JP2009159971A6 - 異常スプライシングを阻害するアンチセンスオリゴヌクレオチドと同物質の利用法 - Google Patents

Abstract

【課題】アンチセンスオリゴヌクレオチドを用いたプレｍＲＮＡ分子の異常スプライシングを阻害する方法と遺伝子発現をアップレギュレーションする方法の開発、および同法の実施に有用なアンチセンスオリゴヌクレオチドの提供。
【解決手段】突然変異を含むプレｍＲＮＡ分子における異常スプライシングの阻害法を開示。アンチセンスオリゴヌクレオチドをプレｍＲＮＡ分子とハイブリッド形成させ、スプライシング可能な条件下で二重鎖分子を作る。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、リボヌクレアーゼＨを活性化せず、突然変異により作りだされたスプライス要素の異常な組み合わせの構成要素をブロックするように選択され、その結果スプライシングにより正常なイントロンが除去され、正常なタンパク質をコードしている第一のｍＲＮＡが生成される。本法の実施に有用なオリゴヌクレオチド。
【選択図】なし

Description

本発明は、国立衛生研究所からの補助金No．GM32994の政府援助により達成された。政府は本発明に対し一定の権利を有する。

＜発明の分野＞
本発明は、アンチセンスオリゴヌクレオチドを用いてプレｍＲＮＡ（ｐｒｅ−ｍＲＮＡ）分子の異常スプライシングを阻害する方法と遺伝子発現をアップレギュレーションする方法、および同法の実施に有用なアンチセンスオリゴヌクレオチドに関する。

＜発明の背景＞
遺伝子発現のモジュレーターとしてのオリゴヌクレオチドの可能性が、現在熱心に研究されており、その努力の大部分は、癌遺伝子またはウィルス遺伝子のような標的遺伝子の発現を阻害することに大部分の力が注がれている。オリゴヌクレオチドは、ＲＮＡ（アンチセンスオリゴヌクレオチド）（M．Ghosh and J．Cohen，Prog．Nucleic Acid Res．Mol．Biol．42,79（1992）；L．Neckers et al.，Crit．Rev．Oncog．3,175(1992)）またはＤＮＡに対する指向性を示し、後者においてオリゴヌクレオチドはＲＮＡポリメラーゼIIによる転写を阻害する三重鎖構造を形成する（J.Hanvey et al.，Science 258，1481（1992）；W．McShan et al.，J．Biol．Chem．267，5712（1992）；M．Grigoriev et al.，J．Biol．Chem．267，3389（1992）；G．Duval-Vlentin et al.，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 89，504(1992)）。所望の効果を達成するために、オリゴヌクレオチドは既存の望ましくないタンパク質のde novoでの形成を有効に阻害することにより、そのタンパク質の消失を促進しなくてはならない。このような技術は、目的が正常な（ｎａｔｉｖｅ）タンパク質の生産のアップレギュレーションである場合には有用ではない。

しかし、遺伝子の発現が、その遺伝子の既存の望ましくない突然変異のためにダウンレギュレーションされる場合には、アンチセンス技術により遺伝子発現をアップレギュレーションする方法が極めて有用な可能性がある。

＜発明の概要＞
本発明は、もしもアンチセンスオリゴヌクレオチドを使用しなければ、遺伝子がコードしているプレｍＲＮＡの異常スプライシングによって、その遺伝子をダウンレギュレーションすることになる、突然変異を含むＤＮＡの発現を、アンチセンスオリゴヌクレオチドを用いてアップレギュレーションする方法を提供する。

従って、本発明の第一点は、突然変異を含むプレｍＲＮＡ分子における異常スプライシングを阻害する方法である。プレｍＲＮＡに突然変異が存在すると、突然変異はプレｍＲＮＡに異常スプライシングを引き起こさせ、通常のプレｍＲＮＡから生成されるｍＲＮＡとは異なる異常ｍＲＮＡあるいはｍＲＮＡフラグメントを生産させる。より詳しくのべれば、プレｍＲＮＡは以下を含んでいる。（i）スプライス要素の第一の組み合わせ、これは、突然変異が存在しない場合、スプライシングによって除去される正常なイントロンを規定し、その結果正常なタンパク質をコードする第一のｍＲＮＡ分子を生産する。（ii）突然変異によって誘発されるスプライス要素の第二の組み合わせ、この組み合わせは、正常なイントロンとは異なる異常イントロンを規定し、突然変異が存在する場合にはスプライシングによって異常イントロンが除去され、第一のｍＲＮＡ分子と異なる第二の異常なｍＲＮＡ分子を生産する。本発明の方法は、アンチセンスオリゴヌクレオチドをプレｍＲＮＡ分子とハイブリッド形成させ、スプライシングが可能な条件で二重鎖分子を作ることを含む。本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、リボヌクレアーゼＨを活性化せず、スプライス要素の異常な第二の組み合わせの構成要素をブロックするように選択されているため、スプライシングにより正常なイントロンが除去され、正常なタンパク質をコードする第一のｍＲＮＡ分子が生産されるものである。

本発明の第二点は、正常なタンパク質をコードしているＤＮＡを含む細胞において、正常なタンパク質の発現をアップレギュレーションする方法である。このＤＮＡは更に突然変異も含んでおり、それによる異常スプライシングが正常なタンパク質のダウンレギュレーションを引き起こす。より詳細に述べれば、ＤＮＡは、上記に明らかにされている特徴を有するプレｍＲＮＡをコードしている。本発明の方法は、スプライシングにより正常なイントロンが除去され、細胞により正常なタンパク質が生産されるように、上記の特徴を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドを細胞に投与することを含む。

本発明の第三点は、突然変異を含むプレｍＲＮＡ分子において異常スプライシングを阻害するのに有用なアンチセンスオリゴヌクレオチドである。プレｍＲＮＡ分子は上記に明らかにされているスプライス要素の第一および第二の組み合わせを含む。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、以下に述べる特徴を有するオリゴヌクレオチドを含む。（i）プレｍＲＮＡとハイブリッド形成し、二重鎖分子を形成する。（ii）リボヌクレアーゼＨを活性化しない。（iii）スプライス要素の異常な第二の組み合わせの一構成成分をブロックする。
本発明の前記およびその他の目的と側面が、本文の図と下記に示す明細書に詳細に検討されている。

