JP7005551B2 - メラノーマの処置および診断 - Google Patents
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Description
させるのに十分な量で投与される方法を特徴とする。
置するのに十分な量でLXRアゴニストまたはApoEポリペプチドを投与することを含む方法を提供する。
えば、化学療法剤および細胞毒性剤、分化誘導剤(例えば、レチノイン酸、ビタミンD、サイトカイン)、ホルモン剤、免疫学的薬剤ならびに抗血管新生剤などから選択することができる。化学療法剤および細胞毒性剤には、アルキル化剤、細胞毒性抗生物質、代謝拮抗剤、ビンカアルカロイド、エトポシド類およびその他(例えば、パクリタキセル、タキソール、ドセタキセル、タキソテール、シス-プラチン)が含まれるが、これらに限定されない。抗増殖活性を有するさらなる化合物のリストを、L.Brunton、B.ChabnerおよびB.Knollman(編)、Goodman and Gilman’s The Pharmacological Basis of Therapeutics、第12版、2011年、McGraw Hill Companies、New York、NYに見出すことができる。
の目的を達成するために、この技術分野において知られている多くの技術を使用することができ、これらには、下記の実施例において記載されるようなmiR-Zip技術、ロックド核酸(LNA)技術およびアンタゴミル(antagomir)技術が含まれるが、これらに限定されない。
されるならば、試験化合物を、メラノーマを処置するために、あるいは、内皮動員、ガン細胞浸潤または転移性血管形成を阻害するために有用な候補物として選択することを含む。
-細胞の接着または遊走に関連づけられるいずれかの疾患または障害として本明細書中では定義される。細胞接着障害にはまた、免疫系または炎症系の不適切な活性化、正常から外れた活性化または正常でない活性化から生じるどのような疾患または障害も含まれる。そのような疾患には、心筋梗塞、細菌感染症またはウイルス感染症、転移性状態(例えば、ガン)が含まれるが、これらに限定されない。本発明はさらに、LXRアゴニストまたはApoEポリペプチドを投与することによって細胞接着障害を処置するための方法を特徴とする。
ために、または、ガンの再発を防止するために使用することが含まれる。
481、190~194)。多数の転移調節性miRNAによるただ1つだけの遺伝子の収斂的調節のための役割がよりにおわされる。転移性進行の堅固な抑制因子として作用した重要な遺伝子が存在したならば、このシナリオが現れるであろう。多数のmiRNAによるこの遺伝子の収斂的かつ協同的な標的化により、そのような重要な転移抑制因子遺伝子の最大のサイレンシングが達成され得るかもしれない。このシナリオは、遺伝的欠失とは対照的に、標的遺伝子の完全な喪失が細胞によって許容され得ないかもしれない場合に認められるかもしれず、この遺伝子は、例えば、代謝作用を媒介するために低いレベルで要求されるであろうと思われる。この可能性を考えれば、協同的な転移促進因子miRNAについての探索により、転移抑制のために非常に重要である新規な遺伝子が発見されるかもしれず、また、転移防止のためのより効果的な処置に対する治療的洞察がもたらされるかもしれない。
APOE-アミノ酸配列(配列番号2)
(下線が施された残基136~残基150はApoEのLRP結合ドメインを表す)
DNAJA4イソ型1-RNA配列(配列番号3)
DNAJA4イソ型1-アミノ酸配列(配列番号4)
DNAJA4イソ型2-RNA配列(配列番号5)
DNAJA4イソ型2-アミノ酸配列(配列番号6)
DNAJA4イソ型3-RNA配列(配列番号7)
DNAJA4イソ型3-アミノ酸配列(配列番号8)
LRP1-RNA配列(配列番号9)
LRP1-アミノ酸配列(配列番号10)
LRP8イソ型1-RNA配列(配列番号11)
LRP8イソ型1-アミノ酸配列(配列番号12)
LRP8イソ型2-RNA配列(配列番号13)
LRP8イソ型2-アミノ酸配列(配列番号14)
LRP8イソ型3-RNA配列(配列番号15)
LRP8イソ型3-アミノ酸配列(配列番号16)
LRP8イソ型4-RNA配列(配列番号17)
LRP8イソ型4-アミノ酸配列(配列番号18)
CTGF-RNA配列(配列番号19)
CTGF-アミノ酸配列(配列番号20)
LXR-aイソ型1:RNA配列(配列番号21)
LXR-a(NR1H3)イソ型1:アミノ酸配列(配列番号22)
LXR-a(NR1H3)イソ型2:RNA配列(配列番号23)
LXR-a(NR1H3)イソ型2:アミノ酸配列(配列番号24)
LXR-a(NR1H3)イソ型3:RNA配列(配列番号25)
LXR-a(NR1H3)イソ型3:アミノ酸配列(配列番号26)
LXR-a(NR1H3)イソ型4:RNA配列(配列番号27)
LXR-a(NR1H3)イソ型4:アミノ酸配列(配列番号28)
LXR-b(NR1H2)イソ型1:RNA配列(配列番号29)
LXR-b(NR1H2)イソ型1:アミノ酸配列(配列番号30)
LXR-b(NR1H2)イソ型2:RNA配列(配列番号31)
LXR-b(NR1H2)イソ型2:アミノ酸配列(配列番号32)
has-miR-199a-1配列(配列番号33)
GCCAACCCAGUGUUCAGACUACCUGUUCAGGAGGCUCUCAAUGUGUACAGUAGUCUGCACAUUGGUUAGGC
has-miR-199a-2配列(配列番号34)
AGGAAGCUUCUGGAGAUCCUGCUCCGUCGCCCCAGUGUUCAGACUACCUGUUCAGGACAAUGCCGUUGUACAGUAGUCUGCACAUUGGUUAGACUGGGCAAGGGAGAGCA
has-miR-1908配列(配列番号35)
CGGGAAUGCCGCGGCGGGGACGGCGAUUGGUCCGUAUGUGUGGUGCCACCGGCCGCCGGCUCCGCCCCGGCCCCCGCCCC
has-miR-7-1配列(配列番号36)
UUGGAUGUUGGCCUAGUUCUGUGUGGAAGACUAGUGAUUUUGUUGUUUUUAGAUAACUAAAUCGACAACAAAUCACAGUCUGCCAUAUGGCACAGGCCAUGCCUCUACAG
has-miR-7-2配列(配列番号37)
CUGGAUACAGAGUGGACCGGCUGGCCCCAUCUGGAAGACUAGUGAUUUUGUUGUUGUCUUACUGCGCUCAACAACAAAUCCCAGUCUACCUAAUGGUGCCAGCCAUCGCA
has-miR-7-3配列(配列番号38)
AGAUUAGAGUGGCUGUGGUCUAGUGCUGUGUGGAAGACUAGUGAUUUUGUUGUUCUGAUGUACUACGACAACAAGUCACAGCCGGCCUCAUAGCGCAGACUCCCUUCGAC
miR-Zip 199a-3p配列(配列番号39)
GATCCGACAGTAGCCTGCACATTAGTCACTTCCTGTCAGTAACCAATGTGCAGACTACTGTTTTTTGAATT
miR-Zip 199a-5p配列(配列番号40)
GATCCGCCCAGTGCTCAGACTACCCGTGCCTTCCTGTCAGGAACAGGTAGTCTGAACACTGGGTTTTTGAATT
miR-Zip 1908配列(配列番号41)
GATCCGCGGCGGGAACGGCGATCGGCCCTTCCTGTCAGGACCAATCGCCGTCCCCGCCGTTTTTGAATT
miR-Zip 7配列(配列番号42)
GATCCGTGGAAGATTAGTGAGTTTATTATCTTCCTGTCAGACAACAAAATCACTAGTCTTCCATTTTTGAATT
このネットワークのメンバーは、転移性メラノーマを処置するための標的として使用することができる。加えて、これらのメンバーは、対象が転移性メラノーマを有するかどうか、または、転移性メラノーマを有する危険性があるかどうかを決定するためのバイオマーカーとして、あるいは、そのような障害を有する患者の予後を明らかにするための、または、そのような障害を有する患者の監視のためのバイオマーカーとして使用することができる。したがって、本発明は、転移性メラノーマを、これらのメンバーの1つまたは複数を標的化することによって処置する方法、当該ガンを阻害するための治療療法の効力を明らかにする方法、および、抗ガン剤を特定する方法を包含する。また、対象が転移性メラノーマを有するかどうか、または、転移性メラノーマを有する危険性があるかどうかを診断する方法、および、当該障害を発症する危険性があると考えられる対象をスクリーニングする方法も提供される。本発明はまた、上述の方法を行うために好適である様々なキットを包含する。
用語「ポリペプチドまたはペプチド」には、本明細書中で使用される場合、ネットワークに関与する特定のドメインまたは部分を有する、上述の転移抑制因子のいずれかの組換えまたは合成により製造された融合体またはキメラ体が含まれる。これらの用語はまた、ペプチドのアナログ、フラグメント、伸長物または誘導体(例えば、原核生物細胞における発現のために有用である付加されたアミノ末端メチオニンを有するもの)を包含する。
まれる。保存的置換の例には、1つの非極性(疎水性)残基(例えば、アラニン、イソロイシン、バリン、ロイシンまたはメチオニンなど)を別の非極性(疎水性)残基の代わりに使用すること、1つの極性(親水性)残基を別の極性(親水性)残基の代わりに使用すること、例えば、アルギニンとリシンとの間、グルタミンとアスパラギンとの間、グリシンとセリンとの間などにおける置換、1つの塩基性残基(例えば、リシン、アルギニンまたはヒスチジンなど)を別の塩基性残基の代わりに使用すること、または、1つの酸性基(例えば、アスパラギン酸またはグルタミン酸など)を別の酸性残基の代わりに使用することが含まれる。
本発明の方法は、LXRアゴニストを転移の防止および処置のために投与することを含
むことができる。LXRアゴニストは、下記に示される式I、式II、式IIIまたは式IVに従う化合物であることが可能である。
Arはアリール基である;
R1は、-OH、-CO2H、-O-(C1~C7)アルキル、-OC(O)-、-(C1~C7)アルキル、-O-(C1~C7)ヘテロアルキル、-OC(O)-(C1~C7)ヘテロアルキル、-NH2、-NH(C1~C7)アルキル、-N((C1~C7)アルキル)2および-NH-S(O)2(C1~C5)アルキルからなる群から選択されるものである;
R2は、(C1~C7)アルキル、(C1~C7)ヘテロアルキル、アリールおよびアリール(C1~C7)アルキルからなる群から選択されるものである;
X1、X2、X3、X4、X5およびX6はそれぞれが独立して、H、(C1~C5)アルキル、(C1~C5)ヘテロアルキル、FおよびClからなる群から選択されるものであり、但し、X1~X6のうちの最大でも3つが、H、(C1~C5)アルキル、(C1~C5)ヘテロアルキルである;かつ
Yは、-N(R12)S(O)m-、-N(R12)S(O)mN(R13)-、-N(R12)C(O)-、-N(R12)C(O)N(R13)-、-N(R12)C(S)-および-N(R12)C(O)O-からなる群から選択される二価の連結基であり、
但し、R12およびR13はそれぞれが独立して、H、(C1~C7)アルキル、(C1~C7)ヘテロアルキル、アリールおよびアリール(C1~C7)アルキルからなる群から選択され、また、必要に応じて、Yが-N(R12)S(O)m-または-N(R12)S(O)mN(R13)-であるときには、R12は、ArまたはR2に対する共有結合による結合を介してArまたはR2にそれぞれ融合する5員環または6員環を形成し、この場合、下付き添え字mは1~2の整数である;
但し、R1がOHであり、かつ、-Y-R2が-N(R12)S(O)m-R2または-N(R12)C(O)N(R13)-R2であり、Arに結合する第四級炭素に対してパラ位に結合するとき、および、R2が、フェニル、ベンジルまたはベンゾイルであるときには、i)R12またはR13の少なくとも1つが水素以外であり、かつ、電子吸引性置換基を含有し、あるいは、ii)R2が、アミノ、アセトアミド、ジ(C1~C7)アルキルアミノ、(C1~C7)アルキルアミノ、ハロゲン、ヒドロキシ、ニトロまたは(C1~C7)アルキルとは異なる成分により置換され、あるいは、iii)R2のベンゼン環部分が、Y基に加えて、または、Yに対する結合点に加えて少なくとも3つの独立して選択された基により置換される。
OHである。
R1はHである;
X1は、結合、C1~C5アルキル、-C(O)-、-C(=CR8R9)-、-O-、-S(O)t-、-NR8-、-CR8R9-、-CHR23、-CR8(CR9)-、-C(CR8)2-、-CR8(OC(O)R9)-、-C=NOR9-、-C(O)NR8-、-CH2O-、-CH2S-、-CH2NR8-、-OCH2-、-SCH2-、-NR8CH2-または
R2は、H、C1~C6アルキル、C2~C6アルケニル、C2~C6アルキニル、C3~C6シクロアルキル、-CH2OH、C7~C11アリールアルキル、フェニル、ナ
フチル、C1~C3ペルフルオロアルキル、CN、C(O)NH2、CO2R12、または、C1~C3アルキル、C2~C4アルケニル、C2~C4アルキニル、C1~C3アルコキシ、C1~C3ペルフルオロアルキル、ハロゲン、-NO2、-NR8R9、-CN、-OH、および、1個~5個のフッ素により置換されるC1~C3アルキルから独立して選択される群の1つまたは複数によって独立して置換されるフェニルであり、あるいは、R2は、ピリジン、チオフェン、ベンゾイソオキサゾール、ベンゾチオフェン、オキサジアゾール、ピロール、ピラゾール、イミダゾールおよびフランからなる群から選択される複素環であり、この場合、それらのそれぞれが場合により、C1~C3アルキル、C1~C3アルコキシ、C1~C3ペルフルオロアルキル、ハロゲン、-NO2、-NR8R9、-CN、および、1個~5個のフッ素により置換されるC1~C3アルキルから独立して選択される1つ~3つの基により置換される場合がある;
X2は結合または-CH2-である;
R3は、フェニル、ナフチル、あるいは、C1~C3アルキル、ヒドロキシ、フェニル、アシル、ハロゲン、-NH2、-CN、-NO2、C1~C3アルコキシ、C1~C3ペルフルオロアルキル、1個~5個のフッ素により置換されるC1~C3アルキル、NR14R15、-C(O)R10、
-C(O)NR10R11、-C(O)NR11A、-C≡CR8、-CH=CHR8、-WA、-C≡CA、-CH=CHA、-WYA、-WYNR11-A、
-WYR10、-WY(CH2)jA、-WCHR11(CH2)jA、-W(CH2)jA、-W(CH2)jR10、-CHR11W(CH2)jR10、
-CHR11W(CH2)jA、-CHR11NR12YA、-CHR11NR12YR10、ピロール、-W(CH2)jA(CH2)kD(CH2)pZ、
-W(CR18R19)A(CH2)kD(CH2)pZ、-(CH2)jWA(CH2)kD(CH2)pZ、-CH=CHA(CH2)kD(CH2)pZ、-C≡CA(CH2)kD(CH2)pZ、-W(CH2)jC≡CA(CH2)kD(CH2)pZおよび-W(CH2)jZから独立して選択される1つ~4つの基によって独立して置換されるフェニルまたはナフチルであり、
あるいは、R3は、ピリミジン、チオフェン、フラン、ベンゾチオフェン、インドール、ベンゾフラン、ベンゾイミダゾール、ベンゾチアゾール、ベンゾオキサゾールおよびキノリンから選択される複素環であり、この場合、それらのそれぞれが場合により、C1~C3アルキル、C1~C3アルコキシ、ヒドロキシ、フェニル、アシル、ハロゲン、-NH2、-CN、-NO2、C1~C3ペルフルオロアルキル、1個~5個のフッ素により置換されるC1~C3アルキル、-C(O)R10、-C(O)NR10R11、-C(O)NR11A、-C≡CR8、-CH=CHR8、-WA、-C≡CA、-CH=CHA、-WYA、-WYR10、-WY(CH2)jA、
-W(CH2)jA、-W(CH2)jR10、-CHR11W(CH2)jR10、-CHR11W(CH2)jA、-CHR11NR12YA、-CHR11NR12YR10、
-WCHR11(CH2)jA、-W(CH2)jA(CH2)kD(CH2)pZ、-W(CR18R19)A(CH2)kD(CH2)pZ、-(CH2)jWA(CH2)kD(CH2)pZ、-CH=CHA(CH2)kD(CH2)pZ、-C≡CA(CH2)kD(CH2)pZ、-W(CH2)jC≡CA(CH2)kD(CH2)pZおよび-W(CH2)jZ
から独立して選択される1つ~3つの基により置換される場合がある;
Wは、結合、-O-、-S-、-S(O)-、-S(O)2-、-NR11-または-N(COR12)-である;
Yは、-CO-、-S(O)2-、-CONR13、-CONR13CO-、-CONR13SO2-、-C(NCN)-、-CSNR13、-C(NH)NR13または-C(O)O-である;
jは0~3である;
kは0~3である;
tは0~2である;
Dは、結合、-CH=CH-、-C≡C-、-C=、-C(O)-、フェニル、-O-、-NH-、-S-、-CHR14-、-CR14R15-、-OCHR14、-OCR14R15-または-CH(OH)CH(OH)-である;
pは0~3である;
Zは、-CO2R11、-CONR10R11、-C(NR10)NR11R12、-CONH2NH2、-CN、-CH2OH、-NR16R17、フェニル、CONHCH(R20)COR12、フタルイミド、ピロリジン-2,5ジオン、チアゾリジン-2,4-ジオン、テトラゾリル、ピロール、インドール、オキサゾール、2-チオキソ-1,3-チアゾリニン-4-オン、C1~C7アミン、C3~C7環状アミン、または、1個~2個のOH基により置換されるC1~C3アルキルであり、但し、前記ピロールは場合により、-CO2CH3、-CO2H、-COCH3、-CONH2および-CNからなる群から独立して選択される1つまたは2つの置換基により置換され、
前記C1~C7アミンは場合により、-OH、ハロゲン、-OCH3および-C≡CHからなる群から独立して選択される1つまたは2つの置換基により置換され、
前記フェニルは場合により、CO2R11により置換され、かつ、前記C3~C7環状アミンは場合により、-OH、-CH2OH、C1~C3アルキル、-CH2OCH3、-CO2CH3および-CONH2からなる群から独立して選択される1つまたは2つの置換基により置換され、かつ、前記オキサゾールは場合により、CH2CO2R11により置換される;
Aは、フェニル、ナフチル、テトラヒドロナフチル、インダンまたはビフェニルであり、この場合、それらのそれぞれが場合により、ハロゲン、C1~C3アルキル、C2~C4アルケニル、C2~C4アルキニル、アシル、ヒドロキシ、ハロゲン、-CN、-NO2、-CO2R11、-CH2CO2R11、フェニル、C1~C3ペルフルオロアルコキシ、C1~C3ペルフルオロアルキル、-NR10R11、-CH2NR10R11、-SR11、1個~5個のフッ素により置換されるC1~C6アルキル、1個~2個のOH基により置換されるC1~C3アルキル、1個~5個のフッ素により場合により置換されるC1~C6アルコキシ、または、1個~2個のCF3基により場合により置換されるフェノキシから独立して選択される1つ~4つの基により置換される場合がある;あるいは
Aは、ピロール、ピリジン、ピリジン-N-オキシド、ピリミジン、ピラゾール、チオフェン、フラン、キノリン、オキサゾール、チアゾール、イミダゾール、イソオキサゾール、インドール、ベンゾ[1,3]-ジオキソール、ベンゾ[1,2,5]-オキソジアゾール、イソクロメン-1-オン、ベンゾチオフェン、ベンゾフラン、2,3-ジ-5ヒドロベンゾ[1,4]-ジオキシン、ビテイニル、キナゾリン-2,4-9[3H]ジオンおよび3-H-イソベンゾフラン-1-オンから選択される複素環であり、この場合、それらのそれぞれが場合により、ハロゲン、C1~C3アルキル、アシル、ヒドロキシ、-CN、-NO2、C1~C3ペルフルオロアルキル、-NR10R11、-CH2NR10R11、-SR11、1個~5個のフッ素により置換されるC1~C3アルキル、および、1個~5個のフッ素により場合により置換されるC1~C3アルコキシから独立して選択される1つ~3つの基により置換される場合がある;
R4、R5およびR6はそれぞれが独立して、-Hまたは-Fである;
R7は、C1~C4アルキル、C1~C4ペルフルオロアルキル、ハロゲン、-NO2、-CN、フェニル、あるいは、ハロゲン、C1~C2アルキルおよびOHから独立して選択される1つまたは2つの基により置換されるフェニルである;
但し、X1R2が水素を形成するならば、R3は、
(a)-W(CH2)jA(CH2)kD(CH2)pZ、-W(CR18R19)A(CH2)kD(CH2)pZ、-(CH2)jWA(CH2)kD(CH2)pZ、-CH=CHA(CH2)kD(CH2)pZ、-C≡CA(CH2)kD(CH2)pZま
たは-W(CH2)jC≡CA(CH2)kD(CH2)pZによって置換されるフェニル(但し、フェニル成分はさらに場合により、C1~C2アルキル、C1~C2ペルフルオロアルキル、ハロゲンおよびCNから独立して選択される1つまたは2つの基により置換される);および
(b)ピリミジン、チオフェンおよびフランから選択される複素環(但し、これらのそれぞれが、-W(CH2)jA(CH2)kD(CH2)pZ、-W(CR18R19)A(CH2)kD(CH2)pZ、-(CH2)jWA(CH2)kD(CH2)pZ、-CH=CHA(CH2)kD(CH2)pZ、-C≡CA(CH2)kD(CH2)pZまたは-W(CH2)jC≡CA(CH2)kD(CH2)pZのうちの1つによって置換される)
