HUT77081A - Protein kináz NPK-110 - Google Patents
Protein kináz NPK-110 Download PDFInfo
- Publication number
- HUT77081A HUT77081A HU9702175A HU9702175A HUT77081A HU T77081 A HUT77081 A HU T77081A HU 9702175 A HU9702175 A HU 9702175A HU 9702175 A HU9702175 A HU 9702175A HU T77081 A HUT77081 A HU T77081A
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- ser
- npk
- tau
- leu
- map2c
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
- C12N9/1205—Phosphotransferases with an alcohol group as acceptor (2.7.1), e.g. protein kinases
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
- A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
- C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
- C07K14/4711—Alzheimer's disease; Amyloid plaque core protein
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Neurology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Neurosurgery (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Hospice & Palliative Care (AREA)
- Psychiatry (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Description
A találmány egy olyan szekvenciára vonatkozik, amely tau proteineket, valamint más mikrotubulussal társult proteineket (microtubule associated proteins = MAPs) foszforiláló új neuron protein kinázt (NPK) kódol. A foszforilálás olyan pozíciókban történik, amelyek döntőek a mikrotubulusokhoz való kötődés szempontjából. A találmány vonatkozik továbbá olyan szerin (Ser) vagy treonin (Thr) csoportokra és az ezen csoportokat tartalmazó epitópokra is, amelyeket az említett NPK foszforilál az említett
MAP-eken, olyan antitestekre, amelyek specifikusan kötődnek az említett kínázhoz, az említett protein kináz inhibitorait tartalmazó gyógyszerkészítményekre, amelyek különösen az Alzheimer kór és a rák kezelésére szolgálnak, továbbá diagnosztikai készletekre (kitekre), valamint az Alzheimer kór és a rák kimutatására szolgáló in vitro diagnosztikai módszerekre.
A mikrotubulussal társult proteinek (MAP-ek) szabályozzák a mikrotubulus hálózat — amelyről úgy vélik, hogy ösztönzi a neurit kinövést — teljes dinamikáját és átrendeződését [ legutóbb Hirokawa tekintette át e témát; N. Hirakawa, Curr.Opinion Cell
Bioi., 6, 74-81 (1994)] . Egész sor bizonyítékból arra lehet következtetni, hogy a MAP-ek, a protein kinázok és foszfatázok által eddig ismeretlen módon kiegyensúlyozott fozsforiláltsági állapota döntő szerepet játszik ezen történések modulálásában. A tau protein — a MAP-ek egy osztályát képviseli emlős agyban [ D.W.Cleveland et al., J.Mól.Bioi., 116, 207-225 (1977)] — in vivő több helyen foszforilált [M.Butler, M.L.Shelanski,
J.Neurochem., 47, 1517-1522 (1986); A.Watanabe et al.,
J.Bioi.Chem., 268, 25712-25717 (1993)] és in vitro több protein ···· ·· · · kináz szubsztrátuma [Összefoglalta G.Lee, Curr. Opinion Cell.Bioi., _5, 88-94 (1993); M.Goedert, Trends in Neurosci., 16,
460-465 (1993); Ε.-M.Mandelkow, E.Mandelkow, TIBS, 18, 480-483 (1993); B.H.Anderton, Hippocampus, 3, 227-237 (1993)] . Alzheimer kórban a neuron degeneráció folyamán a tau protein páros helikális filamentumokká (paired helical filaments = PHFs) aggregálódik, ez képezi a jellegzetes neurofibrilláris léziók legfontosabb rostos komponensét [Összefoglalta V.M.Y.Lee, J.Q. Trojanowski, Curr .Opin .Neurobio., 2_, 653-656 (1992)] . Az ezekből az aggregátumokból izolált tau protein néhány biokémiai módosulást mutat, amelyek közül a hiperfoszforiláltság a legfeltűnőbb [I. Grudke-Iqbal et al., Proc .Natl .Acad. Sci., 83, 4913-4917 (1986); J.F.Brion et al., Biochem. J., 279, 831-836 (1991);
H.Ksiezak-Reding et al., Brain Rés., 597, 209-219 (1992); M.Goedert et al., Neuron, _8, 159-168 (1992)] . A közlések szerint a leginkább rendellenes foszforilációs helyek a Ser/Thr-Pro szekvenciák [V.M.Y.Lee et al., Science (Wash.), 251, 675-678 (1991); J.Biernat et al., EMBO J., 11, 1593-1597 (1992);
B . Lichtenberg-Kraag et al., Proc . Natl .Acad. Sci ., 89, 5384-5388 (1992); N.Gustke et al., FEBS Lett., 307, 199-205 (1992);
A.Watanabe et al·., J.Bioi.Chem., 268, 25712-25717 (1993)], és ez a prolin-irányított kinázok [G.Drewes et al., EMBO J., 11, 2131-2158 (1992); E.-M. Mandelkow et al., FEBS lett., 314, 315-321 (1992); D.Hanger et al. , Neurosci. Lett., 147, 58-62 (1992);
R.Vulliet et al. , J.Bioi.Chem., 267, 22570-22574 (1992);
K.Baumann et al. , FEBS Lett., 336, 417-424 (1993); H. Paudel et al. , J.Bioi.Chem., 268, 23512-23518 (1993); S.Kobayashi et al., ···· ···· ·· ·· ·« · ·· ···
FEBS Lett., 335, 171-175 (1983)] vagy a megfelelő foszfatázok diszregulációjára [G.Drewes et al., FEBS Lett., 336, 425-432 (1993); C.X.Gong et al., J. Neurochem., 62, 803-806 (1994)] utal. Számos laboratórium előállított olyan foszforilációs-függő antitesteket, amelyek megkülönböztetik a „normál és a hiperfoszforilált, „kóros tau formákat [J.Kondo et al. , Neuron, 1_, 827-834 (1988); V.M.Y.Lee et al., Science (Wash.), 251., 675-578 (1991);
M.Mercken et al., Acta Neuropathol., 84, 265-272 (1992); S.G.
Greenberg et al., J.Bioi.Chem., 267, 564-569 (1992)] . Kimutatták, hogy minden ilyen antitest a Ser/Thr-Pro típusú epitópok ellen irányul [V.M.Y.Lee et al., Science (Wash.), 251, 675-678 (1991); J.Biernat et al., EMBO J., 11, 1593-1597 (1992);
B . Lichtenberg-Kraag et al., Proc .Natl .Acad. Sci ., 89, 5384-5388 (1992); E.Lang et al., Biochem.Biophys.Rés.Comm., 187, 783-790 (1992); A.Watanabe et al., J.Bioi.Chem., 268, 25712-25717 (1993)] .
A tau protein mikrotubulus-kötő szakasza (1. ábra) három vagy négy, 31 csoportból álló pszeudoismétlődő szakaszt (pseudorepeats) tartalmaz az izoform típustól függően [G.Lee et al., Neuron, 2, 1615-1624 (1989); M.Goedert et al. , Neuron, 3., 519-526 (1989); A.Himmler et al., Mól.Cell.Bioi., 9, 1381-1388 (1989)].
Valószínűleg ez a szakasz alkotja a páros helikális filamentumok építőkövét [J.Kondo et al., Neuron, _1, 827-834 (1988); C.Wischik et al., Proc .Natl. Acad. Sci ., 85, 4606- -4510 (1988); H.Ksiezak-Reding, S.H.Yen, Neuron, 6, 717-728 (1991); H.Wille et al.,
J.Cell.Bioi., 118, 573-584 (1992)] . Ez a szakasz a 14-16
Ser/Thr-Pro motívum közül, amelyek az ismétlődő szakaszok • · ··· · (repeat-ek) határán gyűlnek össze, egyet sem tartalmaz. Tartalmaz azonban egy olyan állandó szerin (Ser262) csoportot a KIGS szekvencián belül az első repeat-ben, amelyről megállapították, hogy egyike azoknak a fő helyeknek, amelyeket egy agyból izolált szövetkivonat foszforilál [N.Gustke et al., FEBS Lett., 307,
199-205 (1992)]. Megállapították, hogy ez a hely az Alzheimer
PHF-tau-ban is foszforilált, de nem foszforilált a „normál tauban vagy fetális tau-ban [M.Hasegawa et al., J.Bioi.Chem., 26,
17047-15054 (1992)] . Mindeddig csak ezt az egy kóros foszforilációs helyet fedezték fel a tau repeat doménjén belül.
Legutóbb helyre irányuló mutagenezist használtak annak bemutatására, hogy ezen a tau foszforilálása erősen csökkenti mikrotubulus-kötő képességét, míg a Ser/Thr-Pro elemeken (motívumokon) való foszforiláltságnak csak igen kicsi a hatása [J.Biernat et al., Neuron, 11, 153-163 (1993)] . Ez a körülmény olyan idegszöveti protein kinázok iránt indította el a kutatást, amelyek a tau proteint a Ser262-nél képesek foszforilálni. A találmány feladatát egy technikai probléma megoldása képezi, azaz, hogy egy olyan protein kinázt — és egy megfelelő nukleotid szekvenciát — bocsássunk rendelkezésre, amely a humán tau protein kritikus szerin 262 csoportjának foszforilálása révén Alzheimer kórt okoz.
Ezt a technikai problémát a szabadalmi igénypontokban leírt kiviteli alakok megvalósításával oldjuk meg.
A találmány tehát egy olyan neuron protein kinázt (NPK-t) vagy ennek működőképes fragmentumát kódoló DNS szekvenciára vonatkozik, amely a tau-ban, a MAP4-ben, MAP2-ben és MAP2c-ben egy
KXGS típusú szekvencia-motívum foszforilálására képes, és a következő tulajdonságok jellemzik:
(a) a 6. táblázatban MARK-1 jelű aminosavszekvenciát kódolja;
(b) a 6. táblázatban MARK-2 jelű aminosavszekvenciát kódolja;
vagy (c) az (a) vagy (b) DNS-sel hibridizál.
A „DNS szekvencia kifejezés minden DNS szekvenciára vonatkozik, így genomiális vagy cDNS szekvenciára is és félszintetikus vagy szintetikus DNS-re is.
Meglepő módon azt találtuk, hogy az eddig ismert kinázok közül egy sem közvetíti a tau repeat dóménjében lévő négy KXGS elem foszforilálását olyan mértékben, hogy az kielégítően magyarázná az említett foszforilációval társult biológiai és patológiás hatásokat. Ez különösen igaz a szerin 262 csoportra, amely a kezdődő Alzheimer kórra utal. A találmány ezzel szemben olyan DNS szekvenciát ismertet, amely egy fent meghatározott tulajdonságokkal rendelkező olyan új protein kinázt kódol, amely az Alzheimer kór elindítása szempontjából döntő aminosavcsoportok foszforilálásáért felelős. Ezt a protein kinázt ebben a bejelentésben NPK, MARK-1 vagy MARK-2 elnevezéssel láttuk el. Az aminosavcsoportok számozása az ezen bejelentésben szereplő htau40 szekvencia — a humán tau izoform szekvenciák közül ez a leghosszabb [ 441 csoport; M.Goedert et al., Neuron 3_, 519-526 (1989)] — számozását követi.
Egy előnyös kiviteli alakban a találmány egy olyan DNS szekvenciára vonatkozik, amely az alábbi tulajdonságokkal jellemzett neuron protein kinázt (NPK-t) kódolja:
···· · · · · ·· (a) valószínű molekulatömege 110 kD (SDS-PAGE módszerrel meghatározva) ;
(b) a humán tau proteinben a 262, 293, 305, 324 és 356 szerin csoportokat foszforilálja; és (c) az alábbi aminosavszekvenciákat tartalmazza:
KLDTFCGSPPYAAPELFQGK
DRWMNVGHEEEELKPYAEP (K) SSRQNIPRCRNNI
A találmány szerinti DNS szekvencia által kódolt NPK-t egy előnyös kiviteli alakban még az alábbi tulajdonságok is jellemzik :
(d) a PP-2A foszfatáz inaktiválja; és (e) a tau proteinnel rokon MAP2, MAP2c és MAP4 mikrotubulussal társult proteinek (MAP-ek) következő szerin vagy treonin csoportjait foszforilálja
MAP2/MAP2c: S37, S1536, S1676, S1707, S1792, S1796, S1799
MAP4 : T829, T873, T874, T876, S899, S903, S928, S941, S1073 (f) előidézi a tau, MAP4, MAP2 és MAP2c mikrotubulusoktól való disszociációját.
A találmány szerint egy másik meglepő felismerésre is jutottunk, mégpedig arra, hogy az NPK, azáltal, hogy a tau proteinen kívül a mikrotubulusokkal társult proteineket is foszforilálja, ezeknek a proteineknek a mikrotubulusoktól való disszociációját okozza. Ez azután az említett mikrotubulusok destabilizációját, illetve növekvő dinamikai instabilitását eredményezi, és ebből eredően kihat a sejt proliferációra, sejt differenciálódásra vagy sejt degenerálódásra. Tehát a találmány szerinti NPK képes • ·· · ···· *♦···· ·· ·· ·· · ·· ··· az agyban lévő mikrotubulusok dinamikájának és átrendeződésének a szabályozására a tau protein vagy más MAP-ek foszforilálása útján. A fent említett felismerés fontos következtetések levonására ad módot a találmány szerinti kináz szerepét illetően a rák kialakulásában.
Ugyanis az a nézet, hogy a rák lényegében egy ellenőrizetlen sejtproliferáció. Számos rák-ellenes gyógyszer ennélfogva káros hatást gyakorol a sejtosztódásra és proliierációra azáltal, hogy mérgezik a mikrotubulusokat. Másrészt az „onkogének gyakran olyan kinázok, amelyek a sejt-szabályozással okoznak kárt. Egy kináz — amely a találmány szerinti NPK-val azonos vagy vele homológ — deregulációja a különböző sejt típusok mikrotubulusainak stabilitására komoly hatást gyakorolhat. Minthogy a mikrotubulusok fontos szerepet játszanak a sejtosztódásban, az említett NPK deeregulációja ellenőrizhetetlen sejtosztódáshoz és a normál sejtek rákos sejtekké való átalakulásához vezethet. Az említett NPK deregulációja más esetben olyan posztmitótikus terminálisán differenciálódott sejteket — ilyenek a neuronok (amelyek nem osztódnak) — eredményezhet, amelyek osztódásra stimulálódtak. Ez az „abnormális stimulus a neuronok közvetlen programozott sejthalálához (apoptózisához) vezetne (és ezáltal egy Alzheimer-szerű állapothoz), mivel differenciáltsági állapotuk következtében nem képesek osztódni.
A találmány szerinti DNS szekvencia egy további kiviteli alakjában az NPK-t agyszövetből izoláljuk a következő lépések segítségével:
(a) az agykivonatot homogenizáljuk, és ezután centrifugáljuk;
• · · · · · • · · (b) az (a) lépésben kapott felülúszót cellulóz-foszfát (CP) oszlopon kromatografáljuk, amikoris az NPK aktív frakciók
200-400 mM nátrium-klorid-koncentráció között eluálódnak;
(c) a (b) lépésben kapott aktív frakciókat ammónium-szulfáttal csapjuk ki, és a csapadékot dializáljuk;
(d) a (c) lépésben kapott dializátumot Q-Sepharose (Pharmacia) anioncserélőn kromatografáljuk, és az NPK aktív frakciókat eluáljuk, amikoris az említett NPK aktív frakciók egyetlen csúcsot adva, körülbelül 0,2 M nátrium-klorid-koncentrációnál oldódnak le, majd az aktív frakciókat dializáljuk;
(e) a kationcserés kromatográfiát Mono S HR 10/10 oszlopon végezzük;
(f) ezután Mono Q HR 5/5 oszlopon kromatografálunk, és ekkor az NPK aktív frakciók körülbelül 250 mM nátrium-klorid-koncentrációnál oldódnak le;
(g) a gélszűréses kromatográfiát Superdex G-200-οη végezzük, itt az NPK aktivitás 100 kD valószínű molekulatömeggel eluálódik; és végül (h) az affinitás kromatografálást ATP-cellulózon végezzük, és ekkor az NPK aktív frakciók körülbelül 110 kD valószínű molekulatömeggel — SDS-PAGE meghatározás szerint — eluálódnak;
az eljárásban az NPK aktivitást úgy mérjük, hogy a vizsgálandó frakciót egy humán felnőtt tau proteinből származó peptiddel — a-mely a 255-267 aminosavcsoportokat tartalmazza — radioaktív jelzett ATP jelenlétében inkubáljuk, majd meghatározzuk az em• · ·
99 9 99
99 9 9 lített peptidbe beépült radioaktivitást.
A további részleteket, azaz hogy a találmány szerinti NPK-t — amely az egyik kiviteli alak szerint 110 kD (NPK110) molekulatömegű — hogyan izoláljuk, az 1. példában ismertetjük. A szakterületen járatosak a fent megadott technikai előírások alapján azonban tudni fogják, hogy az említett részleteket hogyan egészíthetik ki.
A találmány szerinti NPK bármely gerinces agyból származhat. Egy előnyös kiviteli alakban az NPK emlős agyból származik.
A találmány egy olyan RNS szekvenciára is vonatkozik, amely komplementer a találmány szerinti DNS szekvenciával.
Egy különösen előnyös kiviteli alakban az emlős agy humán vagy sertés agy.
A találmány vonatkozik még egy találmány szerinti DNS szekvencia által kódolt polipeptidre vagy ennek működőképes fragmentumára vagy származékára. Az említett polipeptid, fragmentum vagy származék poszttranszlációs módon vagy kémiailag módosítható. A találmányi leírás folyamán az NPK vagy a MARK (1 vagy 2) rövidítés magába foglalhatja az ilyen fragmentumokat vagy származékokat, ha ezt kifejezetten nem is jelezzük.
A találmány tárgyát képezik a tau proteinnel rokon MAP2, MAP2c és MAP4 mikrotubulussal társult proteinek (MAP-ek) NPK-110 által foszforilált következő szerin vagy treonin csoportjai:
MAP2/MAP2c: S37, S1536, S1676, S1707, S1792, S1796, S1799
MAP4: T829, T873, T874, T876, S899, S903, S928, S941, S1073 és azok az epitópok, amelyek az említett foszforilált szerin vagy treonin csoportokat tartalmazzák.
··*· ·««· ··
A találmány a találmány szerinti NPK-hoz specifikusan kötődő antitestre is vonatkozik.
Az említett antitest szérum eredetű antitest vagy monoklonális antitest lehet. Egy kívánt epitóp elleni monoklonális vagy poliklonális antitest termelése jól ismert ezen a szakterületen (lásd például: Harlow, Lane: Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, 1988) . Az említett antitest a fentieken kívül lehet természetes vagy géntechnológiai módszerekkel előállított antitest, ilyen egy kiméra antitest, amely a szakterület jól ismert technikáival állítható elő. A leírásban használt antitest kifejezés vonatkozik még olyan antitest fragmentumra is amely megtartotta a specifikus epitóphoz kötődő képességét, ilyen például az Fab, F(ab)2 vagy egy Fv fragmentum.
A találmány olyan antitestre is vonatkozik, amely specifikusan kötődik a MAP2, MAP2c és MAP4 alábbi foszforilált szerin vagy treonin csoportjait tartalmazó epitóphoz:
MAP2/MAP2c: S37, S1536, S167S, S1707, S1792, S1796, S1799
MAP4: T829, T873, T874, T876, S899, S903, S928, S941, S1073.
Ez az antitest is lehet poliklonális vagy monoklonális antitest vagy ezeknek olyan fragmentuma, amely megtartotta kötő specif icitását .
Egy előnyös kiviteli alakban a találmány szerinti antitest monoklonális antitest vagy ennek egy fragmentuma vagy származéka .
Egy további előnyös kiviteli alakban az említett antitest poliklonális antitest vagy ennek egy fragmentuma vagy származó* * ·*. * · t · · * • V · · • « * · β · '· ·
....... ” ·” ka.
