DE69633186T2

DE69633186T2 - Methode zur Identifizierung von Verbindungen die mit RAC Proteine Kinase interagieren

Info

Publication number: DE69633186T2
Application number: DE69633186T
Authority: DE
Inventors: Arthur Brian HEMMINGS; Philip Cohen; Dario Alessi; Darren Cross; Mirjana Andjelkovic
Original assignee: Novartis AG
Current assignee: Novartis AG
Priority date: 1995-11-16
Filing date: 1996-11-05
Publication date: 2005-08-18
Anticipated expiration: 2016-11-06
Also published as: JP4173544B2; DK0862622T3; EP0862622B1; EP0862622A1; PT862622E; AU7564396A; JP2000500746A; WO1997018303A1; ATE274053T1; ES2227614T3; DE69633186D1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft das Screening auf Verbindungen, die mit RAC Proteinkinase (RAC-PK) wechselwirken.
Proteinphosphorylierung und Dephosphorylierung sind grundlegende Prozesse für die Regulation der zellulären Funktionen. Die Proteinphosphorylierung ist vorwiegend in die Signaltransduktion involviert, worin extrazelluläre Signale durch eine Kaskade an Proteinphosphorylierung und Dephosphorylierung vermehrt und amplifiziert werden. Zwei der am besten charakterisierten Signaltransduktionswege umfassen die c-AMP-abhängige Proteinkinase (PKA) und die Proteinkinase C (PKC). Jeder Weg verwendet ein unterschiedliches Botenstoffmolekül, um die Proteinkinase zu aktivieren, die wiederum spezifische Zielmoleküle phoshoryliert.
Es wurde kürzlich eine neue Unterfamilie an Serin/Threoninkinasen identifiziert und kloniert, die RAC Kinasen genannt werden (RAC-PK, Jones et al., (1991), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88, 4171–4175, Jones et al., (1991) Cell Regulation 2, 1001–1009), aber auch als PKB oder Akt bekannt sind. RAC Kinasen wurden in zwei eng verwandten Isoformen identifiziert, nämlich RACα und RACβ, die 90% Homologie bei der Gensequenz aufweisen. RACα (c-akt) der Maus ist das zelluläre Homologe des viralen Onkogens v-akt, das durch die Fusion des Gag Proteins vom AKT8 Retrovirus an den N-Terminus von c-akt der Maus erzeugt wird. Die humane RACβ ist bei etwa 10% der Ovarcarzinome beteiligt, was eine Beteiligung der RAC Kinasen bei der Regulation des Zellwachstums nahe legt.
RAC Kinasen enthalten eine aminoterminale Pleckstrinhomologiedomäne (PH) [Haslam et al., (1993), Nature 363, 309–310]. Die PH Domäne wurde ursprünglich als interne Wiederholung identifiziert, die am Amino- und Carboxyterminus von Pleckstrin vorkommt, einem 47 kDa Protein, das das Hauptsubstrat der PKC in aktivierten Blutplättchen ist [Tyers et al., (1988) Nature 333, 470–473]. Die Superfamilie der PH Domäne-enthaltenden Moleküle besteht aus über 90 Vertretern, einschließlich Serin/Threonin Proteinkinasen (RAC, Nrk, βARK, PKCμ), Tyrosinproteinkinasen (Btk, Tec, Itk), GTPase-Regulatoren (ras-GAP, ras-GRF, Vav, SOS, BCR), allen bekannten Phospholipasen Cs von Säugern, Cytoskelettproteinen (β-Spectrin, AFAP-110, Syntrophin), "Adapterproteinen" (GRB-7, 3BP2) und Kinasesubstraten (Pleckstrin, IRS-1).
Während die PH Domänenstruktur für die aminoterminale Domäne von β-Spectrin, Dynamin und Plecktrinen aufgeklärt wurde, bleibt deren exakte Funktion unklar. Das Vorkommen von PH Domänen in vielen Signal- und Cytoskelettproteinen impliziert die Vermittlung von Protein-Protein- und Membranwechselwirkungen. Tatsächlich scheint die PH Domäne der β-adrenergen Rezeptorkinase (βARK) teilweise für deren Bindung an die βγ-Untereinheiten der heterotrimeren G-Proteine verantwortlich zu sein, die mit dem β-adrenergen Rezeptor assoziiert sind, während die PH Domäne der Bruton's Tyrosinkinase (Btk) eine Wechselwirkung mit PKC zu vermitteln scheint. Von mehreren PH Domänen wurde gezeigt, daß sie an Phosphatidylinositol-(4,5)-bisphosphat in vitro binden, wenn auch schwach.
IMPDH ist ein hoch konserviertes Enzym (41% Aminosäureidentität zwischen bakteriellen Sequenzen und Säugersequenzen), das bei dem geschwindigkeitslimitierenden Schritt der Guaninbiosynthese beteiligt ist. Bei Säugern existieren zwei Isoformen, die zu 84% identisch sind und Typ I und Typ II genannt werden, die unterschiedlich exprimiert werden [Natsumeda et al., (1990), J. Biol. Chem. 265, 5292–5295]. Der Typ I wird konstitutiv in geringen Mengen exprimiert, während die Typ II mRNA und die Proteinmengen während der zellulären Proliferation zunehmen. IMPDH Aktivitätsmengen sind eben falls während der schnellen Proliferation in vielen Zellen erhöht [F. R. Colart und E. Huberman (1988), J. Biol. Chem. 263, 15769–15772].
Durch die Messung der metabolischen Flüsse wurde gezeigt, dass der proliferative Index von intakten Krebszellen mit der bevorzugten Einschleusung von IMP in die Guanylatbiosynthese verbunden ist. Die Hemmung der zellulären IMPDH Aktivität führt zu einer abrupten Einstellung der DNA Synthese und zu einer Zellzyklusblockade an der G₁-S Stelle. Die spezifische Hemmung von IMPDH durch Tiazofurin und die anschließende Abnahme im GTP Pool führt zu einer Herabregulierung des G-Proteins ras, das in vielen Signaltransduktionswegen involviert ist, die zur zellulären Proliferation führen (als Zusammenfassung siehe Avruch et al., (1994), Trends Biochem. Sci. 19, 279–283).
Interessanterweise wurde p53 der Regulation der IMPDH Mengen zugeordnet [J. L. Sherley (1991), J. Biol. Chem. 266, 24815–24828]. Hier induziert eine moderate Überexpression von p53 (3–6 fach) einen durchgreifenden Wachstumsstillstand, der durch Purinnukleotidvorläufer aufgehoben wird. Tatsächlich induziert die Überexpression von p53 eine spezifische Blockade in der IMP zu XMP Konversion und einen verringerten Aktivitätsspiegel von IMPDH. Die Blockade von p53 beeinflusst weder die Geschwindigkeit der RNA Synthese noch wird der Phänotyp durch Desoxynukleotide aufgehoben, was zeigt, dass ein Fehlen der Vorläufer für die DNA Synthese nicht de Ursache der Blockade ist. Es ist am wahrscheinlichsten, dass dieser Effekt durch eine Herabregulierung des GTP Pools vermittelt wird, der für G-Proteine erforderlich ist, wie ras.
Die obigen Beobachtungen legen nahe, dass IMPDH vom Typ II primär bei der Bildung von XMP beteiligt ist, das in den GTP Pool kanalisiert wird, der für die Regulation von G-Proteinen entscheidend ist, die in der Signaltransduktion beteiligt sind, wie ras. Es kann sein, dass das Typ I Enzym eine basale Menge an XMP liefert, die in die GTP/dGTP Pools kanalisiert wird, die für die RNA und DNA Synthese erforderlich sind. Die Veränderungen in der IMPDH Typ II Aktivität würden das GTP/GDP Verhältnis durch die spezifische Veränderung der GTP Komponente verändern, was die ras Signalwege stark beeinflussen könnte, da ras gegenüber kleinen Veränderungen im GTP/GDP Verhältnis empfindlich ist.
Die Glycogensynthasekinase 3 (GSK3) ist bei der Kontrolle von mehreren Prozessen beteiligt, die für die Säugerzellphysiologie wichtig sind, einschließlich Glycogenmetabolismus und die Kontrolle der Proteinsynthese durch Insulin, wie auch die Modulierung der Aktivität von mehreren Transkriptionsfaktoren, wie AP-1 und CREB. GSK3 wird in vitro durch Serinphosphorylierung gehemmt, die durch MAP Kinase und p70^S6K verursacht wird, Kinasen, die auf bestimmten durch Insulin stimulierten Signalwegen liegen.
