JP2022515976A - 急性または慢性の肝疾患、腎疾患または肺疾患を診断および／または治療するための方法 - Google Patents

Abstract

本発明は、対象における急性肝疾患または慢性肝疾患、腎疾患および／または肺疾患の治療において使用するためのＣＮＮＭ４阻害剤、ならびに治療上有効な量のＣＮＮＭ４阻害剤および薬学上許容される賦形剤または担体を含んでなる医薬組成物に関する。さらに、本発明は、対象において肝疾患、腎疾患または肺疾患を診断する方法、および細胞において誘発されたＣＮＮＭ４介在疾患または病態を軽減するために潜在的に有用な化合物を同定する方法に関する。【選択図】なし

Description

本発明は、急性疾患または慢性疾患の診断および治療の分野に関する。より詳しくは、本発明は、前記疾患のマーカーとしてのＣＮＮＭ４の使用ならびに肝疾患、腎疾患および肺疾患を治療するためのＣＮＮＭ４の阻害剤に関する。

発明の背景
慢性肝疾患は、異なる病因からの一群の肝臓病理を包含する。非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）は、罹患率が世界人口の２０～３０％であり、単純な脂質蓄積の脂肪症から、炎症および時に線維症を伴う脂肪症を特徴とする脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）の発症までの一連の肝臓障害を含む。ＮＡＦＬＤは、どちらかといえば良性および可逆的病態であり、ＮＡＳＨ患者の約２０％が肝硬変を発症する。重要なこととして、肝硬変は、肝不全を引き起こす細胞外マトリックスの沈着を特徴とする不可逆的病態である。最後に、線維症患者のおよそ４分の１が、肝臓癌の最も多い形態であり、世界において罹患および死亡の第５位の原因である肝細胞癌（ＨＣＣ）を発症する。診断時に治療介入を受けるに適格な患者は極めて少なく、生存率は実に低く、診断後の生存はわずか６～２０か月である。

一方、肝臓は急性損傷を受けることもある。この臓器は薬物代謝およびクリアランスに中枢的役割を果たし、薬物過量摂取の場合、薬物性肝障害（ＤＩＬＩ）を発症することがある。この病態は、米国および欧州のほとんどで急性肝不全および移植の主たる原因である。年間約３００００人の患者がアセトアミノフェン（ＡＰＡＰ）誘発性肝障害を発症し、その２９％が肝移植を受けている。現在までに、標準療法はＮ－アセチルシステインでの処置に基づくものだけであるが、それが肝臓を救済する可能性は低く、従って他の療法が必要とされる。

健康面だけでなく経済的にも幅広い肝臓病態群と集団間のその罹患率を考慮すると、新しい有効な治療の開発が必要とされる。また、肝臓病態はその前段階ではどちらかといえば無症候の疾患であるため、治療の他、進行を止めるためには、できる限り速やかに疾患を検知するために診断手段も必要とされることも述べておかなければならない。

腎線維症は、ほとんど全種類の慢性肝疾患で見られる細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の過剰な蓄積をもたらす。肝臓の場合と同様に、病因は、透析または腎移植を要する破壊的疾患である末期腎不全に至る進行性のプロセスである。ＥＣＭ発症および蓄積のプロセスは、２つの変化によって引き起こされる可能性がある。一方で、いくつかの細胞経路が病的状態においてＥＣＭ産生細胞が生じる主要な道筋として同定され、他方で、欠陥のあるマトリックス分解では、ＥＣＭ分解酵素の正確な作用および機序がますます複雑となっている。動物モデルにおいては多くの治療介入が有効であると思われるが、これらの有望な結果のヒトへの変換は依然として有効でない。

肺線維症は、肺組織の損傷および瘢痕化をもたらす疾患である。肥厚および堅さは障害をもたらし、線維症が増悪するにつれ呼吸が浅くなる。ほとんどの場合で、病態の原因は未知のままであり、従って、通常、特発性肺線維症（ＩＰＦ）として知られている。近年、抗線維化療法が開発されたが、より特異的な治療に向け得る重要なバイオマーカーを同定するいくつかの試みがなされている。

本発明者らは意外にも、ヒトサンプルおよび動物モデルの両方で異なる病態の一群において、ＣＮＮＭ４が過剰発現することを見出した。この病態は、ＮＡＳＨ、肝硬変およびＨＣＣなどの慢性肝臓病態、またはＤＩＬＩなどの急性病態を含んでなる。腎線維症マウスモデルにおけるＣＮＮＭ４の過剰発現もまた見られている。本発明者らはまた、前記疾患の動物モデルにおいて、ＣＮＮＭ４の阻害がバイオマーカー指標のレベルを減少させることも見出した。

よって、第１の態様において、本発明は、医療において使用するためのＣＮＮＭ４阻害剤に関する。

さらなる態様において、本発明は、対象における急性または慢性疾患の治療において使用するためのＣＮＮＭ４阻害剤に関し、その疾患は肝疾患、腎疾患および肺疾患からなる群から選択される。

別の態様において、本発明は、対象において肝疾患、腎疾患または肺疾患を診断するイン・ビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）方法であって、
（ａ）前記対象由来のサンプル中のＣＮＮＭ４の発現レベルを決定すること、および
（ｂ）前記レベルを参照値と比較すること
を含んでなり、
参照値に対する前記サンプル中のＣＮＮＭ４の発現レベルの増加が、前記患者が肝疾患、腎疾患または肺疾患に罹患していることを示す方法に関する。

さらに別の態様では、本発明は、対象において肝疾患、腎疾患または肺疾患をイン・ビトロ診断するためにＣＮＮＭ４の発現レベルを決定するために特異的な試薬の使用に関する。

さらなる態様において、本発明は、細胞において誘発された疾患または病態を軽減するイン・ビトロ方法であって、前記細胞を、前記細胞においてＣＮＮＭ４の活性、レベルまたは機能を低減するために有効な量の特定のＣＮＮＭ４阻害剤に接触させることを含んでなる方法に関する。

最後の態様において、本発明は、細胞において誘発されたＣＮＮＭ４介在疾患または病態を軽減するために潜在的に有用である化合物を同定するイン・ビトロ方法であって、前記細胞を、細胞においてＣＮＮＭ４の活性、レベルもしくは機能を低減するために有効な量の、または参照値に対して相対的脂質蓄積を低減するもしくは相対的ミトコンドリアＲＯＳを低減するために有効な量の候補化合物と接触させることを含んでなり、細胞において誘発されたＣＮＮＭ４介在疾患または病態において、ＣＮＮＭ４活性を阻害するか、参照値に対して相対的脂質蓄積を低減するか、または参照値に対して相対的ミトコンドリアＲＯＳを低減する候補化合物が、ＣＮＮＭ４介在肝疾患、腎疾患および／または肺疾患を治療および／または予防するために潜在的に有用である化合物として同定される方法に関する。

図１は、ＤＩＬＩおよび慢性肝疾患の異なる病態に由来するヒトサンプルおよびマウスモデルにおいてＩＨＣにより決定された肝臓のＣＮＮＭ４発現を示す。^＊健常に対してｐ＜０，０５；^＊＊健常に対してｐ＜０，０１；^＊＊＊健常に対してｐ＜０，００１。 図２Ａは、脂肪肝患者およびＮＡＳＨ患者由来のサンプルと比較した健常対象由来のヒト肝臓サンプルのＣＮＮＭ４ ｍＲＮＡレベルのｑＰＣＲにより決定されたＣＮＮＭ４発現を示す。図２Ｂは、イン・ビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）マウスモデルにおけるＣＮＮＭ４ ｍＲＮＡレベルのｑＰＣＲにより決定されたＣＮＮＭ４発現を示す。図２Ｃ）は、イン・ビトロマウス細胞モデルにおけるＣＮＮＭ４ ｍＲＮＡレベルのｑＰＣＲにより決定されたＣＮＮＭ４発現を示す。^＊健常に対してｐ＜０，０５。 図３ＡはＮＡＳＨ誘発初代肝細胞における脂質含量はｓｉＲＮＡ ＣＮＮＭ４で処理した際に健常レベルに戻ること、図３Ｂは処置マウスではＲＯＳにより誘発された炎症も回復すること、および、図３ＣはＤＩＬＩ誘発細胞死が肝細胞をｓｉＲＮＡ療法で処理した場合に改善することをそれぞれ示す。^＊健常に対してｐ＜０．０５：^＊＊健常に対してｐ＜０．０１；^＊＊＊健常に対してｐ＜０．００１；＃ＮＡＳＨに対してｐ＜０．０５；＃＃ＮＡＳＨに対してｐ＜０．０１；＃＃＃ＤＩＬＩに対してｐ＜０．００１。 図４Ａは、ＮＡＳＨ誘発ヒト細胞における脂質含量はｓｉＲＮＡ ＣＮＮＭ４で処理した際に健常レベルに戻ることを示す。図４Ｂは、ＮＡＳＨ誘発ヒト細胞における脂質含量はｓｈＲＮＡ ＣＮＮＭ４で処理した際に健常レベルに戻ることを示す。^＊健常に対してｐ＜０．０５；^＊＊健常に対してｐ＜０．０１；＃ＮＡＳＨ対照に対してｐ＜０．０５；＃＃ＮＡＳＨ対照に対してｐ＜０．０１。 図５Ａは、ＮＡＳＨ誘発初代肝細胞における脂質含量は、ｓｉＲＮＡ ＣＮＮＭ１、ｓｉＲＮＡ ＣＮＮＭ２またはｓｉＲＮＡ ＣＮＮＭ３で処理しても健常レベルに戻らないことを示す。図５Ｂは、ＣＮＮＭ４過剰発現の場合、マグネシウム補充は初代肝細胞の脂質含量を減少させないことを示す。図５Ｃは、初代肝細胞におけるｓｉＲＮＡ ＣＮＮＭ４処理は、マグネシウム欠乏により引き起こされた脂質蓄積を減少させることを示す。^＊＊＊健常に対してｐ＜０．００１；＃＃ＮＡＳＨモデル／Ｍｇ２＋不含＋ｓｉＲＮＡ φ（空集合）に対してｐ＜０．０１。 図６は、ｓｉＲＮＡ ＣＮＮＭ４療法後のＮＡＦＬＤ進行を観察するために分析したパラメーターを示す。図６Ａは脂質含量減少の指標としてのスーダンレッド、図６Ｂ）は肝臓損傷の指標としての血清中のＧＰＴ、図６ＣはＲＯＳによる炎症の指標としてのＤＨＥ、および、図６Ｄは線維化の指標としてのαＳＭＡをそれぞれ示す。^＊ｓｉＲＮＡ φ（空集合）に対してｐ＜０．０５；^＊＊ｓｉＲＮＡ φ（空集合）に対してｐ＜０．０１。 図７は、７－アミノ－２－フェニル－５Ｈ－チエノ［３，２－ｃ］ピリジン－４－オンによるＣＮＮＭ４の薬理学的阻害は、ＮＡＳＨ誘発肝細胞においてｓｉＲＮＡ ＣＮＮＭ４療法と同じ効果を有することを示す。図７Ａは処理された肝細胞は脂質レベルの減少、および、図７Ｂは細胞内マグネシウムレベルの増加をそれぞれ示す。^＊非処理に対してｐ＜０．０５；^＊＊＊非処理に対してｐ＜０．００１。 図８は、腎臓線維症の動物サンプルにおいてＩＨＣにより決定されたＣＮＮＭ４発現を示す。^＊＊＊健常に対してｐ＜０．００１。 図９Ａは、正常組織と比較した肝細胞癌（ＬＩＨＣ）のＴＣＧＡ（癌ゲノムアトラス）原発腫瘍サンプルにおいて決定されたＣＮＮＭ４発現を示す。図９Ｂは、正常組織と比較した肺腺癌（ＬＵＡＤ）のＴＣＧＡ（癌ゲノムアトラス）原発腫瘍サンプルにおいて決定されたＣＮＮＭ４発現を示す。

発明の具体的説明

従前に述べたように、本発明者らは、意外にも、ヒトサンプルおよび動物モデルの両方で異なる病態の一群において、ＣＮＮＭ４が過剰発現することを見出した。これらの病態は、ＮＡＳＨ、肝硬変およびＨＣＣなどの慢性肝臓病態、またはＤＩＬＩなどの急性病態を含んでなる。腎線維症マウスモデルにおけるＣＮＮＭ４の過剰発現もまた見られている。本発明者らはまた、前記疾患の動物モデルにおいて、ＣＮＮＭ４の阻害がバイオマーカー指標のレベルを減少させることも見出した。

ＣＮＮＭ４阻害剤の医学的使用
よって、第１の態様において、本発明は、医薬において使用するための（すなわち、薬剤として使用するための）ＣＮＮＭ４阻害剤に関する。

第２の態様において、本発明は、対象における急性または慢性疾患の治療において使用するためのＣＮＮＭ４阻害剤に関し、前記疾患は肝疾患、腎疾患および肺疾患からなる群から選択される。

本明細書で使用される場合、用語「ＣＮＮＭ４」は、「サイクリンおよびＣＢＳドメイン二価金属陽イオン輸送メディエーター（Ｃｙｃｌｉｎ ａｎｄ ＣＢＳ ｄｏｍａｉｎ ｄｉｖａｌｅｎｔ ｍｅｔａｌ ｃａｔｉｏｎ ｔｒａｎｓｐｏｒｔ ｍｅｄｉａｔｏｒ）」（Ａｎｃｉｅｎｔ Ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ Ｄｏｍａｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ、ＡＣＤＰ、サイクリンＭすなわちＣＮＮＭとしても知られる）を意味する。ＣＮＮＭは、発生中に、主として脳で発現されるＣＮＮＭ１以外は総ての成体組織で進化的に発現される４つの遺伝子ＣＮＮＭ１、ＣＮＮＭ２、ＣＮＮＭ３およびＣＮＮＭ４によりコードされる膜タンパク質である。ＣＮＮＭは、種々の臓器で細胞膜を経たマグネシウムイオン（Ｍｇ２＋）の輸送に重要な役割を果たす(Funato et al., 2014. J Clin Invest.124(12):5398-5410)。ＣＮＮＭ４は、ＥｎｓｅｍｂｌデータベースにおいてＩＤ番号ＥＮＳＧ０００００１５８１５８（２０１８年７月のリリース９３による）により同定されるヒト遺伝子に相当する。Ｅｎｓｅｍｂｌデータベースによれば、ＣＮＮＭ４は、少なくとも４つの転写物またはスプライス変異体をコードする。よって、本開示は、変異体ＣＮＮＭ４－２０１（ＥＮＳＴ０００００３７７０７５．２）および他の３つの変異体ＣＮＮＭ４－２０４（ＥＮＳＴ０００００４９６１８６．５）、ＣＮＮＭ４－２０３（ＥＮＳＴ０００００４９３３８４．１）およびＣＮＮＭ４－２０２（ＥＮＳＴ０００００４８２７１６．５）に関する。ＣＮＮＭ４遺伝子は、ＵｎｉｐｒｏｔデータベースでＱ６Ｐ４Ｑ７（２０１８年１０月１０日のバージョン１３０による）により同定されるタンパク質「金属輸送体ＣＮＮＭ４」をコードする。

本明細書で使用される場合、用語「阻害剤」（阻害物質）は、遺伝子ＣＮＮＭ４の転写を抑制する、従って、その遺伝子の転写産物のいずれかの形成を回避することにより、または遺伝子ＣＮＮＭ４の転写産物のいずれかの分解を促進することにより、またはコードされるタンパク質の発現を特異的に低減、抑制および／もしくは遮断することにより遺伝子の発現を特異的にサイレンシング、低減、抑制および／または遮断し得る任意の物質または化合物、ならびにＣＮＮＭ４タンパク質の活性を阻害する任意の化合物として理解される。一実施形態では、ＣＮＮＭ４阻害剤は、遺伝子ＣＮＮＭ４の転写を抑制する、従って、その遺伝子の転写産物のいずれかの形成を回避することにより、または遺伝子ＣＮＮＭ４の転写産物のいずれかの分解を促進することにより、またはコードされるタンパク質の発現を特異的に低減、抑制および／もしくは遮断することにより、遺伝子の発現を特異的にサイレンシング、低減、抑制および／または遮断する任意の物質または化合物である。

用語「転写産物」または「転写物」は、本明細書で使用する場合、遺伝子の転写から誘導されたＲＮＡを指す。

タンパク質または核酸の発現は、そのレベルが参照値に対して少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも１００％（すなわち、存在しない）減少している場合に低減されていると見なされる。参照値は、特定の疾患に罹患していない対象および一般に健常と見なされる対象であり得る対照とする対象におけるｍＲＮＡまたはタンパク質のレベルを指す。あるいは、参照値は、阻害剤の投与前の対象におけるｍＲＮＡまたはタンパク質のレベルを指し得る。本発明に関して、参照値は、対照とする対象または阻害剤の投与前の対象におけるＣＮＮＭ４のタンパク質またはｍＲＮＡレベルを指す。ある実施形態において、対照とする対象は、肝疾患、腎疾患または肺疾患に罹患していない対象である。

ＣＮＮＭ４タンパク質の活性は、前記活性が参照値に対して少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも１００％（すなわち、存在しない）減少している場合に阻害されていると見なされる。ある実施形態において、参照値は、特定の疾患に罹患していない対象および一般に健常と見なされる対象であり得る対照とする対象からのサンプルにおけるＣＮＮＭ４タンパク質の活性を指す。あるいは、参照値は、ＣＮＮＭ４阻害剤の投与前の対象からのサンプルにおけるＣＮＮＭ４タンパク質の活性を指す。本発明に関して、参照値は、対照とする対象またはＣＮＮＭ４阻害剤の投与前の対象におけるＣＮＮＭ４タンパク質活性を指す。ある実施形態において、対照とする対象は、肝疾患、腎疾患または肺疾患に罹患していない対象である。

「参照値」は、本明細書で使用する場合、サンプルから得られた値／データに対する参照として使用される検査値を指す。参照値（または参照レベル）は、絶対値、相対値、上限および／または下限を有する値、一連の値、平均値、中央値、平均値、または対照値もしくは参照値を参照することにより表される値であり得る。参照値は、例えば、試験のサンプルから得られた値であるが従前の時点で得られた値などの、個々のサンプルから得られた値に基づき得る。参照値は、サンプル集団において得られた値または試験サンプルを含むもしくは除くサンプルのプールに基づく値など、多数のサンプルに基づき得る。

ＣＮＮＭ４の発現レベルを決定するために好適な方法は当技術分野で公知であり、ＣＮＮＭ４遺伝子の発現および／またはそのタンパク質レベルを決定するために好適ないずれの方法も含む。特定の実施形態では、参照値は、本発明の阻害剤の不在下でＣＮＮＭ４遺伝子から転写されたｍＲＮＡのレベルである。

ＣＮＮＭ４遺伝子の発現レベルを決定するために好適な方法には、限定されるものではないが、ｑＰＣＲ、ＲＴ－ＰＣＲ、ＲＮＡ保護分析、ノーザンブロット、ＲＮＡドットブロット、イン・サイチュ（ｉｎ ｓｉｔｕ）ハイブリダイゼーション、マイクロアレイ技術などのｍＲＮＡの発現レベルを決定するための標準的アッセイ、ＬｏｎｇＳＡＧＥおよびＳｕｐｅｒＳＡＧＥなどの変形を含むＳＡＧＥ（ｓｅｒｉａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）法などのタグに基づく方法、マイクロアレイ、蛍光イン・サイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）（Ｆｌｏｗ－ＦＩＳＨ、ｑＦｉＳＨおよびダブルフュージョンＦＩＳＨ（Ｄ－ＦＩＳＨ）などの変形を含む）などが含まれる。

