KR20200143739A - 근위축증을 치료하기 위한 개선된 엑손 스키핑 조성물 - Google Patents

근위축증을 치료하기 위한 개선된 엑손 스키핑 조성물 Download PDF

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Abstract

엑손 53 스키핑을 유도하기 위해 인간 디스트로핀 유전자에서 선택된 표적 부위에 결합할 수 있는 안티센스 분자가 기재되어 있다.

Description

근위축증을 치료하기 위한 개선된 엑손 스키핑 조성물{IMPROVED EXON SKIPPING COMPOSITIONS FOR TREATING MUSCULAR DYSTROPHY}
관련 출원
본 특허 출원은 2012년 12월 20일자로 제출된 미국 가특허출원 제61/739,968호의 이익을 주장한다. 상기 참조된 가특허출원의 전체 내용은 본원에서 참조로서 도입된다.
발명의 분야
본 발명은 인간 디스트로핀 유전자에서 엑손 스키핑(skipping)을 촉진시키는데 적합한 신규한 안티센스 화합물 및 조성물에 관한 것이다. 또한, 본 발명의 방법에서의 사용에 적합한 신규한 안티센스 조성물을 사용하여 엑손 스키핑을 유도하는 방법을 제공한다.
안티센스 기술은 각종 상이한 수준(전사, 스플라이싱, 안정성, 번역)에서 유전자 발현에 영향을 미치기 위해 다양한 화학반응을 사용하여 개발되고 있다. 다수의 이러한 연구는 광범위한 지표에서 이상 또는 질환-연관 유전자를 수정 또는 보상하기 위해 안티센스 화합물의 사용에 초점이 맞춰져 있다. 안티센스 분자는 특이성과 함께 유전자 발현을 억제할 수 있고, 이 때문에, 유전자 발현의 조절인자로서 올리고뉴클레오티드에 관한 다수의 연구 노력은 표적 유전자의 발현 또는 시스-작용 요소의 기능을 억제하는 것에 초점이 맞춰져 있다. 안티센스 올리고뉴클레오티드는 전형적으로 RNA, 일부 바이러스 RNA 표적의 경우에 센스 본쇄(예: mRNA) 또는 마이너스-본쇄에 대해 지향되어 있다. 특이적 유전자 하향-조절의 목적하는 효과를 달성하기 위해, 올리고뉴클레오티드는 일반적으로 표적 mRNA의 붕괴를 촉진시키고, mRNA의 번역을 차단하거나 시스-작용 RNA 요소의 기능을 차단하고, 이에 의해 표적 단백질의 드 노보 합성 또는 바이러스 RNA의 복제를 효과적으로 방지한다.
그러나, 이러한 기술은 대상체가 천연 단백질의 생성을 상향-조절하거나 번역의 조기 종결을 유도하는 돌연변이, 예를 들면, 논센스 또는 프레임-시프팅 돌연변이를 보상해야 하는 경우에 유용하지 않다. 이들 경우에, 결합 유전자 전사체는 표적 분해 또는 입체 억제에 제공되지 않아야 하고, 따라서 안티센스 올리고뉴클레오티드 화학은 표적 mRNA 붕괴를 촉진하거나 번역을 차단하지 않아야 한다.
다양한 유전자 질환에서, 유전자의 최종 발현에 대한 돌연변이의 효과는 스플라이싱 프로세스 동안 표적 엑손 스키핑의 프로세스를 통해 조절될 수 있다. 스플라이싱 프로세스는 프리-mRNA 중의 인접한 엑손-인트론 접합부를 근접하게 하고 함께 스플라이싱되는 엑손 사이의 이들의 후속 재구성과 함께 인트론의 말단에 포스포디에스테르 결합의 절단을 수행하는 복합 다성분 기구에 의해 유도된다. 이러한 복잡한 및 고도로 정밀한 프로세스는, 후속적으로 스플라이싱 반응에 관여하는 다핵 스플라이싱 인자가 결합하는 비교적 짧은 반-보존된 RNA 세그먼트인 프리-mRNA 중의 서열 모티프에 의해 매개된다. 스플라이싱 기구가 프리-mRNA 프로세싱에 관여하는 모티프를 판독하거나 인식하는 방식을 변경함으로써, 상이하게 스플라이싱된 mRNA 분자를 생성할 수 있다. 인간 유전자의 대부분은, 관련 메카니즘이 동정되지 않았지만, 정상 유전자 발현 동안 대체적으로 스플라이싱되는 것으로 현재 인식되어 왔다. 베네트 등(Bennett et al.)(미국 특허 제6,210,892호)은 표적 RNA의 RNAse H-매개된 절단을 유도하지 않는 안티센스 올리고뉴클레오티드 유사체를 사용하는 야생형 세포 mRNA 프로세싱의 안티센스 조절을 기재한다. 이는 막 관통 도메인을 코딩하는 엑손을 결여하는 가용성 TNF 상과 수용체의 생성을 위해 특이적 엑손(예: 문헌[참조: Sazani, Kole, et al. 2007]에 기재된 바와 같음)을 결여하는 대안적으로 스플라이싱된 mRNA를 생성할 수 있는 것에 유용성을 발견한다.
정상 기능성 단백질이 그 내부의 돌연변이 때문에 조기에 종결되는 경우, 안티센스 기술을 통한 일부 기능성 단백질 생성을 회복하는 수단은 스플라이싱 프로세스 동안 간섭을 통해 가능하고, 질환-유발 돌연변이와 연관된 엑손이 일부 유전자로부터 특이적으로 결실될 수 있는 경우, 종종 천연 단백질의 유사한 생물학적 특성을 갖거나 엑손과 연관된 돌연변이에 의해 유발된 질환을 완화시키기에 충분한 생물학적 활성을 갖는 단축 단백질 생성물이 종종 생성될 수 있는 것으로 밝혀졌다[참조: Sierakowska, Sambade et al. 1996; Wilton, Lloyd et al. 1999; van Deutekom, Bremmer-Bout et al. 2001; Lu, Mann et al. 2003; Aartsma-Rus, Janson et al. 2004]. 콜 등(Kole et al.)(미국 특허 제5,627,274호; 제5,916,808호; 제5,976,879호; 및 제5,665,593호)은 표적 프리-mRNA의 붕괴를 촉진시키지 않는 변형된 안티센스 올리고뉴클레오티드 유사체를 사용하여 이상 스플라이싱에 대항하는 방법을 개시한다. 베네트 등(Bennett et al.)(미국 특허 제6,210,892호)은 표적 RNA의 RNAse H-매개된 절단을 유도하지 않는 안티센스 올리고뉴클레오티드 유사체를 또한 사용하는 야생형 세포 mRNA 프로세싱의 안티센스 조절을 기재한다.
표적 엑손 스키핑의 프로세스는, 다수의 엑손 및 인트론이 존재하고 엑손의 유전자 구성에 중복이 있거나 하나 이상의 특정 엑손 없이 기능할 수 있는 긴 유전자에 특히 유용할 가능성이 있다. 다양한 유전자 중의 돌연변이에 의해 유발된 절단과 연관된 유전자 질환의 치료를 위한 유전자 프로세싱을 재유도하려는 노력은, (1) 스플라이싱 프로세스에 관여하는 요소와 완전히 또는 부분적으로 중첩하거나, (2) 당해 요소에서 발생하는 특정 스플라이싱 반응을 정상적으로 조절하는 스플라이싱 인자의 결합 및 기능을 파괴하기 위해 상기 요소에 충분히 근접하는 위치에서 프리-mRNA에 결합하는, 안티센스 올리고뉴클레오티드의 사용에 초점이 맞춰져 있다.
뒤센형 근위축증(DMD)은 단백질 디스트로핀의 발현 결함에 의해 유발된다. 상기 단백질을 코딩하는 유전자는 DNA의 2백만개 이상의 뉴클레오티드에 걸쳐 신장된 79 엑손을 함유한다. 엑손의 판독 프레임을 변화시키거나, 정지 코돈을 도입하거나, 프레임 엑손 또는 엑손 중의 전체의 제거 또는 하나 이상의 엑손의 복제를 특징으로 하는 임의의 엑손 돌연변이는 기능성 디스트로핀의 생성을 파괴하여 DMD를 초래할 가능성이 있다.
보다 덜 심각한 형태의 근위축증, 벡커 근위축증(BMD)은, 돌연변이, 전형적으로 하나 이상의 엑손의 결실이 전체 디스트로핀 전사체를 따라 정확한 판독 프레임을 초래하여 단백질로의 mRNA의 번역이 조기에 종결되지 않는 경우에 발생하는 것으로 밝혀졌다. 돌연변이된 디스트로핀 프리-mRNA의 프로세싱에서 상류 및 하류 엑손의 결합이 유전자의 정확한 판독 프레임을 유지하는 경우, 그 결과는 일부 활성을 보유하여 벡커 표현형을 초래하는 짧은 내부 결실을 갖는 단백질을 코딩하는 mRNA이다.
수년 동안, 디스트로핀 단백질의 판독 프레임을 변경하지 않는 엑손 또는 엑손들의 결실은 BMD 표현형을 발생시키는 반면, 프레임-시프트를 유발하는 엑손 결실은 DMD를 발생시키는 것으로 공지되어 있었다[참조: Monaco, Bertelson et al. 1988]. 일반적으로, 점 돌연변이를 포함하는 디스트로핀 돌연변이 및 판독 프레임을 변화시켜 적절한 번역을 간섭하는 엑손 결실은 DMD를 초래한다. 또한, 일부 BMD 및 DMD 환자는 복수의 엑손을 커버하는 엑손 결실을 갖는 것에 유의해야 한다.
안티센스 올리고리보뉴클레오티드를 사용한 돌연변이 디스트로핀 프리-mRNA 스프라이싱의 조절은 시험관내 및 생체내 둘 다에서 보고되어 있다[참조: Matsuo, Masumura et al. 1991; Takeshima, Nishio et al. 1995; Pramono, Takeshima et al. 1996; Dunckley, Eperon et al. 1997; Dunckley, Manoharan et al. 1998; Errington, Mann et al. 2003].
mdx 마우스 모델에서 특이적 및 재현가능한 엑손 스키핑의 최초의 예는 윌톤(Wilton) 등에 의해 보고되었다[참조: Wilton, Lloyd et al. 1999]. 안티센스 분자를 공여체 스플라이싱 부위로 지향시킴으로써, 일관된 및 효율적 엑손 23 스키핑이 배양된 세포의 처리 6시간 이내에 디스트로핀 mRNA에서 유도되었다. 윌톤 등은 또한 보다 긴 안티센스 올리고뉴클레오티드를 사용하여 마우스 디스트로핀 프리-mRNA의 수용체 영역을 표적화하는 것을 기재한다. 인트론 23 공여체 스플라이싱으로 지향된 최초의 안티센스 올리고뉴클레오티드는 초대 배양된 근아세포에서 일관된 엑손 스키핑을 유도했지만, 이 화합물은 보다 높은 수준의 디스트로핀을 발현하는 불멸 세포 배양물에서 훨씬 덜 효율적인 것으로 밝혀졌다. 그러나, 세련된 표적화 및 안티센스 올리고뉴클레오티드 디자인을 사용하여, 특이적 엑손 제거의 효율은 거의 10배 증가했다[참조: Mann, Honeyman et al. 2002].
최근의 연구는 디스트로핀의 부재하에 영향을 받은 조직에서 최소 부작용을 수반하는 지속된 디스트로핀 발현을 달성하기 위한 과제를 해소하기 시작했다. DMD를 갖는 4명의 환자에서 전경골근으로 엑손 51(PRO051)을 표적화한 안티센스 올리고뉴클레오티드의 근육내 주사는 임의의 임상적으로 명백한 부작용 없이 엑손 51의 특이적 스키핑을 가져왔다[참조: Mann, Honeyman et al. 2002; van Deutekom, Janson et al. 2007]. mdx 마우스에서 엑손 23을 표적화한 세포-투과성 펩티드(PPMO)와 접합된 안티센스 포스포로디아미데이트 모르폴리노 올리고머의 전신 전달을 찾는 연구는 검출가능한 독성 없이 골격근 및 심근에서 고도의 지속된 디스트로핀 단백질 생성을 생성했다[참조: Jearawiriyapaisarn, Moulton et al. 2008; Wu, Moulton et al. 2008; Yin, Moulton et al. 2008].
DMD의 치료를 위해 스플라이싱 스위칭 올리고뉴클레오티드(SSO)의 안전성 및 효능을 시험하는 최근의 임상 시험은 스플라이세오솜의 입체적 차단에 의해 프리-mRNA의 대체 스플라이싱을 유도하기 위해 SSO 기술에 기초한다[참조: Cirak et al., 2011; Goemans et al., 2011; Kinali et al., 2009; van Deutekom et al., 2007].
이들 성공에도 불구하고, 복수의 디스트로핀 엑손을 표적화한 개선된 안티센스 올리고머, 및 DMD 치료학적 적용을 위한 개선된 근육 전달 조성물 및 방법의 필요성이 여전히 존재한다.
한 가지 국면에 따라, 본 발명은 엑손 스키핑을 유도하기 위해 인간 디스트포린 프리-mRNA에서 선택된 표적에 결합할 수 있는 안티센스 분자를 제공한다. 또 다른 국면에서, 본 발명은 단일 또는 복수 엑손 스키핑을 유도하기 위해 함께 사용되는 2개 이상의 안티센스 올리고뉴클레오티드를 제공한다. 예를 들면, 단일 또는 복수 엑손의 엑손 스키핑은 2개 이상의 안티센스 올리고뉴클레오티드 분자를 함께 결합시킴으로써 달성될 수 있다.
또 다른 국면에서, 본 발명은, H53A(+33+60) 및 H53A(+22+46)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 어닐링 부위로서 지정된 디스트로핀 유전자의 엑손 53 표적 영역에 상보적인, 적어도 10개, 12개, 15개, 17개, 20개 또는 그 이상의 연속 뉴클레오티드를 포함하는 길이 20개 내지 50개 뉴클레오티드의 단리된 안티센스 올리고뉴클레오티드로서, 상기 안티센스 올리고뉴클레오티드가 엑손 53 스키핑을 유도하는 어닐링 부위와 특이적으로 하이브리드화하는, 단리된 안티센스 올리고뉴클레오티드에 관한 것이다. 한 가지 실시형태에서, 상기 안티센스 올리고뉴클레오티드는 길이 25 내지 28개 뉴클레오티드이다. 본 발명의 또 다른 실시형태는, H53(+46+73), H53A(+46+69) 및 H53A(+40+61)으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 어닐링 부위로서 지정된 디스트로핀 유전자의 엑손 53 표적 영역에 상보적인, 적어도 10개, 12개, 15개, 17개, 20개 또는 그 이상의 연속 뉴클레오티드를 포함하는 길이 20개 내지 50개 뉴클레오티드의 단리된 안티센스 올리고뉴클레오티드로서, 상기 안티센스 올리고뉴클레오티드가 엑손 53 스키핑을 유도하는 어닐링 부위와 특이적으로 하이브리드화하는, 단리된 안티센스 올리고뉴클레오티드에 관한 것이다.
또 다른 국면에서, 본 발명은, 서열번호 1 및 7로 이루어진 그룹으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열의 적어도 10개, 12개, 15개, 17개, 20개 또는 그 이상의 뉴클레오티드를 포함하는 길이 20개 내지 50개 뉴클레오티드의 단리된 안티센스 올리고뉴클레오티드로서, 상기 올리고뉴클레오티드가 디스트로핀 유전자의 엑손 53 표적 영역과 특이적으로 하이브리드화하고 엑손 53 스키핑을 유도하는, 단리된 안티센스 올리고뉴클레오티드에 관한 것이다. 한 가지 실시형태에서, 서열번호 1 및 7에서 티민 염기는 임의로 우라실이다.
본 발명의 다른 실시형태는, 서열번호 6, 8 및 9로 이루어진 그룹으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열의 적어도 10개, 12개, 15개, 17개, 20개 또는 그 이상의 뉴클레오티드를 포함하는 길이 20개 내지 50개 뉴클레오티드의 단리된 안티센스 올리고뉴클레오티드로서, 상기 올리고뉴클레오티드가 디스트로핀 유전자의 엑손 53 표적 영역과 특이적으로 하이브리드화하고 엑손 53 스키핑을 유도하는, 단리된 안티센스 올리고뉴클레오티드에 관한 것이다. 한 가지 실시형태에서, 서열번호 6, 8 및 9에서 티민 염기가 임의로 우라실이다.
엑손 53을 표적화한 예시적 안티센스 서열은 하기 동정된 것들을 포함한다:
H53A(+33+60): 5'-GTTGCCTCCGGTTCTGAAGGTGTTCTTG-3' (서열번호 1)
H53A(+46+73): 5'-ATTTCATTCAACTGTTGCCTCCGGTTCT-3' (서열번호 6)
H53A(+22+46): 5'- TGAAGGTGTTCTTGTACTTCATCCC-3' (서열번호 7)
H53A(+46+69): 5'-CATTCAACTGTTGCCTCCGGTTCT-3' (서열번호 8)
H53A(+40+61): 5'-TGTTGCCTCCGGTTCTGAAGGT-3' (서열번호 9)
한 가지 실시형태에서, 상기 안티센트 올리고머는 어닐링 부위 H53A(+33+60), 예를 들면, 서열번호 1과 특이적으로 하이브리드화하고, 여기서 티민 염기는 임의로 우라실이다. 여전히 또 다른 실시형태에서, 상기 안티센스 올리고머는 어닐링 부위 H53A(+22+46), 예를 들면, 서열번호 7과 특이적으로 하이브리드화한다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오티드는 Rnase H에 의한 절단을 최소화 또는 방지하기 위해 하나 이상의 변형을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오티드는 RNase H를 활성화시키지 않는다. 일부 실시형태에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 비-천연 골격을 포함한다. 일부 실시형태에서, 올리고뉴클레오티드 골격의 당 모이어티는 비-천연 모이어티, 예를 들면, 모르폴리노로 치환되어 있다. 일부 실시형태에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 변형된 포스페이트 등과 같이 비-천연 뉴클레오티드간 결합으로 치환된 올리고뉴클레오티드 골격의 뉴클레오티드간 결합을 갖는다. 예시의 변형된 포스페이트는 메틸 포스포네이트, 메틸 포스포로티오에이트, 포스포로모르폴리데이트, 포스포로피페라지데이트 및 포스포로아미데이트를 포함한다. 일부 실시형태에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 2'-O-메틸-올리고리보뉴클레오티드 또는 펩티드 핵산이다.
일부 실시형태에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 염기 변형 또는 치환을 함유한다. 예를 들면, 특정한 뉴클레오-염기는 본원에 기재된 안티센스 올리고뉴클레오티드의 결합 친화성을 증가시키기 위해 선택될 수 있다. 이들은 2-아미노프로필아데닌, 5-프로피닐우라실, 5-프로피닐시토신 및 2,6-디아미노퓨린을 포함하여 5-치환된 피리미딘, 6-아자피리미딘 및 N-2, N-6 및 O-6 치환된 퓨린을 포함한다. 5-메틸시토신 치환체는 0.6 내지 1.2℃까지 핵산 이본쇄 안정성을 증가시키는 것으로 밝혀졌다. 한 가지 실시형태에서, 올리고뉴클레오티드의 적어도 하나의 피리미딘 염기는 5-치환된 피리미딘 염기를 포함하고, 여기서 상기 피리미딘 염기는 시토신, 티민 및 우라실로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 한 가지 실시형태에서, 5-치환된 피리미딘 염기는 5-메틸시토신이다. 또 다른 실시형태에서, 올리고뉴클레오티드의 적어도 하나의 퓨린 염기는 N-2, N-6 치환된 퓨린 염기를 포함한다. 한 가지 실시형태에서, N-2, N-6 치환된 퓨린 염기는 2,6-디아미노퓨린이다.
한 가지 실시형태에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 단독으로 또는 또 다른 변형, 예를 들면, 2'-O-메톡시에틸 당 변형과 조합하여 하나 이상의 5-메틸시토신 치환체를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 단독으로 또는 또 다른 변형과 조합하여 하나 이상의 2,6-디아미노퓨린 치환체를 포함한다.
또 다른 국면에서, 본 발명은, (i) 인접한 아단위의 5' 환외(exocyclic) 탄소에 하나의 아단위의 모르폴리노 질소를 결합시키는 모르폴리노 아단위 및 인-함유 아단위간 결합으로 구성되고, (ii) 10 내지 50개 뉴클레오티드 염기를 함유하고, (iii) 디스트로핀 프리-mRNA에서 표적 서열의 적어도 10개 또는 12개 연속 염기와 하이브리드화하고 엑손 스키핑을 유도하기에 효과적인 염기 서열을 갖는, 안티센스 올리고뉴클레오티드를 포함한다.
한 가지 국면에서, 안티센스 화합물은 인접한 아단위의 5' 환외 탄소에 하나의 아단위 모르폴리노 질소를 결합시키는 인-함유 아단위간 결합으로 구성된다. 화합물 중의 모르폴리노 아단위는 구조에 따라 포스포로디아미데이트 결합에 의해 결합될 수 있다:
Figure pat00001
여기서, Y1는 O이고, Z는 O이고, Pj는 염기-특이적 수소 결합에 의해 폴리뉴클레오티드 중의 염기에 결합하는데 효과적인 퓨린 또는 피리미딘 염기-짝짓기 모이어티이고, X는 알킬, 알콕시, 티오알콕시 또는 알킬 아미노이고, 여기서 X는 NR2이고, 각각의 R은 독립적으로 수소 또는 메틸이다. 하전되지 않은 상기 아단위간 결합은 생리학적 pH에서 양으로 하전되는 결합이 산재될 수 있고, 양으로 하전된 결합의 총 수는 1 내지 아단위간 결합의 모든 총수 이하이다.
또 다른 예시적 실시형태에서, 상기 화합물은, 이의 전체가 본원에서 도입되는 미국 특허원 제13/118,298호에 기재된 바와 같이 아단위간 결합 및 말단 변형으로 구성되어 있다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 안티센스 올리고머는 RNase H를 활성화시키지 않는다. 일부 실시형태에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 비-천연 골격을 포함한다. 일부 실시형태에서, 올리고뉴클레오티드 골격의 당 모이어티는 모르폴리노 등의 비-천연 모이어티로 대체되어 있다. 일부 실시형태에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 변형된 포스페이트 등의 비-천연 뉴클레오티드간 결합으로 치환된 올리고뉴클레오티드 골격의 뉴클레오티드간 결합을 갖는다. 예시의 변형된 포스페이트는 메틸 포스포네이트, 메틸 포스포로티오에이트, 포스포로모르폴리데이트, 포스포로피페라지데이트 및 포스포로아미데이트를 포함한다. 일부 실시형태에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 2'-O-메틸-올리고리보뉴클레오티드 또는 펩티드 핵산이다.
