EP1366172A1 - Nukleinsäure codierend für ein mit einem porin kanal wechselwirkenden protein - Google Patents

Nukleinsäure codierend für ein mit einem porin kanal wechselwirkenden protein

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EP1366172A1
EP1366172A1 EP02721985A EP02721985A EP1366172A1 EP 1366172 A1 EP1366172 A1 EP 1366172A1 EP 02721985 A EP02721985 A EP 02721985A EP 02721985 A EP02721985 A EP 02721985A EP 1366172 A1 EP1366172 A1 EP 1366172A1
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EP
European Patent Office
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raf
nucleic acid
substances
prospective
protein
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Withdrawn
Application number
EP02721985A
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English (en)
French (fr)
Inventor
Ulf Rapp
Veronique Residence Le Jardin des Muses LEMALLEY
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Individual
Original Assignee
Individual
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Publication date
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Publication of EP1366172A1 publication Critical patent/EP1366172A1/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • C12N9/1205—Phosphotransferases with an alcohol group as acceptor (2.7.1), e.g. protein kinases
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54366—Apparatus specially adapted for solid-phase testing
    • G01N33/54373—Apparatus specially adapted for solid-phase testing involving physiochemical end-point determination, e.g. wave-guides, FETS, gratings
    • G01N33/5438—Electrodes
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    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6872—Intracellular protein regulatory factors and their receptors, e.g. including ion channels
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
    • G01N2500/10—Screening for compounds of potential therapeutic value involving cells
    • G—PHYSICS
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    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
    • G01N2500/20—Screening for compounds of potential therapeutic value cell-free systems

Definitions

  • the invention relates to nucleic acids which code for a protein interacting with porins, in particular VDAC, BAX channels or bacterial porins, and uses of such nucleic acids or proteins or peptides encoded thereby in screening processes or for the production of pharmaceutical compositions.
  • raf protein in its various isoforms c-raf, B-raf and A-raf plays an important role in regulating the proliferation and differentiation of cells, raf is an effector kinase of ras and an important link in the mitogenic cytoplasmic protein kinase (MAPK ) Signaling cascade (see, for example, Daum, 0., et al., Trends Biochem. Sci. 19: 474-479 (1994)).
  • raf Proto-oncogenes are highly conserved genes which encode serine / threonine-specific cytoplasmic kinases. These kinases have functions in mitogenic signal transduction.
  • This cascade transmits signals from receptor tyrosine kinases via ras, raf, MEK and ERK to targets in the cytoplasm and in the nucleus to regulate the proliferation and differentiation of the cells.
  • the role of c-raf-1 in the classic mitogenic MAP kinase cascade is quite good examined. In detail, this is only exemplified by UR Rapp in The Oncogene Handbook, T. Curran et al. , Eds, Elsevier Science Publishers, The Netherlands, 1988, pages 115-154. c-raf-1 is practically ubiquitous in the human organism.
  • the transduction of an apoptosis signal into a cell is accompanied by changes in the permeability of mitochondrial membranes.
  • an increase in the permeability of these membranes leads to a translocation of the apopotic protein cytochrome C into the cytoplasm, which ultimately activates caspase called proteolytic proteins.
  • proteolytic proteins These proteins lead to apoptosis.
  • the permeability of mitochondrial membranes is determined, among other things, by the permeability of the mitochondral porine channels VDAC (Voltage-Dependent Anion Channel). Permeability is also affected by a family of proteins to which Bcl-2, Bcl-X L , BAX and BAK belong. Bcl-2 is protective and presumably binds to VDAC.
  • BAX is an integral membrane protein and promotes apoptosis. Bax and Bcl-2 can heterodimerize and overexpression of BAX overcompensates for the protective effect of Bcl-2.
  • the members of the Bcl-2 family have in common that there are four regions with amino acid homology, BH1, BH2, BH3 and BH4. These domains are different for the er erization and / or function Members essential. In particular, the presence or absence of BH4 appears to play an essential role in the antiapoptotic or proapoptotic effect (see, for example, Wang, H.-G. et al., Cell 87: 629-638 (1996)). For example, Bcl-2 has BH4, while BAX does not have BH4.
  • the technical problem underlying the invention is to inhibit undesired cell death and to provide suitable active substances for the treatment of diseases accompanied by undesired cell death, in particular AIDS, neurodegenerative diseases, or bacterial infections accompanied by undesired cell death.
  • the invention relates to a nucleic acid coding for at least one partial sequence of a protein kinase of the mitogenic signaling cascade, the partial sequence interacting with porins, in particular with VDAC, BAX channels in mitochondral membranes or with bacterial porin channels, or with nucleic acid hybridizing with such a nucleic acid or homologues or derivatives of such nucleic acids.
  • nucleic acid includes in particular DNA, RNA and PNA. Also subsumed under the term are double-stranded nucleic acids and single-stranded nucleic acids and consequently also nucleic acids that are complementary to one another. Silent mutations are also considered to be nucleic acids according to the invention. Silent mutations mean variants in the sequence that do not lead to any functional difference, based on the interaction with VDAC or BAX, of the variant compared to the natural, non-mutated sequence. Silent mutations can be alleles or artificial mutations. Derivatives also fall under the invention. Derivatives are non-natural chemical modifications. Nucleic acids hybridizing with nucleic acids according to the invention are those which hybridize under stringent conditions.
  • Stringency typically occurs in a temperature range from 5 ° C to 25 ° C below The melting temperature during hybridization.
  • Stringent conditions mean a hybridization with at least 95% sequence identity, preferably 98%.
  • A-raf, B-raf or c-raf are particularly suitable as protein kinases of the mitogenic signaling cascade.
  • the nucleic acid according to the invention can also be only a partial raf sequence, namely the kinase domain CR3 or active partial sequences thereof, and silent mutations and / or derivatives thereof.
  • CR3 is above amino acid 302 in the range up to 648.
  • the nucleic acid can be, for example, a nucleic acid coding for ⁇ raf (26-302). It seems to be important that the nucleic acid codes for an active form of the kinase or kinase-active part thereof or for a homologous protein or peptide.
  • the nucleic acids according to the invention can be used to search for substances interacting with VDAC, BAX or bacterial porin channels.
  • substances to the previously considered for the Wech ⁇ sel
  • raf bind substances to the previously considered for the Wech ⁇ sel
  • such nucleic acids can also serve as a template for substances of the same function which have a higher activity.
  • a nucleic acid according to the invention is preferred in which the interaction consists in a reduction in the permeability of VDAC, BAX or bacterial porin channels.
