에서 직접적으로 분석하였다.
결과 : 도 16에 나타낸 것과 같이, 테스트된 어떠한 안티센스 올리고뉴클레오티드들도 악틴 단백질을 상향조절하지 않았다. 따라서, 이들 올리고뉴클레오티드는 SCN1A 단백질에 특이적이다.
실시예 15: SCNA -특이적 천연 안티센스 전사체를 표적으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오티드들로 처리된 Vero 76 세포들에서 악틴 단백질은 상향조절되지 않는다.
본 실험의 목적은 SCN1A 단백질을 상향조절할 수 있는 SCN1A-특이적 천연 안티센스 전사체를 표적으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오티드(CUR-1740, CUR-1770, CUR-1916, CUR-1924 및 CUR-1945)가 Vero 76 세포들에서 악틴과 같은 무관한 유전자의 단백질 발현을 또한 조절할 수 있는 지를 점검하는 것이었다. Vero 76은 쎄르코피테쿠스 에티옵스(Cercopithecus aethiops)(베르베트 또는 아프리카 녹색 원숭이) 신장 세포계이다.
재료 및 방법들 . ATCC로부터 Vero 76 아프리카 녹색 원숭이 배아 신장 세포계 (cat# CRL-1587)은 실시예 10에서 설명한 것과 동일한 조건들에서 성장시켰다. 세포들은 실시예 10에서 설명한 것과 정확하게 동일한 조건에서 고정시키고, 착색시켰지만, 단, 제 1 항체는 1:500의 희석에 이용된 토끼 항-악틴(Abeam cat#abl801)이었다. 세포의 착색은 실시예 10에서 설명한 것과 동일한 과정을 이용하여 24개-웰 플레이트의 웰 내부에서 직접적으로 분석하였다.
결과 : 도 17에 나타낸 것과 같이, 테스트된 어떠한 안티센스 올리고뉴클레오티드들도 악틴 단백질을 상향조절하지 않았다. 따라서, 이들 올리고뉴클레오티드는 SCN1A 단백질에 특이적이다.
실시예 16: SCNA -특이적 천연 안티센스 전사체를 표적으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오티드들로 처리된 Dravet 증후군-연관된 돌연변이를 나르는 주요 인간 섬유아세포들에서 악틴 단백질은 상향조절되지 않는다.
본 실험의 목적은 SCN1A 단백질을 상향조절할 수 있는 SCN1A-특이적 천연 안티센스 전사체를 표적으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오티드(CUR-1740, CUR- 1764, CUR-1770, CUR-1838 및 CUR-1916)가 Dravet 증후군-연관된 돌연변이를 나르는 주요 인간 섬유아세포들에서 악틴과 같은 무관한 유전자의 단백질 발현을 또한 조절할 수 있는 지를 점검하는 것이었다.
재료 및 방법들 . Dr. N. Kenyon (University of Miami)에 의해 배양물로 도입된 Dravet 증후군-연관된 돌연변이를 나르는 주요 인간 피부 섬유아세포들은 실시예 8에서 설명한 것과 같은 동일한 조건에서 성장시켰다. 세포들은 실시예 8에서 설명한 것과 정확하게 동일한 조건에서 고정시키고, 착색시켰지만, 단, 제 1 항체는 1:500의 희석에 이용된 토끼 항-악틴(Abeam cat#abl801)이었다. 세포의 착색은 실시예 8에서 설명한 것과 동일한 과정을 이용하여 24개-웰 플레이트의 웰 내부에서 직접적으로 분석하였다.
결과 : 도 18에 나타낸 것과 같이, 테스트된 어떠한 안티센스 올리고뉴클레오티드들도 악틴 단백질을 상향조절하지 않았다. 따라서, 이들 올리고뉴클레오티드는 SCN1A 단백질에 특이적이다.
실시예 17: SCNA -특이적 천연 안티센스 전사체를 표적으로 하는 올리고뉴클레오티드들로 처리된 Dravet 증후군-연관된 돌연변이를 나르는 주요 인간 섬유아세포들에서 ELISA 를 이용한 SCNA 단백질의 정량화
본 실험의 목적은 Dravet 증후군-연관된 돌연변이를 나르는 주요 인간 섬유아세포들에서 SCN1A-특이적 천연 안티센스 전사체를 표적으로 하는 올리고뉴클레오티드들(CUR-1740, CUR-1770 및 CUR-1916)로 처리함으로써 ELISA를 이용하여 SCN1A 단백질의 상향조절 수준을 정량화시키는 것이었다.
재료 및 방법들: Dr. N. Kenyon (University of Miami)에 의해 배양물로 도입된 Dravet 증후군-연관된 돌연변이를 나르는 섬유아세포들을 실시예 8에서 설명한 것과 동일한 조건하에서 성장시켰으나, 단, 투약에는 0 및 80nM 농도의 올리고뉴클레오티드만을 이용하였다. 그 다음 세포들을 카운트하였고, 96웰 플레이트에 재도말시켰다. 24시간 후, 이들 세포는 총 300㎕의 용적을 100㎕로 감소시킨 것을 제외하고 실시예 8 및 16에서 설명한 것과 정확하게 동일한 조건하에서 고정시켰다. 복제 웰은 모든 반응은 100㎕ 용적에서 실시한 것을 제외하고 실시예 8에서 설명된 것과 같이 악틴 및 SCN1A 항체들로 착색시켰다. 항-악틴 항체 희석은 1:500이었고, 항-SCN1A 희석은 1:250이었고, 그리고 항-마우스 희석은 1:250이었다. 또한, 디아미노벤지딘(DAB) 과산화효소 기질 용액 대신, 테트라메틸벤지딘(TMB) 과산화효소 기질 용액을 이용하였다(Thermo Scientific cat#N301). 상청액이 청색으로 변화된 후, 새로운 96웰 플레이트(Greiner bio one cat #65121)로 옮겼고, 1 M 황산을 추가하였다. 흡수도는 Multiskan Spectrum 분광광도계(Thermo Scientific)를 이용하여 450nm에서 판독하였다. 모든 SCN1A 및 악틴 판독으로부터 배경 신호(1차 항체로 항-마우스로 착색된 웰에서 판독된)를 차감시켰다. 그 다음 각 조건에서 악틴 신호에 대해 SCN1A 신호를 표준화시켰다.
결과 : 도 19는 테스트된 모든 안티센스 올리고뉴클레오티드(CUR-1740, CUR-1770 및 CUR-1916)가 최대 40%까지 SCN1A 단백질을 상향조절하는데 효과적이었다는 것을 보여준다.
실시예 18: SCNA -특이적 천연 안티센스 전사체를 표적으로 하는 올리고뉴클레오티드들로 처리된 Vero 76 세포들에서 ELISA 를 이용한 SCNA 단백질의 정량화
본 실험의 목적은 Dravet 증후군-연관된 돌연변이를 나르는 주요 인간 섬유아세포들에서 SCN1A-특이적 천연 안티센스 전사체를 표적으로 하는 올리고뉴클레오티드들(CUR-1740, CUR-1770, CUR-1916, CUR-1924 및 CUR-1945)로 처리함으로써 ELISA를 이용하여 SCN1A 단백질의 상향조절 수준을 정량화시키는 것이었다.
재료 및 방법들 : Vero 76 아프리카 녹색 원숭이 배아 신장 세포들은 실시예 10에서 설명한 것과 동일한 조건하에서 성장시켰으나, 단지 투약에는 0 및 80nM 농도의 올리고뉴클레오티드만을 이용하였다. 그 다음 세포들을 카운트하였고, 96웰 플레이트에 재도말시켰다. 24시간 후, 이들 세포는 총 300㎕의 용적을 100㎕로 감소시킨 것을 제외하고 실시예 8에서 설명한 것과 정확하게 동일한 조건하에서 고정시켰다. 복제 웰은 모든 반응은 100㎕ 용적에서 실시한 것을 제외하고 실시예 10 및 15에서 설명된 것과 같이 악틴 및 SCN1A 항체들로 착색시켰고, 항-악틴 항체 희석은 1:500이었고, 항-SCN1A 희석은 1:250이었고, 그리고 항-마우스 희석은 1:250이었다. 또한, 디아미노벤지딘(DAB) 과산화효소 기질 용액 대신, 테트라메틸벤지딘(TMB) 과산화효소 기질 용액을 이용하였다(Thermo Scientific cat#N301). 상청액이 청색으로 변화된 후, 새로운 96웰 플레이트(Greiner bio one cat #65121)로 옮겼고, 1 M 황산을 추가하였다. 흡수도는 Multiskan Spectrum 분광광도계(Thermo Scientific)를 이용하여 450nm에서 판독하였다. 모든 SCN1A 및 악틴 판독으로부터 배경 신호(1차 항체로 항-마우스로 착색된 웰에서 판독된)를 차감시켰다. 그 다음 각 조건에서 악틴 신호에 대해 SCN1A 신호를 표준화시켰다.
결과 : 도 20은 테스트된 모든 안티센스 올리고뉴클레오티드(CUR-1740, CUR-1770, CUR-1916, CUR-1924 및 CUR-1945)가 최대 300%까지 SCN1A 단백질을 상향조절하는데 효과적이었다는 것을 보여준다.
실시예 19: SCNA -특이적 천연 안티센스 전사체를 표적으로 하는 올리고뉴클레오티드들로 처리된 SK-N-AS 세포들에서 ELISA 를 이용한 SCNA 단백질의 정량화
본 실험의 목적은 SK-N-AS 세포들에서 SCN1A-특이적 천연 안티센스 전사체를 표적으로 하는 올리고뉴클레오티드들(CUR-1740, CUR-1770, CUR-1924 및 CUR-1945)로 처리함으로써 ELISA를 이용하여 SCN1A 단백질의 상향조절 수준을 정량화시키는 것이었다.