ＣＮＮＭ４タンパク質の発現レベルを決定するために好適な方法には、限定されるものではないが、例えば、ＣＮＮＭ４タンパク質に特異的に結合し得る抗体とその後の結果として生じた抗体抗原複合体の定量を用いる従来法による定量が含まれる。非標識抗体（一次抗体）および標識抗体（二次抗体）を用いる本発明で使用可能な周知の広範なアッセイが存在し、これらの技術には、とりわけ、ウエスタンブロット、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）、ＲＩＡ（ラジオイムノアッセイ）、競合ＥＩＡ（競合酵素イムノアッセイ）、ＤＡＳ－ＥＬＩＳＡ（二重抗体サンドイッチＥＬＩＳＡ）、免疫細胞化学および免疫組織化学技術、特異的抗体を含むバイオチップもしくはタンパク質マイクロアレイの使用に基づく技術、またはディップスティックなどの形式のコロイド沈澱に基づくアッセイが含まれる。対象とするタンパク質を検出し、そのレベルを定量するその他の方法には、アフィニティークロマトグラフィー技術、リガンド結合アッセイなどが含まれる。

好ましい実施形態では、ＣＮＮＭ４の発現の阻害剤は、タンパク質、核酸、小分子またはそれらの組合せからなる群から選択される。あるいは、ＣＮＮＭ４の発現の阻害剤は、タンパク質、核酸、またはそれらの組合せからなる群から選択される。好ましくは、ＣＮＮＭ４の発現の阻害剤は、中和抗体またはその機能的フラグメント、拮抗剤、可溶性結合タンパク質、可溶性受容体変異体、非機能的誘導体、アンチセンスポリヌクレオチド、ＲＮＡ干渉オリゴヌクレオチド、ホスホロジアミデートモルホリノオリゴマー（ＰＭＯ）、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、メチル化ｓｉＲＮＡ、処理ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、ダイサー基質２７マー二重鎖、アプタマー、ＤＮＡザイム、リボザイム、三重鎖形成性オリゴヌクレオチド（ＴＦＯ）、小分子およびそれらの組合せからなる群から選択される。

ある実施形態において、ＣＮＮＭ４の阻害剤は中和抗体またはその機能的フラグメントである。本明細書で使用される場合、用語「抗体」は、少なくとも１つの免疫グロブリン可変領域、例えば、免疫グロブリン可変ドメインを提供するアミノ酸配列または免疫グロブリン可変ドメインの配列を含むタンパク質を指す。「機能的フラグメント」は、ＣＮＮＭ４を阻害するその能力を保持し得る抗体の任意のフラグメントである。抗体は、例えば、重鎖可変（Ｈ）領域（本明細書ではＶＨと略す）および軽鎖可変（Ｌ）領域（本明細書ではＶＬと略す）を含み得る。一般に、抗体は、２つの重鎖可変領域と２つの軽鎖可変領域を含む。用語「抗体」は、ＩｇＡ、ＩｇＧタイプ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４）、ＩｇＥ、ＩｇＤ、ＩｇＭ（ならびにそれらのサブタイプ）の抗原結合抗体フラグメント（例えば、一本鎖抗体、ナノボディ（ＶＨＨ）、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆｄフラグメント、ＦｖフラグメントおよびｄＡｂフラグメント）ならびに完全抗体、例えば、無傷および／または全長免疫グロブリンを包含する。重鎖可変領域および軽鎖可変領域は、「フレームワーク領域」（ＦＲ）と呼ばれるより保存された領域と混じり合った「相補性決定領域」（「ＣＤＲ」）と呼ばれる超可変領域にさらに細分することができる。ＦＲおよびＣＤＲの伸張は正確に定義されている（Kabat, E.A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第5版, The United States Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242;およびChothia, C. et al. (1987) J. Mol. Biol. 196:901-917参照）。Ｋａｂａｔの定義が本明細書で使用される。各重鎖および軽鎖可変領域は一般に、アミノ末端からカルボキシル末端へ次の順序で構成される３つのＣＤＲと４つのＦＲから形成される：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４。抗体のＶＨ鎖またはＶＬ鎖は、さらに、重鎖または軽鎖定常領域の全部または一部を含み、それによりそれぞれ重鎖（ＨＣ）または軽鎖（ＬＣ）免疫グロブリンを形成し得る。免疫グロブリン軽鎖および重鎖は、ジスルフィド橋により結合され得る。重鎖定常領域は一般に、３つの定常ドメインＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３を含む。軽鎖定常領域は一般に、ＣＬドメインを含む。重鎖および軽鎖可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含む。抗体の定常領域は一般に、免疫系の種々の細胞（例えば、エフェクター細胞）および古典的補体系の第１成分（Ｃ１ｑ）を含む宿主組織または因子に対する抗体の結合を媒介する。抗体という用語は、重鎖および軽鎖により形成される抗体と一本鎖抗体の両方を包含する。

本明細書で使用される場合、用語「重鎖」または「ＨＣ」は、全長重鎖とそのフラグメントの両方を包含する。全長重鎖は、可変領域ドメインＶＨと、３つの定常領域ドメインＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３を含む。ＶＨドメインはポリペプチドのアミノ末端にあり、ＣＨ３ドメインはカルボキシル末端にある。

本明細書で使用される場合、用語「軽鎖」は、全長軽鎖およびそのフラグメントを包含する。全長軽鎖は、可変領域ドメインＶＬと定常領域ドメインＣＬを含む。重鎖と同様に、軽鎖可変領域ドメインもポリペプチドのアミノ末端にある。

本明細書で使用される場合、用語「一本鎖抗体」は、遺伝的に融合された一本鎖分子として形成される好適なペプチドリンカーにより結合された軽鎖可変領域と重鎖可変領域を含有する、遺伝子工学により改変された分子を指す。

本明細書で使用される場合、用語「ナノボディ」は、単一の単量体可変抗体ドメインからなる抗体フラグメントであるシングルドメイン抗体（ｓｄＡｂ）を指す。完全抗体と同様に、ナノボディも特定の抗原に選択的に結合することができる。

本明細書で使用される場合、用語「抗体模倣剤」は、抗体と同様に、抗原に特異的に結合し得るが、必ずしも抗体に構造上関連する必要のないいずれの化合物も指す。化合物の「模倣剤」は、機能活性に必要な化合物の化学構造が化合物の立体配座を模倣する他の化学構造で置換された化合物を含む。模倣剤の例には、ペプチド骨格が１以上のベンゾジアゼピン分子（例えば、James, G. L. et al. (1993) Science 260: 1937-1942参照）あるいはアミド結合等価体の使用および／または鎖の伸張もしくはヘテロ原子の組み込みを含む天然ペプチド骨格の修飾によってペプチド二次構造を模倣するオリゴマーで置換されたペプチド化合物が含まれ、その例としては、アザペプチド、オリゴカルバメート、オリゴ尿素、ベータ－ペプチド、ガンマ－ペプチド、オリゴ（フェニレンエチニレン）、ビニローグ性スルホノペプチド、ポリ－Ｎ－置換グリシン（ペプトイド）などが挙げられる。ペプチド模倣化合物を調製するための方法は当技術分野で周知であり、例えば、Quantitative Drug Design, C.A. Ramsden Gd., Chapter 17.2, F. Choplin Pergamon Press (1992)に明示されている。

本明細書で使用する場合、抗体という用語はまた、分子特性、トポロジーまたはスキャフォールドの違いに基づく、免疫グロブリン以外の結合剤としての「非免疫グロブリン剤」も指す。スキャフォールドという用語は、タンパク質変異体に異なる機能（通常は、特異的標的との結合に関するもの）を付与する変更されたアミノ酸または配列挿入を有し得るタンパク質フレームワークを表すことを意味する。このような非免疫グロブリン剤の例は当技術分野で周知であり、限定されるものではないが、ペプチドアプタマー、核酸アプタマー、アフィボディ分子、アフィリン、アフィマー、アフィチン、アルファボディ、アンチカリン、アビマー、ＤＡＲＰｉｎｓ、フィノマー、クニッツドメイン ペプチドモノボディなどが含まれ、他のタンパク質スキャフォールドは、Binz et al., 2005 (Nat. Biotech. 23:1257-68)に総説され、引用により本明細書に含まれる。

本発明によれば、抗体は、ヒト個体において免疫原性を軽減するために「ヒト化」することができる。ヒト化抗体は、モノクローナル抗体療法の安全性および有効性を改善する。ヒト化の１つの一般的方法は、任意の好適な動物（例えば、マウス、ラット、ハムスター）でモノクローナル抗体を生産し、その定常領域をヒト定常領域で置換することであり、この方法で操作された抗体は「キメラ」と呼ばれる。別の一般的方法は、非ヒトＶ－ＦＲをヒトＶ－ＦＲで置換する「ＣＤＲグラフティング」である。このＣＤＲグラフティング法では、ＣＤＲ領域を除く総ての残基がヒト起源である。

別の実施形態では、ＣＮＮＭ４の発現の阻害剤は、拮抗剤である。本明細書で開示されるように、「拮抗剤」は、作動剤のようにそれを活性化するのではなく受容体に結合して遮断することにより生物学的応答を遮断または減弱する受容体リガンドまたは化合物の一種である。あるいは、ＣＮＮＭ４の活性を下方調節し得る別のタンパク性薬剤は、その非機能的誘導体（すなわち、ドミナントネガティブ）であり得る。これらの非機能的誘導体を模倣するペプチドおよびその他は、当技術分野で周知であり、John Morrow Stewart and Janis Dillaha Young, [Solid Phase Peptide Syntheses (第2版, Pierce Chemical Company, 1984)]によりさらに詳しく記載されている固相ペプチド合成法を用いて合成することができる。合成ペプチドは分取高速液体クロマトグラフィーにより精製することができ、その組成はアミノ酸シーケンシングにより確認することができる。

本発明による別のクラスのＣＮＮＭ４阻害剤は、特異的可溶性結合タンパク質を含んでなる。これらの結合タンパク質は、それ自体はＣＮＮＭ４に結合しない。しかしながら、それらはＣＮＮＭ４の関連のある結合部位と複合体を形成することにより、ＣＮＮＭ４がエフェクタータンパク質と相互作用しないようにする。別の実施形態では、前記ＣＮＮＭ４結合阻害剤は、膜結合型受容体のタンパク質分解切断により、または選択的にスプライシングされる受容体ＲＮＡの翻訳により生成される可溶性受容体変異体である。これらの可溶性受容体の多くは、膜結合型の受容体に通常見られる膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを欠いている。

別の特定の実施形態では、ＣＮＮＭ４阻害剤は、ＣＮＮＭ４遺伝子または前記遺伝子の転写産物に特異的に結合して前記遺伝子の発現を遮断する核酸である。

「核酸」は、本明細書で使用する場合、ホスホジエステル結合で互いに連結されたヌクレオチドの生体高分子（ポリヌクレオチド、ポリ核酸）を意味する。核酸のヌクレオチドは、化学的に合成される場合、それに加えてまたはその代わりにホスホロチオエート結合またはホスホロジチオネート結合により連結されてもよい。ヌクレオチドの糖のタイプ（リボースまたはデオキシリボース）によって、リボ核酸（ＲＮＡ）およびデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）の２種類が識別される。本明細書で使用する場合、それは天然または非天然核酸のいずれにも関し、「オリゴヌクレオチド」および「ポリヌクレオチド」は、本発明に関して互換的に使用される。本発明に関して、「天然ヌクレオチド」は、天然源から精製可能なヌクレオチドを意味する。「非天然ヌクレオチド」は、組換え発現系を用いて生産され、場合により精製されたもの、化学的に合成されたものなどと定義される。該当する場合、例えば、化学的に合成された分子の場合、これらの核酸は、ヌクレオシド類似体、例えば、化学的に修飾された塩基または糖、骨格の修飾などを有する類似体を含んでなり得る。核酸配列は、そうではないことが示されない限り５’－３’方向に表される。

ある実施形態において、ＣＮＮＭ４の阻害剤は、アンチセンスポリヌクレオチドである。本明細書で使用される場合、「アンチセンスポリヌクレオチド」は、標的ｍＲＮＡ配列（センス）またはＤＮＡ配列（アンチセンス）に結合し得る一本鎖核酸配列（ＲＮＡまたはＤＮＡ）を含んでなるアンチセンスポリヌクレオチドまたはセンスポリヌクレオチドを指す。好ましい実施形態では、アンチセンスポリヌクレオチドは、アンチセンスＲＮＡである。別の実施形態では、ＣＮＮＭ４の阻害剤は、ＲＮＡ干渉オリゴヌクレオチドである。

別の実施形態では、ＣＮＮＭ４の阻害剤は、ｍｉＲＮＡである。用語「マイクロＲＮＡ」または「ｍｉＲＮＡ」は、遺伝子発現を調節し得る一般に２１～２３ヌクレオチド長前後の短い一本鎖ＲＮＡ分子を指す。ｍｉＲＮＡは、合成物（すなわち、組換え物）であっても天然物であってもよい。天然ｍｉＲＮＡは、ＤＮＡから転写され、一次転写産物からプロセシングを受け（「ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ」）、短いステム－ループ構造（「ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ」）となり、最後に成熟ｍｉＲＮＡとなる遺伝子によりコードされる。成熟ｍｉＲＮＡ分子は、１以上のｍＲＮＡ分子と部分的に相補的であり、ＲＮＡ干渉と同様のプロセスを経て、またはｍＲＮＡの翻訳を阻害することにより遺伝子発現を下方調節する。

別の実施形態では、ＣＮＮＭ４の阻害剤は、ｓｉＲＮＡである。用語「低分子干渉ＲＮＡ」（「ｓｉＲＮＡ」）は、ＲＮＡ干渉経路を誘導する小さな阻害ＲＮＡの二重鎖を指す。低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）は、細胞において、ＲＮアーゼ－ＩＩＩクラスエンドリボヌクレアーゼダイサーによる長いｄｓＲＮＡの酵素的切断によって生成される。ｓｉＲＮＡは、ダイサーにより促進されるプロセスにおけるＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）に関連する。ダイサー基質ＲＮＡｉ法は、ＲＮＡがダイサーによって処理される際に見られるダイサーとＲＩＳＣローディングの間の結合を利用する。従来の２１マーｓｉＲＮＡは、ダイサー産物を模倣してダイサープロセシングの必要を迂回する、化学的に合成されたＲＮＡ二重鎖である。ダイサー基質ＲＮＡは、ダイサープロセシングに最適化された化学的に合成されたＲＮＡ二重鎖である。これらの分子は長さを変更することができ（一般に、１８～３０塩基対）、アンチセンス鎖においてそれらの標的ｍＲＮＡに対する様々な相補性を含む。特定の実施形態では、ＣＮＮＭ４の阻害剤は、ダイサー基質２７マー二重鎖である。

総てではないが一部のｓｉＲＮＡは、センス鎖および／またはアンチセンス鎖の５’または３’末端に対合していないオーバーハング塩基を有する。用語「ｓｉＲＮＡ」は、２つの個々の鎖の二重鎖を含む。本明細書で使用される場合、ｓｉＲＮＡ分子はＲＮＡ分子に限定されないが、モルホリノなどの１以上の化学的に修飾されたヌクレオチドを有する核酸をさらに含む。

好ましい実施形態では、ＣＮＮＭ４阻害剤は、ｓｉＲＮＡである。ｓｉＲＮＡは、ＲＮＡ干渉（ｉＲＮＡ）を媒介する核酸である。特定の実施形態では、ｓｉＲＮＡは、配列番号１３および配列番号１４を有する配列を含んでなる。別の特定の実施形態では、ｓｉＲＮＡは、配列番号１３、配列番号１４、配列番号５０、または配列番号５１の配列のいずれかを含んでなる。別の特定の実施形態では、ｓｉＲＮＡは、好ましくは、配列５’－ＧＣＧＡＧＡＧＣＡＵＧＡＡＧＣＵＧＵＡＵＧＣＡＣＵ－３’（配列番号２５）を標的とする、ヒトＣＮＮＭ４に対する二重鎖ｓｉＲＮＡを含んでなる(Yamazaki D, et al. (2013), PLoS Genet 9(12): e1003983)。さらなる特定の実施形態において、ｓｉＲＮＡは、表１に示される配列番号を有する配列のうち少なくとも１つを含んでなる。これらの配列は、示されているようにマウスＣＮＮＭ４もしくはヒトＣＮＮＭ４のいずれか、または場合によってはマウスＣＮＮＭ４およびヒトＣＮＮＭ４の両方を標的とする。

別の実施形態では、ＣＮＮＭ４の阻害剤は、ｓｈＲＮＡである。本明細書で使用される場合、用語「ｓｈＲＮＡ」または「短鎖ヘアピンＲＮＡ」は、２本の鎖が一方の鎖の３’末端と対応する他方の鎖の５’末端の間のヌクレオチドに干渉しない鎖により結合されて二重鎖構造を形成している二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を指す。ｓｈＲＮＡは、ｓｈＲＮＡはプロセシングされればＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）に位置するようになり、相補配列を有するｍＲＮＡにＲＩＳＣを標的化するため、ＲＮＡ干渉によって標的遺伝子発現をサイレンシングするために使用することができる。ＲＩＳＣは、このｍＲＮＡを切断し得るか、またはその翻訳を抑制し得る。特定の実施形態では、ｓｈＲＮＡは、配列番号５２を有する配列を含んでなる。

別の実施形態では、ＣＮＮＭ４の阻害剤は、ｓｇＲＮＡである。本明細書に開示されるように、シングルガイドＲＮＡ（「ｓｇＲＮＡ」）という用語は、ある遺伝子領域を特異的に認識する標的化配列（ｃｒＲＮＡ配列）とＣＲＩＳＰＲ酵素を含有するキメラノンコーディングＲＮＡを指す。ｃｒＲＮＡ領域は、対象とする遺伝子領域に相同であり、ＣＲＩＳＰＲ酵素活性を命令する２０ヌクレオチドの配列である。本明細書に開示されるように、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、Ｃａｓ９およびＣｐｆ１などの当技術分野で公知のいずれのものであってもよい。