  • the nucleic acid preferably codes for an active protein or peptide containing the sequence c-raf-1 (338 to 627) or an active fragment thereof or is a nucleic acid hybridizing with such a nucleic acid or coded for a protein or peptide consisting of the sequence c -raf-1 (338 to 627) or is a nucleic acid hybridizing with such a nucleic acid. It can also be a cDNA. In the context of the invention it is preferably human raf. For research purposes, however, it can also be raf from non-human mammals.
  • the invention further relates to an isolated recombinant vector containing a nucleic acid according to the invention or an expression plasmid with this nucleic acid.
  • a DNA fragment coding for a suitable viral protein for example gag
  • gag fusion gag with, for example, c-raf or c-raf fragment.
  • a transformant can be formed by means of the expression plasmid, which in turn can be used to produce the protein or peptide encoded by the nucleic acid.
  • the transformant is cultivated in a suitable manner using customary methods.
  • the invention further relates to a protein or peptide encoded by a nucleic acid according to the invention.
  • the invention relates in particular to the use of a nucleic acid according to the invention or a protein or peptide encoded thereby for the production of a pharmaceutical composition for the treatment of AIDS or of neurodegenerative diseases or for the protection of untransformed cells in a tissue containing cancer cells or bacterial infections that the nucleic acid according to the invention or that encoded protein or peptide has an anti-apoptotic effect and prevents (premature) cell death with the consequence of a corresponding disease.
  • the T lymphocytes are protected.
  • nerve cells are protected from (irreparable) cell death.
  • normal healthy cells can be protected against unwanted cell death by the action of the cell poison.
  • the invention also relates to screening methods for determining substances which activate raf and are therefore suitable for the production of pharmaceutical compositions for the treatment of the abovementioned diseases, preferably of low molecular weight ( ⁇ 10,000 da, preferably ⁇ 5000 da).
  • a screening method is also understood to be a method for verifying raf activation by a prospective active ingredient.
  • such a screening method can be directed towards substances that directly or indirectly, for example in a cell model, increase the raf concentration.
  • these can be raf expression of up-regulating substances.
  • they can also be substances which themselves inhibit modulator substances which inhibit raf expression or raf itself.
  • such screening methods can be carried out as follows.
  • a screening process for the identification of raf activating substances can be equipped with the following process stages: a) Target cells are made with a prospective active ingredient or a mixture prospective active substances are added and the target cells are cultivated, b) after a defined time the expression and / or concentration of raf protein is measured and the measured value obtained is compared with a measured value which is under the same conditions but without the addition of a prospective active substance , c) a prospective active ingredient or a mixture of prospective active ingredients are selected with the proviso that an increase in expression and / or concentration of raf protein was found in stage b), d) optionally a deconvolute is used when a mixture of prospective active ingredients is used - tion carried out, for example by individual measurement of the active ingredients of the mixture.
  • a screening method for identifying raf activating substances can also be equipped with the following process stages: a) raf inhibitors which occur naturally in target cells, in particular substances which bind to the kinase domain of raf or substances which downregulate raf expression, are identified, b) a substance identified in stage a), optionally isolated and / or purified, is mixed with a prospective active substance or a mixture of prospective active substances in a binding assay and the binding ability of the substance with the prospective active substance is examined, c) a prospective active substance or a mixture of prospective active substances For which a binding event was determined in stage b), selection is made; d) optionally, if a mixture is used, it becomes more prospective
  • Active ingredients a deconvolution is carried out, for example by individually measuring the active ingredients of the mixture, e) optionally a selected one prospective agent or a selected mixture of prospective agents are subjected to a method according to claim 10 for the verification of the raf activation.
  • a method according to claim 10 for the verification of the raf activation.
  • all methods known to the person skilled in the art for determining a raf concentration and / or binding assays can be used.
  • it may be expedient if the target cells used are genetically modified in such a way that expressed raf carries a reporter group which is particularly easy to detect by measurement technology and which does not naturally occur in the target cells.
  • the invention also includes a pharmaceutical composition containing at least one inhibitor of raf
  • the invention also relates to healing methods, for example classically by suitable administration of pharmaceutical preparations, but also gene therapy, by means of which one or more substances according to the invention are introduced into a target cell or generated in the target cell or their expression is stimulated or strengthened.
  • Fig. 3 Permeability of BCL-2 ⁇ TM channels after incubation with GST-c-rafYY340 / 341DD.
  • BAX is known and under the accession no. L22473 available at www.ncbi.nlm.nih.gov.
  • BCL-2 is known and under the accession no. M13995 available at www.ncbi.nlm.nih.gov.
  • VDAC is known and under the accession no. NM003374 available at www.ncbi.nlm.nih.gov.
  • c-raf is known and under the accession no. X03484 available at www.ncbi.nlm.nih.gov.
  • A-raf is known and under the accession no.
  • BAX and BCL-2 cDNAs were used, which code for proteins that lack the COOH-terminal transmembrane domain ( ⁇ TM).
  • BAX this is BAX ⁇ C19, i.e. amino acids 172-191 are missing.
  • BCL-2 this is BCL-2 ⁇ C21, i.e. amino acids 219-239 are missing.
  • cDNA coding for BAX ⁇ TM was cut out of the vector pJG4-5 by digestion with EcoRI / XhoI and subcloned into the EcoRI / XhoI sites of pGEX-4Tl.
  • cDNA encoding BCL-2 ⁇ TM was expressed in the pGEX-4Tl plasmid (obtained from J. Reed).
  • GST-c-rafYY340 / 341DD and GST ⁇ c-rafL375W were cloned in pFastBac baculoviruses for expression in Sf9 insect cells.
  • Escherichia coli BL21 DE3 (pLysS) were transformed with BAX ⁇ TM or BCL-2 ⁇ TM constructs and grown in the presence of 0.1 mg / ml ampicilin at 37 ° C. overnight.
  • a single colony of each vector was cultured in 2xY-TG medium containing 0.1 mg / ml ampicilin at 37 ° C to an OD (600nm) value of 0.6.
  • Protein expression was induced by means of 0.1 mM isopropyl- ⁇ -D-thiogalactopyranoside for 16 h at 25 ° C.
  • the supernatant was incubated with gluthathione Sepharose Beads (Pharmacia Amersham) for 2 h at 4 ° C.
  • the beads were washed with lysis buffer containing Triton-XIOO (0.1%) and NaCl (20 mM) and incubated overnight in a buffer containing thrombin (Sig a) (Tris 50 mM pH 8, ⁇ -mercaptoethanol 20 mM).