일부 실시형태에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는, 안티센스 올리고뉴클레오티드의 활성, 세포 분포 또는 세포 흡수를 증강시키는 하나 이상의 모이어티, 예를 들면, 폴리에틸렌 글리콜 모이어티, 또는 접합체, 예를 들면, 아르기닌-풍부 세포 투과성 펩티드(예: 서열번호 10 내지 25)에 화학적으로 결합된다. 한 가지 예시적 실시형태에서, 아르기닌-풍부 폴리펩티드는 안티센스 화합물의 3' 또는 5' 말단에 이의 N-말단 또는 C-말단 잔기에서 공유 결합된다. 또한, 예시적 실시형태에서, 안티센스 화합물은 인접한 아단위의 5' 환외 탄소에 하나의 아단위의 모르폴리노 질소를 결합시키는 모르폴리노 아단위 및 인-함유 아단위간 결합으로 구성된다.
또 다른 국면에서, 본 발명은 상기 기재된 안티센스 올리고뉴클레오티드, 예를 들면, 서열번호 1 및 7의 안티센스 올리고뉴클레오티드를 도입하는 발현 벡터를 제공한다. 일부 실시형태에서, 발현 벡터는 변형된 레트로바이러스 또는 비-레트로바이러스 벡터, 예를 들면, 아데노-연관 바이러스 벡터이다.
또 다른 국면에서, 본 발명은 상기 기재된 안티센스 올리고뉴클레오티드, 및 인산염 완충제를 포함하는 염수 용액을 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.
또 다른 국면에서, 본 발명은 환자에게 전달하기에 적합한 형태로 안티센스 분자를 적어도 포함하는 유전자 질환의 예방학적 또는 치료학적 치료를 보조하기 위해 선택된/되거나 적용된 안티센스 분자를 제공한다.
또 다른 국면에서, 본 발명은, (a) 본원에 기재된 방법에 따라 안티센스 분자를 선택하는 단계 및 (b) 이러한 치료를 필요로 하는 환자에게 상기 분자를 투여하는 단계를 포함하여, 특정 단백질을 코딩하는 유전자에서 돌연변이가 존재하고 상기 돌연변이의 영향이 엑손 스키핑에 의해 제거될 수 있는, 유전자 질환을 앓고 있는 환자를 치료하는 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 유전자 질환 치료용 의약을 제조하기 위한 본 발명의 정제된 및 단리된 안티센스 올리고뉴클레오티드의 용도를 제공한다.
또 다른 국면에서, 본 발명은, 환자에서 특정 유전자 병변과 관련하여 본 발명의 적절하게 디자인된 안티센스 올리고뉴클레오티드의 유효량을 환자에게 투여하는 것을 포함하여 뒤센 근위축증을 특징으로 하는 상태를 치료하는 방법을 제공한다. 추가로, 본 발명은, 유효량의 안티센스 올리고뉴클레오티드, 또는 하나 이상의 이들 생물학적 분자를 포함하는 약제학적 조성물을 환자에게 투여하여 뒤센형 근위축증을 예방하거나 최소화하기 위해 환자를 예방학적으로 치료하는 방법을 제공한다.
또 다른 국면에서, 본 발명은, 유전자 질환을 치료하기 위한 키트로서, 적합한 용기에 팩키징된 본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오티드 및 이의 사용 지침을 적어도 포함하는 키트를 제공한다.
이들 및 기타 목적 및 특징은 본 발명의 하기 상세한 설명을 도면과 함께 읽을 경우에 보다 충분하게 이해될 것이다.
도 1a는 포스포로디아미데이트 결합을 갖는 예시적 모르폴리노 올리고머 구조를 나타낸다.
도 1b는 본 발명의 실시형태에 따라 아르기닌-풍부 펩티드와 안티센스 올리고머의 접합체를 나타낸다.
도 1c는 골격 결합이 하나 이상의 양으로 하전된 그룹을 함유하는 도 1b에와 같은 접합체를 나타낸다.
도 1d 내지 1g는 d 내지 g로 지정된 예시적 모르폴리노 올리고뉴클레오티드의 반복 아단위 세그먼트를 나타낸다.
도 2는 예시적 안티센스 올리고머를 인간 디스트로핀 엑손 53에 어닐링하여 엑손 53 스키핑을 유도하는 상대 위치를 나타낸다.
도 3 및 4는 배양된 인간 횡문근육종 세포에서 엑손 53 스키핑을 유도하기 위한 예시적 안티센스 올리고머의 상대 활성을 나타내는 2개 독립 실험에 상응하는 그래프를 도시한다. 지시된 올리고머로 처리된 횡문근육종 세포로부터 단리된 RNA를 엑손 53-특이적 네스티드 RT-PCR 증폭에 제공하고, 이어서 겔 전기영동 및 밴드 강도 정량화에 제공했다. 데이터는 PCR에 의해 평가된 엑손 스키핑(%), 즉 전장 PCR 생성물에 대한 엑손-스키핑된 생성물의 밴드 강도로서 플롯되어 있다. NG-11-0352, NG-12-0078 및 NG-12-0079(각각 서열번호 2 내지 4)는 공개된 올리고머이다.
도 5는 배양된 1차 근아세포에서 엑손 53 스키핑을 유도하는 예시적 안티센스 올리고머의 상대 활성을 나타내는 그래프를 도시한다. 지시된 올리고머로 처리한 1차 근아세포로부터 단리된 RNA를 엑손 53-특이적 네스티드 RT-PCR 증폭에 제공하고, 이어서 겔 전기영동 및 밴드 강도 정량화에 제공했다. 데이터는 PCR에 의해 평가된 엑손 스키핑(%), 즉 전장 PCR 생성물에 대한 엑손-스키핑된 생성물의 밴드 강도로서 플롯되어 있다. NG-12-0080는 서열번호 1에 기재된 올리고머에 상응한다.
본 발명의 실시형태는 일반적으로 인간 디스트로핀 유전자에서 엑손 스키핑을 유도하도록 특이적으로 디자인된 개선된 안티센스 화합물 및 이의 사용 방법에 관한 것이다. 디스트포린은 근육 기능에서 중요한 역활을 담당하고, 다양한 근육-관련 질환은 이 유전자의 돌연변이된 형태를 특징으로 한다. 따라서, 특정한 실시형태에서, 본원에 기재된 개선된 안티센스 화합물은 돌연변이 형태의 인간 디스트로핀 유전자, 예를 들면, 뒤센형 근위축증(DMD) 및 벡커 근위축증(BMD)에서 발견되는 돌연변이된 디스트로핀 유전자에서 엑손 스키핑을 유도한다.
돌연변이에 의해 유발된 이상 mRNA 스플라이싱 사상에 기인하여, 이들 돌연변이된 인간 디스트로핀 유전자는 결함 디스트로핀 단백질을 발현하거나, 측정가능한 디스트로핀을 전혀 발현하지 않고, 이 상태는 다양한 형태의 근위축증을 유도한다. 이 상태를 개선하기 위해, 본 발명의 안티센스 화합물은 돌연변이된 디스트로핀 유전자의 전처리된 RNA의 선택된 영역과 하이브리드화하고, 엑손 스키핑 및 달리는 이상 스플라이싱된 디스트로핀 mRNA에서 상이한 스플라이싱을 유도하고, 이에 의해 근육 세포가 기능성 디스트로핀 단백질을 코딩하는 mRNA 전사체를 생성하게 한다. 특정 실시형태에서, 생성되는 디스트로핀 단백질은 반드시 "야생형" 형태의 디스트로핀인 것은 아니고, 오히려 절단된, 또한 기능적 또는 반-기능적 형태의 디스트로핀이다.
근육 세포에서 기능적 디스트로핀 단백질의 수준을 증가시킴으로써, 이들 및 관련 실시형태는, 이상 mRNA 스플라이싱에 기인하여 결함 디스트로핀 단백질의 발현을 특징으로 하는 근위축증, 특히 DMD 및 BMD 등의 근위축증 형태의 예방 및 치료에 유용할 수 있다. 본원에 기재된 특이적 올리고머는 사용시에 다른 올리고머에 비해 개선된 디스트로핀-엑손-특이적 표적화를 제공하고, 이에 의해 관련 형태의 근위축증을 치료하는 다른 방법에 비해 중요한 및 실용적 이점을 제공한다.
따라서, 본 발명은, H53A(+33+60) 및 H53A(+22+46)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 어닐링 부위로서 지정된 디스트로핀 영역의 엑손 53 표적 영역에 상보적인, 적어도 10개, 12개, 15개, 17개, 20개 또는 그 이상의 뉴클레오티드를 포함하는 길이 20개 내지 50개 뉴클레오티드의 단리된 안티센스 올리고뉴클레오티드에 관한 것이다. 안티센스 올리고뉴클레오티드는 엑손 53 스키핑을 유도하는 어닐링 부위와 특이적으로 하이브리드화한다. 본 발명의 다른 안티센스 올리고뉴클레오티드는 길이 20개 내지 50개 뉴클레오티드이고, H53(+46+73), H53A(+46+69) 및 H53A(+40+61)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 어닐링 부위로서 지정된 디스트로핀 유전자의 엑손 53 표적 영역에 상보적인 적어도 10개, 12개, 15개, 17개, 20개 또는 그 이상의 뉴클레오티드를 포함한다.
본 발명의 다른 안티센스 올리고뉴클레오티드는 길이 20개 내지 50개 뉴클레오티드이고, 서열번호 1 또는 7의 적어도 10개, 12개, 15개, 17개, 20개, 22개, 25개 또는 그 이상의 뉴클레오티드를 포함한다. 다른 실시형태는 서열번호 6, 8 및 9의 적어도 10개, 12개, 15개, 17개, 20개, 22개, 25개 또는 그 이상의 뉴클레오티드를 포함하여 길이 20개 내지 50개 뉴클레오티드의 안티센스 올리고뉴클레오티드에 관한 것이다. 일부 실시형태에서, 서열번호 1, 6, 7, 8 및 9 중의 티민 염기는 임의로 우라실이다.
본 발명의 예시적 안티센스 올리고머는 하기 기재되어 있다:
H53A(+33+60): 5'-GTTGCCTCCGGTTCTGAAGGTGTTCTTG-3' (서열번호 1)
H53A(+46+73): 5'-ATTTCATTCAACTGTTGCCTCCGGTTCT-3' (서열번호 6)
H53A(+22+46): 5'- TGAAGGTGTTCTTGTACTTCATCCC-3' (서열번호 7)
H53A(+46+69): 5'-CATTCAACTGTTGCCTCCGGTTCT-3' (서열번호 8)
H53A(+40+61): 5'-TGTTGCCTCCGGTTCTGAAGGT-3' (서열번호 9)
바람직한 실시형태에서, 안티센스 올리고머는 서열번호 1에 기재된 뉴클레오티드 서열 등의 어닐링 부위 H53A(+33+60)와 특이적으로 하이브리드화한다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용된 모든 기술 용어 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 당해 기술분야의 숙련가에 의해 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본원에 기재된 것들과 유사하거나 동등한 임의의 방법 및 재료가 본 발명의 실시 또는 시험에 사용될 수 있지만, 바람직한 방법 및 재료가 기재되어 있다. 본 발명의 목적을 위해, 하기 용어를 이하에 정의한다.
I. 정의
"약"이란 기준 양, 수준, 값, 수, 빈도, 백분율, 치수, 크기, 양, 중량 또는 기준에 대해 30, 25, 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1%만큼 변화하는 양, 수준, 값, 수, 빈도, 백분율, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이를 의미한다.
용어 "상보적" 및 "상보성"은 염기-짝짓기 규칙에 의해 관련되는 폴리뉴클레오티드(즉, 뉴클레오티드의 서열)를 지칭한다. 예를 들면, 서열 "T-G-A(5'-3')"은 서열 "T-C-A(5'-3')"에 상보적이다. 상보성은 핵산 염기의 일부만이 염기 짝짓기 규칙에 따라 정합되는 "부분적"일 수 있다. 또는, 핵산 사이에 "완전" 또는 "전체" 상보성이 있을 수도 있다. 핵산 쇄 사이의 상보성 정도는 핵산 쇄 사이의 하이브리드화의 효율 및 강도에 유의한 효과를 갖는다. 완전 상보성이 종종 요구되지만, 일부 양태는 표적 RNA와 관련하여 하나 이상, 바람직하게는 6, 5, 4, 3, 2 또는 1개의 부정합을 포함할 수 있다. 올리고머 내의 임의의 위치에서 변이가 포함된다. 특정 실시형태에서, 올리고머의 말단 부근에서 서열의 변이는 일반적으로 내부의 변이에 비해 바람직하고, 존재하는 경우, 전형적으로 5' 및/또는 3' 말단의 약 6, 5, 4, 3, 2 또는 1개 뉴클레오티드 내에 존재한다.
용어 "세포 투과성 펩티드" 및 "CPP"는 호환적으로 사용되고, 양이온성 세포 투과성 펩티드(수송 펩티드로도 불리움), 담체 펩티드 또는 펩티드 도입 도메인을 지칭한다. 본원에 제시된 바와 같은 펩티드는 소정 세포 배양 모집단의 세포의 100% 이내의 세포 투과를 유도하는 능력을 갖고, 전신 투여시에 생체내에서 복수 조직 내에서 거대분자 전좌를 가능하게 한다. 바람직한 CPP 실시형태는 하기 추가로 기재된 바와 같은 아르기닌-풍부 펩티드이다.
용어 "안티센스 올리고머" 및 "안티센스 화합물" 및 "안티센스 올리고뉴클레오티드"는 호환적으로 사용되고, 표적 서열 내의 핵산:올리고머 헤테로이중쇄를 형성하기 위해 염기-짝짓기 모이어티가 왓슨-크릭 염기 짝짓기에 의해 핵산(전형적으로 RNA) 내의 표적 서열과 하이브리드화하는 것을 가능하게 하는 아단위간 결합에 의해 결합된, 각각 염기-짝짓기 모이어티를 포함하는 사이클릭 아단위의 서열을 지칭한다. 사이클릭 아단위는 리보스 또는 또 다른 펜토스 당에 기반하거나, 바람직한 실시형태에서 모르폴리노 그룹(하기 모르폴리노 올리고머의 기재 참조)에 기반한다. 올리고머는 표적 서열에 대해 정확한 또는 부근의 서열 상보성을 가질 수 있고; 올리고머의 말단 부근에서의 서열 변이는 일반적으로 내부에서의 변이보다 바람직하다.
이러한 안티센스 올리고머는 mRNA의 번역을 차단 또는 억제하거나 천연 프리-mRNA 스플라이싱 프로세싱을 억제하기 위해 디자인될 수 있고, 이것이 하이브리드화하는 표적 서열에 대해 "지향" 또는 "표적화"되는 것으로 언급될 수 있다. 표적 서열은 전형적으로 mRNA의 AUG 개시 코돈, 번역 억제 올리고머, 또는 전처리된 mRNA의 스플라이싱 부위, 스플라이싱 억제 올리고머(SSO)를 포함하는 영역이다. 스플라이싱 부위에 대한 표적 서열은 전처리된 mRNA에서 정상 스플라이싱 수용체 접합의 하류에 있는 이의 5' 말단 1 내지 약 25개 염기쌍을 갖는 mRNA 서열을 포함할 수 있다. 바람직한 표적 서열은, 스플라이싱 부위를 포함하거나 엑손 코딩 서열 내에 완전히 함유되거나 스플라이싱 수용체 또는 공여체 부위에 걸쳐 있는 전처리된 mRNA의 임의의 영역이다. 올리고머는 보다 일반적으로, 이들이 상기 기재된 방식으로 표적의 ?e산에 대해 표적화되는 경우, 단백질, 바이러스 또는 세균 등의 생물학적 관련 표적"에 대해 표적화"되는 것으로 언급된다.
용어 "모르폴리노 올리고머" 또는 "PMO"(포스포르아미데이트- 또는 포스포로디아미데이트 모르폴리노 올리고머)는 모르폴리노 아단위 구조로 구성된 올리고뉴클레오티드 유사체를 지칭하고, 여기서 (i) 상기 구조는, 인접한 아단위의 5' 환외 탄소에 하나의 아단위의 모르폴리노 질소를 결합시키는, 인-함유 결합, 1 내지 3개 원자 길이, 바람직하게는 2개 원자 길이 및 바람직하게는 비하전되거나 양이온성에 의해 함께 결합되고, (ii) 각각의 모르폴리노 환은 염기 특이적 수소 결합에 의해 폴리뉴클레오티드 중의 염기에 결합하는데 효과적인 퓨린 또는 피리미딘 염기-짝짓기 모이어티를 포함한다. 예를 들면, 도 1a 중의 구조는 바람직한 포스포로디아미데이트 결합 유형을 나타낸다. 변이는 이들이 결합 또는 활성을 간섭하지 않는 한 이러한 결합에 대해 이루어질 수 있다. 예를 들면, 인에 부착된 산소는 황(티오포스포로디아미데이트)로 치환될 수 있다. 5' 산소는 아미노 또는 저급 알킬 치환된 아미노로 치환될 수 있다. 인에 부착된 펜던트 질소는 치환되지 않거나, (임의로 치환된) 저급 알킬로 일치환 또는 이치환될 수 있다. 또한, 하기 양이온성 결합의 설명을 참조한다. 퓨린 또는 피리미딘 염기 짝짓기 모이어티는 전형적으로 아데닌, 시토신, 구아닌, 우라실, 티민 또는 이노신이다. 모르폴리노 올리고머의 합성, 구조 및 결합 특성은 미국 특허 제5,698,685호, 제5,217,866호, 제5,142,047호, 제5,034,506호, 제5,166,315호, 제5,521,063호, 제5,506,337호, 제8,076,476호, 제8,299,206호 및 제7,943,762호(양이온성 결합)에 기재되어 있고, 이들 모두는 참조로서 본원에 도입된다. 변형된 아단위간 결합 및 말단 그룹은 PCR 출원 제US2011/038459호 및 공개공보 제WO/2011/150408호에 상세되어 있고, 이들은 이들의 전체가 본원에서 참조로서 도입된다.
"아미노산 아단위" 또는 "아미노산 잔기"는 α-아미노산 잔기(-CO-CHR-NH-) 또는 β- 또는 기타 아미노산 잔기(예: -CO-(CH2)nCHR-NH-)(여기서, R은 측쇄(이는 수소를 포함할 수 있다)이고, n은 1 내지 6, 바람직하게는 1 내지 4이다)를 지칭한다.
용어 "천연 발생 아미노산"은 자연에서 발견된 단백질에 존재하는 아미노산을 지칭한다. 용어 "비-천연 아미노산"은 자연에서 발견된 단백질에 존재하지 않는 아미노산을 지칭하고, 예는 베타-알라닌(β-Ala), 6-아미노헥산산(Ahx) 및 6-아미노펜산산을 포함한다.
용어 "천연 발생 핵산"은 자연에서 발견된 핵산을 지칭한다. 전형적으로, 천연 발생 핵산은 포스포디에스테르 결합에 의해 함께 결합된 뉴클레오티드의 폴리머(각각 퓨린 또는 피리미딘 뉴클레오염기 및 펜토즈 당을 함유함)이다. 예시적 천연 발생 핵산 분자는 RNA 및 DNA를 포함한다. 용어 "비-천연 발생 핵산"은 자연에 존재하지 않는 핵산을 지칭한다. 예를 들면, 비-천연 발생 핵산은 하나 이상의 비-천연 염기, 당 및/또는 아단위간 결합, 예를 들면, 천연 발생 핵산 분자에서 발견된 것과 고나련하여 변형되거나 치환된 당, 염기 및/또는 결합을 포함할 수 있다. 예시적 변형은 본원에 기재되어 있다. 일부 실시형태에서, 비-천연 발생 핵산은 하나 이상의 변형, 예를 들면, 당 및 염기 변형, 당 및 염기 결합 변형, 염기 및 결합 변형, 또는 염기, 당 및 결합 변형을 포함한다. 바람직한 실시형태에서, 본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오티드는 비-천연 발생 핵산 분자이다. 예를 들면, 일부 실시형태에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 비-천연(예: 변형되거나 치환된) 염기를 함유한다. 일부 실시형태에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 비-천연(예: 변형되거나 치환된) 당을 함유한다. 일부 실시형태에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 비-천연(예: 변형되거나 치환된) 아단위간 결합을 함유한다. 일부 실시형태에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 한 종류 이상의 변형 또는 치환, 예를 들면, 비-천연 염기 및/또는 비-천연 당 및/또는 비-천연 아단위간 결합을 함유한다. 다른 실시형태에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 천연 발생 핵산 분자의 화학적 조성을 갖고, 예를 들면, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 변형되거나 치환된 염기, 당 또는 아단위간 결합을 포함하지 않는다. 화학적 조성과 관계 없이, 본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오티드는 시험관내에서 합성되고, 생물학적 기원의 안티센스 조성물을 포함하지 않는다.
"엑손"은 단백질을 코딩하는 핵산, 또는 전처리된(또는 전구체) RNA의 일부가 스플라이싱에 의해 제거된 후에 성숙 형태의 RNA 분자로 표현된 핵산 서열의 정의된 부분을 지칭한다. 성숙 RNA 분자는 메신저 RNA(mRNA), 또는 rRNA 또는 tRNA 등과 같은 기능적 형태의 비-코딩 RNA일 수 있다. 인간 디스트로핀 유전자는 약 79개 엑손을 갖는다.
"인트론"은 단백질로 번역되지 않는 핵산 영역(유전자 내)을 지칭한다. 인트론은 전구체 mRNA(프리-mRNA)로 전사되고 이어서 성숙 RNA의 형성 동안 스플라이싱에 의해 제거되는 비-코딩 부분이다.
"유효량" 또는 "치료학적 유효량"은 목적하는 치료 효과를 생성하기에 효과적인 단일 용량 또는 일련의 용량의 일부로서 포유동물 대상체에게 투여되는 안티센스 올리고머 등의 치료학적 화합물의 양을 지칭한다. 안티센스 올리고머의 경우, 이러한 효과는 선택된 표적 서열의 번역 또는 천연 스플라이싱-처리를 억제함으로써 전형적으로 유발된다.