A találmány tárgyát képezi továbbá egy olyan gyógyszerkészítmény, amely a találmány szerinti NPK specifikus inhibitorát tartalmazza adott esetben egy gyógyszerészetileg elfogadott vivőanyaggal és/vagy oldószerrel kombinálva.
A „találmány szerinti NPK specifikus inhibitora megfogalmazás olyan anyagokra vonatkozik, amelyek specifikusan gátolják a találmány szerinti protein kináz enzim hatását. Az enzimek — mint például a protein kinázok — inhibitorai és ezek hatásmechanizmusa jól ismertek ezen a szakterületen. Egy ilyen inhibitor például az enzim katalitikus doménjéhez kötődhet, és ezáltal az enzim képtelen lesz szubsztrátumát konvertálni.
Az említett gyógyszerkészítmény olyan betegnél alkalmazható, akinek erre szüksége van, olyan módon és adagban, amelyet megfelelőnek tart az az orvos, aki az esetet jól ismeri. A gyógyszerészetileg elfogadható vivőanyagok s/vagy oldószerek jól ismertek a szakterületen, és a beadás módjától vagy a beteg speciális betegségi státusától függően formulázhatók.
Egy előnyös kiviteli alakban a találmány tárgyát az Alzheimer kór kezelésére szolgáló gyógyszerkészítmény képezi.
Ez a gyógyszerkészítmény is olyan módon és adagban adható be egy betegnek, akineknek erre szüksége van, amelyet az esetet kezelő orvos megfelelőnek ítél.
Egy további előnyös kiviteli alakban a találmány szerinti gyógyszerkészítményt rák kezelésére használjuk.
Mint ahogy fent rámutattunk, a találmány szerinti NPK deregulációs hatása a mikrotubulusokkal társult proteineket kifejező »··· ·;>· *··« • ·· ·· · · ~ · különböző sejt típusokat olyan pályára vezetheti, amely végül az említett sejtek daganatos transzformációját eredményezheti. Tehát egy NPK inhibitor hatékony mennyisége a transzformációs folyamatot megállítja és/vagy visszafordítja. A beadandó inhibitor mennyiségét az illető eseteket kezelő orvos határozza meg.
A találmány szerinti gyógyszerkészítmény egy további kiviteli alakjában az említett inhibitor a találmány szerinti antitest vagy egy foszfatáz, előnyösen a PP-2A foszfatáz vagy az említett NPK-t aktiváló kináz egy inhibitora vagy egy olyan tau eredetű peptid, amely a Ser262 csoportot tartalmazza, vagy egy olyan MAP2, MAP2c vagy MAP4 eredetű peptid, amely a MAP2, MAP2c vagy MAP4 alábbi szerin vagy treonin csoportjai közül legalább egyet tartalmaz:
MAP2/MAP2C: S37, S1536, S1676, S1707, S1792, S1796, S1799
MAP4: T829, T873, T874, T876, S899, S903, S928, S941, S1073.
A „tau eredetű peptid, amely a Ser262 csoportot tartalmazza és „egy MAP2, MAP2c vagy MAP4 eredetű peptid, amely a MAP2, MAP2c vagy MAP4 alábbi szerin vagy teonin csoportjai közül legalább egyet tartalmaz:
MAP2/MAP2c: S37, S1536, S1676, S1707, S1792, S1796, S1799
MAP4: T829, T873, T874, T876, S899, S903, S928, S941, S1073 (itt használt) meghatározások egy olyan peptidre vonatkoznak, amely háromdimenziós szerkezetében helyreállítja a tau protein vagy a MAP2, MAP2c vagy MAP4 proteinek természetes konformációját a szerin 262 csoportot (tau) tartalmazó epitopot illetően vagy a fent említett további (MAP) MAP2, MAP2c és MAP4 csoportokat. Ezek a peptidek a találmány szerinti NPK természetes ···· ···· • · szubsztrátumát (azaz a tau protein vagy a tau proteinnel rokon MAP-eket) fogják mímelni, de nem fognak kifejteni NPK-val kapcsolatba hozható biológiai hatást. Az említett peptidek — amelyek vagy csak epitópokból állnak, vagy további határoló aminosavakat tartalmaznak — szintézise jól ismert a szakemberek számára .
A találmány az alábbiakat tartalmazó diagnosztikai készletre is vonatkozik:
(a) találmány szerinti NPK;
(b) találmány szerinti antitest, vagy fragmentuma;
(c) egy peptid, amely a tau, MAP2, MAP2c vagy MAP4 fent említett foszforilálható szerinjeit vagy treoninjait tartalmazza .
A fent említett diagnosztikai készlet felhasználható az Alzheimer kór vagy a rák vagy ezek kezdeti stádiumának a kimutatására. A találmány szerinti antitest felhasználható a találmány szerinti NPK rendellenes, különösen magas koncentrációinak vagy szintjeinek a kimutatására, továbbá az említett NPK magasabb aktiváltsági fokának a kimutatására, amely az említett betegségekre utal. A készlettel forgalmazott NPK belső kontroll gyanánt használható. Másrészt, a fent meghatározott peptidek szubsztrátumként használhatók a találmány szerinti NPK rendellenes aktivitásának a kimutatására. A diagnosztikai készletben lévő NPK aktivitása szintén belső kontrollként szolgálhat.
A fent felsorolt és a MAP4-ben, MAP2-ben vagy MAP2c-ben lévő foszforaiéit szerin csoportokhoz specifikusan kötődő antitestet ezen mikrotubulushoz társult proteinek rendellenes foszforilált15 ságának — ami rákra utaló jel — a kimutatására használhatjuk.
A diagnosztikai készlet további alkalmazási területei a következők: az egyik kiviteli alakban az említett diagnosztikai készítmény a fent ismertetett egyik epitóp elleni találmány szerinti antitestet tartalmazhatja. Például Alzheimer kórral vagy rákkal összefüggő betegség mutatható ki egy mintából úgy, hogy a mintát az említett epitópok közül egyet vagy többet felismerő antitesttel kezeljük. Az antitest-epitóp (haptén) komplexet egy olyan második antitest — ez egy találmány szerinti antitest elleni antitest — használatával tehetjük láthatóvá, amelyet a szakterület ismert módszerei szerint jeleztünk (lásd például:
Harlow és Lane, ibid.).
A találmány még egy további kiviteli alakjában az említett diagnosztikai készítmény egy fent ismertetett epitópból és egy találmány szerinti antitestből állhat. Egy mintának az említett antitesttel való kezelése a megfelelő beteg betegségi státusára vonatkozó következtetések levonásához vezethet, amennyiben az említett antitestnek az említett mintához való kötődését az említett antitestnek a referencia mintaként fent említett epitóphoz való kötődéséhez viszonyítjuk.
Egy másik kiviteli alakban a diagnosztikai készítmény egy fent említett epitópot, a találmány szerinti NPK-t és egy találmány szerinti antitestet tartalmazhat. A kináz aktivitást úgy monitorozhatjuk, hogy a minta foszforilációját a találmány szerinti epitóp főszforilációjához hasonlítjuk. A meghatározott NPK aktivitásból a mintában lévő tau protein vagy a MAP2, 2c vagy 4 foszforiláltsági fokára és ebből a beteg betegségi állapotára • · ·· ···· ·· következtethetünk. A kináz aktivitást levezethetjük például úgy, hogy ugyanebben a reakcióban olyan szubsztrát-analógot viszünk be, amely enzimes konverzió révén vizuálisan észlelhető. Ilyen szubsztrát-analógokat széles körben használnak ezen a szakterületen. Más esetben úgy járunk el, hogy a mintában lévő foszforilált tau protein vagy MAP2, 2c vagy 4 mennyiségét a találmány szerinti kinázzal való kezelés után mutatjuk ki olyan módon, hogy egy olyan találmány szerinti antitestet használunk, amelyet a foszforilált epitóp ellen termeltünk, belső standardként pedig a diagnosztikai készítményben rendelkezésre álló antitest-epitóp komplex mennyiségét használjuk, vagy pedig meghatározzuk a tau proteinbe vagy a MAP2, 2c vagy 4-be az NPK révén beépült foszfát mennyiségét például radioaktív jelzett módszerekkel, amelyek jól ismertek ezen a szakterületen.
Figyelembe kell venni azonban, hogy azok a szakemberek, akik ezen a területen 'gyakorlattal rendelkeznek, és a diagnosztikai elvekkel tisztában vannak, könnyen különbözőképpen kombinálhatják a fent említett vegyületeket, vagy kiegészíthetik a készítményt második vagy harmadik, jelzett vagy jelzetlen antitestekkel vagy enzimekkel és szubsztrátumokkal. Ezek a kiviteli módszerek szintén a találmány oltalmi körébe tartoznak.
Egy további kiviteli alakban a találmány az Alzheimer kór in vitro diagnózisára és/vagy monitorozására szolgáló módszerre vonatkozik, mely szerint betegből vett cerebrospinális folyadék mintát vizsgálunk, vagy idegszövetből (például szaglóhámból) biopsziás mintát veszünk, és az említett szövetet a találmány szerinti NPK-ra teszteljük.
• ·· ·· ···· • · · · · · • · · · · · • · ·· · · ·· · ·· · · ·
Vonatkozik továbbá a találmány az Alzheimer kór in vitro diagnózisára és/vagy monitorozására szolgáló módszerre, amikoris egy betegből vett cereberospinális folyadékot vizsgálunk, vagy egy idegszövetből biopsziás mintát veszünk, és az említett szövetet a találmány szerinti NPK fiziológiástól eltérő mennyiségeinek jelenlétére vagy az említett NPK fiziológiástól eltérő aktivitására teszteljük.
Az említett biopsziára alkalmas idegszövet például a szaglóhám.
A találmány szerinti eljárás például a találmány szerinti diagnosztikai készítménnyel, elsősorban az említett NPK elleni antitest használatával kivitelezhető. Egy előnyös találmány szerinti kiviteli alakban tehát a találmány szerinti NPK-t az említett NPK-hoz specifikusan kötődő találmány szerinti antitesttel mutatjuk ki.
A találmány ezenkívül a rák vagy egy kezdődő rák in vitro diagnózisára szolgáló módszerre is vonatkozik. A módszer abból áll, hogy egy megfelelő szövetet vagy testfolyadékot a tau proteinnel rokon mikrotubulussal társult proteinek (MAP-ek) — MAP2,
MAP2c és MAP4 — alábbi pozícióiban foszforilált szerin vagy treonin csoportjaira vizsgálunk:
MAP2/MAP2c: S37, S1536, S1676, S1707, S1792, S1796, S1799
MAP4: T829, T873, T874, T876, S899, S903, S928, S941, S1073, vagy pedig a találmány szerinti NPK fiziológiástól eltérő menynyiségeinek a jelenlétére vagy egy NPK specifikus foszfatázra vizsgálunk. Tudjuk, hogy ilyenkor a szerin vagy treonin csoportok foszforiláltsági fokának a fiziológiástól eltérőnek kell ···· ···· lennie. Egy ilyen foszforiláltsági státus meghatározásának módszereit részletesen ismerteti a PCT/EP 92 02 829 számú európai szabadalmi leírás, amelyet referenciának tekintünk.
Az említett foszforilált szerin vagy treonin csoportok vizsgálatát például egy olyan antitest használatával végezhetjük el, amely az említett foszforilált csoportokat vagy az említett csoportokat tartalmazó epitópokat specifikusan mutatja ki.
A mintában lévő NPK mennyiségét az erre specifikus antitest használatával mérhetjük, vagy pedig úgy, hogy az aktivitását mérjük egy megfelelő szubsztrátum, például egy olyan peptid használatával, amely a fent hivatkozott szerint vagy treonint foszforilálatlan állapotban tartalmazza, vagy használhatjuk a MAP2, MAP2c és MAP4 közül valamelyiket szintén foszforilálatlan állapotban. A proteinek foszforiláltsági állapotának mérésére szolgáló módszerek részletes leírását a PCT/EP 92 02 829 számú európai szabadalmi leírás tartalmazza. A fosztatázok — például a PP-2A, PPI vagy kalcineurin — aktivitását úgy teszteljük, hogy összehozzuk a szubsztrátummal, például a találmány szerinti diagnosztikai készítményben lévő találmány szerinti NPK-val.
Ezen találmány szerinti in vitro módszer kivitelezéséhez használható megfelelő szövet vagy testfolyadék a cerebrospinális folyadék, a vér és a szövetből (például máj vagy bőr) vett biopsziás minták.
Ugyancsak a találmány tárgyát képezi egy módszer, amelyben a normál MAP2, MAP2c vagy MAP4 proteineket a találmány szerinti
NPK-val való in vitro kezelés segítségével az alábbi pozíciókban foszforilált proteinekké alakítjuk:
···· · · · ·
MAP2/MAP2c: S37, S1536, S1676, S1707, S1792, S1796, S1799
MAP4: T829, T873, T874, T876, S899, S903, S928, S941, S1073, ugyanis az említett foszforiláltsági állapot a rákra vagy a kezdődő rákra utal. Az említett MAP-ek foszforilációját elősegítő körülményeket meghatározhatjuk, amennyiben az ezen bejelentésben megadott általános előírásokat követjük. A foszforilált MAP-ek ezután specifikus antitestekkel mutathatók ki. Ezen in vitro módszer eredményei további bepillantást engednek a rák kialakulásába .
Tesztelhetjük ezenkívül azokat az inhibitorokat, amelyek megakadályozzák, hogy a normál MAP protein a fent említett pozíciókban foszforilált MAP proteinné alakuljon át. Ezek az „inhibitorok vagy a foszforilálandó epitópra specifikusak, például úgy, hogy blokkolják az epitópot, vagy a találmány szerinti protein kináz — NPK — különböző doménjei ellen irányulhatnak, amennyiben akadályozzák vagy zavarják ennek biológiai aktivitását. A gátlás egy második típusa a foszfatázok által az említett MAP-ekre vagy az említett NPK-ra kifejtett antagonista hatás, vagy pedig az említett NPK-aktiváló kináz gátlása.
A találmány szerinti módszerrel előállított MAP-et mikrotubulus struktúrák in vitro és in vivő kötési vizsgálataiban is alkalmazhatjuk, és ezzel hozzájárulunk a rák keletkezése molekuláris bázisának a tisztázásához.
A találmány vonatkozik még a találmány szerinti MAP foszforilált szerin vagy treonin csoportjának (csoportjainak) vagy az említett csoportok (csoportokat) tartalmazó epitópnak a felhasználására olyan specifikus antitestek előállításához, amelyek a • · ··· · ···· ···· • · · • · · ♦ · ··· • ·· ··-·· * »♦ ·· ·· · ·· ··· rákot vagy a kezdődő rákot kimutatják.
Az említett antitestek előállítására szolgáló módszerek jól ismertek ezen a szakterületen, tehát a poliklonális vagy monoklonális antitestek előállítását standard módszerek használatával végezhetjük (lásd például: Harlow és Lane, ugyanitt). Amennyiben oligo- vagy polipeptidet használunk antitestek előállításához, helyesen úgy járunk el, ha az epitopot tartalmazó peptidet egy olyan alkalmas molekulához kapcsoljuk, amely képes megindítani vagy erősíteni az említett epitópra adott immunválaszt, ilyen például a marha szérumalbumin vagy a csiga-hemocianin (keyhole limpet hemocyanin) . A haptén (az epitopot tartalmazza vagy azzal azonos) és a vivőanyag összekapcsolásának módszerei szintén jól ismertek ezen a szakterületen (Harlow és Lane, ugyanitt). Az is magától értetődik, hogy minden olyan állat használható, amely alkalmas a kívánt antitest termelésére.
Az alábbiakban az ábrák leírása következik.
1. ábra: A K18 tau szerkezet [ htau40 izoforma, amely a központi idegszövetben a legnagyobb forma; M.Goedert et al., Neuron, 3, 519-526 (1989)] keretes diagrammja. A szerkezet a négy ismétlődő szakaszt (repeat-et) tartalmazza, ezenkívül számos, agyi kináz aktivitás által foszforilált helyet tartalmaz [M.Gustke et al., FEBS Lett., 307, 199-205 (1992)] . Az N-terminális vég közelében lévő vonalkázott boxok olyan inszertumokat jelölnek, amelyek a megkülönböztető splicing következtében hiányozhatnak, az 1-től 4-ig jelölt boxok a négy repeat-et képviselik, amelyek közül a második hiányozhat. A repeat-eken kívül a »· · · · · • · * · • · · » ·· ···· • · · · • · ··· legtöbb foszforilált hely Ser-Pro (SP) vagy Thr-Pro (TP) motívumú, de az agyi kináz aktivitás a repeat-eken belül is foszforilál két helyet, mégpedig a Ser262 és Ser356 helyet.
2. ábra: NPK110 izolálása sertés agyból. (A) A szövetkivonatot foszfocellulózra (PC) vittük fel, és 0,15 - 1 M nátrium-kloriddal lépésenként eluáltuk. A vonalkázott hasábok a kioldott anyag össz-protein koncentrációját, az üres hasábok pedig az aktivitást ábrázolják. Ez utóbbit úgy mértük, hogy szubsztrátum gyanánt a K18 tau szerkezetet használtuk. (B) A 0,3 - 0,5 M nátrium-kloriddal eluált anyagot ammónium-szulfáttal csaptuk ki, és a dializált csapadékot Q-Sepharose oszlopra vittük fel. A betöltött körök a protein koncentrációt mutatják, az üres körök pedig az aktivitási profilt. A grádiens összetételét a jobboldali tengelyen jeleztük. (C) A Q-Sepharose-ról kapott 8-15 frakciókat dializáltuk, és egy SP-Sepharose oszlopra vittük. (D) Az SP-Sepharose-ról kapott 12 - 16. számú frakciókat dializáltuk, és egy Mono Q HR 5/5 oszlopra vittük. (E) A mono Q oszlopról kapott 9-11. számú frakciókat Superdex 200 gélszűrő oszlopra vittük. A molekulatömeg markerek elúciós helyét a jobboldali tengelyen jeleztük.
3. ábra: Az NPK110 végső tisztítása ATP-Sepharose-on affinitás-kromatográfiával (SDS-PAGE, 1-3. nyomsáv) és vizsgálata ingei foszforilációval (autoradiográfia, 4-6. nyomsáv). A gélszűrő oszlopról származó legaktívabb frakciókat (1. nyomsáv) ATP affinitás oszlopra vittük. A kináz specifikus kioldását 5 mM ATP-vel • · ·· ·«·· ·· • · ·· ♦ *
végeztük (2., 3. nyomsáv). Az ezüsttel festett gél egy körülbelül 110 kD valószínű molekulatömegű elmosódott sávot és egy második, 95 kD molekulatömegű éles sávot mutatott. A 4-6. nyomsávok az 1-3. nyomsávokban lévő minták in-gel foszforilációjának autoradiogrammjait mutatják. A tau proteint (5 μΜ) , mint szubsztrátumot, a gél mátrixba polimerizáltuk. Renaturálás és g-32P-ATP-vel való inkubálás után világosan látszott, hogy csak a 110 kD sáv fejt ki kináz aktivitást a tau proteinnel szemben.
4. ábra: A vad típusú (wild type = wt) tau és a K18 szerkezet (mikrotubulus kötő dómén) foszforilálása NPKllO-zel. A htau40-et (hT40) (10 μΜ 1,2 nyomsávok) és a K18-at (20 μΜ, 3, 4 nyomsávok) 5 μΕ/ml NPKllO-zel és 2 mM g-32P-ATP-vel foszforiláltuk 37 °C-on 2 órán át. Alikvot részeket elektroforetizáltunk 7-20 %-os SDS grádiens gélben: 1,2 nyomsáv: htau40 foszforilálás előtt és után; 3,4 nyomsáv: K18 foszforilálás előtt és után. Figyelemre méltó a foszforilációra létrejött változás a 2-es és 4-es nyomsávokban. A jobboldalon ugyanezen gél autoradiogrammja látható, a 2. és 4. nyomsávban a foszforilált htau40 és K18 látható.
