DE10110350A1

DE10110350A1 - Nukleinsäure codierend für ein mit VDAC- oder BAX-Kanälen wechselwirkendes Protein

Info

Publication number: DE10110350A1
Application number: DE2001110350
Authority: DE
Inventors: Ulf R Rapp; Veronique Lemalley
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2001-03-23
Filing date: 2001-02-27
Publication date: 2002-09-12

Abstract

Die Erfindung betrifft eine Nukleinsäure, codierend für zumindest eine Teilsequenz einer Protein Kinase der mitogenen Signalisierungskaskade, insbesondere c-raf, wobei die Teilsequenz mit VDAC- oder BAX-Kanälen in mitochondralen Membranen wechselwirkt, oder mit einer solchen Nukleinsäure hybridisierende Nukleinsäure oder Homologe oder Derivate solcher Nukleinsäuren, durch eine solche Nukleinsäure codierte Proteine oder Peptide sowie ein Screening Verfahren.

Description

Gebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft Nukleinsäuren, welche für ein mit VDAC- oder BAX Kanälen wechselwirkendes Protein codieren sowie Verwendungen solcher Nukleinsäuren oder hiervon codierten Proteinen oder Peptiden in Screening Verfahren oder zur Herstellung von pharmazeutischen Zusammensetzungen.

Hintergrund der Erfindung und Stand der Technik

Das raf Protein in seinen verschiedenen Isoformen c- raf, B-raf und A-raf spielt eine wichtige Rolle in der Regulierung der Proliferation und Differenzierung von Zellen. raf ist eine Effektorkinase von ras und ein wichtiges Glied in der mitogenen cytoplasmischen Pro tein Kinase (MAPK) Signalisierungskaskade (siehe z. B. Daum, O., et al., Trends Biochem. Sci. 19: 474-479 (1994)). raf Protoonkogene sind hoch konservierte Gene, welche Serin/Threonin-spezifische Kinasen des Cytoplasmas codieren. Diese Kinasen weisen Funktionen in der mitogenen Signaltransduktion auf. Diese Kaskade überträgt Signale von Rezeptor Tyrosin-Kinasen über ras, raf, MEK und ERK zu Targets in dem Cytoplasma und im Kern zur Regulation der Proliferation und Differen zierung der Zellen. Die Rolle von c-raf-1 in der klas sischen mitogenen MAP Kinase Kaskade ist recht gut untersucht. Im einzelnen wird hierzu lediglich beispielhaft auf U. R. Rapp in The Oncogene Handbook, T. Curran et al., Eds, Elsevier Science Publishers, Niederlande, 1988, Seiten 115-154, verwiesen. c-raf-1 ist im menschlichen Organismus praktisch ubiquitär.

Mit der Transduktion eines Apoptosesignals in eine Zelle gehen Änderungen der Permeabilität von Membranen der Mitochondrien einher. So führt eine Erhöhung der Permeabilität dieser Membranen zu einer Translokation des apopotischen Proteins Cytochrom C in das Cyto plasma, wodurch letztendlich Caspase genannte prote olytische Proteine aktiviert werden. Diese Proteine führen zur Apoptose. Die Permeabilität von Mitochon drienmembranen wird u. a. bestimmt von der Durchlässig keit der mitochondralen Porinkanäle VDAC (Voltage-De pendent Anion Channel). Die Permeabilität wird weiter hin beeinflußt von einer Proteinfamilie, zu welcher Bcl-2, Bcl-X_L, BAX und BAK gehören. Bcl-2 wirkt pro tektiv und bindet vermutlich an VDAC. BAX ist ein in tegrales Membranprotein und fördert Apoptose. Bax und Bcl-2 können heterodimerisieren und eine Überexpres sion von BAX überkompensiert den protektiven Effekt von Bcl-2. Für eine vertiefte Darstellung der Zusam menhänge wird lediglich beispielhaft auf Zhou, M., et al. J. Biol. Chem. 273: 11930-11936 (1998) und Shimizu, M., Nature (Asia) 399: 483 (1999) verwiesen.

Den Mitgliedern der Bcl-2 Familie ist gemeinsam, daß vier Regionen mit Aminosäurenhomologie vorhanden sind, BH1, BH2, BH3 und BH4. Diese Domänen sind für die Dimerisation und/oder die Funktion der verschiedenen Mitglieder essentiell. Insbesondere das Vorhandensein oder die Abwesenheit von BH4 scheint eine wesentliche Rolle für die antiapoptotische oder proapoptotische Wirkung zu spielen (siehe z. B. Wang, H.-G. et al., Cell 87: 629-638 (1996)). So weist Bcl-2 BH4 auf, während BAX BH4 nicht aufweist.

