KR20210096143A - 급성 또는 만성 간, 신장 또는 폐 질환의 진단 및/또는 치료 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 대상에서 급성 또는 만성 간, 신장 및/또는 폐 질환의 치료에 사용하기 위한 CNNM4 억제제, 및 치료적으로 효과적인 양의 CNNM4 억제제 및 약학적으로 허용 가능한 부형제 또는 담체를 포함하는 약학적 조성물에 관한 것이다. 나아가, 본 발명은 대상에서 간 질환, 신장 질환, 또는 폐 질환을 진단하는 방법, 및 세포 내에서 유발된 CNNM4-매개 질환 또는 상태를 감소시키는데 잠재적으로 유용한 화합물을 확인하는 시험관내 방법에 관한 것이다.
Description
본 발명은 급성 또는 만성 질환의 진단 및 치료 분야에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 상기 질환의 마커로서 CNNM4의 용도, 및 간, 신장 및 폐 질환 치료를 위한 CNNM4 억제제에 관한 것이다.
만성 간 질환은 상이한 병인으로부터의 간 병리들의 군을 포괄한다. 세계 인구 중 20-30%의 발병률을 가지는 비-알코올성 지방간 질환(NAFLD)은 단순 지질 축적인 지방증으로부터 염증 및 간혹 섬유화가 있는 지방증을 특징으로 하는 지방간염(NASH)까지의 간 내 다양한 장애를 포함한다. NAFLD는 다소 양성이고 가역적인 병리이나, NASH 환자의 약 20%에서 간경병증이 발생한다. 중요한 것은 간경병증은 간 기능장애를 야기하는 세포외 기질 디포지션을 특징으로 하는 비가역적 병리라는 것이다. 결국, 섬유증 환자의 대략 4분의 1에서 간세포암종(HCC)이 발생하며, 이는 가장 빈번한 형태의 간암이고 전세계적으로 발병률 및 사망률의 다섯번째 원인이다. 진단시 치료적 개입을 할 수 있는 환자는 거의 드물고, 진단 후 단지 6-20 개월 생존으로 생존률이 매우 저조하다.
다른 한편으로, 간은 급성 손상을 겪을 수 있다. 이 장기는 약물 대사 및 제거에 있어서 중심적인 역할을 하며, 약물 과다복용의 경우, 약인성 간손상(DLIL)이 발생할 수 있다. 이러한 병리는 미국 및 유럽 대부분에서 급성 간 부전 및 이식의 주요 원인이다. 매년 약 30000 명의 환자에서 아세트아미노펜(APAP)-유발 간 손상이 발생하고, 그들 중 29%가 간 이식을 받는다. 현재까지, 표준 치료법은 단지 N-아세틸시스테인을 이용하는 치료에 근거한 것뿐이나, 이는 간을 구조할 가능성이 더 낮으므로 다른 치료법들이 요구된다.
광범위한 간 병리 군 및 그 발병을 고려하면, 건강 측면에서뿐 아니라 경제적으로도 새로운 효과적인 치료의 개발이 요구된다. 이는 그의 이전 단계 동안 다소 무증상 질환이므로, 치료와 별도로, 진행을 중단시키기 위하여 가능한 한 빨리 그 질환을 발견하기 위한 진단 도구가 요구됨을 또한 언급하여야 한다.
신장 섬유증은 거의 모든 유형의 만성 간 질환에서 발생하는 세포외 기질(ECM)의 과도 축적의 결과이다. 간에서와 마찬가지로, 그 발병 과정은 투석 또는 신장 이식을 필요로 하는 치명적인 장애인 말기 신부전을 초래하는 진행적 과정이다. ECM 발전 및 축적 과정은 두 가지 변화에 의하여 야기될 수 있다. 한편으로, 몇몇 세포 경로가 질환 상태에서 ECM-생산 세포 발생을 위한 주요 경로로서 확인되었고, 다른 한편으로, EMC-분해 효소의 정확한 작용 및 메커니즘이 점점 더 복잡해지는 결함 기질 분해이다. 동물 모델에서 많은 치료적 개입이 효과적인 것으로 나타나지만, 이러한 유망한 결과를 인간 내 변형하면 비-효과적이다.
폐 섬유증은 폐 조직 손상 및 반흔을 초래하는 질환이다. 비후화 및 경직은 섬유증이 악화될수록 호흡이 짧아지는 어려움을 초래한다. 대부분의 경우, 그 병리의 원인은 알려져 있지 않으므로, 이는 보통 특발성 폐섬유증(IPF)으로 알려져 있다. 최근 몇 년 동안 항섬유증 치료법이 개발되었으나, 더 특이적인 치료의 발견으로 이어질 수 있는 주요 바이오마커의 확인에 대한 노력이 이루어지고 있다.
본 발명자들은 놀랍게도, CNNM4가 인간 샘플 및 동물 모델 모두에서 상이한 병리들 군에서 과발현됨을 발견하였다. 이러한 병리는 NASH, 간경병증 및 HCC와 같은 만성 간 질환, 또는 DILI와 같은 급성 질환을 포함한다. 신장 섬유증 마우스 모델 내 CNNM4 과발현이 또한 관찰되었다. 본 발명자들은 또한, CNNM4 억제가 상기 질환에 대한 동물 모델 내에서 바이오마커 지표 수준을 감소시킴을 발견하였다.
따라서, 제1 측면에서, 본 발명은 약제 내 사용하기 위한 CNNM4 억제제에 관한 것이다.