本明細書で開示されるように、ＣＲＩＳＰＲは、ゲノム編集法である。ゲノム編集におけるこの技術の使用は、例えば、米国特許第８，６９７，３５９号および本明細書に引用されている参照文献など、当技術分野で十分に記載されている。簡単に述べると、ＣＲＩＳＰＲは、侵入するファージおよびプラスミドに対する防御に関与する微生物のヌクレアーゼ系である。微生物宿主のＣＲＩＳＰＲ遺伝子座は、ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）遺伝子ならびにＣＲＩＳＰＲにより媒介される核酸切断の特異性をプログラムし得るノンコーディングＲＮＡ要素（ｓｇＲＮＡ）の組合せを含んでいる。広域の細菌宿主で３つのタイプ（Ｉ～ＩＩＩ）のＣＲＩＳＰＲ系が同定されている。各ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座の１つの重要な特徴が、非繰り返し配列（スペーサー）の短いストレッチが挿入された繰り返し配列アレイ（ダイレクトリピート）の存在である。ノンコーディングＣＲＩＳＰＲアレイはダイレクトリピート内で転写および切断されて個々のスペーサー配列を含む短いｃｒＲＮＡとなり、これがＣａｓヌクレアーゼを標的部位（プロトスペーサー）に誘導する。タイプＩＩ ＣＲＩＳＰＲは、より良く特徴付けられた系の１つであり、４つの一連のステップで標的化されたＤＮＡ二本鎖切断を行う。まず、２つのノンコーディングＲＮＡ、ｐｒｅ－ｃｒＲＮＡアレイとｔｒａｃｒＲＮＡがＣＲＩＳＰＲ遺伝子座から転写される。第２に、ｔｒａｃｒＲＮＡがｐｒｅ－ｃｒＲＮＡのリピート領域にハイブリダイズし、ｐｒｅ－ｃｒＲＮＡの、個々のスペーサー配列を含有する成熟ｃｒＲＮＡへのプロセシングを媒介する。第３に、成熟ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ複合体が、ｃｒＲＮＡ上のスペーサーと、標的認識にさらに必要とされるプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）に隣接する標的ＤＮＡ上のプロトスペーサーとの間のワトソン・クリック塩基対合により、標的ＤＮＡにＣａｓ９を誘導する。最後に、Ｃａｓ９が標的ＤＮＡの切断を媒介してプロトスペーサー内に二本鎖切断を作り出す。

従来の遺伝子ターゲティングおよびその他のプログラム可能なエンドヌクレアーゼと比較した場合のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９系の１つの主要な利点は、多重化が容易なことであり、それぞれ異なる遺伝子を標的とする複数のｓｇＲＮＡを用いることで複数の遺伝子を同時に簡単に変異させることができる。さらに、あるゲノム領域を挟み込む２つのｓｇＲＮＡを使用すれば、間の切片を欠失または逆転させることができる。

よって、Ｃａｓ９は、タイプＩＩ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系の特徴的なタンパク質であり、２つのノンコーディングＲＮＡ：ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）とトランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）の複合体により、ＰＡＭ（プロトスペーサー隣接モチーフ）配列モチーフに隣接するＤＮＡ標的配列に誘導される大きな単量体ＤＮＡヌクレアーゼである。Ｃａｓ９タンパク質は、ＲｕｖＣヌクレアーゼおよびＨＮＨヌクレアーゼに相同な２つのヌクレアーゼドメインを含む。ＨＮＨヌクレアーゼドメインは相補的ＤＮＡ鎖を切断し、一方、ＲｕｖＣ様ドメインは非相補鎖を切断し、結果として、平滑切断が標的ＤＮＡに導入される。Ｃａｓ９をｓｇＲＮＡとともに異種発現させれば、様々な生物からの生細胞のゲノムＤＮＡに部位特異的二本鎖切断（ＤＳＢ）を導入することができる。真核生物に適用するためには、ストレプトコッカス・ピオゲネス(Streptococcus pyogenes)に起源するＣａｓ９の、コドンの最適化を行った変種が使用されているが、代わりにスタフィロコッカス・アウレウス(Staphylococcus aureus)Ｃａｓ９（ＳａＣａｓ９）、カンピロバクター・ジェジュニ(Campylobacter jejuni)Ｃａｓ９（ＣｊＣａｓ９）などの他の好適なＣａｓ９オーソログを使用することもできる。

シングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）は、Ｃａｓ９ヌクレアーゼと複合体を形成するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系の第２の成分である。ｓｇＲＮＡは、ｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡを融合させることによって作出された合成ＲＮＡキメラである。その５‘末端に位置するｓｇＲＮＡガイド配列は、ＤＮＡに標的特異性を付与する。よって、ガイド配列を改変することにより、異なる標的特異性を有するｓｇＲＮＡを作出することができる。ガイド配列のカノニカルな長さは２０ｂｐである。植物において、ｓｇＲＮＡは、Ｕ６およびＵ３などの植物ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターを用いて発現されたものである。

本発明の方法において使用するためのＣａｓ９発現プラスミドは、当技術分野で記載されている通りに構築することができる。

「ｃｒＲＮＡ」またはＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡは、プロトスペーサーエレメントとｔｒａｃｒＲＮＡに相補的な付加的ヌクレオチドを含むＲＮＡ配列を意味する。

「ｔｒａｃｒＲＮＡ」（トランス活性化ＲＮＡ）は、ｃｒＲＮＡにハイブリダイズし、Ｃａｓ９などのＣＲＩＳＰＲ酵素に結合し、それによりヌクレアーゼ複合体を活性化して、ゲノム配列内の、アルファ－、ガンマ－および／またはオメガグリアジンのうち少なくとも１つの特異的部位に二本鎖切断を導入するＲＮＡ配列を意味する。

「プロトスペーサーエレメント」は、ゲノムＤＮＡ標的配列（通常、２０ヌクレオチド長前後）に相補的なｃｒＲＮＡ（またはｓｇＲＮＡ）の一部を意味する。これはスペーサーまたは標的配列としても知られ得る。

「ｓｇＲＮＡ」（シングルガイドＲＮＡ）は、好ましくは、リンカーループ（ｔｒａｃｒＲＮＡとｃｒＲＮＡをつないで単一の分子とする）も含む、ｔｒａｃｒＲＮＡとｃｒＲＮＡの単一のＲＮＡ分子としての組合せを意味する。「ｓｇＲＮＡ」は「ｇＲＮＡ」と呼ばれることもあり、本明細書では、これらの用語は互換的である。ｓｇＲＮＡまたはｇＲＮＡは、標的特異性とＣａｓヌクレアーゼに対する足場／結合能の両方を提供する。ｇＲＮＡは、ｃｒＲＮＡ分子とｔｒａｃｒＲＮＡ分子を含んでなる二重ＲＮＡ分子を指し得る。ｓｇＲＮＡは、ＲＮＡ分子としてまたは機能的ｓｇＲＮＡへと転写されるＤＮＡ分子として提供することができる。

「ＣＲＩＳＰＲ酵素」は、ＣＲＩＳＰＲ系に関連し得るＲＮＡガイドＤＮＡエンドヌクレアーゼを意味する。特に、このような酵素は、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列に結合する。一実施形態では、ＣＲＩＰＳＲ酵素は、Ｃａｓタンパク質（「ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質」）、好ましくは、Ｃａｓ９またはＣｐｆ１である。

別の実施形態では、ＣＮＮＭ４の阻害剤は、アプタマーである。本明細書で使用される場合、用語「アプタマー」は、標的リガンドと選択的に結合するが、その後の化学反応を触媒しないオリゴヌクレオチドを意味する。用語「ペプチドアプタマー」は、タンパク質スキャフォールドと両末端で付着し、特定の標的分子に結合する短い可変ペプチドドメインを指す。可変ループ長は一般に１０～２０のアミノ酸から構成され、スキャフォールドは、良好な溶解度および稠密特性を有するいずれのタンパク質であってもよい。用語「核酸アプタマー」または「ＤＮＡアプタマー」は、本明細書で使用する場合、特定の分子標的と結合するように反復選択により操作された短いＤＮＡ鎖を指す。

別の実施形態では、ＣＮＮＭ４の阻害剤は、ＤＮＡザイムである。本明細書で使用される場合、用語「ＤＮＡザイム」は、特定の化学反応を実行することができる、通常は触媒性のＤＮＡオリゴヌクレオチドを指す。

別の実施形態では、ＣＮＮＭ４の阻害剤は、リボザイムである。本明細書で使用される場合、用語「リボザイム」または「ＲＮＡ酵素」または「触媒ＲＮＡ」は、化学反応を触媒するＲＮＡ分子を指す。リボザイムは、他のＲＮＡ中のホスホジエステル結合を加水分解するために使用され得る。ＣＮＮＭ４の発現を阻害する能力を有する核酸は、核酸塩基に、糖に、および／またはヌクレオチド間結合に１以上の修飾を含み得る。

別の実施形態では、ＣＮＮＭ４の阻害剤は、三重鎖形成性オリゴヌクレオチドである。本明細書で使用される場合、用語「三重鎖形成性オリゴヌクレオチド（ＴＦＯ）」は、水素結合の形成を介して配列特異的に二重鎖ＤＮＡの主溝内に結合する、三重鎖を形成することができるオリゴヌクレオチドである。従前に記載した総ての阻害剤は１以上の修飾を受け得る。核酸骨格の１以上の残基に対する修飾は、以下のうち１以上を含んでなり得る：２’－Ｏ－メチル（２’－ＯＭｅ）、２’－Ｏ－メトキシエチル（２’－ＭＯＥ）、２’－Ｏ－メトキシエトキシ、２’－フルオロ（２’－Ｆ）、２’－アリル、２’－Ｏ－［２－（メチルアミノ）－２－オキソエチル］、２’－Ｏ－（Ｎ－メチルカルバメート）などの２’における糖の修飾；４’－チオ、４’－ＣＨ２－Ｏ－２’橋、４－（ＣＨ２）２－Ｏ－２’橋を含む４’における糖の修飾；ロックド核酸（ＬＮＡ）；ペプチド核酸（ＰＮＡ）；インターカレート核酸（ＩＮＡ）；ツイストインターカレート核酸（ＴＩＮＡ）；ヘキシトール核酸（ＨＮＡ）；アラビノ核酸（ＡＮＡ）；シクロヘキセン核酸（ＣＮＡ）；シクロヘキセニル核酸（ＣｅＮＡ）；トレオース核酸（ＴＮＡ）；モルホリンオリゴヌクレオチド；ギャップマー；ミックスマー；アルギニンリッチペプチドの組み込み；合成ＲＮＡへの５’－リン酸の付加；ＲＮＡアプタマー（(Que-Gewirth NS, Gene Ther. 2007 Feb;14(4):283-91)；特定のＲＮＡアプタマーの対象における解毒剤により制御されるＲＮＡアプタマー（Oney S, Oligonucleotides. 2007 Fall; 17(3):265-74参照））、またはそれらの任意の組合せ。

核酸の１以上のヌクレオシド結合の修飾は、以下のうち１以上を含んでなり得る：ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホルアミデート、ホスホロジアミデート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレノエート、ホスホロジセレノエート、ホスホロアニロチオエート、およびホスホロアニリデート、またはそれらの任意の組合せ。

一般に接近不能ＲＮＡとも呼ばれるロックド核酸（ＬＮＡ）は、修飾されたＲＮＡヌクレオチドである。ＬＮＡヌクレオチドのリボース基は、炭素２’と４’を連結する余分な橋（Ｏ２’、Ｃ４’－メチレン橋）で修飾される。この橋はリボースを３’エンド型立体配座に「ロック」し、これは通常Ａ型のＤＮＡまたはＲＮＡに見られる。ＬＮＡヌクレオチドは、所望により核酸中にＤＮＡ塩基またはＲＮＡ塩基と混在させることもできる。このようなオリゴマーは市販されている。

ペプチド核酸（ＰＮＡ）は、骨格が、ペプチド結合により連結されたＮ－（２－アミノエチル）－グリシンの繰り返し単位から構成される、人工的に合成されたポリマーである。種々のプリン塩基およびピリミジン塩基がメチレン－カルボニル結合により骨格に連結される。

インターカレート核酸（ＩＮＡ）は、疎水性挿入に共有結合された通常のデオキシリボヌクレオチドを含んでなる修飾された核酸類似体である。

ヘキシトール核酸（ＨＮＡ）は、天然の核酸塩基とリン酸化された１，５－アンヒドロヘキシトール骨格により形成されたヌクレオチドである。ＨＮＡとＲＮＡの間の分子会合は、ＨＮＡとＤＮＡの間および天然核酸間の分子会合（ｄｓＤＮＡ、ｄｓＲＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡ）よりも安定である。他の合成的に修飾されたオリゴヌクレオチドは、ＡＮＡ（アラビノ核酸）、ＣＮＡ（シクロヘキセン核酸）、ＣｅＮＡ（シクロヘキセニル(cyclohenexyl)核酸）、およびＴＮＡ（トレオース核酸）を含んでなる。

モルホリノは、天然核酸構造を再設計する産物である合成分子である。構造的には、モルホリノとＤＮＡまたはＲＮＡとの違いは、モルホリノは標準的な核酸塩基を有するが、その塩基はデオキシリボース／リボース環ではなく６員のモルホリン環に連結され、サブユニット間の非イオン性ホスホロジアミデート結合は陰イオン性ホスホジエステル結合に置き換わっていることである。モルホリノは、ＰＭＯ（ホスホロジアミデートモルホリノオリゴヌクレオチド）と呼ばれることがある。６員モルホリン環は、化学式Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２）２ＮＨを有する。

ギャップマーすなわち「ギャップを有するオリゴマー化合物」は、通常のまたは修飾されたＲＮＡオリゴヌクレオチドに、「ウイング」として知られるＤＮＡウィンドウまたはギャップが挿入されたＲＮＡ－ＤＮＡ－ＲＮＡキメラオリゴヌクレオチドプローブである。この修飾はイン・ビボにおけるオリゴヌクレオチドの安定性を高め、プローブを標的とより相互作用しやすくし、これにより、より短いプローブが効果的に使用され得る。好ましくは、これらのウイングは、内部ブロックをヌクレアーゼ分解から保護する、修飾された２’－Ｏ－メチル（ＯＭｅ）または２’－Ｏ－メトキシエチル（ＭＯＥ）オリゴヌクレオチドである。さらに、ギャップまたはウイングを形成するヌクレオチドは、ホスホジエステル結合またはホスホロチオエート結合により連結可能であり、それにより、それらをＲＮアーゼ分解に耐性とする。さらに、ウイングを形成するヌクレオチドはまた、３’－メチルホスホネート結合により連結された塩基の組み込みにより修飾することもできる。

別の実施形態では、ＣＮＮＭ４の阻害剤は小分子である。本明細書で使用される場合、用語「小分子」は、生物学的プロセスを調節することができる低分子量（＜９００ダルトン）の有機化合物を指す。小分子はタンパク質の特定の機能を阻害することができる、またはタンパク質－タンパク質相互作用を破壊することができる。好ましい実施形態では、小分子は、７－アミノ－２－フェニル－５Ｈ－チエノ［３，２－ｃ］ピリジン－４－オン（PubChem CID 91383855）またはPark, H., et al. 2008. Bioorg Med Chem Lett. 18(7):2250-5 (Chemspider ID 1014170)に記載されているような２－［５－（４－オキソ－２－チオキソ－チアゾリジン－５－イリデンメチル）－フラン－２－イル］－安息香酸として知られるロダニン誘導体である。

別の実施形態では、ＣＮＮＭ４の阻害剤は、上述の阻害剤の任意の組合せである。

本明細書で使用する場合、用語「治療」は、本明細書に記載されるような病態の終息、予防、改善および／または感受性の軽減を目的とするいずれのタイプの療法も含んでなる。よって、「治療」は、本明細書で使用する場合、ヒトを含む哺乳動物の病状または障害のいずれの治療も包含して、所望の薬理学的および／または生理学的効果を得ることを指す。効果は、障害またはその症状を完全にもしくは部分的に防止するという点で予防的であってもよく、および／または、障害および／またはその障害に起因し得る有害作用の部分的もしくは完全な治癒という点で治療的であってもよい。それは哺乳動物、特にヒトにおいて疾患におけるいずれの治療も包含し、（ａ）生存期間を延長すること；（ｂ）疾患による死亡リスクを軽減すること；（ｃ）疾患素因を持つ可能性があるがそれに罹患しているとはまだ診断されてない対象において疾患が生じないように予防すること；（ｄ）疾患を阻害すること、すなわち、その発症を止めること（例えば、疾患の進行速度を引き下げること）；および（ｅ）疾患を緩和すること、すなわち、疾患を退縮させることを含む。

本明細書で使用する場合、「疾患」は、正常な機能を損ない、一般に徴候および症状の鑑別により証明される、生きている動物またはその部分の１つの状態を意味する。好ましい実施形態の動物は、哺乳動物、好ましくは、ヒトである。

本明細書で使用する場合、「急性疾患」は、重篤で発症が突然である病態を意味する。

本明細書で使用する場合、「慢性疾患」は、長期にわたって発症する病態を意味する。急性疾患は、慢性疾患に至ることがある。

用語「対象」、「患者」または「個体」は、本明細書では、動物界のいずれのメンバーも指して互換的に使用され、哺乳動物、魚類、鳥類、爬虫類、または両生類などの脊椎動物であり得、ヒト、非ヒト霊長類、ウマ、ブタ、ウサギ、イヌ、ヒツジ、ヤギ、ウシ、ネコ、モルモットまたは齧歯類を含む。好ましくは、対象は、哺乳動物、より好ましくは、ヒトである。

本発明によれば、疾患は、肝疾患、腎疾患および肺疾患からなる群から選択される。一実施形態では、疾患は、非増殖性疾患である（すなわち、疾患は癌以外の疾患である）。

本明細書で使用する場合、「肝疾患」は、通常、感染、傷害、薬物または毒性化合物への曝露、アルコール、食物中の不純物、および血中の通常の物質の異常な増加、自己免疫プロセス、または遺伝子欠陥（ヘモクロマトーシスなど）により引き起こされる肝臓に対する急性損傷または慢性損傷である。傷害の正確な原因はわからない場合がある。肝疾患は、疾患の持続期間に基づいて急性肝疾患または慢性肝疾患として分類することができる。急性肝炎および急性肝不全（ＡＬＦ）などの急性肝疾患では、病歴は６か月を超えない。それより長い持続期間の肝疾患は、慢性肝疾患として分類される。一般的な肝疾患の限定されない例としては、肝硬変、肝線維症、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、肝虚血性再潅流傷害、原発性胆汁性肝硬変（ＰＢＣ）、ならびにウイルス性肝炎およびアルコール性肝炎を含む肝炎が挙げられる。最も多い形態のウイルス性肝炎は、Ｂ型肝炎およびＣ型肝炎（それぞれＨＢＶおよびＨＣＶ）である。慢性肝炎は、肝硬変を招くことがある。アポトーシスとして知られるプロセスによる肝細胞の死滅が総ての形態の肝疾患で一般的である。肝細胞のアポトーシスは、肝線維症およびその他の肝疾患につながる。

肝疾患、特に、薬物により引き起こされる肝疾患（薬物性肝障害またはＤＩＬＩ）は、それ自体、特定の情報が得られないなどの、臨床上多様な症状で発現する。症状の限定されない例としては、食欲不振、倦怠感、めまい、体重減少、悪心、嘔吐、発熱、右上腹部領域痛、関節痛、筋肉痛、そう痒、発疹、排泄物の変色が挙げられ、目および皮膚の黄疸が含まれる。

本分野の専門家が知るように、活動性肝疾患の存在は、しばしば、血中の酵素レベルの増加の存在によって検出される。特に、臨床上許容される正常範囲を超えるＡＬＴ（アラニンアミノトランスフェラーゼ）およびＡＳＴ（アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ）の血中レベルは、進行中の肝損傷の指標であることが知られている。医学的処置の間に肝疾患の進行を評価するためには、肝疾患患者をＡＬＴおよびＡＳＴの血中レベルに関して定期的に経過観察することが臨床的に使用される。増加していたＡＬＴおよびＡＳＴが許容される正常範囲に下がることが、患者の進行中の肝損傷の重症度の軽減を反映する臨床エビデンスと考えられる。特定の実施形態では、肝疾患は、いずれかの種類の肝損傷によって引き起こされる。