Aus der Literaturstelle Wang, H.-G. et al., Cell 87: 629-638 (1996) ist es bekannt, daß raf-1 mit Bcl-2 wechselwirkt. Gemäß dieser Literaturstelle ist BH-4 für die Wechselwirkung essentiell. Eine Assoziation raf-1/BAX ist nicht festgestellt, vielmehr negiert worden. Die Ergebnisse unterliegen der Diskussion.

Verschiedene Erkrankungen gehen mit einer Störung der natürlichen Zelltod-Programmierung einher. Mangelnde Funktion des natürlichen Zelltodes ist beispielsweise mit Krebs oder Autoimmunkrankheiten assoziiert. Dem gegenüber geht excessiver Zelltod mit Krankheiten, wie AIDS und neurodegenerativen Erkrankungen einher.

Technisches Problem

Der Erfindung liegt das technische Problem zugrunde, unerwünschten Zelltod zu inhibieren und geeignete Wirkstoffe zur Behandlung von durch unerwünschten Zelltod begleitete Erkrankungen, insbesondere AIDS oder neurodegenerative Erkrankungen, bereit zu stellen.

Der Erfindung zugrundeliegende Erkenntnis

Es wurden verschiedene Experimente zur Membranperme abilität von VDAC oder BAX Channels in synthetischen Membranen durchgeführt. Hierbei wurde festgestellt, daß bei Inkubation von VDAC oder BAX mit c-raf die Channels geschlossen bleiben. Demgegenüber sind die Channels bei Inkubation von VDAC oder BAX mit einer inaktiven Form des c-raf offen.

Die gefunden Wechselwirkung von raf mit VDAC oder BAX kann direkt oder indirekt über mediierende Substanzen, möglicherweise Bcl-2, erfolgen.

Grundzüge der Erfindung und Ausführungsformen

Die Erfindung betrifft eine Nukleinsäure codierend für zumindest eine Teilsequenz einer Protein Kinase der mitogenen Signalisierungskaskade, wobei die Teilse quenz mit VDAC- oder BAX-Kanälen in mitochondralen Membranen wechselwirkt, oder mit einer solchen Nuk leinsäure hybridisierende Nukleinsäure oder Homologe oder Derivate solcher Nukleinsäuren.

Der Begriff der Nukleinsäure umfaßt insbesondere DNA, RNA und PNA. Ebenfalls subsumiert unter den Begriff sind doppelsträngige Nukleinsäuren sowie einzel strängige Nukleinsäuren und folglich auch zueinander komplementäre Nukleinsäuren. Als unter erfindungs gemäße Nukleinsäuren fallend werden auch stille Muta tionen betrachtet. Stille Mutationen meint Varianten in der Sequenz, die zu keinem funktionalen Unterschied, bezogen auf die Wechselwirkung mit VDAC oder BAX, der Variante gegenüber der natürlichen, nicht mutierten Sequenz führen. Stille Mutationen kön nen Allele oder künstliche Mutationen sein. Derivate fallen ebenfalls unter die Erfindung. Derivate sind nicht-natürliche chemische Modifikationen. Mit er findungsgemäßen Nukleinsäuren hybridisierende Nuklein säuren sind solche, die unter stringenten Bedingungen hybridisieren. Stringenz tritt typischerweise in einem Temperaturbereich von 5°C bis 25°C unterhalb der Aufschmelztemperatur bei der Hybridisierung ein. Unter stringenten Bedingungen wird eine Hybridisierung bei zumindest 95% Sequenzidentität, vorzugsweise 98%, ver standen. Hinsichtlich der diesen Definitionen zugrun deliegenden Hybridisierungsmethode wird auf die Literaturstellen Sambrook, j. m. et al., A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989) und Southern, E. M., J. Mol. Biol. 98: 503 (1975) verwiesen.

Als Protein Kinasen der mitogenen Signalisierungs kaskade kommen insbesondere A-raf, B-raf oder c-raf in Frage. Bei der erfindungsgemäßen Nukleinsäure kann es sich auch nur um eine raf-Teilsequenz handeln, und zwar die Kinase Domäne CR3 oder aktive Teilsequenzen hieraus sowie um stille Mutationen und/oder Derivate hiervon. CR3 liegt oberhalb der Aminosäure 302 in dem Bereich bis 648. Insofern kann es sich bei der Nuk leinsäure beispielsweise um eine für Δraf(26-302) cod ierende Nukleinsäure handeln. Wichtig scheint zu sein, daß die Nukleinsäure für eine aktive Form der Kinase bzw. kinase aktiven Teil hiervon bzw. ein homologes Protein oder Peptid codiert.

