JP2022001571A - メラノーマの処置および診断 - Google Patents

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Abstract

【課題】メラノーマの診断及び処置のための新規な薬剤及び方法を提供する。【解決手段】ガンを処置するための方法であって、その必要性のある対象にＬＸＲアゴニストを投与することを含み、前記ＬＸＲアゴニストが、前記ガンの転移の伝播を遅くするのに十分なレベルにまでＡｐｏＥの発現レベルまたは活性レベルを増大させるのに十分な量で投与される、方法である。【選択図】なし

Description

関連出願の相互参照
本出願は米国仮特許出願第６１／６８２，３３９号（２０１２年８月１３日出願）およ
び米国仮特許出願第６１／７８４，０５７号（２０１３年３月１４日出願）の優先権を主
張する。これらの出願の内容はそれらの全体において参照によって本明細書中に組み込ま
れる。
本発明は、遊走性ガンおよびメラノーマの診断および処置に関連する。
メラノーマは悪性腫瘍であり、下部表皮における異常なメラノサイトから発達し、血液
系およびリンパ系を介して体内の遠位部位に転移し得る。メラノーマは皮膚ガン症例の５
％未満を占めるにもかかわらず、はるかにより危険であり、皮膚ガンに伴う死者の大多数
に関わっている。世界中で、メラノーマの発生率が、驚くべき割合で増大し続けてきてお
り、メラノーマを発症する生涯リスクが合衆国において男性については１／５８もの大き
さである（非特許文献１）。悪性メラノーマの死亡率もまた、世界中で劇的に上昇し続け
ている。２００６年のＷＨＯ報告書によれば、約４８，０００名のメラノーマ関連死亡が
１年あたり世界中で生じている（非特許文献２）。合衆国では、ほぼ７０，０００名の人
々が２０１０年の間にメラノーマと診断され、およそ９，０００名がこの疾患により死亡
すると予想されるであろうことが見積もられた（非特許文献３）。
いくつかの従来的なガン治療法が転移性メラノーマを処置する際に使用されているにも
かかわらず、それらは効果的ではない。したがって、転移性メラノーマは依然として、処
置することが最も困難なガンの１つであり、また、最も恐れられている新生物の１つであ
る。したがって、メラノーマの診断および処置のための新規な薬剤および方法が求められ
ている。
Ｊｅｍａｌ他、２００８、ＣＡ：Ｃａｎｃｅｒ Ｊ．Ｃｌｉｎ．、５８：７１〜９６ Ｌｕｃａｓ他（２００６）、Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｂｕｒｄｅｎ ｏｆ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｓｅｒｉｅｓ．１３．Ｗｏｒｌｄ Ｈｅａｌｔｈ Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ．ＩＳＢＮ９２−４−１５９４４０−３ 米国ガン学会；ｗｗｗ．ｃａｎｃｅｒ．ｏｒｇ
本発明は、上述の必要性を、メラノーマの診断および処置のための薬剤および方法を提
供することによって対処する。本発明は、少なくとも部分的には、転移性メラノーマにお
いて脱調節される協同的なｍｉＲＮＡ−タンパク質ネットワークの予想されなかった発見
に基づいている。このネットワークには、多くの転移抑制因子および転移促進因子が含ま
れる。
１つの局面において、本発明は、ガンを処置するための方法であって、その必要性のあ
る対象にＬＸＲアゴニストを投与することを含み、ＬＸＲアゴニストが、当該ガンの転移
の伝播を遅くするのに十分なレベルにまでＡｐｏＥの発現レベルまたは活性レベルを増大
させるのに十分な量で投与される方法を特徴とする。
別の局面において、本発明は、ガンを処置するための方法であって、その必要性のある
対象に、当該ガンを処置するのに十分な量でＡｐｏＥポリペプチドを投与することを含む
方法を特徴とする。
別の局面において、本発明は、遊走性ガンの伝播を遅らせる方法であって、その必要性
のある対象にＬＸＲアゴニストまたはＡｐｏＥポリペプチドを投与することを含む方法を
特徴とする。
上述の方法のいずれかのいくつかの実施形態において、ＬＸＲアゴニストはＬＸＲβア
ゴニストである。特定の実施形態において、ＬＸＲアゴニストはＡｐｏＥの発現レベルを
インビトロにおいて少なくとも２．５倍増大させる。特定の実施形態において、ＬＸＲβ
アゴニストはＬＸＲαよりもＬＸＲβに対して選択的である。他の実施形態において、Ｌ
ＸＲβアゴニストは、ＬＸＲαに対する前記アゴニストの活性よりも少なくとも２．５倍
大きいＬＸＲβに対する活性を有する。いくつかの実施形態において、ＬＸＲβアゴニス
トは、ＬＸＲαに対する前記アゴニストの活性よりも少なくとも１０倍大きいＬＸＲβに
対する活性を有する。さらなる実施形態において、ＬＸＲβアゴニストは、ＬＸＲαに対
する前記アゴニストの活性よりも少なくとも１００倍大きいＬＸＲβに対する活性を有す
る。特定の実施形態において、ＬＸＲアゴニストは、ＬＸＲαに対する前記アゴニストの
活性の少なくとも２．５倍以内であるＬＸＲβに対する活性を有する。
いくつかの実施形態において、遊走性ガンは転移性ガンである。転移性ガンには、遊走
性細胞の遊走および／または浸潤を示す細胞を挙げることができ、ならびに／あるいは、
内皮動員および／または血管形成を示す細胞を挙げることができる。他の実施形態におい
て、遊走性ガンは細胞遊走ガンである。なおさらに他の実施形態において、細胞遊走ガン
は非転移性の細胞遊走ガンである。
遊走性ガンは、腹膜腔、胸膜腔、心膜腔またはクモ膜下腔の表面に播種することを介し
て伝播するガンであり得る。代替では、遊走性がんは、リンパ系を介して伝播するガン、
または、血行を介して伝播するガンであり得る。
特定の実施形態において、遊走性ガンは、非転移性の細胞遊走ガンである細胞遊走ガン
であり、例えば、卵巣ガン、中皮腫または原発性肺ガンなどである。
関連する局面において、本発明は、ガンの転移を阻害するための、または軽減させるた
めの方法であって、ＬＸＲアゴニストまたはＡｐｏＥポリペプチドを投与することを含む
方法を提供する。
別の局面において、本発明は、ガン幹細胞またはガン始原細胞の増殖または成長を阻害
するための方法であって、当該細胞を、前記細胞の増殖または成長を阻害するのに十分な
量でＬＸＲアゴニストまたはＡｐｏＥポリペプチドと接触させることを含む方法を提供す
る。
さらに別の局面において、本発明は、ガンの腫瘍播種速度を低下させる方法であって、
その必要性のある対象に、腫瘍播種を低下させるのに十分な量でＬＸＲアゴニストまたは
ＡｐｏＥポリペプチドを投与することを含む方法を提供する。
なおさらにさらなる局面において、本発明は、ガンの転移性結節形成を低下させるか、
または処置する方法であって、その必要性のある対象に、ガンの前記転移性結節形成を処
置するのに十分な量でＬＸＲアゴニストまたはＡｐｏＥポリペプチドを投与することを含
む方法を提供する。
他の実施形態において、ガンは、乳ガン、結腸ガン、腎細胞ガン、非小細胞肺ガン、肝
細胞ガン、胃ガン、卵巣ガン、膵臓ガン、食道ガン、前立腺ガン、肉腫またはメラノーマ
である。いくつかの実施形態において、ガンはメラノーマである。他の実施形態において
、ガンは乳ガンである。特定の実施形態において、ガンは腎細胞ガンである。さらなる実
施形態において、ガンは膵臓ガンである。他の実施形態において、ガンは非小細胞肺ガン
である。いくつかの実施形態において、ガンは結腸ガンである。さらなる実施形態におい
て、ガンは卵巣ガンである。
他の実施形態において、ガンは薬物抵抗性のガンである。さらなる実施形態において、
ガンは、ベムラフェニブ、ダカルバジン、ＣＴＬＡ４阻害剤、ＰＤ１阻害剤またはＰＤＬ
１阻害剤に対して抵抗性である。
いくつかの実施形態において、上記方法は、式Ｉ〜式ＩＶのいずれか１つの化合物また
は化合物番号１〜化合物番号３９のいずれかの化合物あるいはそれらの医薬的に許容され
る塩からなるリストから選択されるＬＸＲアゴニストを投与することを含む。いくつかの
実施形態において、ＬＸＲアゴニストは化合物１またはその医薬的に許容される塩である
。他の実施形態において、ＬＸＲアゴニストは化合物２またはその医薬的に許容される塩
である。特定の実施形態において、ＬＸＲアゴニストは化合物３またはその医薬的に許容
される塩である。さらなる実施形態において、ＬＸＲアゴニストは化合物１２またはその
医薬的に許容される塩である。いくつかの実施形態において、ＬＸＲアゴニストは化合物
２５またはその医薬的に許容される塩である。他の実施形態において、ＬＸＲアゴニスト
は化合物３８またはその医薬的に許容される塩である。さらなる実施形態において、ＬＸ
Ｒアゴニストは化合物３９またはその医薬的に許容される塩である。
上記方法はさらに、抗増殖剤を投与することを含むことができ、この場合、前記ＬＸＲ
アゴニストおよび前記抗増殖剤が、一緒になって遊走性ガンの進行を遅らせるのに十分で
ある量で投与される。例えば、抗増殖剤およびＬＸＲアゴニストを、一緒になって上記対
象を処置するために効果的である量で、それぞれの２８日以内（例えば、２１日以内、１
４日以内、１０日以内、７日以内、５日以内、４日以内、３日以内、２日以内または１日
以内）において、または、他の２４時間以内（例えば、１２時間以内、６時間以内、３時
間以内、２時間以内もしくは１時間以内、または同時）において投与することができる。
いくつかの実施形態において、上記方法は、ＡｐｏＥポリペプチドを投与することを含
む。ＡｐｏＥポリペプチドフラグメントはＬＲＰ１またはＬＲＰ８の活性レベルまたは発
現レベルを増大させることができ、ならびに／あるいは、ＡｐｏＥポリペプチドはＬＲＰ
１またはＬＲＰ８に結合することができ、ＡｐｏＥポリペプチドはＡｐｏＥの受容体結合
領域（ＲＢＲ）であることが可能である。上記方法はさらに、抗増殖剤を投与することを
含むことができ、この場合、前記ＡｐｏＥポリペプチドおよび前記抗増殖剤が、一緒にな
って遊走性ガンの進行を遅らせるのに十分である量で投与される。例えば、抗増殖剤およ
びＡｐｏＥポリペプチドを、一緒になって上記対象を処置するために効果的である量で、
それぞれの２８日以内（例えば、２１日以内、１４日以内、１０日以内、７日以内、５日
以内、４日以内、３日以内、２日以内または１日以内）において、または、他の２４時間
以内（例えば、１２時間以内、６時間以内、３時間以内、２時間以内もしくは１時間以内
、または同時）において投与することができる。
いくつかの実施形態において、医薬組成物はさらに、抗増殖活性を有するさらなる化合
物を含む場合がある。抗増殖活性を有するさらなる化合物は、様々な化合物の群から、例
えば、化学療法剤および細胞毒性剤、分化誘導剤（例えば、レチノイン酸、ビタミンＤ、
サイトカイン）、ホルモン剤、免疫学的薬剤ならびに抗血管新生剤などから選択すること
ができる。化学療法剤および細胞毒性剤には、アルキル化剤、細胞毒性抗生物質、代謝拮
抗剤、ビンカアルカロイド、エトポシド類およびその他（例えば、パクリタキセル、タキ
ソール、ドセタキセル、タキソテール、シス−プラチン）が含まれるが、これらに限定さ
れない。抗増殖活性を有するさらなる化合物のリストを、Ｌ．Ｂｒｕｎｔｏｎ、Ｂ．Ｃｈ
ａｂｎｅｒおよびＢ．Ｋｎｏｌｌｍａｎ（編）、Ｇｏｏｄｍａｎ ａｎｄ Ｇｉｌｍａｎ
’ｓ Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕ
ｔｉｃｓ、第１２版、２０１１年、ＭｃＧｒａｗ Ｈｉｌｌ Ｃｏｍｐａｎｉｅｓ、Ｎｅ
ｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹに見出すことができる。
上記方法はさらに、アルキル化剤、白金剤、代謝拮抗剤、トポイソメラーゼ阻害剤、抗
腫瘍抗生物質、有糸分裂阻害剤、アロマターゼ阻害剤、チミジル酸シンターゼ阻害剤、Ｄ
ＮＡアンタゴニスト、ファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤、ポンプ阻害剤、ヒストン
アセチルトランスフェラーゼ阻害剤、メタロプロテイナーゼ阻害剤、リボヌクレオシドレ
ダクターゼ阻害剤、ＴＮＦアルファのアゴニスト／アンタゴニスト、エンドセリンＡ受容
体アンタゴニスト、レチノイン酸受容体アゴニスト、免疫調節剤、ホルモン剤および抗ホ
ルモン剤、光線力学的薬剤、チロシンキナーゼ阻害剤、アンチセンス化合物、コルチコス
テロイド類、ＨＳＰ９０阻害剤、プロテオソーム阻害剤（例えば、ＮＰＩ−００５２）、
ＣＤ４０阻害剤、抗ＣＳＩ抗体、ＦＧＦＲ３阻害剤、ＶＥＧＦ阻害剤、ＭＥＫ阻害剤、サ
イクリンＤ１阻害剤、ＮＦ−κＢ阻害剤、アントラサイクリン類、ヒストンデアセチラー
ゼ、キネシン阻害剤、ホスファターゼ阻害剤、ＣＯＸ２阻害剤、ｍＴＯＲ阻害剤、カルシ
ニューリンアンタゴニスト、ＩＭｉＤ、または、増殖性疾患を処置するために使用される
他の薬剤からなる群から選択される抗増殖性化合物を投与することを含む場合がある。そ
のような化合物の例が表１に提供される。
別の局面において、本発明は、メラノーマ（例えば、転移性メラノーマ）を、その処置
を必要とする対象において処置するための方法を特徴とする。この方法は、（ａ）当該対
象において、ＤＮＡＪＡ４、アポリポタンパク質Ｅ（ＡｐｏＥ）、ＬＲＰ１、ＬＲＰ８、
肝臓Ｘ受容体（ＬＸＲ、例えば、ＬＸＲ−アルファおよびＬＸＲ−ベータの両方）および
ｍｉＲ−７からなる群から選択される転移抑制因子の発現レベルまたは活性レベルを増大
させること、あるいは、（ｂ）当該対象において、ｍｉＲ−１９９ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１
９９ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１９０８およびＣＴＧＦからなる群から選択される転移促進因子
の発現レベルまたは活性レベルを低下させることを含む。
この方法において、増大させる工程は、下記の（ｉ）〜（ｉｖ）のうちの１つまたは複
数を当該対象に投与することによって行うことができる：（ｉ）ＤＮＡＪＡ４、ＡｐｏＥ
またはＡｐｏＥフラグメント、ＬＲＰ１、ＬＲＰ８、あるいは、ＬＸＲの配列を有するポ
リペプチド、（ｉｉ）ＤＮＡＪＡ４、ＡｐｏＥ、ＬＲＰ１、ＬＲＰ８またはＬＸＲをコー
ドする配列を有する核酸、（ｉｉｉ）ＬＲＰ１、ＬＲＰ８またはＬＸＲに対するリガンド
、および、（ｉｖ）ｍｉＲ−７をコードするＲＮＡｉ剤。ＬＲＰ１リガンドまたはＬＲＰ
８リガンドの例には、ＡｐｏＥの受容体結合部分、抗ＬＲＰ１抗体または抗ＬＲＰ８抗体
、および、小分子リガンドが含まれる。一例において、ＡｐｏＥの発現レベルを増大させ
ることを、ＬＸＲの活性レベルまたは発現レベルを増大させることによって行うことがで
きる。ＤＮＡＪＡ４の発現レベルを増大させることもまた、ＬＸＲの活性レベルまたは発
現レベルを増大させることによって行うことができる。ＬＸＲの活性レベルは、ＬＸＲの
リガンド、例えば、下記で開示されるような式Ｉ〜式ＩＶの化合物などを当該対象に投与
することによって増大させることができる。増大させる工程はまた、ｍｉＲ−１９９ａ−
３ｐ、ｍｉＲ−１９９ａ−５ｐおよびｍｉＲ−１９０８からなる群から選択されるマイク
ロＲＮＡの発現レベルまたは活性レベルを低下させることによって行うことができる。こ
の目的を達成するために、この技術分野において知られている多くの技術を使用すること
ができ、これらには、下記の実施例において記載されるようなｍｉＲ−Ｚｉｐ技術、ロッ
クド核酸（ＬＮＡ）技術およびアンタゴミル（ａｎｔａｇｏｍｉｒ）技術が含まれるが、
これらに限定されない。
別の局面において、本発明は、対象が転移性メラノーマを有するかどうか、または、転
移性メラノーマを有する危険性があるかどうかを決定するための方法を提供する。この方
法は、対象からサンプルを得ること；当該サンプルにおいて、（ｉ）ｍｉＲ−１９９ａ−
３ｐ、ｍｉＲ−１９９ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１９０８およびＣＴＧＦからなる群から選択さ
れる転移促進因子の第１の発現レベル、または、（ｉｉ）ＤＮＡＪＡ４、ＡｐｏＥ、ＬＲ
Ｐ１、ＬＲＰ８、ＬＸＲおよびｍｉＲ−７からなる群から選択される転移抑制因子の第２
の発現レベルを測定すること；ならびに、第１の発現レベルを第１の所定の参照値と比較
すること、または、第２の発現レベルを第２の所定の参照値と比較することを含む。対象
は、（ａ）第１の発現レベルが第１の所定の参照値を超えているならば、または、（ｂ）
第２の発現レベルが第２の所定の参照値を下回っているならば、転移性メラノーマを有す
ることが決定されるか、または、転移性メラノーマを有する危険性があることが決定され
る。第１の所定の参照値および第２の所定の参照値を、転移性メラノーマを有しないコン
トロール対象から得ることができる。１つの実施形態において、測定する工程は、第１の
発現レベルと第２の発現レベルとの両方を測定することを含む。サンプルは、体液サンプ
ル、腫瘍サンプル、母斑サンプルまたはヒト皮膚サンプルであることが可能である。
別の局面において、本発明は、複数の特有の位置を有する支持体と、（ｉ）ｍｉＲ−１
９９ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１９９ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１９０８およびＣＴＧＦからなる群か
ら選択される転移促進因子をコードする核酸またはその相補体に対して相補的である配列
を有する少なくとも１つの核酸、あるいは、（ｉｉ）ＤＮＡＪＡ４、ＡｐｏＥ、ＬＲＰ１
、ＬＲＰ８、ＬＸＲおよびｍｉＲ−７からなる群から選択される転移抑制因子をコードす
る核酸またはその相補体に対して相補的である配列を有する少なくとも１つの核酸の任意
の組合せとを含むアレイを提供する。好ましくは、それぞれの核酸が支持体の特有の位置
に固定化される。このアレイは転移性メラノーマの診断および予後のために使用すること
ができる。
したがって、本発明はまた、メラノーマの転移可能性を対象において診断するためのキ
ットを提供する。キットは、ＤＮＡＪＡ４、ＡｐｏＥ、ＬＲＰ１、ＬＲＰ８、ＬＸＲおよ
びｍｉＲ−７からなる群から選択される転移抑制因子遺伝子の発現産物に特異的に結合す
る第１の試薬、または、ｍｉＲ−１９９ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１９９ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１
９０８およびＣＴＧＦからなる群から選択される転移促進因子遺伝子の発現産物に特異的
に結合する第２の試薬を含む。第２の薬剤は、抑制因子遺伝子または促進因子遺伝子ある
いはその相補体に対して相補的である配列を有するプローブであることが可能である。キ
ットはさらに、免疫アッセイ、ハイブリダイゼーションアッセイまたはＰＣＲアッセイを
行うための試薬を含むことができる。１つの実施形態において、キットは上述のアレイを
含有した。
別の局面において、本発明は、メラノーマを処置するために、あるいは、内皮動員、細
胞浸潤または転移性血管形成を阻害するために有用な化合物を特定する方法を提供する。
この方法は、（ｉ）ｍｉＲ−１９９ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１９９ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１９０
８およびＣＴＧＦからなる群から選択されるマーカー遺伝子のプロモーターに作動可能に
連結される核酸によってコードされるレポーター遺伝子を発現する試験細胞を得ること；
（ｉｉ）試験細胞を試験化合物にさらすこと；（ｉｉｉ）試験細胞におけるレポーター遺
伝子の発現レベルを測定すること；（ｉｖ）発現レベルをコントロールレベルと比較する
こと；ならびに（ｖ）比較により、発現レベルがコントロールレベルよりも低いことが示
されるならば、試験化合物を、メラノーマを処置するために、あるいは、内皮動員、ガン
細胞浸潤または転移性血管形成を阻害するために有用な候補物として選択することを含む
。
本発明は、メラノーマを処置するために、あるいは、内皮動員、細胞浸潤または転移性
血管形成を阻害するために有用な化合物を特定する別の方法を提供する。この方法は、（
ｉ）ＤＮＡＪＡ４、ＡｐｏＥ、ＬＲＰ１、ＬＲＰ８、ＬＸＲおよびｍｉＲ−７からなる群
から選択されるマーカー遺伝子のプロモーターに作動可能に連結される核酸によってコー
ドされるレポーター遺伝子を発現する試験細胞を得ること；（ｉｉ）試験細胞を試験化合
物にさらすこと；（ｉｉｉ）試験細胞におけるレポーター遺伝子の発現レベルを測定する
こと；（ｉｖ）発現レベルをコントロールレベルと比較すること；ならびに（ｖ）比較に
より、発現レベルがコントロールレベルよりも大きいことが示されるならば、試験化合物
を、メラノーマを処置するために、あるいは、内皮動員、ガン細胞浸潤または転移性血管
形成を阻害するために有用な候補物として選択することを含む。
上述の特定方法において、レポーター遺伝子は、この技術分野において知られている標
準的なレポーター遺伝子（例えば、ＬａｘＺ遺伝子、ＧＦＰ遺伝子またはルシフェラーゼ
遺伝子など）、あるいは、上述の転移抑制因子遺伝子または転移促進因子遺伝子の１つで
あることが可能である。これらの方法において、コントロールレベルは、試験化合物にさ
らされていないことを除いて試験細胞と同じであるコントロール細胞から得ることができ
る。
別の局面において、本発明は、内皮動員を、その阻害を必要とする対象において阻害す
るための方法、または、腫瘍細胞浸潤を、その阻害を必要とする対象において阻害するた
めの方法、または、転移性ガンを、その処置を必要とする対象において処置するための方
法であって、ＣＴＧＦの発現または活性を阻害する薬剤を当該対象に投与することによる
方法を提供する。対象は、ガン（例えば、転移性メラノーマ）、眼障害および炎症性障害
（これらに限定されない）を含めて、病理学的な血管形成によって特徴づけられる障害を
有するものであることが可能である。腫瘍細胞の一例が転移性のメラノーマ細胞である。
薬剤の例には、抗体、核酸、ポリペプチドおよび小分子化合物が含まれる。好ましい実施
形態において、抗体はモノクローナル抗体である。
別の局面において、本発明は、内皮動員を、その阻害を必要とする対象において阻害す
るための方法、または、腫瘍細胞浸潤を、その阻害を必要とする対象において阻害するた
めの方法、または、転移性ガンを、その処置を必要とする対象において処置するための方
法であって、ｍｉＲ−７の発現または活性を増大させる薬剤を当該対象に投与することに
よる方法を提供する。腫瘍細胞の一例が転移性のメラノーマ細胞である。薬剤の例には、
抗体、核酸、ポリペプチドまたは小分子化合物が含まれる。一例において、薬剤はｍｉＲ
−７活性を有する。核酸はオリゴヌクレオチドであることが可能である。オリゴヌクレオ
チドは、配列番号３６〜３８からなる群から選択される配列を含むことができる。
本明細書中で使用される場合、「遊走性ガン」は、腫瘍を形成するガン細胞が遊走し、
続いて、最初の腫瘍の部位とは異なる他の部位において悪性移植物として成長するガンを
示す。ガン細胞は、体腔内に伝播するために腹膜腔、胸膜腔、心膜腔またはクモ膜下腔の
表面に播種することを介して、リンパ細胞の浸潤によるリンパ系への浸潤、ならびに、局
所リンパ節および遠位リンパ節への輸送、次いで、身体の他の部分への輸送を介して、血
液細胞の浸潤による血行性伝播を介して、または、周囲組織への浸潤を介して遊走する。
遊走性ガンには、転移性腫瘍および細胞遊走ガン（例えば、卵巣ガン、中皮腫および原発
性肺ガンなど、これらのそれぞれが細胞の遊走によって特徴づけられる）が含まれる。
本明細書中で使用される場合、「遊走性ガンの伝播を遅くする」は、新しい病巣の形成
を弱めるか、または停止させること、あるいは、腫瘍負荷を縮小させること、停止させる
こと、または逆行させることを示す。
本明細書中で使用される場合、「転移性腫瘍」は、腫瘍を形成するガン細胞が、リンパ
系を介して、または、血行性伝播を介して転移するか、または、対象の体内において１つ
の場所から別の場所（１つまたは複数）に伝播する大きい能力を有するか、あるいは、リ
ンパ系を介して、または、血行性伝播を介して転移すること、または、対象の体内におい
て１つの場所から別の場所（１つまたは複数）に伝播することを開始し、例えば対象の体
内に二次的腫瘍を生成する、腫瘍またはガンを示す。そのような転移挙動により、悪性腫
瘍が示される場合がある。場合によっては、転移挙動には、腫瘍細胞の細胞遊走挙動およ
び／または細胞浸潤挙動における増大が伴うことがある。
本明細書中で使用される場合、「転移の伝播を遅くする」は、新しい病巣の形成を弱め
るか、または停止させること、あるいは、腫瘍負荷を縮小させること、停止させること、
または逆行させることを示す。
用語「ガン」は、どのようなガンであれ、悪性の新生物性細胞の増殖によって引き起こ
されるガンを示し、例えば、腫瘍、新生物、ガン腫、肉腫、白血病およびリンパ腫などを
示す。
本明細書中で使用される場合、「薬物抵抗性（の）ガン」は、どのようなガンであれ、
表２における抗増殖剤に対して抵抗性であるガンを示す。
転移性であるとして定義され得るガンの例には、非小細胞肺ガン、乳ガン、卵巣ガン、
結腸直腸ガン、胆道ガン、膀胱ガン、脳ガン（神経膠芽細胞腫および髄芽細胞腫を含む）
、子宮頸ガン、絨毛ガン、子宮内膜ガン、食道ガン、胃ガン、血液学的新生物、多発性骨
髄腫、白血病、上皮内新生物、肝臓ガン、リンパ腫、神経芽細胞腫、口腔ガン、膵臓ガン
、前立腺ガン、肉腫、皮膚ガン（メラノーマ、基底細胞ガン、扁平上皮ガンを含む）、精
巣ガン、間質性腫瘍、胚細胞腫瘍、甲状腺ガンおよび腎臓ガンが含まれるが、これらに限
定されない。
「増殖」は、本出願において使用される場合、（細胞）要素を構成することに起因する
類似する形態（細胞）の複製または増加を伴う。
「細胞遊走」は、本出願において使用される場合、周囲組織へのガン細胞による浸潤、
および、ガン細胞の遠位器官における脈管構造から出るための血管壁の横断を伴う。
「細胞遊走ガン」によって、周囲組織へのガン細胞による浸潤、および、ガン細胞の遠
位器官における脈管構造から出るための血管壁の横断によって遊走するガンが意味される
。
「非転移性（の）細胞遊走ガン」は、本明細書中で使用される場合、リンパ系を介して
、または、血行性伝播を介して遊走しないガンを示す。
本明細書中で使用される場合、「細胞−細胞の接着」は、セレクチン分子とセレクチン
特異的リガンドとの間での相互作用を介した少なくとも２つの細胞の間における接着を示
す。細胞−細胞の接着は細胞遊走を含む。
「細胞接着関連障害」が、細胞−細胞の接着または遊走から生じるか、あるいは、細胞
−細胞の接着または遊走に関連づけられるいずれかの疾患または障害として本明細書中で
は定義される。細胞接着障害にはまた、免疫系または炎症系の不適切な活性化、正常から
外れた活性化または正常でない活性化から生じるどのような疾患または障害も含まれる。
そのような疾患には、心筋梗塞、細菌感染症またはウイルス感染症、転移性状態（例えば
、ガン）が含まれるが、これらに限定されない。本発明はさらに、ＬＸＲアゴニストまた
はＡｐｏＥポリペプチドを投与することによって細胞接着障害を処置するための方法を特
徴とする。
本明細書中で使用される場合、「ガン幹細胞」または「ガン始原細胞」は、正常な幹細
胞に関連する特徴を有するガン細胞、具体的には、特定のガンサンプルにおいて見出され
るすべての細胞タイプを生じさせる能力を有するガン細胞を示す。したがって、ガン幹細
胞は、おそらくは他の非腫瘍原性ガン細胞とは対照的に、腫瘍原性、すなわち、腫瘍形成
性である。ガン幹細胞は、異なった集団として腫瘍において持続していることがあり、新
しい腫瘍を生じさせることによってガンの再発および転移の原因となることがある。
本明細書中で使用される場合、「腫瘍播種」は、腫瘍細胞クラスターの流出、および、
最初の腫瘍の部位とは異なる部位における悪性移植物としてのそれらのその後の成長を示
す。
本明細書中で使用される場合、「転移性結節」は、最初の腫瘍の部位とは異なる部位に
おける体内での腫瘍細胞の凝集物を示す。
本発明の１つまたは複数の実施形態の詳細が下記の説明において示される。本発明の他
の特徴、目的および利点が、説明から、また、請求項から明らかであろう。
ヒトメラノーマ転移の内因性促進因子としてのｍｉＲ−１９０８、ｍｉＲ−１９９ａ−３ｐおよびｍｉＲ−１９９ａ−５ｐの体系的特定。（Ａ）独立したＭｅＷｏ転移性派生物およびＡ３７５転移性派生物において、それらのそれぞれの親細胞に対してアップレギュレーションされるｍｉＲＮＡの分散正規化されたマイクロアレイ発現値を例示するヒートマップ。それぞれのヒートマップ列の平均からの標準偏差の変化がカラーマップによって示される。（Ｂ）アップレギュレーションされることがマイクロアレイハイブリダイゼーションによって見出されるｍｉＲＮＡを、ＭｅＷｏ−ＬＭ２転移性派生物においてｑＲＴ−ＰＣＲによって確認した。ｎ＝３。（Ｃ）ｍｉＲ−１９９ａ、ｍｉＲ−１９０８、ｍｉＲ−２１４またはコントロールヘアピンに対する前駆体を過剰発現する４×１０４個の親ＭｅＷｏ細胞を静脈内注入した後における肺での転移性コロニー形成のバイオルミネセンス画像化プロット。肺を注入後６３日で取り出し、Ｈ＆Ｅ染色した。ｎ＝５。（Ｄ）ｍｉＲ−１９０８（ｍ１９０８ ＫＤ）、ｍｉＲ−１９９ａ−３ｐ（ｍ１９９ａ３ｐ ＫＤ）、ｍｉＲ−１９９ａ−５ｐ（ｍ１９９ａ５ｐ ＫＤ）を阻害する短いヘアピン（ｍｉＲ−Ｚｉｐ）またはコントロール配列（ｓｈＣＴＲＬ）を発現する４×１０４個のＬＭ２細胞を静脈内注入した後における肺転移に対応するバイオルミネセンス画像化プロットおよびＨ＆Ｅ染色された肺。肺を注入後４９日で取り出し、Ｈ＆Ｅ染色した。ｎ＝５〜８。（Ｅ）ｍｉＲ−１９０８、ｍｉＲ−１９９ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１９９ａ−５ｐまたはコントロール配列のｍｉＲ−Ｚｉｐ誘導サイレンシングを伴う２×１０５個のＡ３７５−ＬＭ３転移性派生物による肺でのコロニー形成をバイオルミネセンス画像化によって４２日目に定量化した。ｎ＝５〜８。（Ｆ）ｍｉＲ−１９９ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１９９ａ−５ｐおよびｍｉＲ−１９０８の発現レベルを、ＭＳＫＣＣ患者から得られる非転移原発性メラノーマ皮膚病変部（ｎ＝３８）および転移原発性メラノーマ皮膚病変部（ｎ＝３３）のコホートにおいてｑＲＴ−ＰＣＲによって盲検様式で求めた。ｎ＝７１。すべてのデータが平均±ＳＥＭとして表される。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。図１２もまた参照のこと。 ｍｉＲ−１９０８、ｍｉＲ−１９９ａ−３ｐおよびｍｉＲ−１９９ａ−５ｐは、メラノーマ転移進行を調節することにおける二重の細胞自律的役割／細胞非自律的役割を示す。（Ａ）ｍｉＲ−１９９ａ、ｍｉＲ−１９０８またはコントロールヘアピンを過剰発現する１×１０６個の親ＭｅＷｏ細胞を免疫不全マウスに皮下注入し、原発性腫瘍体積を経時的にモニターした。ｎ＝４〜６。（Ｂ）ｍｉＲ−１９９ａ、ｍｉＲ−１９０８またはコントロールヘアピンを過剰発現する１×１０５個の親ＭｅＷｏ細胞を、トランスウエルのマトリゲル被覆挿入物を通って２４時間にわたって浸潤させ、それぞれの挿入物の基部側に浸潤する細胞の数を定量化した。ｎ＝７。（Ｃ〜Ｄ）ｍｉＲ−１９９ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１９９ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１９０８またはコントロール配列のｍｉＲ−Ｚｉｐ誘導阻害を伴う１×１０５個の高転移性のＭｅＷｏ−ＬＭ２細胞（Ｃ）およびＡ３７５−ＬＭ３細胞（Ｄ）を細胞浸潤アッセイに供した。ｎ＝６〜８。（Ｅ）ｍｉＲ−１９９ａ、ｍｉＲ−１９０８またはコントロールヘアピンを過剰発現する５×１０４個のＭｅＷｏ細胞をウエルの底部に播種し、１×１０５個のヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を、トランスウエルの挿入物を通って１６時間にわたってガン細胞に向かって遊走させた。内皮動員能を、それぞれの挿入物の基部側に遊走するＨＵＶＥＣの数を定量化することによって測定した。ｎ＝７。（Ｆ〜Ｇ）ｍｉＲ−１９９ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１９９ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１９０８またはコントロール配列について阻害される５×１０４個のＭｅＷｏ−ＬＭ２細胞（Ｆ）およびＡ３７５−ＬＭ３細胞（Ｇ）による内皮動員。ｎ＝６〜１０。（Ｈ）ｍｉＲ−１９９−３ｐ、ｍｉＲ−１９９ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１９０８またはコントロール配列について枯渇化される２×１０５個の高転移性ＭｅＷｏ−ＬＭ２細胞を静脈内注入した後に形成される転移性結節についての百分率血管密度分布の累積割合プロット。肺の切片をヒトビメンチン（青色）およびＭＥＣＡ−３２（赤色）について免疫組織化学的に二重染色し、ビメンチン染色に基づいて区別されるそれぞれの転移性結節の内部における百分率ＭＥＣＡ−３２陽性面積を定量化した。ｎ＝２１１個の結節（コントロールＫＤ）；ｎ＝６０個の結節（ｍ１９９ａ３ｐ ＫＤ）；ｎ＝１３８個の結節（ｍ１９９ａ５ｐ ＫＤ）；ｎ＝３９個の結節（ｍ１９０８ ＫＤ）。すべてのデータが平均±ＳＥＭとして表される。スケールバー、１００μｍ。図１３もまた参照のこと。 ｍｉＲ−１９９ａおよびｍｉＲ−１９０８の共通標的遺伝子としてのＡｐｏＥおよびＤＮＡＪＡ４の特定。（Ａ）ｍｉＲ−１９９ａ、ｍｉＲ−１９０８またはコントロールヘアピンを過剰発現する低転移性のＭｅＷｏ細胞と、高転移性のＭｅＷｏ−ＬＭ２細胞とにおける、ｑＲＴ−ＰＣＲによって測定されるＡｐｏＥおよびＤＮＡＪＡ４のｍＲＮＡレベルを示すヒートマップ。カラーマップにより、それぞれのヒートマップ列の平均からの標準偏差の変化が例示される。（Ｂ）ｍｉＲ−１９９ａ、ｍｉＲ−１９０８またはコントロールヘアピンを過剰発現する親ＭｅＷｏ細胞における、野生型のＡｐｏＥ ３’ＵＴＲ／ＣＤＳルシフェラーゼ融合物およびＤＮＡＪＡ４ ３’ＵＴＲ／ＣＤＳルシフェラーゼ融合物、または、ｍｉＲＮＡ標的部位変異型のＡｐｏＥ ３’ＵＴＲ／ＣＤＳルシフェラーゼ融合物およびＤＮＡＪＡ４ ３’ＵＴＲ／ＣＤＳルシフェラーゼ融合物の安定性を測定する異種ルシフェラーゼレポーターアッセイ。ｎ＝３〜４。（Ｃ）ｍｉＲ−１９９ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１９９ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１９０８またはコントロール配列の発現が沈黙させられたＭｅＷｏ−ＬＭ２細胞における野生型のＡｐｏＥ ３’ＵＴＲ／ＣＤＳルシフェラーゼ融合物およびＤＮＡＪＡ４ ３’ＵＴＲ／ＣＤＳルシフェラーゼ融合物の安定性。ｎ＝４。（Ｄ）ｍｉＲ−１９９ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１９９ａ−５ｐおよびｍｉＲ−１９０８によるＡｐｏＥ ３’ＵＴＲ／ＣＤＳ標的化およびＤＮＡＪＡ４ ３’ＵＴＲ／ＣＤＳ標的化の実験由来モデルの概略。（Ｅ）高転移性のＭｅＷｏ−ＬＭ２派生物およびそれらの低転移性の親細胞株における野生型およびｍｉＲＮＡ標的部位変異型のＡｐｏＥ ３’ＵＴＲ／ＣＤＳルシフェラーゼ融合物およびＤＮＡＪＡ４ ３’ＵＴＲ／ＣＤＳルシフェラーゼ融合物のルシフェラーゼ活性。ｎ＝４。（Ｆ）コントロールベクターを発現するか、あるいは、ＡｐｏＥまたはＤＮＡＪＡ４を過剰発現する１×１０５個のＭｅＷｏ−ＬＭ２細胞によるマトリゲル浸潤能。ｎ＝４。（Ｇ）コントロールベクター、あるいは、ＡｐｏＥまたはＤＮＡＪＡ４のための過剰発現ベクターにより形質導入される５×１０４個のＭｅＷｏ−ＬＭ２細胞による内皮動員能。ｎ＝６。（Ｈ〜Ｉ）ＡｐｏＥ、ＤＮＡＪＡ４またはコントロール配列を標的化する短いレンチウイルスヘアピンにより形質導入される低転移性の親ＭｅＷｏ細胞をそれらのマトリゲル浸潤能（Ｈ）および内皮細胞動員能（Ｉ）について評価した。ｎ＝６〜８。すべてのデータが平均±ＳＥＭとして表される。スケールバー、１００μｍ。図１４もまた参照のこと。 ｍｉＲ−１９９ａおよびｍｉＲ−１９０８によるＡｐｏＥおよびＤＮＡＪＡ４の直接的な標的化は、転移浸潤、内皮動員およびコロニー形成を促進する。（Ａ〜Ｄ）コントロールｓｈＲＮＡ、あるいは、ＡｐｏＥまたはＤＮＡＪＡ４をｍｉＲ−１９０８阻害の状況（ｍ１９０８ ＫＤ；Ａ、Ｂ）またはｍｉＲ−１９９ａ−５ｐ阻害の状況（ｍ１９９ａ５ｐ ＫＤ；Ｃ、Ｄ）で標的化するｓｈＲＮＡを発現する高転移性ＬＭ２細胞を細胞浸潤アッセイ（Ａ、Ｃ）および内皮動員アッセイ（Ｂ、Ｄ）に供した。ｎ＝６〜８。（Ｅ〜Ｆ）コントロールヘアピン、あるいは、ＡｐｏＥ、ＤＮＡＪＡ４またはコントロール配列をｍｉＲ−１９０８サイレンシングの状況（Ｅ）またはｍｉＲ−１９９ａ−５ａサイレンシングの状況（Ｆ）で標的化するヘアピンを発現する１×１０５個のＬＭ２細胞を静脈内注入した後における肺転移を表すバイオルミネセンス画像化プロットおよびＨ＆Ｅ染色された肺。ｎ＝５。（Ｇ〜Ｈ）ＡｐｏＥまたはＤＮＡＪＡ４を過剰発現する、あるいは、コントロールベクターをｍｉＲ−１９０８過剰発現の状況で発現する親ＭｅＷｏ細胞をマトリゲル浸潤表現型（Ｇ）および内皮動員表現型（Ｈ）について分析した。（Ｉ〜Ｊ）コントロールｓｈＲＮＡ、または、ＡｐｏＥおよびＤＮＡＪＡ４を標的化するｓｈＲＮＡを発現するＡ３７５−ＬＭ３派生物を、ｍｉＲ−１９９ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１９９ａ−５ｐおよびｍｉＲ−１９０８を標的化するＬＮＡのカクテル、または、コントロールＬＮＡにより形質導入し、マトリゲル浸潤アッセイ（Ｉ）および内皮動員アッセイ（Ｊ）において分析した。ｎ＝４。（Ｋ）ｍｉＲ−１９０８について阻害され、かつ、ＡｐｏＥ、ＤＮＡＪＡ４またはコントロール配列を標的化するｓｈＲＮＡにより形質導入されるＭｅＷｏ−ＬＭ２細胞によって形成される転移性結節についての、累積割合プロットで表される血管密度分布。図４Ｅからの肺の切片をヒトビメンチン（青色）および内皮マーカーＭＥＣＡ−３２（赤色）について免疫細胞化学的に二重染色した。それぞれのビメンチン陽性結節の内部における百分率ＭＥＣＡ−３２陽性面積を定量化した。ｎ＝３９個の結節（ｓｈＣＴＲＬ）；ｎ＝９７（ｓｈＡＰＯＥ１）；ｎ＝３８（ｓｈＡＰＯＥ２）；ｎ＝２００（ｓｈＤＮＡＪＡ４１）；ｎ＝１９（ｓｈＤＮＡＪＡ４２）。すべてのデータが平均±ＳＥＭとして表される。スケールバー、１００μｍ。図１５もまた参照のこと。 メラノーマ細胞により分泌されるＡｐｏＥはメラノーマ浸潤および内皮動員を阻害し、一方、ＡｐｏＥの遺伝的欠失は転移を速める。（Ａ〜Ｂ）ＭｅＷｏ−ＬＭ２転移性派生物およびそれらの親細胞（Ａ）、ならびに、ｍｉＲ−１９９ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１９０８またはコントロール配列について沈黙させられるＬＭ２細胞（Ｂ）から得られる馴化培地におけるＥＬＩＳＡによって定量化される細胞外ＡｐｏＥレベル。ｎ＝３。（Ｃ）ＡｐｏＥ中和抗体１Ｄ７（１０〜４０μｇ／ｍＬ）またはＩｇＧ（４０μｇ／ｍＬ）を細胞培地に加え、親ＭｅＷｏ細胞によるマトリゲル浸潤を評価した。ｎ＝４〜６。（Ｄ）１Ｄ７抗体（４０μｇ／ｍＬ）またはコントロールＩｇＧ抗体（４０μｇ／ｍＬ）の存在下における親ＭｅＷｏ細胞による内皮動員。ｎ＝４。（Ｅ）マトリゲル浸潤および内皮動員の表現型を、細胞培地に加えられるウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（１００μＭ）または組換えＡｐｏＥ３（１００μＭ）の存在下、ＬＭ２細胞において評価した。ｎ＝７〜１０。（Ｆ〜Ｇ）ｍｉＲ−１９９ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１９９ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１９０８またはコントロール配列の発現が沈黙させられたＬＭ２細胞を、ＩｇＧ抗体またはＡｐｏＥ中和１Ｄ７抗体（４０μｇ／ｍＬ）の存在下、マトリゲル浸潤能（Ｆ）および内皮動員能（Ｇ）について調べた。ｎ＝５〜６。（Ｈ）ＤＮＡＪＡ４またはコントロール配列を標的化するｓｈＲＮＡにより形質導入される親ＭｅＷｏ細胞から得られる馴化培地におけるＥＬＩＳＡによって定量化されるＡｐｏＥレベル。ｎ＝３。（Ｉ〜Ｊ）ＤＮＡＪＡ４のｓｈＲＮＡ誘導サイレンシングを有する親ＭｅＷｏ細胞を、ＢＳＡ（１００μＭ）または組換えＡｐｏＥ３（１００μＭ）のどちからの存在下、マトリゲル浸潤表現型（Ｉ）および内皮動員表現型（Ｊ）について分析した。ｎ＝４。（Ｋ）母斑サンプル（ｎ＝９）、原発性メラノーマサンプル（ｎ＝６）および遠位メラノーマ転移物サンプル（ｎ＝１９）における、アレイに基づくＡｐｏＥ発現レベル。（Ｌ）高転移性ＭｅＷｏ−ＬＭ２細胞を１００μｇ／ｍＬでの組換えＡｐｏＥ３またはＢＳＡの存在下でインキュベーションした。２４時間後、４×１０４個の細胞をＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスに静脈内注入し、肺でのコロニー形成をバイオルミネセンス画像化によってモニターした。ｎ＝６。（Ｍ）ＡｐｏＥの遺伝的ヌルＣ５７ＢＬ／６マウスまたはそれらの野生型コントロール同腹子に静脈内注入される５×１０４個のＢ１６Ｆ１０マウスメラノーマ細胞による肺転移。肺バイオルミネセンス定量化および代表的なＨ＆Ｅ染色された肺は注入後１９日に対応する。ｎ＝８〜１８。すべてのデータが平均±ＳＥＭとして表される。スケールバー、１００μｍ。 メラノーマ浸潤および内皮動員に対するＡｐｏＥの影響を媒介する異なったメラノーマ細胞受容体および内皮細胞受容体の特定。（Ａ）マトリゲル浸潤能を、ＢＳＡ（１００μΜ）または組換えＡｐｏＥ３（１００μΜ）のどちらかの存在下、ＬＤＬＲ、ＶＬＤＬＲ、ＬＲＰ８、ＬＲＰ１またはコントロール配列を標的化するｓｉＲＮＡにより形質導入される１×１０５個のＬＭ２細胞において調べた。ｎ＝４〜７。（Ｂ）ｍｉＲ−１９０８またはコントロール配列を標的化する短いヘアピンにより形質導入される１×１０５個のＭｅＷｏ−ＬＭ２細胞を、ＬＲＰ１を標的化するｓｉＲＮＡまたはコントロールｓｉＲＮＡによりトランスフェクションし、マトリゲル浸潤アッセイに供した。ｎ＝４。（Ｃ）ｍｉＲ−１９０８阻害の状況における、ＬＲＰ１またはコントロール配列を標的化するｓｉＲＮＡにより形質導入される１×１０５個のＬＭ２細胞による肺でのコロニー形成のバイオルミネセンス画像化。ｎ＝５。（Ｄ）ＢＳＡ（１００μΜ）または組換えＡｐｏＥ３（１００μΜ）と２４時間プレインキュベーションされる１×１０５個の内皮細胞を５×１０５個のＬＭ２細胞による内皮動員表現型について分析した。ｎ＝３〜４。（Ｅ）１×１０５個の内皮細胞を、ＬＤＬＲ、ＶＬＤＬＲ、ＬＲＰ１、ＬＲＰ８またはコントロール配列を標的化するｓｉＲＮＡにより形質導入し、ｍｉＲ−１９０８またはコントロール配列について阻害されるＬＭ２細胞に向かってトランスウエル系において遊走させた。ｎ＝４〜１２。（Ｆ）細胞培地に加えられるＩｇＧ抗体（４０μｇ／ｍＬ）または１Ｄ７抗体（４０μｇ／ｍＬ）の存在下における１×１０５個の内皮細胞によるトランスウエル遊走。ｎ＝６〜８。（Ｇ）ＢＳＡ（１００μΜ）または組換えＡｐｏＥ３（１００μΜ）の存在下における、ＬＲＰ８またはコントロール配列を標的化するｓｉＲＮＡにより形質導入される１×１０５個の内皮細胞によるトランスウエル遊走。ｎ＝６〜７。（Ｈ）１×１０５個の内皮細胞を、ＬＲＰ８またはコントロール配列を標的化するｓｉＲＮＡにより形質導入し、トランスウエル走化性遊走をＡｐｏＥ勾配に沿って評価した。ｎ＝６〜８。（Ｉ）ＢＳＡ（１０μｇ／ｍＬ）、ＶＥＧＦ（４００ｎｇ／ｍＬ）＋ＢＳＡ（１０μｇ／ｍＬ）、または、ＶＥＧＦ（４００ｎｇ／ｍＬ）＋組換えＡｐｏＥ３（１０μｇ／ｍＬ）を含有する、マウスの腹側わき腹の上方において皮下に埋め込まれたマトリゲルプラグの中への内皮動員。ｎ＝３〜６。（Ｊ）５×１０４個のＢ１６Ｆ１０マウスメラノーマ細胞を野生型マウスまたはＡｐｏＥ遺伝的ヌルマウスに静脈内注入した後に形成される肺転移性結節の内部における血管密度。図５Ｍからの肺の切片をＭＥＣＡ−３２について免疫組織化学的に染色し、細胞への色素沈着に基づいて輪郭が示されるそれぞれの転移性結節の内部における百分率ＭＥＣＡ−３２陽性面積を定量化した。ｎ＝１７〜２０。すべてのデータが平均±ＳＥＭとして表される。スケールバー、１００μｍ。 メラノーマ転移における、ｍｉＲ−１９９ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１９９ａ−５ｐおよびｍｉＲ−１９０８の間での臨床的および治療的な協同性（Ａ〜Ｄ）。患者の原発性メラノーマ病変部のｍｉＲ−１９９ａ−３ｐ発現レベル（Ａ）、ｍｉＲ−１９９ａ−５ｐ発現レベル（Ｂ）、ｍｉＲ−１９０８発現レベル（Ｃ）、または、３つのｍｉＲＮＡの総発現レベル（Ｄ）の関数として患者の転移非存在生存を表すＭＳＫＣＣコホート（ｎ＝７１）についてのカプラン・マイヤー曲線。原発性腫瘍のｍｉＲＮＡ発現レベルまたは総ｍｉＲＮＡ発現レベル（ｍｉＲ−１９９ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１９９ａ−５ｐおよびｍｉＲ−１９０８の発現の和）が集団についてのメジアンを超えた患者をｍｉＲＮＡ発現陽性（赤色）として分類し、一方、原発性腫瘍がこれらの所与ｍｉＲＮＡをこのメジアンよりも低いレベルで発現した患者をｍｉＲＮＡ発現陰性（青色）として分類した。（Ｅ）ｍｉＲ−１９０８、ｍｉＲ−１９９ａ−３ｐまたはｍｉＲ−１９９ａ−５ｐをそれぞれ個々に標的化するＬＮＡ、３つすべてのｍｉＲＮＡを標的化するＬＮＡの組合せ、あるいは、コントロールＬＮＡによりトランスフェクションされる高転移性ＬＭ２細胞による肺転移。トランスフェクション後４８時間で、１×１０５個の細胞を免疫不全マウスに静脈内注入した。ｎ＝５〜６。（Ｆ）コントロールＬＮＡ（ＬＮＡ−ＣＴＲＬ）、または、ｍｉＲ−１９０８、ｍｉＲ−１９９ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１９９ａ−５ｐを標的化するＬＮＡのカクテル（ＬＮＡ−３ｍｉＲＮＡｓ）により、無胸腺ヌードマウスへの心臓内注入の４８時間前にトランスフェクションされた１×１０５個のＬＭ２細胞による全身転移。ｎ＝５。（Ｇ）心臓内注入後２８日目における、ＬＮＡ−ＣＴＲＬのＬＭ２細胞およびＬＮＡ−３ｍｉＲＮＡｓのＬＭ２細胞から生じる全身転移病巣の数。ｎ＝５。（Ｈ〜Ｉ）ＬＮＡ−ＣＴＲＬのＬＭ２細胞およびＬＮＡ−３ｍｉＲＮＡｓのＬＭ２細胞の心臓内注入後２８日目における骨転移（Ｈ）および脳転移（Ｉ）のバイオルミネセンスシグナル定量化。ｎ＝５。（Ｊ）４×１０４個の高転移性ＭｅＷｏ−ＬＭ２細胞を免疫低下マウスに尾静脈注入し、これらのマウスを、ｍｉＲ−１９０８、ｍｉＲ−１９９ａ−３ｐおよびｍｉＲ−１９９ａ−５ｐを標的化するインビボ最適化ＬＮＡのカクテルにより１２．５ｍｇ／ｋｇの総用量で、または、模擬ＰＢＳコントロールにより、４週間にわたって週に２回、静脈内投与により処置した。肺でのコロニー形成をバイオルミネセンス画像化によって評価した。５６日目に取り出される代表的なＨ＆Ｅ染色された肺が示される。ｎ＝５〜６。（Ｋ）ＡｐｏＥ媒介のメラノーマ細胞ＬＲＰ１受容体シグナル伝達および内皮細胞ＬＲＰ８受容体シグナル伝達を標的化することを介する、メラノーマにおける転移性浸潤、内皮動員およびコロニー形成のｍｉＲＮＡ依存的調節のモデル。 ＡｐｏＥ／ＬＲＰ１シグナル伝達のｍｉＲＮＡ依存的標的化は、ＣＴＧＦの誘導を介してガン細胞浸潤および内皮動員を促進させる。（Ａ）ｑＲＴ−ＰＣＲ分析によって求められる、下記の細胞における分散正規化されたＣＴＧＦ発現レベルのヒートマップ：（１）ＭｅＷｏ親細胞およびＭｅＷｏ−ＬＭ２細胞、（２）ｍｉＲ−１９９ａ、ｍｉＲ−１９０８またはコントロールヘアピンを過剰発現するＭｅＷｏ親細胞、ならびに、（３）ＡｐｏＥまたはコントロール配列を標的化する短いヘアピンにより形質導入されるＭｅＷｏ親細胞。カラーマップは平均からの標準偏差の変化を示す。（Ｂ）ＥＬＩＳＡによって求められる、ＡｐｏＥノックダウンを有するＭｅＷｏ親細胞からの馴化培地におけるＣＴＧＦレベル。ｎ＝６；ｐ値は片側スチューデントｔ検定に基づく。（Ｃ）ＬＲＰ１ノックダウンまたはコントロールノックダウンの状況で組換えＡｐｏＥにより処置される高転移性ＭｅＷｏ−ＬＭ２細胞からの馴化培地における、ＥＬＩＳＡによって定量化されるＣＴＧＦレベル。ｎ＝３〜４；ｐ値は片側スチューデントｔ検定に基づく。（Ｄ〜Ｅ）ｓｈＲＮＡ誘導のＡｐｏＥノックダウンを有する親ＭｅＷｏ細胞を、（１）ＣＴＧＦまたはコントロール配列を標的化する無関係なｓｉＲＮＡによりトランスフェクションし、あるいは、（２）ＣＴＧＦ中和抗体（２０μｇ／ｍＬ）またはＩｇＧコントロール抗体（２０μｇ／ｍＬ）の存在下でインキュベーションし、細胞を細胞浸潤アッセイ（Ｄ）および内皮動員アッセイ（Ｅ）に供した。ｎ＝６〜８；ｐ値は片側スチューデントｔ検定に基づく。スケールバーは１００μＭを示す。すべてのデータが平均±ＳＥＭとして表される。 ＣＴＧＦは、ｍｉＲＮＡ依存的な転移性浸潤、内皮動員およびコロニー形成を媒介する。（Ａ）コントロールヘアピンを発現するか、あるいは、ｍｉＲ−１９９ａまたはｍｉＲ−１９０８を過剰発現する１×１０５個の親ＭｅＷｏ細胞を、図に示されるように、ＣＴＧＦを標的化する阻止抗体（２０μｇ／ｍＬ）またはコントロールのＩｇＧ抗体（２０μｇ／ｍＬ）の存在下におけるトランスウエル細胞浸潤アッセイに供した。ｎ＝４〜１０；ｐ値は片側スチューデントｔ検定に基づく。すべてのデータが平均±ＳＥＭとして表される。（Ｂ）コントロールヘアピンを発現するか、あるいは、ｍｉＲ−１９９ａまたはｍｉＲ−１９０８を過剰発現する親ＭｅＷｏ細胞による内皮動員。アッセイ開始時に、ＣＴＧＦを標的化する中和抗体（２０μｇ／ｍＬ）またはコントロールのＩｇＧ抗体（２０μｇ／ｍＬ）を示されるように内皮細胞に加え、１×１０５個の内皮細胞をトランスウエル遊走アッセイにおいて５×１０４個のガン細胞に向かって遊走させた。ｎ＝３〜８；ｐ値は片側スチューデントｔ検定に基づく。（Ｃ）ｍｉＲ−１９９ａまたはｍｉＲ−１９０８の過剰発現の状況における、ＣＴＧＦについてノックダウンされる５×１０４個の親ＭｅＷｏ細胞による肺転移のバイオルミネセンス画像化。ｎ＝５〜６；ｐ値を、片側マン−ホイットニーｔ検定を使用して求めた。すべてのデータが平均±ＳＥＭとして表される。 ＬＸＲアゴニストのＧＷ３９６５による処置はメラノーマ細胞のＡｐｏＥレベルを上昇させ、ガン細胞浸潤、内皮動員および転移性コロニー形成を抑制する。（Ａ〜Ｂ）親ＭｅＷｏ細胞を、示された濃度でのＤＭＳＯまたはＧＷ３９６５の存在下でインキュベーションした。４８時間後、総ＲＮＡを抽出し、ＡｐｏＥのレベル（Ａ）およびＤＮＡＪＡ４のレベル（Ｂ）をｑＲＴ−ＰＣＲによって求めた。ｎ＝３。（Ｃ）ＧＷ３９６５またはＤＭＳＯにより４８時間にわたって前処理される１×１０５個の親ＭｅＷｏ細胞による細胞浸潤。ｎ＝６〜７；ｐ値は片側スチューデントｔ検定に基づく。すべてのデータが平均±ＳＥＭとして表される。（Ｄ）ＧＷ３９６５またはＤＭＳＯにより４８時間にわたって前処理される５×１０４個の親ＭｅＷｏ細胞による内皮動員。ｎ＝６〜７；ｐ値は片側スチューデントｔ検定に基づく。（Ｅ）マウスに、ＧＷ３９６５（２０ｍｇ／ｋｇ）を含有する穀物系固形飼料餌、または、コントロール餌を与えた。１０日後、４×１０４個の親ＭｅＷｏ細胞をマウスに尾静脈注入し、これらのマウスに実験期間中を通して、ＧＷ３９６５含有固形飼料またはコントロール餌を連続して与えた。肺でのコロニー形成をバイオルミネセンス画像化によって評価した。ｎ＝５〜６；ｐ値を、片側マン・ホイットニーｔ検定を使用して得た。すべてのデータが平均±ＳＥＭとして表される。 メラノーマ転移の内因性抑制因子としてのｍｉＲ−７の特定。（Ａ）ｍｉＲ−７を阻害する短いヘアピン（ｍｉＲ−Ｚｉｐ）を発現する４×１０４個の親ＭｅＷｏ細胞（ｍｉＲ−７ ＫＤ）を静脈内注入した後における肺での転移性コロニー形成のバイオルミネセンス画像化プロット。肺を注入後６３日で取り出し、Ｈ＆Ｅ染色した。ｎ＝５。（Ｂ）ｍｉＲ−７についての前駆体またはコントロールヘアピンを過剰発現する４×１０４個のＬＭ２細胞による肺転移。肺でのコロニー形成をバイオルミネセンス画像化によって毎週モニターし、肺を注入後７７日目に取り出した。ｎ＝５。すべてのデータが平均±ＳＥＭとして表される；ｐ値を、片側マン−ホイットニーｔ検定を使用して求めた。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１。 高転移性のヒトメラノーマ細胞株派生物についてのインビボ選抜、ならびに、転移促進因子ｍｉＲＮＡとしてのｍｉＲ−１９９ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１９９ａ−５ｐおよびｍｉＲ−１９０８の特定。（Ａ〜Ｂ）ＭｅＷｏ−ＬＭ２転移性派生物（Ａ）およびＡ３７５−ＬＭ３転移性派生物（Ｂ）ならびにそれらのそれぞれの親細胞株に対応する肺転移のバイオルミネセンス画像化およびＨ＆Ｅ染色された肺の代表的な画像。４×１０４個のＭｅＷｏ−Ｐａｒ／ＭｅＷｏ−ＬＭ２細胞および１×１０５個のＡ３７５−Ｐａｒ／Ａ３７５−ＬＭ３細胞をＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスに静脈内注入し、肺を７２日目および４９日目にそれぞれ取り出し、Ｈ＆Ｅ染色した。ｎ＝４〜５。（Ｃ）ｍｉＲ−１９９ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１９９ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１９０８およびｍｉＲ−２１４の発現レベルをＡ３７５−ＬＭ３転移性派生物およびそれらの親細胞においてｑＲＴ−ＰＣＲによって求めた。ｎ＝３。（Ｄ）親ＭｅＷｏ細胞を、コントロールヘアピンを発現するか、あるいは、ｍｉＲ−１９９ａ（ｍｉＲ−１９９ａ−３ｐおよびｍｉＲ−１９９ａ−５ｐの両方）、ｍｉＲ−１９０８またはｍｉＲ−２１４を生じさせるプレ−ｍｉＲＮＡヘアピン構築物を発現するレトロウイルスにより形質導入した。標的ｍｉＲＮＡの発現レベルをｑＲＴ−ＰＣＲによって求めた。ｎ＝３。（Ｅ）図１ＣからのＨ＆Ｅ染色された肺切片を、ｍｉＲ−１９９ａ、ｍｉＲ−１９０８またはコントロールヘアピンを過剰発現する親ＭｅＷｏ細胞から生じる転移性結節の数について分析した。ｎ＝３。（Ｆ）ｍｉＲ−１９９ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１９９ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１９０８またはコントロール配列の発現が沈黙させられたＬＭ２細胞によって形成される転移性結節の数を図１ＤからのＨ＆Ｅ染色された肺切片において分析した。ｎ＝３。すべてのデータが平均±ＳＥＭとして表される。 ｍｉＲ−１９９ａおよびｍｉＲ−１９０８は増殖をインビトロにおいて阻害し、細胞浸潤および内皮動員を選択的に促進させる。（Ａ）ｍｉＲ−１９９ａ、ｍｉＲ−１９０８またはコントロールヘアピンを過剰発現する２．５×１０４個のＭｅＷｏ細胞を三連で播種し、生細胞を５日後に計数した。ｎ＝３。（Ｂ）１×１０５個の低転移性の親ＭｅＷｏ細胞および高転移性のＬＭ２細胞をトランスウエルアッセイにおけるそれらのマトリゲル通過浸潤能について比較した。ｎ＝３〜４。（Ｃ）１×１０５個の内皮細胞を６ウエルプレートに播種し、単層を形成させた。ｍｉＲ−１９９ａ、ｍｉＲ−１９０８またはコントロールヘアピンを過剰発現する２×１０５個の親ＭｅＷｏ細胞を内皮単層の上に播種し、３０分間インキュベーションした。それぞれの単層をその後で画像化し、内皮細胞に接着するガン細胞の数を定量化した。ｎ＝３。（Ｄ）ｍｉＲ−１９９ａ、ｍｉＲ−１９０８またはコントロールヘアピンを過剰発現する１×１０６個の親ＭｅＷｏ細胞を、０．２％のメチルセルロースが補充される細胞培地を含有する低接着性プレートに播種した。懸濁状態での４８時間の後、死細胞および生細胞の数を定量化した。ｎ＝３。（Ｅ）ｍｉＲ−１９９ａ、ｍｉＲ−１９０８またはコントロールヘアピンを過剰発現する５×１０５個の親ＭｅＷｏ細胞を６ウエルプレートに播種し、低血清培地において４８時間インキュベーションし、その後、生細胞の数を定量化した。ｎ＝４。（Ｆ）ｍｉＲ−１９９ａ、ｍｉＲ−１９０８またはコントロールヘアピンを過剰発現する親ＭｅＷｏ細胞によるコロニー形成。５０個の細胞を６ｃｍのプレートに播種し、形成されたコロニーの数を２週間後に定量化した。ｎ＝４。（Ｇ）５×１０４個の親ＭｅＷｏ細胞およびＬＭ２細胞をウエルの底部に播種し、それらの内皮細胞動員能について評価した。ｎ＝６〜８。（Ｈ）ｍｉＲ−１９９ａ、ｍｉＲ−１９０８またはコントロールヘアピンを過剰発現する親ＭｅＷｏ細胞によって形成される転移性結節についての、累積割合プロットとして示される百分率血管密度。図１Ｃからの肺切片をヒトビメンチンおよびＭＥＣＡ−３２について免疫組織化学的に二重染色し、ヒトビメンチン染色によって与えられる総結節面積に対するＭＥＣＡ−３２陽性面積を、ＩｍａｇｅＪを使用して定量化した。ｎ＝４３個の結節（コントロール）；ｎ＝１１７個の結節（ｍｉＲ−１９９ａ ＯＥ）；ｎ＝５５個の結節（ｍｉＲ−１９０８ ＯＥ）。すべてのデータが平均±ＳＥＭとして表される。スケールバー、１００μｍ。 ｍｉＲ−１９９ａおよびｍｉＲ−１９０８はＡｐｏＥおよびＤＮＡＪＡ４を収斂的かつ協同的に標的とする。（Ａ）ｍｉＲ−１９９ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１９９ａ−５ｐおよびｍｉＲ−１９０８に共通な推定される標的遺伝子の特定をもたらす統合的な実験的取り組みを示すベン図。それぞれのｍｉＲＮＡの過剰発現のときに１．５倍超の差でダウンレギュレーションされる遺伝子のトランスクリプトームプロファイリングを、それぞれのｍｉＲＮＡのサイレンシングのときに１．５倍を超えてアップレギュレーションされる遺伝子と重ね合わせ、また、それらの親細胞株に対して転移性ＬＭ２細胞において１．５倍超の差でダウンレギュレーションされる遺伝子と重ね合わせた。（Ｂ〜Ｄ）ｍｉＲ−１９９ａ、ｍｉＲ−１９０８またはコントロールヘアピンを過剰発現する親ＭｅＷｏ細胞（Ｂ）、親ＭｅＷｏ細胞およびそれらの高転移性のＬＭ２派生細胞株（Ｃ）、ならびに、ｍｉＲ−１９９ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１９９ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１９０８またはコントロール配列のｍｉＲ−Ｚｉｐ媒介サイレンシングを有するＭｅＷｏ−ＬＭ２細胞（Ｄ）における、ｑＲＴ−ＰＣＲによって測定されるＡｐｏＥおよびＤＮＡＪＡ４の発現レベル。ｎ＝３。（Ｅ）ｍｉＲ−１９９ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１９９ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１９０８またはコントロール配列の阻害を有する高転移性ＬＭ２細胞における、ｍｉＲ−１９９ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１９９ａ−５ｐまたはｍｉＲ−１９０８の標的部位変異型のＡｐｏＥ ３’ＵＴＲ／ＣＤＳルシフェラーゼ融合物およびＤＮＡＪＡ４ ３’ＵＴＲ／ＣＤＳルシフェラーゼ融合物の安定性を測定する異種ルシフェラーゼレポーターアッセイ。ｎ＝３〜４。（Ｆ）ＭｅＷｏ−ＬＭ２細胞を、コントロールベクターを発現するレトロウイルス、あるいは、ＡｐｏＥまたはＤＮＡＪＡ４を生じさせる過剰発現ベクターを発現するレトロウイルスにより形質導入した。標的遺伝子の発現レベルをｑＲＴ−ＰＣＲによって求めた。（Ｇ）ＡｐｏＥ、ＤＮＡＪＡ４またはコントロール配列を標的化するレンチウイルスｓｈＲＮＡにより形質導入される親ＭｅＷｏ細胞における、ｑＲＴ−ＰＣＲによって求められるＡｐｏＥおよびＤＮＡＪＡ４の発現レベル。すべてのデータが平均±ＳＥＭとして表される。 ｍｉＲ−１９９ａ／ｍｉＲ−１９０８とＡｐｏＥ／ＤＮＡＪＡ４との間におけるエピタシス相互作用（Ａ〜Ｄ）。ＭｅＷｏ−ＬＭ２細胞を、ｍｉＲ−１９０８のｍｉＲ−Ｚｉｐ誘導サイレンシングの状況（Ａ、Ｂ）、ｍｉＲ−１９９ａ−５ｐのｍｉＲ−Ｚｉｐ誘導サイレンシングの状況（Ｃ、Ｄ）、または、コントロール配列のｍｉＲ−Ｚｉｐ誘導サイレンシングの状況で、ＡｐｏＥを標的化するレンチウイルスｓｈＲＮＡ（Ａ、Ｃ）、ＤＮＡＪＡ４を標的化するレンチウイルスｓｈＲＮＡ（Ｂ、Ｄ）、または、コントロールｓｈＲＮＡにより形質導入した。標的遺伝子のレベルをｑＲＴ−ＰＣＲによって分析した。（Ｅ）コントロールヘアピン、あるいは、ＡｐｏＥ、ＤＮＡＪＡ４またはコントロール配列をｍｉＲ−１９０８阻害の状況で標的化する（図４Ｅで使用されるｓｈＲＮＡとは無関係な）ｓｈＲＮＡを発現する１×１０５個のＬＭ２細胞による肺転移のバイオルミネセンス画像化。代表的なバイオルミネセンス画像およびＨ＆Ｅ染色された肺は注入後４２日目に対応する。ｎ＝５。（Ｆ〜Ｇ）ＡｐｏＥおよびＤＮＡＪＡ４の発現レベルを、コントロールベクター、あるいは、ＡｐｏＥまたはＤＮＡＪＡ４のための過剰発現ベクターをｍｉＲ−１９０８過剰発現（Ｆ）またはｍｉＲ−１９９ａ過剰発現（Ｇ）の状況で発現するレトロウイルスにより形質導入される親ＭｅＷｏ細胞においてｑＲＴ−ＰＣＲによって分析した。（Ｈ〜Ｉ）ｍｉＲ−１９９ａ過剰発現の状況でＡｐｏＥまたはＤＮＡＪＡ４を過剰発現する、あるいは、コントロールベクターを発現する親ＭｅＷｏ細胞を浸潤表現型（Ｈ）および内皮動員表現型（Ｉ）について調べた。ｎ＝７〜８。（Ｊ）ｍｉＲ−１９０８過剰発現の状況でＡｐｏＥまたはＤＮＡＪＡ４を過剰発現する、あるいは、コントロールベクターを発現する４×１０４個の親ＭｅＷｏ細胞による肺転移のバイオルミネセンス画像化。代表的なバイオルミネセンス画像およびＨ＆Ｅ染色された肺は注入後５６日に対応する。ｎ＝４〜８。（Ｋ）ＡｐｏＥおよびＤＮＡＪＡ４またはコントロール配列を標的化するｓｈＲＮＡ構築物を発現するレンチウイルスにより形質導入される高転移性のＡ３７５−ＬＭ３派生物における、ｑＲＴ−ＰＣＲによって求められるＡｐｏＥおよびＤＮＡＪＡ４の発現レベル。すべてのデータが平均±ＳＥＭとして表される。スケールバー、１００μｍ。 細胞外ＡｐｏＥは、ガン細胞または内皮細胞の増殖および生存に対する何らかの影響とは無関係にメラノーマ浸潤および内皮動員の表現型を阻害する。（Ａ）細胞外ＡｐｏＥレベルを、ｍｉＲ−１９９ａ、ｍｉＲ−１９０８またはコントロールヘアピンを過剰発現するＭｅＷｏ細胞からの馴化培地においてＥＬＩＳＡによって測定した。ｎ＝３。（Ｂ〜Ｃ）３×１０４個のＭｅＷｏ−ＬＭ２細胞（Ｂ）または内皮細胞（Ｃ）をＢＳＡ（１００μΜ）またはＡＰＯＥ（１００μΜ）の存在下で培養し、細胞増殖を、生細胞の数をそれぞれの示された時点で計数することによって経時的にモニターした。ｎ＝３。（Ｄ〜Ｅ）ＢＳＡ（１００μΜ）またはＡＰＯＥ（１００μΜ）の存在下での血清飢餓の状況におけるＭｅＷｏ−ＬＭ２細胞（Ｄ）または内皮細胞（Ｅ）の生存。ｎ＝３。（Ｆ〜Ｇ）ＡｐｏＥのｍＲＮＡ発現レベルを、コントロールヘアピン、または、ＤＮＡＪＡ４を標的化する短いヘアピン構築物を発現するレンチウイルスにより形質導入される親ＭｅＷｏ細胞（Ｆ）、および、コントロールベクター、または、ＤＮＡＪＡ４のための過剰発現ベクターを発現するレトロウイルスにより形質導入されるＬＭ２細胞（Ｇ）において評価した。ｎ＝３。（Ｈ〜Ｉ）コントロールベクター、または、ＤＮＡＪＡ４のための過剰発現ベクターを発現するレトロウイルスにより形質導入されるＬＭ２細胞を、ＩｇＧ抗体（４０μｇ／ｍＬ）または１Ｄ７抗体（４０μｇ／ｍＬ）（ＡｐｏＥ中和抗体）の存在下でのトランスウエルアッセイにおいて、それらのマトリゲル通過浸潤能（Ｈ；ｎ＝６〜８）および内皮細胞動員能（Ｉ；ｎ＝４）について評価した。すべてのデータが平均±ＳＥＭとして表される。 ＡｐｏＥは、細胞浸潤および内皮動員を、メラノーマ細胞のＬＲＰ１受容体および内皮細胞のＬＲＰ８受容体を標的化することによって阻害する。（Ａ）ＬＲＰ１またはコントロール配列に対するｓｉＲＮＡにより形質導入される１×１０５個のＬＭ２細胞をマトリゲル通過浸潤能について分析した。ｎ＝９〜１２。（Ｂ）ｍｉＲ−１９９ａ−５ｐまたはコントロール配列について阻害される１×１０５個のＭｅＷｏ−ＬＭ２細胞をＬＲＰ１標的化ｓｉＲＮＡまたはコントロールｓｉＲＮＡによりトランスフェクションし、それらのマトリゲル浸潤能について調べた。ｎ＝４。（Ｃ）コントロールｓｉＲＮＡまたはＬＲＰ１標的化ｓｉＲＮＡにより形質導入されるＭｅＷｏ−ＬＭ２ ｍｉＲ−１９０８ ＫＤ細胞が注入されたＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスから５６日目に取り出される代表的なＨ＆Ｅ染色された肺（図６Ｃを参照のこと）。（Ｄ〜Ｅ）１×１０５個の内皮細胞をＬＲＰ８標的化ｓｉＲＮＡまたはコントロール配列によりトランスフェクションし、短いコントロールヘアピンを発現する５×１０４個のＭｅＷｏ−ＬＭ２細胞（Ｄ；ｎ＝８）、あるいは、ｍｉＲ−１９９ａ−５ｐまたはコントロール配列について阻害される５×１０４個のＭｅＷｏ−ＬＭ２細胞（Ｅ；ｎ＝４）に向かってトランスウエル遊走させた。すべてのデータが平均±ＳＥＭとして表される。スケールバー、１００μｍ。 ｍｉＲ−１９９ａおよびｍｉＲ−１９０８のＬＮＡ型阻害はメラノーマ転移を抑制する。（Ａ）コントロールＬＮＡ、または、ｍｉＲ−１９９ａ−３ｐ、ｍｉＲ１９９ａ−５ｐおよびｍｉＲ−１９０８を標的化するＬＮＡのカクテルにより形質導入される２．５×１０４個のＭｅＷｏ−ＬＭ２細胞によるインビトロ細胞増殖。生細胞の数を５日後に定量化した。ｎ＝３。（Ｂ）コントロールＬＮＡ、または、ｍｉＲ−１９９ａ−３ｐ、ｍｉＲ１９９ａ−５ｐおよびｍｉＲ−１９０８を標的化するＬＮＡのカクテルによりトランスフェクションされる高転移性のＡ３７５−ＬＭ３派生物による肺でのコロニー形成。トランスフェクション後４８時間で、５×１０５個の細胞をＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスに静脈内注入し、肺でのコロニー形成を、バイオルミネセンスを３５日後に測定することによって求めた。ｎ＝５〜６。（Ｃ）これら３つのｍｉＲＮＡを標的化するＬＮＡのカクテル、または、模擬ＰＢＳコントロール処置（図７Ｊ）により処置されるマウスの重量を週に２回モニターした。ｎ＝５〜６。すべてのデータが平均±ＳＥＭとして表される。 ＬＸＲβシグナル伝達の活性化はメラノーマ細胞浸潤および内皮動員を抑制する。（Ａ）ＮＣＩ−６０メラノーマ細胞株コレクションにおけるＬＸＲイソ型およびＲＸＲイソ型の、マイクロアレイに基づく発現レベルを示すヒートマップ。これらの遺伝子についてのヒートマップが核ホルモン受容体ファミリーのより大きなヒートマップ（図２０）から抽出される。カラーマップ凡例により、それぞれの細胞株におけるすべてのマイクロアレイ・プロファイリングされた遺伝子（３９，０００を超える転写変異体）の平均発現値に対するそれぞれの受容体の発現値についての標準偏差における変化が示される。（Ｂ）１×１０５個のＭｅＷｏヒトメラノーマ細胞、５×１０４個のＨＴ−１４４ヒトメラノーマ細胞、５×１０５個のＳＫ−Ｍｅｌ−２ヒトメラノーマ細胞および５×１０４個のＳＫ−Ｍｅｌ−３３４．２ヒトメラノーマ細胞による細胞浸潤。細胞を、１μＭでのＤＭＳＯ、ＧＷ３９６５、Ｔ０９０１３１７またはベキサロテンにより７２時間処理し、トランスウエルでのマトリゲル浸潤アッセイに供した。ｎ＝４８。（Ｃ）５×１０４個のＭｅＷｏヒトメラノーマ細胞、ＨＴ−１４４ヒトメラノーマ細胞、ＳＫ−Ｍｅｌ−２ヒトメラノーマ細胞およびＳＫ−Ｍｅｌ−３３４．２ヒトメラノーマ細胞を、これらのメラノーマ細胞を１μＭでのＤＭＳＯ、ＧＷ３９６５、Ｔ０９０１３１７またはベキサロテンにより７２時間処理した後、トランスウエル遊走アッセイで、１×１０５個の内皮細胞を動員するそれらの能力について試験した。ｎ＝４〜８。（Ｄ〜Ｅ）コントロールｓｈＲＮＡ、あるいは、ＬＸＲαまたはＬＸＲβを標的化するｓｈＲＮＡを発現する１×１０５個のＭｅＷｏヒトメラノーマ細胞（Ｄ）および１×１０５個のＨＴ−１４４ヒトメラノーマ細胞（Ｅ）を、これらの細胞を１μＭでのＤＭＳＯ、ＧＷ３９６５またはＴ０９０１３１７により７２時間処理した後で細胞浸潤アッセイに供した。ｎ＝４〜１２。（Ｆ〜Ｇ）ＬＸＲαまたはＬＸＲβを標的化するレンチウイルスｓｈＲＮＡ、あるいは、コントロールｓｈＲＮＡにより形質導入される５×１０４個のＭｅＷｏ細胞（Ｆ）および５×１０４個のＨＴ−１４４細胞（Ｇ）を、１μＭでのＤＭＳＯ、ＧＷ３９６５またはＴ０９０１３１７により７２時間処理し、トランスウエル遊走アッセイで、１×１０５個の内皮細胞を動員するそれらの能力について試験した。ｎ＝７〜８。すべてのデータが平均±ＳＥＭとして表される。スケールバー、５０μｍ。＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。 メラノーマにおける核ホルモン受容体発現の分析ならびにインビトロ細胞成長に対するＬＸＲアゴニストおよびＲＸＲアゴニストに対する影響（これらは図１９（Ａ〜Ｇ）に関連づけられる）。（Ａ）すべての核ホルモン受容体ファミリーメンバーのマイクロアレイに基づく発現レベルを様々なメラノーマ系統のＮＣＩ−６０コレクションにわたって示すヒートマップ。それぞれの受容体の発現レベルが、それぞれの細胞株においてマイクロアレイによって検出されるすべての遺伝子（３９，０００を超える転写変異体）の平均発現レベルを下回る、または超える標準偏差の数字として示される。（Ｂ）２．５×１０４個のＭｅＷｏヒトメラノーマ細胞、ＨＴ−１４４ヒトメラノーマ細胞またはＳＫ−Ｍｅｌ−３３４．２ヒトメラノーマ細胞を６ウエルプレートに播種し、１μＭでのＤＭＳＯ、ＧＷ３９６５、Ｔ０９０１３１７またはベキサロテンの存在下で培養した。生細胞を播種後５日目に計数した。ｎ＝３〜６。（Ｃ）２．５×１０４個のＭｅＷｏ細胞、ＨＴ−１４４細胞またはＳＫ−Ｍｅｌ−３３４．２細胞を三連で置床し、ＤＭＳＯ、ＧＷ３９６５、Ｔ０９０１３１７またはベキサロテンを１μＭで含有する培地において５日間インキュベーションし、その後、死細胞の数を、トリパンブルー死細胞染色を使用して定量化した。ｎ＝３。（Ｄ〜Ｇ）コントロールｓｈＲＮＡ、あるいは、ＬＸＲαまたはＬＸＲβを標的化するｓｈＲＮＡを発現するＭｅＷｏヒトメラノーマ細胞（Ｄ、Ｅ）およびＨＴ−１４４ヒトメラノーマ細胞（Ｆ、Ｇ）における、ｑＲＴ−ＰＣＲによって求められるＬＸＲαおよびＬＸＲβの相対的発現。すべてのデータが平均±ＳＥＭとして表される。 治療的なＬＸＲ活性化はメラノーマ腫瘍成長を阻害する。（Ａ〜Ｂ）Ｃ５７ＢＬ／６−ＷＴマウスに皮下注入される５×１０４個のＢ１６Ｆ１０マウスメラノーマ細胞による原発性腫瘍成長。腫瘍成長が体積で５ｍｍ３〜１０ｍｍ３に達した後、マウスには連続して、コントロール固形飼料、あるいは、ＧＷ３９６５が補充される固形飼料（２０ｍｇ／ｋｇ／日または１００ｍｇ／ｋｇ／日）（Ａ）、または、Ｔ０９０１３１７が補充される固形飼料（２０ｍｇ／ｋｇ／日）（Ｂ）を与えた。示される代表的な腫瘍画像は、最終日（ｄ１２）に取り出された腫瘍に対応する。ｎ＝１０〜１８（Ａ）、８〜１０（Ｂ）。（Ｃ〜Ｅ）免疫低下マウスに皮下注入された１×１０６個のＭｅＷｏヒトメラノーマ細胞（Ｃ）、７．５×１０５個のＳＫ−Ｍｅｌ−３３４．２ヒトメラノーマ細胞（Ｄ）および２×１０６個のＳＫ−Ｍｅｌ−２ヒトメラノーマ細胞（Ｅ）による原発性腫瘍成長。腫瘍成長が体積で５ｍｍ３〜１０ｍｍ３に達した後、マウスを無作為に、コントロール餌、または、ＧＷ３９６５が補充される餌（示されるように２０ｍｇ／ｋｇまたは１００ｍｇ／ｋｇ）に割り当てた。示される腫瘍画像は測定の最終日に対応する。ｎ＝６〜３４（Ｃ）、８（Ｄ）、５（Ｅ）。（Ｆ）５×１０４個のＢ１６Ｆ１０細胞をＣ５７ＢＬ／６−ＷＴマウスに皮下注入した。腫瘍成長が１５０ｍｍ３に達したとき、マウスには連続して、コントロール固形飼料、または、ＧＷ３９６５（１５０ｍｇ／ｋｇ）を含有する固形飼料を与え、腫瘍成長を毎日測定した。ｎ＝６〜１３。（Ｇ〜Ｉ）通常の固形飼料、または、ＧＷ３９６５（１００ｍｇ／ｋｇ）が補充される固形飼料が、体積で５ｍｍ３〜１０ｍｍ３である腫瘍を形成したときに与えられるマウスに、５×１０４個のＢ１６Ｆ１０細胞（Ｇ）、１×１０６個のＭｅＷｏ細胞（Ｈ）および７．５×１０５個のＳＫ−Ｍｅｌ−３３４．２細胞（Ｉ）を皮下移植した後におけるマウス全生存。ｎ＝６〜９（Ｆ）、４〜７（Ｈ）、３〜６（Ｉ）。（Ｊ〜Ｌ）コントロール餌またはＧＷ３９６５補充餌（２０ｍｇ／ｋｇ）による３５日間のマウス処置に対する応答での１×１０６個のＭｅＷｏヒトメラノーマ細胞によって形成される皮下メラノーマ腫瘍における、マウス内皮細胞抗原ＭＥＣＡ−３２についての免疫組織化学的染色によって求められる腫瘍の内皮細胞密度（Ｊ）、増殖性マーカーＫｉ−６７についての染色によって求められる腫瘍細胞増殖（Ｋ）、および、切断型カスパーゼ−３についての染色によって求められる腫瘍細胞アポトーシス（Ｌ）。ｎ＝５。腫瘍体積を、（最少直径）２×（最大直径）／２として計算した。すべてのデータが平均±ＳＥＭとして表される。スケールバー、５ｍｍ（Ａ〜Ｄ）、５０μｍ（Ｊ、Ｋ）、２５μｍ（Ｌ）。 ＬＸＲβアゴニズムはメラノーマ腫瘍成長を抑制する（これは図２１（Ａ〜Ｅ）に関連づけられる）。（Ａ）コントロール餌、あるいは、ＧＷ３９６５が補充される餌（２０ｍｇ／ｋｇ／日または１００ｍｇ／ｋｇ／日）またはＴ０９０１３１７が補充される餌（２０ｍｇ／ｋｇ）が６５日間与えられるマウスの重量測定。ｎ＝５〜６。 ＬＸＲアゴニズムは肺および脳へのメラノーマ転移を抑制する。（Ａ）ＭｅＷｏ細胞をＤＭＳＯまたはＧＷ３９６５（１μＭ）により４８時間にわたって前処理し、４×１０４個の細胞を、ＮＯＤ Ｓｃｉｄマウスに、尾静脈を介して静脈内注入した。肺でのコロニー形成を毎週のバイオルミネセンス画像化によってモニターした。最終日（ｄ７０）に対応する代表的なＨ＆Ｅ染色された肺が示される。ｎ＝４〜５。（Ｂ〜Ｃ）コントロール固形飼料、あるいは、ＧＷ３９６５（２０ｍｇ／ｋｇ）またはＴ０９０１３１７（２０ｍｇ／ｋｇ）を含有する固形飼料がガン細胞注入の１０日前に始まって与えられるＮＯＤ Ｓｃｉｄマウスに静脈内注入された４×１０４個のＭｅＷｏ細胞による肺転移のバイオルミネセンス画像化。代表的なＨ＆Ｅ染色された肺が画像化最終日に対応する。ｎ＝５〜６。（Ｂ〜Ｃ）コントロール固形飼料、あるいは、ＧＷ３９６５（２０ｍｇ／ｋｇ）またはＴ０９０１３１７（２０ｍｇ／ｋｇ）を含有する固形飼料がガン細胞注入の１０日前に始まって与えられるＮＯＤ Ｓｃｉｄマウスに静脈内注入された４×１０４個のＭｅＷｏ細胞による肺転移のバイオルミネセンス画像化。代表的なＨ＆Ｅ染色された肺が画像化最終日に対応する。ｎ＝５〜６。（Ｆ）コントロール餌またはＧＷ３９６５補充餌（１００ｍｇ／ｋｇ）が注入後０日目に開始して与えられる無胸腺ヌードマウスに１×１０５個のＭｅＷｏ脳転移性派生物細胞を心臓内注入した後における全身および脳の光子束。ｎ＝７。（Ｇ）ＧＷ３９６５処置が腫瘍切除後の肺転移を抑制することができるかを評価するために使用される実験的同所性転移モデルの概略。（Ｈ）コントロール餌、または、ＧＷ３９６５（１００ｍｇ／ｋｇ）を含有する餌が、１×１０６個のＭｅＷｏメラノーマ細胞によって形成されるサイズ一致（体積で約３００ｍｍ３）の皮下メラノーマ腫瘍を切除した後の１ヶ月間にわたって与えられたＮＯＤ Ｓｃｉｄマウスにおける、バイオルミネセンス画像化によって求められるエクスビボ肺光子束。ヒトビメンチンについて染色される代表的な肺もまた示される。ｎ＝７〜９。（Ｉ）４×１０４個のＭｅＷｏ細胞を、ＮＯＤ Ｓｃｉｄマウスに静脈内注入した。転移が始まった後（これが、ｄ４２においてバイオルミネセンス画像化によって検出された）、マウスには、コントロール餌またはＧＷ３９６５餌（１００ｍｇ／ｋｇ）が、示されるように与えられ、肺でのコロニー形成の進行を毎週測定した。ｎ＝６。（Ｊ）コントロール餌、または、ＧＷ３９６５（１００ｍｇ／ｋｇ）が補充される餌が、（Ｉ）において示されるように与えられるＮＯＤ Ｓｃｉｄマウスから最終日（ｄ７７）に取り出されているＨ＆Ｅ染色された肺における肉眼的転移性結節の数。ｎ＝４〜５。（Ｋ）コントロール固形飼料またはＧＷ３９６５補充固形飼料（２０ｍｇ／ｋｇ）がガン細胞注入の１０日前に開始して連続して与えられたＮＯＤ−Ｓｃｉｄマウスに４×１０４個のＭｅＷｏ細胞を静脈内注入した後における全マウス生存。ｎ＝５〜６。すべてのデータが平均±ＳＥＭとして表される。 遺伝的主導のメラノーマ進行のＬＸＲ活性化療法による抑制。（Ａ）４−ＨＴ（２５ｍｇ／ｋｇ）の３日間連続での腹腔内投与による全身的メラノーマ誘導の後におけるＴｙｒ：：ＣｒｅＥＲ；ＢｒａｆＶ６００Ｅ／＋；Ｐｔｅｎｌｏｘ／＋Ｃ５７ＢＬ／６マウスの全生存。１回目の４−ＨＴ注射の後、マウスを無作為に、コントロール餌、または、ＧＷ３９６５（１００ｍｇ／ｋｇ）が補充される餌に割り当てた。ｎ＝１０〜１１。（Ｂ）コントロール固形飼料、または、ＧＷ３９６５（１００ｍｇ／ｋｇ）が補充される固形飼料が（Ａ）において記載されるようなメラノーマ誘導のときに与えられるＴｙｒ：：ＣｒｅＥＲ；ＢｒａｆＶ６００Ｅ／＋；Ｐｔｅｎｌｏｘ／ｌｏｘマウスにおいて３５日目に測定される背側皮膚面積の百分率として表されるメラノーマ腫瘍負荷量。ｎ＝４〜５。（Ｃ）コントロール固形飼料、または、ＧＷ３９６５（１００ｍｇ／ｋｇ）を含有する固形飼料が（Ａ）において記載されるようなメラノーマ進行の全体的誘導の後で与えられたＴｙｒ：：ＣｒｅＥＲ；ＢｒａｆＶ６００Ｅ／＋；Ｐｔｅｎｌｏｘ／ｌｏｘマウスにおいて死後に検出される、唾液腺リンパ節への肉眼的転移性結節の数。ｎ＝７〜８。（Ｄ）１×１０５個のＢｒａｆＶ６００Ｅ／＋；Ｐｔｅｎ−／−；ＣＤＫＮ２Ａ−／−原発性メラノーマ細胞を同系のＣ５７ＢＬ／６−ＷＴマウスに皮下注入した後における腫瘍成長。腫瘍成長が体積で５ｍｍ３〜１０ｍｍ３に達したとき、マウスには、コントロール固形飼料、または、ＧＷ３９６５（１００ｍｇ／ｋｇ）が補充される固形飼料を与えた。ｎ＝１６〜１８。（Ｅ）１×１０５個のＢｒａｆＶ６００Ｅ／＋；Ｐｔｅｎ−／−；ＣＤＫＮ２Ａ−／−メラノーマ細胞が皮下注入され、かつ、腫瘍成長が体積で５ｍｍ３〜１０ｍｍ３に達した後でＧＷ３９６５餌（１００ｍｇ／ｋｇ）またはコントロール餌により処置されるＣ５７ＢＬ／６−ＷＴマウスの全生存。ｎ＝７〜８。（Ｆ）Ｃ５７ＢＬ／６−ＷＴマウスに静脈内注入される１×１０５個のＢｒａｆＶ６００Ｅ／＋；Ｐｔｅｎ−／−；ＣＤＫＮ２Ａ−／−原発性メラノーマ細胞による肺でのコロニー形成。ガン細胞注入後直ちに、マウスを無作為に、実験の残り期間についてはコントロール餌またはＧＷ３９６５補充餌（１００ｍｇ／ｋｇ）に割り当てた。ｎ＝１４〜１５。すべてのデータが平均±ＳＥＭとして表される。スケールバー、２ｍｍ（Ｂ）、５ｍｍ（Ｄ）。 遺伝的主導のメラノーママウスモデルにおけるメラノーマ進行のＬＸＲ媒介抑制（これは図２４（Ａ〜Ｃ）に関連づけられる）。（Ａ）４−ＨＴ（２５ｍｇ／ｋｇ）の３日間連続での腹腔内投与による全身的メラノーマ誘導の後におけるＴｙｒ：：ＣｒｅＥＲ；ＢｒａｆＶ６００Ｅ／＋；Ｐｔｅｎｌｏｘ／ｌｏｘＣ５７ＢＬ／６マウスの全生存。１回目の４−ＨＴ注射の後、マウスを無作為に、コントロール餌、または、ＧＷ３９６５（１００ｍｇ／ｋｇ）が補充される餌に割り当てた。ｎ＝７。（Ｂ）腹腔内４−ＨＴ投与によるメラノーマ誘導の４３日後に撮影される、コントロール餌またはＧＷ３９６５補充餌（１００ｍｇ／ｋｇ）が与えられるＴｙｒ：：ＣｒｅＥＲ；ＢｒａｆＶ６００Ｅ／ ＋；Ｐｔｅｎｌｏｘ／ｌｏｘＣ５７ＢＬ／６マウスの代表的な画像。 ＧＷ３９６５処置に対する応答でのＭｅＷｏヒトメラノーマ細胞における５０個の最もアップレギュレーションされた遺伝子のリスト。 ＬＸＲβの活性化はメラノーマ細胞におけるＡｐｏＥ発現を誘導する；ＡｐｏＥはインビトロでのメラノーマ進行表現型のＬＸＲβ依存的抑制を媒介する。（Ａ〜Ｃ）ＭｅＷｏヒトメラノーマ細胞（Ａ）、ＨＴ−１４４ヒトメラノーマ細胞（Ｂ）およびＷＭ−２６６−４ヒトメラノーマ細胞（Ｃ）を、示された濃度でのＧＷ３９６５またはＴ０９０１３１７により４８時間処理し、ＡｐｏＥの発現レベルをｑＲＴ−ＰＣＲによって分析した。ｎ＝３。（Ｄ）１μＭでのＤＭＳＯ、ＧＷ３９６５またはＴ０９０１３１７により７２時間処理されるＨＴ−１４４ヒトメラノーマ細胞から集められる血清非含有馴化培地における、ＥＬＩＳＡによって定量化される細胞外ＡｐｏＥタンパク質レベル。ｎ＝３〜４。（Ｅ〜Ｆ）１μＭでのＤＭＳＯ、ＧＷ３９６５またはＴ０９０１３１７により７２時間処理される５×１０４個のＨＴ−１４４細胞を、アッセイ開始時にそれぞれのトランスウエルに４０μｇ／ｍＬで加えられるＡｐｏＥ中和抗体（１Ｄ７）またはＩｇＧコントロール抗体の存在下において細胞浸潤表現型（Ｅ）および内皮動員表現型（Ｆ）について試験した。ｎ＝４。（Ｇ〜Ｈ）コントロールｓｈＲＮＡ、または、ＡｐｏＥを標的化するｓｈＲＮＡを発現し、かつ、１μＭでのＤＭＳＯまたはＧＷ３９６５によりそれぞれのアッセイの前の７２時間にわたって処理される１×１０５個および５×１０４個のＭｅＷｏ細胞によってそれぞれもたらされる細胞浸潤（Ｇ）および内皮動員（Ｆ）。ｎ＝７〜８。（Ｉ〜Ｊ）コントロールｓｈＲＮＡ、あるいは、ＬＸＲαまたはＬＸＲβを標的化するｓｈＲＮＡにより形質導入され、続いて、１μＭでのＤＭＳＯ、ＧＷ３９６５またはＴ０９０１３１７により４８時間処理されるＭｅＷｏ細胞（Ｉ）およびＨＴ−１４４細胞（Ｊ）における、ｑＲＴ−ＰＣＲによって定量化される相対的ＡｐｏＥ発現。ｎ＝３〜９。（Ｋ）コントロールｓｈＲＮＡ、あるいは、ＬＸＲαまたはＬＸＲβを標的化するｓｈＲＮＡにより形質導入され、続いて、１μＭでのＤＭＳＯまたはＧＷ３９６５により７２時間処理されるＨＴ−１４４細胞から集められる血清非含有馴化培地における、ＥＬＩＳＡによって測定される細胞外ＡｐｏＥタンパク質レベル。ｎ＝３。すべてのデータが平均±ＳＥＭとして表される。スケールバー、５０μｍ。 ＬＸＲβの活性化は、メラノーマ浸潤および内皮動員を、メラノーマ細胞のＡｐｏＥ発現を転写的に強化することによって抑制する。（Ａ）マルチエンハンサーエレメント１（ＭＥ．１）配列またはマルチエンハンサーエレメント２（ＭＥ．２）配列の下流側に融合されるＡｐｏＥプロモーターから駆動され、１μＭでのＤＭＳＯ、ＧＷ３９６５またはＴ０９０１３１７により２４時間処理されるＭｅＷｏ細胞にトランスフェクションされるルシフェラーゼ活性。ｎ＝４〜８。（Ｂ）細胞外ＡｐｏＥタンパク質レベルを、１μＭでのＤＭＳＯ、ＧＷ３９６５またはＴ０９０１３１７により７２時間処理されるＭｅＷｏ細胞から集められる血清非含有馴化培地においてＥＬＩＳＡによって定量化した。ｎ＝３〜４。（Ｃ）１μＭでのＤＭＳＯ、ＧＷ３９６５またはＴ０９０１３１７により７２時間にわたって前処理される１×１０５個のＭｅＷｏ細胞による細胞浸潤。アッセイ開始時に、ＡｐｏＥ中和抗体（１Ｄ７）またはＩｇＧコントロール抗体を、示されるようにそれぞれのトランスウエルに４０μｇ／ｍＬで加えた。ｎ＝７〜８。（Ｄ）１μＭでのＤＭＳＯ、ＧＷ３９６５またはＴ０９０１３１７により７２時間にわたって前処理される５×１０４個のＭｅＷｏ細胞を、１×１０５個の内皮細胞を４０μｇ／ｍＬでの１Ｄ７抗体またはＩｇＧ抗体の存在下で動員するそれらの能力について試験した。ｎ＝６〜８。（Ｅ）１μＭでのＤＭＳＯまたはＧＷ３９６５により７２時間処理されるＳＫ−Ｍｅｌ−３３４．２原発性ヒトメラノーマ細胞からの血清非含有馴化培地における、ＥＬＩＳＡによって定量化される細胞外ＡｐｏＥタンパク質レベル。ｎ＝４。（Ｆ〜Ｇ）１μＭでのＧＷ３９６５により７２時間にわたって前処理される５×１０４個のＳＫ−Ｍｅｌ−３３４．２細胞を、４０μｇ／ｍＬでの１Ｄ７抗体またはＩｇＧ抗体の存在下における細胞浸潤アッセイ（Ｆ）および内皮動員アッセイ（Ｇ）に供した。ｎ＝７〜８。（Ｈ）ＭＥ．１エンハンサーエレメントまたはＭＥ．２エンハンサーエレメントに融合されるＡｐｏＥプロモーターの活性を、コントロールｓｈＲＮＡ、あるいは、ＬＸＲαまたはＬＸＲβを標的化するｓｈＲＮＡを発現するＭｅＷｏ細胞におけるルシフェラーゼレポーター活性を２４時間にわたるＤＭＳＯまたはＧＷ３９６５（１μＭ）の存在下で測定することにより求めた。ｎ＝３〜８。（Ｉ）ＥＬＩＳＡによって定量化される細胞外ＡｐｏＥタンパク質レベルを、ＧＷ３９６５またはＴ０９０１３１７（１μＭ）による７２時間の処理に対する応答での、コントロールｓｈＲＮＡ、あるいは、ＬＸＲαまたはＬＸＲβを標的化するｓｈＲＮＡを発現するヒトＭｅＷｏメラノーマ細胞から集められる血清非含有馴化培地において評価した。ｎ＝３〜８。すべてのデータが平均±ＳＥＭとして表される。スケールバー、５０μｍ。 ＬＸＲアゴニストの治療的送達はメラノーマ由来のＡｐｏＥ発現および全身的なＡｐｏＥ発現をアップレギュレーションする。（Ａ〜Ｂ）Ｃ５７ＢＬ／６マウスに注入されるＢ１６Ｆ１０マウスメラノーマ細胞によって形成される皮下腫瘍における、ｑＲＴ−ＰＣＲによって定量化されるＡｐｏＥ発現レベル。５ｍｍ３の腫瘍が形成された後、マウスには、コントロール餌、あるいは、ＧＷ３９６５（２０ｍｇ／ｋｇ）を含有する餌（Ａ）、または、Ｔ０９０１３１７（２０ｍｇ／ｋｇ）を含有する餌（Ｂ）を７日間与えた。ｎ＝３〜４。（Ｃ〜Ｅ）コントロール固形飼料、または、ＧＷ３９６５（２０ｍｇ／ｋｇ）が補充される固形飼料が与えられたＮＯＤ Ｓｃｉｄマウスに移植されたＭｅＷｏヒトメラノーマ細胞によって形成される原発性腫瘍（Ｃ）、肺転移物（Ｄ）および脳転移物（Ｅ）におけるＡｐｏＥ転写物発現。ＡｐｏＥのレベルを、ガン細胞注入後の３５日目（Ｃ）、１５３日目（Ｄ）および３４日目（Ｅ）に評価した。ｎ＝３〜５。（Ｆ）ＬＸＲα、ＬＸＲβおよびＡｐｏＥの相対的発現レベルを、コントロールヘアピン、あるいは、マウスＬＸＲαを標的化するｓｈＲＮＡ（ｓｈ＿ｍＬＸＲα）、マウスＬＸＲβを標的化するｓｈＲＮＡ（ｓｈ＿ｍＬＸＲβ）、または、マウスＡｐｏＥを標的化するｓｈＲＮＡ（ｓｈ＿ｍＡｐｏＥ）を発現するＢ１６Ｆ１０マウスメラノーマ細胞においてｑＲＴ−ＰＣＲによって求めた。（Ｇ〜Ｈ）コントロールｓｈＲＮＡ、あるいは、マウスＬＸＲβまたはマウスＡｐｏＥを標的化するｓｈＲＮＡを発現するＢ１６Ｆ１０細胞における、ｑＲＴ−ＰＣＲによって測定されるＡｐｏＥのｍＲＮＡレベル（Ｇ）およびＡＢＣＡ１のｍＲＮＡレベル（Ｈ）。細胞を５μＭでのＤＭＳＯまたはＧＷ３９６５により４８時間処理した。ｎ＝３。（Ｉ）コントロール餌またはＧＷ３９６５補充餌（２０ｍｇ／ｋｇ）が１０日間与えられるＬＸＲα−／−マウスまたはＬＸＲβ−／−マウスから取り出される全身白血球における、ｑＲＴ−ＰＣＲによって測定されるＡＢＣＡ１のｍＲＮＡレベル。ｎ＝３〜４。（Ｊ）マウスの皮膚組織および肺組織における、ＳＡＧＥタグの頻度として表されるＡｐｏＥのｍＲＮＡの相対的発現を、ＮＣＩにより資金提供されるＣａｎｃｅｒ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｔｏｍｙ Ｐｒｏｊｅｃｔ（ＣＧＡＰ）から入手可能である公開されているｍＳＡＧＥ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｍａｔｒｉｘデータベースを使用して求めた。（Ｋ）コントロールの非選抜ＭｅＷｏ親細胞に対する、肺転移性結節から分離されるＭｅＷｏメラノーマ細胞（ＬＭ２）、または、原発性腫瘍における、ｑＲＴ−ＰＣＲによって求められるＡｐｏＥのｍＲＮＡの相対的発現。ｎ＝３。 ＬＸＲβアゴニズムは、メラノーマの腫瘍成長および転移を、メラノーマ由来のＡｐｏＥ発現および全身的なＡｐｏＥ発現を誘導することによって抑制する。（Ａ）コントロール固形飼料、あるいは、ＧＷ３９６５（２０ｍｇ／ｋｇ）またはＴ０９０１３１７（２０ｍｇ／ｋｇ）が補充される固形飼料が１０日間与えられる野生型マウスから取り出される脂肪組織、肺組織および脳組織の溶解物におけるＡｐｏＥタンパク質レベルのウエスタンブロット測定。（Ｂ）（Ａ）において示されるウエスタンブロットに基づくＡｐｏＥタンパク質発現の定量化。総チューブリンを正規化のための内因性コントロールとして使用した。ｎ＝３〜５。（Ｃ）コントロール餌、あるいは、ＧＷ３９６５またはＴ０９０１３１７が補充される餌が２０ｍｇ／ｋｇで１０日間与えられるマウスから得られる全身白血球における、ｑＲＴ−ＰＣＲによって求められるＡｐｏＥの発現レベル。ｎ＝３〜６。（Ｄ）Ｂ１６Ｆ１０コントロール細胞、あるいは、マウスＬＸＲαを標的化するｓｈＲＮＡ（ｓｈ＿ｍＬＸＲα）、または、マウスＬＸＲβを標的化するｓｈＲＮＡ（ｓｈ＿ｍＬＸＲβ）を発現するＢ１６Ｆ１０細胞を、Ｃ５７ＢＬ／６−ＷＴマウス、ＬＸＲα−／−マウスまたはＬＸＲβ−／−マウスに皮下注入した。腫瘍が体積で５ｍｍ３〜１０ｍｍ３に達すると、マウスには、コントロール餌、または、ＧＷ３９６５（２０ｍｇ／ｋｇ）が補充される餌を７日間与え、その後、最終的な腫瘍体積を測定した。終了点において取り出された代表的な腫瘍画像が右側パネルに示される。ｎ＝６〜１８。（Ｅ）コントロール餌またはＧＷ３９６５補充餌（２０ｍｇ／ｋｇ）が１０日間与えられるＬＸＲα−／−マウスまたはＬＸＲβ−／−マウスから取り出される全身白血球における、ｑＲＴ−ＰＣＲによって定量化されるＡｐｏＥ転写物レベル。ｎ＝３〜５。（Ｆ）５×１０４個のＢ１６Ｆ１０コントロール細胞、あるいは、マウスＡｐｏＥを標的化するｓｈＲＮＡ（ｓｈ＿ｍＡｐｏＥ）をＣ５７ＢＬ／６−ＷＴマウスまたはＡｐｏＥ−／−マウスにおいて発現するＢ１６Ｆ１０細胞による皮下腫瘍成長。体積で５ｍｍ３〜１０ｍｍ３である腫瘍が形成された後、マウスには、コントロール餌、または、ＧＷ３９６５（２０ｍｇ／ｋｇ）が補充される餌を７日間与え、最終的な腫瘍体積を定量化した。測定最終日（ｄ１２）に取り出された腫瘍の代表的な画像が右側に示される。ｎ＝８〜１８。（Ｇ）コントロールｓｈＲＮＡまたはｓｈ＿ｍＡｐｏＥにより形質導入され、かつ、Ｃ５７ＢＬ／６−ＷＴマウスまたはＡｐｏＥ−／−マウスに静脈内注入される５×１０４個のＢ１６Ｆ１０細胞による肺でのコロニー形成。ガン細胞注入の１０日前に開始して、マウスをコントロール餌による処理またはＧＷ３９６５補充餌（２０ｍｇ／ｋｇ）による処置に割り当てた。肺転移物をバイオルミネセンス画像化によってｄ２２において定量化した。終了点（ｄ２２）において取り出された代表的な肺が右側パネルに示される。ｎ＝５〜１０。（Ｈ）ＭＳＫＣＣにおける患者から得られる非転移性（ｎ＝３９）および転移性（ｎ＝３４）の原発性メラノーマ皮膚病変部サンプルにおける、盲検での免疫組織化学的分析によって求められるＡｐｏＥタンパク質発現。ＡｐｏＥ陽性染色細胞面積の割合を総腫瘍面積の百分率として定量化した。（Ｉ）患者の転移非存在生存を患者の原発性メラノーマ病変部におけるＡｐｏＥタンパク質発現の関数として示す、ＭＳＫＣＣコホート（ｎ＝７１）についてのカプラン・マイヤー曲線。ＡｐｏＥのレベルが集団のメジアンを超えていたメラノーマをＡｐｏＥ陽性（ｐｏｓ）として分類し、これに対して、ＡｐｏＥの発現がこのメジアンを下回っている腫瘍をＡｐｏＥ陰性（ｎｅｇ）として分類した。すべてのデータが平均±ＳＥＭとして表される。スケールバー、５ｍｍ（ＤおよびＦ）、１００μｍ（Ｈ）。 ＬＸＲβの活性化は、ダカルバジンおよびベムラフェニブに対して抵抗性であるメラノーマ系統のインビボ成長を抑制する。（Ａ）細胞培地に４日間加えられる様々な用量のダカルバジン（ＤＴＩＣ）に対する応答における、２．５×１０４個のＢ１６Ｆ１０親細胞およびインビトロ由来のＢ１６Ｆ１０ ＤＴＩＣ抵抗性細胞によるインビトロ細胞成長。ｎ＝３。（Ｂ〜Ｄ）Ｃ５７ＢＬ／６−ＷＴマウスに皮下注入される５×１０４個のＤＴＩＣ感受性Ｂ１６Ｆ１０親細胞（Ｂ）または５×１０４個のＤＴＩＣ抵抗性Ｂ１６Ｆ１０細胞（Ｃ）による腫瘍成長。腫瘍成長が体積で５ｍｍ３〜１０ｍｍ３に達した後、マウスをダカルバジン（５０ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．、毎日）またはコントロールビヒクルにより処置し、通常の固形飼料、または、ＧＷ３９６５（１００ｍｇ／ｋｇ）が補充される固形飼料に無作為に割り当てた。最終日の腫瘍体積測定結果が（Ｄ）に示される。ｎ＝８〜１６（Ｂ）、７〜８（Ｃ）。（Ｅ〜Ｆ）ＤＴＩＣ処置またはＧＷ３９６５処置に対する応答における、ＤＴＩＣ感受性ＭｅＷｏ親細胞およびインビボ由来のＤＴＩＣ抵抗性ＭｅＷｏヒトメラノーマ細胞による腫瘍成長。５×１０５個の細胞を、ＮＯＤ Ｓｃｉｄガンママウスに皮下注入した。体積で５ｍｍ３〜１０ｍｍ３である腫瘍が形成された後、マウスを盲検的に、コントロール処置、あるいは、ＤＴＩＣ処置（５０ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．、２日の休薬処置間隔を伴う５日サイクルで毎日投与される）、または、ＧＷ３９６５補充餌処置（１００ｍｇ／ｋｇ）に割り当てた。最終日の腫瘍測定結果が（Ｆ）に示される。ｎ＝６〜８。（Ｇ）腫瘍が体積で５ｍｍ３〜１０ｍｍ３にまで成長した後で、コントロール餌、または、ＧＷ３９６５（１００ｍｇ／ｋｇ）が補充される餌に割り当てられたＮＯＤ Ｓｃｉｄガンママウスに皮下注入された２×１０６個のＳＫ−Ｍｅｌ−２３９ベムラフェニブ抵抗性クローン細胞による腫瘍成長。ｎ＝７〜８。（Ｈ）２×１０６個のＳＫ−Ｍｅｌ−２３９ベムラフェニブ抵抗性細胞を移植した後における全マウス生存。腫瘍が体積で５ｍｍ３〜１０ｍｍ３にまで成長すると、マウスには連続して、コントロール餌、または、ＧＷ３９６５（１００ｍｇ／ｋｇ）が補充される餌を与えた。ｎ＝７。（Ｉ）メラノーマ進行表現型の抑制を媒介することにおけるＬＸＲβ活性化療法による全身的ＡｐｏＥおよびメラノーマ自律的ＡｐｏＥの関与を示す実験的に導かれるモデル。細胞外ＡｐｏＥは、メラノーマ細胞のＬＲＰ１受容体および内皮細胞のＬＲＰ８受容体を標的化することを介してメラノーマ細胞浸潤および細胞非自律的な内皮動員を協調的に阻害することによってそれぞれ、メラノーマの転移を抑制する。すべてのデータが平均±ＳＥＭとして表される。スケールバー、５ｍｍ。 ヒトメラノーマ細胞による腫瘍成長のダカルバジン誘導の抑制。（Ａ）Ｎｏｄ ＳＣＩＤガンママウスに皮下注入される５×１０５個のＤＴＩＣ感受性ＭｅＷｏ親細胞による腫瘍成長。腫瘍が５ｍｍ３〜１０ｍｍ３の体積に達したとき、マウスをコントロールビヒクルまたはＤＴＩＣ（５０ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．、２日の休薬処置間隔を伴う５日サイクルで毎日投与される）により処置し、腫瘍体積を週に２回測定した。ｎ＝６。 多数のガンタイプにわたる細胞浸潤のＡｐｏＥ媒介抑制。（Ａ〜Ｂ）５×１０４個のＭＵＭ２Ｂヒトぶどう膜メラノーマ細胞およびＯＣＭ１ヒトぶどう膜メラノーマ細胞、（Ｃ〜Ｅ）５×１０４個のＭＤＡ−２３１ヒト三重陰性乳ガン細胞、ＭＤＡ−４６８ヒト三重陰性乳ガン細胞およびＢＴ５４９ヒト三重陰性乳ガン細胞、（Ｆ〜Ｇ）５×１０４個のＰＡＮＣ１ヒト膵臓ガン細胞およびＢＸＰＣ−３ヒト膵臓ガン細胞、ならびに、（Ｈ〜Ｉ）５×１０４個の７８６−００ヒト腎臓ガン細胞およびＲＣＣ４ヒト腎臓ガン細胞を、マトリゲル被覆トランスウエル挿入物を通って浸潤するそれらの能力についてインビトロにおいて試験した。ＢＳＡおよび組換えＡｐｏＥをアッセイ開始時に１００μｇ／ｍＬで細胞培地に加えた。ｎ＝４。すべてのデータが平均±ＳＥＭとして表される；＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。 ヒトメラノーマ細胞におけるＡｐｏＥ発現に対するＬＸＲアゴニスト（ＬＸＲ−６２３、ＷＯ−２００７−００２５６３（Ｅｘ．１９）、ＷＯ−２０１０−０１３８５９８（Ｅｘ．９）およびＳＢ７４２８８１）の影響。（Ａ〜Ｄ）ＭｅＷｏヒトメラノーマ細胞を、ＤＭＳＯ、あるいは、ＬＸＲアゴニストのＬＸＲ−６２３（Ａ）、ＷＯ−２００７−００２５６３（Ｂ）、ＷＯ−２０１０−０１３８５９８（Ｃ）またはＳＢ７４２８８１（Ｄ）により、５００ｎＭ、１μＭまたは２μＭで４８時間処理した。その後、ＡｐｏＥの発現レベルをｑＲＴ−ＰＣＲによって定量化した。ｎ＝３。すべてのデータが平均±ＳＥＭとして表される。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１。 ＬＸＲアゴニストのＧＷ３９６５による処置は、腎臓ガン、膵臓ガンおよび肺ガンのインビトロ腫瘍細胞浸潤を阻害する。（Ａ〜Ｃ）１μＭでのＤＭＳＯまたはＧＷ３９６５によりアッセイ前の７２時間にわたって処置された５×１０４個のＲＣＣヒト腎臓ガン細胞（Ａ）、５×１０４個のＰＡＮＣ１ヒト膵臓ガン細胞（Ｂ）および５×１０４個のＨ４６０ヒト肺ガン細胞（Ｃ）によるトランスウエルでのマトリゲル浸潤。ｎ＝４。すべてのデータが平均±ＳＥＭとして表される。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１。 ＬＸＲアゴニストのＧＷ３９６５による処置は乳ガン腫瘍成長をインビボにおいて阻害する。ＮＯＤ Ｓｃｉｄガンママウスの乳房脂肪パッドに注入される２×１０６個のＭＤＡ−４６８ヒト乳ガン細胞による原発性腫瘍成長。ガン細胞注入の２日前に、マウスを、コントロール餌処置、または、ＧＷ３９６５（７５ｍｇ／ｋｇ）が補充される餌に割り当て、対応する餌で実験期間中を通して維持した。ｎ＝８。すべてのデータが平均±ＳＥＭとして表される。＊＊＊ｐ＜０．００１。 インビトロでのメラノーマ進行表現型に対するＬＸＲアゴニスト（ＬＸＲ−６２３、ＷＯ−２００７−００２５６３（Ｅｘ．１９）、ＷＯ−２０１０−０１３８５９８（Ｅｘ．９）およびＳＢ７４２８８１）の影響。（Ａ）ＤＭＳＯ、ＬＸＲ−６２３、ＷＯ−２００７−００２５６３（Ｅｘ．１９）、ＷＯ−２０１０−０１３８５９８（Ｅｘ．９）またはＳＢ７４２８８１によりそれぞれ１μＭで７２時間にわたって前処理される１×１０５個のＭｅＷｏヒトメラノーマ細胞による細胞浸潤。マトリゲル被覆されたトランスウエル挿入物の基部側に浸潤する細胞の数を定量化した。ｎ＝５。（Ｂ）ＤＭＳＯ、ＬＸＲ−６２３、ＷＯ−２００７−００２５６３（Ｅｘ．１９）、ＷＯ−２０１０−０１３８５９８（Ｅｘ．９）またはＳＢ７４２８８１によりそれぞれ１μＭで７２時間にわたって前処理される５×１０４個のＭｅＷｏ細胞による内皮動員。ガン細胞を２４ウエルプレートの底に播種した。内皮細胞をそれぞれのウエルに取り付けられるトランスウエル挿入物に播種し、ガン細胞に向かって遊走させた。それぞれのトランスウエル挿入物の基部側に遊走する内皮細胞の数を定量化した。ｎ＝４〜５。すべてのデータが平均±ＳＥＭとして表される。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１。 インビボでの腫瘍成長に対するＬＸＲアゴニスト（ＬＸＲ−６２３、ＷＯ−２００７−００２５６３（Ｅｘ．１９）、ＷＯ−２０１０−０１３８５９８（Ｅｘ．９）およびＳＢ７４２８８１）の影響。（Ａ〜Ｄ）７週齢のＣ５７ＢＬ／６マウスに皮下注入される５×１０４個のＢ１６Ｆ１０マウスメラノーマ細胞による腫瘍成長。腫瘍が体積で５ｍｍ３〜１０ｍｍ３に達した後、マウスを無作為に、コントロール餌処置、２０ｍｇ／ｋｇ／日でのＬＸＲ−６２３補充餌処置（Ａ）、１００ｍｇ／ｋｇ／日でのＷＯ−２００７−００２５６３（Ｅｘ．１９）補充餌処置（Ｂ）、１０ｍｇ／ｋｇ／日または１００ｍｇ／ｋｇ／日でのＷＯ−２０１０−０１３８５９８（Ｅｘ．１９）補充餌処置（Ｃ）、あるいは、１００ｍｇ／ｋｇ／日でのＳＢ７４２８８１補充餌処置（Ｄ）に割り当てた。ｎ＝８〜１０。すべてのデータが平均±ＳＥＭとして表される。
発明の詳細な説明
本発明は、細胞の正常でない増殖、分化または生存を防止するか、または軽減するため
の方法を特徴とする。例えば、本発明の化合物は、腫瘍がサイズにおいて増大するか、ま
たは、転移性状態に達するという危険性を減らすことにおいて、あるいは、腫瘍をサイズ
において増大させないか、または、転移性状態に至らせないことにおいて有用である場合
がある。本発明の主題化合物は、ガンの進行または発達を停止させるために投与される場
合がある。加えて、本発明には、本発明の主題化合物を、ガンが再発する危険性を減らす
ために、または、ガンの再発を防止するために使用することが含まれる。
転移性進行は、共通する細胞表現型に関与する様々な一連のエフェクタータンパク質が
首尾一貫して発現されることを必要とする（ＧｕｐｔａおよびＭａｓｓａｇｕｅ、２００
６、Ｃｅｌｌ、１２７、６７９〜６９５；ＨａｎａｈａｎおよびＷｅｉｎｂｅｒｇ、２０
１１、Ｃｅｌｌ、１４４、６４６〜６７４；ＴａｌｍａｄｇｅおよびＦｉｄｌｅｒ、２０
１０、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、７０、５６４９〜５６６９；Ｈｙｎｅｓ、２００３、Ｃ
ｅｌｌ、１１３、８２１〜８２３）。そのような協調した発現状態が、転移する原発性乳
ガンの遺伝子発現プロフィルにおいて明らかであり（Ｗａｎｇ他、２００５、Ｌａｎｃｅ
ｔ、３６５、６７１〜６７９）、同様にまた、高まった転移活性を呈示する様々なヒトガ
ン細胞クローンのプロフィルにおいて明らかである（Ｋａｎｇ他、２００３、Ｃａｎｃｅ
ｒ Ｃｅｌｌ、３、５３７〜５４９；Ｍｉｎｎ他、２００５、Ｎａｔｕｒｅ、４３６、５
１８〜５２４）。近年では、転写後調節が、協調した発現状態および表現型レベルの制御
の広範囲にわたる、また、堅固な様式として明らかになってきている。転移調節活性を有
する転写後調節因子の最も研究されているクラスが、小さい非コードＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ
）である（Ｂａｒｔｅｌ、２００９、Ｃｅｌｌ、１３６、２１５〜２３３；Ｆａｂｉａｎ
他、２０１０、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、７９、３５１〜３７９；Ｆｉｌｉ
ｐｏｗｉｃｚ他、２００８、Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．、９、１０２〜１１４）。転
移促進因子ｍｉＲＮＡ（Ｍａ他、２００７、Ｎａｔｕｒｅ、４４９、６８２〜６８８；Ｈ
ｕａｎｇ他、２００８、Ｎａｔ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．、１０、２０２〜２１０）および
転移抑制因子ｍｉＲＮＡ（Ｔａｖａｚｏｉｅ他、２００８、Ｎａｔｕｒｅ、４５１、１４
７〜１５２）が乳ガンにおいて初めて発見された。その後の研究により、他のガンタイプ
の腫瘍形成および転移における調節的役割を有するさらに多くのｍｉＲＮＡが明らかにさ
れた（Ｈａｔｚｉａｐｏｓｔｏｌｏｕ他、２０１１、Ｃｅｌｌ、１４７、１２３３〜１２
４７；Ｈｕｒｓｔ他、２００９、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、６９、７４９５〜７４９８；
Ｏｌｓｏｎ他、２００９、Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．、２３、２１５２〜２１６５；Ｚｈａｎ
ｇ他、２０１０、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ、２９、９３７〜９４８）。多くの場合において、ヒ
トガンサンプルにおけるこれらのｍｉＲＮＡの発現レベルは、転移におけるそれらの実験
的役割を裏づけている。したがって、脱調節されたｍｉＲＮＡ発現（Ｇａｒｚｏｎ他、２
０１０、Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ．、９、７７５〜７８９；Ｌｕｊａｍ
ｂｉｏおよびＬｏｗｅ、２０１２、Ｎａｔｕｒｅ、４８２、３４７〜３５５）、および、
より近年には、長い非コードＲＮＡの脱調節された発現（Ｃａｌｉｎ他、２００７、Ｎａ
ｔ．Ｒｅｖ．Ｃａｎｃｅｒ、６、８５７〜８６６；Ｇｕｐｔａ他、２０１０、Ｎａｔｕｒ
ｅ、４６４、１０７１〜１０７６；Ｇｕｔｔｍａｎ他、２００９、Ｎａｔｕｒｅ、４５８
、２２３〜２２７；Ｈｕａｒｔｅ他、２０１０、Ｃｅｌｌ、１４２、４０９〜４１９；Ｌ
ｏｅｗｅｒ他、２０１０、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．、４２、１１１３〜１１１７）、同様に
また、内因性ｍｉＲＮＡが結合するために競合する非コード偽遺伝子の脱調節された発現
（Ｐｏｌｉｓｅｎｏ他、２０１０、Ｎａｔｕｒｅ、４６５、１０３３〜１０３８）が、ヒ
トガンの広範囲にわたる特徴であるようである。特異的なｍｉＲＮＡが転移性進行に及ぼ
す堅固な制御に関する様々な手がかりが、ただ１つだけの転移抑制因子ｍｉＲＮＡによる
多数の転移遺伝子の協調した標的化が劇的な転移抑制効果に関わっていたことを示す初期
の研究からもたらされた（Ｔａｖａｚｏｉｅ他、２００８、Ｎａｔｕｒｅ、４５１、１４
７〜１５２）。様々なｍｉＲＮＡによるそのような多岐にわたる遺伝子標的化が、これら
の調節因子の特徴づける特徴であることが明らかになってきている。
概念的レベルにおいて、ガンにおける遺伝子発現の多岐にわたる調節の必要性が容易に
理解される。ｍｉＲＮＡが、転移のために要求される多数の遺伝子を標的化するその能力
によって、堅固な転移抑制を発揮し得るかもしれない。遺伝子的または後成的な機構を介
するｍｉＲＮＡのサイレンシングが、転移の多数の促進因子を脱抑制することによってガ
ンの進行を容易に促進させるであろうと思われる（Ｐｎｇ他、２０１１、Ｎａｔｕｒｅ、
４８１、１９０〜１９４）。多数の転移調節性ｍｉＲＮＡによるただ１つだけの遺伝子の
収斂的調節のための役割がよりにおわされる。転移性進行の堅固な抑制因子として作用し
た重要な遺伝子が存在したならば、このシナリオが現れるであろう。多数のｍｉＲＮＡに
よるこの遺伝子の収斂的かつ協同的な標的化により、そのような重要な転移抑制因子遺伝
子の最大のサイレンシングが達成され得るかもしれない。このシナリオは、遺伝的欠失と
は対照的に、標的遺伝子の完全な喪失が細胞によって許容され得ないかもしれない場合に
認められるかもしれず、この遺伝子は、例えば、代謝作用を媒介するために低いレベルで
要求されるであろうと思われる。この可能性を考えれば、協同的な転移促進因子ｍｉＲＮ
Ａについての探索により、転移抑制のために非常に重要である新規な遺伝子が発見される
かもしれず、また、転移防止のためのより効果的な処置に対する治療的洞察がもたらされ
るかもしれない。
本明細書中に開示されるように、体系的であるインビボ選抜に基づく取り組みを介して
、一組のｍｉＲＮＡが、メラノーマ、すなわち、発生率が増大している非常に広まってい
るガン（ＧａｒｂｅおよびＬｅｉｔｅｒ、２００９、Ｃｌｉｎ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．、２
７、３〜９）を有する多数の患者に由来する多数の無関係な転移性系統において脱調節さ
れることが確認された。本明細書中に開示されるように、ｍｉＲ−１９０８、ｍｉＲ−１
９９ａ−３ｐおよびｍｉＲ−１９９ａ−５ｐが、代謝遺伝子ＡｐｏＥおよび熱ショックタ
ンパク質ＤＮＡＪＡ４の収斂的な標的化を介してメラノーマ転移の堅固な内因性促進因子
として作用する。機能喪失分析、機能獲得分析およびエピスタシス分析により、ＡｐｏＥ
のシグナル伝達を最大限に沈黙させる協同的なｍｉＲＮＡネットワークの輪郭が明らかに
なる。ガン細胞により分泌されるＡｐｏＥにより、転移性浸潤および内皮動員が阻害され
、このことが、メラノーマ細胞および内皮細胞における異なった受容体に対するその作用
を介して媒介される。これらのｍｉＲＮＡは、メラノーマの転移性再発を発症する患者を
特定することにおける著しい予後能を示しており、一方、これらのｍｉＲＮＡを標的化す
るＬＮＡの治療的送達により、メラノーマ転移が著しく阻害される。外科的切除後のメラ
ノーマ転移を防止するための効果的な治療法が現在不足していること（Ｇａｒｂｅ他、２
０１１、Ｏｎｃｏｌｏｇｉｓｔ、１６、５〜２４）は、メラノーマの転移性進行の改善さ
れた分子的かつ機構的な理解を必要としている。この目的を達成するために、本明細書中
に開示される発見は、メラノーマ進行に関与するいくつかの重要な新規な非コード遺伝子
およびコード遺伝子を明らかにしており、また、メラノーマ転移について危険性が大きい
患者を特定すること、および、そのような患者を処置することの両方のための新規な手段
をもたらしている。
下記には、上述のネットワークのメンバーの核酸配列およびアミノ酸配列ならびにいく
つかの他の配列が示される。
ＡＰＯＥ−ＲＮＡ配列（配列番号１）
Figure 2022001571