"엑손 스키핑"은, 전체 엑손 또는 이의 일부가 소정 전처리된 RNA로부터 제거되고 이에 의해 단백질로 번역되는 성숙 mRNA 등의 성숙 RNA에 존재하는 것으로부터 배제되는 프로세스를 일반적으로 지칭한다. 따라서, 스키핑된 엑손에 의해 달리 코딩되는 단백질의 일부는 발현된 형태의 단백질에 존재하지 않고, 이는 전형적으로 여전히 기능적이지만 변화된 형태의 단백질을 생성한다. 특정 실시형태에서, 스키핑되는 엑손은 인간 디스트로핀 유전자의 이상 엑손이고, 이는 또한 이상 스플라이싱을 유발하는 이의 서열내에 돌연변이 또는 기타 변화를 함유할 수 있다. 특정 실시형태에서, 스키핑되는 엑손은, 인간 디스트로핀 유전자의 엑손 53이 바람직하지만, 디스트로핀 유전자의 엑손 1 내지 79 중의 임의의 하나 이상이다.
"디스트로핀"은 막대상 세포질 단백질, 및 세포 막을 통해 주위 세포외 매트릭스에 근섬유의 세포골격을 연결하는 단백질 복합체의 중요한 부분이다. 디스트로핀은 복수의 기능성 도메인을 함유한다. 예를 들면, 디스트로핀은 약 아미노산 14 내지 240개의 액틴 결합 도메인 및 약 아미노산 253 내지 3040개의 중앙 막대 도메인을 함유한다. 거대 중앙 도메인은, 알파-액티닌 및 스펙트린과 상동성인 약 109개 아미노산의 24개 스펙트린-형 삼중-헬리컬 요소에 의해 형성된다. 반복체는 힌지 영역으로도 지칭되는 4개 프롤린-풍부 비-반복 세그먼트에 의해 통상 차단되어 있다. 반복체 15 및 16은 디스트로핀의 단백질분해 절단을 위한 주요 부위를 제공하는 것으로 나타나는 18개 아미노산 스트렛치에 의해 분리되어 있다. 대부분 반복체 사이의 서열 동일성은 10 내지 25% 범위이다. 하나의 반복체는 3개의 알파-헬릭스: 1, 2 및 3을 함유한다. 알파-헬릭스 1 및 3은 각각 7개 헬릭스 턴에 의해 형성되어, 아마도 소수성 인터페이스를 통해 코일드-코일로서 상호작용한다. 알파-헬릭스 2는 보다 복잡한 구조를 갖고, 글리신 또는 프롤린 잔기에 의해 분리된 4개 및 3개 헬릭스 턴의 세그먼트에 의해 형성된다. 각각의 반복체는, 알파-헬릭스 2의 최초 부분에서 아미노산 47 및 48 사이의 인트론에 의해 통상 차단되는 2개 엑손에 의해 코딩된다. 다른 인트론은 반복체의 상이한 위치에서 발견되고, 통상 헬릭스-3에 걸쳐 산재된다. 디스트로핀은 또한, 점균류(딕티오스텔리움 디스코이데움) 알파-액티닌의 C-말단 도메인에 대해 상동성을 나타내는 시스테인-풍부 세그먼트(즉, 280 아미노산 중의 15개 시스테인)을 포함하여 약 아미노산 3080 내지 3360의 시스테인-풍부 도메인을 함유한다. 카복시-말단 도메인은 약 아미노산 3361 내지 3685에 존재한다.
디스트로핀의 아미노-말단은 근세포막에서 디스트로핀-연관된 단백질 복합체(DAPC)에 결합한다. DAPC는 디스트로글리칸, 사르코글리칸, 인테그린 및 카베올린을 포함하고, 임의의 이들 성분 중의 돌연변이는 상염색체 계승 근위축증을 유발한다. DAPC는 디스트로핀이 부재하는 경우에 불안정화되고, 이는 막 단백질의 감소된 수준을 초래하고 또한 점진적 섬유 손상 및 막 누출을 유도한다. 다양한 형태의 근위축증, 예를 들면, 뒤센형 근위축증(DMD) 및 벡커 근위축증(BDM)에서, 근육 세포는, 주로 부정확한 스플라이싱을 유도하는 유전자 서열의 돌연변이에 기인하여 변화된 및 기능적 결함 형태의 디스트로핀을 생성하거나 디스트로핀을 전혀 생성하지 않는다. 결함 디스트로핀 단백질의 주요 발현 또는 디스트로핀 또는 디스트로핀-형 단백질의 완전한 결여는 상술한 바와 같이 근육 변성의 신속한 진행을 유도한다. 이와 관련하여, "결함" 디스트로핀 단백질은 당해 기술분야에 공지된 바와 같이 DMD 또는 BMD를 갖는 특정 대상체에서 생성되는 디스트로핀의 형태, 또는 검출가능한 디스트로핀의 부재에 의해 특성화될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "기능" 및 "기능성" 등은 생물학적, 효소적 또는 치료학적 기능을 지칭한다.
"기능성" 디스트로핀 단백질은, DMD 또는 BMD를 갖는 특정 대상체에 존재하는 변화되거나 "결함" 형태의 디스트로핀 단백질과 통상적으로 비교하여, 달리는 근위축증의 특징인 근육 조직의 점진적 열화를 감소시키기에 충분한 생물학적 활성을 갖는 디스트로핀 단백질을 일반적으로 지칭한다. 특정 실시형태에서, 기능성 디스트로핀 단백질은, 당해 기술분야의 통상적 기술에 따라 측정되는 바와 같이, 야생형 디스트로핀의 시험관내 또는 생체내 생물학적 활성의 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100%(이들 사이의 모든 정수 포함)를 가질 수 있다. 한 가지 예로서, 시험관내에서 근육 배양물 중의 디스트로핀-관련 활성은 근관 크기, 근원섬유 조직(또는 해부), 수축 활성 및 아세틸콜린 수용체의 자발적 클러스터링에 따라 측정할 수 있다[참조: Brown et al., Journal of Cell Science. 112:209-216, 1999]. 동물 모델은 질환의 병인을 연구하기 위한 귀중한 자원이고, 디스트로핀-관련 활성을 시험하는 수단을 제공한다. DMD 연구를 위해 가장 광범위하게 사용되는 2개 동물 모델은 mdx 마우스 및 골든 리트리버 근위축증(GRMD) 개이고, 이들 둘 다는 디스트로핀 음성이다[참조: Collins & Morgan, Int J Exp Pathol 84: 165-172, 2003]. 이들 및 기타 동물 모델을 사용하여 다양한 디스트로핀 단백질의 기능적 활성을 측정할 수 있다. 절단된 형태의 디스트로핀, 예를 들면, 본 발명의 특정한 엑손-스키핑 안티센스 화합물에 의해 생성되는 형태가 포함된다.
"단리된"이란 천연 상태에서 통상적으로 수반되는 성분을 실질적으로 또는 본질적으로 함유하지 않는 물질을 의미한다. 예를 들면, 본원에 사용된 바와 같이, "단리된 폴리뉴클레오티드"는, 천연 발생 상태에서 이들에 인접하는 서열로부터 정제되거나 제거된 폴리뉴클레오티드, 예를 들면, 상기 단편에 통상 인접하는 서열로부터 제거된 DNA 단편을 지칭할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "충분한 길이"는 표적 디스트로핀 프리-mRNA 중의 적어도 8개, 보다 전형적으로 8 내지 30개의 연속 뉴클레오염기에 상보성인 안티센스 올리고뉴클레오티드를 지칭한다. 일부 실시형태에서, 충분한 길이의 안티센스는 표적 디스트로핀 프리-mRNA 중의 적어도 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 17, 20개 또는 그 이상의 연속 뉴클레오염기를 포함한다. 다른 실시형태에서, 충분한 길이의 안티센스는 표적 디스트로핀 프리-mRNA 중의 적어도 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 또는 25개 연속 뉴클레오염기를 포함한다. 충분한 길이의 안티센스 올리고뉴클레오티드는 엑손 53과 특이적으로 하이브리드화할 수 있는 적어도 최소수의 뉴클레오티드를 갖는다. 바람직하게는, 충분한 길이의 올리고뉴클레오티드는 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 및 40개 또는 그 이상의 뉴클레오티드를 포함하는 길이 약 10 내지 약 50개 뉴클레오티드이다. 한 가지 실시형태에서, 충분한 길이의 올리고뉴클레오티드는 길이 10 내지 약 30개 뉴클레오티드이다. 또 다른 실시형태에서, 충분한 길이의 올리고뉴클레오티드는 길이 15 내지 약 25개 뉴클레오티드이다. 또 다른 실시형태에서, 충분한 길이의 올리고뉴클레오티드는 길이 20 내지 30개 또는 20 내지 50개 뉴클레오티드이다. 또 다른 실시형태에서, 충분한 길이의 올리고뉴클레오티드는 길이 25 내지 28개 뉴클레오티드이다.
"증강시키다" 또는 "증강시키는", 또는 "증가시키다" 또는 "증가시키는", 또는 "자극하다" 또는 "자극시키는"이란, 무-안티센스 화합물 또는 대조군 화합물에 의해 유발된 반응과 비교하여, 하나 또는 안티센스 화합물 또는 조성물이 세포 또는 대상체에서 보다 큰 생리학적 반응(즉, 하류 효과)을 생성하거나 유발하는 능력을 일반적으로 지칭한다. 측정가능한 생리학적 반응은 당해 기술분야 및 본원 기재에서의 이해로부터 명백한 기타 반응 중에서 디스트로핀 단백질의 기능적 형태의 증가된 발현 또는 근육 조직에서 증가된 디스트로핀-관련 생물학적 활성을 포함할 수 있다. 약 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100%까지 근육 기능의 증가 또는 개선을 포함하는 증가된 근육 기능이 또한 측정될 수 있다. 근섬유의 약 1%, 2%, %, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100% 증가된 디스트로핀 발현을 포함하는 기능적 디스트로핀을 발현하는 근섬유의 비율이 측정될 수 있다. 예를 들면, 섬유의 25 내지 30%가 디스트로핀을 발현하는 경우에 근육 기능 개선의 대략 40%가 발생할 수 있는 것으로 밝혀졌다[참조: DelloRusso et al, Proc Natl Acad Sci USA 99: 12979-12984, 2002]. "증가된" 또는 "증강된" 양은 전형적으로 "통계학적으로 유의한" 양이고, 무-안티센스 화합물(제제의 부재) 또는 대조군 화합물에 의해 생성된 양의 1.1, 1.2, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 40, 50배 또는 그 이상(예: 500, 1000배)(1 사이 및 1 초과의 모든 정수 및 소수점, 예를 들면, 1.5, 1.6, 1.7. 1.8 등 포함)인 증가를 포함한다.
용어 "감소시키다" 또는 "억제시키다"는, 진단 분야에서의 통상의 기술에 따라 측정되는 바와 같이, 본원에 기재된 질환 증상 또는 상태 등의 관련 생리학적 또는 세포 반응을 "감소"시키는 본 발명의 하나 이상의 안티센스 화합물의 능력과 일반적으로 관련될 수 있다. 관련 생리학적 또는 세포 반응(생체내 또는 시험관내)은 당해 기술분야의 숙련가에세 명백할 것이고, 근위축증의 증상 또는 병상의 감소 또는 디스트로핀의 결함 형태, 예를 들면, DMD 또는 BMD를 갖는 개체에서 발현되는 디스트로핀의 변화된 형태의 발현 감소를 포함할 수 있다. 반응의 "감소"는 무-안티센스 화합물 또는 대조군 조성물에 의해 생성된 반응과 비교하여 통계학적으로 유의적일 수 있고, 이들 사이의 모든 정수를 포함하여 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100% 감소를 포함할 수 있다.
또한, 본원에 기재된 바와 같이 서열번호 1 및 6 내지 9 중의 어느 하나 이상을 포함하는 폴리뉴클레오티드 서열을 발현하는 벡터 등과 같이 본 발명의 올리고머성 디스트로핀-표적화 서열을 발현할 수 있는 벡터 전달 시스템이 포함된다. "벡터" 또는 "핵산 작제물"이란, 폴리뉴클레오티드가 삽입 또는 클로닝될 수 있는, 예를 들면, 플라스미드, 박테리오파지, 효모 또는 바이러스로부터 유래하는 폴리뉴클레오티드 분자, 바람직하게는 DNA 분자를 의미한다. 벡터는 바람직하게는 하나 이상의 고유 제한 부위를 함유하고, 표적 세포 또는 조직 또는 이의 전구 세포 또는 조직을 포함하는 정의된 숙주 세포에서 자가 복제할 수 있거나, 클로닝된 서열이 재현 가능하도록 정의된 숙주의 게놈과 통합할 수 있다. 따라서, 벡터는 염색체 복제와는 독립적인 자가 복제성 벡터, 즉 염색체외 속성으로서 존재하는 벡터, 예를 들면, 선형 또는 폐환상 플라스미드, 염색체외 요소, 미니-염색체 또는 합성 염색체일 수 있다. 벡터는 자가-복제를 보장하는 임의의 수단을 함유할 수 있다. 또는, 벡터는, 숙주 세포 내로 도입되는 경우, 게놈 내로 통합되고 통합된 염색체(들)와 함께 복제되는 것일 수 있다.
개체(예: 인간 등의 포유동물) 또는 세포의 "치료"는 개체 또는 세포의 자연 과정을 변화시키는 시도에 사용되는 임의 유형의 개입이다. 처리는, 이로써 한정되는 것은 아니지만, 약제학적 조성물의 투여를 포함하고, 예방학적으로 또는 병리학적 사상의 개시에 후속적으로 또는 병원제와 접촉하여 수행할 수 있다. 치료는 근위축증의 특정 형태에서와 같이 디스트로핀 단백질과 연관된 질환 또는 상태의 증상 또는 병상에 대한 임의의 목적하는 효과를 포함하고, 예를 들면, 치료되는 질환 또는 상태의 하나 이상의 측정가능한 마커의 최소 변화 또는 개선을 포함할 수 있다. 또한, "예방학적" 치료가 포함되고, 이는 치료되는 질환 또는 상태의 진행 속도를 감소시키고, 당해 질환 또는 상태의 개시를 지연시키거나 이의 개시의 중증도를 감소시키는 것과 관련될 수 있다. "치료" 또는 "예방"은 반드시 질환 또는 상태 또는 이의 관련 증상의 완전한 제거, 치유 또는 예방을 나타내는 것은 아니다.
따라서, 이를 필요로 하는 대상체에게, 임의로 약제학적 제제 또는 투여 형태의 일부로서, 본 발명의 하나 이상의 안티센스 올리고머(예: 서열번호 1 및 6 내지 9 및 이의 변이체)를 투여함으로써 DMD 및 BMD 등의 근위축증을 치료하는 방법이 포함된다. 또한, 엑손이 디스트로핀 유전자, 바람직하게는 인간 디스트로핀 유전자로부터의 엑손 53인 하나 이상의 안티센스 올리고머를 투여함으로써 대상체에서 엑손-스키핑을 유도하는 방법이 포함된다. "대상체"는, 본원에 사용된 바와 같이, 증상을 나타내거나 증상을 나타낼 위험에 있고, 본 발명의 안티센스 화합물로 치료될 수 있는 임의의 동물, 예를 들면, DMD 또는 BMD, 또는 이들 상태와 연관된 임의의 증상(예: 근섬유 손실)을 갖거나 가질 위험이 있는 대상체를 포함한다. 적합한 대상체(환자)는 실험 동물(예: 마우스, 랫트, 래빗 또는 기니아 피그), 농장 동물 및 가축 또는 애완동물(예: 고양이 또는 개)을 포함한다. 비-인간 영장류 및 바람직하게는 인간 환자가 포함된다.
"알킬" 또는 "알킬렌"은 둘 다 1 내지 18개 탄소를 함유하는 포화 직쇄 또는 분지쇄 탄화수소 라디칼을 지칭한다. 예는, 제한 없이, 메틸, 에틸, 프로필, 이소-프로필, 부틸, 이소-부틸, tert-부틸, n-펜틸 및 n-헥실을 포함한다. 용어 "저급 알킬"은 1 내지 8개 탄소를 함유하는 본원에 정의된 바와 같은 알킬 그룹을 지칭한다.
"알케닐"은 2 내지 18개 탄소를 함유하고 적어도 1개의 탄소 내지 탄소 이중 결합을 포함하는 불포화 직쇄 또는 분지쇄 탄화수소 라디칼을 지칭한다. 예는, 제한 없이, 에테닐, 프로페닐, 이소-프로페닐, 부테닐, 이소-부테닐, tert-부테닐, n-펜테닐 및 n-헥세닐을 포함한다. 용어 "저급 알케닐"은 2 내지 8개 탄소를 함유하는 본원에 정의된 바와 같은 알케닐 그룹을 지칭한다.
"알키닐"은 2 내지 18개 탄소를 함유하고 적어도 하나의 탄소 내지 탄소 삼중 결합을 포함하는 불포화 직쇄 또는 분지쇄 탄화수소 라디칼을 지칭한다. 예는, 제한 없이, 에티닐, 프로피닐, 이소-프로피닐, 부티닐, 이소-부티닐, tert-부티닐, 펜티닐 및 헥시닐을 포함한다. 용어 "저급 알키닐"은 2 내지 8개 탄소를 함유하는 본원에 정의된 바와 같은 알키닐 그룹을 지칭한다.
"사이클로알킬"은 모노- 또는 폴리-사이클릭 알킬 라디칼을 지칭한다. 예는, 제한 없이, 사이클로부틸, 사이클로펜틸, 사이클로헥실, 사이클로헵틸 및 사이클로옥틸을 포함한다.
"아릴"은 하나 이상의 폐환(들)을 갖는 1 내지 18개 탄소를 함유하는 사이클릭 방향족 탄화수소 모이어티를 지칭한다. 예는, 제한 없이, 페닐, 벤질, 나프틸, 안트라세닐, 펜안트라세닐 및 바이페닐을 포함한다.
"아르알킬"은 화학식 RaRb의 라디칼을 지칭하고, 여기서 Ra는 상기 정의된 바와 같은 알킬렌 쇄이고, Rb는 상기 정의된 바와 같은 하나 이상의 아릴 라디칼, 예를 들면, 벤질, 디페닐메틸 등이다.
"티오알콕시"는 화학식 -SRc의 라디칼을 지칭하고, 여기서 Rc는 본원에 정의된 바와 같은 알킬 라디칼이다. 용어 "저급 티오알콕시"는 1 내지 8개 탄소를 함유하는 본원에 정의된 바와 같은 알콕시 그룹을 지칭한다.
"알콕시"는 화학식 -ORda의 라디칼을 지칭하고, 여기서 Rd는 본원에 정의된 바와 같은 알킬 라디칼이다. 용어 "저급 알콕시"는 1 내지 8개 탄소를 함유하는 본원에 정의된 바와 같은 알킬 라디칼이다. 알콕시 그룹의 예는, 제한 없이, 메톡시 및 에톡시를 포함한다.
"알콕시알킬"은 알콕시 그룹으로 치환된 알킬 그룹을 지칭한다.
"카보닐"은 C(=O)- 라디칼을 지칭한다.
"구아니디닐"은 H2N(C=NH2)-NH- 라디칼을 지칭한다.
"아미디닐"은 H2N(C=NH2)CH- 라디칼을 지칭한다.
"아미노"는 NH2 라디칼을 지칭한다.
"알킬아미노"는 화학식 -NHRd 또는 -NRdRd의 라디칼을 지칭하고, 여기서 각각의 Rd는 독립적으로 본원에 정의된 바와 같은 알킬 라디칼이다. 용어 "저급 알킬아미노"는 1 내지 8개 탄소를 함유하는 본원에 정의된 바와 같은 알킬아미노 그룹을 지칭한다.
"헤테로사이클"은, 임의의 상기 헤테로사이클이 벤젠 환에 융합되어 있는 바이사이클릭 환을 포함하여, 포화, 불포화 또는 방향족이고 질소, 산소 및 황으로부터 독립적으로 선택된 1 내지 4개 헤테로원자를 함유하는 5원 내지 7원의 모노사이클릭 또는 7원 내지 10원의 바이사이클릭, 헤테로사이클릭 환을 의미하고, 여기서 질소 및 황 헤테로원자는 임의로 산화될 수 있고, 질소 헤테로원자는 임의로 4급화될 수 있다. 헤테로사이클은 임의의 헤테로원자 또는 탄소 원자를 통해 부착될 수 있다. 헤테로사이클은 하기 정의된 바와 같은 헤테로아릴을 포함한다. 따라서, 하기 수록된 헤테로아릴 이외에, 헤테로사이클은 또한 모르폴리닐, 피롤리디노닐, 피롤리디닐, 피페리디닐, 피페리지닐, 하이단토이닐, 발레로락타밀, 옥시라닐, 옥세타닐, 테트라하이드로푸라닐, 테트라하이드로피라닐, 테트라하이드로피리디닐, 테트라하이드로티오페닐, 테트라하이드로티오피라닐, 테트라하이드로피리미디닐, 테트라하이드로티오피라닐 등을 포함한다.
"헤테로아릴"은, 모노사이클릭 및 바이사이클린 환 시스템 둘 다를 포함하여, 질소, 산소 및 황으로부터 선택된 적어도 하나의 헤테로원자를 갖고 적어도 1개의 탄소원자를 함유하는 5원 내지 10원의 방향족 헤테로사이클 환을 의미한다. 대표적인 헤테로아릴은 피리딜, 푸릴, 벤조푸라닐, 티오페닐, 벤조티오페닐, 퀴놀리닐, 피롤릴, 인돌릴, 옥사졸릴, 벤즈옥사졸릴, 이미다졸릴, 벤즈이미다졸릴, 티아졸릴, 벤조티아졸릴, 이소옥사졸릴, 피라졸릴, 이소티아졸릴, 피리다지닐, 피리미디닐, 피라지닐, 트리아지닐, 신놀리닐, 프탈라지닐 및 퀴나졸리닐이다.
용어 "임의로 치환된 알킬", "임의로 치환된 알케닐", "임의로 치환된 알콕시", "임의로 치환된 티오알콕시", "임의로 치환된 알킬 아미노", "임의로 치환된 저급 알킬", "임의로 치환된 저급 알케닐", "임의로 치환된 저급 알콕시", "임의로 치환된 저급 티오알콕시", "임의로 치환된 저급 알킬 아미노" 및 "임의로 치환된 헤테로사이클릴"은, 치환되는 경우, 적어도 하나의 수소원자가 치환체로 치환되는 것을 의미한다. 옥소 치환체(=O)의 경우에, 2개의 수소원자가 치환된다. 이와 관련하여, 치환체는 중수소, 임의로 치환된 알킬, 임의로 치환된 알케닐, 임의로 치환된 알키닐, 임의로 치환된 아릴, 임의로 치환된 헤테로사이클, 임의로 치환된 사이클로알킬, 옥소, 할로겐, -CN, -ORx, NRxRy, NRxC(=O)Ry, NRxSO2Ry, -NRxC(=O)NRxRy, C(=O)Rx, C(=O)ORx, C(=O)NRxRy, -SOmRx 및 -SOmNRxRy를 포함하고, 여기서 m은 0, 1 또는 2이고, Rx 및 Ry는 동일하거나 상이하고 독립적으로 수소, 임의로 치환된 알킬, 임의로 치환된 알케닐, 임의로 치환된 알키닐, 임의로 치환된 아릴, 임의로 치환된 헤테로사이클 또는 임의로 치환된 사이클로알킬이고, 각각의 상기 임의로 치환된 알킬, 임의로 치환된 알케닐, 임의로 치환된 알키닐, 임의로 치환된 아릴, 임의로 치환된 헤테로사이클 및 임의로 치환된 사이클로알킬 치환체는 하나 이상의 옥소, 할로겐, -CN, -ORx, NRxRy, NRxC(=O)Ry, NRxSO2Ry, -NRxC(=O)NRxRy, C(=O)Rx, C(=O)ORx, C(=O)NRxRy, -SOmRx 및 -SOmNRxRy로 추가로 치환될 수 있다.
