KR20230018429A - 세포에서 cnnm4의 발현을 억제하기 위한 핵산 - Google Patents

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호르헤 시몬 이스피노자
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Abstract

본 발명은 CNNM4(사이클린 M4) 유전자 발현을 방해하거나 억제하는 핵산 생성물에 관한 것이다. 또한 비-알코올성 지방간 질환 (NAFLD), 비-알코올성 지방간염 (NASH), 간 지방증, 간 섬유증, 간경변증, 간암 및 마그네슘 조절장애와 연관된 다른 질환을 포함하여 간 질환과 같은 질환의 치료에서의 CNNM4 억제의 치료적 용도에 관한 것이다.

Description

세포에서 CNNM4의 발현을 억제하기 위한 핵산
본 발명은 CNNM4(사이클린 M4) 유전자 발현을 방해하거나 억제하는 핵산 생성물에 관한 것이다. 또한 질환, 특히 비-알코올성 지방간 질환 (NAFLD), 비-알코올성 지방간염 (NASH), 간 지방증, 간 섬유증, 간경변증, 간암 및 마그네슘 조절장애와 연관된 다른 질환과 같은 간 질환의 치료에서의 CNNM4 억제의 치료적 용도에 관한 것이다.
상보적인 염기쌍을 통해 발현된 mRNA에 결합할 수 있는 이중 가닥 RNA(dsRNA)는 "RNA 간섭(RNAi)"으로 불리는 메커니즘에 의해 유전자 발현을 차단하는 것으로 나타났다(Fire 등, 1998, Nature. 1998 Feb 19;391(6669):806-11 및 Elbashir 등, 2001, Nature. 2001 May 24;411(6836):494-8). 짧은 dsRNA는 척추동물을 포함한 많은 유기체에서 유전자 특이적, 전사 후 사일런싱(silencing)을 지시하고 유전자 기능을 연구하는 데 유용한 도구가 되었다. RNAi는 RNA 유도 사일런싱 복합체(RISC), RISC 복합체에 적재된 사일런싱 트리거에 충분한 상보성 또는 상동성을 갖는 메신저 RNA를 분해하는 서열 특이적 다성분 뉴클레아제에 의해 매개된다. siRNA, 안티센스 RNA 및 마이크로 RNA와 같은 간섭 RNA는 유전자 사일런싱, 즉 mRNA 분자의 분해를 통해 단백질의 유전자 번역을 억제하여 단백질의 형성을 방지하는 올리고뉴클레오티드이다. 유전자 사일런싱 제제는 의약에서 치료적 적용을 위해 점점 더 중요해지고 있다.
문헌[Watts and Corey in the Journal of Pathology (2012; Vol 226, p 365-379)]에 따르면, 핵산 사일런싱 트리거를 설계하는 데 사용할 수 있는 알고리즘이 있지만 이러한 모든 알고리즘에는 심각한 제한이 있다. 알고리즘은 표적 mRNA의 3차 구조 또는 RNA 결합 단백질의 관여와 같은 요인을 고려하지 않기 때문에 강력한 siRNA를 식별하기 위해 다양한 실험 방법이 필요할 수 있다. 따라서 최소한의 표적외 효과로 강력한 핵산 사일런싱 트리거를 발견하는 것은 복잡한 과정이다. 이러한 고도로 하전된 분자의 약제학적 개발을 위해서는, 경제적으로 합성되고, 표적 조직에 분포되고, 세포에 들어가서 허용 가능한 독성 한계 내에서 기능할 수 있어야 한다.
만성 간 질환은 다양한 병인의 간 병리 그룹을 포함한다. 비-알코올성 지방간 질환(NAFLD)은 전 세계 인구에서 20-30%의 발병률을 가지며(Younossi 등, Hepatology 64, 73-84 (2016)), 간 장애의 스펙트럼을 포함한다. 간에 지방이 축적되는 단순 지방증에서 염증과 간헐적인 섬유증을 동반한 지방증을 특징으로 하는 비-알코올성 지방간염(NASH)까지 진행될 수 있다. 지방증은 비교적 양성이고 가역적인 상태로 간주되지만, 섬유증, 간경변 및 간세포 암종(HCC)으로 발전할 수 있는 지방간 및 간 세포 손상을 특징으로 하는 만성 진행성 질환인 NASH로 진행될 위험이 있다 (Povsic 등, Adv. Ther. 36, 1574-1594 (2019)). NASH 환자의 약 20%는 간 기능장애를 유발하는 세포외 기질 침착을 특징으로 하는 비가역적 병리인 간경변이 발생한다. 간 섬유증 환자의 약 4분의 1은 간암의 가장 흔한 형태이며 세계에서 사망율 및 이환율의 다섯 번째 원인인 HCC를 발달시킨다 (Younossi 등, Clin. Gastroenterol. Hepatol. 4,748-755 (2018)). 진단 시 현재 이용 가능한 치료 개입에 적합한 환자는 거의 없으며 생존율은 진단 후 평균 6-20개월에 불과하다. 따라서 이들 및 유사한 만성 질환의 치료에 대한 명확한 미충족 수요가 있다.
간도 급성 손상을 입을 수 있다. 이 기관은 약물 대사 및 청소능에서 중추적 역할을 하며 약물 과다용량으로 인해 약물 유발 간 손상(DILI)이 발생할 수 있다. DILI는 미국과 대부분의 유럽에서 급성 간부전 및 이식의 주요 원인이다. 연간 약 30,000명의 환자가 아세트아미노펜(APAP) 유래 간 손상을 일으키고 이 중 29%가 간 이식을 받는다. 현재, DILI의 표준 요법은 N-아세틸시스테인을 사용한 치료이다. 그러나 이 치료법은 간을 성공적으로 구출하는 경우가 드물기 때문에 새로운 요법이 필요하다.
Mg2+ 이온 형태의 마그네슘은 세포에서 가장 풍부한 2가 양이온이며 약 300가지 효소 반응의 보조인자로 필요하다 (Baaij 등, Physiol. Rev. 1920, 1-46 (2015)). 여러 단백질이 이 과정에 참여하여 세포막을 가로지르는 양이온의 흐름을 허용한다 (Jahnen-Dechent Clin. Kidney J. 5, i3-i14 (2012); Funato and Miki, J. Biochem. 165(3):219-225). 2019)). 마그네슘 항상성은 적절한 일일 섭취량과 함께 신장 재흡수와 소변 배출 사이의 균형에 의해 유지된다. 마그네슘 조절장애는 인슐린 저항성 및 당뇨병, 심혈관 합병증 및 비만과 같은 NAFLD의 여러 동반이환에 존재한다 (Ozcan 등, Science (80). 306, 457 LP - 461 (2004)). 또한, Mg2+의 결핍은 염증 반응 유발, 미토콘드리아 기능장애 및 항산화제 시스템 활성 감소와도 관련이 있다 (Barbagallo et al Metabolism. 63, 502-509 (2014)). 사이클린 M (CNNM) 단백질은 여러 기관의 세포막을 통해 마그네슘 이온을 수송하는 데 중요한 역할을 한다(Funato and Miki 2019). 본 발명자들은 놀랍게도 NASH, 간경변 및 간세포 암종(HCC)과 같은 간 질환이 있는 환자의 간 뿐만 아니라 NASH, 약물 유도 간 손상(DILI) 및 HCC에 대한 전임상 모델에서 CNNM4가 과발현된다는 것을 발견하였다. 따라서 마그네슘 섭동을 일으킬 수 있으며 많은 유형의 간 질환과 같이 이 양이온의 조절장애와 연관된 질환의 원인 및 진행에 기여할 수 있다. 본 발명자들은 또한 간에서의 CNNM4 억제가 NAFLD의 전임상 모델에서 지질 함량을 감소시키고 따라서 NAFLD의 치료에 유익할 수 있음을 발견하였다. 그 효과는 간에서 Mg2+ 항상성의 회복에 의해 적어도 부분적으로 달성될 가능성이 있다. 따라서 CNNM4의 발현 감소는 간과 관련된 병리, 특히 NAFLD, 간 섬유증, HCC 및 대사 증후군과 같은 마그네슘 섭동과 연관된 병리를 치료하기 위한 유망한 새로운 치료 전략이다.
NAFLD에 대한 현재 치료법은 운동 프로그램을 시작하고 체중을 줄이도록 권장하는 것과 같이 환자의 건강에 해로운 생활 습관을 바꾸는 데 중점을 둔다. 그러나 환자의 장기적인 순응도는 종종 문제가 된다. 따라서 이러한 질환 및 다른 간 질환의 효과적인 치료를 위한 약리적 개입이 필요하다.
신장 또는 신장 섬유증은 거의 모든 종류의 만성 간 질환에서 발생하는 세포외 기질(ECM)의 과도한 축적으로 인해 발생한다. 병인은 투석이나 신장 이식이 필요한 파괴적인 장애인 말기 신부전으로 이어지는 진행성 과정이다. 본 발명자들은 또한 신장 섬유증 동물 모델에서 CNNM4 과발현을 발견하였다. 따라서 신장 섬유증은 간 및/또는 신장에서 CNNM4를 억제함으로써 부분적으로 치료될 수 있다.
본 발명자들은 또한 놀랍게도 폐암에서 CNNM4 과발현을 관찰하였으며, CNNM4 억제는 그러한 암을 치료하는 새로운 방식일 수 있다.
요약하면, 본 발명자들은 놀랍게도 CNNM4가 인간 샘플과 동물 모델 모두에서 상이한 병리 그룹에서 과발현된다는 것을 발견하였다. 이러한 병리는 간 질환 예컨대 NAFLD, 간경변 및 HCC, 또는 급성 간 병리 예컨대 DILI를 포함한다. CNNM4 과발현은 신장 및 폐 질환에서도 관찰되었다. 이러한 질환의 대부분은 널리 퍼져 있지만 효과적인 치료법이 부족하다. 본 발명자들은 이러한 질환을 치료하는 새로운 방법으로서 RNA 간섭에 의한 CNNM4 억제를 사용하는 것을 제안하고 그러한 치료에 사용하기 위한 CNNM4 siRNA를 제공한다.
본 발명의 한 측면은 CNNM4의 발현을 억제하기 위한 이중 가닥 핵산이고, 핵산은 제1 가닥 및 제2 가닥을 포함하고, 제1 가닥 서열은 서열번호: 243, 267, 277, 279, 287, 317, 319, 325, 333, 345, 347, 349, 361, 367, 369, 371, 377, 401, 411, 413, 415, 420, 421, 524, 526, 528, 530, 532, 534, 536, 538, 540, 542, 544, 546, 548, 549, 550, 551 및 552로부터 선택된 서열 중 어느 하나로부터 3개 이하의 뉴클레오티드만큼 상이한 적어도 15개 뉴클레오티드의 서열을 포함하는, 이중 가닥 핵산.
한 측면은 약제로서 또는 연관 진단 또는 치료 방법에서 사용하기 위한, 바람직하게는 세포에서 CNNM4의 발현을 억제할 수 있는 이중 가닥 핵산과 관련이 있고, 핵산은 바람직하게는 제1 가닥 및 제2 가닥을 포함하거나 그로 이루어지고, 바람직하게는 제1 가닥은 RNA 간섭을 매개하기 위해 CNNM4 mRNA에 충분히 상보적인 서열을 포함한다.
한 측면은 본 명세서에 개시된 바와 같은 핵산 및 용매 (바람직하게는 물) 및/또는 전달 비히클 및/또는 생리적으로 허용가능한 부형제 및/또는 담체 및/또는 염 및/또는 희석제 및/또는 완충액 및/또는 보존제를 포함하는 조성물과 관련이 있다.
한 측면은 본 명세서에 개시된 바와 같은 핵산 및 예를 들어, 올리고뉴클레오티드, 소분자, 단일클론성 항체, 다클론성 항체 및 펩티드로부터 선택된 추가 치료제를 포함하는 조성물과 관련이 있다.
한 측면은 약제로서 또는 관련 방법에서 사용하기 위한 본 명세서에 개시된 바와 같은 핵산 또는 이를 포함하는 조성물에 관한 것이다.
한 측면은 질환, 장애 또는 증후군을 예방, 앓을 위험의 감소 또는 치료에 사용하기 위한 본 명세서에 개시된 바와 같은 핵산 또는 이를 포함하는 조성물에 관한 것이다.
한 측면은 질환, 장애 또는 증후군의 예방, 앓을 위험의 감소, 또는 치료에 있어서 본 명세서에 개시된 바와 같은 핵산 또는 이를 포함하는 조성물의 용도에 관한 것이며, 질환, 장애 또는 증후군은 바람직하게는 NASH이다
한 측면은 질환, 장애 또는 증후군을 예방하거나, 앓을 위험의 감소시키거나 치료하는 방법과 관련이 있고, 이 방법은 본 명세서에 개시된 핵산 또는 조성물의 약제학적 유효 용량 또는 양을 필요로 하는 개체에게 투여하는 것을 포함하고, 여기서 핵산 또는 조성물은 대상체에게 피하, 정맥내 또는 경구, 직장, 폐, 근육내 또는 복강내 투여에 의해 투여된다.
본 발명은 CNNM4의 발현된 RNA 전사체의 일부와 상동성 및/또는 상보적인 서열을 포함하는 이중 가닥 핵산 및 그의 조성물에 관한 것이다. 이들 핵산, 또는 그의 접합체 또는 조성물은 CNNM4 유전자 산물의 감소된 발현이 바람직한 다양한 질환, 장애 및 증후군의 치료 및 예방에 사용될 수 있다.
본 발명의 제1 측면은 바람직하게는 세포에서 CNNM4의 발현을 억제하기 위한 이중 가닥 핵산이고, 핵산은 제1 가닥 및 제2 가닥을 포함하고, 제1 가닥 서열은 서열번호: 243, 267, 277, 279, 287, 317, 319, 325, 333, 345, 347, 349, 361, 367, 369, 371, 377, 401, 411, 413, 415, 420, 421, 524, 526, 528, 530, 532, 534, 536, 538, 540, 542, 544, 546, 548, 549, 550, 551 및 552로부터 선택된 서열 중 어느 하나로부터 3개 이하의 뉴클레오티드만큼 상이한 적어도 15개 뉴클레오티드의 서열을 포함하는, 이중 가닥 핵산. 무엇보다도 이러한 핵산은 전-임상 및 임상 개발에 관련된 다양한 종에서 활성이 있고/있거나 관련된 표적외 효과가 거의 없다는 이점이 있다. 관련된 비표적 효과가 거의 없다는 것은 핵산이 의도된 표적을 특이적으로 억제하고 다른 유전자를 유의하게 억제하지 않거나 치료적으로 허용되는 수준에서 하나 또는 소수의 다른 유전자만 억제한다는 것을 의미한다.
바람직하게는, 제1 가닥 서열은 3개 이하의 뉴클레오티드, 바람직하게는 2개 이하의 뉴클레오티드, 더 바람직하게는 1개 이하의 뉴클레오티드가 상이하고, 가장 바람직하게는 서열번호: 243, 267, 277, 279, 287, 317, 319, 325, 333, 345, 347, 349, 361, 367, 369, 371, 377, 401, 411, 413, 415, 420, 421, 524, 526, 528, 530, 532, 534, 536, 538, 540, 542, 544, 546, 548, 549, 550, 551 및 552로부터 선택된 서열 중 어느 하나로부터의 임의의 뉴클레오티드가 상이하지 않은 적어도 16, 더 바람직하게는 적어도 17, 더욱 더 바람직하게는 적어도 18 및 가장 바람직하게는 모두 19개의 뉴클레오티드의 서열을 포함한다.
바람직하게는, 핵산의 제1 가닥 서열은 서열번호: 243, 267, 277, 279, 287, 317, 319, 325, 333, 345, 347, 349, 361, 367, 369, 371, 377, 401, 411, 413, 415, 420, 421, 524, 526, 528, 530, 532, 534, 536, 538, 540, 542, 544, 546, 548, 549, 550, 551 및 552로부터 선택된 서열 중 하나로 구성된다. 그러나 서열은 뉴클레오티드의 동일성을 변경하지 않는 다수의 핵산 변형에 의해 변형될 수 있다. 예를 들어, 핵산의 백본 또는 당 잔기의 변형은 염기 자체가 참조 서열에서와 동일하게 유지되기 때문에 뉴클레오티드의 동일성을 변경하지 않는다.
본 명세서에서 참조 서열에 따른 서열을 포함하는 핵산은 핵산이 참조 서열에 정의된 순서대로 연속 뉴클레오티드의 서열을 포함함을 의미한다.
해당 서열에서 변형된 것으로 나타나지 않는 다수의 뉴클레오타이드를 포함하거나 이로 구성된 참조 서열이 본 명세서에서 언급될 때, 동일한 참조는 또한 2, 3, 4, 5, 6, 7개 또는 그 초과(모두 포함)과 같은 1개, 여러 개의 뉴클레오티드가 2'-OMe, 2'-F와 같은 변형에 의해 변형되어 리간드, 또는 링커에 연결되거나, 3' 말단 또는 5' 말단 변형 또는 임의의 다른 변형을 갖는 동일한 뉴클레오티드 서열을 포괄한다. 이는 또한 천연 포스포디에스테르 연결에 의해 또는 임의의 다른 연결 예컨대 포스포로티오에이트 또는 포스포로디티오에이트 연결에 의해 2개 이상의 뉴클레오티드가 서로 연결된 서열을 포괄한다.
이중 가닥 핵산은 제1 가닥과 제1 가닥이 길이의 적어도 일부에 걸쳐 서로 혼성화하므로 생리적 조건, 예를 들어 PBS에서 37℃, 각 가닥의 1 μM 농도에서 이중체 영역을 형성할 수 있는 핵산이다. 제1 및 제2 가닥은 바람직하게는 서로 혼성화할 수 있고 따라서 적어도 15개 뉴클레오티드, 바람직하게는 16, 17, 18 또는 19개 뉴클레오티드의 영역에 걸쳐 이중체 영역을 형성할 수 있다. 이 이중체 영역은 바람직하게는 왓슨-크릭(Watson-Crick) 염기쌍 및/또는 워블(wobble) 염기쌍(GU 염기쌍과 같은)에 기초한 두 가닥 사이의 뉴클레오티드 염기쌍을 포함한다. 이중체 영역 내의 두 가닥의 모든 뉴클레오티드는 이중체 영역을 형성하기 위해 서로 염기쌍을 형성할 필요가 없다. 두 가닥의 뉴클레오티드 서열 사이의 특정 수의 불일치, 결실 또는 삽입이 허용된다. 제1 또는 제2 가닥의 한쪽 말단에 있는 오버행 또는 이중 가닥 핵산의 양쪽 말단에 있는 쌍을 이루지 않은 뉴클레오티드도 가능하다. 이중 가닥 핵산은 생리적 조건 하에서 안정한 이중 가닥 핵산인 것이 바람직하고, 바람직하게는 예를 들어 각 가닥의 1 μM 농도에서 PBS에서 45℃ 이상, 바람직하게는 50℃ 이상, 보다 바람직하게는 55℃ 이상의 용융 온도(Tm)를 갖는다.
생리적 조건 하의 안정한 이중 가닥 핵산은 예를 들어 각 가닥의 1 μM 농도에서 PBS에서 45℃ 이상, 바람직하게는 50℃ 이상, 보다 바람직하게는 55℃ 이상의 용융 온도(Tm)를 갖는 이중 가닥 핵산이다.
제1 가닥 및 제2 가닥은 바람직하게 i) 길이의 적어도 일부, 바람직하게는 길이 모두의 적어도 15개 뉴클레오티드에 걸쳐, ii) 제1 가닥의 전장에 걸쳐, iii) 제2 가닥의 전장에 걸쳐 또는 iv) 제1 및 제2 가닥 모두의 전장에 걸쳐 이중체 영역을 형성할 수 있다(즉, 서로 상보적임). 특정 길이에서 서로 상보적인 가닥은 해당 길이에서 왓슨-클릭 또는 워블 염기쌍을 통해 가닥이 서로 염기쌍을 이룰 수 있음을 의미한다. 그 길이의 각 뉴클레오티드는 생리적 조건 하에서 안정한 이중 가닥 뉴클레오티드가 형성될 수 있는 한 전체 주어진 길이에 걸쳐 다른 가닥의 대응물과 반드시 염기 쌍을 이룰 필요는 없다. 그러나 특정 구현예에서 길이의 각각의 뉴클레오티드가 전체 주어진 길이에 걸쳐 다른 가닥의 대응물과 염기 쌍을 이룰 수 있는 경우가 바람직하다.
제2 가닥과 표적 서열 사이 또는 제1 가닥과 제2 가닥 사이의 특정 수의 불일치, 결실 또는 삽입은 siRNA의 맥락에서 용인될 수 있으며 특정 경우에는 RNA 간섭 (예를 들어, 억제) 활성을 증가시킬 가능성도 있다.
본 발명에 따른 핵산의 억제 활성은 제1 가닥의 전부 또는 일부와 표적 핵산의 일부 사이의 이중체 영역의 형성에 의존한다. 제1 가닥과 이중체 영역을 형성하는 표적 핵산 부분(이는 (제1 가닥과 표적 서열 사이에 형성된 제1 염기쌍으로 시작하여 제1 가닥과 표적 서열 사이에 형성된 마지막 염기쌍으로 끝나는 것으로 정의됨)은 표적 핵산 서열 또는 간단히 표적 서열입니다. 제1 가닥과 제2 가닥 사이에 형성된 이중체 영역은 제1 가닥과 표적 서열 사이에 형성된 이중체 영역과 동일할 필요는 없다. 즉, 제2 가닥은 표적 서열과 다른 서열을 가질 수 있지만; 제1 가닥은 적어도 생리적 조건 하에서 제2 가닥과 표적 서열 모두와 이중체 구조를 형성할 수 있어야 한다.
제1 가닥과 표적 서열 사이의 상보성은 완벽할 수 있다(즉, 표적 서열과 비교하여 제1 가닥에서 뉴클레오티드 불일치 또는 삽입 또는 결실이 없는 100% 동일성).
제1 가닥과 표적 서열 사이의 상보성은 완벽하지 않을 수 있다. 상보성은 약 70% 내지 약 100%일 수 있다. 보다 구체적으로, 상보성은 적어도 70%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 및 중간 값일 수 있다.
제1 가닥과 표적 서열의 상보적 서열 사이의 동일성은 약 75% 내지 약 100% 범위일 수 있다. 보다 구체적으로, 핵산이 CNNM4의 발현을 감소시키거나 억제할 수 있는 경우 상보성은 적어도 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 및 중간 값일 수 있다.
제1 가닥과 표적 서열 사이의 상보성이 100% 미만인 핵산은 CNNM4의 발현을 제1 가닥과 표적 서열 사이에 완벽한 상보성을 갖는 핵산과 동일한 수준으로 감소시킬 수 있다. 대안적으로, 완벽한 상보성을 갖는 핵산에 의해 달성되는 감소 수준의 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 100%인 수준으로 CNNM4의 발현을 감소시킬 수 있다.
한 측면에서, 본 개시내용의 핵산은 다음과 같은 핵산이다:
(a) 제1 가닥 서열은 표 1의 제1 가닥 서열 중 임의의 하나와 3개 이하의 뉴클레오티드만큼 상이한 서열을 포함하고 선택적으로 제2 가닥 서열은 표의 동일한 라인에 있는 제2 가닥 서열과 3개 이하의 뉴클레오티드만큼 상이한 서열을 포함하고;
(b) 제1 가닥 서열은 표 1의 제1 가닥 서열 중 임의의 하나와 2개 이하의 뉴클레오티드만큼 상이한 서열을 포함하고 선택적으로 제2 가닥 서열은 표의 동일한 라인에 있는 제2 가닥 서열과 2개 이하의 뉴클레오티드만큼 상이한 서열을 포함하고;
(c) 제1 가닥 서열은 표 1의 제1 가닥 서열 중 임의의 하나와 1개 이하의 뉴클레오티드만큼 상이한 서열을 포함하고 선택적으로 제2 가닥 서열은 표의 동일한 라인에 있는 제2 가닥 서열과 1개 이하의 뉴클레오티드만큼 상이한 서열을 포함하고;
(d) 제1 가닥 서열은 표 1의 제1 가닥 서열 중 임의의 하나의 5' 말단으로부터의 뉴클레오티드 2 내지 17에 상응하는 서열을 포함하고 선택적으로 제2가닥 서열은 상기 표의 동일 라인에 있는 제2 가닥 서열의 5' 말단부터 뉴클레오티드 2 내지 17에 해당하는 서열을 포함하고;
(e) 제1 가닥 서열은 표 1의 제1 가닥 서열 중 임의의 하나의 5' 말단으로부터의 뉴클레오티드 2 내지 8에 상응하는 서열을 포함하고 선택적으로 제2가닥 서열은 상기 표의 동일 라인에 있는 제2 가닥 서열의 5' 말단부터 뉴클레오티드 2 내지 8에 해당하는 서열을 포함하고;
(f) 제1 가닥 서열은 표 1의 제1 가닥 서열 중 임의의 하나의 5' 말단으로부터의 뉴클레오티드 2 내지 9에 상응하는 서열을 포함하고 선택적으로 제2가닥 서열은 상기 표의 동일 라인에 있는 제2 가닥 서열의 5' 말단부터 뉴클레오티드 2 내지 9에 해당하는 서열을 포함하고;
(g) 제1 가닥 서열은 표 1의 제1 가닥 서열 중 임의의 하나의 5' 말단으로부터의 뉴클레오티드 2 내지 19에 상응하는 서열을 포함하고 선택적으로 제2가닥 서열은 상기 표의 동일 라인에 있는 제2 가닥 서열의 5' 말단부터 뉴클레오티드 1 내지 18에 해당하는 서열을 포함하고;
(h) 제1 가닥 서열은 표 1의 제1 가닥 서열 중 임의의 하나의 서열을 포함하고, 선택적으로 제2 가닥 서열은 표의 동일 라인에 있는 제2 가닥 서열의 서열을 포함하거나; 또는
(i) 제1 가닥 서열은 표 1의 제1 가닥 서열 중 임의의 하나로 구성되고, 선택적으로 제2 가닥 서열은 표의 동일 라인에 있는 제2 가닥 서열의 서열로 구성되며;
여기서 표 1은 다음과 같다:
Figure pct00001
Figure pct00002
Figure pct00003
Figure pct00004
한 측면에서, 핵산은 다음과 같은 핵산이다:
(a) 제1 가닥 서열은 서열번호: 325의 서열을 포함하고 선택적으로 제2 가닥 서열은 서열번호: 326의 서열을 포함하거나; 또는
(b) 제1 가닥 서열은 서열번호: 371의 서열을 포함하고 선택적으로 제2 가닥 서열은 서열번호: 372의 서열을 포함하거나; 또는
(c) 제1 가닥 서열은 서열번호: 411의 서열을 포함하고 선택적으로 제2 가닥 서열은 서열번호: 278의 서열을 포함하거나; 또는
(d) 제1 가닥 서열은 서열번호: 413의 서열을 포함하고 선택적으로 제2 가닥 서열은 서열번호: 280 또는 414의 서열을 포함하거나; 또는
(e) 제1 가닥 서열은 서열번호: 420의 서열을 포함하고 선택적으로 제2 가닥 서열은 서열번호: 362의 서열을 포함하거나; 또는
(f) 제1 가닥 서열은 서열번호: 421의 서열을 포함하고 선택적으로 제2 가닥 서열은 서열번호: 270의 서열을 포함하거나; 또는
(g) 제1 가닥 서열은 서열번호: 371로 구성되고 선택적으로 제2 가닥 서열은 서열번호: 372로 구성되거나; 또는
(h) 제1 가닥 서열은 서열번호: 411로 구성되고 선택적으로 제2 가닥 서열은 서열번호: 278 또는 412로 구성되거나; 또는
(i) 제1 가닥 서열은 서열번호: 413으로 구성되고 선택적으로 제2 가닥 서열은 서열번호: 280 또는 414로 구성되거나; 또는
(j) 제1 가닥 서열은 서열번호: 420로 구성되고 선택적으로 제2 가닥 서열은 서열번호: 362로 구성되거나; 또는
(k) 제1 가닥 서열은 서열번호: 421로 구성되고 선택적으로 제2 가닥 서열은 서열번호: 370로 구성되거나; 또는
(l) 제1 가닥 서열은 서열번호: 548로 구성되고 선택적으로 제2 가닥 서열은 서열번호: 529로 구성되거나; 또는
(m) 제1 가닥 서열은 서열번호: 549로 구성되고 선택적으로 제2 가닥 서열은 서열번호: 533으로 구성되거나; 또는
(n) 제1 가닥 서열은 서열번호: 550로 구성되고 선택적으로 제2 가닥 서열은 서열번호: 541로 구성되거나; 또는
(o) 제1 가닥 서열은 서열번호: 551로 구성되고 선택적으로 제2 가닥 서열은 서열번호: 543으로 구성되거나; 또는
(p) 제1 가닥 서열은 서열번호: 548로 구성되고 선택적으로 제2 가닥 서열은 서열번호: 547로 구성된다.
한 측면에서, 제1 가닥의 5'-최말단 뉴클레오티드가 A 또는 U 이외의 뉴클레오티드인 경우, 이 뉴클레오티드는 A 또는 U로 대체된다. 바람직하게는, 제1 가닥의 5'-최말단 뉴클레오티드가 U 이외의 뉴클레오티드인 경우, 이 뉴클레오티드는 U로, 보다 바람직하게는 U로 5' 비닐포스포네이트로 대체된다.
한 측면에서, 제1 가닥의 5' 말단에 있는 제2 뉴클레오티드와 제2 가닥의 상응하는 뉴클레오티드(불일치가 없다면 염기쌍을 형성할 뉴클레오티드) 사이에 불일치가 있다. 예를 들어, 제1 가닥의 5' 뉴클레오티드는 U일 수 있고 제2 가닥의 상응하는 뉴클레오티드는 A 이외의 임의의 뉴클레오티드일 수 있다. 이 경우 두 뉴클레오티드는 전통적 왓슨-클릭 염기쌍을 형성할 수 없고 두 뉴클레오티드 사이에 불일치가 있다.
본 발명의 핵산이 예를 들어 표 1에 주어진 바와 같이 참조 제1 가닥 및/또는 제2 가닥 서열의 전체 서열을 포함하지 않거나, 하나 또는 둘 모두의 가닥이 상응하는 참조 서열과 1개, 2개 또는 3개의 뉴클레오티드에 의해 상이한 경우, 핵산은 비교 가능한 실험에서 전체 제1 가닥 및 제2 가닥 참조 서열을 포함하는 상응하는 핵산의 억제 활성과 비교하여 CNNM4 억제 활성의 바람직하게는 적어도 30%, 더 바람직하게는 적어도 50%, 더 바람직하게는 적어도 70%, 더 바람직하게는 적어도 80%, 더욱 더 바람직하게는 적어도 90%, 더욱 더 바람직하게는 적어도 95% 및 가장 바람직하게는 적어도 100%을 유지한다.
일 측면에서, 핵산은 하기인 핵산이다: 제1 가닥 서열은 서열번호: 325의 서열을 포함하거나 바람직하게는 그로 구성되고, 선택적으로 제2 가닥 서열은 적어도 15, 바람직하게는 적어도 16, 더 바람직하게는 적어도 17, 더욱 더 바람직하게는 적어도 18의 서열 및 가장 바람직하게는 서열번호: 326의 서열의 모든 뉴클레오티드를 포함하거나 그로 구성되거나; 또는 제1 가닥 서열은 서열번호: 371의 서열을 포함하거나 바람직하게는 그로 구성되고, 선택적으로 제2 가닥 서열은 적어도 15, 바람직하게는 적어도 16, 더 바람직하게는 적어도 17, 더욱 더 바람직하게는 적어도 18의 서열 및 가장 바람직하게는 서열번호: 372의 서열의 모든 뉴클레오티드를 포함하거나 그로 구성되거나; 또는 제1 가닥 서열은 서열번호: 411의 서열을 포함하거나 바람직하게는 그로 구성되고, 선택적으로 제2 가닥 서열은 적어도 15, 바람직하게는 적어도 16, 더 바람직하게는 적어도 17, 더욱 더 바람직하게는 적어도 18의 서열 및 가장 바람직하게는 서열번호: 478 또는 412의 서열의 모든 뉴클레오티드를 포함하거나 그로 구성되거나; 또는 제1 가닥 서열은 서열번호: 412의 서열을 포함하거나 바람직하게는 그로 구성되고, 선택적으로 제2 가닥 서열은 적어도 15, 바람직하게는 적어도 16, 더 바람직하게는 적어도 17, 더욱 더 바람직하게는 적어도 18의 서열 및 가장 바람직하게는 서열번호: 280 또는 414의 서열의 모든 뉴클레오티드를 포함하거나 그로 구성되거나; 또는 제1 가닥 서열은 서열번호: 420의 서열을 포함하거나 바람직하게는 그로 구성되고, 선택적으로 제2 가닥 서열은 적어도 15, 바람직하게는 적어도 16, 더 바람직하게는 적어도 17, 더욱 더 바람직하게는 적어도 18의 서열 및 가장 바람직하게는 서열번호: 362의 서열의 모든 뉴클레오티드를 포함하거나 그로 구성되거나; 또는 제1 가닥 서열은 서열번호: 421의 서열을 포함하거나 바람직하게는 그로 구성되고, 선택적으로 제2 가닥 서열은 적어도 15, 바람직하게는 적어도 16, 더 바람직하게는 적어도 17, 더욱 더 바람직하게는 적어도 18의 서열 및 가장 바람직하게는 서열번호: 370의 서열의 모든 뉴클레오티드를 포함하거나 그로 구성되거나; 또는 제1 가닥 서열은 서열번호: 548의 서열을 포함하거나 바람직하게는 그로 구성되고, 선택적으로 제2 가닥 서열은 적어도 15, 바람직하게는 적어도 16, 더 바람직하게는 적어도 17, 더욱 더 바람직하게는 적어도 18의 서열 및 가장 바람직하게는 서열번호: 529의 서열의 모든 뉴클레오티드를 포함하거나 그로 구성되거나; 또는 제1 가닥 서열은 서열번호: 549의 서열을 포함하거나 바람직하게는 그로 구성되고, 선택적으로 제2 가닥 서열은 적어도 15, 바람직하게는 적어도 16, 더 바람직하게는 적어도 17, 더욱 더 바람직하게는 적어도 18의 서열 및 가장 바람직하게는 서열번호: 533의 서열의 모든 뉴클레오티드를 포함하거나 그로 구성되거나; 또는 제1 가닥 서열은 서열번호: 550의 서열을 포함하거나 바람직하게는 그로 구성되고, 선택적으로 제2 가닥 서열은 적어도 15, 바람직하게는 적어도 16, 더 바람직하게는 적어도 17, 더욱 더 바람직하게는 적어도 18의 서열 및 가장 바람직하게는 서열번호: 541의 서열의 모든 뉴클레오티드를 포함하거나 그로 구성되거나; 또는 제1 가닥 서열은 서열번호: 551의 서열을 포함하거나 바람직하게는 그로 구성되고, 선택적으로 제2 가닥 서열은 적어도 15, 바람직하게는 적어도 16, 더 바람직하게는 적어도 17, 더욱 더 바람직하게는 적어도 18의 서열 및 가장 바람직하게는 서열번호: 543의 서열의 모든 뉴클레오티드를 포함하거나 그로 구성되거나; 또는 제1 가닥 서열은 서열번호: 552의 서열을 포함하거나 바람직하게는 그로 구성되고, 선택적으로 제2 가닥 서열은 적어도 15, 바람직하게는 적어도 16, 더 바람직하게는 적어도 17, 더욱 더 바람직하게는 적어도 18의 서열 및 가장 바람직하게는 서열번호: 547의 서열의 모든 뉴클레오티드를 포함하거나 그로 구성된다.
한 측면에서, 핵산은 바람직하게는 세포에서 CNNM4의 발현을 억제하기 위한 이중 가닥 핵산이고, 핵산은 제1 핵산 가닥 및 제2 핵산 가닥을 포함하고, 제1 가닥은 서열번호: 240, 242, 244, 250, 252, 254, 256, 258, 260, 262, 264, 266, 268, 270, 272, 274, 276, 278, 280, 282, 284, 286, 288, 290, 292, 294, 296, 298, 300, 302, 304, 306, 308, 310, 312, 314, 316, 318, 320, 322, 324, 326, 328, 330, 332, 334, 336, 338, 340, 342, 344, 346, 348, 350, 352, 354, 356, 358, 360, 362, 364, 366, 368, 370, 372, 374, 376, 378, 380, 382, 384, 386, 388, 390, 392, 394, 396, 398, 400, 402, 404, 406, 408, 410, 412, 414, 416, 423, 425, 427, 429, 431, 433, 435, 437, 439, 441, 443, 445, 447, 449, 525, 527, 529, 531, 533, 535, 537, 539, 541, 543, 545 및 547로부터 선택된 서열의 핵산에 생리적 조건 하에서 혼성화될 수 있고; 그리고
여기서 제2 가닥은 생리적 조건 하에서 제1 가닥에 혼성화하여 이중체 영역을 형성할 수 있다.
생리적 조건 하에서 혼성화할 수 있는 핵산은 적어도 이중체 영역을 형성하기 위해 가닥에서 대향 뉴클레오티드의 적어도 일부 사이에서 염기쌍, 바람직하게는 왓슨-크릭 또는 워블 염기쌍을 형성할 수 있는 핵산이다. 이러한 이중 가닥 핵산은 바람직하게는 생리적 조건(예를 들어 각 가닥의 1 μM 농도에서 37℃의 PBS에서) 하에서 안정한 이중 가닥 핵산이며, 이는 이러한 조건 하에서 두 가닥이 서로에 대해서 혼성화된 상태를 유지함을 의미한다. 이중 가닥 뉴클레오티드의 Tm은 바람직하게는 45℃ 이상, 바람직하게는 50℃ 이상, 보다 바람직하게는 55℃ 이상이다.
본 발명의 한 측면은 바람직하게는 세포에서 CNNM4의 발현을 억제하기 위한 핵산에 관한 것이며, 핵산은 3개 이하의 뉴클레오티드, 바람직하게는 2개 이하의 뉴클레오티드, 더 바람직하게는 1개 이하의 뉴클레오티드가 상이하고, 가장 바람직하게는 표 4의 서열 중 임의의 것으로부터 임의의 뉴클레오티드가 상이하지 않은 적어도 15, 바람직하게는 적어도 16, 더 바람직하게는 적어도 17, 더욱 더 바람직하게는 적어도 18의 제1 서열 및 가장 바람직하게는 모든 뉴클레오티드를 포함하고, 제1 서열은 생리적 조건 하에 CNNM4 유전자 전사체 (예컨대 mRNA)에 혼성화될 수 있다. 바람직하게는, 핵산은 추가로 3개 이하의 뉴클레오티드, 바람직하게는 2개 이하의 뉴클레오티드, 더 바람직하게는 1개 이하의 뉴클레오티드가 상이하고 가장 바람직하게는 표 4의 서열 중 임의의 것으로부터 임의의 뉴클레오티드가 상이하지 않은 제2 적어도 15, 바람직하게는 적어도 16, 더 바람직하게는 적어도 17, 더욱 더 바람직하게는 적어도 18의 서열 및 가장 바람직하게는 모든 뉴클레오티드를 포함하고, 제2 서열은 생리적 조건 하에서 제1 서열에 혼성화할 수 있고 바람직하게는 핵산은 RNAi 경로를 통해 CNNM4 발현을 억제할 수 있는 siRNA이다.
한 측면은 바람직하게는 CNNM4의 발현을 억제하기 위한, 표 2에 개시된 바와 같은 임의의 이중 가닥 핵산과 관련이 있고, 단, 이중 가닥 핵산은 CNNM4의 발현을 억제할 수 있다. 이러한 핵산은 모두 다양한 뉴클레오티드 변형을 가진 siRNA이다. 그들 중 일부는 간세포와 같은 GalNAc 수용체를 가진 세포를 특이적으로 표적화할 수 있는 GalNAc 모이어티를 포함하는 접합체이다.
한 측면은 약제로서 또는 연관 진단 또는 치료 방법에서 사용하기 위한, 바람직하게는 세포에서 CNNM4의 발현을 억제할 수 있는 이중 가닥 핵산과 관련이 있고, 핵산은 바람직하게는 제1 가닥 및 제2 가닥을 포함하거나 그로 이루어지고, 바람직하게는 제1 가닥은 RNA 간섭을 매개하기 위해 CNNM4 mRNA에 충분히 상보적인 서열을 포함한다.
본 명세서에 기재된 핵산은 바람직하게는 세포에서 CNNM4의 발현을 억제할 수 있다. 핵산은 CNNM4 발현을 완전히 억제할 수 있어 핵산 처리 시 남아 있는 발현이 0%가 될 수 있다. 핵산은 CNNM4 발현을 부분적으로 억제할 수 있다. 부분적 억제는, CNNM4 발현이 비교 가능한 조건 하에서 본 발명의 핵산의 부재와 비교하여 15%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 이상, 또는 중간 값으로 감소됨을 의미한다. 억제 수준은 처리된 샘플을 미처리 샘플 또는 예를 들어 CNNM4를 표적화하지 않는 siRNA와 같은 대조군으로 처리된 샘플과 비교함으로써 측정될 수 있다. 억제는 CNNM4 mRNA 및/또는 단백질 수준 또는 CNNM4 존재 또는 활성과 상관관계가 있는 바이오마커 또는 지표의 수준을 측정하여 측정할 수 있다. 이는 본 명세서에 기재된 핵산으로 시험관 내에서 처리되었을 수 있는 세포에서 측정될 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 억제는 세포, 예컨대 간세포, 또는 조직, 예컨대 간 조직, 또는 기관, 예컨대 간에서, 또는 체액 예컨대 혈액, 혈청, 림프에서 또는 본 명세서에 개시된 핵산으로 이전에 치료된 대상체로부터 임의의 다른 몸체부 또는 체액에서 측정될 수 있다. 바람직하게는, CNNM4 발현의 억제는 이상적인 조건(적절한 농도 및 조건에 대한 예 참조) 하에서 본 명세서에 개시된 이중 가닥 RNA로 시험관내 처리 24 또는 48시간 후 CNNM4-발현 세포에서 측정된 CNNM4 mRNA 수준을 처리되지 않았거나 모의 처리되었거나 동일하거나 적어도 비교 가능한 조건 하에서 대조군 이중 가닥 RNA로 처리된 대조군 세포에서 측정된 CNNM4 mRNA 수준과 비교함으로써 결정된다.
본 발명의 한 측면은 제1 가닥 및 제2 가닥은 주위에 고리를 이루는 핵산의 단일 가닥 상에 존재하여 제1 가닥 및 제2 가닥이 서로 혼성화할 수 있도록 하고, 이로써 이중체 영역을 갖는 이중 가닥 핵산을 형성하는 핵산에 관한 것이다.
