JP2024041827A - メラノーマの処置および診断 - Google Patents
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Abstract
【課題】ガンを処置するための医薬組成物を提供する。【解決手段】(a)及び(b)からなる医薬組成物。(a)化合物1、2、12、及び25からなる群より選択されるLXRβアゴニスト。(b)免疫調節剤、トポイソメラーゼ阻害剤、代謝拮抗剤、血管新生阻害剤、チロシンキナーゼ阻害剤、アルキル化剤、及び有糸分裂阻害剤からなる群より選択される抗増殖性化合物。TIFF2024041827000078.tif110166【選択図】図19AC
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本出願は米国仮特許出願第61/682,339号(2012年8月13日出願)および米国仮特許出願第61/784,057号(2013年3月14日出願)の優先権を主張する。これらの出願の内容はそれらの全体において参照によって本明細書中に組み込まれる。
本発明は、遊走性ガンおよびメラノーマの診断および処置に関連する。
メラノーマは悪性腫瘍であり、下部表皮における異常なメラノサイトから発達し、血液系およびリンパ系を介して体内の遠位部位に転移し得る。メラノーマは皮膚ガン症例の5%未満を占めるにもかかわらず、はるかにより危険であり、皮膚ガンに伴う死者の大多数に関わっている。世界中で、メラノーマの発生率が、驚くべき割合で増大し続けてきており、メラノーマを発症する生涯リスクが合衆国において男性については1/58もの大きさである(非特許文献1)。悪性メラノーマの死亡率もまた、世界中で劇的に上昇し続けている。2006年のWHO報告書によれば、約48,000名のメラノーマ関連死亡が1年あたり世界中で生じている(非特許文献2)。合衆国では、ほぼ70,000名の人々が2010年の間にメラノーマと診断され、およそ9,000名がこの疾患により死亡すると予想されるであろうことが見積もられた(非特許文献3)。
いくつかの従来的なガン治療法が転移性メラノーマを処置する際に使用されているにもかかわらず、それらは効果的ではない。したがって、転移性メラノーマは依然として、処置することが最も困難なガンの1つであり、また、最も恐れられている新生物の1つである。したがって、メラノーマの診断および処置のための新規な薬剤および方法が求められている。
Jemal他、2008、CA:Cancer J.Clin.、58:71~96
Lucas他(2006)、Environmental Burden of Disease Series.13.World Health Organization.ISBN92-4-159440-3
米国ガン学会;www.cancer.org
本発明は、上述の必要性を、メラノーマの診断および処置のための薬剤および方法を提供することによって対処する。本発明は、少なくとも部分的には、転移性メラノーマにおいて脱調節される協同的なmiRNA-タンパク質ネットワークの予想されなかった発見に基づいている。このネットワークには、多くの転移抑制因子および転移促進因子が含まれる。
1つの局面において、本発明は、ガンを処置するための方法であって、その必要性のある対象にLXRアゴニストを投与することを含み、LXRアゴニストが、当該ガンの転移の伝播を遅くするのに十分なレベルにまでApoEの発現レベルまたは活性レベルを増大
させるのに十分な量で投与される方法を特徴とする。
させるのに十分な量で投与される方法を特徴とする。
別の局面において、本発明は、ガンを処置するための方法であって、その必要性のある対象に、当該ガンを処置するのに十分な量でApoEポリペプチドを投与することを含む方法を特徴とする。
別の局面において、本発明は、遊走性ガンの伝播を遅らせる方法であって、その必要性のある対象にLXRアゴニストまたはApoEポリペプチドを投与することを含む方法を特徴とする。
上述の方法のいずれかのいくつかの実施形態において、LXRアゴニストはLXRβアゴニストである。特定の実施形態において、LXRアゴニストはApoEの発現レベルをインビトロにおいて少なくとも2.5倍増大させる。特定の実施形態において、LXRβアゴニストはLXRαよりもLXRβに対して選択的である。他の実施形態において、LXRβアゴニストは、LXRαに対する前記アゴニストの活性よりも少なくとも2.5倍大きいLXRβに対する活性を有する。いくつかの実施形態において、LXRβアゴニストは、LXRαに対する前記アゴニストの活性よりも少なくとも10倍大きいLXRβに対する活性を有する。さらなる実施形態において、LXRβアゴニストは、LXRαに対する前記アゴニストの活性よりも少なくとも100倍大きいLXRβに対する活性を有する。特定の実施形態において、LXRアゴニストは、LXRαに対する前記アゴニストの活性の少なくとも2.5倍以内であるLXRβに対する活性を有する。
いくつかの実施形態において、遊走性ガンは転移性ガンである。転移性ガンには、遊走性細胞の遊走および/または浸潤を示す細胞を挙げることができ、ならびに/あるいは、内皮動員および/または血管形成を示す細胞を挙げることができる。他の実施形態において、遊走性ガンは細胞遊走ガンである。なおさらに他の実施形態において、細胞遊走ガンは非転移性の細胞遊走ガンである。
遊走性ガンは、腹膜腔、胸膜腔、心膜腔またはクモ膜下腔の表面に播種することを介して伝播するガンであり得る。代替では、遊走性がんは、リンパ系を介して伝播するガン、または、血行を介して伝播するガンであり得る。
特定の実施形態において、遊走性ガンは、非転移性の細胞遊走ガンである細胞遊走ガンであり、例えば、卵巣ガン、中皮腫または原発性肺ガンなどである。
関連する局面において、本発明は、ガンの転移を阻害するための、または軽減させるための方法であって、LXRアゴニストまたはApoEポリペプチドを投与することを含む方法を提供する。
別の局面において、本発明は、ガン幹細胞またはガン始原細胞の増殖または成長を阻害するための方法であって、当該細胞を、前記細胞の増殖または成長を阻害するのに十分な量でLXRアゴニストまたはApoEポリペプチドと接触させることを含む方法を提供する。
さらに別の局面において、本発明は、ガンの腫瘍播種速度を低下させる方法であって、その必要性のある対象に、腫瘍播種を低下させるのに十分な量でLXRアゴニストまたはApoEポリペプチドを投与することを含む方法を提供する。
なおさらにさらなる局面において、本発明は、ガンの転移性結節形成を低下させるか、または処置する方法であって、その必要性のある対象に、ガンの前記転移性結節形成を処
置するのに十分な量でLXRアゴニストまたはApoEポリペプチドを投与することを含む方法を提供する。
置するのに十分な量でLXRアゴニストまたはApoEポリペプチドを投与することを含む方法を提供する。
他の実施形態において、ガンは、乳ガン、結腸ガン、腎細胞ガン、非小細胞肺ガン、肝細胞ガン、胃ガン、卵巣ガン、膵臓ガン、食道ガン、前立腺ガン、肉腫またはメラノーマである。いくつかの実施形態において、ガンはメラノーマである。他の実施形態において、ガンは乳ガンである。特定の実施形態において、ガンは腎細胞ガンである。さらなる実施形態において、ガンは膵臓ガンである。他の実施形態において、ガンは非小細胞肺ガンである。いくつかの実施形態において、ガンは結腸ガンである。さらなる実施形態において、ガンは卵巣ガンである。
他の実施形態において、ガンは薬物抵抗性のガンである。さらなる実施形態において、ガンは、ベムラフェニブ、ダカルバジン、CTLA4阻害剤、PD1阻害剤またはPDL1阻害剤に対して抵抗性である。
いくつかの実施形態において、上記方法は、式I~式IVのいずれか1つの化合物または化合物番号1~化合物番号39のいずれかの化合物あるいはそれらの医薬的に許容される塩からなるリストから選択されるLXRアゴニストを投与することを含む。いくつかの実施形態において、LXRアゴニストは化合物1またはその医薬的に許容される塩である。他の実施形態において、LXRアゴニストは化合物2またはその医薬的に許容される塩である。特定の実施形態において、LXRアゴニストは化合物3またはその医薬的に許容される塩である。さらなる実施形態において、LXRアゴニストは化合物12またはその医薬的に許容される塩である。いくつかの実施形態において、LXRアゴニストは化合物25またはその医薬的に許容される塩である。他の実施形態において、LXRアゴニストは化合物38またはその医薬的に許容される塩である。さらなる実施形態において、LXRアゴニストは化合物39またはその医薬的に許容される塩である。
上記方法はさらに、抗増殖剤を投与することを含むことができ、この場合、前記LXRアゴニストおよび前記抗増殖剤が、一緒になって遊走性ガンの進行を遅らせるのに十分である量で投与される。例えば、抗増殖剤およびLXRアゴニストを、一緒になって上記対象を処置するために効果的である量で、それぞれの28日以内(例えば、21日以内、14日以内、10日以内、7日以内、5日以内、4日以内、3日以内、2日以内または1日以内)において、または、他の24時間以内(例えば、12時間以内、6時間以内、3時間以内、2時間以内もしくは1時間以内、または同時)において投与することができる。
いくつかの実施形態において、上記方法は、ApoEポリペプチドを投与することを含む。ApoEポリペプチドフラグメントはLRP1またはLRP8の活性レベルまたは発現レベルを増大させることができ、ならびに/あるいは、ApoEポリペプチドはLRP1またはLRP8に結合することができ、ApoEポリペプチドはApoEの受容体結合領域(RBR)であることが可能である。上記方法はさらに、抗増殖剤を投与することを含むことができ、この場合、前記ApoEポリペプチドおよび前記抗増殖剤が、一緒になって遊走性ガンの進行を遅らせるのに十分である量で投与される。例えば、抗増殖剤およびApoEポリペプチドを、一緒になって上記対象を処置するために効果的である量で、それぞれの28日以内(例えば、21日以内、14日以内、10日以内、7日以内、5日以内、4日以内、3日以内、2日以内または1日以内)において、または、他の24時間以内(例えば、12時間以内、6時間以内、3時間以内、2時間以内もしくは1時間以内、または同時)において投与することができる。
いくつかの実施形態において、医薬組成物はさらに、抗増殖活性を有するさらなる化合物を含む場合がある。抗増殖活性を有するさらなる化合物は、様々な化合物の群から、例
えば、化学療法剤および細胞毒性剤、分化誘導剤(例えば、レチノイン酸、ビタミンD、サイトカイン)、ホルモン剤、免疫学的薬剤ならびに抗血管新生剤などから選択することができる。化学療法剤および細胞毒性剤には、アルキル化剤、細胞毒性抗生物質、代謝拮抗剤、ビンカアルカロイド、エトポシド類およびその他(例えば、パクリタキセル、タキソール、ドセタキセル、タキソテール、シス-プラチン)が含まれるが、これらに限定されない。抗増殖活性を有するさらなる化合物のリストを、L.Brunton、B.ChabnerおよびB.Knollman(編)、Goodman and Gilman’s The Pharmacological Basis of Therapeutics、第12版、2011年、McGraw Hill Companies、New York、NYに見出すことができる。
えば、化学療法剤および細胞毒性剤、分化誘導剤(例えば、レチノイン酸、ビタミンD、サイトカイン)、ホルモン剤、免疫学的薬剤ならびに抗血管新生剤などから選択することができる。化学療法剤および細胞毒性剤には、アルキル化剤、細胞毒性抗生物質、代謝拮抗剤、ビンカアルカロイド、エトポシド類およびその他(例えば、パクリタキセル、タキソール、ドセタキセル、タキソテール、シス-プラチン)が含まれるが、これらに限定されない。抗増殖活性を有するさらなる化合物のリストを、L.Brunton、B.ChabnerおよびB.Knollman(編)、Goodman and Gilman’s The Pharmacological Basis of Therapeutics、第12版、2011年、McGraw Hill Companies、New York、NYに見出すことができる。
上記方法はさらに、アルキル化剤、白金剤、代謝拮抗剤、トポイソメラーゼ阻害剤、抗腫瘍抗生物質、有糸分裂阻害剤、アロマターゼ阻害剤、チミジル酸シンターゼ阻害剤、DNAアンタゴニスト、ファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤、ポンプ阻害剤、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ阻害剤、メタロプロテイナーゼ阻害剤、リボヌクレオシドレダクターゼ阻害剤、TNFアルファのアゴニスト/アンタゴニスト、エンドセリンA受容体アンタゴニスト、レチノイン酸受容体アゴニスト、免疫調節剤、ホルモン剤および抗ホルモン剤、光線力学的薬剤、チロシンキナーゼ阻害剤、アンチセンス化合物、コルチコステロイド類、HSP90阻害剤、プロテオソーム阻害剤(例えば、NPI-0052)、CD40阻害剤、抗CSI抗体、FGFR3阻害剤、VEGF阻害剤、MEK阻害剤、サイクリンD1阻害剤、NF-κB阻害剤、アントラサイクリン類、ヒストンデアセチラーゼ、キネシン阻害剤、ホスファターゼ阻害剤、COX2阻害剤、mTOR阻害剤、カルシニューリンアンタゴニスト、IMiD、または、増殖性疾患を処置するために使用される他の薬剤からなる群から選択される抗増殖性化合物を投与することを含む場合がある。そのような化合物の例が表1に提供される。
別の局面において、本発明は、メラノーマ(例えば、転移性メラノーマ)を、その処置を必要とする対象において処置するための方法を特徴とする。この方法は、(a)当該対象において、DNAJA4、アポリポタンパク質E(ApoE)、LRP1、LRP8、肝臓X受容体(LXR、例えば、LXR-アルファおよびLXR-ベータの両方)およびmiR-7からなる群から選択される転移抑制因子の発現レベルまたは活性レベルを増大させること、あるいは、(b)当該対象において、miR-199a-3p、miR-199a-5p、miR-1908およびCTGFからなる群から選択される転移促進因子の発現レベルまたは活性レベルを低下させることを含む。
この方法において、増大させる工程は、下記の(i)~(iv)のうちの1つまたは複数を当該対象に投与することによって行うことができる:(i)DNAJA4、ApoEまたはApoEフラグメント、LRP1、LRP8、あるいは、LXRの配列を有するポリペプチド、(ii)DNAJA4、ApoE、LRP1、LRP8またはLXRをコードする配列を有する核酸、(iii)LRP1、LRP8またはLXRに対するリガンド、および、(iv)miR-7をコードするRNAi剤。LRP1リガンドまたはLRP8リガンドの例には、ApoEの受容体結合部分、抗LRP1抗体または抗LRP8抗体、および、小分子リガンドが含まれる。一例において、ApoEの発現レベルを増大させることを、LXRの活性レベルまたは発現レベルを増大させることによって行うことができる。DNAJA4の発現レベルを増大させることもまた、LXRの活性レベルまたは発現レベルを増大させることによって行うことができる。LXRの活性レベルは、LXRのリガンド、例えば、下記で開示されるような式I~式IVの化合物などを当該対象に投与することによって増大させることができる。増大させる工程はまた、miR-199a-3p、miR-199a-5pおよびmiR-1908からなる群から選択されるマイクロRNAの発現レベルまたは活性レベルを低下させることによって行うことができる。こ
の目的を達成するために、この技術分野において知られている多くの技術を使用することができ、これらには、下記の実施例において記載されるようなmiR-Zip技術、ロックド核酸(LNA)技術およびアンタゴミル(antagomir)技術が含まれるが、これらに限定されない。
の目的を達成するために、この技術分野において知られている多くの技術を使用することができ、これらには、下記の実施例において記載されるようなmiR-Zip技術、ロックド核酸(LNA)技術およびアンタゴミル(antagomir)技術が含まれるが、これらに限定されない。
別の局面において、本発明は、対象が転移性メラノーマを有するかどうか、または、転移性メラノーマを有する危険性があるかどうかを決定するための方法を提供する。この方法は、対象からサンプルを得ること;当該サンプルにおいて、(i)miR-199a-3p、miR-199a-5p、miR-1908およびCTGFからなる群から選択される転移促進因子の第1の発現レベル、または、(ii)DNAJA4、ApoE、LRP1、LRP8、LXRおよびmiR-7からなる群から選択される転移抑制因子の第2の発現レベルを測定すること;ならびに、第1の発現レベルを第1の所定の参照値と比較すること、または、第2の発現レベルを第2の所定の参照値と比較することを含む。対象は、(a)第1の発現レベルが第1の所定の参照値を超えているならば、または、(b)第2の発現レベルが第2の所定の参照値を下回っているならば、転移性メラノーマを有することが決定されるか、または、転移性メラノーマを有する危険性があることが決定される。第1の所定の参照値および第2の所定の参照値を、転移性メラノーマを有しないコントロール対象から得ることができる。1つの実施形態において、測定する工程は、第1の発現レベルと第2の発現レベルとの両方を測定することを含む。サンプルは、体液サンプル、腫瘍サンプル、母斑サンプルまたはヒト皮膚サンプルであることが可能である。
別の局面において、本発明は、複数の特有の位置を有する支持体と、(i)miR-199a-3p、miR-199a-5p、miR-1908およびCTGFからなる群から選択される転移促進因子をコードする核酸またはその相補体に対して相補的である配列を有する少なくとも1つの核酸、あるいは、(ii)DNAJA4、ApoE、LRP1、LRP8、LXRおよびmiR-7からなる群から選択される転移抑制因子をコードする核酸またはその相補体に対して相補的である配列を有する少なくとも1つの核酸の任意の組合せとを含むアレイを提供する。好ましくは、それぞれの核酸が支持体の特有の位置に固定化される。このアレイは転移性メラノーマの診断および予後のために使用することができる。
したがって、本発明はまた、メラノーマの転移可能性を対象において診断するためのキットを提供する。キットは、DNAJA4、ApoE、LRP1、LRP8、LXRおよびmiR-7からなる群から選択される転移抑制因子遺伝子の発現産物に特異的に結合する第1の試薬、または、miR-199a-3p、miR-199a-5p、miR-1908およびCTGFからなる群から選択される転移促進因子遺伝子の発現産物に特異的に結合する第2の試薬を含む。第2の薬剤は、抑制因子遺伝子または促進因子遺伝子あるいはその相補体に対して相補的である配列を有するプローブであることが可能である。キットはさらに、免疫アッセイ、ハイブリダイゼーションアッセイまたはPCRアッセイを行うための試薬を含むことができる。1つの実施形態において、キットは上述のアレイを含有した。
別の局面において、本発明は、メラノーマを処置するために、あるいは、内皮動員、細胞浸潤または転移性血管形成を阻害するために有用な化合物を特定する方法を提供する。この方法は、(i)miR-199a-3p、miR-199a-5p、miR-1908およびCTGFからなる群から選択されるマーカー遺伝子のプロモーターに作動可能に連結される核酸によってコードされるレポーター遺伝子を発現する試験細胞を得ること;(ii)試験細胞を試験化合物にさらすこと;(iii)試験細胞におけるレポーター遺伝子の発現レベルを測定すること;(iv)発現レベルをコントロールレベルと比較すること;ならびに(v)比較により、発現レベルがコントロールレベルよりも低いことが示されるならば、試験化合物を、メラノーマを処置するために、あるいは、内皮動員、ガン細胞浸潤または転移性血管形成を阻害するために有用な候補物として選択することを含む。
本発明は、メラノーマを処置するために、あるいは、内皮動員、細胞浸潤または転移性血管形成を阻害するために有用な化合物を特定する別の方法を提供する。この方法は、(i)DNAJA4、ApoE、LRP1、LRP8、LXRおよびmiR-7からなる群から選択されるマーカー遺伝子のプロモーターに作動可能に連結される核酸によってコードされるレポーター遺伝子を発現する試験細胞を得ること;(ii)試験細胞を試験化合物にさらすこと;(iii)試験細胞におけるレポーター遺伝子の発現レベルを測定すること;(iv)発現レベルをコントロールレベルと比較すること;ならびに(v)比較により、発現レベルがコントロールレベルよりも大きいことが示されるならば、試験化合物を、メラノーマを処置するために、あるいは、内皮動員、ガン細胞浸潤または転移性血管形成を阻害するために有用な候補物として選択することを含む。
上述の特定方法において、レポーター遺伝子は、この技術分野において知られている標準的なレポーター遺伝子(例えば、LaxZ遺伝子、GFP遺伝子またはルシフェラーゼ遺伝子など)、あるいは、上述の転移抑制因子遺伝子または転移促進因子遺伝子の1つであることが可能である。これらの方法において、コントロールレベルは、試験化合物にさらされていないことを除いて試験細胞と同じであるコントロール細胞から得ることができる。
別の局面において、本発明は、内皮動員を、その阻害を必要とする対象において阻害するための方法、または、腫瘍細胞浸潤を、その阻害を必要とする対象において阻害するための方法、または、転移性ガンを、その処置を必要とする対象において処置するための方法であって、CTGFの発現または活性を阻害する薬剤を当該対象に投与することによる方法を提供する。対象は、ガン(例えば、転移性メラノーマ)、眼障害および炎症性障害(これらに限定されない)を含めて、病理学的な血管形成によって特徴づけられる障害を有するものであることが可能である。腫瘍細胞の一例が転移性のメラノーマ細胞である。薬剤の例には、抗体、核酸、ポリペプチドおよび小分子化合物が含まれる。好ましい実施形態において、抗体はモノクローナル抗体である。
別の局面において、本発明は、内皮動員を、その阻害を必要とする対象において阻害するための方法、または、腫瘍細胞浸潤を、その阻害を必要とする対象において阻害するための方法、または、転移性ガンを、その処置を必要とする対象において処置するための方法であって、miR-7の発現または活性を増大させる薬剤を当該対象に投与することによる方法を提供する。腫瘍細胞の一例が転移性のメラノーマ細胞である。薬剤の例には、抗体、核酸、ポリペプチドまたは小分子化合物が含まれる。一例において、薬剤はmiR-7活性を有する。核酸はオリゴヌクレオチドであることが可能である。オリゴヌクレオチドは、配列番号36~38からなる群から選択される配列を含むことができる。
本明細書中で使用される場合、「遊走性ガン」は、腫瘍を形成するガン細胞が遊走し、続いて、最初の腫瘍の部位とは異なる他の部位において悪性移植物として成長するガンを示す。ガン細胞は、体腔内に伝播するために腹膜腔、胸膜腔、心膜腔またはクモ膜下腔の表面に播種することを介して、リンパ細胞の浸潤によるリンパ系への浸潤、ならびに、局所リンパ節および遠位リンパ節への輸送、次いで、身体の他の部分への輸送を介して、血液細胞の浸潤による血行性伝播を介して、または、周囲組織への浸潤を介して遊走する。遊走性ガンには、転移性腫瘍および細胞遊走ガン(例えば、卵巣ガン、中皮腫および原発性肺ガンなど、これらのそれぞれが細胞の遊走によって特徴づけられる)が含まれる。
本明細書中で使用される場合、「遊走性ガンの伝播を遅くする」は、新しい病巣の形成を弱めるか、または停止させること、あるいは、腫瘍負荷を縮小させること、停止させること、または逆行させることを示す。
本明細書中で使用される場合、「転移性腫瘍」は、腫瘍を形成するガン細胞が、リンパ系を介して、または、血行性伝播を介して転移するか、または、対象の体内において1つの場所から別の場所(1つまたは複数)に伝播する大きい能力を有するか、あるいは、リンパ系を介して、または、血行性伝播を介して転移すること、または、対象の体内において1つの場所から別の場所(1つまたは複数)に伝播することを開始し、例えば対象の体内に二次的腫瘍を生成する、腫瘍またはガンを示す。そのような転移挙動により、悪性腫瘍が示される場合がある。場合によっては、転移挙動には、腫瘍細胞の細胞遊走挙動および/または細胞浸潤挙動における増大が伴うことがある。
本明細書中で使用される場合、「転移の伝播を遅くする」は、新しい病巣の形成を弱めるか、または停止させること、あるいは、腫瘍負荷を縮小させること、停止させること、または逆行させることを示す。
用語「ガン」は、どのようなガンであれ、悪性の新生物性細胞の増殖によって引き起こされるガンを示し、例えば、腫瘍、新生物、ガン腫、肉腫、白血病およびリンパ腫などを示す。
本明細書中で使用される場合、「薬物抵抗性(の)ガン」は、どのようなガンであれ、表2における抗増殖剤に対して抵抗性であるガンを示す。
転移性であるとして定義され得るガンの例には、非小細胞肺ガン、乳ガン、卵巣ガン、結腸直腸ガン、胆道ガン、膀胱ガン、脳ガン(神経膠芽細胞腫および髄芽細胞腫を含む)、子宮頸ガン、絨毛ガン、子宮内膜ガン、食道ガン、胃ガン、血液学的新生物、多発性骨髄腫、白血病、上皮内新生物、肝臓ガン、リンパ腫、神経芽細胞腫、口腔ガン、膵臓ガン、前立腺ガン、肉腫、皮膚ガン(メラノーマ、基底細胞ガン、扁平上皮ガンを含む)、精巣ガン、間質性腫瘍、胚細胞腫瘍、甲状腺ガンおよび腎臓ガンが含まれるが、これらに限定されない。
「増殖」は、本出願において使用される場合、(細胞)要素を構成することに起因する類似する形態(細胞)の複製または増加を伴う。
「細胞遊走」は、本出願において使用される場合、周囲組織へのガン細胞による浸潤、および、ガン細胞の遠位器官における脈管構造から出るための血管壁の横断を伴う。
「細胞遊走ガン」によって、周囲組織へのガン細胞による浸潤、および、ガン細胞の遠位器官における脈管構造から出るための血管壁の横断によって遊走するガンが意味される。
「非転移性(の)細胞遊走ガン」は、本明細書中で使用される場合、リンパ系を介して、または、血行性伝播を介して遊走しないガンを示す。
本明細書中で使用される場合、「細胞-細胞の接着」は、セレクチン分子とセレクチン特異的リガンドとの間での相互作用を介した少なくとも2つの細胞の間における接着を示す。細胞-細胞の接着は細胞遊走を含む。
「細胞接着関連障害」が、細胞-細胞の接着または遊走から生じるか、あるいは、細胞
-細胞の接着または遊走に関連づけられるいずれかの疾患または障害として本明細書中では定義される。細胞接着障害にはまた、免疫系または炎症系の不適切な活性化、正常から外れた活性化または正常でない活性化から生じるどのような疾患または障害も含まれる。そのような疾患には、心筋梗塞、細菌感染症またはウイルス感染症、転移性状態(例えば、ガン)が含まれるが、これらに限定されない。本発明はさらに、LXRアゴニストまたはApoEポリペプチドを投与することによって細胞接着障害を処置するための方法を特徴とする。
-細胞の接着または遊走に関連づけられるいずれかの疾患または障害として本明細書中では定義される。細胞接着障害にはまた、免疫系または炎症系の不適切な活性化、正常から外れた活性化または正常でない活性化から生じるどのような疾患または障害も含まれる。そのような疾患には、心筋梗塞、細菌感染症またはウイルス感染症、転移性状態(例えば、ガン)が含まれるが、これらに限定されない。本発明はさらに、LXRアゴニストまたはApoEポリペプチドを投与することによって細胞接着障害を処置するための方法を特徴とする。
本明細書中で使用される場合、「ガン幹細胞」または「ガン始原細胞」は、正常な幹細胞に関連する特徴を有するガン細胞、具体的には、特定のガンサンプルにおいて見出されるすべての細胞タイプを生じさせる能力を有するガン細胞を示す。したがって、ガン幹細胞は、おそらくは他の非腫瘍原性ガン細胞とは対照的に、腫瘍原性、すなわち、腫瘍形成性である。ガン幹細胞は、異なった集団として腫瘍において持続していることがあり、新しい腫瘍を生じさせることによってガンの再発および転移の原因となることがある。
本明細書中で使用される場合、「腫瘍播種」は、腫瘍細胞クラスターの流出、および、最初の腫瘍の部位とは異なる部位における悪性移植物としてのそれらのその後の成長を示す。
本明細書中で使用される場合、「転移性結節」は、最初の腫瘍の部位とは異なる部位における体内での腫瘍細胞の凝集物を示す。
本発明の1つまたは複数の実施形態の詳細が下記の説明において示される。本発明の他の特徴、目的および利点が、説明から、また、請求項から明らかであろう。
本発明は、細胞の正常でない増殖、分化または生存を防止するか、または軽減するための方法を特徴とする。例えば、本発明の化合物は、腫瘍がサイズにおいて増大するか、または、転移性状態に達するという危険性を減らすことにおいて、あるいは、腫瘍をサイズにおいて増大させないか、または、転移性状態に至らせないことにおいて有用である場合がある。本発明の主題化合物は、ガンの進行または発達を停止させるために投与される場合がある。加えて、本発明には、本発明の主題化合物を、ガンが再発する危険性を減らす
ために、または、ガンの再発を防止するために使用することが含まれる。
ために、または、ガンの再発を防止するために使用することが含まれる。
転移性進行は、共通する細胞表現型に関与する様々な一連のエフェクタータンパク質が首尾一貫して発現されることを必要とする(GuptaおよびMassague、2006、Cell、127、679~695;HanahanおよびWeinberg、2011、Cell、144、646~674;TalmadgeおよびFidler、2010、Cancer Res.、70、5649~5669;Hynes、2003、Cell、113、821~823)。そのような協調した発現状態が、転移する原発性乳ガンの遺伝子発現プロフィルにおいて明らかであり(Wang他、2005、Lancet、365、671~679)、同様にまた、高まった転移活性を呈示する様々なヒトガン細胞クローンのプロフィルにおいて明らかである(Kang他、2003、Cancer Cell、3、537~549;Minn他、2005、Nature、436、518~524)。近年では、転写後調節が、協調した発現状態および表現型レベルの制御の広範囲にわたる、また、堅固な様式として明らかになってきている。転移調節活性を有する転写後調節因子の最も研究されているクラスが、小さい非コードRNA(miRNA)である(Bartel、2009、Cell、136、215~233;Fabian他、2010、Annu.Rev.Biochem.、79、351~379;Filipowicz他、2008、Nat.Rev.Genet.、9、102~114)。転移促進因子miRNA(Ma他、2007、Nature、449、682~688;Huang他、2008、Nat.Cell Biol.、10、202~210)および転移抑制因子miRNA(Tavazoie他、2008、Nature、451、147~152)が乳ガンにおいて初めて発見された。その後の研究により、他のガンタイプの腫瘍形成および転移における調節的役割を有するさらに多くのmiRNAが明らかにされた(Hatziapostolou他、2011、Cell、147、1233~1247;Hurst他、2009、Cancer Res.、69、7495~7498;Olson他、2009、Genes Dev.、23、2152~2165;Zhang他、2010、Oncogene、29、937~948)。多くの場合において、ヒトガンサンプルにおけるこれらのmiRNAの発現レベルは、転移におけるそれらの実験的役割を裏づけている。したがって、脱調節されたmiRNA発現(Garzon他、2010、Nat.Rev.Drug Discov.、9、775~789;LujambioおよびLowe、2012、Nature、482、347~355)、および、より近年には、長い非コードRNAの脱調節された発現(Calin他、2007、Nat.Rev.Cancer、6、857~866;Gupta他、2010、Nature、464、1071~1076;Guttman他、2009、Nature、458、223~227;Huarte他、2010、Cell、142、409~419;Loewer他、2010、Nat.Genet.、42、1113~1117)、同様にまた、内因性miRNAが結合するために競合する非コード偽遺伝子の脱調節された発現(Poliseno他、2010、Nature、465、1033~1038)が、ヒトガンの広範囲にわたる特徴であるようである。特異的なmiRNAが転移性進行に及ぼす堅固な制御に関する様々な手がかりが、ただ1つだけの転移抑制因子miRNAによる多数の転移遺伝子の協調した標的化が劇的な転移抑制効果に関わっていたことを示す初期の研究からもたらされた(Tavazoie他、2008、Nature、451、147~152)。様々なmiRNAによるそのような多岐にわたる遺伝子標的化が、これらの調節因子の特徴づける特徴であることが明らかになってきている。
概念的レベルにおいて、ガンにおける遺伝子発現の多岐にわたる調節の必要性が容易に理解される。miRNAが、転移のために要求される多数の遺伝子を標的化するその能力によって、堅固な転移抑制を発揮し得るかもしれない。遺伝子的または後成的な機構を介するmiRNAのサイレンシングが、転移の多数の促進因子を脱抑制することによってガンの進行を容易に促進させるであろうと思われる(Png他、2011、Nature、
481、190~194)。多数の転移調節性miRNAによるただ1つだけの遺伝子の収斂的調節のための役割がよりにおわされる。転移性進行の堅固な抑制因子として作用した重要な遺伝子が存在したならば、このシナリオが現れるであろう。多数のmiRNAによるこの遺伝子の収斂的かつ協同的な標的化により、そのような重要な転移抑制因子遺伝子の最大のサイレンシングが達成され得るかもしれない。このシナリオは、遺伝的欠失とは対照的に、標的遺伝子の完全な喪失が細胞によって許容され得ないかもしれない場合に認められるかもしれず、この遺伝子は、例えば、代謝作用を媒介するために低いレベルで要求されるであろうと思われる。この可能性を考えれば、協同的な転移促進因子miRNAについての探索により、転移抑制のために非常に重要である新規な遺伝子が発見されるかもしれず、また、転移防止のためのより効果的な処置に対する治療的洞察がもたらされるかもしれない。
481、190~194)。多数の転移調節性miRNAによるただ1つだけの遺伝子の収斂的調節のための役割がよりにおわされる。転移性進行の堅固な抑制因子として作用した重要な遺伝子が存在したならば、このシナリオが現れるであろう。多数のmiRNAによるこの遺伝子の収斂的かつ協同的な標的化により、そのような重要な転移抑制因子遺伝子の最大のサイレンシングが達成され得るかもしれない。このシナリオは、遺伝的欠失とは対照的に、標的遺伝子の完全な喪失が細胞によって許容され得ないかもしれない場合に認められるかもしれず、この遺伝子は、例えば、代謝作用を媒介するために低いレベルで要求されるであろうと思われる。この可能性を考えれば、協同的な転移促進因子miRNAについての探索により、転移抑制のために非常に重要である新規な遺伝子が発見されるかもしれず、また、転移防止のためのより効果的な処置に対する治療的洞察がもたらされるかもしれない。
本明細書中に開示されるように、体系的であるインビボ選抜に基づく取り組みを介して、一組のmiRNAが、メラノーマ、すなわち、発生率が増大している非常に広まっているガン(GarbeおよびLeiter、2009、Clin.Dermatol.、27、3~9)を有する多数の患者に由来する多数の無関係な転移性系統において脱調節されることが確認された。本明細書中に開示されるように、miR-1908、miR-199a-3pおよびmiR-199a-5pが、代謝遺伝子ApoEおよび熱ショックタンパク質DNAJA4の収斂的な標的化を介してメラノーマ転移の堅固な内因性促進因子として作用する。機能喪失分析、機能獲得分析およびエピスタシス分析により、ApoEのシグナル伝達を最大限に沈黙させる協同的なmiRNAネットワークの輪郭が明らかになる。ガン細胞により分泌されるApoEにより、転移性浸潤および内皮動員が阻害され、このことが、メラノーマ細胞および内皮細胞における異なった受容体に対するその作用を介して媒介される。これらのmiRNAは、メラノーマの転移性再発を発症する患者を特定することにおける著しい予後能を示しており、一方、これらのmiRNAを標的化するLNAの治療的送達により、メラノーマ転移が著しく阻害される。外科的切除後のメラノーマ転移を防止するための効果的な治療法が現在不足していること(Garbe他、2011、Oncologist、16、5~24)は、メラノーマの転移性進行の改善された分子的かつ機構的な理解を必要としている。この目的を達成するために、本明細書中に開示される発見は、メラノーマ進行に関与するいくつかの重要な新規な非コード遺伝子およびコード遺伝子を明らかにしており、また、メラノーマ転移について危険性が大きい患者を特定すること、および、そのような患者を処置することの両方のための新規な手段をもたらしている。
下記には、上述のネットワークのメンバーの核酸配列およびアミノ酸配列ならびにいくつかの他の配列が示される。
APOE-RNA配列(配列番号1)
APOE-アミノ酸配列(配列番号2)
(下線が施された残基136~残基150はApoEのLRP結合ドメインを表す)
DNAJA4イソ型1-RNA配列(配列番号3)
DNAJA4イソ型1-アミノ酸配列(配列番号4)
DNAJA4イソ型2-RNA配列(配列番号5)
DNAJA4イソ型2-アミノ酸配列(配列番号6)
DNAJA4イソ型3-RNA配列(配列番号7)
DNAJA4イソ型3-アミノ酸配列(配列番号8)
LRP1-RNA配列(配列番号9)
LRP1-アミノ酸配列(配列番号10)
LRP8イソ型1-RNA配列(配列番号11)
LRP8イソ型1-アミノ酸配列(配列番号12)
LRP8イソ型2-RNA配列(配列番号13)
LRP8イソ型2-アミノ酸配列(配列番号14)
LRP8イソ型3-RNA配列(配列番号15)
LRP8イソ型3-アミノ酸配列(配列番号16)
LRP8イソ型4-RNA配列(配列番号17)
LRP8イソ型4-アミノ酸配列(配列番号18)
CTGF-RNA配列(配列番号19)
CTGF-アミノ酸配列(配列番号20)
LXR-aイソ型1:RNA配列(配列番号21)
LXR-a(NR1H3)イソ型1:アミノ酸配列(配列番号22)
LXR-a(NR1H3)イソ型2:RNA配列(配列番号23)
LXR-a(NR1H3)イソ型2:アミノ酸配列(配列番号24)
LXR-a(NR1H3)イソ型3:RNA配列(配列番号25)
LXR-a(NR1H3)イソ型3:アミノ酸配列(配列番号26)
LXR-a(NR1H3)イソ型4:RNA配列(配列番号27)
LXR-a(NR1H3)イソ型4:アミノ酸配列(配列番号28)
LXR-b(NR1H2)イソ型1:RNA配列(配列番号29)
LXR-b(NR1H2)イソ型1:アミノ酸配列(配列番号30)
LXR-b(NR1H2)イソ型2:RNA配列(配列番号31)
LXR-b(NR1H2)イソ型2:アミノ酸配列(配列番号32)
has-miR-199a-1配列(配列番号33)
GCCAACCCAGUGUUCAGACUACCUGUUCAGGAGGCUCUCAAUGUGUACAGUAGUCUGCACAUUGGUUAGGC
has-miR-199a-2配列(配列番号34)
AGGAAGCUUCUGGAGAUCCUGCUCCGUCGCCCCAGUGUUCAGACUACCUGUUCAGGACAAUGCCGUUGUACAGUAGUCUGCACAUUGGUUAGACUGGGCAAGGGAGAGCA
has-miR-1908配列(配列番号35)
CGGGAAUGCCGCGGCGGGGACGGCGAUUGGUCCGUAUGUGUGGUGCCACCGGCCGCCGGCUCCGCCCCGGCCCCCGCCCC
has-miR-7-1配列(配列番号36)
UUGGAUGUUGGCCUAGUUCUGUGUGGAAGACUAGUGAUUUUGUUGUUUUUAGAUAACUAAAUCGACAACAAAUCACAGUCUGCCAUAUGGCACAGGCCAUGCCUCUACAG
has-miR-7-2配列(配列番号37)
CUGGAUACAGAGUGGACCGGCUGGCCCCAUCUGGAAGACUAGUGAUUUUGUUGUUGUCUUACUGCGCUCAACAACAAAUCCCAGUCUACCUAAUGGUGCCAGCCAUCGCA
has-miR-7-3配列(配列番号38)
AGAUUAGAGUGGCUGUGGUCUAGUGCUGUGUGGAAGACUAGUGAUUUUGUUGUUCUGAUGUACUACGACAACAAGUCACAGCCGGCCUCAUAGCGCAGACUCCCUUCGAC
miR-Zip 199a-3p配列(配列番号39)
GATCCGACAGTAGCCTGCACATTAGTCACTTCCTGTCAGTAACCAATGTGCAGACTACTGTTTTTTGAATT
miR-Zip 199a-5p配列(配列番号40)
GATCCGCCCAGTGCTCAGACTACCCGTGCCTTCCTGTCAGGAACAGGTAGTCTGAACACTGGGTTTTTGAATT
miR-Zip 1908配列(配列番号41)
GATCCGCGGCGGGAACGGCGATCGGCCCTTCCTGTCAGGACCAATCGCCGTCCCCGCCGTTTTTGAATT
miR-Zip 7配列(配列番号42)
GATCCGTGGAAGATTAGTGAGTTTATTATCTTCCTGTCAGACAACAAAATCACTAGTCTTCCATTTTTGAATT
このネットワークのメンバーは、転移性メラノーマを処置するための標的として使用することができる。加えて、これらのメンバーは、対象が転移性メラノーマを有するかどうか、または、転移性メラノーマを有する危険性があるかどうかを決定するためのバイオマーカーとして、あるいは、そのような障害を有する患者の予後を明らかにするための、または、そのような障害を有する患者の監視のためのバイオマーカーとして使用することができる。したがって、本発明は、転移性メラノーマを、これらのメンバーの1つまたは複数を標的化することによって処置する方法、当該ガンを阻害するための治療療法の効力を明らかにする方法、および、抗ガン剤を特定する方法を包含する。また、対象が転移性メラノーマを有するかどうか、または、転移性メラノーマを有する危険性があるかどうかを診断する方法、および、当該障害を発症する危険性があると考えられる対象をスクリーニングする方法も提供される。本発明はまた、上述の方法を行うために好適である様々なキットを包含する。
APOE-アミノ酸配列(配列番号2)
(下線が施された残基136~残基150はApoEのLRP結合ドメインを表す)
DNAJA4イソ型1-RNA配列(配列番号3)
DNAJA4イソ型1-アミノ酸配列(配列番号4)
DNAJA4イソ型2-RNA配列(配列番号5)
DNAJA4イソ型2-アミノ酸配列(配列番号6)
DNAJA4イソ型3-RNA配列(配列番号7)
DNAJA4イソ型3-アミノ酸配列(配列番号8)
LRP1-RNA配列(配列番号9)
LRP1-アミノ酸配列(配列番号10)
LRP8イソ型1-RNA配列(配列番号11)
LRP8イソ型1-アミノ酸配列(配列番号12)
LRP8イソ型2-RNA配列(配列番号13)
LRP8イソ型2-アミノ酸配列(配列番号14)
LRP8イソ型3-RNA配列(配列番号15)
LRP8イソ型3-アミノ酸配列(配列番号16)
LRP8イソ型4-RNA配列(配列番号17)
LRP8イソ型4-アミノ酸配列(配列番号18)
CTGF-RNA配列(配列番号19)
CTGF-アミノ酸配列(配列番号20)
LXR-aイソ型1:RNA配列(配列番号21)
LXR-a(NR1H3)イソ型1:アミノ酸配列(配列番号22)
LXR-a(NR1H3)イソ型2:RNA配列(配列番号23)
LXR-a(NR1H3)イソ型2:アミノ酸配列(配列番号24)
LXR-a(NR1H3)イソ型3:RNA配列(配列番号25)
LXR-a(NR1H3)イソ型3:アミノ酸配列(配列番号26)
LXR-a(NR1H3)イソ型4:RNA配列(配列番号27)
LXR-a(NR1H3)イソ型4:アミノ酸配列(配列番号28)
LXR-b(NR1H2)イソ型1:RNA配列(配列番号29)
LXR-b(NR1H2)イソ型1:アミノ酸配列(配列番号30)
LXR-b(NR1H2)イソ型2:RNA配列(配列番号31)
LXR-b(NR1H2)イソ型2:アミノ酸配列(配列番号32)
has-miR-199a-1配列(配列番号33)
GCCAACCCAGUGUUCAGACUACCUGUUCAGGAGGCUCUCAAUGUGUACAGUAGUCUGCACAUUGGUUAGGC
has-miR-199a-2配列(配列番号34)
AGGAAGCUUCUGGAGAUCCUGCUCCGUCGCCCCAGUGUUCAGACUACCUGUUCAGGACAAUGCCGUUGUACAGUAGUCUGCACAUUGGUUAGACUGGGCAAGGGAGAGCA
has-miR-1908配列(配列番号35)
CGGGAAUGCCGCGGCGGGGACGGCGAUUGGUCCGUAUGUGUGGUGCCACCGGCCGCCGGCUCCGCCCCGGCCCCCGCCCC
has-miR-7-1配列(配列番号36)
UUGGAUGUUGGCCUAGUUCUGUGUGGAAGACUAGUGAUUUUGUUGUUUUUAGAUAACUAAAUCGACAACAAAUCACAGUCUGCCAUAUGGCACAGGCCAUGCCUCUACAG
has-miR-7-2配列(配列番号37)
CUGGAUACAGAGUGGACCGGCUGGCCCCAUCUGGAAGACUAGUGAUUUUGUUGUUGUCUUACUGCGCUCAACAACAAAUCCCAGUCUACCUAAUGGUGCCAGCCAUCGCA
has-miR-7-3配列(配列番号38)
AGAUUAGAGUGGCUGUGGUCUAGUGCUGUGUGGAAGACUAGUGAUUUUGUUGUUCUGAUGUACUACGACAACAAGUCACAGCCGGCCUCAUAGCGCAGACUCCCUUCGAC
miR-Zip 199a-3p配列(配列番号39)
GATCCGACAGTAGCCTGCACATTAGTCACTTCCTGTCAGTAACCAATGTGCAGACTACTGTTTTTTGAATT
miR-Zip 199a-5p配列(配列番号40)
GATCCGCCCAGTGCTCAGACTACCCGTGCCTTCCTGTCAGGAACAGGTAGTCTGAACACTGGGTTTTTGAATT
miR-Zip 1908配列(配列番号41)
GATCCGCGGCGGGAACGGCGATCGGCCCTTCCTGTCAGGACCAATCGCCGTCCCCGCCGTTTTTGAATT
miR-Zip 7配列(配列番号42)
GATCCGTGGAAGATTAGTGAGTTTATTATCTTCCTGTCAGACAACAAAATCACTAGTCTTCCATTTTTGAATT
このネットワークのメンバーは、転移性メラノーマを処置するための標的として使用することができる。加えて、これらのメンバーは、対象が転移性メラノーマを有するかどうか、または、転移性メラノーマを有する危険性があるかどうかを決定するためのバイオマーカーとして、あるいは、そのような障害を有する患者の予後を明らかにするための、または、そのような障害を有する患者の監視のためのバイオマーカーとして使用することができる。したがって、本発明は、転移性メラノーマを、これらのメンバーの1つまたは複数を標的化することによって処置する方法、当該ガンを阻害するための治療療法の効力を明らかにする方法、および、抗ガン剤を特定する方法を包含する。また、対象が転移性メラノーマを有するかどうか、または、転移性メラノーマを有する危険性があるかどうかを診断する方法、および、当該障害を発症する危険性があると考えられる対象をスクリーニングする方法も提供される。本発明はまた、上述の方法を行うために好適である様々なキットを包含する。
ApoEポリペプチド
用語「ポリペプチドまたはペプチド」には、本明細書中で使用される場合、ネットワークに関与する特定のドメインまたは部分を有する、上述の転移抑制因子のいずれかの組換えまたは合成により製造された融合体またはキメラ体が含まれる。これらの用語はまた、ペプチドのアナログ、フラグメント、伸長物または誘導体(例えば、原核生物細胞における発現のために有用である付加されたアミノ末端メチオニンを有するもの)を包含する。
用語「ポリペプチドまたはペプチド」には、本明細書中で使用される場合、ネットワークに関与する特定のドメインまたは部分を有する、上述の転移抑制因子のいずれかの組換えまたは合成により製造された融合体またはキメラ体が含まれる。これらの用語はまた、ペプチドのアナログ、フラグメント、伸長物または誘導体(例えば、原核生物細胞における発現のために有用である付加されたアミノ末端メチオニンを有するもの)を包含する。
「アポリポタンパク質ポリペプチドまたはApoEポリペプチド」は、本明細書中で使用される場合、長さが10アミノ酸残基~200アミノ酸残基の間のペプチドであるアポリポタンパク質のアナログ、フラグメント、伸長物または誘導体を含めて、生来型アポリポタンパク質の機能をインビボまたはインビトロのどちらにおいてであれ模倣するペプチド、薬物または化合物を意味し、そのようなペプチドは、アミド結合を含有する天然型アミノ酸または非天然型アミノ酸のどちらをも含有することができる。アポリポタンパク質のペプチドフラグメントは、生体内におけるそれらの安定性または生物学的利用能を改善するために、この技術分野において知られているように改変される場合があり、また、アミノ酸側鎖に様々な結合を介して結合される有機化合物を含有する場合がある。
1つの局面において、本発明者らの発明は、TQQIRLQAEIFQAR(マウス)(配列番号43)またはAQQIRLQAEAFQAR(ヒト)(配列番号44)のアミノ酸配列を有する単離されたapoEp1.Bペプチド、あるいは、当該ペプチドのアナログ、フラグメント、伸長物または誘導体を使用するための方法である。本発明にはまた、apoEp1.Bペプチドあるいはそのアナログ、フラグメント、伸長物または誘導体をコードする核酸分子が含まれる。
用語「アナログ」には、どのようなペプチドであれ、1つまたは複数の残基が、機能的に類似する残基により保存的に置換されている、生来型ペプチドと実質的に同一であるアミノ酸残基配列を有するペプチドで、生来型ペプチドを模倣する能力を示すペプチドが含
まれる。保存的置換の例には、1つの非極性(疎水性)残基(例えば、アラニン、イソロイシン、バリン、ロイシンまたはメチオニンなど)を別の非極性(疎水性)残基の代わりに使用すること、1つの極性(親水性)残基を別の極性(親水性)残基の代わりに使用すること、例えば、アルギニンとリシンとの間、グルタミンとアスパラギンとの間、グリシンとセリンとの間などにおける置換、1つの塩基性残基(例えば、リシン、アルギニンまたはヒスチジンなど)を別の塩基性残基の代わりに使用すること、または、1つの酸性基(例えば、アスパラギン酸またはグルタミン酸など)を別の酸性残基の代わりに使用することが含まれる。
まれる。保存的置換の例には、1つの非極性(疎水性)残基(例えば、アラニン、イソロイシン、バリン、ロイシンまたはメチオニンなど)を別の非極性(疎水性)残基の代わりに使用すること、1つの極性(親水性)残基を別の極性(親水性)残基の代わりに使用すること、例えば、アルギニンとリシンとの間、グルタミンとアスパラギンとの間、グリシンとセリンとの間などにおける置換、1つの塩基性残基(例えば、リシン、アルギニンまたはヒスチジンなど)を別の塩基性残基の代わりに使用すること、または、1つの酸性基(例えば、アスパラギン酸またはグルタミン酸など)を別の酸性残基の代わりに使用することが含まれる。
表現「保存的置換」にはまた、化学的に誘導体化された残基を非誘導体化残基の代わりに使用することが、そのようなポリペプチドが必要不可欠な活性を呈示するという条件のもとで含まれる。上記ペプチドのアナログには、下記の配列を有するペプチドが含まれる:TAQIRLQAEIFQAR(配列番号45)、TQAIRLQAEIFQAR(配列番号46)、TQQARLQAEIFQAR(配列番号47)およびTQQIALQAEIFQAR(配列番号48)。
「誘導体」は、1つまたは複数の残基が機能的側鎖の反応によって化学的に誘導体化されているペプチドを示す。そのような誘導体化された分子には、例えば、フリーのアミノ基が、アミン塩酸塩、p-トルエンスルホニル基、カルボベンゾキシ基、t-ブチルオキシカルボニル基、クロロアセチル基またはホルミル基を形成するために誘導体化されているそのような分子が含まれる。フリーのカルボキシル基が、塩、メチルエステルおよびエチルエステルまたは他のタイプのエステルあるいはヒドラジドを形成するために誘導体化される場合がある。フリーのヒドロキシル基が、O-アシル誘導体またはO-アルキル誘導体を形成する誘導体化される場合がある。ヒスチジンのイミダゾール窒素が、N-im-ベンジルヒスチジンを形成する誘導体化される場合がある。また、20個の標準的アミノ酸の1つまたは複数の天然に存在するアミノ酸誘導体を含有するそのようなペプチドも含まれる。例えば、4-ヒドロキシプロリンがプロリンの代わりに使用される場合がある;5-ヒドロキシリシンがリシンの代わりに使用される場合がある;3-メチルヒスチジンがヒスチジンの代わりに使用される場合がある;ホモセリンがセリンの代わりに使用される場合がある;また、オルニチンがリシンの代わりに使用される場合がある。本発明のポリペプチドにはまた、必要不可欠な活性が維持される限り、どのようなポリペプチドであれ、配列が本明細書中に示されるポリペプチドの配列に対して残基の1つまたは複数の付加および/または欠失を有するポリペプチドが含まれる。
用語「フラグメント」は、どのような主題ペプチドであれ、アミノ酸残基配列が本明細書中に示されるペプチドのアミノ酸残基配列よりも短いアミノ酸残基配列を有する主題ペプチドを示す。
用語「伸長物」は、どのような主題ペプチドであれ、本発明のペプチドのアミノ酸配列よりも(カルボキシ末端またはアミノ末端のどちらにおいてでも)1つまたは2つのアミノ酸によって長くなっているアミノ酸配列を有する主題ペプチドを示す。好ましくは、伸長がアミノ末端において行われる。上記ペプチドのフラグメントおよび伸長物には、下記の配列を有するペプチドが含まれる:QTQQIRLQAEIFQAR(配列番号49)およびQQIRLQAEIFQAR(配列番号50)。
様々なApoEポリペプチドおよびそれらの調製方法が米国特許第6,652,860号に記載される(これは参照によって本明細書中に組み込まれる)。
LXRアゴニスト
本発明の方法は、LXRアゴニストを転移の防止および処置のために投与することを含
むことができる。LXRアゴニストは、下記に示される式I、式II、式IIIまたは式IVに従う化合物であることが可能である。
本発明の方法は、LXRアゴニストを転移の防止および処置のために投与することを含
むことができる。LXRアゴニストは、下記に示される式I、式II、式IIIまたは式IVに従う化合物であることが可能である。
式Iが下記において提供される:
Arはアリール基である;
R1は、-OH、-CO2H、-O-(C1~C7)アルキル、-OC(O)-、-(C1~C7)アルキル、-O-(C1~C7)ヘテロアルキル、-OC(O)-(C1~C7)ヘテロアルキル、-NH2、-NH(C1~C7)アルキル、-N((C1~C7)アルキル)2および-NH-S(O)2(C1~C5)アルキルからなる群から選択されるものである;
R2は、(C1~C7)アルキル、(C1~C7)ヘテロアルキル、アリールおよびアリール(C1~C7)アルキルからなる群から選択されるものである;
X1、X2、X3、X4、X5およびX6はそれぞれが独立して、H、(C1~C5)アルキル、(C1~C5)ヘテロアルキル、FおよびClからなる群から選択されるものであり、但し、X1~X6のうちの最大でも3つが、H、(C1~C5)アルキル、(C1~C5)ヘテロアルキルである;かつ
Yは、-N(R12)S(O)m-、-N(R12)S(O)mN(R13)-、-N(R12)C(O)-、-N(R12)C(O)N(R13)-、-N(R12)C(S)-および-N(R12)C(O)O-からなる群から選択される二価の連結基であり、
但し、R12およびR13はそれぞれが独立して、H、(C1~C7)アルキル、(C1~C7)ヘテロアルキル、アリールおよびアリール(C1~C7)アルキルからなる群から選択され、また、必要に応じて、Yが-N(R12)S(O)m-または-N(R12)S(O)mN(R13)-であるときには、R12は、ArまたはR2に対する共有結合による結合を介してArまたはR2にそれぞれ融合する5員環または6員環を形成し、この場合、下付き添え字mは1~2の整数である;
但し、R1がOHであり、かつ、-Y-R2が-N(R12)S(O)m-R2または-N(R12)C(O)N(R13)-R2であり、Arに結合する第四級炭素に対してパラ位に結合するとき、および、R2が、フェニル、ベンジルまたはベンゾイルであるときには、i)R12またはR13の少なくとも1つが水素以外であり、かつ、電子吸引性置換基を含有し、あるいは、ii)R2が、アミノ、アセトアミド、ジ(C1~C7)アルキルアミノ、(C1~C7)アルキルアミノ、ハロゲン、ヒドロキシ、ニトロまたは(C1~C7)アルキルとは異なる成分により置換され、あるいは、iii)R2のベンゼン環部分が、Y基に加えて、または、Yに対する結合点に加えて少なくとも3つの独立して選択された基により置換される。
いくつかの実施形態において、Yは-N(R12)S(O)2-であり、かつ、R1は
OHである。
OHである。
したがって、式Iの化合物には、下記に示される構造を有する化合物が含まれるが、これに限定されない:
式Iの化合物は、米国特許第6,316,503号(これは参照によって本明細書中に組み込まれる)によって記載されるように合成することができる。
式IIが下記において提供される:
(式中、
R1はHである;
X1は、結合、C1~C5アルキル、-C(O)-、-C(=CR8R9)-、-O-、-S(O)t-、-NR8-、-CR8R9-、-CHR23、-CR8(CR9)-、-C(CR8)2-、-CR8(OC(O)R9)-、-C=NOR9-、-C(O)NR8-、-CH2O-、-CH2S-、-CH2NR8-、-OCH2-、-SCH2-、-NR8CH2-または
である;
R2は、H、C1~C6アルキル、C2~C6アルケニル、C2~C6アルキニル、C3~C6シクロアルキル、-CH2OH、C7~C11アリールアルキル、フェニル、ナ
フチル、C1~C3ペルフルオロアルキル、CN、C(O)NH2、CO2R12、または、C1~C3アルキル、C2~C4アルケニル、C2~C4アルキニル、C1~C3アルコキシ、C1~C3ペルフルオロアルキル、ハロゲン、-NO2、-NR8R9、-CN、-OH、および、1個~5個のフッ素により置換されるC1~C3アルキルから独立して選択される群の1つまたは複数によって独立して置換されるフェニルであり、あるいは、R2は、ピリジン、チオフェン、ベンゾイソオキサゾール、ベンゾチオフェン、オキサジアゾール、ピロール、ピラゾール、イミダゾールおよびフランからなる群から選択される複素環であり、この場合、それらのそれぞれが場合により、C1~C3アルキル、C1~C3アルコキシ、C1~C3ペルフルオロアルキル、ハロゲン、-NO2、-NR8R9、-CN、および、1個~5個のフッ素により置換されるC1~C3アルキルから独立して選択される1つ~3つの基により置換される場合がある;
X2は結合または-CH2-である;
R3は、フェニル、ナフチル、あるいは、C1~C3アルキル、ヒドロキシ、フェニル、アシル、ハロゲン、-NH2、-CN、-NO2、C1~C3アルコキシ、C1~C3ペルフルオロアルキル、1個~5個のフッ素により置換されるC1~C3アルキル、NR14R15、-C(O)R10、
-C(O)NR10R11、-C(O)NR11A、-C≡CR8、-CH=CHR8、-WA、-C≡CA、-CH=CHA、-WYA、-WYNR11-A、
-WYR10、-WY(CH2)jA、-WCHR11(CH2)jA、-W(CH2)jA、-W(CH2)jR10、-CHR11W(CH2)jR10、
-CHR11W(CH2)jA、-CHR11NR12YA、-CHR11NR12YR10、ピロール、-W(CH2)jA(CH2)kD(CH2)pZ、
-W(CR18R19)A(CH2)kD(CH2)pZ、-(CH2)jWA(CH2)kD(CH2)pZ、-CH=CHA(CH2)kD(CH2)pZ、-C≡CA(CH2)kD(CH2)pZ、-W(CH2)jC≡CA(CH2)kD(CH2)pZおよび-W(CH2)jZから独立して選択される1つ~4つの基によって独立して置換されるフェニルまたはナフチルであり、
あるいは、R3は、ピリミジン、チオフェン、フラン、ベンゾチオフェン、インドール、ベンゾフラン、ベンゾイミダゾール、ベンゾチアゾール、ベンゾオキサゾールおよびキノリンから選択される複素環であり、この場合、それらのそれぞれが場合により、C1~C3アルキル、C1~C3アルコキシ、ヒドロキシ、フェニル、アシル、ハロゲン、-NH2、-CN、-NO2、C1~C3ペルフルオロアルキル、1個~5個のフッ素により置換されるC1~C3アルキル、-C(O)R10、-C(O)NR10R11、-C(O)NR11A、-C≡CR8、-CH=CHR8、-WA、-C≡CA、-CH=CHA、-WYA、-WYR10、-WY(CH2)jA、
-W(CH2)jA、-W(CH2)jR10、-CHR11W(CH2)jR10、-CHR11W(CH2)jA、-CHR11NR12YA、-CHR11NR12YR10、
-WCHR11(CH2)jA、-W(CH2)jA(CH2)kD(CH2)pZ、-W(CR18R19)A(CH2)kD(CH2)pZ、-(CH2)jWA(CH2)kD(CH2)pZ、-CH=CHA(CH2)kD(CH2)pZ、-C≡CA(CH2)kD(CH2)pZ、-W(CH2)jC≡CA(CH2)kD(CH2)pZおよび-W(CH2)jZ
から独立して選択される1つ~3つの基により置換される場合がある;
Wは、結合、-O-、-S-、-S(O)-、-S(O)2-、-NR11-または-N(COR12)-である;
Yは、-CO-、-S(O)2-、-CONR13、-CONR13CO-、-CONR13SO2-、-C(NCN)-、-CSNR13、-C(NH)NR13または-C(O)O-である;
jは0~3である;
kは0~3である;
tは0~2である;
Dは、結合、-CH=CH-、-C≡C-、-C=、-C(O)-、フェニル、-O-、-NH-、-S-、-CHR14-、-CR14R15-、-OCHR14、-OCR14R15-または-CH(OH)CH(OH)-である;
pは0~3である;
Zは、-CO2R11、-CONR10R11、-C(NR10)NR11R12、-CONH2NH2、-CN、-CH2OH、-NR16R17、フェニル、CONHCH(R20)COR12、フタルイミド、ピロリジン-2,5ジオン、チアゾリジン-2,4-ジオン、テトラゾリル、ピロール、インドール、オキサゾール、2-チオキソ-1,3-チアゾリニン-4-オン、C1~C7アミン、C3~C7環状アミン、または、1個~2個のOH基により置換されるC1~C3アルキルであり、但し、前記ピロールは場合により、-CO2CH3、-CO2H、-COCH3、-CONH2および-CNからなる群から独立して選択される1つまたは2つの置換基により置換され、
前記C1~C7アミンは場合により、-OH、ハロゲン、-OCH3および-C≡CHからなる群から独立して選択される1つまたは2つの置換基により置換され、
前記フェニルは場合により、CO2R11により置換され、かつ、前記C3~C7環状アミンは場合により、-OH、-CH2OH、C1~C3アルキル、-CH2OCH3、-CO2CH3および-CONH2からなる群から独立して選択される1つまたは2つの置換基により置換され、かつ、前記オキサゾールは場合により、CH2CO2R11により置換される;
Aは、フェニル、ナフチル、テトラヒドロナフチル、インダンまたはビフェニルであり、この場合、それらのそれぞれが場合により、ハロゲン、C1~C3アルキル、C2~C4アルケニル、C2~C4アルキニル、アシル、ヒドロキシ、ハロゲン、-CN、-NO2、-CO2R11、-CH2CO2R11、フェニル、C1~C3ペルフルオロアルコキシ、C1~C3ペルフルオロアルキル、-NR10R11、-CH2NR10R11、-SR11、1個~5個のフッ素により置換されるC1~C6アルキル、1個~2個のOH基により置換されるC1~C3アルキル、1個~5個のフッ素により場合により置換されるC1~C6アルコキシ、または、1個~2個のCF3基により場合により置換されるフェノキシから独立して選択される1つ~4つの基により置換される場合がある;あるいは