재료 및 방법들 : SK-N-AS 인간 신경아종 세포들(ATCC cat#CRL-2137)은 실시예 10에서 설명한 것과 동일한 조건하에서 성장시켰으나, 단지 투약에는 0 및 20nM 농도의 올리고뉴클레오티드만을 이용하였다. 그 다음 세포들을 카운트하였고, 96웰 플레이트에 재도말시켰다. 24시간 후, 이들 세포는 총 300㎕의 용적을 100㎕로 감소시킨 것을 제외하고 실시예 9에서 설명한 것과 정확하게 동일한 조건하에서 고정시켰다. 복제 웰은 모든 반응은 100㎕ 용적에서 실시한 것을 제외하고 실시예 9 및 13에서 설명된 것과 같이 악틴 및 SCN1A 항체들로 착색시켰고, 항-악틴 항체 희석은 1:500이었고, 항-SCN1A 희석은 1:250이었고, 그리고 항-마우스 희석은 1:250이었다. 또한, 디아미노벤지딘(DAB) 과산화효소 기질 용액 대신, 테트라메틸벤지딘(TMB) 과산화효소 기질 용액을 이용하였다(Thermo Scientific cat#N301). 상청액이 청색으로 변화된 후, 새로운 96웰 플레이트(Greiner bio one cat #65121)로 옮겼고, 1 M 황산을 추가하였다. 흡수도는 Multiskan Spectrum 분광광도계(Thermo Scientific)를 이용하여 450nm에서 판독하였다. 모든 SCN1A 및 악틴 판독으로부터 배경 신호(1차 항체로 항-마우스로 착색된 웰에서 판독된)를 차감시켰다. 그 다음 각 조건에서 악틴 신호에 대해 SCN1A 신호를 표준화시켰다.
결과 : 도 21은 테스트된 모든 안티센스 올리고뉴클레오티드(CUR-1740, CUR-1770, CUR-1924 및 CUR-1945)가 SK-N-AS 세포들에서 최대 500%까지 SCN1A 단백질을 상향조절하는데 효과적이었다는 것을 보여준다.
실시예 20: HepG2 세포들과 Dravet 증후군-연관된 돌연변이를 나르는 주요 인간 섬유아세포들에서 천연 안티센스 BG724147 의 탐지.
본 실험의 목적은 인간 간세포 암종 HepG2 세포계와 Dravet 증후군-연관된 돌연변이를 나르는 주요 인간 섬유아세포 안에 천연 안티센스 BG724147이 존재하는지를 판단하는 것이었다. 이를 위하여 두 가지 상이한 RNA(폴리 A RNA 와 총 RNA)를 이용하였다. 두 가지 세포 유형을 모두 이용한 2회 연속 PCR후 수득한 PCR 산물들을 겔 상에서 분석하였다. BG724147-특이적 프라이머를 이용한 유사한 크기의 밴드들의 증폭은 두 가지 세포 유형 모두에 BG724147의 존재를 확인시켰다.
재료 및 방법들 :
총 RNA 의 단리 . 75 cm2 배양 플라스크에서 80% 합류로 성장한 HepG2 세포들 또는 Dravet 증후군-연관된 돌연변이를 나르는 주요 인간 섬유아세포들은 PBS AccuGENE 1X (Lonza Rockeland Inc., Rockeland, ME)로 2회 세척하였다. PBS를 버린 후, b-멀캅토에탄올(QIAGEN Inc-USA, Valencia, CA)과 RLT 5 ml을 이들 세포에 추가하였고, 세포 용해물은 전체 RNA가 단리될 때까지 -80℃에서 마이크로원심분리 튜브 안 1ml 방울에 보관하였다. 이들 세포로부터 전체 RNA의 단리는 RNeasy midi 키트(QIAGEN Inc.-USA, Valencia, CA)를 이용하여 제조업자의 프로토콜에 따라 실행하였다. 간략하게 설명하자면, 세포 용해물은 5분간 3000xg에서 원심분리하여 용해물을 맑게 하고, 임의의 펠렛은 버렸다. 맑아진 세포 용해물은 14800xg에서 QIAshredder 컬럼(내부 2 ml 마이크로원심분리 튜브)을 통하여 원심분리하였고, 생성된 균질화된 용해물은 동일한 용적의 70% 에탄올과 혼합시켰다. 에탄올과 혼합된 세포 용해물을 RNeasy midi 컬럼(내부 15 ml 원뿔형 튜브)에 제공하였고, 그리고 3000xg에서 5분간 원심분리하였다. 컬럼은 4 ml의 RW1 완충액으로 1회 세척하였고, 그 다음 RDD 완충액내 140㎕의 RNase-없는 DNase로 15분 컬럼상에서(on-column) DNase 절단시켰다. DNase 절단은 4 ml의 RW1 완충액을 추가하여 중단시켰고, 그리고 3000xg에서 컬럼을 원심분리시켰다. 컬럼은 RPE 완충액으로 2회 세척시키고, 필터에 결합된 전체 RNA는 150㎕의 DNase 및 RNAse 없는 물로 용리시켰다. RNA는 다음 단계까지 -80℃에 보관하였다.
HepG2 세포의 총 RNA 로부터 폴리 -A RNA 의 단리 . HepG2 세포 및 Dravet 증후군-연관된 돌연변이를 나르는 주요 인간 섬유아세포의 총 RNA로부터 폴리 A RNA의 단리는 Ambion (Applied Biosystems/Ambion, Austin, TX)의 자석 비드 키트와 함께 폴리-A 단리를 이용하여 제조업자의 프로토콜에 따라 실행하였다. 기본적으로, 100 μg의 전체 RNA를 DNase/RNAse 없는 물에서 최종 농도가 600 μg/ml이 되도록 재현탁시키고, 동용적의 2X 결합 용액을 첨가하였다. 이 시간 동안 10 ㎕의 0ligo(dT) 자석 비드를 마이크로원심분리 튜브 안에 두고, 이 튜브는 자석 스탠드에 위치시켜 고정되어 있으며, 저장 완충액을 버렸다. 50 ㎕의 세척 용액 1을 비드에 추가하였고, 튜브는 자석 스탠드로부터 빼내었고, 세척 용액을 버렸다. 이때, 1X 결합 완충액내 HepG2 세포로부터 총 RNA는 자석 비드와 함께 혼합시켰고, 70℃에서 5분간 가열하였고, 그 다음 부드럽게 교반시키면서 실온에서 60분 동안 항온처리하였다. 자석 비드에 결합된 폴리 A RNA는 5분간 자석 스탠드를 이용하여 붙잡았다. 상청액은 버렸다. 0ligo(dT) 자석 비드는 세척 용액 1로 2회 세척하였고, 세척 용액 2로 1회 세척하여 비-특이적으로 결합된 RNA를 제거하였다. 자석 비드는 자석 스탠드로 잡아두었고, 200㎕의 따뜻한 RNA 저장 용액(5분간 70℃에서 사전-가열시킨)을 비드에 추가하였다. 자석 비드는 자석 스탠드로 붙잡아두었고, 상청액은 보관하였다(폴리 A RNA의 제 1 용리액). 그 다음 두 번째 200㎕의 따뜻한 RNA 저장 용액(5분간 70℃에서 사전-가열시킨)을 비드에 추가하였다. 폴리 A RNA의 두 번째 용리액을 첫 번째 용리액에 추가하였다. 이때, 용리된 RNA는 5 M 암모늄 아세테이트, 글리코겐 및 100% 에탄올을 이용하여 20℃에서 하룻밤 동안 침전시켰다. 폴리 RNA는 4℃에서 30분간 14800xg에서 원심분리시켰다. 상청액은 버렸고, RNA 펠렛은 1 ml의 70% 에탄올로 3회 세척하였고, 4℃에서 10분간 원심분리시킴으로써 매회 RNA 펠렛을 회수하였다. 끝으로, 폴리 A RNA 펠렛은 RNA를 더 잘 용해시키기 위하여 70℃로 사전-가열시킨 RNA 보관 용액에서 재현탁시켰다. 폴리 A RNA는 -80 ℃에 보관하였다.
RNA 전사체의 3' 단부에 아데노신 추가. HepG2 세포들 또는 Dravet 증후군-연관된 돌연변이를 나르는 주요 인간 섬유아세포들로부터 총 RNA(40μg)은 100 μl (Ambion, Applied Biosystems, St. Austin TX)의 최종 반응 용적을 이용하여 2 단위(unit)의 RNA Poly (A) 중합효소(Polymerase)와 혼합하였다. 폴리아데닐화 반응에 이용한 ATP는 Invitrogen의 것이었다. 폴리아데닐화 후, RNA는 페놀 클로로포름 기술을 이용하여 정제하였고, 이어서 글리코겐/아세테이트 나트륨 침전시켰다. 이 RNA는 40 μl의 DNAse/RNAse 없는 물에 재현탁시켰고, 그리고 3 'RACE 반응(FirstChoice RLM-RACE kit from Ambion, Applied Biosystems, St. Austin TX)에 이용하였다.
SCN1A의 BG724147 천연 안티센스 전사체의 3' 연장. 두 가지 상이한 세트의 cDNA Ends (RACE) 반응의 3' 신속한 증폭은 FirstChoice RLM-RACE 키트(Ambion, Applied Biosystems (St. Austin, TX))를 이용하여 실시하였다. 한 개 세트는 HepG2 세포들 또는 Dravet 증후군-연관된 돌연변이를 나르는 주요 인간 섬유아세포들로부터 얻은 폴리 A RNA를 이용하였고, 다른 세트는 한 개 아데노신이 추가된, 총 RNA를 이용하였다. 2가지 연속 PCR 라운드를 실행하였다. 첫 번째 PCR은 키트에서 공급된 3' 아우터(outer) 프라이머와 OPKO CURNA에 의해 기획된 BG724147에 특이적인 5' 프라이머 (5' GATTCTCCTACAGCAATTGGTA 3')를 이용하여 실시하였다. 두 번째 PCR 라운드는 키트에서 공급된 3' 아우터(outer) 프라이머와 OPKO CURNA에 의해 기획된 BG724147에 특이적인 상이한 5' 프라이머(5' GACATGTAATCACTTTCATCAA 3')를 이용하였다. 두 번째 PCR 반응 산물을 1% 아가로즈-1xTAE 겔 상에서 이동시켰다.
결과: 도 22는 HepG2 세포들로부터 추가된 아데노신과 함께 폴리 A RNA와 전체 RNA를 이용하고, 그리고 Dravet 증후군-연관된 돌연변이를 나르는 주요 인간 섬유아세포들로부터 추가된 아데노신과 함께 폴리 A RNA와 전체 RNA를 이용하여 3 ' RACE 실험들로부터 두 번째 PCR 반응의 산물들을 나타낸다. HepG2 세포들과 Dravet 증후군-연관된 돌연변이를 나르는 주요 인간 섬유아세포들의 폴리 A RNA에서 동일한 밴드가 관찰된다.