ＡＰＯＥ−アミノ酸配列（配列番号２）
Figure 2022001571
（下線が施された残基１３６〜残基１５０はＡｐｏＥのＬＲＰ結合ドメインを表す）

ＤＮＡＪＡ４イソ型１−ＲＮＡ配列（配列番号３）
Figure 2022001571
Figure 2022001571

ＤＮＡＪＡ４イソ型１−アミノ酸配列（配列番号４）
Figure 2022001571

ＤＮＡＪＡ４イソ型２−ＲＮＡ配列（配列番号５）
Figure 2022001571

ＤＮＡＪＡ４イソ型２−アミノ酸配列（配列番号６）
Figure 2022001571

ＤＮＡＪＡ４イソ型３−ＲＮＡ配列（配列番号７）
Figure 2022001571
Figure 2022001571

ＤＮＡＪＡ４イソ型３−アミノ酸配列（配列番号８）
Figure 2022001571

ＬＲＰ１−ＲＮＡ配列（配列番号９）
Figure 2022001571
Figure 2022001571
Figure 2022001571
Figure 2022001571
Figure 2022001571
ＬＲＰ１−アミノ酸配列（配列番号１０）
Figure 2022001571
Figure 2022001571

ＬＲＰ８イソ型１−ＲＮＡ配列（配列番号１１）
Figure 2022001571
Figure 2022001571
Figure 2022001571

ＬＲＰ８イソ型１−アミノ酸配列（配列番号１２）
Figure 2022001571

ＬＲＰ８イソ型２−ＲＮＡ配列（配列番号１３）
Figure 2022001571
Figure 2022001571
Figure 2022001571

ＬＲＰ８イソ型２−アミノ酸配列（配列番号１４）
Figure 2022001571

ＬＲＰ８イソ型３−ＲＮＡ配列（配列番号１５）
Figure 2022001571
Figure 2022001571
Figure 2022001571

ＬＲＰ８イソ型３−アミノ酸配列（配列番号１６）
Figure 2022001571

ＬＲＰ８イソ型４−ＲＮＡ配列（配列番号１７）
Figure 2022001571
Figure 2022001571
Figure 2022001571

ＬＲＰ８イソ型４−アミノ酸配列（配列番号１８）
Figure 2022001571

ＣＴＧＦ−ＲＮＡ配列（配列番号１９）
Figure 2022001571

ＣＴＧＦ−アミノ酸配列（配列番号２０）
Figure 2022001571
ＬＸＲ−ａイソ型１：ＲＮＡ配列（配列番号２１）
Figure 2022001571

ＬＸＲ−ａ（ＮＲ１Ｈ３）イソ型１：アミノ酸配列（配列番号２２）
Figure 2022001571

ＬＸＲ−ａ（ＮＲ１Ｈ３）イソ型２：ＲＮＡ配列（配列番号２３）
Figure 2022001571
Figure 2022001571

ＬＸＲ−ａ（ＮＲ１Ｈ３）イソ型２：アミノ酸配列（配列番号２４）
Figure 2022001571

ＬＸＲ−ａ（ＮＲ１Ｈ３）イソ型３：ＲＮＡ配列（配列番号２５）
Figure 2022001571
Figure 2022001571
ＬＸＲ−ａ（ＮＲ１Ｈ３）イソ型３：アミノ酸配列（配列番号２６）
Figure 2022001571

ＬＸＲ−ａ（ＮＲ１Ｈ３）イソ型４：ＲＮＡ配列（配列番号２７）
Figure 2022001571

ＬＸＲ−ａ（ＮＲ１Ｈ３）イソ型４：アミノ酸配列（配列番号２８）
Figure 2022001571
Figure 2022001571

ＬＸＲ−ｂ（ＮＲ１Ｈ２）イソ型１：ＲＮＡ配列（配列番号２９）
Figure 2022001571

ＬＸＲ−ｂ（ＮＲ１Ｈ２）イソ型１：アミノ酸配列（配列番号３０）
Figure 2022001571

ＬＸＲ−ｂ（ＮＲ１Ｈ２）イソ型２：ＲＮＡ配列（配列番号３１）
Figure 2022001571
Figure 2022001571

ＬＸＲ−ｂ（ＮＲ１Ｈ２）イソ型２：アミノ酸配列（配列番号３２）
Figure 2022001571

ｈａｓ−ｍｉＲ−１９９ａ−１配列（配列番号３３）
GCCAACCCAGUGUUCAGACUACCUGUUCAGGAGGCUCUCAAUGUGUACAGUAGUCUGCACAUUGGUUAGGC

ｈａｓ−ｍｉＲ−１９９ａ−２配列（配列番号３４）
AGGAAGCUUCUGGAGAUCCUGCUCCGUCGCCCCAGUGUUCAGACUACCUGUUCAGGACAAUGCCGUUGUACAGUAGUCUG
CACAUUGGUUAGACUGGGCAAGGGAGAGCA

ｈａｓ−ｍｉＲ−１９０８配列（配列番号３５）
CGGGAAUGCCGCGGCGGGGACGGCGAUUGGUCCGUAUGUGUGGUGCCACCGGCCGCCGGCUCCGCCCCGGCCCCCGCCCC

ｈａｓ−ｍｉＲ−７−１配列（配列番号３６）
UUGGAUGUUGGCCUAGUUCUGUGUGGAAGACUAGUGAUUUUGUUGUUUUUAGAUAACUAAAUCGACAACAAAUCACAGUC
UGCCAUAUGGCACAGGCCAUGCCUCUACAG

ｈａｓ−ｍｉＲ−７−２配列（配列番号３７）
CUGGAUACAGAGUGGACCGGCUGGCCCCAUCUGGAAGACUAGUGAUUUUGUUGUUGUCUUACUGCGCUCAACAACAAAUC
CCAGUCUACCUAAUGGUGCCAGCCAUCGCA

ｈａｓ−ｍｉＲ−７−３配列（配列番号３８）
AGAUUAGAGUGGCUGUGGUCUAGUGCUGUGUGGAAGACUAGUGAUUUUGUUGUUCUGAUGUACUACGACAACAAGUCACA
GCCGGCCUCAUAGCGCAGACUCCCUUCGAC