5. ábra: NPKllO-zel foszforilált vad típusú (wt) tau (htau40) és K18 szerkezet tripszines foszfopeptid térképe. 30 μg tau proteint 0,5 μΕ NPKllO-zel foszforiláltunk 2 órán át 37 °C-on. (A) Teljes hosszúságú 4-repeat-tau (htau40) , (Β) K18 szerkezet mikrotubulus kötő szakasz (MT kötő szakasz, a teljes hosszúságú tau 244-372 csoportjai), (C) a legfeltűnőbb foltok diagrammja: az 1.
folt Ser262-t tartalmaz, a 2. folt fent jobbra Ser356-ot, a 3.
• · ·· « ··» · ·· »·♦ ♦ folt (1. folt alatt) Ser305-öt, a 4. folt (egymást fedő kettős folt egy része) Ser324-et, az 5. folt Ser293-at tartalmaz (ezt a tripszines CGSK peptidet nem kaptuk meg a HPLC oszlopról, feltehetően kis mérete miatt, de a folt helyre irányuló mutagenezissel azonosítható). (D) Az (A) és (B) ábrán látható foszfopeptidekből származó, azonos beütési számú (10.000 cpm) mennyiségek keveréke (mix). A (C) ábrán bemutatott foszforilációs helyek azonosítását a HPLC-vel tisztított és szekvenált peptidek (felsorolásukat lásd az 1. táblázatban) kétdimenziós analízisével végeztük. Mindegyik tisztított pepiidből 10.000 cpm mennyiséget analizáltunk önmagában és az (A) ábrán látható foszfopeptidek 5.000 cpm-nyi részletével kombinálva, annak érdekében, hogy lehetővé tegyük az egyértelmű azonosítást.
6. ábra: k ser262 foszforilációja megszünteti a mikrotubulusokhoz való kötődést.
(A) A tau kötődését a taxol-stabilizált mikrotubulusokhoz (30 μΜ) egy olyan koszedimentációs vizsgálatban mértük, amelyet alább, a 2. példában ismertetünk. Teljes hosszúságú vad típusú tau („wt, htau40) proteint és egy Ser262—>Ala mutánst (A262) (10 μΜ) előzőleg NPKllO-zel (végső koncentráció: 8,5 μΕ/ml) foszforiláltunk 2 órán át 37 °C-on. A görbéket nem-lineáris regreszszióval kaptuk [ J.Biernat et al., Neuron, 11, 153-163 (1993)] . A vad típusú tau kötődését teljesen törölte a foszforiláció (betöltött körök), míg az A262 mutáns még kötődött, bár alacsonyabb affinitással (háromszögek). Összehasonlításul a foszforilálatlan tau kötődését is bemutatjuk (üres körök).
»** « (B) A mikrotubulushoz kötött tau NPKllO-zel való foszforilálás folyamán leválik. A htau40-et (10 μΜ) taxol-stabi-lizált mikrotubulusokkal (30 μΜ) inkubáltuk. Az NPKllO-et t=O időpontban adtuk hozzá 10 μΕ/ml végső koncentrációban, és a reakcióelegyből időközönként, egytől húsz órán át, részleteket vettünk ki, és lecentrifugáltuk. A tau proteint az üledékben és a felülúszókban mértük az SDS gélek denzitometriás mérésével (betöltött körök). A beépült foszfátot a gél-darabok Cerenkov számlálásával mértük (üres körök), és ezt a jobboldali tengelyen jeleztük. A foszfát beépülése a tau proteinbe mikrotubulusok nélkül láthatóan gyorsabban megy végbe (négyzetek).
7. ábra: A mikrotubulusok sötét látóterű videó mikroszkópos vizsgálata és a tau proteinben lévő Ser262 csoport foszforilálásának hatása. Mikrotubulusokat állítottunk elő polimerizálással (nukleálás) (5 μΜ tubulin) tengeri sün sperma axonémákon 2,5 μΜ tau (htau40 izoforma) és 10 μΕ/ml NPK110 jelenlétében, a) 20 perc alatt ATP nélkül, b) ATP-vel. Az a) esetben a mikrotubulusok folyamatosan növekedtek, a b) esetben a Ser262 foszforilálódhat, és ez a mikrotubulusok destabilizációjához és rövidüléséhez vezetett. Lépték: 10 μΜ.
8. ábra: A nem foszforilált és NPKllO-zel foszforilált tau hatása az axonémákon nukleált mikrotubulusok hosszára sötét látóterű mikroszkópos mérés szerint. Az egyes körülmények mellett
500-600 mikrotubulust mértünk végig; az átlagos hosszúságot ábrázoltuk az idő függvényében. A tubulin koncentráció 5 μΜ volt, megjegyzendő, hogy tau hozzáadása nélkül mikrotubulusok nem voltak megfigyelhetők ennél a koncentrációnál. A tau koncentrációja minden esetben 2,5 μΜ volt. A kontroll kísérletekben az ATP-t kihagytuk („—ATP ) .
(A) Az NPKllO-zel előfoszforilált tau nem segítette elő a mikrotubulus növekedést (betöltött körök), de az előfoszforilált A262 pont-mutáns igen (háromszögek, a 6B. ábrának megfelelő időre bontott kötési vizsgálattal).
(B) Tubulint és tau proteint 4 °C-on 10 μΕ/ml (végső koncentráció) NPKllO-zel kevertünk el 2 mM mg-ATP jelenlétében (betöltött körök), majd t=O időben a hőmérsékletet 37 °C-ra emeltük. A vad típusú tau proteinnel és ATP nélkül a mikrotubulusok folyamatosan növekedtek (üres körök); ugyanezt az eredményt kaptuk a Ser262—>Ala mutánssal is (háromszögek) . ATP-nek a vad típusú tauhoz való hozzáadása azonban kezdeti növekedéshez, majd ezt követően zsugorodáshoz vezetett.
(C-E) Mikrotubulus (MT) hosszúsági hisztogrammok a B ábra megfelelő görbéinek 5. percénél és 30. percénél. Mindegyik minta kifejezett csúcsot mutat 20 μΜ körül 5 perc után (üres körök). Amikor hiányzott a Mg-ATP (C) vagy a Ser262 Ala262-vé mutált (E) , az eloszlás szélesebb lett, és a nagyobb hosszúság felé tolódott el a 30. percnél. Ezzel szemben, a tau foszforilációja sikeresen csökkentette a mikrotubulusok átlagos hosszúságát az inkubáció 30 perce folyamán (D).
9. ábra: Agy kivonattal (A), NPKllO-zel (B), PKC-vel (C), illetve PKA-val (D) foszforilált vad típusú tau (htau40) és K18
szerkezet tripszines foszfopeptid térképei. A foltok számozása azonos az 5. ábráéval (1. folt : Ser262; 2. folt : Ser356; 3.
folt : Ser305; 4. folt : Ser324; 5. folt : Ser293) . A jobboldali panelek a teljes hosszúságú tau megfelelő kétdimenziós foszfo-aminosav analízisét mutatják az egyes kinázok esetén.
10. ábra: A diagramm a különböző foszforilációs helyek befolyását ábrázolja a tau — mikrotubulus kölcsönhatásokra. A Ser/Thr-Pro motívumok többsége a repeat domént határoló szakaszokban található, ezeknek csak csekély a befolyása a tau kötődésére. A repeat dómén számos foszforilálható, nem Ser-Pro helyet tartalmaz, ilyen főként a négy KXGS motívum. Ezek közül a Ser262-nek — az első KIGS motívumban — messze a legnagyobb a befolyása a mikrotubuluson való kötődésre.
11. ábra: Az NPKllO-zel foszforilált rekombináns MAP2c foszfopeptid térképe. A peptidek a következő foszforilált csoportokat tartalmazzák: 1 = Serl707, 2 = Serl676, 3 = Ser37 és Serl536, 4 = Serl792, Serl796 és Serl799. [A csoportok számozása megegyezik az Abala és munkatársai szerinti számozással; J.S.
Abala et al., Gene, 136, 377-378 (1993)] .
12. ábra: Az NPKllO-zel foszforilált MAP4 fúziós protein foszfopeptid térképe. A peptidek a következő foszforilált csoportokat tartalmazzák: 1 = Thr829, 2 = Ser941, 3 = Ser928, 4 = = Thr873, Thr874 és Thr876, 5 = Ser899 és Ser903, 6 = Serl073, = Ser928. [A csoportok számozása megegyezik a West és munka27 társai szerinti számozással; R.R.West et al., J.Bioi.Chem., 266,
21886-21896 (1991)] .
13. ábra: A foszforilálatlan és NPKllO-zel foszforilált MAP4,
MAP2 és MAP2c hatása az axonéma nukleált mikrotubulusok hosszára. A mérést sötét látóterű mikroszkóppal végeztük. Mindegyik esetben 500-600 mikrotubulust mértünk végig; az átlag hosszúságot az idő függvényében ábrázoltuk. A tubulin koncentráció 5 μΜ, a MAP-ek koncentrációja 1 μΜ volt. Megjegyzendő, hogy MAP-ek hozzáadása nélkül mikrotubulusokat nem figyeltünk meg ennél a koncentrációnál .
(A) Tubulint és MAP4-et kevertünk össze 4 °C-on 10 μΕ/ml NPKllO-zel (végső koncentráció) 2 mM mg-ATP jelenlétében (betöltött körök) vagy enélkül (üres körök). A t=O időpontban a hőmérsékletet 37 °C-ra emeltük. MAP4-gyel és ATP nélkül a mikrotubulusok folyamatosan növekedtek (üres körök). A MAP4 plusz ATP azonban kezdeti növekedéshez, de ezután zsugorodáshoz vezetett (betöltött körök), mivel a MAP4 foszforilálódott, levált a mikrotubulusokról, és a mikrotubulusok destabilizálódtak.
(B) (A)-val azonos kísérlet — de MAP2 használatával — hasonló eredményekkel.
(C) (A)-val azonos kísérlet — de MAP2c használatával — hasonló eredményekkel.
24. ábra: Felnőtt és fetális humán szövetek Northern biot vizsgálata MARK cDNS szondával.
Baloldali kép: felnőtt szövet.
• · · · · ·
Nyomsáv:
1: hasnyálmirigy (pancreas = Pa)
2: vese (kidney = Ki)
3: izom (muscle = Mu)
4: máj (liver = Li)
5: tüdő (lung = Lu)
6: placenta (Pl)
7: agy (brain = Br)
8: szív (heart = H) .
i kép: fetális szövet.
Jobboldal
Nyomsáv:
9: | vese | (kidney | = Ki) |
10 : | máj | (liver = | Li) |
11 : | tüdő | (lung = | Lu) |
12: | agy | (brain = | Br) . |
15. ábra: Rekombináns vad típusú MAP2c és MAP2c pont-mutánsok kötődése taxol-stabilizált mikrotubulusokhoz (30 μΜ tubulin dimerek) pllOMARK kinázzal történő foszforiláció befolyása alatt. Üres körök: vad típusú MAP2c, nem foszforilált. A kötődés szoros (Kd = körülbelül 0,25 μΜ) , körülbelül 17 μΜ ligandummal vagy 2 tubulin dimerenként körülbelül 1 MAP2c-vel telítődik. Betöltött körök: vad típusú MAP2c, előzőleg pllOMARK kinázzal (2,5 mE/ml; 1 egység percenként 30 °C-on 1 μΜ foszfát MAP2c-re való átvitelének felel meg) foszforilálva 2 órán át. Megjegyzendő, hogy itt lényegében nincs kötődés. Betöltött és üres négyzetek: MAP2cA319 és MAP2cA350 előzőleg pllOMARK (2,5 mE/ml) segítségével 2 órán át foszforilálva. Ezekben a mutánsokban a 319. vagy a 350. szerint — az első vagy második repeatben lévő KXGS motívumokban — • · · *
pont-mutációval alánokká változtattuk. A mikrotubulusokhoz való affinitás jelentősen csökkent (Kd ~ 7 μΜ) , bár sztöchiometriai arányuk a vad típusú MAP2c-hez hasonló maradt. Háromszögek: MAP2cA319/A350, előzőleg pllOMARK segítségével (2,5 mE/ml) 2 órán át foszforilálva. Ebben a mutánsban mindkét szerint — 319.
és 350. — alaninná mutáltuk. A kötődés a nem foszforilált proteinéhez hasonlított, ami azt mutatta, hogy a foszforilációra való érzékenység megszűnt, mivel a két KXGS motívum már többé nem volt foszforilálható.
16. ábra: A nem foszforilált és a pllOMARK-kal foszforilált MAP4 (A) , MAP2 (B), MAP2c (C) és MAP2c pont-mutánsok (D) hatása a maguktól felépülő (self-nucleated) mikrotubulusok hosszára, sötét látóteres mikroszkóppal mérve. Minden esetben 500-600 mikrotubulust analizáltunk, és átlag hosszúságukat az idővel szemben ábrázoltuk. A tubulin koncentráció minden esetben 10 μΜ volt, a MAP4 és MAP2 koncentrációja 1 μΜ és a MAP2c koncentrációja 2 μΜ volt. A kontroli-kísérletben kihagytuk az ATP-t („—ATP ) .
A,B,C-ben az üres körök: A MAP-eket 30 percig 2,5 mE/ml (végső koncentráció) pllOMARK-kal preinkubáltuk, ATP nélkül. 10 μΜ tubulin hozzáadására a mikrotubulusok felépülése megindult, és a mikrotubulusok átlag hosszúsága körülbelül 20 μΜ-re nőtt 30 percen belül. Ezzel szemben, amikor ATP volt jelen, nem történt ön--felépülés (self-nucleation), ami arra utal, hogy a MAP-ek foszforilációja megakadályozta a mikrotubulus képződést. Csak körülbelül 2 μΜ hosszúságú, rövid mikrotubulusokat tudtunk megfi30 gyelni, amikor axonémákat (10 - 100 fM) adtunk a reakcióhoz (axonémákkal oltottuk be a reakciót) (seeded nucleaton) a felépülés serkentése végett (üres háromszögek A, B, C-ben).
D: A foszforilációs hely hatása a MAP2c pont-mutánsokra. Mindegyik proteint úgy foszforiláltuk, ahogyan fent leírtuk (30 perces preinkubációval). Háromszögek: vad típusú MAP2c; betöltött körök: MAP2cA319 (al első repeat-ben a KXGS-t KXGA-ra változtattuk) ; négyszögek: MAP2cA350 (a második repeat-ben lévő KXGS-t KXGA-ra változtattuk); betöltött négyszögek: MAP2cA319/A350 (mindkét repeatben a KXGS-t KXGA-ra változtattuk) .
A találmányt az alábbi példákkal szemléltetjük, anélkül azonban, hogy korlátoznánk a találmány oltalmi körét.
A példákban leírt tau proteineket illetően megjegyezzük, hogy csak E.coli-ban kifejezett rekombináns humán tau proteineket használtunk. A cDNS kiónokat M.Goedert [M.Goedert et al., Neuron, 3_, 519-526 (1989)] szerint állítottuk elő és a pET expreszsziós vektor variánsait [W.F.Studier et al., Meth.Enzymol., 185, 60-89 (1990)] használtuk ezek kifejezésére. A proteinek tisztításánál figyelembe vettük a tau hőstabilitását és Mono S FPLC-t alkalmaztunk [ T.Hagestedt et al., J.Cell Bioi., 109, 1643-1651 (1989)] . A K18 szerkezet a 4-repeat-tau izoformából származik, és a mikrotubulus kötő szakaszt — 244 - 372. csoportok — tartalmazza [ J.Biernat et al., Neuron, 11, 153-163 (1993)] . Az „A262 mutáns a leghosszabb humán izoformán alapult: Egyetlen csoportot változtattunk alanin csoportra, mégpedig a Ser262-t. A változtatáshoz hagyományos technológiát alkalmaztunk. A foszfo···· ···· • · · · ·· · · · cellulózon tisztított tubulint (PC-tubulin) sertés agyból állítottuk elő Mandelkow és munkatársai szerint [ E.-Mandelkow et al. , J.Mól.Bioi., 185, 311-327 (1985)] . A protein kináz A (PKA) katalitikus alegységet [ marha szívből izolálva, aktivitása 27 ηΕ/μΙ kemptiddel meghatározva (kemptid: foszfát akceptor heptapeptid); 100 ρΕ/μΙ kazeinnel meghatározva] a Promega cégtől, a protein kináz C-t (PKC) (patkány agyból izolálva, aktivitása 80 ρΕ/μΙ, hiszton Hl-gyel meghatározva) a Boehringer-Mannheim cégtől szereztük be.
1. példa:
Az NPK110 protein kináz tisztítása és vizsgálata.
Minden műveletet 4 °C-on végeztünk. A helyi vágóhídról sertés agyakat (körülbelül 1 kg-ot) szereztünk be, és 1 liter A pufferben (5 mM EGTA, 100 mM NaF, 1 mM PMSF, 1 mM benzamidin, 1 mM
Na3VO4,l mM DTT, 0,1% Brij-35 tartalmú 50 mM trisz; pH 8,5) homogenizáltuk. [EGTA = etilénglikol-bisz(β-amino-etil-éter)-N,N,Ν' ,Ν' -tetraecetsav; PMSF = fenil-metil-szulfonil-fluorid;
NaF = nátrium-f luorid; Na3VO4 = nátrium-vanadát; DTT = ditiotreitol; Brij-35 : polioxietilén-éter] . A homogenizátumot jégen szállítottuk a laboratóriumba, ahol 1 órán át 30.000 g mellett centrifugáltuk. A felülúszót centrifugálással (50.000 g; 30 perc) derítettük, a pH-t 6,8-ra állítottuk be, és gyenge vákuum alkalmazásával Büchner tölcsérre vittük, amely B pufferrel (50 mM MES, pH 6,8, 2 mM EGTA, 50 mM NaF, 1 mM PMSF, 1 mM benzamidin, 1 mM Na3VO4, 1 mM DTT, 0,1% Brij-35) kiegyensúlyozott 150 ml
Whatman Pll-et tartalmazott. A foszfocellulózt 500 ml B puffer• · · • ·· rel mostuk, és lépésenként 150-150 ml 0,15 Μ - 1 M nátrium-kloridot tartalmazó B pufferrel eluáltuk (2A ábra). A frakciók aktivitását egy olyan tau szerkezet (K18) foszforilációja alapján szűrtük — lényegében Drewes és munkatársai leírása szerint [ G. Drewes et al., EMBO J., 11, 2131-2138 (1992)] — amely a négy mikrotubulus kötő repeat-ből állt. Az aktív frakciókat ammónium-szulfátos kicsapással frakcionáltuk. A 30 - 50 %-os telítés között kapott csapadékot jégen A pufferrel szemben dializáltuk egy éjszakán át. A dializátumot (körülbelül 50 ml) ultracentrifugálással derítettük, majd anioncserélő oszlopra (Q Sepharose HR, 80x16 mm; Pharmacia) vittük fel egy Superloop (Pharmacia) segítségével. Az oszlopot 100 ml A pufferrel mostuk, majd 0 - 0,5 M nátrium-kloriddal lépésenként! grádiens eluciót alkalmaztunk (2B ábra; átfolyási sebesség: 5 ml/perc) frakció-mennyiség: 7 ml) . Az aktív frakciókat (körülbelül 40 ml) B pufferrel szemben dializáltuk, majd kationcserélő oszlopra (SP-Sepharose HR, 60x16 mm; Pharmacia) vittük (2C. ábra; átfolyási sebesség: 4 ml/perc, frakció-mennyiség: 7 ml), majd 0 - 0,5 M nátrium-kloriddal való eluálás után az aktív frakciókat (körülbelül 40 ml) egyesítettük, a puffért egy Sephadex G-25 oszlopon (300x26 mm) A pufferrel cseréltük le, majd Mono Q HR 5/5 oszlopra (Pharmacia) vittük. Az elúciót meredek nátrium-klorid gradiensben végeztük (2D ábra; átfolyási sebesség: 0,5 ml/perc, frakció-mennyiség: 1 ml).