から選択される;
それぞれのR8は独立して、-HまたはC1~C3アルキルである;
それぞれのR9は独立して、-HまたはC1~C3アルキルである;
それぞれのR10は独立して、-H、-CH、C1~C3アルコキシ、C1~C7アルキル、C3~C7アルケニル、C3~C7アルキニル、C3~C7シクロアルキル、-CH2CH2OCH3、2-メチル-テトラヒドロ-フラン、2-メチル-テトラヒドロ-ピラン、4-メチル-ピペリジン、モルホリン、ピロリジン、あるいは、1個または2個のC1~C3アルコキシ基により場合により置換されるフェニルであり、但し、前記C1~C7アルキルは場合により、C1~C3アルコキシ、C1~C3チオアルコキシおよびCNから独立して置換される1つ、2つまたは3つの基により置換される;
それぞれのR11は独立して、-H、C1~C3アルキルまたはR22であり、あるいは、R10およびR11は、同じ原子に結合するとき、前記原子と一緒になって、
C1~C3アルキル、OHおよびC1~C3アルコキシから独立して選択される1つまたは2つの基により場合により置換される5員~7員の飽和環、あるいは、1個または2個のヘテロ原子を含有し、C1~C3アルキル、OHおよびC1~C3アルコキシから独立して選択される1つまたは2つの基によって場合により置換される5員~7員の環
を形成する:
それぞれのR12は独立して、-HまたはC1~C3アルキルである;
それぞれのR13は独立して、-HまたはC1~C3アルキルである;
それぞれのR14およびR15は独立して、C1~C7アルキル、C3~C8シクロアルキル、C2~C7アルケニル、C2~C7アルキニル、-CH、-F、C7~C14アリールアルキルであり、但し、前記アリールアルキルは場合により、NO2、C1~C6アルキル、C1~C3ペルハロアルキル、ハロゲン、CH2CO2R11、フェニルおよびC1~C3アルコキシから独立して選択される1つ~3つの基により置換され、あるいは、R12およびR15は、それらが結合する原子と一緒になって、3員~7員の飽和環を形成することができる;
それぞれのR16およびR17は独立して、水素、C1~C3アルキル、C1~C3アルケニル、C1~C3アルキニル、フェニル、ベンジルまたはC3~C8シクロアルキルであり、但し、前記C1~C3アルキルは場合により、1つのOH基により置換され、かつ、前記ベンジルは場合により、C1~C3アルキルおよびC1~C3アルコキシから選択される1つ~3つの基により置換され、あるいは、R16およびR17は、それらが結合する原子と一緒になって、C1~C3アルキル、-OH、CH2OH、-CH2OCH3、-CO2CH3および-CONH2からなる群から独立して選択される1つまたは2つの置換基により場合により置換される3員~8員の複素環を形成することができる;
それぞれのR18およびR19は独立して、C1~C3アルキルである;
それぞれのR20は独立して、H、フェニル、または、天然に存在するアルファアミノ酸の側鎖である;
それぞれのR22は独立して、CH2COOHにより場合により置換されるアリールアルキルである;かつ
それぞれのR23はフェニルである)
またはその医薬的に許容される塩。
Xは、水素、C1~C8アルキル、ハロ、-OR10、-NR10R11、ニトロ、シアノ、-COOR10または-COR10から選択される;
Zは、CH、CR3またはNであり、但し、ZがCHまたはCR3であるときには、kは0~4であり、かつ、tは0または1であり、また、ZがNであるときには、kは0~3であり、かつ、tは0である;
Yは、-O-、-S-、-N(R12)-および-C(R4)(R5)-から選択される;
W1は、C1~C6アルキル、C0~C6アルキル、C3~C6シクロアルキル、アリールおよびHetから選択され、但し、前記C1~C8アルキル、C3~C8シクロアルキル、ArおよびHetは場合により非置換であるか、あるいは、ハロ、シアノ、ニトロ、C1~C6アルキル、C3~C6アルケニル、C3~C6アルキニル、-C0~C6アルキル-CO2R12、-C0~C6アルキル-C(O)SR12、-C0~C6アルキル-CONR13R14、-C0~C6アルキル-COR15、-C0~C6アルキル-NR13R14、-C0~C6アルキル-SR12、-C0~C6アルキル-OR12、-C0~C6アルキル-SO3H、-C0~C6アルキル-SO2NR13R14、-C0~C6アルキル-SO2R12、-C0~C6アルキル-SOR15、-C0~C6アルキルOCOR15、-C0~C6アルキル-OC(O)NR13R14、-C0~C6アルキル-OC(O)OR15、-C0~C6アルキル-NR13C(O)OR15、-C0~C6アルキル-NR13C(O)NR13R14および-C0~C6アルキル-NR13COR15から独立して選択される1つまたは複数の基により置換され、この場合、前記C1~C6アルキルは場合により非置換であるか、あるいは、1つまたは複数のハロ置換基によって置換される;
W2は、H、ハロ、C1~C6アルキル、C2~C6アルケニル、C2~C6アルキニル、-C0~C6アルキル-NR13R14、-C0~C6アルキル-SR12、-C0~C6アルキル-OR12、-C0~C6アルキルCO2R12、-C0~C6アルキル-C(O)SR12、-C0~C6アルキルCONR13R14、-C0~C6アルキル-COR15、-C0~C6アルキルOCOR15、-C0~C6アルキル-OCONR13R14、-C0~C6アルキル-NR13CONR13R14、-C0~C6アルキル-NR13COR15、-C0~C6アルキル-Het、-C0~C6アルキル-Arおよび-C0~C6アルキル-C3~C7シクロアルキルから選択され、但し、前記C1~C6アルキルは場合により非置換であるか、あるいは、1つまたは複数のハロ置換基によって置換され、かつ、前記-C0~C6アルキル-Het、-C0~C6アルキル-Arおよび-C0~C6アルキル-C3~C7シクロアルキルのC3~C7シクロアルキル部分、Ar部分およびHet部分は場合により非置換であるか、あるいは、ハロ、シアノ、ニトロ、C1~C6アルキル、C3~C6アルケニル、C3~C6アルキニル、-C0
~C6アルキル-CO2R12、-C0~C6アルキル-C(O)SR12、-C0~C6アルキル-CONR13R14、-C0~C6アルキル-COR15、-C0~C6アルキル-NR13R14、-C0~C6アルキル-SR12、-C0~C6アルキル-OR12、-C0~C6アルキル-SO3H、-C0~C6アルキル-SO2NR13R14、-C0~C6アルキル-SO2R12、-C0~C6アルキル-SOR15、-C0~C6アルキル-OCOR15、-C0~C6アルキル-OC(O)NR13R14、-C0~C6アルキル-OC(O)OR15、-C0~C6アルキル-NR13C(O)OR15、-C0~C6アルキル-NR13C(O)NR13R14および-C0~C6アルキル-NR13COR15から独立して選択される1つまたは複数の基により置換され、この場合、前記C1~C6アルキルは場合により非置換であるか、あるいは、1つまたは複数のハロ置換基によって置換される;
W3は、H、ハロ、C1~C6アルキル、-C0~C6アルキル-NR13R14、-C0~C6アルキルSR12、-C0~C6アルキル-OR12、-C0~C6アルキル-CO2R12、-C0~C6アルキル-C(O)SR12、-C0~C6アルキル-CONR13R14、
-C0~C6アルキル-COR15、-C0~C6アルキル-OCOR15、-C0~C6アルキル-OCONR13R14、-C0~C6アルキルNR13CONR13R14、
-C0~C6アルキル-NR13COR15、-C0~C6アルキル-Het、-C1~C6アルキル-Arおよび-C1~C6アルキル-C3~C7シクロアルキルからなる群から選択され、
但し、前記C1~C6アルキルは場合により非置換であるか、あるいは、1つまたは複数のハロ置換基によって置換される;
Qは、C3~C8シクロアルキル、ArおよびHetから選択され、但し、前記C3~C8シクロアルキル、ArおよびHetは場合により非置換であるか、あるいは、ハロ、シアノ、ニトロ、C1~C6アルキル、C3~C6アルケニル、C3~C6アルキニル、-C0~C6アルキルCO2R12、-C0~C6アルキル-C(O)SR12、-C0~C6アルキルCONR13R14、-C0~C6アルキル-COR15、-C0~C6アルキルNR13R14、-C0~C6アルキル-SR12、-C0~C6アルキル-OR12、-C0~C6アルキル-SO3H、-C0~C6アルキル-SO2NR13R14、-C0~C6アルキル-SO2R12、-C0~C6アルキル-SOR15、-C0~C6アルキル-OCOR15、-C0~C6アルキル-OC(O)NR13R14、-C0~C6アルキル-OC(O)OR15、-C0~C6アルキルNR13C(O)OR15、-C0~C6アルキル-NR13C(O)NR13R14および-C0~C6アルキル-NR13COR15から独立して選択される1つまたは複数の基により置換され、この場合、前記C1C6アルキルは場合により非置換であるか、あるいは、1つまたは複数のハロ置換基によって置換される;
pは0~8である;
nは2~8である;
mは0または1である;
qは0または1である;
tは0または1である;
それぞれのR1およびR2は独立して、H、ハロ、C1~C6アルキル、C3~C6アルケニル、C3~C6アルキニル、-C0~C6アルキル-NR13R14、-C0~C6アルキル-OR12、-C0~C6アルキル-SR12、-C1~C6アルキル-Het、-C1~C6アルキル-Arおよび-C1~C6アルキル-C3~C7シクロアルキルから選択されるか、あるいは、R1およびR2は、それらが結合する炭素と一緒になって、3員~5員の炭素環式環または複素環式環を形成し、この場合、前記複素環式環は、N、OおよびSから選択される1つまたは複数のヘテロ原子を含有し、但し、前記C1~C6アルキルのいずれもが場合により非置換であるか、あるいは、1つまたは複数のハロ
置換基によって置換される;
それぞれのR3は同じまたは異なり、独立して、ハロ、シアノ、ニトロ、C1~C6アルキル、C3~C6アルケニル、C3~C6アルキニル、-C0~C6アルキル-Ar、-C0~C6アルキル-Het、-C0~C6アルキル-C3~C7シクロアルキル、-C0~C6アルキル-CO2R12、-C0~C6アルキル-C(O)SR12、-C0~C6アルキル-CONR13R14、-C0~C6アルキル-COR15、-C0~C6アルキル-NR13R14、-C0~C6アルキル-SR12、-C0~C6アルキル-OR12、-C0~C6アルキル-SO3H、-C0~C6アルキルSO2NR13R14、-C0~C6アルキル-SO2R12、-C0~C6アルキルSOR15、-C0~C6アルキル-OCOR15、-C0~C6アルキル-OC(O)NR13R14、-C0~C6アルキル-OC(O)OR15、-C0~C6アルキル-NR13C(O)OR15、-C0~C6アルキル-NR13C(O)NR13R14および-C0~C6アルキル-NR13COR15から選択され、但し、前記C1~C6アルキルは場合により非置換であるか、あるいは、1つまたは複数のハロ置換基によって置換される;
それぞれのR4およびR5は独立して、H、ハロ、C1~C6アルキル、-C0~C6アルキル-Het、-C0~C6アルキル-Arおよび-C0~C6アルキル-C3~C7シクロアルキルから選択される;
R6およびR7はそれぞれが独立して、H、ハロ、C1~C6アルキル、-C0~C6アルキル-Het、-C0~C6アルキル-Arおよび-C0~C6アルキル-C3~C7シクロアルキルから選択される;
R8およびR9はそれぞれが独立して、H、ハロ、C1~C6アルキル、-C0~C6アルキル-Het、-C0~C6アルキル-Arおよび-C0~C6アルキル-C3~C7シクロアルキルから選択される;
R10およびR11はそれぞれが独立して、H、C1~C12アルキル、C3~C12アルケニル、C3~C12アルキニル、
-C0~C8アルキル-Ar、-C0~C8アルキル-Het、-C0~C8アルキル-C3~C7シクロアルキル、-C0~C8アルキル-O-Ar、-C0~C8アルキル-O-Het、
-C0~C8アルキル-O-C3~C7シクロアルキル、-C0~C8アルキル-S(O)x-C0~C6アルキル、-C0~C8アルキル-S(O)x-Ar、-C0~C8アルキル-S(O)x-Het、-C0~C8アルキル-S(O)x-C3~C7シクロアルキル、-C0~C8アルキル-NH-Ar、-C0~C8アルキル-NH-Het、-C0~C8アルキル-NH-C3~C7シクロアルキル、-C0~C8アルキル-N(C1~C4アルキル)-Ar、-C0~C8アルキル-N(C1~C4アルキル)-Het、-C0~C8アルキル-N(C1~C4アルキル-C3~C7シクロアルキル、-C0~C8アルキル-Ar、-C0~C8アルキル-Hetおよび-C0~C8アルキル-C3~C7シクロアルキルから選択され、この場合、xは、0、1または2であり、
あるいは、R10およびR11は、それらが結合する窒素と一緒になって、N、OおよびSから選択される1つまたは複数のさらなるヘテロ原子を場合により含有する4員~7員の複素環式環を形成し、但し、前記C1~C12アルキル、C3~C12アルケニルまたはC3~C12アルキニルは場合により、ハロ、-OH、-SH、-NH2、-NH(非置換C1~C6アルキル)、-N(非置換C1~C6アルキル)(非置換C1~C6アルキル)、非置換の-OC1~C6アルキル、-CO2H、-CO2(非置換C1~C6アルキル)、-CONH2、-CONH(非置換C1~C6アルキル)、-CON(非置換C1~C6アルキル)(非置換C1~C6アルキル)、-SO3H、-SO2NH2、-SO2NH(非置換C1~C6アルキル)および-SO2N(非置換C1~C6アルキル)(非置換C1~C6アルキル)の群から独立して選択される置換基の1つまたは複数によって置換される;
R12は、H、C1~C6アルキル、C3~C6アルケニル、C3~C6アルキニル、-C0~C6アルキル-Ar、-C0~C6アルキル-Hetおよび-C0~C6アルキ
ル-C3~C7シクロアルキルから選択される;
それぞれのR13およびそれぞれのR14は独立して、H、C1~C6アルキル、C3~C6アルケニル、C3~C6アルキニル、-C0~C6アルキル-Ar、-C0~C6アルキル-Hetおよび-C0~C6アルキル-C3~C7シクロアルキルから選択され、あるいは、R13およびR14は、それらが結合する窒素と一緒になって、N、OおよびSから選択される1つまたは複数のさらなるヘテロ原子を場合により含有する4員~7員の複素環式環を形成する;
R15は、C1~C6アルキル、C3~C6アルケニル、C3~C6アルキニル、-C0~C6アルキル-Ar、-C0~C6アルキル-Hetおよび-C0~C6アルキル-C3~C7シクロアルキルから選択される)
またはその医薬的に許容される塩。
式IVが下記に示される:
J11は-N=であり、かつ、J21は-CR300-であり、または、J11は-CR200-であり、かつ、J21は=N-である;
R00は、G1、G21またはRNである;
R200は、G1、G21またはRCである;
R300およびR400は独立して、RCまたはQであり、但し、R300、R400およびR500のうちのただ1つだけがQである;
Qは、C3~6シクロアルキル、ヘテロアリールまたはヘテロシクリルであり、それぞれが場合により、1つ~4つのRQにより置換されるか、あるいは、Qは-X-Y-Zであり、但し、それぞれのRQが独立して、アリールオキシ、アラルキルオキシ、アリールオキシアルキル、アリールC0~C6アルキルカルボキシ、C(R110)=C(R110)-COOH、オキソ、=S、-Z、-Y’-Zまたは-X-Y-Zであり、それぞれのRQは場合により、1つ~4つのR80により置換される;
R500は、G1、G21、QまたはRCであり、但し、この場合、R00、R200およびR500のうちのただ1つがG1であり、かつ、R00、N=およびR500のうちのただ1つがG21である;
G21は-J0-K0であり、式中、J0およびK0は独立して、アリールまたはヘテロアリールであり、それぞれが場合により、1つ~4つのRK基により置換され、それぞれのRKが独立して、水素、ハロゲン、CR110=CR110COOR110、ニトロ、-Z、-Y-Zまたは-X-Y-Zである;
G1は-L10-Rであり、但し、L10は、結合、L50、L60、-L50-L60-L50-または-L60-L50-L50-であり、これらの式において、
それぞれのL50が独立して、-[C(R150)2]m-であり、
それぞれのL60が独立して、-CS-、-CO-、-SO2-、-O-、-CON(R110)-、-CONR110N(R110)-、-C(=NR110)-、-C(NOR11)-、-C(=N-N(R110)2)-、-C3~C8シクロアルキル-または-ヘテロシクリル-であり、前記シクロアルキルまたはヘテロシクリルは場合により、1つ~4つのR140基により置換され、あるいは、それぞれのL60が独立して、C2~C6アリジイルであり、前記アリジイル鎖は場合により、-C(R100)2-、-C(R110)2C(R110)z-、-C(R11)C(R110)-、-C(R110)2O-、-C(R110)zNR110-、-C C-、-O-、-S-、-N(RO)CO-、-N(R100)CO2-、-CON(R110)-、-CO-、-CO2-、-OC(=O)-、-OC(=O)N(R100)-、-SO2-、-N(R100)SO2-または-SO2N(R100)によって中断され、
Rが、アリール、ヘテロシクリル、ヘテロアリールまたは-(C3~C6)シクロアルキルであり、但し、Rは場合により、1つ~4つのRAにより置換され、この場合、それぞれのRAが独立して、ハロゲン、ニトロ、ヘテロシクリル、C1~C6アルキル、C2~C6アルケニル、C2~C6アルキニル、C3~C8シクロアルキル、(C3~C8シ
クロアルキル)-C1~C6アルキル-、(C3~C8シクロアルケニル)-C1~C6アルキル-、(C3~C8シクロアルキル)-C1~C6アルケニル-、アリールアルキル、アリールオキシ、アリールC1~6アルコキシ、C1~C6ハロアルキル、SO2R110、OR110、SR110、N3、SOR110、COR110、SO2N(R110)2、SO2NR110COR110、C≡N、C(O)OR110、CON(R110)2、-CON(R110)OR110、OCON(R110)2、-NR110COR110、NR110CON(R110)2、NR110COOR110、-C(=N-OH)R110、-C(=S)N(R110)2、
-S(=O)N(R110)2、-S(=O)OR110、-N(R110)S(=O)2R110、-C(=O)N(R110)N(R110)2、-OC(=O)-R110、-OC(=O)-OR110またはN(R11)2であり、
かつ、それぞれのRAが場合により、独立して-ハロゲン、-C1~C6アルキル、アリールオキシ、C0~6アルキルSO2R110、C0~6アルキルCOOR110、C1~6アルコキシアリール、C1~C6ハロアルキル、
-SO2R110、-OR110、-SR110、-N3、-SO2R110、-COR110、-SO2N(R110)2、-SO2NR110COR110、-C≡N、-C(O)OR110、
-CON(R110)2、-CON(R110)OR110、-OCON(R110)2、-NR110COR110、-NR110CON(R110)2、-NR110COOR110または-N(R110)2である1つ~4つの基により置換される;
RNは-L31-R60であり、但し、L31は、結合、-X3(CHz)n-X3-、-(CH2)m-X3-(CH2)n-または-(CH2)1+w,-Y3-(CH2)w-であり、これらの式において、それぞれのwが独立して、0~5であり、かつ、それぞれのX3が独立して、結合、-C(R110)2-、-C(R110)2C(R110)2-、-C(R110)=C(R110)-、-C≡C-、-CO-、-CS-、-CONR100-、-C(=N)(R100)-、-C(=N-OR110)-、-C[=N-N(R110)2]、-CO2-、-SO2-または-SO2N(R110)-であり、かつ
Y3が、-O-、-S-、-NR70-、-N(R100)CO-、-N(R110)CO2-、-OCO-、-OC(=O)N(R100)-、-NR100CONR100-、-N(R110)SO2-または-NR100CSNR100-であり、
あるいは、L31はC2~C6アリジイル鎖であり、但し、前記アリジイル鎖は場合により、-C(R110)2-、
-C(R110)2C(R110)2-、-C(R110)=C(R110)-、-C(R110)2O-、-C(R110)2NR110-、-C≡C-、-O-、-S-、-N(R100)CO-、
-N(R100)CO2-、-CON(R100)-、-CO-、-CO2-、-O(C=O)-、-O(C=O)N(R110)-、-SO2-、-N(R100)SO2-または-SO2N(R100)-によって中断され、
R60が、C1~C6アルキル、C1~C6ハロアルキル、アリール、C3~C8シクロアルキル、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、-CN、
-C(=O)R110、-C(=O)OR110、-C(=O)N(R110)2、-N(R110)2、-SO2R110、-S(=O)2N(R110)2、-C(=O)N(R110)N(R110)2または-C(=O)N(R11)(OR110)であり、但し、前記アリール、ヘテロアリール、シクロアルキルまたはヘテロシクリルは場合により、1つ~4つのR60aにより置換され、この場合、
