JP2009159971A - 異常スプライシングを阻害するアンチセンスオリゴヌクレオチドと同物質の利用法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】突然変異を含むプレmRNA分子における異常スプライシングの阻害法を開示。アンチセンスオリゴヌクレオチドをプレmRNA分子とハイブリッド形成させ、スプライシング可能な条件下で二重鎖分子を作る。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、リボヌクレアーゼHを活性化せず、突然変異により作りだされたスプライス要素の異常な組み合わせの構成要素をブロックするように選択され、その結果スプライシングにより正常なイントロンが除去され、正常なタンパク質をコードしている第一のmRNAが生成される。本法の実施に有用なオリゴヌクレオチド。
【選択図】なし
Description
本発明は、アンチセンスオリゴヌクレオチドを用いてプレmRNA(pre−mRNA)分子の異常スプライシングを阻害する方法と遺伝子発現をアップレギュレーションする方法、および同法の実施に有用なアンチセンスオリゴヌクレオチドに関する。
遺伝子発現のモジュレーターとしてのオリゴヌクレオチドの可能性が、現在熱心に研究されており、その努力の大部分は、癌遺伝子またはウィルス遺伝子のような標的遺伝子の発現を阻害することに大部分の力が注がれている。オリゴヌクレオチドは、RNA(アンチセンスオリゴヌクレオチド)(M.Ghosh and J.Cohen,Prog.Nucleic Acid Res.Mol.Biol.42,79(1992);L.Neckers et al.,Crit.Rev.Oncog.3,175(1992))またはDNAに対する指向性を示し、後者においてオリゴヌクレオチドはRNAポリメラーゼIIによる転写を阻害する三重鎖構造を形成する(J.Hanvey et al.,Science 258,1481(1992);W.McShan et al.,J.Biol.Chem.267,5712(1992);M.Grigoriev et al.,J.Biol.Chem.267,3389(1992);G.Duval-Vlentin et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89,504(1992))。所望の効果を達成するために、オリゴヌクレオチドは既存の望ましくないタンパク質のde novoでの形成を有効に阻害することにより、そのタンパク質の消失を促進しなくてはならない。このような技術は、目的が正常な(native)タンパク質の生産のアップレギュレーションである場合には有用ではない。
本発明は、もしもアンチセンスオリゴヌクレオチドを使用しなければ、遺伝子がコードしているプレmRNAの異常スプライシングによって、その遺伝子をダウンレギュレーションすることになる、突然変異を含むDNAの発現を、アンチセンスオリゴヌクレオチドを用いてアップレギュレーションする方法を提供する。
本発明の前記およびその他の目的と側面が、本文の図と下記に示す明細書に詳細に検討されている。
イントロンは、真核細胞のDNAの一部で、DNAのコーディング部分、すなわち“エキソン”の間に介在する。イントロンとエキソンは、“一次転写産物、mRNAの前駆体”(または“プレmRNA”)と呼ばれるRNAに転写される。エキソンによってコードされている正常なタンパク質が生産されるには、プレmRNAからイントロンが除去されなくてはならない(ここで使用される“正常なタンパク質”とは天然に存在する野生型または機能のあるタンパク質を指す。)。スプライシング過程で、プレmRNAからイントロンが除去され、その後エキソンの結合が行われる。
ヌクレオチド配列はここでは単鎖のみで表示され、左から右に5’から3’の方向が示されている。
種々のヒトβグロビンのプレmRNA分子の構成と構造が図1に示されている。四角はエキソンを示している。実線はイントロンである。IVS1とIVS2のヌクレオチド1に対し、突然変異の位置(110と705)がそれぞれHBΔ6クローンの上に表示されている。下の数字はヌクレオチドの数で、エキソンとイントロンの長さを示している。アンチセンスオリゴヌクレオチド(下記に詳細に論じられている)は、β110とIVS2705構造の下に番号が付いた短い棒によって表示され、破線によりスプライシング経路が表示されている。プレmRNAは全て、SP64ベクター内にサブクローニングされたヒトβグロビン遺伝子の適切なフラグメントから、SP6RNAポリメラーゼ(M.Konarska et al.,Cell 38,731(1984))によって転写された。HBΔ6(A.Krainer et al.,Cell 36,993(1984))は、ヒトβグロビン遺伝子全体を含む。β110構造はエキソン1と2を含み、元のサラセミアのクローンからサブクローニングされた(R.Spritz et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78,2455(1981))。転写前、プラスミドはBamHI部位で直鎖状にした。IVS2705プラスミドを構成するために、実質的に2番目のエキソン全体、2番目のイントロン全体、3番目のエキソンの大部分を殆ど含むHBΔ6のフラグメントを先ずSP64の中にサブクローニングし、続いて公知の技術(T.Kunkel et al.,Methods Enzymol.154,367(1987))により部位特異的突然変異を起こし、イントロンのヌクレオチド705の位置においてTからGへの突然変異を誘発する。次にPvuII部位で直鎖状にしたプラスミドに転写が行われた。
