CN109689062B - 使用抗PI3Kβ和抗免疫检查点药剂的组合治疗PTEN缺陷型上皮癌的方法 - Google Patents

使用抗PI3Kβ和抗免疫检查点药剂的组合治疗PTEN缺陷型上皮癌的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及使用抗PI3Kβ和抗免疫检查点药剂的组合治疗PTEN缺陷型上皮癌的方法。

Description

使用抗PI3Kβ和抗免疫检查点药剂的组合治疗PTEN缺陷型上 皮癌的方法
相关申请的交叉引用
本申请要求2016年7月11日提交的美国临时申请号62/360,596的优先权；所述申请的全部内容通过引用整体并入本申请。
权利声明
本发明是在国立卫生研究院授予的拔款号为R01CA172461、R01CA187918、T32CA009361-34和P01AI056299的政府支持下完成的。政府拥有本发明的某些权利。
发明背景
乳腺癌是最常见的癌症类型之一，每年诊断出超过230,000例新病例，仅在美国每年就造成超过40,000例死亡。例如，三阴性乳腺癌(TNBC，其特征为缺乏雌激素受体(ER)、孕酮受体(PR)和人表皮生长因子受体2(HER2)表达)，占乳腺癌病例的15％至20％，通常具有临床侵袭性，并且通常表现出高复发率和死亡率。此外，它们不响应当前用于临床中的对治疗管腔或HER2阳性乳腺癌高度有效的靶向疗法。虽然标准化疗对早期TNBC会有效，但晚期TNBC患者通常响应不佳并可能发展为癌细胞侵入其它组织的转移性疾病。值得注意的是，转移占乳腺癌相关死亡的90％以上，并且目前尚无针对转移性TNBC的有效治疗。尽管缺乏共同的遗传决定因子，但在25％至30％的TNBC中观察到磷酸酶和张力蛋白同源物(PTEN)肿瘤抑制功能的丧失(Cancer Genome Atlas Network(2012)Nature490：61-70)。由于PTEN是细胞中PI3K活性的主要负调节因子，因此PTEN缺陷型癌症通常表现出对PI3K信号传导的致癌偏好。因此，PI3K通路和特别是I类PI3K同种型(包括p110α、p110β、p110γ和p110δ)已经成为有吸引力的治疗靶标(Thorpe等人(2015)Nat.Rev.Cancer15：7-24)。然而，使用泛PI3K抑制剂的临床试验仅显示有限的疗效并且作为单一疗法减少了治疗窗口，这主要是由于抑制所有PI3K同种型引起的脱靶和中靶作用(Fruman和Rommel(2014)Nat.Rev.DrugDisc.13：140-156和Brachmann等人(2012)Mol.Cancer Ther.11：1747-1757)。
临床前研究和新出现的临床试验数据表明，与使用泛PI3K抑制剂相比，选择性靶向单个同种型可以获得更好的疗效，副作用更少，因此目前正在对同种型特异性PI3K抑制剂进行包括乳腺癌的多种癌症类型的单一疗法和联合疗法形式的临床试验(Fruman和Rommel(2014)Nat.Rev.Drug Disc.13：140-156；Thorpe等人(2015)Nat.Rev.Cancer 15：7-24)。许多学术和制药研究小组已在靶向PI3Kα(也称为p110α)的化合物上付出了大量努力。这很大程度上是因为在大量癌症中发现了编码PI3Kα的基因PIK3CA中的突变(CancerGenome Atlas Network(2012)Nature 490：61-70)。此外，由受体酪氨酸激酶(例如Her2+乳腺癌)或Ras过度激活驱动的肿瘤主要需要经由PI3Kα进行信号传导而存活(Schmit等人(2014)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 111：6395-400)。
然而，PTEN缺陷型癌症通常依赖于PIK3CB编码的PI3激酶的β同种型(PI3Kβ；p110β)而存活，而p110β的药理学靶向可有效减少小鼠模型中PTEN缺陷型肿瘤的生长(Jia等人(2008)Nature 454：776-779；Ni等人(2012)Cancer Discov.2：425-433；Peng等人(2016)Cancer Disc.6：202-216)。在TNBC中，癌症基因组图谱(TCGA)仅在7％的病例中发现编码PI3Kα的PIK3CA中的激活突变，但在超过35％的病例中发生遗传性PTEN缺失(CancerGenome Atlas Network(2012)Nature 490：61-70)。
除了靶向疗法外，还探索了治疗癌症的其它模式。例如，免疫检查点阻断(ICB)，其通过阻断免疫抑制信号来增强抗肿瘤T细胞反应。迄今为止开发的ICB药剂的两个主要靶标是CTLA-4(细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4)和PD-1(程序性死亡-1)受体，它们在活化的T细胞表面表达并负责抑制免疫反应。CTLA-4阻断被认为发生在次级淋巴器官中，从而影响全身免疫功能。相比之下，PD-1配体通常被癌细胞过表达。因此，PD-1阻断主要发生在肿瘤微环境内并且与较少的副作用相关(Topalian等人(2015)Cancer Cell 27：450-461)。虽然免疫检查点阻断(ICB)免疫疗法已经显示了有希望的结果，但用作单一疗法的ICB药剂仅在有限百分比的患者中产生治疗功效。越来越多的证据表明，靶向疗法可以在多种癌症类型中与免疫疗法协同作用，但哪种靶向疗法与哪种免疫疗法结合有效治疗哪些癌症目前尚不清楚且难以预测(Vannemann和Dranoff(2012)Nat.Rev.Cancer 12：237-251；Sagiv-Barfi等人(2015)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 112：e966-e972)。
因此，本领域非常需要识别有效治疗癌症(例如诸如TNBC的上皮癌)的特定的治疗干预。类似地，浆液性卵巢癌(SOC)在历史上也难以治疗，其与TNBC具有许多潜在的遗传相似性，并且与其它癌症(如黑素瘤)有很大不同。例如，两种类型的癌症都与高组织学分级和不良预后相关。在遗传水平上，这两种癌症含有相似类型和频率的基因组突变，例如，高频率的TP53(编码人类p53肿瘤抑制因子)突变、BRCA1失活、PTEN的遗传和表观遗传缺失以及cMYC致癌基因的扩增和高表达。由于TNBC和SOC之间的相似性，研究人员已经提出这两种癌症可能被相似的疗法靶向(Wang等人(2012)Clin.Cancer Res.18：5806-5815)。
发明内容
本发明至少部分基于以下发现：抑制或阻断PI3Kβ和免疫检查点两者克服了治疗性治疗具有PTEN缺陷的癌症(无论是否具有另外的p53缺陷)的传统障碍。考虑到先前由于集中于PI3K的其它同种型(例如PI3Kα)而未认可PI3Kβ调节在治疗癌症方面的作用，这种结果是出乎意料的。
在一个方面，提供治疗罹患缺乏磷酸酶和张力蛋白同源物(PTEN)的癌症的个体的方法，所述方法包括向所述个体施用治疗有效量的至少一种抑制或阻断磷酸肌醇3-激酶同种型β(PI3Kβ)和免疫检查点两者的药剂，其中所述癌症是上皮癌(例如，乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌等)。
进一步提供了许多实施方式，其可以应用于本发明的任何方面和/或与本申请描述的任何其它实施方式结合。例如，在一个实施方式中，所述至少一种药剂是抑制或阻断PI3Kβ和免疫检查点两者的单一药剂。在另一个实施方式中，所述至少一种药剂包含选择性抑制或阻断PI3Kβ的第一药剂和选择性抑制或阻断免疫检查点的第二药剂。在再另一个实施方式中，所述第一药剂和第二药剂包含抑制或阻断PI3Kβ和/或免疫检查点的小分子。在又一个实施方式中，所述至少一种药剂包含抑制PI3Kβ和/或免疫检查点表达的RNA干扰剂(例如，所述RNA干扰剂是小干扰RNA(siRNA)、小发夹RNA(shRNA)或微小RNA(miRNA))。在另一个实施方式中，所述至少一种药剂包含与PI3Kβ和/或免疫检查点互补的反义寡核苷酸。在再另一个实施方式中，所述至少一种药剂包含抑制或阻断PI3Kβ和/或免疫检查点的肽或肽模拟物。在又一个实施方式中，所述至少一种药剂包含抑制或阻断PI3Kβ和/或免疫检查点的适体。在另一个实施方式中，所述至少一种药剂是抗体和/或胞内抗体或其抗原结合片段，其特异性结合PI3Kβ蛋白和/或免疫检查点蛋白(例如，所述抗体和/或胞内抗体或其抗原结合片段是鼠的、嵌合的、人源化的、混合的或人的)。在再一个实施方式中，所述抗体和/或胞内抗体或其抗原结合片段被可检测地标记，包含效应结构域，包含Fc结构域，和/或选自下组：Fv、Fav、F(ab’)2)、Fab’、dsFv、scFv、sc(Fv)2和双功能抗体片段。在又一个实施方式中，所述抗体和/或胞内抗体或其抗原结合片段与细胞毒性剂缀合(例如，细胞毒性剂选自下组：化疗剂、生物剂、毒素和放射性同位素)。
在另一个实施方式中，所述免疫检查点选自下组：CTLA-4、PD-1、VISTA、B7-H2、B7-H3、PD-L1、B7-H4、B7-H6、2B4、ICOS、HVEM、PD-L2、CD160、gp49B、PIR-B、KIR家族受体、TIM-1、TIM-3、TIM-4、LAG-3、BTLA、SIRPα、CD47、CD48、2B4(CD244)、B7.1、B7.2、ILT-2、ILT-4、TIGIT、IDO、CD39、精氨酸酶、CD73和A2aR。在再另一个实施方式中，所述免疫检查点选自下组：CTLA-4、PD-1、PD-L1、PD-L2、TIM-3和LAG-3。在又一个实施方式中，所述免疫检查点是PD-1。在另一个实施方式中，所述至少一种药剂包含PI3Kβ选择性抑制剂(例如，与选自PI3Kα、PI3Kδ和PI3Kγ的非PI3Kβ同种型相比，所述PI3Kβ选择性抑制剂对PI3Kβ同种型具有的选择性至少高2倍)。在再另一个实施方式中，所述至少一种药剂包含5-(2,6-二吗啉-4-基嘧啶-4-基)-4-(三氟甲基)吡啶-2-胺(BKM120)和/或(-)-2-[[(1R)-1-[7-甲基-2-(4-吗啉基)-4-氧代-4H-吡啶并[1,2-a]嘧啶-9-基]乙基]氨基]苯甲酸(KIN193)。在又一个实施方式中，所述至少一种药剂减少癌症中增殖细胞的数量和/或减小癌症的肿瘤体积或大小。在另一个实施方式中，所述至少一种药剂增加癌症肿瘤内活CD8+T细胞的数量。在再另一个实施方式中，所述至少一种药剂以药学上可接受的制剂施用。在又一个实施方式中，所述方法还包括向个体施用用于治疗癌症的治疗剂或方案。
在另一个实施方式中，本申请所述的癌症还具有p53缺陷。在再另一个实施方式中，所述p53缺陷和/或PTEN缺陷选自编码p53和/或PTEN蛋白的基因组核酸序列的突变。在又一个实施方式中，所述突变选自下组：错义突变、无义突变、移码突变、插入突变、缺失突变和重排突变。在另一个实施方式中，所述PTEN缺陷被确定为非常低或无效，如通过免疫组织化学所评定，或者所述PTEN缺陷是编码PTEN蛋白的基因组核酸序列的突变，并且所述突变是PTEN密码子C71、R130、R233、D268、T319或X70或磷酸酶结构域或C2结构域的错义突变、无义突变、移码突变、插入突变、缺失突变或重排突变。在再另一个实施方式中，所述PTEN缺陷是无效突变。在又一个实施方式中，所述PTEN缺陷是种系或体细胞PTEN无效突变。在另一个实施方式中，所述p53缺陷是编码p53蛋白的基因组核酸序列的突变，并且所述突变是p53密码子L45、Y126、P151、S166、R175、C176、H179、G187、H193、L194、R196、R213、Y220、C242、G245、R248、R249、R273、R280、D281、R282、E286、E294或反式激活结构域、DNA结合结构域或寡聚化结构域的错义突变、无义突变、移码突变、插入突变、缺失突变或重排突变。在再另一个实施方式中，所述p53缺陷是无效突变。在又一个实施方式中，所述p53缺陷是种系或体细胞p53无效突变。在另一个实施方式中，本申请所述的上皮癌是乳腺癌、卵巢癌或前列腺癌。在再另一个实施方式中，所述乳腺癌是三阴性乳腺癌(TNBC)。在又一个实施方式中，所述TNBC是转移性TNBC。在另一个实施方式中，所述卵巢癌是浆液性卵巢癌。在再另一个实施方式中，所述个体是TNBC或卵巢癌的动物模型。在另一个实施方式中，所述动物模型是人源性上皮癌的原位异种移植动物模型。在再一个实施方式中，所述动物模型是小鼠模型。在又一个实施方式中，所述个体是哺乳动物，例如小鼠或人。
简要附图说明
图1包括2个图，标识为图A和B，其显示乳腺细胞中的Pten缺失导致乳腺肿瘤形成(图A)，其依赖于Pik3cb，但不依赖于Pik3ca(图B)。
图2包括3个图，标识为图A、B和C，其显示额外缺失Pik3ca(PPA)或Pik3cb的Pten；Trp53-无效(PP；Trp53在小鼠中编码p53)TNBC原代细胞维持亲本肿瘤的生化和表型特征，包括诊断标志物的表达(图A)和对使用泛PI3K抑制剂(BKM120)、p110α抑制剂(BYL719)和p110β抑制剂(KIN-193)的同种型特异性PI3K抑制的敏感性(图B-C)。
图3包括4个图，标识为图A、B、C和D，其显示PI3Kβ信号传导调节细胞侵袭和运动程序(图A-D)。
图4显示用苏木精和曙红(H&E)染色或使用免疫组织化学(IHC)用PTEN抗体分析得到的具有PTEN缺陷的远端TNBC转移切片中肿瘤(T)和内皮(E)细胞的代表性图像。
图5包括3个图，标识为图A、B和C，其显示PP TNBC肿瘤在免疫缺陷(裸)小鼠中生长得更快(图A)并形成转移性结节(图B-C)。
图6显示PP和PPA TNBC肿瘤在免疫功能正常的小鼠中生长，而PPB肿瘤在免疫功能正常的小鼠中不形成肿瘤。
图7包括3个图，标识为图A、B和C，其显示组合的PI3K靶向疗法和ICB疗法对抑制PP肿瘤生长(图A)和增加CD8+T细胞浸润(图B-C)的结果。
图8包括4个图，标识为图A、B、C和D，其显示群组1的组合的PI3Kβ靶向疗法和ICB疗法协同抑制PP TNBC肿瘤生长(图A-C)和增加CD8+T细胞浸润(图D)的结果。
图9包括2个图，标识为图A和B，其显示群组2的组合的PI3Kβ靶向疗法和ICB疗法协同抑制PP TNBC肿瘤生长的结果。
图10显示了较之于单独任一种药剂相比于媒剂对照，PI3Kβ靶向疗法和ICB疗法组合相比于媒剂对照，参与抗肿瘤免疫反应的基因在更大程度上得到富集(由更高的标准化富集评分(NES)值表示)并具有更高程度的统计学显著性(由较低的q值表示)。
图11显示CD8+T细胞浸润与肿瘤大小负相关。
图12显示在拉帕替尼(Lap；EGFR和Her2/Neu双重抑制剂)的治疗方案中添加PI3Kβ靶向抑制剂使得Her2阳性乳腺癌模型中肿瘤生长减少。
图13包括3个图，标识为图A、B和C，其显示PDX模型如实地再现了患者源性样品，如IHC分析(图A)、全外显子组测序(图B)和转移性病变的实时成像(图C)所示。
图14显示组合的PI3Kβ靶向疗法和ICB疗法协同抑制PTEN/p53缺陷型卵巢癌肿瘤生长。
图15包括2个图，标识为图A和B，其显示p110β在PTEN无效的肿瘤(图A)中的独特作用和Rac/p110β激活的循环。
图16包括4个图，标识为图A、B、C和D，其显示Rac抑制剂在产自PTEN无效的造血干细胞的p110β依赖性肿瘤中的功效。
图17包括3个图，标识为图A、B和C，其显示p110β依赖性PTEN无效肿瘤细胞系对他汀类药物敏感，但可通过p110αPC3细胞的激活的等位基因拯救。具有野生型Pten的细胞和恢复PTEN表达的PTEN无效细胞不敏感。
图18显示额外缺失p110β的PP TNBC肿瘤(PPB TNBC)在免疫功能正常的小鼠中不能生长，但在免疫缺陷小鼠中形成肿瘤。
请注意，对于含有直方图的每幅图，每个离散测量从左到右的条形图对应于所指示的图例中从上到下的图形框。
发明详述
本申请已基于PTEN缺陷型TNBC模型的遗传、药理学和分子学分析确定，无论是否存在另外的p53缺陷，抑制或阻断PI3Kβ与抑制或阻断免疫检查点(ICB)相结合克服了治疗具有PTEN缺陷的癌症的治疗上的传统障碍。例如，KIN-193(即PI3Kβ选择性抑制剂)而非BYL719(即PI3Kα选择性抑制剂)与ICB协同作用以抑制PTEN/p53无效的TNBC肿瘤生长。
分析一组TNBC患者源性样品，其中绝大多数样品显示不存在PTEN表达(参见下表1，至少三个保留野生型PTEN基因)，表明具有缺陷型PTEN表达的TNBC的百分比可能高于基于遗传缺失确定的百分比。
表1.TNBC患者源性样品数据
TNBC脑转移的原位PDX模型
Figure BDA0001989453360000071
PTEN/p53/PI3Kβ三重缺失肿瘤细胞不能在免疫功能正常的小鼠中形成肿瘤，而PTEN/p53/PI3Kα三重缺失肿瘤细胞在免疫功能正常的小鼠中生长侵袭性肿瘤，这进一步证明PI3Kβ在克服抗肿瘤免疫反应和支持PTEN缺陷型肿瘤生长中的重要性。在另一方面，PTEN/p53双重缺失、PTEN/p53/PI3Kβ三重缺失和PTEN/p53/PI3Kα三重缺失的肿瘤细胞都在缺乏T细胞的免疫缺陷小鼠中形成肿瘤。值得注意的是，ICB和PI3Kβ选择性抑制的组合严重增加CD8+T细胞浸润到肿瘤中，这表明该组合治疗在肿瘤生长的免疫调节中的重要作用。此外，结果显示PI3Kβ而非PI3Kα，是诱导PTEN/p53共缺失的原发性乳腺癌细胞中的细胞运动所必需的。与这些发现一致，PTEN在经分析的来自TNBC患者的所有远端转移样品中缺失。因此，可以认为PI3Kβ抑制剂对晚期和转移性TNBC有效。
此外，PI3Kβ抑制结合免疫检查点阻断(ICB)还抑制由Her2/Neu过表达和携带野生型p53驱动的Her2阳性乳腺癌模型的生长(至少参见图12)。此外，在具有PTEN/p53缺失和Myc过表达的浆液性卵巢癌(SOC)模型中，组合PI3Kβ抑制剂和ICB带来比单独的任一种药剂更强的肿瘤生长抑制(至少参见图14)。
基于至少下述的几个原因，这些结果是令人惊讶的。首先，抗癌剂通常集中于抑制或阻断PI3Kα或除PI3Kβ之外的PI3K同种型。然而，特异性靶向PI3Kβ而非所有PI3K蛋白或单独的PI3Kα的显著益处是PI3Kβ抑制比泛PI3K或PI3Kα抑制的毒性低，因为PI3Kα是正常细胞中胰岛素功能的主要效应物，因此抑制PI3Kα会导致显著的副作用。其次，TNBC和SOC被认为特别适用PI3Kβ抑制/阻断和ICB的组合，因为它们具有区别于其它癌症类型的关于PTEN缺陷的特定基因型背景。例如，TNBC和SOC的特征在于显著水平的PTEN缺陷和高度的PTEN/p53共缺陷。此外，与目前食品和药物管理局(FDA)批准的ICB疗法所针对的黑素瘤和肺癌不同，TNBC和SOC往往不具有高突变负荷，因此预计对单独的IBC疗法反应不佳。最后，已知PI3Kβ抑制在一些癌症中产生抗性，例如在PTEN缺陷型前列腺癌中(Schwartz等人(2015)CancerCell 27：109-22)，其强调需要找到与PI3Kβ抑制剂结合的新型治疗靶标。
因此，本发明部分涉及用PI3Kβ和免疫检查点抑制剂的组合来治疗PTEN缺陷型上皮癌(例如，乳腺癌和SOC)的方法。在另一方面，本发明提供了基于本申请所述生物标志物的测定和分析，对患者进行分层并预测癌症对PI3Kβ和免疫检查点抑制剂的组合治疗的反应的诊断、预后和预防方法。
I.定义
本申请使用的冠词“一个”和“一种”是指所述冠词的语法对象的一个或多于一个(即，指至少一个)。举例来说，“一个要素”意味着一个要素或多于一个要素。
术语“施用”旨在包括允许药剂执行其预期功能的施用途径。可以使用的治疗身体的施用途径的实例包括注射(皮下、静脉内、肠胃外、腹膜内、鞘内等)、口服、吸入和透皮途径。注射可以是弹丸注射或可以是连续输注。根据施用途径，药剂可以用选定的材料包衣或处理，以保护其免受可能不利地影响其执行其预期功能的能力的自然条件。药剂可以单独施用，或与药学上可接受的载体联合施用。药剂还可以作为前药施用，其在体内转化为其活性形式。
术语“改变量”或“改变的水平”是指生物标志物核酸增加或减少的(例如，种系和/或体细胞的)拷贝数，例如，与对照样品中生物标志物核酸的表达水平或拷贝数相比，癌症样品中增加或降低的表达水平。与正常对照样品中的相应蛋白质水平相比，术语生物标志物的“改变量”还包括样品(例如癌症样品)中生物标志物蛋白增加或降低的蛋白质水平。此外，可以通过检测翻译后修饰(例如标志物的甲基化状态)来确定生物标志物蛋白的改变量，所述翻译后修饰可以影响生物标志物蛋白的表达或活性。
如果生物标志物的量分别比正常水平大或小的量大于用以评估量的分析的标准误差，并且优选地大于至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、150％、200％、300％、350％、400％、500％、600％、700％、800％、900％、1000％或更多，则个体中生物标志物的量“显著”高于或低于生物标志物的正常量。或者，如果个体中生物标志物的量分别比生物标志物的正常量高或低至少约两倍，并且优选至少约三倍、四倍或五倍，则可以认为所述量“显著”高于或低于正常量。这种“显著性”也可以应用于本申请所述的任何其它测量参数，例如表达、抑制、细胞毒性、细胞生长等。
生物标志物的术语“改变的表达水平”是指测试样品(例如，来源于患有癌症的患者的样品)中生物标志物的表达水平或拷贝数，其大于或小于用于评估表达或拷贝数的分析方法的标准误差，并且优选地，是对照样品(例如，来自不患有相关疾病的健康个体的样品)中生物标志物的表达水平或拷贝数(优选地，是几个对照样品中生物标志物的平均表达水平或拷贝数)的至少两倍，更优选三倍、四倍、五倍或十倍或更多倍。改变的表达水平大于或小于用于评估表达或拷贝数的分析的标准误差，并且优选地是对照样品(例如，来自不患有相关疾病的健康个体的样品)中生物标志物的表达水平或拷贝数(优选地，是几个对照样品中生物标志物的平均表达水平或拷贝数)的至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、150％、200％、300％、350％、400％、500％、600％、700％、800％、900％、1000％或更多倍。在一些实施方式中，生物标志物的水平是指生物标志物本身的水平、经修饰的生物标志物(例如，磷酸化的生物标志物)的水平或相对于另一个测量变量(如对照)的生物标志物的水平(例如，相对于未磷酸化的生物标志物来说磷酸化的生物标志物的水平)。
生物标志物的术语“改变的活性”是指与正常对照样品中生物标志物的活性相比，生物标志物在疾病状态(例如癌症样品)中增加或减少的活性。生物标志物的改变的活性可以是例如生物标志物的表达改变、生物标志物的蛋白质水平改变、生物标志物的结构改变，或者例如与所述生物标志物参与相同或不同通路的其它蛋白质的相互作用改变或与转录激活剂或抑制剂的相互作用改变的结果。
生物标志物的术语“改变的结构”是指生物标志物核酸或蛋白质内存在突变或等位基因变体，例如，与正常或野生型基因或蛋白质相比，影响生物标志物核酸或蛋白质的表达或活性的突变。例如，突变包括但不限于取代、缺失或插入突变。突变可以存在于生物标志物核酸的编码区或非编码区中。
除非本文另有说明，否则术语“抗体”广泛地涵盖天然存在形式的抗体(例如IgG、IgA、IgM、IgE)和重组抗体，例如单链抗体、嵌合和人源化抗体和多特异性抗体，以及所有前述抗体的片段和衍生物，所述片段和衍生物具有至少一个抗原结合位点。抗体衍生物可包含与抗体缀合的蛋白质或化学部分。
本申请所用的术语“抗体”还包括抗体的“抗原结合部分”(或简称“抗体部分”)。如本申请所用，术语“抗原结合部分”是指抗体的一个或多个片段，其保留特异性结合抗原(例如，生物标志物多肽或其片段)的能力。已经显示，抗体的抗原结合功能可以通过全长抗体的片段进行。涵盖于抗体的术语“抗原结合部分”内的结合片段的实例包括(i)Fab片段，由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段；(ii)F(ab')2片段，包含两个在铰链区通过二硫桥键连接的Fab片段的二价片段；(iii)由VH和CH1结构域组成的Fd片段；(iv)由抗体单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段，(v)dAb片段(Ward等人,(1989)Nature 341：544-546)，其由VH结构域组成；和(vi)分离的互补决定区(CDR)。此外，尽管Fv片段的两个结构域VL和VH由不同的基因编码，但它们可以使用重组方法通过合成的接头连接，使得它们能够形成单个蛋白质链，其中VL和VH区配对形成单价多肽(称为单链Fv(scFv)；参见例如Bird等人(1988)Science 242：423-426；和Huston等人(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：5879-5883；和Osbourn等人1998,Nature Biotechnology 16：778)。这类单链抗体也意图被涵盖于抗体的术语“抗原结合部分”内。特定scFv的任何VH和VL序列可以与人免疫球蛋白恒定区cDNA或基因组序列连接，以产生编码完整IgG多肽或其它同种型的表达载体。通过使用蛋白质化学或重组DNA技术，VH和VL也可以用于产生Fab、Fv或免疫球蛋白的其它片段。该术语还涵盖其它形式的单链抗体，例如双功能抗体。双功能抗体是二价双特异性抗体，其中VH和VL结构域在单个多肽链上表达，但使用的接头太短而不允许在同一链上的两个结构域之间配对，从而迫使其结构域与另一条链的互补结构域配对并产生两个抗原结合位点(参见例如Holliger,P.等人,(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90：6444-6448；Poljak,R.J.等人,(1994)Structure 2：1121-1123)。
更进一步地，抗体或其抗原结合部分可以是较大免疫粘附多肽的一部分，所述免疫粘附多肽通过抗体或抗体部分与一种或多种其它蛋白质或肽的共价或非共价缔合形成。这类免疫粘附多肽的实例包括使用抗生蛋白链菌素核心区来制备四聚体scFv多肽(Kipriyanov,S.M.等人,(1995)Human Antibodies and Hybridomas 6：93-101)和使用半胱氨酸残基、生物标志物肽和C端多聚组氨酸标签来制备二价和生物素化的ScFv多肽(Kipriyanov,S.M.等人,(1994)Mol.Immunol.31：1047-1058)。抗体部分，例如Fab和F(ab')2片段，可以使用常规技术由全抗体制备，例如分别对全抗体进行木瓜蛋白酶或胃蛋白酶消化。此外，如本申请所述，可以使用标准重组DNA技术获得抗体、抗体部分和免疫粘附多肽。
相比之下，抗原结合部分可以适于在细胞内表达为“细胞内抗体”(Chen等人(1994)Human Gene Ther.5：595-601)。使抗体适于靶向(例如，抑制)细胞内物质的方法是本领域众所周知的，例如使用单链抗体(scFv)、修饰免疫球蛋白VL结构域以获得超稳定性、修饰抗体以抵抗细胞内还原环境、产生增加细胞内稳定性和/或调节细胞内定位的融合蛋白等。细胞内抗体也可以在多细胞生物的一种或多种细胞、组织或器官中引入和表达，例如用于预防和/或治疗目的(例如，作为基因疗法)(至少参见PCT公开号WO 08/020079、WO 94/02610、WO 95/22618和WO 03/014960；美国专利号7,004,940；Cattaneo和Biocca(1997)Intracellular Antibodies：Development and Applications(Landes and Springer-Verlag publs.)；Kontermann(2004)Methods 34：163-170；Cohen等人(1998)Oncogene 17：2445-2456；Auf der Maur等人(2001)FEBS Lett.508：407-412；Shaki-Loewenstein等人(2005)J.Immunol.Meth.303：19-39)。
抗体可以是多克隆的或单克隆的；异种基因的、同种异基因的或同基因的；或其修饰形式(例如人源化的、嵌合的等)。抗体也可以是完全人的。优选地，本发明的抗体特异性地或基本上特异性地结合生物标志物多肽或其片段。如本申请所用，术语“单克隆抗体”和“单克隆抗体组合物”是指仅含有一种能够与抗原的特定表位免疫反应的抗原结合位点的抗体多肽群，而术语“多克隆抗体”和“多克隆抗体组合物”是指含有多种能够与特定抗原相互作用的抗原结合位点的抗体多肽群。单克隆抗体组合物通常对与其发生免疫反应的特定抗原显示出单一的结合亲和力。
抗体也可以是“人源化的”，其意图包括由非人细胞制备的具有可变区和恒定区的抗体，所述可变区和恒定区已经被改变以更接近地类似于由人细胞制备的抗体。例如，通过改变非人抗体氨基酸序列以引入人种系免疫球蛋白序列中发现的氨基酸。本发明的人源化抗体可包括不由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如，通过体外随机或位点特异性诱变或通过体内体细胞突变引入的突变)，例如在CDR中。如本申请所用，术语“人源化抗体”还包括这样的抗体，在抗体中来源于另一种哺乳动物物种(例如小鼠)种系的CDR序列被移植到人框架序列上。
术语“分配分数”(assigned score)是指测量患者样品中的生物标志物后为每种生物标志物指定的数值。分配分数与样品中生物标志物的缺失、存在或推断的量相关。可以人工(例如，通过视觉检查)或借助于用于图像采集和分析的仪器生成分配分数。在某些实施方式中，通过定性评估(例如在分级量表上检测荧光读数)或定量评估来确定分配分数。在一个实施方式中，“集合分数”(aggregate score)，指的是来自多个测量的生物标志物的分配分数的组合，并由该组合确定。在一个实施方式中，集合分数是分配分数的总和。在另一个实施方式中，分配分数的组合涉及在将分配分数组合成集合分数之前对它们进行数学运算。在某些实施方式中，集合分数在本申请中也称为“预测分数”。
术语“生物标志物”是指本发明的可测量实体，其已被确定可预测PI3K和mTOR组合抑制剂疗法对癌症的作用。生物标志物可包括但不限于核酸和蛋白质，包括表、实施例、附图和本文中另外描述的那些。如本申请所述，可以使用生物标志物的任何相关特征，例如拷贝数、量、活性、位置、修饰(例如，磷酸化)等。
“阻断”抗体或抗体“拮抗剂”是抑制或降低其结合的抗原的至少一种生物活性的抗体。在某些实施方式中，本申请所述的阻断抗体或拮抗剂抗体或其片段基本上或完全抑制某给定的抗原的生物活性。
术语“体液”是指从体内排出或分泌的液体以及通常不从体内排出或分泌的液体(例如羊水、房水、胆汁、血液和血浆、脑脊髓液、耵聍和耳垢、考珀液或射精前液、乳糜、食糜、粪便、女性射精、间质液、细胞内液、淋巴液、月经、母乳、粘液、胸膜液、脓液、唾液、皮脂、精液、血清、汗液、滑液、泪液、尿液、阴道润滑、玻璃体液、呕吐物)。
术语“癌症”或“肿瘤”或“过度增殖”是指存在具有致癌细胞典型特征的细胞，所述特征例如不受控制的增殖、永生、转移潜能、快速生长和增殖速率，以及某些特征性形态特征。除非另有说明，否则所述术语包括组织转化。在一些实施方式中，由于PTEN的表达、活性降低和/或缺失，这类细胞部分或完全表现出这些特征。在其它实施方式中，由于PTEN和p53的表达、活性降低和/或缺失，这类细胞部分或完全表现出这些特征。癌细胞通常是肿瘤形式，但是这些细胞可以单独存在于动物体内，或者可以是非致瘤性癌细胞，例如白血病细胞。如本申请所用，术语“癌症”包括恶变前癌症以及恶性癌症。癌症包括但不限于B细胞癌，例如多发性骨髓瘤、瓦尔登斯特伦氏巨球蛋白血症(
Figure BDA0001989453360000121
macroglobulinemia)，重链疾病，例如α链疾病、γ链疾病和μ链疾病，良性单克隆丙种球蛋白病，和免疫细胞淀粉样变性，黑素瘤，乳腺癌，肺癌，支气管癌，结肠直肠癌，前列腺癌，胰腺癌，胃癌，卵巢癌，膀胱癌，脑或中枢神经系统癌，外周神经系统癌，食道癌，宫颈癌，子宫或子宫内膜癌，口腔癌或咽癌，肝癌，肾癌，睾丸癌，胆道癌，小肠或阑尾癌，唾液腺癌，甲状腺癌，肾上腺癌，骨肉瘤，软骨肉瘤，血液组织癌等。适用于本发明所涵盖方法的癌症类型的其它非限制性实例包括人肉瘤和癌，例如纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、成骨肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管内皮细胞瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤文氏肿瘤(Ewing’s tumor)、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、结肠直肠癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、囊腺癌、髓样癌、支气管肺癌、肾细胞癌、肝癌、胆管癌、肝癌、绒毛膜癌、精原细胞瘤、胚胎癌、维尔姆斯瘤(Wilms’tumor)、宫颈癌、骨癌、脑肿瘤、睾丸癌、肺癌、小细胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、胶质瘤、星形细胞瘤、成神经管细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、血管母细胞瘤、听神经瘤、少突神经胶质瘤、脑膜瘤、黑素瘤、神经母细胞瘤、视网膜母细胞瘤；白血病，例如急性淋巴细胞白血病和急性髓细胞白血病(成髓细胞、早幼粒细胞、髓单核细胞、单核细胞和红白血病)；慢性白血病(慢性髓细胞(粒细胞)白血病和慢性淋巴细胞白血病)；和真性红细胞增多症、淋巴瘤(霍奇金氏病(Hodgkin’s disease)和非霍奇金氏病(non-Hodgkin’s disease))、多发性骨髓瘤、瓦尔登斯特伦氏巨球蛋白血症和重链疾病。在一些实施方式中，癌症本质上是上皮癌，包括但不限于膀胱癌、乳腺癌、宫颈癌、结肠癌、妇科癌症、肾癌、喉癌、肺癌、口腔癌、头颈癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌或皮肤癌。在其它实施方式中，癌症是乳腺癌、前列腺癌、肺癌或结肠癌。在其它实施方式中，上皮癌是非小细胞肺癌、非乳头状肾细胞癌、宫颈癌、卵巢癌(例如浆液性卵巢癌)或乳腺癌。上皮癌可以各种其它方式表征，包括但不限于浆液性、子宫内膜样、粘液性、透明细胞、Brenner或未分化。
在一些实施方式中，癌症是“上皮癌”，其是指从上皮细胞/组织(例如，上皮)起源发展的癌症。上皮组织在整个身体的血管和器官的腔和表面。上皮细胞有三种主要形状：鳞状、柱状和立方形。它们可以单层细胞形式排列为鳞状、柱状、立方形、假分层柱状的单层上皮，或者以两层或更多层细胞形式排列为鳞状、柱状或立方形的分层(层状)上皮。所有腺体均由上皮细胞构成。任何这些不同类型的上皮细胞的功能障碍可能导致癌症或上皮癌。根据它们的不同细胞来源，不同类型的上皮癌包括例如鳞状细胞癌(从鳞状细胞开始，鳞状细胞是在例如皮肤或喉咙或管道(食管)的内膜的区域中发现的平坦的表面覆盖细胞)、腺癌(从称为腺瘤细胞的腺细胞开始，所述细胞产生液体以保持组织湿润)、移行细胞癌(从可随着器官扩张而伸展并构成称为移行上皮的组织的细胞开始，一个实例是膀胱内膜)、基底细胞癌(从最深层的皮肤细胞开始)等。其中，基底细胞癌生长缓慢，可以破坏周围组织，但不太可能扩散到远端区域或导致死亡(Cakir等人(2012)Facial plastic surgery clinicsof North America.20：419-422)。它通常表现为皮肤的无痛凸起区域，可能有光泽并有小血管在它上面通过，或者可能表现为有溃疡的凸起区域。鳞状细胞皮肤癌更容易扩散(Cakir等人(2012)，见上文)。它通常表现为具有鳞片状顶部的硬块，但也可能形成溃疡。示例性上皮癌至少包括肺癌(例如，非小细胞肺癌)、非乳头状肾细胞癌、宫颈癌、卵巢癌(例如，浆液性卵巢癌)、乳腺癌、膀胱癌、结肠直肠癌、前列腺癌等。上皮癌可以各种其它方式表征，包括但不限于浆液性、子宫内膜样、粘液性、透明细胞、勃勒纳(Brenner)或未分化。上皮癌可能是由于暴露于太阳的紫外线辐射引起的。减少暴露于紫外线辐射和使用防晒剂(通常含有氧化锌和/或氧化钛)似乎是预防鳞状细胞皮肤癌的有效方法。对基底细胞癌的影响尚不清楚。其它治疗通常包括手术切除，以及较不常见的放射疗法或局部药疗法，例如氟尿嘧啶。局部化疗可能适用于大面积表浅性基底细胞癌和其它上皮癌。对于低风险疾病，放射疗法(外束放射疗法或近距离放射疗法)、局部化疗(例如，咪喹莫特或5-氟尿嘧啶)和冷冻疗法(例如，冷冻去除癌症)可以提供足够的控制。然而，它们的整体治愈率可能低于某些类型的手术。对于基底细胞癌和鳞状细胞癌，发现其它治疗模式，如光动力疗法、局部化疗、电干燥法和刮除术。Mohs显微外科手术(Mohs手术)是一种用于以最少的周围组织去除癌症的技术，并且立即检查其边缘以查看是否发现肿瘤。在疾病已经扩散(转移)的情况下，可能需要进一步的外科手术或化疗。已发现，将嵌合抗原受体(CAR)或T细胞受体(TCR)基因疗法用于上皮癌是有前景的，其通过首先利用白细胞分离术从患者的外周血中收获单核细胞来进行。然后用编码CAR至TCR的病毒载体或其它基因转移平台转导来自白细胞分离术产物的T细胞。基因工程T细胞在实验室中扩增并静脉内施用于患者。可以在细胞输注之前给予淋巴细胞耗尽化学疗法以增强工程化T细胞的植入和功能。T细胞输注之后可以全身施用细胞因子(例如白细胞介素-2)以支持T细胞。CAR是由与靶肿瘤抗原结合的抗体单链可变片段(ScFv)、来自CD3信号传导链的结构域和提供细胞内信号传导的T细胞共刺激受体分子构成的合成分子。关于CAR和TCR的综述，参见Hinrichs(2016)Clin Cancer Res.22：1559-1564。许多类型的上皮衍生肿瘤具有升高的Notch水平，其也与不良结果相关。一组新疗法靶向上皮癌中的干细胞样细胞，其识别多种药物靶标和通路。关于示例性治疗和临床试验的综述，参见Ahmed等人(2017)Stem Cells 35：839-850。例如，影响许多癌症干细胞(CSC)调节因子(例如Hedgehog、Notch、PI3K/Akt/mTOR途径等)的Wnt抑制剂，例如姜黄素、类似物GO-Y030和二氟化姜黄素(CDF)，已经在阶段2中针对结肠CSC、胰腺CSC和乳房CSC进行了测试(Naujokat和Laufer(2013)J.Cancer Res.Updates 2：36-67；Ramasamy等人(2015)CancerCell Int.15.doi：10.1186/s12935-015-0241-x)。治疗乳腺癌、肺癌、结肠直肠癌和胰腺癌的多种化合物也概述于Ahmed等人(2017),见上文中。
在一些实施方式中，癌症是“三阴性乳腺癌”或“TNBC”，其是指雌激素受体(ER)阴性、孕酮受体(PR)阴性和人表皮生长因子受体2(HER-2)阴性的乳腺癌(Pegram等人(1998)J.Clin.Oncol.16：2659-2671；Wiggans等人(1979)Cancer Chemother.Pharmacol.3：45-48；Carey等人(2007)Clin.Cancer Res.13：2329-2334)。TNBC的几种亚型是已知的，包括2种基底样亚型(BL1和BL2)、免疫调节亚型(IM)、间充质亚型(M)、间充质干细胞样亚型(MSL)和管腔雄激素受体亚型(LAR)(参见例如美国专利公开2014/0303133)。TNBC或其亚型的确定可以使用熟知的标准技术完成，例如ER、PR和HER-2受体状态的免疫组织化学和/或核酸分析(Chebil等人(2003)Acta Oncol.42：43-47；Chebil等人(2003)Acta Oncol.42：719-725；Yamashita等人(2006)Rinsho Byori 54：27-30；Schaller等人(2001)Ann.Oncol.12：S97-S100；和Kallioniemi等人(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.89：5321-5325)。
TNBC占所有乳腺癌的10-20％，更频繁地影响年轻患者，并且在非裔美国女性中更普遍(Morris等人(2007)Cancer 110：876-884)。TNBC肿瘤通常尺寸较大，等级较高，在诊断时具有淋巴结受累，并且在生物学上更具侵袭性(Haffty等人(2006)J.Clin.Oncol.24：5652-5657)。尽管对术前(新辅助疗法)化疗的临床反应率较高，但与患有其它乳腺癌亚型的女性相比，TNBC患者的远端复发率较高并且预后较差(Haffty等人(2006)J.Clin.Oncol.24：5652-5657；Dent等人(2007)Clin.Cancer Res.13：4429-4434)。不到30％的患有转移性TNBC的女性存活5年，并且虽然进行了辅助化疗(这是治疗的主要方法)，但几乎所有女性都死于该疾病(Dent等人(2007)Clin.Cancer Res.13：4429-4434)。
治疗激素受体阳性乳腺癌的三种主要模式中的两种(即内分泌和生物学)由于缺乏激素受体表达而不适用于TNBC。因此，沿用已久的疗法，例如使用他莫昔芬(tamoxifen)或抗雌激素的选择性ER调节、芳香酶抑制剂、非类固醇药物(例如，来曲唑(letrozol)、阿那曲唑(anastrozol)和沃斯曲唑(vostrozol))、类固醇药物(例如依西美坦(exemestane))、卵巢切除手术、卵巢切除放疗、LHRH类似物疗法、抗HER-2抗体、抗ER抗体、抗PR抗体等通常对TNBC无效。因此，治疗TNBC的一般护理标准是化疗。在乳腺癌中经常施用的化学治疗药物是来自蒽环霉素类、紫杉烷类和较低程度的抗代谢物(例如卡培他滨(capecitabine)、吉西他滨(gemcitabine)、烷化剂、长春花生物碱(vinca alkaloids)等)的药物。这些药物用于两种基本施用方案。药物可以作为单一药剂以顺序方式施用，或者它们可以组合方式使用。两种治疗子模式可以在一定程度上组合。蒽环霉素，特别是阿霉素(doxorubicin)和表柔比星(epirubicin)，已被证明是治疗乳腺癌的活性剂，含蒽环霉素的组合方案是在未接受过蒽环霉素的患者的辅助治疗中常见的一线治疗方法。常见的组合治疗由例如阿霉素/表柔比星加环磷酰胺，阿霉素/表柔比星加环磷酰胺和5-氟尿嘧啶，或蒽环霉素和卡培他滨或吉西他滨的组合组成。然而，随着蒽环霉素在乳腺癌治疗早期的普遍使用，蒽环霉素抗性形式的乳腺癌的可能性增加(Bernard-Marty等人(2004)Oncologist9：617-632)。