Mittels erfindungsgemäßer Nukleinsäuren kann nach mit VDAC oder BAX wechselwirkenden Substanzen gesucht wer den. Einerseits kann im Falle einer indirekten Wech selwirkung nach Substanzen geforscht werden, die an den zuvor als für die Wechselwirkung essentiell ermit telten Teil von raf binden. Andererseits können solche Nukleinsäuren auch als Vorlage für eine höhere Wirk samkeit aufweisende Substanzen gleicher Funktion di enen. Daher betrifft die Erfindung auch ein Screening Verfahren zur Ermittelung von VDAC oder BAX modulier enden Substanzen mit den folgenden Verfahrensschrit ten: a) es wird VDAC oder BAX, optional nur eine definierte Teilsequenz hiervon, mit einer Probensub stanz, insbesondere einer Teilsequenz von raf, inku biert, b) die Lösung aus Stufe a) wird mit einer in einem Elektrolyten positionierten Membran kontaktiert, c) die Membran aus Stufe b) wird zu einem Zeitpunkt t = 0 einer elektrischen Potentialdifferenz zwischen verschiedenen Seiten der Membran unterworfen, wobei beginnend bei t = 0 oder einer definierten Zeit nach t = 0 die potentialdifferenzbedingte Stromstärke oder der Ladungstransport durch die Membran vorzugsweise zeitabhängig gemessen wird, d) der in Stufe c) ge messene Wert wird mit einem Wert verglichen, welcher unter gleichen Bedingungen, jedoch mit einer inaktiven oder aktiven Form von raf gemessen wurde. Hierdurch wird beispielsweise gegenüber der inaktiven Form er mittelt, ob überhaupt eine Hemmung eintritt und beispielsweise gegenüber der aktiven Form, ob die Hem mung stärker als bei aktivem raf ist.

Bevorzugt ist eine erfindungsgemäße Nukleinsäure, bei welcher die Wechselwirkung in einer Reduktion der Per meabilität von VDAC- oder BAX-Kanälen besteht.

Bevorzugterweise codiert die Nukleinsäure für ein ak tives Protein oder Peptid enthaltend die Sequenz c-raf-1 (338 bis 627) oder ein aktives Fragment hi eraus oder ist eine mit einer solchen Nukleinsäure hybridisierende Nukleinsäure bzw. codiert für ein Pro tein oder Peptid bestehend aus der Sequenz c-raf-1 (338 bis 627) oder ist eine mit einer solchen Nuklein säure hybridisierende Nukleinsäure. Es kann sich auch um eine cDNA handeln. Bevorzugterweise handelt es sich im Rahmen der Erfindung um human raf. Zu For schungszwecken kann es sich aber auch um raf von nicht menschlichen Säugetieren handeln.

Die Erfindung betrifft weiterhin einen isolierten rekombinanten Vektor enthaltend eine erfindungsgemäße Nukleinsäure bzw. ein Expressionsplasmid mit dieser Nukleinsäure. Hierbei kann zwecks stabiler Expression ein für ein geeignetes virales Protein codierendes DNA Fragment, beispielsweise gag, mit eingesetzt sein (Fu sion gag mit beispielsweise c-raf bzw. c-raf Frag ment). Mittels des Expressionsplasmids läßt sich eine Transformante bilden, welche wiederum zur Herstellung des durch die Nukleinsäure codierten Proteins bzw. Peptids verwendet werden kann. Hierzu wird die Trans formante nach üblichen Methoden auf geeignete Weise kultiviert.

Die Erfindung betrifft weiterhin ein Protein oder Pep tid codiert durch eine erfindungsgemäße Nukleinsäure.

Gegenstand der Erfindung ist schließlich insbesondere die Verwendung einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure oder eines hierdurch kodierten Proteins oder Peptids zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung von AIDS oder von neurodegenerativen Erkrankungen oder zur Protektion nicht transformierter Zellen in einem Krebszellen enthaltenden Gewebe. Hier bei wird genutzt, daß die erfindungsgemäße Nuklein säure bzw. das dadurch codierte Protein oder Peptid antiapoptotisch wirkt und einen (frühzeitigen) Zelltod mit der Folge entsprechender Erkrankung verhindert. Im Falle von AIDS werden die T-Lymphozyten geschützt. Im Falle neurodegenerativer Erkrankungen werden Nerven zellen vor dem (irreparablen) Zelltod geschützt. Im Rahmen einer Krebstherapie mit auf unkontrolliert pro liferierende Zellen gerichteten Zellgiften können nor male gesunde Zellen vor dem unerwünschten Zelltod durch Wirkung des Zellgiftes geschützt werden.