Az aktív frakciókat (2-3 ml) kétszeresére koncentráltuk Amicon féle Centricon 30 mikrokoncentrátorral, majd gélszűrő oszlopra (Superdex 200, 300x16 mm; Pharmacia) vittük, amelyet A pufferrel (pH 7,8, 150 mM nátrium-kloridot és 10% glicerint tartalmaz) hoztunk egyensúlyba, és ezzel eluáltuk (átfolyási sebesség: 0,2 ml/perc, frakció-mennyiség: 2 ml) . Az oszlopot előzőleg egy marker protein kit-tel (Pharmacia) kalibráltuk. Az aktív frakciókat egyesítettük, és a puffért Sephadex G-25 oszlopon (100x16 mm) C pufferre (40 mM β-glicero-foszfát, 10 mM magnézium-klorid, mM EGTA, 1 mM benzamidin, 0,2 mM DTT, 0,1% Brij-35) cseréltük le. A G-25 oszlopról kapott protein csúcsot (10-15 ml) 0,1 ml/perc sebességgel ATP-Sepharose oszlopra (15x5 mm; Upstate Biotechnology Inc., Laké Piacid, USA) vittük. Az oszlopot 5 ml C pufferrel mostuk, és 2 ml 5 mM Mg-ATP tartalmú C pufferrel eluáltuk. Az eluátumot koncentráltuk, és egy Mono Q PC 1,6/5 oszlopon („Smart rendszer; Pharmacia) eltávolítottuk az ATP-t és a puffer anyagokat, majd 250 mM nátrium-klorid, 1 mM EGTA, 0,2 mM
DTT, 1 mM benzamidin és 0,03% Brij-35 tartalmú 25 mM trisz.HC1 pufferrel (pH 7,4) eluáltuk. Az aktív frakciókat 50% (térf/térf) glicerinnel kevertük, és -20 °C-on tároltuk. Aktivitását ilyen körülmények között legalább egy hónapig megőrzi.
Ezzel a hat kromatográfiás lépéssel a sertés agyszövet-kivonat Ser262-foszforiláló aktivitásának mintegy 10.000-szeres tisztítását értük el. Mint a 2. ábra mutatja, foszfocellulózt (PC) (A) , Q- és SP-Sepharose-on és Mono Q-n ioncserés kromatográfiát (B,C,D), gélszűrést (E) és végül immobilizált ATP használatával affinitás kromatográfiát alkalmaztunk. A szövetkivonatban a kináz aktivitása körülbelül 0,2 mE/mg volt, az affinitással tisztított kináz aktivitása mintegy 2 E/mg volt (1 egység percenként 1 μΜ foszfátot visz át) . Az enzim molekulatömegére gélszűréssel körülbelül 90 - 100 kD-t kaptunk, de az aktivitási csúcs széles volt, és gyakran kifejezett farok képződést mutatott (2E ábra). SDS gélben a valószínű molekulatömegre mintegy 110 kD-t kaptunk (3. ábra). Az enzim renaturálható a gélben;
amikor a tau proteint a gél-mátrixba polimerizáltuk szubsztrátum gyanánt, és a gélt γ- P-ATP-vel inkubáltuk, autoradiográfiával a 110 kD sáv élessé vált (3. ábra, 4-6. nyomsáv), míg az ezüsttel festett gélben észlelt kisebb szennyezéseknek nem volt kimutatható aktivitása. NPKllO-zel való foszforilálás után mind a teljes hosszúságú tau protein, mind a K18 szerkezet csekély, de kifejezett mobilitás változást mutatott SDS-PAGE vizsgálatban (4. ábra, 1-4. nyomsáv). A beépült foszfát végső mennyisége mintegy 1,8 - 2,5 M/M tau volt, némiképp az enzim koncentrációjától és aktivitásától függően; a foszforilációnak ez a szintje körülbelül 2 óra után érhető el. A foszforilációs reakciókat a következőképpen végeztük:
A foszforilációs reakciókat 2 mM ATP, 5 mM magnézium-klorid, mM DTT, 0,1 mM PMSF, 0,03% Brij-35 tartalmú 40 mM HEPES pufferben (pH 7,2) végeztük. Amikor a kivonatokat vagy a kináz készítmények nyers frakcióit szűrtük, 50 mM nátrium-fluoridot vagy 1 μΜ okadasavat (okadaic acid, LC Services, Woburn, MA., USA) adtunk a reakcióelegyhez. A reakciókat 95 °C-ra való felhevítéssel állítottuk le. A foszforilációt vagy SDS gélekben vizsgáltuk [B.
Steiner et al., EMBO J., % 3539-3544 (1990)] , vagy foszfocellulóz papírkorongokon (Gibco) [ J.E.Casnelli et al., Meth.Enzymol. ,
200, 115-120 (1991)] . Az in-gel foszforilációs assay-ket Geahlen és munkatársai szerint végeztük [R.L.Geahlen et al. , Anal.
Biochem., 153, 151-158 (1986)].
»*·· ···· ·· ·· ···· .· ,* ϊ ϊ * · ··· ►······
It ·· ·· ··· ···
Az ΝΡΚ110 tau proteinnel szembeni specificitását a foszforilált protein tripszines emésztésével és ezt követően kétdimenziós vékonyréteg elektroforézissel és kromatográfiával vizsgáltuk (5. ábra). Amennyiben valamelyik peptid képe a rekombináns teljes hosszúságú 4-repeat-tau proteinnél (5A. ábra) és a K18 4-repeatfragmentumnál (5B ábra) kapott foszforilációs képhez hasonlít, akkor valószínű, hogy a foszforilált peptidek többsége a repeat doménből származik. Ezt a két minta keverékének az analízisével igazoltuk (5D. ábra). Egy második megközelítésben a tripszines emésztési elegyet HPLC-vel bontottuk fel (nem mutatjuk be). Ezeket a megoldásokat — részletesebben — a következőképpen kiviteleztük:
A foszforilációs reakciók után úgy távolítjuk el a kinázokat, hogy a mintákat 0,5 M NaCl/10 mM DTT elegyében forraljuk, majd centrifugáljuk. A tau protein a felülúszóban marad, és ezt 15% TCA-val csapjuk ki. A cisztein csoportokat perhangyasavas kezeléssel módosítjuk [C.H.W. Hirs, Methods.Enzymol. , 11, 325-329 (1967)] . A proteint egy éjszakán át tripszinnel (Promega, szekvenálási minőség) emésztjük 0,1 mM kalcium-klorid jelenlétében úgy, hogy kétszer adagoljuk az enzimet 1:10 - 1:20 (tömeg/tömeg) arányban. A kétdimenziós foszfopeptid térképezést vékonyréteg-cellulóz lemezeken (Macherey-Nagel, Düren, Németország) , Boyle és munkatársai szerint végezzük [W.J.Boyle et al., Methods.Enzymol., 201, 110-149 (1991)] . Röviden: az első dimenzióban pH 1,9 mellett, hangyasav (88%)/ecetsav/víz (50/156/1794) elegyében végezzük az elektroforézist, a második dimenzióban n-butanol/piridin/ecetsav/víz (150/100/30/120) elegyében kroma36 tografálunk. A foszforilációs helyek szekvenálással való térképezéséhez rekombináns humán tau proteint (200 μρ, htau40 klón) foszforilálunk NPKllO-zel és 32P-ATP-vel (100 Ci/M) 2 órán át. A foszforilációt rövid hőkezeléssel állítjuk le. A proteint 6 M karbamiddal és 2 mM DTT-vel Ínkubáljuk, és a ciszteineket vinil-piridinnel [G.E.Tarr et al., Proc .Natl. Acad.Sci ., 80, 6552-6556 (1983)] vagy perhangyasavas kezeléssel blokkoljuk. 10 mM ammónium-hidrogén-karbonáttal szemben való dialízis után a proteint liofilizáljuk, és tripszinnel (1:20) emésztjük 0,1 mM kalcium-klorid jelenlétében. A peptidek elválasztását két egymást követő HPLC menettel végezzük, μ!3ΡΟ C2/C18SC 2,1/10 oszlopon („Smart rendszer; Pharmacia). Az emésztési elegyet ecetsavval· (5%, térf/térf) megsavanyítjuk, és HPLC-vel frakciónáljuk acetonitril — 10 mM ammónium-acetátban — grádiens használatával (átfolyási sebesség: 0,1 ml/perc, 0 - 25% 120 perc alatt, 25 - 50% 20 perc alatt) . A peptideket UV abszorpcióval, 214, 254 és 280 nm mellett detektáljuk, és a beépült foszfátot szcintillációs számlálóban (Hewlett-Packard TriCarb 1900 CA) — mint Cerenkov sugárzást — mérjük. Az átfolyt frakciókat és a gradiensből kapott radioaktív csúcsokat tovább tisztítjuk, amikoris acetonitril grádienst — TFA-ban — használunk (átfolyási sebesség: 0,1 ml/perc, 0% acetonitril/0, 075% TFA — 66% acetonitril/0,05% TFA 60 perc alatt) . A peptidek szekvencia analízisét egy 477A pulzált folyadékfázisú szekvenátor és egy 120A online PTH aminosav analizátor (Applied Biosystems) használatával végezzük. A foszfoszerineket a dehidroalanin ditiotreitol adduktumaként, gázfázisú szekvenálással azonosítjuk [H.E.Meyer et al., Meth.
···· ···· ·· ·· ···· φ· »· · · · ··· • ·· · · · · ·· ·· ·· ······
Enzymol., 201, 169-185 (1991)] (TFA = trifluor-ecetsav).
A fenti eljárás számos jelzett peptidet eredményezett, amelyeket direkt foszfopeptid szekvenálással és foszfoaminosav analízissel analizáltunk. Foszfoaminosav analízis: az emésztett minták részleteit részlegesen hidrolizáltuk 6 M sósavban (110°C, 60 perc), és kétdimenziós elektroforézissel — pH 1,9 és pH 3,5 mellett — analizáltuk (W.J.Boyle et al., Methods.Enzymol., 201,
110-149 (1991)] . A foszfopeptid szekvenálás eredményeit az 1.
táblázatban foglaltuk össze.
1. táblázat
NPKllO-zel foszforilált htau40 eredetű, HPLC-vel kapott tripszines foszfopeptidek. A szekvenciák a fő radioaktív csúcsoknak felelnek meg. A következőket soroltuk fel: a második menet után kapott beütési számokat, az anyag mennyiségét, a foszforilált, csillaggal jelölt csoportot tartalmazó szekvenciát (azonosítva
S-etil-ciszteinként), a foszforilációs helyet (számozás a htau40 szerint). Megjegyezzük, hogy a második repeat-ből származó CGSK tripszines foszfopeptidet a HPLC nem mutatta ki (valószínűleg annak kis mérete és hidrofób volta miatt) , és ezért foszfopeptid térképezéssel és helyre irányuló mutagenezissel kellett azonosítani .
Peptidben mért cpm | Kapott pM | Kapott szekvencia | Foszforilált helyek |
400.000 | 1.000 | IGS+TENLK | Ser-262 |
150.000 | 350 | IGS+LDNIPHVPG | |
GGNHK | Ser-356 | ||
150.000 | 300 | CGS+LGNIHHK | Ser-324 |
60.000 | 200 | HVPGGGS+VQIVYK | Ser-305 |
A radioaktivitás nagy részét a foszforilált Ser262-t tartalmazó pepiidben találtuk. A Ser356 (a negyedik repeat KIGS motívumában) és a Ser324 (a harmadik repeat KCGS motívumában) szintén radioaktív jelzett volt. Ezen tisztított peptidek kétdimenziós alalízise a foltok azonosítását tette lehetővé, lásd az 5C.
ábrát. Világosan látszik, hogy a Ser262 (1. folt) az NPK110 fő célhelye a tau proteinen, ezután következik a Ser356 (2. folt). Az azonosítás szerint a 3. folt a Ser305-öt tartalmazó peptidet jélenti, a 4. folt a Ser324-nek felel meg (a harmadik repeat KCGS motívumában) és az 5. folt a Ser293-nak felel meg (a második repeat KCGS motívumában). A megfelelő tripszines peptidet
91 ( CGSK) nem lehetett közvetlen reverz fázisú HPLC kromatográfiával izolálni, valószínűleg rövidsége és hidrofil volta miatt.
Ezért helyre irányuló mutagenezissel azonosítottuk a K18 pont-mutánsai segítségével, amelyekben a szerineket mind a négy KXGS motívumban (Ser262, 293, 324, 356) alaninokká konvertáltuk.
NPKllO-zel való foszforilálás után csak a 3. folt (Ser305) volt látható, míg az 1., 2., 4. és 5. folt eltűnt. így azonosítottuk az 5. foltnak megfelelő Ser293-at (az adatokat nem mutattuk be).
2. példa:
Tau - mikrotubulus kötődés és dinamikai instabilitás.
Előzőleg kimutattuk, hogy a Ser262 foszforilációja erősen csökkenti a tau és a mikrotubulusok közötti kölcsönhatást; azaz nemcsak a disszociációs konstans nő, hanem a sztöchiometriai arány is csökken. Ezeket a megfigyeléseket az támasztotta alá, hogy a tau protein NPKllO-zel való foszforilációja után hasonló eredményt kaptunk. A 6A. ábrán bemutatjuk, hogy a kötődésben tapasztalt csökkenés valóban még kifejezettebb: az NPK teljesen megszünteti a mikrotubulushoz való kötődést az elérhető koncentráció tartományon belül. Minthogy a kötődés annyira gyenge lett, ezután már nem is lehetett meghatározni a disszociációs konstans értékeket és a sztöchiometriai arányokat. Más szavakkal, az
NPK110 hatására a tau elveszíti mikrotubulusokhoz való kötődési képességét. A kötési kísérleteket a következőképpen végeztük:
A kötési vizsgálatokban a taxol-stabilizált mikrotubulusok (30 μΜ) és a tau koszedimentációját mértük 30 μΙ-es minták ultracentrifugálásával (Beckman TL 100). Az üledék és a felülúszó részleteit SDS-PAGE módszerrel, Coomassie blue festéssel analizáltuk. A protein mennyiségeit a szárított gélek pásztázó denzitometriás vizsgálatával mértük [ a részletekre vonatkozóan lásd: N.Gustke et al., FEBS Letters, 307, 199-205 (1992)] .
Az eredmény igazolására pontmutációt (Ser262->Ala) vittünk be a tau proteinbe abból a célból, hogy ez a hely többé ne legyen foszforilálható. Ebben az esetben a mutáns NPKllO-zel való inkubálása a mikrotubulus kötő kapacitást nagyrészt érintetlenül hagyta, bár bizonyos csökkenés mutatkozott az affinitásban és a • · · sztöchiometriai arányokban (~25%; 6A. ábra). Ez az eddigi vizsgálatok két pontját támasztotta alá: (i) a Ser262 foszforilációja a fő momentum a tau mikrotubulusokkal szembeni affinitásának szabályozásában; (ii) a kináz által foszforilált többi helynek csekély, de mérhető hatása van a kötődésre (azaz főként az egyenértékű szerineké a 2., 3. és 4. repeat KXGS motívumaiban).
A következő kérdés az volt, hogy a mikrotubulusok megvédik-e a tau proteint az NPK110 által történő foszforilálástól. Ha ez lenne a helyzet, akkor a tau — ha már kötődött a mikrotubulusokhoz — megtarthatná a mikrotubulusok iránti erős affinitását. Ennek a kérdésnek a megválaszolására a taxol-stabilizált mikrotubulusokat először tau proteinnel telítettük és ezután NPKllO-zel inkubáltuk. Mint a 6B. ábra szemlélteti, a foszforiláció előrehaladtával a tau fokozatosan ledisszociált a mikrotubulusokról.
A mikrotubulusok tehát késleltetik a tau kináz általi foszforilá-cióját, de nem tudják megakadályozni.
A tau egyik fontos funkciója az, hogy stabilizálja a mikrotubulusokat, és szuppresszálja dinamikai instabilitásukat [ D.N.Drechsel· et al., Mól.Bioi.Cell, 3, 1141-1154 (1992)] . Tehát, ha a tau elveszti mikrotubulus kötő képességét, azt várnánk, hogy a stabil mikrotubulusok dinamikusakká (mozgékonyakká) válnak. Ezt a hatást flagelláris axonémákra telepített (oltott) egyedi mikrotubulusok sötét látóterű videó mikroszkópos vizsgálatával szemléltethetjük (7. ábra). A vizsgálatot a következőképpen végeztük:
Az axonémákon felépülő (nukleált) mikrotubulusok videó mikroszkópos vizsgálatát lényegében Trinczek és munkatársai leírása » ; ι szerint végeztük [B.Trinczek et al., Molec .Biol.Cell, _4, 323-335 (1993)] . Röviden: 5 μΜ PC-tubulint, 2,5 μΜ tau proteint (foszforilálatlan vagy foszforilált) kis mennyiségű tengeri sün sperma axonémát (10 - 100 fM) kevertünk össze 3 mM magnézium-klorid, mM EGTA, 1 mM GTP és 1 mM DTT tartalmú 50 mM Na-PIPES pufferben (pH 6,9). A mintákból 0,1 μΙ-t tettünk tárgylemezre, 18x18 mm-es fedőlemezzel· lefedtük, zártuk, és hőmérséklet-szabályozott áramló levegőben 37 °C-ra melegítettük 5 másodpercen belül. Az áramló levegővel 37 °C-os állandó hőmérsékletet tartottunk fenn. Az axonémákon felépülő mikrotubulusokról a hőmérséklet emelése után 2,5, 5, 10, 15, 20, 25 és 30 perc múlva készítettünk felvételt. Minden esetben és időpontban egy mintából 3-5 axonémát és
10-20 kísérletet analizáltunk, és 500-600 mikrotubulust mértünk végig teljes hosszában. Csak azokat a mikrotubulusokat vettük figyelembe, amelyek biztosan a fókusz-síkban helyezkedtek el. Az oldat mélysége 3-4 pm, a fókusz mélység 1-2 pm volt.
A 8A. ábrán bemutatott kísérletben a tubulin koncentrációt (15 μΜ) úgy választottuk meg, hogy a mikrotubulusok maguktól ne szerelődjenek össze, hanem a tau (foszforilálatlan) hozzáadására növekedjenek. Az NPKllO-zel foszforilált tau nem támogatta a növekedést, míg a Ser262-»Ala mutáns segítette. Más szavakkal, a Ser262 helyen foszforilált tau úgy viselkedett, mintha nem lenne tau, minthogy nem reagált a mikrotubulusokkal, ellentétben a mutánssal, amely reagált. A kináz hatására még drámaibb a mikrotubulusok átalakulása a nem dinamikus viselkedésből a dinamikusba. A 8B. ábrán bemutatott kísérletben a mikrotubulusok számára lehetővé tettük, hogy tau jelenlétében az axonémákon túl nőve··«· ··«· kedjenek, és átlagos hosszúságukról, amely 50 μπι-re növekedett, 20 percen át készítettünk felvételt. Egy párhuzamos kísérletben az NPKllO-et ATP-vel együtt adtuk (vagy kontroll gyanánt, ATP nélkül) a reakcióelegyhez. A kontroll kísérletben (ATP nélkül) a mikrotubulusok folyamatosan tudtak növekedni, és csekély dinamikai instabilitást mutattak (8B. ábra, üres körök) . A hozzáadott
ATP-vel az átlag hosszúság csak 20 μι-η-re nőtt, majd újból abbamaradt a tau fokozatos foszforilációja következtében, és ami ezzel együtt jár, a mikrotubulus dinamikában bekövetkezett növekedés következtében (betöltött körök) . Amikor a Ser262—>Ala mutánst használtuk, a mikrotubulusok normál módon növekedtek, még kináz és ATP jelenlétében is (háromszögek). Ezeket az eredményeket a 8 C-D. ábrákon látható hosszúság hisztogrammokban foglaltuk össze. A mikrotubulusok felépülésük megindulásának korai időszakában rövidek, és hosszúságuk eléggé homogén (az üres körök csúcsai 5 perc-nél), a megszakított növekedés késői időszakában a mikrotubulusok hosszúra nőnek, és hosszúságuk erős megoszlást mutat (betöltött körök a 8C. és 8E. ábrán). Azonban, ha lehetővé teszszük, hogy a kináz foszforilálja a Ser262-t (azaz, ha kináz, ATP és Ser262-t tartalmazó vad típusú tau van jelen), a mikrotubulusok rövidek maradnak (üres körök a 8D. ábrán).