在某些实施方式中，癌症是“卵巢癌”。卵巢癌可以是一类卵巢癌，例如上皮卵巢癌，或其亚型，例如浆液性卵巢癌。卵巢癌是女性中第五大常见癌症，并且在妇科恶性肿瘤中死亡率最高(美国专利公开2016/0097102Suh等人(2010)Exp.Rev.Mol.Diagn.10：1069-1083；Landen等人(2008)J.Clin.Oncol.26：995-1005)。尽管在早期(I/II)检测到卵巢癌的5年生存率约为90％，但由于该病在I期和II期早期的无症状性，近80％的新病例被诊断时处于晚期(III/IV)。不幸的是，晚期卵巢癌的5年存活率低至11％(Altekruse等人,SEERCancer Statistics Review,1975-2007,National Cancer Institute.Bethesda,Md.)。
通常，卵巢癌分为3大类：(1)上皮肿瘤(由排列或覆盖卵巢的细胞产生的肿瘤)；(2)生殖细胞肿瘤(起源于预定在卵巢内形成卵的细胞的肿瘤；和(3)性索间质细胞肿瘤(在结缔细胞中开始的肿瘤，其将卵巢保持在一起并产生雌性激素)。最常见的卵巢癌是上皮肿瘤，占所有卵巢癌的约90％。卵巢上皮肿瘤分为亚型，包括浆液性、乳头状浆液性、子宫内膜样、粘液性和透明细胞肿瘤。
卵巢癌的浆液性亚型占卵巢癌病例的约60-80％并且表现出最具侵略性的组织结构(Levanon等人(2008)J.Clin.Oncol.26：5284-5293)。不到25％的浆液性卵巢癌病例在早期(I期和II期)被检测到，其残酷地反映在存活率图上(Seidman等人(2004)Int.J.Gynecol.Pathol.23：41-44)。高级别浆液性癌涉及卵巢表面(通常是双侧的)以及腹膜，癌病发作迅速，这一事实将手术选项仅局限于减积手术(Levanon等人(2008)J.Clin.Oncol.26：5284-5293)。尽管在治疗方案中引入紫杉烷以及施用腹膜内化疗延长存活率，但在提高治愈率方面几乎没有进展，这一参数在呈现时仍然完全取决于疾病阶段(Levanon等人(2008)J.Clin.Oncol.26：5284-5293)。
卵巢的乳头状浆液性癌是最常见和致命的恶性肿瘤之一(Tong等人(2007)ModernPathol.20：856-863)。乳头状浆液性组织结构占卵巢癌的75％，其组织学模式模拟输卵管的内层(Jelovac和Armstrong(2011)CA 61：183-203)。大多数乳头状浆液性卵巢癌病例被诊断时为晚期，此时肿瘤已经转移(Kim等人(2012)Proc.Natl.Acad.Sci.USA109：3921-3926)。尽管手术和化疗稳步改善，但是超过90％的患有晚期卵巢癌的女性在复发后死亡(Bukowski等人(2007)Semin.Oncol.34：S1-S15)。因此，早期检测这些高级别浆液性癌是减少卵巢癌死亡的关键(Bast等人(2009)Nat.Rev.Cancer 9：415-428)。
卵巢子宫内膜样癌仅占卵巢癌的10％(McConechy等人(2007)Modern Pathol.27：128-134)。大多数卵巢子宫内膜样癌是低级别癌，预后良好(Chen等人(2005)ModernPathol.18：903-911)。
粘液细胞型占所有原发性上皮卵巢癌的约10％(Chan等人(2008)Gynecol.Oncol.109：370-376)。大多数粘液性上皮卵巢癌在早期(国际妇产科联合会(FIGO)I-IIA期)被诊断，并限于一个卵巢。在I期粘液性上皮卵巢癌中，5年无病生存率约为90％，略高于浆液性上皮卵巢癌患者所观察到的76％(Vergote等人(2001)Lancet 357：176-182)。较不常见的是，原发性粘液性上皮卵巢癌与腹膜癌扩散和/或腹膜外转移(FIGOIIB-IV期)相关。与FIGO I期肿瘤不同，据报道，晚期粘液性上皮卵巢癌的预后比浆液性上皮卵巢癌更差(Omura等人(1991)J.Clin.Oncol.9：1138-1150；Teramukai等人(2007)J.Clin.Oncol.25：3302-3306)。
卵巢透明细胞腺癌占所有卵巢恶性肿瘤的<5％和所有上皮卵巢癌的3.7-12.1％(Tan和Kaye(2007)J.Clin.Pathol.60：355-360)。与其它上皮卵巢癌(EOC)亚型相比，当处于晚期时，它们与较差的预后相关，并且对常规的基于铂的化疗具有相对抗性(Sugiyama等人(2000)Cancer 88：2584-2589)。相反，早期透明细胞卵巢癌具有相对良好的预后(Tan和Kaye(2007)J.Clin.Pathol.60：355-360)。因此，早期检测是改善预后和减少与此类卵巢癌相关的死亡的关键。
用于确定卵巢癌是否已在卵巢内扩散或扩散到身体其它部分(即转移)的过程称为分期。确定卵巢癌的分期很重要，因为该分期将决定选择用于对抗该疾病的治疗计划的类型。用于诊断卵巢癌的测试结果通常也用于对疾病分期。这些测试包括超声、计算机断层摄影(CT)扫描、正电子发射断层摄影(PET)扫描、磁共振成像(MRI)、X射线和活组织检查。国际妇产科联合会(FIGO)制定了卵巢癌分期指南。用于卵巢癌的FIGO分期系统在本领域中是众所周知的。
除分期外，还可以通过等级(G)GX、GB和G1-G4描述卵巢肿瘤。分级确定卵巢癌组织与正常组织的相似程度。通过癌组织的显微镜检查确定肿瘤等级；健康细胞呈现为分化良好。也就是说，卵巢肿瘤分化越多，预后越好。卵巢癌分级系统在本领域中是众所周知的。
浆液性卵巢癌不以这种方式分级，仅考虑低级别和高级别的分类。低级别浆液性癌表现为低级细胞核，少有有丝分裂象。它们从腺纤维瘤或交界性肿瘤进化而来，常有KRAS、BRAF或ERBB2基因突变，并且可能缺乏TP53突变(I型通路)。低级别肿瘤是惰性的，并且比高级别肿瘤具有更好的结果。相反，高级别浆液性癌具有高级细胞核和许多有丝分裂象(Vang等人(2009)Adv.Anat.Pathol.16：267-282)。
许多众所周知的护理标准疗法可用于治疗卵巢癌。由于缺乏有效的筛选程序，在早期诊断出卵巢癌的仅占病例的约25％。(Kim等人(2012)J.Exp.Clin.Cancer Res.31：14)。在大多数这些病例中，手术能够治愈这种疾病，且早期(I期或II期)卵巢癌的五年存活率约为90％(Hennessy等人(2009)Lancet 374：1371-1382)。对早期卵巢癌的辅助化疗仍存在争议，但一些研究显示其在受限条件下的益处。根据这些研究，处于IA或IB FIGO分期、非透明细胞组织结构、分化良好(G1)肿瘤并进行“最佳”手术(即根据国际指南进行，伴随骨盆和腹膜后评定)的患者似乎没有从化疗中受益(Trimbos等人(2003)J.Natl.CancerInst.95：105-112)。因此，通常认为，至少在这些情况下，可以避免化疗，并且可以建议患者进行临床和仪器随访。在所有其它(早期)患者中，需要(辅助)化疗(Hennessy等人(2009)Lancet 374：1371-1382)。
相比之下，晚期卵巢癌患者的标准治疗方法是最大程度的手术性细胞减灭术(即全腹子宫切除术、双侧输卵管卵巢切除术、盆腔和主动脉旁淋巴结切除术和卵巢切除术)，然后进行基于铂的全身性化疗(如顺铂随后是基于卡铂的组合、顺铂与紫杉醇(paclitaxel)、顺铂与环磷酰胺、顺铂与阿霉素等)。这些患者的预期的5年存活率为10-30％(Hennessy等人(2009)Lancet 374：1371-1382)。初级减积手术的概念是将残余肿瘤负荷减少到辅助治疗最佳有效的程度。可以最佳地进行细胞减灭术的晚期卵巢癌患者的百分比大约在17％-87％的范围内(Ramirez等人(2011)Cancer Control 18：22-30)。这个百分比在很大程度上取决于外科医生的经验。
此外，对卵巢癌生物学的深入了解已经导致多种分子靶标如生长因子受体、信号转导通路、细胞周期调节因子和血管生成机制的发现(Kim等人(2012)J.Exp.Clin.CancerRes.31：14)。例如，卵巢癌肿瘤中的VEGF表达高于正常卵巢组织或良性卵巢肿瘤，并且来源于卵巢癌肿瘤的细胞溶质部分中的VEGF表达或术前血清中血清VEGF水平的增加被认为与晚期和预后不良相关(Kim等人(2012)J.Exp.Clin.Cancer Res.31：14)。为了抑制VEGF通路，有两个主要策略：(1)用抗体或可溶性受体抑制VEGF配体和(2)用酪氨酸激酶抑制剂(TKI5)或受体抗体抑制VEGF受体(VEGFR)。在VEGF靶向疗法中，最常用的一种是用贝伐单抗(bevacizumab)抑制VEGF配体。然而，已显示VEGF受体(VEGFR)酪氨酸激酶口服抑制剂在患有复发性卵巢癌的患者中具有活性，使得肿瘤反应和疾病稳定，延迟肿瘤进展(Friedlander等人(2010)Gynecol.Oncol.119：32-37；Ledermann等人(2011)J.Clin.Oncol.29：3798-3804；Matulonis等人(2009)J.Clin.Oncol.27：5601-5606；Biagi等人(2011)Ann.Oncol.22：335-340；Matei等人(2011)J.Clin.Oncol.29：69-75)。
抑制的其它靶标包括在高达70％的卵巢癌患者中过表达的表皮生长因子受体(EGFR)(Kohler等人(1992)Eur.J.Cancer 28a：1432-1437)，例如通过厄洛替尼(erlotinib)治疗；参与抑制细胞凋亡、肿瘤进展和转移的胰岛素生长因子1(IGF 1)，例如通过aMG479单克隆抗体或OSI-906治疗；聚(ADP-核糖)聚合酶(PARP)(Rouleau等人(2010)Nat.Rev.Cancer 10：293-301)，例如通过奥拉帕尼(olaparib)治疗(Fong等人(2010)J.Clin.Oncol.28：2512-2519)。
在一些实施方式中，癌症是“前列腺癌”，其是指在男性前列腺中发生的癌症。前列腺癌是男性中最常见的癌症类型之一。前列腺癌通常生长缓慢，最初仍局限于前列腺，此时它可能不会造成严重伤害。虽然某些类型的前列腺癌生长缓慢并且可能需要极少或不需要治疗，但其它类型是侵袭性的并且可以快速扩散。早期检测到的前列腺癌——当它仍局限于前列腺时——有更好的成功治疗机会。在绝大多数情况下，前列腺癌始于腺体细胞——这被称为腺癌。
前列腺癌的分期，或它们扩散的程度有助于确定预后和治疗。确定癌症分期的最常见系统是TNM(肿瘤/淋巴结/转移)。这涉及确定肿瘤的大小、涉及多少淋巴结以及是否存在任何其它转移。在使用TNM系统进行定义时，区分是仅限于前列腺的癌症还是已在其它地方扩散的癌症是至关重要的。临床T1和T2癌症仅在前列腺中发现，在其它任何地方都没有，而T3和T4已在前列腺外扩散。有很多方式可以确定癌症是否已经扩散。计算机断层摄影术将检查骨盆内的扩散，骨扫描将判定癌症是否已扩散到骨骼，而直肠内线圈磁共振成像将评估前列腺囊和精囊。
前列腺癌在其早期可能没有任何体征或症状。更晚期的前列腺癌可能会有体征和症状，例如：排尿困难(尿量很少或没有，开始(紧张)或停止尿流困难，尿流力降低，尿液频率增加)，尿液或精液带血和/或深背，髋部、骨盆或腹部区域的不适，骨痛，勃起功能障碍，泌尿问题，尿频，滴尿，排尿时疼痛或灼烧)，勃起功能障碍或射精疼痛。其它症状可能包括体重减轻、骨痛(通常在脊柱(椎骨)、骨盆或肋骨)、腿部无力(如果癌症扩散到脊柱并压迫脊髓)、尿失禁(如果癌症扩散到脊柱并压迫脊髓)、大便失禁(如果癌症扩散到脊柱并压迫脊髓)和下肢肿胀。除肿瘤易位(tumor translocation)外，前列腺癌至少与BPH(良性前列腺增生)、急性和慢性细菌性前列腺炎和慢性前列腺炎(非细菌性)有关。
前列腺癌的具体原因尚不清楚，尽管遗传和环境因素可能都是相关的。有很多可能的因素，仅举几例，包括年龄、种族、生活方式、药物和遗传。年龄被认为是主要的风险因素。一个人年纪越大，他的风险就越高。前列腺癌在45岁以下的男性中很少见，但在50岁以后则更常见。在遗传因素中，已报道BRCA1和BRCA2是前列腺癌的相关基因(Castro等人(2013)J.Clin.Oncol.31：1748-1757)。染色体上的许多其它基因座也与前列腺癌相关，包括如MSMB、TBP2、JAZF1、PNE3、IL16、LMTK2、KLK2、KLK3和CDH13基因(Thomas等人(2008)NatGenet.40：310-315；Eeles等人(2008)Nat Genet.40：316-321)。PRSS3/中胰蛋白酶也是转移性前列腺癌的治疗靶标(Hockla等人(2008)Mol Cancer Res.10：1555-1566)。发现非癌性前列腺组织中具有慢性炎症的男性患前列腺癌的风险几乎加倍，代表了前列腺炎症与前列腺癌之间的明显关联(Gurel等人(2014)Cancer Epidemiol Biomarkers Prev.23：847-856)。饮食、肥胖、性传播疾病(STD，如淋病)也是风险因素。
前列腺筛查测试可以至少包括直肠指检(DRE)和前列腺特异性抗原(PSA)测试。更进一步的诊断方法包括超声检测和/或前列腺活检。Gleason评分用于表示癌症的侵袭性，其结合了两个数字，通常范围从2(非侵袭性的癌症)到10(极具侵袭性的癌症)。可以使用进一步扫描(例如骨扫描、超声、计算机断层摄影(CT)扫描、磁共振成像(MRI)、正电子发射断层摄影(PET)扫描等)来确定前列腺癌扩散到其它组织和/或器官的程度。
早期前列腺癌(例如，当癌组织很小并且被包含/局部化时)的治疗可以至少包括：1)观察等待——不立即进行治疗，定期监测PSA血液水平；2)根治性前列腺切除术——手术切除前列腺；3)近距离放射疗法——将放射性种子植入前列腺；4)适形放射疗法——对辐射束进行塑形使得它们重叠的区域与需要治疗的器官或区域的形状近似相同，从而使暴露于辐射的健康组织减到最少；和5)调强放射疗法——使用可变强度的射束，通常由计算机控制的线性加速器提供高级形式的适形放射疗法。
治疗建议实际上取决于各个病例。一般而言，如果预后良好并且癌症处于早期，则可以考虑所有选项。然而，它们都有其优点和缺点。患者应与他的医生彻底讨论可用的选项。更具侵袭性或晚期的前列腺癌可能需要放射疗法和激素疗法(例如，防止睾酮产生)的组合。其它手术方法至少包括挽救性根治性前列腺切除术、图像引导式调强放射疗法(IG-IMRT)、立体定向高精度放射外科手术(类似于CyberKnife)、立体定向大分割加速放射疗法(SHARP)和低剂量率永久性种子植入和高剂量率临时种子植入(两种形式的近距离放射疗法)。对于具有小的局部前列腺肿瘤的男性，可以使用局灶疗法或部分腺体消融。化学疗法和免疫疗法也是重要的治疗方法。例如，Sipuleucel-T(APC8015，商品名
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)是用于前列腺癌的基于细胞的癌症免疫疗法。前列腺癌的其它免疫疗法至少包括PROSTVAC(类似于
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因为它使用重新工程化的细胞来攻击前列腺癌细胞。这种疫苗靶向PSA抗原并已经过测试单独或与伊匹单抗(ipilimumab,
Figure BDA0001989453360000213
)、GVAX(单独或与伊匹单抗
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组合)等组合用于治疗前列腺癌。
在某些实施方式中，癌症是“PI3Kβ依赖性癌症”，其可以指功能上依赖于PI3Kβ的癌症。例如，即使肿瘤组织中PI3Kβ(例如，PI3KβmRNA、PI3Kβ蛋白、新合成的PI3Kβ蛋白等)的表达水平与其在正常组织中的表达水平相当，如果例如通过使用RNAi或任何其它方式直接或间接地抑制PI3KβmRNA和/或蛋白质，或PI3Kβ基因的缺失(例如，通过敲除或规律间隔成簇短回文重复序列(CRISPR)技术)导致抑制肿瘤发生、肿瘤细胞增殖、肿瘤转移或诱导肿瘤细胞分化，则癌症是PI3Kβ依赖性的。术语“PI3Kβ依赖性癌症”还指PI3Kβ(例如，PI3KβmRNA、PI3Kβ蛋白、新合成的PI3Kβ蛋白等)的表达水平显著高于与PI3Kβ依赖性癌症相同细胞类型的非癌性细胞中表达的PI3Kβ的正常量的癌症。相对于PI3Kβ的正常量，PI3Kβ的显著调节量是分别小于或大于用于评估表达量的分析方法的标准误差的量，并且优选是正常(对照)量的至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、110％、120％、130％、140％、150％、160％、170％、180％、190％、200％、250％、300％、350％、400％、500％、600％、700％、800％、900％、1000％或更多。或者，如果个体中生物标志物的量分别比PI3Kβ的正常(对照)量高或低至少约20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、110％、120％、130％、140％、150％、160％、170％、180％、190％、200％、250％、300％、350％、400％、500％、600％、700％、800％、900％、1000％或更多，则认为所述量相对于正常(对照量)被“显著”调节。
如本申请所用的术语“微转移”优选地定义为测量的最大宽度大于0.2mm和/或具有大于200个细胞至2mm的一组融汇的癌细胞。更优选地，“微转移”定义为最大宽度为0.2mm至2mm的一组融汇的癌细胞(参见Edge等人(2010)AJCC Cancer Staging Manual andHandbook(第7版))。“微转移”的另一个优选定义是具有至少1000个癌细胞和最宽尺寸至少0.1mm至最宽尺寸1mm的融汇组。微转移在标准对比MRI成像或其它临床成像技术中通常不可见。然而，在某些癌症中，针对肿瘤选择性抗原(例如，乳腺癌转移的Her2)的放射性抗体允许微转移的可视化。其它间接检测方法包括由于VEGF诱导的血管渗漏导致的脑微转移部位的造影剂渗漏(Yano等人(2000)Cancer Res.60：4959-49067；美国专利公开2015/0352113)。还可以应用更灵敏的成像技术来检测微转移。例如，可以使用替代造影剂USPIO(Molday Iron,Biopal,Worcester,Mass.)通过MRI对血容量进行成像以检测微转移(Yin等人(2009)Clin.Exp.Metastasis.26：403-414)。
术语“编码区”是指包含翻译成氨基酸残基的密码子的核苷酸序列区，而术语“非编码区”是指不翻译成氨基酸的核苷酸序列区(例如，5'和3'非翻译区)。
术语“互补”是一个广义概念，其指两条核酸链的区域之间或同一核酸链的两个区域之间的序列互补性。已知，如果第二核酸区的一个残基是胸腺嘧啶或尿嘧啶，并且所述第二核酸区与第一区反向平行，则第一核酸区的腺嘌呤残基能够与第二核酸区的该残基形成特定的氢键(“碱基配对”)。类似地，已知，如果第二核酸链的一个残基是鸟嘌呤，并且所述第二核酸链与第一链反向平行，则第一核酸链的胞嘧啶残基能够与第二核酸链的该残基碱基配对。如果当两个核酸区域以反向平行方式排列时，第一区的至少一个核苷酸残基能够与第二区的残基碱基配对，那么核酸的第一区与相同或不同核酸的第二区互补。优选地，第一区包含第一部分，第二区包含第二部分，由此，当第一和第二部分以反平行方式排列时，第一部分的至少约50％，优选至少约75％，至少约90％，或至少约95％的核苷酸残基能够与第二部分中的核苷酸残基碱基配对。更优选地，第一部分的所有核苷酸残基都能够与第二部分中的核苷酸残基碱基配对。
术语“对照”是指适合于提供与测试样品中的表达产物做比较的任何参考标准。在一个实施方式中，对照包含获得“对照样品”，从该对照样品中检测表达产物水平并与来自测试样品的表达产物水平进行比较。这样的对照样品可包含任何合适的样品，包括但不限于来自对照癌症患者的具有已知结果的样品(可以是储存样品或先前样品测量)；从个体(例如正常患者或癌症患者)分离的正常组织或细胞、从个体(例如正常个体或癌症患者)分离的培养的原代细胞/组织、从癌症患者的相同器官或身体位置获得的邻近正常细胞/组织、从正常个体分离的组织或细胞样品、或从保藏中获得的原代细胞/组织。在另一个优选的实施方式中，对照可以包含来自任何合适来源的参考标准的表达产物水平，包括但不限于管家基因、来自正常组织(或其它先前分析的对照样品)的表达产物水平范围、来自一组患者的测试样品内的先前确定的表达产物水平范围，或具有特定结果(例如，存活一年、两年、三年、四年等)或接受某种治疗(例如，护理标准癌症疗法)的一组患者。本领域技术人员将理解，这些对照样品和参考标准表达产物水平可以组合用作本发明方法中的对照。在一个实施方式中，对照可以包含正常或非癌细胞/组织样品。在另一个优选实施方式中，对照可以包含一组患者的表达水平，所述一组患者例如一组癌症患者，或一组接受某种治疗的癌症患者，或一组具有一种结果与另一种结果进行比较的患者。在前一种情况下，每个患者的特定表达产物水平可以指定为百分位表达水平，或表示为高于或低于参考标准表达水平的平均值。在另一个优选实施方式中，对照可以包含正常细胞、来自用组合化学疗法治疗的患者的细胞和来自患有良性癌症的患者的细胞。在另一个实施方式中，对照还可以包含测量值，例如，与相同群体中管家基因的表达水平相比，群体中特定基因的平均表达水平。这样的群体可以包含正常个体、未经历任何治疗(即，未经治疗的)的癌症患者、经历护理标准疗法的癌症患者或患有良性癌症的患者。在另一个优选实施方式中，对照包含表达产物水平的比率变换，包括但不限于确定测试样品中两个基因的表达产物水平的比率，并将其与参考标准中相同两个基因的任何合适比率进行比较；确定测试样品中两个或更多个基因的表达产物水平，并确定任何合适对照中表达产物水平的差异；以及确定测试样品中两个或更多个基因的表达产物水平，将其表达相对于测试样品中管家基因的表达标准化，并与任何合适的对照进行比较。在特别优选的实施方式中，对照包含对照样品，其与测试样品具有相同的谱系和/或类型。在另一个实施方式中，对照可以包含表达产物水平，其表现为依据一组患者样品(例如所有患有癌症的患者的样品)组内的百分位数或基于一组患者样品(例如所有患有癌症的患者的样品)的百分位数。在一个实施方式中，建立对照表达产物水平，其中基于相对于例如特定百分位数更高或更低水平的表达产物来预测结果。在另一个优选实施方式中，使用来自具有已知结果的癌症对照患者的表达产物水平来建立对照表达产物水平，并将来自测试样品的表达产物水平与对照表达产物水平进行比较作为预测结果的基础。如下面的数据所证明，本发明的方法不限于使用特定的切结点来对测试样品中的表达产物水平与对照进行比较。
生物标志物核酸的“拷贝数”是指编码特定基因产物的细胞(例如，生殖细胞和/或体细胞)中的DNA序列的数目。通常，对于给定的基因，哺乳动物具有每个基因的两个拷贝。然而，可以通过基因扩增或复制增加拷贝数，或通过缺失减少拷贝数。例如，生殖细胞拷贝数变化包括在一个或多个基因组基因座处的变化，其中所述一个或多个基因组基因座不包含在对照中生殖细胞拷贝的正常互补拷贝数(例如，与上述确定特定生殖细胞DNA及其相应拷贝数的物种相同的生殖细胞DNA中的正常拷贝数)中。体细胞拷贝数变化包括在一个或多个基因组基因座处的变化，其中所述一个或多个基因组基因座不算入对照的生殖细胞DNA中的拷贝数(例如，与确定体细胞DNA和相应拷贝数相同个体的生殖细胞DNA中的拷贝数)中。
生物标志物核酸的“正常”拷贝数(例如，种系和/或体细胞)或生物标志物核酸或蛋白质的“正常”表达水平是生物样品中的表达活性/水平或拷贝数，所述生物样品例如来自未患有癌症的个体(例如人)或来自患有癌症的相同个体的相应非癌组织的含有组织、全血、血清、血浆、口腔刮擦物、唾液、脑脊髓液、尿液、粪便和骨髓的样品。
如本申请所用，关于活化的免疫细胞的术语“共刺激”包括共刺激分子提供诱导增殖或效应功能的第二种非激活受体介导的信号(“共刺激信号”)的能力。例如，共刺激信号可导致细胞因子分泌，例如在已接受T细胞受体介导的信号的T细胞中。已经接受细胞受体介导的信号(例如通过激活受体)的免疫细胞在本申请中称为“活化的免疫细胞”。
术语“确定个体的合适治疗方案”用于表示基于或基本上基于或至少部分地基于根据本发明的分析结果而确定个体的治疗方案(即，用于预防和/或治疗个体的癌症的单一疗法或不同疗法的组合)的开始、修改和/或结束。一个实例是在手术后开始辅助疗法，其目的是降低复发的风险，另一个实例是改变特定化学疗法的剂量。除了根据本发明的分析结果之外，所述确定可以基于待治疗个体的个人特征。在大多数情况下，主治医师或医生将进行个体的合适治疗方案的实际确定。
术语“诊断癌症”包括使用本发明的方法、系统和代码来确定个体中癌症或其亚型的存在或不存在。所述术语还包括用于评估个体的疾病活动水平的方法、系统和代码。
如果分子与基质共价或非共价结合，则分子被“固定”或“粘附”到基质上，使得基质可以用流体(例如标准盐水柠檬酸盐，pH 7.4)冲洗而没有相当大部分的分子与基质分离。
术语“表达特征(signature)”或“特征”是指一组与所测表型相关的一个或多个协调表达的生物标志物。例如，构成此特征的基因、蛋白质、代谢物等可以在特定细胞谱系、分化阶段或特定生物反应期间表达。生物标志物可以反映表达其的肿瘤的生物学特征，例如癌症起源细胞、活组织检查中非恶性细胞的性质以及导致癌症的致癌机制。表达数据和基因表达水平可以存储在计算机可读介质上，例如与微阵列或芯片读取装置结合使用的计算机可读介质。可以处理这样的表达数据以生成表达特征。
如本申请所用，“同源”是指同一核酸链的两个区域之间或两条不同核酸链的区域之间的核苷酸序列相似性。当两个区域中的核苷酸残基位置被相同的核苷酸残基占据时，则所述区域在该位置是同源的。如果每个区域的至少一个核苷酸残基位置被相同的残基占据，则第一区域与第二区域同源。两个区域之间的同源性以相同核苷酸残基占据的两个区域的核苷酸残基位置的比例表示。举例来说，具有核苷酸序列5’-ATTGCC-3’的区域和具有核苷酸序列5’-TATGGC-3’的区域具有50％的同源性。优选地，第一区域包含第一部分，第二区域包含第二部分，由此，每个部分至少约50％，优选至少约75％，至少约90％，或至少约95％的核苷酸残基位置被相同的核苷酸残基占据。更优选地，每个部分的所有核苷酸残基位置被相同的核苷酸残基占据。
术语“免疫细胞”是指在免疫应答中起作用的细胞。免疫细胞具有造血起源，并且包括淋巴细胞，例如B细胞和T细胞；自然杀伤细胞；骨髓细胞，例如单核细胞、巨噬细胞、嗜酸性粒细胞、肥大细胞、嗜碱性粒细胞和粒细胞。
术语“免疫检查点”是指CD4+和/或CD8+T细胞的细胞表面上的一组分子，其通过下调或抑制抗肿瘤免疫应答来微调免疫应答。免疫检查点蛋白是本领域众所周知的，包括但不限于CTLA-4、PD-1、VISTA、B7-H2、B7-H3、PD-L1、B7-H4、B7-H6、2B4、ICOS、HVEM、PD-L2、CD160、gp49B、PIR-B、KIR家族受体、TIM-1、TIM-3、TIM-4、LAG-3、BTLA、SIRPα、CD47、CD48、2B4(CD244)、B7.1、B7.2、ILT-2、ILT-4、TIGIT、IDO、CD39、精氨酸酶、CD73和A2aR(参见例如WO 2012/177624)。所述术语还涵盖生物活性蛋白质片段，以及编码全长免疫检查点蛋白及其生物活性蛋白质片段的核酸。在一些实施方式中，所述术语还涵盖根据本申请提供的同源性描述的任何片段。
免疫检查点及其序列在本领域中是众所周知的，下面描述代表性实施方式。例如，术语“PD-1”是指免疫球蛋白基因超家族的成员，其作为共抑制受体发挥功能，其已知的配体有PD-L1和PD-L2。先前使用基于减法克隆的方法以选择在TCR诱导激活T细胞死亡期间上调的基因，鉴定出了PD-1。PD-1基于其结合PD-L1的能力，是CD28/CTLA-4分子家族的成员。与CTLA-4一样，PD-1响应于抗CD3，在T细胞表面上快速被诱导(Agata等人25(1996)Int.Immunol.8：765)。然而，与CTLA-4不同，PD-1也在B细胞表面上诱导(响应于抗IgM)。PD-1也在胸腺细胞和骨髓细胞的子集上表达(Agata等人(1996)见上文；Nishimura等人(1996)Int.Immunol.8：773)。
公众可在GenBank数据库通过NM_005018.2和NP_005009.2获得代表性的人PD-1生物标志物的核酸和氨基酸序列，如表3所示(另外参见Ishida等人(1992)20EMBO J11：3887；Shinohara等人(1994)Genomics 23：704；美国专利5,698,520)。PD-1具有包含免疫球蛋白超家族结构域、跨膜结构域的胞外区，以及包括基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(ITIM)(Ishida等人(1992)EMBO J.11：3887；Shinohara等人(1994)Genomics 23：704；和美国专利5,698,520)和基于免疫受体酪氨酸的开关基序(ITSM)的胞内区。这些特征还定义了更大的多肽家族，称为免疫抑制受体，其还包括gp49B、PIR-B和杀伤抑制性受体(KIR)(Vivier和Daeron(1997)Immunol.Today 18：286)。通常认为这些受体的酪氨酰磷酸化的ITIM和/或ITSM基序与含有SH2结构域的磷酸酶相互作用，这形成抑制信号。这些免疫抑制性受体的子集与MHC多肽结合，例如KIR和CTLA4与B7-1和B7-2结合。已经提出，在MHC和B7基因之间存在系统发育关系(Henry等人(1999)Immunol.Today20(6)：285-8)。人类以外的生物体中的PD-1直系同源物的核酸和多肽序列是众所周知的，包括例如小鼠PD-1(NM_008798.2和NP_032824.1)、大鼠PD-1(NM_001106927.1和NP_001100397.1)、狗PD-1(XM_543338.3和XP_543338.3)、牛PD-1(NM_001083506.1和NP_001076975.1)和鸡PD-1(XM_422723.3和XP_422723.2)。
PD-1多肽是能够向免疫细胞传递抑制信号从而抑制免疫细胞效应功能的抑制性受体，或者能够促进免疫细胞的共刺激(例如，通过竞争性抑制)，例如当以可溶性单体形式存在时。优选的PD-1家族成员与PD-1共享序列同一性，并与抗原呈递细胞上的一个或多个B7家族成员(例如B7-1、B7-2、PD-1配体)和/或其它多肽结合。
术语“PD-1活性”包括PD-1多肽调节活化的免疫细胞中的抑制信号的能力，例如通过结合肿瘤微环境中的抗原呈递细胞、肿瘤细胞或其它细胞上的天然PD-1配体。免疫细胞中抑制信号的调节使得产生对免疫细胞的增殖和/或细胞因子分泌的调节。因此，术语“PD-1活性”包括PD-1多肽结合其天然配体的能力，调节免疫细胞共刺激或抑制信号的能力，以及调节免疫应答的能力。
术语“PD-1配体”是指PD-1受体的结合配偶体，包括PD-L1(Freeman等人(2000)J.Exp.Med.192：1027)和PD-L2(Latchman等人(2001)Nat.Immunol.2：261)。存在至少两种类型的人PD-1配体多肽。PD-1配体蛋白包含信号序列、IgV结构域、IgC结构域、跨膜结构域和短的细胞质尾。PD-L1(参见Freeman等人(2000)J.Exp.Med.192：1027的序列数据)和PD-L2(参见Latchman等人(2001)Nat.Immunol.2：261的序列数据)是B7多肽家族的成员。PD-L1和PD-L2均在胎盘、脾、淋巴结、胸腺和心脏中表达。只有PD-L2在胰腺、肺和肝脏中表达，而只有PD-L1在胎儿肝脏中表达。尽管PD-L1表达更广泛，但PD-1的两种配体均在活化的单核细胞和树突细胞上被上调。例如，已知PD-L1在小鼠造血细胞(例如，T细胞、B细胞、巨噬细胞、树突细胞(DC)和骨髓衍生的肥大细胞)和非造血细胞(例如，内皮细胞、上皮细胞和肌细胞)上组成型表达并上调至更高水平，而PD-L2在DC、巨噬细胞和骨髓衍生的肥大细胞上诱导型表达(参见Butte等人(2007)Immunity27：111)。
PD-1配体包含具有某些保守结构和功能特征的多肽家族。如本申请所定义，当用于指蛋白质或核酸分子时，术语“家族”旨在指两种或更多种具有共同结构域或基序且具有足够氨基酸或核苷酸序列同源性的蛋白质或核酸分子。这些家族成员可以是天然或非天然存在的，并且可以来自相同或不同的物种。例如，家族可以含有人源的第一蛋白，以及人源的其它不同的蛋白，或者可以含有非人源的同源物。家庭成员也可以具有共同的功能特征。PD-1配体是B7多肽家族的成员。如本申请所用的术语“B7家族”或“B7多肽”包括与B7多肽(例如与B7-1、B7-2、B7h(Swallow等人(1999)Immunity 11：423))和/或PD-1配体(例如，PD-L1或PD-L2)具有序列同源性的共刺激多肽。例如，当使用NCBI的BLAST程序以默认参数(Blosum62矩阵，缺口罚分设置为存在11和延伸1)进行比较时，人B7-1和B7-2具有大约26％的氨基酸序列同一性(参见NCBI网站)。术语B7家族还包括能够调节免疫细胞功能的这些多肽的变体。B7家族的分子共享许多保守区，包括信号结构域、IgV结构域和IgC结构域。IgV结构域和IgC结构域是本领域公认的Ig超家族成员结构域。这些结构域对应于具有称为Ig折叠的独特的折叠模式的结构单元。Ig折叠由两个β片的夹层构成，每片由5-10个氨基酸的反向平行β链组成，在大多数(但不是全部)的情况中，所述两个片层之间具有保守的二硫键，Ig、TCR和MHC分子的IgC结构域具有相同类型的序列模式，在Ig超家族中称为C1集合。其它IgC结构域属于其它集合。IgV结构域也共享序列模式，称为V集合结构域。IgV结构域比IgC结构域长，并含有另外一对β链。优选的B7多肽能够向免疫细胞提供共刺激或抑制信号，从而促进或抑制免疫细胞反应。例如，结合共刺激受体的B7家族成员增加T细胞活化和增殖，而结合抑制性受体的B7家族成员减少共刺激。此外，相同的B7家族成员可以增加或减少T细胞共刺激。例如，当与共刺激受体结合时，PD-1配体可诱导免疫细胞的共刺激或可抑制免疫细胞共刺激，例如当以可溶形式存在时。当与抑制性受体结合时，PD-1配体多肽可以向免疫细胞传递抑制信号。优选的B7家族成员包括B7-1、B7-2、B7h、PD-L1或PD-L2及其可溶性片段或衍生物。在一个实施方式中，B7家族成员与免疫细胞上的一种或多种受体结合，例如CTLA4、CD28、ICOS、PD-1和/或其它受体，并且取决于该受体，B7家族成员具有将抑制信号或共刺激信号传递给免疫细胞(优选T细胞)的能力。
共刺激信号的调节导致免疫细胞的效应功能的调节。因此，术语“PD-1配体活性”包括PD-1配体多肽结合其天然受体(例如PD-1或B7-1)的能力、调节免疫细胞共刺激或抑制信号的能力以及调节免疫应答的能力。
术语“PD-L1”是指特定的PD-1配体。已经发现了两种形式的人PD-L1分子。一种形式是天然存在的PD-L1可溶性多肽，即具有短亲水结构域且没有跨膜结构域，并且在本申请中称为PD-L1S(见表3)。第二种形式是与细胞结合的多肽，即具有跨膜和细胞质结构域，在本申请中称为PD-L1M(如SEQ ID NO：6所示)。公众也可在GenBank数据库通过NM_014143.3和NP_054862.1获得关于PD-L1M的代表性的人PD-L1生物标志物的核酸和氨基酸序列。PD-L1蛋白包含信号序列、IgV结构域和IgC结构域。SEQ ID NO：4中，信号序列如自约氨基酸1至约氨基酸18所示。SEQ ID NO：6中，信号序列如自约氨基酸1至约氨基酸18所示。SEQ ID NO：4中，IgV结构域如自约氨基酸19至约氨基酸134所示，SEQ ID NO：6中，IgV结构域如自约氨基酸19至约氨基酸134所示。SEQ ID NO：4中，IgC结构域如自约氨基酸135至约氨基酸227所示，SEQ ID NO：6中，IgC结构域如自约氨基酸135至约氨基酸227所示。SEQ ID NO：4中例示的PD-L1的亲水性尾部包含自约氨基酸228至约氨基酸245所示的亲水性尾部。SEQ ID NO：6中例示的PD-L1多肽包含如SEQ ID NO：6的约氨基酸239至约氨基酸259所示的跨膜结构域和如SEQ ID NO：6的氨基酸260至约氨基酸290所示的约30个氨基酸的细胞质结构域。此外，人类以外的生物体中PD-L1直系同源物的核酸和多肽序列是众所周知的，包括例如小鼠PD-L1(NM_021893.3和NP_068693.1)、大鼠PD-L1(NM_001191954.1和NP_001178883.1)、狗PD-L1(XM_541302.3和XP_541302.3)、牛PD-L1(NM_001163412.1和NP_001156884.1)和鸡PD-L1(XM_424811.3和XP_424811.3)。
术语“PD-L2”是指另一种特异性PD-1配体。PD-L2是在各种APC上表达的B7家族成员，所述APC包括树突细胞、巨噬细胞和骨髓衍生的肥大细胞(Zhong等人(2007)Eur.J.Immunol.37：2405)。APC表达的PD-L2能够通过与PD-1结合抑制T细胞活化并通过PD-1独立机制共刺激T细胞活化(Shin等人(2005)J.Exp.Med.201：1531)。此外，树突细胞表达的PD-L2的结合使得树突细胞细胞因子表达的增强和细胞的存活增强(Radhakrishnan等人(2003)J.Immunol.37：1827；Nguyen等人(2002)J.Exp.Med.196：1393)。代表性人PD-L2生物标志物的核酸和氨基酸序列(例如，SEQ ID NO：7和8)是本领域众所周知的，并且公众也可在GenBank数据库通过NM_025239.3和NP_079515.2获得。PD-L2蛋白的特征在于有共同的结构要素。在一些实施方式中，PD-L2蛋白包括以下结构域中的至少一个或多个：信号肽结构域、跨膜结构域、IgV结构域、IgC结构域、细胞外结构域、跨膜结构域和细胞质结构域。例如，SEQ ID NO：8的氨基酸1-19包含信号序列。如本申请所用，“信号序列”或“信号肽”用于将含有这种序列的多肽导向脂质双层，并在分泌的和膜结合的多肽中裂解，并且包括含有约15个或更多个氨基酸的肽，其在分泌的和膜结合的多肽的N端并且含有大量疏水性氨基酸残基。例如，信号序列含有至少约10-30个氨基酸残基，优选约15-25个氨基酸残基，更优选约18-20个氨基酸残基，甚至更优选约19个氨基酸残基，并且至少具有约35-65％，优选约38-50％，更优选约40-45％的疏水性的氨基酸残基(例如，缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸或苯丙氨酸)。在另一个实施方式中，天然人PD-L2多肽的氨基酸残基220-243和成熟多肽的氨基酸残基201-243包含跨膜结构域。如本申请所用，术语“跨膜结构域”包括长度为约15个氨基酸残基的氨基酸序列，其跨越质膜。更优选地，跨膜结构域包括约至少20、25、30、35、40或45个氨基酸残基并跨越质膜。跨膜结构域富含疏水残基，并且通常具有α-螺旋结构。在一个优选的实施方式中，跨膜结构域的至少50％、60％、70％、80％、90％、95％或更多个氨基酸是疏水性的，例如亮氨酸、异亮氨酸、酪氨酸或色氨酸。跨膜结构域描述于例如Zagotta,W.N.等人(1996)Annu.Rev.Neurosci.19：235-263中。在另一个实施方式中，天然人PD-L2多肽的氨基酸残基20-120和成熟多肽的氨基酸残基1-101包含IgV结构域。天然人PD-L2多肽的氨基酸残基121-219和成熟多肽的氨基酸残基102-200包含IgC结构域。如本申请所用，IgV和IgC结构域在本领域中被认为是Ig超家族成员结构域。这些结构域对应于具有称为Ig折叠的独特的折叠模式的结构单元。Ig折叠由两个β片的夹层构成，每片由5-10个氨基酸的反向平行β链组成，在大多数(但非全部)结构域中两个片层之间具有保守的二硫键。Ig、TCR和MHC分子的IgC结构域共享相同类型的序列模式，在Ig超家族中称为Cl集合。其它IgC结构域属于其它集合。IgV结构域也共享序列模式，称为V集合结构域。IgV结构域比C结构域长，并形成另外一对链。在另一个实施方式中，天然人PD-L2多肽的氨基酸残基1-219和成熟多肽的氨基酸残基1-200包含细胞外结构域。如本申请所用，术语“细胞外结构域”表示N端氨基酸，其为从细胞表面延伸的尾部。本发明的细胞外结构域包括IgV结构域和IgC结构域，并且可以包括信号肽结构域。在另一个实施方式中，天然人PD-L2多肽的氨基酸残基244-273和成熟多肽的氨基酸残基225-273包含细胞质结构域。如本申请所用，术语“细胞质结构域”表示C端氨基酸，其为延伸进细胞的细胞质中的尾部。此外，人类以外的生物体中PD-L2直系同源物的核酸和多肽序列是众所周知的，包括例如小鼠PD-L2(NM_021396.2和NP_067371.1)、大鼠PD-L2(NM_001107582.2和NP_001101052.2)、狗PD-L2(XM_847012.2和XP_852105.2)、牛PD-L2(XM_586846.5和XP_586846.3)和黑猩猩PD-L2(XM_001140776.2和XP_001140776.1)。
术语“PD-L2活性”、“PD-L2的生物活性”或“PD-L2的功能活性”是指通过标准技术在体内或体外确定的PD-L2蛋白、多肽或核酸分子对PD-L2应答细胞或组织，或对PD-L2多肽结合配偶体显示出的活性。在一个实施方式中，PD-L2活性是直接活性，例如与PD-L2结合配偶体结合。如本申请所用，“靶分子”或“结合配偶体”是能与PD-L2多肽天然结合或相互作用的分子，从而实现PD-L2介导的功能。在一个示例性实施方式中，PD-L2靶分子是受体RGMb。或者，PD-L2活性是间接活性，例如由PD-L2多肽与其天然结合配偶体(即，参与免疫功能或其它生物相关功能的生理相关的相互作用大分子)，例如RGMb相互作用介导的细胞信号传导活性。本申请描述了PD-L2的生物活性。例如，本发明的PD-L2多肽可具有一种或多种以下活性：1)结合和/或调节受体RGMb、PD-1或其它PD-L2天然结合配偶体的活性，2)调节细胞内或细胞间信号传导，3)调节免疫细胞例如T淋巴细胞的活化，和4)调节生物体(例如小鼠或人类生物体)的免疫应答。