  • Cleaved BAX ⁇ TM and BCL-2 ⁇ TM were further purified on a Resource Q anion exchange column (Pharmacia-Amersha) and the proteins were eluted with a NaCl gradient (0-0.5 M).
  • the Sf9 insect cells were infected with the baculoviruses and cell pellets were frozen and at -70 ° C.
  • the pellets were in lysis buffer (Tris 25 mM pH 7.6, NaCl 150 mM, Na 4 P 2 0 7 10 mM, ⁇ -glycerophosphate 25 mM, glycerin 10%, NP-40 0.75%, leupeptin 10 ⁇ g / ml, aprotinin 10 ⁇ g / ml, benzamidine 1 mM, phenylmethylsulfonyl fluoride 1 mM) resuspended, honed and for 40 min.
  • lysis buffer Tris 25 mM pH 7.6, NaCl 150 mM, Na 4 P 2 0 7 10 mM, ⁇ -glycerophosphate 25 mM, glycerin 10%, NP-40 0.75%, leupeptin 10 ⁇ g / ml, a
  • VDAC protein was purified from rat liver under denaturing / renaturing conditions.
  • Example 3 Carrying out the experiments on lipid bilayers.
  • the channel-forming proteins were reconstituted into an artificial lipid bilayer.
  • the experimental setup comprised a Teflon chamber with two 5 ml volumes of aqueous KCL buffer (0.3 M) containing chambers, the chambers being connected by a circular hole with a cross section of 0.2 mm 2 .
  • the membrane was formed from a solution of 1% (w / v) diphytanoylphosphatidylcholine (DiphPC, Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL) in n-decane. The double layer formation was recognizable by the fact that the membrane became optically black with respect to reflected light.
  • BAX ⁇ TM, BCL-2 ⁇ TM or VDAC protein was added to the KC1 buffer of both chambers.
  • the single-channel conductivity of the pores or channels formed was measured after applying a constant membrane potential (20 mV) by introducing one Ag / AgCl electrode with salt bridges into the buffer of the two chambers.
  • the recorded current values were amplified using a current amplifier and recorded as a function of time using a recorder.
  • the channel-forming proteins (BAX ⁇ TM: 2.4 ⁇ g, BCL-2 ⁇ TM: 1.8 ⁇ g) were in kinase buffer (Hepes 25 mM pH 7 , 4, NaCl 150 mM, ⁇ -glycerophosphate 25 mM, DTT 1 mM, MgCl 2 10 mM) in the presence of ATP (0.1 mM) for 30 min.
  • FIG. 1 a, b show the results of the permeability measurements with an experimental setup according to Example 3, namely VDAC / GST-c-rafL375W (a) and BAX ⁇ TM / GST-c-rafL375W (b). It can be seen that channels are formed, i.e. no inhibition takes place.
  • FIGS. 2a, b show that the use of the active form of c-raf, GST-c-rafYY340 / 341DD, instead of the inactive form according to FIG. 1a, b, leads to a considerable inhibition of channel formation.
  • This is based on the interaction of the active c-raf protein with VDAC or BAX ⁇ TM according to the invention.
  • a possible influence on BCL-2 ⁇ TM was also tested with the active form of c-raf.
  • FIG. 3 It can be seen that channel formation is evidently taking place, ie c-raf does not interact with BCL-2 in any way in a manner which inhibits channel formation.

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Abstract

Die Erfindung betrifft eine Nukleinsäure codierend für zumindest eine Teilsequenz einer Protein Kinase der mitogenen Signalisierungskaskade, insbesondere c-raf, wobei die Teilsequenz mit VDAC- oder BAX-Kanälen in mitochondralen Membranen wechselwirkt, oder mit einer solchen Nukleinsäure hybridisierende Nukleinsäure oder Homologe oder Derivate solcher Nukleinsäuren, durch eine solche Nukleinsäure codierte Proteine oder Peptide sowie ein Screening Verfahren.

Description

Nukleinsaure codierend für ein mit einem Porin Kanal wechselwirkendes Protein.
Gebiet der Erfindung
Die Erfindung betrifft Nukleinsäuren, welche für ein mit Porinen, insbesondere VDAC-, BAX Kanälen oder bakteriellen Porinen wechselwirkendes Protein codieren sowie Verwendungen solcher Nukleinsäuren oder hiervon codierten Proteinen oder Peptiden in Screening Verfahren oder zur Herstellung von pharmazeutischen Zusammensetzungen .
Hintergrund der Erfindung und Stand der Technik
Das raf Protein in seinen verschiedenen Isoformen c- raf, B-raf und A-raf spielt eine wichtige Rolle in der Regulierung der Proliferation und Differenzierung von Zellen, raf ist eine Effektorkinase von ras und ein wichtiges Glied in der mitogenen cytoplasmischen Protein Kinase (MAPK) Signalisierungskaskade (siehe z.B. Daum, 0., et al . , Trends Biochem. Sei. 19:474-479 (1994) ) . raf Protoonkogene sind hoch konservierte Gene, welche Serin/Threonin-spezifische Kinasen des Cytoplas as codieren. Diese Kinasen weisen Funktionen in der mitogenen Signaltransduktion auf. Diese Kaskade überträgt Signale von Rezeptor Tyrosin-Kinasen über ras, raf, MEK und ERK zu Targets in dem Cytoplasma und im Kern zur Regulation der Proliferation und Differenzierung der Zellen. Die Rolle von c-raf-1 in der klassischen mitogenen MAP Kinase Kaskade ist recht gut untersucht. Im einzelnen wird hierzu lediglich beispielhaft auf U.R. Rapp in The Oncogene Handbook, T. Curran et al . , Eds, Elsevier Science Publishers, Niederlande, 1988, Seiten 115 - 154, verwiesen. c-raf-1 ist im menschlichen Organismus praktisch ubiquitär .