Aは、ピロール、ピリジン、ピリジン-N-オキシド、ピリミジン、ピラゾール、チオフェン、フラン、キノリン、オキサゾール、チアゾール、イミダゾール、イソオキサゾール、インドール、ベンゾ[1,3]-ジオキソール、ベンゾ[1,2,5]-オキソジアゾール、イソクロメン-1-オン、ベンゾチオフェン、ベンゾフラン、2,3-ジ-5ヒドロベンゾ[1,4]-ジオキシン、ビテイニル、キナゾリン-2,4-9[3H]ジオンおよび3-H-イソベンゾフラン-1-オンから選択される複素環であり、この場合、それらのそれぞれが場合により、ハロゲン、C1~C3アルキル、アシル、ヒドロキシ、-CN、-NO2、C1~C3ペルフルオロアルキル、-NR10R11、-CH2NR10R11、-SR11、1個~5個のフッ素により置換されるC1~C3アルキル、および、1個~5個のフッ素により場合により置換されるC1~C3アルコキシから独立して選択される1つ~3つの基により置換される場合がある;
R4、R5およびR6はそれぞれが独立して、-Hまたは-Fである;
R7は、C1~C4アルキル、C1~C4ペルフルオロアルキル、ハロゲン、-NO2、-CN、フェニル、あるいは、ハロゲン、C1~C2アルキルおよびOHから独立して選択される1つまたは2つの基により置換されるフェニルである;
但し、X1R2が水素を形成するならば、R3は、
(a)-W(CH2)jA(CH2)kD(CH2)pZ、-W(CR18R19)A(CH2)kD(CH2)pZ、-(CH2)jWA(CH2)kD(CH2)pZ、-CH=CHA(CH2)kD(CH2)pZ、-C≡CA(CH2)kD(CH2)pZま
たは-W(CH2)jC≡CA(CH2)kD(CH2)pZによって置換されるフェニル(但し、フェニル成分はさらに場合により、C1~C2アルキル、C1~C2ペルフルオロアルキル、ハロゲンおよびCNから独立して選択される1つまたは2つの基により置換される);および
(b)ピリミジン、チオフェンおよびフランから選択される複素環(但し、これらのそれぞれが、-W(CH2)jA(CH2)kD(CH2)pZ、-W(CR18R19)A(CH2)kD(CH2)pZ、-(CH2)jWA(CH2)kD(CH2)pZ、-CH=CHA(CH2)kD(CH2)pZ、-C≡CA(CH2)kD(CH2)pZまたは-W(CH2)jC≡CA(CH2)kD(CH2)pZのうちの1つによって置換される)
から選択される;
それぞれのR8は独立して、-HまたはC1~C3アルキルである;
それぞれのR9は独立して、-HまたはC1~C3アルキルである;
それぞれのR10は独立して、-H、-CH、C1~C3アルコキシ、C1~C7アルキル、C3~C7アルケニル、C3~C7アルキニル、C3~C7シクロアルキル、-CH2CH2OCH3、2-メチル-テトラヒドロ-フラン、2-メチル-テトラヒドロ-ピラン、4-メチル-ピペリジン、モルホリン、ピロリジン、あるいは、1個または2個のC1~C3アルコキシ基により場合により置換されるフェニルであり、但し、前記C1~C7アルキルは場合により、C1~C3アルコキシ、C1~C3チオアルコキシおよびCNから独立して置換される1つ、2つまたは3つの基により置換される;
それぞれのR11は独立して、-H、C1~C3アルキルまたはR22であり、あるいは、R10およびR11は、同じ原子に結合するとき、前記原子と一緒になって、
C1~C3アルキル、OHおよびC1~C3アルコキシから独立して選択される1つまたは2つの基により場合により置換される5員~7員の飽和環、あるいは、1個または2個のヘテロ原子を含有し、C1~C3アルキル、OHおよびC1~C3アルコキシから独立して選択される1つまたは2つの基によって場合により置換される5員~7員の環
を形成する:
それぞれのR12は独立して、-HまたはC1~C3アルキルである;
それぞれのR13は独立して、-HまたはC1~C3アルキルである;
それぞれのR14およびR15は独立して、C1~C7アルキル、C3~C8シクロアルキル、C2~C7アルケニル、C2~C7アルキニル、-CH、-F、C7~C14アリールアルキルであり、但し、前記アリールアルキルは場合により、NO2、C1~C6アルキル、C1~C3ペルハロアルキル、ハロゲン、CH2CO2R11、フェニルおよびC1~C3アルコキシから独立して選択される1つ~3つの基により置換され、あるいは、R12およびR15は、それらが結合する原子と一緒になって、3員~7員の飽和環を形成することができる;
それぞれのR16およびR17は独立して、水素、C1~C3アルキル、C1~C3アルケニル、C1~C3アルキニル、フェニル、ベンジルまたはC3~C8シクロアルキルであり、但し、前記C1~C3アルキルは場合により、1つのOH基により置換され、かつ、前記ベンジルは場合により、C1~C3アルキルおよびC1~C3アルコキシから選択される1つ~3つの基により置換され、あるいは、R16およびR17は、それらが結合する原子と一緒になって、C1~C3アルキル、-OH、CH2OH、-CH2OCH3、-CO2CH3および-CONH2からなる群から独立して選択される1つまたは2つの置換基により場合により置換される3員~8員の複素環を形成することができる;
それぞれのR18およびR19は独立して、C1~C3アルキルである;
それぞれのR20は独立して、H、フェニル、または、天然に存在するアルファアミノ酸の側鎖である;
それぞれのR22は独立して、CH2COOHにより場合により置換されるアリールアルキルである;かつ
それぞれのR23はフェニルである)
またはその医薬的に許容される塩。
R1はHである;
X1は、結合、C1~C5アルキル、-C(O)-、-C(=CR8R9)-、-O-、-S(O)t-、-NR8-、-CR8R9-、-CHR23、-CR8(CR9)-、-C(CR8)2-、-CR8(OC(O)R9)-、-C=NOR9-、-C(O)NR8-、-CH2O-、-CH2S-、-CH2NR8-、-OCH2-、-SCH2-、-NR8CH2-または
R2は、H、C1~C6アルキル、C2~C6アルケニル、C2~C6アルキニル、C3~C6シクロアルキル、-CH2OH、C7~C11アリールアルキル、フェニル、ナ
フチル、C1~C3ペルフルオロアルキル、CN、C(O)NH2、CO2R12、または、C1~C3アルキル、C2~C4アルケニル、C2~C4アルキニル、C1~C3アルコキシ、C1~C3ペルフルオロアルキル、ハロゲン、-NO2、-NR8R9、-CN、-OH、および、1個~5個のフッ素により置換されるC1~C3アルキルから独立して選択される群の1つまたは複数によって独立して置換されるフェニルであり、あるいは、R2は、ピリジン、チオフェン、ベンゾイソオキサゾール、ベンゾチオフェン、オキサジアゾール、ピロール、ピラゾール、イミダゾールおよびフランからなる群から選択される複素環であり、この場合、それらのそれぞれが場合により、C1~C3アルキル、C1~C3アルコキシ、C1~C3ペルフルオロアルキル、ハロゲン、-NO2、-NR8R9、-CN、および、1個~5個のフッ素により置換されるC1~C3アルキルから独立して選択される1つ~3つの基により置換される場合がある;
X2は結合または-CH2-である;
R3は、フェニル、ナフチル、あるいは、C1~C3アルキル、ヒドロキシ、フェニル、アシル、ハロゲン、-NH2、-CN、-NO2、C1~C3アルコキシ、C1~C3ペルフルオロアルキル、1個~5個のフッ素により置換されるC1~C3アルキル、NR14R15、-C(O)R10、
-C(O)NR10R11、-C(O)NR11A、-C≡CR8、-CH=CHR8、-WA、-C≡CA、-CH=CHA、-WYA、-WYNR11-A、
-WYR10、-WY(CH2)jA、-WCHR11(CH2)jA、-W(CH2)jA、-W(CH2)jR10、-CHR11W(CH2)jR10、
-CHR11W(CH2)jA、-CHR11NR12YA、-CHR11NR12YR10、ピロール、-W(CH2)jA(CH2)kD(CH2)pZ、
-W(CR18R19)A(CH2)kD(CH2)pZ、-(CH2)jWA(CH2)kD(CH2)pZ、-CH=CHA(CH2)kD(CH2)pZ、-C≡CA(CH2)kD(CH2)pZ、-W(CH2)jC≡CA(CH2)kD(CH2)pZおよび-W(CH2)jZから独立して選択される1つ~4つの基によって独立して置換されるフェニルまたはナフチルであり、
あるいは、R3は、ピリミジン、チオフェン、フラン、ベンゾチオフェン、インドール、ベンゾフラン、ベンゾイミダゾール、ベンゾチアゾール、ベンゾオキサゾールおよびキノリンから選択される複素環であり、この場合、それらのそれぞれが場合により、C1~C3アルキル、C1~C3アルコキシ、ヒドロキシ、フェニル、アシル、ハロゲン、-NH2、-CN、-NO2、C1~C3ペルフルオロアルキル、1個~5個のフッ素により置換されるC1~C3アルキル、-C(O)R10、-C(O)NR10R11、-C(O)NR11A、-C≡CR8、-CH=CHR8、-WA、-C≡CA、-CH=CHA、-WYA、-WYR10、-WY(CH2)jA、
-W(CH2)jA、-W(CH2)jR10、-CHR11W(CH2)jR10、-CHR11W(CH2)jA、-CHR11NR12YA、-CHR11NR12YR10、
-WCHR11(CH2)jA、-W(CH2)jA(CH2)kD(CH2)pZ、-W(CR18R19)A(CH2)kD(CH2)pZ、-(CH2)jWA(CH2)kD(CH2)pZ、-CH=CHA(CH2)kD(CH2)pZ、-C≡CA(CH2)kD(CH2)pZ、-W(CH2)jC≡CA(CH2)kD(CH2)pZおよび-W(CH2)jZ
から独立して選択される1つ~3つの基により置換される場合がある;
Wは、結合、-O-、-S-、-S(O)-、-S(O)2-、-NR11-または-N(COR12)-である;
Yは、-CO-、-S(O)2-、-CONR13、-CONR13CO-、-CONR13SO2-、-C(NCN)-、-CSNR13、-C(NH)NR13または-C(O)O-である;
jは0~3である;
kは0~3である;
tは0~2である;
Dは、結合、-CH=CH-、-C≡C-、-C=、-C(O)-、フェニル、-O-、-NH-、-S-、-CHR14-、-CR14R15-、-OCHR14、-OCR14R15-または-CH(OH)CH(OH)-である;
pは0~3である;
Zは、-CO2R11、-CONR10R11、-C(NR10)NR11R12、-CONH2NH2、-CN、-CH2OH、-NR16R17、フェニル、CONHCH(R20)COR12、フタルイミド、ピロリジン-2,5ジオン、チアゾリジン-2,4-ジオン、テトラゾリル、ピロール、インドール、オキサゾール、2-チオキソ-1,3-チアゾリニン-4-オン、C1~C7アミン、C3~C7環状アミン、または、1個~2個のOH基により置換されるC1~C3アルキルであり、但し、前記ピロールは場合により、-CO2CH3、-CO2H、-COCH3、-CONH2および-CNからなる群から独立して選択される1つまたは2つの置換基により置換され、
前記C1~C7アミンは場合により、-OH、ハロゲン、-OCH3および-C≡CHからなる群から独立して選択される1つまたは2つの置換基により置換され、
前記フェニルは場合により、CO2R11により置換され、かつ、前記C3~C7環状アミンは場合により、-OH、-CH2OH、C1~C3アルキル、-CH2OCH3、-CO2CH3および-CONH2からなる群から独立して選択される1つまたは2つの置換基により置換され、かつ、前記オキサゾールは場合により、CH2CO2R11により置換される;
Aは、フェニル、ナフチル、テトラヒドロナフチル、インダンまたはビフェニルであり、この場合、それらのそれぞれが場合により、ハロゲン、C1~C3アルキル、C2~C4アルケニル、C2~C4アルキニル、アシル、ヒドロキシ、ハロゲン、-CN、-NO2、-CO2R11、-CH2CO2R11、フェニル、C1~C3ペルフルオロアルコキシ、C1~C3ペルフルオロアルキル、-NR10R11、-CH2NR10R11、-SR11、1個~5個のフッ素により置換されるC1~C6アルキル、1個~2個のOH基により置換されるC1~C3アルキル、1個~5個のフッ素により場合により置換されるC1~C6アルコキシ、または、1個~2個のCF3基により場合により置換されるフェノキシから独立して選択される1つ~4つの基により置換される場合がある;あるいは
Aは、ピロール、ピリジン、ピリジン-N-オキシド、ピリミジン、ピラゾール、チオフェン、フラン、キノリン、オキサゾール、チアゾール、イミダゾール、イソオキサゾール、インドール、ベンゾ[1,3]-ジオキソール、ベンゾ[1,2,5]-オキソジアゾール、イソクロメン-1-オン、ベンゾチオフェン、ベンゾフラン、2,3-ジ-5ヒドロベンゾ[1,4]-ジオキシン、ビテイニル、キナゾリン-2,4-9[3H]ジオンおよび3-H-イソベンゾフラン-1-オンから選択される複素環であり、この場合、それらのそれぞれが場合により、ハロゲン、C1~C3アルキル、アシル、ヒドロキシ、-CN、-NO2、C1~C3ペルフルオロアルキル、-NR10R11、-CH2NR10R11、-SR11、1個~5個のフッ素により置換されるC1~C3アルキル、および、1個~5個のフッ素により場合により置換されるC1~C3アルコキシから独立して選択される1つ~3つの基により置換される場合がある;
R4、R5およびR6はそれぞれが独立して、-Hまたは-Fである;
R7は、C1~C4アルキル、C1~C4ペルフルオロアルキル、ハロゲン、-NO2、-CN、フェニル、あるいは、ハロゲン、C1~C2アルキルおよびOHから独立して選択される1つまたは2つの基により置換されるフェニルである;
但し、X1R2が水素を形成するならば、R3は、
(a)-W(CH2)jA(CH2)kD(CH2)pZ、-W(CR18R19)A(CH2)kD(CH2)pZ、-(CH2)jWA(CH2)kD(CH2)pZ、-CH=CHA(CH2)kD(CH2)pZ、-C≡CA(CH2)kD(CH2)pZま
たは-W(CH2)jC≡CA(CH2)kD(CH2)pZによって置換されるフェニル(但し、フェニル成分はさらに場合により、C1~C2アルキル、C1~C2ペルフルオロアルキル、ハロゲンおよびCNから独立して選択される1つまたは2つの基により置換される);および
(b)ピリミジン、チオフェンおよびフランから選択される複素環(但し、これらのそれぞれが、-W(CH2)jA(CH2)kD(CH2)pZ、-W(CR18R19)A(CH2)kD(CH2)pZ、-(CH2)jWA(CH2)kD(CH2)pZ、-CH=CHA(CH2)kD(CH2)pZ、-C≡CA(CH2)kD(CH2)pZまたは-W(CH2)jC≡CA(CH2)kD(CH2)pZのうちの1つによって置換される)
から選択される;
それぞれのR8は独立して、-HまたはC1~C3アルキルである;
それぞれのR9は独立して、-HまたはC1~C3アルキルである;
それぞれのR10は独立して、-H、-CH、C1~C3アルコキシ、C1~C7アルキル、C3~C7アルケニル、C3~C7アルキニル、C3~C7シクロアルキル、-CH2CH2OCH3、2-メチル-テトラヒドロ-フラン、2-メチル-テトラヒドロ-ピラン、4-メチル-ピペリジン、モルホリン、ピロリジン、あるいは、1個または2個のC1~C3アルコキシ基により場合により置換されるフェニルであり、但し、前記C1~C7アルキルは場合により、C1~C3アルコキシ、C1~C3チオアルコキシおよびCNから独立して置換される1つ、2つまたは3つの基により置換される;
それぞれのR11は独立して、-H、C1~C3アルキルまたはR22であり、あるいは、R10およびR11は、同じ原子に結合するとき、前記原子と一緒になって、
C1~C3アルキル、OHおよびC1~C3アルコキシから独立して選択される1つまたは2つの基により場合により置換される5員~7員の飽和環、あるいは、1個または2個のヘテロ原子を含有し、C1~C3アルキル、OHおよびC1~C3アルコキシから独立して選択される1つまたは2つの基によって場合により置換される5員~7員の環
を形成する:
それぞれのR12は独立して、-HまたはC1~C3アルキルである;
それぞれのR13は独立して、-HまたはC1~C3アルキルである;
それぞれのR14およびR15は独立して、C1~C7アルキル、C3~C8シクロアルキル、C2~C7アルケニル、C2~C7アルキニル、-CH、-F、C7~C14アリールアルキルであり、但し、前記アリールアルキルは場合により、NO2、C1~C6アルキル、C1~C3ペルハロアルキル、ハロゲン、CH2CO2R11、フェニルおよびC1~C3アルコキシから独立して選択される1つ~3つの基により置換され、あるいは、R12およびR15は、それらが結合する原子と一緒になって、3員~7員の飽和環を形成することができる;
それぞれのR16およびR17は独立して、水素、C1~C3アルキル、C1~C3アルケニル、C1~C3アルキニル、フェニル、ベンジルまたはC3~C8シクロアルキルであり、但し、前記C1~C3アルキルは場合により、1つのOH基により置換され、かつ、前記ベンジルは場合により、C1~C3アルキルおよびC1~C3アルコキシから選択される1つ~3つの基により置換され、あるいは、R16およびR17は、それらが結合する原子と一緒になって、C1~C3アルキル、-OH、CH2OH、-CH2OCH3、-CO2CH3および-CONH2からなる群から独立して選択される1つまたは2つの置換基により場合により置換される3員~8員の複素環を形成することができる;
それぞれのR18およびR19は独立して、C1~C3アルキルである;
それぞれのR20は独立して、H、フェニル、または、天然に存在するアルファアミノ酸の側鎖である;
それぞれのR22は独立して、CH2COOHにより場合により置換されるアリールアルキルである;かつ
それぞれのR23はフェニルである)
またはその医薬的に許容される塩。
式IIの化合物は、米国特許第7,576,215号(これは参照によって本明細書中に組み込まれる)に記載されるように合成することができる。式IIの化合物は、化合物26~化合物32のいずれかまたはその医薬的に許容される塩であることが可能である。
式IIIが下記において提供される:
(式中、
Xは、水素、C1~C8アルキル、ハロ、-OR10、-NR10R11、ニトロ、シアノ、-COOR10または-COR10から選択される;
Zは、CH、CR3またはNであり、但し、ZがCHまたはCR3であるときには、kは0~4であり、かつ、tは0または1であり、また、ZがNであるときには、kは0~3であり、かつ、tは0である;
Yは、-O-、-S-、-N(R12)-および-C(R4)(R5)-から選択される;
W1は、C1~C6アルキル、C0~C6アルキル、C3~C6シクロアルキル、アリールおよびHetから選択され、但し、前記C1~C8アルキル、C3~C8シクロアルキル、ArおよびHetは場合により非置換であるか、あるいは、ハロ、シアノ、ニトロ、C1~C6アルキル、C3~C6アルケニル、C3~C6アルキニル、-C0~C6アルキル-CO2R12、-C0~C6アルキル-C(O)SR12、-C0~C6アルキル-CONR13R14、-C0~C6アルキル-COR15、-C0~C6アルキル-NR13R14、-C0~C6アルキル-SR12、-C0~C6アルキル-OR12、-C0~C6アルキル-SO3H、-C0~C6アルキル-SO2NR13R14、-C0~C6アルキル-SO2R12、-C0~C6アルキル-SOR15、-C0~C6アルキルOCOR15、-C0~C6アルキル-OC(O)NR13R14、-C0~C6アルキル-OC(O)OR15、-C0~C6アルキル-NR13C(O)OR15、-C0~C6アルキル-NR13C(O)NR13R14および-C0~C6アルキル-NR13COR15から独立して選択される1つまたは複数の基により置換され、この場合、前記C1~C6アルキルは場合により非置換であるか、あるいは、1つまたは複数のハロ置換基によって置換される;
W2は、H、ハロ、C1~C6アルキル、C2~C6アルケニル、C2~C6アルキニル、-C0~C6アルキル-NR13R14、-C0~C6アルキル-SR12、-C0~C6アルキル-OR12、-C0~C6アルキルCO2R12、-C0~C6アルキル-C(O)SR12、-C0~C6アルキルCONR13R14、-C0~C6アルキル-COR15、-C0~C6アルキルOCOR15、-C0~C6アルキル-OCONR13R14、-C0~C6アルキル-NR13CONR13R14、-C0~C6アルキル-NR13COR15、-C0~C6アルキル-Het、-C0~C6アルキル-Arおよび-C0~C6アルキル-C3~C7シクロアルキルから選択され、但し、前記C1~C6アルキルは場合により非置換であるか、あるいは、1つまたは複数のハロ置換基によって置換され、かつ、前記-C0~C6アルキル-Het、-C0~C6アルキル-Arおよび-C0~C6アルキル-C3~C7シクロアルキルのC3~C7シクロアルキル部分、Ar部分およびHet部分は場合により非置換であるか、あるいは、ハロ、シアノ、ニトロ、C1~C6アルキル、C3~C6アルケニル、C3~C6アルキニル、-C0
~C6アルキル-CO2R12、-C0~C6アルキル-C(O)SR12、-C0~C6アルキル-CONR13R14、-C0~C6アルキル-COR15、-C0~C6アルキル-NR13R14、-C0~C6アルキル-SR12、-C0~C6アルキル-OR12、-C0~C6アルキル-SO3H、-C0~C6アルキル-SO2NR13R14、-C0~C6アルキル-SO2R12、-C0~C6アルキル-SOR15、-C0~C6アルキル-OCOR15、-C0~C6アルキル-OC(O)NR13R14、-C0~C6アルキル-OC(O)OR15、-C0~C6アルキル-NR13C(O)OR15、-C0~C6アルキル-NR13C(O)NR13R14および-C0~C6アルキル-NR13COR15から独立して選択される1つまたは複数の基により置換され、この場合、前記C1~C6アルキルは場合により非置換であるか、あるいは、1つまたは複数のハロ置換基によって置換される;
W3は、H、ハロ、C1~C6アルキル、-C0~C6アルキル-NR13R14、-C0~C6アルキルSR12、-C0~C6アルキル-OR12、-C0~C6アルキル-CO2R12、-C0~C6アルキル-C(O)SR12、-C0~C6アルキル-CONR13R14、
-C0~C6アルキル-COR15、-C0~C6アルキル-OCOR15、-C0~C6アルキル-OCONR13R14、-C0~C6アルキルNR13CONR13R14、
-C0~C6アルキル-NR13COR15、-C0~C6アルキル-Het、-C1~C6アルキル-Arおよび-C1~C6アルキル-C3~C7シクロアルキルからなる群から選択され、
但し、前記C1~C6アルキルは場合により非置換であるか、あるいは、1つまたは複数のハロ置換基によって置換される;
Qは、C3~C8シクロアルキル、ArおよびHetから選択され、但し、前記C3~C8シクロアルキル、ArおよびHetは場合により非置換であるか、あるいは、ハロ、シアノ、ニトロ、C1~C6アルキル、C3~C6アルケニル、C3~C6アルキニル、-C0~C6アルキルCO2R12、-C0~C6アルキル-C(O)SR12、-C0~C6アルキルCONR13R14、-C0~C6アルキル-COR15、-C0~C6アルキルNR13R14、-C0~C6アルキル-SR12、-C0~C6アルキル-OR12、-C0~C6アルキル-SO3H、-C0~C6アルキル-SO2NR13R14、-C0~C6アルキル-SO2R12、-C0~C6アルキル-SOR15、-C0~C6アルキル-OCOR15、-C0~C6アルキル-OC(O)NR13R14、-C0~C6アルキル-OC(O)OR15、-C0~C6アルキルNR13C(O)OR15、-C0~C6アルキル-NR13C(O)NR13R14および-C0~C6アルキル-NR13COR15から独立して選択される1つまたは複数の基により置換され、この場合、前記C1C6アルキルは場合により非置換であるか、あるいは、1つまたは複数のハロ置換基によって置換される;
pは0~8である;
nは2~8である;
mは0または1である;
qは0または1である;
tは0または1である;
それぞれのR1およびR2は独立して、H、ハロ、C1~C6アルキル、C3~C6アルケニル、C3~C6アルキニル、-C0~C6アルキル-NR13R14、-C0~C6アルキル-OR12、-C0~C6アルキル-SR12、-C1~C6アルキル-Het、-C1~C6アルキル-Arおよび-C1~C6アルキル-C3~C7シクロアルキルから選択されるか、あるいは、R1およびR2は、それらが結合する炭素と一緒になって、3員~5員の炭素環式環または複素環式環を形成し、この場合、前記複素環式環は、N、OおよびSから選択される1つまたは複数のヘテロ原子を含有し、但し、前記C1~C6アルキルのいずれもが場合により非置換であるか、あるいは、1つまたは複数のハロ置換基によって置換される;
それぞれのR3は同じまたは異なり、独立して、ハロ、シアノ、ニトロ、C1~C6アルキル、C3~C6アルケニル、C3~C6アルキニル、-C0~C6アルキル-Ar、-C0~C6アルキル-Het、-C0~C6アルキル-C3~C7シクロアルキル、-C0~C6アルキル-CO2R12、-C0~C6アルキル-C(O)SR12、-C0~C6アルキル-CONR13R14、-C0~C6アルキル-COR15、-C0~C6アルキル-NR13R14、-C0~C6アルキル-SR12、-C0~C6アルキル-OR12、-C0~C6アルキル-SO3H、-C0~C6アルキルSO2NR13R14、-C0~C6アルキル-SO2R12、-C0~C6アルキルSOR15、-C0~C6アルキル-OCOR15、-C0~C6アルキル-OC(O)NR13R14、-C0~C6アルキル-OC(O)OR15、-C0~C6アルキル-NR13C(O)OR15、-C0~C6アルキル-NR13C(O)NR13R14および-C0~C6アルキル-NR13COR15から選択され、但し、前記C1~C6アルキルは場合により非置換であるか、あるいは、1つまたは複数のハロ置換基によって置換される;
それぞれのR4およびR5は独立して、H、ハロ、C1~C6アルキル、-C0~C6アルキル-Het、-C0~C6アルキル-Arおよび-C0~C6アルキル-C3~C7シクロアルキルから選択される;
R6およびR7はそれぞれが独立して、H、ハロ、C1~C6アルキル、-C0~C6アルキル-Het、-C0~C6アルキル-Arおよび-C0~C6アルキル-C3~C7シクロアルキルから選択される;
R8およびR9はそれぞれが独立して、H、ハロ、C1~C6アルキル、-C0~C6アルキル-Het、-C0~C6アルキル-Arおよび-C0~C6アルキル-C3~C7シクロアルキルから選択される;
R10およびR11はそれぞれが独立して、H、C1~C12アルキル、C3~C12アルケニル、C3~C12アルキニル、
-C0~C8アルキル-Ar、-C0~C8アルキル-Het、-C0~C8アルキル-C3~C7シクロアルキル、-C0~C8アルキル-O-Ar、-C0~C8アルキル-O-Het、
-C0~C8アルキル-O-C3~C7シクロアルキル、-C0~C8アルキル-S(O)x-C0~C6アルキル、-C0~C8アルキル-S(O)x-Ar、-C0~C8アルキル-S(O)x-Het、-C0~C8アルキル-S(O)x-C3~C7シクロアルキル、-C0~C8アルキル-NH-Ar、-C0~C8アルキル-NH-Het、-C0~C8アルキル-NH-C3~C7シクロアルキル、-C0~C8アルキル-N(C1~C4アルキル)-Ar、-C0~C8アルキル-N(C1~C4アルキル)-Het、-C0~C8アルキル-N(C1~C4アルキル-C3~C7シクロアルキル、-C0~C8アルキル-Ar、-C0~C8アルキル-Hetおよび-C0~C8アルキル-C3~C7シクロアルキルから選択され、この場合、xは、0、1または2であり、
あるいは、R10およびR11は、それらが結合する窒素と一緒になって、N、OおよびSから選択される1つまたは複数のさらなるヘテロ原子を場合により含有する4員~7員の複素環式環を形成し、但し、前記C1~C12アルキル、C3~C12アルケニルまたはC3~C12アルキニルは場合により、ハロ、-OH、-SH、-NH2、-NH(非置換C1~C6アルキル)、-N(非置換C1~C6アルキル)(非置換C1~C6アルキル)、非置換の-OC1~C6アルキル、-CO2H、-CO2(非置換C1~C6アルキル)、-CONH2、-CONH(非置換C1~C6アルキル)、-CON(非置換C1~C6アルキル)(非置換C1~C6アルキル)、-SO3H、-SO2NH2、-SO2NH(非置換C1~C6アルキル)および-SO2N(非置換C1~C6アルキル)(非置換C1~C6アルキル)の群から独立して選択される置換基の1つまたは複数によって置換される;
R12は、H、C1~C6アルキル、C3~C6アルケニル、C3~C6アルキニル、-C0~C6アルキル-Ar、-C0~C6アルキル-Hetおよび-C0~C6アルキル-C3~C7シクロアルキルから選択される;
それぞれのR13およびそれぞれのR14は独立して、H、C1~C6アルキル、C3~C6アルケニル、C3~C6アルキニル、-C0~C6アルキル-Ar、-C0~C6アルキル-Hetおよび-C0~C6アルキル-C3~C7シクロアルキルから選択され、あるいは、R13およびR14は、それらが結合する窒素と一緒になって、N、OおよびSから選択される1つまたは複数のさらなるヘテロ原子を場合により含有する4員~7員の複素環式環を形成する;
R15は、C1~C6アルキル、C3~C6アルケニル、C3~C6アルキニル、-C0~C6アルキル-Ar、-C0~C6アルキル-Hetおよび-C0~C6アルキル-C3~C7シクロアルキルから選択される)
またはその医薬的に許容される塩。
Xは、水素、C1~C8アルキル、ハロ、-OR10、-NR10R11、ニトロ、シアノ、-COOR10または-COR10から選択される;
Zは、CH、CR3またはNであり、但し、ZがCHまたはCR3であるときには、kは0~4であり、かつ、tは0または1であり、また、ZがNであるときには、kは0~3であり、かつ、tは0である;
Yは、-O-、-S-、-N(R12)-および-C(R4)(R5)-から選択される;
W1は、C1~C6アルキル、C0~C6アルキル、C3~C6シクロアルキル、アリールおよびHetから選択され、但し、前記C1~C8アルキル、C3~C8シクロアルキル、ArおよびHetは場合により非置換であるか、あるいは、ハロ、シアノ、ニトロ、C1~C6アルキル、C3~C6アルケニル、C3~C6アルキニル、-C0~C6アルキル-CO2R12、-C0~C6アルキル-C(O)SR12、-C0~C6アルキル-CONR13R14、-C0~C6アルキル-COR15、-C0~C6アルキル-NR13R14、-C0~C6アルキル-SR12、-C0~C6アルキル-OR12、-C0~C6アルキル-SO3H、-C0~C6アルキル-SO2NR13R14、-C0~C6アルキル-SO2R12、-C0~C6アルキル-SOR15、-C0~C6アルキルOCOR15、-C0~C6アルキル-OC(O)NR13R14、-C0~C6アルキル-OC(O)OR15、-C0~C6アルキル-NR13C(O)OR15、-C0~C6アルキル-NR13C(O)NR13R14および-C0~C6アルキル-NR13COR15から独立して選択される1つまたは複数の基により置換され、この場合、前記C1~C6アルキルは場合により非置換であるか、あるいは、1つまたは複数のハロ置換基によって置換される;
W2は、H、ハロ、C1~C6アルキル、C2~C6アルケニル、C2~C6アルキニル、-C0~C6アルキル-NR13R14、-C0~C6アルキル-SR12、-C0~C6アルキル-OR12、-C0~C6アルキルCO2R12、-C0~C6アルキル-C(O)SR12、-C0~C6アルキルCONR13R14、-C0~C6アルキル-COR15、-C0~C6アルキルOCOR15、-C0~C6アルキル-OCONR13R14、-C0~C6アルキル-NR13CONR13R14、-C0~C6アルキル-NR13COR15、-C0~C6アルキル-Het、-C0~C6アルキル-Arおよび-C0~C6アルキル-C3~C7シクロアルキルから選択され、但し、前記C1~C6アルキルは場合により非置換であるか、あるいは、1つまたは複数のハロ置換基によって置換され、かつ、前記-C0~C6アルキル-Het、-C0~C6アルキル-Arおよび-C0~C6アルキル-C3~C7シクロアルキルのC3~C7シクロアルキル部分、Ar部分およびHet部分は場合により非置換であるか、あるいは、ハロ、シアノ、ニトロ、C1~C6アルキル、C3~C6アルケニル、C3~C6アルキニル、-C0
~C6アルキル-CO2R12、-C0~C6アルキル-C(O)SR12、-C0~C6アルキル-CONR13R14、-C0~C6アルキル-COR15、-C0~C6アルキル-NR13R14、-C0~C6アルキル-SR12、-C0~C6アルキル-OR12、-C0~C6アルキル-SO3H、-C0~C6アルキル-SO2NR13R14、-C0~C6アルキル-SO2R12、-C0~C6アルキル-SOR15、-C0~C6アルキル-OCOR15、-C0~C6アルキル-OC(O)NR13R14、-C0~C6アルキル-OC(O)OR15、-C0~C6アルキル-NR13C(O)OR15、-C0~C6アルキル-NR13C(O)NR13R14および-C0~C6アルキル-NR13COR15から独立して選択される1つまたは複数の基により置換され、この場合、前記C1~C6アルキルは場合により非置換であるか、あるいは、1つまたは複数のハロ置換基によって置換される;
W3は、H、ハロ、C1~C6アルキル、-C0~C6アルキル-NR13R14、-C0~C6アルキルSR12、-C0~C6アルキル-OR12、-C0~C6アルキル-CO2R12、-C0~C6アルキル-C(O)SR12、-C0~C6アルキル-CONR13R14、
-C0~C6アルキル-COR15、-C0~C6アルキル-OCOR15、-C0~C6アルキル-OCONR13R14、-C0~C6アルキルNR13CONR13R14、
-C0~C6アルキル-NR13COR15、-C0~C6アルキル-Het、-C1~C6アルキル-Arおよび-C1~C6アルキル-C3~C7シクロアルキルからなる群から選択され、
但し、前記C1~C6アルキルは場合により非置換であるか、あるいは、1つまたは複数のハロ置換基によって置換される;
Qは、C3~C8シクロアルキル、ArおよびHetから選択され、但し、前記C3~C8シクロアルキル、ArおよびHetは場合により非置換であるか、あるいは、ハロ、シアノ、ニトロ、C1~C6アルキル、C3~C6アルケニル、C3~C6アルキニル、-C0~C6アルキルCO2R12、-C0~C6アルキル-C(O)SR12、-C0~C6アルキルCONR13R14、-C0~C6アルキル-COR15、-C0~C6アルキルNR13R14、-C0~C6アルキル-SR12、-C0~C6アルキル-OR12、-C0~C6アルキル-SO3H、-C0~C6アルキル-SO2NR13R14、-C0~C6アルキル-SO2R12、-C0~C6アルキル-SOR15、-C0~C6アルキル-OCOR15、-C0~C6アルキル-OC(O)NR13R14、-C0~C6アルキル-OC(O)OR15、-C0~C6アルキルNR13C(O)OR15、-C0~C6アルキル-NR13C(O)NR13R14および-C0~C6アルキル-NR13COR15から独立して選択される1つまたは複数の基により置換され、この場合、前記C1C6アルキルは場合により非置換であるか、あるいは、1つまたは複数のハロ置換基によって置換される;
pは0~8である;
nは2~8である;
mは0または1である;
qは0または1である;
tは0または1である;
それぞれのR1およびR2は独立して、H、ハロ、C1~C6アルキル、C3~C6アルケニル、C3~C6アルキニル、-C0~C6アルキル-NR13R14、-C0~C6アルキル-OR12、-C0~C6アルキル-SR12、-C1~C6アルキル-Het、-C1~C6アルキル-Arおよび-C1~C6アルキル-C3~C7シクロアルキルから選択されるか、あるいは、R1およびR2は、それらが結合する炭素と一緒になって、3員~5員の炭素環式環または複素環式環を形成し、この場合、前記複素環式環は、N、OおよびSから選択される1つまたは複数のヘテロ原子を含有し、但し、前記C1~C6アルキルのいずれもが場合により非置換であるか、あるいは、1つまたは複数のハロ置換基によって置換される;
それぞれのR3は同じまたは異なり、独立して、ハロ、シアノ、ニトロ、C1~C6アルキル、C3~C6アルケニル、C3~C6アルキニル、-C0~C6アルキル-Ar、-C0~C6アルキル-Het、-C0~C6アルキル-C3~C7シクロアルキル、-C0~C6アルキル-CO2R12、-C0~C6アルキル-C(O)SR12、-C0~C6アルキル-CONR13R14、-C0~C6アルキル-COR15、-C0~C6アルキル-NR13R14、-C0~C6アルキル-SR12、-C0~C6アルキル-OR12、-C0~C6アルキル-SO3H、-C0~C6アルキルSO2NR13R14、-C0~C6アルキル-SO2R12、-C0~C6アルキルSOR15、-C0~C6アルキル-OCOR15、-C0~C6アルキル-OC(O)NR13R14、-C0~C6アルキル-OC(O)OR15、-C0~C6アルキル-NR13C(O)OR15、-C0~C6アルキル-NR13C(O)NR13R14および-C0~C6アルキル-NR13COR15から選択され、但し、前記C1~C6アルキルは場合により非置換であるか、あるいは、1つまたは複数のハロ置換基によって置換される;
それぞれのR4およびR5は独立して、H、ハロ、C1~C6アルキル、-C0~C6アルキル-Het、-C0~C6アルキル-Arおよび-C0~C6アルキル-C3~C7シクロアルキルから選択される;
R6およびR7はそれぞれが独立して、H、ハロ、C1~C6アルキル、-C0~C6アルキル-Het、-C0~C6アルキル-Arおよび-C0~C6アルキル-C3~C7シクロアルキルから選択される;
R8およびR9はそれぞれが独立して、H、ハロ、C1~C6アルキル、-C0~C6アルキル-Het、-C0~C6アルキル-Arおよび-C0~C6アルキル-C3~C7シクロアルキルから選択される;
R10およびR11はそれぞれが独立して、H、C1~C12アルキル、C3~C12アルケニル、C3~C12アルキニル、
-C0~C8アルキル-Ar、-C0~C8アルキル-Het、-C0~C8アルキル-C3~C7シクロアルキル、-C0~C8アルキル-O-Ar、-C0~C8アルキル-O-Het、
-C0~C8アルキル-O-C3~C7シクロアルキル、-C0~C8アルキル-S(O)x-C0~C6アルキル、-C0~C8アルキル-S(O)x-Ar、-C0~C8アルキル-S(O)x-Het、-C0~C8アルキル-S(O)x-C3~C7シクロアルキル、-C0~C8アルキル-NH-Ar、-C0~C8アルキル-NH-Het、-C0~C8アルキル-NH-C3~C7シクロアルキル、-C0~C8アルキル-N(C1~C4アルキル)-Ar、-C0~C8アルキル-N(C1~C4アルキル)-Het、-C0~C8アルキル-N(C1~C4アルキル-C3~C7シクロアルキル、-C0~C8アルキル-Ar、-C0~C8アルキル-Hetおよび-C0~C8アルキル-C3~C7シクロアルキルから選択され、この場合、xは、0、1または2であり、
あるいは、R10およびR11は、それらが結合する窒素と一緒になって、N、OおよびSから選択される1つまたは複数のさらなるヘテロ原子を場合により含有する4員~7員の複素環式環を形成し、但し、前記C1~C12アルキル、C3~C12アルケニルまたはC3~C12アルキニルは場合により、ハロ、-OH、-SH、-NH2、-NH(非置換C1~C6アルキル)、-N(非置換C1~C6アルキル)(非置換C1~C6アルキル)、非置換の-OC1~C6アルキル、-CO2H、-CO2(非置換C1~C6アルキル)、-CONH2、-CONH(非置換C1~C6アルキル)、-CON(非置換C1~C6アルキル)(非置換C1~C6アルキル)、-SO3H、-SO2NH2、-SO2NH(非置換C1~C6アルキル)および-SO2N(非置換C1~C6アルキル)(非置換C1~C6アルキル)の群から独立して選択される置換基の1つまたは複数によって置換される;
R12は、H、C1~C6アルキル、C3~C6アルケニル、C3~C6アルキニル、-C0~C6アルキル-Ar、-C0~C6アルキル-Hetおよび-C0~C6アルキル-C3~C7シクロアルキルから選択される;
それぞれのR13およびそれぞれのR14は独立して、H、C1~C6アルキル、C3~C6アルケニル、C3~C6アルキニル、-C0~C6アルキル-Ar、-C0~C6アルキル-Hetおよび-C0~C6アルキル-C3~C7シクロアルキルから選択され、あるいは、R13およびR14は、それらが結合する窒素と一緒になって、N、OおよびSから選択される1つまたは複数のさらなるヘテロ原子を場合により含有する4員~7員の複素環式環を形成する;
R15は、C1~C6アルキル、C3~C6アルケニル、C3~C6アルキニル、-C0~C6アルキル-Ar、-C0~C6アルキル-Hetおよび-C0~C6アルキル-C3~C7シクロアルキルから選択される)
またはその医薬的に許容される塩。
いくつかの実施形態において、Xは水素であり、pは0であり、tは0であり、ZはCHであり、かつ、Yは-O-である。
さらなる実施形態において、Xは水素であり、pは0であり、tは0であり、ZはCHであり、かつ、Yは-O-であり、W1およびW2はフェニルであり、W3は水素であり、qは1であり、かつ、R8およびR9は水素である。
他の実施形態において、Xは水素であり、pは0であり、tは0であり、ZはCHであり、かつ、Yは-O-であり、W1およびW2はフェニルであり、W3は水素であり、qは1であり、かつ、R8およびR9は水素であり、かつ、QはArである。
したがって、式IIIの化合物には、下記に示される構造を有する化合物、GW3965[2]およびSB742881[25]が含まれるが、これらに限定されない:
式IIIの化合物は、米国特許第7,365,085号および同第7,560,586号(これらは参照によって本明細書中に組み込まれる)に記載されるように合成することができる。
式IVが下記に示される:
またはその医薬的に許容される塩、但し、式IVにおいて、
J11は-N=であり、かつ、J21は-CR300-であり、または、J11は-CR200-であり、かつ、J21は=N-である;
R00は、G1、G21またはRNである;
R200は、G1、G21またはRCである;
R300およびR400は独立して、RCまたはQであり、但し、R300、R400およびR500のうちのただ1つだけがQである;
Qは、C3~6シクロアルキル、ヘテロアリールまたはヘテロシクリルであり、それぞれが場合により、1つ~4つのRQにより置換されるか、あるいは、Qは-X-Y-Zであり、但し、それぞれのRQが独立して、アリールオキシ、アラルキルオキシ、アリールオキシアルキル、アリールC0~C6アルキルカルボキシ、C(R110)=C(R110)-COOH、オキソ、=S、-Z、-Y’-Zまたは-X-Y-Zであり、それぞれのRQは場合により、1つ~4つのR80により置換される;
R500は、G1、G21、QまたはRCであり、但し、この場合、R00、R200およびR500のうちのただ1つがG1であり、かつ、R00、N=およびR500のうちのただ1つがG21である;
G21は-J0-K0であり、式中、J0およびK0は独立して、アリールまたはヘテロアリールであり、それぞれが場合により、1つ~4つのRK基により置換され、それぞれのRKが独立して、水素、ハロゲン、CR110=CR110COOR110、ニトロ、-Z、-Y-Zまたは-X-Y-Zである;
G1は-L10-Rであり、但し、L10は、結合、L50、L60、-L50-L60-L50-または-L60-L50-L50-であり、これらの式において、
それぞれのL50が独立して、-[C(R150)2]m-であり、
それぞれのL60が独立して、-CS-、-CO-、-SO2-、-O-、-CON(R110)-、-CONR110N(R110)-、-C(=NR110)-、-C(NOR11)-、-C(=N-N(R110)2)-、-C3~C8シクロアルキル-または-ヘテロシクリル-であり、前記シクロアルキルまたはヘテロシクリルは場合により、1つ~4つのR140基により置換され、あるいは、それぞれのL60が独立して、C2~C6アリジイルであり、前記アリジイル鎖は場合により、-C(R100)2-、-C(R110)2C(R110)z-、-C(R11)C(R110)-、-C(R110)2O-、-C(R110)zNR110-、-C C-、-O-、-S-、-N(RO)CO-、-N(R100)CO2-、-CON(R110)-、-CO-、-CO2-、-OC(=O)-、-OC(=O)N(R100)-、-SO2-、-N(R100)SO2-または-SO2N(R100)によって中断され、
Rが、アリール、ヘテロシクリル、ヘテロアリールまたは-(C3~C6)シクロアルキルであり、但し、Rは場合により、1つ~4つのRAにより置換され、この場合、それぞれのRAが独立して、ハロゲン、ニトロ、ヘテロシクリル、C1~C6アルキル、C2~C6アルケニル、C2~C6アルキニル、C3~C8シクロアルキル、(C3~C8シ
クロアルキル)-C1~C6アルキル-、(C3~C8シクロアルケニル)-C1~C6アルキル-、(C3~C8シクロアルキル)-C1~C6アルケニル-、アリールアルキル、アリールオキシ、アリールC1~6アルコキシ、C1~C6ハロアルキル、SO2R110、OR110、SR110、N3、SOR110、COR110、SO2N(R110)2、SO2NR110COR110、C≡N、C(O)OR110、CON(R110)2、-CON(R110)OR110、OCON(R110)2、-NR110COR110、NR110CON(R110)2、NR110COOR110、-C(=N-OH)R110、-C(=S)N(R110)2、
-S(=O)N(R110)2、-S(=O)OR110、-N(R110)S(=O)2R110、-C(=O)N(R110)N(R110)2、-OC(=O)-R110、-OC(=O)-OR110またはN(R11)2であり、
かつ、それぞれのRAが場合により、独立して-ハロゲン、-C1~C6アルキル、アリールオキシ、C0~6アルキルSO2R110、C0~6アルキルCOOR110、C1~6アルコキシアリール、C1~C6ハロアルキル、
-SO2R110、-OR110、-SR110、-N3、-SO2R110、-COR110、-SO2N(R110)2、-SO2NR110COR110、-C≡N、-C(O)OR110、
-CON(R110)2、-CON(R110)OR110、-OCON(R110)2、-NR110COR110、-NR110CON(R110)2、-NR110COOR110または-N(R110)2である1つ~4つの基により置換される;
RNは-L31-R60であり、但し、L31は、結合、-X3(CHz)n-X3-、-(CH2)m-X3-(CH2)n-または-(CH2)1+w,-Y3-(CH2)w-であり、これらの式において、それぞれのwが独立して、0~5であり、かつ、それぞれのX3が独立して、結合、-C(R110)2-、-C(R110)2C(R110)2-、-C(R110)=C(R110)-、-C≡C-、-CO-、-CS-、-CONR100-、-C(=N)(R100)-、-C(=N-OR110)-、-C[=N-N(R110)2]、-CO2-、-SO2-または-SO2N(R110)-であり、かつ
Y3が、-O-、-S-、-NR70-、-N(R100)CO-、-N(R110)CO2-、-OCO-、-OC(=O)N(R100)-、-NR100CONR100-、-N(R110)SO2-または-NR100CSNR100-であり、
あるいは、L31はC2~C6アリジイル鎖であり、但し、前記アリジイル鎖は場合により、-C(R110)2-、
-C(R110)2C(R110)2-、-C(R110)=C(R110)-、-C(R110)2O-、-C(R110)2NR110-、-C≡C-、-O-、-S-、-N(R100)CO-、
-N(R100)CO2-、-CON(R100)-、-CO-、-CO2-、-O(C=O)-、-O(C=O)N(R110)-、-SO2-、-N(R100)SO2-または-SO2N(R100)-によって中断され、
R60が、C1~C6アルキル、C1~C6ハロアルキル、アリール、C3~C8シクロアルキル、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、-CN、
-C(=O)R110、-C(=O)OR110、-C(=O)N(R110)2、-N(R110)2、-SO2R110、-S(=O)2N(R110)2、-C(=O)N(R110)N(R110)2または-C(=O)N(R11)(OR110)であり、但し、前記アリール、ヘテロアリール、シクロアルキルまたはヘテロシクリルは場合により、1つ~4つのR60aにより置換され、この場合、
それぞれのR60aが独立して、-Z、-Y’-Zまたは-X-Y-Zである;
それぞれのRCは独立して、-L30-R70であり、但し、
それぞれのL30が独立して、結合または-(CH2)m-V10-(CH2)n-であり、式中、
V10は、-C(R110)2-、-C(R110)2C(R110)2、-C(R110)=C(R110)-、-C(R110)2O-、-C(R110)2NR110-、-C≡C-、-O-、
-S-、-NR10-、-N(R100)CO-、-N(R100)CO2-、-OCO-、-CO-、-CS-、-CONR100-、-C(=N-R110)-、-C(=N-OR110)-、
-C[=N-N(R110)2]、-CO2-、-OC(=O)-、-OC(=O)N(R100)-、SO2-、-N(R100)SO2-、-SO2N(R100)-、-NR100CONR100-、-NR100CSNR100-、C3~C6シクロアルキルまたはC3~C6シクロハロアルキルであり、
あるいは、それぞれのL30が独立して、C2~C6アリジイルであり、但し、前記アリジイル鎖は場合により、-C(R110)2-、-C(R110)2C(R110)2-、-C(R110)C(R110)-、-C(R110)2O-、-C(R110)2NR110-、-C≡C-、-O-、-S-、-N(R100)CO-、
-N(R100)CO2-、-NR110-、-CON(R100)-、-CO-、-CO2-、-O(C=O)-、-O(C=O)N(R100)-、-SO2-、-N(R100)SO2-または-SO2N(R100)-によって中断され、
それぞれのR70が独立して、水素、ハロゲン、ニトロ、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、-Z、-Y-Zまたは-X-YZであり、
この場合、前記アリール、ヘテロアリールおよびヘテロシクリルはそれぞれが場合により、1つ~4つのR70aにより置換され、但し、それぞれのR70aが独立し、アリールオキシ、アラルキルオキシ、アリールオキシアルキル、アリールC0~C6アルキルカルボキシ、C(R110)=C(R110)COOH、オキソ、-Z、-Y’-Zまたは-X-Y-Zであり、かつ、それぞれのR70aが場合により、1つ~4つのR80により置換され、但し、それぞれのR80が独立して、ハロゲン、C1~C6アルキル、C1~C6アルコキシ、C1~C8ハロアルキル、C1~C8ハロアルキル(OR110)、C0~C6アルキルOR110、C0~C6アルキルCON(R110)2、C0~C6アルキルCOR110、C0~C6アルキルCOOR110またはC0~C6アルキルSO2R110である;
それぞれのR100は独立して、-R110、-C(=O)R110、-CO2R110または-SO2R110である;
それぞれのR110は独立して、-水素、-C1~C6アルキル、C2~C6アルケニル、-C1~C6アルキニル、-C1~C6ハロアルキルまたは-N(R12)2であり、但し、R110のいずれもが場合により、R120の1つ~4つの基により置換される:
それぞれのR120は独立して、ハロゲン、シアノ、ニトロ、オキソ、-B(OR130)、C0~C6アルキルN(R13)2、C1~C6ハロアルキル、C1~C6アルキル、C1~C6アルコキシ、(C0~C6アルキル)C=O(OR130)、C0~C6アルキルOR130、C0~C6アルキルCOR130、
C0~C6アルキルSO2R130、C0~C6アルキルCON(R13)2、C0~C6アルキルCONR130OR130、C0~C6アルキルSO2N(R130)2、C0~C6アルキルSR130、C0~C6ハロアルキルOR130、C0~C6アルキルCN、-C0~C6アルキN(R13)2、-NR13SO2R13または-OC0~6アルキルCOOR130である;
それぞれのR130は独立して、水素、C1~C6アルキル、C2~C6アルケニルまたはC2~C6アルキニルである;
それぞれのR140は独立して、C1~C6アルキル、C1~C6アルコキシ、ハロゲン、C1~C6ハロアルキル、C0~C6アルキルCON(R110)o、C0~C6アルキルCONR110R10、C0~C6アルキルOR110またはC0~C6アルキルCOOR110である;かつ
それぞれのR150は独立して、水素、ハロゲン、OR130、(C1~C6)アルキルまたは(C1~C6)ハロアルキルであり、但し、
それぞれのアルキルは場合により、それぞれが独立してハロゲン、シアノ、ニトロ、アジド、OR130、C(O)R130、C(O)OR13C(O)N(R130)2、N(R130)2、N(R130)C(O)R130、N(R130)S(O)2R130、-OC(O)OR130、OC(O)N(R130)2、N(R130)C(O)OR130、N(R130)C(O)N(R130)、SR130、S(O)R130、S(O)2R’またはS(O)2N(R130)2である少なくとも1つの基により置換され、あるいは、(同じ原子または異なる原子に結合する)2つのR150は一緒になって、C3~C6シクロアルキルを形成することができる;
それぞれのXは独立して、-O-、-S-または-N(R100)-である;
それぞれのYは独立して、-[C(R150)2]p-または-C2~C6アルケニルであり、但し、pは、1、2、3、4、5または6である;
それぞれのY’は独立して、-[C(R150)2]p-、-C2~C6アルケニルC3~C8シクロアルキルまたはヘテロシクリルであり、但し、前記シクロアルキルまたはヘテロシクリルは場合により、1つ~3つのZ基により置換される:
それぞれのZは独立して、-H、ハロゲン、-OR110、-SR110、-C(=O)R110、-C(=O)OR110、-C(=O)N(R110)2、
-N(R100)2、-N3、-NO2、-C(=N-OH)R110、-C(=S)N(R110)2、-CN、-S(=O)R110、-S(=O)N(R110)2、-S(=O)OR110、
-S(=O)2R110、S(=O)2N(R110)2、-NR110COR110、-N(R110)C(=O)N(R110)2、-N(R110)COOR110、-N(R110)S(=O)2R110、-C(=O)N(R110)N(R110)2、-C(=O)N(R110)(OR110)、-OC(=O)-R110、-OC(=O)-OR110または-OC(=O)-N(R110)2である;かつ
それぞれのmおよびnは独立して、0、1、2、3、4、5または6である。
式IVが下記に示される:
J11は-N=であり、かつ、J21は-CR300-であり、または、J11は-CR200-であり、かつ、J21は=N-である;
R00は、G1、G21またはRNである;
R200は、G1、G21またはRCである;
R300およびR400は独立して、RCまたはQであり、但し、R300、R400およびR500のうちのただ1つだけがQである;
Qは、C3~6シクロアルキル、ヘテロアリールまたはヘテロシクリルであり、それぞれが場合により、1つ~4つのRQにより置換されるか、あるいは、Qは-X-Y-Zであり、但し、それぞれのRQが独立して、アリールオキシ、アラルキルオキシ、アリールオキシアルキル、アリールC0~C6アルキルカルボキシ、C(R110)=C(R110)-COOH、オキソ、=S、-Z、-Y’-Zまたは-X-Y-Zであり、それぞれのRQは場合により、1つ~4つのR80により置換される;
R500は、G1、G21、QまたはRCであり、但し、この場合、R00、R200およびR500のうちのただ1つがG1であり、かつ、R00、N=およびR500のうちのただ1つがG21である;
G21は-J0-K0であり、式中、J0およびK0は独立して、アリールまたはヘテロアリールであり、それぞれが場合により、1つ~4つのRK基により置換され、それぞれのRKが独立して、水素、ハロゲン、CR110=CR110COOR110、ニトロ、-Z、-Y-Zまたは-X-Y-Zである;
G1は-L10-Rであり、但し、L10は、結合、L50、L60、-L50-L60-L50-または-L60-L50-L50-であり、これらの式において、
それぞれのL50が独立して、-[C(R150)2]m-であり、
それぞれのL60が独立して、-CS-、-CO-、-SO2-、-O-、-CON(R110)-、-CONR110N(R110)-、-C(=NR110)-、-C(NOR11)-、-C(=N-N(R110)2)-、-C3~C8シクロアルキル-または-ヘテロシクリル-であり、前記シクロアルキルまたはヘテロシクリルは場合により、1つ~4つのR140基により置換され、あるいは、それぞれのL60が独立して、C2~C6アリジイルであり、前記アリジイル鎖は場合により、-C(R100)2-、-C(R110)2C(R110)z-、-C(R11)C(R110)-、-C(R110)2O-、-C(R110)zNR110-、-C C-、-O-、-S-、-N(RO)CO-、-N(R100)CO2-、-CON(R110)-、-CO-、-CO2-、-OC(=O)-、-OC(=O)N(R100)-、-SO2-、-N(R100)SO2-または-SO2N(R100)によって中断され、
Rが、アリール、ヘテロシクリル、ヘテロアリールまたは-(C3~C6)シクロアルキルであり、但し、Rは場合により、1つ~4つのRAにより置換され、この場合、それぞれのRAが独立して、ハロゲン、ニトロ、ヘテロシクリル、C1~C6アルキル、C2~C6アルケニル、C2~C6アルキニル、C3~C8シクロアルキル、(C3~C8シ
クロアルキル)-C1~C6アルキル-、(C3~C8シクロアルケニル)-C1~C6アルキル-、(C3~C8シクロアルキル)-C1~C6アルケニル-、アリールアルキル、アリールオキシ、アリールC1~6アルコキシ、C1~C6ハロアルキル、SO2R110、OR110、SR110、N3、SOR110、COR110、SO2N(R110)2、SO2NR110COR110、C≡N、C(O)OR110、CON(R110)2、-CON(R110)OR110、OCON(R110)2、-NR110COR110、NR110CON(R110)2、NR110COOR110、-C(=N-OH)R110、-C(=S)N(R110)2、
-S(=O)N(R110)2、-S(=O)OR110、-N(R110)S(=O)2R110、-C(=O)N(R110)N(R110)2、-OC(=O)-R110、-OC(=O)-OR110またはN(R11)2であり、
かつ、それぞれのRAが場合により、独立して-ハロゲン、-C1~C6アルキル、アリールオキシ、C0~6アルキルSO2R110、C0~6アルキルCOOR110、C1~6アルコキシアリール、C1~C6ハロアルキル、
-SO2R110、-OR110、-SR110、-N3、-SO2R110、-COR110、-SO2N(R110)2、-SO2NR110COR110、-C≡N、-C(O)OR110、
-CON(R110)2、-CON(R110)OR110、-OCON(R110)2、-NR110COR110、-NR110CON(R110)2、-NR110COOR110または-N(R110)2である1つ~4つの基により置換される;
RNは-L31-R60であり、但し、L31は、結合、-X3(CHz)n-X3-、-(CH2)m-X3-(CH2)n-または-(CH2)1+w,-Y3-(CH2)w-であり、これらの式において、それぞれのwが独立して、0~5であり、かつ、それぞれのX3が独立して、結合、-C(R110)2-、-C(R110)2C(R110)2-、-C(R110)=C(R110)-、-C≡C-、-CO-、-CS-、-CONR100-、-C(=N)(R100)-、-C(=N-OR110)-、-C[=N-N(R110)2]、-CO2-、-SO2-または-SO2N(R110)-であり、かつ
Y3が、-O-、-S-、-NR70-、-N(R100)CO-、-N(R110)CO2-、-OCO-、-OC(=O)N(R100)-、-NR100CONR100-、-N(R110)SO2-または-NR100CSNR100-であり、
あるいは、L31はC2~C6アリジイル鎖であり、但し、前記アリジイル鎖は場合により、-C(R110)2-、
-C(R110)2C(R110)2-、-C(R110)=C(R110)-、-C(R110)2O-、-C(R110)2NR110-、-C≡C-、-O-、-S-、-N(R100)CO-、
-N(R100)CO2-、-CON(R100)-、-CO-、-CO2-、-O(C=O)-、-O(C=O)N(R110)-、-SO2-、-N(R100)SO2-または-SO2N(R100)-によって中断され、
R60が、C1~C6アルキル、C1~C6ハロアルキル、アリール、C3~C8シクロアルキル、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、-CN、
-C(=O)R110、-C(=O)OR110、-C(=O)N(R110)2、-N(R110)2、-SO2R110、-S(=O)2N(R110)2、-C(=O)N(R110)N(R110)2または-C(=O)N(R11)(OR110)であり、但し、前記アリール、ヘテロアリール、シクロアルキルまたはヘテロシクリルは場合により、1つ~4つのR60aにより置換され、この場合、
それぞれのR60aが独立して、-Z、-Y’-Zまたは-X-Y-Zである;
それぞれのRCは独立して、-L30-R70であり、但し、
それぞれのL30が独立して、結合または-(CH2)m-V10-(CH2)n-であり、式中、
V10は、-C(R110)2-、-C(R110)2C(R110)2、-C(R110)=C(R110)-、-C(R110)2O-、-C(R110)2NR110-、-C≡C-、-O-、
-S-、-NR10-、-N(R100)CO-、-N(R100)CO2-、-OCO-、-CO-、-CS-、-CONR100-、-C(=N-R110)-、-C(=N-OR110)-、
-C[=N-N(R110)2]、-CO2-、-OC(=O)-、-OC(=O)N(R100)-、SO2-、-N(R100)SO2-、-SO2N(R100)-、-NR100CONR100-、-NR100CSNR100-、C3~C6シクロアルキルまたはC3~C6シクロハロアルキルであり、
あるいは、それぞれのL30が独立して、C2~C6アリジイルであり、但し、前記アリジイル鎖は場合により、-C(R110)2-、-C(R110)2C(R110)2-、-C(R110)C(R110)-、-C(R110)2O-、-C(R110)2NR110-、-C≡C-、-O-、-S-、-N(R100)CO-、
-N(R100)CO2-、-NR110-、-CON(R100)-、-CO-、-CO2-、-O(C=O)-、-O(C=O)N(R100)-、-SO2-、-N(R100)SO2-または-SO2N(R100)-によって中断され、
それぞれのR70が独立して、水素、ハロゲン、ニトロ、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、-Z、-Y-Zまたは-X-YZであり、
この場合、前記アリール、ヘテロアリールおよびヘテロシクリルはそれぞれが場合により、1つ~4つのR70aにより置換され、但し、それぞれのR70aが独立し、アリールオキシ、アラルキルオキシ、アリールオキシアルキル、アリールC0~C6アルキルカルボキシ、C(R110)=C(R110)COOH、オキソ、-Z、-Y’-Zまたは-X-Y-Zであり、かつ、それぞれのR70aが場合により、1つ~4つのR80により置換され、但し、それぞれのR80が独立して、ハロゲン、C1~C6アルキル、C1~C6アルコキシ、C1~C8ハロアルキル、C1~C8ハロアルキル(OR110)、C0~C6アルキルOR110、C0~C6アルキルCON(R110)2、C0~C6アルキルCOR110、C0~C6アルキルCOOR110またはC0~C6アルキルSO2R110である;