术语“TIM-3”是指I型细胞表面糖蛋白，其包含N端免疫球蛋白(Ig)样结构域、具有O-连接糖基化和靠近膜的N-连接糖基化的粘蛋白结构域、单个跨膜结构域和具有酪氨酸磷酸化基序的细胞质区域(参见例如，美国专利公开2013/0156774)。TIM-3是T细胞/跨膜、免疫球蛋白和粘蛋白(TIM)基因家族的成员。人TIM-3的核酸和多肽序列是本领域众所周知的并且是公众可获得的，例如，如NM_032782.4和NP_116171.3中所述。如上文关于有用的标志物如PD-L1和PD-1所述，所述术语包括任何天然存在的等位基因、其剪接变体和加工形式。通常，TIM-3是指人TIM-3，并且可以包括TIM-3多肽的截短形式或片段。此外，人类以外的生物体中TIM-3直系同源物的核酸和多肽序列是众所周知的，包括例如小鼠TIM-3(NM_134250.2和NP_599011.2)、黑猩猩TIM-3(XM_518059.4和XP_518059.3)、狗TIM-3(NM_001254715.1和NP_001241644.1)、牛TIM-3(NM_001077105.2和NP_001070573.1)和大鼠TIM-3(NM_001100762.1和NP_001094232.1)。此外，中和性的抗TIM-3抗体是本领域众所周知的(参见，至少美国专利公开2013/0183688，Ngiow等人(2011)Cancer Res.71：3540-3551；和来自R&D Biosystems的抗体344823，以及克隆2C23、5D12、2E2、4A4和IG5，它们都已公开并因此可公开获得)。
TIM-3最初被鉴定为小鼠Th1特异性细胞表面蛋白，其在几轮体外Th1分化后被表达，后来显示其也在Th17细胞上表达。在人类中，TIM-3在活化的CD4+T细胞的子集上表达、在分化的Th1细胞上表达、在一些CD8+T细胞上表达表达，并且在Th17细胞上以较低水平表达(Hastings等人(2009)Eur.J.Immunol.39：2492-2501)。TIM-3也在先天免疫系统的细胞上表达，包括小鼠肥大细胞、巨噬细胞亚群和树突细胞(DC)、NK和NKT细胞、人单核细胞、人树突细胞和小鼠原代支气管上皮细胞系。TIM-3表达受转录因子T-bet调节。TIM-3可以产生抑制信号，使得Th1和Tc1细胞的凋亡，并且可以介导凋亡细胞的吞噬作用和抗原的交叉呈递。TIM-1和TIM-3中的多态性可以往复地调节T细胞应答的方向(Freeman等人(2010)Immunol.Rev.235：172-89)。
TIM-3具有几种已知的配体，包括半乳糖凝集素-9、磷脂酰丝氨酸和HMGB1。例如，半乳糖凝集素-9是S型凝集素，其具有通过长柔性接头连接的两个不同的碳水化合物识别结构域，并且对较大的含聚-N-乙酰基乳糖胺的结构具有增强的亲和力。半乳糖凝集素-9没有信号序列并且位于细胞质中。然而，它可以通过碳水化合物链与靶细胞表面上的糖蛋白结合而分泌并发挥其功能(Freeman等人(2010)Immunol.Rev.235：172-89)。通过半乳糖凝集素-9与TIM-3的接合使得Th1细胞死亡和随后的IFN-γ产物的下降。当在体内给予时，半乳糖凝集素-9在几种鼠疾病模型中具有有益作用，所述鼠疾病模型包括EAE模型、关节炎小鼠模型、心脏和皮肤同种异体移植模型以及接触性超敏反应和银屑病模型(Freeman等人(2010)Immunol.Rev.235：172-89)。对于TIM-3与半乳糖凝集素-9的结合影响重大的残基包括TIM-3(44)、TIM-3(74)和TIM-3(100)，其经历了N-和/或O-糖基化。还已知TIM-3介导与慢性病毒感染相关的T细胞功能障碍(Golden-Mason等人(2009)J.Virol.83：9122-9130；Jones等人(2008)J.Exp.Med.205：2763-2779)，并在离体阻断时增加HIV-1特异性T细胞应答(Golden-Mason等人(2009)J.Virol.83：9122-9130)。此外，慢性HCV感染中，在CD4+和CD8+T细胞，特别是慢性HCV感染中的HCV特异性CD8+细胞毒性T细胞(CTL)上的TIM-3表达增加，并且用TIM-3的阻断单克隆抗体治疗逆转了HCV特异性T细胞耗竭(Jones等人(2008)J.Exp.Med.205：2763-2779)。
术语“LAG-3”，也称为CD223，是指免疫球蛋白超基因家族的成员，其在结构上和遗传上与CD4相关(参见美国专利公开2011/0150892)。LAG-3通常因由位于12号染色体短臂远端部分、靠近CD4基因的基因编码的膜蛋白而被知晓，表明LAG-3基因可能通过基因复制进化(Triebel等人(1990)J.Exp.Med.171：1393-1405)。然而，蛋白质的分泌形式是已知的(例如，对于人和小鼠TIM-3)。人LAG-3的核酸和多肽序列是本领域众所周知的并且是公众可获得的，例如，如NM_002286.5和NP_002277.4中所示。
上述术语涵盖任何天然存在的等位基因、其剪接变体和加工形式。通常，LAG-3指人LAG-3，并且可以包括LAG-3多肽的截短形式或片段。此外，人类以外的生物体中LAG-3直系同源物的核酸和多肽序列是众所周知的，包括例如小鼠LAG-3(NM_008479.2和NP_032505.1)、黑猩猩LAG-3(XM_508966.4和XP_508966.2)、猴LAG-3(XM_001108923.2和XP_001108923.1)、牛LAG-3(NM_00124949.1和NP_001232878.1)、大鼠LAG-3(NM_212513.2和NP_997678.2)和鸡LAG-3(XM_416510.3、XP_416510.2、XM_004938117.1和XP_004938174.1)。此外，中和性的抗LAG-3抗体是本领域众所周知的(参见至少美国专利公开2011/0150892和2010/0233183；Macon-Lemaitre和Triebel(2005)Immunology 115：170-178；Drake等人(2006)J.Clin.Oncol.24：2573；Richter等人(2010)Int.Immunol.22：13-23)。
LAG-3不在静息的外周血淋巴细胞上表达，但在活化的T细胞和NK细胞上表达，并具有许多功能(参见美国专利公开2011/0150892)。与CD4类似，LAG-3被证实与MHCII类分子相互作用，但与CD4不同，LAG-3不与人免疫缺陷病毒gp120蛋白相互作用(Baixeras等人(1992)J.Exp.Med.176：327-337)。使用可溶性LAG-3免疫球蛋白融合蛋白(sLAG-3Ig)的研究证明了LAG-3与细胞表面上的MHC II类的直接和特异性结合(Huard等人(1996)Eur.J.Immunol.26：1180-1186)。在抗原特异性T细胞应答的体外研究中，抗LAG-3抗体的添加使得T细胞增殖增加和激活抗原如CD25的更高表达，从而支持LAG-/MHC II类相互作用在下调CD4+T淋巴细胞的抗原依赖性刺激中的作用(Huard等人(1994)Eur.J.Immunol.24：3216-3221)。已经证明LAG-3的细胞质内区域与称为LAP的蛋白相互作用，LAP被认为是参与CD3/TCR活化通路下调的信号转导分子(Iouzalen等人(2001)Eur.J.Immunol.31：2885-2891)。此外，已显示CD4+CD25+调节性T细胞(Treg)在活化时表达LAG-3，并且LAG-3抗体在体外和体内均抑制由诱导的调节性T细胞引起的抑制，表明LAG-3有助于调节性T细胞的抑制活性(Huang等人(2004)Immunity21：503-513)。更进一步地，已经显示LAG-3在T细胞依赖性和独立机制中通过调节性T细胞负调节T细胞稳态(Workman和Vignali(2005)J.Immunol.174：688-695)。
在某些情况下，LAG-3也被证明具有免疫刺激作用。例如，与未转染的肿瘤细胞相比，移植到同基因小鼠中的LAG-3转染的肿瘤细胞显示出显著的生长减少或完全消退，表明LAG-3在肿瘤细胞上的表达藉由通过MHC II类分子触发抗原呈递细胞，进而刺激了抗肿瘤反应(Prigent等人(1999)Eur.J.Immunol.29：3867-3876)。另外，可溶性LAG-3Ig融合蛋白已被证明在与抗原一起施用于小鼠时刺激体液免疫应答和细胞免疫应答，表明可溶性LAG-3Ig可充当疫苗佐剂(El Mir和Triebel(2000)J.Immunol.164：5583-5589)。此外，可溶性人LAG-3Ig已被证明其扩大了在体外产生I型肿瘤特异性免疫(Casati等人(2006)CancerRes.66：4450-4460)。在Triebel(2003)Trends Immunol.24：619-622中进一步综述了LAG-3的功能活性。
“抗免疫检查点”疗法是指使用抑制免疫检查点核酸和/或蛋白质的药剂。免疫检查点具有提供抑制免疫应答的抑制信号的共同功能，并且抑制一个或多个免疫检查点可以阻断或以其它方式中和抑制性信号传导，从而上调免疫应答以更有效地治疗癌症。用于抑制免疫检查点的示例性药剂包括可以结合和/或灭活或抑制免疫检查点蛋白或其片段的抗体、小分子、肽、肽模拟物、天然配体和天然配体的衍生物；以及可以下调免疫检查点核酸或其片段的表达和/或活性的RNA干扰、反义、核酸适体等。用于上调免疫应答的示例性药剂包括针对一种或多种免疫检查点蛋白的抗体，其阻断蛋白质与其天然受体之间的相互作用；非活化形式的一种或多种免疫检查点蛋白(例如显性负性多肽)；阻断一种或多种免疫检查点蛋白与其天然受体之间相互作用的小分子或肽；与其天然受体结合的融合蛋白(例如与抗体或免疫球蛋白的Fc部分融合的免疫检查点抑制蛋白的细胞外部分)；阻断免疫检查点核酸转录或翻译的核酸分子等等。这些药剂可以直接阻断一种或多种免疫检查点与其天然受体(例如抗体)之间的相互作用，以防止抑制性信号传导并上调免疫应答。或者，药剂可以间接阻断一种或多种免疫检查点蛋白与其天然受体之间的相互作用，以防止抑制性信号传导并上调免疫应答。例如，免疫检查点蛋白配体的可溶形式例如稳定的细胞外结构域可以与其受体结合，以间接降低能与适当配体结合的受体的有效浓度。在一个实施方式中，单独或组合使用抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体和/或抗PD-L2抗体来抑制免疫检查点。这些实施方式也适用于针对特定免疫检查点如PD-1通路的特定疗法(例如，抗PD-1通路疗法，也称为PD-1通路抑制剂疗法)。许多免疫检查点抑制剂是已知的并且可公开获得，包括例如
Figure BDA0001989453360000331
(帕博利珠单抗(pembrolizumab)；抗PD-1抗体)、
Figure BDA0001989453360000333
(尼沃单抗(nivolumab)；抗PD-1抗体)、
Figure BDA0001989453360000332
(阿特珠单抗(atezolizumab)；抗PD-L1抗体)、度伐单抗(durvalumab)(抗PD-L1抗体)等。
术语“免疫应答”包括T细胞介导的和/或B细胞介导的免疫应答。示例性免疫应答包括T细胞应答，例如细胞因子的产生和细胞毒性。此外，术语免疫应答包括间接受T细胞激活(例如抗体产生(体液应答))和细胞因子应答细胞(例如巨噬细胞)的活化而影响的免疫应答。
术语“免疫治疗剂”可包括可刺激宿主免疫系统以对个体的肿瘤或癌症产生免疫应答的任何分子、肽、抗体或其它药剂。各种免疫治疗剂可用于本申请所述的组合物和方法中。
术语“抑制”或“缺陷”包括例如特定动作、功能或相互作用的减少、限制或阻断。在一些实施方式中，如果癌症的至少一种症状得到缓解、终止、减缓或预防，则癌症被“抑制”。如本申请所用，如果癌症的复发或转移减少、减缓、延迟或预防，则癌症也被“抑制”。类似地，如果与参考状态(例如像野生型状态的对照)相比，生物功能，例如蛋白质的功能降低，则生物功能被抑制。例如，与野生型PI3激酶和/或未与抑制剂接触的PI3激酶相比，如果激酶活性由于突变和/或与抑制剂接触而降低，则突变型PI3激酶或与PI3激酶抑制剂接触的PI3激酶的激酶活性被抑制或缺陷。这种抑制或缺陷可以被诱导(例如通过在特定时间和/或地点施用药剂)或者可以是组成型的(例如通过可遗传的突变)。这种抑制或缺陷也可以是部分的或完全的(例如，与参考状态例如像野生型状态的对照相比基本上没有可测量的活性)。基本上完全抑制或缺陷被称为阻断。
当提及两个分子之间的相互作用时，术语“相互作用”是指分子彼此的物理接触(例如，结合)。通常，这种相互作用导致一种或两种所述分子的活性(产生生物效应)。
“分离的蛋白质”是指这样的蛋白质：当其从细胞中分离或通过重组DNA技术产生时基本上不含其它蛋白质、细胞物质、分离介质和培养基，或当化学合成时其基本上不含化学前体或其它化学品。“分离的”或“纯化的”蛋白质或其生物活性部分基本上不含细胞或组织来源(可获得抗体、多肽、肽或融合蛋白)的细胞物质或其它污染蛋白质，或基本上不含化学合成时的化学前体或其它化学品。用语“基本上不含细胞物质”包括生物标志物多肽或其片段的制剂，其中蛋白质与分离或重组产生它的细胞的细胞组分分离。在一个实施方式中，用语“基本上不含细胞物质”包括生物标志物蛋白或其片段的制剂，其具有少于约30％(以干重计)的非生物标志物蛋白(在本申请中也称为“污染蛋白”)，更优选少于约20％的非生物标志物蛋白，更优选少于约10％的非生物标志物蛋白，最优选少于约5％的非生物标志物蛋白。当重组产生抗体、多肽、肽或融合蛋白或其片段(例如其生物活性片段)时，其也优选基本上不含培养基，即培养基占蛋白质制剂体积的小于约20％，更优选小于约10％，最优选小于约5％。
“试剂盒”是包含至少一种试剂(例如探针或小分子)的任何制品(例如包或容器)，用于特异性检测和/或影响本发明标志物的表达。试剂盒可以作为一个单元进行促销、分发或销售，用于执行本发明方法。试剂盒可以包含一种或多种试剂，所述试剂对用于本发明方法的组合物的表达是必需。在某些实施方式中，试剂盒可以进一步包含参考标准，例如编码不影响或不调节控制细胞生长、分裂、迁移、存活或凋亡的信号传导通路的蛋白质的核酸。本领域技术人员可以设想许多这样的对照蛋白，包括但不限于常见的分子标签(例如，绿色荧光蛋白和β-半乳糖苷酶)；通过GeneOntology参考，未被归类于涵盖细胞生长、分裂、迁移、存活或凋亡的任何通路的蛋白质；或普遍存在的管家蛋白。试剂盒中的试剂可以在单个容器中提供，或者在单个容器中作为两种或更多种试剂的混合物提供。另外，可以包括描述试剂盒中组合物的用途的说明材料。
术语“新辅助疗法”是指在初次治疗之前给予的治疗。新辅助疗法的实例可包括化学疗法、放射疗法和激素疗法。例如，在治疗乳腺癌时，新辅助疗法可以允许患有大乳腺癌的患者进行保乳手术。
生物标志物的“正常”表达水平和/或活性是未患癌症的个体例如人类患者的细胞中生物标志物的表达水平和/或活性。生物标志物的“过表达”或“显著更高的表达水平”是指测试样品中的表达水平高于用以评估表达的分析的标准误差，并且优选地比对照样品(例如，来自未患有生物标志物相关疾病的健康个体的样品)中生物标志物的表达活性或水平(优选几个对照样品中生物标志物的平均表达水平)高至少10％，更优选1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10、10.5、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20倍或更多。生物标志物的“显著更低的表达水平”是指测试样品中的表达水平比对照样品(例如，来自未患有生物标志物相关疾病的健康个体的样品)中生物标志物的表达水平(优选几个对照样品中生物标志物的平均表达水平)低至少10％，更优选1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10、10.5、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20倍或更多。可以进行相同的测定以确定过度活性或活性不足。
术语“PI3K信号传导通路”是指通过生长因子与受体酪氨酸激酶的结合而激活的细胞内信号传导通路之一。参与癌症发展和复发的PI3K信号传导通路的改变通常由于催化或调节性PI3K亚基的突变、受体酪氨酸激酶的激活或扩增、或PTEN的丧失或失活而发生。
通常，在活化后，PI3K将磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸(PIP2)磷酸化为磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸(PIP3)，这是PTEN逆转的过程。PIP3信号激活激酶PDK1，激酶PDK1又激活激酶AKT。AKT蛋白家族，其成员也称为蛋白激酶B(PKB)，在哺乳动物细胞信号传导中起重要作用。Akt激酶是丝氨酸/苏氨酸激酶，其是磷酸肌醇3-激酶的下游效应分子，并参与保护细胞免于凋亡。Akt激酶被认为参与癌症的进展，因为它刺激细胞增殖并抑制细胞凋亡。Akt1通过抑制细胞凋亡过程从而参与细胞存活通路。Akt1还能够诱导蛋白质合成通路，因此是细胞通路中的关键信号传导蛋白，其使得骨骼肌肥大和一般组织生长。由于它可以阻断细胞凋亡，从而促进细胞存活，因此Akt1被认为是许多类癌症的主要因子。已知Akt在细胞周期中起作用。在各种情况下，显示Akt的活化克服了G1期和G2期的细胞周期停滞。此外，活化的Akt可以使具有保持潜在诱变作用的细胞增殖和存活，因此可能有助于获得其它基因的突变。AKT(活化、扩增)和PTEN(突变、缺失、表观遗传失活)在许多人类癌症中失调(Altomare等人(2003)J.Cell Biochem.88：470-476；Ruggeri等人(1998)Mol.Carcin.21：81-86；Cheng等人(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.93：3636-3641；Staal等人(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.84：5034-5037；Li等人(2005)World J.Gastroenterol.11：285-288；Li等人(1997)Science 275：1943-1947；Goel等人(2004)Cancer Res.64：3014-3021)。可以通过对临床样品中PTEN或磷酸化AKT水平的免疫组织化学分析来评估PI3K通路激活(Slipicevic等人(2005)Am.J.Clin.Pathol.124：528-536)。
这些抑制剂的分子靶标包括但不限于PI3K、AKT、S6K1、mTORC1、PDK1、MYC、cMET、FGFR2、生长因子(EGF、b-FGF、IGF1、胰岛素或调蛋白)等。例如，mTOR存在于哺乳动物细胞中描述为raptor-mTOR复合物(mTORC1)和rictor-mTOR复合物(mTORC2)的至少2种不同的多蛋白复合物中(有时仅称为TORC1和TORC2)(Dowling等人(2010)Biochim.Biophys.Acta1804：433-439；Dunlop等人(2009)Cell.Signal.21：827-8735；Hoeffer等人(2010)TrendsNeurosci.33：67-75；Laplante等人(2012)Cell149：274-293；Laplante等人(2013)J.Cell.Sci.126：1713-1719；Neufeld(2010)Curr.Opin.Cell Biol.22：157-168；Zoncu等人(2011)Nat.Rev.Mol.Cell Biol.12：21-35)。mTORC1由mTOR、GβL和raptor蛋白构成，它与FKBP12-雷帕霉素结合。mTORC1是雷帕霉素敏感的复合物，因为其激酶活性在体外被FKB12-雷帕霉素抑制，同时mTORC1复合物正调节细胞生长。mTOR通路的raptor分支调节多个进程，包括mRNA翻译、核糖体生物发生、营养代谢和自噬。与蛋白质合成相关的两种哺乳动物蛋白S6激酶1(S6K1)和4E-BP1是mTORC1的下游靶标。S6K1还磷酸化S6RP，其是参与调节翻译、细胞大小、细胞增殖和葡萄糖稳态的40S核糖体亚基的S6组分(Magnuson等人(2012)Biochem.J.441：1-21)。已经显示，mTORC1在T389处磷酸化S6K1并且在体外被FKBP12-雷帕霉素抑制和在体内被雷帕霉素抑制。mTORC1还可以在体外和体内的T37/46处磷酸化4E-BP1。其它分子靶标在本领域中是众所周知的，并且描述于例如美国专利公开2011/0015869中。在一些实施方式中，PI3K信号传导通路限于如下通路内的生物分子的子集，例如PI3K、PI3K同种型、mTORC1、S6RP和4E-BP1，或该通路内的单个生物分子，例如PI3K、PI3k同种型、mTORC1、S6RP或4E-BP1。
PI3K信号传导通路成员的抑制剂也是本领域众所周知的，包括mTOR抑制剂，例如RAD001(也称为依维莫司(Everolimus)；Novartis)、CCI-779(也称为坦罗莫司(Temsirolimus)；Pfizer)、AP23573(Ariad Pharmaceuticals)和KU-0059475(KudusPharmaceuticals；Mita,M.M.等人(2003)Cancer Biology&Therapy 2：4：增刊1.1,S169-S177)；S6K1抑制剂，例如PF-4708671(Pearce等人,2010,Biochem.J.431：245-255)和DG2(3-溴-4-(4-(2-甲氧基苯基)哌嗪-1-基)-1H-吡唑并[3,4-d]-嘧啶(Axon Medchem)；AKT抗体(Shin等人,2005,Cancer Res.65：2815-2824)(关于AKT通路抑制剂的综述还参见Cheng等人,Oncogene,2005,24：7482-7492)；PDK1抑制剂，例如AR-12、BX-795、星形孢菌素(staurosporine)、OSU-03012、塞内昔布(celecoxib)和美国专利号6,124,272、7,344,870和7,041,687中所述的其它；和IGF1R抑制剂(例如单克隆抗体MK-0646，美国专利号7,241,444)。
如本申请所用，术语“PI3K”是指能够磷酸化磷脂酰肌醇(PtdIns)的肌醇环的3位羟基的细胞内信号转导酶家族。基于酶的一级结构、酶调节和脂质底物特异性，PI3K分为四个不同类别，称为I类、II类、III类和IV类(Leevers等人(1999)Curr.Opin.Cell Biol.11：219-225)。I类PI3K是由调节性和催化性亚基构成的异二聚体分子，由G蛋白偶联受体(GPCR)和酪氨酸激酶受体激活，并负责产生以下磷脂酰肌醇：PI(3)P、PI(3,4)P2和PI(3,4,5)P3。II类PI3K不含有调节性亚基、在与钙离子的配位结合所需的C端C2结构域中缺少关键的Asp残基、可以包含三种催化同种型(C2α、C2β或C2γ)之一，并催化由PI产生PI(3)P和由PIP产生PI(3,4)P2。III类PI3K在结构上类似于II类PI3K，但仅由PI产生PI(3)P。最后，IV类PI3K是一组更远距离相关的酶，它们是蛋白质丝氨酸/苏氨酸激酶，包括成员mTOR、DNA-PK、ATM和ATR。在人类中，四种I类催化性PI3K被称为PIK3Cα、PIK3Cβ、PIK3Cγ和PIK3Cδ。术语“泛PI3K”是指PIK3Cα、PIK3Cβ、PIK3Cγ和PIK3Cδ的组。例如，“泛PI3K抑制剂”抑制PIK3Cα、PIK3Cβ、PIK3Cγ和PIK3Cδ。
每种PI3K(包括催化性PI3K)的核酸和氨基酸序列是本领域已知的，并且可以在由美国国家生物技术信息中心维护的GenBank数据库中公开获得。例如，PIK3Cα(PIK3CA)核酸和氨基酸序列是众所周知的，包括例如人PIK3CA(NM_006218.2和NP_006209.2)、猴PIK3CA(NM_001260668.1和NP_001247597.1)、小鼠PIK3CA(XM_006535409.2、XP_006535472.1、XM_006535410.2和XP_006535473.1)和大鼠PIK3CA(NM_133399.2和NP_596890.2)。PIK3Cβ(PIK3CB)核酸和氨基酸序列是众所周知的，包括例如人PIK3CB(NM_006219.2、NP_006210.1、NM_001256045.1和NP_001242974.1)、猴PIK3CB(XM_015132082.1和XP_014987568.1)、小鼠PIK3CB(NM_029094.3和NP_083370.2)和大鼠PIK3CB(XM_008766567.1、XP_008764789.1、XM_006243642.2和XP_006243704.1)。PIK3Cγ(PIK3CG)核酸和氨基酸序列是众所周知的，包括例如人PIK3CG(NM_002649.3、NP_002640.2、NM_001282426.1、NP_001269355.1、NM_001282427.1和NP_001269356.1)、猴PIK3CG(NM_001266758.1和NP_001253687.1)、小鼠PIK3CG(NM_020272.2、NP_064668.2、NM_001146201.1、NP_001139673.1、NM_001146200.1和NP_001139672.1)和大鼠PIK3CG(XM_006240004.2、XP_006240066.1、XM_006240005.2、XP_006240067.1、XM_006240003.2和XP_006240065.1)。PIK3Cδ(PIK3CD)核酸和氨基酸序列是众所周知的，包括例如人PIK3CD(NM_005026.3和NP_005017.3)、黑猩猩PIK3CD(XM_009447951.1、XP_009446226.1、XM_009447957.1和XP_009446232.1)、小鼠PIK3CD(NM_008840.3、NP_032866.2、NM_001164052.1、NP_001157524.1、NM_001164051.1、NP_001157523.1、NM_001164050.1、NP_001157522.1、NM_001164049.1、NP_001157521.1、NM_001029837.2和NP_001025008.2)和大鼠PIK3CD(NM_0011089078.1和NP_001102448.1)。抗PI3K试剂(包括胞内抗体、核酸等)是本领域众所周知的，包括例如已知对所有催化性PI3K具有广泛抑制活性的泛PI3K抑制剂(例如，泛I类PI3K抑制剂)，并包括BKM120(5-(2,6-二吗啉-4-基嘧啶-4-基)-4-(三氟甲基)吡啶-2-胺；Maira等人(2011)Mol.Cancer Ther.11：317-348)、BEZ235(Maira等人(2011)Mol.CancerTher.11：317-348)、渥曼青霉素(wortmannin)(Wymann等人(1996)Mol.Cell.Biol.16：1722-1733)、LY294002(Vlahos等人(1994)J.Biol.Chem.269：5241-5248；Wetzker和Rommel(2004)Curr.Pharm.Des.10：1915-1922)和BAY 80-80-6946(库潘尼西(copanlisib))。此外，PI3K同种型特异性小分子抑制剂是已知的。例如，AZD6482和GSK2636771选择性抑制PI3KB，AS-602450和AS-604850选择性抑制PI3KG，IC87114选择性抑制PI3KD，GDC0941选择性抑制PI3KA和PI3KD(Finan和Thomas(2004)Biochem.Soc.Trans.32：378-382；PCT公开WO01/81346；PCT公开WO01/372557；美国专利号6,403,588；和PCT公开WO01/43266)。PI3K的其它抑制剂(例如，并非肽或核酸的有机化学分子的其它小分子)是已知的。另外，结合PI3K的抗体，例如TA802118、TA801482和TA303167(PIK3CA；OriGene Technol.,Inc.)；TA308795、TA330901和TA329903(PIK3CB；OriGene Technol.,Inc.)；TA505226、TA505228和TA505227(PIK3CGl OriGene Technol.,Inc.)；和OTI2H3、TA325015和TA307256(PIK3CD；OriGene Technol.,Inc.)，和核酸，例如SR303520、TF310428、SR421939和TL501641(PIK3CA特异性，OriGene Technol.,Inc.)；SR303521、TL310427、SR421863、TL515159、SR512202和TL711892(PIK3CB特异性，OriGene Technol.,Inc.)；SR303524、TL310425、SR422070、TL502804、TR705298(PIK3CG特异性，OriGene Technol.,Inc.)；和SR303523、TL310426、SR421859、TL515984、SR500333和TL707500(PIK3CD特异性，OriGene Technol.,Inc.)是本领域中众所周知的。应注意，所述术语可进一步用于指本申请所述的关于PI3K的特征的任何组合。例如，类别、序列组成、百分比同一性、序列长度、结构域结构、功能活性等的任何组合可用于描述本发明的PI3K。
如本申请所用，术语“P53”是指众所周知的肿瘤抑制因子p53(参见例如Meek(2015)Biochem J.469：325-346；Ballinger等人(2015)Curr.Opin.Oncol.27：332-337；Amelio和Melino(2015)Trends Biochem.Sci.40：425-434；Saha等人(2014)Prog.Biophys.Mol.Biol.117：250-263；Tchelebit等人(2014)Subcell.Biochem.85：133-159；Yeudall(2014)Subcell.Biochem.85：105-117；Santoro等人(2014)Subcell.Biochem.85：91-103；Girardini等人(2014)Subcell.Biochem.85：41-70；Soussi等人(2014)Hum.Mutat.35：766-778；Leroy等人(2014)Hum.Mutat.35：756-765；Leory等人(2014)Hum.Mutat.35：672-688；Nguyen等人(2014)Hum.Mutat.35：738-755；Bertheau等人(2013)Breast 22：S27-S29；Brachova等人(2013)Int.J.Mol.Sci.14：19257-19275；Carvajal和Manfredi(2013)EMBO Rep.14：414-421；Tornesello等人(2013)Gynecol.Oncol.128：442-448；Lehmann和Pietenpol(2012)J.Clin.Oncol.30：3648-3650；Bellini等人(2012)J.Biomed.Biotechnol.2012：891961；Li等人(2012)Biochim.Biophys.Acta.1819：684-687；和Naccarati等人(2012)Mutagenesis 27：211-218)。编码p53蛋白的基因在脊椎动物中是高度保守的，并且突变导致超过50％的人类癌症中p53蛋白功能的缺陷(Surget等人(2013)OncoTargets Therapy 7：57-68)。在人类中，位于17p13.1的p53基因编码至少15种蛋白质同种型。p53蛋白的蛋白质结构是众所周知的，其特征在于某些结构域。例如，在一个实施方式中，野生型功能性人p53包含：
1)酸性的N端转录激活结构域(TAD)，也称为激活结构域1(AD1)，其激活转录因子(例如，残基1-42)。N端含有两个互补的转录激活结构域，其中较大的一个位于残基1-42，较小的一个位于残基55-75，所述结构域特别参与几个促凋亡基因的调控(Venot等人(1998)EMBO J.17：4668-4679)；
2)激活结构域2(AD2)，其对凋亡活性是重要的(例如，残基43-63)；
3)富含脯氨酸的结构域，其藉由MAPK通过核输出对p53的凋亡活性是重要的(例如，残基64-92)；
4)中心DNA结合核心结构域(DBD)，其含有一个锌原子和几个精氨酸氨基酸(例如，残基102-292)。此区域负责结合p53共抑制因子LMO3(Larsen等人(2010)Biochem.Biophys.Res.Commun.392：252-257；
5)核定位信号传导结构域(例如，残基316-325)；
6)同型寡聚化结构域(OD)(例如，残基307-355)。四聚化对于体内p53的活性至关重要；和
7)涉及下调中心结构域的DNA结合的C端结构域(例如，残基356-393)(Harms等人(2005)Mol.Cell.Biol.25：2014-2030)。
导致癌症的p53缺陷的突变通常发生在DBD中。大多数这些突变破坏了蛋白质与其靶DNA序列结合的能力，从而阻止了这些基因的转录激活。因此，DBD中的突变是隐性功能丧失突变。具有OD突变的p53分子与野生型p53二聚化，并阻止它们激活转录。因此，OD突变对p53的功能具有显性负性作用。如上所述，不编码功能性p53蛋白或编码功能降低的p53蛋白(统称为p53缺陷)的p53核酸突变在本领域中是众所周知的，并且可以通过许多众所周知的突变类型产生，所述突变包括例如错义突变(造成编码的氨基酸改变的的碱基变化)、无义突变(将编码的氨基酸改变为提前的终止密码子的碱基变化)、移码突变(以不是3的倍数的方式添加或缺失碱基)、插入突变(大量或少量添加任何碱基，改变编码的蛋白质的功能)、缺失突变(大量或少量缺失任何碱基，改变编码的蛋白质的功能)或重排突变(任何大或小的改变，改变编码的蛋白质的功能，同时保留碱基的起始量)。在一些实施方式中，可以组合突变，例如当重排伴随添加和/或缺失，或组合多个错义突变时。在一些实施方式中，突变是基因无效的(完成的任何突变将会消除编码的蛋白质的功能)，其在生殖细胞、体细胞或两者中产生。这种突变类型的描述适用于本申请描述的任何标志物。
用于确定p53活性或活性降低的分析是众所周知的并且可商购获得的(参见例如Qiagen
Figure BDA0001989453360000401
p53报告试剂盒、Active
Figure BDA0001989453360000402
p53报告试剂盒；CaymanChemical p53转录因子分析试剂盒产品号600020、GenecopoeiaTMTF-DetectTM人p53活性分析试剂盒；Hiraki等人(2015)Cell Chem.Biol.22：1206-1216；Flaman等人(1995)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92：3963-3967(1995)；和Kovvali等人(2001)Nucl.AcidsRes.29：e28)。
p53核酸和蛋白质的核酸和氨基酸序列是本领域已知的，并且可以在由美国国家生物技术信息中心维护的GenBank数据库中公开获得。例如，人p53核酸和氨基酸序列是众所周知的，包括例如NM_000546.5(变体1)和NP_000537.3(同种型a)；NM_001126112.2(变体2)和NP_001119584.1(同种型a)；NM_001126114.2(变体3)和NP_001119586.1(同种型b)；NM_001126113.2(变体4)和NP_001119585.1(同种型c)；NM_001126115.1(变体5)和NP_001119587.1(同种型d)；NM_001126116.1(变体6)和NP_001119588.1(同种型e)；NM_001126117.1(变体7)和NP_001119589.1(同种型f)；NM_001126118.1(变体8)和NP_001119590.1(同种型g)；NM_001276695.1(变体9)和NP_001263624.1(同种型h)；NM_001276696.1(变体10)和NP_001263625.1(同种型i)；NM_001276697.1(变体10)和NP_001263626.1(同种型j)；NM_001276698.1(变体11)和NP_001263627.1(同种型k)；NM_001276699.1(变体12)和NP_001263628.1(同种型l)；NM_001276760.1(变体13)和NP_001263689.1(同种型g)；和NM_001276761.1(变体14)和NP_001263690.1(同种型g)。其它物种中p53直系同源物的核酸和氨基酸序列也是众所周知的，包括例如小鼠p53(NM_001127233.1、NP_001120705.1、NM_011640.3和NP_035770.2)、黑猩猩p53(XM_001172077.4和XP_001172077.2)、猴p53(NM_001047151.2和NP_001040616.1)、狗p53(NM_001003210.1和NP_001003210.1)、牛p53(NM_174201.2和NP_776626.1)、蛙p53(NM_001001903.1和NP_001001903.1)和斑马鱼p53(NM_001271820.1、NP_001258749.1、NM_131327.3和NP_571402.1)。应注意，所述术语可进一步用于指本申请所述的关于p53的特征的任何组合。例如，类别、序列组成、百分比同一性、序列长度、结构域结构、功能活性等的任何组合可用于描述根据本发明使用的p53。
术语“预定的”生物标志物量和/或活性测量值可以是这样的生物标志物量和/或活性测量值：其用于(仅作为实例)评估可以被选择进行特定治疗的个体、评估对例如PI3Kβ和免疫检查点抑制剂组合疗法的治疗的反应、和/或评估疾病状态。可以在患有或未患有癌症的患者群体中确定预定的生物标志物量和/或活性测量值。预定的生物标志物量和/或活性测量值可以是单个数字，其同等适用于每个患者，或者预定的生物标志物量和/或活性测量值可以根据患者的特定亚群而变化。个体的年龄、体重、身高和其他因素都可能影响个体的预定的生物标志物量和/或活性测量值。此外，可以单独地为每个个体确定预的定生物标志物量和/或活性。在一个实施方式中，本申请描述的方法中确定和/或比较的量基于绝对测量值。在另一个实施方式中，在本申请描述的方法中确定和/或比较的量基于相对测量值，例如比率(例如，相对于管家或其它通常恒定的生物标志物的表达标准化的血清生物标志物)。预定的生物标志物量和/或活性测量值可以是任何合适的标准。例如，可以从正在进行患者选择评估的相同或不同的人处获得预定的生物标志物量和/或活性测量值。在一个实施方式中，预定的生物标志物量和/或活性测量值可以从同一患者的先前评估中获得。以这种方式，可以随时间推移监测患者选择的进展。另外，如果个体是人，则可以从另一个人或多个人(例如，选定的人群)的评估中获得对照。以这种方式，可以将正在进行选择评估的人的选择程度与合适的其他人进行比较，例如，与感兴趣的人处于类似情况的其他人(例如患有相似或相同病况和/或同一种族群体的那些人。
术语“预测的”包括使用在疗法之前、期间或之后的生物标志物核酸和/或蛋白质状态(例如肿瘤的过度活性或活性不足、出现、表达、生长、缓解、复发或抗性)来确定癌症对组合PI3Kβ和免疫检查点抑制剂疗法(例如，用PI3Kβ选择性抑制剂如KIN193和免疫检查点抑制剂如抗PD-1抗体的组合治疗)应答的可能性。生物标志物的这种预测的用途的确定可以通过例如(1)拷贝数的增加或减少(例如通过FISH、FISH加SKY、单分子测序，例如，如本领域中至少J.Biotechnol.,86：289-301中所述，或qPCR)；生物标志物核酸的过表达或表达不足(例如通过ISH、Northern印迹或qPCR)；生物标志物蛋白的增加或减少(例如通过IHC)；或活性的增加或降低，例如大于所分析的人类癌症类型或癌症样品的约5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、100％或更多；(2)其在生物样品中的绝对或相对调节的存在或不存在，所述生物样品例如来自罹患癌症的个体(例如人类)的含有组织、全血、血清、血浆、口腔刮擦物、唾液、脑脊髓液、尿液、粪便或骨髓的样品；(3)其在癌症患者的临床亚组(例如，对特定组合PI3Kβ和免疫检查点抑制剂疗法有应答的那些或对其产生抗性的那些)中的绝对或相对调节的存在或不存在。
如本申请所述的术语“恶变前病变”是指虽然不是癌性的，但有可能变成癌性的病变。它还包括术语“恶变前病症”或“潜在的恶性病症”。特别地，这指的是具有大于正常的恶性转化风险的良性的形态学和/或组织学改变的组织；以及疾病或患者的习惯，其不一定会改变局部组织的临床表现，但与该组织中大于正常的癌前病变或癌症发展(白斑病、红斑病、红白斑扁平苔藓(苔藓样反应)和任何病变或组织学检查显示细胞异常或发育异常的区域)的风险相关。在一个实施方式中，化生是恶变前病变。
术语“预防(prevent/preventing/prevention)”、“预防性治疗”等是指降低在未患有但处于罹患疾病、病症或病况的风险下或易患疾病、病症或病况的个体患上疾病、病症或病况的可能性。
术语“探针”是指能够选择性结合特定目标靶分子的任何分子，例如由生物标志物核酸编码或对应于生物标志物核酸的核苷酸转录物或蛋白质。探针可以由本领域技术人员合成，或者来源于适当的生物制品。如本申请所述，为了检测靶分子，可以特异性地设计探针以进行标记，。可用作探针的分子的实例包括但不限于RNA、DNA、蛋白质、抗体和有机分子。
术语“预后”包括预测癌症的可能病程和结果或从疾病中恢复的可能性。在一些实施方式中，统计算法的使用为个体提供了癌症的预后。例如，预后可以是手术、癌症的临床亚型(例如，实体瘤，例如食道癌和胃癌)的发展、一种或多种临床因素的发展或从疾病中恢复。