Mit der Transduktion eines Apoptosesignals in eine Zelle gehen Änderungen der Permeabilität von Membranen der Mitochondrien einher. So führt eine Erhöhung der Permeabilität dieser Membranen zu einer Translokation des apopotischen Proteins Cytochrom C in das Cytoplasma, wodurch letztendlich Caspase genannte prote- olytische Proteine aktiviert werden. Diese Proteine führen zur Apoptose. Die Permeabilität von Mitochon- drien embranen wird u.a. bestimmt von der Durchlässigkeit der mitochondralen Porinkanäle VDAC (Voltage-De- pendent Anion Channel) . Die Permeabilität wird weiterhin beeinflußt von einer Proteinfamilie, zu welcher Bcl-2, Bcl-XL, BAX und BAK gehören. Bcl-2 wirkt pro- tektiv und bindet vermutlich an VDAC. BAX ist ein integrales Membranprotein und fördert Apoptose. Bax und Bcl-2 können heterodimerisieren und eine Überexpression von BAX überkompensiert den protektiven Effekt von Bcl-2. Für eine vertiefte Darstellung der Zusammenhänge wird lediglich beispielhaft auf Zhou, M., et al. J. Biol. Che . 273:11930-11936 (1998) und Shimizu, M., Nature (Asia) 399:483 (1999) verwiesen.
Den Mitgliedern der Bcl-2 Familie ist gemeinsam, daß vier Regionen mit Aminosäurenhomologie vorhanden sind, BH1, BH2, BH3 und BH4. Diese Domänen sind für die Di erisation und/oder die Funktion der verschiedenen Mitglieder essentiell. Insbesondere das Vorhandensein oder die Abwesenheit von BH4 scheint eine wesentliche Rolle für die antiapoptotische oder proapoptotische Wirkung zu spielen (siehe z.B. Wang, H.-G. et al., Cell 87:629-638 (1996)). So weist Bcl-2 BH4 auf, während BAX BH4 nicht aufweist.
Aus der Literaturstelle Wang, H.-G. et al . , Cell 87:629-638 (1996) ist es bekannt, daß raf-1 mit Bcl-2 wechselwirkt. Gemäß dieser Literaturstelle ist BH-4 für die Wechselwirkung essentiell. Eine Assoziation raf-1 / BAX ist nicht festgestellt, vielmehr negiert worden. Die Ergebnisse unterliegen der Diskussion.
Verschiedene Erkrankungen gehen mit einer Störung der natürlichen Zelltod-Programmierung einher. Mangelnde Funktion des natürlichen Zelltodes ist beispielsweise mit Krebs oder Autoimmunkrankheiten assoziiert. Demgegenüber geht excessiver Zelltod mit Krankheiten, wie AIDS und neurodegenerativen Erkrankungen einher. Aber auch Infektionen mit pathogenen Bakterien können mit einer Störung des natürlichen Zelltodes einhergehen, wobei bakterielle Porine in eine zelluläre Membran translociert werden und dort Apoptose der Zielzellen auslösen können. So ist beispielsweise aus der Literaturstelle The EMBO Journal 18:339-352 (1999) bekannt, daß das Porin PorB, in seinen verschiedenen Varianten, von beispielsweise Neisseria gonorrhoeae aus der äußeren Membran des Bakteriums sowohl in künstliche Membrane als auch in zelluläre Zielmembrane, insbesondere die äußere Mitochondrienmembran translociert. Diese Zusammenhänge gelten allgemein für Gram-negative Bakterien. Die Verwandschaft natürlicher mitochondraler Porine mit bakteriellen Porinen ist im übrigen beispielsweise für Escherichia coli, Sal o- nella typhimurium und Pseodomonas aeruginosa bereits in der Literaturstelle Biochimica et Biophysica Acta 686:204-214 (1982) beschrieben worden.
Technisches Problem
Der Erfindung liegt das technische Problem zugrunde, unerwünschten Zelltod zu inhibieren und geeignete Wirkstoffe zur Behandlung von durch unerwünschten Zelltod begleitete Erkrankungen, insbesondere AIDS, neurodegenerative Erkrankungen, oder mit unerwünschtem Zelltod begleitete bakterielle Infektionen, bereit zu stellen.
Der Erfindung zugrundeliegende Erkenntnis.
Es wurden verschiedene Experimente zur Membranperrae- abilität von VDAC oder BAX Channels in synthetischen Membranen durchgeführt. Hierbei wurde festgestellt, daß bei Inkubation von VDAC oder BAX mit c-raf die Channels geschlossen bleiben. Demgegenüber sind die Channels bei Inkubation von VDAC oder BAX mit einer inaktiven Form des c-raf offen. Die gefunden Wechselwirkung von raf mit VDAC oder BAX kann direkt oder indirekt über mediierende Substanzen, möglicherweise Bcl-2, erfolgen. Es ist weiterhin davon auszugehen, daß aufgrund der Ähnlichkeit zwischen einerseits natürlichen mitochondralen Porinen, VDAC und/oder BAX, und andererseits bakteriellen Porinen auch letztere sich durch Wechselwirkung mit raf inhibieren bzw. schließen lassen.
Grundzüge der Erfindung und Ausführungsformen
Die Erfindung betrifft eine Nukleinsaure codierend für zumindest eine Teilsequenz einer Protein Kinase der mitogenen Signalisierungskaskade, wobei die Teilse- quenz mit Porinen, insbesondere mit VDAC-, BAX-Kanälen in mitochondralen Membranen oder mit bakteriellen Porin Kanälen wechselwirkt, oder mit einer solchen Nukleinsaure hybridisierende Nukleinsaure oder Homologe oder Derivate solcher Nukleinsäuren.
Der Begriff der Nukleinsaure umfaßt insbesondere DNA, RNA und PNA. Ebenfalls subsumiert unter den Begriff sind doppelsträngige Nukleinsäuren sowie einzel- strängige Nukleinsäuren und folglich auch zueinander komplementäre Nukleinsäuren. Als unter erfindungs- gemäße Nukleinsäuren fallend werden auch stille Mutationen betrachtet. Stille Mutationen meint Varianten in der Sequenz, die zu keinem funktionalen Unterschied, bezogen auf die Wechselwirkung mit VDAC oder BAX, der Variante gegenüber der natürlichen, nicht mutierten Sequenz führen. Stille Mutationen können Allele oder künstliche Mutationen sein. Derivate fallen ebenfalls unter die Erfindung. Derivate sind nicht-natürliche chemische Modifikationen. Mit er- findungsgemäßen Nukleinsäuren hybridisierende Nukleinsäuren sind solche, die unter stringenten Bedingungen hybridisieren. Stringenz tritt typischerweise in einem Temperaturbereich von 5°C bis 25°C unterhalb der AufSchmelztemperatur bei der Hybridisierung ein. Unter stringenten Bedingungen wird eine Hybridisierung bei zumindest 95% Sequenzidentität, vorzugsweise 98%, verstanden. Hinsichtlich der diesen Definitionen zugrun- deliegenden Hybridisierungsmethode wird auf die
Literaturstellen Sambrook, j .m. et al., A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989) und Southern, E.M., J. Mol. Biol. 98:503 (1975) verwiesen.