결론 : SCN1A의 BG724147 천연 안티센스 전사체에 특이적인 프라이머들을 이용한 PCR 증폭은 두 가지 상이한 세포들(HepG2 세포와 Dravet 증후군-연관된 돌연변이를 나르는 주요 인간 섬유아세포들)에서 공통적인 PCR 밴드를 만들었다. 또한, SCN1A 천연 안티센스 BG724147을 표적으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오티드들은 실시예 2, 7 및 16에서 나타낸 것과 같이, 이들 세포에서 SCN1A mRNA 및 단백질을 상향조절하는 것으로 나타났다. 이들 데이터에서 BG724147은 두 가지 종류의 세포들(HepG2 세포와 Dravet 증후군-연관된 돌연변이를 나르는 주요 인간 섬유아세포들)에 실재로 존재함을 나타낸다.
실시예 21: SCNA 천연 안티센스 서열 BG724147 의 연장
본 실험의 목적은 이들 서열 모두를 서열화함으로써 SCN1A 천연 안티센스 BG724147의 공지 서열을 늘리는 것이다. 고유 BG724147 RNA 전사체는 Miklos Palkovits의 주선에 의해 인간 고환으로부터 구하였다. cDNA 라이브러리는 Michael J. Brownstein (at NHGRI), Shiraki Toshiyuki and Piero Carninci (RIKEN에서)에 의해 pBluescriptR 벡터에서 준비하였다. cDNA 라이브러리는 I.M.A.G.E. Consortium (또는 LLNL)에 의해 배열시켰고, 그리고 클론들은 2001년 5월에 Incyte Genomics, Inc.에 의해 서열화되었다. BG724147 클론은 Open Biosystems (Open Biosystems Products, Huntsville, AL)에서 이용가능하다. 2001년, BG724147 클론에서 cDNA 삽업물이 완벽하게 서열화되지 않았다. OPKO-CURNA는 BG724147 클론을 구하였고, 온전한 삽입체를 서열화하였다. 이를 이루기 위하여, BG724147 삽입체를 가진 플라스미드를 함유하는 박테리아 클론을 Open Biosystems으로부터 수득하였고, 개별 콜로니를 단리하기 위하여 암피실린이 포함된 Luria Bertani (LB)-한천 플레이트에 도말시켰다. 그 다음 콜로니는 5 ml의 LB 브로스에서 증폭시켰다. BG724147 삽입체를 포함하는 플라스미드는 이들 박테리아로부터 단리시켰고, 서열화를 위하여 Davis Sequencing (Davis, CA)로 발송하였다.
재료 및 방법들
SCNA 천연 안티센스 BG724147 를 위하여 cDNA 를 포함하는 플라스미드의 단리 및 서열화. BG724147 플라스미드를 함유하는 냉동 박테리아의 현탁액을 Open Biosystems (Open Biosystems Products, cat# 4829512)으로부터 구입하였고, 1:10, 1:100, 1:1000, 1:10000, 1:100000 배로 희석시켰고, 그 다음 100 μg/ml의 암피실린(Calbiochem, cat#171254)과 함께 Luria Bertani (LB) (BD, cat# 244520)-한천 플레이트(Falcon, cat#351005)에 도말하였다. 15시간 후, 20개의 박테리아의 개별 클론들을 플레이트로부터 1:100000 희석으로 단리시켰고, 5 ml의 LB 브로스(Fisher Scientific, cat# BP1426-2)에서 15시간-24시간 동안 별도로 성장시켰다. 이때, 박테리아를 펠렛화시켰고, 플라스미드(BG724147 RNA 전사체의 cDNA를 함유하는)는 제조업자의 프로토콜에 따라 PureYieldTM Plasmid Miniprep System 키트(Promega사 (Promega, cat#A1222))를 이용하여 단리하였다. 단리된 DNA를 200 ng/ml로 희석시켰고, 각 콜로니로부터 12 μl의 플라스미드는 서열화를 위하여 Davis sequencing (Davis, CA)으로 발송하였다.
결과 : Davis sequencing로부터 수득한 서열들은 연장된 BG724147(서열 번호: 12)을 제공한다.
결론 : 403개 뉴클레오티드에 의해 공지의 BG724147 서열의 성공적인 연장은 SCN1A 천연 안티센스 전사체 BG724147에 대한 안티센스 올리고뉴클레오티드를 기획하는 기초로 삼았다.
본 발명이 하나 이상의 실행에 관하여 예시되고 설명되었지만, 본 명세서 및 첨부된 도면을 읽고 이해하는 당업자에게 동등한 개변은 명백할 것이다. 이에 더하여, 본 발명의 특정한 특징이 여러 실행 중에서 단지 하나에 관하여 개시되고 있긴 하지만, 이와 같은 특징은 임의의 소정의 또는 특정한 적용을 위하여 바람직하고 유리한 경우에, 다른 실행의 하나 이상의 다른 특징과 복합될 수 있다.
내용의 요약은 독자가 기술 내용의 성격을 신속하게 확인할 수 있도록 도와줄 것이다. 이는 아래의 특허청구범위의 범위 또는 의미를 해석하거나 제한하는데 이용되지 않는 것으로 이해되어야 한다.
SEQUENCE LISTING <110> OPKO CURNA LLC <120> TREATMENT OF SODIUM CHANNEL, VOLTAGE-GATED, TYPE I, ALPHA SUBUNIT (SCN1A) RELATED DISEASES BY INHIBITION OF NATURAL ANTISENSE TRANSCRIPT TO SCN1A <130> SCN1A <150> US61/357,774 <151> 2010-06-23 <160> 96 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 8133 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 aatgtgcagg atgacaagat ggagcaaaca gtgcttgtac caccaggacc tgacagcttc 60 aacttcttca ccagagaatc tcttgcggct attgaaagac gcattgcaga agaaaaggca 120 aagaatccca aaccagacaa aaaagatgac gacgaaaatg gcccaaagcc aaatagtgac 180 ttggaagctg gaaagaacct tccatttatt tatggagaca ttcctccaga gatggtgtca 240 gagcccctgg aggacctgga cccctactat atcaataaga aaacttttat agtattgaat 300 aaagggaagg ccatcttccg gttcagtgcc acctctgccc tgtacatttt aactcccttc 360 aatcctctta ggaaaatagc tattaagatt ttggtacatt cattattcag catgctaatt 420 atgtgcacta ttttgacaaa ctgtgtgttt atgacaatga gtaaccctcc tgattggaca 480 aagaatgtag aatacacctt cacaggaata tatacttttg aatcacttat aaaaattatt 540 gcaaggggat tctgtttaga agattttact 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Antisense oligonucleotide <400> 33 gtagaagaac agcccgtagt g 21 <210> 34 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 34 gtggtctctg cattctgtca 20 <210> 35 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 35 gtggtatagg aactggcagc a 21 <210> 36 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 36 gtccaatcat acagcagaa 19 <210> 37 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 37 gtgactgtac caattgctgt 20 <210> 38 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 38 acttcttcca ctccttcct 19 <210> 39 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 39 gatgtccctt cctgcgttgt 20 <210> 40 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 40 tgtggatgct gggtgtctct c 21 <210> 41 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 41 tcccagtgac tcccgatgct 20 <210> 42 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 42 agtctcagtt gtcagtacct c 21 <210> 43 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 43 gttattgaat gccctggtgt 20 <210> 44 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 44 tcggatcatc agggttgtag t 21 <210> 45 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 45 gtggtatagg aactggcagc a 21 <210> 46 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 46 tctgctcttc cctacattgg 20 <210> 47 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 47 gtaatctgct cttccctac 19 <210> 48 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 48 gggagaactt gagagcaaca g 21 <210> 49 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 49 gccagtcaca aattcagatc a 21 <210> 50 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 50 gtataggaac tggca 15 <210> 51 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 51 gtggtatagg aactg 15 <210> 52 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 52 mgmumggmua muaggaamct ggmcamgmcm a 31 <210> 53 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 53 agaacttgag agcaa 15 <210> 54 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 54 mgmgmgagaa mctmugagag mcaamcmamg 30 <210> 55 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 55 gccagtcaca aattc 15 <210> 56 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 56 cacaaattca gatca 15 <210> 57 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 57 mgmcmcagtm cacaaamutm cagamumcma 30 <210> 58 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 58 rarururura rararcrarc rgrgrararg rarcrururu rargrurarg rurg 54 <210> 59 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 59 rurcrarcra rararururc rargrarurc rarcrcrcra rurcrururc rura 54 <210> 60 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 60 gtggtatagg aactg 15 <210> 61 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 61 mgmumggmua muaggaamct ggmcamgmcm a 31 <210> 62 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 62 gccagtcaca aattc 15 <210> 63 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 63 cacaaattca gatca 15 <210> 64 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 64 mgmgmuamua ggmaacmugg mcagmcagmu gmumumg 37 <210> 65 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 65 mumgmgtamu agmgaamctg gmcagcmamg mu 32 <210> 66 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 66 mggtamuagg aamctggmca gmcagtgttm g 31 <210> 67 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 67 mamagmcggm uataggaamc tggmcagmca mg 32 <210> 68 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 68 gtggcatagg gacgggcagc a 21 <210> 69 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 69 mgmumggmca muagmggamc gggmcamgmc ma 32 <210> 70 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 70 mgmamgccag mucamcaaam utcagmatca mcmcmc 36 <210> 71 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 71 maamugggag aamcmumuga gagmcmama 29 <210> 72 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 72 mamcmamamg muggcatagg gacggmgmcm amgmcma 37 <210> 73 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 73 mamcaagmug gmcatamggg amcgggmcag mcma 34 <210> 74 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 74 maagmuggmc amuagmggam cgggmcagmc agmu 34 <210> 75 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 75 mamamgmumg gcatagggac gggcamgmcm amgmu 35 <210> 76 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 76 gtgactgtgc ccattgctg 19 <210> 77 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 77 gccacttgat gatctaaac 19 <210> 78 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 78 gtggacagga tgcacaaagg a 21 <210> 79 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 79 mgtgacmugt gccmcattgc tmg 23 <210> 80 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 80 mgtgactgtg cccattgctm g 21 <210> 81 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 81 mcctcmuttc muggcmcttg mcttmc 26 <210> 82 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 82 mgacaamcct tgmcagccam ctgamugatg ma 32 <210> 83 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 83 tggtatagga actggcagca 20 <210> 84 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 84 mumggmuamu aggaamctgg mcamgmcma 29 <210> 85 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 85 mcmcagtmca caaamutmca gamumcma 28 <210> 86 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 86 mumggmuamu aggaamctgg mcamgmcma 29 <210> 87 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 87 mamgccagmu camcaaamut cagmatcamc mcmc 34 <210> 88 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 88 mgmccagmuc amcaaamutc mamg 24 <210> 89 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 89 mgmccagmuc amcaaamumu mc 22 <210> 90 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 90 gccagmucam caamamutc 19 <210> 91 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 91 gccagtcaca aattc 15 <210> 92 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 92 gcmcagmuca mcamaat 17 <210> 93 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 93 gccagtcaca aat 13 <210> 94 <211> 11 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 94 gccagtcaca a 11 <210> 95 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse complement of the antisense oligonucleotide SEQ ID NO: 48 <400> 95 rcrurarcru rararargru rcrururcrc rgrurgruru ruraraat 48 <210> 96 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse complement of the antisense oligonucleotide SEQ ID NO: 49 <400> 96 rgrarargra rurgrgrgru rgrarurcru rgrararuru rurgruga 48

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  18. 서열 번호: 12 내지 28 중 어느 하나로 구성된, 전압 작동 나트륨 통로, 알파 소단위 (SCNA) 유전자의 자연 안티센스 폴리뉴클레오티드를 표적함으로써, 서열 번호:1 내지 11 중 어느 하나에 제시된 SCNA 유전자의 발현을 상향조절하는 합성, 변형된 올리고뉴클레오티드에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드는 서열 번호:70의 서열로 구성되며, 상기 올리고뉴클레오티드는 SCNA 유전자의 자연 안티센스 폴리뉴클레오티드에 혼성화되어, 정상적인 대조와 비교하여 생체내에서 또는 시험관내에서 SCNA의 기능 또는 발현 또는 기능 및 발현을 상향조절하는 안티센스 화합물인 것을 특징으로 하는 합성, 변형된 올리고뉴클레오티드.