図１は、プレｍＲＮＡの構造を示している。四角はエキソンを示している。実線はイントロンである。ＩＶＳ１とＩＶＳ ２のヌクレオチド１に対し、突然変異の位置（１１０と７０５）がＨＢΔ６クローンの上に表示されている。下の数字はヌクレオチドの数で、エキソンとイントロンの長さを示している。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、β^１１０とＩＶＳ２^７０５構造の下に番号が付いた短い棒によって表示され、破線によりスプライシング経路が表示されている。 図２は、βグロビンのプレｍＲＮＡのイントロン１の通常の分岐点を指向するオリゴヌクレオチド１による異常スプライシングの逆転を示す。生成物と中間体の構造が右側に示され、ヌクレオチドで表されたそれらのサイズが左側に示されている。星印は、投げ縄構造を含む中間体の異常な移動を示す。同じ表示法が後の図でも使用されている。レーン１は、対照のＨＢΔ６のプレｍＲＮＡのスプライシングを示す。レーン２は、β^１１０のプレｍＲＮＡのスプライシングを示す。レーン３〜８は、オリゴヌクレオチド１の量（図の上に表示されている）を増加させたときのβ^１１０のプレｍＲＮＡのスプライシングを示す。レーン９は、βグロビンのプレｍＲＮＡのイントロン２の配列を標的とするオリゴヌクレオチド３の存在下におけるβ^１１０のプレｍＲＮＡのスプライシングを示す。 図３は、β^１１０のプレｍＲＮＡのイントロン１の中の異常３’スプライス部位を指向するオリゴヌクレオチド２の効果を示している。レーン１は、β^１１０のプレｍＲＮＡのスプライシングを示している。レーン２〜７はオリゴヌクレオチド２の量（図の上に表示されている）を増加させた時のβ^１１０のプレｍＲＮＡのスプライシングを示している。 図４は、ＩＶＳ２^７０５のプレｍＲＮＡのイントロン２の中の潜在３’スプライス部位を指向するオリゴヌクレオチド３と、異常５’スプライス部位を指向するオリゴヌクレオチド４によるＩＶＳ２^７０５のプレｍＲＮＡの異常スプライシングの逆転を示す。レーン１は、インプットされたＲＮＡを示す。レーン２と３は、対照転写産物（図の上に表示されている）のスプライシングを示す。レーン４〜８とレーン９〜１３は、オリゴヌクレオチド３とオリゴヌクレオチド４のそれぞれの存在下におけるＩＶＳ２^７０５のプレｍＲＮＡのスプライシングを示す。反応時のオリゴヌクレオチドの量が図の上に表示されている。左の“？”は、見かけ上の分解生成物を示す。 図５は、LIPOFECTIN（登録商標）トランスフェクション試薬の存在下に、３’潜在スプライス部位を指向する２’−Ｏ−メチル−リボオリゴヌクレオチド（１７−ｍｅｒ）アンチセンスオリゴヌクレオチドによりＩＶＳ２−６５４細胞を処理する効果を示している。レーン１、３、５において、プライマーＡ（プレｍＲＮＡの異常スプライシングの検出に特異的）を用いて、全セルロースＲＮＡに逆転転写酵素・ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）が実施された。レーン２、４、６においては、プライマーＣ（プレｍＲＮＡの正常スプライシングの検出に特異的）を用いてＲＴ−ＰＣＲが実施された。スプライシングされていないプレｍＲＮＡと、その正常スプライシング生成物および異常スプライシング生成物がゲルレーンの下に図示されている。レーン１と２は、LIPOFECTIN（登録商標）トランスフェクション試薬と２’−Ｏ−メチル−リボオリゴヌクレオチド由来の３μＭのプレｍＲＮＡで処理された細胞から得られたプレｍＲＮＡのスプライシングを示している。レーン３と４は、LIPOFECTIN（登録商標）トランスフェクション試薬のみで処理された細胞のスプライシングを示している。レーン５と６は、未処理細胞から得られたプレｍＲＮＡのスプライシングを示している。 図６は、上記の図５と類似しており、複製能欠損アデノウィルスの粒子の存在下に、ＩＶＳ２−６５４＊細胞を３’潜在スプライス部位を指向する５μＭと２０μＭのアンチセンスオリゴヌクレオチドで処理した効果を示している。ヒトβグロビン遺伝子の２番目と３番目のエキソンとそれぞれハイブリッド形成するプライマーを使用して、ＲＴ−ＰＣＲ反応が行われた。レーン１は、未処理細胞から得られたプレｍＲＮＡのスプライシングを示している。レーン２と３は、アデノウィルスの存在下に、それぞれ５μＭと２０μＭのオリゴヌクレオチドと処理された細胞から得られたプレｍＲＮＡのスプライシングを示している。 図７は、上記の図５と類似しており、異常５’スプライス部位を指向する５μＭまたは５０μＭの２’−Ｏ−メチル−リボオリゴヌクレオチドのアンチセンスオリゴヌクレオチドによって処理されたＩＶＳ２−６５４細胞＊のエレクトロポレーションの効果を示している。レーン１は、未処理細胞から得られたプレｍＲＮＡのスプライシングを示している。レーン２と３は、それぞれ５μＭと５０μＭのオリゴヌクレオチドで処理された細胞から得られたプレｍＲＮＡのスプライシングを示している。

＜発明の詳細な説明＞
イントロンは、真核細胞のＤＮＡの一部で、ＤＮＡのコーディング部分、すなわち“エキソン”の間に介在する。イントロンとエキソンは、“一次転写産物、ｍＲＮＡの前駆体”（または“プレｍＲＮＡ”）と呼ばれるＲＮＡに転写される。エキソンによってコードされている正常なタンパク質が生産されるには、プレｍＲＮＡからイントロンが除去されなくてはならない（ここで使用される“正常なタンパク質”とは天然に存在する野生型または機能のあるタンパク質を指す。）。スプライシング過程で、プレｍＲＮＡからイントロンが除去され、その後エキソンの結合が行われる。

スプライシング過程は、実際にはスプライシング因子によって仲介される一連の反応で、転写後、翻訳前にＲＮＡにおいて実行される。従って、“プレｍＲＮＡ”とは、エキソンとイントロンの両方を含むＲＮＡで、“ｍＲＮＡ”は、イントロンが除去されてから、引き続きエキソンが結合されたＲＮＡで、そこからリボソームによってタンパク質が翻訳される。

イントロンは、スプライシング反応を実行する種々のスプライシング因子と結合する比較的短い、保存されたＲＮＡ断片である１組の“スプライス要素”によって規定される。従って、各イントロンは、５’スプライス部位、３’スプライス部位、その間に位置する分岐点によって定義される。アンチセンスオリゴヌクレオチドが完全あるいは部分的にスプライス要素にオーバーラップするか、あるいはスプライス要素に充分に近い位置でプレｍＲＮＡに結合し、そのスプライス要素において発生する特定のスプライシング反応を通常は仲介していると思われるスプライシング因子の結合と機能を崩壊すると、ここに論じられているように、これらのスプライス要素は“ブロック”される（例えば、スプライス要素の３、６、９、１２、１５、または１８個のヌクレオチドの範囲内のある位置でプレｍＲＮＡと結合すると、そのスプライス要素はブロックされる）。

正常なＤＮＡおよびプレｍＲＮＡにおける突然変異は、置換による突然変異か、欠失による突然変異のどちらかで、これによって新しい異常スプライス要素が作られる。従って、異常スプライス要素は、異常イントロンを規定する１組の異常スプライス要素の中の１構成要素である。スプライス要素の異常な組み合わせの残りの構成要素は、正常なイントロンを規定するスプライス要素の組み合わせの構成要素でもあり得る。例えば、突然変異が新しい異常３’スプライス部位を作り、それが正常な３’スプライス部位よりも上流（すなわち５’側）かつ正常な分岐点よりも下流（即ち３’側）である場合には、正常な５’スプライス部位と正常な分岐点は正常なスプライス要素の組み合わせと異常スプライス要素の組み合わせの両者の構成要素として作用し得る。他の状況下においては、突然変異は、通常は休眠状態、すなわちスプライス要素としての役割を果たさないＲＮＡの正常な領域を活性化し、スプライス要素として作用させ得る。このような要素は、“潜在”要素と呼ばれる。例えば、突然変異が正常な３’スプライス部位と正常な分岐点の間に位置する新しい異常突然変異３’スプライス部位を作ると、それによって異常突然変異３’スプライス部位と正常な分岐点の間に潜在分岐点が活性化され得る。その他の状況においては、突然変異によって、正常な分岐点と正常な５’スプライス部位の間に位置する追加の異常５’スプライス部位が作られることがあり、また突然変異によって、潜在３’スプライス部位と潜在分岐点がその順で異常突然変異５’スプライス部位の上流に活性化されることもあり得る。

この場合、正常なイントロンは、２個の異常イントロンに分割され、その間に新しいエキソンが位置することとなる。更に、正常なスプライス要素（特に分岐点）が異常スプライス要素の組み合わせの一構成要素でもある場合には、正常なスプライス要素をブロックし、異常スプライシングよりも、正常スプライシングを行わせるように、正常なスプライス要素の組み合わせの残りの構成要素を補充するような潜在スプライス要素（すなわち潜在分岐点）を活性化し得る。更に言及すべきは、潜在スプライス要素が活性化される場合には、その部位はイントロン内か、あるいは近接するエキソンの１個内に位置する。従って、特定の突然変異によって作りだされる異常スプライス要素の組み合わせに応じて、本発明を実施するために種々のスプライス要素をブロックするためのアンチセンスオリゴヌクレオチドを合成することができる。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、突然変異スプライス要素、潜在スプライス要素、正常なスプライス要素をブロックし得る。つまり、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、５’スプライス部位、３’スプライス部位、または分岐点をブロックし得る。一般に、上記で検討したように、勿論正常なスプライス要素のブロックによって、正常なスプライス要素の組み合わせの代替構成要素として作用する潜在スプライス要素が活性化され、正常スプライシングに参加する場合を考慮して、正常なイントロンをも規定しているスプライス要素をブロックすることはない。

アンチセンスオリゴヌクレオチドの長さ（すなわちその中のヌクレオチドの数）は、目的の部位に選択的に結合する限り重要ではなく、ごく普通の方法によって決定できる。一般に、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、８、１０または１２個から、２０、３０、または５０個のヌクレオチド長である。