用語「肝損傷」は、本明細書で使用する場合、慢性および急性外傷ならびに肝細胞または肝組織に存在する病的変化を含む、いずれの種類の肝外傷（傷害）も表して使用される。肝損傷の病態には、限定されるものではないが、肝細胞の変性、肝臓の血管炎、肝臓に存在する単状壊死もしくは局部壊死、肝臓および門脈域における炎症細胞浸潤もしくは線維芽細胞増殖、または肝腫大、および肝硬変、重度肝損傷から生じる肝細胞腫などを含み得る。肝疾患は肝臓に対する傷害から生じる。肝臓の傷害は、アルコール、数種の薬物、食物中の不純物、血中の通常の物質の異常な増加を含む毒素によるか、感染によるかまたは自己免疫障害により引き起こされ得る。場合によっては、肝臓に対する傷害から生じる肝損傷には、限定されるものではないが、脂肪肝、肝硬変、原発性胆汁性肝硬変、原発性硬化性胆管炎、およびアルファ１アンチトリプシン欠乏症が含まれる。肝損傷には、限定されるものではないが、肝硬変、肝線維症、非アルコール性脂肪性疾患（ＮＡＦＬＤ）、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、肝虚血性再潅流傷害、ウイルス肝炎およびアルコール性肝炎を含む肝炎、ならびに原発性胆汁性肝硬変（ＰＢＣ）が含まれる。

好ましい実施形態では、肝疾患は、肝線維症、静脈閉塞性肝疾患、薬物性肝障害（ＤＩＬＩ）、脂肪症、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、肝硬変、肝細胞癌（ＨＣＣ）、バッド・キアリ症候群および肝炎、またはそれらの組合せから選択される。より好ましい実施形態では、肝疾患は、肝線維症、静脈閉塞性肝疾患、薬物性肝障害（ＤＩＬＩ）、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、肝硬変、肝細胞癌（ＨＣＣ）、バッド・キアリ症候群および肝炎、またはそれらの任意の組合せから選択される。より好ましい実施形態では、肝疾患は、薬物性肝障害（ＤＩＬＩ）、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、肝硬変、肝細胞癌（ＨＣＣ）またはそれらの任意の組合せから選択される。より好ましい実施形態では、肝疾患は、薬物性肝障害（ＤＩＬＩ）、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、肝硬変またはそれらの任意の組合せから選択される。

本明細書で使用する場合、「線維化」は、修復プロセスまたは反応性プロセスの臓器または組織における過剰な繊維性結合組織の形成である。これは反応性、良性、または病的状態であり得る。傷害に応答する場合、これは瘢痕化と呼ばれ、線維化が単細胞系統から生じる場合には、これは線維腫と呼ばれる。生理学的には、線維化は結合組織を沈着させる働きをし、これは基礎にある臓器または組織の構造および機能に干渉し、または全面的に阻害することがある。線維化は、線維組織の過剰な沈着の病的状態、ならびに治癒における結合組織沈着のプロセスを表すために使用され得る。細胞外マトリックス（ＥＣＭ）タンパク質の病的蓄積により定義される場合、線維化は罹患組織の瘢痕化および肥厚をもたらし、それは本質的に、正常な臓器機能に干渉する誇大な創傷治癒応答である。線維化はいずれの臓器も侵し得る。好ましい実施形態では、線維化は肝線維症である。

本明細書で使用する場合、「肝線維症」は、傷害に対する肝臓の応答に相当する瘢痕化プロセスである。皮膚および他の臓器がコラーゲンおよび他のマトリックス成分の沈着により創傷を治癒するのと同様に、肝臓も新たなコラーゲンの沈着によって傷害を修復する。肝線維症は、肝臓の瘢痕化の最初の段階である。その後、肝臓のより多くの部分が瘢痕化すれば、それは肝硬変に至り得る。

本明細書で使用する場合、「静脈閉塞性肝疾患」または「肝類洞閉塞症候群（ＳＯＳ）」は、肝腫大、右上腹部痛、黄疸、および腹水を特徴とし、最も頻繁には造血細胞移植（ＨＣＴ）を受けている患者に、および多くはないが、非移植状態である種の化学療法薬の使用の後、アルカロイド毒素の経口摂取、高線量放射線療法の後、または肝臓移植で見られる。ＳＯＳにおける肝静脈流出障害は、末端肝細静脈および肝類洞の閉塞によるものである。

本明細書で使用する場合、「薬物性肝障害（ＤＩＬＩ）」は、１以上の薬物の使用の後に発生する肝臓に対する傷害を意味する。

本明細書で使用する場合、「脂肪症」は、脂肪変化とも呼ばれ、細胞内の脂質の異常な保持を表すプロセスである。それはトリグリセリド脂肪の合成および排出の正常なプロセスの障害を反映する。過剰な脂質が小胞に蓄積し、細胞質に取って代わる。小胞が核を歪ませるに十分大きければ、その状態は大滴性脂肪症として知られ、そうでなければ、その状態は小滴性脂肪症として知られる。軽傷では細胞に特に有害ではなく、大きな蓄積は細胞成分を破壊し、重症では、細胞はバーストさえすることがある。脂肪症に関連するリスク因子は様々であり、糖尿病、タンパク質栄養不良、高血圧症、細胞毒素、肥満、無酸素症、および睡眠時無呼吸が含まれる。肝臓は脂質代謝の主要な臓器であるので、ほとんどの場合脂肪症に関連するが、いずれの臓器でも、一般には腎臓、心臓、および筋肉で生じ得る。好ましい実施形態では、脂肪症は肝臓において引き起こされる。

本明細書で使用する場合、「非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）」は、飲酒しない患者に発症する症候群であり、それはアルコール性肝炎と組織学的に識別できない肝損傷を引き起こす。それはほとんどの場合、以下のリスク因子：肥満、異脂肪血症、およびグルコース不耐性のうち少なくとも１つを有する患者で発症する。病因は十分に理解されていないが、インスリン抵抗性（例えば、肥満または代謝症候群）に関連すると思われる。ほとんどの患者は無症候である。検査所見として、アミノトランスフェラーゼレベルの増加が含まれる。診断を確定するためには生検が必要とされる。

本明細書で使用する場合、「肝硬変」は、肝構造の歪みおよび再生結節の形成を特徴とする後期の進行性肝線維化を意味する。肝硬変は一般にその進行した段階では不可逆的であると考えられ、その時点での唯一の治療選択は肝移植となり得る。肝硬変の回復（その初期の場合）は、基礎にある原因の処置後にいくつかの形態の肝疾患で可能である。肝硬変患者は様々な合併症を受けやすく、患者の余命は通常著しく下がる。

本明細書で使用する場合、「肝細胞癌（ＨＣＣ）」は、慢性肝疾患および肝硬変の状況でしばしば見られる侵襲性腫瘍である。ＨＣＣは一般に、その経過において後に診断され、診断後の生存期間中央値はおよそ６～２０か月である。治療の中心は外科的切除であるが、大多数の患者は腫瘍範囲または基礎にある肝不全のために適格でない。

本明細書で使用する場合、「バッド・キアリ症候群」（ＢＣＳ）は、閉塞のレベルまたは機序によらず肝静脈流出路閉塞と定義され、ただし、その閉塞は心疾患、心膜疾患、または類洞閉塞症候群（静脈閉塞性疾患）によるものではない。原発性バッド・キアリ症候群は、主として静脈プロセス（血栓症または静脈炎）による閉塞がある場合に存在し、一方、続発性バッド・キアリは、静脈外に起源する病変（例えば、悪性腫瘍）による肝静脈および／または下大静脈の圧迫または浸潤がある場合に存在する。

本明細書で使用する場合、「肝炎」は、原因によらず肝臓の炎症を意味する。肝炎は、薬物毒性、免疫疾患、およびウイルスを含むいくつかの状態によって引き起こされ得る。肝炎は、黄疸、肝肥大、および発熱を特徴とする。

本明細書で使用する場合、「腎疾患」は、腎臓に対する急性損傷または慢性損傷である。外因子、内因子、遺伝的因子などを含む様々な理由のために腎臓に生じる疾患を指す。腎疾患の限定されない例には、腎炎、ネフローゼ、腎線維化、菲薄糸球体基底膜（ＴＧＢＭ）、微小変化疾患（ＭＣＤ）、膜性糸球体腎炎（ＭＧＮ）、巣状分節性糸球体硬化症（ＦＳＧＳ）、ＤＭ腎症、ＩｇＡ腎症（ＩｇＡＮ）、尿細管間質性腎炎（ＴＩＮ）、ヘノッホ－シェンライン紫斑病（ＨＳＰ）腎炎、急性尿細管傷害、ＢＫウイルス腎症、急性細胞性拒絶反応、慢性抗体関連型拒絶、慢性活動性抗体関連型拒絶反応、慢性カルシニュリン阻害薬毒性、急性腎障害、慢性腎疾患、虚血性腎疾患、糸球体腎炎、狼瘡腎炎、多発性嚢胞腎疾患、腎盂腎炎、腎結石、腎結核、腎腫瘍、慢性腎不全、末期腎不全、敗血症、肝傷害により引き起こされる腎傷害などが含まれる。

好ましい実施形態では、腎疾患は、急性腎障害（ＡＫＩ）、慢性腎疾患、腎炎、ネフローゼおよび腎線維症から選択される。

本明細書で使用する場合、「急性腎障害（ＡＫＩ）」または「急性腎不全（ＡＲＦ）」は、７日以内に発症する腎機能の突然の喪失である。非限定的な原因としては、いずれかの原因（例えば、低血圧）からの腎血流の減少（腎虚血）により引き起こされる腎組織の損傷、腎臓に有害な物質への曝露、腎臓内の炎症プロセス、または尿流を妨げる尿路の閉塞が含まれる。ＡＫＩは、血中尿素窒素およびクレアチニンの増加、または腎臓が十分な量の尿を産生できないことなどの特徴的な検査所見に基づいて診断される。ＡＫＩは、代謝性アシドーシス、高カリウムレベル、尿毒症、体液バランスの変化、および他の臓器系に及ぼす影響（死亡を含む）を含むいくつかの合併症をもたらし得る。ＡＫＩを受けた患者は、将来に慢性腎疾患の高いリスクを有し得る。

本明細書で使用する場合、「慢性腎疾患（ＣＤＫ）」は、何ヶ月または何年という期間にわたって腎機能の段階的喪失が見られる腎疾患の一種を意味する。初期では一般に無症状である。その後、下肢の腫脹、倦怠感、嘔吐、食欲不振、または錯乱が生じることがある。合併症としては、心疾患、高血圧、骨疾患、または貧血を含み得る。慢性腎疾患の非限定的な原因としては、糖尿病、高血圧、糸球体腎炎、および多発性嚢胞腎疾患が含まれる。リスク因子としては、この病態の家族歴が含まれる。診断は一般に、糸球体ろ過速度を測定するための血液検査およびアルブミンを測定するための尿検査による。基礎にある原因を決定するためには超音波または腎臓生検などのさらなる検査を行えばよい。

本明細書で使用する場合、「腎炎」は、腎臓の炎症を意味し、糸球体、尿細管、または糸球体および尿細管の周囲の間質組織を含み得る。非限定的な原因としては、感染、毒素および自己免疫障害が含まれる。腎炎としては、糸球体腎炎（糸球体の炎症）および間質性腎炎または尿細管間質性腎炎（腎尿細管の間隙の炎症）が含まれる。

本明細書で使用する場合、「ネフローゼ」は、腎臓尿細管のいずれの変性疾患も意味する。ネフローゼは腎疾患により引き起こされる場合があり、または別の障害、特に、糖尿病の合併症である場合もある。診断は、タンパク質の存在を調べる尿検査、正常より低レベルのタンパク質を調べる血液検査および浮腫の診察によってなされる。

好ましい実施形態では、線維化は、腎線維症である。本明細書で使用する場合、「腎線維症」は、腎臓を侵す線維化を意味する。

本明細書で使用する場合、「呼吸器系疾患」は、高等生物においてガス交換を可能とする臓器および組織を侵すいずれの病状も意味し、上気道、気管、気管支、細気管支、肺胞、胸膜および胸腔、ならびに呼吸の神経および筋肉の病態を含む。

本明細書で使用する場合、「肺疾患」は、肺を侵すいずれの呼吸器系疾患でもある。肺疾患は、肺に対する急性損傷または慢性損傷であり得る。肺疾患の限定されない例としては、喘息、慢性閉塞性肺疾患、慢性気管支炎または急性気管支炎、嚢胞性線維症気腫、急性呼吸窮迫症候群、細菌性肺炎、結核肺塞栓および肺癌が含まれる。

好ましい実施形態では、肺疾患は肺線維症である。本明細書で使用する場合、「肺線維症」は、肺組織に瘢痕が形成されて呼吸障害に至る呼吸器系疾患を意味する。過剰な線維性結合組織の蓄積（線維化と呼ばれるプロセス）である瘢痕形成は壁の肥厚をもたらし、血中への酸素供給の減少を引き起こす。結果として、患者は息切れに苦しむ。肺線維症の症状としては、息切れ、慢性的な渇き、空咳、倦怠感および虚弱、胸痛を含む胸部不快感、食欲不振および急速な体重減少が含まれる。本明細書で開示されるように、肺線維症は、他の疾患の二次的な影響、ならびに／または、鼻腔内投与および経口吸入投与など、肺への治療薬の全身送達および局所送達のための非侵襲的投与を含んでなる特定の処置の二次的な影響である場合もある。二次的な影響としての肺線維症を引き起こし得る疾患および病態の非限定的な例としては、石綿肺における金属、ケイ肺症および特定のガスへの曝露などの環境性および職業性汚染物質の吸入；過敏性肺炎（ほとんどの場合、細菌、真菌、または動物産物で汚染された塵埃の吸入から起こる）；喫煙；関節リウマチ、全身性紅斑性狼瘡（ＳＬＥ）および硬皮症、多発血管炎を伴う類肉腫症および肉芽腫などのいくつかの結合組織疾患；感染症；特定の投薬、例えば、アミオダロン、ブレオマイシン（ピンジャングマイシン）、ブスルファン、メトトレキサート、アポモルフィンおよびニトロフラントイン；胸部への放射線療法が含まれる。

特定の実施形態では、本発明の使用のためのＣＮＮＭ４阻害剤は、医薬組成物の一部として投与することができ、ここで、ＣＮＮＭ４阻害剤は、薬学上許容される賦形剤とともに投与される。よって、本発明は、医療において（すなわち、治療として）使用するための、本明細書に記載されるようなＣＮＮＭ４阻害剤と薬学上許容される賦形剤を含んでなる医薬組成物に関する。本発明はさらに、対象における急性疾患または慢性疾患の治療において使用するための、本明細書に記載されるようなＣＮＮＭ４阻害剤と薬学上許容される賦形剤を含んでなる医薬組成物に関し、ここで、前記疾患は、好ましくは、肝疾患、腎疾患および肺疾患からなる群から選択される。

「医薬組成物」は、本明細書で使用する場合、生理学的に忍容され、ヒトまたは動物に投与した場合にアレルギー反応、または胃障害、めまいなどの類似の不利な反応を一般に生じない組成物および分子実体に関する。好ましくは、用語「薬学上許容される」とは、それが州政府もしくは連邦政府の規制当局により承認されているか、または、動物、より詳しくは、ヒトにおいて使用するために米国薬局方または他の一般に認知されている薬局方に収載されていることを意味する。

用語「賦形剤」は、有効成分とともに投与されるビヒクル、希釈剤またはアジュバントを指す。このような医薬賦形剤は、水、ならびに落花生油、大豆油、鉱油、ゴマ油および類似のものなどの石油起源、動物起源、植物起源または合成起源のものを含む油といった無菌の液体であり得る。水または生理食塩水ならびにデキストロースおよびグリセロール水溶液は、特に、注射用溶液にビヒクルとして好ましく使用される。好適な医薬ビヒクルは、E.W. Martin, 第21版, 2005による"Remington's Pharmaceutical Sciences"または"Handbook of Pharmaceutical Excipients", Rowe C. R.; Paul J. S.; Marian E. Q., 第6版に記載されている。

上記で定義されるような阻害剤の適当な量は、医療において使用するため、特に、肝疾患、腎疾患および／または肺疾患の治療において使用するための医薬組成物を得るために、薬学上許容される賦形剤および／または担体とともに調剤することができる。

好適な薬学上許容されるビヒクルとしては、例えば、水、塩溶液、アルコール、植物油、ポリエチレングリコール、ゼラチン、ラクトース、アミロース、ステアリン酸マグネシウム、タルク、界面活性剤、ケイ酸、粘稠パラフィン、芳香油、脂肪酸のモノグリセリドおよびジグリセリド、脂肪酸エステル、石油、ヒドロキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドンなどが含まれる。

上記で定義されるような阻害剤を含んでなる医薬組成物は、選択される投与経路、例えば、全身投与（例えば、静脈内、皮下、筋肉内注射）、経口投与、非経口投与または局所投与（そのためにこの医薬組成物は、所望の投与方法の調剤に必要な薬学上許容される賦形剤を含む）に適当であると考えられるいずれかの投与剤形で存在し得る。加えて、上記で定義されるような阻害剤を含んでなる組成物を鼻腔内または舌下に投与することも可能であり、これにより非侵襲性の投与様式により全身投与が可能である。また、心室内投与も妥当であり得る。好ましい実施形態では、投与経路は静脈内経路である。別の好ましい実施形態において、投与経路は皮下経路である。

必要であれば、本発明の使用のための阻害剤は、可溶化剤および注射部位の疼痛を改善するための局所麻酔薬も含む組成物内に含まれる。一般に、成分は、単位剤形中に、例えば、有効薬の量を表示したアンプルまたはサシェなどの密封容器内の凍結乾燥粉末または無水濃縮物として、個別にまたは一緒に混合して供給される。組成物が注入により投与される場合には、無菌の製薬等級の水または生理食塩水を含有する注入ボトルで分配することができる。組成物が注射により投与される場合には、投与前に成分が混合できるように無菌の注射水または生理食塩水のアンプルを提供することができる。

静脈内投与以外の場合、組成物は、微量の湿潤剤または乳化剤、またはｐＨ緩衝剤を含有することができる。組成物は溶液、懸濁液、エマルション、ゲル、ポリマー、または徐放性製剤であり得る。組成物は、当技術分野で公知のように、従来の結合剤および担体を用いて調剤することができる。製剤は、医薬の製造に十分確立された機能性を有する不活性担体である、製薬等級のマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどの標準担体を含み得る。様々な送達系が知られており、リポソーム、微粒子、マイクロカプセルなどへの封入を含め、本発明の治療薬を投与するために使用することができる。

経口投与用の固体剤形には、従来のカプセル剤、徐放性カプセル剤、従来の錠剤、徐放性錠剤、チュアブル錠、舌下錠、発泡錠、丸剤、懸濁液、散剤、顆粒およびゲルを含み得る。これらの固体剤形において、有効化合物は、スクロース、ラクトースまたはデンプンなどの少なくとも１つの不活性賦形剤と混合することができる。このような剤形は、通常の実施と同様に、不活性希釈剤以外の付加的物質、例えば、ステアリン酸マグネシウムなどの滑沢剤も含んでなり得る。カプセル剤、錠剤、発泡錠および丸剤の場合、剤形は緩衝剤も含んでなり得る。錠剤および丸剤には腸溶コーティングを提供することができる。