Als Protein Kinasen der mitogenen Signalisierungskaskade kommen insbesondere A-raf, B-raf oder c-raf in Frage. Bei der erfindungsgemäßen Nukleinsaure kann es sich auch nur um eine raf-Teilsequenz handeln, und zwar die Kinase Domäne CR3 oder aktive Teilsequenzen hieraus sowie um stille Mutationen und/oder Derivate hiervon. CR3 liegt oberhalb der Aminosäure 302 in dem Bereich bis 648. Insofern kann es sich bei der Nukleinsaure beispielsweise um eine für Δraf (26-302) codierende Nukleinsaure handeln. Wichtig scheint zu sein, daß die Nukleinsaure für eine aktive Form der Kinase bzw. Kinase-aktiven Teil hiervon bzw. ein homologes Protein oder Peptid codiert.
Mittels erfindungsgemäßer Nukleinsäuren kann nach mit VDAC, BAX oder bakteriellen Porin Kanälen wechselwirkenden Substanzen gesucht werden. Einerseits kann im Falle einer indirekten Wechselwirkung nach Substanzen geforscht werden, die an den zuvor als für die Wech¬ selwirkung essentiell ermittelten Teil von raf binden. Andererseits können solche Nukleinsäuren auch als Vorlage für eine höhere Wirksamkeit aufweisende Substanzen gleicher Funktion dienen. Daher betrifft die Erfindung auch ein Screening Verfahren zur Ermittelung von VDAC, BAX oder bakterielle Porin Kanläe modulierenden Substanzen mit den folgenden Verfahrensschritten: a) es wird VDAC, BAX oder ein bakterieller Porin Kanal, optional nur eine definierte Teilsequenz hier- von, mit einer Probensubstanz, insbesondere einer Teilsequenz von raf, inkubiert, b) die Lösung aus Stufe a) wird mit einer in einem Elektrolyten positionierten Membran kontaktiert, c) die Membran aus Stufe b) wird zu einem Zeitpunkt t=0 einer elektri- sehen Potentialdifferenz zwischen verschiedenen Seiten der Membran unterworfen, wobei beginnend bei t=0 oder einer definierten Zeit nach t=0 die potentialdifferen- zbedingte Stromstärke oder der Ladungstransport durch die Membran vorzugsweise zeitabhängig gemessen wird, d) der in Stufe c) gemessene Wert wird mit einem Wert verglichen, welcher unter gleichen Bedingungen, jedoch mit einer inaktiven oder aktiven Form von raf gemessen wurde. Hierdurch wird beispielsweise gegenüber der inaktiven Form ermittelt, ob überhaupt eine Hemmung eintritt und beispielsweise gegenüber der aktiven
Form, ob die Hemmung stärker als bei aktivem raf ist.
Bevorzugt ist eine erfindungsgemäße Nukleinsaure, bei welcher die Wechselwirkung in einer Reduktion der Per- meabilität von VDAC-, BAX-, oder bakteriellen Porin- Kanälen besteht.
Bevorzugterweise codiert die Nukleinsaure für ein aktives Protein oder Peptid enthaltend die Sequenz c-raf-1 (338 bis 627) oder ein aktives Fragment hieraus oder ist eine mit einer solchen Nukleinsaure hybridisierende Nukleinsaure bzw. codiert für ein Protein oder Peptid bestehend aus der Sequenz c-raf-1 (338 bis 627) oder ist eine mit einer solchen Nukleinsaure hybridisierende Nukleinsaure. Es kann sich auch um eine cDNA handeln. Bevorzugterweise handelt es sich im Rahmen der Erfindung um human raf. Zu For- schungszwecken kann es sich aber auch um raf von nicht menschlichen Säugetieren handeln.
Die Erfindung betrifft weiterhin einen isolierten rekombinanten Vektor enthaltend eine erfindungsgemäße Nukleinsaure bzw. ein Expressionsplasmid mit dieser Nukleinsaure. Hierbei kann zwecks stabiler Expression ein für ein geeignetes virales Protein codierendes DNA Fragment, beispielsweise gag, mit eingesetzt sein (Fusion gag mit beispielsweise c-raf bzw. c-raf Frag- ment) . Mittels des Expressionsplasmids läßt sich eine Transformante bilden, welche wiederum zur Herstellung des durch die Nukleinsaure codierten Proteins bzw. Peptids verwendet werden kann. Hierzu wird die Transformante nach üblichen Methoden auf geeignete Weise kultiviert.
Die Erfindung betrifft weiterhin ein Protein oder Peptid codiert durch eine erfindungsgemäße Nukleinsaure.
Gegenstand der Erfindung ist schließlich insbesondere die Verwendung einer erfindungsgemäßen Nukleinsaure oder eines hierdurch kodierten Proteins oder Peptids zur Herstellung einer pharmazeutischen" Zusammensetzung zur Behandlung von AIDS oder von neurodegenerativen Erkrankungen oder zur Protektion nicht transformierter Zellen in einem Krebszellen enthaltenden Gewebe oder bakterieller Infektionen. Hierbei wird genutzt, daß die erfindungsgemäße Nukleinsaure bzw. das dadurch codierte Protein oder Peptid antiapoptotisch wirkt und einen (frühzeitigen) Zelltod mit der Folge entsprechender Erkrankung verhindert. Im Falle von AIDS werden die T-Lymphozyten geschützt. Im Falle neurode- generativer Erkrankungen werden Nervenzellen vor dem (irreparablen) Zelltod geschützt. Im Rahmen einer Krebstherapie mit auf unkontrolliert proliferierende Zellen gerichteten Zellgiften können normale gesunde Zellen vor dem unerwünschten Zelltod durch Wirkung des Zellgiftes geschützt werden.
