JP2003507051A

JP2003507051A - フォーカルアドヒージョンキナーゼ発現のアンチセンスモジュレーション

Info

Publication number: JP2003507051A
Application number: JP2001518731A
Authority: JP
Inventors: モニャ，ブレット・ピー; ガルデ，ウイリアム・エイ; ニェーロ，パメラ・エス
Original assignee: Isis Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Ionis Pharmaceuticals Inc
Priority date: 1999-08-19
Filing date: 2000-07-13
Publication date: 2003-02-25
Also published as: US20010034329A1; AU6091200A; US6133031A; WO2001014402A8; EP1208110A4; US20040192628A1; EP1208110A1; WO2001014402A1

Abstract

(57)【要約】 FAK媒介性シグナル伝達を阻害するために化合物、組成物および方法を提供する。組成物は、FAKをコードする核酸を標的とするアンチセンス化合物を含む。FAK発現を阻害するために、そしてFAKの過剰発現または構成的活性化と関連する疾患、特にガン、の治療のために、これらのアンチセンス化合物を使用する方法を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】発明の属する分野本発明は、成長因子反応および細胞遊走に関連するシグナル伝達タンパク質を
コードして、疾患に関係するヒトフォーカルアドヒージョンキナーゼ（focal ad
hesion kinase；FAK）遺伝子の発現をモジュレートするための組成物および方法
に関する。本発明はまた、FAK媒介シグナル変換を阻害するための方法も示す；
これらの方法は、診断的あるいは治療的に使用することができる。さらに、本発
明はヒトFAK遺伝子の発現と関連した状態の治療を示す。

【０００２】発明の背景細胞遊走は、様々な生物学的過程の基礎であり、インテグリン受容体媒介シグ
ナル（接触走性（haptotaxis）遊走）および／あるいは可溶性成長因子媒介シグ
ナル（化学走性遊走）の両方により誘導されうる。インテグリン受容体エンゲー
ジメント（engagement）は、シグナル伝達タンパク質の細胞骨格関連ネットワー
クの一部として機能する細胞基底-細胞外マトリクス（ECM）接触部位に位置する
非受容体タンパク質-チロシンキナーゼである、フォーカルアドヒージョンキナ
ーゼを活性化する（Schlaepfer, D.D.ら, Prog. Biophys. Mol. Biol., 1999, 7
1, 435-478）。付着細胞において、FAKはしばしばフォーカルアドヒージョンで
のインテグリンと関連する（Schaller, M.D.ら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
1992, 89, 5192-5196）。その他のタンパク質チロシンキナーゼを含む多くのそ
の他のシグナル伝達タンパク質は、これらの領域においてFAKに関連する。FAKの
リン酸化は、マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ経路の活性化を引き起こす
。加えて、FAKはアポトーシスを妨げるために働く場合があるホスファチジルイ
イノシトール3'キナーゼの活性化を制御する。FAKはまた、インベーシンにより
媒介される細菌の内在化に必要であることも示された（Alrutz, M.A.およびIsbe
rg, R.R., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1998, 95, 13658-13663）。

【０００３】正常細胞は成長するためには細胞外マトリックスへの固定が典型的に必要であ
る。これらの細胞が細胞外マトリックスから外されるとき、それらはアポトーシ
スをうける。一方、形質転換細胞は固定非依存条件で成長することができ、それ
らに成長有利性およびそれらの正常細胞環境から離れることができる能力を与え
る。

【０００４】 FAKの過剰発現は癌の進行に関係する。高レベルのFAKは結腸腫瘍（Weiner, T.
M.ら, Lancet, 1993, 342, 1024-1025）、乳癌（Owens, L.V.ら, Cancer Res.,
1995, 55, 2752-2755）、および口腔癌（Kornberg, L.J., Head Neck, 1998, 20
, 634-639）における侵襲および転移と相関がある。

【０００５】細胞遊走におけるFAKの役割は、それが胎児発生機能不全および血管形成障害
などの他の疾患に関連しうるという推測を導いている（Kornberg, L.J., Head N
eck, 1998, 20, 634-639）。

【０００６】 FAKの特異的な阻害剤はない。アンチセンスアプローチは、FAKの機能を調査す
る手段となっている。Lou, Jら（J. Orthopaedic Res., 1997, 15, 911-918）は
、アンチセンスFAK RNAを発現させるためにアデノウイルス基本ベクターを使用
して、FAKが腱における創傷治癒に関係することを示した。相補配列の400 bpを
含有するもう一つのアンチセンスFAK発現ベクターを使用して、I型コラーゲンと
α2β1インテグリンの相互作用が研究された（Takeuchi, Y.ら, J. Biol. Chem.
, 1997, 272, 29309-29316）。

【０００７】アンチセンスオリゴヌクレオチドはいくつかの研究で使用された。Tanaka, S.
ら（J. Cell. Biochem., 1995, 58, 424-435）は、マウスFAKの開始部位を標的
とする二つのアンチセンスホスホロチオエートオリゴヌクレオチドを開示する。
Xu, L.-H.ら（Cell Growth Diff., 1996, 7, 413-418）は、ヒトFAKのコーディ
ング領域内を標的とする二つのアンチセンスホスホロチオエートオリゴヌクレオ
チドを開示する。彼らはまた、FAKアンチセンス治療は腫瘍細胞においてアポト
ーシスを誘導できたことも示す。Sonoda, Y.ら（Biochem. Biophys. Res. Comm.
, 1997, 241, 769-774）も、ヒトFAKの開始部位およびコーディング領域内を標
的とするアンチセンスホスホロチオエートオリゴヌクレオチドを使用して、アポ
トーシスにおけるFAKの役割を示した。Shibata, K.ら（Cancer Res., 1998, 58,
900-903）は、ヒトFAKの開始部位およびコーディング領域を標的とするアンチ
センスホスホロチオエートオリゴヌクレオチドを開示する。Narase, K.ら（Onco
gene, 1998, 17, 455-463）は、ヒトFAKの開始部位を標的とするアンチセンスホ
スホロチオエートオリゴヌクレオチドを開示する。

【０００８】 FAK遺伝子発現を阻害するための改良された組成物および方法が長い間必要と
考えられているままである。発明の概要本発明は、フォーカルアドヒージョンキナーゼ（FAK）をコードする核酸を標
的とし、そしてFAK媒介性シグナル伝達をモジュレートすることが可能なアンチ
センス化合物を提供する。本発明はまた、ヒトFAKをコードする核酸を標的とす
るキメラオリゴヌクレオチドも提供する。本発明のアンチセンス化合物は、診断
的および治療的の両方に有用であると考えられ、そして本発明の方法で特に有用
であると考えられる。

【０００９】本発明はまた、本発明のアンチセンス化合物を用い、細胞および組織において
、ヒトFAK媒介性シグナル伝達をモジュレートする方法も含む。FAK発現を阻害す
る方法が提供され；これらの方法は、治療的および診断的の両方に有用であると
考えられる。これらの方法はまた、多様な細胞機能および生理学的過程、並びに
症状において、FAKを検出しそしてその役割を決定するためのツールとして、そ
してFAKの発現に関連する異常を診断するためのツールとしても有用である。

【００１０】本発明はまた、結腸ガン、乳ガンおよび口腔ガンを含む癌を診断し、そして治
療するための方法も含む。これらの方法は、例えば、FAK関連疾患の進行を診断
するのに有用であると考えられる。これらの方法は、本発明のアンチセンス化合
物を使用する。これらの方法は、予防的を含め、治療的に、そして臨床研究およ
び診断ツールとして、有用であると考えられる。

【００１１】発明の詳細な説明 FAKは、インテグリン-媒介性シグナル伝達に重要な役割を果たす。FAKの過剰
発現は、腫瘍の進行および転移の可能性と関連する。これ自体、このタンパク質
は、こうした疾患の治療に対して魅力的な標的であることを意味する。特に、FA
K発現の調節は、結腸ガン、乳ガンおよび口腔のガンなどの疾患の治療に有用で
ある可能性がある。

【００１２】本発明は、FAKをコードする核酸分子の機能をモジュレートし、究極的には、
産生されるFAKの量をモジュレートするのに使用するため、アンチセンス化合物
、特にオリゴヌクレオチドを使用する。これは、FAKをコードする核酸、好まし
くはmRNAと特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを提供することによ
り、達成される。

【００１３】オリゴヌクレオチドなどのアンチセンス化合物、およびそれがハイブリダイズ
するその相補的核酸標的の間のこの関係は、一般的に「アンチセンス」と称され
る。本発明の文脈において、選択された核酸標的に対するオリゴヌクレオチドの
「標的化」は、多段階過程である。この過程は、通常、その機能をモジュレート
すべき核酸配列を同定することから始まる。これは、例えば、その発現が特定の
疾患状態と関連する細胞遺伝子（またはその遺伝子から作成されるmRNA）、また
は感染性病原体由来の外来性の核酸であってもよい。本発明において、標的は、
FAKをコードする核酸分子；言い換えるなら、FAKをコードする遺伝子、またはFA
K遺伝子から発現されるmRNAである。FAKをコードするmRNAが、現在、好ましい標
的である。標的化過程にはまた、遺伝子発現のモジュレートが生じるであろうよ
うに、アンチセンス相互作用が起こるための、核酸配列中の1または複数の部位
を決定することが含まれる。

【００１４】本発明にしたがい、当業者は、メッセンジャーRNAには、3文字遺伝暗号を用い
てタンパク質をコードするための情報のみならず、当業者に5'-非翻訳領域、3'-
非翻訳領域、5'キャップ領域およびイントロン／エクソン接合部リボヌクレオチ
ドとして知られる領域を形成する関連リボヌクレオチドも含まれることを理解す
るであろう。したがって、情報を有するリボヌクレオチドと共に、これらの関連
リボヌクレオチド全体またはその一部を標的とするオリゴヌクレオチドを、本発
明にしたがって作製してもよい。したがって、オリゴヌクレオチドは、転写開始
部位領域、翻訳開始コドン領域、5'キャップ領域、イントロン／エクソン接合部
、コード配列、翻訳終止コドン領域あるいは5'-または3'-非翻訳領域中の配列に
特異的にハイブリダイズ可能であってもよい。当該技術分野において知られるよ
うに、翻訳開始コドンは、典型的には5'-AUG（転写されたmRNA分子において；対
応するDNA分子では5'-ATG）であるため、翻訳開始コドンはまた、「AUGコドン」
、「スタートコドン」または「AUGスタートコドン」とも称される。少数の遺伝
子は、RNA配列5'-GUG、5'-UUGまたは5'-CUGを有する翻訳開始コドンを有し、そ
して5'-AUA、5'-ACGおよび5'-CUGがin vivoで機能することが示されている。し
たがって、それぞれの開始アミノ酸が、典型的にはメチオニン（真核生物）また
はホルミルメチオニン（原核生物）であっても、「翻訳開始コドン」および「ス
タートコドン」という用語は、多くのコドン配列を含む可能性がある。真核およ
び原核遺伝子が、2つまたはそれ以上の代わりのスタートコドンを有する可能性
もあり、そのいずれか1つを、特定の細胞種または組織において、あるいは一連
の特定の条件下で、翻訳開始に優先的に利用してもよいこともまた当該技術分野
において知られる。本発明の文脈において、「スタートコドン」および「翻訳開
始コドン」は、こうしたコドンの配列に関わらず、FAKをコードする遺伝子から
転写されるmRNA分子の翻訳を開始するために、in vivoで用いられる1または複数
のコドンを指す。遺伝子の翻訳終止コドン（または「停止コドン」）は、3つの
配列、すなわち5'-UAA、5'-UAGおよび5'-UGA（対応するDNA配列は、それぞれ、5
'-TAA、5'-TAGおよび5'-TGAである）の1つを有する可能性があることもまた、当
該技術分野において知られる。「スタートコドン領域」、「AUG領域」および「
翻訳開始コドン領域」という用語は、翻訳開始コドンからいずれかの方向（すな
わち5'または3'）の約25〜約50の隣接するヌクレオチドを含むmRNAまたは遺伝子
の部分を指す。この領域は好ましい標的領域である。同様に、「停止コドン領域
」および「翻訳終止コドン領域」という用語は、翻訳終止コドンからいずれかの
方向（すなわち5'または3'）の約25〜約50の隣接するヌクレオチドを含むmRNAま
たは遺伝子の部分を指す。この領域は好ましい標的領域である。翻訳開始コドン
および翻訳終止コドンの間の領域を指すことが当該技術分野において知られるオ
ープンリーディングフレーム（ORF）または「コード領域」もまた、効果的に標
的化することができる領域である。他の好ましい標的領域には、翻訳開始コドン
から5'方向のmRNAの部分を指すことが当該技術分野において知られ、そしてした
がってmRNAの5'キャップ部位と翻訳開始コドンとの間のヌクレオチドまたは遺伝
子上の対応するヌクレオチドを含む、5'非翻訳領域（5'UTR）、並びに翻訳終結
コドンから3'方向のmRNAの部分を指すことが当該技術分野において知られ、そし
てしたがってmRNAの翻訳終結コドンと3'端との間のヌクレオチドまたは遺伝子上
の対応するヌクレオチドを含む、3'非翻訳領域（3'UTR）が含まれる。mRNAの5'
キャップは、5'-5'三リン酸結合を介し、mRNAの最も5'の残基に結合している、N
7-メチル化グアノシン残基を含む。mRNAの5'キャップ領域は、5'キャップ構造自
体と共に、キャップに隣接する最初の50ヌクレオチドを含むと考えられる。5'キ
ャップ領域もまた、好ましい標的領域である可能性がある。