経口投与用の液体剤形には、当技術分野で慣用される水などの不活性希釈剤を含有する薬学上許容されるエマルション、溶液、懸濁液、シロップおよびエリキシル剤を含み得る。これらの組成物はまた、湿潤剤、乳化剤および沈殿防止剤、ならびに甘味剤、香味剤および芳香剤などのアジュバントも含んでなり得る。

注射用製剤、例えば、水性または油性懸濁液、無菌注射剤は、既知の技術に従い、好適な分散剤、湿潤剤および／または沈殿防止剤を用いて調剤され得る。使用可能な許容されるビヒクルおよび溶媒としては、水、リンゲル液および等張性塩化ナトリウム溶液がある。無菌油も溶媒または懸濁媒として慣例的に使用される。

局所投与では、本発明の化合物は、例えば、乳化剤、界面活性剤、増粘剤、着色剤およびそれらの２種類以上の組合せなどの好適な賦形剤を使用する従来の方法に従って調剤され得るクリーム、ゲル、ローション、リキッド、ポマード、噴霧溶液、分散剤、固体バー、エマルション、マイクロエマルションおよび類似のものとして調剤することができる。

加えて、上記で定義されるような阻害剤は、経皮パッチまたはイオン泳動デバイスの形態で投与され得る。好適な経皮パッチは当技術分野で公知である。

いくつかの薬物送達システムが知られ、例えば、リポソーム、マイクロバブル、エマルション、微粒子、マイクロカプセル、陽イオン脂質および類似のものへの封入を含む、上記で定義されるような阻害剤を投与するために使用することができる。陽イオン脂質はまた「双頭型両親媒性化合物(bolaamphiphiles)」または「ｂｏｌａｓ」とも呼ばれ、各末端に正電荷を有する１以上の頭基を有する疎水性の鎖からなる。必要とされる量は単一の単位としてまたは徐放性形態で投与することができる。非侵襲的な特定の処置の限定されない例としては、レンチウイルスおよびアデノウイルスなどの、肺への気道遺伝子送達のためのウイルスベクター、ならびにポリマーに基づくナノテクノロジーの使用が含まれ、これらは吸入により肺へ局所投与することもできる。投与方法は、ネブライザー、定量吸入器、およびドライパウダー吸入器を含む、呼吸器系送達に最も慣用されているデバイスのいずれかを用いるものなど、当技術分野で公知のいずれの技術であってもよい。

徐放性形態ならびにそれらの調製のために適当な材料および方法は、例えば、"Modified-Release Drug Delivery Technology", Rathbone, M. J. Hadgraft, J. and Roberts, M. S. (編), Marcel Dekker, Inc., New York (2002)、"Handbook of Pharmaceutical Controlled Release Technology", Wise, D. L. (編), Marcel Dekker, Inc. New York, (2000)に記載されている。本発明の一実施形態では、本発明による阻害剤の経口投与可能な形態は、少なくとも１つのコーティングまたはマトリックスをさらに含んでなる徐放性形態である。コーティングまたは徐放性マトリックスとしては、限定されるものではないが、天然ポリマー、半合成もしくは合成水不溶性の修飾されたワックス、脂肪、脂肪アルコール、脂肪酸、天然、半合成もしくは合成可塑剤、またはそれらの２種類以上の組合せが含まれる。腸溶コーティングは、例えば、Johnson, J. L., "Pharmaceutical tablet coating", Coatings Technology Handbook (第2版), Satas, D. and Tracton, A. A. (編), Marcel Dekker, Inc. New York, (2001), Carstensen, T., "Coating Tablets in Advanced Pharmaceutical Solids", Swarbrick, J. (編), Marcel Dekker, Inc. New York (2001), 455-468に記載されているように、当業者に公知の従来法を用いて施すことができる。

ある実施形態において、ＣＮＮＭ４阻害剤はｓｉＲＮＡである。ｓｉＲＮＡのイン・ビボ送達法は当技術分野で公知である(Davis, M. E. et al., Nature 2010 April 15; 464(7291): 1067-1070)。

ある実施形態において、ｓｉＲＮＡは、少なくとも１つのリガンドにコンジュゲートする。リガンドは好ましくは、標的細胞の表面に発現される受容体に特異的である。肝細胞に標的化されるｓｉＲＮＡでは、少なくとも１つのリガンドは好ましくは、ＧａｌＮＡｃ誘導体またはＧａｌＮＡｃ誘導体である。

特定の実施形態では、ｓｉＲＮＡは、０．１μｇ／μｌ～２．５μｇ／ｍｌの濃度で使用される。好ましい実施形態では、ｓｉＲＮＡは、少なくとも０．１μｇ／μｌ、少なくとも０．２μｇ／μｌ、少なくとも０．３μｇ／μｌ、少なくとも０．４μｇ／μｌ、少なくとも０．５μｇ／μｌ、少なくとも０．６μｇ／μｌ、少なくとも０．７μｇ／μｌ、少なくとも０．８μｇ／μｌ、少なくとも０．９μｇ／μｌ、少なくとも１μｇ／μｌ、少なくとも、１．１μｇ／μｌ、少なくとも１．２μｇ／μｌ、少なくとも１．３μｇ／μｌ、少なくとも１．４μｇ／μｌ、少なくとも１．５μｇ／μｌ、少なくとも１．６μｇ／μｌ、少なくとも１．７μｇ／μｌ、少なくとも１．８μｇ／μｌ、少なくとも１．９μｇ／μｌ、少なくとも２μｇ／μｌ、少なくとも２．１μｇ／μｌ、少なくとも２．２μｇ／μｌ、少なくとも２．３μｇ／μｌ、少なくとも２．４μｇ／μｌ、少なくとも２．５μｇ／μｌ、またはそれを超える濃度で使用される。別の好ましい実施形態では、ｓｉＲＮＡは、０．７５μｇ／μｌの濃度で使用される。

特定の実施形態では、ｓｉＲＮＡは、０．１～１０ｍｇ／患者キログラムの用量で使用される。好ましい実施形態では、ｓｉＲＮＡは、少なくとも０．１ｍｇ／ｋｇ、少なくとも０．５ｍｇ／ｋｇ、少なくとも１ｍｇ／ｋｇ、少なくとも５ｍｇ／ｋｇ、少なくとも１０ｍｇ／ｋｇの用量で使用される。

好ましい実施形態では、ＣＮＮＭ４阻害剤は、１日１回、１日２回、１日３回またはそれより多い回数で投与される。別の好ましい実施形態では、ＣＮＮＭ４阻害剤は、週１回、週２回、週３回、週４回、週５回、週６回、週７回、またはそれより多い回数で投与される。より好ましい実施形態では、ＣＮＮＭ４阻害剤は、週２回投与される。

あるいは、本発明は、肝疾患、腎疾患および／または肺疾患を治療するための方法であって、本発明によるＣＮＮＭ４阻害剤または医薬組成物を、それを必要とする対象に投与することを含んでなる方法に関する。従前に記載した総ての用語および実施形態は、本発明のこの態様に同等に適用可能である。

あるいは、本発明は、肝疾患、腎疾患および／または肺疾患を治療するための薬剤の製造のための、本発明によるＣＮＮＭ４阻害剤または医薬組成物に関する。従前に記載した総ての用語および実施形態は、本発明のこの態様に同等に適用可能である。

肝疾患、腎疾患または肺疾患の診断方法
別の態様において、本発明は、対象において肝疾患、腎疾患および／または肺疾患を診断するイン・ビトロ方法であって、
（ａ）前記対象由来のサンプルにおいてＣＮＮＭ４の発現レベルを決定すること、および
（ｂ）前記レベルを参照値と比較すること
を含んでなり、
参照値に対する前記サンプル中のＣＮＮＭ４の発現レベルの増加が、前記患者が肝疾患、腎疾患または肺疾患に罹患していることを示す方法に関する。

用語「肝疾患」、「腎疾患」、「肺疾患」、「対象」、「ＣＮＮＭ４遺伝子」および「参照」は、本発明の他の態様に関して従前に定義されている。これらの用語に関する本発明の他の態様の特定の実施形態および好ましい実施形態は総て、この態様に完全に当てはまる。

用語「診断」は、本明細書で使用する場合、対象において可能性のある疾患の決定および／または特定を試みるプロセス、すなわち、診断法と、このプロセスにより達した鑑定、すなわち、診断鑑定の両方を指す。従って、ある個体の病態を、治療および予後に関する医学的判断を下すことを可能とする別個の異なるカテゴリーに分類する試みと見なすこともできる。当業者が理解するように、このような診断は、診断対象の１００％に正確であることが好ましいが、そうでなくてもよい。しかしながら、この用語は、対象の統計的に有意な部分が、ある疾患、本明細書においては、特に、肝疾患、腎疾患または肺疾患に罹患している、またはそれに対して疾病素因があると同定され得ることを必要とする。当業者ならば、周知の種々の統計的評価ツールを用いて、例えば、信頼区間の決定、ｐ値の決定、スチューデントの検定、マン・ホイットニーなどにより、ある集団が統計的に有意かどうかを決定することができる（Dowdy and Wearden, 1983参照）。好ましい信頼区間は、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％＞、少なくとも８０％＞、少なくとも９０％）または少なくとも９５％である。ｐ値は好ましくは、０．０５、０．０２５、０．００１またはそれより低い。用語「診断する」は、本明細書で開示されるように、どの疾患または病態がある人の症状および徴候を説明するかを決定するプロセスを意味する。

特定の実施形態では、本発明の肝疾患、腎疾患または肺疾患を診断する方法は、ＣＮＮＭ４の発現レベルを決定することを含んでなる。ＣＮＮＭ４の発現レベルを決定するための方法は、本明細書の他所に開示されている通りである。好ましい実施形態では、本発明の肝疾患、腎疾患または肺疾患を診断する方法は、ＣＮＮＭ４タンパク質の発現レベルを決定することを含んでなる。より好ましい実施形態において、本発明の肝疾患、腎疾患または肺疾患を診断する方法は、免疫組織化学によりＣＮＮＭ４タンパク質の発現レベルを決定することを含んでなる。

ある実施形態において、ＣＮＮＭ４の発現レベルが参照値に対して増加している場合には、その患者は肝疾患、腎疾患および／または肺疾患に罹患している。ＣＮＮＭ４の発現レベルを決定するための方法は、従前に開示されている。ある実施形態において、ＣＮＮＭ４の発現レベルが参照値に対して少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも１００％、またはそれを超えて増加している場合には、その患者は肝疾患、腎疾患および／または肺疾患に罹患していると診断される。

本明細書で使用する場合、「サンプル」または「生体サンプル」は、対象から単離された生体材料を指す。サンプルは、遺伝子の発現レベルを検出するために好適ないずれの材料も含有し、対象の遺伝物質を含んでなる材料であり得る。生体サンプルは、対象の細胞材料および／または非細胞材料、好ましくは、細胞材料を含んでなり得る。特定の実施形態では、サンプルは、検討下の対象の遺伝物質、例えば、ＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、ＲＮＡ、ｍＲＮＡなどを含んでなる。特定の実施形態では、遺伝物質はＲＮＡである。サンプルは、生体組織または体液、例えば、血液、唾液、血漿、血清、尿、脳脊髄液（ＣＳＦ）、糞便、鼻腔、口内スワブまたは頬咽頭スワブ、検体、生検から得られる検体、およびパラフィン包埋組織サンプル、肝組織、肺組織または腎組織から単離することができる。サンプルを単離するための手順は当業者に周知である。生体サンプルは、ＣＮＮＭ４の発現レベルを検出するために好適ないずれの生体材料も含有することができ、対象からの細胞材料および／または非細胞材料を含んでなり得る。好ましくは、ＣＮＮＭ４の発現レベルの決定に使用されるサンプルは、最小の侵襲的手順を用いて得ることができるサンプルである。好ましい実施形態では、サンプルは、肝、腎および／または肺サンプルまたは生検である。

サンプルを分析する前に、多くの場合、サンプル中に存在する他の分子から決定される分子を分離するために前記サンプルを調製する１以上の操作を行うことが望ましい。特定の実施形態では、これらの分子は核酸、ＤＮＡおよび／またはＲＮＡである。これらのサンプル調製操作には、細胞内材料（例えば、組織サンプル／全細胞などからの核酸）の濃縮、懸濁、抽出、核酸増幅、断片化、転写、標識および／または伸張反応などの操作が含まれる。これらの方法は当業者に周知である。限定されるものではないが、ＱｉａｇｅｎからのｍｉＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ、Ｓｉｇｍａ－ＡｌｄｒｉｃｈからのｍｉＲＮＡ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ単離キット、ｍｉｒＰｒｅｍｉｅｒ ｔｈｅ ｍｉｃｒｏＲＮＡ単離キット、およびＲｏｃｈｅからのＨｉｇｈ Ｐｕｒｅ ｍｉＲＮＡ単離キットを含め、ｍＲＮＡ精製のための市販のキットも入手可能である。特定の実施形態では、ＲＮＡの完全性が、Ａｇｉｌｅｎｔ ２１００ ｂｉｏｎａｌｉｚｅｒのＲＮＡ ６０００ Ｎａｎｏ Ｃｈｉｐｓ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いて分析される。

ある実施形態において、患者が肝疾患、腎疾患および／または肺疾患に罹患している診断される場合、治療上有効な量のＣＮＮＭ４阻害剤が前記患者に投与される。

本明細書で使用される場合、用語「治療有効な量」は、ＣＮＮＭ４の発現を阻害することができる本発明による阻害剤のいずれかの量と理解される。好ましい実施形態では、ＣＮＮＭ４発現が参照値に対して少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも１００％増加していることが見出されれば、治療上有効な量のＣＮＮＭ４阻害剤が前記患者に投与される。

好ましい実施形態では、阻害剤は、中和抗体またはその機能的フラグメント、拮抗剤、可溶性結合タンパク質、可溶性受容体変異体、非機能的誘導体、アンチセンスポリヌクレオチド、ＲＮＡ干渉オリゴヌクレオチド、ホスホロジアミデートモルホリノオリゴマー（ＰＭＯ）、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｓｇＲＮＡアンチセンスＲＮＡ、ダイサー基質２７マー二重鎖、アプタマー、ＤＮＡザイム、リボザイム、三重鎖形成性オリゴヌクレオチド（ＴＦＯ）、小分子およびそれらの組合せからなる群から選択される。より好ましい実施形態では、ＣＮＮＭ４阻害剤はｓｉＲＮＡである。さらにより好ましい実施形態では、ｓｉＲＮＡは、配列番号１３、配列番号１４、配列番号５０もしくは配列番号５１の核酸配列、または表１に示される配列番号を有する配列のいずれかのうち少なくとも１つを含んでなる。いっそうより好ましい実施形態では、ｓｉＲＮＡは、本明細書において配列番号７および配列番号８として示される核酸配列を含んでなる。

好ましい実施形態では、肝疾患は、肝線維化、静脈閉塞性肝疾患、薬物性肝障害（ＤＩＬＩ）、脂肪症、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、肝硬変、肝細胞癌（ＨＣＣ）、バッド・キアリ症候群および肝炎、またはそれらの任意の組合せから選択される。別の好ましい実施形態では、腎疾患は、急性腎障害（ＡＫＩ）、慢性腎疾患、腎炎、ネフローゼおよび腎線維症、またはそれらの任意の組合せから選択される。別の好ましい実施形態では、肺疾患は肺線維症である。

従前に記載した総ての用語および実施形態は、本発明のこの態様に同等に適用可能である。

疾患をイン・ビトロ診断するための試薬の使用
さらなる態様において、本発明は、対象において肝疾患、腎疾患または肺疾患をイン・ビトロ診断するためのＣＮＮＭ４の発現レベルを決定するために特異的な試薬の使用に関する。

ＣＮＮＭ４の発現レベルを決定するために特異的な試薬は、キット形式で提供され得る。本発明に関して、「キット」または「アッセイデバイス」は、輸送および貯蔵を可能とするように充填された、ＣＮＮＭ４の発現レベルを決定する方法を実施するために必要な種々の試薬を含有する製品またはデバイスとして理解される。キットの成分を充填するために好適な材料としては、石英、プラスチック（ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリカーボネートなど）、ボトル、バイアル、ペーパー、エンベロープなどが含まれる。加えて、これらのキットは、キット内にある種々の成分の同時、逐次または個別使用のための説明書を含み得る。前記説明書は、印刷物の形態または電子保存媒体（磁気ディスク、テープなど）、光媒体（ＣＤ－ＲＯＭ、ＤＶＤ）といった対象が読み取り可能なものなどの説明書を保存可能な電子支援の形態であり得る。それに加えてまたはその代わりに、媒体は、前記説明書を提供するインターネットアドレスを含み得る。

「ＣＮＮＭ４の発現レベルを決定するために特異的な試薬」という表現は、ｍＲＮＡレベルの決定の手段またはタンパク質レベルの決定の手段の両方により、遺伝子の発現レベルの決定を可能とする化合物または化合物セットを意味する。よって、第１のタイプの試薬には、前記遺伝子によりコードされるｍＲＮＡと特異的にハイブリダイズし得るプローブが含まれる。第２のタイプの試薬には、マーカー遺伝子よりコードされるタンパク質と特異的に結合する化合物が含まれ、好ましくは、抗体が含まれるが、それらは特異的アプタマーであってもよい。

よって、特定の実施形態では、ＣＮＮＭ４の発現レベルを決定するために特異的な試薬は、ＣＮＮＭ４のｍＲＮＡと特異的にハイブリダイズし得る１セットのプローブおよびＣＮＮＭ４のｍＲＮＡを特異的に増幅し得る１セットのプライマーペアからなる群から選択され、またはＣＮＮＭ４の発現レベルを決定するために特異的な試薬は、ＣＮＮＭ４ポリペプチドと特異的に結合する抗体である。

好ましい実施形態では、ＣＮＮＭ４の発現レベルの決定に十分な試薬は、キットを形成する遺伝子の発現レベルの決定に十分な試薬の総量の少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％または少なくとも１００％を占める。

好ましい実施形態では、本発明のキットの第１の成分は、上述の遺伝子と特異的にハイブリダイズし得るプローブを含んでなる。

「特異的にハイブリダイズし得る」という用語は、本明細書で使用する場合、高ストリンジェント条件または中等度ストリンジェント条件下で２つのポリヌクレオチドのハイブリダイズを可能とする条件を指す。

ハイブリダイゼーション反応の「ストリンジェンシー」は、当業者により容易に決定され、一般に、プローブ長、洗浄温度、および塩濃度に応じた、実験に基づく計算である。一般に、長いプローブほど適切なアニーリングに高温を要し、短いプローブほど低温を要する。ハイブリダイゼーションは一般に、相補鎖がそれらの融解温度よりも低い環境に存在する場合に変性したＤＮＡが再アニーリングする能力によって異なる。プローブとハイブリッド可能な配列の間の所望の相同性の程度が高いほど、使用可能な相対温度は高い。結果として、相対温度が高いほど反応条件をよりストリンジェントとする傾向があり、温度が低いほどその傾向が小さいことになる。ハイブリダイゼーション反応のストリンジェンシーのさらなる詳細および説明については、Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers, (1995)を参照。

