CN105385688A - 一种与长QT综合征相关的miRNA及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种可作为长QT综合征预判罹患风险和诊断的分子标记物，即miRNA-3619；以及其反义寡聚核苷酸AMO-3619在制备治疗长QT综合征药物中的应用，主要在于药物促进hERG基因功能的应用，其特征在于，药物组合物含有AMO-3619。

Description

一种与长QT综合征相关的miRNA及其应用

技术领域

本发明涉及发现一种可预判长QT综合征罹患风险及诊断的miRNA，即miR-3619，及其反义寡聚核苷酸AMO-3619在制备治疗长QT综合征药物中的应用，确切地说，本发明涉及AMO-3619在制备治疗长QT综合征药物中促进hERG基因功能的应用。

背景技术

长QT综合征(LongQTSyndrome，LQTs)是指是指心电图上QT间期延长、T波异常，易产生室性心律失常，尤其是尖端扭转性室性心动过速(Torsadedepoints，TdP)、晕厥和猝死的一组综合征。按照病因，可分为先天性长QT综合征(cLQTs)和获得性长QT综合征(aLQTs)。cLQTs是儿童和年轻人发作性晕厥和意外猝死的主要原因。多种通道基因突变可导致先天性长QT综合征，目前已发现有13个基因突变与先天性长QT综合征相关，但hERG基因突变致钾通道功能缺陷所致的先天性2型长QT综合征更常见，占总突变的45％，为第二常见突变基因。目前已发现300多个hERG基因突变位点与先天性长QT综合征相关。而在临床工作中，获得性长QT综合征更常见，其和TdP的发病密切关联，具有潜在致命性，是院内心脏性猝死的重要原因之一。目前已知有多种因素与获得性长QT综合征相关，包括药物、心动过缓/速、冠心病(心肌缺血、心肌梗死)、心肌肥厚、心力衰竭和遗传易感性等，其中药物导致的获得性长QT综合征影响最广。

HERG(huamnether-a-Go-Gorelatedgene，hERG)基因，即KCNH2，定位于人7号染色体。研究表明hERG基因编码的快速激活延迟整流钾电流(IKr)在正常的动作电位复极过程中起关键作用。它是多种药物产生心脏不良反应的分子靶标，与QT间期延长最为紧密相关。药物本身或其代谢产物阻滞Ikr、延长心脏复极化是药物获得性长QT综合征的重要分子机制之一。美国食品和药品管理局(FDA)规定所有药物上市前必须进行HERG的安全性评价。研究表明，先天性和获得性因素均可以通过hERG通道合成障碍、转运障碍、门控及通透性改变最终导致长QT综合征的发生。因此，更好的理解hERG相关LQTS的发病机制将有助于针对LQTS病人寻找新的治疗手段。

微小RNA(microRNAs，miRNAs)是一类长约21～25nt的内源性非编码小RNA，通过与靶基因mRNA互补结合，在转录后水平调节靶基因的表达，抑制蛋白质的翻译或促进mRNA降解，从而对靶基因的表达起着反向调节作用。部分miRNA在心血管组织中特异性表达，使其在心血管系统发育及心脏疾病的发生发展中发挥重要作用。近年来，一系列研究证实，miRNA过度上调或下调均可引起离子通道蛋白表达紊乱，致离子通道平衡失调，诱发心律失常，是潜在的心律失常作用靶点。例如，miR-1可作用于缝隙连接通道蛋白43及内向整流钾通道的α亚单位从而降低心脏功能及引起缺血性心律失常；在糖尿病心脏病兔模型miR-133的高表达可抑制hERG基因表达从而导致心律失常的发生；在乳鼠心肌细胞证实，药物三氧化二砷可通过上调miR-21和miR-23a的水平抑制hERG蛋白表达从而导致长QT综合征。同时研究发现，外源性给予相应miRNA互补的反义寡聚核苷酸序列(anti-miRNAoligonucleotides，AMOs)(AMO-1、AMO-133、AMO-21、AMO-23a)可以减少相应的心律失常发生。因此临床上可将miRNA作为诊断标记物及潜在治疗靶标，而运用与miRNA互补的寡核苷酸序列AMOs可抑制相应miRNA的功能，表明AMOs在作为心律失常的治疗手段方面具有重要的应用价值。

目前长QT综合征的治疗主要采取药物治疗、左心交感神经去除术和植入心脏复律除颤器，但这些方法均存在局限性，而且不能根治。因此寻找有效的治疗手段，具有重要的临床意义。而于遗传性长QT综合征，采取基因治疗是根治的方法之一。而现有技术中，尚未发现促进hERG基因功能的治疗长QT综合征的药物。