それぞれのR100は独立して、-R110、-C(=O)R110、-CO2R110または-SO2R110である;
それぞれのR110は独立して、-水素、-C1~C6アルキル、C2~C6アルケニル、-C1~C6アルキニル、-C1~C6ハロアルキルまたは-N(R12)2であり、但し、R110のいずれもが場合により、R120の1つ~4つの基により置換される:
それぞれのR120は独立して、ハロゲン、シアノ、ニトロ、オキソ、-B(OR130)、C0~C6アルキルN(R13)2、C1~C6ハロアルキル、C1~C6アルキル、C1~C6アルコキシ、(C0~C6アルキル)C=O(OR130)、C0~C6アルキルOR130、C0~C6アルキルCOR130、
C0~C6アルキルSO2R130、C0~C6アルキルCON(R13)2、C0~C6アルキルCONR130OR130、C0~C6アルキルSO2N(R130)2、C0~C6アルキルSR130、C0~C6ハロアルキルOR130、C0~C6アルキルCN、-C0~C6アルキN(R13)2、-NR13SO2R13または-OC0~6アルキルCOOR130である;
それぞれのR130は独立して、水素、C1~C6アルキル、C2~C6アルケニルまたはC2~C6アルキニルである;
それぞれのR140は独立して、C1~C6アルキル、C1~C6アルコキシ、ハロゲン、C1~C6ハロアルキル、C0~C6アルキルCON(R110)o、C0~C6アルキルCONR110R10、C0~C6アルキルOR110またはC0~C6アルキルCOOR110である;かつ
それぞれのR150は独立して、水素、ハロゲン、OR130、(C1~C6)アルキルまたは(C1~C6)ハロアルキルであり、但し、
それぞれのアルキルは場合により、それぞれが独立してハロゲン、シアノ、ニトロ、アジド、OR130、C(O)R130、C(O)OR13C(O)N(R130)2、N(R130)2、N(R130)C(O)R130、N(R130)S(O)2R130、-OC(O)OR130、OC(O)N(R130)2、N(R130)C(O)OR130、N(R130)C(O)N(R130)、SR130、S(O)R130、S(O)2R’またはS(O)2N(R130)2である少なくとも1つの基により置換され、あるいは、(同じ原子または異なる原子に結合する)2つのR150は一緒になって、C3~C6シクロアルキルを形成することができる;
それぞれのXは独立して、-O-、-S-または-N(R100)-である;
それぞれのYは独立して、-[C(R150)2]p-または-C2~C6アルケニルであり、但し、pは、1、2、3、4、5または6である;
それぞれのY’は独立して、-[C(R150)2]p-、-C2~C6アルケニルC3~C8シクロアルキルまたはヘテロシクリルであり、但し、前記シクロアルキルまたはヘテロシクリルは場合により、1つ~3つのZ基により置換される:
それぞれのZは独立して、-H、ハロゲン、-OR110、-SR110、-C(=O)R110、-C(=O)OR110、-C(=O)N(R110)2、
-N(R100)2、-N3、-NO2、-C(=N-OH)R110、-C(=S)N(R110)2、-CN、-S(=O)R110、-S(=O)N(R110)2、-S(=O)OR110、
-S(=O)2R110、S(=O)2N(R110)2、-NR110COR110、-N(R110)C(=O)N(R110)2、-N(R110)COOR110、-N(R110)S(=O)2R110、-C(=O)N(R110)N(R110)2、-C(=O)N(R110)(OR110)、-OC(=O)-R110、-OC(=O)-OR110または-OC(=O)-N(R110)2である;かつ
それぞれのmおよびnは独立して、0、1、2、3、4、5または6である。
いくつかの実施形態において、式IVの化合物は下記の式Vまたは式VIの構造を有する:
他の実施形態において、式VIの化合物は下記の式VIIの構造を有する:
さらに他の実施形態において、式VIの化合物は下記の式VIIIの構造を有する:
なおもさらなる実施形態において、式VIの化合物は下記の式IXの構造を有する:
したがって、本発明の方法において有用であり得る式IVの化合物には、下記に示される構造を有する化合物およびそれらのその医薬的に許容される塩が含まれるが、これらに限定されない:
また、本発明の方法において有用であり得る式IVの化合物は、下記の化合物を含むリストから選択される:
33、2-(1-(3クロロ-3’-フルオロ-4’-(ヒドロキシメチル)-5’-(メチルスルホニル)ビフェニル-4-イル)-2-(2-(2,6ジクロロフェニル)プロパン-2-イル)-1H-イミダゾール-4-イル)プロパン-2-オール;34、2-(2-(2(2-クロロ-3-フルオロフェニル)プロパン-2-イル)-1-(3’-フルオロ-4’-(ヒドロキシメチル)-5’(メチルスルホニル)ビフェニル-4-イル)-1H-イミダゾール-4-イル)プロパン-2-オール;35、2-(2-(2(2,6-ジクロロフェニル)プロパン-2-イル)-1-(3’-フルオロ-4’-(ヒドロキシメチル)-5’(メチルスルホニル)ビフェニル-4-イル)-1H-イミダゾール-4-イル)プロパン-2-オール;36、2-(2-(2(2,6-ジクロロフェニル)プロパン-2-イル)-1-(3,3’-ジフルオロ-4’-(ヒドロキシメチル)-5’(メチルスルホニル)ビフェニル-4-イル)-1H-イミダゾール-4-イル)プロパン-2-オール;および、37、2-(2-[1(2,6-ジクロロフェニル)エチル]-1-[3,3’-ジフルオロ-4’-(ヒドロキシメチル)-5’(メチルスルホニル)ビフェニル-4-イル]-1H-イミダゾール-4-イル)プロパン-2-オール。化合物12はまた、WO2010 0138598のEx.9として知られている。化合物38はまた、WO2007 002563のEx.19として知られている。化合物39はまた、WO2012 0135082として知られている。
33、2-(1-(3クロロ-3’-フルオロ-4’-(ヒドロキシメチル)-5’-(メチルスルホニル)ビフェニル-4-イル)-2-(2-(2,6ジクロロフェニル)プロパン-2-イル)-1H-イミダゾール-4-イル)プロパン-2-オール;34、2-(2-(2(2-クロロ-3-フルオロフェニル)プロパン-2-イル)-1-(3’-フルオロ-4’-(ヒドロキシメチル)-5’(メチルスルホニル)ビフェニル-4-イル)-1H-イミダゾール-4-イル)プロパン-2-オール;35、2-(2-(2(2,6-ジクロロフェニル)プロパン-2-イル)-1-(3’-フルオロ-4’-(ヒドロキシメチル)-5’(メチルスルホニル)ビフェニル-4-イル)-1H-イミダゾール-4-イル)プロパン-2-オール;36、2-(2-(2(2,6-ジクロロフェニル)プロパン-2-イル)-1-(3,3’-ジフルオロ-4’-(ヒドロキシメチル)-5’(メチルスルホニル)ビフェニル-4-イル)-1H-イミダゾール-4-イル)プロパン-2-オール;および、37、2-(2-[1(2,6-ジクロロフェニル)エチル]-1-[3,3’-ジフルオロ-4’-(ヒドロキシメチル)-5’(メチルスルホニル)ビフェニル-4-イル]-1H-イミダゾール-4-イル)プロパン-2-オール。化合物12はまた、WO2010 0138598のEx.9として知られている。化合物38はまた、WO2007 002563のEx.19として知られている。化合物39はまた、WO2012 0135082として知られている。
式IVの化合物は、PCT公開番号US2010/0069367および国際公開WO2010/138598(これらは参照によって本明細書中に組み込まれる)に記載されるように合成することができる。
転移の処置および/または防止のために使用することができるLXRアゴニストは化合物24またはその医薬的に許容される塩が可能である:
さらなる実施形態において、転移の処置および/または防止のために使用することができる化合物が、下記からなるリストにおけるPCT公開公報において見出され得る:WO2006/094034、WO2008/049047、WO2009/020683、WO2009/086138、WO2009/086123、WO2009/086130、WO2009/086129、WO2007/002559、WO2007/002563、WO2007/081335、WO2006/017055、WO2006/102067、WO2009/024550、US2006/0074115、US2006/0135601、WO2009/021868、WO2009/040289、WO2007/047991、WO2007/050425、WO2006/073363、WO2006/073364、WO2006/073365、WO2006/073366、WO2006/073367、US2009/0030082、WO2008/065754、JP2008/179562、WO2007/092065、US2010/0069367、US7998995、US7247748、WO2010/138598、US7365085、US75776215、US63136503、US2004/0072868、US2005/0107444、US2005/0113580、US2005/0131014、US2005/0282908、US2009/0286780(これらは参照によって本明細書中に組み込まれる)。
LXRαおよびLXRβは、ほぼ同じ時期に多数のグループによって最初に発見されたものであり(Apfel他、1994;Willy他、1995;Song他、1994;Shinar他、1994;Teboul他、1995)、グルコース、コレステロールおよび脂肪酸の代謝に関与する遺伝子の転写を媒介するためにコレステロールおよびその酸化誘導体によって内因的に活性化される核ホルモン受容体のファミリーに属する(Janowski他、1996;CalkinおよびTontonoz、2012)。脂質代謝とガン細胞成長との間における入り組んだつながり(Cairns他、2011)を考えれば、メラノーマにおけるLXRβの遍在的発現は偶然の一致であるとは考えられず、これにより、メラノーマ細胞は、その成長を持続するために脂質およびリポタンパク質粒子を合成することができるからである。しかしながら、同時に、そのような安定した基礎的な発現レベルは、LXRβ活性化療法に対するメラノーマ細胞の広範囲にわたる応答性によって例示されるように、LXRβを理想的な治療標的にしている。
様々な化合物が、LXRβまたはLXRαに対する選択性を有することが示されている。この選択性が、増大した活性および/または低下した標的外影響を可能にしているかもしれない。LXRβまたはLXRαに対して選択性を有する化合物の例が表1に示される。
本明細書中で使用される場合、用語「ApoE発現のレベルをインビトロにおいて増大させる」は、ある特定のLXRアゴニストがApoE発現のレベルを5μM未満の濃度(例えば、100nM~2μMの濃度、1μM以下の濃度)で実施例21のqPCRアッセイにおいて2.5倍増大させることができることを示す。このインビトロ効果を示すLXRアゴニストが本発明の方法における使用のために非常に有効であり得る。
用語「アルキル」は、本出願において使用される場合、飽和した分岐型または非分岐型の脂肪族の一価置換基に関連する。アルキル置換基は1個~100個の炭素原子(例えば、1個~22個の炭素原子、1個~10個の炭素原子、1個~6個の炭素原子、1個~3個の炭素原子)を有する。したがって、アルキル置換基の例には、メチル、エチル、n-プロピル、イソプロピル、n-ブチル、イソブチル、sec-ブチル、tert-ブチル、n-ペンチルおよびn-へキシルが含まれる。
用語「アルコキシ」は、式-ORの化学置換基を表しており、但し、式中、Rは、別途指定されない限り、場合により置換されたC1~C6アルキル基である。いくつかの実施形態において、アルキル基は置換されることが可能であり、例えば、アルコキシ基は、本
明細書中で定義されるような置換基を1つ、2つ、3つ、4つ、5つまたは6つ有することができる。
明細書中で定義されるような置換基を1つ、2つ、3つ、4つ、5つまたは6つ有することができる。
用語「アルコキシアルキル」は、アルコキシ基により置換されるアルキル基として記載されるヘテロアルキル基(これは本明細書中で定義される通りである)を表す。例示的な非置換のアルコキシアルキル基は2個~12個の間の炭素を含む。いくつかの実施形態において、アルキルおよびアルコキシはそれぞれがさらに、それぞれの基について本明細書中で定義されるような1つ、2つ、3つまたは4つの置換基により置換され得る。
本明細書中で使用される場合、用語「シクロアルキル」は、単環式、二環式または三環式の置換基を示し、但し、これらは飽和していてもよく、あるいは、部分的に飽和していてもよく、すなわち、1つまたは複数の二重結合を有する。単環式置換基が、3個~8個の炭素原子を含有する飽和環状炭化水素基によって例示される。単環式シクロアルキル置換基の例には、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロペンテニル、シクロヘキシル、シクロへキセニル、シクロヘプチルおよびシクロオクチルが含まれる。二環式の縮合シクロアルキル置換基が、別のシクロアルキル環に縮合するシクロアルキル環によって例示される。二環式シクロアルキル置換基の例には、デカリンおよび1,2,3,7,8,8a-ヘキサヒドロ-ナフタレンなどが含まれるが、これらに限定されない。三環式のシクロアルキル置換基が、さらなるシクロアルキル置換基に縮合するシクロアルキル二環式縮合環によって例示される。
本出願において使用される用語「アルキレン」は、飽和した分岐型または非分岐型の脂肪族の二価置換基に関連する(例えば、アルキレン置換基は、1個~6個の炭素原子、1個~3個の炭素原子を有する)。したがって、アルキレン置換基の例には、メチレン、エチレン、トリメチレン、プロピレン、テトラメチレン、イソプロピリデン、ペンタメチレンおよびヘキサメチレンが含まれる。
用語「アルケニレンまたはアルケニル」は、本出願において使用される場合、二重結合を2つの隣接する炭素原子の間に有する不飽和の分岐型または非分岐型の脂肪族の二価置換基である(例えば、アルケニレン置換基は、2個~6個の炭素原子、2個~4個の炭素原子を有する)。したがって、アルケニレン置換基の例には、ビニレン、1-プロペニレン、2-プロペニレン、メチルビニレン、1-ブテニレン、2-ブテニレン、3-ブテニレン、2-メチル-1-プロペニレン、2-メチル-2-プロペニレン、2-ペンテニレン、2-ヘキセニレンが含まれるが、これらに限定されない。
用語「アルキニレンまたはアルキニル」は、本出願において使用される場合、三重結合を2つの隣接する炭素原子の間に有する不飽和の分岐型または非分岐型の脂肪族の二価置換基である(例えば、アルキニレン置換基は、2個~6個の炭素原子、2個~4個の炭素原子を有する)。アルキニレン置換基の例には、エチニレン、1-プロピニレン、1-ブチニレン、2-ブチニレン、1-ペンチニレン、2-ペンチニレン、3-ペンチニレンおよび2-ヘキシニレンが含まれるが、これらに限定されない。
用語「アルカジエニレン」は、本出願において使用される場合、2つの二重結合を2つの隣接する炭素原子の間に有する不飽和の分岐型または非分岐型の脂肪族の二価置換基である(例えば、アルカジエニレン置換基は4個~10個の炭素原子を有する)。したがって、アルカジエニレン置換基の例には、2,4-ペンタジエニレン、2,4-ヘキサジエニレン、4-メチル-2,4-ペンタジエニレン、2,4-ヘプタジエニレン、2,6-ヘプタジエニレン、3-メチル-2,4-ヘキサジエニレン、2,6-オクタジエニレン、3-メチル-2,6-ヘプタジエニレン、2-メチル-2,4-ヘプタジエニレン、2,8-ノナジエニレン、3-メチル-2,6-オクタジエニレン、2,6-デカジエニレン、2,9-デカジエニレンおよび3,7-ジメチル-2,6-オクタジエニレンの各置換基が含まれるが、これらに限定されない。
用語「ヘテロ脂肪族置換基またはヘテロアルキル」は、本明細書中で使用される場合、1つまたは複数の炭素原子がヘテロ原子により、例えば、酸素原子、イオウ原子、窒素原子、リン原子またはケイ素原子により置換されている一価または二価の置換基を示し、但し、この場合、窒素原子およびイオウ原子は場合により酸化される場合があり、また、窒素ヘテロ原子は場合により四級化される場合がある。ヘテロ原子のO、NおよびSは、ヘテロ脂肪族置換基のどのような内部位置においてでも置かれる場合がある。例には、-CH2-CH2-O-CH3、-CH2-CH2-NH-CH3、-CH2-CH2-N(CH3)-CH3、-CH2-S-CH2-CH3、-S(O)-CH3、-CH2-CH2-S(O)2-CH3、-CH=CH-O-CH3、-CH2-CH=N-OCH3および-CH=CH-N(CH3)-CH3が含まれる。ヘテロ脂肪族置換基は線状または分岐型および飽和型または不飽和型である場合がある。
1つの実施形態において、ヘテロ脂肪族置換基は1個~100個(例えば、1個~42個の炭素原子)を有する。さらに別の実施形態において、ヘテロ脂肪族置換基はポリエチレングリコール残基である。
本明細書中で使用される場合、「芳香族置換基またはアリール」は、少なくとも1つの環が芳香族であり、かつ、非置換であってもよい、または置換されていてもよい、10個までの原子をそれぞれの環に有する安定な単環式炭素環、二環式炭素環または多環式炭素環のどのようなものも意味することが意図される。そのような芳香族置換基の例には、フェニル、p-トルエニル(4-メチルフェニル)、ナフチル、テトラヒドロナフチル、インダニル、ビフェニル、フェナントリル、アントリルまたはアセナフチルが含まれる。芳香族置換基が二環式であり、かつ、1つの環が非芳香族である場合には、結合が芳香族環を介してであることが理解される。
用語「アルキルアリール置換基またはアリールアルキル」は、含有される水素への1つまたは複数の結合が、上記で記載されるようないずれかのアリール置換基への結合によって置き換えられる上記で記載されるようなアルキル置換基を示す。アリールアルキル置換基は、アルキル置換基からの結合を介して本発明の化合物におけるカルボニル基につながることが理解される。アリールアルキル置換基の例には、ベンジル(フェニルメチル)、p-トリフルオロメチルベンジル(4-トリフルオロメチルフェニルメチル)、1-フェニルエチル、2-フェニルエチル、3-フェニルプロピルおよび2-フェニルプロピルなどが含まれるが、これらに限定されない。
用語「ヘテロ芳香族置換基またはヘテロアリール」は、本明細書中で使用される場合、少なくとも1つの環が芳香族であり、かつ、O、NおよびSからなる群から選択される1個~4個のヘテロ原子を含有する、10個までの原子をそれぞれの環に有する安定な単環式環、二環式環または多環式環を表す。二環式のヘテロ芳香族置換基には、
a)1個の窒素原子を有する6員の芳香族(不飽和)複素環式環に縮合する、
b)2個の窒素原子を有する5員または6員の芳香族(不飽和)複素環式環に縮合する、c)1個の窒素原子を1個の酸素原子または1個のイオウ原子のどちらかと一緒に有する5員の芳香族(不飽和)複素環式環に縮合する、あるいは
d)O、NおよびSから選択される1個のヘテロ原子を有する5員の芳香族(不飽和)複素環式環に縮合する
フェニル環、ピリジン環、ピリミジン環またはピリジジン(pyrididine)環が含まれる。
a)1個の窒素原子を有する6員の芳香族(不飽和)複素環式環に縮合する、
b)2個の窒素原子を有する5員または6員の芳香族(不飽和)複素環式環に縮合する、c)1個の窒素原子を1個の酸素原子または1個のイオウ原子のどちらかと一緒に有する5員の芳香族(不飽和)複素環式環に縮合する、あるいは
d)O、NおよびSから選択される1個のヘテロ原子を有する5員の芳香族(不飽和)複素環式環に縮合する
フェニル環、ピリジン環、ピリミジン環またはピリジジン(pyrididine)環が含まれる。
この定義の範囲の範囲内であるヘテロアリール基には、下記の基が含まれるが、それらに限定されない:ベンゾイミダゾリル、ベンゾフラニル、ベンゾフラザニル、ベンゾピラゾリル、ベンゾトリアゾリル、ベンゾチオフェニル、ベンゾオキサゾリル、カルバゾリル、カルボリニル、シンノリニル、フラニル、インドリニル、インドリル、インドラジニル、インダゾリル、イソベンゾフラニル、イソインドリル、イソキノリル、イソチアゾリル、イソオキサゾリル、ナフトピリジニル、オキサジアゾリル、オキサゾリル、オキサゾリン、イソオキサゾリン、オキセタニル、ピラニル、ピラジニル、ピラゾリル、ピリダジニル、ピリドピリジニル、ピリダジニル、ピリジル、ピリミジル、ピロリル、キナゾリニル、キノリル、キノキサリニル、テトラゾリル、テトラゾロピリジル、チアジアゾリル、チアゾリル、チエニル、トリアゾリル、アゼチジニル、アジリジニル、1,4-ジオキサニル、ヘキサヒドロアゼピニル、ジヒドロベンゾイミダゾリル、ジヒドロベンゾフラニル、ジヒドロベンゾチオフェニル、ジヒドロベンゾオキサゾリル、ジヒドロフラニル、ジヒドロイミダゾリル、ジヒドロインドリル、ジヒドロイソオキサゾリル、ジヒドロイソチアゾリル、ジヒドロオキサジアゾリル、ジヒドロオキサゾリル、ジヒドロピラジニル、ジヒドロピラゾリル、ジヒドロピリジニル、ジヒドロピリミジニル、ジヒドロピロリル、ジヒドロキノリニル、ジヒドロテトラゾリル、ジヒドロチアジオゾリル、ジヒドロチアゾリル、ジヒドロチエニル、ジヒドロトリアゾリル、ジヒドロアゼチジニル、メチレンジオキシベンゾイル、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロチエニル、アクリジニル、カルバゾリル、シンノリニル、キノキサリニル、ピラゾリル、インドリル、ベンゾトリアゾリル、ベンゾチアゾリル、ベンゾオキサゾリル、イソオキサゾリル、イソチアゾリル、フラニル、チエニル、ベンゾチエニル、ベンゾフラニル、キノリニル、イソキノリニル、オキサゾリル、イソオキサゾリル、インドリル、ピラジニル、ピリダジニル、ピリジニル、ピリミジニル、ピロリル、テトラヒドロキノリン。ヘテロアリール置換基が二環式であり、かつ、1つの環が非芳香族であるか、または、ヘテロ原子を含有しない場合には、結合がそれぞれ、芳香族環を介して、または、ヘテロ原子含有環を介してであることが理解される。ヘテロアリールが窒素原子を含有するならば、対応するそのN-オキシドもまた本発明によって包含されることが理解される。
脂肪族置換基、ヘテロ脂肪族置換基、芳香族置換基およびヘテロ芳香族置換基は場合により、下記の様々な基(これらに限定されない)を含む下記の置換基のいずれか1つまたは複数により1回または複数回、同じようにまたは異なるように置換され得る:脂肪族置換基、ヘテロ脂肪族置換基、芳香族置換基およびヘテロ芳香族置換基、アリール、ヘテロアリール;アルキルアリール;ヘテロアルキルアリール;アルキルヘテロアリール;ヘテロアルキルヘテロアリール;アルコキシ;アリールオキシ;ヘテロアルコキシ;ヘテロアリールオキシ;アルキルチオ;アリールチオ;ヘテロアルキルチオ;ヘテロアリールチオ;F;Cl;Br;I;-OH;-NO2;-CN;-CF3;-CH2CF3;-CHCl2;-CH2OH;-CH2CH2OH;-CH2NH2;-CH2SO2CH3;-C(O)Rx;-CO2(Rx);-CON(Rx)2;-OC(O)Rx;-OCO2Rx;-OCON(Rx)2;-N(RX)2;-S(O)Rx;-S(O)2Rx;-NRx(CO)Rx、但し、これらの式において、Rxのそれぞれの存在には独立して、脂肪族、脂環式、ヘテロ脂肪族、複素環式、芳香族、ヘテロ芳香族、アリール、ヘテロアリール、アルキルアリール、アルキルヘテロアリール、ヘテロアルキルアリールまたはヘテロアルキルヘテロアリールが含まれるが、これらに限定されず、この場合、上記および本明細書中に記載される脂肪族置換基、脂環式置換基、ヘテロ脂肪族置換基、複素環式置換基、アルキルアリール置換基またはアルキルヘテロアリール置換基のいずれもが、置換または非置換で、分岐型または非分岐型で、飽和型または不飽和型であってもよく、また、上記および本明細書中に記載される芳香族置換基、ヘテロ芳香族置換基、アリール置換基、ヘテロアリール置換基、(アルキル)アリール置換基または(アルキル)ヘテロアリール置換基のいずれもが置換または非置換であってもよい。加えて、いずれか2つの隣接する置換基は一緒になって、置換された、または非置換である4員、5員、6員または7員の脂環式置換基または複素環式置換基を表すことがあることが理解されるであろう。一般に適用可能な置換基のさらなる例が、下記に示される具体的な実施形態によって例示される。
用語「ハロ」および用語「ハロゲン」は、F、Cl、BrおよびIからなる群から選択されるハロゲン原子を示す。
用語「ハロゲン化アルキル置換基、ハロアルキル」は、少なくとも1つのハロゲン原子により置換される上記で定義されるようなアルキル置換基を示す。1つの実施形態において、ハロゲン化アルキル置換基はペルハロゲン化される。別の実施形態において、ペルフルオロアルキルは、式CnF2n+1の一価のペルフルオロ化された置換基であるハロゲン化アルキル置換基を示す。例えば、ハロゲン化アルキル置換基は1個~6個の炭素原子(例えば、1個~3個の炭素原子)を有する場合がある。したがって、アルキル基の例には、トリフルオロメチル、2,2,2-トリフルオロエチル、n-ペルフルオロプロピル、n-ペルフルオロブチルおよびn-ペルフルオロペンチルが含まれる。
用語「アミノ」は、本明細書中で使用される場合、-N(RN1)2を表し、但し、式中、それぞれのRN1が独立して、H、OH、NO2、N(RN2)2、SO2ORN2、SO2RN2、SORN2、N-保護基、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、アリール、アルカリール、シクロアルキル、アルクシクロアルキル(alkcycloalkyl)、ヘテロシクリル(例えば、ヘテロアリール)、アルクヘテロシクリル(alkheterocyclyl)(例えば、アルクヘテロアリール(alkheteroaryl))であり、あるいは、2つのRN1が一緒になって、ヘテロシクリルまたはN-保護基を形成し、かつ、それぞれのRN2が独立して、H、アルキルまたはアリールである。好ましい実施形態において、アミノは-NH2または-NHRN1であり、但し、式中、RN1は独立して、OH、NO2、NH2、NRN2
2、SO2ORN2、SO2RN2、SORN2、アルキルまたはアリールであり、それぞれのRN2は、H、アルキルまたはアリールであり得る。用語「アミノアルキル」は、本明細書中で使用される場合、アミノ基(これは本明細書中で定義される通りである)によって置換されるアルキル基(これは本明細書中で定義される通りである)として記載されるヘテロアルキル基(これは本明細書中で定義される通りである)を表す。アルキルおよびアミノはそれぞれがさらに、それぞれの基について本明細書中に記載されるような1つ、2つ、3つまたは4つの置換基により置換され得る。例えば、アルキル部分はオキソ(=O)置換基を含む場合がある。
本明細書中で使用される場合、用語「アリールオキシ」は、酸素原子を介して別の残基につながれる芳香族系またはヘテロ芳香族系を示す。O-アリールの典型的な一例がフェノキシである。同様に、「アリールアルキル」は、炭素鎖(飽和または不飽和)(そのヘテロ形態を含む)を介して、典型的には、飽和であるときにはC1~C8の炭素鎖、C1~C6の炭素鎖、または、より具体的にはC1~C4の炭素鎖もしくはC1~C3の炭素鎖(それらのヘテロ形態を含む)を介して、あるいは、不飽和であるときにはC2~C8の炭素鎖、C2~C6の炭素鎖、C2~C4の炭素鎖またはC2~C3の炭素鎖(それらのヘテロ形態を含む)を介して別の残基につながれる芳香族系またはヘテロ芳香族系を示す。より確かには、したがって、アリールアルキルには、上記において同様に定義されるようなアルキル成分、ヘテロアルキル成分、アルケニル成分、ヘテロアルケニル成分、アルキニル成分またはヘテロアルキニル成分につながれる上記で定義されるようなアリール基またはヘテロアリール基が含まれる。典型的なアリールアルキルには、アリール(C6~C12)アルキル(C1~C8)、アリール(C6~C12)アルケニル(C2~C8)またはアリール(C6~C12)アルキニル(C2~C8)、加えて、それらのヘテロ形態が挙げられるであろう。典型的な一例がフェニルメチルであり、これは一般にはベンジルと呼ばれる。
芳香族基またはヘテロ芳香族基における、必要に応じた典型的な置換基には、ハロ、CN、NO2、CF3、OCF3、COOR’、CONR’2、OR’、SR’、SOR’、SO2R’、NR’2、NR’(CO)R’、NR’C(O)OR’、NR’C(O)NR’2、NR’SO2NR’2またはNR’SO2R’が独立して含まれ、但し、これらにおいて、それぞれのR’は独立して、H、または、アルキル、アルケニル、アルキニル、ヘテロアルキル、ヘテロアルケニル、ヘテロアルキニル、ヘテロアリールおよびアリール(これらのすべてが上記で定義される通りである)から選択される場合により置換された基である;あるいは、置換基は、アルキル、アルケニル、アルキニル、ヘテロアルキル、ヘテロアルケニル、ヘテロアルキニル、アリール、ヘテロアリール、O-アリール、O-ヘテロアリールおよびアリールアルキルから選択される場合により置換された基である。
非芳香族基(例えば、アルキル基、アルケニル基およびアルキニル基)における必要に応じた置換基は典型的には、本明細書中において別途記されるような場合を除いて、芳香族基またはヘテロ芳香族基について好適である置換基の同じリストから選択される。非芳香族基にはまた、=Oおよび=NOR’(式中、R’は、H、または、アルキル、アルケニル、アルキニル、ヘテロアルキル、ヘテロアルケニル、ヘテロアルキニル、ヘテロアリールおよびアリール(これらのすべてが上記で定義される通りである)から選択される場合により置換された基である)から選択される置換基が含まれる場合がある。
一般に、置換基(例えば、アルキル、アルケニル、アルキニルまたはアリール(上記で定義されるすべてのヘテロ形態を含む))は自身が場合により、さらなる置換基によって置換される場合がある。これらの置換基の性質は、上記の基本的構造における置換基に関して列挙される性質と類似している。したがって、ある置換基の1つの実施形態がアルキルである場合、このアルキルは場合により、置換が化学的意味をなし、かつ、置換がアルキル自体のサイズ限界を損なわない置換基として列記される残りの置換基によって置換される場合がある;例えば、アルキルによって、またはアルケニルによって置換されるアルキルは、これらの実施形態については炭素原子の上限を単に拡大するであろうと考えられ、含まれない。しかしながら、アリール、アミノおよびハロなどによって置換されるアルキルは含まれるであろう。例えば、基が置換される場合、当該基は、1つ、2つ、3つ、4つ、5つまたは6つの置換基により置換される場合がある。必要に応じた置換基には、下記の基が含まれるが、それらに限定されない:C1~C6アルキルまたはヘテロアリール、C2~C6アルケニルまたはヘテロアルケニル、C2~C6アルキニルまたはヘテロアルキニル、ハロゲン;アリール、ヘテロアリール、アジド(-N3)、ニトロ(-NO2)、シアノ(-CN)、アシルオキシ(-OC(=O)R’)、アシル(-C(=O)R’)、アルコキシ(-OR’)、アミド(-NR’C(=O)R’’または-C(=O)NRR’)、アミノ(-NRR’)、カルボン酸(-CO2H)、カルボン酸エステル(-CO2R’)、カルバモイル(-OC(=O)NR’R’’または-NRC(=O)OR’)、ヒドロキシ(-OH)、イソシアノ(-NC)、スルホナート(-S(=O)2OR)、スルホンアミド(-S(=O)2NRR’または-NRS(=O)2R’)またはスルホニル(-S(=O)2R)、但し、これらの式において、それぞれのRまたはR’は、H、C1~C6アルキルまたはヘテロアリール、C2~C6アルケニルまたはヘテロアルケニル、2C~6Cアルキニルまたはヘテロアルキニル、アリールまたはヘテロアリールから独立して選択される。置換された基は、例えば、1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、8つまたは9つの置換基を有する場合がある。
用語「ヘテロシクリル、複素環式またはHet」は、本明細書中で使用される場合、別途指定される場合を除き、窒素、酸素およびイオウからなる群から独立して選択される1
個、2個、3個または4個のヘテロ原子を含有する、例えば、3員環、4員環、5員環、6員環または7員環である環状のヘテロアルキルまたはヘテロアルケニルを表す。5員環は0~2つの二重結合を有し、6員環および7員環は0~3つの二重結合を有する。用語「ヘテロシクリル」はまた、1つまたは複数の炭素および/またはヘテロ原子が単環式環の2つの非隣接メンバーを架橋する架橋された多環式構造を有する複素環式化合物を表し、例えば、キヌクリジニル基を表す。用語「ヘテロシクリル」には、上記複素環式環のいずれかが、1つ、2つまたは3つの炭素環式環(例えば、アリール環、シクロヘキサン環、シクロヘキセン環、シクロペンタン環、シクロペンテン環)または別の単環式の複素環式環(例えば、インドリル、キノリル、イソキノリル、テトラヒドロキノリル、ベンゾフリルおよびベンゾチエニルなど)に縮合する二環式基、三環式基および四環式基が含まれる。
個、2個、3個または4個のヘテロ原子を含有する、例えば、3員環、4員環、5員環、6員環または7員環である環状のヘテロアルキルまたはヘテロアルケニルを表す。5員環は0~2つの二重結合を有し、6員環および7員環は0~3つの二重結合を有する。用語「ヘテロシクリル」はまた、1つまたは複数の炭素および/またはヘテロ原子が単環式環の2つの非隣接メンバーを架橋する架橋された多環式構造を有する複素環式化合物を表し、例えば、キヌクリジニル基を表す。用語「ヘテロシクリル」には、上記複素環式環のいずれかが、1つ、2つまたは3つの炭素環式環(例えば、アリール環、シクロヘキサン環、シクロヘキセン環、シクロペンタン環、シクロペンテン環)または別の単環式の複素環式環(例えば、インドリル、キノリル、イソキノリル、テトラヒドロキノリル、ベンゾフリルおよびベンゾチエニルなど)に縮合する二環式基、三環式基および四環式基が含まれる。
本発明の化合物の一部は1つまたは複数のステレオジェン中心を含む可能性があり、したがって、様々な異性形態で、例えば、立体異性体および/またはジアステレオマーで存在する可能性がある。したがって、本発明の化合物およびそれらの医薬組成物は、個々のエナンチオマー、ジアステレオマーまたは幾何異性体の形態である場合があり、あるいは、立体異性体の混合物の形態である場合がある。特定の実施形態において、本発明の化合物はエナンチオピュアな化合物である。特定の他の実施形態において、立体異性体またはジアステレオマーの混合物が提供される。そのうえ、本発明の化合物が互変異性形態で存在するとき、それぞれの互変異性体が本明細書中では包含される。
さらに、特定の化合物が、本明細書中に記載されるように、別途示される場合を除き、Z異性体またはE異性体のどちらかとして存在し得る1つまたは複数の二重結合を有する場合がある。本発明はさらに、化合物を、他の異性体を実質的に含まない個々の異性体として、また、代替では、様々な異性体の混合物として、例えば、立体異性体のラセミ混合物として包含する。上述の化合物自体に加えて、本発明はまた、これらの化合物の医薬的に許容される誘導体、および、本発明の1つまたは複数の化合物と、1つまたは複数の医薬的に許容される賦形剤または添加剤とを含む組成物を包含する。
処置方法
本明細書中に開示されるように、miR-1908、miR-199a-3p、miR-199a-5pおよびCTGFが、メラノーマにおいて転移性浸潤、内皮動員およびコロニー形成の内因性の転移促進因子として特定され、一方、DNAJA4、ApoE、LRP1、LRP8、LXRおよびmiR7が、同じプロセスの転移抑制因子または転移阻害剤として機能する。加えて、これらのmiRNAがApoEおよび熱ショック因子DNAJA4を収斂的に標的化することが見出された。ガンにより分泌されるApoEは、浸潤および内皮動員を、メラノーマ細胞のLRP1受容体および内皮細胞のLRP8受容体を活性化することによってそれぞれ抑制する。DNAJA4はその結果として、ApoE発現を誘導する。これらのmiRNAは、ヒトでの転移の結末が強く予測するものである。miR-199a-3p、miR-199a-5pおよびmiR-1908を標的化するロックド核酸(LNA)による前処置では、多数の器官への転移が阻害され、一方、これらのLNAの治療的送達では、マウスモデルにおけるヒトメラノーマ細胞の転移が著しく抑制される。
本明細書中に開示されるように、miR-1908、miR-199a-3p、miR-199a-5pおよびCTGFが、メラノーマにおいて転移性浸潤、内皮動員およびコロニー形成の内因性の転移促進因子として特定され、一方、DNAJA4、ApoE、LRP1、LRP8、LXRおよびmiR7が、同じプロセスの転移抑制因子または転移阻害剤として機能する。加えて、これらのmiRNAがApoEおよび熱ショック因子DNAJA4を収斂的に標的化することが見出された。ガンにより分泌されるApoEは、浸潤および内皮動員を、メラノーマ細胞のLRP1受容体および内皮細胞のLRP8受容体を活性化することによってそれぞれ抑制する。DNAJA4はその結果として、ApoE発現を誘導する。これらのmiRNAは、ヒトでの転移の結末が強く予測するものである。miR-199a-3p、miR-199a-5pおよびmiR-1908を標的化するロックド核酸(LNA)による前処置では、多数の器官への転移が阻害され、一方、これらのLNAの治療的送達では、マウスモデルにおけるヒトメラノーマ細胞の転移が著しく抑制される。
したがって、本発明は、メラノーマを、転移抑制因子の1つの発現レベルまたは活性レベルを対象において増大させることを介して処置するための方法を提供する。この増大させることが、とりわけ、転移抑制因子であるDNAJA4、ApoE、LRP1およびLRP8の1つまたは複数の強制された発現によって、あるいは、miR-199a-3p、miR-199a-5pおよびmiR-1908の1つまたは複数の発現レベルまたは活性レベルを低下させることによって達成することができる。加えて、処置を、転移促進因子の1つまたは複数の発現レベルまたは活性レベルを低下させることによって達成することができる。
本発明はまた、血管形成性の障害または血管形成の障害を対象において処置するための方法を提供する。用語「血管形成性の障害」、用語「血管形成の障害」および用語「血管形成障害」は本明細書中では交換可能に使用され、病理学的な血管形成によって特徴づけられる障害を示す。病理学的な血管形成によって特徴づけられる障害は、正常でない血管形成または正常から外れた血管形成が単独で、または他との組合せで、当該障害の原因、開始または症状の一因となる障害を示す。この障害の例には、様々なガン(例えば、血管形成した腫瘍)、眼障害および炎症性障害など含まれる。
上記方法により処置することができる典型的な血管形成した腫瘍には、酸素および栄養分を提供するために血管成分を要求する固形腫瘍(特にガン腫)が含まれる。例示的な固形腫瘍には、肺、乳房、骨、卵巣、胃、膵臓、咽頭、食道、精巣、肝臓、耳下腺、胆道、結腸、直腸、子宮頸部、子宮、子宮内膜、腎臓、膀胱、前立腺、甲状腺のガン腫、扁平上皮ガン、腺ガン、小細胞ガン腫、メラノーマ、神経膠腫、神経膠芽細胞腫、神経芽細胞腫、カポジ肉腫および肉腫が含まれるが、これらに限定されない。
ガン以外の多くの障害または状態もまた、上記の方法により処置することができる。例には、関節炎、関節リウマチ、乾癬、アテローム性動脈硬化、糖尿病性網膜症、加齢性黄斑変性、グレーブス病、血管再狭窄(血管形成術後の再狭窄を含む)、動静脈奇形(AVM)、髄膜腫、血管腫、血管新生緑内障、慢性腎臓疾患、糖尿病性腎症、多発性嚢胞腎疾患、間質性肺疾患、肺高血圧症、慢性閉塞性肺疾患(COPD)、気腫、自己免疫性肝炎、慢性炎症性肝臓疾患、肝硬変、皮膚T細胞リンパ腫、酒さおよび基底細胞ガンが含まれる。
他の処置標的には、例えば、米国特許出願公開第2009004297号、同第20090175791号および同第20070161553号に記載されるものが含まれ、例えば、血管線維腫、アテローム斑、角膜移植血管新生、血友病性関節、肥厚性瘢痕、オスラー・ウェーバー症候群、化膿性肉芽腫、後水晶体線維増殖症、強皮症、トラコーマ、血管癒着、滑膜炎、皮膚炎、様々な他の炎症性疾患および炎症性障害、ならびに、子宮内膜症などが含まれる。
転移抑制因子の強制発現
上述の転移抑制因子のポリペプチド(例えば、DNAJA4、ApoE、LRP1、LRP8およびLXR)と、これらのポリペプチドをコードする核酸との両方を、本発明を実施するために使用することができる。多くのポリペプチド調製物を使用することができるが、高度に精製または単離されたポリペプチドが好ましい。用語「ペプチド」、用語「ポリペプチド」および用語「タンパク質」は、ポリマーでのアミノ酸残基の配列を記載するために本明細書中では交換可能に使用される。ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質は、希なアミノ酸および合成されたアミノ酸アナログに加えて、標準的な20個の天然に存在するアミノ酸から構成され得る。ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質は、長さまたは翻訳後修飾(例えば、グリコシル化またはリン酸化)にかかわらず、アミノ酸のどのような鎖でも可能である。
上述の転移抑制因子のポリペプチド(例えば、DNAJA4、ApoE、LRP1、LRP8およびLXR)と、これらのポリペプチドをコードする核酸との両方を、本発明を実施するために使用することができる。多くのポリペプチド調製物を使用することができるが、高度に精製または単離されたポリペプチドが好ましい。用語「ペプチド」、用語「ポリペプチド」および用語「タンパク質」は、ポリマーでのアミノ酸残基の配列を記載するために本明細書中では交換可能に使用される。ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質は、希なアミノ酸および合成されたアミノ酸アナログに加えて、標準的な20個の天然に存在するアミノ酸から構成され得る。ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質は、長さまたは翻訳後修飾(例えば、グリコシル化またはリン酸化)にかかわらず、アミノ酸のどのような鎖でも可能である。
「本発明の」ポリペプチドには、ネットワークに関与する特定のドメインまたは部分を有する、上述の転移抑制因子のいずれかの組換えまたは合成により製造された融合体またはキメラ体が含まれる。この用語はまた、(原核生物細胞における発現のために有用である)付加されたアミノ末端メチオニンを有するポリペプチドを包含する。
本発明の範囲内には、上述の配列の1つまたは複数と、異種の配列とを含有する融合タンパク質が含まれる。「キメラ(な)」または「融合」は、異なる起源のアミノ酸配列が、それらのコードするヌクレオチド配列の読み枠を合わせた組合せによって1つのポリペプチド鎖において組み合わされていることを示す。この用語は明示的に、内部融合体、すなわち、ポリペプチド鎖内における異なる起源の配列の挿入を、その末端の一方に対する融合に加えて包含する。異種のポリペプチド、核酸または遺伝子は、異物種に由来するものであり、または、同じ種に由来するならば、その元の形態から実質的に改変される。2つの融合されたドメインまたは配列は、天然に存在するタンパク質または核酸において互いに隣接していないならば、互いに異種である。
「単離された」または「精製された」ポリペプチドは、自然界で会合する他のタンパク質、脂質および核酸から分離されているポリペプチドを示す。ポリペプチドは、精製された調製物の乾燥重量比で少なくとも10%(すなわち、10%~100%の間におけるいかなる割合も、例えば、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%および99%)を構成することができる。純度を、どのような方法であれ、適切な標準的方法によって測定することができ、例えば、カラムクロマトグラフィー分析、ポリアクリルアミドゲル電気泳動分析またはHPLC分析によって測定することができる。本発明において記載される単離されたポリペプチドは天然源から精製することができ、組換えDNA技術によって、または、化学的方法によって製造することができる。
「組換え」ポリペプチドは、組換えDNA技術によって製造されるポリペプチド、すなわち、所望されるポリペプチドをコードする外因性DNA構築物によって形質転換される細胞から産生されるポリペプチドを示す。「合成」ポリペプチドは、化学的合成によって調製されるポリペプチドを示す。用語「組換え」は、例えば、細胞、核酸、タンパク質またはベクターに関連して使用されるときには、細胞、核酸、タンパク質またはベクターが、異種の核酸もしくはタンパク質の導入によって、または、生来的な核酸もしくはタンパク質の変化によって改変されていること、あるいは、細胞が、そのように改変された細胞に由来することを示す。
「過剰発現」は、宿主細胞に導入された核酸によってコードされるRNAまたはポリペプチドの発現を示し、但し、この場合、そのようなRNAまたはポリペプチドまたはタンパク質は通常の場合には宿主細胞に存在していないか、あるいは、そのようなRNAまたはポリペプチドが、当該RNAまたはポリペプチドをコードする内因性遺伝子から通常の場合に発現されるレベルよりも高いレベルで前記宿主細胞に存在するかのどちらかである。
上述のポリペプチドのそれぞれのアミノ酸組成は、それらの機能を妨害することなく、すなわち、上述のネットワークをアップレギュレーションし(例えば、ApoE/LRPシグナル伝達経路の活性化レベルを増大させ)、それにより、多数の器官への転移を阻害することができることを妨害することなく変化する場合がある。例えば、アミノ酸組成は1つまたは複数の保存的なアミノ酸置換を含有することができる。「保存的なアミノ酸置換」は、アミノ酸残基が、類似する側鎖を有するアミノ酸残基により置き換えられるアミノ酸置換である。類似する側鎖を有するアミノ酸残基の様々な集団がこの技術分野において定義されている。これらの集団には、塩基性側鎖を有するアミノ酸(例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン)、酸性側鎖を有するアミノ酸(例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸)、非荷電の極性側鎖を有するアミノ酸(例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン)、非極性側鎖を有するアミノ酸(例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン)、β-分岐した側鎖を有するアミノ酸(例えば、トレオニ
ン、バリン、イソロイシン)、および、芳香族側鎖を有するアミノ酸(例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン)が含まれる。したがって、上記ポリペプチド(例えば、配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号8、配列番号10、配列番号12、配列番号14、配列番号16および配列番号18)の1つにおける予測された非必須アミノ酸残基が好ましくは、同じ側鎖集団からの別のアミノ酸残基により置き換えられる。代替では、変異を、例えば、飽和変異誘発などによって配列の全体または一部に沿ってランダムに導入することができ、得られた変異体を、上述のネットワークまたはApoE/LRPシグナル伝達経路をアップレギュレーションすることができ、また、下記において実施例に記載されるように活性を保持する変異体を特定するためにそれぞれの細胞応答を誘発することができるかについてスクリーニングすることができる。
ン、バリン、イソロイシン)、および、芳香族側鎖を有するアミノ酸(例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン)が含まれる。したがって、上記ポリペプチド(例えば、配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号8、配列番号10、配列番号12、配列番号14、配列番号16および配列番号18)の1つにおける予測された非必須アミノ酸残基が好ましくは、同じ側鎖集団からの別のアミノ酸残基により置き換えられる。代替では、変異を、例えば、飽和変異誘発などによって配列の全体または一部に沿ってランダムに導入することができ、得られた変異体を、上述のネットワークまたはApoE/LRPシグナル伝達経路をアップレギュレーションすることができ、また、下記において実施例に記載されるように活性を保持する変異体を特定するためにそれぞれの細胞応答を誘発することができるかについてスクリーニングすることができる。
本発明のポリペプチドの機能的等価体は、当該ポリペプチドの誘導体、例えば、1つまたは複数の点変異、挿入、欠失、短縮化、融合タンパク質、あるいは、それらの組合せを有するタンパク質を示す。機能的等価体は上述のポリペプチドの活性を実質的に保持する。本発明の単離されたポリペプチドは、配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号8、配列番号10、配列番号12、配列番号14、配列番号16および配列番号18の1つの配列あるいはその機能的な等価体またはフラグメントを含有することができる。一般に、機能的等価体は、配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号8、配列番号10、配列番号12、配列番号14、配列番号16および配列番号18の1つに対して少なくとも75%(例えば、75%~100%の間におけるいかなる数字も、例えば、70%、80%、85%、90%、95%および99%を含む)の同一性である。
本発明において記載されるポリペプチドは組換えポリペプチドとして得ることができる。組換えポリペプチドを調製するために、当該ポリペプチドをコードする核酸を、融合パートナー(例えば、グルタチオン-s-トランスフェラーゼ(GST)、6×-HisエピトープタグまたはM13遺伝子3タンパク質)をコードする別の核酸に連結することができる。得られた融合核酸は、この技術分野において知られている方法によって単離することができる融合タンパク質を好適な宿主細胞において発現する。単離された融合タンパク質は、融合パートナーを除き、かつ、本発明の組換えポリペプチドを得るために、例えば、酵素消化によってさらに処理することができる。代替では、本発明のポリペプチドは化学合成することができる(例えば、Creighton、“Proteins:Structures and Molecular Principles”(W.H.Freeman & Co.、NY、1983)を参照のこと)。さらなる指針について、当業者は、Ausubel他(Current Protocols in Molecular Biology and Short Protocols in Molecular Biology、第3版、1987&1995)、Sambrook他(Molecular Cloning,A Laboratory Manual、Cold
Spring Harbor Press、Cold Spring Harbor、NY、1989)、および、chemical synthesis、Gait,M.J.編(Oligonucleotide Synthesis、IRL Press、Oxford、1984)を調べる場合がある。
Spring Harbor Press、Cold Spring Harbor、NY、1989)、および、chemical synthesis、Gait,M.J.編(Oligonucleotide Synthesis、IRL Press、Oxford、1984)を調べる場合がある。
細胞タンパク質または膜タンパク質としてのそれらの機能のために、DNAJA4、LRP1、LRP8およびLXRは、細胞透過性ペプチド(CPP)配列を含むアミノ酸配列の1つまたは複数および同様のものと連係させることができ、例えば、それらに対してコンジュゲート化または融合することができる。このようにして、下記で議論されるような本発明の組成物は輸送エンハンサーを含むことができる。細胞透過性ペプチド(CPP)は一般に、30個未満のアミノ酸からなり、正味の正荷電を有する。様々なCPPが、エンドサイトーシス様式または受容体/エネルギー非依存的様式で生体動物細胞において内部移行する。いくつかのクラスのCPPが、完全にタンパク質由来のCPPから、キメラCPPを介して、完全に合成的なCPPにまで様々な起源とともに存在する。様々なCPPの例がこの技術分野において知られている。例えば、米国特許出願公開第20090099066号および同第20100279918号を参照のこと。CPPは外因性タンパク質を様々な細胞の中に送達できることが知られている。
上述のポリペプチドの天然に存在する形態、遺伝子操作された形態および化学合成された形態のすべてが、それらに開示される発明を実施するために使用され得る。組換えDNA技術によって得られるポリペプチドは、天然に存在する形態(例えば、配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号8、配列番号10、配列番号12、配列番号14、配列番号16および配列番号18の1つ)またはその機能的等価体と同じアミノ酸配列を有する場合がある。それらにはまた、化学的に改変された形態が含まれる。化学的に改変されたポリペプチドの例には、立体配座変化、側鎖の付加または欠失を受けるポリペプチド、および、ポリエチレングリコールなどの化合物が結合しているポリペプチドが含まれる。精製され、標準的方法によって、あるいは、下記において実施例に記載される方法、または、この技術分野において知られている他の方法に従って試験されると、ポリペプチドは好適な組成物に含ませることができる。
上述の因子を発現させるために、本発明は、上記で述べられるポリペプチドのいずれかをコードする核酸を提供する。好ましくは、ヌクレオチド配列は単離され、かつ/または精製される。核酸は、DNA分子(例えば、cDNAまたはゲノムDNA、これらに限定されない)、RNA分子(例えば、mRNA、これに限定されない)、あるいは、DNAアナログまたはRNAアナログを示す。DNAアナログまたはRNAアナログをヌクレオチドアナログから合成することができる。核酸分子は一本鎖または二本鎖であることが可能である。「単離された核酸」は、構造が、どのような天然に存在する核酸の構造とも、または、天然に存在するゲノム核酸のどのようなフラグメントの構造とも同一でない核酸である。したがって、この用語は、例えば、下記のものを包含する:(a)天然に存在するゲノムDNA分子の一部の配列を有し、しかし、当該分子が自然界で存在する生物のゲノムにおいて当該分子のそのような一部の両側に位置するコード配列の両方が側面に配置されないDNA;(b)得られた分子がどのような天然に存在するベクターまたはゲノムDNAとも同一でないような様式でベクターに、あるいは、原核生物または真核生物のゲノムDNAに組み込まれる核酸;(c)cDNA、ゲノムフラグメント、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によってもたらされるフラグメント、または、制限フラグメントなどの別個の分子;および(d)ハイブリッド遺伝子、すなわち、融合タンパク質をコードする遺伝子の一部である組換えヌクレオチド配列。
用語「RNA」、用語「RNA分子」および用語「リボ核酸分子」は本明細書中では交換可能に使用され、リボヌクレオチドのポリマーを示す。用語「DNA」または用語「DNA分子」または用語「デオキシリボ核酸分子」は、デオキシリボヌクレオチドのポリマーを示す。DNAおよびRNAは自然界で合成され得る(例えば、DNA複製またはDNAの転写によってそれぞれ合成され得る)。RNAは転写後修飾され得る。DNAおよびRNAはまた、化学合成することができる。DNAおよびRNAは一本鎖であることが可能であり(すなわち、それぞれ、ssRNAおよびssDNA)、または、多重鎖であることが可能である(例えば二重鎖、すなわち、それぞれ、dsRNAおよびdsDNA)。
本発明はまた、本明細書中に記載されるヌクレオチド配列の1つまたは複数を有する組換え構築物を提供する。そのような構築物の例には、本発明の核酸配列が順方向配向または逆方向配向で挿入されているベクター(例えば、プラスミドまたはウイルスベクターなど)が含まれる。好ましい実施形態において、構築物はさらに、配列に作動可能に連結されるプロモーターを含めて、様々な調節配列を含む。非常に多数の好適なベクターおよび
プロモーターが当業者に知られており、また、市販されている。原核生物宿主および真核生物宿主との使用のための適切なクローニングベクターおよび発現ベクターもまた、Sambrook他(2001、Molecular Cloning:A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Press)に記載されている。
プロモーターが当業者に知られており、また、市販されている。原核生物宿主および真核生物宿主との使用のための適切なクローニングベクターおよび発現ベクターもまた、Sambrook他(2001、Molecular Cloning:A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Press)に記載されている。
発現ベクターの例には、染色体DNA配列、非染色体DNA配列および合成DNA配列が含まれ、例えば、シミアンウイルス40(SV40)の誘導体、細菌プラスミド、ファージDNA、バキュロウイルス、酵母プラスミド、プラスミドおよびファージDNAの組合せに由来するベクター、ウイルスDNA(例えば、ワクシニア、アデノウイルス、鶏痘ウイルスおよび仮性狂犬病など)が含まれる。しかしながら、どのような他のベクターも、宿主において複製可能であり、かつ、存続可能である限り、使用される場合がある。適切な核酸配列が、様々な手順によってベクターに挿入される場合がある。一般には、上記で記載されるポリペプチドの1つをコードする核酸配列をこの技術分野において知られている手順によって適切な制限エンドヌクレアーゼ部位に挿入することができる。そのような手順および関連したサブクローニング手順は当業者の範囲内である。
上述の発現ベクターにおける核酸配列は好ましくは、mRNA合成を導くための適切な転写制御配列(プロモーター)に作動可能に連結される。そのようなプロモーターの例には、レトロウイルスの長末端(LTR)またはSV40プロモーター、大腸菌のlacプロモーターまたはtrpプロモーター、ファージラムダのPLプロモーター、および、遺伝子の発現を原核細胞または真核生細胞あるいはウイルスにおいて制御することが知られている他のプロモーターが含まれる。発現ベクターはまた、翻訳開始のためのリボソーム結合部位、および、転写ターミネーターを含有することができる。ベクターは、発現を増幅するための適切な配列を含む場合がある。加えて、発現ベクターは好ましくは、1つまたは複数の選択マーカー遺伝子を、形質転換された宿主細胞を選抜するための表現型形質を提供するために含有する(例えば、真核生物細胞培養物のためのジヒドロ葉酸レダクターゼまたはネオマイシン抵抗性など、あるいは、大腸菌におけるテトラサイクリン抵抗性またはアンピシリン抵抗性など)。
上記で記載されるような適切な核酸配列、同様にまた、適切なプロモーター配列または制御配列を含有するベクターは、適切な宿主細胞を形質転換して、宿主に、上記で記載されるポリペプチドを発現させることを可能にするために用いることができる。そのようなベクターは遺伝子治療において使用することができる。好適な発現宿主の例には、細菌細胞(例えば、大腸菌、ストレプトミセス属、ネズミチフス菌(Salmonella typhimurium))、真菌細胞(酵母)、昆虫細胞(例えば、ショウジョウバエおよびヨトウガ(Spodoptera frugiperda)(Sf9))、動物細胞(例えば、CHO、COSおよびHEK293)、アデノウイルスおよび植物細胞が含まれる。適切な宿主の選択は当業者の範囲内である。いくつかの実施形態において、本発明は、上述のポリペプチドを、これらのポリペプチドの1つをコードするヌクレオチド配列を有する発現ベクターにより宿主細胞をトランスフェクションすることによって製造するための方法を提供する。宿主細胞はその後、ポリペプチドの発現を考慮する適切な条件のもとで培養される。
転移促進因子の発現レベルまたは活性レベルを低下させること
上記で述べられるように、miR-199a-3p、miR-199a-5p、miR-1908またはCTGFの発現レベルまたは活性レベルを低下させる阻害性薬剤を、メラノーマを処置する際に使用することができる。阻害性薬剤(すなわち、阻害剤)は、核酸、ポリペプチド、抗体または小分子化合物であることが可能である。一例において、阻害剤は、転写、mRNA安定性、翻訳、タンパク質安定性/分解、タンパク質修飾および
タンパク質結合のレベルにおいて機能する。
上記で述べられるように、miR-199a-3p、miR-199a-5p、miR-1908またはCTGFの発現レベルまたは活性レベルを低下させる阻害性薬剤を、メラノーマを処置する際に使用することができる。阻害性薬剤(すなわち、阻害剤)は、核酸、ポリペプチド、抗体または小分子化合物であることが可能である。一例において、阻害剤は、転写、mRNA安定性、翻訳、タンパク質安定性/分解、タンパク質修飾および
タンパク質結合のレベルにおいて機能する。
核酸阻害剤は、上述の遺伝子の1つまたは複数(例えば、CTGF)を標的化し、その発現または活性を阻害する小さい干渉RNA(例えば、RNAi剤)をコードすることができる。用語「RNAi剤」は、RNA干渉を導くために標的RNAに対する十分な配列相補性を有するRNAまたはそのアナログを示す。例にはまた、そのようなRNAを作製するために使用することができるDNAも含まれる。RNA干渉(RNAi)は、標的分子(例えば、標的である遺伝子、タンパク質またはRNA)がダウンレギュレーションされる配列特異的または配列選択的なプロセスを示す。一般に、干渉性RNA(「iRNA」)は、特定のmRNAの触媒的分解をもたらし、かつ、遺伝子発現を低下させるために、または阻害するためにもまた使用することができる二本鎖の短い干渉性RNA(siRNA)、短いヘアピンRNA(shRNA)または一本鎖のマイクロRNA(miRNA)である。
用語「短い干渉性RNA」または用語「siRNA」(これらはまた、「小さい干渉性RNA」として知られている)は、長さが約10ヌクレオチド~50ヌクレオチドであり、好ましくは長さが約15ヌクレオチド~25ヌクレオチドの間であり、より好ましくは長さが約17ヌクレオチド、18ヌクレオチド、19ヌクレオチド、20ヌクレオチド、21ヌクレオチド、22ヌクレオチド、23ヌクレオチド、24ヌクレオチドまたは25ヌクレオチドであり、鎖が場合により、例えば、1個、2個または3個の突出ヌクレオチド(またはヌクレオチドアナログ)を含む突出端を有するRNA薬剤(好ましくは、二本鎖の薬剤)で、RNA干渉を導くことができるか、または媒介することができるものを示す。天然に存在するsiRNAは、より長いdsRNA分子(例えば、長さが25ヌクレオチドを超える)から細胞のRNAi装置(例えば、ダイサーまたはそのホモログ)によって生じる。
用語「miRNA」または用語「マイクロRNA」は、長さが約10ヌクレオチド~50ヌクレオチドである、好ましくは長さが約15ヌクレオチド~25ヌクレオチドの間である、より好ましくは長さが約17ヌクレオチド、18ヌクレオチド、19ヌクレオチド、20ヌクレオチド、21ヌクレオチド、22ヌクレオチド、23ヌクレオチド、24ヌクレオチドまたは25ヌクレオチドであるRNA薬剤(好ましくは、二本鎖の薬剤)で、RNA干渉を導くことができるか、または媒介することができるものを示す。天然に存在するmiRNAは、ステム・ループ前駆体RNA(すなわち、プレ-miRNA)からダイサーによって生じる。用語「ダイサー」には、本明細書中で使用される場合、ダイサー、同様にまた、dsRNA構造体を、siRNA、miRNA、siRNA様分子またはmiRNA様分子にプロセシングすることができるどのようなダイサーオルソログまたはダイサーホモログも含まれる。マイクロRNA(または「miRNA」)の用語は、天然に存在するマイクロRNA(または「miRNA」が(例えば、発達期間中に)一時的な様式で発現されることが見出されているという事実に基づいて、用語「小さい一時的RNA」(または「stRNA」)と交換可能に使用される。