Die Erfindung betrifft schließlich auch Screening Verfahren zur Ermittelung von raf aktivierenden und somit zur Herstellung von pharmazeutischen Zusammensetzungen zur Behandlung von vorstehend genannten Erkrankungen geeigneten Substanzen, vorzugsweise niedermolekular (< 10000 da, vorzugsweise < 5000 da) . Als Screening Verfahren wird insofern auch ein Verfahren zur Verifizierung der raf Aktivierung durch einen prospektiven Wirkstoff verstanden. Grundsätzlich kann ein solches Screening Verfahren auf Substanzen gerichtet sein, welche direkt oder indirekt beispielsweise in einem Zellmodell eine Erhöhung der raf Konzentration bewirken. Dies können beispielsweise die raf Expression hochregulierende Substanzen sein. Es kann sich aber auch um Substanzen handeln, welche Modulatorsubstanzen, die die raf Expression oder raf selbst hemmen, ihrerseits hemmen. Im Einzelnen können solche Screening Verfahren wie folgt ausgeführt sein. Ein Screening Verfahren zur Identifizierung von raf aktivierenden Substanzen kann mit den folgenden Verfahrenstufen ausgestattet sein: a) Zielzellen werden mit einem prospektiven Wirkstoff oder einer Mischung prospektiver Wirkstoffe versetzt und die Zielzellen werden kultiviert, b) es wird nach einer definierten Zeit die Expression und/oder Konzentration von raf Protein gemessen und der erhaltene Meßwert wird ver- glichen mit einem Meßwert, welcher unter gleichen Bedingungen, jedoch ohne Zugabe eines prospektiven Wirkstoffes, c) ein prospektiver Wirkstoff oder eine Mischung prospektiver Wirkstoffe werden mit der Maßgabe selektiert, daß eine Erhöhung der Expression und/oder Konzentration an raf Protein in Stufe b) gefunden wurde, d) optional wird im Falle des Einsatzes einer Mischung prospektiver Wirkstoffe eine Deconvolu- tion durchgeführt, beispielsweise durch Einzelmessung der Wirkstoffe der Mischung. Ein Screening Verfahren zur Identifizierung von raf aktivierenden Substanzen kann aber auch mit den folgenden Verfahrenstufen ausgestattet sein: a) es werden in Zielzellen natürlicherweise vorkommende raf Inhibitoren, insbesondere an die Kinase Domäne von raf bindende Substanzen oder die raf Expression herunterregulierende Substanzen, identifiziert, b) eine in Stufe a) identifizierte Substanz wird, optional isoliert und/oder gereinigt, in einem Bindungsassay mit einem prospektiven Wirkstoff oder einer Mischung prospektiver Wirkstoffe versetzt und die Bindungsfähigkeit der Substanz mit den prospektiven Wirkstoff untersucht, c) ein prospektiver Wirkstoff oder eine Mischung prospektiver Wirkstoffe für welchen in Stufe b) ein Bindungsereignis festgestellt wurde, wird selektiert, d) optional wird im Falle des Einsatzes einer Mischung prospektiver
Wirkstoffe eine Deconvolution durchgeführt, beispielsweise durch Einzelmessung der Wirkstoffe der Mischung, e) optional wird ein selektierter prospektiver Wirkstoff oder eine selektierte Mischung prospektiver Wirkstoffe einem Verfahren nach Anspruch 10 zur Verifizierung der raf Aktivierung unterworfen. Grundsätzlich sind alle dem Fachmann geläufige Ver- fahren zur Bestimmung einer raf Konzentration und/oder Bindungsassays einsetzbar. Im Zusammenhang mit der raf-Bestimmung kann es zweckmäßig sein, wenn die verwendeten Zielzellen gentechnisch so verändert sind, daß exprimiertes raf eine Reportergruppe, die meßtech- nisch besonders einfach nachweisbar ist und natürlicherweise in den Zielzellen nicht vorkommt, trägt.
Ergänzend ist anzumerken, daß durch eine Inhibierung von raf, wozu auf die Literatur verwiesen wird, um- gekehrt bei Krebszellen eine Inhibierung des natürlichen Zelltodes verhindert werden kann, i.e. mangels raf werden VDAC und/oder BAX Kanäle nicht geschlossen und es tritt Apoptose ein. Insofern umfaßt die Erfindung auch eine pharmazeutische Zusammensetzung en- thaltend zumindest einen Inhibitor von raf zur
Behandlung von Erkrankungen, bei welchen die natürliche Apoptose in Zellen nicht eintritt, wie beispielsweise in Krebszellen.
Die Erläuterungen für eine Anspruchskategorie der Erfindung gelten entsprechend für andere Anspruchskategorien. Die Erfindung betrifft letztendlich auch Heilverfahren, beispielsweise klassisch durch geeignete Verabreichung von pharmazeutischen Präparaten aber auch gentherapeutisch, mittels welcher eine oder mehrere erfindungsgemäße Substanzen in eine Zielzelle eingebracht oder in der Zielzelle erzeugt werden oder deren Expression angeregt bzw. verstärkt wird.
Im folgenden wird die Erfindung anhand von lediglich Ausführungsbeispiele darstellenden Figuren und Experimenten näher erläutert. Es zeigen:
Fig. la, b: Permeabilität von VDAC (a) und BAXΔTM (b) Kanälen nach Inkubation mit GST-c-rafL375W (a) ,
Fig. 2a, b: Permeabilität von VDAC (a) und BAXΔTM (b) Kanälen nach Inkubation mit GST-c-rafYY340/341DD, und
Fig. 3: Permeabilität von BCL-2ΔTM Kanälen nach Inkubation mit GST-c-rafYY340/341DD.
Sequenzinformation:
Die Sequenz von BAX ist bekannt und unter der Accession-Nr. L22473 bei www.ncbi.nlm.nih.gov abrufbar. Die Sequenz von BCL-2 ist bekannt und unter der Accession-Nr. M13995 bei www.ncbi.nlm.nih.gov abruf- bar. Die Sequenz von VDAC ist bekannt und unter der Accession-Nr. NM003374 bei www.ncbi.nlm.nih.gov abrufbar. Die Sequenz von c-raf ist bekannt und unter der Accession-Nr. X03484 bei www.ncbi.nlm.nih.gov abrufbar. Die Sequenz von A-raf ist bekannt und unter der Accession-Nr. X04790 bei www.ncbi.nlm.nih.gov abrufbar. Die Sequenz von B-raf ist bekannt und unter der Accession-Nr. M95712 bei www.ncbi.nlm.nih.gov abrufbar . Beispiel 1: Herstellung von Plasmiden
BAX und BCL-2 cDNAs wurden eingesetzt, welche für Proteine codieren, denen die COOH-terminale Transmembrandomäne (ΔTM) fehlt. Im Falle von BAX ist dies BAXΔC19, i.e. die Aminosäuren 172-191 fehlen. Im Falle von BCL-2 ist dies BCL-2ΔC21, i.e. die Aminosäuren 219-239 fehlen. cDNA, welche für BAXΔTM codiert, wurde durch Verdau mit EcoRI/XhoI aus dem Vektor pJG4-5 herausgeschnitten und in die EcoRI/XhoI-sites von pGEX-4Tl subkloniert. cDNA, welche für BCL-2ΔTM codiert, wurde im pGEX-4Tl Plasmid (erhalten von J. Reed) exprimiert. GST-c-rafYY340/341DD und GST~c-rafL375W wurden in pFastBac Baculoviren kloniert zur Expression in Sf9 Insektenzellen.