リボヌクレアーゼＨを活性化しないアンチセンスオリゴヌクレオチドは、公知の方法により作ることができる。Pederson et al．の米国特許第5,149,797号を参照（ここに引用されているすべての特許の開示内容は、引用することによって本明細書の一部とする）。デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド配列であるこのようなアンチセンスオリゴヌクレオチドは、その一構成要素としてオリゴヌクレオチドを含む二重鎖分子にリボヌクレアーゼＨの結合を立体的に妨害するか、阻止する何らかの構造的修飾を単に含み、この構造的修飾は二重鎖形成を実質的に妨害または阻止しない。二重鎖形成に関与するオリゴヌクレオチドの部分は、リボヌクレアーゼＨが結合に関与する部位とは実質的に異なり、リボヌクレアーゼＨを活性化しない多くのアンチセンスオリゴヌクレオチドが入手可能である。例えば、このようなアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ヌクレオチド間架橋燐酸残基の少なくとも１個または全てが、メチルホスホン酸類、メチルホスホノチオエート類、ホスホロモルホリデート類、ホスホロピペラジデート類、ホスホラミデート類等の修飾燐酸塩である。例えば、ヌクレオチド間架橋燐酸残基が、報告されているように、交互に修飾され得る。別の本発明を限定しない実施例において、このようなアンチセンスオリゴヌクレオチドは、少なくとも１個または全てのヌクレオチドが２’低級アルキル基（例えば、炭素数１〜４、直鎖または分岐、飽和又は不飽和のメチル基、エチル基、エテニル基、プロピル基、１−プロペニル基、２−ブロペニル基、イソプロピル基）を含むオリゴヌクレオチドである。例えば、ヌクレオチド基が、報告されているように交互に修飾され得る。P．Furdon et al.，Nucleic Acids Res．17，9193-9204（1989）；S．Agrawal et al.，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 87，1401-1405（1990）；C．Baker et al.，Nucleic Acids Res．18，3537-3543（1990）；B．Sproat et al.，Nucleic Acids Res．17，3373-3386（1989）；R．Walder and J．Walder，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 85，5011-5015（1988）も参照。

本発明の方法、オリゴヌクレオチドおよび調製品の利用法は多様である。これらは、ある時間まで発現されている遺伝子の発現をダウンレギュレーションするための手段を得ることが好ましく、その後、遺伝子発現をアップレギュレーションすることが好ましいあらゆる発酵過程に有用である（例えば、発酵の増殖期にはダウンレギュレーションし、発酵の生産期にはアップレギュレーションする）。このような利用に関しては、発現される遺伝子は、遺伝子が正常なイントロンを含んでいる限り、発酵によって生産されるタンパク質をコードしている全ての遺伝子が可能である。次に、遺伝子を、部位特異的突然変異のような（T．Kunkel，米国特許第4,873,192号を参照）適切な手段により突然変異させ、その遺伝子の発現を実質的にダウンレギュレーションする異常イントロンを規定するスプライス要素の第二の組み合わせを計画的に作り出すことができる。次にこの遺伝子を適当な発現ベクターに挿入し、発現ベクターを、標準組み換え技術により宿主細胞（例えば酵母、昆虫または哺乳動物細胞（例えばヒト、ラット））に挿入することができる。次に標準発酵法により、宿主細胞を培地内で増殖させる。突然変異遺伝子の発現をアップレギュレーションすることが好ましい場合には、スプライス要素の異常な第二の組み合わせの一構成成分に結合する適切な調製品形態のアンチセンスオリゴヌクレオチドを培地に加えると、遺伝子の発現はアップレギュレーションされる。

本発明の方法、オリゴヌクレオチドおよび調整品は、発生過程でおよび／または組織に制御されるヒトまたは動物の遺伝子におけるスプライシングを調べるためのin vitroまたはin vivoでの手段としても役立つ。そのような実験は、本明細書の以下に述べる手順または当業者にとって明らかな修飾によって実施され得る。

本発明の方法、オリゴヌクレオチドおよび調製品は、βサラセミア（この場合、オリゴヌクレオチドはβグロビンの、特にヒトのプレｍＲＮＡに結合する）、αサラセミア（この場合オリゴヌクレオチドは、αグロビンのプレｍＲＮＡに結合する）、テイ・サックス病（この場合オリゴヌクレオチドは、β−ヘキソースアミニダーゼαサブユニットのプレｍＲＮＡに結合する。）、フェニルケトン尿症（この場合オリゴヌクレオチドは、フェニルアラニン水酸化酵素のプレｍＲＮＡに結合する）、および特定の形態の嚢胞性繊維症（この場合、オリゴヌクレオチドは嚢胞性繊維症遺伝子のプレｍＲＮＡに結合する）のような、異常スプライシングが関与する疾病治療の治療薬としても有用である。このような疾患においては、突然変異がプレｍＲＮＡの異常スプライシングを引き起こすことが明らかにされている（例えば、Akli et al.，J．Biol．Chem．265，7324（1990）；B．Dworniczak et al.，Genomics 11，242（1991）；L-C．Tsui，Trends in Genet．8,392（1992）を参照）。

本発明により治療し得るβサラセミアの実施例は、β^１１０、ＩＶＳ１^５、ＩＶＳ１^６、ＩＶＳ２^６５４、ＩＶＳ２^７０５、ＩＶＳ２^７４５突然変異クラス（すなわち、この場合βグロビンのプレｍＲＮＡが前述の突然変異を有する）のβサラセミアが含まれるが、これらに限定されない。

“アンチセンスオリゴヌクレオチド”という言葉には、生理学的に、かつ薬剤学的に許容可能なその塩が含まれる。すなわち、好ましい親化合物の生物活性を保持し、更に好ましくない毒性を持たない塩である。このような塩の実施例は、（ａ）ナトリウム、カリウム、ＮＨ_４ ^＋、マグネシウム、カルシウム、スペルミンやスペルミジンのようなポリアミン等のカチオンと形成される塩（ｂ）例えば塩酸、臭化水素酸、硫酸、燐酸、硝酸等の無機酸と形成される、酸を添加された塩（ｃ）酢酸、シュウ酸、酒石酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、グルコン酸、クエン酸、リンゴ酸、アスコルビン酸、安息香酸、タンニン酸、パルミチン酸、アルギニン酸、ポリグルタミン酸、ナフタレンスルホン酸、メタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、ナフタレンジスルホン酸、ポリガラクツロン酸等の有機酸と形成された塩；（ｄ）塩素、臭素、ヨウ素等の元素アニオンから形成された塩、である。

本発明の調製品は、水性担体のような生理学的あるいは薬剤学的に許容可能な担体中のアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む。従って、本発明において使用するための調製品には、皮下、皮内、筋肉内、静脈内、動脈内投与と局所塗布（すなわち、嚢胞性繊維症の患者の肺への呼吸可能な粒子のエアロゾル化調製品の投与）を含む非経口投与に適した調製品が含まれるが、それらに限定されない。

調製品は、単位投与形態で存在し、本技術において公知の方法のいずれかによって調製するのが望ましい。いずれの場合でも、最も適した投与経路は、患者、治療される状態の性質と重症度、使用される特定の活性化合物によって変わり得る。

本発明は、異常スプライシング疾患に罹患している患者において遺伝子発現をアップレギュレーションする薬物を調製するために、上記に明らかにされた特徴を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドの使用法を提供するものである。本発明に従って薬物を製造する際、アンチセンスオリゴヌクレオチドは典型的には、特に許容可能な単体と混合される。勿論、担体は、調製品中の他のどのような成分とも適合するという意味で許容できるものでなくてはならず、患者に有毒であってはならない。担体は固体でも液体でもよい。１個またはそれ以上のアンチセンスオリゴヌクレオチドを本発明の調製品中に含めることができ、これは、１つ以上の補助的治療成分を選択的に含めて、本質的に成分を混合することから成る本技術において公知の技術のいずれかにより調製され得る。

本発明の調製品は、活性成分の滅菌水性および非水性注入液から成り、調製品は好ましくは目的の被投与対象の血液と等張で、本質的に発熱物質を含まない。

これらの調製品には、抗酸化薬、緩衝液、静菌薬および目的の緩衝液の血液と調製品を等張にする溶質を含めることができる。水性および非水性滅菌懸濁液には、懸濁剤と濃厚剤を含めることができる。調製品は、例えばアンプルおよびバイアルに密封され、単位投与量用容器または複数回投与用容器に入れて提供でき、また凍結乾燥条件で保存でき、使用直前に生理食塩水または注射用水等を加えるだけでよい。