ｍｉＲ−Ｚｉｐ １９９ａ−３ｐ配列（配列番号３９）
GATCCGACAGTAGCCTGCACATTAGTCACTTCCTGTCAGTAACCAATGTGCAGACTACTGTTTTTTGAATT

ｍｉＲ−Ｚｉｐ １９９ａ−５ｐ配列（配列番号４０）
GATCCGCCCAGTGCTCAGACTACCCGTGCCTTCCTGTCAGGAACAGGTAGTCTGAACACTGGGTTTTTGAATT

ｍｉＲ−Ｚｉｐ １９０８配列（配列番号４１）
GATCCGCGGCGGGAACGGCGATCGGCCCTTCCTGTCAGGACCAATCGCCGTCCCCGCCGTTTTTGAATT

ｍｉＲ−Ｚｉｐ ７配列（配列番号４２）
GATCCGTGGAAGATTAGTGAGTTTATTATCTTCCTGTCAGACAACAAAATCACTAGTCTTCCATTTTTGAATT

このネットワークのメンバーは、転移性メラノーマを処置するための標的として使用す
ることができる。加えて、これらのメンバーは、対象が転移性メラノーマを有するかどう
か、または、転移性メラノーマを有する危険性があるかどうかを決定するためのバイオマ
ーカーとして、あるいは、そのような障害を有する患者の予後を明らかにするための、ま
たは、そのような障害を有する患者の監視のためのバイオマーカーとして使用することが
できる。したがって、本発明は、転移性メラノーマを、これらのメンバーの１つまたは複
数を標的化することによって処置する方法、当該ガンを阻害するための治療療法の効力を
明らかにする方法、および、抗ガン剤を特定する方法を包含する。また、対象が転移性メ
ラノーマを有するかどうか、または、転移性メラノーマを有する危険性があるかどうかを
診断する方法、および、当該障害を発症する危険性があると考えられる対象をスクリーニ
ングする方法も提供される。本発明はまた、上述の方法を行うために好適である様々なキ
ットを包含する。
ＡｐｏＥポリペプチド
用語「ポリペプチドまたはペプチド」には、本明細書中で使用される場合、ネットワー
クに関与する特定のドメインまたは部分を有する、上述の転移抑制因子のいずれかの組換
えまたは合成により製造された融合体またはキメラ体が含まれる。これらの用語はまた、
ペプチドのアナログ、フラグメント、伸長物または誘導体（例えば、原核生物細胞におけ
る発現のために有用である付加されたアミノ末端メチオニンを有するもの）を包含する。
「アポリポタンパク質ポリペプチドまたはＡｐｏＥポリペプチド」は、本明細書中で使
用される場合、長さが１０アミノ酸残基〜２００アミノ酸残基の間のペプチドであるアポ
リポタンパク質のアナログ、フラグメント、伸長物または誘導体を含めて、生来型アポリ
ポタンパク質の機能をインビボまたはインビトロのどちらにおいてであれ模倣するペプチ
ド、薬物または化合物を意味し、そのようなペプチドは、アミド結合を含有する天然型ア
ミノ酸または非天然型アミノ酸のどちらをも含有することができる。アポリポタンパク質
のペプチドフラグメントは、生体内におけるそれらの安定性または生物学的利用能を改善
するために、この技術分野において知られているように改変される場合があり、また、ア
ミノ酸側鎖に様々な結合を介して結合される有機化合物を含有する場合がある。
１つの局面において、本発明者らの発明は、ＴＱＱＩＲＬＱＡＥＩＦＱＡＲ（マウス）
（配列番号４３）またはＡＱＱＩＲＬＱＡＥＡＦＱＡＲ（ヒト）（配列番号４４）のアミ
ノ酸配列を有する単離されたａｐｏＥｐ１．Ｂペプチド、あるいは、当該ペプチドのアナ
ログ、フラグメント、伸長物または誘導体を使用するための方法である。本発明にはまた
、ａｐｏＥｐ１．Ｂペプチドあるいはそのアナログ、フラグメント、伸長物または誘導体
をコードする核酸分子が含まれる。
用語「アナログ」には、どのようなペプチドであれ、１つまたは複数の残基が、機能的
に類似する残基により保存的に置換されている、生来型ペプチドと実質的に同一であるア
ミノ酸残基配列を有するペプチドで、生来型ペプチドを模倣する能力を示すペプチドが含
まれる。保存的置換の例には、１つの非極性（疎水性）残基（例えば、アラニン、イソロ
イシン、バリン、ロイシンまたはメチオニンなど）を別の非極性（疎水性）残基の代わり
に使用すること、１つの極性（親水性）残基を別の極性（親水性）残基の代わりに使用す
ること、例えば、アルギニンとリシンとの間、グルタミンとアスパラギンとの間、グリシ
ンとセリンとの間などにおける置換、１つの塩基性残基（例えば、リシン、アルギニンま
たはヒスチジンなど）を別の塩基性残基の代わりに使用すること、または、１つの酸性基
（例えば、アスパラギン酸またはグルタミン酸など）を別の酸性残基の代わりに使用する
ことが含まれる。
表現「保存的置換」にはまた、化学的に誘導体化された残基を非誘導体化残基の代わり
に使用することが、そのようなポリペプチドが必要不可欠な活性を呈示するという条件の
もとで含まれる。上記ペプチドのアナログには、下記の配列を有するペプチドが含まれる
：ＴＡＱＩＲＬＱＡＥＩＦＱＡＲ（配列番号４５）、ＴＱＡＩＲＬＱＡＥＩＦＱＡＲ（配
列番号４６）、ＴＱＱＡＲＬＱＡＥＩＦＱＡＲ（配列番号４７）およびＴＱＱＩＡＬＱＡ
ＥＩＦＱＡＲ（配列番号４８）。
「誘導体」は、１つまたは複数の残基が機能的側鎖の反応によって化学的に誘導体化さ
れているペプチドを示す。そのような誘導体化された分子には、例えば、フリーのアミノ
基が、アミン塩酸塩、ｐ−トルエンスルホニル基、カルボベンゾキシ基、ｔ−ブチルオキ
シカルボニル基、クロロアセチル基またはホルミル基を形成するために誘導体化されてい
るそのような分子が含まれる。フリーのカルボキシル基が、塩、メチルエステルおよびエ
チルエステルまたは他のタイプのエステルあるいはヒドラジドを形成するために誘導体化
される場合がある。フリーのヒドロキシル基が、Ｏ−アシル誘導体またはＯ−アルキル誘
導体を形成する誘導体化される場合がある。ヒスチジンのイミダゾール窒素が、Ｎ−ｉｍ
−ベンジルヒスチジンを形成する誘導体化される場合がある。また、２０個の標準的アミ
ノ酸の１つまたは複数の天然に存在するアミノ酸誘導体を含有するそのようなペプチドも
含まれる。例えば、４−ヒドロキシプロリンがプロリンの代わりに使用される場合がある
；５−ヒドロキシリシンがリシンの代わりに使用される場合がある；３−メチルヒスチジ
ンがヒスチジンの代わりに使用される場合がある；ホモセリンがセリンの代わりに使用さ
れる場合がある；また、オルニチンがリシンの代わりに使用される場合がある。本発明の
ポリペプチドにはまた、必要不可欠な活性が維持される限り、どのようなポリペプチドで
あれ、配列が本明細書中に示されるポリペプチドの配列に対して残基の１つまたは複数の
付加および／または欠失を有するポリペプチドが含まれる。
用語「フラグメント」は、どのような主題ペプチドであれ、アミノ酸残基配列が本明細
書中に示されるペプチドのアミノ酸残基配列よりも短いアミノ酸残基配列を有する主題ペ
プチドを示す。
用語「伸長物」は、どのような主題ペプチドであれ、本発明のペプチドのアミノ酸配列
よりも（カルボキシ末端またはアミノ末端のどちらにおいてでも）１つまたは２つのアミ
ノ酸によって長くなっているアミノ酸配列を有する主題ペプチドを示す。好ましくは、伸
長がアミノ末端において行われる。上記ペプチドのフラグメントおよび伸長物には、下記
の配列を有するペプチドが含まれる：ＱＴＱＱＩＲＬＱＡＥＩＦＱＡＲ（配列番号４９）
およびＱＱＩＲＬＱＡＥＩＦＱＡＲ（配列番号５０）。
様々なＡｐｏＥポリペプチドおよびそれらの調製方法が米国特許第６，６５２，８６０
号に記載される（これは参照によって本明細書中に組み込まれる）。
ＬＸＲアゴニスト
本発明の方法は、ＬＸＲアゴニストを転移の防止および処置のために投与することを含
むことができる。ＬＸＲアゴニストは、下記に示される式Ｉ、式ＩＩ、式ＩＩＩまたは式
ＩＶに従う化合物であることが可能である。
式Ｉが下記において提供される：
Figure 2022001571
 またはその医薬的に許容される塩、但し、式Ｉにおいて、
Ａｒはアリール基である；
Ｒ１は、−ＯＨ、−ＣＯ２Ｈ、−Ｏ−（Ｃ１〜Ｃ７）アルキル、−ＯＣ（Ｏ）−、−（
Ｃ１〜Ｃ７）アルキル、−Ｏ−（Ｃ１〜Ｃ７）ヘテロアルキル、−ＯＣ（Ｏ）−（Ｃ１〜
Ｃ７）ヘテロアルキル、−ＮＨ２、−ＮＨ（Ｃ１〜Ｃ７）アルキル、−Ｎ（（Ｃ１〜Ｃ７
）アルキル）２および−ＮＨ−Ｓ（Ｏ）２（Ｃ１〜Ｃ５）アルキルからなる群から選択さ
れるものである；
Ｒ２は、（Ｃ１〜Ｃ７）アルキル、（Ｃ１〜Ｃ７）ヘテロアルキル、アリールおよびア
リール（Ｃ１〜Ｃ７）アルキルからなる群から選択されるものである；
Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５およびＸ６はそれぞれが独立して、Ｈ、（Ｃ１〜Ｃ５）
アルキル、（Ｃ１〜Ｃ５）ヘテロアルキル、ＦおよびＣｌからなる群から選択されるもの
であり、但し、Ｘ１〜Ｘ６のうちの最大でも３つが、Ｈ、（Ｃ１〜Ｃ５）アルキル、（Ｃ
１〜Ｃ５）ヘテロアルキルである；かつ
Ｙは、−Ｎ（Ｒ１２）Ｓ（Ｏ）ｍ−、−Ｎ（Ｒ１２）Ｓ（Ｏ）ｍＮ（Ｒ１３）−、−Ｎ
（Ｒ１２）Ｃ（Ｏ）−、−Ｎ（Ｒ１２）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ１３）−、−Ｎ（Ｒ１２）Ｃ（Ｓ
）−および−Ｎ（Ｒ１２）Ｃ（Ｏ）Ｏ−からなる群から選択される二価の連結基であり、
但し、Ｒ１２およびＲ１３はそれぞれが独立して、Ｈ、（Ｃ１〜Ｃ７）アルキル、（Ｃ
１〜Ｃ７）ヘテロアルキル、アリールおよびアリール（Ｃ１〜Ｃ７）アルキルからなる群
から選択され、また、必要に応じて、Ｙが−Ｎ（Ｒ１２）Ｓ（Ｏ）ｍ−または−Ｎ（Ｒ１
２）Ｓ（Ｏ）ｍＮ（Ｒ１３）−であるときには、Ｒ１２は、ＡｒまたはＲ２に対する共有
結合による結合を介してＡｒまたはＲ２にそれぞれ融合する５員環または６員環を形成し
、この場合、下付き添え字ｍは１〜２の整数である；
但し、Ｒ１がＯＨであり、かつ、−Ｙ−Ｒ２が−Ｎ（Ｒ１２）Ｓ（Ｏ）ｍ−Ｒ２または
−Ｎ（Ｒ１２）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ１３）−Ｒ２であり、Ａｒに結合する第四級炭素に対して
パラ位に結合するとき、および、Ｒ２が、フェニル、ベンジルまたはベンゾイルであると
きには、ｉ）Ｒ１２またはＲ１３の少なくとも１つが水素以外であり、かつ、電子吸引性
置換基を含有し、あるいは、ｉｉ）Ｒ２が、アミノ、アセトアミド、ジ（Ｃ１〜Ｃ７）ア
ルキルアミノ、（Ｃ１〜Ｃ７）アルキルアミノ、ハロゲン、ヒドロキシ、ニトロまたは（
Ｃ１〜Ｃ７）アルキルとは異なる成分により置換され、あるいは、ｉｉｉ）Ｒ２のベンゼ
ン環部分が、Ｙ基に加えて、または、Ｙに対する結合点に加えて少なくとも３つの独立し
て選択された基により置換される。
いくつかの実施形態において、Ｙは−Ｎ（Ｒ１２）Ｓ（Ｏ）２−であり、かつ、Ｒ１は
ＯＨである。
したがって、式Ｉの化合物には、下記に示される構造を有する化合物が含まれるが、こ
れに限定されない：
Figure 2022001571
 式Ｉの化合物は、米国特許第６，３１６，５０３号（これは参照によって本明細書中に
組み込まれる）によって記載されるように合成することができる。
式ＩＩが下記において提供される：
Figure 2022001571
 （式中、
Ｒ１はＨである；
Ｘ１は、結合、Ｃ１〜Ｃ５アルキル、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（＝ＣＲ８Ｒ９）−、−Ｏ−
、−Ｓ（Ｏ）ｔ−、−ＮＲ８−、−ＣＲ８Ｒ９−、−ＣＨＲ２３、−ＣＲ８（ＣＲ９）−
、−Ｃ（ＣＲ８）２−、−ＣＲ８（ＯＣ（Ｏ）Ｒ９）−、−Ｃ＝ＮＯＲ９−、−Ｃ（Ｏ）
ＮＲ８−、−ＣＨ２Ｏ−、−ＣＨ２Ｓ−、−ＣＨ２ＮＲ８−、−ＯＣＨ２−、−ＳＣＨ２
−、−ＮＲ８ＣＨ２−または
Figure 2022001571
 である；
Ｒ２は、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ２〜Ｃ６アルケニル、Ｃ２〜Ｃ６アルキニル、Ｃ
３〜Ｃ６シクロアルキル、−ＣＨ２ＯＨ、Ｃ７〜Ｃ１１アリールアルキル、フェニル、ナ
フチル、Ｃ１〜Ｃ３ペルフルオロアルキル、ＣＮ、Ｃ（Ｏ）ＮＨ２、ＣＯ２Ｒ１２、また
は、Ｃ１〜Ｃ３アルキル、Ｃ２〜Ｃ４アルケニル、Ｃ２〜Ｃ４アルキニル、Ｃ１〜Ｃ３ア
ルコキシ、Ｃ１〜Ｃ３ペルフルオロアルキル、ハロゲン、−ＮＯ２、−ＮＲ８Ｒ９、−Ｃ
Ｎ、−ＯＨ、および、１個〜５個のフッ素により置換されるＣ１〜Ｃ３アルキルから独立
して選択される群の１つまたは複数によって独立して置換されるフェニルであり、あるい
は、Ｒ２は、ピリジン、チオフェン、ベンゾイソオキサゾール、ベンゾチオフェン、オキ
サジアゾール、ピロール、ピラゾール、イミダゾールおよびフランからなる群から選択さ
れる複素環であり、この場合、それらのそれぞれが場合により、Ｃ１〜Ｃ３アルキル、Ｃ
１〜Ｃ３アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ３ペルフルオロアルキル、ハロゲン、−ＮＯ２、−ＮＲ８
Ｒ９、−ＣＮ、および、１個〜５個のフッ素により置換されるＣ１〜Ｃ３アルキルから独
立して選択される１つ〜３つの基により置換される場合がある；
Ｘ２は結合または−ＣＨ２−である；
Ｒ３は、フェニル、ナフチル、あるいは、Ｃ１〜Ｃ３アルキル、ヒドロキシ、フェニル
、アシル、ハロゲン、−ＮＨ２、−ＣＮ、−ＮＯ２、Ｃ１〜Ｃ３アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ３
ペルフルオロアルキル、１個〜５個のフッ素により置換されるＣ１〜Ｃ３アルキル、ＮＲ
１４Ｒ１５、−Ｃ（Ｏ）Ｒ１０、
−Ｃ（Ｏ）ＮＲ１０Ｒ１１、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ１１Ａ、−Ｃ≡ＣＲ８、−ＣＨ＝ＣＨＲ８、
−ＷＡ、−Ｃ≡ＣＡ、−ＣＨ＝ＣＨＡ、−ＷＹＡ、−ＷＹＮＲ１１−Ａ、
−ＷＹＲ１０、−ＷＹ（ＣＨ２）ｊＡ、−ＷＣＨＲ１１（ＣＨ２）ｊＡ、−Ｗ（ＣＨ２）
ｊＡ、−Ｗ（ＣＨ２）ｊＲ１０、−ＣＨＲ１１Ｗ（ＣＨ２）ｊＲ１０、
−ＣＨＲ１１Ｗ（ＣＨ２）ｊＡ、−ＣＨＲ１１ＮＲ１２ＹＡ、−ＣＨＲ１１ＮＲ１２ＹＲ
１０、ピロール、−Ｗ（ＣＨ２）ｊＡ（ＣＨ２）ｋＤ（ＣＨ２）ｐＺ、
−Ｗ（ＣＲ１８Ｒ１９）Ａ（ＣＨ２）ｋＤ（ＣＨ２）ｐＺ、−（ＣＨ２）ｊＷＡ（ＣＨ２
）ｋＤ（ＣＨ２）ｐＺ、−ＣＨ＝ＣＨＡ（ＣＨ２）ｋＤ（ＣＨ２）ｐＺ、−Ｃ≡ＣＡ（Ｃ
Ｈ２）ｋＤ（ＣＨ２）ｐＺ、−Ｗ（ＣＨ２）ｊＣ≡ＣＡ（ＣＨ２）ｋＤ（ＣＨ２）ｐＺお
よび−Ｗ（ＣＨ２）ｊＺから独立して選択される１つ〜４つの基によって独立して置換さ
れるフェニルまたはナフチルであり、
あるいは、Ｒ３は、ピリミジン、チオフェン、フラン、ベンゾチオフェン、インドール、
ベンゾフラン、ベンゾイミダゾール、ベンゾチアゾール、ベンゾオキサゾールおよびキノ
リンから選択される複素環であり、この場合、それらのそれぞれが場合により、Ｃ１〜Ｃ
３アルキル、Ｃ１〜Ｃ３アルコキシ、ヒドロキシ、フェニル、アシル、ハロゲン、−ＮＨ
２、−ＣＮ、−ＮＯ２、Ｃ１〜Ｃ３ペルフルオロアルキル、１個〜５個のフッ素により置
換されるＣ１〜Ｃ３アルキル、−Ｃ（Ｏ）Ｒ１０、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ１０Ｒ１１、−Ｃ（Ｏ
）ＮＲ１１Ａ、−Ｃ≡ＣＲ８、−ＣＨ＝ＣＨＲ８、−ＷＡ、−Ｃ≡ＣＡ、−ＣＨ＝ＣＨＡ
、−ＷＹＡ、−ＷＹＲ１０、−ＷＹ（ＣＨ２）ｊＡ、
−Ｗ（ＣＨ２）ｊＡ、−Ｗ（ＣＨ２）ｊＲ１０、−ＣＨＲ１１Ｗ（ＣＨ２）ｊＲ１０、−
ＣＨＲ１１Ｗ（ＣＨ２）ｊＡ、−ＣＨＲ１１ＮＲ１２ＹＡ、−ＣＨＲ１１ＮＲ１２ＹＲ１
０、
−ＷＣＨＲ１１（ＣＨ２）ｊＡ、−Ｗ（ＣＨ２）ｊＡ（ＣＨ２）ｋＤ（ＣＨ２）ｐＺ、−
Ｗ（ＣＲ１８Ｒ１９）Ａ（ＣＨ２）ｋＤ（ＣＨ２）ｐＺ、−（ＣＨ２）ｊＷＡ（ＣＨ２）
ｋＤ（ＣＨ２）ｐＺ、−ＣＨ＝ＣＨＡ（ＣＨ２）ｋＤ（ＣＨ２）ｐＺ、−Ｃ≡ＣＡ（ＣＨ
２）ｋＤ（ＣＨ２）ｐＺ、−Ｗ（ＣＨ２）ｊＣ≡ＣＡ（ＣＨ２）ｋＤ（ＣＨ２）ｐＺおよ
び−Ｗ（ＣＨ２）ｊＺ
から独立して選択される１つ〜３つの基により置換される場合がある；
Ｗは、結合、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｓ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）２−、−ＮＲ１１−または−
Ｎ（ＣＯＲ１２）−である；
Ｙは、−ＣＯ−、−Ｓ（Ｏ）２−、−ＣＯＮＲ１３、−ＣＯＮＲ１３ＣＯ−、−ＣＯＮ
Ｒ１３ＳＯ２−、−Ｃ（ＮＣＮ）−、−ＣＳＮＲ１３、−Ｃ（ＮＨ）ＮＲ１３または−Ｃ
（Ｏ）Ｏ−である；
ｊは０〜３である；
ｋは０〜３である；
ｔは０〜２である；
Ｄは、結合、−ＣＨ＝ＣＨ−、−Ｃ≡Ｃ−、−Ｃ＝、−Ｃ（Ｏ）−、フェニル、−Ｏ−
、−ＮＨ−、−Ｓ−、−ＣＨＲ１４−、−ＣＲ１４Ｒ１５−、−ＯＣＨＲ１４、−ＯＣＲ
１４Ｒ１５−または−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ（ＯＨ）−である；
ｐは０〜３である；
Ｚは、−ＣＯ２Ｒ１１、−ＣＯＮＲ１０Ｒ１１、−Ｃ（ＮＲ１０）ＮＲ１１Ｒ１２、−
ＣＯＮＨ２ＮＨ２、−ＣＮ、−ＣＨ２ＯＨ、−ＮＲ１６Ｒ１７、フェニル、ＣＯＮＨＣＨ
（Ｒ２０）ＣＯＲ１２、フタルイミド、ピロリジン−２，５ジオン、チアゾリジン−２，
４−ジオン、テトラゾリル、ピロール、インドール、オキサゾール、２−チオキソ−１，
３−チアゾリニン−４−オン、Ｃ１〜Ｃ７アミン、Ｃ３〜Ｃ７環状アミン、または、１個
〜２個のＯＨ基により置換されるＣ１〜Ｃ３アルキルであり、但し、前記ピロールは場合
により、−ＣＯ２ＣＨ３、−ＣＯ２Ｈ、−ＣＯＣＨ３、−ＣＯＮＨ２および−ＣＮからな
る群から独立して選択される１つまたは２つの置換基により置換され、
前記Ｃ１〜Ｃ７アミンは場合により、−ＯＨ、ハロゲン、−ＯＣＨ３および−Ｃ≡ＣＨ
からなる群から独立して選択される１つまたは２つの置換基により置換され、
前記フェニルは場合により、ＣＯ２Ｒ１１により置換され、かつ、前記Ｃ３〜Ｃ７環状
アミンは場合により、−ＯＨ、−ＣＨ２ＯＨ、Ｃ１〜Ｃ３アルキル、−ＣＨ２ＯＣＨ３、
−ＣＯ２ＣＨ３および−ＣＯＮＨ２からなる群から独立して選択される１つまたは２つの
置換基により置換され、かつ、前記オキサゾールは場合により、ＣＨ２ＣＯ２Ｒ１１によ
り置換される；
Ａは、フェニル、ナフチル、テトラヒドロナフチル、インダンまたはビフェニルであり
、この場合、それらのそれぞれが場合により、ハロゲン、Ｃ１〜Ｃ３アルキル、Ｃ２〜Ｃ
４アルケニル、Ｃ２〜Ｃ４アルキニル、アシル、ヒドロキシ、ハロゲン、−ＣＮ、−ＮＯ
２、−ＣＯ２Ｒ１１、−ＣＨ２ＣＯ２Ｒ１１、フェニル、Ｃ１〜Ｃ３ペルフルオロアルコ
キシ、Ｃ１〜Ｃ３ペルフルオロアルキル、−ＮＲ１０Ｒ１１、−ＣＨ２ＮＲ１０Ｒ１１、
−ＳＲ１１、１個〜５個のフッ素により置換されるＣ１〜Ｃ６アルキル、１個〜２個のＯ
Ｈ基により置換されるＣ１〜Ｃ３アルキル、１個〜５個のフッ素により場合により置換さ
れるＣ１〜Ｃ６アルコキシ、または、１個〜２個のＣＦ３基により場合により置換される
フェノキシから独立して選択される１つ〜４つの基により置換される場合がある；あるい
は
Ａは、ピロール、ピリジン、ピリジン−Ｎ−オキシド、ピリミジン、ピラゾール、チオ
フェン、フラン、キノリン、オキサゾール、チアゾール、イミダゾール、イソオキサゾー
ル、インドール、ベンゾ［１，３］−ジオキソール、ベンゾ［１，２，５］−オキソジア
ゾール、イソクロメン−１−オン、ベンゾチオフェン、ベンゾフラン、２，３−ジ−５ヒ
ドロベンゾ［１，４］−ジオキシン、ビテイニル、キナゾリン−２，４−９［３Ｈ］ジオ
ンおよび３−Ｈ−イソベンゾフラン−１−オンから選択される複素環であり、この場合、
それらのそれぞれが場合により、ハロゲン、Ｃ１〜Ｃ３アルキル、アシル、ヒドロキシ、
−ＣＮ、−ＮＯ２、Ｃ１〜Ｃ３ペルフルオロアルキル、−ＮＲ１０Ｒ１１、−ＣＨ２ＮＲ
１０Ｒ１１、−ＳＲ１１、１個〜５個のフッ素により置換されるＣ１〜Ｃ３アルキル、お
よび、１個〜５個のフッ素により場合により置換されるＣ１〜Ｃ３アルコキシから独立し
て選択される１つ〜３つの基により置換される場合がある；
Ｒ４、Ｒ５およびＲ６はそれぞれが独立して、−Ｈまたは−Ｆである；
Ｒ７は、Ｃ１〜Ｃ４アルキル、Ｃ１〜Ｃ４ペルフルオロアルキル、ハロゲン、−ＮＯ２
、−ＣＮ、フェニル、あるいは、ハロゲン、Ｃ１〜Ｃ２アルキルおよびＯＨから独立して
選択される１つまたは２つの基により置換されるフェニルである；
但し、Ｘ１Ｒ２が水素を形成するならば、Ｒ３は、
（ａ）−Ｗ（ＣＨ２）ｊＡ（ＣＨ２）ｋＤ（ＣＨ２）ｐＺ、−Ｗ（ＣＲ１８Ｒ１９）Ａ（
ＣＨ２）ｋＤ（ＣＨ２）ｐＺ、−（ＣＨ２）ｊＷＡ（ＣＨ２）ｋＤ（ＣＨ２）ｐＺ、−Ｃ
Ｈ＝ＣＨＡ（ＣＨ２）ｋＤ（ＣＨ２）ｐＺ、−Ｃ≡ＣＡ（ＣＨ２）ｋＤ（ＣＨ２）ｐＺま
たは−Ｗ（ＣＨ２）ｊＣ≡ＣＡ（ＣＨ２）ｋＤ（ＣＨ２）ｐＺによって置換されるフェニ
ル（但し、フェニル成分はさらに場合により、Ｃ１〜Ｃ２アルキル、Ｃ１〜Ｃ２ペルフル
オロアルキル、ハロゲンおよびＣＮから独立して選択される１つまたは２つの基により置
換される）；および
（ｂ）ピリミジン、チオフェンおよびフランから選択される複素環（但し、これらのそれ
ぞれが、−Ｗ（ＣＨ２）ｊＡ（ＣＨ２）ｋＤ（ＣＨ２）ｐＺ、−Ｗ（ＣＲ１８Ｒ１９）Ａ
（ＣＨ２）ｋＤ（ＣＨ２）ｐＺ、−（ＣＨ２）ｊＷＡ（ＣＨ２）ｋＤ（ＣＨ２）ｐＺ、−
ＣＨ＝ＣＨＡ（ＣＨ２）ｋＤ（ＣＨ２）ｐＺ、−Ｃ≡ＣＡ（ＣＨ２）ｋＤ（ＣＨ２）ｐＺ
または−Ｗ（ＣＨ２）ｊＣ≡ＣＡ（ＣＨ２）ｋＤ（ＣＨ２）ｐＺのうちの１つによって置
換される）
から選択される；
それぞれのＲ８は独立して、−ＨまたはＣ１〜Ｃ３アルキルである；
それぞれのＲ９は独立して、−ＨまたはＣ１〜Ｃ３アルキルである；
それぞれのＲ１０は独立して、−Ｈ、−ＣＨ、Ｃ１〜Ｃ３アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ７アル
キル、Ｃ３〜Ｃ７アルケニル、Ｃ３〜Ｃ７アルキニル、Ｃ３〜Ｃ７シクロアルキル、−Ｃ
Ｈ２ＣＨ２ＯＣＨ３、２−メチル−テトラヒドロ−フラン、２−メチル−テトラヒドロ−
ピラン、４−メチル−ピペリジン、モルホリン、ピロリジン、あるいは、１個または２個
のＣ１〜Ｃ３アルコキシ基により場合により置換されるフェニルであり、但し、前記Ｃ１
〜Ｃ７アルキルは場合により、Ｃ１〜Ｃ３アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ３チオアルコキシおよび
ＣＮから独立して置換される１つ、２つまたは３つの基により置換される；
それぞれのＲ１１は独立して、−Ｈ、Ｃ１〜Ｃ３アルキルまたはＲ２２であり、あるい
は、Ｒ１０およびＲ１１は、同じ原子に結合するとき、前記原子と一緒になって、
Ｃ１〜Ｃ３アルキル、ＯＨおよびＣ１〜Ｃ３アルコキシから独立して選択される１つまた
は２つの基により場合により置換される５員〜７員の飽和環、あるいは、１個または２個
のヘテロ原子を含有し、Ｃ１〜Ｃ３アルキル、ＯＨおよびＣ１〜Ｃ３アルコキシから独立
して選択される１つまたは２つの基によって場合により置換される５員〜７員の環
を形成する：
それぞれのＲ１２は独立して、−ＨまたはＣ１〜Ｃ３アルキルである；
それぞれのＲ１３は独立して、−ＨまたはＣ１〜Ｃ３アルキルである；
それぞれのＲ１４およびＲ１５は独立して、Ｃ１〜Ｃ７アルキル、Ｃ３〜Ｃ８シクロア
ルキル、Ｃ２〜Ｃ７アルケニル、Ｃ２〜Ｃ７アルキニル、−ＣＨ、−Ｆ、Ｃ７〜Ｃ１４ア
リールアルキルであり、但し、前記アリールアルキルは場合により、ＮＯ２、Ｃ１〜Ｃ６
アルキル、Ｃ１〜Ｃ３ペルハロアルキル、ハロゲン、ＣＨ２ＣＯ２Ｒ１１、フェニルおよ
びＣ１〜Ｃ３アルコキシから独立して選択される１つ〜３つの基により置換され、あるい
は、Ｒ１２およびＲ１５は、それらが結合する原子と一緒になって、３員〜７員の飽和環
を形成することができる；
それぞれのＲ１６およびＲ１７は独立して、水素、Ｃ１〜Ｃ３アルキル、Ｃ１〜Ｃ３ア
ルケニル、Ｃ１〜Ｃ３アルキニル、フェニル、ベンジルまたはＣ３〜Ｃ８シクロアルキル
であり、但し、前記Ｃ１〜Ｃ３アルキルは場合により、１つのＯＨ基により置換され、か
つ、前記ベンジルは場合により、Ｃ１〜Ｃ３アルキルおよびＣ１〜Ｃ３アルコキシから選
択される１つ〜３つの基により置換され、あるいは、Ｒ１６およびＲ１７は、それらが結
合する原子と一緒になって、Ｃ１〜Ｃ３アルキル、−ＯＨ、ＣＨ２ＯＨ、−ＣＨ２ＯＣＨ
３、−ＣＯ２ＣＨ３および−ＣＯＮＨ２からなる群から独立して選択される１つまたは２
つの置換基により場合により置換される３員〜８員の複素環を形成することができる；
それぞれのＲ１８およびＲ１９は独立して、Ｃ１〜Ｃ３アルキルである；
それぞれのＲ２０は独立して、Ｈ、フェニル、または、天然に存在するアルファアミノ
酸の側鎖である；
それぞれのＲ２２は独立して、ＣＨ２ＣＯＯＨにより場合により置換されるアリールア
ルキルである；かつ
それぞれのＲ２３はフェニルである）
またはその医薬的に許容される塩。
式ＩＩの化合物は、米国特許第７，５７６，２１５号（これは参照によって本明細書中
に組み込まれる）に記載されるように合成することができる。式ＩＩの化合物は、化合物
２６〜化合物３２のいずれかまたはその医薬的に許容される塩であることが可能である。
Figure 2022001571
 式ＩＩＩが下記において提供される：
Figure 2022001571
 （式中、
Ｘは、水素、Ｃ１〜Ｃ８アルキル、ハロ、−ＯＲ１０、−ＮＲ１０Ｒ１１、ニトロ、シ
アノ、−ＣＯＯＲ１０または−ＣＯＲ１０から選択される；
Ｚは、ＣＨ、ＣＲ３またはＮであり、但し、ＺがＣＨまたはＣＲ３であるときには、ｋ
は０〜４であり、かつ、ｔは０または１であり、また、ＺがＮであるときには、ｋは０〜
３であり、かつ、ｔは０である；
Ｙは、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｎ（Ｒ１２）−および−Ｃ（Ｒ４）（Ｒ５）−から選択され
る；
Ｗ１は、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ０〜Ｃ６アルキル、Ｃ３〜Ｃ６シクロアルキル、アリ
ールおよびＨｅｔから選択され、但し、前記Ｃ１〜Ｃ８アルキル、Ｃ３〜Ｃ８シクロアル
キル、ＡｒおよびＨｅｔは場合により非置換であるか、あるいは、ハロ、シアノ、ニトロ
、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ３〜Ｃ６アルケニル、Ｃ３〜Ｃ６アルキニル、−Ｃ０〜Ｃ６ア
ルキル−ＣＯ２Ｒ１２、−Ｃ０〜Ｃ６アルキル−Ｃ（Ｏ）ＳＲ１２、−Ｃ０〜Ｃ６アルキ
ル−ＣＯＮＲ１３Ｒ１４、−Ｃ０〜Ｃ６アルキル−ＣＯＲ１５、−Ｃ０〜Ｃ６アルキル−
ＮＲ１３Ｒ１４、−Ｃ０〜Ｃ６アルキル−ＳＲ１２、−Ｃ０〜Ｃ６アルキル−ＯＲ１２、
−Ｃ０〜Ｃ６アルキル−ＳＯ３Ｈ、−Ｃ０〜Ｃ６アルキル−ＳＯ２ＮＲ１３Ｒ１４、−Ｃ
０〜Ｃ６アルキル−ＳＯ２Ｒ１２、−Ｃ０〜Ｃ６アルキル−ＳＯＲ１５、−Ｃ０〜Ｃ６ア
ルキルＯＣＯＲ１５、−Ｃ０〜Ｃ６アルキル−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ１３Ｒ１４、−Ｃ０〜Ｃ６
アルキル−ＯＣ（Ｏ）ＯＲ１５、−Ｃ０〜Ｃ６アルキル−ＮＲ１３Ｃ（Ｏ）ＯＲ１５、−
Ｃ０〜Ｃ６アルキル−ＮＲ１３Ｃ（Ｏ）ＮＲ１３Ｒ１４および−Ｃ０〜Ｃ６アルキル−Ｎ
Ｒ１３ＣＯＲ１５から独立して選択される１つまたは複数の基により置換され、この場合
、前記Ｃ１〜Ｃ６アルキルは場合により非置換であるか、あるいは、１つまたは複数のハ
ロ置換基によって置換される；
Ｗ２は、Ｈ、ハロ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ２〜Ｃ６アルケニル、Ｃ２〜Ｃ６アルキニ
ル、−Ｃ０〜Ｃ６アルキル−ＮＲ１３Ｒ１４、−Ｃ０〜Ｃ６アルキル−ＳＲ１２、−Ｃ０
〜Ｃ６アルキル−ＯＲ１２、−Ｃ０〜Ｃ６アルキルＣＯ２Ｒ１２、−Ｃ０〜Ｃ６アルキル
−Ｃ（Ｏ）ＳＲ１２、−Ｃ０〜Ｃ６アルキルＣＯＮＲ１３Ｒ１４、−Ｃ０〜Ｃ６アルキル
−ＣＯＲ１５、−Ｃ０〜Ｃ６アルキルＯＣＯＲ１５、−Ｃ０〜Ｃ６アルキル−ＯＣＯＮＲ
１３Ｒ１４、−Ｃ０〜Ｃ６アルキル−ＮＲ１３ＣＯＮＲ１３Ｒ１４、−Ｃ０〜Ｃ６アルキ
ル−ＮＲ１３ＣＯＲ１５、−Ｃ０〜Ｃ６アルキル−Ｈｅｔ、−Ｃ０〜Ｃ６アルキル−Ａｒ
および−Ｃ０〜Ｃ６アルキル−Ｃ３〜Ｃ７シクロアルキルから選択され、但し、前記Ｃ１
〜Ｃ６アルキルは場合により非置換であるか、あるいは、１つまたは複数のハロ置換基に
よって置換され、かつ、前記−Ｃ０〜Ｃ６アルキル−Ｈｅｔ、−Ｃ０〜Ｃ６アルキル−Ａ
ｒおよび−Ｃ０〜Ｃ６アルキル−Ｃ３〜Ｃ７シクロアルキルのＣ３〜Ｃ７シクロアルキル
部分、Ａｒ部分およびＨｅｔ部分は場合により非置換であるか、あるいは、ハロ、シアノ
、ニトロ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ３〜Ｃ６アルケニル、Ｃ３〜Ｃ６アルキニル、−Ｃ０
〜Ｃ６アルキル−ＣＯ２Ｒ１２、−Ｃ０〜Ｃ６アルキル−Ｃ（Ｏ）ＳＲ１２、−Ｃ０〜Ｃ
６アルキル−ＣＯＮＲ１３Ｒ１４、−Ｃ０〜Ｃ６アルキル−ＣＯＲ１５、−Ｃ０〜Ｃ６ア
ルキル−ＮＲ１３Ｒ１４、−Ｃ０〜Ｃ６アルキル−ＳＲ１２、−Ｃ０〜Ｃ６アルキル−Ｏ
Ｒ１２、−Ｃ０〜Ｃ６アルキル−ＳＯ３Ｈ、−Ｃ０〜Ｃ６アルキル−ＳＯ２ＮＲ１３Ｒ１
４、−Ｃ０〜Ｃ６アルキル−ＳＯ２Ｒ１２、−Ｃ０〜Ｃ６アルキル−ＳＯＲ１５、−Ｃ０
〜Ｃ６アルキル−ＯＣＯＲ１５、−Ｃ０〜Ｃ６アルキル−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ１３Ｒ１４、−
Ｃ０〜Ｃ６アルキル−ＯＣ（Ｏ）ＯＲ１５、−Ｃ０〜Ｃ６アルキル−ＮＲ１３Ｃ（Ｏ）Ｏ
Ｒ１５、−Ｃ０〜Ｃ６アルキル−ＮＲ１３Ｃ（Ｏ）ＮＲ１３Ｒ１４および−Ｃ０〜Ｃ６ア
ルキル−ＮＲ１３ＣＯＲ１５から独立して選択される１つまたは複数の基により置換され
、この場合、前記Ｃ１〜Ｃ６アルキルは場合により非置換であるか、あるいは、１つまた
は複数のハロ置換基によって置換される；
Ｗ３は、Ｈ、ハロ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、−Ｃ０〜Ｃ６アルキル−ＮＲ１３Ｒ１４、−
Ｃ０〜Ｃ６アルキルＳＲ１２、−Ｃ０〜Ｃ６アルキル−ＯＲ１２、−Ｃ０〜Ｃ６アルキル
−ＣＯ２Ｒ１２、−Ｃ０〜Ｃ６アルキル−Ｃ（Ｏ）ＳＲ１２、−Ｃ０〜Ｃ６アルキル−Ｃ
ＯＮＲ１３Ｒ１４、
−Ｃ０〜Ｃ６アルキル−ＣＯＲ１５、−Ｃ０〜Ｃ６アルキル−ＯＣＯＲ１５、−Ｃ０〜Ｃ
６アルキル−ＯＣＯＮＲ１３Ｒ１４、−Ｃ０〜Ｃ６アルキルＮＲ１３ＣＯＮＲ１３Ｒ１４
、
−Ｃ０〜Ｃ６アルキル−ＮＲ１３ＣＯＲ１５、−Ｃ０〜Ｃ６アルキル−Ｈｅｔ、−Ｃ１〜
Ｃ６アルキル−Ａｒおよび−Ｃ１〜Ｃ６アルキル−Ｃ３〜Ｃ７シクロアルキルからなる群
から選択され、
但し、前記Ｃ１〜Ｃ６アルキルは場合により非置換であるか、あるいは、１つまたは複数
のハロ置換基によって置換される；
Ｑは、Ｃ３〜Ｃ８シクロアルキル、ＡｒおよびＨｅｔから選択され、但し、前記Ｃ３〜
Ｃ８シクロアルキル、ＡｒおよびＨｅｔは場合により非置換であるか、あるいは、ハロ、
シアノ、ニトロ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ３〜Ｃ６アルケニル、Ｃ３〜Ｃ６アルキニル、
−Ｃ０〜Ｃ６アルキルＣＯ２Ｒ１２、−Ｃ０〜Ｃ６アルキル−Ｃ（Ｏ）ＳＲ１２、−Ｃ０
〜Ｃ６アルキルＣＯＮＲ１３Ｒ１４、−Ｃ０〜Ｃ６アルキル−ＣＯＲ１５、−Ｃ０〜Ｃ６
アルキルＮＲ１３Ｒ１４、−Ｃ０〜Ｃ６アルキル−ＳＲ１２、−Ｃ０〜Ｃ６アルキル−Ｏ
Ｒ１２、−Ｃ０〜Ｃ６アルキル−ＳＯ３Ｈ、−Ｃ０〜Ｃ６アルキル−ＳＯ２ＮＲ１３Ｒ１
４、−Ｃ０〜Ｃ６アルキル−ＳＯ２Ｒ１２、−Ｃ０〜Ｃ６アルキル−ＳＯＲ１５、−Ｃ０
〜Ｃ６アルキル−ＯＣＯＲ１５、−Ｃ０〜Ｃ６アルキル−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ１３Ｒ１４、−
Ｃ０〜Ｃ６アルキル−ＯＣ（Ｏ）ＯＲ１５、−Ｃ０〜Ｃ６アルキルＮＲ１３Ｃ（Ｏ）ＯＲ
１５、−Ｃ０〜Ｃ６アルキル−ＮＲ１３Ｃ（Ｏ）ＮＲ１３Ｒ１４および−Ｃ０〜Ｃ６アル
キル−ＮＲ１３ＣＯＲ１５から独立して選択される１つまたは複数の基により置換され、
この場合、前記Ｃ１Ｃ６アルキルは場合により非置換であるか、あるいは、１つまたは複
数のハロ置換基によって置換される；
ｐは０〜８である；
ｎは２〜８である；
ｍは０または１である；
ｑは０または１である；
ｔは０または１である；
それぞれのＲ１およびＲ２は独立して、Ｈ、ハロ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ３〜Ｃ６ア
ルケニル、Ｃ３〜Ｃ６アルキニル、−Ｃ０〜Ｃ６アルキル−ＮＲ１３Ｒ１４、−Ｃ０〜Ｃ
６アルキル−ＯＲ１２、−Ｃ０〜Ｃ６アルキル−ＳＲ１２、−Ｃ１〜Ｃ６アルキル−Ｈｅ
ｔ、−Ｃ１〜Ｃ６アルキル−Ａｒおよび−Ｃ１〜Ｃ６アルキル−Ｃ３〜Ｃ７シクロアルキ
ルから選択されるか、あるいは、Ｒ１およびＲ２は、それらが結合する炭素と一緒になっ
て、３員〜５員の炭素環式環または複素環式環を形成し、この場合、前記複素環式環は、
Ｎ、ＯおよびＳから選択される１つまたは複数のヘテロ原子を含有し、但し、前記Ｃ１〜
Ｃ６アルキルのいずれもが場合により非置換であるか、あるいは、１つまたは複数のハロ
置換基によって置換される；
それぞれのＲ３は同じまたは異なり、独立して、ハロ、シアノ、ニトロ、Ｃ１〜Ｃ６ア
ルキル、Ｃ３〜Ｃ６アルケニル、Ｃ３〜Ｃ６アルキニル、−Ｃ０〜Ｃ６アルキル−Ａｒ、
−Ｃ０〜Ｃ６アルキル−Ｈｅｔ、−Ｃ０〜Ｃ６アルキル−Ｃ３〜Ｃ７シクロアルキル、−
Ｃ０〜Ｃ６アルキル−ＣＯ２Ｒ１２、−Ｃ０〜Ｃ６アルキル−Ｃ（Ｏ）ＳＲ１２、−Ｃ０
〜Ｃ６アルキル−ＣＯＮＲ１３Ｒ１４、−Ｃ０〜Ｃ６アルキル−ＣＯＲ１５、−Ｃ０〜Ｃ
６アルキル−ＮＲ１３Ｒ１４、−Ｃ０〜Ｃ６アルキル−ＳＲ１２、−Ｃ０〜Ｃ６アルキル
−ＯＲ１２、−Ｃ０〜Ｃ６アルキル−ＳＯ３Ｈ、−Ｃ０〜Ｃ６アルキルＳＯ２ＮＲ１３Ｒ
１４、−Ｃ０〜Ｃ６アルキル−ＳＯ２Ｒ１２、−Ｃ０〜Ｃ６アルキルＳＯＲ１５、−Ｃ０
〜Ｃ６アルキル−ＯＣＯＲ１５、−Ｃ０〜Ｃ６アルキル−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ１３Ｒ１４、−
Ｃ０〜Ｃ６アルキル−ＯＣ（Ｏ）ＯＲ１５、−Ｃ０〜Ｃ６アルキル−ＮＲ１３Ｃ（Ｏ）Ｏ
Ｒ１５、−Ｃ０〜Ｃ６アルキル−ＮＲ１３Ｃ（Ｏ）ＮＲ１３Ｒ１４および−Ｃ０〜Ｃ６ア
ルキル−ＮＲ１３ＣＯＲ１５から選択され、但し、前記Ｃ１〜Ｃ６アルキルは場合により
非置換であるか、あるいは、１つまたは複数のハロ置換基によって置換される；
それぞれのＲ４およびＲ５は独立して、Ｈ、ハロ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、−Ｃ０〜Ｃ６
アルキル−Ｈｅｔ、−Ｃ０〜Ｃ６アルキル−Ａｒおよび−Ｃ０〜Ｃ６アルキル−Ｃ３〜Ｃ
７シクロアルキルから選択される；
Ｒ６およびＲ７はそれぞれが独立して、Ｈ、ハロ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、−Ｃ０〜Ｃ６
アルキル−Ｈｅｔ、−Ｃ０〜Ｃ６アルキル−Ａｒおよび−Ｃ０〜Ｃ６アルキル−Ｃ３〜Ｃ
７シクロアルキルから選択される；
Ｒ８およびＲ９はそれぞれが独立して、Ｈ、ハロ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、−Ｃ０〜Ｃ６
アルキル−Ｈｅｔ、−Ｃ０〜Ｃ６アルキル−Ａｒおよび−Ｃ０〜Ｃ６アルキル−Ｃ３〜Ｃ
７シクロアルキルから選択される；
Ｒ１０およびＲ１１はそれぞれが独立して、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ１２アルキル、Ｃ３〜Ｃ１２
アルケニル、Ｃ３〜Ｃ１２アルキニル、
−Ｃ０〜Ｃ８アルキル−Ａｒ、−Ｃ０〜Ｃ８アルキル−Ｈｅｔ、−Ｃ０〜Ｃ８アルキル−
Ｃ３〜Ｃ７シクロアルキル、−Ｃ０〜Ｃ８アルキル−Ｏ−Ａｒ、−Ｃ０〜Ｃ８アルキル−
Ｏ−Ｈｅｔ、
−Ｃ０〜Ｃ８アルキル−Ｏ−Ｃ３〜Ｃ７シクロアルキル、−Ｃ０〜Ｃ８アルキル−Ｓ（Ｏ
）ｘ−Ｃ０〜Ｃ６アルキル、−Ｃ０〜Ｃ８アルキル−Ｓ（Ｏ）ｘ−Ａｒ、−Ｃ０〜Ｃ８ア
ルキル−Ｓ（Ｏ）ｘ−Ｈｅｔ、−Ｃ０〜Ｃ８アルキル−Ｓ（Ｏ）ｘ−Ｃ３〜Ｃ７シクロア
ルキル、−Ｃ０〜Ｃ８アルキル−ＮＨ−Ａｒ、−Ｃ０〜Ｃ８アルキル−ＮＨ−Ｈｅｔ、−
Ｃ０〜Ｃ８アルキル−ＮＨ−Ｃ３〜Ｃ７シクロアルキル、−Ｃ０〜Ｃ８アルキル−Ｎ（Ｃ
１〜Ｃ４アルキル）−Ａｒ、−Ｃ０〜Ｃ８アルキル−Ｎ（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）−Ｈｅｔ
、−Ｃ０〜Ｃ８アルキル−Ｎ（Ｃ１〜Ｃ４アルキル−Ｃ３〜Ｃ７シクロアルキル、−Ｃ０
〜Ｃ８アルキル−Ａｒ、−Ｃ０〜Ｃ８アルキル−Ｈｅｔおよび−Ｃ０〜Ｃ８アルキル−Ｃ
３〜Ｃ７シクロアルキルから選択され、この場合、ｘは、０、１または２であり、
あるいは、Ｒ１０およびＲ１１は、それらが結合する窒素と一緒になって、Ｎ、Ｏおよび
Ｓから選択される１つまたは複数のさらなるヘテロ原子を場合により含有する４員〜７員
の複素環式環を形成し、但し、前記Ｃ１〜Ｃ１２アルキル、Ｃ３〜Ｃ１２アルケニルまた
はＣ３〜Ｃ１２アルキニルは場合により、ハロ、−ＯＨ、−ＳＨ、−ＮＨ２、−ＮＨ（非
置換Ｃ１〜Ｃ６アルキル）、−Ｎ（非置換Ｃ１〜Ｃ６アルキル）（非置換Ｃ１〜Ｃ６アル
キル）、非置換の−ＯＣ１〜Ｃ６アルキル、−ＣＯ２Ｈ、−ＣＯ２（非置換Ｃ１〜Ｃ６ア
ルキル）、−ＣＯＮＨ２、−ＣＯＮＨ（非置換Ｃ１〜Ｃ６アルキル）、−ＣＯＮ（非置換
Ｃ１〜Ｃ６アルキル）（非置換Ｃ１〜Ｃ６アルキル）、−ＳＯ３Ｈ、−ＳＯ２ＮＨ２、−
ＳＯ２ＮＨ（非置換Ｃ１〜Ｃ６アルキル）および−ＳＯ２Ｎ（非置換Ｃ１〜Ｃ６アルキル
）（非置換Ｃ１〜Ｃ６アルキル）の群から独立して選択される置換基の１つまたは複数に
よって置換される；
Ｒ１２は、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ３〜Ｃ６アルケニル、Ｃ３〜Ｃ６アルキニル、
−Ｃ０〜Ｃ６アルキル−Ａｒ、−Ｃ０〜Ｃ６アルキル−Ｈｅｔおよび−Ｃ０〜Ｃ６アルキ
ル−Ｃ３〜Ｃ７シクロアルキルから選択される；
それぞれのＲ１３およびそれぞれのＲ１４は独立して、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ３
〜Ｃ６アルケニル、Ｃ３〜Ｃ６アルキニル、−Ｃ０〜Ｃ６アルキル−Ａｒ、−Ｃ０〜Ｃ６
アルキル−Ｈｅｔおよび−Ｃ０〜Ｃ６アルキル−Ｃ３〜Ｃ７シクロアルキルから選択され
、あるいは、Ｒ１３およびＲ１４は、それらが結合する窒素と一緒になって、Ｎ、Ｏおよ
びＳから選択される１つまたは複数のさらなるヘテロ原子を場合により含有する４員〜７
員の複素環式環を形成する；
Ｒ１５は、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ３〜Ｃ６アルケニル、Ｃ３〜Ｃ６アルキニル、−Ｃ
０〜Ｃ６アルキル−Ａｒ、−Ｃ０〜Ｃ６アルキル−Ｈｅｔおよび−Ｃ０〜Ｃ６アルキル−
Ｃ３〜Ｃ７シクロアルキルから選択される）
またはその医薬的に許容される塩。
いくつかの実施形態において、Ｘは水素であり、ｐは０であり、ｔは０であり、ＺはＣ
Ｈであり、かつ、Ｙは−Ｏ−である。
さらなる実施形態において、Ｘは水素であり、ｐは０であり、ｔは０であり、ＺはＣＨ
であり、かつ、Ｙは−Ｏ−であり、Ｗ１およびＷ２はフェニルであり、Ｗ３は水素であり
、ｑは１であり、かつ、Ｒ８およびＲ９は水素である。
他の実施形態において、Ｘは水素であり、ｐは０であり、ｔは０であり、ＺはＣＨであ
り、かつ、Ｙは−Ｏ−であり、Ｗ１およびＷ２はフェニルであり、Ｗ３は水素であり、ｑ
は１であり、かつ、Ｒ８およびＲ９は水素であり、かつ、ＱはＡｒである。
したがって、式ＩＩＩの化合物には、下記に示される構造を有する化合物、ＧＷ３９６
５［２］およびＳＢ７４２８８１［２５］が含まれるが、これらに限定されない：
Figure 2022001571
 式ＩＩＩの化合物は、米国特許第７，３６５，０８５号および同第７，５６０，５８６
号（これらは参照によって本明細書中に組み込まれる）に記載されるように合成すること
ができる。
式ＩＶが下記に示される：
Figure 2022001571
 またはその医薬的に許容される塩、但し、式ＩＶにおいて、
Ｊ１１は−Ｎ＝であり、かつ、Ｊ２１は−ＣＲ３００−であり、または、Ｊ１１は−Ｃ
Ｒ２００−であり、かつ、Ｊ２１は＝Ｎ−である；
Ｒ００は、Ｇ１、Ｇ２１またはＲＮである；
Ｒ２００は、Ｇ１、Ｇ２１またはＲＣである；
Ｒ３００およびＲ４００は独立して、ＲＣまたはＱであり、但し、Ｒ３００、Ｒ４００
およびＲ５００のうちのただ１つだけがＱである；
Ｑは、Ｃ３〜６シクロアルキル、ヘテロアリールまたはヘテロシクリルであり、それぞ
れが場合により、１つ〜４つのＲＱにより置換されるか、あるいは、Ｑは−Ｘ−Ｙ−Ｚで
あり、但し、それぞれのＲＱが独立して、アリールオキシ、アラルキルオキシ、アリール
オキシアルキル、アリールＣ０〜Ｃ６アルキルカルボキシ、Ｃ（Ｒ１１０）＝Ｃ（Ｒ１１
０）−ＣＯＯＨ、オキソ、＝Ｓ、−Ｚ、−Ｙ’−Ｚまたは−Ｘ−Ｙ−Ｚであり、それぞれ
のＲＱは場合により、１つ〜４つのＲ８０により置換される；
Ｒ５００は、Ｇ１、Ｇ２１、ＱまたはＲＣであり、但し、この場合、Ｒ００、Ｒ２００
およびＲ５００のうちのただ１つがＧ１であり、かつ、Ｒ００、Ｎ＝およびＲ５００のう
ちのただ１つがＧ２１である；
Ｇ２１は−Ｊ０−Ｋ０であり、式中、Ｊ０およびＫ０は独立して、アリールまたはヘテ
ロアリールであり、それぞれが場合により、１つ〜４つのＲＫ基により置換され、それぞ
れのＲＫが独立して、水素、ハロゲン、ＣＲ１１０＝ＣＲ１１０ＣＯＯＲ１１０、ニトロ
、−Ｚ、−Ｙ−Ｚまたは−Ｘ−Ｙ−Ｚである；
Ｇ１は−Ｌ１０−Ｒであり、但し、Ｌ１０は、結合、Ｌ５０、Ｌ６０、−Ｌ５０−Ｌ６
０−Ｌ５０−または−Ｌ６０−Ｌ５０−Ｌ５０−であり、これらの式において、
それぞれのＬ５０が独立して、−［Ｃ（Ｒ１５０）２］ｍ−であり、
それぞれのＬ６０が独立して、−ＣＳ−、−ＣＯ−、−ＳＯ２−、−Ｏ−、−ＣＯＮ（
Ｒ１１０）−、−ＣＯＮＲ１１０Ｎ（Ｒ１１０）−、−Ｃ（＝ＮＲ１１０）−、−Ｃ（Ｎ
ＯＲ１１）−、−Ｃ（＝Ｎ−Ｎ（Ｒ１１０）２）−、−Ｃ３〜Ｃ８シクロアルキル−また
は−ヘテロシクリル−であり、前記シクロアルキルまたはヘテロシクリルは場合により、
１つ〜４つのＲ１４０基により置換され、あるいは、それぞれのＬ６０が独立して、Ｃ２
〜Ｃ６アリジイルであり、前記アリジイル鎖は場合により、−Ｃ（Ｒ１００）２−、−Ｃ
（Ｒ１１０）２Ｃ（Ｒ１１０）ｚ−、−Ｃ（Ｒ１１）Ｃ（Ｒ１１０）−、−Ｃ（Ｒ１１０
）２Ｏ−、−Ｃ（Ｒ１１０）ｚＮＲ１１０−、−Ｃ Ｃ−、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｎ（ＲＯ
）ＣＯ−、−Ｎ（Ｒ１００）ＣＯ２−、−ＣＯＮ（Ｒ１１０）−、−ＣＯ−、−ＣＯ２−
、−ＯＣ（＝Ｏ）−、−ＯＣ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ１００）−、−ＳＯ２−、−Ｎ（Ｒ１００）
ＳＯ２−または−ＳＯ２Ｎ（Ｒ１００）によって中断され、
Ｒが、アリール、ヘテロシクリル、ヘテロアリールまたは−（Ｃ３〜Ｃ６）シクロアル
キルであり、但し、Ｒは場合により、１つ〜４つのＲＡにより置換され、この場合、それ
ぞれのＲＡが独立して、ハロゲン、ニトロ、ヘテロシクリル、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ２
〜Ｃ６アルケニル、Ｃ２〜Ｃ６アルキニル、Ｃ３〜Ｃ８シクロアルキル、（Ｃ３〜Ｃ８シ
クロアルキル）−Ｃ１〜Ｃ６アルキル−、（Ｃ３〜Ｃ８シクロアルケニル）−Ｃ１〜Ｃ６
アルキル−、（Ｃ３〜Ｃ８シクロアルキル）−Ｃ１〜Ｃ６アルケニル−、アリールアルキ
ル、アリールオキシ、アリールＣ１〜６アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ６ハロアルキル、ＳＯ２Ｒ
１１０、ＯＲ１１０、ＳＲ１１０、Ｎ３、ＳＯＲ１１０、ＣＯＲ１１０、ＳＯ２Ｎ（Ｒ１
１０）２、ＳＯ２ＮＲ１１０ＣＯＲ１１０、Ｃ≡Ｎ、Ｃ（Ｏ）ＯＲ１１０、ＣＯＮ（Ｒ１
１０）２、−ＣＯＮ（Ｒ１１０）ＯＲ１１０、ＯＣＯＮ（Ｒ１１０）２、−ＮＲ１１０Ｃ
ＯＲ１１０、ＮＲ１１０ＣＯＮ（Ｒ１１０）２、ＮＲ１１０ＣＯＯＲ１１０、−Ｃ（＝Ｎ
−ＯＨ）Ｒ１１０、−Ｃ（＝Ｓ）Ｎ（Ｒ１１０）２、
−Ｓ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ１１０）２、−Ｓ（＝Ｏ）ＯＲ１１０、−Ｎ（Ｒ１１０）Ｓ（＝Ｏ）
２Ｒ１１０、−Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ１１０）Ｎ（Ｒ１１０）２、−ＯＣ（＝Ｏ）−Ｒ１１０
、−ＯＣ（＝Ｏ）−ＯＲ１１０またはＮ（Ｒ１１）２であり、
かつ、それぞれのＲＡが場合により、独立して−ハロゲン、−Ｃ１〜Ｃ６アルキル、アリ
ールオキシ、Ｃ０〜６アルキルＳＯ２Ｒ１１０、Ｃ０〜６アルキルＣＯＯＲ１１０、Ｃ１
〜６アルコキシアリール、Ｃ１〜Ｃ６ハロアルキル、
−ＳＯ２Ｒ１１０、−ＯＲ１１０、−ＳＲ１１０、−Ｎ３、−ＳＯ２Ｒ１１０、−ＣＯＲ
１１０、−ＳＯ２Ｎ（Ｒ１１０）２、−ＳＯ２ＮＲ１１０ＣＯＲ１１０、−Ｃ≡Ｎ、−Ｃ
（Ｏ）ＯＲ１１０、
−ＣＯＮ（Ｒ１１０）２、−ＣＯＮ（Ｒ１１０）ＯＲ１１０、−ＯＣＯＮ（Ｒ１１０）２
、−ＮＲ１１０ＣＯＲ１１０、−ＮＲ１１０ＣＯＮ（Ｒ１１０）２、−ＮＲ１１０ＣＯＯ
Ｒ１１０または−Ｎ（Ｒ１１０）２である１つ〜４つの基により置換される；
ＲＮは−Ｌ３１−Ｒ６０であり、但し、Ｌ３１は、結合、−Ｘ３（ＣＨｚ）ｎ−Ｘ３−
、−（ＣＨ２）ｍ−Ｘ３−（ＣＨ２）ｎ−または−（ＣＨ２）１＋ｗ，−Ｙ３−（ＣＨ２
）ｗ−であり、これらの式において、それぞれのｗが独立して、０〜５であり、かつ、そ
れぞれのＸ３が独立して、結合、−Ｃ（Ｒ１１０）２−、−Ｃ（Ｒ１１０）２Ｃ（Ｒ１１
０）２−、−Ｃ（Ｒ１１０）＝Ｃ（Ｒ１１０）−、−Ｃ≡Ｃ−、−ＣＯ−、−ＣＳ−、−
ＣＯＮＲ１００−、−Ｃ（＝Ｎ）（Ｒ１００）−、−Ｃ（＝Ｎ−ＯＲ１１０）−、−Ｃ［
＝Ｎ−Ｎ（Ｒ１１０）２］、−ＣＯ２−、−ＳＯ２−または−ＳＯ２Ｎ（Ｒ１１０）−で
あり、かつ
Ｙ３が、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＮＲ７０−、−Ｎ（Ｒ１００）ＣＯ−、−Ｎ（Ｒ１１０）
ＣＯ２−、−ＯＣＯ−、−ＯＣ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ１００）−、−ＮＲ１００ＣＯＮＲ１００
−、−Ｎ（Ｒ１１０）ＳＯ２−または−ＮＲ１００ＣＳＮＲ１００−であり、
あるいは、Ｌ３１はＣ２〜Ｃ６アリジイル鎖であり、但し、前記アリジイル鎖は場合に
より、−Ｃ（Ｒ１１０）２−、
−Ｃ（Ｒ１１０）２Ｃ（Ｒ１１０）２−、−Ｃ（Ｒ１１０）＝Ｃ（Ｒ１１０）−、−Ｃ（
Ｒ１１０）２Ｏ−、−Ｃ（Ｒ１１０）２ＮＲ１１０−、−Ｃ≡Ｃ−、−Ｏ−、−Ｓ−、−
Ｎ（Ｒ１００）ＣＯ−、
−Ｎ（Ｒ１００）ＣＯ２−、−ＣＯＮ（Ｒ１００）−、−ＣＯ−、−ＣＯ２−、−Ｏ（Ｃ
＝Ｏ）−、−Ｏ（Ｃ＝Ｏ）Ｎ（Ｒ１１０）−、−ＳＯ２−、−Ｎ（Ｒ１００）ＳＯ２−ま
たは−ＳＯ２Ｎ（Ｒ１００）−によって中断され、
Ｒ６０が、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６ハロアルキル、アリール、Ｃ３〜Ｃ８シク
ロアルキル、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、−ＣＮ、
−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ１１０、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ１１０、−Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ１１０）２、−Ｎ
（Ｒ１１０）２、−ＳＯ２Ｒ１１０、−Ｓ（＝Ｏ）２Ｎ（Ｒ１１０）２、−Ｃ（＝Ｏ）Ｎ
（Ｒ１１０）Ｎ（Ｒ１１０）２または−Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ１１）（ＯＲ１１０）であり、
但し、前記アリール、ヘテロアリール、シクロアルキルまたはヘテロシクリルは場合によ
り、１つ〜４つのＲ６０ａにより置換され、この場合、
それぞれのＲ６０ａが独立して、−Ｚ、−Ｙ’−Ｚまたは−Ｘ−Ｙ−Ｚである；
それぞれのＲＣは独立して、−Ｌ３０−Ｒ７０であり、但し、
それぞれのＬ３０が独立して、結合または−（ＣＨ２）ｍ−Ｖ１０−（ＣＨ２）ｎ−で
あり、式中、
Ｖ１０は、−Ｃ（Ｒ１１０）２−、−Ｃ（Ｒ１１０）２Ｃ（Ｒ１１０）２、−Ｃ（Ｒ１
１０）＝Ｃ（Ｒ１１０）−、−Ｃ（Ｒ１１０）２Ｏ−、−Ｃ（Ｒ１１０）２ＮＲ１１０−
、−Ｃ≡Ｃ−、−Ｏ−、
−Ｓ−、−ＮＲ１０−、−Ｎ（Ｒ１００）ＣＯ−、−Ｎ（Ｒ１００）ＣＯ２−、−ＯＣＯ
−、−ＣＯ−、−ＣＳ−、−ＣＯＮＲ１００−、−Ｃ（＝Ｎ−Ｒ１１０）−、−Ｃ（＝Ｎ
−ＯＲ１１０）−、
−Ｃ［＝Ｎ−Ｎ（Ｒ１１０）２］、−ＣＯ２−、−ＯＣ（＝Ｏ）−、−ＯＣ（＝Ｏ）Ｎ（
Ｒ１００）−、ＳＯ２−、−Ｎ（Ｒ１００）ＳＯ２−、−ＳＯ２Ｎ（Ｒ１００）−、−Ｎ
Ｒ１００ＣＯＮＲ１００−、−ＮＲ１００ＣＳＮＲ１００−、Ｃ３〜Ｃ６シクロアルキル
またはＣ３〜Ｃ６シクロハロアルキルであり、
あるいは、それぞれのＬ３０が独立して、Ｃ２〜Ｃ６アリジイルであり、但し、前記アリ
ジイル鎖は場合により、−Ｃ（Ｒ１１０）２−、−Ｃ（Ｒ１１０）２Ｃ（Ｒ１１０）２−
、−Ｃ（Ｒ１１０）Ｃ（Ｒ１１０）−、−Ｃ（Ｒ１１０）２Ｏ−、−Ｃ（Ｒ１１０）２Ｎ
Ｒ１１０−、−Ｃ≡Ｃ−、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｎ（Ｒ１００）ＣＯ−、
−Ｎ（Ｒ１００）ＣＯ２−、−ＮＲ１１０−、−ＣＯＮ（Ｒ１００）−、−ＣＯ−、−Ｃ
Ｏ２−、−Ｏ（Ｃ＝Ｏ）−、−Ｏ（Ｃ＝Ｏ）Ｎ（Ｒ１００）−、−ＳＯ２−、−Ｎ（Ｒ１
００）ＳＯ２−または−ＳＯ２Ｎ（Ｒ１００）−によって中断され、
それぞれのＲ７０が独立して、水素、ハロゲン、ニトロ、アリール、ヘテロアリール、
ヘテロシクリル、−Ｚ、−Ｙ−Ｚまたは−Ｘ−ＹＺであり、
この場合、前記アリール、ヘテロアリールおよびヘテロシクリルはそれぞれが場合によ
り、１つ〜４つのＲ７０ａにより置換され、但し、それぞれのＲ７０ａが独立し、アリー
ルオキシ、アラルキルオキシ、アリールオキシアルキル、アリールＣ０〜Ｃ６アルキルカ
ルボキシ、Ｃ（Ｒ１１０）＝Ｃ（Ｒ１１０）ＣＯＯＨ、オキソ、−Ｚ、−Ｙ’−Ｚまたは
−Ｘ−Ｙ−Ｚであり、かつ、それぞれのＲ７０ａが場合により、１つ〜４つのＲ８０によ
り置換され、但し、それぞれのＲ８０が独立して、ハロゲン、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１
〜Ｃ６アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ８ハロアルキル、Ｃ１〜Ｃ８ハロアルキル（ＯＲ１１０）、
Ｃ０〜Ｃ６アルキルＯＲ１１０、Ｃ０〜Ｃ６アルキルＣＯＮ（Ｒ１１０）２、Ｃ０〜Ｃ６
アルキルＣＯＲ１１０、Ｃ０〜Ｃ６アルキルＣＯＯＲ１１０またはＣ０〜Ｃ６アルキルＳ
Ｏ２Ｒ１１０である；
それぞれのＲ１００は独立して、−Ｒ１１０、−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ１１０、−ＣＯ２Ｒ１１
０または−ＳＯ２Ｒ１１０である；
それぞれのＲ１１０は独立して、−水素、−Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ２〜Ｃ６アルケニ
ル、−Ｃ１〜Ｃ６アルキニル、−Ｃ１〜Ｃ６ハロアルキルまたは−Ｎ（Ｒ１２）２であり
、但し、Ｒ１１０のいずれもが場合により、Ｒ１２０の１つ〜４つの基により置換される
：
それぞれのＲ１２０は独立して、ハロゲン、シアノ、ニトロ、オキソ、−Ｂ（ＯＲ１３
０）、Ｃ０〜Ｃ６アルキルＮ（Ｒ１３）２、Ｃ１〜Ｃ６ハロアルキル、Ｃ１〜Ｃ６アルキ
ル、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、（Ｃ０〜Ｃ６アルキル）Ｃ＝Ｏ（ＯＲ１３０）、Ｃ０〜Ｃ６
アルキルＯＲ１３０、Ｃ０〜Ｃ６アルキルＣＯＲ１３０、
Ｃ０〜Ｃ６アルキルＳＯ２Ｒ１３０、Ｃ０〜Ｃ６アルキルＣＯＮ（Ｒ１３）２、Ｃ０〜Ｃ
６アルキルＣＯＮＲ１３０ＯＲ１３０、Ｃ０〜Ｃ６アルキルＳＯ２Ｎ（Ｒ１３０）２、Ｃ
０〜Ｃ６アルキルＳＲ１３０、Ｃ０〜Ｃ６ハロアルキルＯＲ１３０、Ｃ０〜Ｃ６アルキル
ＣＮ、−Ｃ０〜Ｃ６アルキＮ（Ｒ１３）２、−ＮＲ１３ＳＯ２Ｒ１３または−ＯＣ０〜６
アルキルＣＯＯＲ１３０である；
それぞれのＲ１３０は独立して、水素、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ２〜Ｃ６アルケニルま
たはＣ２〜Ｃ６アルキニルである；
それぞれのＲ１４０は独立して、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、ハロゲ
ン、Ｃ１〜Ｃ６ハロアルキル、Ｃ０〜Ｃ６アルキルＣＯＮ（Ｒ１１０）ｏ、Ｃ０〜Ｃ６ア
ルキルＣＯＮＲ１１０Ｒ１０、Ｃ０〜Ｃ６アルキルＯＲ１１０またはＣ０〜Ｃ６アルキル
ＣＯＯＲ１１０である；かつ
それぞれのＲ１５０は独立して、水素、ハロゲン、ＯＲ１３０、（Ｃ１〜Ｃ６）アルキ
ルまたは（Ｃ１〜Ｃ６）ハロアルキルであり、但し、
それぞれのアルキルは場合により、それぞれが独立してハロゲン、シアノ、ニトロ、アジ
ド、ＯＲ１３０、Ｃ（Ｏ）Ｒ１３０、Ｃ（Ｏ）ＯＲ１３Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ１３０）２、Ｎ（
Ｒ１３０）２、Ｎ（Ｒ１３０）Ｃ（Ｏ）Ｒ１３０、Ｎ（Ｒ１３０）Ｓ（Ｏ）２Ｒ１３０、
−ＯＣ（Ｏ）ＯＲ１３０、ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ１３０）２、Ｎ（Ｒ１３０）Ｃ（Ｏ）ＯＲ１
３０、Ｎ（Ｒ１３０）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ１３０）、ＳＲ１３０、Ｓ（Ｏ）Ｒ１３０、Ｓ（Ｏ
）２Ｒ’またはＳ（Ｏ）２Ｎ（Ｒ１３０）２である少なくとも１つの基により置換され、
あるいは、（同じ原子または異なる原子に結合する）２つのＲ１５０は一緒になって、Ｃ
３〜Ｃ６シクロアルキルを形成することができる；
それぞれのＸは独立して、−Ｏ−、−Ｓ−または−Ｎ（Ｒ１００）−である；
それぞれのＹは独立して、−［Ｃ（Ｒ１５０）２］ｐ−または−Ｃ２〜Ｃ６アルケニル
であり、但し、ｐは、１、２、３、４、５または６である；
それぞれのＹ’は独立して、−［Ｃ（Ｒ１５０）２］ｐ−、−Ｃ２〜Ｃ６アルケニルＣ
３〜Ｃ８シクロアルキルまたはヘテロシクリルであり、但し、前記シクロアルキルまたは
ヘテロシクリルは場合により、１つ〜３つのＺ基により置換される：
それぞれのＺは独立して、−Ｈ、ハロゲン、−ＯＲ１１０、−ＳＲ１１０、−Ｃ（＝Ｏ
）Ｒ１１０、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ１１０、−Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ１１０）２、
−Ｎ（Ｒ１００）２、−Ｎ３、−ＮＯ２、−Ｃ（＝Ｎ−ＯＨ）Ｒ１１０、−Ｃ（＝Ｓ）Ｎ
（Ｒ１１０）２、−ＣＮ、−Ｓ（＝Ｏ）Ｒ１１０、−Ｓ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ１１０）２、−Ｓ
（＝Ｏ）ＯＲ１１０、
−Ｓ（＝Ｏ）２Ｒ１１０、Ｓ（＝Ｏ）２Ｎ（Ｒ１１０）２、−ＮＲ１１０ＣＯＲ１１０、
−Ｎ（Ｒ１１０）Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ１１０）２、−Ｎ（Ｒ１１０）ＣＯＯＲ１１０、−Ｎ
（Ｒ１１０）Ｓ（＝Ｏ）２Ｒ１１０、−Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ１１０）Ｎ（Ｒ１１０）２、−
Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ１１０）（ＯＲ１１０）、−ＯＣ（＝Ｏ）−Ｒ１１０、−ＯＣ（＝Ｏ）
−ＯＲ１１０または−ＯＣ（＝Ｏ）−Ｎ（Ｒ１１０）２である；かつ
それぞれのｍおよびｎは独立して、０、１、２、３、４、５または６である。
いくつかの実施形態において、式ＩＶの化合物は下記の式Ｖまたは式ＶＩの構造を有す
る：
Figure 2022001571
 他の実施形態において、式ＶＩの化合物は下記の式ＶＩＩの構造を有する：
Figure 2022001571
 さらに他の実施形態において、式ＶＩの化合物は下記の式ＶＩＩＩの構造を有する：
Figure 2022001571
 なおもさらなる実施形態において、式ＶＩの化合物は下記の式ＩＸの構造を有する：
Figure 2022001571
 したがって、本発明の方法において有用であり得る式ＩＶの化合物には、下記に示され
る構造を有する化合物およびそれらのその医薬的に許容される塩が含まれるが、これらに
限定されない：