それぞれのR60aが独立して、-Z、-Y’-Zまたは-X-Y-Zである;
それぞれのRCは独立して、-L30-R70であり、但し、
それぞれのL30が独立して、結合または-(CH2)m-V10-(CH2)n-であり、式中、
V10は、-C(R110)2-、-C(R110)2C(R110)2、-C(R110)=C(R110)-、-C(R110)2O-、-C(R110)2NR110-、-C≡C-、-O-、
-S-、-NR10-、-N(R100)CO-、-N(R100)CO2-、-OCO-、-CO-、-CS-、-CONR100-、-C(=N-R110)-、-C(=N-OR110)-、
-C[=N-N(R110)2]、-CO2-、-OC(=O)-、-OC(=O)N(R100)-、SO2-、-N(R100)SO2-、-SO2N(R100)-、-NR100CONR100-、-NR100CSNR100-、C3~C6シクロアルキルまたはC3~C6シクロハロアルキルであり、
あるいは、それぞれのL30が独立して、C2~C6アリジイルであり、但し、前記アリジイル鎖は場合により、-C(R110)2-、-C(R110)2C(R110)2-、-C(R110)C(R110)-、-C(R110)2O-、-C(R110)2NR110-、-C≡C-、-O-、-S-、-N(R100)CO-、
-N(R100)CO2-、-NR110-、-CON(R100)-、-CO-、-CO2-、-O(C=O)-、-O(C=O)N(R100)-、-SO2-、-N(R100)SO2-または-SO2N(R100)-によって中断され、
それぞれのR70が独立して、水素、ハロゲン、ニトロ、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、-Z、-Y-Zまたは-X-YZであり、
この場合、前記アリール、ヘテロアリールおよびヘテロシクリルはそれぞれが場合により、1つ~4つのR70aにより置換され、但し、それぞれのR70aが独立し、アリールオキシ、アラルキルオキシ、アリールオキシアルキル、アリールC0~C6アルキルカルボキシ、C(R110)=C(R110)COOH、オキソ、-Z、-Y’-Zまたは-X-Y-Zであり、かつ、それぞれのR70aが場合により、1つ~4つのR80により置換され、但し、それぞれのR80が独立して、ハロゲン、C1~C6アルキル、C1~C6アルコキシ、C1~C8ハロアルキル、C1~C8ハロアルキル(OR110)、C0~C6アルキルOR110、C0~C6アルキルCON(R110)2、C0~C6アルキルCOR110、C0~C6アルキルCOOR110またはC0~C6アルキルSO2R110である;
それぞれのR100は独立して、-R110、-C(=O)R110、-CO2R110または-SO2R110である;
それぞれのR110は独立して、-水素、-C1~C6アルキル、C2~C6アルケニル、-C1~C6アルキニル、-C1~C6ハロアルキルまたは-N(R12)2であり、但し、R110のいずれもが場合により、R120の1つ~4つの基により置換される:
それぞれのR120は独立して、ハロゲン、シアノ、ニトロ、オキソ、-B(OR130)、C0~C6アルキルN(R13)2、C1~C6ハロアルキル、C1~C6アルキル、C1~C6アルコキシ、(C0~C6アルキル)C=O(OR130)、C0~C6アルキルOR130、C0~C6アルキルCOR130、
C0~C6アルキルSO2R130、C0~C6アルキルCON(R13)2、C0~C6アルキルCONR130OR130、C0~C6アルキルSO2N(R130)2、C0~C6アルキルSR130、C0~C6ハロアルキルOR130、C0~C6アルキルCN、-C0~C6アルキN(R13)2、-NR13SO2R13または-OC0~6アルキルCOOR130である;
それぞれのR130は独立して、水素、C1~C6アルキル、C2~C6アルケニルまたはC2~C6アルキニルである;
それぞれのR140は独立して、C1~C6アルキル、C1~C6アルコキシ、ハロゲン、C1~C6ハロアルキル、C0~C6アルキルCON(R110)o、C0~C6アルキルCONR110R10、C0~C6アルキルOR110またはC0~C6アルキルCOOR110である;かつ
それぞれのR150は独立して、水素、ハロゲン、OR130、(C1~C6)アルキルまたは(C1~C6)ハロアルキルであり、但し、
それぞれのアルキルは場合により、それぞれが独立してハロゲン、シアノ、ニトロ、アジド、OR130、C(O)R130、C(O)OR13C(O)N(R130)2、N(R130)2、N(R130)C(O)R130、N(R130)S(O)2R130、-OC(O)OR130、OC(O)N(R130)2、N(R130)C(O)OR130、N(R130)C(O)N(R130)、SR130、S(O)R130、S(O)2R’またはS(O)2N(R130)2である少なくとも1つの基により置換され、あるいは、(同じ原子または異なる原子に結合する)2つのR150は一緒になって、C3~C6シクロアルキルを形成することができる;
それぞれのXは独立して、-O-、-S-または-N(R100)-である;
それぞれのYは独立して、-[C(R150)2]p-または-C2~C6アルケニルであり、但し、pは、1、2、3、4、5または6である;
それぞれのY’は独立して、-[C(R150)2]p-、-C2~C6アルケニルC3~C8シクロアルキルまたはヘテロシクリルであり、但し、前記シクロアルキルまたはヘテロシクリルは場合により、1つ~3つのZ基により置換される:
それぞれのZは独立して、-H、ハロゲン、-OR110、-SR110、-C(=O)R110、-C(=O)OR110、-C(=O)N(R110)2、
-N(R100)2、-N3、-NO2、-C(=N-OH)R110、-C(=S)N(R110)2、-CN、-S(=O)R110、-S(=O)N(R110)2、-S(=O)OR110、
-S(=O)2R110、S(=O)2N(R110)2、-NR110COR110、-N(R110)C(=O)N(R110)2、-N(R110)COOR110、-N(R110)S(=O)2R110、-C(=O)N(R110)N(R110)2、-C(=O)N(R110)(OR110)、-OC(=O)-R110、-OC(=O)-OR110または-OC(=O)-N(R110)2である;かつ
それぞれのmおよびnは独立して、0、1、2、3、4、5または6である。
33、2-(1-(3クロロ-3’-フルオロ-4’-(ヒドロキシメチル)-5’-(メチルスルホニル)ビフェニル-4-イル)-2-(2-(2,6ジクロロフェニル)プロパン-2-イル)-1H-イミダゾール-4-イル)プロパン-2-オール;34、2-(2-(2(2-クロロ-3-フルオロフェニル)プロパン-2-イル)-1-(3’-フルオロ-4’-(ヒドロキシメチル)-5’(メチルスルホニル)ビフェニル-4-イル)-1H-イミダゾール-4-イル)プロパン-2-オール;35、2-(2-(2(2,6-ジクロロフェニル)プロパン-2-イル)-1-(3’-フルオロ-4’-(ヒドロキシメチル)-5’(メチルスルホニル)ビフェニル-4-イル)-1H-イミダゾール-4-イル)プロパン-2-オール;36、2-(2-(2(2,6-ジクロロフェニル)プロパン-2-イル)-1-(3,3’-ジフルオロ-4’-(ヒドロキシメチル)-5’(メチルスルホニル)ビフェニル-4-イル)-1H-イミダゾール-4-イル)プロパン-2-オール;および、37、2-(2-[1(2,6-ジクロロフェニル
)エチル]-1-[3,3’-ジフルオロ-4’-(ヒドロキシメチル)-5’(メチルスルホニル)ビフェニル-4-イル]-1H-イミダゾール-4-イル)プロパン-2-オール。化合物12はまた、WO2010 0138598のEx.9として知られている。化合物38はまた、WO2007 002563のEx.19として知られている。化合物39はまた、WO2012 0135082として知られている。
明細書中で定義されるような置換基を1つ、2つ、3つ、4つ、5つまたは6つ有することができる。
ン、2,9-デカジエニレンおよび3,7-ジメチル-2,6-オクタジエニレンの各置換基が含まれるが、これらに限定されない。
a)1個の窒素原子を有する6員の芳香族(不飽和)複素環式環に縮合する、
b)2個の窒素原子を有する5員または6員の芳香族(不飽和)複素環式環に縮合する、c)1個の窒素原子を1個の酸素原子または1個のイオウ原子のどちらかと一緒に有する5員の芳香族(不飽和)複素環式環に縮合する、あるいは
d)O、NおよびSから選択される1個のヘテロ原子を有する5員の芳香族(不飽和)複素環式環に縮合する
フェニル環、ピリジン環、ピリミジン環またはピリジジン(pyrididine)環が含まれる。
7員の脂環式置換基または複素環式置換基を表すことがあることが理解されるであろう。一般に適用可能な置換基のさらなる例が、下記に示される具体的な実施形態によって例示される。
ジルと呼ばれる。
個、2個、3個または4個のヘテロ原子を含有する、例えば、3員環、4員環、5員環、6員環または7員環である環状のヘテロアルキルまたはヘテロアルケニルを表す。5員環は0~2つの二重結合を有し、6員環および7員環は0~3つの二重結合を有する。用語「ヘテロシクリル」はまた、1つまたは複数の炭素および/またはヘテロ原子が単環式環の2つの非隣接メンバーを架橋する架橋された多環式構造を有する複素環式化合物を表し、例えば、キヌクリジニル基を表す。用語「ヘテロシクリル」には、上記複素環式環のいずれかが、1つ、2つまたは3つの炭素環式環(例えば、アリール環、シクロヘキサン環、シクロヘキセン環、シクロペンタン環、シクロペンテン環)または別の単環式の複素環式環(例えば、インドリル、キノリル、イソキノリル、テトラヒドロキノリル、ベンゾフリルおよびベンゾチエニルなど)に縮合する二環式基、三環式基および四環式基が含まれる。
本明細書中に開示されるように、miR-1908、miR-199a-3p、miR-199a-5pおよびCTGFが、メラノーマにおいて転移性浸潤、内皮動員およびコロニー形成の内因性の転移促進因子として特定され、一方、DNAJA4、ApoE、LRP1、LRP8、LXRおよびmiR7が、同じプロセスの転移抑制因子または転移阻害剤として機能する。加えて、これらのmiRNAがApoEおよび熱ショック因子DNAJA4を収斂的に標的化することが見出された。ガンにより分泌されるApoEは、浸潤および内皮動員を、メラノーマ細胞のLRP1受容体および内皮細胞のLRP8受容体を活性化することによってそれぞれ抑制する。DNAJA4はその結果として、ApoE発現を誘導する。これらのmiRNAは、ヒトでの転移の結末が強く予測するものである。miR-199a-3p、miR-199a-5pおよびmiR-1908を標的化するロックド核酸(LNA)による前処置では、多数の器官への転移が阻害され、一方、これらのLNAの治療的送達では、マウスモデルにおけるヒトメラノーマ細胞の転移が著しく抑制される。
因子の1つまたは複数の発現レベルまたは活性レベルを低下させることによって達成することができる。
上述の転移抑制因子のポリペプチド(例えば、DNAJA4、ApoE、LRP1、LRP8およびLXR)と、これらのポリペプチドをコードする核酸との両方を、本発明を実施するために使用することができる。多くのポリペプチド調製物を使用することができるが、高度に精製または単離されたポリペプチドが好ましい。用語「ペプチド」、用語「ポリペプチド」および用語「タンパク質」は、ポリマーでのアミノ酸残基の配列を記載するために本明細書中では交換可能に使用される。ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質は、希なアミノ酸および合成されたアミノ酸アナログに加えて、標準的な20個の天然に存在するアミノ酸から構成され得る。ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質は、長さまたは翻訳後修飾(例えば、グリコシル化またはリン酸化)にかかわらず、アミノ酸のどのような鎖でも可能である。
ン、バリン、イソロイシン)、および、芳香族側鎖を有するアミノ酸(例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン)が含まれる。したがって、上記ポリペプチド(例えば、配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号8、配列番号10、配列番号12、配列番号14、配列番号16および配列番号18)の1つにおける予測された非必須アミノ酸残基が好ましくは、同じ側鎖集団からの別のアミノ酸残基により置き換えられる。代替では、変異を、例えば、飽和変異誘発などによって配列の全体または一部に沿ってランダムに導入することができ、得られた変異体を、上述のネットワークまたはApoE/LRPシグナル伝達経路をアップレギュレーションすることができ、また、下記において実施例に記載されるように活性を保持する変異体を特定するためにそれぞれの細胞応答を誘発することができるかについてスクリーニングすることができる。
Spring Harbor Press、Cold Spring Harbor、NY、1989)、および、chemical synthesis、Gait,M.J.編(Oligonucleotide Synthesis、IRL Press、Oxford、1984)を調べる場合がある。
ラCPPを介して、完全に合成的なCPPにまで様々な起源とともに存在する。様々なCPPの例がこの技術分野において知られている。例えば、米国特許出願公開第20090099066号および同第20100279918号を参照のこと。CPPは外因性タンパク質を様々な細胞の中に送達できることが知られている。
プロモーターが当業者に知られており、また、市販されている。原核生物宿主および真核生物宿主との使用のための適切なクローニングベクターおよび発現ベクターもまた、Sambrook他(2001、Molecular Cloning:A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Press)に記載されている。
上記で述べられるように、miR-199a-3p、miR-199a-5p、miR-1908またはCTGFの発現レベルまたは活性レベルを低下させる阻害性薬剤を、メラノーマを処置する際に使用することができる。阻害性薬剤(すなわち、阻害剤)は、核酸、ポリペプチド、抗体または小分子化合物であることが可能である。一例において、阻害剤は、転写、mRNA安定性、翻訳、タンパク質安定性/分解、タンパク質修飾および
タンパク質結合のレベルにおいて機能する。
によって触媒される。RNAiを導くために標的RNA配列(例えば、上述のCTGF遺伝子)に対して十分に相補的である配列を有するRNA薬剤は、当該RNA薬剤が、標的RNA配列に対して少なくとも50%の相同性(例えば、50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%、99%または100%の相同性)を有し、その結果、これら2つが、ハイブリダイゼーションし、かつ、標的RNAの破壊をRNAi装置(例えば、RISC複合体)またはRNAiプロセスによって誘発するために互いに十分に相補的であることを意味する。“RNAiを導くために標的RNA配列に対して十分に相補的である配列”を有するRNA薬剤はまた、当該RNA薬剤が、標的RNAの翻訳阻害をRNAi装置またはRNAiプロセスによって誘発するのに十分である配列を有することを意味する。RNA薬剤はまた、標的DNA配列がクロマチンにより沈黙させられるように、標的DNA配列によってコードされる標的RNAに対して十分に相補的である配列を有することができる。別の言い方をすれば、RNA薬剤は、転写型遺伝子サイレンシングを誘導するために、例えば、遺伝子発現を、例えば、クロマチンの構造的変化を標的DNA配列またはその近くにおいて誘導することによって標的DNA配列またはその近くにおいてダウンレギュレーションするのに十分である配列を有する。
おいて有する標的特異的な抗体またはホルモンを使用することによって達成される。当業者は、特異的なポリヌクレオチド配列が、レトロウイルスベクターの標的特異的な送達を可能にするためにレトロウイルスのゲノムに挿入され得るか、または、ウイルスのエンベロープに結合され得ることを認識するであろう。
適切である治療剤の物理的に別個の単位物を示す。しかしながら、本発明の化合物および組成物の1日あたりの総使用が、妥当な医学的判断の範囲内において主治医によって決定されるであろうことが理解されるであろう。どのような患者または生物であれ、特定の患者または生物のための具体的な治療効果的な用量レベルは、処置されている障害および障害の重篤度;用いられる具体的な化合物の抗ガン活性;用いられる具体的な組成物;患者の年齢、体重、全身の健康状態、性別および食事;用いられる具体的な化合物の投与時期、投与経路および排出速度;処置の継続期間;用いられる具体的な化合物との併用で、または同時に使用される薬物;ならびに、医療技術分野において広く知られている同様な要因を含めて様々な要因に依存するであろう。
本発明の範囲内には、好適なキャリアと、上記で記載される治療剤の1つまたは複数とを含有する組成物が含まれる。組成物は、医薬的に許容されるキャリアを含有する医薬組成物、食餌療法に許容される好適なキャリアを含有する食餌療法組成物、または、化粧品に許容されるキャリアを含有する化粧組成物であることが可能である。
するための医薬用キャリアとして利用することができる。医薬的に許容されるキャリアの例には、投薬形体物として使用可能である組成物を達成するための生体適合性のビヒクル、補助剤、添加剤および希釈剤が含まれるが、これらに限定されない。他のキャリアの例には、コロイド状酸化ケイ素、ステアリン酸マグネシウム、セルロース、ラウリル硫酸ナトリウム、および、D&C Yellow #10が含まれる。
Publishing Co.、Easton、Pa.、1980)には、医薬組成物
を配合する際に使用される様々なキャリア、および、その調製のための知られている技術が開示される。どのようなキャリア媒体であれ、従来のキャリア媒体が、例えば、何らかの望ましくない生物学的影響をもたらすか、または、そうでない場合には、医薬組成物の何らかの他の成分と有害な様式で相互作用することなどによって本発明の化合物と不適合性である限りを除いて、その使用は、本発明の範囲内であることが意図される。医薬的に許容されるキャリアとして役立ち得る物質のいくつかの例には、下記の物質が含まれるが、それらに限定されない:糖、例えば、ラクトース、グルコースおよびスクロースなど;デンプン、例えば、トウモロコシデンプンおよびジャガイモデンプンなど;セルロースおよびその誘導体、例えば、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、エチルセルロースおよび酢酸セルロースなど;粉末化トラガカント;麦芽;ゼラチン;タルク;賦形剤、例えば、カカオバターおよび坐薬用ワックスなど;オイル、例えば、ピーナッツ油、綿実油、ベニバナ油、ゴマ油、オリーブ油、トウモロコシ油およびダイズ油など;グリコール、例えば、プロピレングリコールなど;エステル、例えば、オレイン酸エチルおよびラウリン酸エチルなど;寒天;天然リン脂質および合成リン脂質、例えば、ダイズおよび卵黄のホスファチド、レシチン、水素化ダイズレシチン、ジミリストイルレシチン、ジパルミトイルレシチン、ジステアロイルレシチン、ジオレオイルレシチン、ヒドロキシル化レシチン、リゾホスファチジルコリン、カルジオリピン、スフィンゴミエリン、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ジアステアロイル(diastearoyl)ホスファチジルエタノールアミン(DSPE)およびそのペグ化エステル(例えば、DSPE-PEG750およびDSPE-PEG2000など)、ホスファチジン酸、ホスファチジルグリセロールならびにホスファチジルセリンなど。レシチンの好ましい市販規格品には、Phosal(登録商標)またはPhospholipon(登録商標)の商品名で入手可能であるものが含まれ、Phosal 53 MCT、Phosal 50 PG、Phosal 75 SA、Phospholipon 90H、Phospholipon 90G、および、Phospholipon 90 NGが含まれる;ダイズホスファチジルコリン(SoyPC)およびDSPE-PEG2000が特に好ましい;緩衝化剤、例えば、水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウムなど;アルギン酸;パイロジェン非含有水;等張性生理的食塩水;リンゲル液;エチルアルコールおよびリン酸塩緩衝溶液、同様にまた、他の非毒性の適合性滑剤、例えば、ラウリル硫酸ナトリウムおよびステアリン酸マグネシウムなど、同様にまた、着色剤、離型剤、被覆剤、甘味剤、香味剤および芳香剤、保存剤ならびに酸化防止剤もまた、処方者の判断に従って組成物に存在させることができる。
ば、合成されたモノグリセリドまたはジグリセリド)。天然の医薬的に許容されるオイル、例えば、限定されないが、オリーブ油またはひまし油など、それらのポリオキシエチル化体が注射剤の調製において有用であるように、脂肪酸(例えば、限定されないが、オレイン酸など)およびそのグリセリド誘導体が注射剤の調製において有用である。これらのオイル溶液またはオイル懸濁物はまた、長鎖アルコール希釈剤または分散剤(例えば、限定されないが、カルボキシメチルセルロースまたは類似する分散化剤など)を含有することができる。他の一般に使用されている界面活性剤、例えば、限定されないが、各種Tweenもしくは各種Spanまたは他の類似する乳化剤あるいは生物学的利用能強化剤など(これらは、医薬的に許容される固体形態物、液体形態物または他の投薬形態物の製造において一般に使用されるものである)もまた、配合目的のために使用することができる。