調製品中に、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、リポゾームまたは微結晶等の脂質粒子または小胞中に含めることができ、これは非経口投与に適しているものと思われる。粒子は、アンチセンスオリゴヌクレオチドがその中に含まれている限り、単ラメラまたは多重ラメラ小胞のような、いずれか適切な構造で存在し得る。Ｎ−［１−（２，３−ジオレオイロキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチル−アンモニウムメチル硫酸、または“ＤＯＴＡＰ”のような、プラスに荷電された脂質がこのような粒子や小胞に特に好ましい。このような脂質粒子の調製法は公知である。例えば、Janoff et al．の米国特許第4,880,635号；Kurono et al．の第4,906,477号；Wallachの第4,911,928号；Wallachの第4,917,951号；Allen et al．の第4,920,016号；Wheatley et al．の第4,921,757号等を参照。

投与されるアンチセンスオリゴヌクレオチドの投与量は、実施される特定の方法によって異なり、対象生体に投与される場合には、疾病、対象の状態、特定の調製品、投与経路等によって異なる。一般に、オリゴヌクレオチドの細胞内濃度は０．０５から５０μＭで、特に０．２から５μＭが好ましい。ヒトのような対象に投与する場合、投与量は約０．０１、０．１、または１ｍｇ／ｋｇから、５０、１００または１５０ｍｇ／ｋｇが使用される。

本発明は、以下の本発明を制限しない実施例において更に詳細に説明される。
ヌクレオチド配列はここでは単鎖のみで表示され、左から右に５’から３’の方向が示されている。

＜プレｍＲＮＡの構造と構成＞
種々のヒトβグロビンのプレｍＲＮＡ分子の構成と構造が図１に示されている。四角はエキソンを示している。実線はイントロンである。ＩＶＳ１とＩＶＳ２のヌクレオチド１に対し、突然変異の位置（１１０と７０５）がそれぞれＨＢΔ６クローンの上に表示されている。下の数字はヌクレオチドの数で、エキソンとイントロンの長さを示している。アンチセンスオリゴヌクレオチド（下記に詳細に論じられている）は、β^１１０とＩＶＳ２^７０５構造の下に番号が付いた短い棒によって表示され、破線によりスプライシング経路が表示されている。プレｍＲＮＡは全て、ＳＰ６４ベクター内にサブクローニングされたヒトβグロビン遺伝子の適切なフラグメントから、ＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼ（M．Konarska et al.，Cell 38,731(1984)）によって転写された。ＨＢΔ６（A．Krainer et al.，Cell 36,993(1984)）は、ヒトβグロビン遺伝子全体を含む。β^１１０構造はエキソン１と２を含み、元のサラセミアのクローンからサブクローニングされた（R．Spritz et al.，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 78，2455(1981)）。転写前、プラスミドはＢａｍＨＩ部位で直鎖状にした。ＩＶＳ２^７０５プラスミドを構成するために、実質的に２番目のエキソン全体、２番目のイントロン全体、３番目のエキソンの大部分を殆ど含むＨＢΔ６のフラグメントを先ずＳＰ６４の中にサブクローニングし、続いて公知の技術（T．Kunkel et al.，Methods Enzymol．154，367(1987)）により部位特異的突然変異を起こし、イントロンのヌクレオチド７０５の位置においてＴからＧへの突然変異を誘発する。次にＰｖｕＩＩ部位で直鎖状にしたプラスミドに転写が行われた。

＜アンチセンス２’−Ｏ−メチル−オリゴリボヌクレオチドの合成＞
ここに記述されている実施例に使用する２’−Ｏ−メチル−オリゴリボヌクレオチドは、Glen Research社（スターリング、バージニア州）の試薬を使用し、公知の技術に従って合成され、US Biocemicals社から入手可能なSUREPURE（登録商標）精製キットを使用して公知の技術により精製された。
生成された２’−Ｏ−メチル−オリゴリボヌクレオチドは、オリゴ１からオリゴ５と呼ばれる。

イントロン１のヌクレオチド８２〜９５の位置に相補的なオリゴ１（GUCAGUGCCUAUCA）（配列番号１番）は、通常の分岐点を標的としており、イントロン１のヌクレオチド１０３〜１１６の位置に相補的なオリゴ２（AUAGACUAAUAGGC）（配列番号２番）はβグロビン遺伝子のイントロン１においてβ^１１０突然変異によって作られた異常３’スプライス部位を標的としている。イントロン２のヌクレオチド５７３〜５８９の位置に相補的なオリゴ３（CAUUAUUGCCCUGAAAG）（配列番号３番）は、２番目のイントロンのヌクレオチド５７９の位置における潜在３’スプライス部位を標的としている。ヌクレオチド６９７〜７１３の位置に相補的なオリゴ４（CCUCUUACCUCAGUUAC）（配列番号４番）は、ＩＶＳ２^７０５のプレｍＲＮＡの２番目のイントロンのヌクレオチド７０５の位置における突然変異によってつくられた異常５’スプライス部位を標的としている。オリゴ５（GCUAUUACCUUAACCCAG）（配列番号５番）は、ＩＶＳ２^６５４突然変異によって作られた異常５’スプライス部位を標的としている（イントロン２のヌクレオチド６４３〜６６０の位置と相補的）。オリゴ６（GCCUGACCACCAAC）（配列番号６番）は、グロビンのプレｍＲＮＡのエキソン１の潜在５’スプライス部位を標的としている（イントロン１のヌクレオチド１に対して−２３から−１０の位置のヌクレオチドと相補的）。

＜ヒトβグロビンのイントロン１の通常の分岐点を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドによる異常スプライシングの逆転＞
ギリシャおよびキプロス出身の患者に多い疾患型であるβ^１１０サラセミアにおいて、ヒトβグロビン遺伝子の１番目のイントロンのヌクレオチド１１０の位置におけるＡからＧへの突然変異は、更に異常３’スプライス部位を作りだす（R．Spritz et al.，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 78,2455(1981)）。通常の３’スプライス部位が存在するにも関わらず、異常部位がスプライシング機序によって優先的に使用され、１９個のヌクレオチドのイントロン配列を含む異常スプライシングされたｍＲＮＡが生成される（図１）。β^１１０グロビン対立遺伝子をトランスフェクションされた細胞において（M．Busslinger et al.，Cell 27,289(1981)；Y Fukumakiet al.，Cell 28,585(1982)）または核抽出物におけるその転写物のスプライシング中に（R．Reed and T．Maniatis，Cell 41,95(1985)）（図２のレーン２も参照）、正常にスプライシングされたｍＲＮＡは、スプライシング生成物の約１０％を構成するに過ぎず、この型のサラセミアの患者に観察される正常ヘモグロビンレベルの著明な低下と一致している。β^１１０のプレｍＲＮＡにおいて、異常３’スプライス部位が、イントロンのヌクレオチド９３の位置の通常の分岐点を組み入れ、正常３’スプライス部位と競合し、それによって正常スプライス部位を阻害することが認められた（R．Reed and T1 Maniatis，Cell 41，95(1985)）。この研究で重要なことは、通常の分岐点を不活化する突然変異は、ヌクレオチド１０７の位置において潜在分岐点を活性化し、正常３’スプライス部位におけるスプライシングを引き起こすことである（Y．Zhuang and A．Weiner，Genes and Dev．3,1545(1989)）。潜在分岐点と１１０番目の位置の突然変異３’スプライス部位が近接しているため、異常スプライシングは進行できない。

通常の分岐点配列に標的を定めるアンチセンスオリゴヌクレオチドが、強制的にスプライシング機序に潜在分岐点を選択させ、正常にスプライシングされたｍＲＮＡを生成させるかどうかを検討するために、１４ヌクレオチド長の２’−Ｏ−メチル−オリゴヌクレオチド（オリゴヌクレオチド１（配列番号１番））をβグロビンのプレｍＲＮＡのイントロン１の分岐点配列を標的として作用させた。２’−Ｏ−メチル−オリゴヌクレオチドがこのために選択され、その後の実験でも選択されたのは、オリゴ１（GUCAGUGCCUAUCA）（配列番号１番）がヌクレアーゼに耐性をもち、リボヌクレアーゼＨによって分解されないＲＮＡとの安定したハイブリッドを形成するからである（H．Inoue et al.，Nucleic Acids Res．15,6131(1987)；H．Inoue et al.，FEBS Lett．215,327(1987)；B．Sproat et al.，Nucleic Acids Res．17,3373(1989)）。例えば、アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドまたはそれらのホスホロチオエート誘導体が使用される時に認められるリボヌクレアーゼＨによる分解によって、基質であるプレｍＲＮＡが分解され、あらゆるスプライシングが阻害される。