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  20. 청구항 18에 있어서, 최소한 하나의 변형은 포스포로티오에이트, 알킬포스포네이트, 포스포로디티오에이트, 알킬포스포노티오에이트, 포스포라미데이트, 카르바메이트, 카보네이트, 포스페이트 트리에스테르, 아세트아미데이트, 카르복시메틸 에스테르, 그리고 이들의 조합으로 구성된 군에서 선택되는 뉴클레오티드간 연쇄를 포함하는 것을 특징으로 하는 합성, 변형된 올리고뉴클레오티드.
  21. 청구항 20에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드는 최소한 하나의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연쇄를 포함하는 것을 특징으로 하는 합성, 변형된 올리고뉴클레오티드.
  22. 청구항 20에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드는 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연쇄의 골격을 포함하는 것을 특징으로 하는 합성, 변형된 올리고뉴클레오티드.
  23. 청구항 20에 있어서, 올리고뉴클레오티드는 최소한 하나의 변형된 뉴클레오티드를 포함하고, 상기 변형된 뉴클레오티드는 펩티드 핵산, 잠금된 핵산 (LNA), 그리고 이들의 조합에서 선택되는 것을 특징으로 하는 합성, 변형된 올리고뉴클레오티드.
  24. 청구항 18에 있어서, 올리고뉴클레오티드는 복수의 변형을 포함하고, 여기서 상기 변형은 포스포로티오에이트, 알킬포스포네이트, 포스포로디티오에이트, 알킬포스포노티오에이트, 포스포라미데이트, 카르바메이트, 카보네이트, 포스페이트 트리에스테르, 아세트아미데이트, 카르복시메틸 에스테르, 그리고 이들의 조합에서 선택되는 변형된 뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 합성, 변형된 올리고뉴클레오티드.
  25. 청구항 18에 있어서, 올리고뉴클레오티드는 복수의 변형을 포함하고, 여기서 상기 변형은 펩티드 핵산, 잠금된 핵산 (LNA), 그리고 이들의 조합에서 선택되는 변형된 뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 합성, 변형된 올리고뉴클레오티드.
  26. 청구항 18에 있어서, 올리고뉴클레오티드는 2'-O-메톡시에틸 변형된 당 모이어티, 2'-메톡시 변형된 당 모이어티, 2'-O-알킬 변형된 당 모이어티, 이중환상 당 모이어티, 그리고 이들의 조합에서 선택되는 최소한 하나의 변형된 당 모이어티를 포함하는 것을 특징으로 하는 합성, 변형된 올리고뉴클레오티드.
  27. 청구항 18에 있어서, 올리고뉴클레오티드는 복수의 변형을 포함하고, 여기서 상기 변형은 2'-O-메톡시에틸 변형된 당 모이어티, 2'-메톡시 변형된 당 모이어티, 2'-O-알킬 변형된 당 모이어티, 이중환상 당 모이어티, 그리고 이들의 조합에서 선택되는 변형된 당 모이어티를 포함하는 것을 특징으로 하는 합성, 변형된 올리고뉴클레오티드.
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  32. 최소한 하나의 전압 작동 나트륨 통로, 알파 소단위(SCNA) 폴리뉴클레오티드 또는 이의 최소한 하나의 인코딩된 산물과 연관된 질환을 예방하거나 치료하는, 청구항 18에 따른 하나 이상의 올리고뉴클레오티드와 약제학적으로 수용가능한 부형제를 포함하는 약학 조성물에 있어서, SCNA 폴리뉴클레오티드 또는 이의 최소한 하나의 인코딩된 산물과 연관된 질환은 영아기 중증 근간대성 간질(SMEI 또는 Dravet 증후군)인 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
PT2585596T (pt) 2010-06-23 2021-03-23 Curna Inc Tratamento de doenças relacionadas com a subunidade alfa de canais de sódio dependentes de voltagem (scna) por inibição da transcrição antissentido natural para scna
EP2638163B1 (en) 2010-11-12 2017-05-17 The General Hospital Corporation Polycomb-associated non-coding rnas
US9920317B2 (en) 2010-11-12 2018-03-20 The General Hospital Corporation Polycomb-associated non-coding RNAs
MX365525B (es) 2011-09-06 2019-06-06 Curna Inc Compuestos que regulan la expresión de subunidades alfa de canales de sodio regulados por voltaje en enfermedades relacionadas con epilepsia mioclónica severa de la infancia.
CN104583399A (zh) 2012-05-16 2015-04-29 Rana医疗有限公司 用于调节血红蛋白基因家族表达的组合物和方法
CA2873766A1 (en) 2012-05-16 2013-11-21 Rana Therapeutics Inc. Compositions and methods for modulating atp2a2 expression
SG11201407483YA (en) 2012-05-16 2014-12-30 Rana Therapeutics Inc Compositions and methods for modulating smn gene family expression
US10837014B2 (en) 2012-05-16 2020-11-17 Translate Bio Ma, Inc. Compositions and methods for modulating SMN gene family expression
WO2013173645A1 (en) 2012-05-16 2013-11-21 Rana Therapeutics, Inc. Compositions and methods for modulating utrn expression
CN104583402A (zh) 2012-05-16 2015-04-29 Rana医疗有限公司 用于调节mecp2表达的组合物和方法
WO2015020993A2 (en) * 2013-08-05 2015-02-12 The Trustees Of The University Of Pennsylvania RNAi COMPOSITIONS AND METHODS FOR TREATMENT OF FRIEDREICH'S ATAXIA
GB201410693D0 (en) 2014-06-16 2014-07-30 Univ Southampton Splicing modulation
WO2016054615A2 (en) 2014-10-03 2016-04-07 Cold Spring Harbor Laboratory Targeted augmentation of nuclear gene output
EP3212824A4 (en) 2014-10-30 2018-08-08 The General Hospital Corporation Methods for modulating atrx-dependent gene repression
WO2016130943A1 (en) 2015-02-13 2016-08-18 Rana Therapeutics, Inc. Hybrid oligonucleotides and uses thereof
WO2016149455A2 (en) 2015-03-17 2016-09-22 The General Hospital Corporation The rna interactome of polycomb repressive complex 1 (prc1)
WO2017060731A1 (en) 2015-10-09 2017-04-13 University Of Southampton Modulation of gene expression and screening for deregulated protein expression
CN105385688A (zh) * 2015-11-05 2016-03-09 宁波市医疗中心李惠利医院 一种与长QT综合征相关的miRNA及其应用
US11096956B2 (en) 2015-12-14 2021-08-24 Stoke Therapeutics, Inc. Antisense oligomers and uses thereof
EP3390636B1 (en) * 2015-12-14 2021-05-19 Cold Spring Harbor Laboratory Antisense oligomers for treatment of dravet syndrome
JP2019521176A (ja) * 2016-07-18 2019-07-25 ジャーン バイオセラピューティクス エルエルシーＪａａｎ Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ， Ｌｌｃ 心疾患の処置のための組成物及び方法
SG11201905601VA (en) * 2017-01-24 2019-08-27 Olipass Corp Scn9a antisense pain killer
TW202315946A (zh) 2017-04-03 2023-04-16 美商編碼製藥公司 組織選擇性轉基因表現
CA3073515A1 (en) 2017-08-25 2019-02-28 Stoke Therapeutics, Inc. Antisense oligomers for treatment of conditions and diseases
US11713463B2 (en) 2018-01-17 2023-08-01 The Florey Institute Of Neuroscience And Mental Health Compositions and methods for increasing expression of SCN2A
WO2019224864A1 (ja) * 2018-05-21 2019-11-28 国立研究開発法人理化学研究所 Ｓｃｎ１ａ遺伝子の発現増強法とそれによるドラベ症候群の治療法
US20210215665A1 (en) * 2018-05-25 2021-07-15 Rogcon U.R., Inc. Dynamic clamps and methods of use thereof
CN113329739A (zh) 2018-08-20 2021-08-31 罗贡股份有限公司 用于治疗scn1a脑病的靶向scn2a的反义寡核苷酸
WO2020154462A1 (en) * 2019-01-23 2020-07-30 Rogcon U.R., Inc. Antisense oligonucleotides targeting scn2a retained introns
EP3931329A4 (en) * 2019-02-27 2023-12-13 Stoke Therapeutics, Inc. ANTISENSE OLIGOMERS FOR THE TREATMENT OF SUFFERINGS AND DISEASES
AU2020375040A1 (en) * 2019-11-01 2022-05-19 Tevard Biosciences, Inc. Methods and compositions for treating a premature termination codon-mediated disorder
BR112022010882A2 (pt) * 2019-12-06 2022-10-04 Stoke Therapeutics Inc Oligômeros antissenso para tratamento de condições e doenças
CN115397467A (zh) * 2020-01-07 2022-11-25 住友制药株式会社 Tau蛋白病的治疗剂
TW202146652A (zh) * 2020-03-17 2021-12-16 日商大日本住友製藥股份有限公司 Ｓｃｎ１ａ基因之表現及／或功能調節劑
US20230287410A1 (en) 2020-05-11 2023-09-14 Stoke Therapeutics, Inc. Opa1 antisense oligomers for treatment of conditions and diseases
WO2023022974A2 (en) * 2021-08-16 2023-02-23 Editas Medicine, Inc. Treatment of pain
WO2024026122A2 (en) * 2022-07-29 2024-02-01 Stoke Therapeutics, Inc. Compounds for treatment of conditions and diseases

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20040203024A1 (en) 1996-06-06 2004-10-14 Baker Brenda F. Modified oligonucleotides for use in RNA interference
US20050186591A1 (en) 2003-06-09 2005-08-25 Alnylam Pharmaceuticals Method of treating neurodegenerative disease
US20070248590A1 (en) * 2005-12-02 2007-10-25 Sirtris Pharmaceuticals, Inc. Modulators of CDC2-like kinases (CLKS) and methods of use thereof

Family Cites Families (259)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
NZ207394A (en) 1983-03-08 1987-03-06 Commw Serum Lab Commission Detecting or determining sequence of amino acids
US4754065A (en) 1984-12-18 1988-06-28 Cetus Corporation Precursor to nucleic acid probe
US5034506A (en) 1985-03-15 1991-07-23 Anti-Gene Development Group Uncharged morpholino-based polymers having achiral intersubunit linkages
US5506337A (en) 1985-03-15 1996-04-09 Antivirals Inc. Morpholino-subunit combinatorial library and method
US4683202A (en) 1985-03-28 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying nucleic acid sequences
US4683195A (en) 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
US4800159A (en) 1986-02-07 1989-01-24 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or cloning nucleic acid sequences
US5288512A (en) 1987-12-15 1994-02-22 The Procter & Gamble Company Reduced calorie fats made from triglycerides containing medium and long chain fatty acids
NL8800756A (nl) 1988-03-25 1989-10-16 Vereniging Voor Christelijk Wetenschappelijk Onderwijs Genetisch gemanipuleerde plantecellen en planten, alsmede daarvoor bruikbaar recombinant dna.