GSK3 ist für die Serinphosphorylierung in der Gluycogensynthase verantwortlich, deren Dephosphorylierung der Stimulierung der Glycogensynthese durch den Muskel unterliegt. Daher inaktiviert GSK3 die Glycogensynthase, was zu einer Erhöhung der Blutzuckerspiegel führt. Insulin hemmt die Wirkung von GSK3, die in Kombination mit der gleichzeitigen Aktivierung von Phosphatasen, die die Glycogensynthase dephosphorylieren, zur Aktivierung der Glycogensynthase und der Verringerung der Blutzuckerspiegel führt.
Es wurde nun bestimmt, dass RAC-PKis direkt bei der Inaktivierung von GSK3 und der Aktivierung von IMPDH beteiligt sind.
Es wird das Two-Hybrid-System der Hefe [S. Fields und O. K. Song (1989), Nature 340, 245–246, Chien et al., (1991), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 9578–9582] verwendet, um zu bestimmen, ob die RAC-PK durch die Bildung von spezifischen Wechselwirkungen mit anderen Proteinen funktionieren könnte. Es wurde festgestellt, dass RAC-PK mit der humanen Inosin-5'-monophosphatdehydrogenase (IMPDH) TypII und mit einem neuen Protein, das carboxyterminales RAC-PK Bindeprotein (CTBP) genannt wird, wechselwirkt. Die RAC-PK stimuliert die IMPDH Typ II Aktivität. In Zusammenhang mit der bekannten Rolle von IMPDH bei der GTP Biosynthese legen die Ergebnisse eine Rolle für RAC-PK bei der Regulation der Zellproliferation nahe.
Darüberhinaus war es unter Verwendung eines von GSK3 stammenden Peptids und GSK3 selbst möglich, zu zeigen, dass RAC-PK mit GSK3 wechselwirkt, es phosphoryliert und inaktiviert. Dies legt nahe, dass RAC-PK bei der Regulation von Insulin-abhängigen Signalwegen eine Rolle spielt, die die zelluläre Proliferation kontrollieren. Zusammengenommen legen diese Ergebnisse eine hauptsächliche Beteiligung von RAC-PK bei der Kontrolle der Insulinwirkung nahe.
Zusammenfassung der Erfindung
Gemäß der Erfindung wird ein Verfahren zum Screenen auf Verbindungen bereitgestellt, die mit der RAC Proteinkinase (RAC-PK) wechselwirken, was die folgenden Schritte umfasst

(a) Inkubation von RAC-PK oder eines funktionellen Fragments hiervon und der zu screenenden Verbindung,
(b) Messung der Kinaseaktivität der RAC-PK oder eines funktionellen Fragments hiervon mittels GSK3 als Substrat, und
(c) Auswahl der Verbindung, falls das Substrat eine unterschiedliche Menge an phosphorylierten Resten im Vergleich zur Kontrollreaktion ohne Substrat aufweist.

Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Die Erfindung liefert ein Verfahren zum Screnen von Verbindungen, die mit RAC-PK wechselwirken. Das Verfahren umfasst die folgenden Schritte

Vanadat, das hierin verwendet wird, um verschiedene Formen hiervon zu umfassen, wie ortho- und meta-Vanadat, Pervanadat und andere verwandte Vanadiumionen, ist als therapeutisches Mittel bei der Behandlung von Diabetes bekannt. Siehe beispielsweise US 5 421 125 A , EP 0 521 787 A , EP 0 264 278 A und EP 0 245 979 A . In der britischen Patentanmeldung 9525702.8 (Ciba-Geigy AG) vom 15. Dezember 1995 ist beschrieben, dass Vanadat ein starker Aktivator von Kinasen der durch Insulin stimulierten Signalwege ist und insbesondere von RAC-PK. Demnach übt Vanadat seinen therapeuti schen Effekt auf Diabetes durch die Stimulierung von RAC aus, das GSK3 phosphoryliert und deaktiviert, was zur Verringerung der Blutzuckerspiegel führt.
RAC-PK und Aktivatoren hiervon sind daher zur Behandlung von Diabetes und anderen Erkrankungen brauchbar, bei denen zu hohe Blutzuckerspiegel vorliegen. Im Gegensatz dazu sind RAC-PK Inhibitoren, wie Wortmannin und Okadainsäure bei der Behandlung von Erkrankungen brauchbar, die unzureichende Blutzuckerspiegel umfassen. Demnach liefert die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Scrennen von Verbindungen, die zur Behandlung von Erkrankungen brauchbar sind, bei denen die Blutzuckerspiegel zu hoch sind oder von Erkrankungen, bei denen die Blutzuckerspiegel zu gering sind. Vorzugsweise liefert die Erfindung ein Verfahren zum Screenen von Verbindungen, die zur Behandlung von Diabetes brauchbar sind.
In der vorliegenden Erfindung kann die RAC Proteinkinase jede Isoform der RAC Kinase von jeder Spezies sein, wie sie in der Literatur beschrieben ist. Die humane RAC-PK ist bevorzugt. Die humane RAC-PKα ist in der SEQ ID Nr. 3 dargestellt. Domänen der RAC Kinase sind individuelle funktionelle Teile hiervon, wie die PH Domäne, die katalytische Domäne und die C-terminale Domäne. Fragmente von RAC, die Domänen von RAC enthalten, sind funktionell aktive Teile des RAC Kinaseproteins, das in der vorliegenden Erfindung anstelle von RAC verwendet werden kann. Fragmente von RAC-PK sind vorzugsweise die Domänen hiervon, vorteilhafterweise die PH Domäne, die katalytische Domäne und die C-terminale Domäne. In jedem Fall umfasst die verwendete Terminologie Mutanten und Derivate von RAC-PK und deren Fragmente, die erzeugt oder vom natürlich auftretenden Protein gemäß der verfügbaren Technologie abgeleitet werden. Beispielsweise können für RAC-PK kodierende Nukleinsäuren ohne die Beeinflussung der Art des hierdurch kodierten Peptids gemäß der Degeneriertheit des Aminosäurecodes mutiert werden. Darüberhinaus können konservative Aminosäuresubstitutionen in RAC-PK oder einem Fragment hiervon im wesentlichen ohne der Veränderung der Funktion eingeführt werden. Weitere Anfügungen, Deletionen und/oder Substitutionen, die andererseits die Funktion von RAC-PK oder einem Fragment hiervon verbessern, sind vorweggenommen und im Schutzumfang der Erfindung eingeschlossen.
Das Antibiotikum Wortmannin, von dem bekannt ist, das es die Phosphatidylinnositol-3-OH-kinaseaktivierung (PI-3K) hemmt, zielt auf die Signaltransduktion und inaktiviert indirekt unter anderem RAC, möglicherweise über PI-3K. Wortmannin ist bei der Behandlung von neoplastischen Zuständen induziert.
Jedoch war die breite Beteiligung der verschiedenen Isoformen der RAC-PK bei der mitogenen Signaltranduktion wie auch bei der Insulin-abhängigen Signalübertragung bisher nicht bekannt. Es wurde jetzt gezeigt, dass RAC-PK bei der Regulation sowohl von GSK3 als auch IMPDH beteiligt ist, einem Faktor, der bei der Wachstumskontrolle beteiligt ist. Daher kann geschlossen werden, dass RAC-PK eine zentrale Rolle bei der Wachstumskontrolle spielt.
Therapeutische Mittel gemäß der Erfindung können herkömmlich gemäß dem Typ des Mittels formuliert werden. Wenn das Mittel ein Salz ist, wie Vanadat, wird es bequemerweise in wässriger Lösung bei neutralem pH formuliert und oral bei Raumtemperatur verabreicht. Im Fall eines Peptidmedikaments, wie RAC-PK selbst, können kompliziertere Techniken zur Verabreichung, wie Liposomenverabreichung, erforderlich sein, um das Peptid in die Zielzellen einzuführen. Die Abgabesysteme für Peptidtherapeutika sind in der Technik dokumentiert.
Die Identifizierung der RAC-PK als Hauptmediator bei der Wachstumskontrolle erlaubt den Entwurf von Screeningsystemen zur Identifizierung von möglichen therapeutischen Mitteln zur Verwendung bei der Behandlung von Anomalien der Wachstumskontrolle.
Das Screening kann mittels vollständiger RAC Kinase oder einem Fragment hiervon ausgeführt werden. Genauer gesagt wurde gezeigt, dass die PH Domäne der RAC Kinase bei der Vermittlung vieler Effekte wichtig ist, wie dies beispielsweise in der britischen Patentanmeldung 9525703.6 (Ciba-Geigy AG) vom 15. Dezember 1995 beschrieben ist. Darüberhinaus wechselwirkt die RAC-PK mit IMPDH über die PH Domäne. Die Wechselwirkung kann man im Two-Hybrid-System der Hefe nicht beobachten, wenn die vollständige RAC-PK verwendet wird, obwohl die in vitro Bindung von RAC-PK an IMPDH auftritt.