「ストリンジェント条件」または「高ストリンジェンシー条件」は、本明細書で定義されるように、一般に、（１）洗浄に５０℃で、低イオン強度および高温度、例えば、０．０１５Ｍ塩化ナトリウム／０．００１５Ｍクエン酸ナトリウム／０．１％ドデシル硫酸ナトリウムを使用するか；（２）ハイブリダイゼーション中に、４２℃で、変性剤、例えば、ホルムアミド、例えば、５０％（ｖ／ｖ）ホルムアミド（０．１％ウシ血清アルブミン含有）／０．１％フィコール／０．１％ポリビニルピロリドン／５０ｍＭリン酸ナトリウムバッファーｐＨ６．５（７５０ｍＭ塩化ナトリウム、７５ｍＭクエン酸ナトリウム含有）を使用するか；または（３）４２℃で、５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（０．７５Ｍ ＮａＣｌ、０．０７５Ｍクエン酸ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）、０．１％ピロリン酸ナトリウム、５×デンハート液、音波処理サケ精子ＤＮＡ（５０μｇ／ｍｌ）、０．１％ＳＤＳ、および１０％デキストラン硫酸を使用し、４２℃、０．２×ＳＳＣ（塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム）および５０％ホルムアミドで洗浄した後、５５℃でＥＤＴＡを含有する０．１×ＳＳＣからなる高ストリンジェンシー洗浄を行う。

「中等度ストリンジェント条件」は、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Press, 1989に記載されているように特定することができ、上記のものよりも低いストリンジェントの洗浄溶液およびハイブリダイゼーション条件（例えば、温度、イオン強度およびＳＤＳ％）の使用を含む。中等度ストリンジェント条件の例は、３７℃、２０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭＮａＣｌ、１５ｍＭクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハート液、１０％デキストラン硫酸、および２０ｍｇ／ｍｌ変性剪断サケ精子ＤＮＡを含んでなる溶液中での一晩のインキュベーションの後、約３７～５０℃、１×ＳＳＣ中でのフィルターの洗浄である。当業者ならば、プローブ長などの因子を適合させるために必要に応じて、温度、イオン強度などをどのように調整するかが分かるであろう。

ＣＮＮＭ４の発現レベルが前記遺伝子によりコードされるポリペプチドのレベルを測定することにより決定される場合、本使用によるキットは、前記ポリペプチドと特異的に結合し得る試薬を含んでなる。この目的で、De Wildt et al. (2000) Nat. Biotechnol. 18:989-994; Lueking et al. (1999) Anal. Biochem. 270:103-111; Ge et al. (2000) Nucleic Acids Res. 28, e3, I-VII; MacBeath and Schreiber (2000) Science 289:1760-1763; ＷＯ０１／４０８０３およびＷＯ９９／５１７７３Ａ１により記載されているものなどの抗体アレイが有用であり得る。アレイの抗体としては、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥを含む、高い親和性でリガンドと結合し得る免疫薬、ならびにＦａｂ’、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、シングルドメイン抗体またはＤＡＢＳ、Ｆｖ、ｓｃＦｖなどの、抗原結合部位を有する抗体と類似の分子を含む。前記抗体を調製するための技術は当業者に非常によく知られており、Ausubel et al. (Current Protocols in Molecular Biology, 編 Ausubel et al, John Wiley & Sons (1992))により記載されている方法が含まれる。

アレイの抗体は、例えば、市販のロボットシステム（例えば、Ｇｅｎｅｔｉｃ ＭｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓまたはＢｉｏｒｏｂｏｔｉｃｓにより生産されているもの）を用いて高速で適用することができる。アレイの基質は、ニトロセルロース、プラスチック、石英であり得るか、または例えば、アクリルアミド、アガロースまたは別のポリマーとしての多孔質材料であり得る。別の実施形態では、本発明のタンパク質を検出するための特異的抗体を産生する細胞を、アレイフィルターでそれらを培養する手段により使用することが可能である。抗体の発現を誘導した後、これを、フィルターの、産生細胞が局在したアレイの場所に固定化する。この抗体のアレイを、標識した標的と接触させることができ、その標的の固定化抗体への結合レベルを決定することができる。標的が標識されない場合には、支持体に固定化されたポリペプチドに結合するポリペプチドに特異的な第２の標識抗体が使用されるサンドイッチ型のアッセイを使用することができる。アレイの各点のサンプル中に存在するポリペプチドの量の定量を発現プロファイルとしてデータベースに保存することができる。抗体のアレイは二反復で生産することができ、２つの異なるサンプルの結合プロファイルを比較するために使用することができる。

ある実施形態において、本発明は、Ｃｎｎｍ４遺伝子によりコードされるポリペプチドの平均発現レベルの決定のために十分な試薬を含んでなるキットまたはアッセイデバイスの使用に関し、これらの試薬は、前記遺伝子によりコードされるポリペプチドと特異的に結合する抗体または抗体セットであり、前記試薬は、そのキット中に存在する試薬の少なくとも１０％を占める。

特定の態様において、本発明は、肝疾患、腎疾患または肺疾患に罹患している患者の予後の決定のための本発明のキットの使用に関する。好ましい実施形態では、肝疾患は、肝線維症、静脈閉塞性肝疾患、薬物性肝障害（ＤＩＬＩ）、脂肪症、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、肝硬変、肝細胞癌（ＨＣＣ）、バッド・キアリ症候群および肝炎、またはそれらの任意の組合せから選択される。別の好ましい実施形態では、腎疾患は、急性腎障害（ＡＫＩ）、慢性腎疾患、腎炎、ネフローゼおよび腎線維化、またはそれらの任意の組合せから選択される。別の好ましい実施形態では、肺疾患は肺線維症である。

従前に記載した総ての用語および実施形態は、本発明のこの態様に同等に適用可能である。

誘発された疾患または病態を軽減する方法
最終の態様において、本発明は、細胞において誘発された疾患または病態を軽減するイン・ビトロ方法であって、前記細胞を、前記細胞においてＣＮＮＭ４の活性、レベルまたは機能を低減するために有効な量の特定のＣＮＮＭ４阻害剤に接触させることを含んでなる方法に関する。

用語「細胞において誘発された疾患または病態を軽減する方法」は、本明細書で使用する場合、前記疾患の細胞モデルにおいて誘発された疾患に特徴的なバイオマーカーレベルの増加または減少を観察するための方法に関する。特定の実施形態では、細胞において誘発された疾患または病態は、誘発されたＣＮＮＭ４介在疾患または病態であり、前記疾患には参照値に対して増加したＣＮＮＭ４発現を伴う。ある実施形態において、誘発されたＣＮＮＭ４介在疾患または病態には、参照値に対してＣＮＮＭ４発現の増加を伴い、参照値に対して少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも１００％、またはそれを超えて増加しているＣＮＮＭ４の発現レベルを特徴とする。ある実施形態において、参照値は、ＣＮＮＭ４介在疾患または病態が誘発されてない同じ細胞系におけるＣＮＮＭ４発現レベルに相当する。ＣＮＮＭ４介在疾患または病態が誘発されてない同じ細胞系は対照として使用可能である。

ある実施形態において、細胞において誘発された疾患または病態は、ＤＩＬＩ、脂肪症、ＮＡＳＨ、硬変、ＨＣＣ、肝線維症、腎線維症または肺線維症の研究のための疾患モデルである。ある実施形態において、細胞において誘発された疾患または病態は、培養モデル細胞系を指す。ある実施形態において、細胞培養は、初代細胞培養である。ある実施形態において、誘発された疾患または病態は、細胞を培養する前に動物モデルで誘発される。特定の例において、細胞において誘発された疾患または病態は、初代肝細胞において誘発されたＮＡＳＨである。

特定の実施形態では、動物モデルはＮＡＦＬＤ動物モデルであり、ＮＡＦＬＤは、動物（すなわち、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ野生型マウス）に４週間、メチオニン（０．１％）およびコリン（０％）欠乏食を与え、その後、肝臓を採取し、関連の細胞を培養することにより誘発される。

特定の実施形態では、動物モデルは肝硬変動物モデルであり、肝硬変は、動物（すなわち、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ野生型マウス）に胆管連結を施し、１～２１日後に動物を犠牲にし、肝臓を採取し、関連の細胞を培養することにより誘発される。

特定の実施形態では、動物モデルは肝細胞癌（ＨＣＣ）動物モデルであり、ＨＣＣ動物モデルとしての成体ＧＮＭＴ－／－マウスは自発的にＨＣＣを発症する。動物を７～９か月維持し、犠牲にし、肝臓を採取し、関連の細胞を培養する。

特定の実施形態では、動物モデルは薬物性肝障害（ＤＩＬＩ）動物モデルであり、ＤＩＬＩは、動物（すなわち、成体Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ野生型マウス）にアセトアミノフェン（ＡＰＡＰ）５００ｍｇ／ｋｇ処置を施して急性肝障害を誘発することにより誘発される。４８時間後に動物を犠牲にし、肝臓を採取し、関連の細胞を培養する。

本明細書で使用する場合、用語「バイオマーカー」は、特定の疾患モデルにおいて進行を経過観察するために必要とされる関連の読み出しを指す。特定の実施形態では、バイオマーカーは、ＣＮＮＭ４の発現レベルである。特定の実施形態では、バイオマーカーは相対的脂質蓄積である。特定の実施形態では、バイオマーカーは、相対的ミトコンドリアＲＯＳ（反応性酸素種）である。特定の実施形態では、バイオマーカーは、ＴＵＮＥＬ陽性細胞のパーセンテージ値である。特定の実施形態では、バイオマーカーは、細胞内マグネシウム蓄積のレベルである。

別の実施形態では、本発明は、細胞において誘発されたＣＮＮＭ４介在疾患または病態を軽減するために潜在的に有用な化合物を同定する方法であって、前記細胞を、細胞においてＣＮＮＭ４の活性、レベルもしくは機能を低減するために有効な量の候補化合物、または参照値に対して相対的脂質蓄積を低減するもしくは相対的ミトコンドリアＲＯＳを低減するために有効な量の候補化合物と接触させることを含んでなり、細胞において誘発されたＣＮＮＭ４介在疾患または病態において、ＣＮＮＭ４活性を阻害するか、参照値に対して相対的脂質蓄積を低減するか、または参照値に対して相対的ミトコンドリアＲＯＳを低減する候補化合物が、ＣＮＮＭ４介在肝疾患、腎疾患および／または肺疾患を治療および／または予防するために潜在的に有用である化合物として同定される方法に関する。ある実施形態において、参照値は、ＣＮＮＭ４介在疾患または病態が誘発されたが化合物に曝されていない同じ細胞系における脂質蓄積レベルまたはミトコンドリアＲＯＳレベルに相当する。ＣＮＮＭ４介在疾患または病態が誘発されてない同じ細胞系は対照として使用可能である。

細胞モデル系における脂質蓄積または細胞系におけるミトコンドリアＲＯＳレベルは、そのレベルが参照値に対して少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも９９％減少している場合に低減されていると見なされる。

さらに別の実施形態では、本発明は、ＣＮＮＭ４介在肝疾患、腎疾患および／または肺疾患を治療および／または予防するために潜在的に有用な化合物を同定する方法であって、
（ａ）前記候補化合物を疾患の細胞モデルと接触させること；および
（ｂ）前記候補化合物の存在下でマーカーをアッセイすること、ここで、このマーカーは、化合物の存在下でのＣＮＮＭ４の活性、参照値に対する相対的脂質蓄積、または参照値に対する相対的ミトコンドリアＲＯＳからなる群から選択される、
を含んでなり、
ＣＮＮＭ４活性を阻害する、相対的脂質蓄積を参照値に対して低減する、または相対的ミトコンドリアＲＯＳを参照値に対して低減する化合物が肝疾患、腎疾患および肺疾患を治療および／または予防するために潜在的に有用な化合物である方法に関する。

特定の実施形態では、候補化合物は、中和抗体またはその機能的フラグメント、拮抗剤、可溶性結合タンパク質、可溶性受容体変異体、非機能的誘導体、アンチセンスポリヌクレオチド、ＲＮＡ干渉オリゴヌクレオチド、ホスホロジアミデートモルホリノオリゴマー（ＰＭＯ）、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｓｇＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、ダイサー基質２７マー二重鎖、アプタマー、ＤＮＡザイム、リボザイム、三重鎖形成性オリゴヌクレオチド(oligonuclotide)（ＴＦＯ）、小分子およびそれらの組合せからなる群から選択される。

従前に記載した総ての用語および実施形態は、本発明のこの態様に同等に適用可能である。

本発明はさらに以下の態様を開示する。
１．医療に使用するためのＣＮＮＭ４阻害剤。

２．対象における肝疾患、腎疾患および肺疾患からなる群から選択される急性疾患または慢性疾患の治療において使用するためのＣＮＮＭ４阻害剤。

３．前記肝疾患が肝線維症、静脈閉塞性肝疾患、薬物性肝障害（ＤＩＬＩ）、脂肪症、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、肝硬変、肝細胞癌（ＨＣＣ）およびバッド・キアリ症候群、肝炎から選択され；
前記腎疾患が急性腎障害（ＡＫＩ）、慢性腎疾患、腎炎、ネフローゼおよび腎線維症から選択され；かつ
前記肺疾患が肺線維症である、
上記２に記載の使用のためのＣＮＮＭ４阻害剤。

４．前記阻害剤が中和抗体またはその機能的フラグメント、拮抗剤、可溶性結合タンパク質、可溶性受容体変異体、非機能的誘導体、アンチセンスポリヌクレオチド、ＲＮＡ干渉オリゴヌクレオチド、ホスホロジアミデートモルホリノオリゴマー（ＰＭＯ）、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｓｇＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、ダイサー基質２７マー二重鎖、アプタマー、ＤＮＡザイム、リボザイム、三重鎖形成性オリゴヌクレオチド（ＴＦＯ）、小分子およびそれらの組合せからなる群から選択される、上記１～３のいずれかに記載の使用のためのＣＮＮＭ４阻害剤。

５．小分子が７－アミノ－２－フェニル－５Ｈ－チエノ［３，２－ｃ］ピリジン－４－オンまたは２－［５－（４－オキソ－２－チオキソ－チアゾリジン－５－イリデンメチル）－フラン－２－イル］－安息香酸である、上記４に記載の使用のためのＣＮＮＭ４阻害剤。

６．対象において肝疾患、腎疾患または肺疾患を診断するイン・ビトロ方法であって、
（ａ）前記対象由来のサンプル中のＣＮＮＭ４の発現レベルを決定すること、および
（ｂ）前記レベルを参照値と比較すること
を含んでなり、
参照値に対する前記サンプル中のＣＮＮＭ４の発現レベルの増加が、前記患者が肝疾患、腎疾患または肺疾患に罹患していることを示す、方法。

７．前記サンプルが肝生検、腎生検または肺生検である、上記６に記載の方法。

８．前記肝疾患が肝線維症、静脈閉塞性肝疾患、薬物性肝障害（ＤＩＬＩ）、脂肪症、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、肝硬変、肝細胞癌（ＨＣＣ）およびバッド・キアリ症候群、肝炎から選択され；
前記腎疾患が急性腎障害（ＡＫＩ）、慢性腎疾患、腎炎、ネフローゼおよび腎線維症から選択され；かつ
前記肺疾患が肺線維症である、
上記６または７に記載の方法。

９．対象において肝疾患、腎疾患または肺疾患をイン・ビトロ診断するためにＣＮＮＭ４の発現レベルを決定するために特異的な試薬の使用。

１０．前記肝疾患が肝線維症、静脈閉塞性肝疾患、薬物性肝障害（ＤＩＬＩ）、脂肪症、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、肝硬変、肝細胞癌（ＨＣＣ）およびバッド・キアリ症候群、肝炎から選択され；かつ
前記腎疾患が急性腎障害（ＡＫＩ）、慢性腎疾患、腎炎、ネフローゼおよび腎線維症から選択され；
前記肺疾患が肺線維症である、
上記９に記載の使用。

１１．前記ＣＮＮＭ４の発現レベルを決定するために特異的な試薬がＣＮＮＭ４のｍＲＮＡと特異的にハイブリダイズし得る１セットのプローブおよびＣＮＮＭ４のｍＲＮＡを特異的に増幅し得る１セットのプライマーペアからなる群から選択されるか、またはＣＮＮＭ４の発現レベルを決定するために特異的な試薬がＣＮＮＭ４ポリペプチドと特異的に結合する抗体である、上記９または１０に記載の使用。

１２．細胞において誘発された疾患または病態を軽減するイン・ビトロ方法であって、前記細胞を、前記細胞においてＣＮＮＭ４の活性、レベルまたは機能を低減するために有効な量の特定のＣＮＮＭ４阻害剤に接触させることを含んでなる、方法。

１３．細胞において誘発されたＣＮＮＭ４介在疾患または病態を軽減するために潜在的に有用である化合物を同定するイン・ビトロ方法であって、前記細胞を、細胞においてＣＮＮＭ４の活性、レベルもしくは機能を低減するために有効な量の候補化合物、または参照値に対して相対的脂質蓄積を低減するもしくは相対的ミトコンドリアＲＯＳを低減するために有効な量の候補化合物と接触させることを含んでなり、細胞において誘発されたＣＮＮＭ４介在疾患または病態において、ＣＮＮＭ４活性を阻害するか、参照値に対して相対的脂質蓄積を低減するか、または参照値に対して相対的ミトコンドリアＲＯＳを低減する候補化合物が、ＣＮＮＭ４介在肝疾患、腎疾患および／または肺疾患を治療および／または予防するために潜在的に有用である化合物として同定される、方法。

１４．前記阻害剤または前記化合物が中和抗体またはその機能的フラグメント、拮抗剤、可溶性結合タンパク質、可溶性受容体変異体、非機能的誘導体、アンチセンスポリヌクレオチド、ＲＮＡ干渉オリゴヌクレオチド、ホスホロジアミデートモルホリノオリゴマー（ＰＭＯ）、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｓｇＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、ダイサー基質２７マー二重鎖、アプタマー、ＤＮＡザイム、リボザイム、三重鎖形成性オリゴヌクレオチド（ＴＦＯ）、小分子およびそれらの組合せからなる群から選択される、上記１２または１３に記載の方法。

また、以下の実施例により本発明を説明するが、これらの実施例は単に例であって本発明の範囲を限定するものではないと考えるべきである。

材料および方法
ヒトサンプル
試験は総てヘルシンキ宣言に則り、現地法に従って行った。各病院のヒト倫理委員会はこの試験手順を承認し、総ての患者から試験登録の前に書面でのインフォームド・コンセントを得た。

８人の健常サンプルコホート、３１人の肥満診断患者および臨床試験コホートからの４３人から得たヒト血清サンプルからマグネシウムを定量した。アルコール性疾患およびウイルス性肝炎感染症を排除したところで、患者の非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）を評価した。

非アルコール性脂肪性肝疾患ＮＡＦＬＤにおけるヒトＣＮＮＭ４の発現を、４２人の患者：１０人の健常患者のコホートで決定し、２０人の患者を、脂肪症を有すると診断し、１２人をＮＡＦＬＤを有すると診断した。