3. példa:
A tau repeat dóménjét foszforiláló egyéb kinázok.
A tau proteint számos olyan kináz foszforilálhatja in vitro, amelyeket több kritérium alapján osztályozhatunk, funkciójuktól, cél-vegyületeiktől vagy egyéb szempontoktól függően. Néhány pro1· « · ·*·· »· • k> · · • · · • · lin-irányított kináz — amelyek diagnosztikailag fontosak az Alzheimer kór szempontjából (az általuk indukált antitest reakciók miatt) — a repeat-eket határoló szakaszokat foszforilálják, de úgy tűnik, csekély hatást gyakorolnak a tau - mikrotubulus kötődésre. Megfordítva, azt várnánk, hogy a repeat szakaszt foszforiláló kinázok befolyásolják a mikrotubulushoz való kötődést, hiszen tudjuk, hogy a tau résztvesz ebben a funkcióban, és ezt ténylegesen alátámasztották az NPKllO-zel kapott, eddigiekben leírt eredmények. Ennélfogva felmerül a kérdés, mennyiben vethető össze ez a kináz más olyan kinázokkal, amelyek a tau proteint a repeat doménben foszfornálják. Eddig több ilyen kinázról jelentek meg közlemények (2. táblázat) .
2. táblázat
A foszforilációs helyek és a tau repeat-jeire és szomszédos szakaszaira ható kinázok összefoglalása (csak a nem-prolin-irányított kinázokat és helyeket soroltuk fel) . A fő helyeket X betűvel, a jelentékteleneket (x) jellel jelöltük. Megjegyzendő, hogy az eredmények különböző módszerek alkalmazása révén jöttek létre: (1) a tau proteint foszforilálták, ezt követte a proteolítikus emésztés, a peptidek elválasztása és a foszfopeptidek szekvenálása [B.Steiner et al., EMBO J., _9, 3539-3544 (1990);
B.Steiner et al., Ph.D.Thesis, Hamburgi Egyetem (1993); N.Gustke et al., FEBS Letters, 307, 199-205 (1992); C.Scott et al.,
J.Bioi.Chem., 2 68, 1166-1173 (1993)] ; (2) a foszfopeptidek tömegspektrometriás vizsgálata szekvenálással kombinálva [M.Hasegawa et al
J.Bioi.Chem., 267, 17047-17054 (1992);
J··· • ·· ··· ···· c·»-'· I • · · • ·- · · · ·· ··
A.Watanabe et al., J.Biol.Chem., 268, 25712-25717 (1993)]; (3) szintetikus peptid foszforilálása [I.Correas et al., J.Biol. Chem., 2 67, 15721-15728 (1992)] ; (4) foszfopeptidek kétdimenziós térképezése szekvenálással kombinálva (lásd ebben a leírásban).
Minthogy ezek az adatok a K18 repeat doménból származnak, nem tartalmaznak információt a repeat-eken kívüli lehetséges foszforilációs helyekről.
···· ···· • · · ·
Kináz aktivitás vagy referencia | 2. táblázat | S324 KCGS | S356 S377 KIGS | S409 | S416 | ||
S214 | S262 KIGS | S291 S305 KCGS | |||||
PKA Scott et al., 1993 | (x) | (X) | (X) | X | X | ||
PKA Steiner, 1993 | X | (x) | (X) | (X) | X | X | |
PKA jelen leírás | NV | (x) | (X) (X) | X | X | NV | NV |
PKC Correas et al., | |||||||
1992 | X | ||||||
PKC Steiner, 1993 | X | (X) | (X) | (X) | X | ||
PKC jelen leírás | NV | (X) (X) | (X) | NV | |||
CaMK Steiner et al., | |||||||
1990 | X | ||||||
agy extr. Gustke | |||||||
et al., 1992 | X | X | |||||
agy extr. jelen leírás | X | X | |||||
PK 35/41 Biernat | |||||||
et al., 1993 | X | (X) | (X) | X | |||
NPK110 jelen leírás | X | (X) (x) | (X) | X | |||
agy in vivő: | |||||||
Alzheimer: Hasegawa | |||||||
et al., 1992 | X | ||||||
Felnőtt: Watanabe | ... a | repeat szakaszban nincsenek | |||||
et al., 1993 | foszforilációs helyek. | ||||||
fetális: Watanabe | . . .a | repeat szakaszban nincsenek | |||||
et al., 1993 | foszforilációs helyek. |
NV = nem vizsgáltuk ···· ···· • · • · · • · • · · · · ······· · ·· ·· ·· ······
Például: a PKA elsősorban a repeat-eken kívüli Ser214-et, Ser409-et és Ser416-ot foszforilálja, de a repeat-eken belüli jelentéktelen helyeket is, beleértve a Ser324-et és Ser356-ot [ Scott et al., 1993; Steiner, 1993] . Minthogy a helyek közül hiányzik a Ser262, nem várható, hogy lényeges hatása legyen a mikrotubulus kötődésre, egyezően a mi megfigyelésinkkel. A PKC helyek között van a 3. repeat-ben lévő KCGS motívum (Correas et al., 1992; Steiner, 1993), amelynek szintén nincs jelentősebb hatása a mikrotubulus kötődésre. Az előzőekben leírt, részlegesen tisztított kináz aktivitás (Biernat et al., 1993) mind a négy KXGS motívumot foszforilálta, és végül, az agy extraktumból kapott kináz aktivitások mind a Ser/Thr-Pro motívumot, mind a
Ser262-t és Ser356-ot foszforilálták (Gustke et al. , 1992) a közölt erős hatást gyakorolva a mikrotubulus kötődésre a Ser262nek köszönhetően. Az alkalmazott stratégia ezekben a vizsgálatokban az volt, hogy a foszforilált tau-ból proteolítikus fragmentumokat állítsanak elő, amelyeket azután HPLC-vel választottak el, és szekvenálással azonosítottak. Ezzel az eljárással rendszerint rengeteg peptid képződik, amelyeknek a kinyerése nem mindig lineáris, és emiatt nehéz megítélni a foszforiláció relatív mennyiségét a különböző helyeken.
Ezek miatt a bizonytalanságok miatt határoztuk el, hogy különböző megoldásokkal újból megvizsgáljuk a foszforilációs helyeket. A foszfopeptideket nemcsak HPLC-vel és szekvenálással analizáltuk, hanem vékonyréteg-cellulóz lemezeken kétdimenziós térképezéssel is, ami a relatív részesedésekről tisztább képet ad. A teljes hosszúságú 4-repeat-tau proteint és a repeat domént ···· ···· • · · • · · · · ·· ·· ·· ······ (Κ18) agykivonattal, NPKllO-zel, PKC-vel és PKA-val foszforiláltuk. Ez lehetővé tette a tau repeat doménjében a foszforilációs helyek összehasonlítását, és megmutatta az egyes kinázok által a htau40-ben történt foszforiláció mértékét. Az eredményeket a 9. ábra mutatja be, amelyben a K18-ból származó foszfopeptideket az
5. ábra szerint jeleztük. Az egyéb kinázok révén keletkező foltokat úgy azonosítottuk, hogy a mintákat az NPKllO-zel foszforilált K18 minta mellett futtattuk (az adatokat nem közöltük).
A 9A. ábrán látható képet úgy kaptuk, hogy a teljes hosszúságú tau proteint és a K18-at agykivonattal foszforiláltuk. A teljes hosszúságú tau esetén csak az 1. folt (Ser262) látható tisztán, a 2. folt (Ser356) alig látható. Ez mégjobban kitűnik a K18 foszforilációs mintázatban.
Amikor a K18 NPKllO-zel végzett foszforilációját vizsgáltuk, az agykivonattal kapott mintázathoz hasonló peptid mintázat képződött (összehasonlítandó a 9A. és 9B. ábra); a legfeltűnőbb volt az 1. folt és a 2. folt, ezek a Ser262-nek és Ser356-nak feleltek meg, míg a Ser305 (3. folt), Ser324 (4. folt) és Ser293 (5. folt) jelentéktelen komponenseket képviseltek. Ezzel igazoltuk, hogy az NPK110 tölti be a fő Ser262 kináz szerepét. Ezzel szemben a korábbi kináz aktivitás újbóli vizsgálata (Biernat et al., 1993) eddig inhomogén eredményeket adott. Bár ugyanazokat a szerineket foszforilálta, mint az NPK110, a súlypontja különbözött, és az agykivonatban a kináz aktivitása legalább tízszer alacsonyabb volt. Ezzel magyarázható, hogy a tau proteinnek ezzel a kináz aktivitással való mégolyán hosszú inkubációi is a tau mikrotubulusokhoz való kötődését csak részlegesen szuppresz• ·· · ···· ···· szálják, mint korábban leírtuk.
Mint a 9C. ábrából látható, a PKC a K18-ban csak a Ser305-öt (3. folt), Ser324-et (4. folt) és Ser293-at (5. folt) foszforilálja jelentős mértékben. Az elkenődés és a legszélső folt nem tau eredetű foszfopeptidek, ugyanis ezek a kontroll kísérletekben is előfordultak, amelyekhez nem adtunk tau szerkezetet (nem mutattuk be) . A további két foltot nem tudtuk azonosítani, a felső jobb oldali foltnak (csillaggal jelzett) sem a Ser262-vel (1. folt), sem a Ser356-tal (2. folt) nem volt együttes helyzete. Ennek a képnek a teljes tau proteinnel kapott képpel való öszehasonlításából kiderült, hogy a PKC fő foszforilációs helyei a repeat doménen kívül esnek. Csak a Ser350 (3. folt) volt gyengén látható ebben a mintázatban [ megjegyzendő, hogy felül, a jobb oldalon lévő folt nem a K18-ból kapott jobb felső foltnak (csillaggal jelzett) felel meg, ahogy ezt a kontroll vizsgálatok megerősítették (nem mutattuk be)] .
Amikor tisztított PKA-t használtunk a teljes hosszúságú tau és a K18 szerkezet foszforilálására (9D. ábra), a következő fő foltokat találtuk: Ser356 (2. folt), Ser305 (3. folt), Ser324 (4. folt) és Ser293 (5. folt), a Ser262 (1. folt) csak jelentéktelen foszforilációs helynek mutatkozott. A teljes hosszúságú tau foszforilációja (9D. ábra, bal oldali kép) hasonló foltokat eredményezett, valamint további helyeket a tau repeat szakaszán kívül. Ezek az eredmények általánosságban megegyeznek a korábbi adatokkal [C.Scott et al., J.Bioi.Chem., 268, 1166-1173 (1993);
B.Steiner et al., (1993)] . Ezek közül a helyek közül néhány az előzőleg leírt Biernat et al. , (1993)] „35/41 kDal kináz akti49 ···« ···· ·· ·· ···· • · · · · · · • ·· · ···· ······· · • · ·· ·· ······ vitással is látható volt. További kísérletekben megállapítottuk, hogy a 41 kD komponens a PKA katalitikus alegysége [ egy PKA elleni antitestet használtunk, amelyet H.Hilz (Hamburg) bocsátott rendelkezésünkre; az adatokat nem mutatjuk be] ; ez részben megmagyarázza az átfedést az adatokban. A PKC főképpen a következő helyeket foszforilálja: Ser305, Ser293 és Ser324 [ez utóbbi megegyezik a Correas és munkatársai (1992) által közölt adattal] (9C. ábra) .
4. példa:
NPK110 kináz által foszforilált MAP2 és MAP4 helyek.
A MAP2 és a MAP4 két olyan mikrotubulussal társult protein, amelyek ugyanahoz a MAP családhoz tartoznak, mint a tau, mivel nagyfokú homológiát mutatnak abban a három vagy négy belső repeat szakaszban, ahol e proteinek a mikrotubulusokhoz kötődnek [áttekintés végett lásd: S.J.Chapin és J.C.Bulinski, Cell Mot. Cytoskel., 23, 236-243 (1992)] . A MAP2 elsősorban az agyban fordul elő, főképpen a neuronok szomatodendritikus kompartmentumában. Mint a tau, a MAP2 szintén különböző formákban fejeződhet ki az alternatív splicing következtében [S.Kindler et al., Nucl.
Acids Rés., 18, 2822 (1990)] : a második repeat hiányozhat (ez a „klasszikus MAP2); ezenkívül hiányozhat a 152-1514 csoportból álló szakasz (azaz az 1830 csoportból 1363 csoport hiányozhat, mely által egy 467 csoportból álló protein jön létre; ezt a formát szokásosan MAP2c-nek nevezik). Az itt leírt foszforilációs kísérleteket E.coli-ban kifejezett, rekombináns MAP2c-vel végeztük (3. táblázat).
3. táblázat
Második oszlopról kapott csúcsok | A peptid száma | cpm | Extinkció (214 nm) | Peptid szekvencia | Foszforilált csoport |
1 | I | 300.000 | 0,05 | 1705:CGS+LK (a 2. repeatben) | Serl707 |
2 | II | 200.000 | 0, 3 | 1674:IGS + TDNIK (az 1. repeatben) | Serl676 |
3 | III | 100.000 | 0, 8 | 33:DQGGSb GEGLSR 1535:SS+LPP | Ser37 Serl536 |
4 | IV | 100.000 | 0, 6 | 1791:LS+NVSSt SGS+IN | Serl792 Serl796 Serl799 |
Megjegyzés: a csillagok a foszforilált csoportot jelzik. A csoportok számozása az Albala és munkatársai által alkalmazott számozást követi [J.S.Albala et al. , Gene,
136, 377-378 (1993)] .
A MAP4 egy ubiquiter előforduló MAP, amely valószínűleg résztvesz a mitózisban, és ennek is számos splicing izoformája létezik [West et al. , (1991)] . A foszforilációs kísérleteket egy olyan rekombináns MAP4 szerkezettel végeztük, amely a 496 Cterminális csoportot (benne a repeat domént) tartalmazta, és a·· »·· · ·· ·· · · ······ melyet E.coliban fejeztünk ki (4. táblázat).
4. táblázat
Második oszlopról | A peptid száma | cpm | Extinkció (214 nm) | Peptid szekvencia | Foszforilált csoport |
kapott csúcsok | (12.ábra) | ||||
1 | I | 135.000 | 00 o | 825:SPATT+LP | Thr829 |
2 | II | 150.000 | 0,35 | 939:VGS+ TENIK (az 1. repeatben) | Ser941 |
3 | III | 120.000 | 0, 35 | 923:LATTVS+ APDLK | Ser928 |
4 | IV | 100.000 | 0,8 | 872 :NT+T+PT* GAAPP | Thr873 Thr874 Thr876 |
5 | V | 55.000 | 0,3 | 898:SS+GALS+ VDK | Ser899 Ser903 |
6 | VI | 100.000 | 0,8 | 1071:VGS+LD (a 4. repeatben) | Serl073 |
7 | VII | 33.000 | 0, 04 | 923:LATTVS+ APDLK | Ser928 |
Megjegyzés: a csillagok a foszforilált maradékok után állnak. A csoportok számozása a West és munkatársai által al52 • · · * β · · • ·« · *··· ······· · ·· ·· ·« ·»#··· kalmazott számozást [ J.Bioi.Chem., 266, 21886-21896 (1991)] követi.
A foszforilálási módszerek a 2. példában leírtakkal azonosak. A MAP2-t és MAP4-et NPKllO-zel· foszforiláltuk radioaktív
ATP-t használva, a foszforilált proteint tripszinnel emésztettük, és kétdimenziós foszfopeptid térképezéssel analizáltuk (11. ábra: MAP2c szerkezet; 12. ábra: Map4 szerkezet). A peptideket utána két HPLC gradiens oszlopon tisztítottuk. A tisztított radioaktív peptideket szekvenáltuk (a foszforilált csoportok azonosítására) , és kétdimenziós foszfopeptid térképezéssel azonosítottuk .
A foszforilálás hatása a mikrotubulusokkal való kölcsönhatásokra :
A MAP2 és MAP4 NPKllO-zel történő foszforilációjának a hatása azonos volt a tau proteinnél kapott hatással, azaz, a mikrotubulusokhoz való affinitásuk többszörösen lecsökkent, és a mikrotubulusok dinamikai instabilitása sokkal nagyobb lett. Ez például a mikrotubulusok átlag hosszának a csökkenésével igazolható a szóbanforgó MAP, NPK110 kináz és ATP (a foszforiláláshoz szükséges) jelenlétében. A 13. ábra a MAP4, MAP2 és MAP2c eseteihez szolgáltat példákat. A mikrotubulus felépülés 0 időben kezdődik. Az üres körök az átlag hosszúság növekedését mutatják ATP hiányában (nincs foszforiláció). A betöltött körök azt mutatják, hogy ATP jelenlétében (tehát foszforilált MAP-ekkel) az átlag hosszúság csak körülbelül a kontroll felét teszi ki.
Az új NPK110 biológiai jelentősége a következőképpen foglalható össze:
• vfc · ··»«···· 3 ·· ···«·'
Az NPK110 a tau, MAP2, MAP2c és MAP4 hatékony kináza. Mind a négy KXGS motívumot foszforilálja a tau proteinben, ahol az első és a negyedik (Ser262 és Ser356) a legjelentősebb. Ebből a szempontból a kináz az agykivonatból izolált kináz aktivitással kapott korábbi megfigyeléseket reprodukálja [ Gustke et al., (1992) és lásd a 9. ábrát] . A kináz legdrámaibb hatása úgy jelentkezik, hogy gyakorlatilag megszünteti a tau mikrotubulusokhoz való kötődését (6B. ábra), előidézi a tau protein leválását a mikrotubulusokról, és a stabil mikrotubulusokat dinamikailag instabillá változtatja, ahogyan ezt a videó mikroszkópos felvétel mutatja. Ezek a hatások legfőképpen a Ser262 foszforilációjától függenek, ami a Ser262—>Ala pont-mutánssal bizonyítható. Ezen sajátságok alapján az NPK110 enzim választható ki arra célra, hogy a neuronokbán a mikrotubulusok felépültségi állapotát szabályozza. Ezek a sajtáságok a „Tau Hypothesis of Alzheimer' s Disease megfogalmazásaival is egyeznek, amely feltételezi, hogy ha a tau nem képes a mikrotubulusokhoz kötődni és azokat stabilizálni, akkor ez a mikrotubulusok összeomlásához és az axonális transzport megszűnéséhez vezet. Ez vagy akkor következhet be, amikor a tau leválik a mikrotubulusokról, vagy akkor, amikor az újonnan szintetizálódott tau proteinnek a mikrotubulusokhoz való kötődése gátolt. Mindkét eset a foszforiláció eredménye. Eszerint a séma szerint egy olyan beavatkozás, amely lelassítaná az NPKllOet vagy kioltaná potenciális aktiváló kaszkádját, alkalmas lenne az Alzheimer kór kezelésére.