추가적인 측면에서, 본 발명은 대상 내에서 급성 또는 만성 질환의 치료에 사용하기 위한 CNNM4 억제제로서, 상기 질환은 간 질환, 신장 질환 및 폐 질환으로 이루어지는 군으로부터 선택되는, CNNM4 억제제에 관한 것이다.
다른 측면에서, 본 발명은 대상에서 간 질환, 신장 질환 또는 폐 질환을 진단하는 시험관내 방법에 관한 것으로, 상기 방법은:
(a) 상기 대상으로부터의 샘플 내 CNNM4 발현 수준을 측정하는 단계, 및
(b) 상기 수준을 기준값과 비교하는 단계
를 포함하고,
상기 기준값에 대한 상기 샘플 내 증가된 CNNM4 발현 수준은 그 환자가 간 질환, 신장 질환 또는 폐 질환을 겪는다는 것을 나타낸다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 대상에서 간 질환, 신장 질환 또는 폐 질환을 시험관내 진단하기 위한, CNNM4 발현 수준 측정에 특이적인 시약의 용도에 관한 것이다.
부가적인 측면에서, 본 발명은 세포 내에서 유발된 질환 또는 상태를 감소시키는 시험관내 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 상기 세포를 상기 세포 내 CNNM4 활성, 수준 또는 기능을 감소시키기에 효과적인 양의 특이적 CNNM4 억제제와 접촉시키는 단계를 포함한다.
최종적 측면에서, 본 발명은 세포 내에서 유발된 CNNM4-매개 질환 또는 상태를 감소시키는데 잠재적으로 유용한 화합물을 확인하는 시험관내 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 상기 세포를 후보 화합물과 상기 세포 내 CNNM4 활성, 수준 또는 기능을 감소시키기에 효과적인 양으로, 또는 기준값에 대하여 상대적 지질 축적을 감소시키거나 상대적 미토콘드리아 ROS를 감소시키기에 효과적인 양으로 접촉시키는 단계를 포함하고; 세포 내에서 유발된 CNNM4-매개 질환 또는 상태에서 CNNM4 활성을 억제하거나, 기준값에 대하여 상대적 지질 축적을 감소시키거나, 기준값에 대하여 상대적 미토콘드리아 ROS를 감소시키는 후보 화합물은 CNNM4-매개 간, 신장 및/또는 폐 질환을 치료 및/또는 예방하는데 잠재적으로 유용한 화합물로서 확인된다.
본 발명은 급성 또는 만성 질환의 마커로서 CNNM4의 용도, 및 간, 신장 및 폐 질환 치료를 위한 CNNM4 억제제에 관한 것이다.
도 1. DILI 및 상이한 만성 간 질환 병리로부터 인간 샘플 및 마우스 모델 내에서 IHC에 의하여 측정된 간 내 CNNM4 발현. *p<0,05 vs 건강한; **p<0,01 vs 건강한; ***p<0,001 vs 건강한.
도 2. A) 지방증 및 NASH 환자로부터의 샘플과 비교하여 건강한 대상으로부터의 인간 간 샘플 내에서 CNNM4 mRNA 수준의 qPCR에 의하여 측정된, CNNM4 발현. B) 생체내 마우스 모델 내에서 CNNM4 mRNA 수준의 qPCR에 의하여 측정된, CNNM4 발현. C) 시험관내 마우스 세포 모델 내에서 CNNM4 mRNA 수준의 qPCR에 의하여 측정된, CNNM4 발현. *p<0,05 vs 건강한.
도 3. A) siRNA CNNM4로 처리시 NASH-유도 일차 간세포 내 지질 함량이 건강한 수준으로 되돌아간다. B) ROS에 의하여 유도된 염증 또한 처리된 마우스 내에서 회복되고, C) 간세포를 siRNA 치료법으로 처리시 DILI-유도 세포사가 개선된다. *p<0.05 vs 건강한 **p<0.01 vs 건강한; ***p<0.001 vs 건강한; #p<0.05 vs NASH; ##p<0.01 vs NASH; ###p<0.001 vs DILI.
도 4. A) siRNA CNNM4로 처리시 NASH-유도 인간 세포 내 지질 함량이 건강한 수준으로 되돌아간다. B) shRNA CNNM4로 처리시 NASH-유도 인간 세포 내 지질 함량이 건강한 수준으로 되돌아간다. *p<0.05 vs 건강한 **p<0.01 vs 건강한; #p<0.05 vs NASH 대조군; ##p<0.01 vs NASH 대조군.
도 5. A) siRNA CNNM1, siRNA CNNM2, 또는 siRNA CNNM3으로 처리될 경우, NASH-유도 일차 간세포 내 지질 함량이 건강한 수준으로 되돌아가지 않는다. B) CNNM4 과발현의 경우, 마그네슘 보충은 일차 간세포 내 지질 함량을 감소시키지 않는다. C) 일차 간세포 내 siRNA CNNM4 처리는 마그네슘 결핍에 의하여 야기되는 지질 축적을 감소시킨다. ***p<0.001 vs 건강한; ##p<0.01 vs NASH 모델/Mg2+ + siRNA
없음.
도 6. siRNA CNNM4 처리 후 NAFLD 진행 관찰을 위하여 분석된 파라미터. A) 지질 함량 감소의 지표로서 수단 레드, B) 간 손상의 지표로서 혈청 내 GPT, C) ROS에 의한 염증의 지표로서 DHE, 및 D) 섬유증의 지표로서 αSMA. *p<0.05 vs siRNA
; **p<0.01 vs siRNA 
.