바람직하게는, 핵산의 제1 가닥 및 제2 가닥은 별도의 가닥이다. 2개의 별도의 가닥은 바람직하게는 각각 17-25개 길이의 뉴클레오티드, 더 바람직하게는 18-25개 길이의 뉴클레오티드이다. 두 가닥은 길이가 같거나 다를 수 있다. 제1 가닥은 17-25개 길이의 뉴클레오티드일 수 있고, 바람직하게는 18-24개 길이의 뉴클레오티드일 수 있고, 18, 19, 20, 21, 22, 23 또는 24개 길이의 뉴클레오티드일 수 있다 가장 바람직하게는, 제2 가닥은 19개 길이의 뉴클레오티드이다. 제2 가닥은 독립적으로 17-25개 길이의 뉴클레오티드일 수 있고, 바람직하게는 18-24개 길이의 뉴클레오티드일 수 있고, 18, 19, 20, 21, 22, 23 또는 24개 길이의 뉴클레오티드일 수 있다 보다 바람직하게는, 제2 가닥은 18 또는 19 또는 20개 길이의 뉴클레오티드, 및 가장 바람직하게는 it는 19개 길이의 뉴클레오티드이다.
바람직하게는, 핵산의 제1 가닥 및 제2 가닥은 17-25개 길이의 뉴클레오티드의 이중체 영역을 형성한다. 보다 바람직하게는 이중체 영역은 18-24개 길이의 뉴클레오티드이다. 이중체 영역은 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 또는 25개 길이의 뉴클레오티드일 수 있다. 가장 바람직한 구현예에서, 이중체 영역은 18 또는 19개 길이의 뉴클레오티드이다. 이중체 영역은 본 명세서에서 제2 가닥의 뉴클레오티드와 염기쌍을 이루는 제1 가닥의 5'-최말단 뉴클레오티드와 제2 가닥의 뉴클레오티드와 염기쌍을 이루는 제1 가닥의 3'-최말단 뉴클레오티드 사이의 영역으로 정의된다. 이중체 영역은 다른 가닥의 뉴클레오티드와 염기 쌍을 이루지 않는 가닥 중 하나 또는 둘 모두에 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 이는 제1 가닥 및/또는 제2 가닥 상에 1개, 2개, 3개 또는 4개의 이러한 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 그러나, 바람직하게는 이중체 영역은 17-25개의 연속적인 뉴클레오티드 염기쌍으로 구성된다. 즉, 다른 가닥의 뉴클레오티드에 모두 염기쌍을 이루는 두 가닥 모두에 17-25개의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 것이 바람직한다. 더 바람직하게는 이중체 영역은 18 또는 19개, 가장 바람직하게는 18개의 연속적인 뉴클레오티드 염기쌍으로 구성된다.
본 명세서에 개시된 각각의 구현예에서, 핵산은 양 말단에서 무딘 말단일 수 있고; 한 말단에는 오버행이 있고 다른 말단에는 무딘 말단이 있거나, 또는 양쪽 말단에 오버행이 있다.
핵산은 한 말단에 오버행을 가질 수 있고 다른 말단에 무딘 말단을 가질 수 있다. 핵산은 양 말단에 오버행을 가질 수 있다. 핵산은 양쪽 말단이 무딘 말단일 수 있다. 핵산은 말단에서 제1 가닥의 5' 말단 및 제2 가닥의 3' 말단 또는 제1 가닥의 3' 말단 및 제2 가닥의 5' 말단에서 무딘 말단일 수 있다.
핵산은 3' 또는 5' 말단에 오버행을 포함할 수 있다. 핵산은 제1 가닥에 3' 오버행을 가질 수 있다. 핵산은 제2 가닥에 3' 오버행을 가질 수 있다. 핵산은 제1 가닥에 5' 오버행을 가질 수 있다. 핵산은 제2 가닥에 5' 오버행을 가질 수 있다. 핵산은 제1 가닥의 5' 말단과 3' 말단 모두에 오버행을 가질 수 있다. 핵산은 제2 가닥의 5' 말단과 3' 말단 모두에 오버행을 가질 수 있다. 핵산은 제1 가닥에 5' 오버행이 있고 제2 가닥에 3' 오버행이 있을 수 있다. 핵산은 제1 가닥에 3' 오버행이 있고 제2 가닥에 5' 오버행이 있을 수 있다. 핵산은 제1 가닥에 3' 오버행이 있고 제2 가닥에 3' 오버행이 있을 수 있다. 핵산은 제1 가닥에 5' 오버행이 있고 제2 가닥에 5' 오버행이 있을 수 있다.
제2 가닥 또는 제1 가닥의 3' 말단 또는 5' 말단의 오버행은 1, 2, 3, 4 및 5개 길이의 뉴클레오티드로 구성될 수 있다. 선택적으로 오버행은 변형되거나 변형되지 않을 수 있는 1개 또는 2개의 뉴클레오티드로 구성될 수 있다.
한 구현예에서, 제1 가닥의 5' 말단은 1개, 2개 또는 3개의 뉴클레오티드, 바람직하게는 1개의 뉴클레오티드의 단일 가닥 오버행이다.
바람직하게는 핵산은 siRNA이다. siRNA는 RNA 간섭(RNAi) 경로를 통해 표적 유전자의 발현을 억제할 수 있는 짧은 간섭 또는 짧은 사일런싱 RNA이다. 억제는 전사 후 표적 유전자의 mRNA 전사체의 표적화된 분해를 통해 일어난다. siRNA는 RISC 복합체의 일부를 형성한다. RISC 복합체는 표적 서열과 제1(안티센스) 가닥의 서열 상보성에 의해 표적 RNA를 특이적으로 표적으로 한다.
바람직하게는 핵산은 CNNM4를 억제할 수 있다. 억제는 바람직하게는 RNA 간섭(RNAi) 메커니즘에 의해 매개된다. 바람직하게는, 핵산은 적어도 50% 억제율, 더 바람직하게는 적어도 70%, 더 바람직하게는 적어도 80%, 더욱 더 바람직하게는 적어도 90%, 더욱 더 바람직하게는 적어도 95% 및 가장 바람직하게는 100% 억제율의 효능으로 RNA 간섭을 매개한다(즉, 그의 표적을 억제할 수 있다). 억제 효능은 바람직하게는 CNNM4 특이적 siRNA로 처리된 간세포와 같은 세포의 CNNM4 mRNA 수준을 비교 가능한 실험에서 대조군으로 처리된 세포에서 CNNM4 mRNA 수준과 비교함으로써 측정된다. 대조군은 비-CNNM4 표적화 siRNA를 사용하거나 siRNA 없이 처리할 수 있다. 따라서 핵산 또는 적어도 핵산의 제2 가닥은 바람직하게는 RISC 복합체에 통합될 수 있다. 그 결과, 따라서 핵산 또는 적어도 핵산의 제1 가닥은, 핵산 또는 적어도 핵산의 제1 가닥이 적어도 부분적으로 상보적인 특정 표적 RNA로 RISC 복합체를 안내할 수 있다. 그 다음 RISC 복합체는 이 표적 RNA를 특이적으로 절단하고 결과적으로 RNA 줄기가 되는 유전자의 발현을 억제한다.
핵산 변형
본 명세서에서 논의된 핵산은 비변형 RNA 뿐만 아니라 예를 들어 효능 또는 안정성을 개선하기 위해 변형된 RNA를 포함한다. 비변형 RNA는 핵산의 구성요소, 즉 당, 염기 및 인산염 모이어티가 자연에서 발생하는 것과 동일하거나 본질적으로 동일한 분자, 예를 들어 인체에서 자연적으로 발생하는 분자를 지칭한다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "변형된 뉴클레오티드"는 뉴클레오티드의 구성요소 중 하나 이상, 즉 당, 염기 및 인산염 모이어티가 자연에서 발생하는 것과 상이한 뉴클레오티드를 지칭한다. 용어 "변형된 뉴클레오티드"는 또한 어떤 경우에는 당, 염기 또는 인산염 모이어티와 같은 뉴클레오티드의 필수 구성요소가 부족하거나 대체물이 있기 때문에 용어의 엄격한 의미에서 뉴클레오티드가 아닌 분자를 지칭한다 그러한 변형된 뉴클레오티드를 포함하는 핵산은 핵산의 뉴클레오티드 중 하나 이상이 뉴클레오티드의 필수 구성요소가 결여되거나 대체된 변형된 뉴클레오티드로 대체되더라도 여전히 핵산인 것으로 이해되어야 한다.
본 발명의 핵산의 변형은 일반적으로 천연 RNA 분자에 고유한 시험관 내 및 생체 내 안정성 및 생체이용성을 포함하나 이에 제한되지 않는 잠재적 한계를 극복하는 강력한 도구를 제공한다. 본 발명에 따른 핵산은 화학적 변형에 의해 변형될 수 있다. 변형된 핵산은 또한 인간에서 인터페론 활성을 유도할 가능성을 최소화할 수 있다. 변형은 표적 세포에 대한 핵산의 기능적 전달을 추가로 향상시킬 수 있다. 본 발명의 변형된 핵산은 제1 가닥 또는 제2 가닥 중 하나 또는 둘 다의 하나 이상의 화학적으로 변형된 리보뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 리보뉴클레오티드는 염기, 당 또는 인산염 모이어티의 화학적 변형을 포함할 수 있다. 리보핵산은 핵산 또는 염기 유사체의 치환 또는 삽입에 의해 변형될 수 있다.
본 발명의 설명 전체에서 "동일하거나 공통적인 변형"은 A, G, C 또는 U가 메틸 기(2'-OMe) 또는 플루오로 기(2'-F)과 같은 기로 변형되는 임의의 뉴클레오티드에 대한 동일한 변형을 의미한다. 예를 들어, 2'-F-dU, 2'-F-dA, 2'-F-dC, 2'-F-dG는 모두 2'-OMe-rU, 2'-OMe-rA; 2'-OMe-rC; 2'-OMe-rG와 같이 모두 동일하거나 일반적인 변형으로 간주된다. 대조적으로, 2'-F 변형은 2'-OMe 변형에 비해 다른 변형이다.
바람직하게는, 핵산의 제1 및/또는 제2 가닥의 적어도 하나의 뉴클레오티드는 변형된 뉴클레오티드, 바람직하게는 2'-F 변형된 뉴클레오티드와 같은 비-자연 발생 뉴클레오티드이다.
변형된 뉴클레오티드는 당 그룹이 변형된 뉴클레오티드일 수 있다. 2' 하이드록실 기(OH)는 여러 가지 다른 "옥시" 또는 "데옥시" 치환기로 변형되거나 대체될 수 있다.
"옥시"-2' 하이드록실 기 변형의 예는 알콕시 또는 아릴옥시(OR, 예를 들어, R=H, 알킬(예를 들어 메틸), 사이클로알킬, 아릴, 아르알킬, 헤테로아릴 또는 당); 폴리에틸렌글리콜(PEG), O(CH2CH20)nCH2CH2OR; 2' 하이드록실이 예를 들어 메틸렌 다리에 의해 동일한 리보스 당의 4' 탄소에 연결된 "잠긴(locked)" 핵산(LNA); O-AMINE (AMINE=NH2, 알킬아미노, 디알킬아미노, 헤테로사이클릴, 아릴아미노, 디아릴 아미노, 헤테로아릴 아미노, 또는 디헤테로아릴 아미노, 에틸렌 디아민, 또는 폴리아미노) 및 아미노알콕시, O(CH2)nAMINE, (예를 들어, AMINE=NH2, 알킬아미노, 디알킬아미노, 헤테로사이클릴, 아릴아미노, 디아릴 아미노, 헤테로아릴 아미노, 또는 디헤테로아릴 아미노, 에틸렌 디아민, 또는 폴리아미노)를 포함한다.
"데옥시" 변형은 수소, 할로겐, 아미노 (예를 들어, NH2, 알킬아미노, 디알킬아미노, 헤테로사이클릴, 아릴아미노, 디아릴 아미노, 헤테로아릴 아미노, 디헤테로아릴 아미노, 또는 아미노산); NH(CH2CH2NH)nCH2CH2-아민 (아민=NH2, 알킬아미노, 디알킬아미노, 헤테로사이클릴, 아릴아미노, 디아릴 아미노, 헤테로아릴 아미노, 또는 디헤테로아릴 아미노), ―NHC(또는 (R=알킬, 사이클로알킬, 아릴, 아랄킬, 헤테로아릴 또는 당), 시아노; 머캅토; 알킬-티오-알킬; 티오알콕시; 및 예를 들어 아미노 작용기로 선택적으로 치환될 수 있는 알킬, 사이클로알킬, 아릴, 알케닐 및 알키닐을 포함한다. 특정 구현예의 다른 치환기는 2'-메톡시에틸, 2'-OCH3, 2'-O-알릴, 2'-C-알릴 및 2'-플루오로를 포함한다.
당 그룹은 또한 리보스의 상응하는 탄소와 반대되는 입체화학적 배열을 갖는 하나 이상의 탄소를 함유할 수 있다. 따라서 변형된 뉴클레오티드는 아라비노스와 같은 당을 함유할 수 있다.
변형된 뉴클레오티드는 또한 C-1'에 핵염기가 없는 "무염기성" 당을 포함할 수 있다. 이러한 무염기성 당은 구성성분 당 원자 중 하나 이상에서 변형을 추가로 함유할 수 있다.
2' 변형은 하나 이상의 포스페이트 뉴클레오시드간 링커 변형 (예를 들어, 포스포로티오에이트 또는 포스포로디티오에이트)과 함께 사용될 수 있다.
본 발명의 핵산의 하나 이상의 뉴클레오티드는 변형될 수 있다. 핵산은 적어도 하나의 변형된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 변형된 뉴클레오티드는 제1 가닥에 있을 수 있다. 변형된 뉴클레오티드는 제2 가닥에 있을 수 있다. 변형된 뉴클레오티드는 이중체 영역에 있을 수 있다. 변형된 뉴클레오티드는 이중체 영역 외부, 즉 단일 가닥 영역에 있을 수 있다. 변형된 뉴클레오티드는 제1 가닥에 있을 수 있고 이중체 영역 외부에 있을 수 있다. 변형된 뉴클레오티드는 제2 가닥에 있을 수 있고 이중체 영역 외부에 있을 수 있다. 제1 가닥의 3'-말단 뉴클레오티드는 변형된 뉴클레오티드일 수 있다. 제2 가닥의 3'-말단 뉴클레오티드는 변형된 뉴클레오티드일 수 있다. 제1 가닥의 5'-말단 뉴클레오티드는 변형된 뉴클레오티드일 수 있다. 제2 가닥의 5'-말단 뉴클레오티드는 변형된 뉴클레오티드일 수 있다.
본 발명의 핵산은 1개의 변형된 뉴클레오티드를 가질 수 있거나, 본 발명의 핵산은 약 2-4개의 변형된 뉴클레오티드를 가질 수 있거나, 핵산은 약 4-6개의 변형된 뉴클레오티드, 약 6-8개의 변형된 뉴클레오티드, 약 8-10개의 변형된 뉴클레오티드, 약 10-12개의 변형된 뉴클레오티드, 약 12-14개의 변형된 뉴클레오티드, 약 14-16개의 변형된 뉴클레오티드 약 16-18개의 변형된 뉴클레오티드, 약 18-20개의 변형된 뉴클레오티드, 약 20-22개의 변형된 뉴클레오티드, 약 22-24개의 변형된 뉴클레오티드, 약 24-26개의 변형된 뉴클레오티드 또는 약 26-28개의 변형된 뉴클레오티드를 가질 수 있다. 각각의 경우에 상기 변형된 뉴클레오티드를 포함하는 핵산은 상기 변형된 뉴클레오티드가 없는 동일한 핵산 또는 그 반대의 경우와 비교하여 그 활성의 적어도 50%를 유지한다. 핵산은 동일한 핵산에 비해 활성의 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100% 및 중간 값을 유지할 수 있지만 변형된 뉴클레오티드, 또는 상기 변형된 뉴클레오티드 없이 동일한 핵산의 활성의 100% 초과를 가질 수 있다.
변형된 뉴클레오티드는 퓨린 또는 피리미딘일 수 있다. 퓨린의 적어도 절반이 변형될 수 있다. 피리미딘의 적어도 절반이 변형될 수 있다. 모든 퓨린은 변형될 수 있다. 모든 피리미딘은 변형될 수 있다. 변형된 뉴클레오티드는 3' 말단 데옥시 티민 (dT) 뉴클레오티드, 2'-O-메틸 (2'-OMe) 변형된 뉴클레오티드, 2' 변형된 뉴클레오티드, 2' 데옥시 변형된 뉴클레오티드, 잠긴 뉴클레오티드, 무염기성 뉴클레오티드, 2' 아미노 변형된 뉴클레오티드, 2' 알킬 변형된 뉴클레오티드, 2'-데옥시-2'-플루오로 (2'-F) 변형된 뉴클레오티드, 모폴리노 뉴클레오티드, 포스포르아미데이트, 비-천연 염기 포함 뉴클레오티드, 5'-포스포로티오에이트 기를 포함하는 뉴클레오티드, 5' 포스페이트 또는 5' 포스페이트 모방체를 포함하는 뉴클레오티드 및 콜레스테릴 유도체 또는 도데칸산 비스데실아미드 기에 연결된 말단 뉴클레오티드로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
핵산은 변형된 염기를 포함하는 뉴클레오티드를 포함할 수 있으며, 여기서 염기는 2-아미노아데노신, 2,6-디아미노퓨린, 이노신, 피리딘-4-온, 피리딘-2-온, 페닐, 슈도우라실, 2, 4, 6-트리메톡시 벤젠, 3-메틸 우라실, 디하이드로우리딘, 나프틸, 아미노페닐, 5-알킬시티딘 (예를 들어, 5-메틸시티딘), 5-알킬우리딘 (예를 들어, 리보티미딘), 5-할로우리딘 (예를 들어, 5-브로모우리딘), 6-아자피리미딘, 6-알킬피리미딘 (예를 들어 6-메틸우리딘), 프로핀, 퀘우오신, 2-티오우리딘, 4-티오우리딘, 와이부토신, 와이부톡소신, 4-아세틸시티딘, 5-(카복시하이드록시메틸)우리딘, 5'-카복시메틸아미노메틸-2-티오우리딘, 5-카복시메틸아미노메틸우리딘, 베타-D-갈락토실퀘우오신, 1-메틸아데노신, 1-메틸이노신, 2,2-디메틸구아노신, 3-메틸시티딘, 2-메틸아데노신, 2-메틸구아노신, N6-메틸아데노신, 7-메틸구아노신, 5-메톡시아미노메틸-2-티오우리딘, 5-메틸아미노메틸우리딘, 5-메틸카보닐메틸우리딘, 5-메틸옥시우리딘, 5-메틸-2-티오우리딘, 2-메틸티오-N6-이소펜테닐아데노신, 베타-D-만노실퀘우오신, 우리딘- 5-옥시아세트산 및 2-티오시티딘로부터 선택된다.
본 명세서에 기재되고 핵산 내에서 발생하는 많은 변형은 염기, 인산염 모이어티 또는 인산염 모이어티의 비-연결 O의 변형과 같은 폴리뉴클레오티드 분자 내에서 반복될 것이다. 어떤 경우에, 변형이 폴리뉴클레오티드의 모든 가능한 위치/뉴클레오티드에서 일어날 것이지만 많은 경우에는 그렇지 않을 것이다. 변형은 3' 또는 5' 말단 위치에서만 발생할 수 있으며, 말단 뉴클레오티드 상의 위치 또는 가닥의 마지막 2, 3, 4, 5 또는 10개 뉴클레오티드와 같은 말단 영역에서만 발생할 수 있다 변형은 이중 가닥 영역, 단일 가닥 영역 또는 둘 다에서 발생할 수 있다. 변형은 본 발명의 핵산의 이중 가닥 영역에서만 발생할 수 있거나 본 발명의 핵산의 단일 가닥 영역에서만 발생할 수 있다. 비-연결 O 위치에서 포스포로티오에이트 또는 포스포로디티오에이트 변형은 한쪽 또는 양쪽 말단에서만 발생할 수 있고, 말단 영역, 예를 들어 말단 뉴클레오티드 상의 위치 또는 가닥의 마지막 2, 3, 4 또는 5개 뉴클레오티드에서만 발생할 수 있거나, 또는 이중 및/또는 단일 가닥 영역, 특히 말단에서 발생할 수 있다. 5' 말단 및/또는 3' 말단은 인산화될 수 있다.
본 발명의 핵산의 안정성은 오버행에 특정 염기를 포함하거나 단일 가닥 오버행, 예를 들어 5' 또는 3' 오버행 또는 둘 다에 변형된 뉴클레오티드를 포함함으로써 증가될 수 있다. 퓨린 뉴클레오티드는 오버행에 포함될 수 있다. 3' 또는 5' 오버행의 모든 또는 일부 염기가 변형될 수 있다. 변형에는 리보스 당의 2' OH 기에서의 변형 사용, 리보뉴클레오티드 대신 데옥시리보뉴클레오티드 사용, 포스포로티오에이트 또는 포스포로디티오에이트 변형과 같은 포스페이트 기의 변형이 포함될 수 있다. 오버행은 표적 서열과 상동일 필요는 없다.
뉴클레아제는 핵산 포스포디에스테르 결합을 가수분해할 수 있다. 그러나, 핵산에 대한 화학적 변형은 개선된 특성을 부여할 수 있고, 올리고리보뉴클레오티드를 뉴클레아제에 보다 안정하게 만들 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 변형된 핵산은 하기 중 하나 이상을 포함할 수 있다:
(i) 비-연결 포스페이트 산소 중 하나 또는 둘 모두 및/또는 연결된 포스페이트 산소 중 하나 이상의 변경, 예를 들어 대체 (본 발명의 핵산의 5' 및 3' 말단에서도 연결이라고 함);
(ii) 리보스 당의 구성성분, 예를 들어 리보스 당의 2' 하이드록실의 변경, 예를 들어 대체;
(iii) 인산염 모이어티를 "데포스포(dephospho)" 링커로 대체;
(iv) 자연 발생 염기의 변형 또는 대체;
(v) 리보스-포스페이트 백본의 대체 또는 변형; 및
(vi) 제1 가닥 및/또는 제2 가닥의 3' 말단 또는 5' 말단의 변형, 예를 들어 말단 포스페이트 기의 제거, 변형 또는 대체 또는 한 가닥 또는 두 가닥의 3' 또는 5' 말단에 대한 모이어티, 예를 들어 형광 표지된 모이어티의 접합.
대체, 변형 및 변경이라는 용어는 자연 발생 분자와의 차이를 나타낸다.
특정 변형은 아래에서 자세히 논의된다.
핵산은 변형된 제2 및/또는 제1 가닥 상의 하나 이상의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 교대 뉴클레오티드는 변형된 뉴클레오티드를 형성하기 위해 변형될 수 있다.
본 명세서에서 교대한다는 것은 규칙적인 방식으로 차례로 일어나는 것을 의미한다. 즉, 교대는 반복적으로 발생하는 것을 의미한다. 예를 들어, 하나의 뉴클레오티드가 변형되면, 다음 인접 뉴클레오티드는 변형되지 않고 다음 인접 뉴클레오티드가 변형되는 등이다. 하나의 뉴클레오티드는 제1 변형으로 변형될 수 있고, 다음 인접 뉴클레오티드는 제2 변형으로 변형될 수 있으며 다음 인접 뉴클레오티드는 제1 변형으로 변형되고, 여기서 제1 및 제2 변형은 상이하다.
본 발명의 일부 대표적인 변형된 핵산 서열이 실시예에 제시되어 있다. 이러한 예는 대표성을 의미하며 제한적이지 않다.
핵산의 한 측면에서, 제1 가닥의 적어도 뉴클레오티드 2 및 14는 바람직하게는 제1 공통 변형에 의해 변형되고, 뉴클레오티드는 제1 가닥의 5' 말단에서 뉴클레오티드 번호 1로 시작하여 연속적으로 넘버링된다. 제1 변형은 바람직하게는 2'-F이다.
한 측면에서, 제1 가닥의 적어도 하나, 여러 개 또는 바람직하게는 모든 짝수 넘버링된 뉴클레오티드는 바람직하게는 제1 공통 변형에 의해 변형되고, 뉴클레오티드는 제1 가닥의 5' 말단에서 뉴클레오티드 번호 1로 시작하여 연속적으로 넘버링된다. 제1 변형은 바람직하게는 2'-F이다.
한 측면에서, 제1 가닥의 적어도 하나, 여러 개 또는 바람직하게는 모든 홀수 넘버링된 뉴클레오티드는 제1 가닥의 5' 말단에서 뉴클레오티드 번호 1로 시작하여 연속적으로 넘버링된다. 바람직하게는, 이들은 제2 변형에 의해 변형된다. 이 제2 변형은 바람직하게는 핵산이 예를 들어 뉴클레오티드 2 및 14 또는 제1 가닥의 모든 짝수 넘버링된 뉴클레오티드의 제1 변형을 포함하는 경우 제1 변형과 다르다. 제1 변형은 바람직하게는 2'-OH 기, 또는 잠긴 핵산(LNA), 잠금 해제 핵산(UNA) 또는 2'-플루오로아라비노 핵산(FANA) 변형과 크기가 같거나 부피가 더 작은 임의의 2' 리보스 변형이다. 2'-OH 기보다 크기가 같거나 부피가 더 작은 2' 리보스 변형은 예를 들어 2'-F, 2'-H, 2'-할로 또는 2'-NH2일 수 있다. 제2 변형은 바람직하게는 2'-OH 기보다 부피가 큰 임의의 2' 리보스 변형이다. 2'-OH 기보다 부피가 큰 2' 리보스 변형은 예를 들어 2'-OMe, 2'-O-MOE (2'-O-메톡시에틸), 2'-O-알릴 또는 2'-O-알킬일 수 있고, 단 핵산은 비교 가능한 조건 하에서 변형(들) 없이 동일한 핵산과 적어도 동일한 정도로 표적 유전자의 발현을 감소시킬 수 있다. 제1 변형은 바람직하게는 2'-F이고/이거나 제2 변형은 바람직하게는 2'-OMe이다.
본 개시내용의 맥락에서, 2' 리보스 변형과 같은 치환기의 크기 또는 부피는 바람직하게는 반 데르 발스 부피로 측정된다.
한 측면에서, 제1 가닥의 짝수 넘버링된 뉴클레오티드에 상응하는 위치에 있는 제2 가닥의 적어도 하나, 여러 개 또는 바람직하게는 모든 뉴클레오티드는 바람직하게는 제3 변형에 의해 변형된다. 바람직하게는 동일한 핵산에서 뉴클레오티드 2 및 14 또는 제1 가닥의 모든 짝수 넘버링된 뉴클레오티드가 제1 변형으로 변형된다. 추가로 또는 대안적으로, 제2 가닥의 홀수 넘버링된 뉴클레오티드는 제2 변형으로 변형된다. 바람직하게는, 제3 변형은 제1 변형과 상이하고/하거나 제3 변형은 제2 변형과 동일하다. 제1 변형은 바람직하게는 2'-OH 기, 또는 잠긴 핵산(LNA), 잠금 해제 핵산(UNA) 또는 2'-플루오로아라비노 핵산(FANA) 변형과 크기가 같거나 부피가 더 작은 임의의 2' 리보스 변형이다. 2'-OH 기보다 크기가 같거나 부피가 더 작은 2' 리보스 변형은 예를 들어 2'-F, 2'-H, 2'-할로 또는 2'-NH2일 수 있다. 제2 및/또는 제3 변형은 바람직하게는 2'-OH 기보다 부피가 큰 임의의 2' 리보스 변형이다. 2'-OH 기보다 부피가 큰 2' 리보스 변형은 예를 들어 2'-OMe, 2'-O-MOE (2'-O-메톡시에틸), 2'-O-알릴 또는 2'-O-알킬일 수 있고, 단 핵산은 비교 가능한 조건 하에서 변형(들) 없이 동일한 핵산과 적어도 동일한 정도로 표적 유전자의 발현을 감소시킬 수 있다. 제1 변형은 바람직하게는 2'-F이고/이거나 제2 및/또는 제3 변형은 바람직하게는 2'-OMe이다. 제1 가닥의 뉴클레오티드는 제1 가닥의 5' 말단에서 뉴클레오티드 번호 1부터 시작하여 연속적으로 넘버링된다.
예를 들어, 제1 가닥의 짝수 넘버링된 뉴클레오티드에 상응하는 위치에 있는 제2 가닥의 뉴클레오티드는 제1 가닥의 짝수 넘버링된 뉴클레오티드에 염기 쌍을 이루는 제2 가닥의 뉴클레오티드이다.
한 측면에서, 제1 가닥의 홀수 넘버링된 뉴클레오티드에 상응하는 위치에 있는 제2 가닥의 적어도 하나, 여러 개 또는 바람직하게는 모든 뉴클레오티드는 바람직하게는 제4 변형에 의해 변형된다. 바람직하게는 동일한 핵산에서 뉴클레오티드 2 및 14 또는 제2 가닥의 모든 짝수 넘버링된 뉴클레오티드가 제1 변형으로 변형된다. 추가로 또는 대안적으로, 제2 가닥의 홀수 넘버링된 뉴클레오티드는 제2 변형으로 변형된다. 추가로 또는 대안적으로, 제1 가닥의 짝수 넘버링된 뉴클레오티드에 상응하는 위치에 있는 제2 가닥의 모든 뉴클레오티드는 제3 변형으로 변형된다. 제4 변형은 제2 변형과 다른 것이 바람직하고, 제3 변형과 다른 것이 바람직하고, 제4 변형은 제1 변형과 동일한 것이 바람직하다. 제1 변형 및/또는 제4 변형은 제1 변형은 바람직하게는 2'-OH 기, 또는 잠긴 핵산(LNA), 잠금 해제 핵산(UNA) 또는 2'-플루오로아라비노 핵산(FANA) 변형과 크기가 같거나 부피가 더 작은 임의의 2' 리보스 변형이다. 2'-OH 기보다 크기가 같거나 부피가 더 작은 2' 리보스 변형은 예를 들어 2'-F, 2'-H, 2'-할로 또는 2'-NH2일 수 있다. 제2 및/또는 제3 변형은 바람직하게는 2'-OH 기보다 부피가 큰 임의의 2' 리보스 변형이다. 2'-OH 기보다 부피가 큰 2' 리보스 변형은 예를 들어 2'-OMe, 2'-O-MOE (2'-O-메톡시에틸), 2'-O-알릴 또는 2'-O-알킬일 수 있고, 단 핵산은 비교 가능한 조건 하에서 변형(들) 없이 동일한 핵산과 적어도 동일한 정도로 표적 유전자의 발현을 감소시킬 수 있다. 제1 및/또는 제4 변형은 바람직하게는 2'-OMe 변형이고/이거나 제2 및/또는 제3 변형은 바람직하게는 2'-F 변형이다. 제1 가닥의 뉴클레오티드는 제1 가닥의 5' 말단에서 뉴클레오티드 번호 1부터 시작하여 연속적으로 넘버링된다.
핵산의 한 측면에서, 제1 가닥의 뉴클레오티드 11 또는 뉴클레오티드 13 또는 뉴클레오티드 11 및 13 또는 뉴클레오티드 11-13에 상응하는 위치에 있는 제2 가닥의 뉴클레오티드/뉴클레오티드는 제4 변형에 의해 변형된다. 바람직하게는, 제1 가닥의 뉴클레오티드 11 또는 뉴클레오티드 13 또는 뉴클레오티드 11 및 13 또는 뉴클레오티드 11-13에 상응하는 위치에 있는 뉴클레오티드/뉴클레오티드 이외의 제2 가닥의 모든 뉴클레오티드는 제3 변형에 의해 변형된다. 바람직하게는 동일한 핵산에서 뉴클레오티드 2 및 14 또는 제1 가닥의 모든 짝수 넘버링된 뉴클레오티드가 제1 변형으로 변형된다. 추가로 또는 대안적으로, 제1 가닥의 홀수 넘버링된 뉴클레오티드는 제2 변형으로 변형된다. 제4 변형은 제2 변형과 다른 것이 바람직하고, 제3 변형과 다른 것이 바람직하고, 제4 변형은 제1 변형과 동일한 것이 바람직하다. 제1 변형 및/또는 제4 변형은 바람직하게는 2'-OH 기, 또는 잠긴 핵산(LNA), 잠금 해제 핵산(UNA) 또는 2'-플루오로아라비노 핵산(FANA) 변형과 크기가 같거나 부피가 더 작은 임의의 2' 리보스 변형이다. 2'-OH 기보다 크기가 같거나 부피가 더 작은 2' 리보스 변형은 예를 들어 2'-F, 2'-H, 2'-할로 또는 2'-NH2일 수 있다. 제2 및/또는 제3 변형은 바람직하게는 2'-OH 기보다 부피가 큰 임의의 2' 리보스 변형이다. 2'-OH 기보다 부피가 큰 2' 리보스 변형은 예를 들어 2'-OMe, 2'-O-MOE (2'-O-메톡시에틸), 2'-O-알릴 또는 2'-O-알킬일 수 있고, 단 핵산은 비교 가능한 조건 하에서 변형(들) 없이 동일한 핵산과 적어도 동일한 정도로 표적 유전자의 발현을 감소시킬 수 있다. 제1 및/또는 제4 변형은 바람직하게는 2'-OMe 변형이고/이거나 제2 및/또는 제3 변형은 바람직하게는 2'-F 변형이다. 제1 가닥의 뉴클레오티드는 제1 가닥의 5' 말단에서 뉴클레오티드 번호 1부터 시작하여 연속적으로 넘버링된다.
핵산의 한 측면에서, 제1 가닥의 모든 짝수 넘버링된 뉴클레오티드는 제1 변형에 의해 변형되고, 제1 가닥의 모든 홀수 넘버링된 뉴클레오티드가 제2 변형에 의해 변형되고, 제1 가닥의 짝수 넘버링된 뉴클레오티드에 해당하는 위치에 있는 제2 가닥의 모든 뉴클레오티드가 제3 변형에 의해 변형되고, 제1 가닥의 홀수 넘버링된 뉴클레오티드에 해당하는 위치에 있는 제2 가닥의 모든 뉴클레오티드가 제4 변형에 의해 변형되고, 여기서 제1 및/또는 제4 변형은 2'-F이고/이거나 제2 및/또는 제3 변형은 2'-OMe이다.
핵산의 한 측면에서, 제1 가닥의 모든 짝수 넘버링된 뉴클레오티드가 제1 변형에 의해 변형되고, 제1 가닥의 모든 홀수 넘버링된 뉴클레오티드가 제2 변형에 의해 변형되고, 제1 가닥의 뉴클레오티드 11-13에 해당하는 위치에서 제2 가닥의 모든 뉴클레오티드가 제4 변형에 의해 변형되고, 제1 가닥의 뉴클레오티드 11-13에 해당하는 뉴클레오티드를 제외한 제2 가닥의 모든 뉴클레오티드가 제3 변형에 의해 변형되고, 여기서 제1 및 제4 변형은 2'-F이고 제2 및 제3 변형은 2'-OMe이다. 이 측면의 한 구현예에서, 제2 가닥의 3' 말단 뉴클레오티드는 역전된 RNA 뉴클레오티드이다(즉, 뉴클레오티드는 일반적으로 그렇듯이 5' 탄소를 통해서가 아니라 3' 탄소를 통해 가닥의 3' 말단에 연결된다). 제2 가닥의 3' 말단 뉴클레오티드가 역전된 RNA 뉴클레오티드인 경우, 역전된 RNA 뉴클레오티드는 천연 뉴클레오티드 대응물과 비교하여 어떠한 변형도 포함하지 않는다는 점에서 비변형 뉴클레오티드인 것이 바람직하다. 구체적으로, 역전된 RNA 뉴클레오티드는 바람직하게는 2'-OH 뉴클레오티드이다. 바람직하게는, 이 측면에서, 제2 가닥의 3' 말단 뉴클레오티드가 역전된 RNA 뉴클레오티드인 경우, 핵산은 적어도 제1 가닥의 5' 말단을 포함하는 말단에서 무딘 말단이다.
본 발명의 한 측면은 바람직하게는 세포에서 CNNM4 유전자의 발현을 억제하기 위한 본 명세서에 개시된 바와 같은 핵산이며, 여기서 상기 제1 가닥은 RISC에 의해 핵산의 처리를 용이하게 하기 위해 다수의 위치에서 변형된 뉴클레오티드 또는 비변형 뉴클레오티드를 포함한다.
한 측면에서, "RISC에 의한 처리를 용이하게 한다"는 핵산이 RISC에 의해 처리될 수 있음을 의미하며, 예를 들어 존재하는 임의의 변형은 핵산이 RISC에 의해 처리되도록 허용하고 바람직하게는 RISC에 의한 처리에 유익할 것이며, 적절하게는 siRNA 활동이 일어날 수 있다.
한 측면은 본 명세서에 개시된 바와 같은 핵산이고, 제1 가닥의 5' 말단으로부터 위치 2 및 14에 있는 뉴클레오티드는 2'-OMe 변형으로 변형되지 않고, 제1 가닥의 위치 11 또는 위치 13 또는 위치 11 및 13 또는 위치 11, 12 및 13에 해당하는 제2 가닥의 뉴클레오티드/뉴클레오티드는 2'-OMe 변형으로 변형되지 않는다 (즉, 자연 발생 뉴클레오티드이거나 2'-OMe 이외의 변형으로 변형됨).
한 측면에서, 제1 가닥의 위치 13에 상응하는 제2 가닥 상의 뉴클레오티드는 제1 가닥의 위치 13(5' 말단으로부터)과 염기쌍을 형성하는 뉴클레오티드이다.
한 측면에서, 제1 가닥의 위치 11에 상응하는 제2 가닥 상의 뉴클레오티드는 제1 가닥의 위치 11(5' 말단으로부터)과 염기쌍을 형성하는 뉴클레오티드이다.
한 측면에서, 제1 가닥의 위치 12에 상응하는 제2 가닥 상의 뉴클레오티드는 제1 가닥의 위치 12(5' 말단으로부터)과 염기쌍을 형성하는 뉴클레오티드이다.
예를 들어, 이중 가닥이고 무딘 말단인 19-량체 핵산에서, 제1 가닥의 위치 13(5' 말단으로부터)은 제2 가닥의 위치 7(5' 말단으로부터)과 쌍을 이룬다. 제1 가닥의 위치 11(5' 말단에서)은 제2 가닥의 위치 9(5' 말단에서)과 쌍을 이룬다. 이 명명법은 제2 가닥의 다른 위치에 적용될 수 있다.
한 측면에서, 부분적으로 상보적인 제1 및 제2 가닥의 경우, 제1 가닥 상의 위치에 "상응하는" 제2 가닥 상의 뉴클레오티드는 해당 위치가 불일치가 있는 위치인 경우 반드시 염기쌍을 형성하지 않을 수 있지만 명명법의 원칙은 여전히 적용된다.
한 측면은 본 명세서에 개시된 바와 같은 핵산이고, 제1 가닥의 5' 말단으로부터 위치 2 및 14에 있는 뉴클레오티드는 2'-OMe 변형으로 변형되지 않고, 제1 가닥의 위치 11, 또는 13, 또는 11 및 13, 또는 11- 13에 해당하는 제2 가닥의 뉴클레오티드는 2'-F 변형으로 변형된다.
한 측면은 본 명세서에 개시된 바와 같은 핵산이고, 제1 가닥의 5' 말단으로부터 위치 2 및 14에 있는 뉴클레오티드는 2'-F 변형으로 변형되고, 제1 가닥의 위치 11, 또는 13, 또는 11 및 13, 또는 11- 13에 해당하는 제2 가닥의 뉴클레오티드는 2'-OMe 변형으로 변형되지 않는다.
한 측면은 본 명세서에 개시된 바와 같은 핵산이고, 제1 가닥의 5' 말단으로부터 위치 2 및 14에 있는 뉴클레오티드는 2'-F 변형으로 변형되고, 제1 가닥의 위치 11, 또는 13, 또는 11 및 13, 또는 11- 13에 해당하는 제2 가닥의 뉴클레오티드는 2'-F 변형으로 변형된다.
한 측면은 본 명세서에 개시된 바와 같은 핵산이고, 제1 및/또는 제2 가닥의 뉴클레오티드의 50% 초과는 2'-OMe 변형을 포함하고, 예컨대 제1 및/또는 제2 가닥의 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 또는 85%, 또는 그 초과는 2'-OMe 변형을 포함한다.
한 측면은 본 명세서에 개시된 바와 같은 핵산이고, 제1 및/또는 제2 가닥의 뉴클레오티드의 50% 초과는 자연 발생 RNA 변형을 포함하고, 예컨대 제1 및/또는 제2 가닥의 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 또는 85%, 또는 그 초과는 그러한 변형을 포함한다. 적합한 자연 발생 변형은 2'-OMe뿐만 아니라 다른 2' 당 변형, 특히 DNA 뉴클레오티드를 생성하는 2'-H 변형을 포함한다.
한 측면은 제1 및/또는 제2 가닥에서 2'-OMe 변형이 아닌 2' 변형을 갖는 뉴클레오티드의 20% 이하, 예를 들어 15% 이하, 예를 들어 10% 이하를 포함하는 본 명세서에 개시된 바와 같은 핵산이다.
일 측면은 본 명세서에 개시된 바와 같은 핵산이고, 2'-OMe 변형이 아닌 2'-변형을 갖는 제1 및/또는 제2 가닥의 뉴클레오티드 수는 7개 이하, 더 바람직하게는 5개 이하, 가장 바람직하게는 3 이하이다.
하나의 측면은 제1 및/또는 제2 가닥 상의 2'-F 변형의 20% 이하(예를 들어, 15% 이하 또는 10% 이하)를 포함하는 본 명세서에 개시된 바와 같은 핵산이다.
일 측면은 본 명세서에 개시된 바와 같은 핵산이고, 2'-F 변형을 갖는 제1 및/또는 제2 가닥의 뉴클레오티드 수는 7개 이하, 더 바람직하게는 5개 이하, 가장 바람직하게는 3 이하이다.
한 측면은 본 명세서에 개시된 바와 같은 핵산이며, 여기서 모든 뉴클레오티드는 제1 가닥의 5' 말단으로부터의 위치 2 및 14 및 제1 가닥의 위치 11, 또는 13, 또는 11 및 13, 또는 11-13에 해당하는 제2 가닥 상의 뉴클레오티드를 제외하고 2'-OMe 변형으로 변형된다. 바람직하게는 2'-OMe로 변형되지 않은 뉴클레오티드는 2' 위치에서 플루오로로 변형된다(2'-F 변형).
핵산의 모든 뉴클레오티드가 당의 2' 위치에서 변형된 본 명세서에 개시된 바와 같은 핵산이 바람직하다. 바람직하게는 이들 뉴클레오티드는 변형이 2'-OMe 변형이 아닌 2'-F 변형으로 변형된다.
한 측면에서 핵산은 교대 2'-OMe 변형 및 2-F 변형으로 제1 가닥에서 변형되고, 위치 2 및 14(5' 말단에서 시작)는 2'-F로 변형된다. 바람직하게는 제2 가닥은 제1 가닥의 위치 11, 13, 또는 11 및 13, 또는 11-13에 해당하는 제2 가닥 상의 뉴클레오티드에서 2'-F 변형으로 변형된다. 바람직하게는 제2 가닥은 상보적 (이중 가닥) 영역의 제1 위치에서 시작하여 3' 말단으로부터 카운팅하는 위치 11-13에서 2'-F 변형으로 변형되고, 나머지 변형은 자연 발생 변형, 바람직하게는 2'-OMe이다. 적어도 이 경우에 상보적 영역은 두 뉴클레오티드가 서로 염기쌍을 이룰 수 있는지 여부에 관계없이 제1 가닥에 상응하는 뉴클레오티드를 갖는 제2 가닥의 제1 위치에서 시작한다.