用語「shRNA」は、本明細書中で使用される場合、相補的配列の第1の領域および第2の領域を含む、ステム・ループ構造を有するRNA薬剤を示し、但し、この場合、これらの領域の相補性の程度および配向が、塩基対形成がこれらの領域の間において生じるように十分であり、第1の領域および第2の領域がループ領域によってつながれ、ループが、ループ領域内のヌクレオチド(またはヌクレオチドアナログ)の間での塩基対形成がないことから生じる。
本発明の範囲内には、RNA分子の分解(例えば、細胞内での分解)を特徴とするRNAiの利用が含まれる。分解が、酵素的なRNA誘導サイレンシング複合体(RISC)
によって触媒される。RNAiを導くために標的RNA配列(例えば、上述のCTGF遺伝子)に対して十分に相補的である配列を有するRNA薬剤は、当該RNA薬剤が、標的RNA配列に対して少なくとも50%の相同性(例えば、50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%、99%または100%の相同性)を有し、その結果、これら2つが、ハイブリダイゼーションし、かつ、標的RNAの破壊をRNAi装置(例えば、RISC複合体)またはRNAiプロセスによって誘発するために互いに十分に相補的であることを意味する。“RNAiを導くために標的RNA配列に対して十分に相補的である配列”を有するRNA薬剤はまた、当該RNA薬剤が、標的RNAの翻訳阻害をRNAi装置またはRNAiプロセスによって誘発するのに十分である配列を有することを意味する。RNA薬剤はまた、標的DNA配列がクロマチンにより沈黙させられるように、標的DNA配列によってコードされる標的RNAに対して十分に相補的である配列を有することができる。別の言い方をすれば、RNA薬剤は、転写型遺伝子サイレンシングを誘導するために、例えば、遺伝子発現を、例えば、クロマチンの構造的変化を標的DNA配列またはその近くにおいて誘導することによって標的DNA配列またはその近くにおいてダウンレギュレーションするのに十分である配列を有する。
によって触媒される。RNAiを導くために標的RNA配列(例えば、上述のCTGF遺伝子)に対して十分に相補的である配列を有するRNA薬剤は、当該RNA薬剤が、標的RNA配列に対して少なくとも50%の相同性(例えば、50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%、99%または100%の相同性)を有し、その結果、これら2つが、ハイブリダイゼーションし、かつ、標的RNAの破壊をRNAi装置(例えば、RISC複合体)またはRNAiプロセスによって誘発するために互いに十分に相補的であることを意味する。“RNAiを導くために標的RNA配列に対して十分に相補的である配列”を有するRNA薬剤はまた、当該RNA薬剤が、標的RNAの翻訳阻害をRNAi装置またはRNAiプロセスによって誘発するのに十分である配列を有することを意味する。RNA薬剤はまた、標的DNA配列がクロマチンにより沈黙させられるように、標的DNA配列によってコードされる標的RNAに対して十分に相補的である配列を有することができる。別の言い方をすれば、RNA薬剤は、転写型遺伝子サイレンシングを誘導するために、例えば、遺伝子発現を、例えば、クロマチンの構造的変化を標的DNA配列またはその近くにおいて誘導することによって標的DNA配列またはその近くにおいてダウンレギュレーションするのに十分である配列を有する。
上述のポリヌクレオチドは、この技術分野において知られているポリマー状の生分解性マイクロ粒子送達デバイスまたは生分解性マイクロカプセル送達デバイスを使用して送達することができる。ポリヌクレオチドの取り込みを達成するための別の方法が、リポソーム(これは標準的な方法によって調製される)を使用することである。ポリヌクレオチドはこれらの送達ビヒクルに単独で組み込むことができ、または、組織特異的な抗体とともに共組み込みすることができる。代替では、静電力または共有結合力によってポリ-L-リシンに結合するプラスミドまたは他のベクターから構成される分子コンジュゲートを調製することができる。ポリ-L-リシンは、標的細胞上の受容体に結合することができるリガンドに結合する(Cristiano他、1995、J.Mol.Med.、73:479)。代替では、組織特異的な標的化を、この技術分野において知られている組織特異的な転写調節エレメントの使用によって達成することができる。筋肉内部位、皮内部位または皮下部位へのネイクドDNAの送達(すなわち、送達ビヒクルを伴わない送達)は、インビボ発現を達成するための別の手段である。
siRNA分子、miRNA分子およびasRNA(アンチセンスRNA)分子をこの技術分野において広く知られている方法によって設計することができる。どのようなRNAであれ、RNAを一意的に分解するために要求される配列特異性を提供するために十分である相同性を有するsiRNA分子、miRNA分子およびasRNA分子を、AMBION,Inc.およびDHARMACON,Inc.のためのウエブサイトにおいて維持されるプログラム(これらに限定されない)を含めて、この技術分野において知られている様々なプログラムを使用して設計することができる。そのようなsiRNA配列、miRNA配列およびasRNA配列を最適化するための、いくつかの設計された化学種の体系的な試験を、当業者によって常法的に行うことができる。短い干渉性核酸分子を設計するときの検討事項には、生物物理学的、熱力学的および構造的な検討事項、センス鎖における特定の位置における塩基好み、ならびに、相同性が含まれるが、これらに限定されない。これらの検討事項は、この技術分野において広く知られているものであり、これらにより、上述のRNA分子を設計するための指針が提供される。
本発明のアンチセンスポリヌクレオチド(好ましくはDNA)は、上述のネットワークの成分をコードする遺伝子の塩基配列に対して相補的であるか、または実質的に相補的である塩基配列を有する限り、どのようなアンチセンスポリヌクレオチドでもあることが可能である。塩基配列は、ポリペプチドをコードする遺伝子の相補体に対して、少なくとも約70%、80%、90%または95%の相同性であることが可能である。これらのアンチセンスDNAは、DNA合成機を使用して合成することができる。
本発明のアンチセンスDNAは、変化させた、または改変された糖、塩基または連結を含有する場合がある。アンチセンスDNA、同様にまた、上記で述べられるRNAi薬剤はまた、特殊化された形態で、例えば、リポソーム、微小球体などの形態で提供される場合があり、または、遺伝子治療に適用される場合があり、または、結合した成分との組合せで提供される場合がある。そのような結合した成分には、リン酸骨格の電荷中和剤として作用するポリカチオン(例えば、ポリリシンなど)、あるいは、細胞膜との相互作用を強化するか、または、核酸の取り込みを増大させる疎水性成分(例えば、脂質(例えば、リン脂質、コレステロールなど)など)が含まれる。結合させられる脂質の好ましい例が、コレステロールまたはその誘導体(例えば、クロロギ酸コレステリル、コール酸など)である。これらの成分は、核酸にその3’末端または5’末端において結合させられる場合があり、また、塩基、糖または分子間ヌクレオシド連結を介して核酸に結合させられる場合もある。他の成分が、ヌクレアーゼ(例えば、エキソヌクレアーゼ、RNaseなど)による分解を防止するために核酸の3’末端または5’末端に特異的に置かれるキャッピング基である場合がある。そのようなキャッピング基には、グリコール(例えば、ポリエチレングリコールおよびテトラエチレングリコールなど)を含めて、この技術分野において知られている様々なヒドロキシル保護基が含まれるが、これらに限定されない。アンチセンスDNAの阻害作用を、細胞株または動物に基づく本発明の遺伝子発現系をインビボおよびインビトロにおいて使用して調べることができる。
上記で述べられるポリペプチドの1つまたは複数あるいはRNAi薬剤をコードする上記で議論された核酸は、インビトロまたはインビボにおいて細胞に送達するためのベクターにクローン化することができる。インビボでの使用のために、送達は特定の組織または器官(例えば、皮膚)を標的化することができる。標的化された送達では、特定の器官または組織に全身投与後に標的化されるベクター(例えば、器官ホーミングペプチド)の使用が伴う。例えば、ベクターは、アビジンと、肝臓特異的タンパク質に対するモノクローナル抗体との共有結合コンジュゲートを有することができる。
いくつかのある特定の実施形態において、本発明は、上述の転移抑制因子をインビボ発現させるための方法を提供する。そのような方法では、その治療効果が、上記因子のいずれかをコードする核酸配列を、内皮動員、ガン細胞浸潤または転移性血管形成を阻害することを必要とするヒトまたは非ヒト動物の細胞または組織に導入することによって達成されるであろう。核酸配列の送達を、組換え発現ベクター(例えば、キメラウイルスなど)またはコロイド状分散物系を使用して達成することができる。核酸配列の治療的送達のために好ましいものが、標的化されたリポソームの使用である。
本明細書中に開示される遺伝子治療のために利用することができる様々なウイルスベクターには、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス(AAV)、ヘルペスウイルス、ワクシニア、または、好ましくはRNAウイルス(例えば、レトロウイルスおよびレンチウイルスなど)が含まれる。好ましくは、レトロウイルスベクターは、レンチウイルス、あるいは、マウスまたはトリのレトロウイルスの誘導体である。ただ1つだけの外来遺伝子を挿入することができるレトロウイルスベクターの例には、モロニーマウス白血病ウイルス(MoMuLV)、ハーベイマウス肉腫ウイルス(HaMuSV)、マウス乳ガンウイルス(MuMTV)およびラウス肉腫ウイルス(RSV)が含まれるが、これらに限定されない。数多くのさらなるレトロウイルスベクターが多数の遺伝子を取り込むことができる。
これらのベクターのすべてが選択マーカー用の遺伝子を移すことができ、または取り込むことができ、その結果、形質導入された細胞が特定され得るように、また、作製され得るようにされる。レトロウイルスベクターを、例えば、糖、糖脂質またはタンパク質を結合することによって標的特異的にすることができる。好ましい標的化が、受容体を標的に
おいて有する標的特異的な抗体またはホルモンを使用することによって達成される。当業者は、特異的なポリヌクレオチド配列が、レトロウイルスベクターの標的特異的な送達を可能にするためにレトロウイルスのゲノムに挿入され得るか、または、ウイルスのエンベロープに結合され得ることを認識するであろう。
おいて有する標的特異的な抗体またはホルモンを使用することによって達成される。当業者は、特異的なポリヌクレオチド配列が、レトロウイルスベクターの標的特異的な送達を可能にするためにレトロウイルスのゲノムに挿入され得るか、または、ウイルスのエンベロープに結合され得ることを認識するであろう。
核酸を送達するための別の標的化されたシステムがコロイド状分散物系である。コロイド状分散物系には、巨大分子複合体、ナノカプセル、微小球体、ビーズ、ならびに、水中油型エマルション、ミセル、混合ミセルおよびリポソームを含む脂質に基づく系が含まれる。本発明の好ましいコロイド状系がリポソームである。リポソームは、インビトロおよびインビボにおける送達ビヒクルとして有用である人工膜小胞である。RNA、DNAおよび無傷のビリオンを生物学的に活性な形態で水性の内部に封入し、細胞に送達することができる。リポソームビヒクルを使用する効率的な遺伝子移入のための様々な方法がこの技術分野において知られている。リポソームの組成は通常、通常の場合にはステロイドとの併用でのリン脂質の組合せ、とりわけ、コレステロールとの併用でのリン脂質の組合せである。他のリン脂質または他の脂質もまた使用される場合がある。リポソームの物理的特性が、pH、イオン強度および二価カチオンの存在に依存する。
リポソーム作製において有用である脂質の例には、ホスファチジル化合物、例えば、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルエタノールアミンなど、スフィンゴ脂質、セレブロシドおよびガングリオシドが含まれる。例示的なリン脂質には、卵のホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリンおよびジステアロイルホスファチジルコリンが含まれる。リポソームの標的化はまた、例えば、器官特異性、細胞特異性およびオルガネラ特異性に基づいて可能であり、この技術分野において知られている。
インビボで使用されるときには、可逆的な送達-発現系を使用することが望ましい。そのような目的を達成するために、Cre-loxP系またはFLP/FRT系あるいは他の類似する系を上記核酸の1つまたは複数の可逆的な送達-発現のために使用することができる。国際公開WO2005/112620、国際公開WO2005/039643、米国特許出願公開第20050130919号、同第20030022375号、同第20020022018号、同第20030027335号および同第20040216178号を参照のこと。特に、米国特許出願公開第20100284990号に記載される可逆的な送達-発現系を、選択的中断または緊急中断を提供するために使用することができる。
別の一例において、上述の阻害性薬剤は、ポリペプチドまたはタンパク質複合体、例えば、抗体などが可能である。用語「抗体」は、免疫グロブリン分子、または、その免疫学的に活性な部分、すなわち、抗原結合部分を示す。例には、少なくとも1つまたは2つの重(H)鎖可変領域(VH)と、少なくとも1つまたは2つの軽(L)鎖可変領域(VL)とを有するタンパク質が含まれるが、これに限定されない。VH領域およびVL領域はさらに、より保存されている領域(これは「フレームワーク領域」(FR)と呼ばれる)が散らばる超可変性の領域(これは「相補性決定領域」(「CDR」)と呼ばれる)に細かく分けることができる。本明細書中で使用される場合、用語「免疫グロブリン」は、免疫グロブリン遺伝子によって実質的にコードされる1つまたは複数のポリペプチドからなるタンパク質を示す。認識されているヒト免疫グロブリン遺伝子には、カッパ定常領域遺伝子、ラムダ定常領域遺伝子、アルファ定常領域遺伝子(IgA1およびIgA2)、ガンマ定常領域遺伝子(IgG1、IgG2、IgG3およびIgG4)、デルタ定常領域遺伝子、エプシロン定常領域遺伝子およびミュー定常領域遺伝子、同様にまた、無数の免疫グロブリン可変領域遺伝子が含まれる。
抗体の「抗原結合部分」(または「抗体部分」)の用語は、抗原(例えば、LRP1、LRP8およびCTGF)に特異的に結合する能力を保持する抗体の1つまたは複数のフラグメントを示す。抗体の抗原結合機能が全長抗体のフラグメントによって果たされ得ることが示されている。抗体の「抗原結合部分」の用語の範囲内に包含される結合性フラグメントの例には、(i)Fabフラグメント、すなわち、VLドメイン、VHドメイン、CLドメインおよびCH1ドメインからなる一価フラグメント;(ii)F(ab’)2フラグメント、すなわち、ヒンジ領域におけるジスルフィド架橋によって連結される2つのFabフラグメントを含む二価フラグメント;(iii)VHドメインおよびCH1ドメインからなるFdフラグメント;(iv)抗体のただ1つだけのアームのVLドメインおよびVHドメインからなるFvフラグメント;(v)VHドメインからなるdAbフラグメント(Ward他(1989)、Nature、341:544~546);ならびに(vi)単離された相補性決定領域(CDR)が含まれる。そのうえ、Fvフラグメントの2つのドメイン、すなわち、VLおよびVHは、別個の遺伝子によってコードされるにもかかわらず、それらは、VL領域およびVH領域が対形成して一価の分子(これは単鎖Fv(scFv)として知られている)を形成する単一のタンパク質鎖として作製されることを可能にする合成リンカーによって、組換え法を使用してつなぐことができる(例えば、Bird他(1988)、Science、242:423~426、および、Huston他(1988)、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、85:5879~5883を参照のこと)。そのような単鎖抗体もまた、抗体の「抗原結合部分」の用語の範囲内に包含されることが意図される。これらの抗体フラグメントは、当業者に知られている従来の技術を使用して得られ、フラグメントは、無傷の抗体がスクリーニングされるのと同じ様式で有用性についてスクリーニングされる。
上述の標的タンパク質の1つ(例えば、CTGF)に特異的に結合する抗体を、この技術分野において知られている方法を使用して作製することができる。この抗体はポリクローナルまたはモノクローナル抗体であることが可能である。1つの実施形態において、抗体は組換えにより製造することができ、例えば、ファージディスプレーによって、または、コンビナトリアル方法によって製造することができる。別の実施形態において、抗体は、完全なヒト抗体(例えば、抗体をヒト免疫グロブリン配列から産生するように遺伝子操作されているマウスにおいて作製される抗体)、ヒト化抗体、あるいは、非ヒト抗体、例えば、齧歯類(マウスまたはラット)、ヤギ、霊長類(例えば、サル、これに限定されない)、ウサギまたはラクダの抗体(これらに限定されない)である。抗体のヒト化形態を生じさせるための様々な方法の例には、CDRグラフト化(Queen他、米国特許第5,585,089号;Riechmann他、Nature、332:323(1988))、鎖シャフリング(米国特許第5,565,332号)、および、貼り合わせ(veneering)または表面再建(resurfacing)(欧州特許第592,106号;欧州特許第519,596号;Padlan、Molecular Immunology、28(415):489~498(1991);Studnicka他、Protein Engineering、7(6):805~814(1994);Roguska他、PNAS、91:969~973(1994))が含まれるが、これらに限定されない。完全なヒト抗体を生じさせるための様々な方法の例には、ヒト免疫グロブリン遺伝子を発現することができるマウスから抗体を生じさせること、および、ヒト免疫グロブリン遺伝子ライブラリーを作製し、スクリーニングするためにファージディスプレー技術を使用することが含まれるが、これらに限定されない。
「単離された抗体」は、異なる抗原特異性を有する他の抗体を実質的に含まない抗体を示すことが意図される(例えば、CTGFと特異的に結合する単離された抗体は、そのような抗原とは別の抗原と特異的に結合する抗体を実質的に含まない)。そのうえ、単離された抗体は、他の細胞物質および/または化学物質を実質的に含まない場合がある。
用語「モノクローナル抗体」または用語「モノクローナル抗体組成物」は、本明細書中で使用される場合、単一分子組成の抗体分子の調製物を示す。モノクローナル抗体組成物は、特定のエピトープに対する単一の結合特異性および親和性を呈示する。
用語「ヒト抗体」は、本明細書中で使用される場合、フレームワーク領域およびCDR領域の両方がヒト生殖系列の免疫グロブリン配列に由来する可変領域を有する抗体を包含することが意図される。さらには、抗体が定常領域を含有するならば、この定常領域もまた、ヒト生殖系列の免疫グロブリン配列に由来する。本発明のヒト抗体は、ヒト生殖系列の免疫グロブリン配列によってコードされないアミノ酸残基(例えば、インビトロでのランダム変異誘発または部位特異的変異誘発によって、あるいは、インビボでの体細胞変異によって導入される変異)を含む場合がある。しかしながら、用語「ヒト抗体」は、本明細書中で使用される場合、別の哺乳動物種(例えば、マウスなど)の生殖系列に由来するCDR配列がヒトのフレームワーク配列にグラフト化されている抗体を包含することは意図されない。
用語「ヒトモノクローナル抗体」は、フレームワーク領域およびCDR領域の両方がヒト生殖系列の免疫グロブリン配列に由来する可変領域を有する、単一の結合特異性を呈示する抗体を示す。1つの実施形態において、ヒトモノクローナル抗体が、ヒト重鎖の導入遺伝子と、軽鎖の導入遺伝子とを含むゲノムを有する遺伝子組換えの非ヒト動物(例えば、遺伝子組換えマウス)から得られるB細胞を、不死化細胞に融合されて含むハイブリドーマによって産生される。
用語「組換えヒト抗体」には、本明細書中で使用される場合、組換え手段によって調製され、発現され、作出され、または単離されるすべてのヒト抗体が含まれ、例えば、下記の抗体などが含まれる:(a)ヒト免疫グロブリン遺伝子について遺伝子組換えまたは染色体組換えである動物(例えば、マウス)から、あるいは、そのような動物から調製されるハイブリドーマから単離される抗体(これは下記においてさらに記載される);(b)ヒト抗体を発現するように形質転換される宿主細胞から単離される抗体、例えば、トランスフェクトーマから単離される抗体;(c)組換えのコンビナトリアルヒト抗体ライブラリーから単離される抗体;および(d)ヒト免疫グロブリン遺伝子配列を他のDNA配列にスプライシングすることを伴う何らかの他の手段によって調製される、発現される、作出される、または単離される抗体。そのような組換えヒト抗体は、フレームワーク領域およびCDR領域がヒト生殖系列の免疫グロブリン配列に由来する可変領域を有する。しかしながら、いくつかのある特定の実施形態において、そのような組換えヒト抗体はインビトロ変異誘発(または、ヒトIg配列について遺伝子組換えである動物が使用されるときには、インビボ体細胞変異誘発)に供することができ、したがって、組換え抗体のVH領域およびVL領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖系列のVH配列およびVL配列に由来するか、または関連づけられる一方で、当然のことながら、インビボにおいてヒト抗体の生殖系列レパートリーの中に存在しないことがある配列である。
本明細書中で使用される場合、「イソ型」は、重鎖定常領域遺伝子によってコードされる抗体クラス(例えば、IgMまたはIgG1)を示す。表現「抗原を認識する抗体」および表現「抗原について特異的な抗体」は、本明細書中では用語「抗原に特異的に結合する抗体」と交換可能に使用される。本明細書中で使用される場合、用語「高親和性」はIgG抗体については、抗体が標的抗原について10-7M以下のKDを有すること、好ましくは10-8M以下のKDを有すること、より好ましくは10-9M以下のKDを有すること、一層より好ましくは10-10M以下のKDを有することを示す。しかしながら、「高親和性」の結合は、他の抗体イソ型については異なる可能性がある。例えば、IgMイソ型についての「高親和性」の結合は、抗体が10-7M以下のKDを有すること、より好ましくは10-8M以下のKDを有することを示す。
一例において、組成物は、CTGFを中和するモノクローナル抗体を含有する。1つの実施形態において、抗体は、完全なヒト抗体、ヒト化抗体、あるいは、非ヒト抗体、例えば、齧歯類(マウスまたはラット)、ヤギ、霊長類(例えば、サル、これに限定されない)、ウサギまたはラクダの抗体(これらに限定されない)であることが可能である。1つの実施形態において、このモノクローナルなモノクローナル抗体の1つまたは複数のアミノ酸が、その様々な物理的性質を変えるために置換される場合がある。これらの性質には、結合特異性、結合親和性、免疫原性および抗体イソ型が含まれるが、これらに限定されない。上記抗体の完全なヒト形態型またはヒト化形態型を含有する医薬組成物を、メラノーマを処置するために、あるいは、内皮動員、ガン細胞浸潤または転移性血管形成を阻害するために使用することができる。
本明細書中で使用される場合、「対象」はヒトおよび非ヒト動物を示す。非ヒト動物の例には、すべての脊椎動物、例えば、哺乳動物、例えば、非ヒト哺乳動物、非ヒト霊長類(特に、高等霊長類)、イヌ、齧歯類(例えば、マウスまたはラット)、モルモット、ネコおよびウサギなど、ならびに、非哺乳動物、例えば、鳥類、両生類、爬虫類などが含まれる。1つの実施形態において、対象はヒトである。別の実施形態において、対象は、実験動物、または、疾患モデルとして好適な動物である。障害について処置されるための対象を、当該障害のための標準的な診断技術によって特定することができる。必要に応じて、対象は、この技術分野において知られている方法または上記で記載される方法によって処置前に、上記で述べられるmiR-199a-3p、miR-199a-5p、miR-1908およびCTGFの1つまたは複数の変異、発現レベルまたは活性レベルについて調べることができる。対象が特定の変異を遺伝子に有するならば、あるいは、遺伝子発現レベルまたは活性レベルが、例えば、当該対象から得られるサンプルにおいて、正常者から得られるサンプルにおける遺伝子発現レベルまたは活性レベルよりも高いならば、当該対象は本発明の処置のための候補である。
阻害または処置を確認するために、内皮動員または生じている血管形成の阻害を投与工程の前および/または後で、この技術分野において知られている技術を使用して評価および/または確認することができる。例示的な技術には、血管造影または動脈造影が含まれ、身体の血管および器官の内部または内腔を可視化するために使用される医用画像化技術を一般には、放射線不透過性の造影剤を血管内に注入し、X線に基づく技術を使用して、例えば、蛍光透視法などを使用して画像化することによって行うことができる。
「処置する」または「処置」は、本明細書中で使用される場合、障害を有する対象に、当該障害、障害の症状、当該障害に対して二次的である疾患状態、または、当該障害に対する素因を治療するか、緩和するか、軽減するか、治すか、その発症を遅らせるか、防止するか、または改善するための目的を伴って化合物または薬剤を投与することを示す。「効果的な量」または「治療効果的な量」は、医学的に望ましい結果を処置された対象においてもたらすことができる化合物または薬剤の量を示す。処置方法は、単独で、あるいは、他の薬物または治療法との併用でインビボまたはエクスビボにおいて行うことができる。治療効果的な量を、1回または複数回の投与、適用または投薬において投与することができ、また、治療効果的な量は、特定の配合物または投与経路に限定されることは意図されない。
表現「効果的な量」は、本明細書中で使用される場合、所望される治療効果を示すための本発明の化合物の十分な量を示す。要求される正確な量は、対象の種、年齢および全身状態、ならびに、具体的な治療剤などに依存して対象毎に変化するであろう。本発明の化合物は好ましくは、投与の容易さおよび投薬の均一性のために投薬単位形態物に配合される。表現「投薬単位形態物」は、本明細書中で使用される場合、患者が処置されるために
適切である治療剤の物理的に別個の単位物を示す。しかしながら、本発明の化合物および組成物の1日あたりの総使用が、妥当な医学的判断の範囲内において主治医によって決定されるであろうことが理解されるであろう。どのような患者または生物であれ、特定の患者または生物のための具体的な治療効果的な用量レベルは、処置されている障害および障害の重篤度;用いられる具体的な化合物の抗ガン活性;用いられる具体的な組成物;患者の年齢、体重、全身の健康状態、性別および食事;用いられる具体的な化合物の投与時期、投与経路および排出速度;処置の継続期間;用いられる具体的な化合物との併用で、または同時に使用される薬物;ならびに、医療技術分野において広く知られている同様な要因を含めて様々な要因に依存するであろう。
適切である治療剤の物理的に別個の単位物を示す。しかしながら、本発明の化合物および組成物の1日あたりの総使用が、妥当な医学的判断の範囲内において主治医によって決定されるであろうことが理解されるであろう。どのような患者または生物であれ、特定の患者または生物のための具体的な治療効果的な用量レベルは、処置されている障害および障害の重篤度;用いられる具体的な化合物の抗ガン活性;用いられる具体的な組成物;患者の年齢、体重、全身の健康状態、性別および食事;用いられる具体的な化合物の投与時期、投与経路および排出速度;処置の継続期間;用いられる具体的な化合物との併用で、または同時に使用される薬物;ならびに、医療技術分野において広く知られている同様な要因を含めて様々な要因に依存するであろう。
治療剤は単独でインビボまたはエクスビボにおいて投与することができ、あるいは、他の薬物または治療法との併用で、すなわち、カクテル療法で共投与することができる。本明細書中で使用される場合、用語「共投与」または用語「共投与される」は、少なくとも2つの薬剤または治療法を対象に施すことを示す。例えば、腫瘍の処置において、特に血管形成した悪性腫瘍の処置では、薬剤を、単独で、あるいは、例えば、化学療法剤、放射線療法剤、アポトーシス剤、抗血管新生剤および/または免疫毒素もしくはコアグリガンド(coaguligand)との併用で使用することができる。いくつかの実施形態において、2つ以上の薬剤/治療法の共投与は同時である。他の実施形態において、第1の薬剤/治療法が第2の薬剤/治療法に先立って施される。当業者は、使用される様々な薬剤/治療法の配合物および/または投与経路が異なる場合があることを理解している。
インビボでの取り組みにおいて、化合物または薬剤が対象に投与される。一般に、化合物は、医薬的に許容されるキャリア(例えば、生理学的食塩水など、これらに限定されない)に懸濁され、経口投与または静脈内注入によって投与され、あるいは、皮下、筋肉内、クモ膜下腔内、腹腔内、直腸内、膣内、鼻腔内、胃内、気管内または肺内に注入されるか、または埋め込まれる。
要求される投薬量は、投与経路の選定;配合物の性質;患者の病気の性質;対象のサイズ、重量、表面積、年齢および性別;投与されている他の薬物;ならびに主治医の判断に依存する。好適な投薬量が0.01mg/kg~100mg/kgの範囲である。必要とされる投薬量における変化は、利用可能である様々な化合物、および、様々な投与経路の異なる効率を考慮して予想されることである。例えば、経口投与は、i.v.注射による投与よりも大きい投薬量を要求することが予想されるであろう。これらの投薬量レベルにおける変化は、この技術分野において十分に理解されるように最適化のための標準的な経験的常法を使用して調節することができる。好適な送達ビヒクル(例えば、ポリマーマイクロ粒子または埋め込み可能なデバイス)における化合物の封入は、送達効率、特に経口送達についての送達効率を増大させることができる。
組成物
本発明の範囲内には、好適なキャリアと、上記で記載される治療剤の1つまたは複数とを含有する組成物が含まれる。組成物は、医薬的に許容されるキャリアを含有する医薬組成物、食餌療法に許容される好適なキャリアを含有する食餌療法組成物、または、化粧品に許容されるキャリアを含有する化粧組成物であることが可能である。
本発明の範囲内には、好適なキャリアと、上記で記載される治療剤の1つまたは複数とを含有する組成物が含まれる。組成物は、医薬的に許容されるキャリアを含有する医薬組成物、食餌療法に許容される好適なキャリアを含有する食餌療法組成物、または、化粧品に許容されるキャリアを含有する化粧組成物であることが可能である。
用語「医薬組成物」は、活性な薬剤と、当該組成物をインビボまたはエクスビボでの診断用使用または治療用使用のためにとりわけ好適にするキャリア(不活性または活性)との組合せ物を示す。「医薬的に許容されるキャリア」は、対象への投与または塗布の後、望ましくない生理学的影響を引き起こさない。医薬組成物におけるキャリアは、有効成分と適合可能であり、かつ、有効成分を安定化することができるという意味でもまた、「許容される」ものでなければならない。1つまたは複数の可溶化剤を、活性な化合物を送達
するための医薬用キャリアとして利用することができる。医薬的に許容されるキャリアの例には、投薬形体物として使用可能である組成物を達成するための生体適合性のビヒクル、補助剤、添加剤および希釈剤が含まれるが、これらに限定されない。他のキャリアの例には、コロイド状酸化ケイ素、ステアリン酸マグネシウム、セルロース、ラウリル硫酸ナトリウム、および、D&C Yellow #10が含まれる。
するための医薬用キャリアとして利用することができる。医薬的に許容されるキャリアの例には、投薬形体物として使用可能である組成物を達成するための生体適合性のビヒクル、補助剤、添加剤および希釈剤が含まれるが、これらに限定されない。他のキャリアの例には、コロイド状酸化ケイ素、ステアリン酸マグネシウム、セルロース、ラウリル硫酸ナトリウム、および、D&C Yellow #10が含まれる。
本明細書中で使用される場合、用語「医薬的に許容される塩」は、妥当な医学的判断の範囲内において、過度な毒性、刺激およびアレルギー性応答などを伴わない、ヒトおよび下等動物の組織との接触における使用のために好適であり、かつ、合理的なベネフィット/リスク比に対応するそのような塩を示す。アミン、カルボン酸および他のタイプの化合物の様々な医薬的に許容される塩がこの技術分野において広く知られている。例えば、S.M.Berge他は、様々な医薬的に許容される塩を、J.Pharmaceutical Sciences、66:1~19(1977)において詳しく記載する(これは参照によって本明細書中に組み込まれる)。そのような塩は、本発明の化合物の最終的な単離および精製の期間中にその場で調製することができ、あるいは、下記において一般的に記載されるように、フリーの塩基官能基またはフリーの酸官能基を好適な試薬と反応させることによって別個に調製することができる。例えば、フリーの塩基官能基を好適な酸と反応させることができる。さらには、本発明の化合物が酸性成分を有する場合、その好適な医薬的に許容される塩には、金属塩、例えば、アルカリ金属塩(例えば、ナトリウム塩またはカリウム塩)およびアルカリ土類金属塩(例えば、カルシウム塩またはマグネシウム塩)などが含まれる場合がある。医薬的に許容される非毒性の酸付加塩の例として、無機酸(例えば、塩酸、臭化水素酸、リン酸、硫酸および過塩素酸など)または有機酸(例えば、酢酸、シュウ酸、マレイン酸、酒石酸、クエン酸、コハク酸またはマロン酸など)により形成されるアミノ基の塩、あるいは、この技術分野において使用される他の方法(例えば、イオン交換など)を使用することによって形成されるアミノ基の塩が挙げられる。他の医薬的に許容される塩には、アジピン酸塩、アルギン酸塩、アスコルビン酸塩、アスパラギン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、安息香酸塩、重硫酸塩、ホウ酸塩、酪酸塩、ショウノウ酸塩、ショウノウスルホン酸塩、クエン酸塩、シクロペンタンプロピオン酸塩、ジグルコン酸塩、ドデシル硫酸塩、エタンスルホン酸塩、ギ酸塩、フマル酸塩、グルコヘプトン酸塩、グリセロリン酸塩、グルコン酸塩、ヘミ硫酸塩、ヘプタン酸塩、ヘキサン酸塩、ヨウ化水素酸塩、2-ヒドロキシ-エタンスルホン酸塩、ラクトビオン酸塩、乳酸塩、ラウリン酸塩、ラウリル硫酸塩、リンゴ酸塩、マレイン酸塩、マロン酸塩、メタンスルホン酸塩、2-ナフタレンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、硝酸塩、オレイン酸塩、シュウ酸塩、パルミチン酸塩、パモ酸塩、ペクチン酸塩、過硫酸塩、3-フェニルプロピオン酸塩、リン酸塩、ピクリン酸塩、ピバル酸塩、プロピオン酸塩、ステアリン酸塩、コハク酸塩、硫酸塩、酒石酸塩、チオシアン酸塩、p-トルエンスルホン酸塩、ウンデカン酸塩および吉草酸塩などが含まれる。代表的なアルカリ塩またはアルカリ土類金属塩には、ナトリウム、リチウム、カリウム、カルシウムおよびマグネシウムなどが含まれる。さらなる医薬的に許容される塩には、適する場合、対イオンを使用して形成される非毒性のアンモニウムカチオン、第四級アンモニウムカチオンおよびアミンカチオンが含まれる(例えば、ハロゲン化物、水酸化物、カルボン酸塩、硫酸塩、リン酸塩、硝酸塩、低級アルキルスルホン酸塩およびアリールスルホン酸塩など)。
上記で記載されるように、本発明の医薬組成物はさらに、医薬的に許容されるキャリアを含み、この場合、医薬的に許容されるキャリアには、本明細書中で使用される場合、所望される特定の投薬形態物に対して適するように、ありとあらゆる溶媒、希釈剤または他の液体ビヒクル、分散助剤または懸濁助剤、表面活性剤、等張剤、増粘剤または乳化剤、保存剤、固体バインダーおよび滑剤などが含まれる。Remington’s Pharmaceutical Sciences、第16版、E.W.Martin(Mack
Publishing Co.、Easton、Pa.、1980)には、医薬組成物
を配合する際に使用される様々なキャリア、および、その調製のための知られている技術が開示される。どのようなキャリア媒体であれ、従来のキャリア媒体が、例えば、何らかの望ましくない生物学的影響をもたらすか、または、そうでない場合には、医薬組成物の何らかの他の成分と有害な様式で相互作用することなどによって本発明の化合物と不適合性である限りを除いて、その使用は、本発明の範囲内であることが意図される。医薬的に許容されるキャリアとして役立ち得る物質のいくつかの例には、下記の物質が含まれるが、それらに限定されない:糖、例えば、ラクトース、グルコースおよびスクロースなど;デンプン、例えば、トウモロコシデンプンおよびジャガイモデンプンなど;セルロースおよびその誘導体、例えば、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、エチルセルロースおよび酢酸セルロースなど;粉末化トラガカント;麦芽;ゼラチン;タルク;賦形剤、例えば、カカオバターおよび坐薬用ワックスなど;オイル、例えば、ピーナッツ油、綿実油、ベニバナ油、ゴマ油、オリーブ油、トウモロコシ油およびダイズ油など;グリコール、例えば、プロピレングリコールなど;エステル、例えば、オレイン酸エチルおよびラウリン酸エチルなど;寒天;天然リン脂質および合成リン脂質、例えば、ダイズおよび卵黄のホスファチド、レシチン、水素化ダイズレシチン、ジミリストイルレシチン、ジパルミトイルレシチン、ジステアロイルレシチン、ジオレオイルレシチン、ヒドロキシル化レシチン、リゾホスファチジルコリン、カルジオリピン、スフィンゴミエリン、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ジアステアロイル(diastearoyl)ホスファチジルエタノールアミン(DSPE)およびそのペグ化エステル(例えば、DSPE-PEG750およびDSPE-PEG2000など)、ホスファチジン酸、ホスファチジルグリセロールならびにホスファチジルセリンなど。レシチンの好ましい市販規格品には、Phosal(登録商標)またはPhospholipon(登録商標)の商品名で入手可能であるものが含まれ、Phosal 53 MCT、Phosal 50 PG、Phosal 75 SA、Phospholipon 90H、Phospholipon 90G、および、Phospholipon 90 NGが含まれる;ダイズホスファチジルコリン(SoyPC)およびDSPE-PEG2000が特に好ましい;緩衝化剤、例えば、水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウムなど;アルギン酸;パイロジェン非含有水;等張性生理的食塩水;リンゲル液;エチルアルコールおよびリン酸塩緩衝溶液、同様にまた、他の非毒性の適合性滑剤、例えば、ラウリル硫酸ナトリウムおよびステアリン酸マグネシウムなど、同様にまた、着色剤、離型剤、被覆剤、甘味剤、香味剤および芳香剤、保存剤ならびに酸化防止剤もまた、処方者の判断に従って組成物に存在させることができる。
Publishing Co.、Easton、Pa.、1980)には、医薬組成物
を配合する際に使用される様々なキャリア、および、その調製のための知られている技術が開示される。どのようなキャリア媒体であれ、従来のキャリア媒体が、例えば、何らかの望ましくない生物学的影響をもたらすか、または、そうでない場合には、医薬組成物の何らかの他の成分と有害な様式で相互作用することなどによって本発明の化合物と不適合性である限りを除いて、その使用は、本発明の範囲内であることが意図される。医薬的に許容されるキャリアとして役立ち得る物質のいくつかの例には、下記の物質が含まれるが、それらに限定されない:糖、例えば、ラクトース、グルコースおよびスクロースなど;デンプン、例えば、トウモロコシデンプンおよびジャガイモデンプンなど;セルロースおよびその誘導体、例えば、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、エチルセルロースおよび酢酸セルロースなど;粉末化トラガカント;麦芽;ゼラチン;タルク;賦形剤、例えば、カカオバターおよび坐薬用ワックスなど;オイル、例えば、ピーナッツ油、綿実油、ベニバナ油、ゴマ油、オリーブ油、トウモロコシ油およびダイズ油など;グリコール、例えば、プロピレングリコールなど;エステル、例えば、オレイン酸エチルおよびラウリン酸エチルなど;寒天;天然リン脂質および合成リン脂質、例えば、ダイズおよび卵黄のホスファチド、レシチン、水素化ダイズレシチン、ジミリストイルレシチン、ジパルミトイルレシチン、ジステアロイルレシチン、ジオレオイルレシチン、ヒドロキシル化レシチン、リゾホスファチジルコリン、カルジオリピン、スフィンゴミエリン、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ジアステアロイル(diastearoyl)ホスファチジルエタノールアミン(DSPE)およびそのペグ化エステル(例えば、DSPE-PEG750およびDSPE-PEG2000など)、ホスファチジン酸、ホスファチジルグリセロールならびにホスファチジルセリンなど。レシチンの好ましい市販規格品には、Phosal(登録商標)またはPhospholipon(登録商標)の商品名で入手可能であるものが含まれ、Phosal 53 MCT、Phosal 50 PG、Phosal 75 SA、Phospholipon 90H、Phospholipon 90G、および、Phospholipon 90 NGが含まれる;ダイズホスファチジルコリン(SoyPC)およびDSPE-PEG2000が特に好ましい;緩衝化剤、例えば、水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウムなど;アルギン酸;パイロジェン非含有水;等張性生理的食塩水;リンゲル液;エチルアルコールおよびリン酸塩緩衝溶液、同様にまた、他の非毒性の適合性滑剤、例えば、ラウリル硫酸ナトリウムおよびステアリン酸マグネシウムなど、同様にまた、着色剤、離型剤、被覆剤、甘味剤、香味剤および芳香剤、保存剤ならびに酸化防止剤もまた、処方者の判断に従って組成物に存在させることができる。
上記組成物は、上記で記載される形態のどれにおいてでも、メラノーマ、あるいは、本明細書中に記載されるいずれかの他の疾患または状態を処置するために使用することができる。効果的な量は、治療効果を処置された対象に与えるために要求される活性な化合物/薬剤の量を示す。効果的な用量は、当業者によって認識されるように、処置される疾患のタイプ、投与経路、賦形剤使用法、および、他の治療的処置との同時使用の可能性に依存して変化するであろう。
本発明の医薬組成物は、非経口投与、経口投与、鼻腔投与、直腸投与、局所投与または口内投与により投与することができる。用語「非経口」は、本明細書中で使用される場合、皮下注射、皮内注射、静脈内注射、筋肉内注射、関節内注射、動脈内注射、滑液包内注射、胸骨内注射、クモ膜下腔内注射、病巣内注射または頭蓋内注射、同様にまた、どのような注入技術であれ、好適な注入技術を示す。
無菌の注射用組成物は、非毒性の非経口投与許容性の希釈剤または溶媒における溶液または懸濁物であることが可能である。そのような溶液には、1,3-ブタンジオール、マンニトール、水、リンゲル液および等張性塩化ナトリウム溶液が含まれるが、これらに限定されない。加えて、固定油が、溶媒または懸濁用媒体として従来から用いられる(例え
ば、合成されたモノグリセリドまたはジグリセリド)。天然の医薬的に許容されるオイル、例えば、限定されないが、オリーブ油またはひまし油など、それらのポリオキシエチル化体が注射剤の調製において有用であるように、脂肪酸(例えば、限定されないが、オレイン酸など)およびそのグリセリド誘導体が注射剤の調製において有用である。これらのオイル溶液またはオイル懸濁物はまた、長鎖アルコール希釈剤または分散剤(例えば、限定されないが、カルボキシメチルセルロースまたは類似する分散化剤など)を含有することができる。他の一般に使用されている界面活性剤、例えば、限定されないが、各種Tweenもしくは各種Spanまたは他の類似する乳化剤あるいは生物学的利用能強化剤など(これらは、医薬的に許容される固体形態物、液体形態物または他の投薬形態物の製造において一般に使用されるものである)もまた、配合目的のために使用することができる。
ば、合成されたモノグリセリドまたはジグリセリド)。天然の医薬的に許容されるオイル、例えば、限定されないが、オリーブ油またはひまし油など、それらのポリオキシエチル化体が注射剤の調製において有用であるように、脂肪酸(例えば、限定されないが、オレイン酸など)およびそのグリセリド誘導体が注射剤の調製において有用である。これらのオイル溶液またはオイル懸濁物はまた、長鎖アルコール希釈剤または分散剤(例えば、限定されないが、カルボキシメチルセルロースまたは類似する分散化剤など)を含有することができる。他の一般に使用されている界面活性剤、例えば、限定されないが、各種Tweenもしくは各種Spanまたは他の類似する乳化剤あるいは生物学的利用能強化剤など(これらは、医薬的に許容される固体形態物、液体形態物または他の投薬形態物の製造において一般に使用されるものである)もまた、配合目的のために使用することができる。
経口投与用の組成物は、どのような投薬形態物であれ、カプセル、錠剤、エマルション剤、ならびに、水性懸濁物、水性分散物および水溶液を含めて、経口投与許容性の投薬形態物であることが可能である。錠剤の場合、一般に使用されているキャリアには、ラクトースおよびトウモロコシデンプンが含まれるが、これらに限定されない。滑剤、例えば、限定されないが、ステアリン酸マグネシウムなどもまた、典型的には加えられる。カプセル形態での経口投与のために、有用な希釈剤には、ラクトースおよび乾燥トウモロコシデンプンが含まれるが、これらに限定されない。水性の懸濁物またはエマルション剤が経口投与されるとき、有効成分は、乳化剤または懸濁化剤と組み合わされる油相に懸濁または溶解することができる、所望されるならば、ある特定の甘味剤、香味剤または着色剤を加えることができる。
記載された発明による局所投与用の医薬組成物は、溶液、軟膏、クリーム、懸濁物、ローション、粉末剤、ペースト、ゲル、スプレー剤、エアロゾル剤またはオイルとして配合することができる。代替では、局所用配合物は、1つまたは複数の賦形剤または希釈剤を場合により含むことができる、有効成分(1つまたは複数)が含浸されるパッチまたは包帯の形態であることが可能である。いくつかの好ましい実施形態において、局所用配合物は、皮膚または他の患部を介した活性な薬剤の吸収または浸透を強化するであろう物質を含む。
局所用組成物は、皮膚への適用のために好適である皮膚科学的に許容されるキャリアの安全かつ効果的な量を含有する。「化粧品に許容される」または「皮膚科学的に許容される」組成物または成分は、過度な毒性、不適合性、不安定性およびアレルギー性応答などを伴わない、ヒト皮膚との接触における使用のために好適である組成物または成分を示す。キャリアは、活性な薬剤および必要に応じて使用される成分が適切な濃度で皮膚に送達されることを可能にする。したがって、キャリアは、活性な物質が、適切な濃度で、選択された標的に適用され、かつ、当該選択された標的を覆って均一に分布させられることを保証するための希釈剤、分散剤または溶媒などとして作用することができる。キャリアは、固体、半固体または液体であることが可能である。キャリアは、ローション、クリームまたはゲルの形態であることが可能であり、特に、活性な物質が沈降することを防止するための十分な厚さまたは降伏点を有する形態であることが可能である。キャリアは不活性であるか、または、皮膚科学的な利益を有することが可能である。キャリアは、本明細書中に記載される活性な成分と物理的かつ化学的に適合性でなければならず、また、組成物に関連する安定性、効力または他の使用利益を過度に損なってはならない。
併用療法
いくつかの実施形態において、医薬組成物はさらに、抗増殖活性を有するさらなる化合物を含む場合がある。抗増殖活性を有するさらなる化合物を、表2に示される化合物を含む一群の抗増殖剤から選択することができる。
いくつかの実施形態において、医薬組成物はさらに、抗増殖活性を有するさらなる化合物を含む場合がある。抗増殖活性を有するさらなる化合物を、表2に示される化合物を含む一群の抗増殖剤から選択することができる。
本発明の化合物および医薬組成物は配合され、併用療法で用いられ得ること、すなわち、化合物および医薬組成物が、1つまたは複数の他の所望される治療剤または医学的手法とともに配合され得るか、あるいは、1つまたは複数の他の所望される治療剤または医学的手法と同時に、またはそれらに先立って、またはそれらに続いて投与され得ることもまた理解されるであろう。併用レジメンにおいて用いるための治療法(治療剤または手法)の特定の組合せでは、所望される治療剤および/または手法の適合性、ならびに、達成されるべき所望される治療効果が考慮に入れられるであろう。用いられる治療法により、所望される効果が、同じ障害について達成されるかもしれないこと、または、異なる効果(例えば、何らかの有害な影響の抑制)が達成されるかもしれないこともまた理解されるであろう。
「抗増殖剤」によって、本明細書中に列挙される医学的状態を処置するためにLXRアゴニストとの併用でどれもが使用され得る表2に列記されるそのような抗増殖剤を含めて、どのような抗増殖剤も意図される。抗増殖剤にはまた、有機白金誘導体、ナフトキノン誘導体およびベンゾキノン誘導体、クリソファン酸およびそのアントラキノン誘導体が含まれる。
診断および予後のための方法
上記遺伝子は、対象が転移性メラノーマを有するかどうか、または、転移性メラノーマを有する危険性があるかどうかを決定することにおいて使用することができる。代替では、上記遺伝子は、対象におけるそのような障害の予後を決定するために使用することができる。
上記遺伝子は、対象が転移性メラノーマを有するかどうか、または、転移性メラノーマを有する危険性があるかどうかを決定することにおいて使用することができる。代替では、上記遺伝子は、対象におけるそのような障害の予後を決定するために使用することができる。
診断方法
1つの局面において、本発明は、対象が、内皮動員、ガン細胞浸潤または転移性血管形成によって特徴づけられる転移性メラノーマまたは他の疾患を有するかどうか、あるいは、内皮動員、ガン細胞浸潤または転移性血管形成によって特徴づけられる転移性メラノーマまたは他の疾患に罹りやすいかどうかを決定するための定性的および定量的な情報を提供する。そのような障害を有するか、または、そのような障害を引き起こしやすい対象を、対象から得られる試験サンプルにおける上記遺伝子またはそれらの産物(mRNA、マイクロRNAまたはポリペプチド)の発現レベル、発現パターンまたは発現プロフィルに基づいて決定することができる。別の言い方をすれば、そのような産物を、障害の存在または非存在を示すためのマーカーとして使用することができる。本発明の診断アッセイおよび予後アッセイは、そのような産物の発現レベルを評価するための様々な方法を含む。これらの方法により、障害を検出することができる。例えば、1つまたは複数の促進因子(すなわち、miR-199a-3p、miR-199a-5p、miR-1908およびCTGF)の発現レベルにおける相対的な増大は障害の存在を暗示する。逆に、発現より低いレベルまたは欠如は、障害がないことを暗示する。
1つの局面において、本発明は、対象が、内皮動員、ガン細胞浸潤または転移性血管形成によって特徴づけられる転移性メラノーマまたは他の疾患を有するかどうか、あるいは、内皮動員、ガン細胞浸潤または転移性血管形成によって特徴づけられる転移性メラノーマまたは他の疾患に罹りやすいかどうかを決定するための定性的および定量的な情報を提供する。そのような障害を有するか、または、そのような障害を引き起こしやすい対象を、対象から得られる試験サンプルにおける上記遺伝子またはそれらの産物(mRNA、マイクロRNAまたはポリペプチド)の発現レベル、発現パターンまたは発現プロフィルに基づいて決定することができる。別の言い方をすれば、そのような産物を、障害の存在または非存在を示すためのマーカーとして使用することができる。本発明の診断アッセイおよび予後アッセイは、そのような産物の発現レベルを評価するための様々な方法を含む。これらの方法により、障害を検出することができる。例えば、1つまたは複数の促進因子(すなわち、miR-199a-3p、miR-199a-5p、miR-1908およびCTGF)の発現レベルにおける相対的な増大は障害の存在を暗示する。逆に、発現より低いレベルまたは欠如は、障害がないことを暗示する。
試験サンプルにおけるmRNA産物、マイクロRNA産物またはポリペプチド産物の存在、レベルまたは非存在を、試験サンプルを試験対象から得ること、および、試験サンプルを、核酸を検出することができる化合物または薬剤(例えば、RNAプローブまたはDNAプローブ)と、あるいは、ポリペプチドを検出することができる化合物または薬剤と接触させることによって評価することができる。「試験サンプル」には、対象から単離される組織、細胞および生物学的流体、同様にまた、対象の体内に存在する組織、細胞および流体が含まれる。目的とする遺伝子の発現のレベルを、この遺伝子によってコードされるRNAを測定することを含めて、いくつかの方法で測定することができる。
発現したRNAサンプルを、いくつかの広く知られている手順のいずれかを使用して生物学的サンプルから単離することができる。例えば、生物学的サンプルを、グアニジウムに基づく溶解緩衝液(これは場合により、RNAを安定化させるためのさらなる成分を含有する)において溶解することができる。いくつかの実施形態において、溶解緩衝液は、精製RNAを、細胞培養物からのRNAの回収および安定性をモニターするためのコントロールとして含有することができる。そのような精製RNAテンプレートの例には、PROMEGA(Madison、WI)から得られるカナマイシン陽性コントロールRNA、および、LIFE TECHNOLOGIES(Rockville、MD)から得られる7.5kbのポリ(A)テール付加RNAが含まれる。溶解物は直ちに使用される場合があるか、または、例えば、-80℃で凍結保存される場合がある。
場合により、総RNAを、自動化に適合し得る96ウエル形式での、例えば、RNEASY精製プラットフォーム(QIAGEN,Inc.、Valencia、CA)などでのシリカに基づく単離を使用して細胞溶解物(または他のタイプのサンプル)から精製することができる。他のRNA単離方法が意図される(例えば、シリカ被覆ビーズまたはグアニジウムを用いた抽出など)。RNAの単離および調製のためのさらなる方法が当業者によって考案され得る。
本発明の方法は、粗サンプル(例えば、血液、血清、血漿または細胞溶解物)を使用して行うことができ、これにより、RNAを単離しなければならないことが排除される。R
NAse阻害剤が場合により、粗サンプルに加えられる。粗細胞溶解物を使用するとき、ゲノムDNAが、サンプルに依存して、1コピー以上の標的配列(例えば、遺伝子)を与え得ることには留意しなければならない。標的配列が1つまたは複数の高発現遺伝子に由来する状況では、ゲノムDNAから生じるシグナルは有意でない場合がある。しかし、低いレベルで発現される遺伝子については、バックグラウンドを、サンプルをDNAseにより処理することによって除くことができ、あるいは、cDNA産物または増幅産物のその後のプライミングのためのスプライスジャンクション部を標的とするプライマーを使用することによって除くことができる。
NAse阻害剤が場合により、粗サンプルに加えられる。粗細胞溶解物を使用するとき、ゲノムDNAが、サンプルに依存して、1コピー以上の標的配列(例えば、遺伝子)を与え得ることには留意しなければならない。標的配列が1つまたは複数の高発現遺伝子に由来する状況では、ゲノムDNAから生じるシグナルは有意でない場合がある。しかし、低いレベルで発現される遺伝子については、バックグラウンドを、サンプルをDNAseにより処理することによって除くことができ、あるいは、cDNA産物または増幅産物のその後のプライミングのためのスプライスジャンクション部を標的とするプライマーを使用することによって除くことができる。
遺伝子に対応するRNAの細胞におけるレベルを原位置およびインビトロの両方において求めることができる。試験サンプルから単離されるRNAを、サザン分析またはノーザン分析、PCR分析およびプローブアレイを含むハイブリダイゼーションアッセイまたは増幅アッセイにおいて使用することができる。RNAレベルを検出するための好ましい診断方法では、単離されたRNAを、遺伝子によってコードされるRNAにハイブリダイゼーションすることができる核酸プローブと接触させることが伴う。プローブは、全長の核酸またはその一部分(例えば、長さが少なくとも10ヌクレオチドであり、かつ、ストリンジェントな条件のもとでRNAに特異的にハイブリダイゼーションするために十分であるオリゴヌクレオチドなど)であることが可能である。
1つの形式において、RNA(または、RNAから調製されるcDNA)が表面に固定化され、そして、例えば、単離されたRNAをアガロースゲルで泳動し、RNAをゲルからメンブラン(例えば、ニトロセルロースなど)に転写することによってプローブと接触させられる。別の形式において、プローブが表面に固定化され、RNA(またはcDNA)が、例えば、遺伝子チップアレイにおいてプローブと接触させられる。当業者は、既知のRNA検出方法を、RNAのレベルを検出するために適合化することができる。
試験されることになる遺伝子によってコードされるサンプル中のRNA(または、RNAから調製されるcDNA)のレベルを、核酸増幅を用いて、例えば、標準的PCR(米国特許第4,683,202号)、RT-PCR(Bustin S.、J Mol Endocrinol、25:169~93、2000)、定量的PCR(Ong Y.他、Hematology、7:59~67、2002)、リアルタイムPCR(Ginzinger D.、Exp Hematol、30:503~12、2002)およびインサイチューPCR(Thaker V.、Methods Mol Biol、115:379~402、1999)、または、いずれかの他の核酸増幅法、その後、増幅された分子を、この技術分野で知られている技術を使用して検出することによって評価することができる。別の実施形態において、本発明の方法はさらに、コントロールサンプルを、遺伝子の当該RNAを検出することができる化合物または薬剤と接触させること、および、コントロールサンプルにおける当該RNAの存在を試験サンプルにおける当該RNAの存在と比較することを含む。
上記の方法およびマーカーは、メラノーマを発症することについての対象の危険性を評価するために使用することができる。具体的には、本発明は、早期検出に対する不可欠な洞察を得るように、ある種の危険性を既に有している高リスクのコホートにおける対象に適用することができる。メラノーマに関連するmiR遺伝子産物のレベルにおける変化を、対象の細胞における形質転換された表現型または新生物性の表現型の発達の前に、あるいは、対象の細胞における形質転換された表現型または新生物性の表現型の発達の早期段階において検出することができる。したがって、本発明はまた、メラノーマを発症する危険性がある対象をスクリーニングするための方法であって、メラノーマに関連する少なくとも1つの遺伝子産物のレベルを、または、メラノーマに関連する遺伝子産物の組合せのレベルを対象の皮膚から得られる生物学的サンプルにおいて評価することを含む方法を提供する。それによれば、コントロールサンプルにおける対応する遺伝子産物のレベルと比較した場合、生物学的サンプルでの遺伝子産物または遺伝子産物の組合せのレベルにおける変化により、対象はメラノーマを発症する危険性があることが示される。そのようなスクリーニングのために使用される生物学的サンプルには、正常であるか、または、ガン性であることが疑われるかのどちらかである皮膚組織が含まれ得る。メラノーマに関連する1つまたは複数の遺伝子産物のレベルにおける変化を有する対象が、さらなるモニタリングおよび試験のための候補である。そのようなさらなる試験は、組織サンプルの組織学的検査、または、当業者の範囲内である他の技術を含むことができる。
本明細書中で使用される場合、用語「診断」は、疾患または障害を検出すること、あるいは、疾患または障害の病期または程度を決定することを意味する。通常、疾患または障害の診断は、疾患を暗示する1つまたは複数の因子および/または症状を評価することに基づく。すなわち、診断を、疾患または状態の存在または非存在を暗示する因子の存在、非存在または量に基づいて行うことができる。特定の疾患を診断するために暗示すると見なされるそれぞれの因子または症状は、その特定の疾患に対して排他的に関連づけられる必要はない。すなわち、診断的な因子または症状から推測され得る鑑別診断が存在する場合がある。同様に、特定の疾患を暗示する因子または症状が、その特定の疾患を有しない個体に存在している場合があるかもしれない。これらの診断方法は、独立して、あるいは、特定の疾患または障害(例えば、メラノーマ)について医療技術分野において知られている他の診断方法および/または病期分類方法との組合せで使用される場合がある。
予後方法
上記で記載される診断方法により、メラノーマを有する対象、または、メラノーマを発症する危険性がある対象を特定することができる。加えて、生物学的サンプルでの、例えば、末梢血サンプルでの上述の遺伝子の発現レベルおよび/または発現傾向における変化は、回復の早期徴候またはその欠如を提供することができる。例えば、促進因子遺伝子(または阻害剤遺伝子)のさらなる増大(または低下)または持続的に変化した遺伝子発現レベルにより、不良な予後、すなわち、改善の欠如または健康の衰えが示される。したがって、これらの遺伝子により、メラノーマの処置後の回復を評価することができる。この選ばれた一群の遺伝子またはそのサブセットの分析により、状態の結末が示される。
上記で記載される診断方法により、メラノーマを有する対象、または、メラノーマを発症する危険性がある対象を特定することができる。加えて、生物学的サンプルでの、例えば、末梢血サンプルでの上述の遺伝子の発現レベルおよび/または発現傾向における変化は、回復の早期徴候またはその欠如を提供することができる。例えば、促進因子遺伝子(または阻害剤遺伝子)のさらなる増大(または低下)または持続的に変化した遺伝子発現レベルにより、不良な予後、すなわち、改善の欠如または健康の衰えが示される。したがって、これらの遺伝子により、メラノーマの処置後の回復を評価することができる。この選ばれた一群の遺伝子またはそのサブセットの分析により、状態の結末が示される。
本明細書中に記載される予後アッセイは、対象が、内皮動員、ガン細胞浸潤または転移性血管形成を伴うメラノーマまたは他の障害を処置するために薬剤(例えば、アゴニスト、アンタゴニスト、ペプチド模倣体、タンパク質、ペプチド、核酸、小分子または他の薬物候補物)が投与されるために好適であるかどうかを決定するために使用することができる。例えば、そのようなアッセイは、対象に化学療法剤が投与され得るかどうかを決定するために使用することができる。
したがって、本発明によって同様に提供されるのが、細胞増殖性障害のための処置を対象においてモニターする方法である。この目的のために、本明細書中に開示される遺伝子の遺伝子発現レベルを、処置を受ける前に、または、処置を受けている期間中に、または、処置を受けた後で対象からの試験サンプルについて求めることができる。ベースラインレベルと比較されるようなそれらのレベルにおける変化の大きさがその後、評価される。上述の促進因子遺伝子(miR-199a-3p、miR-199a-5p、miR-1908およびCTGF)の発現が処置後に低下していることは、対象がさらに、同じ処置によって処置され得ることを示している。同様に、阻害剤(DNAJA4、ApoE、LRP1およびLRP8)における増大もまた、対象がさらに、同じ処置によって処置され得ることを示している。逆に、促進因子遺伝子の1つまたは複数のさらなる増大または持続的な高い発現レベルは改善の欠如または健康の衰えを示している。