发明内容

miRNA和靶基因的关系是“多对多”的，一个miRNA可以有多个靶基因，同样，一个靶基因也可以有众多的miRNA。我们以miRNA和HERG基因的关系为切入点，以HERG为靶基因反向筛选验证与其相关的miRNA。通过联合多个生物信息学网站RegRNA、miRanda、TargetScan综合预测出与HERG相关的6个miRNA：miR-3619、miR-134、miR-143、miR-103、miR-147、miR-185。首先选定miR-3619，应用双萤光素酶基因报告法对其进行验证，发现miR-3619可与hERG结合，提示hERG是它的靶基因。同时，在稳定表达的hERG-HEK293细胞中，RT-PCR和WesternBlot检测发现miR-3619对hERGmRNA和蛋白质的表达呈负调控，其特异性的反义寡聚(脱氧)核苷酸(AMO-3619)可以拮抗miRNA的作用；激光共聚焦显示miR-3619同时降低了细胞膜及细胞质hERG蛋白的表达，AMO-3619亦可拮抗这种作用；这些实验结果完全相符合，均验证了miR-3619对hERG基因的负性调控作用，同时证明AMO-3619可通过增加通道蛋白的表达从而促进hERG基因功能，改善长QT综合征，从而完成了本发明。而已有诸多研究证实HERG功能抑制是先天性和获得性长QT综合征重要的发病机制之一，故miRNA-3619可作为诊断长QT综合征的分子标记物及潜在治疗靶点，而AMO-3619用于制备治疗长QT综合征药物也具有明显的创新性和切实的可行性。

长QT综合征的发病机制复杂，已有研究证实hERG功能改变是LQTs重要的发病机制之一，且我们的实验发现miR-3619表达的上调可减低hERG蛋白表达、抑制hERG基因功能，然而miRNA在长QT综合征的具体作用机制有待于进一步研究和探讨。鉴于目前尚无有效防治长QT综合征的方法，将相关miRNA作为其分子诊断标记物和潜在治疗靶点以及将相应AMOs用于治疗长QT综合征药物制备的应用具有相当的迫切性。当然，我们需要在动物或人心肌细胞中进一步验证miR-3619对hERG基因的调控作用。

具体实施方式

材料与方法

1.1实验仪器与试剂

1.1.1主要实验仪器

表1实验仪器名称和生产厂家

1.1.2实验药品和试剂

表2实验药品名称和生产厂家

1.1.3实验方法

实时荧光定量PCR

用Trizol试剂从已转染的U2OS细胞中提取总RNA。将RNA随后用无菌的Rnase-free处理，hERG基因mRNA的水平使用Taqman探针评估与qRT-PCR检测。引物和探针是来自ABI公司cat.#4331182(编号：Hs04234270-g1)。反转录条件设定为初始步骤在95℃10分钟，随后在95℃15秒40个循环，并在60℃下维持1分钟。实时PCR反应独立重复进行三次。结果用2-ΔΔCT相对定量方法分析30。

Westernblot

提取hERG蛋白的步骤免疫印迹分析按先前描述的。简而言之，首先转染pcDNA-hERG到U2OS细胞中。所表达的hERG细胞进一步转染各自的miRNA或miRNA加上相应的AMOs。转染48小时后收获细胞。将等量的蛋白灌注在已制备好的7.5％SDS聚丙烯酰胺凝胶上，然后转移到硝酸纤维素膜上。膜封闭用5％的脱脂奶粉，接着用兔多克隆抗hERG的抗体在4℃下孵育过夜。在TBST中将膜洗涤三次，然后在室温下用山羊抗兔IgG孵育1小时。印迹处理用SuperSignalWestPico化学发光底物(PierceBiotechnology公司，美国)，并使用Syngene公司的成像系统。

实验表明，我们采用生物信息学预测反向筛选联合双荧光素酶报告基因、qRT-PCR、Westernblot、激光共聚焦技术筛选出了miR-3619可以负性调控hERG蛋白表达，相应的AMO-3619可以沉默miR-3619对hERG的抑制作用。我们的实验为进一步理解hERG蛋白的调控机制及从基因角度对长QT综合征进行治疗提供了新的视角。然而，这些研究结果需要在动物模型、前期临床及临床中进一步验证。

Claims (9)

1.miRNA-3619在作为预判患长QT综合征风险和诊断长QT综合征分子标记物中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述miR-3619是成熟miR-3619。

3.根据权利要求1所述的应用，其中，所述长QT综合征选自先天性长QT综合征2型，获得性长QT综合征的一种或多种。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述长QT综合征可能引起尖端扭转性室性心动过速。

5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述长QT综合征可能引起心脏形猝死。

6.AMO-3619在制备治疗长QT综合征药物中的应用。

7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，药物组合物中含有AMO-3619。

8.根据权利要求5或6所述的应用，其特征在于，所述AMO-3619为miR-3619的反义寡核苷酸序列。

9.根据权利要求5或6或7所述的应用，其特征在于，AMO-3619为miR-3619抑制剂。