図２は、βグロビンのプレｍＲＮＡのイントロン１中の通常の分岐点を指向するオリゴヌクレオチド１による異常スプライシングの逆転を示している。Ｐ^３２標識β^１１０のプレｍＲＮＡ（反応１回、２５ｆ ｍｏｌｅにつき約１０^５ｃｐｍ）のスプライシングが、反応容量が２倍の５０μＬであった以外は、本質的に報告されているように（A．Krainer et al.，Cell 36，993(1984)；Z．Dominski and R．Kole，Mol．Cell．Biol．12,2108(1992)）、in vitroでＨｅＬａ細胞核抽出物において２時間実施された。反応生成物は、８％ポリアクリルアミド配列決定ゲル上で分析され、オートラジオグラフィーで視覚化された。生成物と中間体の構造が右側に、ヌクレオチドで表したこれらの大きさが左側に示されている。星印は、投げ縄構造を含む中間体の異常な移動を示す。レーン１は、対照のＨＢΔ６のプレｍＲＮＡのスプライシングを示す。レーン２は、β^１１０のプレｍＲＮＡのスプライシングを示す。レーン３〜８は、オリゴヌクレオチド１の量を増加させて（図の上に表示されている）β^１１０のプレｍＲＮＡのスプライシングを観察したものである。レーン９は、βグロビンのプレｍＲＮＡのイントロン２の配列を標的とするオリゴヌクレオチド３の存在下におけるβ^１１０のプレｍＲＮＡのスプライシングを示す。

これらのデータの分析により、オリゴヌクレオチドを含まない対照反応液（図２、レーン２）において、異常スプライシング生成物対正常スプライシング生成物の比は９：１であった。オリゴヌクレオチド１を、１回の反応当たり０．０１から１．０μｇの濃度（０．０５〜５μＭ）で添加すると、濃度依存的に基質の異常スプライシングの阻害と正常スプライシングの誘発を引き起こした（図２、レーン３〜６）。１．０μｇのオリゴヌクレオチドでは、スプライシング生成物の比率が１：５に逆転される。オリゴヌクレオチドの効果は配列特異的である。

なぜならば、βグロビン遺伝子の２番目のイントロンの潜在３’スプライス部位を標的とするオリゴヌクレオチド（オリゴヌクレオチド３（配列番号３番）、下記も参照）を１μｇ添加しても、スプライシング生成物の元の比率に影響しないからである（図２、レーン９）。２．０および４．０μｇのオリゴヌクレオチド１では、両スプライス部位におけるスプライシングが阻害され、２４３−ｍｅｒのＲＮＡフラグメントが生成される（図２、レーン７〜８）。このフラグメントは、スプライシング条件下においてのみ、すなわちＡＴＰとスプライシング混合物のその他の成分が存在する場合のみ蓄積し、ＡＴＰ依存性ヌクレアーゼによるオリゴヌクレオチドの結合部位における切断生成物をほぼ表している。

β^１１０突然変異によって生成される異常３’スプライス部位も、アンチセンスオリゴヌクレオチドによる異常スプライシング逆転の標的と思われる。この配列をブロックすることは、スプライシング機序に強制的にイントロン末端の元の３’スプライス部位を使用させる最も簡単な方法である筈である。しかし、異常スプライス部位を指向する１４−ｍｅｒ（オリゴ２（配列番号２番））は無効であった。オリゴヌクレオチドの濃度を増加させると、両スプライシング生成物の蓄積は阻害され、正常スプライシング生成物の方がやや効果的に阻害された（図３、レーン２〜５）。スプライシングは図２に関して記述されているのと同一条件で実施された。興味深いことに、スプライシング反応の第一段階である、５’スプライス部位における切断と投げ縄構造のエキソン中間体の形成は、最終スプライシング生成物の形成よりも、オリゴ２による影響が小さいように見える。これは、１または２μｇのオリゴヌクレオチドをスプライシング反応に添加した時でも、これらの中間体が存在したことによって示される（図３、レーン５〜６）。反応当たり４μｇでは、５’スプライス部位での切断は阻害されている（図３、レーン７）。

オリゴ１とオリゴ２の異なる効果は、オリゴヌクレオチド、多数のスプライシング因子、通常の分岐点と正常３’スプライス部位の間の３７個のヌクレオチドに位置する配列要素間の複雑な相互作用を反映している。明らかに、この領域の５’末端において通常の分岐点とハイブリッド形成したオリゴヌクレオチド１はスプライシング因子がこの配列に結合するのを妨げ、スプライシング因子に潜在分岐点の下流を選択させる。これによって、β^１１０のプレｍＲＮＡの異常スプライシングが阻害され、正常スプライシングが誘導される。対照的に、オリゴ２による中心に位置する標的配列へのハイブリッド結合は、この部位に集合する多数のスプライシング因子の結合を障害し、全てのスプライシングを阻害し得る。このオリゴヌクレオチドは、異常および正常な３’スプライシング部位の両方のスプライシングに必須であるポリプリミジン経路の大部分をブロックすることにも留意されたい。上記は、このオリゴヌクレオチドが正常のスプライシング経路を回復させ得ないことに関する説明に代わるものである。

＜ヒトβグロビンイントロン２の５’および３’スプライス部位に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドによる異常スプライシングの逆転＞
それにも関わらず、３’スプライス部位が異常スプライシングの逆転の標的として使用できるかどうかが、ヒトβグロビン遺伝子の２番目のイントロンの７０５番目のＴからＧへの突然変異を有するプレｍＲＮＡにおいて検討された。この突然変異（ＩＶＳ２^７０５）は、地中海サラセミア患者に認められ、通常の３’スプライス部位から１４５個のヌクレオチド分上流に異常５’スプライス部位を作りだす（C．Dobkin and A．Bank，J．Biol．Chem．260，16332(1985)）。スプライシング中に、潜在３’スプライス部位がイントロンにおいて５７９番目の位置のヌクレオチドの位置で活性化され、ヌクレオチド１〜５７８および７０６〜８５０の位置が別のイントロンとして除去され、イントロンの残りの部分がスプライシング生成物の中に取り込まれる（図１）。このＲＮＡにおいて、スプライシングに関与する各配列要素の間の距離は、１００ヌクレオチド長を超えるため、オリゴヌクレオチドによる立体障害効果は期待できない。

ＩＶＳ２^７０５のプレｍＲＮＡのイントロン２の潜在３’スプライス部位を指向するオリゴヌクレオチド３（配列番号３番）と異常５’スプライス部位を指向するオリゴヌクレオチド４（配列番号４番）によるＩＶＳ２^７０５のプレｍＲＮＡの異常スプライシングの逆転が図４に示されている。スプライシング反応の条件は、使用前にＲＮＡ転写物が、６％配列決定ゲル上の電気泳動により精製された以外は、上記の図２について記述されている条件と同一であった。レーン１はインプットされたＲＮＡである。レーン２と３は、対照転写物（図の上に表示されている）のスプライシングを示す。レーン４〜８と９〜１３は、オリゴヌクレオチド３とオリゴヌクレオチド４のそれぞれの存在下におけるＩＶＳ２^７０５のプレｍＲＮＡのスプライシングを示す。反応時のオリゴヌクレオチドの量が図の上に表示されている。左の“？”は、見かけ上の分解生成物を示す。

正常βグロビンのプレｍＲＮＡの２番目のイントロンを含む対照転写物は、効率的にスプライシングされ（図４、レーン２）、予想された中間体（５’エキソンと大きな投げ縄構造中間体）と４５１ヌクレオチド長の正常スプライシング生成物を生成した。ＩＶＳ２^７０５のプレｍＲＮＡのスプライシングも効率が高く、突然変異により引き起こされた異常スプライシング経路によって生じた、５７７ヌクレオチド長のスプライシング生成物と予想された３４８−ｍｅｒの中間体を生成した（図４、レーン３）。正常スプライシングされたＲＮＡと異常スプライシングされたＲＮＡの１：２の比率は、in vivoで以前に観察された比率と類似している。５７９番目のヌクレオチドにおいて活性化された潜在３’スプライス部位を標的とするオリゴヌクレオチド３（図１）は非常に活性が高く、濃度依存的にスプライシングの正常スプライシング経路への逆転を引き起こした（図４、レーン４〜８）。１回の反応あたり０．１および０．４μｇのオリゴヌクレオチドでは、逆転はほぼ完全であった。２番目のイントロンのヌクレオチド７０５の位置における突然変異により作りだされた異常５’スプライス部位を標的とするオリゴヌクレオチド４（図１）を同じ濃度で使用した場合にも、正常スプライシングが得られた（図４、９〜１３）。１回の反応あたり１および２μｇでは、どちらのオリゴヌクレオチドも追加の効果は示さなかった。１回の反応あたり３μｇ（２０μＭ）では、全てのスプライシングが阻害される（表示されていない）。図中“？”により印を付けられた強力なバンドを含むそれ以外のバンドは、長い（１３０１個のヌクレオチド）プレｍＲＮＡのヌクレアーゼ分解によるものである可能性が非常に高い。