いくつかの実施形態において、医薬組成物はさらに、抗増殖活性を有するさらなる化合物を含む場合がある。抗増殖活性を有するさらなる化合物を、表2に示される化合物を含む一群の抗増殖剤から選択することができる。
上記遺伝子は、対象が転移性メラノーマを有するかどうか、または、転移性メラノーマを有する危険性があるかどうかを決定することにおいて使用することができる。代替では、上記遺伝子は、対象におけるそのような障害の予後を決定するために使用することができる。
1つの局面において、本発明は、対象が、内皮動員、ガン細胞浸潤または転移性血管形成によって特徴づけられる転移性メラノーマまたは他の疾患を有するかどうか、あるいは、内皮動員、ガン細胞浸潤または転移性血管形成によって特徴づけられる転移性メラノーマまたは他の疾患に罹りやすいかどうかを決定するための定性的および定量的な情報を提供する。そのような障害を有するか、または、そのような障害を引き起こしやすい対象を、対象から得られる試験サンプルにおける上記遺伝子またはそれらの産物(mRNA、マイクロRNAまたはポリペプチド)の発現レベル、発現パターンまたは発現プロフィルに基づいて決定することができる。別の言い方をすれば、そのような産物を、障害の存在または非存在を示すためのマーカーとして使用することができる。本発明の診断アッセイおよび予後アッセイは、そのような産物の発現レベルを評価するための様々な方法を含む。これらの方法により、障害を検出することができる。例えば、1つまたは複数の促進因子(すなわち、miR-199a-3p、miR-199a-5p、miR-1908およびCTGF)の発現レベルにおける相対的な増大は障害の存在を暗示する。逆に、発現より低いレベルまたは欠如は、障害がないことを暗示する。
NAse阻害剤が場合により、粗サンプルに加えられる。粗細胞溶解物を使用するとき、ゲノムDNAが、サンプルに依存して、1コピー以上の標的配列(例えば、遺伝子)を与え得ることには留意しなければならない。標的配列が1つまたは複数の高発現遺伝子に由来する状況では、ゲノムDNAから生じるシグナルは有意でない場合がある。しかし、低いレベルで発現される遺伝子については、バックグラウンドを、サンプルをDNAseにより処理することによって除くことができ、あるいは、cDNA産物または増幅産物のその後のプライミングのためのスプライスジャンクション部を標的とするプライマーを使用することによって除くことができる。
供する。それによれば、コントロールサンプルにおける対応する遺伝子産物のレベルと比較した場合、生物学的サンプルでの遺伝子産物または遺伝子産物の組合せのレベルにおける変化により、対象はメラノーマを発症する危険性があることが示される。そのようなスクリーニングのために使用される生物学的サンプルには、正常であるか、または、ガン性であることが疑われるかのどちらかである皮膚組織が含まれ得る。メラノーマに関連する1つまたは複数の遺伝子産物のレベルにおける変化を有する対象が、さらなるモニタリングおよび試験のための候補である。そのようなさらなる試験は、組織サンプルの組織学的検査、または、当業者の範囲内である他の技術を含むことができる。
上記で記載される診断方法により、メラノーマを有する対象、または、メラノーマを発症する危険性がある対象を特定することができる。加えて、生物学的サンプルでの、例えば、末梢血サンプルでの上述の遺伝子の発現レベルおよび/または発現傾向における変化は、回復の早期徴候またはその欠如を提供することができる。例えば、促進因子遺伝子(または阻害剤遺伝子)のさらなる増大(または低下)または持続的に変化した遺伝子発現レベルにより、不良な予後、すなわち、改善の欠如または健康の衰えが示される。したがって、これらの遺伝子により、メラノーマの処置後の回復を評価することができる。この選ばれた一群の遺伝子またはそのサブセットの分析により、状態の結末が示される。
本発明において同様に提供されるのが、バイオチップまたはアレイである。バイオチップ/アレイは、連結された本明細書中に記載されるプローブまたは複数のプローブを有する固体または半固体の基体を含有する場合がある。プローブは、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件のもとで標的配列にハイブリダイゼーションすることができる場合がある。プローブは、基体上の空間的に定義されたアドレスにおいて連結される場合がある。標的配列あたり2つ以上のプローブが使用される場合があり、但し、この場合、重
複するプローブ、または、特定の標的配列の異なる部分に対するプローブのどちらかが用いられる。プローブは、当業者によって認められるただ1つだけの障害に関連する標的配列にハイブリダイゼーションすることができる場合がある。プローブは最初に合成され、続いてバイオチップに連結される場合があるか、または、バイオチップ上で直接に合成される場合があるかのどちらかである。
6048695号、同第6060240号、同第6090556号および同第6040138号において見出すことができる。
別の局面において、本発明は、本明細書中に記載されるようなポリペプチドおよびマイクロRNAの発現を分析するための方法、組成物およびシステムを具体化するキットを提供する。そのようなキットは、本明細書中に記載される核酸を、下記のうちのいずれかまたはすべてと一緒に含有する場合がある:アッセイ試薬、緩衝液、プローブおよび/またはプライマー、ならびに、無菌の生理的食塩または別の医薬的に許容されるエマルション基剤および懸濁基剤。加えて、キットは、本明細書中に記載される方法を実施するための指示(例えば、プロトコル)を含有する説明用資料を含む場合がある。例えば、キットは、標的mRNA配列または標的マイクロRNA配列の増幅、検出、特定または定量化のためのキットである場合がある。そのような目的を達成するために、キットは、好適なプライマー(例えば、ヘアピンプライマー)、順方向プライマー、逆方向プライマーおよびプローブを含有する場合がある。
核酸を増幅するために好適である1つまたは複数の酵素(これには、様々なポリメラーゼ(RT、Taqなど)が含まれる)、1つまたは複数のデオキシヌクレオチド、および、緩衝液である。
ンプルは直ちに使用される場合があり、または、その後の使用のために貯蔵される場合がある。この技術分野において知られている好適な貯蔵方法はどれもが、体液サンプルを貯蔵するために使用される場合がある:例えば、サンプルが約-20℃~約-70℃で凍結される場合がある。好適な体液が無細胞液である。「無細胞」液には、細胞が存在していないか、または、決定されるmiRNAレベルが、細胞部分ではなく、むしろ、サンプルの液体部分におけるそのレベルを反映するような低い濃度で存在する流体サンプルが含まれる。そのような無細胞体液は一般に、細胞含有体液を、例えば、遠心分離またはろ過によって処理して、細胞を除くことによってもたらされる。典型的には、無細胞体液は無傷の細胞を何ら含有せず、しかしながら、一部の無細胞体液は細胞断片または細胞破片を含有する場合がある。無細胞液の例には、血漿または血清、あるいは、細胞が除かれている体液が含まれる。
果、増大した量の転写物をもたらし、または、ダウンレギュレーションされ、その結果、低下した量の転写物をもたらすという点で、量的である場合がある。発現が異なる程度は、標準的な特徴づけ技術により、例えば、発現アレイ、定量的逆転写酵素PCR、ノーザン分析およびRNase保護などにより定量化するために十分に大きいことだけを必要とする。
間接的に標識される場合がある。
本発明は、メラノーマを処置するために、あるいは、内皮動員、細胞浸潤または転移性血管形成を阻害するために有用である化合物を特定するための方法を提供する。
A、87:6378~6382;Felici、1991、J.Mol.Biol.、222:301~310;ならびに米国特許第5,223,409号)において提示される場合がある。
本実施例は、下記の実施例2~実施例11において使用される材料および方法を記載する。
すべてのマウス実験を、ロックフェラー大学における施設内動物管理使用委員会(IACUC)によって承認されるプロトコルに従って行った。6週齢~8週齢の週齢一致および性一致のマウスを、以前に記載されたように原発性腫瘍の成長アッセイおよび転移アッセイのために使用した(Minn他、2005;Tavazoie他、2008)。拡張された実験手順を参照のこと。
すべてのガン細胞株を以前に記載されたように培養した(Tavazoie他、2008)。293T細胞およびヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)を標準的な条件で維持した。細胞株およびインビトロでの機能的アッセイにおけるmiRNA研究および遺伝子ノックダウン/過剰発現研究が、拡張された実験手順において詳述される。
様々な高転移性派生物にわたって脱調節されるmiRNAを特定するために、小さいRNAを、MeWo細胞株およびA375細胞株に由来する総RNAから濃縮し、LC Sciencesによるプロファイリングに供した。miR-199a-3p、miR-199a-5pおよびmiR-1908の潜在的な遺伝子標的を特定するために、MeWo細胞株から得られる総RNAがロックフェラー大学ゲノミクスコア施設によって標識され、Illumina HT-12 v3 Expression BeadChipアレイへのハイブリダイゼーションに供された。miRNA標的およびmRNA標的に到達するために使用される閾値および判断基準については、拡張された実験手順を参照のこと。
本研究で使用されるすべてのヒト臨床サンプルをIRB指針に従って得て、処理し、分析した。総RNAを、MSKCCにおいて以前に患者から切除された原発性メラノーマ皮膚病変部のパラフィン包埋された断面切片から抽出し、特異的なmiRNAの発現レベルを、TaqMan miRNA Assays(Applied Biosystems)を使用して盲検様式で分析した。それぞれの患者の転移非存在生存データを原発性腫瘍のmiRNA発現値の関数として表すカプラン・マイヤー曲線を、GraphPad Prismソフトウエアパッケージを使用して作製した。
4×104個のMeWo-LM2細胞を尾静脈注入した後、NOD-SCIDマウスを、0.1mLのPBSにおいて送達される12.5mg/kgの組合せ用量での、miR
-199a-3p、miR-199a-5pおよびmiR-1908に対してアンチセンスであるインビボ最適化LNA(Exiqon)により4週間にわたって週に2回、静脈内投与により処置した。
全体的な巨視的転移性結節可視化のために、5μmの厚さの肺組織切片をH&E染色した。インビボでの内皮含有量分析のために、肺切片を、MECA-32に対する抗体(Developmental Studies Hybridoma Bank、The University of Iowa、IA)(これはマウスの内皮細胞を標識する)と、ヒトビメンチンに対する抗体(Vector Laboratories)(これはヒトのメラノーマ細胞を標識する)とにより二重染色した。拡張された実験手順を参照のこと。
すべてのデータが平均±SEMとして表される。コルモゴロフ・スミルノフ検定を使用して、転移性血管密度累積分布における差の有意性を求めた。転移の結末を予測するmiRNAの予後力を、マンテル・コックス・ログランク検定を使用して有意性について検定した。片側マン・ホィットニーt検定を使用して、非ガウス型のバイオルミネセンス測定値についての有意性値を求めた。すべての他の比較のために、片側スチューデントt検定を使用した。0.05未満のp値を、統計学的に有意であると見なした。
すべてのマウス実験を、ロックフェラー大学における施設内動物管理使用委員会(IACUC)によって承認されるプロトコルに従って行った。多数の転移性派生物を2つの独立したヒトメラノーマ細胞株から生じさせるために、インビボ選抜を以前に記載されたように行った(Minn他、2005、Nature、436、518~524;PollackおよびFidler、1982、J.Natl.Cancer Inst.、69、137~141)。簡単に記載すると、1×106個の色素沈着MeWoメラノーマ親細胞または色素非沈着A375メラノーマ親細胞を0.1mLのPBSに再懸濁し、6週齢~8週齢の免疫低下NOD-SCIDマウスに静脈内注入した。肺転移物が形成された後、結節を分離し、細胞をインビトロ増殖させ、これにより、第1世代の肺転移性派生物(LM1)を生じさせた。その後、LM1細胞を、2×105個の細胞をNOD-SCIDマウスに尾静脈を介して注入することによるもう1回のインビボ選抜に供し、これにより、転移性結節を生じさせ、その後の分離により、第2世代の肺転移性派生物(LM2)を得た。A375細胞株については、3回目のインビボ選抜を行い、これにより、高転移性のA375-LM3派生物を得た。
08またはコントロール配列の発現が沈黙させられる4×104個のMeWo-LM2細胞、および、miR-199a-3p、miR-199a-5p、miR-1908またはコントロール配列について阻害される2×105個のA375-LM3細胞を0.1mLのPBSに再懸濁し、6週齢~8週齢のNOD-SCIDマウスに尾静脈注入した。エピスタシス実験のために、ApoE、DNAJA4またはコントロール配列を標的化するshRNAを発現する、あるいは、LRP1またはコントロール配列をmiRNA阻害の状況で阻害するsiRNAを発現する1×105個のMeWo-LM2細胞を6週齢~8週齢のNOD-SCIDマウスに静脈内注入した。ApoE前処置実験のために、MeWo-LM2細胞をApoEまたはBSAの100μg/mLでの存在下において37℃でインキュベーションした。24時間後、4×104個の細胞を7週齢のNOD-SCIDマウスに尾静脈を介して注入した。高転移性メラノーマ細胞を、miR-199a-3p、miR-199a-5pおよびmiR-1908を標的化するLNAにより前処置することの、転移に対する影響を明らかにするために、MeWo-LM2細胞を、それぞれのLNAにより個々に、3つすべてのmiRNAを標的化するLNAのカクテルにより、または、コントロールLNAによりトランスフェクションした。48時間後、1×105個の細胞(0.1mLのPBSに再懸濁される)を肺での転移性コロニー形成の研究のために7週齢のNOD-SCIDマウスに静脈内投与し、または、全身的な転移アッセイのために7週齢の無胸腺ヌードマウスに心臓内注入により投与した。転移に対するApoEの遺伝的欠失の影響を明らかにするために、8週齢のC57BL/6-WTマウスまたはC57BL/6-ApoE-/-マウスに、5×104個のB16F10マウスメラノーマ細胞を静脈内注入した。原発性腫瘍成長の研究のために、miR-199a、miR-1908またはコントロールヘアピンを過剰発現する1×106個の親MeWo細胞をマトリゲルと1:1で混合し、6週齢の免疫不全NOD-SCIDマウスの下部右側わき腹に皮下注入した。動物を腫瘍形成について毎週触診し、腫瘍形成後、かなり大きい腫瘍を週に2回測定した。腫瘍体積を、(最少直径)2×(最大直径)/2として計算した。
293T細胞を10cmのプレートに播種し、60%のコンフルエンシーを達成させた。トランスフェクションに先立って、細胞培地を、10%のFBSが補充される新鮮な抗生物質非含有DMEM培地により取り換えた。6μgのベクターA、12μgのベクターK、および、12μgの適切なmiR-Zip(System Biosciences、Mountain View、CA)またはshRNAプラスミド構築物(MSKCC
HTS Core Facility、New York、NY)を、60μLのTransIT-293トランスフェクション試薬(MIR 2700、Minis Bio
LLC、Madison、WI)を使用して共トランスフェクションした。細胞を37℃で48時間インキュベーションし、ウイルスを、細胞培地を2000gで10分間遠心分離し、その後、0.45μmのフィルターによるウイルスろ過を行うことによって集めた。1×105個のガン細胞を、10μg/mLのポリブレン(TR-1003-G、Millipore、Billerica、MA)の存在下で6時間、2mLの適切なウイルスにより形質導入した。48時間後、2μg/mLのピューロマイシン(P8833、Sigma-Aldrich、St Louis、MO)をレンチウイルス選抜のために細胞培地に加えた。細胞をピューロマイシン選抜の状態で72時間保った。下記のmiR-Zip配列を使用した:
miR-Zip- 199a-3p:5'-GATCCGACAGTAGCCTGCACATTAGTCACTTCCTGTCAGTAACCAATGTGCAGACTACTGTTTTTTGAATT-3'
miR-Zip- 199a-5p: 5'-GATCCGCCCAGTGCTCAGACTACCCGTGCCTTCCTGTCAGGAACAGGTAGTCTGAACACTGGGTTTTTGAATT-3'
miR-Zip-1908 5'-GATCCGCGGCGGGAACGGCGATCGGCCCTTCCTGTCAGGACCAATCGCCGTCC CCGCCGTTTT
TGAATT-3'
下記のshRNA配列を使用した:
shAPOE1:
5'CCGGGAAGGAGTTGAAGGCCTACAACTCGAGTTGTAGGCCTTCAACTCCTTCTTTTT3'
shAPOE2:
5'CCGGGCAGACACTGTCTGAGCAGGTCTCGAGACCTGCTCAGACAGTGTCTGCTTTTT3'
shDNAJA41:
5'CCGGGCGAGAAGTTTAAACTCATATCTCGAGATATGAGTTTAAACTTCTCGCTTTTT3'
shDNAJA42:
5'CCGGCCTCGACAGAAAGTGAGGATTCTCGAGAATCCTCACTTTCTGTCGAGGT TTTT3'
レトロウイルスによるmiRNAおよび遺伝子の過剰発現
6μgのベクターVSVG、12μgのベクターGag-Pol、および、ヒトApoE、DNAJA4のコード配列を含有する12μgのpBabeプラスミド、または、空のベクター、あるいは、miR-199a、miR-214、miR-1908またはコントロールヘアピンの前駆体配列を含有するmiR-Vecを、60%コンフルエンスの293T細胞に、60μLのTransIT-293トランスフェクション試薬を使用して共トランスフェクションした。細胞を37℃で48時間インキュベーションし、その後、ウイルスを集め、10μg/mLのポリブレンの存在下で6時間、ガン細胞に形質導入した。48時間後、2μg/mLのピューロマイシンまたは10μg/mLのブラストサイジン(15205、Sigma-Aldrich、St Louis、MO)をレトロウイルス選抜のために細胞培地に加えた。細胞を、ピューロマイシン選抜の状態で72時間、または、ブラストサイジン選抜の状態で7日間保った。下記のクローニング用プライマーをApoEおよびDNAJA4のコード配列の過剰発現のために使用した:
ApoE CDS Fwd: 5'-TCATGAGGATCCATGAAGGTTCTGTGGGCT-3'
ApoE CDS Rev: 5' -T AGC AG AATTCTC AGTGATTGTCGCTGGG-3'
DNAJA4 CDS Fwd: 5'-ATCCCTGGATCCATGTGGGAAAGCCTGACCC-3'
DNAJA4 CDS Rev: 5'-TACCATGTCGACTCATGCCGTCTGGCACTGC-3'
LNAに基づくmiRNAノックダウン
成熟型miR-199a-3p、成熟型miR-199a-5p、成熟型miR-1908またはコントロール配列に対して相補的なLNA(それぞれ426917-00、426918-00、426878-00および1990050;Exiqon、Vedbaek、デンマーク)を、抗生物質非含有培地で培養された50%コンフルエンスのMeWo-LM2ガン細胞に、リポフェクタミン(商標)2000トランスフェクション試薬(11668-09、Invitrogen、Carlsbad、CA)を使用して50nMの最終濃度でトランスフェクションした。8時間後、トランスフェクション培地を新鮮な培地により取り換えた。48時間後、1×105個の細胞を、肺での転移性コロニー形成を評価するためにNOD-SCIDマウスに静脈内注入し、または、全身転移を評価するために無胸腺ヌードマウスに心臓内注入により注入した。細胞浸潤および内皮動員のインビトロアッセイのために、細胞をトランスフェクション後96時間で使用した。
LRP1、LRP8、VLDLR、LDLRまたはコントロール配列を標的化するsiRNAを、ガン細胞またはHUVECに、リポフェクタミン(商標)2000トランスフ
ェクション試薬を使用して100nMの最終濃度でトランスフェクションした。5時間後、トランスフェクション培地を新鮮な培地により取り換えた。細胞をトランスフェクション後96時間でマトリゲル浸潤アッセイおよび内皮動員アッセイに供した。LRP1またはコントロール配列をmiRNA阻害の状況で標的化するsiRNAにより形質導入される細胞を、トランスフェクション後72時間での肺でのコロニー形成アッセイのために尾静脈注入した。コントロールの非標的化siRNAをDharmaconから得た。下記のLRP1標的配列およびLRP8標的配列を使用した:
siLRP11: 5'-CGAGGACGAUGACUGCUUA-3';
siLRP12: 5'-GCUAUGAGUUUAAGAAGUU-3';
S1LRP81:5 '-CGAGGACGAUGACUGCUUA-3';
siLRP82: 5'-GAACUAUUCACGCCUCAUC-3'.