如本申请所用，术语“PTEN”或“磷酸酶和张力蛋白同源物”是指众所周知的肿瘤抑制因子pten(参见例如Nakanishi等人(2014)Int.J.Oncol.44：1813-1819；Xu等人(2014)Drug Des.Devel.Ther.8：1745-1751；Shi等人(2012)J.Cell Sci.125：4687-4692；Leslie(2012)Sci.Signal.5：pe50；Conde-Perez和Larue(2012)Future Oncol.8：1109-1120；Zhang等人(2012)Biomed.Pharmacother.66：485-490；Song等人(2012)Nat.Rev.Mol.CellBiol.13：283-296；Aguissa-Toure和Li(2012)Cell Mol.Life Sci.69：1475-1491；Wallace等人(2011)Cancer Res.71：1203-1207；Liu等人(2008)Anticancer Res.28：3613-3619；Keniry和Parsons(2008)Oncogene27：5477-5485；Yin和Shen(2008)Oncogene 27：5443-5453；Planchon等人(2008)J.Cell Sci.121：249-253；Maehama(2007)Biol.Pharm.Bull.30：1624-1727；Vazquez和Devreotes(2006)Cell Cycle 5：1523-1527；Steelman等人(2004)Exp.Opin.Ther.Targets 8：537-550；Parsons(2004)Semin.CellDev.Biol.15：171-176；和Maehama等人(2004)Biochem.Soc.Trans.32：343-347)。编码PTEN蛋白——磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸3-磷酸酶的基因在脊椎动物中高度保守，并且突变导致PTEN蛋白功能缺失(例如，负调节细胞中的磷脂酰基-3,4,5-三磷酸(PtdIns(3,4,5)P3，也称为PIP3)水平并负调节AKT/PKB信号传导)。特别地，PTEN特异性地催化PIP3中肌醇环的3'磷酸的去磷酸化以产生二磷酸产物——PtdIns(4,5)P2(也称为PIP2)，并且其去磷酸化抑制AKT/PKB信号传导通路。此外，PTEN具有参与细胞周期调节的蛋白质如IRS1和disheveled的磷酸酶活性(Shi等人(2014)Nat.Struct.Mol.Biol.21：522-527；Shnitsar等人(2015)Nat.Comm.6：838)。在人类中，pten基因位于10q23.3，编码几种不同的同种型。PTEN蛋白的蛋白质结构是众所周知的，并且由某些结构域表征(参见例如Lee等人(1999)Cell 99：323-334；Haynie和Xue(2015)Prot.Sci.24：874-882；Campbell等人(2003)J.Biol.Chem.278：33617-33620；Iijima等人(2004)J.Biol.Chem.279：16606-16613；McConnachie等人(2003)Biochem.J.371：947-955；Rahdar等人(2009)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 106：480-485；Masson等人(2015)Biochem.J.473：135-144；Hopkins等人(2013)Science 341：399-402；Liang等人(2014)Cell Metabol.19：836-848；和Malaney等人(2013)Mol.Biosys.9：877-2888)。例如，在一个实施方式中，野生型功能性人PTEN包含磷酸酶结构域和C2结构域，其中磷酸酶结构域含有活性酶位点，C2结构域结合磷脂膜。PTEN通过磷酸酶和C2结构域结合细胞膜，以使活性位点接近膜结合的PIP3以进行去磷酸化。另外，野生型功能性人PTEN包含但不必包含功能性的若干其它结构域。例如，短的10个氨基酸的N端区域(残基6-15)称为PIP2结合结构域(PBD)，其增加PTEN对细胞膜的亲和力。类似地，跨越残基353-403的C端结构域被组成型地磷酸化并增强PTEN结合脂质膜的能力。最后，PTEN可以表达为长型，向N端添加额外的约173个氨基酸。
造成癌症的PTEN缺陷的突变导致其酶活性失活，从而导致细胞增殖增加和细胞死亡减少。用于测定PTEN活性的分析是众所周知的并且可商购获得(参见例如
Figure BDA0001989453360000441
PTEN活性ELISA目录号K-4700；Shi等人(2014)Nat.Struct.Mol.Biol.21：522-527；和Zhang等人(2012)Biochem.J.444：457-464)。
PTEN核酸和蛋白质的核酸和氨基酸序列是本领域已知的，并且可以在由美国国家生物技术信息中心维护的GenBank数据库中公开获得。例如，人PTEN核酸和氨基酸序列是众所周知的，包括例如NM_000314.6或NM_001304717.2(变体1)，其由于使用替代性翻译起始密码子而编码多种同种型。最长的同种型被称为PTEN-L或PTENα，其通过使用上游非AUG(CUG)起始密码子以亮氨酸起始而获得，被认为优先与线粒体内膜结合，并具有可由NP_001291646.2公开获得的氨基酸序列。两种较短的同种型衍生自下游AUG起始密码子。最丰富的同种型(PTEN)通过使用5’-most AUG起始密码子而获得并且具有可由NP_000305.3公开获得的氨基酸序列。类似地，与变体1相比，NM_001304718.1(变体2)在其5'非翻译区(UTR)中都含有和缺少交替的外显子。与如变体1中所使用的更上游的CUG和AUG起始密码子相比，变体2表现为在下游AUG开始翻译。如变体1中所使用的，更多5'起始密码子的使用与截短的ORF相关，所述截短的ORF将使转录物成为无义介导的衰变(NMD)的候选物。遗漏扫描可以允许在下游AUG开始翻译以编码同种型，其氨基酸序列可由NP_001291647.1公开获得，与上述同种型PTEN-L和PTEN相比，其具有更短的N端。
其它物种中PTEN直系同源物的核酸和氨基酸序列也是众所周知的，包括例如小鼠PTEN(NM_008960.2和NP_032986.1)、猴PTEN(NM_001260965.1和NP_001247894.1)、狗PTEN(NM_001003192.1和NP_001003192.1)、大鼠PTEN(NM_031606.1和NP_113794.1)、蛙PTEN(NM_001123471.1和NP_001116943.1)、鸡PTEN(XM_015278701.1和XP_015134187.1)和斑马鱼PTEN(NM_001001822.2和NP_001001822.1)。应注意，所述术语可进一步用于指本申请所述的关于PTEN的特征的任何组合。例如，类别、序列组成、百分比同一性、序列长度、结构域结构、功能活性等的任何组合可用于描述根据本发明使用的PTEN。
术语“对抗癌疗法的应答”或“对组合PI3Kβ和免疫检查点抑制剂疗法的应答”涉及过度增殖性病症(例如癌症)对抗癌剂(例如用PI3Kβ选择性抑制剂如KIN193和免疫检查点抑制剂如抗PD-1抗体的组合治疗)的任何应答，优选地涉及新辅助或辅助化学疗法开始后肿瘤质量和/或体积的变化。可以评定过度增殖性病症应答，例如功效或在新辅助或辅助情况中，其中可以通过CT、PET、乳房X线照片、超声波或触诊测量将全身介入后肿瘤的大小与初始大小和尺寸进行比较。在活组织检查或手术切除后，还可以通过卡尺测量或肿瘤的病理检查来评定应答。可以如肿瘤体积百分比变化的定量方式，或以如“病理完全应答”(pCR)、“临床完全缓解”(cCR)、“临床部分缓解”(cPR)、“临床稳定疾病”(cSD)、“临床进展性疾病”(cPD)或其它定性标准的定性方式记录应答。过度增殖性病症应答的评定可以在新辅助或辅助疗法开始后的早期进行，例如在数小时、数天、数周后或优选数月后进行。应答评定的典型端点是在终止新辅助化学疗法后或在手术切除残留的肿瘤细胞和/或肿瘤床后。这通常是在新辅助疗法开始后三个月。在一些实施方式中，可以通过测量临床受益率(CBR)来确定本申请所述治疗性处理的临床功效。通过在疗法结束至少6个月的时间点确定完全缓解(CR)患者的百分比、部分缓解(PR)患者的数量和患有稳定疾病(SD)的患者数量的总和来测量临床受益率。这个公式的简写是超过6个月的CBR＝CR+PR+SD。在一些实施方式中，特定癌症治疗方案的CBR为至少25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％或更多。评估对癌症疗法的应答的其它标准与“存活”有关，其包括以下所有：存活直至死亡，也称为总存活(其中所述死亡可以与病因或相关肿瘤无关)；“无复发存活”(其中术语复发应包括局部和远处复发)；无转移存活；无病存活(其中术语疾病应包括癌症和与之相关的疾病)。所述存活的长度可以通过参考确定的起点(例如，诊断时间或治疗开始时间)和终点(例如，死亡、复发或转移)来计算。此外，治疗功效的标准可以扩展到包括对化学疗法的应答、存活概率、给定时间段内转移的概率以及肿瘤复发的概率。例如，为了确定合适的阈值，可以将特定的癌症治疗方案施用于个体群体，并且可以将结果与在施用任何癌症疗法之前确定的生物标志物测量结果相关联。结果测量可以是对新辅助治疗中给予的疗法的病理性应答。或者，可以在一段时间内监测癌症疗法后的个体的结果测量，例如总存活和无病存活，所述个体的生物标志物测量值是已知的。在某些实施方式中，施用的剂量是本领域已知的癌症治疗剂的标准剂量。监测个体的时间段可以变化。例如，可以监测个体至少2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、45、50、55或60个月。可以使用本领域众所周知的方法，例如实施例部分中描述的方法，来确定与癌症疗法结果相关的生物标志物测量阈值。
术语“抗性”是指癌症样品或哺乳动物对癌症疗法的获得性或天然抗性(即，对治疗性治疗无应答或对治疗性治疗的具有降低的或有限的应答)，例如对治疗性治疗的应答降低25％或更多，例如30％、40％、50％、60％、70％、80％或更多，至2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、15倍、20倍或更多。可以通过在获得抗性之前与相同的癌症样品或哺乳动物进行比较，或通过与已知对治疗性治疗无抗性的不同癌症样品或哺乳动物进行比较来测量应答的降低。对化学疗法的典型获得性抗性被称为“多药抗性”。多药抗性可以通过P-糖蛋白介导或可以通过其它机制介导，或者多药抗性可以在哺乳动物感染多药抗性微生物或微生物的组合时出现。对治疗性治疗的抗性的确定在本领域是常规的，并且在普通熟练的临床医生的技能范围内，例如，可以通过如本申请描述为“致敏”的细胞增殖分析和细胞死亡分析来测量。在一些实施方式中，术语“逆转抗性”是指在单独的主要癌症疗法(例如，化学疗法或放射疗法)不能产生与未治疗的肿瘤的肿瘤体积相比统计学上显著的肿瘤体积减小的情况下，将第二药剂与主要癌症疗法(例如，化学疗法或放射疗法)组合使用能够产生与未治疗的肿瘤的肿瘤体积相比时的统计学显著性水平(例如，p<0.05)的肿瘤体积的显著减小。这通常适用于在未治疗的肿瘤有节奏地对数生长时进行的肿瘤体积测量。
术语“应答”或“应答性”是指例如在减小肿瘤大小或抑制肿瘤生长的意义上的抗癌应答。所述术语也可以指改善的预后，例如由复发时间增加或总存活期增加所反映，复发时间是在审查作为第一次事件的第二次原发性癌症或没有复发迹象的死亡的情况下到第一次复发的时期，总存活期是从治疗到任何原因死亡的时期。应答或有应答意味着当暴露于刺激时获得有益的端点。或者，在暴露于刺激时使负面或有害症状最小化、减轻或减弱。应当理解，评估肿瘤或个体将表现出有利应答的可能性等同于评估肿瘤或个体不会表现出有利应答(即，表现出缺乏应答或无应答)的可能性。
如本申请所用的“RNA干扰剂”定义为通过RNA干扰(RNAi)干扰或抑制靶生物标志物基因表达的任何药剂。这类RNA干扰剂包括但不限于核酸分子，其包括与本发明的靶生物标志物基因同源的RNA分子或其片段、短干扰RNA(siRNA)和通过RNA干扰(RNAi)干扰或抑制靶生物标志物核酸表达的小分子。
“RNA干扰(RNAi)”是一种进化上保守的过程，其中与靶生物标志物核酸相同或高度相似的序列的RNA的表达或引入导致从该靶基因转录的信使RNA(mRNA)的序列特异性降解或特异性转录后基因沉默(PTGS)(参见Coburn和Cullen(2002)J.Virol.76：9225)，从而抑制靶生物标志物核酸的表达。在一个实施方式中，RNA是双链RNA(dsRNA)。已经在植物、无脊椎动物和哺乳动物细胞中描述了这一过程。在自然界中，RNAi由dsRNA特异性内切核酸酶Dicer引发，其促进将长dsRNA进行性切割成称为siRNA的双链片段。将siRNA并入识别和切割靶mRNA的蛋白质复合物中。RNAi还可以通过引入核酸分子(例如合成siRNA或RNA干扰剂)来引发，以抑制或沉默靶生物标志物核酸的表达。如本申请所用，“靶生物标志物核酸表达的抑制”或“标志物基因表达的抑制”包括靶生物标志物核酸或由靶生物标志物核酸编码的蛋白质的表达或蛋白质活性或水平的任何降低。与未被RNA干扰剂靶向的靶生物标志物核酸的表达或由未被RNA干扰剂靶向的靶生物标志物核酸编码的蛋白质的活性或水平相比，降低可以是至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％或更多。
用于检测或确定至少一种生物标志物的存在或水平的术语“样品”通常是脑组织、脑脊髓液、全血、血浆、血清、唾液、尿液、粪便(例如大便)、泪液和任何其它体液(例如，如上文在“体液”的定义下所述)，或组织样品(例如，活组织检查)，例如小肠、结肠样品或手术切除组织。在某些情况下，本发明的方法进一步包括在检测或确定样品中至少一种标志物的存在或水平之前从个体获得所述样品。
应用于生物活性剂的术语“选择性抑制”是指与脱靶信号传导活性相比，所述药剂通过与靶标的直接或相互作用选择性地降低靶标信号传导活性的能力。例如，选择性抑制PI3K的一种同种型而不是PI3K的另一种同种型的药剂具有针对第一种同种型的活性，该活性比化合物对第二种同种型的活性至少高2x(倍)(例如，至少约3x、4x、5x、6x、7x、8x、9x、10x、15x、20x、25x、30x、35x、40x、45x、50x、55x、60x、65x、70x、75x、80x、85x、90x、95x、100x、105x、110x、120x、125x、150x、200x、250x、300x、350x、400x、450x、500x、600x、700x、800x、900x、1000x或更高，或介于两者之间的任何范围，包括端点)(Frazzetto等人(2008)Biochem J.414：383-390)。如无细胞分析中所测定，PI3Kβ选择性抑制剂AZD6482对PI3Kβ的IC50为10nM，对PI3Kβ的选择性比对PI3Kδ、PI3Kα和PI3Kγ的选择性分别高8x(IC50 80nM)、87x(IC50 870nM)和109x(IC50 1090nM)(PCT公开WO2009/093972；Ni等人(2012)CancerDiscov.2：425-433；Nylander等人(2012)J.Thromb.Haemost.10：2127-2136)。PI3Kβ选择性抑制剂TGC-221(7-甲基-2-吗啉代-9-(1-(苯基氨基)乙基)-4H-吡啶并[1,2-a]嘧啶-4-酮)对PI3Kβ、PI3Kδ、PI3Kα和PI3Kγ的IC50分别为5nM、0.1μM、5μM和小于10μM(Jackson等人(2005)Nat.Med.11：507-514)。GSK2636771(2-甲基-1-[[2-甲基-3-(三氟甲基)苯基]甲基]-6-(4-吗啉基)-1H-苯并咪唑-4-甲酸)也是PI3Kβ选择性抑制剂(Macauley等人(2012)Drugs Fut.37：451；Weigelt等人(2013)Clin.Cancer Res.19：3533-3544)。
表2.PI3K化学抑制剂的IC50值(改编自万维网selleckchem.com/pathways_PI3K.html)
Figure BDA0001989453360000481
Figure BDA0001989453360000491
Figure BDA0001989453360000501
术语“致敏”是指改造癌细胞或肿瘤细胞以使得允许用癌症疗法(例如，抗免疫检查点、化学疗法和/或放射疗法)更有效地治疗相关癌症的方式。在一些实施方式中，正常细胞受抗免疫检查点疗法影响的程度不会达到导致正常细胞被过度损伤。根据本领域已知的用于特定治疗的方法和下文所述的方法测量对治疗性治疗的增加的敏感性或降低的敏感性，所述方法包括但不限于细胞增殖分析(Tanigawa等人(1982)Cancer Res.42：2159-2164)、细胞死亡分析(Weisenthal等人(1984)Cancer Res.94：161-173；Weisenthal等人(1985)Cancer Treat.Rep.69：615-632；Weisenthal L M,In：Kaspers等人编DrugResistance in Leukemia and Lymphoma.Langhorne,P A：Harwood AcademicPublishers,1993：415-432；Weisenthal等人(1994)Contrib.Gynecol.Obstet.19：82-90)。还可以通过测量一段时间内(例如，对于人为6个月，对于小鼠为4-6周)的肿瘤大小的减小来测量动物的敏感性或抗性。如果与不存在这种组合物或方法时的治疗敏感性或抗性相比，治疗敏感性的增加或抗性的降低为25％或更多，例如30％、40％、50％、60％、70％、80％或更多，至2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、15倍、20倍或更多，则组合物或方法使对治疗性治疗的应答敏感。对治疗性治疗的敏感性或抗性的确定在本领域是常规的，并且在普通熟练的临床医生的技能范围内。应当理解，本申请描述的用于增强癌症疗法功效的任何方法可以同样地应用于使过度增殖或其它癌细胞(例如，抗性细胞)对癌症疗法敏感的方法。
术语“特异性结合”是指药剂如抗体与预定的靶标如抗原结合。通常，当使用感兴趣的抗原作为分析物，使用抗体作为配体，在
Figure BDA0001989453360000511
分析仪器中通过表面等离子共振(SPR)技术测定时，抗体以约小于10-7M，例如约小于10-8M、10-9M或10-10M或甚至更低的亲和力(KD)进行结合，并且与预定抗原结合的亲和力是其与除预定抗原或紧密相关抗原以外的非特异性抗原(例如，BSA、酪蛋白)结合的亲和力的至少1.1倍、1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、1.6倍、1.7倍、1.8倍、1.9倍、2.0倍、2.5倍、3.0倍、3.5倍、4.0倍、4.5倍、5.0倍、6.0倍、7.0倍、8.0倍、9.0倍或10.0倍或更大。短语“识别抗原的抗体”和“对抗原具特异性的抗体”在本申请中可与术语“与抗原特异性结合的抗体”互换使用。选择性结合是一种相对表述，其是指抗体区分结合一种抗原而非另一个抗原的能力。
术语“协同效应”是指两种或更多种抗癌剂的组合效果(例如，用PI3Kβ选择性抑制剂如KIN193和免疫检查点抑制剂如抗PD-1抗体的组合治疗)可以大于单独的抗癌剂的单独效果的总和。
“短干扰RNA”(siRNA)，在本申请中也称为“小干扰RNA”，定义为例如通过RNAi用于抑制靶生物标志物核酸表达的药剂。siRNA可以化学合成，可以通过体外转录产生，或者可以在宿主细胞内产生。在一个实施方式中，siRNA是约15至约40个核苷酸长的双链RNA(dsRNA)分子，优选约15至约28个核苷酸，更优选约19至约25个核苷酸长，更优选约19、20、21或22个核苷酸长，并且每条链上可含有3'和/或5'突出端，其长度为约0、1、2、3、4或5个核苷酸。突出端的长度在两条链之间是独立的，即，一条链上的突出端的长度不依赖于第二条链上的突出端的长度。优选地，siRNA能够通过靶信使RNA(mRNA)的降解或特异性转录后的基因沉默(PTGS)来促进RNA干扰。
在另一个实施方式中，siRNA是小发夹(也称为茎环)RNA(shRNA)。在一个实施方式中，这些shRNA由短的(例如，19-25个核苷酸)反义链，然后是5-9个核苷酸的环和类似的有义链构成。或者，有义链可以在核苷酸环结构之前，反义链可以在其后。这些shRNA可以包含在质粒、逆转录病毒和慢病毒中，并且可以从例如pol III U6启动子或另一种启动子处表达(参见例如Stewart等人,(2003)RNA Apr；9(4)：493-501，以引用的方式并入本申请中)。
RNA干扰剂，例如siRNA分子，可以施用于患有癌症或有患癌风险的患者，以抑制在癌症中过表达的生物标志物基因的表达，从而治疗、预防或抑制个体的癌症。
术语“个体”是指任何健康的动物、哺乳动物或人，或患有癌症的任何动物、哺乳动物或人，所述癌症例如上皮癌，包括脑转移癌、肺癌、卵巢癌、胰腺癌、肝癌、乳腺癌、前列腺癌、结肠癌、黑素瘤、多发性骨髓瘤等。术语“个体”可与“患者”互换。
术语“存活”包括以下所有：存活直至死亡，也称为总存活(其中所述死亡可以与病因或相关肿瘤无关)；“无复发存活”(其中术语复发应包括局部和远处复发)；无转移存活；无病存活(其中术语疾病应包括癌症和与之相关的疾病)。所述存活的长度可以通过参考确定的起点(例如，诊断时间或治疗开始时间)和终点(例如，死亡、复发或转移)来计算。此外，治疗功效的标准可以扩展到包括对化学疗法的应答、存活概率、给定时间段内转移的概率以及肿瘤复发的概率。
术语“治疗作用”是指由药理学活性物质引起的动物，特别是哺乳动物，更特别是人类的局部或全身作用。因此，所述术语是指用于诊断、治愈、缓解、治疗或预防疾病或增强动物或人类所需的身体或精神发育和状况的任何物质。短语“治疗有效量”是指这样的物质的量，其以适用于任何治疗的合理的益处/风险比产生一些所需的局部或全身作用。在某些实施方式中，化合物的治疗有效量将取决于其治疗指数、溶解度等。例如，通过本发明的方法发现的某些化合物可以足够的量施用，以产生适用于这种治疗的合理的益处/风险比。
本申请所用的术语“治疗有效量”和“有效量”是指包含本发明化合物的化合物、材料或组合物的量，其在动物的至少一个细胞亚群中以适用于任何医学治疗的合理利益/风险比有效地产生一些所需的治疗作用。目标化合物的毒性和治疗功效可以通过细胞培养物或实验动物中例如用于测定LD50和ED50的标准药学程序测定。表现出大治疗指数的组合物是优选的。在一些实施方式中，可以测量药剂的LD50(致死剂量)并且可以使其相对于不施用药剂减少例如至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％、300％、400％、500％、600％、700％、800％、900％、1000％或更多。类似地，可以测量药剂的ED50(即，实现症状的半数最大抑制的浓度)并且可以使其相对于不施用药剂增加例如至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％、300％、400％、500％、600％、700％、800％、900％、1000％或更多。此外，类似地，可以测量药剂的IC50(即，对癌细胞实现半数最大细胞毒性或细胞抑制作用的浓度)并且可以使其相对于不施用药剂增加例如至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％、300％、400％、500％、600％、700％、800％、900％、1000％或更多。在一些实施方式中，分析中的癌细胞生长可以被抑制至少约10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或甚至100％。在另一个实施方式中，可以实现实体恶性肿瘤降低至少约10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或甚至100％。
在一个实施方式中，抗体的治疗有效量(即有效剂量)范围为约0.001至30mg/kg体重，优选约0.01至25mg/kg体重，更优选约0.1至20mg/kg体重，并且甚至更优选约1至10mg/kg、2至9mg/kg、3至8mg/kg、4至7mg/kg或5至6mg/kg体重。本领域的技术人员将理解，某些因素可能影响有效治疗个体所需的剂量，包括但不限于疾病或病症的严重程度、先前的治疗、个体的一般健康状况和/或年龄以及存在的其它疾病。此外，用治疗有效量的抗体治疗个体可以包括单次治疗，或者优选地，可以包括一系列治疗。在优选的实例中，个体用约0.1至20mg/kg体重范围的抗体治疗，每周一次，持续约1至10周，优选2至8周，更优选约3至7周，甚至更优选约4周、5周或6周。还应了解，用于治疗的抗体的有效剂量可在特定治疗过程中增加或减少。剂量的变化可能由诊断分析的结果引起。
“转录的多核苷酸”或“核苷酸转录物”是多核苷酸(例如mRNA，hnRNA，cDNA或前述RNA或cDNA的类似物)，其与成熟mRNA的全部或部分互补或同源，所述成熟mRNA通过对生物标志物核酸的转录和对正常的RNA转录本进行任何可能存在的转录后加工(例如剪接)，以及对所述RNA转录本的逆转录制得。
如本申请所用，术语“无应答性”包括癌细胞对疗法的折射或治疗细胞(例如免疫细胞)对刺激(例如通过活化受体或细胞因子的刺激)的折射。例如，由于暴露于免疫抑制剂或暴露于高剂量抗原，可能发生无应答性。如本申请所用，术语“失能”或“耐受性”包括对活化受体介导的刺激的折射。这种折射通常是抗原特异性的并且在暴露于耐受性抗原后持续存在。例如，T细胞中的失能(与无应答性相反)的特征在于缺乏细胞因子产生，例如IL-2。当T细胞暴露于抗原并在不存在第二信号(共刺激信号)的情况下接收第一信号(T细胞受体或CD-3介导的信号)时，发生T细胞失能。在这些条件下，细胞再次暴露于相同的抗原(即使在共刺激多肽存在下发生再暴露)导致不能产生细胞因子，因此不能增殖。然而，如果与细胞因子(例如IL-2)一起培养，失能T细胞可以增殖。例如，如通过ELISA或通过使用指示细胞系的增殖分析所测量的，T淋巴细胞缺乏IL-2产生也可以观察到T细胞失能。或者，可以使用报告基因构建体。例如，失能T细胞不能在5'IL-2基因增强子的控制下由异源启动子诱导起始IL-2基因转录，也不能由可以在增强子内发现的AP1序列的多聚体诱导起始IL-2基因转录(Kang等人(1992)Science 257：1134)。
如遗传密码(如下所示)所定义，特定蛋白质的氨基酸序列与可编码所述蛋白质的核苷酸序列之间存在已知且确定的对应关系。同样地，在特定核酸的核苷酸序列和由该核酸编码的氨基酸序列之间存在已知且确定的对应关系，如遗传密码所定义。
遗传密码
Figure BDA0001989453360000541
Figure BDA0001989453360000551
遗传密码的一个重要且众所周知的特征是其冗余，其中，对于用于制备蛋白质的大多数氨基酸，可以使用多于一种编码核苷酸三联体(如上所述)。因此，许多不同的核苷酸序列可以编码给定的氨基酸序列。这些核苷酸序列被认为是功能上等同的，因为它们导致在所有生物体中产生相同的氨基酸序列(尽管某些生物体可以比其它生物体更有效地翻译某些序列)。此外，偶尔可以在给定的核苷酸序列中发现嘌呤或嘧啶的甲基化变体。这种甲基化不影响三核苷酸密码子和相应氨基酸之间的编码关系。
鉴于前述内容，通过使用遗传密码将DNA或RNA翻译成氨基酸序列，编码生物标志物核酸(或其任何部分)的DNA或RNA的核苷酸序列可用于衍生多肽氨基酸序列。同样，对于多肽氨基酸序列，可以从遗传密码推导出可以编码多肽的相应核苷酸序列(由于其冗余，将为任何给定的氨基酸序列产生多个核酸序列)。因此，本申请中编码多肽的核苷酸序列的描述和/或公开应当被认为还包括由该核苷酸序列编码的氨基酸序列的描述和/或公开。类似地，本申请中多肽氨基酸序列的描述和/或公开应当被认为还包括可编码该氨基酸序列的所有可能核苷酸序列的描述和/或公开。
最后，本发明的基因座和生物标志物的核酸和氨基酸序列信息(例如，表3中列出的生物标记物)在本领域是众所周知的，并且可在可公开获得的数据库中容易地获得，例如国家生物技术信息中心(NCBI)。例如，衍生自可公开获得的序列数据库的示例性核酸和氨基酸序列提供于下文并且包括例如PCT公开WO 2014/022759，其全部内容通过引用并入本申请。
表3
SEQ ID NO：1人PIK3CA cDNA酸序列
Figure BDA0001989453360000561
Figure BDA0001989453360000571
SEQ ID NO：2人PIK3CA氨基酸序列
Figure BDA0001989453360000572
Figure BDA0001989453360000581
SEQ ID NO：3小鼠PIK3CA(转录物1)cDNA酸序列
Figure BDA0001989453360000582
Figure BDA0001989453360000591
SEQ ID NO：4小鼠PIK3CA(同种型1)氨基酸序列
Figure BDA0001989453360000592
Figure BDA0001989453360000601
SEQ ID NO：5小鼠PIK3CA(转录物2)cDNA酸序列
Figure BDA0001989453360000602
Figure BDA0001989453360000611
SEQ ID NO：6小鼠PIK3CA(同种型2)氨基酸序列
Figure BDA0001989453360000621
SEQ ID NO：7人PIK3CB(转录物1)cDNA酸序列
Figure BDA0001989453360000622
Figure BDA0001989453360000631
Figure BDA0001989453360000641
SEQ ID NO：8人PIK3CB(同种型1)氨基酸序列
Figure BDA0001989453360000642
SEQ ID NO：9人PIK3CB(转录物2)cDNA酸序列
Figure BDA0001989453360000643
Figure BDA0001989453360000651
SEQ ID NO：10人PIK3CB(同种型2)氨基酸序列
Figure BDA0001989453360000652
SEQ ID NO：11小鼠PIK3CB cDNA酸序列
Figure BDA0001989453360000661
Figure BDA0001989453360000671
SEQ ID NO：12小鼠PIK3CB氨基酸序列
Figure BDA0001989453360000672
Figure BDA0001989453360000681
SEQ ID NO：13人PIK3CG(转录物1)cDNA酸序列
Figure BDA0001989453360000682
Figure BDA0001989453360000691
SEQ ID NO：14人PIK3CG(同种型1)氨基酸序列
Figure BDA0001989453360000692
Figure BDA0001989453360000701
SEQ ID NO：15人PIK3CG(转录物2)cDNA酸序列
Figure BDA0001989453360000702
Figure BDA0001989453360000711
Figure BDA0001989453360000721
SEQ ID NO：16人PIK3CG(同种型2)氨基酸序列
Figure BDA0001989453360000722
SEQ ID NO：17人PIK3CG(转录物3)cDNA酸序列
Figure BDA0001989453360000723
Figure BDA0001989453360000731
Figure BDA0001989453360000741
SEQ ID NO：18人PIK3CG(同种型3)氨基酸序列
Figure BDA0001989453360000742
SEQ ID NO：19小鼠PIK3CG(转录物1)cDNA酸序列
Figure BDA0001989453360000743
Figure BDA0001989453360000751
Figure BDA0001989453360000761
SEQ ID NO：20小鼠PIK3CG(同种型1)氨基酸序列
Figure BDA0001989453360000762
Figure BDA0001989453360000771
SEQ ID NO：21小鼠PIK3CG(转录物2)cDNA酸序列
Figure BDA0001989453360000772
Figure BDA0001989453360000781
SEQ ID NO：22小鼠PIK3CG(同种型2)氨基酸序列
Figure BDA0001989453360000782
Figure BDA0001989453360000791
SEQ ID NO：23小鼠PIK3CG(转录物3)cDNA酸序列
Figure BDA0001989453360000792
Figure BDA0001989453360000801
Figure BDA0001989453360000811
SEQ ID NO：24小鼠PIK3CG(同种型3)氨基酸序列
Figure BDA0001989453360000812
SEQ ID NO：25人PIK3CD cDNA酸序列
Figure BDA0001989453360000813
Figure BDA0001989453360000821
Figure BDA0001989453360000831
SEQ ID NO：26人PIK3CD氨基酸序列
Figure BDA0001989453360000832
SEQ ID NO：27小鼠PIK3CD(转录物1)cDNA酸序列
Figure BDA0001989453360000833
Figure BDA0001989453360000841
Figure BDA0001989453360000851
SEQ ID NO：28小鼠PIK3CD(同种型1)氨基酸序列
Figure BDA0001989453360000852
Figure BDA0001989453360000861
SEQ ID NO：29小鼠PIK3CD(转录物2)cDNA酸序列
Figure BDA0001989453360000862
Figure BDA0001989453360000871
SEQ ID NO：30小鼠PIK3CD(同种型2)氨基酸序列
Figure BDA0001989453360000872
Figure BDA0001989453360000881
SEQ ID NO：31小鼠PIK3CD(转录物3)cDNA酸序列
Figure BDA0001989453360000882
Figure BDA0001989453360000891
SEQ ID NO：32小鼠PIK3CD(同种型3)氨基酸序列
Figure BDA0001989453360000892
Figure BDA0001989453360000901
SEQ ID NO：33小鼠PIK3CD(转录物4)cDNA酸序列
Figure BDA0001989453360000902
Figure BDA0001989453360000911
SEQ ID NO：34小鼠PIK3CD(同种型4)氨基酸序列
Figure BDA0001989453360000912
Figure BDA0001989453360000921
SEQ ID NO：35小鼠PIK3CD(转录物5)cDNA酸序列
Figure BDA0001989453360000922
Figure BDA0001989453360000931
Figure BDA0001989453360000941
SEQ ID NO：36小鼠PIK3CD(同种型5)氨基酸序列
Figure BDA0001989453360000942
SEQ ID NO：37小鼠PIK3CD(转录物6)cDNA酸序列
Figure BDA0001989453360000943
Figure BDA0001989453360000951
Figure BDA0001989453360000961
SEQ ID NO：38小鼠PIK3CD(同种型6)氨基酸序列
Figure BDA0001989453360000962
SEQ ID NO：39人PD-1cDNA序列
Figure BDA0001989453360000963
Figure BDA0001989453360000971
Figure BDA0001989453360000981
SEQ ID NO：40人PD-1氨基酸序列
Figure BDA0001989453360000982
Figure BDA0001989453360000991
SEQ ID NO：41人PD-L1ScDNA酸序列
Figure BDA0001989453360000992
Figure BDA0001989453360001001
Figure BDA0001989453360001011
SEQ ID NO：42人PD-L1S氨基酸序列
Figure BDA0001989453360001012
Figure BDA0001989453360001021
SEQ ID NO：43人PD-L1M cDNA酸序列
Figure BDA0001989453360001022
Figure BDA0001989453360001031
Figure BDA0001989453360001041
SEQ ID NO：44人PD-L1M氨基酸序列
Figure BDA0001989453360001042
Figure BDA0001989453360001051
SEQ ID NO：45人PD-L2 cDNA酸序列
Figure BDA0001989453360001052
Figure BDA0001989453360001061
SEQ ID NO：46人PD-L2氨基酸序列
Figure BDA0001989453360001062
Figure BDA0001989453360001071
SEQ ID NO：47人TIM-3cDNA序列
Figure BDA0001989453360001072
Figure BDA0001989453360001081
SEQ ID NO：48人TIM-3氨基酸序列
Figure BDA0001989453360001082
SEQ ID NO：49小鼠TIM-3cDNA序列
Figure BDA0001989453360001083
Figure BDA0001989453360001091
SEQ ID NO：50小鼠TIM-3氨基酸序列
Figure BDA0001989453360001092
SEQ ID NO：51人LAG-3 cDNA序列
Figure BDA0001989453360001093
Figure BDA0001989453360001101
SEQ ID NO：52人LAG-3氨基酸序列
Figure BDA0001989453360001102
SEQ ID NO：53小鼠LAG-3cDNA序列
Figure BDA0001989453360001103
Figure BDA0001989453360001111
SEQ ID NO：54小鼠LAG-3氨基酸序列
Figure BDA0001989453360001112
*表3中包括RNA核酸分子(例如，用尿嘧啶取代胸腺嘧啶)、编码所编码蛋白质的直系同源物的核酸分子以及包含在全长上与表3中列出的任何SEQ ID NO的核酸序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更多同一性的核酸序列或其部分的DNA或RNA核酸序列。此类核酸分子可具有如本申请进一步描述的全长核酸的功能。
*表3中包括蛋白质的直系同源物，以及包含在全长上与表3中列出的任何SEQ IDNO的氨基酸序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更多同一性的氨基酸序列或其部分的多肽分子。此类多肽可具有如本申请进一步描述的全长多肽的功能。
II.个体
在一个实施方式中，施用组合PI3Kβ和免疫检查点抑制剂疗法的个体是哺乳动物(例如，小鼠、大鼠、灵长类动物、非人类哺乳动物、家畜例如狗、猫、牛、马等)，并且优选是人。在另一个实施方式中，个体是上皮癌(例如，乳腺癌(例如TNBC)、卵巢癌或前列腺癌)的动物模型。例如，动物模型可以是人源性上皮癌(例如，乳腺癌(例如TNBC)、卵巢癌或前列腺癌)的原位异种移植动物模型。
在本发明方法的另一个实施方式中，个体未进行治疗，例如化学疗法、放射疗法、靶向疗法和/或抗免疫检查点疗法。在另一个实施方式中，个体已进行治疗，例如化学疗法、放射疗法、靶向疗法和/或抗免疫检查点疗法。
在某些实施方式中，个体已进行手术以去除癌性或癌前组织。在其它实施方式中，癌组织尚未被去除，例如，癌组织可位于身体的不可操作区域中，例如在对于生命必不可少的组织中，或在外科手术将对患者造成相当大的伤害风险的区域中。
本发明的方法可用于治疗例如本申请所述的那些个体的许多不同癌症和/或确定所述癌症对组合PI3Kβ和免疫检查点抑制剂疗法的应答性。
III.抗癌疗法
在一个方面，可以施用组合PI3Kβ和免疫检查点抑制剂疗法或疗法组合(例如，一种或多种PI3Kβ选择性抑制剂如KIN193与一种或多种免疫检查点抑制剂如抗PD-1抗体的组合，单独或与其它抗癌疗法如靶向疗法组合)，特别是如果首次表明个体是组合PI3Kβ和免疫检查点抑制剂疗法的可能应答者，例如通过针对其靶癌细胞缺乏p53和/或PTEN进行选择。在另一个实施方式中，一旦指示个体不是这种疗法的可能应答者并且可以施用替代治疗方案(例如靶向和/或非靶向抗癌疗法)，则可以避免这种组合PI3Kβ和免疫检查点抑制剂疗法。
还考虑了组合疗法，其可以包含例如一种或多种化学治疗剂和放射，一种或多种化学治疗剂和免疫疗法，或一种或多种化学治疗剂、放射和化学疗法，其每种组合可以与抗免疫检查点疗法一起。如下所述，药剂可以与例如化学治疗剂、激素、抗血管生成剂、放射性标记的化合物或手术、冷冻疗法和/或放射疗法以组合疗法形式施用。前述治疗方法可以与其它形式的常规疗法(例如，本领域技术人员熟知的癌症的护理标准治疗)结合，连续地、在常规疗法之前或之后施用。例如，这些调节剂可以与治疗有效剂量的化学治疗剂一起施用。在另一个实施方式中，这些调节剂与化学疗法结合施用以增强化学治疗剂的活性和功效。医师案头参考(PDR)公开了已经用于治疗各种癌症的化学治疗剂的剂量。治疗有效的这些上述化学治疗药物的给药方案和剂量将取决于所治疗的特定黑素瘤、疾病的程度和本领域熟练医师熟悉的其它因素，并且可由医师确定。