안티센스 분자 명명 시스템은 상이한 안티센스 분자 사이를 구별하는 것으로 제안 및 공개되어 있다[참조: Mann et al., (2002) J Gen Med 4, 644-654]. 이러한 명명법은, 하기 제시된 바와 같이 모두 동일한 표적 영역으로 지향된 몇몇 약간 상이한 안티센스 분자를 시험하는 경우에 특히 연관되었다:
H#A/D(x:y).
첫번째 문자는 종(예: H: 인간, M: 마우스, C: 개)를 나타낸다. "#"은 표적 디스트로핀 엑손 수를 나타낸다. "A/D"는 각각 엑손의 개시 및 말단에서 수용체 또는 공여체 스플라이싱 부위를 나타낸다. (x y)는 "-" 또는 "+"가 각각 인트론 또는 엑손 서열을 나타내는 어닐링 좌표를 나타낸다. 예를 들면, A(-6+18)은 표적 엑손에 선행하는 인트론의 마지막 6개 염기 및 표적 엑손의 처음 18개 염기를 나타낼 것이다. 가장 근접한 스플라이싱 부위는 수용체일 것이고, 따라서 이들 좌표는 "A"에 선행할 것이다. 공여체 스플라이싱 부위에서 어닐링 좌표를 기재하는 것은 마지막 2개 엑손 염기 및 최초 18개 인트론 염기가 안티센스 분자의 어닐링 부위에 상응하는 D(+2-18)일 수 있다. A(+65+85)로 나타낼 수 있는 완전한 엑손 어닐링 좌표는 당해 엑손의 65번째 내지 85번째 뉴클레오티드 사이의 부위이다.
II. 안티센스 올리고뉴클레오티드
안티센스 분자(들)가 프리-mRNA 서열 내의 엑손의 스플라이싱에 관여하는 뉴클레오티드 서열을 표적화하는 경우, 엑손의 정상 스플라이싱은 억제될 수 있고, 성숙 mRNA로부터 전체 표적화 엑손을 바이패스하는 스플라이싱 기구를 유발한다. 다수의 유전자에서, 전체 엑손의 결실은 중요한 기능적 도메인의 소실 또는 판독 프레임의 파괴를 통해 비-기능적 단백질의 생성을 유도할 것이다. 그러나, 일부 단백질에서, 판독 프레임을 파괴하지 않고 단백질의 생물학적 활성을 심각하게 변화시키지 않으면서 단백질 내에서 하나 이상의 엑손을 결실함으로써 단백질을 단축할 수 있다. 전형적으로, 이러한 단백질은 구조적 역할을 갖고/갖거나 이들의 말단에 기능적 도메인을 보유한다. 뒤센형 근위축증은 전형적으로 판독 프레임을 파괴함으로써 기능적 디스트로핀 유전자 생성물의 합성을 방해하는 돌연변이로부터 발생한다. 돌연변이를 함유하는 디스트로핀 유전자 영역의 엑손 스키핑을 유도하는 안티센스 올리고뉴클레오티드는 근육 세포가 기능적 디스트로핀 단백질을 코딩하는 성숙 mRNA 전사체를 생성하게 할 수 있다. 수득되는 디스트로핀 단백질은 반드시 "야생형" 형태의 디스트로핀인 것은 아니고, 오히려 절단된, 여전히 기능적 또는 반 기능적 형태의 디스트로핀이다. 본 발명은 엑손 53에서 지정된 디스트로핀 프리-mRNA 표적에 결합할 수 있고, 당해 유전자의 프로세싱을 재-지향할 수 있는 안티센스 분자를 기재한다.
특히, 본 발명은 하기: H53A(+33+60), H53A(+22+46), H53(+46+73), H53A(+46+69) 및 H53A(+40+61)로부터 선택된 어닐링 부위로서 지정된 디스트로핀 유전자의 엑손 53 표적 영역에 상보적인, 적어도 10개, 12개, 15개, 17개, 20개 또는 그 이상의 연속 뉴클레오티드를 포함하는 길이 20 내지 50개 뉴클레오티드의 단리된 안티센스 올리고뉴클레오티드에 관한 것이다. 안티센스 올리고뉴클레오티드는 엔손 53 스키핑을 유도하는 어닐링 부위와 특이적으로 하이브리드화한다.
안티센스 올리고뉴클레오티드 및 표적 RNA는, 각각의 분자에서 충분한 수의 상응하는 위치가 서로 수소 결합할 수 있는 뉴클레오티드에 의해 점유되는 경우에 서로 상보적이고, 따라서 안정한 및 특이적 결합이 상기 올리고뉴클레오티드와 표적 사이에서 발생한다. 따라서, "특이적으로 하이브리드화 가능한" 및 "상보적"은 안정한 및 특이적 결합이 올리고뉴클레오티드와 표적 사이에서 발생하도록 충분한 정도의 상보적 또는 정확한 짝짓기를 나타내기 위해 사용된다. 안티센스 분자의 서열은 특이적으로 하이브리드화 가능한 이의 표적 서열의 것과 100% 상보적일 필요는 없다는 것이 당해 기술분야에서 이해된다. 안티센스 분자는 표적 분자에 대한 올리고뉴클레오티드의 결합이 표적 RNA의 정상 기능을 간섭하는 경우에 특이적으로 하이브리드화 가능하고, 예를 들면, 생체내 검정 또는 치료학적 치료의 경우에 생리학적 조건하에 및 시험관내 검정의 경우에 당해 검정이 수행되는 조건하에 특이적 결합이 요구되는 조건하에 비-표적 서열에 대한 안티센스 올리고뉴클레오티드의 비-특이적 결합을 회피하기에 충분한 정도의 상보성이 있다.
안티센스 분자의 길이는 프리-mRNA 분자 내의 의도된 위치에 대해 선택적으로 결합할 수 있는 한 달라질 수 있다. 이러한 서열의 길이는 본원에 기재된 선택 공정에 따라 결정될 수 있다. 일반적으로, 안티센스 분자는 길이 약 10개 뉴클레오티드 내지 길이 약 50개 이하의 뉴클레오티드일 것이다. 그러나, 이러한 범위 내의 임의 길이의 뉴클레오티드가 당해 방법에 사용될 수 있는 것이 이해될 것이다. 바람직하게는, 안티센스 분자의 길이는 길이 10 내지 30개 뉴클레오티드이다.
한 가지 실시형태에서, 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 길이 20 내지 50개 뉴클레오티드이고, 서열번호 1 및 6 내지 9 중의 어느 하나의 적어도 10개, 12개, 15개, 17개, 20개 또는 그 이상의 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 서열번호 1 및 6 내지 9 중의 티민 염기는 임의로 우라실이다.
엑손 결실은 단축 전사된 mRNA 중의 판독 프레임 시프트를 유도하지 않아야 한다. 따라서, 3개 엑손의 선형 서열에서 최초 엑손의 말단이 코돈 내의 3개 뉴클레오티드중 2개를 코딩하고 후속 헥손이 결실되어 있는 경우, 선형 서열 중의 제3 엑손은 코돈의 뉴클레오티드 삼중선을 완료할 수 있는 단일 뉴클레오티드로 개시하여야 한다. 제3 엑손이 단일 뉴클레오티드로 개시하지 않는 경우, 절단되거나 비-기능적 단백질의 생성을 유도할 수 있는 판독 프레임 시프트가 존재할 수 있다.
구조 단백질 중의 엑손 말단에서 코돈 정렬은 코돈의 말단에서 항상 파괴되는 것은 아니고, 결과적으로 mRNA의 프레임내 판독을 보장하기 위해 프리-mRNA로부터 하나 이상의 엑손을 결실시킬 필요가 있을 수 있음이 이해될 것이다. 이러한 상황하에, 복수의 안티센스 올리고뉴클레오티드는 본 발명의 방법에 의해 선택되어야 하고, 여기서 각각은 결실되어야 하는 엑손에서 스플라이싱의 유도에 관여할 수 있는 상이한 영역으로 지향된다.
일부 실시형태에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 천연 발생 핵산 분자의 화학적 조성을 갖고, 즉 안티센스 올리고뉴클레오티드는 변형되거나 치환된 염기, 당 또는 아단위 결합을 포함하지 않는다. 바람직한 실시형태에서, 본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오티드는 비-천연 발생 핵산 분자이다. 예를 들면, 비-천연 발생 핵산은 하나 이상의 비-천연 염기, 당 및/또는 아단위 결합, 예를 들면, 천연 발생 핵산 분자에서 발견되는 것과 관련하여 변형되거나 치환된 염기, 당 및/또는 결합을 포함할 수 있다. 예시적 변형은 하기에 기재되어 있다. 일부 실시형태에서, 비-천연 발생 핵산은 한 가지 유형 이상의 변형, 예를 들면, 당 및 염기 변형, 당 및 결합 변형, 염기 및 결합 변형, 또는 염기, 당 및 결합 변형을 포함한다. 예를 들면, 일부 실시형태에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 비-천연(예: 변형되거나 치환된) 염기를 함유한다. 일부 실시형태에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 비-천연(예: 변형되거나 치환된) 당을 함유한다. 일부 실시형태에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 비-천연(예: 변형되거나 치환된) 아단위간 결합을 함유한다. 일부 실시형태에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 한 유형 이상의 변형 또는 치환, 예를 들면, 비-천연 염기 및/또는 비-천연 당 및/또는 비-천연 아단위간 결합을 함유한다.
안티센스 분자를 사용한 이중쇄 형성 동안 프리-mRNA의 분해를 회피하기 위해, 안티센스 분자는 내인성 RNase H에 의한 절단을 최소화 또는 방지하도록 적합시킬 수 있다. 이들 특성은 세포간 또는 RNase H를 함유하는 조 추출물에서 프리-mRNA:안티센스 올리고뉴클레오티드 이중쇄의 메틸화되지 않은 올리고뉴클레오티드를 사용한 RNA의 처리가 프리-mRNA:안티센스 올리고뉴클레오티드 이중쇄의 분해를 유도하기 때문에 매우 바람직하다. 이러한 분해를 회피하거나 유도하지 않을 수 있는 임의 형태의 변형된 안티센스 분자는 본 발명의 방법에서 사용될 수 있다. RNA와 이중쇄화되는 경우에 세포 RNase H에 의해 절단되지 않는 안티센스 분자의 예는 2'-O-메틸 유도체이다. 2'-O-메틸-올리고리보뉴클레오티드는 세포 환견 및 동물 조직에서 매우 안정하고, RNA와 이들의 이중쇄는 이들의 리보- 또는 데옥시리보-대응물보다 높은 Tm 값을 갖는다. 2' 하이드록시리보스 위치의 메틸화 및 포스포로티오에이트 골격의 도입은 표면적으로 RNA에 유사하지만 뉴클레아제 분해에 대해 훨씬 더 내성이 있는 분자를 생성하는 통상의 전략이다.
RNase H를 활성화시키지 않는 안티센스 분자는 공지된 기술에 따라 제조할 수 있다(참조: 미국 특허 제5,149,797호). 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드 서열일 수 있는 이러한 안티센스 분자는, 구조 변형이 이중쇄 형성을 실질적으로 방해하거나 파괴하지 않는 이의 하나의 구성원으로서 올리고뉴클레오티드를 함유하는 이중쇄 분자에 대한 RNase H의 결합을 입체적으로 방해하거나 방지하는 임의의 구조적 변형을 단순히 함유한다. 이중쇄 형성에 관여하는 올리고뉴클레오티드의 일부가 이에 대한 RNase H 결합에 관여하는 것들의 일부와 실질적으로 상이하기 때문에, RNase H를 활성화시키지 않는 다수의 안티센스 분자가 이용가능하다. 예를 들면, 이러한 안티센스 분자는 적어도 하나 또는 모든 뉴클레오티드간 브릿지 포스페이트 잔기가 변형된 포스페이트, 예를 들면, 메틸 포스포네이트, 메틸 포스포로티오에이트, 포스포로모르폴리데이트, 포스포로피페라지데이트 및 포스포르아미데이트인 올리고뉴클레오티드일 수 있다. 예를 들면, 뉴클레오티드간 브릿지 포스페이트 잔기의 모든 다른 하나는 기재된 바와 같이 변형될 수 있다. 또 다른 비제한적 예에서, 이러한 안티센스 분자는 적어도 하나 또는 모든 뉴클레오티드가 2' 저급 알킬 모이어티(예: C1-C4, 선형 또는 분지형, 포화 또는 불포화 알킬, 예를 들면, 메틸, 에틸, 에테닐, 프로필, 1-프로페닐, 2-프로페닐 및 이소프로필)를 함유한다. 예를 들면, 모든 다른 하나의 뉴클레오티드는 기재된 바와 같이 변형될 수 있다.
본 발명에 유용한 안티센스 올리고뉴클레오티드의 구체적 예는 변형된 골격 또는 비-천연 아단위간 결합을 함유하는 뉴클레오티드를 포함한다. 변형된 골격을 갖는 올리고뉴클레오티드는 골격 중에 인 원자를 보유하는 것들 및 골격 중에 인 원자를 갖지 않는 것들을 포함한다. 이들의 뉴클레오티드간 골격 중에 인 원자를 갖지 않는 변형된 올리고뉴클레오티드는 올리고뉴클레오사이드인 것으로 또한 고려할 수 있다.
다른 안티센스 분자에서, 뉴클레오티드 단위의 당 및 뉴클레오사이드간 결합, 즉 골격 둘 다는 신규 그룹으로 치환되어 있다. 염기 단위는 적절한 핵산 표적 화합물과의 하이브리드화를 위해 유지되어 있다. 한 가지 이러한 올리고머성 화합물, 즉 우수한 하이브리드화 특성을 갖는 것으로 밝혀진 올리고뉴클레오티드 유사체는 펩티드 핵산(PNA)으로 지칭된다. PNA 화합물에서, 올리고뉴클레오티드의 당-골격은 아미드 함유 골격, 특히 아미노에틸글리신 골격으로 치환되어 있다. 뉴클레오-염기는 유지되어 있고, 골격의 아미드 부분의 아자 질소 원자에 직접 또는 간접적으로 결합되어 있다.
변형된 올리고뉴클레오티드는 또한 하나 이상의 치환된 당 모이어티를 함유할 수 있다.
올리고뉴클레오티드는 또한 뉴클레오염기(종종 당해 기술분야에서 간단히 "염기"로서 지칭됨) 변형 또는 치환을 포함할 수 있다. 변형되거나 치환된 염기를 함유하는 올리고뉴클레오티드는 핵산에서 가장 일반적으로 발견되는 하나 이상의 퓨린 또는 피리미딘 염기가 덜 일반적 또는 비-천연 염기로 치환되어 있는 올리고뉴클레오티드를 포함한다.
퓨린 염기는 하기 화학식으로 기재된 바와 같이 이미다졸 환에 융합된 피리미딘 환을 포함한다:
Figure pat00002
퓨린
아데닌 및 구아닌은 핵산에서 가장 일반적으로 발견되는 2개의 퓨린 뉴클레오염기이다. 이들은, 이로써 제한되지 않지만, N6-메틸아데닌, N2-메틸구아닌, 하이포크산틴 및 7-메틸구아닌을 포함하는 다른 천연-발생 퓨린으로 치환될 수 있다.
피리미딘 염기는 하기 화학식으로 기재된 바와 같이 6원의 피리미딘 환을 포함한다:
Figure pat00003
피리미딘
시토신, 우라실 및 티민은 핵산에서 가장 일반적으로 발견되는 피리미딘 염기이다. 이들은, 이로써 제한되지 않지만, 5-메틸시토신, 5-하이드록시메틸시토신, 슈도우라실 및 4-티오우라실을 포함하는 다른 천연-발생 피리미딘으로 치환될 수 있다. 한 가지 실시형태에서, 본원에 기재된 올리고뉴클레오티드는 우라실 대신에 티민 염기를 함유한다.
다른 변형되거나 치환된 염기는, 이로써 제한되지 않지만, 2,6-디아미노퓨린, 오로트산, 아그마티딘, 리시딘, 2-티오피리미딘(예: 2-티오우라실, 2-티오티민), G-클램프 및 이의 유도체, 5-치환된 피리미딘(예: 5-할로우라실, 5-프로피닐우라실, 5-프로피닐시토신, 5-아미노메틸우라실, 5-하이드록시메틸우라실, 5-아미노메틸시토신, 5-하이드록시메틸시토신, 슈퍼 T), 7-데아자구아닌, 7-데아자아데닌, 7-아자-2,6-디아미노퓨린, 8-아자-7-데아자구아닌, 8-아자-7-데아자아데닌, 8-아자-7-데아자-2,6-디아미노퓨린, 슈퍼 G, 슈퍼 A 및 N4-에틸시토신 및 이의 유도체; N2-사이클로펜틸구아닌(cPent-G), N2-사이클로펜틸-2-아미노퓨린(cPent-AP) 및 N2-프로필-2-아미노퓨린(Pr-AP), 슈도우라실 또는 이의 유도체; 및 축퇴 또는 유니버셜 염기, 예를 들면, 2,6-디플루오로톨루엔 또는 부재 염기, 예를 들면, 무염기 위치(예: 1-데옥시리보스, 1,2-디데옥시리보스, 1-데옥시-2-O-메틸리보스; 또는 환 산소가 질소(아자리보스)로 치환되어 있는 피롤리딘 유도체)를 포함한다. 슈퍼 A, 슈퍼 G 및 슈퍼 T의 유도체의 예는 전체가 참조로서 도입되는 미국 특허 제6,683, 173호(Epoch Biosciences)호에서 발견할 수 있다. cPent-G, cPent-AP 및 Pr-AP는 siRNA에 도입되는 경우에 면역자극 효과를 감소시키는 것으로 밝혀졌다[참조: Peacock H. et al. J. Am. Chem. Soc. 2011, 133, 9200]. 슈도우라실은 우리딘에서와 같이 정규 N-글리코사이드가 아닌 C-글리코사이드를 갖는 우라실의 천연 발생 이성체화 버젼이다. 슈도우리딘-함유 합성 mRNA는 우리딘-함유 mPvNA와 비교하여 개선된 안전성 프로파일을 가질 수 있다(WO 2009127230, 이의 전체가 참조로서 본원에 도입됨).
특정의 변형되거나 치환된 뉴클레오-염기는 본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오티드의 결합 친화성을 증가시키는데 특히 유용하다. 이들은 2-아미노프로필아데닌, 5-프로피닐우라실 및 5-프로피닐시토신을 포함하여 5-치환된 피리미딘, 6-아자피리미딘 및 N-2, N-6 및 O-6 치환된 퓨린을 포함한다. 5-메틸시토신 치환체는 0.6 내지 1.2℃까지 핵산 이중쇄 안정성을 증가시키는 것으로 밝혀졌고, 보다 특히는 2'-O-메톡시에틸 당 변형과 조합되는 경우에 현재 바람직한 염기 치환체이다.
일부 실시형태에서, 변형되거나 치환된 뉴클레오-염기는 안티센스 올리고뉴클레오티드의 정제를 용이하게 하는데 유용하다. 예를 들면, 특정한 실시형태에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 3개 이상(예: 3, 4, 5, 6 또는 그 이상)의 연속 구아닌 염기를 함유할 수 있다. 특정의 안티센스 올리고뉴클레오티드에서, 3개 이상의 연속 구아닌 염기의 열은 정제를 복잡하게 하는 올리고뉴클레오티드의 응집을 가져올 수 있다. 이러한 안티센스 올리고뉴클레오티드에서, 하나 이상의 연속 구아닌은 이노신으로 치환될 수 있다. 3개 이상의 연속 우아닌 염기의 열에서 하나 이상의 구아닌의 이노신으로의 치환은 안티센스 올리고뉴클레오티드의 응집을 감소시키고, 이에 의해 정제를 용이하게 할 수 있다.
한 가지 실시형태에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드의 또 다른 변형은 올리고뉴클레오티드의 활성, 세포 분포 또는 세포 흡수를 증강시키는 올리고뉴클레오티드의 하나 이상의 모이어티 또는 접합체에 대한 화학적 결합을 수반한다. 이러한 모이어티는, 이로써 제한되지 않지만, 지질 모이어티, 예를 들면, 콜레스테롤 모이어티, 콜린산, 티오에테르, 예를 들면, 헥실-5-트리틸티올, 티오콜레스테롤, 지방족 쇄, 예를 들면, 도데칸디올 또는 운데실 잔기, 인지질, 예를 들면, 디-헥사데실-rac-글리세롤 또는 트리에틸암모늄 1,2-디-O-헥사데실-rac-글리세로-3-H-포스포네이트, 폴리아민 또는 폴리에틸렌 글리콜 쇄 또는 아다만탄 아세트산, 팔미틸 모이어티, 또는 옥타데실아민 또는 헥실아미노-카보닐-옥시콜레스테롤 모이어티를 포함한다.
소정 화합물 중의 모든 위치가 균일하게 변형될 필요는 없고, 사실 하나 이상의 상술된 변형은 단일 화합물에 또는 심지어 올리고뉴클레오티드 내의 단일 뉴클레오사이드에 도입될 수 있다. 본 발명은 또한 키메라 화합물인 안티센스 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 본 발명과 관련하여 "키메라" 안티센스 화합물 또는 "키메라"는 2개 이상의 화학적으로 상이한 영역을 함유하고 각각이 적어도 하나의 단량체 단위, 즉 올리고뉴클레오티드 화합물의 경우에 뉴클레오티드로 구성되는 안티센스 분자, 특히 올리고뉴클레오티드이다. 이들 올리고뉴클레오티드는 올리고뉴클레오티드가 변형되어, 뉴클레아제 분해에 대해 증가된 내성, 증가된 세포 흡수, 및 표적 핵산에 대한 증가된 결합 친화성을 위한 추가의 영역을 제공하는 적어도 하나의 영역을 통상적으로 함유한다.