도 7. 7-아미노-2-페닐-5H-티에노[3,4-c]피리딘-4-온에 의한 CNNM4의 약학적 억제는 NASH-유도 간세포 내에서 siRNA CNNM4 치료법과 동일한 효과를 가진다. A) 처리된 간세포는 감소된 지질 수준 및 B) 세포내 마그네슘 수준 증가를 보인다. *p<0.05 vs 처리되지 않은; ***p<0.001 vs 처리되지 않은
도 8. 신장 섬유증의 동물 샘플 내에서 IHC에 의하여 측정된 CNNM4 발현. ***p<0.001 vs 건강한.
도 9. A) 정상 조직과 비교하여, 간세포암종(LIHC)의 TCGA(The Cancer Genome Atlas) 원발 종양 샘플 내에서 측정된 CNNM4 발현. B) 정상 조직과 비교하여, 폐 선암(LUAD)의 TCGA(The Cancer Genome Atlas) 원발 종양 샘플 내에서 측정된 CNNM4 발현.
도 2. A) 지방증 및 NASH 환자로부터의 샘플과 비교하여 건강한 대상으로부터의 인간 간 샘플 내에서 CNNM4 mRNA 수준의 qPCR에 의하여 측정된, CNNM4 발현. B) 생체내 마우스 모델 내에서 CNNM4 mRNA 수준의 qPCR에 의하여 측정된, CNNM4 발현. C) 시험관내 마우스 세포 모델 내에서 CNNM4 mRNA 수준의 qPCR에 의하여 측정된, CNNM4 발현. *p<0,05 vs 건강한.
도 3. A) siRNA CNNM4로 처리시 NASH-유도 일차 간세포 내 지질 함량이 건강한 수준으로 되돌아간다. B) ROS에 의하여 유도된 염증 또한 처리된 마우스 내에서 회복되고, C) 간세포를 siRNA 치료법으로 처리시 DILI-유도 세포사가 개선된다. *p<0.05 vs 건강한 **p<0.01 vs 건강한; ***p<0.001 vs 건강한; #p<0.05 vs NASH; ##p<0.01 vs NASH; ###p<0.001 vs DILI.
도 4. A) siRNA CNNM4로 처리시 NASH-유도 인간 세포 내 지질 함량이 건강한 수준으로 되돌아간다. B) shRNA CNNM4로 처리시 NASH-유도 인간 세포 내 지질 함량이 건강한 수준으로 되돌아간다. *p<0.05 vs 건강한 **p<0.01 vs 건강한; #p<0.05 vs NASH 대조군; ##p<0.01 vs NASH 대조군.
도 5. A) siRNA CNNM1, siRNA CNNM2, 또는 siRNA CNNM3으로 처리될 경우, NASH-유도 일차 간세포 내 지질 함량이 건강한 수준으로 되돌아가지 않는다. B) CNNM4 과발현의 경우, 마그네슘 보충은 일차 간세포 내 지질 함량을 감소시키지 않는다. C) 일차 간세포 내 siRNA CNNM4 처리는 마그네슘 결핍에 의하여 야기되는 지질 축적을 감소시킨다. ***p<0.001 vs 건강한; ##p<0.01 vs NASH 모델/Mg2+ + siRNA
도 6. siRNA CNNM4 처리 후 NAFLD 진행 관찰을 위하여 분석된 파라미터. A) 지질 함량 감소의 지표로서 수단 레드, B) 간 손상의 지표로서 혈청 내 GPT, C) ROS에 의한 염증의 지표로서 DHE, 및 D) 섬유증의 지표로서 αSMA. *p<0.05 vs siRNA
도 7. 7-아미노-2-페닐-5H-티에노[3,4-c]피리딘-4-온에 의한 CNNM4의 약학적 억제는 NASH-유도 간세포 내에서 siRNA CNNM4 치료법과 동일한 효과를 가진다. A) 처리된 간세포는 감소된 지질 수준 및 B) 세포내 마그네슘 수준 증가를 보인다. *p<0.05 vs 처리되지 않은; ***p<0.001 vs 처리되지 않은
도 8. 신장 섬유증의 동물 샘플 내에서 IHC에 의하여 측정된 CNNM4 발현. ***p<0.001 vs 건강한.
도 9. A) 정상 조직과 비교하여, 간세포암종(LIHC)의 TCGA(The Cancer Genome Atlas) 원발 종양 샘플 내에서 측정된 CNNM4 발현. B) 정상 조직과 비교하여, 폐 선암(LUAD)의 TCGA(The Cancer Genome Atlas) 원발 종양 샘플 내에서 측정된 CNNM4 발현.
전술한 바와 같이, 본 발명자들은 놀랍게도, CNNM4가 인간 샘플 및 동물 모델 모두에서 상이한 병리들의 군에서 과발현됨을 발견하였다. 이러한 병리는 NASH, 간경병증 및 HCC와 같은 만성 간 질환, 또는 DILI와 같은 급성 질환을 포함한다. 신장 섬유증 마우스 모델 내 CNNM4 과발현 또한 관찰되었다. 본 발명자들은 또한 CNNM4 억제가 상기 질환의 동물 모델 내 바이오마커 지표 수준을 감소시킴을 발견하였다.
CNNM4 억제제의 의학적 용도
따라서, 제1 측면에서, 본 발명은 약제 내 사용하기 위한 (즉, 약제로서 사용하기 위한) CNNM4 억제제에 관한 것이다.