Wechselwirkungen treten auch zwischen anderen Fragmenten von RAC-PK und dessen physiologischen Zielen und Regulatoren auf. Beispielsweise bindet GSK3 an RAC-PK über die katalytische Domäne, wie dies durch die Phosphorylierung von GSK3 durch RAC nachgewiesen wird. CTBP bindet andererseits nicht die katalytische oder PH Domäne, sondern spezifisch an die carboxyterminale Domäne von RAC.
Vorzugsweise umfasst die Erfindung daher die Inkubation einer zu screenenden Verbindung mit einem Fragment von RAC, das vorteilhafterweise die PH Domäne, die katalytische Domäne oder die carboxyterminale Domäne ist.
RAC-PK Fragmente zur Verwendung im erfindungsgemäßen Verfahren können in Form von isolierten Fragmenten oder in Form des mit weiteren Polypeptiden komplexierten Fragments vorliegen. Beispielsweise wird im Fall des Two-Hybrid-Systems das Fragment an eine DNA bindende oder transkriptionsaktivierende Domäne komplexiert, die von einem anderen Protein stammt, wie dem Hefeaktivator GAL4.
Darüberhinaus kann die im erfindungsgemäßen Verfahren verwendete RAC-PK in Form einer Mutante hiervon vorliegen, beispielsweise einer konstitutiv aktivierten Kinase. Ein wichtiger aktivierender Rest ist T308, der in der sogenannten T-Schlaufe zwischen den Subdomänen 7 und 8 der Kinase vorkommt. Eine allgemeine Beschreibung über Kinasestruktur ist in Woodgett (1994), Protein Kinases, IRL Press, UK angegeben. Eine Substitution von T308 durch Asparaginsäure führt zu einer deutlichen Erhöhung der basalen Aktivität der Kinase, die jedoch ein Potential für eine weitere Aktivierung aufweist. Die Erfindung liefert daher ein RAC Kinaseprotein, worin Thr 308 zu Asp mutiert wurde.
Vorzugsweise ist SER473 zusätzlich zu Asp mutiert. Die Phosphorylierung dieses Rests ist für die volle Aktivierung der RAC-PK in vivo erforderlich und die T308/S473 Doppelmutante (beide Reste zu Asp umgewandelt) zeigt eine konstitutive Aktivität, die um das achtzehnfache höher liegt, das die native RAC-PK. Die Doppelmutante ist nicht für eine weitere Aktivierung zugänglich.
Die Mutationen können durch jede geeignete Technik ausgeführt werden. Bevorzugt ist jedoch die ortsspezifische in vitro Mutagenese einer für RAC kodierenden Nukleotidsequenz und die anschließende Expression von RAC in einem rekombinanten DNA Expressionssystem. Dieses Verfahren ist ein in vitro Mutageneseverfahren, durch das eine definierte Stelle innerhalb einer Region der klonierten DNA verändert werden kann (siehe die Zusammenfassungsartikel von M. J. Zoller und M. Smith, Methods Enzymol. (1983), 100, 468, D. Botstein und D. Shortle, Science (1985), 229, 1193). Verfahren zur ortsspezifischen Mutagenese sind dem Fachmann gut bekannt, wie dies beispielhaft dargestellt wird von Sam brook (1989): Molecular Cloning – A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY, USA und der Anzahl an im Handel erhältlichen in vitro Mutagenesekits.
Die zu screenende Verbindung kann in im wesentlichen reiner, unkomplexierter Form vorliegen oder kann mit chemischen Gruppen oder weiteren Polypeptiden komplexiert werden. Im Fall des Two-Hybrid-Systems wird sie an eine DNA bindende oder transkriptionsaktivierende Domäne komplexiert, um die PH Domäne zu komplementieren.
Die isolierte PH Domäne kann zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung hergestellt werden, wie dies in der britischen Patentanmeldung 9525705.1 (Ciba-Geigy AG) vom 15. Dezember 1995 beschrieben ist. Wenn jedoch eine kleine Menge an PH Domäne ausreicht, kann die PH Domäne durch die Expression einer Nukleinsäuresequenz, die sie kodiert, in bakterieller Kultur in Form eines Fusionsproteins erhalten werden, das anschließend gemäß den in der Technik bekannten Verfahren gespalten wird. Beispielsweise können die Aminosäuren 1–131 von RAC, die die PH Domäne kodieren, als Fusionsprotein, vorteilhafterweise mit Glutathion-S-transferase (GST) exprimiert werden, wobei anschließend das Fusionsprotein mit Thrombin gespalten wird und die Domäne durch Proteinreinigungstechniken isoliert wird, wie FPLC. Dieses Verfahren ergibt eine relativ kleine Ausbeute an reiner löslicher PH Domäne.
Carboxy- und Kinasedomänen werden ähnlich vorteilhafterweise als Fusionsproteine synthetisiert, beispielsweise als GST Fusionen.
RAC-PK oder eine Fragment hiervon kann zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung hergestellt werden, wie dies in der britischen Patentanmeldung 9525702.5 beschrieben ist. Alternativ dazu kann RAC-PK in einer rekombinanten Zellkultur exprimiert werden. Baculovirusvektoren, die speziell für eine Insektenkultur vorgesehen sind, sind besonders bevorzugt und sind häufig im Handel erhältlich (beispielsweise von Invitrogen und Clontech). Andere Virusvektoren, die zur Infektion von Insektenzellen fähig sind, sind bekannt, wie das Sindbis-Virus (Hahn et al (1992) PNAS (USA) 89, 2679–2683). Der Baculovirusvektor der Wahl (zusammengefasst von Miller (1988) Ann. Rev. Microbiol. 42, 177–199) ist Autographa californica Multiple Nuklear Polyhedrosisvirus, AcMNPV.
Typischerweise ersetzt das heterologe Gen zumindest teilweise das Polyhedringen von AcMNPV, da Polyhedrin nicht für die Virusbildung erforderlich ist. Um das heterologe Gen einzubauen wird vorteilhafterweise ein Transfervektor verwendet. Transfervektoren werden in E. coli Wirtszellen hergestellt und die DNA Insertion wird dann durch ein Verfahren der homologen Rekombination in AcMNPV transferiert. Die in der vorliegenden Erfindung brauchbaren Baculovirustechniken sind Standard und in der Technik gut bekannt und werden in O'Reilly et al., (1994) Baculovirus Expression Vectors, A Laboratory Manual, Oxford University Press Inc., NY, USA wie auch in der Literatur zusammengefasst, die von Herstellern im Handel erhältlicher Baculoviruskits veröffentlicht werden (beispielsweise Pharmingen).
Die Inkubationsbedingungen variieren gemäß der genauen Methode, die zur Detektion der Wechselwirkung zwischen der PH Domäne und der gescreenten Verbindung verwendet wird. Im Fall des Transkriptionsaktivierungsdetektionssystems, wie dem Two-Hybrid-System der Hefe, sind Inkubationsbedingungen für die Gentranskription geeignet, wie sie innerhalb einer lebenden Zelle auftreten. Andere Detektionssysteme erfordern jedoch unterschiedliche Inkubationsbedingungen. Wenn beispielsweise die Detektion der Wechselwirkung auf der relativen Affinität in einem chromatographischen Test basiert, wie dies von der Affinitätschromatographie bekannt ist, werden die Bedingungen so angepasst, um die Bin dung zu fördern und dann graduell verändert, so dass der Punkt, an dem die gescreente Verbindung nicht länger an die RAC-PK PH Domäne bindet, bestimmt werden kann.