Beispiel 2: Expression und Reinigung der rekoiabmanten Proteine.
Escherichia coli BL21 DE3(pLysS) wurden mit BAXΔTM oder BCL-2ΔTM Konstrukten transformiert und in Gegen- wart vom 0,1 mg/ml Ampicilin bei 37 °C über Nacht angezüchtet. Eine einzelne Kolonie jedes Vektors wurde in 2xY-TG Medium enthaltend 0,1 mg/ml Ampicilin bei 37 °C bis einem OD(600nm) Wert von 0,6 kultiviert. Proteinexpression wurde mittels 0,1 mM Isopropyl-ß-D- thiogalactopyranosid für 16 h bei 25 °C induziert. Die
Zellen wurden mittels Zentrifugation bei 4000 rpm für
30 min. bei 4 °C gewonnen und in Lysis Puffer (Tris 50 mM pH 8, NaCl 100 mM, EDTA 1 mM, Benza idin 1 mM, Phenylmethylsulfonylfluorid 1 mM, Leupeptin 10 μg/ml, Aprotinin 10 μg/ml, ß-Mercaptoethanol 10 mM) resuspendiert. Homogenate der Zellen wurden in Gegenwart von 1 mg Lysosym in flüssigem Stickstoff eingefroren und wieder aufgetaut vor Ultraschallbehandlung. Nach Zentrifugieren bei 28.000 g bei 4 °C und für 30 min. wurde der Überstand mit Gluthathion Sepharose Beads (Pharmacia Amersham) für 2 h bei 4°C inkubiert. Die Beads wurden mit Lysis Puffer enthaltend Triton-XIOO (0,1%) und NaCl (20 mM) gewaschen und über Nacht in einem Thrombin (Sig a) enthaltenden Puffer (Tris 50 mM pH 8, ß-Mercaptoethanol 20 mM) inkubiert. Gespaltenes BAXΔTM und BCL-2ΔTM wurde auf einer Anionenaus- tauschersäule Resource Q (Pharmacia-Amersha ) weiter gereinigt und die Protein wurden mit einem NaCl Gradienten ( 0 - 0,5 M) eluiert.
Zur Gewinnung der GST-C-raf Proteine wurden die Sf9 Insektenzellen mit den Baculoviren infiziert und Zell- pellets wurden eingefroren und bei -70 °C. Die Pellets wurden in Lysis Puffer (Tris 25 mM pH 7,6, NaCl 150 mM, Na4P207 10 mM, ß-Glycerophosphat 25 mM, Glycerin 10%, NP-40 0,75%, Leupeptin 10 μg/ml, Aprotinin 10 μg/ml, Benzamidin 1 mM, Phenylmethylsulfonylfluorid 1 mM) resuspendiert, honogenisiert und für 40 min. bei 4 °C inkubiert. Zelldebris wurde durch Zentrifugieren bei 15.000 g bei 4 °C und für 30 min. entfernt. Überstände wurden mit Gluthathion Sepharose Beads (Pharmacia Amersham) für 2 h bei 4°C inkubiert. Die Beads wurden mit Lysis Puffer ein erstes Mal und ein zweites Mal mit Lysispuffer enthaltend NaCl (500 M) gewaschen. GST Fusionsproteine wurden mit Puffer (Tris 50 mM pH 8, Aprotinin, Leupeptin, Benzamidin) enthaltend 20 mM Gluthation eluiert.
VDAC Protein wurde aus Rattenleber unter denaturieren- den/renaturierenden Bedingungen gereinigt.
Beispiel 3: Durchführung der Versuche an Lipid-Doppelschichten.
Die kanalbildenden Proteine wurden in eine künstliche Lipid-Doppelschicht rekonstituiert. Der experimentelle Aufbau umfaßte eine Teflonkammer mit zwei wäßrige KCL Puffer (0,3 M) enthaltenden Kammern eines Volumens von 5 ml, wobei die Kammern durch ein kreisrundes Loch eines Querschnitts von 0,2 mm2 verbunden sind. Die Membran wurde aus einer Lösung von 1 % (w/v) Diphyta- noylphosphatidylcholin (DiphPC, Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL) in n-Decan gebildet. Die Doppelschicht- bildung war dadurch erkennbar, daß die Membran optisch schwarz bezüglich reflektierten Lichtes wurde.
BAXΔTM, BCL-2ΔTM oder VDAC Protein wurde zu dem KC1 Puffer beider Kammern hinzugegeben. Die single-channel Leitfähigkeit der gebildeten Poren bzw. Kanäle wurde gemessen nach Anlegung eines konstanten Membranpotentials (20 mV) durch Einbringung von je einer Ag/AgCl Elektrode mit Salzbrücken in den Puffer der beiden Kammern. Die aufgenommenen Stromstärkewerte wurden mittels eines Stromverstärkers verstärkt und mittels eines Schreibers als Funktion der Zeit aufgenommen. Um den Effekt der c-raf Kinase auf BAXΔTM, BCL-2ΔTM oder VDAC Kanäle zu testen, wurde die kanalbildenden Proteine (BAXΔTM: 2,4 μg, BCL-2ΔTM: 1,8 μg) in Kinase Puffer (Hepes 25 mM pH 7,4, NaCl 150 mM, ß- Glycerophosphat 25 mM, DTT 1 mM, MgCl2 10 mM) in der Gegenwart von ATP (0,1 mM) für 30 min. bei 30 °C mit GST-c-rafYY340/341DD (aktive Form von c-raf), GST-c-rafL375W (inaktive Form von c-raf) oder GST allein inkubiert. Proben wurden in die KCL Puffer der Kammern beidseitig der DiphPC Membran eingebracht und es wurde die single-channel Bildung gemessen. Im Rahmen von Kontrollmessungen wurde festgestellt, daß GST-c-rafYY340/341DD, GST-c-rafL375W oder GST, jeweils allein, nicht zu einer Kanalbildung in der künstlichen Doppelschichtmembran führten.
Beispiel 4: Ergebnisse
In der Figur 1 a,b sind die Ergebnisse der Permeabilitätsmessungen mit einem experimentellen Aufbau gemäß Beispiel 3 dargestellt, und zwar VDAC/GST-c-rafL375W (a) und BAXΔTM/GST-c-rafL375W (b) . Man erkennt, daß Kanäle gebildet werden, i.e. keine Inhibierung stattfindet.