US6203976B1 (en) 1989-07-18 2001-03-20 Osi Pharmaceuticals, Inc. Methods of preparing compositions comprising chemicals capable of transcriptional modulation
US5457189A (en) 1989-12-04 1995-10-10 Isis Pharmaceuticals Antisense oligonucleotide inhibition of papillomavirus
US5852188A (en) 1990-01-11 1998-12-22 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotides having chiral phosphorus linkages
US5459255A (en) 1990-01-11 1995-10-17 Isis Pharmaceuticals, Inc. N-2 substituted purines
US6034233A (en) 1990-05-04 2000-03-07 Isis Pharmaceuticals Inc. 2'-O-alkylated oligoribonucleotides and phosphorothioate analogs complementary to portions of the HIV genome
IE66205B1 (en) 1990-06-14 1995-12-13 Paul A Bartlett Polypeptide analogs
US5650489A (en) 1990-07-02 1997-07-22 The Arizona Board Of Regents Random bio-oligomer library, a method of synthesis thereof, and a method of use thereof
US5218105A (en) 1990-07-27 1993-06-08 Isis Pharmaceuticals Polyamine conjugated oligonucleotides
US5610289A (en) 1990-07-27 1997-03-11 Isis Pharmaceuticals, Inc. Backbone modified oligonucleotide analogues
US5138045A (en) 1990-07-27 1992-08-11 Isis Pharmaceuticals Polyamine conjugated oligonucleotides
US5432272A (en) 1990-10-09 1995-07-11 Benner; Steven A. Method for incorporating into a DNA or RNA oligonucleotide using nucleotides bearing heterocyclic bases
JP3150340B2 (ja) 1990-11-13 2001-03-26 イムネクス コーポレイション 二機能選択可能融合遺伝子
US6307040B1 (en) 1992-03-05 2001-10-23 Isis Pharmaceuticals, Inc. Sugar modified oligonucleotides that detect and modulate gene expression
US5474796A (en) 1991-09-04 1995-12-12 Protogene Laboratories, Inc. Method and apparatus for conducting an array of chemical reactions on a support surface
US5576302A (en) 1991-10-15 1996-11-19 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotides for modulating hepatitis C virus having phosphorothioate linkages of high chiral purity
US5661134A (en) 1991-10-15 1997-08-26 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotides for modulating Ha-ras or Ki-ras having phosphorothioate linkages of high chiral purity
DE59208572D1 (de) 1991-10-17 1997-07-10 Ciba Geigy Ag Bicyclische Nukleoside, Oligonukleotide, Verfahren zu deren Herstellung und Zwischenprodukte
US6335434B1 (en) 1998-06-16 2002-01-01 Isis Pharmaceuticals, Inc., Nucleosidic and non-nucleosidic folate conjugates
US5605662A (en) 1993-11-01 1997-02-25 Nanogen, Inc. Active programmable electronic devices for molecular biological analysis and diagnostics
US5573905A (en) 1992-03-30 1996-11-12 The Scripps Research Institute Encoded combinatorial chemical libraries
IL101600A (en) 1992-04-15 2000-02-29 Yissum Res Dev Co Synthetic partially phosphorothioated antisense oligodeoxynucleotides and pharmaceutical compositions containing them
US5288514A (en) 1992-09-14 1994-02-22 The Regents Of The University Of California Solid phase and combinatorial synthesis of benzodiazepine compounds on a solid support
US6710174B2 (en) 2001-09-13 2004-03-23 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense inhibition of vascular endothelial growth factor receptor-1 expression
AU674891B2 (en) 1992-10-15 1997-01-16 Toray Industries, Inc. Process for producing major histocompatibility antigen class II protein and material having the same immobilized thereon
ES2290951T3 (es) 1993-05-11 2008-02-16 The University Of North Carolina At Chapel Hill Oligonucleotidos antisentido que combaten el corte y empalme aberrante y metodos de uso de los mismos.
FR2705361B1 (fr) * 1993-05-18 1995-08-04 Centre Nat Rech Scient Vecteurs viraux et utilisation en thérapie génique.
EP0804590A1 (en) 1993-05-21 1997-11-05 Targeted Genetics Corporation Bifunctional selectable fusion genes based on the cytosine deaminase (cd) gene
CA2170869C (en) 1993-09-03 1999-09-14 Phillip Dan Cook Amine-derivatized nucleosides and oligonucleosides
US5491084A (en) 1993-09-10 1996-02-13 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Uses of green-fluorescent protein
JPH09506253A (ja) 1993-11-30 1997-06-24 マクギル・ユニヴァーシティ Ｄｎａメチルトランスフェラーゼの阻害
US5908779A (en) 1993-12-01 1999-06-01 University Of Connecticut Targeted RNA degradation using nuclear antisense RNA
US5519134A (en) 1994-01-11 1996-05-21 Isis Pharmaceuticals, Inc. Pyrrolidine-containing monomers and oligomers
US5593853A (en) 1994-02-09 1997-01-14 Martek Corporation Generation and screening of synthetic drug libraries
AU1925195A (en) 1994-02-22 1995-09-04 Dana-Farber Cancer Institute Nucleic acid delivery system, method of synthesis and uses thereof
US5539083A (en) 1994-02-23 1996-07-23 Isis Pharmaceuticals, Inc. Peptide nucleic acid combinatorial libraries and improved methods of synthesis
US5902880A (en) 1994-08-19 1999-05-11 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. RNA polymerase III-based expression of therapeutic RNAs
US6551618B2 (en) 1994-03-15 2003-04-22 University Of Birmingham Compositions and methods for delivery of agents for neuronal regeneration and survival
US6015880A (en) 1994-03-16 2000-01-18 California Institute Of Technology Method and substrate for performing multiple sequential reactions on a matrix
US5807522A (en) 1994-06-17 1998-09-15 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods for fabricating microarrays of biological samples
US5525735A (en) 1994-06-22 1996-06-11 Affymax Technologies Nv Methods for synthesizing diverse collections of pyrrolidine compounds
US5549974A (en) 1994-06-23 1996-08-27 Affymax Technologies Nv Methods for the solid phase synthesis of thiazolidinones, metathiazanones, and derivatives thereof
US6645943B1 (en) 1994-10-25 2003-11-11 Hybridon, Inc. Method of down-regulating gene expression
GB9501465D0 (en) 1995-01-25 1995-03-15 King S College London Nucleoside phosphorothioate derivatives,synthesis and use thereof
DE19502912A1 (de) 1995-01-31 1996-08-01 Hoechst Ag G-Cap Stabilisierte Oligonucleotide
IT1275862B1 (it) 1995-03-03 1997-10-24 Consiglio Nazionale Ricerche Trascritto antisenso associato ad alcuni tipi di cellule tumorali ed oligodeossinucleotidi sintetici utili nella diagnosi e nel trattamento
IT1276642B1 (it) 1995-03-03 1997-11-03 Consiglio Nazionale Ricerche Trascritto antisenso presente in linfociti b ed oligodeossinucleotidi sintetici utili per inibirne l'azione
US5739311A (en) 1995-06-07 1998-04-14 Gen-Probe Incorporated Enzymatic synthesis of phosphorothioate oligonucleotides using restriction endonucleases
US5569588A (en) 1995-08-09 1996-10-29 The Regents Of The University Of California Methods for drug screening
AU725262B2 (en) 1996-02-14 2000-10-12 Isis Pharmaceuticals, Inc. Sugar-modified gapped oligonucleotides
DE69724241T2 (de) 1996-03-14 2004-06-09 Genentech, Inc., South San Francisco Gdnf-rezeptor und dessen verwendung
BR9708701A (pt) 1996-04-17 2000-01-04 Hoechst Marion Roussel De Gmbh Inibidores anti-sense de expressão do fator de crescimento endotelial vascular.