본 발명에 따라 사용된 안티센스 분자는 고체상 합성의 공지된 기술을 통해 편리하게 및 통상적으로 제조할 수 있다. 이러한 합성을 위한 장치는, 예를 들면 어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems; Foster City, Calif.)를 포함하는 몇몇 공급업체에 의해 판매되고 있다. 변형된 고체 지지체 상에서 올리고뉴클레오티드를 합성하는 한 가지 방법은 미국 특허 제4,458,066호에 기재되어 있다.
당해 기술분야에 공지된 이러한 합성을 위한 임의의 다른 수단을 추가로 또는 대체적으로 사용할 수 있다. 포스포로티오에이트 및 알킬화 유도체 등과 같이 올리고뉴클레오티드를 제조하기 위해 유사한 기술을 사용하는 것은 공지되어 있다. 이러한 한 가지 자동화 실시형태에서, 디에틸-포스포르아미다이트는 출발 물질로서 사용되고 문헌[참조: Beaucage, et al., (1981) Tetrahedron Letters, 22:1859-1862]에 기재된 바와 같이 합성할 수 있다.
본 발명의 안티센스 분자는 시험관내에서 합성되고, 생물학적 기원의 안티센스 조성물을 포함하지 않는다. 본 발명의 분자는 또한, 예를 들면, 흡수, 분포 및/또는 흡수를 보조하기 위한 리포좀, 수용체 표적화 분자, 경구, 직장, 국소 또는 기타 제제로서 다른 분자, 분자 구조체 또는 화합물의 혼합물과 혼합, 캡슐화, 접합 또는 달리는 회합될 수 있다.
A. 모르폴리노 올리고뉴클레오티드
본 발명의 예시적 양태는 도 1a 내지 1c에 설명된 바와 같이 인-함유 골격 결합을 갖는 모르폴리노 올리고뉴클레오티드에 관한 것이다. 도 1c에 제시된 바와 같은 포스포로디아미데이트-결합된 모르폴리노 올리고뉴클레오티드가 바람직하고, 이는 본 발명의 한 가지 국면에 따라 바람직하게는 이의 골격 결합의 10% 내지 50%에서 양으로 하전된 그룹을 함유하도록 변형되어 있다. 안티센스 올리고뉴클레오티드를 포함하는 비하전된 골격 결합을 갖는 모르폴리노올리고뉴클레오티드는, 예를 들면, 문헌[참조: Summerton and Weller 1997] 및 공동 소유의 미국 특허 제5,698,685호, 제5,217,866호, 제5,142,047호, 제5,034,506호, 제5,166,315호, 제5,185,444호, 제5,521,063호, 제5,506,337호, 제8,076,476호, 제8,299,206호 및 제7,943,762호에 상세되어 있고, 이들 모두는 본원에서 명확하게 도입된다.
모르폴리노계 아단위의 중요한 특성은 1) 안정한, 비하전된 또는 양으로 하전된 골격 결합에 의해 올리고머성 형태로 결합되는 능력; 2) 형성된 폴리머가 비교적 짧은 올리고뉴클레오티드(예: 10 내지 15개 염기)에서 약 45℃ 초과의 Tm 값에서 표적 RNA를 포함하는 상보성-염기 표적 핵산과 하이브리드화할 수 있도록 뉴클레오티드 염기(예: 아데닌, 시토신, 구아닌, 티미딘, 우라실 및 이노신)을 지지하는 능력; 3) 포유동물 세포 내로 능동적 또는 수동적으로 수송되는 올리고뉴클레오티드의 능력; 및 4) 각각 RNAse 및 RNase H 분해에 저항하는 안티센스 올리고뉴클레오티드:RNA 헤테로이중쇄의 능력을 포함한다.
특허청구된 대상의 안티센스 올리고뉴클레오티드의 예시적 골격 구조는 각각 비하전되거나 양으로 하전된 인-함유 아단위 결합에 의해 결합된 도 1d 내지 1g에 제시된 모르폴리노 아단위 유형을 포함한다. 도 1d는 모르폴리노 환이 1-원자 포스포아미드 결합에 의해 결합되어 있는 5개 원자 반복-단위 골격을 형성하는 인-함유 결합을 나타낸다. 도 1e는 6-원자 반복-단위 골격을 생성하는 결합을 나타낸다. 이 구조에서, 5' 모르폴리노 탄소를 인 그룹에 결합시키는 원자 Y는 황, 질소, 탄소 또는 바람직하게는 산소일 수 있다. 인으로부터 펜던트된 X 모이어티는 불소, 알킬 또는 치환된 알킬, 알콕시 또는 치환된 알콕시, 티오알콕시 또는 치환된 티오알콕시, 또는 사이클릭 구조를 포함하여 치환되지 않거나 일치환 또는 이치환된 질소, 예를 들면, 모르폴린 또는 피페리딘일 수 있다. 알킬, 알콕시 및 티오알콕시는 바람직하게는 1 내지 6개의 탄소원자를 포함한다. Z 모이어티는 황 또는 산소이고, 바람직하게는 산소이다.
도 1f 및 1g에 제시된 결합은 7-원자 단위-길이의 골격에 대해 지정되어 있다. 구조 1f에서, X 모이어티는 구조 1e에와 같고, Y 모이어티는 메틸렌, 황 또는 바람직하게는 산소일 수 있다. 구조 1g에서, X 및 Y 모이어티는 구조 1E에서와 같다. 특히 바람직한 모르폴리노 올리고뉴클레오티드는, X가 NH2, N(CH3)2 또는 1-피페라진 또는 기타 하전된 그룹이고 Y가 0이고 Z가 0인, 도 1e에 제시된 형태의 모르폴리노 아단위 구조로 구성된 것들을 포함한다.
실질적으로 비하전된 올리고뉴클레오티드는 본 발명의 국면에 따라 하전된 그룹을, 예를 들면, 2 내지 5개의 비하전된 결합당 약 1개 이하, 예를 들면, 10개의 비하전된 결합당 약 4 내지 5개 포함하도록 변형될 수 있다. 특정한 실시형태에서, 안티센스 활성의 최적 개선은 약 25%의 골격 결합이 양이온인 경우에 관찰할 수 있다. 특정 실시형태에서, 증강은 소수, 예를 들면, 10 내지 20%의 양이온성 결합, 또는 양이온성 결합의 수가 범위 50 내지 80%, 예를 들면, 약 60%에 존재하는 경우에 관찰할 수 있다.
완전히 양이온-결합된 올리고머를 포함하여 임의 수의 양이온성 결합을 갖는 올리고머가 제공된다. 그러나, 바람직하게는, 올리고머는 부분적으로 하전되고, 예를 들면, 10% 내지 80%를 갖는다. 바람직한 실시형태에서, 약 10% 내지 60%, 및 바람직하게는 20% 내지 50%의 결합은 양이온성이다.
한 가지 실시형태에서, 양이온성 결합은 골격을 따라 점재되어 있다. 부분 하전된 올리고머는 바람직하게는 적어도 2개의 연속 비하전된 결합을 함유하고, 즉 올리고머는 바람직하게는 이의 전체 길이를 따라 엄격하게 교호하는 패턴을 갖지 않는다.
또한, 양이온성 결합의 블록 및 비하전된 결합의 블록을 갖는 올리고머가 고려되고, 예를 들면, 비하전된 결합의 중앙 블록은 양이온성 결합의 블록에 의해 인접할 수 있고 그 반대일 수도 있다. 한 가지 실시형태에서, 올리고머는 대략 동등한 길이의 5', 3' 및 중앙 영역을 갖고, 중앙 영역 중의 양이온성 결합의 비율은 약 50% 초과, 바람직하게는 약 70% 초과이다.
특정한 실시형태에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 상기 및 혼합물 또는 비하전된 및 양이온성 골격 결합을 갖는 올리고뉴클레오티드의 합성과 관련하여 하기에 인용된 참고문헌에 상세된 방법을 사용하여 단계적 고체상 합성법에 의해 제조할 수 있다. 일부 경우에, 예를 들면, 약동학을 증강시키거나 화합물의 포획 또는 검출을 용이하게 하기 위해 안티센스 화합물에 추가의 화학적 모이어티를 부가하는 것이 바람직할 수 있다. 이러한 모이어티는 표준 합성 방법에 따라 공유 부착시킬 수 있다. 예를 들면, 폴리에틸렌 글리콜 또는 다른 친수성 폴리머, 예를 들면, 1 내지 100개 단량체성 아단위를 갖는 것들의 부가는 안정성의 증강에 유용할 수 있다.
리포터 모이어티, 예를 들면, 플루오레세인 또는 방사성표지된 그룹은 검출 목적으로 부착시킬 수 있다. 또는, 올리고머에 부착된 리포터 표지는 표지된 항체 또는 스트렙트아비딘을 결합할 수 있는 항원 또는 비오틴 등의 리간드일 수 있다. 안티센스 올리고뉴클레오티드의 부착 또는 변형을 위한 모이어티의 선택에 있어서, 생체적합성이고 바람직하지 않은 부작용 없이 대상체에 의해 허용될 가능성이 있는 그룹의 화학적 화합물을 선택하는 것이 물론 일반적으로 바람직하다.
안티센스 적용에 사용하기 위한 올리고뉴클레오티드는 일반적으로 약 10 내지 약 50개 아단위, 보다 바람직하게는 약 10 내지 30개 아단위 및 전형적으로 15 내지 25개 염기의 길이 범위이다. 예를 들면, 19 내지 20개 아단위, 즉 안티센스 올리고뉴클레오티드에 유용한 길이를 갖는 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 이상적으로는 2 내지 10개, 예를 들면, 4 내지 8개의 양이온성 결합 및 나머지 비하전된 결합을 가질 수 있다. 14 내지 15개 아단위를 갖는 올리고뉴클레오티드는 이상적으로는 2 내지 7개, 예를 들면, 3, 4 또는 5개의 양이온성 결합 및 나머지 비하전된 결합을 가질 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 올리고뉴클레오티드는 25 내지 28개 아단위를 갖는다.
각각의 모르폴리노 환 구조는 염기 짝짓기 모이어티를 지지하여, 세포 또는 치료되는 대상체에서 선택된 안티센스 표적과 하이브리드화하도록 통상 지정되는 염기 짝짓기 모이어티의 서열을 형성한다. 염기 짝짓기 모이어티는 천연 DNA 또는 RNA(예: A, G, C, T 또는 U)에서 발견되는 퓨린 또는 피리미딘, 또는 유사체, 예를 들면, 하이포크산톤(예: 뉴클레오사이드 이노신의 염기 성분) 또는 5-메틸 시토신일 수 있다.
상기 언급한 바와 같이, 특정한 양태는 PMO-X 올리고머 및 변형된 말단 그룹을 갖는 것들을 포함하여 신규한 아단위간 결합을 포함하는 올리고뉴클레오티드에 관한 것이다. 일부 실시형태에서, 이들 올리고머는 상응하는 비변형된 올리고머보다 DNA 및 RNA에 대한 보다 높은 친화성을 갖고, 다른 아단위간 결합을 갖는 올리고머와 비교하여 개선된 세포 전달, 효력 및/또는 조직 분포 특성을 입증한다. 다양한 결합 유형 및 올리고머의 구조적 특징 및 특성은 하기 논의에서 보다 상세히 기재되어 있다. 이들 및 관련 올리고머의 합성법은 이의 전체가 참조로서 도입되는 공동 소유의 미국 특허원 제13/118,298호에 기재되어 있다.
특정한 실시형태에서, 본 발명은 인간 질환과 연과되고 하기 식을 갖는 뉴클레오티드의 서열을 포함하는 표적 서열과 상보적인 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드 및 이의 약제학적으로 허용되는 염을 제공한다:
Figure pat00004
상기 식에서,
Nu는 뉴클레오염기이고;
R1은 화학식
Figure pat00005
(여기서, q는 0, 1 또는 2이고,
R2는 수소, C1-C5 알킬, C1-C5 아르알킬 및 포름아미디닐 그룹으로 이루어진 그룹으로부터 선택되고,
R3은 수소, C1-C10 아실, C1-C10 아미노아실, 천연 또는 비-천연 알파 또는 베타 아미노산의 아실 모이어티, C1-C10 아르알킬 및 C1-C10 알킬로 이루어진 그룹으로부터 선택되거나,
R2 및 R3은 결합하여, 당해 환이 C1-C10 알킬, 페닐, 할로겐 및 C1-C10 아르알킬로 이루어진 그룹으로부터 선택된 치환체로 임의로 치환될 수 있는 5 내지 7원의 환을 형성하고;
R4는 전자 쌍, 수소, C1-C6 알킬 및 C1-C6 아르알킬로 이루어진 그룹으로부터 선택된다)를 갖고;
Rx는 사르코신아미드, 하이드록실, 뉴클레오티드, 세포 투과성 펩티드 모이어티 및 피페라지닐로 이루어진 그룹으로부터 선택되고;
Ry는 수소, C1-C6 알킬, 뉴클레오티드, 세포 투과성 펩티드 모이어티, 아미노산, 포름아미디닐 그룹 및 C1-C6 아실로 이루어진 그룹으로부터 선택되고;
Rz는 전자 쌍, 수소, C1-C6 알킬 및 C1-C6 아실로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
Nu는 아데닐, 구아닌, 티민, 우라실, 시토신 및 하이포크산틴으로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있다. 보다 바람직하게는, Nu는 티민 또는 우라실이다.
바람직한 실시형태에서, 본 발명의 하기 화학식을 갖는 뉴클레오티드 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드 및 이의 약제학적으로 허용되는 염을 제공한다:
Figure pat00006
상기 식에서, Nu는 뉴클레오티드이고;
R1은 R1' 및 R1''로 이루어진 그룹으로부터 선택되고, 여기서 R1'는 디메틸-아미노이고, R1''는 화학식
Figure pat00007
(여기서, 적어도 하나의 R1은 R1''이고;
q는 0, 1 또는 2이고; 단, R1의 적어도 하나의 피페리디닐 모이어티이고;
R2는 수소, C1-C5 알킬, C1-C5 아르알킬 및 포름아미디닐 그룹으로 이루어진 그룹으로부터 선택되고,
R3은 수소, C1-C10 아실, C1-C10 아미노아실, 천연 또는 비-천연 알파 또는 베타 아미노산의 아실 모이어티, C1-C10 아르알킬 및 C1-C10 알킬로 이루어진 그룹으로부터 선택되거나;
R2 및 R3은 결합하여, 당해 환이 C1-C10 알킬, 페닐, 할로겐 및 C1-C10 아르알킬로 이루어진 그룹으로부터 선택된 치환체로 임의로 치환될 수 있는 5 내지 7원의 환을 형성하고;
R4는 전자 쌍, 수소, C1-C6 알킬 및 아르알킬로 이루어진 그룹으로부터 선택된다)을 갖고;
Rx는 사르코신아미드, 하이드록실, 뉴클레오티드, 세포 투과성 펩티드 모이어티 및 피페라지닐로 이루어진 그룹으로부터 선택되고;
Ry는 수소, C1-C6 알킬, 뉴클레오티드, 세포 투과성 펩티드 모이어티, 아미노산, 포름아미디닐 그룹 및 C1-C6 아실로 이루어진 그룹으로부터 선택되고;
Rz는 전자 쌍, 수소, C1-C6 알킬 및 C1-C6 아실로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
Nu는 아데닌, 구아닌, 티민, 우라실, 시토신 및 하이포크산틴으로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있다. 보다 바람직하게는, Nu는 티민 또는 우라실이다.
R1 그룹의 약 90 내지 50%는 디메틸아미노(즉, R1')이다. 보다 바람직하게는, R1 그룹의 90 내지 50%는 디메틸아미노이다. 가장 바람직하게는, R1 그룹의 약 66%는 디메틸아미노이다.
R1''는 하기로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있다:
Figure pat00008
바람직하게는, 올리고뉴클레오티드의 적어도 하나의 뉴클레오티드는 화학식
Figure pat00009
(여기서, Rx, Ry, Rz 및 Nu는 상기 정의된 바와 같다)을 갖는다. 가장 바람직하게는, Nu는 티민 또는 우라실이다.
티민(T)은 상기 기재된 화학적 변형을 함유하는 바람직한 염기 짝짓기 모이어티(Nu 또는 Pi)이지만, 당해 기술분야의 숙련가에게 공지된 임의의 염기 아단위가 염기 짝짓기 모이어티로서 사용될 수 있다.
B. 펩티드 수송체
본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오티드는 CPP, 바람직하게는 세포 내로 화합물의 수송을 증강시키는데 효과적인 아르기닌-풍부 펩티드 수송 모이어티에 접합된 올리고뉴클레오티드 모이어티를 포함할 수 있다. 수송 모이어티는 바람직하게는, 예를 들면, 도 1b 및 1c에 제시된 바와 같이 올리고머의 말단에 부착된다. 펩티드는 이들 사이의 모든 정수를 포함하여 소정 세포 배양 모집단의 세포의 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100% 내에서 세포 투과를 유도하는 능력을 갖고, 전신 투여시에 생체내에서 복수 조직 내에서 거대분자 전좌를 가능하게 한다. 한 가지 실시형태에서, 세포-투과성 펩티드는 아르기닌-풍부 펩티드 수송체일 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 세포-투과성 펩티드는 페네트라틴 또는 Tat 펩티드일 수 있다. 이들 펩티드는 당해 기술분야에 공지되어 있고, 예를 들면, 이의 전체가 참조로서 도입된 미국 공개공보 제2010-0016215 A1호에 개시되어 있다. 안티센스 올리고뉴클레오티드에 대한 펩티드의 접합에 특히 바람직한 방법은 이의 전체가 참조로서 도입되는 PCT 공개공보 제WO2012/150960호에서 발견할 수 있다. 본 발명의 펩티드 접합된 올리고뉴클레오티드의 바람직한 실시형태는 CPP와 안티센스 올리고뉴클레오티드 사이의 링커로서 글리신을 사용한다. 예를 들면, 바람직한 펩티드 접합된 PMO는 R6-G-PMO로 구성되어 있다.
상기 기재된 바와 같은 수송 모이어티는 부착된 수송 모이어티의 부재하의 올리고머의 흡수와 비교하여 부착된 올리고머의 세포 도입을 크게 증가시키는 것으로 밝혀졌다. 흡수는 비접합된 화합물과 비교하여 바람직하게는 적어도 10배, 및 보다 바람직하게는 20배 증강된다.
아르기닌-풍부 펩티드 수송체(즉, 세포-투과성 펩티드)의 사용은 본 발명의 실시에 특히 유용하다. 특정한 펩티드 수송체는 근육 세포를 포함하여 일차 세포로 안티센스 화합물의 전달에 고도로 효과적인 것으로 밝혀졌다[참조: Marshall, Oda et al. 2007; Jearawiriyapaisarn, Moulton et al. 2008; Wu, Moulton et al. 2008]. 추가로, 페네트라틴 및 Tat 펩티드 등의 기타 공지된 펩티드 수송체와 비교하여, 본원에 기재된 펩티드 수송체는, 안티센스 PMO와 접합되는 경우, 몇몇 유전자 전사체의 스플라이싱을 변화시키는 증강된 능력을 입증한다[참조: Marshall, Oda et al. 2007].
링커를 제외한 예시적 펩티드 수송체는 하기 표 1에 제공되어 있다.
[표 1]
예시적 펩티드 수송체
Figure pat00010
A 서열번호에 할당된 서열은 결합 부분을 포함하지 않는다(예: Ahx 및 B가 각각 6-아미노헥산산 및 베타-알라닌을 지칭하는 C, G, P, Ahx, B, AhxB).
C. 발현 벡터
한 가지 실시형태에서, 본 발명은 세포에서 본원에 기재된 디스트로핀-표적화 서열의 발현을 위한 발현 벡터를 포함한다. 벡터 전달 시스템은 본 발명의 올리고머성 디스트로핀-표적화 서열을 발현시킬 수 있다. 한 가지 실시형태에서, 이러한 벡터는 서열번호 1 및 6 내지 9 중의 하나 이상의 적어도 10개 연속 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드 서열을 발현시킨다. 다른 실시형태에서, 이러한 벡터는 서열번호 1 및 6 내지 9 중의 하나 이상을 포함하는 폴리뉴클레오티드 서열을 발현시킨다. 유전자 절단에 적합한 발현 벡터는 당해 기술분야에 공지되어 있다. 이러한 발현 벡터는 본원에 기재된 디스트로핀-표적화 서열을 발현하도록 변형시킬 수 있다. 예시적 발현 벡터는, 예를 들면, 폴리뉴클레오티드가 삽입 또는 클로닝될 수 있는, 플라스미드, 박테리오파지, 효모 또는 바이러스(예: 아데노바이러스, 아데노-연관 바이러스, 렌티바이러스 등)으로부터 유래하는 폴리뉴클레오티드 분자, 바람직하게는 DNA 분자를 포함한다. 벡터는 바람직하게는 하나 이상의 고유의 제한 부위를 함유하고, 표적 세포 또는 조직 또는 이의 전구 세포 또는 조직을 포함하는 정의된 숙주 세포에서 자가 복제할수 있거나, 클로닝된 서열이 재현가능하도록 정의된 숙주의 게놈으로 통합될 수 있다. 따라서, 벡터는 자가 복제 벡터, 즉 염색체외 속성으로 존재하고 이의 복제가 염색체 복제와 독립적인 벡터, 예를 들면, 선형 또는 폐환상 플라스미드, 염색체외 요소, 미니-염색체 또는 합성 염색체일 수 있다. 벡터는 자가-복제를 보장하는 임의의 수단을 함유할 수 있다. 또는, 벡터는, 숙주 세포에 도입되는 경우, 게놈으로 통합되고, 통합된 염색체(들)과 함께 복제되는 것일 수 있다.
한 가지 실시형태에서, 발현 벡터는 특정 세포 또는 목적하는 조직(예: 근육)에서 본원에 기재된 올리고머성 디스트로핀-표적화 서열의 발현을 촉진시키는 조직-특이적 프로모터, 예를 들면, 근육-특이적 프로모터 및/또는 인핸서를 포함한다. 근육 세포에서의 발현에 적합한 프로모터 서열 및 발현 벡터는, 예를 들면, 이의 전체 내용이 본원에 참조로서 도입되는 미국 특허공보 제US 2011/0212529에 기재된 것들을 포함한다. 예시적 근육-특이적 프로모터는 데스민 프로모터, 근육 크레아틴 키나제(MCK) 프로모터, Pitx3 프로모터, 골격 알파-액틴 프로모터 또는 트로포닌 I 프로모터를 포함한다. 근육-특이적 프로모터의 사용은, 예를 들면, 문헌[참조: Talbot et al., Molecular Therapy (2010), 18(3): 601-608; Wang et al., Gene Therapy (2008), 15(22): 1489-99; and Coulon et al., Journal of Biological Chemistry (2007), 282(45): 33192-33200]에 추가로 기재되어 있다.