Megjegyezzük még, hogy a KXGS motívum nemcsak a tau repeateken belül állandó, hanem más MAP-eken belül is, mint például a • · • · · · · · neuron MAP2-n és az ubiquiter MAP4-ben belül is (az összefoglalást lásd Chapin és Bulinski [ Cell .Mot.Cystoskel., 23, 236-243 (1992)] közleményében). Ennélfogva lehetsége, hogy az NPKllO-nek sokkal általánosabb a szerepe, mivel hatást gyakorol a különböző MAP-ekre és talán más proteinekre is. Elképzelhető, hogy az NPK110 — egy szerepe szerint — résztvesz a rák keletkezésében is .
5. példa:
A találmány szerinti NPK további vizsgálata.
A cDNS kiónok leírása.
Egy agy-pllOMARK peptid szekvenciákból származó degenerált oligonukleotidokat tartalmazó patkány egy cDNS tár szűrése kilenc kiónt eredményezett, amelyeket szekvenáltunk. Ezek legalább két különböző kinázt kódolnak, legalább két különböző génből, 70 %-os kölcsönös homológiával. A peptid szekvenciák teljesen megegyeznek a nagyobb kiónnal — ennek neve MARKI (az NPKllO-nek felel meg) — amelynek 5' -prímé vége hiányzik (a kódolt protein molekulatömege körülbelül 90 kD) . A kisebb, MARK-2 cDNS egy 81 kD proteint kódol. Az említett cDNS tárak szűréséhez szolgáló oligonukleotidok tervezéséhez alkalmas peptideket az 5. táblázatban adjuk közre. Az azonosított kiónok aminosavszekvenciáit a 6.
táblázat tartalmazza.
Homológiák.
Az adatbázisokban végzett kutatás homológ szekvenciák után két rokon, de nem azonos szekvenciát eredményezett.
···· ··· · • ·
MMKEM (X70764), egy egér cDNS, amely ismeretlen funkciójú, valószínűleg protein kinázt kódol [J.D.Inglis et al., Mamm. Genoms, _4, 401-403 (1993)] , és 73 %-os homológiát mutat a MARK-1-hez és 69 %-os homológiát a MARK-2-höz.
HUMP78A (M80359), egy nyilvánosságra nem hozott humán cDNS szekvencia, amely 73 %-os homológiát mutat a MARK-l-hez és 69 %os homológiát a MARK-2-höz. Mindegyik kináz gyenge homológiát (körülbelül 25 %-os) mutat a Saccharomyces cerevisiae-ből származó KIN1 és KIN2 proteinekkel [D.E.Levin et al., Proc.Natl.
Acad.Sci., 84, 6035-6039 (1987); D.E.Levin, J.M.Bishop, Proc.
Natl.Acad.Sci., 87, 8272-8276 (1990)] .
Szöveti megoszlás.
Northern blotting alapján (14. ábra) megállapítottuk, hogy a
MARK-1 és a MARK-2 mRNS-ek mindenhol kifejeződnek fetális és felnőtt szövetekben. A legmagasabb fokú kifejeződést az izomban, agyban és a fetális (de nem felnőtt) vesében találtuk.
Aktiválás.
Az agyból előállított pllO/MARK legalább százszor aktívabb, mint az E.Coli-ban kifejezett MARK. Az aktiválás magának a MARKnak a Ser és/vagy Thr csoportjain bekövetkező foszforilációtól függ, minthogy foszfatáz 2A-val való defoszforiláció után teljesen elveszti aktivitását.
A pllO/MARK foszforilációja SDS géleken 110 kD valószínű molekulatömeget eredményezett, míg a cDNS szekvenálás alapján a várható molekulatömeg 90 kD-nak adódott. A valószínű molekulatö···· ···· • · ·· ····
megben előforduló ezen foszfopeptideknél. | eltolódás | gyakran | megfigyelhető a |
Cél-szubsztrátumok. | |||
A pllOMARK nemcsak a | tau proteint | foszforilálja, hanem a ro- | |
kon MAP-eket is, mint a | MAP2-t vagy | MAP2c-t | (a neuron MAP-ek |
túlnyomórészt a szomatodendritikus kompartmentumra korlátozódnak) és a MAP4-et (egy ubiquiter MAP) , ami arra utal, hogy az enzim kiterjedt funkcióval rendelkezik. A fontosabb foszforilációs helyek ezekben a MAP-ekben azonosak, ilyenek a repeat doménekben a KXGS motívumokban lévő szerinek. A foszforilációs hatás szintén összehasonlítható, nevezetesen a foszforiláció a MAP-ek mikrotubulus kötő kapacitását erősen csökkenti, miáltal a mikrotubulusok elvesztik stabilitásukat (lásd például a 15. és 16.
ábrát).
···· ···· • · ·· • · · • · ·
I · · · ·· • · · · ·
5. táblázat
Sertés agy MARK készítményből lysC emésztéssel kapott peptid szekvenciák.
Frakció szekvenciák:
2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 15 17 18 19 20
33-12* DRWMNVGHEEEELKPYAEPE P
47-16
71-09*
87-24*
120
121
130-13
A N E L K
AENLLLDADMNIK
XSSRQNIPRCRNNII il'nhpnivk
LDTFCGSPPYAAPELFQGK
LFVLNPIK
LFREVRIX
YRIPFYMSTDCEN
140-9
FRQIVSAVQYCHQK
140-20 RIEIMVTMGFL • · • · · · ···· • · · · ·· ······
6. táblázat
Patkány (Rattus norvegicus) cDNS tárból kapott MARK-1 és MARK-2 cDNS szekvenciáknak megfelelő aminosavszekvenciák.
MARK-1 (nagyobb, részleges cDNS klón). Ossz csoportszám: 779. MARK-2 (kisebb, teljes cDNS klón). Ossz csoportszám: 772.
Két egymáshoz igazított csoport azonosságát a következő jel mutatja: 1
MARK-1 - TENHTSVDGYTETHIPP........TKSSSRQNIPRCRNSITS -35
II I II I I III II
MARK-2 - MSS-ARTPLPTLNERDTEQPTLGHLDSKPSSKSNMLRGRNSATS -43
MARK-1 - ATDEQPHIGNYRLQKTIGKGNFAKVKLARHVLTGRSVAVKIIDKTQLNPT -85
I lllllllllll llllllllllllllll III lllllllllllll
MARK-2 - A-DEQPHIGNYRLLKTIGKGNFAKVKLARHILTGKEVAVKIIDKTQLNSS -92
MARK-1 - SLQKLFREVRIMKILNHPNIVKLFEVIETEKTLYLVMSYASGGEVFDYLV -135 lllllllllllll llllllllllllllllllllllllllllllllllll
MARK-2 - SLQKLFREVRIMKVLNHPNIVKLFEVIETEKTLYLVMEYASGGEVFDYLV -142
MARK-1 - . AHGRMKEKEARAKFRQIVSAVQYCHQKCIVHRDLKAENLLLDADMNIKIA -185 lllllllllllllllllllllllll I llllllllllllllllllllll
MARK-2 - AHGRMKEKEARAKFRQIVSAVQYCHHKFIVHRDLKAENLLLDADMNIKIA -192
MARK-1 - DFGFSNEFTVGNKLDTFCGSPPYAAPELFQGKKYDGPEVDVWSLGVILYT -23 5 lllllllll llllllllllllllllllllllílllllllllllllllll
MARK-2 - DFGFSNEFTFGNKLDTFCGSPPYAAPELFQGKKYDGPEVDVWSLGVILYT -242
MARK-1 - LVSGSLPFDGQNLKELRERSCLRGKYRVPFYMSTDCENLLKKLLVLNPIK -285
MARK-2 - LVSGSLPFDGQNLKELRERV-LRGKYRIPFYMSTDCENLLKKFLILNPSK -291 • · · ··
MARX-1
MARK-2
MARK-1
MARK-2
MARK-1
MARK-2
MARK-1
MARK-2
MARK-1
MARK-2
MARK-1
MARK-2
MARK-1
MARK-2
MARK-1
MARK-2
MARK-1
MARK-2
MARK-1
MARK-2
MARK-1
MARK-2
- RGSLEQIMKDRWMNVGHEEEELXPYSEPELDLNDAKRIOIMVTMGFARDE -33S
II lllllllllllllll lllll II I I I II II I I
- RGTLEQIMKDRWMNVGHEDDELKPYVEPLPDYKDPRRTELMVSMGYTREE -341
- INDALVSQKYDEVMATYILLGRKPPEFSGGESLSSGNLCQRSRPSSDLNN -385 ι ι ii ι ι inni ιη ι ι η ιη η ι
- IQDSLVGQRYNEVMATYLLLGYKSSELEG......DTITLKPRPSADLTN -385
- STLQSPAHLKVQRTISANQKQRRFSDKAGPSIPPAVSYTKRPQANSVESE -435
I II I Ilii III Ilii II I I II II I I I I
- SSAPSPSH-KVQRSVSANPKQRRSSDQAVPAXPTSNSYSKKTQSNNASNX -434
- QKEEWDKDTARRLGSTTVGSKSEVTASPLVGPDRKKSSAGPS-NNVYSGG -484 nii ii nn ι nn η ι ι ι
- RPEE---ETGRK.....ASSTAKVPASPLPGLDRKKTTPTPSTNSVLSTS -4 76
- SMTRRNTYVCERSTDRYAALQNGRDSSLTEMSASSMSSTGSTVASAGPSA -534
II I I III II
- TNRSRNSPLLDRASLGQASIQNGKDST....................... -503
- RPRHQKSMSTSGHPIKVTLPTIKDGSEAYRPGTAQRVPAASPSAHSISAS -534 nn nnn η ι
.............-...................APQRVPVASPSAHNISSS -521
- T--PDRTRFPRGSSSRSTFHGEQLRERR---SAAYSGPPASPSKDTAALA -629 nn nn ι nnn ιη ι 11 ni
- SGAPDRTNFPRGVSSRSTFHAGQLRQVRDQQNLPFGVTPASPS----GHS -567
- HARRGTSTGIISKITSKFVRRDPSEGEASGRTDTAR----GSSGEPKDKE -675 ιη ι ι n nnni ι ι ι ι ι ι ι ι n
- QGRRGPSGSIFSKFTSKFVRRNLNEPESKDRVETLRPHWGGGGTDKEKE -617
- EGKEAKPR-LRFTWSMKTTSSMDPNDMVREIRKVLDANTCDYEQRERFLL -724 ι nni nnnnnni η ι nnnnn ι ι η ι
- EFREAKPRSLRFTWSMKTTSSMEPNEMMREIRKVLDANSCQSELHERYML -667
- FCVHGDARQDSLVQWEMEVCKLPRLSLNGVRFKRISGTSIAFKNIASKIA -774 nn η 11 η ι η 11 η 1111111 η 11 η ι nnnnn
- LCVHGTPGHENFVQWEMEVCKLPRLSLNGVRFKRISGTSMAFKNIASKIA -717
- NELKL -779 lllll
- NELKL -722
Szekvenciák jegyzéke (1) AZ 1.SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZ: 20 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (C) SZÁLASSÁG: egyes (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUS: peptid (xi) AZ 1.SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
Lys Leu Asp Thr Phe Cys Gly Ser Pro Pro Tyr Alá Alá Pro Glu Leu 15 10 15
Phe Gin Gly Lys 20 (2) A 2. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZ: 19 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (C) SZÁLASSÁG: egyes (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUS: peptid (xi) A 2.SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
Asp Arg Trp Met Asn Val Gly His Glu Glu Glu Glu Leu Lys Pro Tyr 15 10 15
Alá Glu Pro (3) A 3. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZ: 14 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (C) SZÁLASSÁG: egyes (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUS: peptid (xi) A 3.SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
Lys Ser Ser Arg Gin Asn Ile Pro Arg Cys Arg Asn Asn Ile 15 10 •··· ···· (4) A 4.SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZ: 8 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (C) SZÁLASSÁG: egyes (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUS: peptid (ix) JELLEGZETESSÉG:
(A) NÉV/KULCS: peptid (B) HELYZET:3 (D) EGYÉB INFORMÁCIÓ:/megjegyzés= a 3-helyzetű Ser f oszforilált (xi) A 4.SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
Ile Gly Ser Thr Glu Asn Leu Lys 1 5 (5) AZ 5.SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZ: 17 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (C) SZÁLASSÁG: egyes (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUS: peptid (ix) JELLEGZETESSÉG:
(A) NÉV/KULCS: peptid (B) HELYZET:3 (D) EGYÉB INFORMÁCIÓ:/megjegyzés= a 3-helyzetű Ser foszforilált (xi) AZ 5.SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
Ile Gly Ser Leu Asp Asn Ile Pro His Val Pro Gly Gly Gly Asn His 15 10 15
Lys (6) A 6. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZ: 10 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (C) SZÁLASSÁG: egyes (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUS: peptid ···· ···· ··· · (ix) JELLEGZETESSÉG:
(A) NÉV/KULCS: peptid (B) HELYZET: 3 (D) EGYÉB INFORMÁCIÓ:/megjegyzés= a 3-helyzetű Ser foszforilált (xi) A 6.SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
Cys Gly Ser Leu Gly Asn lle His His Lys
10 (7) A 7.SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZ: 13 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (C) SZÁLASSÁG: egyes (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUS: peptid (ix) JELLEGZETESSÉG:
(A) NÉV/KULCS: peptid (B) HELYZET:7 (D) EGYÉB INFORMÁCIÓ:/megjegyzés= a 7-helyzetű Ser foszforilált (xi) A 7.SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
His Val Pro Gly Gly Gly Ser Val Gin lle Val Tyr Lys 15 10 (8) A 8.SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZ: 5 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (C) SZÁLASSÁG: egyes (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUS: peptid (ix) JELLEGZETESSÉG:
(A) NÉV/KULCS: peptid (B) HELYZET:3 (D) EGYÉB INFORMÁCIÓ:/megjegyzés= a 3-helyzetű Ser foszforilált (xi) A 8.SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
Cys Gly Ser Leu Lys
5 • ··· ·»» · ·· ··· (9) A 9.SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZ: 8 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (C) SZÁLASSÁG: egyes (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUS: peptid (ix) JELLEGZETESSÉG:
(A) NÉV/KULCS: peptid (B) HELYZET:3 (D) EGYÉB INFORMÁCIÓ:/megjegyzés^ a 3-helyzetű Ser foszforilált.
(xi) A 9.SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
Ile Gly Ser Thr Asp Asn Ile Lys 1 5 (10) A 10.SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZ: 11 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (C) SZÁLASSÁG: egyes (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUS: peptid (ix) JELLEGZETESSÉG:
(A) NÉV/KULCS: peptid (B) HELYZET:5 (D) EGYÉB INFORMÁCIÓ:/megjegyzés= az 5-helyzetű Ser foszforilált.
(xi) A 10.SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
Asp Gin Gly Gly Ser Gly Glu Gly Leu Ser Arg 15 10 (11) A 11.SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZ: 5 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (C) SZÁLASSÁG: egyes (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUS: peptid ··· » • · ·· ·»·· V · *· • · · · · • ·· · · · · · • · * · · · ·**··· (ix) JELLEGZETESSÉG:
(A) NÉV/KULCS: peptid (B) HELYZET:2 (D) EGYÉB INFORMÁCIÓ:/megjegyzés= a 2-helyzetű Ser foszforilált.
(xi)
A 11.SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
Ser Ser Leu Pro Pro 1 5 (12) A 12.SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZ: 11 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (C) SZÁLASSÁG: egyes (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUS: peptid (ix) JELLEGZETESSÉG:
(A) NÉV/KULCS: peptid (B) HELYZET:2 (D) EGYÉB INFORMÁCIÓ:/megjegyzés= a 2-helyzetű Ser foszforilált.
(ix) JELLEGZETESSÉG:
(A) NÉV/KULCS: peptid (B) HELYZET:6 (D) EGYÉB INFORMÁCIÓ:/megjegyzés= a 6-helyzetű Ser foszforilált.
(ix) JELLEGZETESSÉG:
(A) NÉV/KULCS: peptid (B) HELYZET:9 (D) EGYÉB INFORMÁCIÓ:/megjegyzés= a 9-helyzetű Ser foszforilált.
(xi)
A 12.SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
Leu Ser Asn Val Ser Ser Ser Gly Ser Ile Asn 15 10 (13) A 13.SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZ: 7 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (C) SZÁLASSÁG: egyes (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUS: peptid • · 9 · * · . · s· 900 a · · a (ix) JELLEGZETESSÉG:
(A) NÉV/KULCS: peptid (B) HELYZET:5 (D) EGYÉB INFORMÁCIÓ:/megjegyzés= az 5-helyzetű Thr foszforilált (xi)
A 13.SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
Ser Pro Alá Thr Thr Leu Pro 1 5 (14) A 14.SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZ: 8 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (C) SZÁLASSÁG: egyes (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUS: peptid (ix) JELLEGZETESSÉG:
(A) NÉV/KULCS: peptid (B) HELYZET:3 (D) EGYÉB INFORMÁCIÓ:/megjegyzés= a 3-helyzetű Ser foszforilált (xi
A 14.SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
Val Gly Ser Thr Glu Asn Ile Lys 1 5 (15) A 15.SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZ: 11 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (C) SZÁLASSÁG: egyes (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUS: peptid (ix) JELLEGZETESSÉG:
(A) NÉV/KULCS: peptid (B) HELYZET:6 (D) EGYÉB INFORMÁCIÓ:/megjegyzés= a 6-helyzetű Ser foszforilált.
(xi) A 15.SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
Leu Alá Thr Thr Val Ser Alá Pro Asp Leu Lys 15 10 ···· «·.· »· ·»» · ί» ··· (16) A 16.SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZ: 10 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (C) SZÁLASSÁG: egyes (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUS: peptid (ix) JELLEGZETESSÉG:
(A) NÉV/KULCS: peptid (B) HELYZET:2 (D) EGYÉB INFORMÁCIÓ:/megjegyzés= a 2-helyzetű Thr foszforilált.
(ix) JELLEGZETESSÉG:
(A) NÉV/KULCS: peptid (B) HELYZET:3 (D) EGYÉB INFORMÁCIÓ:/megjegyzés= a 3-helyzetű Thr foszforilált (ix) JELLEGZETESSÉG:
(A) NÉV/KULCS: peptid (B) HELYZET:5 (D) EGYÉB INFORMÁCIÓ:/megjegyzés= az 5-helyzetű Thr foszforilált (xi)
A 16.SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
Asn Thr Thr Pro Thr Gly Alá Alá Pro Pro 15 10 (17) A 17.SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZ: 9 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (C) SZÁLASSÁG: egyes (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUS: peptid (ix) JELLEGZETESSÉG:
(A) NÉV/KULCS: peptid (B) HELYZET:2 (D) EGYÉB INFORMÁCIÓ:/megjegyzés= a 2-helyzetű Ser foszforilált (ix) JELLEGZETESSÉG:
(A) NÉV/KULCS: peptid (B) HELYZET:6 (D) EGYÉB INFORMÁCIÓ:/megjegyzés= a 6-helyzetű Ser foszforilált • · (xi) A 17.SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
Ser Ser Gly Alá Leu Ser Val Asp Lys 1 5 (18) A 18.SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZ: 5 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (C) SZÁLASSÁG: egyes (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUS: peptid (ix) JELLEGZETESSÉG:
(A) NÉV/KULCS: peptid (B) HELYZET:3 (D) EGYÉB INFORMÁCIÓ:/megjegyzés= a 3-helyzetű Ser foszforilált.
(xi) A 18.SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
Val Gly Ser Leu Asp 1 5 (19) A 19.SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZ: 11 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (C) SZÁLASSÁG: egyes (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUS: peptid (ix) JELLEGZETESSÉG:
(A) NÉV/KULCS: peptid (B) HELYZET:6 (D) EGYÉB INFORMÁCIÓ:/megjegyzés= a 6-helyzetű Ser foszforilált.