US5786213A (en) 1996-04-18 1998-07-28 Board Of Regents, The University Of Texas System Inhibition of endogenous gastrin expression for treatment of colorectal cancer
US5756710A (en) 1996-06-05 1998-05-26 The Trustees Of Columbia University In City Of New York Phosphorothioate oligonucleotides that bind to the V3-loop and uses thereof
US5898031A (en) 1996-06-06 1999-04-27 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligoribonucleotides for cleaving RNA
US5849902A (en) 1996-09-26 1998-12-15 Oligos Etc. Inc. Three component chimeric antisense oligonucleotides
US5739119A (en) 1996-11-15 1998-04-14 Galli; Rachel L. Antisense oligonucleotides specific for the muscarinic type 2 acetylcholine receptor MRNA
US7008776B1 (en) 1996-12-06 2006-03-07 Aventis Pharmaceuticals Inc. Compositions and methods for effecting the levels of high density lipoprotein (HDL) cholesterol and apolipoprotein AI very low density lipoprotein (VLDL) cholesterol and low density lipoprotein (LDL) cholesterol
US7235653B2 (en) 1996-12-31 2007-06-26 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotide compositions and methods for the modulation of the expression of B7 protein
JP3756313B2 (ja) 1997-03-07 2006-03-15 武 今西 新規ビシクロヌクレオシド及びオリゴヌクレオチド類縁体
US6013786A (en) 1997-08-22 2000-01-11 Hybridon, Inc. MDM2-specific antisense oligonucleotides
US7572582B2 (en) 1997-09-12 2009-08-11 Exiqon A/S Oligonucleotide analogues
US6794499B2 (en) 1997-09-12 2004-09-21 Exiqon A/S Oligonucleotide analogues
JP4236812B2 (ja) 1997-09-12 2009-03-11 エクシコン エ／エス オリゴヌクレオチド類似体
US7285288B1 (en) 1997-10-03 2007-10-23 Board Of Regents, The University Of Texas System Inhibition of Bcl-2 protein expression by liposomal antisense oligodeoxynucleotides
US6034883A (en) 1998-01-29 2000-03-07 Tinney; Charles E. Solid state director for beams
US6175409B1 (en) 1999-04-02 2001-01-16 Symyx Technologies, Inc. Flow-injection analysis and variable-flow light-scattering methods and apparatus for characterizing polymers
US7321828B2 (en) 1998-04-13 2008-01-22 Isis Pharmaceuticals, Inc. System of components for preparing oligonucleotides
US20040186071A1 (en) 1998-04-13 2004-09-23 Bennett C. Frank Antisense modulation of CD40 expression
US6221587B1 (en) 1998-05-12 2001-04-24 Isis Pharmceuticals, Inc. Identification of molecular interaction sites in RNA for novel drug discovery
US6833361B2 (en) 1998-05-26 2004-12-21 Ribapharm, Inc. Nucleosides having bicyclic sugar moiety
NZ507913A (en) 1998-05-26 2003-02-28 Icn Pharmaceuticals Novel nucleosides having bicyclic sugar moiety
US20030139359A1 (en) 2001-12-04 2003-07-24 Isis Pharmaceuticals Inc. Antisense modulation of phospholipid scramblase 3 expression
US6100090A (en) 1999-06-25 2000-08-08 Isis Pharmaceuticals Inc. Antisense inhibition of PI3K p85 expression
US6867294B1 (en) 1998-07-14 2005-03-15 Isis Pharmaceuticals, Inc. Gapped oligomers having site specific chiral phosphorothioate internucleoside linkages
US6242589B1 (en) 1998-07-14 2001-06-05 Isis Pharmaceuticals, Inc. Phosphorothioate oligonucleotides having modified internucleoside linkages
US6821724B1 (en) * 1998-09-17 2004-11-23 Affymetrix, Inc. Methods of genetic analysis using nucleic acid arrays
US6214986B1 (en) 1998-10-07 2001-04-10 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense modulation of bcl-x expression
US6376541B1 (en) 1998-11-06 2002-04-23 Alcon Manufacturing, Ltd. Upregulation of endogenous prostaglandins to lower intraocular pressure
US5985663A (en) 1998-11-25 1999-11-16 Isis Pharmaceuticals Inc. Antisense inhibition of interleukin-15 expression
ES2498745T3 (es) 1999-01-27 2014-09-25 Coda Therapeutics, Inc. Formulaciones que comprenden nucleótidos antisentido para conexinas
ES2234563T5 (es) 1999-02-12 2018-01-17 Daiichi Sankyo Company, Limited Nuevos análogos de nucleósidos y oligonucleótidos
CA2850318A1 (en) 1999-02-26 2000-08-31 The University Of British Columbia Trpm-2 antisense therapy
US20040137423A1 (en) 1999-03-15 2004-07-15 Hayden Michael R. Compositions and methods for modulating HDL cholesterol and triglyceride levels
DE1100895T1 (de) 1999-03-15 2001-09-06 Univ British Columbia Abc1 polypeptide und verfahren und reagenzien zur modulation des cholesterolgehalts
WO2000056916A2 (en) 1999-03-18 2000-09-28 Exiqon A/S Detection of mutations in genes by specific lna primers
US7084125B2 (en) 1999-03-18 2006-08-01 Exiqon A/S Xylo-LNA analogues
US6639059B1 (en) 1999-03-24 2003-10-28 Exiqon A/S Synthesis of [2.2.1]bicyclo nucleosides
US6734291B2 (en) 1999-03-24 2004-05-11 Exiqon A/S Synthesis of [2.2.1]bicyclo nucleosides
KR100887164B1 (ko) 1999-03-26 2009-03-10 아벤티스 파마슈티칼스 인크. Ｌｉｐｇ 폴리펩타이드의 활성을 증가시키고 초저밀도 지단백질(ｖｌｄｌ) 콜레스테롤 및 저밀도 지단백질(ｌｄｌ) 콜레스테롤의 수준을 저하시키는 조성물 및 이를 위해 유용한 화합물을 동정하는 방법
CA2365907C (en) 1999-04-08 2010-08-17 Chiron Corporation Enhancement of the immune response for vaccine and gene therapy applications
AU4657500A (en) 1999-04-21 2000-11-02 Pangene Corporation Locked nucleic acid hybrids and methods of use
CA2372085C (en) 1999-05-04 2009-10-27 Exiqon A/S L-ribo-lna analogues
US20030233670A1 (en) 2001-12-04 2003-12-18 Edgerton Michael D. Gene sequences and uses thereof in plants
US6525191B1 (en) 1999-05-11 2003-02-25 Kanda S. Ramasamy Conformationally constrained L-nucleosides
DE19925073C2 (de) 1999-06-01 2001-07-19 Stefan Weiss Nucleinsäuremoleküle mit spezifischer Erkennung von nativem PrP·S··c·, Herstellung und Verwendung
US6656730B1 (en) 1999-06-15 2003-12-02 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotides conjugated to protein-binding drugs
CA2383871A1 (en) 1999-06-25 2001-01-04 Genset S.A. A novel bap28 gene and protein
US20040006031A1 (en) 2002-07-02 2004-01-08 Isis Pharmaceuticals Inc. Antisense modulation of HMG-CoA reductase expression
US6147200A (en) 1999-08-19 2000-11-14 Isis Pharmaceuticals, Inc. 2'-O-acetamido modified monomers and oligomers
EP1218411A4 (en) 1999-09-20 2004-09-01 Millennium Pharm Inc SECRETED PROTEINS AND THEIR USES
EP1700603A3 (en) * 1999-09-25 2007-06-13 Coley Pharmaceutical GmbH Immunostimulatory nucleic acids
US6617442B1 (en) 1999-09-30 2003-09-09 Isis Pharmaceuticals, Inc. Human Rnase H1 and oligonucleotide compositions thereof
US6986988B2 (en) 1999-10-06 2006-01-17 Quark Biotech, Inc. Method for enrichment of natural antisense messenger RNA
WO2001025488A2 (en) 1999-10-06 2001-04-12 Quark Biotech, Inc. Method for enrichment of natural antisense messenger rna
CA2394229C (en) * 1999-11-26 2010-04-13 Mcgill University Loci for idiopathic generalized epilepsy, mutations thereof and method using same to assess, diagnose, prognose or treat epilepsy
WO2001051630A1 (en) 2000-01-07 2001-07-19 Baylor University Antisense compositions and methods
ATE336492T1 (de) 2000-01-14 2006-09-15 Us Gov Health & Human Serv Methonocarbacycloalkylanaloga von nucleosiden
US6303374B1 (en) 2000-01-18 2001-10-16 Isis Pharmaceuticals Inc. Antisense modulation of caspase 3 expression
JP2001247459A (ja) 2000-03-03 2001-09-11 Oakland Uniservices Ltd 癌の組み合わせ療法
CA2404780A1 (en) 2000-03-27 2001-10-04 University Of Delaware Targeted chromosomal genomic alterations with modified single stranded oligonucleotides
US6936467B2 (en) 2000-03-27 2005-08-30 University Of Delaware Targeted chromosomal genomic alterations with modified single stranded oligonucleotides
AU2001250572A1 (en) * 2000-04-07 2001-10-23 Epigenomics Ag Detection of single nucleotide polymorphisms (snp's) and cytosine-methylations
US7402434B2 (en) 2000-05-08 2008-07-22 Newman Stuart A Splice choice antagonists as therapeutic agents
JP2001352987A (ja) 2000-06-13 2001-12-25 Japan Science & Technology Corp ナトリウムチャンネルｓｃｎ１ａ
JP2004530420A (ja) 2000-06-29 2004-10-07 ファーマ パシフィック プロプライエタリー リミテッド インターフェロン−α誘導性遺伝子
JP2004505047A (ja) 2000-07-28 2004-02-19 キャンサー・リサーチ・テクノロジー・リミテッド 複合治療による癌治療
US7053199B2 (en) 2000-08-29 2006-05-30 Takeshi Imanishi Nucleoside analogs and oligonucleotide derivatives containing these analogs
HUP0301805A3 (en) 2000-09-02 2005-12-28 Gruenenthal Gmbh Antisense oligonucleotides against vanilloid receptor 1
US6444464B1 (en) 2000-09-08 2002-09-03 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense modulation of E2F transcription factor 2 expression
WO2002024717A1 (en) 2000-09-20 2002-03-28 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense modulation of flip-c expression
EP1325121A2 (en) 2000-10-13 2003-07-09 Institut de Cardiologie de Montreal Antisense oligonucleotide directed toward mammalian vegf receptor genes and uses thereof
US20030228618A1 (en) 2000-11-24 2003-12-11 Erez Levanon Methods and systems for identifying naturally occurring antisense transcripts and methods, kits and arrays utilizing same
US20050222029A1 (en) 2001-01-04 2005-10-06 Myriad Genetics, Incorporated Compositions and methods for treating diseases
US7423142B2 (en) 2001-01-09 2008-09-09 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for inhibiting expression of anti-apoptotic genes