III. 제제 및 투여 방식
특정 실시형태에서, 본 발명은 본원에 기재된 바와 같이 안티센스 올리고머의 치료학적 전달에 적합한 제제 또는 조성물을 제공한다. 따라서, 특정 실시형태에서, 본 발명은 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 담체(첨가제) 및/또는 희석제와 함께 제형화된, 본원에 기재된 치료학적 유효량의 하나 이상의 올리고머를 포함하는 약제학적으로 허용되는 조성물을 제공한다. 본 발명의 올리고머는 단독으로 투여할 수 있지만, 화합물을 약제학적 제제(조성물)로서 투여하는 것이 바람직하다.
핵산 분자의 전달 방법은, 예를 들면, 문헌[참조: Akhtar et al., 1992, Trends Cell Bio., 2:139; and Delivery Strategies for Antisense Oligonucleotide Therapeutics, ed. Akhtar; Sullivan et al., PCT WO 94/02595]에 기재되어 있다. 이들 및 기타 프로토콜은 본 발명의 단리된 올리고머를 포함하여 실질적으로 모든 핵산 분자의 전달에 사용될 수 있다.
하기 상세된 바와 같이, 본 발명의 약제학적 조성물은 고체 또는 액체 형태로의 투여를 위해 특별하게 제형화될 수 있고, 하기: (1) 경구 투여, 예를 들면, 드렌치제(수성 또는 비수성 용액 또는 현탁액), 정제, 예를 들면, 볼, 설하 및 전신 흡수를 위해 표적화된 것들, 볼루스, 분말, 과립, 혀에의 적용을 위한 페이스트; (2) 예를 들면, 멸균 용액 또는 현탁액 또는 서방출 제제로서, 예를 들면, 피하, 근육내, 정맥내 또는 경막외 주사에 의한 비경구 투여; (3) 예를 들면, 크림, 연고, 또는 피부에 도포된 조절-방출 패치 또는 스프레이로서 국소 적용; (4) 예를 들면, 페서리, 크림 또는 폼으로서 질내 또는 직장내; (5) 설하; (6) 안; (7) 경피적 또는 (8) 비내에 적합한 것들을 포함한다.
문구 "약제학적으로 허용되는"은 건전한 의사의 범위 내에서 과도한 독성, 자극, 알러지 반응 또는 기타 문제 또는 합병증 없이 인간 및 동물의 조직과 접촉하여 사용하기에 적합하고 타당한 이익/위험 비에 상응하는 화합물, 물질, 조성물 및/또는 투여 형태를 지칭하기 위해 본원에서 사용된다.
본원에 사용된 문구 "약제학적으로 허용되는 담체"는 약제학적으로 허용되는 물질, 조성물 또는 비히클, 예를 들면, 액체 또는 고체 충전제, 희석제, 부형제, 제조 조제(예: 윤활제, 탈크 마그네슘, 칼슘 또는 아연 스테아레이트 또는 스테아르산), 또는 대상 화합물을 하나의 긱관 또는 신체 일부로부터 또 다른 기관 또는 신체 일부로 운반 또는 수송하는 것에 관여하는 용매 캡슐화 물질을 의미한다. 각각의 담체는 제제의 다른 성분과 상용성이고 환자에게 손상이 없다는 측면에서 "허용"되어야 한다.
약제학적으로 허용되는 담체로서 사용될 수 있는 물질의 일부 예는, 제한 없이, (1) 당, 예를 들면, 락토즈, 글루코즈 및 슈크로즈; (2) 전분, 예를 들면, 옥수수 전분 및 감자 전분; (3) 셀룰로즈 및 이의 유도체, 예를 들면, 나트륨 카복시메틸 셀룰로즈, 에틸 셀룰로즈 및 셀룰로즈 아세테이트; (4) 분말화된 트라가칸트; (5) 맥아; (6) 젤라틴; (7) 탈크; (8) 부형제, 예를 들면, 코코아 버터 및 좌약 왁스; (9) 오일, 예를 들면, 땅콩유, 면실유, 해바라기유, 참깨유, 올리브유, 옥수소유 및 대두유; (10) 글리콜, 예를 들면, 프로필렌 글리콜; (11) 폴리올, 예를 들면, 글리세린, 솔비톨, 만니톨 및 폴리에틸렌 글리콜; (12) 에스테르, 예를 들면, 에틸 올레에이트 및 에틸 라우레이트; (13) 아가; (14) 완충제, 예를 들면, 수산화마그네슘 및 수산화알루미늄; (15) 알긴산; (16) 피로겐-비함유 물; (17) 등장성 염수; (18) 링거 용액; (19) 에틸 알콜; (20) pH 완충 용액; (21) 폴리에스테르, 폴리카보네이트 및/또는 폴리무수물; 및 (22) 약제학적 제제에 사용된 기타 무독성 상용성 물질을 포함한다.
본 발명의 안티센스 올리고머와의 제형화에 적합한 제제의 추가의 비제한적 예는 다양한 조직으로 약물의 도입을 증강시킬 수 있는, PEG 접합된 핵산, 인지질 접합된 핵산, 친지성 잔기를 함유하는 핵산, 포스포로티오에이트, P-당단백질 억제제(예: 플루로닉 P85); 생분해성 폴리머, 예를 들면, 이식후 지속 방출 전달을 위한 폴리(DL-락티드-코글리콜라이드) 미소구체[참조: Emerich, D F et al., 1999, Cell Transplant, 8, 47-58, Alkermes, Inc. Cambridge, Mass.]; 및 적재된 나노입자, 예를 들면, 혈액 뇌 관문을 통해 약무을 전달할 수 있고 신경 흡수 메카니즘을 변화시킬 수 있는 폴리부틸시아노아크릴레이트로 제조된 것들[참조: Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry, 23, 941-949, 1999]을 포함한다.
본 발명은 또한 폴리(에틸렌 글리콜) 지질(PEG-변형된, 분지된 및 비분지된 또는 이들의 조합, 또는 장기-순환 리포좀 또는 잠행 리포좀)을 함유하는 표면-변형된 리포좀을 포함하는 조성물의 사용을 특징으로 한다. 본 발명의 올리고머는 다양한 분자량의 공유 부착된 PEG 분자를 또한 포함할 수 있다. 이들 제제는 표적 조직에서 약물의 축적을 증가시키는 방법을 제공한다. 이러한 부류의 약물 담체는 단핵 식세포 시스템(MPS 또는 RES)에 의한 옵소닌작용 및 제거에 저항성이 있고, 이에 의해 보다 긴 혈액 순환 시간 및 캡슐화 약물에 대한 증강된 조직 노출을 가능하게 한다[참조: Lasic et al. Chem. Rev. 1995, 95, 2601-2627; Ishiwata et al., Chem. Pharm. Bull. 1995, 43, 1005-1011]. 이러한 리포좀은 아마도 혈관신생 표적 조직에서 혈관외 유출 및 포획에 의해 종양에서 선택적으로 축적하는 것으로 밝혀졌다[참조: Lasic et al., Science 1995, 267, 1275-1276; Oku et al., 1995, Biochim. Biophys. Acta, 1238, 86-90]. 장기-순환 리포좀은 특히 MPS의 조직에서 축적하는 것으로 공지된 통상의 양이온성 리포좀과 비교하여 DNA 및 RNA의 약력학 및 약동학을 증강시킨다[참조: Liu et al., J. Biol. Chem. 1995, 42, 24864-24870; Choi et al., 국제 PCT 공개공보 WO 96/10391; Ansell et al., 국제 PCT 공개공보 WO 96/10390; Holland et al., 국제 PCT 공개공보 WO 96/10392]. 장기-순환 리포좀은 또한 간 및 비장 등의 대사적으로 공격적 MPS 조직에서 축적을 회피하는 이들의 능력에 기초하여 양이온성 리포좀과 비교하여 보다 큰 정도로 뉴클레아제 분해로부터 약물을 보호할 가능성이 있다.
추가의 실시형태에서, 본 발명은 미국 특허 제6,692,911호, 제7,163,695호 및 제7,070,807호에 기재된 바와 같이 전달을 위해 제조된 올리고머 조성물을 포함한다. 이와 관련하여, 한 가지 실시형태에서, 본 발명은 단독으로 또는 PEG(예: 분지상 또는 비분지상 PEG 또는 둘 다의 혼합물)와 조합하여, PEG 및 표적화 잔기 또는 가교결합제와 조합된 상기의 어느 하나와 조합하여 리신 및 히스티딘(HK)(미국 특허 제7,163,695호, 제7,070,807호 및 제6,692,911호에 기재된 바와 같음)의 공중합체를 포함하는 조성물 중에 본 발명의 올리고머를 제공한다. 특정 실시형태에서, 본 발명은 글루콘산-변형된 폴리히스티딘 또는 글루코닐화된-폴리히스티딘/트랜스페린-폴리리신을 포함하는 조성물 중에 안티센스 올리고머를 제공한다. 당해 기술분야의 통상의 숙련가는 또한 His 및 Lys와 유사한 특성을 갖는 아미노산이 상기 조성물 내에서 치환될 수 있음을 인지할 것이다.
본원에 기재된 올리고머의 특정 실시형태는 염기성 관능기, 예를 들면, 아미노 또는 알킬아미노를 함유할 수 있고, 따라서 약제학적으로-허용되는 산과의 약제학적으로-허용되는 염을 형성할 수 있다. 이와 관련하여 용어 "약제학적으로-허용되는 염"은 본 발명의 화합물의 비교적 무독성, 무기 및 유기 산 부가 염을 지칭한다. 이들 염은 투여 비히클 또는 투여형 제조 공정에서 동일 반응계에서, 또는 유리 염기 형태의 본 발명의 정제된 화합물을 적합한 유기 또는 무기 산과 별도로 반응시키고 이렇게 형성된 염을 후속 정제 동안 단리함으로써 제조할 수 있다. 대표적 염은 브롬화수소, 염화수소, 설페이트, 바이설페이트, 포스페이트, 니트레이트, 아세테이트, 발레레이트, 올레에이트, 팔미테이트, 스테아레이트, 라우레이트, 벤조에이트, 락테이트, 포스페이트, 토실레이트, 시트레이트, 말레에이트, 푸마레이트, 석시네이트, 타르트레이트, 나프틸레이트, 메실레이트, 글루코헵토네이트, 락토비오네이트 및 라우릴설포네이트 염 등을 포함한다[참조: Berge et al. (1977) "Pharmaceutical Salts", J. Pharm. Sci. 66:1-19].
본 발명의 올리고머의 약제학적으로 허용되는 염은, 예를 들면, 무독성 유기 또는 무기 산으로부터 상기 화합물의 통상의 무독성 염 또는 4급 암모늄 염을 포함한다. 예를 들면, 이러한 통상의 무독성 염은 무기 산, 예를 들면, 염화수소, 브롬화수소, 황산, 설팜산, 인산, 질산 등으로부터 유래된 것들; 및 유기 산, 예를 들면, 아세트산, 프로피온산, 석신산, 글리콜산, 스테아르산, 락트산, 말산, 타르타르산, 시트르산, 아스코르브산, 팔미트산, 말레산, 하이드록시말레산, 페닐아세트산, 글루탐산, 벤조산, 살리실산, 설파닐산, 2-아세톡시벤조산, 푸마르산, 톨루엔설폰산, 메탄설폰산, 에탄 디설폰산, 옥살산, 이소티온산 등으로부터 제조된 염을 포함한다.
특정 실시형태에서, 본 발명의 올리고머는 하나 이상의 산성 관능기를 함유할 수 있고, 따라서 약제학적으로-허용되는 염기와의 약제학적으로-허용되는 염을 형성할 수 있다. 이들 예에서 용어 "약제학적으로-허용되는 염"은 본 발명의 화합물의 비교적 무독성, 무기 및 유기 염기 부가 염을 지칭한다. 이들 염은 또한 투여 비히클 또는 투여형 제조 공정에서 동일 반응계에서, 또는 이의 유리 형태의 정제된 화합물을 적합한 염기, 예를 들면, 약제학적으로 허용되는 금속 양이온의 수산화물, 탄산염 또는 중탄산염, 암모니아 또는 약제학적으로-허용되는 1급, 2급 또는 tert 아민과 별도로 반응시킴으로써 제조할 수 있다. 대표적 알칼리 또는 알칼리 토류 염은 리튬, 나트륨, 칼륨, 칼슘, 마그네슘 및 알루미늄 염 등을 포함한다. 염기 부가 염의 형성에 유용한 대표적 유기 아민은 에틸아민, 디에틸아민, 에틸렌디아민, 에탄올아민, 디에탄올아민, 피페라진 등을 포함한다[참조: Berge et al., supra].
습윤제, 유화제 및 윤활제, 예를 들면, 나트륨 라우릴 설페이트 및 마그네슘 스테아레이트, 및 착색제, 방출제, 코팅제, 감미제, 향미제 및 방향제, 보존제 및 항산화제가 또는 조성물에 존재할 수 있다.
약제학적으로-허용되는 항산화제의 예는 (1) 수용성 항산화제, 예를 들면, 아스코르브산, 시스테인 하이드로클로라이드, 나트륨 바이설페이트, 나트륨 메타바이설페이트, 나트륨 설파이트 등; (2) 유용성 항산화제, 예를 들면, 아스코르빌 팔미테이트, 부틸화 하이드록시아니솔(BHA), 부틸화 하이드록시톨루엔(BHT), 레시틴, 프로필 갈레이트, 알파-토코페롤 등; 및 (3) 금속 킬레이트제, 예를 들면, 시트르산, 에틸렌디아민 테트라아세트산(EDTA), 솔비톨, 타르타르산, 인산 등을 포함한다.
본 발명의 제제는 경구, 비내, 국소(볼내 및 설하 포함), 직장내, 질내 및/또는 비경구 투여에 적합한 것들을 포함한다. 제제는 약학 분야에서 공지된 임의의 방법에 의해 제조할 수 있다. 단일 투여형을 생성하기 위해 담체 물질과 조합될 수 있는 활성 성분의 양은 치료되는 숙주, 특정한 투여 방식에 따라 달라질 것이다. 단일 투여형을 제조하기 위해 담체 물질과 조합될 수 있는 활성 성분의 양은 일반적으로 치료 효과를 생성하는 화합물의 양일 것이다. 일반적으로, 100% 중에서, 이러한 양은 약 0.1% 내지 약 99%의 활성 성분, 바람직하게는 약 5% 내지 약 70%, 가장 바람직하게는 약 10% 내지 약 30%의 범위일 것이다.
특정 실시형태에서, 본 발명의 제제는 사이클로덱스트린, 셀룰로즈, 리포좀, 미셀 형성제, 예를 들면, 담즙산 및 폴리머 담체, 예를 들면, 폴리에스테르 및 폴리무수물로부터 선택된 부형제; 및 본 발명의 올리고머를 포함한다. 특정 실시형태에서, 상술한 제제는 본 발명의 올리고머를 경구적으로 생물이용 가능하게 한다.
이들 제제 및 조성물을 제조하는 방법은 본 발명의 올리고머를 담체 및 임의로 하나 이상의 보조 성분과 혼합하는 단계를 포함한다. 일반적으로 제제는 본 발명의 혼합물을 액체 담체 또는 미분된 고체 담체 또는 이들 둘 다와 균일하고 친밀하게 혼합하고, 이어서 필요에 따라 생성물을 성형함으로써 제조한다.
경구 투여에 적합한 본 발명의 제제는, 각각 활성 성분으로서 본 발명의 화합물의 소정량을 함유하는, 캡슐제, 카쉐제, 환제, 정제, 로젠지제(향미 기준, 통상 슈크로즈 및 아카시아 또는 트라가칸트를 사용), 산제, 과립제의 형태 또는 수성 또는 비-수성 액체 중의 용액 또는 현탁액 또는 수중유 또는 유중수 액체 에멀젼, 또는 엘릭시르 또는 시럽, 또는 캔디(불활성 염기, 예를 들면, 젤라틴 및 글리세린 또는 슈크로즈 및 아카시아를 사용) 및/또는 구강 세정제 등으로서 존재할 수 있다. 본 발명의 올리고머는 또한 볼루스, 연약 또는 페이스트로서 투여할 수 있다.
경구 투여를 위한 본 발명의 고체 투여형(캡슐제, 정제, 환제, 당의정, 산제, 과립제, 트로치제 등)에서, 활성 성분은 하나 이상의 약제학적으로-허용되는 담체, 예를 들면, 나트륨 시트레이트 또는 인산이칼슘, 및/또는 하기 중의 어느 하나: (1) 충전제 또는 증량제, 예를 들면, 전분, 락토즈, 슈크로즈, 글루코즈, 만니톨 및/또는 실릭산; (2) 결합제, 예를 들면, 카복시메틸 셀룰로즈, 알기네이트, 젤라틴, 폴리비닐 피롤리돈, 슈크로즈 및/또는 아카시아; (3) 습윤제, 예를 들면, 글리세롤; (4) 붕해제, 예를 들면, 아가-아가, 탄산칼슘, 감자 또는 타피오카 전분, 알긴산, 특정 실리케이트 및 탄산나트륨; (5) 용해 지연제, 예를 들면, 파라핀; (6) 흡수 촉진제, 예를 들면, 4급 암모늄 화합물 및 계면활성제, 예를 들면, 폴록사머 및 나트륨 라우릴 설페이트; (7) 습윤제, 예를 들면, 세틸 알콜, 글리세롤 모노스테아레이트 및 비이온성 계면활성제; (8) 흡수제, 예를 들면, 카올린 및 벤토나이트 점토; (9) 윤활제, 예를 들면, 탈크, 칼슘 스테아레이트, 마그네슘 스테아레이트, 고체 폴리에틸렌 글리콜, 나트륨 라우릴 설페이트, 아연 스테아레이트, 나트륨 스테아레이트, 스테아르산 및 이들의 혼합물; (10) 착색제; 및 (11) 조절 방출제, 예를 들면, 크로스포비돈 또는 에틸 셀룰로즈와 혼합할 수 있다. 캡슐제, 정제 및 환제의 경우에, 약제학적 조성물은 또한 완충제를 포함할 수 있다. 유사한 유형의 고체 조성물은 고분자량 폴리에틸렌 글리콜 등 뿐만 아니라 락토즈 또는 유당 등의 부형제를 사용하여 연질 및 경질-쉘 젤라틴 캡슐 중의 충전제로서 사용될 수 있다.
정제는 임의로 하나 이상의 보조 성분과 함께 압축 또는 성형하여 제조할 수 있다. 압축 정제는 결합제(예: 젤라틴 또는 하이드록시프로필메틸 셀룰로즈), 윤활제, 불활성 희석제, 보존제, 붕해제(예: 나트륨 전분 글리콜레이트 또는 가교결합된 나트륨 카복시메틸 셀룰로즈), 표면-활성 또는 분산제를 사용하여 제조할 수 있다. 성형 정제는 불활성 액체 희석제로 습윤화된 분말상 화합물의 혼합물을 적합한 기계에서 성형함으로써 제조할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물의 정제 및 기타 고체 투여형, 예를 들면, 당의정, 캡슐제, 환제 및 과립제는 임의로 코팅 및 쉘, 예를 들면, 약제학적 제형화 분양에 공지된 장용성 코팅 또는 기타 코팅을 사용하여 임의로 채점 또는 제조할 수 있다. 이들은 또한, 예를 들면, 목적하는 방출 프로파일, 기타 폴리머 매트릭스, 리포좀 및/또는 미소구체를 제공하기 위해 하이드록시프로필메틸 셀룰로즈를 상이한 비율로 사용하여 본원의 활성 성분의 느린 또는 조절된 방출을 제공하도록 제형화할 수 있다. 이들은 신속 방출을 위해 제형화될 수 있고, 예를 들면, 동결-건조될 수 있다. 이들은, 예를 들면, 세균-체류 필터를 통한 여과, 또는 멸균수 또는 사용 직전에 일부 기타 멸균 주사가능한 매질에 용해될 수 있는 멸균 고체 조성물 형태로 멸균제를 도입함으로써 멸균시킬 수 있다. 이들 조성물은 또한 임의로 불투명화제를 함유할 수 있고, 이들이 활성 성분(들)을 단독으로 또는 위장관의 특정 부분에서 우선적으로, 임의로 지연된 방식으로 방출하는 조성으로 이루어질 수 있다. 사용될 수 있는 포매(embedding) 조성물의 예는 폴리머 물질 및 왁스를 포함한다. 활성 성분은 또한, 적절한 경우, 하나 이상의 상기한 부형제와 함께, 미세-캡슐화된 형태로 존재할 수 있다.
본 발명의 화합물의 경구 투여를 위한 액체 투여형은 약제학적으로 허용되는 에멀젼, 미세에멀젼, 용액, 현탁액, 시럽 및 엘릭시르를 포함한다. 활성 성분 이외에, 액체 투여형은 당해 기술분야에서 통상 사용되는 불활성 희석제, 예를 들면, 물 또는 기타 용매, 가용화제 및 유화제, 예를 들면, 에틸 알콜, 이소프로필 알콜, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알콜, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸렌 글리콜, 오일(특히, 면실유, 땅콩유, 옥수수유, 배아, 올리브유, 피마자유 및 참깨유), 글리세롤, 테트라하이드로푸릴 알콜, 폴리에틸렌 글리콜 및 솔비탄의 지방산 에스테르 및 이들의 혼합물을 함유할 수 있다.
불활성 희석제 이외에, 경구 조성물은 또한 아쥬반트(adjuvant), 예를 들면, 습윤제, 유화제 및 현탁화제, 감미제, 향미제, 착색제, 향료 및 보존제를 포함할 수 있다.
현탁액은, 활성 화합물 이외에, 현탁화제, 예를 들면, 에톡실화 이소스테아릴 알콜, 폴리옥시에틸렌 솔비톨 및 솔비탄 에스테르, 미정질 셀룰로즈, 알루미늄 메타하이드록사이드, 벤토나이트, 아가-아가 및 트라가칸트 및 이들의 혼합물을 함유할 수 있다.
직장 또는 질내 투여를 위한 제제는, 본 발명의 하나 이상의 화합물을, 예를 들면, 코코아 버터, 폴리에틸렌 글리콜, 좌약 왁스 또는 살리실레이트를 포함하는 하나 이상의 적합한 무자극 부형제 또는 담체와 혼합하여 제조할 수 있고 실온에서는 고체이지만 체온에서는 액체이고 따라서 직장 또는 질강에서 용융하여 활성 화합물을 방출하는 좌제로서 제공될 수 있다.