Demgegenüber ist den Figuren 2 a,b entnehmbar, daß der Einsatz der aktiven Form von c-raf, GST-c- rafYY340/341DD, anstelle der inaktiven Form nach Fig. 1 a,b, zu einer beachtlichen Hemmung der Kanalbildung führt. Dies beruht auf der erfindungsgemäßen Wechselwirkung des aktiven c-raf Proteins mit VDAC bzw. BAXΔTM. Mit der aktiven Form von c-raf wurde weiterhin ein eventueller Einfluß auf BCL-2ΔTM getestet. Diese Ergebnisse sind in der Fig. 3 dargestellt. Man erkennt, daß offenbar eine Kanalbildung stattfindet, i.e. c-raf wechselwirkt mit BCL-2 jedenfalls nicht einer die Kanalbildung hemmenden Weise.

Claims

Patentansprüche :
1) Nukleinsaure codierend für zumindest eine Teilsequenz einer Protein Kinase der mitogenen Signalisierungskaskade, wobei die Teilsequenz mit einem Porin Kanal wechselwirkt, oder mit einer solchen Nukleinsaure hybridisierende Nukleinsaure oder Homologe oder Derivate solcher Nukleinsäuren.
2) Nukleinsaure nach Anspruch 1, wobei die Wechselwirkung in einer Reduktion der Permeabilität der Porin Kanäle, insbesondere von VDAC-, BAX- oder bakteriellen Porin-Kanälen, besteht.
3) Nukleinsaure nach Anspruch 1 oder 2 codierend für ein aktives Protein oder Peptid enthaltend die Se- quenz c-raf-1 (338 bis 627) oder ein aktives Fragment hieraus oder eine mit einer solchen Nukleinsaure hybridisierende Nukleinsaure.
4) cDNA nach einem der Ansprüche 1 bis 3.
5) Isolierter rekombinanter Vektor enthaltend eine Nukleinsaure nach einem der Ansprüche 1 bis 4.
6) Protein oder Peptid codiert durch eine Nukleinsaure nach einem der Ansprüche 1 bis 4. 7) Verwendung einer Nukleinsaure nach einem der Ansprüche 1 bis 4 oder eines hierdurch kodierten Pro- teins oder Peptids zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung von AIDS, von neurodegenerativen Erkrankungen, zur Protektion nicht transformierter Zellen in einem Krebszellen enthaltenden Gewebe, oder von bakteri- eilen Infektionen.
8) Verwendung einer Nukleinsaure nach einem der Ansprüche 1 bis 4 oder eines hierdurch kodierten Pro- teins oder Peptids in einem screening Verfahren zur Ermittelung einer die Schließung von VDAC oder BAX oder bakteriellen Kanälen bewirkenden Substanz.
9) Screening Verfahren zur Ermittelung von Porin
Kanälen, insbesondere VDAC oder BAX oder bakteriellen Porin Kanälen, modulierenden Substanzen mit den folgenden Verfahrensschritten:
a) es wird ein Porin, insbesondere VDAC oder BAX oder ein bakterielles Porin, optional nur eine definierte Teilsequenz hiervon, mit einer Probensubstanz, insbesondere einer Teilsequenz von raf, inkubiert,
b) die Lösung aus Stufe a) wird mit einer in einem Elekrolyten positionierten Membran kontaktiert, c) die Membran aus Stufe b) wird zu einem Zeitpunkt t=0 einer elektrischen Potentialdifferenz zwischen verschiedenen Seiten der Membran unterworfen, wobei beginnend bei t=0 oder einer definierten Zeit nach t=0 die potentialdiffer- enzbedingte Stromstärke oder der Ladungstransport durch die Membran vorzugsweise zeitabhängig gemessen wird,
d) der in Stufe c) gemessene Wert wird mit einem Wert verglichen, welcher unter gleichen Bedingungen, jedoch mit einer inaktiven Form oder aktiven Form von raf, insbesondere c-raf-1, gemessen wurde.
10) Screening Verfahren zur Identifizierung von raf aktivierenden Substanzen zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung einer Erkrankung nach Anspruch 7 mit den folgenden Verfahrenstufen :
a) Zielzellen werden mit einem prospektiven Wirkstoff oder einer Mischung prospektiver Wirkstoffe versetzt und die Zielzellen werden kultiviert,
b) es wird nach einer definierten Zeit die Expression und/oder Konzentration von raf Protein gemessen und der erhaltene Meßwert wird verglichen mit einem Meßwert, welcher unter gleichen Bedingungen, jedoch ohne Zugabe eines prospektiven Wirkstoffes, c) ein prospektiver Wirkstoff oder eine Mischung prospektiver Wirkstoffe werden mit der Maßgabe selektiert, daß eine Erhöhung der Expression und/oder Konzentration an raf Protein in Stufe b) gefunden wurde,
d) optional wird im Falle des Einsatzes einer Mischung prospektiver Wirkstoffe eine Deconvo- lution durchgeführt, beispielsweise durch Einzelmessung der Wirkstoffe der Mischung.
11) Screening Verfahren zur Identifizierung von raf aktivierenden Substanzen zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung einer Erkrankung nach Anspruch 7 mit den folgenden Verfahrenstufen :
a) es werden in Zielzellen natürlicherweise vorkommende raf Inhibitoren, insbesondere an die Kinase Domäne von raf bindende Substanzen oder die Expression von raf herunterregulierende Substanzen identifiziert,
b) eine in Stufe a) identifizierte Substanz wird, optional isoliert und/oder gereinigt, in einem Bindungsassay mit einem prospektiven Wirkstoff oder einer Mischung prospektiver Wirkstoffe versetzt und die Bindungsfähigkeit der Substanz mit den prospektiven Wirkstoff untersucht, c) ein prospektiver Wirkstoff oder eine Mischung prospektiver Wirkstoffe für welchen in Stufe b) ein Bindungsereignis festgestellt wurde, wird selektiert,
d) optional wird im Falle des Einsatzes einer Mischung prospektiver Wirkstoffe eine Deconvo- lution durchgeführt, beispielsweise durch Einzelmessung der Wirkstoffe der Mischung,
e) optional wird ein selektierter prospektiver Wirkstoff oder eine selektierte Mischung prospektiver Wirkstoffe einem Verfahren nach Anspruch 10 zur Verifizierung der raf Ak- tivierung unterworfen.
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