細胞増殖アッセイ
miR-199aまたはmiR-1908の過剰発現およびコンビナトリアルLNA誘導のmiRNA阻害の細胞増殖に対する影響を明らかにするために、2.5×104個の細胞を三連で6ウエルプレートに播種し、生細胞を5日後に計数した。組換えApoEの添加のメラノーマ細胞増殖または内皮細胞増殖に対する影響を評価するために、3×104個のメラノーマMeWo-LM2細胞または内皮細胞をApoE(100μM)またはBSA(100μM)の存在下でインキュベーションした。生細胞を、8時間後、24時間後、48時間後、72時間後および120時間後に計数した。
ガン細胞を、FBSが0.2%のDMEM系培地における12時間の血清飢餓に供した。トランスウエル浸潤チャンバー(354480、BD Biosciences、Bedford、MA)を、0.5mLの飢餓培地を上部チャンバーおよび底部チャンバーに加えることによってアッセイ開始前に事前に平衡化させた。30分後、上部チャンバー内の培地を除き、1×105個のガン細胞を含有する0.5mLの培地をそれぞれのマトリゲル被覆トランスウエル挿入物の中に加え、37℃で24時間インキュベーションした。中和抗体実験および/または組換えタンパク質実験のために、抗体/組換えタンパク質を、図に示されるような下記の濃度でアッセイ開始時にそれぞれのウエルに加えた:5μg/mL~40μg/mLの抗ApoE 1D7(Heart Institute、University of Ottawa)、5μg/mL~40μg/mLの抗IgG(AB-108-C、R&D Systems、Minneapolis、MN)、100μMの組換えヒトApoE3(4696、Bio Vision、Mountain View、CA)および100μMのBSA(A2153、Sigma-Aldrich)。アッセイが完了したとき、マトリゲル被覆挿入物をPBSにより洗浄し、それぞれの挿入物の上部面における細胞をかき取り、挿入物を4%パラホルムアルデヒドにおいて15分間、固定処理した。その後、挿入物を切り出し、DAPI(H-1000、Vector Laboratories、Burlingame、CA)を含有するVectaShield固定用媒体を使用してスライドに固定した。それぞれの挿入物の基部面を、倒立型蛍光顕微鏡(Zeiss Axiovert 40 CFL)を5×の倍率で使用して画像化し、これにより、3枚の代表的な画像をそれぞれの挿入物について撮影した。浸潤した細胞の数を、ImageJ(NIH)を使用して定量化した。
5×104個のガン細胞をアッセイ開始のおよそ24時間前に24ウエルプレートに播種した。HUVECを80%のコンフルエンシーに成長させ、0.2%のFBSが補充されるEGM-2培地における16時間の血清飢餓に供した。その後、HUVECを、Cell Tracker Red CMTPX色素(C34552、Invitrogen)により45分間パルス処理した。その間に、ガン細胞をPBSにより洗浄し、FBSが0.2%のEGM-2培地の0.5mLをそれぞれのウエルに加え、3.0μmのHTS
Fluoroblock挿入物(351151、BD Falcon、San Jose、CA)をそれぞれのウエルの中に置いた。1×105個のHUVEC(0.5mLの飢餓培地に再懸濁される)をそれぞれのトランスウエル挿入物の中に播種し、動員アッセイを37℃で16時間~18時間にわたって進行させた。中和抗体実験および/または組換えタンパク質実験のために、その後、抗体/タンパク質を、図に示されるような下記の適切な濃度でそれぞれのウエルに加えた:40μg/mLの抗ApoE 1D7、40μg/mLの抗IgG、100μΜのrhApoE3および100μΜのBSA。アッセイが完了したとき、挿入物を上記のマトリゲル浸潤アッセイについて記載されるように処理し、分析した(マトリゲル浸潤アッセイを参照のこと)。
血清飢餓に供されたHUVECを、Cell Tracker Red CMTPX色素により45分間パルス処理し、それぞれの挿入物につき0.5mLの飢餓培地における1×105個のHUVECの濃度でHTS Fluoroblockトランスウエル挿入物の中に播種した。アッセイを37℃で16時間~18時間にわたって進行させ、挿入物を上記で記載されるように処理し、分析した(マトリゲル浸潤アッセイを参照のこと)。
HUVECを、FBSが0.2%のEGM-2培地における16時間の血清飢餓に供し、Cell Tracker Red CMTPX色素により45分間標識した。その間に、示された量(1μg~5μg)の組換えヒトApoE3またはBSAを250μLのマトリゲル(356231、BD Biosciences)と混合し、24ウエルプレートの底部において30分間固化させた。その後、0.2%のFBSを含有する250μLのHUVEC EGM-2培地をそれぞれのマトリゲル被覆ウエルに加え、3.0μMのHTS Fluoroblock挿入物をそれぞれのウエルの中にはめ込んだ。1×105個のHUVEC(0.5mLの飢餓培地に再懸濁される)をそれぞれの挿入物の中に播種し、マトリゲルの勾配に沿って37℃で16時間~18時間にわたって遊走させた。アッセイが完了したとき、挿入物を上記で記載されるようにスライドに固定し、分析した(マトリゲル浸潤アッセイを参照のこと)。
HUVECを6ウエルプレートに播種し、単層を形成させた。ガン細胞を、FBSが0.2%のDMEM系培地における30分間の血清飢餓に供し、Cell Tracker
Green CMFDA色素(C7025、Invitrogen)により45分間パルス処理した。2×105個のガン細胞(0.5mLの飢餓培地に再懸濁される)をそれぞれの内皮単層の上に播種した。ガン細胞をHUVEC単層に37℃で30分間接着させた。その後、内皮単層をPBSにより穏やかに洗浄し、4%パラホルムアルデヒドにより15分間、固定処理した。その後、それぞれのウエルをPBSにより覆い、8枚の画像を、倒立型蛍光顕微鏡(Zeiss Axiovert 40 CFL)を10×の倍率で使用してそれぞれの内皮単層について撮影した。HUVECに接着しているガン細胞の数を、ImageJを使用して定量化した。
miR-199a、miR-1908またはコントロールヘアピンを過剰発現する1×106個のMeWo細胞を、0.2%のメチルセルロースが補充される細胞培地を含有する低接着性プレートに播種した。懸濁状態に48時間置いた後、死細胞および生細胞の数を、トリパンブルーを使用して計数した。
メラノーマ細胞の血清飢餓能に対するmiR-199aおよびmiR-1908の影響
を明らかにするために、miR-199a、miR-1908またはコントロールヘアピンを過剰発現する1×105個のMeWo親細胞を四連で6ウエルプレートに播種し、FBSが0.2%の飢餓DMEM系培地において48時間インキュベーションし、その後、生細胞の数を、トリパンブルーを使用して計数した。血清飢餓条件におけるメラノーマ細胞または内皮細胞の生存に対する組換えApoE3の添加の影響を明らかにするために、3×104個のMeWo-LM2細胞または内皮細胞を低血清条件(0.2%のFBS)においてApoE3(100μM)またはBSA(100μM)の存在下でインキュベーションした。生細胞の数を、8時間後、16時間後および24時間後に計数した。
miR-199a、miR-1908またはコントロールヘアピンを過剰発現する50個のMeWo親細胞を四連で6cmのプレートに播種した。2週間後、細胞をPBSにより洗浄し、6%グルタルアルデヒドにより固定処理し、0.5%のクリスタルバイオレットにより染色した。陽性に染まっているコロニーの数を計数した。
脱調節された発現を様々な高転移性メラノーマ細胞株派生物にわたって示すmiRNAを特定するために、多数の独立した転移性派生物ならびにそれらのそれぞれの親MeWo細胞集団および親A375細胞集団から得られる総RNAを使用して、小さいRNAについて濃縮し、その後、それらを標識し、LC sciencesによるマイクロ流体の特注マイクロアレイプラットフォームに対してハイブリダイゼーションさせた。アレイは、Sanger miRBaseリリース13.0に列記されるmiRNA転写物に対応する894個の成熟型miRNAを検出するように設計された。分析される全プローブのうち、169個のmiRNAに対応するプローブが、分析される多数の細胞株にわたってバックグラウンド閾値を超えるシグナルをもたらした。生のシグナル強度(これらはプローブのハイブリダイゼーションに対応する)をそれぞれの細胞株についてメジアン正規化した。メジアン正規化された発現値の2倍以上のアップレギュレーションの閾値を、2つの独立したヒトメラノーマ細胞株について多数の転移性派生物において一般に誘導されるmiRNAを特定するために使用した。
miR-199a-3p、miR-199a-5pおよびmiR-1908によって標的化される潜在的な遺伝子を特定するために、総RNAを、それぞれのmiRNAの機能喪失または機能獲得を有するMeWo細胞株から抽出し、Illumina HT-12
v3 Expression BeadChipマイクロアレイに対するハイブリダイゼーションのためにロックフェラー大学におけるゲノミクスコア施設に送付した。生のシグナル強度(これらはプローブのハイブリダイゼーションに対応する)をその後、それぞれの細胞株サンプルについてメジアン正規化した。3組のマイクロアレイプロフィル比較がなされた:(1)miR-199aまたはmiR-1908を過剰発現するMeWo細胞に対するMeWoコントロール細胞、(2)miR-199a-3p、miR-199a-5pまたはmiR-1908を標的化する短いヘアピン(miR-Zip)を発現するMeWo-LM2細胞に対するMeWo-LM2コントロール細胞、および、(3)MeWo-LM2細胞に対するMeWo親細胞。これらのアレイから得られるメジアン正規化された発現値に基づいて、下記の判断基準を使用して、miR-199aおよびmiR-1908に対して共通する可能な標的遺伝子に達した:(1)miR-199aおよびmiR-1908のそれぞれの個々の過剰発現に対して1.5倍超の差でダウンレギュレーションされる遺伝子、(2)miR-199a-3pおよびmiR-1908の両方の阻害またはmiR-199a-5pおよびmiR-1908の両方の阻害のどちらかのときに1.5倍超の差でアップレギュレーションされる遺伝子、そして、(3)MeWo親
細胞に対して上記3つのmiRNAの生理学的により高いレベルを発現するLM2細胞において1.5倍超の差でダウンレギュレーションされる遺伝子。
総RNAを、miRvanaキット(AM1560、Applied Biosystems、Austin、TX)を使用して様々な細胞株から抽出した。成熟型miRNAの発現レベルを、Taqman miRNA発現アッセイ(4427975-0002228、Applied Biosystems)を使用して定量化した。RNU44を正規化のための内因性コントロールとして使用した。mRNA発現分析のために、600ngの総RNAを、cDNA First-Strand Synthesis Kit(18080-051、Invitrogen)を使用して逆転写し、得られたcDNAのおよそ200ngをその後、SYBRグリーンPCR Master Mix(4309155、Applied Biosystems)および適切なプライマーと混合した。それぞれの反応を四連で行い、mRNA発現を、ABI Prism 7900HT Real-Time PCR System(Applied Biosystems)を使用してリアルタイムPCR増幅を行うことによって定量化した。GAPDHを正規化のための内因性コントロールとして使用した。下記のプライマーを使用した:
ApoE Fwd: 5'-TGGGTCGCTTTTGGGATTAC-3'
ApoE Rev: 5' -TTC AACTCCTTC ATGGTCTCG-3'
DNAJA4_Fwd: 5'-CCAGCTTCTCTTCACCCATG-3'
DNAJA4 Rev:5'-GCCAATTTCTTCGTGACTCC-3'
GAPDH Fwd: 5'-AGCCACATCGCTCAGACAC-3'
GAPDH Rev: 5'-GCCCAATACGACCAAATCC-3'
LRPl Fwd: 5' -TTTAACAGC ACCGAGTACCAG-3'
LRPl Rev: 5' C AGGC AGATGTC AGAGC AG-3'
LRP8 Fwd: 5'-GCTACCCTGGCTACGAGATG-3'
LRP8 Rev: 5' -GATT AGGG ATGGGCTCTTGC-3'
ELISA
馴化されたガン細胞培地を、細胞を、FBSが0.2%の血清飢餓DMEM系培地において24時間インキュベーションすることによって調製した。馴化培地におけるApoEのレベルを、APOE ELISAキット(IRAPKT031、Innovative
Research、Novi、Michigan)を使用して求めた。
異種ルシフェラーゼレポーターアッセイを以前に記載されたように行った(Tavazoie他、2008)。簡単に記載すると、ApoEおよびDNAJA4の全長型の3’UTRおよびCDSをpsiCheck2二重ルシフェラーゼレポーターベクター(C8021、Promega、Madison、WI)にウミシイタケルシフェラーゼレポーターの下流側にクローン化した。5×104個の親MeWo細胞、MeWo-LM2細胞、miR-199a、miR-1908またはコントロールヘアピンを過剰発現するMeWo細胞、および、miR-199a-3p、miR-199a-5p、miR-1908またはコントロール配列を標的化するmiR-Zipヘアピンを発現するMeWo-LM2細胞を、TransiT-293トランスフェクション試薬を使用して100ngのそれぞれの特異的レポーター構築物によりトランスフェクションした。トランスフェクション後24時間で、細胞を溶解し、ウミシイタケルシフェラーゼ発現対ホタルルシフェラーゼ発現の比率を、二重ルシフェラーゼアッセイ(E1910、Promega)を使用して求めた。それぞれの標的構築物における推定されるmiRNA結合部位を、相補的なmiRNAシード配列(miR-199a-3p:5’-CAGUAGUC-3’;miR-199a-5p:5’-CCAGUGUU-3’;miR-1908:5’-GGCGGGGA-3’)に対するアライメントによって特定した。それぞれの標的構築物にお
けるmiRNA相補的部位を、QuickChange Multi Site-Directed Mutagenesis Kit(200514、Agilent Technologies、Santa Clara、CA)を使用して変異させた。miRNAシード配列相補性分析に基づいて、ApoEのCDSを141位において(CTGからACTに)変異させ、ApoEの3’UTRを83位において(GCCからATAに)、かつ、98位において(CTGからACAに)変異させ、DNAJA4のCDSを373位において(CGCからTATに)、かつ、917位において(CTGからAGAに)変異させ、DNAJA4の3’UTRを576位において(CTGからACAに)、1096位において(CTGからTCTに)、1396位において(CGCからTGTに)、かつ、1596位において(CTGからTGTに)変異させた。下記のプライマーを、ApoEおよびDNAJA4の3’UTRおよびCDSをクローン化するために使用した:
ApoE CDS Fwd: 5 '-AGTACCTCGAGGGGATCCTTGAGTCCTACTC-3 '
APOE CDS Rev: 5 '-TAATTGCGGCCGCTCAGACAGTGTCTGCACCCAG-3'
DNAJA4_CDS_Fwd: 5 '-TAATATCTCGAGATGTGGGAAAGCCTGACCC-3'
DNAJA4 CDS Rev: 5 '-CAATTGCGGCCGCTCATGCCGTCTGGCACTGC-3'
APOE 3 'UTR Fwd: 5 '-TTAGCCTCGAGACGCCGAAGCCTGCAGCCA-3'
APOE 3'UTR Rev: 5 '-TTACTGCGGCCGCTGCGTGAAACTTGGTGAATCTT-3'
DNAJA4 3 'UTR Fwd: 5'-TAATATCTCGAGCGTGGTGCGGGGCAGCGT-3 '
DNAJA4 3 'UTR Rev: 5'-CAATTGCGGCCGCTTATCTCTCATACCAGCTCAAT-3 '
下記のプライマーを、それぞれの標的におけるmiRNA結合部位を変異誘発するために使用した:
APOE CDS mut: 5'-
GCCAGCGCTGGGAACTGGCAACTGGTCGCTTTTGGGATTACCT-3'
APOE 3 'UTR mutl : 5 '-
CAGCGGGAGACCCTGTCCCCATACCAGCCGTCCTCCTGGGGTG-3'
APOE 3 'UTR_mut2 : 5 ' -
TCCCCGCCCCAGCCGTCCTCACAGGGTGGACCCTAGTTTAATA-3 '
DNAJA4_CDS_mutl : 5'-
GGGATCGGTGGAGAAGTGCCTATTGTGCAAGGGGCGGGGGATG-3'
DNAJA4_CDS_mut2: 5'-
GTAGGGGGCGGGGAACGTGTTATCCGTGAAGAGGTGGCTAGGG-3'
DNAJA4 3 'UTR mutl : 5 '-
CAGGGCCAACTTAGTTCCTAACATTCTGTGCCCTTCAGTGGAT-3'
DNAJA4 3 'UTR_mut2 : 5 ' -
ACAGTTTGTATGGACTACTATCTTAAATTATAGCTTGTTTGGA-3'
DNAJA4 3 'UTR_mut3 : 5 ' -
TAATTATTGCTAAAGAACTATGTTTTAGTTGGTAATGGTGTAA-3'
DNAJA4 3 'UTR_mut4 : 5 ' -
CAGCTGCACGGACCAGGTTCCATAAAAACATTGCCAGCTAGTGAG-3 '
ヒトメラノーマ皮膚病変部におけるmiRNA発現の分析
本研究で使用されるすべてのヒト臨床サンプルを施設内IRB指針に従って得て、処理し、分析した。71名のヒト患者からの原発性メラノーマ皮膚病変部のパラフィン包埋された断面切片をMSKCCから得た。これらのサンプルを5回の連続したキシレン洗浄(それぞれ5分)によって脱パラフィン化した。脱パラフィン化の後、悪性腫瘍含有領域をH&E染色によって特定し、解剖し、総RNAを、RecoverAll Total Nucleic Acid Isolation Kit(AM1975、Applied Biosystems)を使用して解剖物から抽出した。それぞれのサンプルにおける成熟型のmiR-199a-3p、miR-199a-5pおよびmiR-1908の発現レベルを、Taqman miRNAアッセイを使用して盲検様式で定量化した。R