본원에 제공된 올리고머의 국소 또는 경피 투여를 위한 제제 또는 투여형은 분말, 스프레이, 연고, 페이스트, 크림, 로션, 겔, 용액, 패치 및 흡입제를 포함한다. 활성 올리고머는 멸균 조건하에 약제학적으로 허용되는 담체 및 임의의 보존제, 완충제 또는 요구될 수 있는 추진제와 혼합할 수 있다. 연고, 페이스트, 크림 및 겔은, 본 발명의 활성 화합물 이외에, 부형제, 예를 들면, 동물성 및 식물성 지방, 오일, 왁스, 파라핀, 전분, 트라가칸트, 셀룰로즈 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실릭산, 탈크 및 산화아연 또는 이들의 혼합물을 함유할 수 있다.
분말 및 스프레이는, 본 발명의 올리고머 이외에, 부형제, 예를 들면, 락토즈, 탈크, 실릭산, 수산화알루미늄, 규산칼슘 및 폴리아미드 분말 또는 이들 물질의 혼합물을 함유할 수 있다. 스프레이는 추가로 통상의 추진제, 예를 들면, 클로로플루오로하이드로카본 및 휘발성 비치환된 탄화수소, 예를 들면, 부탄 및 프로판을 함유할 수 있다.
경피 패치는 본 발명의 올리고머의 조절된 전달을 신체에 제공하는 부가 잇점을 갖는다. 이러한 투여형은 올리고머를 적절한 매질에 용해 또는 분산시킴으로써 제조할 수 있다. 흡수 증강제를 또한 사용하여 피부를 통한 제제의 유동을 증가시킬 수 있다. 이러한 유동 속도는 당해 기술분야에 공지된 기타 방법 중에서 속도 조절 막을 제공하거나 폴리머 매트릭스 또는 겔에 제제를 분산시킴으로써 조절할 수 있다.
비경구 투여에 적합한 약제학적 조성물은 본 발명의 하나 이상의 올리고머를, 하나 이상의 약제학적으로-허용되는 멸균 등장성 수성 또는 비수성 용액, 분산액, 현탁액 또는 에멀젼, 또는 사용 직전에 멸균 주사가능한 용액 또는 분산액으로 재구성할 수 있고 당, 알콜, 항산화제, 완충제, 정균제, 제제를 의도된 수용자의 혈액으로 등장성으로 되게 하는 용질 또는 현탁제 또는 증점제를 함유할 수 있는 멸균 분말과 조합하여 포함할 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물에 사용될 수 있는 적합한 수성 및 비수성 담체의 예는 물, 에탄올, 폴리올(예: 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜 등) 및 이의 적합한 혼합물, 식물성 오일, 예를 들면, 올리브유, 및 주사가능한 유기 에스테르, 예를 들면, 에틸 올레에이트를 포함한다. 적절한 유동성은, 예를 들면, 코팅 물질, 예를 들면, 레시틴의 사용에 의해, 분산제의 경우에 요구된 입자 크기의 유지에 의해 및 계면활성제의 사용에 의해 유지할 수 있다.
이들 조성물은 또한 아쥬반트, 예를 들면, 보존제, 습윤제, 유화제 및 분산제를 함유할 수 있다. 본 발명의 올리고머에 대한 미생물의 작용의 방지는 다양한 항균성 및 항진균성 제제, 예를 들면, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀 소르브산 등의 포함에 의해 보장할 수 있다. 이는 또한 등장성 제제, 예를 들면, 당, 염화나트륨 등을 조성물에 포함시키는 것이 바람직할 수 있다. 또한, 주사가능한 약제학적 형태의 연장된 흡수는 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴 등과 같이 흡수를 지연시키는 제제의 포함에 의해 제공될 수 있다.
일부 경우에, 약물의 효과를 연장시키기 위해, 피하 또는 근육내 주사로부터 약물의 흡수를 지연시키는 것이 바람직하다. 이는 당해 기술분야에 공지된 기타 방법 중에서 불량한 수용해도를 갖는 결정질 또는 무정형 물질의 액체 현탁액의 사용에 의해 달성될 수 있다. 이어서, 약물의 흡수 속도는 결정 크기 및 결정질 형태에 또한 의존할 수 있는 이의 용해 속도에 좌우된다. 또는, 비경구-투여된 약물 형태의 지연된 흡수는 약물을 오일 비히클에 용해 또는 현탁시킴으로써 달성된다.
주사가능한 데포 형태는 폴리락티드-폴리글리콜리드 등의 생분해성 폴리머에서 본 발명 올리고머의 미세캡슐 매트릭스를 형성함으로써 제조할 수 있다. 올리고머 대 폴리머의 비율 및 사용된 특정 폴리머의 성질에 따라, 올리고머 방출 속도가 조절될 수 있다. 기타 생분해성 폴리머의 예는 폴리(오르토에스테르) 및 폴리(무수물)을 포함한다. 데포 주사가능한 제제는 또한 약물을 신체 조직과의 적합성이 있는 리포좀 또는 미세에멀젼에 봉입함으로써 제조할 수 있다.
본 발명의 올리고머가 약제로서 인간 및 동물에게 투여되는 경우, 이들은 자체로 제공되거나, 예를 들면, 약제학적으로 허용되는 담체와 함께 0.1 내지 99%(보다 바람직하게는 10 내지 30%)의 활성 성분을 함유하는 약제학적 조성물로서 제공될 수 있다.
상기 언급된 바와 같이, 본 발명의 제제 또는 조제물은 경구, 비경구, 국소 또는 직장내로 제공될 수 있다. 이들은 전형적으로 각각의 투여 경로에 적합한 형태로 제공된다. 예를 들면, 이들은 정제 또는 캡슐 형태로, 주사, 흡입, 안 로션(eye lotion), 연고, 좌제 등에 의해, 주사, 주입 또는 흡입에 의한 투여; 로션 또는 연고에 의해 국소로; 및 좌제에 의해 직장으로 투여된다.
본원에 사용된 문구 "비경구 투여" 및 "비경구적으로 투여된"은 장용 및 국소 투여 이외의 투여 방식, 통상적으로 주사에 의한 투여 방식을 의미하고, 제한 없이, 정맥내, 근육내, 동맥내, 척추강내, 관절내, 안와내, 심장내, 피내, 복강내, 기관지경, 피하, 표피하, 지주막하, 척수내 및 흉골내 주사 및 주입을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같은 문구 "전신 투여", "전신적으로 투여된", "말초 투여" 및 "말초 투여된"은, 환자 시스템으로 들어가고 따라서 대사 및 기타 유사한 프로세스에 제공되도록, 중추신경계 내로의 직접 투여 이외의 화합물, 약물 또는 기타 물질의 투여를 의미한다.
선택된 투여 경로와 상관 없이, 적합한 수화된 형태로 사용될 수 있는 본 발명의 올리고머 및/또는 본 발명의 약제학적 조성물은 당해 기술분야의 숙련가에게 공지된 통상의 방법에 의해 약제학적으로-허용되는 투여형으로 제형화할 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물 중의 활성 성분의 실제 용량 수준은, 환자에게 허용되지 않는 독성 없이, 특정 환자 조성물 및 투여 방식에 대한 바람직한 치료학적 반응을 달성하기에 효과적인 활성 성분의 양을 수득하도록 달라질 수 있다.
선택된 용량 수준은 사용된 본 발명의 특정 올리고머, 또는 이의 에스테르, 염 또는 아미드의 활성, 투여 경로, 투여 시간, 배변 속도 또는 사용된 특정 올리고머의 대사, 흡수 속도와 정도, 치료 기간, 사용된 특정 올리고머와 조합하여 사용된 기타 약물, 화합물 및/또는 물질, 치료되는 환자의 연령, 성별, 체중, 상태, 일반 건강 및 이전 병력 및 의학 분야에 공지된 유사한 요인을 포함하는 다양한 요인에 따라 달라질 것이다.
당해 기술분야의 통상의 지식을 갖는 의사 또는 수의사는 요구되는 약제학적 조성물의 유효량을 용이하게 측정 및 처방할 수 있다. 예를 들면, 의사 또는 수의사는 목적하는 치료학적 효과를 달성하기 위해 요구된 것보다 낮은 수준에서 약제학적 조성물에 사용된 본 발명의 화합물의 투여를 개시할 수 있고, 목적하는 효과가 달성될 때까지 용량을 점차 증가시킬 수 있다. 일반적으로, 본 발명의 화합물의 적합한 1일 용량은 치료학적 효과를 생성하기에 효과적인 최저 용량인 화합물의 양일 것이다. 이러한 유효 용량은 일반적으로 상기 기재된 요인에 의존할 것이다. 일반적으로, 환자에 대한 본 발명의 화합물의 경구, 정맥내, 뇌실내 및 피하 용량은, 지시된 효과를 위해 사용되는 경우, 1일당 체중 kg당 약 0.0001 내지 약 100mg 범위일 것이다.
경우에 따라, 활성 화합물의 유효 1일 용량은, 임의로, 단위 투여형으로, 1일을 통해 적절한 간격으로 별도로 투여된 2, 3, 4, 5, 6 또는 그 이상의 서브용량으로 투여될 수 있다. 특정한 상황하에, 투여는 1일당 1회 투여이다. 특정 실시형태에서, 투여는 기능적 디스트로핀 단백질의 목적하는 발현을 유지하기 위해, 필요에 따라, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14일당, 또는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12주당, 또는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12개월당 1회 이상의 투여이다.
핵산 분자는, 본원에 기재되고 당해 기술분야에 공지된 바와 같이, 이로써 제한되지 않지만, 리포좀 중의 캡슐화, 이온도입법에 의해, 또는 비히클, 예를 들면, 하이드로겔, 사이클로덱스트린, 생분해성 나노캡슐 및 생체부착성 미소구체 내로의 도입을 포함하여 당해 기술분야의 숙련가에게 공지된 다양한 방법에 의해 세포에 투여될 수 있다. 특정 실시형태에서, 마이크로유화 기술은 친지성(수불용성) 약제학적 제제의 생물이용성을 개선시키기 위해 사용될 수 있다. 예는 트리메트린을 포함한다[참조: Dordunoo, S. K., et al., Drug Development and Industrial Pharmacy, 17(12), 1685-1713, 1991 and REV 5901 (Sheen, P. C., et al., J Pharm Sci 80(7), 712-714, 1991]. 다른 잇점 중에서, 마이크로유화는 순화계 대신에 림프계에 대한 흡수를 우선적으로 지향함으로써 증강된 생물이용성을 제공하고, 이에 의해 간장을 바이패스하고 간담 순화시에 화합물의 파괴를 방지한다.
본 발명의 한 가지 국면에서, 제제는 본원에 제공된 바와 같은 올리고머로 형성된 미셀 및 적어도 하나의 양친매성 담체를 함유하고, 여기서 미셀은 약 100nm 미만의 평균 직경을 갖는다. 보다 바람직한 실시형태는 약 50nm 미만의 평균 직경을 갖는 미셀을 제공하고, 보다 바람직한 실시형태는 약 30nm 미만 또는 심지어 약 20nm 미만의 평균 직경을 갖는 미셀을 제공한다.
모든 적합한 양친매성 담체가 고려되지만, 본 발명의 바람직한 담체는 일반적으로, 안전한 것으로 일반적으로 인식되는(GRAS) 상태를 갖고 본 발명의 화합물을 용해시키고, 용액을 복잡한 수상(인간 위장관에서 발견되는 것과 같은)과 접촉하는 경우, 후기 단계에서 이를 마이크로유화시킬 수 있는 것들이다. 통상적으로, 이들 요건을 충족시키는 양친매성 성분은 2 내지 20의 HLB(친수성 대 친지성 밸런스) 값을 갖고, 이들의 구조는 C-6 내지 C-20 범위의 직쇄 지방족 라디칼을 함유한다. 예는 폴리에틸렌-글리콜화 지방 글리세라이드 및 폴리에틸렌 글리콜이다.
양친매성 담체의 예는 포화된 및 모노불포화된 폴리에틸렌 글리콜화 지방산 글리세라이드, 예를 들면, 완전 또는 부분 수소화된 각종 식물성 오일로부터 수득된 것들을 포함한다. 이러한 오일은 유리하게는 상응하는 지방산의 트리-, 디- 및 모노-지방산 글리세라이드 및 디- 및 모노-폴리에틸렌글리콜 에스테르로 이루어질 수 있고, 특히 바람직한 지방산 조성은 카프르산 4 내지 10%, 카프르산 3 내지 9%, 라우르산 40 내지 50%, 미르스트산 14 내지 24%, 팔미트산 4 내지 14% 및 스테아르산 5 내지 15%를 포함한다. 또 다른 유용한 부류의 양친매성 담체는 포화되거나 모노-불포화된 지방산(SPAN-시리즈) 또는 상응하는 에톡실화 유사체(TWEEN-시리즈)와 함께 부분 에스테르화 솔비탄 및/또는 솔비톨을 포함한다.
겔루시르(Gelucire)-시리즈, 라브라필(Labrafil), 라브라솔(Labrasol) 또는 라우로글리콜(Lauroglycol)(모두 가테포스 코포레이션(Gattefosse Corporation, Saint Priest, France)에 의해 제조 및 배포됨), PEG-모노-올레에이트, PEG-디-올레에이트, PEG-모노-라우레이트 및 디-라우레이트, 레시틴, 폴리솔베이트 80 등(미국 및 세계의 다수의 회사에 의해 제조 및 배포됨)을 포함하는 상업적으로 이용가능한 양친매성 담체가 특히 유용할 수 있다.
특정 실시형태에서, 전달은 적합한 숙주 세포 내로 본 발명의 조성물의 도입을 위해 리포좀, 나노캡슐, 미립자, 미소구체, 지질 입자, 소포 등의 사용에 의해 발생할 수 있다. 특히, 본 발명의 조성물은 지질 입자, 리포좀, 소포, 나노구체, 나노입자 등에 캡슐화된 전달을 위해 제형화할 수 있다. 이러한 전달 소포의 제형화 및 사용은 공지된 통상의 기술을 사용하여 수행할 수 있다.
본 발명에서 사용하기에 적합한 친수성 폴리머는 용이하게 수용성이고 소포-형성 지질에 공유 부착될 수 있고 독성 효과 없이 생체내에서 허용(즉, 생체적합성)되는 것들이다. 적합한 폴리머는 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 폴리락트산(또한 폴리락티드로 명명됨), 폴리글리콜산(또한 폴리글리콜라이드로 명명됨), 폴리락트산-폴리글리콜산 공중합체 및 폴리비닐 알콜을 포함한다. 특정 실시형태에서, 폴리머는 약 100 또는 120달톤 내지 약 5,000 또는 10,000달톤 이하, 또는 약 300달톤 내지 약 5,000달톤의 분자량을 갖는다. 다른 실시형태에서, 폴리머는 약 100 내지 약 5,000달톤의 분자량을 갖거나, 약 300 내지 약 5,000달톤의 분자량을 갖는 폴리에틸렌글리콜이다. 특정 실시형태에서, 폴리머는 750달톤의 폴리에틸렌글리콜(PEG(750))이다. 폴리머는 또한 본원의 다수의 단량체에 의해 정의될 수 있고; 본 발명의 바람직한 실시형태는 적어도 약 3개의 단량체의 폴리머를 사용하고, 이러한 PEG 폴리머는 3개 단량체로 이루어져 있다(대략 150달톤).
본 발명에서의 사용에 적합할 수 있는 다른 친수성 폴리머는 폴리비닐피롤리돈, 폴리메톡사졸린, 폴리에틸옥사졸린, 폴리하이드록시프로필 메타크릴아미드, 폴리메타크릴아미드, 폴리디메틸아크릴아미드 및 유도체화된 셀룰로즈, 예를 들면, 하이드록시메틸셀룰로즈 또는 하이드록시에틸셀룰로즈를 포함한다.
특정한 실시형태에서, 본 발명의 제제는 폴리아미드, 폴리카보네이트, 폴리알킬렌, 아크릴산과 메타크릴산 에스테르의 폴리머, 폴리비닐 폴리머, 폴리글리콜라이드, 폴리실록산, 폴리우레탄 및 이의 공중합체, 셀룰로즈, 폴리프로필렌, 폴리에틸렌, 폴리스티렌, 락트산과 글리콜산의 폴리머, 폴리무수물, 폴리(오르토)에스테르, 폴리(부틴산), 폴리(발레르산), 폴리(락티드-코-카프롤락톤), 폴리사카라이드, 단백질, 폴리히알루론산, 폴리시아노아크릴레이트 및 이들의 블렌드, 혼합물 또는 공중합체로 이루어진 그룹으로부터 선택된 생체적합성 폴리머를 포함한다.
사이클로덱스트린은 각각 그리스 문자 α, β 또는 γ로 지정된, 6, 7 또는 8개의 글루코즈 단위로 이루어진 사이클릭 올리고사카라이드이다. 글루코즈 단위는 α-1,4-글루코사이드 결합에 의해 결합되어 있다. 당 단위의 입체 배좌의 결과로서, 모든 2차 하이드록실 그룹(C-2, C-3에서)은 환의 한쪽 측면에 배치되어 있고, C-6에서 모든 일차 하이드록실 그룹은 다른 측면에 배치되어 있다. 그 결과, 외부 면은 사이클로덱스트린을 수용성으로 되게 하는 친수성이다. 대조적으로, 사이클로덱스트린의 공동은 소수성이고, 이는 원자 C-3 및 C-5의 수소에 의해 및 에테르-유사 산소에 의해 선형화되어 있기 때문이다. 이들 매트릭스는, 예를 들면, 스테로이드 화합물, 예를 들면, 17α-에스트라디올[참조: van Uden et al. Plant Cell Tiss. Org. Cult. 38:1-3-113 (1994)]을 포함하여 다양한 비교적 소수성 화합물과의 복합체화를 가능하게 한다. 복합체화는 반 데르 발스 상호작용에 의해 및 수소 결합 형성에 의해 발생한다. 사이클로덱스트린 화학의 일반 개설에 대해서는 문헌[참조: Wenz, Agnew. Chem. Int. Ed. Engl., 33:803-822 (1994)]을 참조한다.
사이클로덱스트린 유도체의 물리화학적 특성은 치환 종류 및 정도에 강력하게 의존한다. 예를 들면, 수중에서의 이들의 용해도는 불용성(예: 트리아세틸-베타-사이클로덱스트린) 내지 147% 가용성(w/v)(G-2-베타-사이클로덱스트린) 범위이다. 또한, 이들은 다수의 유기 용매에 가용성이다. 사이클로덱스트린의 특성은 이들의 용해도를 증가 또는 감소시킴으로써 다양한 제제 성분의 용해도의 조절을 가능하게 한다.
다수 사이클로덱스트린 및 이들의 제조 방법은 기재되어 있다. 예를 들면, 문헌[참조: Parmeter (I), et al. (미국 특허 제3,453,259호) and Gramera, et al. (미국 특허 제3,459,731호)]은 전기적 중성 사이클로덱스트린을 기재한다. 기타 유도체는 양이온성 특성을 갖는 사이클로덱스트린[Parmeter (II), U.S. Pat. No. 3,453,257], 불용성 가교결합된 사이클로덱스트린(Solms, U.S. Pat. No. 3,420,788) 및 음이온성 특성을 갖는 사이클로덱스트린[Parmeter (III), U.S. Pat. No. 3,426,011]을 포함한다. 음이온성 특성을 갖는 사이클로덱스트린 유도체 중에서, 카복실산, 아인산, 차아인산, 포스폰산, 인산, 티오인산, 티오설핀산 및 설폰산은 모 사이클로덱스트린에 첨부되었다[참조: Parmeter (III), supra]. 추가로, 설포알킬 에테르 사이클로덱스트린 유도체는 문헌[참조: Stella, et al. (U.S. Pat. No. 5,134,127)]에 기재되어 있다.
리포좀은 수성 내부 구획을 둘러싸는 적어도 하나의 지질 이중층 막으로 이루어져 있다. 리포좀은 막 유형 및 크기에 의해 특성화할 수 있다. 소형 단층 소포(SUV)는 단일 막을 갖고, 전형적으로 직경 0.02 내지 0.05㎛ 범위이고; 거대 단층 소포(LUVS)는 전형적으로 0.05㎛보다 크다. 올리고라멜라 대형 소포 및 다층 소포는 복수, 통상적으로 동심원상 막 층을 갖고, 전형적으로 0.1㎛보다 크다. 몇몇 비동심원상 막을 갖는 리포좀, 즉 거대 소포 내에 함유된 몇몇 보다 작은 소포는 다소포성 소포로 명명된다.
본 발명의 한 가지 국면은 본 발명의 올리고머를 함유하는 리포좀을 포함하는 제제에 관한 것이고, 여기서 상기 리포좀 막은 증가된 담지 능력을 갖는 리포좀을 제공하도록 제형화된다. 대체적으로 또는 또한, 본 발명의 화합물은 리포좀의 리포좀 이중층 내에 함유되거나 상에 흡수될 수 있다. 본 발명의 올리고머는 지질 계면활성제로 응집될 수 있고, 리포좀의 내부 공간 내에 함유될 수 있고; 이들 경우에, 리포좀 막은 활성제-계면활성제 응집물의 파괴 효과에 내성을 갖도록 제형화된다.
본 발명의 한 가지 실시형태에 따라, 리포좀의 지질 이중층은 폴리에틸렌 글리콜(PEG)로 유도체화된 지질을 함유하고, 이에 의해 PEG 쇄는 지질 이중층의 내부 표면으로부터 리포좀에 의해 캡슐화된 내부 공간으로 신장하고 지질 이중층의 외부로부터 주변 환경으로 신장한다.