Die Erläuterungen für eine Anspruchskategorie der Er findung gelten entsprechend für andere Anspruchskate gorien. Die Erfindung betrifft letztendlich auch Heilverfahren, beispielsweise klassisch durch geeignete Verabreichung von pharmazeutischen Präparaten aber auch gentherapeutisch, mittels welcher eine oder mehrere Substanzen gemäß der Ansprüche 1 bis 7 in eine Zielzelle eingebracht oder in der Zielzelle erzeugt werden.

Im folgenden wird die Erfindung anhand von lediglich Ausführungsbeispiele darstellenden Figuren und Experi menten näher erläutert. Es zeigen:

Fig. 1a, b Permeabilität von VDAC (a) und BAXΔTM (b) Kanälen nach Inkubation mit GST-c-rafL375W (a),

Fig. 2a, b Permeabilität von VDAC (a) und BAXΔTM (b) Kanälen nach Inkubation mit GST-c-rafYY340/341DD, und

Fig. 3 Permeabilität von BCL-2ΔTM Kanälen nach Inkubation mit GST-c-rafYY340/341DD.

Sequenzinformation

Die Sequenz von BAX ist bekannt und unter der Accession-Nr. L22473 bei www.ncbi.nlm.nih.gov abruf bar. Die Sequenz von BCL-2 ist bekannt und unter der Accession-Nr. M13995 bei www.ncbi.nlm.nih.gov abruf bar. Die Sequenz von VDAC ist bekannt und unter der Accession-Nr. NM003374 bei www.ncbi.nlm.nih.gov abruf bar. Die Sequenz von c-raf ist bekannt und unter der Accession-Nr. X03484 bei www.ncbi.nlm.nih.gov abruf bar. Die Sequenz von A-raf ist bekannt und unter der Accession-Nr. X04790 bei www.ncbi.nlm.nih.gov abruf bar. Die Sequenz von B-raf ist bekannt und unter der Accession-Nr. M95712 bei www.ncbi.nlm.nih.gov abrufbar.

Beispiel 1 Herstellung von Plasmiden 13

BAX und BCL-2 cDNAs wurden eingesetzt, welche für Pro teine codieren, denen die COOH-terminale Transmembrandomäne (ΔTM) fehlt. Im Falle von BAX ist dies BAXΔC19, i. e. die Aminosäuren 172-191 fehlen. Im Falle von BCL-2 ist dies BCL-2ΔC21, i. e. die Aminosäuren 219-239 fehlen. cDNA, welche für BAXΔTM codiert, wurde durch Verdau mit EcoRI/XhoI aus dem Vektor pJG4-5 heraus geschnitten und in die EcoRI/XhoI-sites von pGEX-4T1 subkloniert. cDNA, welche für BCL-2ΔTM codiert, wurde im pGEX-4T1 Plasmid (erhalten von J. Reed) exprimiert. GST-c-rafYY340/341DD und GST-c-rafL375W wurden in pFastBac Baculoviren kloniert zur Expression in Sf9 Insektenzellen.