제2 측면에서, 본 발명은 대상 내에서 급성 또는 만성 질환의 치료에 사용하기 위한 CNNM4 억제제로서, 상기 질환은 간 질환, 신장 질환 및 폐 질환으로 이루어지는 군으로부터 선택되는, CNNM4 억제제에 관한 것이다.
본원에서 용어 "CNNM4"는 "사이클린 및 CBS 도메인 2가 금속 양이온 운반 매개자" (Ancient Conserved Domain Protein, ACDP, Cyclin M 또는 CNNM으로도 알려짐)을 의미한다. CNNMs은 네 개의 유전자 CNNM1, CNNM2, CNNM3 및 CNNM4에 의하여 인코딩되는 막 단백질이며, 상기 유전자들은 뇌 내에서 주로 발현되는 CNNM1을 제외하고, 발달을 통하여 모든 성인 조직 내에서 점진적으로 발현된다. CNNMs는 상이한 장기 내에서 세포막을 통한 마그네슘 이온(Mg2+)의 운반에 있어서 주요한 역할을 한다 (Funato et al., 2014. J Clin Invest.124(12):5398-5410). CNNM4는 Ensembl 데이터베이스 (2018, 7월의 release 93에 따른) 내 ID 넘버 ENSG00000158158로 확인되는 인간 유전자에 해당된다. 상기 Ensembl 데이터베이스에 따르면, CNNM4는 적어도 4 개의 전사체 또는 스플라이스 변이체를 인코딩한다. 따라서, 본 발명은 변이 CNNM4-201 (ENST00000377075.2) 및 나머지 세 개의 변이 CNNM4-204 (ENST00000496186.5), CNNM4-203 (ENST00000493384.1) 및 CNNM4-202 (ENST00000482716.5)에 관한 것이다. CNNM4 유전자는 Q6P4Q7로서 Uniprot 데이터베이스에 의하여 확인되는 (2018, 10, 10의 버전 130에 따른) 단백질 "금속 운반자 CNNM4"를 인코딩한다.
본원에서 용어 "억제제(inhibitor)"는 NNM4 단백질 활성을 억제하는 임의의 화합물뿐 아니라, 유전자 CNNM4의 전사를 방지하여 그 유전자의 전사 산물의 형성을 피하거나, 유전자 CNNM4의 전사 산물의 분해를 촉진하거나, 또는 인코딩된 단백질의 발현을 특이적으로 감소, 방지 및/또는 차단함으로써, 유전자 발현을 특이적으로 침묵(silencing), 감소, 방지 및/또 차단할 수 있는 임의의 물질 또는 화합물로서 이해된다. 일 구현예에서, 상기 CNNM4 억제제는 유전자 CNNM4의 전사를 방지하여 그 유전자의 전사 산물의 형성을 피하거나, 유전자 CNNM4의 전사 산물의 분해를 촉진하거나, 또는 인코딩된 단백질의 발현을 특이적으로 감소, 방지 및/또는 차단함으로써, 유전자 발현을 특이적으로 침묵, 감소, 방지 및/또 차단할 수 있는 임의의 물질 또는 화합물이다.
본원에 사용되는 용어 "전사 산물" 또는 "전사체"는 유전자의 전사로부터 유도되는 RNA를 나타낸다.
단백질 또는 핵산의 발현은 그 수준이 기준값에 대하여 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 100%(즉, 부재) 감소할 때 감소되는 것으로 간주된다. 기준값은 특정 질환을 겪지 않고 일반적으로 건강한 것으로 간주되는 대상일 수 있는, 대조 대상 내 mRNA 또는 단백질 수준을 나타낸다. 대안적으로, 기준값은 억제제 투여전 대상 내 mRNA 또는 단백질 수준을 나타낼 수 있다. 본 발명의 문맥상, 기준값은 대조 대상 내 또는 억제제 투여전 대상 내 CNNM4의 단백질 또는 mRNA 수준을 나타낸다. 구현예에서, 상기 대조 대상은 간, 신장 또는 폐 질환을 겪지 않는 대상이다.
CNNM4 단백질 활성은 상기 활성이 기준값에 대하여 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 100%(즉, 부재) 감소할 때 억제되는 것으로 간주된다. 구현예에서, 상기 기준값은 특정 질환을 겪지 않고 일반적으로 건강한 것으로 간주되는 대상일 수 있는, 대조 대상으로부터의 샘플 내 CNNM4 단백질의 활성을 나타낸다. 대안적으로, 상기 기준값은 CNNM4 억제제 투여 전 대상으로부터의 샘플 내 CNNM4 단백질의 활성을 나타낸다. 본 발명의 문맥상, 상기 기준값은 대조 대상 내 또는 억제제 투여 전 대상 내 CNNM4 단백질 활성을 나타낸다. 구현예에서, 상기 대조 대상은 간, 신장 또는 폐 질환을 겪지 않는 대상이다.
본원에서 "기준값"은 샘플로부터 얻어지는 값/데이터에 대한 기준으로서 사용되는 실험실 값이다. 상기 기준값(또는 기준 수준)은 절대값, 상대값, 상한 및/또는 하한을 가지는 값, 일련의 값들, 평균값(average value), 중간값, 평균값(mean value), 또는 대조 또는 기준값을 참조로 표현되는 값일 수 있다. 기준값은, 예를 들어, 연구 샘플로부터 얻어지나 이전 시점에서 얻어진 값과 같은, 개별 샘플로부터 얻어진 값을 기준으로 할 수 있다. 상기 기준값은 샘플들의 집단 내 얻어진 값과 같이 많은 수의 샘플들을 기준으로 하거나, 또는 시험될 샘플을 포함 또는 제외한 샘플들의 풀을 기준으로 할 수 있다.