Figure 2022001571
Figure 2022001571
Figure 2022001571
また、本発明の方法において有用であり得る式ＩＶの化合物は、下記の化合物を含むリス
トから選択される：
３３、２−（１−（３クロロ−３’−フルオロ−４’−（ヒドロキシメチル）−５’−（
メチルスルホニル）ビフェニル−４−イル）−２−（２−（２，６ジクロロフェニル）プ
ロパン−２−イル）−１Ｈ−イミダゾール−４−イル）プロパン−２−オール；３４、２
−（２−（２（２−クロロ−３−フルオロフェニル）プロパン−２−イル）−１−（３’
−フルオロ−４’−（ヒドロキシメチル）−５’（メチルスルホニル）ビフェニル−４−
イル）−１Ｈ−イミダゾール−４−イル）プロパン−２−オール；３５、２−（２−（２
（２，６−ジクロロフェニル）プロパン−２−イル）−１−（３’−フルオロ−４’−（
ヒドロキシメチル）−５’（メチルスルホニル）ビフェニル−４−イル）−１Ｈ−イミダ
ゾール−４−イル）プロパン−２−オール；３６、２−（２−（２（２，６−ジクロロフ
ェニル）プロパン−２−イル）−１−（３，３’−ジフルオロ−４’−（ヒドロキシメチ
ル）−５’（メチルスルホニル）ビフェニル−４−イル）−１Ｈ−イミダゾール−４−イ
ル）プロパン−２−オール；および、３７、２−（２−［１（２，６−ジクロロフェニル
）エチル］−１−［３，３’−ジフルオロ−４’−（ヒドロキシメチル）−５’（メチル
スルホニル）ビフェニル−４−イル］−１Ｈ−イミダゾール−４−イル）プロパン−２−
オール。化合物１２はまた、ＷＯ２０１０ ０１３８５９８のＥｘ．９として知られてい
る。化合物３８はまた、ＷＯ２００７ ００２５６３のＥｘ．１９として知られている。
化合物３９はまた、ＷＯ２０１２ ０１３５０８２として知られている。
式ＩＶの化合物は、ＰＣＴ公開番号ＵＳ２０１０／００６９３６７および国際公開ＷＯ
２０１０／１３８５９８（これらは参照によって本明細書中に組み込まれる）に記載され
るように合成することができる。
転移の処置および／または防止のために使用することができるＬＸＲアゴニストは化合
物２４またはその医薬的に許容される塩が可能である：
Figure 2022001571
 さらなる実施形態において、転移の処置および／または防止のために使用することがで
きる化合物が、下記からなるリストにおけるＰＣＴ公開公報において見出され得る：ＷＯ
２００６／０９４０３４、ＷＯ２００８／０４９０４７、ＷＯ２００９／０２０６８３、
ＷＯ２００９／０８６１３８、ＷＯ２００９／０８６１２３、ＷＯ２００９／０８６１３
０、ＷＯ２００９／０８６１２９、ＷＯ２００７／００２５５９、ＷＯ２００７／００２
５６３、ＷＯ２００７／０８１３３５、ＷＯ２００６／０１７０５５、ＷＯ２００６／１
０２０６７、ＷＯ２００９／０２４５５０、ＵＳ２００６／００７４１１５、ＵＳ２００
６／０１３５６０１、ＷＯ２００９／０２１８６８、ＷＯ２００９／０４０２８９、ＷＯ
２００７／０４７９９１、ＷＯ２００７／０５０４２５、ＷＯ２００６／０７３３６３、
ＷＯ２００６／０７３３６４、ＷＯ２００６／０７３３６５、ＷＯ２００６／０７３３６
６、ＷＯ２００６／０７３３６７、ＵＳ２００９／００３００８２、ＷＯ２００８／０６
５７５４、ＪＰ２００８／１７９５６２、ＷＯ２００７／０９２０６５、ＵＳ２０１０／
００６９３６７、ＵＳ７９９８９９５、ＵＳ７２４７７４８、ＷＯ２０１０／１３８５９
８、ＵＳ７３６５０８５、ＵＳ７５７７６２１５、ＵＳ６３１３６５０３、ＵＳ２００４
／００７２８６８、ＵＳ２００５／０１０７４４４、ＵＳ２００５／０１１３５８０、Ｕ
Ｓ２００５／０１３１０１４、ＵＳ２００５／０２８２９０８、ＵＳ２００９／０２８６
７８０（これらは参照によって本明細書中に組み込まれる）。
ＬＸＲαおよびＬＸＲβは、ほぼ同じ時期に多数のグループによって最初に発見された
ものであり（Ａｐｆｅｌ他、１９９４；Ｗｉｌｌｙ他、１９９５；Ｓｏｎｇ他、１９９４
；Ｓｈｉｎａｒ他、１９９４；Ｔｅｂｏｕｌ他、１９９５）、グルコース、コレステロー
ルおよび脂肪酸の代謝に関与する遺伝子の転写を媒介するためにコレステロールおよびそ
の酸化誘導体によって内因的に活性化される核ホルモン受容体のファミリーに属する（Ｊ
ａｎｏｗｓｋｉ他、１９９６；ＣａｌｋｉｎおよびＴｏｎｔｏｎｏｚ、２０１２）。脂質
代謝とガン細胞成長との間における入り組んだつながり（Ｃａｉｒｎｓ他、２０１１）を
考えれば、メラノーマにおけるＬＸＲβの遍在的発現は偶然の一致であるとは考えられず
、これにより、メラノーマ細胞は、その成長を持続するために脂質およびリポタンパク質
粒子を合成することができるからである。しかしながら、同時に、そのような安定した基
礎的な発現レベルは、ＬＸＲβ活性化療法に対するメラノーマ細胞の広範囲にわたる応答
性によって例示されるように、ＬＸＲβを理想的な治療標的にしている。
様々な化合物が、ＬＸＲβまたはＬＸＲαに対する選択性を有することが示されている
。この選択性が、増大した活性および／または低下した標的外影響を可能にしているかも
しれない。ＬＸＲβまたはＬＸＲαに対して選択性を有する化合物の例が表１に示される
。
Figure 2022001571
 本明細書中で使用される場合、ＬＸＲαおよびＬＸＲβにおけるＬＸＲアゴニストの活
性に対する参照は、Ｓｐｅｎｃｅｒ他、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃ
ｈｅｍｉｓｔｒｙ、２００１、４４、８８６〜８９７（これは参照によって本明細書中に
組み込まれる）に記載されるリガンドセンシングアッセイ（ＬｉＳＡ）を使用して測定さ
れるような活性を示す。いくつかの実施形態において、ＬＸＲアゴニストは、リガンドセ
ンシングアッセイにおいて１μＭ未満のＥＣ５０（例えば、０．５ｎｍ〜５００ｎＭ、１
０ｎＭ〜１００ｎＭ）を有する。例えば、本発明の方法は、ＬＸＲαに対する当該アゴニ
ストの活性よりも少なくとも３倍大きいＬＸＲβに対する活性を有するＬＸＲβアゴニス
ト、または、ＬＸＲαに対する当該アゴニストの活性よりも少なくとも１０倍大きいＬＸ
Ｒβに対する活性を有するＬＸＲβアゴニスト、または、ＬＸＲαに対する当該アゴニス
トの活性よりも少なくとも１００倍大きいＬＸＲβに対する活性を有するＬＸＲβアゴニ
スト、または、ＬＸＲαに対する当該アゴニストの活性の少なくとも３倍以内であるＬＸ
Ｒβに対する活性を有するＬＸＲβアゴニストを使用して行うことができる。ＬｉＳＡア
ッセイアッセイにおける「より大きい活性」という用語は、より低いＥＣ５０を示す。例
えば、ＧＷ３９６５［２］は、ＬＸＲα（ＥＣ５０＝１９０）と比較して、ＬＸＲβ（Ｅ
Ｃ５０＝３０）に対するおよそ６倍より大きい活性を有する。
本明細書中で使用される場合、用語「ＡｐｏＥ発現のレベルをインビトロにおいて増大
させる」は、ある特定のＬＸＲアゴニストがＡｐｏＥ発現のレベルを５μＭ未満の濃度（
例えば、１００ｎＭ〜２μＭの濃度、１μＭ以下の濃度）で実施例２１のｑＰＣＲアッセ
イにおいて２．５倍増大させることができることを示す。このインビトロ効果を示すＬＸ
Ｒアゴニストが本発明の方法における使用のために非常に有効であり得る。
用語「アルキル」は、本出願において使用される場合、飽和した分岐型または非分岐型
の脂肪族の一価置換基に関連する。アルキル置換基は１個〜１００個の炭素原子（例えば
、１個〜２２個の炭素原子、１個〜１０個の炭素原子、１個〜６個の炭素原子、１個〜３
個の炭素原子）を有する。したがって、アルキル置換基の例には、メチル、エチル、ｎ−
プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル
、ｎ−ペンチルおよびｎ−へキシルが含まれる。
用語「アルコキシ」は、式−ＯＲの化学置換基を表しており、但し、式中、Ｒは、別途
指定されない限り、場合により置換されたＣ１〜Ｃ６アルキル基である。いくつかの実施
形態において、アルキル基は置換されることが可能であり、例えば、アルコキシ基は、本
明細書中で定義されるような置換基を１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたは６つ有するこ
とができる。
用語「アルコキシアルキル」は、アルコキシ基により置換されるアルキル基として記載
されるヘテロアルキル基（これは本明細書中で定義される通りである）を表す。例示的な
非置換のアルコキシアルキル基は２個〜１２個の間の炭素を含む。いくつかの実施形態に
おいて、アルキルおよびアルコキシはそれぞれがさらに、それぞれの基について本明細書
中で定義されるような１つ、２つ、３つまたは４つの置換基により置換され得る。
本明細書中で使用される場合、用語「シクロアルキル」は、単環式、二環式または三環
式の置換基を示し、但し、これらは飽和していてもよく、あるいは、部分的に飽和してい
てもよく、すなわち、１つまたは複数の二重結合を有する。単環式置換基が、３個〜８個
の炭素原子を含有する飽和環状炭化水素基によって例示される。単環式シクロアルキル置
換基の例には、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロペンテニル、シ
クロヘキシル、シクロへキセニル、シクロヘプチルおよびシクロオクチルが含まれる。二
環式の縮合シクロアルキル置換基が、別のシクロアルキル環に縮合するシクロアルキル環
によって例示される。二環式シクロアルキル置換基の例には、デカリンおよび１，２，３
，７，８，８ａ−ヘキサヒドロ−ナフタレンなどが含まれるが、これらに限定されない。
三環式のシクロアルキル置換基が、さらなるシクロアルキル置換基に縮合するシクロアル
キル二環式縮合環によって例示される。
本出願において使用される用語「アルキレン」は、飽和した分岐型または非分岐型の脂
肪族の二価置換基に関連する（例えば、アルキレン置換基は、１個〜６個の炭素原子、１
個〜３個の炭素原子を有する）。したがって、アルキレン置換基の例には、メチレン、エ
チレン、トリメチレン、プロピレン、テトラメチレン、イソプロピリデン、ペンタメチレ
ンおよびヘキサメチレンが含まれる。
用語「アルケニレンまたはアルケニル」は、本出願において使用される場合、二重結合
を２つの隣接する炭素原子の間に有する不飽和の分岐型または非分岐型の脂肪族の二価置
換基である（例えば、アルケニレン置換基は、２個〜６個の炭素原子、２個〜４個の炭素
原子を有する）。したがって、アルケニレン置換基の例には、ビニレン、１−プロペニレ
ン、２−プロペニレン、メチルビニレン、１−ブテニレン、２−ブテニレン、３−ブテニ
レン、２−メチル−１−プロペニレン、２−メチル−２−プロペニレン、２−ペンテニレ
ン、２−ヘキセニレンが含まれるが、これらに限定されない。
用語「アルキニレンまたはアルキニル」は、本出願において使用される場合、三重結合
を２つの隣接する炭素原子の間に有する不飽和の分岐型または非分岐型の脂肪族の二価置
換基である（例えば、アルキニレン置換基は、２個〜６個の炭素原子、２個〜４個の炭素
原子を有する）。アルキニレン置換基の例には、エチニレン、１−プロピニレン、１−ブ
チニレン、２−ブチニレン、１−ペンチニレン、２−ペンチニレン、３−ペンチニレンお
よび２−ヘキシニレンが含まれるが、これらに限定されない。
用語「アルカジエニレン」は、本出願において使用される場合、２つの二重結合を２つ
の隣接する炭素原子の間に有する不飽和の分岐型または非分岐型の脂肪族の二価置換基で
ある（例えば、アルカジエニレン置換基は４個〜１０個の炭素原子を有する）。したがっ
て、アルカジエニレン置換基の例には、２，４−ペンタジエニレン、２，４−ヘキサジエ
ニレン、４−メチル−２，４−ペンタジエニレン、２，４−ヘプタジエニレン、２，６−
ヘプタジエニレン、３−メチル−２，４−ヘキサジエニレン、２，６−オクタジエニレン
、３−メチル−２，６−ヘプタジエニレン、２−メチル−２，４−ヘプタジエニレン、２
，８−ノナジエニレン、３−メチル−２，６−オクタジエニレン、２，６−デカジエニレ
ン、２，９−デカジエニレンおよび３，７−ジメチル−２，６−オクタジエニレンの各置
換基が含まれるが、これらに限定されない。
用語「ヘテロ脂肪族置換基またはヘテロアルキル」は、本明細書中で使用される場合、
１つまたは複数の炭素原子がヘテロ原子により、例えば、酸素原子、イオウ原子、窒素原
子、リン原子またはケイ素原子により置換されている一価または二価の置換基を示し、但
し、この場合、窒素原子およびイオウ原子は場合により酸化される場合があり、また、窒
素ヘテロ原子は場合により四級化される場合がある。ヘテロ原子のＯ、ＮおよびＳは、ヘ
テロ脂肪族置換基のどのような内部位置においてでも置かれる場合がある。例には、−Ｃ
Ｈ２−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ３、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＨ３、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｎ（
ＣＨ３）−ＣＨ３、−ＣＨ２−Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ３、−Ｓ（Ｏ）−ＣＨ３、−ＣＨ２−Ｃ
Ｈ２−Ｓ（Ｏ）２−ＣＨ３、−ＣＨ＝ＣＨ−Ｏ−ＣＨ３、−ＣＨ２−ＣＨ＝Ｎ−ＯＣＨ３
および−ＣＨ＝ＣＨ−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ３が含まれる。ヘテロ脂肪族置換基は線状また
は分岐型および飽和型または不飽和型である場合がある。
１つの実施形態において、ヘテロ脂肪族置換基は１個〜１００個（例えば、１個〜４２
個の炭素原子）を有する。さらに別の実施形態において、ヘテロ脂肪族置換基はポリエチ
レングリコール残基である。
本明細書中で使用される場合、「芳香族置換基またはアリール」は、少なくとも１つの
環が芳香族であり、かつ、非置換であってもよい、または置換されていてもよい、１０個
までの原子をそれぞれの環に有する安定な単環式炭素環、二環式炭素環または多環式炭素
環のどのようなものも意味することが意図される。そのような芳香族置換基の例には、フ
ェニル、ｐ−トルエニル（４−メチルフェニル）、ナフチル、テトラヒドロナフチル、イ
ンダニル、ビフェニル、フェナントリル、アントリルまたはアセナフチルが含まれる。芳
香族置換基が二環式であり、かつ、１つの環が非芳香族である場合には、結合が芳香族環
を介してであることが理解される。
用語「アルキルアリール置換基またはアリールアルキル」は、含有される水素への１つ
または複数の結合が、上記で記載されるようないずれかのアリール置換基への結合によっ
て置き換えられる上記で記載されるようなアルキル置換基を示す。アリールアルキル置換
基は、アルキル置換基からの結合を介して本発明の化合物におけるカルボニル基につなが
ることが理解される。アリールアルキル置換基の例には、ベンジル（フェニルメチル）、
ｐ−トリフルオロメチルベンジル（４−トリフルオロメチルフェニルメチル）、１−フェ
ニルエチル、２−フェニルエチル、３−フェニルプロピルおよび２−フェニルプロピルな
どが含まれるが、これらに限定されない。
用語「ヘテロ芳香族置換基またはヘテロアリール」は、本明細書中で使用される場合、
少なくとも１つの環が芳香族であり、かつ、Ｏ、ＮおよびＳからなる群から選択される１
個〜４個のヘテロ原子を含有する、１０個までの原子をそれぞれの環に有する安定な単環
式環、二環式環または多環式環を表す。二環式のヘテロ芳香族置換基には、
ａ）１個の窒素原子を有する６員の芳香族（不飽和）複素環式環に縮合する、
ｂ）２個の窒素原子を有する５員または６員の芳香族（不飽和）複素環式環に縮合する、
ｃ）１個の窒素原子を１個の酸素原子または１個のイオウ原子のどちらかと一緒に有する
５員の芳香族（不飽和）複素環式環に縮合する、あるいは
ｄ）Ｏ、ＮおよびＳから選択される１個のヘテロ原子を有する５員の芳香族（不飽和）複
素環式環に縮合する
フェニル環、ピリジン環、ピリミジン環またはピリジジン（ｐｙｒｉｄｉｄｉｎｅ）環が
含まれる。
この定義の範囲の範囲内であるヘテロアリール基には、下記の基が含まれるが、それら
に限定されない：ベンゾイミダゾリル、ベンゾフラニル、ベンゾフラザニル、ベンゾピラ
ゾリル、ベンゾトリアゾリル、ベンゾチオフェニル、ベンゾオキサゾリル、カルバゾリル
、カルボリニル、シンノリニル、フラニル、インドリニル、インドリル、インドラジニル
、インダゾリル、イソベンゾフラニル、イソインドリル、イソキノリル、イソチアゾリル
、イソオキサゾリル、ナフトピリジニル、オキサジアゾリル、オキサゾリル、オキサゾリ
ン、イソオキサゾリン、オキセタニル、ピラニル、ピラジニル、ピラゾリル、ピリダジニ
ル、ピリドピリジニル、ピリダジニル、ピリジル、ピリミジル、ピロリル、キナゾリニル
、キノリル、キノキサリニル、テトラゾリル、テトラゾロピリジル、チアジアゾリル、チ
アゾリル、チエニル、トリアゾリル、アゼチジニル、アジリジニル、１，４−ジオキサニ
ル、ヘキサヒドロアゼピニル、ジヒドロベンゾイミダゾリル、ジヒドロベンゾフラニル、
ジヒドロベンゾチオフェニル、ジヒドロベンゾオキサゾリル、ジヒドロフラニル、ジヒド
ロイミダゾリル、ジヒドロインドリル、ジヒドロイソオキサゾリル、ジヒドロイソチアゾ
リル、ジヒドロオキサジアゾリル、ジヒドロオキサゾリル、ジヒドロピラジニル、ジヒド
ロピラゾリル、ジヒドロピリジニル、ジヒドロピリミジニル、ジヒドロピロリル、ジヒド
ロキノリニル、ジヒドロテトラゾリル、ジヒドロチアジオゾリル、ジヒドロチアゾリル、
ジヒドロチエニル、ジヒドロトリアゾリル、ジヒドロアゼチジニル、メチレンジオキシベ
ンゾイル、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロチエニル、アクリジニル、カルバゾリル
、シンノリニル、キノキサリニル、ピラゾリル、インドリル、ベンゾトリアゾリル、ベン
ゾチアゾリル、ベンゾオキサゾリル、イソオキサゾリル、イソチアゾリル、フラニル、チ
エニル、ベンゾチエニル、ベンゾフラニル、キノリニル、イソキノリニル、オキサゾリル
、イソオキサゾリル、インドリル、ピラジニル、ピリダジニル、ピリジニル、ピリミジニ
ル、ピロリル、テトラヒドロキノリン。ヘテロアリール置換基が二環式であり、かつ、１
つの環が非芳香族であるか、または、ヘテロ原子を含有しない場合には、結合がそれぞれ
、芳香族環を介して、または、ヘテロ原子含有環を介してであることが理解される。ヘテ
ロアリールが窒素原子を含有するならば、対応するそのＮ−オキシドもまた本発明によっ
て包含されることが理解される。
脂肪族置換基、ヘテロ脂肪族置換基、芳香族置換基およびヘテロ芳香族置換基は場合に
より、下記の様々な基（これらに限定されない）を含む下記の置換基のいずれか１つまた
は複数により１回または複数回、同じようにまたは異なるように置換され得る：脂肪族置
換基、ヘテロ脂肪族置換基、芳香族置換基およびヘテロ芳香族置換基、アリール、ヘテロ
アリール；アルキルアリール；ヘテロアルキルアリール；アルキルヘテロアリール；ヘテ
ロアルキルヘテロアリール；アルコキシ；アリールオキシ；ヘテロアルコキシ；ヘテロア
リールオキシ；アルキルチオ；アリールチオ；ヘテロアルキルチオ；ヘテロアリールチオ
；Ｆ；Ｃｌ；Ｂｒ；Ｉ；−ＯＨ；−ＮＯ２；−ＣＮ；−ＣＦ３；−ＣＨ２ＣＦ３；−ＣＨ
Ｃｌ２；−ＣＨ２ＯＨ；−ＣＨ２ＣＨ２ＯＨ；−ＣＨ２ＮＨ２；−ＣＨ２ＳＯ２ＣＨ３；
−Ｃ（Ｏ）Ｒｘ；−ＣＯ２（Ｒｘ）；−ＣＯＮ（Ｒｘ）２；−ＯＣ（Ｏ）Ｒｘ；−ＯＣＯ
２Ｒｘ；−ＯＣＯＮ（Ｒｘ）２；−Ｎ（ＲＸ）２；−Ｓ（Ｏ）Ｒｘ；−Ｓ（Ｏ）２Ｒｘ；
−ＮＲｘ（ＣＯ）Ｒｘ、但し、これらの式において、Ｒｘのそれぞれの存在には独立して
、脂肪族、脂環式、ヘテロ脂肪族、複素環式、芳香族、ヘテロ芳香族、アリール、ヘテロ
アリール、アルキルアリール、アルキルヘテロアリール、ヘテロアルキルアリールまたは
ヘテロアルキルヘテロアリールが含まれるが、これらに限定されず、この場合、上記およ
び本明細書中に記載される脂肪族置換基、脂環式置換基、ヘテロ脂肪族置換基、複素環式
置換基、アルキルアリール置換基またはアルキルヘテロアリール置換基のいずれもが、置
換または非置換で、分岐型または非分岐型で、飽和型または不飽和型であってもよく、ま
た、上記および本明細書中に記載される芳香族置換基、ヘテロ芳香族置換基、アリール置
換基、ヘテロアリール置換基、（アルキル）アリール置換基または（アルキル）ヘテロア
リール置換基のいずれもが置換または非置換であってもよい。加えて、いずれか２つの隣
接する置換基は一緒になって、置換された、または非置換である４員、５員、６員または
７員の脂環式置換基または複素環式置換基を表すことがあることが理解されるであろう。
一般に適用可能な置換基のさらなる例が、下記に示される具体的な実施形態によって例示
される。
用語「ハロ」および用語「ハロゲン」は、Ｆ、Ｃｌ、ＢｒおよびＩからなる群から選択
されるハロゲン原子を示す。
用語「ハロゲン化アルキル置換基、ハロアルキル」は、少なくとも１つのハロゲン原子
により置換される上記で定義されるようなアルキル置換基を示す。１つの実施形態におい
て、ハロゲン化アルキル置換基はペルハロゲン化される。別の実施形態において、ペルフ
ルオロアルキルは、式ＣｎＦ２ｎ＋１の一価のペルフルオロ化された置換基であるハロゲ
ン化アルキル置換基を示す。例えば、ハロゲン化アルキル置換基は１個〜６個の炭素原子
（例えば、１個〜３個の炭素原子）を有する場合がある。したがって、アルキル基の例に
は、トリフルオロメチル、２，２，２−トリフルオロエチル、ｎ−ペルフルオロプロピル
、ｎ−ペルフルオロブチルおよびｎ−ペルフルオロペンチルが含まれる。
用語「アミノ」は、本明細書中で使用される場合、−Ｎ（ＲＮ１）２を表し、但し、式
中、それぞれのＲＮ１が独立して、Ｈ、ＯＨ、ＮＯ２、Ｎ（ＲＮ２）２、ＳＯ２ＯＲＮ２
、ＳＯ２ＲＮ２、ＳＯＲＮ２、Ｎ−保護基、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルコ
キシ、アリール、アルカリール、シクロアルキル、アルクシクロアルキル（ａｌｋｃｙｃ
ｌｏａｌｋｙｌ）、ヘテロシクリル（例えば、ヘテロアリール）、アルクヘテロシクリル
（ａｌｋｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｙｌ）（例えば、アルクヘテロアリール（ａｌｋｈｅｔｅ
ｒｏａｒｙｌ））であり、あるいは、２つのＲＮ１が一緒になって、ヘテロシクリルまた
はＮ−保護基を形成し、かつ、それぞれのＲＮ２が独立して、Ｈ、アルキルまたはアリー
ルである。好ましい実施形態において、アミノは−ＮＨ２または−ＮＨＲＮ１であり、但
し、式中、ＲＮ１は独立して、ＯＨ、ＮＯ２、ＮＨ２、ＮＲＮ２ ２、ＳＯ２ＯＲＮ２、Ｓ
Ｏ２ＲＮ２、ＳＯＲＮ２、アルキルまたはアリールであり、それぞれのＲＮ２は、Ｈ、ア
ルキルまたはアリールであり得る。用語「アミノアルキル」は、本明細書中で使用される
場合、アミノ基（これは本明細書中で定義される通りである）によって置換されるアルキ
ル基（これは本明細書中で定義される通りである）として記載されるヘテロアルキル基（
これは本明細書中で定義される通りである）を表す。アルキルおよびアミノはそれぞれが
さらに、それぞれの基について本明細書中に記載されるような１つ、２つ、３つまたは４
つの置換基により置換され得る。例えば、アルキル部分はオキソ（＝Ｏ）置換基を含む場
合がある。
本明細書中で使用される場合、用語「アリールオキシ」は、酸素原子を介して別の残基
につながれる芳香族系またはヘテロ芳香族系を示す。Ｏ−アリールの典型的な一例がフェ
ノキシである。同様に、「アリールアルキル」は、炭素鎖（飽和または不飽和）（そのヘ
テロ形態を含む）を介して、典型的には、飽和であるときにはＣ１〜Ｃ８の炭素鎖、Ｃ１
〜Ｃ６の炭素鎖、または、より具体的にはＣ１〜Ｃ４の炭素鎖もしくはＣ１〜Ｃ３の炭素
鎖（それらのヘテロ形態を含む）を介して、あるいは、不飽和であるときにはＣ２〜Ｃ８
の炭素鎖、Ｃ２〜Ｃ６の炭素鎖、Ｃ２〜Ｃ４の炭素鎖またはＣ２〜Ｃ３の炭素鎖（それら
のヘテロ形態を含む）を介して別の残基につながれる芳香族系またはヘテロ芳香族系を示
す。より確かには、したがって、アリールアルキルには、上記において同様に定義される
ようなアルキル成分、ヘテロアルキル成分、アルケニル成分、ヘテロアルケニル成分、ア
ルキニル成分またはヘテロアルキニル成分につながれる上記で定義されるようなアリール
基またはヘテロアリール基が含まれる。典型的なアリールアルキルには、アリール（Ｃ６
〜Ｃ１２）アルキル（Ｃ１〜Ｃ８）、アリール（Ｃ６〜Ｃ１２）アルケニル（Ｃ２〜Ｃ８
）またはアリール（Ｃ６〜Ｃ１２）アルキニル（Ｃ２〜Ｃ８）、加えて、それらのヘテロ
形態が挙げられるであろう。典型的な一例がフェニルメチルであり、これは一般にはベン
ジルと呼ばれる。
芳香族基またはヘテロ芳香族基における、必要に応じた典型的な置換基には、ハロ、Ｃ
Ｎ、ＮＯ２、ＣＦ３、ＯＣＦ３、ＣＯＯＲ’、ＣＯＮＲ’２、ＯＲ’、ＳＲ’、ＳＯＲ’
、ＳＯ２Ｒ’、ＮＲ’２、ＮＲ’（ＣＯ）Ｒ’、ＮＲ’Ｃ（Ｏ）ＯＲ’、ＮＲ’Ｃ（Ｏ）
ＮＲ’２、ＮＲ’ＳＯ２ＮＲ’２またはＮＲ’ＳＯ２Ｒ’が独立して含まれ、但し、これ
らにおいて、それぞれのＲ’は独立して、Ｈ、または、アルキル、アルケニル、アルキニ
ル、ヘテロアルキル、ヘテロアルケニル、ヘテロアルキニル、ヘテロアリールおよびアリ
ール（これらのすべてが上記で定義される通りである）から選択される場合により置換さ
れた基である；あるいは、置換基は、アルキル、アルケニル、アルキニル、ヘテロアルキ
ル、ヘテロアルケニル、ヘテロアルキニル、アリール、ヘテロアリール、Ｏ−アリール、
Ｏ−ヘテロアリールおよびアリールアルキルから選択される場合により置換された基であ
る。
非芳香族基（例えば、アルキル基、アルケニル基およびアルキニル基）における必要に
応じた置換基は典型的には、本明細書中において別途記されるような場合を除いて、芳香
族基またはヘテロ芳香族基について好適である置換基の同じリストから選択される。非芳
香族基にはまた、＝Ｏおよび＝ＮＯＲ’（式中、Ｒ’は、Ｈ、または、アルキル、アルケ
ニル、アルキニル、ヘテロアルキル、ヘテロアルケニル、ヘテロアルキニル、ヘテロアリ
ールおよびアリール（これらのすべてが上記で定義される通りである）から選択される場
合により置換された基である）から選択される置換基が含まれる場合がある。
一般に、置換基（例えば、アルキル、アルケニル、アルキニルまたはアリール（上記で
定義されるすべてのヘテロ形態を含む））は自身が場合により、さらなる置換基によって
置換される場合がある。これらの置換基の性質は、上記の基本的構造における置換基に関
して列挙される性質と類似している。したがって、ある置換基の１つの実施形態がアルキ
ルである場合、このアルキルは場合により、置換が化学的意味をなし、かつ、置換がアル
キル自体のサイズ限界を損なわない置換基として列記される残りの置換基によって置換さ
れる場合がある；例えば、アルキルによって、またはアルケニルによって置換されるアル
キルは、これらの実施形態については炭素原子の上限を単に拡大するであろうと考えられ
、含まれない。しかしながら、アリール、アミノおよびハロなどによって置換されるアル
キルは含まれるであろう。例えば、基が置換される場合、当該基は、１つ、２つ、３つ、
４つ、５つまたは６つの置換基により置換される場合がある。必要に応じた置換基には、
下記の基が含まれるが、それらに限定されない：Ｃ１〜Ｃ６アルキルまたはヘテロアリー
ル、Ｃ２〜Ｃ６アルケニルまたはヘテロアルケニル、Ｃ２〜Ｃ６アルキニルまたはヘテロ
アルキニル、ハロゲン；アリール、ヘテロアリール、アジド（−Ｎ３）、ニトロ（−ＮＯ
２）、シアノ（−ＣＮ）、アシルオキシ（−ＯＣ（＝Ｏ）Ｒ’）、アシル（−Ｃ（＝Ｏ）
Ｒ’）、アルコキシ（−ＯＲ’）、アミド（−ＮＲ’Ｃ（＝Ｏ）Ｒ’’または−Ｃ（＝Ｏ
）ＮＲＲ’）、アミノ（−ＮＲＲ’）、カルボン酸（−ＣＯ２Ｈ）、カルボン酸エステル
（−ＣＯ２Ｒ’）、カルバモイル（−ＯＣ（＝Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’または−ＮＲＣ（＝Ｏ）
ＯＲ’）、ヒドロキシ（−ＯＨ）、イソシアノ（−ＮＣ）、スルホナート（−Ｓ（＝Ｏ）
２ＯＲ）、スルホンアミド（−Ｓ（＝Ｏ）２ＮＲＲ’または−ＮＲＳ（＝Ｏ）２Ｒ’）ま
たはスルホニル（−Ｓ（＝Ｏ）２Ｒ）、但し、これらの式において、それぞれのＲまたは
Ｒ’は、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ６アルキルまたはヘテロアリール、Ｃ２〜Ｃ６アルケニルまたはヘ
テロアルケニル、２Ｃ〜６Ｃアルキニルまたはヘテロアルキニル、アリールまたはヘテロ
アリールから独立して選択される。置換された基は、例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、
５つ、６つ、７つ、８つまたは９つの置換基を有する場合がある。
用語「ヘテロシクリル、複素環式またはＨｅｔ」は、本明細書中で使用される場合、別
途指定される場合を除き、窒素、酸素およびイオウからなる群から独立して選択される１
個、２個、３個または４個のヘテロ原子を含有する、例えば、３員環、４員環、５員環、
６員環または７員環である環状のヘテロアルキルまたはヘテロアルケニルを表す。５員環
は０〜２つの二重結合を有し、６員環および７員環は０〜３つの二重結合を有する。用語
「ヘテロシクリル」はまた、１つまたは複数の炭素および／またはヘテロ原子が単環式環
の２つの非隣接メンバーを架橋する架橋された多環式構造を有する複素環式化合物を表し
、例えば、キヌクリジニル基を表す。用語「ヘテロシクリル」には、上記複素環式環のい
ずれかが、１つ、２つまたは３つの炭素環式環（例えば、アリール環、シクロヘキサン環
、シクロヘキセン環、シクロペンタン環、シクロペンテン環）または別の単環式の複素環
式環（例えば、インドリル、キノリル、イソキノリル、テトラヒドロキノリル、ベンゾフ
リルおよびベンゾチエニルなど）に縮合する二環式基、三環式基および四環式基が含まれ
る。
本発明の化合物の一部は１つまたは複数のステレオジェン中心を含む可能性があり、し
たがって、様々な異性形態で、例えば、立体異性体および／またはジアステレオマーで存
在する可能性がある。したがって、本発明の化合物およびそれらの医薬組成物は、個々の
エナンチオマー、ジアステレオマーまたは幾何異性体の形態である場合があり、あるいは
、立体異性体の混合物の形態である場合がある。特定の実施形態において、本発明の化合
物はエナンチオピュアな化合物である。特定の他の実施形態において、立体異性体または
ジアステレオマーの混合物が提供される。そのうえ、本発明の化合物が互変異性形態で存
在するとき、それぞれの互変異性体が本明細書中では包含される。
さらに、特定の化合物が、本明細書中に記載されるように、別途示される場合を除き、
Ｚ異性体またはＥ異性体のどちらかとして存在し得る１つまたは複数の二重結合を有する
場合がある。本発明はさらに、化合物を、他の異性体を実質的に含まない個々の異性体と
して、また、代替では、様々な異性体の混合物として、例えば、立体異性体のラセミ混合
物として包含する。上述の化合物自体に加えて、本発明はまた、これらの化合物の医薬的
に許容される誘導体、および、本発明の１つまたは複数の化合物と、１つまたは複数の医
薬的に許容される賦形剤または添加剤とを含む組成物を包含する。
処置方法
本明細書中に開示されるように、ｍｉＲ−１９０８、ｍｉＲ−１９９ａ−３ｐ、ｍｉＲ
−１９９ａ−５ｐおよびＣＴＧＦが、メラノーマにおいて転移性浸潤、内皮動員およびコ
ロニー形成の内因性の転移促進因子として特定され、一方、ＤＮＡＪＡ４、ＡｐｏＥ、Ｌ
ＲＰ１、ＬＲＰ８、ＬＸＲおよびｍｉＲ７が、同じプロセスの転移抑制因子または転移阻
害剤として機能する。加えて、これらのｍｉＲＮＡがＡｐｏＥおよび熱ショック因子ＤＮ
ＡＪＡ４を収斂的に標的化することが見出された。ガンにより分泌されるＡｐｏＥは、浸
潤および内皮動員を、メラノーマ細胞のＬＲＰ１受容体および内皮細胞のＬＲＰ８受容体
を活性化することによってそれぞれ抑制する。ＤＮＡＪＡ４はその結果として、ＡｐｏＥ
発現を誘導する。これらのｍｉＲＮＡは、ヒトでの転移の結末が強く予測するものである
。ｍｉＲ−１９９ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１９９ａ−５ｐおよびｍｉＲ−１９０８を標的化す
るロックド核酸（ＬＮＡ）による前処置では、多数の器官への転移が阻害され、一方、こ
れらのＬＮＡの治療的送達では、マウスモデルにおけるヒトメラノーマ細胞の転移が著し
く抑制される。
したがって、本発明は、メラノーマを、転移抑制因子の１つの発現レベルまたは活性レ
ベルを対象において増大させることを介して処置するための方法を提供する。この増大さ
せることが、とりわけ、転移抑制因子であるＤＮＡＪＡ４、ＡｐｏＥ、ＬＲＰ１およびＬ
ＲＰ８の１つまたは複数の強制された発現によって、あるいは、ｍｉＲ−１９９ａ−３ｐ
、ｍｉＲ−１９９ａ−５ｐおよびｍｉＲ−１９０８の１つまたは複数の発現レベルまたは
活性レベルを低下させることによって達成することができる。加えて、処置を、転移促進
因子の１つまたは複数の発現レベルまたは活性レベルを低下させることによって達成する
ことができる。
本発明はまた、血管形成性の障害または血管形成の障害を対象において処置するための
方法を提供する。用語「血管形成性の障害」、用語「血管形成の障害」および用語「血管
形成障害」は本明細書中では交換可能に使用され、病理学的な血管形成によって特徴づけ
られる障害を示す。病理学的な血管形成によって特徴づけられる障害は、正常でない血管
形成または正常から外れた血管形成が単独で、または他との組合せで、当該障害の原因、
開始または症状の一因となる障害を示す。この障害の例には、様々なガン（例えば、血管
形成した腫瘍）、眼障害および炎症性障害など含まれる。
上記方法により処置することができる典型的な血管形成した腫瘍には、酸素および栄養
分を提供するために血管成分を要求する固形腫瘍（特にガン腫）が含まれる。例示的な固
形腫瘍には、肺、乳房、骨、卵巣、胃、膵臓、咽頭、食道、精巣、肝臓、耳下腺、胆道、
結腸、直腸、子宮頸部、子宮、子宮内膜、腎臓、膀胱、前立腺、甲状腺のガン腫、扁平上
皮ガン、腺ガン、小細胞ガン腫、メラノーマ、神経膠腫、神経膠芽細胞腫、神経芽細胞腫
、カポジ肉腫および肉腫が含まれるが、これらに限定されない。
ガン以外の多くの障害または状態もまた、上記の方法により処置することができる。例
には、関節炎、関節リウマチ、乾癬、アテローム性動脈硬化、糖尿病性網膜症、加齢性黄
斑変性、グレーブス病、血管再狭窄（血管形成術後の再狭窄を含む）、動静脈奇形（ＡＶ
Ｍ）、髄膜腫、血管腫、血管新生緑内障、慢性腎臓疾患、糖尿病性腎症、多発性嚢胞腎疾
患、間質性肺疾患、肺高血圧症、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、気腫、自己免疫性肝炎
、慢性炎症性肝臓疾患、肝硬変、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、酒さおよび基底細胞ガンが含まれ
る。
他の処置標的には、例えば、米国特許出願公開第２００９００４２９７号、同第２００
９０１７５７９１号および同第２００７０１６１５５３号に記載されるものが含まれ、例
えば、血管線維腫、アテローム斑、角膜移植血管新生、血友病性関節、肥厚性瘢痕、オス
ラー・ウェーバー症候群、化膿性肉芽腫、後水晶体線維増殖症、強皮症、トラコーマ、血
管癒着、滑膜炎、皮膚炎、様々な他の炎症性疾患および炎症性障害、ならびに、子宮内膜
症などが含まれる。
転移抑制因子の強制発現
上述の転移抑制因子のポリペプチド（例えば、ＤＮＡＪＡ４、ＡｐｏＥ、ＬＲＰ１、Ｌ
ＲＰ８およびＬＸＲ）と、これらのポリペプチドをコードする核酸との両方を、本発明を
実施するために使用することができる。多くのポリペプチド調製物を使用することができ
るが、高度に精製または単離されたポリペプチドが好ましい。用語「ペプチド」、用語「
ポリペプチド」および用語「タンパク質」は、ポリマーでのアミノ酸残基の配列を記載す
るために本明細書中では交換可能に使用される。ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク
質は、希なアミノ酸および合成されたアミノ酸アナログに加えて、標準的な２０個の天然
に存在するアミノ酸から構成され得る。ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質は、長
さまたは翻訳後修飾（例えば、グリコシル化またはリン酸化）にかかわらず、アミノ酸の
どのような鎖でも可能である。
「本発明の」ポリペプチドには、ネットワークに関与する特定のドメインまたは部分を
有する、上述の転移抑制因子のいずれかの組換えまたは合成により製造された融合体また
はキメラ体が含まれる。この用語はまた、（原核生物細胞における発現のために有用であ
る）付加されたアミノ末端メチオニンを有するポリペプチドを包含する。
本発明の範囲内には、上述の配列の１つまたは複数と、異種の配列とを含有する融合タ
ンパク質が含まれる。「キメラ（な）」または「融合」は、異なる起源のアミノ酸配列が
、それらのコードするヌクレオチド配列の読み枠を合わせた組合せによって１つのポリペ
プチド鎖において組み合わされていることを示す。この用語は明示的に、内部融合体、す
なわち、ポリペプチド鎖内における異なる起源の配列の挿入を、その末端の一方に対する
融合に加えて包含する。異種のポリペプチド、核酸または遺伝子は、異物種に由来するも
のであり、または、同じ種に由来するならば、その元の形態から実質的に改変される。２
つの融合されたドメインまたは配列は、天然に存在するタンパク質または核酸において互
いに隣接していないならば、互いに異種である。
「単離された」または「精製された」ポリペプチドは、自然界で会合する他のタンパク
質、脂質および核酸から分離されているポリペプチドを示す。ポリペプチドは、精製され
た調製物の乾燥重量比で少なくとも１０％（すなわち、１０％〜１００％の間におけるい
かなる割合も、例えば、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８
５％、９０％、９５％および９９％）を構成することができる。純度を、どのような方法
であれ、適切な標準的方法によって測定することができ、例えば、カラムクロマトグラフ
ィー分析、ポリアクリルアミドゲル電気泳動分析またはＨＰＬＣ分析によって測定するこ
とができる。本発明において記載される単離されたポリペプチドは天然源から精製するこ
とができ、組換えＤＮＡ技術によって、または、化学的方法によって製造することができ
る。
「組換え」ポリペプチドは、組換えＤＮＡ技術によって製造されるポリペプチド、すな
わち、所望されるポリペプチドをコードする外因性ＤＮＡ構築物によって形質転換される
細胞から産生されるポリペプチドを示す。「合成」ポリペプチドは、化学的合成によって
調製されるポリペプチドを示す。用語「組換え」は、例えば、細胞、核酸、タンパク質ま
たはベクターに関連して使用されるときには、細胞、核酸、タンパク質またはベクターが
、異種の核酸もしくはタンパク質の導入によって、または、生来的な核酸もしくはタンパ
ク質の変化によって改変されていること、あるいは、細胞が、そのように改変された細胞
に由来することを示す。
「過剰発現」は、宿主細胞に導入された核酸によってコードされるＲＮＡまたはポリペ
プチドの発現を示し、但し、この場合、そのようなＲＮＡまたはポリペプチドまたはタン
パク質は通常の場合には宿主細胞に存在していないか、あるいは、そのようなＲＮＡまた
はポリペプチドが、当該ＲＮＡまたはポリペプチドをコードする内因性遺伝子から通常の
場合に発現されるレベルよりも高いレベルで前記宿主細胞に存在するかのどちらかである
。
上述のポリペプチドのそれぞれのアミノ酸組成は、それらの機能を妨害することなく、
すなわち、上述のネットワークをアップレギュレーションし（例えば、ＡｐｏＥ／ＬＲＰ
シグナル伝達経路の活性化レベルを増大させ）、それにより、多数の器官への転移を阻害
することができることを妨害することなく変化する場合がある。例えば、アミノ酸組成は
１つまたは複数の保存的なアミノ酸置換を含有することができる。「保存的なアミノ酸置
換」は、アミノ酸残基が、類似する側鎖を有するアミノ酸残基により置き換えられるアミ
ノ酸置換である。類似する側鎖を有するアミノ酸残基の様々な集団がこの技術分野におい
て定義されている。これらの集団には、塩基性側鎖を有するアミノ酸（例えば、リシン、
アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アスパラギン酸、グル
タミン酸）、非荷電の極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、グリシン、アスパラギン、グ
ルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖を有するアミノ酸
（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、
メチオニン、トリプトファン）、β−分岐した側鎖を有するアミノ酸（例えば、トレオニ
ン、バリン、イソロイシン）、および、芳香族側鎖を有するアミノ酸（例えば、チロシン
、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）が含まれる。したがって、上記ポリ
ペプチド（例えば、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、
配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６および配列番号１８）の１つにおける予測さ
れた非必須アミノ酸残基が好ましくは、同じ側鎖集団からの別のアミノ酸残基により置き
換えられる。代替では、変異を、例えば、飽和変異誘発などによって配列の全体または一
部に沿ってランダムに導入することができ、得られた変異体を、上述のネットワークまた
はＡｐｏＥ／ＬＲＰシグナル伝達経路をアップレギュレーションすることができ、また、
下記において実施例に記載されるように活性を保持する変異体を特定するためにそれぞれ
の細胞応答を誘発することができるかについてスクリーニングすることができる。
本発明のポリペプチドの機能的等価体は、当該ポリペプチドの誘導体、例えば、１つま
たは複数の点変異、挿入、欠失、短縮化、融合タンパク質、あるいは、それらの組合せを
有するタンパク質を示す。機能的等価体は上述のポリペプチドの活性を実質的に保持する
。本発明の単離されたポリペプチドは、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号
８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６および配列番号１８の１
つの配列あるいはその機能的な等価体またはフラグメントを含有することができる。一般
に、機能的等価体は、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０
、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６および配列番号１８の１つに対して少なく
とも７５％（例えば、７５％〜１００％の間におけるいかなる数字も、例えば、７０％、
８０％、８５％、９０％、９５％および９９％を含む）の同一性である。
本発明において記載されるポリペプチドは組換えポリペプチドとして得ることができる
。組換えポリペプチドを調製するために、当該ポリペプチドをコードする核酸を、融合パ
ートナー（例えば、グルタチオン−ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、６×−Ｈｉｓエ
ピトープタグまたはＭ１３遺伝子３タンパク質）をコードする別の核酸に連結することが
できる。得られた融合核酸は、この技術分野において知られている方法によって単離する
ことができる融合タンパク質を好適な宿主細胞において発現する。単離された融合タンパ
ク質は、融合パートナーを除き、かつ、本発明の組換えポリペプチドを得るために、例え
ば、酵素消化によってさらに処理することができる。代替では、本発明のポリペプチドは
化学合成することができる（例えば、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ、“Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒ
ｕｃｔｕｒｅｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ”（Ｗ．Ｈ．Ｆｒ
ｅｅｍａｎ ＆ Ｃｏ．、ＮＹ、１９８３）を参照のこと）。さらなる指針について、当
業者は、Ａｕｓｕｂｅｌ他（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕ
ｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃ
ｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、第３版、１９８７＆１９９５）、Ｓａｍｂｒｏｏｋ他（Ｍｏ
ｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、
ＮＹ、１９８９）、および、ｃｈｅｍｉｃａｌ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ
．編（Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ、Ｏ
ｘｆｏｒｄ、１９８４）を調べる場合がある。
細胞タンパク質または膜タンパク質としてのそれらの機能のために、ＤＮＡＪＡ４、Ｌ
ＲＰ１、ＬＲＰ８およびＬＸＲは、細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）配列を含むアミノ酸配
列の１つまたは複数および同様のものと連係させることができ、例えば、それらに対して
コンジュゲート化または融合することができる。このようにして、下記で議論されるよう
な本発明の組成物は輸送エンハンサーを含むことができる。細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ
）は一般に、３０個未満のアミノ酸からなり、正味の正荷電を有する。様々なＣＰＰが、
エンドサイトーシス様式または受容体／エネルギー非依存的様式で生体動物細胞において
内部移行する。いくつかのクラスのＣＰＰが、完全にタンパク質由来のＣＰＰから、キメ
ラＣＰＰを介して、完全に合成的なＣＰＰにまで様々な起源とともに存在する。様々なＣ
ＰＰの例がこの技術分野において知られている。例えば、米国特許出願公開第２００９０
０９９０６６号および同第２０１００２７９９１８号を参照のこと。ＣＰＰは外因性タン
パク質を様々な細胞の中に送達できることが知られている。
上述のポリペプチドの天然に存在する形態、遺伝子操作された形態および化学合成され
た形態のすべてが、それらに開示される発明を実施するために使用され得る。組換えＤＮ
Ａ技術によって得られるポリペプチドは、天然に存在する形態（例えば、配列番号２、配
列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列
番号１６および配列番号１８の１つ）またはその機能的等価体と同じアミノ酸配列を有す
る場合がある。それらにはまた、化学的に改変された形態が含まれる。化学的に改変され
たポリペプチドの例には、立体配座変化、側鎖の付加または欠失を受けるポリペプチド、
および、ポリエチレングリコールなどの化合物が結合しているポリペプチドが含まれる。
精製され、標準的方法によって、あるいは、下記において実施例に記載される方法、また
は、この技術分野において知られている他の方法に従って試験されると、ポリペプチドは
好適な組成物に含ませることができる。
上述の因子を発現させるために、本発明は、上記で述べられるポリペプチドのいずれか
をコードする核酸を提供する。好ましくは、ヌクレオチド配列は単離され、かつ／または
精製される。核酸は、ＤＮＡ分子（例えば、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ、これらに限定
されない）、ＲＮＡ分子（例えば、ｍＲＮＡ、これに限定されない）、あるいは、ＤＮＡ
アナログまたはＲＮＡアナログを示す。ＤＮＡアナログまたはＲＮＡアナログをヌクレオ
チドアナログから合成することができる。核酸分子は一本鎖または二本鎖であることが可
能である。「単離された核酸」は、構造が、どのような天然に存在する核酸の構造とも、
または、天然に存在するゲノム核酸のどのようなフラグメントの構造とも同一でない核酸
である。したがって、この用語は、例えば、下記のものを包含する：（ａ）天然に存在す
るゲノムＤＮＡ分子の一部の配列を有し、しかし、当該分子が自然界で存在する生物のゲ
ノムにおいて当該分子のそのような一部の両側に位置するコード配列の両方が側面に配置
されないＤＮＡ；（ｂ）得られた分子がどのような天然に存在するベクターまたはゲノム
ＤＮＡとも同一でないような様式でベクターに、あるいは、原核生物または真核生物のゲ
ノムＤＮＡに組み込まれる核酸；（ｃ）ｃＤＮＡ、ゲノムフラグメント、ポリメラーゼ連
鎖反応（ＰＣＲ）によってもたらされるフラグメント、または、制限フラグメントなどの
別個の分子；および（ｄ）ハイブリッド遺伝子、すなわち、融合タンパク質をコードする
遺伝子の一部である組換えヌクレオチド配列。
用語「ＲＮＡ」、用語「ＲＮＡ分子」および用語「リボ核酸分子」は本明細書中では交
換可能に使用され、リボヌクレオチドのポリマーを示す。用語「ＤＮＡ」または用語「Ｄ
ＮＡ分子」または用語「デオキシリボ核酸分子」は、デオキシリボヌクレオチドのポリマ
ーを示す。ＤＮＡおよびＲＮＡは自然界で合成され得る（例えば、ＤＮＡ複製またはＤＮ
Ａの転写によってそれぞれ合成され得る）。ＲＮＡは転写後修飾され得る。ＤＮＡおよび
ＲＮＡはまた、化学合成することができる。ＤＮＡおよびＲＮＡは一本鎖であることが可
能であり（すなわち、それぞれ、ｓｓＲＮＡおよびｓｓＤＮＡ）、または、多重鎖である
ことが可能である（例えば二重鎖、すなわち、それぞれ、ｄｓＲＮＡおよびｄｓＤＮＡ）
。
本発明はまた、本明細書中に記載されるヌクレオチド配列の１つまたは複数を有する組
換え構築物を提供する。そのような構築物の例には、本発明の核酸配列が順方向配向また
は逆方向配向で挿入されているベクター（例えば、プラスミドまたはウイルスベクターな
ど）が含まれる。好ましい実施形態において、構築物はさらに、配列に作動可能に連結さ
れるプロモーターを含めて、様々な調節配列を含む。非常に多数の好適なベクターおよび
プロモーターが当業者に知られており、また、市販されている。原核生物宿主および真核
生物宿主との使用のための適切なクローニングベクターおよび発現ベクターもまた、Ｓａ
ｍｂｒｏｏｋ他（２００１、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔ
ｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ）に記載さ
れている。
発現ベクターの例には、染色体ＤＮＡ配列、非染色体ＤＮＡ配列および合成ＤＮＡ配列
が含まれ、例えば、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）の誘導体、細菌プラスミド、ファ
ージＤＮＡ、バキュロウイルス、酵母プラスミド、プラスミドおよびファージＤＮＡの組
合せに由来するベクター、ウイルスＤＮＡ（例えば、ワクシニア、アデノウイルス、鶏痘
ウイルスおよび仮性狂犬病など）が含まれる。しかしながら、どのような他のベクターも
、宿主において複製可能であり、かつ、存続可能である限り、使用される場合がある。適
切な核酸配列が、様々な手順によってベクターに挿入される場合がある。一般には、上記
で記載されるポリペプチドの１つをコードする核酸配列をこの技術分野において知られて
いる手順によって適切な制限エンドヌクレアーゼ部位に挿入することができる。そのよう
な手順および関連したサブクローニング手順は当業者の範囲内である。
上述の発現ベクターにおける核酸配列は好ましくは、ｍＲＮＡ合成を導くための適切な
転写制御配列（プロモーター）に作動可能に連結される。そのようなプロモーターの例に
は、レトロウイルスの長末端（ＬＴＲ）またはＳＶ４０プロモーター、大腸菌のｌａｃプ
ロモーターまたはｔｒｐプロモーター、ファージラムダのＰＬプロモーター、および、遺
伝子の発現を原核細胞または真核生細胞あるいはウイルスにおいて制御することが知られ
ている他のプロモーターが含まれる。発現ベクターはまた、翻訳開始のためのリボソーム
結合部位、および、転写ターミネーターを含有することができる。ベクターは、発現を増
幅するための適切な配列を含む場合がある。加えて、発現ベクターは好ましくは、１つま
たは複数の選択マーカー遺伝子を、形質転換された宿主細胞を選抜するための表現型形質
を提供するために含有する（例えば、真核生物細胞培養物のためのジヒドロ葉酸レダクタ
ーゼまたはネオマイシン抵抗性など、あるいは、大腸菌におけるテトラサイクリン抵抗性
またはアンピシリン抵抗性など）。
上記で記載されるような適切な核酸配列、同様にまた、適切なプロモーター配列または
制御配列を含有するベクターは、適切な宿主細胞を形質転換して、宿主に、上記で記載さ
れるポリペプチドを発現させることを可能にするために用いることができる。そのような
ベクターは遺伝子治療において使用することができる。好適な発現宿主の例には、細菌細
胞（例えば、大腸菌、ストレプトミセス属、ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔ
ｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ））、真菌細胞（酵母）、昆虫細胞（例えば、ショウジョウバエお
よびヨトウガ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）（Ｓｆ９））、動物細胞
（例えば、ＣＨＯ、ＣＯＳおよびＨＥＫ２９３）、アデノウイルスおよび植物細胞が含ま
れる。適切な宿主の選択は当業者の範囲内である。いくつかの実施形態において、本発明
は、上述のポリペプチドを、これらのポリペプチドの１つをコードするヌクレオチド配列
を有する発現ベクターにより宿主細胞をトランスフェクションすることによって製造する
ための方法を提供する。宿主細胞はその後、ポリペプチドの発現を考慮する適切な条件の
もとで培養される。
転移促進因子の発現レベルまたは活性レベルを低下させること
上記で述べられるように、ｍｉＲ−１９９ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１９９ａ−５ｐ、ｍｉＲ
−１９０８またはＣＴＧＦの発現レベルまたは活性レベルを低下させる阻害性薬剤を、メ
ラノーマを処置する際に使用することができる。阻害性薬剤（すなわち、阻害剤）は、核
酸、ポリペプチド、抗体または小分子化合物であることが可能である。一例において、阻
害剤は、転写、ｍＲＮＡ安定性、翻訳、タンパク質安定性／分解、タンパク質修飾および
タンパク質結合のレベルにおいて機能する。
核酸阻害剤は、上述の遺伝子の１つまたは複数（例えば、ＣＴＧＦ）を標的化し、その
発現または活性を阻害する小さい干渉ＲＮＡ（例えば、ＲＮＡｉ剤）をコードすることが
できる。用語「ＲＮＡｉ剤」は、ＲＮＡ干渉を導くために標的ＲＮＡに対する十分な配列
相補性を有するＲＮＡまたはそのアナログを示す。例にはまた、そのようなＲＮＡを作製
するために使用することができるＤＮＡも含まれる。ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は、標的分
子（例えば、標的である遺伝子、タンパク質またはＲＮＡ）がダウンレギュレーションさ
れる配列特異的または配列選択的なプロセスを示す。一般に、干渉性ＲＮＡ（「ｉＲＮＡ
」）は、特定のｍＲＮＡの触媒的分解をもたらし、かつ、遺伝子発現を低下させるために
、または阻害するためにもまた使用することができる二本鎖の短い干渉性ＲＮＡ（ｓｉＲ
ＮＡ）、短いヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）または一本鎖のマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ
）である。
用語「短い干渉性ＲＮＡ」または用語「ｓｉＲＮＡ」（これらはまた、「小さい干渉性
ＲＮＡ」として知られている）は、長さが約１０ヌクレオチド〜５０ヌクレオチドであり
、好ましくは長さが約１５ヌクレオチド〜２５ヌクレオチドの間であり、より好ましくは
長さが約１７ヌクレオチド、１８ヌクレオチド、１９ヌクレオチド、２０ヌクレオチド、
２１ヌクレオチド、２２ヌクレオチド、２３ヌクレオチド、２４ヌクレオチドまたは２５
ヌクレオチドであり、鎖が場合により、例えば、１個、２個または３個の突出ヌクレオチ
ド（またはヌクレオチドアナログ）を含む突出端を有するＲＮＡ薬剤（好ましくは、二本
鎖の薬剤）で、ＲＮＡ干渉を導くことができるか、または媒介することができるものを示
す。天然に存在するｓｉＲＮＡは、より長いｄｓＲＮＡ分子（例えば、長さが２５ヌクレ
オチドを超える）から細胞のＲＮＡｉ装置（例えば、ダイサーまたはそのホモログ）によ
って生じる。
用語「ｍｉＲＮＡ」または用語「マイクロＲＮＡ」は、長さが約１０ヌクレオチド〜５
０ヌクレオチドである、好ましくは長さが約１５ヌクレオチド〜２５ヌクレオチドの間で
ある、より好ましくは長さが約１７ヌクレオチド、１８ヌクレオチド、１９ヌクレオチド
、２０ヌクレオチド、２１ヌクレオチド、２２ヌクレオチド、２３ヌクレオチド、２４ヌ
クレオチドまたは２５ヌクレオチドであるＲＮＡ薬剤（好ましくは、二本鎖の薬剤）で、
ＲＮＡ干渉を導くことができるか、または媒介することができるものを示す。天然に存在
するｍｉＲＮＡは、ステム・ループ前駆体ＲＮＡ（すなわち、プレ−ｍｉＲＮＡ）からダ
イサーによって生じる。用語「ダイサー」には、本明細書中で使用される場合、ダイサー
、同様にまた、ｄｓＲＮＡ構造体を、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ様分子または
ｍｉＲＮＡ様分子にプロセシングすることができるどのようなダイサーオルソログまたは
ダイサーホモログも含まれる。マイクロＲＮＡ（または「ｍｉＲＮＡ」）の用語は、天然
に存在するマイクロＲＮＡ（または「ｍｉＲＮＡ」が（例えば、発達期間中に）一時的な
様式で発現されることが見出されているという事実に基づいて、用語「小さい一時的ＲＮ
Ａ」（または「ｓｔＲＮＡ」）と交換可能に使用される。
用語「ｓｈＲＮＡ」は、本明細書中で使用される場合、相補的配列の第１の領域および
第２の領域を含む、ステム・ループ構造を有するＲＮＡ薬剤を示し、但し、この場合、こ
れらの領域の相補性の程度および配向が、塩基対形成がこれらの領域の間において生じる
ように十分であり、第１の領域および第２の領域がループ領域によってつながれ、ループ
が、ループ領域内のヌクレオチド（またはヌクレオチドアナログ）の間での塩基対形成が
ないことから生じる。
本発明の範囲内には、ＲＮＡ分子の分解（例えば、細胞内での分解）を特徴とするＲＮ
Ａｉの利用が含まれる。分解が、酵素的なＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）
によって触媒される。ＲＮＡｉを導くために標的ＲＮＡ配列（例えば、上述のＣＴＧＦ遺
伝子）に対して十分に相補的である配列を有するＲＮＡ薬剤は、当該ＲＮＡ薬剤が、標的
ＲＮＡ配列に対して少なくとも５０％の相同性（例えば、５０％、６０％、７０％、８０
％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％の相同性）を有し、その結果、これ
ら２つが、ハイブリダイゼーションし、かつ、標的ＲＮＡの破壊をＲＮＡｉ装置（例えば
、ＲＩＳＣ複合体）またはＲＮＡｉプロセスによって誘発するために互いに十分に相補的
であることを意味する。“ＲＮＡｉを導くために標的ＲＮＡ配列に対して十分に相補的で
ある配列”を有するＲＮＡ薬剤はまた、当該ＲＮＡ薬剤が、標的ＲＮＡの翻訳阻害をＲＮ
Ａｉ装置またはＲＮＡｉプロセスによって誘発するのに十分である配列を有することを意
味する。ＲＮＡ薬剤はまた、標的ＤＮＡ配列がクロマチンにより沈黙させられるように、
標的ＤＮＡ配列によってコードされる標的ＲＮＡに対して十分に相補的である配列を有す
ることができる。別の言い方をすれば、ＲＮＡ薬剤は、転写型遺伝子サイレンシングを誘
導するために、例えば、遺伝子発現を、例えば、クロマチンの構造的変化を標的ＤＮＡ配
列またはその近くにおいて誘導することによって標的ＤＮＡ配列またはその近くにおいて
ダウンレギュレーションするのに十分である配列を有する。
上述のポリヌクレオチドは、この技術分野において知られているポリマー状の生分解性
マイクロ粒子送達デバイスまたは生分解性マイクロカプセル送達デバイスを使用して送達
することができる。ポリヌクレオチドの取り込みを達成するための別の方法が、リポソー
ム（これは標準的な方法によって調製される）を使用することである。ポリヌクレオチド
はこれらの送達ビヒクルに単独で組み込むことができ、または、組織特異的な抗体ととも
に共組み込みすることができる。代替では、静電力または共有結合力によってポリ−Ｌ−
リシンに結合するプラスミドまたは他のベクターから構成される分子コンジュゲートを調
製することができる。ポリ−Ｌ−リシンは、標的細胞上の受容体に結合することができる
リガンドに結合する（Ｃｒｉｓｔｉａｎｏ他、１９９５、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．、７３：
４７９）。代替では、組織特異的な標的化を、この技術分野において知られている組織特
異的な転写調節エレメントの使用によって達成することができる。筋肉内部位、皮内部位
または皮下部位へのネイクドＤＮＡの送達（すなわち、送達ビヒクルを伴わない送達）は
、インビボ発現を達成するための別の手段である。
ｓｉＲＮＡ分子、ｍｉＲＮＡ分子およびａｓＲＮＡ（アンチセンスＲＮＡ）分子をこの
技術分野において広く知られている方法によって設計することができる。どのようなＲＮ
Ａであれ、ＲＮＡを一意的に分解するために要求される配列特異性を提供するために十分
である相同性を有するｓｉＲＮＡ分子、ｍｉＲＮＡ分子およびａｓＲＮＡ分子を、ＡＭＢ
ＩＯＮ，Ｉｎｃ．およびＤＨＡＲＭＡＣＯＮ，Ｉｎｃ．のためのウエブサイトにおいて維
持されるプログラム（これらに限定されない）を含めて、この技術分野において知られて
いる様々なプログラムを使用して設計することができる。そのようなｓｉＲＮＡ配列、ｍ
ｉＲＮＡ配列およびａｓＲＮＡ配列を最適化するための、いくつかの設計された化学種の
体系的な試験を、当業者によって常法的に行うことができる。短い干渉性核酸分子を設計
するときの検討事項には、生物物理学的、熱力学的および構造的な検討事項、センス鎖に
おける特定の位置における塩基好み、ならびに、相同性が含まれるが、これらに限定され
ない。これらの検討事項は、この技術分野において広く知られているものであり、これら
により、上述のＲＮＡ分子を設計するための指針が提供される。
本発明のアンチセンスポリヌクレオチド（好ましくはＤＮＡ）は、上述のネットワーク
の成分をコードする遺伝子の塩基配列に対して相補的であるか、または実質的に相補的で
ある塩基配列を有する限り、どのようなアンチセンスポリヌクレオチドでもあることが可
能である。塩基配列は、ポリペプチドをコードする遺伝子の相補体に対して、少なくとも
約７０％、８０％、９０％または９５％の相同性であることが可能である。これらのアン
チセンスＤＮＡは、ＤＮＡ合成機を使用して合成することができる。
本発明のアンチセンスＤＮＡは、変化させた、または改変された糖、塩基または連結を
含有する場合がある。アンチセンスＤＮＡ、同様にまた、上記で述べられるＲＮＡｉ薬剤
はまた、特殊化された形態で、例えば、リポソーム、微小球体などの形態で提供される場
合があり、または、遺伝子治療に適用される場合があり、または、結合した成分との組合
せで提供される場合がある。そのような結合した成分には、リン酸骨格の電荷中和剤とし
て作用するポリカチオン（例えば、ポリリシンなど）、あるいは、細胞膜との相互作用を
強化するか、または、核酸の取り込みを増大させる疎水性成分（例えば、脂質（例えば、
リン脂質、コレステロールなど）など）が含まれる。結合させられる脂質の好ましい例が
、コレステロールまたはその誘導体（例えば、クロロギ酸コレステリル、コール酸など）
である。これらの成分は、核酸にその３’末端または５’末端において結合させられる場
合があり、また、塩基、糖または分子間ヌクレオシド連結を介して核酸に結合させられる
場合もある。他の成分が、ヌクレアーゼ（例えば、エキソヌクレアーゼ、ＲＮａｓｅなど
）による分解を防止するために核酸の３’末端または５’末端に特異的に置かれるキャッ
ピング基である場合がある。そのようなキャッピング基には、グリコール（例えば、ポリ
エチレングリコールおよびテトラエチレングリコールなど）を含めて、この技術分野にお
いて知られている様々なヒドロキシル保護基が含まれるが、これらに限定されない。アン
チセンスＤＮＡの阻害作用を、細胞株または動物に基づく本発明の遺伝子発現系をインビ
ボおよびインビトロにおいて使用して調べることができる。
上記で述べられるポリペプチドの１つまたは複数あるいはＲＮＡｉ薬剤をコードする上
記で議論された核酸は、インビトロまたはインビボにおいて細胞に送達するためのベクタ
ーにクローン化することができる。インビボでの使用のために、送達は特定の組織または
器官（例えば、皮膚）を標的化することができる。標的化された送達では、特定の器官ま
たは組織に全身投与後に標的化されるベクター（例えば、器官ホーミングペプチド）の使
用が伴う。例えば、ベクターは、アビジンと、肝臓特異的タンパク質に対するモノクロー
ナル抗体との共有結合コンジュゲートを有することができる。
いくつかのある特定の実施形態において、本発明は、上述の転移抑制因子をインビボ発
現させるための方法を提供する。そのような方法では、その治療効果が、上記因子のいず
れかをコードする核酸配列を、内皮動員、ガン細胞浸潤または転移性血管形成を阻害する
ことを必要とするヒトまたは非ヒト動物の細胞または組織に導入することによって達成さ
れるであろう。核酸配列の送達を、組換え発現ベクター（例えば、キメラウイルスなど）
またはコロイド状分散物系を使用して達成することができる。核酸配列の治療的送達のた
めに好ましいものが、標的化されたリポソームの使用である。
本明細書中に開示される遺伝子治療のために利用することができる様々なウイルスベク
ターには、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）、ヘルペスウイルス、ワクシ
ニア、または、好ましくはＲＮＡウイルス（例えば、レトロウイルスおよびレンチウイル
スなど）が含まれる。好ましくは、レトロウイルスベクターは、レンチウイルス、あるい
は、マウスまたはトリのレトロウイルスの誘導体である。ただ１つだけの外来遺伝子を挿
入することができるレトロウイルスベクターの例には、モロニーマウス白血病ウイルス（
ＭｏＭｕＬＶ）、ハーベイマウス肉腫ウイルス（ＨａＭｕＳＶ）、マウス乳ガンウイルス
（ＭｕＭＴＶ）およびラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）が含まれるが、これらに限定されな
い。数多くのさらなるレトロウイルスベクターが多数の遺伝子を取り込むことができる。
これらのベクターのすべてが選択マーカー用の遺伝子を移すことができ、または取り込
むことができ、その結果、形質導入された細胞が特定され得るように、また、作製され得
るようにされる。レトロウイルスベクターを、例えば、糖、糖脂質またはタンパク質を結
合することによって標的特異的にすることができる。好ましい標的化が、受容体を標的に
おいて有する標的特異的な抗体またはホルモンを使用することによって達成される。当業
者は、特異的なポリヌクレオチド配列が、レトロウイルスベクターの標的特異的な送達を
可能にするためにレトロウイルスのゲノムに挿入され得るか、または、ウイルスのエンベ
ロープに結合され得ることを認識するであろう。
核酸を送達するための別の標的化されたシステムがコロイド状分散物系である。コロイ
ド状分散物系には、巨大分子複合体、ナノカプセル、微小球体、ビーズ、ならびに、水中
油型エマルション、ミセル、混合ミセルおよびリポソームを含む脂質に基づく系が含まれ
る。本発明の好ましいコロイド状系がリポソームである。リポソームは、インビトロおよ
びインビボにおける送達ビヒクルとして有用である人工膜小胞である。ＲＮＡ、ＤＮＡお
よび無傷のビリオンを生物学的に活性な形態で水性の内部に封入し、細胞に送達すること
ができる。リポソームビヒクルを使用する効率的な遺伝子移入のための様々な方法がこの
技術分野において知られている。リポソームの組成は通常、通常の場合にはステロイドと
の併用でのリン脂質の組合せ、とりわけ、コレステロールとの併用でのリン脂質の組合せ
である。他のリン脂質または他の脂質もまた使用される場合がある。リポソームの物理的
特性が、ｐＨ、イオン強度および二価カチオンの存在に依存する。
リポソーム作製において有用である脂質の例には、ホスファチジル化合物、例えば、ホ
スファチジルグリセロール、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチ
ジルエタノールアミンなど、スフィンゴ脂質、セレブロシドおよびガングリオシドが含ま
れる。例示的なリン脂質には、卵のホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジ
ルコリンおよびジステアロイルホスファチジルコリンが含まれる。リポソームの標的化は
また、例えば、器官特異性、細胞特異性およびオルガネラ特異性に基づいて可能であり、
この技術分野において知られている。
インビボで使用されるときには、可逆的な送達−発現系を使用することが望ましい。そ
のような目的を達成するために、Ｃｒｅ−ｌｏｘＰ系またはＦＬＰ／ＦＲＴ系あるいは他
の類似する系を上記核酸の１つまたは複数の可逆的な送達−発現のために使用することが
できる。国際公開ＷＯ２００５／１１２６２０、国際公開ＷＯ２００５／０３９６４３、
米国特許出願公開第２００５０１３０９１９号、同第２００３００２２３７５号、同第２
００２００２２０１８号、同第２００３００２７３３５号および同第２００４０２１６１
７８号を参照のこと。特に、米国特許出願公開第２０１００２８４９９０号に記載される
可逆的な送達−発現系を、選択的中断または緊急中断を提供するために使用することがで
きる。
別の一例において、上述の阻害性薬剤は、ポリペプチドまたはタンパク質複合体、例え
ば、抗体などが可能である。用語「抗体」は、免疫グロブリン分子、または、その免疫学
的に活性な部分、すなわち、抗原結合部分を示す。例には、少なくとも１つまたは２つの
重（Ｈ）鎖可変領域（ＶＨ）と、少なくとも１つまたは２つの軽（Ｌ）鎖可変領域（ＶＬ
）とを有するタンパク質が含まれるが、これに限定されない。ＶＨ領域およびＶＬ領域は
さらに、より保存されている領域（これは「フレームワーク領域」（ＦＲ）と呼ばれる）
が散らばる超可変性の領域（これは「相補性決定領域」（「ＣＤＲ」）と呼ばれる）に細
かく分けることができる。本明細書中で使用される場合、用語「免疫グロブリン」は、免
疫グロブリン遺伝子によって実質的にコードされる１つまたは複数のポリペプチドからな
るタンパク質を示す。認識されているヒト免疫グロブリン遺伝子には、カッパ定常領域遺
伝子、ラムダ定常領域遺伝子、アルファ定常領域遺伝子（ＩｇＡ１およびＩｇＡ２）、ガ
ンマ定常領域遺伝子（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４）、デルタ定常領域
遺伝子、エプシロン定常領域遺伝子およびミュー定常領域遺伝子、同様にまた、無数の免
疫グロブリン可変領域遺伝子が含まれる。
抗体の「抗原結合部分」（または「抗体部分」）の用語は、抗原（例えば、ＬＲＰ１、
ＬＲＰ８およびＣＴＧＦ）に特異的に結合する能力を保持する抗体の１つまたは複数のフ
ラグメントを示す。抗体の抗原結合機能が全長抗体のフラグメントによって果たされ得る
ことが示されている。抗体の「抗原結合部分」の用語の範囲内に包含される結合性フラグ
メントの例には、（ｉ）Ｆａｂフラグメント、すなわち、ＶＬドメイン、ＶＨドメイン、
ＣＬドメインおよびＣＨ１ドメインからなる一価フラグメント；（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２
フラグメント、すなわち、ヒンジ領域におけるジスルフィド架橋によって連結される２つ
のＦａｂフラグメントを含む二価フラグメント；（ｉｉｉ）ＶＨドメインおよびＣＨ１ド
メインからなるＦｄフラグメント；（ｉｖ）抗体のただ１つだけのアームのＶＬドメイン
およびＶＨドメインからなるＦｖフラグメント；（ｖ）ＶＨドメインからなるｄＡｂフラ
グメント（Ｗａｒｄ他（１９８９）、Ｎａｔｕｒｅ、３４１：５４４〜５４６）；ならび
に（ｖｉ）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）が含まれる。そのうえ、Ｆｖフラグメン
トの２つのドメイン、すなわち、ＶＬおよびＶＨは、別個の遺伝子によってコードされる
にもかかわらず、それらは、ＶＬ領域およびＶＨ領域が対形成して一価の分子（これは単
鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として知られている）を形成する単一のタンパク質鎖として作製され
ることを可能にする合成リンカーによって、組換え法を使用してつなぐことができる（例
えば、Ｂｉｒｄ他（１９８８）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４２：４２３〜４２６、および、Ｈ
ｕｓｔｏｎ他（１９８８）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８５：５
８７９〜５８８３を参照のこと）。そのような単鎖抗体もまた、抗体の「抗原結合部分」
の用語の範囲内に包含されることが意図される。これらの抗体フラグメントは、当業者に
知られている従来の技術を使用して得られ、フラグメントは、無傷の抗体がスクリーニン
グされるのと同じ様式で有用性についてスクリーニングされる。
上述の標的タンパク質の１つ（例えば、ＣＴＧＦ）に特異的に結合する抗体を、この技
術分野において知られている方法を使用して作製することができる。この抗体はポリクロ
ーナルまたはモノクローナル抗体であることが可能である。１つの実施形態において、抗
体は組換えにより製造することができ、例えば、ファージディスプレーによって、または
、コンビナトリアル方法によって製造することができる。別の実施形態において、抗体は
、完全なヒト抗体（例えば、抗体をヒト免疫グロブリン配列から産生するように遺伝子操
作されているマウスにおいて作製される抗体）、ヒト化抗体、あるいは、非ヒト抗体、例
えば、齧歯類（マウスまたはラット）、ヤギ、霊長類（例えば、サル、これに限定されな
い）、ウサギまたはラクダの抗体（これらに限定されない）である。抗体のヒト化形態を
生じさせるための様々な方法の例には、ＣＤＲグラフト化（Ｑｕｅｅｎ他、米国特許第５
，５８５，０８９号；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ他、Ｎａｔｕｒｅ、３３２：３２３（１９８８
））、鎖シャフリング（米国特許第５，５６５，３３２号）、および、貼り合わせ（ｖｅ
ｎｅｅｒｉｎｇ）または表面再建（ｒｅｓｕｒｆａｃｉｎｇ）（欧州特許第５９２，１０
６号；欧州特許第５１９，５９６号；Ｐａｄｌａｎ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏ
ｌｏｇｙ、２８（４１５）：４８９〜４９８（１９９１）；Ｓｔｕｄｎｉｃｋａ他、Ｐｒ
ｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、７（６）：８０５〜８１４（１９９４）；Ｒｏｇ
ｕｓｋａ他、ＰＮＡＳ、９１：９６９〜９７３（１９９４））が含まれるが、これらに限
定されない。完全なヒト抗体を生じさせるための様々な方法の例には、ヒト免疫グロブリ
ン遺伝子を発現することができるマウスから抗体を生じさせること、および、ヒト免疫グ
ロブリン遺伝子ライブラリーを作製し、スクリーニングするためにファージディスプレー
技術を使用することが含まれるが、これらに限定されない。
「単離された抗体」は、異なる抗原特異性を有する他の抗体を実質的に含まない抗体を
示すことが意図される（例えば、ＣＴＧＦと特異的に結合する単離された抗体は、そのよ
うな抗原とは別の抗原と特異的に結合する抗体を実質的に含まない）。そのうえ、単離さ
れた抗体は、他の細胞物質および／または化学物質を実質的に含まない場合がある。
用語「モノクローナル抗体」または用語「モノクローナル抗体組成物」は、本明細書中
で使用される場合、単一分子組成の抗体分子の調製物を示す。モノクローナル抗体組成物
は、特定のエピトープに対する単一の結合特異性および親和性を呈示する。
用語「ヒト抗体」は、本明細書中で使用される場合、フレームワーク領域およびＣＤＲ
領域の両方がヒト生殖系列の免疫グロブリン配列に由来する可変領域を有する抗体を包含
することが意図される。さらには、抗体が定常領域を含有するならば、この定常領域もま
た、ヒト生殖系列の免疫グロブリン配列に由来する。本発明のヒト抗体は、ヒト生殖系列
の免疫グロブリン配列によってコードされないアミノ酸残基（例えば、インビトロでのラ
ンダム変異誘発または部位特異的変異誘発によって、あるいは、インビボでの体細胞変異
によって導入される変異）を含む場合がある。しかしながら、用語「ヒト抗体」は、本明
細書中で使用される場合、別の哺乳動物種（例えば、マウスなど）の生殖系列に由来する
ＣＤＲ配列がヒトのフレームワーク配列にグラフト化されている抗体を包含することは意
図されない。
用語「ヒトモノクローナル抗体」は、フレームワーク領域およびＣＤＲ領域の両方がヒ
ト生殖系列の免疫グロブリン配列に由来する可変領域を有する、単一の結合特異性を呈示
する抗体を示す。１つの実施形態において、ヒトモノクローナル抗体が、ヒト重鎖の導入
遺伝子と、軽鎖の導入遺伝子とを含むゲノムを有する遺伝子組換えの非ヒト動物（例えば
、遺伝子組換えマウス）から得られるＢ細胞を、不死化細胞に融合されて含むハイブリド
ーマによって産生される。
用語「組換えヒト抗体」には、本明細書中で使用される場合、組換え手段によって調製
され、発現され、作出され、または単離されるすべてのヒト抗体が含まれ、例えば、下記
の抗体などが含まれる：（ａ）ヒト免疫グロブリン遺伝子について遺伝子組換えまたは染
色体組換えである動物（例えば、マウス）から、あるいは、そのような動物から調製され
るハイブリドーマから単離される抗体（これは下記においてさらに記載される）；（ｂ）
ヒト抗体を発現するように形質転換される宿主細胞から単離される抗体、例えば、トラン
スフェクトーマから単離される抗体；（ｃ）組換えのコンビナトリアルヒト抗体ライブラ
リーから単離される抗体；および（ｄ）ヒト免疫グロブリン遺伝子配列を他のＤＮＡ配列
にスプライシングすることを伴う何らかの他の手段によって調製される、発現される、作
出される、または単離される抗体。そのような組換えヒト抗体は、フレームワーク領域お
よびＣＤＲ領域がヒト生殖系列の免疫グロブリン配列に由来する可変領域を有する。しか
しながら、いくつかのある特定の実施形態において、そのような組換えヒト抗体はインビ
トロ変異誘発（または、ヒトＩｇ配列について遺伝子組換えである動物が使用されるとき
には、インビボ体細胞変異誘発）に供することができ、したがって、組換え抗体のＶＨ領
域およびＶＬ領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖系列のＶＨ配列およびＶＬ配列に由来する
か、または関連づけられる一方で、当然のことながら、インビボにおいてヒト抗体の生殖
系列レパートリーの中に存在しないことがある配列である。
本明細書中で使用される場合、「イソ型」は、重鎖定常領域遺伝子によってコードされ
る抗体クラス（例えば、ＩｇＭまたはＩｇＧ１）を示す。表現「抗原を認識する抗体」お
よび表現「抗原について特異的な抗体」は、本明細書中では用語「抗原に特異的に結合す
る抗体」と交換可能に使用される。本明細書中で使用される場合、用語「高親和性」はＩ
ｇＧ抗体については、抗体が標的抗原について１０−７Ｍ以下のＫＤを有すること、好ま
しくは１０−８Ｍ以下のＫＤを有すること、より好ましくは１０−９Ｍ以下のＫＤを有す
ること、一層より好ましくは１０−１０Ｍ以下のＫＤを有することを示す。しかしながら
、「高親和性」の結合は、他の抗体イソ型については異なる可能性がある。例えば、Ｉｇ
Ｍイソ型についての「高親和性」の結合は、抗体が１０−７Ｍ以下のＫＤを有すること、
より好ましくは１０−８Ｍ以下のＫＤを有することを示す。
一例において、組成物は、ＣＴＧＦを中和するモノクローナル抗体を含有する。１つの
実施形態において、抗体は、完全なヒト抗体、ヒト化抗体、あるいは、非ヒト抗体、例え
ば、齧歯類（マウスまたはラット）、ヤギ、霊長類（例えば、サル、これに限定されない
）、ウサギまたはラクダの抗体（これらに限定されない）であることが可能である。１つ
の実施形態において、このモノクローナルなモノクローナル抗体の１つまたは複数のアミ
ノ酸が、その様々な物理的性質を変えるために置換される場合がある。これらの性質には
、結合特異性、結合親和性、免疫原性および抗体イソ型が含まれるが、これらに限定され
ない。上記抗体の完全なヒト形態型またはヒト化形態型を含有する医薬組成物を、メラノ
ーマを処置するために、あるいは、内皮動員、ガン細胞浸潤または転移性血管形成を阻害
するために使用することができる。
本明細書中で使用される場合、「対象」はヒトおよび非ヒト動物を示す。非ヒト動物の
例には、すべての脊椎動物、例えば、哺乳動物、例えば、非ヒト哺乳動物、非ヒト霊長類
（特に、高等霊長類）、イヌ、齧歯類（例えば、マウスまたはラット）、モルモット、ネ
コおよびウサギなど、ならびに、非哺乳動物、例えば、鳥類、両生類、爬虫類などが含ま
れる。１つの実施形態において、対象はヒトである。別の実施形態において、対象は、実
験動物、または、疾患モデルとして好適な動物である。障害について処置されるための対
象を、当該障害のための標準的な診断技術によって特定することができる。必要に応じて
、対象は、この技術分野において知られている方法または上記で記載される方法によって
処置前に、上記で述べられるｍｉＲ−１９９ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１９９ａ−５ｐ、ｍｉＲ
−１９０８およびＣＴＧＦの１つまたは複数の変異、発現レベルまたは活性レベルについ
て調べることができる。対象が特定の変異を遺伝子に有するならば、あるいは、遺伝子発
現レベルまたは活性レベルが、例えば、当該対象から得られるサンプルにおいて、正常者
から得られるサンプルにおける遺伝子発現レベルまたは活性レベルよりも高いならば、当
該対象は本発明の処置のための候補である。
阻害または処置を確認するために、内皮動員または生じている血管形成の阻害を投与工
程の前および／または後で、この技術分野において知られている技術を使用して評価およ
び／または確認することができる。例示的な技術には、血管造影または動脈造影が含まれ
、身体の血管および器官の内部または内腔を可視化するために使用される医用画像化技術
を一般には、放射線不透過性の造影剤を血管内に注入し、Ｘ線に基づく技術を使用して、
例えば、蛍光透視法などを使用して画像化することによって行うことができる。
「処置する」または「処置」は、本明細書中で使用される場合、障害を有する対象に、
当該障害、障害の症状、当該障害に対して二次的である疾患状態、または、当該障害に対
する素因を治療するか、緩和するか、軽減するか、治すか、その発症を遅らせるか、防止
するか、または改善するための目的を伴って化合物または薬剤を投与することを示す。「
効果的な量」または「治療効果的な量」は、医学的に望ましい結果を処置された対象にお
いてもたらすことができる化合物または薬剤の量を示す。処置方法は、単独で、あるいは
、他の薬物または治療法との併用でインビボまたはエクスビボにおいて行うことができる
。治療効果的な量を、１回または複数回の投与、適用または投薬において投与することが
でき、また、治療効果的な量は、特定の配合物または投与経路に限定されることは意図さ
れない。
表現「効果的な量」は、本明細書中で使用される場合、所望される治療効果を示すため
の本発明の化合物の十分な量を示す。要求される正確な量は、対象の種、年齢および全身
状態、ならびに、具体的な治療剤などに依存して対象毎に変化するであろう。本発明の化
合物は好ましくは、投与の容易さおよび投薬の均一性のために投薬単位形態物に配合され
る。表現「投薬単位形態物」は、本明細書中で使用される場合、患者が処置されるために
適切である治療剤の物理的に別個の単位物を示す。しかしながら、本発明の化合物および
組成物の１日あたりの総使用が、妥当な医学的判断の範囲内において主治医によって決定
されるであろうことが理解されるであろう。どのような患者または生物であれ、特定の患
者または生物のための具体的な治療効果的な用量レベルは、処置されている障害および障
害の重篤度；用いられる具体的な化合物の抗ガン活性；用いられる具体的な組成物；患者
の年齢、体重、全身の健康状態、性別および食事；用いられる具体的な化合物の投与時期
、投与経路および排出速度；処置の継続期間；用いられる具体的な化合物との併用で、ま
たは同時に使用される薬物；ならびに、医療技術分野において広く知られている同様な要
因を含めて様々な要因に依存するであろう。
治療剤は単独でインビボまたはエクスビボにおいて投与することができ、あるいは、他
の薬物または治療法との併用で、すなわち、カクテル療法で共投与することができる。本
明細書中で使用される場合、用語「共投与」または用語「共投与される」は、少なくとも
２つの薬剤または治療法を対象に施すことを示す。例えば、腫瘍の処置において、特に血
管形成した悪性腫瘍の処置では、薬剤を、単独で、あるいは、例えば、化学療法剤、放射
線療法剤、アポトーシス剤、抗血管新生剤および／または免疫毒素もしくはコアグリガン
ド（ｃｏａｇｕｌｉｇａｎｄ）との併用で使用することができる。いくつかの実施形態に
おいて、２つ以上の薬剤／治療法の共投与は同時である。他の実施形態において、第１の
薬剤／治療法が第２の薬剤／治療法に先立って施される。当業者は、使用される様々な薬
剤／治療法の配合物および／または投与経路が異なる場合があることを理解している。
インビボでの取り組みにおいて、化合物または薬剤が対象に投与される。一般に、化合
物は、医薬的に許容されるキャリア（例えば、生理学的食塩水など、これらに限定されな
い）に懸濁され、経口投与または静脈内注入によって投与され、あるいは、皮下、筋肉内
、クモ膜下腔内、腹腔内、直腸内、膣内、鼻腔内、胃内、気管内または肺内に注入される
か、または埋め込まれる。
要求される投薬量は、投与経路の選定；配合物の性質；患者の病気の性質；対象のサイ
ズ、重量、表面積、年齢および性別；投与されている他の薬物；ならびに主治医の判断に
依存する。好適な投薬量が０．０１ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇの範囲である。必要と
される投薬量における変化は、利用可能である様々な化合物、および、様々な投与経路の
異なる効率を考慮して予想されることである。例えば、経口投与は、ｉ．ｖ．注射による
投与よりも大きい投薬量を要求することが予想されるであろう。これらの投薬量レベルに
おける変化は、この技術分野において十分に理解されるように最適化のための標準的な経
験的常法を使用して調節することができる。好適な送達ビヒクル（例えば、ポリマーマイ
クロ粒子または埋め込み可能なデバイス）における化合物の封入は、送達効率、特に経口
送達についての送達効率を増大させることができる。
組成物
本発明の範囲内には、好適なキャリアと、上記で記載される治療剤の１つまたは複数と
を含有する組成物が含まれる。組成物は、医薬的に許容されるキャリアを含有する医薬組
成物、食餌療法に許容される好適なキャリアを含有する食餌療法組成物、または、化粧品
に許容されるキャリアを含有する化粧組成物であることが可能である。
用語「医薬組成物」は、活性な薬剤と、当該組成物をインビボまたはエクスビボでの診
断用使用または治療用使用のためにとりわけ好適にするキャリア（不活性または活性）と
の組合せ物を示す。「医薬的に許容されるキャリア」は、対象への投与または塗布の後、
望ましくない生理学的影響を引き起こさない。医薬組成物におけるキャリアは、有効成分
と適合可能であり、かつ、有効成分を安定化することができるという意味でもまた、「許
容される」ものでなければならない。１つまたは複数の可溶化剤を、活性な化合物を送達
するための医薬用キャリアとして利用することができる。医薬的に許容されるキャリアの
例には、投薬形体物として使用可能である組成物を達成するための生体適合性のビヒクル
、補助剤、添加剤および希釈剤が含まれるが、これらに限定されない。他のキャリアの例
には、コロイド状酸化ケイ素、ステアリン酸マグネシウム、セルロース、ラウリル硫酸ナ
トリウム、および、Ｄ＆Ｃ Ｙｅｌｌｏｗ ＃１０が含まれる。
本明細書中で使用される場合、用語「医薬的に許容される塩」は、妥当な医学的判断の
範囲内において、過度な毒性、刺激およびアレルギー性応答などを伴わない、ヒトおよび
下等動物の組織との接触における使用のために好適であり、かつ、合理的なベネフィット
／リスク比に対応するそのような塩を示す。アミン、カルボン酸および他のタイプの化合
物の様々な医薬的に許容される塩がこの技術分野において広く知られている。例えば、Ｓ
．Ｍ．Ｂｅｒｇｅ他は、様々な医薬的に許容される塩を、Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃ
ａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、６６：１〜１９（１９７７）において詳しく記載する（これは
参照によって本明細書中に組み込まれる）。そのような塩は、本発明の化合物の最終的な
単離および精製の期間中にその場で調製することができ、あるいは、下記において一般的
に記載されるように、フリーの塩基官能基またはフリーの酸官能基を好適な試薬と反応さ
せることによって別個に調製することができる。例えば、フリーの塩基官能基を好適な酸
と反応させることができる。さらには、本発明の化合物が酸性成分を有する場合、その好
適な医薬的に許容される塩には、金属塩、例えば、アルカリ金属塩（例えば、ナトリウム
塩またはカリウム塩）およびアルカリ土類金属塩（例えば、カルシウム塩またはマグネシ
ウム塩）などが含まれる場合がある。医薬的に許容される非毒性の酸付加塩の例として、
無機酸（例えば、塩酸、臭化水素酸、リン酸、硫酸および過塩素酸など）または有機酸（
例えば、酢酸、シュウ酸、マレイン酸、酒石酸、クエン酸、コハク酸またはマロン酸など
）により形成されるアミノ基の塩、あるいは、この技術分野において使用される他の方法
（例えば、イオン交換など）を使用することによって形成されるアミノ基の塩が挙げられ
る。他の医薬的に許容される塩には、アジピン酸塩、アルギン酸塩、アスコルビン酸塩、
アスパラギン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、安息香酸塩、重硫酸塩、ホウ酸塩、酪酸塩、
ショウノウ酸塩、ショウノウスルホン酸塩、クエン酸塩、シクロペンタンプロピオン酸塩
、ジグルコン酸塩、ドデシル硫酸塩、エタンスルホン酸塩、ギ酸塩、フマル酸塩、グルコ
ヘプトン酸塩、グリセロリン酸塩、グルコン酸塩、ヘミ硫酸塩、ヘプタン酸塩、ヘキサン
酸塩、ヨウ化水素酸塩、２−ヒドロキシ−エタンスルホン酸塩、ラクトビオン酸塩、乳酸
塩、ラウリン酸塩、ラウリル硫酸塩、リンゴ酸塩、マレイン酸塩、マロン酸塩、メタンス
ルホン酸塩、２−ナフタレンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、硝酸塩、オレイン酸塩、シュ
ウ酸塩、パルミチン酸塩、パモ酸塩、ペクチン酸塩、過硫酸塩、３−フェニルプロピオン
酸塩、リン酸塩、ピクリン酸塩、ピバル酸塩、プロピオン酸塩、ステアリン酸塩、コハク
酸塩、硫酸塩、酒石酸塩、チオシアン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩、ウンデカン酸塩
および吉草酸塩などが含まれる。代表的なアルカリ塩またはアルカリ土類金属塩には、ナ
トリウム、リチウム、カリウム、カルシウムおよびマグネシウムなどが含まれる。さらな
る医薬的に許容される塩には、適する場合、対イオンを使用して形成される非毒性のアン
モニウムカチオン、第四級アンモニウムカチオンおよびアミンカチオンが含まれる（例え
ば、ハロゲン化物、水酸化物、カルボン酸塩、硫酸塩、リン酸塩、硝酸塩、低級アルキル
スルホン酸塩およびアリールスルホン酸塩など）。
上記で記載されるように、本発明の医薬組成物はさらに、医薬的に許容されるキャリア
を含み、この場合、医薬的に許容されるキャリアには、本明細書中で使用される場合、所
望される特定の投薬形態物に対して適するように、ありとあらゆる溶媒、希釈剤または他
の液体ビヒクル、分散助剤または懸濁助剤、表面活性剤、等張剤、増粘剤または乳化剤、
保存剤、固体バインダーおよび滑剤などが含まれる。Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒ
ｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１６版、Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎ（Ｍａｃｋ
Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、Ｐａ．、１９８０）には、医薬組成物
を配合する際に使用される様々なキャリア、および、その調製のための知られている技術
が開示される。どのようなキャリア媒体であれ、従来のキャリア媒体が、例えば、何らか
の望ましくない生物学的影響をもたらすか、または、そうでない場合には、医薬組成物の
何らかの他の成分と有害な様式で相互作用することなどによって本発明の化合物と不適合
性である限りを除いて、その使用は、本発明の範囲内であることが意図される。医薬的に
許容されるキャリアとして役立ち得る物質のいくつかの例には、下記の物質が含まれるが
、それらに限定されない：糖、例えば、ラクトース、グルコースおよびスクロースなど；
デンプン、例えば、トウモロコシデンプンおよびジャガイモデンプンなど；セルロースお
よびその誘導体、例えば、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、エチルセルロースお
よび酢酸セルロースなど；粉末化トラガカント；麦芽；ゼラチン；タルク；賦形剤、例え
ば、カカオバターおよび坐薬用ワックスなど；オイル、例えば、ピーナッツ油、綿実油、
ベニバナ油、ゴマ油、オリーブ油、トウモロコシ油およびダイズ油など；グリコール、例
えば、プロピレングリコールなど；エステル、例えば、オレイン酸エチルおよびラウリン
酸エチルなど；寒天；天然リン脂質および合成リン脂質、例えば、ダイズおよび卵黄のホ
スファチド、レシチン、水素化ダイズレシチン、ジミリストイルレシチン、ジパルミトイ
ルレシチン、ジステアロイルレシチン、ジオレオイルレシチン、ヒドロキシル化レシチン
、リゾホスファチジルコリン、カルジオリピン、スフィンゴミエリン、ホスファチジルコ
リン、ホスファチジルエタノールアミン、ジアステアロイル（ｄｉａｓｔｅａｒｏｙｌ）
ホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）およびそのペグ化エステル（例えば、ＤＳ
ＰＥ−ＰＥＧ７５０およびＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００など）、ホスファチジン酸、ホスフ
ァチジルグリセロールならびにホスファチジルセリンなど。レシチンの好ましい市販規格
品には、Ｐｈｏｓａｌ（登録商標）またはＰｈｏｓｐｈｏｌｉｐｏｎ（登録商標）の商品
名で入手可能であるものが含まれ、Ｐｈｏｓａｌ ５３ ＭＣＴ、Ｐｈｏｓａｌ ５０
ＰＧ、Ｐｈｏｓａｌ ７５ ＳＡ、Ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｏｎ ９０Ｈ、Ｐｈｏｓｐｈｏ
ｌｉｐｏｎ ９０Ｇ、および、Ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｏｎ ９０ ＮＧが含まれる；ダイ
ズホスファチジルコリン（ＳｏｙＰＣ）およびＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００が特に好ましい
；緩衝化剤、例えば、水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウムなど；アルギン酸；
パイロジェン非含有水；等張性生理的食塩水；リンゲル液；エチルアルコールおよびリン
酸塩緩衝溶液、同様にまた、他の非毒性の適合性滑剤、例えば、ラウリル硫酸ナトリウム
およびステアリン酸マグネシウムなど、同様にまた、着色剤、離型剤、被覆剤、甘味剤、
香味剤および芳香剤、保存剤ならびに酸化防止剤もまた、処方者の判断に従って組成物に
存在させることができる。
上記組成物は、上記で記載される形態のどれにおいてでも、メラノーマ、あるいは、本
明細書中に記載されるいずれかの他の疾患または状態を処置するために使用することがで
きる。効果的な量は、治療効果を処置された対象に与えるために要求される活性な化合物
／薬剤の量を示す。効果的な用量は、当業者によって認識されるように、処置される疾患
のタイプ、投与経路、賦形剤使用法、および、他の治療的処置との同時使用の可能性に依
存して変化するであろう。
本発明の医薬組成物は、非経口投与、経口投与、鼻腔投与、直腸投与、局所投与または
口内投与により投与することができる。用語「非経口」は、本明細書中で使用される場合
、皮下注射、皮内注射、静脈内注射、筋肉内注射、関節内注射、動脈内注射、滑液包内注
射、胸骨内注射、クモ膜下腔内注射、病巣内注射または頭蓋内注射、同様にまた、どのよ
うな注入技術であれ、好適な注入技術を示す。
無菌の注射用組成物は、非毒性の非経口投与許容性の希釈剤または溶媒における溶液ま
たは懸濁物であることが可能である。そのような溶液には、１，３−ブタンジオール、マ
ンニトール、水、リンゲル液および等張性塩化ナトリウム溶液が含まれるが、これらに限
定されない。加えて、固定油が、溶媒または懸濁用媒体として従来から用いられる（例え
ば、合成されたモノグリセリドまたはジグリセリド）。天然の医薬的に許容されるオイル
、例えば、限定されないが、オリーブ油またはひまし油など、それらのポリオキシエチル
化体が注射剤の調製において有用であるように、脂肪酸（例えば、限定されないが、オレ
イン酸など）およびそのグリセリド誘導体が注射剤の調製において有用である。これらの
オイル溶液またはオイル懸濁物はまた、長鎖アルコール希釈剤または分散剤（例えば、限
定されないが、カルボキシメチルセルロースまたは類似する分散化剤など）を含有するこ
とができる。他の一般に使用されている界面活性剤、例えば、限定されないが、各種Ｔｗ
ｅｅｎもしくは各種Ｓｐａｎまたは他の類似する乳化剤あるいは生物学的利用能強化剤な
ど（これらは、医薬的に許容される固体形態物、液体形態物または他の投薬形態物の製造
において一般に使用されるものである）もまた、配合目的のために使用することができる
。
経口投与用の組成物は、どのような投薬形態物であれ、カプセル、錠剤、エマルション
剤、ならびに、水性懸濁物、水性分散物および水溶液を含めて、経口投与許容性の投薬形
態物であることが可能である。錠剤の場合、一般に使用されているキャリアには、ラクト
ースおよびトウモロコシデンプンが含まれるが、これらに限定されない。滑剤、例えば、
限定されないが、ステアリン酸マグネシウムなどもまた、典型的には加えられる。カプセ
ル形態での経口投与のために、有用な希釈剤には、ラクトースおよび乾燥トウモロコシデ
ンプンが含まれるが、これらに限定されない。水性の懸濁物またはエマルション剤が経口
投与されるとき、有効成分は、乳化剤または懸濁化剤と組み合わされる油相に懸濁または
溶解することができる、所望されるならば、ある特定の甘味剤、香味剤または着色剤を加
えることができる。
記載された発明による局所投与用の医薬組成物は、溶液、軟膏、クリーム、懸濁物、ロ
ーション、粉末剤、ペースト、ゲル、スプレー剤、エアロゾル剤またはオイルとして配合
することができる。代替では、局所用配合物は、１つまたは複数の賦形剤または希釈剤を
場合により含むことができる、有効成分（１つまたは複数）が含浸されるパッチまたは包
帯の形態であることが可能である。いくつかの好ましい実施形態において、局所用配合物
は、皮膚または他の患部を介した活性な薬剤の吸収または浸透を強化するであろう物質を
含む。
局所用組成物は、皮膚への適用のために好適である皮膚科学的に許容されるキャリアの
安全かつ効果的な量を含有する。「化粧品に許容される」または「皮膚科学的に許容され
る」組成物または成分は、過度な毒性、不適合性、不安定性およびアレルギー性応答など
を伴わない、ヒト皮膚との接触における使用のために好適である組成物または成分を示す
。キャリアは、活性な薬剤および必要に応じて使用される成分が適切な濃度で皮膚に送達
されることを可能にする。したがって、キャリアは、活性な物質が、適切な濃度で、選択
された標的に適用され、かつ、当該選択された標的を覆って均一に分布させられることを
保証するための希釈剤、分散剤または溶媒などとして作用することができる。キャリアは
、固体、半固体または液体であることが可能である。キャリアは、ローション、クリーム
またはゲルの形態であることが可能であり、特に、活性な物質が沈降することを防止する
ための十分な厚さまたは降伏点を有する形態であることが可能である。キャリアは不活性
であるか、または、皮膚科学的な利益を有することが可能である。キャリアは、本明細書
中に記載される活性な成分と物理的かつ化学的に適合性でなければならず、また、組成物
に関連する安定性、効力または他の使用利益を過度に損なってはならない。
併用療法
いくつかの実施形態において、医薬組成物はさらに、抗増殖活性を有するさらなる化合
物を含む場合がある。抗増殖活性を有するさらなる化合物を、表２に示される化合物を含
む一群の抗増殖剤から選択することができる。
本発明の化合物および医薬組成物は配合され、併用療法で用いられ得ること、すなわち
、化合物および医薬組成物が、１つまたは複数の他の所望される治療剤または医学的手法
とともに配合され得るか、あるいは、１つまたは複数の他の所望される治療剤または医学
的手法と同時に、またはそれらに先立って、またはそれらに続いて投与され得ることもま
た理解されるであろう。併用レジメンにおいて用いるための治療法（治療剤または手法）
の特定の組合せでは、所望される治療剤および／または手法の適合性、ならびに、達成さ
れるべき所望される治療効果が考慮に入れられるであろう。用いられる治療法により、所
望される効果が、同じ障害について達成されるかもしれないこと、または、異なる効果（
例えば、何らかの有害な影響の抑制）が達成されるかもしれないこともまた理解されるで
あろう。
「抗増殖剤」によって、本明細書中に列挙される医学的状態を処置するためにＬＸＲア
ゴニストとの併用でどれもが使用され得る表２に列記されるそのような抗増殖剤を含めて
、どのような抗増殖剤も意図される。抗増殖剤にはまた、有機白金誘導体、ナフトキノン
誘導体およびベンゾキノン誘導体、クリソファン酸およびそのアントラキノン誘導体が含
まれる。