Beispiel 2 Expression und Reinigung der rekombinanten Proteine

Escherichia coli BL21 DE3(pLysS) wurden mit BAXΔTM oder BCL-2ΔTM Konstrukten transformiert und in Gegen wart vom 0,1 mg/ml Ampicilin bei 37°C über Nacht angezüchtet. Eine einzelne Kolonie jedes Vektors wurde in 2xY-TG Medium enthaltend 0,1 mg/ml Ampicilin bei 37 °C bis einem OD(600 nm) Wert von 0,6 kultiviert. Prote inexpression wurde mittels 0,1 mM Isopropyl-β-D- thiogalactopyranosid für 16 h bei 25°C induziert. Die Zellen wurden mittels Zentrifugation bei 4000 rpm für 30 min. bei 4°C gewonnen und in Lysis Puffer (Tris 50 mM pH 8, NaCl 100 mM, EDTA 1 mM, Benzamidin 1 mM, Phenylmethylsulfonylfluorid 1 mM, Leupeptin 10 µg/ml, Aprotinin 10 µg/ml, β-Mercaptoethanol 10 mM) resus pendiert. Homogenate der Zellen wurden in Gegenwart von 1 mg Lysosym in flüssigem Stickstoff eingefroren und wieder aufgetaut vor Ultraschallbehandlung. Nach Zentrifugieren bei 28.000 g bei 4°C und für 30 min. wurde der Überstand mit Gluthathion Sepharose Beads (Pharmacia Amersham) für 2 h bei 4°C inkubiert. Die Beads wurden mit Lysis Puffer enthaltend Triton-X100 (0,1%) und NaCl (20 mM) gewaschen und über Nacht in einem Thrombin (Sigma) enthaltenden Puffer (Tris 50 mM pH 8, β-Mercaptoethanol 20 mM) inkubiert. Gespaltenes BAXΔTM und BCL-2ΔTM wurde auf einer Anionenaus tauschersäule Resource Q (Pharmacia-Amersham) weiter gereinigt und die Protein wurden mit einem NaCl Gradi enten (0-0,5 M) eluiert.

Zur Gewinnung der GST-C-raf Proteine wurden die Sf9 Insektenzellen mit den Baculoviren infiziert und Zell pellets wurden eingefroren und bei -70°C. Die Pellets wurden in Lysis Puffer (Tris 25 mM pH 7,6, NaCl 150 mM, Na₄P₂O₇ 10 mM, β-Glycerophosphat 25 mM, Glycerin 10%, NP-40 0,75%, Leupeptin 10 µg/ml, Aprotinin 10 µg/ml, Benzamidin 1 mM, Phenylmethylsulfonylfluorid 1 mM) resuspendiert, honogenisiert und für 40 min. bei 4 °C inkubiert. Zelldebris wurde durch Zentrifugieren bei 15.000 g bei 4°C und für 30 min. entfernt. Über stände wurden mit Gluthathion Sepharose Beads (Pharma cia Amersham) für 2 h bei 4°C inkubiert. Die Beads wurden mit Lysis Puffer ein erstes Mal und ein zweites Mal mit Lysispuffer enthaltend NaCl (500 mM) ge waschen. GST Fusionsproteine wurden mit Puffer (Tris 50 mM pH 8, Aprotinin, Leupeptin, Benzamidin) enthal tend 20 mM Gluthation eluiert.

VDAC Protein wurde aus Rattenleber unter denaturieren den/renaturierenden Bedingungen gereinigt.

Beispiel 3 Durchführung der Versuche an Lipid-Doppelschichten

Die kanalbildenden Proteine wurden in eine künstliche Lipid-Doppelschicht rekonstituiert. Der experimentelle Aufbau umfaßte eine Teflonkammer mit zwei wäßrige KCL Puffer (0,3 M) enthaltenden Kammern eines Volumens von 5 ml, wobei die Kammern durch ein kreisrundes Loch eines Querschnitts von 0,2 mm² verbunden sind. Die Membran wurde aus einer Lösung von 1% (w/v) Diphyta noylphosphatidylcholin (DiphPC, Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL) in n-Decan gebildet. Die Doppelschicht bildung war dadurch erkennbar, daß die Membran optisch schwarz bezüglich reflektierten Lichtes wurde.

BAXΔTM, BCL-2ATM oder VDAC Protein wurde zu dem KCl Puffer beider Kammern hinzugegeben. Die single-channel Leitfähigkeit der gebildeten Poren bzw. Kanäle wurde gemessen nach Anlegung eines konstanten Membranpoten tials (20 mV) durch Einbringung von je einer Ag/AgCl Elektrode mit Salzbrücken in den Puffer der beiden Kammern. Die aufgenommenen Stromstärkewerte wurden mittels eines Stromverstärkers verstärkt und mittels eines Schreibers als Funktion der Zeit aufgenommen.

Um den Effekt der c-raf Kinase auf BAXΔTM, BCL-2ΔTM oder VDAC Kanäle zu testen, wurde die kanalbildenden Proteine (BAXΔTM: 2,4 µg, BCL-2ΔTM: 1,8 µg) in Kinase Puffer (Hepes 25 mM pH 7,4, NaCl 150 mM, β- Glycerophosphat 25 mM, DTT 1 mM, MgCl₂ 10 mM) in der Gegenwart von ATP (0,1 mM) für 30 min. bei 30°C mit GST-c-rafYY340/341DD (aktive Form von c-raf), GST-c-rafL375W (inaktive Form von c-raf) oder GST allein inkubiert. Proben wurden in die KCL Puffer der Kammern beidseitig der DiphPC Membran eingebracht und es wurde die single-channel Bildung gemessen. Im Rah men von Kontrollmessungen wurde festgestellt, daß GST-c-rafYY340/341DD, GST-c-rafL375W oder GST, jeweils allein, nicht zu einer Kanalbildung in der künstlichen Doppelschichtmembran führten.