上記アッセイの実施から得られる情報は、個々の対象の健康状態に影響を及ぼす疾患および他の有害な状態の予後判定において、個々の対象の健康状態に影響を及ぼす疾患および他の有害な状態の進行を特定することにおいて、また、個々の対象の健康状態に影響を及ぼす疾患および他の有害な状態の臨床管理において有用である。好ましい実施形態において、前述の診断アッセイは、内皮動員、ガン細胞浸潤または転移性血管形成によって特徴づけられるメラノーマおよび他の状態の予後判定において、内皮動員、ガン細胞浸潤または転移性血管形成によって特徴づけられるメラノーマおよび他の状態の進行を特定することにおいて、また、ガン細胞浸潤または転移性血管形成によって特徴づけられるメラノーマおよび他の状態の臨床管理において有用な情報を提供する。この情報は、そのような状態を罹患対象の身体から根絶するための、すなわち、ヒトの身体から根絶するための化学療法レジメンまたは他の処置レジメンを設計することにおいて臨床医をより具体的に助ける。
用語「予後」は、本明細書中で使用される場合、臨床的状態または疾患の起こりそうな経過および結末の予測を示す。予後は通常、疾患の好都合または不都合な経過または結末を暗示する疾患の因子または症状を評価することによって行われる。表現「予後を決定する」は、本明細書中で使用される場合、当業者が患者における状態の経過または結末を予測することができるプロセスを示す。用語「予後」は、状態の経過または結末を100%の精度により予測することができることを示さず、その代わり、当業者は、用語「予後」が、ある特定の経過または結末が生じるであろうという増大した確率を示すことを理解するであろう。すなわち、経過または結末が、当該状態を示さないそのような個体と比較したとき、所与の状態を示す患者では生じる可能性がより大きいことを理解するであろう。
用語「好都合な予後」および用語「陽性の予後」または用語「不都合な予後」および用語「陰性の予後」は、本明細書中で使用される場合、状態または疾患の起こりそうな経過および/または見込みのある結末を予測することについての相対的な用語である。好都合な予後または陽性の予後により、不都合な予後または陰性の予後よりも良好な、状態についての結末が予測される。一般的な意味において、「好都合な予後」は、特定の状態に伴い得ると思われる多くの他の可能な予後よりも相対的に良好である結末であり、これに対して、不都合な予後は、特定の状態に伴い得ると思われる多くの他の可能な予後よりも相対的に悪い結末を予測する。好都合な予後または陽性の予後の典型的な例には、平均よりも良好な治癒率、転移についてのより低い傾向、予想されるよりも長い平均余命、ガン性プロセスからの良性プロセスの分化などが含まれる。例えば、陽性の予後の1つが、患者が、処置後に特定のガンから治る50%の確率を有する予後であり、一方、同じガンを有する平均的な患者は、治る確率がほんの25%にすぎない。
用語「決定する」、用語「測定する」、用語「評価する」および用語「アッセイする」は交換可能に使用され、定量的測定および定性的測定の両方を含み、また、特性、形質または特徴が存在するか否かを決定することを含む。評価することは相対的または絶対的である場合がある。標的“の存在を評価する”には、存在する標的の量を決定すること、同様にまた、標的が存在しているか、または存在していないかどうかを決定することが含まれる。
アレイ
本発明において同様に提供されるのが、バイオチップまたはアレイである。バイオチップ/アレイは、連結された本明細書中に記載されるプローブまたは複数のプローブを有する固体または半固体の基体を含有する場合がある。プローブは、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件のもとで標的配列にハイブリダイゼーションすることができる場合がある。プローブは、基体上の空間的に定義されたアドレスにおいて連結される場合がある。標的配列あたり2つ以上のプローブが使用される場合があり、但し、この場合、重
複するプローブ、または、特定の標的配列の異なる部分に対するプローブのどちらかが用いられる。プローブは、当業者によって認められるただ1つだけの障害に関連する標的配列にハイブリダイゼーションすることができる場合がある。プローブは最初に合成され、続いてバイオチップに連結される場合があるか、または、バイオチップ上で直接に合成される場合があるかのどちらかである。
本発明において同様に提供されるのが、バイオチップまたはアレイである。バイオチップ/アレイは、連結された本明細書中に記載されるプローブまたは複数のプローブを有する固体または半固体の基体を含有する場合がある。プローブは、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件のもとで標的配列にハイブリダイゼーションすることができる場合がある。プローブは、基体上の空間的に定義されたアドレスにおいて連結される場合がある。標的配列あたり2つ以上のプローブが使用される場合があり、但し、この場合、重
複するプローブ、または、特定の標的配列の異なる部分に対するプローブのどちらかが用いられる。プローブは、当業者によって認められるただ1つだけの障害に関連する標的配列にハイブリダイゼーションすることができる場合がある。プローブは最初に合成され、続いてバイオチップに連結される場合があるか、または、バイオチップ上で直接に合成される場合があるかのどちらかである。
「連結される」または「固定化される」は、核酸(例えば、プローブ)および固体支持体に言及するために本明細書中で使用される場合、プローブと固体支持体との間における結合が、結合、洗浄、分析および除去の条件のもとで安定であるために十分であることを意味する。結合は共有結合性または非共有結合性である場合がある。共有結合性の結合がプローブと固体支持体との間に直接に形成される場合があり、あるいは、架橋剤によって、または、特異的な反応基を固体支持体もしくはプローブのどちらかに、または両方の分子に含むことによって形成される場合がある。非共有結合性の結合が、静電的相互作用、親水性相互作用および疎水性相互作用の1つまたは複数である場合がある。非共有結合性の結合に含まれるのが、ストレプトアビジンなどの分子を支持体に共有結合により連結すること、および、ビオチン化されたプローブをこのストレプトアビジンに非共有結合により結合することである。固定化にはまた、共有結合性相互作用と非共有結合性相互作用との組合せが伴う場合がある。
固体基体は、プローブの連結または会合のために適切である離れた個々の部位を含有するように改変されることがあり、かつ、少なくとも1つの検出方法を受け入れる材料であることが可能である。そのような基体の例には、ガラスおよび修飾ガラスまたは機能化ガラス、プラスチック(アクリル、ポリスチレン、ならびに、スチレンおよび他の材料のコポリマー、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリブチレン、ポリウレタン、TeflonJなどを含む)、多糖、ナイロンまたはニトロセルロース、樹脂、シリカまたはシリカ系材料(ケイ素および修飾ケイ素を含む)、炭素、金属、無機ガラスおよびプラスチックが含まれる。基体は、光学的検出を、認められるほどの蛍光を生じさせることなく可能にする場合がある。
基体は平面状であることが可能であり、だが、他の形状の基体が同様に使用される場合がある。例えば、プローブが、サンプル体積を最小限にするためのフロースルー型サンプル分析のためにはチューブの内側表面に設置される場合がある。同様に、基体は柔軟性である場合があり、例えば、特定のプラスチックから作製される独立気泡フォームを含めて、軟質フォームなどである場合がある。
アレイ/バイオチップおよびプローブは、これら2つのその後の連結のための化学的官能基により誘導体化される場合がある。例えば、バイオチップが、アミノ基、カルボキシル基、オキソ基またはチオール基(これらに限定されない)を含む化学的官能基により誘導体化される場合がある。これらの官能基を使用する場合、プローブは、直接に、または、リンカーを使用して間接的にそのどちらかで、プローブ上の官能基を使用して連結される場合がある。プローブは、5’末端ヌクレオチド、3’末端ヌクレオチドのどちらかによって、または、内部ヌクレオチドを介して固体支持体に連結される場合がある。プローブはまた、固体支持体に非共有結合により連結される場合がある。例えば、ビオチン化されたオリゴヌクレオチドを作製することができ、この場合、このビオチン化されたオリゴヌクレオチドは、共有結合によってストレプトアビジンにより被覆される表面に結合する場合があり、これにより、連結をもたらす。代替では、プローブが、光重合およびフォトリソグラフィーなどの技術を使用して表面において合成される場合がある。核酸を支持体基体に連結するための様々な方法の詳細な議論を、例えば、米国特許第5837832号、同第6087112号、同第5215882号、同第5707807号、同第5807522号、同第5958342号、同第5994076号、同第6004755号、同第6048695号、同第6060240号、同第6090556号および同第6040138号において見出すことができる。
いくつかの実施形態において、発現した転写物(例えば、本明細書中に記載されるマイクロRNA遺伝子の転写物)が核酸アレイにおいて表される。そのような実施形態において、一組の結合部位が、発現した転写物の異なる配列セグメントに対して相補的である異なる核酸を伴うプローブを含むことができる。そのような核酸の例として、15塩基~200塩基、20塩基~100塩基、25塩基~50塩基、40塩基~60塩基の長さのものを挙げることができる。それぞれのプローブ配列はまた、その標的配列に対して相補的である配列に加えて、1つまたは複数のリンカー配列を含むことができる。リンカー配列は、その標的配列に対して相補的である配列と支持体の表面との間における配列である。例えば、本発明の核酸アレイは、それぞれの標的マイクロRNA遺伝子に対して特異的である1つのプローブを有することができる。しかしながら、所望されるならば、核酸アレイは、何らかの発現した転写物(例えば、本明細書中に記載されるマイクロRNA遺伝子の転写物)に対して特異的である少なくとも2個、5個、10個、100個、200個、300個、400個、500個またはそれ以上のプローブを含有することができる。
キット
別の局面において、本発明は、本明細書中に記載されるようなポリペプチドおよびマイクロRNAの発現を分析するための方法、組成物およびシステムを具体化するキットを提供する。そのようなキットは、本明細書中に記載される核酸を、下記のうちのいずれかまたはすべてと一緒に含有する場合がある:アッセイ試薬、緩衝液、プローブおよび/またはプライマー、ならびに、無菌の生理的食塩または別の医薬的に許容されるエマルション基剤および懸濁基剤。加えて、キットは、本明細書中に記載される方法を実施するための指示(例えば、プロトコル)を含有する説明用資料を含む場合がある。例えば、キットは、標的mRNA配列または標的マイクロRNA配列の増幅、検出、特定または定量化のためのキットである場合がある。そのような目的を達成するために、キットは、好適なプライマー(例えば、ヘアピンプライマー)、順方向プライマー、逆方向プライマーおよびプローブを含有する場合がある。
別の局面において、本発明は、本明細書中に記載されるようなポリペプチドおよびマイクロRNAの発現を分析するための方法、組成物およびシステムを具体化するキットを提供する。そのようなキットは、本明細書中に記載される核酸を、下記のうちのいずれかまたはすべてと一緒に含有する場合がある:アッセイ試薬、緩衝液、プローブおよび/またはプライマー、ならびに、無菌の生理的食塩または別の医薬的に許容されるエマルション基剤および懸濁基剤。加えて、キットは、本明細書中に記載される方法を実施するための指示(例えば、プロトコル)を含有する説明用資料を含む場合がある。例えば、キットは、標的mRNA配列または標的マイクロRNA配列の増幅、検出、特定または定量化のためのキットである場合がある。そのような目的を達成するために、キットは、好適なプライマー(例えば、ヘアピンプライマー)、順方向プライマー、逆方向プライマーおよびプローブを含有する場合がある。
一例において、本発明のキットは、複数の異なる核酸(それぞれが上述の遺伝子の1つに対応する)が配置されている1つまたは複数のマイクロアレイ用スライド(または代替ではマイクロアレイフォーマット)を含む。キットはまた、複数の標識されたプローブを含むことができる。代替では、キットは、プローブとして好適である複数のポリヌクレオチド配列、および、含まれているポリヌクレオチド配列または実施者の裁量での他のポリヌクレオチド配列を最適化するために好適である標識の選択を含むことができる。一般に、少なくとも1つの含まれているポリヌクレオチド配列が、コントロール配列に、例えば、正規化遺伝子などに対応する。例示的な標識には、蛍光団、色素、放射性標識、酵素タグ(これらは核酸プライマーに連結される)が含まれるが、これらに限定されない。
1つの実施形態において、発現したRNAサンプルに対応する核酸を増幅するために好適であるキットが提供される。そのようなキットは、上記で記載される増幅方法のいずれかにおける使用のために好適である試薬およびプライマーを含む。代替では、または、加えて、キットは、プローブと、標的核酸サンプル(例えば、マイクロアレイ上に置かれる標的核酸サンプル)との間におけるハイブリダイゼーションに対応するシグナルを増幅するために好適である。
加えて、遺伝子発現分析のための生物学的サンプルを調製するために要求される1つまたは複数の材料および/または試薬が場合によりキットに含まれる。さらには、これらのキットに場合により含まれるものが、増幅のための必要な反応混合物を提供するための、
核酸を増幅するために好適である1つまたは複数の酵素(これには、様々なポリメラーゼ(RT、Taqなど)が含まれる)、1つまたは複数のデオキシヌクレオチド、および、緩衝液である。
核酸を増幅するために好適である1つまたは複数の酵素(これには、様々なポリメラーゼ(RT、Taqなど)が含まれる)、1つまたは複数のデオキシヌクレオチド、および、緩衝液である。
典型的には、上記キットは、mRNAまたはマイクロRNAを開始テンプレートとして使用して遺伝子発現パターンを分析するために用いられる。RNAテンプレートが、総細胞RNAまたは単離RNAのどちらかとして与えられる場合がある;両方のタイプのサンプルにより、同程度の結果がもたらされる。他の実施形態において、本発明において記載される方法およびキットは、tRNA、rRNAまたは他の転写産物を含めて、遺伝子発現の他の産物の定量化を可能にする。
場合により、本発明のキットはさらに、データの生成、分析および/または保管を促進させるための、また、データベースへのアクセスを容易にするためのソフトウエアを含む。ソフトウエアは、データの収集、保管および/または分析において使用することができる論理命令、命令セットまたは好適なコンピュータープログラムを含む。データの比較分析および関係分析が、提供されるソフトウエアを使用して可能である。
キットは場合により、それぞれの個々の試薬成分および/または酵素成分のための別個の容器を含有する。それぞれの成分が一般に、そのそれぞれの容器において小分けされるように好適であろう。キットの容器には場合により、少なくとも1つのバイアル、アンプルまたは試験チューブが含まれる。試薬が配置および/または小分けされ得るフラスコ、ビンおよび他の容器機構もまた可能である。キットの個々の容器が好ましくは、商用販売のために密封されて維持される。好適なより大きい容器には、所望されるバイアルが保持される射出成形された、またはブロー成形されたプラスチック容器が含まれる場合がある。説明書、例えば、本発明のキットの使用を詳述する文書化された指示またはビデオテープによる実演などが場合により、キットとともに提供される。
さらなる局面において、本発明は、本明細書中のいずれかの組成物またはキットの使用、あるいは、本明細書中のいずれかの方法またはアッセイの実施、ならびに/あるいは、本明細書中のいずれかのアッセイまたは方法を実施するためのいずれかの装置またはキットの使用を提供する。
「試験サンプル」または「生物学的サンプル」は、本明細書中で使用される場合、核酸を含む生物学的な組織または流体のサンプルを意味する場合がある。そのようなサンプルには、動物から単離される組織または体液が含まれるが、これらに限定されない。生物学的サンプルにはまた、組織の切片(例えば、生検サンプルおよび検死サンプルなど)、組織学的目的のために採取された凍結切片、血液、血漿、血清、痰、便、涙液、粘液、尿、滲出液、羊水、腹水、毛髪および皮膚が含まれる場合がある。生物学的サンプルにはまた、患者組織に由来する外植片ならびに初代細胞培養物および/または形質転換細胞培養物が含まれる。生物学的サンプルが、細胞のサンプルを動物から取り出すことによって提供される場合があり、しかし、生物学的サンプルはまた、以前に単離された細胞(例えば、別人によって、別のときに、かつ/または、別の目的のために単離された細胞)を使用することによって、または、本明細書中に記載される方法をインビボにおいて行うことによって達成することができる。アーカイブサンプル、例えば、処置履歴または結末履歴を有するサンプルなどもまた使用される場合がある。
用語「体液」または用語「身体流体」は、どのような流体であれ、動物の身体から得られる流体を示す。体液の例には、血漿、血清、血液、リンパ液、脳脊髄液、滑液、尿、唾液、粘液、粘液質(phlegm)および痰が含まれるが、これらに限定されない。体液サンプルが、どのような方法であれ、好適な方法によって集められる場合がある。体液サ
ンプルは直ちに使用される場合があり、または、その後の使用のために貯蔵される場合がある。この技術分野において知られている好適な貯蔵方法はどれもが、体液サンプルを貯蔵するために使用される場合がある:例えば、サンプルが約-20℃~約-70℃で凍結される場合がある。好適な体液が無細胞液である。「無細胞」液には、細胞が存在していないか、または、決定されるmiRNAレベルが、細胞部分ではなく、むしろ、サンプルの液体部分におけるそのレベルを反映するような低い濃度で存在する流体サンプルが含まれる。そのような無細胞体液は一般に、細胞含有体液を、例えば、遠心分離またはろ過によって処理して、細胞を除くことによってもたらされる。典型的には、無細胞体液は無傷の細胞を何ら含有せず、しかしながら、一部の無細胞体液は細胞断片または細胞破片を含有する場合がある。無細胞液の例には、血漿または血清、あるいは、細胞が除かれている体液が含まれる。
ンプルは直ちに使用される場合があり、または、その後の使用のために貯蔵される場合がある。この技術分野において知られている好適な貯蔵方法はどれもが、体液サンプルを貯蔵するために使用される場合がある:例えば、サンプルが約-20℃~約-70℃で凍結される場合がある。好適な体液が無細胞液である。「無細胞」液には、細胞が存在していないか、または、決定されるmiRNAレベルが、細胞部分ではなく、むしろ、サンプルの液体部分におけるそのレベルを反映するような低い濃度で存在する流体サンプルが含まれる。そのような無細胞体液は一般に、細胞含有体液を、例えば、遠心分離またはろ過によって処理して、細胞を除くことによってもたらされる。典型的には、無細胞体液は無傷の細胞を何ら含有せず、しかしながら、一部の無細胞体液は細胞断片または細胞破片を含有する場合がある。無細胞液の例には、血漿または血清、あるいは、細胞が除かれている体液が含まれる。
用語「遺伝子」は、本明細書中で使用される場合、転写調節配列および/または翻訳調節配列ならびに/あるいはコード領域または非翻訳配列(例えば、イントロン、5’非翻訳配列および3’非翻訳配列)を含む天然の遺伝子(例えば、ゲノム遺伝子)または合成遺伝子を示す。遺伝子のコード領域は、アミノ酸配列または機能的RNA(例えば、tRNA、rRNA、触媒RNA、siRNA、miRNAまたはアンチセンスRNA)をコードするヌクレオチド配列である場合がある。遺伝子はまた、当該コード領域に連結される5’非翻訳配列または3’非翻訳配列を場合により含むコード領域(例えば、エクソンおよびmiRNA)に対応するmRNAまたはcDNAである場合がある。遺伝子はまた、コード領域のすべてまたは一部ならびに/あるいはコード領域に連結される5’非翻訳配列または3’非翻訳配列を含むインビトロで作製される増幅された核酸分子である場合がある。この用語にはまた、既知遺伝子の機能不全の類縁体である偽遺伝子で、それらのタンパク質コード能を失っているか、または、他の場合には、細胞においてもはや発現されない偽遺伝子が含まれる。
「発現プロフィル」は、本明細書中で使用される場合、ゲノムの発現プロフィルを示し、例えば、マイクロRNAの発現プロフィルを示す。プロフィルが、核酸配列のレベルを決定するためのいずれかの好都合な手段によって、例えば、マイクロRNA、cRNAなどの定量的ハイブリダイゼーション、定量的PCR、定量化のためのELISAなどによって得られる場合があり、プロフィルは、2つのサンプルの間における示差的な遺伝子発現の分析を可能にする場合がある。対象または患者のサンプルが、例えば、細胞またはその集団が、例えば、組織がアッセイされる。サンプルが、どのような方法であれ、この技術分野において知られているような好都合な方法によって集められる。目的とする核酸配列は、本明細書中に記載されるものの核酸配列を含めて、予測的であることが見出される核酸配列であり、この場合、発現プロフィルは、列記された核酸配列のすべてを含めて、列記された核酸配列の5個、10個、20個、25個、50個、100個またはそれ以上についての発現データを含む場合がある。用語「発現プロフィル」はまた、核酸配列の存在量を測定されたサンプルにおいて測定することを意味する場合がある。
「示差的発現」は、細胞および組織の内部および間における時間的な遺伝子発現パターンおよび/または細胞の遺伝子発現パターンにおける質的または量的な差を示す。したがって、示差的に発現した遺伝子は質的には、例えば、疾患組織に対して正常組織において、活性化または不活性化を含めて、変化したその発現を有する可能性がある。遺伝子は、別の状態に対して、特定の状態において発現がオンまたはオフされる場合があり、したがって、2つ以上の状態の比較が可能となる。質的に調節された遺伝子は、標準的な技術によって検出可能であるかもしれない状態内または細胞タイプ内での発現パターンを示すであろう。いくつかの遺伝子が、1つの状態および1つの細胞タイプの両方においてではなく、1つの状態または1つの細胞タイプにおいて発現されるであろう。代替では、発現における差は、例えば、発現が調節され、すなわち、アップレギュレーションされ、その結果、増大した量の転写物をもたらし、または、ダウンレギュレーションされ、その結果、低下した量の転写物をもたらすという点で、量的である場合がある。発現が異なる程度は、標準的な特徴づけ技術により、例えば、発現アレイ、定量的逆転写酵素PCR、ノーザン分析およびRNase保護などにより定量化するために十分に大きいことだけを必要とする。
「核酸」または「オリゴヌクレオチド」または「ポリヌクレオチド」は、本明細書中で使用される場合、共有結合により連結されて一緒になる少なくとも2個のヌクレオチドを示す。単鎖を示すことにより、相補鎖の配列もまた定義される。したがって、核酸はまた、示された単鎖の相補鎖を包含する。核酸の多くの変異体が、与えられた核酸と同じ目的のために使用される場合がある。したがって、核酸はまた、実質的に同一の核酸およびその相補体を包含する。単鎖により、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件のもとで標的配列にハイブリダイゼーションすることがあるプローブが提供される。したがって、核酸はまた、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件のもとでハイブリダイゼーションするプローブを包含する。
核酸は一本鎖または二本鎖である場合があり、あるいは、二本鎖配列および一本鎖配列の両方からなる部分を含有する場合がある。核酸は、DNA(ゲノムDNAおよびcDNAの両方)、RNA、または、核酸が、デオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチドの組合せ、ならびに、ウラシル、アデニン、チミン、シトシン、グアニン、イノシン、キサンチン、ヒポキサンチン、イソシトシンおよびイソグアニンを含む様々な塩基の組合せを含むことがあるハイブリッドである場合がある。核酸が化学的合成法または組換え法によって得られる場合がある。
用語「プライマー」は、どのような核酸であれ、相補的な核酸分子にその3’末端においてハイブリダイゼーションすることができ、かつ、核酸ポリメラーゼによって伸長され得るフリーの3’ヒドロキシ末端を提供する核酸を示す。本明細書中で使用される場合、増幅プライマーは、遺伝子の5’領域または3’領域(プラス鎖およびマイナス鎖、それぞれ、または、逆に、マイナス鎖およびプラス鎖、それぞれ)にアニーリングすることができ、かつ、短い領域を間に含有する1対の核酸分子である。適切な条件のもとで、かつ、適切な試薬により、そのようなプライマーは、これらのプライマーによって挟まれるヌクレオチド配列を有する核酸分子の増幅を可能にする。インサイチュー法のために、細胞サンプルまたは組織サンプルを調製し、支持体(例えば、ガラススライドなど)に固定化し、その後、RNAにハイブリダイゼーションし得るプローブと接触させることができる。発現したRNAサンプルに対応する核酸を増幅するための代わりの方法には、例えば、米国特許第7,897,750号に記載される方法が含まれる。
用語「プローブ」は、本明細書中で使用される場合、1つまたは複数のタイプの化学結合を介して、通常の場合には、相補的な塩基対形成を介して、通常の場合には水素結合の形成を介して相補的配列の標的核酸に結合することができるオリゴヌクレオチドを示す。プローブは、ハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーに依存して、プローブ配列との完全な相補性を欠く標的配列と結合する場合がある。標的配列と、本明細書中に記載される一本鎖核酸との間におけるハイブリダイゼーションを妨げるであろう多くの塩基対ミスマッチが存在する場合がある。しかしながら、変異の数が非常に多くて、ハイブリダイゼーションが、最も小さいストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件のもとでさえ生じることができないならば、その配列は相補的な標的配列ではない。プローブは一本鎖である場合があり、または、部分的に一本鎖であり、かつ、部分的に二本鎖である場合がある。プローブのストランド状態(strandedness)が、標的配列の構造、組成および性質によって決定される。プローブは、例えば、ストレプトアビジン複合体が後で結合することがあるビオチンなどにより直接に標識される場合があり、または、
間接的に標識される場合がある。
間接的に標識される場合がある。
「相補体」または「相補的」は、核酸に言及するために本明細書中に記載される場合、核酸分子のヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログの間におけるワトソン・クリック塩基対形成(例えば、A-T/UおよびC-G)またはフーグスティーン塩基対形成を意味する場合がある。完全な相補体または完全に相補的は、核酸分子のヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログの間における100%相補的な塩基対形成を意味する場合がある。
「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」は、本明細書中に記載される場合、第1の核酸配列(例えば、プローブ)が、例えば、核酸の複雑な混合物などにおいて第2の核酸配列(例えば、標的)にハイブリダイゼーションする条件を示す。ストリンジェントな条件は配列依存的であり、状況毎に異なっており、当業者によって好適に選択することができる。ストリンジェントな条件が、規定されたイオン強度pHにおける特定の配列についての熱的融解点(Tm)よりも約5℃~10℃低くなるように選択される場合がある。Tmは、標的に対して相補的なプローブの50%が平衡状態において標的配列にハイブリダイゼーションする(規定されたイオン強度、pHおよび核濃度のもとでの)温度である場合がある(標的配列は過剰に存在するので、Tmにおいて、プローブの50%が平衡状態において使用される)。ストリンジェントな条件は、塩濃度が7.0~8.3のpHにおいて約1.0M未満のナトリウムイオンであり、例えば、約0.01M~1.0Mのナトリウムイオン濃度(または他の塩)などであり、かつ、温度が短いプローブ(例えば、約10ヌクレオチド~50ヌクレオチド)については少なくとも約30℃であり、長いプローブ(例えば、約50ヌクレオチドを超える)については少なくとも約60℃である条件である場合がある。ストリンジェントな条件はまた、脱安定化剤(例えば、ホルムアミドなど)の添加によって達成される場合がある。選択的または特異的なハイブリダイゼーションのために、陽性シグナルは、少なくとも2倍~10倍のバックグラウンドハイブリダイゼーションである場合がある。例示的なストリンジェントなハイブリダイゼーション条件には、下記の条件が含まれる:42℃でインキュベーションする場合には、50%のホルムアミド、5×SSCおよび1%のSDS、または、65℃でインキュベーションする場合には、5×SSC、1%のSDS、これには、0.2×SSCおよび0.1%のSDSにおける65℃での洗浄が伴う。しかしながら、温度以外のいくつかの要因、例えば、塩濃度などが、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響を及ぼす可能性があり、当業者は、類似するストリンジェンシーを達成するための様々な要因を好適に選択することができる。
本明細書中で使用される場合、用語「参照値」は、アッセイ結果に対して比較されたとき、特定の結末に対して統計学的に相関する値を示す。好ましい実施形態において、参照値が、マイクロRNAの発現を既知の臨床的結末と比較する研究の統計学的分析から決定される。参照値が閾値スコア値またはカットオフスコア値である場合がある。典型的には、参照値は、超えた場合(または下回った場合)には1つの結末がより確実であり、かつ、下回った場合には代わりの閾値がより確実である閾値であろう。
1つの実施形態において、参照レベルが、健康な(疾患非存在の)対象からなるコントロール集団から採取されるサンプルから得られる循環miRNAのレベルの平均として表される1つまたは複数の循環miRNAレベルである場合がある。別の実施形態において、参照レベルは、異なる時点での、例えば、アッセイ前での同じ対象におけるレベル、例えば、対象が疾患を発症する前に求められるレベル、または、治療を開始する前に求められるレベルなどである場合がある。一般に、サンプルは共通の因子によって正規化される。例えば、無細胞体液サンプルが体液量によって正規化され、細胞含有サンプルがタンパク質含有量または細胞数によって正規化される。核酸サンプルはまた、内部コントロール核酸に対して正規化される場合がある。
本明細書中に開示されるように、1つまたは複数のポリペプチドまたはRNA(mRNAまたはマイクロRNA)のレベルの差により、疾患またはその段階が暗示される。表現「レベルの差」は、コントロールレベルまたは参照レベルに対して比較されるような、サンプル中の特定のマーカー(例えば、核酸など)の量における違いを示す。例えば、特定のバイオマーカーの量が、参照レベルと比較して、新生物疾患を有する患者のサンプルにおいて、上昇した量で、または、低下した量で存在する場合がある。1つの実施形態において、「レベルの差」が、少なくとも約1%、2%、3%、5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、50%、60%、75%、80% 100%、150%、200%またはそれ以上である、コントロール(例えば、参照値)に対して比較されるようなサンプルに存在する特定のバイオマーカーとの間における差である場合がある。1つの実施形態において、「レベルの差」が、コントロールに対して比較されるようなサンプルに存在するバイオマーカーの量の間における統計学的に有意な差である場合がある。例えば、バイオマーカーの測定されたレベルが、いずれかのコントロール群または参照群の平均の約1.0標準偏差から、約1.5標準偏差から、約2.0標準偏差から、または、約2.5標準偏差からはずれているならば、差が統計学的に有意な差である場合がある。miRNA測定に関して、レベルが、Ct値としてリアルタイムPCRから測定される場合があり、この場合、Ct値は、下記の実施例において記載されるようなΔCt値に対して正規化される場合がある。
薬物スクリーニング
本発明は、メラノーマを処置するために、あるいは、内皮動員、細胞浸潤または転移性血管形成を阻害するために有用である化合物を特定するための方法を提供する。
本発明は、メラノーマを処置するために、あるいは、内皮動員、細胞浸潤または転移性血管形成を阻害するために有用である化合物を特定するための方法を提供する。
スクリーニングされるための候補化合物(例えば、タンパク質、ペプチド、ペプチド模倣体、ペプトイド、抗体、小分子または他の薬物)を、数多くの取り組みのいずれかをこの技術分野において知られているコンビナトリアルライブラリー方法において使用して得ることができる。そのようなライブラリーには、下記のライブラリーが含まれる:ペプチドライブラリー、ペプトイドライブラリー(ペプチドの機能性を有し、しかし、酵素分解に対して抵抗性である新規な非ペプチド骨格を有する分子のライブラリー)、空間的にアドレス指定可能な並列固相ライブラリーまたは液相ライブラリー、デコンボルーションまたはアフィニティークロマトグラフィー選抜によって得られる合成ライブラリー、および、「一ビーズ一化合物」ライブラリー。例えば、Zuckermann他、1994、J.Med.Chem.、37:2678~2685、および、Lam、1997、Anticancer Drug Des.、12:145を参照のこと。分子ライブラリーを合成するための様々な方法の例を、例えば、DeWitt他、1993、PNAS USA、90:6909;Erb他、1994、PNAS USA、91:11422;Zuckermann他、1994、J.Med.Chem.、37:2678;Cho他、1993、Science、261:1303;Carrell他、1994、Angew.Chem.Int.Ed.Engl.、33:2059;Carell他、1994、Angew.Chem.Int.Ed.Engl.、33:2061;およびGallop他、1994、J.Med.Chem.、37:1233において見出すことができる。化合物のライブラリーが溶液で提示される場合があり(例えば、Houghten、1992、Biotechniques、13:412~421)、あるいは、ビーズ(Lam、1991、Nature、354:82~84)、チップ(Fodor、1993、Nature、364:555~556)、細菌(米国特許第5,223,409号)、胞子(米国特許第5,223,409号)、プラスミド(Cull他、1992、PNAS USA、89:1865~1869)またはファージ(ScottおよびSmith、1990、Science、249:386~390;Devlin、1990、Science、249:404~406;Cwirla他、1990、PNAS USA、87:6378~6382;Felici、1991、J.Mol.Biol.、222:301~310;ならびに米国特許第5,223,409号)において提示される場合がある。
有用な化合物を特定するために、試験化合物を、上述の転移促進因子または転移抑制因子から選択されるマーカー遺伝子のプロモーターに作動可能に連結される核酸によってコードされるレポーター遺伝子を発現する試験細胞を含有する系と接触させることができる。この系はインビトロ細胞株モデルまたはインビボ動物モデルであることが可能である。細胞は上記遺伝子を自然の状態で発現することができ、または、組換え核酸を発現するように改変することができる。組換え核酸は、異種プロモーターに対するレポーターポリペプチドをコードする核酸を含有することができる。その後、miRNA、ポリペプチドまたはレポーターポリペプチドの発現レベルが測定される。
ポリペプチドについては、発現レベルをmRNAレベルまたはタンパク質レベルのどちらにおいてでも決定することができる。細胞、組織サンプルまたは体液におけるmRNAレベルを測定する様々な方法がこの技術分野では広く知られている。mRNAレベルを測定するために、細胞を溶解することができ、かつ、溶解物におけるmRNAのレベルを、あるいは、溶解物から精製または半精製されるRNAにおけるmRNAのレベルを、例えば、ハイブリダイゼーションアッセイ(検出可能に標識された遺伝子特異的なDNAプローブまたはRNAプローブを使用する)、および、定量的または半定量的なRT-PCR(適切な遺伝子特異的プライマーを使用する)によって決定することができる。代替では、定量的または半定量的なインサイチューハイブリダイゼーションアッセイを、組織切片または非溶解細胞懸濁物および検出可能に(例えば、蛍光または酵素)標識されたDNAプローブまたはRNAプローブを使用して行うことができる。さらなるmRNA定量化方法には、RNA保護アッセイ(RPA)およびSAGEが含まれる。タンパク質レベルを細胞サンプルまたは組織サンプルにおいて測定する方法もまたこの技術分野において知られている。
メラノーマを処置するための、あるいは、内皮動員、細胞浸潤または転移性血管形成を阻害するための候補化合物の有効性を決定するために、上記で記載される様式で得られるレベルを、コントロールレベル(例えば、候補化合物の非存在下で得られるレベル)と比較することができる。化合物は、(i)転移抑制因子のレベルがコントロール値または参照値よりも低いならば、あるいは、(ii)転移促進因子のレベルがコントロール値または参照値よりも高いならば、効果的であるとして特定される。このようにして特定される化合物の効力を、下記の実施例において開示されるようなインビトロ細胞培養モデルまたはインビボ動物モデルを使用してさらに確認することができる。
実施例1 材料および方法
本実施例は、下記の実施例2~実施例11において使用される材料および方法を記載する。
本実施例は、下記の実施例2~実施例11において使用される材料および方法を記載する。
動物研究
すべてのマウス実験を、ロックフェラー大学における施設内動物管理使用委員会(IACUC)によって承認されるプロトコルに従って行った。6週齢~8週齢の週齢一致および性一致のマウスを、以前に記載されたように原発性腫瘍の成長アッセイおよび転移アッセイのために使用した(Minn他、2005;Tavazoie他、2008)。拡張された実験手順を参照のこと。
すべてのマウス実験を、ロックフェラー大学における施設内動物管理使用委員会(IACUC)によって承認されるプロトコルに従って行った。6週齢~8週齢の週齢一致および性一致のマウスを、以前に記載されたように原発性腫瘍の成長アッセイおよび転移アッセイのために使用した(Minn他、2005;Tavazoie他、2008)。拡張された実験手順を参照のこと。
細胞培養
すべてのガン細胞株を以前に記載されたように培養した(Tavazoie他、2008)。293T細胞およびヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)を標準的な条件で維持した。細胞株およびインビトロでの機能的アッセイにおけるmiRNA研究および遺伝子ノックダウン/過剰発現研究が、拡張された実験手順において詳述される。
すべてのガン細胞株を以前に記載されたように培養した(Tavazoie他、2008)。293T細胞およびヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)を標準的な条件で維持した。細胞株およびインビトロでの機能的アッセイにおけるmiRNA研究および遺伝子ノックダウン/過剰発現研究が、拡張された実験手順において詳述される。
マイクロアレイハイブリダイゼーション
様々な高転移性派生物にわたって脱調節されるmiRNAを特定するために、小さいRNAを、MeWo細胞株およびA375細胞株に由来する総RNAから濃縮し、LC Sciencesによるプロファイリングに供した。miR-199a-3p、miR-199a-5pおよびmiR-1908の潜在的な遺伝子標的を特定するために、MeWo細胞株から得られる総RNAがロックフェラー大学ゲノミクスコア施設によって標識され、Illumina HT-12 v3 Expression BeadChipアレイへのハイブリダイゼーションに供された。miRNA標的およびmRNA標的に到達するために使用される閾値および判断基準については、拡張された実験手順を参照のこと。
様々な高転移性派生物にわたって脱調節されるmiRNAを特定するために、小さいRNAを、MeWo細胞株およびA375細胞株に由来する総RNAから濃縮し、LC Sciencesによるプロファイリングに供した。miR-199a-3p、miR-199a-5pおよびmiR-1908の潜在的な遺伝子標的を特定するために、MeWo細胞株から得られる総RNAがロックフェラー大学ゲノミクスコア施設によって標識され、Illumina HT-12 v3 Expression BeadChipアレイへのハイブリダイゼーションに供された。miRNA標的およびmRNA標的に到達するために使用される閾値および判断基準については、拡張された実験手順を参照のこと。
ヒトメラノーマ皮膚病変部におけるmiRNA発現の分析
本研究で使用されるすべてのヒト臨床サンプルをIRB指針に従って得て、処理し、分析した。総RNAを、MSKCCにおいて以前に患者から切除された原発性メラノーマ皮膚病変部のパラフィン包埋された断面切片から抽出し、特異的なmiRNAの発現レベルを、TaqMan miRNA Assays(Applied Biosystems)を使用して盲検様式で分析した。それぞれの患者の転移非存在生存データを原発性腫瘍のmiRNA発現値の関数として表すカプラン・マイヤー曲線を、GraphPad Prismソフトウエアパッケージを使用して作製した。
本研究で使用されるすべてのヒト臨床サンプルをIRB指針に従って得て、処理し、分析した。総RNAを、MSKCCにおいて以前に患者から切除された原発性メラノーマ皮膚病変部のパラフィン包埋された断面切片から抽出し、特異的なmiRNAの発現レベルを、TaqMan miRNA Assays(Applied Biosystems)を使用して盲検様式で分析した。それぞれの患者の転移非存在生存データを原発性腫瘍のmiRNA発現値の関数として表すカプラン・マイヤー曲線を、GraphPad Prismソフトウエアパッケージを使用して作製した。
インビボLNA治療
4×104個のMeWo-LM2細胞を尾静脈注入した後、NOD-SCIDマウスを、0.1mLのPBSにおいて送達される12.5mg/kgの組合せ用量での、miR-199a-3p、miR-199a-5pおよびmiR-1908に対してアンチセンスであるインビボ最適化LNA(Exiqon)により4週間にわたって週に2回、静脈内投与により処置した。
4×104個のMeWo-LM2細胞を尾静脈注入した後、NOD-SCIDマウスを、0.1mLのPBSにおいて送達される12.5mg/kgの組合せ用量での、miR-199a-3p、miR-199a-5pおよびmiR-1908に対してアンチセンスであるインビボ最適化LNA(Exiqon)により4週間にわたって週に2回、静脈内投与により処置した。
組織学
全体的な巨視的転移性結節可視化のために、5μmの厚さの肺組織切片をH&E染色した。インビボでの内皮含有量分析のために、肺切片を、MECA-32に対する抗体(Developmental Studies Hybridoma Bank、The University of Iowa、IA)(これはマウスの内皮細胞を標識する)と、ヒトビメンチンに対する抗体(Vector Laboratories)(これはヒトのメラノーマ細胞を標識する)とにより二重染色した。拡張された実験手順を参照のこと。
全体的な巨視的転移性結節可視化のために、5μmの厚さの肺組織切片をH&E染色した。インビボでの内皮含有量分析のために、肺切片を、MECA-32に対する抗体(Developmental Studies Hybridoma Bank、The University of Iowa、IA)(これはマウスの内皮細胞を標識する)と、ヒトビメンチンに対する抗体(Vector Laboratories)(これはヒトのメラノーマ細胞を標識する)とにより二重染色した。拡張された実験手順を参照のこと。
データ分析
すべてのデータが平均±SEMとして表される。コルモゴロフ・スミルノフ検定を使用して、転移性血管密度累積分布における差の有意性を求めた。転移の結末を予測するmiRNAの予後力を、マンテル・コックス・ログランク検定を使用して有意性について検定した。片側マン・ホィットニーt検定を使用して、非ガウス型のバイオルミネセンス測定値についての有意性値を求めた。すべての他の比較のために、片側スチューデントt検定を使用した。0.05未満のp値を、統計学的に有意であると見なした。
すべてのデータが平均±SEMとして表される。コルモゴロフ・スミルノフ検定を使用して、転移性血管密度累積分布における差の有意性を求めた。転移の結末を予測するmiRNAの予後力を、マンテル・コックス・ログランク検定を使用して有意性について検定した。片側マン・ホィットニーt検定を使用して、非ガウス型のバイオルミネセンス測定値についての有意性値を求めた。すべての他の比較のために、片側スチューデントt検定を使用した。0.05未満のp値を、統計学的に有意であると見なした。
インビボ選抜、実験的転移および原発性腫瘍成長アッセイ
すべてのマウス実験を、ロックフェラー大学における施設内動物管理使用委員会(IACUC)によって承認されるプロトコルに従って行った。多数の転移性派生物を2つの独立したヒトメラノーマ細胞株から生じさせるために、インビボ選抜を以前に記載されたように行った(Minn他、2005、Nature、436、518~524;PollackおよびFidler、1982、J.Natl.Cancer Inst.、69、137~141)。簡単に記載すると、1×106個の色素沈着MeWoメラノーマ親細胞または色素非沈着A375メラノーマ親細胞を0.1mLのPBSに再懸濁し、6週齢~8週齢の免疫低下NOD-SCIDマウスに静脈内注入した。肺転移物が形成された後、結節を分離し、細胞をインビトロ増殖させ、これにより、第1世代の肺転移性派生物(LM1)を生じさせた。その後、LM1細胞を、2×105個の細胞をNOD-SCIDマウスに尾静脈を介して注入することによるもう1回のインビボ選抜に供し、これにより、転移性結節を生じさせ、その後の分離により、第2世代の肺転移性派生物(LM2)を得た。A375細胞株については、3回目のインビボ選抜を行い、これにより、高転移性のA375-LM3派生物を得た。
すべてのマウス実験を、ロックフェラー大学における施設内動物管理使用委員会(IACUC)によって承認されるプロトコルに従って行った。多数の転移性派生物を2つの独立したヒトメラノーマ細胞株から生じさせるために、インビボ選抜を以前に記載されたように行った(Minn他、2005、Nature、436、518~524;PollackおよびFidler、1982、J.Natl.Cancer Inst.、69、137~141)。簡単に記載すると、1×106個の色素沈着MeWoメラノーマ親細胞または色素非沈着A375メラノーマ親細胞を0.1mLのPBSに再懸濁し、6週齢~8週齢の免疫低下NOD-SCIDマウスに静脈内注入した。肺転移物が形成された後、結節を分離し、細胞をインビトロ増殖させ、これにより、第1世代の肺転移性派生物(LM1)を生じさせた。その後、LM1細胞を、2×105個の細胞をNOD-SCIDマウスに尾静脈を介して注入することによるもう1回のインビボ選抜に供し、これにより、転移性結節を生じさせ、その後の分離により、第2世代の肺転移性派生物(LM2)を得た。A375細胞株については、3回目のインビボ選抜を行い、これにより、高転移性のA375-LM3派生物を得た。
転移をバイオルミネセンス画像化によりインビボにおいてモニターするために、A375親細胞およびMeWo親細胞ならびにそれらの転移性派生物を、ルシフェラーゼレポーターを発現するレトロウイルス構築物により形質導入した(Ponomarev他、2004、Eur J Nucl Med Mol Imaging、31、740~751)。すべての転移実験のために、肺または全身でのコロニー形成を以前に記載されたように非浸襲性バイオルミネセンス画像化により経時的にモニターし、定量化した(Minn他、2005)。インビボ選抜が達成されたかどうかを明らかにするために、4×104個のMeWo親細胞またはMeWo-LM2細胞および1×105個のA375親細胞またはA375-LM3細胞を0.1mLのPBSに再懸濁し、6週齢~8週齢のNOD-SCIDマウスに外側尾静脈を介して注入した。肺でのコロニー形成に対する推定される促進因子miRNAの影響を調べる実験的転移アッセイのために、miR-199a、miR-1908、miR-214またはコントロールヘアピンを過剰発現する4×104個のMeWo親細胞、miR-199a-3p、miR-199a-5p、miR-1908またはコントロール配列の発現が沈黙させられる4×104個のMeWo-LM2細胞、および、miR-199a-3p、miR-199a-5p、miR-1908またはコントロール配列について阻害される2×105個のA375-LM3細胞を0.1mLのPBSに再懸濁し、6週齢~8週齢のNOD-SCIDマウスに尾静脈注入した。エピスタシス実験のために、ApoE、DNAJA4またはコントロール配列を標的化するshRNAを発現する、あるいは、LRP1またはコントロール配列をmiRNA阻害の状況で阻害するsiRNAを発現する1×105個のMeWo-LM2細胞を6週齢~8週齢のNOD-SCIDマウスに静脈内注入した。ApoE前処置実験のために、MeWo-LM2細胞をApoEまたはBSAの100μg/mLでの存在下において37℃でインキュベーションした。24時間後、4×104個の細胞を7週齢のNOD-SCIDマウスに尾静脈を介して注入した。高転移性メラノーマ細胞を、miR-199a-3p、miR-199a-5pおよびmiR-1908を標的化するLNAにより前処置することの、転移に対する影響を明らかにするために、MeWo-LM2細胞を、それぞれのLNAにより個々に、3つすべてのmiRNAを標的化するLNAのカクテルにより、または、コントロールLNAによりトランスフェクションした。48時間後、1×105個の細胞(0.1mLのPBSに再懸濁される)を肺での転移性コロニー形成の研究のために7週齢のNOD-SCIDマウスに静脈内投与し、または、全身的な転移アッセイのために7週齢の無胸腺ヌードマウスに心臓内注入により投与した。転移に対するApoEの遺伝的欠失の影響を明らかにするために、8週齢のC57BL/6-WTマウスまたはC57BL/6-ApoE-/-マウスに、5×104個のB16F10マウスメラノーマ細胞を静脈内注入した。原発性腫瘍成長の研究のために、miR-199a、miR-1908またはコントロールヘアピンを過剰発現する1×106個の親MeWo細胞をマトリゲルと1:1で混合し、6週齢の免疫不全NOD-SCIDマウスの下部右側わき腹に皮下注入した。動物を腫瘍形成について毎週触診し、腫瘍形成後、かなり大きい腫瘍を週に2回測定した。腫瘍体積を、(最少直径)2×(最大直径)/2として計算した。
レンチウイルスによるmiRNA阻害および遺伝子ノックダウン
293T細胞を10cmのプレートに播種し、60%のコンフルエンシーを達成させた。トランスフェクションに先立って、細胞培地を、10%のFBSが補充される新鮮な抗生物質非含有DMEM培地により取り換えた。6μgのベクターA、12μgのベクターK、および、12μgの適切なmiR-Zip(System Biosciences、Mountain View、CA)またはshRNAプラスミド構築物(MSKCC HTS Core Facility、New York、NY)を、60μLのTransIT-293トランスフェクション試薬(MIR 2700、Minis Bio LLC、Madison、WI)を使用して共トランスフェクションした。細胞を37℃で48時間インキュベーションし、ウイルスを、細胞培地を2000gで10分間遠心分離し、その後、0.45μmのフィルターによるウイルスろ過を行うことによって集めた。1×105個のガン細胞を、10μg/mLのポリブレン(TR-1003-G、Millipore、Billerica、MA)の存在下で6時間、2mLの適切なウイルスにより形質導入した。48時間後、2μg/mLのピューロマイシン(P8833、Sigma-Aldrich、St Louis、MO)をレンチウイルス選抜のために細胞培地に加えた。細胞をピューロマイシン選抜の状態で72時間保った。下記のmiR-Zip配列を使用した:
miR-Zip- 199a-3p:5'-GATCCGACAGTAGCCTGCACATTAGTCACTTCCTGTCAGTAACCAATGTGCAGACTACTGTTTTTTGAATT-3'
miR-Zip- 199a-5p: 5'-GATCCGCCCAGTGCTCAGACTACCCGTGCCTTCCTGTCAGGAACAGGTAGTCTGAACACTGGGTTTTTGAATT-3'
miR-Zip-1908 5'-GATCCGCGGCGGGAACGGCGATCGGCCCTTCCTGTCAGGACCAATCGCCGTCC CCGCCGTTTT
TGAATT-3'
下記のshRNA配列を使用した:
shAPOE1:
5'CCGGGAAGGAGTTGAAGGCCTACAACTCGAGTTGTAGGCCTTCAACTCCTTCTTTTT3'
shAPOE2:
5'CCGGGCAGACACTGTCTGAGCAGGTCTCGAGACCTGCTCAGACAGTGTCTGCTTTTT3'
shDNAJA41:
5'CCGGGCGAGAAGTTTAAACTCATATCTCGAGATATGAGTTTAAACTTCTCGCTTTTT3'
shDNAJA42:
5'CCGGCCTCGACAGAAAGTGAGGATTCTCGAGAATCCTCACTTTCTGTCGAGGT TTTT3'
レトロウイルスによるmiRNAおよび遺伝子の過剰発現
6μgのベクターVSVG、12μgのベクターGag-Pol、および、ヒトApoE、DNAJA4のコード配列を含有する12μgのpBabeプラスミド、または、空のベクター、あるいは、miR-199a、miR-214、miR-1908またはコントロールヘアピンの前駆体配列を含有するmiR-Vecを、60%コンフルエンスの293T細胞に、60μLのTransIT-293トランスフェクション試薬を使用して共トランスフェクションした。細胞を37℃で48時間インキュベーションし、その後、ウイルスを集め、10μg/mLのポリブレンの存在下で6時間、ガン細胞に形質導入した。48時間後、2μg/mLのピューロマイシンまたは10μg/mLのブラストサイジン(15205、Sigma-Aldrich、St Louis、MO)をレトロウイルス選抜のために細胞培地に加えた。細胞を、ピューロマイシン選抜の状態で72時間、または、ブラストサイジン選抜の状態で7日間保った。下記のクローニング用プライマーをApoEおよびDNAJA4のコード配列の過剰発現のために使用した:
ApoE CDS Fwd: 5'-TCATGAGGATCCATGAAGGTTCTGTGGGCT-3'
ApoE CDS Rev: 5' -T AGC AG AATTCTC AGTGATTGTCGCTGGG-3'
DNAJA4 CDS Fwd: 5'-ATCCCTGGATCCATGTGGGAAAGCCTGACCC-3'
DNAJA4 CDS Rev: 5'-TACCATGTCGACTCATGCCGTCTGGCACTGC-3'
LNAに基づくmiRNAノックダウン
成熟型miR-199a-3p、成熟型miR-199a-5p、成熟型miR-1908またはコントロール配列に対して相補的なLNA(それぞれ426917-00、426918-00、426878-00および1990050;Exiqon、Vedbaek、デンマーク)を、抗生物質非含有培地で培養された50%コンフルエンスのMeWo-LM2ガン細胞に、リポフェクタミン(商標)2000トランスフェクション試薬(11668-09、Invitrogen、Carlsbad、CA)を使用して50nMの最終濃度でトランスフェクションした。8時間後、トランスフェクション培地を新鮮な培地により取り換えた。48時間後、1×105個の細胞を、肺での転移性コロニー形成を評価するためにNOD-SCIDマウスに静脈内注入し、または、全身転移を評価するために無胸腺ヌードマウスに心臓内注入により注入した。細胞浸潤および内皮動員のインビトロアッセイのために、細胞をトランスフェクション後96時間で使用した。
293T細胞を10cmのプレートに播種し、60%のコンフルエンシーを達成させた。トランスフェクションに先立って、細胞培地を、10%のFBSが補充される新鮮な抗生物質非含有DMEM培地により取り換えた。6μgのベクターA、12μgのベクターK、および、12μgの適切なmiR-Zip(System Biosciences、Mountain View、CA)またはshRNAプラスミド構築物(MSKCC HTS Core Facility、New York、NY)を、60μLのTransIT-293トランスフェクション試薬(MIR 2700、Minis Bio LLC、Madison、WI)を使用して共トランスフェクションした。細胞を37℃で48時間インキュベーションし、ウイルスを、細胞培地を2000gで10分間遠心分離し、その後、0.45μmのフィルターによるウイルスろ過を行うことによって集めた。1×105個のガン細胞を、10μg/mLのポリブレン(TR-1003-G、Millipore、Billerica、MA)の存在下で6時間、2mLの適切なウイルスにより形質導入した。48時間後、2μg/mLのピューロマイシン(P8833、Sigma-Aldrich、St Louis、MO)をレンチウイルス選抜のために細胞培地に加えた。細胞をピューロマイシン選抜の状態で72時間保った。下記のmiR-Zip配列を使用した:
miR-Zip- 199a-3p:5'-GATCCGACAGTAGCCTGCACATTAGTCACTTCCTGTCAGTAACCAATGTGCAGACTACTGTTTTTTGAATT-3'
miR-Zip- 199a-5p: 5'-GATCCGCCCAGTGCTCAGACTACCCGTGCCTTCCTGTCAGGAACAGGTAGTCTGAACACTGGGTTTTTGAATT-3'
miR-Zip-1908 5'-GATCCGCGGCGGGAACGGCGATCGGCCCTTCCTGTCAGGACCAATCGCCGTCC CCGCCGTTTT
TGAATT-3'
下記のshRNA配列を使用した:
shAPOE1:
5'CCGGGAAGGAGTTGAAGGCCTACAACTCGAGTTGTAGGCCTTCAACTCCTTCTTTTT3'
shAPOE2:
5'CCGGGCAGACACTGTCTGAGCAGGTCTCGAGACCTGCTCAGACAGTGTCTGCTTTTT3'
shDNAJA41:
5'CCGGGCGAGAAGTTTAAACTCATATCTCGAGATATGAGTTTAAACTTCTCGCTTTTT3'
shDNAJA42:
5'CCGGCCTCGACAGAAAGTGAGGATTCTCGAGAATCCTCACTTTCTGTCGAGGT TTTT3'
レトロウイルスによるmiRNAおよび遺伝子の過剰発現
6μgのベクターVSVG、12μgのベクターGag-Pol、および、ヒトApoE、DNAJA4のコード配列を含有する12μgのpBabeプラスミド、または、空のベクター、あるいは、miR-199a、miR-214、miR-1908またはコントロールヘアピンの前駆体配列を含有するmiR-Vecを、60%コンフルエンスの293T細胞に、60μLのTransIT-293トランスフェクション試薬を使用して共トランスフェクションした。細胞を37℃で48時間インキュベーションし、その後、ウイルスを集め、10μg/mLのポリブレンの存在下で6時間、ガン細胞に形質導入した。48時間後、2μg/mLのピューロマイシンまたは10μg/mLのブラストサイジン(15205、Sigma-Aldrich、St Louis、MO)をレトロウイルス選抜のために細胞培地に加えた。細胞を、ピューロマイシン選抜の状態で72時間、または、ブラストサイジン選抜の状態で7日間保った。下記のクローニング用プライマーをApoEおよびDNAJA4のコード配列の過剰発現のために使用した:
ApoE CDS Fwd: 5'-TCATGAGGATCCATGAAGGTTCTGTGGGCT-3'
ApoE CDS Rev: 5' -T AGC AG AATTCTC AGTGATTGTCGCTGGG-3'
DNAJA4 CDS Fwd: 5'-ATCCCTGGATCCATGTGGGAAAGCCTGACCC-3'
DNAJA4 CDS Rev: 5'-TACCATGTCGACTCATGCCGTCTGGCACTGC-3'
LNAに基づくmiRNAノックダウン
成熟型miR-199a-3p、成熟型miR-199a-5p、成熟型miR-1908またはコントロール配列に対して相補的なLNA(それぞれ426917-00、426918-00、426878-00および1990050;Exiqon、Vedbaek、デンマーク)を、抗生物質非含有培地で培養された50%コンフルエンスのMeWo-LM2ガン細胞に、リポフェクタミン(商標)2000トランスフェクション試薬(11668-09、Invitrogen、Carlsbad、CA)を使用して50nMの最終濃度でトランスフェクションした。8時間後、トランスフェクション培地を新鮮な培地により取り換えた。48時間後、1×105個の細胞を、肺での転移性コロニー形成を評価するためにNOD-SCIDマウスに静脈内注入し、または、全身転移を評価するために無胸腺ヌードマウスに心臓内注入により注入した。細胞浸潤および内皮動員のインビトロアッセイのために、細胞をトランスフェクション後96時間で使用した。
siRNAに基づくmRNAノックダウン
LRP1、LRP8、VLDLR、LDLRまたはコントロール配列を標的化するsiRNAを、ガン細胞またはHUVECに、リポフェクタミン(商標)2000トランスフ
ェクション試薬を使用して100nMの最終濃度でトランスフェクションした。5時間後、トランスフェクション培地を新鮮な培地により取り換えた。細胞をトランスフェクション後96時間でマトリゲル浸潤アッセイおよび内皮動員アッセイに供した。LRP1またはコントロール配列をmiRNA阻害の状況で標的化するsiRNAにより形質導入される細胞を、トランスフェクション後72時間での肺でのコロニー形成アッセイのために尾静脈注入した。コントロールの非標的化siRNAをDharmaconから得た。下記のLRP1標的配列およびLRP8標的配列を使用した:
siLRP11: 5'-CGAGGACGAUGACUGCUUA-3';
siLRP12: 5'-GCUAUGAGUUUAAGAAGUU-3';
S1LRP81:5 '-CGAGGACGAUGACUGCUUA-3';
siLRP82: 5'-GAACUAUUCACGCCUCAUC-3'.
細胞増殖アッセイ
miR-199aまたはmiR-1908の過剰発現およびコンビナトリアルLNA誘導のmiRNA阻害の細胞増殖に対する影響を明らかにするために、2.5×104個の細胞を三連で6ウエルプレートに播種し、生細胞を5日後に計数した。組換えApoEの添加のメラノーマ細胞増殖または内皮細胞増殖に対する影響を評価するために、3×104個のメラノーマMeWo-LM2細胞または内皮細胞をApoE(100μM)またはBSA(100μM)の存在下でインキュベーションした。生細胞を、8時間後、24時間後、48時間後、72時間後および120時間後に計数した。
LRP1、LRP8、VLDLR、LDLRまたはコントロール配列を標的化するsiRNAを、ガン細胞またはHUVECに、リポフェクタミン(商標)2000トランスフ
ェクション試薬を使用して100nMの最終濃度でトランスフェクションした。5時間後、トランスフェクション培地を新鮮な培地により取り換えた。細胞をトランスフェクション後96時間でマトリゲル浸潤アッセイおよび内皮動員アッセイに供した。LRP1またはコントロール配列をmiRNA阻害の状況で標的化するsiRNAにより形質導入される細胞を、トランスフェクション後72時間での肺でのコロニー形成アッセイのために尾静脈注入した。コントロールの非標的化siRNAをDharmaconから得た。下記のLRP1標的配列およびLRP8標的配列を使用した:
siLRP11: 5'-CGAGGACGAUGACUGCUUA-3';
siLRP12: 5'-GCUAUGAGUUUAAGAAGUU-3';
S1LRP81:5 '-CGAGGACGAUGACUGCUUA-3';
siLRP82: 5'-GAACUAUUCACGCCUCAUC-3'.