CNNM4 발현 수준을 측정하는데 적합한 방법은 종래 기술에 알려져 있으며, CNNM4 유전자 및/또는 그 단백질 발현 수준을 측정하기 위한 임의의 방법을 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 기준값은 본 발명의 억제제 부재 하에 CNNM4 유전자로부터 전사된 mRNA 수준이다.
CNNM4 유전자 발현 수준 측정에 적합한 방법은 제한없이, qPCR, RT-PCR, RNA 보호 분석, 노던 블랏(Northern blot), RNA 도트 블랏(dot blot), in situ 혼성화, 미세배열 기술, LongSAGE 및 SuperSAGE와 같은 변이체를 포함하는 유전자 발현의 연속 분석(serial analysis of gene expression, SAGE)과 같은 태그 기반 방법, 미세배열, Flow-FISH, qFiSH 및 double fusion FISH (D-FISH)와 같은 변형을 포함하는, 형광 in situ 혼성화 (FISH) 등과 같은, mRNA 발현 수준 측정을 위한 표준 분석을 포함한다.
CNNM4 단백질 발현 수준 측정에 적합한 방법은 제한없이, 예를 들어, CNNM4 단백질에 특이적으로 결합할 수 있는 항체를 이용하는 전형적인 방법에 의한 정량 후, 결과 항체-항원 복합체의 정량을 포함한다. 비-표지 항체(일차 항체) 및 표지 항체(이차 항체)를 이용하는, 본 발명에 사용될 수 있는 광범위한 잘 알려진 분석이 있으며; 이러한 기술은 무엇보다도, 웨스턴 블랏, ELISA(효소결합 면역흡착법), RIA(방사 면역 측정법), 경쟁적 EIA(경쟁적 효소 면역분석), DAS-ELISA(이중 항체 샌드위치 ELISA), 면역 세포 화학 및 면역 조직 화학 기술, 특정 항체를 포함하는 바이오칩 또는 단백질 미세배열의 사용에 근거한 기술, 또는 딥스틱과 같은 포맷의 콜로이드성 침전에 근거한 분석을 포함한다. 관심 단백질의 수준을 검출 및 정량하는 다른 방법들은 친화성 크로마토그래피 기법, 리간드 결합 분석 등을 포함한다.
바람직한 구현예에서, CNNM4 발현 억제제는 단백질, 핵산, 소분자 또는 이의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택된다. 대안적으로, CNNM4 발현 억제제는 단백질, 핵산, 또는 이의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택된다. 바람직하게, CNNM4 발현 억제제는 중화 항체 또는 그의 기능적 단편, 길항제, 가용성 결합 단백질, 가용성 변이 수용체, 비-기능성 유도체, 안티센스 폴리뉴클레오티드, RNA 간섭 올리고뉴클레오티드, 포스포로디아미데이트 모르폴리노 올리고머(PMO), miRNA, siRNA, shRNA, sgRNA, 안티센스 RNA, 다이서-기질 27-머 듀플렉스, 압타머, DNAzyme, 리보자임, 트리플렉스 형성 올리고뉴클레오티드(TFO), 소분자 및 이의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택된다.
구현예에서, CNNM4 억제제는 중화 항체 또는 그의 기능적 단편이다. 본원에서 용어 "항체"는 적어도 하나의 면역글로불린 가변 영역, 예를 들어 면역글로불린 가변 도메인을 제공하는 아미노산 서열 또는 면역글로불린 가변 도메인의 서열을 포함하는 단백질을 의미한다. "기능적 단편"은 CNNM4를 억제하는 능력을 유지할 수 있는 항체의 임의의 단편이다. 항체는, 예를 들어, 가변 중사슬(H) 영역(이하 VH로 줄임) 및 가변 경사슬(L) 영역(이하 VL로 줄임)을 포함할 수 있다. 전형적으로, 항체는 두 개의 가변 중사슬 영역 및 두 개의 가변 경사슬 영역을 포함한다. 용어 "항체"는 전체 항체, 예를 들어, IgA, IgG 타입 (예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4), IgE, IgD, IgM (및 이의 서브타입)의 무손상 및/또는 전장 면역글로불린뿐 아니라, 항원-결합 항체 단편 (예를 들어, 단일 사슬 항체, 나노항체(VHH), Fab 단편, F(ab')2 단편, Fd 단편, Fv 단편 및 dAb 단편)을 포함한다. 가변 중사슬 및 경사슬 영역은 추가적으로, "프레임워크 영역(FR) "으로 언급되는 더 많은 보존 영역들과 함께 혼합되는, "상보성 결정 영역(CDR)"으로 언급되는 과가변 영역으로 하위 구분될 수 있다. FRs 및 CDRs의 연장은 정확히 정의되어 있다 (Kabat, E.A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, The United States Department of Health and 인간 Services, NIH Publication No. 91-3242; and Chothia, C. et al. (1987) J. Mol. Biol. 196:901-917 참조). Kabat 정의가 본원에서 사용된다. 각각의 가변 중사슬 및 경사슬 영역은 전형적으로 세 개의 CDRs 및 FRs로 구성되고, 다음 순서로 아미노 말단으로부터 카르복실 말단으로 구조화된다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. 항체 VH 또는 VL 사슬은 중사슬 또는 경사슬 불변 영역의 전부 또는 일부를 더 포함하여, 중사슬(HC) 또는 경사슬(LC) 면역글로불린을 각각 형성할 수 있다. 면역글로불린 경사슬 및 중사슬은 다이설파이드 브릿지에 의하여 결합될 수 있다. 중사슬 불변 영역은 전형적으로 세 개의 불변 도메인, CH1, CH2 및 CH3을 포함한다. 경사슬 불변 영역은 전형적으로 CL 도메인을 포함한다. 가변 중사슬 및 경사슬 영역은 항원과 상호작용하는 결합 도메인을 함유한다. 항체의 불변 영역은 전형적으로, 면역 체계의 다양한 세포(예를 들어, 이펙터 세포) 및 전형적인 보체계의 첫 번째 컴포넌트(C1q)를 포함하는, 숙주 조직 또는 인자에 항체의 결합을 매개한다.