【００１５】直接翻訳される真核mRNA転写物もあるが、多くは、1つまたはそれ以上の成熟m
RNAを生じるために、プレmRNA転写物から切り出される、1つまたはそれ以上の「
イントロン」として知られる領域を含む。残った（そしてしたがって翻訳される
）領域は、「エクソン」として知られ、そして共にスプライシングされ、連続す
るmRNA配列を形成する。mRNAスプライシング部位、すなわちエクソン-エクソン
またはイントロン-エクソン接合部もまた、好ましい標的領域である可能性があ
り、そして異常なスプライシングが疾患に関連付けられている状況、または特定
のmRNAスプライシング産物の過剰産生が疾患に関連付けられている状況で特に有
用である。再構成または欠失による異常な融合接合部もまた好ましい標的である
。選択的スプライシングmRNA中の特定のエクソンの標的化もまた好ましい。イン
トロンもまた、例えばDNAまたはプレmRNAを標的とするアンチセンス化合物の、
有効な、そしてしたがって好ましい標的領域である可能性があることもまた見出
されてきている。

【００１６】ひとたび1つまたはそれ以上の標的部位が同定されたら、標的に十分に相補的
な、すなわち十分によく、そして十分な特異性でハイブリダイズし、望ましいモ
ジュレートをもたらす、オリゴヌクレオチドを選択する。

【００１７】本発明の文脈において、「ハイブリダイゼーション」は、通常、向かい合う核
酸鎖または1本の核酸鎖の2つの領域上にある相補的な塩基間の、ワトソン-クリ
ック塩基対形成としても知られる、水素結合を意味する。グアニンおよびシトシ
ンは、それらの間に3つの水素結合を形成することが知られる相補的塩基の例で
ある。アデニンおよびチミンは、それらの間に2つの水素結合を形成することが
知られる相補的塩基の例である。

【００１８】「特異的にハイブリダイズ可能」および「相補的」は、DNAまたはRNA標的とオ
リゴヌクレオチドとの間で、安定で特異的な結合が起こるような、十分な程度の
相補性を示すのに用いられる用語である。

【００１９】オリゴヌクレオチドは、特異的にハイブリダイズ可能であるために、その標的
核酸配列と100％相補的である必要はないことが理解されている。オリゴヌクレ
オチドは、オリゴヌクレオチドの標的に対する結合が、標的分子の正常機能を妨
害し、有用性の損失を引き起こし、そして特異的結合が望ましい条件下、すなわ
ちin vivoアッセイまたは治療処置の場合には生理学的条件下、あるいはin vitr
oアッセイの場合にはアッセイが行われる条件下で、非標的配列に対するオリゴ
ヌクレオチドの非特異的結合を避けるのに十分な程度の相補性がある場合、特異
的にハイブリダイズできる。

【００２０】アンチセンスオリゴヌクレオチドとmRNAのハイブリダイゼーションは、mRNAの
1つまたはそれ以上の正常機能を妨害する。妨害すべきmRNAの機能には、すべて
の生命維持に必要な機能、例えば、タンパク質翻訳部位へのRNAの移動、RNAから
のタンパク質の翻訳、1つまたはそれ以上のmRNA種を生じるRNAのスプライシング
、RNAが関与する可能性がある触媒活性が含まれる。RNAへの単数または複数のタ
ンパク質の結合もまた、RNAへのアンチセンスオリゴヌクレオチドハイブリダイ
ゼーションにより、妨害することができる。

【００２１】 mRNA機能の妨害の全体的な効果は、FAK発現のモジュレートである。本発明の
文脈において、「モジュレート」は、阻害または刺激いずれか；すなわち発現の
減少または増加のいずれかを意味する。このモジュレートは、当該技術分野にお
いて日常的な方法で、例えば、本出願の実施例において教示されるように、mRNA
発現のノーザンブロットアッセイ、または逆転写酵素PCRにより、あるいはタン
パク質発現のウェスタンブロットまたはELISAアッセイにより、あるいはタンパ
ク質発現の免疫沈降アッセイにより、測定することができる。細胞増殖または腫
瘍細胞増殖に対する影響もまた、本出願の実施例において教示されるように、測
定することができる。阻害が現在、好ましい。

【００２２】本発明のオリゴヌクレオチドは、診断剤、治療剤、予防剤で、そして研究試薬
として、そしてキット中で用いてもよい。本発明のオリゴヌクレオチドは、FAK
をコードする核酸にハイブリダイズするため、サンドイッチ、比色および他のア
ッセイを容易に構築して、この事実を利用することができる。オリゴヌクレオチ
ドのFAK遺伝子またはmRNAとのハイブリダイゼーションを検出するための手段の
提供は、日常的に達成することができる。こうした提供には、酵素結合、放射標
識またはいずれか他の適切な検出系を含んでもよい。FAKの存在または非存在を
検出するためのキットもまた、調製することができる。

【００２３】本発明はまた、自己免疫疾患または炎症性疾患、例えば肝炎または結腸、肝臓
、または肺のガンおよびリンパ腫などのガンを有すると疑われる患者由来の組織
または他の試料における、異常な炎症状態または特定の癌を診断するのにも適し
ている。本発明を使用する多数のアッセイを作成することが可能であり、こうし
たアッセイは、一般的に、検出および、通常、こうした阻害の定量化を可能にす
るよう選択された条件下で、組織試料と本発明のオリゴヌクレオチドとを接触さ
せることを含むであろう。本発明の文脈において、1または複数のオリゴヌクレ
オチドと、組織または細胞を「接触」させることは、通常、液体キャリアー中の
オリゴヌクレオチドを、in vitroまたはex vivoいずれかで、細胞懸濁物または
組織試料に添加すること、あるいはオリゴヌクレオチドを、動物内の細胞または
組織に投与することを意味する。

【００２４】本発明のオリゴヌクレオチドはまた、研究目的に用いることもできる。したが
って、オリゴヌクレオチドにより示される特異的なハイブリダイゼーションを、
アッセイ、精製、細胞産物調製のために、および当業者が認識することができる
他の方法論に用いてもよい。

【００２５】本発明の文脈において、「オリゴヌクレオチド」という用語は、リボ核酸また
はデオキシリボ核酸のオリゴマーまたはポリマーを指す。この用語は、天然に存
在するヌクレオ塩基、糖および共有糖間（バックボーン）結合からなるオリゴヌ
クレオチドと共に、同様に機能する天然に存在しない部分を有するオリゴヌクレ
オチドを含む。こうした修飾または置換オリゴヌクレオチドは、例えば、細胞取
り込み亢進、標的に対する結合の亢進、およびヌクレアーゼの存在下での安定性
の増加などの望ましい特性のため、しばしば、天然型より好ましい。

【００２６】本発明にしたがったアンチセンス化合物は、好ましくは約5ないし約50ヌクレ
オ塩基を含む。特に好ましいのは、約8ないし約30ヌクレオ塩基を含むアンチセ
ンスオリゴヌクレオチド（すなわち約8ないし約30の結合したヌクレオシド）で
ある。当該技術分野において知られるように、ヌクレオシドは塩基-糖の組み合
わせである。ヌクレオシドの塩基部分は、通常、複素環塩基である。こうした複
素環塩基の2つの最も一般的な種類は、プリン類およびピリミジン類である。ヌ
クレオチドは、ヌクレオシドの糖部分に共有結合するリン酸基をさらに含む、ヌ
クレオシドである。ペントフラノシル糖を含むヌクレオシドに関しては、リン酸
基は、その糖の2'、3'または5'ヒドロキシル部分のいずれに結合してもよい。オ
リゴヌクレオチドを形成する際、リン酸基は、互いに、隣接するヌクレオシドと
共有結合し、直線ポリマー化合物を形成する。次に、この直線ポリマー構造のそ
れぞれの端を、さらに結合させて環状構造を形成させてもよいが、開環直線構造
が、一般的に好ましい。オリゴヌクレオチド構造内で、リン酸基は、一般的に、
オリゴヌクレオチドのヌクレオシド間バックボーンを形成すると称される。RNA
およびDNAの正常の結合またはバックボーンは、3'から5'のホスホジエステル結
合である。

【００２７】本発明に有用な好ましいアンチセンス化合物の具体的な例には、修飾バックボ
ーンまたは非天然ヌクレオシド間結合を含有するオリゴヌクレオチドが含まれる
。本明細書において定義されるように、修飾バックボーンを有するオリゴヌクレ
オチドには、バックボーン内にリン原子を保持するもの、およびバックボーン内
にリン原子を持たないものが含まれる。本明細書の目的のための、そして当該技
術分野において時に引用されるような、ヌクレオシド間バックボーンにリン原子
を持たない修飾オリゴヌクレオチドもまた、オリゴヌクレオシドと考えることが
できる。

【００２８】好ましい修飾オリゴヌクレオチドバックボーンには、例えば、ホスホロチオエ
ート類、キラルホスホロチオエート類、ホスホロジチオエート類、ホスホトリエ
ステル類、アミノアルキルホスホトリエステル類、3'-アルキレンホスホネート
類およびキラルホスホネート類を含むメチルおよび他のアルキルホスホネート類
、ホスフィネート類、3'-アミノホスホールアミデート類およびアミノアルキル
ホスホールアミデート類を含むホスホールアミデート類、チオノホスホールアミ
デート類、チオノアルキルホスホネート類、チオノアルキルホスホトリエステル
類、並びに通常の3'-5'結合を有するボラノホスフェート類、これらの2'-5'結合
類似体、およびヌクレオシド単位の隣接する対が5'-3'に愛して3'-5'で、または
5'-2'から2'-5'で結合する逆向きの極性を有するものが含まれる。様々な塩、混
合塩および遊離酸型もまた、含まれる。

【００２９】上記のリン含有結合の調製を教示する代表的な米国特許には、米国特許：3,68
7,808；4,469,863；4,476,301；5,023,243；5,177,196；5,188,897；5,264,423
；5,276,019；5,278,302；5,286,717；5,321,131；5,399,676；5,405,939；5,45
3,496；5,455,233；5,466,677；5,476,925；5,519,126；5,536,821；5,541,306
；5,550,111；5,563,253；5,571,799；5,587,361；および5,625,050が含まれる
が、これらに限定されるわけではない。

【００３０】リン原子を含まない好ましい修飾オリゴヌクレオチドバックボーンは、短鎖ア
ルキルまたはシクロアルキルヌクレオシド間結合、混合ヘテロ原子およびアルキ
ルまたはシクロアルキルヌクレオシド間結合、あるいは1つまたはそれ以上の短
鎖ヘテロ原子または複素環ヌクレオシド間結合により形成されるバックボーンを
有する。これらには、モルホリノ結合（部分的にヌクレオシドの糖部分から形成
される）；シロキサンバックボーン；スルフィド、スルホキシドおよびスルホン
バックボーン；ホルムアセチルおよびチオホルムアセチルバックボーン；メチレ
ンホルムアセチルおよびチオホルムアセチルバックボーン；アルケン含有バック
ボーン；スルファメートバックボーン；メチレンイミノおよびメチレンヒドラジ
ノバックボーン；スルホネートおよびスルホンアミドバックボーン；アミドバッ
クボーンを有するもの；並びに混合N、O、SおよびCH₂構成要素部分を有する他の
ものが含まれる。

【００３１】上記のオリゴヌクレオシドの調製を教示する代表的な米国特許には、米国特許
：5,034,506；5,166,315；5,185,444；5,214,134；5,216,141；5,235,033；5,26
4,562；5,264,564；5,405,938；5,434,257；5,466,677；5,470,967；5,489,677
；5,541,307；5,561,225；5,596,086；5,602,240；5,610,289；5,602,240；5,60
8,046；5,610,289；5,618,704；5,623,070；5,663,312；5,633,360；5,677,437
；および5,677,439が含まれるが、これらに限定されるわけではない。

【００３２】他の好ましいオリゴヌクレオチド模倣体において、ヌクレオチド単位の糖およ
びヌクレオシド間結合両方、すなわちバックボーンが、新規の基と置き換えられ
る。塩基単位は、適切な核酸標的化合物とのハイブリダイゼーションのため、維
持される。優れたハイブリダイゼーション特性を持つことが示されているオリゴ
ヌクレオチド模倣体であるこうしたオリゴマー化合物の1つは、ペプチド核酸（P
NA）と称される。PNA化合物において、オリゴヌクレオチドの糖-バックボーンは
、アミド含有バックボーン、特にアミノエチルグリシンバックボーンと置き換え
られる。ヌクレオ塩基は保持され、そしてバックボーンのアミド部分のアザ窒素
原子と、直接または間接的に結合される。PNA化合物の調製を教示する代表的な
米国特許には、米国特許：5,539,082；5,714,331；and 5,719,262が含まれるが
、これらに限定されるわけではない。PNA化合物のさらなる教示は、Nielsenら、
Science, 1991, 254, 1497-1500に見出すことができる。

【００３３】本発明の最も好ましい態様は、ホスホロチオエートバックボーンを持つオリゴ
ヌクレオチドおよびヘテロ原子バックボーンを持つオリゴヌクレオチド、並びに
特に上に引用される米国特許5,489,677の-CH₂-NH-O-CH₂-、-CH₂-N（CH₃）-O-CH₂ -（メチレン（メチルイミノ）またはMMIバックボーンとして知られる）、-CH₂-O
-N（CH₃）-CH₂-、-CH₂-N（CH₃）-N（CH₃）-CH₂-および-O-N（CH₃）-CH₂-CH₂-（
天然ホスホジエステルバックボーンは-O-P-O-CH₂-として示される）および上に
引用される米国特許5,602,240のアミドバックボーンを持つオリゴヌクレオチド
である。上に引用される米国特許5,034,506のモルホリノ骨格バックボーンを有
するオリゴヌクレオチドもまた、好ましい。