細胞増殖アッセイ
miR-199aまたはmiR-1908の過剰発現およびコンビナトリアルLNA誘導のmiRNA阻害の細胞増殖に対する影響を明らかにするために、2.5×104個の細胞を三連で6ウエルプレートに播種し、生細胞を5日後に計数した。組換えApoEの添加のメラノーマ細胞増殖または内皮細胞増殖に対する影響を評価するために、3×104個のメラノーマMeWo-LM2細胞または内皮細胞をApoE(100μM)またはBSA(100μM)の存在下でインキュベーションした。生細胞を、8時間後、24時間後、48時間後、72時間後および120時間後に計数した。
マトリゲル浸潤アッセイ
ガン細胞を、FBSが0.2%のDMEM系培地における12時間の血清飢餓に供した。トランスウエル浸潤チャンバー(354480、BD Biosciences、Bedford、MA)を、0.5mLの飢餓培地を上部チャンバーおよび底部チャンバーに加えることによってアッセイ開始前に事前に平衡化させた。30分後、上部チャンバー内の培地を除き、1×105個のガン細胞を含有する0.5mLの培地をそれぞれのマトリゲル被覆トランスウエル挿入物の中に加え、37℃で24時間インキュベーションした。中和抗体実験および/または組換えタンパク質実験のために、抗体/組換えタンパク質を、図に示されるような下記の濃度でアッセイ開始時にそれぞれのウエルに加えた:5μg/mL~40μg/mLの抗ApoE 1D7(Heart Institute、University of Ottawa)、5μg/mL~40μg/mLの抗IgG(AB-108-C、R&D Systems、Minneapolis、MN)、100μMの組換えヒトApoE3(4696、Bio Vision、Mountain View、CA)および100μMのBSA(A2153、Sigma-Aldrich)。アッセイが完了したとき、マトリゲル被覆挿入物をPBSにより洗浄し、それぞれの挿入物の上部面における細胞をかき取り、挿入物を4%パラホルムアルデヒドにおいて15分間、固定処理した。その後、挿入物を切り出し、DAPI(H-1000、Vector Laboratories、Burlingame、CA)を含有するVectaShield固定用媒体を使用してスライドに固定した。それぞれの挿入物の基部面を、倒立型蛍光顕微鏡(Zeiss Axiovert 40 CFL)を5×の倍率で使用して画像化し、これにより、3枚の代表的な画像をそれぞれの挿入物について撮影した。浸潤した細胞の数を、ImageJ(NIH)を使用して定量化した。
ガン細胞を、FBSが0.2%のDMEM系培地における12時間の血清飢餓に供した。トランスウエル浸潤チャンバー(354480、BD Biosciences、Bedford、MA)を、0.5mLの飢餓培地を上部チャンバーおよび底部チャンバーに加えることによってアッセイ開始前に事前に平衡化させた。30分後、上部チャンバー内の培地を除き、1×105個のガン細胞を含有する0.5mLの培地をそれぞれのマトリゲル被覆トランスウエル挿入物の中に加え、37℃で24時間インキュベーションした。中和抗体実験および/または組換えタンパク質実験のために、抗体/組換えタンパク質を、図に示されるような下記の濃度でアッセイ開始時にそれぞれのウエルに加えた:5μg/mL~40μg/mLの抗ApoE 1D7(Heart Institute、University of Ottawa)、5μg/mL~40μg/mLの抗IgG(AB-108-C、R&D Systems、Minneapolis、MN)、100μMの組換えヒトApoE3(4696、Bio Vision、Mountain View、CA)および100μMのBSA(A2153、Sigma-Aldrich)。アッセイが完了したとき、マトリゲル被覆挿入物をPBSにより洗浄し、それぞれの挿入物の上部面における細胞をかき取り、挿入物を4%パラホルムアルデヒドにおいて15分間、固定処理した。その後、挿入物を切り出し、DAPI(H-1000、Vector Laboratories、Burlingame、CA)を含有するVectaShield固定用媒体を使用してスライドに固定した。それぞれの挿入物の基部面を、倒立型蛍光顕微鏡(Zeiss Axiovert 40 CFL)を5×の倍率で使用して画像化し、これにより、3枚の代表的な画像をそれぞれの挿入物について撮影した。浸潤した細胞の数を、ImageJ(NIH)を使用して定量化した。
内皮動員アッセイ
5×104個のガン細胞をアッセイ開始のおよそ24時間前に24ウエルプレートに播種した。HUVECを80%のコンフルエンシーに成長させ、0.2%のFBSが補充されるEGM-2培地における16時間の血清飢餓に供した。その後、HUVECを、Cell Tracker Red CMTPX色素(C34552、Invitrogen)により45分間パルス処理した。その間に、ガン細胞をPBSにより洗浄し、FBSが0.2%のEGM-2培地の0.5mLをそれぞれのウエルに加え、3.0μmのHTS Fluoroblock挿入物(351151、BD Falcon、San Jose、CA)をそれぞれのウエルの中に置いた。1×105個のHUVEC(0.5mLの飢餓培地に再懸濁される)をそれぞれのトランスウエル挿入物の中に播種し、動員アッセイを37℃で16時間~18時間にわたって進行させた。中和抗体実験および/または組換えタンパク質実験のために、その後、抗体/タンパク質を、図に示されるような下記の適切な濃度でそれぞれのウエルに加えた:40μg/mLの抗ApoE 1D7、40μg/mLの抗IgG、100μΜのrhApoE3および100μΜのBSA。アッセイが完了したとき、挿入物を上記のマトリゲル浸潤アッセイについて記載されるように処理し、分析した(マトリゲル浸潤アッセイを参照のこと)。
5×104個のガン細胞をアッセイ開始のおよそ24時間前に24ウエルプレートに播種した。HUVECを80%のコンフルエンシーに成長させ、0.2%のFBSが補充されるEGM-2培地における16時間の血清飢餓に供した。その後、HUVECを、Cell Tracker Red CMTPX色素(C34552、Invitrogen)により45分間パルス処理した。その間に、ガン細胞をPBSにより洗浄し、FBSが0.2%のEGM-2培地の0.5mLをそれぞれのウエルに加え、3.0μmのHTS Fluoroblock挿入物(351151、BD Falcon、San Jose、CA)をそれぞれのウエルの中に置いた。1×105個のHUVEC(0.5mLの飢餓培地に再懸濁される)をそれぞれのトランスウエル挿入物の中に播種し、動員アッセイを37℃で16時間~18時間にわたって進行させた。中和抗体実験および/または組換えタンパク質実験のために、その後、抗体/タンパク質を、図に示されるような下記の適切な濃度でそれぞれのウエルに加えた:40μg/mLの抗ApoE 1D7、40μg/mLの抗IgG、100μΜのrhApoE3および100μΜのBSA。アッセイが完了したとき、挿入物を上記のマトリゲル浸潤アッセイについて記載されるように処理し、分析した(マトリゲル浸潤アッセイを参照のこと)。
内皮遊走アッセイ
血清飢餓に供されたHUVECを、Cell Tracker Red CMTPX色素により45分間パルス処理し、それぞれの挿入物につき0.5mLの飢餓培地における1×105個のHUVECの濃度でHTS Fluoroblockトランスウエル挿入物の中に播種した。アッセイを37℃で16時間~18時間にわたって進行させ、挿入物を上記で記載されるように処理し、分析した(マトリゲル浸潤アッセイを参照のこと)。
血清飢餓に供されたHUVECを、Cell Tracker Red CMTPX色素により45分間パルス処理し、それぞれの挿入物につき0.5mLの飢餓培地における1×105個のHUVECの濃度でHTS Fluoroblockトランスウエル挿入物の中に播種した。アッセイを37℃で16時間~18時間にわたって進行させ、挿入物を上記で記載されるように処理し、分析した(マトリゲル浸潤アッセイを参照のこと)。
走化性アッセイ
HUVECを、FBSが0.2%のEGM-2培地における16時間の血清飢餓に供し、Cell Tracker Red CMTPX色素により45分間標識した。その間に、示された量(1μg~5μg)の組換えヒトApoE3またはBSAを250μLのマトリゲル(356231、BD Biosciences)と混合し、24ウエルプレートの底部において30分間固化させた。その後、0.2%のFBSを含有する250μLのHUVEC EGM-2培地をそれぞれのマトリゲル被覆ウエルに加え、3.0μMのHTS Fluoroblock挿入物をそれぞれのウエルの中にはめ込んだ。1×105個のHUVEC(0.5mLの飢餓培地に再懸濁される)をそれぞれの挿入物の中に播種し、マトリゲルの勾配に沿って37℃で16時間~18時間にわたって遊走させた。アッセイが完了したとき、挿入物を上記で記載されるようにスライドに固定し、分析した(マトリゲル浸潤アッセイを参照のこと)。
HUVECを、FBSが0.2%のEGM-2培地における16時間の血清飢餓に供し、Cell Tracker Red CMTPX色素により45分間標識した。その間に、示された量(1μg~5μg)の組換えヒトApoE3またはBSAを250μLのマトリゲル(356231、BD Biosciences)と混合し、24ウエルプレートの底部において30分間固化させた。その後、0.2%のFBSを含有する250μLのHUVEC EGM-2培地をそれぞれのマトリゲル被覆ウエルに加え、3.0μMのHTS Fluoroblock挿入物をそれぞれのウエルの中にはめ込んだ。1×105個のHUVEC(0.5mLの飢餓培地に再懸濁される)をそれぞれの挿入物の中に播種し、マトリゲルの勾配に沿って37℃で16時間~18時間にわたって遊走させた。アッセイが完了したとき、挿入物を上記で記載されるようにスライドに固定し、分析した(マトリゲル浸潤アッセイを参照のこと)。
内皮接着アッセイ
HUVECを6ウエルプレートに播種し、単層を形成させた。ガン細胞を、FBSが0.2%のDMEM系培地における30分間の血清飢餓に供し、Cell Tracker Green CMFDA色素(C7025、Invitrogen)により45分間パルス処理した。2×105個のガン細胞(0.5mLの飢餓培地に再懸濁される)をそれぞれの内皮単層の上に播種した。ガン細胞をHUVEC単層に37℃で30分間接着させた。その後、内皮単層をPBSにより穏やかに洗浄し、4%パラホルムアルデヒドにより15分間、固定処理した。その後、それぞれのウエルをPBSにより覆い、8枚の画像を、倒立型蛍光顕微鏡(Zeiss Axiovert 40 CFL)を10×の倍率で使用してそれぞれの内皮単層について撮影した。HUVECに接着しているガン細胞の数を、ImageJを使用して定量化した。
HUVECを6ウエルプレートに播種し、単層を形成させた。ガン細胞を、FBSが0.2%のDMEM系培地における30分間の血清飢餓に供し、Cell Tracker Green CMFDA色素(C7025、Invitrogen)により45分間パルス処理した。2×105個のガン細胞(0.5mLの飢餓培地に再懸濁される)をそれぞれの内皮単層の上に播種した。ガン細胞をHUVEC単層に37℃で30分間接着させた。その後、内皮単層をPBSにより穏やかに洗浄し、4%パラホルムアルデヒドにより15分間、固定処理した。その後、それぞれのウエルをPBSにより覆い、8枚の画像を、倒立型蛍光顕微鏡(Zeiss Axiovert 40 CFL)を10×の倍率で使用してそれぞれの内皮単層について撮影した。HUVECに接着しているガン細胞の数を、ImageJを使用して定量化した。
アノイキスアッセイ
miR-199a、miR-1908またはコントロールヘアピンを過剰発現する1×106個のMeWo細胞を、0.2%のメチルセルロースが補充される細胞培地を含有する低接着性プレートに播種した。懸濁状態に48時間置いた後、死細胞および生細胞の数を、トリパンブルーを使用して計数した。
miR-199a、miR-1908またはコントロールヘアピンを過剰発現する1×106個のMeWo細胞を、0.2%のメチルセルロースが補充される細胞培地を含有する低接着性プレートに播種した。懸濁状態に48時間置いた後、死細胞および生細胞の数を、トリパンブルーを使用して計数した。
血清飢餓アッセイ
メラノーマ細胞の血清飢餓能に対するmiR-199aおよびmiR-1908の影響
を明らかにするために、miR-199a、miR-1908またはコントロールヘアピンを過剰発現する1×105個のMeWo親細胞を四連で6ウエルプレートに播種し、FBSが0.2%の飢餓DMEM系培地において48時間インキュベーションし、その後、生細胞の数を、トリパンブルーを使用して計数した。血清飢餓条件におけるメラノーマ細胞または内皮細胞の生存に対する組換えApoE3の添加の影響を明らかにするために、3×104個のMeWo-LM2細胞または内皮細胞を低血清条件(0.2%のFBS)においてApoE3(100μM)またはBSA(100μM)の存在下でインキュベーションした。生細胞の数を、8時間後、16時間後および24時間後に計数した。
メラノーマ細胞の血清飢餓能に対するmiR-199aおよびmiR-1908の影響
を明らかにするために、miR-199a、miR-1908またはコントロールヘアピンを過剰発現する1×105個のMeWo親細胞を四連で6ウエルプレートに播種し、FBSが0.2%の飢餓DMEM系培地において48時間インキュベーションし、その後、生細胞の数を、トリパンブルーを使用して計数した。血清飢餓条件におけるメラノーマ細胞または内皮細胞の生存に対する組換えApoE3の添加の影響を明らかにするために、3×104個のMeWo-LM2細胞または内皮細胞を低血清条件(0.2%のFBS)においてApoE3(100μM)またはBSA(100μM)の存在下でインキュベーションした。生細胞の数を、8時間後、16時間後および24時間後に計数した。
コロニー形成アッセイ
miR-199a、miR-1908またはコントロールヘアピンを過剰発現する50個のMeWo親細胞を四連で6cmのプレートに播種した。2週間後、細胞をPBSにより洗浄し、6%グルタルアルデヒドにより固定処理し、0.5%のクリスタルバイオレットにより染色した。陽性に染まっているコロニーの数を計数した。
miR-199a、miR-1908またはコントロールヘアピンを過剰発現する50個のMeWo親細胞を四連で6cmのプレートに播種した。2週間後、細胞をPBSにより洗浄し、6%グルタルアルデヒドにより固定処理し、0.5%のクリスタルバイオレットにより染色した。陽性に染まっているコロニーの数を計数した。
miRNAマイクロアレイハイブリダイゼーション
脱調節された発現を様々な高転移性メラノーマ細胞株派生物にわたって示すmiRNAを特定するために、多数の独立した転移性派生物ならびにそれらのそれぞれの親MeWo細胞集団および親A375細胞集団から得られる総RNAを使用して、小さいRNAについて濃縮し、その後、それらを標識し、LC sciencesによるマイクロ流体の特注マイクロアレイプラットフォームに対してハイブリダイゼーションさせた。アレイは、Sanger miRBaseリリース13.0に列記されるmiRNA転写物に対応する894個の成熟型miRNAを検出するように設計された。分析される全プローブのうち、169個のmiRNAに対応するプローブが、分析される多数の細胞株にわたってバックグラウンド閾値を超えるシグナルをもたらした。生のシグナル強度(これらはプローブのハイブリダイゼーションに対応する)をそれぞれの細胞株についてメジアン正規化した。メジアン正規化された発現値の2倍以上のアップレギュレーションの閾値を、2つの独立したヒトメラノーマ細胞株について多数の転移性派生物において一般に誘導されるmiRNAを特定するために使用した。
脱調節された発現を様々な高転移性メラノーマ細胞株派生物にわたって示すmiRNAを特定するために、多数の独立した転移性派生物ならびにそれらのそれぞれの親MeWo細胞集団および親A375細胞集団から得られる総RNAを使用して、小さいRNAについて濃縮し、その後、それらを標識し、LC sciencesによるマイクロ流体の特注マイクロアレイプラットフォームに対してハイブリダイゼーションさせた。アレイは、Sanger miRBaseリリース13.0に列記されるmiRNA転写物に対応する894個の成熟型miRNAを検出するように設計された。分析される全プローブのうち、169個のmiRNAに対応するプローブが、分析される多数の細胞株にわたってバックグラウンド閾値を超えるシグナルをもたらした。生のシグナル強度(これらはプローブのハイブリダイゼーションに対応する)をそれぞれの細胞株についてメジアン正規化した。メジアン正規化された発現値の2倍以上のアップレギュレーションの閾値を、2つの独立したヒトメラノーマ細胞株について多数の転移性派生物において一般に誘導されるmiRNAを特定するために使用した。
miR-199aおよびmiR-1908についてのマイクロアレイに基づく遺伝子標的予測
miR-199a-3p、miR-199a-5pおよびmiR-1908によって標的化される潜在的な遺伝子を特定するために、総RNAを、それぞれのmiRNAの機能喪失または機能獲得を有するMeWo細胞株から抽出し、Illumina HT-12
v3 Expression BeadChipマイクロアレイに対するハイブリダイゼーションのためにロックフェラー大学におけるゲノミクスコア施設に送付した。生のシグナル強度(これらはプローブのハイブリダイゼーションに対応する)をその後、それぞれの細胞株サンプルについてメジアン正規化した。3組のマイクロアレイプロフィル比較がなされた:(1)miR-199aまたはmiR-1908を過剰発現するMeWo細胞に対するMeWoコントロール細胞、(2)miR-199a-3p、miR-199a-5pまたはmiR-1908を標的化する短いヘアピン(miR-Zip)を発現するMeWo-LM2細胞に対するMeWo-LM2コントロール細胞、および、(3)MeWo-LM2細胞に対するMeWo親細胞。これらのアレイから得られるメジアン正規化された発現値に基づいて、下記の判断基準を使用して、miR-199aおよびmiR-1908に対して共通する可能な標的遺伝子に達した:(1)miR-199aおよびmiR-1908のそれぞれの個々の過剰発現に対して1.5倍超の差でダウンレギュレーションされる遺伝子、(2)miR-199a-3pおよびmiR-1908の両方の阻害またはmiR-199a-5pおよびmiR-1908の両方の阻害のどちらかのときに1.5倍超の差でアップレギュレーションされる遺伝子、そして、(3)MeWo親細胞に対して上記3つのmiRNAの生理学的により高いレベルを発現するLM2細胞において1.5倍超の差でダウンレギュレーションされる遺伝子。
miR-199a-3p、miR-199a-5pおよびmiR-1908によって標的化される潜在的な遺伝子を特定するために、総RNAを、それぞれのmiRNAの機能喪失または機能獲得を有するMeWo細胞株から抽出し、Illumina HT-12
v3 Expression BeadChipマイクロアレイに対するハイブリダイゼーションのためにロックフェラー大学におけるゲノミクスコア施設に送付した。生のシグナル強度(これらはプローブのハイブリダイゼーションに対応する)をその後、それぞれの細胞株サンプルについてメジアン正規化した。3組のマイクロアレイプロフィル比較がなされた:(1)miR-199aまたはmiR-1908を過剰発現するMeWo細胞に対するMeWoコントロール細胞、(2)miR-199a-3p、miR-199a-5pまたはmiR-1908を標的化する短いヘアピン(miR-Zip)を発現するMeWo-LM2細胞に対するMeWo-LM2コントロール細胞、および、(3)MeWo-LM2細胞に対するMeWo親細胞。これらのアレイから得られるメジアン正規化された発現値に基づいて、下記の判断基準を使用して、miR-199aおよびmiR-1908に対して共通する可能な標的遺伝子に達した:(1)miR-199aおよびmiR-1908のそれぞれの個々の過剰発現に対して1.5倍超の差でダウンレギュレーションされる遺伝子、(2)miR-199a-3pおよびmiR-1908の両方の阻害またはmiR-199a-5pおよびmiR-1908の両方の阻害のどちらかのときに1.5倍超の差でアップレギュレーションされる遺伝子、そして、(3)MeWo親細胞に対して上記3つのmiRNAの生理学的により高いレベルを発現するLM2細胞において1.5倍超の差でダウンレギュレーションされる遺伝子。
細胞株におけるmiRNA発現およびmRNA発現の分析
総RNAを、miRvanaキット(AM1560、Applied Biosystems、Austin、TX)を使用して様々な細胞株から抽出した。成熟型miRNAの発現レベルを、Taqman miRNA発現アッセイ(4427975-0002228、Applied Biosystems)を使用して定量化した。RNU44を正規化のための内因性コントロールとして使用した。mRNA発現分析のために、600ngの総RNAを、cDNA First-Strand Synthesis Kit(18080-051、Invitrogen)を使用して逆転写し、得られたcDNAのおよそ200ngをその後、SYBRグリーンPCR Master Mix(4309155、Applied Biosystems)および適切なプライマーと混合した。それぞれの反応を四連で行い、mRNA発現を、ABI Pris 7900HT Real-Time PCR System(Applied Biosystems)を使用してリアルタイムPCR増幅を行うことによって定量化した。GAPDHを正規化のための内因性コントロールとして使用した。下記のプライマーを使用した:
ApoE Fwd: 5'-TGGGTCGCTTTTGGGATTAC-3'
ApoE Rev: 5' -TTC AACTCCTTC ATGGTCTCG-3'
DNAJA4_Fwd: 5'-CCAGCTTCTCTTCACCCATG-3'
DNAJA4 Rev:5'-GCCAATTTCTTCGTGACTCC-3'
GAPDH Fwd: 5'-AGCCACATCGCTCAGACAC-3'
GAPDH Rev: 5'-GCCCAATACGACCAAATCC-3'
LRPl Fwd: 5' -TTTAACAGC ACCGAGTACCAG-3'
LRPl Rev: 5' C AGGC AGATGTC AGAGC AG-3'
LRP8 Fwd: 5'-GCTACCCTGGCTACGAGATG-3'
LRP8 Rev: 5' -GATT AGGG ATGGGCTCTTGC-3'
ELISA
馴化されたガン細胞培地を、細胞を、FBSが0.2%の血清飢餓DMEM系培地において24時間インキュベーションすることによって調製した。馴化培地におけるApoEのレベルを、APOE ELISAキット(IRAPKT031、Innovative
Research、Novi、Michigan)を使用して求めた。
総RNAを、miRvanaキット(AM1560、Applied Biosystems、Austin、TX)を使用して様々な細胞株から抽出した。成熟型miRNAの発現レベルを、Taqman miRNA発現アッセイ(4427975-0002228、Applied Biosystems)を使用して定量化した。RNU44を正規化のための内因性コントロールとして使用した。mRNA発現分析のために、600ngの総RNAを、cDNA First-Strand Synthesis Kit(18080-051、Invitrogen)を使用して逆転写し、得られたcDNAのおよそ200ngをその後、SYBRグリーンPCR Master Mix(4309155、Applied Biosystems)および適切なプライマーと混合した。それぞれの反応を四連で行い、mRNA発現を、ABI Pris 7900HT Real-Time PCR System(Applied Biosystems)を使用してリアルタイムPCR増幅を行うことによって定量化した。GAPDHを正規化のための内因性コントロールとして使用した。下記のプライマーを使用した:
ApoE Fwd: 5'-TGGGTCGCTTTTGGGATTAC-3'
ApoE Rev: 5' -TTC AACTCCTTC ATGGTCTCG-3'
DNAJA4_Fwd: 5'-CCAGCTTCTCTTCACCCATG-3'
DNAJA4 Rev:5'-GCCAATTTCTTCGTGACTCC-3'
GAPDH Fwd: 5'-AGCCACATCGCTCAGACAC-3'
GAPDH Rev: 5'-GCCCAATACGACCAAATCC-3'
LRPl Fwd: 5' -TTTAACAGC ACCGAGTACCAG-3'
LRPl Rev: 5' C AGGC AGATGTC AGAGC AG-3'
LRP8 Fwd: 5'-GCTACCCTGGCTACGAGATG-3'
LRP8 Rev: 5' -GATT AGGG ATGGGCTCTTGC-3'
ELISA
馴化されたガン細胞培地を、細胞を、FBSが0.2%の血清飢餓DMEM系培地において24時間インキュベーションすることによって調製した。馴化培地におけるApoEのレベルを、APOE ELISAキット(IRAPKT031、Innovative
Research、Novi、Michigan)を使用して求めた。
ルシフェラーゼレポーターアッセイ
異種ルシフェラーゼレポーターアッセイを以前に記載されたように行った(Tavazoie他、2008)。簡単に記載すると、ApoEおよびDNAJA4の全長型の3’UTRおよびCDSをpsiCheck2二重ルシフェラーゼレポーターベクター(C8021、Promega、Madison、WI)にウミシイタケルシフェラーゼレポーターの下流側にクローン化した。5×104個の親MeWo細胞、MeWo-LM2細胞、miR-199a、miR-1908またはコントロールヘアピンを過剰発現するMeWo細胞、および、miR-199a-3p、miR-199a-5p、miR-1908またはコントロール配列を標的化するmiR-Zipヘアピンを発現するMeWo-LM2細胞を、TransiT-293トランスフェクション試薬を使用して100ngのそれぞれの特異的レポーター構築物によりトランスフェクションした。トランスフェクション後24時間で、細胞を溶解し、ウミシイタケルシフェラーゼ発現対ホタルルシフェラーゼ発現の比率を、二重ルシフェラーゼアッセイ(E1910、Promega)を使用して求めた。それぞれの標的構築物における推定されるmiRNA結合部位を、相補的なmiRNAシード配列(miR-199a-3p:5’-CAGUAGUC-3’;miR-199a-5p:5’-CCAGUGUU-3’;miR-1908:5’-GGCGGGGA-3’)に対するアライメントによって特定した。それぞれの標的構築物におけるmiRNA相補的部位を、QuickChange Multi Site-Directed Mutagenesis Kit(200514、Agilent Technologies、Santa Clara、CA)を使用して変異させた。miRNAシード配列相補性分析に基づいて、ApoEのCDSを141位において(CTGからACTに)変異させ、ApoEの3’UTRを83位において(GCCからATAに)、かつ、98位において(CTGからACAに)変異させ、DNAJA4のCDSを373位において(CGCからTATに)、かつ、917位において(CTGからAGAに)変異させ、DNAJA4の3’UTRを576位において(CTGからACAに)、1096位において(CTGからTCTに)、1396位において(CGCからTGTに)、かつ、1596位において(CTGからTGTに)変異させた。下記のプライマーを、ApoEおよびDNAJA4の3’UTRおよびCDSをクローン化するために使用した:
ApoE CDS Fwd: 5 '-AGTACCTCGAGGGGATCCTTGAGTCCTACTC-3 '
APOE CDS Rev: 5 '-TAATTGCGGCCGCTCAGACAGTGTCTGCACCCAG-3'
DNAJA4_CDS_Fwd: 5 '-TAATATCTCGAGATGTGGGAAAGCCTGACCC-3'
DNAJA4 CDS Rev: 5 '-CAATTGCGGCCGCTCATGCCGTCTGGCACTGC-3'
APOE 3 'UTR Fwd: 5 '-TTAGCCTCGAGACGCCGAAGCCTGCAGCCA-3'
APOE 3'UTR Rev: 5 '-TTACTGCGGCCGCTGCGTGAAACTTGGTGAATCTT-3'
DNAJA4 3 'UTR Fwd: 5'-TAATATCTCGAGCGTGGTGCGGGGCAGCGT-3 '
DNAJA4 3 'UTR Rev: 5'-CAATTGCGGCCGCTTATCTCTCATACCAGCTCAAT-3 '
下記のプライマーを、それぞれの標的におけるmiRNA結合部位を変異誘発するために使用した:
APOE CDS mut: 5'-
GCCAGCGCTGGGAACTGGCAACTGGTCGCTTTTGGGATTACCT-3'
APOE 3 'UTR mutl : 5 '-
CAGCGGGAGACCCTGTCCCCATACCAGCCGTCCTCCTGGGGTG-3'
APOE 3 'UTR_mut2 : 5 ' -
TCCCCGCCCCAGCCGTCCTCACAGGGTGGACCCTAGTTTAATA-3 '
DNAJA4_CDS_mutl : 5'-
GGGATCGGTGGAGAAGTGCCTATTGTGCAAGGGGCGGGGGATG-3'
DNAJA4_CDS_mut2: 5'-
GTAGGGGGCGGGGAACGTGTTATCCGTGAAGAGGTGGCTAGGG-3'
DNAJA4 3 'UTR mutl : 5 '-
CAGGGCCAACTTAGTTCCTAACATTCTGTGCCCTTCAGTGGAT-3'
DNAJA4 3 'UTR_mut2 : 5 ' -
ACAGTTTGTATGGACTACTATCTTAAATTATAGCTTGTTTGGA-3'
DNAJA4 3 'UTR_mut3 : 5 ' -
TAATTATTGCTAAAGAACTATGTTTTAGTTGGTAATGGTGTAA-3'
DNAJA4 3 'UTR_mut4 : 5 ' -
CAGCTGCACGGACCAGGTTCCATAAAAACATTGCCAGCTAGTGAG-3 '
ヒトメラノーマ皮膚病変部におけるmiRNA発現の分析
本研究で使用されるすべてのヒト臨床サンプルを施設内IRB指針に従って得て、処理し、分析した。71名のヒト患者からの原発性メラノーマ皮膚病変部のパラフィン包埋された断面切片をMSKCCから得た。これらのサンプルを5回の連続したキシレン洗浄(それぞれ5分)によって脱パラフィン化した。脱パラフィン化の後、悪性腫瘍含有領域をH&E染色によって特定し、解剖し、総RNAを、RecoverAll Total Nucleic Acid Isolation Kit(AM1975、Applied Biosystems)を使用して解剖物から抽出した。それぞれのサンプルにおける成熟型のmiR-199a-3p、miR-199a-5pおよびmiR-1908の発現レベルを、Taqman miRNAアッセイを使用して盲検様式で定量化した。RNU44を正規化のための内因性コントロールとして使用した。それぞれのmiRNAの発現レベルを、転移する傾向を有する原発性メラノーマと、転移しなかった原発性メラノーマとの間で比較した。カプラン・マイヤー曲線を、患者の転移非存在生存データを使用して、それぞれの患者腫瘍におけるそれぞれのmiRNAについての発現レベルの関数としてプロットした。肺、脳、骨および軟組織のような部位への転移性再発が以前に記録されており、そのような転移性再発は、特定されたmiRNAの発現レベルと転移性再発との間における関係の遡及的分析を可能にした。
異種ルシフェラーゼレポーターアッセイを以前に記載されたように行った(Tavazoie他、2008)。簡単に記載すると、ApoEおよびDNAJA4の全長型の3’UTRおよびCDSをpsiCheck2二重ルシフェラーゼレポーターベクター(C8021、Promega、Madison、WI)にウミシイタケルシフェラーゼレポーターの下流側にクローン化した。5×104個の親MeWo細胞、MeWo-LM2細胞、miR-199a、miR-1908またはコントロールヘアピンを過剰発現するMeWo細胞、および、miR-199a-3p、miR-199a-5p、miR-1908またはコントロール配列を標的化するmiR-Zipヘアピンを発現するMeWo-LM2細胞を、TransiT-293トランスフェクション試薬を使用して100ngのそれぞれの特異的レポーター構築物によりトランスフェクションした。トランスフェクション後24時間で、細胞を溶解し、ウミシイタケルシフェラーゼ発現対ホタルルシフェラーゼ発現の比率を、二重ルシフェラーゼアッセイ(E1910、Promega)を使用して求めた。それぞれの標的構築物における推定されるmiRNA結合部位を、相補的なmiRNAシード配列(miR-199a-3p:5’-CAGUAGUC-3’;miR-199a-5p:5’-CCAGUGUU-3’;miR-1908:5’-GGCGGGGA-3’)に対するアライメントによって特定した。それぞれの標的構築物におけるmiRNA相補的部位を、QuickChange Multi Site-Directed Mutagenesis Kit(200514、Agilent Technologies、Santa Clara、CA)を使用して変異させた。miRNAシード配列相補性分析に基づいて、ApoEのCDSを141位において(CTGからACTに)変異させ、ApoEの3’UTRを83位において(GCCからATAに)、かつ、98位において(CTGからACAに)変異させ、DNAJA4のCDSを373位において(CGCからTATに)、かつ、917位において(CTGからAGAに)変異させ、DNAJA4の3’UTRを576位において(CTGからACAに)、1096位において(CTGからTCTに)、1396位において(CGCからTGTに)、かつ、1596位において(CTGからTGTに)変異させた。下記のプライマーを、ApoEおよびDNAJA4の3’UTRおよびCDSをクローン化するために使用した:
ApoE CDS Fwd: 5 '-AGTACCTCGAGGGGATCCTTGAGTCCTACTC-3 '
APOE CDS Rev: 5 '-TAATTGCGGCCGCTCAGACAGTGTCTGCACCCAG-3'
DNAJA4_CDS_Fwd: 5 '-TAATATCTCGAGATGTGGGAAAGCCTGACCC-3'
DNAJA4 CDS Rev: 5 '-CAATTGCGGCCGCTCATGCCGTCTGGCACTGC-3'
APOE 3 'UTR Fwd: 5 '-TTAGCCTCGAGACGCCGAAGCCTGCAGCCA-3'
APOE 3'UTR Rev: 5 '-TTACTGCGGCCGCTGCGTGAAACTTGGTGAATCTT-3'
DNAJA4 3 'UTR Fwd: 5'-TAATATCTCGAGCGTGGTGCGGGGCAGCGT-3 '
DNAJA4 3 'UTR Rev: 5'-CAATTGCGGCCGCTTATCTCTCATACCAGCTCAAT-3 '
下記のプライマーを、それぞれの標的におけるmiRNA結合部位を変異誘発するために使用した:
APOE CDS mut: 5'-
GCCAGCGCTGGGAACTGGCAACTGGTCGCTTTTGGGATTACCT-3'
APOE 3 'UTR mutl : 5 '-
CAGCGGGAGACCCTGTCCCCATACCAGCCGTCCTCCTGGGGTG-3'
APOE 3 'UTR_mut2 : 5 ' -
TCCCCGCCCCAGCCGTCCTCACAGGGTGGACCCTAGTTTAATA-3 '
DNAJA4_CDS_mutl : 5'-
GGGATCGGTGGAGAAGTGCCTATTGTGCAAGGGGCGGGGGATG-3'
DNAJA4_CDS_mut2: 5'-
GTAGGGGGCGGGGAACGTGTTATCCGTGAAGAGGTGGCTAGGG-3'
DNAJA4 3 'UTR mutl : 5 '-
CAGGGCCAACTTAGTTCCTAACATTCTGTGCCCTTCAGTGGAT-3'
DNAJA4 3 'UTR_mut2 : 5 ' -
ACAGTTTGTATGGACTACTATCTTAAATTATAGCTTGTTTGGA-3'
DNAJA4 3 'UTR_mut3 : 5 ' -
TAATTATTGCTAAAGAACTATGTTTTAGTTGGTAATGGTGTAA-3'
DNAJA4 3 'UTR_mut4 : 5 ' -
CAGCTGCACGGACCAGGTTCCATAAAAACATTGCCAGCTAGTGAG-3 '
ヒトメラノーマ皮膚病変部におけるmiRNA発現の分析
本研究で使用されるすべてのヒト臨床サンプルを施設内IRB指針に従って得て、処理し、分析した。71名のヒト患者からの原発性メラノーマ皮膚病変部のパラフィン包埋された断面切片をMSKCCから得た。これらのサンプルを5回の連続したキシレン洗浄(それぞれ5分)によって脱パラフィン化した。脱パラフィン化の後、悪性腫瘍含有領域をH&E染色によって特定し、解剖し、総RNAを、RecoverAll Total Nucleic Acid Isolation Kit(AM1975、Applied Biosystems)を使用して解剖物から抽出した。それぞれのサンプルにおける成熟型のmiR-199a-3p、miR-199a-5pおよびmiR-1908の発現レベルを、Taqman miRNAアッセイを使用して盲検様式で定量化した。RNU44を正規化のための内因性コントロールとして使用した。それぞれのmiRNAの発現レベルを、転移する傾向を有する原発性メラノーマと、転移しなかった原発性メラノーマとの間で比較した。カプラン・マイヤー曲線を、患者の転移非存在生存データを使用して、それぞれの患者腫瘍におけるそれぞれのmiRNAについての発現レベルの関数としてプロットした。肺、脳、骨および軟組織のような部位への転移性再発が以前に記録されており、そのような転移性再発は、特定されたmiRNAの発現レベルと転移性再発との間における関係の遡及的分析を可能にした。
組織学
動物をPBSにより灌流し、その後、心臓内注入により、続いて気管内注入により注入される4%パラホルムアルデヒドによる固定処理を行った。肺を切開し、4%パラホルムアルデヒドにおいて4℃で一晩インキュベーションし、パラフィンに包埋し、5μmの厚さの連続切片にスライスした。全体的な巨視的転移性結節可視化のために、肺切片をH&E染色した。ヒトメラノーマMeWo細胞によってマウスに形成される転移性結節における内皮含有量分析のために、代表的な肺切片を、MECA-32に対する一次抗体(Developmental Studies Hybridoma Bank、The University of Iowa、IA)(これはマウスの内皮細胞を標識する)と、ヒトビメンチンに対する一次抗体(VP-V684、Vector Laboratories)(これはヒトのメラノーマ細胞を標識する)とにより二重染色した。様々なAlexa Fluor色素コンジュゲート化二次抗体を、一次抗体を検出するために使用した。転移性結節内の血管密度を求めるために、蛍光を、Zeissレーザー走査共焦点顕微鏡(LSM510)を使用して測定し、それぞれの転移性結節の内部におけるMECA-32シグナル(これにより、輪郭がヒトビメンチンとの同時染色に基づいて示される)を、ImageJ(NIH)を使用して盲検様式で定量化した。B16F10マウスメラノーマ細胞によって野生型マウスおよびApoEの遺伝的ヌルマウスにおいて形成される転移性結節における内皮含有量分析のために、代表的な肺切片をMECA-32について染色し、それぞれの結節の内部におけるMECA-32シグナル(これにより、境界が細胞の色素沈着に基づいて定まる)を盲検様式で定量化した。総体的血管面積(これは、それぞれの転移性結節の総面積に対する、血管によって覆われる百分率面積として与えられる)を、バックグラウンド除去(1ピクセルの転がりボールの半径)と、カットオフとしての所定の閾値の使用とによって得た。転移性結節を、どのような領域であれ、総面積が2000μm2を超える領域として定義した。大きい結節については、少なくとも4つの代表的な画像を得て、それらの平均血管密度を計算した。
動物をPBSにより灌流し、その後、心臓内注入により、続いて気管内注入により注入される4%パラホルムアルデヒドによる固定処理を行った。肺を切開し、4%パラホルムアルデヒドにおいて4℃で一晩インキュベーションし、パラフィンに包埋し、5μmの厚さの連続切片にスライスした。全体的な巨視的転移性結節可視化のために、肺切片をH&E染色した。ヒトメラノーマMeWo細胞によってマウスに形成される転移性結節における内皮含有量分析のために、代表的な肺切片を、MECA-32に対する一次抗体(Developmental Studies Hybridoma Bank、The University of Iowa、IA)(これはマウスの内皮細胞を標識する)と、ヒトビメンチンに対する一次抗体(VP-V684、Vector Laboratories)(これはヒトのメラノーマ細胞を標識する)とにより二重染色した。様々なAlexa Fluor色素コンジュゲート化二次抗体を、一次抗体を検出するために使用した。転移性結節内の血管密度を求めるために、蛍光を、Zeissレーザー走査共焦点顕微鏡(LSM510)を使用して測定し、それぞれの転移性結節の内部におけるMECA-32シグナル(これにより、輪郭がヒトビメンチンとの同時染色に基づいて示される)を、ImageJ(NIH)を使用して盲検様式で定量化した。B16F10マウスメラノーマ細胞によって野生型マウスおよびApoEの遺伝的ヌルマウスにおいて形成される転移性結節における内皮含有量分析のために、代表的な肺切片をMECA-32について染色し、それぞれの結節の内部におけるMECA-32シグナル(これにより、境界が細胞の色素沈着に基づいて定まる)を盲検様式で定量化した。総体的血管面積(これは、それぞれの転移性結節の総面積に対する、血管によって覆われる百分率面積として与えられる)を、バックグラウンド除去(1ピクセルの転がりボールの半径)と、カットオフとしての所定の閾値の使用とによって得た。転移性結節を、どのような領域であれ、総面積が2000μm2を超える領域として定義した。大きい結節については、少なくとも4つの代表的な画像を得て、それらの平均血管密度を計算した。
インビボでのマトリゲルプラグアッセイ
10μg/mLの組換えヒトApoE3(4696、BioVision)、10μg/mLのBSA(A2153、Sigma Aldrich)または400ng/mlのVEGFを、示されるようにマトリゲル(356231、BD Biosciences)と混合した。示された組換えタンパク質を含有する400μLのマトリゲルを免疫低下NOD-SCIDマウスの腹側わき腹のすぐ上に皮下注入した。プラグを注入後3日目に取り出し、4%パラホルムアルデヒドにおいて48時間、固定処理した。その後、プラグをパラフィン包埋し、5μmの厚さの連続切片にした。プラグの断面切片を、マウス内皮抗原MECA-32に対する一次抗体(Developmental Studies Hybridoma Bank、The University of Iowa、IA)を使用して免疫組織化学的に染色し、ペルオキシダーゼコンジュゲート化二次抗体によって検出し、続いて、DAB酸化によって可視化した。それぞれのマトリゲルプラグの中への内細胞浸潤の程度を定量化するために、内皮細胞の数をそれぞれのプラグについて4つ~5つのランダムな視野において計数し、所与のプラグ面積あたりの内皮細胞の平均数を計算した。
10μg/mLの組換えヒトApoE3(4696、BioVision)、10μg/mLのBSA(A2153、Sigma Aldrich)または400ng/mlのVEGFを、示されるようにマトリゲル(356231、BD Biosciences)と混合した。示された組換えタンパク質を含有する400μLのマトリゲルを免疫低下NOD-SCIDマウスの腹側わき腹のすぐ上に皮下注入した。プラグを注入後3日目に取り出し、4%パラホルムアルデヒドにおいて48時間、固定処理した。その後、プラグをパラフィン包埋し、5μmの厚さの連続切片にした。プラグの断面切片を、マウス内皮抗原MECA-32に対する一次抗体(Developmental Studies Hybridoma Bank、The University of Iowa、IA)を使用して免疫組織化学的に染色し、ペルオキシダーゼコンジュゲート化二次抗体によって検出し、続いて、DAB酸化によって可視化した。それぞれのマトリゲルプラグの中への内細胞浸潤の程度を定量化するために、内皮細胞の数をそれぞれのプラグについて4つ~5つのランダムな視野において計数し、所与のプラグ面積あたりの内皮細胞の平均数を計算した。
組織培養
SK-Mel-334原発性ヒトメラノーマ系統をMSKCCにおける1名の患者のBraf変異型メラノーマの軟組織転移物から確立した。インビトロにおける最小限の拡大培養の後、細胞を、肺転移性派生物のSK-Mel-334.2を生じさせるためにインビボ選抜した(PollackおよびFidler、1982)。SK-Mel-239のベムラフェニブ抵抗性クローン(C1)は、Poulikos Poulikakos(Mount Sinai Medical School)からの譲渡物であり、B-RafV600E/+;Pten-/-;CDKN2A-/-原発性マウスメラノーマ細胞株は、Marcus Rosenberg(Yale University)によって譲渡された。使用されるすべての他の細胞株をATCCから購入した。
SK-Mel-334原発性ヒトメラノーマ系統をMSKCCにおける1名の患者のBraf変異型メラノーマの軟組織転移物から確立した。インビトロにおける最小限の拡大培養の後、細胞を、肺転移性派生物のSK-Mel-334.2を生じさせるためにインビボ選抜した(PollackおよびFidler、1982)。SK-Mel-239のベムラフェニブ抵抗性クローン(C1)は、Poulikos Poulikakos(Mount Sinai Medical School)からの譲渡物であり、B-RafV600E/+;Pten-/-;CDKN2A-/-原発性マウスメラノーマ細胞株は、Marcus Rosenberg(Yale University)によって譲渡された。使用されるすべての他の細胞株をATCCから購入した。
ApoEのElisa
DMSO、GW3965またはT0901317(それぞれ1μM)により処理されるメラノーマ細胞から得られる血清非含有の馴化培地における細胞外ApoEレベルを、ApoE ELISAキット(Innovative Research)を使用して、処理後72時間で定量化した。
DMSO、GW3965またはT0901317(それぞれ1μM)により処理されるメラノーマ細胞から得られる血清非含有の馴化培地における細胞外ApoEレベルを、ApoE ELISAキット(Innovative Research)を使用して、処理後72時間で定量化した。
ウエスタンブロッティング
マウスの肺組織サンプルおよび脳組織サンプルを、プロテアーゼ阻害剤(Roche)が補充されるRIPA緩衝液(Sigma-Aldrich)において氷上でホモジネートした。マウスの脂肪組織をTNET緩衝液(1.5mM Tris(pH 7.5)、150mM NaCl、2mM EDTA、1%トリトン、プロテアーゼ阻害剤)において氷上でホモジネートした。総タンパク質溶解物(2μg)をSDS-PAGEによって分離し、PVDFメンブランに転写し、抗マウスApoE抗体(ab20874、Abcam)および抗チューブリンα/β抗体(2148、Cell Signaling)によりブロッティングした。
マウスの肺組織サンプルおよび脳組織サンプルを、プロテアーゼ阻害剤(Roche)が補充されるRIPA緩衝液(Sigma-Aldrich)において氷上でホモジネートした。マウスの脂肪組織をTNET緩衝液(1.5mM Tris(pH 7.5)、150mM NaCl、2mM EDTA、1%トリトン、プロテアーゼ阻害剤)において氷上でホモジネートした。総タンパク質溶解物(2μg)をSDS-PAGEによって分離し、PVDFメンブランに転写し、抗マウスApoE抗体(ab20874、Abcam)および抗チューブリンα/β抗体(2148、Cell Signaling)によりブロッティングした。
メラノーマ臨床サンプルにおけるApoE発現分析
臨床サンプルの入手、処理および分析のすべてをIRB指針に厳密に従って行った。原発性メラノーマ皮膚病変部をMSKCCにおいて患者から事前に切除して、ホルマリン固定し、パラフィン包埋し、5μmの厚さのスライド片に切片化した。ApoEタンパク質発現を、D6E10抗ApoE抗体(ab1906、Abcam)を使用する二重盲検の免疫組織化学的分析によって評価した。
臨床サンプルの入手、処理および分析のすべてをIRB指針に厳密に従って行った。原発性メラノーマ皮膚病変部をMSKCCにおいて患者から事前に切除して、ホルマリン固定し、パラフィン包埋し、5μmの厚さのスライド片に切片化した。ApoEタンパク質発現を、D6E10抗ApoE抗体(ab1906、Abcam)を使用する二重盲検の免疫組織化学的分析によって評価した。
組織化学
動物をPBSにより心臓内灌流し、その後、4%パラホルムアルデヒド(PFA)による灌流を行った。固定処理された肺をパラフィンに包埋し、5μmの厚さの連続切片にした。巨視的な肺転移性結節をH&E染色によって可視化した。腫瘍での内皮細胞含有量、腫瘍の増殖およびアポトーシスを分析するために、原発性腫瘍のパラフィン包埋切片を、MECA-32に対する抗体(Developmental Studies Hybridoma Bank、University of Iowa)、KI-67に対する抗体(ab15580、Abcam)および切断型カスパーゼ-3に対する抗体(9661、Cell Signaling)によりそれぞれ染色した。
動物をPBSにより心臓内灌流し、その後、4%パラホルムアルデヒド(PFA)による灌流を行った。固定処理された肺をパラフィンに包埋し、5μmの厚さの連続切片にした。巨視的な肺転移性結節をH&E染色によって可視化した。腫瘍での内皮細胞含有量、腫瘍の増殖およびアポトーシスを分析するために、原発性腫瘍のパラフィン包埋切片を、MECA-32に対する抗体(Developmental Studies Hybridoma Bank、University of Iowa)、KI-67に対する抗体(ab15580、Abcam)および切断型カスパーゼ-3に対する抗体(9661、Cell Signaling)によりそれぞれ染色した。
尾静脈転移アッセイ
インビボ転移アッセイのために使用されるメラノーマ細胞を、ルシフェラーゼレポーター遺伝子をコードする安定的に発現したレトロウイルス構築物により形質導入し(Ponomarev他、2004)、これにより、本発明者らはメラノーマ細胞のインビボ進行をバイオルミネセンス画像化によってモニターすることができた。下記の数のメラノーマ細胞(100μLのPBSに再懸濁される)を、尾静脈を介して静脈内注入した:4×104個のMeWo細胞、2.5×105個のHT-144細胞、2×105個のSK-Mel-334.2細胞、5×104個のB16F10細胞、および、1×105個のYUMM細胞。MeWo細胞、HT-144細胞およびSK-Mel-334.2細胞は6週齢~8週齢の性一致NOD scidマウスに注入され、一方、B16F10細胞およびYUMM細胞は6週齢~8週齢の性一致C57BL/6マウスに注入された。転移形成に対するGW3965の影響を評価するすべての実験において、マウスをコントロール餌またはGW3965補充餌(20mg/kg)で10日間にわたって前処置した。脳転移に対するGW3965処置の影響を評価するために、1×105個のMeWo脳転移性派生物を無胸腺ヌードマウスに心臓内注入した。注入後直ちに、マウスを無作為にコントロール餌またはGW3965補充餌(100mg/kg)に割り当てた。GW3965の経口送達が初期転移の進行を阻害し得るかどうかを明らかにするために、NOD Scidマウスに、4×104個のMeWo細胞を静脈内注入し、細胞を42日間にわたって肺にコロニー形成させ、その後、マウスを盲検的にコントロール餌処置またはGW3965補充餌処置(100mg/kg)に割り当てた。
インビボ転移アッセイのために使用されるメラノーマ細胞を、ルシフェラーゼレポーター遺伝子をコードする安定的に発現したレトロウイルス構築物により形質導入し(Ponomarev他、2004)、これにより、本発明者らはメラノーマ細胞のインビボ進行をバイオルミネセンス画像化によってモニターすることができた。下記の数のメラノーマ細胞(100μLのPBSに再懸濁される)を、尾静脈を介して静脈内注入した:4×104個のMeWo細胞、2.5×105個のHT-144細胞、2×105個のSK-Mel-334.2細胞、5×104個のB16F10細胞、および、1×105個のYUMM細胞。MeWo細胞、HT-144細胞およびSK-Mel-334.2細胞は6週齢~8週齢の性一致NOD scidマウスに注入され、一方、B16F10細胞およびYUMM細胞は6週齢~8週齢の性一致C57BL/6マウスに注入された。転移形成に対するGW3965の影響を評価するすべての実験において、マウスをコントロール餌またはGW3965補充餌(20mg/kg)で10日間にわたって前処置した。脳転移に対するGW3965処置の影響を評価するために、1×105個のMeWo脳転移性派生物を無胸腺ヌードマウスに心臓内注入した。注入後直ちに、マウスを無作為にコントロール餌またはGW3965補充餌(100mg/kg)に割り当てた。GW3965の経口送達が初期転移の進行を阻害し得るかどうかを明らかにするために、NOD Scidマウスに、4×104個のMeWo細胞を静脈内注入し、細胞を42日間にわたって肺にコロニー形成させ、その後、マウスを盲検的にコントロール餌処置またはGW3965補充餌処置(100mg/kg)に割り当てた。
同所性転移アッセイ
同所性部位から分離されるメラノーマ細胞による肺でのコロニー形成に対するGW3965処置の影響を明らかにするために、ルシフェラーゼレポーターを発現する1×106個のMeWo細胞を、NOD Scidマウスの両側の下部わき腹に皮下注入した。体積で約300mm3である腫瘍が形成されたとき、腫瘍を切除し、マウスを無作為にコントロール餌処置またはGW3965補充餌処置(100mg/kg)に割り当てた。腫瘍切除後1ヶ月で、肺を取り出し、肺でのコロニー形成をエクスビボ・バイオルミネセンス画像化によって測定した。メラノーマの肺でのコロニー形成の程度を組織学的に確認するために、その後、肺を4%のPFAにおいて一晩にわたって固定処理し、パラフィン包埋し、5μMの連続切片にし、ヒトビメンチンについて染色した(VP-V684、Vector Laboratories)。
同所性部位から分離されるメラノーマ細胞による肺でのコロニー形成に対するGW3965処置の影響を明らかにするために、ルシフェラーゼレポーターを発現する1×106個のMeWo細胞を、NOD Scidマウスの両側の下部わき腹に皮下注入した。体積で約300mm3である腫瘍が形成されたとき、腫瘍を切除し、マウスを無作為にコントロール餌処置またはGW3965補充餌処置(100mg/kg)に割り当てた。腫瘍切除後1ヶ月で、肺を取り出し、肺でのコロニー形成をエクスビボ・バイオルミネセンス画像化によって測定した。メラノーマの肺でのコロニー形成の程度を組織学的に確認するために、その後、肺を4%のPFAにおいて一晩にわたって固定処理し、パラフィン包埋し、5μMの連続切片にし、ヒトビメンチンについて染色した(VP-V684、Vector Laboratories)。
ダカルバジン抵抗性メラノーマ細胞の作製
ダカルバジン抵抗性のB16F10マウスメラノーマ細胞を、細胞をDTIC(D2390、Sigma-Aldrich、St.Louis、MO)の存在下で連続培養することによって作製した。最初、細胞を500μg/mLのDTICにより1週間処理した。この最初のDTIC処理の後、残存する(約10%の)生細胞を1週間にわたって回復させ、その後、750μg/mLのDTICを細胞培地に5日間加えた。この高用量処理に続いて、細胞を低用量のDTIC(100μg/mL)の存在下で1週間にわたって回復させた。その後、細胞を、細胞をマウスに移植する前の少なくとも1ヶ月間、200μg/mLのDTICを含有する細胞培地において連続培養した。DTICを3日毎に、新鮮なガン細胞培地に加えた。腫瘍成長実験のために、5×104個のB16F10親細胞およびDTIC抵抗性細胞を7週齢のC57BL/6マウスの下部わき腹に皮下注入した。体積で5mm3~10mm3である小さい腫瘍が形成された後、マウスを下記の処置群に無作為に割り当てた:(1)コントロール餌+ビヒクル(i.p.);(2)コントロール餌+DTIC(i.p.)(50mg/kg);(3)GW3965補充餌(100mg/kg)+ビヒクル(i.p.)。DTICをクエン酸の存在下(重量比で1:1)で水に溶解し、腹腔内注射によって毎日投与した。DTIC抵抗性のMeWoヒトメラノーマ細胞株クローンが、体積で600mm3~800mm3であるMeWo腫瘍を有するマウスのDTIC処置の後で得られた。最初の2週間の期間中における毎日のDTIC投薬(50mg/kg、i.p.)に対する応答での最初の腫瘍縮小の後、腫瘍が最終的には抵抗性を発達させ、成長を再開し、その時点で腫瘍細胞を分離し、DTIC抵抗性MeWo細胞株が確立された。細胞を、DTIC(200μg/mL)の存在下で1週間、インビトロにおいて拡大培養し、その後、5×105個のDTIC抵抗性MeWo細胞を8週齢のNod SCIDガンママウスに再注入した。腫瘍が体積で5mm3~10mm3に成長した後、マウスを下記の処置群に盲検的に割り当てた:(1)コントロール餌;(2)コントロール餌+DTIC(50mg/kg);(3)GW3965補充餌(100mg/kg)。親の非選抜MeWo細胞による腫瘍成長に対するDTICの影響を明らかにするために、5×105個のMeWo細胞を、Nod SCIDガンママウスに皮下注入し、マウスを、体積で5mm3~10mm3である腫瘍が形成された後でコントロールビヒクルまたはDTIC(50g/kg)により処置した。DTICを、2日の休薬処置の合間がある5回の連続した毎日の処置からなるサイクルで、上記で記載されるように毎日投与した。腫瘍成長を週に2回測定した。
ダカルバジン抵抗性のB16F10マウスメラノーマ細胞を、細胞をDTIC(D2390、Sigma-Aldrich、St.Louis、MO)の存在下で連続培養することによって作製した。最初、細胞を500μg/mLのDTICにより1週間処理した。この最初のDTIC処理の後、残存する(約10%の)生細胞を1週間にわたって回復させ、その後、750μg/mLのDTICを細胞培地に5日間加えた。この高用量処理に続いて、細胞を低用量のDTIC(100μg/mL)の存在下で1週間にわたって回復させた。その後、細胞を、細胞をマウスに移植する前の少なくとも1ヶ月間、200μg/mLのDTICを含有する細胞培地において連続培養した。DTICを3日毎に、新鮮なガン細胞培地に加えた。腫瘍成長実験のために、5×104個のB16F10親細胞およびDTIC抵抗性細胞を7週齢のC57BL/6マウスの下部わき腹に皮下注入した。体積で5mm3~10mm3である小さい腫瘍が形成された後、マウスを下記の処置群に無作為に割り当てた:(1)コントロール餌+ビヒクル(i.p.);(2)コントロール餌+DTIC(i.p.)(50mg/kg);(3)GW3965補充餌(100mg/kg)+ビヒクル(i.p.)。DTICをクエン酸の存在下(重量比で1:1)で水に溶解し、腹腔内注射によって毎日投与した。DTIC抵抗性のMeWoヒトメラノーマ細胞株クローンが、体積で600mm3~800mm3であるMeWo腫瘍を有するマウスのDTIC処置の後で得られた。最初の2週間の期間中における毎日のDTIC投薬(50mg/kg、i.p.)に対する応答での最初の腫瘍縮小の後、腫瘍が最終的には抵抗性を発達させ、成長を再開し、その時点で腫瘍細胞を分離し、DTIC抵抗性MeWo細胞株が確立された。細胞を、DTIC(200μg/mL)の存在下で1週間、インビトロにおいて拡大培養し、その後、5×105個のDTIC抵抗性MeWo細胞を8週齢のNod SCIDガンママウスに再注入した。腫瘍が体積で5mm3~10mm3に成長した後、マウスを下記の処置群に盲検的に割り当てた:(1)コントロール餌;(2)コントロール餌+DTIC(50mg/kg);(3)GW3965補充餌(100mg/kg)。親の非選抜MeWo細胞による腫瘍成長に対するDTICの影響を明らかにするために、5×105個のMeWo細胞を、Nod SCIDガンママウスに皮下注入し、マウスを、体積で5mm3~10mm3である腫瘍が形成された後でコントロールビヒクルまたはDTIC(50g/kg)により処置した。DTICを、2日の休薬処置の合間がある5回の連続した毎日の処置からなるサイクルで、上記で記載されるように毎日投与した。腫瘍成長を週に2回測定した。
メラノーマ進行の遺伝子開始モデル
メラノーマ進行のTyr::CreER;B-RafV600E/+;Ptenlox/+/Tyr::CreER;B-RafV600E/+;Ptenlox/lox条件的モデルがDankort他(2009)によって以前に確立され、特徴づけられた。簡単に記載すると、これらのマウスにおけるメラノーマを、4-HT(H6278、70%の異性体、Sigma-Aldrich、St Louis、MO)をピーナッツ油において投与される25mg/kgで3日間連続して腹腔内注射することによって6週齢において誘導した。4-HTのストック溶液を、4-HTを、45℃で5分間加熱し、混合することにより100%のEtOHに50mg/mLで溶解することによって調製した。溶解されると、このストック4-HT溶液をピーナッツ油において10倍希釈し、これにより、マウスにその後に注入される5mg/mLの4-HT作業用溶液を得た。1回目の4-HT注射の後、マウスを盲検的に、コントロール餌、または、GW3965(100mg/kg)が補充される餌のどちらかを受けるように割り当てた。マウスをメラノーマ病変の存在および進行について週に3回調べた。35日目に、背側皮膚サンプルをコントロール処置マウスおよびGW3965処置マウスから集め、4%のPFAにおいて固定処理し、10Xで写真撮影した。総皮膚面積からの色素沈着したメラノーマ病変部面積の百分率を、ImageJを使用して定量化した。生存分析のために、マウスをメラノーマ進行について毎日モニターし、メラノーマ負荷量の進行に伴う瀕死状態および不快の初期徴候を考慮に入れて標準的な身体状態スコアに従って安楽死させた。死後、肺、脳および唾液腺を集め、巨視的メラノーマ病変の存在について調べた。
メラノーマ進行のTyr::CreER;B-RafV600E/+;Ptenlox/+/Tyr::CreER;B-RafV600E/+;Ptenlox/lox条件的モデルがDankort他(2009)によって以前に確立され、特徴づけられた。簡単に記載すると、これらのマウスにおけるメラノーマを、4-HT(H6278、70%の異性体、Sigma-Aldrich、St Louis、MO)をピーナッツ油において投与される25mg/kgで3日間連続して腹腔内注射することによって6週齢において誘導した。4-HTのストック溶液を、4-HTを、45℃で5分間加熱し、混合することにより100%のEtOHに50mg/mLで溶解することによって調製した。溶解されると、このストック4-HT溶液をピーナッツ油において10倍希釈し、これにより、マウスにその後に注入される5mg/mLの4-HT作業用溶液を得た。1回目の4-HT注射の後、マウスを盲検的に、コントロール餌、または、GW3965(100mg/kg)が補充される餌のどちらかを受けるように割り当てた。マウスをメラノーマ病変の存在および進行について週に3回調べた。35日目に、背側皮膚サンプルをコントロール処置マウスおよびGW3965処置マウスから集め、4%のPFAにおいて固定処理し、10Xで写真撮影した。総皮膚面積からの色素沈着したメラノーマ病変部面積の百分率を、ImageJを使用して定量化した。生存分析のために、マウスをメラノーマ進行について毎日モニターし、メラノーマ負荷量の進行に伴う瀕死状態および不快の初期徴候を考慮に入れて標準的な身体状態スコアに従って安楽死させた。死後、肺、脳および唾液腺を集め、巨視的メラノーマ病変の存在について調べた。
マウスの遺伝子型決定
すべてのマウスの遺伝子型決定を、Jackson Labsによって推奨されるような標準的なPCR条件を使用して行った。下記の遺伝子型決定用プライマーをそれぞれのPCR反応のために使用した:
Tyr::CreER;B-RafV600E/+;Ptenlox/+マウスおよびTyr::CreER;B-RafV600E/+;Ptenlox/loxマウス:
B-Raf Forward: 5'-TGA GTA TTT TTG TGG CAA CTG C-3'
5- a/Reverse: 5'-CTC TGC TGG GAA AGC GGC-3'
Pten Forward: 5'-CAA GCA CTC TGC GAA CTG AG-3'
Pten Reverse: 5'-AAG TTT TTG AAG GCA AGA TGC-3'
Cre Transgene Forward: 5 '-GCG GTC TGG CAG TAA AAA CTA TC-3 '
Cre Transgene Reverse: 5'-GTG AAA CAG CAT TGC TGT CAC TT-3'
Internal Positive Control Forward: 5' -CTA GGC CAC AGA ATT GAA AGA TCT-3'
Internal Positive Control Reverse: 5'-GTA GGT GGA AATTCT AGC ATC ATC C-3'
ApoE-/-マウス:
Common Forward: 5'-GCC TAG CCG AGG GAG AGC CG-3'
Wild-type Reverse: 5'-TGT GAC TTG GGA GCT CTG CAG C-3'
Mutant Reverse: 5'-GCC GCC CCG ACT GCA TCT-3'
LXRα-/-マウス:
Common Forward: 5'-TCA GTG GAG GGA AGG AAA TG-3'
Wild-type Reverse: 5'-TTC CTG CCC TGG ACA CTT AC-3'
Mutant Reverse: 5'-TTG TGC CCA GTC ATA GCC GAA T-3'
LXRβ-/-マウス:
Common Forward: 5'-CCT TTT CTC CCT GAC ACC G-3'
Wild-type Reverse: 5'-GCA TCC ATC TGG CAG GTT C-3'
Mutant Reverse: 5'-AGG TGA GAT GAC AGG AGA TC-3'
細胞増殖アッセイおよび生存性アッセイ
GW3965、T0901317およびベキサロテンのインビトロ細胞成長に対する影響を明らかにするために、2.5×104個のメラノーマ細胞を三連で6ウエルプレートに播種し、DMSO、GW3965、T0901317またはベキサロテンのそれぞれ1μMでの存在下で培養した。5日後、生細胞および死細胞の数を、死細胞を選択的に標識するトリパンブルー(72-57-1、Sigma-Aldrich)を使用して計数した。
すべてのマウスの遺伝子型決定を、Jackson Labsによって推奨されるような標準的なPCR条件を使用して行った。下記の遺伝子型決定用プライマーをそれぞれのPCR反応のために使用した:
Tyr::CreER;B-RafV600E/+;Ptenlox/+マウスおよびTyr::CreER;B-RafV600E/+;Ptenlox/loxマウス:
B-Raf Forward: 5'-TGA GTA TTT TTG TGG CAA CTG C-3'
5- a/Reverse: 5'-CTC TGC TGG GAA AGC GGC-3'
Pten Forward: 5'-CAA GCA CTC TGC GAA CTG AG-3'
Pten Reverse: 5'-AAG TTT TTG AAG GCA AGA TGC-3'
Cre Transgene Forward: 5 '-GCG GTC TGG CAG TAA AAA CTA TC-3 '
Cre Transgene Reverse: 5'-GTG AAA CAG CAT TGC TGT CAC TT-3'
Internal Positive Control Forward: 5' -CTA GGC CAC AGA ATT GAA AGA TCT-3'
Internal Positive Control Reverse: 5'-GTA GGT GGA AATTCT AGC ATC ATC C-3'
ApoE-/-マウス:
Common Forward: 5'-GCC TAG CCG AGG GAG AGC CG-3'
Wild-type Reverse: 5'-TGT GAC TTG GGA GCT CTG CAG C-3'
Mutant Reverse: 5'-GCC GCC CCG ACT GCA TCT-3'
LXRα-/-マウス:
Common Forward: 5'-TCA GTG GAG GGA AGG AAA TG-3'
Wild-type Reverse: 5'-TTC CTG CCC TGG ACA CTT AC-3'
Mutant Reverse: 5'-TTG TGC CCA GTC ATA GCC GAA T-3'
LXRβ-/-マウス:
Common Forward: 5'-CCT TTT CTC CCT GAC ACC G-3'
Wild-type Reverse: 5'-GCA TCC ATC TGG CAG GTT C-3'
Mutant Reverse: 5'-AGG TGA GAT GAC AGG AGA TC-3'
細胞増殖アッセイおよび生存性アッセイ
GW3965、T0901317およびベキサロテンのインビトロ細胞成長に対する影響を明らかにするために、2.5×104個のメラノーマ細胞を三連で6ウエルプレートに播種し、DMSO、GW3965、T0901317またはベキサロテンのそれぞれ1μMでの存在下で培養した。5日後、生細胞および死細胞の数を、死細胞を選択的に標識するトリパンブルー(72-57-1、Sigma-Aldrich)を使用して計数した。