Das Detektionsverfahren kann die natürliche Fluoreszenz von Trp²² in der RAC-PK PH Domäne verwenden, die durch bestimmte Wechselwirkungen mit der Domäne gehemmt wird, wie dies in der britischen Patentanmeldung 9525703.6 beschrieben ist. Kurz gesagt kann die Fluoreszenz des aminoterminalen Trp Rest in den PH Domänen von bestimmten die PH Domäne enthaltenden Proteinen durch die Anregung des Moleküls auf Fluoreszenz mit der geeigneten Frequenz und der Verfolgung der Emission detektiert werden. Beispielsweise fluoresziert das N-terminale Trp²² von RAC bei 345 nm, wenn es bei 290 nm angeregt wird. Techniken zur Verfolgung der Proteinfluoreszenz sind in der Technik gut bekannt. Es wurde gezeigt, dass die PH Domäne von RAC-PK Phospholipid mit hoher Affinität bindet, was nahe legt, dass RAC-PK in vivo über die PH Domäne an die Membran gebunden ist. Die Bindung des Phospholipids an die RAC-PK PH Domäne löscht die natürliche Fluoreszenz des N-teminalen Tryptophans an der Position 22 (Trp²²). Die Wechselwirkung der pH Domäne mit der Zellmembran dürfte für die stabile Wechselwirkung von RAC-PK mit membrangebundenen Partnern in Signalwegen wichtig sein, so dass die Zerstörung dieser Wechselwirkung zur Modulierung des Signaleffekts über die Dissoziation des Signalmoleküls von der Zellmembran führt. Die Modulation kann entweder Herabregulieren, beispielsweise falls die sonst stabile Wechselwirkung des Moleküls mit den membrangebundenen Partnern eine stimulierende Wechselwirkung ist, oder auch Heraufregulieren sein, wenn die Wechselwirkung eine hemmende Wechselwirkung ist. Demnach kann eine Verbindung, die ein Modulatorkandidat der Signalreaktion ist, durch ein Verfahren gescreent werden, das die folgenden Schritte umfasst:

(a) Inkubation der Verbindung mit der PH Domäne eines Signalmoleküls, das zur Fluoreszenz fähig ist,
(b) Bestimmung der durch Phospholipid induzierten Modulierung in der Fluoreszenz der PH Domäne, wobei eine Veränderung der Fluoreszenz in Gegenwart der Verbindung eine funktionelle Wechselwirkung zwischen der Verbindung und der PH Domäne anzeigt.

In diesem Fall werden die Inkubationsbedingungen so eingestellt, dass sie die Detektion der Fluoreszenz bei 345 nm erleichtern, wenn die PH Domäne bei einer Frequenz von 290 nm angeregt wird.
Die Inkubation gemäß der Erfindung kann durch mehrere Mittel erreicht werden, aber die grundlegende Voraussetzung ist, dass RAC-PK oder ein Fragment hiervon und die zu screenende Verbindung dazu fähig sind, miteinander in Kontakt zu treten. Dies kann durch Mischen von RAC-PK oder einem Fragment hiervon und der Verbindung oder durch deren Produktion in situ erreicht werden, wie durch die Expression von Nukleinsäuren, die sie kodieren. Wenn die RAC-PK oder das RAC-PK Fragment und/oder die Verbindung in Form von Fusionen mit anderen Polypeptiden vorkommen, können sie als solche in situ exprimiert werden.
Vorzugsweise basiert das erfindungsgemäße Verfahren auf einem Two-Hybrid-System. Solche Systeme detektieren spezifisch Protein-Protein Wechselwirkungen durch die Ausnutzung der Transkriptionsaktivatoren, die trennbare DNA bindende und transkriptionsaktivierende Domänen aufweisen, wie der GAL4 Aktivator der Hefe. Ein Reportergen wird funktionsfähig an ein Element gebunden, das auf den verwendeten Transkriptionsaktivator reagiert und gegenüber RAC-PK oder einem Fragment hiervon und der zu screenenden Verbindung ausgesetzt wird, von denen eines an die transkriptionsaktivierende Domäne des Transkriptionsaktivators und das andere an die DNA Bindedomäne hiervon gebunden ist. Falls eine spezifische Wechselwirkung zwischen RAC-PK oder einem Fragment hiervon und der Verbindung besteht, werden die DNA bindenden und transkriptionsaktivierenden Domänen des Transkriptionsaktivators zusammengebracht und die Transkription vom Reportergen wird aktiviert.
Alternativ dazu kann die Detektion auf der beobachteten Bindung zwischen RAC-PK oder einem Fragment hiervon, wie der PH Domäne oder der katalytischen Domäne und der gescreenten Verbindung oder einem Fragment hiervon basieren. Beispielsweise kann die Wechselwirkung zwischen RAC-PK und dem Insulinmediator GSK3 hierin später durch die Verfolgung der Wechselwirkung eines Peptids detektiert werden, das die Hauptphosphorylierungsstelle von GSK3 umgibt, die bekanntermaßen für die Inaktivierung durch RAC Kinase verantwortlich ist. Vorzugsweise läuft das erfindungsgemäße Verfahren so ab, dass das Substrat in Schritt (b) das Peptid GRPRTSSFAEG umfasst und dass der näher am C-Terminus des Peptids liegende Serinrest phosphoryliert ist. Auf eine ähnliche Weise kann die Beteiligung von RAC-PK auf die Aktivierung oder Inaktivierung einer bestimmten Verbindung durch die Verfolgung der Wechselwirkung eines Teils hiervon gescreent werden, der bekanntermaßen bei Modulationsereignissen mit RAC beteiligt ist.
RAC-PK oder ein Fragment hiervon kann zum Screening von Verbindungen verwendet werden, die hieran binden, indem man sie mit der zu screenenden Verbindung inkubiert und anschließend die RAC-PK Komplexe mit einem RAC-spezifischen Antikörper "herunterzieht". Antikörper, die zur Immunfällung oder Immunaffinitätschromatographie geeignet sind, können durch herkömmliche Techniken gereinigt werden, die dem Fachmann bekannt sind und können von der Art her monoklonal oder polyklonal sein. Siehe beispielsweise Lane et al., (1992) EMBO J. 11, 1743–1749. Nachdem der RAC-Verbindungskomplex durch Affinität isoliert wurde, kann die Verbindung vom RAC-PK Antikörper abgelöst werden und durch herkömmliche Techniken charakterisiert werden.
Die Wechselwirkung von RAC-PK oder einem Fragment hiervon mit der gescreenten Verbindung kann auch indirekt beobachtet werden. Beispielweise kann ein Inhibitor oder Aktivator der RAC-PK Funktion durch die Beobachtung der Effekte von RAC-PK auf ein Substrat in Gegenwart oder Abwesenheit der Verbindung detektiert werden.
Die Aktivität der RAC-PK oder katalytischen Domäne hiervon kann durch einen Kinaseaktivitätstest bestimmt werden, wobei ein Substrat für die Kinase verwendet wird. Beispielsweise kann Myelinbasisprotein gemäß etablierter Testverfahren verwendet werden. Physiologische Substrate, wie GSK3, können auch verwendet werden. Alternativ dazu kann die RAC-PK Aktivität durch die Bestimmung des Ausmaßes an aktivierender Phosphorylierung von RAC-PK selbst untersucht werden. Vorteilhafterweise wird die Phosphorylierung von Resten untersucht, die normalerweise bei der Kinaseaktivierung beteiligt sind. RAC-PK wird vorzugsweise durch die Phosphorylierung an den Serin- und Threoninresten aktiviert, wie es in EP 0 877 818 A1 beschrieben ist.
Demnach liefert eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung ein Verfahren zum Screenen eines Aktivators der RAC-PK Funktion, worin die Verbindung in Schritt (c) des Verfahrens ausgewählt wird, falls sie die Menge an phosphorylierten Resten dieses Substrats erhöht. Alternativ dazu wird ein Verfahren zum Screening eines Inhibitors der RAC-PK Funktion bereitgestellt, worin die Verbindung in Schritt (c) des Verfahrens ausgewählt wird, falls sie die Menge an phosphorylierten Resten des Substrats verringert.
Der erfindungsgemäße Test kann zur Messung des direkten Effekts der in Frage kommenden Verbindung auf RAC verwendet werden oder es kann zur Bestimmung des Effekts der Verbindung auf eine Kinase verwendet werden, die stromaufwärts hiervon in einem Signalweg wirkt. In der letzteren Situation wirkt die RAC-PK als Substrat für die stromaufwärts liegende Kinase und die Aktivität der stromaufwärts liegenden Kinase wird durch die Bestimmung des Phoshorylierungszustands oder der Aktivität der RAC-PK untersucht.
Um ein aussagekräftiges Ergebnis zu erhalten, sollte die Aktivität der RAC-PK, die gegenüber dem in Frage kommenden immunsuppressiven oder antiproliferativen Mittel ausgesetzt wird, mit der Aktivität der RAC-PK verglichen werden, die nicht gegenüber dem Mittel ausgesetzt wurde, wobei eine Modulation der RAC Kinaseaktivität einen Modulator der Zellproliferation und/oder Signaltransduktion anzeigen kann.
Vielversprechende Verbindungen können dann weiter durch die direkte Bestimmung der Eigenschaften hiervon untersucht werden, beispielsweise durch einen Zellproliferationstest. Ein solcher Test umfasst vorzugsweise die physische Bestimmung der Proliferation bei Zellen, die einer Kinaseaktivierung durch einen Phosphataseinhibitor unterzogen wurden, welche dem in Frage kommenden RAC-PK Modulator ausgesetzt wurden und wahlweise mit einem Mitogen stimuliert wurden, wie einem Wachstumsfaktor, IL-2 oder PMA. Einfacher gesagt kann der Test die Exposition von unstimulierten Zellen gegenüber dem in Frage kommenden Modulator, gefolgt von einer Stimulierung mit einem Phosphataseinhibitor umfassen.