术语“靶向疗法”是指施用选择性地与所选生物分子相互作用的药剂从而治疗癌症。一个实例包括上皮癌抗原，例如乳腺癌、卵巢癌或前列腺癌抗原。
术语“PI3Kβ治疗”和“免疫检查点抑制剂”如上所述。然而，为了进一步说明免疫检查点抑制，抗PD-1通路药剂的描述说明了靶标的类别及其抑制剂。抗PD-1通路药剂，例如治疗性单克隆阻断抗体，是本领域众所周知的并且如上所述，可用于靶向肿瘤微环境和表达PD-1通路的不需要组分(例如PD-1受体及其配体PD-L1和PD-L2)的细胞。“PD-1通路抑制剂”阻断或以其它方式减少PD-1与其一种或两种配体之间的相互作用，从而阻断或以其它方式减少由相互作用产生的免疫抑制信号。抗免疫检查点抑制剂可以是直接或间接的。直接抗免疫检查点抑制剂阻断或以其它方式减少免疫检查点与其至少一种配体之间的相互作用。例如，PD-1抑制剂可以阻断PD-1与其一种或两种配体的结合。直接PD-1组合抑制剂在本领域中是众所周知的，尤其因为PD-1的天然结合配偶体(例如，PD-L1和PD-L2)、PD-L1的天然结合配偶体(例如，PD-1和B7-1)和PD-L2的天然结合配偶体(例如，PD-1和RGMb)是已知的。
例如，直接阻断PD-1与PD-L1、PD-1与PD-L2、PD-1与PD-L1和PD-L2两者之间的相互作用的药剂，例如双特异性抗体，可以阻止抑制性信号传导和上调免疫应答(即作为PD-1通路抑制剂)。或者，间接阻断PD-1与其一种或两种配体之间相互作用的药剂可以阻止抑制性信号传导并上调免疫应答。例如，B7-1或其可溶形式通过与PD-L1多肽结合间接降低了可用于结合PD-1的PD-L1多肽的有效浓度。示例性药剂包括针对PD-1、PD-L1和/或PD-L2的单特异性或双特异性阻断抗体，其阻断受体和配体之间的相互作用；非活化形式的PD-1、PD-L1和/或PD-L2(例如，显性阴性或可溶性多肽)，阻断PD-1、PD-L1和/或PD-L2之间相互作用的小分子或肽；与PD-1、PD-L1和/或PD-L2结合并抑制受体和配体之间的相互作用的融合蛋白(例如PD-1、PD-L1和/或PD-L2的细胞外部分与抗体或免疫球蛋白的Fc部分融合)；非活化形式的天然PD-1、PD-L2和/或PD-L2配体，以及可溶形式的天然PD-1、PD-L2和/或PD-L2配体。
间接抗免疫检查点抑制剂阻断或以其它方式减少免疫检查点与其至少一种配体之间相互作用产生的免疫抑制性信号传导。例如，抑制剂可以阻断PD-1与其一种或两种配体之间的相互作用，而不必直接阻断PD-1与其一种或两种配体之间的相互作用。例如，间接抑制剂包括结合信号传导所需的PD-1和/或PD-L1的细胞内部分的胞内抗体，以阻断或以其它方式减少免疫抑制性信号传导。类似地，降低PD-1、PD-L1和/或PD-L2表达的核酸可通过去除相互作用组分的可用性而间接抑制PD-1与其一种或两种配体之间的相互作用。此类核酸分子可以阻断PD-L1、PD-L2和/或PD-L2转录或翻译。
或者，免疫疗法是靶向疗法的一种形式，其可包含例如使用癌症疫苗和/或致敏抗原呈递细胞。例如，溶瘤病毒是能够感染和裂解癌细胞，同时使正常细胞不受伤害的病毒，这使其可能在癌症疗法中有用。溶瘤病毒的复制既促进肿瘤细胞的破坏，又在肿瘤部位产生剂量扩增。它们还可以充当抗癌基因的载体，允许基因被特异性地递送到肿瘤部位。免疫疗法可以涉及用于短期保护宿主的被动免疫，其通过施用针对癌抗原或疾病抗原的预先形成的抗体(例如，向肿瘤抗原施用任选地与化学治疗剂或毒素连接的单克隆抗体)来实现。免疫疗法还可以集中于使用癌细胞系的细胞毒性淋巴细胞识别的表位。或者，可以使用反义多核苷酸、核酶、RNA干扰分子、三螺旋多核苷酸等选择性调节与肿瘤或癌症的起始、进展和/或病理学相关的生物分子。
术语“非靶向疗法”是指施用不选择性地与所选生物分子相互作用但治疗癌症的药剂。非靶向疗法的代表性实例包括但不限于化学疗法、基因疗法和放射疗法。
在一个实施方式中，使用化学疗法。化学疗法包括施用化学治疗剂。这种化学治疗剂可以是但不限于选自以下化合物组的那些：铂化合物、细胞毒性抗生素、抗代谢药、抗有丝分裂剂、烷化剂、砷化合物、DNA拓扑异构酶抑制剂、紫杉烷、核苷类似物、植物生物碱和毒素；及其合成衍生物。示例性化合物包括但不限于烷化剂：顺铂、曲奥舒凡(treosulfan)和曲磷胺(trofosfamide)；植物生物碱：长春碱(vinblastine)、紫杉醇、多西他赛(docetaxol)；DNA拓扑异构酶抑制剂：替尼泊苷(teniposide)、克立那托(crisnatol)和丝裂霉素(mitomycin)；抗叶酸剂：甲氨蝶呤(methotrexate)、霉酚酸(mycophenolic acid)和羟基脲；嘧啶类似物：5-氟尿嘧啶、脱氧氟尿苷和胞嘧啶阿拉伯糖苷；嘌呤类似物：巯基嘌呤和硫鸟嘌呤；DNA抗代谢物：2'-脱氧-5-氟尿苷、甘氨酸阿非迪霉素(aphidicolinglycinate)和吡唑并咪唑；和抗有丝分裂剂：软海绵素(halichondrin)、秋水仙碱(colchicine)和根霉素(rhizoxin)。还可以使用包含一种或多种化学治疗剂(例如，FLAG、CHOP)的组合物。FLAG包含氟达拉滨(fludarabine)、胞嘧啶阿拉伯糖苷(Ara-C)和G-CSF。CHOP包含环磷酰胺、长春新碱(vincristine)、阿霉素和泼尼松(prednisone)。在另一个实施方式中，使用PARP(例如，PARP-1和/或PARP-2)抑制剂，并且此类抑制剂是本领域中众所周知的(例如，奥拉帕尼(Olaparib)、ABT-888、BSI-201、BGP-15(N-GeneResearchLaboratories,Inc.)；INO-1001(Inotek Pharmaceuticals Inc.)；PJ34(Soriano等人,2001；Pacher等人,2002b)；3-氨基苯甲酰胺(Trevigen)；4-氨基-1,8-萘二甲酰亚胺(Trevigen)；6(5H)-菲啶酮(Trevigen)；苯甲酰胺(美国专利Re.36,397)；和NU1025(Bowman等人)。作用机制通常与PARP抑制剂结合PARP并降低其活性的能力有关。PARP催化β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)转化为烟酰胺和聚-ADP-核糖(PAR)。聚(ADP-核糖)和PARP都与转录调节、细胞增殖、基因组稳定性和致癌作用有关(Bouchard V.J.等人ExperimentalHematology,第31卷,第6期,2003年6月,第446-454(9)页；Herceg Z.；Wang Z.-Q.MutationResearch/Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis,第477卷,第1期,2001年6月2日,第97-110(14)页)。聚(ADP-核糖)聚合酶1(PARP1)是修复DNA单链断裂(SSB)的关键分子(de Murcia J.等人1997.Proc Natl Acad Sci USA 94：7303-7307；SchreiberV,Dantzer F,Ame J C,de Murcia G(2006)Nat Rev Mol Cell Biol 7：517-528；Wang Z Q等人,(1997)Genes Dev11：2347-2358)。通过抑制PARP1功能来敲除SSB修复诱导DNA双链断裂(DSB)，其可以在具有缺陷同源指导的DSB修复的癌细胞中触发合成致死性(Bryant H E等人,(2005)Nature 434：913-917；Farmer H等人,(2005)Nature 434：917-921)。前述化学治疗剂的实例是说明性的，而不是限制性的。
在另一个实施方式中，使用放射疗法。放射疗法中使用的辐射可以是电离辐射。放射疗法也可以是γ射线、X射线或质子束。放射疗法的实例包括但不限于外束放射疗法、放射性同位素(I-125、钯、铱)的间质植入、放射性同位素如锶-89、胸部放射疗法、腹膜内P-32放射疗法和/或全腹和盆腔放射疗法。关于放射疗法的一般概述，参见Hellman,Chapter16：Principles of Cancer Management：Radiation Therapy,第6版,2001,DeVita等人编,J.B.Lippencott Company,Philadelphia。放射疗法可以作为外部线束放射或远距离放射疗法施用，其中放射线来自远程源。放射治疗还可以作为内部疗法或近距离放射疗法施用，其中放射源放置在靠近癌细胞或肿瘤块的体内。还涵盖使用光动力疗法，包含施用光敏剂，例如血卟啉及其衍生物维替泊芬(Vertoporfin)(BPD-MA)、酞菁、光敏剂Pc4、去甲氧基-竹红菌素A；和2BA-2-DMHA。
在另一个实施方式中，可以进行外科手术以物理方式去除癌细胞和/或组织。
在另一个实施方式中，使用激素疗法。激素治疗性治疗可包含例如激素激动剂、激素拮抗剂(例如，氟他胺(flutamide)、比卡鲁胺(bicalutamide)、他莫昔芬(tamoxifen)、雷洛昔芬(raloxifene)、醋酸亮丙瑞林(leuprolide acetate)(LUPRON)、LH-RH拮抗剂)、激素生物合成和加工的抑制剂以及类固醇(例如，地塞米松(dexamethasone)、类维生素A(retinoids)、三角肌(deltoids)、倍他米松(betamethasone)、皮质醇(cortisol)、可的松(cortisone)、泼尼松(prednisone)、脱氢睾酮、糖皮质激素、盐皮质激素、雌激素、睾酮、孕激素)、维生素A衍生物(如全反式维甲酸(ATRA))；维生素D3类似物；抗孕激素(例如，米非司酮(mifepristone)、奥那司酮(onapristone))或抗雄激素(例如醋酸环丙孕酮(cyproterone acetate))。
在另一个实施方式中，使用热疗，一种身体组织暴露于高温(高达106℉)的程序。热量可能通过破坏细胞或剥夺它们存活所需的物质来帮助缩小肿瘤。热疗可以是使用外部和内部加热装置的局部、区域性和全身热疗。热疗几乎总是与其它形式的疗法(例如，放射疗法、化学疗法和生物疗法)一起使用以试图提高其有效性。局部热疗是指施加于非常小的区域(例如肿瘤)的热量。所述区域可以在外部用来自体外装置的瞄准肿瘤的高频波加热。为了实现内部加热，可以使用几种类型的无菌探针中的一种，包括薄的加热的电线或填充有温水的中空管；植入微波天线；和射频电极。在区域性热疗时，器官或肢体被加热。将产生高能量的磁体和装置放置在待加热区域上。在称为灌注的另一种方法中，将患者的一些血液移出，加热，然后泵送(灌注)到内部待加热的区域。全身加热用于治疗扩散到全身的转移性癌症。它可以使用温水毯、热蜡、感应线圈(如电热毯中的那些)或热室(类似于大型培养箱)来实现。热疗不会引起辐射副作用或并发症的任何显著增加。然而，直接施加到皮肤上的热量可导致约一半接受治疗的患者的不适或甚至显著的局部疼痛。它还可以引起水疱，通常会迅速愈合。
在另一个实施方式中，光动力疗法(也称为PDT、光辐射疗法、光疗法或光化学疗法)用于治疗某些类型的癌症。它基于以下发现：当生物体暴露于特定类型的光时，某些称为光敏剂的化学物质可以杀死单细胞生物体。PDT通过使用固定频率激光与光敏剂结合来破坏癌细胞。在PDT中，光敏剂被注入血流并被全身细胞吸收。与在正常细胞中相比，药剂在癌细胞中的存留时间更长。当处理过的癌细胞暴露于激光时，光敏剂吸收光并产生破坏处理过的癌细胞的活性氧形式。必须仔细定时曝光，以便在大多数光敏剂离开健康细胞但仍存在于癌细胞中时进行。PDT中使用的激光可以通过光纤(非常薄的玻璃束)引导。将光纤靠近癌症放置，以提供适量的光。光纤可通过支气管镜导入肺部以治疗肺癌，或通过内窥镜导入食道以治疗食道癌。PDT的一个优点是它对健康组织造成的损害最小。然而，由于目前使用的激光不能通过超过约3厘米的组织(略大于一英寸又八分之一英寸)，PDT主要用于治疗皮肤上或恰好在皮肤下或内部器官内膜上的肿瘤。光动力疗法使治疗后皮肤和眼睛对光敏感持续6周或更长时间。建议患者避免阳光直射和明亮的室内照明至少6周。如果患者必须到户外，他们需要穿戴防护服，包括太阳镜。PDT的其它临时副作用与特定区域的治疗有关，可能包括咳嗽、吞咽困难、腹痛以及呼吸疼痛或呼吸短促。在1995年12月，美国食品和药物管理局(FDA)批准了一种名为卟吩姆钠(porfimer sodium)或
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的光敏剂，以缓解引起阻塞的食道癌的症状以及仅用激光不能令人满意地治疗的食道癌。在1998年1月，FDA批准卟吩姆钠用于治疗不合适常规肺癌治疗的患者的早期非小细胞肺癌。国家癌症研究所和其它机构正在支持临床试验(研究)，以评估光动力疗法在几种癌症中的使用，包括膀胱癌、脑癌、喉癌和口腔癌。
在另一个实施方式中，激光疗法用于利用高强度光来破坏癌细胞。这种技术通常用于缓解癌症的症状，例如出血或阻塞，特别是当癌症不能通过其它治疗来治愈时。它还可以通过缩小或破坏肿瘤来用于治疗癌症。术语“激光”代表通过受激辐射发射的光放大。普通光，例如来自灯泡的普通光，具有许多波长并在所有方向上扩散。另一方面，激光具有特定波长并聚焦在窄光束中。这种高强度光源含有大量能量。激光非常强大，可用于切割钢材或塑造钻石。激光还可以用于非常精确的外科手术，例如修复眼睛中受损的视网膜或切割组织(代替手术刀)。虽然有几种不同种类的激光器，但只有三种在医学中得到广泛应用：二氧化碳(CO2)激光--这种类型的激光可以从皮肤表面去除薄层而不会穿透更深的层。这种技术特别适用于治疗未深入皮肤的肿瘤和某些癌前病况。作为传统手术刀手术的替代方案，CO2激光还能够切割皮肤。以这种方式使用激光去除皮肤癌。钕：钇铝石榴石(Nd：YAG)激光--来自这种激光的光可以比来自其它类型激光的光更深地穿透到组织中，并且可以使血液快速凝结。它可以通过光纤传输到身体不易接近的部位。这种类型的激光有时用于治疗喉癌。氩激光--这种激光只能通过表层的组织，因此可用于皮肤科和眼科手术。它还在称为光动力疗法(PDT)的程序中与光敏染料一起用于治疗肿瘤。与标准手术工具相比，激光具有多种优势，包括：激光比手术刀更精确；切口附近的组织受到保护，因为与周围皮肤或其它组织几乎没有接触；激光产生的热量使手术部位消毒，从而降低感染风险；由于激光的精度允许切口较小，因此可能需要较少的操作时间；愈合时间往往缩短；因为激光热封血管，出血、肿胀或疤痕较少；激光手术可能不那么复杂，例如，利用光纤，激光可以被引导到身体的部位而不需要做大的切口。可以在门诊的基础上完成更多程序。激光可以通过两种方式用于治疗癌症：通过加热缩小或破坏肿瘤，或通过激活一种化学物质--称为光敏剂--来破坏癌细胞。在PDT中，光敏剂保留在癌细胞中并且可以被光刺激以引起杀死癌细胞的反应。CO2和Nd：YAG激光用于缩小或破坏肿瘤。它们可以与内窥镜、管子一起使用，使医生能够看到身体的某些区域，例如膀胱。来自某些激光器的光可以通过配有光纤的柔性内窥镜传输。这使得医生能够看到并在除了手术之外无法到达的身体部位工作，因此可以非常精确地瞄准激光束。激光也可以与低功率显微镜一起使用，让医生清楚地看到正在治疗的部位。与其它仪器一起使用时，激光系统可以产生直径小至200微米的切割区域--小于非常细的线的宽度。激光用于治疗多种类型的癌症。激光手术是声门(声带)癌、宫颈癌、皮肤癌、肺癌、阴道癌、外阴癌和阴茎癌的某些阶段的标准治疗方法。除了用于摧毁癌症外，激光手术还用于帮助缓解癌症引起的症状(姑息治疗)。例如，激光可用于缩小或破坏阻塞患者气管的肿瘤，使其更容易呼吸。它有时也用于结肠直肠癌和肛门癌的姑息治疗。激光诱导的间质热疗(LITT)是激光疗法的最新发展之一。LITT使用与称为热疗的癌症治疗相同的想法；热量可能有助于通过破坏细胞或剥夺它们生存所需的物质来缩小肿瘤。在这种治疗中，激光被引导到体内的间质区域(器官之间的区域)。然后激光会升高肿瘤的温度，从而损害或破坏癌细胞。
用疗法治疗的持续时间和/或剂量可根据具体治疗剂或其组合而变化。本领域技术人员将理解特定癌症治疗剂的适当治疗时间。本发明涵盖对每种癌症治疗剂的最佳治疗方案的持续评定，其中通过本发明的方法确定的个体的癌症的表型是决定最佳治疗剂量和方案的因素。
用于将多核苷酸引入人或非人哺乳动物或其细胞的任何方式可以适用于本发明的实践，用于将本发明的各种构建体递送到预期的接受者中。在本发明的一个实施方式中，通过转染，即通过递送“裸”DNA或在与胶体分散系统的复合物中递送而将DNA构建体递送至细胞。胶体系统包括大分子复合物、纳米胶囊、微球、珠子和基于脂质的系统，包括水包油乳剂、胶束、混合胶束和脂质体。本发明优选的胶体系统是脂质复合的或脂质体配制的DNA。在前一种方法中，在例如用脂质配制DNA之前，可以首先对含有携带所需DNA构建体的转基因的质粒进行实验优化以进行表达(例如，在5’非翻译区中包含内含子并消除不必要的序列(Felgner等人,Ann NY Acad Sci126-139,1995)。然后可以使用已知的方法和材料实现DNA的配制(例如用各种脂质或脂质体材料)，并将其递送给受体哺乳动物。参见例如Canonico等人,Am J Respir Cell Mol Biol 10：24-29,1994；Tsan等人,Am J Physiol 268；Alton等人,Nat Genet.5：135-142,1993和Carson等人的美国专利号5,679,647。
脂质体的靶向可以基于解剖和机理因素进行分类。解剖分类基于选择性水平，例如器官特异性、细胞特异性和细胞器特异性。机理靶向可以基于它是被动的还是主动的来区分。被动靶向利用脂质体的自然趋势分布到含有窦状毛细血管的器官中的网状内皮系统(RES)的细胞中。另一方面，主动靶向涉及通过将脂质体偶联至特定配体(例如单克隆抗体、糖、糖脂或蛋白质)或通过改变脂质体的组成或大小来改变脂质体，以实现靶向除天然存在的定位位点以外的器官和细胞类型。
可以各种方式修饰靶向递送系统的表面。在脂质体靶向递送系统的情况下，脂质基团可以掺入脂质体的脂质双层中，以保持靶向性配体与脂质体双层稳定结合。各种连接基团可用于将脂质链连接至靶向性配体。裸DNA或与递送载体(例如脂质体)相关的DNA可以施用于个体的几个部位(见下文)。
核酸可以任何所需的载体递送。这些载体包括病毒或非病毒载体(包括腺病毒载体、腺相关病毒载体、逆转录病毒载体、慢病毒载体和质粒载体)。示例性的病毒类型包括HSV(单纯疱疹病毒)、AAV(腺相关病毒)、HIV(人免疫缺陷病毒)、BIV(牛免疫缺陷病毒)和MLV(鼠白血病病毒)。核酸可以任何所需的形式施用，所述形式提供足够有效的递送水平，包括在病毒颗粒中、在脂质体中、在纳米颗粒中和与聚合物复合。
编码感兴趣的蛋白质或核酸的核酸可以在质粒或病毒载体中，或本领域已知的其它载体中。这些载体是众所周知的，可以根据具体应用选择任何载体。在本发明的一个实施方式中，基因递送媒介物包含启动子和去甲基酶编码序列。优选的启动子是组织特异性启动子和通过细胞增殖活化的启动子，例如胸苷激酶和胸苷酸合成酶启动子。其它优选的启动子包括可被病毒感染激活的启动子，例如α-和β-干扰素启动子，以及可被激素如雌激素激活的启动子。可以使用的其它启动子包括Moloney病毒LTR、CMV启动子和小鼠白蛋白启动子。启动子可以是组成型或诱导型的。
在另一个实施方案中，如WO90/11092和美国专利5,580,859中所述，将裸的多核苷酸分子用作基因递送媒介物。这种基因递送媒介物可以是生长因子DNA或RNA，并且在某些实施方案中，与杀死的腺病毒连接。Curiel等人,Hum.Gene.Ther.3：147 154,1992。可任选使用的其他媒介物包括DNA-配体(Wu等人,J.Biol.Chem.264：1698516987,1989)、脂质-DNA组合物(Felgner等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84：7413 7417,1989)、脂质体(Wang等人,Proc.Natl.Acad.Sci.84：7851 7855,1987)和微粒(Williams等人,Proc.Natl.Acad.Sci.88：2726 2730,1991)。
基因递送媒介物可任选地包含病毒序列，例如病毒复制起点或包装信号。这些病毒序列可选自例如星状病毒、冠状病毒、正粘病毒、乳多空病毒、副粘病毒、细小病毒、小核糖核酸病毒、痘病毒、逆转录病毒、披膜病毒或腺病毒。在优选的实施方案中，所述生长因子基因递送媒介物是重组的逆转录病毒载体。重组的逆转录病毒及其各种用途已在许多参考文献中有描述，包括，例如，Mann等人,Cell 33：153,1983,Cane and Mulligan,Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA 81：6349,1984,Miller等人,Human Gene Therapy 1：5-14,1990，美国专利号4,405,712、4,861,719和4,980,289，以及PCT申请号WO89/02,468、WO89/05,349和WO90/02,806。许多逆转录病毒基因递送媒介物都可用于本发明，包括例如描述于如下的那些：EP0,415,731；WO90/07936；WO94/03622；WO93/25698；WO93/25234；美国专利号5,219,740；WO9311230；WO9310218；Vile和Hart,Cancer Res.53：3860-3864,1993；Vile和Hart,Cancer Res.53：962-967,1993；Ram等人,Cancer Res.53：83-88,1993；Takamiya等人,J.Neurosci.Res.33：493-503,1992；Baba等人,J.Neurosurg.79：729-735,1993(美国专利号4,777,127、GB2200651,EP0345242和WO91/02805)。可用于递送本发明的多核苷酸的其它病毒载体系统衍生自疱疹病毒例如单纯疱疹病毒(1997年5月20日颁布的Woo等人的美国专利号5,631,236，Neurovex的WO 00/08191)、牛痘病毒(Ridgeway(1988)Ridgeway,“Mammalian expression vectors,”In：Rodriguez R L,Denhardt D T编,Vectors：Asurvey of molecular cloning vectors and their uses.Stoneham：Butterworth,；Baichwal和Sugden(1986)“Vectors for gene transfer derived from animal DNAviruses：Transient and stable expression of transferred genes,”In：KucherlapatiR编,Gene transfer.New York：Plenum Press；Coupar等人(1988)Gene,68：1-10)和几种RNA病毒。优选的病毒包括甲病毒、痘病毒、沙粒病毒、痘苗病毒、脊髓灰质炎病毒等。它们为各种哺乳动物细胞提供了几种有吸引力的特征(Friedmann(1989)Science,244：1275-1281；Ridgeway,1988,见上文；Baichwal和Sugden,1986,见上文；Coupar等人,1988；Horwich等人(1990)J.Virol.,64：642-650)。
在其它实施方式中，可以使用本领域众所周知的方法操作基因组中的靶DNA。例如，基因组中的靶DNA可以通过缺失、插入和/或突变来操纵用于引入外源DNA或产生修饰的DNA/修饰的核DNA，所述缺失、插入和/或突变是逆转录病毒插入、人工染色体技术、基因插入、用组织特异性启动子随机插入、基因靶向、转座因子和/或任何其它方法。其它修饰技术包括从基因组中删除DNA序列和/或改变核DNA序列。例如，核DNA序列可以通过定点诱变来改变。
在其它实施方式中，重组生物标志物多肽及其片段可以施用于个体。在一些实施方式中，可以构建和施用融合蛋白，其具有增强的生物学特性。此外，生物标志物多肽及其片段可以根据本领域众所周知的药理学方法(例如，聚乙二醇化、糖基化、寡聚化等)进行修饰，以进一步增强所需的生物活性，例如提高的生物利用度和降低蛋白水解性降解。
临床功效可通过本领域已知的任何方法测量。例如，对疗法(例如组合PI3Kβ和免疫检查点抑制剂疗法)的应答涉及癌症(例如肿瘤)对疗法的任何应答，优选涉及新辅助或辅助化疗开始后的肿瘤质量和/或体积的变化。可以在新辅助或辅助情况下评定肿瘤应答，其中可以将通过CT、PET、乳房X线照片、超声波或触诊测量的全身介入后肿瘤的大小与初始大小和尺寸进行比较，并且可以在组织学上估计肿瘤的细胞构成并与在开始治疗之前进行的肿瘤活组织检查的细胞构成进行比较。在活组织检查或手术切除后，还可以通过卡尺测量或肿瘤的病理检查来评定应答。可以定量方式，如肿瘤体积或细胞构成的百分比变化，或使用半定量评分系统，例如残留癌症负荷(Symmans等人,J.Clin.Oncol.(2007)25：4414-4422)或Miller-Payne得分(Ogston等人,(2003)Breast(Edinburgh,Scotland)12：320-327)，以定性方式，如“病理完全应答”(pCR)、“临床完全缓解”(cCR)、“临床部分缓解”(cPR)、“临床稳定疾病”(cSD)、“临床进展性疾病”(cPD)或其它定性标准记录应答。肿瘤应答的评定可以在新辅助或辅助疗法开始后早期进行，例如在数小时、数天、数周后或优选数月后进行。应答评定的典型端点是在终止新辅助化学疗法后或在手术切除残留的肿瘤细胞和/或肿瘤床后。
在一些实施方式中，可以通过测量临床受益率(CBR)来确定本申请所述治疗性治疗的临床功效。通过在疗法结束至少6个月的时间点确定完全缓解(CR)患者的百分比、部分缓解(PR)患者的数量和患有稳定疾病(SD)的患者数量的总和来测量临床受益率。这个公式的简写是超过6个月的CBR＝CR+PR+SD。在一些实施方式中，特定抗免疫检查点治疗方案的CBR为至少25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％或更多。
评估对抗免疫检查点疗法的应答的其它标准与“存活”有关，其包括以下所有：存活直至死亡，也称为总存活(其中所述死亡可以与病因或相关肿瘤无关)；“无复发存活”(其中术语复发应包括局部和远处复发)；无转移存活；无病存活(其中术语疾病应包括癌症和与之相关的疾病)。所述存活的长度可以通过参考确定的起点(例如，诊断时间或治疗开始时间)和终点(例如，死亡、复发或转移)来计算。此外，治疗功效的标准可以扩展到包括对化学疗法的应答、存活概率、给定时间段内转移的概率以及肿瘤复发的概率。
例如，为了确定合适的阈值，可以将特定的抗癌治疗方案施用于个体群体，并且可以将结果与在施用任何组合PI3Kβ和免疫检查点抑制剂疗法之前确定的生物标志物测量结果相关联。结果测量可以是对新辅助治疗中给予的疗法的病理性应答。或者，可以在一段时间内监测抗免疫检查点疗法后的个体的结果测量，例如总存活和无病存活，所述个体的生物标志物测量值是已知的。在某些实施方式中，向每个个体施用相同剂量的抗免疫检查点药剂。在相关实施方式中，施用的剂量是本领域已知的抗免疫检查点药剂的标准剂量。监测个体的时间段可以变化。例如，可以监测个体至少2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、45、50、55或60个月。可以使用例如实施例部分中描述的那些方法，来确定与抗免疫检查点疗法结果相关的生物标志物测量阈值。
3.药物组合物
本发明提供药学上可接受的组合物，其包含治疗有效量的调节(例如，降低)生物标志物表达和/或活性的药剂，与一种或多种药学上可接受的载剂(添加剂)和/或稀释剂一起配制。如下面详细描述的，本发明的药物组合物可以特别配制成以固体或液体形式施用，包括适合于以下的那些：(1)口服施用，例如浸液(水溶液或非水溶液或悬浮液)、片剂、大丸剂、粉末、颗粒、糊剂；(2)肠胃外施用，例如以例如无菌溶液或悬浮液形式通过皮下、肌肉内或静脉内注射；(3)局部施用，例如作为施用于皮肤的乳膏、软膏或喷雾剂；(4)阴道内或直肠内，例如作为子宫托、乳膏或泡沫；或(5)气溶胶，例如作为含有所述化合物的水性气溶胶、脂质体制剂或固体颗粒。
本申请所用的短语“治疗有效量”是指调节(例如，抑制)生物标志物表达和/或活性、或复合物的表达和/或活性的药剂的量，或包含调节(例如，抑制)生物标志物表达和/或活性、或复合物的表达和/或活性的药剂的组合物的量，其以合理的益处/风险比有效地产生一些所需的治疗效果，例如癌症治疗。
短语“药学上可接受的”在本申请中用以指在合理医学判断范围内，适用于与人类和动物的组织接触而无过量毒性、刺激、过敏反应或其它问题或并发症，与合理效益/风险比相称的那些药剂、材料、组合物和/或剂型。
本申请所用的短语“药学上可接受的载剂”是指药学上可接受的材料、组合物或媒剂，例如液体或固体填充剂、稀释剂、赋形剂、溶剂或囊封材料，涉及将受试化学品从一个器官或身体的一部分运载或输送到另一个器官或身体的一部分。在与制剂的其它成分相容并且对受试者无害的意义上，每种载剂必须是“可接受的”。可充当药学上可接受的载剂的材料的一些实例包括：(1)糖，例如乳糖、葡萄糖和蔗糖；(2)淀粉，例如玉米淀粉和马铃薯淀粉；(3)纤维素及其衍生物，例如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和乙酸纤维素；(4)粉末黄芪胶；(5)麦芽；(6)明胶；(7)滑石；(8)赋形剂，例如可可脂和栓剂蜡；(9)油类，例如花生油、棉籽油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油和大豆油；(10)二醇，例如丙二醇；(11)多元醇，例如甘油、山梨糖醇、甘露糖醇和聚乙二醇；(12)酯类，例如油酸乙酯和月桂酸乙酯；(13)琼脂；(14)缓冲剂，例如氢氧化镁和氢氧化铝；(15)海藻酸；(16)无热原水；(17)等渗盐水；(18)林格氏溶液；(19)乙醇；(20)磷酸盐缓冲溶液；和(21)药物制剂中使用的其它无毒性相容物质。
术语“药学上可接受的盐”是指本发明所涵盖的调节(例如，抑制)生物标志物表达和/或活性、或复合物的表达和/或活性的药剂的相对无毒性的无机和有机酸加成盐。这些盐可以在治疗剂的最终分离和纯化过程中原位制备，或者通过使纯化的游离碱形式的治疗剂与合适的有机或无机酸分别反应，并分离由此形成的盐。代表性的盐包括氢溴酸盐、盐酸盐、硫酸盐、硫酸氢盐、磷酸盐、硝酸盐、乙酸盐、戊酸盐、油酸盐、棕榈酸盐、硬脂酸盐、月桂酸盐、苯甲酸盐、乳酸盐、磷酸盐、甲苯磺酸盐、柠檬酸盐、马来酸盐、富马酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐、萘二甲酸盐、甲磺酸盐、葡庚糖酸盐、乳糖酸盐和月桂基磺酸盐等(参见例如Berge等人(1977)“Pharmaceutical Salts”,J.Pharm.Sci.66：1-19)。
在其它情况下，可用于本发明方法的药剂可含有一个或多个酸性官能团，因此能够与药学上可接受的碱形成药学上可接受的盐。在这些情况下，术语“药学上可接受的盐”是指调节(例如，抑制)生物标志物表达和/或活性、或复合物的表达和/或活性的相对无毒性的无机和有机碱加成盐。这些盐同样可以在治疗剂的最终分离和纯化过程中原位制备，或者通过使纯化的游离酸形式的治疗剂与合适的碱(例如药学上可接受的金属阳离子的氢氧化物、碳酸盐或碳酸氢盐)、氨或药学上可接受的有机伯、仲或叔胺分别反应来制备。代表性的碱金属或碱土金属盐包括锂盐、钠盐、钾盐、钙盐、镁盐和铝盐等。可用于形成碱加成盐的代表性有机胺包括乙胺、二乙胺、乙二胺、乙醇胺、二乙醇胺、哌嗪等(参见例如Berge等人，见上文)。
润湿剂、乳化剂及润滑剂(例如月桂基硫酸钠和硬脂酸镁)以及着色剂、脱模剂、包覆剂、甜味剂、调味剂及芳香剂、防腐剂和抗氧化剂也可以存在于所述组合物中。
药学上可接受的抗氧化剂的实例包括：(1)水溶性抗氧化剂，例如抗坏血酸、半胱氨酸盐酸盐、硫酸氢钠、偏亚硫酸氢钠、亚硫酸钠等；(2)油溶性抗氧化剂，例如抗坏血酸棕榈酸酯、丁基化羟基苯甲醚(BHA)、丁基化羟基甲苯(BHT)、卵磷脂、没食子酸丙酯、α-生育酚等；以及(3)金属螯合剂，例如柠檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨糖醇、酒石酸、磷酸等。
可用于本发明方法的制剂包括适用于口服、鼻腔、局部(包括口腔和舌下)、直肠、阴道、气溶胶和/或肠胃外施用的制剂。制剂可以方便地以单位剂型存在，并且可以通过药学领域中众所周知的任何方法制备。可以与载剂材料组合以产生单一剂型的活性成分的量将根据所治疗的宿主、具体的施用方式而变化。可以与载剂材料组合以产生单一剂型的活性成分的量通常是产生治疗效果的化合物的量。通常，在百分之一百中，这一量的范围为活性成分的约1％至约99％，优选约5％至约70％，最优选约10％至约30％。
制备这些制剂或组合物的方法包括使调节(例如，抑制)生物标志物表达和/或活性的药剂与载剂和任选的一种或多种辅助成分结合的步骤。通常，通过使治疗剂与液体载剂或细粉状固体载剂或两者均匀且紧密地结合，然后，如果需要，使产品成形来制备制剂。
适于口服施用的制剂可以呈胶囊、扁囊剂、丸剂、片剂、含片(使用调味基础、通常是蔗糖和阿拉伯胶或黄芪胶)、粉末、颗粒形式、或作为水性或非水性液体中的溶液或悬浮液、或作为水包油或油包水液体乳液、或作为酏剂或糖浆、或作为锭剂(使用惰性基质，例如明胶和甘油、或蔗糖和阿拉伯胶)和/或作为漱口剂等，每个含有预定量的治疗剂作为活性成分。化合物也可以大丸剂、药糖剂或糊剂形式施用。
在用于口服施用的固体剂型(胶囊、片剂、丸剂、糖衣丸、粉末、颗粒等)中，活性成分与一种或多种药学上可接受的载剂混合，例如柠檬酸钠或磷酸二钙，和/或以下任一种：(1)填充剂或增量剂，例如淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露糖醇和/或硅酸；(2)粘合剂，例如羧甲基纤维素、藻酸盐、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖和/或阿拉伯胶；(3)保湿剂，例如甘油；(4)崩解剂，例如琼脂、碳酸钙、马铃薯或木薯淀粉、海藻酸、某些硅酸盐和碳酸钠；(5)溶液缓凝剂，例如石蜡；(6)吸收促进剂，例如季铵化合物；(7)润湿剂，例如乙酰醇和单硬脂酸甘油酯；(8)吸收剂，例如高岭土和膨润土；(9)润滑剂，例如滑石、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、十二烷基硫酸钠及其混合物；以及(10)着色剂。在胶囊、片剂和丸剂的情况下，药物组合物还可包含缓冲剂。也可以使用如乳糖以及高分子量聚乙二醇等赋形剂将类似类型的固体组合物用作软和硬填充明胶胶囊中的填充剂。
片剂可以通过压缩或模塑制备，任选地含有一种或多种辅助成分。可以使用粘合剂(例如，明胶或羟丙基甲基纤维素)、润滑剂、惰性稀释剂、防腐剂、崩解剂(例如，羟基乙酸淀粉钠或交联羧甲基纤维素钠)、表面活性剂或分散剂制备压缩片剂。模制片剂可以通过在合适的机器中模制用惰性液体稀释剂润湿的粉末肽或肽模拟物的混合物来制备。
片剂和其它固体剂型，例如糖衣丸、胶囊、丸剂和颗粒，可任选地用包衣和外壳(例如肠溶包衣和药物配制领域中众所周知的其它包衣)刻痕或制备。它们也可以使用例如不同比例的羟丙基甲基纤维素以提供所需的释放曲线、其它聚合物基质、脂质体和/或微球配制成，使其中的活性成分缓慢或受控释放。它们可以通过例如通过细菌截留过滤器过滤，或通过掺入无菌固体组合物形式的灭菌剂来灭菌，所述灭菌剂可以在使用前立即溶解在无菌水或一些其它无菌可注射介质中。这些组合物还可以任选地含有遮光剂，并且可以是仅在或优先在胃肠道的某一部分任选以延迟的方式释放活性成分的组合物。可以使用的包埋组合物的实例包括聚合物质和蜡。如果合适，活性成分也可以与一种或多种上述赋形剂一起呈微囊封形式。
用于口服施用的液体剂型包括药学上可接受的乳液、微乳液、溶液、悬浮液、糖浆和酏剂。除活性成分外，液体剂型可含有本领域常用的惰性稀释剂，例如水或其它溶剂、增溶剂和乳化剂，例如乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸苯甲酯、丙二醇、1,3-丁二醇、油(特别是棉籽油、花生油、玉米油、胚芽油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油)、甘油、四氢呋喃醇、聚乙二醇和脱水山梨糖醇脂肪酸酯及其混合物。
除惰性稀释剂外，口服组合物还可包括佐剂，例如润湿剂、乳化剂和悬浮剂、甜味剂、调味剂、着色剂、芳香剂和防腐剂。
除活性剂以外，悬浮液可以含有悬浮剂，例如乙氧基化异硬脂醇、聚氧乙烯山梨糖醇和脱水山梨糖醇酯、微晶纤维素、偏氢氧化铝、膨润土、琼脂和黄芪胶及其混合物。
用于直肠或阴道施用的制剂可以作为栓剂提供，其可以通过将一种或多种治疗剂与一种或多种合适的无刺激性赋形剂或载剂混合来制备，所述赋形剂或载剂包括例如可可脂、聚乙二醇、栓剂蜡或水杨酸酯，它在室温下是固体，但在体温下是液体，因此会在直肠或阴道腔内融化并释放出活性剂。
适用于阴道施用的制剂还包括含有本领域已知的适当载剂的子宫托、棉塞、乳膏、凝胶、糊剂、泡沫或喷雾制剂。
用于局部或透皮施用的调节(例如，抑制)生物标志物表达和/或活性的药剂的剂型包括粉末、喷雾剂、软膏、糊剂、乳膏、洗剂、凝胶、溶液、贴剂和吸入剂。活性组分可以在无菌条件下与药学上可接受的载剂混合，并与可能需要的任何防腐剂、缓冲剂或推进剂混合。
除治疗剂外，软膏、糊剂、乳膏和凝胶可含有赋形剂，例如动物和植物脂肪、油、蜡、石蜡、淀粉、黄芪胶、纤维素衍生物、聚乙二醇、硅氧烷、膨润土、硅酸、滑石和氧化锌，或其混合物。
除调节(例如，抑制)生物标志物表达和/或活性的药剂外，粉末和喷雾剂还可含有赋形剂，例如乳糖、滑石、硅酸、氢氧化铝、硅酸钙和聚酰胺粉末，或这些物质的混合物。喷雾剂可另外含有常规推进剂，例如氯氟烃和挥发性未取代的烃，例如丁烷和丙烷。
调节(例如，抑制)生物标志物表达和/或活性的药剂可以替代地通过气溶胶施用。这通过制备含有化合物的含水气溶胶、脂质体制剂或固体颗粒来实现。可以使用非水(例如碳氟化合物推进剂)悬浮液。声波喷雾器是优选的，因为它们最大限度地减少药剂暴露于可导致化合物降解的剪切。
通常，通过将药剂的水溶液或悬浮液与常规的药学上可接受的载剂和稳定剂一起配制来制备含水气溶胶。载剂和稳定剂随特定化合物的要求而变化，但通常包括非离子型表面活性剂(吐温类(Tween)、普朗罗尼类(Pluronics)或聚乙二醇)、无害蛋白质如血清白蛋白、脱水山梨糖醇酯、油酸、卵磷脂、氨基酸如甘氨酸、缓冲剂、盐、糖或糖醇。气溶胶通常由等渗溶液制备。
透皮贴剂具有提供治疗剂向身体的受控递送的附加优点。这种剂型可以通过将药剂溶解或分散在适当的介质中来制备。吸收增强剂也可用于增加肽模拟物通过皮肤的通量。可以通过提供速率控制膜或将肽模拟物分散在聚合物基质或凝胶中来控制这种通量的速率。
眼科制剂、眼用软膏、粉末、溶液等也包括在本发明的范围内。
适用于肠胃外给药的本发明药物组合物包含一种或多种治疗剂与一种或多种药学上可接受的无菌等渗水溶液或非水溶液、分散液、悬浮液或乳液，或可在临使用之前重构成无菌可注射溶液或分散液的无菌粉末的组合，其可含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂、使制剂与预期接受者的血液等渗的溶质，或悬浮剂或增稠剂。
可用于本发明药物组合物的合适的水性和非水性载剂的实例包括水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)及其合适的混合物，植物油(例如橄榄油)和可注射的有机酯(例如油酸乙酯)。例如，通过使用包衣材料如卵磷脂，通过在分散体的情况下保持所需的粒度，以及通过使用表面活性剂，可以保持适当的流动性。
这些组合物还可含有佐剂，例如防腐剂、润湿剂、乳化剂和分散剂。通过包含各种抗细菌剂和抗真菌剂，例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚山梨酸等，可以确保防止微生物的作用。还可能需要在组合物中包含等渗剂，例如糖、氯化钠等。此外，可以通过包含延迟吸收的药剂如单硬脂酸铝和明胶来延长可注射药物形式的吸收。
在某些情况下，为了延长药物的作用，希望减慢皮下或肌内注射药物的吸收。这可以通过使用水溶性差的结晶或无定形材料的液体悬浮液来实现。然后，药物的吸收速率取决于其溶解速率，而溶解速率又取决于晶体大小和晶形。或者，通过将药物溶解或悬浮在油性媒剂中来实现胃肠外施用的药物形式的延迟吸收。
通过在可生物降解的聚合物如聚丙交酯-聚乙交酯中形成调节(例如，抑制)生物标志物表达和/或活性的药剂的微囊基质来制备可注射的贮库形式。依据药物与聚合物的比例以及所用特定聚合物的性质，可以控制药物释放速率。其它可生物降解的聚合物的实例包括聚(原酸酯)和聚(酸酐)。还通过将药物包埋在与身体组织相容的脂质体或微乳液中来制备贮库可注射制剂。
当本发明的治疗剂作为药物施用于人和动物时，它们本身可以给予或作为含有例如0.1-99.5％(更优选0.5-90％)活性成分与药学上可接受的载剂组合的药物组合物给予。
本发明药物组合物中活性成分的实际剂量水平可通过本发明的方法测定，以获得有效实现特定个体、组合物和施用模式所需治疗应答而对个体无毒的活性成分的量。
可以将本发明的核酸分子插入载体中并用作基因疗法载体。基因疗法载体可以通过例如静脉内注射、局部施用(参见美国专利号5,328,470)或通过立体定位注射(参见例如Chen等人(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：3054 3057)递送给个体。基因疗法载体的药物制剂可以包括在可接受的稀释剂中的基因疗法载体，或者可以包含其中嵌入基因递送媒介物的缓释基质。或者，当完整的基因递送载体可以从重组细胞完整产生时，例如逆转录病毒载体，药物制剂可以包括一种或多种产生基因递送系统的细胞。
本发明还包括用于检测和/或调节本申请所述生物标志物的试剂盒。本发明的试剂盒还可以包括说明材料，其公开或描述了本发明的试剂盒或抗体在如本申请所提供的本发明方法中的用途。试剂盒还可以包括其它组分，以便于针对试剂盒所设计的特定应用。例如，试剂盒可另外含有检测标记的手段(例如，用于酶标记的酶底物、用于检测荧光标记的过滤器组、适当的二级标记如绵羊抗小鼠-HRP等)和对照(例如，对照生物样品或标准品)所需的试剂。试剂盒可另外包括缓冲液和被认可用于本发明方法的其它试剂。非限制性实例包括降低非特异性结合的试剂，例如载体蛋白或洗涤剂。