これらの結果は、潜在３’スプライス部位と突然変異５’スプライス部位が、異常スプライス部位の特異的逆転の適切な標的を提供することを示している。オリゴヌクレオチド３および４の効果の類似性は、標的スプライス部位への接近し易さに大きな差が無いことを示唆している。両ヌクレオチドは、図２に示す実験において使用されたオリゴヌクレオチド１よりも約１０倍以上有効である。このように効率が高いのは、幾つかの因子によるものと思われる。オリゴヌクレオチド３および４は、オリゴヌクレオチド１よりも３ヌクレオチド長だけ長く、ＲＮＡとより安定性の高いハイブリッドを形成する。これらは、異常スプライス部位をブロックするため、スプライシング機序は、正常スプライス部位、恐らく正常分岐点を使用することができる。これに反して、β^１１０のプレｍＲＮＡにおいて、オリゴヌクレオチド１は、スプライシング機序に適性がやや劣る潜在分岐点配列を使用させるため、正常スプライシングされたｍＲＮＡの生成は、比較すると効率が低くなる可能性がある。図４に示す実験において、インプットされた長いＲＮＡは２時間の反応後殆ど検出できないことから、その不安定性が示唆される。従って、オリゴヌクレオチドのモル濃度は、前の実験と本質的に同じであるが、基質のプレｍＲＮＡを大きく上回っていたものと思われる。

上記の実験において、オリゴヌクレオチドは、スプライシング反応の他の成分と同時に添加された。オリゴヌクレオチドをプレｍＲＮＡと前もってハイブリッド形成させても、それらの効率は増大せず、反応開始１５分後、すなわちスプライシング複合体を形成するチャンスを与えた後に（B．Ruskin and M．Green，Cell 43，131(1985)）オリゴヌクレオチドを加えても、効果はほぼ同じであった（データは提示されず）。これらの結果は、２’−Ｏ−メチル−修飾を含むオリゴヌクレオチドが、その標的配列に対し、スプライシング因子と効果的に競合できることを示している。これらの化合物の活性が高いのは、これらの化合物がＲＮＡと強力にハイブリッド形成することによる可能性が非常に高い。

＜潜在３’スプライス部位ＩＶＳ１−５およびＩＶＳ１−６をブロックするアンチセンスオリゴヌクレオチドによる異常スプライシングの逆転＞
この実験は、サラセミア突然変異が、ＩＶＳ１−５およびＩＶＳ１−６の突然変異である点を除き、上記と本質的に同様に実施される。これらの突然変異では、ＩＶＳ１の真の５’スプライス部位が突然変異される。サラセミアを引き起こす異常スプライシングは、突然変異ＩＶＳ１−５およびＩＶＳ１−６が５’スプライス部位を弱化させるため、１６ヌクレオチド上流に位置する潜在スプライス部位とスプライシング因子をうまく競合させたという事実によるものである。他のプレｍＲＮＡにおいて突然変異されたスプライス部位と類似のスプライス部位が機能しているように見えることから、この実験において、潜在スプライス部位にアンチセンスなオリゴヌクレオチドが、突然変異にも関わらず、異常スプライシングを逆転し、突然変異された５’スプライス部位に戻し、正常スプライシングを回復し得るかどうかを検討した。使用したオリゴヌクレオチドはオリゴ６（配列番号６番）、上記実施例２のように生成された２’−Ｏ−メチル−リボオリゴヌクレオチドである。

＜ＩＶＳ２^６５４突然変異の異常５’スプライス部位をブロックするアンチセンスオリゴヌクレオチドによる異常スプライシングの逆転＞
これらの実験は、ＩＶＳ２^６５４突然変異を含むヒトβグロビンのプレｍＲＮＡが使用される以外は、本質的に上記と同様に実施され、オリゴ５（配列番号５番）が使用される。

中国出身のサラセミア患者にしばしば同定されるＩＶＳ２^６５４突然変異は、ヌクレオチド６５３において更に５’スプライス部位を作り、イントロン２のヌクレオチド５７９の位置における共通の潜在３’スプライス部位を活性化することによって、スプライシングに影響を与える。ＩＶＳ２^６５４のプレｍＲＮＡの異常スプライシングの効率は、ＩＶＳ２^７０５のプレｍＲＮＡよりも高く、in vitroのスプライシング中に、異常スプライシング生成物と比べ、正常スプライシング生成物は少量しか検出されない。異常スプライシングの効率が高いにも係わらず、潜在３’スプライス部位を標的とするオリゴ３と、異常５’スプライス部位を標的とするオリゴ５は、上記と類似の濃度で正常スプライシング効率を回復した。
いずれのオリゴヌクレオチドも２μＭの濃度において、正常スプライシング生成物が蓄積し、異常生成物は殆ど検出されない（データは示されていない。）

＜ヒトβグロビンイントロン１の分岐点をブロックするアンチセンスオリゴヌクレオチドによる異常スプライシングの逆転＞
この実験は、オリゴヌクレオチドがβグロビン遺伝子のイントロン１の正常な分岐点配列からすぐ上流に位置する配列（ヌクレオチド７５〜８８の位置）に結合する以外は、本質的に上記と同様に実施され、β−１１０ 突然変異のプレｍＲＮＡにおける正常スプライシングを回復した。オリゴヌクレオチドの配列はCCCAAAGACUAUCC（配列番号７番）である。正常スプライシングが回復された。

＜サラセミアヒトβグロビンのプレｍＲＮＡを発現する細胞系の調製＞
一連の安定した細胞系は、サイトメガロウィルス初期プロモーターの下でサラセミアグロビン遺伝子をＨｅＬａ細胞とＣＨＯ細胞にトランスフェクションすることによって調製される。遺伝子はＩＶＳ１−１１０、ＩＶＳ２−６５４、ＩＶＳ１−５突然変異を含む。

安定した細胞系は、標準技術に従って入手される。例えばMolecular Biology（P．Ausubel．et al.編、1987）の中”Current Protocols”を参照。簡単に述べれば、細胞は、ＣＭＶプロモーターの下でサラセミアグロビン遺伝子を有するプラスミドと、選択可能マーカーとしてネオマイシン耐性遺伝子を有するプラスミド（ｐＳＶ２ｎｅｏ）により同時にトランスフェクションされる。トランスフェクションは、エレクトロポレーション（Z．Dominski and R．Kole，Mol．Cel．Biol．11:6075-6083(1991)；Z．Dominski and R．Kole，Mol．Cel．Biol．12:2108-2114(1992)）または燐酸カルシウム法のいずれかによるものである。細胞を平板培養し、２４〜４８時間後Ｇ４１８を含む選択培地に接触させる。生存コロニーを増殖させ、以下のようにサラセミアグロビンのｍＲＮＡの発現を分析する。

製造業者のプロトコルに従って、市販のＴｒｉ試薬（Molecular Research Center，シンシナチ、オハイオ州）を用いて、約１０^５個の細胞から全ＲＮＡを単離する。この方法により、大量の小さなサンプルを容易に処理することができ、高品質のＲＮＡを高収率で得られる。ｒＴｔｈポリメラーゼを使用し、製造業者のプロトコルに従って（Perkin Elmer）、ＲＴ−ＰＣＲによりスプライシングパターンを分析する。一過性にトランスフェクションされた細胞においてスプライシングされたＲＮＡを検出するのに、わずか１〜５％の単離されたＲＮＡしか必要としないので、この方法は、安定細胞系において容易に検出するのに十分な鋭敏度を持っている。サラセミアｍＲＮＡの中の異常配列とハイブリッド形成し、スプライス結合部にかかる３’プライマーにより逆転写酵素ステップが実施される。