Die Erfindung umfasst ferner die Verwendung der RAC-PK oder eines Fragments hiervon in eine Screeningsystem. Das Screeningsystem wird vorzugsweise zum Screenen von Verbindungen verwendet, die Modulatoren der Insulinaktivität sind, insbesondere wenn die Aktivität sich auf den Glycogenmetabolismus oder die Zellproliferation bezieht.
In einer weiteren Ausführungsform liefert die Erfindung ein Verfahren, das direkt oder indirekt mit RAC-PK oder einem Fragment hiervon wechselwirkt. Im Fall von direkt wirkenden Verbindungen, werden Mittel, wie Insulin und Wortmannin ausgeschlossen. Eine solche Verbindung kann anorganisch oder organisch sein, beispielsweise ein Antibiotikum und ist vorzugsweise eine proteinartige Verbindung, die in einem intrazellulären Signalweg beteiligt ist. Beispielsweise kann die Verbindung CTBP (SEQ ID Nr. 1 und 2) sein.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen können durch Screening mittels der hierin vorher beschriebenen Techniken identifiziert werden und durch Extraktion aus natürlichen Quellen gemäß etablierter Verfahren oder durch Synthese, speziell im Fall von niedermolekularen chemischen Verbindungen hergestellt werden. Proteinartige Verbindungen können durch Expression in rekombinanten Expressionssystemen, beispielsweise einem vorher beschriebenen Baculovirussystem oder einem bakteriellen System hergestellt werden, wie dies beispielsweise in der britischen Patentanmeldung 9525705.1 beschrieben ist. Proteinartige Verbindungen sind vor allem für die Erforschung der Funktion von Signalwegen brauchbar, obwohl sie eine therapeutische Anwendung haben können.
Niedermolekulare Verbindungen werden andererseits vorzugsweise durch chemische Synthese gemäß etablierter Verfahren hergestellt. Sie sind primär als therapeutische Mittel indiziert. Niedermolekulare Verbindungen und organische Verbindungen im allgemeinen sind als Insulinmimetika oder antiproliferative Mittel brauchbar.
Die Erfindung wird nur zu Erläuterungszwecken in den folgenden Beispielen weiter beschrieben.
Beispiel 1
Spezifische Wechselwirkung von RAC-PK mit IMPDH
(a) Bakterien- und Hefestämme
Alle Hefestämme und Plasmide für die Two-Hybrid-Experimente werden von Clontech (Palo Alto, CA) als Komponenten des Matchmaker^® Two Hybrid Systems oder von Dr. D. Nathans (Howard Highes Medical Institute, Baltimore, ML) erhalten. Die Hefestämme SFY526 (MATa, ura3–52, his3–200, ade2–101, lys2–801, trp1–901, leu2–3, 112, can^r, gal4–542, gal80–538, URA3::GAL1-lacZ), HF7c (MATa, ura3–52, his3–200, lys2–801, ade2–101, trp1–901, leu2–3, 112, gal4–542, gal80–538, LYS2::Gal1-HIS3, URA3::(GAL4 17-mer)₃-CYC1-lacZ) und PCY2 [Chevray und Nathans, 1992) (MATα-his3–200, ade2–101, lys2–801, trp1–63, leu2–3, gal4–542, gal80–538, URA3::GAL1-lacZ) werden zum Test auf Protein-Protein-Wechselwirkungen verwendet. Der Hefestamm HF7c wird für das Genbankscreening verwendet. SFY526 und PCY2 weisen die stromaufwärts aktivierende Sequenz und die TATA Sequenz des GAL1 Promotors fusioniert an das lacZ Gen auf. Bei HF7c ist HIS3 an die GAL1 Promotorsequenz fusioniert und LacZ ist an die drei Kopien eines 17-mers der GAL4 Konsensussequenz plus der TATA Sequenz des CYC1 Promotors fusioniert. Sowohl HIS3 als auch LacZ sprechen auf die GAL4 Aktivierung an. Hefetechniken, einschließlich der Transformation, werden gemäß den Anleitungen im MATCHMAKER^® Two Hybrid System und wie beschrieben ausgeführt [Ausubel et al., (1994) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, New York, NY]. Die Bakterienstämme XL-1 Blue (Stratagene) und JM109 werden bei der Klonierung der Plasmide und der Bildung der GST Fusionsproteine verwendet. Die Bakterienstämme JM109(DE3), BL21(DE3)pLysS und BL21(DE3)pLysE (Invitrogen) werden zur Herstellung der Proteine mit (HIS)₆-Anhängen verwendet. Allgemeine molekularbiologische Techniken werden ausgeführt, wie dies vorher beschrieben wurde [Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Ausgabe, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, Davis et al (1986), Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier Science Publishing Co., New York, NY].
(b) Plasmidkonstruktion
Hefevektorplasmide, die die GAL4 DNA Bindedomäne (Aminosäuren 1–147, pGBT9) und die GAL4 Aktivierungsdomäne (Aminosäuren 768–881, pGAD424) enthalten wie auch die Kontrollplasmide pCL1 (Volllängen GAL4-Gen), pVA3 (p53 Gen), pTD1 (großes T Antigen vonSV40) und pLAM5' (humanes Lamin C-Gen) stammen von Clontech. Der Hefevektor pC62, der die GAL4 DNA Bindedomäne enthält, stammt von Dr. D. Nathans. Der Glutathion-S-transferase (GST) Fusionsvektor pGEX-2T stammt von Pharmacia. Der Baculovirustransfervektor (pVL1392) und der (HIS)₆-tag-Vektor (pRSET-A) stammen von Invitrogen. pGBT-PH127, pGBT-PH150, pGBT-PHI–III und pGBT-PHIII–VI enthalten jeweils Fusionen der Aminosäuren 1–127, 1–150, 1–47, 47–127 der humanen RACα PH Domäne im Leserahmen mit der GAL4 DNA Bindedomäne. Sie werden durch die Subklonierung der mit spezifischen Oligonukleotiden erzeugten PCR Fragmenten in die EcoRI-BamHI Schnittstellen von pGBT9 erzeugt. pGEX-PH131, PGEX-PH-KIN, pGEX-PH-KIN-CT, pGEX-KIN-CT, pGEX-KIN und pGEX-CT enthalten jeweils Fusionen der Aminosäuren 1–131, 1–411, 1–480, 147–411, 411–480 der humanen RACα im Leserahmen mit GST. Sie werden durch die Subklonierung der mit spezifischen Oligonukleotiden erzeugten PCR Fragmente in die BamHI-EcoRI Schnittstellen von pGEX-2T konstruiert. pGBT-PH-KIN, pGBT-PH-KIN-CT, pGBT-KIN-CT, pGBT-KIN und pGBT-CT enthalten jeweils Fusionen der Aminosäuren 1–411, 1–480, 147–480, 147–411, 411–480 der humanen RACα im Leserahmen mit der GAL4 DNA Bindedomäne. Sie werden durch die Subklonierung der geeigneten BamHI-EcoRI Fragmente von den entsprechenden pGEX Konstrukten in die PstI-XbaI Schnittstellen von pPC62 mittels PstI-BamHI und EcoRI-XbaI Adaptern konstruiert. Die Xho-XbaI Fragmente der entstehenden pPC62 Plasmide werden isoliert und in die XhoI-EcoRI Schnittstellen von pGBT9 mittels eines XbaI-EcoRI Adapters kloniert. pGAD-IMPDH1–481, pGAD-IMPDH1–427, pGAD-IMPDH1–325, pGAD-IMPDH28–514, pGAD-IMPDH70–514, pGAD-IMPDH1–40 und pGAD-IMPDH428–514 enthalten jeweils Fusionen der Aminosäuren 1–481, 1–427, 1–325, 28–514, 70–514, 1–40, 428–514 der humanen IMPDH Typ II im Leserahmen mit der GAL4 Aktivierungsdomäne. Sie werden durch die Subklonierung der mit spezifischen Oligonukleotiden erzeugten PCR Fragmente in die BamHI-SalI Schnittstellen von pGAD424 konstruiert. pGEX-IMPDH enthält eine Fusion der vollständigen IMPDH Typ II im Leserahmen mit GST. Es wird durch die Subklonierung des SmaI-XhoI IMPDH-Fragments aus pGADGH-IMPDH in die SmaI Schnittstelle von pGEX-2T mittels eines XhoI-SmaI Adapters konstruiert. pVL1392-hRACα enthält das EcoRI Fragment aus WI38xRAC71 [Jones et al., (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 4171–4175], das die gesamte kodierende Region der humanen RACα umfasst. pRSET-PHQKKK enthält eine Fusion der Aminosäuren 1–116 der humanen RACα im Leserahmen mit einem aminoterminalen (HIS)₆-Anhang und der Anfügung von drei Lysinen am Carboxyterminus. Es wird durch die Subklonierung eines NdeI-PflMI Framents von pRK-RAC [Jones et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 4171–4175] in die BamHI-EcoRI Schnittstellen von pRSET-A unter Verwendung von BamHI-NdeI und PflMI-EcoRI Adaptern konstruiert. Alle Plasmidkonstruktionen werden durch Restriktionsfragmentanalyse und Sequenzierung bestätigt.