핵산의 한 측면에서, 제1 가닥 및 제2 가닥의 각각의 뉴클레오티드는 변형된 뉴클레오티드이다.
달리 구체적으로 언급되지 않는 한, 여기에서 제1 가닥의 뉴클레오티드는 제1 가닥의 5' 말단에서 뉴클레오티드 번호 1부터 시작하여 연속적으로 넘버링된다. 제2 가닥의 뉴클레오티드는 제2 가닥의 3' 말단에서 뉴클레오티드 번호 1부터 시작하여 연속적으로 넘버링된다.
"홀수 넘버링된" 뉴클레오티드는, 뉴클레오티드가 넘버링된 말단이 표시되지 않은 경우 뉴클레오티드는 표시된 말단에서 또는 가닥의 5' 말단에서 시작하여 연속적으로 넘버링되는 가닥에서 홀수로 넘버링된 뉴클레오티드이다. "짝수 넘버링된" 뉴클레오티드는, 뉴클레오티드가 넘버링된 말단이 표시되지 않은 경우 뉴클레오티드는 표시된 말단에서 또는 가닥의 5' 말단에서 시작하여 연속적으로 넘버링되는 가닥에서 짝수로 넘버링된 뉴클레오티드이다.
제1 및/또는 제2 가닥 상의 하나 이상의 뉴클레오티드가 변형되어 변형된 뉴클레오티드를 형성할 수 있다. 제1 가닥의 홀수 넘버링된 뉴클레오티드 중 하나 이상이 변형될 수 있다. 제1 가닥의 짝수 넘버링된 뉴클레오티드 중 하나 이상은 적어도 제2 변형에 의해 변형될 수 있으며, 여기서 적어도 제2 변형은 하나 이상의 홀수 넘버링된 뉴클레오티드 상의 변형과 상이하다. 하나 이상의 변형된 짝수 넘버링된 뉴클레오티드 중 적어도 하나는 하나 이상의 변형된 홀수 넘버링된 뉴클레오티드 중 적어도 하나에 인접할 수 있다.
제1 가닥의 복수의 홀수 넘버링된 뉴클레오티드는 본 발명의 핵산에서 변형될 수 있다. 제1 가닥의 복수의 짝수 넘버링된 뉴클레오티드는 제2 변형에 의해 변형될 수 있다. 제1 가닥은 공통 변형에 의해 변형된 인접한 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 제1 가닥은 또한 제2의 상이한 변형에 의해 변형된 인접한 뉴클레오티드를 포함할 수 있다(즉, 제1 가닥은 서로 인접하고 제1 변형에 의해 변형된 뉴클레오티드 뿐만 아니라 서로 인접하고 제1 변형과 다른 제2 변형에 의해 변형된 다른 뉴클레오티드를 포함할 수 있다).
제2 가닥의 홀수 넘버링된 뉴클레오티드(여기서 뉴클레오티드는 제2 가닥의 3' 말단에서 뉴클레오티드 번호 1부터 시작하여 연속적으로 넘버링됨) 중 하나 이상은 제1 가닥 상의 홀수 넘버링된 뉴클레오티드 (여기서 뉴클레오티드는 제1 가닥의 5' 말단에서 뉴클레오티드 번호 1부터 시작하여 연속적으로 넘버링됨)의 변형과 상이한 변형에 의해 변형될 수 있고/있거나 제2 가닥의 짝수 넘버링된 뉴클레오티드 중 하나 이상이 제1 가닥의 홀수 넘버링된 뉴클레오티드의 동일한 변형에 의해 변형될 수 있다. 제2 가닥의 하나 이상의 변형된 짝수 넘버링된 뉴클레오티드 중 적어도 하나는 하나 이상의 변형된 홀수 넘버링된 뉴클레오티드에 인접할 수 있다. 제2 가닥의 복수의 홀수 넘버링된 뉴클레오티드는 공통 변형에 의해 변형될 수 있고/있거나 복수의 짝수 넘버링된 뉴클레오티드는 제1 가닥 홀수 넘버링된 뉴클레오티드에 존재하는 동일한 변형에 의해 변형될 수 있다. 제2 가닥 상의 복수의 홀수 넘버링된 뉴클레오티드는 제1 가닥 홀수 넘버링된 뉴클레오티드의 변형과 다른 변형에 의해 변형될 수 있다.
제2 가닥은 공통 변형에 의해 변형된 인접한 뉴클레오티드를 포함할 수 있으며, 이는 제1 가닥의 홀수 넘버링된 뉴클레오티드의 변형과 상이한 변형일 수 있다.
본 발명의 핵산에 있어서, 제1 가닥의 홀수 넘버링된 뉴클레오티드 각각 및 제2 가닥의 짝수 넘버링된 뉴클레오티드 각각은 공통 변형으로 변형될 수 있고, 짝수 넘버링된 뉴클레오티드 각각은 상이한 변형을 갖는 제1 가닥에서 변형될 수 있고, 홀수 넘버링된 뉴클레오티드 각각은 상이한 변형을 갖는 제2 가닥에서 변형될 수 있다.
본 발명의 핵산은 제2 가닥의 비변형 또는 상이하게 변형된 뉴클레오티드에 비해 적어도 하나의 뉴클레오티드만큼 이동된 제1 가닥의 변형된 뉴클레오티드를 가질 수 있다.
하나 이상 또는 각각의 홀수 넘버링된 뉴클레오티드는 제1 가닥에서 변형될 수 있고 하나 이상 또는 각각의 짝수 넘버링된 뉴클레오티드는 제2 가닥에서 변형될 수 있다. 가닥 하나 또는 둘 다 상의 하나 이상 또는 각각의 교대 뉴클레오티드는 제2 변형에 의해 변형될 수 있다. 하나 이상 또는 각각의 짝수 넘버링된 뉴클레오티드는 제1 가닥에서 변형될 수 있고 하나 이상 또는 각각의 짝수 넘버링된 뉴클레오티드는 제2 가닥에서 변형될 수 있다. 가닥 하나 또는 둘 다 상의 하나 이상 또는 각각의 교대 뉴클레오티드는 제2 변형에 의해 변형될 수 있다. 하나 이상 또는 각각의 홀수 넘버링된 뉴클레오티드는 제1 가닥에서 변형될 수 있고 하나 이상의 홀수 넘버링된 뉴클레오티드는 공통 변형에 의해 제2 가닥에서 변형될 수 있다. 가닥 하나 또는 둘 다 상의 하나 이상 또는 각각의 교대 뉴클레오티드는 제2 변형에 의해 변형될 수 있다. 하나 이상 또는 각각의 짝수 넘버링된 뉴클레오티드는 제1 가닥에서 변형될 수 있고 하나 이상 또는 각각의 홀수 넘버링된 뉴클레오티드는 공통 변형에 의해 제2 가닥에서 변형될 수 있다. 가닥 하나 또는 둘 다 상의 하나 이상 또는 각각의 교대 뉴클레오티드는 제2 변형에 의해 변형될 수 있다.
본 발명의 핵산은 가닥 중 하나 또는 둘 다에서 교대 변형의 적어도 2개 영역을 포함하는 단일- 또는 이중-가닥 작제물을 포함할 수 있다. 이들 교대 영역은 최대 약 12개의 뉴클레오티드를 포함할 수 있지만 바람직하게는 약 3 내지 약 10개의 뉴클레오티드를 포함한다. 교대 뉴클레오티드 영역은 본 발명의 핵산의 한 가닥 또는 두 가닥 모두의 말단에 위치할 수 있다. 핵산은 각각의 말단(3' 및 5')에서 교대 뉴클레오티드의 4 내지 약 10개의 뉴클레오티드를 포함할 수 있고, 이들 영역은 약 5 내지 약 12개의 인접 비변형 또는 상이하거나 일반적으로 변형된 뉴클레오티드에 의해 분리될 수 있다.
제1 가닥의 홀수 넘버링된 뉴클레오티드는 변형될 수 있고 짝수 넘버링된 뉴클레오티드는 제2 변형으로 변형될 수 있다. 제2 가닥은 공통 변형에 의해 변형된 인접한 뉴클레오티드를 포함할 수 있으며, 이는 제1 가닥의 홀수 넘버링된 뉴클레오티드의 변형과 동일할 수 있다. 제2 가닥의 하나 이상의 뉴클레오티드는 또한 제2 변형으로 변형될 수 있다. 제2 변형을 갖는 하나 이상의 뉴클레오티드는 서로 인접할 수 있고 제1 가닥의 홀수 넘버링된 뉴클레오티드의 변형과 동일한 변형을 갖는 뉴클레오티드에 인접할 수 있다. 제1 가닥은 또한 3' 말단 및 5' 말단에서 2개의 뉴클레오티드 사이의 포스포로티오에이트 연결 또는 3' 말단에서 2개의 뉴클레오티드 사이의 포스포로디티오에이트 연결을 포함할 수 있다. 제2 가닥은 5' 말단에서 2개의 뉴클레오티드 사이에 포스포로티오에이트 또는 포스포로디티오에이트 연결을 포함할 수 있다. 제2 가닥은 또한 5' 말단에서 리간드에 접합될 수 있다.
본 발명의 핵산은 공통 변형으로 변형된 인접 뉴클레오티드를 포함하는 제1 가닥을 포함할 수 있다. 하나 이상의 그러한 뉴클레오티드는 제2 변형으로 변형될 수 있는 하나 이상의 뉴클레오티드에 인접할 수 있다. 제2 변형을 갖는 하나 이상의 뉴클레오티드는 인접할 수 있다. 제2 가닥은 공통 변형으로 변형된 인접 뉴클레오티드를 포함할 수 있으며, 이는 제1 가닥의 하나 이상의 뉴클레오티드의 변형 중 하나와 동일할 수 있다. 제2 가닥의 하나 이상의 뉴클레오티드는 또한 제2 변형으로 변형될 수 있다. 제2 변형을 갖는 하나 이상의 뉴클레오티드는 인접할 수 있다. 제1 가닥은 또한 3' 말단 및 5' 말단에서 2개의 뉴클레오티드 사이의 포스포로티오에이트 연결 또는 3' 말단에서 2개의 뉴클레오티드 사이의 포스포로디티오에이트 연결을 포함할 수 있다. 제2 가닥은 3' 말단에서 2개의 뉴클레오티드 사이에 포스포로티오에이트 또는 포스포로디티오에이트 연결을 포함할 수 있다. 제2 가닥은 또한 5' 말단에서 리간드에 접합될 수 있다.
제1 가닥 상에서 5'에서 3'으로 및 제2 가닥에서 3'에서 5'로 넘버링된 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23 및 25의 뉴클레오티드는 제1 가닥 상의 변형에 의해 변형된다. 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 및 24로 넘버링된 뉴클레오티드는 제1 가닥 상의 제2 변형에 의해 변형될 수 있다. 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23으로 넘버링된 뉴클레오티드는 제2 가닥 상의 변형에 의해 변형될 수 있다. 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 및 24로 넘버링된 뉴클레오티드는 제2 가닥 상의 제2 변형에 의해 변형될 수 있다. 뉴클레오티드는 본 발명의 핵산을 위해 제1 가닥에서 5'에서 3'으로 및 제2 가닥에서 3'에서 5'로 넘버링된다.
2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 및 24로 넘버링된 뉴클레오티드는 제1 가닥 상의 변형에 의해 변형될 수 있다. 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23으로 넘버링된 뉴클레오티드는 제1 가닥 상의 제2 변형에 의해 변형될 수 있다. 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23으로 넘버링된 뉴클레오티드는 제2 가닥 상의 변형에 의해 변형될 수 있다. 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 및 24로 넘버링된 뉴클레오티드는 제2 가닥 상의 제2 변형에 의해 변형될 수 있다.
분명히, 제1 및/또는 제2 가닥이 25개 길이의 뉴클레오티드, 예컨대 19개 길이의 뉴클레오티드보다 짧은 경우, 변형될 20, 21, 22, 23, 24 및 25로 넘버링된 뉴클레오티드가 없다. 따라서 당업자는 더 짧은 가닥에 적용되는 상기 설명을 이해한다.
제1 가닥 상의 하나 이상의 변형된 뉴클레오티드는 공통 변형을 갖는 제2 가닥 상의 변형된 뉴클레오티드와 쌍을 이룰 수 있다. 제1 가닥 상의 하나 이상의 변형된 뉴클레오티드는 상이한 변형을 갖는 제2 가닥 상의 변형된 뉴클레오티드와 쌍을 이룰 수 있다. 제1 가닥 상의 하나 이상의 변형된 뉴클레오티드는 제2 가닥 상의 비변형된 뉴클레오티드와 쌍을 이룰 수 있다. 제2 가닥 상의 하나 이상의 변형된 뉴클레오티드는 제1 가닥 상의 비변형된 뉴클레오티드와 쌍을 이룰 수 있다. 즉, 교대 뉴클레오티드는 두 가닥 상에 정렬될 수 있고, 예를 들어, 제2 가닥의 교대 영역의 모든 변형은 제1 가닥의 동일한 변형과 쌍을 이루거나, 대안적으로 변형은 다른 가닥에서 유사하지 않은 변형(즉, 제2 또는 추가 변형)과 쌍을 이루는 한 가닥의 교대 영역에서 공통 변형을 갖는 하나의 뉴클레오티드에 의해 상쇄될 수 있다. 또 다른 옵션은 각 가닥에 비유사 변형을 갖는 것이다.
제1 가닥 상의 변형은 제2 가닥의 변형된 뉴클레오티드에 비해 하나의 뉴클레오티드만큼 이동되어, 공통 변형된 뉴클레오티드가 서로 쌍을 이루지 않도록 할 수 있다.
변형 및/또는 변형들은 각각 개별적으로 3' 말단 데옥시 티민, 2'-OMe, 2' 데옥시 변형, 2' 아미노 변형, 2' 알킬 변형, 모폴리노 변형, 포스포르아미데이트 변형, 5'-포스포로티오에이트 기 변형, 5' 포스페이트 또는 5' 포스페이트 모방체 변형 및 콜레스테릴 유도체 또는 도데칸산 비스데실아미드 기 변형 로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있고/있거나 변형된 뉴클레오티드는 잠긴 뉴클레오티드, 무염기성 뉴클레오티드 또는 비-천연 염기 포함 뉴클레오티드 중 어느 하나일 수 있다.
적어도 하나의 변형은 2'-OMe일 수 있고/있거나 적어도 하나의 변형은 2'-F일 수 있다. 본 명세서에 기재된 바와 같은 추가적인 변형이 제1 및/또는 제2 가닥에 존재할 수 있다.
본 발명의 핵산은 하나 또는 여러 가닥 말단에서 역전된 RNA 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 이러한 역전된 뉴클레오티드는 핵산에 안정성을 제공한다. 바람직하게는, 핵산은 제1 및/또는 제2 가닥의 3' 말단 및/또는 제2 가닥의 5' 말단에 적어도 역전된 뉴클레오티드를 포함한다. 보다 바람직하게는, 핵산은 제2 가닥의 3' 말단에 역전된 뉴클레오티드를 포함한다. 가장 바람직하게는, 핵산은 제2 가닥의 3' 말단에 역전된 RNA 뉴클레오티드를 포함하고 이 뉴클레오티드는 바람직하게는 역전된 A이다. 역전된 뉴클레오티드는 일반적으로 그렇듯이 5' 탄소가 아닌 3' 탄소를 통해 핵산의 3' 말단에 연결되거나 3' 탄소가 아닌 5' 탄소를 통해 핵산의 5' 말단에 연결 뉴클레오티드이다. 역전된 뉴클레오티드는 바람직하게 오버행으로서가 아니라 다른 가닥의 상응하는 뉴클레오티드 반대편에 있는 가닥의 말단에 존재한다. 따라서, 핵산은 바람직하게는 역전된 RNA 뉴클레오티드를 포함하는 말단에서 무딘 말단이다. 가닥의 말단에 존재하는 역전된 RNA 뉴클레오티드는 바람직하게는 가닥의 이 말단에 있는 마지막 뉴클레오티드가 역전된 RNA 뉴클레오티드임을 의미한다. 이러한 뉴클레오티드를 가진 핵산은 안정하고 합성하기 쉽다. 역전된 RNA 뉴클레오티드는 천연 뉴클레오티드 대응물과 비교하여 어떠한 변형도 포함하지 않는다는 점에서 비변형 뉴클레오티드인 것이 바람직하다. 구체적으로, 역전된 RNA 뉴클레오티드는 바람직하게는 2'-OH 뉴클레오티드이다.
본 발명의 핵산은 2'-H로 2' 위치에서 변형된 하나 이상의 뉴클레오티드를 포함할 수 있으며, 따라서 핵산 내에 DNA 뉴클레오티드를 갖는다. 본 발명의 핵산은 제1 가닥의 5' 말단으로부터 카운팅하는 제1 가닥의 위치 2 및/또는 14에 DNA 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 핵산은 제1 가닥의 위치 11, 13, 또는 11 및 13, 또는 11-13에 해당하는 제2 가닥의 DNA 뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
한 측면에서 본 발명의 핵산당 하나 이하의 DNA 뉴클레오티드가 존재한다.
본 발명의 핵산은 하나 이상의 LNA 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 본 발명의 핵산은 제1 가닥의 5' 말단으로부터 카운팅하는 제1 가닥의 위치 2 및/또는 14에 LNA 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 핵산은 제1 가닥의 위치 11, 13, 또는 11 및 13, 또는 11-13에 해당하는 제2 가닥의 LNA를 포함할 수 있다.
본 발명의 일부 대표적인 변형된 핵산 서열이 실시예에 제시되어 있다. 이러한 예는 대표성을 의미하며 제한적이지 않다.
바람직하게는, 핵산은 2'-OMe 변형 및 2'-F 변형을 포함하는 그룹으로부터 각각 및 개별적으로 선택된 제1 변형 및 제2 또는 추가 변형을 포함할 수 있다. 핵산은 제1 변형일 수 있는 2'-OMe인 변형 및 2'-F인 제2 변형을 포함할 수 있다. 본 발명의 핵산은 또한 포스포로티오에이트 또는 포스포로디티오에이트 변형 및/또는 각각 또는 각 가닥 또는 두 가닥의 임의의 말단의 말단 2 또는 3 뉴클레오티드에 또는 그 사이에 존재할 수 있는 데옥시 변형을 포함할 수 있다.
핵산의 한 측면에서, 제1 및/또는 제2 가닥의 적어도 하나의 뉴클레오티드는, 제1 가닥이 적어도 하나의 변형된 뉴클레오티드를 포함하는 경우 변형된 뉴클레오티드이다:
(i) 제1 가닥의 뉴클레오티드 2 및 14 중 적어도 하나 또는 둘 모두가 제1 변형에 의해 변형되고/되거나;
(ii) 제1 가닥의 적어도 하나, 여러 개 또는 모든 짝수 넘버링된 뉴클레오티드가 제1 변형에 의해 변형되고/되거나;
(iii) 제1 가닥의 적어도 하나, 여러 개 또는 모든 홀수 넘버링된 뉴클레오티드가 제2 변형에 의해 변형되고/되거나;
여기서 제2 가닥이 적어도 하나의 변형된 뉴클레오티드를 포함하는 경우:
(iv) 제1 가닥의 짝수 넘버링된 뉴클레오티드에 상응하는 위치에 있는 제2 가닥의 적어도 하나, 여러 개 또는 모든 뉴클레오티드는 제3 변형에 의해 변형되고/되거나;
(v) 제1 가닥의 홀수 넘버링된 뉴클레오티드에 상응하는 위치에 있는 제2 가닥의 적어도 하나, 여러 개 또는 모든 뉴클레오티드는 제4 변형에 의해 변형되고/되거나;
(vi) 제1 가닥의 뉴클레오티드 11 또는 뉴클레오티드 13 또는 뉴클레오티드 11 및 13 또는 뉴클레오티드 11-13에 상응하는 위치에 있는 제2 가닥의 적어도 하나, 여러 개 또는 모든 뉴클레오티드가 제4 변형에 의해 변형되고/되거나;
(vii) 제1 가닥의 뉴클레오티드 11 또는 뉴클레오티드 13 또는 뉴클레오티드 11 및 13 또는 뉴클레오티드 11-13에 해당하는 위치 이외의 위치에 있는 제2 가닥의 적어도 하나, 여러 개 또는 모든 뉴클레오티드는 제3 변형에 의해 변형되고; 여기서 제1 가닥 상의 뉴클레오티드는 제1 가닥의 5' 말단에서 뉴클레오티드 번호 1부터 시작하여 연속적으로 넘버링되고;
여기서 변형은 바람직하게는 하기 중 적어도 하나이다:
(a) 제1 변형은 바람직하게는 제2 및 제3 변형과 상이하고;
(b) 제1 변형은 바람직하게는 제4 변형과 동일하고;
(c) 제2 및 제3 변형은 바람직하게는 동일한 변형이고;
(d) 제1 변형은 바람직하게는 2'-F 변형이고;
(e) 제2 변형은 바람직하게는 2'-OMe 변형이고;
(f) 제3 변형은 바람직하게는 2'-OMe 변형이고/이거나;
(g) 제4 변형은 바람직하게는 2'-F 변형이고; 그리고
여기서 선택적으로 핵산은 리간드에 접합된다.
일 측면은 바람직하게는 세포에서 CNNM4의 발현을 억제하기 위한 이중 가닥 핵산이며, 핵산은 제1 가닥 및 제2 가닥을 포함하고, 제1 가닥 서열은 서열번호: 243, 267, 277, 279, 287, 317, 319, 325, 333, 345, 347, 349, 361, 367, 369, 371, 377, 401, 411, 413, 415, 420, 421, 524, 526, 528, 530, 532, 534, 536, 538, 540, 542, 544, 546, 548, 549, 550, 551 및 552로부터 선택된 서열 중 임의의 하나로부터 3개 이하의 뉴클레오티드가 상이한 적어도 15개의 뉴클레오티드의 서열을 포함하고 제1 가닥의 모든 짝수 넘버링된 뉴클레오티드는 제1 변형에 의해 변형되고, 제1 가닥의 모든 홀수 넘버링된 뉴클레오티드가 제2 변형에 의해 변형되고, 제1 가닥의 짝수 넘버링된 뉴클레오티드에 해당하는 위치에 있는 제2 가닥의 모든 뉴클레오티드가 제3 변형에 의해 변형되고, 제1 가닥의 홀수 넘버링된 뉴클레오티드에 해당하는 위치에 있는 제2 가닥의 모든 뉴클레오티드가 제4 변형에 의해 변형되고, 여기서 제1 및 제4 변형은 2'-F이고 제2 및 제3 변형은 2'-OMe이다.
일 측면은 바람직하게는 세포에서 CNNM4의 발현을 억제하기 위한 이중 가닥 핵산이며, 핵산은 제1 가닥 및 제2 가닥을 포함하고, 제1 가닥 서열은 서열번호: 243, 267, 277, 279, 287, 317, 319, 325, 333, 345, 347, 349, 361, 367, 369, 371, 377, 401, 411, 413, 415, 420, 421, 524, 526, 528, 530, 532, 534, 536, 538, 540, 542, 544, 546, 548, 549, 550, 551 및 552로부터 선택된 서열 중 하나 이상으로부터 3개 이하의 뉴클레오티드가 상이한 적어도 15개의 뉴클레오티드의 서열을 포함하고 제1 가닥의 모든 짝수 넘버링된 뉴클레오티드는 제1 변형에 의해 변형되고, 제1 가닥의 모든 홀수 넘버링된 뉴클레오티드가 제2 변형에 의해 변형되고, 제1 가닥의 뉴클레오티드 11-13에 상응하는 위치에서 제2 가닥의 모든 뉴클레오티드는 제4 변형에 의해 변형되고, 제1 가닥의 뉴클레오티드 11-13에 상응하는 뉴클레오티드 이외의 제2 가닥의 모든 뉴클레오티드는 제3 변형에 의해 변형되고, 여기서 제1 및 제4 변형은 2'-F이고 제2 및 제3 변형은 2'-OMe이다.
올리고뉴클레오티드의 3' 및 5' 말단은 변형될 수 있다. 이러한 변형은 분자의 3' 말단 또는 5' 말단 또는 양쪽 말단에 있을 수 있다. 그들은 전체 말단 포스페이트 또는 포스페이트 기의 원자 중 하나 이상의 변형 또는 대체를 포함할 수 있다. 예를 들어, 올리고뉴클레오티드의 3' 및 5' 말단은 다른 기능적 분자 독립체 예컨대 표지 모이어티, 예를 들어 형광단(예를 들어, 피렌, TAMRA, 플루오레세인, Cy3 또는 Cy5 염료) 또는 보호기(예를 들어, 황, 규소, 붕소 또는 에스테르 기반)에 접합될 수 있다. 기능적 분자 독립체는 포스페이트 기 및/또는 링커를 통해 당에 부착될 수 있다. 링커의 말단 원자는 당의 포스페이트 기 또는 C-3' 또는 C-5' O, N, S 또는 C 기의 연결 원자에 연결되거나 대체될 수 있다. 대안적으로, 링커는 뉴클레오티드 대용물(예를 들어, PNA)의 말단 원자에 연결하거나 대체할 수 있다. 이들 스페이서 또는 링커는 예를 들어, ―(CH2)n―, ―(CH2)nN―, ― (CH2)nO―, ―(CH2)nS―, ―(CH2CH2O)nCH2CH2O― (예를 들어, n=3 또는 6), 무염기성 당, 아미드, 카복시, 아민, 옥시아민, 옥시이민, 티오에테르, 디설파이드, 티오우레아, 설폰아미드, 또는 모폴리노, 또는 바이오틴 및 플루오레세인 시약을 포함할 수 있다. 3' 말단은 -OH 기일 수 있다.
말단 변형의 다른 예는 염료, 개재 물질 (예를 들어, 아크리딘), 가교결합제 (예를 들어, 소랄렌, 미토마이신 C), 포르피린 (TPPC4, 텍사파이린, 사피린), 다환형 방향족 탄화수소 (예를 들어, 펜아진, 디하이드로펜아진), 인공 엔도뉴클레아제, EDTA, 친유성 담체 (예를 들어, 콜레스테롤, 콜산, 아다만탄 아세트산, 1-피렌 부티르산, 디하이드로테스토스테론, 1,3-비스-O(헥사데실)글리세롤, 제라닐옥시헥실 기, 헥사데실글리세롤, 보르네올, 멘톨, 1,3-프로판디올, 헵타데실 기, 팔미트산, 미리스트산, O3-(올레오일)리토콜린산, O3-(올레오일)콜렌산, 디메톡시트리틸, 또는 펜옥사진) 및 펩티드 콘주게이트 (예를 들어, 안네나페디아 펩티드, Tat 펩티드), 알킬화제, 포스페이트, 아미노, 머캅토, PEG (예를 들어, PEG-40K), MPEG, [MPEG]2, 폴리아미노, 알킬, 치환된 알킬, 방사선표지 마커, 효소, 햅텐(haptens) (예를 들어, 바이오틴), 수송/흡수 촉진제 (예를 들어, 아스피린, 비타민 E, 엽산), 합성 리보뉴클레아제 (예를 들어, 이미다졸, 비스이미다졸, 히스타민, 이미다졸 클러스터, 아크리딘-이미다졸 콘주게이트, 테트라아자매크로사이클의 Eu3+ 복합체)를 포함한다.
말단 변형은 또한 분포를 모니터링하는 데 유용할 수 있으며 이러한 경우 추가할 그룹에는 형광단, 예를 들어 플루오레세인 또는 Alexa 염료가 포함될 수 있다. 말기 변형은 또한 섭취를 향상시키는 데 유용할 수 있으며, 이에 대한 유용한 변형에는 콜레스테롤이 포함된다. 말단 변형은 또한 RNA 제제를 다른 모이어티에 가교시키는 데 유용할 수 있다.
활성을 조절하거나 열화에 대한 저항을 조절하는 것을 포함하여 여러 가지 이유로 말단 변형을 추가할 수 있다. 활성 조절에 유용한 말단 변형에는 포스페이트 또는 포스페이트 유사체를 사용한 5' 말단의 변형이 포함된다. 제1 또는 제2 가닥 상의 본 발명의 핵산은 5' 인산화되거나 5' 프라임 말단에 포스포릴 유사체를 포함할 수 있다. 5'-포스페이트 변형에는 RISC 매개 유전자 사일런싱과 호환되는 변형이 포함된다. 적합한 변형은 하기를 포함한다: 5'-일인산염 ((HO)2(O)P―O-5'); 5'-디포스페이트 ((HO)2(O)P―O―P(HO)(O)―O-5'); 5'-트리포스페이트 ((HO)2(O)P―O―(HO)(O)P―O―P(HO)(O)―O-5'); 5'-구아노신 캡 (7-메틸화된 또는 비-메틸화된) (7m-G-O-5'-(HO)(O)P―O―(HO)(O)P―O―P(HO)(O)―O-5'); 5'-아데노신 캡 (Appp), 및 임의의 변형된 또는 비변형된 뉴클레오티드 캡 구조 (N―O-5'-(HO)(O)P―O―(HO)(O)P―O―P(HO)(O)―O-5'); 5'-모노티오포스페이트 (포스포로티오에이트; (HO)2(S)P―O-5'); 5'-모노디티오포스페이트 (포스포로디티오에이트; (HO)(HS)(S)P―O-5'), 5'-포스포로티올레이트 ((HO)2(O)P―S-5'); 하기의 임의의 추가의 조합: 산소/황 대체된 일인산염, 디포스페이트 및 트리포스페이트 (예를 들어, 5'-알파-티오트리포스페이트, 5'-감마-티오트리포스페이트, 등), 5'-포스포르아미데이트 ((HO)2(O)P―NH-5', (HO)(NH2)(O)P―O-5'), 5'-알킬포스포네이트 (알킬=메틸, 에틸, 이소프로필, 프로필 등, 예를 들어 RP(OH)(O)―O-5'-(여기서 R은 알킬임), OH)2(O)P-5'-CH2-), 5' 비닐포스포네이트, 5'-알킬에테르포스포네이트 (알킬에테르=메톡시메틸 (MeOCH2-), 에톡시메틸 등, 예를 들어 RP(OH)(O)―O-5'- (여기서 R은 알킬에테르)).
특정 모이어티는 제1 가닥 또는 제2 가닥의 5' 말단에 연결될 수 있다. 이들은 무염기성 리보스 모이어티, 무염기성 데옥시리보스 모이어티, 변형 무염기성 리보스 및 무염기성 데옥시리보스 모이어티 (2'-O 알킬 변형 포함); 역전된 무염기성 리보스 및 무염기성 데옥시리보스 모이어티 및 그의 변형, C6-이미노-Pi; a 거울 뉴클레오티드 (L-DNA 및 L-RNA 포함); 5'OMe 뉴클레오티드; 및 뉴클레오티드 유사체 (4', 5'-메틸렌 뉴클레오티드 포함); 1-(β-D-에리트롤푸라노실)뉴클레오티드; 4'-티오 뉴클레오티드, 탄소환 뉴클레오티드; 5'-아미노-알킬 포스페이트; 1,3-디아미노-2-프로필 포스페이트, 3-아미노프로필 포스페이트; 6-아미노헥실 포스페이트; 12-아미노도데실 포스페이트; 하이드록시프로필 포스페이트; 1,5-안하이드로헥시톨 뉴클레오티드; 알파-뉴클레오티드; 트레오-펜토푸라노실 뉴클레오티드; 비환형 3',4'-세코 뉴클레오티드; 3,4-디하이드록시부틸 뉴클레오티드; 3,5-디하이드록시펜틸 뉴클레오티드, 5'-5'-역전된 무염기성 모이어티; 1,4-부탄디올 포스페이트; 5'-아미노; 및 브릿징 또는 비-브릿징 메틸포스포네이트 및 5'-머캅토 모이어티를 포함한다.
본 명세서에 기재된 각각의 서열에서, C-말단 "-OH" 모이어티는 C-말단 "-NH2" 모이어티로 치환될 수 있고, 그 역으로도 치환될 수 있다.
본 발명은 또한 본 명세서에 기재된 본 발명의 임의의 측면에 따른 핵산을 제공하며, 여기서 제1 가닥은 5' 말단에 말단 5' (E)-비닐포스포네이트 뉴클레오티드를 갖는다. 이 말단 5' (E)-비닐포스포네이트 뉴클레오티드는 바람직하게는 포스포디에스테르 연결에 의해 제1 가닥의 제2 뉴클레오티드에 연결된다.
핵산의 제1 가닥은 화학식 (I)을 포함할 수 있다:
(vp)-N(po)[N(po)]n- (I)
여기서 '(vp)-'는 5' (E)-비닐포스포네이트이고, 'N'은 뉴클레오티드이고, 'po'는 포스포디에스테르 연결이고, n은 1 내지 (제1 가닥의 뉴클레오티드의 총수 - 2 ), 바람직하게는 n은 1 내지 (제1 가닥의 뉴클레오티드 총수 -3)이고, 더욱 바람직하게는 n은 1 내지 (제1 가닥의 뉴클레오티드 총수 -4)이다.
바람직하게는 말단 5' (E)-비닐포스포네이트 뉴클레오티드는 RNA 뉴클레오티드, 바람직하게는 (vp)-U이다.
말단 5' (E)-비닐포스포네이트 뉴클레오티드는, 5'-말단의 천연 포스페이트 기가 E-비닐포스포네이트로 대체된 뉴클레오티드이며, 여기서 5' 인산화된 가닥의 말단 뉴클레오티드의 브릿징 5'-산소 원자는 메티닐(-CH=) 기로 대체된다.
Figure pct00005
Figure pct00006
5'-말단에 천연 인산염이 있는 5'-말단에 E-비닐포스포네이트가
뉴클레오티드 있는 뉴클레오티드
5' (E)-비닐포스포네이트는 5' 인산염 모방체이다. 생물학적 모방체는 모방되고 있는 원래 분자와 동일한 기능을 수행할 수 있고 구조적으로 매우 유사한 분자이다. 본 발명의 맥락에서, 5' (E)-비닐포스포네이트는 정상적인 5' 포스페이트의 기능을 모방하여, 예를 들어 효율적인 RISC 로딩을 가능하게 한다. 또한 구조가 약간 변경되었기 때문에 5' (E) 비닐포스포네이트는 포스파타제와 같은 효소에 의한 탈인산화로부터 보호하여 5'-말단 뉴클레오티드를 안정화시킬 수 있다.
한 측면에서, 제1 가닥은 그의 5' 말단에 말단 5' (E)-비닐포스포네이트 뉴클레오티드를 갖고, 말단 5' (E)-비닐포스포네이트 뉴클레오티드는 포스포디에스테르 연결에 의해 제1 가닥의 제2 뉴클레오티드에 연결되고, 제1 가닥은 a) 1개 초과의 포스포디에스테르 연결; b) 적어도 3개의 말단 5' 뉴클레오티드 사이의 포스포디에스테르 연결 및/또는 c) 적어도 4개의 말단 5' 뉴클레오티드 사이의 포스포디에스테르 연결을 포함한다.
한 측면에서, 핵산의 제1 가닥 및/또는 제2 가닥은 2개의 뉴클레오티드 사이에 적어도 하나의 포스포로티오에이트(ps) 및/또는 적어도 하나의 포스포로디티오에이트(ps2) 연결을 포함한다.
한 측면에서, 핵산의 제1 가닥 및/또는 제2 가닥은 하나 초과의 포스포로티오에이트 및/또는 하나 이상의 포스포로디티오에이트 연결을 포함한다.
한 측면에서, 핵산의 제1 가닥 및/또는 제2 가닥은 말단 2개의 3' 뉴클레오티드 사이의 포스포로티오에이트 또는 포스포로디티오에이트 연결 또는 말단 3개의 3' 뉴클레오티드 사이의 포스포로티오에이트 또는 포스포로디티오에이트 연결을 포함한다.
바람직하게는, 제1 가닥 및/또는 제2 가닥의 다른 뉴클레오티드 사이의 연결은 포스포디에스테르 연결이다.
한 측면에서, 핵산의 제1 가닥 및/또는 제2 가닥은 말단 2개의 5' 뉴클레오티드 사이의 포스포로티오에이트 연결 또는 말단 3개의 5' 뉴클레오티드 사이의 포스포로티오에이트 연결을 포함한다.
한 측면에서, 본 발명의 핵산은 제1 및/또는 제2 가닥의 말단 중 하나 이상에 하나 이상의 포스포로티오에이트 또는 포스포로디티오에이트 변형을 포함한다. 선택적으로, 제1 가닥의 각각 또는 어느 한쪽 말단은 1개 또는 2개 또는 3개의 포스포로티오에이트 또는 포스포로디티오에이트 변형된 뉴클레오티드(뉴클레오시드간 연결)를 포함할 수 있다. 선택적으로, 제2 가닥의 각각 또는 어느 한쪽 말단은 1개 또는 2개 또는 3개의 포스포로티오에이트 또는 포스포로디티오에이트 변형된 뉴클레오티드(뉴클레오시드간 연결)를 포함할 수 있다.
한 측면에서, 핵산은 제1 및/또는 제2 가닥의 말단 2개 또는 3개의 3' 뉴클레오티드 및/또는 5' 뉴클레오티드 사이의 포스포로티오에이트 연결을 포함한다. 바람직하게는, 핵산은 제1 가닥 및 제2 가닥의 말단 3개의 3' 뉴클레오티드 각각과 말단 3개의 5' 뉴클레오티드 사이의 포스포로티오에이트 연결을 포함한다. 바람직하게는, 제1 및/또는 제2 가닥의 뉴클레오티드 사이에 남아 있는 모든 연결은 포스포디에스테르 연결이다.
한 측면에서, 핵산은 제1 가닥의 3' 말단에서 2개, 3개 또는 4개의 말단 뉴클레오티드 각각 사이에 포스포로디티오에이트 연결을 포함하고/하거나 제2 가닥의 3' 말단에서 2개, 3개 또는 4개의 말단 뉴클레오티드 각각 사이에 포스포로디티오에이트 연결 및/또는 제2 가닥의 5' 말단에서 2개, 3개 또는 4개의 말단 뉴클레오티드 각각 사이에 포스포로디티오에이트 연결을 포함하고 제1 가닥의 5' 말단에서 2개, 3개 또는 4개의 말단 뉴클레오티드 사이에 포스포로디티오에이트 연결 이외의 연결을 포함한다.
한 측면에서, 핵산은 제1 가닥 및 제2 가닥의 말단 3개의 3' 뉴클레오티드와 말단 3개의 5' 뉴클레오티드 사이의 포스포로티오에이트 연결을 포함한다. 바람직하게는, 제1 및/또는 제2 가닥의 뉴클레오티드 사이에 남아 있는 모든 연결은 포스포디에스테르 연결이다.
한 측면에서, 핵산은,
(i) 제1 가닥의 말단 3개의 3' 뉴클레오티드와 말단 3개의 5' 뉴클레오티드 사이에 포스포로티오에이트 연결을 갖고;
(ii) 제2 가닥의 3' 말단 뉴클레오티드 또는 5' 말단 뉴클레오티드에서 트리안테나리 리간드에 접합되고;
(iii) 트리안테나리 리간드에 접합된 것과 반대쪽 말단에서 제2 가닥의 말단 3개 뉴클레오티드 사이에 포스포로티오에이트 연결을 갖고; 그리고
(iv) 선택적으로 제1 및/또는 제2 가닥의 뉴클레오티드 사이에 남아 있는 모든 연결은 포스포디에스테르 연결이다.
한 측면에서, 핵산은,
(i) 제1 가닥의 5' 말단에 말단 5' (E)-비닐포스포네이트 뉴클레오티드를 갖고;
(ii) 제1 및 제2 가닥의 말단 3개 3' 뉴클레오티드 사이와 제2 가닥의 말단 3개 5' 뉴클레오티드 사이에 포스포로티오에이트 연결을 갖거나 제1 및 제2 가닥의 말단 2개 3' 뉴클레오티드 사이 및 제1 및 제2 가닥의 말단 2개 3' 뉴클레오티드 사이와 제2 가닥 상의 말단 2개의 5' 뉴클레오티드 사이에 포스포로티오에이트 연결을 갖고; 그리고
(iii) 선택적으로 제1 및/또는 제2 가닥의 뉴클레오티드 사이에 남아 있는 모든 연결은 포스포디에스테르 연결이다.
본 발명의 핵산에서 포스포로디티오에이트 연결의 사용은 동일한 위치에 포스포로티오에이트를 포함하는 분자와 비교하여 핵산 분자 집단의 입체화학의 변이를 감소시킨다. 포스포로티오에이트 연결은 키랄 중심을 도입하고 비-연결 산소가 황을 대체하는 것을 제어하기 어렵다. 포스포로디티오에이트를 사용하면 해당 연결에 키랄 중심이 존재하지 않으므로 핵산 분자에 사용되는 포스포로디티오에이트 및 포스포로티오에이트 연결의 수에 따라 핵산 분자 집단의 변이가 감소하거나 제거된다.
한 측면에서, 핵산은 제1 가닥의 3' 말단에서 2개의 말단 뉴클레오티드 사이의 포스포로디티오에이트 연결 및 제2 가닥의 3' 말단에서 2개의 말단 뉴클레오티드 사이의 포스포로디티오에이트 연결 및 제2 가닥의 5' 말단에서 2개의 말단 뉴클레오티드 사이의 포스포로디티오에이트 연결을 포함하고 제1 가닥의 5' 말단에서 2개, 3개 또는 4개의 말단 뉴클레오티드 사이에 포스포로디티오에이트 연결 이외의 연결을 포함한다 바람직하게는, 제1 가닥은 5' 말단에 말단 5' (E)-비닐포스포네이트 뉴클레오티드를 갖는다. 이 말단 5' (E)-비닐포스포네이트 뉴클레오티드는 바람직하게는 포스포디에스테르 연결에 의해 제1 가닥의 제2 뉴클레오티드에 연결된다. 바람직하게는, 제1 가닥의 3' 말단에 있는 2개의 말단 뉴클레오티드 사이의 연결 및 제2 가닥의 3' 말단 및 5' 말단에 있는 2개의 말단 뉴클레오티드 사이의 연결을 제외한 두 가닥의 뉴클레오티드 사이의 모든 연결은 포스포디에스테르 연결이다.
한 측면에서, 핵산은 그 말단에 포스포로디티오에이트 연결이 존재하지 않는 경우, 제1 가닥 상의 3개의 말단 3' 뉴클레오티드 각각 사이 및/또는 3개의 말단 5' 뉴클레오티드 각각 사이, 및/또는 3개의 말단 3' 뉴클레오티드 각각 사이 및 /또는 제2 가닥의 3개의 말단 5' 뉴클레오티드 각각 사이에 포스포로티오에이트 연결을 포함한다 말단에 존재하는 포스포로디티오에이트 연결이 없다는 것은 해당 핵산 말단의 2개의 말단 뉴클레오티드 사이, 또는 바람직하게는 3개의 말단 뉴클레오티드 사이의 연결이 포스포로디티오에이트 연결 이외의 연결임을 의미한다.