肝硬変患者のＣＮＮＭ４レベルを１２人の患者のコホートで決定し、そのうち５人を健常および７人を肝硬変と診断した。

また、４７人の肝細胞癌（ＨＣＣ）患者のＣＮＮＭ４レベルも決定した：６人の患者が健常であり、４１人の患者がＨＣＣと診断された。

１１人の薬物性肝障害（ＤＩＬＩ）患者のコホートでＣＮＮＭ４レベルを決定し、３人の健常患者と比較した。

最後に、腎線症の１４のヒトサンプルを、ＣＮＮＭ４発現を決定するために分析した。７サンプルが健常であり、別の７サンプルが腎線維症と診断された。

動物実験
動物実験は総て、スペイン実験動物の管理と使用に関する指針(Spanish Guide for Care and use of Laboratory animals)に従い、国際動物実験委員会標準(International Care and Use Committee Standards)を用いて行った。総ての手順はＣＩＣ ｂｉｏＧＵＮＥの動物実験委員会および監督当局（Diputacion de Bizkaia）により承認された。マウスは温度制御された動物施設（AAALAC認定）にて１２時間明／暗周期で飼育した。Ｇ－マウスには標準餌（Harlan Tekland）を与え、水を自由に摂らせた。

ＮＡＦＬＤ動物モデル：ＣＮＮＭ４決定のための０．１％メチオニンおよびコリン欠損餌（０．１％ＭＣＤＤ）
Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ野生型マウスにメチオニン（０．１％）およびコリン（０％）欠損餌を４週間与えた。処置の終了時に動物を犠牲にし、ＲＮＡ抽出またはタンパク質抽出、組織学および免疫組織化学のためのホルマリン固定または代謝分析を含む次の分析のために、肝臓を数片に分割した。処置中、血清分析のために血液を週１回採取した。

前臨床試験：ｓｉＲＮＡ療法を用いるＮＡＦＬＤ動物モデル
Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ野生型マウスにメチオニン（０．１％）およびコリン（０％）欠損餌を４週間与えた。その食餌の開始から２週間後、マウスを２群に分け、イン・ビボサイレンシングＣＮＮＭ４または非処置ｓｉＲＮＡ対照とし、製造者の説明書に従ってインビボフェクトアミン（登録商標）３．０試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ）を用い、ＣＮＮＭ４特異的イン・ビボ ｓｉＲＮＡ（Ｃｕｓｔｏｍ Ａｍｂｉｏｎ、ＵＳＡ）または対照ｓｉＲＮＡ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、ＵＳＡ）の０．７５μｇ／μｌ溶液２００μｌを施した。尾静脈注射を週に２回、４週目まで行った。処置の終了時に動物を犠牲にし、ＲＮＡ抽出またはタンパク質抽出、組織学および免疫組織化学のためのホルマリン固定または代謝分析を含む次の分析のために、肝臓を数片に分割した。処置中、血清分析のために血液を週１回採取した。

肝硬変動物モデル：胆管連結（ＢＤＬ）
成体Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ野生型マウスに、従前に記載したようにＢＤＬを施した(Fernandez-Alvarez et al., 2015. Lab Invest. 95(2):223-36)。簡単に述べれば、マウスをＯ２中１．５％イソフルオランで麻酔し、開腹した。門脈および肝動脈から胆管を分離し、胆管の縫合を行い、外科結びで締めた。最後に、閉腹し２４時間、４８時間、７２時間、３日および２１日の時点でマウスを犠牲にした。ＲＮＡ抽出またはタンパク質抽出、組織学および免疫組織化学のためのホルマリン固定または代謝分析を含む次の分析のために、肝臓を数片に分割した。処置中、血清分析のために血液を週１回採取した。

肝細胞癌動物モデル（ＨＣＣ）：ＧＮＭＴ－／－マウス
成体ＧＮＭＴ^－／－マウスを、それらが自発的にＨＣＣを発症すると記載されている(Wagner et al., 2009. Toxicol Appl Pharmacol. 1;237(2):246; author reply 247)７～９か月生育させた。この時点で動物を犠牲にし、ＲＮＡ抽出またはタンパク質抽出、組織学および免疫組織化学のためのホルマリン固定または代謝分析を含む次の分析のために、肝臓を数片に分割した。処置中、血清分析のために血液を週１回採取した。

薬物性肝障害（ＤＩＬＩ）：アセトアミノフェン（ＡＰＡＰ）過量投与
成体Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ野生型マウスを、急性肝障害を誘発させるために５００ｍｇ／ｋｇのアセトアミノフェン（ＡＰＡＰ）で処置した。処置４８時間後にマウスを犠牲にし、ＲＮＡ抽出またはタンパク質抽出、組織学および免疫組織化学のためのホルマリン固定または代謝分析を含む次の分析のために、肝臓を数片に分割した。処置中、血清分析のために血液を週１回採取した。

初代肝細胞の単離、培養および処理
３か月齢の野生型（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ）マウスからの初代肝細胞を、Ｉ型コラゲナーゼ（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ、ＵＳＡ）を灌流させることにより単離した。簡単に述べれば、動物をイソフルラン（Ｏ_２中１．５％イソフルラン）で麻酔した。次に、開腹し、下大静脈にカテーテルを挿入した。肝臓にバッファーＡ（１×ＰＢＳ、５ｍＭ ＥＧＴＡ、３７℃、含酸素）を灌流させ、門脈を切断した。次に、肝臓にバッファーＢ（１×ＰＢＳ、１ｍＭ ＣａＣｌ_２ ３７℃および含酸素）を灌流させてＥＧＴＡを除去し、最後に、バッファーＣ（１×ＰＢＳ、２ｍＭ ＣａＣｌ_２、０．６５ＢＳＡ、Ｉ型コラゲナーゼ、３７℃および含酸素）を灌流させた。バッファーＣ灌流の後に、肝臓を身体の残りの部分から分離し、ＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ、ＵＳＡ）を含むペトリ皿に入れた。胆嚢を注意深く除去した後、肝臓をピンセットで機械的に解離させた。消化した肝臓をＭＥＭに希釈したものを無菌ガーゼで濾過し、濾過した肝細胞を集め、上清のクッパー細胞および肝星細胞単離物を保存しつつ１０％ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）／１％ＰＳＧ（Ｇｉｂｃｏ）を添加したＭＥＭ中で３回洗浄した（４００ＲＰＭで１×４分および５００ＲＰＭで２×５分）。最終洗浄の後、ペレットに含まれる肝細胞を次の培養のために１０％ＦＢＳ １％ＰＳＧ ＭＥＭに再懸濁させた。

予めコラーゲンコーティングした培養ディッシュに初代肝細胞を、１０％ＦＢＳ／１％ＰＳＧを添加したＭＥＭ中７６００細胞／ｍｍ^２の密度で播種し、３７℃、５％ＣＯ_２－９５％空気のインキュベーターに入れた。６時間の付着の後、目的とする処理のため、培養培地および付着していない肝細胞を新鮮な０％ＦＢＳ／１％ＰＳＧ ＭＥＭを用いて除去した（表２）。

ＴＨＬＥ２細胞
ＴＨＬＥ－２細胞はＡＴＣＣ（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ－２７０６ＴＭ）から購入した。それらを、ＢＥＧＭ Ｂｕｌｌｅｔ ＫｉｔＴＭ（Ｌｏｎｚａ）および１０％ＦＢＳを添加した気管支上皮増殖培地（ＢＥＧＭＴＭ、Ｌｏｎｚａ）で維持した。それらを０．０５％トリプシン－ＥＤＴＡで分離させ、ＢＥＧＭ中に集めた。１２３ｇで５分間の遠心分離の後、上清を廃棄し、ペレットを再懸濁させた。

プラスミドトランスフェクション
プラスミドを、製造者のプロトコールに従ってｊｅｔＰＲＩＭＥ（登録商標）（Ｐｏｌｙｐｌｕｓ、ＵＳＡ）トランスフェクション試薬を用い、過剰発現のために、初代マウス肝細胞にトランスフェクトした。２４ウェルプレートで、０．５μｇのプラスミドをｊｅＰＲＩＭＥ（登録商標）バッファーに加え、１μｌのｊｅｔＰＲＩＭＥ（登録商標）試薬を加える前に１０秒ボルテックスで撹拌した。この混合物を１０秒ボルテックスで撹拌し、回転沈降させ、室温で１０分インキュベートした。トランスフェクションを細胞懸濁培地で行い、示されていなければ、トランスフェクション混合物をトランスフェクション６時間後の新鮮培地に置き換えた。

ｓｉＲＮＡ送達による遺伝子サイレンシング
製造者のプロトコールに従ってＤｈａｒｍａＦＥＣＴ １試薬（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ）を用い、細胞を終濃度１００ｎＭの特定のｓｉＲＮＡでトランスフェクトした。ＤｈａｒｍａＦＥＣＴ １およびｓｉＲＮＡは個別に０％ＦＢＳ／１％ＰＳＧ ＭＥＭで、室温で５分間希釈した。次に、希釈液を混合し、室温で２０分間インキュベートした。その後、混合したｓｉＲＮＡトランスフェクションを細胞懸濁培地に加え、６時間後に新鮮培地に置き換えた。ｓｉＲＮＡトランスフェクション容量（６ウェルプレートに関して示す）および配列を表３にまとめる。

ｓｈＲＮＡ送達による遺伝子サイレンシング
リポフェクタミン（登録商標）３０００（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を用いて、製造者の説明書によるプロトコールに従い、細胞を特定のｓｈＲＮＡでトランスフェクトした。７．５μｌのリポフェクタミンおよび３ｓｈＲＮＡを個別に０．２ｍｌの培養培地に希釈し、室温で５分間インキュベートした。インキュベーション後にそれらを再び混合し、細胞に送達する前に室温で３０分間インキュベートした。ｓｈＲＮＡトランスフェクション容量は６ウェルプレートに関して示され、配列は配列番号５２である。
５’－ＵＣＵＣＵＧＣＣＵＵＣＡＡＧＧＡＵＧＣＧＧＡＣＡＡＵＧＡＧ－３’（配列番号５２）

ＲＮＡの単離およびｃＤＮＡ発現の決定
ＲＮＡの単離
ＴＲＩｚｏｌ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を製造者の説明書に従って用い、全肝臓または培養細胞からの全ＲＮＡを単離した。細胞ｍＲＮＡ抽出の場合、ＲＮＡペレットを見やすくするためにＲＮＡ沈降ステップに５μｇのグリコーゲン（Ａｍｂｉｏｎ、ＵＳＡ）を用いた。ＲＮＡ濃度を、Ｎａｎｏｄｒｏｐ ＮＤ－１００分光光度計（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＵＳＡ）を用いて分光光度法により測定した。

逆転写
１～２μｇの単離されたＲＮＡを、ＤＮアーゼＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｒｅｎ）で処理し、ランダムプライマーおよびＲＮアーゼＯＵＴの存在下、Ｍ－ＭＬＶ逆転写酵素（総てＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから）によりｃＤＮＡを合成するために使用した。得られたｃＤＮＡをＲＮアーゼ不含水（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）で１／１０（２μｇを使用した場合には１／２０）希釈した。

リアルタイム定量的ＰＣＲ（ＲＴ－ｑＰＣＲ）
ｑＰＣＲを、ＳＹＢＲ Ｓｅｌｅｃｔ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、ＵＳＡ）とともにＶｉｉＡ ７またはＱＳ６リアルタイムＰＣＲシステムのいずれかを用いて行った。３８４ウェルプレート（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）にて総反応容量６．５μｌに対して特定のプライマーを含む１．５μｌのｃＤＮＡを用いた。反応は総て３連で行った。プライマーに対するＰＣＲ条件を最適化し、融解温度６０℃および各ステップ３０秒の４０サイクルを用いた。各ステップでヒト(Homo Sapien)およびハツカネズミ(Mus musculus)の両プライマーは、Ｓｉｇｍａ ＡｌｄｒｉｃｈによりＮＣＢＩ－ヌクレオチドウェブページ(www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide)のプライマー３ソフトウエアを用いて設計され、合成された。プライマー配列の詳細を表４および表５に示す。融解曲線を用いてＰＣＲ産物の特異性を確認した後に、データはハウスキーピング遺伝子（ＧＡＰＤＨ、ＡＲＰ）の発現に対して正規化した。

タンパク質
タンパク質の抽出および分析
総タンパク質の抽出は示されたように行った。細胞を冷ＰＢＳバッファーで洗浄し、２００μｌのＲＩＰＡ溶解バッファー（１．６ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、８．４ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、０．５％アジド、０．１Ｍ ＮａＣｌ、０．１％ＳＤＳ、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、５ｍｇ／ｍｌデオキシコール酸ナトリウム）に再懸濁させた。溶解バッファーにプロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤カクテル（Ｒｏｃｈｅ、スイス）を添加した。それらを遠心分離し（１３０００ｒｐｍ、４℃で２０分）、上清（タンパク質抽出物）を総タンパク質含量に関してブラッドフォードタンパク質アッセイ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）により定量し、Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ Ｍ３分光光度計（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ、ＵＳＡ）を用いて決定した。

凍結肝組織の場合、およそ５０μｇの組織を５００μｌのバッファー中、Ｐｒｅｃｅｌｌｙｓ ２４組織ホモジナイザー（Ｐｒｅｃｅｌｌｙｓ、フランス）を使用することによりホモジナイズした。総ての場合において、溶解液を遠心分離し（１３０００ｒｐｍ、２０分、４℃）、上清（タンパク質抽出物）を、使用する溶解バッファーのタイプに応じてブラッドフォードタンパク質アッセイまたはＢＣＡタンパク質アッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ、ＵＳＡ）により、総タンパク質含量に関して定量し、Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ Ｍ３分光光度計を用いて決定した。

ウエスタンブロット法
タンパク質抽出液をＳＤＳ－ＰＡＧＥサンプルバッファー（２５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ６．８、５００ｍＭ β－メルカプトエタノール、５０％グリセロール、１０％ＳＤＳおよびブロモフェノールブルー）中、９５℃で５分間煮沸した。タンパク質の存在量および抗体の感受性に応じて適当な量のタンパク質（５～５０μｇ）を、Ｍｉｎｉ－ＰＲＯＴＥＡＮ電気泳動システム（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を用い、３％～１５％アクリルアミドゲル（対象とするタンパク質の分子量に応じて）中、ドデシル硫酸ナトリウム－ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）により分離した。Ｍｉｎｉ Ｔｒａｎｓ－Ｂｌｏｔ ｃｅｌｌ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を用いる電気ブロッティングにより、ニトロセルロース膜にゲルを転写した。室温で１時間、０．１％Ｔｗｅｅｎ－２０を含有するＴＢＳ ｐＨ８（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）（ＴＢＳＴ－０．１％）中５％脱脂乳で膜をブロッキングし、ＴＢＳＴ－０．１％で１０分３回洗浄し、市販の一次抗体とともに４℃で一晩インキュベートした。一次抗体およびそれらの最適なインキュベーション条件を表６に詳説する。次に、膜をＴＢＳＴ－０．１％で１０分３回洗浄し、セイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ、表６）にコンジュゲートした二次抗体を含有するブロッキング溶液中、室温で１時間インキュベートした。免疫反応性タンパク質は、Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅａｃｅｎｃｅ試薬（ＥＣＬ、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、ＵＳＡ）を使用することにより検出し、Ｃｕｒｉｘ ６０ Ｄｅｖｅｌｏｐｅｒ（ＡＧＦＡ、ベルギー）内でＳｕｐｅｒ Ｒｘ－Ｎ Ｘ線フィルム（Ｆｕｊｉ、日本）に露光した。

染色アッセイ
脂質染色のためのスーダンレッド
Ｏ．Ｃ．Ｔに含まれる凍結肝臓サンプルを１０μｍの切片とした。切片を６０％イソプロパノールで洗浄した後、新鮮なスーダンＩＩＩ（イソプロパノール中０．５％；Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）溶液で３０分間染色した。次に、サンプルを６０％イソプロパノールで再び洗浄した後、ヘマトキシリンおよびエオジンで対比染色した。次に、これらの切片を蒸留水で洗浄し、ＤＰＸ封入剤にマウントした。正立光学顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ）で画像を取得した。

ＤＨＥによるＲＯＳの決定
Ｏ．Ｃ．Ｔに包埋された８μｍ切片を、室温にて１時間、ＭｎＴＢＡＰ １５０μＭとともにインキュベートした。次に、サンプルを３７℃で３０分間、ジヒドロエチジン（ＤＨＥ）５μＭとともにインキュベートし、０．７ｍｇ／ｌのＤＡＰＩを含有するＦｌｕｏｒｏｍｏｕｎｔ－Ｇ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ、ＵＳＡ）を用いて切片をマウントして核を対比染色した。Ａｘｉｏｉｍａｇｅｒ Ｄ１（Ｚｅｉｓｓ）を用いて画像を取得した。

ＣＮＮＭ４決定のための免疫組織化学
パラフィン包埋切片（５μｍ厚）を、使用する一次抗体に応じて賦活化し、過酸化物のブロッキングを施した（ＰＢＳ中３％Ｈ_２Ｏ_２、１０分、室温）。マウス組織におけるマウスを宿主とする抗体による染色のために、サンプルをヤギ抗マウスＦａｂフラグメント（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ、ＵＳＡ）でブロッキングし（１：１０、１時間、室温）、５％ヤギ血清でブロッキングした（３０分、室温）。次に、切片を加湿チャンバー内でＤＡＫＯ抗体希釈剤（ＤＡＫＯ）中、１：１００でＣＮＮＭ４一次抗体（Ａｂ１９１２０７、Ａｂｃａｍ）とともにインキュベートした後、Ｅｎｖｉｓｉｏｎ抗ウサギ（ＤＡＫＯ）ＨＲＰコンジュゲート二次抗体とのインキュベーション（３０’、室温）を行った。Ｖｅｃｔｏｒ ＶＩＰ色素原（Ｖｅｃｔｏｒ）で比色定量検出を確認し、切片をヘマトキシリンで対比染色した。サンプルを、ＤＰＸ封入剤を用いてマウントした。正立光学顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ）で画像を取得した。

αＳＭＡ決定のための免疫蛍光
α－ＳＭＡ染色のために、Ｏ．Ｃ．Ｔに包埋した１０μｍ切片を、Ｃｙ３にコンジュゲートされた一次抗体の０．０１％ＰＢＳアジド（Ｃ６１９８、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）の２％ＢＳＡ中１／２００希釈溶液とともにインキュベートし、核を対比染色するための０．７ｍｇ／ｌのＤＡＰＩを含有するＦｌｕｏｒｏｍｏｕｎｔ－Ｇ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いてマウントした。Ａｘｉｏｉｍａｇｅｒ Ｄ１（Ｚｅｉｓｓ）を用いて画像を取得した。

初代肝細胞における脂質定量のためのＢＯＤＩＰＹ
高脂質含量培地（ＯＡ）またはメチオニン／コリン欠損培地（ＭＤＭＣ）で培養した初代肝細胞を、ＰＢＳ中４％パラホルムアルデヒドで固定し（１０分、室温）、１ｍｇ／ｍｌのＢＯＤＩＰＹ ４９３／５０３（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｐｂｅｓ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）とともにインキュベートした（１時間、室温）。Ａｘｉｏｉｍａｇｅｒ Ｄ１（Ｚｅｉｓｓ）顕微鏡を用いてＢＯＤＩＰＹ ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｆｌｕｏｒｏｒｅｓｃｅｎｃｅ画像を取得した。脂肪体の定量はＦｒｉｄａソフトウエアを用いて行い、細胞総数に対する平均面積として表した。

データ分析
各サンプルの強度または染色面積パーセンテージの平均合計を、ＦＲＩＤＡソフトウエアを用いて計算した(http://bui3.win.ad.jhu.edu/frida/, John Hopkins University)。