ここに記述されている実施例に使用する2’−O−メチル−オリゴリボヌクレオチドは、Glen Research社(スターリング、バージニア州)の試薬を使用し、公知の技術に従って合成され、US Biocemicals社から入手可能なSUREPURE(登録商標)精製キットを使用して公知の技術により精製された。
生成された2’−O−メチル−オリゴリボヌクレオチドは、オリゴ1からオリゴ5と呼ばれる。
ギリシャおよびキプロス出身の患者に多い疾患型であるβ110サラセミアにおいて、ヒトβグロビン遺伝子の1番目のイントロンのヌクレオチド110の位置におけるAからGへの突然変異は、更に異常3’スプライス部位を作りだす(R.Spritz et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78,2455(1981))。通常の3’スプライス部位が存在するにも関わらず、異常部位がスプライシング機序によって優先的に使用され、19個のヌクレオチドのイントロン配列を含む異常スプライシングされたmRNAが生成される(図1)。β110グロビン対立遺伝子をトランスフェクションされた細胞において(M.Busslinger et al.,Cell 27,289(1981);Y Fukumakiet al.,Cell 28,585(1982))または核抽出物におけるその転写物のスプライシング中に(R.Reed and T.Maniatis,Cell 41,95(1985))(図2のレーン2も参照)、正常にスプライシングされたmRNAは、スプライシング生成物の約10%を構成するに過ぎず、この型のサラセミアの患者に観察される正常ヘモグロビンレベルの著明な低下と一致している。β110のプレmRNAにおいて、異常3’スプライス部位が、イントロンのヌクレオチド93の位置の通常の分岐点を組み入れ、正常3’スプライス部位と競合し、それによって正常スプライス部位を阻害することが認められた(R.Reed and T1 Maniatis,Cell 41,95(1985))。この研究で重要なことは、通常の分岐点を不活化する突然変異は、ヌクレオチド107の位置において潜在分岐点を活性化し、正常3’スプライス部位におけるスプライシングを引き起こすことである(Y.Zhuang and A.Weiner,Genes and Dev.3,1545(1989))。潜在分岐点と110番目の位置の突然変異3’スプライス部位が近接しているため、異常スプライシングは進行できない。
それにも関わらず、3’スプライス部位が異常スプライシングの逆転の標的として使用できるかどうかが、ヒトβグロビン遺伝子の2番目のイントロンの705番目のTからGへの突然変異を有するプレmRNAにおいて検討された。この突然変異(IVS2705)は、地中海サラセミア患者に認められ、通常の3’スプライス部位から145個のヌクレオチド分上流に異常5’スプライス部位を作りだす(C.Dobkin and A.Bank,J.Biol.Chem.260,16332(1985))。スプライシング中に、潜在3’スプライス部位がイントロンにおいて579番目の位置のヌクレオチドの位置で活性化され、ヌクレオチド1〜578および706〜850の位置が別のイントロンとして除去され、イントロンの残りの部分がスプライシング生成物の中に取り込まれる(図1)。このRNAにおいて、スプライシングに関与する各配列要素の間の距離は、100ヌクレオチド長を超えるため、オリゴヌクレオチドによる立体障害効果は期待できない。
この実験は、サラセミア突然変異が、IVS1−5およびIVS1−6の突然変異である点を除き、上記と本質的に同様に実施される。これらの突然変異では、IVS1の真の5’スプライス部位が突然変異される。サラセミアを引き起こす異常スプライシングは、突然変異IVS1−5およびIVS1−6が5’スプライス部位を弱化させるため、16ヌクレオチド上流に位置する潜在スプライス部位とスプライシング因子をうまく競合させたという事実によるものである。他のプレmRNAにおいて突然変異されたスプライス部位と類似のスプライス部位が機能しているように見えることから、この実験において、潜在スプライス部位にアンチセンスなオリゴヌクレオチドが、突然変異にも関わらず、異常スプライシングを逆転し、突然変異された5’スプライス部位に戻し、正常スプライシングを回復し得るかどうかを検討した。使用したオリゴヌクレオチドはオリゴ6(配列番号6番)、上記実施例2のように生成された2’−O−メチル−リボオリゴヌクレオチドである。
これらの実験は、IVS2654突然変異を含むヒトβグロビンのプレmRNAが使用される以外は、本質的に上記と同様に実施され、オリゴ5(配列番号5番)が使用される。
いずれのオリゴヌクレオチドも2μMの濃度において、正常スプライシング生成物が蓄積し、異常生成物は殆ど検出されない(データは示されていない。)