한 측면에서, 제1 가닥의 3' 말단에 있는 2개의 말단 뉴클레오티드 사이의 연결 및 제2 가닥의 3' 말단 및 5' 말단에 있는 2개의 말단 뉴클레오티드 사이의 연결을 제외한 두 가닥의 뉴클레오티드 사이의 핵산의 모든 연결은 포스포디에스테르 연결이다.
다른 인산염 연결 변형이 가능하다.
포스페이트 링커는 연결 산소를 질소(가교 포스포로아미데이트), 황(가교 포스포로티오에이트) 및 탄소(가교 메틸렌포스포네이트)로 대체하여 변형될 수도 있다. 대체는 말단 산소에서 발생할 수 있다. 비-연결 산소를 질소로 대체하는 것이 가능하다.
인산염 기는 비-인(non-phosphorus) 함유 커넥터로 개별적으로 대체될 수도 있다.
포스페이트 기를 대체할 수 있는 모이어티의 예는 실록산, 카보네이트, 카복시메틸, 카바메이트, 아미드, 티오에테르, 에틸렌 옥사이드 링커, 설포네이트, 설폰아미드, 티오포름아세탈, 포름아세탈, 옥심, 메틸렌이미노, 메틸렌메틸이미노, 메틸렌하이드라조, 메틸렌디메틸하이드라조 및 메틸렌옥시메틸이미노를 포함한다. 특정 구현예에서, 대체물은 메틸렌카르보닐아미노 및 메틸렌메틸이미노 기를 포함할 수 있다.
포스페이트 링커와 리보스 당은 뉴클레아제 저항성 뉴클레오티드로 대체될 수 있다. 그 예는 모르폴리노, 사이클로부틸, 피롤리딘 및 펩티드 핵산(PNA) 뉴클레오시드 대용물을 포함한다. 특정 구현예에서, PNA 대용물이 사용될 수 있다.
한 측면에서, 바람직하게는 RNAi를 통해 바람직하게는 세포에서 CNNM4의 발현을 억제하는 바람직하게는 siRNA인 핵산은 하기 중 하나 이상 또는 모두를 포함한다:
(i) 변형된 뉴클레오티드;
(ii) 제1 가닥의 5' 말단으로부터 위치 2 및 14에 2'-OMe 변형된 뉴클레오티드 이외의 변형된 뉴클레오티드, 바람직하게는 2'-F 변형된 뉴클레오티드;
(iii) 제1 가닥의 5' 말단에서 1부터 시작하여 넘버링된 제1 가닥의 각 홀수 넘버링된 뉴클레오티드는 2'-OMe 변형된 뉴클레오티드이고;
(iv) 제1 가닥의 5' 말단에서 1부터 시작하여 넘버링된 제1 가닥의 각 짝수 넘버링된 뉴클레오티드는 2'-F 변형된 뉴클레오티드이고;
(v) 제1 가닥의 위치 11 및/또는 13 또는 11-13에 해당하는 제2 가닥 뉴클레오티드는 2'-OMe 변형 이외의 변형에 의해 변형되며, 바람직하게는 이러한 위치 중 하나 또는 둘 다 또는 모두가 2'-F 변형을 포함하고;
(vi) 역전된 뉴클레오티드, 바람직하게는 제2 가닥의 3' 말단에서 3'-3' 연결;
(vii) 하나 이상의 포스포로티오에이트 연결;
(viii) 하나 이상의 포스포로디티오에이트 연결; 및/또는
(ix) 제1 가닥은 5' 말단에 말단 5' (E)-비닐포스포네이트 뉴클레오티드를 가지며, 이 경우 말단 5' (E)-비닐포스포네이트 뉴클레오티드는 바람직하게는 우리딘이고 바람직하게는 포스포디에스테르 연결에 의해 제1 가닥에서 제2 뉴클레오티드에 연결된다.
핵산의 모든 특징은 본 명세서에 개시된 본 발명의 모든 다른 측면과 조합될 수 있다.
리간드
본 발명의 핵산은 리간드에 접합될 수 있다. 생체내 세포로의 올리고뉴클레오티드, 특히 본 발명의 이중 가닥 핵산의 효율적인 전달은 중요하며 세포외 환경, 특히 혈청 단백질로부터의 특이적 표적화 및 실질적인 보호를 필요로 한다. 특정 표적화를 달성하는 한 가지 방법은 리간드를 핵산에 접합시키는 것이다. 일부 구현예에서, 리간드는 접합된 리간드에 결합하고 이를 내재화하는 세포 표면 수용체를 갖는 표적 세포에 핵산을 표적화하는 것을 돕는다. 이러한 구현예에서, 접합된 분자가 상이한 수용체 매개 세포내이입 경로 또는 기능적으로 유사한 과정과 같은 메카니즘에 의해 표적 세포에 의해 흡수되도록 하기 위해 원하는 수용체 분자에 대한 적절한 리간드를 접합할 필요가 있다. 다른 구현예에서, 수용체 매개 세포내이입 이외의 메카니즘에 의해 표적 세포로의 핵산의 내재화를 매개할 수 있는 리간드는 대안적으로 세포 또는 조직 특이적 표적화를 위해 본 발명의 핵산에 접합될 수 있다.
수용체 매개 세포내이입을 매개하는 접합체의 한 예는 본 명세서에 기재된 GalNAc 모이어티에 높은 친화성을 갖는 아시알로당단백질 수용체 복합체(ASGP-R)이다. ASGP-R 복합체는 간세포에 매우 풍부한 막 ASGR1 및 ASGR2 수용체의 다양한 비율의 다량체로 구성된다. 공액 리간드로서 트리안테나리 클러스터 글리코시드의 사용에 대한 최초의 개시내용 중 하나는 미국 특허 번호 US 5,885,968에 있었다. 3개의 GalNAc 리간드를 갖고 포스페이트 기를 포함하는 접합체는 문헌[Dubber et al (Bioconjug. Chem. 2003 Jan-Feb;14(1):239-46.)]에 공지되어 있다. ASGP-R 복합체는 D-Gal보다 N-아세틸-D-갈락토사민 (GalNAc)에 대해 50배 더 높은 친화성을 나타낸다.
ASGP-R 복합체는 글리코실화 단백질 또는 다른 올리고당의 말단 β-갈락토실 서브유닛을 특이적으로 인식하고(Weigel, P.H. et. al., Biochim. Biophys. Acta. 2002 Sep 19;1572(2-3):341-63), 원료 의약품에 대한 갈락토오스 또는 갈락토사민의 공유 커플링에 의해 수용체 복합체를 발현하는 간의 간세포에 약물을 전달하기 위해 사용될 수 있다(Ishibashi.S.; et. al., J Biol. Chem. 1994 Nov 11;269(45): 27803-6). 또한, 결합 친화도는 표적화 모이어티의 반복에 의해 달성되는 다중 원자가 효과에 의해 상당히 증가될 수 있다(Biessen EA, 등, J Med Chem. 1995 Apr 28; 38(9): 1538-46). .
ASGP-R 복합체는 말단 β-갈락토실 함유 당단백질을 세포의 엔도좀으로 능동적으로 흡수하기 위한 매개체이다. 따라서, ASGPR은 예를 들어 핵산과 같은 이러한 리간드에 접합된 약물 후보를 수용체 발현 세포로의 표적 전달에 매우 적합하다(Akinc 등, Mol Ther. 2010 Jul; 18(7): 1357-64).
보다 일반적으로 리간드는 표적 세포 상의 적어도 하나의 유형의 수용체에 대한 친화성을 갖도록 선택된 당류를 포함할 수 있다. 특히, 수용체는 포유동물 간 세포의 표면, 예를 들어 이전에 기재된 간 아시알로당단백질 수용체 복합체(ASGP-R)에 있다.
당류는 N-아세틸 갈락토사민, 만노스, 갈락토즈, 글루코스, 글루코사민 및 푸코스로부터 선택될 수 있다. 당류는 N-아세틸 갈락토사민(GalNAc)일 수 있다.
따라서, 본 발명에서 사용하기 위한 리간드는 (i) 하나 이상의 N-아세틸 갈락토사민(GalNAc) 모이어티 및 그의 유도체, 및 (ii) 링커를 포함할 수 있으며, 링커는 GalNAc 모이어티를 임의의 이전 측면에 정의된 바와 같은 핵산에 접합시킨다. 링커는 1가 구조 또는 2가 또는 3가 또는 4가 분지형 구조일 수 있다. 뉴클레오티드는 본원에 정의된 바와 같이 변형될 수 있다.
따라서 리간드는 GalNAc를 포함할 수 있다.
한 측면에서, 핵산은 하기 화학식 II의 화합물을 포함하는 리간드에 접합된다:
[S-X1-P-X2]3-A-X3- (II)
여기서
S는 당류를 나타내고, 바람직하게는 당류는 N-아세틸 갈락토사민이고;
X1은 C3-C6 알킬렌 또는 (-CH2-CH2-O)m(-CH2)2-를 나타내고, 여기서 m은 1, 2 또는 3이고;
P는 포스페이트 또는 변형된 포스페이트, 바람직하게는 티오포스페이트이고;
X2는 알킬렌 또는 화학식 (-CH2)n-O-CH2-의 알킬렌 에테르이고, 여기서 n은 1 내지 6이고;
A는 분지 단위이고;
X3은 분지 단위를 나타내고;
본 발명에 따른 핵산은 포스페이트 또는 변형된 포스페이트, 바람직하게는 티오포스페이트를 통해 X3에 접합된다.
화학식 II에서, 분지 단위 "A"는 바람직하게는 3개의 당류 리간드를 수용하기 위해 3개로 분지된다. 분지 단위는 바람직하게는 리간드 및 핵산의 나머지 테더링된 부분에 공유 부착된다. 분지 단위는 알킬, 아미드, 디설파이드, 폴리에틸렌 글리콜, 에테르, 티오에테르 및 하이드록시아미노 기로부터 선택되는 군을 포함하는 분지형 지방족 기를 포함할 수 있다. 분지 단위는 알킬 및 에테르 기로부터 선택된 기를 포함할 수 있다.
분지 단위 A는 다음으로부터 선택된 구조를 가질 수 있다:
Figure pct00007
및
Figure pct00008
여기서 각각의 A1은 독립적으로 O, S, C=O 또는 NH를 나타내고; 각각의 n은 독립적으로 1 내지 20의 정수를 나타낸다.
분지 단위는 다음으로부터 선택된 구조를 가질 수 있다:
Figure pct00009
및
Figure pct00010
여기서 각각의 A1은 독립적으로 O, S, C=O 또는 NH를 나타내고; 각각의 n은 독립적으로 1 내지 20의 정수를 나타낸다.
분지 단위는 다음으로부터 선택된 구조를 가질 수 있다:
Figure pct00011
및
Figure pct00012
여기서 A1은 독립적으로 O, S, C=O 또는 NH를 나타내고; 각각의 n은 독립적으로 1 내지 20의 정수를 나타낸다.
분지 단위는 다음의 구조를 가질 수 있다:
Figure pct00013
분지 단위는 다음의 구조를 가질 수 있다:
Figure pct00014
분지 단위는 다음의 구조를 가질 수 있다:
Figure pct00015
대안적으로, 분지 단위 A는 다음으로부터 선택된 구조를 가질 수 있다:
Figure pct00016
여기서
R1은 수소 또는 C1-C10 알킬렌이고;
R2는 C1-C10 알킬렌이다.
선택적으로 분지 단위는 탄소 원자로만 구성된다.
"X3" 부분은 분지 단위이다. 분지 단위는 선형이며 분지 단위와 핵산에 공유 결합된다.
X3는 -C1-C20 알킬렌-, -C2-C20 알케닐렌-, 식 -(C1-C20 알킬렌)-O-(C1-C20 알킬렌)-의 알킬렌 에테르, -C(O)-C1-C20 알킬렌-, -CO-C4 알킬렌(Cy)CO-C4 알킬렌-로부터 선택될 수 있고, 여기서 Cy는 치환된 또는 비치환된 5 또는 6 원 사이클로알킬렌, 아릴렌, 헤테로사이클릴렌 또는 헤테로아릴렌 고리, -C1-C4 알킬렌-NHC(O)-C1-C4 알킬렌-, -C1-C4 알킬렌-C(O)NH-C1-C4 알킬렌-, -C1-C4 알킬렌-SC(O)-C1-C4 알킬렌-, -C1-C4 알킬렌-C(O)S-C1-C4 알킬렌-, -C1-C4 알킬렌-OC(O)-C1-C4 알킬렌-, -C1-C4 알킬렌-C(O)O-C1-C4 알킬렌-, 및 -C1-C6 알킬렌-S-S-C1-C6 알킬렌을 나타낸다.
X3은 화학식 -(C1-C20 알킬렌)-O-(C1-C20 알킬렌)-의 알킬렌 에테르일 수 있다. X3은 화학식 -(C1-C20 알킬렌)-O-(C4-C20 알킬렌)-의 알킬렌 에테르일 수 있으며, 여기서 상기 (C4-C20 알킬렌)은 Z에 연결되어 있다. X3은 -CH2-O-C3H6-, -CH2-O-C4H8-, -CH2-O-C6H12- 및 -CH2-O-C8H16-, 특히 -CH2-O-C4H8-, -CH2-O-C6H12- 및 -CH2-O-C8H16-로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있고, 여기서 각 경우에 -CH2- 기는 A에 연결된다.
한 측면에서, 핵산은 하기 화학식 III의 화합물을 포함하는 리간드에 접합된다:
[S-X1-P-X2]3-A-X3- (III)
여기서
S는 당류, 바람직하게는 GalNAc를 나타내고;
X1은 C3-C6 알킬렌 또는 (-CH2-CH2-O)m(-CH2)2-를 나타내고, 여기서 m은 1, 2 또는 3이고;
P는 포스페이트 또는 변형된 포스페이트, 바람직하게는 티오포스페이트이고;
X2는 C1-C8 알킬렌이고;
A는 하기로부터 선택되는 분지 단위이다.
Figure pct00017
X3은 분지 단위이고;
본 발명에 따른 핵산은 포스페이트 또는 변형된 포스페이트, 바람직하게는 티오포스페이트를 통해 X3에 접합된다.
분지 단위 A는 다음의 구조를 가질 수 있다:
Figure pct00018
분지 단위 A는 다음의 구조를 가질 수 있다:
Figure pct00019
여기서 X3은 질소 원자에 부착되어 있다.
X3은 C1-C20 알킬렌일 수 있다. 바람직하게는, X3은 -C3H6-, -C4H8-, -C6H12- 및 -C8H16-, 특히 -C4H8-, -C6H12- 및 -C8H16-으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
한 측면에서, 핵산은 하기 화학식 IV의 화합물을 포함하는 리간드에 접합된다:
[S-X1-P-X2]3-A-X3- (IV)
여기서
S는 당류, 바람직하게는 GalNAc를 나타내고;
X1은 C3-C6 알킬렌 또는 (-CH2-CH2-O)m(-CH2)2-를 나타내고, 여기서 m은 1, 2 또는 3이고;
P는 포스페이트 또는 변형된 포스페이트, 바람직하게는 티오포스페이트이고;
X2는 화학식 -C3H6-O-CH2-의 알킬렌 에테르이고;
A는 분지 단위이고;
X3은 -CH2-O-CH2-, -CH2-O-C2H4-, -CH2-O-C3H6-, -CH2-O-C4H8-, -CH2-O-C5H10-, -CH2-O-C6H12-, -CH2-O-C7H14-, 및 -CH2-O-C8H16-로 이루어진 군으로부터 선택된 식의 알킬렌 에테르이고, 여기서 각 경우에 -CH2- 기는 A에 연결되고 X3은 포스페이트 또는 변형된 포스페이트, 바람직하게는 티오포스페이트에 의해 본 발명에 따른 핵산에 접합된다.
분지 단위는 탄소를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 분지 단위는 탄소이다.
X3는 -CH2-O-C4H8-, -CH2-O-C5H10-, -CH2-O-O6H12-, -CH2-O-C7H14- 및 -CH2-O-C8H16-으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 바람직하게는, X3은 -CH2-O-C4H8-, -CH2-O-C6H12- 및 -CH2-O-C8H16으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
X1은 (-CH2-CH2-O)(-CH2)2-일 수 있다. X1은 (-CH2-CH2-O)2(-CH2)2-일 수 있다. X1은 (-CH2-CH2-O)3(-CH2)2-일 수 있다. 바람직하게는, X1은 (-CH2-CH2-O)2(-CH2)2-일 수 있다. 대안적으로, X1은 C3-C6 알킬렌을 나타낸다. X1은 프로필렌일 수 있다. X1은 부틸렌일 수 있다. X1은 펜틸렌일 수 있다. X1은 헥실렌일 수 있다. 바람직하게는 알킬은 선형 알킬렌이다. 특히, X1은 부틸렌일 수 있다.
X2는 화학식 -C3H6-O-CH2-의 알킬렌 에테르, 즉 C3 알콕시 메틸렌 또는 -CH2CH2CH2OCH2-를 나타낸다.
임의의 상기 측면에 대해, P가 변형된 포스페이트 기를 나타낼 때, P는 다음과 같이 나타낼 수 있다:
Figure pct00020
여기서 Y1 및 Y2는 각각 독립적으로 =O, =S, -O, -OH, -SH, -BH3, -OCH2CO2, -OCH2CO2Rx, -OCH2C(S)ORx, 및 -ORx를 나타내고, 여기서 Rx는 C1-C6 알킬을 나타내고, 여기서
Figure pct00021
는 화합물의 나머지 부분에 대한 부착을 나타낸다.
변형된 포스페이트는 비-연결 산소 중 하나 이상이 대체된 포스페이트 기를 의미한다. 변형된 포스페이트 기의 예는 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 포스포로셀레네이트, 보라노 포스페이트, 보라노 포스페이트 에스테르, 수소 포스포네이트, 포스포로아미데이트, 알킬 또는 아릴 포스포네이트 및 포스포트리에스테르를 포함한다. 포스포로디티오에이트는 황으로 대체된 비-결합 산소를 모두 갖는다. 포스페이트 기에서 하나, 각각 또는 둘 모두의 비-연결 산소는 독립적으로 S, Se, B, C, H, N 또는 OR(R은 알킬 또는 아릴임) 중 어느 하나일 수 있다.
포스페이트는 연결 산소를 질소(가교 포스포로아미데이트), 황(가교 포스포로티오에이트) 및 탄소(가교 메틸렌포스포네이트)로 대체하여 변형될 수도 있다. 대체는 말단 산소에서 발생할 수 있다. 비-연결 산소를 질소로 대체하는 것이 가능하다.
예를 들어, Y1은 -OH를 나타낼 수 있고 Y2는 =O 또는 =S를 나타낼 수 있거나; 또는
Y1은 -O를 나타낼 수 있고 Y2는 =O 또는 =S를 나타낼 수 있으며;
Y1은 =O를 나타낼 수 있고 Y2는 -CH3, -SH, -ORx, 또는 -BH3를 나타낼 수 있으며;
Y1은 =S를 나타낼 수 있고 Y2는 -CH3, ORx 또는 -SH를 나타낼 수 있다.
특정 경우에 Y1과 Y2 사이에 비편재화가 있을 것이라는 것을 당업자는 이해할 것이다.
바람직하게는, 변형된 포스페이트 기는 티오포스페이트 기이다. 티오포스페이트 기는 바이티오포스페이트(즉, 여기서 Y1은 =S를 나타내고 Y2는 -S를 나타냄) 및 모노티오포스페이트(즉, 여기서 Y1은 -O를 나타내고 Y2는 =S를 나타내거나, 여기서 Y1은 =O를 나타내고 Y2는 -S를 나타냄)를 포함한다. 바람직하게는 P는 모노티오포스페이트이다. 본 발명자들은 포스페이트 기 대신에 티오포스페이트 기를 갖는 접합체가 개선된 효능 및 생체내 작용 지속시간을 갖는다는 것을 발견하였다.
P는 또한 에틸포스페이트(즉, 여기서 Y1은 =O를 나타내고 Y2는 OCH2CH3를 나타냄)일 수 있다.
당류는 표적 세포 상의 적어도 하나의 유형의 수용체에 대한 친화성을 갖도록 선택될 수 있다. 특히, 수용체는 포유동물 간 세포의 표면, 예를 들어 간 아시알로당단백질 수용체 복합체(ASGP-R) 상에 있다.
임의의 상기 또는 하기 측면에 대해, 당류는 갈락토사민, 만노즈, 갈락토즈, 글루코스, 글루코사민 및 푸룩토스 중 하나 이상을 갖는 N-아세틸로부터 선택될 수 있다. 전형적으로 본 발명에서 사용되는 리간드는 N-아세틸 갈락토사민(GalNAc)을 포함할 수 있다. 바람직하게는 본 발명의 화합물은 각각 바람직하게는 N-아세틸 갈락토사민을 포함할 3개의 리간드를 가질 수 있다.
"GalNAc"는 일반적으로 문헌에서 N-아세틸 갈락토사민으로 언급되는 2-(아세틸아미노)-2-데옥시-D-갈락토파이라노스를 지칭한다. "GalNAc" 또는 "N-아세틸 갈락토사민"에 대한 언급은 β형: 2-(아세틸아미노)-2-데옥시-β-D-갈락토파이라노스 및 α형: 2-(아세틸아미노)-2-데옥시-α-D-갈락토파이라노스 모두를 포함한다. 특정 구현예에서,β형: 2-(아세틸아미노)-2-데옥시-β-D-갈락토파이라노스 및 α형: 2-(아세틸아미노)-2-데옥시-α-D-갈락토파이라노스 모두가 상호교환적으로 사용될 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 화합물은 β형, 2-(아세틸아미노)-2-데옥시-13-D-갈락토파이라노스를 포함한다.
Figure pct00022
2-(아세틸아미노)-2-데옥시-D-갈락토파이라노스
Figure pct00023
2-(아세틸아미노)-2-데옥시-β-D-갈락토파이라노스
Figure pct00024
2-(아세틸아미노)-2-데옥시-α-D-갈락토파이라노스
한 측면에서, 핵산은 접합된 핵산이며, 여기서 핵산은 다음 구조 중 하나를 갖는 트리안테나리 리간드에 접합된다:
Figure pct00025
Figure pct00026
Figure pct00027
Figure pct00028
Figure pct00029
Figure pct00030
Figure pct00031
Figure pct00032
Figure pct00033
Figure pct00034
여기서 Z는 본원에 정의된 임의의 핵산이다.
바람직하게는, 핵산은 접합된 핵산이며, 여기서 핵산은 다음 구조를 갖는 트리안테나리 리간드에 접합된다:
Figure pct00035
여기서 Z는 본원에 정의된 임의의 핵산이다.
화학식 (II), (III) 또는 (IV)의 리간드 또는 본 명세서에 개시된 트리안테나리 리간드 중 임의의 하나는 제1(안티센스) 가닥의 3'-말단 및/또는 제2(센스) 가닥의 3' 및/또는 5' 말단 중 임의의 것에서 부착될 수 있다. 핵산은 화학식 (II), (III) 또는 (IV)의 하나 초과의 리간드 또는 본 명세서에 개시된 트리안테나리 리간드 중 임의의 하나를 포함할 수 있다. 그러나, 화학식 (II), (III) 또는 (IV)의 단일 리간드 또는 본 명세서에 개시된 트리안테나리 리간드 중 임의의 하나가 바람직한데, 그 이유는 이러한 단일 리간드가 표적 세포에 대한 핵산의 효율적인 표적화에 충분하기 때문이다. 바람직하게는 그 경우에, 리간드가 부착된 핵산의 말단에 있는 적어도 마지막 2개, 바람직하게는 적어도 마지막 3개, 보다 바람직하게는 적어도 마지막 4개의 뉴클레오티드는 포스포디에스테르 연결에 의해 연결된다.
바람직하게는, 제1(안티센스) 가닥의 5'-말단은 화학식 (II), (III) 또는 (IV)의 리간드 또는 본 명세서에 개시된 트리안테나리 리간드 중 임의의 하나에 부착되지 않는데, 그 이유는 이 위치의 리간드가 잠재적으로 핵산의 생물학적 활성을 방해하기 때문이다.
화학식 (II), (III) 또는 (IV)의 단일 리간드 또는 가닥의 5' 말단에 본 명세서에 개시된 트라이안테나리 리간드 중 임의의 하나를 갖는 핵산은 3' 말단에 동일한 리간드를 갖는 동일한 핵산보다 합성하기 쉽고 따라서 저렴하다. 따라서 바람직하게는 임의의 화학식 (II), (III) 또는 (IV)의 단일 리간드 또는 본 명세서에 개시된 트리안테나리 리간드 중 임의의 하나는 핵산의 제2 가닥의 5' 말단에 공유 부착(접합)된다
한 측면에서, 핵산의 제1 가닥은 하기 화학식 (V)의 화합물이다:
Figure pct00036
여기서 b는 바람직하게는 0 또는 1이고; 그리고
제2 가닥은 화학식 (VI)의 화합물이다:
Figure pct00037
여기서
c 및 d는 독립적으로 바람직하게는 0 또는 1이고;
Z1 및 Z2는 각각 핵산의 제2 및 제2 가닥이며;
Y는 독립적으로 O 또는 S이고;
n은 독립적으로 0, 1, 2 또는 3이고; 그리고
L1은 리간드가 부착된 링커이고, 여기서 L1은 화학식 (V) 및 (VI)에서 동일하거나 상이하고, L1이 동일한 화학식 내에서 1회 초과 존재하는 경우 화학식 (V) 및 (VI) 내에서 동일하거나 상이하고, L1은 바람직하게는 화학식 (VII)이고;
여기서 b + c + d는 바람직하게는 2 또는 3이다.
바람직하게는, 화학식 (V) 및 (VI)에서 L1은 화학식 (VII)의 것이다:
Figure pct00038
여기서
L은 하기를 포함하거나 바람직하게는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된다:
-(CH2)r-C(O)-, 여기서 r = 2-12;
-(CH2-CH2-O)s-CH2-C(O)-, 여기서 s = 1-5;
-(CH2)t-CO-NH-(CH2)t-NH-C(O)-, 여기서 t는 독립적으로 1 내지 5임;
-(CH2)u-CO-NH-(CH2)u-C(O)-, 여기서 u는 독립적으로 1 내지 5이고; 그리고
-(CH2)v-NH-C(O)-, 여기서 v는 2 내지 12이고; 그리고
여기서 말단 C(O)는 존재하는 경우 화학식 (VII)의 X에 부착되거나, X가 존재하지 않는 경우, 화학식 (VII)의 W1에 부착되거나, W1이 존재하지 않는 경우 화학식 (VII)의 V에 부착되고;
W1, W3 및 W5는 개별적으로 존재하지 않거나 하기를 포함하거나 바람직하게는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된다:
-(CH2)r-, 여기서 r = 1-7;
-(CH2)s-O-(CH2)s-, 여기서 s는 독립적으로 0 내지 5임;
-(CH2)t-S-(CH2)r-, 여기서 t는 독립적으로 0 내지 5임;
X는 존재하지 않거나 하기를 포함하거나 바람직하게는 NH, NCH3 또는 NC2H5로 이루어진 군으로부터 선택되고;
V은 하기를 포함하거나 바람직하게는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된다:
Figure pct00039
또는
Figure pct00040
;
여기서 B는 존재한다면 변형된 또는 천연 핵염기이다.
한 측면에서, 제1 가닥은 화학식 (VIII)의 화합물이다.
Figure pct00041
여기서 b는 바람직하게는 0 또는 1이고; 그리고
제2 가닥은 화학식 (IX)의 화합물이다:
Figure pct00042
여기서 c 및 d는 독립적으로 바람직하게는 0 또는 1이고;
여기서
Z1 및 Z2는 각각 핵산의 제2 및 제2 가닥이며;
Y는 독립적으로 O 또는 S이고;
R1은 H 또는 메틸이고;
n은 독립적으로 바람직하게는 0, 1, 2 또는 3이고; 그리고
L은 화학식 (VIII) 및 (IX)에서 동일하거나 상이하고, L이 동일한 화학식 내에서 1회 초과로 존재할 때 화학식 (VIII) 및 (IX) 내에서 동일하거나 상이하고, 그리고 하기를 포함하거나 그로 이루어진 군으로부터 선택된다:
-(CH2)r-C(O)-, 여기서 r = 2-12;
-(CH2-CH2-O)s-CH2-C(O)-, 여기서 s = 1-5;
-(CH2)t-CO-NH-(CH2)t-NH-C(O)-, 여기서 t는 독립적으로 1 내지 5임;
-(CH2)u-CO-NH-(CH2)u-C(O)-, 여기서 u는 독립적으로 1 내지 5이고; 그리고
-(CH2)v-NH-C(O)-, 여기서 v는 2 내지 12이고; 그리고
여기서 C(O) 말단은 존재하는 경우 (표적화 리간드가 아닌 링커의) NH 기에 부착되고;
여기서 b + c + d는 바람직하게는 2 또는 3이다.
한 측면에서, 핵산의 제1 가닥은 하기 화학식 (X)의 화합물이다:
Figure pct00043
여기서 b는 바람직하게는 0 또는 1이고; 그리고
제2 가닥은 화학식 (XI)의 화합물이다:
Figure pct00044
여기서
c 및 d는 독립적으로 바람직하게는 0 또는 1이고;
Z1 및 Z2는 각각 핵산의 제2 및 제2 가닥이며;
Y는 독립적으로 O 또는 S이고;
n은 독립적으로 바람직하게는 0, 1, 2 또는 3이고; 그리고
L2는 화학식 (X) 및 (XI)에서 동일하거나 상이하고, b, c 및 d로 괄호로 묶은 모이어티에서 동일하거나 상이하며, 하기를 포함하거나 바람직하게는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된다:
Figure pct00045
및
Figure pct00046
n은 0이고 L2는 하기이고:
말단 OH 기는 부재하여 하기의 모이어티가 형성된다:
Figure pct00047
여기서
F는 포화된 분지형 또는 비분지형(예를 들어 비분지형) C1-8알킬(예를 들어 C1-6알킬) 사슬이며, 상기 산소 원자가 적어도 2개의 탄소 원자에 의해 또 다른 헤테로원자(예를 들어, O 또는 N 원자)로부터 분리된다면, 탄소 원자 중 하나는 산소 원자로 선택적으로 대체되고;
L은 화학식 (X) 및 (XI)에서 동일하거나 상이하며, 하기를 포함하거나 바람직하게는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된다:
-(CH2)r-C(O)-, 여기서 r = 2-12;
-(CH2-CH2-O)s-CH2-C(O)-, 여기서 s = 1-5;
-(CH2)t-CO-NH-(CH2)t-NH-C(O)-, 여기서 t는 독립적으로 1 내지 5임;
-(CH2)u-CO-NH-(CH2)u-C(O)-, 여기서 u는 독립적으로 1 내지 5이고; 그리고
-(CH2)v-NH-C(O)-, 여기서 v는 2 내지 12이고; 그리고
여기서 C(O) 말단은 존재하는 경우 (표적화 리간드가 아닌 링커의) NH 기에 부착되고;
여기서 b + c + d는 바람직하게는 2 또는 3이다.
한 측면에서, 화학식 (V) 및 (VI) 또는 (VIII) 및 (IX) 또는 (X) 및 (XI)의 임의의 핵산에서 b는 0이고, c는 1이고, d는 1이고; b는 1이고, c는 0이고, 그리고 d는 1이고; b는 1이고, c는 1이고, d는 0이거나; 또는 b는 1이고, c는 1이고, d는 1이다. 바람직하게는, b는 0이고, c는 1이고, d는 1이고; b는 1이고, c는 0이고, 그리고 d는 1이고; 또는 b는 1이고, c는 1이고, d는 1이다 가장 바람직하게는, b는 0이고, c는 1이고 d는 1이다.
한 측면에서, Y는 화학식 (V) 및 (VI) 또는 (VIII) 및 (IX) 또는 (X) 및 (XI)의 임의의 핵산에서 O이다. 다른 측면에서, Y는 S이다. 바람직한 측면에서, Y는 화학식에서 상이한 위치에 있는 O 또는 S로부터 독립적으로 선택된다.
한 측면에서, R1은 화학식 (VIII) 및 (IX)의 임의의 핵산에서 H 또는 메틸이다. 한 측면에서, R1은 H이다. 또 다른 측면에서, R1은 메틸이다.
한 측면에서, n은 화학식 (V) 및 (VI) 또는 (VIII) 및 (IX) 또는 (X) 및 (XI)의 임의의 핵산에서 0, 1, 2 또는 3이다. 바람직하게는 n은 0이다.
화학식 (X) 및 (XI)의 임의의 핵산에서 F 모이어티의 예는 (CH2)1-6, 예를 들어 (CH2)1-4, 예를 들어 CH2, (CH2), (CH2)5 또는 (CH2)6, 또는 CH2O(CH2)2-3, 예를 들어 CH2O(CH2)CH3를 포함한다.
한 측면에서, 화학식 (X) 및 (XI)에서 L2는
Figure pct00048
이다.
한 측면에서, L2는
Figure pct00049
이다.
한 측면에서, L2는
Figure pct00050
이다.
한 측면에서, L2는
Figure pct00051
이다.
한 측면에서, n은 0이고 L2는 하기
Figure pct00052
이다.
말단 OH 기는 부재하여 하기의 모이어티가 형성된다:
Figure pct00053
여기서 Y는 O 또는 S이다.
한 측면에서, 화학식 (V) 및 (VI) 또는 (VIII) 및 (IX) 또는 (X) 및 (XI)의 핵산에서 L은 하기를 포함하거나 그로 이루어진 군으로부터 선택된다:
-(CH2)r-C(O)-, 여기서 r = 2-12;
-(CH2-CH2-O)s-CH2-C(O)-, 여기서 s = 1-5;
-(CH2)t-CO-NH-(CH2)t-NH-C(O)-, 여기서 t는 독립적으로 1 내지 5임;
-(CH2)u-CO-NH-(CH2)u-C(O)-, 여기서 u는 독립적으로 1 내지 5이고; 그리고
-(CH2)v-NH-C(O)-, 여기서 v는 2 내지 12이고;
여기서 말단 C(O)는 NH 기에 부착된다.
바람직하게는, L은 -(CH2)rC(O)-이고, 여기서 r = 2-12, 더 바람직하게는 r = 2-6, 더욱 더 바람직하게는 r = 4 또는 6, 예를 들어 4.
바람직하게는, L은
Figure pct00054
이다.
b, c 및 d로 괄호로 묶은 모이어티 내에서, 화학식 X 및 XI의 핵산에서 L2는 일반적으로 동일하다. b, c 및 d로 괄호로 묶은 모이어티 사이에서 L2는 동일하거나 상이할 수 있다. 한 구현예에서, c로 괄호로 묶은 모이어티의 L2는 d로 괄호로 묶은 모이어티의 L2와 동일하다. 한 구현예에서, c로 괄호로 묶은 모이어티의 L2는 d로 괄호로 묶은 모이어티의 L2와 동일하지 않다. 한 구현예에서, b, c 및 d로 괄호로 묶은 모이어티의 L2는 예를 들어 링커 모이어티가 세리놀 유래 링커 모이어티인 경우 동일하다.
세리놀 유래된 링커 모이어티는 임의의 입체화학에서, 즉 L-세린 이성질체, D-세린 이성질체, 라세미 세린 또는 이성질체의 다른 조합으로부터 유래된 세리놀을 기반으로 할 수 있다. 본 발명의 바람직한 측면에서, 세리놀-GalNAc 모이어티(SerGN)는 하기의 입체화학을 갖는다:
Figure pct00055
즉, L-세린 이성질체에서 유래된 (S)-세리놀-아미다이트 또는 (S)-세리놀 석시네이트 고체 지지 빌딩 블록을 기반으로 한다.
바람직한 측면에서, 핵산의 제1 가닥은 화학식 (VIII)의 화합물이고 핵산의 제2 가닥은 화학식 (IX)의 화합물이고, 여기서
b는 0이고;
c 및 d는 1이고,
n은 0이고,
Z1 및 Z2는 각각 핵산의 제2 및 제2 가닥이며,
Y는 S이고,
R1은 H이고, 그리고
L은 -(CH2)4-C(O)-이고, 여기서 L의 말단 C(O)는 링커의 N 원자에 부착된다(즉, 표적화 리간드의 가능한 N 원자가 아님).
또 다른 바람직한 측면에서, 핵산의 제1 가닥은 화학식 (V)의 화합물이고 핵산의 제2 가닥은 화학식 (VI)의 화합물이고, 여기서
b는 0이고;
c 및 d는 1이고,
n은 0이고,
Z1 및 Z2는 각각 핵산의 제2 및 제2 가닥이며,
Y는 S이고,
L1은 화학식 (VII)의 것이고, 여기서:
W1은 -CH2-O-(CH2)3-이고,
W3은 -CH2-이고,
W5는 부재하고,
V는 CH이고,
X는 NH이고, 그리고
L은 -(CH2)4-C(O)-이고, 여기서 L의 말단 C(O)는 화학식 (VII)에서 X의 N 원자에 부착된다.
또 다른 바람직한 측면에서, 핵산의 제1 가닥은 화학식 (V)의 화합물이고 핵산의 제2 가닥은 화학식 (VI)의 화합물이고, 여기서
b는 0이고,
c 및 d는 1이고,
n은 0이고,
Z1 및 Z2는 각각 핵산의 제2 및 제2 가닥이며,
Y는 S이고,
L1은 화학식 (VII)의 것이고, 여기서:
W1, W3 및 W5는 부재하고,
V는
Figure pct00056
이고,
X는 부재하고, 그리고
L은 -(CH2)4-C(O-NH-(CH2)5-C(O)-이고, 여기서 L의 말단 C(O)는 화학식 (VII)에서 V의 N 원자에 부착된다.
한 측면에서, 핵산은 하기 구조를 갖는 트리안테나리 리간드에 접합된다:
Figure pct00057
여기서 핵산은 a) 제2 가닥의 5' 말단에 있는 마지막 뉴클레오티드; b) 제2 가닥의 3' 말단에 있는 마지막 뉴클레오티드; 또는 c) 제2 가닥의 3' 말단에 있는 마지막 뉴클레오티드까지 리간드의 포스페이트 기를 통해 리간드에 접합된다.
핵산의 한 측면에서, 리간드를 갖는 핵산에 의해 표적화되는 세포는 간세포이다.
GalNAc가 존재하는 상기 리간드 중 임의의 하나에서, GalNAc는 본 명세서에 언급된 것들, 특히 만노스, 갈락토스, 글루코스, 글루코사민 및 푸코스와 같은 임의의 다른 표적화 리간드로 치환될 수 있다.
특히 바람직한 구현예는 제1 가닥이 서열번호: 237을 포함하거나 이로 구성되고 제2 가닥이 선택적으로 서열번호: 156을 포함하거나 이로 구성되는 핵산이다. 이 핵산은 바람직하게는 제2(센스) 가닥의 5' 말단에서 리간드에 추가로 접합될 수 있다. 더욱 더 바람직한 것은 제1 가닥이 서열번호: 237을 포함하거나 이로 구성되고 제2 가닥이 선택적으로 서열번호: 238을 포함하거나 이로 구성되는 핵산이다. 이 구현예에서 가장 바람직한 것은 서열번호: 237 및 서열번호: 238로 구성된 siRNA이다. 본 발명의 한 측면은 EU414이다.
대안적인 특히 바람직한 구현예는 제1 가닥이 서열번호: 237을 포함하거나 이로 구성되고 제2 가닥이 선택적으로 서열번호: 553을 포함하거나 이로 구성되는 핵산이다. 이 핵산은 바람직하게는 제2(센스) 가닥의 5' 말단에서 리간드에 추가로 접합될 수 있다. 더욱 더 바람직한 것은 제1 가닥이 서열번호: 237을 포함하거나 이로 구성되고 제2 가닥이 선택적으로 서열번호: 460을 포함하거나 이로 구성되는 핵산이다. 이 구현예에서 가장 바람직한 것은 서열번호: 237 및 서열번호: 460로 구성된 siRNA이다. 본 발명의 한 측면은 EU420이다.
대안적인 특히 바람직한 구현예는 제1 가닥이 서열번호: 461을 포함하거나 이로 구성되고 제2 가닥이 선택적으로 서열번호: 554를 포함하거나 이로 구성되는 핵산이다. 이 핵산은 바람직하게는 제2(센스) 가닥의 5' 말단에서 리간드에 추가로 접합될 수 있다. 더욱 더 바람직한 것은 제1 가닥이 서열번호: 461을 포함하거나 이로 구성되고 제2 가닥이 선택적으로 서열번호: 462을 포함하거나 이로 구성되는 핵산이다. 이 구현예에서 가장 바람직한 것은 서열번호: 461 및 서열번호: 462로 구성된 siRNA이다. 본 발명의 한 측면은 EU422이다.
한 측면에서, 핵산은 지질을 포함하는 리간드, 보다 바람직하게는 콜레스테롤을 포함하는 리간드에 접합된다.
조성물, 용도 및 방법
본 발명은 또한 본 발명의 핵산을 포함하는 조성물을 제공한다. 핵산 및 조성물은 단독으로 또는 다른 제제와 조합하여 약제 또는 진단제로 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 하나 이상의 핵산(들)은 전달 비히클(예를 들어, 리포솜) 및/또는 담체, 희석제와 같은 부형제와 조합될 수 있다. 보존제 및 안정화제와 같은 다른 제제도 첨가할 수 있다. 본 발명의 임의의 핵산의 약제학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물은 마찬가지로 본 발명의 범위 내에 있다. 핵산 전달 방법은 당업계에 공지되어 있고 당업자의 지식 범위 내에 있다.
본 명세서에 개시된 조성물은 특히 약제학적 조성물이다. 이러한 조성물은 대상체에게 투여하기에 적합하다.
한 측면에서, 조성물은 본 명세서에 개시된 핵산, 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물, 및 용매 및/또는 전달 비히클 및/또는 생리적으로 허용가능한 부형제 및/또는 담체 및/또는 염 및/또는 희석제 및/또는 완충액 및/또는 보존제를 포함한다.
약제학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제는 경구, 직장, 비강 또는 비경구(피하, 근육내, 정맥내, 진피내 및 경피 포함) 투여에 적합한 제형에 사용되는 것들을 포함한다. 제형은 단위 투여 형태로 편리하게 제공될 수 있고 약학 분야에 잘 알려진 임의의 방법에 의해 제조될 수 있다. 피하 또는 경피 투여 방식이 본 명세서에 기재된 화합물에 특히 적합할 수 있다.
본 발명의 핵산의 치료적 유효량은 투여 경로, 치료되는 포유동물의 유형 및 고려 중인 특정 포유동물의 물리적 특성에 따라 달라질 것이다. 이러한 인자 및 이 양을 결정하는 것과의 관계는 의료 분야의 숙련된 의사에게 잘 알려져 있다. 이 양 및 투여 방법은 최적의 효능을 달성하도록 맞춤화될 수 있으며, 체중, 식단, 동반 약물처치 및 의료 분야의 숙련자에게 잘 알려진 다른 인자와 같은 인자에 따라 달라질 수 있다. 인간 사용에 가장 적합한 투여량 크기 및 투약 레지멘은 본 발명에 의해 얻어진 결과에 의해 안내될 수 있고 적절하게 설계된 임상 시험에서 확인될 수 있다.