これによって、確実に、汚染ＤＮＡと正常グロビンＲＮＡは検出されず、分析を障害しないことがわかる。サラセミアのプレｍＲＮＡを発現するクローニングされた細胞系は、下記のように、アンチセンス２’−Ｏ−メチル−オリゴヌクレオチドを用いる治療に使用される。

＜細胞培養におけるアンチセンスオリゴヌクレオチドの投与＞
上記実施例８において生産された細胞を、ウェル当たり２００μｌの培地を含む２４穴培養皿の中で増殖させる。ウェル当たり２×１０^４個の細胞を接種し、付着したらそれらを５０μＭまでの濃度のアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む２００μｌの培地で処理する。密集増殖（２〜３×１０^５個の細胞）に達するまで、オリゴヌクレオチドの存在下に４日間まで細胞を培養する。２’−Ｏ−メチル−リボオリゴヌクレオチドは培地を含む血清内で極めて安定なので、培地は僅か２日おきで交換される。５０μＭ（ウェル当たり４０μｇ）の濃度のオリゴヌクレオチドは、in vitroでスプライシングの効率的な回復を誘発するのに必要な濃度よりも１００倍以上高い。この濃度でも、１μＭのスケールでオリゴヌクレオチドを１回合成すると、１〜１．６ｍｇのオリゴヌクレオチドが生成され、これは２５から４０の試料を処理するのに十分量の材料が提供される。

これに代わる方法においては、公知の技術に従って（C．Bennett et al.，Mol．Pharm．41:1023-1033(1992)）、オリゴヌクレオチドを添加する前に、１０μｇ／ｍｌの濃度のLIPOFECTIN（登録商標）試薬（DOTMA、BRLより）により細胞は前処理される。

処理後、全ＲＮＡを上記のように単離し、ＲＴ−ＰＣＲにより正常スプライシングされたｍＲＮＡの存在を分析する。α−Ｐ^３２標識ＡＴＰの存在下に、プライマーの増幅を行い、 検出感度を増大させ、サイクル回数を１５回に減少させる。

前記実施例は、本発明を説明するものであり、それらの制限を意図するものではない。本発明は、ここに含まれる請求項と同等物と共に、以下の請求項とによって規定される。

＜リポゾームトランスフェクション＞
ＩＶＳ２−６５４サラセミア突然変異を有するヒトβグロビンクローンを安定的にトランスフェクションしたＨｅＬａを基とする細胞系を使用して、以下の実験を行った。ＩＶＳ２−６５４細胞系のあるサブクローンは、異常スプライシングされたβグロビンｍＲＮＡを多く発現し、正常にスプライシングされたｍＲＮＡを少量発現する。ＩＶＳ２−６５４＊と名付けられた第二のサブクローンは、異常スプライシングされたβグロビンｍＲＮＡと正常スプライシングされたβグロビンｍＲＮＡを約１：１の比率で発現する。単層に増殖させた約１０^５個のＩＶＳ２−６５４細胞を、血清を含まないＯＰＴＩ−ＭＥＭ培地において、製造業者の仕様書に従って、２０μｇ／ｍｌのLIPOFECTIN（登録商標）リポゾームトランスフェクション試薬（ＢＲＬ）の存在下に３’潜在スプライシングにアンチセンスな３μＭの２’−Ｏ−メチル−リボオリゴヌクレオチド（１７−ｍｅｒ）［オリゴ３（CAUUAUUGCCCUGAAAG）（配列番号３番）］で、５時間処理した。インキュベーション後、培地を除去し、細胞を通常の増殖培地（１０％胎児ウシ血清を加えたＭＥＭ）に戻した。未処理細胞と、LIPOFECTIN（登録商標）単独で処理した細胞を対照として使用した。一晩増殖させた後、Ｔｒｉ試薬（Molecular Research Center、シンシナチ、オハイオ州）を用いて、製造業者のプロトコルに従って全細胞ＲＮＡを単離した。ＲＮＡは、２６０ｎｍにおける吸光度により定量された。

逆転写酵素・ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）によりスプライシングの分析を実施した。ｒＴｔｈＲＴ−ＰＣＲキット（Cetus-Perkin Elmer）を用いて、各試料からの同量のＲＮＡを分析した。１μＣｉのα−Ｐ^３２標識ｄＡＴＰをＲＴ−ＰＣＲ反応に添加した以外は製造業者のプロトコルに従った。ＰＣＲ生成物を、８％非変性ポリアクリルアミドゲル上で分析した。ヒトβグロビン遺伝子の２番目のエキソンとハイブリッド形成するオリゴヌクレオチドを共通のプライマーとして使用した。異常スプライシングに特異的なプライマー（プライマーＡ）は、異常スプライス結合部にかかり、一方正常スプライス部位のプライマー（プライマーＣ）は正常スプライス結合部にかかる（図５）。レーン１、３、５においてプライマーＡを用いて、レーン２、４、６においてプライマーＣを用いてＲＴ−ＰＣＲが実行された。レーン１、３、５に加えられたＰＣＲ生成物の量は、レーン２、４、６の１／５であった。レーン１および２は、LIPOFECTIN（登録商標）試薬と３μＭの２’−Ｏ−メチル−オリゴリボヌクレオチドで処理した細胞から得られたプレｍＲＮＡのスプライシングを示している。レーン３と４は、LIPOFECTIN（登録商標）試薬単独で処理した細胞から得られたプレｍＲＮＡのスプライシングを示している。レーン５と６は、未処理細胞から得られたｍＲＮＡのスプライシングを示す。

レーン２においてLIPOFECTIN（登録商標）試薬の存在下にオリゴヌクレオチドで処理した細胞の正常スプライシングが視覚的に検出可能な増加を示すことに注意すること。

＜アデノウィルスによって仲介される転移＞
一晩単層に増殖させた約１０^５個のＩＶＳ２−６５４＊細胞を、複製欠失アデノウィルス（ｄｌ−３１２株、チャペルヒルのノースカロライナ大学のDr．Huの寄贈による）１０^６個の粒子の存在下に、３’潜在スプライシング部位にアンチセンスな５μＭと２０μＭの２’−Ｏ−メチル−リボオリゴヌクレオチド（１７−ｍｅr）［オリゴ３（CAUUAUUGCCCUGAAAG）（配列番号３番）］で処理した。ウィルスとオリゴヌクレオチドをＯＰＴＩ−ＭＥＭ中で３０分間プレインキュベーションしてから、細胞培養に加え、インキュベーションを２時間続けた。培地を吸引し、通常の増殖培地と交換した。一晩増殖させた後、全ＲＮＡを上記の如く単離した。プライマーがヒトβグロビンの２番目と３番目のエキソンとそれぞれハイブリッド形成した以外は、上記と同様にＲＴ−ＰＣＲ反応を実施した。同量のＰＣＲ生成物がゲルに添加された以外は、上記実施例１０と同様に生成物の分析を行った。結果を図６に示す。レーン１は、未処理細胞のスプライシングを示す。レーン２と３は、アデノウィルスの存在下に、５μＭと２０μＭのオリゴヌクレオチドでそれぞれ処理された細胞のスプライシングを示す。５μＭと２０μＭのオリゴヌクレオチドで処理した細胞に関して、濃度依存的に正常スプライシングの増加と、それに対応する異常スプライシングの減少が視覚的に検出可能であったことに注意すること。

＜エレクトロポレーション＞
一晩単層に増殖させた約１０^５個のＩＶＳ２−６５４＊細胞にトリプシンを添加し、０．５ｍｌのＯＰＴＩ−ＭＥＭ中で１０ｍｍエレクトロポレーションキュベットに移した。異常５’スプライス部位にアンチセンスな５または５０μＭの２’−Ｏ−メチル−リボオリゴヌクレオチド［オリゴ４（CCUCUUACCUCAGUUAC）（配列番号４番）］を各試料に加え、０．７５μＦに設定されたウィスコンシン大学エレクトロニクス研究所エレクトロポレーターを用いて、混合物を１５００Ｖパルスでエレクトロポレーションした。エレクトロポレーション後、細胞を通常の増殖培地内に再懸濁し、一晩単層に増殖させた。全ＲＮＡを上記の如く単離し、上記実施例１１に記述されているようにＲＴ−ＰＣＲにより分析した。

結果を図７に示す。異常スプライシングの減少と、それに対応する正常スプライシングの増加が、特に５０μＭのオリゴを作用させた時に、視覚的に検出可能であったことに注意すること。

Claims (34)