この実験は、オリゴヌクレオチドがβグロビン遺伝子のイントロン1の正常な分岐点配列からすぐ上流に位置する配列(ヌクレオチド75〜88の位置)に結合する以外は、本質的に上記と同様に実施され、β−110 突然変異のプレmRNAにおける正常スプライシングを回復した。オリゴヌクレオチドの配列はCCCAAAGACUAUCC(配列番号7番)である。正常スプライシングが回復された。
一連の安定した細胞系は、サイトメガロウィルス初期プロモーターの下でサラセミアグロビン遺伝子をHeLa細胞とCHO細胞にトランスフェクションすることによって調製される。遺伝子はIVS1−110、IVS2−654、IVS1−5突然変異を含む。
上記実施例8において生産された細胞を、ウェル当たり200μlの培地を含む24穴培養皿の中で増殖させる。ウェル当たり2×104個の細胞を接種し、付着したらそれらを50μMまでの濃度のアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む200μlの培地で処理する。密集増殖(2〜3×105個の細胞)に達するまで、オリゴヌクレオチドの存在下に4日間まで細胞を培養する。2’−O−メチル−リボオリゴヌクレオチドは培地を含む血清内で極めて安定なので、培地は僅か2日おきで交換される。50μM(ウェル当たり40μg)の濃度のオリゴヌクレオチドは、in vitroでスプライシングの効率的な回復を誘発するのに必要な濃度よりも100倍以上高い。この濃度でも、1μMのスケールでオリゴヌクレオチドを1回合成すると、1〜1.6mgのオリゴヌクレオチドが生成され、これは25から40の試料を処理するのに十分量の材料が提供される。
IVS2−654サラセミア突然変異を有するヒトβグロビンクローンを安定的にトランスフェクションしたHeLaを基とする細胞系を使用して、以下の実験を行った。IVS2−654細胞系のあるサブクローンは、異常スプライシングされたβグロビンmRNAを多く発現し、正常にスプライシングされたmRNAを少量発現する。IVS2−654*と名付けられた第二のサブクローンは、異常スプライシングされたβグロビンmRNAと正常スプライシングされたβグロビンmRNAを約1:1の比率で発現する。単層に増殖させた約105個のIVS2−654細胞を、血清を含まないOPTI−MEM培地において、製造業者の仕様書に従って、20μg/mlのLIPOFECTIN(登録商標)リポゾームトランスフェクション試薬(BRL)の存在下に3’潜在スプライシングにアンチセンスな3μMの2’−O−メチル−リボオリゴヌクレオチド(17−mer)[オリゴ3(CAUUAUUGCCCUGAAAG)(配列番号3番)]で、5時間処理した。インキュベーション後、培地を除去し、細胞を通常の増殖培地(10%胎児ウシ血清を加えたMEM)に戻した。未処理細胞と、LIPOFECTIN(登録商標)単独で処理した細胞を対照として使用した。一晩増殖させた後、Tri試薬(Molecular Research Center、シンシナチ、オハイオ州)を用いて、製造業者のプロトコルに従って全細胞RNAを単離した。RNAは、260nmにおける吸光度により定量された。
一晩単層に増殖させた約105個のIVS2−654*細胞を、複製欠失アデノウィルス(dl−312株、チャペルヒルのノースカロライナ大学のDr.Huの寄贈による)106個の粒子の存在下に、3’潜在スプライシング部位にアンチセンスな5μMと20μMの2’−O−メチル−リボオリゴヌクレオチド(17−mer)[オリゴ3(CAUUAUUGCCCUGAAAG)(配列番号3番)]で処理した。ウィルスとオリゴヌクレオチドをOPTI−MEM中で30分間プレインキュベーションしてから、細胞培養に加え、インキュベーションを2時間続けた。培地を吸引し、通常の増殖培地と交換した。一晩増殖させた後、全RNAを上記の如く単離した。プライマーがヒトβグロビンの2番目と3番目のエキソンとそれぞれハイブリッド形成した以外は、上記と同様にRT−PCR反応を実施した。同量のPCR生成物がゲルに添加された以外は、上記実施例10と同様に生成物の分析を行った。結果を図6に示す。レーン1は、未処理細胞のスプライシングを示す。レーン2と3は、アデノウィルスの存在下に、5μMと20μMのオリゴヌクレオチドでそれぞれ処理された細胞のスプライシングを示す。5μMと20μMのオリゴヌクレオチドで処理した細胞に関して、濃度依存的に正常スプライシングの増加と、それに対応する異常スプライシングの減少が視覚的に検出可能であったことに注意すること。
一晩単層に増殖させた約105個のIVS2−654*細胞にトリプシンを添加し、0.5mlのOPTI−MEM中で10mmエレクトロポレーションキュベットに移した。異常5’スプライス部位にアンチセンスな5または50μMの2’−O−メチル−リボオリゴヌクレオチド[オリゴ4(CCUCUUACCUCAGUUAC)(配列番号4番)]を各試料に加え、0.75μFに設定されたウィスコンシン大学エレクトロニクス研究所エレクトロポレーターを用いて、混合物を1500Vパルスでエレクトロポレーションした。エレクトロポレーション後、細胞を通常の増殖培地内に再懸濁し、一晩単層に増殖させた。全RNAを上記の如く単離し、上記実施例11に記述されているようにRT−PCRにより分析した。
Claims (34)