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診断および予後のための方法
上記遺伝子は、対象が転移性メラノーマを有するかどうか、または、転移性メラノーマ
を有する危険性があるかどうかを決定することにおいて使用することができる。代替では
、上記遺伝子は、対象におけるそのような障害の予後を決定するために使用することがで
きる。
診断方法
１つの局面において、本発明は、対象が、内皮動員、ガン細胞浸潤または転移性血管形
成によって特徴づけられる転移性メラノーマまたは他の疾患を有するかどうか、あるいは
、内皮動員、ガン細胞浸潤または転移性血管形成によって特徴づけられる転移性メラノー
マまたは他の疾患に罹りやすいかどうかを決定するための定性的および定量的な情報を提
供する。そのような障害を有するか、または、そのような障害を引き起こしやすい対象を
、対象から得られる試験サンプルにおける上記遺伝子またはそれらの産物（ｍＲＮＡ、マ
イクロＲＮＡまたはポリペプチド）の発現レベル、発現パターンまたは発現プロフィルに
基づいて決定することができる。別の言い方をすれば、そのような産物を、障害の存在ま
たは非存在を示すためのマーカーとして使用することができる。本発明の診断アッセイお
よび予後アッセイは、そのような産物の発現レベルを評価するための様々な方法を含む。
これらの方法により、障害を検出することができる。例えば、１つまたは複数の促進因子
（すなわち、ｍｉＲ−１９９ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１９９ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１９０８およ
びＣＴＧＦ）の発現レベルにおける相対的な増大は障害の存在を暗示する。逆に、発現よ
り低いレベルまたは欠如は、障害がないことを暗示する。
試験サンプルにおけるｍＲＮＡ産物、マイクロＲＮＡ産物またはポリペプチド産物の存
在、レベルまたは非存在を、試験サンプルを試験対象から得ること、および、試験サンプ
ルを、核酸を検出することができる化合物または薬剤（例えば、ＲＮＡプローブまたはＤ
ＮＡプローブ）と、あるいは、ポリペプチドを検出することができる化合物または薬剤と
接触させることによって評価することができる。「試験サンプル」には、対象から単離さ
れる組織、細胞および生物学的流体、同様にまた、対象の体内に存在する組織、細胞およ
び流体が含まれる。目的とする遺伝子の発現のレベルを、この遺伝子によってコードされ
るＲＮＡを測定することを含めて、いくつかの方法で測定することができる。
発現したＲＮＡサンプルを、いくつかの広く知られている手順のいずれかを使用して生
物学的サンプルから単離することができる。例えば、生物学的サンプルを、グアニジウム
に基づく溶解緩衝液（これは場合により、ＲＮＡを安定化させるためのさらなる成分を含
有する）において溶解することができる。いくつかの実施形態において、溶解緩衝液は、
精製ＲＮＡを、細胞培養物からのＲＮＡの回収および安定性をモニターするためのコント
ロールとして含有することができる。そのような精製ＲＮＡテンプレートの例には、ＰＲ
ＯＭＥＧＡ（Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）から得られるカナマイシン陽性コントロールＲＮＡ
、および、ＬＩＦＥ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）から得ら
れる７．５ｋｂのポリ（Ａ）テール付加ＲＮＡが含まれる。溶解物は直ちに使用される場
合があるか、または、例えば、−８０℃で凍結保存される場合がある。
場合により、総ＲＮＡを、自動化に適合し得る９６ウエル形式での、例えば、ＲＮＥＡ
ＳＹ精製プラットフォーム（ＱＩＡＧＥＮ，Ｉｎｃ．、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）などで
のシリカに基づく単離を使用して細胞溶解物（または他のタイプのサンプル）から精製す
ることができる。他のＲＮＡ単離方法が意図される（例えば、シリカ被覆ビーズまたはグ
アニジウムを用いた抽出など）。ＲＮＡの単離および調製のためのさらなる方法が当業者
によって考案され得る。
本発明の方法は、粗サンプル（例えば、血液、血清、血漿または細胞溶解物）を使用し
て行うことができ、これにより、ＲＮＡを単離しなければならないことが排除される。Ｒ
ＮＡｓｅ阻害剤が場合により、粗サンプルに加えられる。粗細胞溶解物を使用するとき、
ゲノムＤＮＡが、サンプルに依存して、１コピー以上の標的配列（例えば、遺伝子）を与
え得ることには留意しなければならない。標的配列が１つまたは複数の高発現遺伝子に由
来する状況では、ゲノムＤＮＡから生じるシグナルは有意でない場合がある。しかし、低
いレベルで発現される遺伝子については、バックグラウンドを、サンプルをＤＮＡｓｅに
より処理することによって除くことができ、あるいは、ｃＤＮＡ産物または増幅産物のそ
の後のプライミングのためのスプライスジャンクション部を標的とするプライマーを使用
することによって除くことができる。
遺伝子に対応するＲＮＡの細胞におけるレベルを原位置およびインビトロの両方におい
て求めることができる。試験サンプルから単離されるＲＮＡを、サザン分析またはノーザ
ン分析、ＰＣＲ分析およびプローブアレイを含むハイブリダイゼーションアッセイまたは
増幅アッセイにおいて使用することができる。ＲＮＡレベルを検出するための好ましい診
断方法では、単離されたＲＮＡを、遺伝子によってコードされるＲＮＡにハイブリダイゼ
ーションすることができる核酸プローブと接触させることが伴う。プローブは、全長の核
酸またはその一部分（例えば、長さが少なくとも１０ヌクレオチドであり、かつ、ストリ
ンジェントな条件のもとでＲＮＡに特異的にハイブリダイゼーションするために十分であ
るオリゴヌクレオチドなど）であることが可能である。
１つの形式において、ＲＮＡ（または、ＲＮＡから調製されるｃＤＮＡ）が表面に固定
化され、そして、例えば、単離されたＲＮＡをアガロースゲルで泳動し、ＲＮＡをゲルか
らメンブラン（例えば、ニトロセルロースなど）に転写することによってプローブと接触
させられる。別の形式において、プローブが表面に固定化され、ＲＮＡ（またはｃＤＮＡ
）が、例えば、遺伝子チップアレイにおいてプローブと接触させられる。当業者は、既知
のＲＮＡ検出方法を、ＲＮＡのレベルを検出するために適合化することができる。
試験されることになる遺伝子によってコードされるサンプル中のＲＮＡ（または、ＲＮ
Ａから調製されるｃＤＮＡ）のレベルを、核酸増幅を用いて、例えば、標準的ＰＣＲ（米
国特許第４，６８３，２０２号）、ＲＴ−ＰＣＲ（Ｂｕｓｔｉｎ Ｓ．、Ｊ Ｍｏｌ Ｅ
ｎｄｏｃｒｉｎｏｌ、２５：１６９〜９３、２０００）、定量的ＰＣＲ（Ｏｎｇ Ｙ．他
、Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ、７：５９〜６７、２００２）、リアルタイムＰＣＲ（Ｇｉｎｚ
ｉｎｇｅｒ Ｄ．、Ｅｘｐ Ｈｅｍａｔｏｌ、３０：５０３〜１２、２００２）およびイ
ンサイチューＰＣＲ（Ｔｈａｋｅｒ Ｖ．、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ、１１５
：３７９〜４０２、１９９９）、または、いずれかの他の核酸増幅法、その後、増幅され
た分子を、この技術分野で知られている技術を使用して検出することによって評価するこ
とができる。別の実施形態において、本発明の方法はさらに、コントロールサンプルを、
遺伝子の当該ＲＮＡを検出することができる化合物または薬剤と接触させること、および
、コントロールサンプルにおける当該ＲＮＡの存在を試験サンプルにおける当該ＲＮＡの
存在と比較することを含む。
上記の方法およびマーカーは、メラノーマを発症することについての対象の危険性を評
価するために使用することができる。具体的には、本発明は、早期検出に対する不可欠な
洞察を得るように、ある種の危険性を既に有している高リスクのコホートにおける対象に
適用することができる。メラノーマに関連するｍｉＲ遺伝子産物のレベルにおける変化を
、対象の細胞における形質転換された表現型または新生物性の表現型の発達の前に、ある
いは、対象の細胞における形質転換された表現型または新生物性の表現型の発達の早期段
階において検出することができる。したがって、本発明はまた、メラノーマを発症する危
険性がある対象をスクリーニングするための方法であって、メラノーマに関連する少なく
とも１つの遺伝子産物のレベルを、または、メラノーマに関連する遺伝子産物の組合せの
レベルを対象の皮膚から得られる生物学的サンプルにおいて評価することを含む方法を提
供する。それによれば、コントロールサンプルにおける対応する遺伝子産物のレベルと比
較した場合、生物学的サンプルでの遺伝子産物または遺伝子産物の組合せのレベルにおけ
る変化により、対象はメラノーマを発症する危険性があることが示される。そのようなス
クリーニングのために使用される生物学的サンプルには、正常であるか、または、ガン性
であることが疑われるかのどちらかである皮膚組織が含まれ得る。メラノーマに関連する
１つまたは複数の遺伝子産物のレベルにおける変化を有する対象が、さらなるモニタリン
グおよび試験のための候補である。そのようなさらなる試験は、組織サンプルの組織学的
検査、または、当業者の範囲内である他の技術を含むことができる。
本明細書中で使用される場合、用語「診断」は、疾患または障害を検出すること、ある
いは、疾患または障害の病期または程度を決定することを意味する。通常、疾患または障
害の診断は、疾患を暗示する１つまたは複数の因子および／または症状を評価することに
基づく。すなわち、診断を、疾患または状態の存在または非存在を暗示する因子の存在、
非存在または量に基づいて行うことができる。特定の疾患を診断するために暗示すると見
なされるそれぞれの因子または症状は、その特定の疾患に対して排他的に関連づけられる
必要はない。すなわち、診断的な因子または症状から推測され得る鑑別診断が存在する場
合がある。同様に、特定の疾患を暗示する因子または症状が、その特定の疾患を有しない
個体に存在している場合があるかもしれない。これらの診断方法は、独立して、あるいは
、特定の疾患または障害（例えば、メラノーマ）について医療技術分野において知られて
いる他の診断方法および／または病期分類方法との組合せで使用される場合がある。
予後方法
上記で記載される診断方法により、メラノーマを有する対象、または、メラノーマを発
症する危険性がある対象を特定することができる。加えて、生物学的サンプルでの、例え
ば、末梢血サンプルでの上述の遺伝子の発現レベルおよび／または発現傾向における変化
は、回復の早期徴候またはその欠如を提供することができる。例えば、促進因子遺伝子（
または阻害剤遺伝子）のさらなる増大（または低下）または持続的に変化した遺伝子発現
レベルにより、不良な予後、すなわち、改善の欠如または健康の衰えが示される。したが
って、これらの遺伝子により、メラノーマの処置後の回復を評価することができる。この
選ばれた一群の遺伝子またはそのサブセットの分析により、状態の結末が示される。
本明細書中に記載される予後アッセイは、対象が、内皮動員、ガン細胞浸潤または転移
性血管形成を伴うメラノーマまたは他の障害を処置するために薬剤（例えば、アゴニスト
、アンタゴニスト、ペプチド模倣体、タンパク質、ペプチド、核酸、小分子または他の薬
物候補物）が投与されるために好適であるかどうかを決定するために使用することができ
る。例えば、そのようなアッセイは、対象に化学療法剤が投与され得るかどうかを決定す
るために使用することができる。
したがって、本発明によって同様に提供されるのが、細胞増殖性障害のための処置を対
象においてモニターする方法である。この目的のために、本明細書中に開示される遺伝子
の遺伝子発現レベルを、処置を受ける前に、または、処置を受けている期間中に、または
、処置を受けた後で対象からの試験サンプルについて求めることができる。ベースライン
レベルと比較されるようなそれらのレベルにおける変化の大きさがその後、評価される。
上述の促進因子遺伝子（ｍｉＲ−１９９ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１９９ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１
９０８およびＣＴＧＦ）の発現が処置後に低下していることは、対象がさらに、同じ処置
によって処置され得ることを示している。同様に、阻害剤（ＤＮＡＪＡ４、ＡｐｏＥ、Ｌ
ＲＰ１およびＬＲＰ８）における増大もまた、対象がさらに、同じ処置によって処置され
得ることを示している。逆に、促進因子遺伝子の１つまたは複数のさらなる増大または持
続的な高い発現レベルは改善の欠如または健康の衰えを示している。
上記アッセイの実施から得られる情報は、個々の対象の健康状態に影響を及ぼす疾患お
よび他の有害な状態の予後判定において、個々の対象の健康状態に影響を及ぼす疾患およ
び他の有害な状態の進行を特定することにおいて、また、個々の対象の健康状態に影響を
及ぼす疾患および他の有害な状態の臨床管理において有用である。好ましい実施形態にお
いて、前述の診断アッセイは、内皮動員、ガン細胞浸潤または転移性血管形成によって特
徴づけられるメラノーマおよび他の状態の予後判定において、内皮動員、ガン細胞浸潤ま
たは転移性血管形成によって特徴づけられるメラノーマおよび他の状態の進行を特定する
ことにおいて、また、ガン細胞浸潤または転移性血管形成によって特徴づけられるメラノ
ーマおよび他の状態の臨床管理において有用な情報を提供する。この情報は、そのような
状態を罹患対象の身体から根絶するための、すなわち、ヒトの身体から根絶するための化
学療法レジメンまたは他の処置レジメンを設計することにおいて臨床医をより具体的に助
ける。
用語「予後」は、本明細書中で使用される場合、臨床的状態または疾患の起こりそうな
経過および結末の予測を示す。予後は通常、疾患の好都合または不都合な経過または結末
を暗示する疾患の因子または症状を評価することによって行われる。表現「予後を決定す
る」は、本明細書中で使用される場合、当業者が患者における状態の経過または結末を予
測することができるプロセスを示す。用語「予後」は、状態の経過または結末を１００％
の精度により予測することができることを示さず、その代わり、当業者は、用語「予後」
が、ある特定の経過または結末が生じるであろうという増大した確率を示すことを理解す
るであろう。すなわち、経過または結末が、当該状態を示さないそのような個体と比較し
たとき、所与の状態を示す患者では生じる可能性がより大きいことを理解するであろう。
用語「好都合な予後」および用語「陽性の予後」または用語「不都合な予後」および用
語「陰性の予後」は、本明細書中で使用される場合、状態または疾患の起こりそうな経過
および／または見込みのある結末を予測することについての相対的な用語である。好都合
な予後または陽性の予後により、不都合な予後または陰性の予後よりも良好な、状態につ
いての結末が予測される。一般的な意味において、「好都合な予後」は、特定の状態に伴
い得ると思われる多くの他の可能な予後よりも相対的に良好である結末であり、これに対
して、不都合な予後は、特定の状態に伴い得ると思われる多くの他の可能な予後よりも相
対的に悪い結末を予測する。好都合な予後または陽性の予後の典型的な例には、平均より
も良好な治癒率、転移についてのより低い傾向、予想されるよりも長い平均余命、ガン性
プロセスからの良性プロセスの分化などが含まれる。例えば、陽性の予後の１つが、患者
が、処置後に特定のガンから治る５０％の確率を有する予後であり、一方、同じガンを有
する平均的な患者は、治る確率がほんの２５％にすぎない。
用語「決定する」、用語「測定する」、用語「評価する」および用語「アッセイする」
は交換可能に使用され、定量的測定および定性的測定の両方を含み、また、特性、形質ま
たは特徴が存在するか否かを決定することを含む。評価することは相対的または絶対的で
ある場合がある。標的“の存在を評価する”には、存在する標的の量を決定すること、同
様にまた、標的が存在しているか、または存在していないかどうかを決定することが含ま
れる。
アレイ
本発明において同様に提供されるのが、バイオチップまたはアレイである。バイオチッ
プ／アレイは、連結された本明細書中に記載されるプローブまたは複数のプローブを有す
る固体または半固体の基体を含有する場合がある。プローブは、ストリンジェントなハイ
ブリダイゼーション条件のもとで標的配列にハイブリダイゼーションすることができる場
合がある。プローブは、基体上の空間的に定義されたアドレスにおいて連結される場合が
ある。標的配列あたり２つ以上のプローブが使用される場合があり、但し、この場合、重
複するプローブ、または、特定の標的配列の異なる部分に対するプローブのどちらかが用
いられる。プローブは、当業者によって認められるただ１つだけの障害に関連する標的配
列にハイブリダイゼーションすることができる場合がある。プローブは最初に合成され、
続いてバイオチップに連結される場合があるか、または、バイオチップ上で直接に合成さ
れる場合があるかのどちらかである。
「連結される」または「固定化される」は、核酸（例えば、プローブ）および固体支持
体に言及するために本明細書中で使用される場合、プローブと固体支持体との間における
結合が、結合、洗浄、分析および除去の条件のもとで安定であるために十分であることを
意味する。結合は共有結合性または非共有結合性である場合がある。共有結合性の結合が
プローブと固体支持体との間に直接に形成される場合があり、あるいは、架橋剤によって
、または、特異的な反応基を固体支持体もしくはプローブのどちらかに、または両方の分
子に含むことによって形成される場合がある。非共有結合性の結合が、静電的相互作用、
親水性相互作用および疎水性相互作用の１つまたは複数である場合がある。非共有結合性
の結合に含まれるのが、ストレプトアビジンなどの分子を支持体に共有結合により連結す
ること、および、ビオチン化されたプローブをこのストレプトアビジンに非共有結合によ
り結合することである。固定化にはまた、共有結合性相互作用と非共有結合性相互作用と
の組合せが伴う場合がある。
固体基体は、プローブの連結または会合のために適切である離れた個々の部位を含有す
るように改変されることがあり、かつ、少なくとも１つの検出方法を受け入れる材料であ
ることが可能である。そのような基体の例には、ガラスおよび修飾ガラスまたは機能化ガ
ラス、プラスチック（アクリル、ポリスチレン、ならびに、スチレンおよび他の材料のコ
ポリマー、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリブチレン、ポリウレタン、Ｔｅｆｌｏｎ
Ｊなどを含む）、多糖、ナイロンまたはニトロセルロース、樹脂、シリカまたはシリカ系
材料（ケイ素および修飾ケイ素を含む）、炭素、金属、無機ガラスおよびプラスチックが
含まれる。基体は、光学的検出を、認められるほどの蛍光を生じさせることなく可能にす
る場合がある。
基体は平面状であることが可能であり、だが、他の形状の基体が同様に使用される場合
がある。例えば、プローブが、サンプル体積を最小限にするためのフロースルー型サンプ
ル分析のためにはチューブの内側表面に設置される場合がある。同様に、基体は柔軟性で
ある場合があり、例えば、特定のプラスチックから作製される独立気泡フォームを含めて
、軟質フォームなどである場合がある。
アレイ／バイオチップおよびプローブは、これら２つのその後の連結のための化学的官
能基により誘導体化される場合がある。例えば、バイオチップが、アミノ基、カルボキシ
ル基、オキソ基またはチオール基（これらに限定されない）を含む化学的官能基により誘
導体化される場合がある。これらの官能基を使用する場合、プローブは、直接に、または
、リンカーを使用して間接的にそのどちらかで、プローブ上の官能基を使用して連結され
る場合がある。プローブは、５’末端ヌクレオチド、３’末端ヌクレオチドのどちらかに
よって、または、内部ヌクレオチドを介して固体支持体に連結される場合がある。プロー
ブはまた、固体支持体に非共有結合により連結される場合がある。例えば、ビオチン化さ
れたオリゴヌクレオチドを作製することができ、この場合、このビオチン化されたオリゴ
ヌクレオチドは、共有結合によってストレプトアビジンにより被覆される表面に結合する
場合があり、これにより、連結をもたらす。代替では、プローブが、光重合およびフォト
リソグラフィーなどの技術を使用して表面において合成される場合がある。核酸を支持体
基体に連結するための様々な方法の詳細な議論を、例えば、米国特許第５８３７８３２号
、同第６０８７１１２号、同第５２１５８８２号、同第５７０７８０７号、同第５８０７
５２２号、同第５９５８３４２号、同第５９９４０７６号、同第６００４７５５号、同第
６０４８６９５号、同第６０６０２４０号、同第６０９０５５６号および同第６０４０１
３８号において見出すことができる。
いくつかの実施形態において、発現した転写物（例えば、本明細書中に記載されるマイ
クロＲＮＡ遺伝子の転写物）が核酸アレイにおいて表される。そのような実施形態におい
て、一組の結合部位が、発現した転写物の異なる配列セグメントに対して相補的である異
なる核酸を伴うプローブを含むことができる。そのような核酸の例として、１５塩基〜２
００塩基、２０塩基〜１００塩基、２５塩基〜５０塩基、４０塩基〜６０塩基の長さのも
のを挙げることができる。それぞれのプローブ配列はまた、その標的配列に対して相補的
である配列に加えて、１つまたは複数のリンカー配列を含むことができる。リンカー配列
は、その標的配列に対して相補的である配列と支持体の表面との間における配列である。
例えば、本発明の核酸アレイは、それぞれの標的マイクロＲＮＡ遺伝子に対して特異的で
ある１つのプローブを有することができる。しかしながら、所望されるならば、核酸アレ
イは、何らかの発現した転写物（例えば、本明細書中に記載されるマイクロＲＮＡ遺伝子
の転写物）に対して特異的である少なくとも２個、５個、１０個、１００個、２００個、
３００個、４００個、５００個またはそれ以上のプローブを含有することができる。
キット
別の局面において、本発明は、本明細書中に記載されるようなポリペプチドおよびマイ
クロＲＮＡの発現を分析するための方法、組成物およびシステムを具体化するキットを提
供する。そのようなキットは、本明細書中に記載される核酸を、下記のうちのいずれかま
たはすべてと一緒に含有する場合がある：アッセイ試薬、緩衝液、プローブおよび／また
はプライマー、ならびに、無菌の生理的食塩または別の医薬的に許容されるエマルション
基剤および懸濁基剤。加えて、キットは、本明細書中に記載される方法を実施するための
指示（例えば、プロトコル）を含有する説明用資料を含む場合がある。例えば、キットは
、標的ｍＲＮＡ配列または標的マイクロＲＮＡ配列の増幅、検出、特定または定量化のた
めのキットである場合がある。そのような目的を達成するために、キットは、好適なプラ
イマー（例えば、ヘアピンプライマー）、順方向プライマー、逆方向プライマーおよびプ
ローブを含有する場合がある。
一例において、本発明のキットは、複数の異なる核酸（それぞれが上述の遺伝子の１つ
に対応する）が配置されている１つまたは複数のマイクロアレイ用スライド（または代替
ではマイクロアレイフォーマット）を含む。キットはまた、複数の標識されたプローブを
含むことができる。代替では、キットは、プローブとして好適である複数のポリヌクレオ
チド配列、および、含まれているポリヌクレオチド配列または実施者の裁量での他のポリ
ヌクレオチド配列を最適化するために好適である標識の選択を含むことができる。一般に
、少なくとも１つの含まれているポリヌクレオチド配列が、コントロール配列に、例えば
、正規化遺伝子などに対応する。例示的な標識には、蛍光団、色素、放射性標識、酵素タ
グ（これらは核酸プライマーに連結される）が含まれるが、これらに限定されない。
１つの実施形態において、発現したＲＮＡサンプルに対応する核酸を増幅するために好
適であるキットが提供される。そのようなキットは、上記で記載される増幅方法のいずれ
かにおける使用のために好適である試薬およびプライマーを含む。代替では、または、加
えて、キットは、プローブと、標的核酸サンプル（例えば、マイクロアレイ上に置かれる
標的核酸サンプル）との間におけるハイブリダイゼーションに対応するシグナルを増幅す
るために好適である。
加えて、遺伝子発現分析のための生物学的サンプルを調製するために要求される１つま
たは複数の材料および／または試薬が場合によりキットに含まれる。さらには、これらの
キットに場合により含まれるものが、増幅のための必要な反応混合物を提供するための、
核酸を増幅するために好適である１つまたは複数の酵素（これには、様々なポリメラーゼ
（ＲＴ、Ｔａｑなど）が含まれる）、１つまたは複数のデオキシヌクレオチド、および、
緩衝液である。
典型的には、上記キットは、ｍＲＮＡまたはマイクロＲＮＡを開始テンプレートとして
使用して遺伝子発現パターンを分析するために用いられる。ＲＮＡテンプレートが、総細
胞ＲＮＡまたは単離ＲＮＡのどちらかとして与えられる場合がある；両方のタイプのサン
プルにより、同程度の結果がもたらされる。他の実施形態において、本発明において記載
される方法およびキットは、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡまたは他の転写産物を含めて、遺伝子発
現の他の産物の定量化を可能にする。
場合により、本発明のキットはさらに、データの生成、分析および／または保管を促進
させるための、また、データベースへのアクセスを容易にするためのソフトウエアを含む
。ソフトウエアは、データの収集、保管および／または分析において使用することができ
る論理命令、命令セットまたは好適なコンピュータープログラムを含む。データの比較分
析および関係分析が、提供されるソフトウエアを使用して可能である。
キットは場合により、それぞれの個々の試薬成分および／または酵素成分のための別個
の容器を含有する。それぞれの成分が一般に、そのそれぞれの容器において小分けされる
ように好適であろう。キットの容器には場合により、少なくとも１つのバイアル、アンプ
ルまたは試験チューブが含まれる。試薬が配置および／または小分けされ得るフラスコ、
ビンおよび他の容器機構もまた可能である。キットの個々の容器が好ましくは、商用販売
のために密封されて維持される。好適なより大きい容器には、所望されるバイアルが保持
される射出成形された、またはブロー成形されたプラスチック容器が含まれる場合がある
。説明書、例えば、本発明のキットの使用を詳述する文書化された指示またはビデオテー
プによる実演などが場合により、キットとともに提供される。
さらなる局面において、本発明は、本明細書中のいずれかの組成物またはキットの使用
、あるいは、本明細書中のいずれかの方法またはアッセイの実施、ならびに／あるいは、
本明細書中のいずれかのアッセイまたは方法を実施するためのいずれかの装置またはキッ
トの使用を提供する。
「試験サンプル」または「生物学的サンプル」は、本明細書中で使用される場合、核酸
を含む生物学的な組織または流体のサンプルを意味する場合がある。そのようなサンプル
には、動物から単離される組織または体液が含まれるが、これらに限定されない。生物学
的サンプルにはまた、組織の切片（例えば、生検サンプルおよび検死サンプルなど）、組
織学的目的のために採取された凍結切片、血液、血漿、血清、痰、便、涙液、粘液、尿、
滲出液、羊水、腹水、毛髪および皮膚が含まれる場合がある。生物学的サンプルにはまた
、患者組織に由来する外植片ならびに初代細胞培養物および／または形質転換細胞培養物
が含まれる。生物学的サンプルが、細胞のサンプルを動物から取り出すことによって提供
される場合があり、しかし、生物学的サンプルはまた、以前に単離された細胞（例えば、
別人によって、別のときに、かつ／または、別の目的のために単離された細胞）を使用す
ることによって、または、本明細書中に記載される方法をインビボにおいて行うことによ
って達成することができる。アーカイブサンプル、例えば、処置履歴または結末履歴を有
するサンプルなどもまた使用される場合がある。
用語「体液」または用語「身体流体」は、どのような流体であれ、動物の身体から得ら
れる流体を示す。体液の例には、血漿、血清、血液、リンパ液、脳脊髄液、滑液、尿、唾
液、粘液、粘液質（ｐｈｌｅｇｍ）および痰が含まれるが、これらに限定されない。体液
サンプルが、どのような方法であれ、好適な方法によって集められる場合がある。体液サ
ンプルは直ちに使用される場合があり、または、その後の使用のために貯蔵される場合が
ある。この技術分野において知られている好適な貯蔵方法はどれもが、体液サンプルを貯
蔵するために使用される場合がある：例えば、サンプルが約−２０℃〜約−７０℃で凍結
される場合がある。好適な体液が無細胞液である。「無細胞」液には、細胞が存在してい
ないか、または、決定されるｍｉＲＮＡレベルが、細胞部分ではなく、むしろ、サンプル
の液体部分におけるそのレベルを反映するような低い濃度で存在する流体サンプルが含ま
れる。そのような無細胞体液は一般に、細胞含有体液を、例えば、遠心分離またはろ過に
よって処理して、細胞を除くことによってもたらされる。典型的には、無細胞体液は無傷
の細胞を何ら含有せず、しかしながら、一部の無細胞体液は細胞断片または細胞破片を含
有する場合がある。無細胞液の例には、血漿または血清、あるいは、細胞が除かれている
体液が含まれる。
用語「遺伝子」は、本明細書中で使用される場合、転写調節配列および／または翻訳調
節配列ならびに／あるいはコード領域または非翻訳配列（例えば、イントロン、５’非翻
訳配列および３’非翻訳配列）を含む天然の遺伝子（例えば、ゲノム遺伝子）または合成
遺伝子を示す。遺伝子のコード領域は、アミノ酸配列または機能的ＲＮＡ（例えば、ｔＲ
ＮＡ、ｒＲＮＡ、触媒ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡまたはアンチセンスＲＮＡ）をコ
ードするヌクレオチド配列である場合がある。遺伝子はまた、当該コード領域に連結され
る５’非翻訳配列または３’非翻訳配列を場合により含むコード領域（例えば、エクソン
およびｍｉＲＮＡ）に対応するｍＲＮＡまたはｃＤＮＡである場合がある。遺伝子はまた
、コード領域のすべてまたは一部ならびに／あるいはコード領域に連結される５’非翻訳
配列または３’非翻訳配列を含むインビトロで作製される増幅された核酸分子である場合
がある。この用語にはまた、既知遺伝子の機能不全の類縁体である偽遺伝子で、それらの
タンパク質コード能を失っているか、または、他の場合には、細胞においてもはや発現さ
れない偽遺伝子が含まれる。
「発現プロフィル」は、本明細書中で使用される場合、ゲノムの発現プロフィルを示し
、例えば、マイクロＲＮＡの発現プロフィルを示す。プロフィルが、核酸配列のレベルを
決定するためのいずれかの好都合な手段によって、例えば、マイクロＲＮＡ、ｃＲＮＡな
どの定量的ハイブリダイゼーション、定量的ＰＣＲ、定量化のためのＥＬＩＳＡなどによ
って得られる場合があり、プロフィルは、２つのサンプルの間における示差的な遺伝子発
現の分析を可能にする場合がある。対象または患者のサンプルが、例えば、細胞またはそ
の集団が、例えば、組織がアッセイされる。サンプルが、どのような方法であれ、この技
術分野において知られているような好都合な方法によって集められる。目的とする核酸配
列は、本明細書中に記載されるものの核酸配列を含めて、予測的であることが見出される
核酸配列であり、この場合、発現プロフィルは、列記された核酸配列のすべてを含めて、
列記された核酸配列の５個、１０個、２０個、２５個、５０個、１００個またはそれ以上
についての発現データを含む場合がある。用語「発現プロフィル」はまた、核酸配列の存
在量を測定されたサンプルにおいて測定することを意味する場合がある。
「示差的発現」は、細胞および組織の内部および間における時間的な遺伝子発現パター
ンおよび／または細胞の遺伝子発現パターンにおける質的または量的な差を示す。したが
って、示差的に発現した遺伝子は質的には、例えば、疾患組織に対して正常組織において
、活性化または不活性化を含めて、変化したその発現を有する可能性がある。遺伝子は、
別の状態に対して、特定の状態において発現がオンまたはオフされる場合があり、したが
って、２つ以上の状態の比較が可能となる。質的に調節された遺伝子は、標準的な技術に
よって検出可能であるかもしれない状態内または細胞タイプ内での発現パターンを示すで
あろう。いくつかの遺伝子が、１つの状態および１つの細胞タイプの両方においてではな
く、１つの状態または１つの細胞タイプにおいて発現されるであろう。代替では、発現に
おける差は、例えば、発現が調節され、すなわち、アップレギュレーションされ、その結
果、増大した量の転写物をもたらし、または、ダウンレギュレーションされ、その結果、
低下した量の転写物をもたらすという点で、量的である場合がある。発現が異なる程度は
、標準的な特徴づけ技術により、例えば、発現アレイ、定量的逆転写酵素ＰＣＲ、ノーザ
ン分析およびＲＮａｓｅ保護などにより定量化するために十分に大きいことだけを必要と
する。
「核酸」または「オリゴヌクレオチド」または「ポリヌクレオチド」は、本明細書中で
使用される場合、共有結合により連結されて一緒になる少なくとも２個のヌクレオチドを
示す。単鎖を示すことにより、相補鎖の配列もまた定義される。したがって、核酸はまた
、示された単鎖の相補鎖を包含する。核酸の多くの変異体が、与えられた核酸と同じ目的
のために使用される場合がある。したがって、核酸はまた、実質的に同一の核酸およびそ
の相補体を包含する。単鎖により、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件のも
とで標的配列にハイブリダイゼーションすることがあるプローブが提供される。したがっ
て、核酸はまた、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件のもとでハイブリダイ
ゼーションするプローブを包含する。
核酸は一本鎖または二本鎖である場合があり、あるいは、二本鎖配列および一本鎖配列
の両方からなる部分を含有する場合がある。核酸は、ＤＮＡ（ゲノムＤＮＡおよびｃＤＮ
Ａの両方）、ＲＮＡ、または、核酸が、デオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチ
ドの組合せ、ならびに、ウラシル、アデニン、チミン、シトシン、グアニン、イノシン、
キサンチン、ヒポキサンチン、イソシトシンおよびイソグアニンを含む様々な塩基の組合
せを含むことがあるハイブリッドである場合がある。核酸が化学的合成法または組換え法
によって得られる場合がある。
用語「プライマー」は、どのような核酸であれ、相補的な核酸分子にその３’末端にお
いてハイブリダイゼーションすることができ、かつ、核酸ポリメラーゼによって伸長され
得るフリーの３’ヒドロキシ末端を提供する核酸を示す。本明細書中で使用される場合、
増幅プライマーは、遺伝子の５’領域または３’領域（プラス鎖およびマイナス鎖、それ
ぞれ、または、逆に、マイナス鎖およびプラス鎖、それぞれ）にアニーリングすることが
でき、かつ、短い領域を間に含有する１対の核酸分子である。適切な条件のもとで、かつ
、適切な試薬により、そのようなプライマーは、これらのプライマーによって挟まれるヌ
クレオチド配列を有する核酸分子の増幅を可能にする。インサイチュー法のために、細胞
サンプルまたは組織サンプルを調製し、支持体（例えば、ガラススライドなど）に固定化
し、その後、ＲＮＡにハイブリダイゼーションし得るプローブと接触させることができる
。発現したＲＮＡサンプルに対応する核酸を増幅するための代わりの方法には、例えば、
米国特許第７，８９７，７５０号に記載される方法が含まれる。
用語「プローブ」は、本明細書中で使用される場合、１つまたは複数のタイプの化学結
合を介して、通常の場合には、相補的な塩基対形成を介して、通常の場合には水素結合の
形成を介して相補的配列の標的核酸に結合することができるオリゴヌクレオチドを示す。
プローブは、ハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーに依存して、プローブ配
列との完全な相補性を欠く標的配列と結合する場合がある。標的配列と、本明細書中に記
載される一本鎖核酸との間におけるハイブリダイゼーションを妨げるであろう多くの塩基
対ミスマッチが存在する場合がある。しかしながら、変異の数が非常に多くて、ハイブリ
ダイゼーションが、最も小さいストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件のもと
でさえ生じることができないならば、その配列は相補的な標的配列ではない。プローブは
一本鎖である場合があり、または、部分的に一本鎖であり、かつ、部分的に二本鎖である
場合がある。プローブのストランド状態（ｓｔｒａｎｄｅｄｎｅｓｓ）が、標的配列の構
造、組成および性質によって決定される。プローブは、例えば、ストレプトアビジン複合
体が後で結合することがあるビオチンなどにより直接に標識される場合があり、または、
間接的に標識される場合がある。
「相補体」または「相補的」は、核酸に言及するために本明細書中に記載される場合、
核酸分子のヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログの間におけるワトソン・クリック塩
基対形成（例えば、Ａ−Ｔ／ＵおよびＣ−Ｇ）またはフーグスティーン塩基対形成を意味
する場合がある。完全な相補体または完全に相補的は、核酸分子のヌクレオチドまたはヌ
クレオチドアナログの間における１００％相補的な塩基対形成を意味する場合がある。
「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」は、本明細書中に記載される場合
、第１の核酸配列（例えば、プローブ）が、例えば、核酸の複雑な混合物などにおいて第
２の核酸配列（例えば、標的）にハイブリダイゼーションする条件を示す。ストリンジェ
ントな条件は配列依存的であり、状況毎に異なっており、当業者によって好適に選択する
ことができる。ストリンジェントな条件が、規定されたイオン強度ｐＨにおける特定の配
列についての熱的融解点（Ｔｍ）よりも約５℃〜１０℃低くなるように選択される場合が
ある。Ｔｍは、標的に対して相補的なプローブの５０％が平衡状態において標的配列にハ
イブリダイゼーションする（規定されたイオン強度、ｐＨおよび核濃度のもとでの）温度
である場合がある（標的配列は過剰に存在するので、Ｔｍにおいて、プローブの５０％が
平衡状態において使用される）。ストリンジェントな条件は、塩濃度が７．０〜８．３の
ｐＨにおいて約１．０Ｍ未満のナトリウムイオンであり、例えば、約０．０１Ｍ〜１．０
Ｍのナトリウムイオン濃度（または他の塩）などであり、かつ、温度が短いプローブ（例
えば、約１０ヌクレオチド〜５０ヌクレオチド）については少なくとも約３０℃であり、
長いプローブ（例えば、約５０ヌクレオチドを超える）については少なくとも約６０℃で
ある条件である場合がある。ストリンジェントな条件はまた、脱安定化剤（例えば、ホル
ムアミドなど）の添加によって達成される場合がある。選択的または特異的なハイブリダ
イゼーションのために、陽性シグナルは、少なくとも２倍〜１０倍のバックグラウンドハ
イブリダイゼーションである場合がある。例示的なストリンジェントなハイブリダイゼー
ション条件には、下記の条件が含まれる：４２℃でインキュベーションする場合には、５
０％のホルムアミド、５×ＳＳＣおよび１％のＳＤＳ、または、６５℃でインキュベーシ
ョンする場合には、５×ＳＳＣ、１％のＳＤＳ、これには、０．２×ＳＳＣおよび０．１
％のＳＤＳにおける６５℃での洗浄が伴う。しかしながら、温度以外のいくつかの要因、
例えば、塩濃度などが、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響を及ぼす可
能性があり、当業者は、類似するストリンジェンシーを達成するための様々な要因を好適
に選択することができる。
本明細書中で使用される場合、用語「参照値」は、アッセイ結果に対して比較されたと
き、特定の結末に対して統計学的に相関する値を示す。好ましい実施形態において、参照
値が、マイクロＲＮＡの発現を既知の臨床的結末と比較する研究の統計学的分析から決定
される。参照値が閾値スコア値またはカットオフスコア値である場合がある。典型的には
、参照値は、超えた場合（または下回った場合）には１つの結末がより確実であり、かつ
、下回った場合には代わりの閾値がより確実である閾値であろう。
１つの実施形態において、参照レベルが、健康な（疾患非存在の）対象からなるコント
ロール集団から採取されるサンプルから得られる循環ｍｉＲＮＡのレベルの平均として表
される１つまたは複数の循環ｍｉＲＮＡレベルである場合がある。別の実施形態において
、参照レベルは、異なる時点での、例えば、アッセイ前での同じ対象におけるレベル、例
えば、対象が疾患を発症する前に求められるレベル、または、治療を開始する前に求めら
れるレベルなどである場合がある。一般に、サンプルは共通の因子によって正規化される
。例えば、無細胞体液サンプルが体液量によって正規化され、細胞含有サンプルがタンパ
ク質含有量または細胞数によって正規化される。核酸サンプルはまた、内部コントロール
核酸に対して正規化される場合がある。
本明細書中に開示されるように、１つまたは複数のポリペプチドまたはＲＮＡ（ｍＲＮ
ＡまたはマイクロＲＮＡ）のレベルの差により、疾患またはその段階が暗示される。表現
「レベルの差」は、コントロールレベルまたは参照レベルに対して比較されるような、サ
ンプル中の特定のマーカー（例えば、核酸など）の量における違いを示す。例えば、特定
のバイオマーカーの量が、参照レベルと比較して、新生物疾患を有する患者のサンプルに
おいて、上昇した量で、または、低下した量で存在する場合がある。１つの実施形態にお
いて、「レベルの差」が、少なくとも約１％、２％、３％、５％、１０％、１５％、２０
％、２５％、３０％、３５％、４０％、５０％、６０％、７５％、８０％ １００％、１
５０％、２００％またはそれ以上である、コントロール（例えば、参照値）に対して比較
されるようなサンプルに存在する特定のバイオマーカーとの間における差である場合があ
る。１つの実施形態において、「レベルの差」が、コントロールに対して比較されるよう
なサンプルに存在するバイオマーカーの量の間における統計学的に有意な差である場合が
ある。例えば、バイオマーカーの測定されたレベルが、いずれかのコントロール群または
参照群の平均の約１．０標準偏差から、約１．５標準偏差から、約２．０標準偏差から、
または、約２．５標準偏差からはずれているならば、差が統計学的に有意な差である場合
がある。ｍｉＲＮＡ測定に関して、レベルが、Ｃｔ値としてリアルタイムＰＣＲから測定
される場合があり、この場合、Ｃｔ値は、下記の実施例において記載されるようなΔＣｔ
値に対して正規化される場合がある。
薬物スクリーニング
本発明は、メラノーマを処置するために、あるいは、内皮動員、細胞浸潤または転移性
血管形成を阻害するために有用である化合物を特定するための方法を提供する。
スクリーニングされるための候補化合物（例えば、タンパク質、ペプチド、ペプチド模
倣体、ペプトイド、抗体、小分子または他の薬物）を、数多くの取り組みのいずれかをこ
の技術分野において知られているコンビナトリアルライブラリー方法において使用して得
ることができる。そのようなライブラリーには、下記のライブラリーが含まれる：ペプチ
ドライブラリー、ペプトイドライブラリー（ペプチドの機能性を有し、しかし、酵素分解
に対して抵抗性である新規な非ペプチド骨格を有する分子のライブラリー）、空間的にア
ドレス指定可能な並列固相ライブラリーまたは液相ライブラリー、デコンボルーションま
たはアフィニティークロマトグラフィー選抜によって得られる合成ライブラリー、および
、「一ビーズ一化合物」ライブラリー。例えば、Ｚｕｃｋｅｒｍａｎｎ他、１９９４、Ｊ
．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．、３７：２６７８〜２６８５、および、Ｌａｍ、１９９７、Ａｎｔ
ｉｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓ．、１２：１４５を参照のこと。分子ライブラリーを
合成するための様々な方法の例を、例えば、ＤｅＷｉｔｔ他、１９９３、ＰＮＡＳ ＵＳ
Ａ、９０：６９０９；Ｅｒｂ他、１９９４、ＰＮＡＳ ＵＳＡ、９１：１１４２２；Ｚｕ
ｃｋｅｒｍａｎｎ他、１９９４、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．、３７：２６７８；Ｃｈｏ他、
１９９３、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２６１：１３０３；Ｃａｒｒｅｌｌ他、１９９４、Ａｎｇｅ
ｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．、３３：２０５９；Ｃａｒｅｌｌ他、１９９４
、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．、３３：２０６１；およびＧａｌｌ
ｏｐ他、１９９４、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．、３７：１２３３において見出すことができ
る。化合物のライブラリーが溶液で提示される場合があり（例えば、Ｈｏｕｇｈｔｅｎ、
１９９２、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、１３：４１２〜４２１）、あるいは、ビーズ（
Ｌａｍ、１９９１、Ｎａｔｕｒｅ、３５４：８２〜８４）、チップ（Ｆｏｄｏｒ、１９９
３、Ｎａｔｕｒｅ、３６４：５５５〜５５６）、細菌（米国特許第５，２２３，４０９号
）、胞子（米国特許第５，２２３，４０９号）、プラスミド（Ｃｕｌｌ他、１９９２、Ｐ
ＮＡＳ ＵＳＡ、８９：１８６５〜１８６９）またはファージ（ＳｃｏｔｔおよびＳｍｉ
ｔｈ、１９９０、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４９：３８６〜３９０；Ｄｅｖｌｉｎ、１９９０、
Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４９：４０４〜４０６；Ｃｗｉｒｌａ他、１９９０、ＰＮＡＳ ＵＳ
Ａ、８７：６３７８〜６３８２；Ｆｅｌｉｃｉ、１９９１、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２
２２：３０１〜３１０；ならびに米国特許第５，２２３，４０９号）において提示される
場合がある。
有用な化合物を特定するために、試験化合物を、上述の転移促進因子または転移抑制因
子から選択されるマーカー遺伝子のプロモーターに作動可能に連結される核酸によってコ
ードされるレポーター遺伝子を発現する試験細胞を含有する系と接触させることができる
。この系はインビトロ細胞株モデルまたはインビボ動物モデルであることが可能である。
細胞は上記遺伝子を自然の状態で発現することができ、または、組換え核酸を発現するよ
うに改変することができる。組換え核酸は、異種プロモーターに対するレポーターポリペ
プチドをコードする核酸を含有することができる。その後、ｍｉＲＮＡ、ポリペプチドま
たはレポーターポリペプチドの発現レベルが測定される。
ポリペプチドについては、発現レベルをｍＲＮＡレベルまたはタンパク質レベルのどち
らにおいてでも決定することができる。細胞、組織サンプルまたは体液におけるｍＲＮＡ
レベルを測定する様々な方法がこの技術分野では広く知られている。ｍＲＮＡレベルを測
定するために、細胞を溶解することができ、かつ、溶解物におけるｍＲＮＡのレベルを、
あるいは、溶解物から精製または半精製されるＲＮＡにおけるｍＲＮＡのレベルを、例え
ば、ハイブリダイゼーションアッセイ（検出可能に標識された遺伝子特異的なＤＮＡプロ
ーブまたはＲＮＡプローブを使用する）、および、定量的または半定量的なＲＴ−ＰＣＲ
（適切な遺伝子特異的プライマーを使用する）によって決定することができる。代替では
、定量的または半定量的なインサイチューハイブリダイゼーションアッセイを、組織切片
または非溶解細胞懸濁物および検出可能に（例えば、蛍光または酵素）標識されたＤＮＡ
プローブまたはＲＮＡプローブを使用して行うことができる。さらなるｍＲＮＡ定量化方
法には、ＲＮＡ保護アッセイ（ＲＰＡ）およびＳＡＧＥが含まれる。タンパク質レベルを
細胞サンプルまたは組織サンプルにおいて測定する方法もまたこの技術分野において知ら
れている。
メラノーマを処置するための、あるいは、内皮動員、細胞浸潤または転移性血管形成を
阻害するための候補化合物の有効性を決定するために、上記で記載される様式で得られる
レベルを、コントロールレベル（例えば、候補化合物の非存在下で得られるレベル）と比
較することができる。化合物は、（ｉ）転移抑制因子のレベルがコントロール値または参
照値よりも低いならば、あるいは、（ｉｉ）転移促進因子のレベルがコントロール値また
は参照値よりも高いならば、効果的であるとして特定される。このようにして特定される
化合物の効力を、下記の実施例において開示されるようなインビトロ細胞培養モデルまた
はインビボ動物モデルを使用してさらに確認することができる。
実施例１ 材料および方法
本実施例は、下記の実施例２〜実施例１１において使用される材料および方法を記載す
る。
化合物
Figure 2022001571
動物研究
すべてのマウス実験を、ロックフェラー大学における施設内動物管理使用委員会（ＩＡ
ＣＵＣ）によって承認されるプロトコルに従って行った。６週齢〜８週齢の週齢一致およ
び性一致のマウスを、以前に記載されたように原発性腫瘍の成長アッセイおよび転移アッ
セイのために使用した（Ｍｉｎｎ他、２００５；Ｔａｖａｚｏｉｅ他、２００８）。拡張
された実験手順を参照のこと。
細胞培養
すべてのガン細胞株を以前に記載されたように培養した（Ｔａｖａｚｏｉｅ他、２００
８）。２９３Ｔ細胞およびヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を標準的な条件で維持し
た。細胞株およびインビトロでの機能的アッセイにおけるｍｉＲＮＡ研究および遺伝子ノ
ックダウン／過剰発現研究が、拡張された実験手順において詳述される。
マイクロアレイハイブリダイゼーション
様々な高転移性派生物にわたって脱調節されるｍｉＲＮＡを特定するために、小さいＲ
ＮＡを、ＭｅＷｏ細胞株およびＡ３７５細胞株に由来する総ＲＮＡから濃縮し、ＬＣ Ｓ
ｃｉｅｎｃｅｓによるプロファイリングに供した。ｍｉＲ−１９９ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１
９９ａ−５ｐおよびｍｉＲ−１９０８の潜在的な遺伝子標的を特定するために、ＭｅＷｏ
細胞株から得られる総ＲＮＡがロックフェラー大学ゲノミクスコア施設によって標識され
、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＨＴ−１２ ｖ３ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ＢｅａｄＣｈｉｐアレ
イへのハイブリダイゼーションに供された。ｍｉＲＮＡ標的およびｍＲＮＡ標的に到達す
るために使用される閾値および判断基準については、拡張された実験手順を参照のこと。
ヒトメラノーマ皮膚病変部におけるｍｉＲＮＡ発現の分析
本研究で使用されるすべてのヒト臨床サンプルをＩＲＢ指針に従って得て、処理し、分
析した。総ＲＮＡを、ＭＳＫＣＣにおいて以前に患者から切除された原発性メラノーマ皮
膚病変部のパラフィン包埋された断面切片から抽出し、特異的なｍｉＲＮＡの発現レベル
を、ＴａｑＭａｎ ｍｉＲＮＡ Ａｓｓａｙｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ
）を使用して盲検様式で分析した。それぞれの患者の転移非存在生存データを原発性腫瘍
のｍｉＲＮＡ発現値の関数として表すカプラン・マイヤー曲線を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐ
ｒｉｓｍソフトウエアパッケージを使用して作製した。
インビボＬＮＡ治療
４×１０４個のＭｅＷｏ−ＬＭ２細胞を尾静脈注入した後、ＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスを
、０．１ｍＬのＰＢＳにおいて送達される１２．５ｍｇ／ｋｇの組合せ用量での、ｍｉＲ
−１９９ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１９９ａ−５ｐおよびｍｉＲ−１９０８に対してアンチセン
スであるインビボ最適化ＬＮＡ（Ｅｘｉｑｏｎ）により４週間にわたって週に２回、静脈
内投与により処置した。
組織学
全体的な巨視的転移性結節可視化のために、５μｍの厚さの肺組織切片をＨ＆Ｅ染色し
た。インビボでの内皮含有量分析のために、肺切片を、ＭＥＣＡ−３２に対する抗体（Ｄ
ｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｓｔｕｄｉｅｓ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ Ｂａｎｋ、Ｔｈｅ
Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｉｏｗａ、ＩＡ）（これはマウスの内皮細胞を標識する）
と、ヒトビメンチンに対する抗体（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）（これは
ヒトのメラノーマ細胞を標識する）とにより二重染色した。拡張された実験手順を参照の
こと。
データ分析
すべてのデータが平均±ＳＥＭとして表される。コルモゴロフ・スミルノフ検定を使用
して、転移性血管密度累積分布における差の有意性を求めた。転移の結末を予測するｍｉ
ＲＮＡの予後力を、マンテル・コックス・ログランク検定を使用して有意性について検定
した。片側マン・ホィットニーｔ検定を使用して、非ガウス型のバイオルミネセンス測定
値についての有意性値を求めた。すべての他の比較のために、片側スチューデントｔ検定
を使用した。０．０５未満のｐ値を、統計学的に有意であると見なした。
インビボ選抜、実験的転移および原発性腫瘍成長アッセイ
すべてのマウス実験を、ロックフェラー大学における施設内動物管理使用委員会（ＩＡ
ＣＵＣ）によって承認されるプロトコルに従って行った。多数の転移性派生物を２つの独
立したヒトメラノーマ細胞株から生じさせるために、インビボ選抜を以前に記載されたよ
うに行った（Ｍｉｎｎ他、２００５、Ｎａｔｕｒｅ、４３６、５１８〜５２４；Ｐｏｌｌ
ａｃｋおよびＦｉｄｌｅｒ、１９８２、Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．、６９
、１３７〜１４１）。簡単に記載すると、１×１０６個の色素沈着ＭｅＷｏメラノーマ親
細胞または色素非沈着Ａ３７５メラノーマ親細胞を０．１ｍＬのＰＢＳに再懸濁し、６週
齢〜８週齢の免疫低下ＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスに静脈内注入した。肺転移物が形成された
後、結節を分離し、細胞をインビトロ増殖させ、これにより、第１世代の肺転移性派生物
（ＬＭ１）を生じさせた。その後、ＬＭ１細胞を、２×１０５個の細胞をＮＯＤ−ＳＣＩ
Ｄマウスに尾静脈を介して注入することによるもう１回のインビボ選抜に供し、これによ
り、転移性結節を生じさせ、その後の分離により、第２世代の肺転移性派生物（ＬＭ２）
を得た。Ａ３７５細胞株については、３回目のインビボ選抜を行い、これにより、高転移
性のＡ３７５−ＬＭ３派生物を得た。
転移をバイオルミネセンス画像化によりインビボにおいてモニターするために、Ａ３７
５親細胞およびＭｅＷｏ親細胞ならびにそれらの転移性派生物を、ルシフェラーゼレポー
ターを発現するレトロウイルス構築物により形質導入した（Ｐｏｎｏｍａｒｅｖ他、２０
０４、Ｅｕｒ Ｊ Ｎｕｃｌ Ｍｅｄ Ｍｏｌ Ｉｍａｇｉｎｇ、３１、７４０〜７５１
）。すべての転移実験のために、肺または全身でのコロニー形成を以前に記載されたよう
に非浸襲性バイオルミネセンス画像化により経時的にモニターし、定量化した（Ｍｉｎｎ
他、２００５）。インビボ選抜が達成されたかどうかを明らかにするために、４×１０４
個のＭｅＷｏ親細胞またはＭｅＷｏ−ＬＭ２細胞および１×１０５個のＡ３７５親細胞ま
たはＡ３７５−ＬＭ３細胞を０．１ｍＬのＰＢＳに再懸濁し、６週齢〜８週齢のＮＯＤ−
ＳＣＩＤマウスに外側尾静脈を介して注入した。肺でのコロニー形成に対する推定される
促進因子ｍｉＲＮＡの影響を調べる実験的転移アッセイのために、ｍｉＲ−１９９ａ、ｍ
ｉＲ−１９０８、ｍｉＲ−２１４またはコントロールヘアピンを過剰発現する４×１０４
個のＭｅＷｏ親細胞、ｍｉＲ−１９９ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１９９ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１９
０８またはコントロール配列の発現が沈黙させられる４×１０４個のＭｅＷｏ−ＬＭ２細
胞、および、ｍｉＲ−１９９ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１９９ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１９０８また
はコントロール配列について阻害される２×１０５個のＡ３７５−ＬＭ３細胞を０．１ｍ
ＬのＰＢＳに再懸濁し、６週齢〜８週齢のＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスに尾静脈注入した。エ
ピスタシス実験のために、ＡｐｏＥ、ＤＮＡＪＡ４またはコントロール配列を標的化する
ｓｈＲＮＡを発現する、あるいは、ＬＲＰ１またはコントロール配列をｍｉＲＮＡ阻害の
状況で阻害するｓｉＲＮＡを発現する１×１０５個のＭｅＷｏ−ＬＭ２細胞を６週齢〜８
週齢のＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスに静脈内注入した。ＡｐｏＥ前処置実験のために、ＭｅＷ
ｏ−ＬＭ２細胞をＡｐｏＥまたはＢＳＡの１００μｇ／ｍＬでの存在下において３７℃で
インキュベーションした。２４時間後、４×１０４個の細胞を７週齢のＮＯＤ−ＳＣＩＤ
マウスに尾静脈を介して注入した。高転移性メラノーマ細胞を、ｍｉＲ−１９９ａ−３ｐ
、ｍｉＲ−１９９ａ−５ｐおよびｍｉＲ−１９０８を標的化するＬＮＡにより前処置する
ことの、転移に対する影響を明らかにするために、ＭｅＷｏ−ＬＭ２細胞を、それぞれの
ＬＮＡにより個々に、３つすべてのｍｉＲＮＡを標的化するＬＮＡのカクテルにより、ま
たは、コントロールＬＮＡによりトランスフェクションした。４８時間後、１×１０５個
の細胞（０．１ｍＬのＰＢＳに再懸濁される）を肺での転移性コロニー形成の研究のため
に７週齢のＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスに静脈内投与し、または、全身的な転移アッセイのた
めに７週齢の無胸腺ヌードマウスに心臓内注入により投与した。転移に対するＡｐｏＥの
遺伝的欠失の影響を明らかにするために、８週齢のＣ５７ＢＬ／６−ＷＴマウスまたはＣ
５７ＢＬ／６−ＡｐｏＥ−／−マウスに、５×１０４個のＢ１６Ｆ１０マウスメラノーマ
細胞を静脈内注入した。原発性腫瘍成長の研究のために、ｍｉＲ−１９９ａ、ｍｉＲ−１
９０８またはコントロールヘアピンを過剰発現する１×１０６個の親ＭｅＷｏ細胞をマト
リゲルと１：１で混合し、６週齢の免疫不全ＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスの下部右側わき腹に
皮下注入した。動物を腫瘍形成について毎週触診し、腫瘍形成後、かなり大きい腫瘍を週
に２回測定した。腫瘍体積を、（最少直径）２×（最大直径）／２として計算した。
レンチウイルスによるｍｉＲＮＡ阻害および遺伝子ノックダウン
２９３Ｔ細胞を１０ｃｍのプレートに播種し、６０％のコンフルエンシーを達成させた
。トランスフェクションに先立って、細胞培地を、１０％のＦＢＳが補充される新鮮な抗
生物質非含有ＤＭＥＭ培地により取り換えた。６μｇのベクターＡ、１２μｇのベクター
Ｋ、および、１２μｇの適切なｍｉＲ−Ｚｉｐ（Ｓｙｓｔｅｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ
、Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ、ＣＡ）またはｓｈＲＮＡプラスミド構築物（ＭＳＫＣＣ
ＨＴＳ Ｃｏｒｅ Ｆａｃｉｌｉｔｙ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹ）を、６０μＬのＴｒ
ａｎｓＩＴ−２９３トランスフェクション試薬（ＭＩＲ ２７００、Ｍｉｎｉｓ Ｂｉｏ
ＬＬＣ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を使用して共トランスフェクションした。細胞を３７
℃で４８時間インキュベーションし、ウイルスを、細胞培地を２０００ｇで１０分間遠心
分離し、その後、０．４５μｍのフィルターによるウイルスろ過を行うことによって集め
た。１×１０５個のガン細胞を、１０μｇ／ｍＬのポリブレン（ＴＲ−１００３−Ｇ、Ｍ
ｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）の存在下で６時間、２ｍＬの適切なウイ
ルスにより形質導入した。４８時間後、２μｇ／ｍＬのピューロマイシン（Ｐ８８３３、
Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）をレンチウイルス選抜のために
細胞培地に加えた。細胞をピューロマイシン選抜の状態で７２時間保った。下記のｍｉＲ
−Ｚｉｐ配列を使用した：
miR-Zip- 199a-3p:5'-GATCCGACAGTAGCCTGCACATTAGTCACTTCCTGTCAGTAACCAATGTGCAGACTACTG
TTTTTTGAATT-3'