효과적인 투여량과 치료 프로토콜은 실험 동물에서 낮은 용량으로 시작하여 효과를 모니터링하면서 투여량을 늘리고 체계적으로 투여 레지멘을 변경하는 기존의 방법으로 결정할 수 있다. 임상의는 주어진 대상체에 대한 최적 투여량을 결정할 때 수많은 인자를 고려할 수 있다. 이러한 고려 사항은 당업자에게 알려져 있다.
본 발명의 핵산 또는 그의 염은 저장 또는 투여를 위해 제조된 약제학적 조성물로서 제형화될 수 있으며, 이는 전형적으로 약제학적으로 허용가능한 담체 중에 치료적 유효량의 본 발명의 핵산 또는 그의 염을 포함한다.
본 발명의 핵산 또는 접합된 핵산은 또한 다른 치료 화합물과 조합하여 개별적으로 또는 동시에, 예를 들어 조합된 단위 용량으로 투여될 수 있다. 본 발명은 또한 안정화제, 보존제, 희석제, 완충액 등과 같은 생리학적/약제학적으로 허용가능한 부형제 중에 본 발명에 따른 하나 이상의 핵산을 포함하는 조성물을 포함한다.
한 측면에서, 조성물은 본 명세서에 개시된 핵산 및 올리고뉴클레오티드, 소분자, 단일클론성 항체, 다클론성 항체 및 펩티드를 포함하는 군으로부터 선택되는 추가 치료제를 포함한다. 한 구현예에서, 추가 치료제는 CNNM4의 억제제이다. 바람직한 구현예에서, 추가 치료제는 문헌[Park, H., et al 2008. Bioorg Med Chem Lett. 18(7):2250-5 (Chemspider ID 1014170)]에 기재된 바와 같이 소분자 7-아미노-2-페닐-5H-티에노[3,2-c]피리딘-4-온 (PubChem CID 91383855) 또는 로다닌 유도체 2-[5-(4-Oxo-2-티옥소-티아졸리딘-5-일리덴메틸)-푸란-2-일]-벤조산이다.
특정 구현예에서, 상이한 서열을 갖는 본 발명의 2개 이상의 핵산은 동시에 또는 순차적으로 투여될 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 상이한 핵산 및 적어도 하나의 약제학적으로 허용가능한 담체 중 하나 또는 그 조합을 포함하는 조성물, 예를 들어 약제학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 약제 및 조성물에 대한 투여량 수준은 실험에 의해 당업자에 의해 결정될 수 있다. 한 측면에서, 단위 용량은 약 0.01 mg/kg 내지 약 100 mg/kg 체중의 핵산 또는 접합된 핵산을 함유할 수 있다. 대안적으로, 용량은 10 g/kg 내지 25 g/kg 체중, 또는 1 g/kg 내지 10 g/kg 체중, 또는 0.05 g/kg 내지 5 g/kg 체중, 또는 0.1 g/kg 내지 5 g/kg 체중, 또는 0.1 g/kg 내지 1 g/kg 체중, 또는 0.1 g/kg 내지 0.5 g/kg 체중, 또는 0.5 g/kg 내지 1 g/kg 체중일 수 있다. 대안적으로, 용량은 약 0.5 mg/kg 내지 약 10 mg/kg 체중, 또는 약 0.6 mg/kg 내지 약 8 mg/kg 체중, 또는 약 0.7 mg/kg 내지 약 7 mg/kg 체중, 또는 약 0.8 mg/kg 내지 약 6 mg/kg 체중, 또는 약 0.9 mg/kg 내지 약 5.5 mg/kg 체중, 또는 약 1 mg/kg 내지 약 5 mg/kg 체중, 또는 약 1 mg/kg 체중, 또는 약 3 mg/kg 체중, 또는 약 1 mg/kg 체중, 또는 약 3 mg/kg 체중, 또는 약 5 mg/kg 체중일 수 있고, "약"은 표시된 값으로부터 최대 30%, 바람직하게는 최대 20%, 더 바람직하게는 최대 10%, 더욱 더 바람직하게는 최대 5% 및 가장 바람직하게는 0%의 편차이다. 투여량 수준은 예를 들어 신체 표면적과 같은 다른 파라미터를 통해 계산될 수도 있다.
투여량 및 투여 빈도는 치료가 치료인지 또는 예방인지(예를 들어, 예방)에 따라 달라질 수 있고, 치료 과정 동안 조정될 수 있다. 특정 예방 적용에서, 상대적으로 저투여량이 상대적으로 장기간에 걸쳐 상대적으로 드문 간격으로 투여된다. 일부 대상체는 평생 동안 계속해서 치료를 받을 수 있다. 특정 치료적 적용에서, 질환의 진행이 감소될 때까지 또는 환자가 질환 증상의 부분적 또는 완전한 개선을 보일 때까지 상대적으로 짧은 간격으로 상대적으로 높은 투여량이 때때로 요구된다. 그 후, 환자는 적절한 예방적 투여 레지멘으로 전환될 수 있다.
본 발명의 핵산 단독 또는 본 발명의 약제학적 조성물 중의 하나 이상의 다른 활성 성분과의 조합의 실제 투여량 수준은 대상체 또는 환자에게 유해한 부작용을 일으키지 않으면서 특정 환자, 조성물 및 투여 방식에 대해 원하는 치료 반응을 달성하는 데 효과적인 활성 성분의 양을 얻기 위해 다양할 수 있다. 선택된 투여량 수준은 이용된 특정 핵산 또는 조성물의 활성, 투여 경로, 투여 시간, 이용되는 특정 핵산의 배출 속도, 치료의 지속기간, 이용된 특정 조성물과 조합하여 사용된 다른 약물, 화합물 및/또는 물질, 치료되고 있는 대상체 또는 환자의 연령, 성별, 체중, 상태, 일반적인 건강 및 과거 병력, 및 의료 분야에 잘 알려진 유사한 인자를 포함하여 다양한 인자, 예컨대 약동학적 인자에 좌우될 것이다.
약제학적 조성물은 멸균 주사 가능한 수성 현탁액 또는 용액이거나 동결건조된 형태일 수 있다.
약제학적 조성물은 단위 투여 형태일 수 있다. 이러한 형태에서, 조성물은 적절한 양의 활성 성분을 함유하는 단위 용량으로 분할된다. 단위 투여 형태는 포장된 제제, 개별 양의 제제를 함유하는 패키지, 예를 들어 패킷 정제, 캡슐 및 바이알 또는 앰플의 분말일 수 있다. 단위 투여 형태는 또한 캡슐, 카셰(cachet) 또는 정제 그 자체일 수 있거나, 이러한 포장 형태의 적절한 수일 수 있다. 예를 들어 펜의 형태로 단일 용량 주사 가능한 형태로 제공될 수 있다. 조성물은 임의의 적합한 경로 및 투여 수단을 위해 제형화될 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물 및 약제는 약제학적 유효 용량으로 포유동물 대상체에게 투여될 수 있다. 포유동물은 인간, 비-인간 영장류, 유인원 또는 원유인원, 개, 고양이, 말, 소, 돼지, 염소, 양, 마우스, 랫트, 햄스터, 고슴도치와 기니아 피그 또는 다른 관련 종으로부터 선택될 수 있다. 이에 기초하여, 본 명세서에서 사용된 "CNNM4"는 자연적으로 또는 인공적으로 표현되는 경우 상기 언급된 임의의 종의 핵산 또는 단백질을 나타내지만, 바람직하게는 이 용어는 인간 핵산 또는 단백질을 나타낸다.
본 발명의 약제학적 조성물은 단독으로 또는 하나 이상의 다른 치료제 또는 진단제와 함께 투여될 수 있다. 병용 요법은 치료할 특정 환자, 질환 또는 상태에 기초하여 선택된 적어도 하나의 다른 치료제와 조합된 본 발명의 핵산을 포함할 수 있다. 다른 이러한 제제의 예는 특히 치료적 활성 소분자 또는 폴리펩티드, 단일 사슬 항체, 고전적 항체 또는 그의 단편, 또는 하나 이상의 추가 유전자의 유전자 발현을 조절하는 핵산 분자, 및 치료적 또는 예방적 치료 요법을 보완하거나 그렇지 않으면 유익할 수 있는 유사한 조절 치료제를 포함한다.
약제학적 조성물은 전형적으로 제조 및 저장의 조건 하에서 멸균되고 안정하다. 조성물은 용액, 마이크로에멀젼, 리포솜, 또는 높은 약물 농도에 적합한 다른 정렬된 구조로 제형화될 수 있다. 담체는 예를 들어, 물, 알코올 예컨대 에탄올, 폴리올 (예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 및 액체 폴리에틸렌 글리콜), 또는 임의의 적합한 혼합물을 함유하는 용매 또는 분산매일 수 있다. 적절한 유동성은 예를 들어 레시틴과 같은 코팅의 사용, 분산의 경우 필요한 입자 크기의 유지 및 당업계에 잘 알려진 제형 화학에 따른 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다. 특정 구현예에서, 등장제, 예를 들어, 당, 폴리알코올 예컨대 만니톨, 소르비톨, 또는 염화나트륨이 조성물에 바람직할 수 있다. 주사가능 조성물의 연장된 흡수는 흡수를 지연시키는 제제, 예를 들어 모노스테아레이트 염 및 젤라틴을 조성물에 포함시킴으로써 야기될 수 있다.
본 발명의 한 측면은 약제로 사용하기 위한 본 명세서에 개시된 핵산 또는 조성물이다. 핵산 또는 조성물은 바람직하게는 질환, 장애 또는 증후군의 예방, 앓을 위험의 감소 또는 치료에 사용하기 위한 것이다.
본 발명은 CNNM4 발현의 억제에 반응하는 병태, 질환 및 장애의 치료 또는 예방을 위해 단독으로 또는 약제학적 조성물에서 하나 이상의 추가 치료제와 함께 사용하기 위한 핵산을 제공한다.
본 발명의 한 측면은 질환, 장애 또는 증후군을 예방, 앓을 위험의 감소, 또는 치료에 있어서 본 명세서에 개시된 바와 같은 핵산 또는 조성물의 용도이다.
본 발명의 한 측면은 세포에서, 바람직하게는 시험관 내에서 CNNM4의 발현을 억제하는 방법에서 본 명세서에 개시된 바와 같은 핵산 또는 조성물의 용도이다.
본 발명의 한 측면은 본 명세서에 개시된 바와 같은 핵산 또는 조성물을 세포에, 바람직하게는 시험관내 투여하는 단계를 포함하는, 세포에서, 바람직하게는 시험관 내에서 CNNM4의 발현을 억제하는 방법이다.
본 발명의 핵산 및 약제학적 조성물은 다양한 병태, 장애 또는 질환의 치료에 사용될 수 있다. 본 발명의 핵산으로의 치료는 바람직하게는 간 및/또는 혈액에서 생체내 CNNM4 고갈을 초래한다. 이와 같이, 본 발명의 핵산 및 이를 포함하는 조성물은 CNNM4의 발현을 억제하는 것이 유익할 수 있는 다양한 병리적 장애를 치료하는 방법에 유용할 것이다. 본 발명은 치료적 유효량의 본 발명의 핵산을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 질환, 장애 또는 증후군을 치료하는 방법을 제공한다.
따라서 본 발명은 질환, 장애 또는 증후군의 치료 또는 예방 방법을 제공하며, 이 방법은 하기를 포함하는 치료적 유효량의 핵산 또는 본 발명의 핵산을 포함하는 약제학적 조성물을 필요로 하는 대상체(예를 들어, 환자)에게 투여하는 단계를 포함한다.
가장 바람직한 치료적 유효량은 이를 필요로 하는 주어진 대상체에 대해 당업자에 의해 선택된 특정 치료의 원하는 효능을 생성할 양이다. 이 양은 치료 화합물의 특징 (활성, 약동학, 약력학, 및 생체이용률 포함), 대상체의 생리학적 상태 (연령, 성별, 질환 유형 및 병기, 일반적인 신체 상태, 주어진 투여량에 대한 반응성, 및 약물처치의 유형 포함), 제형 내의 약제학적으로 허용가능한 담체 또는 담체들의 본질, 및 투여 경로를 포함하지만 이에 제한되지 않는, 숙련된 작업자에 의해 이해되는 다양한 인자에 따라 달라질 것이다. 임상 및 약리학 분야의 숙련자는 실험을 통해, 즉 화합물 투여에 대한 대상체의 반응을 모니터링하고 그에 따라 투여량을 조정함으로써 치료적 유효량을 결정할 수 있을 것이다. 예를 들어 문헌[Remington: The Science and Practice of Pharmacy 21st Ed., Univ. of Sciences in Philadelphia (USIP), Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, PA, 2005]를 참조한다.
특정 구현예에서, 본 발명의 핵산 및 약제학적 조성물은 질환, 장애 또는 증후군을 치료하거나 예방하기 위해 사용될 수 있다.
특정 구현예에서, 본 발명은 인간과 같은 포유동물 대상체에서 질환, 장애 또는 증후군을 치료하는 방법을 제공하며, 이 방법은 본 명세서에 개시된 바와 같은 핵산의 치료적 유효량을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
본 발명의 핵산의 "치료적 유효 투여량"의 투여는 질환 증상의 중증도 감소, 질환 증상이 없는 기간의 빈도 및 기간 증가, 또는 질환 고통으로 인한 손상 또는 상해의 예방을 초래할 수 있다.
본 발명의 핵산은 본 명세서에 기재된 방법을 사용하여 진단 또는 치료될 수 있는 질환, 장애 또는 증후군을 치료 또는 진단하는데 유익할 수 있다. 다른 질환, 장애 또는 증후군의 치료 및 진단도 본 발명의 범위에 속하는 것으로 간주된다.
본 발명의 한 측면은 질환, 장애 또는 증후군을 예방하거나, 앓을 위험의 감소시키거나 치료하는 방법이고, 이 방법은 본 명세서에 개시된 핵산 또는 조성물의 약제학적 유효 용량 또는 양을 필요로 하는 개체에게 투여하는 것을 포함하고, 여기서 핵산 또는 조성물은 대상체에게 피하, 정맥내 또는 경구, 직장, 폐, 근육내 또는 복강내 투여에 의해 투여된다. 바람직하게는 피하로 투여된다.
본 명세서에 개시된 핵산 또는 조성물로 예방하거나 치료할 질환, 장애 또는 증후군은 바람직하게는 간에서의 마그네슘 조절장애, 바람직하게는 저마그네슘혈증과 연관된 질환, 장애 또는 증후군이다.
본 명세서에 개시된 핵산 또는 조성물로 예방 또는 치료될 질환, 장애 또는 증후군은 바람직하게는 간에서의 마그네슘 조절장애, 예컨대 저마그네슘혈증과 연관되고/되거나 비정상적인 발현 및/또는 과발현 또는 이소성 발현 또는 CNNM4의 국소화 또는 축적과 연관된다. 예방 또는 치료할 질환, 장애 또는 증후군은 유전적 원인이 있거나 후천적일 수 있다.
본 명세서에 개시된 핵산 또는 조성물로 예방하거나 치료할 질환, 장애 또는 증후군은 하기와 같다:
a) 간 질환, 신장 질환 또는 폐 질환, 바람직하게는 간 질환으로부터 선택됨;
b) 비-알코올성 지방간염 (NASH), 간경변증, 간세포 암종 (HCC), 약물 유도 간 손상 (DILI), 비-알코올성 지방간 질환 (NAFLD), 지방간, 간암, 간 섬유증, 정맥 폐쇄성 간 질환, 간 동양혈관 폐쇄 증후군 (SOS), 지방증, Budd-키아리 증후군, 바이러스성 간염 B, 바이러스성 간염 C, 알코올성 간염, 간 허혈 재관류 손상, 원발성 담도 간경변증 (PBC), 만성 간 질환, 급성 간 질환, 간 손상, 비-증식성 간 질환, 담관암종 (담도암), 간의 저마그네슘혈증과 연관될 질환, 마그네슘 조절장애, 신장 섬유증, 급성 신장 손상 (AKI), 만성 신장 질환, 신장 신장염, 신장 신장증, 폐암, 폐 선암종 (LUAD), 폐 섬유증, 대사 증후군, 심혈관 질환 또는 합병증, 비만, 인슐린 내성, 당뇨병, 아세트아미노펜 (APAP) 유도된 간 손상, 염증 반응, 미토콘드리아 기능장애, 항산화제 시스템 활성의 감소, 비-증식성 질환, 동맥경화증 또는 이들의 임의의 조합으로부터 선택되고;
c) 비-알코올성 지방간염 (NASH), 간경변증, 간세포 암종 (HCC), 약물 유도 간 손상 (DILI), 비-알코올성 지방간 질환 (NAFLD), 지방간, 간암, 간 섬유증, 정맥 폐쇄성 간 질환, 간 동양혈관 폐쇄 증후군 (SOS), 지방증, 버드-키아리(Budd-Chiari) 증후군, 바이러스성 간염 B, 바이러스성 간염 C, 알코올성 간염, 간 허혈 재관류 손상, 원발성 담도 간경변증 (PBC), 만성 간 질환, 급성 간 질환, 간 손상, 비-증식성 간 질환 담관암종 (담도암), 간의 저마그네슘혈증과 연관될 질환으로부터 선택된 간 질환, 바람직하게는 간 질환은 비-알코올성 지방간염 (NASH)임;
d) 비-알코올성 지방간염 (NASH), 간경변증, 간세포 암종 (HCC), 약물 유도 간 손상 (DILI), 비-알코올성 지방간 질환 (NAFLD) 및 지방간으로부터 선택된 간 질환;
e) 비-알코올성 지방간염 (NASH), 간경변증, 간 섬유증, 정맥 폐쇄성 간 질환, 약물 유도 간 손상 (DILI), 간세포 암종 (HCC) 및 버드-키아리 증후군 및 간염으로부터 선택된 간 질환;
f) 비-알코올성 지방간염 (NASH), 간경변증, 간 섬유증, 약물 유도 간 손상 (DILI) 및 간세포 암종 (HCC)으로부터 선택된 간 질환;
g) 비-알코올성 지방간염 (NASH), 약물 유도 간 손상 (DILI) 및 간경변증으로부터 선택된 간 질환;
h) 비-알코올성 지방간 질환(NAFLD);
i) 비-알코올성 지방간염(NASH);
j) 약물 유발 간 손상(DILI);
k) 바람직하게는 신장 섬유증, 급성 신장 손상 (AKI), 만성 신장 질환, 신장 신장염 및 신장 신장증, 및 가장 바람직하게는 신장 질환은 신장 섬유증으로부터 신장 질환; 및/또는
l) 바람직하게는 폐암, 폐 선암종 (LUAD) 및 간 섬유증으로부터 폐 질환, 및 가장 바람직하게는 폐 질환은 폐 선암종 (LUAD)임.
간암은 바람직하게는 간세포 암종(HCC) 또는 담관암종(담도암)이다.
한 구현예에서, 본 발명의 핵산 또는 조성물은 하기를 위해 사용되거나 하기에 대한 치료 방법에 사용된다:
a) 대상체의 간에서 Mg2+ 수준을 증가시키고;
b) 대상체의 혈장 또는 혈청에서 Mg2+ 수준을 감소시키고;
c) 대상체의 간에서 Mg2+ 항상성을 회복시키고;
d) 대상체의 간에서 지질 함량 감소시키고;
e) 바람직하게는 대상체의 간에서 반응성 산소종(ROS)에 의한 염증을 감소시키고;
f) 바람직하게는 대상체의 간에서 반응성 산소종(ROS) 수준을 감소시키고; g) 바람직하게는 대상체의 간에서 염증을 감소시키고/시키거나;
h) 바람직하게는 대상체의 간에서 섬유증을 감소시킨다.
바람직하게는, 본 명세서에 개시된 핵산 또는 조성물의 사용은 핵산 또는 조성물로 치료된 대상체의 간에서 Mg2+ 수준을 건강한 대상체에서 예상되는 상응하는 수준으로 증가시킨다. 대안적으로, 치료 전 대상체의 간에서의 Mg2+ 수준과 건강한 대상체에서 예상되는 상응하는 수준 사이의 차이가 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95%까지 적어도 일시적으로 감소되도록 핵산 또는 조성물로 치료된 대상체의 간에서 Mg2+ 수준을 증가시킨다.
바람직하게는, 본 명세서에 개시된 핵산 또는 조성물의 사용은 핵산 또는 조성물로 치료된 대상체의 혈장 또는 혈청에서 Mg2+ 수준을 건강한 대상체에서 예상되는 상응하는 수준으로 감소시킨다. 대안적으로, 치료 전 대상체의 혈장 또는 혈청에서의 Mg2+ 수준과 건강한 대상체에서 예상되는 상응하는 수준 사이의 차이가 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95%까지 적어도 일시적으로 감소되도록 핵산 또는 조성물로 치료된 대상체의 혈장 또는 혈청에서 Mg2+ 수준을 감소시킨다.
바람직하게는, 본 명세서에 개시된 핵산 또는 조성물의 사용은 핵산 또는 조성물로 치료된 대상체의 간에서 지질 함량을 건강한 대상체에서 예상되는 상응하는 수준으로 감소시킨다. 대안적으로, 치료 전 대상체의 간에서의 지질 함량과 건강한 대상체에서 예상되는 상응하는 수준 사이의 차이가 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95%까지 적어도 일시적으로 감소되도록 핵산 또는 조성물로 치료된 대상체의 간에서의 지질 함량을 감소시킨다.
바람직하게는, 본 명세서에 개시된 핵산 또는 조성물의 사용은 핵산 또는 조성물로 치료된 대상체의 간에서 반응성 산소종 (ROS)에 의한 염증을 건강한 대상체에서 예상되는 상응하는 수준으로 감소시킨다. 대안적으로, 치료 전 대상체의 간에서의 반응성 산소종 (ROS)에 의한 염증과 건강한 대상체에서 예상되는 상응하는 수준 사이의 차이가 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95%까지 적어도 일시적으로 감소되도록 핵산 또는 조성물로 치료된 대상체의 간에서의 반응성 산소종 (ROS)에 의한 염증을 감소시킨다.
바람직하게는, 본 명세서에 개시된 핵산 또는 조성물의 사용은 핵산 또는 조성물로 치료된 대상체의 간에서 반응성 산소종 (ROS) 수준을 건강한 대상체에서 예상되는 상응하는 수준으로 감소시킨다. 대안적으로, 치료 전 대상체의 간에서의 반응성 산소종 (ROS) 수준과 건강한 대상체에서 예상되는 상응하는 값 사이의 차이가 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95%까지 적어도 일시적으로 감소되도록 핵산 또는 조성물로 치료된 대상체의 간에서의 반응성 산소종 (ROS) 수준을 감소시킨다.
바람직하게는, 본 명세서에 개시된 핵산 또는 조성물의 사용은 핵산 또는 조성물로 치료된 대상체의 간에서 염증을 건강한 대상체에서 예상되는 상응하는 수준으로 감소시킨다. 대안적으로, 치료 전 대상체의 간에서의 염증과 건강한 대상체에서 예상되는 상응하는 수준 사이의 차이가 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95%까지 적어도 일시적으로 감소되도록 핵산 또는 조성물로 치료된 대상체의 간에서의 염증을 감소시킨다.
바람직하게는, 본 명세서에 개시된 핵산 또는 조성물의 사용은 핵산 또는 조성물로 치료된 대상체의 간에서 섬유증을 건강한 대상체에서 예상되는 상응하는 수준으로 감소시킨다. 대안적으로, 치료 전 대상체의 간에서의 섬유증과 건강한 대상체에서 예상되는 상응하는 수준 사이의 차이가 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95%까지 적어도 일시적으로 감소되도록 핵산 또는 조성물로 치료된 대상체의 간에서의 섬유증을 감소시킨다. 대상체의 간의 섬유증은 예를 들어 대상체의 간에서 알파 평활근 액틴(αSMA) 또는 콜라겐 침착의 수준을 측정함으로써 측정될 수 있다.
이러한 결과를 달성하기 위해서는 핵산 또는 조성물의 적절한 투여 레지멘이 필요하다는 것이 명백하다. 당업자는 이러한 결과를 달성하는 데 필요한 투여 레지멘을 결정할 수 있을 것이다.
일반적으로 간 질환, 그러나 특히 약물에 의해 유발되는 간 질환(약물 유발 간 손상 또는 DILI)은 그 자체로 특별한 정보가 아닌 다양한 증상으로 임상적으로 나타난다. 증상의 비-제한적 예는 하기를 포함한다: 식욕 상실, 탈진, 현기증, 체중 감소, 메스꺼움, 구토, 발열, 우상측 복부 통증, 관절통, 근육통, 가려움증, 발진, 언급될 수 있는 배설물의 변색, 눈 및 피부의 황변.
해당 분야의 전문가가 알고 있듯이 활동성 간 질환의 존재는 종종 혈액 내 효소 수치의 상승으로 감지된다. 구체적으로, 임상적으로 허용되는 정상 범위를 초과하는 ALT(알라닌 아미노트랜스퍼라제) 및 AST(아스파르테이트 아미노트랜스퍼라제)의 혈중 수준은 진행 중인 간 손상을 나타내는 것으로 알려져 있다. ALT 및 AST의 혈중 수치에 대한 간 질환 환자의 일상적인 모니터링은 의료 치료를 받는 동안 간 질환의 진행을 측정하기 위해 임상적으로 사용된다. 상승된 ALT 및 AST의 허용된 정상 범위 내로의 감소는 환자의 진행 중인 간 손상의 중증도 감소를 반영하는 임상적 증거로 간주된다. 특정 구현예에서, 간 질환은 임의의 종류의 간 손상에 의해 유발된다.
본 명세서에 개시된 핵산 또는 조성물은 매주 1회 또는 2회, 매주, 2주마다, 3주마다, 4주마다, 5주마다, 6주마다, 7주마다, 8주마다, 9주마다, 10주마다, 11주마다, 12주마다, 3개월마다, 4개월마다, 5개월마다, 6개월마다 또는 전술한 간격의 조합과 같이 다양한 투여 빈도를 갖는 레지멘으로 치료를 포함하는 레지멘에서 사용하기 위한 것일 수 있다. 핵산 또는 조성물은 피하, 정맥내 또는 경구, 직장, 폐 또는 복강내와 같은 임의의 다른 적용 경로를 사용하기 위한 것일 수 있다. 바람직하게는 피하용이다.
예시적인 치료 레지멘은 2주에 1회, 3주에 1회, 4주에 1회, 1개월에 1회, 2개월 또는 3개월에 1회 또는 4개월, 5개월 또는 6개월 또는 그 이상에 1회 투여하는 것이다. 투여량은 특정 대상, 예를 들어 환자에 대한 치료적 이점을 최대화하기 위해 필요한 만큼 숙련된 건강 관리 전문가에 의해 선택 및 재조정될 수 있다. 핵산은 전형적으로 여러 경우에 투여될 것이다. 단일 투여 사이의 간격은 예를 들어 2 내지 5일, 매주, 격주, 매월, 2개월 또는 3개월마다, 4개월 또는 5개월마다, 6개월마다 또는 매년일 수 있다. 투여 사이의 간격은 또한 예를 들어 대상체 또는 환자의 혈액 또는 간에서 핵산 표적 유전자 산물 수준을 기준으로 불규칙적일 수 있다.
본 명세서에 개시된 바와 같은 핵산 또는 조성물로 치료되거나 이를 받은 세포 및/또는 대상체에서, CNNM4 발현은 미처리 세포 및/또는 대상체에 비해 15% 최대 100% 그러나 적어도 약 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 또는 100% 또는 중간 값의 범위까지 억제할 수 있다. 억제 수준은 바람직하게는 간에서 CNNM4 발현 또는 과발현 또는 저마그네슘혈증과 연관된 질환의 치료를 가능하게 하거나 CNNM4 유전자 산물의 기능 및 생리학적 역할을 추가로 조사하는 역할을 할 수 있다. 억제 수준은 바람직하게는 핵산 또는 조성물로 치료된 대상체의 간 또는 혈액 또는 신장, 바람직하게는 간에서 측정된다.
한 측면은 바람직하게는 간 또는 신장에서 CNNM4의 상승된 수준과 연관된 추가 병리 또는 위에 열거된 것과 같은 질환, 장애 또는 증후군, 또는 바람직하게는 간에서 저마그네슘혈증을 치료하기 위한 약제의 제조에서, 또는 CNNM4 발현의 억제가 요구되는 추가적인 치료적 접근법에서 본 명세서에 개시된 바와 같은 핵산 또는 조성물의 용도이다. 약제는 약제학적 조성물이다.
본 발명의 각각의 핵산 및 이의 약제학적으로 허용가능한 염 및 용매화물은 본 발명의 개별적인 구현예를 구성한다.
또한, 또한 본 발명에는 상기 열거된 것들과 같은 질환, 장애 또는 증후군을 치료 또는 예방하는 방법이 포함되고, 이 방법은 (이러한 병리를 개선하기 위해) 치료를 필요로 하는 개체에게 본 명세서에 기재된 바와 같은 핵산 또는 조성물을 포함하는 조성물을 투여하는 것을 포함한다. 핵산 또는 조성물은 매주 2회, 매주 1회, 2주마다, 3주마다, 4주마다, 5주마다, 6주마다, 7주마다, 또는 8주 내지 12주마다 또는 그 초과에 1회 치료를 포함하는 레지멘 또는 앞서 언급한 간격의 조합과 같은 다양한 투여 빈도의 레지멘으로 투여될 수 있다. 핵산 또는 접합된 핵산은 피하 또는 정맥내 또는 경구, 직장 또는 복강내와 같은 다른 적용 경로에 사용하기 위한 것일 수 있다.
본 발명의 핵산은 에어로졸, 장관, 비강, 안과용, 경구, 비경구, 직장, 질, 또는 경피 (예를 들어, 크림, 겔 또는 연고의 국소 투여, 또는 경피 패치에 의해)을 포함하지만 이에 제한되지 않는, 당업계에서 알려진 임의의 적절한 투여 경로에 의해 투여될 수 있다. "비경구 투여"는 전형적으로 안와하, 주입, 동맥내, 낭내, 심장내, 진피내, 근육내, 복강내, 폐내, 척수내, 흉골내, 척추강내, 자궁내, 정맥내, 지주막하, 피막밑, 피하, 경점막, 또는 경기관 투여를 포함하는 의도된 작용 부위에서의 주사 또는 이와 소통하는 것과 연관된다.
핵산의 화학적 변형 패턴의 사용은 혈청에서 뉴클레아제 안정성을 부여하고 예를 들어 피하 적용 경로를 가능하게 한다.
진피내 또는 피하 적용에 사용되는 용액 또는 현탁액은 전형적으로 멸균 희석제 예컨대 주사용 물, 식염수, 고정유, 폴리에틸렌 글리콜, 글리세린, 프로필렌 글리콜 또는 다른 합성 용매; 항박테리아제 예컨대 벤질 알코올 또는 메틸 파라벤; 항산화제 예컨대 아스코르브산 또는 아황산수소나트륨; 킬레이트화제 예컨대 에틸렌디아민테트라아세트산; 완충액 예컨대 아세테이트, 시트레이트 또는 포스페이트; 및/또는 등장성 조정제 예컨대, 예를 들어, 염화나트륨 또는 덱스트로스 중 하나 이상을 포함한다. pH는 염산 또는 수산화나트륨과 같은 산 또는 염기, 또는 시트레이트, 포스페이트, 아세테이트 등의 완충액으로 조정될 수 있다. 이러한 제제는 유리 또는 플라스틱으로 만들어진 앰플, 일회용 주사기 또는 다중 용량 바이알에 봉입될 수 있다.
멸균 주사용 용액은 필요에 따라 위에서 설명한 성분 중 하나 또는 조합과 함께 적절한 용매에 필요한 양의 핵산을 통합한 다음 멸균 미세여과를 수행하여 제조할 수 있다. 분산액은 활성 화합물을 분산매 및 선택적으로 상기 기재된 것과 같은 다른 성분을 함유하는 멸균 비히클에 혼입시켜 제조할 수 있다. 멸균 주사가능 용액의 제조를 위한 멸균 분말의 경우, 제조 방법은 멸균 여과된 용액으로부터의 임의의 추가의 원하는 성분 외에 활성 성분의 분말을 생성하는 진공 건조 및 냉동 건조(동결건조)이다.
본 발명의 핵산의 치료적 유효량이 예를 들어 정맥내, 피부 또는 피하 주사에 의해 투여되는 경우, 핵산은 발열원이 없고 비경구적으로 허용되는 수용액 형태일 것이다. 적절한 pH, 등장성, 안정성 등을 고려하여, 비경구적으로 허용되는 용액을 제조하는 방법은 당업계의 기술 범위 내에 있다. 정맥내, 피부 또는 피하 주사를 위한 바람직한 약제학적 조성물은 핵산 이외에, 등장성 비히클 예컨대 염화나트륨 주사, 링거 주사, 덱스트로스 주사, 덱스트로스 및 염화나트륨 주사, 락테이트화된 링거 주사, 또는 당해 분야에서 알려진 바와 같은 다른 비히클을 함유할 것이다. 본 발명의 약제학적 조성물은 또한 안정화제, 보존제, 완충액, 항산화제, 또는 당업자에게 잘 알려진 다른 첨가제를 함유할 수 있다.
단일 투여 형태를 생성하기 위해 담체 물질과 조합될 수 있는 핵산의 양은 치료되고 있는 대상체 및 특정 투여 방식을 포함하는 다양한 인자에 따라 달라질 것이다. 일반적으로 특정 상황에서 적절한 치료 효과를 나타내는 조성물의 양이 될 것이다. 일반적으로, 100% 중, 이 양은 약제학적으로 허용가능한 담체와 조합된 핵산의 약 0.01% 내지 약 99%, 약 0.1% 내지 약 70%, 또는 약 1% 내지 약 30% 범위일 것이다.
핵산은 이식물, 경피 패치 및 마이크로캡슐화된 전달 시스템을 포함하는 조절 방출 제형과 같은 빠른 방출에 대해 화합물을 보호할 담체와 함께 제조될 수 있다. 에틸렌 비닐 아세테이트, 폴리무수물, 폴리글리콜산, 콜라겐, 폴리오르토에스테르 및 폴리락트산과 같은 생분해성, 생체적합성 폴리머가 사용될 수 있다. 그러한 제형의 제조를 위한 많은 방법은 특허를 받았거나 일반적으로 당업자에게 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌[Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J. R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978]을 참조한다.
최적의 원하는 반응(예를 들어, 치료 반응)을 제공하기 위해 복용 레지멘을 조정할 수 있다. 예를 들어, 용량이 투여될 수 있고, 여러 분할 용량이 시간에 따라 투여될 수 있거나, 용량은 경우에 따라 치료 상황의 특정 상황에 따라 비례적으로 감소 또는 증가될 수 있다. 대상체 또는 환자에게 투여할 때 투여의 용이성과 복용량의 균일성을 위해 비경구 조성물을 복용량 단위 형태로 제형화하는 것이 특히 유리하다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 투여 단위 형태는 치료될 대상체에 대한 일체형 투여량으로서 적합한 물리적으로 별개의 단위를 의미하고; 각 단위는 원하는 치료 효과를 생성하도록 계산된 활성 화합물의 미리 결정된 양을 함유한다. 본 발명의 투여 단위 형태에 대한 사양은 활성 화합물의 특정 특성 및 달성하고자 하는 특정 치료 효과(들) 및 임의의 개별 환자의 치료 및 민감도에 따라 달라진다.
본 발명의 핵산 또는 조성물은 고상 화학 합성과 같은 화학 합성을 포함하는 당업계의 통상적인 방법을 사용하여 생성될 수 있다.
본 발명의 핵산 또는 조성물은 당업계에 공지된 하나 이상의 다양한 의료 기기로 투여될 수 있다. 예를 들어, 일 구현예에서, 본 발명의 핵산은 무바늘 피하 주사 장치로 투여될 수 있다. 본 발명에 유용한 잘 알려진 임플란트 및 모듈의 예는 예를 들어 제어된 전달 속도를 위한 이식가능한 미세주입 펌프; 피부를 통해 투여하기 위한 장치; 정확한 주입 속도로 전달하기 위한 주입 펌프; 지속적인 약물 전달을 위한 가변 흐름 이식형 주입 장치; 및 삼투성 약물 전달 시스템을 포함한다. 이들 및 다른 이러한 임플란트, 전달 시스템 및 모듈은 당업자에게 공지되어 있다.
특정 구현예에서, 본 발명의 핵산 또는 조성물은 생체내 원하는 분포를 보장하도록 제형화될 수 있다. 특정 생체 내 위치에 본 발명의 치료 화합물 또는 조성물을 표적화하기 위해, 이들은 예를 들어 특정 세포 또는 기관으로 선택적으로 수송되는 하나 이상의 모이어티를 포함할 수 있는 리포솜으로 제형화될 수 있어 표적 약물 전달을 향상시킬 수 있다.
본 발명은 분자 및 조직 지향 전달 수준에서 높은 특이성을 특징으로 한다. 본 발명의 핵산의 서열은 그들의 표적에 대해 고도로 특이적이며, 이는 이들이 표적으로 설계되지 않은 유전자의 발현을 억제하지 않거나 표적으로 설계되지 않은 유전자의 발현을 최소한으로만 억제하고/하거나 표적으로 설계되지 않은 적은 수의 유전자 발현만 억제하는 것을 의미한다. 핵산이 특정 세포 유형에 의해 특이적으로 인식되고 내재화되는 리간드에 연결될 때 추가 수준의 특이성이 달성된다. 이것은 예를 들어 간세포에 의해 특이적으로 인식되고 내재화되는 GalNAc 모이어티를 포함하는 리간드에 핵산이 연결된 경우이다. 이것은 그들이 연결된 리간드에 의해 표적화된 세포에서만 그들의 표적의 발현을 억제하는 핵산으로 이어진다. 이 두 가지 수준의 특이성은 잠재적으로 현재 이용 가능한 치료법보다 더 나은 안전성 프로파일을 부여한다. 따라서 특정 구현예에서, 본 발명은 하나 이상의 GalNAc 모이어티를 포함하거나 핵산의 세포 유형 또는 조직 특이적 내재화를 부여함으로써 RNA 간섭에 의한 표적 유전자 녹다운의 추가 특이성을 부여하는 하나 이상의 다른 모이어티를 포함하는 리간드에 연결된 본 발명의 핵산을 제공한다.
본 명세서에 기재된 바와 같은 핵산은 리포솜 형태의 지질로 제형화될 수 있다. 이러한 제형은 당업계에서 리포플렉스(lipoplex)로 기재될 수 있다. 지질/리포솜을 갖는 조성물은 본 발명의 핵산을 표적 세포로 전달하는 것을 돕기 위해 사용될 수 있다. 본 명세서에 기재된 지질 전달 시스템은 접합된 리간드에 대한 대안으로서 사용될 수 있다. 본 명세서에 기재된 변형은 지질 전달 시스템 또는 리간드 접합체 전달 시스템과 함께 본 발명의 핵산을 사용할 때 존재할 수 있다.
이러한 리포플렉스는 하기를 포함하는 지질 조성물을 포함할 수 있다:
i) 양이온성 지질 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염;
ii) 스테로이드;
iii) 포스파티딜에탄올아민 인지질; 및/또는
iv) PEG화된 지질.
양이온성 지질은 아미노 양이온성 지질일 수 있다.
양이온성 지질 성분의 함량은 조성물의 전체 지질 함량의 약 55 몰% 내지 약 65 몰%일 수 있다. 특히, 양이온성 지질 성분은 조성물의 전체 지질 함량의 약 59 몰%이다.
조성물은 스테로이드를 추가로 포함할 수 있다. 스테로이드는 콜레스테롤일 수 있다. 스테로이드의 함량은 지질 조성물의 전체 지질 함량의 약 26 몰% 내지 약 35 몰%일 수 있다. 보다 구체적으로, 스테로이드의 함량은 지질 조성물의 전체 지질 함량의 약 30몰%일 수 있다.
포스파티딜에탄올아민 인지질은 1.2-디파이타노일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (DPhyPE), 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (DOPE), 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (DSPE), 1.2-디라우로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (DLPE), 1,2-디미리스토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (DMPE), 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (DPPE), 1.2-디리놀레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (DLoPE), 1-팔미토일-2-올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (POPE), 1,2-디에루코일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (DEPE), 1.2-디스쿠알레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (DSQPE) 및 1-스테아로일-2-리놀레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (SLPE)로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 인지질의 함량은 조성물의 전체 지질 함량의 약 10 몰%일 수 있다.
PEG화된 지질은 1,2-디미리스토일-sn-글리세롤, 메톡시폴리에틸렌 글리콜 (DMG-PEG) 및 C16-세라미드-PEG로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. PEG화된 지질의 함량은 조성물의 전체 지질 함량의 약 1 내지 5 몰%일 수 있다.
조성물 중 양이온성 지질 성분의 함량은 지질 조성물의 전체 지질 함량의 약 55 몰% 내지 약 65 몰%, 바람직하게는 지질 조성물의 전체 지질 함량의 약 59 몰%일 수 있다.
조성물은 55:34:10:1; 56:33:10:1; 57:32:10:1; 58:31:10:1; 59:30:10:1; 60:29:10:1; 61:28:10:1; 62:27:10:1; 63:26:10:1; 64:25:10:1; 및 65:24:10:1로부터 선택된 i):ii):iii):iv)의 성분의 몰비를 갖는다.
중성 리포솜 조성물은 예를 들어, 디미리스토일 포스파티딜콜린 (DMPC) 또는 디팔미토일 포스파티딜콜린 (DPPC)으로부터 형성될 수 있다. 음이온성 리포솜 조성물은 디미리스토일 포스파티딜글리세롤로부터 형성될 수 있는 반면, 음이온성 융합유도 리포솜은 주로 디올레오일 포스파티딜에탄올아민(DOPE)으로부터 형성될 수 있다. 다른 유형의 리포솜 조성물은 예를 들어 포스파티딜콜린 (PC) 예컨대, 예를 들어, 대두 PC, 및 에그(egg) PC로부터 형성될 수 있다. 또 다른 유형은 인지질 및/또는 포스파티딜콜린 및/또는 콜레스테롤의 혼합물로 형성된다.
양전하를 띤 합성 양이온성 지질인 N-[1-(2,3-디올레일옥시)프로필]-N,N,N-트리메틸염화암모늄 (DOTMA)은 조직 배양 세포의 세포막의 음전하를 띤 지질과 융합할 수 있는 지질-핵산 복합체를 형성하기 위해 핵산과 자발적으로 상호작용하는 작은 리포솜을 형성하는 데 사용될 수 있다. DOTMA 유사체는 또한 리포솜을 형성하는 데 사용될 수 있다.
본 명세서에 기재된 지질의 유도체 및 유사체는 또한 리포솜을 형성하는 데 사용될 수 있다.
핵산을 함유하는 리포솜은 다양한 방법으로 제조될 수 있다. 일례로, 리포솜의 지질 성분은 마이셀이 지질 성분으로 형성되도록 세제에 용해된다. 예를 들어, 지질 성분은 양친매성 양이온성 지질 또는 지질 접합체일 수 있다. 세제는 임계 마이셀 농도가 높을 수 있고 비이온성일 수 있다. 예시적인 세제는 콜레이트, CHAPS, 옥틸글루코시드, 데옥시콜레이트, 및 라우로일 사르코신을 포함한다. 그 다음 핵산 제제를 지질 성분을 포함하는 마이셀에 첨가한다. 지질의 양이온성 기는 핵산과 상호 작용하고 핵산 주위에 응축되어 리포솜을 형성한다. 축합 후, 세제는 예를 들어 투석에 의해 제거되어 핵산의 리포솜 제제를 생성한다.