- 突然変異を含むプレmRNA分子における異常スプライシングを阻害する方法であって、
上記突然変異が存在せず、正常なタンパク質をコードする第一のRNAを生成するとき、上記プレmRNA分子は、スプライシングによって除去される正常なイントロンを規定するスプライス要素の第一の組み合わせを含み、
上記プレmRNAは、上記突然変異によって誘発された、上記正常なイントロンとは異なる異常イントロンを規定するスプライス要素の第二の組み合わせをさらに含み、上記突然変異が存在して上記第一のmRNA分子とは異なる異常な第二のmRNAを生成するとき、上記異常イントロンはスプライシングによって除去され、
上記方法は、スプライシングが可能な条件下で、アンチセンスオリゴヌクレオチドを上記プレmRNA分子とハイブリッド形成させて二重鎖分子をつくるステップを含み、
ここで、上記アンチセンスオリゴヌクレオチドは、リボヌクレアーゼHを活性化せず、かつ、スプライス要素の上記第二の異常な組み合わせの構成要素をブロックし、
その結果、上記正常なイントロンがスプライシングによって除去され、タンパク質をコードする上記第一のmRNA分子が生成される、異常スプライシングを阻害する方法。 - 上記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、突然変異したスプライス要素をブロックする請求項1に記載の方法。
- 上記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、正常なスプライス要素をブロックする請求項1に記載の方法。
- 上記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、潜在スプライス要素をブロックする請求項1に記載の方法。
- 上記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、5’スプライス部位をブロックする請求項1に記載の方法。
- 上記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、3’スプライス部位をブロックする請求項1に記載の方法。
- 上記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、分岐点をブロックする請求項1に記載の方法。
- 上記ハイブリッド形成ステップが細胞内で実施され、上記第一のmRNAが上記正常なタンパク質に翻訳される請求項1に記載の方法。
- 上記正常なタンパク質が、βグロビンである請求項1に記載の方法。
- 上記正常なタンパク質が、ヒトβグロビンである請求項1に記載の方法。
- 上記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、8〜50ヌクレオチド長である請求項1に記載の方法。
- 上記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、メチルホスホネート類、メチルホスホノチオエート類、ホスホロモルホリデート類、ホスホロピペラジデート類およびホスホラミデート類からなる群から選択される修飾されたヌクレオチド間架橋燐酸残基を含む請求項1に記載の方法。
- 上記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、その2’位に低級アルキル置換基を持つヌクレオチドを含む請求項1に記載の方法。
- 正常なタンパク質をコードするDNAを含む細胞における、該正常なタンパク質の発現をアップレギュレーションする方法であって、上記DNAは異常スプライシングによって上記正常なタンパク質のダウンレギュレーションを引き起こす突然変異を含み、
上記DNAは、プレmRNAをコードし、
上記プレmRNAは、上記突然変異が存在せず、上記正常なタンパク質をコードする第一のmRNAを生成するとき、スプライシングによって除去される正常なイントロンを規定するスプライス要素の第一の組み合わせを含み、
上記プレmRNAは、上記突然変異によって誘発された、上記正常なイントロンとは異なる異常イントロンを規定するスプライス要素の第二の組み合わせをさらに含み、上記突然変異が存在して上記第一のmRNAと異なる異常な第二のmRNAを生成するとき、上記異常イントロンはスプライシングによって除去され、
上記方法は、スプライシングが可能な条件下で、上記プレmRNAとハイブリッドを形成して二重鎖分子をつくるアンチセンスオリゴヌクレオチドを上記細胞に投与するステップを含み、
ここで上記アンチセンスオリゴヌクレオチドは、リボヌクレアーゼHを活性化せず、かつ、スプライス要素の上記第二の異常な組み合わせの構成要素をブロックし、
その結果、上記正常なイントロンは、スプライシングによって除去され、上記正常なタンパク質が生成される、上記タンパク質の発現をアップレギュレーションする方法。 - 上記細胞が、酵母、昆虫、哺乳類の細胞からなる群から選択される真核細胞である請求項14に記載の方法。
- 突然変異を含むプレmRNA分子における異常スプライシングの阻害に有用なアンチセンスオリゴヌクレオチドであって、
上記突然変異が存在せず、正常なタンパク質をコードする第一のmRNAを生成するとき、上記プレmRNA分子は、スプライシングによって除去される正常なイントロンを規定するスプライス要素の第一の組み合わせを含み、