miR-Zip- 199a-5p: 5'-GATCCGCCCAGTGCTCAGACTACCCGTGCCTTCCTGTCAGGAACAGGTAGTCTGAACAC
TGGGTTTTTGAATT-3'

miR-Zip-1908 5'-GATCCGCGGCGGGAACGGCGATCGGCCCTTCCTGTCAGGACCAATCGCCGTCC CCGCCGTTTT
TGAATT-3'

下記のｓｈＲＮＡ配列を使用した：

shAPOE1:
5'CCGGGAAGGAGTTGAAGGCCTACAACTCGAGTTGTAGGCCTTCAACTCCTTCTTTTT3'

shAPOE2:
5'CCGGGCAGACACTGTCTGAGCAGGTCTCGAGACCTGCTCAGACAGTGTCTGCTTTTT3'

shDNAJA41:
5'CCGGGCGAGAAGTTTAAACTCATATCTCGAGATATGAGTTTAAACTTCTCGCTTTTT3'

shDNAJA42:
5'CCGGCCTCGACAGAAAGTGAGGATTCTCGAGAATCCTCACTTTCTGTCGAGGT TTTT3'

レトロウイルスによるｍｉＲＮＡおよび遺伝子の過剰発現
６μｇのベクターＶＳＶＧ、１２μｇのベクターＧａｇ−Ｐｏｌ、および、ヒトＡｐｏ
Ｅ、ＤＮＡＪＡ４のコード配列を含有する１２μｇのｐＢａｂｅプラスミド、または、空
のベクター、あるいは、ｍｉＲ−１９９ａ、ｍｉＲ−２１４、ｍｉＲ−１９０８またはコ
ントロールヘアピンの前駆体配列を含有するｍｉＲ−Ｖｅｃを、６０％コンフルエンスの
２９３Ｔ細胞に、６０μＬのＴｒａｎｓＩＴ−２９３トランスフェクション試薬を使用し
て共トランスフェクションした。細胞を３７℃で４８時間インキュベーションし、その後
、ウイルスを集め、１０μｇ／ｍＬのポリブレンの存在下で６時間、ガン細胞に形質導入
した。４８時間後、２μｇ／ｍＬのピューロマイシンまたは１０μｇ／ｍＬのブラストサ
イジン（１５２０５、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）をレトロ
ウイルス選抜のために細胞培地に加えた。細胞を、ピューロマイシン選抜の状態で７２時
間、または、ブラストサイジン選抜の状態で７日間保った。下記のクローニング用プライ
マーをＡｐｏＥおよびＤＮＡＪＡ４のコード配列の過剰発現のために使用した：
ApoE CDS Fwd: 5'-TCATGAGGATCCATGAAGGTTCTGTGGGCT-3'
ApoE CDS Rev: 5' -T AGC AG AATTCTC AGTGATTGTCGCTGGG-3'
DNAJA4 CDS Fwd: 5'-ATCCCTGGATCCATGTGGGAAAGCCTGACCC-3'
DNAJA4 CDS Rev: 5'-TACCATGTCGACTCATGCCGTCTGGCACTGC-3'

ＬＮＡに基づくｍｉＲＮＡノックダウン
成熟型ｍｉＲ−１９９ａ−３ｐ、成熟型ｍｉＲ−１９９ａ−５ｐ、成熟型ｍｉＲ−１９
０８またはコントロール配列に対して相補的なＬＮＡ（それぞれ４２６９１７−００、４
２６９１８−００、４２６８７８−００および１９９００５０；Ｅｘｉｑｏｎ、Ｖｅｄｂ
ａｅｋ、デンマーク）を、抗生物質非含有培地で培養された５０％コンフルエンスのＭｅ
Ｗｏ−ＬＭ２ガン細胞に、リポフェクタミン（商標）２０００トランスフェクション試薬
（１１６６８−０９、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を使用して５０
ｎＭの最終濃度でトランスフェクションした。８時間後、トランスフェクション培地を新
鮮な培地により取り換えた。４８時間後、１×１０５個の細胞を、肺での転移性コロニー
形成を評価するためにＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスに静脈内注入し、または、全身転移を評価
するために無胸腺ヌードマウスに心臓内注入により注入した。細胞浸潤および内皮動員の
インビトロアッセイのために、細胞をトランスフェクション後９６時間で使用した。
ｓｉＲＮＡに基づくｍＲＮＡノックダウン
ＬＲＰ１、ＬＲＰ８、ＶＬＤＬＲ、ＬＤＬＲまたはコントロール配列を標的化するｓｉ
ＲＮＡを、ガン細胞またはＨＵＶＥＣに、リポフェクタミン（商標）２０００トランスフ
ェクション試薬を使用して１００ｎＭの最終濃度でトランスフェクションした。５時間後
、トランスフェクション培地を新鮮な培地により取り換えた。細胞をトランスフェクショ
ン後９６時間でマトリゲル浸潤アッセイおよび内皮動員アッセイに供した。ＬＲＰ１また
はコントロール配列をｍｉＲＮＡ阻害の状況で標的化するｓｉＲＮＡにより形質導入され
る細胞を、トランスフェクション後７２時間での肺でのコロニー形成アッセイのために尾
静脈注入した。コントロールの非標的化ｓｉＲＮＡをＤｈａｒｍａｃｏｎから得た。下記
のＬＲＰ１標的配列およびＬＲＰ８標的配列を使用した：
siLRP11: 5'-CGAGGACGAUGACUGCUUA-3';
siLRP12: 5'-GCUAUGAGUUUAAGAAGUU-3';
S1LRP81:5 '-CGAGGACGAUGACUGCUUA-3';
siLRP82: 5'-GAACUAUUCACGCCUCAUC-3'.
細胞増殖アッセイ
ｍｉＲ−１９９ａまたはｍｉＲ−１９０８の過剰発現およびコンビナトリアルＬＮＡ誘
導のｍｉＲＮＡ阻害の細胞増殖に対する影響を明らかにするために、２．５×１０４個の
細胞を三連で６ウエルプレートに播種し、生細胞を５日後に計数した。組換えＡｐｏＥの
添加のメラノーマ細胞増殖または内皮細胞増殖に対する影響を評価するために、３×１０
４個のメラノーマＭｅＷｏ−ＬＭ２細胞または内皮細胞をＡｐｏＥ（１００μＭ）または
ＢＳＡ（１００μＭ）の存在下でインキュベーションした。生細胞を、８時間後、２４時
間後、４８時間後、７２時間後および１２０時間後に計数した。
マトリゲル浸潤アッセイ
ガン細胞を、ＦＢＳが０．２％のＤＭＥＭ系培地における１２時間の血清飢餓に供した
。トランスウエル浸潤チャンバー（３５４４８０、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｂｅ
ｄｆｏｒｄ、ＭＡ）を、０．５ｍＬの飢餓培地を上部チャンバーおよび底部チャンバーに
加えることによってアッセイ開始前に事前に平衡化させた。３０分後、上部チャンバー内
の培地を除き、１×１０５個のガン細胞を含有する０．５ｍＬの培地をそれぞれのマトリ
ゲル被覆トランスウエル挿入物の中に加え、３７℃で２４時間インキュベーションした。
中和抗体実験および／または組換えタンパク質実験のために、抗体／組換えタンパク質を
、図に示されるような下記の濃度でアッセイ開始時にそれぞれのウエルに加えた：５μｇ
／ｍＬ〜４０μｇ／ｍＬの抗ＡｐｏＥ １Ｄ７（Ｈｅａｒｔ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｕｎ
ｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｏｔｔａｗａ）、５μｇ／ｍＬ〜４０μｇ／ｍＬの抗ＩｇＧ（
ＡＢ−１０８−Ｃ、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）、１００
μＭの組換えヒトＡｐｏＥ３（４６９６、Ｂｉｏ Ｖｉｓｉｏｎ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖ
ｉｅｗ、ＣＡ）および１００μＭのＢＳＡ（Ａ２１５３、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）
。アッセイが完了したとき、マトリゲル被覆挿入物をＰＢＳにより洗浄し、それぞれの挿
入物の上部面における細胞をかき取り、挿入物を４％パラホルムアルデヒドにおいて１５
分間、固定処理した。その後、挿入物を切り出し、ＤＡＰＩ（Ｈ−１０００、Ｖｅｃｔｏ
ｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、ＣＡ）を含有するＶｅｃｔａＳ
ｈｉｅｌｄ固定用媒体を使用してスライドに固定した。それぞれの挿入物の基部面を、倒
立型蛍光顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ Ａｘｉｏｖｅｒｔ ４０ ＣＦＬ）を５×の倍率で使用し
て画像化し、これにより、３枚の代表的な画像をそれぞれの挿入物について撮影した。浸
潤した細胞の数を、ＩｍａｇｅＪ（ＮＩＨ）を使用して定量化した。
内皮動員アッセイ
５×１０４個のガン細胞をアッセイ開始のおよそ２４時間前に２４ウエルプレートに播
種した。ＨＵＶＥＣを８０％のコンフルエンシーに成長させ、０．２％のＦＢＳが補充さ
れるＥＧＭ−２培地における１６時間の血清飢餓に供した。その後、ＨＵＶＥＣを、Ｃｅ
ｌｌ Ｔｒａｃｋｅｒ Ｒｅｄ ＣＭＴＰＸ色素（Ｃ３４５５２、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ
）により４５分間パルス処理した。その間に、ガン細胞をＰＢＳにより洗浄し、ＦＢＳが
０．２％のＥＧＭ−２培地の０．５ｍＬをそれぞれのウエルに加え、３．０μｍのＨＴＳ
Ｆｌｕｏｒｏｂｌｏｃｋ挿入物（３５１１５１、ＢＤ Ｆａｌｃｏｎ、Ｓａｎ Ｊｏｓ
ｅ、ＣＡ）をそれぞれのウエルの中に置いた。１×１０５個のＨＵＶＥＣ（０．５ｍＬの
飢餓培地に再懸濁される）をそれぞれのトランスウエル挿入物の中に播種し、動員アッセ
イを３７℃で１６時間〜１８時間にわたって進行させた。中和抗体実験および／または組
換えタンパク質実験のために、その後、抗体／タンパク質を、図に示されるような下記の
適切な濃度でそれぞれのウエルに加えた：４０μｇ／ｍＬの抗ＡｐｏＥ １Ｄ７、４０μ
ｇ／ｍＬの抗ＩｇＧ、１００μΜのｒｈＡｐｏＥ３および１００μΜのＢＳＡ。アッセイ
が完了したとき、挿入物を上記のマトリゲル浸潤アッセイについて記載されるように処理
し、分析した（マトリゲル浸潤アッセイを参照のこと）。
内皮遊走アッセイ
血清飢餓に供されたＨＵＶＥＣを、Ｃｅｌｌ Ｔｒａｃｋｅｒ Ｒｅｄ ＣＭＴＰＸ色
素により４５分間パルス処理し、それぞれの挿入物につき０．５ｍＬの飢餓培地における
１×１０５個のＨＵＶＥＣの濃度でＨＴＳ Ｆｌｕｏｒｏｂｌｏｃｋトランスウエル挿入
物の中に播種した。アッセイを３７℃で１６時間〜１８時間にわたって進行させ、挿入物
を上記で記載されるように処理し、分析した（マトリゲル浸潤アッセイを参照のこと）。
走化性アッセイ
ＨＵＶＥＣを、ＦＢＳが０．２％のＥＧＭ−２培地における１６時間の血清飢餓に供し
、Ｃｅｌｌ Ｔｒａｃｋｅｒ Ｒｅｄ ＣＭＴＰＸ色素により４５分間標識した。その間
に、示された量（１μｇ〜５μｇ）の組換えヒトＡｐｏＥ３またはＢＳＡを２５０μＬの
マトリゲル（３５６２３１、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）と混合し、２４ウエルプレ
ートの底部において３０分間固化させた。その後、０．２％のＦＢＳを含有する２５０μ
ＬのＨＵＶＥＣ ＥＧＭ−２培地をそれぞれのマトリゲル被覆ウエルに加え、３．０μＭ
のＨＴＳ Ｆｌｕｏｒｏｂｌｏｃｋ挿入物をそれぞれのウエルの中にはめ込んだ。１×１
０５個のＨＵＶＥＣ（０．５ｍＬの飢餓培地に再懸濁される）をそれぞれの挿入物の中に
播種し、マトリゲルの勾配に沿って３７℃で１６時間〜１８時間にわたって遊走させた。
アッセイが完了したとき、挿入物を上記で記載されるようにスライドに固定し、分析した
（マトリゲル浸潤アッセイを参照のこと）。
内皮接着アッセイ
ＨＵＶＥＣを６ウエルプレートに播種し、単層を形成させた。ガン細胞を、ＦＢＳが０
．２％のＤＭＥＭ系培地における３０分間の血清飢餓に供し、Ｃｅｌｌ Ｔｒａｃｋｅｒ
Ｇｒｅｅｎ ＣＭＦＤＡ色素（Ｃ７０２５、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）により４５分間パ
ルス処理した。２×１０５個のガン細胞（０．５ｍＬの飢餓培地に再懸濁される）をそれ
ぞれの内皮単層の上に播種した。ガン細胞をＨＵＶＥＣ単層に３７℃で３０分間接着させ
た。その後、内皮単層をＰＢＳにより穏やかに洗浄し、４％パラホルムアルデヒドにより
１５分間、固定処理した。その後、それぞれのウエルをＰＢＳにより覆い、８枚の画像を
、倒立型蛍光顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ Ａｘｉｏｖｅｒｔ ４０ ＣＦＬ）を１０×の倍率で
使用してそれぞれの内皮単層について撮影した。ＨＵＶＥＣに接着しているガン細胞の数
を、ＩｍａｇｅＪを使用して定量化した。
アノイキスアッセイ
ｍｉＲ−１９９ａ、ｍｉＲ−１９０８またはコントロールヘアピンを過剰発現する１×
１０６個のＭｅＷｏ細胞を、０．２％のメチルセルロースが補充される細胞培地を含有す
る低接着性プレートに播種した。懸濁状態に４８時間置いた後、死細胞および生細胞の数
を、トリパンブルーを使用して計数した。
血清飢餓アッセイ
メラノーマ細胞の血清飢餓能に対するｍｉＲ−１９９ａおよびｍｉＲ−１９０８の影響
を明らかにするために、ｍｉＲ−１９９ａ、ｍｉＲ−１９０８またはコントロールヘアピ
ンを過剰発現する１×１０５個のＭｅＷｏ親細胞を四連で６ウエルプレートに播種し、Ｆ
ＢＳが０．２％の飢餓ＤＭＥＭ系培地において４８時間インキュベーションし、その後、
生細胞の数を、トリパンブルーを使用して計数した。血清飢餓条件におけるメラノーマ細
胞または内皮細胞の生存に対する組換えＡｐｏＥ３の添加の影響を明らかにするために、
３×１０４個のＭｅＷｏ−ＬＭ２細胞または内皮細胞を低血清条件（０．２％のＦＢＳ）
においてＡｐｏＥ３（１００μＭ）またはＢＳＡ（１００μＭ）の存在下でインキュベー
ションした。生細胞の数を、８時間後、１６時間後および２４時間後に計数した。
コロニー形成アッセイ
ｍｉＲ−１９９ａ、ｍｉＲ−１９０８またはコントロールヘアピンを過剰発現する５０
個のＭｅＷｏ親細胞を四連で６ｃｍのプレートに播種した。２週間後、細胞をＰＢＳによ
り洗浄し、６％グルタルアルデヒドにより固定処理し、０．５％のクリスタルバイオレッ
トにより染色した。陽性に染まっているコロニーの数を計数した。
ｍｉＲＮＡマイクロアレイハイブリダイゼーション
脱調節された発現を様々な高転移性メラノーマ細胞株派生物にわたって示すｍｉＲＮＡ
を特定するために、多数の独立した転移性派生物ならびにそれらのそれぞれの親ＭｅＷｏ
細胞集団および親Ａ３７５細胞集団から得られる総ＲＮＡを使用して、小さいＲＮＡにつ
いて濃縮し、その後、それらを標識し、ＬＣ ｓｃｉｅｎｃｅｓによるマイクロ流体の特
注マイクロアレイプラットフォームに対してハイブリダイゼーションさせた。アレイは、
Ｓａｎｇｅｒ ｍｉＲＢａｓｅリリース１３．０に列記されるｍｉＲＮＡ転写物に対応す
る８９４個の成熟型ｍｉＲＮＡを検出するように設計された。分析される全プローブのう
ち、１６９個のｍｉＲＮＡに対応するプローブが、分析される多数の細胞株にわたってバ
ックグラウンド閾値を超えるシグナルをもたらした。生のシグナル強度（これらはプロー
ブのハイブリダイゼーションに対応する）をそれぞれの細胞株についてメジアン正規化し
た。メジアン正規化された発現値の２倍以上のアップレギュレーションの閾値を、２つの
独立したヒトメラノーマ細胞株について多数の転移性派生物において一般に誘導されるｍ
ｉＲＮＡを特定するために使用した。
ｍｉＲ−１９９ａおよびｍｉＲ−１９０８についてのマイクロアレイに基づく遺伝子標
的予測
ｍｉＲ−１９９ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１９９ａ−５ｐおよびｍｉＲ−１９０８によって標
的化される潜在的な遺伝子を特定するために、総ＲＮＡを、それぞれのｍｉＲＮＡの機能
喪失または機能獲得を有するＭｅＷｏ細胞株から抽出し、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＨＴ−１２
ｖ３ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ＢｅａｄＣｈｉｐマイクロアレイに対するハイブリダイ
ゼーションのためにロックフェラー大学におけるゲノミクスコア施設に送付した。生のシ
グナル強度（これらはプローブのハイブリダイゼーションに対応する）をその後、それぞ
れの細胞株サンプルについてメジアン正規化した。３組のマイクロアレイプロフィル比較
がなされた：（１）ｍｉＲ−１９９ａまたはｍｉＲ−１９０８を過剰発現するＭｅＷｏ細
胞に対するＭｅＷｏコントロール細胞、（２）ｍｉＲ−１９９ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１９９
ａ−５ｐまたはｍｉＲ−１９０８を標的化する短いヘアピン（ｍｉＲ−Ｚｉｐ）を発現す
るＭｅＷｏ−ＬＭ２細胞に対するＭｅＷｏ−ＬＭ２コントロール細胞、および、（３）Ｍ
ｅＷｏ−ＬＭ２細胞に対するＭｅＷｏ親細胞。これらのアレイから得られるメジアン正規
化された発現値に基づいて、下記の判断基準を使用して、ｍｉＲ−１９９ａおよびｍｉＲ
−１９０８に対して共通する可能な標的遺伝子に達した：（１）ｍｉＲ−１９９ａおよび
ｍｉＲ−１９０８のそれぞれの個々の過剰発現に対して１．５倍超の差でダウンレギュレ
ーションされる遺伝子、（２）ｍｉＲ−１９９ａ−３ｐおよびｍｉＲ−１９０８の両方の
阻害またはｍｉＲ−１９９ａ−５ｐおよびｍｉＲ−１９０８の両方の阻害のどちらかのと
きに１．５倍超の差でアップレギュレーションされる遺伝子、そして、（３）ＭｅＷｏ親
細胞に対して上記３つのｍｉＲＮＡの生理学的により高いレベルを発現するＬＭ２細胞に
おいて１．５倍超の差でダウンレギュレーションされる遺伝子。
細胞株におけるｍｉＲＮＡ発現およびｍＲＮＡ発現の分析
総ＲＮＡを、ｍｉＲｖａｎａキット（ＡＭ１５６０、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔ
ｅｍｓ、Ａｕｓｔｉｎ、ＴＸ）を使用して様々な細胞株から抽出した。成熟型ｍｉＲＮＡ
の発現レベルを、Ｔａｑｍａｎ ｍｉＲＮＡ発現アッセイ（４４２７９７５−０００２２
２８、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して定量化した。ＲＮＵ４４を正
規化のための内因性コントロールとして使用した。ｍＲＮＡ発現分析のために、６００ｎ
ｇの総ＲＮＡを、ｃＤＮＡ Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ（
１８０８０−０５１、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して逆転写し、得られたｃＤＮＡの
およそ２００ｎｇをその後、ＳＹＢＲグリーンＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（４３０９
１５５、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）および適切なプライマーと混合した。
それぞれの反応を四連で行い、ｍＲＮＡ発現を、ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ７９００ＨＴ Ｒ
ｅａｌ−Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を
使用してリアルタイムＰＣＲ増幅を行うことによって定量化した。ＧＡＰＤＨを正規化の
ための内因性コントロールとして使用した。下記のプライマーを使用した：
ApoE Fwd: 5'-TGGGTCGCTTTTGGGATTAC-3'
ApoE Rev: 5' -TTC AACTCCTTC ATGGTCTCG-3'
DNAJA4_Fwd: 5'-CCAGCTTCTCTTCACCCATG-3'
DNAJA4 Rev:5'-GCCAATTTCTTCGTGACTCC-3'
GAPDH Fwd: 5'-AGCCACATCGCTCAGACAC-3'
GAPDH Rev: 5'-GCCCAATACGACCAAATCC-3'
LRPl Fwd: 5' -TTTAACAGC ACCGAGTACCAG-3'
LRPl Rev: 5' C AGGC AGATGTC AGAGC AG-3'
LRP8 Fwd: 5'-GCTACCCTGGCTACGAGATG-3'
LRP8 Rev: 5' -GATT AGGG ATGGGCTCTTGC-3'
ＥＬＩＳＡ
馴化されたガン細胞培地を、細胞を、ＦＢＳが０．２％の血清飢餓ＤＭＥＭ系培地にお
いて２４時間インキュベーションすることによって調製した。馴化培地におけるＡｐｏＥ
のレベルを、ＡＰＯＥ ＥＬＩＳＡキット（ＩＲＡＰＫＴ０３１、Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ
Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｎｏｖｉ、Ｍｉｃｈｉｇａｎ）を使用して求めた。
ルシフェラーゼレポーターアッセイ
異種ルシフェラーゼレポーターアッセイを以前に記載されたように行った（Ｔａｖａｚ
ｏｉｅ他、２００８）。簡単に記載すると、ＡｐｏＥおよびＤＮＡＪＡ４の全長型の３’
ＵＴＲおよびＣＤＳをｐｓｉＣｈｅｃｋ２二重ルシフェラーゼレポーターベクター（Ｃ８
０２１、Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）にウミシイタケルシフェラーゼレポー
ターの下流側にクローン化した。５×１０４個の親ＭｅＷｏ細胞、ＭｅＷｏ−ＬＭ２細胞
、ｍｉＲ−１９９ａ、ｍｉＲ−１９０８またはコントロールヘアピンを過剰発現するＭｅ
Ｗｏ細胞、および、ｍｉＲ−１９９ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１９９ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１９０
８またはコントロール配列を標的化するｍｉＲ−Ｚｉｐヘアピンを発現するＭｅＷｏ−Ｌ
Ｍ２細胞を、ＴｒａｎｓｉＴ−２９３トランスフェクション試薬を使用して１００ｎｇの
それぞれの特異的レポーター構築物によりトランスフェクションした。トランスフェクシ
ョン後２４時間で、細胞を溶解し、ウミシイタケルシフェラーゼ発現対ホタルルシフェラ
ーゼ発現の比率を、二重ルシフェラーゼアッセイ（Ｅ１９１０、Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用
して求めた。それぞれの標的構築物における推定されるｍｉＲＮＡ結合部位を、相補的な
ｍｉＲＮＡシード配列（ｍｉＲ−１９９ａ−３ｐ：５’−ＣＡＧＵＡＧＵＣ−３’；ｍｉ
Ｒ−１９９ａ−５ｐ：５’−ＣＣＡＧＵＧＵＵ−３’；ｍｉＲ−１９０８：５’−ＧＧＣ
ＧＧＧＧＡ−３’）に対するアライメントによって特定した。それぞれの標的構築物にお
けるｍｉＲＮＡ相補的部位を、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ Ｍｕｌｔｉ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒ
ｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（２００５１４、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃ
ｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ、ＣＡ）を使用して変異させた。ｍｉＲＮ
Ａシード配列相補性分析に基づいて、ＡｐｏＥのＣＤＳを１４１位において（ＣＴＧから
ＡＣＴに）変異させ、ＡｐｏＥの３’ＵＴＲを８３位において（ＧＣＣからＡＴＡに）、
かつ、９８位において（ＣＴＧからＡＣＡに）変異させ、ＤＮＡＪＡ４のＣＤＳを３７３
位において（ＣＧＣからＴＡＴに）、かつ、９１７位において（ＣＴＧからＡＧＡに）変
異させ、ＤＮＡＪＡ４の３’ＵＴＲを５７６位において（ＣＴＧからＡＣＡに）、１０９
６位において（ＣＴＧからＴＣＴに）、１３９６位において（ＣＧＣからＴＧＴに）、か
つ、１５９６位において（ＣＴＧからＴＧＴに）変異させた。下記のプライマーを、Ａｐ
ｏＥおよびＤＮＡＪＡ４の３’ＵＴＲおよびＣＤＳをクローン化するために使用した：
ApoE CDS Fwd: 5 '-AGTACCTCGAGGGGATCCTTGAGTCCTACTC-3 '
APOE CDS Rev: 5 '-TAATTGCGGCCGCTCAGACAGTGTCTGCACCCAG-3'
DNAJA4_CDS_Fwd: 5 '-TAATATCTCGAGATGTGGGAAAGCCTGACCC-3'
DNAJA4 CDS Rev: 5 '-CAATTGCGGCCGCTCATGCCGTCTGGCACTGC-3'
APOE 3 'UTR Fwd: 5 '-TTAGCCTCGAGACGCCGAAGCCTGCAGCCA-3'
APOE 3'UTR Rev: 5 '-TTACTGCGGCCGCTGCGTGAAACTTGGTGAATCTT-3'
DNAJA4 3 'UTR Fwd: 5'-TAATATCTCGAGCGTGGTGCGGGGCAGCGT-3 '
DNAJA4 3 'UTR Rev: 5'-CAATTGCGGCCGCTTATCTCTCATACCAGCTCAAT-3 '
下記のプライマーを、それぞれの標的におけるｍｉＲＮＡ結合部位を変異誘発するため
に使用した：
APOE CDS mut: 5'-
GCCAGCGCTGGGAACTGGCAACTGGTCGCTTTTGGGATTACCT-3'
APOE 3 'UTR mutl : 5 '-
CAGCGGGAGACCCTGTCCCCATACCAGCCGTCCTCCTGGGGTG-3'
APOE 3 'UTR_mut2 : 5 ' -
TCCCCGCCCCAGCCGTCCTCACAGGGTGGACCCTAGTTTAATA-3 '
DNAJA4_CDS_mutl : 5'-
GGGATCGGTGGAGAAGTGCCTATTGTGCAAGGGGCGGGGGATG-3'
DNAJA4_CDS_mut2: 5'-
GTAGGGGGCGGGGAACGTGTTATCCGTGAAGAGGTGGCTAGGG-3'
DNAJA4 3 'UTR mutl : 5 '-
CAGGGCCAACTTAGTTCCTAACATTCTGTGCCCTTCAGTGGAT-3'
DNAJA4 3 'UTR_mut2 : 5 ' -
ACAGTTTGTATGGACTACTATCTTAAATTATAGCTTGTTTGGA-3'
DNAJA4 3 'UTR_mut3 : 5 ' -
TAATTATTGCTAAAGAACTATGTTTTAGTTGGTAATGGTGTAA-3'
DNAJA4 3 'UTR_mut4 : 5 ' -
CAGCTGCACGGACCAGGTTCCATAAAAACATTGCCAGCTAGTGAG-3 '

ヒトメラノーマ皮膚病変部におけるｍｉＲＮＡ発現の分析
本研究で使用されるすべてのヒト臨床サンプルを施設内ＩＲＢ指針に従って得て、処理
し、分析した。７１名のヒト患者からの原発性メラノーマ皮膚病変部のパラフィン包埋さ
れた断面切片をＭＳＫＣＣから得た。これらのサンプルを５回の連続したキシレン洗浄（
それぞれ５分）によって脱パラフィン化した。脱パラフィン化の後、悪性腫瘍含有領域を
Ｈ＆Ｅ染色によって特定し、解剖し、総ＲＮＡを、ＲｅｃｏｖｅｒＡｌｌ Ｔｏｔａｌ
Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＡＭ１９７５、Ａｐｐｌｉｅ
ｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して解剖物から抽出した。それぞれのサンプルにおけ
る成熟型のｍｉＲ−１９９ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１９９ａ−５ｐおよびｍｉＲ−１９０８の
発現レベルを、Ｔａｑｍａｎ ｍｉＲＮＡアッセイを使用して盲検様式で定量化した。Ｒ
ＮＵ４４を正規化のための内因性コントロールとして使用した。それぞれのｍｉＲＮＡの
発現レベルを、転移する傾向を有する原発性メラノーマと、転移しなかった原発性メラノ
ーマとの間で比較した。カプラン・マイヤー曲線を、患者の転移非存在生存データを使用
して、それぞれの患者腫瘍におけるそれぞれのｍｉＲＮＡについての発現レベルの関数と
してプロットした。肺、脳、骨および軟組織のような部位への転移性再発が以前に記録さ
れており、そのような転移性再発は、特定されたｍｉＲＮＡの発現レベルと転移性再発と
の間における関係の遡及的分析を可能にした。
組織学
動物をＰＢＳにより灌流し、その後、心臓内注入により、続いて気管内注入により注入
される４％パラホルムアルデヒドによる固定処理を行った。肺を切開し、４％パラホルム
アルデヒドにおいて４℃で一晩インキュベーションし、パラフィンに包埋し、５μｍの厚
さの連続切片にスライスした。全体的な巨視的転移性結節可視化のために、肺切片をＨ＆
Ｅ染色した。ヒトメラノーマＭｅＷｏ細胞によってマウスに形成される転移性結節におけ
る内皮含有量分析のために、代表的な肺切片を、ＭＥＣＡ−３２に対する一次抗体（Ｄｅ
ｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｓｔｕｄｉｅｓ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ Ｂａｎｋ、Ｔｈｅ Ｕ
ｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｉｏｗａ、ＩＡ）（これはマウスの内皮細胞を標識する）と
、ヒトビメンチンに対する一次抗体（ＶＰ−Ｖ６８４、Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｉｅｓ）（これはヒトのメラノーマ細胞を標識する）とにより二重染色した。様々なＡ
ｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ色素コンジュゲート化二次抗体を、一次抗体を検出するために使用
した。転移性結節内の血管密度を求めるために、蛍光を、Ｚｅｉｓｓレーザー走査共焦点
顕微鏡（ＬＳＭ５１０）を使用して測定し、それぞれの転移性結節の内部におけるＭＥＣ
Ａ−３２シグナル（これにより、輪郭がヒトビメンチンとの同時染色に基づいて示される
）を、ＩｍａｇｅＪ（ＮＩＨ）を使用して盲検様式で定量化した。Ｂ１６Ｆ１０マウスメ
ラノーマ細胞によって野生型マウスおよびＡｐｏＥの遺伝的ヌルマウスにおいて形成され
る転移性結節における内皮含有量分析のために、代表的な肺切片をＭＥＣＡ−３２につい
て染色し、それぞれの結節の内部におけるＭＥＣＡ−３２シグナル（これにより、境界が
細胞の色素沈着に基づいて定まる）を盲検様式で定量化した。総体的血管面積（これは、
それぞれの転移性結節の総面積に対する、血管によって覆われる百分率面積として与えら
れる）を、バックグラウンド除去（１ピクセルの転がりボールの半径）と、カットオフと
しての所定の閾値の使用とによって得た。転移性結節を、どのような領域であれ、総面積
が２０００μｍ２を超える領域として定義した。大きい結節については、少なくとも４つ
の代表的な画像を得て、それらの平均血管密度を計算した。
インビボでのマトリゲルプラグアッセイ
１０μｇ／ｍＬの組換えヒトＡｐｏＥ３（４６９６、ＢｉｏＶｉｓｉｏｎ）、１０μｇ
／ｍＬのＢＳＡ（Ａ２１５３、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）または４００ｎｇ／ｍｌの
ＶＥＧＦを、示されるようにマトリゲル（３５６２３１、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ
）と混合した。示された組換えタンパク質を含有する４００μＬのマトリゲルを免疫低下
ＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスの腹側わき腹のすぐ上に皮下注入した。プラグを注入後３日目に
取り出し、４％パラホルムアルデヒドにおいて４８時間、固定処理した。その後、プラグ
をパラフィン包埋し、５μｍの厚さの連続切片にした。プラグの断面切片を、マウス内皮
抗原ＭＥＣＡ−３２に対する一次抗体（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｓｔｕｄｉｅｓ
Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ Ｂａｎｋ、Ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｉｏｗａ、ＩＡ
）を使用して免疫組織化学的に染色し、ペルオキシダーゼコンジュゲート化二次抗体によ
って検出し、続いて、ＤＡＢ酸化によって可視化した。それぞれのマトリゲルプラグの中
への内細胞浸潤の程度を定量化するために、内皮細胞の数をそれぞれのプラグについて４
つ〜５つのランダムな視野において計数し、所与のプラグ面積あたりの内皮細胞の平均数
を計算した。
組織培養
ＳＫ−Ｍｅｌ−３３４原発性ヒトメラノーマ系統をＭＳＫＣＣにおける１名の患者のＢ
ｒａｆ変異型メラノーマの軟組織転移物から確立した。インビトロにおける最小限の拡大
培養の後、細胞を、肺転移性派生物のＳＫ−Ｍｅｌ−３３４．２を生じさせるためにイン
ビボ選抜した（ＰｏｌｌａｃｋおよびＦｉｄｌｅｒ、１９８２）。ＳＫ−Ｍｅｌ−２３９
のベムラフェニブ抵抗性クローン（Ｃ１）は、Ｐｏｕｌｉｋｏｓ Ｐｏｕｌｉｋａｋｏｓ
（Ｍｏｕｎｔ Ｓｉｎａｉ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｈｏｏｌ）からの譲渡物であり、Ｂ−
ＲａｆＶ６００Ｅ／＋；Ｐｔｅｎ−／−；ＣＤＫＮ２Ａ−／−原発性マウスメラノーマ細
胞株は、Ｍａｒｃｕｓ Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ（Ｙａｌｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）によっ
て譲渡された。使用されるすべての他の細胞株をＡＴＣＣから購入した。
ＡｐｏＥのＥｌｉｓａ
ＤＭＳＯ、ＧＷ３９６５またはＴ０９０１３１７（それぞれ１μＭ）により処理される
メラノーマ細胞から得られる血清非含有の馴化培地における細胞外ＡｐｏＥレベルを、Ａ
ｐｏＥ ＥＬＩＳＡキット（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を使用して、処
理後７２時間で定量化した。
ウエスタンブロッティング
マウスの肺組織サンプルおよび脳組織サンプルを、プロテアーゼ阻害剤（Ｒｏｃｈｅ）
が補充されるＲＩＰＡ緩衝液（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）において氷上でホモジネー
トした。マウスの脂肪組織をＴＮＥＴ緩衝液（１．５ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ ７．５）、
１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＥＤＴＡ、１％トリトン、プロテアーゼ阻害剤）におい
て氷上でホモジネートした。総タンパク質溶解物（２μｇ）をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって
分離し、ＰＶＤＦメンブランに転写し、抗マウスＡｐｏＥ抗体（ａｂ２０８７４、Ａｂｃ
ａｍ）および抗チューブリンα／β抗体（２１４８、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）に
よりブロッティングした。
メラノーマ臨床サンプルにおけるＡｐｏＥ発現分析
臨床サンプルの入手、処理および分析のすべてをＩＲＢ指針に厳密に従って行った。原
発性メラノーマ皮膚病変部をＭＳＫＣＣにおいて患者から事前に切除して、ホルマリン固
定し、パラフィン包埋し、５μｍの厚さのスライド片に切片化した。ＡｐｏＥタンパク質
発現を、Ｄ６Ｅ１０抗ＡｐｏＥ抗体（ａｂ１９０６、Ａｂｃａｍ）を使用する二重盲検の
免疫組織化学的分析によって評価した。
組織化学
動物をＰＢＳにより心臓内灌流し、その後、４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）によ
る灌流を行った。固定処理された肺をパラフィンに包埋し、５μｍの厚さの連続切片にし
た。巨視的な肺転移性結節をＨ＆Ｅ染色によって可視化した。腫瘍での内皮細胞含有量、
腫瘍の増殖およびアポトーシスを分析するために、原発性腫瘍のパラフィン包埋切片を、
ＭＥＣＡ−３２に対する抗体（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｓｔｕｄｉｅｓ Ｈｙｂｒ
ｉｄｏｍａ Ｂａｎｋ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｉｏｗａ）、ＫＩ−６７に対する
抗体（ａｂ１５５８０、Ａｂｃａｍ）および切断型カスパーゼ−３に対する抗体（９６６
１、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）によりそれぞれ染色した。
尾静脈転移アッセイ
インビボ転移アッセイのために使用されるメラノーマ細胞を、ルシフェラーゼレポータ
ー遺伝子をコードする安定的に発現したレトロウイルス構築物により形質導入し（Ｐｏｎ
ｏｍａｒｅｖ他、２００４）、これにより、本発明者らはメラノーマ細胞のインビボ進行
をバイオルミネセンス画像化によってモニターすることができた。下記の数のメラノーマ
細胞（１００μＬのＰＢＳに再懸濁される）を、尾静脈を介して静脈内注入した：４×１
０４個のＭｅＷｏ細胞、２．５×１０５個のＨＴ−１４４細胞、２×１０５個のＳＫ−Ｍ
ｅｌ−３３４．２細胞、５×１０４個のＢ１６Ｆ１０細胞、および、１×１０５個のＹＵ
ＭＭ細胞。ＭｅＷｏ細胞、ＨＴ−１４４細胞およびＳＫ−Ｍｅｌ−３３４．２細胞は６週
齢〜８週齢の性一致ＮＯＤ ｓｃｉｄマウスに注入され、一方、Ｂ１６Ｆ１０細胞および
ＹＵＭＭ細胞は６週齢〜８週齢の性一致Ｃ５７ＢＬ／６マウスに注入された。転移形成に
対するＧＷ３９６５の影響を評価するすべての実験において、マウスをコントロール餌ま
たはＧＷ３９６５補充餌（２０ｍｇ／ｋｇ）で１０日間にわたって前処置した。脳転移に
対するＧＷ３９６５処置の影響を評価するために、１×１０５個のＭｅＷｏ脳転移性派生
物を無胸腺ヌードマウスに心臓内注入した。注入後直ちに、マウスを無作為にコントロー
ル餌またはＧＷ３９６５補充餌（１００ｍｇ／ｋｇ）に割り当てた。ＧＷ３９６５の経口
送達が初期転移の進行を阻害し得るかどうかを明らかにするために、ＮＯＤ Ｓｃｉｄマ
ウスに、４×１０４個のＭｅＷｏ細胞を静脈内注入し、細胞を４２日間にわたって肺にコ
ロニー形成させ、その後、マウスを盲検的にコントロール餌処置またはＧＷ３９６５補充
餌処置（１００ｍｇ／ｋｇ）に割り当てた。
同所性転移アッセイ
同所性部位から分離されるメラノーマ細胞による肺でのコロニー形成に対するＧＷ３９
６５処置の影響を明らかにするために、ルシフェラーゼレポーターを発現する１×１０６
個のＭｅＷｏ細胞を、ＮＯＤ Ｓｃｉｄマウスの両側の下部わき腹に皮下注入した。体積
で約３００ｍｍ３である腫瘍が形成されたとき、腫瘍を切除し、マウスを無作為にコント
ロール餌処置またはＧＷ３９６５補充餌処置（１００ｍｇ／ｋｇ）に割り当てた。腫瘍切
除後１ヶ月で、肺を取り出し、肺でのコロニー形成をエクスビボ・バイオルミネセンス画
像化によって測定した。メラノーマの肺でのコロニー形成の程度を組織学的に確認するた
めに、その後、肺を４％のＰＦＡにおいて一晩にわたって固定処理し、パラフィン包埋し
、５μＭの連続切片にし、ヒトビメンチンについて染色した（ＶＰ−Ｖ６８４、Ｖｅｃｔ
ｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）。
ダカルバジン抵抗性メラノーマ細胞の作製
ダカルバジン抵抗性のＢ１６Ｆ１０マウスメラノーマ細胞を、細胞をＤＴＩＣ（Ｄ２３
９０、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）の存在下で連続培養する
ことによって作製した。最初、細胞を５００μｇ／ｍＬのＤＴＩＣにより１週間処理した
。この最初のＤＴＩＣ処理の後、残存する（約１０％の）生細胞を１週間にわたって回復
させ、その後、７５０μｇ／ｍＬのＤＴＩＣを細胞培地に５日間加えた。この高用量処理
に続いて、細胞を低用量のＤＴＩＣ（１００μｇ／ｍＬ）の存在下で１週間にわたって回
復させた。その後、細胞を、細胞をマウスに移植する前の少なくとも１ヶ月間、２００μ
ｇ／ｍＬのＤＴＩＣを含有する細胞培地において連続培養した。ＤＴＩＣを３日毎に、新
鮮なガン細胞培地に加えた。腫瘍成長実験のために、５×１０４個のＢ１６Ｆ１０親細胞
およびＤＴＩＣ抵抗性細胞を７週齢のＣ５７ＢＬ／６マウスの下部わき腹に皮下注入した
。体積で５ｍｍ３〜１０ｍｍ３である小さい腫瘍が形成された後、マウスを下記の処置群
に無作為に割り当てた：（１）コントロール餌＋ビヒクル（ｉ．ｐ．）；（２）コントロ
ール餌＋ＤＴＩＣ（ｉ．ｐ．）（５０ｍｇ／ｋｇ）；（３）ＧＷ３９６５補充餌（１００
ｍｇ／ｋｇ）＋ビヒクル（ｉ．ｐ．）。ＤＴＩＣをクエン酸の存在下（重量比で１：１）
で水に溶解し、腹腔内注射によって毎日投与した。ＤＴＩＣ抵抗性のＭｅＷｏヒトメラノ
ーマ細胞株クローンが、体積で６００ｍｍ３〜８００ｍｍ３であるＭｅＷｏ腫瘍を有する
マウスのＤＴＩＣ処置の後で得られた。最初の２週間の期間中における毎日のＤＴＩＣ投
薬（５０ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．）に対する応答での最初の腫瘍縮小の後、腫瘍が最終的に
は抵抗性を発達させ、成長を再開し、その時点で腫瘍細胞を分離し、ＤＴＩＣ抵抗性Ｍｅ
Ｗｏ細胞株が確立された。細胞を、ＤＴＩＣ（２００μｇ／ｍＬ）の存在下で１週間、イ
ンビトロにおいて拡大培養し、その後、５×１０５個のＤＴＩＣ抵抗性ＭｅＷｏ細胞を８
週齢のＮｏｄ ＳＣＩＤガンママウスに再注入した。腫瘍が体積で５ｍｍ３〜１０ｍｍ３
に成長した後、マウスを下記の処置群に盲検的に割り当てた：（１）コントロール餌；（
２）コントロール餌＋ＤＴＩＣ（５０ｍｇ／ｋｇ）；（３）ＧＷ３９６５補充餌（１００
ｍｇ／ｋｇ）。親の非選抜ＭｅＷｏ細胞による腫瘍成長に対するＤＴＩＣの影響を明らか
にするために、５×１０５個のＭｅＷｏ細胞を、Ｎｏｄ ＳＣＩＤガンママウスに皮下注
入し、マウスを、体積で５ｍｍ３〜１０ｍｍ３である腫瘍が形成された後でコントロール
ビヒクルまたはＤＴＩＣ（５０ｇ／ｋｇ）により処置した。ＤＴＩＣを、２日の休薬処置
の合間がある５回の連続した毎日の処置からなるサイクルで、上記で記載されるように毎
日投与した。腫瘍成長を週に２回測定した。
メラノーマ進行の遺伝子開始モデル
メラノーマ進行のＴｙｒ：：ＣｒｅＥＲ；Ｂ−ＲａｆＶ６００Ｅ／＋；Ｐｔｅｎｌｏｘ
／＋／Ｔｙｒ：：ＣｒｅＥＲ；Ｂ−ＲａｆＶ６００Ｅ／＋；Ｐｔｅｎｌｏｘ／ｌｏｘ条件
的モデルがＤａｎｋｏｒｔ他（２００９）によって以前に確立され、特徴づけられた。簡
単に記載すると、これらのマウスにおけるメラノーマを、４−ＨＴ（Ｈ６２７８、７０％
の異性体、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）をピーナッツ油にお
いて投与される２５ｍｇ／ｋｇで３日間連続して腹腔内注射することによって６週齢にお
いて誘導した。４−ＨＴのストック溶液を、４−ＨＴを、４５℃で５分間加熱し、混合す
ることにより１００％のＥｔＯＨに５０ｍｇ／ｍＬで溶解することによって調製した。溶
解されると、このストック４−ＨＴ溶液をピーナッツ油において１０倍希釈し、これによ
り、マウスにその後に注入される５ｍｇ／ｍＬの４−ＨＴ作業用溶液を得た。１回目の４
−ＨＴ注射の後、マウスを盲検的に、コントロール餌、または、ＧＷ３９６５（１００ｍ
ｇ／ｋｇ）が補充される餌のどちらかを受けるように割り当てた。マウスをメラノーマ病
変の存在および進行について週に３回調べた。３５日目に、背側皮膚サンプルをコントロ
ール処置マウスおよびＧＷ３９６５処置マウスから集め、４％のＰＦＡにおいて固定処理
し、１０Ｘで写真撮影した。総皮膚面積からの色素沈着したメラノーマ病変部面積の百分
率を、ＩｍａｇｅＪを使用して定量化した。生存分析のために、マウスをメラノーマ進行
について毎日モニターし、メラノーマ負荷量の進行に伴う瀕死状態および不快の初期徴候
を考慮に入れて標準的な身体状態スコアに従って安楽死させた。死後、肺、脳および唾液
腺を集め、巨視的メラノーマ病変の存在について調べた。
マウスの遺伝子型決定
すべてのマウスの遺伝子型決定を、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｓによって推奨されるよう
な標準的なＰＣＲ条件を使用して行った。下記の遺伝子型決定用プライマーをそれぞれの
ＰＣＲ反応のために使用した：
Ｔｙｒ：：ＣｒｅＥＲ；Ｂ−ＲａｆＶ６００Ｅ／＋；Ｐｔｅｎｌｏｘ／＋マウスおよびＴ
ｙｒ：：ＣｒｅＥＲ；Ｂ−ＲａｆＶ６００Ｅ／＋；Ｐｔｅｎｌｏｘ／ｌｏｘマウス：
B-Raf Forward: 5'-TGA GTA TTT TTG TGG CAA CTG C-3'
5- a/Reverse: 5'-CTC TGC TGG GAA AGC GGC-3'
Pten Forward: 5'-CAA GCA CTC TGC GAA CTG AG-3'
Pten Reverse: 5'-AAG TTT TTG AAG GCA AGA TGC-3'
Cre Transgene Forward: 5 '-GCG GTC TGG CAG TAA AAA CTA TC-3 '
Cre Transgene Reverse: 5'-GTG AAA CAG CAT TGC TGT CAC TT-3'
Internal Positive Control Forward: 5' -CTA GGC CAC AGA ATT GAA AGA TCT-3'
Internal Positive Control Reverse: 5'-GTA GGT GGA AATTCT AGC ATC ATC C-3'
ＡｐｏＥ−／−マウス：
Common Forward: 5'-GCC TAG CCG AGG GAG AGC CG-3'
Wild-type Reverse: 5'-TGT GAC TTG GGA GCT CTG CAG C-3'
Mutant Reverse: 5'-GCC GCC CCG ACT GCA TCT-3'
ＬＸＲα−／−マウス：
Common Forward: 5'-TCA GTG GAG GGA AGG AAA TG-3'
Wild-type Reverse: 5'-TTC CTG CCC TGG ACA CTT AC-3'
Mutant Reverse: 5'-TTG TGC CCA GTC ATA GCC GAA T-3'
ＬＸＲβ−／−マウス：
Common Forward: 5'-CCT TTT CTC CCT GAC ACC G-3'
Wild-type Reverse: 5'-GCA TCC ATC TGG CAG GTT C-3'
Mutant Reverse: 5'-AGG TGA GAT GAC AGG AGA TC-3'

細胞増殖アッセイおよび生存性アッセイ
ＧＷ３９６５、Ｔ０９０１３１７およびベキサロテンのインビトロ細胞成長に対する影
響を明らかにするために、２．５×１０４個のメラノーマ細胞を三連で６ウエルプレート
に播種し、ＤＭＳＯ、ＧＷ３９６５、Ｔ０９０１３１７またはベキサロテンのそれぞれ１
μＭでの存在下で培養した。５日後、生細胞および死細胞の数を、死細胞を選択的に標識
するトリパンブルー（７２−５７−１、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を使用して計数し
た。
細胞浸潤アッセイ
細胞浸潤アッセイを、トランスウエル・マトリゲル浸潤チャンバーシステム（３５４４
８０、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して詳しくは以前に記載されたように行っ
た（Ｐｅｎｃｈｅｖａ他、２０１２）。簡単に記載すると、様々なメラノーマ細胞を、Ｄ
ＭＳＯ、ＧＷ３９６５、Ｔ０９０１３１７またはベキサロテンの１μΜでの存在下で５６
時間培養し、その後、メラノーマ細胞をそれぞれの薬物の存在下で１６時間にわたって飢
餓培地（０．２％のＦＢＳ）に切り換えた。飢餓後、細胞をマトリゲル被覆トランスウエ
ル挿入物の中に播種し、浸潤アッセイを３７℃で２４時間にわたって進行させた。Ａｐｏ
Ｅ抗体中和実験のために、４０μｇ／ｍＬの１Ｄ７抗ＡｐｏＥ阻止抗体（Ｈｅａｒｔ Ｉ
ｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｏｔｔａｗａ、Ｏｔｔａｗａ、カナダ
）または４０μｇ／ｍＬの抗ＩｇＧコントロール抗体（ＡＢ−１０８−Ｃ、Ｒ＆Ｄ Ｓｙ
ｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）をアッセイ開始時にそれぞれのトランスウ
エル挿入物に加えた。
内皮動員アッセイ
内皮動員アッセイを以前に記載されたように行った（Ｐｅｎｃｈｅｖａ他、２０１２；
Ｐｎｇ他、２０１２）。メラノーマ細胞を、ＤＭＳＯ、ＧＷ３９６５、Ｔ０９０１３１７
またはベキサロテンにより１μΜで５６時間処理し、その後、５×１０４個の細胞をそれ
ぞれの薬物の存在下で２４ウエルプレートに播種し、アッセイを開始する前の１６時間に
わたって付着させた。ＨＵＶＥＣ細胞を、０．２％のＦＢＳを含有するＥＧＭ−２培地に
おける一晩の血清飢餓に供した。翌日、１×１０５個のＨＵＶＥＣ細胞を、ガン細胞を底
部に含有するそれぞれのウエルにはめ込まれる３．０μｍのＨＴＳ Ｆｌｕｏｒｏｂｌｏ
ｃｋトランスウエル遊走挿入物（３５１１５１、ＢＤ Ｆａｌｃｏｎ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ
、ＣＡ）の中に播種した。ＨＵＶＥＣ細胞を３７℃で２０時間にわたってガン細胞に向か
って遊走させ、その後、挿入物を以前に記載されたように処理した（Ｐｅｎｃｈｅｖａ他
、２０１２）。ＡｐｏＥ抗体中和実験のために、４０μｇ／ｍＬの１Ｄ７抗ＡｐｏＥ阻止
抗体（Ｈｅａｒｔ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｏｔｔａｗａ、
Ｏｔｔａｗａ、カナダ）または４０μｇ／ｍＬの抗ＩｇＧコントロール抗体（ＡＢ−１０
８−Ｃ、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）をアッセイ開始時に
それぞれのトランスウエル挿入物に加えた。
レンチウイルスによるｓｈＲＮＡに基づく遺伝子ノックダウン
ｓｈＲＮＡを、以前に記載されたように（Ｐｅｎｃｈｅｖａ他、２０１２；Ｐｎｇ他、
２０１２）、６μｇのベクターＡ、１２μｇのベクターＫおよび１２μｇのｓｈＲＮＡプ
ラスミドをＨＥＫ−２９３Ｔパッケージング細胞にトランスフェクションすることによっ
て調製されるレンチウイルス粒子に組み込んだ。レンチウイルスによるｓｈＲＮＡ形質導
入を、以前に記載されたように（Ｐｅｎｃｈｅｖａ他、２０１２）、１０μｇ／ｍＬのポ
リブレン（ＴＲ−１００３−Ｇ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）の存
在下で６時間行った。細胞を形質導入後７２時間にわたって拡大培養し、レンチウイルス
選抜を、細胞を２μｇ／ｍＬのピューロマイシン（Ｐ８８３３、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉ
ｃｈ）の存在下で７２時間培養することによって行った。
下記のｓｈＲＮＡ配列を使用した：
ヒト：
Sh1LXRα: 5'-
CCGGCCGACTGATGTTCCCACGGATCTCGAGATCCGTGGGAACATCAGTCGGTT TTT-3 '
sh2LXRα: 5'-
CCGGGCAACTCAATGATGCCGAGTTCTCGAGAACTCGGCATCATTGAGTTGCTT TTT-3'
sh3LXRβ: 5'-
CCGGAGAGTGTATCACCTTCTTGAACTCGAGTTCAAGAAGGTGATACACTCTTT TTT-3'
sh2LXRβ: 5'-
CCGGGAAGGCATCCACTATCGAGATCTCGAGATCTCGATAGTGGATGCCTTCTT TTT-3'
shApoE: 5'-
CCGGGCAGACACTGTCTGAGCAGGTCTCGAGACCTGCTCAGACAGTGTCTGCTT TTT-3'
マウス：
sh_mLXRα: 5'-
CCGGGCAACTCAATGATGCTGAGTTCTCGAGAACTCAGCATCATTGAGTTGCTT TTT-3'
sh_mLXRβ: 5'-
CCGGTGAGATCATGTTGCTAGAAACCTCGAGGTTTCTAGCAACATGATCTCATTTTTG-3'
sh_mApoE: 5'-
CCGGGAGGACACTATGACGGAAGTACTCGAGTACTTCCGTCATAGTGTCCTCTT TTT-3'

ｑＲＴ−ＰＣＲによる遺伝子発現分析：
ＲＮＡを、Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（１７２００、Ｎ
ｏｒｇｅｎ、Ｔｈｏｒｏｌｄ、カナダ）を使用して全細胞溶解物から抽出した。その後、
６００ｎｇの総ＲＮＡを、ｃＤＮＡ Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ
Ｋｉｔ（１８０８０−０５１、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してｃＤＮＡに逆転写し、
定量的リアルタイムＰＣＲ増幅を、ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ７９００ＨＴ Ｒｅａｌ−Ｔｉ
ｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ａｕｓｔｉｎ、
ＴＸ）を使用して以前に記載されたように行った（Ｐｅｎｃｈｅｖａ他、２０１２）。そ
れぞれのＰＣＲ反応を四連で行った。遺伝子発現を、内因性コントロールとして使用され
るＧＡＰＤＨに対して正規化した。
下記のプライマーを使用した：
ヒト：
ApoE Forward: 5 ' -TGGGTCGCTTTTGGGATTAC-3 '
ApoE Reverse: 5 '-TTCAACTCCTTCATGGTCTCG-3 '
GAPDH Forward: 5 '-AGCCACATCGCTCAGACAC-3 '
GAPDH Reverse: 5'-GCCCAATACGACCAAATCC-3'
LXRα Fwd: 5'-GTTATAACCGGGAAGACTTTGC-3 '
LXRα Rev: 5'- AAACTCGGC ATC ATTGAGTTG-3 '
LXRβ_Fwd: 5'- TTTGAGGGTATTTGAGTAGCGG-3 '
LXRβRev: 5'- CTCTCGCGGAGTGAACTAC-3 '
マウス：
ApoE Forward: 5 '-GACCCTGGAGGCTAAGGACT-3 '
ApoE Reverse: 5 '-AGAGCCTTCATCTTCGCAAT-3 '
GAPDH Forward: 5 ' -GCAC AGTC AAGGCCGAGAAT-3 '
GAPDH Reverse: 5 ' -GCCTTCTCC ATGGTGGTGAA-3 '
LXRα Forward:5'-GCGCTCAGCTCTTGTCACT-3'
LXRα Reverse: 5'-CTCCAGCCACAAGGACATCT-3'
LXRβ Forward: 5 ' -GCTCTGCCTAC ATCGTGGTC-3 '
LXRβ Reverse: 5'-CTCATGGCCCAGCATCTT-3'
ABCA1 Forward: 5'- ATGGAGCAGGGAAGACCAC-3 '
ABCA1 Reverse: 5'- GTAGGCCGTGCCAGAAGTT-3 '

ＡｐｏＥプロモーター活性アッセイ
ＡｐｏＥプロモーター（これは、ＡｐｏＥ遺伝子の上流側９８０塩基対および下流側９
３塩基対に広がる配列からなる）を、ｐＧＬ３−Ｂａｓｉｃベクター（Ｅ１７５１、Ｐｒ
ｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）に、ＮｈｅＩ制限酵素お
よびＳａｃＩ制限酵素を使用してホタルルシフェラーゼの上流側にクローン化した。その
後、マルチエンハンサーエレメント１（ＭＥ．１）およびマルチエンハンサーエレメント
２（ＭＥ．２）を、ＭｌｕＩ制限酵素およびＳａｃＩ制限酵素を使用してＡｐｏＥプロモ
ーターのすぐ上流側にクローン化した。ＬＸＲアゴニストによるＡｐｏＥプロモーター駆
動およびＭＥ．１／ＭＷ．２駆動の転写活性化を評価するために、５×１０４個のＭｅＷ
ｏ細胞を２４ウエルプレートに播種した。翌日、１００ｎｇのｐＧＬ３−ＭＥ．１／ＭＥ
．２−ＡｐｏＥプロモーター構築物および２ｎｇのｐＲＬ−ＣＭＶウミシイタケルシフェ
ラーゼ構築物（Ｅ２２６１、Ｐｒｏｍｅｇａ）を、ＤＭＳＯ、ＧＷ３９６５またはＴ０９
０１３１７の１μΜでの存在下、それぞれの条件を四連で細胞に共トランスフェクション
した。ＬＸＲαまたはＬＸＲβによる転写活性化を評価するために、コントロールｓｈＲ
ＮＡ、あるいは、ＬＸＲαまたはＬＸＲβを標的化するｓｈＲＮＡを発現する５×１０４
個のＭｅＷｏ細胞を２４ウエルプレートに播種した。翌日、２００ｎｇのｐＧＬ３−ＭＥ
．１／ＭＥ．２−ＡｐｏＥプロモーター構築物および２ｎｇのｐＲＬ−ＣＭＶウミシイタ
ケルシフェラーゼ構築物を、ＤＭＳＯ、ＧＷ３９６５またはＴ０９０１３１７の１μΜで
の存在下、それぞれの条件を四連で細胞に共トランスフェクションした。２４時間後、細
胞を溶解し、細胞溶解物を、Ｄｕａｌ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅ
ｍ（Ｅ１９６０、Ｐｒｏｍｅｇａ）およびＢｉｏ−Ｔｅｋ Ｓｙｎｅｒｇｙ ＮＥＯ Ｍ
ｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒを使用してホタルルシフェラーゼ活性およびウミシイ
タケルシフェラーゼ活性について分析した。ホタルルシフェラーゼのシグナルをウミシイ
タケルシフェラーゼのシグナルに対して正規化した。すべてのデータが、ＤＭＳＯ処理コ
ントロール細胞において測定されるルシフェラーゼ活性比率に対して表される。
下記のクローニング用プライマーを使用した：
ApoE-promoterForward: 5'-TCA TAG CTA GCG CAG AGC CAG GAT TCA CGC CCT G-3'
ApoE-promoter Reverse: 5'-TGG TCC TCG AGG AAC CTT CATCTT CCT GCC TGT GA-3'
ME.1 Forward: 5 '-TAG TTA CGC GTA GTA GCC CCC ATC TTT GCC-3'
ME.1 Reverse: 5'-AAT CAG CTA GCC CCT CAG CTG CAA AGC TC-3'
ME.2 Forward: 5 '-TAG TTA CGC GTA GTA GCC CCC TCT TTGCC-3'
ME.2 Reverse: 5'-AAT CAG CTA GCC CTT CAG CTG CAA AGCTCT G-3'