필요한 경우, 예를 들어 조절된 첨가에 의해 축합 반응 중에 축합을 돕는 담체 화합물을 첨가할 수 있다. 예를 들어, 담체 화합물은 핵산 이외의 중합체(예를 들어, 스페르민 또는 스페르미딘)일 수 있다. 축합을 선호하도록 pH를 조정할 수도 있다.
본 발명의 핵산 제형은 계면활성제를 포함할 수 있다. 한 구현예에서, 핵산은 계면활성제를 포함하는 에멀젼으로 제형화된다.
이온화되지 않은 계면활성제는 비이온성 계면활성제이다. 예는 비-이온성 에스테르, 예컨대 에틸렌 글리콜 에스테르, 프로필렌 글리콜 에스테르, 글리세릴 에스테르 등, 비이온성 알칸올아미드, 및 에테르 예컨대 지방 알코올 에톡실레이트, 프로폭실화 알코올, 및 에톡실화된/프로폭실화된 블록 중합체를 포함한다.
물에 용해되거나 분산될 때 음전하를 띠는 계면활성제는 음이온성 계면활성제이다. 예는 카복실레이트, 예컨대 비누, 아실 락틸레이트, 아미노산의 아실 아미드, 황산의 에스테르 황산 예컨대 알킬 설페이트 및 에톡실화된 알킬 설페이트, 설포네이트 예컨대 알킬 벤젠 설포네이트, 아실 이세티오네이트, 아실 타우레이트 및 설포석시네이트, 및 포스페이트를 포함한다.
물에 용해되거나 분산될 때 양전하를 띠는 계면활성제는 양이온성 계면활성제이다. 예는 사차 암모늄 염 및 에톡실화된 아민을 포함한다.
양전하 또는 음전하를 운반하는 능력이 있는 계면활성제는 양쪽성 계면활성제이다. 예는 아크릴산 유도체, 치환된 알킬아미드, N-알킬베타인 및 포스파티드를 포함한다.
"마이셀"은 분자의 모든 소수성 부분이 내부를 향하고 친수성 부분이 주변 수성상과 접촉하도록 남겨두도록 양친매성 분자가 구형 구조로 배열되는 특정 유형의 분자 조립체로서 본 명세서에서 정의된다. 환경이 소수성인 경우 정반대 배열이 존재한다. 마이셀은 핵산의 수용액, 알칼리 금속 알킬 설페이트 및 적어도 하나의 마이셀 형성 화합물을 혼합함으로써 형성될 수 있다.
마이셀 형성 화합물의 예는 레시틴, 히알루론산, 히알루론산의 약제학적으로 허용가능한 염, 글리콜산, 락트산, 카모마일 추출물, 오이 추출물, 올레산, 리놀레산, 리놀렌산, 모노올레인, 모노올레에이트, 모노라우레이트, 보리지 오일, 달맞이꽃유, 멘톨, 트리하이드록시 옥소 콜라닐 글리신 및 그의 약제학적으로 허용가능한 염, 글리세롤, 폴리글리세롤, 라이신, 폴리라이신, 트리올레인, 폴리옥시에틸렌 에테르 및 그의 유사체, 폴리도카놀 알킬 에테르 및 그의 유사체, 체노데옥시콜레이트, 데옥시콜레이트, 및 이들의 혼합물을 포함한다.
페놀 및/또는 m-크레졸이 안정화제 및 보존제로서 작용하기 위해 혼합된 마이셀 조성물에 첨가될 수 있다. 글리세린과 같은 등장제가 첨가될 수 있다.
핵산 제제는 마이크로입자와 같은 입자에 통합될 수 있다. 마이크로입자는 분무 건조, 동결 건조, 증발, 유동층 건조, 진공 건조 또는 이들 방법의 조합에 의해 생성될 수 있다.
정의
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 유전자 발현과 관련하여 용어 "억제하다", "하향 조절하다" 또는 "감소시키다"는 유전자의 발현, 또는 하나 이상의 단백질 또는 단백질 서브유닛(예를 들어, mRNA)을 인코딩하는 RNA 분자 또는 동등한 RNA 분자의 수준, 또는 하나 이상의 단백질 또는 단백질 서브유닛의 활성이 본 발명의 핵산 또는 결합된 핵산의 부재 하에서 또는 인간 전사체에 대해 공지된 상동성이 없는 siRNA 분자로 수득된 것(본 명세서서 비-사일런싱 대조군이라 칭함)과 비교하여 관찰된 것 이하로 감소된다는 것을 의미한다. 이러한 대조군은 본 발명의 분자와 유사한 방식으로 접합 및 변형될 수 있고 동일한 경로에 의해 표적 세포로 전달될 수 있다. 본 발명의 핵산으로 처리한 후 발현은 95%, 90%, 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 15%, 10%, 5%, 또는 0% 또는 중간 값, 또는 핵산 또는 접합된 핵산의 부재에서 관찰된 것 미만으로 감소될 수 있다. 발현은 핵산이 적용된 세포에서 측정될 수 있다. 대안적으로, 특히 핵산이 대상체에게 투여되는 경우, 그 수준은 세포의 다른 그룹에서 또는 조직이나 기관에서 또는 혈액이나 혈장과 같은 체액에서 측정될 수 있다. 억제 수준은 바람직하게는 시험관내에서 핵산으로 처리된 세포에서 표적 mRNA 수준에 대한 핵산의 가장 큰 효과를 나타내기 때문에 선택된 조건에서 측정된다. 억제 수준은 예를 들어 0.038 nM 내지 10 μM, 바람직하게는 1 nM, 10 nM 또는 100 nM 농도의 핵산으로 처리한 후 24시간 또는 48시간 후에 측정할 수 있다. 이러한 조건은 상이한 핵산 서열에 대해 또는 상이한 유형의 핵산에 대해 상이할 수 있으며, 예를 들어 비변형 또는 변형되거나 리간드에 접합되거나 그렇지 않은 핵산에 대해 상이할 수 있다. 억제 수준을 결정하기 위한 적합한 조건의 예는 실시예에 기재되어 있다.
핵산이란 유전자 발현을 방해할 수 있는 뉴클레오티드를 포함하는 두 가닥을 포함하는 핵산을 의미한다. 억제는 완전하거나 부분적일 수 있으며 표적 방식으로 유전자 발현을 하향 조절한다. 핵산은 두 개의 별개의 폴리뉴클레오티드 가닥: 가이드 가닥일 수도 있는 제1 가닥; 및 패신저 가닥일 수도 있는 제2 가닥을 포함한다. 제1 가닥과 제2 가닥은 이중 가닥 분자를 형성하기 위해 다시 '접히는' 자가 상보적인 동일한 폴리뉴클레오티드 분자의 일부일 수 있다. 핵산은 siRNA 분자일 수 있다.
핵산은 표적 서열 또는 상보적 가닥 상의 상응하는 염기와 '쌍을 이룰' 수 있도록 리보뉴클레오티드, 변형된 리보뉴클레오티드, 데옥시뉴클레오티드, 데옥시리보뉴클레오티드, 또는 뉴클레오티드를 모방할 수 있는 뉴클레오티드 유사체 비-뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 핵산은 제1 가닥(당업계에서 가이드 가닥으로도 알려짐)의 전부 또는 일부 및 제2 가닥(또한 당업계에서 패신저 가닥으로도 알려짐)의 전부 또는 일부에 의해 형성된 이중 가닥 핵산 부분 또는 이중체 영역을 추가로 포함할 수 있다. 이중체 영역은 제1 가닥과 제2 가닥 사이에 형성된 제1 염기쌍으로 시작하여 제1 가닥과 제2 가닥 사이에 형성된 마지막 염기쌍으로 끝나는 것으로 정의된다.
이중체 영역은 왓슨-크릭(Watson-Crick) 염기쌍 또는 상보적이거나 실질적으로 상보적인 올리고뉴클레오티드 가닥 사이의 이중체를 허용하는 임의의 다른 방식에 의해 서로 염기쌍을 형성하는 2개의 상보적이거나 실질적으로 상보적인 올리고뉴클레오티드 내의 영역을 의미한다. 예를 들어, 21개의 뉴클레오티드 단위를 갖는 올리고뉴클레오티드 가닥은 21개의 뉴클레오티드 단위의 다른 올리고뉴클레오티드와 염기쌍을 형성할 수 있지만, 각 가닥의 19개 뉴클레오티드만이 상보적이거나 실질적으로 상보적이어서 "이중체 영역"은 19개의 염기쌍으로 구성된다. 나머지 염기쌍은 5' 및 3' 오버행 또는 단일 가닥 영역으로 존재할 수 있다. 또한 이중체 영역 내에서, 100% 상보성은 필요하지 않고; 이중체 영역 내에서 실질적인 상보성이 허용된다. 실질적인 상보성은 생물학적 조건 하에서 어닐링이 가능하도록 가닥 사이의 상보성을 지칭한다. 두 가닥이 생물학적 조건 하에서 어닐링할 수 있는지를 경험적으로 결정하는 기술은 당업계에 잘 알려져 있다. 대안적으로, 두 가닥을 합성하고 생물학적 조건에서 함께 추가하여 서로 어닐링하는지 결정할 수 있다. 적어도 하나의 이중체 영역을 형성하는 제1 가닥 및 제2 가닥의 부분은 완전히 상보적일 수 있고 서로에 대해 적어도 부분적으로 상보적이다. 핵산의 길이에 따라, 제1 가닥과 제2 가닥 사이의 염기 상보성 측면에서 완벽한 일치가 반드시 필요한 것은 아니다. 그러나 제1 및 제2 가닥은 생리적 조건에서 혼성화할 수 있어야 한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "비-쌍형성 뉴클레오티드 유사체"는 하기를 포함하나 이에 제한되지 않는 비-염기쌍 형성 모이어티를 포함하는 뉴클레오티드 유사체를 의미한다: 6 데스 아미노 아데노신(네불라린), 4-Me-인돌, 3-니트로피롤, 5-니트로인돌, Ds, Pa, N3-Me 리보 U, N3-Me 리보T, N3-Me dC, N3-Me-dT, N1-Me-dG, N1-Me-dA, N3-에틸-dC, 및 N3-Me dC. 일부 구현예에서 비-염기쌍 결합 뉴클레오티드 유사체는 리보뉴클레오티드이다. 다른 구현예에서 이는 데옥시리보뉴클레오티드이다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "말단 작용기"는 제한 없이 할로겐, 알코올, 아민, 카복실, 에스테르, 아미드, 알데하이드, 케톤 및 에테르 기를 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 "오버행"은 당업계에서 통상적이고 관례적인 의미를 가지며, 즉 이중 가닥 핵산에서 상보적 가닥의 말단 뉴클레오티드를 넘어 연장되는 핵산의 단일 가닥 부분을 의미한다. 용어 "무딘 말단(blunt end)"은 말단 뉴클레오티드(들)이 염기쌍인지 여부에 관계없이 두 가닥 모두 동일한 위치에서 종결되는 이중 가닥 핵산을 포함한다. 무딘 말단에서 제1 가닥 및 제2 가닥의 말단 뉴클레오티드는 염기 쌍을 이룰 수 있다. 무딘 말단에서 제1 가닥 및 제2 가닥의 말단 뉴클레오티드는 쌍을 이루지 않을 수 있다. 무딘 말단에서 제1 가닥 및 제2 가닥의 말단 2개의 뉴클레오티드는 염기 쌍을 이룰 수 있다. 무딘 말단에서 제1 가닥 및 제2 가닥의 말단 2개의 뉴클레오티드는 쌍을 이루지 않을 수 있다.
용어 "세리놀 유래 링커 모이어티"는 링커 모이어티가 다음 구조를 포함함을 의미한다:
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상기 구조의 O 원자는 전형적으로 RNA 가닥에 연결되고 N 원자는 전형적으로 표적화 리간드에 연결된다.
용어 "환자", "대상체" 또는 "개체"는 상호교환적으로 사용되며 인간 또는 비-인간 동물을 지칭한다. 이러한 용어는 포유동물 예컨대 인간, 영장류, 가축 동물 (예를 들어, 소과, 돼지), 반려 동물 (예를 들어, 개과, 고양이) 및 설치류 (예를 들어, 마우스 및 랫트)를 포함한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, "치료하는" 또는 "치료" 및 그의 문법적 변형은 유익하거나 원하는 임상 결과를 얻기 위한 접근법을 지칭한다. 이 용어는 병태, 장애 또는 질환의 발병 또는 발달 속도를 늦추거나, 이와 연관된 증상을 감소 또는 완화하거나, 병태의 완전 또는 부분 퇴행을 일으키거나, 또는 상기 중 임의의 조합을 지칭할 수 있다. 본 발명의 목적을 위해, 유익하거나 원하는 임상 결과는, 검출가능하든 검출 불가능하든 어느 것이든 간에, 증상의 경감, 질환 정도의 저하, 안정화(즉, 악화되지 않는) 질환 상태, 질환 진행의 지연 또는 둔화, 질환 상태의 개선 또는 고식, 및 관해(부분 또는 전체 어느 것이든)를 포함한다. "치료"는 또한 치료를 받지 않는 경우 예상되는 생존과 비교하여 생존을 연장하는 것을 의미할 수 있다. 따라서 치료가 필요한 대상체(예를 들어, 인간)는 문제의 질환 또는 장애로 이미 고통받고 있는 대상체일 수 있다. 용어 "치료"는 치료의 부재에 비해 병리적 상태 또는 증상의 중증도 증가의 억제 또는 감소를 포함하며, 관련 질환, 장애 또는 병태의 완전한 중단을 반드시 의미하는 것은 아니다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "예방하는" 및 그의 문법적 변형은 병태, 질환 또는 장애의 발달을 방지하거나 병리를 변경하기 위한 접근법을 지칭한다. 따라서 "예방"은 예방 또는 방지 조치를 의미할 수 있다. 본 발명의 목적을 위해, 유익하거나 원하는 임상 결과는 검출 가능하거나 검출 불가능하든 간에 증상의 예방 또는 둔화, 질환의 진행 또는 발달을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 따라서 예방이 필요한 대상체(예를 들어, 인간)는 문제의 질환 또는 장애에 아직 걸리지 않은 대상체일 수 있다. "예방"이라는 용어는 치료의 부재에 비해 질환의 발병을 늦추는 것을 포함하며 반드시 관련 질환, 장애 또는 병태의 영구적인 예방을 의미하는 것은 아니다. 따라서 병태의 "예방하는" 또는 "예방"은 특정 상황에서 병태가 발병할 위험을 감소시키거나 병태와 연관된 증상의 발달을 예방하거나 지연시키는 것을 의미할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "유효량", "치료적 유효량" 또는 "유효 용량"은 표적 병태를 예방 또는 치료하거나 병태와 관련된 증상을 유리하게 완화하는 것과 같이 대상체에서 적어도 하나의 원하는 치료 효과를 생성하는 조성물(예를 들어, 치료 조성물 또는 약제)의 양이다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "약제학적으로 허용가능한 염"은 해당 염이 투여되는 환자 또는 대상체에게 해롭지 않은 염을 지칭한다. 예를 들어, 산 부가 염 및 염기성 염 중에서 선택되는 염일 수 있다. 산 부가 염의 예는 클로라이드 염, 시트레이트 염 및 아세테이트 염을 포함한다. 염기성 염의 예는 양이온이 알칼리 금속 양이온, 예컨대 나트륨 또는 칼륨 이온, 알칼리 토금속 양이온, 예컨대 칼슘 또는 마그네슘 이온, 뿐만 아니라 치환된 암모늄 이온, 예컨대 이온 of the 유형 N(R1)(R2)(R3)(R4)+의 이온으로부터 선택되는 염을 포함하고, R1, R2, R3 및 R4는 독립적으로 수소, 선택적으로 치환된 C1-6-알킬기 또는 선택적으로 치환된 C2-6-알케닐 기를 나타낸다. 관련된 C1-6-알킬 기의 예는 메틸, 에틸, 1-프로필 및 2-프로필 기를 포함한다. 가능한 관련성이 있는 C2-6-알케닐 기의 예는 에테닐, 1-프로페닐 및 2-프로페닐을 포함한다. 약제학적으로 허용가능한 염의 다른 예는 문헌["Remington's Pharmaceutical Sciences", 17th edition, Alfonso R. Gennaro (Ed.), Mark Publishing Company, Easton, PA, USA, 1985 (and more recent editions thereof), the "Encyclopaedia of Pharmaceutical Technology", 3rd edition, James Swarbrick (Ed.), Informa Healthcare USA (Inc.), NY, USA, 2007, 및 J. Pharm. Sci. 66: 2 (1977)]에 기재되어 있다. "약제학적으로 허용가능한 염"은 화합물에 비해 임의의 원하지 않는 효과를 부여하지 않으면서 모 화합물의 원하는 생물학적 활성을 정성적으로 유지한다. 약제학적으로 허용가능한 염의 예는 산 부가 염 및 염기 부가 염을 포함한다. 산 부가 염은 무독성 무기 산, 예컨대 염산, 질산, 인, 인산, 황산, 브롬화수소산, 요오드화수소산 등으로부터, 또는 무독성 유기 산 예컨대 지방족 모노- 및 디-카복실산, 페닐-치환된 알칸산, 하이드록시 알칸산, 방향산, 지방족 및 방향족 설폰산 등으로부터 유래된 염을 포함한다. 염기 부가 염은 알칼리 토금속, 예컨대 나트륨, 칼륨, 마그네슘, 칼슘 등으로부터 뿐만 아니라 무독성 유기 아민, 예컨대 N, N'-디벤질에틸렌디아민, N-메틸글루카민, 클로로프로카인, 콜린, 디에탄올아민, 에틸렌디아민, 프로카인 등으로부터 유래된 염을 포함한다.
"약제학적으로 허용가능한 담체"라는 용어는 임의의 표준 약제학적 담체를 포함한다. 치료 용도를 위한 약제학적으로 허용가능한 담체는 약제 분야에 잘 알려져 있으며, 예를 들어 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co.(A. R. Gennaro edit. 1985)]에 기재되어 있다. 예를 들어, 약산성 또는 생리학적 pH의 멸균 식염수 및 인산염 완충 식염수를 사용할 수 있다. 예시적인 pH 완충액은 포스페이트, 시트레이트, 아세테이트, 트리스/하이드록시메틸)아미노메탄 (TRIS), N-트리스(하이드록시메틸)메틸-3-아미노프로판설폰산 (TAPS), 중탄산암모늄, 디에탄올아민, 바람직한 완충액인 히스티딘, 아르기닌, 라이신, 또는 아세테이트 또는 이들의 혼합물을 포함한다. 이 용어는 인간을 포함하는 동물에 사용하기 위해 미국 약전(US Pharmacopeia)에 나열된 모든 제제를 더 포괄한다. "약제학적으로 허용가능한 담체"는 임의의 및 모든 생리학적으로 허용되는, 즉 상용성 용매, 분산매, 코팅, 항균제, 등장성 및 흡수 지연제 등을 포함한다. 특정 구현예에서, 담체는 정맥내, 근육내, 피하, 비경구, 척추 또는 표피 투여(예를 들어, 주사 또는 주입에 의해)에 적합하다. 선택된 투여 경로에 따라, 핵산은 특정 투여 경로에 의해 대상체에게 투여될 때 핵산이 노출될 수 있는 산의 작용 및 다른 자연 불활성화 조건으로부터 화합물을 보호하기 위한 물질 또는 물질들로 코팅될 수 있다.
본 발명의 맥락에서 용어 "용매화물"은 용매(경우에 따라, 본 발명에 따른 핵산 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염)과 용매 사이에 형성된 정의된 화학량론의 복합체를 지칭한다. 이와 관련하여 용매는 예를 들어 물 또는 다른 약제학적으로 허용가능한 일반적으로 소분자 유기 종, 예를 들어 아세트산 또는 락트산일 수 있지만 이에 제한되지 않는다. 문제의 용매가 물인 경우, 그러한 용매화물은 일반적으로 수화물로 지칭된다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "CNNM4"는 "사이클린 및 CBS 도메인 2가 금속 양이온 수송 매개체"(Ancient Conserved Domain Protein, ACDP, 사이클린 M 또는 CNNM으로도 알려져 있음)를 의미한다. CNNM은 뇌에서 주로 발현되는 CNNM1을 제외하고 발달 과정과 모든 성인 조직에서 진화적으로 발현되는 CNNM1, CNNM2, CNNM3 및 CNNM4의 네 가지 유전자에 의해 인코딩된 막 단백질이다. CNNM은 여러 기관의 세포막을 통해 마그네슘 이온(Mg2+)을 수송하는 데 중요한 역할을 한다(Funato 등, 2014. J Clin lnvest.124(12):5398-5410). CNNM4는 Ensembl 데이터베이스에서 ID 번호 ENSG00000158158로 식별되는 인간 유전자에 해당한다(2018년 7월 릴리스 93에 따름). Ensembl 데이터베이스에 따르면, CNNM4는 최소 4개의 전사 또는 스플라이스 변이체를 인코딩한다. 따라서, 본 개시내용은 변이체 CNNM4-201(ENST00000377075.2) 및 다른 3개의 변이체 CNNM4-204(ENST00000496186.5), CNNM4-203(ENST00000493384.1) 및 CNNM4-202(ENST00000482716.5)에 관한 것이다. CNNM4 유전자는 Uniprot 데이터베이스에서 Q6P4Q7(2018년 10월 10일자 버전 130에 따름)로 식별된 단백질 "금속 수송체 CNNM4"를 인코딩한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "간 질환"은 "간 질환"은 일반적으로 감염, 부상, 약물이나 독성 화합물에 대한 노출, 알코올, 음식의 불순물, 혈액 내 정상적인 물질의 비정상적 축적, 자가 면역 과정에 의해, 또는 유전적 결함(예컨대 혈색소증)에 의해 유발된 간의 급성 또는 만성 손상이다. 때로는 질환이나 손상의 정확한 원인을 알 수 없을 수도 있다. 간 질환은 질환의 지속 기간에 따라 급성 또는 만성 간질환으로 분류할 수 있다. 급성 간염 및 급성 간부전(ALF)과 같은 급성 간 질환의 경우, 질환의 이력이 6개월을 넘지 않는다. 더 오래 지속되는 간 질환은 만성 간 질환으로 분류된다. 일반적인 간 질환의 비-제한적 예는 간경변, 간 섬유증, 비-알코올성 지방간 질환 (NAFLD), 비-알코올성 지방간염 (NASH), 간 허혈 재관류 손상, 원발성 담도 간경변증 (PBC), 및 바이러스 포함 간염 및 알코올성 간염을 포함한다. 바이러스성 간염의 가장 흔한 형태는 B형 간염과 C형 간염(각각 HBV와 HCV)이다. 만성 간염은 간경변을 유발할 수 있다. 세포자멸사로 알려진 과정을 통한 간 세포의 죽음은 모든 형태의 간 질환에서 일반적이다. 간 세포의 세포자멸사는 간 섬유증 및 다른 간 질환과 관련이 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "간 손상"은 간 세포 또는 조직에 존재하는 병리적 변화뿐만 아니라 만성 및 급성 외상을 포함하는 임의의 유형의 간 외상(손상)을 나타내는 데 사용된다. 간 손상의 임상적 상태는 이에 제한되지 않지만, 살아있는 세포의 퇴행, 간의 혈관염, 간에 존재하는 반점성 괴사 또는 소상 괴사, 간 및 문맥에서의 염증 세포 침윤 또는 섬유아세포 증식, 또는 간비대 및 간경변증, 심각한 간 손상에서 생긴 간종양 등을 포함할 수 있다. 간 질환은 간 손상으로 인해 발생한다. 간 손상은 알코올, 일부 약물, 음식의 불순물, 혈액 내 정상 물질의 비정상적 축적, 감염 또는 자가면역 장애를 포함한 독소로 인해 발생할 수 있다. 일부 경우에, 간 손상으로 인한 간 손상은 지방간, 간경변, 원발성 담도 간경변증, 원발성 경화성 담관염, 및 alpha1- 항트립신 결핍을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 간 손상은 간경변, 간 섬유증, 비-알코올성 지방간 질환 (NAFLD), 비-알코올성 지방간염 (NASH), 간 허혈 재관류 손상, 바이러스를 포함하는 간염, 및 알코올성 간염 및 원발성 담도 간경변증 (PBC)을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "섬유증"은 회복 또는 반응 과정에서 기관 또는 조직에서 과도한 섬유성 결합 조직의 형성이다. 이것은 반응성, 양성 또는 병리학적 상태일 수 있다. 손상에 대한 반응으로, 이를 반흔이라고 하며, 섬유증이 단일 세포주에서 발생한 경우 이를 섬유종이라고 한다. 생리적으로, 섬유증은 결합 조직을 침착시키는 작용을 하며, 이는 기본 기관 또는 조직의 정상적인 구조 및 기능을 방해하거나 완전히 억제할 수 있다. 섬유증은 치유 시 결합 조직 침착 과정뿐만 아니라 섬유 조직의 과도한 침착의 병리학적 상태를 설명하는 데 사용될 수 있다. 섬유증은 세포외 기질(ECM) 단백질의 병리적 축적으로 정의되며 환부 조직의 흉터 및 비후를 초래한다. 본질적으로 정상적인 기관 기능을 방해하는 과장된 상처 치유 반응이다. 섬유증은 모든 기관에 영향을 줄 수 있다. 바람직한 구현예에서, 섬유증은 간 섬유증이다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "간 섬유증"은 손상에 대한 간의 반응을 나타내는 반흔형성 과정이다. 피부와 다른 기관이 콜라겐과 다른 매트릭스 성분의 침착을 통해 상처를 치유하는 것과 같은 방식으로, 간은 새로운 콜라겐의 침착을 통해 손상을 복구한다. 간 섬유증은 간 반흔의 제1 병기이다. 나중에 간이 더 많이 손상되면 간경변증으로 이어질 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "정맥 폐색성 간 질환" 또는 "간 동양혈관 폐쇄 증후군 (SOS)"은 간비대, 우상복부 통증, 황달, 및 복수를 특징으로 하며, 조혈 세포 이식(HCT) 및 그 이하의 환자에서 가장 자주 발생하고 일반적으로 비이식 설정에서 특정 화학요법제 사용, 알칼로이드 독소 섭취, 고용량 방사선 요법 후 또는 간 이식 후에 발생한다. SOS에서 간 정맥 유출 폐색은 말단 간 세정맥 및 간 동양혈관의 폐색에 기인한다.
본 명세서에서 사용되는 "약물 유도 간 손상(DILI)"은 하나 이상의 약물 사용 후 발생하는 간 손상을 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 지방 변화라고도 불리는 "지방증"은 세포 내 지질의 비정상적 보유를 기술하는 과정이다. 그것은 트리글리세리드 지방의 정상적인 합성 및 제거 과정의 손상을 반영한다. 과도한 지질은 세포질을 대체하는 소포에 축적된다. 소포가 핵을 왜곡할 만큼 충분히 크면, 이 상태를 거대소포성 지방증이라고 하고; 그렇지 않으면 병태는 미세소포성 지방증으로 알려져 있다. 경미한 경우 세포에 특별히 해롭지는 않지만, 큰 축적은 세포 구성 요소를 파괴할 수 있으며 심한 경우 세포가 파열될 수도 있다. 지방증과 연관된 위험 인자는 다양하며 진성 당뇨병, 단백질 영양실조, 고혈압, 세포 독소, 비만, 무산소증, 및 수면 무호흡증을 포함한다. 간은 지질 대사의 주요 기관이므로 지방증과 가장 자주 연관되지만; 일반적으로 신장, 심장 및 근육과 같은 모든 기관에서 발생할 수 있다. 바람직한 구현예에서, 지방증은 간에서 유발된다.
본 명세서에서 사용되는 "비-알코올성 지방간염(NASH)"은 간 증후군이다. 조직학적으로 알코올성 간염과 구별할 수 없는 간 손상을 일으킨다. 그러나 알코올 의존증을 앓지 않는 현재 환자일 수도 있다. NASH는 비만, 이상지질혈증 및 포도당 과민증 중 적어도 하나의 위험 요소가 있는 환자에서 가장 자주 발생한다. 병인은 항상 잘 이해되지는 않지만 인슐린 내성과 관련이 있는 것으로 보인다(예를 들어 비만 또는 대사 증후군). 대부분의 환자는 무증상이다. 실험실 소견에는 아미노트랜스퍼라제 수준의 상승이 포함된다. 진단을 확인하려면 생검이 필요하다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, "간경변"은 간 구조의 왜곡 및 재생성 결절의 형성을 특징으로 하는 진행성 간 섬유증의 후기 단계를 의미한다. 일반적으로 진행 단계에서는 돌이킬 수 없는 것으로 간주되며, 이 시점에서 유일한 치료 옵션은 간 이식일 수 있다. 간경변의 역전(초기 단계)은 근본 원인을 치료한 후 여러 형태의 간 질환에서 가능하다. 간경변증 환자는 다양한 합병증에 걸리기 쉬우며 일반적으로 기대 수명이 짧다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "간세포 암종(HCC)"은 만성 간 질환 및 간경변의 환경에서 종종 발생하는 공격적인 종양을 의미한다. 그것은 일반적으로 과정 후반에 진단되며 진단 후 중앙 생존은 약 6 내지 20개월이다.
요법의 주류는 외과적 절제이지만 대부분의 환자는 종양 범위 또는 근본적인 간 기능장애로 인해 적격이 아니다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, "버드-키아리 증후군"(BCS)은 폐색이 심장 질환, 심장주위 질환, 또는 사인파모양 폐색 증후군 (정맥 폐색성 질환)으로 인한 것이 아닌 경우, 폐색 수준이나 메커니즘과 무관하게 간 정맥 유출관 폐색으로 정의된다.
. 일차 버드-키아리 증후군은 우세한 정맥 과정(혈전증 또는 정맥염)으로 인한 폐색이 있을 때 존재하는 반면, 이차 버드-키아리 증후군은 정맥 외부에서 발생한 병변(예를 들어 악성 종양)에 의해 간 정맥 및/또는 하대 대정맥이 압박되거나 침범될 때 존재한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, "간염"은 원인에 관계없이 간의 염증을 의미한다. 간염은 약물 독성, 면역 질환 및 바이러스를 비롯한 여러 조건에 의해 발생할 수 있다. 황달, 간 확대 및 열병을 특징으로 한다.
본 명세서에서 사용되는 "신장 질환"은 신장에 대한 급성 또는 만성 손상이다. 외인성, 내인성, 유전적 요인 등 다양한 원인에 의해 신장에 생기는 질환을 지칭한다. 신장 질환의 비-제한적 예는 하기를 포함한다: 신장염, 신장증, 신장 섬유증, 얇은 사구체 기저막 (TGBM), 최소 변화 질환 (MCD), 막성 사구체신염 (MGN), 국소 분절사구체경화증 (FSGS), DM 신병증, IgA 신병증 (IgAN), 세뇨관간질 신장염 (주석), 헨노흐-숀라인 자반병 (HSP) 신장염, 급성 관상 손상, BK 바이러스 신병증, 급성 세포 거부, 만성 항체 매개된 거부, 만성 활성 항체 매개된 거부, 만성 칼시뉴린 억제제 독성, 급성 신장 손상, 만성 신장 질환, 허혈성 신장 질환, 사구체신염, 루푸스 신장염, 다낭성 신장 질환, 신우신염, 신장결석, 신장 결핵, 신장 종양, 만성 신부전, 말기 신부전, 패혈증, 간 손상에 의해 유발된 신장 손상 등.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, "급성 신장 손상 (AKI)" 또는 "급성 신부전 (ARF)"는 7일 이내에 발생하는 급격한 신장 기능 상실이다. 비-제한적 원인에는 다음이 포함된다: 모든 원인(예를 들어 저혈압)으로 인한 신장 혈류 감소(신장 허혈)로 인한 신장 조직 손상, 신장에 유해한 물질에 대한 노출, 신장의 염증 과정 또는 소변의 흐름을 방해하는 요로의 폐색. AKI는 혈중 요소 질소 및 크레아티닌 상승 또는 신장이 충분한 양의 소변을 생성하지 못하는 것과 같은 특징적인 실험실 소견에 근거하여 진단된다. AKI는 대사성 산증, 높은 칼륨 수치, 요독증, 체액 균형의 변화, 사망을 포함한 다른 기관계에 대한 영향을 포함한 여러 가지 합병증을 유발할 수 있다. AKI를 경험한 사람들은 미래에 만성 신장 질환의 위험이 증가할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, "만성 신장 질환 (CKD)"은 수개월 또는 수년에 걸쳐 신장 기능이 점진적으로 상실되는 신장 질환의 한 유형을 의미한다. 초기에는 일반적으로 증상이 없다. 나중에 다리 부종, 피곤함, 구토, 식욕 상실 또는 혼란이 발생할 수 있다. 합병증에는 심장 질환, 고혈압, 뼈 질환 또는 빈혈이 포함될 수 있다. 만성 신장 질환의 비-제한적 원인에는 당뇨병, 고혈압, 사구체신염 및 다낭성 신장 질환이 포함된다. 위험 요인에는 병태의 가족력이 포함된다. 진단은 일반적으로 사구체 여과 속도를 측정하기 위한 혈액 검사와 알부민을 측정하기 위한 소변 검사로 이루어진다. 근본 원인을 확인하기 위해 초음파 또는 신장 생검과 같은 추가 검사를 수행할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, "신장염"은 신장의 염증을 의미하고 사구체, 세관, 또는 사구체와 세관을 둘러싸는 간질 조직을 수반할 수 있다. 비-제한적 원인에는 감염, 독소 및 자가면역 장애가 포함된다. 신장염에는 사구체신염(사구체의 염증) 및 간질성 신염 또는 세뇨관-간질성 신장염(세뇨관 사이 공간의 염증)이 포함된다.
본 명세서에서 사용되는 "신장증"은 세뇨관의 임의의 퇴행성 질환을 의미한다. 신장증은 신장 질환으로 인해 발생하거나 다른 장애, 특히 당뇨병의 합병증일 수 있다. 진단은 단백질 존재에 대한 소변 검사, 정상보다 낮은 수준의 단백질에 대한 혈액 검사 및 부종 관찰을 통해 확립된다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, "호흡기 질환"은 고등 유기체에서 가스 교환을 가능하게 하는 기관 및 조직에 영향을 미치는 임의의 병리 상태를 의미하고, 상기도, 기관, 기관지, 세기관지, 폐포, 흉막 및 늑막 공동, 호흡의 신경 및 근육을 포함한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, "폐 질환"는 폐에 영향을 미치는 임의의 호흡기 질환이다. 폐 질환은 폐의 급성 또는 만성 손상일 수 있다. 폐 질환의 비-제한적 예는 하기를 포함한다: 천식, 만성적 폐색성 폐 질환, 만성 또는 급성 기관지염, 낭포성 섬유증 폐기종, 급성 호흡기 곤란 증후군, 세균성 폐렴, 결핵 폐 색전증 및 폐암.
본 명세서에서 사용되는 "폐 섬유증"은 폐 조직에 반흔이 형성되어 호흡 문제를 일으키는 호흡기 질환을 의미한다. 과도한 섬유질 결합 조직의 축적(섬유증이라고 하는 과정)인 반흔 형성은 벽을 두껍게 만들고 혈액 내 산소 공급을 감소시킨다. 결과적으로 환자는 숨가쁨을 겪을 수 있다. 폐 섬유증의 증상은 하기를 포함한다: 숨가쁨, 만성 건조, 해킹(hacking) 기침, 피로 및 쇠약, 가슴 통증을 포함하는 가슴 불편함, 식욕 상실 및 신속한 체중 감소. 본 명세서에 개시된 바와 같이, 폐 섬유증은 비강내 투여 및 경구 흡입 투여와 같은 치료제의 폐로의 전신 및 국소 전달을 위한 비-침습성 투여를 포함하는 다른 질환 및/또는 특정 치료의 이차 효과일 수 있다. 이차 영향으로 폐 섬유증을 유발할 수 있는 질환 및 병태의 비-제한적 예는 하기를 포함한다: 석면폐증, 규폐증 및 특정 가스에 대한 노출의 금속과 같은 환경 및 직업 오염 물질의 흡입; 박테리아, 진균 또는 동물 제품으로 오염된 먼지를 흡입하여 가장 자주 발생하는 과민성 폐렴; 담배 흡연; 일부 결합 조직 질환 예컨대 류마티스성 관절염, 전신 홍반성 낭창 (SLE) 및 경피증, 다발성맥관염이 있는 유육종증 및 육아종증; 감염; 특정 약물처치, 예를 들어, 아미오다론, 블레오마이신 (핑양마니신), 부설판, 메토트렉세이트, 아포모르핀 및 니트로푸란토인; 가슴에 대한 방사선 요법.
이제 본 발명은 다음의 비-제한적인 도면 및 실시예를 참조하여 설명될 것이다.
도면의 간단한 설명
도 1. DILI의 인간 샘플 및 마우스 모델에서 IHC에 의해 결정된 간에서의 CNNM4 발현 및 만성 간 질환의 다양한 병리. *p<0,05 대 건강함; **p<0,01 대 건강함; ***p<0,001 대 건강함.
도 2a. 지방증 및 NASH 환자의 샘플과 비교하여 건강한 대상체의 인간 간 샘플에서 CNNM4 mRNA 수준의 qPCR에 의해 결정된 CNNM4 발현. 도 2b. 생체내 마우스 모델에서 CNNM4 mRNA 수준의 qPCR에 의해 결정된 CNNM4 발현.
도 2c. 시험관내 마우스 세포 모델에서 CNNM4 mRNA 수준의 qPCR에 의해 결정된 CNNM4 발현. *p<0,05 대 건강함.
도 3a. NASH 유래된 일차 간세포의 지질 함량은 siRNA CNNM4로 처리했을 때 건강한 수준으로 돌아간다.
도 3b. 처리된 마우스에서 ROS에 의해 유도된 염증.
도 3c. DILI 유래된 세포 사멸은 siRNA 요법에 의해 감소된다. *p<0.05 대 건강 **p<0.01 대 건강함; ***p<0.001 대 건강한; #p<0.05 대 NASH; ##p<0.01 대 NASH; ###p<0.001 대 DILI.
도 4a. NASH 유래된 인간 세포의 지질 함량은 CNNM4 siRNA로 처리했을 때 건강한 수준으로 돌아간다.
도 4b. NASH 유래된 인간 세포의 지질 함량은 CNNM4 shRNA로 처리했을 때 건강한 수준으로 돌아간다. *p<0.05 대 건강함; **p<0.01 대 건강함; #p<0.05 대 NASH 대조군; ##p<0.01 대 NASH 대조군.
도 5a. NASH 유래된 1차 간세포의 지질 함량은 CNNM1, CNNM2 또는 CNNM3에 대한 siRNA로 처리할 때 건강한 수준으로 돌아오지 않는다.
도 5b. CNNM4가 과발현될 때 마그네슘 보충은 일차 간세포의 지질 함량을 감소시키지 않는다.
도 5c. 일차 간세포의 CNNM4 siRNA 처리는 마그네슘 결핍으로 인한 지질 축적을 감소시킨다. ***p<0.001 대 건강함; ##p<0.01 대 NASH 모델/Mg2+ + siRNA π 없음.
도 6. CNNM4 siRNA 요법 후 NAFLD 진행을 관찰하기 위해 분석된 파라미터. A) 지질 함량 감소 지표인 수단 레드(Sudan Red), B) 간 손상 지표인 혈청 내 GPT, C) ROS에 의한 염증 지표인 DHE, D) 섬유증 지표인 αSMA. *p<0.05 대 siRNA π; **p<0.01 대 siRNA π.
도 7. 7-아미노-2-페닐-5H-티에노[3,2-c]피리딘-4-온에 의한 CNNM4의 약리학적 억제. 처리된 간세포는 A) 지질 수준이 감소하고 B) 세포내 마그네슘 수치가 증가한다. *p<0.05 대 미처리; ***p<0.001 대 미처리.
도 8. 신장 섬유증의 동물 샘플에서 IHC에 의해 결정된 CNNM4 발현. ***p<0.001 대 건강함.
도 9. A) 정상 조직과 비교하여 간 간세포 암종(HHC)의 TCGA(The Cancer Genome Atlas) 원발성 종양 샘플에서 결정된 CNNM4 발현. B) 정상 조직과 비교하여 폐 선암종(LUAD)의 TCGA(The Cancer Genome Atlas) 원발성 종양 샘플에서 결정된 CNNM4 발현.
도 10. DMT-세리놀(GalNAc)-CEP 및 CPG에 대한 가능한 합성 경로.
도 11. CNNM4 siRNA의 형질감염에 의한 인간 HepG2 세포에서의 인간 CNNM4 mRNA 수준의 감소
도 12. CNNM4 siRNA의 형질감염에 의한 뮤린 Hepa 1-6 세포에서 CNNM4 mRNA 수준의 감소.
도 13. CNNM4 siRNA의 형질감염에 의한 뮤린 Hepa 1-6 세포에서 CNNM4 mRNA 수준의 용량 의존 감소.
도 14. CNNM4 siRNA 접합체의 수용체 매개 흡수에 의한 일차 인간 간세포에서의 인간 CNNM4 유전자 발현의 억제
도 15. CNNM4 siRNA 접합체의 수용체 매개 흡수에 의한 일차 마우스 간세포에서의 마우스 CNNM4 유전자 발현의 억제.
도 16. CNNM4 siRNA 접합체의 수용체 매개 흡수에 의한 일차 인간 간세포에서의 인간 CNNM4 유전자 발현의 억제.
도 17. CNNM4 siRNA 접합체의 수용체 매개 흡수에 의한 일차 뮤린 간세포에서의 CNNM4 유전자 발현의 억제.
도 18. CNNM4 siRNA 접합체에 의한 간에서의 CNNM4 표적 유전자 발현의 용량 의존적 억제.
도 19. CNNM4 siRNA 접합체에 의한 간에서의 CNNM4 표적 유전자 발현의 용량 의존적 억제.
도 20. CNNM4 siRNA 접합체에 의한 간에서의 CNNM4 표적 유전자 발현의 오래 지속되는 억제.
도 21. CNNM4 siRNA 접합체로 처리된 설치류 NASH 모델에서 CNNM4 발현의 억제.
도 22. CNNM4 siRNA 접합체를 사용한 처리는 간세포의 지질 축적을 감소시킨다.
도 23. CNNM4 siRNA 접합체를 사용한 처리는 간세포에서 미토콘드리아 반응성 산소종(ROS) 생성을 감소시킨다.
도 24. 설치류 NASH 모델을 CNNM4 siRNA 접합체로 처리하면 NASH 발달이 감소한다.
도 25. CNNM4 siRNA 접합체는 아세트아미노펜(APAP)에 의해 유래된 세포자멸사 및 세포 사멸로부터 간세포를 보호한다.
도 26. CNNM4 siRNA의 형질감염에 의한 인간 Huh-7 세포에서의 인간 CNNM4 mRNA 수준의 감소
도 27. CNNM4 siRNA의 형질감염에 의한 인간 Huh-7 세포에서 CNNM4 mRNA 수준의 용량 의존 감소.