上記プレmRNAは、上記突然変異によって誘発され、上記正常なイントロンとは異なる異常イントロンを規定するスプライス要素の第二の組み合わせをさらに含み、上記突然変異が存在して上記第一のmRNA分子と異なる異常な第二のmRNAを生成するとき、上記異常イントロンはスプライシングによって優先的に除去され、
(i)上記プレmRNAとハイブリッド形成して二重鎖分子を形成し、
(ii)リボヌクレアーゼHを活性化せず、
(iii)スプライス要素の上記第二の異常な組み合わせの構成要素をブロックするオリゴヌクレオチドを含む上記アンチセンスオリゴヌクレオチド。 - 上記オリゴヌクレオチドが8〜50ヌクレオチド長である請求項16に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
- 上記オリゴヌクレオチドが、メチルホスホネート類、メチルホスホノチオエート類、ホスホロモルホリデート類、ホスホロピペラジデード類およびホスホラミデート類からなる群から選択された修飾されたヌクレオチド間架橋燐酸残基を含む請求項16に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
- 上記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、その2’位に低級アルキル置換基を持つヌクレオチドを含む請求項16に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
- 水性の生理学的に許容可能な担体溶液中にある請求項16に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
- 脂質小胞中にある請求項16に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
- プレmRNA分子における選択的スプライシングを阻害する方法であって、
上記プレmRNA分子は、スプライシングによって除去されて第一のタンパク質をコードする第一のmRNA分子を生じる第一のイントロンを規定するスプライシング要素の第一の組み合わせを含み、
上記プレmRNAは、前記第一のイントロンとは異なる選択的イントロンを規定するスプライス要素の第二の組み合わせをさらに含み、上記選択的イントロンはスプライシングによって除去されて上記第一のmRNA分子とは異なる選択的な第二のmRNA分子を生じ、
上記方法は、
スプライシングが可能な条件下で、アンチセンスオリゴヌクレオチドを上記プレmRNA分子とハイブリッド形成させて二重鎖分子をつくるステップを含み、ここで、上記アンチセンスオリゴヌクレオチドは、リボヌクレアーゼHを活性化せず、かつ、スプライス要素の上記選択的な第二の組み合わせの構成要素をブロックし、
その結果、上記第一のイントロンはスプライシングにより除去され、タンパク質をコードする上記第一のmRNA分子が生成される上記方法。 - 上記アンチセンスオリゴヌクレオチドが突然変異を起こしたスプライス要素をブロックする請求項22に記載の方法。
- 上記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、正常なスプライス要素をブロックする請求項22に記載の方法。
- 上記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、潜在スプライス要素をブロックする請求項22に記載の方法。
- 上記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、5’スプライス部位をブロックする請求項22に記載の方法。
- 上記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、3’スプライス部位をブロックする請求項22に記載の方法。
- 上記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、分岐点をブロックする請求項22に記載の方法。
- 上記ハイブリッド形成ステップが細胞内で実施され、上記第一のmRNAが上記正常なタンパク質に翻訳される請求項22に記載の方法。
- 上記正常なタンパク質がβグロビンである請求項22に記載の方法。
- 上記正常なタンパク質がヒトβグロビンである請求項22に記載の方法。
- 上記アンチセンスオリゴヌクレオチドは8〜50ヌクレオチド長である請求項22に記載の方法。
- 上記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、メチルホスホネート類、メチルホスホノチオエート類、ホスホロモルホリデート類、ホスホロピペラジデート類およびホスホラミデート類からなる群から選択される修飾ヌクレオチド間架橋燐酸残基を含む請求項22に記載の方法。
- 上記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、その2’位に低級アルキル置換基を有するヌクレオチドを含む請求項22に記載の方法。
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