본원에서 용어 "중사슬(heavy chain)" 또는 "HC"는 전장 중사슬 및 그의 단편 모두를 포함한다. 전장 중사슬은 가변 영역 도메인인 VH, 및 세 개의 불변 영역 도메인인 CH1, CH2 및 CH3를 포함한다. 상기 VH 도메인은 폴리펩티드의 아미노 말단에 있고, 상기 CH3 도메인은 카르복실 말단에 있다.
본원에서 용어 "경사슬(light chain)"은 전장 경사슬 및 그의 단편을 포함한다. 전장 경사슬은 가변 영역 도메인인 VL, 및 불변 영역 도메인인 CL을 포함한다. 중사슬과 마찬가지로, 상기 가변 경사슬 영역 도메인은 폴리펩티드의 아미노 말단에 있다.
본원에서 용어 "단일 사슬 항체"는 유전적으로 융합된 단일-사슬 분자로서 형성되는, 적합한 펩타이드 링커에 의하여 결합되는 가변 경사슬 영역 및 가변 중사슬 영역을 함유하는 유전자 조작에 의하여 변형된 분자를 의미한다.
본원에서 용어 "나노항체"는 단일 모노머 가변 항체 도메인으로 구성되는 항체 단편인, 단일-도메인 항체(sdAb)를 의미한다. 전체 항체와 마찬가지로, 이는 특정 항원에 선택적으로 결합할 수 있다.
본원에서 용어 "항체 유사체(antibody mimetic)"는, 항체와 마찬가지로 항원에 특이적으로 결합할 수 있으나, 반드시 항체와 구조적으로 연관될 필요는 없는 임의의 화합물을 의미한다. 화합물의 "유사체"는 기능적 활성에 필요한 그 화합물의 화학 구조가 그 화합물의 구조를 모방하는 다른 화학 구조로 대체된 화합물을 포함한다. 유사체의 예는 펩타이드 백본이 하나 이상의 벤조디아제핀 분자로 대체된 펩타이드성 화합물 (예를 들어, James, G. L. et al. (1993) Science 260: 1937-1942 참조), 또는 아미드 결합 이소스테레스(isosteres)의 이용 및/또는 사슬 연장 또는 이종 원자 도입을 포함하는, 천연 펩타이드 백본의 변형을 통하여 펩타이드 이차 구조를 모방하는 올리고머를 포함하며; 그 예는 아자펩타이드, 올리고카바메이트, 올리고우레아, 베타-펩타이드, 감마-펩타이드, 올리고(페닐렌 에티닐렌), 비닐(vinylogous) 술포노펩타이드, 폴리-N-치환 글리신 (펩토이드) 등을 포함한다. 펩타이드유사(peptidomimetic) 화합물의 제조 방법은 종래 기술에 잘 알려져 있으며, 예를 들어, Quantitative Drug Design, C.A. Ramsden Gd., Chapter 17.2, F. Choplin Pergamon Press (1992)에 구체적으로 기재되어 있다.
본원에서 용어 항체는 또한, 상이한 분자 특성, 위상 또는 스캐폴드를 기초로 하는 면역글로불린 이외의 결합제로서 "비-면역글로불린 제제"를 의미한다. 용어 스캐폴드는 변형 단백질에 대개 결합 특이적 표적을 위한 상이한 기능을 부여하는 변경된 아미노산 또는 서열 삽입을 가질 수 있는 단백질 프레임워크를 의미한다. 이러한 비-면역글로불린 제제의 예는 종래 기술에 잘 알려져 있으며, 제한없이, 펩타이드 압타머, 핵산 압타머, 어피바디(Affibody) 분자, 어필린(Affilins), 어피머(Affimers), 어피틴(Affitins), 알파바디(Alphabodies), 안티칼린(Anticalins), 어비머(Avimers), DARPins, 파이노머(Fynomers), Kunitz 도메인 펩타이드 모노바디 등을 포함하고, 기타 단백질 스캐폴드가 Binz et al., 2005 (Nat. Biotech. 23:1257-68)에서 검토되며, 상기 문헌은 본원에 참조로 포함된다.