(xi) A 19.SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
Leu Alá Thr Thr Val Ser Alá Pro Asp Leu Lys 15 10 (20) A 20.SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZ: 21 aminosav (B) TÍPUS: aminosav ···· ···· (C) SZÁLASSÁG: egyes (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUS: peptid (xi) A 20.SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
Asp Arg Trp Met Asn Val Gly His Glu Glu Glu Glu Leu Lys Pro Tyr 15 10 15
Ala Glu Pro Glu Pro 20 (21) A 21.SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZ: 6 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (C) SZÁLASSÁG: egyes (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUS: peptid (xi) A 21.SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
Ile Ala Asn Glu Leu Lys 1 5 (22) A 22.SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZ: 13 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (C) SZÁLASSÁG: egyes (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUS: peptid (xi) A 22.SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
Ala Glu Asn Leu Leu Leu Asp Ala Asp Met Asn Ile Lys 15 10 (23) A 23. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZ: 15 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (C) SZÁLASSÁG: egyes (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUS: peptid ···· ···· • ·· · (xi) A 23.SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
Xaa Ser Ser Arg Gin Asn Ile Pro Arg Cys Arg Asn Asn Ile Ile 15 10 15 (24) A 24.SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZ: 9 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (C) SZÁLASSÁG: egyes (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUS: peptid (xi) A 24.SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
Ile Leu Asn His Pro Asn Ile Val Lys 1 5 (25) A 25.SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZ: 19 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (C) SZÁLASSÁG: egyes (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUS: peptid (xi) A 25.SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
Leu Asp Thr Phe Cys Gly Ser Pro Pro Tyr Alá Alá Pro Glu Leu Phe 15 10 15
Gin Gly Lys (26) A 26.SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZ: 8 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (C) SZÁLASSÁG: egyes (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUS: peptid (xi) A 26.SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
Leu Phe Val Leu Asn Pro Ile Lys 1 5 ···· ···· • · · • · · · · ······· ············ (27) A 27.SZÁMÓ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZ: 8 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (C) SZÁLASSÁG: egyes (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUS: peptid (xi) A 27.SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
Leu Phe Arg Glu Val Arg Ile Xaa 1 5 (28) A 28. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZ: 13 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (C) SZÁLASSÁG: egyes (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUS: peptid (xi) A 28.SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
Tyr Arg Ile Pro Phe Tyr Met Ser Thr Asp Cys Glu Asn 15 10 (29) A 29. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZ: 14 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (C) SZÁLASSÁG: egyes (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUS: peptid (xi) A 29.SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
Phe Arg Gin Ile Val Ser Alá Val Gin Tyr Cys His Gin Lys 15 10 (30) A 30. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZ: 11 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (C) SZÁLASSÁG: egyes (D) TOPOLÓGIA: lineáris • · · · · · · • ·· · ···· • · « · · · * • · ·· ·· ······ (ii) MOLEKULATÍPUS: peptid (xi) A 30.SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
Arg Ile Glu Ile Met Val Thr Met Gly Phe Leu 15 10 (31)
A 31.SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZ: 779 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (C) SZÁLASSÁG: egyes (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUS: protein (xi) A 31.SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
Thr 1 | Glu | Asn | His | Thr 5 | Ser | Val | Asp |
Pro | Thr | Lys | Ser 20 | Ser | Ser | Arg | Gin |
Ile | Thr | Ser 35 | Alá | Thr | Asp | Glu | Gin 40 |
Gin | Lys 50 | Thr | Ile | Gly | Lys | Gly 55 | Asn |
His 65 | Val | Leu | Thr | Gly | Arg 70 | Glu | Val |
Gin | Leu | Asn | Pro | Thr 85 | Ser | Leu | Gin |
Met | Lys | Ile | Leu 100 | Asn | His | Pro | Asn |
Glu | Thr | Glu 115 | Lys | Thr | Leu | Tyr | Leu 120 |
Glu | Val 130 | Phe | Asp | Tyr | Leu | Val 135 | Alá |
Alá 145 | Arg | Alá | Lys | Phe | Arg 150 | Gin | Ile |
Gin | Lys | Cys | Ile | Val 165 | His | Arg | Asp |
Asp | Alá | Asp | Met | Asn | Ile | Lys | Ile |
Gly Tyr Thr Glu Thr His Ile Pro 10 15
Asn Ile Pro Arg Cys Arg Asn Ser 25 30
Pro His Ile Gly Asn Tyr Arg Leu 45
Phe Alá Lys Val Lys Leu Alá Arg 60
Alá Val Lys Ile Ile Asp Lys Thr 75 80
Lys Leu Phe Arg Glu Val Arg Ile 90 95
Ile Val Lys Leu Phe Glu Val Ile 105 110
Val Met Glu Tyr Alá Ser Gly Gly 125
His Gly Arg Met Lys Glu Lys Glu 140
Val Ser Alá Val Gin Tyr Cys His 155 160
Leu Lys Alá Glu Asn Leu Leu Leu 170 175
Alá Asp Phe Gly Phe Ser Asn Glu 185 190
180 ···· ····
Phe Thr Val Gly Asn Lys Leu Asp Thr Phe Cys Gly Ser Pro Pro | Tyr | ||||||||||||||
195 | 200 | 205 | |||||||||||||
Alá | Alá | Pro | Glu | Leu | Phe | Gin | Gly | Lys | Lys | Tyr | Asp | Gly | Pro | Glu | Val |
210 | 215 | 220 | |||||||||||||
Asp | Val | Trp | Ser | Leu | Gly | Val | Ile | Leu | Tyr | Thr | Leu | Val | Ser | Gly | Ser |
225 | 230 | 235 | 240 | ||||||||||||
Leu | Pro | Phe | Asp | Gly | Gin | Asn | Leu | Lys | Glu | Leu | Arg | Glu | Arg | Ser | Cys |
245 | 250 | 255 | |||||||||||||
Leu | Arg | Gly | Lys | Tyr | Arg | Val | Pro | Phe | Tyr | Met | Ser | Thr | Asp | Cys | Glu |
260 | 265 | 270 | |||||||||||||
Asn | Leu | Leu | Lys | Lys | Leu | Leu | Val | Leu | Asn | Pro | Ile | Lys | Arg | Gly | Ser |
275 | 280 | 285 | |||||||||||||
Leu | Glu | Gin | Ile | Met | Lys | Asp | Arg | Trp | Met | Asn | Val | Gly | His | Glu | Glu |
290 | 295 | 300 | |||||||||||||
Glu | Glu | Leu | Lys | Pro | Tyr | Ser | Glu | Pro | Glu | Leu | Asp | Leu | Asn | Asp | Alá |
305 | 310 | 315 | 320 | ||||||||||||
Lys | Arg | Ile | Asp | Ile | Met | Val | Thr | Met | Gly | Phe | Alá | Arg | Asp | Glu | Ile |
325 | 330 | 335 | |||||||||||||
Asn | Asp | Alá | Leu | Val | Ser | Gin | Lys | Tyr | Asp | Glu | Val | Met | Alá | Thr | Tyr |
340 | 345 | 350 | |||||||||||||
Ile | Leu | Leu | Gly | Arg | Lys | Pro | Pro | Glu | Phe | Glu | Gly | Gly | Glu | Ser | Leu |
355 | 360 | 365 | |||||||||||||
Ser | Ser | Gly | Asn | Leu | Cys | Gin | Arg | Ser | Arg | Pro | Ser | Ser | Asp | Leu | Asn |
370 | 375 | 380 | |||||||||||||
Asn | Ser | Thr | Leu | Gin | Ser | Pro | Alá | His | Leu | Lys | Val | Gin | Arg | Thr | Ile |
385 | 390 | 395 | 400 | ||||||||||||
Ser | Alá | Asn | Gin | Lys | Gin | Arg | Arg | Phe | Ser | Asp | His | Alá | Gly | Pro | Ser |
405 | 410 | 415 | |||||||||||||
Ile | Pro | Pro | Alá | Val | Ser | Tyr | Thr | Lys | Arg | Pro | Gin | Alá | Asn | Ser | Val |
420 | 425 | 430 | |||||||||||||
Glu | Ser | Glu | Gin | Lys | Glu | Glu | Trp | Asp | Lys | Asp | Thr | Alá | Arg | Arg | Leu |
435 | 440 | 445 | |||||||||||||
Gly | Ser | Thr | Thr | Val | Gly | Ser | Lys | Ser | Glu | Val | Thr | Alá | Ser | Pro | Leu |
450 | 455 | 460 | |||||||||||||
Val | Gly | Pro | Asp | Arg | Lys | Lys | Ser | Ser | Alá | Gly | Pro | Ser | Asn | Asn | Val |
465 | 470 | 475 | 480 |
• · · · · · · •« ·· ··· · • ·· · ···· • · · · · · · . ·
Tyr Ser Gly | Gly Ser Met Thr Arg Arg Asn | Thr Tyr Val | Cys | Glu Arg 495 | |||||||||||
485 | 490 | ||||||||||||||
Ser | Thr | Asp | Arg | Tyr | Alá | Alá | Leu | Gin | Asn | Gly | Arg | Asp | Ser | Ser | Leu |
500 | 505 | 510 | |||||||||||||
Thr | Glu | Met | Ser | Alá | Ser | Ser | Met | Ser | Ser | Thr | Gly | Ser | Thr | Val | Alá |
515 | 520 | 525 | |||||||||||||
Ser | Alá | Gly | Pro | Ser | Alá | Arg | Pro | Arg | His | Gin | Lys | Ser | Met | Ser | Thr |
530 | 535 | 540 | |||||||||||||
Ser | Gly | His | Pro | Ile | Lys | Val | Thr | Leu | Pro | Thr | Ile | Lys | Asp | Gly | Ser |
545 | 550 | 555 | 560 | ||||||||||||
Glu | Alá | Tyr | Arg | Pro | Gly | Thr | Alá | Gin | Arg | Val | Pro | Alá | Alá | Ser | Pro |
565 | 570 | 575 | |||||||||||||
Ser | Alá | His | Ser | Ile | Ser | Alá | Ser | Thr | Pro | Asp | Arg | Thr | Arg | Phe | Pro |
580 | 585 | 590 | |||||||||||||
Arg | Gly | Ser | Ser | Ser | Arg | Ser | Thr | Phe | His | Gly | Glu | Gin | Leu | Arg | Glu |
595 | 600 | 605 | |||||||||||||
Arg | Arg | Ser | Alá | Alá | Tyr | Ser | Gly | Pro | Pro | Alá | Ser | Pro | Ser | His | Asp |
610 | 615 | 620 | |||||||||||||
Thr | Alá | Alá | Leu | Alá | His | Alá | Arg | Arg | Gly | Thr | Ser | Thr | Gly | Ile | Ile |
625 | 630 | 635 | 640 | ||||||||||||
Ser | Lys | Ile | Thr | Ser | Lys | Phe | Val | Arg | Arg | Asp | Pro | Ser | Glu | Gly | Glu |
645 | 650 | 655 | |||||||||||||
Alá | Ser | Gly | Arg | Thr | Asp | Thr | Alá | Arg | Gly | Ser | Ser | Gly | Glu | Pro | Lys |
660 | 665 | 670 | |||||||||||||
Asp | Lys | Glu | Glu | Gly | Lys | Glu | Alá | Lys | Pro | Arg | Leu | Arg | Phe | Thr | Trp |
675 | 680 | 685 | |||||||||||||
Ser | Met | Lys | Thr | Thr | Ser | Ser | Met | Asp | Pro | Asn | Asp | Met | Val | Arg | Glu |
690 | 695 | 700 | |||||||||||||
Ile | Arg | Lys | Val | Leu | Asp | Alá | Asn | Thr | Cys | Asp | Tyr | Glu | Gin | Arg | Glu |
705 | 710 | 715 | 720 | ||||||||||||
Arg | Phe | Leu | Leu | Phe | Cys | Val | His | Gly | Asp | Alá | Arg | Gin | Asp | Ser | Leu |
725 | 730 | 735 | |||||||||||||
Val | Gin | Trp | Glu | Met | Glu | Val | Cys | Lys | Leu | Pro | Arg | Leu | Ser | Leu | Asn |
740 | 745 | 750 | |||||||||||||
Gly | Val | Arg | Phe | Lys | Arg | Ile | Ser | Gly | Thr | Ser | Ile | Alá | Phe | Lys | Asn |
755 | 760 | 765 |
Ile Alá Ser Lys Ile Alá Asn Glu Leu Lys Leu 770 775 • · · · · · (32) A 32. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZ: 722 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (C) SZÁLASSÁG: egyes (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUS: protein (xi) A 32.SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
Met Ser Ser Alá Arg Thr Pro Leu Pro Thr Leu Asn Glu Arg Asp | Thr | ||||||||||||||
1 | 5 | 10 | 15 | ||||||||||||
Glu | Gin | Pro | Thr | Leu | Gly | His | Leu | Asp | Ser | Lys | Pro | Ser | Ser | Lys | Ser |
20 | 25 | 30 | |||||||||||||
Asn | Met | Leu | Arg | Gly | Arg | Asn | Ser | Alá | Thr | Ser | Alá | Asp | Glu | Gin | Pro |
35 | 40 | 45 | |||||||||||||
His | Ile | Gly | Asn | Tyr | Arg | Leu | Leu | Lys | Thr | Ile | Gly | Lys | Gly | Asn | Phe |
50 | 55 | 60 | |||||||||||||
Alá | Lys | Val | Lys | Leu | Alá | Arg | His | Ile | Leu | Thr | Gly | Lys | Glu | Val | Alá |
65 | 70 | 75 | 80 | ||||||||||||
Val | Lys | Ile | Ile | Asp | Lys | Thr | Gin | Leu | Asn | Ser | Ser | Ser | Leu | Gin | Lys |
85 | 90 | 95 | |||||||||||||
Leu | Phe | Arg | Glu | Val | Arg | Ile | Met | Lys | Val | Leu | Asn | His | Pro | Asn | Ile |
100 | 105 | 110 | |||||||||||||
Val | Lys | Leu | Phe | Glu | Val | Ile | Glu | Thr | Glu | Lys | Thr | Leu | Tyr | Leu | Val |
115 | 120 | 125 | |||||||||||||
Met | Glu | Tyr | Alá | Ser | Gly | Gly | Glu | Val | Phe | Asp | Tyr | Leu | Val | Alá | His |
130 | 135 | 140 | |||||||||||||
Gly | Arg | Met | Lys | Glu | Lys | Glu | Alá | Arg | Alá | Lys | Phe | Arg | Gin | Ile | Val |
145 | 150 | 155 | 160 | ||||||||||||
Ser | Alá | Val | Gin | Tyr | Cys | His | His | Lys | Phe | Ile | Val | His | Arg | Asp | Leu |
165 | 170 | 175 | |||||||||||||
Lys | Alá | Glu | Asn | Leu | Leu | Leu | Asp | Alá | Asp | Met | Asn | Ile | Lys | Ile | Alá |
180 | 185 | 190 | |||||||||||||
Asp | Phe | Gly | Phe | Ser | Asn | Glu | Phe | Thr | Phe | Gly | Asn | Lys | Leu | Asp | Thr |
195 | 200 | 205 | |||||||||||||
Phe | Cys | Gly | Ser | Pro | Pro | Tyr | Alá | Alá | Pro | Glu | Leu | Phe | Gin | Gly | Lys |
210 | 215 | 220 |
Lys Tyr Asp Gly Pro Glu Val Asp | |||||||
225 | 230 | ||||||
Tyr | Thr | Leu | Val | Ser 245 | Gly | Ser | Leu |
Glu | Leu | Arg | Glu 260 | Arg | Val | Leu | Arg |
Met | Ser | Thr 275 | Asp | Cys | Glu | Asn | Leu 280 |
Pro | Ser 290 | Lys | Arg | Gly | Thr | Leu 295 | Glu |
Asn 305 | Val | Gly | His | Glu | Asp 310 | Asp | Glu |
Pro | Asp | Tyr | Lys | Asp 325 | Pro | Arg | Arg |
Tyr | Thr | Arg | Glu 340 | Glu | Ile | Gin | Asp |
Glu | Val | Met 355 | Alá | Thr | Tyr | Leu | Leu 360 |
Glu | Gly 370 | Asp | Thr | Ile | Thr | Leu 375 | Lys |
Asn 385 | Ser | Ser | Alá | Pro | Ser 390 | Pro | Ser |
Alá | Asn | Pro | Lys | Gin 405 | Arg | Arg | Ser |
Pro | Thr | Ser | Asn 420 | Ser | Tyr | Ser | Lys |
Asn | Lys | Arg 435 | Pro | Glu | Glu | Glu | Thr 440 |
Lys | Val 450 | Pro | Alá | Ser | Pro | Leu 455 | Pro |
Pro 465 | Thr | Pro | Ser | Thr | Asn 470 | Ser | Val |
Arg | Asn | Ser | Pro | Leu 485 | Leu | Asp | Arg |
Gin | Asn | Gly | Lys 500 | Asp | Ser | Thr | Alá |
Pro | Ser | Alá 515 | His | Asn | Ile | Ser | Ser 520 |
• ··
• ··· • • • · • · | ··· · ·· ·· • · · · • · · · · ·, | • ·· · • · · • • ··· | |||||
Val | Trp | Ser 235 | Leu | Gly | Val | Ile | Leu 240 |
Pro | Phe 250 | Asp | Gly | Gin | Asn | Leu 255 | Lys |
Gly 265 | Lys | Tyr | Arg | Ile | Pro 270 | Phe | Tyr |
Leu | Lys | Lys | Phe | Leu 285 | Ile | Leu | Asn |
Gin | Ile | Met | Lys 300 | Asp | Arg | Trp | Met |
Leu | Lys | Pro 315 | Tyr | Val | Glu | Pro | Leu 320 |
Thr | Glu 330 | Leu | Met | Val | Ser | Met 335 | Gly |
Ser 345 | Leu | Val | Gly | Gin | Arg 350 | Tyr | Asn |
Leu | Gly | Tyr | Lys | Ser 365 | Ser | Glu | Leu |
Pro | Arg | Pro | Ser 380 | Alá | Asp | Leu | Thr |
His | Lys | Val 395 | Gin | Arg | Ser | Val | Ser 400 |
Ser | Asp 410 | Gin | Alá | Val | Pro | Alá 415 | Ile |
Lys 425 | Thr | Gin | Ser | Asn | Asn 430 | Alá | Glu |
Gly | Arg | Lys | Alá | Ser 445 | Ser | Thr | Alá |
Gly | Leu | Asp | Arg 460 | Lys | Lys | Thr | Thr |
Leu | Ser | Thr 475 | Ser | Thr | Asn | Arg | Ser 480 |
Alá | Ser 490 | Leu | Gly | Gin | Alá | Ser 495 | Ile |
Pro 505 | Gin | Arg | Val | Pro | Val 510 | Alá | Ser |
Ser | Ser | Gly | Alá | Pro | Asp | Arg | Thr |
525 • · ·· ···· ··» · • ·· · ···· »«·«··* · * ············
Asn Phe 530 | Pro Arg Gly | Val | Ser Ser Arg Ser Thr Phe | His | Alá | Gly | Gin | ||||||||
535 | 540 | ||||||||||||||
Leu | Arg | Gin | Val | Arg | Asp | Gin | Gin | Asn | Leu | Pro | Phe | Gly | Val | Thr | Pro |
545 | 550 | 555 | 560 | ||||||||||||
Alá | Ser | Pro | Ser | Gly | His | Ser | Gin | Gly | Arg | Arg | Gly | Pro | Ser | Gly | Ser |
565 | 570 | 575 | |||||||||||||
lle | Phe | Ser | Lys | Phe | Thr | Ser | Lys | Phe | Val | Arg | Arg | Asn | Leu | Asn | Glu |
580 | 585 | 590 | |||||||||||||
Pro | Glu | Ser | Lys | Asp | Arg | Val | Glu | Thr | Leu | Arg | Pro | His | Val | Val | Gly |
595 | 600 | 605 | |||||||||||||
Gly | Gly | Gly | Thr | Asp | Lys | Glu | Lys | Glu | Glu | Phe | Arg | Glu | Alá | Lys | Pro |
610 | 615 | 620 | |||||||||||||
Arg | Ser | Leu | Arg | Phe | Thr | Trp | Ser | Met | Lys | Thr | Thr | Ser | Ser | Met | Glu |
625 | 630 | 635 | 640 | ||||||||||||
Pro | Asn | Glu | Met | Met | Arg | Glu | He | Arg | Lys | Val | Leu | Asp | Alá | Asn | Ser |
645 | 650 | 655 | |||||||||||||
Cys | Gin | Ser | Glu | Leu | His | Glu | Arg | Tyr | Met | Leu | Leu | Cys | Val | His | Gly |
660 | 665 | 670 | |||||||||||||
Thr | Pro | Gly | His | Glu | Asn | Phe | Val | Gin | Trp | Glu | Met | Glu | Val | Cys | Lys |
675 | 680 | 685 | |||||||||||||
Leu | Pro | Arg | Leu | Ser | Leu | Asn | Gly | Val | Arg | Phe | Lys | Arg | lle | Ser | Gly |
690 | 695 | 700 | |||||||||||||
Thr | Ser | Met | Alá | Phe | Lys | Asn | lle | Alá | Ser | Lys | He | Alá | Asn | Glu | Leu |
705 | 710 | 715 | 720 |
Lys Leu
Claims (25)
- SZABADALMI IGÉNYPONTOK1. A tau proteinben, ΜΑΡ-4-ben, ΜΑΡ-2-ben és MAP2c-ben lévő KXGS típusú szekvenciamotívum foszforilálására képes neuron protein kinázt (NPK-t) vagy ennek működőképes fragmentumát kódoló DNS szekvencia, amelyet a következő sajátságok jellemeznek:(a) a 6. táblázatban leírt MARK-1 elnevezésű aminosavszekvenciát kódolja;(b) a 6. táblázatban leírt MARK-2 elnevezésű aminosavszekvenciát kódolja; vagy (c) az (a) vagy (b) szerinti DNS szekvenciával hibridizál.