4.本发明的其它用途和方法
本申请所述的组合物可用于各种诊断、预后和治疗应用。在本申请描述的任何方法中，例如诊断方法、预后方法、治疗方法或其组合，所述方法的所有步骤可以由单个行动者执行，或者由不止一个行动者执行。例如，诊断可以由提供治疗性治疗的行动者直接进行。或者，提供治疗剂的个人可以要求进行诊断分析。诊断医师和/或治疗干预者可以解释诊断分析结果以确定治疗策略。类似地，此类替代方法可以应用于其它分析，例如预后分析。
1.预测医学
本发明可以涉及预测医学领域，其中诊断分析、预后分析和监测临床试验用于预后(预测)目的，从而预防性地治疗个体。因此，本发明的一个方面涉及用于在生物样品(例如，血液、血清、细胞或组织)的背景下确定本申请所述生物标志物的量和/或活性水平，例如p53和/或PTEN缺陷状态的诊断分析，从而确定患有癌症的个体是否可能对组合PI3Kβ和免疫检查点抑制剂疗法有应答，例如在上皮癌(例如，乳腺癌、卵巢癌或前列腺癌)中。此类分析可单独用于预后或预测目的，或可与治疗性干预相结合，从而在特征在于生物标记物多肽、核酸表达或活性或与之相关的病症的发作之前或复发之后预防性地治疗个体。本领域技术人员将理解，任何方法可以使用本申请所述生物标志物中的一种或多种(例如组合)，例如表格、图、实施例和说明书中另外描述的那些。
本发明的另一方面涉及监测药剂(例如，药物、化合物和基于小核酸的分子)对本申请所述的生物标志物的表达或活性或癌症状态的影响。以下部分将更详细地描述这些和其它药剂。
本领域技术人员还将理解，在某些实施方式中，本发明的方法执行计算机程序和计算机系统。例如，计算机程序可用于执行本申请描述的算法。计算机系统还可以存储和操纵由本发明的方法产生的数据，所述数据包括多个生物标志物信号变化/分布，计算机系统可以使用这些变化/分布来实施本发明的方法。在某些实施方式中，计算机系统接收生物标志物表达数据；(ii)存储数据；和(iii)以本申请所述的任何数量的方式(例如，相对于适当对照的分析)比较数据以确定来自癌性或癌前组织的信息性生物标志物的状态。在其它实施方式中，计算机系统(i)将确定的表达生物标志物水平与阈值进行比较；和(ii)输出所述生物标记物水平是否被显著调节(例如，高于或低于)阈值的指示，或基于所述指示的表型。
在某些实施方式中，这种计算机系统也被认为是本发明的一部分。根据生物信息学和/或计算机领域的技术人员所拥有的知识，可以使用许多类型的计算机系统来实施本发明的分析方法。在这种计算机系统的操作期间，可以将若干软件组件加载到存储器中。软件组件可以包括本领域标准的软件组件和本发明特有的组件(例如，Lin等人(2004)Bioinformatics 20,1233-1240中描述的dCHIP软件；本领域已知的径向基础机器学习算法(RBM))。
本发明的方法还可以在数学软件包中编程或建模，所述数学软件包允许方程的符号输入和处理的高级规范，包括欲使用的特定算法，从而使用户无需程序地编程单个方程和算法。这种软件包包括例如来自Mathworks(马萨诸塞州纳蒂克)的Matlab、来自WolframResearch(伊利诺伊州尚佩恩)的Mathematica或来自MathSoft(华盛顿州西雅图)的S-Plus。
在某些实施方式中，计算机包括用于存储生物标志物数据的数据库。可以访问这些存储的简档，并用于在稍后的时间点进行目的比较。例如，可以存储源自个体的非癌组织的样品的生物标志物表达谱和/或相关物种的相关群体中的感兴趣的信息性基因座的基于群体的分布产生的谱，并且随后将其与源自个体的癌组织或个体疑似癌变的组织的样品进行比较。
除了本申请描述的示例性程序结构和计算机系统之外，其它替代程序结构和计算机系统对于本领域技术人员来说将是显而易见的。因此，这类替代系统将被涵盖在所附权利要求中，其在主旨或范围上不脱离上述计算机系统和程序结构。
2.诊断分析
本发明部分地提供了用于精确分类生物样品是否与可能对组合PI3Kβ和免疫检查点抑制剂疗法有应答的癌症相关的方法、系统和代码。在一些实施方式中，本发明可用于使用统计算法和/或经验数据(例如，本申请例如在表格、图、实施例中描述的和说明书中另外描述的生物标志物的量或活性)将样品(例如，来自个体)分类为与对组合PI3Kβ和免疫检查点抑制剂疗法有应答或无应答相关或在其风险下。
用于检测本申请所述生物标志物的量或活性，并因此可用于分类样品是否可能或不可能对组合PI3Kβ和免疫检查点抑制剂疗法有应答的示例性方法涉及从测试个体获得生物样品并使生物样品与药剂(例如蛋白质结合剂，如抗体或其抗原结合片段，或核酸结合剂，如寡核苷酸)接触，从而能够检测生物样品中生物标志物(例如p53和/或PTEN核酸或目标蛋白质)的量或活性。在一些实施方式中，使用至少一种抗体或其抗原结合片段，其中两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种、十种或更多种此类抗体或抗体片段可以组合(例如，在夹心ELISA中)或串联使用。在某些情况下，统计算法是单个学习统计分类器系统。例如，基于预测或概率值以及生物标志物的存在或水平，单个学习统计分类器系统可用于将样品分类。单个学习统计分类器系统的使用通常将样品分类为例如可能的抗免疫检查点疗法应答者或进展者样品，其敏感性、特异性、阳性预测值、阴性预测值和/或总体准确性为至少约75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。
其它合适的统计算法对于本领域技术人员来说是众所周知的。例如，学习统计分类器系统包括机器学习算法技术，其能够适应复杂数据集(例如，感兴趣的标记组)并基于这些数据集做出决策。在一些实施方式中，使用单个学习统计分类器系统，例如分类树(例如，随机森林)。在其它实施方式中，使用2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多种学习统计分类器系统的组合，优选串联使用。学习统计分类器系统的实例包括但不限于使用归纳学习(例如，决策/分类树如随机森林、分类和回归树(C&RT)、增强树等)、可能近似正确(PAC)学习、连接主义学习(例如，神经网络(NN)、人工神经网络(ANN)、神经模糊网络(NFN)、网络结构、感知器如多层感知器、多层前馈网络、神经网络应用、信念网络中的贝叶斯学习等)、强化学习(例如，在已知环境中的被动学习如幼稚学习、自适应动态学习、时间差异学习、未知环境中的被动学习、未知环境中的主动学习、学习行动价值功能、强化学习的应用等)以及遗传算法和进化规划的系统。其它学习统计分类器系统包括支持向量机(例如，核方法)、多变量自适应回归样条(MARS)、莱文贝格-马夸特算法(Levenberg-Marquardtalgorithm)、高斯-牛顿算法(Gauss-Newton algorithm)、高斯混合、梯度下降算法和学习矢量量化(LVQ)。在某些实施方式中，本发明的方法还包括将样品分类结果发送给临床医生，例如肿瘤科医生。
在另一个实施方式中，对个体的诊断之后，是基于诊断向个体施用治疗有效量的确定的治疗。
在一个实施方式中，所述方法还涉及获得对照生物样品(例如，来自未患有癌症或其癌症对组合PI3Kβ和免疫检查点抑制剂疗法敏感的个体的生物样品)、来自在缓解期间的个体的生物样品、或来自尽管使用组合PI3Kβ和免疫检查点抑制剂疗法但在治疗期间出现癌症发展的个体的生物样品。
3.预后分析
此外，本申请所述的诊断方法还可用于鉴定患有癌症或有患癌风险的个体，所述癌症可能或不可能对组合PI3Kβ和免疫检查点抑制剂疗法有应答。本申请所述的分析，例如前述诊断分析或以下分析，可用于鉴定患有与本申请所述的至少一种生物标志物的量或活性的错误调节相关的病症(例如癌症)或有患所述病症的风险的个体。或者，预后分析可用于鉴定患有与本申请所述的至少一种生物标志物的错误调节相关的病症(例如癌症)或有患所述病症的风险的个体。此外，本申请所述的预后分析可用于确定个体是否可以施用药剂(例如，激动剂、拮抗剂、肽模拟物、多肽、肽、核酸、小分子或其它候选药物)来治疗与异常的生物标志物表达或活性相关的疾病或与病症。
4.生物标志物核酸和多肽
本发明的治疗方法和其它方法使用感兴趣的生物标志物。在一些实施方式中，感兴趣的生物标志物是分离的核酸分子，其对应于编码生物标志物多肽或这种多肽的一部分的生物标志物核酸。如本申请所用，术语“核酸分子”旨在包括DNA分子(例如cDNA或基因组DNA)和RNA分子(例如mRNA)以及使用核苷酸类似物产生的DNA或RNA的类似物。核酸分子可以是单链或双链的，但优选是双链DNA。
“分离的”核酸分子是与存在于核酸分子的天然来源中的其它核酸分子分离的核酸分子。优选地，“分离的”核酸分子不含这样的序列(优选蛋白质编码序列)：其天然地位于所述核酸所来源的生物的基因组DNA中的核酸的侧翼(即位于所述核酸的5'和3'端的序列)。例如，在各种实施方式中，分离的核酸分子可含有小于约5kB、4kB、3kB、2kB、1kB、0.5kB或0.1kB的核苷酸序列，其天然位于获得所述核酸所来源的细胞的基因组DNA中的核酸分子侧翼。此外，“分离的”核酸分子，例如cDNA分子，当通过重组技术产生时基本上不含其它细胞物质或培养基，或者当化学合成时基本上不含化学前体或其它化学物质。
可以使用标准分子生物学技术和本申请描述的数据库记录中的序列信息分离本发明的生物标志物核酸分子。藉由此类核酸序列的全部或一部分，可以使用标准杂交和克隆技术分离本发明的核酸分子(例如，如Sambrook等人编,Molecular Cloning：ALaboratory Manual,第2版,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold SpringHarbor,NY,1989中所述)。
可以使用cDNA、mRNA或基因组DNA作为模板和根据标准PCR扩增技术的合适的寡核苷酸引物扩增本发明的核酸分子。如此扩增的核酸分子可以克隆到合适的载体中并通过DNA序列分析进行表征。此外，对应于本发明核酸分子的全部或一部分的寡核苷酸可以通过标准合成技术制备，例如使用自动化DNA合成仪。
此外，本发明的核酸分子可仅包含核酸序列的一部分，其中全长核酸序列包含本发明的标志物或其编码对应于本发明标志物的多肽。此类核酸分子可用作例如探针或引物。探针/引物通常作为一种或多种基本上纯化的寡核苷酸使用。寡核苷酸通常包含在严格条件下与生物标志物核酸序列的至少约7个，优选约15个，更优选约25、50、75、100、125、150、175、200、250、300、350或400或更多个连续核苷酸杂交的核苷酸序列区域。基于所述生物标志物核酸分子的序列的探针可用于检测对应于本发明的一种或多种标志物的转录物或基因组序列。探针包含与其连接的标记基团，例如放射性同位素、荧光化合物、酶或酶辅因子。
还考虑了生物标志物核酸分子，其由于遗传密码的简并性而不同于编码对应于生物标志物的蛋白质的核酸分子的核苷酸序列，因此编码相同的蛋白质。
此外，本领域技术人员应理解，导致氨基酸序列变化的DNA序列多态性可存在于群体(例如人群)中。由于天然等位基因变异，这种遗传多态性可存在于群体内的个体之间。等位基因是在给定遗传基因座上交替出现的一组基因之一。此外，应当理解，还可以存在影响RNA表达水平的DNA多态性，其可以影响该基因的总体表达水平(例如，通过影响调节或降解)。
本申请中可与“等位基因变体”互换使用的术语“等位基因”是指基因或其部分的替代形式。等位基因在同源染色体上占据相同的基因座或位置。当个体具有一个基因的两个相同等位基因时，所述个体被认为是所述基因或等位基因的纯合子。当个体具有一个基因的两个不同等位基因时，所述个体被认为是所述基因或等位基因的杂合子。例如，生物标志物等位基因可以在单个核苷酸或几个核苷酸中彼此不同，并且可以包括核苷酸的取代、缺失和插入。基因的等位基因也可以是含有一个或多个突变的基因的形式。
本申请可互换使用的术语“基因多态性区域的等位基因变体”或“等位基因变体”是指基因的替代形式，其具有在群体中该基因的该区域中发现的几种可能的核苷酸序列之一。如本申请所用，等位基因变体意指包括功能性等位基因变体、非功能性等位基因变体、SNP、突变和多态性。
术语“单核苷酸多态性”(SNP)是指由单个核苷酸占据的多态性位点，其是等位基因序列之间的变异位点。所述位点通常在等位基因的高度保守序列(例如，在群体的小于1/100或1/1000成员中变化的序列)之前和之后。SNP通常由于在多态性位点用一个核苷酸替换另一个核苷酸而产生。SNP还可以源自相对于参考等位基因的核苷酸的缺失或核苷酸的插入。通常，多态性位点被参考碱基以外的碱基占据。例如，当参考等位基因在多态性位点含有碱基“T”(胸苷)时，改变的等位基因可以在多态性位点含有“C”(胞苷)、“G”(鸟嘌呤)或“A”(腺嘌呤)。SNP可以在蛋白质编码核酸序列中发生，在这种情况下它们可能产生缺陷或其他变异的蛋白质或遗传疾病。这样的SNP可以改变基因的编码序列，因此指定另一种氨基酸(“错义”SNP)或SNP可以引入终止密码子(“无义”SNP)。当SNP不改变蛋白质的氨基酸序列时，该SNP被称为“沉默”。SNP也可以在核苷酸序列的非编码区中发生。这可能导致蛋白质表达缺陷，例如由于替代性剪接，或者它可能对蛋白质的功能没有影响。
如本申请所用，术语“基因”和“重组基因”是指包含编码对应于本发明标志物的多肽的开放阅读框的核酸分子。这种天然等位基因变异通常可导致给定基因的核苷酸序列中1-5％的变异。可以通过在许多不同个体中测序感兴趣的基因来鉴定替代等位基因。这可以通过使用杂交探针在多种个体中鉴定相同的遗传基因座而容易地进行。任何和所有这样的核苷酸变异和由天然等位基因变异引起的并且不改变功能活性的所得氨基酸多态性或变异都在本发明的范围内。
在另一个实施方式中，生物标志物核酸分子为至少7、15、20、25、30、40、60、80、100、150、200、250、300、350、400、450、550、650、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900、2000、2200、2400、2600、2800、3000、3500、4000、4500或更多个核苷酸长，并且在严格条件下与对应于本发明标志物的核酸分子或编码对应于本发明标志物的蛋白质的核酸分子杂交。如本申请所用，术语“在严格条件下杂交”旨在描述杂交和洗涤的条件，在所述条件下彼此至少60％(65％、70％、75％、80％，优选85％)相同的核苷酸序列通常保持彼此杂交。这种严格条件是本领域技术人员已知的，可以在Current Protocolsin Molecular Biology,John Wiley&Sons,N.Y.(1989)的6.3.1-6.3.6节中找到。严格杂交条件的优选的非限制性实例是在约45℃下在6×氯化钠/柠檬酸钠(SSC)中杂交，然后在50-65℃下在0.2×SSC，0.1％SDS中洗涤一次或多次。
除了可以存在于群体中的本发明核酸分子的天然存在的等位基因变体之外，本领域技术人员将进一步理解，可以通过突变引入序列改变，从而导致编码蛋白质的氨基酸序列的改变，而不改变由其编码的蛋白质的生物活性。例如，可以进行核苷酸取代，导致“非必需”氨基酸残基处的氨基酸取代。“非必需”氨基酸残基是可以从野生型序列改变而来而不改变生物活性的残基，而“必需”氨基酸残基是生物活性所需要的。例如，在各种物种的同源物中不保守或仅半保守的氨基酸残基可能对活性不是必需的，因此可能是改变的目标。或者，在各种物种(例如鼠和人)的同源物中保守的氨基酸残基可能对活性是必需的，因此可能不是改变的目标。
因此，本发明的另一方面涉及编码本发明多肽的核酸分子，其含有对活性不是必需的氨基酸残基的变化。这些多肽的氨基酸序列与对应于本发明标志物的天然存在的蛋白质的氨基酸序列不同，但仍保留生物活性。在一个实施方式中，生物标志物蛋白具有与本申请所述的生物标志物蛋白的氨基酸序列至少约40％相同，50％、60％、70％、75％、80％、83％、85％、87.5％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或相同的氨基酸序列。
编码变体蛋白的分离的核酸分子可以通过将一个或多个核苷酸取代、添加或缺失引入本发明核酸的核苷酸序列中来产生，使得一个或多个氨基酸残基的取代、添加或缺失被引入编码的蛋白质中。可以通过标准技术引入突变，例如定点诱变和PCR介导的诱变。优选地，在一个或多个预测的非必需氨基酸残基处进行保守氨基酸取代。“保守氨基酸取代”是其中氨基酸残基被具有相似侧链的氨基酸残基取代的氨基酸取代。本领域已经定义了具有相似侧链的氨基酸残基家族。这些家族包括具有碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性侧链(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β-分支侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸。或者，可以沿着全部或部分编码序列随机引入突变，例如通过饱和诱变，并且可以筛选所得突变体的生物活性以鉴定保留活性的突变体。诱变后，可以重组表达编码的蛋白质，并可以确定蛋白质的活性。
在一些实施方式中，本发明进一步考虑使用抗生物标志物反义核酸分子，即与本发明的有义核酸互补的分子，例如与对应于本发明标志物的双链cDNA分子的编码链互补或与对应于本发明标志物的mRNA序列互补。因此，本发明的反义核酸分子可以与本发明的有义核酸形成氢键(即与其退火)。反义核酸可以与整个编码链互补，或仅与其一部分互补，例如全部或部分蛋白质编码区(或开放阅读框)。反义核酸分子也可以与编码本发明多肽的核苷酸序列的编码链的全部或部分非编码区反义。非编码区(“5'和3'非翻译区”)是5'和3'序列，其位于编码区的侧翼并且不翻译成氨基酸。
反义寡核苷酸的长度可以是例如约5、10、15、20、25、30、35、40、45或50或更多个核苷酸。可以使用本领域已知的程序使用化学合成和酶促连接反应构建反义核酸。例如，反义核酸(例如，反义寡核苷酸)可以使用天然存在的核苷酸或各种修饰的核苷酸化学合成，所述修饰的核苷酸被设计成增加分子的生物稳定性或增加反义和有义核酸之间形成的双链体的物理稳定性，例如可以使用硫代磷酸酯衍生物和吖啶取代的核苷酸。可用于产生反义核酸的修饰的核苷酸的实例包括5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤、4-乙酰胞嘧啶、5-(羧基羟甲基)尿嘧啶、5-羧甲基氨基甲基-2-硫尿苷、5-羧甲基氨基甲基尿嘧啶、二氢尿嘧啶、β-D-半乳糖Q核苷、肌苷、N6-异戊烯基腺嘌呤、1-甲基鸟嘌呤、1-甲基肌苷、2,2-二甲基鸟嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鸟嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N6-腺嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、5-甲基氨基甲基尿嘧啶、5-甲氧基氨基甲基-2-硫尿嘧啶、β-D-甘露糖Q核苷、5'-甲氧基羧甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲硫基-N6-异戊烯基腺嘌呤、尿嘧啶-5-氧基乙酸(v)、Y丁氧苷(wybutoxosine)、假尿嘧啶、Q核苷、2-硫胞嘧啶、5-甲基-2-硫尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、尿嘧啶-5-氧基乙酸甲酯、尿嘧啶-5-氧基乙酸(v)、5-甲基-2-硫尿嘧啶、3-(3-氨基-3-N-2-羧丙基)尿嘧啶、(acp3)w和2,6-二氨基嘌呤。或者，可以使用核酸已经以反义方向(即，从插入的核酸转录的RNA将具有与感兴趣的靶核酸的反义方向，在下面的小节中进一步描述)亚克隆到其中的表达载体以生物学方式产生反义核酸。
本发明的反义核酸分子通常施用于个体或原位产生，使得它们与编码对应于本发明的选定标志物的多肽的细胞mRNA和/或基因组DNA杂交或结合，从而例如通过抑制转录和/或翻译来抑制标志物表达。杂交可以通过常规核苷酸互补性形成稳定的双链体，或者例如，反义核酸分子通过双螺旋的大沟中的特异性相互作用结合DNA双链体。本发明的反义核酸分子的施用途径的实例包括在组织部位直接注射或将反义核酸注入血液或骨髓相关的体液中。或者，可以修饰反义核酸分子以靶向选定的细胞，然后全身施用。例如，对于全身给药，可以修饰反义分子，使得它们特异性结合选定细胞表面上表达的受体或抗原，例如通过将反义核酸分子连接到与细胞表面受体或抗原结合的肽或抗体。也可以使用本申请描述的载体将反义核酸分子递送至细胞。为了获得足够的细胞内反义分子浓度，优选将反义核酸分子置于强pol II或pol III启动子控制下的载体构建体中。
本发明的反义核酸分子可以是α-异头核酸分子。α-异头核酸分子与互补RNA形成特异性双链杂交体，其中与通常的α-单元相反，链彼此平行(Gaultier等人,1987,NucleicAcids Res.15：6625-6641)。反义核酸分子还可以包含2'-o-甲基核糖核苷酸(Inoue等人,1987,Nucleic Acids Res.15：6131-6148)或嵌合RNA-DNA类似物(Inoue等人,1987,FEBSLett.215：327-330)。
本发明还涵盖核酶。核酶是具有核糖核酸酶活性的催化性RNA分子，其能够切割与其具有互补区的单链核酸，例如mRNA。因此，核酶(例如，如Haselhoff和Gerlach,1988,Nature 334：585-591中所述的锤头状核酶)可用于催化切割mRNA转录物，从而抑制由mRNA编码的蛋白质的翻译。可以基于对应于标志物的cDNA的核苷酸序列设计对编码对应于本发明标志物的多肽的核酸分子具有特异性的核酶。例如，可以构建四膜虫L-19IVSRNA的衍生物，其中活性位点的核苷酸序列与待切割的核苷酸序列互补(参见Cech等人美国专利第4,987,071号；和Cech等人美国专利第5,116,742号)。或者，编码本发明多肽的mRNA可用于从RNA分子库中选择出具有特异性核糖核酸酶活性的催化性RNA(参见例如，Bartel和Szostak,1993,Science 261：1411-1418)。
本发明还涵盖形成三螺旋结构的核酸分子。例如，可以通过靶向与编码多肽的基因的调节区(例如，启动子和/或增强子)互补的核苷酸序列来抑制生物标志物蛋白的表达，以形成防止基因在靶细胞中转录的三螺旋结构。一般参见Helene(1991)Anticancer DrugDes.6(6)：569-84；Helene(1992)Ann.N.Y.Acad.Sci.660：27-36；和Maher(1992)Bioassays14(12)：807-15。
在各种实施方式中，可以在碱基部分、糖基部分或磷酸骨架上修饰本发明的核酸分子，以改善例如分子的稳定性、杂交或溶解性。例如，可以修饰核酸分子的脱氧核糖磷酸主链以产生肽核酸分子(参见Hyrup等人,1996,Bioorganic&Medicinal Chemistry 4(1)：5-23)。如本申请所用，术语“肽核酸”或“PNA”是指核酸模拟物，例如DNA模拟物，其中脱氧核糖磷酸骨架被伪肽骨架取代，并且仅保留了四个天然核碱基。已经显示，PNA的中性骨架允许在低离子强度条件下与DNA和RNA特异性杂交。PNA寡聚体的合成可以使用如Hyrup等人(1996),见上文；Perry-O'Keefe等人(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93：14670-675描述的标准固相肽合成方案进行。
PNA可用于治疗和诊断应用中。例如，PNA可用作反义或反基因药剂，用于通过例如诱导转录或翻译停滞或抑制复制来进行基因表达的序列特异性调节。PNA也可用于例如通过例如PNA指导的PCR钳夹分析基因中的单碱基对突变；当与其它酶(例如S1核酸酶)组合使用时，用作人工限制酶(Hyrup(1996),见上文)；或用作DNA序列和杂交的探针或引物(Hyrup,1996,见上文；Perry-O'Keefe等人,1996,Proc.Natl.Acad.Sci.USA93：14670-675)。
在另一个实施方式中，可以修饰PNA例如以增强其稳定性或细胞摄取。所述修饰通过将亲脂性或其它辅助基团连接至PNA，通过形成PNA-DNA嵌合体，或通过使用脂质体或本领域中已知的其它药物递送技术。例如，可以产生PNA-DNA嵌合体，其可以结合PNA和DNA的有利特性。这种嵌合体允许DNA识别酶(例如RNASE H和DNA聚合酶)与DNA部分相互作用，而PNA部分将提供高结合亲和力和特异性。可以使用在碱基堆积、核碱基之间的键数和取向方面选择的适当长度的接头连接PNA-DNA嵌合体(Hyrup,1996,见上文)。PNA-DNA嵌合体的合成可如Hyrup(1996),见上文和Finn等人(1996)Nucleic Acids Res.24(17)：3357-63所述进行。例如，可以使用标准亚磷酰胺偶联化学和修饰的核苷类似物在固体支持物上合成DNA链。例如5'-(4-甲氧基三苯甲基)氨基-5'-脱氧-胸苷亚磷酰胺的化合物可用作PNA和DNA的5'端之间的连接(Mag等人,1989,Nucleic Acids Res.17：5973-88)。然后以逐步方式偶联PNA单体以产生具有5'PNA区段和3'DNA区段的嵌合分子(Finn等人,1996,Nucleic AcidsRes.24(17)：3357-63)。或者，可以用5'DNA区段和3'PNA区段合成嵌合分子(Peterser等人,1975,Bioorganic Med.Chem.Lett.5：1119-11124)。
在其它实施方式中，寡核苷酸可以包括其它附加的基团，例如肽(例如，用于体内靶向宿主细胞受体)，或促进跨细胞膜转运的药剂(参见例如，Letsinger等人,1989,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：6553-6556；Lemaitre等人,1987,Proc.Natl.Acad.Sci.USA84：648-652；PCT公开号WO 88/09810)或血脑屏障(参见例如，PCT公开号WO 89/10134)。另外，寡核苷酸可以用杂交触发的切割剂(参见例如，Krol等人,1988,Bio/Techniques 6：958-976)或插入剂(参见例如，Zon,1988,Pharm.Res.5：539-549)修饰。为此，寡核苷酸可以与另一分子缀合，例如肽、杂交触发的交联剂、转运剂、杂交触发的裂解剂等。
本发明的另一方面涉及生物标志物蛋白及其生物活性部分的用途。在一个实施方式中，可以使用标准蛋白质纯化技术通过适当的纯化方案从细胞或组织来源分离对应于标志物的天然多肽。在另一个实施方式中，通过重组DNA技术产生对应于本发明标志物的多肽。作为重组表达的替代，可以使用标准肽合成技术化学合成对应于本发明标志物的多肽。
“分离的”或“纯化的”蛋白质或其生物活性部分基本上不含来自获得蛋白质的细胞或组织来源的细胞物质或其它污染蛋白质，或化学合成时基本上不含化学前体或其它化学物质。措辞“基本上不含细胞物质”包括蛋白质制剂，其中蛋白质与从中分离或重组产生蛋白质的细胞的细胞组分分离。因此，基本上不含细胞物质的蛋白质包括具有少于约30％、20％、10％或5％(干重)异源蛋白质(在本申请中也称为“污染蛋白质”)的蛋白质制剂。当重组产生蛋白质或其生物活性部分时，它也优选地基本上不含培养基，即培养基占蛋白质制剂体积的小于约20％、10％或5％。当通过化学合成产生蛋白质时，它优选地基本上不含化学前体或其它化学物质，即，它与参与蛋白质合成的化学前体或其它化学物质分离。因此，这种蛋白质制剂具有少于约30％、20％、10％、5％(干重)的化学前体或除感兴趣的多肽之外的化合物。
生物标志物多肽的生物活性部分包括含有与本申请所述的生物标志物蛋白氨基酸序列充分相同或由此衍生的氨基酸序列的多肽，但其包含比全长蛋白质更少的氨基酸，并且表现出相应于全长蛋白质的至少一种活性。通常，生物活性部分包含具有相应蛋白质的至少一种活性的结构域或基序。本发明的蛋白质的生物活性部分可以是例如长度为10、25、50、100或更多个氨基酸的多肽。此外，其它生物活性部分(其中蛋白质的其它区域缺失)可以通过重组技术制备，并就本发明的多肽的天然形式的一种或多种功能活性被评估。
优选的多肽具有由本申请所述的核酸分子编码的生物标志物蛋白的氨基酸序列。其它有用的蛋白质与这些序列之一基本上相同(例如，至少约40％，优选50％、60％、70％、75％、80％、83％、85％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)，并保留相应天然存在的蛋白质的蛋白质的功能活性，但由于天然的等位基因变异或诱变而氨基酸序列不同。
为了确定两个氨基酸序列或两个核酸的百分比同一性，将序列进行比对以用于最佳比较目的(例如，可以在第一氨基酸或核酸序列的序列中引入空位以与第二氨基或核酸序列最佳比对)。然后比较相应氨基酸位置或核苷酸位置的氨基酸残基或核苷酸。当第一序列中的位置被与第二序列中相应位置的相同氨基酸残基或核苷酸占据时，则所述分子在该位置是相同的。两个序列之间的百分比同一性是序列共有的相同位置数的函数(即，％同一性＝相同位置的数量/位置(例如，重叠位置)总数×100)。在一个实施方式中，两个序列长度相同。
可以使用数学算法来确定两个序列之间的百分比同一性。用于比较两个序列的数学算法的优选的非限制性实例是Karlin和Altschul(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA87：2264-2268的算法，如Karlin和Altschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：5873-5877中所修改。这种算法被并入Altschul等人,(1990)J.Mol.Biol.215：403-410的NBLAST和XBLAST程序中。可以用NBLAST程序进行BLAST核苷酸搜索，得分＝100，字长＝12，以获得与本发明的核酸分子同源的核苷酸序列。可以用XBLAST程序进行BLAST蛋白质搜索，得分＝50，字长＝3，以获得与本发明的蛋白质分子同源的氨基酸序列。为了获得用于比较目的的空位比对，可以如Altschul等人(1997)Nucleic Acids Res.25：3389-3402所述利用空位BLAST(Gapped BLAST)。或者，PSI-Blast可用于执行迭代搜索，其检测分子之间的远距离关系。当使用BLAST、空位BLAST和PSI-Blast程序时，可以使用各个程序(例如，XBLAST和NBLAST)的默认参数。参见http：//www.ncbi.nlm.nih.gov。用于比较序列的数学算法的另一个优选的非限制性实例是Myers和Miller,(1988)Comput Appl Biosci,4：11-7的算法。这种算法被合并到ALIGN程序(版本2.0)中，所述程序是GCG序列比对软件包的一部分。当利用ALIGN程序比较氨基酸序列时，可以使用PAM120权重残基表，空位长度罚分为12，空位罚分为4。用于鉴定局部序列相似性和比对区域的另一种有用算法是如Pearson和Lipman(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：2444-2448中所述的FASTA算法。当使用FASTA算法比较核苷酸或氨基酸序列时，PAM120权重残基表可以例如与k元组值2一起使用。两个序列之间的同一性百分比可以在允许或不允许空位的情况下使用与上述类似的技术确定。在计算百分比同一性时，仅计数精确匹配。
本发明还提供了对应于生物标志物蛋白的嵌合或融合蛋白。如本申请所用，“嵌合蛋白”或“融合蛋白”包含与异源多肽(即，除对应于标志物的多肽以外的多肽)可操作地连接的对应于本发明标志物的多肽的全部或部分(优选生物活性部分)。在融合蛋白内，术语“可操作地连接”旨在表示本发明的多肽和异源多肽彼此框内融合。异源多肽可以与本发明的多肽的氨基末端或羧基末端融合。
一种有用的融合蛋白是GST融合蛋白，其中对应于本发明标志物的多肽与GST序列的羧基末端融合。此类融合蛋白可以促进纯化本发明的重组多肽。
在另一个实施方式中，融合蛋白含有异源的信号序列、免疫球蛋白融合蛋白、毒素或其它有用的蛋白质序列。本发明的嵌合和融合蛋白可通过标准重组DNA技术产生。在另一个实施方式中，融合基因可以通过常规技术合成，包括自动化DNA合成仪。或者，可以使用锚定引物进行基因片段的PCR扩增，所述锚定引物在两个连续基因片段之间产生互补突出端，其随后可以退火并重新扩增以产生嵌合基因序列(参见例如，Ausubel等人,见上文)。此外，许多表达载体是可商购的，其已经编码融合部分(例如，GST多肽)。可以将编码本发明多肽的核酸克隆到这样的表达载体中，使得融合部分与本发明的多肽框内连接。
信号序列可用于促进分泌蛋白或其它感兴趣的蛋白的分泌和分离。信号序列通常以疏水性氨基酸的核心为特征，所述疏水性氨基酸核心通常在一个或多个切割事件的分泌期间从成熟蛋白质中切割。此类信号肽含有加工位点，当它们通过分泌途径时，所述加工位点允许信号序列从成熟蛋白质中切割。因此，本发明涉及所述具有信号序列的多肽，以及信号序列已被蛋白水解切割的多肽(即切割产物)。在一个实施方式中，编码信号序列的核酸序列可以在表达载体中与感兴趣的蛋白质(例如通常不分泌或难以分离的蛋白质)可操作地连接。信号序列指导蛋白质例如从转化表达载体的真核宿主中分泌，并且所述信号序列随后或同时被切割。然后可以通过本领域公认的方法从细胞外培养基中容易地纯化该蛋白质。或者，可以使用促进纯化的序列(例如具有GST结构域)将信号序列与感兴趣的蛋白质连接。
本发明还涉及本申请所述的生物标志物多肽的变体。这些变体具有改变的氨基酸序列，其可以作为激动剂(模拟物)或作为拮抗剂起作用。变体可以通过诱变产生，例如离散点突变或截短。激动剂可以保留与天然存在形式的蛋白质基本上相同或其子集的生物活性。蛋白质的拮抗剂可以通过例如竞争性结合包含感兴趣的蛋白质的细胞信号级联的下游或上游成员来抑制天然存在形式的蛋白质的一种或多种活性。因此，可以通过用有限功能的变体治疗引发特定的生物学效应。相对于用天然存在形式的蛋白质的治疗，用具有天然存在形式的蛋白质的生物活性的子集的变体来治疗个体可以在个体中产生较少的副作用。
可以通过针对激动剂或拮抗剂活性筛选本发明蛋白质的突变体(例如截短突变体)的组合文库，以此鉴定充当激动剂(模拟物)或拮抗剂的生物标志物蛋白的变体。在一个实施方式中，通过核酸水平的组合诱变产生多样化的变体文库，并由多样化的基因文库编码。可以通过例如将合成的寡核苷酸的混合物酶促连接到基因序列中来产生多样化的变体文库，使得简并的潜在蛋白质序列组可以作为单独的多肽表达，或者作为一组较大的融合蛋白表达(例如，用于噬菌体展示)。有多种方法可用于从简并寡核苷酸序列产生本发明的多肽的潜在变体文库。合成简并寡核苷酸的方法是本领域已知的(参见例如，Narang,1983,Tetrahedron 39：3；Itakura等人,1984,Annu.Rev.Biochem.53：323；Itakura等人,1984,Science198：1056；Ike等人,1983Nucleic Acid Res.11：477)。
另外，对应于本发明标志物的多肽编码序列的片段文库可用于产生多样化的多肽群，用于筛选和随后的选择变体。例如，可以通过在一定条件下用核酸酶处理感兴趣的编码序列的双链PCR片段来产生编码序列片段的文库，其中每个分子仅发生一次切口，使双链DNA变性，使DNA复原以形成双链DNA，其可以包括来自不同切口产物的有义/反义对，通过用S1核酸酶处理从重组双链体中除去单链部分，并将得到的片段文库连接到表达载体中。通过这种方法，可以衍生出表达文库，其编码各种大小的感兴趣的蛋白质的氨基末端和内部片段。
本领域已知几种技术用于筛选通过点突变或截短产生的组合文库的基因产物，并用于筛选具有所选性质的基因产物的cDNA文库。适用于高通量分析的用于筛选大基因文库的最广泛使用的技术通常包括将基因文库克隆到可复制的表达载体中，用所得的载体文库转化合适的细胞，并在一定条件下表达组合基因，其中检测期望的活性有助于分离编码检测到其产物的基因的载体。递归整体诱变(REM)是一种增强文库中功能性突变体频率的技术，可以与筛选分析组合使用以鉴定本发明蛋白质的变体(Arkin和Yourvan,1992,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：7811-7815；Delgrave等人,1993,Protein Engineering 6(3)：327-331)。
通过使用标准重组技术可以促进本申请所述的生物标志物核酸和/或生物标志物多肽分子的生产和使用。在一些实施方式中，此类技术使用载体，优选表达载体，其含有编码生物标志物多肽或这种多肽的一部分的核酸。如本申请所用，术语“载体”是指能够转运与其连接的另一种核酸的核酸分子。一种类型的载体是“质粒”，其是指环状双链DNA环，其中可以连接额外的DNA区段。另一种类型的载体是病毒载体，其中额外的DNA区段可以连接到病毒基因组中。某些载体能够在引入它们的宿主细胞中自主复制(例如，具有细菌复制起点的细菌载体和附加型哺乳动物载体)。其它载体(例如，非附加型哺乳动物载体)在引入宿主细胞后被整合到宿主细胞的基因组中，从而与宿主基因组一起复制。此外，某些载体，即表达载体，能够指导它们可操作地连接的基因的表达。通常，在重组DNA技术中有用的表达载体通常是质粒(载体)的形式。然而，本发明旨在包括这些其它形式的具有相同功能的表达载体，例如病毒载体(例如，复制缺陷型逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒)。
本发明的重组表达载体包含本发明的核酸，其呈适于在宿主细胞中表达的形式。这意味着重组表达载体包括一种或多种调节序列，其基于待用于表达的宿主细胞选择，与待表达的核酸序列可操作地连接。在重组表达载体内，“可操作地连接”意指感兴趣的核苷酸序列以允许核苷酸序列表达的方式与调节序列连接(例如，在体外转录/翻译系统中或当载体被引入宿主细胞时在宿主细胞中)。术语“调节序列”旨在包括启动子、增强子和其它表达控制元件(例如，多腺苷酸化信号)。此类调节序列描述于例如Goeddel,Methods inEnzymology：Gene Expression Technology第185卷,Academic Press,San Diego,CA(1991)中。调节序列包括在许多类型的宿主细胞中指导核苷酸序列组成型表达的调节序列和仅在某些宿主细胞中指导核苷酸序列表达的调节序列(例如，组织特异性调节序列)。本领域技术人员应理解，表达载体的设计可取决于例如待转化的宿主细胞的选择、所需蛋白质的表达水平等因素。可以将本发明的表达载体引入宿主细胞中，从而产生由本申请所述的核酸编码的蛋白质或肽，包括融合蛋白或肽。
用于本发明的重组表达载体可以设计用于在原核(例如，大肠杆菌)或真核细胞(例如，昆虫细胞{使用杆状病毒表达载体}、酵母细胞或哺乳动物细胞)中表达对应于本发明标志物的多肽。合适的宿主细胞在Goeddel(见上文)中进一步讨论。或者，重组表达载体可以在体外转录和翻译，例如使用T7启动子调节序列和T7聚合酶。
蛋白质在原核生物中的表达最常在大肠杆菌中用含有组成型或诱导型启动子的载体进行，所述启动子指导融合蛋白或非融合蛋白的表达。融合载体向其编码的蛋白质添加许多氨基酸，通常添加到重组蛋白质的氨基末端。此类融合载体通常用于三个目的：1)增加重组蛋白的表达；2)增加重组蛋白的溶解度；和3)通过在亲和纯化中充当配体来帮助纯化重组蛋白。通常，在融合表达载体中，在融合部分和重组蛋白的连接处引入蛋白水解切割位点，以使融合蛋白纯化后重组蛋白与融合部分分离。这些酶及其同源识别序列包括因子Xa、凝血酶和肠激酶。典型的融合表达载体包括pGEX(Pharmacia Biotech Inc；Smith和Johnson,1988,Gene 67：31-40)、pMAL(New England Biolabs,Beverly,MA)和pRIT5(Pharmacia,Piscataway,NJ)，其将谷胱甘肽S-转移酶(GST)、麦芽糖E结合蛋白或蛋白质A分别与靶重组蛋白融合。
合适的诱导型非融合大肠杆菌表达载体的实例包括pTrc(Amann等人,1988,Gene69：301-315)和pET 11d(Studier等人,第60-89页,In Gene Expression Technology：Methods in Enzymology第185卷,Academic Press,San Diego,CA,1991)。来自pTrc载体的靶生物标志物核酸表达依赖于来自杂合trp-lac融合启动子的宿主RNA聚合酶转录。来自pET 11d载体的靶生物标志物核酸的表达依赖于由共表达的病毒RNA聚合酶(T7gn1)介导的来自T7gn10-lac融合启动子的转录。这种病毒聚合酶由宿主菌株BL21(DE3)或HMS174(DE3)提供，其来自含有lacUV 5启动子转录控制下的T7gn1基因的常驻原噬菌体。
在大肠杆菌中最大化重组蛋白表达的一种策略是在蛋白水解切割重组蛋白的能力受损的宿主细菌中表达蛋白质(Gottesman,第119-128页,In Gene ExpressionTechnology：Methods in Enzymology第185卷,Academic Press,San Diego,CA,1990。另一种策略是改变待插入表达载体的核酸的核酸序列，使得每个氨基酸的单个密码子是优先用于大肠杆菌的那些密码子(Wada等人,1992,Nucleic Acids Res.20：2111-2118)。本发明的核酸序列的这种改变可以通过标准DNA合成技术进行。
在另一个实施方式中，表达载体是酵母表达载体。用于在酵母(酿酒酵母)中表达的载体的实例包括pYepSec1(Baldari等人,1987,EMBO J.6：229-234)、pMFa(Kurjan和Herskowitz,1982,Cell 30：933-943)、pJRY88(Schultz等人,1987,Gene 54：113-123)、pYES2(Invitrogen Corporation,San Diego,CA)和pPicZ(Invitrogen Corp,San Diego,CA)。
或者，表达载体是杆状病毒表达载体。可用于在培养的昆虫细胞(例如，Sf 9细胞)中表达蛋白质的杆状病毒载体包括pAc系列(Smith等人,1983,Mol.Cell Biol.3：2156-2165)和pVL系列(Lucklow和Summers,1989,Virology 170：31-39)。