【００３４】修飾オリゴヌクレオチドはまた、1つまたはそれ以上の置換糖部分も含有する
ことができる。好ましいオリゴヌクレオチドは、2'位に以下の1つを含む：OH；F
；O-、S-、またはN-アルキル、O-アルキル-O-アルキル、O-、S-、またはN-アル
ケニル、あるいはO-、S-、またはN-アルキニルであって、ここでアルキル、アル
ケニルおよびアルキニルが、置換または非置換のC₁〜C₁₀アルキルまたはC₂〜C₁₀ アルケニルおよびアルキニルであってもよいもの。特に好ましいのは、O［（CH₂ ）_nO］_mCH₃、O（CH₂）_nOCH₃、O（CH₂）₂ON（CH₃）₂、O（CH₂）_nNH₂、O（CH₂）_nC
H₃、O（CH₂）_nONH₂、およびO（CH₂）_nON［（CH₂）_nCH₃］］₂であって、nおよびm
が1〜約10であるものである。他の好ましいオリゴヌクレオチドは、2'位に以下
の1つを含む：C₁〜C₁₀の低級アルキル、置換低級アルキル、アルカリール、アラ
ルキル、O-アルカリールまたはO-アラルキル、SH、SCH₃、OCN、Cl、Br、CN、CF₃ 、OCF₃、SOCH₃、SO₂CH₃、ONO₂、NO₂、N₃、NH₂、ヘテロシクロアルキル、ヘテロ
シクロアルカリール、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリル
、RNA切断基、レポーター基、インターカレーター、オリゴヌクレオチドの薬物
動態特性を改善するための基、またはオリゴヌクレオチドの薬力学特性を改善す
るための基、および同様の特性を有する他の置換基。好ましい修飾には、2'-メ
トキシエトキシ（2'-O-CH₂CH₂OCH₃、2'-O-（2-メトキシエチル）または2'-MOEと
しても知られる）（Martinら、Helv. Chim. Acta, 1995, 78, 486-504）、すな
わちアルコキシアルコキシ基が含まれる。さらに好ましい修飾には、2'-DMAOEと
しても知られる2'-ジメチルアミノオキシエトキシ、すなわちO（CH₂）₂ON（CH₃
）₂基、および2'-ジメチルアミノ-エトキシエトキシ（2'-DMAEOE）、すなわち2'
-O-CH₂-O-CH₂-N（CH₂）₂が含まれる。

【００３５】他の好ましい修飾には、2'-メトキシ（2'-O-CH₃）、2'-アミノプロポキシ（2'
-OCH₂CH₂CH₂NH₂）、および2'-フルオロ（2'-F）が含まれる。同様の修飾はまた
、オリゴヌクレオチド上の他の位置、特に3'末端ヌクレオチド上のまたは2'-5'
結合オリゴヌクレオチド内の糖の3'位および5'末端ヌクレオチドの5'位でも行っ
てもよい。オリゴヌクレオチドはまた、ペントフラノシル糖の代わりにシクロブ
チル部分などの糖模倣体も有してもよい。こうした修飾糖構造の調製を教示する
代表的な米国特許には、米国特許：4,981,957；5,118,800；5,319,080；5,359,0
44；5,393,878；5,446,137；5,466,786；5,514,785；5,519,134；5,567,811；5,
576,427；5,591,722；5,597,909；5,610,300；5,627,053；5,639,873；5,646,26
5；5,658,873；5,670,633；および5,700,920が含まれるが、これらに限定される
わけではない。

【００３６】オリゴヌクレオチドはまた、ヌクレオ塩基（当該技術分野において、しばしば
単に「塩基」と称される）修飾または置換も含んでもよい。本明細書において使
用する場合、「非修飾」または「天然」ヌクレオ塩基には、プリン塩基であるア
デニン（A）およびグアニン（G）、並びにピリミジン塩基であるチミン（T）、
シトシン（C）およびウラシル（U）が含まれる。修飾ヌクレオ塩基には、他の合
成および天然ヌクレオ塩基が含まれ、例えば5-メチルシトシン（5-me-Cまたはm5
C）、5-ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、2-アミノア
デニン、アデニンおよびグアニンの6-メチルおよび他のアルキル誘導体、アデニ
ンおよびグアニンの2-プロピルおよび他のアルキル誘導体、2-チオウラシル、2-
チオチミンおよび2-チオシトシン、5-ハロウラシルおよびシトシン、5-プロピニ
ルウラシルおよびシトシン、6-アゾウラシル、シトシンおよびチミン、5-ウラシ
ル（シュードウラシル）、4-チオウラシル、8-ハロ、8-アミノ、8-チオール、8-
チオアルキル、8-ヒドロキシルおよび他の8-置換アデニン類およびグアニン類、
5-ハロ、特に5-ブロモ、5-トリフルオロメチルおよび他の5-置換ウラシル類およ
びシトシン類、7-メチルグアニンおよび7-メチルアデニン、8-アザグアニンおよ
び8-アザアデニン、7-デアザグアニンおよび7-デアザアデニン並びに3-デアザグ
アニンおよび3-デアザアデニンが含まれる。さらなるヌクレオ塩基には、米国特
許3,687,808に開示されるもの、The Concise Encyclopedia Of Polymer Science
And Engineering（1990, pages 858-859, Kroschwitz, J.I., ed. John Wiley
& Sons）に開示されるもの、Englischら（Angewandte Chemie, International E
dition 1991, 30, 613-722）に開示されるもの、およびSanghvi, Y.S.、第15章
、Antisense Research and Applications（1993, pages 289-302, Crooke, S.T.
and Lebleu, B., ed., CRC Press）に開示されるものが含まれる。これらのヌ
クレオ塩基の特定のものは、本発明のオリゴマー化合物の結合親和性を増加させ
るのに特に有用である。これらには、5-置換ピリミジン類、6-アザピリミジン類
およびN-2、N-6およびO-6置換プリン類が含まれ、2-アミノプロピルアデニン、5
-プロピニルウラシルおよび5-プロピニルシトシンが含まれる。5-メチルシトシ
ン置換は、核酸二重鎖安定性を、0.6〜1.2℃増加させることが示されており（Sa
nghvi, Y.S., Crooke, S.T. and Lebleu, B., eds., Antisense Research and A
pplications 1993, CRC Press, Boca Raton, pages 276-278）、そして現在好ま
しい塩基置換であり、2'-O-メトキシエチル糖修飾と組み合わされた場合、特に
より好ましい。

【００３７】上記の修飾ヌクレオ塩基の特定のものと共に他の修飾ヌクレオ塩基の調製を教
示する代表的な米国特許には、上記の米国特許3,687,808と共に、米国特許：4,8
45,205；5,130,302；5,134,066；5,175,273；5,367,066；5,432,272；5,457,187
；5,459,255；5,484,908；5,502,177；5,525,711；5,552,540；5,587,469；5,59
4,121, 5,596,091；5,614,617；および5,681,941が含まれるが、これらに限定さ
れるわけではない。

【００３８】本発明のオリゴヌクレオチドの別の修飾は、オリゴヌクレオチドに、そのオリ
ゴヌクレオチドの活性、細胞分布または細胞取り込みを亢進させる、1つまたは
それ以上の部分または結合体を化学的に結合させることを伴う。こうした部分に
は、脂質部分、例えばコレステロール部分（Letsinger et al., Proc. Natl. Ac
ad. Sci. USA 1989, 86, 6553-6556）、コール酸（Manoharan et al., Bioorg.
Med. Chem. Lett. 1994, 4, 1053-1059）、チオエーテル、例えば、ヘキシル-S-
トリチルチオール（Manoharan et al., Ann. N.Y. Acad. Sci. 1992, 660, 306-
309；Manoharan et al., Bioorg. Med. Chem. Let. 1993, 3, 2765-2770）、チ
オコレステロール（Oberhauser et al., Nucl. Acids Res. 1992, 20, 533-538
）、脂肪族鎖、例えばドデカンジオールまたはウンデシル残基（Saison-Behmoar
as et al., EMBO J. 1991, 10, 1111-1118; Kabanov et al., FEBS Lett. 1990,
259, 327-330；Svinarchuk et al., Biochimie 1993, 75, 49-54）、リン脂質
、例えばジ-ヘキサデシル-rac-グリセロールまたはトリエチルアンモニウム1,2-
ジ-O-ヘキサデシル-rac-グリセロ-3-H-ホスホネート（Manoharan et al., Tetra
hedron Lett. 1995, 36, 3651-3654；Shea et al., Nucl. Acids Res. 1990, 18
, 3777-3783）、ポリアミンまたはポリエチレングリコール鎖（Manoharan et al
., Nucleosides & Nucleotides 1995, 14, 969-973）、あるいはアダマンタン酢
酸（Manoharan et al., Tetrahedron Lett. 1995, 36, 3651-3654）、パルミチ
ル部分（Mishra et al., Biochim. Biophys. Acta 1995, 1264, 229-237）、あ
るいはオクタデシルアミンまたはヘキシルアミノ-カルボニル-オキシコレステロ
ール部分（Crooke et al., J. Pharmacol. Exp. Ther. 1996, 277, 923-937）が
含まれるが、これらには限定されない。

【００３９】こうしたオリゴヌクレオチド結合体の調製を解説する代表的な米国特許には、
米国特許：4,828,979；4,948,882；5,218,105；5,525,465；5,541,313；5,545,7
30；5,552,538；5,578,717, 5,580,731；5,580,731；5,591,584；5,109,124；5,
118,802；5,138,045；5,414,077；5,486,603；5,512,439；5,578,718；5,608,04
6；4,587,044；4,605,735；4,667,025；4,762,779；4,789,737；4,824,941；4,8
35,263；4,876,335；4,904,582；4,958,013；5,082,830；5,112,963；5,214,136
；5,082,830；5,112,963；5,214,136；5,245,022；5,254,469；5,258,506；5,26
2,536；5,272,250；5,292,873；5,317,098；5,371,241, 5,391,723；5,416,203,
5,451,463；5,510,475；5,512,667；5,514,785；5,565,552；5,567,810；5,574
,142；5,585,481；5,587,371；5,595,726；5,597,696；5,599,923；5,599,928
および5,688,941が含まれるが、これらに限定されるわけではない。

【００４０】本発明はまた、キメラオリゴヌクレオチドであるオリゴヌクレオチドも含む。
本発明の文脈において、「キメラ」オリゴヌクレオチドまたは「キメラ」は、各
々少なくとも1つのヌクレオチドからなる、2つまたはそれ以上の化学的に異なる
領域を含有するオリゴヌクレオチドである。これらのオリゴヌクレオチドは、典
型的には、少なくとも一つの領域を含有しており、そのオリゴヌクレオチドに、
ヌクレアーゼ分解に対する耐性の増加、細胞取り込みの増加、および／または標
的核酸に対する結合親和性の増加を与えるように、そのオリゴヌクレオチドが修
飾されている。オリゴヌクレオチドのさらなる領域は、RNA：DNAまたはRNA：RNA
ハイブリッドを切断することができる酵素に対する基質として働く可能性がある
。例として、RNase Hは、RNA：DNA二重鎖のRNA鎖を切断する細胞性エンドヌクレ
アーゼである。RNase Hの活性化は、したがって、RNA標的の切断を生じ、それに
より、遺伝子発現のアンチセンス阻害の効率を非常に亢進させる。RNA標的の切
断は、ゲル電気泳動、および必要な場合、当該技術分野において知られる関連す
る核酸ハイブリダイゼーション技術により、日常的に検出できる。このRNA標的
のRNase H-媒介性切断は、核酸を切断するためのリボザイムの使用とは異なる。
リボザイムは本発明に含まれない。

【００４１】キメラオリゴヌクレオチドの例には、通常、互いに化学的に同等であるが、ギ
ャップとは異なる2つの領域に隣接する中央領域を有する、3つの異なる領域が存
在する「ギャップマー」が含まれるが、これに限定されるわけではない。ギャッ
プマーの好ましい例は、オリゴヌクレオチドの中央部分（「ギャップ」）が、RN
ase Hの基質として働き、そして好ましくは2'-デオキシヌクレオチドで構成され
、一方、隣接領域（5'および3'「ウィング」）が、標的RNA分子により高い親和
性を有するよう修飾されているが、ヌクレアーゼ活性を支持することができない
（例えばフルオロまたは2'-メトキシエチル-置換）、オリゴヌクレオチドである
。キメラオリゴヌクレオチドは、糖上に修飾を持つものに限定されず、修飾バッ
クボーンを持つ、例えばホスホロチオエート（P＝S）およびホスホジエステル（
P＝O）バックボーン結合の領域、またはMMIおよびP＝Sバックボーン結合の領域
を持つ、オリゴヌクレオシドまたはオリゴヌクレオチドもまた、含んでもよい。
他のキメラは、当該技術分野において「ヘミマー」としても知られる「ウィング
マー」、すなわち2つの異なる領域を持つオリゴヌクレオチドを含む。ウィング
マーの好ましい例では、オリゴヌクレオチドの5'部分は、RNase Hの基質として
働き、そして好ましくは2'-デオキシヌクレオチドで構成され、一方、3'部分は
、標的RNA分子に対するより高い親和性を有する方式で修飾されるが、ヌクレア
ーゼ活性を支持することができない（例えば2'-フルオロ-または2'-O-メトキシ
エチル-置換）か、またはその逆である。一態様において、本発明のオリゴヌク
レオチドは、少なくとも1つのヌクレオチドの糖部分上に、2'-O-メトキシエチル
（2'-O-CH₂CH₂OCH₃）修飾を含む。この修飾は、オリゴヌクレオチドのその標的
への親和性およびオリゴヌクレオチドのヌクレアーゼ耐性の両方を増加させるこ
とが示されている。本発明にしたがい、本発明のオリゴヌクレオチドの、1つの
、複数の、またはすべてのヌクレオチドサブユニットは、2'-O-メトキシエチル
（-O-CH₂CH₂OCH₃）修飾を有してもよい。2'-O-メトキシエチル修飾を有する複数
のヌクレオチドサブユニットを含むオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチド
内のいずれかのヌクレオチドサブユニット上にこうした修飾を有してもよく、そ
してキメラオリゴヌクレオチドであってもよい。2'-O-メトキシエチル修飾のほ
かに、またはその修飾に加え、アンチセンス効率、強度または標的親和性を亢進
させる、他の修飾を含有するオリゴヌクレオチドもまた、好ましい。1つまたは
それ以上のこうした修飾を含むキメラオリゴヌクレオチドが、現在、好ましい。