본 발명의 리포좀 내에 함유된 활성제는 가용화 형태로 존재한다. 계면활성제와 활성제의 응집물(예: 목적하는 활성제를 함유하는 에멀젼 또는 미셀)은 본 발명에 따라 리포좀의 내부 공간 내에 포획될 수 있다. 계면활성제는 활성제를 분산 및 용해시키도록 작용하고, 이로써 제한되지 않지만, 상이한 쇄 길이(예를 들면, 약 C14 내지 약 C20)의 생물적합성 리소포스파티딜콜린(LPG)을 포함하는 임의의 적합한 지방족, 지환족 또는 방향족 계면활성제로부터 선택될 수 있다. PEG-지질 등의 폴리머-유도체화된 지질은, 이들이 미셀/막 융합을 억제하도록 작용하고 계면활성제 분자에 대한 폴리머의 첨가가 계면활성제의 CMC를 감소시키고 미셀 형성을 보조하기 때문에 미셀 형성에 또한 사용될 수 있다. 마이크로몰 범위의 CMO를 갖는 계면활성제가 바람직하고; 보다 높은 CMC 계면활성제는 본 발명의 리포좀 내에 포획된 미셀을 제조하기 위해 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 리포좀은 당해 기술분야에 공지된 다양한 임의의 기술에 의해 제조할 수 있다[참조: U.S. Pat. No. 4,235,871; Published PCT applications WO 96/14057; New RRC, Liposomes: A practical approach, IRL Press, Oxford (1990), pages 33-104; Lasic DD, Liposomes from physics to applications, Elsevier Science Publishers BV, Amsterdam, 1993]. 예를 들면, 본 발명의 리포좀은 친수성 폴리머로 유도체화된 지질을 예비형성된 리포좀 내로 확산시킴으로써, 예를 들면, 예비형성된 리포좀을, 리포좀에 요구되는 유도체화된 지질의 최종 몰 퍼센트에 상응하는 지질 농도에서 지질-그래프트된 폴리머로 구성된 미셀에 노출시킴으로써 제조할 수 있다. 친수성 폴리머를 함유하는 리포좀은 또한 당해 기술분야에 공지된 바와 같이 균질화, 지질-필드 수화 또는 압출 기술에 의해 형성될 수 있다.
또 다른 예시적 제형화 공정에서, 활성제는 소수성 분자를 용이하게 용해시키는 리소포스파티딜콜린 또는 기타 낮은 CMC 계면활성제(폴리머 그래프트된 지질 포함)에서 초음파처리에 의해 먼저 분산시킨다. 이어서, 활성제의 생성된 미셀 현탁액을 사용하여, 폴리머-그래프트된 지질 또는 콜레스테롤의 적합한 몰 퍼센트를 함유하는 건조 지질 샘플을 재수화시킨다. 이어서, 지질 및 활성제 현탁액은 당해 기술분야에 공지되어 있는 압출 기술을 사용하여 리포좀으로 형성하고, 수득되는 리포좀을 표준 컬럼 분리에 의해 미캡슐화 용액으로부터 분리한다.
본 발명의 한 가지 국면에서, 리포좀은 선택된 크기 범위의 실질적으로 균질한 크기를 갖도록 제조한다. 한 가지 효과적인 사이징 방법은 선택된 균일한 세공 크기를 갖는 일련의 폴리카보네이트 막을 통해 리포좀의 수성 현탁액을 압출시키는 것을 수반하고; 막의 세공 크기는 막을 통한 압출에 의해 생성된 최대 크기의 리포좀에 대략 상응할 것이다[참조: 미국 특허 제4,737,323호(Apr. 12, 1988)]. 특정 실시형태에서, DharmaFECT® 및 Lipofectamine® 등의 시약을 사용하여 폴리뉴클레오티드 또는 단백질을 세포에 도입할 수 있다.
본 발명의 제제의 방출 특성은 캡슐화 물질, 캡슐화 약물의 농도 및 방출 개질제의 존재에 의존한다. 예를 들면, 방출은, 예를 들면, 위장에서와 같이 낮은 pH에서만 방출하거나 위장에서와 같이 높은 pH에서 방출하는 pH 감수성 코팅을 사용하여 pH 의존성이도록 조작할 수 있다. 장용 코팅은 발생으로부터 위장을 통한 통과 후에까지 방출을 방지하기 위해 사용될 수 있다. 상이한 물질로 캡슐화된 시안아미드의 복수 코팅 또는 혼합물은 위장에서의 초기 방출, 및 이어서 위장에서의 후기 방출을 수득하기 위해 사용할 수 있다. 방출은 또한, 캡슐로부터의 확산에 의해 약물의 물 흡수 또는 방출을 증가시킬 수 있는, 염 또는 세공 형성제의 포함에 의해 조작할 수 있다. 약물의 용해도를 변형시키는 부형제는 방출 속도를 조절하기 위해 또한 사용할 수 있다. 매트릭스의 분해를 증강시키거나 매트릭스로부터 방출하는 제제를 또한 도입할 수 있다. 이들은 약물에 첨가되거나, 별개의 상(즉, 입자로서)으로 첨가되거나, 화합물에 의존하여 폴리머 상에 동시 용해시킬 수 있다. 대부분의 경우에, 양은 0.1 내지 30%(w/w 폴리머)이어야 한다. 분해 증강제의 유형은 유기 염, 예를 들면, 황산암모늄 및 염화암모늄, 유기 산, 예를 들면, 시트르산, 벤조산 및 아스코르브산, 무기 염기, 예를 들면, 탄산나트륨, 탄산칼륨, 탄산칼슘, 탄산아연 및 수산화아연, 및 유기 염기, 예를 들면, 프로타민 설페이트, 스페르민, 콜린, 에탄올아민, 디에탄올아민 및 트리에탄올아민 및 계면활성제, 예를 들면, 트원R 및 플루로닉R을 포함한다. 미세구조를 매트릭스에 첨가하는 세공 형성제(즉, 수용성 화합물, 예를 들면, 무기 염 및 당)는 미립자로서 첨가된다. 상기 범위는 전형적으로 1 내지 30%이다(w/w 폴리머).
흡수는 또한 장내에서 입자의 체류 시간을 변화시킴으로써 조작할 수 있다. 이는, 예를 들면, 입자를 코팅하거나 캡슐화 물질, 점막 부착 폴리머로서 선택함으로써 달성할 수 있다. 예는 유리 카복시 그룹을 갖는 대부분의 폴리머, 예를 들면, 키토산, 셀룰로즈 및 특히 폴리아크릴레이트(본원에 사용된 바와 같이, 폴리아크릴레이트는 아크릴레이트 그룹 및 개질된 아크릴레이트 그룹, 예를 들면, 시아노아크릴레이트 및 메타크릴레이트를 포함하는 폴리머를 지칭한다)를 포함한다.
올리고머는 외과적 또는 의료 장치 또는 이식편에 함유되도록 제형화되거나 이들에 의해 방출하도록 적합시킬 수 있다. 특정한 국면에서, 이식편은 코팅되거나 달리는 올리고머로 처리될 수 있다. 예를 들면, 하이드로겔 또는 기타 폴리머, 예를 들면, 생체적합성 및/또는 생분해성 폴리머는 본 발명의 조성물로 이식편을 코팅하기 위해 사용할 수 있다(즉, 조성물은 하이드로겔 또는 기타 폴리머를 사용함으로써 의료 장치에 사용하기 위해 적합시킬 수 있다). 의료 장치를 제제로 코팅하기 위한 폴리머 및 공중합체는 당해 기술분야에 공지되어 있다. 이식편의 예는, 이로써 제한되지 않지만, 스텐츠, 약물-용출 스텐츠, 봉합사, 보철, 혈관 카테터, 투석 카테터, 혈관 이식편, 인공 심장 밸브, 심장 페이스메이커, 이식가능한 제세동기, IV 침, 골 설정 및 형성을 위한 장치, 예를 들면, 핀, 스크류, 플레이트 및 기타 장치, 및 창상 치유를 위한 인공 조직 매트릭스를 포함한다.
본원에 제공된 방법 이외에, 본 발명에 따라 사용하기 위한 올리고머는 다른 약제와 유사하게 인간 또는 가축 의약에 사용하기 위한 통상의 임의의 방식으로 투여하기 위해 제형화될 수 있다. 안티센스 올리고머 및 이들의 상응하는 제제는 근위축증의 치료, 예를 들면, 근아세포 이식, 줄기 세포 치료, 아미노글리코사이드 항생제, 프로테아좀 억제제 및 상향-조절 치료제(예: 유트로핀의 상향조절, 디스트로핀의 상염색체 파라로그)의 투여에서 단독으로 또는 다른 치료학적 전략과 조합하여 투여할 수 있다.
당업자는 임의의 특정 동물 및 상태에 대한 최적 투여 경로 및 임의의 용량을 용이하게 결정할 수 있기 때문에, 처방된 투여 경로는 가이드로서만 의도된다. 기능성 신규 유전자 물질을 시험관내 및 생체내 둘 다에서 세포 내로 도입하는 복수의 방법은 시도되어 왔다[참조: Friedmann (1989) Science, 244:1275-1280]. 이들 방법은 변형된 레트로바이러스 내로 발현되는 유전자의 통합[참조: Friedmann (1989) supra; Rosenberg (1991) Cancer Research 51(18), suppl.: 5074S-5079S]; 비-레트로바이러스 벡터(예: 아데노-연관 바이러스 벡터) 내로의 통합[참조: Rosenfeld, et al. (1992) Cell, 68:143-155; Rosenfeld, et al. (1991) Science, 252:431-434]; 또는 리포좀을 통해 이종성 프로모터-증강제 요소에 결합된 도입유전자의 전달[참조: Friedmann (1989), supra; Brigham, et al. (1989) Am. J. Med. Sci., 298:278-281; Nabel, et al. (1990) Science, 249:1285-1288; Hazinski, et al. (1991) Am. J. Resp. Cell Molec. Biol., 4:206-209; and Wang and Huang (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 84:7851-7855]; 리간드-특이적, 양이온계 수송 시스템에 대한 커플링[참조: Wu and Wu (1988) J. Biol. Chem., 263:14621-14624] 또는 네이키드 DNA, 발현 벡터의 사용[참조: Nabel et al. (1990), supra); Wolff et al. (1990) Science, 247:1465-1468]을 포함한다. 조직 내로의 도입유전자의 직접 주입은 단지 국지화된 발현[참조: Rosenfeld (1992) supra; Rosenfeld et al. (1991) supra; Brigham et al. (1989) supra; Nabel (1990) supra; and Hazinski et al. (1991) supra]을 생성한다. 문헌[참조: The Brigham et al. group (Am. J. Med. Sci. (1989) 298:278-281 and Clinical Research (1991) 39 (abstract)]은 DNA 리포좀 복합체의 정맥내 또는 기관지내 투여 후에 마우스 폐의 생체내 형질감염을 보고했다. 인간 유전자 치료 공정에 대한 고찰 문헌의 예는 문헌[참조: Anderson, Science (1992) 256:808-813]이다.
IV. 키트
본 발명은 유전자 질환을 갖는 환자의 치료를 위한 키트를 제공하고, 상기 키트는 이의 사용 지침과 함께 적합한 용기 내에 팩키징된 적어도 안티센스 분자(예: 서열번호 1 및 6 내지 9에 기재된 안티센스 올리고머)를 포함한다. 상기 키트는 또한 주변 시약, 예를 들면, 완충제, 안정화제 등을 함유할 수 있다. 당해 기술분야의 숙련가는 상기 방법의 적용이 다수의 기타 질환의 치료에 사용하기에 적합한 안티센스 분자를 동정하기 위한 광범위한 적용을 갖는 것을 인지해야 한다.
V. 실시예
상기 발명은 이해를 명확하게 하기 위한 목적으로 설명 및 예에 의해 약간 상세하게 기재되었지만, 첨부된 특허청구범위의 정신 또는 범주로부터 벗어나지 않고도 특정한 변화 및 변형이 이에 대해 이루어질 수 있다는 것은 본 발명의 교시에 비추어 당해 기술분야의 숙련가에게 용이하게 명백할 것이다. 하기 실시예는 단지 설명을 위해 제공되고, 제한적인 것이 아니다. 당해 기술분야의 숙련가는 본질적으로 유사한 결과를 수득하기 위해 변화 또는 변형될 수 있는 중요하지 않은 다양한 파라미터를 용이하게 인식할 것이다.
물질 및 방법
세포 및 조직 배양 처리 조건
인간 횡문근육종 세포((ATCC, CCL-136; RD 세포)는, L-글루카민(HyClone), 10% 태소 혈청 및 1% 페니실린-스트렙토마이신 항생제 용액(CelGro)을 갖는 24mL의 가온 DMEM에서 1.5×106개 세포/플라스크로 조직 배양-처리된 T75 플라스크(Nunc)에 씨딩하고; 24시간 후, 배지를 흡인하고, 신선한 배지를 첨가했다. 세포를 5.0% CO2에서 37℃ 인큐베이터에서 80% 컨플루언트로 성장시키고, 트립신을 사용하여 수거했다. 동결건조된 포스포로디아미데이트 모르폴리노 올리고머(PMO)를 뉴클레아제-비함유 물 중에서 대략 2.0mM로 재현탁시키고; 몰농도를 확인하기 위해, PMO 용액은 NanoDrop 2000 분광계(Thermo Scientific)를 사용하여 측정했다. PMO는 제조업자의 지침 및 SG 키트(Lonza)에 따라 핵천공(nucleoporation)을 사용하여 RD 세포에 전달했다. PMO는 다양한 농도(2.5, 5, 12.5 및 25마이크로몰)에서 시험했다. 세포는 핵천공후 24시간 동안 12-웰 플레이트(n=3)의 웰당 3×105개 세포로 배양하고, 이어서 하기 기재된 바와 같이 RNA 추출에 제공했다.
일차 인간 근아세포는 표준 기술을 사용하여 골격근 세포 성장 배지(PromoCell)에서 배양했다. 다양한 농도에서 PMO의 핵천공은 상기 RD 세포에 대해 기재된 바와 같이 수행했다. 이어서, 세포를 PromoCell 성장 배지에서 12-웰 플레이트의 삼중 웰에 플레이팅하고, 하기 기재된 바와 같이 RNA 추출 전에 24시간 동안 배양했다.
RNA 추출 및 PCR 증폭
RNA는 GE 헬스케어로부터 RNAspin 96 웰 RNA 단리 키트를 사용하여 PMO-처리된 세포(RD 세포 또는 일차 인간 근아세포)로부터 추출하고, 표준 기술 및 하기 프라이머 쌍을 사용하여 네스티드 RT-PCR에 제공했다. 외부 프라이머: 전방 5'-CTTGGACAGAACTTACCGACTGG-3'(서열번호 26), 역방 5'-GTTTCTTCCAAAGCAGCCTCTCG-3'(서열번호 27); 내부 프라이머: 전방 5'-GCAGGATTTGGAACAGAGGCG-3'(서열번호 28), 역방 5'-CATCTACATTTGTCTGCCACTGG-3'(서열번호 29). 엑손 스키핑은 칼리퍼 랩칩(Caliper LabChip) 바이오분석기를 사용하여 측정하고, 엑손 스키핑(%)(즉, 전장 PCR 생성물과 비교하여 엑손-스키핑 생성물의 밴드 강도)를 도 3 내지 5에 제시된 바와 같이 그래프화했다.
실시예 1
엑손 53 스키핑
인간 디스트로핀 엑손 53을 표적화하는 일련의 안티센스 올리고머를 다음과 같이 디자인하고 합성했다:
Figure pat00011
상기 안티센스 올리고머는 다양한 지시된 농도에서 RD 세포를 처리함으로써 엑손 스키핑 효능에 대해 평가했다. 이들 실험에서, H53A(+23+47)(US 8,232,384; 서열번호 2), H53A(+33+62)(US 8,084,601; 서열번호 3) 및 H53A(+33+65)(WO2011/057350; 서열번호 4)에 상응하는 공개된 안티센스 올리고머는 대조군 올리고머로서 사용했다. 도 3 및 4에 제시된 바와 같이(2개의 독립적 실험), 올리고머 H53A(+33+60)(서열번호 1)는 RD 세포에서 엑손 53 스키핑의 유도에 고도로 효과적이었다. H53A(+31+55)(서열번호 5) 및 H53A(+22+46)(서열번호 7)는 또한 엑손 53 스키핑을 유도했지만, H53A(+33+60)(서열번호 1)보다 낮은 정도로 유도했다. 도 5에 제시된 바와 같이, H53A(+33+60)(서열번호 1; NG-12-0080로 지정됨)은 기타 고도 활성 안티센스 올리고뉴클레오티드와 비교하여 배양된 일차 인간 근아세포에서 엑손 53 스키핑의 유도에 고도로 효과적이었다.
본 명세서에 인용된 모든 간행물 및 특허 출원은, 각각의 개개 간행물 또는 특허 출원이 참조로서 구체적이고 개별적으로 도입되는 것으로 지시되는 것과 같이 참조로서 본원에 도입된다.
참조문헌
Figure pat00012
Figure pat00013
서열번호
Figure pat00014
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(P007) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2) <223> Xaa is 6-aminohexanoic acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5) <223> Xaa is 6-aminohexanoic acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8) <223> Xaa is 6-aminohexanoic acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (11) <223> Xaa is 6-aminohexanoic acid <400> 21 Arg Xaa Arg Arg Xaa Arg Arg Xaa Arg Arg Xaa Arg 1 5 10 <210> 22 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (RAhxR)5; (CP04057) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2) <223> Xaa is 6-aminohexanoic acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5) <223> Xaa is 6-aminohexanoic acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8) <223> Xaa is 6-aminohexanoic acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (11) <223> Xaa is 6-aminohexanoic acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (14) <223> Xaa is 6-aminohexanoic acid <400> 22 Arg Xaa Arg Arg Xaa Arg Arg Xaa Arg Arg Xaa Arg Arg Xaa Arg 1 5 10 15 <210> 23 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (RAhxRRBR)2;CP06062 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2) <223> Xaa is 6-aminohexanoic acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8) <223> Xaa is 6-aminohexanoic acid <400> 23 Arg Xaa Arg Arg Asx Arg Arg Xaa Arg Arg Asx Arg 1 5 10 <210> 24 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (RAR)4F2 <400> 24 Arg Ala Arg Arg Ala Arg Arg Ala Arg Arg Ala Arg Phe Phe 1 5 10 <210> 25 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (RGR)4F2 <400> 25 Arg Gly Arg Arg Gly Arg Arg Gly Arg Arg Gly Arg Phe Phe 1 5 10 <210> 26 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Primer <400> 26 cttggacaga acttaccgac tgg 23 <210> 27 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Primer <400> 27 gtttcttcca aagcagcctc tcg 23 <210> 28 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Primer <400> 28 gcaggatttg gaacagaggc g 21 <210> 29 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Primer <400> 29 catctacatt tgtctgccac tgg 23

Claims (28)

  1. 어닐링 부위 H53A(+33+60)으로 지정된 디스트로핀 유전자의 엑손 53 표적 영역에 상보적인 적어도 20개 연속 뉴클레오티드를 포함하는 길이 20 내지 50개 뉴클레오티드의 단리된 안티센스 올리고뉴클레오티드로서,
    상기 올리고뉴클레오티드가 디스트로핀 유전자의 엑손 53 표적 영역에 특이적으로 하이브리드화하고 엑손 53 스키핑(skipping)을 유도하는, 단리된 안티센스 올리고뉴클레오티드.
  2. 제1항에 있어서, 티미딘 염기가 임의로 우라실 염기인 서열번호 1에 기재된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 안티센스 올리고뉴클레오티드.
  3. 제1항에 있어서, 서열번호 1에 기재된 뉴클레오티드 서열로 이루어진, 안티센스 올리고뉴클레오티드.
  4. 제1항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드가 RNase H를 활성화시키지 않는, 안티센스 올리고뉴클레오티드.
  5. 제1항에 있어서, 비-천연 골격을 포함하는, 안티센스 올리고뉴클레오티드.
  6. 제1항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드 골격의 당 모이어티가 비-천연 모이어티로 대체되어 있는, 안티센스 올리고뉴클레오티드.
  7. 제6항에 있어서, 상기 비-천연 모이어티가 모르폴리노인, 안티센스 올리고뉴클레오티드.
  8. 제1항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드 골격의 뉴클레오티드간(inter-nucleotide) 결합이 비-천연 뉴클레오티드간 결합으로 치환되어 있는, 안티센스 올리고뉴클레오티드.
  9. 제8항에 있어서, 상기 비-천연 뉴클레오티드간 결합이 변형된 포스페이트인, 안티센스 올리고뉴클레오티드.
  10. 제1항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드 골격의 당 모이어티가 비-천연 모이어티로 대체되어 있고, 상기 올리고뉴클레오티드 골격의 뉴클레오티드간 결합이 비-천연 뉴클레오티드간 결합으로 치환되어 있는, 안티센스 올리고뉴클레오티드.
  11. 제10항에 있어서, 상기 비-천연 모이어티가 모르폴리노이고, 상기 비-천연 뉴클레오티드간 결합이 변형된 포스페이트인, 안티센스 올리고뉴클레오티드.
  12. 제11항에 있어서, 상기 변형된 포스페이트가 메틸 포스포네이트, 메틸 포스포로티오에이트, 포스포로모르폴리데이트, 포스포로피페라지데이트 또는 포스포로아미데이트인, 안티센스 올리고뉴클레오티드.
  13. 제1항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드가 2'-O-메틸-올리고리보뉴클레오티드인, 안티센스 올리고뉴클레오티드.
  14. 제1항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드가 펩티드 핵산인, 안티센스 올리고뉴클레오티드.
  15. 제1항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드가, 안티센스 올리고뉴클레오티드의 활성, 세포 분포 또는 세포 흡수를 증강시키는 하나 이상의 모이어티 또는 접합체에 화학적으로 결합되어 있는, 안티센스 올리고뉴클레오티드.
  16. 제15항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드가 아르기닌-풍부 세포 투과성 펩티드에 접합되어 있는, 안티센스 올리고뉴클레오티드.
  17. 제15항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드가 폴리에틸렌 글리콜 모이어티에 화학적으로 결합되어 있는, 안티센스 올리고뉴클레오티드.
  18. 제1항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드의 적어도 하나의 피리미딘 염기가 5-치환된 피리미딘 염기를 포함하는, 안티센스 올리고뉴클레오티드.
  19. 제18항에 있어서, 상기 피리미딘 염기가 시토신, 티민 및 우라실로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 안티센스 올리고뉴클레오티드.
  20. 제18항에 있어서, 상기 5-치환된 피리미딘 염기가 5-메틸시토신인, 안티센스 올리고뉴클레오티드.
  21. 제1항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드의 적어도 하나의 퓨린 염기가 N-2, N-6 치환된 퓨린 염기를 포함하는, 안티센스 올리고뉴클레오티드.
  22. 제21항에 있어서, 상기 N-2, N-6 치환된 퓨린 염기가 2,6-디아미노퓨린인, 안티센스 올리고뉴클레오티드.
  23. 제1항의 안티센스 올리고뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터.
  24. 제1항의 안티센스 올리고뉴클레오티드, 및 인산염 완충제를 포함하는 염수 용액을 포함하는 약제학적 조성물.
  25. 제24항의 약제학적 조성물의 유효량을 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 뒤센형(Duchenne) 근위축증의 치료 방법.
  26. 근위축증 치료용 의약을 제조하기 위한 제1항에 따른 안티센스 분자의 용도.
  27. 안티센스 분자 기반 요법에 사용하기 위한 제1항에 따른 안티센스 분자.
  28. 제1항에 따른 적어도 하나의 안티센스 분자, 적합한 담체 및 사용 지침을 포함하는 키트.
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