腫瘍の組織化学
腫瘍をマウスから切除し、４％パラホルムアルデヒドにおいて４℃で４８時間にわたっ
て固定処理した。その後、腫瘍をパラフィン包埋し、５μｍの厚さの連続切片にした。腫
瘍における内皮細胞含有量分析のために、腫瘍切片を、マウス内皮細胞マーカーのＭＥＣ
Ａ−３２に対する一次抗体（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｓｔｕｄｉｅｓ Ｈｙｂｒｉ
ｄｏｍａ Ｂａｎｋ、Ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｉｏｗａ、ＩＡ）により染
色し、ＤＡＰＩ核染色により対比染色した。腫瘍細胞の増殖およびアポトーシスを明らか
にするために、腫瘍切片を、増殖性マーカーのＫｉ−６７に対する抗体（Ａｂｃａｍ、ａ
ｂｌ５５８０、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）と、アポトーシスマーカーの切断型カスパー
ゼ−３に対する抗体（９６６１、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、Ｄａｎｖｅｒｓ、ＭＡ
）とによりそれぞれ染色した。様々なＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒｏ色素コンジュゲート化二
次抗体を、一次抗体を検出するために使用した。蛍光を、倒立型蛍光顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ
Ａｘｉｏｖｅｒｔ ４０ ＣＦＬ）をＭＥＣＡ−３２染色およびＫｉ−６７染色につい
ては５×の倍率で使用して、また、切断型カスパーゼ−３染色については１０×の倍率で
使用して測定した。内皮細胞含有密度および腫瘍増殖速度を、総腫瘍面積からのＭＥＣＡ
−３２陽性染色面積またはＫｉ−６７陽性染色面積の平均百分率を計算することによって
定量化した。腫瘍のアポトーシスを、切断型カスパーゼ−３を発現する細胞の数を所与の
腫瘍面積あたり計数することによって測定した。
原発性メラノーマ病変部におけるＡｐｏＥ発現の分析
ヒト原発性メラノーマ皮膚病変部をＭＳＫＣＣにおいてメラノーマ患者から切除し、ホ
ルマリン固定し、パラフィンに包埋し、５μｍの厚さの連続切片にした。ＡｐｏＥタンパ
ク質発現を明らかにするために、サンプルを最初に、２回の連続するキシレン洗浄（それ
ぞれ５分）によって脱パラフィン化し、そして、一連のエタノール洗浄（１００％、９５
％、８０％および７０％のＥｔＯＨ）によって再水和した。ＡｐｏＥ抗原を、サンプルを
プロテイナーゼＫ（５μｇ／ｍＬ）の存在下において室温で２０分間インキュベーション
することによって回復させた。内因性ペルオキシダーゼ活性を失活させるために、スライ
ドを３％のＨ２Ｏ２溶液においてインキュベーションした。その後、スライドを、３回の
連続するアビジンブロック溶液、ビオチンブロック溶液およびウマ血清ブロック溶液にお
いてそれぞれ１５分間、室温でブロック処理した（ＳＰ−２００１、Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａ
ｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、ＣＡ）。ＡｐｏＥをＤ６Ｅ１０抗Ａｐｏ
Ｅ抗体（ａｂ１９０８、Ａｂｃａｍ）による染色によって検出した。このとき、抗体はＰ
ＢＳにおいて１：１００の希釈で４℃で一晩使用した。その後、一次抗体が、スライドを
ペルオキシダーゼコンジュゲート化二次抗体（ＰＫ−４００２、Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏ
ｒａｔｏｒｉｅｓ）においてインキュベーションすることによって認識され、ＤＡＢ（Ｓ
Ｋ−４１０５、Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）酸化反応によって顕示された
。スライドを１０×の倍率で画像化し、二重盲検様式で分析した。ＡｐｏＥ発現を、ＤＡ
Ｂ陽性細胞の数を計数し、かつ、細胞外ＡｐｏＥ染色の面積を測定することによって定量
化した。総ＡｐｏＥ染色シグナルを、それぞれのサンプルについての一致したＨ＆Ｅ染色
スライドに基づいて決定される所与の腫瘍面積あたりの百分率染色面積として表した。患
者の転移非存在生存時間を示すカプラン・マイヤー曲線を、それぞれの患者の再発非存在
生存データをその患者の原発性メラノーマ病変部おけるＡｐｏＥ発現の関数としてプロッ
トすることによって作成した。腫瘍が集団のメジアンＡｐｏＥ発現よりも低いＡｐｏＥレ
ベルを有する患者をＡｐｏＥ陰性として分類し、これに対して、メラノーマが該メジアン
を超えてＡｐｏＥを発現する患者をＡｐｏＥ陽性として分類した。肺、脳、骨、軟組織お
よび皮下組織ならびに皮膚などの部位への転移性再発の以前に記録された患者の病歴によ
り、本発明者らは、原発性メラノーマ部位におけるＡｐｏＥ発現と、転移性再発との間に
おける関係を遡及的に明らかにすることができた。
実施例２ 内因性のｍｉｒ−１９０８、ｍｉｒ−１９９ａ−３ｐおよびｍｉｒ−１９９
ａ−５ｐはヒトメラノーマ転移を促進させる
メラノーマ転移のｍｉＲＮＡ調節因子を特定するために、インビボ選抜（Ｐｏｌｌａｃ
ｋおよびＦｉｄｌｅｒ、１９８２）を、色素沈着したＭｅＷｏヒトメラノーマ細胞株およ
び色素沈着しなかったＡ３７５ヒトメラノーマ細胞株とともに利用して、多数の第２世代
（ＬＭ２）および第３世代（ＬＭ３）の肺転移性派生物を作製した。ＭｅＷｏ−ＬＭ２系
統およびＡ３７５−ＬＭ３系統の転移可能性の比較により、これらの派生物が肺でのコロ
ニー形成アッセイにおいてそれらのそれぞれの親集団よりも著しく効率的に転移すること
が示された（図１２Ａ〜図１２Ｂ）。８９４個の成熟型ｍｉＲＮＡのハイブリダイゼーシ
ョンに基づく小ＲＮＡのプロファイリング、その後、定量的なステム・ループＰＣＲ（ｑ
ＲＴ−ＰＣＲ）により、４つのｍｉＲＮＡ（ｍｉＲ−１９０８、ｍｉＲ−１９９ａ−３ｐ
、ｍｉＲ−１９９ａ−５ｐおよびｍｉＲ−２１４）が、多数のＡ３７５転移性派生物およ
びＭｅＷｏ転移性派生物において、それらのそれぞれの親細胞に対して２倍を超えてアッ
プレギュレーションされることが明らかにされた（図１Ａ〜図１Ｂ、図１２Ｃ）。多数の
転移性派生物の全体にわたる、ｍｉＲ−１９９ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１９９ａ−５ｐ、ｍｉ
Ｒ−２１４およびｍｉＲ−１９０８の著しい誘導は、これらのｍｉＲＮＡについての転移
促進役割を示唆した。ｍｉＲ−１９９ａ−３ｐおよびｍｉＲ−１９９ａ−５ｐ（これらは
ｍｉＲ−１９９ａヘアピンと同時に過剰発現させられる）ならびにｍｉＲ−１９０８につ
いての前駆体のレトロウイルス媒介の形質導入および過剰発現は、バイオルミネセンスシ
グナル定量化および全体的な肺組織学の両方に基づいて肺での転移性コロニー形成におけ
る堅固な増大を引き起こし（図１Ｃ、図１２Ｄ；ｍｉＲ−１９０８については９．６４倍
の増大、Ｐ＝０．０１６；ｍｉＲ−１９９ａについては８．６２倍の増大、Ｐ＝０．０２
８）、一方、ｍｉＲ−２１４の過剰発現は転移に著しい影響を与えなかった。重要なこと
に、ｍｉＲ−１９９ａおよびｍｉＲ−１９０８のそれぞれの過剰発現は、形成される転移
性結節の数を増大させ（図１２Ｅ）、これは転移開始におけるこれらのｍｉＲＮＡについ
ての役割と一致していた。これらの発見により、ｍｉＲ−１９９ａおよびｍｉＲ−１９０
８が、高まった転移性コロニー形成のために十分であることもまた明らかにされた。
次に、様々なアッセイを、これらのｍｉＲＮＡの内因性レベルが転移を促進させるかを
調べるために行った。この目的を達成するために、ｍｉＲ−１９０８と、ｍｉＲ−１９９
ａヘアピンから生じる２つのｍｉＲＮＡ（ｍｉＲ−１９９ａ−３ｐおよびｍｉＲ−１９９
ａ−５ｐ）のそれぞれとを、ｍｉＲ−Ｚｉｐ技術により高転移性細胞において阻害した。
これらのｍｉＲＮＡのそれぞれの個々の阻害は転移性コロニー形成を７倍超の差で抑制し
（図１Ｄ；ｍｉＲ−１９０８阻害についてはＰ＝０．０４７；ｍｉＲ−１９９ａ−３ｐ阻
害についてはＰ＝０．０１０；ｍｉＲ−１９９ａ−５ｐ阻害についてはＰ＝０．０１５）
、かつ、形成される転移性結節の数を劇的に低下させた（図１２Ｆ）。
これらのｍｉＲＮＡがまた、転移を無関係な細胞株において促進させるかどうかを明ら
かにするために、それらの発現をＡ３７５転移性派生細胞株おいて沈黙させた。実際に、
ｍｉＲ−１９０８、ｍｉＲ−１９９ａ−３ｐまたはｍｉＲ−１９９ａ−５ｐの阻害は、転
移性Ａ３７５−ＬＭ３細胞の肺でのコロニー形成能を著しく低下させ（図１Ｅ）、このこ
とから、これら３つのｍｉＲＮＡがヒトメラノーマ細胞による転移の内因性促進因子であ
ることが立証された。
メラノーマ転移をヒト細胞転移のマウスモデルにおいて促進させることにおけるｍｉＲ
−１９０８、ｍｉＲ−１９９ａ−３ｐおよびｍｉＲ−１９９ａ−５ｐの堅固な機能的役割
を考えれば、さらなるアッセイを、これらのｍｉＲＮＡの発現がヒト原発性メラノーマ病
変部の転移能と相関するかどうかを調べるために行った。この目的を達成するために、Ｍ
ｅｍｏｒｉａｌ Ｓｌｏａｎ−Ｋｅｔｔｅｒｉｎｇ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｎｔｅｒ（ＭＳ
ＫＣＣ）の患者から得られる７１個の原発性メラノーマ皮膚病変部を、ｍｉＲ−１９０８
、ｍｉＲ−１９９ａ−３ｐおよびｍｉＲ−１９９ａ−５ｐの発現レベルについて、ｑＲＴ
−ＰＣＲにより盲検様式で分析した。上記の機能的研究と一致して、３つすべてのｍｉＲ
ＮＡが、転移した原発性メラノーマでは、転移しなかった原発性メラノーマと比較して著
しく誘導された（図１Ｆ；ｍｉＲ−１９０８についてはＰ＝０．０３７；ｍｉＲ−１９９
ａ−３ｐについてはＰ＝０．００２５；ｍｉＲ−１９９ａ−５ｐについてはＰ＝０．００
６８）。このことから、原発性病変部におけるこれらのｍｉＲＮＡのアップレギュレーシ
ョンされた発現が、メラノーマのガン進行を予測する初期事象であることが示唆された。
実施例３ ｍｉＲ−１９０８、ｍｉＲ−１９９ａ−３ｐおよびｍｉＲ−１９９ａ−５ｐ
は細胞浸潤および内皮動員を促進させる
本実施例では、アッセイを、ｍｉＲ−１９０８、ｍｉＲ−１９９ａ−３ｐおよびｍｉＲ
−１９９ａ−５ｐが転移を調節する細胞機構を明らかにするために行った。
最初に、これらのｍｉＲＮＡが、増殖または腫瘍成長を高めることによって転移を促進
させるかを調べた。これに反して、それぞれのｍｉＲＮＡの過剰発現は細胞増殖を低下さ
せた（図１３Ａ）。より重要なことに、ｍｉＲ−１９０８の過剰発現は原発性腫瘍成長を
増大させず、一方、ｍｉＲ−１９９ａの過剰発現は実際に、腫瘍体積における著しい低下
（３５％、Ｐ＜０．００１）を引き起こした（図２Ａ）。このことは、ｍｉＲ−１９０８
およびｍｉＲ−１９９ａの転移支援的（ｐｒｏ−ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ）影響は腫瘍成長
促進または高まった細胞増殖の二次的なものでないことを示している。
次に、これらのｍｉＲＮＡが、細胞浸潤、すなわち、重要な転移表現型を調節するかど
うかを調べた。転移性ＬＭ２細胞（これはこれらのｍｉＲＮＡのより大きいレベルを発現
する）は、著しく増大したマトリゲル浸潤能を、転移性がより小さいそれらの親集団に対
して示した（図１３Ｂ）。したがって、ｍｉＲ−１９９ａおよびｍｉＲ−１９０８の過剰
発現は個々に、親ＭｅＷｏ細胞がマトリゲルを通って浸潤する能力を高めた（図２Ｂ；ｍ
ｉＲ−１９９については３倍の増大；ｍｉＲ−１９０８については２倍の増大）。逆に、
ｍｉＲ−１９９ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１９９ａ−５ｐおよびｍｉＲ−１９０８の個々の阻害
は、ＭｅＷｏ−ＬＭ２転移性メラノーマ細胞派生物の浸潤能を著しく低下させ（図２Ｃ）
、同様にまた、Ａ３７５−ＬＭ３転移性メラノーマ細胞派生物の浸潤能を著しく低下させ
た（図２Ｄ）。
転移性進行に対するこれらのｍｉＲＮＡの堅固な影響を考えれば、さらなるアッセイを
、それらが何らかのさらなる転移支援的表現型を調節しているかもしれないかどうかを調
べるために行った。ｍｉＲ−１９９ａまたはｍｉＲ−１９０８の過剰発現は、内皮細胞に
対するメラノーマ細胞接着（図１３Ｃ）、アノイキスに対する抵抗性（図１３Ｄ）、血清
飢餓の状況での生存（図１３Ｅ）またはコロニー形成（図１３Ｆ）を調節しなかったが、
それぞれのｍｉＲＮＡが、内皮細胞をトランスウエル内皮動員アッセイにおいて動員する
親ＭｏＷｅ細胞の能力を劇的に高めた（３倍を超える増大）（図２Ｅ）。このことと一致
して、転移性Ｍｅｗｏ−ＬＭ２細胞（これはｍｉＲ−１９９ａおよびｍｉＲ−１９０８を
生理学的に過剰発現する）は、それらの親細胞に対して、内皮細胞を動員することにおい
てより効率的であった（図１３Ｇ）。逆に、ｍｉＲ−１９９ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１９９ａ
−５ｐまたはｍｉＲ−１９０８の転移性ＭｅＷｏ−ＬＭ２細胞における阻害（図２Ｆ）、
同様にまた、Ａ３７５−ＬＭ３細胞における阻害（図２Ｇ）は内皮動員を抑制し、このこ
とは、転移性メラノーマ細胞の高まった内皮動員能のためにこれらのｍｉＲＮＡが要求さ
れ、かつ、十分であることと一致していた。
内因性のｍｉＲ−１９９ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１９９ａ−５ｐおよびｍｉＲ−１９０８が
インビボにおいて転移性細胞による内皮動員を調節するかどうかを明らかにするために、
様々なアッセイを行って、転移性血管密度を、ヒトビメンチン（これはヒトのＭｅＷｏメ
ラノーマ細胞を標識する）およびマウス内皮細胞抗原（ＭＥＣＡ−３２）（これはマウス
の内皮細胞を標識する）についての共免疫染色を行うことによって調べた。驚くべきこと
に、ｍｉＲ−１９９ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１９９ａ−５ｐまたはｍｉＲ−１９０８の阻害は
個々に、転移性結節内における血管密度における際立った低下（ｍｉＲ−１９９ａ−３ｐ
およびｍｉＲ−１９９ａ−５ｐについては平均して３倍、ｍｉＲ−１９０８については平
均して４．７倍）を引き起こし（図２Ｈ；ｍｉＲ−１９９ａ−３ｐについてはＰ＜０．０
０１；ｍｉＲ−１９９ａ−５ｐについてはＰ＜０．００１；ｍｉＲ−１９０８については
Ｐ＜０．００１）、このことから、転移性内皮含有量および転移性血管形成を促進させる
ことにおけるこれらのｍｉＲＮＡについての役割が明らかにされた。逆に、低転移性のメ
ラノーマ細胞におけるそれぞれのｍｉＲＮＡの過剰発現は転移性血管密度を劇的に増大さ
せた（図１３Ｈ）。これらの発見から、ｍｉＲ−１９９ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１９９ａ−５
ｐおよびｍｉＲ−１９０８が、メラノーマ進行時における高まった浸潤および内皮動員の
ために必要であり、かつ、十分であるとして明らかにされる。
実施例４ ｍｉｒ−１９０８、ｍｉｒ−１９９ａ−３ｐおよびｍｉｒ−１９９ａ−５ｐ
はＡｐｏｅおよびＤＮＡＪＡ４を収斂的かつ協同的に標的化する
本実施例では、体系的で、かつ、先入観のない取り組みを、これらのｍｉＲＮＡの直接
的な分子標的を特定するために用いた。
ｍｉＲ−１９０８、ｍｉＲ−１９９ａ−３ｐおよびｍｉＲ−１９９ａ−５ｐはインビト
ロ表現型およびインビボ表現型の同じセットを媒介しており、また、ｍｉＲ−１９９ａ−
３ｐおよびｍｉＲ−１９９ａ−５ｐが同じ前駆体ヘアピンから生じているので、これらの
ｍｉＲＮＡの転移支援的表現型が共通の標的遺伝子のサイレンシングにより生じているか
もしれないことが仮定された。哺乳動物のｍｉＲＮＡが、主に標的ｍＲＮＡ転写物を脱安
定化することによって作用することを考えれば（Ｇｕｏ他、２０１０、Ｎａｔｕｒｅ、４
６６、８３５〜８４０）、メラノーマ細胞のトランスクリプトームプロファイリングをそ
れぞれのｍｉＲＮＡについての機能喪失および機能獲得の両方の状況において行った。こ
れにより、ｍｉＲ−１９９ａおよびｍｉＲ−１９０８の両方によって抑制され、かつ、こ
れらのｍｉＲＮＡのより大きい内因性レベルを発現する転移性ＬＭ２派生物においてより
低いレベルを同様に示した小さい一組の遺伝子が明らかにされた（図１４Ａ）。定量的Ｒ
Ｔ−ＰＣＲにより、２つの遺伝子、すなわち、代謝遺伝子のアポリポタンパク質Ｅ（Ａｐ
ｏＥ）および熱ショックタンパク質のＤＮＡＪＡ４が、ｍｉＲ−１９９ａおよびｍｉＲ−
１９０８によって著しく調節され、かつ、高転移性ＬＭ２細胞において劇的に沈黙させら
れるとして確認された（図３Ａおよび図１４Ｂ〜図１４Ｄ）。
ＡｐｏＥおよびＤＮＡＪＡ４が、ｍｉＲ−１９０８、ｍｉＲ−１９９ａ−３ｐおよびｍ
ｉＲ−１９９ａ−５ｐによって直接に標的化されるかどうかを明らかにするために、その
推定される標的の安定性に対するそれぞれのｍｉＲＮＡの影響を異種ルシフェラーゼレポ
ーターアッセイにより調べた。興味深いことに、ｍｉＲ−１９９ａの過剰発現は、Ａｐｏ
ＥおよびＤＮＡＪＡ４の両方の３’非翻訳領域（ＵＴＲ）およびコード領域（ＣＤＳ）の
安定性を抑制し、一方、ｍｉＲ−１９０８の過剰発現はＡｐｏＥの３’ＵＴＲならびにＤ
ＮＡＪＡ４の３’ＵＴＲおよびＣＤＳを脱安定化した。直接的な標的化と一致して、それ
ぞれの標的におけるｍｉＲＮＡ相補的配列を変異させることにより、ｍｉＲＮＡ媒介調節
が消失した（図３Ｂ）。内因性標的化の直接的な試験において、転移性ＬＭ２細胞におけ
る個々のｍｉＲＮＡ阻害は、増大した標的安定性をもたらし（図３Ｃ）、この増大した標
的安定性が、ｍｉＲＮＡ標的部位を変異させたときには消失した（図１４Ｅ）。このこと
から、ＡｐｏＥがｍｉＲ−１９０８およびｍｉＲ−１９９ａ−５ｐによって直接に標的化
され、かつ、ＤＮＡＪＡ４が３つすべてのｍｉＲＮＡによって直接に標的化されることが
明らかにされた（図３Ｄ）。重要なことに、これらの遺伝子の両方のＣＤＳおよび３’Ｕ
ＴＲは、これら３つの調節性ｍｉＲＮＡの生理学的により大きいレベルを発現する高転移
性ＬＭ２細胞ではあまり安定でなかった。このことは、これらのｍｉＲＮＡによるＡｐｏ
ＥおよびＤＮＡＪＡ４の内因性標的化がメラノーマ転移に関係することを示している（図
３Ｅ）。
共通の標的遺伝子に対する、ｍｉＲ−１９９ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１９９ａ−５ｐおよび
ｍｉＲ−１９０８の分子的収斂を考えれば、これらの標的、すなわち、ＡｐｏＥおよびＤ
ＮＡＪＡ４が、これらのｍｉＲＮＡによってもたらされる転移表現型を媒介し得るかどう
かを次に調べた。転移性ＬＭ２細胞におけるそれぞれの遺伝子の過剰発現は、細胞浸潤お
よび内皮動員の表現型における際立った低下を引き起こした（図３Ｆ〜３Ｇ、図１４Ｆ）
。逆に、無関係なヘアピンを使用する、低転移性細胞におけるＡｐｏＥまたはＤＮＡＪＡ
４のノックダウンは、細胞浸潤および内皮動員を著しく高めた（図３Ｈ〜図３Ｉ、図１４
Ｇ）。このことから、ＡｐｏＥおよびＤＮＡＪＡ４がこれらの転移支援的表現型の内因性
抑制因子として作用することが明らかにされ、このことは、上述の転移促進性ｍｉＲＮＡ
によるそれらの標的化と一致していた。
実施例５ ＡｐｏＥおよびＤＮＡＪＡ４は、ｍｉＲ−１９９ａおよびｍｉＲ−１９０８
に依存する転移性浸潤、内皮動員およびコロニー形成を媒介する
ＡｐｏＥおよびＤＮＡＪＡ４がｍｉＲ−１９９ａおよびｍｉＲ−１９０８の下流側の直
接的な生物学的エフェクターであるかどうかを明らかにするために、様々なアッセイを行
って、これら２つの標的遺伝子がとりわけ、それぞれのｍｉＲＮＡと相互作用するかどう
かを調べた。予想されたように、ｍｉＲＮＡサイレンシングは高転移性メラノーマ細胞の
浸潤能および内皮動員能を低下させた。重要なことに、ｍｉＲＮＡ阻害の状況におけるＡ
ｐｏＥまたはＤＮＡＪＡ４のノックダウンは、それぞれのｍｉＲＮＡのサイレンシングの
とき、浸潤（図４Ａおよび図４Ｃ）および内皮動員（図４Ｂおよび図４Ｄ）の抑制を著し
く妨げた。驚くべきことに、これらの遺伝子のどちらかのノックダウンは、ｍｉＲ−１９
０８またはｍｉＲ−１９９ａ−５ｐについて枯渇化された細胞では、ｍｉＲＮＡ阻害から
生じる転移性コロニー形成の劇的な抑制を完全に回復させた（図４Ｅ〜図４Ｆ、図１５Ｅ
）。逆に、ＡｐｏＥまたはＤＮＡＪＡ４の過剰発現は、ｍｉＲ−１９０８を過剰発現する
細胞（図４Ｇ〜図４Ｈ、図１５Ｆ）またはｍｉＲ−１９９ａを過剰発現する細胞（図１５
Ｇ〜図１５Ｉ）では、細胞浸潤および内皮動員を抑制するために十分であった。加えて、
ＡｐｏＥまたはＤＮＡＪＡ４の過剰発現は、ｍｉＲＮＡ媒介の転移性コロニー形成を阻害
するために十分であった（図１５Ｊ）。重要なことに、ＡｐｏＥおよびＤＮＡＪＡ４はま
た、高転移性Ａ３７５−ＬＭ３細胞によるｍｉＲＮＡ依存的な高まった細胞浸潤および内
皮動員のために要求された（図４Ｉ〜図４Ｊ、図１５Ｋ）。
ＡｐｏＥおよびＤＮＡＪＡ４がまた、ｍｉＲＮＡ依存的な転移性内皮動員をインビボに
おいて調節するかどうかを明らかにするために、メラノーマ転移物（ヒトビメンチン）お
よび内皮細胞（ＭＥＣＡ−３２）の共免疫染色を、これらの遺伝子のそれぞれについてノ
ックダウンされる細胞によってｍｉＲＮＡ阻害の状況で形成される肺の転移性結節におい
て行った。注目すべきことに、ＡｐｏＥまたはＤＮＡＪＡ４のノックダウンは、ｍｉＲＮ
Ａサイレンシングを有する細胞から生じる転移物での転移性血管密度における著しい（３
．５倍超の）増大をもたらした（図４Ｋ、ＡｐｏＥノックダウン細胞およびＤＮＡＪＡ４
ノックダウン細胞の両方についてＰ＜０．０１）。これらの発見から、ＡｐｏＥおよびＤ
ＮＡＪＡ４が、これらの転移支援的ｍｉＲＮＡによってメラノーマにおいて誘導されるｍ
ｉＲＮＡ依存的な転移性浸潤表現型、コロニー形成表現型および内皮動員表現型の直接的
な下流側のエフェクターとして明らかにされた。
実施例６ メラノーマ細胞により分泌されるＡｐｏＥは浸潤および内皮動員の必要かつ
十分な媒介因子であり、一方、ＡｐｏＥの遺伝的欠失は転移を促進させる
ＡｐｏＥは分泌型因子である。そのようなものとして、メラノーマ細胞により分泌され
たＡｐｏＥが浸潤および内皮動員を抑制し得るかどうかを調べた。それによれば、ＥＬＩ
ＳＡによって検出される細胞外ＡｐｏＥレベルが、転移性ＬＭ２細胞（これは、より大き
いレベルのｍｉＲ−１９９ａおよびｍｉＲ−１９０８を発現する）では、転移性があまり
大きくないそれらの親細胞の３．５分の１であった（図５Ａ）。分泌されたＡｐｏＥレベ
ルがまた、内因性のｍｉＲ−１９９ａおよびｍｉＲ−１９０８によって著しく抑制された
（図５Ｂおよび図１６Ａ）。
次に、ＡｐｏＥの受容体結合ドメインを認識する中和抗体（１Ｄ７）の使用によりＡｐ
ｏＥを阻害することにより、親ＭｅＷｏ細胞（これはＡｐｏＥの高い内因性レベルを発現
する（図１４Ｃ））による細胞浸潤（図５Ｃ、１．６８倍の増大）および内皮動員（図５
Ｄ、１．８４倍の増大）の両方が高まった。逆に、組換えヒトＡｐｏＥの添加は、転移性
ＬＭ２細胞（これは低い内因性ＡｐｏＥレベルを発現する（図１４Ｃ））による浸潤およ
び内皮動員を著しく抑制した（図５Ｅ）。重要なことに、組換えＡｐｏＥの添加は、メラ
ノーマ細胞または内皮細胞のインビトロ増殖（図１６Ｂ〜図１６Ｃ）または血清飢餓条件
での生存（図１６Ｄ〜図１６Ｅ）に影響を与えなかった。このことは、組換えＡｐｏＥに
よるこれらの表現型の抑制が増殖における低下または損なわれた生存の二次的なものでな
いことを示している。ＡｐｏＥがエピスタシスにおいてｍｉＲ−１９９ａおよびｍｉＲ−
１９０８の下流側であることと一致して、ＡｐｏＥ中和抗体１Ｄ７によるＡｐｏＥの中和
は、それぞれのｍｉＲＮＡの阻害とともに認められる抑制された浸潤表現型および内皮動
員表現型を有意に取り消した（図５Ｆ〜図５Ｇ）。上記発見により、メラノーマ細胞によ
り分泌されるＡｐｏＥが、メラノーマにおけるｍｉＲＮＡ依存的な浸潤表現型および内皮
動員表現型の必要かつ十分な抑制因子として明らかにされる。
さらなるアッセイを、ＤＮＡＪＡ４（十分には特徴づけられていない熱ショックタンパ
ク質）が内皮動員および浸潤を媒介する機構を詳しく調べるために行った。ＡｐｏＥおよ
びＤＮＡＪＡ４によって呈示される表現型共通性を考えれば、ＤＮＡＪＡ４が調節的役割
を果たし、ＡｐｏＥレベルを高めているかもしれないことが仮定された。実際に、ＤＮＡ
ＪＡ４のノックダウンは、ＡｐｏＥ転写物レベル（図１６Ｆ）、同様にまた、分泌された
ＡｐｏＥレベル（図５Ｈ）の両方を低下させ、一方、ＤＮＡＪＡ４の過剰発現はＡｐｏＥ
発現を実質的に上昇させた（図１６Ｇ）。ＤＮＡＪＡ４がＡｐｏＥの上流側で作用するこ
とと一致して、組換えＡｐｏＥの添加は、ＤＮＡＪＡ４のノックダウンとともに認められ
る高まった細胞浸潤表現型および内皮動員表現型を取り消した（図５Ｉ〜図５Ｊ）。逆に
、ＤＮＡＪＡ４の過剰発現とともに認められる浸潤表現型および内皮動員表現型の抑制が
、ＡｐｏＥの抗体中和によって著しく妨げられた（図１６Ｈ〜図１６Ｉ）。これらの発見
により、ＤＮＡＪＡ４が、メラノーマの浸潤および内皮動員を、ＡｐｏＥの発現および生
じる分泌の正の調節を介して抑制することが明らかにされる。
これらの転移促進性ｍｉＲＮＡおよびＤＮＡＪＡ４遺伝子のＡｐｏＥに対する調節的収
斂を考慮して、アッセイを、ＡｐｏＥの発現がヒトメラノーマ進行と相関するかどうかを
明らかにするために行った。この目的を達成するために、アレイに基づく発表されたＡｐ
ｏＥについての発現データ（Ｈａｑｑ他、２００５、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓ
ｃｉ．ＵＳＡ、１０２、６０９２〜６０９７）を、母斑病変部、原発性病変部および転移
性病変部において分析した。転移抑制的な役割と一致して、ＡｐｏＥのレベルが、遠位器
官転移物では、原発性病変部に対して著しく低く（Ｐ＜０．０２５）、また、母斑病変部
に対して著しく低かった（Ｐ＜０．０００３）（図５Ｋ）。
ヒトメラノーマ進行とのその有意な相関を考えれば、ＡｐｏＥのシグナル伝達をメラノ
ーマ細胞において増大させることが、メラノーマの転移を抑制することにおける治療的効
力を有し得るかどうかを調べた。より具体的には、転移性ＭｅＷｏ−ＬＭ２細胞をマウス
への注入の前の２４時間にわたって組換えＡｐｏＥまたはＢＳＡとプレインキュベーショ
ンした。驚くべきことに、ＡｐｏＥによるガン細胞の前処理は転移性コロニー形成を３０
０倍超の差で堅固に抑制した（図５Ｌ）。メラノーマ細胞をＡｐｏＥとプレインキュベー
ションすることによる転移のこの劇的な抑制は、メラノーマ細胞に対するＡｐｏＥの影響
が転移開始のために非常に重要であることを反映する。これは、ＡｐｏＥにより前処理さ
れた細胞が、低下した浸潤能を示し、この浸潤能が、肺でのコロニー形成を引き起こす転
移事象を開始させるために必要とされるからである。
転移表現型および転移表現型に対するＡｐｏＥによって及ぼされる堅固な影響、同様に
また、ヒトメラノーマ進行とのその強い関連を考えれば、さらなるアッセイを行って、メ
ラノーマ進行に対する全身的ＡｐｏＥの遺伝的欠失の影響をメラノーマ転移の免疫適格マ
ウスモデルにおいて詳しく調べた。転移における細胞外ＡｐｏＥについての主要な抑制的
役割と一致して、循環に注入されたＢ１６Ｆ１０マウスメラノーマ細胞は、ＡｐｏＥ遺伝
的ヌルマウスにおいて、それらの野生型同腹子と比較して転移性コロニー形成における７
倍を超える増大を示した（図５Ｍ）。これらの発見により、全身的ＡｐｏＥおよびガン分
泌ＡｐｏＥがヒトおよびマウスでのメラノーマ転移の堅固な抑制因子として立証される。
実施例７ 細胞外ＡｐｏＥはメラノーマ細胞のＬＲＰ１受容体および内皮細胞のＬＲＰ
８受容体を異なるように標的化する
本実施例では、様々なアッセイを、ＡｐｏＥが転移を抑制する分子的機構を詳しく調べ
るために行った。
浸潤を媒介するＡｐｏＥ受容体を特定するために、知られている４つすべてのＡｐｏＥ
受容体、すなわち、ＶＬＤＬＲ、ＬＲＰ１、ＬＲＰ８およびＬＤＬＲ（Ｈａｔｔｅｒｓ他
、２００６、Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．、３１、４４５〜４５４；Ｈａｕ
ｓｅｒ他、２０１１、Ｐｒｏｇ．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．、５０、６２〜７４）をメラノー
マ細胞においてノックダウンさせた。興味深いことに、ＬＲＰ１のノックダウンは、それ
以外のＡｐｏＥ受容体では生じなかったが、組換えＡｐｏＥによって誘導される細胞浸潤
抑制効果を消失させた（図６Ａ）。重要なことに、転移性ＬＭ２細胞（これは低いレベル
のＡｐｏＥを示す）におけるＬＲＰ１のノックダウンは細胞浸潤をほんのわずかに増大さ
せただけであり（図１７Ａ）、このことから、ＬＲＰ１の影響が内因性ＡｐｏＥによって
媒介されることが示唆された。
ＬＲＰ１がまた、浸潤および転移性コロニー形成に対するｍｉＲＮＡ依存的影響を媒介
するかを明らかにするために、ＬＲＰ１をｍｉＲＮＡ阻害の状況でノックダウンさせた。
ｍｉＲＮＡサイレンシングの状況におけるＬＲＰ１のノックダウンは、ｍｉＲＮＡ阻害か
ら生じる抑制された浸潤表現型を回復させた（図６Ｂ、図１７Ｂ）。これらのインビトロ
結果と一致して、ＬＲＰ１のノックダウンは、ｍｉＲ−１９０８について沈黙させられる
ＬＭ２細胞によるインビボでの転移性コロニー形成を著しく高めた（図６Ｃ、図１７Ｃ）
。これらの発見により、ＬＲＰ１がエピスタシスにおいて、ｍｉＲＮＡ／ＡｐｏＥ依存的
なメラノーマ浸潤および転移性コロニー形成の下流側であることが明らかにされる。
浸潤表現型は、メラノーマ細胞に対するＡｐｏＥの細胞自律的な影響を反映するが、内
皮動員表現型は、直接的には内皮細胞に対するガン発現ＡｐｏＥの細胞非自律的な役割を
示唆する。このことと一致して、ＡｐｏＥによる内皮細胞の前処理は、高転移性ガン細胞
に向かうそれらの遊走能を著しく低下させた（図６Ｄ）。内皮動員表現型を媒介する内皮
細胞上のＡｐｏＥ受容体を特定するために、知られている４つすべてのＡｐｏＥ受容体を
内皮細胞においてノックダウンさせた。興味深いことに、ガン細胞の浸潤の場合とは異な
り、内皮ＬＲＰ８のノックダウンは、それ以外の受容体はいずれも取り消さなかったが、
ｍｉＲＮＡサイレンシングによって引き起こされる内皮動員が選択的かつ有意に取り消し
た（図６Ｅ、図１７Ｄ〜図１７Ｅ）。これらの発見は、ＬＰＲ８受容体が内皮動員に対す
るｍｉＲＮＡ／ＡｐｏＥ依存的影響の下流側の内皮媒介因子であることと一致している。
次に、アッセイを、ＡｐｏＥ／ＬＲＰ８のシグナル伝達がまた、全身的な内皮遊走をガ
ン細胞非存在系において調節しているかもしれないかどうかを調べるために行った。それ
によれば、ＡｐｏＥ（これは内皮細胞培地に存在する）の抗体中和は内皮遊走を著しく高
め（図６Ｆ）、一方、組換えＡｐｏＥは、内皮遊走を内皮細胞のＬＲＰ８受容体に依存的
な様式でトランスウエルアッセイ（図６Ｇ）および勾配型走化性アッセイ（図６Ｈ）にお
いて阻害するために十分であった。重要なことに、ＡｐｏＥの添加は、皮下マトリゲルプ
ラグ内へのインビボでのＶＥＧＦ誘導の内皮動員の劇的な（４０倍超の差で）抑制を引き
起こした（図６Ｉ）。
内皮動員を媒介することにおいてＡｐｏＥが要求され、かつ、十分であることを考えれ
ば、さらなるアッセイを、全身的なＡｐｏＥが転移性血管形成を調節しているかもしれな
いかどうかを調べるために行った。メラノーマ細胞によって分泌されるＡｐｏＥによる転
移性内皮含有量の堅固な抑制（図４Ｋ）と一致して、遺伝的ヌルＡｐｏＥマウスは、それ
らの野生型同腹子と比較して、より大きい血管密度を、Ｂ１６Ｆ１０マウスメラノーマ細
胞により形成されるそれらの肺転移性結節の内部において示した（図６Ｊ；２．４１倍の
増大、Ｐ＝０．００５５）。まとめると、上記発見により、メラノーマ細胞のＬＲＰ１受
容体および内皮細胞のＬＲＰ８受容体によって媒介される異なったシグナル伝達を介する
転移抑制におけるＡｐｏＥについての細胞自律的／細胞非自律的な二重の役割が明らかに
される。
実施例８ メラノーマ転移における堅固な予後標的および治療標的としてのｍｉＲ−１
９９ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１９９ａ−５ｐおよびｍｉＲ−１９０８
本明細書中に記載される転移促進因子ｍｉＲＮＡが転移性結末の臨床的予測因子として
役立ち得るかどうかを調べるために、ｍｉＲ−１９９ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１９９ａ−５ｐ
およびｍｉＲ−１９０８の発現レベルを、ＭＳＫＣＣにおいて患者から得られるヒトメラ
ノーマサンプルのコホートにおけるｑＲＴ−ＰＣＲによって盲検様式で定量化した。その
後、原発性メラノーマ病変部におけるこれらのｍｉＲＮＡのレベルと、転移性再発の結末
との間における関係を求めた。
重要なことに、原発性メラノーマ病変部が、（集団についてのメジアンよりも）大きい
レベルのｍｉＲ−１９９ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１９９ａ−５ｐまたはｍｉＲ−１９０８を発
現する患者は、原発性メラノーマがこれらのｍｉＲＮＡのそれぞれのより低いレベルを発
現する患者よりも、遠位転移を発症する可能性が大きく、また、有意に短い転移非存在生
存時間を示した（図７Ａ〜図７Ｃ、ｍｉＲ−１９９ａ−３ｐについてはＰ＝０．００３２
、ｍｉＲ−１９９ａ−５ｐについてはＰ＝０．００３４、ｍｉＲ−１９０８についてはＰ
＝０．０２７）。驚くべきことに、これら３つのｍｉＲＮＡの総発現レベルは、転移性再
発についての危険性が大きい患者を、その危険性が非常に低い患者から階層化することに
おいて、最も強い予後能を示した（図７Ｄ、Ｐ＜０．０００１）。これらの臨床的発見は
、ガン進行の調節におけるこれらのｍｉＲＮＡの間での機能的協同性と一致しており、メ
ラノーマ転移の臨床的予後バイオマーカーとしてのこれらの分子についての有用性を示唆
している。
メラノーマ転移を防止するための効果的な処置選択肢の現在の欠如、および、メラノー
マ転移におけるこれら３つの調節的ｍｉＲＮＡの強い予後値を考慮して、これらのｍｉＲ
ＮＡを、アンチセンスＬＮＡ治療を使用して治療的に標的化した（Ｅｌｍｅｒ他、２００
８（ａ）；Ｅｌｍｅｒ他、２００８（ｂ））。成熟型のｍｉＲ−１９９ａ−３ｐ、ｍｉＲ
−１９９ａ−５ｐまたはｍｉＲ−１９０８に対してアンチセンスであるＬＮＡオリゴヌク
レオチドにより前処理される高転移性ＭｅＷｏ−ＬＭ２細胞は、転移活性における大雑把
には４分の１への低下を示した。これらのｍｉＲＮＡの間における協同性についての臨床
的証拠を考えれば、３つすべてのｍｉＲＮＡを沈黙させることの、転移性進行に対する影
響を調べた。注目すべきことに、３つすべてのｍｉＲＮＡに対するＬＮＡの共トランスフ
ェクションは、転移性コロニー形成を、７０倍を超える差によって抑制し、このことから
、内因性のｍｉＲ−１９９ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１９９ａ−５ｐおよびｍｉＲ−１９０８の
間における劇的な相乗作用および協同性が明らかにされた（図７Ｅ、Ｐ＝０．００４）。
重要なことに、三重ＬＮＡ前処理によるこれらのｍｉＲＮＡの阻害は、低下したインビト
ロ増殖をもたらさなかった（図１８Ａ）。このことは、この劇的な転移抑制表現型が、損
なわれた増殖の二次的なものではないことを示している。独立したＡ３７５転移性派生物
系統におけるコンビナトリアルＬＮＡ媒介のｍｉＲＮＡ標的化もまた、肺でのコロニー形
成を著しく阻害した（図１８Ｂ）。
次に、コンビナトリアルＬＮＡ誘導のｍｉＲＮＡ阻害が多数の遠位器官への全身的なメ
ラノーマ転移を抑制し得るかどうかを調べた。実際に、これら３つの調節的ｍｉＲＮＡを
標的化するＬＮＡのカクテルにより前処理される高転移性メラノーマ細胞の心臓内注入に
より、内因性のｍｉＲ−１９９ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１９９ａ−５ｐおよびｍｉＲ−１９０
８が全身的なメラノーマ転移を促進させることが明らかにされた（図７Ｆ）。これら３つ
のｍｉＲＮＡのコンビナトリアルＬＮＡ媒介阻害は、脳および骨（図７Ｈ〜図７Ｉ）など
の遠位部位での全身的な転移性病巣の数における低下を引き起こした（図７Ｇ）。
さらなるアッセイを、メラノーマ転移防止における全身投与されたインビボ最適化ＬＮ
Ａの治療的効力を調べるために行った。この目的を達成するために、高転移性ＭｅＷｏ−
ＬＭ２細胞をマウスに注入した。翌日、マウスを、ｍｉＲ−１９９ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１
９９ａ−５ｐおよびｍｉＲ−１９０８を標的化するＬＮＡにより、４週間にわたって週に
２回での低い総用量（１２．５ｍｇ／ｋｇ）で静脈内投与により処置した。注目すべきこ
とに、コンビナトリアルＬＮＡ処置は肺でのコロニー形成を９倍の差で低下させ（図７Ｊ
、Ｐ＝０．０３１）、毒性の明らかな徴候を何ら伴っていなかった（図１８Ｃ）。まとめ
ると、上記発見から、メラノーマ転移性進行の細胞自律的特徴および細胞非自律的特徴を
制御するためにＡｐｏＥシグナル伝達に集中する新規なｍｉＲＮＡ依存的調節ネットワー
クが明らかにされる（図７Ｋ）。上記の基礎的研究により、メラノーマの臨床的管理にお
ける強力な予後可能性および治療可能性を有する一組のｍｉＲＮＡが特定されている。
実施例９ ＡｐｏＥ／ＬＲＰ１シグナル伝達のｍｉＲＮＡ依存的な標的化はＣＴＧＦの
誘導を介してガン細胞浸潤および内皮動員を促進させる
本実施例では、結合組織増殖因子（ＣＴＧＦ）が、ガン細胞浸潤および内皮動員におけ
るＡｐｏＥ／ＬＲＰ１シグナル伝達の下流側の媒介因子として特定された。ｑＲＴ−ＰＣ
Ｒ分析およびＥＬＩＳＡによって求められるようなＣＴＧＦ発現レベルがＡｐｏＥ／ＬＲ
Ｐ１シグナル伝達によって媒介されている（図８Ａ、図８Ｂおよび図８Ｃ）。加えて、Ａ
ｐｏＥ／ＬＲＰ１はガン細胞の浸潤を調節し、内皮動員がＣＴＧＦによって媒介される（
図８Ｄ、図８Ｅ）。
実施例１０ ＣＴＧＦは、ｍｉＲＮＡ依存的な転移性浸潤、内皮動員およびコロニー形
成を媒介する
本実施例では、アッセイを、ＣＴＧＦがｍｉＲＮＡ依存的な浸潤および内皮動員を媒介
するかどうかを詳しく調べるために行った。簡単に記載すると、トランスウエル細胞浸潤
アッセイおよび内皮動員アッセイを、ＣＴＧＦを標的化する阻止抗体の存在下でｍｉＲ−
１９９ａまたはｍｉＲ−１９０８を過剰発現する親ＭｅＷｏ細胞に対して行った。実際に
、ｍｉｒ−１９９ａおよびｍｉｒ−１９０８に依存的な転移性浸潤および内皮動員がＣＴ
ＧＦによって媒介されることが見出された（図９Ａおよび図９Ｂ）。インビボでのメラノ
ーマ転移（転移性コロニー形成）がＣＴＧＦによって媒介されるかどうかを詳しく調べる
ために、バイオルミネセンス画像化を、ｍｉＲ−１９９ａまたはｍｉＲ−１９０８の過剰
発現の状況でＣＴＧＦについてノックダウンされる５×１０４個の親ＭｅＷｏ細胞による
肺転移に対して行った。この状況におけるＣＴＧＦのノックダウンはインビボでのメラノ
ーマ転移における著しい低下を生じさせた（図９Ｃ）。
実施例１１ ＬＸＲアゴニストのＧＷ３９６５による処置はメラノーマ細胞のＡｐｏＥ
レベルおよびＤＮＡＪＡ４レベルを上昇させ、ガン細胞浸潤、内皮動員および転移性コロ
ニー形成を抑制する
肝臓Ｘ受容体（ＬＸＲ）の様々な小分子アゴニストがＡｐｏＥのレベルを増大させるこ
とが以前に示されている。ＬＸＲ活性化を介してＡｐｏ−Ｅのレベルを増大させることが
治療的利益をもたらしたかどうかを詳しく調べるために、様々なアッセイを行って、Ａｐ
ｏ−Ｅのレベル、腫瘍細胞浸潤、内皮動員およびインビボでのメラノーマ転移に対するＬ
ＸＲアゴニストＧＷ３９６５（化学名：３−［３−［Ｎ−（２−クロロ−３−トリフルオ
ロメチルベンジル）−（２，２−ジフェニルエチル）アミノ］プロピルオキシ］フェニル
酢酸塩酸塩）の影響を評価した（図１０）。治療的濃度のＧＷ３９６５の存在下における
親ＭｅＷｏ細胞のインキュベーションはＡｐｏＥおよびＤＮＡＪＡ４の発現を増大させた
（図１０Ａおよび図１０Ｂ）。ＧＷ３９６５によるＭｅＷＯ細胞の前処理は腫瘍細胞浸潤
を低下させ（図１０Ｃ）、内皮動員を低下させた（図１０Ｄ）。ＧＷ３９６５が転移をイ
ンビボにおいて阻害し得るかどうかを試験するために、マウスに、ＧＷ３９６５（２０ｍ
ｇ／ｋｇ）を含有する穀物型固形飼料餌またはコントロール餌を与え、肺転移を、４×１
０４個の親ＭｅＷｏ細胞をマウスに尾静脈注入した後、バイオルミネセンスを使用してア
ッセイした（図１０Ｅ）。この様式でのマウスへのＧＷ３９６５の経口投与はインビボで
のメラノーマ転移における著しい低下をもたらした（図１０Ｅ）。
実施例１２ メラノーマ転移の内因性抑制因子としてのｍｉＲ−７の特定
本実施例では、ｍｉＲ−７が、メラノーマ転移の内因性抑制因子として特定された（図
１１）。ｍｉＲ−７がメラノーマ転移をインビボにおいて抑制するかどうかを試験するた
めに、その発現を、ｍｉＲ−Ｚｉｐ技術を使用して親ＭｅＷｏ細胞においてノックダウン
させた（図１１Ａ）。ｍｉＲ−７の短いヘアピン（ｍｉＲ−Ｚｉｐ）阻害剤を発現する４
×１０４個の親ＭｅＷｏ細胞（ｍｉＲ−７ ＫＤ）を静脈内注入した後における肺での転
移性コロニー形成のバイオルミネセンス画像化プロットは、肺転移をインビボにおいて著
しく増大させた（図１１Ａ）。逆に、ＬＭ２細胞におけるｍｉＲ−７の過剰発現は肺転移
をインビボにおいて著しく低下させた（図１１Ｂ）。
ガンの複雑性は、体系的な分析を適用することを必要とする（Ｐｅ’ｅｒおよびＨａｃ
ｏｈｅｎ、２０１１）。体系的な全体的取り組みを介して、様々なｍｉＲＮＡの協同的ネ
ットワークが発見された。これらのｍｉＲＮＡが、ｉ）高転移性のヒトメラノーマ細胞に
おいてアップレギュレーションされ、ｉｉ）メラノーマにおける転移性コロニー形成およ
び血管形成のために要求され、かつ、十分であり、また、ｉｉｉ）ヒトメラノーマの転移
性再発の堅固な病理学的予測因子である。トランスクリプトームに基づく、かつ、生物学
的に導かれる標的特定取り組みを通して、ｍｉＲ−１９０８、ｍｉＲ−１９９ａ−３ｐお
よびｍｉＲ−１９９ａ−５ｐが、熱ショック因子のＤＮＡＪＡ４および代謝遺伝子のＡｐ
ｏＥを収斂的に標的化することが見出された。それぞれの個々のｍｉＲＮＡが転移のため
に要求されることは、これら３つの収斂的ｍｉＲＮＡが、メラノーマ転移を促進させるこ
とにおいて非冗長的であることを示しており、一方、コンビナトリアルｍｉＲＮＡ阻害に
よって達成される堅固な相乗的な転移抑制により、これらのｍｉＲＮＡの間における機能
的な協同性（これはおそらくは、ＡｐｏＥまたはＤＮＡＪＡ４の最大限のサイレンシング
を介して達成されるかもしれない）が明らかにされる。３つの転移促進因子ｍｉＲＮＡに
よって負に調節され、転移抑制因子遺伝子（ＤＮＡＪＡ４）によって正に調節され、かつ
、臨床での転移サンプルにおいて沈黙させられる遺伝子としてＡｐｏＥが特定されたこと
により、メラノーマ進行の抑制因子としてのこの遺伝子の重要性が強調される。
実施例１３ メラノーマにおける新規な治療標的としてのＬＸＲβシグナル伝達の特定
広範囲の発現をメラノーマにおいて示す核ホルモン受容体を特定するために、本発明者
らはすべての核ホルモン受容体ファミリーメンバーの発現レベルをヒトメラノーマ細胞株
のＮＣＩ−６０コレクションにわたって調べた。いくつかの受容体が、安定な発現を多数
のメラノーマ系統にわたって示し、このことから、これらの受容体がメラノーマにおける
新規な潜在的標的を表し得ることが示唆された（図１９Ａおよび図２０Ａ）。注目すべき
ことに、これらのうち、肝臓Ｘ受容体（ＬＸＲ）はＡｐｏＥの転写を脂肪細胞およびマク
ロファージにおいて高めることが以前に示されており（Ｌａｆｆｉｔｔｅ他、２００１）
、一方、ＲＸＲの薬理学的活性化はＡｐｏＥの発現を前臨床的なアルツハイマーモデルに
おいて行わせることが見出された（Ｃｒａｍｅｒ他、２０１２）。
メラノーマにおけるＡｐｏＥの近年に発見された転移抑制的役割（Ｐｅｎｃｈｅｖａ他
、２０１２）を考えれば、メラノーマにおけるＬＸＲβおよびＲＸＲαの遍在的な基礎的
発現、ならびに、様々なＬＸＲおよびＲＸＲを治療的に活性化するための薬理学的薬剤が
入手可能であることを考えれば、本発明者らは、メラノーマ細胞におけるＬＸＲまたはＲ
ＸＲの活性化がメラノーマ進行表現型を阻害するかもしれないかどうかを詳しく調べた。
乳ガン細胞増殖および前立腺ガン細胞増殖における核ホルモン受容体（例えば、ＥＲおよ
びＡＲなど）の立証された役割を考慮して、本発明者らは最初に、メラノーマ細胞におけ
るＬＸＲまたはＲＸＲの薬理学的アゴニズムがインビトロ細胞成長に影響を及ぼすかどう
かを調べた。
２つの構造的に異なったＬＸＲアゴニスト、すなわち、ＧＷ３９６５［２］またはＴ０
９０１３１７［１］による、あるいは、ＲＸＲアゴニストのベキサロテンによるメラノー
マ細胞の処理は、細胞増殖または細胞生存性割合に影響を与えなかった（図２０Ｂ〜図２
０Ｃ）。本発明者らは次に、細胞浸潤および内皮動員（これらは、転移性メラノーマ集団
および転移性乳ガン集団によって呈示される表現型である）に対するＬＸＲ活性化または
ＲＸＲ活性化の影響を評価した（Ｐｅｎｃｈｅｖａ他、２０１２；Ｐｎｇ他、２０１２）
。変異多様性のＭｅＷｏ（Ｂ−Ｒａｆ／Ｎ−Ｒａｓ野生型）ヒトメラノーマ系統、ＨＴ−
１４４（Ｂ−Ｒａｆ変異型）ヒトメラノーマ系統およびＳＫ−Ｍｅｌ−２（Ｎ−Ｒａｓ変
異型）ヒトメラノーマ系統、同様にまた、ＳＫ−Ｍｅｌ−３３４．２（Ｂ−Ｒａｆ変異型
）原発性ヒトメラノーマ系統のＧＷ３９６５［２］またはＴ０９０１３１７［１］による
処理は、メラノーマ細胞がトランスウエルアッセイにおいてマトリゲルを通って浸潤する
ことができることおよび内皮細胞を動員することができることを一貫して抑制した（図１
９Ｂ〜図１９Ｃ）。比較において、ベキサロテンによる処理は、浸潤を試験されたメラノ
ーマ系統の半数においてのみ抑制しただけであり、また、内皮動員表現型には有意な影響
を及ぼさなかった（図１９Ｂ〜図１９Ｃ）。
ＬＸＲアゴニズムが、細胞浸潤および内皮動員の両方を多数のメラノーマ系統にわたっ
て幅広く阻害することにおいてＲＸＲアゴニズムよりも優位であることを考えれば、本発
明者らは、ＬＸＲアゴニストの抑制的影響を媒介することにおいてＬＸＲシグナル伝達が
要求されることを詳しく調べた。ＬＸＲαではなく、メラノーマのＬＸＲβのノックダウ
ンは、ＧＷ３９６５［２］およびＴ０９０１３１７［１］の浸潤抑制能および内皮動員抑
制能を取り消し（図１９Ｄ〜図１９Ｇおよび図２０Ｄ〜図２０Ｇ）、このことから、メラ
ノーマ細胞のＬＸＲβが、これらのインビトロ表現型の抑制を誘発することにおけるＬＸ
Ｒアゴニストの機能的標的であることが明らかにされた。本発明者らの分子的発見は、Ｌ
ＸＲβが、メラノーマ細胞によって発現される優勢なＬＸＲイソ型であることと一致して
いる（図１９Ａ、Ｐ＜０．０００１）。
メラノーマにおけるＬＸＲβの遍在的な基礎的発現はおそらくは、ＬＸＲが、脂質の輸
送、合成および異化を制御する際に果たす全般的役割を反映している（Ｃａｌｋｉｎおよ
びＴｏｎｔｏｎｏｚ、２０１３）。そのような安定なＬＸＲβ発現が、メラノーマ細胞の
代謝および成長を維持するために重要であると思われるが、そのような安定なＬＸＲβ発
現はまた、ＬＸＲシグナル伝達を、メラノーマにおける作用範囲が広い治療的標的化のた
めの魅力的な候補物にしている。
実施例１４ ＬＸＲアゴニストの治療的送達はメラノーマ腫瘍成長を抑制する
様々なＬＸＲアゴニストが最初、脂質異常症およびアテローム性動脈硬化の患者におい
てコレステロールを低下させるという目的のための経口薬物候補物として開発された（Ｃ
ｏｌｌｉｎｓ他、２００２；ＪｏｓｅｐｈおよびＴｏｎｔｏｎｏｚ、２００３）。これら
の化合物は、脂質レベルを大型動物の前臨床モデルにおいて低下させることができないこ
とに付随して臨床的に断念された（Ｇｒｏｏｔ他、２００５）。
インビトロでのメラノーマ進行表現型を抑制するＧＷ３９６５［２］およびＴ０９０１
３１７［１］の堅固な能力（図１９Ｂ〜図１９Ｃ）を考えれば、本発明者らは、治療的な
ＬＸＲ活性化がメラノーマの処置のために利用され得るかどうかを詳しく調べた。実際に
、ＧＷ３９６５［２］またはＴ０９０１３１７［１］の低用量（２０ｍｇ／ｋｇ）での経
口投与は、体積で５ｍｍ３〜１０ｍｍ３である皮下腫瘍が形成された後では、免疫適格モ
デルにおける攻撃的Ｂ１６Ｆ１０マウスメラノーマ細胞による腫瘍成長を６７％および６
１％それぞれ抑制した（図２１Ａ〜図２１Ｂ）。より大きいＬＸＲアゴニスト用量（１０
０ｍｇ／ｋｇ）の投与は腫瘍成長における８０％の低下をもたらし（図２１Ａ）、これは
、用量依存的な抑制効果と一致していた。
ＧＷ３９６５［２］の経口投与はまた、ＭｅＷｏヒトメラノーマ細胞株による腫瘍成長
を堅固に抑制し（７０％の阻害）、ＳＫ−Ｍｅｌ−２ヒトメラノーマ細胞株による腫瘍成
長を堅固に抑制し（４９％の阻害）、同様にまた、ＳＫ−Ｍｅｌ−３３４．２原発性ヒト
メラノーマ系統による腫瘍成長を堅固に抑制した（７３％の阻害）（図２１Ｃ〜図２１Ｅ
および図２２Ａ）。
小さい腫瘍（５ｍｍ３〜１０ｍｍ３）に対するＬＸＲアゴニストの堅固な腫瘍抑制的影
響（図２１Ａ〜図２１Ｅ）によって勇気づけられて、本発明者らは次に、ＬＸＲ活性化療
法が大きい（約１５０ｍｍ３の）腫瘍の成長を阻害し得るかどうかを詳しく調べた。
本発明者らは、ＧＷ３９６５［２］による処置が、確立された大きいＢ１６Ｆ１０腫瘍
の成長における大雑把には５０％の低下を引き起こしたことを見出した（図２１Ｆ）。重
要なことに、腫瘍確立後におけるＧＷ３９６５［２］の治療的送達は、マウスＢ１６Ｆ１
０細胞が注入された免疫適格マウス、ヒトＭｅＷｏ樹立メラノーマ系統に由来する腫瘍異
種移植片を有する免疫低下マウス、同様にまた、ＳＫ−Ｍｅｌ．３３４−２原発性ヒトメ
ラノーマ系統に由来する腫瘍異種移植片を有する免疫低下マウスの全生存期間を実質的に
延ばした（図２１Ｇ〜図２１Ｉ）。これらの発見は、下記の多様な変異サブタイプの黒色
性および無色素性の樹立されたメラノーマ腫瘍にわたるＬＸＲ活性化療法の広域応答性と
一致している：Ｂ−ＲａｆおよびＮ−Ｒａｓの野生型（Ｂ１６Ｆ１０およびＭｅＷｏ；図
２１Ａ〜図２１Ｃ）、Ｂ−Ｒａｆ変異型（ＳＫ−Ｍｅｌ−３３４．２；図２１Ｄ）、Ｎ−
Ｒａｓ変異型（ＳＫ−Ｍｅｌ−２；図２１Ｅ）。
本発明者らは次に、腫瘍成長を抑制することにおいてＬＸＲアゴニストによって調節さ
れる細胞生物学的表現型を明らかにしようと努めた。インビトロでのメラノーマ細胞によ
る内皮動員に対するＧＷ３９６５［２］の阻害的影響と一致して、ＧＷ３９６５［２］の
投与は、腫瘍の内皮細胞含有量における大雑把には２分の１への低下を引き起こした（図
２１Ｊ）。この影響には、インビボにおける活発に増殖する腫瘍細胞の数における大きく
ない低下（２３％）が付随し（図２１Ｋ）、アポトーシス細胞の数には変化がなかった（
図２１Ｌ）。これらの結果は、局所的な腫瘍浸潤を減少させることに加えて、ＬＸＲ活性
化は、メラノーマ腫瘍成長を、主には腫瘍の血管形成をインビボ増殖における生じる低下
を伴って阻害することにより抑制することを示唆する。
実施例１５ ＬＸＲアゴニズムは肺および脳へのメラノーマ転移を抑制し、初期転移の
進行を阻害する
メラノーマ腫瘍成長に対するＬＸＲアゴニストの強力な抑制的影響は、本発明者らに、
ＬＸＲ活性化がまた、メラノーマ細胞による転移性コロニー形成を抑制し得るかどうかを
調べさせるための動機を与えた。この目的を達成するために、ＧＷ３９６５［２］による
ヒトＭｅＷｏメラノーマ細胞の前処理は、それらの転移性コロニー形成能における５０倍
超の差での低下を引き起こした（図２３Ａ）。この劇的な阻害的影響に照らして、本発明
者らは次に、経口投与されたＬＸＲアゴニストが転移を抑制し得るかを評価した。ＧＷ３
９６５［２］またはＴ０９０１３１７［１］が経口投与された免疫低下マウスは、３１倍
の差での低下および２３倍の差での低下がそれぞれ、ヒトＭｅＷｏ細胞による肺での転移
性コロニー形成において生じた（図２３Ｂ〜図２３Ｃ）。ＧＷ３９６５［２］による処置
はまた、ＨＴ−１４４メラノーマ系統による転移性コロニー形成を抑制し（図２３Ｄ）、
同様にまた、ＳＫ−Ｍｅｌ−３３４．２原発性メラノーマ系統による転移性コロニー形成
を抑制した（図２３Ｅ）。
ＧＷ３９６５［２］は、血液脳関門を効率的に横断し、かつ、ＬＸＲシグナル伝達を脳
において強力に活性化することができる親油性分子である。このことと一致して、ＧＷ３
９６５［２］の経口送達は、アミロイド斑病理学および記憶欠損をアルツハイマー病の前
臨床モデルにおいて改善することが以前に示された（Ｊｉａｎｇ他、２００８）。したが
って、本発明者らは、ＬＸＲアゴニズムが、メラノーマの脳転移、すなわち、効果的な治
療を緊急に必要とする恐れられるメラノーマ結末（Ｆｏｎｋｅｍ他、２０１２）の抑制に
おいて治療活性を示し得るのではないかと思った。注目すべきことに、ＧＷ３９６５［２
］の経口投与により、ＭｅＷｏ親系統に由来する脳転移性メラノーマ細胞の心臓内注入後
における全身的な播種および脳でのコロニー形成の両方が阻害された（図２３Ｆ）。これ
らの結果から、ＬＸＲ活性化療法による堅固な転移抑制が、多数のメラノーマ系統にわた
って、また、多数の遠位器官転移性部位において明らかにされる。
転移形成を抑制することにおいて認められる堅固な効果（図２３Ａ〜図２３Ｆ）によっ
て勇気づけられて、本発明者らは次に、ＬＸＲ活性化療法が、転移により既に散らばって
いるメラノーマ細胞の進行を停止させ得るかどうかを明らかにしようと努めた。本発明者
らは最初に、ＧＷ３９６５［２］が、同所性部位から散らばるメラノーマ細胞による肺で
のコロニー形成を原発性腫瘍除去後において低下させることができるかを試験した（図２
３Ｇ）。重要なことに、腫瘍切除後におけるＧＷ３９６５［２］の経口投与は、散らばっ
たメラノーマ細胞による肺でのコロニー形成を１７倍の差で阻害した（図２３Ｈ）。注目
すべきことに、ＧＷ３９６５［２］によるマウスの処置もまた、播種時にベースラインか
ら８倍進行している初期の肺転移物によるコロニー形成を劇的に（２８分の１に）抑制し
た（図２３Ｉ）。転移開始を阻害するＬＸＲ活性化と一致して、ＧＷ３９６５［２］によ
る処置は、形成される巨視的な転移性結節の数を低下させた（図２３Ｊ）。最後に、この
‘補助的な’前臨床状況におけるＧＷ３９６５［２］によるマウスの処置は、転移性コロ
ニー形成の後におけるマウスの生存期間を著しく延ばした（図２３Ｋ）。
実施例１６ ＬＸＲ活性化は、メラノーマの遺伝的主導マウスモデルにおけるメラノー
マの進行および転移を低下させる
ヒトメラノーマ腫瘍の大雑把には６０％が、Ｂｒａｆガン遺伝子における活性化する変
異を特徴としており、１つの一アミノ酸変異体、すなわち、Ｂ−ＲａｆＶ６００Ｅが、見
出される優性な変異である（Ｄａｖｉｅｓ他、２００２）。ほぼ２０％のメラノーマが、
Ｐｔｅｎ腫瘍抑制因子の同時サイレンシングを伴ってＢ−Ｒａｆにおける活性化する変異
を示しており、このことが、悪性のメラノーマ状態への進行に至らしている（Ｔｓａｏ他
、２００４；Ｃｈｉｎ他、２００６）。近年には、チロシナーゼ（Ｔｙｒ）主導の条件的
なＢ−Ｒａｆ活性化およびＰｔｅｎ喪失が、マウスのメラノーマ進行を押し進めることに
おいて遺伝的に協同することが示された（Ｄａｎｋｏｒｔ他、２００９）。
ＬＸＲ活性化がこの遺伝的開始モデルにおいてメラノーマ進行を抑制し得るかどうかを
明らかにするために、本発明者らは、メラノーマを４−ヒドロキシタモキシフェン（４−
ＨＴ）の腹腔内投与によってＴｙｒ：：ＣｒｅＥＲ；Ｂ−ＲａｆＶ６００Ｅ／＋；Ｐｔｅ
ｎｌｏｘ／＋マウスおよびＴｙｒ：：ＣｒｅＥＲ；Ｂ−ＲａｆＶ６００Ｅ／＋；Ｐｔｅｎ
ｌｏｘ／ｌｏｘマウスにおいて誘導した。注目すべきことに、メラノーマ開始後における
ＧＷ３９６５［２］の経口投与は、ＰＴＥＮヘテロ接合性のＴｙｒ：：ＣｒｅＥＲ；Ｂ−
ＲａｆＶ６００Ｅ／＋；Ｐｔｅｎｌｏｘ／＋マウスおよびＰＴＥＮホモ接合性のＴｙｒ：
：ＣｒｅＥＲ；Ｂ−ＲａｆＶ６００Ｅ／＋；Ｐｔｅｎｌｏｘ／ｌｏｘマウスの両方の腫瘍
進行を弱め、かつ、全生存期間を著しく延ばした（図２４Ａ〜図２４Ｂおよび図２５Ａ〜
図２５Ｂ）。次に、本発明者らは、ＧＷ３９６５［２］がこの遺伝的状況においてメラノ
ーマ転移を抑制し得るかを調べた。本発明者らは、巨視的な転移物を４−ＨＴ処置された
Ｔｙｒ：：ＣｒｅＥＲ；Ｂ−ＲａｆＶ６００Ｅ／＋；Ｐｔｅｎｌｏｘ／ｌｏｘコントロー
ルマウスの肺または脳において検出しなかったが、唾液腺リンパ節へのメラノーマ転移を
一貫して認めた。重要なことに、ＧＷ３９６５［２］により処置されるＴｙｒ：：Ｃｒｅ
ＥＲ；Ｂ−ＲａｆＶ６００Ｅ／＋；Ｐｔｅｎｌｏｘ／ｌｏｘマウスは、死後に検出される
リンパ転移物の数における低下を示した（図２４Ｃ）。これらの発見は、ＬＸＲ活性化が
、原発性メラノーマ腫瘍進行に対するその抑制的影響に加えて、同所性転移を、遺伝的主
導メラノーマモデルにおいて阻害することを示している。
メラノーマ進行を押し進めることにおけるＢ−Ｒａｆ活性化およびＰｔｅｎ喪失の間で
の協同性がさらに、ＣＤＫＮ２Ａ（家族性メラノーマにおいて頻繁に変異する細胞周期調
節因子）の不活性化によって高められ得る（Ｈｕｓｓｕｓｓｉａｎ他、１９９４；Ｋａｍ
ｂ他、１９９４）。したがって、本発明者らは、Ｂ−ＲａｆＶ６００Ｅ／＋；Ｐｔｅｎ−
／−；ＣＤＫＮ２Ａ−／−メラノーマに対するＬＸＲ活性化の影響を調べ、これにより、
本発明者らは、ＬＸＲアゴニズムの治療的効力をより攻撃的な遺伝的主導メラノーマ進行
モデルにおいて試験することができた。重要なことに、ＧＷ３９６５［２］の治療的送達
は、同系の免疫適格マウスに注入されるＢ−ＲａｆＶ６００Ｅ／＋；Ｐｔｅｎ−／−；Ｃ
ＤＫＮ２Ａ−／−原発性マウスメラノーマ細胞による腫瘍成長および肺転移を堅固に阻害
し、かつ、Ｂ−ＲａｆＶ６００Ｅ／＋；Ｐｔｅｎ−／−；ＣＤＫＮ２Ａ−／−メラノーマ
負荷を有するマウスの全生存を延ばした（図２４Ｄ〜図２４Ｆ）。まとめると、ヒトメラ
ノーマの多様な変異プロフィルを示す異種移植および遺伝子誘導の独立した免疫適格メラ
ノーママウスモデルにわたるメラノーマ進行の堅固な抑制は、ＬＸＲ活性化療法の臨床試
験を行うための動機を与えた。
実施例１７ ＬＸＲβの薬理学的活性化は、メラノーマ細胞のＡｐｏＥ発現を転写誘導
することによってメラノーマ表現型を抑制する
本発明者らは次に、メラノーマ進行の抑制を媒介するＬＸＲβの下流側の分子標的を明
らかにしようと努めた。この目的を達成するために、本発明者らは、ＬＸＲアゴニストの
ＧＷ３９６５［２］により処置されるヒトＭｅＷｏメラノーマ細胞のトランスクリプトー
ムプロファイリングを行った。
ＬＸＲ活性化に応答して著しく誘導された３６５個の遺伝子の中から、本発明者らは、
ＡｐｏＥ、すなわち、マクロファージおよび脂肪細胞におけるＬＸＲの以前に確認された
転写標的（Ｌａｆｆｉｔｔｅ他、２００１）を、メラノーマ細胞における最もアップレギ
ュレーションされた分泌型因子として特定した（図２６）。定量的リアルタイムＰＣＲ（
ｑＲＴ−ＰＣＲ）による確認により、ＡｐｏＥ転写物発現の堅固なアップレギュレーショ
ンが、関係性がないＬＸＲアゴニストによる処置の後、多数のヒトメラノーマ系統にわた
って明らかにされた（図２７Ａ〜図２７Ｃ）。
メラノーマにおけるＡｐｏＥの以前に報告された転移抑制的機能（Ｐｅｎｃｈｅｖａ他
、２０１２）に照らして、本発明者らは、ＬＸＲβ活性化がメラノーマ進行をＡｐｏＥの
転写誘導により抑制するかどうかを詳しく調べた。実際に、ＧＷ３９６５［２］およびＴ
０９０１３１７［１］は、２つの以前に特徴づけられたＬＸＲ結合性のマルチエンハンサ
ーエレメント（ＭＥ．１またはＭＥ．２）（Ｌａｆｆｉｔｔｅ他、２００１）のどちらか
に融合されるＡｐｏＥプロモーターを含有するルシフェラーゼレポーター構築物のメラノ
ーマ細胞駆動の活性を高めることが見出された（図２８Ａ）。重要なことに、この転写誘
導は、上昇したレベルの分泌されたＡｐｏＥタンパク質をもたらした（図２８Ｂ）。メラ
ノーマ細胞におけるＡｐｏＥの直接的なＬＸＲβ標的化と一致して、抗体による細胞外Ａ
ｐｏＥの中和は細胞浸潤および内皮動員のＬＸＲβ媒介抑制を完全に阻止し、かつ、これ
らの表現型をコントロールＩｇＧ処置に対してさらに高め（図２８Ｃ〜図２８Ｇおよび図
２７Ｄ〜図２７Ｆ）、このことから、ＬＸＲアゴニズムの影響が細胞外ＡｐｏＥによって
調節されることが明らかにされた。
加えて、メラノーマ細胞におけるＡｐｏＥの分子的ノックダウンはまた、細胞浸潤表現
型および内皮動員表現型のＧＷ３９６５［２］媒介抑制を阻止した（図２７Ｇ〜図２７Ｈ
）。このことと一致して、ＬＸＲαではなく、ＬＸＲβのメラノーマ細胞での枯渇化は、
ＧＷ３９６５［２］およびＴ０９０１３１７［１］がＡｐｏＥの転写および最終的にはタ
ンパク質発現をアップレギュレーションすることができることを取り消した（図２８Ｈ〜
図２８Ｉおよび図２７Ｉ〜図２７Ｋ）。まとめると、これらの発見は、ＬＸＲβ（メラノ
ーマ細胞によって発現される優性なＬＸＲイソ型）の薬理学的活性化が、メラノーマ細胞
による細胞固有的な浸潤および内皮動員を、ＡｐｏＥ発現をメラノーマ細胞において転写
活性化することを介して抑制することを示している。
実施例１８ ＬＸＲβ活性化療法によるメラノーマ由来ＡｐｏＥおよび全身的ＡｐｏＥ
の関与
インビトロにおける細胞外ＡｐｏＥによる重要なメラノーマ表現型のＬＸＲβ誘導によ
る抑制により、インビボでのＬＸＲアゴニストの抑制的影響が末梢組織（これは細胞外Ａ
ｐｏＥの堅固な供給源として役立ち得る）におけるＬＸＲの活性化によってさらに強化さ
れるかもしれないことが示唆された。
重要なことに、そのような非形質転換組織は、患者における長期間のＡｐｏＥ誘導を可
能にするＬＸＲ活性化療法に対する抵抗性をそれほど発達させやすいであろうとは思われ
ない。したがって、本発明者らは、治療的なＬＸＲアゴニズムが、メラノーマ進行を、メ
ラノーマ細胞または全身組織に由来するＡｐｏＥを誘導することによって抑制するかどう
かを詳しく調べた。ＬＸＲβアゴニズムがＡｐｏＥ発現をインビボでのメラノーマ細胞に
おいて増大させることと一致して、ＡｐｏＥ転写物レベルが、メラノーマ原発性腫瘍にお
いて、同様にまた、ＬＸＲアゴニスト補充餌が与えられたマウスから分離されるメラノー
マの肺転移物および脳転移物においてアップレギュレーションされた（図２９Ａ〜図２９
Ｅ）。重要なことに、ＧＷ３９６５［２］またはＴ０９０１３１７［１］のどちらかによ
るマウスの処置は、ＡｐｏＥタンパク質発現をマウスの全身的な脂肪細胞組織、肺組織お
よび脳組織において著しく上昇させ（図３０Ａ〜図３０Ｂ）、また、ＡｐｏＥ転写物レベ
ルを循環白血球においても同様にアップレギュレーションさせた（図３０Ｃ）。これらの
結果は、ＬＸＲ活性化療法がメラノーマ細胞および全身組織の両方のＡｐｏＥ発現をイン
ビボにおいて誘導することを示している。
メラノーマ由来のＬＸＲ活性化および全身的なＬＸＲ活性化が、経口投与されたＬＸＲ
アゴニストの腫瘍抑制的影響のためにインビボにおいて要求されることを明らかにするた
めに、本発明者らは最初に、ＧＷ３９６５［２］が、ＬＸＲβが枯渇化されるＢ１６Ｆ１
０マウスメラノーマ細胞による腫瘍成長を抑制することができるかを試験した。
ヒトメラノーマ細胞における本発明者らの発見と一致して、マウスメラノーマ細胞のＬ
ＸＲβノックダウンはＡｐｏＥ発現のＧＷ３９６５媒介による誘導を取り消した（図２９
Ｆ〜図２９Ｈ）。このことにもかかわらず、メラノーマ細胞のＬＸＲβノックダウンはＧ
Ｗ３９６５［２］による腫瘍成長の抑制を妨げることができず（図２９Ｄ）、このことか
ら、ＧＷ３９６５［２］による腫瘍成長阻害における全身的なＬＸＲ活性化についての役
割が暗示された。ＬＸＲアゴニストによるメラノーマ成長のこの腫瘍非自律的な抑制を媒
介するＬＸＲイソ型を特定するために、本発明者らは、ＬＸＲαまたはＬＸＲβの遺伝的
ヌルマウスに埋め込まれた腫瘍に対するＧＷ３９６５［２］の影響を調べた。興味深いこ
とに、全身的ＬＸＲβの遺伝的消失は、ＧＷ３９６５がメラノーマ腫瘍成長を抑制するこ
とができることを阻止し、一方、ＬＸＲαの不活性化はＧＷ３９６５による腫瘍成長阻害
に対する影響を何ら有していなかった（図６Ｄ）。重要なことに、ＧＷ３９６５［２］（
ＬＸＲαよりもＬＸＲβに対する６倍大きい活性を有するアゴニスト）による全身的Ａｐ
ｏＥ発現のアップレギュレーションが、ＬＸＲα−／−のマウスにおいてではなく、ＬＸ
Ｒβ−／−のマウスにおいて取り消された（図３０Ｅおよび図２９Ｉ）。これらの結果は
、末梢組織におけるＧＷ３９６５［２］によるＡｐｏＥ誘導が全身的なＬＸＲβ活性化に
よって主に押し進められることを示している。このことと一致して、本発明者らは、全身
的なＬＸＲβが、メラノーマ腫瘍成長抑制を媒介することにおけるＧＷ３９６５［２］の
主要な分子標的で、かつ、エフェクターであることを見出している。
本発明者らは次に、ＡｐｏＥがＬＸＲアゴニストのインビボでのメラノーマ抑制的影響
のために要求されるかどうかを調べた。メラノーマ細胞のＬＸＲβノックダウンについて
はＧＷ３９６５［２］の腫瘍抑制活性に対する影響がないことと一致して、メラノーマ細
胞ＡｐｏＥの枯渇化は、ＧＷ３９６５［２］による腫瘍成長阻害もまた妨げなかった（図
２９Ｆ〜図２９Ｈおよび図３０Ｆ）。これらの発見は、ＧＷ３９６５［２］の腫瘍抑制的
影響が主に全身組織におけるＡｐｏＥ誘導を介して媒介されているかもしれないことを示
唆する。
実際に、ＧＷ３９６５［２］は、ＡｐｏＥについて遺伝的に不活性化されるマウスにお
ける腫瘍成長を抑制することにおいて完全に無力ではなく（図３０Ｆ）、このことから、
全身的ＡｐｏＥが、メラノーマ腫瘍成長抑制を押し進めることにおける全身的ＬＸＲβの
下流側エフェクターとして明らかにされた。興味深いことに、原発性腫瘍成長の調節とは
対照的に、メラノーマ細胞のＡｐｏＥノックダウンはＧＷ３９６５［２］の転移抑制的影
響を部分的に妨げた（図３０Ｇ）。同様に、ＡｐｏＥの遺伝的不活性化もまた、ＧＷ３９
６５［２］によって誘発される転移抑制を部分的に妨げただけであった（図３０Ｇ）。転
移のＧＷ３９６５主導の阻害が、メラノーマ細胞ＡｐｏＥノックダウンおよび全身的Ａｐ
ｏＥの遺伝的不活性化の両方の状況でのみ完全に阻止され（図３０Ｇ）、このことから、
ＬＸＲβによるメラノーマ由来ＡｐｏＥの関与および全身的ＡｐｏＥの関与の両方が、転
移を抑制することにおいて要求されることが暗示された。したがって、本発明者らは、原
発性腫瘍成長に対するＬＸＲβ活性化の影響が、主に全身的なＡｐｏＥ誘導により誘発さ
れ、一方、転移に対するＬＸＲβアゴニズムの影響がメラノーマ細胞および全身組織の両
方におけるＡｐｏＥの転写誘導により媒介されると結論する。
ＡｐｏＥがメラノーマ表現型のＬＸＲβ誘導抑制の唯一の下流側媒介因子として特定さ
れたことにより、メラノーマ進行の抑制因子としてのこの遺伝子の重要性がさらに強調さ
れる。ＡｐｏＥ発現がメラノーマの転移性結末の臨床的な予後となるかどうかを明らかに
するために、本発明者らは、ＡｐｏＥのタンパク質レベルを、手術により切除された７１
個のヒト原発性メラノーマ病変部に対する盲検化された免疫組織化学的分析を行うことに
よって評価した。
本発明者らは、メラノーマが転移していた患者が、メラノーマが転移していない患者に
対して、それらの原発性腫瘍における大雑把には３分の１に低下したＡｐｏＥ発現を示し
たことを見出した（図３０Ｈ、Ｐ＝０．００２）。注目すべきことに、患者の原発性メラ
ノーマ病変部におけるＡｐｏＥの発現レベルにより、転移性再発についての危険性が大き
い患者が、その危険性が低い患者から堅固に階層化された（図３０Ｉ、Ｐ＝０．００２）
。これらの観測結果は、遠位メラノーマ転移部における著しくより低いレベルのＡｐｏＥ
が原発性病変部に対して明らかにされた以前の発見（Ｐｅｎｃｈｅｖａ他、２０１２）と
一致している。まとめると、本研究は、ＡｐｏＥがただ１つの遺伝子として、ｉ）メラノ
ーマの転移性再発についての危険性があり、かつ、そのようなものとして、ｉｉ）臨床的
利益をＬＸＲβアゴニスト媒介のＡｐｏＥ誘導から得ることができると思われる患者を特
定するための原発性メラノーマにおける予後的かつ予測的なバイオマーカーとしておそら
くは作用し得るかもしれないことを示している。
実施例１９ ＬＸＲβ活性化療法は、ダカルバジンおよびベムラフェニブに対して抵抗
性であるメラノーマの成長を抑制する
ＬＸＲβ活性化療法は多様な変異背景の広範囲のメラノーマ系統にわたってメラノーマ
の腫瘍成長および腫瘍転移を堅固に抑制することができることによって勇気づけられて、
本発明者らは次に、転移性メラノーマの管理において使用される主力となる臨床薬剤のう
ちの２つに対して、すなわち、ダカルバジンおよびベムラフェニブに対して抵抗性である
メラノーマが、ＬＸＲβ活性化療法に応答し得るかどうかを明らかにしようと努めた。
この目的を達成するために、本発明者らは、ダカルバジン（ＤＴＩＣ）に対して抵抗性
であるＢ１６Ｆ１０クローンを、メラノーマ細胞をＤＴＩＣの存在下で２ヶ月間にわたっ
て連続培養することによって作製した。これにより、親のＢ１６Ｆ１０細胞株と比較して
、高用量のＤＴＩＣ処理に対する応答での生存性における７倍の増大を示した細胞の集団
が得られた（図３１Ａ）。このインビトロ由来ＤＴＩＣクローンもまた、インビボにおい
てＤＴＩＣに対して抵抗性であることを確認するために、本発明者らは、腫瘍成長に対す
るダカルバジン処理の影響を評価した。
ダカルバジンはＤＴＩＣ感受性の親系統の成長を著しく抑制した（図３１Ｂ）が、Ｂ１
６Ｆ１０のＤＴＩＣ抵抗性細胞による腫瘍成長には影響を及ぼさなかった（図３１Ｃ）。
ＧＷ３９６５［２］は、ＤＴＩＣ抵抗性のＢ１６Ｆ１０メラノーマクローンによる腫瘍成
長を７０％超の差で堅固に抑制した（図３１Ｃ〜図３１Ｄ）。重要なことに、ＧＷ３９６
５［２］の経口送達もまた、関係性がないＭｅＷｏ細胞株によって形成されるインビボ由
来のＤＴＩＣ抵抗性ヒトメラノーマ腫瘍の成長を強く阻害した（図３１Ｅ〜図３１Ｆおよ
び図３２Ａ）。
これらの結果から、ＬＸＲβアゴニズムが、ダカルバジン（転移性メラノーマにおける
唯一のＦＤＡ承認された細胞毒性化学療法剤）に対して抵抗性である多数のメラノーマ細
胞集団を抑制することにおいて効果的であることが明らかにされる。本発明者らの発見は
、メラノーマの処置についての重要な臨床的意味合いを有している。これは、ダカルバジ
ンにより処置されるすべての第ＩＶ期患者が、この薬剤に対して抵抗性である腫瘍を発達
させることによって最終的には進行するからである。
本発明者らは、近年に承認されたＢ−Ｒａｆキナーゼ阻害剤であるベムラフェニブに対
して、すなわち、Ｂ−Ｒａｆ変異型メラノーマに対して活性を示す治療様式（Ｂｏｌｌａ
ｇ他、２０１０；Ｓｏｓｍａｎ他、２０１２）に対して抵抗性であるメラノーマ細胞に対
するＬＸＲβ活性化療法の影響を試験した。数多くの研究者が、ベムラフェニブに対して
抵抗性であるメラノーマ株を導いている（Ｐｏｕｌｉｋａｋｏｓ他、２０１１；Ｓｈｉ他
、２０１２；Ｄａｓ Ｔｈａｋｕｒ他、２０１３）。ＧＷ３９６５［２］による処置は、
以前に導かれたベムラフェニブ抵抗性ＳＫ−Ｍｅｌ−２３９系統の成長を７２％抑制し（
図３１Ｇ）、かつ、ベムラフェニブ抵抗性メラノーマの負荷を有するマウスの生存を著し
く延ばした（図３１Ｈ）。メラノーマの多様な前臨床モデルにおける組み合わされた薬理
学的研究、分子的研究および遺伝学的研究からの本発明者らの発見により、ＬＸＲβ標的
化が、メラノーマの腫瘍成長および腫瘍転移をＡｐｏＥ（メラノーマ浸潤および転移性血
管形成の重要な抑制因子）の転写誘導により堅固に抑制する新規な治療的取り組みとして
立証される（Ｐｅｎｃｈｅｖａ他、２０１２；図３１Ｉ）。
実施例２０ ＡｐｏＥによる処置は、腫瘍細胞浸潤および内皮動員を、乳ガン、腎細胞
ガンおよび膵臓ガンを含めて多数のガンタイプにわたって抑制する
ＡｐｏＥ処置が、メラノーマに加えて、様々なガンタイプを処置するために効果的であ
り得るかを明らかにするために、インビトロアッセイを行って、乳ガン細胞株、腎細胞ガ
ン細胞株および膵臓ガン細胞株を含めて、いくつかの異なるガン細胞株に対するＡｐｏＥ
処置の影響を評価した（図３３）。
ガン細胞がインビトロにおいてマトリゲルを通って浸潤し得ることを、トランスウエル
・マトリゲル浸潤チャンバーシステム（３５４４８０、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）
を使用することによって試験した。様々なガン細胞株を、０．２％のＦＢＳを含有する培
地における一晩の血清飢餓に供した。翌日、浸潤チャンバーを、０．５ｍＬの飢餓培地を
上部ウエルおよび底部ウエルに加えることによってアッセイ前に事前に平衡化させた。そ
の間に、ガン細胞をトリプシン処理し、生細胞を、トリパンブルー死細胞排除色素を使用
して計数した。その後、ガン細胞を１ｍＬの飢餓培地あたり１×１０５細胞の濃度で再懸
濁し、０．５ｍＬの細胞懸濁物（５×１０４個の細胞を含有する）をそれぞれのトランス
ウエルの中に播種した。ガン細胞浸潤に対する組換えＡｐｏＥの影響を明らかにするため
に、ヒト組換えＡｐｏＥ３（４６９６、Ｂｉｏｖｉｓｉｏｎ）またはＢＳＡをアッセイ開
始時にそれぞれのトランスウエルに１００μｇ／ｍＬで加えた。浸潤アッセイを３７℃で
２４時間にわたって進行させた。アッセイが完了したとき、挿入物をＰＢＳで洗浄し、浸
潤していない細胞を、ｑ−チップを使用してそれぞれの挿入物の上部面から穏やかにかき
取り、挿入物の基部面に浸潤した細胞を４％のＰＦＡにおいて室温で１５分間にわたって
固定処理した。固定処理の後、挿入物をＰＢＳで洗浄し、その後、切り出し、ＤＡＰＩ核
染色（Ｈ−１０００、Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を含有するＶｅｃｔａ
Ｓｈｉｅｌｓ固定用媒体を使用してスライドに固定した。それぞれの挿入物の基部面を、
倒立型蛍光顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ Ａｘｉｏｖｅｒｔ ４０ ＣＦＬ）を５×の倍率で使用
して画像化し、ＤＡＰＩ陽性細胞の数を、ＩｍａｇｅＪを使用して定量化した。
実際に、ＡｐｏＥによる処理は、腫瘍細胞浸潤および内皮動員の両方をこれらのガンタ
イプの３つすべてにわたって阻害した（図３３Ａ〜図３３Ｉ）。
実施例２１ ＬＸＲアゴニストのＬＸＲ−６２３、ＷＯ−２００７−００２５６３（Ｅ
ｘ．１９）、ＷＯ−２０１０−０１３８５９８（Ｅｘ．９）およびＳＢ７４２８８１はＡ
ｐｏＥ発現をヒトメラノーマ細胞において誘導する
ＬＸＲアゴニストのＧＷ３９６５［２］およびＴ０９０１３１７［１］を用いた処理に
よるＡｐｏＥ活性化が、腫瘍の成長および転移を阻害するための治療的利益をもたらした
ことを考えれば、本発明者らは次に、他のＬＸＲアゴニストがＡｐｏＥ発現をヒトメラノ
ーマ細胞において誘導し得るかを調べた（図３４）。
メラノーマ細胞におけるＡｐｏＥ発現に対する様々なＬＸＲアゴニスト（ＬＸＲ−６２
３、ＷＯ−２００７−００２５６３（Ｅｘ．１９）、ＷＯ−２０１０−０１３８５９８（
Ｅｘ．９）およびＳＢ７４２８８１）の影響を明らかにするために、１×１０５個のヒト
ＭｅＷｏメラノーマ細胞を６ウエルプレートに播種した。翌日、ＤＭＳＯまたはそれぞれ
のＬＸＲアゴニストを、示されるように５００ｎＭ、１μＭまたは２μＭの濃度で細胞培
地に加え、細胞をＤＭＳＯまたは薬物の存在下において３７℃で４８時間インキュベーシ
ョンした。細胞培地に加えられるＤＭＳＯの総量を０．２％未満に保った。ＲＮＡを、Ｔ
ｏｔａｌ ＲＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（１７２００、Ｎｏｒｇｅｎ）を
使用して全細胞溶解物から抽出した。どのサンプルについても、６００ｎｇのＲＮＡを、
ｃＤＮＡ Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅ
ｎ）を使用してｃＤＮＡに逆転写した。およそ２００ｎｇのｃＤＮＡを、ＳＹＢＲ（登録
商標）グリーンＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ、ならびに、ヒトＡｐｏＥを検出するため
に特異的である対応する順方向プライマーおよび逆方向プライマーと混合した。それぞれ
の反応を四連で行い、ＡｐｏＥのｍＲＮＡ発現レベルを、ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ７９００
ＨＴ Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅ
ｍｓ）を使用して定量的リアルタイムＰＣＲ増幅によって測定した。相対的なＡｐｏＥ発
現を、ΔΔＣｔ法を使用して求めた。ＧＡＰＤＨを正規化目的のための内因性コントロー
ルとして使用した。
実際に、上記ＬＸＲアゴニスト（ＬＸＲ−６２３、ＷＯ−２００７−００２５６３（Ｅ
ｘ．１９）、ＷＯ−２０１０−０１３８５９８（Ｅｘ．９）およびＳＢ７４２８８１）に
よる処理はすべてが、様々な程度のＡｐｏＥ発現誘導を引き起こした（図３４Ａ〜図３４
Ｃ）。
実施例２２ ＬＸＲアゴニストのＧＷ３９６５による処置は、腎臓ガン、膵臓ガンおよ
び肺ガンのインビトロでの腫瘍細胞浸潤を阻害する
本発明者らは、ＬＸＲアゴニストによる処置がメラノーマ腫瘍細胞浸潤の阻害をもたら
したことを明らかにしている。この効果がＡｐｏＥ発現の活性化によって媒介されること
を考えれば、本発明者らは、ＬＸＲアゴニストによる処置が、乳ガン、膵臓ガンおよび腎
臓ガンにおけるインビトロでの腫瘍細胞浸潤の阻害をもたらすであろうと仮定した。これ
は、これらのガンタイプがＡｐｏＥ処置に対して応答性であったからである。この仮説を
検証するために、本発明者らは、インビトロ腫瘍細胞浸潤アッセイを、乳ガン細胞株、膵
臓ガン細胞株および腎細胞ガン細胞株をＬＸＲアゴニストのＧＷ３９６５［２］により処
理することによって行った（図３５）。
様々な細胞株（５×１０４個のＲＣＣヒト腎臓ガン細胞、５×１０４個のＰＡＮＣ１ヒ
ト膵臓ガン細胞および５×１０４個のＨ４６０ヒト肺ガン細胞）を１μＭでのＤＭＳＯま
たはＧＷ３９６５により５６時間処理した。細胞を、ＤＭＳＯまたはＧＷ３９６５の存在
下、ＦＢＳが０．２％の培地における１６時間の血清飢餓に供した。血清飢餓の後、細胞
を、マトリゲル浸潤チャンバーシステム（３５４４８０、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ
）を使用するトランスウエル浸潤アッセイに供した。浸潤チャンバーを、０．５ｍＬの飢
餓培地を上部ウエルおよび底部ウエルに加えることによってアッセイ前に事前に平衡化さ
せた。その間に、ガン細胞をトリプシン処理し、生細胞を、トリパンブルーを使用して計
数した。その後、ガン細胞を１ｍＬの飢餓培地あたり１×１０５細胞の濃度で再懸濁し、
０．５ｍＬの細胞懸濁物（５×１０４個の細胞を含有する）をそれぞれのトランスウエル
の中に播種した。浸潤アッセイを３７℃で２４時間にわたって進行させた。アッセイが完
了したとき、挿入物をＰＢＳで洗浄し、浸潤していない細胞を、ｑ−チップを使用してそ
れぞれの挿入物の上部面から穏やかにかき取り、挿入物の基部面に浸潤した細胞を４％の
ＰＦＡにおいて室温で１５分間にわたって固定処理した。固定処理の後、挿入物をＰＢＳ
で洗浄し、その後、切り出し、ＤＡＰＩ核染色（Ｈ−１０００、Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏ
ｒａｔｏｒｉｅｓ）を含有するＶｅｃｔａＳｈｉｅｌｄ固定用媒体を使用してスライドに
固定した。それぞれの挿入物の基部面を、倒立型蛍光顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ Ａｘｉｏｖｅ
ｒｔ ４０ ＣＦＬ）を５×の倍率で使用して画像化し、ＤＡＰＩ陽性細胞の数を、Ｉｍ
ａｇｅＪを使用して定量化した。
実際に、ＧＷ３９６５［２］による処理は、試験された３つすべてのガンタイプにおけ
る腫瘍細胞浸潤の阻害をもたらした（図３５Ａ〜図３５Ｃ）。このことからさらに、様々
なガンタイプを処置するためのＬＸＲアゴニストの幅広い治療的可能性が実証された。
実施例２３ ＬＸＲアゴニストのＧＷ３９６５による処置は乳ガンの腫瘍成長をインビ
ボにおいて阻害する
本発明者らは、ＬＸＲアゴニストが、乳ガン、膵臓ガンおよび腎臓ガンにおけるインビ
トロでのガン進行表現型を阻害することを明らかにしている。ＬＸＲアゴニストによる処
置が乳ガンの原発性腫瘍成長をインビボにおいて阻害するかを詳しく調べるために、ＭＤ
Ａ−４６８ヒト乳ガン細胞が注入されるマウスを、コントロール餌、または、ＬＸＲアゴ
ニストのＧＷ３９６５［２］が補充される餌のどちらかにより処置した（図３６）。
経口送達されたＧＷ３９６５［２］の乳ガン腫瘍成長に対する影響を明らかにするため
に、２×１０６個のＭＤＡ−４６８ヒト乳ガン細胞を５０μＬのＰＢＳおよび５０μＬの
マトリゲルに再懸濁し、細胞懸濁物を７週齢のＮｏｄ Ｓｃｉｄガンマの雌マウスの両方
の下部メモリ脂肪パッド（ｍｅｍｏｒｙ ｆａｔ ｐａｄ）に注入した。マウスをガン細
胞注入の２日前にコントロール餌処置またはＧＷ３９６５補充餌処置（７５ｍｇ／ｋｇ／
日）に割り当てた。ＧＷ３９６５［２］の薬物化合物は、Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｄｉｅｔｓ
，Ｉｎｃ．によってマウス固形飼料に配合された。腫瘍の大きさを、デジタルカリパスを
使用して測定し、腫瘍体積を、（最小直径）２×（最大直径）／２として計算した。
ＧＷ３９６５による処置は乳ガン腫瘍サイズにおける著しい減少をインビボにおいても
たらした（図３６）。
実施例２４ インビトロでのメラノーマ進行表現型に対するＬＸＲアゴニスト（ＬＸＲ
−６２３、ＷＯ−２００７−００２５６３（Ｅｘ．１９）、ＷＯ−２０１０−０１３８５
９８（Ｅｘ．９）およびＳＢ７４２８８１）による処置の影響
本発明者らは、様々なＬＸＲアゴニストが、ＡｐｏＥ発現を、メラノーマ細胞における
様々な効力を伴って誘導し得ることを明らかにしている（図３４）。ガンに対するＬＸＲ
アゴニストの治療効果がＡｐｏＥ発現の活性化を介してであるので、本発明者らは、どの
ようなＬＸＲアゴニストであれ、与えられたＬＸＲアゴニストの治療効力がそのＡｐｏＥ
発現誘導能と直接に相関づけられることを仮定した。このことを確認するために、本発明
者らは、メラノーマ細胞のインビトロでの内皮動員および腫瘍細胞浸潤に対する様々なＬ
ＸＲアゴニストによる処置の影響を定量化した。図３７に示されるように、ＬＸＲアゴニ
ストがインビトロでのガン進行表現型を阻害する程度が、ＬＸＲアゴニストのＡｐｏＥ誘
導効力に関連づけられる。
細胞浸潤：ＭｅＷｏヒトメラノーマ細胞を、ＤＭＳＯ、ＬＸＲ−６２３、ＷＯ−２００
７−００２５６３（Ｅｘ．１９）、ＷＯ−２０１０−０１３８５９８（Ｅｘ．９）または
ＳＢ７４２８８１によりそれぞれ１μＭで５６時間処理した。その後、細胞を、それぞれ
の対応する薬物またはＤＭＳＯの存在下、ＦＢＳが０．２％の培地における１６時間の血
清飢餓に供した。血清飢餓の後、細胞を、マトリゲル浸潤チャンバーシステム（３５４４
８０、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用するトランスウエル浸潤アッセイに供した
。浸潤チャンバーを、０．５ｍＬの飢餓培地を上部ウエルおよび底部ウエルに加えること
によってアッセイ前に事前に平衡化させた。その間に、ガン細胞をトリプシン処理し、生
細胞を、トリパンブルーを使用して計数した。その後、ガン細胞を１ｍＬの飢餓培地あた
り２×１０５細胞の濃度で再懸濁し、０．５ｍＬの細胞懸濁物（１×１０５個の細胞を含
有する）をそれぞれのトランスウエルの中に播種した。浸潤アッセイを３７℃で２４時間
にわたって進行させた。アッセイが完了したとき、挿入物をＰＢＳで洗浄し、浸潤してい
ない細胞を、ｑ−チップを使用してそれぞれの挿入物の上部面から穏やかにかき取り、挿
入物の基部面に浸潤した細胞を４％のＰＦＡにおいて室温で１５分間にわたって固定処理
した。固定処理の後、挿入物をＰＢＳで洗浄し、切り出し、ＤＡＰＩ核染色（Ｈ−１００
０、Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を含有するＶｅｃｔａＳｈｉｅｌｓ固定
用媒体を使用してスライドに固定した。それぞれの挿入物の基部面を、倒立型蛍光顕微鏡
（Ｚｅｉｓｓ Ａｘｉｏｖｅｒｔ ４０ ＣＦＬ）を５×の倍率で使用して画像化し、Ｄ
ＡＰＩ陽性細胞の数を、ＩｍａｇｅＪを使用して定量化した。
内皮動員：ＭｅＷｏヒトメラノーマ細胞を、ＤＭＳＯ、ＬＸＲ−６２３、ＷＯ−２００
７−００２５６３（Ｅｘ．１９）、ＷＯ−２０１０−０１３８５９８（Ｅｘ．９）または
ＳＢ７４２８８１によりそれぞれ１μＭで５６時間処理した。続いて、５×１０４個のガ
ン細胞をそれぞれの薬物またはＤＭＳＯの存在下において２４ウエルプレートに播種し、
アッセイを開始する前の１６時間にわたって付着させた。ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶ
ＥＣ細胞）を、０．２％のＦＢＳを含有する培地における血清飢餓に一晩供した。翌日、
１×１０５個のＨＵＶＥＣ細胞を、ガン細胞を底部に含有するそれぞれのウエルにはめ込
まれる３．０μｍのＨＴＳ Ｆｌｕｏｒｏｂｌｏｃｋ挿入物（３５１１５１、ＢＤ Ｆａ
ｌｃｏｎ）の中に播種した。ＨＵＶＥＣ細胞をガン細胞に向かって２０時間にわたって遊
走させ、その後、挿入物をＰＢＳで洗浄し、４％のＰＦＡにおいて固定処理し、ＤＡＰＩ
により標識し、スライドに固定した。それぞれの挿入物の基部面を、倒立型蛍光顕微鏡（
Ｚｅｉｓｓ Ａｘｉｏｖｅｒｔ ４０ ＣＦＬ）を５×の倍率で使用して画像化し、ＤＡ
ＰＩ陽性細胞の数を、ＩｍａｇｅＪを使用して定量化した。
ＡｐｏＥ発現を強力に誘導するＬＸＲアゴニスト（例えば、ＷＯ−２０１０−０１３８
５９８（Ｅｘ．９）およびＳＢ７４２８８１）は、ガン進行表現型を阻害することにおい
て、効力がより低いＬＸＲアゴニストよりも効果的である（図３７）。このことからさら
に、ＬＸＲアゴニスト処置の治療的利益がＡｐｏＥ誘導の結果であることが実証される。
実施例２５ ＬＸＲアゴニストによる処置はメラノーマ腫瘍成長をインビボにおいて阻
害する
本発明者らは、ＡｐｏＥ発現を誘導する様々なＬＸＲアゴニストがインビトロ腫瘍活性
を阻害することを明らかにしている。これらのアゴニストがメラノーマ腫瘍成長をインビ
ボにおいて阻害するかを確認するために、Ｂ１６Ｆ１０メラノーマ細胞が注入されるマウ
スを、ＬＸＲ−６２３、ＷＯ−２００７−００２５６３（Ｅｘ．１９）、ＷＯ−２０１０
−０１３８５９８（Ｅｘ．９）またはＳＢ７４２８８１のいずれかにより処置した。
経口投与されたＬＸＲ−６２３、ＷＯ−２００７−００２５６３（Ｅｘ．１９）、ＷＯ
−２０１０−０１３８５９８（Ｅｘ．９）またはＳＢ７４２８８１のメラノーマ腫瘍成長
に対する影響を評価するために、５×１０４個のＢ１６Ｆ１０マウスメラノーマ細胞を５
０μＬのＰＢＡおよび５０μＬのマトリゲルに再懸濁し、細胞懸濁物を７週齢Ｃ５７ＢＬ
／６マウスの両側の下部背側わき腹に皮下注入した。マウスを腫瘍形成について毎日触診
し、体積で５ｍ３〜１０ｍ３である腫瘍が検出された後、マウスを、コントロール固形飼
料、または、下記のそれぞれのＬＸＲアゴニストを含有する固形飼料に割り当てた：ＬＸ
Ｒ−６２３（２０ｍｇ／ｋｇ／日）、ＷＯ−２００７−００２５６３（Ｅｘ．１９）（１
００ｍｇ／ｋｇ／日）、ＷＯ−２０１０−０１３８５９８（Ｅｘ．９）（１０ｍｇ／ｋｇ
／日または１００ｍｇ／ｋｇ／日）またはＳＢ７４２８８１（１００ｍｇ／ｋｇ／日）。
これらのＬＸＲアゴニスト薬物化合物は、Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｄｉｅｔｓ，Ｉｎｃ．によ
ってマウス固形飼料に配合された。腫瘍の大きさを、デジタルカリパスを使用して測定し
、腫瘍体積を、（最小直径）２×（最大直径）／２として計算した。
本発明者らのインビトロでのデータと一致して、ＡｐｏＥ発現をインビトロにおいて強
力に誘導するＬＸＲアゴニスト（ＷＯ−２０１０−０１３８５９８（Ｅｘ．９）およびＳ
Ｂ７４２８８１）はメラノーマ原発性腫瘍成長をインビボにおいて著しく阻害した（図３
８）。このことはまた、ＡｐｏＥ発現を強力に誘導する他のＬＸＲアゴニスト（ＧＷ３９
６５［２］、Ｔ０９０１３１７［１］）もまた、原発性腫瘍成長をインビボにおいて阻害
することを実証する本発明者らの結果（図２１）と一致している。
したがって、上記例は、その効果を発揮する分子的機構および細胞機構を特徴づけるこ
とに集中した。この目的を達成するために、ＡｐｏＥが、２つの別種の細胞タイプにおけ
る２つの異なった、それにもかかわらず相同的な受容体を標的化することが見出された。
メラノーマ細胞のＬＲＰ１受容体に作用するＡｐｏＥはメラノーマの浸潤を阻害し、一方
、内皮細胞のＬＲＰ８受容体に対するその作用は内皮遊走を抑制する。機能喪失分析、機
能獲得分析、エピスタシス分析、臨床的相関分析およびインビボ選抜派生物発現分析から
の結果により、３つのｍｉＲＮＡが転移抑制因子ネットワークを収斂的に標的化して、Ａ
ｐｏＥの分泌を制限し、したがって、メラノーマ細胞に対するＡｐｏＥ／ＬＲＰ１シグナ
ル伝達および内皮細胞に対するＡｐｏＥ／ＬＲＰ８シグナル伝達を抑制するモデルが得ら
れる（図７Ｋ）。上記の体系的分析により、ＡｐｏＥおよびＤＮＡＪＡ４が、これらのｍ
ｉＲＮＡによって調節される転移表現型の重要な標的および直接的な媒介因子として特定
されているにもかかわらず、これら３つのｍｉＲＮＡは、サイレンシングが転移性進行に
寄与するかもしれないさらなる遺伝子標的を個々に保持しているかもしれないことを排除
することができない。しかしながら、ＡｐｏＥまたはＤＮＡＪＡ４のノックダウンが、個
々のｍｉＲＮＡサイレンシングとともに認められる転移抑制表現型を完全に回復させ得る
ことは、これらの遺伝子が転移に対するｍｉＲＮＡ依存的影響の重要な媒介因子であるこ
とを強く示唆する。
上記の結果から、メラノーマ転移性進行の抑制におけるＡｐｏＥについて要求され、か
つ、十分である役割に対する組み合わされた分子的、遺伝子的かつインビボでの証拠が明
らかにされる。ＡｐｏＥは、リポタンパク質結合状態および脂質非含有状態の両方におい
て循環系に分布し得る（Ｈａｔｔｅｒｓ他、２００６）。脂質非含有の組換えＡｐｏＥが
、メラノーマ浸潤および内皮遊走を抑制するために十分であることが示されているが、リ
ポタンパク質粒子に含有されるＡｐｏＥもまた、メラノーマ浸潤および内皮動員を抑制し
得るであろうことが可能である。組換えＡｐｏＥが、これら転移支援的表現型、同様にま
た、抗体媒介のＡｐｏＥ中和とともに認められる増大したメラノーマ浸潤表現型および内
皮動員表現型を阻害し得ることは、ＡｐｏＥ分子自身がこれらの表現型の重要な媒介因子
であることを示唆する。本明細書中に開示される発見と一致して、ＡｐｏＥの合成ペプチ
ドフラグメントは、内皮遊走を、不明な機構を介して阻害することが以前に見出された（
Ｂｈａｔｔａｃｈａｒｊｅｅ他、２０１１）。本明細書中に開示される発見は、内皮動員
を阻害することにおけるメラノーマ細胞分泌のＡｐｏＥおよび全身的な内因性ＡｐｏＥに
ついての役割と一致しており、この場合、この役割は、損なわれた内皮細胞成長の二次的
なものではない。
上記の分子的研究、遺伝子研究およびインビボ研究から、内皮ＬＲＰ８受容体のシグナ
ル伝達を介する内皮遊走およびガン血管形成の調節における内因性のガン由来ＡｐｏＥに
ついての役割が明らかにされる。ＡｐｏＥ／ＬＲＰ８シグナル伝達によって媒介されるこ
の堅固な細胞非自律的な内皮動員表現型は、ＡｐｏＥがまた、転移性血管形成を他のガン
タイプにおいて調節しているかもしれないことを示唆しており、そして、ガンの血管形成
におけるＡｐｏＥについてのそのような全体的な役割は今後、検討されなければならない
。ＡｐｏＥは、脂質障害、心臓血管障害および神経変性障害における十分に確立された役
割を有する多型分子である。その３つの主要な変異体、すなわち、ＡｐｏＥ２、ＡｐｏＥ
３およびＡｐｏＥ４が、様々な提示物をヒト集団において示しており、ＡｐｏＥ３が最も
一般的な変異体である（Ｈａｔｔｅｒｓ他、２００６）。これら３つのイソ型は、Ａｐｏ
Ｅ受容体結合ドメインを含有するＮ末端ドメインにおける１１２位および１５８位の残基
において異なる。これらの構造的変化が変異体の間における異なった機能的属性を生じさ
せていると考えられる。このことと一致して、これら３つのＡｐｏＥイソ型は、ＬＤＬ受
容体ファミリーのメンバーについてのそれらの結合親和性、リポタンパク質結合の好み、
および、Ｎ末端の安定性において異なる。すなわち、ＡｐｏＥ２は、ＬＤＬ受容体結合能
が、ＡｐｏＥ３およびＡｐｏＥ４と比較して、５０分の１〜１００分の１と弱く（Ｗｅｉ
ｓｇｒａｂｅｒ他、１９８２）、一方、ＡｐｏＥ４は、それ以外の２つの変異体とは異な
り、大きいより低密度のリポタンパク質に優先的に結合し（Ｗｅｉｓｇｒａｂｅｒ他、１
９９０）、また、最も低いＮ末端安定性を示す（Ｍｏｒｒｏｗ他、２０００）。これらの
機能的な違いにより、ＡｐｏＥのイソ型を選択するための病態生理学的性質がもたらされ
る。ＡｐｏＥ３（これは集団の７８％において見出される）は中立的な対立遺伝子である
と見なされるが、ＡｐｏＥ２はＩＩＩ型高リポタンパク血症に関連し（Ｈａｔｔｅｒｓ他
、２００６）、ＡｐｏＥ４はアルツハイマー病についての主要な知られている遺伝的リス
クを表し（Ｃｏｒｄｅｒ他、１９９３）、また、心臓血管疾患を発症する危険性における
大きくない増大と相関する（Ｌｕｃ他、１９９４）。上記研究において分析された多数の
ヒトメラノーマ細胞株がＡｐｏＥ３対立遺伝子についてホモ接合性であること、同様にま
た、組換えＡｏＥ３がメラノーマ浸潤および内皮動員を阻害し得ることを考えれば、上記
の発見は、ＡｐｏＥ３がメラノーマ転移性進行の抑制のために十分であり、かつ、要求さ
れることと一致している。しかしながら、ＡｐｏＥ２およびＡｐｏＥ４がこれらの転移支
援的表現型をＡｐｏＥ３と同じような程度に調節し得るかどうか、また、特定のＡｐｏＥ
遺伝子型が、メラノーマ転移性進行の高まった危険性をもたらすかどうかを明らかにする
ことは、将来、注目されるであろう。
原発性メラノーマ病変部の外科的切除を除いて、現在においてはメラノーマ転移を防止
するための効果的な治療法はなく、インターフェロン療法が５年での全生存率をメタ分析
に基づいてわずかに３％増大させており、一方、有意な生存利益の第ＩＩＩ相臨床データ
実証は依然として顕著である（Ｇａｒｂｅ他、２０１１）。全身的ＡｐｏＥの遺伝的消失
の状況におけるメラノーマ転移性進行の劇的な高まりは、ＡｐｏＥレベルを調節すること
が、メラノーマ、すなわち、およそ４８，０００名の命を世界中で毎年奪う疾患（Ｌｕｃ
ａｓ他、２００６）のための重要な治療的意味合いを有しているかもしれないことを示唆
する。ＡｐｏＥが、メラノーマ浸潤、内皮遊走、転移性血管形成および転移性コロニー形
成を堅固に抑制し得ることを考えれば、内因性ＡｐｏＥレベルの薬理学的誘導を目的とす
る治療的取り組みは、メラノーマ死亡率を、転移発生を低下させることによって著しく低
下させるかもしれない。
先入観のない、インビボ選抜に基づく上記取り組みは、黒色性メラノーマおよび無色素
性メラノーマの両方を表す独立した患者のメラノーマ細胞株からのガン細胞による転移を
相乗的かつ劇的に促進させる脱調節されたｍｉＲＮＡの発見をもたらした。ｍｉＲ−１９
０８は以前には特徴づけられていないが、ｍｉＲ−１９９ａが、メラノーマに反してｍｉ
Ｒ−１９９ａ発現レベルのダウンレギュレーションを示す肝細胞ガン（Ｈｏｕ他、２０１
１；Ｓｈｅｎ他、２０１０）および骨肉腫（Ｄｕａｎ他、２０１１）において関係づけら
れている。これらの違いは、様々なガンタイプにおけるｍｉＲＮＡの立証された組織特異
的な発現プロフィルと一致している。メラノーマ転移の促進因子としてのｍｉＲ−１９９
ａの特定が、増大したｍｉＲ−１９９ａレベルがぶどう膜メラノーマの進行と相関するこ
とを明らかにする以前の臨床的合同研究（Ｗｏｒｌｅｙ他、２００８）によって裏づけら
れており、このことから、誘導されたｍｉＲ−１９９ａ発現が、起源部位にかかわらず、
転移性メラノーマの定義づける特徴であるかもしれないことが示唆される。以前の研究で
は、さらなるｍｉＲＮＡが、メラノーマ転移性進行を促進させることにおいて関係づけら
れている：例えば、ｍｉＲ−１８２（Ｓｅｇｕｒａ他、２００９）、ｍｉＲ−２１４（こ
れは転移性メラノーマ細胞においてアップレギュレーションされたが、上記研究では作動
可能に機能しなかった；Ｐｅｎｎａ他、２０１１）、および、ｍｉＲ−３０ｂ／ｍｉＲ−
３０ｄ（Ｇａｚｉｅｌ−Ｓｏｖｒａｎ他、２０１１）など。これらのｍｉＲＮＡのそれぞ
れがメラノーマ転移をほどほどにしか調節せず、これにより、１．５倍〜２倍の差で増大
または低下した転移調節をｍｉＲＮＡの過剰発現またはノックダウンのときにそれぞれ引
き起こすことが報告されている。対照的には、ｍｉＲ−１９９ａまたはｍｉＲ−１９０８
のどちらかの過剰発現は転移を９倍高め（図１Ｃ）、一方、コンビナトリアルｍｉＲＮＡ
ノックダウンは、７０倍超の差でメラノーマ転移を相乗的に抑制した（図７Ｅ）。したが
って、本明細書中に開示される研究は、ヒトメラノーマ転移を収斂的かつ堅固に促進させ
る多数のｍｉＲＮＡの最初の体系的な発見、同様にまた、二重の細胞自律的／細胞非自律
的な役割をガンにおける内因性の転移調節ｍｉＲＮＡに対応づける最初のものであること
を表している。
乳ガンにおけるｍｉＲＮＡの以前の体系的な分析では、インビボ選抜された転移性乳ガ
ン細胞での多数のマイクロＲＮＡの発現レベルにおける低下が主に明らかにされた（Ｔａ
ｖａｚｏｉｅ他、２００８）。それらの知見は、乳ガンにおける多くさらなる転移抑制因
子ｍｉＲＮＡのその後の発見（Ｓｈｉ他、２０１０；ＷａｎｇおよびＷａｎｇ、２０１１
）、ｐ５３腫瘍抑制因子の直接的な転写標的としてのいくつかのｍｉＲＮＡの特定（Ｈｅ
他、２００７）、正常な組織に対して乳ガンにおけるｍｉＲＮＡのダウンレギュレーショ
ン（ＣａｌｉｎおよびＧｒｏｃｅ、２００６；Ｉｏｒｉｏ他、２００５）、ドローシャお
よびダイサーの乳ガン（Ｙａｎ他、２０１１）および転移性乳ガン（Ｇｒｅｌｉｅｒ他、
２０１１）におけるダウンレギュレーション、同様にまた、ダイサーのノックダウンを介
する全般的なｍｉＲＮＡサイレンシングの腫瘍形成支援的影響および転移支援的影響（Ｋ
ｕｍａｒ他、２００７；Ｋｕｍａｒ他、２００９；Ｍａｒｔｅｌｌｏ他、２０１０；Ｎｏ
ｈ他、２０１１）と一致していた。乳ガンとは対照的には、メラノーマにおける上記知見
から、転移性ヒトメラノーマにおいてアップレギュレーションされる一組のｍｉＲＮＡが
明らかにされ、このことは、ｍｉＲＮＡのプロセシングが実際にメラノーマにおいて腫瘍
形成支援的様式または転移支援的様式で作用しているかもしれないという興味深い可能性
をもたらしている。このことと一致して、ダイサーがメラニン細胞の発達のために要求さ
れ（Ｌｅｖｙ他、２０１０）、また、ダイサーの発現が近年には、臨床病理学的研究にお
いてヒトメラノーマ進行と正に相関することが見出された（Ｍａ他、２０１１）。これら
の発見は、ここに開示される発見と統合されたとき、ダイサーがメラノーマ転移において
作動可能に要求されること（Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ他、２００１）を詳しく調べるためのさ
らなる研究の動機づけとなっている。
黒色性メラノーマ転移および無色素性メラノーマ転移のインビボ選抜モデルの確立は、
高転移性メラノーマ細胞によって呈示される細胞表現型を特定することを可能にしている
。この研究から、高まった浸潤性に加えて、内皮細胞を動員するメラノーマ細胞の能力が
、低転移性のメラノーマ細胞に対して、高転移性メラノーマ細胞において著しく高まるこ
とが明らかにされる。加えて、転移の３つの主要な転写後調節因子が内皮動員を強く媒介
することが見出された。これらのｍｉＲＮＡによって調節される下流側のシグナル伝達経
路もまた、内皮動員を調節することがさらに見出された。これらの発見から、内皮動員が
転移性メラノーマ細胞の定義づける特徴であることが明らかにされる。高まった内皮動員
能はまた、転移性乳ガンの定義づける特徴であることが近年には見出され、この場合、ｍ
ｉＲ−１２６による転移の抑制が、内皮動員を促進させる２つの異なったシグナル伝達経
路のｍｉＲＮＡ標的化を介して媒介された（Ｐｎｇ他、２０１２）。乳ガンにおいて、内
皮動員は、腫瘍成長よりも、むしろ、転移開始の可能性を増大させた。同様に、この場合
に研究されるメラノーマ転移促進因子ｍｉＲＮＡは、転移性コロニー形成を、原発性腫瘍
成長を高めることなく劇的に高め、また、転移性結節の数を増大させ、これらは、腫瘍成
長促進ではなく、むしろ、転移開始におけるこれらのｍｉＲＮＡおよびそれらの調節ネッ
トワークについての役割と一致するものであった。まとめると、これらの発見は、これら
の異なった上皮ガンタイプにおける転移開始および転移性コロニー形成の促進因子として
作用する転移ニッチの中への内皮動員と一致している。ガン進行における内皮細胞につい
てのそのような非正準的役割は、高まった腫瘍成長を急がせる血流の血管形成強化におけ
る内皮細胞の立証された役割と対照をなすものであろう。内皮細胞は、様々な合図を器官
形成の期間中に付近の細胞に与えることによって発達におけるそのような非正準的役割を
果たすことが知られている（Ｌａｍｍｅｒｔ他、２００１）。そのような合図はまた、器
官再生を促進させることが近年には示されている（Ｄｉｎｇ他、２０１１；Ｄｉｎｇ他、
２０１０；Ｋｏｂａｙａｓｈｉ他、２０１０）。今後の研究が、転移開始を触媒する内皮
細胞によって提供される転移刺激因子を明らかにするために必要となる。
ｍｉＲ−１９９ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１９９ａ−５ｐおよびｍｉＲ−１９０８により、メ
ラノーマ患者のコホートにおける転移非存在生存を個々に予測することができることは、
メラノーマガン進行の臨床での予測因子としてのそれぞれのｍｉＲＮＡの重要性を示して
いる。重要なことに、転移性再発についての危険性が大きい患者を、どの危険性が本質的
にはない患者から階層化するためのこれら３つのｍｉＲＮＡの総合的シグナチャー（図７
Ｄ）の劇的かつ非常に著しい能力により、これらのｍｉＲＮＡの協同性、同様にまた、ｍ
ｉＲＮＡ阻害療法から利益を受けるかもしれない患者のサブセットを特定するためのメラ
ノーマのバイオマーカーとしてのそれらの臨床的可能性（Ｓａｗｙｅｒｓ、２００８）が
ともに明らかにされる。治療的なｍｉＲＮＡ標的化は、ｍｉＲＮＡに拮抗することがマウ
ス（Ｅｌｍｅｒ他、２００８（ｂ）；Ｋｒｕｔｚｆｅｌｄｔ他、２００５；Ｏｂａｄ他、
２０１１）および霊長類（Ｅｌｍｅｒ他、２００８（ａ））において示されている、また
、ヒト臨床試験において現在試験中であるインビボＬＮＡの使用により勢いが増している
。これら３つのｍｉＲＮＡの強力な予後能力、高転移性メラノーマ細胞を、ｍｉＲ−１９
９ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１９９ａ−５ｐおよびｍｉＲ−１９０８を標的化するＬＮＡのカク
テルにより処置することによって達成される堅固な相乗的な転移防止の原理証明による実
証（図７Ｅ）、同様にまた、これらのｍｉＲＮＡを標的化する治療的に送達されたインビ
ボ最適化ＬＮＡの転移抑制効果（図７Ｊ）は、メラノーマ転移についての、すなわち、効
果的な化学療法選択肢を現時点では欠く結末についての危険性が高い患者においてこれら
の転移支援的ｍｉＲＮＡおよび血管形成支援的ｍｉＲＮＡを組合せにより標的化すること
の治療的可能性を明らかにすることを目的とする今後の臨床研究に動機を与えるものであ
る。
好ましい実施形態の上記の実施例および記載は、請求項によって定義されるような本発
明を限定するとしてではなく、むしろ、例示であるとして解釈されなければならない。容
易に理解されるであろうように、上記で示される特徴の数多くの変化および組合せを、請
求項において示されるような本発明から逸脱することなく利用することができる。そのよ
うな変化は、本発明の範囲から逸脱するものとして見なされず、すべてのそのような変化
が、下記の請求項の範囲に含まれることが意図される。本明細書中で引用されるすべての
参考文献がそれらの全体において組み込まれる。