도 28. 수용체 매개 흡수에 의한 일차 인간 간세포에서의 CNNM4 유전자 발현의 억제.
도 29. 수용체 매개 흡수에 의한 일차 사이노몰구스 간세포에서의 CNNM4 유전자 발현의 억제.
도 30. NASH에 대한 설치류 모델에서 CNNM4 유전자 발현의 억제
실시예
실시예 1
물질 및 방법
인간 샘플
모든 연구는 헬싱키 선언을 준수하고 현지 국가법에 따라 수행하였다. 연구 절차는 각 병원의 인간 윤리 위원회에 승인을 받았고, 연구에 참여하기 전 모든 환자에게서 서면으로 고지에 의한 동의를 받았다.
건강한 샘플 8명, 비만-진단 환자 31명 및 임상 시험 코호트의 43명으로 이루어진 코호트에서 채취한 인간 혈청 샘플에서 마그네슘을 정량화하였다. 일단 알코올성 질환 및 바이러스성 간염 감염을 제외하고, 다른 마커에 의해 비-알코올성 지방 간 질환(NAFLD)에 대해 환자를 평가하였다.
건강한 환자 10명, 지방증으로 진단된 환자 20명, NAFLD로 진단된 환자 12명으로 이루어진 환자 42명의 코호트를 대상으로 비-알코올성 지방 간 질환(NAFLD)에서 인간 CNNM4 발현을 측정하였다. 간경변 환자 중 CNNM4 수준은 건강하다고 진단된 5명과 간경변으로 진단된 7명으로 이루어진 환자 12명의 코호트에서 측정하였다. 건강한 환자 6명과 간세포 암종(HCC)으로 진단된 환자 41명으로 이루어진 HCC 환자 47명의 CNNM4 수준 또한 측정하였다. 약물 유도 간 손상(DILI) 환자 11명의 코호트에서 CNNM4 수준을 측정하고, 건강한 환자 3명과 비교하였다. 최종적으로, 신장 섬유증 환자 14명의 인간 샘플을 분석하여 CNNM4 발현을 측정하였다. 7명은 건강했고, 또 다른 7명은 신장 섬유증으로 진단받은 바 있다.
동물 실험
모든 동물 실험은 실험실 동물의 관리 및 사용에 대한 스페인 가이드에 맞춰, 그리고 국제 관리 및 사용 위원회 표준으로 수행하였다. 모든 절차는 CIC bioGUNE 동물 관리 및 사용 위원회 및 적격 당국(Diputacion de Bizkaia)의 승인을 받았다. 마우스를 12시간 명/암 주기 하에 온도-제어된 동물 시설(AAALAC-승인된)에 수용하였다. G-They에 표준 식단(Harlan Tekland)을 공급하고, 선택적으로 물을 공급하였다.
NAFLD 동물 모델: CNNM4 측정을 위한 0.1% 메티오닌 및 콜린-결핍 식단(0.1% MCDD). 4주 동안, C57BL/6J 야생형 마우스에 메티오닌(0.1%) 및 콜린(0%) 결핍 식단을 공급하였다. 처리 종료 시점에, 동물을 희생시켜, 하기의 후속 분석을 위해 간을 몇 개의 절편으로 분할하였다: RNA 또는 단백질 추출, 조직학 및 면역조직화학 또는 대사 분석을 위한 포르말린 고정. 혈청 분석을 위해, 처리 중에 주 1회 혈액을 수집하였다.
전-임상 연구: siRNA 요법을 적용한 NAFLD 동물 모델
4주 동안, C57BL/6J 야생형 마우스에 메티오닌(0.1%) 및 콜린 (0%) 결핍 식단을 공급하였다. 상기 식단을 시작하고 2주 후, 마우스를 두 집단으로 나누고 생체 내 침묵화 CNNM4 또는 무관한 siRNA 제어를 시행하였는데, 이들은 제조사의 지침에 따라 Invivofectamine® 3.0 시약(Invitrogen, USA)을 사용하여, CNNM4-특이적 생체 내 siRNA(Custom Ambion, USA) 또는 대조군 siRNA (Sigma-Aldrich, USA) 중 하나의 용액 0.75μg/μl 중 200μll를 투여하였다. 4주차까지 주 2회로 꼬리 정맥 주사를 수행하였다. 처리 종료 시, 동물을 희생시키고, 하기를 포함한 후속 분석을 위해 간을 몇 개의 절편으로 분할하였다: RNA 또는 단백질 추출, 조직학 및 면역조직화학 또는 대사 분석을 위한 포르말린 고정. 혈청 분석을 위해, 처리 중에 주 1회로 혈액을 수집하였다.
간경변 동물 모델: 담관 결찰(BDL)
성체 C57BL/6J 야생형 마우스에 이전에 기재된 바와 같이 BDL을 시행하였다(Fernandez-Alvarez et al., 2015. Lab Invest. 95(2):223-36). 간략하게, O2 중 1.5% 아이소플루오란으로 마우스를 마취시키고, 복부를 개방하였다. 담관을 문맥 및 간 동맥에서 분리하고, 담관 주변을 봉합하여 외과적으로 고정시켰다. 최종적으로, 상기 복부를 닫고 마우스를 24시간, 48시간, 72시간, 3일 및 21일에 희생시켰다. 하기의 후속 분석을 위해 간을 몇 개의 절편으로 분할하였다: RNA 또는 단백질 추출, 조직학 및 면역조직화학 또는 대사 분석을 위한 포르말린 고정. 혈청 분석을 위해 처리 중에 주 1회 혈액을 수집하였다.
간세포 암종 동물 모델(HCC): GNMT-/- 마우스
성체 GNMT-/- 마우스를 7 내지 9개월 동안 키웠는데, 이들 마우스는 HCC가 자연스럽게 발병했다고 기술되었다(Wagner et al, 2009. Toxicol Appl Pharmacol. 1;237(2):246; author reply 247). 그때 동물을 희생시켰고, 하기와 같은 후속 분석을 위해 간을 몇 개의 절편으로 분할하였다: RNA 또는 단백질 추출, 조직학 및 면역조직화학 또는 대사 분석을 위한 포르말린 고정. 혈청 분석을 위해, 처리 중에 주1회 혈액을 수집하였다.
약물로 유도된 간 손상(DILI): 아세트아미노펜(APAP) 과다용량
성체 C57BL/6J 야생형 마우스에서 급성 간 손상을 유도하기 위해 아세트아미노펜(APAP) 500mg/kg을 투여하였다. 투여 후 48시간이 지나서, 마우스를 희생시켰고, 하기와 같은 후속 분석을 위해 간을 몇 개의 절편으로 분할하였다: RNA 또는 단백질 추출, 조직학 및 면역조직화학 또는 대사 분석을 위한 포르말린 고정. 혈청 분석을 위해, 처리 중 주 1회로 혈액을 수집하였다.
일차 간세포의 단리, 배양 및 처리
3-월령 야생형(C57BL/6J) 마우스의 일차 간세포를 콜라게나제 유형 I(Worthington, USA)로 관류에 의해 단리하였다. 간략하게, 동물을 이소플루란(O2 중 1.5% 이소플루란)으로 마취시켰다. 이어서, 복부를 개방하고, 카테터를 하대정맥에 삽입하였다. 완충액 A(1x PBS, 5mM EGTA, 37℃ 및 산소화됨)로 간을 관류하고, 문맥을 절개하였다. 다음으로, 간을 완충액 B(1x PBS, 1mM CaCl2 37℃ 및 산소화됨)로 관류하여 EGTA를 제거하고, 최종적으로 완충액 C(1x PBS, 2mM CaCl2, 0.65 BSA, 콜라게나제 유형 I, 37℃ 및 산소화된)로 관류하였다. 완충액 C 관류 후, 몸의 나머지 부분에서 간을 분리하고, MEM(Gibco, USA)이 담긴 페트리 접시에 옮겨 담았다. 담낭을 신중하게 제거한 뒤, 겸자로 간을 기계적으로 분해하였다. MEM에 희석된 소화된 간을 멸균 거즈를 통해 여과하고, 여과된 간 세포를 수집하여 MEM이 보충된 10% FBS (Gibco)/1% PSG(Gibco)에서 3회 세척(400RPM에서 1x4' 및 500RPM에서 2x5')하여, 모든 상청액 Kupffer 및 간 성상 세포 단리를 보존하였다. 최종 세척 후, 후속 배양을 위해 펠렛에 함유된 간세포를 10% FBS 1% PSG MEM에 재현탁하였다.
일차 간세포를 MEM이 보충된 10% FBS/1% PSG에서 7600 세포/mm2의 밀도로 사전에 콜라켄이 도포된 배양 접시에 시딩하고, 5%CO2~95% 공기 및 37℃의 인큐베이터에 옮겨 담았다. 부착 6시간 후, 원하는 처리를 위해 신선한 0% FBS/1% PSG MEM으로 배양 배지 및 미부착된 간세포를 제거하였다.
THLE2 세포
THLE-2 세포를 ATCC(ATCC® CRL-2706TM)에서 구입하였다. 상기 세포를 BEGM 불릿 키트TM(Lonza) 및 10%FBS가 보충된 기관지 상피 성장 배지(BEGMTM, Lonza) 상에 유지시켰다. 상기 세포를 0.05% 트립신-EDTA로 분할하고, BEGM에 수집하였다. 5분 동안 123g로 원심분리한 후, 상청액을 폐기하고 펠렛을 재현탁하였다.
플라스미드 형질감염
제조자의 프로토콜에 따라 jetPRIME® (Polyplus, USA) 형질감염 시약을 사용하여 과발현을 위해 플라스미드로 일차 마우스 간세포를 형질감염시켰다. 24-웰 플레이트에서, 플라스미드 0.5μg를 jePRIME® 완충액에 첨가하고, 1μl jetPRIME® 시약을 첨가하기 전 10초 동안 와동하였다. 상기 혼합액을 10초 동안 와동하고 스핀 다운하여 실온에서 10분 동안 배양하였다. 세포 현탁액 배지에서 형질감염을 수행하고, 지시되지 않는 한 형질감염 후 6시간이 지나면 형질감염 혼합액을 신선한 배지로 교체하였다.
siRNA 전달에 의한 유전자 침묵화
제조자의 프로토콜에 따라 DharmaFECT 1 시약 (Dharmacon)을 사용하여 100nM의 최종 농도에서 특이적 siRNA(인간 CNNM4의 경우 Hs n7o 및 마우스 CNNM4의 경우 Mm n7o)로 세포를 형질감염시켰다. DharmaFECT 1과 siRNA를 실온에서 5분 동안 0% FBS/1% PSG MEM에 따로 희석하였다. 이어서, 희석액을 혼합하고, 실온에서 20분 동안 배양하였다. 그러고 나서, siRNA 형질감염 혼합액을 세포 현탁액 배지에 첨가하고, 6시간 후 신선한 배지로 교체하였다.
shRNA 전달에 의한 유전자 침묵화
리포펙타민® 3000(Thermofisher)을 사용하여 제조자 지침에 따른 프로토콜을 준수하여, CNNM4 shRNA(서열번호: 454)로 세포를 형질감염시켰다. 7.5μl 리포펙타민과 shRNA를 0.2ml 배양 배지에 따로 희석시키고, 실온에서 5분 동안 배양하였다. 배양 후, 이들을 다시 혼합하고, 상기 세포에 전달하기 전에 실온에서 30분 동안 배양하였다.
RNA 단리
제조자의 지침에 따라 TRIzol 시약(Invitrogen)을 사용하여 전체 간 또는 배양 세포에서 총 RNA를 단리하였다. 세포 mRNA 추출의 경우, RNA 펠렛의 가시성을 용이하게 하기 위해, 글리코겐(Ambion, USA) 5μg을 RNA 침전 단계에 사용하였다. 나노드롭 ND-100 분광광도계(ThermoFisher Scientific, USA)를 사용하여 RNA 농도를 분광광도 차원에서 측정하였다.
레트로전사
단리된 RNA 1~2μg를 DNAse I(Invitrogren)로 처리하고, 이것을 사용하여 랜덤 프라이머 및 RNAseOUT(모두 Invitrogen에서 구입)의 존재 하에 M-MLV 역전사효소로 cDNA를 합성하였다. 수득된 cDNA를 RNAse 유리수(Sigma-Aldrich)에 1/10(2μg이 사용된 경우, 1/20)로 희석하였다.
실시간 정량적 PCR(RT-qPCR)
SYBR 셀렉트 마스터 믹스(Applied Biosystems, USA)와 함께 ViiA 7 또는 QS6 실시간 PCR 시스템 중 하나를 사용하여 qPCR를 수행하였다. cDNA 1.5μl를 사용하였고, 384-웰 플레이트(Applied Biosystems)에서 총 반응 부피가 6.5μl가 되도록 특이적 프라이머를 포함시켰다. 모든 반응을 삼중으로 수행하였다. 프라이머를 위한 PCR 조건을 최적화하고 단계별로 30초 동안 60℃의 용융 온도로 40 사이클을 사용하였다. NCBI-뉴클레오티드 웹페이지(www.ncbi.nlm.nih.gov/뉴클레오티드)를 통해 프라이머 3 소프트웨어를 사용하여, 호모사피엔스 및 무스 무스큘러스 프라이머를 설계하고, Sigma Aldrich에 의해 합성하였다. 용융 곡선으로 PCR 생성물의 특이성을 확인한 후, 하우스키핑 유전자(GAPDH, ARP)의 발현에 대해 데이터를 정규화하였다.
단백질 추출 및 분석
지시된 바와 같이, 총 단백질의 추출을 수행하였다. 차가운 PBS 완충액으로 세포를 세척하고, RIPA 용해 완충액 200μl(1.6 mM NaH2P04, 8.4 mM Na2HP04, 0.5% 아지드, 0.1 M NaCI, 0.1% SDS, 0.1% Triton X-100, 5 mg/ml 소듐 데옥시콜레이트)에 재현탁시켰다. 상기 용해 완충액에 프로테아제 및 포스파타제 억제제 칵테일 (Roche, Switzerland)을 보충하였다. 이들은 (4℃에서 20분 동안 13000rpm으로) 원심분리하고, 상기 상청액(단백질 추출물)은 브라드포드 단백질 검정(Bio-Rad)에 의해 총 단백질 함량에 대해 정량화하고, Spectramax M3 분광광도계(Molecular Devices, USA)를 사용하여 측정하였다. 냉동된 간 조직의 경우, 500μl 완충액에서 Precellys 24 조직 균질기(Precellys, France)를 사용하여 조직 대략 50μg를 균질화하였다. 모든 경우에, 상기 용해물을 원심분리하고(13000rpm, 20분, 4℃), 상기 상청액(단백질 추출물)을 사용된 용해 완충액의 유형에 따라 브라드포드 단백질 검정 또는 BCA 단백질 검정(Pierce, USA)에 의해 총 단백질 함량에 대해 정량화하고, Spectramax M3 분광광도계를 사용하여 측정하였다.
웨스턴 블롯팅
단백질 추출물을 SDS-PAGE 샘플 완충액(250 mM 트리스-HCI pH 6.8, 500 mM β-머캅토에탄올, 50% 글리세롤, 10% SDS 및 브로모페놀 블루)에서 5분 동안 95℃로 끓였다. Mini-PROTEAN 전기영동 시스템(Bio-Rad)을 사용하여, 3% 내지 15% 아크릴아미드 겔(관심 대상 단백질의 분자량에 따라)에서 소듐 도데실 설페이트-폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE)에 의해, 단백질 존재비 및 항체 민감성에 따라, 적절한 양의 단백질(5 내지 50μg)을 분리하였다. 트랜스-블롯 세포(Bio-Rad)를 이용하여, 전자블롯팅에 의해 겔을 니트로셀룰로스 막으로 이전하였다. 상기 막은 실온에서 1시간 동안 0.1% Tween-20 (Sigma Aldrich)을 함유한 TBS pH 8(TBST-0.1%) 중 5% 무지방 우유로 차단하였고, 10분 동안 TBST-0.1%로 3회 세척하고, 밤새 4℃에서 상업적 일차 항체로 배양하였다. 일차 항체 및 그것의 최적의 배양 조건이 표 6에 상세하게 기술되었다. 이어서, TBST-0.1%로 10분 동안 상기 막을 3회 세척하고, 실온에서 1시간 동안 서양고추냉이-과산화효소(HRP, 표 6)에 접합된 이차 항체를 함유한 차단 용액에서 배양하였다. 웨스턴 라이트닝 향상 화학발광 시약(ECL, PerkinElmer, USA)을 사용하여 면역반응성 단백질을 검출하고, Curix 60 전개액(AGFA, Belgium)에서 슈퍼 Rx-N X-선 필름(Fuji, Japan)에 노출시켰다.
지질 염색을 위한 수단 레드
O.C.T-포함된 냉동된 간 샘플을 10μm 절편으로 절단하였다. 상기 절편들은60% 이소프로판올로 세척하고, 그 다음 신선한 수단 III(이소프로판올 중 0.5%; Sigma Aldrich) 용액으로 30분 동안 염색하였다. 이어서, 샘플을 60% 이소프로판올로 다시 한 번 세척하고, 그 다음 헤마톡실린 및 에오신으로 대조염색하였다. 상기 절편을 이어서 증류수로 세척하고, DPX 실장 배지에 실장하였다. 직립 광학 현미경(Zeiss)으로 영상을 찍었다.
DHE에 의한 ROS 측정
O.C.T-포매된 8μm 절편을 실온에서 1시간 동안 MnTBAP 150μM과 함께 배양하였다. 이어서, 상기 샘플을 37℃에서 30분 동안 디하이드로에티듐(DHE) 5μM와 함께 배양하고, 핵을 대조염색하기 위해 상기 절편에 DAPI를 0.7mg/l 함유한 플루오로 실장-G(Southern Biotech, USA)를 실장하였다. Axioimager D1(Zeiss)를 사용하여 영상을 찍었다.
CNNM4 측정을 위한 면역조직화학
과산화물 차단(PBS 중 3% H2O2, 10', 실온)에 사용되어 차단이 실시될 일차 항체에 따라서, 파라핀-포매된 절편(5μm 두께)은 마스킹하지 않았다. 마우스 조직에서 마우스-호스팅된 항체를 이용한 염색을 위해, 샘플을 염소 항-마우스 Fab 단편(Jackson Immuno연구, USA)(1:10, 1시간, 실온)으로 차단하고, 5% 염소 혈청(30', 실온)으로 차단하였다. 이어서, 습한 배양실에서 1:100의 DAKO 항체 희석제(DAKO) 중 CNNM4 일차 항체(Ab191207, Abeam)와 함께 상기 절편을 배양하고, 이어서 엔비전(Envision) 항 토끼(DAKO) HRP-접합 이차 항체를 배양하였다(30', RT), 실벡터 VIP 색원체(Vector)로 비색 검출을 확인하고, 헤마톡실린으로 조직을 대조염색하였다. DPX 실장 배지를 사용하여 샘플을 실장하였다. 직립 광학 현미경(Zeiss)으로 영상을 찍었다.
αSMA 측정을 위한 면역형광
α-SMA 염색을 위해, O.C.T-포매된 10μm 절편을 Cy3에 접합된 일차 항체의 0.01%PBS-아지드(C6198, Sigma Aldrich) 중 2%BSA에서의 1/200 희석액과 함께 배양하고, 핵을 대조염색하기 위해 DAPI를 0.7 mg/l 함유한 플루오로 실장-G(Southern Biotech)를 실장하였다. Axioimager D1(Zeiss)으로 영상을 찍었다.
일차 간세포에서 지질 정량화를 위한 BODIPY
높은 지질 함량 배지(OA) 또는 메티오닌/콜린 결핍 배지(MDMC)에서 배양된 일차 간세포를 PBS 중 4% 파라포름알데하이드(10', 실온)에 고정시키고, 1mg/ml의 BODIPY 493/503(Molecular Probes, Invitrogen)과 함께 배양하였다(1시간, 실온). Axioimager D1(Zeiss) 현미경을 사용하여, BODIPY 면역세포형광 영상을 찍었다. Frida 소프트웨어를 사용하여 지질체의 정량화를 수행하고, 세포의 총 개수당 평균 면적으로 표시하였다.
데이터 분석
FRIDA 소프트웨어(http://bui3.win.ad.jhu.edu/frida/, John Hopkins University)를 사용하여, 각 샘플의 강도의 평균합 또는 염색된 면적 백분율을 계산하였다.
간 지질 정량화
냉동된 간 30mg을 돌림판(potter) 균질기에서 빙냉 PBS 10 부피로 균질화하였다. Wako 화학물질 키트(Richmond, VA)를 사용하여 균질물에서 지방산을 측정하고, 기재된 바와 같이 지질을 정량화하였다(Folch et al, 1957. J Biol Chem. 226(1):497-509). 간략하게, 간 균질물에서 유래된 단백질 1.5mg에서 지질을 추출하였다. 포스파티딜콜린(PC), 포스파티딜에탄올아민(PE), 지방산(FA) 및 콜레스테롤(Ch)을 박층 크로마토그래피(TLC)로 분리하고, 기재된 바와 같이 정량화하였다(Ruiz and Ochoa, 1997). A. Menarini 진단(이태리) 키트로 상기 지질 추출물에서 트리글리세리드(TG)를 측정하였다.
세포내 마그네슘 수준
유리 커버슬립에서 성장한 일차 간세포에 0% FBS/1% PSG 배지 중 2μM Mag-S-Tz 또는 1μM Mag-S-Tz-AM 희석된 REF(Gruskos et al., 2016. J. Am. Chem. Soc. 138 (44), pp 14639-14649)를 로딩하고, 37℃ 및 5% CO2에서 각각 30분 또는 1시간 동안 배양하였다. 염료-함유 배지를 제거한 후, 0% FBS/1% PSG에서 30분 동안 배양을 수행하였다. 이어서, 커버슬립을 20mM 트리스-HCI, 2.4mM CaCI2, 10mM 글루코스, pH 7.4 완충액에서 세척하고, Eclipse TE 300-기반 마이크로분광형광계(Nikon, USA) 상에서 온도조절장치로 관류 챔버에 실장하고, 40 x 오일-침지 형광으로 시각화하였다. Grynkiewicz(Grynkiewiz et alo., 1985. J Biol Chem. 260(6): 3440-50)에 의해 기재된 방법을 사용하여, 세포내 Mg2+ 수준을 측정하였다. 상기 340/380nm 여기 광 비율을 델타 시스템(Photon Technologies International, Princeton)으로 계산하고, 하기 표준 방정식을 사용하여 Mg2+ 농도로 전환하였다:
Figure pct00059
여기서 Kd는 Mag-S-Tz (3.2 mM) 및 Mag-S-Tz-AM (8.9 mM)의 Mg2 + 해리 상수이고, Q는 380nm에서 최소/최대 형광 강도의 비이다.
세포외 마그네슘 수준
QuantiCromTM 마그네슘 검정 키트(BioAssay Systems, USA)를 사용하여 세포외 마그네슘을 정량화하였다. 간략하게, 혈청 또는 배양 배지 5μl를 시약 A 및 시약 B의 1:1비 혼합액 200μl와 혼합하였다. 2분 동안 실온에서 배양한 후, Spectramax M3 분광광도계(Molecular Devices, USA)를 사용하여, 500nm 길이에서 OD를 결정하였다. 이어서, EDTA 10μl을 첨가하고 OD500을 다시 결정하였다. 표준 농도(2mg/ml)에서 OD500과 비교하여, 최종적으로 마그네슘 농도를 계산하였다.
미토콘드리아 ROS 측정
제조자의 지침에 따라, MitoSOXTM 레드 시약(Life Technologies)을 사용하여, 미토콘드리아 ROS를 측정하였다. 간략하게, 일차 간세포 및 간종양 세포를 정상적인 배양 배지에서 MitoSOX 시약(CO2 인큐베이터에서 2.5μM, 10분, 37℃)과 함께 배양하였다. 이어서, PBS로 세포를 2회 세척하고, 분광광도계를 사용하여 510nm 여기 및 595nm 방출에서 형광을 측정하였다. 최종 값을 총 단백질 농도에 맞게 정규화하였다.
TUNEL에 의한 세포 사멸 측정
앞서 명시된 바와 같이 제조자의 지침에 따라 제자리에서 세포 사멸 검출 키트(Roche)를 사용하여 세포 사멸을 분석하였다. 3분 동안, 세포에 과산화물 차단(메탄올 중 3% H2O2)을 실시한 후, 37℃에서 1시간 동안 FITC-접합 일차 항체(희석액 1/50)를 함유한 TUNEL 희석제 완충액과 함께 배양하였다. 절편을 Dako 형광 실장 배지(Dako)에 실장하였다. Axioimager D1(Zeiss) 현미경을 사용하여 영상을 찍고, TUNEL 양성 세포의 %를 결정하여 세포 생존력을 계산하였다.
결과
간 병리학에서 CNNM4 과발현
만성 간 질환은 다른 병리군을 포함한다. 인간 간 생검 및 마우스 동물 모델의 간에서 면역조직화학(IHC)에 의해 CNNM4 발현을 검출하는 방법이 개발된 바 있다. 본원에서는 CNNM4 발현이 인간 생검 및 동물 모델 양쪽 모두에서 DILI 및 만성 간 질환의 모든 단계의 특징이 됨으로써, 모든 병리에서 단백질의 과발현이 관찰되었다(도 1). 지방증 및 NASH 환자의 샘플과 비교하여, 건강한 대상체의 인간 간 샘플에서 CNNM4 mRNA 수준의 qPCR에 의해 CNNM4 발현을 검출하는 방법으로, 이들 결과를 확인하였다(도 2a). CNNM4 발현은 또한 시험관 내 NASH 마우스 세포 모델(도 2c)에서 뿐만 아니라 생체 내 NASH 마우스 모델(도 2b)에서의 CNNM4 mRNA 수준의 qPCR에 의해 결정될 수 있다.
간 질환을 치료하기 위한 표적, CNNM4
IHC에 의한 CNNM4 측정에서 관찰된 과발현은 DILI 및 만성 질환 양쪽의 경우에서 모두, 간 질환을 치료하기 위한 잠재 표적으로서 CNNM4를 시사한다. 일차 간세포에서 NASH를 유도하고 siRNA CNNM4 요법으로 이것을 치료하는 시험관 내 연구를 수행하였다. NASH 모델-일차 간세포의 경우, 상기 지질 함량 및 반응성 산소 종(ROS)에 의한 염증을 측정하였고, 이로써 siRNA 요법으로 처리된 NASH 간세포에서 둘 다 회복됨이 관찰되었다(도 3a 및 3b). 아세트아미노펜 과다용량에 의해 유도된 DILI에 대한 추가의 시험관 내 연구를 수행하였다. DILI 모델-간세포에서의 예상된 세포 사멸이 관찰되었고, 그뿐만 아니라 siRNA 처리 시 회복이 관찰되었다(도 3C). 인간 세포에서 NASH를 유도한 추가의 시험관 내 연구를 수행하였고, 이어서 이들 세포를 siRNA CNNM4 요법 또는 shRNA CNNM4 요법으로 처리하였다. siRNA 요법으로 처리한 NASH-유도된 인간 세포(THLE2 세포)(도 4a) 및 shRNA 요법으로 처리한 NASH-유도 인간 세포(도 4b) 모두에서 상대적 지질 축적 회복을 관찰하였다.
CNNM4 표적화의 특이성 및 필요성
NASH 및 DILI에서 siRNA CNNM4-요법의 보호 효과를 관찰하면서, CNNM 계열(CNNM1, CNNM2 및 CNNM3)의 다른 단백질의 표적화된 침묵화의 효과를 측정하였다. 일차 간세포에서 NASH를 유도하고, CNNM1, CNNM2 및 CNNM3에 대해 siRNA로 처리하였다. siRNA CNNM4 요법과는 상이하게, CNNM 계열의 다른 단백질의 침묵화는 아무런 효과가 없었는데, 이는 CNNM4만을 기반으로, 그리고 다른 CNNM 계열 단백질은 기반으로 하지 않는 가능한 치료의 특이성을 가리킨다(도 5A). 또한, CNNM4-기반 치료의 필요성을 입증하는 실험을 수행하였다. 제1 실험에서, NASH 환자 및 동물 모델에서 관찰된 상황을 모방하기 위해 일차 간세포에서 CNNM4 과발현에 의해 지질 축적을 유도하였다. 마그네슘 보충은 이러한 간세포에서 지질 축적의 수준에 어떤 효과도 미치지 않았다(도 5b). 제2 실험에서, 일차 간세포에서 마그네슘 박탈에 의해 지질 축적을 유도하였고, 이것은 CNNM4 과발현과 유사한 생리학적 상태를 초래한다. 이 경우에, siRNA CNNM4 요법이 지질 축적을 감소시켰다(도 5c). 이들 마지막 두 결과는 마그네슘 보충이 NASH 치료에 충분하지 않음과 CNNM4-기반 요법의 필요성이 존재함을 보여준다.
siRNA CNNM4-기반 요법의 전임상 연구
세포에서뿐만 아니라 동물에서 CNNM4 조절의 효능을 테스트하기 위해 만성 간 질환의 1기인 NAFLD의 전임상 연구를 개발하였다. 마우스에서 NAFLD가 발병하도록 2주 동안 마우스에 0.1% 메티오닌 및 콜린-결핍 식단(0.1%MCDD)을 공급하였다. 이어서, 하위군을 siRNA CNNM4 요법으로 치료하고, 또 다른 하위군은 siCtrl RNA로 치료하였다. 동물을 희생시키고, NAFLD 진행을 분석하기 위해 다른 바이오마커를 측정하였다. 지질 축적을 측정하기 위해 수단 레드 염색을 사용하였다(도 6a). 간 손상을 표지하는 혈청 중 트랜스아미나제 수준 역시 측정하였다(도 6b). ROS에 의해 유발된 염증을 정량화하기 위해 DHE 염색을 사용하고(도 6c) 섬유증의 진행을 표시하기 위해 α-평활근 액틴(αSMA) 수준을 측정하였다(도 6d). 이들 결과는 siRNA CNNM4 요법이 NAFLD를 감소시킴을 분명히 보여준다.
CNNM4의 약리학적 억제
siRNA 요법과 더불어, CNNM4 활성이 또한 약리학적으로 조절될 수 있다. 일차 간세포에서 NASH를 유도하여 이것을 화합물 7-아미노-2-페닐-5H-티에노[3,2-c]피리딘-4-온으로 처리하는 시험관 내 검정을 수행하였다. 이와 같은 CNNM4의 약리학적 억제가 NASH-유도 간세포에서 siRNA 요법과 동일한 효과를 나타내고, 이것이 지질 함량을 감소시키고(도 7a) 마그네슘 축적을 야기함(도 7b)이 관찰될 수 있다. 따라서 CNNM4 siRNA와 7-아미노-2-페닐-5H-티에노[3,2-c]피리딘-4-온 또는 유사한 기능을 가진 그것의 유도체의 병용 요법이 NASH의 강력한 치료로 이어질 수 있음이 예상된다.
다른 기관의 병리에서 CNNM4 과발현
도 1에 나타낸 바와 같이, 동물 모델 및 인간 샘플 모두의 다른 간 병리에서 CNNM4가 과발현된다. 그러나, 섬유증 발병은 간에서뿐만 아니라 다른 기관 예컨대 신장에서도 발생한다. 두 조직에서 섬유증의 발병에는 유사성이 있을 수 있고, 또한 CNNM4는 상기 기관에서 조절되지 않을 수 있다. 이는 실제로 사실이다. 우리는 신장 섬유증 마우스 모델에서 CNNM4 과발현을 관찰하였고, 이는 CNNM4 발현을 감소시키는 요법이 신장 섬유증의 치료에도 효과적일 수 있음을 시사한다(도 8). 또한, TCGA(The Cancer Genome Atlas) 데이터의 분석에 따르면, CNNM4가 정상 조직과 비교하여 간 간세포 암종(HHC)의 원발성. 종양 샘플 및 폐 선암종(LUAD)의 원발성 종양 샘플에서 과발현됨이 나타난다(도 9a 및 9b). CNNM4의 과발현은 또한 담관암종(담도암)에서 검출된 바 있고, Mg2+　항상성을 회복시킨다.
요약하면, 상기 제시된 결과는 CNNM4가 NAFLD 진행을 방지하기 위한 적합한 표적임을 입증하고, 이것의 억제가 다른 간 병리(DILI, 간경변 및 HCC), 신장 섬유증 및 폐암을 개선할 수 있음을 시사한다. CNNM4는 이들 모든 질환에서 과발현된다. 또한, DILI의 경우, 상기 시험관 내 연구는 APAP 과다용량으로부터 siRNA 요법의 보호 효과를 보여준다. CNNM4의 억제 또는 침묵화, 특히 siRNA 요법에 의한 것이 간 질환, 신장 섬유증 및 폐암을 치료하기에 적합한 방법이다.
실시예 2 - 구성 요소의 합성
아래에 기재된 바와 같이 DMT-세리놀(GalNAc)-CEP 및 CPG의 합성 경로가 도 10에 개략되어 있다. 문헌에 공개된 방법(Hoevelmann et al Chem. Sci., 2016,7, 128-135)에 따라 상업적으로 입수 가능한 L-세린에서 출발 물질 DMT-세리놀(H) (1)을 제조하였다. 상업적으로 입수 가능한 퍼(per)-아세틸화된 갈락토스 아민에서 출발하여, 문헌에 공개된 방법(Nair et al J. Am. Chem. Soc., 2014, 136 (49), pp 16958-1696)에 따라, GalNAc(Ac3)-C4H8-COOH(2)를 제조하였다. 포스파이틸화 시약 2-시아노에틸-N,N-디이소프로필클로로포스포르-아미다이트(4)는 상업적으로 입수가능하다. Prakash, Nucleic Acids Res. 2015, 43(6), 2993-3011 and Haraszti, Nucleic Acids Res. 2017, 45(13), 7581-7592에 기재된 바와 같이, (vp)-mU-phos의 합성을 수행하였다. ST23(ST23-phos)뿐만 아니라 ST43(ST43-phos)의 포스포르아미다이트 유도체의 합성을 WO2017/174657에 기재된 바와 같이 수행할 수 있다.
DMT-세리놀(GalNAc) (3)
HBTU(9.16g, 24.14 mmol)를 GalNAc(Ac3)-C4H8-COOH (2)(11.4g, 25.4mmol)과 DIPEA(8.85ml, 50.8mmol)의 교반 용액에 첨가하였다. 2 분 활성화 시간 후, 상기 교반 혼합물에 아세토니트릴(무수)(200ml) 중 DMT-세리놀(H) (1)(10g, 25.4mmol)의 용액을 첨가하였다. 1시간 후, LCMS가 우수한 전환을 보였다. 상기 반응 혼합물을 진공에서 농축시켰다. 상기 잔기를 EtOAc에서 완전히 용해시키고, 나중에 물(2x)과 염수로 세척하였다. 상기 유기층을 Na2S04 상에서 건조시키고 여과하여 감압 하에서 농축하였다. 상기 잔기를 칼럼 크로마토그래피(CH2Cl2 + 1% Et3N 중 3% MeOH, 700g 실리카)로 추가로 정제하였다. 분획을 함유한 생성물을 모으고, 농축하고, CH2Cl2로 스트립핑(2x)하여, 황백색 포말로 10.6g(51%)의 DMT-세리놀(GalNAc) (3)을 수득하였다.
DMT-세리놀(GalNAc)-CEP (5)
아르곤 대기 하에 0℃에서 2-시아노에틸-N,N-디이소프로필클로로포스포르아미다이트 (4)(5.71ml, 25.6mmol)을 디클로로메탄(건조)(150ml) 중 DMT-세리놀(GalNAc) (3)(15.0g, 17.0mmol), DIPEA (14.9ml, 85mmol) 및 4Å 분자체의 교반 혼합물에 천천히 첨가하였다. 상기 반응 혼합물을 0℃에서 1시간 동안 교반하였다. TLC는 완전한 전환을 나타내었다. 상기 반응 혼합물을 여과하고 진공에서 농축시켜서 점성 오일을 수득하였다. 상기 잔기를 디클로로메탄에 용해시키고, 추가적으로 플래시 크로마토그래피(톨루엔 1%Et3N 중 0~50% 아세톤, 220g 실리카)로 정제하였다. 분획을 함유한 생성물을 모으고 진공에서 농축시켰다. 상기 수득된 오일을 MeCN으로 스트립핑((2x)하여 무색 DMT-세리놀(GalNAc)-CEP (5) 발포 13.5g(77%)를 수득하였다.
DMT-세리놀(GalNAc)-석시네이트 (6)
아르곤 대기 하에 디클로로메탄(50ml)과 피리딘(50ml)의 혼합물 중 DMT-세리놀(GalNAc) (3)(7.5g, 9.11mmol) 및 석신산 무수물(4.56g, 45.6mmol)의 교반 용액에 DMAP(1.11g, 9.11mmol)를 첨가하였다. 16시간 동안 교반한 후, 상기 반응 혼합물을 진공에서 농축시키고 상기 잔기를 EtOAc에 취하고, 5% 시트르산 산(수성)으로 세척하였다. 상기 수성층을 EtOAc로 추출하였다. 나중에 상기 조합된 유기층을 포화된 NaHCO3(수성) 및 염수로 세척하고, Na2S04 상에서 건조시키고, 여과하여 진공에서 농축시켰다. 플래시 크로마토그래피(CH2CI2+1% Et3N 중 0~5% MeOH, 120g 실리카)로 추가적인 정제를 달성하였다. 분획을 함유한 생성물을 모으고 진공에서 농축시켰다. 상기 잔기를 MeCN으로 스트립핑(3x)하여 5.9g(70%)의 DMT-세리놀(GalNAc)-석시네이트 (6)을 수득하였다.
DMT-세리놀(GalNAc)-석시닐-lcaa-CPG (7)
상기 DMT-세리놀(GalNAc)-석시네이트 (6)(1 eq.)와 HBTU(1.1 eq.)를 CH3CN(10 ml)에 용해시켰다. 디이소프로필에틸아민(2 eq.)을 상기 용액에 첨가하고, 2분 동안 상기 혼합물에 와류를 발생시키고, 이어서 천연 아미노-lcaa-CPG(500A, 88μmol/g, 1 eq.)를 첨가하였다. 상기 현탁액을 16시간 동안 실온에서 손목진탕기(wrist-action shaker)로 부드럽게 진탕하고, 이어서 여과한 후 아세토니트릴로 세척하였다. 고체 지지체를 2시간 동안 감압 하에 건조시켰다. 실온에서 Ac20/2,6-루티딘/NMI와 함께 교반함으로써(2x15분), 상기 지지체 상의 미반응 아민을 캡핑하였다. 앞서와 같이, 상기 지지체의 세척을 반복하였다. 상기 고체를 진공 하에 건조시켜 DMT-세리놀(GalNAc)-석시닐-lcaa-CPG (7)(로딩: 34μmol/g, 탈트리틸화 검정에 의해 측정됨)을 수득하였다.
실시예 3 - 올리고뉴클레오티드 합성
하기에 기재되고 당업자에게 알려진 방법에 따라 예시적인 화합물을 합성하였다. 포스포르아미다이트 방법론을 적용하는 고상 합성에 의해 올리고뉴클레오티드 사슬 및 링커 구성요소의 조립을 수행하였다.
다운스트림 쪼개짐, 탈보호 및 정제는 당해 기술에 알려진 표준 절차를 준수하였다.
상업적으로 입수가능한 2'O-메틸 RNA와 2'플루오로-2'데옥시 RNA 염기 로딩된 CPG 고체 지지체를 사용하여 AKTA 올리고파일럿 10상에서 올리고뉴클레오티드 합성을 수행하고, 포스포르아미다이트(모든 표준 보호, ChemGenes, LinkTech)를 사용하였다. DMT-(S)-세리놀(GalNAc)-석시닐 lcaa CPG (7)과 DMT-(S)-세리놀(GalNAc)-CEP (5)의 합성이 실시예 2에 기재되어 있다.
보조적인 시약을 EMP Biotech에서 구입하였다. 건조 아세토니트릴(<20 ppm H2O) 중 포스포르아미다이트의 0.1M 용액을 사용하여 합성을 수행하였고, 벤질티오테트라졸(BTT)을 활성화제(아세토니트릴 중 0.3M)로 사용하였다. 체결 시간은 10분이었다. Cap/OX/Cap 또는 Cap/티오/Cap 주기를 적용하였다(Cap: Ac20/NMI/루티딘/아세토니트릴, 산화제: 피리딘/H2O 중 0.05M I2). 아세토니트릴 중 상업적으로 입수가능한 티올화 시약 50mM EDITH(Link technologies)를 사용하여 포스포로티오에이트를 도입하였다. 톨루엔 중 3% 디클로로아세트산으로의 처리에 의해 DMT 쪼개짐을 달성하였다. 프로그래밍된 합성 주기의 완료 시, 디에틸아민(DEA) 세척을 수행하였다. 모든 올리고뉴클레오티드를 DMT-없음(off) 방식으로 합성하였다.
염기-로딩된 (S)-DMT-세리놀(GalNAc)-석시닐-lcaa-CPG (7) 또는 (S)-DMT-세리놀(GalNAc)-CEP (5) 중 하나의 사용으로 세리놀(GalNAc) 모이어티의 부착을 달성하였다. 분기화 트레블러 아미다이트 유도체(C6XLT-phos), 그리고 이어서 GalNAc 아미다이트 (ST23-phos)의 연속적인 체결에 의해 트리-촉각 GalNAc 클러스터(ST23/ST43)를 도입하였다. 마지막 합성 주기에서 (vp)-mU-phos의 사용에 의해 (vp)-mU 모이어티의 부착을 달성하였다. 상기 (vp)-mU-phos는 추가적인 합성 연신비에 적합한 하이드록시 작용기를 제공하지 않기 때문에, DMT-작용기를 소유하지 않는다. 그러므로, (vp)-mU-phos의 체결은 합성 종결을 초래한다.
비닐포스포네이트를 마스킹하는 메틸 에스테르의 제거를 위해, 충분히 조립된 올리고뉴클레오티드를 운반하는 CPG를 감압 하에 건조시키고 고상 펩티드 합성을 위해 디스크 프릿(Carl Roth GmbH)이 장착된 20ml PP 주사기 반응기로 옮겨 담았다. 이어서, 실온에서 상기 CPG를 CH2Cl2중 TMSBr 250μL와 피리딘 177μL의 용액과 접촉시키고(0.5 ml/μmol 고체 지지체 결합 올리고뉴클레오티드) 상기 반응기를 Luer 캡으로 밀봉하였다. 상기 반응 용기를 2x15분의 기간에 걸쳐 약간 진탕하였고, 상기 과잉 시약은 폐기하고 잔여 CPG는 10ml 아세토니트릴로 2x 세척하였다. 추가적인 다운스트림 프로세싱이 임의의 다른 예시적인 화합물과 다르지 않았다.
40% 수성 메틸아민 처리(90분, 실온)로 CPG에서 단일 가닥을 절단하였다. 염화나트륨 구배를 사용하는 AKTA 순수 HPLC 시스템 상에서 상기 생성된 미가공 올리고뉴클레오티드를 이온 교환 크로마토그래피(자원 Q, 6ml, GE Healthcare)로 정제하였다. 분획을 함유한 생성물을 모으고, 크기 배제 컬럼(Zetadex, EMP Biotech) 상에서 탈염하고 추후 사용 때까지 동결건조하였다.