【００４２】本発明にしたがって用いられるオリゴヌクレオチドは、固相合成の周知の技術
を通じ、都合よくそして日常的に、作成することができる。こうした合成のため
の装置は、Applied Biosystemsを含む、いくつかの業者により、販売されている
。こうした合成のための、いずれか他の手段もまた、使用することができ；オリ
ゴヌクレオチドの実際の合成は、日常的に合成を行うものの技能の範囲内である
。ホスホロチオエートおよび2'-O-メトキシエチルオリゴヌクレオチドを含む、2
'-アルコキシまたは2'-アルコキシアルコキシ誘導体などのオリゴヌクレオチド
を調製する同様の技術を用いることがよく知られている（Martin, P., Helv. Ch
im. Acta 1995, 78, 486-504）。同様の技術および商業的に入手可能な修飾アミ
ダイトおよび調節孔ガラス（CPG）製品、例えばビオチン、フルオレセイン、ア
クリジンまたはソラレン修飾アミダイトおよび／またはCPG（Glen Research, St
erling, VAより入手可能）を用い、蛍光標識された、ビオチン化されたまたは他
の結合体化されたオリゴヌクレオチドを合成することもまた、よく知られている
。

【００４３】本発明のアンチセンス化合物は、薬学的に許容可能な塩およびプロドラッグを
含む、生物学的等価化合物を含む。これは、いかなる薬学的に許容可能な塩、エ
ステル、またはこうしたエステルの塩も、あるいはヒトを含む動物に投与した際
、生物学的に活性がある代謝産物またはその残留物を（直接または間接的に）提
供することが可能な、いずれか他の化合物も含む。したがって、例えば、本開示
はまた、本発明の核酸の薬学的に許容可能な塩およびこうした核酸のプロドラッ
グにも関する。「薬学的に許容可能な塩」は、本発明の核酸の生理学的および薬
学的に許容可能な塩：すなわち親化合物の望ましい生物学的活性を保持し、そし
て望ましくない毒物学的影響を与えない塩である（例えば、Berge et al.,“Pha
rmaceutical Salts,”J. of Pharma Sci. 1977, 66, 1-19を参照されたい）。

【００４４】オリゴヌクレオチドに関しては、薬学的に許容可能な塩には、（a）陽イオン
、例えばナトリウム、カリウム、アンモニウム、マグネシウム、カルシウム、ポ
リアミン、例えばスペルミンおよびスペルミジンなどで形成される塩；（b）無
機酸、例えば塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸、硝酸などにより形成される酸付
加塩；（c）有機酸、例えば酢酸、シュウ酸、酒石酸、コハク酸、マレイン酸、
フマル酸、グルコン酸、クエン酸、リンゴ酸、アスコルビン酸、安息香酸、タン
ニン酸、パルミチン酸、アルギン酸、ポリグルタミン酸、ナフタレンスルホン酸
、メタンスルホン酸、p-トルエンスルホン酸、ナフタレンジスルホン酸、ポリガ
ラクツロン酸、などにより形成される塩；並びに（d）塩素、臭素、およびヨー
ドなど元素陰イオンから形成される塩；が含まれるが、これらに限定されるわけ
ではない。

【００４５】本発明のオリゴヌクレオチドは、追加的にまたは代替的に、「プロドラッグ」
型で送達されるよう、調製してもよい。「プロドラッグ」という用語は、内因性
酵素または他の化学物質および／または条件の作用により、体内またはその細胞
内で活性型（すなわち薬剤）に変換される、不活性型で調製されている治療剤を
示す。特に、本発明のオリゴヌクレオチドのプロドラッグ型は、1993年12月9日
に公開されたGosselinらに対するWO 93／24510に開示される方法にしたがったSA
TE（（S-アセチル-2-チオエチル）リン酸）誘導体として調製される。

【００４６】治療的または予防的処置のため、本発明にしたがい、オリゴヌクレオチドを投
与する。本発明のオリゴヌクレオチド化合物は、薬剤組成物中に製剤化してもよ
く、これは、オリゴヌクレオチドに加え、薬学的に許容可能なキャリアー、増粘
剤、希釈剤、緩衝剤、保存剤、界面活性剤、中性または陽イオン性脂質、脂質複
合体、リポソーム、浸透亢進剤、キャリアー化合物および他の薬学的に許容可能
なキャリアーまたは賦形剤などを含んでもよい。こうした組成物および製剤が本
発明に含まれる。

【００４７】本発明のオリゴヌクレオチドを含む薬剤組成物は、オリゴヌクレオチドの消化
管吸収を亢進するため、浸透亢進剤を含んでもよい。浸透亢進剤は、5つの広い
カテゴリー、すなわち、脂肪酸、胆汁酸塩、キレート剤、界面活性剤、および非
界面活性剤、の1つに属するとして分類することができる（Lee et al., Critica
l Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems 1991, 8, 91-192; Muranishi
, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems 1990, 7, 1-33）。
1つまたはそれ以上のこれらの広いカテゴリーから1つまたはそれ以上の浸透亢進
剤を含んでもよい。

【００４８】浸透亢進剤として作用する、様々な脂肪酸およびその誘導体には、例えば、オ
レイン酸、ラウリン酸、カプリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン
酸、リノール酸、リノレン酸、ジカプレート、トリカプレート、レシンリエート
（recinleate）、モノオレイン（別名1-モノオレオイル-rac-グリセロール）、
ジラウリン、カプリル酸、アラキドン酸、グリセリン-1-モノカプレート、1-ド
デシルアザシクロへプタン-2-オン、アシルカルニチン類、アシルコリン類、そ
れらのモノ-およびジ-グリセリド類、並びに生理学的に許容しうる塩（すなわち
オレイン酸塩、ラウリン酸塩、カプリン酸塩、ミリスチン酸塩、パルミチン酸塩
、ステアリン酸塩、リノール酸塩など）が含まれる（Lee et al., Critical Rev
iews in Therapeutic Drug Carrier Systems 1991, page 92; Muranishi, Criti
cal Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems 1990, 7, 1; El-Hariri et
al., J. Pharm. Pharmacol. 1992 44, 651-654）。

【００４９】胆汁の生理学的役割には、脂質および脂溶性ビタミンの分散および吸収の促進
が含まれる（Brunton, Chapter 38 In: Goodman & Gilman's The Pharmacologic
al Basis of Therapeutics, 9th Ed., Hardman et al., eds., McGraw-Hill, Ne
w York, NY, 1996, pages 934-935）。様々な天然の胆汁酸塩、およびそれらの
合成誘導体は、浸透亢進剤として作用する。したがって、「胆汁酸塩」という用
語には、胆汁のいずれかの天然に存在する構成要素と共にそのいずれかの合成誘
導体も含まれる。

【００５０】 1つまたはそれ以上の浸透亢進剤を含む複合製剤を用いてもよい。例えば、胆
汁酸塩を、脂肪酸と組み合わせて使用し、複合製剤を作成してもよい。キレート剤には、エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム（EDTA）、クエン酸、
サリチル酸塩類（例えばサリチル酸ナトリウム、5-メトキシサリチレートおよび
ホモバニレート（homovanilate））、コラーゲンのN-アシル誘導体、ラウレス（
laureth）-9およびベータ-ジケトン類のN-アミノアシル誘導体（エナミン類）が
含まれるが、これらに限定されるわけではない（Lee et al., Critical Reviews
in Therapeutic Drug Carrier Systems 1991, page 92; Muranishi, Critical
Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems 1990, 7, 1-33；Buur et al.,
J. Control Rel. 1990, 14, 43-51）。キレート剤は、DNase阻害剤としても働く
、追加的利点を有する。

【００５１】界面活性剤には、例えば、ラウリル硫酸ナトリウム、ポリオキシエチレン-9-
ラウリルエーテルおよびポリオキシエチレン-20-セチル-エーテル（Lee et al.,
Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems 1991, page 92）；
およびペルフルオロ化学乳剤、例えばFC-43（Takahashi et al., J. Pharm. Pha
macol. 1988, 40, 252-257）が含まれる。

【００５２】非界面活性剤には、例えば、非飽和環状尿素、1-アルキル-および1-アルケニ
ルアザシクロ-アルカノン誘導体（Lee et al., Critical Reviews in Therapeut
ic Drug Carrier Systems 1991, page 92）；および非ステロイド性抗炎症剤、
例えばジクロフェナクナトリウム、インドメタシンおよびフェニルブタゾン（Ya
mashita et al., J. Pharm. Pharmacol. 1987, 39, 621-626）が含まれる。

【００５３】本明細書において使用する場合、「キャリアー化合物」は、不活性である（す
なわち、それ自体、生物学的活性を持たない）が、例えば、生物学的に活性な核
酸を分解する、または循環からのその除去を促進することにより、生物学的活性
を有する核酸の生物学的利用能を減少させるin vivo過程により、核酸として認
識される、核酸、またはその類似体を指す。核酸およびキャリアー化合物の同時
投与は、典型的には、後者の物質が過剰であり、おそらく共通の受容体に対する
キャリアー化合物および核酸の間の競合のため、肝臓、腎臓または他の循環外貯
蔵器官において回収される核酸の量を実質的に減少させることができる。キャリ
アー化合物と対照的に、「薬学的に許容可能なキャリアー」（賦形剤）は、動物
に1つまたはそれ以上の核酸を送達するための、薬学的に許容可能な溶媒、懸濁
剤またはいずれか他の薬理学的に不活性なビヒクルである。薬学的に許容可能な
キャリアーは、液体または固体であってもよく、そして既定の薬剤組成物の核酸
および他の構成要素と組み合わせた際、望ましいバルク、コンシステンシーなど
を提供するように、計画した方式の投与と共に選択する。典型的な薬学的に許容
可能なキャリアーには、結合剤（例えば、α化トウモロコシデンプン、ポリビニ
ルピロリドンまたはヒドロキシプロピルメチルセルロースなど）；充填剤（例え
ばラクトースおよび他の糖、微結晶性セルロース、ペクチン、ゼラチン、硫酸カ
ルシウム、エチルセルロース、ポリアクリレート類またはリン酸水素カルシウム
など）；潤滑剤（例えばステアリン酸マグネシウム、タルク、シリカ、コロイド
性二酸化ケイ素、ステアリン酸、金属性ステアリン酸塩類、硬化植物油類、コー
ンスターチ、ポリエチレングリコール類、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウム
など）；崩壊剤（例えばデンプン、デンプングリコール酸ナトリウムなど）；ま
たは湿潤剤（例えばラウリル硫酸ナトリウムなど）が含まれるが、これらに限定
されるわけではない。持続放出経口送達系および／または経口投与剤形のための
腸被覆は、米国特許4,704,295；4,556,552；4,309,406；および4,309,404に記載
される。

【００５４】本発明の組成物はまた、さらに、薬剤組成物に慣用的に見られる他の付属構成
要素を、その当該技術分野において確立された使用レベルで、含んでもよい。し
たがって、例えば、組成物は、例えばかゆみ止め剤、収斂剤、局所麻酔剤または
抗炎症剤などの、さらなる適合する薬学的に活性な物質を含んでもよいし、ある
いは、本発明の組成物の様々な剤形を物理的に処方するのに有用である、さらな
る物質、例えば色素、着香剤、保存剤、酸化防止剤、乳白剤（opacifier）、増
粘剤および安定化剤などを含んでもよい。しかし、こうした物質は、添加される
際、本発明の組成物の構成要素の生物学的活性を、過度に妨げてはならない。

【００５５】本発明のオリゴヌクレオチドが患者に導入される方法に関わらず、コロイド分
散系を送達ビヒクルとして用い、オリゴヌクレオチドのin vivo安定性を亢進し
および／または特定の器官、組織または細胞種に対してオリゴヌクレオチドを標
的化してもよい。コロイド分散系には、巨大分子複合体、ナノカプセル、微小球
体、ビーズ、並びに水中油エマルジョン、ミセル、混合ミセル、リポソームおよ
び性質決定されない構造の脂質：オリゴヌクレオチド複合体を含む脂質に基づく
系が含まれるが、これらに限定されるわけではない。好ましいコロイド分散系は
、複数のリポソームである。リポソームは、二層立体配置に配置された脂質で構
成される、1つまたはそれ以上の外層により取り囲まれた水性コアを有する顕微
鏡的球体である（一般的には、Chonn et al., Current Op. Biotech. 1995, 6,
698-708を参照されたい）。

【００５６】本発明の薬剤組成物は、局所または全身治療が望ましいかどうかに応じ、そし
て治療しようとする領域に応じ、いくつかの方式で投与することができる。投与
は、局所（眼、膣、直腸、鼻腔内、上皮、および経皮を含む）、経口または非経
口であってもよい。非経口投与は、静脈内滴注、皮下、腹腔内または筋内注射、
例えば吸入（inhalation）または吹き入れ（insufflation）による肺投与、ある
いは頭蓋内、例えばくも膜下または脳室内、投与を含む。少なくとも1つの2'-O-
メトキシエチル修飾を持つオリゴヌクレオチドは、経口投与に特に有用であると
考えられる。

【００５７】局所投与のための製剤は、経皮パッチ、軟膏、ローション、クリーム、ゲル、
ドロップ、座薬、スプレー、液体および粉末を含んでもよい。慣用的な薬剤キャ
リアー、水性、粉末または油性基剤、増粘剤（thickener）などが必要であるま
たは望ましい可能性がある。被覆コンドーム、手袋などもまた、有用である可能
性がある。