US20020147165A1 (en) 2001-02-22 2002-10-10 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense modulation of calreticulin expression
CA2437898A1 (en) 2001-02-26 2002-09-06 Pharma Pacific Pty. Ltd Interferon-alpha induced gene
EP2341148A3 (en) * 2001-04-12 2012-05-30 Imperial Innovations Limited Diagnosis and treatment of cancer
WO2002085309A2 (en) * 2001-04-24 2002-10-31 Epigenesis Pharmaceuticals, Inc. Composition, formulations & kits for treatment of respiratory & lung disease with anti-sense oligonucleotides & a bronchodilating agent
AUPR497101A0 (en) 2001-05-14 2001-06-07 Queensland University Of Technology Polynucleotides and polypeptides linked to cancer and/or tumorigenesi
IL143379A (en) 2001-05-24 2013-11-28 Yissum Res Dev Co Oligonucleotide against human ache isoform r and its uses
US20060122789A1 (en) * 2001-05-30 2006-06-08 Feldmann Richard J Symmetry relationships between pairs of connectrons
US7053195B1 (en) 2001-06-12 2006-05-30 Syngenta Participatious Ag Locked nucleic acid containing heteropolymers and related methods
US7153954B2 (en) 2001-07-12 2006-12-26 Santaris Pharma A/S Method for preparation of LNA phosphoramidites
BR0211111A (pt) 2001-07-12 2004-06-22 Univ Massachusetts Molécula de ácido nucleico isolada, vetor, célula hospedeira, transgene, precursor de rna engenheirado, animal transgênico não humano, e, método de induzir a interferência de ácido ribonucleico de um gene alvo em uma célula
US7425545B2 (en) 2001-07-25 2008-09-16 Isis Pharmaceuticals, Inc. Modulation of C-reactive protein expression
US20030096772A1 (en) 2001-07-30 2003-05-22 Crooke Rosanne M. Antisense modulation of acyl CoA cholesterol acyltransferase-2 expression
US7259150B2 (en) 2001-08-07 2007-08-21 Isis Pharmaceuticals, Inc. Modulation of apolipoprotein (a) expression
EP1446412B1 (en) 2001-09-04 2012-03-07 Exiqon A/S Novel lna compositions and uses thereof
US20040214766A1 (en) 2001-10-01 2004-10-28 Kari Alitalo VEGF-C or VEGF-D materials and methods for treatment of neuropathologies
AU2002333434B2 (en) 2001-10-10 2007-12-13 Societe Des Produits Nestle S.A. Coffee plant with reduced alpha-D-galactosidase activity
US7125982B1 (en) 2001-12-05 2006-10-24 Frayne Consultants Microbial production of nuclease resistant DNA, RNA, and oligo mixtures
US6965025B2 (en) 2001-12-10 2005-11-15 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense modulation of connective tissue growth factor expression
CA2365811A1 (en) 2001-12-21 2003-06-21 Institut De Cardiologie A new gene therapy using antisense strategy to estrogen receptors (er .alpha. and/or er .beta.) to optimize vascular healing and cardioprotection after vascular injury
KR20030056538A (ko) 2001-12-28 2003-07-04 주식회사 웰진 리본형 안티센스 올리고뉴클레오티드에 의한 형질전이성장 인자-β1의 효과적 저해제 개발
CA2474957A1 (en) * 2002-02-04 2003-08-14 Vermicon Ag Methods for specific rapid detection of pathogenic food-relevant bacteria
US20030191075A1 (en) 2002-02-22 2003-10-09 Cook Phillip Dan Method of using modified oligonucleotides for hepatic delivery
AU2003212729A1 (en) 2002-02-25 2003-09-09 Gunnar Norstedt Vitamin d upregulated protein 1 (vdup-1) methods and uses thereof
EP1483280B1 (en) 2002-03-08 2012-10-24 Glen Research Corporation Fluorescent nitrogenous base and nucleosides incorporating same
GB2386836B (en) 2002-03-22 2006-07-26 Cancer Res Ventures Ltd Anti-cancer combinations
US7169916B2 (en) 2002-04-01 2007-01-30 Isis Pharmaceuticals, Inc. Chloral-free DCA in oligonucleotide synthesis
US20050215504A1 (en) 2002-04-02 2005-09-29 Bennett C F Antisense modulation of sterol regulatory element-binding protein-1 expression
HUE037352T2 (hu) 2002-04-05 2018-08-28 Roche Innovation Ct Copenhagen As A HIF-1alfa expresszálódását módosító oligomer vegyületek
US6808906B2 (en) 2002-05-08 2004-10-26 Rigel Pharmaceuticals, Inc. Directionally cloned random cDNA expression vector libraries, compositions and methods of use
US7569575B2 (en) 2002-05-08 2009-08-04 Santaris Pharma A/S Synthesis of locked nucleic acid derivatives
US7199107B2 (en) 2002-05-23 2007-04-03 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense modulation of kinesin-like 1 expression
US7148342B2 (en) 2002-07-24 2006-12-12 The Trustees Of The University Of Pennyslvania Compositions and methods for sirna inhibition of angiogenesis
CA2495398A1 (en) 2002-08-14 2004-02-26 Pharmacia Corporation Antisense modulation of nav1.3 expression
US20040033480A1 (en) 2002-08-15 2004-02-19 Wong Norman C.W. Use of resveratrol to regulate expression of apolipoprotein A1
AU2003270537B2 (en) 2002-09-10 2008-03-20 The Samuel Roberts Noble Foundation, Inc. Methods and compositions for production of flavonoid and isoflavonoid nutraceuticals
JP2006500070A (ja) 2002-09-25 2006-01-05 ファルマシア・コーポレーション ファルネソイドｘ受容体発現のアンチセンス調節
EP1575498A2 (en) * 2002-09-25 2005-09-21 Pharmacia Corporation Antisense modulation of microsomal prostaglandin e2 synthase expression
EP2272958A1 (en) 2002-09-26 2011-01-12 ISIS Pharmaceuticals, Inc. Modulation of forkhead box O1A expression
GB2394658A (en) 2002-11-01 2004-05-05 Cancer Rec Tech Ltd Oral anti-cancer composition
US20040152651A1 (en) 2002-11-01 2004-08-05 Rana Tariq M. Regulation of transcription elongation factors
JP5449639B2 (ja) 2002-11-01 2014-03-19 ザ トラスティーズ オブ ザ ユニバーシティ オブ ペンシルバニア ＨＩＦ−１アルファのｓｉＲＮＡ阻害に関する組成物及び方法
US8604183B2 (en) 2002-11-05 2013-12-10 Isis Pharmaceuticals, Inc. Compositions comprising alternating 2′-modified nucleosides for use in gene modulation
WO2004041889A2 (en) 2002-11-05 2004-05-21 Isis Pharmaceuticals, Inc. Polycyclic sugar surrogate-containing oligomeric compounds and compositions for use in gene modulation
US20060009410A1 (en) 2002-11-13 2006-01-12 Crooke Rosanne M Effects of apolipoprotein B inhibition on gene expression profiles in animals
JP2006507841A (ja) * 2002-11-14 2006-03-09 ダーマコン， インコーポレイテッド 機能的ｓｉＲＮＡおよび超機能的ｓｉＲＮＡ
WO2006006948A2 (en) * 2002-11-14 2006-01-19 Dharmacon, Inc. METHODS AND COMPOSITIONS FOR SELECTING siRNA OF IMPROVED FUNCTIONALITY
US7250496B2 (en) * 2002-11-14 2007-07-31 Rosetta Genomics Ltd. Bioinformatically detectable group of novel regulatory genes and uses thereof
EP2752488B1 (en) 2002-11-18 2020-02-12 Roche Innovation Center Copenhagen A/S Antisense design
US7144999B2 (en) 2002-11-23 2006-12-05 Isis Pharmaceuticals, Inc. Modulation of hypoxia-inducible factor 1 alpha expression
US20080318210A1 (en) * 2003-08-27 2008-12-25 Rosetta Genomics Bioinformatically detectable group of novel regulatory viral and viral associated oligonucleotides and uses thereof
US7713738B2 (en) 2003-02-10 2010-05-11 Enzon Pharmaceuticals, Inc. Oligomeric compounds for the modulation of survivin expression
WO2005003164A2 (en) * 2003-03-04 2005-01-13 Wyeth Compositions and methods for diagnosing and treating asthma or other allergic or inflammatory diseases
JP2004275115A (ja) * 2003-03-18 2004-10-07 Institute Of Physical & Chemical Research 重篤な知的能力の退行を伴う難治小児てんかんにおけるｓｃｎ２ａ遺伝子の変異
AU2003901425A0 (en) 2003-03-27 2003-04-10 Bionomics Limited A diagnostic method for epilepsy
US7598227B2 (en) 2003-04-16 2009-10-06 Isis Pharmaceuticals Inc. Modulation of apolipoprotein C-III expression
AU2003224132A1 (en) 2003-04-24 2004-11-19 Galapagos Genomics N.V. Effective sirna knock-down constructs
US7339051B2 (en) 2003-04-28 2008-03-04 Isis Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for the treatment of severe acute respiratory syndrome (SARS)
WO2004108081A2 (en) 2003-06-02 2004-12-16 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotide synthesis with alternative solvents
EP2241572A3 (en) 2003-06-03 2011-04-06 Eli Lilly And Company Modulation of survivin expression
ATE459707T1 (de) * 2003-06-30 2010-03-15 Dnavec Research Inc Negativ-strang rna-virus-vektoren, welche ein gen mit veränderten hypermutierbaren regionen tragen
US7825235B2 (en) 2003-08-18 2010-11-02 Isis Pharmaceuticals, Inc. Modulation of diacylglycerol acyltransferase 2 expression
EP2256201A3 (en) 2003-09-18 2012-07-04 Isis Pharmaceuticals, Inc. Modulation of eIF4E expression
EP1687410A4 (en) 2003-10-07 2008-04-09 Isis Pharmaceuticals Inc ANTISENSE OLIGONUCLEOTIDES OPTIMIZED TO TARGET THE KIDNEY
CA2541836A1 (en) 2003-10-13 2005-04-21 Bionomics Limited A diagnostic method for neonatal or infantile epilepsy syndromes
EP1682661A2 (en) * 2003-10-23 2006-07-26 Sirna Therapeutics, Inc. Rna interference mediated inhibition of gene expression using short interfering nucleic acid (sina)
WO2005045034A2 (en) 2003-10-23 2005-05-19 Sirna Therapeutics, Inc. RNA INTERFERENCE MEDIATED TREATMENT OF PARKINSON DISEASE USING SHORT INTERERING NUCLEIC ACID (siNA)
JP4642775B2 (ja) 2003-12-23 2011-03-02 サンタリス ファーマ アー／エス Ｂｃｌ−２のモデュレーションのためのオリゴマー化合物
EP1716228A4 (en) 2004-01-12 2009-06-17 Univ Pennsylvania A SYSTEM AND METHOD FOR HIGH-REGULATING BMP (BONE MORPHOGENETIC PROTEIN) GENE EXPRESSION IN BONE CELLS THROUGH THE APPLICATION OF FIELDS PRODUCED BY SPECIFIC AND SELECTIVE ELECTRICAL AND ELECTROMAGNETIC SIGNALS