- 2. Az 1. igénypont szerinti DNS szekvencia által kódolt NPK, amelyet a következő tulajdonságok jellemeznek:(a) valószínű molekulatömege 110 kD SDS-PAGE módszerrel való meghatározás szerint;(b) a humán tau protein következő szerin csoportjait foszforilálja: 262, 293, 305, 324 és 356;(c) a következő aminosavszekvenciákat tartalmazza:KLDTFCGSPPYAAPELFQGKDRWMNVGHEEEELKPYAEP (K) SSRQNIPRCRNNI
- 3. Az 1. és 2. igénypont szerinti DNS szekvencia által kódolt NPK, amelyet a következő további tulajdonságok jellemeznek:(d) a foszfatáz PP-2A inaktiválja; és (e) a tau proteinnel rokon MAP2, MAP2c és MAP4 mikrotubulussal társult proteinek (MAP-ek) következő szerin vagy treonin csoportjait foszfornálja:···· ···· ·· ··· ·MAP2/MAP2c: S37, S1536, S1676, S1707, S1792, S1796, S1799MAP4: T829, T873, T874, T876, S899, S903, S928, S941, S1073;(f) a tau, MAP4, MAP2 és MAP2c mikrotubulusokról való disszociációját idézi elő.
- 4. Az 1-3- igénypontok bármelyike szerinti DNS szekvencia által kódolt NPK, azzal jellemezve, hogy agyszövetből állítható elő a következő lépések alkalmazásával:(a) az agyszövetet homogenizáljuk, és ezután centrifugáljuk;(b) az (a) lépésben kapott felülúszót cellulózfoszfáton kromatografáljuk, amikoris az NPK aktív frakciók 200-400 mM nátrium-klorid-koncentráció között eluálódik;(c) a (b) lépésben kapott aktív frakciókat ammónium-szulfáttal csapjuk ki, és a csapadékot dializáljuk;(d) a (c) lépésben kapott dializátumot anioncserélő Q-Sepharose-on (Pharmacia) kromatografáljuk, és az NPK aktív frakciókat eluáljuk, amikoris az említett NPK aktív frakciók egyetlen csúcsként, körülbelül 0,2 M nátrium-klorid koncentrációnál oldódnak le, majd az aktív frakciókat dializáljuk;(e) ezután kationcserés kromatografálást végzünk Mono S HR10/10 (Pharmacia) oszlopon;(f) Mono Q HR 5/5 kromatograf álással az NPK aktív frakciók körülbelül 250 mM nátrium-klorid koncentrációnál oldódnak le;(g) gélszűréses kromatografálást végzünk Superdex G-200-οη, amikoris az NPK aktivitás SDS-PAGE meghatározás szerint100 kD valószínű molekulatömeggel eluálódik; és ···· «· · •·· · • · · Λ · · · • ·· · ···· ······« · · • · ·· · · ······ (h) affinitás kromatografálást végzünk ATP-cellulózon, amikoris az NPK aktív frakciók SDS-PAGE meghatározás szerint körülbelül 110 kD valószínű molekulatömeggel eluálódnak;a lépésekben kapott frakciók NPK aktivitását úgy mérjük, hogy a vizsgálandó frakciót és egy olyan peptidet, amely a humán felnőtt tau protein 255-267 aminosavcsoportokat tartalmazza, radioaktív jelzett ATP jelenlétében inkubáljuk, és meghatározzuk az említett peptidbe beépült radioaktivitást.
- 5. Az 1-4. igénypontok bármelyike szerinti DNS által kódolt NPK, azzal jellemezve, hogy emlős agyból származó NPK.
- 6. Az 5. igénypont szerinti DNS által kódolt NPK, azzal jellemezve, hogy az említett emlős agy humán vagy sertés agy.
- 7. Polipeptid — vagy egy működőképes fragmentuma — azzal jellemezve, hogy az 1. igénypont szerinti DNS szekvencia kódolja.
- 8. Szerin vagy treonin csoport, azzal jellemezve, hogy a 7. igénypont szerinti polipeptid foszforilálja, és az említett szerin vagy treonin csoport a tau proteinnel rokon MAP2, MAP2c és MAP4 mikrotubulussal társult proteinek (MAP-ek) alábbi aminosav pozícióiban helyezkednek el:MAP2/MAP2c: S37, S1536, S1676, S1707, S1792, S1796, S1799MAP4: T829, T873, T874, T876, S899, S903, S928, S941, S1073.
- 9. Epitóp, azzal jellemezve, hogy a 8. igénypont szerinti szerin vagy treonin csoportot tartalmazza.
- 10. Antitest, azzal jellemezve, hogy a 7. igénypont szerinti polipeptidhez, vagy ennek egy fragmentumához specifikusan kötődik.99 999 9 • 9 9 * « · · • 9 9 9 * 9999 9 9 9 9 9 ·9 9 »9 9 9 «*«··«
- 11. Antitest, azzal jellemezve, hogy specifikusan kötődik a9. igénypont szerinti epitóphoz.
- 12. A 10. vagy a 11. igénypont szerinti antitest, azzal jellemezve, hogy monoklonális antitest vagy ennek egy származéka vagy fragmentuma.
- 13. A 10. vagy a 11. igénypont szerinti antitest, azzal jellemezve, hogy poliklonális antitest vagy ennek egy származéka, vagy fragmentuma.
- 14. Gyógyszerkészítmény, azzal jellemezve, hogy a 7. igénypont szerinti polipeptidnek vagy fragmentumának egy specifikus inhibitorát tartalmazza adott esetben egy gyógyszerészetileg elfogadott vivőanyaggal és/vagy oldószerrel kombinálva.
- 15. A 14. igénypont szerinti gyógyszerkészítmény, azzal jellemezve, hogy az Alzheimer kór kezelésére szolgál.
- 16. A 14. igénypont szerinti gyógyszerkészítmény, azzal jellemezve, hogy rák kezelésére szolgál.
- 17. A 14-16. igénypontok bármelyike szerinti gyógyszerkészítmény, azzal jellemezve, hogy az említett inhibitor egy, a11-13. igénypontok bármelyike szerinti antitest vagy egy foszfatáz — előnyösen a foszfatáz PP-2A — amely képes a 7. igénypont szerinti polipeptidet vagy fragmentumot defoszforilálni, vagy a 7. igénypont szerinti polipeptidet aktiváló kináz egy inhibitora, vagy a tau egy peptid származéka, amely a Ser262 csoportot tartalmazza, vagy a MAP4, MAP2/MAP2c egy peptid származéka, amely legalább egy olyan szerin vagy treonin csoportot tartalmaz, amelyet a 8. igénypont említ.
- 18. Diagnosztikai készítmény, amely az alábbiakat tártál··»· ·*-»* ».·« ·»ίV mázzá:(a) a 7. igénypont szerinti polipeptidet;(b) a 11-13. igénypont bármelyike szerinti antitestet; és/vagy (c) egy peptidet, amely a 2(b) igénypont szerinti szerin csoportot tartalmazza.
- 19. Eljárás Alzheimer kór in vitro diagnosztizálására és/vagy monitorozására, amely a következőkből áll: egy beteg cerebrospinális folyadék mintáját vizsgáljuk vagy a betegtől idegszöveti biopsziás mintát (például a szaglóhámból) veszünk, és az említett szövetet a 7. igénypont szerinti polipeptid vagy fragmentuma fiziológiástól eltérő mennyiségeinek vagy aktivitásának jelenlétére vizsgáljuk.
- 20. Eljárás Alzheimer kór in vitro diagnosztizálására és/vagy monitorozására, amely a következőkből áll: egy beteg cerebrospinális folyadék mintáját vizsgáljuk, vagy a betegtől idegszöveti biopsziás mintát veszünk, és az említett szövetet a 7. igénypont szerinti polipeptid vagy fragmentuma fiziológiástól eltérő mennyiségeinek vagy aktivitásának a jelenlétére vizsgáij uk.
- 21. A 19. vagy a 20. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az NPK-t a 10., 12. vagy 13. igénypont szerinti antitesttel mutatjuk ki.
- 22. Eljárás rák vagy kezdődő rák- in vitro diagnosztizálására, amely a következőkből áll: a megfelelő szövetet vagy testfolyadékot a tau proteinnel rokon MAP2, MAP2c és MAP4 mikrotubulussal társult proteinek (MAP-ek) alábbi pozícióiban lévő foszforilált szerin vagy treonin csoportok jelenlétére vizsgáljuk:···· ··»!MAP2/MAP2c: S37, S1536, S1676, S1707, S1792, S1796, S1799MAP4: T829, T873, T874, T876, S899, S903, S928, S941, S1073;vagy pedig a 7. igénypont szerinti polipeptid vagy fragmentuma fiziológiástól eltérő mennyiségeinek a jelenlétére, vagy az említett polipeptidre vagy fragmentumára specifikus foszfatáz jelenlétére vizsgáljuk.
- 23. Eljárás normál MAP2, MAP2c vagy MAP4 in vitro átalakítására a 7. igénypont szerinti polipeptiddel vagy fragmentumával való kezelés révén, az alábbi pozíciókban foszforilált proteinekké :MAP2/MAP2c: S37, S1536, S1676, S1707, S1792, S1796, S1799MAP4: T829, T873, T874, T876, S899, S903, S928, S941, S1073, amikoris az említett foszforilációs állapot rákra vagy kezdődő rákra enged következtetni.
- 24. A 8. igénypont szerinti MAP foszforilált szerin vagy treonin csoportjának (csoportjainak) vagy az ezen csoportot (csoportokat) tartalmazó 9. igénypont szerinti epitópnak a felhasználása rákot vagy kezdődő rákot jelző specifikus antitestek előállítására.
- 25. RNS szekvencia, azzal jellemezve, hogy az 1-6. igénypontok bármelyike szerinti DNS-sel komplementer.
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
EP94117122 | 1994-10-28 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
HUT77081A true HUT77081A (hu) | 1998-03-02 |
Family
ID=8216419
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
HU9702175A HUT77081A (hu) | 1994-10-28 | 1995-10-30 | Protein kináz NPK-110 |
Country Status (12)
Country | Link |
---|---|
US (2) | US6579691B1 (hu) |
EP (1) | EP0791067B1 (hu) |
JP (1) | JPH10508199A (hu) |
KR (1) | KR100275591B1 (hu) |
CN (1) | CN1168699A (hu) |
AT (1) | ATE417930T1 (hu) |
CA (1) | CA2203910A1 (hu) |
DE (1) | DE69535901D1 (hu) |
HU (1) | HUT77081A (hu) |
NO (1) | NO971966L (hu) |
NZ (1) | NZ295371A (hu) |
WO (1) | WO1996013592A2 (hu) |
Families Citing this family (15)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
ATE438716T1 (de) * | 1991-12-06 | 2009-08-15 | Max Planck Gesellschaft | Verwendung von protein-kinasen zur diagnose und behandlung der alzheimer-krankheit |
AU6421498A (en) * | 1997-04-28 | 1998-11-24 | Helix Research Institute | Serine/threonine protein kinase |
WO2001081558A2 (en) * | 2000-04-25 | 2001-11-01 | Millennium Pharmaceuticals, Inc. | 13295 novel protein kinase molecules and uses therefor |
JP2005512501A (ja) * | 2000-12-06 | 2005-05-12 | インサイト・ゲノミックス・インコーポレイテッド | キナーゼおよびホスファターゼ |
US7119185B2 (en) * | 2000-12-21 | 2006-10-10 | Trustees Of The University Of Pennsylvania | Hormonally up-regulated, neu-tumor-associated kinase |
DE60226429D1 (de) * | 2001-02-27 | 2008-06-19 | Brni Neurosciences Inst | Diagnose der alzheimer-krankheit auf basis von mitogenaktivierter proteinkinase-phosphorylierung |
AU2002312241A1 (en) * | 2001-06-05 | 2002-12-16 | Exelixis, Inc. | B3galts as modifiers of the p53 pathway and methods of use |
US6492156B1 (en) * | 2001-10-31 | 2002-12-10 | Pe Corporation (Ny) | Isolated human kinase proteins, nucleic acid molecules encoding human kinase proteins, and uses thereof |
CA2527853A1 (en) * | 2003-06-19 | 2005-01-13 | Exelixis, Inc. | Mptens as modifiers of the pten/igf pathway and methods of use |
US8273536B2 (en) | 2003-06-19 | 2012-09-25 | Exelixis, Inc. | Marks as modifers of the PTEN pathway and methods of use |
CN100424184C (zh) * | 2005-12-09 | 2008-10-08 | 浙江大学 | 疱疹类病毒基因芯片及其应用 |
US9433922B2 (en) * | 2007-08-14 | 2016-09-06 | Emd Millipore Corporation | Media for membrane ion exchange chromatography based on polymeric primary amines, sorption device containing that media, and chromatography scheme and purification method using the same |
KR101294725B1 (ko) * | 2010-12-30 | 2013-08-08 | 연세대학교 산학협력단 | 인산화된 grasp를 포함하는 낭포성섬유증 치료용 약학 조성물 |
SG10201703771WA (en) | 2011-09-19 | 2017-06-29 | Axon Neuroscience Se | Protein-based therapy and diagnosis of tau-mediated pathology in alzheimer's disease |
CN117551674A (zh) * | 2023-11-20 | 2024-02-13 | 内蒙古农业大学 | 沙葱萤叶甲微管亲和调节激酶GdMARK2基因的克隆及其功能 |
Family Cites Families (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP0544942A1 (en) * | 1991-12-06 | 1993-06-09 | Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. | Novel tools for the diagnosis and treatment of Alzheimer disease |
-
1995
- 1995-10-30 EP EP95937855A patent/EP0791067B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1995-10-30 CN CN95196569A patent/CN1168699A/zh active Pending
- 1995-10-30 WO PCT/EP1995/004258 patent/WO1996013592A2/en active IP Right Grant
- 1995-10-30 JP JP8514323A patent/JPH10508199A/ja not_active Ceased
- 1995-10-30 HU HU9702175A patent/HUT77081A/hu unknown
- 1995-10-30 NZ NZ295371A patent/NZ295371A/en unknown
- 1995-10-30 CA CA002203910A patent/CA2203910A1/en not_active Abandoned
- 1995-10-30 DE DE69535901T patent/DE69535901D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1995-10-30 AT AT95937855T patent/ATE417930T1/de not_active IP Right Cessation
- 1995-10-30 KR KR1019970702885A patent/KR100275591B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1995-10-30 US US08/817,832 patent/US6579691B1/en not_active Expired - Fee Related
-
1997
- 1997-04-28 NO NO971966A patent/NO971966L/no not_active Application Discontinuation
-
2003
- 2003-05-16 US US10/440,435 patent/US7485712B2/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
DE69535901D1 (de) | 2009-01-29 |
CA2203910A1 (en) | 1996-05-09 |
US7485712B2 (en) | 2009-02-03 |
NZ295371A (en) | 1998-11-25 |
NO971966D0 (no) | 1997-04-28 |
WO1996013592A3 (en) | 1996-08-01 |
AU3870295A (en) | 1996-05-23 |
ATE417930T1 (de) | 2009-01-15 |
US20040038361A1 (en) | 2004-02-26 |
EP0791067B1 (en) | 2008-12-17 |
AU714636B2 (en) | 2000-01-06 |
NO971966L (no) | 1997-06-19 |
JPH10508199A (ja) | 1998-08-18 |
CN1168699A (zh) | 1997-12-24 |
MX9703101A (es) | 1998-07-31 |
US6579691B1 (en) | 2003-06-17 |
US20030104516A1 (en) | 2003-06-05 |
WO1996013592A2 (en) | 1996-05-09 |
EP0791067A2 (en) | 1997-08-27 |
KR100275591B1 (ko) | 2001-02-01 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Meyer et al. | Microtubule-associated protein/microtubule affinity-regulating kinase (p110mark): a novel protein kinase that regulates tau-microtubule interactions and dynamic instability by phosphorylation at the Alzheimer-specific site serine 262 | |
EP0911390B1 (en) | Protein kinases as tools for the diagnosis and treatment of Alzheimer's disease | |
US7408027B1 (en) | Tools for the diagnosis and treatment of Alzheimer's disease | |
HUT77081A (hu) | Protein kináz NPK-110 | |
US5621075A (en) | Insulin receptor substrate | |
US6576437B2 (en) | Stimulus-inducible protein kinase complex and methods of use therefor | |
AU2001263952B2 (en) | Tumour suppressor and uses thereof | |
EP1363939A2 (en) | Peptides for use in the treatment of alzheimer's disease | |
AU2001263952A1 (en) | Tumour suppressor and uses thereof | |
AU3139797A (en) | Mitogen-activated protein kinase p38-2 and methods of use therefor | |
US6258579B1 (en) | Stimulus-inducible protein kinase complex and methods of use therefor | |
US20020127214A1 (en) | RAC-protein kinase as therapeutic agent or in diagnostics | |
WO1992013083A1 (en) | Nucleic acid encoding insulin receptor substrate-1 (irs-1), irs-1 protein, diseases, therapy associated with the metabolism of irs-1 | |
AU714636C (en) | Protein kinase (NPK-110) | |
MXPA97003101A (en) | Protein kinase novedosa (npk-1 | |
AU2644400A (en) | Novel protein kinase NPK-110 | |
Richie-Jannetta | Mechanism and function of dimerization of cGMP-dependent protein kinase type Iβ |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
DFA9 | Temporary protection cancelled due to abandonment |