Claims (92)

  1. ガンを処置するための方法であって、その必要性のある対象にＬＸＲアゴニストを投与
    することを含み、前記ＬＸＲアゴニストが、前記ガンの転移の伝播を遅くするのに十分な
    レベルにまでＡｐｏＥの発現レベルまたは活性レベルを増大させるのに十分な量で投与さ
    れる、方法。
  2. ガンを処置するための方法であって、その必要性のある対象に、前記ガンを処置するの
    に十分な量でＡｐｏＥポリペプチドを投与することを含む方法。
  3. 遊走性ガンの伝播を遅らせる方法であって、その必要性のある対象に、前記遊走性ガン
    の該伝播を遅らせるのに十分な量でＬＸＲアゴニストまたはＡｐｏＥポリペプチドを投与
    することを含む方法。
  4. 前記ＬＸＲアゴニストがＬＸＲβアゴニストである、請求項１〜３のいずれか一項に記
    載の方法。
  5. 前記ＬＸＲアゴニストがＡｐｏＥの発現レベルをインビトロにおいて少なくとも２．５
    倍増大させる、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
  6. 前記ＬＸＲβアゴニストがＬＸＲαよりもＬＸＲβに対して選択的である、請求項５に
    記載の方法。
  7. 前記ＬＸＲβアゴニストが、ＬＸＲαに対する前記アゴニストの活性よりも少なくとも
    ２．５倍大きいＬＸＲβに対する活性を有する、請求項６に記載の方法。
  8. 前記ＬＸＲβアゴニストが、ＬＸＲαに対する前記アゴニストの活性よりも少なくとも
    １０倍大きいＬＸＲβに対する活性を有する、請求項６または７に記載の方法。
  9. 前記ＬＸＲβアゴニストが、ＬＸＲαに対する前記アゴニストの活性よりも少なくとも
    １００倍大きいＬＸＲβに対する活性を有する、請求項６〜８のいずれか一項に記載の方
    法。
  10. 前記ＬＸＲアゴニストが、ＬＸＲαに対する前記アゴニストの活性の少なくとも２．５
    倍以内であるＬＸＲβに対する活性を有する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法
    。
  11. 前記遊走性ガンが転移性ガンである、請求項４〜１０のいずれか一項に記載の方法。
  12. 前記転移性ガンが、遊走性細胞の遊走および／または浸潤を示す細胞を含む、請求項１
    １に記載の方法。
  13. 前記転移性ガンが、内皮動員および／または血管形成を示す細胞を含む、請求項１１ま
    たは１２に記載の方法。
  14. 前記遊走性ガンが、腹膜腔、胸膜腔、心膜腔またはクモ膜下腔の表面に播種することを
    介して伝播する、請求項４〜１１のいずれか一項に記載の方法。
  15. 前記遊走性ガンがリンパ系を介して伝播する、請求項４〜１１のいずれか一項に記載の
    方法。
  16. 前記遊走性ガンが血行を介して伝播する、請求項４〜１１のいずれか一項に記載の方法
    。
  17. 前記遊走性ガンが細胞遊走ガンである、請求項４〜１１のいずれか一項に記載の方法。
  18. 前記細胞遊走ガンが非転移性の細胞遊走ガンである、請求項１７に記載の方法。
  19. 前記遊走性ガンが、卵巣ガン、中皮腫または原発性肺ガンである、請求項１８に記載の
    方法。
  20. ガン幹細胞またはガン始原細胞の増殖または成長を阻害するための方法であって、前記
    細胞を、前記細胞の増殖または成長を阻害するのに十分な量でＬＸＲアゴニストまたはＡ
    ｐｏＥポリペプチドと接触させることを含む方法。
  21. ガンの腫瘍播種速度を低下させる方法であって、その必要性のある対象に、腫瘍播種を
    低下させるのに十分な量でＬＸＲアゴニストまたはＡｐｏＥポリペプチドを投与すること
    を含む方法。
  22. ガンの転移性結節形成を低下させるか、または処置する方法であって、その必要性のあ
    る対象に、ガンの前記転移性結節形成を処置するのに十分な量でＬＸＲアゴニストまたは
    ＡｐｏＥポリペプチドを投与することを含む方法。
  23. 前記ガンが、乳ガン、結腸ガン、腎細胞ガン、非小細胞肺ガン、肝細胞ガン、胃ガン、
    卵巣ガン、膵臓ガン、食道ガン、前立腺ガン、肉腫およびメラノーマからなるリストから
    選択される、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の方法。
  24. 前記ガンがメラノーマである、請求項２３に記載の方法。
  25. 前記ガンが乳ガンである、請求項２３に記載の方法。
  26. 前記ガンが腎細胞ガンである、請求項２３に記載の方法。
  27. 前記ガンが膵臓ガンである、請求項２３に記載の方法。
  28. 前記ガンが非小細胞肺ガンである、請求項２３に記載の方法。
  29. 前記ガンが結腸ガンである、請求項２３に記載の方法。
  30. 前記ガンが卵巣ガンである、請求項２３に記載の方法。
  31. 前記ガンが薬物抵抗性のガンである、請求項１〜３０のいずれか一項に記載の方法。
  32. 前記ガンが、ベムラフェニブ、ダカルバジン、ＣＴＬＡ４阻害剤、ＢＲＡＦ阻害剤、Ｍ
    ＥＫ阻害剤、ＰＤ１阻害剤またはＰＤＬ１阻害剤に対して抵抗性である、請求項１〜３１
    のいずれか一項に記載の方法。
  33. 式Ｉ〜式ＩＶのいずれか１つの化合物または化合物番号１〜化合物番号３９のいずれか
    の化合物あるいはそれらの医薬的に許容される塩からなるリストから選択されるＬＸＲア
    ゴニストを投与することを含む、請求項１〜３２のいずれか一項に記載の方法。
  34. 前記ＬＸＲアゴニストが化合物１またはその医薬的に許容される塩である、請求項３３
    に記載の方法。
  35. 前記ＬＸＲアゴニストが化合物２またはその医薬的に許容される塩である、請求項３３
    に記載の方法。
  36. 前記ＬＸＲアゴニストが化合物３またはその医薬的に許容される塩である、請求項３３
    に記載の方法。
  37. 前記ＬＸＲアゴニストが化合物１２またはその医薬的に許容される塩である、請求項３
    ３に記載の方法。
  38. 前記ＬＸＲアゴニストが化合物２５またはその医薬的に許容される塩である、請求項３
    ３に記載の方法。
  39. 前記ＬＸＲアゴニストが化合物３８またはその医薬的に許容される塩である、請求項３
    ３に記載の方法。
  40. 前記ＬＸＲアゴニストが化合物３９またはその医薬的に許容される塩である、請求項３
    ３に記載の方法。
  41. ＡｐｏＥポリペプチドを投与することを含む、請求項１〜３２のいずれか一項に記載の
    方法。
  42. 前記ＡｐｏＥポリペプチドがＬＲＰ１またはＬＲＰ８の活性レベルまたは発現レベルを
    増大させる、請求項４１に記載の方法。
  43. 前記ＡｐｏＥポリペプチドが、ＬＲＰ１、ＬＲＰ８、ＡｐｏＥ２受容体、ＬＤＬ受容体
    またはＶＬＤＬ受容体に結合する、請求項４１または４２に記載の方法。
  44. 前記ＡｐｏＥポリペプチドがＡｐｏＥの受容体結合領域（ＲＢＲ）である、請求項４１
    〜４３のいずれかに記載の方法。
  45. 抗増殖剤を投与することをさらに含み、前記ＬＸＲアゴニストおよび前記抗増殖剤が、
    一緒になって遊走性ガンの進行を遅らせるのに十分な量で投与される、請求項３３〜４０
    のいずれか一項に記載の方法。
  46. 前記ＬＸＲアゴニストおよび前記抗増殖剤が、一緒になって前記対象を処置するために
    効果的である量で互いに２８日以内に投与される、請求項４５に記載の方法。
  47. 抗増殖剤を投与することをさらに含み、前記ＡｐｏＥポリペプチドおよび前記抗増殖剤
    が、一緒になって遊走性ガンの進行を遅らせるのに十分な量で投与される、請求項４１〜
    ４４のいずれか一項に記載の方法。
  48. 前記ＡｐｏＥポリペプチドおよび前記抗増殖剤が、一緒になって前記対象を処置するた
    めに効果的である量で互いに２８日以内に投与される、請求項４７に記載の方法。
  49. メラノーマを、その処置を必要とする対象において処置するための方法であって、（ａ
    ）該対象において、ＤＮＡＪＡ４、ＡｐｏＥ、ＬＲＰ１、ＬＲＰ８、肝臓Ｘ受容体（ＬＸ
    Ｒ）およびｍｉＲ−７からなる群から選択される転移抑制因子の発現レベルまたは活性レ
    ベルを増大させること、あるいは、（ｂ）該対象において、ｍｉＲ−１９９ａ−３ｐ、ｍ
    ｉＲ−１９９ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１９０８およびＣＴＧＦからなる群から選択される転移
    促進因子の発現レベルまたは活性レベルを低下させることを含む方法。
  50. 前記メラノーマが転移性である、請求項４９に記載の方法。
  51. 前記増大させる工程が、
    （ｉ）ＤＮＡＪＡ４、ＡｐｏＥ、ＬＲＰ１、ＬＲＰ８またはＬＸＲの配列を有するポリペ
    プチド；
    （ｉｉ）ＤＮＡＪＡ４、ＡｐｏＥ、ＬＲＰ１、ＬＲＰ８またはＬＸＲをコードする配列を
    有する核酸；
    （ｉｉｉ）ＬＲＰ１、ＬＲＰ８またはＬＸＲに対するリガンド；および
    （ｉｖ）ｍｉＲ−７をコードするＲＮＡｉ剤
    のうちの１つまたは複数を前記対象に投与することによって行われる、請求項４９または
    ５０に記載の方法。
  52. 前記増大させる工程が、ｍｉＲ−１９９ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１９９ａ−５ｐおよびｍｉ
    Ｒ−１９０８からなる群から選択されるマイクロＲＮＡの発現レベルまたは活性レベルを
    低下させることによって行われる、請求項４９または５０に記載の方法。
  53. 前記低下させる工程がｍｉＲ−Ｚｉｐ技術によって行われる、請求項５２に記載の方法
    。
  54. 前記低下させる工程がロックド核酸（ＬＮＡ）技術によって行われる、請求項５２に記
    載の方法。
  55. 前記低下させる工程がアンタゴミル（ａｎｔａｇｏｍｉｒ）によって行われる、請求項
    ５２に記載の方法。
  56. ＬＲＰ１に対する前記リガンドまたはＬＲＰ８に対する前記リガンドが小分子または抗
    体である、請求項５２に記載の方法。
  57. ＡｐｏＥまたはＤＮＡＪＡ４の発現レベルを増大させる前記工程が、ＬＸＲの活性レベ
    ルまたは発現レベルを増大させることによって行われる、請求項５０に記載の方法。
  58. ＬＸＲの活性レベルを増大させる前記工程が、ＬＸＲアゴニストを前記対象に投与する
    ことによって行われる、請求項５７に記載の方法。
  59. 前記ＬＸＲアゴニストが式Ｉ〜式ＩＶのいずれか１つの化合物である、請求項５８に記
    載の方法。
  60. 対象が転移性メラノーマを有するかどうか、または、転移性メラノーマを有する危険性
    があるかどうかを決定するための方法であって、
    前記対象からサンプルを得ること；
    前記サンプルにおいて、（ｉ）ｍｉＲ−１９９ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１９９ａ−５ｐ、ｍ
    ｉＲ−１９０８およびＣＴＧＦからなる群から選択される転移促進因子の第１の発現レベ
    ル、または、（ｉｉ）ＤＮＡＪＡ４、ＡｐｏＥ、ＬＲＰ１、ＬＲＰ８、肝臓Ｘ受容体（Ｌ
    ＸＲ）およびｍｉＲ−７からなる群から選択される転移抑制因子の第２の発現レベルを測
    定すること；ならびに
    前記第１の発現レベルを第１の所定の参照値と比較し、または、前記第２の発現レベル
    を第２の所定の参照値と比較し、それにより、（ａ）前記第１の発現レベルが第１の所定
    の参照値を超えているならば、または、（ｂ）前記第２の発現レベルが第２の所定の参照
    値を下回っているならば、前記対象は、転移性メラノーマを有することが決定され、また
    は、転移性メラノーマを有する危険性があることが決定されること
    を含む方法。
  61. 前記第１の所定の参照値および第２の所定の参照値が、転移性メラノーマを有しないコ
    ントロール対象から得られる、請求項６０に記載の方法。
  62. 前記サンプルが体液サンプルである、請求項６０に記載の方法。
  63. 前記サンプルが腫瘍サンプルである、請求項６０に記載の方法。
  64. 前記サンプルが母斑サンプルである、請求項６０に記載の方法。
  65. 前記サンプルがヒト皮膚サンプルである、請求項６０に記載の方法。
  66. 前記測定する工程が、前記第１の発現レベルと前記第２の発現レベルとの両方を測定す
    ることを含む、請求項６０に記載の方法。
  67. 前記サンプルが体液サンプルである、請求項６６に記載の方法。
  68. 前記サンプルが、腫瘍サンプル、母斑サンプルまたはヒト皮膚サンプルである、請求項
    ６６に記載の方法。
  69. 複数の特有の位置を有する支持体、ならびに
    下記の核酸：
    （ｉ）ｍｉＲ−１９９ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１９９ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１９０８およびＣＴ
    ＧＦからなる群から選択される転移促進因子をコードする核酸またはその相補体に対して
    相補的である配列を有する少なくとも１つの核酸、あるいは
    （ｉｉ）ＤＮＡＪＡ４、ＡｐｏＥ、ＬＲＰ１、ＬＲＰ８、肝臓Ｘ受容体（ＬＸＲ）および
    ｍｉＲ−７からなる群から選択される転移抑制因子をコードする核酸またはその相補体に
    対して相補的である配列を有する少なくとも１つの核酸
    の任意の組合せ
    を含むアレイであって、
    それぞれの核酸が前記支持体の特有の位置に固定化される、アレイ。
  70. メラノーマの転移可能性を対象において診断するためのキットであって、
    ＤＮＡＪＡ４、ＡｐｏＥ、ＬＲＰ１、ＬＲＰ８、肝臓Ｘ受容体（ＬＸＲ）およびｍｉＲ
    −７からなる群から選択される転移抑制因子遺伝子の発現産物に特異的に結合する第１の
    試薬、または
    ｍｉＲ−１９９ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１９９ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１９０８およびＣＴＧＦ
    からなる群から選択される転移促進因子遺伝子の発現産物に特異的に結合する第２の試薬
    を含むキット。
  71. 前記第２の薬剤が、前記抑制因子遺伝子または促進因子遺伝子あるいはその相補体に対
    して相補的である配列を有するプローブである、請求項７０に記載のキット。
  72. 免疫アッセイ、ハイブリダイゼーションアッセイまたはＰＣＲアッセイを行うための試
    薬をさらに含む、請求項７０に記載のキット。
  73. 請求項６９に記載されるアレイを含む、請求項７０に記載のキット。
  74. メラノーマを処置するために、あるいは、内皮動員、細胞浸潤または転移性血管形成を
    阻害するために有用な化合物を特定する方法であって、
    （ｉ）ｍｉＲ−１９９ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１９９ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１９０８およびＣＴ
    ＧＦからなる群から選択されるマーカー遺伝子のプロモーターに作動可能に連結される核
    酸によってコードされるレポーター遺伝子を発現する試験細胞を得ること；
    （ｉｉ）前記試験細胞を試験化合物にさらすこと；
    （ｉｉｉ）前記試験細胞における前記レポーター遺伝子の発現レベルを測定すること；
    （ｉｖ）前記発現レベルをコントロールレベルと比較すること；ならびに
    （ｖ）前記比較により、前記発現レベルが前記コントロールレベルよりも低いことが示さ
    れるならば、前記試験化合物を、メラノーマを処置するために、あるいは、内皮動員、ガ
    ン細胞浸潤または転移性血管形成を阻害するために有用な候補物として選択すること
    を含む方法。
  75. メラノーマを処置するために、あるいは、内皮動員、細胞浸潤または転移性血管形成を
    阻害するために有用な化合物を特定する方法であって、
    （ｉ）ＤＮＡＪＡ４、ＡｐｏＥ、ＬＲＰ１、ＬＲＰ８、肝臓Ｘ受容体（ＬＸＲ）およびｍ
    ｉＲ−７からなる群から選択されるマーカー遺伝子のプロモーターに作動可能に連結され
    る核酸によってコードされるレポーター遺伝子を発現する試験細胞を得ること；
    （ｉｉ）前記試験細胞を試験化合物にさらすこと；
    （ｉｉｉ）前記試験細胞における前記レポーター遺伝子の発現レベルを測定すること；
    （ｉｖ）前記発現レベルをコントロールレベルと比較すること；ならびに
    （ｖ）前記比較により、前記発現レベルが前記コントロールレベルよりも大きいことが示
    されるならば、前記試験化合物を、メラノーマを処置するために、あるいは、内皮動員、
    ガン細胞浸潤または転移性血管形成を阻害するために有用な候補物として選択すること
    を含む方法。
  76. 前記コントロールレベルが、前記試験化合物にさらされていないことを除いて前記試験
    細胞と同じであるコントロール細胞から得られる、請求項７４または７５に記載の方法。
  77. 前記レポーター遺伝子が前記マーカー遺伝子と同じである、請求項７４または７５に記
    載の方法。
  78. 内皮動員を、その阻害を必要とする対象において阻害するための方法であって、ＣＴＧ
    Ｆの発現または活性を阻害する薬剤を前記対象に投与することを含む方法。
  79. 前記対象が、病理学的な血管形成によって特徴づけられる障害を有する、請求項７８に
    記載の方法。
  80. 前記障害が、ガン、眼障害または炎症性障害である、請求項７９に記載の方法。
  81. 前記ガンが転移性メラノーマである、請求項８０に記載の方法。
  82. 腫瘍細胞浸潤を、その阻害を必要とする対象において阻害するための方法であって、Ｃ
    ＴＧＦの発現または活性を阻害する薬剤を前記対象に投与することを含む方法。
  83. 前記腫瘍細胞が転移性メラノーマ細胞である、請求項８２に記載の方法。
  84. 転移性ガンを、その処置を必要とする対象において処置するための方法であって、ＣＴ
    ＧＦの発現または活性を阻害する薬剤を前記対象に投与することを含み、該ガンがメラノ
    ーマである、方法。
  85. 前記薬剤が、抗体、核酸、ポリペプチドまたは小分子化合物である、請求項７８〜８４
    のいずれかに記載の方法。
  86. 前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項８５に記載の方法。
  87. 転移性ガンを、その処置を必要とする対象において処置するための方法であって、ｍｉ
    Ｒ−７の発現または活性を増大させる薬剤を前記対象に投与することを含む方法。
  88. 前記ガンが転移性メラノーマである、請求項８７に記載の方法。
  89. 前記薬剤が、抗体、核酸、ポリペプチドまたは小分子化合物である、請求項８７または
    ８８に記載の方法。
  90. 前記薬剤がｍｉＲ−７活性を有する、請求項８７〜８９のいずれかに記載の方法。
  91. 前記核酸がオリゴヌクレオチドである、請求項８９に記載の方法。
  92. 前記オリゴヌクレオチドが、配列番号３６〜３８からなる群から選択される配列を含む
    、請求項９１に記載の方法。
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HONGYUAN ZHANG ET AL.: "11ah Data Transmission Flow", IEEE 802.11-11/1484R0, JPN6016001968, 7 November 2011 (2011-11-07), pages 1 - 15, ISSN: 0005138853 *

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