【００５８】経口投与のための組成物には、粉末または顆粒、水または非水性媒体中の懸濁
物または溶液、カプセル、サシェー剤（sachet）または錠剤が含まれる。増粘剤
、着香剤（flavoring agents）、希釈剤、乳化剤、分散補助または結合剤が望ま
しい可能性もある。

【００５９】非経口投与のための組成物は、バッファー、希釈剤および他の適切な添加物も
また含んでもよい、無菌水性溶液を含んでもよい。いくつかの場合、治療措置の
効率を増加させるため、他の伝統的な治療様式と組み合わせて、本発明のオリゴ
ヌクレオチドで、患者を治療することがより有効である可能性がある。本発明の
文脈において、「治療措置」という用語は、療法、緩和および予防様式を含むこ
とを意味する。例えば、患者は、慣用的な化学療法剤、特に、腫瘍および癌治療
に用いられるもので治療してもよい。こうした化学療法剤の例には、ダウノルビ
シン、ダウノマイシン、ダクチノマイシン、ドキソルビシン、エピルビシン、イ
ダルビシン、エソルビシン、ブレオマイシン、マホスファミド、イホスファミド
、シトシンアラビノシド、ビス-クロロエチルニトロソ尿素、ブスルファン、マ
イトマイシンC、アクチノマイシンD、ミトラマイシン、プレドニソン、ヒドロキ
シプロゲステロン、テストステロン、タモキシフェン、ダカルバジン、プロカル
バジン、ヘキサメチルメラミン、ペンタメチルメラミン、マイトキサントロン、
アムサクリン、クロランブシル、メチルシクロヘキシルニトロソ尿素、ナイトロ
ジェンマスタード、メルファラン、シクロホスファミド、6-メルカプトプリン、
6-チオグアニン、シタラビン（CA）、5-アザシチジン、ヒドロキシ尿素、デオキ
シコフォルマイシン、4-ヒドロキシペルオキシシクロホスホールアミド、5-フル
オロウラシル（5-FU）、5-フルオロデオキシウリジン（5-FUdR）、メトトレキセ
ート（MTX）、コルヒチン、タキソール、ビンクリスチン、ビンブラスチン、エ
トポシド、トリメトトレキセート、テニポシド、シスプラチンおよびジエチルス
チルベストロール（DES）が含まれるが、これらに限定されるわけではない。一
般的には、The Merck Manual of Diagnosis and Therapy、第15版（1987, pp. 1
206-1228, Berkow et al., eds., Rahway, N.J.）を参照されたい。本発明の化
合物と共に用いる場合、こうした化学療法剤は、個々に（例えば5-FUおよびオリ
ゴヌクレオチド）、1つまたはそれ以上の他のこうした化学療法剤と、連続して
（例えば、一定期間の5-FUおよびオリゴヌクレオチドに続き、MTXおよびオリゴ
ヌクレオチド）、あるいは組み合わせて（例えば、5FU、MTXおよびオリゴヌクレ
オチド、または5-FU、放射線療法およびオリゴヌクレオチド）用いてもよい。

【００６０】治療用組成物の製剤化およびそれに続く投与は、当業者の技術の範囲内である
と考えられる。用量は、治療しようとする疾患状態の重症度および反応性に応じ
、治療過程は数日から数ヶ月、あるいは治癒が達成されるまでまたは疾患状態の
軽減が達成されるまで持続する。最適投薬計画は、患者の体内の薬剤蓄積の測定
値から計算することができる。当業者は、容易に最適用量、投薬方法および反復
率を決定することができる。最適用量は、個々のオリゴヌクレオチドの相対強度
に応じ異なる可能性があり、そして一般的にin vitroおよびin vivo動物モデル
で有効であることが見出されたEC₅₀に基づき、概算することができる。一般的に
、用量は体重1 kg当たり0.01μg〜100 gであり、そして1日、1週間、1ヶ月また
は1年に1回またはそれ以上、あるいは2ないし20年ごとに1回、投与してもよい。
当業者は、体液または組織における、薬剤の測定された滞留時間および濃度に基
づく投薬反復率を、容易に概算することができる。治療の成功後、患者に疾患状
態の再発を防ぐ維持療法を受けさせることが望ましい場合があり、ここで、オリ
ゴヌクレオチドは、毎日1回またはそれ以上、ないし20年ごとに1回、体重1 kg当
たり0.01μg〜100 gの範囲の維持用量で投与される。

【００６１】以下の実施例は、本発明を例示するためのみに提供され、そして本発明を限定
することを意図しない。

【００６２】

【実施例】実施例1：オリゴヌクレオチドの合成非修飾オリゴデオキシヌクレオチドは、ヨウ素による酸化を伴う標準的ホスホ
ールアミダイト化学反応を用い、自動化DNA合成装置（Applied Biosystems モデ
ル380B）上で合成する。β-シアノエチルジイソプロピル-ホスホールアミダイト
は、Applied Biosystems（Foster City, CA）より購入する。ホスホロチオエー
トオリゴヌクレオチドに関しては、ホスファイト結合の段階的チア化（thiation
）のため、標準的酸化ビンを、アセトニトリル中0.2 Mの³H-1,2-ベンゾジチオー
ル-3-オン1,1-ジオキシド溶液により置き換えた。チア化サイクル待機工程を68
秒に増やし、そして続いてキャッピング工程を行った。シトシンは、5-メチルシ
トシンでもよい（5-メチルデオキシシチジンホスホールアミダイトは、Glen Res
earch, Sterling, VA、またはAmersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJよ
り入手可能）。

【００６３】 2'-メトキシオリゴヌクレオチドは、2'-メトキシβ-シアノエチルジイソプロ
ピル-ホスホールアミダイト（Chemgenes, Needham, MA）、並びにテトラゾール
および塩基のパルス搬送後の待機工程を360秒に増加すること以外は、非修飾オ
リゴヌクレオチドの標準的なサイクルを用い、合成する。他の2'-アルコキシオ
リゴヌクレオチドは、適切な2'-修飾アミダイト、例えばGlen Research, Inc.（
Sterling, VA）より入手可能なものを用い、本方法を修飾することにより、合成
する。

【００６４】 2'-フルオロオリゴヌクレオチドは、Kawasakiら（J. Med. Chem. 1993, 36, 8
31-841）に記載されるように合成する。簡潔には、商業的に入手可能な9-β-D-
アラビノフラノシルアデニンを出発物質として利用し、そして文献法を修飾する
ことにより、2'-α-フルオロ原子を、2'-β-O-トリフィル（trifyl）基のS_N2置
換により導入し、保護ヌクレオシドN⁶-ベンゾイル-2'-デオキシ-2'-フルオロア
デノシンを合成する。したがって、N⁶-ベンゾイル-9-β-D-アラビノフラノシル
アデニンは、3',5'-ジテトラヒドロピラニル（THP）中間体として、中程度の収
量で、選択的に保護される。THPおよびN⁶-ベンゾイル基の脱保護は、標準的方法
を用いて、達成され、そして標準的方法を用いて、5'-ジメトキシトリチル-（DM
T）および5'-DMT-3'-ホスホールアミダイト中間体を得る。

【００６５】 2'-デオキシ-2'-フルオログアノシンの合成は、テトライソプロピルジシロキ
サニル（TPDS）保護化9-β-D-アラビノフラノシルグアニンを出発物質として使
用し、そして、中間体ジイソブチリル-アラビノフラノシルグアノシンへの変換
を使用して、達成する。TPDS基の脱保護に続き、ヒドロキシル基をTHPで保護し
、ジイソブチリルジ-THP保護化アラビノフラノシルグアニンを得る。選択的O-脱
アシル化およびトリフラート化に続いて、粗生成物のフルオリドでの処理を行い
、その後、THP基の脱保護を行う。標準的方法を用いて、5'-DMT-および5'-DMT-3
'-ホスホールアミダイトを得る。

【００６６】 2'-デオキシ-2'-フルオロウリジンの合成は、既知の方法の修飾により達成し
、ここで2,2'-無水-1-β-D-アラビノフラノシルウラシルを、70％フッ化水素-ピ
リジンで処理する。標準法を用いて、5'-DMTおよび5'-DMT-3'ホスホールアミダ
イトを得る。

【００６７】 2'-デオキシ-2'-フルオロシチジンは、2'-デオキシ-2'-フルオロウリジンのア
ミノ化を介して合成し、それに続き、選択的保護によりN⁴-ベンゾイル-2'-デオ
キシ-2'-フルオロシチジンを得る。標準的な方法を用いて、5'-DMTおよび5'-DMT
-3'ホスホールアミダイトを得る。

【００６８】 2'-（2-メトキシエチル）-修飾アミダイトは、Martin, P.（Helv. Chim. Acta
1995, 78, 486-506）にしたがい、合成した。合成を容易にするため、最後のヌ
クレオチドはデオキシヌクレオチドであってもよい。2'-O-CH₂CH₂OCH₃-シトシン
は、5-メチルシトシンであってもよい。

【００６９】 5-メチルシトシン単量体の合成： 2,2'-無水［1-（β-D-アラビノフラノシル）-5-メチルウリジン］： 5-メチルウリジン（リボシルチミン、ヤマサ、日本・銚子を通じ商業的に入手
可能）（72.0 g、0.279 M）、炭酸ジフェニル（90.0 g、0.420 M）および炭酸水
素ナトリウム（2.0 g、0.024 M）をDMF（300 mL）に添加した。混合物を攪拌し
ながら加熱して還流し、発生する二酸化炭素ガスが調節された方式で放出させた
。1時間後、わずかに黒ずんだ溶液を減圧下で濃縮した。生じたシロップを、攪
拌しながらジエチルエーテル（2.5 L）に注いだ。産物はガム状物を形成した。
エーテルをデカントし、そして残留物を最少量のメタノール（およそ400 mL）に
溶解した。溶液を新鮮なエーテル（2.5 L）に注ぎ、硬いガム状物を得た。エー
テルをデカントし、そして粘性物質を真空オーブンで乾燥させ（60℃、1 mmHgで
24時間）、固体を得て、その固体を粉砕して薄い褐色の粉末にした（57 g、85％
粗収率）。その物質を、そのままさらなる反応に用いた。

【００７０】 2'-O-メトキシエチル-5-メチルウリジン： 2,2'-無水-5-メチルウリジン（195 g、0.81 M）、トリス（2-メトキシエチル
）ボレート（231 g、0.98 M）および2-メトキシエタノール（1.2 L）を、2 Lの
ステンレス鋼圧力容器に添加し、そしてあらかじめ加熱した油槽中、160℃で静
置した。155〜160℃で48時間加熱した後、容器を開き、そして溶液を蒸発乾固し
、そしてMeOH（200 mL）を加えて磨砕した。残留物を熱いアセトン（1 L）に懸
濁した。不溶性塩をろ過し、アセトン（150 mL）で洗浄し、そしてろ液を蒸発さ
せた。残留物（280 g）をCH₃CN（600 mL）に溶解し、そして蒸発させた。シリカ
ゲルカラム（3 kg）を、0.5％Et₃NHを含有するCH₂Cl₂／アセトン／MeOH（20：5
：3）中で充填した。残留物をCH₂Cl₂（250 mL）に溶解し、シリカ（150 g）上に
吸着させ、その後カラム上に装填した。産物を充填用溶媒で溶出し、160 g（63
％）の産物を得た。

【００７１】 2'-O-メトキシエチル-5'-O-ジメトキシトリチル-5-メチルウリジン： 2'-O-メトキシエチル-5-メチルウリジン（160 g、0.506 M）をピリジン（250
mL）と共蒸発させ、そして乾燥残留物をピリジン（1.3 L）に溶解した。塩化ジ
メトキシトリチルの第一のアリコート（94.3 g、0.278 M）を添加し、そして混
合物を室温で1時間攪拌した。塩化ジメトキシトリチルの第二のアリコート（94.
3 g、0.278 M）を添加し、そして反応物をさらに1時間攪拌した。その後、メタ
ノール（170 mL）を添加し、反応を停止した。HPLCは、およそ70％の産物の存在
を示した。溶媒を蒸発させ、そしてCH₃CN（200 mL）を加えて磨砕した。残留物
をCHCl₃（1.5 L）に溶解し、そして2×500 mLの飽和NaHCO₃および2×500 mLの飽
和NaClで抽出した。有機相をNa₂SO₄上で乾燥させ、ろ過し、そして蒸発させた。
275 gの残留物を得た。0.5％Et₃NHを含有するEtOAc／ヘキサン／アセトン（5：5
：1）で充填しそして溶出する3.5 kgのシリカゲルカラム上で、残留物を精製し
た。純粋画分を蒸発させ、164 gの産物を得た。不純画分からさらにおよそ20 g
を得て、総収量183 g（57％）を得た。

【００７２】 3'-O-アセチル-2'-O-メトキシエチル-5'-O-ジメトキシトリチル-5-メチルウリジン： 2'-O-メトキシエチル-5'-O-ジメトキシトリチル-5-メチルウリジン（106 g、0
.167 M）、DMF／ピリジン（562 mLのDMFおよび188 mLのピリジンから調製した3
：1混合物、750 mL）および無水酢酸（24.38 mL、0.258 M）を合わせ、そして室
温で24時間攪拌した。反応は、最初にtlc試料をMeOH添加で反応停止することに
より、tlcによりモニターした。tlcにより判断されるような反応の完了に際し、
MeOH（50 mL）を添加し、そして混合物を35℃で蒸発させた。残留物をCHCl₃（80
0 mL）に溶解し、そして2×200 mLの飽和炭酸水素ナトリウムおよび2×200 mLの
飽和NaClで抽出した。水層を200 mLのCHCl₃で逆抽出した。合わせた有機物を硫
酸ナトリウムで乾燥させ、そして蒸発させ、122 gの残留物を得た（およそ90％
の産物）。残留物を3.5 kgのシリカゲルカラム上で精製し、そしてEtOAc／ヘキ
サン（4：1）を用い溶出した。純粋産物画分を蒸発させ、96 g（84％）を得た。