(c) Genbankscreening
Um zu bestimmen, ob die PH Domäne von RAC mit anderen Proteinen wechselwirken kann, wird sie an die GAL4 DNA Bindedomäne fusioniert und es wird eine HeLa cDNA Bank im Hefereporterstamm HF7c gescreent, die an die GAL4 Transkriptionsaktivierungsdomäne fusioniert ist. Die humane HeLa S3 Matchmaker^® cDNA Bank wird von Clontech bezogen. pGBT-PH127 wird in HF7c mit und ohne der Kontrollplasmide (pGAD424, pCL1, pTD1) transformiert. Kolonien aus dieser Transformation werden auf HIS3 und LacZ Expression getestet, um zu bestätigen, dass die PH Domäne alleine die Transkription nicht aktiviert. Der HFc Transformand, der nur pGBT-PH127 enthält, wird dann mit ausreichend HeLa S3 cDNA Bank transformiert, die in den Two-Hybrid-Vektor pGADGH inseriert ist, um 1,0 × 10⁶ Hefe Leu⁺/Trp⁺ Transformanden zu bilden. Zweifach transformierte Zellen werden auf Leu^–, Trp^–, His^– Platten plattiert und bei 30°C für 3–8 Tage inkubiert. Positive Kolonien werden gepickt, erneut auf den dreifach negativen Platten ausgestrichen und auf LacZ Aktivität durch den Filtertest getestet. Genbankklone, die His⁺ und LacZ⁺ sind, werden dann vom pGBT-PH127 Plasmid befreit und erneut auf His Auxotrophie und LacZ Aktivität getestet. Von dem Plasmid befreite Klone, die in beiden Tests negativ sind, werden dann mit Transformanden von PCY2, die entweder pGBT9, pGBT-PH127, pLAM5' oder pTD1 enthalten, in einem Mating zusammengebracht. Die Aktivierungsklone, die den Diploiden entsprechen, die sowohl in Bezug auf His Auxotrophie als auch lacZ Aktivität nur in Gegenwart von pGBT-PH127 positiv werden, werden für eine Sequenzierung ausgewählt.
Im Screening von 1,0 × 10⁶ primären Transformanden werden 37 Klone identifiziert, die eine spezifische Wechselwirkung mit der PH Domäne von RAC durch die Aktivierung der Reporter für His Auxotrophie und LacZ Aktivität zeigen. Die Klone können in 6 unterschiedliche cDNA Klassen auf der Grundlage der Größe des cDNA Inserts unterteilt werden. Nach der Sequenzierung wird festgestellt, dass alle Klone das humane IMPDH Typ II einschließlich des Startmethionins bis zum Stopcodon der vorher klonierten cDNA enthalten [F. R. Colart und E. Huberman (1988), J. Biol. Chem. 263, 15769–15772].
Die Wechselwirkung erfordert eine vollständige PH Domäne, da Konstrukte, die entweder die Subdomänen I–III (Aminosäuren 1–47) oder die Subdomänen IV–VI (Aminosäuren 47–127) alleine enthalten, keine Wechselwirkung mit IMPDH zeigen. Das Fehlen der Wechselwirkung mit den Subdomänen IV–VI ist signifikant, da von dieser Region vorher gezeigt wurde, dass sie schwach mit βγ-Untereinheiten von heterotrimeren G-Proteinen wechselwirkt. Diese Wechselwirkung von IMPDH und der PH Domäne von RAC wird jedoch im Two-Hybrid-System mit Konstrukten gehemmt, die Kinasedomäne von RAC direkt angehängt an die PH Domäne von RAC aufweisen, wie dies im natürlichen Zusammenhang vorkommt. Dies könnte auf einer intramolekularen Wechselwirkung der PH Domäne von RAC mit sich selbst oder einer anderen Region von RAC beruhen. Jedoch hemmt die Einbeziehung von Aminosäuren zwischen der PH- und Kinase-Domäne (einschließlich der ersten vier Aminosäuren der Kinasedomäne) die Wechselwirkung nicht. Es wird auch die PH Domäne von RAC an die GAL4 Aktivierungsdomäne fusioniert, um zu testen, falls sie mit einem der humanen RACα GAL4 DNA Bindekonstrukten wechselwirkt. Es wurde keine solche Wechselwirkung detektiert, was andeutet, dass die PH Domäne nicht selbstassoziiert oder einen Komplex mit einer anderen Region des RAC-PK Moleküls in diesem System bildet. Die Hemmung der oben beobachteten Wechselwirkung wäre sonst aufgrund einer sterischen Behinderung zu erklären.
Es werden zusammenliegende amino- und carboxyterminale Deletionen von IMPDH konstruiert, um die Region des Moleküls zu bestimmen, die für die Wechselwirkung mit der PH Domäne von RAC verantwortlich ist. Dies zeigt, dass ein fast intaktes IMPDH Molekül für die Wechselwirkung erforderlich ist. Die aminoterminale Grenze der PH Wechselwirkungsdomäne liegt zwischen den Aminosäuren 28 und 70, während die carboxyterminale Grenze zwischen den Aminosäuren 427 und 481 liegt.
(d) In vitro Bindungsstudien
Um zu testen, ob IMPDH direkt mit der PH Domäne von RAC wechselwirkt, wird ein in vitro Bindungstestsystem mittels GST Fusionen verwendet. Die GST Fusionen, die mit den Plasmiden pGEX-2T, pGEX-PH131 und pGEX-IMPDH gebildet werden, werden in E. coli XL1 Blue Zellen durch die Induktion mit 0,1 mM IPTG für 2 Stunden bei 24°C exprimiert. Die Fusionsproteine werden gereinigt, wie dies beschrieben ist [D. B. Smith und K. S. Johnson (1988) Gene 67, 31–40], außer dass die Zellen in einer French Press lysiert werden. Die humane RACα PH Domänenfusion, die mit (HIS)₆ Anhang versehen ist, und von BI21(DE3)pLysS Zellen gebildet wird, die mit pRSET-PHQKKK transformiert sind, wird wie beschrieben [britische Patentanmeldung 9525705.1] exprimiert und gereinigt. Kurz gesagt werden die Zellen mit 0,2 mM IPTG für 2 Stunden bei 24°C vor der Ernte induziert. Die Zellpellets werden in einer French Press lysiert und die lösliche PH Domäne wird nacheinander auf Ni-(II)-Affinität-, Kationenaustausch- und Gelfiltrationssäulen gereinigt. Die Bindungsstudien werden mittels GST Fusionen (2,5 μg), die an Glutathion-Agarosekügelchen in Bindepuffer (20 mM Phosphatpuffer pH 7,2, 150 mM NaCl, 1 Triton X-100, 5 mM DTT) gekuppelt sind, worin 2,5 μg an PH Domäne mit (HIS)₆-Anhang oder von Bacu lovirus gebildeter humaner RACα in einem Gesamtvolumen von 100 μl enthalten sind, ausgeführt. Die Proben werden bei 4°C für 1–2 Stunden unter Schütteln alle 5 Minuten inkubiert. Die Kügelchen werden dann dreimal mit Puffer (20 mM Phosphatpuffer pH 7,2, 150 mM NaCl) gewaschen, bevor sie durch SDS-PAGE analysiert und mit Coomassie Blue R-250 (für PH Bindedomäne mit (HIS)₆-Anhang) oder SDS PAGE gefolgt von Western Blot Analyse mittels eines für humane RACα spezifischen Antiserums (für humane RACα Bindung) analysiert werden [Jones et al., obige Literaturstelle]. Der sekundäre Antikörper ist ein an Meerrettichperoxidase gekuppelter anti-Kaninchen-Antikörper (Amersham), der mittels der ECL Methode (Amersham) durch Autoradiographie detektiert wird. In diesem Test wird beobachtet, dass die PH Domäne mit (HIS)₆-Anhang an die GST-IMPDH Fusion aber nicht an GST alleine binden kann.