본 발명에 따르면, 항체는 "인간화"되어 인간 개체 내 면역원성을 감소시킬 수 있다. 인간화된 항체는 모노클로날 항체 치료법의 안전성 및 효능을 개선한다. 인간화의 한가지 통상적인 방법은 모노클로날 항체를 적절한 동물(예를 들어, 마우스, 래트, 햄스터) 내에서 생산하고, 불변 영역을 인간 불변 영역으로 대체하는 것이며, 이러한 방식으로 조작된 항체를 "키메릭(chimeric)"이라 한다. 다른 통상적인 방법은 비-인간 V-FRs를 인간 V-FRs로 대체하는 "CDR 그라프팅"이다. CDR 그라프팅 방법에서, CDR 영역을 제외한 모든 잔사가 인간 기원이다.
다른 구현예에서, CNNM4 발현 억제제는 길항제이다. 본원에 개시되는 "길항제"는 작용제와 같이 수용체를 활성화시키는 대신, 수용체에 결합하거나 이를 블록킹함으로써 생물학적 반응을 차단 또는 약화시키는 수용체 리간드 또는 화합물 유형이다. 대안적으로, CNNM4 활성을 하향 조절할 수 있는 다른 단백질성 제제는 이의 비-기능적 유도체 (즉, dominant negative)일 수 있다. 이러한 비-기능적 유도체 등을 모방하는 펩타이드는 종래 기술에 잘 알려져 있으며 John Morrow Stewart and Janis Dillaha Young, [Solid Phase Peptide Syntheses (2nd Ed., Pierce Chemical Company, 1984)]에 추가로 기재되는, 고상 펩타이드 합성 절차를 사용하여 합성될 수 있다. 합성 펩타이드는 제조용 고성능 액체 크로마토그래피에 의하여 정제될 수 있으며, 그 조성은 아미노산 시퀀싱에 의하여 확인될 수 있다.
본 발명에 따른 다른 부류의 CNNM4 억제제는 특정 가용성 결합 단백질을 포함한다. 이러한 결합 단백질은 그 자체로는 CNNM4에 결합하지 않는다. 그러나, 이들은 CNNM4의 적절한 결합 부위를 착화함으로써 CNNM4가 이펙터 단백질과 상호 작용하는 것을 방지한다. 다른 구현예에서, 상기 CNNM4-결합 억제제는 가용성 변이 수용체이며, 이들은 막-결합 수용체의 단백질 분해성 절단에 의하여 또는 대안적으로 스플라이싱된 수용체 RNAs의 번역에 의하여 생성된다. 이러한 가용성 수용체의 대다수는 수용체의 막-결합 형태에서 정상적으로 발견되는 막횡단 및 세포질 도메인을 결여한다.
다른 특정 구현예에서, CNNM4 억제제는 CNNM4 유전자에 또는 상기 유전자의 전사 산물에 특이적으로 결합하여 상기 유전자 발현을 차단하는 핵산이다.
"핵산"은 본원에서 포스포디에스테르 결합을 통하여 서로 결합되는 뉴클레오티드의 바이오폴리머이다 (폴리뉴클레오티드, 폴리핵산). 핵산의 뉴클레오티드는 추가적으로 또는 대안적으로, 화학적으로 합성될 때 포스포로티오에이트 또는 포스포로디티오네이트 결합을 통하여 결합될 수 있다. 뉴클레오티드 내 당의 유형에 따라 (리보오스 또는 디옥시리보스), 리보핵산(RNA) 및 디옥시리보핵산(DNA)의 두 부류로 구분한다. 본원에서 이는 임의의 천연 또는 비-천연 핵산을 의미하며, "올리고뉴클레오티드" 및 "폴리뉴클레오티드"는 본 발명의 문맥상 상호 교환 가능하게 사용된다. 본 발명의 문맥상, "천연 뉴클레오티드"는 천연 공급원으로부터 정제될 수 이는 뉴클레오티드를 의미한다. "비-천연 뉴클레오티드"는 재조합 발현 시스템을 이용하여 생산되고, 임의로, 정제, 화학적으로 합성된 것들로서 정의된다. 적절하다면, 예를 들어, 화학적으로 합성된 분자의 경우, 핵산은 화학적으로 개질된 염기 또는 당, 백본 변경을 가지는 유사체와 같은 뉴클레오시드 유사체를 포함할 수 있다. 핵산 서열은 달리 기재하지 않는 한 5'-3' 방향으로 표시된다.
구현예에서, CNNM4 억제제는 안티센스 폴리뉴클레오티드이다. 본원에서 "안티센스 폴리뉴클레오티드"는 표적 mRNA 서열(센스) 또는 DNA 서열(안티센스)에 결합할 수 있는 단일-가닥 핵산 서열(RNA 또는 DNA)을 포함하는 안티센스 또는 센스 폴리뉴클레오티드를 나타낸다. 바람직한 구현예에서, 안티센스 폴리뉴클레오티드는 안티센스 RNA이다. 다른 구현예에서, CNNM4 억제제는 RNA 간섭 올리고뉴클레오티드이다.
다른 구현예에서, CNNM4 억제제는 miRNA이다. 용어 "마이크로 RNA" 또는 miRNA"는 유전자 발현을 조절할 수 있는, 전형적으로 약 21 내지 23 뉴클레오티드 길이의 짧은 단일-가닥 RNA 분자를 나타낸다. miRNA는 합성(즉, 재조합) 또는 천연일 수 있다. 천연 miRNA는 DNA로부터 전사되는 유전자에 의하여 인코딩되고, 일차 전사체("pri-miRNA")로부터 짧은 스템-루프 구조("pre-miRNA")로, 최종적으로 성숙한 miRNA로 가공된다. 성숙한 miRNA 분자는 하나 이상의 mRNA 분자에 부분적으로 상보성이고, RNA 간섭과 유사한 공정을 통하여 또는 mRNA의 번역을 억제함으로써 유전자 발현을 하향 조절한다.