在另一个实施方式中，使用哺乳动物表达载体在哺乳动物细胞中表达本发明的核酸。哺乳动物表达载体的实例包括pCDM8(Seed,1987,Nature 329：840)和pMT2PC(Kaufman等人,1987,EMBO J.6：187-195)。当在哺乳动物细胞中使用时，表达载体的控制功能通常由病毒调节元件提供。例如，常用的启动子衍生自多瘤病毒、腺病毒2、巨细胞病毒和猿猴病毒40。对于原核细胞和真核细胞的其它合适的表达系统，参见Sambrook等人，见上文的第16和17章。
在另一个实施方式中，重组哺乳动物表达载体能够优先指导核酸在特定细胞类型中的表达(例如，组织特异性调节元件用于表达核酸)。组织特异性调节元件是本领域已知的。合适的组织特异性启动子的非限制性实例包括白蛋白启动子(肝特异性；Pinkert等人,1987,Genes Dev.1：268-277)；淋巴特异性启动子(Calame和Eaton,1988,Adv.Immunol.43：235-275)，特别是T细胞受体的启动子(Winoto和Baltimore,1989,EMBO J.8：729-733)和免疫球蛋白启动子(Banerji等人,1983,Cell 33：729-740；Queen和Baltimore,1983,Cell33：741-748)；神经元特异性启动子(例如，神经细丝启动子；Byrne和Ruddle,1989,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：5473-5477)；胰腺特异性启动子(Edlund等人,1985,Science230：912-916)和乳腺特异性启动子(例如，乳清启动子；美国专利号4,873,316和欧洲申请公开号264,166)。还涵盖发育调节的启动子，例如鼠hox启动子(Kessel和Gruss,1990,Science 249：374-379)和α-胎蛋白启动子(Camper和Tilghman,1989,Genes Dev.3：537-546)。
本发明进一步提供了重组表达载体，其包含以反义方向克隆到表达载体中的DNA分子。也就是说，DNA分子以允许表达(通过DNA分子的转录)RNA分子的方式与调节序列可操作地连接，所述RNA分子与编码本发明多肽的mRNA反义。可选择与以反义方向克隆的核酸可操作地连接的调节序列，其指导反义RNA分子在多种细胞类型中的连续表达，例如病毒启动子和/或增强子，或可选择指导反义RNA的组成型、组织特异性或细胞类型特异性表达的调节序列。反义表达载体可以是重组质粒、噬菌粒或减毒病毒的形式，其中反义核酸在高效调节区的控制下产生，其活性可由引入载体的细胞类型决定。关于使用反义基因调节基因表达的讨论(参见Weintraub等人,1986,Trends in Genetics,第1(1)卷)。
本发明的另一方面涉及引入了本发明的重组表达载体的宿主细胞。术语“宿主细胞”和“重组宿主细胞”在本申请中可互换使用。应理解，这些术语不仅指特定的受试细胞，还指这种细胞的后代或潜在后代。因为某些修饰可能由于突变或环境影响而在后代中发生，所以这些后代事实上可能与亲本细胞不同，但仍包括在本申请所用术语的范围内。
宿主细胞可以是任何原核(例如大肠杆菌)或真核细胞(例如昆虫细胞、酵母或哺乳动物细胞)。
可以通过常规转化或转染技术将载体DNA引入原核或真核细胞中。如本申请所用，术语“转化”和“转染”意指多种本领域公认的用于将外源核酸引入宿主细胞的技术，包括磷酸钙或氯化钙共沉淀、DEAE-葡聚糖介导的转染、脂质转染或电穿孔。用于转化或转染宿主细胞的合适方法可以在Sambrook等人(见上文)和其它实验室手册中找到。
对于稳定转染哺乳动物细胞，已知，取决于所用的表达载体和转染技术，只有一小部分细胞可以将外源DNA整合到它们的基因组中。为了鉴定和选择这些整合体，通常将编码可选标记(例如抗生素抗性)的基因与感兴趣的基因一起引入宿主细胞。优选的可选标记包括赋予药物抗性的标记，例如G418、潮霉素和甲氨蝶呤。用引入的核酸稳定转染的细胞可以通过药物选择来鉴定(例如，掺入可选标记基因的细胞将存活，而其它细胞死亡)。5.分析生物标志物核酸和多肽
对于本申请所述的任何方法，可以根据本申请所述的方法和本领域技术人员已知的技术分析生物标志物核酸和/或生物标志物多肽，以鉴定可用于本发明的此类遗传或表达的改变，包括但不限于1)生物标志物转录物或多肽水平的改变，2)来自生物标志物基因的一个或多个核苷酸的缺失或添加，4)生物标志物基因的一个或多个核苷酸的取代，5)生物标志物基因的异常修饰，例如表达调节区等。
a.检测生物标志物拷贝数的方法
评估生物标志物核酸的拷贝数的方法是本领域技术人员熟知的。可以简单地通过确定本申请鉴定的区域或标志物的拷贝数来评估染色体获得或缺失的存在或不存在。
在一个实施方式中，测试生物样品中含有基因组标志物的基因组基因座中拷贝数变化的存在。拷贝数至少为3、4、5、6、7、8、9或10预示着PI3K/mTOR组合抑制剂治疗的较差结果。
评估生物标志物基因座的拷贝数的方法包括但不限于基于杂交的分析。基于杂交的分析包括但不限于传统的“直接探针”方法，例如Southern印迹、原位杂交(例如，FISH和FISH加SKY)方法，和“比较探针”(comparative probe)方法，例如比较基因组杂交(CGH)，例如基于cDNA或基于寡核苷酸的CGH。所述方法可以多种形式使用，包括但不限于基质(例如膜或玻璃)结合方法或基于阵列的方法。
在一个实施方式中，评估样品中的生物标志物基因拷贝数涉及Southern印迹。在Southern印迹中，基因组DNA(通常在电泳凝胶上片段化并分离)与对靶区域具有特异性的探针杂交。来自针对靶区域的探针的杂交信号强度与来自正常基因组DNA分析(例如，相同或相关细胞、组织、器官等的非扩增部分)的对照探针信号强度的比较提供了靶核酸的相对拷贝数的估计值。或者，可以使用Northern印迹来评估样品中编码核酸的拷贝数。在Northern印迹中，mRNA与对靶区域具有特异性的探针杂交。来自针对靶区域的探针的杂交信号强度与来自正常RNA分析(例如，相同或相关细胞、组织、器官等的非扩增部分)的对照探针信号强度的比较提供了靶核酸的相对拷贝数的估计值。或者，可以使用本领域众所周知的用于检测RNA的其它方法，使得相对于适当对照(例如，相同或相关细胞组织、器官等的非扩增部分)的更高或更低的表达提供了靶核酸的相对拷贝数的估计值。
用于确定基因组拷贝数的另一种方式是原位杂交(例如，Angerer(1987)Meth.Enzymol152：649)。通常，原位杂交包括以下步骤：(1)固定待分析的组织或生物结构；(2)生物结构的预杂交处理，以增加靶DNA的可接近性，并减少非特异性结合；(3)核酸混合物与生物结构或组织中的核酸杂交；(4)杂交后洗涤以除去未在杂交中结合的核酸片段和(5)检测杂交的核酸片段。在这些步骤中的每一个中使用的试剂和使用条件根据具体应用而变化。在典型的原位杂交分析中，将细胞固定在固体支持物上，通常是载玻片。如果要探测核酸，通常用热或碱使细胞变性。然后使细胞在中等温度下与杂交溶液接触，以使对编码蛋白质的核酸序列具有特异性的标记探针退火。然后通常以预定的严格性或以增加的严格性洗涤目标(例如，细胞)，直到获得适当的信噪比。通常用例如放射性同位素或荧光报道分子标记的探针。在一个实施方式中，探针足够长以便在严格条件下与靶核酸特异性杂交。探针的长度通常为约200个碱基至约1000个碱基。在一些应用中，必须阻断重复序列的杂交能力。因此，在一些实施方式中，tRNA、人基因组DNA或Cot-I DNA用于阻断非特异性杂交。
确定基因组拷贝数的另一种方式是比较基因组杂交。通常，如果需要，从正常参考细胞以及测试细胞(例如肿瘤细胞)分离出基因组DNA并扩增。将两种核酸差异标记，然后原位杂交至参照细胞的中期染色体。通过某些方式除去参照DNA和测试DNA中的重复序列或降低它们的杂交能力，例如通过与适当的封闭核酸预杂交和/或在所述杂交过程中包含所述重复序列的封闭核酸序列。然后，如果需要，以可视化的形式呈现所结合的标记DNA序列。可以通过检测来自两个DNA的信号比率被改变的区域来鉴定测试细胞中拷贝数增加或减少的染色体区域。例如，与基因组的其它区域相比，测试细胞中拷贝数减少的那些区域将显示来自测试DNA的相对低于参考的信号。测试细胞中拷贝数增加的区域将显示来自测试DNA的相对较高的信号。在存在染色体缺失或倍增的情况下，将检测来自两个标记的信号的比率的差异，并且所述比率将提供拷贝数的量度。在CGH的另一个实施方式阵列CGH(aCGH)中，固定的染色体元件被阵列上的固体支持物结合的靶核酸的集合替换，允许大的或完整百分比的基因组在固体支持物结合的靶标的集合中表示。靶核酸可包含cDNA、基因组DNA、寡核苷酸(例如，以检测单核苷酸多态性)等。基于阵列的CGH也可以用单色标记进行(与用两种不同的染料标记对照和可能的肿瘤样品并在杂交前混合它们相反，由于阵列上探针的竞争性杂交，这将产生比率)。在单色CGH中，标记对照且其与一个阵列杂交，并读取绝对信号，标记可能的肿瘤样品且其与第二阵列(具有相同内容)杂交，并读取绝对信号。基于来自两个阵列的绝对信号计算拷贝数差异。制备固定化染色体或阵列并进行比较基因组杂交的方法是本领域众所周知的(参见例如，美国专利号：6,335,167；6,197,501；5,830,645；和5,665,549；以及Albertson(1984)EMBO J.3：1227-1234；Pinkel(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：9138-9142；EPO公开号430,402；Methods in Molecular Biology,第33卷：In situHybridization Protocols,Choo编,Humana Press,Totowa,N.J.(1994)等)。在另一个实施方式中，使用Pinkel等人,(1998)Nature Genetics20：207-211或Kallioniemi(1992)Proc.Natl Acad Sci USA 89：5321-5325(1992)的杂交方案。
在另一个实施方式中，基于扩增的分析可用于测量拷贝数。在这种基于扩增的分析中，核酸序列在扩增反应(例如，聚合酶链式反应(PCR)中充当模板。在定量扩增中，扩增产物的量将与原始样品中模板的量成比例。与适当对照(例如健康组织)的比较提供了拷贝数的量度。
“定量”扩增的方法是本领域技术人员众所周知的。例如，定量PCR涉及使用相同的引物同时共扩增已知量的对照序列。这提供了可用于校准PCR反应的内标。定量PCR的详细方案提供于Innis等人,(1990)PCR Protocols,A Guide to Methods and Applications,Academic Press,Inc.N.Y.)中。Ginzonger等人,(2000)Cancer Research 60：5405-5409描述了使用定量PCR分析测量微卫星基因座处的DNA拷贝数。已知的基因核酸序列足以使本领域技术人员能够常规选择引物以扩增基因的任何部分。荧光定量PCR也可用于本发明的方法中。在荧光定量PCR中，定量基于荧光信号的量，例如TaqMan和SYBR green。
其它合适的扩增方法包括但不限于连接酶链式反应(LCR)(参见Wu和Wallace(1989)Genomics 4：560，Landegren等人,(1988)Science 241：1077，和Barringer等人(1990)Gene 89：117)、转录扩增(Kwoh等人,(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：1173)、自主序列复制(self-sustained sequence replication)(Guatelli等人,(1990)Proc.Nat.Acad.Sci.USA 87：1874)、dot PCR和连接子接头PCR等。
杂合性丢失(LOH)和主要拷贝比例(MCP)作图(Wang,Z.C.等人,(2004)CancerRes64(1)：64-71；Seymour,A.B.等人,(1994)Cancer Res 54,2761-4；Hahn,S.A.等人,(1995)Cancer Res 55,4670-5；Kimura,M.等人,(1996)Genes Chromosomes Cancer 17,88-93；Li等人,(2008)MBC Bioinform.9,204-219)也可用于鉴定扩增或缺失区域。
b.检测生物标志物核酸表达的方法
可以通过用于检测转录分子或蛋白质的表达的多种众所周知的方法中的任何一种来评定生物标志物表达。此类方法的非限制性实例包括用于检测分泌蛋白、细胞表面蛋白、细胞质蛋白或核蛋白的免疫学方法；蛋白质纯化方法；蛋白质功能或活性分析；核酸杂交方法；核酸逆转录方法和核酸扩增方法。
在优选的实施方式中，特定基因的活性通过基因转录物(例如mRNA)的量度、通过翻译蛋白质的量的量度或通过基因产物活性的量度来表征。可以多种方式监测标志物表达，包括通过检测mRNA水平、蛋白质水平或蛋白质活性，其中任何一种都可以使用标准技术测量。检测可涉及基因表达水平的定量(例如，基因组DNA、cDNA、mRNA、蛋白质或酶活性)，或者，可以是基因表达水平的定性评估，特别是与对照水平相比较。从上下文中可以清楚地检测到的水平类型。
在另一个实施方式中，检测或测定生物标志物及其功能相似同源物，包括其片段或遗传改变(例如，在其调节或启动子区域中)的表达水平包括检测或测定感兴趣的标志物的RNA水平。在一个实施方式中，获得来自待测试个体的一个或多个细胞，并从细胞中分离RNA。在一个优选的实施方式中，从个体获得乳腺组织细胞样品。
在一个实施方式中，RNA是从单个细胞获得。例如，可以通过激光捕获显微切割(LCM)从组织样品中分离细胞。使用这种技术，可以从组织切片(包括染色的组织切片)中分离细胞，从而确保分离所需的细胞(参见例如，Bonner等人(1997)Science 278：1481；Emmert-Buck等人(1996)Science 274：998；Fend等人(1999)Am.J.Path.154：61和Murakami等人(2000)Kidney Int.58：1346)。例如，Murakami等人,见上文描述了从先前免疫染色的组织切片中分离细胞。
还可以从个体获得细胞并在体外培养细胞，以便获得可以从中提取RNA的更大细胞群。建立非转化细胞培养物即原代细胞培养物的方法是本领域已知的。
当从来自个体的组织样品或细胞中分离RNA时，在从个体中移出组织或细胞后防止基因表达的任何进一步改变可能是重要的。已知表达水平的变化在扰动，例如热休克或用脂多糖(LPS)或其它试剂激活后迅速改变。此外，组织和细胞中的RNA可能迅速降解。因此，在一个优选的实施方式中，尽快速冻从个体获得的组织或细胞。
可以通过多种方法从组织样品中提取RNA，例如硫氰酸胍裂解，然后进行CsCl离心(Chirgwin等人,1979,Biochemistry 18：5294-5299)。来自单细胞的RNA可以如用于从单细胞制备cDNA文库的方法获得，例如Dulac,C.(1998)Curr.Top.Dev.Biol.36,245和Jena等人(1996)J.Immunol.Methods 190：199中描述的那些。必须注意避免RNA降解，例如通过包含RNAsin。
然后可以在特定物种中富集RNA样品。在一个实施方式中，从RNA样品中分离poly(A)+RNA。通常，这种纯化利用mRNA上的poly-A尾。特别地并且如上所述，可以将poly-T寡核苷酸固定在固体支持物上以充当mRNA的亲和配体。用于此目的的试剂盒是可商购的，例如MessageMaker试剂盒(Life Technologies,Grand Island,NY)。
在一个优选的实施方式中，RNA群富含标志物序列。可以例如通过引物特异性cDNA合成，或基于cDNA合成和模板指导的体外转录的多轮线性扩增进行富集(参见例如，Wang等人(1989)PNAS 86,9717；Dulac等人,见上文和Jena等人,见上文)。
可以进一步扩增富含或不富含特定物种或序列的RNA群。如本申请所定义，“扩增过程”被设计为加强、增加或扩大RNA内的分子。例如，在RNA是mRNA的情况下，可以利用例如RT-PCR的扩增过程来扩增mRNA，使得信号可检测或增强检测。尤其当生物、组织或肿瘤样品具有小尺寸或体积时，这种扩增过程是有益的。
可以使用各种扩增和检测方法。例如，将mRNA逆转录为cDNA然后进行聚合酶链式反应(RT-PCR)；或者，如美国专利号5,322,770所述，将单一酶用于两个步骤或者如R.L.Marshall等人,PCR Methods and Applications 4：80-84(1994)中所述，将mRNA逆转录为cDNA，然后进行对称空位连接酶链式反应(RT-AGLCR)也在本发明的范围内。也可以使用实时PCR。
可用于本申请的其它已知扩增方法包括但不限于PNAS USA 87：1874-1878(1990)中描述的以及Nature 350(第6313期)：91-92(1991)中描述的所谓的“NASBA”或“3SR”技术；如公开的欧洲专利申请(EPA)号4544610中所述的Q-β扩增；链置换扩增(如G.T.Walker等人,Clin.Chem.42：9-13(1996)和欧洲专利申请号684315中所述；靶介导的扩增，如PCT公开WO9322461所述；PCR；连接酶链式反应(LCR)(参见例如，Wu和Wallace,Genomics4,560(1989)，Landegren等人,Science 241,1077(1988))；自主序列复制(SSR)(参见例如，Guatelli等人,Proc.Nat.Acad.Sci.USA,87,1874(1990))；和转录扩增(参见例如，Kwoh等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86,1173(1989))。
在现有技术中已知许多技术用于确定基因表达的绝对和相对水平，适用于本发明的常用技术包括Northern分析、RNA酶保护分析(RPA)、微阵列和基于PCR的技术，例如定量PCR和差异显示PCR。例如，Northern印迹涉及在变性琼脂糖凝胶上运行RNA制剂，并将其转移至合适的支持物，例如激活的纤维素、硝化纤维素或玻璃或尼龙膜。然后将放射性标记的cDNA或RNA与制剂杂交，洗涤并通过放射自显影分析。
还可以采用原位杂交可视化，其中放射性标记的反义RNA探针与活检样品的薄切片杂交，洗涤，用RNA酶切割并暴露于敏感乳液用于放射自显影。样品可以用苏木精染色以证明样品的组织学组成，并且用合适的滤光器进行的暗视野成像，显示了显影的乳液。也可以使用非放射性标记，例如地高辛(digoxigenin)。
或者，可以在DNA阵列、芯片或微阵列上检测mRNA表达。从个体处获得的测试样品的标记的核酸可以与包含生物标志物DNA的固体表面杂交。用含有生物标志物转录物的样品获得阳性杂交信号。制备DNA阵列的方法及其用途是本领域众所周知的(参见例如，美国专利号：6,618,6796；6,379,897；6,664,377；6,451,536；548,257；U.S.20030157485和Schena等人(1995)Science 20,467-470；Gerhold等人(1999)Trends In Biochem.Sci.24,168-173；和Lennon等人(2000)Drug Discovery Today 5,59-65，其全部内容通过引用并入本申请)。还可以进行基因表达的系列分析(SAGE)(参见例如美国专利申请20030215858)。
为了监测mRNA水平，例如从待测试的生物样品中提取mRNA，逆转录，并产生荧光标记的cDNA探针。然后用标记的cDNA探针探测能够与标志物cDNA杂交的微阵列，扫描载玻片并测量荧光强度。此强度与杂交强度和表达水平相关。
可用于本申请所述方法的探针类型包括cDNA、核糖核酸探针、合成寡核苷酸和基因组探针。所用探针的类型通常由特定情况决定，例如用于原位杂交的核糖核酸探针和用于Northern印迹的cDNA。在一个实施方式中，探针针对RNA独特的核苷酸区域。探针可以与差异识别标志物mRNA转录物所需的一样短，并且可以短至例如15个碱基；然而，可以使用至少17、18、19或20或更多个碱基的探针。在一个实施方式中，引物和探针在严格条件下特异性杂交至具有对应于标志物的核苷酸序列的DNA片段。如本申请所用，术语“严格条件”是指仅在核苷酸序列中存在至少95％同一性时才发生杂交。在另一个实施方式中，在“严格条件”下的杂交在序列之间存在至少97％同一性时发生。
探针的标记形式可以是任何合适的形式，例如使用放射性同位素，例如32P和35S。无论探针是化学合成的还是生物学的，通过使用适当标记的碱基，可以实现用放射性同位素标记。
在一个实施方式中，生物样品含有来自测试个体的多肽分子。或者，生物样品可含有来自测试个体的mRNA分子或来自测试个体的基因组DNA分子。
在另一个实施方式中，所述方法还涉及从对照个体获得对照生物样品，使对照样品与能够检测标志物多肽、mRNA、基因组DNA或其片段的化合物或药剂接触，以便在生物样品中检测标志物多肽、mRNA、基因组DNA或其片段的存在，并将对照样品中标志物多肽、mRNA、基因组DNA或其片段的存在与测试样品中标志物多肽、mRNA、基因组DNA或其片段的存在进行比较。
c.检测生物标志物蛋白质表达的方法
可以通过检测或定量表达的多肽来检测和/或定量生物标志物蛋白的活性或水平。可以通过本领域技术人员熟知的许多方法中的任何一种来检测和定量多肽。由生物标志物核酸及其功能相似的同源物(包括其片段或遗传改变(例如，在其调节或启动子区域中))编码的多肽的多肽异常表达水平与癌症对PI3K/mTOR组合抑制剂疗法的应答可能性相关。可以使用本领域已知的用于检测多肽的任何方法。这些方法包括但不限于免疫扩散、免疫电泳、放射免疫分析(RIA)、酶联免疫吸附分析(ELISA)、免疫荧光分析、Western印迹、结合剂-配体分析、免疫组化技术、凝集、补体分析、高效液相色谱(HPLC)、薄层色谱(TLC)、超扩散色谱等(例如，Basic and Clinical Immunology,Sites和Terr编,Appleton andLange,Norwalk,Conn.第217-262页,1991，其通过引用并入)。优选的是粘合剂-配体免疫分析方法，包括使抗体与一个或多个表位反应并竞争性置换标记的多肽或其衍生物。
例如，可以进行ELISA和RIA程序，以便标记(用放射性同位素如125I或35S，或可分析的酶，如辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶)所需的生物标志物蛋白标准物，并与未标记的样品一起与相应的抗体接触，其中第二抗体用于结合第一抗体，并分析放射性或固定化酶(竞争性分析)。或者，使样品中的生物标志物蛋白与相应的固定化抗体反应，使放射性同位素或酶标记的抗生物标志物蛋白抗体与系统反应，并分析放射性或酶(ELISA-夹心分析)。其它常规方法也可以适当使用。
上述技术可以基本上以“一步”或“两步”分析进行。“一步”分析涉及使抗原与固定的抗体接触，并且在不洗涤的情况下，使混合物与标记的抗体接触。“两步”分析涉及在使混合物与标记的抗体接触之前进行洗涤。其它常规方法也可以适当使用。
在一个实施方式中，用于测量生物标志物蛋白水平的方法包括以下步骤：使生物样本与选择性结合生物标志物蛋白的抗体或其变体(例如片段)接触，并检测所述抗体或其变体是否与所述样品结合，从而测量生物标志物蛋白的水平。
生物标志物蛋白和/或抗体的酶促和放射性标记可以通过常规方式实现。这些方式通常包括酶与所讨论的抗原或抗体的共价连接，例如通过戊二醛，特别是为了不对酶的活性产生不利影响，这意味着酶必须仍然能够与其底物相互作用，但是没有必要使所有的酶都具有活性，只要有足够的酶保持活性以允许进行分析。实际上，一些结合酶的技术是非特异性的(例如使用甲醛)，并且仅产生一定比例的活性酶。
通常希望将分析系统的一个组分固定在支持物上，从而使系统的其它组分与所述组分接触并易于被除去而无需费力和费时的劳动。第二相可能远离第一相固定，但一相通常就足够了。
可以将酶本身固定在支持物上，但是如果需要固相酶，那么这通常最好通过与抗体结合并将抗体固定到本领域众所周知的支持物、模型和系统来实现。简单的聚乙烯可以提供合适的支持物。
可用于标记的酶没有特别限制，但可以选自例如氧化酶组的成员。这些通过与其底物反应催化过氧化氢的产生，并且葡萄糖氧化酶由于其良好的稳定性、易于获得和便宜，以及其底物(葡萄糖)的易得性而经常被使用。氧化酶的活性可以通过测量在本领域众所周知的受控条件下酶标记的抗体与底物反应后形成的过氧化氢的浓度来分析。
基于本公开内容，根据从业者的偏好，可以使用其它技术来检测生物标志物蛋白。一种这样的技术是Western印迹(Towbin等人,Proc.Nat.Acad.Sci.76：4350(1979))，其中适当处理过的样品在SDS-PAGE凝胶上电泳，然后转移到固体支持物上，例如硝化纤维素滤膜。然后使抗生物标志物蛋白抗体(未标记的)与支持物接触，并通过第二免疫试剂分析，第二免疫试剂为例如标记的蛋白质A或抗免疫球蛋白(合适的标记包括125I、辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶)。也可以使用色谱检测。
免疫组织化学可用于检测生物标志物蛋白的表达，例如在活组织检查样品中。使合适的抗体与例如薄细胞层接触，洗涤，然后与第二种标记的抗体接触。可以通过荧光标记物、酶(如过氧化物酶)、抗生物素蛋白或放射性标记进行标记。使用显微镜对分析进行目测评分。
抗生物标志物蛋白抗体，例如胞内抗体，也可用于成像目的，例如检测个体细胞和组织中生物标志物蛋白的存在。合适的标记包括放射性同位素碘(125I、121I)、碳(14C)、硫(35S)、氚(3H)、铟(112In)和锝(99mTc)；荧光标记，如荧光素和罗丹明；以及生物素。
对于体内成像目的，抗体本身不能从体外检测到，因此必须进行标记或以其它方式修饰以允许检测。用于此目的的标志物可以是基本上不干扰抗体结合但允许外部检测的任何标志物。合适的标志物可包括可通过X射线照相术、NMR或MRI检测的标志物。对于X射线照相技术，合适的标志物包括任何放射性同位素，其发射可检测的辐射但对个体没有明显的伤害，例如钡或铯。用于NMR和MRI的合适标志物通常包括具有可检测的特征性自旋的标志物，例如氘，其可通过例如适当标记相关杂交瘤的营养物而掺入抗体中。
个体的大小和使用的成像系统将确定产生诊断图像所需的成像部分的量。就放射性同位素部分，对于人类个体，注射的放射性量通常为约5至20毫居里的锝-99。然后标记的抗体或抗体片段优先在含有生物标志物蛋白的细胞的位置积累。然后可以使用已知技术检测标记的抗体或抗体片段。
可用于检测生物标志物蛋白的抗体包括天然或合成、全长或其片段、单克隆或多克隆的任何抗体，其与待检测的生物标志物蛋白足够强烈且特异性地结合。抗体的Kd可为至多约10-6M、10-7M、10-8M、10-9M、10-10M、10-11M、10-12M。短语“特异性结合”是指例如抗体与表位或抗原或抗原决定簇的结合，使得结合可以与相同或相似表位、抗原或抗原决定簇的第二制剂置换或竞争。相对于其它蛋白质，例如相关蛋白质，抗体可优先结合生物标志物蛋白。
抗体可商购获得或可根据本领域已知的方法制备。
可以使用的抗体及其衍生物涵盖多克隆或单克隆抗体、嵌合抗体、人抗体、人源化抗体、灵长类化(CDR移植)抗体、饰面或单链抗体以及抗体的功能片段，即生物标志物蛋白结合片段。例如，可以使用能够结合生物标志物蛋白或其部分的抗体片段，包括但不限于Fv、Fab、Fab'和F(ab')2片段。这些片段可以通过酶促切割或通过重组技术产生。例如，木瓜蛋白酶或胃蛋白酶切割可分别产生Fab或F(ab')2片段。具有必需底物特异性的其它蛋白酶也可用于产生Fab或F(ab')2片段。还可以使用已经在天然终止位点的上游引入了一个或多个终止密码子的抗体基因以多种截短形式产生抗体。例如，编码F(ab')2重链部分的嵌合基因可以被设计为包括编码重链的CH、结构域和铰链区的DNA序列。
合成的和工程化的抗体描述于例如Cabilly等人的美国专利号4,816,567，Cabilly等人的欧洲专利号0,125,023B1；Boss等人的美国专利号4,816,397；Boss等人的欧洲专利号0,120,694B1；Neuberger,M.S.等人的WO 86/01533；Neuberger,M.S.等人的欧洲专利号0,194,276B1；Winter的美国专利号5,225,539；Winter的欧洲专利号0,239,400B1；Queen等人的欧洲专利号0451216B1；和Padlan,E.A.等人的EP 0519596A1。还参见关于灵长类化抗体的Newman,R.等人,BioTechnology,10：1455-1460(1992)和关于单链抗体的Ladner等人,美国专利号4,946,778和Bird,R.E.等人,Science,242：423-426(1988))。还可以使用由文库(例如噬菌体展示文库)产生的抗体。
在一些实施方式中，使用特异性结合除抗体之外的生物标志物蛋白的药剂，例如肽。可以通过本领域已知的任何方式鉴定特异性结合生物标志物蛋白的肽。例如，可以使用肽噬菌体展示文库筛选生物标志物蛋白的特异性肽结合物。
d.检测生物标志物结构化改变的方法
以下说明性方法可用于鉴定生物标志物核酸和/或生物标志物多肽分子中结构化改变的存在，以便例如鉴定过表达、过度功能化等的PI3K/mTOR通路蛋白。
在某些实施方式中，所述改变的检测涉及在聚合酶链式反应(PCR)如锚定PCR或RACE PCR中(参见例如，美国专利号4,683,195和4,683,202)，或者在连接链式反应(LCR)中使用探针/引物(参见例如，Landegran等人(1988)Science 241：1077-1080；和Nakazawa等人(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：360-364)，后者对于检测生物标志物核酸(例如生物标志物基因)中的点突变特别有用(参见Abravaya等人(1995)Nucleic Acids Res.23：675-682)。此方法可包括以下步骤：从个体收集细胞样品，从样品细胞中分离核酸(例如，基因组、mRNA或两者)，使核酸样品与一种或多种引物接触，所述引物在生物标志物基因(如果存在)发生杂交和扩增的条件下与生物标志物基因特异性杂交，检测扩增产物的存在或不存在，或检测扩增产物的大小并将长度与对照样品进行比较。预期PCR和/或LCR可能需要与用于检测本申请所述突变的任何技术一起用作初步扩增步骤。
替代性扩增方法包括：自主序列复制(Guatelli,J.C.等人(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87：1874-1878)、转录扩增系统(Kwoh,D.Y.等人(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA86：1173-1177)、Q-β复制酶(Lizardi,P.M.等人(1988)Bio-Technology 6：1197)或任何其它核酸扩增方法，然后使用本领域技术人员熟知的技术检测扩增分子。如果这些分子以非常低的数量存在，则这些检测方案对核酸分子的检测特别有用。
在一个替代性实施方式中，来自样品细胞的生物标志物核酸中的突变可以通过限制酶切割模式的改变来鉴定。例如，分离样品和对照DNA，扩增(任选地)，用一种或多种限制性内切核酸酶消化，通过凝胶电泳确定片段长度大小并进行比较。样品和对照DNA之间片段长度大小的差异表明样品DNA中存在突变。此外，序列特异性核酶的使用(参见例如，美国专利号5,498,531)可用于通过核酶切割位点的出现或丧失来对特定突变的存在进行评分。
在其它实施方式中，生物标志物核酸中的遗传突变可以通过将样品和对照核酸(例如DNA或RNA)杂交至含有数百或数千个寡核苷酸探针的高密度阵列来鉴定(Cronin,M.T.等人(1996)Hum.Mutat.7：244-255；Kozal,M.J.等人(1996)Nat.Med.2：753-759)。例如，生物标志物基因突变可以在含有光产生的DNA探针的二维阵列中鉴定，如Cronin等人(1996)见上文所述。简而言之，通过制备顺序重叠探针的线性阵列，第一杂交探针阵列可用于扫描样品和对照中的长片段DNA，以鉴定序列之间的碱基变化。此步骤允许鉴定点突变。此步骤之后是第二杂交阵列，其允许通过使用与检测到的所有变体或突变互补的较小的、专门的探针阵列来表征特定突变。每个突变阵列由平行探针组组成，一与野生型基因互补，另一与突变基因互补。可以在多种情况下鉴定此类生物标志物基因突变，包括例如生殖细胞和体细胞突变。
在另一个实施方式中，本领域已知的多种测序反应中的任何一种可用于直接对生物标志物基因测序，并通过比较样品生物标志物的序列与相应的野生型(对照)序列来检测突变。测序反应的实例包括基于由Maxam和Gilbert(1977)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 74：560或Sanger(1977)Proc.Natl.Acad Sci.USA 74：5463开发的技术的测序反应。还预期，在进行诊断分析时可以使用任何各种自动化测序程序(Naeve(1995)Biotechniques 19：448-53)，包括通过质谱测序(参见例如PCT国际公开号WO 94/16101；Cohen等人(1996)Adv.Chromatogr.36：127-162；和Griffin等人(1993)Appl.Biochem.Biotechnol.38：147-159)。
用于检测生物标志物基因中的突变的其它方法包括使用避免切割剂来检测RNA/RNA或RNA/DNA异源双链体中的错配碱基的方法(Myers等人(1985)Science 230：1242)。通常，“错配切割”的技术开始于提供通过使(标记的)含有野生型生物标志物序列的RNA或DNA与从组织样品获得的潜在突变RNA或DNA杂交而形成的异源双链体。用切割双链体的单链区的药剂处理双链双链体，例如由于对照和样品链之间的碱基对错配而存在的单链区。例如，可以用RNA酶和用SI核酸酶处理的DNA/DNA杂交体来处理RNA/DNA双链体，以酶促消化错配区。在其它实施方式中，DNA/DNA或RNA/DNA双链体可以用羟胺或四氧化锇和哌啶处理，以消化错配区。在消化错配区后，然后在变性聚丙烯酰胺凝胶上通过大小来分离所得物质，以确定突变位点。参见例如，Cotton等人(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：4397和Saleeba等人(1992)Methods Enzymol.217：286-295。在一个优选的实施方式中，可以标记对照DNA或RNA用于检测。
在另一个实施方式中，错配切割反应使用一种或多种在限定的系统中识别双链DNA中错配碱基对的蛋白质(所谓的“DNA错配修复”酶)，用于检测和定位从细胞样品中获得的生物标志物cDNA中的点突变。例如，大肠杆菌的mutY酶在G/A错配时切割A，而来自HeLa细胞的胸苷DNA糖基化酶在G/T错配时切割T(Hsu等人(1994)Carcinogenesis15：1657-1662)。根据一个示例性实施方式，可以从电泳方案等(例如，美国专利号5,459,039)检测基于生物标志物序列的探针，例如用DNA错配修复酶处理的野生型生物标志物和切割产物(如果有的话)。
在其它实施方式中，电泳迁移率的改变可用于鉴定生物标志物基因中的突变。例如，单链构象多态性(SSCP)可用于检测突变体和野生型核酸之间的电泳迁移率的差异(Orita等人(1989)Proc Natl.Acad.Sci USA 86：2766；另参见Cotton(1993)Mutat.Res.285：125-144和Hayashi(1992)Genet.Anal.Tech.Appl.9：73-79)。将样品和对照生物标志物核酸的单链DNA片段变性并使其复性。单链核酸的二级结构根据序列而变化，所导致的电泳迁移率的改变使得甚至能够检测到单个碱基变化。可以用标记的探针标记或检测DNA片段。通过使用RNA(而不是DNA)可以增强分析的灵敏度，其中二级结构对序列的变化更敏感。在一个优选的实施方式中，本发明方法利用异源双链体分析基于电泳迁移率的变化来分离双链异源双链体分子(Keen等人(1991)Trends Genet.7：5)。
在另一个实施方式中，使用变性梯度凝胶电泳(DGGE)(Myers等人(1985)Nature313：495)分析突变体或野生型片段在含有变性剂梯度的聚丙烯酰胺凝胶中的移动。当DGGE用作分析方法时，DNA将被修饰以确保其不会完全变性，例如通过PCR添加大约40bp的富含GC的高熔点DNA的GC钳。在另一个实施方式中，使用温度梯度代替变性梯度以鉴定对照和样品DNA的迁移率差异(Rosenbaum和Reissner(1987)Biophys.Chem.265：12753)。
用于检测点突变的其它技术的实例包括但不限于选择性寡核苷酸杂交、选择性扩增或选择性引物延伸。例如，可以制备寡核苷酸引物，其中将已知突变集中放置，然后在允许杂交的条件下(只有在发现完全匹配时才能进行杂交)与靶DNA杂交，(Saiki等人(1986)Nature 324：163；Saiki等人(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：6230)。当寡核苷酸与杂交膜连接并与标记的靶DNA杂交时，这些等位基因特异性寡核苷酸与PCR扩增的靶DNA或许多不同的突变杂交。
或者，依赖于选择性PCR扩增的等位基因特异性扩增技术可以与本发明结合使用。用作特异性扩增的引物的寡核苷酸可以在分子的中心(因此扩增取决于差异杂交)(Gibbs等人(1989)Nucleic Acids Res.17：2437-2448)或在一种引物的极端3’端携带感兴趣的突变，其中在适当条件下，错配可以阻止或减少聚合酶延伸(Prossner(1993)Tibtech 11：238)。此外，可能需要在突变区中引入新的限制性位点以产生基于切割的检测(Gasparini等人(1992)Mol.Cell Probes 6：1)。预期在某些实施方式中，还可以使用Taq连接酶进行扩增(Barany(1991)Proc.Natl.Acad.Sci USA 88：189)。在这种情况下，只有在5’序列的3’端存在完全匹配时才会发生连接，从而可以通过寻找扩增的存在或不存在来检测特定位点是否存在已知突变。
e.采样方法
在一些实施方式中，将来自个体的样品中的生物标志物量和/或活性测量值与预定的对照(标准)样品进行比较。来自个体的样品通常来自患病组织，例如癌细胞或组织。对照样品可以来自相同个体或来自不同个体。对照样品通常是正常的非患病样品。然而，在一些实施方式中，例如用于疾病分期或用于评估治疗功效，对照样品可来自患病组织。对照样品可以是来自几个不同个体的样品的组合。在一些实施方式中，将来自个体的生物标志物量和/或活性测量值与预定的水平进行比较。此预定水平通常从正常样品获得。如本申请所述，“预定的”生物标志物量和/或活性测量值可以是用于(仅作为实例)评估可以被选择进行治疗的个体(例如，基于基因组突变的数量和/或引起DNA修复基因的非功能性蛋白质的基因组突变的数量)、评估对PI3K/mTOR组合抑制剂疗法的应答、和/或评估对PI3K/mTOR组合抑制剂疗法与一种或多种另外的抗癌疗法的应答的生物标志物量和/或活性测量值。可以在患有或未患有癌症的患者群体中确定预定生物标志物量和/或活性测量值。预定生物标志物量和/或活性测量值可以是同等适用于每个患者的单个数字，或者预定生物标志物量和/或活性测量值可以根据患者的特定亚群而变化。个体的年龄、体重、身高和其它因素可能影响个体的预定的生物标志物量和/或活性测量值。此外，可以单独地为每个个体确定预定的生物标志物量和/或活性。在一个实施方式中，在本申请描述的方法中确定和/或比较的量基于绝对测量值。
在另一个实施方式中，在本申请描述的方法中确定和/或比较的量基于相对测量值，例如比率(例如，治疗前与治疗后的生物标志物拷贝数、水平和/或活性，相对于加标或人造对照的此类生物标志物测量值，相对于管家基因表达的此类生物标志物测量值等)。例如，相对分析可以基于治疗前生物标志物测量值与治疗后生物标志物测量值的比率。可以在开始抗癌疗法之前的任何时间进行治疗前生物标志物测量。可以在开始抗癌疗法后的任何时间进行治疗后生物标志物测量。在一些实施方式中，治疗后生物标志物测量是在开始抗癌疗法后的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20周或更长时间来进行，甚至更久地向着无限期地继续监测。治疗可以包括抗癌疗法，例如仅包含一种或多种PI3K/mTOR组合抑制剂或与其它抗癌剂组合，例如与免疫检查点抑制剂组合的治疗方案。
预定的生物标志物量和/或活性测量值可以是任何合适的标准。例如，可以从正在进行患者选择评估的相同或不同的人获得预定生物标志物量和/或活性测量值。在一个实施方式中，预定的生物标志物量和/或活性测量值可以从同一患者的先前评定中获得。以这种方式，可以随时间推移监测患者选择的进展。另外，如果个体是人，则可以从另一个人或多个人(例如，选定的人群)的评估中获得对照。以这种方式，可以将正在进行选择评估的人的选择程度与合适的其他人进行比较，例如，与感兴趣的人处于类似情况的其他人，例如患有相似或相同病况和/或同一种族群体的那些人。
在本发明的一些实施方式中，生物标志物量和/或活性测量值从预定水平的变化是约0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5或5.0倍或更大，或介于其间(包括端点)的任何范围。当测量基于相对变化时，例如基于治疗前生物标志物测量与治疗后生物标志物测量的比率，这样的截止值同样适用。
可以从患者的各种来源收集生物样品，包括包含核酸和/或蛋白质的体液样品、细胞样品或组织样品。“体液”是指从体内排出或分泌的液体以及通常不从体内排出或分泌的液体(例如羊水、房水、胆汁、血液和血浆、脑脊髓液、耵聍和耳垢、考珀液或射精前液、乳糜、食糜、粪便、女性射精、间质液、细胞内液、淋巴液、月经、母乳、粘液、胸膜液、脓液、唾液、皮脂、精液、血清、汗液、滑液、泪液、尿液、阴道润滑、玻璃体液、呕吐物)。在一个优选实施方式中，个体和/或对照样品选自下组：细胞、细胞系、组织切片、石蜡包埋组织、活检体、全血、乳头抽吸物、血清、血浆、口腔刮擦物、唾液、脑脊髓液、尿液、粪便和骨髓。在一个实施方式中，样品是血清、血浆或尿液。在另一个实施方式中，样品是血清。