NU44を正規化のための内因性コントロールとして使用した。それぞれのmiRNAの発現レベルを、転移する傾向を有する原発性メラノーマと、転移しなかった原発性メラノーマとの間で比較した。カプラン・マイヤー曲線を、患者の転移非存在生存データを使用して、それぞれの患者腫瘍におけるそれぞれのmiRNAについての発現レベルの関数としてプロットした。肺、脳、骨および軟組織のような部位への転移性再発が以前に記録されており、そのような転移性再発は、特定されたmiRNAの発現レベルと転移性再発との間における関係の遡及的分析を可能にした。
動物をPBSにより灌流し、その後、心臓内注入により、続いて気管内注入により注入される4%パラホルムアルデヒドによる固定処理を行った。肺を切開し、4%パラホルムアルデヒドにおいて4℃で一晩インキュベーションし、パラフィンに包埋し、5μmの厚さの連続切片にスライスした。全体的な巨視的転移性結節可視化のために、肺切片をH&E染色した。ヒトメラノーマMeWo細胞によってマウスに形成される転移性結節における内皮含有量分析のために、代表的な肺切片を、MECA-32に対する一次抗体(Developmental Studies Hybridoma Bank、The University of Iowa、IA)(これはマウスの内皮細胞を標識する)と、ヒトビメンチンに対する一次抗体(VP-V684、Vector Laboratories)(これはヒトのメラノーマ細胞を標識する)とにより二重染色した。様々なAlexa Fluor色素コンジュゲート化二次抗体を、一次抗体を検出するために使用した。転移性結節内の血管密度を求めるために、蛍光を、Zeissレーザー走査共焦点顕微鏡(LSM510)を使用して測定し、それぞれの転移性結節の内部におけるMECA-32シグナル(これにより、輪郭がヒトビメンチンとの同時染色に基づいて示される)を、ImageJ(NIH)を使用して盲検様式で定量化した。B16F10マウスメラノーマ細胞によって野生型マウスおよびApoEの遺伝的ヌルマウスにおいて形成される転移性結節における内皮含有量分析のために、代表的な肺切片をMECA-32について染色し、それぞれの結節の内部におけるMECA-32シグナル(これにより、境界が細胞の色素沈着に基づいて定まる)を盲検様式で定量化した。総体的血管面積(これは、それぞれの転移性結節の総面積に対する、血管によって覆われる百分率面積として与えられる)を、バックグラウンド除去(1ピクセルの転がりボールの半径)と、カットオフとしての所定の閾値の使用とによって得た。転移性結節を、どのような領域であれ、総面積が2000μm2を超える領域として定義した。大きい結節については、少なくとも4つの代表的な画像を得て、それらの平均血管密度を計算した。
10μg/mLの組換えヒトApoE3(4696、BioVision)、10μg/mLのBSA(A2153、Sigma Aldrich)または400ng/mlのVEGFを、示されるようにマトリゲル(356231、BD Biosciences)と混合した。示された組換えタンパク質を含有する400μLのマトリゲルを免疫低下NOD-SCIDマウスの腹側わき腹のすぐ上に皮下注入した。プラグを注入後3日目に取り出し、4%パラホルムアルデヒドにおいて48時間、固定処理した。その後、プラグをパラフィン包埋し、5μmの厚さの連続切片にした。プラグの断面切片を、マウス内皮抗原MECA-32に対する一次抗体(Developmental Studies Hybridoma Bank、The University of Iowa、IA)を使用して免疫組織化学的に染色し、ペルオキシダーゼコンジュゲート化二次抗体によって検出し、続いて、DAB酸化によって可視化した。それぞれのマトリゲルプラグの中への内細胞浸潤の程度を定量化するために、内皮細胞の数をそれぞれのプラグについて4つ~5つのランダムな視野において計数し、所与のプラグ面積あたりの内皮細胞の平均数を計算した。
SK-Mel-334原発性ヒトメラノーマ系統をMSKCCにおける1名の患者のBraf変異型メラノーマの軟組織転移物から確立した。インビトロにおける最小限の拡大培養の後、細胞を、肺転移性派生物のSK-Mel-334.2を生じさせるためにインビボ選抜した(PollackおよびFidler、1982)。SK-Mel-239のベムラフェニブ抵抗性クローン(C1)は、Poulikos Poulikakos(Mount Sinai Medical School)からの譲渡物であり、B-RafV600E/+;Pten-/-;CDKN2A-/-原発性マウスメラノーマ細胞株は、Marcus Rosenberg(Yale University)によって譲渡された。使用されるすべての他の細胞株をATCCから購入した。
DMSO、GW3965またはT0901317(それぞれ1μM)により処理されるメラノーマ細胞から得られる血清非含有の馴化培地における細胞外ApoEレベルを、ApoE ELISAキット(Innovative Research)を使用して、処理後72時間で定量化した。
マウスの肺組織サンプルおよび脳組織サンプルを、プロテアーゼ阻害剤(Roche)が補充されるRIPA緩衝液(Sigma-Aldrich)において氷上でホモジネートした。マウスの脂肪組織をTNET緩衝液(1.5mM Tris(pH 7.5)、150mM NaCl、2mM EDTA、1%トリトン、プロテアーゼ阻害剤)において氷上でホモジネートした。総タンパク質溶解物(2μg)をSDS-PAGEによって分離し、PVDFメンブランに転写し、抗マウスApoE抗体(ab20874、Abcam)および抗チューブリンα/β抗体(2148、Cell Signaling)によりブロッティングした。
臨床サンプルの入手、処理および分析のすべてをIRB指針に厳密に従って行った。原発性メラノーマ皮膚病変部をMSKCCにおいて患者から事前に切除して、ホルマリン固定し、パラフィン包埋し、5μmの厚さのスライド片に切片化した。ApoEタンパク質発現を、D6E10抗ApoE抗体(ab1906、Abcam)を使用する二重盲検の免疫組織化学的分析によって評価した。
動物をPBSにより心臓内灌流し、その後、4%パラホルムアルデヒド(PFA)による灌流を行った。固定処理された肺をパラフィンに包埋し、5μmの厚さの連続切片にした。巨視的な肺転移性結節をH&E染色によって可視化した。腫瘍での内皮細胞含有量、腫瘍の増殖およびアポトーシスを分析するために、原発性腫瘍のパラフィン包埋切片を、MECA-32に対する抗体(Developmental Studies Hybridoma Bank、University of Iowa)、KI-67に対する抗体(ab15580、Abcam)および切断型カスパーゼ-3に対する抗体(9661、Cell Signaling)によりそれぞれ染色した。
インビボ転移アッセイのために使用されるメラノーマ細胞を、ルシフェラーゼレポーター遺伝子をコードする安定的に発現したレトロウイルス構築物により形質導入し(Ponomarev他、2004)、これにより、本発明者らはメラノーマ細胞のインビボ進行をバイオルミネセンス画像化によってモニターすることができた。下記の数のメラノーマ細胞(100μLのPBSに再懸濁される)を、尾静脈を介して静脈内注入した:4×1
04個のMeWo細胞、2.5×105個のHT-144細胞、2×105個のSK-Mel-334.2細胞、5×104個のB16F10細胞、および、1×105個のYUMM細胞。MeWo細胞、HT-144細胞およびSK-Mel-334.2細胞は6週齢~8週齢の性一致NOD scidマウスに注入され、一方、B16F10細胞およびYUMM細胞は6週齢~8週齢の性一致C57BL/6マウスに注入された。転移形成に対するGW3965の影響を評価するすべての実験において、マウスをコントロール餌またはGW3965補充餌(20mg/kg)で10日間にわたって前処置した。脳転移に対するGW3965処置の影響を評価するために、1×105個のMeWo脳転移性派生物を無胸腺ヌードマウスに心臓内注入した。注入後直ちに、マウスを無作為にコントロール餌またはGW3965補充餌(100mg/kg)に割り当てた。GW3965の経口送達が初期転移の進行を阻害し得るかどうかを明らかにするために、NOD Scidマウスに、4×104個のMeWo細胞を静脈内注入し、細胞を42日間にわたって肺にコロニー形成させ、その後、マウスを盲検的にコントロール餌処置またはGW3965補充餌処置(100mg/kg)に割り当てた。
同所性部位から分離されるメラノーマ細胞による肺でのコロニー形成に対するGW3965処置の影響を明らかにするために、ルシフェラーゼレポーターを発現する1×106個のMeWo細胞を、NOD Scidマウスの両側の下部わき腹に皮下注入した。体積で約300mm3である腫瘍が形成されたとき、腫瘍を切除し、マウスを無作為にコントロール餌処置またはGW3965補充餌処置(100mg/kg)に割り当てた。腫瘍切除後1ヶ月で、肺を取り出し、肺でのコロニー形成をエクスビボ・バイオルミネセンス画像化によって測定した。メラノーマの肺でのコロニー形成の程度を組織学的に確認するために、その後、肺を4%のPFAにおいて一晩にわたって固定処理し、パラフィン包埋し、5μMの連続切片にし、ヒトビメンチンについて染色した(VP-V684、Vector Laboratories)。
ダカルバジン抵抗性のB16F10マウスメラノーマ細胞を、細胞をDTIC(D2390、Sigma-Aldrich、St.Louis、MO)の存在下で連続培養することによって作製した。最初、細胞を500μg/mLのDTICにより1週間処理した。この最初のDTIC処理の後、残存する(約10%の)生細胞を1週間にわたって回復させ、その後、750μg/mLのDTICを細胞培地に5日間加えた。この高用量処理に続いて、細胞を低用量のDTIC(100μg/mL)の存在下で1週間にわたって回復させた。その後、細胞を、細胞をマウスに移植する前の少なくとも1ヶ月間、200μg/mLのDTICを含有する細胞培地において連続培養した。DTICを3日毎に、新鮮なガン細胞培地に加えた。腫瘍成長実験のために、5×104個のB16F10親細胞およびDTIC抵抗性細胞を7週齢のC57BL/6マウスの下部わき腹に皮下注入した。体積で5mm3~10mm3である小さい腫瘍が形成された後、マウスを下記の処置群に無作為に割り当てた:(1)コントロール餌+ビヒクル(i.p.);(2)コントロール餌+DTIC(i.p.)(50mg/kg);(3)GW3965補充餌(100mg/kg)+ビヒクル(i.p.)。DTICをクエン酸の存在下(重量比で1:1)で水に溶解し、腹腔内注射によって毎日投与した。DTIC抵抗性のMeWoヒトメラノーマ細胞株クローンが、体積で600mm3~800mm3であるMeWo腫瘍を有するマウスのDTIC処置の後で得られた。最初の2週間の期間中における毎日のDTIC投薬(50mg/kg、i.p.)に対する応答での最初の腫瘍縮小の後、腫瘍が最終的には抵抗性を発達させ、成長を再開し、その時点で腫瘍細胞を分離し、DTIC抵抗性MeWo細胞株が確立された。細胞を、DTIC(200μg/mL)の存在下で1週間、インビトロにおいて拡大培養し、その後、5×105個のDTIC抵抗性MeWo細胞を8週齢のNod SCIDガンママウスに再注入した。腫瘍が体積で5mm3~10mm3
に成長した後、マウスを下記の処置群に盲検的に割り当てた:(1)コントロール餌;(2)コントロール餌+DTIC(50mg/kg);(3)GW3965補充餌(100mg/kg)。親の非選抜MeWo細胞による腫瘍成長に対するDTICの影響を明らかにするために、5×105個のMeWo細胞を、Nod SCIDガンママウスに皮下注入し、マウスを、体積で5mm3~10mm3である腫瘍が形成された後でコントロールビヒクルまたはDTIC(50g/kg)により処置した。DTICを、2日の休薬処置の合間がある5回の連続した毎日の処置からなるサイクルで、上記で記載されるように毎日投与した。腫瘍成長を週に2回測定した。
メラノーマ進行のTyr::CreER;B-RafV600E/+;Ptenlox/+/Tyr::CreER;B-RafV600E/+;Ptenlox/lox条件的モデルがDankort他(2009)によって以前に確立され、特徴づけられた。簡単に記載すると、これらのマウスにおけるメラノーマを、4-HT(H6278、70%の異性体、Sigma-Aldrich、St Louis、MO)をピーナッツ油において投与される25mg/kgで3日間連続して腹腔内注射することによって6週齢において誘導した。4-HTのストック溶液を、4-HTを、45℃で5分間加熱し、混合することにより100%のEtOHに50mg/mLで溶解することによって調製した。溶解されると、このストック4-HT溶液をピーナッツ油において10倍希釈し、これにより、マウスにその後に注入される5mg/mLの4-HT作業用溶液を得た。1回目の4-HT注射の後、マウスを盲検的に、コントロール餌、または、GW3965(100mg/kg)が補充される餌のどちらかを受けるように割り当てた。マウスをメラノーマ病変の存在および進行について週に3回調べた。35日目に、背側皮膚サンプルをコントロール処置マウスおよびGW3965処置マウスから集め、4%のPFAにおいて固定処理し、10Xで写真撮影した。総皮膚面積からの色素沈着したメラノーマ病変部面積の百分率を、ImageJを使用して定量化した。生存分析のために、マウスをメラノーマ進行について毎日モニターし、メラノーマ負荷量の進行に伴う瀕死状態および不快の初期徴候を考慮に入れて標準的な身体状態スコアに従って安楽死させた。死後、肺、脳および唾液腺を集め、巨視的メラノーマ病変の存在について調べた。
すべてのマウスの遺伝子型決定を、Jackson Labsによって推奨されるような標準的なPCR条件を使用して行った。下記の遺伝子型決定用プライマーをそれぞれのPCR反応のために使用した:
Tyr::CreER;B-RafV600E/+;Ptenlox/+マウスおよびTyr::CreER;B-RafV600E/+;Ptenlox/loxマウス:
B-Raf Forward: 5'-TGA GTA TTT TTG TGG CAA CTG C-3'
5- a/Reverse: 5'-CTC TGC TGG GAA AGC GGC-3'
Pten Forward: 5'-CAA GCA CTC TGC GAA CTG AG-3'
Pten Reverse: 5'-AAG TTT TTG AAG GCA AGA TGC-3'
Cre Transgene Forward: 5 '-GCG GTC TGG CAG TAA AAA CTA TC-3 '
Cre Transgene Reverse: 5'-GTG AAA CAG CAT TGC TGT CAC TT-3'
Internal Positive Control Forward: 5' -CTA GGC CAC AGA ATT GAA AGA TCT-3'
Internal Positive Control Reverse: 5'-GTA GGT GGA AATTCT AGC ATC ATC C-3'
ApoE-/-マウス:
Common Forward: 5'-GCC TAG CCG AGG GAG AGC CG-3'
Wild-type Reverse: 5'-TGT GAC TTG GGA GCT CTG CAG C-3'
Mutant Reverse: 5'-GCC GCC CCG ACT GCA TCT-3'
LXRα-/-マウス:
Common Forward: 5'-TCA GTG GAG GGA AGG AAA TG-3'
Wild-type Reverse: 5'-TTC CTG CCC TGG ACA CTT AC-3'
Mutant Reverse: 5'-TTG TGC CCA GTC ATA GCC GAA T-3'
LXRβ-/-マウス:
Common Forward: 5'-CCT TTT CTC CCT GAC ACC G-3'
Wild-type Reverse: 5'-GCA TCC ATC TGG CAG GTT C-3'
Mutant Reverse: 5'-AGG TGA GAT GAC AGG AGA TC-3'
細胞増殖アッセイおよび生存性アッセイ
GW3965、T0901317およびベキサロテンのインビトロ細胞成長に対する影響を明らかにするために、2.5×104個のメラノーマ細胞を三連で6ウエルプレートに播種し、DMSO、GW3965、T0901317またはベキサロテンのそれぞれ1μMでの存在下で培養した。5日後、生細胞および死細胞の数を、死細胞を選択的に標識するトリパンブルー(72-57-1、Sigma-Aldrich)を使用して計数した。
細胞浸潤アッセイを、トランスウエル・マトリゲル浸潤チャンバーシステム(354480、BD Biosciences)を使用して詳しくは以前に記載されたように行った(Pencheva他、2012)。簡単に記載すると、様々なメラノーマ細胞を、DMSO、GW3965、T0901317またはベキサロテンの1μΜでの存在下で56時間培養し、その後、メラノーマ細胞をそれぞれの薬物の存在下で16時間にわたって飢餓培地(0.2%のFBS)に切り換えた。飢餓後、細胞をマトリゲル被覆トランスウエル挿入物の中に播種し、浸潤アッセイを37℃で24時間にわたって進行させた。ApoE抗体中和実験のために、40μg/mLの1D7抗ApoE阻止抗体(Heart Institute、University of Ottawa、Ottawa、カナダ)または40μg/mLの抗IgGコントロール抗体(AB-108-C、R&D Systems、Minneapolis、MN)をアッセイ開始時にそれぞれのトランスウエル挿入物に加えた。
内皮動員アッセイを以前に記載されたように行った(Pencheva他、2012;Png他、2012)。メラノーマ細胞を、DMSO、GW3965、T0901317またはベキサロテンにより1μΜで56時間処理し、その後、5×104個の細胞をそれぞれの薬物の存在下で24ウエルプレートに播種し、アッセイを開始する前の16時間にわたって付着させた。HUVEC細胞を、0.2%のFBSを含有するEGM-2培地における一晩の血清飢餓に供した。翌日、1×105個のHUVEC細胞を、ガン細胞を底部に含有するそれぞれのウエルにはめ込まれる3.0μmのHTS Fluoroblockトランスウエル遊走挿入物(351151、BD Falcon、San Jose、CA)の中に播種した。HUVEC細胞を37℃で20時間にわたってガン細胞に向かって遊走させ、その後、挿入物を以前に記載されたように処理した(Pencheva他、2012)。ApoE抗体中和実験のために、40μg/mLの1D7抗ApoE阻止抗体(Heart Institute、University of Ottawa、Ottawa、カナダ)または40μg/mLの抗IgGコントロール抗体(AB-108-C、R&D Systems、Minneapolis、MN)をアッセイ開始時にそれぞれのトランスウエル挿入物に加えた。