肝臓脂質の定量
３０ｍｇの凍結肝臓を、ポッター型ホモジナイザー内で１０容量の氷冷ＰＢＳを用いてホモジナイズした。Ｗａｋｏ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓキット（Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、ＶＡ）を用い、ホモジネート中の脂肪酸を測定し、脂質は記載のように定量した(Folch et al., 1957. J Biol Chem. 226(1):497-509)。簡単に述べれば、肝臓ホモジネート由来の１．５ｍｇのタンパク質から脂質を抽出した。ホスファチジルコリン（ＰＣ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、脂肪酸（ＦＡｓ）およびコレステロール（Ｃｈ）を薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）により分離し、記載のように定量した(Ruiz and Ochoa, 1997)。トリグリセリド（ＴＧｓ）は、脂質抽出物においてＡ． Ｍｅｎａｒｉｎｉ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ（イタリア）キットを用いて測定した。

マグネシウム決定アッセイ
細胞内マグネシウムレベル
カバーガラスで増殖させた初代肝細胞に０％ＦＢＳ／１％ＰＳＧ培地中、２μＭ Ｍａｇ－Ｓ－Ｔｚまたは１μＭ Ｍａｇ－Ｓ－Ｔｚ－ＡＭ希釈ＲＥＦ(Gruskos et al., 2016. J. Am. Chem. Soc. 138 (44), pp 14639-14649)を添加し、３７℃およびび５％ＣＯ_２にてそれぞれ３０分または１時間インキュベートした。色素含有培地を除去した後、０％ＦＢＳ／１％ＰＳＧ中で３０分のインキュベーションを行った。次に、カバーガラスを２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、２．４ｍＭ ＣａＣｌ_２、１０ｍＭグルコース、ｐＨ７．４バッファー中で洗浄し、Ｅｃｌｉｐｓｅ ＴＥ ３００に基づくマイクロスペクトロフルオロメーター（Ｎｉｋｏｎ、ＵＳＡ）上のサーモスタチテス灌流チャンバーに装着し、４０倍油浸蛍光で可視化した。細胞内Ｍｇ^２＋レベルを、Ｇｒｙｎｋｉｅｗｉｃｚ(Grynkiewiz et al., 1985. J Biol Chem. 260(6):3440-50)により記載されている方法を用いて決定した。３４０／３８０ｎｍ励起光比を、Ｄｅｌｔａシステム（Ｐｈｏｔｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、プリンストン）を用いて決定し、標準式からＭｇ^２＋濃度に変換した。

（式中、Ｋ_ｄは、Ｍａｇ－Ｓ－Ｔｚ（３．２ｍＭ）およびＭａｇ－Ｓ－Ｔｚ－ＡＭ（８．９ｍＭ）のＭｇ^２＋解離定数であり、Ｑは、３８０ｎｍにおける最小／最大蛍光強度比である。）

細胞外マグネシウムレベル
細胞外マグネシウムは、ＱｕａｎｔｉＣｒｏｍ（商標）マグネシウムアッセイキット（ＢｉｏＡｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ、ＵＳＡ）を用いて定量した。簡単に述べれば、５μｌの血清または培養培地を、試薬Ａと試薬Ｂの１：１混合物２００μｌと混合した。室温で２分のインキュベーションの後、Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ Ｍ３分光光度計（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ、ＵＳＡ）を用いて、５００ｎｍ波長でＯＤを決定した。次に、１０μｌのＥＤＴＡを加え、再びＯＤ_５００を決定した。最後に、標準濃度（２ｍｇ／ｍｌ）からのＯＤ_５００と比較することによりマグネシウム濃度を計算した。

イン・ビトロアッセイ
ミトコンドリアＲＯＳの決定
ミトコンドリアＲＯＳは、ＭｉｔｏＳＯＸＴＭ Ｒｅｄ試薬（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を製造者の説明書に従って用いて測定した。簡単に述べれば、初代肝細胞および肝細胞腫細胞を通常の培養培地中、ＭｉｔｏＳＯＸ試薬（２．５μＭ、１０分、３７℃、ＣＯ２インキュベーター中）とともにインキュベートした。次に、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、分光光度計を用いて、励起５１０ｎｍおよび発光５９５ｎｍで蛍光を測定した。最終値は総タンパク質濃度に対して正規化した。

ＴＵＮＥＬによる細胞死の決定
細胞死は、上記に示したように、イン・サイチュ細胞死検出キット（Ｒｏｃｈｅ）を製造者の説明書に従って使用することにより分析した。細胞を３分間、過酸化物ブロック（メタノール中３％Ｈ_２Ｏ_２）に曝した後、ＦＩＴＣコンジュゲート一次抗体（希釈率１／５０） を含有するＴＵＮＥＬ希釈バッファーとともに３７℃で１時インキュベートした。切片をＤａｋｏ蛍光封入剤（Ｄａｋｏ）にマウントした。Ａｘｉｏｉｍａｇｅｒ Ｄ１（Ｚｅｉｓｓ）顕微鏡を用いて画像を取得し、ＴＵＮＥＬ陽性細胞の％を決定することにより細胞生存率を計算した。

結果
肝臓病態におけるＣＮＮＭ４の過剰発現
慢性肝疾患には一群の異なる病態が含まれる。ヒト肝生検およびマウス動物モデルからの肝臓において免疫組織化学（ＩＨＣ）によりＣＮＮＭ４発現を検出するための方法が開発されている。ここで、ＣＮＮＭ４発現は、ヒト生検および動物モデルの両方で、ＤＩＬＩにおいて、また慢性肝疾患からのあらゆる病期において特徴的であるとされており、あらゆる病態においてこのタンパク質の過剰発現が見られる（図１）。これらの結果は、脂肪肝およびＮＡＳＨ患者からのサンプルに比べた、健常対象からのヒト肝臓サンプルのＣＮＮＭ４ ｍＲＮＡレベルのｑＰＣＲによりＣＮＮＭ４発現を検出するための方法によって確認された（図２Ａ）。ＣＮＮＭ４発現はまた、イン・ビボ ＮＡＳＨマウスモデル（図２Ｂ）、ならびにイン・ビトロＮＡＳＨマウス細胞モデル（図２Ｃ）において、ＣＮＮＭ４ ｍＲＮＡレベルのｑＰＣＲによっても決定することができた。

肝疾患を治療するための新たな標的ＣＮＮＭ４
従前に示されたＩＨＣによるＣＮＮＭ４の決定で見られた過剰発現は、ＤＩＬＩおよび慢性疾患の両方に関して、肝疾患を治療するための潜在的標的としてＣＮＮＭ４を示唆する。初代肝細胞においてＮＡＳＨを誘発し、ｓｉＲＮＡ ＣＮＮＭ４療法でそれらを治療するイン・ビトロ試験を行った。ＮＡＳＨモデル初代肝細胞の場合、脂質含量および反応性酸素種（ＲＯＳ）による炎症を測定したところ、ｓｉＲＮＡ療法で処理したＮＡＳＨ肝細胞では双方が開腹することが認められた（図３Ａおよび３Ｂ）。また、アセトアミノフェン過量投与によりＤＩＬＩを模倣する別のイン・ビトロ試験も行ったところ、ＤＩＬＩモデル肝細胞に予想された細胞死が見られ、標的化ｓｉＲＮＡ療法で細胞を処理した場合には回復が見られた（図３Ｃ）。さらに、ヒト細胞においてＮＡＳＨを誘発し、ｓｉＲＮＡ ＣＮＮＭ４療法またはｓｈＲＮＡ ＣＮＮＭ４療法でそれらを治療するイン・ビトロ試験を行い、脂質含量を測定したところ、ｉＲＮＡ療法で処理したＮＡＳＨ誘発ヒト細胞（ＴＨＬＥ２細胞）（図４Ａ）およびｓｈＲＮＡ療法で処理したＮＡＳＨ誘発ヒト細胞（図４Ｂ）の両方で相対的脂質蓄積が回復することが認められた。

ＣＮＮＭ４標的化の特異性および必要
ｓｉＲＮＡ ＣＮＮＭ４療法の、ＮＡＳＨおよびＤＩＬＩからの保護効果が認められたことから、ＣＮＮＭファミリーの他のタンパク質（ＣＮＮＭ１、ＣＮＮＭ２およびＣＮＮＭ３）を標的サイレンシングする効果を決定した。初代肝細胞においてＮＡＳＨを誘発し、それらをｓｉＲＮＡ ＣＮＮＭ１、ｓｉＲＮＡ ＣＮＮＭ２およびｓｉＲＮＡ ＣＮＮＭ３で処理した。ｓｉＲＮＡ ＣＮＮＭ４療法とは異なり、ＣＮＮＭファミリーの他のタンパク質のサイレンシングには効果がなく、このことはＣＮＮＭ４のみでおよびＣＮＮＭファミリーのタンパク質はそうではないことに基づき処理の特異性を示す（図５Ａ）。さらに、ＣＮＮＭ４に基づく処理の必要を証明するための実験を行った。第１の場合では、ＮＡＳＨ患者および動物モデルに見られるものと同様に、ＣＮＮＭ４過剰発現により初代肝細胞に脂質蓄積を誘発し、次に、それらにマグネシウムを添加した。マグネシウムの添加は、ｓｉＲＮＡ ＣＮＮＭ４処理と同様に、脂質蓄積の減少に効果がない（図５Ｂ）。第２に、初代肝細胞において、ＣＮＮＭ４過剰発現の場合と同様の生理条件であるマグネシウム欠乏により脂質蓄積を誘発した。この場合には、ｓｉＲＮＡ ＣＮＮＭ４療法は脂質蓄積を低減した（図５Ｃ）。これら２つの結果を考慮すると、マグネシウム添加はＮＡＳＨを治療するには十分でなく、従って、ＣＮＮＭ４に基づく療法の必要がある。

ｓｉＲＮＡ ＣＮＮＭ４に基づく療法の前臨床試験
細胞だけでなく動物でもＣＮＮＭ４調節の有効性に取り組むために、慢性肝疾患の第１段階であるＮＡＦＬＤにおける前臨床試験を開発した。ＮＡＦＬＤを発症させるために、マウスに０．１％メチオニンおよびコリン欠損餌（０．１％ＭＣＤＤ）を２週間与えた。この時点で、２週間の０．１％ＭＣＤＤの後に、一群をｓｉＲＮＡ ＣＮＮＭ４療法で、別の群をｓｉＣｔｒｌ ＲＮＡで処置した。動物を犠牲にし、ＮＡＦＬＤの進行を分析するために種々のバイオマーカーを測定した。スーダンレッド染色は脂質蓄積を評価し（図６Ａ）、血中トランスアミナーゼは肝損傷を示し（図６Ｂ）、ＤＨＥ染色はＲＯＳにより引き起こされる炎症を定量し（図６Ｃ）、α－平滑筋アクチン（αＳＭＡ）は線維化の進行を示す（図６Ｄ）。ｓｉＲＮＡ ＣＮＮＭ４療法で処置下動物群では、ＮＡＦＬＤが軽減されることが認められる。

ＣＮＮＭ４の薬理学的阻害
ｓｉＲＮＡ療法に加え、ＣＮＮＭ４活性は薬理学的に調節することもできる。初代肝細胞においてＮＡＳＨを誘発し、それらを７－アミノ－２－フェニル－５Ｈ－チエノ［３，２－ｃ］ピリジン－４－オンとして知られる化合物で処理するイン・ビトロアッセイを行った。このＣＮＮＭ４の薬理学的阻害は、ＮＡＳＨ誘発肝細胞において、ｓｉＲＮＡ療法と同様の効果を有し、その脂質含量を低減し（図７Ａ）、それらにマグネシウム蓄積をもたらす（図７Ｂ）ことが認められる。

種々の臓器の病態におけるＣＮＮＭ４の過剰発現
図１に示されるように、ＣＮＮＭ４は、動物モデルおよびヒトサンプルの両方で種々の肝臓病態において過剰発現することが見出されている。特に、線維化の発生は肝臓だけでなく腎臓などの他の臓器にも見られ、線維化の発生は両組織にあり得るといういくつかの類似点を考えれば、ＣＮＮＭ４がこの臓器において脱調節されている可能性もある。腎線維症マウスモデルでＣＮＮＭ４の過剰発現が見られたが、これはＣＮＮＭ４に基づく療法がこの疾患の治療に有効なものであることを示す（図８）。加えて、ＴＣＧＡ（癌ゲノムアトラス）データの分析は、ＣＮＮＭ４が正常組織に対して肝細胞癌（ＬＩＨＣ）の原発腫瘍サンプルおよび肺腺癌（ＬＵＡＤ）の原発腫瘍サンプルで過剰発現することを示す（図９Ａおよび図９Ｂ）。

要約すると、示された結果は、ＣＮＮＭ４がＮＡＦＬＤ進行を予防するための好適な標的であること証明し、他の肝臓病態（ＤＩＬＩ、肝硬変およびＨＣＣ）、腎線維症および肺癌も改善できたことを示す。ＤＩＬＩの場合、イン・ビトロ試験は、ＡＰＡＰ過量投与からのｓｉＲＮＡ療法の保護効果を示し、他の病態におけるＣＮＮＭ４の決定は、それらの総てにおいて過剰発現していることを示す。従って、このタンパク質またはその相手をｓｉＲＮＡ療法によってまたは薬理学的に阻害またはサイレンシングすることが、肝疾患、腎線維症および肺癌を治療するための好適な方法となる。

Claims (13)

1. 対象における急性疾患または慢性疾患の治療において使用するためのＣＮＮＭ４阻害剤であって、前記疾患が肝疾患、腎疾患および肺疾患からなる群から選択される、ＣＮＮＭ４阻害剤。
2. 前記肝疾患が肝線維症、静脈閉塞性肝疾患、薬物性肝障害（ＤＩＬＩ）、脂肪症、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、肝硬変、肝細胞癌（ＨＣＣ）およびバッド・キアリ症候群、肝炎から選択され；
   前記腎疾患が急性腎障害（ＡＫＩ）、慢性腎疾患、腎炎、ネフローゼおよび腎線維症から選択され；かつ
   前記肺疾患が肺線維症である、
   請求項１に記載の使用のためのＣＮＮＭ４阻害剤。
3. 前記阻害剤が中和抗体またはその機能的フラグメント、拮抗剤、可溶性結合タンパク質、可溶性受容体変異体、非機能的誘導体、アンチセンスポリヌクレオチド、ＲＮＡ干渉オリゴヌクレオチド、ホスホロジアミデートモルホリノオリゴマー（ＰＭＯ）、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｓｇＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、ダイサー基質２７マー二重鎖、アプタマー、ＤＮＡザイム、リボザイム、三重鎖形成性オリゴヌクレオチド（ＴＦＯ）、小分子およびそれらの組合せからなる群から選択される、請求項１または２に記載の使用のためのＣＮＮＭ４阻害剤。
4. 小分子が７－アミノ－２－フェニル－５Ｈ－チエノ［３，２－ｃ］ピリジン－４－オンまたは２－［５－（４－オキソ－２－チオキソ－チアゾリジン－５－イリデンメチル）－フラン－２－イル］－安息香酸である、請求項３に記載の使用のためのＣＮＮＭ４阻害剤。
5. 対象において肝疾患、腎疾患または肺疾患を診断するイン・ビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）方法であって、
   （ａ）前記対象由来のサンプル中のＣＮＮＭ４の発現レベルを決定すること、および
   （ｂ）前記レベルを参照値と比較すること
   を含んでなり、
   参照値に対する前記サンプル中のＣＮＮＭ４の発現レベルの増加が、前記患者が肝疾患、腎疾患または肺疾患に罹患していることを示す、方法。
6. 前記サンプルが肝生検、腎生検または肺生検である、請求項５に記載の方法。
7. 前記肝疾患が肝線維症、静脈閉塞性肝疾患、薬物性肝障害（ＤＩＬＩ）、脂肪症、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、肝硬変、肝細胞癌（ＨＣＣ）およびバッド・キアリ症候群、肝炎から選択され；
   前記腎疾患が急性腎障害（ＡＫＩ）、慢性腎疾患、腎炎、ネフローゼおよび腎線維症から選択され；かつ
   前記肺疾患が肺線維症である、
   請求項５または６に記載の方法。
8. ＣＮＮＭ４の発現レベルの決定に特異的な試薬の使用であって、対象において肝疾患、腎疾患または肺疾患をイン・ビトロ診断するための使用。
9. 前記肝疾患が肝線維症、静脈閉塞性肝疾患、薬物性肝障害（ＤＩＬＩ）、脂肪症、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、肝硬変、肝細胞癌（ＨＣＣ）およびバッド・キアリ症候群、肝炎から選択され；
   前記腎疾患が急性腎障害（ＡＫＩ）、慢性腎疾患、腎炎、ネフローゼおよび腎線維症から選択され；かつ
   前記肺疾患が肺線維症である、
   請求項８に記載の使用。
10. 前記ＣＮＮＭ４の発現レベルの決定に特異的な試薬がＣＮＮＭ４のｍＲＮＡと特異的にハイブリダイズする１セットのプローブおよびＣＮＮＭ４のｍＲＮＡを特異的に増幅し得る１セットのプライマーペアからなる群から選択されるか、または前記ＣＮＮＭ４の発現レベルの決定に特異的な試薬がＣＮＮＭ４ポリペプチドと特異的に結合する抗体である、請求項８または９に記載の使用。
11. 細胞において誘発された疾患または病態を軽減するイン・ビトロ方法であって、前記誘発された疾患または病態が、ＤＩＬＩ、脂肪症、ＮＡＳＨ、肝硬変、ＨＣＣ、肝線維症、腎線維症または肺線維症の研究用疾患モデルであり、前記細胞を、前記細胞においてＣＮＮＭ４の活性、レベルまたは機能を低減するために有効な量の特定のＣＮＮＭ４阻害剤に接触させることを含んでなる、方法。
12. 細胞において誘発されたＣＮＮＭ４介在疾患または病態を軽減するために潜在的に有用である化合物を同定するイン・ビトロ方法であって、前記細胞を、細胞においてＣＮＮＭ４の活性、レベルもしくは機能を低減するために有効な量の候補化合物、または参照値に対して相対的脂質蓄積を低減するもしくは相対的ミトコンドリアＲＯＳを低減するために有効な量の候補化合物と接触させることを含んでなり、細胞において誘発されたＣＮＮＭ４介在疾患または病態において、ＣＮＮＭ４活性を阻害するか、参照値に対して相対的脂質蓄積を低減するか、または参照値に対して相対的ミトコンドリアＲＯＳを低減する候補化合物が、ＣＮＮＭ４介在肝疾患、腎疾患および／または肺疾患を治療および／または予防するために潜在的に有用である化合物として同定される、方法。
13. 前記阻害剤または前記化合物が、中和抗体またはその機能的フラグメント、拮抗剤、可溶性結合タンパク質、可溶性受容体変異体、非機能的誘導体、アンチセンスポリヌクレオチド、ＲＮＡ干渉オリゴヌクレオチド、ホスホロジアミデートモルホリノオリゴマー（ＰＭＯ）、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｓｇＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、ダイサー基質２７マー二重鎖、アプタマー、ＤＮＡザイム、リボザイム、三重鎖形成性オリゴヌクレオチド（ＴＦＯ）、小分子およびそれらの組合せからなる群から選択される、請求項１１または１２に記載の方法。
    
    

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