可以在纵向时间段内重复地从个体收集样品(例如，大约每天、每周、每月、每年、每半年一次或多次等)。在一段时间内从个体获得大量样品可用于验证早期检测的结果和/或鉴定由于例如疾病进展、药物治疗等导致的生物学模式的改变。例如，根据本发明，可以每月、每两个月或一个月、两个月或三个月间隔的组合来采集和监测个体样品。此外，随着时间的推移获得的个体的生物标志物量和/或活性测量值可以方便地在监测期间彼此以及与正常对照的那些相比较，从而提供个体自身的值作为内部对照或个人对照用于长期监测。
样品制备和分离可涉及任何程序，这取决于收集的样品类型和/或生物标志物测量的分析。仅举例来说，此类程序包括浓缩、稀释、调节pH、去除高丰度多肽(例如白蛋白、γ球蛋白和转铁蛋白等)、添加防腐剂和校准物、添加蛋白酶抑制剂、添加变性剂、样品脱盐、样品蛋白浓度、脂质的提取和纯化。
样品制备还可以将与非共价复合物结合的分子与其它蛋白质(例如载体蛋白质)分离。此过程可以分离与特定载体蛋白(例如白蛋白)结合的那些分子，或使用更一般的过程，例如通过蛋白质变性(例如使用酸)从所有载体蛋白释放结合分子，然后除去载体蛋白。
使用高亲和力试剂、高分子量过滤器、超速离心和/或电渗析可以从样品中除去不需要的蛋白质(例如，高丰度、无信息或不可检测的蛋白质)。高亲和力试剂包括选择性结合高丰度蛋白质的抗体或其它试剂(例如适体)。样品制备还可包括离子交换色谱、金属离子亲和色谱、凝胶过滤、疏水色谱、色谱聚焦、吸附色谱、等电聚焦和相关技术。分子量过滤器包括基于尺寸和分子量来分离分子的膜。这种过滤器可以进一步采用反渗透、纳滤、超滤和微滤。
超速离心是从样品中除去不需要的多肽的方法。超速离心是以约15,000-60,000rpm离心样品，同时用光学系统监测颗粒的沉降(或其缺乏)。电渗析是一种在过程中使用电膜或半透膜的程序，其中离子在电位梯度的影响下通过半透膜从一种溶液输送到另一种溶液。由于电渗析中使用的膜可能具有选择性地输送具有正电荷或负电荷的离子、排斥相反电荷的离子或者允许物质基于尺寸和电荷迁移通过半透膜的能力，因此使电渗析可用于浓缩、去除或分离电解质。
本发明中的分离和纯化可包括本领域已知的任何程序，例如毛细管电泳(例如，在毛细管中或芯片上)或色谱法(例如，在毛细管中、柱中或芯片上)。电泳是一种可用于在电场影响下分离离子分子的方法。电泳可以在凝胶、毛细管或芯片上的微通道中进行。用于电泳的凝胶的实例包括淀粉、丙烯酰胺、聚环氧乙烷、琼脂糖或其组合。凝胶可以通过其交联、添加洗涤剂或变性剂、固定酶或抗体(亲和电泳)或底物(酶谱法)和pH梯度的掺入来修饰。用于电泳的毛细管的实例包括与电喷雾连接的毛细管。
毛细管电泳(CE)优选用于分离复杂的亲水性分子和高度带电的溶质。CE技术也可以在微流体芯片上实现。根据所用毛细管和缓冲液的类型，CE可进一步分为分离技术，如毛细管区带电泳(CZE)、毛细管等电聚焦(CIEF)、毛细管等速电泳(cITP)和毛细管电色谱(CEC)。将CE技术与电喷雾电离相结合的实施方式涉及使用挥发性溶液，例如含有挥发性酸和/或碱和有机物如醇或乙腈的含水混合物。
毛细管等速电泳(cITP)是一种技术，其中分析物以恒定速度移动通过毛细管但仍然被它们各自的迁移率分开。毛细管区带电泳(CZE)，也称为自由溶液CE(FSCE)，是基于由分子上的电荷决定的物种的电泳迁移率的差异，以及分子在迁移过程中经常遇到的摩擦阻力，这通常与分子大小成正比。毛细管等电聚焦(CIEF)允许弱电离的两性分子通过pH梯度电泳分离。CEC是传统高效液相色谱(HPLC)与CE之间的混合技术。
用于本发明的分离和纯化技术包括本领域已知的任何色谱程序。色谱可以基于某些分析物的差异吸附和洗脱或分析物在移动相和固定相之间的分配。色谱的不同实例包括但不限于液相色谱(LC)、气相色谱(GC)、高效液相色谱(HPLC)等。
实施例
实施例1：实施例2-5的材料和方法
a.小鼠
将FVB/N背景的K14Cre、PtenL/L、Pik3caL/L、Pik3cbL/L、Trp53L/L和MMTV-Neu-IRES-Cre(NIC)小鼠杂交以产生用于此项研究的小鼠。根据丹娜法伯癌症研究所和哈佛医学院(Dana-Farber Cancer Institute and Harvard Medical School)的机构动物护理和使用委员会批准的方案，饲养和处理所有动物。
b.乳腺肿瘤
为了获得有或没有额外Pik3caL/L或Pik3cbL/L，同时避免K14阳性基底细胞中Pten缺失引起的表皮并发症的K14Cre；PtenL/L；Trp53L/L乳腺肿瘤(Wang等人(2013)Genes andDevelopment 27：1568-1580)，切除来自基因工程改造的有或没有额外Pik3caL/L或Pik3cbL /L的K14Cre；PtenL/L；Trp53L/L小鼠的乳腺，并将片段原位移植到四周龄雌性裸鼠(CrTac：NCr-Foxn1nu)的清除的乳腺脂肪垫中。监测小鼠直至形成乳腺肿瘤。切除肿瘤并移植到另外的裸鼠中进行扩增。为了获得用于实验的NIC-PtenL/L肿瘤，切除GEM模型中从头形成的肿瘤并移植到另外的六周龄FVB/NJ(Taconic)小鼠的第3和第4脂肪垫中。通过将40％基质胶中的1.0×105个原代细胞注射到六周龄FVB/NJ(Taconic)的第3乳房脂肪垫中来获得原位肿瘤。通过用数字卡尺测量长轴和短轴来评定肿瘤生长，并且通过使用修改的椭球公式(长×短2×0.52)计算肿瘤体积。对于涉及肿瘤移植的所有实验，所有小鼠在同一天从单细胞池移植。小鼠在两到三天后被加标签并随机分配到治疗组或对照组。所有肿瘤测量均由同一研究人员进行，以避免归因于方法学的变异。所有分析均由第二位研究人员进行，所述研究人员对肿瘤测量不知情。
c.原发性乳腺癌细胞的衍生
有或没有额外的Pik3caL/L或Pik3cbL/L的原发性K14Cre；PtenL/L；Trp53L/L乳腺肿瘤或NIC-PtenL/L肿瘤被切除，切碎并在37℃下在胶原酶/透明质酸酶缓冲液(10mM HEPES，5％FBS，20μg/mL DNase I[Stem Cell Technologies]，胶原酶/透明质酸酶[Stem CellTechnologies]至1X)中解离45分钟，然后进行红细胞裂解(4体积的0.8％NH4Cl 0.1mMEDTA[Stem Cell Technologies]加1体积PBS)，并通过40um滤网沥滤到细胞培养皿中。来自有或没有额外的Pik3caL/L或Pik3cbL/L的K14Cre；PtenL/L；Trp53L/L乳腺肿瘤的原代细胞在37℃下在5％CO2的潮湿培养箱中，在补充有25ng/mL氢化可的松、5μg/mL胰岛素、8.5ng/mL霍乱毒素、0.125ng/mL EGF、10μg/mL庆大霉素和5μM Y-27632的F12/DMEM(1：3)培养基中生长。衍生自NIC-PtenL/L肿瘤的原代细胞在补充有0.6％FBS、0.5μg/mL氢化可的松、2.5μg/mL胰岛素、1.0ng/mL霍乱毒素、20ng/mL EGF、10μg/mL庆大霉素和5uM Y-27632的F12/DMEM(1：1)培养基中生长。
d.卵巢肿瘤
为了获得浆液性卵巢癌(SOC)肿瘤，我们从PtenL/L；Trp53L/L小鼠卵巢中分离出卵巢表面上皮(OSE)细胞，并分别通过体外腺病毒和慢病毒转导引入Cre和Myc表达。随后将经转导的OSE细胞注射到受体裸鼠的卵巢囊中。如上所述切除、切碎和解离所得肿瘤。为了评估体内肿瘤生长，在将细胞注射回受体FVB/NJ小鼠的卵巢囊中之前，通过体外慢病毒转导pLenti-杀稻瘟素-荧光素酶引入萤火虫荧光素酶表达。将得到的表达荧光素酶的SOC肿瘤用于原位移植到FVB/NJ小鼠的实验组中。
e.体内药物治疗
将BKM120、BYL719和KIN193在一体积的NMP(1-甲基-2-吡咯烷酮；Sigma)和9体积的PEG-300(聚乙二醇300；Fluka Analytical)中重构。通过口服强饲法每天一次以30mg/kg给予小鼠。通过腹膜内注射，每三天一次以250μg/小鼠施用对小鼠PD-1(克隆332.8H3)具有特异性的单克隆抗体。
f.流式细胞术
将含有0.2％BSA和5mM EDTA的PBS中的单细胞肿瘤悬浮液与αCD16/32抗体一起在4℃下培养10分钟以阻断Fc受体，然后在4℃下适当地与荧光团标记的一抗一起培育20分钟。在LSR II上进行细胞分选，并用FloJo软件分析。
g.组织学和免疫组织化学
对于组织学分析，由丹娜法伯/哈佛癌症中心啮齿动物病理组织学中心(DanaFarber/Harvard Cancer Center Rodent Histopathology Core)将福尔马林固定的组织切片包埋在石蜡中，切片，并用苏木精和曙红染色。对于免疫组织化学，将切片脱石蜡，在一抗中培育过夜，然后进行二抗和DAB培育，并用苏木精复染。
h.细胞活力和细胞侵袭分析
对于细胞活力分析，将一千个原代细胞接种在超低附着96孔板中，并以适当的药物浓度培育五天。通过与CellTiter-
Figure BDA0001989453360001621
(Promega)一起培育来确定活力。简而言之，通过添加CellTiter-
Figure BDA0001989453360001622
裂解细胞，然后转移至不透明板以测量发光。使用6.5mm，8.0μm孔聚碳酸酯膜transwell小室(BD Biosciences)，将1.0×105个细胞在无血清培养基中接种到内室中，并将正常生长培养基添加到外室中来进行细胞侵袭分析。将细胞培育过夜。用棉签小心地除去非迁移细胞。迁移细胞在室温下用0.5％结晶紫在70％乙醇中染色10分钟，并在Zeiss光学显微镜下拍照。对至少五个随机视野进行计数和平均。
i.Western印迹
在EBC250裂解缓冲液(250mM NaCl，50mM Tris·HCl，pH 8.0，0.5％Nonidet P-40，0.2mM PMSF，2μg/mL抑肽酶和2μg/mL亮抑酶肽，5mM NaF和0.5mM NaVO4)中裂解细胞。通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)拆分等量的蛋白质，转移至聚偏二氟乙烯膜(PVDF)，并与适当的一抗和偶联荧光团的二抗杂交，用于随后由
Figure BDA0001989453360001623
扫描仪(Li-Cor)检测。
j.基因表达分析和定量聚合酶链式反应(Q-PCR)
使用
Figure BDA0001989453360001624
微型试剂盒(Qiagen)分离总RNA，并使用
Figure BDA0001989453360001626
III第一链合成系统(ThermoFisher)进行逆转录。使用
Figure BDA0001989453360001625
Green PCR试剂盒(Qiagen)在7300实时PCR系统(Applied Biosystems,CA)中进行Q-PCR。反应在96孔板中在95℃下进行15分钟，然后进行40个循环：94℃持续15秒，51℃持续30秒和72℃持续30秒。通过ΔΔCt方法将基因表达标准化为GAPDH表达。对于RNA测序(RNA Seq)，根据制造商的说明书使用TRIzol试剂从大块肿瘤片段中分离RNA。RNA Seq由Ion Torrent(Thermo Fisher)使用一组3,826个小鼠特异性基因进行。基因集表达分析(GSEA)由GSEA软件(The Broad Instituteof MIT and Harvard)进行。
实施例2：实验性TNBC动物模型
为了研究p110β在PTEN缺陷型TNBC中的作用并开发新的治疗策略，产生了Pten无效TNBC的基因工程小鼠(GEM)模型(图1A)。与先前在前列腺和卵巢癌的遗传模型中的结果一致(Jia等人(2008)Nature 454：776-9；Schmit等人(2014)Proc.Natl.Acad.Sci.USA111：6395-400)，Pten缺失导致肿瘤形成，该肿瘤形成通过额外的Pik3cb缺失而不通过Pik3ca缺失被阻止(图1B)。这些初步发现证实了PTEN缺陷型TNBC依赖于p110β而存活的假设，并支持基于PI3Kβ的组合疗法可以导致针对PTEN缺陷型TNBC的更有效治疗的假设。
为了获得适合于研究TNBC的更稳健的表型，通过使K14-Cre；PtenL/L小鼠与Trp53L /L小鼠杂交获得K14-Cre；PtenL/L；Trp53L/L小鼠来同时删除肿瘤抑制因子p53(由人中的TP53和小鼠中的Trp53编码)。值得注意的是，大约84％的TNBC表现出缺失的或突变的p53。从得到的肿瘤中，获得早期传代的原代Pten；Trp53无效(PP)TNBC细胞，其维持亲代肿瘤的生物化学和表型特征，包括诊断标志物的表达(图2A)和对同种型特异性PI3K抑制的敏感性，如用泛PI3K抑制剂(BKM120)、p110α抑制剂(BYL719)或p110β抑制剂(KIN-193)处理所示(图2B-2C)。此系统构成了一种持久的研究工具，允许在Pten无效TNBC环境中分析PI3K同种型特异性信号传导网络，并进一步允许分析靶向这些通路对肿瘤生长和癌症进展的影响。
已经观察到p110α特异性信号传导通路和p110β特异性信号传导通路之间的明显差异。例如，原代Pten；Trp53；Pik3ca无效(PPA)细胞表现出上皮间质转化(EMT)的明显迹象，包括间充质标志物(N-钙粘蛋白和波形蛋白)的表达增加和不可检测水平的上皮标志物E-钙粘蛋白。相反，原代Pten；Trp53；Pik3cb无效(PPB)细胞表达更高水平的E-钙粘蛋白和不可检测水平的波形蛋白(图3A)。先前已经显示，p110α和p110β竞争结合p85PI3K调节亚基，因此一个PI3K催化同种型的缺失导致通过另一个同种型的信号传导输出增加(Utermark等人(2012).Genes Dev 26：1573-86)。换句话说，PPA细胞含有上调的p110β信号传导，而PPB细胞含有上调的p110α活性。此外，与原代PP和PPB细胞相比，原代PPA细胞显示出增加的侵袭通过基质胶的能力(图3B)，其可被特异性p110β抑制阻断(KIN-193；图3C)。同样地，可以通过抑制p110β而不是通过p110α抑制来阻止原代PP细胞侵袭(BYL719；图3D)。这些结果表明p110β信号传导可以调节细胞侵袭和运动程序，其可能潜在地影响易感性轴以与p110β抑制相结合。
实验模型表明PTEN缺失可通过持续的p110β信号传导促进转移性扩散。为了支持这一假设，确认了从晚期TNBC患者分析的大多数远端转移样品中PTEN表达的丧失(n＝20)(图4)。另外，最近报道了一个案例研究，其中最初应答的患者最终产生对p110α抑制的抗性并且呈现出许多已经完全丧失PTEN表达的转移性病变(Juric等人(2014)Nature518：240-44)。总之，这些结果和临床观察表明，基于PI3Kβ的治疗方案可以防止TNBC进展为转移性疾病，或者即使原发性肿瘤不是PTEN缺陷型，也可以有效靶向转移性TNBC病变。有趣的是，我们观察到原代PP细胞在免疫受损小鼠(无胸腺裸鼠)中比在同基因免疫功能正常的小鼠(FVB品系；图5A)中生长的速度更快。此外，当静脉内注射到裸鼠中时，原代PP细胞在肺中形成许多转移性结节，而在免疫活性FVB小鼠中未观察到转移性结节(图5B-5C)。这些结果表明，这些肿瘤的生长可能受到免疫系统的初始排斥，但最终会出现抗性。此外，原代PPA肿瘤细胞在免疫活性FVB小鼠中以极快的速度生长，而原代PPB肿瘤细胞不能在免疫功能正常的小鼠中形成肿瘤(图6)，但在免疫缺陷的裸鼠中形成肿瘤。总之，这些结果表明Pten/p53缺陷型乳腺癌细胞需要PI3Kβ活性来抑制抗肿瘤免疫活性。
实施例3：组合的PI3Kβ和免疫检查点阻断延迟乳腺癌肿瘤生长
评估实施例2中描述的PTEN缺陷型乳腺癌模型中同种型选择性PI3K抑制和ICB免疫疗法的组合。具体而言，携带原位Pten；Trp53无效肿瘤的免疫活性FVB小鼠用免疫检查点阻断剂(ICB)抗小鼠PD-1单克隆抗体(α-mPD-1)单独或与BKM120(泛PI3K抑制剂)组合治疗。观察到对组合治疗的强烈应答，即显著延迟肿瘤生长(图7A)。此外，荧光激活细胞分选(FACS)分析显示，在组合治疗中CD8+T细胞浸润到肿瘤中的增加(图7B-7C)。
接下来，如上所述，测试使用PI3Kα特异性抑制剂BYL719和PI3Kβ特异性抑制剂KIN193(Ni等人(2012)Cancer Discov.2：425-433；Nylander等人(2012)J.Thromb.Haemost.10：2127-36)与抗小鼠PD-1单克隆抗体(α-mPD-1)组合的同种型特异性组合治疗。确定BYL719单独或与抗小鼠PD-1组合的治疗不影响肿瘤生长。同样，单独的KIN-193治疗仅略微影响肿瘤生长。相比之下，KIN-193与ICB组合令人惊讶地以强烈的方式抑制肿瘤生长(图8A)。值得注意的是，用这种组合疗法治疗的六个肿瘤中有三个消退到不可检测的水平(图8B)。这通过组织学分析证实，其证明肿瘤细胞性完全丧失(图8C)。如通过FACS所评定，也一致地观察到用组合的PI3Kβ抑制和ICB处理的小鼠的肿瘤中CD8+T细胞浸润增加(图8D)。
在第二组小鼠中证实了这些结果，所述小鼠产生了类似的结果。PI3Kβ抑制和ICB与抗小鼠PD-1单克隆抗体的组合强烈地抑制肿瘤生长，而与媒剂对照相比，单独的药剂均不会导致肿瘤生长的显著降低(图9A)。在此第二组中，在用组合治疗处理的六个病例中有两个中观察到完全应答，而另外两个病例显示几乎完全的应答(图9B)。
可以通过对感兴趣的标志物表达的IHC表征肿瘤来进一步进行分析，包括对CD8+细胞、可以减弱免疫应答的Foxp3+调节性T细胞和PD-1配体1(PD-L1，其通常被肿瘤细胞过度表达以抑制抗肿瘤免疫应答)的染色。一般认为，所述结果允许推断免疫抑制是否是由于增加的Treg浸润或适应性肿瘤应答。
此外，使用从Dharmacon获得的基于慢病毒的GIPZ shRNA构建体消除PP原代TNBC细胞中的PD-L1表达，所述构建体允许通过嘌呤霉素抗性和GFP表达进行选择。不受理论束缚，一般认为，具有沉默的PD-L1表达的PP细胞在原位移植到FVB小鼠中后显示较慢且减少的肿瘤生长。
由于观察到用组合的p110β抑制和ICB免疫疗法治疗的40-50％肿瘤完全缓解，通过继续治疗另外两个月，然后中断治疗，来确定此应答的稳健性。在此期间监测肿瘤生长和复发，并再监测10个月。在肿瘤复发的情况下，恢复治疗并评估应答性和/或抗性。
为了研究由组合的PI3Kβ和ICB诱导的基因表达的变化，在用单独的每种药剂或组合处理96小时的小鼠的肿瘤中分析基因表达水平。结果显示，与单独的任一种药剂相比，组合治疗使得与抗肿瘤免疫应答相关的富集基因特征，其具有大得多并且显著的程度(图10)。
此外，已经观察到应答和CD8+T细胞浸润之间的明确相关性(图11)，来自相同小鼠的肿瘤之间具有不同的应答，表明治疗功效不一定是由于全身因素。
为了将这些结果扩展到PTEN丧失的其它类型的乳腺癌，在由Her2/Neu过表达和携带野生型p53表达驱动的乳腺癌的Her2阳性模型中评估组合的PI3Kβ抑制和ICB。在此模型中，单独使用拉帕替尼(一种在临床环境中使用的小分子EGFR/Her2抑制剂)治疗并未显著影响肿瘤生长。类似地，用拉帕替尼和抗小鼠PD-1ICB治疗不影响肿瘤生长。然而，用拉帕替尼加抗小鼠PD-1和KIN-193(PI3Kβ抑制剂)治疗则显著地抑制肿瘤生长(图12)。这些结果表明组合的PI3Kβ抑制和ICB抑制多个乳腺癌模型中的PTEN无效肿瘤生长。
为了确定治疗前CD8+T细胞浸润是否与治疗应答相关，在治疗前、治疗期间和治疗后对PP肿瘤进行活组织检查，并通过FACS确定CD8+浸润。此外，为了研究T细胞群之间的转录差异是否导致应答差异，从用或不用组合的p110β靶向疗法和ICB处理的小鼠的肿瘤和脾(其代表全身淋巴细胞水平)中分离出CD8+T细胞，并通过转录组分析来分析基因表达。还在纯化的肿瘤和基质细胞中分析基因表达。使用磁性细胞分离和细胞分离试剂盒(MiltenyiBiotec)分离肿瘤和T细胞。不受理论束缚，一般认为，这些分析表明肿瘤微环境如何影响对免疫疗法的应答。这些结果为合理设计辅助疗法以增强抗肿瘤免疫应答提供了信息。
对于仅涉及两组的统计分析，使用学生t检验来评定统计学显著性。然而，大多数分析涉及至少三组(例如，PP、PPA和PPB原代TNBC细胞之间的基因表达差异)。对于涉及三组或更多组的统计分析，使用单向ANOVA，然后使用图基HSD事后分析(Tukey's HSDpost-hoc)。基于初步结果，在FVB小鼠中原位移植的PP肿瘤在端点达到平均体积1,365mm3(n＝8；SD＝702mm3)。为了通过组合PI3Kβ选择性抑制剂和ICB治疗实现降低60％，假设方差相似，则认为以下功效计算适用：
表4.预期值
Figure BDA0001989453360001661
表5.每组所需的样本量
Figure BDA0001989453360001662
因此，为了观察P值为0.05和功效水平为95％的统计学显著性差异，分析每种病况至少11个肿瘤。由于对照小鼠和上述用KIN-193和抗小鼠PD-1处理的小鼠之间平均减少72％，因此认为用于我们的功效计算的平均值的60％差异是保守的合适估值。对于涉及肿瘤移植的所有实验，所有小鼠在同一天从单细胞池移植。小鼠在两到三天后被加标签并随机分配到治疗组或对照组。所有肿瘤测量均由同一研究技术人员进行，以避免归因于方法学的变异。所有分析均由同一研究者进行，所述研究者对肿瘤测量不知情。在不太可能的与肿瘤负荷无关的端点之前死亡的情况下，弃去来自小鼠的数据，因为肿瘤的死后分析受到损害。
实施例4：患者来源的异种移植物(PD)TNBC模型
在实施例2和3中描述的PTEN缺陷型乳腺癌模型中的同种型选择性PI3K抑制和ICB免疫疗法的组合被扩展到使用来自晚期TNBC的一组原位患者来源的异种移植物的临床前癌症模型的分析中。PDX模型的主要优点之一是它们提供临床相关系统，因为在这些模型中发现的遗传和表观遗传的改变对应于临床中实际发现的改变。同样，PDX模型概括了在单个肿瘤内和在患者之间发现的异质性。由于PDX模型适用于分子和药理学操作，该系统可用于评估对新型癌症疗法的应答、检查应答者和非应答者肿瘤之间的遗传和表观遗传差异、研究抗性或复发的分子机制、甚至有助于为患者设计个性化治疗选项。因此，PDX模型提供了一种独特的强大的工具来评估新型癌症疗法，以及一个优秀的系统来验证从基因工程小鼠(GEM)模型处获得的结果。
已经建立了20多种来自原发性肿瘤和远端转移(即肺、肝和脑)的TNBC的PDX模型，其忠实地概括了ER、PR和HER2状态，如免疫组织化学(IHC)所示(图13A)。该集合通过收集新诊断病例的组织不断扩展。通过全外显子组测序对两种PDX模型的初步分析证明了这些模型保留了患者匹配的肿瘤的遗传特征(图13B)。另外，可以将荧光素酶基因引入肿瘤细胞中以允许转移性病变的活体成像(图13C)。
进行PTEN和磷酸化AKT的IHC染色，磷酸化AKT是PI3K的主要下游靶标和效应物。IHC载玻片由两名独立的病理学家以盲法评分，并且例如通过全外显子组测序鉴定PTEN以及其它相关基因中的潜在突变和拷贝数改变。RNA-Seq也用于检查基因表达谱。在PDX转移性TNBC模型上测试PI3Kβ选择性抑制剂，例如KIN-193。例如，将早期传代的带荧光素酶标签的转移性PDX肿瘤移植到NODSCIDgamma(NSG)小鼠的第三乳房脂肪垫中并如上所述进行处理。如上所述评定肿瘤生长，并使用荧光素酶成像检查转移性扩散。监测对PI3Kβ抑制的应答，并评估使用抑制剂对推定靶标(例如免疫检查点)的组合治疗。
不受理论束缚，一般认为，大多数转移性TNBC PDX模型表现出PTEN表达的丧失，与上述结果保持一致。基于所描述的基因工程小鼠(GEM)模型和源自人PTEN无效细胞系的肿瘤的体内研究，认为PTEN缺陷型PDX模型对PI3Kβ抑制敏感。进一步认为，两种临床前方法(即免疫功能正常的小鼠中的纯遗传模型和免疫缺陷小鼠中的患者来源的样品)的组合有效地相互补充，以分析同种型选择性PI3K抑制和ICB免疫疗法的组合的治疗效果。
实施例5：组合的PI3Kβ和免疫检查点阻断延迟卵巢癌肿瘤生长
由p53和PTEN共同丧失驱动的先前产生的卵巢癌(OvCa)GEM模型(PP OvCa)证明PPOvCa肿瘤依赖于PI3Kβ存活，因为具有额外p110β缺失的PP OvCa肿瘤(PPB OvCa)显示出显著地减少体内肿瘤生长，而额外的p110α缺失(PPA OvCa)不影响肿瘤生长(Schmit等人(2014)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 111：6395-400)。一致地，药理学p110β特异性抑制(KIN193)而非p110α特异性(BYL719)抑制显著地抑制肿瘤生长(Schmit等人(2014)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 111：6395-400)。
因此，通过删除PTEN和p53以及过表达Myc来开发适合于组合PI3Kβ和ICB的实验评估的浆液性卵巢癌模型。评估了在该PTEN缺陷型浆液性卵巢癌模型中的同种型选择性PI3Kβ抑制和ICB免疫疗法的组合。抗小鼠PD-1单克隆抗体对PD-1的阻断不影响肿瘤生长。尽管与媒剂对照相比，KIN193对PI3Kβ的抑制延迟了肿瘤生长，但组合的PI3Kβ抑制和ICB显著抑制了卵巢癌肿瘤的生长(图14)。这些结果表明，组合的PI3Kβ抑制和ICB抑制PTEN缺陷的卵巢癌中的PTEN无效肿瘤的生长。
实施例6：治疗PTEN缺陷型前列腺癌
由于PTEN病变在原发性前列腺癌(PCA)中如此常见，并且在晚期PCA中变得更加常见(和局灶性)，因此PTEN通路成为该疾病中有吸引力的治疗靶标。然而，早期的临床试验根本没有前途。这种失败的一个可能原因是由于缺乏对PI3K的关键催化同种型的理解(参见例如，Lu等人(2017)Nature 728-735)。使用GEM模型，证明了虽然由癌基因或受体酪氨酸激酶驱动的肿瘤依赖于p110α，但由PTEN丧失而驱动的肿瘤独特地依赖于p110β同种型。值得注意的是，前列腺试验使用了所谓的泛PI3K抑制剂，它实际上不能充分抑制p110β的作用。一般认为，除了驱动p110β激活之外，PTEN丧失还激活使细胞至少部分地抵抗PI3K疗法的通路。分子机制研究结果表明新的靶标应该与p110β抑制作用互补。主要目的是使用p110β抑制剂启动临床试验，以确认所述假设和从患者处获得有关肿瘤敏感性标志物以及初始和获得性抗性的数据中获得有价值的信息。此外，已经研究了将PTEN丧失与p110β激活相关联以获得足够的额外临床前数据的机制，以准备与p110β定向疗法和免疫疗法组合来攻击新机制靶标的试验。
具体而言，认为PTEN丧失与p110β激活独特地偶联的分子细节如下所示，这不仅解释了p110β如何在PTEN丧失的情况下被激活，而且还表明为什么相同的肿瘤可能很快变得部分或甚至完全抵抗PI3K抑制。相同的机制清楚地表明在PTEN无效肿瘤中在相同治疗或与PI3K/p110β组合下的其它治疗靶标。
步骤1：将p110β定位于脂筏
要解决的第一个问题是如何通过GPCR在生理条件下激活p110β。由于质膜是PI3K激活和发散生长因子信号整合的主要部位，因此最初的目的是了解质膜中的空间区室化如何有助于普遍存在的IA类磷酸肌醇3-激酶(PI3K)同种型p110α和p110β的功能。值得注意的是，已知GPCR位于脂筏中。发现p110β也以Rac1依赖性方式定位于膜筏。这种定位是G蛋白偶联受体(GPCR)激活Akt所必需的。因此，p110β的Rac1结合缺陷等位基因与筏的遗传靶向减轻了对GPCR信号传导、细胞生长和迁移的p110β-Rac1缔合的需求。相比之下，发现在生理性GPCR信号传导中不起作用的p110α仅存在于质膜的非筏区。然而，已显示，通过融合来自c-Lyn的筏靶向基序，p110α的筏靶向允许GPCR介导的p110α激活Akt。Rac通过脂筏中的定位在p110β激活中起关键作用，该发现导致了关于Rac在PTEN无效肿瘤中的作用的问题。值得注意的是，Rac仅与p110β相互作用而不与p110α相互作用(Fritsch等人(2013)Cell 153(5)：1050-63)。已知p110α实际上与Ras相互作用(Rodriguez-Viciana等人(1994)Nature 370：527-32；Rodriguez-Viciana等人(1996)EMBO J.15：2442-51)。因此，Rac激活是p110β激活的必要前奏，使得Rac成为p110β的上游激活因子。然而，Rac家族成员的独特之处在于，已知它们的激活因子Rac GEF被PI3K的磷酸肌醇产物激活。因此，Rac也是PI3K的下游效应因子。因此，Rac和p110β的相互作用构成了正反馈环的定义。在没有PTEN的情况下，没有什么可以阻止这个正反馈循环--一个典型的恶性循环。这意味着Rac抑制剂可能在PTEN无效肿瘤中非常有用(见下文)，并且可能是与p110β抑制剂的理想组合配偶体。这已经被证实并且于最近被公布(Yuzugullu等人(2015)Nat Commun.6：8501)，如图15所示。
值得注意的是，p110β依赖性PTEN无效肿瘤细胞也严重依赖于其脂筏的完整性。如下所述，降低胆固醇可以阻断组织培养和体内肿瘤中的PI3K信号传导和细胞生长。总的来说，这些发现提供了膜筏定位如何调节不同PI3K同种型的差异激活的机制解释，并提供了对PTEN无效肿瘤中补体p110b抑制的治疗方法的见解。
步骤2激活p110β
上面描述的关于Rac/p110β反馈循环的数据(详情参见Yuzugullu等人(2015)NatCommun.6：8501)留下了一个大问题：首先如何激活反馈循环。虽然理论上p100β可以通过其与GPCR的Gβγ亚基的相互作用而被激活，但是目前的数据表明通常不是这种情况。在没有PTEN的情况下，激活过程必须有更多的东西。新的p110β结合蛋白被认为解决了这种机制。使用taptag技术，CRKL被鉴定为新的PI3Kβ相互作用蛋白。在PTEN无效人癌细胞中沉默内源性CRKL表达，导致p110β依赖性PI3K信号传导和细胞增殖的减少。相比之下，CRKL的消耗不会损害p110α介导的信号传导或生长。此外，CRKL又与PTEN无效的癌细胞中酪氨酸磷酸化的p130Cas结合。已经显示，FAK/SRC家族激酶既被PTEN负调节又磷酸化和激活p130Cas(Zhang等人(2017)Cell Reports 20：1-9)。值得注意的是，p130CAS和CRKL也与激活Rac的GEF结合(Zhang等人(2017),见上文)。这些GEF又由p110β产生的3’磷酸化磷酸肌醇激活。这导致了图11中所示的模型。
该模型可以进行可测试的预测。在此模型中，PTEN丧失导致除PI3K之外的许多信号传导分子的激活。已知这些分子中的两种SRC和MEK/ERK使细胞对PI3K抑制具有抗性(Cheng等人(2016)Oncogene.35：2961-2970)。此外，抑制这些通路可以与PI3K抑制剂协同作用。如下所示，两种预测都被认为是真实的。
p110β抑制剂与靶向机制研究中发现的候选物的化合物的组合的临床前测试
由于靶向疗法作为单一药剂很少有效，因此研究了靶向疗法的新组合。尽管在小鼠中成功的抑制剂组合在临床试验中通常过于毒性，但是p110β抑制剂经验证具有比泛PI3K或p110α抑制剂低得多的中靶毒性。这部分是因为p110β在胰岛素作用中的作用小于p110α(Hill等人(2009)Endocrinology 150：4874-4882；Sopasakis等人(2010)CellMetabolism11：220-230；Xu等人(2010)Cell Metabolism 12：88-95)。实际上，可能有在体内的任何组织中都没有p110β活性的健康的成年小鼠。例如，骨髓(Gritsman等人(2014)JClin Invest.124：1794-1809；Yuzugullu等人(2015)Nat Commun.6：8501)、肝脏(Sopasakis等人(2010)Cell Metabolism.11：220-230)、乳腺(Utermark等人(2012)Genes&Development.26：1573-1586)、卵巢(Schmit等人(2014)Proc Natl Acad Sci USA.111：6395-6400)或前列腺(Jia等人(2008)Nature 454：776-779)中的组织特异性p110β缺失对靶组织或整个动物几乎没有影响。因此，认为包含p110β抑制剂的有效组合是可能的治疗选项。以下实施例说明了靶向p110β定位的抑制剂的鉴定，以及其激活模式和/或新的下游靶标。此外，临床样品用于测试该通道在人肿瘤中的参与(如下所述)。使用已建立的方案，包括动物研究和使用各种类器官模型的类器官测试。
靶向p110β定位
存在大量靶向p110β定位的可能的抑制剂组合。初步数据表明，Rac与其GEF之间相互作用的抑制剂有效阻断PTEN无效人肿瘤细胞系和基因工程小鼠(GEM)肿瘤模型的生长(图16；Yuzugullu等人(2015)Nat Commun.6：8501)。然而，PTEN无效肿瘤的生长也需要脂筏完整性(图17)。已经发现，他汀类药物(statins)在许多模型中在体外是有效的(图17和Cizmecioglu等人(2016)eLIFE 5：e17635)。此外，初步数据显示他汀类药物在PTEN无效肿瘤模型中是有效的，与现有文献一致(Platz等人(2006)J Natl Cancer Inst.98(24)：1819-25)。有效的体外遗传对照用于证明他汀类药物的效果实际上是通过p110β发生的(图17和Cizmecioglu等人(2016)eLIFE 5：e17635)。由于他汀类药物只能实现相对较小的胆固醇水平降低，因此还测试了其它药剂，包括LXR激动剂以及靶向PCSK9的抗体，其可以更大程度地降低胆固醇。此外，将检查预防模型，特别是在前列腺癌模型中。
靶向p110β激活和下游信号传导
已经表明，在某些情况下，通过PTEN丧失激活p110β的机制涉及Src家族成员。值得注意的是，公开的数据显示Src家族激酶被PTEN丧失激活(Dey等人(2008)Cancer Res.68(6)：1862-71)。Src抑制剂，例如达沙替尼(dasatinib)，在体外与p110β抑制协同作用。对于在Rac下游激活的PAK和MEK激酶的抑制剂也是如此。这样的抑制剂的体内验证将相应地进行。在临床研究中，PI3K或Akt抑制剂与MEK抑制剂的组合耐受性差。然而，由于p110β和Src抑制以及胆固醇降低都不具有内在毒性，因此进一步的组合也有耐受性并且更有效。将使用类似的方案测试和找到最佳给药方案。
免疫疗法加p110β抑制剂的测试
免疫肿瘤学代表了癌症疗法的巨大机会。此时，几种所谓的“检查点抑制剂”已被批准用于黑素瘤和肺癌。它们还在前列腺癌乳腺癌和脑癌中显示出前景(例如，Klein等人(2015)J.Immunol.194：213.10)。这种抑制剂类的优点在于它提供的缓解作用远远超过靶向抑制剂通常能够实现的作用。然而，只有一小部分特定类型的肿瘤有应答。这与靶向疗法相反，靶向疗法在正确基因型的肿瘤中给出广泛应答，但其应答通常具有有限的持续时间。因此，目前的研究旨在组合两种疗法的优点，以在易患肿瘤类型中实现广泛和持久的肿瘤应答。值得注意的是，PTEN丧失被认为是对检查点抑制剂的抗性模式，这可以解释为什么前列腺肿瘤对ICB的应答不如黑素瘤。靶向疗法的一个担忧是它们可能会不利地改变免疫功能。然而，已经表明，在造血干细胞中敲除p110β对免疫系统没有影响。此外，由于PTEN丧失似乎经常通过p110β抑制起作用，因此预期p110β会增加对检查点抑制的敏感性。如上所述，在三阴性乳腺癌的PTEN/P53(PP)敲除GEMN模型中，已经建立了有关将p110b敲除和抑制与抗PD1组合的效果的有希望的数据。如图5所示，PP TNBC肿瘤在免疫受损小鼠(无胸腺裸鼠)中比在同基因免疫功能正常的小鼠(FVB株)中以更快的速率生长。通过PI3K-p110β的信号传导对于介导免疫逃避至关重要，因为额外缺失p110β的PP TNBC肿瘤(PPB TNBC)在免疫功能正常的小鼠中不能生长，但在免疫缺陷小鼠中形成肿瘤(图18)。产生前列腺癌的PTEN无效/Erg同种异体移植模型，以在前列腺癌模型中测试这些结果。
测试两种疗法的最佳施用时间(目前的理论建议首先用靶向疗法治疗肿瘤，以引发肿瘤细胞杀伤，其产生先天免疫应答并引发后期适应性免疫疗法)。例如，欲测试组合疗法的不同序列和/或时间。通过比较每种测试疗法的治疗结果，得出组合疗法的最有效序列/时间。类似地，还测试了p110β抑制剂与其它免疫疗法(例如抗PDL1/2)的有效性。类似地测试上文所述靶向p110β定位、激活和信号传导的其它药物与免疫疗法的组合。此外，还在相同的模型中测试了增加“新抗原”负荷的效果。例如，DNA聚合酶ε，Polε的增变等位基因(P286R)被外源表达(Kane等人(2014)Cancer Res.74(7)：1895-901；Shinbrot等人(2014)Genome Res.24(11)：1740-50)，以产生匹配的肿瘤，其中新抗原的数量范围从很低到很高。如本申请所述，在非常大类的PTEN缺陷型人肿瘤中，多种方法用于最大化治疗功效，所述治疗将免疫疗法与PI3Kβ指导的定向疗法组合。
p110β抑制剂与AR靶向疗法组合的临床试验
批准的SPORE项目的临床试验正在进行中。从试验中建立类器官和切片培养物。来自试验的样品和现有样品用于测试机制的假设并验证组合疗法的临床前发现。为了测量病理学样品中的通路激活，将用于通路分析的多重方法用于来自先前试验的新鲜组织和固定的样品。例如，在临床前研究中观察到的PI3K通路激活对检查点阻断应答的任何影响的潜在机制的验证将用试验样品进行。此研究形成了将p110β抑制与检查点阻断组合的第二次试验的基础。除了测试p110β抑制对肿瘤对免疫系统可见性的影响之外，还要测试抑制剂对免疫系统本身的影响。临床前研究表明，敲除p110β对免疫系统功能影响不大。然而，在测试临床候选p110β抑制剂后，抑制可能在体内有效。
以引用的方式并入
本申请提及的所有出版物、专利和专利申请均通过引用整体并入本申请，如同每个单独的出版物、专利或专利申请被具体和单独地指出通过引用并入。在矛盾的情况下，以本申请(包括本申请中的任何定义)为准。
另外通过引用整体并入的是任何多核苷酸和多肽序列，其参考与公共数据库中的条目相关的登录号，例如由基因组研究所(TIGR)在万维网tigr.org和/或国家生物技术信息中心(NCBI)在万维网ncbi.nlm.nih.gov维护的那些。
等同物
本领域技术人员将认识到或者能够使用不超过常规的实验来确定本申请所述的本发明具体实施例的许多等同物。这些等同物旨在涵盖于权利要求内。
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Claims (27)

1.磷酸肌醇3-激酶同种型β（PI3Kβ）抑制剂(-)-2-[[(1R)-1-[7-甲基-2-(4-吗啉基)-4-氧代-4H-吡啶并[1,2-a]嘧啶-9-基]乙基]氨基]苯甲酸（KIN193）和抗PD-1单克隆抗体或其抗原结合片段在制备用于治疗罹患缺乏p53和缺乏磷酸酶和张力蛋白同源物（PTEN）的癌症的个体的药物中的用途，其中所述癌症是乳腺癌或卵巢癌,其中所述抗原结合片段选自Fv、Fab、F(ab’)2、Fab’、dsFv、scFv或sc(Fv)2。
2.如权利要求1所述的用途，其中所述抗PD-1单克隆抗体或其抗原结合片段是鼠的、嵌合的、人源化的、复合的或人的。
3.如权利要求1或2所述的用途，其中所述抗PD-1单克隆抗体或其抗原结合片段被可检测地标记，包含效应结构域或包含Fc结构域。
4.如权利要求1或2所述的用途，其中所述抗PD-1单克隆抗体或其抗原结合片段与细胞毒性剂缀合。
5.如权利要求4所述的用途，其中所述细胞毒性剂选自下组：化疗剂、生物剂、毒素和放射性同位素。
6.如权利要求1所述的用途，其中所述KIN-193和所述抗PD-1单克隆抗体或其抗原结合片段减少所述癌症中增殖细胞的数量和/或减小所述癌症的肿瘤体积或大小。
7.如权利要求1所述的用途，其中所述KIN-193和所述抗PD-1单克隆抗体或其抗原结合片段增加所述癌症的肿瘤内活CD8+ T细胞的数量。
8.如权利要求1所述的用途，其中所述KIN-193和所述抗PD-1单克隆抗体或其抗原结合片以药学上可接受的制剂施用。
9.如权利要求1所述的用途，其中进一步包括用于治疗所述癌症的其他治疗剂或方案。
10.如权利要求1所述的用途，其中所述PTEN缺陷包含编码PTEN的基因组核酸序列的突变。
11.如权利要求10所述的用途，其中所述突变选自下组：错义突变、无义突变、移码突变、插入突变、缺失突变和重排突变。
12.如权利要求1所述的用途，其中所述PTEN缺陷确定为非常低或无效，或者所述PTEN缺陷是编码PTEN蛋白的基因组核酸序列的突变，并且所述突变是PTEN密码子C71、R130、R233、D268、T319或X70或磷酸酶或C2结构域的错义突变、无义突变、移码突变、插入突变、缺失突变或重排突变。
13.如权利要求12所述的用途，其中所述PTEN缺陷确定为非常低或无效是通过免疫组织化学所评定的。
14.如权利要求12所述的用途，其中所述PTEN缺陷是无效突变。
15.如权利要求14所述的用途，其中所述PTEN缺陷是种系或体细胞PTEN无效突变。
16.如权利要求1所述的用途，其中所述p53缺陷是编码p53蛋白的基因组核酸序列的突变，并且所述突变是p53密码子L45、Y126、P151、S166、R175、C176、H179、G187、H193、L194、R196、R213、Y220、C242、G245、R248、R249、R273、R280、D281、R282、E286、E294或反式激活、DNA结合或寡聚化结构域的错义突变、无义突变、移码突变、插入突变、缺失突变或重排突变。
17.如权利要求1所述的用途，其中所述p53缺陷是无效突变。
18.如权利要求17所述的用途，其中所述p53缺陷是种系或体细胞p53无效突变。
19.如权利要求1所述的用途，其中所述乳腺癌是三阴性乳腺癌(TNBC)。
20.如权利要求19所述的用途，其中所述TNBC是转移性TNBC。
21.如权利要求1所述的用途，其中所述卵巢癌是浆液性卵巢癌。
22.如权利要求1所述的用途，其中所述个体是所述乳腺癌或卵巢癌的动物模型。
23.如权利要求22所述的用途，其中所述动物模型是人源性乳腺癌或卵巢癌的原位异种移植动物模型。
24.如权利要求23所述的用途，其中所述动物模型是小鼠模型。
25.如权利要求1所述的用途，其中所述个体是哺乳动物。
26.如权利要求25所述的用途，其中所述哺乳动物是小鼠或人。
27.如权利要求26所述的用途，其中所述哺乳动物是人。
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