Beispiel 4 Ergebnisse

In der Fig. 1a, b sind die Ergebnisse der Permeabil itätsmessungen mit einem experimentellen Aufbau gemäß Beispiel 3 dargestellt, und zwar VDAC/GST-c-rafL375W (a) und BAXΔTM/GST-c-rafL375W (b). Man erkennt, daß Kanäle gebildet werden, i. e. keine Inhibierung stattfindet.

Demgegenüber ist den Fig. 2a, b entnehmbar, daß der Einsatz der aktiven Form von c-raf, GST-c- rafYY340/341DD, anstelle der inaktiven Form nach Fig. 1a, b, zu einer beachtlichen Hemmung der Kanalbildung führt. Dies beruht auf der erfindungsgemäßen Wechsel wirkung des aktiven c-raf Proteins mit VDAC bzw. BAXΔTM.

Mit der aktiven Form von c-raf wurde weiterhin ein eventueller Einfluß auf BCL-2ΔTM getestet. Diese Er gebnisse sind in der Fig. 3 dargestellt. Man erkennt, daß offenbar eine Kanalbildung stattfindet, i. e. c-raf wechselwirkt mit BCL-2 jedenfalls nicht einer die Ka nalbildung hemmenden Weise.

Claims

1. Nukleinsäure codierend für zumindest eine Teilse quenz einer Protein Kinase der mitogenen Signalis ierungskaskade, wobei die Teilsequenz mit VDAC- oder BAX-Kanälen in mitochondralen Membranen wech selwirkt, oder mit einer solchen Nukleinsäure hy bridisierende Nukleinsäure oder Homologe oder Derivate solcher Nukleinsäuren.

2. Nukleinsäure nach Anspruch 1, wobei die Wechsel wirkung in einer Reduktion der Permeabilität von VDAC- oder BAX-Kanälen besteht.

3. Nukleinsäure nach Anspruch 1 oder 2 codierend für ein aktives Protein oder Peptid enthaltend die Se quenz c-raf-1 (338 bis 627) oder ein aktives Frag ment hieraus oder eine mit einer solchen Nukleinsäure hybridisierende Nukleinsäure.

4. cDNA nach einem der Ansprüche 1 bis 3.

5. Isolierter rekombinanter Vektor enthaltend eine Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 4.

6. Protein oder Peptid codiert durch eine Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 4.

7. Verwendung einer Nukleinsäure nach einem der An sprüche 1 bis 4 oder eines hierdurch kodierten Pro teins oder Peptids zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung von AIDS oder von neurodegenerativen Erkrankungen oder zur Protektion nicht transformierter Zellen in einem Krebszellen enthaltenden Gewebe.

8. Verwendung einer Nukleinsäure nach einem der An sprüche 1 bis 4 oder eines hierdurch kodierten Pro teins oder Peptids in einem screening Verfahren zur Ermittelung einer die Schließung von VDAC oder BAX bewirkenden Substanz.

9. Screening Verfahren zur Ermittelung von VDAC oder BAX modulierenden Substanzen mit den folgenden Verfahrensschritten:

a) es wird VDAC oder BAX, optional nur eine definierte Teilsequenz hiervon, mit einer Pro bensubstanz, insbesondere einer Teilsequenz von raf, inkubiert,
b) die Lösung aus Stufe a) wird mit einer in einem Elekrolyten positionierten Membran kontaktiert,
c) die Membran aus Stufe b) wird zu einem Zeit punkt t = 0 einer elektrischen Potentialdifferenz zwischen verschiedenen Seiten der Membran unterworfen, wobei beginnend bei t = 0 oder einer definierten Zeit nach t = 0 die potentialdiffer enzbedingte Stromstärke oder der Ladungstrans port durch die Membran vorzugsweise zeitabhängig gemessen wird,
d) der in Stufe c) gemessene Wert wird mit einem Wert verglichen, welcher unter gleichen Bedin gungen, jedoch mit einer inaktiven Form oder aktiven Form von raf, insbesondere c-raf-1, gemessen wurde.