細胞浸潤アッセイ
細胞浸潤アッセイを、トランスウエル・マトリゲル浸潤チャンバーシステム(354480、BD Biosciences)を使用して詳しくは以前に記載されたように行った(Pencheva他、2012)。簡単に記載すると、様々なメラノーマ細胞を、DMSO、GW3965、T0901317またはベキサロテンの1μΜでの存在下で56時間培養し、その後、メラノーマ細胞をそれぞれの薬物の存在下で16時間にわたって飢餓培地(0.2%のFBS)に切り換えた。飢餓後、細胞をマトリゲル被覆トランスウエル挿入物の中に播種し、浸潤アッセイを37℃で24時間にわたって進行させた。ApoE抗体中和実験のために、40μg/mLの1D7抗ApoE阻止抗体(Heart Institute、University of Ottawa、Ottawa、カナダ)または40μg/mLの抗IgGコントロール抗体(AB-108-C、R&D Systems、Minneapolis、MN)をアッセイ開始時にそれぞれのトランスウエル挿入物に加えた。
細胞浸潤アッセイを、トランスウエル・マトリゲル浸潤チャンバーシステム(354480、BD Biosciences)を使用して詳しくは以前に記載されたように行った(Pencheva他、2012)。簡単に記載すると、様々なメラノーマ細胞を、DMSO、GW3965、T0901317またはベキサロテンの1μΜでの存在下で56時間培養し、その後、メラノーマ細胞をそれぞれの薬物の存在下で16時間にわたって飢餓培地(0.2%のFBS)に切り換えた。飢餓後、細胞をマトリゲル被覆トランスウエル挿入物の中に播種し、浸潤アッセイを37℃で24時間にわたって進行させた。ApoE抗体中和実験のために、40μg/mLの1D7抗ApoE阻止抗体(Heart Institute、University of Ottawa、Ottawa、カナダ)または40μg/mLの抗IgGコントロール抗体(AB-108-C、R&D Systems、Minneapolis、MN)をアッセイ開始時にそれぞれのトランスウエル挿入物に加えた。
内皮動員アッセイ
内皮動員アッセイを以前に記載されたように行った(Pencheva他、2012;Png他、2012)。メラノーマ細胞を、DMSO、GW3965、T0901317またはベキサロテンにより1μΜで56時間処理し、その後、5×104個の細胞をそれぞれの薬物の存在下で24ウエルプレートに播種し、アッセイを開始する前の16時間にわたって付着させた。HUVEC細胞を、0.2%のFBSを含有するEGM-2培地における一晩の血清飢餓に供した。翌日、1×105個のHUVEC細胞を、ガン細胞を底部に含有するそれぞれのウエルにはめ込まれる3.0μmのHTS Fluoroblockトランスウエル遊走挿入物(351151、BD Falcon、San Jose、CA)の中に播種した。HUVEC細胞を37℃で20時間にわたってガン細胞に向かって遊走させ、その後、挿入物を以前に記載されたように処理した(Pencheva他、2012)。ApoE抗体中和実験のために、40μg/mLの1D7抗ApoE阻止抗体(Heart Institute、University of Ottawa、Ottawa、カナダ)または40μg/mLの抗IgGコントロール抗体(AB-108-C、R&D Systems、Minneapolis、MN)をアッセイ開始時にそれぞれのトランスウエル挿入物に加えた。
内皮動員アッセイを以前に記載されたように行った(Pencheva他、2012;Png他、2012)。メラノーマ細胞を、DMSO、GW3965、T0901317またはベキサロテンにより1μΜで56時間処理し、その後、5×104個の細胞をそれぞれの薬物の存在下で24ウエルプレートに播種し、アッセイを開始する前の16時間にわたって付着させた。HUVEC細胞を、0.2%のFBSを含有するEGM-2培地における一晩の血清飢餓に供した。翌日、1×105個のHUVEC細胞を、ガン細胞を底部に含有するそれぞれのウエルにはめ込まれる3.0μmのHTS Fluoroblockトランスウエル遊走挿入物(351151、BD Falcon、San Jose、CA)の中に播種した。HUVEC細胞を37℃で20時間にわたってガン細胞に向かって遊走させ、その後、挿入物を以前に記載されたように処理した(Pencheva他、2012)。ApoE抗体中和実験のために、40μg/mLの1D7抗ApoE阻止抗体(Heart Institute、University of Ottawa、Ottawa、カナダ)または40μg/mLの抗IgGコントロール抗体(AB-108-C、R&D Systems、Minneapolis、MN)をアッセイ開始時にそれぞれのトランスウエル挿入物に加えた。
レンチウイルスによるshRNAに基づく遺伝子ノックダウン
shRNAを、以前に記載されたように(Pencheva他、2012;Png他、2012)、6μgのベクターA、12μgのベクターKおよび12μgのshRNAプラスミドをHEK-293Tパッケージング細胞にトランスフェクションすることによっ
て調製されるレンチウイルス粒子に組み込んだ。レンチウイルスによるshRNA形質導入を、以前に記載されたように(Pencheva他、2012)、10μg/mLのポリブレン(TR-1003-G、Millipore、Billerica、MA)の存在下で6時間行った。細胞を形質導入後72時間にわたって拡大培養し、レンチウイルス選抜を、細胞を2μg/mLのピューロマイシン(P8833、Sigma-Aldrich)の存在下で72時間培養することによって行った。
shRNAを、以前に記載されたように(Pencheva他、2012;Png他、2012)、6μgのベクターA、12μgのベクターKおよび12μgのshRNAプラスミドをHEK-293Tパッケージング細胞にトランスフェクションすることによっ
て調製されるレンチウイルス粒子に組み込んだ。レンチウイルスによるshRNA形質導入を、以前に記載されたように(Pencheva他、2012)、10μg/mLのポリブレン(TR-1003-G、Millipore、Billerica、MA)の存在下で6時間行った。細胞を形質導入後72時間にわたって拡大培養し、レンチウイルス選抜を、細胞を2μg/mLのピューロマイシン(P8833、Sigma-Aldrich)の存在下で72時間培養することによって行った。
下記のshRNA配列を使用した:
ヒト:
Sh1LXRα: 5'-
CCGGCCGACTGATGTTCCCACGGATCTCGAGATCCGTGGGAACATCAGTCGGTT TTT-3 '
sh2LXRα: 5'-
CCGGGCAACTCAATGATGCCGAGTTCTCGAGAACTCGGCATCATTGAGTTGCTT TTT-3'
sh3LXRβ: 5'-
CCGGAGAGTGTATCACCTTCTTGAACTCGAGTTCAAGAAGGTGATACACTCTTT TTT-3'
sh2LXRβ: 5'-
CCGGGAAGGCATCCACTATCGAGATCTCGAGATCTCGATAGTGGATGCCTTCTT TTT-3'
shApoE: 5'-
CCGGGCAGACACTGTCTGAGCAGGTCTCGAGACCTGCTCAGACAGTGTCTGCTT TTT-3'
マウス:
sh_mLXRα: 5'-
CCGGGCAACTCAATGATGCTGAGTTCTCGAGAACTCAGCATCATTGAGTTGCTT TTT-3'
sh_mLXRβ: 5'-
CCGGTGAGATCATGTTGCTAGAAACCTCGAGGTTTCTAGCAACATGATCTCATTTTTG-3'
sh_mApoE: 5'-
CCGGGAGGACACTATGACGGAAGTACTCGAGTACTTCCGTCATAGTGTCCTCTT TTT-3'
qRT-PCRによる遺伝子発現分析:
RNAを、Total RNA Purification Kit(17200、Norgen、Thorold、カナダ)を使用して全細胞溶解物から抽出した。その後、600ngの総RNAを、cDNA First-Strand Synthesis Kit(18080-051、Invitrogen)を使用してcDNAに逆転写し、定量的リアルタイムPCR増幅を、ABI Prism 7900HT Real-Time PCR System(Applied Biosystems、Austin、TX)を使用して以前に記載されたように行った(Pencheva他、2012)。それぞれのPCR反応を四連で行った。遺伝子発現を、内因性コントロールとして使用されるGAPDHに対して正規化した。
ヒト:
Sh1LXRα: 5'-
CCGGCCGACTGATGTTCCCACGGATCTCGAGATCCGTGGGAACATCAGTCGGTT TTT-3 '
sh2LXRα: 5'-
CCGGGCAACTCAATGATGCCGAGTTCTCGAGAACTCGGCATCATTGAGTTGCTT TTT-3'
sh3LXRβ: 5'-
CCGGAGAGTGTATCACCTTCTTGAACTCGAGTTCAAGAAGGTGATACACTCTTT TTT-3'
sh2LXRβ: 5'-
CCGGGAAGGCATCCACTATCGAGATCTCGAGATCTCGATAGTGGATGCCTTCTT TTT-3'
shApoE: 5'-
CCGGGCAGACACTGTCTGAGCAGGTCTCGAGACCTGCTCAGACAGTGTCTGCTT TTT-3'
マウス:
sh_mLXRα: 5'-
CCGGGCAACTCAATGATGCTGAGTTCTCGAGAACTCAGCATCATTGAGTTGCTT TTT-3'
sh_mLXRβ: 5'-
CCGGTGAGATCATGTTGCTAGAAACCTCGAGGTTTCTAGCAACATGATCTCATTTTTG-3'
sh_mApoE: 5'-
CCGGGAGGACACTATGACGGAAGTACTCGAGTACTTCCGTCATAGTGTCCTCTT TTT-3'
qRT-PCRによる遺伝子発現分析:
RNAを、Total RNA Purification Kit(17200、Norgen、Thorold、カナダ)を使用して全細胞溶解物から抽出した。その後、600ngの総RNAを、cDNA First-Strand Synthesis Kit(18080-051、Invitrogen)を使用してcDNAに逆転写し、定量的リアルタイムPCR増幅を、ABI Prism 7900HT Real-Time PCR System(Applied Biosystems、Austin、TX)を使用して以前に記載されたように行った(Pencheva他、2012)。それぞれのPCR反応を四連で行った。遺伝子発現を、内因性コントロールとして使用されるGAPDHに対して正規化した。
下記のプライマーを使用した:
ヒト:
ApoE Forward: 5 ' -TGGGTCGCTTTTGGGATTAC-3 '
ApoE Reverse: 5 '-TTCAACTCCTTCATGGTCTCG-3 '
GAPDH Forward: 5 '-AGCCACATCGCTCAGACAC-3 '
GAPDH Reverse: 5'-GCCCAATACGACCAAATCC-3'
LXRα Fwd: 5'-GTTATAACCGGGAAGACTTTGC-3 '
LXRα Rev: 5'- AAACTCGGC ATC ATTGAGTTG-3 '
LXRβ_Fwd: 5'- TTTGAGGGTATTTGAGTAGCGG-3 '
LXRβRev: 5'- CTCTCGCGGAGTGAACTAC-3 '
マウス:
ApoE Forward: 5 '-GACCCTGGAGGCTAAGGACT-3 '
ApoE Reverse: 5 '-AGAGCCTTCATCTTCGCAAT-3 '
GAPDH Forward: 5 ' -GCAC AGTC AAGGCCGAGAAT-3 '
GAPDH Reverse: 5 ' -GCCTTCTCC ATGGTGGTGAA-3 '
LXRα Forward:5'-GCGCTCAGCTCTTGTCACT-3'
LXRα Reverse: 5'-CTCCAGCCACAAGGACATCT-3'
LXRβ Forward: 5 ' -GCTCTGCCTAC ATCGTGGTC-3 '
LXRβ Reverse: 5'-CTCATGGCCCAGCATCTT-3'
ABCA1 Forward: 5'- ATGGAGCAGGGAAGACCAC-3 '
ABCA1 Reverse: 5'- GTAGGCCGTGCCAGAAGTT-3 '
ApoEプロモーター活性アッセイ
ApoEプロモーター(これは、ApoE遺伝子の上流側980塩基対および下流側93塩基対に広がる配列からなる)を、pGL3-Basicベクター(E1751、Promega Corporation、Madison、WI)に、NheI制限酵素およびSacI制限酵素を使用してホタルルシフェラーゼの上流側にクローン化した。その後、マルチエンハンサーエレメント1(ME.1)およびマルチエンハンサーエレメント2(ME.2)を、MluI制限酵素およびSacI制限酵素を使用してApoEプロモーターのすぐ上流側にクローン化した。LXRアゴニストによるApoEプロモーター駆動およびME.1/MW.2駆動の転写活性化を評価するために、5×104個のMeWo細胞を24ウエルプレートに播種した。翌日、100ngのpGL3-ME.1/ME.2-ApoEプロモーター構築物および2ngのpRL-CMVウミシイタケルシフェラーゼ構築物(E2261、Promega)を、DMSO、GW3965またはT0901317の1μΜでの存在下、それぞれの条件を四連で細胞に共トランスフェクションした。LXRαまたはLXRβによる転写活性化を評価するために、コントロールshRNA、あるいは、LXRαまたはLXRβを標的化するshRNAを発現する5×104個のMeWo細胞を24ウエルプレートに播種した。翌日、200ngのpGL3-ME.1/ME.2-ApoEプロモーター構築物および2ngのpRL-CMVウミシイタケルシフェラーゼ構築物を、DMSO、GW3965またはT0901317の1μΜでの存在下、それぞれの条件を四連で細胞に共トランスフェクションした。24時間後、細胞を溶解し、細胞溶解物を、Dual Luciferase Assay System(E1960、Promega)およびBio-Tek Synergy NEO Microplate Readerを使用してホタルルシフェラーゼ活性およびウミシイタケルシフェラーゼ活性について分析した。ホタルルシフェラーゼのシグナルをウミシイタケルシフェラーゼのシグナルに対して正規化した。すべてのデータが、DMSO処理コントロール細胞において測定されるルシフェラーゼ活性比率に対して表される。
ヒト:
ApoE Forward: 5 ' -TGGGTCGCTTTTGGGATTAC-3 '
ApoE Reverse: 5 '-TTCAACTCCTTCATGGTCTCG-3 '
GAPDH Forward: 5 '-AGCCACATCGCTCAGACAC-3 '
GAPDH Reverse: 5'-GCCCAATACGACCAAATCC-3'
LXRα Fwd: 5'-GTTATAACCGGGAAGACTTTGC-3 '
LXRα Rev: 5'- AAACTCGGC ATC ATTGAGTTG-3 '
LXRβ_Fwd: 5'- TTTGAGGGTATTTGAGTAGCGG-3 '
LXRβRev: 5'- CTCTCGCGGAGTGAACTAC-3 '
マウス:
ApoE Forward: 5 '-GACCCTGGAGGCTAAGGACT-3 '
ApoE Reverse: 5 '-AGAGCCTTCATCTTCGCAAT-3 '
GAPDH Forward: 5 ' -GCAC AGTC AAGGCCGAGAAT-3 '
GAPDH Reverse: 5 ' -GCCTTCTCC ATGGTGGTGAA-3 '
LXRα Forward:5'-GCGCTCAGCTCTTGTCACT-3'
LXRα Reverse: 5'-CTCCAGCCACAAGGACATCT-3'
LXRβ Forward: 5 ' -GCTCTGCCTAC ATCGTGGTC-3 '
LXRβ Reverse: 5'-CTCATGGCCCAGCATCTT-3'
ABCA1 Forward: 5'- ATGGAGCAGGGAAGACCAC-3 '
ABCA1 Reverse: 5'- GTAGGCCGTGCCAGAAGTT-3 '
ApoEプロモーター活性アッセイ
ApoEプロモーター(これは、ApoE遺伝子の上流側980塩基対および下流側93塩基対に広がる配列からなる)を、pGL3-Basicベクター(E1751、Promega Corporation、Madison、WI)に、NheI制限酵素およびSacI制限酵素を使用してホタルルシフェラーゼの上流側にクローン化した。その後、マルチエンハンサーエレメント1(ME.1)およびマルチエンハンサーエレメント2(ME.2)を、MluI制限酵素およびSacI制限酵素を使用してApoEプロモーターのすぐ上流側にクローン化した。LXRアゴニストによるApoEプロモーター駆動およびME.1/MW.2駆動の転写活性化を評価するために、5×104個のMeWo細胞を24ウエルプレートに播種した。翌日、100ngのpGL3-ME.1/ME.2-ApoEプロモーター構築物および2ngのpRL-CMVウミシイタケルシフェラーゼ構築物(E2261、Promega)を、DMSO、GW3965またはT0901317の1μΜでの存在下、それぞれの条件を四連で細胞に共トランスフェクションした。LXRαまたはLXRβによる転写活性化を評価するために、コントロールshRNA、あるいは、LXRαまたはLXRβを標的化するshRNAを発現する5×104個のMeWo細胞を24ウエルプレートに播種した。翌日、200ngのpGL3-ME.1/ME.2-ApoEプロモーター構築物および2ngのpRL-CMVウミシイタケルシフェラーゼ構築物を、DMSO、GW3965またはT0901317の1μΜでの存在下、それぞれの条件を四連で細胞に共トランスフェクションした。24時間後、細胞を溶解し、細胞溶解物を、Dual Luciferase Assay System(E1960、Promega)およびBio-Tek Synergy NEO Microplate Readerを使用してホタルルシフェラーゼ活性およびウミシイタケルシフェラーゼ活性について分析した。ホタルルシフェラーゼのシグナルをウミシイタケルシフェラーゼのシグナルに対して正規化した。すべてのデータが、DMSO処理コントロール細胞において測定されるルシフェラーゼ活性比率に対して表される。
下記のクローニング用プライマーを使用した:
ApoE-promoterForward: 5'-TCA TAG CTA GCG CAG AGC CAG GAT TCA CGC CCT G-3'
ApoE-promoter Reverse: 5'-TGG TCC TCG AGG AAC CTT CATCTT CCT GCC TGT GA-3'
ME.1 Forward: 5 '-TAG TTA CGC GTA GTA GCC CCC ATC TTT GCC-3'
ME.1 Reverse: 5'-AAT CAG CTA GCC CCT CAG CTG CAA AGC TC-3'
ME.2 Forward: 5 '-TAG TTA CGC GTA GTA GCC CCC TCT TTGCC-3'
ME.2 Reverse: 5'-AAT CAG CTA GCC CTT CAG CTG CAA AGCTCT G-3'
腫瘍の組織化学
腫瘍をマウスから切除し、4%パラホルムアルデヒドにおいて4℃で48時間にわたって固定処理した。その後、腫瘍をパラフィン包埋し、5μmの厚さの連続切片にした。腫瘍における内皮細胞含有量分析のために、腫瘍切片を、マウス内皮細胞マーカーのMECA-32に対する一次抗体(Developmental Studies Hybridoma Bank、The University of Iowa、IA)により染
色し、DAPI核染色により対比染色した。腫瘍細胞の増殖およびアポトーシスを明らかにするために、腫瘍切片を、増殖性マーカーのKi-67に対する抗体(Abcam、abl5580、Cambridge、MA)と、アポトーシスマーカーの切断型カスパーゼ-3に対する抗体(9661、Cell Signaling、Danvers、MA)とによりそれぞれ染色した。様々なAlexa Fluoro色素コンジュゲート化二次抗体を、一次抗体を検出するために使用した。蛍光を、倒立型蛍光顕微鏡(Zeiss Axiovert 40 CFL)をMECA-32染色およびKi-67染色については5×の倍率で使用して、また、切断型カスパーゼ-3染色については10×の倍率で使用して測定した。内皮細胞含有密度および腫瘍増殖速度を、総腫瘍面積からのMECA-32陽性染色面積またはKi-67陽性染色面積の平均百分率を計算することによって定量化した。腫瘍のアポトーシスを、切断型カスパーゼ-3を発現する細胞の数を所与の腫瘍面積あたり計数することによって測定した。
ApoE-promoterForward: 5'-TCA TAG CTA GCG CAG AGC CAG GAT TCA CGC CCT G-3'
ApoE-promoter Reverse: 5'-TGG TCC TCG AGG AAC CTT CATCTT CCT GCC TGT GA-3'
ME.1 Forward: 5 '-TAG TTA CGC GTA GTA GCC CCC ATC TTT GCC-3'
ME.1 Reverse: 5'-AAT CAG CTA GCC CCT CAG CTG CAA AGC TC-3'
ME.2 Forward: 5 '-TAG TTA CGC GTA GTA GCC CCC TCT TTGCC-3'
ME.2 Reverse: 5'-AAT CAG CTA GCC CTT CAG CTG CAA AGCTCT G-3'
腫瘍の組織化学
腫瘍をマウスから切除し、4%パラホルムアルデヒドにおいて4℃で48時間にわたって固定処理した。その後、腫瘍をパラフィン包埋し、5μmの厚さの連続切片にした。腫瘍における内皮細胞含有量分析のために、腫瘍切片を、マウス内皮細胞マーカーのMECA-32に対する一次抗体(Developmental Studies Hybridoma Bank、The University of Iowa、IA)により染
色し、DAPI核染色により対比染色した。腫瘍細胞の増殖およびアポトーシスを明らかにするために、腫瘍切片を、増殖性マーカーのKi-67に対する抗体(Abcam、abl5580、Cambridge、MA)と、アポトーシスマーカーの切断型カスパーゼ-3に対する抗体(9661、Cell Signaling、Danvers、MA)とによりそれぞれ染色した。様々なAlexa Fluoro色素コンジュゲート化二次抗体を、一次抗体を検出するために使用した。蛍光を、倒立型蛍光顕微鏡(Zeiss Axiovert 40 CFL)をMECA-32染色およびKi-67染色については5×の倍率で使用して、また、切断型カスパーゼ-3染色については10×の倍率で使用して測定した。内皮細胞含有密度および腫瘍増殖速度を、総腫瘍面積からのMECA-32陽性染色面積またはKi-67陽性染色面積の平均百分率を計算することによって定量化した。腫瘍のアポトーシスを、切断型カスパーゼ-3を発現する細胞の数を所与の腫瘍面積あたり計数することによって測定した。
原発性メラノーマ病変部におけるApoE発現の分析
ヒト原発性メラノーマ皮膚病変部をMSKCCにおいてメラノーマ患者から切除し、ホルマリン固定し、パラフィンに包埋し、5μmの厚さの連続切片にした。ApoEタンパク質発現を明らかにするために、サンプルを最初に、2回の連続するキシレン洗浄(それぞれ5分)によって脱パラフィン化し、そして、一連のエタノール洗浄(100%、95%、80%および70%のEtOH)によって再水和した。ApoE抗原を、サンプルをプロテイナーゼK(5μg/mL)の存在下において室温で20分間インキュベーションすることによって回復させた。内因性ペルオキシダーゼ活性を失活させるために、スライドを3%のH2O2溶液においてインキュベーションした。その後、スライドを、3回の連続するアビジンブロック溶液、ビオチンブロック溶液およびウマ血清ブロック溶液においてそれぞれ15分間、室温でブロック処理した(SP-2001、Vector Laboratories、Burlingame、CA)。ApoEをD6E10抗ApoE抗体(ab1908、Abcam)による染色によって検出した。このとき、抗体はPBSにおいて1:100の希釈で4℃で一晩使用した。その後、一次抗体が、スライドをペルオキシダーゼコンジュゲート化二次抗体(PK-4002、Vector Laboratories)においてインキュベーションすることによって認識され、DAB(SK-4105、Vector Laboratories)酸化反応によって顕示された。スライドを10×の倍率で画像化し、二重盲検様式で分析した。ApoE発現を、DAB陽性細胞の数を計数し、かつ、細胞外ApoE染色の面積を測定することによって定量化した。総ApoE染色シグナルを、それぞれのサンプルについての一致したH&E染色スライドに基づいて決定される所与の腫瘍面積あたりの百分率染色面積として表した。患者の転移非存在生存時間を示すカプラン・マイヤー曲線を、それぞれの患者の再発非存在生存データをその患者の原発性メラノーマ病変部おけるApoE発現の関数としてプロットすることによって作成した。腫瘍が集団のメジアンApoE発現よりも低いApoEレベルを有する患者をApoE陰性として分類し、これに対して、メラノーマが該メジアンを超えてApoEを発現する患者をApoE陽性として分類した。肺、脳、骨、軟組織および皮下組織ならびに皮膚などの部位への転移性再発の以前に記録された患者の病歴により、本発明者らは、原発性メラノーマ部位におけるApoE発現と、転移性再発との間における関係を遡及的に明らかにすることができた。
ヒト原発性メラノーマ皮膚病変部をMSKCCにおいてメラノーマ患者から切除し、ホルマリン固定し、パラフィンに包埋し、5μmの厚さの連続切片にした。ApoEタンパク質発現を明らかにするために、サンプルを最初に、2回の連続するキシレン洗浄(それぞれ5分)によって脱パラフィン化し、そして、一連のエタノール洗浄(100%、95%、80%および70%のEtOH)によって再水和した。ApoE抗原を、サンプルをプロテイナーゼK(5μg/mL)の存在下において室温で20分間インキュベーションすることによって回復させた。内因性ペルオキシダーゼ活性を失活させるために、スライドを3%のH2O2溶液においてインキュベーションした。その後、スライドを、3回の連続するアビジンブロック溶液、ビオチンブロック溶液およびウマ血清ブロック溶液においてそれぞれ15分間、室温でブロック処理した(SP-2001、Vector Laboratories、Burlingame、CA)。ApoEをD6E10抗ApoE抗体(ab1908、Abcam)による染色によって検出した。このとき、抗体はPBSにおいて1:100の希釈で4℃で一晩使用した。その後、一次抗体が、スライドをペルオキシダーゼコンジュゲート化二次抗体(PK-4002、Vector Laboratories)においてインキュベーションすることによって認識され、DAB(SK-4105、Vector Laboratories)酸化反応によって顕示された。スライドを10×の倍率で画像化し、二重盲検様式で分析した。ApoE発現を、DAB陽性細胞の数を計数し、かつ、細胞外ApoE染色の面積を測定することによって定量化した。総ApoE染色シグナルを、それぞれのサンプルについての一致したH&E染色スライドに基づいて決定される所与の腫瘍面積あたりの百分率染色面積として表した。患者の転移非存在生存時間を示すカプラン・マイヤー曲線を、それぞれの患者の再発非存在生存データをその患者の原発性メラノーマ病変部おけるApoE発現の関数としてプロットすることによって作成した。腫瘍が集団のメジアンApoE発現よりも低いApoEレベルを有する患者をApoE陰性として分類し、これに対して、メラノーマが該メジアンを超えてApoEを発現する患者をApoE陽性として分類した。肺、脳、骨、軟組織および皮下組織ならびに皮膚などの部位への転移性再発の以前に記録された患者の病歴により、本発明者らは、原発性メラノーマ部位におけるApoE発現と、転移性再発との間における関係を遡及的に明らかにすることができた。
実施例2 内因性のmir-1908、mir-199a-3pおよびmir-199a-5pはヒトメラノーマ転移を促進させる
メラノーマ転移のmiRNA調節因子を特定するために、インビボ選抜(PollackおよびFidler、1982)を、色素沈着したMeWoヒトメラノーマ細胞株および色素沈着しなかったA375ヒトメラノーマ細胞株とともに利用して、多数の第2世代(LM2)および第3世代(LM3)の肺転移性派生物を作製した。MeWo-LM2系統およびA375-LM3系統の転移可能性の比較により、これらの派生物が肺でのコロ
ニー形成アッセイにおいてそれらのそれぞれの親集団よりも著しく効率的に転移することが示された(図12A~図12B)。894個の成熟型miRNAのハイブリダイゼーションに基づく小RNAのプロファイリング、その後、定量的なステム・ループPCR(qRT-PCR)により、4つのmiRNA(miR-1908、miR-199a-3p、miR-199a-5pおよびmiR-214)が、多数のA375転移性派生物およびMeWo転移性派生物において、それらのそれぞれの親細胞に対して2倍を超えてアップレギュレーションされることが明らかにされた(図1A~図1B、図12C)。多数の転移性派生物の全体にわたる、miR-199a-3p、miR-199a-5p、miR-214およびmiR-1908の著しい誘導は、これらのmiRNAについての転移促進役割を示唆した。miR-199a-3pおよびmiR-199a-5p(これらはmiR-199aヘアピンと同時に過剰発現させられる)ならびにmiR-1908についての前駆体のレトロウイルス媒介の形質導入および過剰発現は、バイオルミネセンスシグナル定量化および全体的な肺組織学の両方に基づいて肺での転移性コロニー形成における堅固な増大を引き起こし(図1C、図12D;miR-1908については9.64倍の増大、P=0.016;miR-199aについては8.62倍の増大、P=0.028)、一方、miR-214の過剰発現は転移に著しい影響を与えなかった。重要なことに、miR-199aおよびmiR-1908のそれぞれの過剰発現は、形成される転移性結節の数を増大させ(図12E)、これは転移開始におけるこれらのmiRNAについての役割と一致していた。これらの発見により、miR-199aおよびmiR-1908が、高まった転移性コロニー形成のために十分であることもまた明らかにされた。
メラノーマ転移のmiRNA調節因子を特定するために、インビボ選抜(PollackおよびFidler、1982)を、色素沈着したMeWoヒトメラノーマ細胞株および色素沈着しなかったA375ヒトメラノーマ細胞株とともに利用して、多数の第2世代(LM2)および第3世代(LM3)の肺転移性派生物を作製した。MeWo-LM2系統およびA375-LM3系統の転移可能性の比較により、これらの派生物が肺でのコロ
ニー形成アッセイにおいてそれらのそれぞれの親集団よりも著しく効率的に転移することが示された(図12A~図12B)。894個の成熟型miRNAのハイブリダイゼーションに基づく小RNAのプロファイリング、その後、定量的なステム・ループPCR(qRT-PCR)により、4つのmiRNA(miR-1908、miR-199a-3p、miR-199a-5pおよびmiR-214)が、多数のA375転移性派生物およびMeWo転移性派生物において、それらのそれぞれの親細胞に対して2倍を超えてアップレギュレーションされることが明らかにされた(図1A~図1B、図12C)。多数の転移性派生物の全体にわたる、miR-199a-3p、miR-199a-5p、miR-214およびmiR-1908の著しい誘導は、これらのmiRNAについての転移促進役割を示唆した。miR-199a-3pおよびmiR-199a-5p(これらはmiR-199aヘアピンと同時に過剰発現させられる)ならびにmiR-1908についての前駆体のレトロウイルス媒介の形質導入および過剰発現は、バイオルミネセンスシグナル定量化および全体的な肺組織学の両方に基づいて肺での転移性コロニー形成における堅固な増大を引き起こし(図1C、図12D;miR-1908については9.64倍の増大、P=0.016;miR-199aについては8.62倍の増大、P=0.028)、一方、miR-214の過剰発現は転移に著しい影響を与えなかった。重要なことに、miR-199aおよびmiR-1908のそれぞれの過剰発現は、形成される転移性結節の数を増大させ(図12E)、これは転移開始におけるこれらのmiRNAについての役割と一致していた。これらの発見により、miR-199aおよびmiR-1908が、高まった転移性コロニー形成のために十分であることもまた明らかにされた。
次に、様々なアッセイを、これらのmiRNAの内因性レベルが転移を促進させるかを調べるために行った。この目的を達成するために、miR-1908と、miR-199aヘアピンから生じる2つのmiRNA(miR-199a-3pおよびmiR-199a-5p)のそれぞれとを、miR-Zip技術により高転移性細胞において阻害した。これらのmiRNAのそれぞれの個々の阻害は転移性コロニー形成を7倍超の差で抑制し(図1D;miR-1908阻害についてはP=0.047;miR-199a-3p阻害についてはP=0.010;miR-199a-5p阻害についてはP=0.015)、かつ、形成される転移性結節の数を劇的に低下させた(図12F)。
これらのmiRNAがまた、転移を無関係な細胞株において促進させるかどうかを明らかにするために、それらの発現をA375転移性派生細胞株おいて沈黙させた。実際に、miR-1908、miR-199a-3pまたはmiR-199a-5pの阻害は、転移性A375-LM3細胞の肺でのコロニー形成能を著しく低下させ(図1E)、このことから、これら3つのmiRNAがヒトメラノーマ細胞による転移の内因性促進因子であることが立証された。
メラノーマ転移をヒト細胞転移のマウスモデルにおいて促進させることにおけるmiR-1908、miR-199a-3pおよびmiR-199a-5pの堅固な機能的役割を考えれば、さらなるアッセイを、これらのmiRNAの発現がヒト原発性メラノーマ病変部の転移能と相関するかどうかを調べるために行った。この目的を達成するために、Memorial Sloan-Kettering Cancer Center(MSKCC)の患者から得られる71個の原発性メラノーマ皮膚病変部を、miR-1908、miR-199a-3pおよびmiR-199a-5pの発現レベルについて、qRT-PCRにより盲検様式で分析した。上記の機能的研究と一致して、3つすべてのmiRNAが、転移した原発性メラノーマでは、転移しなかった原発性メラノーマと比較して著しく誘導された(図1F;miR-1908についてはP=0.037;miR-199a-3pについてはP=0.0025;miR-199a-5pについてはP=0.0068)。このことから、原発性病変部におけるこれらのmiRNAのアップレギュレーションされた発現が、メラノーマのガン進行を予測する初期事象であることが示唆された。
実施例3 miR-1908、miR-199a-3pおよびmiR-199a-5pは細胞浸潤および内皮動員を促進させる
本実施例では、アッセイを、miR-1908、miR-199a-3pおよびmiR-199a-5pが転移を調節する細胞機構を明らかにするために行った。
本実施例では、アッセイを、miR-1908、miR-199a-3pおよびmiR-199a-5pが転移を調節する細胞機構を明らかにするために行った。
最初に、これらのmiRNAが、増殖または腫瘍成長を高めることによって転移を促進させるかを調べた。これに反して、それぞれのmiRNAの過剰発現は細胞増殖を低下させた(図13A)。より重要なことに、miR-1908の過剰発現は原発性腫瘍成長を増大させず、一方、miR-199aの過剰発現は実際に、腫瘍体積における著しい低下(35%、P<0.001)を引き起こした(図2A)。このことは、miR-1908およびmiR-199aの転移支援的(pro-metastatic)影響は腫瘍成長促進または高まった細胞増殖の二次的なものでないことを示している。
次に、これらのmiRNAが、細胞浸潤、すなわち、重要な転移表現型を調節するかどうかを調べた。転移性LM2細胞(これはこれらのmiRNAのより大きいレベルを発現する)は、著しく増大したマトリゲル浸潤能を、転移性がより小さいそれらの親集団に対して示した(図13B)。したがって、miR-199aおよびmiR-1908の過剰発現は個々に、親MeWo細胞がマトリゲルを通って浸潤する能力を高めた(図2B;miR-199については3倍の増大;miR-1908については2倍の増大)。逆に、miR-199a-3p、miR-199a-5pおよびmiR-1908の個々の阻害は、MeWo-LM2転移性メラノーマ細胞派生物の浸潤能を著しく低下させ(図2C)、同様にまた、A375-LM3転移性メラノーマ細胞派生物の浸潤能を著しく低下させた(図2D)。
転移性進行に対するこれらのmiRNAの堅固な影響を考えれば、さらなるアッセイを、それらが何らかのさらなる転移支援的表現型を調節しているかもしれないかどうかを調べるために行った。miR-199aまたはmiR-1908の過剰発現は、内皮細胞に対するメラノーマ細胞接着(図13C)、アノイキスに対する抵抗性(図13D)、血清飢餓の状況での生存(図13E)またはコロニー形成(図13F)を調節しなかったが、それぞれのmiRNAが、内皮細胞をトランスウエル内皮動員アッセイにおいて動員する親MoWe細胞の能力を劇的に高めた(3倍を超える増大)(図2E)。このことと一致して、転移性Mewo-LM2細胞(これはmiR-199aおよびmiR-1908を生理学的に過剰発現する)は、それらの親細胞に対して、内皮細胞を動員することにおいてより効率的であった(図13G)。逆に、miR-199a-3p、miR-199a-5pまたはmiR-1908の転移性MeWo-LM2細胞における阻害(図2F)、同様にまた、A375-LM3細胞における阻害(図2G)は内皮動員を抑制し、このことは、転移性メラノーマ細胞の高まった内皮動員能のためにこれらのmiRNAが要求され、かつ、十分であることと一致していた。
内因性のmiR-199a-3p、miR-199a-5pおよびmiR-1908がインビボにおいて転移性細胞による内皮動員を調節するかどうかを明らかにするために、様々なアッセイを行って、転移性血管密度を、ヒトビメンチン(これはヒトのMeWoメラノーマ細胞を標識する)およびマウス内皮細胞抗原(MECA-32)(これはマウスの内皮細胞を標識する)についての共免疫染色を行うことによって調べた。驚くべきことに、miR-199a-3p、miR-199a-5pまたはmiR-1908の阻害は個々に、転移性結節内における血管密度における際立った低下(miR-199a-3pおよびmiR-199a-5pについては平均して3倍、miR-1908については平均して4.7倍)を引き起こし(図2H;miR-199a-3pについてはP<0.001;miR-199a-5pについてはP<0.001;miR-1908についてはP<0.001)、このことから、転移性内皮含有量および転移性血管形成を促進させることにおけるこれらのmiRNAについての役割が明らかにされた。逆に、低転移性のメラノーマ細胞におけるそれぞれのmiRNAの過剰発現は転移性血管密度を劇的に増大させた(図13H)。これらの発見から、miR-199a-3p、miR-199a-5pおよびmiR-1908が、メラノーマ進行時における高まった浸潤および内皮動員のために必要であり、かつ、十分であるとして明らかにされる。
実施例4 mir-1908、mir-199a-3pおよびmir-199a-5pはApoeおよびDNAJA4を収斂的かつ協同的に標的化する
本実施例では、体系的で、かつ、先入観のない取り組みを、これらのmiRNAの直接的な分子標的を特定するために用いた。
本実施例では、体系的で、かつ、先入観のない取り組みを、これらのmiRNAの直接的な分子標的を特定するために用いた。
miR-1908、miR-199a-3pおよびmiR-199a-5pはインビトロ表現型およびインビボ表現型の同じセットを媒介しており、また、miR-199a-3pおよびmiR-199a-5pが同じ前駆体ヘアピンから生じているので、これらのmiRNAの転移支援的表現型が共通の標的遺伝子のサイレンシングにより生じているかもしれないことが仮定された。哺乳動物のmiRNAが、主に標的mRNA転写物を脱安定化することによって作用することを考えれば(Guo他、2010、Nature、466、835~840)、メラノーマ細胞のトランスクリプトームプロファイリングをそれぞれのmiRNAについての機能喪失および機能獲得の両方の状況において行った。これにより、miR-199aおよびmiR-1908の両方によって抑制され、かつ、これらのmiRNAのより大きい内因性レベルを発現する転移性LM2派生物においてより低いレベルを同様に示した小さい一組の遺伝子が明らかにされた(図14A)。定量的RT-PCRにより、2つの遺伝子、すなわち、代謝遺伝子のアポリポタンパク質E(ApoE)および熱ショックタンパク質のDNAJA4が、miR-199aおよびmiR-1908によって著しく調節され、かつ、高転移性LM2細胞において劇的に沈黙させられるとして確認された(図3Aおよび図14B~図14D)。
ApoEおよびDNAJA4が、miR-1908、miR-199a-3pおよびmiR-199a-5pによって直接に標的化されるかどうかを明らかにするために、その推定される標的の安定性に対するそれぞれのmiRNAの影響を異種ルシフェラーゼレポーターアッセイにより調べた。興味深いことに、miR-199aの過剰発現は、ApoEおよびDNAJA4の両方の3’非翻訳領域(UTR)およびコード領域(CDS)の安定性を抑制し、一方、miR-1908の過剰発現はApoEの3’UTRならびにDNAJA4の3’UTRおよびCDSを脱安定化した。直接的な標的化と一致して、それぞれの標的におけるmiRNA相補的配列を変異させることにより、miRNA媒介調節が消失した(図3B)。内因性標的化の直接的な試験において、転移性LM2細胞における個々のmiRNA阻害は、増大した標的安定性をもたらし(図3C)、この増大した標的安定性が、miRNA標的部位を変異させたときには消失した(図14E)。このことから、ApoEがmiR-1908およびmiR-199a-5pによって直接に標的化され、かつ、DNAJA4が3つすべてのmiRNAによって直接に標的化されることが明らかにされた(図3D)。重要なことに、これらの遺伝子の両方のCDSおよび3’UTRは、これら3つの調節性miRNAの生理学的により大きいレベルを発現する高転移性LM2細胞ではあまり安定でなかった。このことは、これらのmiRNAによるApoEおよびDNAJA4の内因性標的化がメラノーマ転移に関係することを示している(図3E)。
共通の標的遺伝子に対する、miR-199a-3p、miR-199a-5pおよびmiR-1908の分子的収斂を考えれば、これらの標的、すなわち、ApoEおよびDNAJA4が、これらのmiRNAによってもたらされる転移表現型を媒介し得るかどう
かを次に調べた。転移性LM2細胞におけるそれぞれの遺伝子の過剰発現は、細胞浸潤および内皮動員の表現型における際立った低下を引き起こした(図3F~3G、図14F)。逆に、無関係なヘアピンを使用する、低転移性細胞におけるApoEまたはDNAJA4のノックダウンは、細胞浸潤および内皮動員を著しく高めた(図3H~図3I、図14G)。このことから、ApoEおよびDNAJA4がこれらの転移支援的表現型の内因性抑制因子として作用することが明らかにされ、このことは、上述の転移促進性miRNAによるそれらの標的化と一致していた。
かを次に調べた。転移性LM2細胞におけるそれぞれの遺伝子の過剰発現は、細胞浸潤および内皮動員の表現型における際立った低下を引き起こした(図3F~3G、図14F)。逆に、無関係なヘアピンを使用する、低転移性細胞におけるApoEまたはDNAJA4のノックダウンは、細胞浸潤および内皮動員を著しく高めた(図3H~図3I、図14G)。このことから、ApoEおよびDNAJA4がこれらの転移支援的表現型の内因性抑制因子として作用することが明らかにされ、このことは、上述の転移促進性miRNAによるそれらの標的化と一致していた。
実施例5 ApoEおよびDNAJA4は、miR-199aおよびmiR-1908に依存する転移性浸潤、内皮動員およびコロニー形成を媒介する
ApoEおよびDNAJA4がmiR-199aおよびmiR-1908の下流側の直接的な生物学的エフェクターであるかどうかを明らかにするために、様々なアッセイを行って、これら2つの標的遺伝子がとりわけ、それぞれのmiRNAと相互作用するかどうかを調べた。予想されたように、miRNAサイレンシングは高転移性メラノーマ細胞の浸潤能および内皮動員能を低下させた。重要なことに、miRNA阻害の状況におけるApoEまたはDNAJA4のノックダウンは、それぞれのmiRNAのサイレンシングのとき、浸潤(図4Aおよび図4C)および内皮動員(図4Bおよび図4D)の抑制を著しく妨げた。驚くべきことに、これらの遺伝子のどちらかのノックダウンは、miR-1908またはmiR-199a-5pについて枯渇化された細胞では、miRNA阻害から生じる転移性コロニー形成の劇的な抑制を完全に回復させた(図4E~図4F、図15E)。逆に、ApoEまたはDNAJA4の過剰発現は、miR-1908を過剰発現する細胞(図4G~図4H、図15F)またはmiR-199aを過剰発現する細胞(図15G~図15I)では、細胞浸潤および内皮動員を抑制するために十分であった。加えて、ApoEまたはDNAJA4の過剰発現は、miRNA媒介の転移性コロニー形成を阻害するために十分であった(図15J)。重要なことに、ApoEおよびDNAJA4はまた、高転移性A375-LM3細胞によるmiRNA依存的な高まった細胞浸潤および内皮動員のために要求された(図4I~図4J、図15K)。
ApoEおよびDNAJA4がmiR-199aおよびmiR-1908の下流側の直接的な生物学的エフェクターであるかどうかを明らかにするために、様々なアッセイを行って、これら2つの標的遺伝子がとりわけ、それぞれのmiRNAと相互作用するかどうかを調べた。予想されたように、miRNAサイレンシングは高転移性メラノーマ細胞の浸潤能および内皮動員能を低下させた。重要なことに、miRNA阻害の状況におけるApoEまたはDNAJA4のノックダウンは、それぞれのmiRNAのサイレンシングのとき、浸潤(図4Aおよび図4C)および内皮動員(図4Bおよび図4D)の抑制を著しく妨げた。驚くべきことに、これらの遺伝子のどちらかのノックダウンは、miR-1908またはmiR-199a-5pについて枯渇化された細胞では、miRNA阻害から生じる転移性コロニー形成の劇的な抑制を完全に回復させた(図4E~図4F、図15E)。逆に、ApoEまたはDNAJA4の過剰発現は、miR-1908を過剰発現する細胞(図4G~図4H、図15F)またはmiR-199aを過剰発現する細胞(図15G~図15I)では、細胞浸潤および内皮動員を抑制するために十分であった。加えて、ApoEまたはDNAJA4の過剰発現は、miRNA媒介の転移性コロニー形成を阻害するために十分であった(図15J)。重要なことに、ApoEおよびDNAJA4はまた、高転移性A375-LM3細胞によるmiRNA依存的な高まった細胞浸潤および内皮動員のために要求された(図4I~図4J、図15K)。
ApoEおよびDNAJA4がまた、miRNA依存的な転移性内皮動員をインビボにおいて調節するかどうかを明らかにするために、メラノーマ転移物(ヒトビメンチン)および内皮細胞(MECA-32)の共免疫染色を、これらの遺伝子のそれぞれについてノックダウンされる細胞によってmiRNA阻害の状況で形成される肺の転移性結節において行った。注目すべきことに、ApoEまたはDNAJA4のノックダウンは、miRNAサイレンシングを有する細胞から生じる転移物での転移性血管密度における著しい(3.5倍超の)増大をもたらした(図4K、ApoEノックダウン細胞およびDNAJA4ノックダウン細胞の両方についてP<0.01)。これらの発見から、ApoEおよびDNAJA4が、これらの転移支援的miRNAによってメラノーマにおいて誘導されるmiRNA依存的な転移性浸潤表現型、コロニー形成表現型および内皮動員表現型の直接的な下流側のエフェクターとして明らかにされた。
実施例6 メラノーマ細胞により分泌されるApoEは浸潤および内皮動員の必要かつ十分な媒介因子であり、一方、ApoEの遺伝的欠失は転移を促進させる
ApoEは分泌型因子である。そのようなものとして、メラノーマ細胞により分泌されたApoEが浸潤および内皮動員を抑制し得るかどうかを調べた。それによれば、ELISAによって検出される細胞外ApoEレベルが、転移性LM2細胞(これは、より大きいレベルのmiR-199aおよびmiR-1908を発現する)では、転移性があまり大きくないそれらの親細胞の3.5分の1であった(図5A)。分泌されたApoEレベルがまた、内因性のmiR-199aおよびmiR-1908によって著しく抑制された(図5Bおよび図16A)。
ApoEは分泌型因子である。そのようなものとして、メラノーマ細胞により分泌されたApoEが浸潤および内皮動員を抑制し得るかどうかを調べた。それによれば、ELISAによって検出される細胞外ApoEレベルが、転移性LM2細胞(これは、より大きいレベルのmiR-199aおよびmiR-1908を発現する)では、転移性があまり大きくないそれらの親細胞の3.5分の1であった(図5A)。分泌されたApoEレベルがまた、内因性のmiR-199aおよびmiR-1908によって著しく抑制された(図5Bおよび図16A)。
次に、ApoEの受容体結合ドメインを認識する中和抗体(1D7)の使用によりApoEを阻害することにより、親MeWo細胞(これはApoEの高い内因性レベルを発現する(図14C))による細胞浸潤(図5C、1.68倍の増大)および内皮動員(図5D、1.84倍の増大)の両方が高まった。逆に、組換えヒトApoEの添加は、転移性LM2細胞(これは低い内因性ApoEレベルを発現する(図14C))による浸潤および内皮動員を著しく抑制した(図5E)。重要なことに、組換えApoEの添加は、メラノーマ細胞または内皮細胞のインビトロ増殖(図16B~図16C)または血清飢餓条件での生存(図16D~図16E)に影響を与えなかった。このことは、組換えApoEによるこれらの表現型の抑制が増殖における低下または損なわれた生存の二次的なものでないことを示している。ApoEがエピスタシスにおいてmiR-199aおよびmiR-1908の下流側であることと一致して、ApoE中和抗体1D7によるApoEの中和は、それぞれのmiRNAの阻害とともに認められる抑制された浸潤表現型および内皮動員表現型を有意に取り消した(図5F~図5G)。上記発見により、メラノーマ細胞により分泌されるApoEが、メラノーマにおけるmiRNA依存的な浸潤表現型および内皮動員表現型の必要かつ十分な抑制因子として明らかにされる。
さらなるアッセイを、DNAJA4(十分には特徴づけられていない熱ショックタンパク質)が内皮動員および浸潤を媒介する機構を詳しく調べるために行った。ApoEおよびDNAJA4によって呈示される表現型共通性を考えれば、DNAJA4が調節的役割を果たし、ApoEレベルを高めているかもしれないことが仮定された。実際に、DNAJA4のノックダウンは、ApoE転写物レベル(図16F)、同様にまた、分泌されたApoEレベル(図5H)の両方を低下させ、一方、DNAJA4の過剰発現はApoE発現を実質的に上昇させた(図16G)。DNAJA4がApoEの上流側で作用することと一致して、組換えApoEの添加は、DNAJA4のノックダウンとともに認められる高まった細胞浸潤表現型および内皮動員表現型を取り消した(図5I~図5J)。逆に、DNAJA4の過剰発現とともに認められる浸潤表現型および内皮動員表現型の抑制が、ApoEの抗体中和によって著しく妨げられた(図16H~図16I)。これらの発見により、DNAJA4が、メラノーマの浸潤および内皮動員を、ApoEの発現および生じる分泌の正の調節を介して抑制することが明らかにされる。
これらの転移促進性miRNAおよびDNAJA4遺伝子のApoEに対する調節的収斂を考慮して、アッセイを、ApoEの発現がヒトメラノーマ進行と相関するかどうかを明らかにするために行った。この目的を達成するために、アレイに基づく発表されたApoEについての発現データ(Haqq他、2005、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、102、6092~6097)を、母斑病変部、原発性病変部および転移性病変部において分析した。転移抑制的な役割と一致して、ApoEのレベルが、遠位器官転移物では、原発性病変部に対して著しく低く(P<0.025)、また、母斑病変部に対して著しく低かった(P<0.0003)(図5K)。
ヒトメラノーマ進行とのその有意な相関を考えれば、ApoEのシグナル伝達をメラノーマ細胞において増大させることが、メラノーマの転移を抑制することにおける治療的効力を有し得るかどうかを調べた。より具体的には、転移性MeWo-LM2細胞をマウスへの注入の前の24時間にわたって組換えApoEまたはBSAとプレインキュベーションした。驚くべきことに、ApoEによるガン細胞の前処理は転移性コロニー形成を300倍超の差で堅固に抑制した(図5L)。メラノーマ細胞をApoEとプレインキュベーションすることによる転移のこの劇的な抑制は、メラノーマ細胞に対するApoEの影響が転移開始のために非常に重要であることを反映する。これは、ApoEにより前処理された細胞が、低下した浸潤能を示し、この浸潤能が、肺でのコロニー形成を引き起こす転移事象を開始させるために必要とされるからである。
転移表現型および転移表現型に対するApoEによって及ぼされる堅固な影響、同様にまた、ヒトメラノーマ進行とのその強い関連を考えれば、さらなるアッセイを行って、メラノーマ進行に対する全身的ApoEの遺伝的欠失の影響をメラノーマ転移の免疫適格マウスモデルにおいて詳しく調べた。転移における細胞外ApoEについての主要な抑制的役割と一致して、循環に注入されたB16F10マウスメラノーマ細胞は、ApoE遺伝的ヌルマウスにおいて、それらの野生型同腹子と比較して転移性コロニー形成における7倍を超える増大を示した(図5M)。これらの発見により、全身的ApoEおよびガン分泌ApoEがヒトおよびマウスでのメラノーマ転移の堅固な抑制因子として立証される。
実施例7 細胞外ApoEはメラノーマ細胞のLRP1受容体および内皮細胞のLRP8受容体を異なるように標的化する
本実施例では、様々なアッセイを、ApoEが転移を抑制する分子的機構を詳しく調べるために行った。
本実施例では、様々なアッセイを、ApoEが転移を抑制する分子的機構を詳しく調べるために行った。
浸潤を媒介するApoE受容体を特定するために、知られている4つすべてのApoE受容体、すなわち、VLDLR、LRP1、LRP8およびLDLR(Hatters他、2006、Trends Biochem.Sci.、31、445~454;Hauser他、2011、Prog.Lipid Res.、50、62~74)をメラノーマ細胞においてノックダウンさせた。興味深いことに、LRP1のノックダウンは、それ以外のApoE受容体では生じなかったが、組換えApoEによって誘導される細胞浸潤抑制効果を消失させた(図6A)。重要なことに、転移性LM2細胞(これは低いレベルのApoEを示す)におけるLRP1のノックダウンは細胞浸潤をほんのわずかに増大させただけであり(図17A)、このことから、LRP1の影響が内因性ApoEによって媒介されることが示唆された。
LRP1がまた、浸潤および転移性コロニー形成に対するmiRNA依存的影響を媒介するかを明らかにするために、LRP1をmiRNA阻害の状況でノックダウンさせた。miRNAサイレンシングの状況におけるLRP1のノックダウンは、miRNA阻害から生じる抑制された浸潤表現型を回復させた(図6B、図17B)。これらのインビトロ結果と一致して、LRP1のノックダウンは、miR-1908について沈黙させられるLM2細胞によるインビボでの転移性コロニー形成を著しく高めた(図6C、図17C)。これらの発見により、LRP1がエピスタシスにおいて、miRNA/ApoE依存的なメラノーマ浸潤および転移性コロニー形成の下流側であることが明らかにされる。
浸潤表現型は、メラノーマ細胞に対するApoEの細胞自律的な影響を反映するが、内皮動員表現型は、直接的には内皮細胞に対するガン発現ApoEの細胞非自律的な役割を示唆する。このことと一致して、ApoEによる内皮細胞の前処理は、高転移性ガン細胞に向かうそれらの遊走能を著しく低下させた(図6D)。内皮動員表現型を媒介する内皮細胞上のApoE受容体を特定するために、知られている4つすべてのApoE受容体を内皮細胞においてノックダウンさせた。興味深いことに、ガン細胞の浸潤の場合とは異なり、内皮LRP8のノックダウンは、それ以外の受容体はいずれも取り消さなかったが、miRNAサイレンシングによって引き起こされる内皮動員が選択的かつ有意に取り消した(図6E、図17D~図17E)。これらの発見は、LPR8受容体が内皮動員に対するmiRNA/ApoE依存的影響の下流側の内皮媒介因子であることと一致している。
次に、アッセイを、ApoE/LRP8のシグナル伝達がまた、全身的な内皮遊走をガン細胞非存在系において調節しているかもしれないかどうかを調べるために行った。それによれば、ApoE(これは内皮細胞培地に存在する)の抗体中和は内皮遊走を著しく高め(図6F)、一方、組換えApoEは、内皮遊走を内皮細胞のLRP8受容体に依存的な様式でトランスウエルアッセイ(図6G)および勾配型走化性アッセイ(図6H)にお
いて阻害するために十分であった。重要なことに、ApoEの添加は、皮下マトリゲルプラグ内へのインビボでのVEGF誘導の内皮動員の劇的な(40倍超の差で)抑制を引き起こした(図6I)。
いて阻害するために十分であった。重要なことに、ApoEの添加は、皮下マトリゲルプラグ内へのインビボでのVEGF誘導の内皮動員の劇的な(40倍超の差で)抑制を引き起こした(図6I)。
内皮動員を媒介することにおいてApoEが要求され、かつ、十分であることを考えれば、さらなるアッセイを、全身的なApoEが転移性血管形成を調節しているかもしれないかどうかを調べるために行った。メラノーマ細胞によって分泌されるApoEによる転移性内皮含有量の堅固な抑制(図4K)と一致して、遺伝的ヌルApoEマウスは、それらの野生型同腹子と比較して、より大きい血管密度を、B16F10マウスメラノーマ細胞により形成されるそれらの肺転移性結節の内部において示した(図6J;2.41倍の増大、P=0.0055)。まとめると、上記発見により、メラノーマ細胞のLRP1受容体および内皮細胞のLRP8受容体によって媒介される異なったシグナル伝達を介する転移抑制におけるApoEについての細胞自律的/細胞非自律的な二重の役割が明らかにされる。
実施例8 メラノーマ転移における堅固な予後標的および治療標的としてのmiR-199a-3p、miR-199a-5pおよびmiR-1908
本明細書中に記載される転移促進因子miRNAが転移性結末の臨床的予測因子として役立ち得るかどうかを調べるために、miR-199a-3p、miR-199a-5pおよびmiR-1908の発現レベルを、MSKCCにおいて患者から得られるヒトメラノーマサンプルのコホートにおけるqRT-PCRによって盲検様式で定量化した。その後、原発性メラノーマ病変部におけるこれらのmiRNAのレベルと、転移性再発の結末との間における関係を求めた。
本明細書中に記載される転移促進因子miRNAが転移性結末の臨床的予測因子として役立ち得るかどうかを調べるために、miR-199a-3p、miR-199a-5pおよびmiR-1908の発現レベルを、MSKCCにおいて患者から得られるヒトメラノーマサンプルのコホートにおけるqRT-PCRによって盲検様式で定量化した。その後、原発性メラノーマ病変部におけるこれらのmiRNAのレベルと、転移性再発の結末との間における関係を求めた。
重要なことに、原発性メラノーマ病変部が、(集団についてのメジアンよりも)大きいレベルのmiR-199a-3p、miR-199a-5pまたはmiR-1908を発現する患者は、原発性メラノーマがこれらのmiRNAのそれぞれのより低いレベルを発現する患者よりも、遠位転移を発症する可能性が大きく、また、有意に短い転移非存在生存時間を示した(図7A~図7C、miR-199a-3pについてはP=0.0032、miR-199a-5pについてはP=0.0034、miR-1908についてはP=0.027)。驚くべきことに、これら3つのmiRNAの総発現レベルは、転移性再発についての危険性が大きい患者を、その危険性が非常に低い患者から階層化することにおいて、最も強い予後能を示した(図7D、P<0.0001)。これらの臨床的発見は、ガン進行の調節におけるこれらのmiRNAの間での機能的協同性と一致しており、メラノーマ転移の臨床的予後バイオマーカーとしてのこれらの分子についての有用性を示唆している。
メラノーマ転移を防止するための効果的な処置選択肢の現在の欠如、および、メラノーマ転移におけるこれら3つの調節的miRNAの強い予後値を考慮して、これらのmiRNAを、アンチセンスLNA治療を使用して治療的に標的化した(Elmer他、2008(a);Elmer他、2008(b))。成熟型のmiR-199a-3p、miR-199a-5pまたはmiR-1908に対してアンチセンスであるLNAオリゴヌクレオチドにより前処理される高転移性MeWo-LM2細胞は、転移活性における大雑把には4分の1への低下を示した。これらのmiRNAの間における協同性についての臨床的証拠を考えれば、3つすべてのmiRNAを沈黙させることの、転移性進行に対する影響を調べた。注目すべきことに、3つすべてのmiRNAに対するLNAの共トランスフェクションは、転移性コロニー形成を、70倍を超える差によって抑制し、このことから、内因性のmiR-199a-3p、miR-199a-5pおよびmiR-1908の間における劇的な相乗作用および協同性が明らかにされた(図7E、P=0.004)。重要なことに、三重LNA前処理によるこれらのmiRNAの阻害は、低下したインビトロ増殖をもたらさなかった(図18A)。このことは、この劇的な転移抑制表現型が、損なわれた増殖の二次的なものではないことを示している。独立したA375転移性派生物系統におけるコンビナトリアルLNA媒介のmiRNA標的化もまた、肺でのコロニー形成を著しく阻害した(図18B)。
次に、コンビナトリアルLNA誘導のmiRNA阻害が多数の遠位器官への全身的なメラノーマ転移を抑制し得るかどうかを調べた。実際に、これら3つの調節的miRNAを標的化するLNAのカクテルにより前処理される高転移性メラノーマ細胞の心臓内注入により、内因性のmiR-199a-3p、miR-199a-5pおよびmiR-1908が全身的なメラノーマ転移を促進させることが明らかにされた(図7F)。これら3つのmiRNAのコンビナトリアルLNA媒介阻害は、脳および骨(図7H~図7I)などの遠位部位での全身的な転移性病巣の数における低下を引き起こした(図7G)。
さらなるアッセイを、メラノーマ転移防止における全身投与されたインビボ最適化LNAの治療的効力を調べるために行った。この目的を達成するために、高転移性MeWo-LM2細胞をマウスに注入した。翌日、マウスを、miR-199a-3p、miR-199a-5pおよびmiR-1908を標的化するLNAにより、4週間にわたって週に2回での低い総用量(12.5mg/kg)で静脈内投与により処置した。注目すべきことに、コンビナトリアルLNA処置は肺でのコロニー形成を9倍の差で低下させ(図7J、P=0.031)、毒性の明らかな徴候を何ら伴っていなかった(図18C)。まとめると、上記発見から、メラノーマ転移性進行の細胞自律的特徴および細胞非自律的特徴を制御するためにApoEシグナル伝達に集中する新規なmiRNA依存的調節ネットワークが明らかにされる(図7K)。上記の基礎的研究により、メラノーマの臨床的管理における強力な予後可能性および治療可能性を有する一組のmiRNAが特定されている。
実施例9 ApoE/LRP1シグナル伝達のmiRNA依存的な標的化はCTGFの誘導を介してガン細胞浸潤および内皮動員を促進させる
本実施例では、結合組織増殖因子(CTGF)が、ガン細胞浸潤および内皮動員におけるApoE/LRP1シグナル伝達の下流側の媒介因子として特定された。qRT-PCR分析およびELISAによって求められるようなCTGF発現レベルがApoE/LRP1シグナル伝達によって媒介されている(図8A、図8Bおよび図8C)。加えて、ApoE/LRP1はガン細胞の浸潤を調節し、内皮動員がCTGFによって媒介される(図8D、図8E)。
本実施例では、結合組織増殖因子(CTGF)が、ガン細胞浸潤および内皮動員におけるApoE/LRP1シグナル伝達の下流側の媒介因子として特定された。qRT-PCR分析およびELISAによって求められるようなCTGF発現レベルがApoE/LRP1シグナル伝達によって媒介されている(図8A、図8Bおよび図8C)。加えて、ApoE/LRP1はガン細胞の浸潤を調節し、内皮動員がCTGFによって媒介される(図8D、図8E)。
実施例10 CTGFは、miRNA依存的な転移性浸潤、内皮動員およびコロニー形成を媒介する
本実施例では、アッセイを、CTGFがmiRNA依存的な浸潤および内皮動員を媒介するかどうかを詳しく調べるために行った。簡単に記載すると、トランスウエル細胞浸潤アッセイおよび内皮動員アッセイを、CTGFを標的化する阻止抗体の存在下でmiR-199aまたはmiR-1908を過剰発現する親MeWo細胞に対して行った。実際に、mir-199aおよびmir-1908に依存的な転移性浸潤および内皮動員がCTGFによって媒介されることが見出された(図9Aおよび図9B)。インビボでのメラノーマ転移(転移性コロニー形成)がCTGFによって媒介されるかどうかを詳しく調べるために、バイオルミネセンス画像化を、miR-199aまたはmiR-1908の過剰発現の状況でCTGFについてノックダウンされる5×104個の親MeWo細胞による肺転移に対して行った。この状況におけるCTGFのノックダウンはインビボでのメラノーマ転移における著しい低下を生じさせた(図9C)。
本実施例では、アッセイを、CTGFがmiRNA依存的な浸潤および内皮動員を媒介するかどうかを詳しく調べるために行った。簡単に記載すると、トランスウエル細胞浸潤アッセイおよび内皮動員アッセイを、CTGFを標的化する阻止抗体の存在下でmiR-199aまたはmiR-1908を過剰発現する親MeWo細胞に対して行った。実際に、mir-199aおよびmir-1908に依存的な転移性浸潤および内皮動員がCTGFによって媒介されることが見出された(図9Aおよび図9B)。インビボでのメラノーマ転移(転移性コロニー形成)がCTGFによって媒介されるかどうかを詳しく調べるために、バイオルミネセンス画像化を、miR-199aまたはmiR-1908の過剰発現の状況でCTGFについてノックダウンされる5×104個の親MeWo細胞による肺転移に対して行った。この状況におけるCTGFのノックダウンはインビボでのメラノーマ転移における著しい低下を生じさせた(図9C)。
実施例11 LXRアゴニストのGW3965による処置はメラノーマ細胞のApoEレベルおよびDNAJA4レベルを上昇させ、ガン細胞浸潤、内皮動員および転移性コロ
ニー形成を抑制する
肝臓X受容体(LXR)の様々な小分子アゴニストがApoEのレベルを増大させることが以前に示されている。LXR活性化を介してApo-Eのレベルを増大させることが治療的利益をもたらしたかどうかを詳しく調べるために、様々なアッセイを行って、Apo-Eのレベル、腫瘍細胞浸潤、内皮動員およびインビボでのメラノーマ転移に対するLXRアゴニストGW3965(化学名:3-[3-[N-(2-クロロ-3-トリフルオロメチルベンジル)-(2,2-ジフェニルエチル)アミノ]プロピルオキシ]フェニル酢酸塩酸塩)の影響を評価した(図10)。治療的濃度のGW3965の存在下における親MeWo細胞のインキュベーションはApoEおよびDNAJA4の発現を増大させた(図10Aおよび図10B)。GW3965によるMeWO細胞の前処理は腫瘍細胞浸潤を低下させ(図10C)、内皮動員を低下させた(図10D)。GW3965が転移をインビボにおいて阻害し得るかどうかを試験するために、マウスに、GW3965(20mg/kg)を含有する穀物型固形飼料餌またはコントロール餌を与え、肺転移を、4×104個の親MeWo細胞をマウスに尾静脈注入した後、バイオルミネセンスを使用してアッセイした(図10E)。この様式でのマウスへのGW3965の経口投与はインビボでのメラノーマ転移における著しい低下をもたらした(図10E)。
ニー形成を抑制する
肝臓X受容体(LXR)の様々な小分子アゴニストがApoEのレベルを増大させることが以前に示されている。LXR活性化を介してApo-Eのレベルを増大させることが治療的利益をもたらしたかどうかを詳しく調べるために、様々なアッセイを行って、Apo-Eのレベル、腫瘍細胞浸潤、内皮動員およびインビボでのメラノーマ転移に対するLXRアゴニストGW3965(化学名:3-[3-[N-(2-クロロ-3-トリフルオロメチルベンジル)-(2,2-ジフェニルエチル)アミノ]プロピルオキシ]フェニル酢酸塩酸塩)の影響を評価した(図10)。治療的濃度のGW3965の存在下における親MeWo細胞のインキュベーションはApoEおよびDNAJA4の発現を増大させた(図10Aおよび図10B)。GW3965によるMeWO細胞の前処理は腫瘍細胞浸潤を低下させ(図10C)、内皮動員を低下させた(図10D)。GW3965が転移をインビボにおいて阻害し得るかどうかを試験するために、マウスに、GW3965(20mg/kg)を含有する穀物型固形飼料餌またはコントロール餌を与え、肺転移を、4×104個の親MeWo細胞をマウスに尾静脈注入した後、バイオルミネセンスを使用してアッセイした(図10E)。この様式でのマウスへのGW3965の経口投与はインビボでのメラノーマ転移における著しい低下をもたらした(図10E)。