1. 突然変異を含むプレｍＲＮＡ分子における異常スプライシングを阻害する方法であって、
   上記突然変異が存在せず、正常なタンパク質をコードする第一のＲＮＡを生成するとき、上記プレｍＲＮＡ分子は、スプライシングによって除去される正常なイントロンを規定するスプライス要素の第一の組み合わせを含み、
   上記プレｍＲＮＡは、上記突然変異によって誘発された、上記正常なイントロンとは異なる異常イントロンを規定するスプライス要素の第二の組み合わせをさらに含み、上記突然変異が存在して上記第一のｍＲＮＡ分子とは異なる異常な第二のｍＲＮＡを生成するとき、上記異常イントロンはスプライシングによって除去され、
   上記方法は、スプライシングが可能な条件下で、アンチセンスオリゴヌクレオチドを上記プレｍＲＮＡ分子とハイブリッド形成させて二重鎖分子をつくるステップを含み、
   ここで、上記アンチセンスオリゴヌクレオチドは、リボヌクレアーゼＨを活性化せず、かつ、スプライス要素の上記第二の異常な組み合わせの構成要素をブロックし、
   その結果、上記正常なイントロンがスプライシングによって除去され、タンパク質をコードする上記第一のｍＲＮＡ分子が生成される、異常スプライシングを阻害する方法。
2. 上記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、突然変異したスプライス要素をブロックする請求項１に記載の方法。
3. 上記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、正常なスプライス要素をブロックする請求項１に記載の方法。
4. 上記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、潜在スプライス要素をブロックする請求項１に記載の方法。
5. 上記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、５’スプライス部位をブロックする請求項１に記載の方法。
6. 上記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、３’スプライス部位をブロックする請求項１に記載の方法。
7. 上記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、分岐点をブロックする請求項１に記載の方法。
8. 上記ハイブリッド形成ステップが細胞内で実施され、上記第一のｍＲＮＡが上記正常なタンパク質に翻訳される請求項１に記載の方法。
9. 上記正常なタンパク質が、βグロビンである請求項１に記載の方法。
10. 上記正常なタンパク質が、ヒトβグロビンである請求項１に記載の方法。
11. 上記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、８〜５０ヌクレオチド長である請求項１に記載の方法。
12. 上記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、メチルホスホネート類、メチルホスホノチオエート類、ホスホロモルホリデート類、ホスホロピペラジデート類およびホスホラミデート類からなる群から選択される修飾されたヌクレオチド間架橋燐酸残基を含む請求項１に記載の方法。
13. 上記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、その２’位に低級アルキル置換基を持つヌクレオチドを含む請求項１に記載の方法。
14. 正常なタンパク質をコードするＤＮＡを含む細胞における、該正常なタンパク質の発現をアップレギュレーションする方法であって、上記ＤＮＡは異常スプライシングによって上記正常なタンパク質のダウンレギュレーションを引き起こす突然変異を含み、
    上記ＤＮＡは、プレｍＲＮＡをコードし、
    上記プレｍＲＮＡは、上記突然変異が存在せず、上記正常なタンパク質をコードする第一のｍＲＮＡを生成するとき、スプライシングによって除去される正常なイントロンを規定するスプライス要素の第一の組み合わせを含み、
    上記プレｍＲＮＡは、上記突然変異によって誘発された、上記正常なイントロンとは異なる異常イントロンを規定するスプライス要素の第二の組み合わせをさらに含み、上記突然変異が存在して上記第一のｍＲＮＡと異なる異常な第二のｍＲＮＡを生成するとき、上記異常イントロンはスプライシングによって除去され、
    上記方法は、スプライシングが可能な条件下で、上記プレｍＲＮＡとハイブリッドを形成して二重鎖分子をつくるアンチセンスオリゴヌクレオチドを上記細胞に投与するステップを含み、
    ここで上記アンチセンスオリゴヌクレオチドは、リボヌクレアーゼＨを活性化せず、かつ、スプライス要素の上記第二の異常な組み合わせの構成要素をブロックし、
    その結果、上記正常なイントロンは、スプライシングによって除去され、上記正常なタンパク質が生成される、上記タンパク質の発現をアップレギュレーションする方法。
15. 上記細胞が、酵母、昆虫、哺乳類の細胞からなる群から選択される真核細胞である請求項１４に記載の方法。
16. 突然変異を含むプレｍＲＮＡ分子における異常スプライシングの阻害に有用なアンチセンスオリゴヌクレオチドであって、
    上記突然変異が存在せず、正常なタンパク質をコードする第一のｍＲＮＡを生成するとき、上記プレｍＲＮＡ分子は、スプライシングによって除去される正常なイントロンを規定するスプライス要素の第一の組み合わせを含み、
    上記プレｍＲＮＡは、上記突然変異によって誘発され、上記正常なイントロンとは異なる異常イントロンを規定するスプライス要素の第二の組み合わせをさらに含み、上記突然変異が存在して上記第一のｍＲＮＡ分子と異なる異常な第二のｍＲＮＡを生成するとき、上記異常イントロンはスプライシングによって優先的に除去され、
    （ｉ）上記プレｍＲＮＡとハイブリッド形成して二重鎖分子を形成し、
    （ｉｉ）リボヌクレアーゼＨを活性化せず、
    （ｉｉｉ）スプライス要素の上記第二の異常な組み合わせの構成要素をブロックするオリゴヌクレオチドを含む上記アンチセンスオリゴヌクレオチド。
17. 上記オリゴヌクレオチドが８〜５０ヌクレオチド長である請求項１６に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
18. 上記オリゴヌクレオチドが、メチルホスホネート類、メチルホスホノチオエート類、ホスホロモルホリデート類、ホスホロピペラジデード類およびホスホラミデート類からなる群から選択された修飾されたヌクレオチド間架橋燐酸残基を含む請求項１６に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
19. 上記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、その２’位に低級アルキル置換基を持つヌクレオチドを含む請求項１６に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
20. 水性の生理学的に許容可能な担体溶液中にある請求項１６に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
21. 脂質小胞中にある請求項１６に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
22. プレｍＲＮＡ分子における選択的スプライシングを阻害する方法であって、
    上記プレｍＲＮＡ分子は、スプライシングによって除去されて第一のタンパク質をコードする第一のｍＲＮＡ分子を生じる第一のイントロンを規定するスプライシング要素の第一の組み合わせを含み、
    上記プレｍＲＮＡは、前記第一のイントロンとは異なる選択的イントロンを規定するスプライス要素の第二の組み合わせをさらに含み、上記選択的イントロンはスプライシングによって除去されて上記第一のｍＲＮＡ分子とは異なる選択的な第二のｍＲＮＡ分子を生じ、
    上記方法は、
    スプライシングが可能な条件下で、アンチセンスオリゴヌクレオチドを上記プレｍＲＮＡ分子とハイブリッド形成させて二重鎖分子をつくるステップを含み、ここで、上記アンチセンスオリゴヌクレオチドは、リボヌクレアーゼＨを活性化せず、かつ、スプライス要素の上記選択的な第二の組み合わせの構成要素をブロックし、
    その結果、上記第一のイントロンはスプライシングにより除去され、タンパク質をコードする上記第一のｍＲＮＡ分子が生成される上記方法。
23. 上記アンチセンスオリゴヌクレオチドが突然変異を起こしたスプライス要素をブロックする請求項２２に記載の方法。
24. 上記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、正常なスプライス要素をブロックする請求項２２に記載の方法。
25. 上記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、潜在スプライス要素をブロックする請求項２２に記載の方法。
26. 上記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、５’スプライス部位をブロックする請求項２２に記載の方法。
27. 上記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、３’スプライス部位をブロックする請求項２２に記載の方法。
28. 上記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、分岐点をブロックする請求項２２に記載の方法。
29. 上記ハイブリッド形成ステップが細胞内で実施され、上記第一のｍＲＮＡが上記正常なタンパク質に翻訳される請求項２２に記載の方法。
30. 上記正常なタンパク質がβグロビンである請求項２２に記載の方法。
31. 上記正常なタンパク質がヒトβグロビンである請求項２２に記載の方法。
32. 上記アンチセンスオリゴヌクレオチドは８〜５０ヌクレオチド長である請求項２２に記載の方法。
33. 上記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、メチルホスホネート類、メチルホスホノチオエート類、ホスホロモルホリデート類、ホスホロピペラジデート類およびホスホラミデート類からなる群から選択される修飾ヌクレオチド間架橋燐酸残基を含む請求項２２に記載の方法。
34. 上記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、その２’位に低級アルキル置換基を有するヌクレオチドを含む請求項２２に記載の方法。

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