shRNAを、以前に記載されたように(Pencheva他、2012;Png他、2012)、6μgのベクターA、12μgのベクターKおよび12μgのshRNAプラスミドをHEK-293Tパッケージング細胞にトランスフェクションすることによっ
て調製されるレンチウイルス粒子に組み込んだ。レンチウイルスによるshRNA形質導入を、以前に記載されたように(Pencheva他、2012)、10μg/mLのポリブレン(TR-1003-G、Millipore、Billerica、MA)の存在下で6時間行った。細胞を形質導入後72時間にわたって拡大培養し、レンチウイルス選抜を、細胞を2μg/mLのピューロマイシン(P8833、Sigma-Aldrich)の存在下で72時間培養することによって行った。
ヒト:
Sh1LXRα: 5'-
CCGGCCGACTGATGTTCCCACGGATCTCGAGATCCGTGGGAACATCAGTCGGTT TTT-3 '
sh2LXRα: 5'-
CCGGGCAACTCAATGATGCCGAGTTCTCGAGAACTCGGCATCATTGAGTTGCTT TTT-3'
sh3LXRβ: 5'-
CCGGAGAGTGTATCACCTTCTTGAACTCGAGTTCAAGAAGGTGATACACTCTTT TTT-3'
sh2LXRβ: 5'-
CCGGGAAGGCATCCACTATCGAGATCTCGAGATCTCGATAGTGGATGCCTTCTT TTT-3'
shApoE: 5'-
CCGGGCAGACACTGTCTGAGCAGGTCTCGAGACCTGCTCAGACAGTGTCTGCTT TTT-3'
マウス:
sh_mLXRα: 5'-
CCGGGCAACTCAATGATGCTGAGTTCTCGAGAACTCAGCATCATTGAGTTGCTT TTT-3'
sh_mLXRβ: 5'-
CCGGTGAGATCATGTTGCTAGAAACCTCGAGGTTTCTAGCAACATGATCTCATTTTTG-3'
sh_mApoE: 5'-
CCGGGAGGACACTATGACGGAAGTACTCGAGTACTTCCGTCATAGTGTCCTCTT TTT-3'
qRT-PCRによる遺伝子発現分析:
RNAを、Total RNA Purification Kit(17200、Norgen、Thorold、カナダ)を使用して全細胞溶解物から抽出した。その後、600ngの総RNAを、cDNA First-Strand Synthesis Kit(18080-051、Invitrogen)を使用してcDNAに逆転写し、定量的リアルタイムPCR増幅を、ABI Prism 7900HT Real-Time PCR System(Applied Biosystems、Austin、TX)を使用して以前に記載されたように行った(Pencheva他、2012)。それぞれのPCR反応を四連で行った。遺伝子発現を、内因性コントロールとして使用されるGAPDHに対して正規化した。
ヒト:
ApoE Forward: 5 ' -TGGGTCGCTTTTGGGATTAC-3 '
ApoE Reverse: 5 '-TTCAACTCCTTCATGGTCTCG-3 '
GAPDH Forward: 5 '-AGCCACATCGCTCAGACAC-3 '
GAPDH Reverse: 5'-GCCCAATACGACCAAATCC-3'
LXRα Fwd: 5'-GTTATAACCGGGAAGACTTTGC-3 '
LXRα Rev: 5'- AAACTCGGC ATC ATTGAGTTG-3 '
LXRβ_Fwd: 5'- TTTGAGGGTATTTGAGTAGCGG-3 '
LXRβRev: 5'- CTCTCGCGGAGTGAACTAC-3 '
マウス:
ApoE Forward: 5 '-GACCCTGGAGGCTAAGGACT-3 '
ApoE Reverse: 5 '-AGAGCCTTCATCTTCGCAAT-3 '
GAPDH Forward: 5 ' -GCAC AGTC AAGGCCGAGAAT-3 '
GAPDH Reverse: 5 ' -GCCTTCTCC ATGGTGGTGAA-3 '
LXRα Forward:5'-GCGCTCAGCTCTTGTCACT-3'
LXRα Reverse: 5'-CTCCAGCCACAAGGACATCT-3'
LXRβ Forward: 5 ' -GCTCTGCCTAC ATCGTGGTC-3 '
LXRβ Reverse: 5'-CTCATGGCCCAGCATCTT-3'
ABCA1 Forward: 5'- ATGGAGCAGGGAAGACCAC-3 '
ABCA1 Reverse: 5'- GTAGGCCGTGCCAGAAGTT-3 '
ApoEプロモーター活性アッセイ
ApoEプロモーター(これは、ApoE遺伝子の上流側980塩基対および下流側93塩基対に広がる配列からなる)を、pGL3-Basicベクター(E1751、Promega Corporation、Madison、WI)に、NheI制限酵素およびSacI制限酵素を使用してホタルルシフェラーゼの上流側にクローン化した。その後、マルチエンハンサーエレメント1(ME.1)およびマルチエンハンサーエレメント2(ME.2)を、MluI制限酵素およびSacI制限酵素を使用してApoEプロモーターのすぐ上流側にクローン化した。LXRアゴニストによるApoEプロモーター駆動およびME.1/MW.2駆動の転写活性化を評価するために、5×104個のMeWo細胞を24ウエルプレートに播種した。翌日、100ngのpGL3-ME.1/ME.2-ApoEプロモーター構築物および2ngのpRL-CMVウミシイタケルシフェラーゼ構築物(E2261、Promega)を、DMSO、GW3965またはT0901317の1μΜでの存在下、それぞれの条件を四連で細胞に共トランスフェクションした。LXRαまたはLXRβによる転写活性化を評価するために、コントロールshRNA、あるいは、LXRαまたはLXRβを標的化するshRNAを発現する5×104個のMeWo細胞を24ウエルプレートに播種した。翌日、200ngのpGL3-ME.1/ME.2-ApoEプロモーター構築物および2ngのpRL-CMVウミシイタケルシフェラーゼ構築物を、DMSO、GW3965またはT0901317の1μΜでの存在下、それぞれの条件を四連で細胞に共トランスフェクションした。24時間後、細胞を溶解し、細胞溶解物を、Dual Luciferase Assay System(E1960、Promega)およびBio-Tek Synergy NEO Microplate Readerを使用してホタルルシフェラーゼ活性およびウミシイタケルシフェラーゼ活性について分析した。ホタルルシフェラーゼのシグナルをウミシイタケルシフェラーゼのシグナルに対して正規化した。すべてのデータが、DMSO処理コントロール細胞において測定されるルシフェラーゼ活性比率に対して表される。
ApoE-promoterForward: 5'-TCA TAG CTA GCG CAG AGC CAG GAT TCA CGC CCT G-3'
ApoE-promoter Reverse: 5'-TGG TCC TCG AGG AAC CTT CATCTT CCT GCC TGT GA-3'
ME.1 Forward: 5 '-TAG TTA CGC GTA GTA GCC CCC ATC TTT GCC-3'
ME.1 Reverse: 5'-AAT CAG CTA GCC CCT CAG CTG CAA AGC TC-3'
ME.2 Forward: 5 '-TAG TTA CGC GTA GTA GCC CCC TCT TTGCC-3'
ME.2 Reverse: 5'-AAT CAG CTA GCC CTT CAG CTG CAA AGCTCT G-3'
腫瘍の組織化学
腫瘍をマウスから切除し、4%パラホルムアルデヒドにおいて4℃で48時間にわたって固定処理した。その後、腫瘍をパラフィン包埋し、5μmの厚さの連続切片にした。腫瘍における内皮細胞含有量分析のために、腫瘍切片を、マウス内皮細胞マーカーのMECA-32に対する一次抗体(Developmental Studies Hybridoma Bank、The University of Iowa、IA)により染
色し、DAPI核染色により対比染色した。腫瘍細胞の増殖およびアポトーシスを明らかにするために、腫瘍切片を、増殖性マーカーのKi-67に対する抗体(Abcam、abl5580、Cambridge、MA)と、アポトーシスマーカーの切断型カスパーゼ-3に対する抗体(9661、Cell Signaling、Danvers、MA)とによりそれぞれ染色した。様々なAlexa Fluoro色素コンジュゲート化二次抗体を、一次抗体を検出するために使用した。蛍光を、倒立型蛍光顕微鏡(Zeiss
Axiovert 40 CFL)をMECA-32染色およびKi-67染色については5×の倍率で使用して、また、切断型カスパーゼ-3染色については10×の倍率で使用して測定した。内皮細胞含有密度および腫瘍増殖速度を、総腫瘍面積からのMECA-32陽性染色面積またはKi-67陽性染色面積の平均百分率を計算することによって定量化した。腫瘍のアポトーシスを、切断型カスパーゼ-3を発現する細胞の数を所与の腫瘍面積あたり計数することによって測定した。
ヒト原発性メラノーマ皮膚病変部をMSKCCにおいてメラノーマ患者から切除し、ホルマリン固定し、パラフィンに包埋し、5μmの厚さの連続切片にした。ApoEタンパク質発現を明らかにするために、サンプルを最初に、2回の連続するキシレン洗浄(それぞれ5分)によって脱パラフィン化し、そして、一連のエタノール洗浄(100%、95%、80%および70%のEtOH)によって再水和した。ApoE抗原を、サンプルをプロテイナーゼK(5μg/mL)の存在下において室温で20分間インキュベーションすることによって回復させた。内因性ペルオキシダーゼ活性を失活させるために、スライドを3%のH2O2溶液においてインキュベーションした。その後、スライドを、3回の連続するアビジンブロック溶液、ビオチンブロック溶液およびウマ血清ブロック溶液においてそれぞれ15分間、室温でブロック処理した(SP-2001、Vector Laboratories、Burlingame、CA)。ApoEをD6E10抗ApoE抗体(ab1908、Abcam)による染色によって検出した。このとき、抗体はPBSにおいて1:100の希釈で4℃で一晩使用した。その後、一次抗体が、スライドをペルオキシダーゼコンジュゲート化二次抗体(PK-4002、Vector Laboratories)においてインキュベーションすることによって認識され、DAB(SK-4105、Vector Laboratories)酸化反応によって顕示された。スライドを10×の倍率で画像化し、二重盲検様式で分析した。ApoE発現を、DAB陽性細胞の数を計数し、かつ、細胞外ApoE染色の面積を測定することによって定量化した。総ApoE染色シグナルを、それぞれのサンプルについての一致したH&E染色スライドに基づいて決定される所与の腫瘍面積あたりの百分率染色面積として表した。患者の転移非存在生存時間を示すカプラン・マイヤー曲線を、それぞれの患者の再発非存在生存データをその患者の原発性メラノーマ病変部おけるApoE発現の関数としてプロットすることによって作成した。腫瘍が集団のメジアンApoE発現よりも低いApoEレベルを有する患者をApoE陰性として分類し、これに対して、メラノーマが該メジアンを超えてApoEを発現する患者をApoE陽性として分類した。肺、脳、骨、軟組織および皮下組織ならびに皮膚などの部位への転移性再発の以前に記録された患者の病歴により、本発明者らは、原発性メラノーマ部位におけるApoE発現と、転移性再発との間における関係を遡及的に明らかにすることができた。
メラノーマ転移のmiRNA調節因子を特定するために、インビボ選抜(PollackおよびFidler、1982)を、色素沈着したMeWoヒトメラノーマ細胞株および色素沈着しなかったA375ヒトメラノーマ細胞株とともに利用して、多数の第2世代(LM2)および第3世代(LM3)の肺転移性派生物を作製した。MeWo-LM2系統およびA375-LM3系統の転移可能性の比較により、これらの派生物が肺でのコロ
ニー形成アッセイにおいてそれらのそれぞれの親集団よりも著しく効率的に転移することが示された(図12A~図12B)。894個の成熟型miRNAのハイブリダイゼーションに基づく小RNAのプロファイリング、その後、定量的なステム・ループPCR(qRT-PCR)により、4つのmiRNA(miR-1908、miR-199a-3p、miR-199a-5pおよびmiR-214)が、多数のA375転移性派生物およびMeWo転移性派生物において、それらのそれぞれの親細胞に対して2倍を超えてアップレギュレーションされることが明らかにされた(図1A~図1B、図12C)。多数の転移性派生物の全体にわたる、miR-199a-3p、miR-199a-5p、miR-214およびmiR-1908の著しい誘導は、これらのmiRNAについての転移促進役割を示唆した。miR-199a-3pおよびmiR-199a-5p(これらはmiR-199aヘアピンと同時に過剰発現させられる)ならびにmiR-1908についての前駆体のレトロウイルス媒介の形質導入および過剰発現は、バイオルミネセンスシグナル定量化および全体的な肺組織学の両方に基づいて肺での転移性コロニー形成における堅固な増大を引き起こし(図1C、図12D;miR-1908については9.64倍の増大、P=0.016;miR-199aについては8.62倍の増大、P=0.028)、一方、miR-214の過剰発現は転移に著しい影響を与えなかった。重要なことに、miR-199aおよびmiR-1908のそれぞれの過剰発現は、形成される転移性結節の数を増大させ(図12E)、これは転移開始におけるこれらのmiRNAについての役割と一致していた。これらの発見により、miR-199aおよびmiR-1908が、高まった転移性コロニー形成のために十分であることもまた明らかにされた。
本実施例では、アッセイを、miR-1908、miR-199a-3pおよびmiR-199a-5pが転移を調節する細胞機構を明らかにするために行った。
P<0.001)、このことから、転移性内皮含有量および転移性血管形成を促進させることにおけるこれらのmiRNAについての役割が明らかにされた。逆に、低転移性のメラノーマ細胞におけるそれぞれのmiRNAの過剰発現は転移性血管密度を劇的に増大させた(図13H)。これらの発見から、miR-199a-3p、miR-199a-5pおよびmiR-1908が、メラノーマ進行時における高まった浸潤および内皮動員のために必要であり、かつ、十分であるとして明らかにされる。
本実施例では、体系的で、かつ、先入観のない取り組みを、これらのmiRNAの直接的な分子標的を特定するために用いた。
かを次に調べた。転移性LM2細胞におけるそれぞれの遺伝子の過剰発現は、細胞浸潤および内皮動員の表現型における際立った低下を引き起こした(図3F~3G、図14F)。逆に、無関係なヘアピンを使用する、低転移性細胞におけるApoEまたはDNAJA4のノックダウンは、細胞浸潤および内皮動員を著しく高めた(図3H~図3I、図14G)。このことから、ApoEおよびDNAJA4がこれらの転移支援的表現型の内因性抑制因子として作用することが明らかにされ、このことは、上述の転移促進性miRNAによるそれらの標的化と一致していた。
ApoEおよびDNAJA4がmiR-199aおよびmiR-1908の下流側の直接的な生物学的エフェクターであるかどうかを明らかにするために、様々なアッセイを行って、これら2つの標的遺伝子がとりわけ、それぞれのmiRNAと相互作用するかどうかを調べた。予想されたように、miRNAサイレンシングは高転移性メラノーマ細胞の浸潤能および内皮動員能を低下させた。重要なことに、miRNA阻害の状況におけるApoEまたはDNAJA4のノックダウンは、それぞれのmiRNAのサイレンシングのとき、浸潤(図4Aおよび図4C)および内皮動員(図4Bおよび図4D)の抑制を著しく妨げた。驚くべきことに、これらの遺伝子のどちらかのノックダウンは、miR-1908またはmiR-199a-5pについて枯渇化された細胞では、miRNA阻害から生じる転移性コロニー形成の劇的な抑制を完全に回復させた(図4E~図4F、図15E)。逆に、ApoEまたはDNAJA4の過剰発現は、miR-1908を過剰発現する細胞(図4G~図4H、図15F)またはmiR-199aを過剰発現する細胞(図15G~図15I)では、細胞浸潤および内皮動員を抑制するために十分であった。加えて、ApoEまたはDNAJA4の過剰発現は、miRNA媒介の転移性コロニー形成を阻害するために十分であった(図15J)。重要なことに、ApoEおよびDNAJA4はまた、高転移性A375-LM3細胞によるmiRNA依存的な高まった細胞浸潤および内皮動員のために要求された(図4I~図4J、図15K)。
ApoEは分泌型因子である。そのようなものとして、メラノーマ細胞により分泌されたApoEが浸潤および内皮動員を抑制し得るかどうかを調べた。それによれば、ELISAによって検出される細胞外ApoEレベルが、転移性LM2細胞(これは、より大きいレベルのmiR-199aおよびmiR-1908を発現する)では、転移性があまり大きくないそれらの親細胞の3.5分の1であった(図5A)。分泌されたApoEレベルがまた、内因性のmiR-199aおよびmiR-1908によって著しく抑制された(図5Bおよび図16A)。
本実施例では、様々なアッセイを、ApoEが転移を抑制する分子的機構を詳しく調べるために行った。
いて阻害するために十分であった。重要なことに、ApoEの添加は、皮下マトリゲルプラグ内へのインビボでのVEGF誘導の内皮動員の劇的な(40倍超の差で)抑制を引き起こした(図6I)。
本明細書中に記載される転移促進因子miRNAが転移性結末の臨床的予測因子として役立ち得るかどうかを調べるために、miR-199a-3p、miR-199a-5pおよびmiR-1908の発現レベルを、MSKCCにおいて患者から得られるヒトメラノーマサンプルのコホートにおけるqRT-PCRによって盲検様式で定量化した。その後、原発性メラノーマ病変部におけるこれらのmiRNAのレベルと、転移性再発の結末との間における関係を求めた。
ロ増殖をもたらさなかった(図18A)。このことは、この劇的な転移抑制表現型が、損なわれた増殖の二次的なものではないことを示している。独立したA375転移性派生物系統におけるコンビナトリアルLNA媒介のmiRNA標的化もまた、肺でのコロニー形成を著しく阻害した(図18B)。