모든 최종 단일-가닥 생성물을 AEX-HPLC로 분석하여 그것의 순도를 입증하였다. 각각의 단일-가닥 생성물의 동일성을 LC-MS 분석으로 입증하였다.
실시예 4 - 이중-가닥 형성
H2O 중 60 OD/ml의 농도에 개별 단일 가닥을 용해시켰다. 반응 용기에 두 가지 개별 올리고뉴클레오티드 용액을 함께 첨가하였다. 좀 더 용이하게 반응을 모니터링하기 위해, 적정을 수행하였다. 260nm에서 UV-흡수에 의해 측정된 바에 따르면 제1 가닥이 제2 가닥보다 25% 과하게 첨가되었다. 상기 반응 혼합물을 5분 동안 80℃로 가열하고, 그 다음 천천히 실온까지 냉각시켰다. 이온 쌍형성 역상 HPLC에 의해 이중-가닥 형성을 모니터링하였다. 잔여 단일 가닥의 UV-영역에서, 제2 가닥의 필요량을 계산하여 반응 혼합물에 첨가하였다. 상기 반응을 다시 80℃로 가열하고, 천천히 실온으로 냉각시켰다. 검출된 잔여 단일 가닥이 10% 미만이 될 때까지 이와 같은 절차를 반복하였다.
실시예 5
CNNM4 siRNA의 형질감염에 의한 인간 HepG2 세포에서 인간 CNNM4 mRNA 수준의 감소.
시험관 내 테스트가 CNNM4 siRNA 분자의 형질감염에 의한 인간 HepG2 세포에서 CNNM4 mRNA 수준의 감소를 보여준다.
배양 배지에 첨가된 10nM siRNA와 0.3μl RNAiFect와 함께 96-웰 플레이트에 웰당 40,000개 세포의 밀도로 HepG2 세포를 시딩하였다. 다음날, RNA 추출을 위해 세포를 용해하고, Taqman qRT-PCR에 의해 CNNM4 및 HPRT1 mRNA 수준을 결정하였다. CNNM4 mRNA에 대해 수득된 하우스키핑 유전자 HRPT1에 대해 생성되고 1배 표적 유전자 발현에서 미처리 샘플(ut) 집합의 평균값과 관련된 값에 대해 정규화하였다. 각각의 바는 3개의 생물학적 복제물에서의 평균 +/- SD를 나타낸다. 본 연구에서 사용된 siRNA 이중체를 표 2에 나열하였다. 결과는 도 11a 및 11b에 나타내었다.
실시예 6
CNNM4 siRNA의 형질감염에 의한 쥐과 Hepa 1-6 세포에서 CNNM4 mRNA 수준의 감소.
시험관 내 테스트는 10nM의 농도의 다른 CNNM4 siRNA 분자의 형질감염에 의한 쥐과 Hepa 1-6 세포 중 CNNM4 RNA 수준의 감소를 보여준다.
배양 배지에 첨가된 10nM siRNA 및 0.6μl RNAiFect의 존재 하에 웰당 12,500개 세포의 밀도로 Hepa 1-6 세포를 96 웰 플레이트에 시딩하였다. 다음날, RNA 추출을 위해 세포를 용해하고, Taqman qRT-PCR에 의해 CNNM4 및 ApoB mRNA 수준을 결정하였다. CNNM4 mRNA에 대해 수득된 값을 하우스키핑 유전자 ApoB에 대해 생성되고 1배 표적 유전자 발현에서 미처리 샘플(ut) 집합의 평균과 관련된 값에 대해 정규화하였다. 각각의 바는 3개의 생물학적 복제물에서의 평균 +/- SD를 나타낸다. 본 연구에 사용된 siRNA 이중체가 표 2에 나열되었다. 결과는 도 12a 및 12b에 도시되었다.
실시예 7
CNNM4 siRNA의 형질감염에 의한 쥐과 Hepa 1-6 세포에서의 CNNM4 mRNA 수준의 용량-의존적 감소.
시험관 내 테스트는 4nM 내지 0.0001nM의 용량 범위에서 상이한 CNNM4 siRNA 분자의 형질감염에 의한 쥐과 Hepa 1-6 세포에서의 CNNM4 siRNA mRNA 수준의 감소를 보여준다.
배양 배지에 첨가된 4nM, 0.8nM, 0.16nM, 0.032nM, 0.006nM, 0.001nM, 0.0003nM 또는 0.0001nM siRNA 및 0.6μl RNAiFect의 존재 하에 웰당 12,500개 세포의 밀도로 96 웰 플레이트에 Hepa 1-6 세포를 시딩하였다. 다음날, RNA 추출을 위해 세포를 용해하고, Taqman qRT-PCR에 의해 CNNM4 및 ApoB mRNA 수준을 결정하였다. CNNM4 mRNA에 대해 수득된 값을 하우스키핑 유전자 ApoB에 대해 생성되고 1배 표적 유전자 발현에서 미처리 샘플(ut) 집합의 평균과 관련된 값에 대해 정규화하였다. 각각의 바는 3개의 생물학적 복제물의 평균 +/- SD를 나타낸다. 본 연구에 사용된 siRNA 이중체가 표 2에 나타나 있다. 결과는 도 13a 내지 13d에 도시되었다.
실시예 8
CNNM4 siRNA 콘주게이트의 수용체 매개 흡수에 의한 일차 인간 간세포에서 인간 CNNM4 유전자 발현의 억제.
본 실시예는 일차 인간 간세포에서 EU401 내지 EU414에 의한 인간 CNNM4 mRNA 수준의 용량-의존적 감소를 보여준다.
일차 인간 간세포(Life Technologies)를 플레이팅 배지에 웰당 35000개 세포의 밀도로 96 웰 플레이트에 시딩하고, 도 14에 나타낸 바와 같이 100nM, 10nM 및 1nM의 농도로 CNNM4 siRNA 콘주게이트 EU401 내지 EU414와 배양하거나 또는 100nM (Ctr는 EU400임)의 비-표적 대조군 콘주게이트(Ctr)와 배양하였다. 다음날, RNA 추출을 위해 세포를 용해하고, Taqman qRT-PCR에 의해 CNNM4 및 HPRT1 mRNA 수준을 결정하였다. CNNM4 mRNA에 대해 수득된 값을 하우스키핑 유전자 HRPT1에 대해 생성되고 1배 표적 유전자 발현에서 미처리 샘플(ut) 집합의 평균에 관련된 값에 대해 정규화하였다. 각각의 바는 3개의 생물학적 복제물의 평균 +/- SD를 나타낸다. 본 연구에서 사용된 siRNA 콘주게이트가 표 2에 나열되었다. 결과는 도 14에 도시되었다.
실시예 9
CNNM4 siRNA 콘주게이트의 수용체 매개 흡수에 의한 일차 마우스 간세포에서 마우스 CNNM4 유전자 발현의 억제.
본 실시예는 일차 마우스 간세포에서 EU401 내지 EU408에 의한 그리고 EU410 내지 EU414에 의한 마우스 CNNM4 mRNA 수준의 용량-의존적 감소를 보여준다.
일차 마우스 간세포를 플레이팅 배지에서 웰당 25000개 세포의 밀도로 96 웰 플레이트에 시딩하고, 도 15에서 나타낸 바와 같이 100nM, 10nM 및 1nM의 농도로 CNNM4 siRNA 콘주게이트 EU401 내지 408 및 EU410 내지 EU414와 함께 배양하거나 또는 100nM의 비-표적 대조군 콘주게이트(Ctr)와 함께 배양하였다(Ctr는 EU400임). 다음날, RNA 추출을 위해 세포를 용해하고, Taqman qRT-PCR에 의해 CNNM4 및 ApoB mRNA 수준을 결정하였다. CNNM4 mRNA에 대해 수득된 값을 하우스키핑 유전자 ApoB에 대해 생성되고 1배 표적 유전자 발현에서 미처리 샘플(ut) 집합의 평균에 관련된 값에 대해 정규화하였다. 각각의 바는 3개의 생물학적 복제물의 평균 +/- SD를 나타낸다. 본 연구에서 사용된 siRNA 콘주게이트가 표 2에 나열되었다. 결과는 도 15에 도시되었다
실시예 10
CNNM4 siRNA 콘주게이트의 수용체 매개 흡수에 의한 일차 인간 간세포에서 인간 CNNM4 유전자 발현의 억제.
본 실시예는 일차 인간 간세포에서 EU415 내지 EU422에 의한 인간 CNNM4 mRNA 수준의 용량-의존적 감소를 보여준다.
일차 인간 간세포(Life Technologies)를 플레이팅 배지에서 웰당 35000개 세포의 밀도로 96-웰 플레이트에 시딩하고, 도 16에서 나타낸 바와 같이 100nM, 10nM 및 1nM의 농도로 CNNM4 siRNA 콘주게이트 EU415 내지 EU422와 함께 배양하거나, 또는 100nM의 비-표적 대조군 콘주게이트(Ctr)와 함께 배양하였다(Ctr는 EU423임). 다음날, RNA 추출을 위해 세포를 용해하고, Taqman qRT-PCR에 의해 CNNM4 및 HPRT1 mRNA 수준을 결정하였다. CNNM4 mRNA에 대해 수득된 값을 하우스키핑 유전자 HRPT1에 대해 생성되고 1배 표적 유전자 발현에서 미처리 샘플(ut) 집합의 평균과 관련된 값에 대해 정규화하였다. 각각의 바는 3개의 생물학적 복제물의 평균 +/- SD를 나타낸다. 본 연구에서 사용된 siRNA 콘주게이트가 표 2에 나열되었다. 결과는 도 16에 도시되었다.
실시예 11
CNNM4 siRNA 콘주게이트의 수용체 매개 흡수에 의한 일차 쥐과 간세포에서 CNNM4 유전자 발현의 억제.
본 실시예는 일차 마우스 간세포에서 EU415 내지 EU424에 의한 마우스 CNNM4 mRNA 수준의 용량-의존적 감소를 보여준다.
일차 마우스 간세포를 플레이팅 배지에서 웰당 25000개 세포의 밀도로 96-웰 플레이트에 시딩하고, 도 17에서 나타낸 바와 같이 100nM, 10nM 및 1nM의 농도로 CNNM4 siRNA 콘주게이트 EU415 내지 EU422와 함께 배양하거나, 또는 100nM의 비표적 대조군 콘주게이트(Ctr)와 함께 배양하였다(Ctr는 EU423임). 다음날, RNA 추출을 위해 세포를 용해하고, Taqman qRT-PCR에 의해 CNNM4 및 ApoB mRNA 수준을 결정하였다. CNNM4 mRNA에 대해 수득된 값을 하우스키핑 유전자 ApoB에 대해 생성되고, 1배 표적 유전자 발현에서 미처리 샘플(ut) 집합의 평균과 관련된 값에 대해 정규화하였다. 각각의 바는 3개의 생물학적 복제물의 평균 +/- SD를 나타낸다. 본 연구에서 사용된 siRNA 콘주게이트가 표 2에 나열되어 있다. 결과는 도 17에 도시되었다.
실시예 12
CNNM4 siRNA 콘주게이트에 의한 간에서 CNNM4 표적 유전자 발현의 용량-의존적 억제.
본 실시예는 피하 주사로 EU403, EU404, EU408, EU412 및 EU114의 단일 투약 후 2주가 지나서 야생형 마우스의 간에서의 CNNM4 mRNA 수준의 감소를 보여준다.
5- 내지 7-주령 수컷 C57BL/6 마우스를 피하 주사로 체중(kg)당 1 또는 5mg siRNA 콘주게이트의 단일 용량으로 처리하였다. 대조군에는 비히클 PBS를 함유한 피하 주사를 투여하였다. 처리 후 2주가 지나서, 모든 마우스에서 간 샘플을 수집하고, 급속 냉동시켰다. 간 샘플에서 RNA를 추출하여, Taqman qRT-PCR로 CNNM4 및 액틴 mRNA 수준을 결정하였다. CNNM4 mRNA에 대해 수득된 값을 하우스키핑 유전자 액틴에 대해 생성되고 1배 표적 유전자 발현에서 미처리 샘플(ut) 집합의 평균과 관련된 값에 대해 정규화하였다. 각각의 바는 6마리 동물의 평균 값 +/-SD를 나타낸다.
본 연구에서 사용된 siRNA 콘주게이트가 표 2에 나열되어 있다.siRNA 콘주게이트로 처리 후 마우스 간에서의 CNNM4 mRNA의 감소가 도 18에 도시되었다.
실시예 13
CNNM4 siRNA 콘주게이트에 의한 간에서 CNNM4 표적 유전자 발현의 용량-의존적 억제.
본 실시예는 피하 주사로 EU418, EU420 및 EU422의 단일 투약 후 2주가 지나서, 야생형 마우스의 간에서의 CNNM4 mRNA 수준의 감소를 보여준다.
5 내지 7-주령 수컷 C57BL/6 마우스를 피하 주사로 체중(kg)당 siRNA 콘주게이트 0.3 또는 1mg의 단일 용량으로 처리하였다. 대조군에는 비히클 PBS가 함유된 피하 주사를 투여하였다. 치료 후 2주가 지나서, 모든 마우스에서 간 샘플을 수집하고, 급속 냉동시켰다. 간 샘플에서 RNA를 추출하고, Taqman qRT-PCR로 CNNM4 및 액틴 mRNA 수준을 결정하였다. CNNM4 mRNA에 대해 수득된 값을 하우스키핑 유전자 액틴에 대해 생성되고 1배 표적 유전자 발현에서 미처리 샘플(ut) 집합의 평균과 관련된 값에 대해 정규화하였다. 각각의 바는 6마리 동물의 평균 값 +/-SD를 나타낸다.
본 연구에서 사용된 siRNA 콘주게이트가 표 2에 나열되었다. siRNA 콘주게이트로 처리 후 마우스의 간에서 CNNM4 mRNA의 감소가 도 19에 도시되었다.
실시예 14
CNNM4 siRNA 콘주게이트에 의한 간에서 CNNM4 표적 유전자 발현의 오래 지속되는 억제.
본 실시예는 피하 주사로 EU418, EU420 및 EU422의 단일 투약 후 5주가 지나서, 야생형 마우스의 간에서 CNNM4 mRNA 수준의 감소를 보여준다.
5- 내지 7-주령 수컷 C57BL/6 마우스를 피하 주사로 체중(kg)당 siRNA 콘주게이트 1mg의 단일 용량으로 처리하였다. 대조군에 비히클 PBS가 함유된 피하 주사를 투여하였다. 처리 후 5주가 지나서, 모든 마우스에서 간 샘플을 수집하여 급속 냉동시켰다. 간 샘플에서 RNA를 추출하고 Taqman qRT-PCR에 의해 CNNM4 및 액틴 mRNA 수준을 결정하였다. CNNM4 mRNA에 대해 수득된 값을 하우스키핑 유전자 액틴에 대해 생성되고 1배 표적 유전자 발현에서 PBS 처리 코호트(PBS) 집합의 평균과 관련된 값에 대해 정규화하였다. 각각의 바는 6마리 동물의 평균 값 +/-SD를 나타낸다.
본 연구에서 사용된 siRNA 콘주게이트가 표 2에 나열되었다. siRNA 콘주게이트로 처리 후 마우스의 간에서 CNNM4 mRNA의 감소가 도 20에 도시되었다.
실시예 15
CNNM4 siRNA 콘주게이트로 처리된 설치류 NASH 모델에서 CNNM4 발현의 억제.
본 실시예는 CNNM4 siRNA 콘주게이트로의 처리 후 NASH가 있는 마우스에서의 CNNM4 mRNA 수준의 감소를 보여준다. 6주 동안 마우스에 콜린이 결여된 식단과 0.1% 메티오닌을 제공하여 NASH 표현형을 유도하였다.
6주 동안, 3-월령 수컷 C57BL/6 마우스에 0.1% 메티오닌 함유 콜린 결핍 식단(0.1%MCDD)(A02082006i, Research Diets, Inc., New Jersey, USA)을 유지시켰다. 3주 동안 0.1% MCDD를 제공한 후, 마우스에 CNNM4 siRNA 콘주게이트(EU414)를 체중(kg)당 1mg 또는 5mg siRNA로 처리하였다. 대조군에 비-표적 siRNA 콘주게이트(EU400) 1mg/kg을 투여하였다. 이어서, 또 다른 3주 동안 마우스에 0.1% MCDD를 유지시키고, 후속적으로 모든 마우스에서 간 샘플을 수집하여 급속 냉동시켰다. 간 샘플에서 RNA를 추출하고 Taqman qRT-PCR에 의해 CNNM4 및 액틴 mRNA 수준을 결정하였다. CNNM4 mRNA에 대해 수득된 값을 하우스키핑 유전자 액틴에 대해 생성되고 1-배 표적 유전자 발현에서 EU400 처리 코호트 집합의 평균과 관련된 값에 대해 정규화하였다. 각각의 바는 동물 6~8마리의 평균 값 +/-SD를 나타낸다.
본 연구에서 사용된 siRNA 콘주게이트가 표 2에 나열되었다. CNNM4 siRNA 콘주게이트로 처리 후 3주가 지나서 쥐과 NASH 모델의 간에서의 CNNM4 mRNA의 감소가 도 21에 도시되었다.
실시예 16
CNNM4 siRNA 콘주게이트로의 처리가 간세포에서의 지질 축적을 감소시킨다.
본 실시예는 간세포의 지질 축적이 올레산 보충에 의해 또는 메티오닌 및 콜린-결핍배지에서 상기 세포를 배양함으로써 유도됨을 보여준다. 지질 축적은 CNNM4 siRNA 콘주게이트로의 처리에 의해 약화된다.
새롭게 단리된 쥐과 간세포를 다중-웰 플레이트에서 코팅된 커버 슬라이드 상에 시딩하였다. 세포가 부착되면, 6시간 동안 10 또는 100nM의 EU403, EU404, EU408, EU412 또는 EU414와 함께 배양하였다. 다음날, 미처리된 세포(ut)를 또 다른 24시간 동안 대조군 배지(MEM/Gibco)에 유지시켰다. 처리된 세포를 24시간 동안400μM 올레산(Sigma)의 존재 하에 배양하거나 또는 메티오닌- 및 콜린- 결핍 DMEM/F12 배지(맞춤형, Gibco)와 함께 배양하였다. 이어서, 세포를 4% 파라포름알데하이드 용액에 고정하였다. 붕소-디피로메텐(BODIPY 493/503, Molecular Probes, Thermo Fisher Scientific)을 사용하여 지질체의 염색에 의해, 간세포에서 지질 축적을 판단하였다. 형광 현미경검사로 영상을 획득하고, ImageJ 소프트웨어로 BODIPY 염색을 정량화하였다.
두 가지 독립적 실험을 각각 4중으로 수행하였다. 값을 1-배에서 미처리 샘플 집합의 평균 값에 대해 정규화하였다. 각각의 바는 평균 +/-SD를 나타낸다. 본 연구에서 사용된 siRNA 콘주게이트가 표 2에 나열되었다. 메티오닌- 및 콜린-결핍 배지에서 CNNM4 siRNA 처리가 지질 축적에 미치는 효과가 도 22a에 도시되었다. 올레산에 의해 유도된 CNNM4 siRNA 처리가 지질 축적에 미치는 효과가 도 22b에 도시되었다. 통계: 로그 변환 값에서 각각의 올레산 및 MCD 대조군에 대한 던넷 사후 테스트와 관련한 양방향 ANOVA. * p≤ 0.05; **p ≤ 0.01; ***p ≤ 001; ****p ≤ 0.0001. 유의미한 실험간 차이는 없다.
실시예 17
CNNM4 siRNA 콘주게이트로의 처리가 간세포에서 미토콘드리아 반응성 산소 종(ROS) 생산을 감소시킨다.
본 실시예는 올레산 보충에 의해 또는 메티오닌- 및 콜린-결핍 배지에서 세포의 배양에 의해 유도된 미토콘드리아 ROS가 CNNM4 siRNA 분자로의 처리에 의해 감소됨을 보여준다.
새롭게 제조된 쥐과 간세포를 다중-웰 플레이트에 시딩하였다. 세포가 부착되면, 6시간 동안 1nM, 10 또는 100nM의 EU404 또는 EU414와 함께 세포를 배양하였다. 다음날, 미처리된 세포(ut)를 또 다른 24시간 동안 대조군 배지(MEM/Gibco)에 유지시켰다. 상기 처리된 세포를 24시간 동안 400μM 올레산(Sigma)의 존재 하에 또는 메티오닌- 및 콜린-결핍 DMEM/F12 배지(맞춤형, Gibco BRL)와 함께 배양하였다. MitoSOX 레드 미토콘드리아 초과산화물 지표(Invitrogen, USA)를 사용하여, 간세포에서의 미토콘드리아 ROS 생산을 평가하였다. 37℃의 CO2 인큐베이터에서 10분 동안 상기 세포에 2μM MitoSOX 레드를 로딩하였다. 이어서, 상기 세포를 PBS로 3회 세척하였다. 플레이트 판독기 SpectraMax M2 (bioNova, USA)를 사용하여 510nm (여기) 및 595(방출)에서 형광을 측정하였다.
두 가지 독립적 실험을 각각 4중으로 수행하였다. 값을 1-배에서 미처리 샘플 집합의 평균값에 대해 정규화하였다. 각각의 바는 평균 +/-SD를 나타낸다. 본 연구에서 사용된 siRNA 콘주게이트가 표 2에 나열되었다. 메티오닌- 및 콜린-결핍된 배지에서 CNNM4 siRNA 처리가 미토콘드리아 ROS 생산에 미치는 효과가 도 23a에 도시되었다. 올레산에 의해 유도된 CNNM4 siRNA가 ROS 생산에 미치는 효과가 도 23b에 도시되었다. 통계: 로그 변환 값에서 각각의 올레산 및 MCD 대조군에 대한 던넷 사후 테스트와 관련한 양방향 ANOVA. * p ≤ 0.05; **p ≤ 0.01; ***p ≤ 001; ***p ≤ 0.0001; #는 유의미한 실험간 차이를 나타낸다(p≤0.0001).
실시예 18
CNNM4 siRNA 콘주게이트로 설치류 NASH 모델의 처리가 NASH의 발병을 감소시킨다.
본 실시예는 설치류 NASH 모델에서 CNNM4 siRNA 콘주게이트로의 처리가 지질 축적, 반응성 산소 종(ROS) 및 섬유증을 감소시킴을 보여준다. 상기 NASH 표현형은 6주 동안 마우스에 콜린 결여 식단과 0.1% 메티오닌을 제공함으로써 유도하였다.
6주 동안 3-월령 수컷 C57BL/6 마우스에 0.1% 메티오닌(0.1%MCDD)을 함유한 콜린 결핍 식단(A02082006i, Research Diets, Inc., New Jersey, USA)을 지속적으로 제공하거나 또는 표준 차우(SC; standard chow)를 제공하였다. 3주 동안 0.1% MCDD를 제공한 후, 마우스를 체중당 1mg 또는 5mg의 CNNM4 siRNA 콘주게이트(EU414)로 처리하였다. 0.1% MCD가 제공된 대조군에는 1mg/kg의 비-표적 siRNA 콘주게이트(EU400)를 투여하였다. 정상적인 먹이(SC)를 제공한 대조군 마우스에는 동일한 시점(3주)에 비히클 PBS를 투여하였다. 후속적으로 도 24에 표시된 바와 같이 마우스를 0.1% MCDD 또는 표준 차우(SC)로 유지시켰다. 연구 종료 시, 모든 마우스에서 간 샘플을 수집하여 광 간섭 단층촬영 냉동화합물(cryocompound)(OCT)에 포매함으로써 동결보존하거나 또는 절편을 위한 준비로 포르말린으로 고정하고 파라핀에 포매하였다. 각각 수단 레드 및 디하이드록시에티듐(DHE)으로 염색하여 동결절편에서 지질체 및 반응성 산소 종(ROS)을 검출하였다. 면역조직화학에 의한 평활근 세포 마커 알파 평활근 액틴(αSMA)의 염색으로, 또한 사이리우스 레드 염색에 의한 콜라겐 섬유의 검출에 의해 파라핀 절편에서 간 섬유증을 평가하였다. 면역조직화학에 의해, 파라핀-포매된 간 절편의 F4/80 염색에 의해 대식세포를 검출하였다. 6주 시점에 혈청 준비를 위해 모든 동물에서 혈액 샘플을 수집하였다. 이어서, QuantiCromTM 마그네슘 검정 키트(BioAssay Systems, USA)를 사용하여 혈청 Mg2+　수준을 측정하였다.
본 연구에서 사용된 siRNA 콘주게이트가 표 2에 나열되었다. 0.1% MCDD NASH 모델에서 CNNM4 siRNA 처리에 의한 간 지방증의 감소가 도 24a에 도시되었다. 도 24b는 CNNM4 siRNA 처리에 의한 반응성 산소 종의 감소를 보여준다. 도 24c는 CNNM4 siRNA 처리에 의한 간에서 대식세포 침윤(F4/80 양성 세포)의 감소를 보여준다. 도 24d 및 24e는 동일한 NASH 모델에서 CNNM4 siRNA 처리에 의한 간 섬유증의 감소를 보여준다. 이들 도면은 5-95% 백분위수를 가진 박스 및 위스커 플롯에서 FIJI(https://imagej.net/Fiji.)를 사용하여 계산된 각각의 개별 염색에서의 염색된 면적 비율의 정량화를 보여준다. n=5-7.(a.u. = 임의의 단위). 도 24f는 EU414로의 처리에 의해 0.1%MCDD NASH 모델에서 혈청 Mg2 +　수준의 감소를 보여준다.
실시예 19
CNNM4 siRNA 콘주게이트는 아세트아미노펜(APAP)에 의해 유도되는 세포자멸사 및 세포 사멸에서 간세포를 보호한다.
본 실시예는 일차 간세포에서 CNNM4 mRNA 수준의 억제가 아세트아미노펜 재투여 실험(challenge)에 의해 유도된 세포 사멸에서 이들 세포를 보호함을 보여준다.
새롭게 제조된 쥐과 간세포를 다중-웰 플레이트에 시딩하였다. 세포가 부착되면, 6시간 동안 1nM 및 10nM의 EU404 또는 EU414와 함께 세포를 배양하거나 또는 처리하지 않고 방치하였다. 그 후에, 13 내지 14시간 동안 세포를 무혈청 배양 배지(MEM)에서 배양하였다. 후속적으로, 세포를 미처리 상태(Ut)로 유지하거나 또는 10mM 아세트아미노펜을 상기 배지(APAP)에 첨가하였다. 6시간 후, Tunel 검정 또는 트립판 블루 염색으로 세포를 염색하여 괴사성(Tunel 양성) 또는 세포 사멸(트립판 블루 양성)을 겪은 세포의 비율을 계산하였다.
본 연구에서 사용된 siRNA 콘주게이트가 표 2에 나열되었다. EU414 및 EU404에 의한 CNNM4 발현의 감소가 도 25a에 도시되었다. 아세트아미노펜에 노출 후 CNNM4 siRNA 처리에 의한 Tunel 양성 세포(괴사 마커) 및 트립판 블루 양성 세포(세포 사멸 마커)의 감소가 각각 도 25a 및 25b에 도시되었다.
실시예 20
CNNM4 siRNA의 형질감염에 의한 인간 Huh-7 세포에서 CNNM4 mRNA 수준의 억제.
시험관 내 테스트는 CNNM4 siRNA 분자의 형질감염에 의한 인간 Huh-7 세포에서의 CNNM4 mRNA 수준의 감소를 보여준다.
Huh7 세포를 웰당 20000개 세포의 밀도로 96 웰 플레이트에 시딩하고, 1μl/ml 배양 배지의 최종 농도에서 0.5nM siRNA 및 RNAiMAX로 형질감염시켰다. 다음날, RNA 추출을 위해 세포를 용해시켰고, Taqman qRT-PCR에 의해 CNNM4 및 HPRT1 mRNA 수준을 결정하였다. CNNM4 mRNA에 대해 수득된 값을 하우스키핑 유전자 HRPT1에 대해 생성되고 1배 표적 유전자 발현에서 미처리 샘플(ut) 집합의 평균과 관련된 값에 대해 정규화하였다. 각각의 바는 3개의 생물학적 복제물의 평균 +/- SD를 나타낸다. 본 연구에서 사용된 siRNA 이중체가 표 2에 나열되었다. 결과는 도 26에 도시되었다.
실시예 21
CNNM4 siRNA의 형질감염에 의한 인간 Huh-7 세포에서 CNNM4 mRNA 수준의 용량-의존적 감소.
시험관 내 테스트가 10nM 내지 0.01nM의 용량 범위에서 다른 CNNM4 siRNA 분자의 형질감염에 의한 인간 Huh-7 세포에서의 CNNM4 RNA 수준의 감소를 보여준다.
Huh-7 세포를 웰당 20000개 세포의 밀도로 96 웰 플레이트에 시딩하고, 1μl/ml 배양 배지의 최종 농도에서 10nM, 1nM, 0.1nM, 0.01nM의 siRNA 및 RNAiMAX로 형질감염시켰다. 다음날 RNA 추출을 위해 세포를 용해시키고, Taqman qRT-PCR에 의해 CNNM4 및 HPRT1 mRNA 수준을 결정하였다. CNNM4 mRNA에 대해 수득된 값을 하우스키핑 유전자 HPRT1에 대해 생성되고 1배 표적 유전자 발현에서 미처리 샘플(ut) 집합의 평균과 관련된 값에 대해 정규화하였다. 각각의 바는 3개의 생물학적 복제물의 평균 +/- SD을 나타낸다. 본 연구에서 사용된 siRNA 이중체가 표 2에 나열되었다. 결과는 도 27a 및 b에 도시되었다.
실시예 22
수용체 매개 흡수에 의한 일차 인간 간세포에서 CNNM4 유전자 발현의 억제.
본 실시예는 수용체 매개 흡수에 의해 일차 인간 간세포에서 EU424 내지 EU433에 의한 인간 CNNM4 mRNA 수준의 용량-의존적 감소를 보여준다.
일차 인간 간세포(Life Technologies)를 플레이팅 배지에서 웰당 35000개 세포의 밀도로 96 웰 플레이트에 시딩하고, 후속적으로 도 28에서 나타낸 바와 같이, 100nM, 10nM, 1nM, 0.1nM 또는 0.01nM의 농도로 CNNM4 siRNA 콘주게이트 EU424 내지 EU433과 함께 또는 비-표적 대조군 siRNA, EU423(Ctr로 표시됨)과 함께 배양하였다. CNNM4 mRNA에 대해 수득된 값을 하우스키핑 유전자 HPRT1에 대해 생성되고 1배 표적 유전자 발현에서 미처리 샘플(ut) 집합의 평균과 관련된 값에 대해 정규화하였다. 각각의 바는 3개의 생물학적 복제물의 평균 +/- SD를 나타낸다. 본 연구에서 사용된 SiRNA 콘주게이트가 표 2에 나열되었다. EU424 내지 EU433의 결과가 도 28에 도시되었다.
실시예 23
수용체 매개 흡수에 의한 일차 사이노몰구스 간세포에서 CNNM4 유전자 발현의 억제.
본 실시예는 수용체 매개 흡수에 의해 일차 사이노몰구스 간세포에서 EU429 내지 EU433에 의한 CNNM4 mRNA 수준의 용량-의존적 감소를 나타낸다.
일차 간세포를 플레이팅 배지에서 웰당 45000개 세포의 밀도로 96 웰 플레이트에 시딩하고, 후속적으로 도 29에서 나타낸 바와 같이 100nM, 10nM, 1nM, 0.1 또는 0.01nM의 농도로 CNNM4 siRNA 콘주게이트 EU429 내지 EU433과 함께 또는 100nM의 비-표적 대조군 siRNA, EU423(Ctr로 표시됨)과 함께 배양하였다. CNNM4 mRNA에 대해 수득된 값을 하우스키핑 유전자 PPIB에 대해 생성되고 1배 표적 유전자 발현에서 미처리 샘플(ut) 집합의 평균과 관련된 값에 대해 정규화하였다. 각각의 바는 3개의 생물학적 복제물의 평균 +/- SD를 나타낸다. 본 연구에서 사용된 siRNA 콘주게이트가 표 2에 나열되었다. EU429 내지 433의 결과가 도 29에 도시되었다.
실시예 24
NASH에 대한 설치류 모델에서의 CNNM4 유전자 발현의 억제.
본 실시예는 NASH에 대한 쥐과 모델에서 EU422에 의한 CNNM4 mRNA 수준의 용량 의존적 감소를 보여준다.
5-주령 C57BL/6 수컷 마우스에 약 32주 동안 DIO-NASH 식단을 제공하고, 사전 간 생검 섬유증 및 지방증 점수에 기초하여 무작위로 마우스를 선정하였다. 섬유증 점수가 ≥1이고 지방증 점수가 ≥ 2인 동물만 본 연구에 포함시켰다. 이어서, 또 다른 16주 동안 동물에 DIO-NASH 식단을 계속 제공하였다. 사전 간 생검 후 4주, 8주 및 12주 시점에, 마우스를 EU422 각각 1 mg/kg 또는 5 mg/kg로 처리하거나 또는 피하 주사로 비히클 PBS를 투여하였다. 최종 처리 후 4주가 지나서, 모든 마우스에서 간 샘플을 수집하여 급속 냉동시켰다. 간 샘플에서 RNA를 추출하고 Taqman qRT-PCR에 의해 CNNM4 및 HPRT mRNA 수준을 결정하였다. CNNM4 mRNA에 대해 수득된 값을 하우스키핑 유전자 HPRT에 대해 생성되고 1배 표적 유전자 발현에서 미처리 샘플(ut) 집합의 평균과 관련된 값에 대해 정규화하였다. 각각의 바는 동물 15마리의 평균 값 +/-SD를 나타낸다.
본 연구에서 사용된 siRNA 콘주게이트가 표 2에 나열되었다. siRNA 콘주게이트로 처리 후 마우스 간에서 CNNM4 mRNA의 감소가 도 30에 도시되었다.
요약 표
요약 이중체 표 - 표 2
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요약 약어 표 - 표 3
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본 명세서에서는 상기 약어표에 기재된 약어를 사용할 수 있다. 약어 목록은 철저하지 않을 수 있으며 추가 약어와 그 의미는 이 문서 전체에서 찾을 수 있다.
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SEQUENCE LISTING <110> Silence Therapeutics GmbH ASOCIACION CENTRO DE INVESTIGACION COOPERATIVA EN BIOCIENCIAS-CIC bioGUNE <120> Nucleic acids for inhibiting expression of CNNM4 in a cell <130> 007919186 <150> EP20382449.5 <151> 2020-05-27 <150> EP20382947.8 <151> 2020-10-30 <160> 554 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA strand - sequence modified as per summary sequence table at the end of the description <400> 1 ucgaaguauu ccgcguacg 19 <210> 2 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA strand - sequence modified as per summary sequence table at the end of the description <400> 2 cguacgcgga auacuucga 19 <210> 3 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA strand - sequence modified as per summary sequence table at the end of the description <400> 3 ccuaggauca cgcucugcu 19 <210> 4 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA strand - sequence modified as per summary 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Artificial Sequence <220> <223> siRNA strand <400> 253 guaaacagug cgaaucucc 19 <210> 254 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA strand <400> 254 ggagauucgc acuguuuac 19 <210> 255 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA strand <400> 255 guuguaaaca gugcgaauc 19 <210> 256 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA strand <400> 256 gauucgcacu guuuacaac 19 <210> 257 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA strand <400> 257 cauuauaggg cucugucac 19 <210> 258 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA strand <400> 258 gugacagagc ccuauaaug 19 <210> 259 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA strand <400> 259 gucauuauag ggcuccguc 19 <210> 260 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA strand <400> 260 gacggagccc uauaaugac 19 <210> 261 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA strand <400> 261 gaucauauug agcuccucu 19 <210> 262 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cguacgcgga auacuucga 19 <210> 465 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA strand - sequence modified as per summary sequence table at the end of the description <400> 465 uccuuguccg uccacuuca 19 <210> 466 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA strand - sequence modified as per summary sequence table at the end of the description <400> 466 ugaaguggac ggacaagga 19 <210> 467 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA strand - sequence modified as per summary sequence table at the end of the description <400> 467 caaucuugcg ggcauagcg 19 <210> 468 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA strand - sequence modified as per summary sequence table at the end of the description <400> 468 cgcuaugccc gcaagauug 19 <210> 469 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA strand - sequence modified as per summary sequence table at the end of the description <400> 469 uaaacagugc gaaucuccu 19 <210> 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cagccgccgu auuuauuuu 19 <210> 501 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA strand - sequence modified as per summary sequence table at the end of the description <400> 501 augcaaaaua aauacggcg 19 <210> 502 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA strand - sequence modified as per summary sequence table at the end of the description <400> 502 cgccguauuu auuuugcau 19 <210> 503 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA strand - sequence modified as per summary sequence table at the end of the description <400> 503 agucaaacuc auaacgcca 19 <210> 504 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA strand - sequence modified as per summary sequence table at the end of the description <400> 504 uggcguuaug aguuugacu 19 <210> 505 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA strand - sequence modified as per summary sequence table at the end of the description <400> 505 cauaacaaca aaacucccc 19 <210> 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cuugcugaag uuaguagua 19 <210> 536 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA strand <400> 536 aguacuacua acuucagca 19 <210> 537 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA strand <400> 537 ugcugaaguu aguaguacu 19 <210> 538 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA strand <400> 538 aacaaaaguc uggugucuu 19 <210> 539 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA strand <400> 539 aagacaccag acuuuuguu 19 <210> 540 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA strand <400> 540 aaaauaaaua cggcggcug 19 <210> 541 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA strand <400> 541 cagccgccgu auuuauuuu 19 <210> 542 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA strand <400> 542 augcaaaaua aauacggcg 19 <210> 543 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA strand <400> 543 cgccguauuu auuuugcau 19 <210> 544 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> 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Artificial Sequence <220> <223> siRNA strand - sequence modified as per summary sequence table at the end of the description <400> 553 acucuugugu cuuuuguca 19 <210> 554 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA strand - sequence modified as per summary sequence table at the end of the description <400> 554 acucuugugu cuuuuguca 19

Claims (16)

  1. CNNM4의 발현을 억제하기 위한 이중 가닥 핵산으로서,
    핵산은 제1 가닥 및 제2 가닥을 포함하고,
    제1 가닥 서열은 서열번호: 371, 243, 267, 277, 279, 287, 317, 319, 325, 333, 345, 347, 349, 361, 367, 369, 377, 401, 411, 413, 415, 420, 421, 524, 526, 528, 530, 532, 534, 536, 538, 540, 542, 544, 546, 548, 549, 550, 551 및 552로부터 선택된 서열 중 어느 하나로부터 3개 이하의 뉴클레오티드만큼 상이한 적어도 15개 뉴클레오티드의 서열을 포함하는, 이중 가닥 핵산.
  2. 약제로 사용하기 위한 CNNM4의 발현을 억제할 수 있는 이중 가닥 핵산으로서,
    핵산은 제1 가닥 및 제2 가닥을 포함하는, 핵산.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    제1 가닥 및 제2 가닥은 17-25개 길이의 뉴클레오티드의 이중체 영역을 형성하는, 핵산.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    RNA 간섭을 매개하는, 핵산.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    제1 및/또는 제2 가닥의 적어도 하나의 뉴클레오티드는 변형된 뉴클레오티드이고, 바람직하게는 변형된 뉴클레오티드는 2'-F 변형된 뉴클레오티드와 같은 비-자연 발생 뉴클레오티드인, 핵산.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    제1 가닥의 적어도 뉴클레오티드 2 및 14는 제1 변형에 의해 변형되고, 뉴클레오티드는 제1 가닥의 5' 말단에서 뉴클레오티드 번호 1로 시작하여 연속적으로 넘버링되는, 핵산.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
    제1 가닥은 그의 5' 말단에 말단 5'(E)-비닐포스포네이트 뉴클레오티드를 갖는, 핵산.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    핵산은 제1 및/또는 제2 가닥의 말단 2개 또는 3개의 3' 뉴클레오티드 및/또는 5' 뉴클레오티드 사이에 포스포로티오에이트 연결을 포함하고, 바람직하게는 나머지 뉴클레오티드 사이의 연결은 포스포디에스테르 연결인, 핵산.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    제1 가닥의 3' 말단에서 2개, 3개 또는 4개의 말단 뉴클레오티드 각각 사이에 포스포로디티오에이트 연결을 포함하고/하거나, 제2 가닥의 3' 말단에서 2개, 3개 또는 4개의 말단 뉴클레오티드 각각 사이에 포스포로디티오에이트 연결 및/또는 제2 가닥의 5' 말단에서 2개, 3개 또는 4개의 말단 뉴클레오티드 각각 사이에 포스포로디티오에이트 연결을 포함하고
    제1 가닥의 5' 말단에서 2개, 3개 또는 4개의 말단 뉴클레오티드 사이에 포스포로디티오에이트 연결 이외의 연결을 포함하는, 핵산.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
    리간드에 접합된 것인, 핵산.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 리간드는
    (i) 하나 이상의 N-아세틸 갈락토사민(GalNAc) 모이어티 또는 그의 유도체, 및
    (ii) 링커
    를 포함하고, 링커는 적어도 하나의 GalNAc 모이어티 또는 그의 유도체를 핵산에 접합하는, 핵산.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항의 핵산, 및
    용매 및/또는 전달 비히클 및/또는 생리적으로 허용가능한 부형제 및/또는 담체 및/또는 염 및/또는 희석제 및/또는 완충액 및/또는 보존제, 및/또는 올리고뉴클레오티드, 소분자, 단일클론성 항체, 다클론성 항체 및 펩티드를 포함하는 군으로부터 선택되는 추가 치료제
    를 포함하는 조성물.
  13. 약제로서 사용하기 위한, 제1항 및 제3항 내지 제11항 중 어느 한 항의 핵산 또는 제12항의 조성물.
  14. 질환, 장애 또는 증후군을 예방, 앓을 위험의 감소, 또는 치료에 사용하기 위한 제1항 및 제3항 내지 제11항 중 어느 한 항의 핵산 또는 제12항의 조성물로서,
    질환, 장애 또는 증후군은 바람직하게는 간 질환, 신장 질환 또는 폐 질환인, 핵산 또는 조성물.
  15. 질환, 장애 또는 증후군을 예방, 앓을 위험의 감소, 또는 치료에서의, 제1항 및 제3항 내지 제11항 중 어느 한 항의 핵산 또는 제12항의 조성물의 용도로서,
    질환, 장애 또는 증후군은 바람직하게는 간 질환, 신장 질환 또는 폐 질환인, 핵산 또는 조성물의 용도.
  16. 질환, 장애 또는 증후군을 예방하거나, 앓을 위험의 감소시키거나 치료하는 방법으로서,
    치료를 필요로 하는 개체에게 제1항 및 제3항 내지 제11항 중 어느 한 항의 핵산 또는 제12항의 조성물의 약제학적 유효량을 투여하는 것을 포함하고, 질환, 장애 또는 증후군은 바람직하게는 간 질환, 신장 질환 또는 폐 질환인, 방법.
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