【００７３】 3'-O-アセチル-2'-O-メトキシエチル-5'-O-ジメトキシトリチル-5-メチル-4 -トリアゾールウリジン： CH₃CN（700 mL）に3'-O-アセチル-2'-O-メトキシエチル-5'-O-ジメトキシトリ
チル-5-メチルウリジン（96 g、0.144 M）を溶解することにより、第一の溶液を
調製し、そして取り置いた。トリエチルアミン（189 mL、1.44 M）を、CH₃CN（1
L）中のトリアゾール（90 g、1.3 M）の溶液に添加し、-5℃に冷却し、そして
オーバーヘッドスターラーを用い、0.5時間攪拌した。POCl₃を、30分間にわたり
、0〜10℃に維持した攪拌溶液に一滴ずつ添加し、そして生じた混合物をさらに2
時間攪拌した。第一の溶液を、45分間にわたり、後者の溶液に一滴ずつ添加した
。生じた反応混合物を低温室に一晩保存した。反応混合物から塩をろ過し、そし
て溶液を蒸発させた。残留物をEtOAc（1 L）に溶解し、そして不溶固体をろ過に
より除去した。ろ液を、1×300 mLのNaHCO₃および2×300 mLの飽和NaClで洗浄し
、硫酸ナトリウム上で乾燥させ、そして蒸発させた。残留物にEtOAcを加えてす
りつぶし、表題化合物を得た。

【００７４】 2'-O-メトキシエチル-5'-O-ジメトキシトリチル-5-メチルシチジン：ジオキサン（500 mL）およびNH₄OH（30 mL）中の3'-O-アセチル-2'-O-メトキ
シエチル-5'-O-ジメトキシトリチル-5-メチル-4-トリアゾールウリジン（103 g
、0.141 M）の溶液を室温で2時間攪拌した。ジオキサン溶液を蒸発させ、そして
残留物をMeOH（2×200 mL）により共沸した。残留物をMeOH（300 mL）に溶解し
、そして2リットルのステンレス鋼圧力容器に移した。NH₃ガスで飽和させたMeOH
（400 mL）を添加し、そして容器を100℃に2時間加熱した（tlcは完全変換を示
した）。容器内容物を蒸発乾固させ、そして残留物をEtOAc（500 mL）に溶解し
、そして飽和NaCl（200 mL）で1回洗浄した。有機物を硫酸ナトリウム上で乾燥
させ、そして溶媒を蒸発させ、85 g（95％）の表題化合物を得た。

【００７５】 N⁴-ベンゾイル-2'-O-メトキシエチル-5'-O-ジメトキシトリチル-5-メチルシチジン： 2'-O-メトキシエチル-5'-O-ジメトキシトリチル-5-メチルシチジン（85 g、0.
134 M）をDMF（800 mL）に溶解し、そして安息香酸無水物（37.2 g、0.165 M）
を攪拌しながら添加した。3時間攪拌した後、tlcは反応がおよそ95％完了したこ
とを示した。溶媒を蒸発させ、そして残留物をMeOH（200 mL）と共沸した。残留
物をCHCl₃（700 mL）に溶解し、そして飽和NaHCO₃（2×300 mL）および飽和NaCl
（2×300 mL）で抽出し、MgSO₄上で乾燥させ、そして蒸発させ、残留物（96 g）
を得た。0.5％Et₃NHを含有するEtOAc／ヘキサン（1：1）を溶出溶媒として用い
、1.5 kgのシリカカラム上で残留物をクロマトグラフィーした。純粋産物画分を
蒸発させ、90 g（90％）の表題化合物を得た。

【００７６】 N⁴-ベンゾイル-2'-O-メトキシエチル-5'-O-ジメトキシトリチル-5-メチルシチジン-3'-アミダイト： N⁴-ベンゾイル-2'-O-メトキシエチル-5'-O-ジメトキシトリチル-5-メチルシチ
ジン（74 g、0.10 M）をCH₂Cl₂（1 L）に溶解した。テトラゾールジイソプロピ
ルアミン（7.1 g）および2-シアノエトキシ-テトラ（イソプロピル）ホスファイ
ト（40.5 mL、0.123 M）を、窒素雰囲気下で、攪拌しながら添加した。生じた混
合物を室温で20時間攪拌した（tlcは反応が95％完了したことを示した）。反応
混合物を飽和NaHCO₃（1×300 mL）および飽和NaCl（3×300 mL）で抽出した。水
性洗浄物をCH₂Cl₂（300 mL）で逆抽出し、そして抽出物を合わせ、MgSO₄上で乾
燥させそして濃縮した。EtOAc／ヘキサン（3：1）を溶出溶媒として用い、1.5 k
gのシリカカラム上で、得られた残留物をクロマトグラフィーした。純粋画分を
合わせ、90.6 g（87％）の表題化合物を得た。

【００７７】 5-メチル-2'-デオキシシチジン（5-me-C）含有オリゴヌクレオチドは、商業的
に入手可能なホスホールアミダイト（Glen Research, Sterling VA、またはChem
Genes, Needham MA）を用い、公表されている方法（Sanghvi et al., Nucl. Aci
ds Res. 1993, 21, 3197-3203）にしたがい、合成した。

【００７８】 2'-O-（ジメチルアミノオキシエチル）ヌクレオシドアミダイト 2'-（ジメチルアミノオキシエトキシ）ヌクレオシドアミダイト（当該技術分
野において2'-O-（ジメチルアミノオキシエチル）ヌクレオシドアミダイトとし
ても知られる）は、以下の段落に記載されるように調製する。アデノシン、シチ
ジンおよびグアノシンヌクレオシドアミダイトは、環外アミンを、アデノシンお
よびシチジンの場合にはベンゾイル部分で、そしてグアノシンの場合にはイソブ
チリルで保護する以外は、チミジン（5-メチルウリジン）と同様に調製する。

【００７９】 5'-O-tert-ブチルジフェニルシリル-O²-2'-無水-5-メチルウリジン O²-2'-無水-5-メチルウリジン（Pro. Bio. Sint., Varese, Italy、100.0 g、
0.416 mmol）、ジメチルアミノピリジン（0.66 g、0.013 eq、0.0054 mmol）を
、アルゴン雰囲気下で、そして機械的に攪拌し、乾燥ピリジン（500 mL）に周囲
温度で溶解した。tert-ブチルジフェニルクロロシラン（125.8 g、119.0 mL、1.
1 eq、0.458 mmol）を一度に加えた。反応物を周囲温度で16時間攪拌した。TLC
（Rf 0.22、酢酸エチル）は反応の完了を示した。減圧下で溶液を濃縮し、濃厚
な油にした。これをジクロロメタン（1 L）および飽和炭酸水素ナトリウム（2×
1 L）およびブライン（1 L）の間で分配した。有機層を硫酸ナトリウム上で乾燥
させ、そして減圧下で濃縮し、濃厚な油にした。その油を、酢酸エチルおよびエ
チルエーテルの1：1混合物（600 mL）に溶解し、そしてその溶液を-10℃に冷却
した。生じた結晶産物をろ過により収集し、エチルエーテル（3×200 mL）で洗
浄し、そして乾燥し（40℃、1 mmHg、24時間）、白色固体149 g（74.8％）を得
た。TLCおよびNMRは純粋産物と一致した。

【００８０】 5'-O-tert-ブチルジフェニルシリル-2'-O-（2-ヒドロキシエチル）-5-メチ
ルウリジン 2 Lのステンレス鋼の非攪拌圧力反応装置に、テトラヒドロフラン中のボラン
（1.0 M、2.0 eq、622 mL）を添加した。換気フード中でそして手動で攪拌しな
がら、エチレングリコール（350 mL、過剰量）を、始めは注意深く、水素ガスの
発生が収まるまで添加した。5'-O-tert-ブチルジフェニルシリル-O²-2'-無水-5-
メチルウリジン（149 g、0.311 mol）および炭酸水素ナトリウム（0.074 g、0.0
03 eq）を手動で攪拌しながら添加した。反応装置を密封し、そして油槽中で、
内部温度が160℃に到達するまで加熱し、そしてその後16時間維持した（圧力＜1
00 psig）。反応容器を周囲温度に冷却し、そして開封した。TLC（望ましい産物
のRf 0.67およびara-T副産物のRf 0.82、酢酸エチル）は、産物の約70％の変換
を示した。さらなる副産物形成を避けるため、反応を停止し、エチレングリコー
ルを除去するため、より厳しい条件を用い、減圧（10ないし1 mmHg）下で温水槽
（40-100℃）中で濃縮した。（あるいは低沸点溶媒がなくなったら、残った溶液
を酢酸エチルおよび水の間で分配してもよい。産物は有機相にあるであろう。）
カラムクロマトグラフィー（2 kg シリカゲル、酢酸エチル-ヘキサン勾配1：1な
いし4：1）により残留物を精製した。適切な画分を合わせ、ストリッピングしそ
して乾燥させ、白色のパリパリの泡状物として産物を得た（84 g、50％）。出発
物質（17.4 g）が混入しており、そして純粋な再利用可能な出発成分は20 gであ
った。出発物質に基づく、より純粋でない回収出発物質の収率は、58％であった
。TLCおよびNMRは99％純粋産物と一致した。

【００８１】 2'-O-（[2-フタルイミドオキシ]エチル）-5'-t-ブチルジフェニルシリル-5- メチルウリジン 5'-O-tert-ブチルジフェニルシリル-2'-O-（2-ヒドロキシエチル）-5-メチル
ウリジン（20 g、36.98 mmol）をトリフェニルホスフィン（11.63 g、44.36 mmo
l）およびN-ヒドロキシフタルイミド（7.24 g、44.36 mmol）と混合した。その
後、高真空下で、P₂O₅上で、40℃で2日間乾燥させた。反応混合物にアルゴンを
フラッシュし、そして乾燥THF（369.8 mL、Aldrich、sure seal bottle）を添加
し、透明な溶液を得た。ジエチル-アゾジカルボキシレート（6.98 mL、44.36 mm
ol）を反応混合物に一滴ずつ添加した。添加速度は、生じる真紅色が、次の滴を
添加する直前に消失するように維持する。添加完了後、反応物を4時間攪拌した
。その時点までに、TLCは反応完了を示した（酢酸エチル：ヘキサン、60：40）
。溶媒を真空中で蒸発させた。得た残留物をフラッシュカラムに入れ、そして酢
酸エチル：ヘキサン（60：40）で溶出し、白色泡状物として2'-O-（[2-フタルイ
ミドオキシ]エチル）-5'-t-ブチルジフェニルシリル-5-メチルウリジン（21.819
g、86％）を得た。

【００８２】 5'-O-tert-ブチルジフェニルシリル-2'-O-[（2-ホルムアドキシイミノオキ
シ）エチル]-5-メチルウリジン 2'-O-（[2-フタルイミドオキシ]エチル）-5'-t-ブチルジフェニルシリル-5-メ
チルウリジン（3.1 g、4.5 mmol）を乾燥CH₂Cl₂（4.5 mL）に溶解し、そしてメ
チルヒドラジン（300 mL、4.64 mmol）を-10℃〜0℃で、一滴ずつ添加した。1時
間後、混合物をろ過し、ろ液を氷冷CH₂Cl₂で洗浄し、そして合わせた有機相を水
、ブラインで洗浄し、そして無水Na₂SO₄上で乾燥させた。溶液を濃縮し、2'-O-
（アミノオキシエチル）チミジンを得て、その後これをMeOH（67.5 mL）に溶解
した。これにホルムアルデヒド（20％水性溶液、w／w、1.1 eq）を添加し、そし
て生じた混合物を1時間攪拌した。溶媒を真空下で除去し；残留物をクロマトグ
ラフィーし、白色泡状物として5'-O-tert-ブチルジフェニルシリル-2'-O-[（2-
ホルムアドキシイミノオキシ）エチル]-5-メチルウリジン（1.95 g、78％）を得
た。

【００８３】 5'-O-tert-ブチルジフェニルシリル-2'-O-[N,N-ジメチルアミノオキシエチ
ル]-5-メチルウリジン 5'-O-tert-ブチルジフェニルシリル-2'-O-[（2-ホルムアドキシイミノオキシ
）エチル]-5-メチルウリジン（1.77 g、3.12 mmol）を、乾燥MeOH（30.6 mL）中
の1M ピリジニウムp-トルエンスルホン酸（PPTS）の溶液に溶解した。この溶液
に不活性雰囲気下で、10℃で、シアノボロ水素化ナトリウム（0.39 g、6.13 mmo
l）を添加した。反応混合物を10℃で10分間攪拌した。その後、反応容器を氷槽
から取りだし、そして室温で2時間攪拌し、反応をTLC（CH₂Cl₂中の5％MeOH）で
モニターした。水性NaHCO₃溶液（5％、10 mL）を添加し、そして酢酸エチル（2
×20 mL）で抽出した。酢酸エチル相を、無水Na₂SO₄上で乾燥させ、蒸発乾固し
た。残留物を、MeOH中の1M PPTSの溶液（30.6 mL）に溶解した。ホルムアルデヒ
ド（20％w／w、30 mL、3.37 mmol）を添加し、そして反応混合物を室温で10分間
攪拌した。反応混合物を氷槽で10℃に冷却し、シアノボロ水素化ナトリウム（0.
39 g、6.13 mmol）を添加し、そして反応混合物を10℃で10分間攪拌した。10分
後、反応混合物を氷槽から取りだし、そして室温で2時間攪拌した。反応混合物
に5％NaHCO₃（25 mL）溶液を添加し、そして酢酸エチル（2×25 mL）で抽出した
。酢酸エチル層を無水Na₂SO₄上で乾燥させ、そして蒸発乾固した。得た残留物を
フラッシュカラムクロマトグラフィーにより精製し、そしてCH₂Cl₂中の5％MeOH
で溶出し、白色泡状物として5'-O-tert-ブチルジフェニルシリル-2'-O-[N,N-ジ
メチルアミノオキシエチル]-5-メチルウリジン（14.6 g、80％）を得た。