本実施例では、結合組織増殖因子(CTGF)が、ガン細胞浸潤および内皮動員におけるApoE/LRP1シグナル伝達の下流側の媒介因子として特定された。qRT-PCR分析およびELISAによって求められるようなCTGF発現レベルがApoE/LRP1シグナル伝達によって媒介されている(図8A、図8Bおよび図8C)。加えて、ApoE/LRP1はガン細胞の浸潤を調節し、内皮動員がCTGFによって媒介される(図8D、図8E)。
本実施例では、アッセイを、CTGFがmiRNA依存的な浸潤および内皮動員を媒介するかどうかを詳しく調べるために行った。簡単に記載すると、トランスウエル細胞浸潤アッセイおよび内皮動員アッセイを、CTGFを標的化する阻止抗体の存在下でmiR-199aまたはmiR-1908を過剰発現する親MeWo細胞に対して行った。実際に、mir-199aおよびmir-1908に依存的な転移性浸潤および内皮動員がCTGFによって媒介されることが見出された(図9Aおよび図9B)。インビボでのメラノーマ転移(転移性コロニー形成)がCTGFによって媒介されるかどうかを詳しく調べるために、バイオルミネセンス画像化を、miR-199aまたはmiR-1908の過剰発現の状況でCTGFについてノックダウンされる5×104個の親MeWo細胞による肺転移に対して行った。この状況におけるCTGFのノックダウンはインビボでのメラノーマ転移における著しい低下を生じさせた(図9C)。
ニー形成を抑制する
肝臓X受容体(LXR)の様々な小分子アゴニストがApoEのレベルを増大させることが以前に示されている。LXR活性化を介してApo-Eのレベルを増大させることが治療的利益をもたらしたかどうかを詳しく調べるために、様々なアッセイを行って、Apo-Eのレベル、腫瘍細胞浸潤、内皮動員およびインビボでのメラノーマ転移に対するLXRアゴニストGW3965(化学名:3-[3-[N-(2-クロロ-3-トリフルオロメチルベンジル)-(2,2-ジフェニルエチル)アミノ]プロピルオキシ]フェニル酢酸塩酸塩)の影響を評価した(図10)。治療的濃度のGW3965の存在下における親MeWo細胞のインキュベーションはApoEおよびDNAJA4の発現を増大させた(図10Aおよび図10B)。GW3965によるMeWO細胞の前処理は腫瘍細胞浸潤を低下させ(図10C)、内皮動員を低下させた(図10D)。GW3965が転移をインビボにおいて阻害し得るかどうかを試験するために、マウスに、GW3965(20mg/kg)を含有する穀物型固形飼料餌またはコントロール餌を与え、肺転移を、4×104個の親MeWo細胞をマウスに尾静脈注入した後、バイオルミネセンスを使用してアッセイした(図10E)。この様式でのマウスへのGW3965の経口投与はインビボでのメラノーマ転移における著しい低下をもたらした(図10E)。
本実施例では、miR-7が、メラノーマ転移の内因性抑制因子として特定された(図11)。miR-7がメラノーマ転移をインビボにおいて抑制するかどうかを試験するために、その発現を、miR-Zip技術を使用して親MeWo細胞においてノックダウンさせた(図11A)。miR-7の短いヘアピン(miR-Zip)阻害剤を発現する4×104個の親MeWo細胞(miR-7 KD)を静脈内注入した後における肺での転移性コロニー形成のバイオルミネセンス画像化プロットは、肺転移をインビボにおいて著しく増大させた(図11A)。逆に、LM2細胞におけるmiR-7の過剰発現は肺転移をインビボにおいて著しく低下させた(図11B)。
広範囲の発現をメラノーマにおいて示す核ホルモン受容体を特定するために、本発明者らはすべての核ホルモン受容体ファミリーメンバーの発現レベルをヒトメラノーマ細胞株のNCI-60コレクションにわたって調べた。いくつかの受容体が、安定な発現を多数のメラノーマ系統にわたって示し、このことから、これらの受容体がメラノーマにおける
新規な潜在的標的を表し得ることが示唆された(図19Aおよび図20A)。注目すべきことに、これらのうち、肝臓X受容体(LXR)はApoEの転写を脂肪細胞およびマクロファージにおいて高めることが以前に示されており(Laffitte他、2001)、一方、RXRの薬理学的活性化はApoEの発現を前臨床的なアルツハイマーモデルにおいて行わせることが見出された(Cramer他、2012)。
様々なLXRアゴニストが最初、脂質異常症およびアテローム性動脈硬化の患者においてコレステロールを低下させるという目的のための経口薬物候補物として開発された(Collins他、2002;JosephおよびTontonoz、2003)。これらの化合物は、脂質レベルを大型動物の前臨床モデルにおいて低下させることができないことに付随して臨床的に断念された(Groot他、2005)。
進行を阻害する
メラノーマ腫瘍成長に対するLXRアゴニストの強力な抑制的影響は、本発明者らに、LXR活性化がまた、メラノーマ細胞による転移性コロニー形成を抑制し得るかどうかを調べさせるための動機を与えた。この目的を達成するために、GW3965[2]によるヒトMeWoメラノーマ細胞の前処理は、それらの転移性コロニー形成能における50倍超の差での低下を引き起こした(図23A)。この劇的な阻害的影響に照らして、本発明者らは次に、経口投与されたLXRアゴニストが転移を抑制し得るかを評価した。GW3965[2]またはT0901317[1]が経口投与された免疫低下マウスは、31倍の差での低下および23倍の差での低下がそれぞれ、ヒトMeWo細胞による肺での転移性コロニー形成において生じた(図23B~図23C)。GW3965[2]による処置はまた、HT-144メラノーマ系統による転移性コロニー形成を抑制し(図23D)、同様にまた、SK-Mel-334.2原発性メラノーマ系統による転移性コロニー形成を抑制した(図23E)。
ヒトメラノーマ腫瘍の大雑把には60%が、Brafガン遺伝子における活性化する変異を特徴としており、1つの一アミノ酸変異体、すなわち、B-RafV600Eが、見出される優性な変異である(Davies他、2002)。ほぼ20%のメラノーマが、Pten腫瘍抑制因子の同時サイレンシングを伴ってB-Rafにおける活性化する変異を示しており、このことが、悪性のメラノーマ状態への進行に至らしている(Tsao他、2004;Chin他、2006)。近年には、チロシナーゼ(Tyr)主導の条件的なB-Raf活性化およびPten喪失が、マウスのメラノーマ進行を押し進めることにおいて遺伝的に協同することが示された(Dankort他、2009)。
本発明者らは次に、メラノーマ進行の抑制を媒介するLXRβの下流側の分子標的を明らかにしようと努めた。この目的を達成するために、本発明者らは、LXRアゴニストのGW3965[2]により処置されるヒトMeWoメラノーマ細胞のトランスクリプトームプロファイリングを行った。
インビトロにおける細胞外ApoEによる重要なメラノーマ表現型のLXRβ誘導による抑制により、インビボでのLXRアゴニストの抑制的影響が末梢組織(これは細胞外ApoEの堅固な供給源として役立ち得る)におけるLXRの活性化によってさらに強化されるかもしれないことが示唆された。
LXRβ活性化療法は多様な変異背景の広範囲のメラノーマ系統にわたってメラノーマの腫瘍成長および腫瘍転移を堅固に抑制することができることによって勇気づけられて、本発明者らは次に、転移性メラノーマの管理において使用される主力となる臨床薬剤のうちの2つに対して、すなわち、ダカルバジンおよびベムラフェニブに対して抵抗性であるメラノーマが、LXRβ活性化療法に応答し得るかどうかを明らかにしようと努めた。
以前に導かれたベムラフェニブ抵抗性SK-Mel-239系統の成長を72%抑制し(図31G)、かつ、ベムラフェニブ抵抗性メラノーマの負荷を有するマウスの生存を著しく延ばした(図31H)。メラノーマの多様な前臨床モデルにおける組み合わされた薬理学的研究、分子的研究および遺伝学的研究からの本発明者らの発見により、LXRβ標的化が、メラノーマの腫瘍成長および腫瘍転移をApoE(メラノーマ浸潤および転移性血管形成の重要な抑制因子)の転写誘導により堅固に抑制する新規な治療的取り組みとして立証される(Pencheva他、2012;図31I)。
ApoE処置が、メラノーマに加えて、様々なガンタイプを処置するために効果的であり得るかを明らかにするために、インビトロアッセイを行って、乳ガン細胞株、腎細胞ガン細胞株および膵臓ガン細胞株を含めて、いくつかの異なるガン細胞株に対するApoE処置の影響を評価した(図33)。
LXRアゴニストのGW3965[2]およびT0901317[1]を用いた処理によるApoE活性化が、腫瘍の成長および転移を阻害するための治療的利益をもたらしたことを考えれば、本発明者らは次に、他のLXRアゴニストがApoE発現をヒトメラノーマ細胞において誘導し得るかを調べた(図34)。
のLXRアゴニストを、示されるように500nM、1μMまたは2μMの濃度で細胞培地に加え、細胞をDMSOまたは薬物の存在下において37℃で48時間インキュベーションした。細胞培地に加えられるDMSOの総量を0.2%未満に保った。RNAを、Total RNA Purification Kit(17200、Norgen)を使用して全細胞溶解物から抽出した。どのサンプルについても、600ngのRNAを、cDNA First-Strand Synthesisキット(Invitrogen)を使用してcDNAに逆転写した。およそ200ngのcDNAを、SYBR(登録商標)グリーンPCR Master Mix、ならびに、ヒトApoEを検出するために特異的である対応する順方向プライマーおよび逆方向プライマーと混合した。それぞれの反応を四連で行い、ApoEのmRNA発現レベルを、ABI Prism 7900HT Real-Time PCR System(Applied Biosystems)を使用して定量的リアルタイムPCR増幅によって測定した。相対的なApoE発現を、ΔΔCt法を使用して求めた。GAPDHを正規化目的のための内因性コントロールとして使用した。
本発明者らは、LXRアゴニストによる処置がメラノーマ腫瘍細胞浸潤の阻害をもたらしたことを明らかにしている。この効果がApoE発現の活性化によって媒介されることを考えれば、本発明者らは、LXRアゴニストによる処置が、乳ガン、膵臓ガンおよび腎臓ガンにおけるインビトロでの腫瘍細胞浸潤の阻害をもたらすであろうと仮定した。これは、これらのガンタイプがApoE処置に対して応答性であったからである。この仮説を検証するために、本発明者らは、インビトロ腫瘍細胞浸潤アッセイを、乳ガン細胞株、膵臓ガン細胞株および腎細胞ガン細胞株をLXRアゴニストのGW3965[2]により処理することによって行った(図35)。
本発明者らは、LXRアゴニストが、乳ガン、膵臓ガンおよび腎臓ガンにおけるインビトロでのガン進行表現型を阻害することを明らかにしている。LXRアゴニストによる処置が乳ガンの原発性腫瘍成長をインビボにおいて阻害するかを詳しく調べるために、MDA-468ヒト乳ガン細胞が注入されるマウスを、コントロール餌、または、LXRアゴニストのGW3965[2]が補充される餌のどちらかにより処置した(図36)。
本発明者らは、様々なLXRアゴニストが、ApoE発現を、メラノーマ細胞における様々な効力を伴って誘導し得ることを明らかにしている(図34)。ガンに対するLXRアゴニストの治療効果がApoE発現の活性化を介してであるので、本発明者らは、どのようなLXRアゴニストであれ、与えられたLXRアゴニストの治療効力がそのApoE発現誘導能と直接に相関づけられることを仮定した。このことを確認するために、本発明者らは、メラノーマ細胞のインビトロでの内皮動員および腫瘍細胞浸潤に対する様々なLXRアゴニストによる処置の影響を定量化した。図37に示されるように、LXRアゴニストがインビトロでのガン進行表現型を阻害する程度が、LXRアゴニストのApoE誘導効力に関連づけられる。
ない細胞を、q-チップを使用してそれぞれの挿入物の上部面から穏やかにかき取り、挿入物の基部面に浸潤した細胞を4%のPFAにおいて室温で15分間にわたって固定処理した。固定処理の後、挿入物をPBSで洗浄し、切り出し、DAPI核染色(H-1000、Vector Laboratories)を含有するVectaShiels固定用媒体を使用してスライドに固定した。それぞれの挿入物の基部面を、倒立型蛍光顕微鏡(Zeiss Axiovert 40 CFL)を5×の倍率で使用して画像化し、DAPI陽性細胞の数を、ImageJを使用して定量化した。
本発明者らは、ApoE発現を誘導する様々なLXRアゴニストがインビトロ腫瘍活性を阻害することを明らかにしている。これらのアゴニストがメラノーマ腫瘍成長をインビボにおいて阻害するかを確認するために、B16F10メラノーマ細胞が注入されるマウスを、LXR-623、WO-2007-002563(Ex.19)、WO-2010-0138598(Ex.9)またはSB742881のいずれかにより処置した。
力に誘導するLXRアゴニスト(WO-2010-0138598(Ex.9)およびSB742881)はメラノーマ原発性腫瘍成長をインビボにおいて著しく阻害した(図38)。このことはまた、ApoE発現を強力に誘導する他のLXRアゴニスト(GW3965[2]、T0901317[1])もまた、原発性腫瘍成長をインビボにおいて阻害することを実証する本発明者らの結果(図21)と一致している。
E受容体結合ドメインを含有するN末端ドメインにおける112位および158位の残基において異なる。これらの構造的変化が変異体の間における異なった機能的属性を生じさせていると考えられる。このことと一致して、これら3つのApoEイソ型は、LDL受容体ファミリーのメンバーについてのそれらの結合親和性、リポタンパク質結合の好み、および、N末端の安定性において異なる。すなわち、ApoE2は、LDL受容体結合能が、ApoE3およびApoE4と比較して、50分の1~100分の1と弱く(Weisgraber他、1982)、一方、ApoE4は、それ以外の2つの変異体とは異なり、大きいより低密度のリポタンパク質に優先的に結合し(Weisgraber他、1990)、また、最も低いN末端安定性を示す(Morrow他、2000)。これらの機能的な違いにより、ApoEのイソ型を選択するための病態生理学的性質がもたらされる。ApoE3(これは集団の78%において見出される)は中立的な対立遺伝子であると見なされるが、ApoE2はIII型高リポタンパク血症に関連し(Hatters他、2006)、ApoE4はアルツハイマー病についての主要な知られている遺伝的リスクを表し(Corder他、1993)、また、心臓血管疾患を発症する危険性における大きくない増大と相関する(Luc他、1994)。上記研究において分析された多数のヒトメラノーマ細胞株がApoE3対立遺伝子についてホモ接合性であること、同様にまた、組換えAoE3がメラノーマ浸潤および内皮動員を阻害し得ることを考えれば、上記の発見は、ApoE3がメラノーマ転移性進行の抑制のために十分であり、かつ、要求されることと一致している。しかしながら、ApoE2およびApoE4がこれらの転移支援的表現型をApoE3と同じような程度に調節し得るかどうか、また、特定のApoE遺伝子型が、メラノーマ転移性進行の高まった危険性をもたらすかどうかを明らかにすることは、将来、注目されるであろう。
可能に機能しなかった;Penna他、2011)、および、miR-30b/miR-30d(Gaziel-Sovran他、2011)など。これらのmiRNAのそれぞれがメラノーマ転移をほどほどにしか調節せず、これにより、1.5倍~2倍の差で増大または低下した転移調節をmiRNAの過剰発現またはノックダウンのときにそれぞれ引き起こすことが報告されている。対照的には、miR-199aまたはmiR-1908のどちらかの過剰発現は転移を9倍高め(図1C)、一方、コンビナトリアルmiRNAノックダウンは、70倍超の差でメラノーマ転移を相乗的に抑制した(図7E)。したがって、本明細書中に開示される研究は、ヒトメラノーマ転移を収斂的かつ堅固に促進させる多数のmiRNAの最初の体系的な発見、同様にまた、二重の細胞自律的/細胞非自律的な役割をガンにおける内因性の転移調節miRNAに対応づける最初のものであることを表している。
の異なった上皮ガンタイプにおける転移開始および転移性コロニー形成の促進因子として作用する転移ニッチの中への内皮動員と一致している。ガン進行における内皮細胞についてのそのような非正準的役割は、高まった腫瘍成長を急がせる血流の血管形成強化における内皮細胞の立証された役割と対照をなすものであろう。内皮細胞は、様々な合図を器官形成の期間中に付近の細胞に与えることによって発達におけるそのような非正準的役割を果たすことが知られている(Lammert他、2001)。そのような合図はまた、器官再生を促進させることが近年には示されている(Ding他、2011;Ding他、2010;Kobayashi他、2010)。今後の研究が、転移開始を触媒する内皮細胞によって提供される転移刺激因子を明らかにするために必要となる。
Claims (15)
- 前記ガンが、卵巣ガン、乳ガン、肺ガン、神経膠芽細胞腫、又はメラノーマである、請求項1に記載の医薬組成物。
- 前記ガンが卵巣ガンである、請求項1に記載の医薬組成物。
- 前記卵巣ガンが白金剤に対して抵抗性である、請求項3に記載の医薬組成物。
- 前記ガンが乳ガンである、請求項1に記載の医薬組成物。
- 前記乳ガンが三重陰性乳ガンである、請求項5に医薬組成物。
- 前記ガンが肺ガンである、請求項1に記載の医薬組成物。
- 前記肺ガンが非小細胞肺ガンである、請求項7に記載の医薬組成物。
- 前記ガンが神経膠芽細胞腫である、請求項1に記載の医薬組成物。
- 前記ガンがメラノーマである、請求項1に記載の医薬組成物。
- 前記LXRβアゴニストが前記化合物25である、請求項1に記載の医薬組成物。
- 前記ガンが転移性である、請求項1に記載の医薬組成物。
- 前記LXRβアゴニストが、対象において転移性ガンの転移の伝播を遅くするのに十分なレベルにまでApoEの発現レベルまたは活性レベルを増大させるのに十分な量で投与される、請求項1に記載の医薬組成物。
- 前記ガンが、ニボルマブ又はイピリムマブでの処置中又は後に進行したものである、請求項1に記載の医薬組成物。
- 前記ガンが、ニボルマブ又はイピリムマブに対する抵抗性を有すると診断または予測される、請求項1に記載の医薬組成物。
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C21 | Notice of transfer of a case for reconsideration by examiners before appeal proceedings |
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TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
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