US7468431B2 (en) 2004-01-22 2008-12-23 Isis Pharmaceuticals, Inc. Modulation of eIF4E-BP2 expression
GB0403041D0 (en) 2004-02-11 2004-03-17 Milner Anne J Induction of apoptosis
EP1566202A1 (en) 2004-02-23 2005-08-24 Sahltech I Göteborg AB Use of resistin antagonists in the treatment of rheumatoid arthritis
US7402574B2 (en) 2004-03-12 2008-07-22 Avi Biopharma, Inc. Antisense composition and method for treating cancer
US7842800B2 (en) * 2004-04-02 2010-11-30 Rosetta Genomics Ltd. Bioinformatically detectable group of novel regulatory bacterial and bacterial associated oligonucleotides and uses thereof
AU2005248147A1 (en) * 2004-05-11 2005-12-08 Alphagen Co., Ltd. Polynucleotides for causing RNA interference and method for inhibiting gene expression using the same
US8394947B2 (en) 2004-06-03 2013-03-12 Isis Pharmaceuticals, Inc. Positionally modified siRNA constructs
PL1766012T3 (pl) * 2004-07-02 2011-11-30 Avi Biopharma Inc Antysensowne, przeciwbakteryjne związki i sposoby
WO2006085987A2 (en) 2004-07-09 2006-08-17 University Of Iowa Research Foundation Rna interference in respiratory epitheial cells
WO2006023880A2 (en) 2004-08-23 2006-03-02 Isis Pharmaceuticals, Inc. Compounds and methods for the characterization of oligonucleotides
US7485468B2 (en) 2004-10-15 2009-02-03 Galapagos Bv Molecular targets and compounds, and methods to identify the same, useful in the treatment of joint degenerative and inflammatory diseases
CA2587173C (en) 2004-11-09 2016-09-06 Santaris Pharma A/S Potent lna oligonucleotides for the inhibition of hif-1a expression
JP2008524999A (ja) * 2004-12-24 2008-07-17 アレス トレーディング エス．エー． 精神障害を治療するための組成物及び方法
US7220549B2 (en) 2004-12-30 2007-05-22 Helicos Biosciences Corporation Stabilizing a nucleic acid for nucleic acid sequencing
US20100088778A1 (en) * 2005-06-16 2010-04-08 John Charles Mulley Methods of Treatment, and Diagnosis of Epilepsy by Detecting Mutations in the SCN1A Gene
WO2007002718A2 (en) 2005-06-27 2007-01-04 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Rnai modulation of hif-1 and theraputic uses thereof
US20070213292A1 (en) 2005-08-10 2007-09-13 The Rockefeller University Chemically modified oligonucleotides for use in modulating micro RNA and uses thereof
EP1937312B1 (en) 2005-08-30 2016-06-29 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Chimeric oligomeric compounds for modulation of splicing
EP1941059A4 (en) 2005-10-28 2010-11-03 Alnylam Pharmaceuticals Inc COMPOSITIONS AND METHODS FOR INHIBITING THE EXPRESSION OF THE HUNTINGTIN GENE
WO2007056326A2 (en) 2005-11-04 2007-05-18 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for inhibiting expression of nav1.8 gene
AU2006336624B2 (en) 2005-11-17 2010-11-25 Board Of Regents, The University Of Texas System Modulation of gene expression by oligomers targeted to chromosomal DNA
CN101378764A (zh) 2005-12-09 2009-03-04 贝勒研究院 通过血液白细胞微阵列分析对系统性红斑狼疮的诊断、预后和疾病发展的监测
CN100356377C (zh) 2005-12-20 2007-12-19 无锡永中科技有限公司 文档显示方法
US20070213274A1 (en) 2005-12-20 2007-09-13 Oy Jurilab Ltd Novel genes and markers associated with high-density lipoprotein-cholesterol (HDL-C)
EP1976567B1 (en) 2005-12-28 2020-05-13 The Scripps Research Institute Natural antisense and non-coding rna transcripts as drug targets
DK2314594T3 (da) 2006-01-27 2014-10-27 Isis Pharmaceuticals Inc 6-modificerede bicykliske nukleinsyreanaloger
US7569686B1 (en) 2006-01-27 2009-08-04 Isis Pharmaceuticals, Inc. Compounds and methods for synthesis of bicyclic nucleic acid analogs
DK2002004T3 (en) * 2006-03-23 2015-11-30 Roche Innovation Ct Copenhagen As LITTLE INTERNAL SEGMENTED INTERFERENCE RNA
WO2007115168A2 (en) 2006-03-31 2007-10-11 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for inhibiting expression of eg5 gene
CA3044969A1 (en) * 2006-05-05 2007-12-21 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Compounds and methods for modulating gene expression
US7666854B2 (en) 2006-05-11 2010-02-23 Isis Pharmaceuticals, Inc. Bis-modified bicyclic nucleic acid analogs
CA2651453C (en) 2006-05-11 2014-10-14 Isis Pharmaceuticals, Inc. 5'-modified bicyclic nucleic acid analogs
NZ572666A (en) 2006-05-11 2010-11-26 Alnylam Pharmaceuticals Inc Compositions comprising double stranded rna and methods for inhibiting expression of the pcsk9 gene
EP1867338A1 (en) 2006-05-30 2007-12-19 Université Libre De Bruxelles Pharmaceutical composition comprising apolipoproteins for the treatment of human diseases
AU2007306542B2 (en) * 2006-10-11 2013-08-01 Max-Planck-Gesellschaft Zur Forderung Der Wissenschaften E.V. Influenza targets
WO2008066672A2 (en) 2006-11-06 2008-06-05 Beth Israel Deaconess Medical Center Identification and use of small molecules to modulate transcription factor function and to treat transcription factor associated diseases
WO2008057556A2 (en) 2006-11-06 2008-05-15 Beth Israel Deaconess Medical Center Identification and use of small molecules to modulate ese-1 transcription factor function and to treat ese-1 transcription factor associated diseases
US8093222B2 (en) 2006-11-27 2012-01-10 Isis Pharmaceuticals, Inc. Methods for treating hypercholesterolemia
CA2675946A1 (en) 2007-01-19 2008-07-24 Lionel Navarro Methods and compositions for modulating the sirna and rna-directed-dna methylation pathways
JP5205979B2 (ja) 2007-01-23 2013-06-05 日立電線株式会社 絶縁電線
US20100255117A1 (en) 2007-04-06 2010-10-07 The Johns Hopkins University Methods and compositions for the treatment of cancer
US20080293142A1 (en) 2007-04-19 2008-11-27 The Board Of Regents For Oklahoma State University Multiple shRNA Expression Vectors and Methods of Construction
WO2009012263A2 (en) * 2007-07-18 2009-01-22 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Tissue-specific micrornas and compositions and uses thereof
AU2008310661A1 (en) * 2007-10-11 2009-04-16 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Amides useful as inhibitors of voltage-gated sodium channels
CN201191661Y (zh) 2008-01-29 2009-02-04 富士康(昆山)电脑接插件有限公司 电连接器组件
WO2009143277A2 (en) 2008-05-20 2009-11-26 Intradigm Corporation Compositions comprising hscn9a sirna and methods of use thereof
WO2010002984A1 (en) 2008-07-01 2010-01-07 Monsanto Technology, Llc Recombinant dna constructs and methods for modulating expression of a target gene
CA2729897A1 (en) * 2008-07-03 2010-01-07 Santaris Pharma A/S Rna antagonist compounds for the inhibition of expression of mitochondrial glycerol-3-phosphate acyltransferase 1 (mtgpat1)
US8153606B2 (en) 2008-10-03 2012-04-10 Opko Curna, Llc Treatment of apolipoprotein-A1 related diseases by inhibition of natural antisense transcript to apolipoprotein-A1
EP2177615A1 (en) 2008-10-10 2010-04-21 Fraunhofer-Gesellschaft zur Förderung der angewandten Forschung e.V. Method for a genome wide identification of expression regulatory sequences and use of genes and molecules derived thereof for the diagnosis and therapy of metabolic and/or tumorous diseases
US8606289B2 (en) 2008-11-10 2013-12-10 Qualcomm Incorporated Power headroom-sensitive scheduling
JP2012509306A (ja) 2008-11-22 2012-04-19 ザ ユニバーシティ オブ ブリストル ＶＥＧＦｘｘｘｂの新規な使用
CN102317458B (zh) * 2008-12-04 2018-01-02 库尔纳公司 通过红细胞生成素(epo)天然反义转录物的抑制对epo相关疾病的治疗
EP2370580B1 (en) * 2008-12-04 2019-09-11 CuRNA, Inc. Treatment of sirtuin 1 (sirt1) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to sirtuin 1
WO2010065671A2 (en) * 2008-12-04 2010-06-10 Curna, Inc. Treatment of vascular endothelial growth factor (vegf) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to vegf
US20130036482A1 (en) 2010-01-29 2013-02-07 National University Corporation Okayama University Method for assessment of potential for development of dravet syndrome and use thereof
PT2585596T (pt) 2010-06-23 2021-03-23 Curna Inc Tratamento de doenças relacionadas com a subunidade alfa de canais de sódio dependentes de voltagem (scna) por inibição da transcrição antissentido natural para scna
US9133496B2 (en) 2010-06-29 2015-09-15 Public University Corporation Nagoya City University Material for screening for compound acting on ion channel and use thereof

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20040203024A1 (en) 1996-06-06 2004-10-14 Baker Brenda F. Modified oligonucleotides for use in RNA interference
US20050186591A1 (en) 2003-06-09 2005-08-25 Alnylam Pharmaceuticals Method of treating neurodegenerative disease
US20070248590A1 (en) * 2005-12-02 2007-10-25 Sirtris Pharmaceuticals, Inc. Modulators of CDC2-like kinases (CLKS) and methods of use thereof

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* Cited by examiner, † Cited by third party
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British Jorunal of Pharmacology, Vol. 156, pp. 420-431 (2009.01.19.)

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