【００８４】 2'-O-（ジメチルアミノオキシエチル）-5-メチルウリジントリエチルアミントリヒドロフルオリド（3.91 mL、24.0 mmol）を乾燥THFお
よびトリエチルアミン（1.67 mL、12 mmol、乾燥、KOH上で維持）に溶解した。
その後、トリエチルアミン-2HFのこの混合物を、5'-O-tert-ブチルジフェニルシ
リル-2'-O-[N,N-ジメチルアミノオキシエチル]-5-メチルウリジン（1.40 g、2.4
mmol）に添加し、そして室温で24時間攪拌した。反応はTLC（CH₂Cl₂中の5％MeO
H）でモニターした。溶媒を真空下で除き、そして残留物をフラッシュカラムに
入れ、そしてCH₂Cl₂中の10％MeOHで溶出し、2'-O-（ジメチルアミノオキシエチ
ル）-5-メチルウリジン（766 mg、92.5％）を得た。

【００８５】 5'-O-DMT-2'-O-（ジメチルアミノオキシエチル）-5-メチルウリジン 2'-O-（ジメチルアミノオキシエチル）-5-メチルウリジン（750 mg、2.17 mmo
l）を高真空下で、40℃で一晩、P₂O₅上で乾燥させた。その後、無水ピリジン（2
0 mL）と共蒸発させた。得た残留物を、アルゴン雰囲気下で、ピリジン（11 mL
）に溶解した。4-ジメチルアミノピリジン（26.5 mg、2.60 mmol）、4,4'-ジメ
トキシトリチルクロリド（880 mg、2.60 mmol）を混合物に添加し、そして出発
物質がすべて消失するまで、反応混合物を室温で攪拌した。真空下でピリジンを
除き、そして残留物をクロマトグラフィーし、そしてCH₂Cl₂中の10％MeOH（数滴
のピリジンを含有する）で溶出し、5'-O-DMT-2'-O-（ジメチルアミノ-オキシエ
チル）-5-メチルウリジン（1.13 g、80％）を得た。

【００８６】 5'-O-DMT-2'-O-（2-N,N-ジメチルアミノオキシエチル）-5-メチルウリジン- 3'-[（2-シアノエチル）-N,N-ジイソプロピルホスホールアミダイト] 5'-O-DMT-2'-O-（ジメチルアミノオキシエチル）-5-メチルウリジン（1.08 g
、1.67 mmol）をトルエン（20 mL）と共蒸発させた。残留物にN,N-ジイソプロピ
ルアミンテトラゾニド（0.29 g、1.67 mmol）を添加し、そして高真空下で、40
℃で一晩、P₂O₅上で乾燥させた。その後、反応混合物を無水アセトニトリル（8.
4 mL）に溶解し、そして2-シアノエチル-N,N,N¹,N¹-テトライソプロピルホスホ
ールアミダイト（2.12 mL、6.08 mmol）を添加した。反応混合物を、不活性雰囲
気下で、周囲温度で4時間攪拌した。反応の進行をTLC（ヘキサン：酢酸エチル1
：1）によりモニターした。溶媒を蒸発させ、その後、残留物を酢酸エチル（70
mL）に溶解し、そして5％水性NaHCO₃（40 mL）で洗浄した。酢酸エチル層を無水
Na₂SO₄上で乾燥させ、そして濃縮した。得た残留物をクロマトグラフィーし（溶
出剤は酢酸エチル）、5'-O-DMT-2'-O-（2-N,N-ジメチルアミノオキシエチル）-5
-メチルウリジン-3'-[（2-シアノエチル）-N,N-ジイソプロピルホスホールアミ
ダイト]（1.04 g、74.9％）を泡状物として得た。

【００８７】メチレン（メチルイミノ）（MMI）バックボーンを有するオリゴヌクレオチド
は、米国特許5,378,825にしたがって合成し、この特許は本発明の譲受人に譲渡
され、そしてその全体を本明細書に援用される。合成を容易にするため、MMI結
合を含む様々なヌクレオシド二量体を合成し、そしてオリゴヌクレオチド内に取
り込む。他の窒素含有バックボーンは、WO 92／20823にしたがって合成し、この
出願もまた、本発明の譲受人に譲渡され、そしてその全体を本明細書に援用され
る。

【００８８】アミドバックボーンを有するオリゴヌクレオチドは、Mesmaekerら（Acc. Chem
. Res. 1995, 28, 366-374）にしたがって合成する。アミド部分は、単純でそし
て公知の合成法により容易に利用可能であり、そしてオリゴヌクレオチドの固相
合成に必要とされる条件に適合する。

【００８９】モルホリノバックボーンを持つオリゴヌクレオチドは、米国特許5,034,506（S
ummertonおよびWeller）にしたがい、合成する。ペプチド-核酸（PNA）オリゴマーは、P.E. Nielsenら（Science 1991, 254, 1
497-1500）にしたがい、合成する。

【００９０】調節孔ガラスカラム（Applied Biosystems）からの切断および濃水酸化アンモ
ニウム中での55℃、18時間の脱ブロッキング後、2.5体積のエタノールを用い、0
.5 M NaClからの2回の沈殿により、オリゴヌクレオチドを精製する。合成された
オリゴヌクレオチドは、変性ゲル上のポリアクリルアミドゲル電気泳動またはキ
ャピラリーゲル電気泳動により解析し、そして全長物質が少なくとも85％である
と判断された。合成で得られるホスホロチオエートおよびホスホジエステル結合
の相対量は、³¹P核磁気共鳴分光により、定期的に確認し、そしていくつかの研
究では、オリゴヌクレオチドを、Chiangら（J. Biol. Chem. 1991, 266, 18162
）に記載されるように、HPLCにより精製した。HPLC精製物質で得られた結果は、
非HPLC精製物質で得られたものと同様であった。

【００９１】あるいは、オリゴヌクレオチドは、標準的96ウェル形式で、同時に96の配列を
組み立てることができる自動化合成装置上で、固相P（III）ホスホールアミダイ
ト化学反応を介し、96ウェルプレート形式で合成する。ホスホジエステルヌクレ
オチド間結合は、水性ヨウ素での酸化により、得られる。ホスホロチオエートヌ
クレオチド間結合は、無水アセトニトリル中の3,H-1,2ベンゾジチオール-3-オン
1,1-ジオキシド（Beaucage Reagent）を利用した硫化により、生成する。標準的
塩基-保護ベータ-シアノエチル-ジ-イソプロピルホスホールアミダイトは、商業
的業者（例えばPE-Applied Biosystems, Foster City, CA、またはPharmacia, P
iscataway, NJ）から購入する。非標準的ヌクレオシドは、公表された方法にし
たがい、合成する。これらは、塩基保護化ベータ-シアノエチルジイソプロピル
ホスホールアミダイトとして利用する。

【００９２】オリゴヌクレオチドを支持体から切断し、そして濃NH₄OHを用い上昇した温度
（55〜60℃）で12〜16時間、脱保護し、そしてその後、遊離した産物を真空で乾
燥させる。その後、乾燥産物を無菌水に再懸濁し、マスタープレートを得て、こ
こからその後、すべての解析および試験プレート試料を、ロボットピペッターを
利用し、希釈する。

【００９３】実施例2：ヒトFAKオリゴヌクレオチド配列アンチセンスオリゴヌクレオチドはヒトFAKを標的とするように設計された。
標的配列のデータは、Whitney, G.S.ら（DNA Cell Biol., 1993, 12, 823-830）
；本明細書中でSEQ ID NO:1として与えられるGenbank受諾番号L13616、によって
公開されたフォーカルアドヒージョンキナーゼ（focal adhesion kinase；FAK）
cDNA配列由来である。オリゴヌクレオチドの一つのセットは、その両側（5'およ
び3'方向）で5-ヌクレオチド“ウイング”に隣接する10個の2'-デオキシヌクレ
オチドから成る中央“ギャップ”領域で構成される長さ20ヌクレオチドのキメラ
オリゴヌクレオチド（“ギャップマー”）として合成された。ウイングは2'-メ
トキシエチル（2'-MOE）ヌクレオチドで構成される。ヌクレオシド間（バックボ
ーン）結合は、オリゴヌクレオチドを介したホスホロチオエート（P=S）である
。全ての2'-MOEシトシンは5-メチルシトシンである。これらのオリゴヌクレオチ
ド配列を表1に示す。配列の同じセットは完全にホスホロチオエート化したオリ
ゴデオキシヌクレオチドとして調製した。これらは表2に示す。オリゴヌクレオ
チドのさらなるセットは、その両側（5'および3'方向）で5-ヌクレオチド“ウイ
ング”に隣接する5つの2'-デオキシヌクレオチドから成る中央“ギャップ”領域
で構成される長さ15ヌクレオチドのキメラオリゴヌクレオチド（“ギャップマー
”）として合成された。ウイングは2'-メトキシエチル（2'-MOE）ヌクレオチド
で構成される。ヌクレオシド間（バックボーン）結合は、オリゴヌクレオチドを
介したホスホロチオエート（P=S）である。全ての2'-MOEシトシンは5-メチルシ
トシンである。これらのオリゴヌクレオチド配列を表3に示す。配列の同じセッ
トは完全にホスホロチオエート化したオリゴデオキシヌクレオチドとして調製し
た。これらは表4に示す。

【００９４】ヒトA549肺癌細胞（American Type Culture Collection, Manassas, VA）を、
10％ウシ胎児血清（FBS）、MEMの非必須アミノ酸、ピルビン酸ナトリウム（1 mM
）、ペニシリン（50 U/ml）およびストレプトマイシン（50μg/ml）を補充したD
MEM中で成長させた。全ての細胞培養試薬はLife Technologies（Rockville, MD
）から入手した。

【００９５】細胞を一度OPTIMEM^TM（Life Technologies, Rockville, MD）で洗浄して、次
に400 nM オリゴヌクレオチド、および膜濾過水中での陽イオン脂質N-[1-（2,3-
ジオレイルオキシ）プロピル]-n,n,n-塩化トリメチルアンモニウム（DOTMA）お
よびジオレオイルホスホチジルエタノールアミン（DOPE）の1:1（w/w）リポソー
ム製剤（formulation）である12 mg/ml LIPOFECTIN^TM（Life Technologies, Roc
kville, MD）を用いてトランスフェクションした。細胞を4時間オリゴヌクレオ
チドともにインキュベートして、その後培地を新鮮培地に置き換えて細胞をさら
に20時間インキュベートした。

【００９６】全細胞RNAは、ATLAS^TM Pure RNA単離キット（Clontech, Palo Alto, CA）を使
用して単離した。次に、RNAを1.2％アガロース-ホルムアルデヒドゲル上で分離
して、陽性荷電ナイロン膜であるHybond-N+膜（Amersham Pharmacia Biotech, A
rlington Heights, IL）にトランスファーした。固定化RNAをUV光への暴露によ
って架橋した。膜をFAKあるいはグリセルアルデヒド3-リン酸脱水素酵素（G3PDH
）プローブのいずれかを用いてプローブ化した。プローブをPRIME-A-GENE^TM Lab
eling System（Promega, Madison, WI）を使用して、ランダムプライマーによっ
て標識して、膜にハイブリダイズさせた。mRNAシグナルをPhosphoImager（Molec
ular Dynamics, Sunnyvale, CA）によって定量化した。

【００９７】 FAKアンチセンスオリゴヌクレオチドの最初のスクリーニングの結果は、表5（
20 mers）および表6（15 mers）に示す。オリゴヌクレオチド15392 （SEQ ID NO
. 3）、15394（SEQ ID NO. 4）、15397（SEQ ID NO. 6）、15399（SEQ ID NO. 7
）、15401（SEQ ID NO. 8）、15403（SEQ ID NO. 9）、15405（SEQ ID NO. 10）
、15407（SEQ ID NO. 11）、15409（SEQ ID NO. 12）、15413（SEQ ID NO. 14）
、15415（SEQ ID NO. 15）、15458（SEQ ID NO. 16）、15460（SEQ ID NO. 17）
、15421（SEQ ID NO. 18）、15425（SEQ ID NO. 20）、15393（SEQ ID NO. 23）
、15406（SEQ ID NO. 30）、15408（SEQ ID NO. 31）および15412（SEQ ID NO.
33）は、このアッセイにおいてFAK mRNA発現の約50％あるいはそれ以上の阻害を
引き起こした。オリゴヌクレオチド15401（SEQ ID NO. 8）、15403（SEQ ID NO.
9）、15409（SEQ ID NO. 12）、15413（SEQ ID NO. 14）、15415（SEQ ID NO.
15）、および15421（SEQ ID NO. 18）は、FAK mRNA発現の約80％あるいはそれ以
上の阻害を引き起こした。

【００９８】

【表１】

【００９９】

【表２】

【０１００】

【表３】

【０１０１】

【表４】

【０１０２】

【表５】

【０１０３】

【表６】

【０１０４】実施例3：アンチセンスホスホロチオエートオリゴヌクレオチドの用量反応はA
549細胞においてFAKレベルに影響するいくつかのより活性の高いオリゴヌクレオチドを用量反応研究のために選択し
た。A549細胞を増殖させて、オリゴヌクレオチドの濃度を変えた以外は、実施例
2に記載したように処理して進めた。