Das Testsystem wird auch verwendet, um zu testen, ob aus Baculovirus gereinigte humane Vollängen-RACα direkt mit IMPDH wechselwirken kann. Die humane Vollängen-RACα wird mittels des Baculovirussystems exprimiert und gereinigt, wie dies beschrieben ist [siehe britische Patentanmeldung 9525702.8]. Kurz gesagt wird ein Baculovirus durch die Cotransfektion von Sf9 Zellen mit pVL1392-hRACα und Wildtyp Baculovirus AcMNPV DNA konstruiert und durch Grenzverdünnung gereinigt und durch Dot-Blot-Hybridisierung detektiert. Das gereinigte Virus wird zur Bildung der humanen RACα in Sf9 Zellen verwendet. Die humane RACα wird durch sequenzielle Anionenaustausch-, Phosphozellulose- und Gelfiltrationschromatographie gereinigt. Hier wird eine spezifische Wechselwirkung des RAC-PK Vollängenmoleküls mit GST-IMPDH und nicht GST alleine oder der GST-PH Fusion beobachtet.
(e) In vivo Fällungstest
Unter Verwendung mit GST-IMPDH in einem Fällungstest mit MCF-7 Zellextrakten wird eine spezifische Assoziierung der humanen RACα mit GST-IMPDH und nicht mit GST beobachtet. MCF-7 Zellen werden in Puffer (50 mM Tris-HCl pH 8,0, 120 mM NaCl, 1% NP-40, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 30 mM pNPP, 25 mM β-Glycerinphosphat, 15 mM PPi, 25 mM NaF, 1 mM Vanadat, 20 μM PAO, 1 mM Benzamidin, 0,1 mM PMSF) mittels zwölf Schlägen eines Dounce Homegenisiergeräts lysiert. Das lösliche Protein aus dem Überstand der Lysate, die bei 14000 × g für 15 Minuten bei 4°C zentrifugiert wurden, wird zu GST, GST-PH oder GST-IMPDH Protein (5 μg) gegeben, das an Glutathionkügelchen gebunden ist und bei 4°C für 2 Stunden unter kontinuierlichem Schütteln inkubiert. Die Kügelchen werden dann viermal mit Lysepuffer gewaschen, bevor sie durch Western Blot, wie dies oben beschrieben wurde, mit einem für humane RACα spezifischen Antiserum [Jones et al., siehe obige Literaturstelle (1991), Cell Reg. 2, 1001–1009] oder mit einem für IMPDH spezifischen Antiserum [F. R. Collart und E. Huberman (1988), J. Biol. Chem. 263, 15769–15772] analysiert werden. Es kann auch das umgekehrte Experiment ausgeführt werden, bei dem IMPDH aus den Zelllysaten mittels des GST-PH Domänenfusionsproteins ausgefällt wird. Daher wird die Existenz einer Assoziation zwischen der humanen RACα und der humanen IMPDH Typ II in drei heterologen Systemen beschrieben.
(f) Enzymanalyse
Es wird dann der Effekt der Wechselwirkung auf die Aktivität von IMPDH getestet. Die Zugabe von löslicher PH Domäne als GST Fusion ruft eine Aktivierung von IMPDH im Vergleich zur Zugabe von GST alleine hervor. Tests für die IMPDH Aktivität werden im wesentlichen ausgeführt, wie dies oben beschrieben wurde [L. C. Antonio und J. C. Wu (1994) Biochem. 33, 1753–1759], wobei die Bildung von XMP durch die Absorption bei 286 nm verfolgt wird. Das IMPDH wird als GST Fusion gebildet, die auf Glutathionkügelchen gereinigt wird und dann als lösliches Protein mit reduziertem Glutathion eluiert wird. Die IMPDH Aktivität wird in Gegenwart von entweder löslichem GST (hergestellt aus pGEX-2T) oder PH Domäne (hergestellt aus pGEX-PH131) in einem Molverhältnis von IMPDH zu GST/PH Domäne von 1 : 5 getestet. RAC Kinasetests mit der durch Baculovirus hergestellten humanen RACα mittels verschiedener Substrate (Myelinbasisprotein, GST oder GST-IMPDH) werden ausgeführt, wie dies im wesentlichen beschrieben ist [Jones et al., siehe obige Literaturstelle]. Wenn IMPDH in RAC Kinasetests mittels der durch Baculovirus hergestellten humanen RACα getestet wird, um zu sehen, ob es ein Substrat ist, kann keine signifikante Phosphorylierung der IMPDH detektiert werden.
Beispiel 2
Hemmung von GSK3
Zwei Hauptkinasen, die bekanntermaßen bei der Regulation der Insulin-abhängigen Signalwege beteiligt sind, sind MAPKAP Kinase-1 und p70^S6K. Diese Kinasen werden jeweils durch PD98059 und Rapamycin gehemmt. Beide Agenzien können die Phosphorylierung von GSK3 nicht hemmen, was nahe legt, dass die für die GSK3 Inaktivierung verantwortliche Kinase nicht die MAPKAP Kinase-1 oder p70^S6K ist.
L6 Myotubuli werden mit beiden Verbindungen inkubiert und dann folgendermaßen mit Insulin stimuliert. Monoschichten von L6 Zellen werden in 6 cm Petrischalen bis zum Stadium der Myotubuli angezogen, über Nacht vom Serum befreit und dann für 1 Stunde in 20 mM Hepes/NaOH (pH 7,4)/0,14 M NaCl/5 mM KCl/2,5 mM MgSO₄/1 mM CaCl₂/25 mM Glucose (HBS Puffer) in Gegenwart oder Abwesenheit von 50 μM PD98059 oder 100 μM LY294002 inkubiert. 2 mM 8-Br-cAMP oder 0,1 μM Rapamycin werden bei Zugabe für die letzten 15 Minuten eingearbeitet. Die Zellen werden für 5 Minuten oder für Zeitspannen bis zu 10 Minuten mit 0,1 μM Insulin stimuliert. Das Medium wird durch Absaugen entfernt, die Zellen werden auf Eis gegeben und in 0,2 ml eiskaltem Puffer A lysiert [50 mM Tris-HCl (pH 7,5, 20°C)/1 mM EDTA/1 mM EGTA/1% (G/V) Triton X-100/1 mM Natriumorthovanadat/10 mM Natrium Glycerophosphat/50 mM Natriumfluorid/5 mM Natriumpyrophosphat/2 μM Microcystin/0,1 (V/V) 2-Mercaptoethanol/Leupeptin 4 μg/ml, 1 mM Benzamidin, 1 mM Phenylmethansulfonylfluorid, 30 μg/ml Aprotinin, 30 μg/ml Antipain, 10 μg/ml Pepstatin].
Die Fällung von p42^MAPK, MAPKAP Kinase-1 oder GSK3 aus den Zelllysaten durch Immunfällung und Analyse ihrer Aktivität mit spezifischen Protein- oder Peptidsubstraten (Cross et al., (1994) Biochem J. 303, 21–26) zeigt, dass die Insulinaktivierung von GSK3 nicht durch Mittel beeinflusst wird (2 mM 8-Br-cAMP oder 0,1 μM Rapamycin), die die klassischen MAP Kinase oder p70^S6K Signalwege hemmen.
Um die Kinase zu identifizieren, die GSK3 in Gegenwart von Rapamycin und PD98059 hemmt, werden die Zellen wie oben lysiert und die Zelllysate (0,3 mg) werden auf einer 5 × 0,16 cm Mono Q Säule (Sutherland et al., (1994), FEBS Lett. 338, 37–42) chromatographiert, außer dass der Puffer zusätzlich 1 mM EGTA, 0,1 mM Natriumorthovanadat und 0,5% (G/V) Triton X-100 enthält.
Die Fraktionen (0,05 ml) werden mit dem synthetischen Peptid GRPRTSSFAEG getestet, das der Sequenz von GSK3 entspricht, die das Serin (fett gedruckt) umgibt, dessen Phosphorylierung die Inaktivierung von GSK3α (Ser²¹) und GSK3β (Ser⁹) auslöst. Es werden 3 Aktivitätspeaks eluiert, die zu einer Phosphorylierung dieses Peptids führen. Diese Peaks fehlen, wenn die Insulinstimulierung nicht verab reicht wird oder falls die Zellen mit 0,1 μM Wortmannin vor der Insulinstimulierung inkubiert werden. Der inaktivierende Effekt von Insulin auf GSK3 wird bekanntermaßen durch die Verabreichung dieser Wortmanninkonzentration oder 100 μM LY294002, einem strukturell nicht verwandten Inhibitor von PI-3K verhindert.