実施例12 メラノーマ転移の内因性抑制因子としてのmiR-7の特定
本実施例では、miR-7が、メラノーマ転移の内因性抑制因子として特定された(図11)。miR-7がメラノーマ転移をインビボにおいて抑制するかどうかを試験するために、その発現を、miR-Zip技術を使用して親MeWo細胞においてノックダウンさせた(図11A)。miR-7の短いヘアピン(miR-Zip)阻害剤を発現する4×104個の親MeWo細胞(miR-7 KD)を静脈内注入した後における肺での転移性コロニー形成のバイオルミネセンス画像化プロットは、肺転移をインビボにおいて著しく増大させた(図11A)。逆に、LM2細胞におけるmiR-7の過剰発現は肺転移をインビボにおいて著しく低下させた(図11B)。
本実施例では、miR-7が、メラノーマ転移の内因性抑制因子として特定された(図11)。miR-7がメラノーマ転移をインビボにおいて抑制するかどうかを試験するために、その発現を、miR-Zip技術を使用して親MeWo細胞においてノックダウンさせた(図11A)。miR-7の短いヘアピン(miR-Zip)阻害剤を発現する4×104個の親MeWo細胞(miR-7 KD)を静脈内注入した後における肺での転移性コロニー形成のバイオルミネセンス画像化プロットは、肺転移をインビボにおいて著しく増大させた(図11A)。逆に、LM2細胞におけるmiR-7の過剰発現は肺転移をインビボにおいて著しく低下させた(図11B)。
ガンの複雑性は、体系的な分析を適用することを必要とする(Pe’erおよびHacohen、2011)。体系的な全体的取り組みを介して、様々なmiRNAの協同的ネットワークが発見された。これらのmiRNAが、i)高転移性のヒトメラノーマ細胞においてアップレギュレーションされ、ii)メラノーマにおける転移性コロニー形成および血管形成のために要求され、かつ、十分であり、また、iii)ヒトメラノーマの転移性再発の堅固な病理学的予測因子である。トランスクリプトームに基づく、かつ、生物学的に導かれる標的特定取り組みを通して、miR-1908、miR-199a-3pおよびmiR-199a-5pが、熱ショック因子のDNAJA4および代謝遺伝子のApoEを収斂的に標的化することが見出された。それぞれの個々のmiRNAが転移のために要求されることは、これら3つの収斂的miRNAが、メラノーマ転移を促進させることにおいて非冗長的であることを示しており、一方、コンビナトリアルmiRNA阻害によって達成される堅固な相乗的な転移抑制により、これらのmiRNAの間における機能的な協同性(これはおそらくは、ApoEまたはDNAJA4の最大限のサイレンシングを介して達成されるかもしれない)が明らかにされる。3つの転移促進因子miRNAによって負に調節され、転移抑制因子遺伝子(DNAJA4)によって正に調節され、かつ、臨床での転移サンプルにおいて沈黙させられる遺伝子としてApoEが特定されたことにより、メラノーマ進行の抑制因子としてのこの遺伝子の重要性が強調される。
実施例13 メラノーマにおける新規な治療標的としてのLXRβシグナル伝達の特定
広範囲の発現をメラノーマにおいて示す核ホルモン受容体を特定するために、本発明者らはすべての核ホルモン受容体ファミリーメンバーの発現レベルをヒトメラノーマ細胞株のNCI-60コレクションにわたって調べた。いくつかの受容体が、安定な発現を多数のメラノーマ系統にわたって示し、このことから、これらの受容体がメラノーマにおける
新規な潜在的標的を表し得ることが示唆された(図19Aおよび図20A)。注目すべきことに、これらのうち、肝臓X受容体(LXR)はApoEの転写を脂肪細胞およびマクロファージにおいて高めることが以前に示されており(Laffitte他、2001)、一方、RXRの薬理学的活性化はApoEの発現を前臨床的なアルツハイマーモデルにおいて行わせることが見出された(Cramer他、2012)。
広範囲の発現をメラノーマにおいて示す核ホルモン受容体を特定するために、本発明者らはすべての核ホルモン受容体ファミリーメンバーの発現レベルをヒトメラノーマ細胞株のNCI-60コレクションにわたって調べた。いくつかの受容体が、安定な発現を多数のメラノーマ系統にわたって示し、このことから、これらの受容体がメラノーマにおける
新規な潜在的標的を表し得ることが示唆された(図19Aおよび図20A)。注目すべきことに、これらのうち、肝臓X受容体(LXR)はApoEの転写を脂肪細胞およびマクロファージにおいて高めることが以前に示されており(Laffitte他、2001)、一方、RXRの薬理学的活性化はApoEの発現を前臨床的なアルツハイマーモデルにおいて行わせることが見出された(Cramer他、2012)。
メラノーマにおけるApoEの近年に発見された転移抑制的役割(Pencheva他、2012)を考えれば、メラノーマにおけるLXRβおよびRXRαの遍在的な基礎的発現、ならびに、様々なLXRおよびRXRを治療的に活性化するための薬理学的薬剤が入手可能であることを考えれば、本発明者らは、メラノーマ細胞におけるLXRまたはRXRの活性化がメラノーマ進行表現型を阻害するかもしれないかどうかを詳しく調べた。乳ガン細胞増殖および前立腺ガン細胞増殖における核ホルモン受容体(例えば、ERおよびARなど)の立証された役割を考慮して、本発明者らは最初に、メラノーマ細胞におけるLXRまたはRXRの薬理学的アゴニズムがインビトロ細胞成長に影響を及ぼすかどうかを調べた。
2つの構造的に異なったLXRアゴニスト、すなわち、GW3965[2]またはT0901317[1]による、あるいは、RXRアゴニストのベキサロテンによるメラノーマ細胞の処理は、細胞増殖または細胞生存性割合に影響を与えなかった(図20B~図20C)。本発明者らは次に、細胞浸潤および内皮動員(これらは、転移性メラノーマ集団および転移性乳ガン集団によって呈示される表現型である)に対するLXR活性化またはRXR活性化の影響を評価した(Pencheva他、2012;Png他、2012)。変異多様性のMeWo(B-Raf/N-Ras野生型)ヒトメラノーマ系統、HT-144(B-Raf変異型)ヒトメラノーマ系統およびSK-Mel-2(N-Ras変異型)ヒトメラノーマ系統、同様にまた、SK-Mel-334.2(B-Raf変異型)原発性ヒトメラノーマ系統のGW3965[2]またはT0901317[1]による処理は、メラノーマ細胞がトランスウエルアッセイにおいてマトリゲルを通って浸潤することができることおよび内皮細胞を動員することができることを一貫して抑制した(図19B~図19C)。比較において、ベキサロテンによる処理は、浸潤を試験されたメラノーマ系統の半数においてのみ抑制しただけであり、また、内皮動員表現型には有意な影響を及ぼさなかった(図19B~図19C)。
LXRアゴニズムが、細胞浸潤および内皮動員の両方を多数のメラノーマ系統にわたって幅広く阻害することにおいてRXRアゴニズムよりも優位であることを考えれば、本発明者らは、LXRアゴニストの抑制的影響を媒介することにおいてLXRシグナル伝達が要求されることを詳しく調べた。LXRαではなく、メラノーマのLXRβのノックダウンは、GW3965[2]およびT0901317[1]の浸潤抑制能および内皮動員抑制能を取り消し(図19D~図19Gおよび図20D~図20G)、このことから、メラノーマ細胞のLXRβが、これらのインビトロ表現型の抑制を誘発することにおけるLXRアゴニストの機能的標的であることが明らかにされた。本発明者らの分子的発見は、LXRβが、メラノーマ細胞によって発現される優勢なLXRイソ型であることと一致している(図19A、P<0.0001)。
メラノーマにおけるLXRβの遍在的な基礎的発現はおそらくは、LXRが、脂質の輸送、合成および異化を制御する際に果たす全般的役割を反映している(CalkinおよびTontonoz、2013)。そのような安定なLXRβ発現が、メラノーマ細胞の代謝および成長を維持するために重要であると思われるが、そのような安定なLXRβ発現はまた、LXRシグナル伝達を、メラノーマにおける作用範囲が広い治療的標的化のための魅力的な候補物にしている。
実施例14 LXRアゴニストの治療的送達はメラノーマ腫瘍成長を抑制する
様々なLXRアゴニストが最初、脂質異常症およびアテローム性動脈硬化の患者においてコレステロールを低下させるという目的のための経口薬物候補物として開発された(Collins他、2002;JosephおよびTontonoz、2003)。これらの化合物は、脂質レベルを大型動物の前臨床モデルにおいて低下させることができないことに付随して臨床的に断念された(Groot他、2005)。
様々なLXRアゴニストが最初、脂質異常症およびアテローム性動脈硬化の患者においてコレステロールを低下させるという目的のための経口薬物候補物として開発された(Collins他、2002;JosephおよびTontonoz、2003)。これらの化合物は、脂質レベルを大型動物の前臨床モデルにおいて低下させることができないことに付随して臨床的に断念された(Groot他、2005)。
インビトロでのメラノーマ進行表現型を抑制するGW3965[2]およびT0901317[1]の堅固な能力(図19B~図19C)を考えれば、本発明者らは、治療的なLXR活性化がメラノーマの処置のために利用され得るかどうかを詳しく調べた。実際に、GW3965[2]またはT0901317[1]の低用量(20mg/kg)での経口投与は、体積で5mm3~10mm3である皮下腫瘍が形成された後では、免疫適格モデルにおける攻撃的B16F10マウスメラノーマ細胞による腫瘍成長を67%および61%それぞれ抑制した(図21A~図21B)。より大きいLXRアゴニスト用量(100mg/kg)の投与は腫瘍成長における80%の低下をもたらし(図21A)、これは、用量依存的な抑制効果と一致していた。
GW3965[2]の経口投与はまた、MeWoヒトメラノーマ細胞株による腫瘍成長を堅固に抑制し(70%の阻害)、SK-Mel-2ヒトメラノーマ細胞株による腫瘍成長を堅固に抑制し(49%の阻害)、同様にまた、SK-Mel-334.2原発性ヒトメラノーマ系統による腫瘍成長を堅固に抑制した(73%の阻害)(図21C~図21Eおよび図22A)。
小さい腫瘍(5mm3~10mm3)に対するLXRアゴニストの堅固な腫瘍抑制的影響(図21A~図21E)によって勇気づけられて、本発明者らは次に、LXR活性化療法が大きい(約150mm3の)腫瘍の成長を阻害し得るかどうかを詳しく調べた。
本発明者らは、GW3965[2]による処置が、確立された大きいB16F10腫瘍の成長における大雑把には50%の低下を引き起こしたことを見出した(図21F)。重要なことに、腫瘍確立後におけるGW3965[2]の治療的送達は、マウスB16F10細胞が注入された免疫適格マウス、ヒトMeWo樹立メラノーマ系統に由来する腫瘍異種移植片を有する免疫低下マウス、同様にまた、SK-Mel.334-2原発性ヒトメラノーマ系統に由来する腫瘍異種移植片を有する免疫低下マウスの全生存期間を実質的に延ばした(図21G~図21I)。これらの発見は、下記の多様な変異サブタイプの黒色性および無色素性の樹立されたメラノーマ腫瘍にわたるLXR活性化療法の広域応答性と一致している:B-RafおよびN-Rasの野生型(B16F10およびMeWo;図21A~図21C)、B-Raf変異型(SK-Mel-334.2;図21D)、N-Ras変異型(SK-Mel-2;図21E)。
本発明者らは次に、腫瘍成長を抑制することにおいてLXRアゴニストによって調節される細胞生物学的表現型を明らかにしようと努めた。インビトロでのメラノーマ細胞による内皮動員に対するGW3965[2]の阻害的影響と一致して、GW3965[2]の投与は、腫瘍の内皮細胞含有量における大雑把には2分の1への低下を引き起こした(図21J)。この影響には、インビボにおける活発に増殖する腫瘍細胞の数における大きくない低下(23%)が付随し(図21K)、アポトーシス細胞の数には変化がなかった(図21L)。これらの結果は、局所的な腫瘍浸潤を減少させることに加えて、LXR活性化は、メラノーマ腫瘍成長を、主には腫瘍の血管形成をインビボ増殖における生じる低下を伴って阻害することにより抑制することを示唆する。
実施例15 LXRアゴニズムは肺および脳へのメラノーマ転移を抑制し、初期転移の
進行を阻害する
メラノーマ腫瘍成長に対するLXRアゴニストの強力な抑制的影響は、本発明者らに、LXR活性化がまた、メラノーマ細胞による転移性コロニー形成を抑制し得るかどうかを調べさせるための動機を与えた。この目的を達成するために、GW3965[2]によるヒトMeWoメラノーマ細胞の前処理は、それらの転移性コロニー形成能における50倍超の差での低下を引き起こした(図23A)。この劇的な阻害的影響に照らして、本発明者らは次に、経口投与されたLXRアゴニストが転移を抑制し得るかを評価した。GW3965[2]またはT0901317[1]が経口投与された免疫低下マウスは、31倍の差での低下および23倍の差での低下がそれぞれ、ヒトMeWo細胞による肺での転移性コロニー形成において生じた(図23B~図23C)。GW3965[2]による処置はまた、HT-144メラノーマ系統による転移性コロニー形成を抑制し(図23D)、同様にまた、SK-Mel-334.2原発性メラノーマ系統による転移性コロニー形成を抑制した(図23E)。
進行を阻害する
メラノーマ腫瘍成長に対するLXRアゴニストの強力な抑制的影響は、本発明者らに、LXR活性化がまた、メラノーマ細胞による転移性コロニー形成を抑制し得るかどうかを調べさせるための動機を与えた。この目的を達成するために、GW3965[2]によるヒトMeWoメラノーマ細胞の前処理は、それらの転移性コロニー形成能における50倍超の差での低下を引き起こした(図23A)。この劇的な阻害的影響に照らして、本発明者らは次に、経口投与されたLXRアゴニストが転移を抑制し得るかを評価した。GW3965[2]またはT0901317[1]が経口投与された免疫低下マウスは、31倍の差での低下および23倍の差での低下がそれぞれ、ヒトMeWo細胞による肺での転移性コロニー形成において生じた(図23B~図23C)。GW3965[2]による処置はまた、HT-144メラノーマ系統による転移性コロニー形成を抑制し(図23D)、同様にまた、SK-Mel-334.2原発性メラノーマ系統による転移性コロニー形成を抑制した(図23E)。
GW3965[2]は、血液脳関門を効率的に横断し、かつ、LXRシグナル伝達を脳において強力に活性化することができる親油性分子である。このことと一致して、GW3965[2]の経口送達は、アミロイド斑病理学および記憶欠損をアルツハイマー病の前臨床モデルにおいて改善することが以前に示された(Jiang他、2008)。したがって、本発明者らは、LXRアゴニズムが、メラノーマの脳転移、すなわち、効果的な治療を緊急に必要とする恐れられるメラノーマ結末(Fonkem他、2012)の抑制において治療活性を示し得るのではないかと思った。注目すべきことに、GW3965[2]の経口投与により、MeWo親系統に由来する脳転移性メラノーマ細胞の心臓内注入後における全身的な播種および脳でのコロニー形成の両方が阻害された(図23F)。これらの結果から、LXR活性化療法による堅固な転移抑制が、多数のメラノーマ系統にわたって、また、多数の遠位器官転移性部位において明らかにされる。
転移形成を抑制することにおいて認められる堅固な効果(図23A~図23F)によって勇気づけられて、本発明者らは次に、LXR活性化療法が、転移により既に散らばっているメラノーマ細胞の進行を停止させ得るかどうかを明らかにしようと努めた。本発明者らは最初に、GW3965[2]が、同所性部位から散らばるメラノーマ細胞による肺でのコロニー形成を原発性腫瘍除去後において低下させることができるかを試験した(図23G)。重要なことに、腫瘍切除後におけるGW3965[2]の経口投与は、散らばったメラノーマ細胞による肺でのコロニー形成を17倍の差で阻害した(図23H)。注目すべきことに、GW3965[2]によるマウスの処置もまた、播種時にベースラインから8倍進行している初期の肺転移物によるコロニー形成を劇的に(28分の1に)抑制した(図23I)。転移開始を阻害するLXR活性化と一致して、GW3965[2]による処置は、形成される巨視的な転移性結節の数を低下させた(図23J)。最後に、この‘補助的な’前臨床状況におけるGW3965[2]によるマウスの処置は、転移性コロニー形成の後におけるマウスの生存期間を著しく延ばした(図23K)。
実施例16 LXR活性化は、メラノーマの遺伝的主導マウスモデルにおけるメラノーマの進行および転移を低下させる
ヒトメラノーマ腫瘍の大雑把には60%が、Brafガン遺伝子における活性化する変異を特徴としており、1つの一アミノ酸変異体、すなわち、B-RafV600Eが、見出される優性な変異である(Davies他、2002)。ほぼ20%のメラノーマが、Pten腫瘍抑制因子の同時サイレンシングを伴ってB-Rafにおける活性化する変異を示しており、このことが、悪性のメラノーマ状態への進行に至らしている(Tsao他、2004;Chin他、2006)。近年には、チロシナーゼ(Tyr)主導の条件的なB-Raf活性化およびPten喪失が、マウスのメラノーマ進行を押し進めることにおいて遺伝的に協同することが示された(Dankort他、2009)。
ヒトメラノーマ腫瘍の大雑把には60%が、Brafガン遺伝子における活性化する変異を特徴としており、1つの一アミノ酸変異体、すなわち、B-RafV600Eが、見出される優性な変異である(Davies他、2002)。ほぼ20%のメラノーマが、Pten腫瘍抑制因子の同時サイレンシングを伴ってB-Rafにおける活性化する変異を示しており、このことが、悪性のメラノーマ状態への進行に至らしている(Tsao他、2004;Chin他、2006)。近年には、チロシナーゼ(Tyr)主導の条件的なB-Raf活性化およびPten喪失が、マウスのメラノーマ進行を押し進めることにおいて遺伝的に協同することが示された(Dankort他、2009)。
LXR活性化がこの遺伝的開始モデルにおいてメラノーマ進行を抑制し得るかどうかを明らかにするために、本発明者らは、メラノーマを4-ヒドロキシタモキシフェン(4-HT)の腹腔内投与によってTyr::CreER;B-RafV600E/+;Ptenlox/+マウスおよびTyr::CreER;B-RafV600E/+;Ptenlox/loxマウスにおいて誘導した。注目すべきことに、メラノーマ開始後におけるGW3965[2]の経口投与は、PTENヘテロ接合性のTyr::CreER;B-RafV600E/+;Ptenlox/+マウスおよびPTENホモ接合性のTyr::CreER;B-RafV600E/+;Ptenlox/loxマウスの両方の腫瘍進行を弱め、かつ、全生存期間を著しく延ばした(図24A~図24Bおよび図25A~図25B)。次に、本発明者らは、GW3965[2]がこの遺伝的状況においてメラノーマ転移を抑制し得るかを調べた。本発明者らは、巨視的な転移物を4-HT処置されたTyr::CreER;B-RafV600E/+;Ptenlox/loxコントロールマウスの肺または脳において検出しなかったが、唾液腺リンパ節へのメラノーマ転移を一貫して認めた。重要なことに、GW3965[2]により処置されるTyr::CreER;B-RafV600E/+;Ptenlox/loxマウスは、死後に検出されるリンパ転移物の数における低下を示した(図24C)。これらの発見は、LXR活性化が、原発性メラノーマ腫瘍進行に対するその抑制的影響に加えて、同所性転移を、遺伝的主導メラノーマモデルにおいて阻害することを示している。
メラノーマ進行を押し進めることにおけるB-Raf活性化およびPten喪失の間での協同性がさらに、CDKN2A(家族性メラノーマにおいて頻繁に変異する細胞周期調節因子)の不活性化によって高められ得る(Hussussian他、1994;Kamb他、1994)。したがって、本発明者らは、B-RafV600E/+;Pten-/-;CDKN2A-/-メラノーマに対するLXR活性化の影響を調べ、これにより、本発明者らは、LXRアゴニズムの治療的効力をより攻撃的な遺伝的主導メラノーマ進行モデルにおいて試験することができた。重要なことに、GW3965[2]の治療的送達は、同系の免疫適格マウスに注入されるB-RafV600E/+;Pten-/-;CDKN2A-/-原発性マウスメラノーマ細胞による腫瘍成長および肺転移を堅固に阻害し、かつ、B-RafV600E/+;Pten-/-;CDKN2A-/-メラノーマ負荷を有するマウスの全生存を延ばした(図24D~図24F)。まとめると、ヒトメラノーマの多様な変異プロフィルを示す異種移植および遺伝子誘導の独立した免疫適格メラノーママウスモデルにわたるメラノーマ進行の堅固な抑制は、LXR活性化療法の臨床試験を行うための動機を与えた。
実施例17 LXRβの薬理学的活性化は、メラノーマ細胞のApoE発現を転写誘導することによってメラノーマ表現型を抑制する
本発明者らは次に、メラノーマ進行の抑制を媒介するLXRβの下流側の分子標的を明らかにしようと努めた。この目的を達成するために、本発明者らは、LXRアゴニストのGW3965[2]により処置されるヒトMeWoメラノーマ細胞のトランスクリプトームプロファイリングを行った。
本発明者らは次に、メラノーマ進行の抑制を媒介するLXRβの下流側の分子標的を明らかにしようと努めた。この目的を達成するために、本発明者らは、LXRアゴニストのGW3965[2]により処置されるヒトMeWoメラノーマ細胞のトランスクリプトームプロファイリングを行った。
LXR活性化に応答して著しく誘導された365個の遺伝子の中から、本発明者らは、ApoE、すなわち、マクロファージおよび脂肪細胞におけるLXRの以前に確認された転写標的(Laffitte他、2001)を、メラノーマ細胞における最もアップレギュレーションされた分泌型因子として特定した(図26)。定量的リアルタイムPCR(qRT-PCR)による確認により、ApoE転写物発現の堅固なアップレギュレーションが、関係性がないLXRアゴニストによる処置の後、多数のヒトメラノーマ系統にわたって明らかにされた(図27A~図27C)。
メラノーマにおけるApoEの以前に報告された転移抑制的機能(Pencheva他、2012)に照らして、本発明者らは、LXRβ活性化がメラノーマ進行をApoEの転写誘導により抑制するかどうかを詳しく調べた。実際に、GW3965[2]およびT0901317[1]は、2つの以前に特徴づけられたLXR結合性のマルチエンハンサーエレメント(ME.1またはME.2)(Laffitte他、2001)のどちらかに融合されるApoEプロモーターを含有するルシフェラーゼレポーター構築物のメラノーマ細胞駆動の活性を高めることが見出された(図28A)。重要なことに、この転写誘導は、上昇したレベルの分泌されたApoEタンパク質をもたらした(図28B)。メラノーマ細胞におけるApoEの直接的なLXRβ標的化と一致して、抗体による細胞外ApoEの中和は細胞浸潤および内皮動員のLXRβ媒介抑制を完全に阻止し、かつ、これらの表現型をコントロールIgG処置に対してさらに高め(図28C~図28Gおよび図27D~図27F)、このことから、LXRアゴニズムの影響が細胞外ApoEによって調節されることが明らかにされた。
加えて、メラノーマ細胞におけるApoEの分子的ノックダウンはまた、細胞浸潤表現型および内皮動員表現型のGW3965[2]媒介抑制を阻止した(図27G~図27H)。このことと一致して、LXRαではなく、LXRβのメラノーマ細胞での枯渇化は、GW3965[2]およびT0901317[1]がApoEの転写および最終的にはタンパク質発現をアップレギュレーションすることができることを取り消した(図28H~図28Iおよび図27I~図27K)。まとめると、これらの発見は、LXRβ(メラノーマ細胞によって発現される優性なLXRイソ型)の薬理学的活性化が、メラノーマ細胞による細胞固有的な浸潤および内皮動員を、ApoE発現をメラノーマ細胞において転写活性化することを介して抑制することを示している。
実施例18 LXRβ活性化療法によるメラノーマ由来ApoEおよび全身的ApoEの関与
インビトロにおける細胞外ApoEによる重要なメラノーマ表現型のLXRβ誘導による抑制により、インビボでのLXRアゴニストの抑制的影響が末梢組織(これは細胞外ApoEの堅固な供給源として役立ち得る)におけるLXRの活性化によってさらに強化されるかもしれないことが示唆された。
インビトロにおける細胞外ApoEによる重要なメラノーマ表現型のLXRβ誘導による抑制により、インビボでのLXRアゴニストの抑制的影響が末梢組織(これは細胞外ApoEの堅固な供給源として役立ち得る)におけるLXRの活性化によってさらに強化されるかもしれないことが示唆された。
重要なことに、そのような非形質転換組織は、患者における長期間のApoE誘導を可能にするLXR活性化療法に対する抵抗性をそれほど発達させやすいであろうとは思われない。したがって、本発明者らは、治療的なLXRアゴニズムが、メラノーマ進行を、メラノーマ細胞または全身組織に由来するApoEを誘導することによって抑制するかどうかを詳しく調べた。LXRβアゴニズムがApoE発現をインビボでのメラノーマ細胞において増大させることと一致して、ApoE転写物レベルが、メラノーマ原発性腫瘍において、同様にまた、LXRアゴニスト補充餌が与えられたマウスから分離されるメラノーマの肺転移物および脳転移物においてアップレギュレーションされた(図29A~図29E)。重要なことに、GW3965[2]またはT0901317[1]のどちらかによるマウスの処置は、ApoEタンパク質発現をマウスの全身的な脂肪細胞組織、肺組織および脳組織において著しく上昇させ(図30A~図30B)、また、ApoE転写物レベルを循環白血球においても同様にアップレギュレーションさせた(図30C)。これらの結果は、LXR活性化療法がメラノーマ細胞および全身組織の両方のApoE発現をインビボにおいて誘導することを示している。
メラノーマ由来のLXR活性化および全身的なLXR活性化が、経口投与されたLXRアゴニストの腫瘍抑制的影響のためにインビボにおいて要求されることを明らかにするために、本発明者らは最初に、GW3965[2]が、LXRβが枯渇化されるB16F10マウスメラノーマ細胞による腫瘍成長を抑制することができるかを試験した。
ヒトメラノーマ細胞における本発明者らの発見と一致して、マウスメラノーマ細胞のLXRβノックダウンはApoE発現のGW3965媒介による誘導を取り消した(図29F~図29H)。このことにもかかわらず、メラノーマ細胞のLXRβノックダウンはGW3965[2]による腫瘍成長の抑制を妨げることができず(図29D)、このことから、GW3965[2]による腫瘍成長阻害における全身的なLXR活性化についての役割が暗示された。LXRアゴニストによるメラノーマ成長のこの腫瘍非自律的な抑制を媒介するLXRイソ型を特定するために、本発明者らは、LXRαまたはLXRβの遺伝的ヌルマウスに埋め込まれた腫瘍に対するGW3965[2]の影響を調べた。興味深いことに、全身的LXRβの遺伝的消失は、GW3965がメラノーマ腫瘍成長を抑制することができることを阻止し、一方、LXRαの不活性化はGW3965による腫瘍成長阻害に対する影響を何ら有していなかった(図6D)。重要なことに、GW3965[2](LXRαよりもLXRβに対する6倍大きい活性を有するアゴニスト)による全身的ApoE発現のアップレギュレーションが、LXRα-/-のマウスにおいてではなく、LXRβ-/-のマウスにおいて取り消された(図30Eおよび図29I)。これらの結果は、末梢組織におけるGW3965[2]によるApoE誘導が全身的なLXRβ活性化によって主に押し進められることを示している。このことと一致して、本発明者らは、全身的なLXRβが、メラノーマ腫瘍成長抑制を媒介することにおけるGW3965[2]の主要な分子標的で、かつ、エフェクターであることを見出している。
本発明者らは次に、ApoEがLXRアゴニストのインビボでのメラノーマ抑制的影響のために要求されるかどうかを調べた。メラノーマ細胞のLXRβノックダウンについてはGW3965[2]の腫瘍抑制活性に対する影響がないことと一致して、メラノーマ細胞ApoEの枯渇化は、GW3965[2]による腫瘍成長阻害もまた妨げなかった(図29F~図29Hおよび図30F)。これらの発見は、GW3965[2]の腫瘍抑制的影響が主に全身組織におけるApoE誘導を介して媒介されているかもしれないことを示唆する。
実際に、GW3965[2]は、ApoEについて遺伝的に不活性化されるマウスにおける腫瘍成長を抑制することにおいて完全に無力ではなく(図30F)、このことから、全身的ApoEが、メラノーマ腫瘍成長抑制を押し進めることにおける全身的LXRβの下流側エフェクターとして明らかにされた。興味深いことに、原発性腫瘍成長の調節とは対照的に、メラノーマ細胞のApoEノックダウンはGW3965[2]の転移抑制的影響を部分的に妨げた(図30G)。同様に、ApoEの遺伝的不活性化もまた、GW3965[2]によって誘発される転移抑制を部分的に妨げただけであった(図30G)。転移のGW3965主導の阻害が、メラノーマ細胞ApoEノックダウンおよび全身的ApoEの遺伝的不活性化の両方の状況でのみ完全に阻止され(図30G)、このことから、LXRβによるメラノーマ由来ApoEの関与および全身的ApoEの関与の両方が、転移を抑制することにおいて要求されることが暗示された。したがって、本発明者らは、原発性腫瘍成長に対するLXRβ活性化の影響が、主に全身的なApoE誘導により誘発され、一方、転移に対するLXRβアゴニズムの影響がメラノーマ細胞および全身組織の両方におけるApoEの転写誘導により媒介されると結論する。
ApoEがメラノーマ表現型のLXRβ誘導抑制の唯一の下流側媒介因子として特定されたことにより、メラノーマ進行の抑制因子としてのこの遺伝子の重要性がさらに強調される。ApoE発現がメラノーマの転移性結末の臨床的な予後となるかどうかを明らかにするために、本発明者らは、ApoEのタンパク質レベルを、手術により切除された71個のヒト原発性メラノーマ病変部に対する盲検化された免疫組織化学的分析を行うことによって評価した。
本発明者らは、メラノーマが転移していた患者が、メラノーマが転移していない患者に対して、それらの原発性腫瘍における大雑把には3分の1に低下したApoE発現を示したことを見出した(図30H、P=0.002)。注目すべきことに、患者の原発性メラノーマ病変部におけるApoEの発現レベルにより、転移性再発についての危険性が大きい患者が、その危険性が低い患者から堅固に階層化された(図30I、P=0.002)。これらの観測結果は、遠位メラノーマ転移部における著しくより低いレベルのApoEが原発性病変部に対して明らかにされた以前の発見(Pencheva他、2012)と一致している。まとめると、本研究は、ApoEがただ1つの遺伝子として、i)メラノーマの転移性再発についての危険性があり、かつ、そのようなものとして、ii)臨床的利益をLXRβアゴニスト媒介のApoE誘導から得ることができると思われる患者を特定するための原発性メラノーマにおける予後的かつ予測的なバイオマーカーとしておそらくは作用し得るかもしれないことを示している。
実施例19 LXRβ活性化療法は、ダカルバジンおよびベムラフェニブに対して抵抗性であるメラノーマの成長を抑制する
LXRβ活性化療法は多様な変異背景の広範囲のメラノーマ系統にわたってメラノーマの腫瘍成長および腫瘍転移を堅固に抑制することができることによって勇気づけられて、本発明者らは次に、転移性メラノーマの管理において使用される主力となる臨床薬剤のうちの2つに対して、すなわち、ダカルバジンおよびベムラフェニブに対して抵抗性であるメラノーマが、LXRβ活性化療法に応答し得るかどうかを明らかにしようと努めた。
LXRβ活性化療法は多様な変異背景の広範囲のメラノーマ系統にわたってメラノーマの腫瘍成長および腫瘍転移を堅固に抑制することができることによって勇気づけられて、本発明者らは次に、転移性メラノーマの管理において使用される主力となる臨床薬剤のうちの2つに対して、すなわち、ダカルバジンおよびベムラフェニブに対して抵抗性であるメラノーマが、LXRβ活性化療法に応答し得るかどうかを明らかにしようと努めた。
この目的を達成するために、本発明者らは、ダカルバジン(DTIC)に対して抵抗性であるB16F10クローンを、メラノーマ細胞をDTICの存在下で2ヶ月間にわたって連続培養することによって作製した。これにより、親のB16F10細胞株と比較して、高用量のDTIC処理に対する応答での生存性における7倍の増大を示した細胞の集団が得られた(図31A)。このインビトロ由来DTICクローンもまた、インビボにおいてDTICに対して抵抗性であることを確認するために、本発明者らは、腫瘍成長に対するダカルバジン処理の影響を評価した。
ダカルバジンはDTIC感受性の親系統の成長を著しく抑制した(図31B)が、B16F10のDTIC抵抗性細胞による腫瘍成長には影響を及ぼさなかった(図31C)。GW3965[2]は、DTIC抵抗性のB16F10メラノーマクローンによる腫瘍成長を70%超の差で堅固に抑制した(図31C~図31D)。重要なことに、GW3965[2]の経口送達もまた、関係性がないMeWo細胞株によって形成されるインビボ由来のDTIC抵抗性ヒトメラノーマ腫瘍の成長を強く阻害した(図31E~図31Fおよび図32A)。
これらの結果から、LXRβアゴニズムが、ダカルバジン(転移性メラノーマにおける唯一のFDA承認された細胞毒性化学療法剤)に対して抵抗性である多数のメラノーマ細胞集団を抑制することにおいて効果的であることが明らかにされる。本発明者らの発見は、メラノーマの処置についての重要な臨床的意味合いを有している。これは、ダカルバジンにより処置されるすべての第IV期患者が、この薬剤に対して抵抗性である腫瘍を発達させることによって最終的には進行するからである。
本発明者らは、近年に承認されたB-Rafキナーゼ阻害剤であるベムラフェニブに対して、すなわち、B-Raf変異型メラノーマに対して活性を示す治療様式(Bollag他、2010;Sosman他、2012)に対して抵抗性であるメラノーマ細胞に対するLXRβ活性化療法の影響を試験した。数多くの研究者が、ベムラフェニブに対して抵抗性であるメラノーマ株を導いている(Poulikakos他、2011;Shi他、2012;Das Thakur他、2013)。GW3965[2]による処置は、以前に導かれたベムラフェニブ抵抗性SK-Mel-239系統の成長を72%抑制し(図31G)、かつ、ベムラフェニブ抵抗性メラノーマの負荷を有するマウスの生存を著しく延ばした(図31H)。メラノーマの多様な前臨床モデルにおける組み合わされた薬理学的研究、分子的研究および遺伝学的研究からの本発明者らの発見により、LXRβ標的化が、メラノーマの腫瘍成長および腫瘍転移をApoE(メラノーマ浸潤および転移性血管形成の重要な抑制因子)の転写誘導により堅固に抑制する新規な治療的取り組みとして立証される(Pencheva他、2012;図31I)。
実施例20 ApoEによる処置は、腫瘍細胞浸潤および内皮動員を、乳ガン、腎細胞ガンおよび膵臓ガンを含めて多数のガンタイプにわたって抑制する
ApoE処置が、メラノーマに加えて、様々なガンタイプを処置するために効果的であり得るかを明らかにするために、インビトロアッセイを行って、乳ガン細胞株、腎細胞ガン細胞株および膵臓ガン細胞株を含めて、いくつかの異なるガン細胞株に対するApoE処置の影響を評価した(図33)。
ApoE処置が、メラノーマに加えて、様々なガンタイプを処置するために効果的であり得るかを明らかにするために、インビトロアッセイを行って、乳ガン細胞株、腎細胞ガン細胞株および膵臓ガン細胞株を含めて、いくつかの異なるガン細胞株に対するApoE処置の影響を評価した(図33)。
ガン細胞がインビトロにおいてマトリゲルを通って浸潤し得ることを、トランスウエル・マトリゲル浸潤チャンバーシステム(354480、BD Biosciences)を使用することによって試験した。様々なガン細胞株を、0.2%のFBSを含有する培地における一晩の血清飢餓に供した。翌日、浸潤チャンバーを、0.5mLの飢餓培地を上部ウエルおよび底部ウエルに加えることによってアッセイ前に事前に平衡化させた。その間に、ガン細胞をトリプシン処理し、生細胞を、トリパンブルー死細胞排除色素を使用して計数した。その後、ガン細胞を1mLの飢餓培地あたり1×105細胞の濃度で再懸濁し、0.5mLの細胞懸濁物(5×104個の細胞を含有する)をそれぞれのトランスウエルの中に播種した。ガン細胞浸潤に対する組換えApoEの影響を明らかにするために、ヒト組換えApoE3(4696、Biovision)またはBSAをアッセイ開始時にそれぞれのトランスウエルに100μg/mLで加えた。浸潤アッセイを37℃で24時間にわたって進行させた。アッセイが完了したとき、挿入物をPBSで洗浄し、浸潤していない細胞を、q-チップを使用してそれぞれの挿入物の上部面から穏やかにかき取り、挿入物の基部面に浸潤した細胞を4%のPFAにおいて室温で15分間にわたって固定処理した。固定処理の後、挿入物をPBSで洗浄し、その後、切り出し、DAPI核染色(H-1000、Vector Laboratories)を含有するVectaShiels固定用媒体を使用してスライドに固定した。それぞれの挿入物の基部面を、倒立型蛍光顕微鏡(Zeiss Axiovert 40 CFL)を5×の倍率で使用して画像化し、DAPI陽性細胞の数を、ImageJを使用して定量化した。
実際に、ApoEによる処理は、腫瘍細胞浸潤および内皮動員の両方をこれらのガンタイプの3つすべてにわたって阻害した(図33A~図33I)。
実施例21 LXRアゴニストのLXR-623、WO-2007-002563(Ex.19)、WO-2010-0138598(Ex.9)およびSB742881はApoE発現をヒトメラノーマ細胞において誘導する
LXRアゴニストのGW3965[2]およびT0901317[1]を用いた処理によるApoE活性化が、腫瘍の成長および転移を阻害するための治療的利益をもたらしたことを考えれば、本発明者らは次に、他のLXRアゴニストがApoE発現をヒトメラノーマ細胞において誘導し得るかを調べた(図34)。
LXRアゴニストのGW3965[2]およびT0901317[1]を用いた処理によるApoE活性化が、腫瘍の成長および転移を阻害するための治療的利益をもたらしたことを考えれば、本発明者らは次に、他のLXRアゴニストがApoE発現をヒトメラノーマ細胞において誘導し得るかを調べた(図34)。
メラノーマ細胞におけるApoE発現に対する様々なLXRアゴニスト(LXR-623、WO-2007-002563(Ex.19)、WO-2010-0138598(Ex.9)およびSB742881)の影響を明らかにするために、1×105個のヒトMeWoメラノーマ細胞を6ウエルプレートに播種した。翌日、DMSOまたはそれぞれのLXRアゴニストを、示されるように500nM、1μMまたは2μMの濃度で細胞培地に加え、細胞をDMSOまたは薬物の存在下において37℃で48時間インキュベーションした。細胞培地に加えられるDMSOの総量を0.2%未満に保った。RNAを、Total RNA Purification Kit(17200、Norgen)を使用して全細胞溶解物から抽出した。どのサンプルについても、600ngのRNAを、cDNA First-Strand Synthesisキット(Invitrogen)を使用してcDNAに逆転写した。およそ200ngのcDNAを、SYBR(登録商標)グリーンPCR Master Mix、ならびに、ヒトApoEを検出するために特異的である対応する順方向プライマーおよび逆方向プライマーと混合した。それぞれの反応を四連で行い、ApoEのmRNA発現レベルを、ABI Prism 7900HT Real-Time PCR System(Applied Biosystems)を使用して定量的リアルタイムPCR増幅によって測定した。相対的なApoE発現を、ΔΔCt法を使用して求めた。GAPDHを正規化目的のための内因性コントロールとして使用した。
実際に、上記LXRアゴニスト(LXR-623、WO-2007-002563(Ex.19)、WO-2010-0138598(Ex.9)およびSB742881)による処理はすべてが、様々な程度のApoE発現誘導を引き起こした(図34A~図34C)。
実施例22 LXRアゴニストのGW3965による処置は、腎臓ガン、膵臓ガンおよび肺ガンのインビトロでの腫瘍細胞浸潤を阻害する
本発明者らは、LXRアゴニストによる処置がメラノーマ腫瘍細胞浸潤の阻害をもたらしたことを明らかにしている。この効果がApoE発現の活性化によって媒介されることを考えれば、本発明者らは、LXRアゴニストによる処置が、乳ガン、膵臓ガンおよび腎臓ガンにおけるインビトロでの腫瘍細胞浸潤の阻害をもたらすであろうと仮定した。これは、これらのガンタイプがApoE処置に対して応答性であったからである。この仮説を検証するために、本発明者らは、インビトロ腫瘍細胞浸潤アッセイを、乳ガン細胞株、膵臓ガン細胞株および腎細胞ガン細胞株をLXRアゴニストのGW3965[2]により処理することによって行った(図35)。
本発明者らは、LXRアゴニストによる処置がメラノーマ腫瘍細胞浸潤の阻害をもたらしたことを明らかにしている。この効果がApoE発現の活性化によって媒介されることを考えれば、本発明者らは、LXRアゴニストによる処置が、乳ガン、膵臓ガンおよび腎臓ガンにおけるインビトロでの腫瘍細胞浸潤の阻害をもたらすであろうと仮定した。これは、これらのガンタイプがApoE処置に対して応答性であったからである。この仮説を検証するために、本発明者らは、インビトロ腫瘍細胞浸潤アッセイを、乳ガン細胞株、膵臓ガン細胞株および腎細胞ガン細胞株をLXRアゴニストのGW3965[2]により処理することによって行った(図35)。
様々な細胞株(5×104個のRCCヒト腎臓ガン細胞、5×104個のPANC1ヒト膵臓ガン細胞および5×104個のH460ヒト肺ガン細胞)を1μMでのDMSOまたはGW3965により56時間処理した。細胞を、DMSOまたはGW3965の存在下、FBSが0.2%の培地における16時間の血清飢餓に供した。血清飢餓の後、細胞を、マトリゲル浸潤チャンバーシステム(354480、BD Biosciences)を使用するトランスウエル浸潤アッセイに供した。浸潤チャンバーを、0.5mLの飢餓培地を上部ウエルおよび底部ウエルに加えることによってアッセイ前に事前に平衡化させた。その間に、ガン細胞をトリプシン処理し、生細胞を、トリパンブルーを使用して計数した。その後、ガン細胞を1mLの飢餓培地あたり1×105細胞の濃度で再懸濁し、0.5mLの細胞懸濁物(5×104個の細胞を含有する)をそれぞれのトランスウエルの中に播種した。浸潤アッセイを37℃で24時間にわたって進行させた。アッセイが完了したとき、挿入物をPBSで洗浄し、浸潤していない細胞を、q-チップを使用してそれぞれの挿入物の上部面から穏やかにかき取り、挿入物の基部面に浸潤した細胞を4%のPFAにおいて室温で15分間にわたって固定処理した。固定処理の後、挿入物をPBSで洗浄し、その後、切り出し、DAPI核染色(H-1000、Vector Laboratories)を含有するVectaShield固定用媒体を使用してスライドに固定した。それぞれの挿入物の基部面を、倒立型蛍光顕微鏡(Zeiss Axiovert 40 CFL)を5×の倍率で使用して画像化し、DAPI陽性細胞の数を、ImageJを使用して定量化した。
実際に、GW3965[2]による処理は、試験された3つすべてのガンタイプにおける腫瘍細胞浸潤の阻害をもたらした(図35A~図35C)。このことからさらに、様々なガンタイプを処置するためのLXRアゴニストの幅広い治療的可能性が実証された。
実施例23 LXRアゴニストのGW3965による処置は乳ガンの腫瘍成長をインビボにおいて阻害する
本発明者らは、LXRアゴニストが、乳ガン、膵臓ガンおよび腎臓ガンにおけるインビトロでのガン進行表現型を阻害することを明らかにしている。LXRアゴニストによる処置が乳ガンの原発性腫瘍成長をインビボにおいて阻害するかを詳しく調べるために、MDA-468ヒト乳ガン細胞が注入されるマウスを、コントロール餌、または、LXRアゴニストのGW3965[2]が補充される餌のどちらかにより処置した(図36)。
本発明者らは、LXRアゴニストが、乳ガン、膵臓ガンおよび腎臓ガンにおけるインビトロでのガン進行表現型を阻害することを明らかにしている。LXRアゴニストによる処置が乳ガンの原発性腫瘍成長をインビボにおいて阻害するかを詳しく調べるために、MDA-468ヒト乳ガン細胞が注入されるマウスを、コントロール餌、または、LXRアゴニストのGW3965[2]が補充される餌のどちらかにより処置した(図36)。
経口送達されたGW3965[2]の乳ガン腫瘍成長に対する影響を明らかにするために、2×106個のMDA-468ヒト乳ガン細胞を50μLのPBSおよび50μLのマトリゲルに再懸濁し、細胞懸濁物を7週齢のNod Scidガンマの雌マウスの両方の下部メモリ脂肪パッド(memory fat pad)に注入した。マウスをガン細胞注入の2日前にコントロール餌処置またはGW3965補充餌処置(75mg/kg/日)に割り当てた。GW3965[2]の薬物化合物は、Research Diets,Inc.によってマウス固形飼料に配合された。腫瘍の大きさを、デジタルカリパスを使用して測定し、腫瘍体積を、(最小直径)2×(最大直径)/2として計算した。
GW3965による処置は乳ガン腫瘍サイズにおける著しい減少をインビボにおいてもたらした(図36)。
実施例24 インビトロでのメラノーマ進行表現型に対するLXRアゴニスト(LXR-623、WO-2007-002563(Ex.19)、WO-2010-0138598(Ex.9)およびSB742881)による処置の影響
本発明者らは、様々なLXRアゴニストが、ApoE発現を、メラノーマ細胞における様々な効力を伴って誘導し得ることを明らかにしている(図34)。ガンに対するLXRアゴニストの治療効果がApoE発現の活性化を介してであるので、本発明者らは、どのようなLXRアゴニストであれ、与えられたLXRアゴニストの治療効力がそのApoE発現誘導能と直接に相関づけられることを仮定した。このことを確認するために、本発明者らは、メラノーマ細胞のインビトロでの内皮動員および腫瘍細胞浸潤に対する様々なLXRアゴニストによる処置の影響を定量化した。図37に示されるように、LXRアゴニストがインビトロでのガン進行表現型を阻害する程度が、LXRアゴニストのApoE誘導効力に関連づけられる。
本発明者らは、様々なLXRアゴニストが、ApoE発現を、メラノーマ細胞における様々な効力を伴って誘導し得ることを明らかにしている(図34)。ガンに対するLXRアゴニストの治療効果がApoE発現の活性化を介してであるので、本発明者らは、どのようなLXRアゴニストであれ、与えられたLXRアゴニストの治療効力がそのApoE発現誘導能と直接に相関づけられることを仮定した。このことを確認するために、本発明者らは、メラノーマ細胞のインビトロでの内皮動員および腫瘍細胞浸潤に対する様々なLXRアゴニストによる処置の影響を定量化した。図37に示されるように、LXRアゴニストがインビトロでのガン進行表現型を阻害する程度が、LXRアゴニストのApoE誘導効力に関連づけられる。
細胞浸潤:MeWoヒトメラノーマ細胞を、DMSO、LXR-623、WO-2007-002563(Ex.19)、WO-2010-0138598(Ex.9)またはSB742881によりそれぞれ1μMで56時間処理した。その後、細胞を、それぞれの対応する薬物またはDMSOの存在下、FBSが0.2%の培地における16時間の血清飢餓に供した。血清飢餓の後、細胞を、マトリゲル浸潤チャンバーシステム(354480、BD Biosciences)を使用するトランスウエル浸潤アッセイに供した。浸潤チャンバーを、0.5mLの飢餓培地を上部ウエルおよび底部ウエルに加えることによってアッセイ前に事前に平衡化させた。その間に、ガン細胞をトリプシン処理し、生細胞を、トリパンブルーを使用して計数した。その後、ガン細胞を1mLの飢餓培地あたり2×105細胞の濃度で再懸濁し、0.5mLの細胞懸濁物(1×105個の細胞を含有する)をそれぞれのトランスウエルの中に播種した。浸潤アッセイを37℃で24時間にわたって進行させた。アッセイが完了したとき、挿入物をPBSで洗浄し、浸潤していない細胞を、q-チップを使用してそれぞれの挿入物の上部面から穏やかにかき取り、挿入物の基部面に浸潤した細胞を4%のPFAにおいて室温で15分間にわたって固定処理した。固定処理の後、挿入物をPBSで洗浄し、切り出し、DAPI核染色(H-1000、Vector Laboratories)を含有するVectaShiels固定用媒体を使用してスライドに固定した。それぞれの挿入物の基部面を、倒立型蛍光顕微鏡(Zeiss Axiovert 40 CFL)を5×の倍率で使用して画像化し、DAPI陽性細胞の数を、ImageJを使用して定量化した。
内皮動員:MeWoヒトメラノーマ細胞を、DMSO、LXR-623、WO-2007-002563(Ex.19)、WO-2010-0138598(Ex.9)またはSB742881によりそれぞれ1μMで56時間処理した。続いて、5×104個のガン細胞をそれぞれの薬物またはDMSOの存在下において24ウエルプレートに播種し、アッセイを開始する前の16時間にわたって付着させた。ヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC細胞)を、0.2%のFBSを含有する培地における血清飢餓に一晩供した。翌日、1×105個のHUVEC細胞を、ガン細胞を底部に含有するそれぞれのウエルにはめ込まれる3.0μmのHTS Fluoroblock挿入物(351151、BD Falcon)の中に播種した。HUVEC細胞をガン細胞に向かって20時間にわたって遊走させ、その後、挿入物をPBSで洗浄し、4%のPFAにおいて固定処理し、DAPIにより標識し、スライドに固定した。それぞれの挿入物の基部面を、倒立型蛍光顕微鏡(Zeiss Axiovert 40 CFL)を5×の倍率で使用して画像化し、DAPI陽性細胞の数を、ImageJを使用して定量化した。
ApoE発現を強力に誘導するLXRアゴニスト(例えば、WO-2010-0138598(Ex.9)およびSB742881)は、ガン進行表現型を阻害することにおいて、効力がより低いLXRアゴニストよりも効果的である(図37)。このことからさらに、LXRアゴニスト処置の治療的利益がApoE誘導の結果であることが実証される。
実施例25 LXRアゴニストによる処置はメラノーマ腫瘍成長をインビボにおいて阻害する
本発明者らは、ApoE発現を誘導する様々なLXRアゴニストがインビトロ腫瘍活性を阻害することを明らかにしている。これらのアゴニストがメラノーマ腫瘍成長をインビボにおいて阻害するかを確認するために、B16F10メラノーマ細胞が注入されるマウスを、LXR-623、WO-2007-002563(Ex.19)、WO-2010-0138598(Ex.9)またはSB742881のいずれかにより処置した。
本発明者らは、ApoE発現を誘導する様々なLXRアゴニストがインビトロ腫瘍活性を阻害することを明らかにしている。これらのアゴニストがメラノーマ腫瘍成長をインビボにおいて阻害するかを確認するために、B16F10メラノーマ細胞が注入されるマウスを、LXR-623、WO-2007-002563(Ex.19)、WO-2010-0138598(Ex.9)またはSB742881のいずれかにより処置した。
経口投与されたLXR-623、WO-2007-002563(Ex.19)、WO-2010-0138598(Ex.9)またはSB742881のメラノーマ腫瘍成長に対する影響を評価するために、5×104個のB16F10マウスメラノーマ細胞を50μLのPBAおよび50μLのマトリゲルに再懸濁し、細胞懸濁物を7週齢C57BL/6マウスの両側の下部背側わき腹に皮下注入した。マウスを腫瘍形成について毎日触診し、体積で5m3~10m3である腫瘍が検出された後、マウスを、コントロール固形飼料、または、下記のそれぞれのLXRアゴニストを含有する固形飼料に割り当てた:LXR-623(20mg/kg/日)、WO-2007-002563(Ex.19)(100mg/kg/日)、WO-2010-0138598(Ex.9)(10mg/kg/日または100mg/kg/日)またはSB742881(100mg/kg/日)。これらのLXRアゴニスト薬物化合物は、Research Diets,Inc.によってマウス固形飼料に配合された。腫瘍の大きさを、デジタルカリパスを使用して測定し、腫瘍体積を、(最小直径)2×(最大直径)/2として計算した。
本発明者らのインビトロでのデータと一致して、ApoE発現をインビトロにおいて強
力に誘導するLXRアゴニスト(WO-2010-0138598(Ex.9)およびSB742881)はメラノーマ原発性腫瘍成長をインビボにおいて著しく阻害した(図38)。このことはまた、ApoE発現を強力に誘導する他のLXRアゴニスト(GW3965[2]、T0901317[1])もまた、原発性腫瘍成長をインビボにおいて阻害することを実証する本発明者らの結果(図21)と一致している。
力に誘導するLXRアゴニスト(WO-2010-0138598(Ex.9)およびSB742881)はメラノーマ原発性腫瘍成長をインビボにおいて著しく阻害した(図38)。このことはまた、ApoE発現を強力に誘導する他のLXRアゴニスト(GW3965[2]、T0901317[1])もまた、原発性腫瘍成長をインビボにおいて阻害することを実証する本発明者らの結果(図21)と一致している。
したがって、上記例は、その効果を発揮する分子的機構および細胞機構を特徴づけることに集中した。この目的を達成するために、ApoEが、2つの別種の細胞タイプにおける2つの異なった、それにもかかわらず相同的な受容体を標的化することが見出された。メラノーマ細胞のLRP1受容体に作用するApoEはメラノーマの浸潤を阻害し、一方、内皮細胞のLRP8受容体に対するその作用は内皮遊走を抑制する。機能喪失分析、機能獲得分析、エピスタシス分析、臨床的相関分析およびインビボ選抜派生物発現分析からの結果により、3つのmiRNAが転移抑制因子ネットワークを収斂的に標的化して、ApoEの分泌を制限し、したがって、メラノーマ細胞に対するApoE/LRP1シグナル伝達および内皮細胞に対するApoE/LRP8シグナル伝達を抑制するモデルが得られる(図7K)。上記の体系的分析により、ApoEおよびDNAJA4が、これらのmiRNAによって調節される転移表現型の重要な標的および直接的な媒介因子として特定されているにもかかわらず、これら3つのmiRNAは、サイレンシングが転移性進行に寄与するかもしれないさらなる遺伝子標的を個々に保持しているかもしれないことを排除することができない。しかしながら、ApoEまたはDNAJA4のノックダウンが、個々のmiRNAサイレンシングとともに認められる転移抑制表現型を完全に回復させ得ることは、これらの遺伝子が転移に対するmiRNA依存的影響の重要な媒介因子であることを強く示唆する。
上記の結果から、メラノーマ転移性進行の抑制におけるApoEについて要求され、かつ、十分である役割に対する組み合わされた分子的、遺伝子的かつインビボでの証拠が明らかにされる。ApoEは、リポタンパク質結合状態および脂質非含有状態の両方において循環系に分布し得る(Hatters他、2006)。脂質非含有の組換えApoEが、メラノーマ浸潤および内皮遊走を抑制するために十分であることが示されているが、リポタンパク質粒子に含有されるApoEもまた、メラノーマ浸潤および内皮動員を抑制し得るであろうことが可能である。組換えApoEが、これら転移支援的表現型、同様にまた、抗体媒介のApoE中和とともに認められる増大したメラノーマ浸潤表現型および内皮動員表現型を阻害し得ることは、ApoE分子自身がこれらの表現型の重要な媒介因子であることを示唆する。本明細書中に開示される発見と一致して、ApoEの合成ペプチドフラグメントは、内皮遊走を、不明な機構を介して阻害することが以前に見出された(Bhattacharjee他、2011)。本明細書中に開示される発見は、内皮動員を阻害することにおけるメラノーマ細胞分泌のApoEおよび全身的な内因性ApoEについての役割と一致しており、この場合、この役割は、損なわれた内皮細胞成長の二次的なものではない。
上記の分子的研究、遺伝子研究およびインビボ研究から、内皮LRP8受容体のシグナル伝達を介する内皮遊走およびガン血管形成の調節における内因性のガン由来ApoEについての役割が明らかにされる。ApoE/LRP8シグナル伝達によって媒介されるこの堅固な細胞非自律的な内皮動員表現型は、ApoEがまた、転移性血管形成を他のガンタイプにおいて調節しているかもしれないことを示唆しており、そして、ガンの血管形成におけるApoEについてのそのような全体的な役割は今後、検討されなければならない。ApoEは、脂質障害、心臓血管障害および神経変性障害における十分に確立された役割を有する多型分子である。その3つの主要な変異体、すなわち、ApoE2、ApoE3およびApoE4が、様々な提示物をヒト集団において示しており、ApoE3が最も一般的な変異体である(Hatters他、2006)。これら3つのイソ型は、ApoE受容体結合ドメインを含有するN末端ドメインにおける112位および158位の残基において異なる。これらの構造的変化が変異体の間における異なった機能的属性を生じさせていると考えられる。このことと一致して、これら3つのApoEイソ型は、LDL受容体ファミリーのメンバーについてのそれらの結合親和性、リポタンパク質結合の好み、および、N末端の安定性において異なる。すなわち、ApoE2は、LDL受容体結合能が、ApoE3およびApoE4と比較して、50分の1~100分の1と弱く(Weisgraber他、1982)、一方、ApoE4は、それ以外の2つの変異体とは異なり、大きいより低密度のリポタンパク質に優先的に結合し(Weisgraber他、1990)、また、最も低いN末端安定性を示す(Morrow他、2000)。これらの機能的な違いにより、ApoEのイソ型を選択するための病態生理学的性質がもたらされる。ApoE3(これは集団の78%において見出される)は中立的な対立遺伝子であると見なされるが、ApoE2はIII型高リポタンパク血症に関連し(Hatters他、2006)、ApoE4はアルツハイマー病についての主要な知られている遺伝的リスクを表し(Corder他、1993)、また、心臓血管疾患を発症する危険性における大きくない増大と相関する(Luc他、1994)。上記研究において分析された多数のヒトメラノーマ細胞株がApoE3対立遺伝子についてホモ接合性であること、同様にまた、組換えAoE3がメラノーマ浸潤および内皮動員を阻害し得ることを考えれば、上記の発見は、ApoE3がメラノーマ転移性進行の抑制のために十分であり、かつ、要求されることと一致している。しかしながら、ApoE2およびApoE4がこれらの転移支援的表現型をApoE3と同じような程度に調節し得るかどうか、また、特定のApoE遺伝子型が、メラノーマ転移性進行の高まった危険性をもたらすかどうかを明らかにすることは、将来、注目されるであろう。
原発性メラノーマ病変部の外科的切除を除いて、現在においてはメラノーマ転移を防止するための効果的な治療法はなく、インターフェロン療法が5年での全生存率をメタ分析に基づいてわずかに3%増大させており、一方、有意な生存利益の第III相臨床データ実証は依然として顕著である(Garbe他、2011)。全身的ApoEの遺伝的消失の状況におけるメラノーマ転移性進行の劇的な高まりは、ApoEレベルを調節することが、メラノーマ、すなわち、およそ48,000名の命を世界中で毎年奪う疾患(Lucas他、2006)のための重要な治療的意味合いを有しているかもしれないことを示唆する。ApoEが、メラノーマ浸潤、内皮遊走、転移性血管形成および転移性コロニー形成を堅固に抑制し得ることを考えれば、内因性ApoEレベルの薬理学的誘導を目的とする治療的取り組みは、メラノーマ死亡率を、転移発生を低下させることによって著しく低下させるかもしれない。
先入観のない、インビボ選抜に基づく上記取り組みは、黒色性メラノーマおよび無色素性メラノーマの両方を表す独立した患者のメラノーマ細胞株からのガン細胞による転移を相乗的かつ劇的に促進させる脱調節されたmiRNAの発見をもたらした。miR-1908は以前には特徴づけられていないが、miR-199aが、メラノーマに反してmiR-199a発現レベルのダウンレギュレーションを示す肝細胞ガン(Hou他、2011;Shen他、2010)および骨肉腫(Duan他、2011)において関係づけられている。これらの違いは、様々なガンタイプにおけるmiRNAの立証された組織特異的な発現プロフィルと一致している。メラノーマ転移の促進因子としてのmiR-199aの特定が、増大したmiR-199aレベルがぶどう膜メラノーマの進行と相関することを明らかにする以前の臨床的合同研究(Worley他、2008)によって裏づけられており、このことから、誘導されたmiR-199a発現が、起源部位にかかわらず、転移性メラノーマの定義づける特徴であるかもしれないことが示唆される。以前の研究では、さらなるmiRNAが、メラノーマ転移性進行を促進させることにおいて関係づけられている:例えば、miR-182(Segura他、2009)、miR-214(これは転移性メラノーマ細胞においてアップレギュレーションされたが、上記研究では作動可能に機能しなかった;Penna他、2011)、および、miR-30b/miR-30d(Gaziel-Sovran他、2011)など。これらのmiRNAのそれぞれがメラノーマ転移をほどほどにしか調節せず、これにより、1.5倍~2倍の差で増大または低下した転移調節をmiRNAの過剰発現またはノックダウンのときにそれぞれ引き起こすことが報告されている。対照的には、miR-199aまたはmiR-1908のどちらかの過剰発現は転移を9倍高め(図1C)、一方、コンビナトリアルmiRNAノックダウンは、70倍超の差でメラノーマ転移を相乗的に抑制した(図7E)。したがって、本明細書中に開示される研究は、ヒトメラノーマ転移を収斂的かつ堅固に促進させる多数のmiRNAの最初の体系的な発見、同様にまた、二重の細胞自律的/細胞非自律的な役割をガンにおける内因性の転移調節miRNAに対応づける最初のものであることを表している。
乳ガンにおけるmiRNAの以前の体系的な分析では、インビボ選抜された転移性乳ガン細胞での多数のマイクロRNAの発現レベルにおける低下が主に明らかにされた(Tavazoie他、2008)。それらの知見は、乳ガンにおける多くさらなる転移抑制因子miRNAのその後の発見(Shi他、2010;WangおよびWang、2011)、p53腫瘍抑制因子の直接的な転写標的としてのいくつかのmiRNAの特定(He他、2007)、正常な組織に対して乳ガンにおけるmiRNAのダウンレギュレーション(CalinおよびGroce、2006;Iorio他、2005)、ドローシャおよびダイサーの乳ガン(Yan他、2011)および転移性乳ガン(Grelier他、2011)におけるダウンレギュレーション、同様にまた、ダイサーのノックダウンを介する全般的なmiRNAサイレンシングの腫瘍形成支援的影響および転移支援的影響(Kumar他、2007;Kumar他、2009;Martello他、2010;Noh他、2011)と一致していた。乳ガンとは対照的には、メラノーマにおける上記知見から、転移性ヒトメラノーマにおいてアップレギュレーションされる一組のmiRNAが明らかにされ、このことは、miRNAのプロセシングが実際にメラノーマにおいて腫瘍形成支援的様式または転移支援的様式で作用しているかもしれないという興味深い可能性をもたらしている。このことと一致して、ダイサーがメラニン細胞の発達のために要求され(Levy他、2010)、また、ダイサーの発現が近年には、臨床病理学的研究においてヒトメラノーマ進行と正に相関することが見出された(Ma他、2011)。これらの発見は、ここに開示される発見と統合されたとき、ダイサーがメラノーマ転移において作動可能に要求されること(Bernstein他、2001)を詳しく調べるためのさらなる研究の動機づけとなっている。
黒色性メラノーマ転移および無色素性メラノーマ転移のインビボ選抜モデルの確立は、高転移性メラノーマ細胞によって呈示される細胞表現型を特定することを可能にしている。この研究から、高まった浸潤性に加えて、内皮細胞を動員するメラノーマ細胞の能力が、低転移性のメラノーマ細胞に対して、高転移性メラノーマ細胞において著しく高まることが明らかにされる。加えて、転移の3つの主要な転写後調節因子が内皮動員を強く媒介することが見出された。これらのmiRNAによって調節される下流側のシグナル伝達経路もまた、内皮動員を調節することがさらに見出された。これらの発見から、内皮動員が転移性メラノーマ細胞の定義づける特徴であることが明らかにされる。高まった内皮動員能はまた、転移性乳ガンの定義づける特徴であることが近年には見出され、この場合、miR-126による転移の抑制が、内皮動員を促進させる2つの異なったシグナル伝達経路のmiRNA標的化を介して媒介された(Png他、2012)。乳ガンにおいて、内皮動員は、腫瘍成長よりも、むしろ、転移開始の可能性を増大させた。同様に、この場合に研究されるメラノーマ転移促進因子miRNAは、転移性コロニー形成を、原発性腫瘍成長を高めることなく劇的に高め、また、転移性結節の数を増大させ、これらは、腫瘍成長促進ではなく、むしろ、転移開始におけるこれらのmiRNAおよびそれらの調節ネットワークについての役割と一致するものであった。まとめると、これらの発見は、これらの異なった上皮ガンタイプにおける転移開始および転移性コロニー形成の促進因子として作用する転移ニッチの中への内皮動員と一致している。ガン進行における内皮細胞についてのそのような非正準的役割は、高まった腫瘍成長を急がせる血流の血管形成強化における内皮細胞の立証された役割と対照をなすものであろう。内皮細胞は、様々な合図を器官形成の期間中に付近の細胞に与えることによって発達におけるそのような非正準的役割を果たすことが知られている(Lammert他、2001)。そのような合図はまた、器官再生を促進させることが近年には示されている(Ding他、2011;Ding他、2010;Kobayashi他、2010)。今後の研究が、転移開始を触媒する内皮細胞によって提供される転移刺激因子を明らかにするために必要となる。
miR-199a-3p、miR-199a-5pおよびmiR-1908により、メラノーマ患者のコホートにおける転移非存在生存を個々に予測することができることは、メラノーマガン進行の臨床での予測因子としてのそれぞれのmiRNAの重要性を示している。重要なことに、転移性再発についての危険性が大きい患者を、どの危険性が本質的にはない患者から階層化するためのこれら3つのmiRNAの総合的シグナチャー(図7D)の劇的かつ非常に著しい能力により、これらのmiRNAの協同性、同様にまた、miRNA阻害療法から利益を受けるかもしれない患者のサブセットを特定するためのメラノーマのバイオマーカーとしてのそれらの臨床的可能性(Sawyers、2008)がともに明らかにされる。治療的なmiRNA標的化は、miRNAに拮抗することがマウス(Elmer他、2008(b);Krutzfeldt他、2005;Obad他、2011)および霊長類(Elmer他、2008(a))において示されている、また、ヒト臨床試験において現在試験中であるインビボLNAの使用により勢いが増している。これら3つのmiRNAの強力な予後能力、高転移性メラノーマ細胞を、miR-199a-3p、miR-199a-5pおよびmiR-1908を標的化するLNAのカクテルにより処置することによって達成される堅固な相乗的な転移防止の原理証明による実証(図7E)、同様にまた、これらのmiRNAを標的化する治療的に送達されたインビボ最適化LNAの転移抑制効果(図7J)は、メラノーマ転移についての、すなわち、効果的な化学療法選択肢を現時点では欠く結末についての危険性が高い患者においてこれらの転移支援的miRNAおよび血管形成支援的miRNAを組合せにより標的化することの治療的可能性を明らかにすることを目的とする今後の臨床研究に動機を与えるものである。
好ましい実施形態の上記の実施例および記載は、請求項によって定義されるような本発明を限定するとしてではなく、むしろ、例示であるとして解釈されなければならない。容易に理解されるであろうように、上記で示される特徴の数多くの変化および組合せを、請求項において示されるような本発明から逸脱することなく利用することができる。そのような変化は、本発明の範囲から逸脱するものとして見なされず、すべてのそのような変化が、下記の請求項の範囲に含まれることが意図される。本明細書中で引用されるすべての参考文献がそれらの全体において組み込まれる。
Claims (15)
- 前記ガンが転移性ガンである、請求項1に記載の医薬組成物。
- 前記ガンが非小細胞肺ガンである、請求項1に記載の医薬組成物。
- 前記ガンが子宮内膜ガンである、請求項1に記載の医薬組成物。
- 前記LXRβアゴニストが前記化合物25である、請求項1~4のいずれかに記載の医薬組成物。
- 前記抗増殖性化合物が、白金剤及び細胞毒性剤を含む、請求項1~5のいずれかに記載の医薬組成物。
- 前記抗増殖性化合物が、白金剤、ペメトレキセド、パクリタキセル、タキソール、ドセタキセル、及びタキソテールからなる群より選択される、請求項1~5のいずれかに記載の医薬組成物。
- 前記抗増殖性化合物が、白金剤及びパクリタキセルである、請求項1~5のいずれかに記載の医薬組成物。
- 前記抗増殖性化合物が、白金剤及びペメトレキセドである、請求項1~5のいずれかに記載の医薬組成物。
- 前記白金剤が、スピロプラチン、テトラプラチン、オルマプラチン、イプロプラチン、オキサリプラチン、カルボプラチン、ロバプラチン、サトラプラチン、及びシスプラチンからなる群より選択される、請求項6又は7に記載の医薬組成物。
- 前記対象が、PD1阻害剤またはPDL1阻害剤を投与されている、請求項1~10のいずれかに記載の医薬組成物。
- 前記PD1阻害剤がニボルマブである、請求項11に記載の医薬組成物。
- 前記PDL1阻害剤がMPDL3280Aである、請求項11に記載の医薬組成物。
- 前記ガンを処置する他の治療法に先立って投与される、請求項1~13のいずれかに記載の医薬組成物。
- 前記ガンを処置する他の治療法の後に投与される、請求項1~13のいずれかに記載の医薬組成物。
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