【０１０５】結果を表7に示す。多くのオリゴヌクレオチドは50 nMあるいはそれ以下のIC₅₀ を示し、認められた最大阻害は95％であった。

【０１０６】

【表７】

【０１０７】タンパク質レベルの用量反応実験は二つのオリゴヌクレオチドを用いて行った
。A549細胞を表3に示したように濃度を変えた以外は実施例2に記載したように増
殖させて処理した。オリゴヌクレオチドに対するLIPOFECTIN^TMの割合を、100 nM
オリゴヌクレオチド当たり3 mg/ml LIPOFECTIN^TMに維持した。FAKタンパク質レ
ベルは、アンチセンス処理後48時間に全細胞溶解物中で抗FAKブロッティングに
より決定した。10 cmプレート上の細胞を0.5 ml修飾RIPA溶解バッファーを用い
て溶解し、0.5 ml HNTGバッファー（50 mM HEPES、pH 7.4、150 mM NaCl、0.1％
Triton X-100、10％グリセロール）で希釈して、アガロースビーズと共にインキ
ュベートして、遠心分離によりきれいにした。ポリクローナルFAK抗体（Salk In
stitute of Biological Studies, La Jolla, CA；追加のFAK抗体はUpstate Biot
echnology Incorporated, Lake Placid, NYから入手した）を用いた免疫沈降を4
℃で4時間行い、プロテインA（Repligen, Cambridge, MA）あるいはプロテインG
-プラス（Calbiochem）アガロースビーズ上に回収して、沈降タンパク質複合体
をTritonのみの溶解バッファー（デオキシコール酸ナトリウムおよびSDSを除い
た修飾RIPA）中にて4℃で洗浄した後、HNTGバッファー中で洗浄して、SDS-PAGE
により直接解析をした。免疫ブロッティングのため、タンパク質をフッ化ポリビ
ニリデン膜（Millipore）にトランスファーして、室温で2時間1:1000希釈のポリ
クローナル抗体と共にインキュベートした。結合一次抗体は強化化学発光検出に
より視覚化した。

【０１０８】結果を表8に示す。

【０１０９】

【表８】

【０１１０】実施例4：成長因子刺激遊走および侵襲に対するFAKアンチセンスホスホロチオ
エートオリゴヌクレオチドの効果インテグリン制御フォーカルアドヒージョンキナーゼ（focal adhesion kinas
e；FAK）は、初代線維芽細胞、平滑筋、および腺癌細胞の表皮成長因子（EFG）
および血小板由来成長因子（PDGF）誘導運動性の重要な要素である。細胞遊走に
対するFAKアンチセンスオリゴヌクレオチドの効果を測定するために、修飾ボイ
デンチャンバー（Millipore, Bedford, MA）アッセイを使用した（Sieg, D.J.ら
, J. Cell Sci., 1999, 112, 2677-2691）。両方の膜面を37℃で2時間ラット尾
コラーゲン（PBS中で5 mg/ml、Boehringer Mannheim）でコートし、PBSで洗浄し
て、表示した濃度でヒト組換えPDGF-BB、EGF、あるいは塩基性-FGF（Calbiochem
, San Diego, CA）を含むあるいは含まない遊走培地（0.5％BSA含有0.5 ml DMEM
）を含有する24ウェル板の中にチャンバーを置いた。血清欠乏（starved）A549
細胞（0.3 ml遊走培地中に1×10⁵細胞）を上部チャンバーに加えて、37℃で3時
間後に、膜上面の細胞をコットンチップアプリケーター（cotton tip applicato
r）で除去して、下方膜面の遊走細胞を固定し、染色（0.1％クリスタルバイオレ
ット、0.1 Mホウ酸 pH 9.0、2％EtOH）して、色素を600 nMで吸光度測定のため
に溶出した。個々の実験は三つの独立したチャンバーからの平均を表す。化学走
性刺激（0.5％BSAのみ）の非存在下での細胞遊走のバックグランドレベル（全体
の5％以下）を全ての点から引いた。

【０１１１】結果は表9に示す。ISIS 17636（SEQ ID NO. 43）は、ISIS 15421（SEQ ID NO.
18）に対する5塩基ミスマッチ対照オリゴヌクレオチドである。

【０１１２】

【表９】

【０１１３】 FAKアンチセンスオリゴヌクレオチドを〜1 mm MATRIGEL^TM（Becton Dickinson
, Franklin Lakes, NJ）基底膜バリアを使用したin vitro侵襲アッセイで試験し
た（Albini, A., Pathol. Oncol. Res., 1998, 4, 230-241）。遊走チャンバー
をMATRIGEL^TMの示された濃度でコートし、ラミナフローの下で乾燥させて、そし
て回転振盪器上で90分間冷血清不含DMEMを用いて再水和した。A549細胞を実施例
2に記載したように成長させてトランスフェクションした。次に細胞（1×10⁵）
をMATRIGEL^TMコート膜上に置き、示した時間、10％FBS化学誘引物質に向かってM
ATRIGEL^TMを介して侵入させた。MATRIGEL^TMを介して侵入した細胞は、遊走アッ
セイで詳述したようにクリスタルバイオレット染色より視覚化した。MATRIGEL^TM の量はアッセイ中で変えて、侵襲を測定していることおよび遊走が血清誘導性で
ないことを示した。

【０１１４】結果は表10に示す。

【０１１５】

【表１０】

【０１１６】実施例5：網膜新血管新生モデルにおけるFAKアンチセンスオリゴヌクレオチド FAKアンチセンスオリゴヌクレオチドを網膜新血管新生のウサギモデルにおい
て試験した（Kimura, H.ら, Invest. Opthalmol. Vis. Sci., 1995, 36, 2110-2
119）。このモデルでは、成長因子をカプセルに包んで網膜直下に注射する。

【０１１７】 8羽の雄ダッチベルトウサギおよび1羽の雄ブラックサテン／ニュージーランド
ホワイトクロスウサギをこのアッセイに使用した。ISIS 15409（SEQ ID NO. 12
）は、重合ペレットの外科的移植の前に一度およびペレット移植中に一度、注射
により硝子体内に投与した。網膜新血管新生は間接オプタルモルスコピー（opth
almolscopy）で測定して、基底部写真により詳細に記録した。網膜新血管新生は
1は、正常および5は網膜出血および／あるいは剥離を示す、1から5の等級で段階
分けした。ペレットを含有する塩類溶液および成長因子を注射した動物では、網
膜新血管新生の証拠は最初の週に検出でき、網膜出血は第3週の終わりまでに始
まった。アンチセンスFAKオリゴヌクレオチドを受けた動物は、4週間以上にわた
る網膜新血管新生の証拠は示さなかった。

【配列表】

【手続補正書】

【提出日】平成１４年３月１３日（２００２．３．１３）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】特許請求の範囲

【補正方法】変更

【補正の内容】

【特許請求の範囲】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｐ 35/00 Ａ６１Ｐ 43/00 １１１ 43/00 １１１Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者ガルデ，ウイリアム・エイアメリカ合衆国カリフォルニア州92009，カールズバッド，ケブラダ・サークル 3105 (72)発明者ニェーロ，パメラ・エスアメリカ合衆国カリフォルニア州92104，サンディエゴ，クインス・ストリート 3618 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 CA01 HA17 4C084 AA13 DC32 NA14 ZA33 ZB26 4C086 AA01 AA02 AA03 EA16 MA01 NA14 ZA33 ZB26

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】フォーカルアドヒージョンキナーゼ（focal adhesion kinase
）をコードする核酸の5'-非翻訳領域、翻訳終止領域または3'-非翻訳領域を標的
とし、長さ8〜30のヌクレオ塩基を有するアンチセンス化合物であって、前記フ
ォーカルアドヒージョンキナーゼの発現を阻害する、前記アンチセンス化合物。
【請求項２】請求項1に記載のアンチセンス化合物。 which is アンチセン
スオリゴヌクレオチド.
【請求項３】アンチセンスオリゴヌクレオチドがSEQ ID NO: 3、4、6、7、8
、9、16、17、18、20または23を含む配列を有する、請求項2に記載のアンチセン
ス化合物。
【請求項４】アンチセンスオリゴヌクレオチドが少なくとも一つの修飾ヌク
レオシド間結合を含む、請求項2に記載のアンチセンス化合物。
【請求項５】修飾ヌクレオシド間結合がホスホロチオエート結合である、請
求項4に記載のアンチセンス化合物。
【請求項６】アンチセンスオリゴヌクレオチドが少なくとも一つの修飾糖部
分を含む、請求項2に記載のアンチセンス化合物。
【請求項７】修飾糖部分が2'-O-メトキシエチル部分である、請求項6に記載
のアンチセンス化合物。
【請求項８】アンチセンスオリゴヌクレオチドが少なくとも一つの修飾ヌク
レオ塩基を含む、請求項2に記載のアンチセンス化合物。
【請求項９】修飾ヌクレオ塩基が5-メチルシトシンである、請求項8に記載
のアンチセンス化合物。
【請求項１０】アンチセンスオリゴヌクレオチドがキメラオリゴヌクレオチ
ドである、請求項2に記載のアンチセンス化合物。
【請求項１１】請求項1に記載のアンチセンス化合物および医薬的に許容可
能なキャリアまたは希釈剤を含む、医薬組成物。
【請求項１２】コロイド分散系をさらに含む、請求項11に記載の医薬組成物
。
【請求項１３】アンチセンス化合物がアンチセンスオリゴヌクレオチドであ
る、請求項11に記載の医薬組成物。
【請求項１４】細胞または組織を請求項1に記載のアンチセンス化合物と接
触させて、それによりフォーカルアドヒージョンキナーゼの発現を阻害する、前
記細胞または組織中においてフォーカルアドヒージョンキナーゼの発現を阻害す
る方法。
【請求項１５】フォーカルアドヒージョンキナーゼをコードする核酸分子の
コード領域または開始部位を標的とし、長さ30までのヌクレオ塩基を有するアン
チセンス化合物であって、前記フォーカルアドヒージョンキナーゼの発現を阻害
し、そしてSEQ ID NO: 10、11、12、14、15、30、31または33の少なくとも8ヌク
レオ塩基の部分を含む配列を有する、アンチセンス化合物。
【請求項１６】アンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項15に記載の
アンチセンス化合物。
【請求項１７】アンチセンスオリゴヌクレオチドが少なくとも一つの修飾ヌ
クレオシド間結合を含む、請求項16に記載のアンチセンス化合物。
【請求項１８】修飾ヌクレオシド間結合がホスホロチオエート結合である、
請求項17に記載のアンチセンス化合物。
【請求項１９】アンチセンスオリゴヌクレオチドが少なくとも一つの修飾糖
部分を含む、請求項16に記載のアンチセンス化合物。
【請求項２０】修飾糖部分が2'-O-メトキシエチル部分である、請求項19に
記載のアンチセンス化合物。
【請求項２１】アンチセンスオリゴヌクレオチドが少なくとも一つの修飾ヌ
クレオ塩基を含む、請求項16に記載のアンチセンス化合物。
【請求項２２】修飾ヌクレオ塩基が5-メチルシトシンである、請求項21に記
載のアンチセンス化合物。
【請求項２３】アンチセンスオリゴヌクレオチドがキメラオリゴヌクレオチ
ドである、請求項16に記載のアンチセンス化合物。
【請求項２４】請求項15に記載のアンチセンス化合物および医薬的に許容可
能なキャリアまたは希釈剤を含む、医薬組成物。
【請求項２５】コロイド分散系をさらに含む、請求項24に記載の医薬組成物
。
【請求項２６】アンチセンス化合物がアンチセンスオリゴヌクレオチドであ
る、請求項24に記載の医薬組成物。
【請求項２７】細胞または組織を請求項15に記載のアンチセンス化合物と接
触させて、それによりフォーカルアドヒージョンキナーゼの発現を阻害すること
を含む、前記細胞または組織におけるフォーカルアドヒージョンキナーゼの発現
を阻害する方法。
【請求項２８】治療的または予防的有効量のアンチセンス化合物であって、
ヒトフォーカルアドヒージョンキナーゼをコードし核酸分子を標的とし、長さ8
〜30のヌクレオ塩基を有するアンチセンス化合物を、動物に投与することを含む
、フォーカルアドヒージョンキナーゼと関連する疾患または症状を有する動物を
治療する方法であって、前記アンチセンス化合物がヒトフォーカルアドヒージョ
ンキナーゼの発現を阻害する、前記治療する方法。
【請求項２９】疾患または症状がガンである、請求項28に記載の方法。
【請求項３０】前記ガンが、乳ガン、結腸ガンまたは口腔ガンである、請求
項29に記載の方法。
【請求項３１】前記疾患または症状が血管形成性障害である、請求項28に記
載の方法。
【請求項３２】前記血管形成性障害が網膜の血管新生である、請求項32に記
載の方法。
【請求項３３】治療的または予防的有効量のアンチセンス化合物であって、
ヒトフォーカルアドヒージョンキナーゼをコードする核酸分子を標的とし、長さ
8〜30のヌクレオ塩基を有するアンチセンス化合物を、細胞に対して投与するこ
とを含む、フォーカルアドヒージョンキナーゼの発現と関連する細胞の移行（mi
gration）を予防する方法であって、前記アンチセンス化合物がヒトフォーカル
アドヒージョンキナーゼの発現を阻害する、前記方法。
【請求項３４】治療的または予防的有効量のアンチセンス化合物であって
、ヒトフォーカルアドヒージョンキナーゼをコードする核酸分子を標的とし、長
さ8〜30のヌクレオ塩基を有するアンチセンス化合物を、動物に対して投与する
ことを含む、前記動物においてフォーカルアドヒージョンキナーゼの発現に関連
する血管新生を予防する方法であって、前記アンチセンス化合物がヒトフォーカ
ルアドヒージョンキナーゼの発現を阻害する、前記方法。