Alle drei Peaks der Phosphorylierungsaktivität können mit einem anti-RAC Antikörper mittels eines polyklonalen Kaninchenantiserums, das gegen das Peptid FPQFSYSASSTA gerichtet ist, immungefällt werden, wobei das Serum durch die subkutane Injektion der Kaninchen mit dem Peptid erzeugt wurde und durch die Fällung mittels 50% (NH₄)₂SO₄ gereinigt wurde, wonach eine Affinitätschromatographie auf einer RAC-Peptid gekuppelten Affigel^® 10 Säule (Bio-Rad) erfolgt.
Im Gegensatz dazu kann die Immunfällung mit einem anti-MAPKAP Kinase-1 Antikörper keine peptidphosphorylierende Aktivität von der Mono Q Säule verschwinden lassen.
Um zu bestimmen, dass vollständiges GSK3 durch RAC inaktiviert werden kann, werden GSK3α und GSK3β partiell aus dem Kaninchenskelettmuskel gereinigt (Sutherland et al., siehe obige Literaturstelle) und mit einem spezifischen Peptidsubstrat getestet (Cross et al., siehe obige Literaturstelle). Jede GSK3 Isoform wird auf 15 E/ml verdünnt und die GSK3 Aktivität wird nach einer Inkubation für 20 Minuten mit MgATP in Gegenwart oder Abwesenheit von RAC gemessen. Die Inkubation wird auf 20 mM EDTA gebracht, um die Kinasereaktion zu stoppen, für 20 Minuten mit 5 mE/ml PP2A inkubiert, um GSK3 zu reaktivieren, auf 2 μM Okadainsäure zur Inaktivierung von PP2A gebracht und dann auf GSK3 Aktivität getestet.
In Abwesenheit von RAC ist GSK3 während des Experiments stabil aktiv. Andererseits wird jedoch RAC-PK erfolgreich durch die GSK3 Aktivität gehemmt und diese Inaktivierung ist gegenüber PP2A empfindlich, die die GSK3 Aktivität wiederherstellt. Das Fehlen der Insulinstimulierung, die Anwesenheit von Wortmannin oder die Zerstörung der RAC-PK Immunfällung durch die Inkubation des anti-RAC Antikörpers mit dem Peptidimmunogen führt jeweils zu einem Fehlen der GSK3 Inaktivierung in diesem Experiment.
Beispiel 3
Um zu bestimmen, ob die Kinasedomäne von RAC mit ihrer carboxyterminalen Verlängerung mit anderen Proteinen wechselwirken kann, wird sie an die GAL4 Bindedomäne fusioniert und eine HeLa cDNA Genbank, die an die GAL4 Transkriptionsaktivierungsdomäne im Hefereporterstamm HF7c fusioniert ist, wird gemäß dem Verfahren von Beispiel 1 gescreent. Kurz gesagt werden die Aminosäuren 147–480 von RACα im Leserahmen an GST im Expressionsvektor pGEX-2T fusioniert (siehe Beispiel 1). Ein geeignetes BamHI-EcoRI Fragment wird dann in die PstI-XbaI Schnittstellen des Hefevektors pPC62 (Dr. D. Nathans) mittels PstI-BamHI und EcoRI-XbaI Linkern subkloniert, um eine GAL4 DNA Bindedomäne-RAC Kinase und Fusion der C-terminalen Domäne zu erzeugen. XhoI-XbaI Fragmente werden dann in pGBT9 (Clontech) subkloniert. Die HeLa S3 Matchmaker^® cDNA wird wie vorher verwendet.
Beim Screening von 1,5 × 10⁶ primären Transformanden werden sieben Klone identifiziert, die eine spezifische Wechselwirkung mit der Kinasedomäne von RAC plus der carboxyterminalen Verlängerung durch die Aktivierung der Reporter für His Auxotrophie und LacZ Aktivität zeigen. Eine detaillierte Analyse der spezifischen Region von RAC-PK, mit der der Klon wechselwirkt, zeigt, dass die carboxyterminalen 69 Aminosäuren alles sind, was zur Vermittlung der Wechselwirkung erforderlich ist. Daher wird das Molekül CTBP für carboxy-terminates Binde-protein genannt. Keiner dieser Klone zeigt eine Wechselwirkung mit der Kinasedomäne alleine. Diese Wechselwirkung beobachtet man in allen Konstrukten, die die carboxyterminale Verlängerung einschließlich eines Volllängen RAC-PK Konstrukts enthalten, was andeutet, dass die Wechselwirkung nicht durch eine andere Region des RAC-PK Moleküls gehemmt wird. Interessanterweise wird die C-terminale Domäne von RAC-PK in Reaktion auf die Insulinaktivierung phosphoryliert, was eine Rolle für CTBP als Modulator der Insulinwirkung nahe legt.
Alle sieben wechselwirkenden Klone enthalten identische cDNA Inserts mit einer Länge von 1,3 kb mit einer ALU Wiederholung von 300 Nukleotiden am 3'-Ende (SEQ ID Nr. 1). Eine Suche in der Gene-EMBL Nukleotiddatenbank mittels der cDNA Sequenz ohne der ALU Wiederholung mit dem FASTA Programm (GCG Package) identifiziert keine signifikanten Homologien. Die abgeleitete Aminosäuresequenz der CTBP cDNA bildet ein kurzes Polypeptid mit 47 Resten, das reich an Alaninen (21%) und Arginin (21%) ist. Eine Suche in der PIR, Swiss-Prot und GP Proteindatenbanken mittels FASTA (GCG Package) und der Gene-EMBL Nukleotiddatenbank mittels TFASTA (GCG Package) zeigt keine signifikanten Homologien zur CTBP Proteinsequenz.
Die identifizierte CTBP Sequenz dürfte das 3'-Ende des vollständigen CTBP Moleküls darstellen.
Um zu testen, ob das neue Protein CTBP direkt mit RAC-PK wechselwirken kann, wird ein in vitro Bindungstestsystem mittels GST Fusionen verwendet, wie dies in Beispiel 1 beschrieben ist. In diesem Test wird eine spezifische Wechselwirkung der Volllängen RAC, die im Baculovirussystem gebildet wurde, mit GST-CTBP und nicht mit GST alleine beobachtet.
Um zu testen, ob diese Wechselwirkung in vivo auftritt, wird ein Fällungstest mittels des GST-CTBP Fusionsproteins und MCF-7 Zellextrakten verwendet, wie dies in Beispiel 1 beschrieben wurde. Hier wird eine spezifische Assoziierung der MCF-7 RACα mit GST-CTBP, aber nicht mit GST alleine beobachtet.
Sequenzliste

Claims

Verfahren zum Screenen von Verbindungen, die mit RAC-PK wechselwirken, das die folgenden Schritte umfasst: (a) Inkubation von RAC-PK oder eines funktionellen Fragments hiervon und der zu screenenden Verbindung, (b) Messung der Kinaseaktivität der RAC-PK oder eines funktionellen Fragments hiervon mittels GSK3 als Substrat, und (c) Auswahl der Verbindung, falls das Substrat eine unterschiedliche Menge an phosphorylierten Resten im Vergleich zur Kontrollreaktion ohne Substrat aufweist.
Verfahren nach Anspruch 1, worin humane RAC-PK oder ein funktionelles Fragment hiervon verwendet wird.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, worin das Substrat in Schritt (b) das Peptid GRPRTSSFAEG umfasst und worin der Serinrest, der näher am C-Terminus des Peptids liegt, phosphoryliert ist.
Verfahren nach Anspruch 1, 2 oder 3, worin das funktionelle Fragment in Schritt (a) die katalytische Domäne von RAC-PK ist.
Verfahren zum Screenen eines Aktivators der RAC-PK Funktion gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, worin die Verbindung in Schritt (c) ausgewählt wird, falls sie die Menge an phosphorylierten Resten dieses Substrats erhöht.
Verfahren zum Screenen eines Inhibitors der RAC-PK Funktion gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, worin die Verbindung in Schritt (c) ausgewählt wird, falls sie die Menge an phosphorylierten Resten in diesem Substrat verringert.
Verfahren nach Anspruch 5 zum Screenen von Verbindungen, die zur Behandlung von Erkrankungen brauchbar sind, bei denen die Blutzuckerspiegel zu hoch sind.
Verfahren nach Anspruch 6 zum Screenen von Verbindungen, die zur Behandlung von Erkrankungen brauchbar sind, die zu geringe Blutzuckerspiegel umfassen.
Verfahren nach Anspruch 7 zum Screenen von Verbindungen, die zur Behandlung von Diabetes brauchbar sind.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, worin RAC-PK mit einer oder beiden Mutationen aus T308 → D und S473 → D verwendet wird.