다른 구현예에서, CNNM4 억제제는 siRNA이다. 용어 "소간섭 RNA" ("siRNA")는 RNA 간섭 경로를 유발하는 작은 억제 RNAs의 듀플렉스를 의미한다. 소간섭 RNAs (siRNAs)는 RNase-III 클래스 엔도리보뉴클레아제 다이서(Dicer)에 의한 긴 dsRNAs의 효소적 절단에 의하여 세포 내에서 생산된다. siRNAs는 다이서에 의하여 촉진되는 공정에서 RNA 유도 사일런싱 복합체(RISC)와 결합된다. 다이서-기질 RNAi 방법은 RNAs가 다이서에 의하여 가공될 때 일어나는 다이서 및 RISC 로딩 사이의 링크를 이용한다. 전형적인 21-머 siRNAs는 다이서 산물을 모방하고 다이서 가공의 필요성을 건너뛰는 화학적으로 합성된 RNA이다. 다이서-기질 RNAs는 다이서 가공에 최적화된 화학적으로 합성된 RNA 듀플렉스이다. 이러한 분자들의 길이는 변화할 수 있으며 (일반적으로 18 내지 30 염기쌍), 안티센스 가닥 내 그들의 표적 mRNA에 대하여 변화하는 정도의 상보성을 함유한다. 특정 구현예에서, CNNM4 억제제는 다이서-기질 27-머 듀플렉스이다.
일부 siRNAs는, 전부 그러하지는 않으나, 센스 가닥 및/또는 안티센스 가닥의 5' 또는 3' 말단에서 페어링되지 않은 오버행잉 염기를 가진다. 용어 "siRNA"는 두 개의 각각의 가닥의 듀플렉스를 포함한다. 본원에서 siRNA 분자는 RNA에 제한되지 않으며, 모르폴리노와 같은, 하나 이상의 화학적으로 변형된 뉴클레오티드를 가지는 핵산을 더 포함한다.
바람직한 구현예에서, CNNM4 억제제는 siRNA이다. siRNA는 RNA 간섭(iRNA)을 매개하는 핵산이다. 특정 구현예에서, siRNA는 서열 번호 13 및 서열 번호 14를 가지는 서열을 포함한다. 다른 특정 구현예에서, siRNA는 서열 번호 13, 서열 번호 14, 서열 번호 50, 또는 서열 번호 51의 서열 중 임의의 것을 포함한다. 다른 특정 구현예에서, siRNA는, 바람직하게 서열 5'-GCGAGAGCAUGAAGCUGUAUGCACU-3' (서열 번호 25) (Yamazaki D, et al. (2013), PLoS Genet 9(12): e1003983)을 표적화하는, 인간 CNNM4에 대한 듀플렉스 siRNA를 포함한다. 추가적인 특정 구현예에서, siRNA는 표 1에 나타내는 서열 번호들을 가지는 서열들 중 적어도 하나를 포함한다. 이들 서열들은 명시되는 바와 같이 마우스 또는 인간 CNNM4를, 또는 어떠한 경우 마우스 및 인간 CNNM4 모두를 표적화한다.
| 서열 이름 | 서열 | 서열 번호. |
| 마우스 CNNM4 siRNA 서열 n1 FW | GAA CUG AGA AGG AGA GAA AUU | SEQ ID NO: 26 |
| 마우스 CNNM4 siRNA 서열 n1 RV | UUU CUC UCC UUC UCA GUU CUU | SEQ ID NO: 27 |
| 마우스 CNNM4 siRNA 서열 n2 FW | GGG AGA AGC UGA UGG AGA UUU | SEQ ID NO: 28 |
| 마우스 CNNM4 siRNA 서열 n2 RV | AUC UCC AUC AGC UUC UCC CUU | SEQ ID NO: 29 |
| 마우스 CNNM4 siRNA 서열 n3 FW | CAA UGA ACU CAA AGU GAA AUU | SEQ ID NO: 30 |
| 마우스 CNNM4 siRNA 서열 n3 RV | UUU CAC UUU GAG UUC AUU GUU | SEQ ID NO: 31 |
| 마우스 CNNM4 siRNA 서열 n4 FW | CGG GAG AAG CUG AUG GAG AUU | SEQ ID NO: 32 |
| 마우스 CNNM4 siRNA 서열 n4 RV | UCU CCA UCA GCU UCU CCC GUU | SEQ ID NO: 33 |
| 마우스 CNNM4 siRNA 서열 n5 FW | UGG UGA AGG AGG AGU UAA AUU | SEQ ID NO: 34 |
| 마우스 CNNM4 siRNA 서열 n5 RV | UUU AAC UCC UCC UUC ACC AUU | SEQ ID NO: 35 |
| 마우스 CNNM4 siRNA 서열 n6 FW | GUG AAG GAG GAG UUA AAU AUU | SEQ ID NO: 36 |
| 마우스 CNNM4 siRNA 서열 n6 RV | UAU UUA ACU CCU CCU UCA CUU | SEQ ID NO: 37 |
| 인간 CNNM4 siRNA 서열 n1 FW | GAU UGU AGC UGU UAA GAA AUU | SEQ ID NO: 38 |
| 인간 CNNM4 siRNA 서열 n1 RV | UUU CUU AAC AGC UAC AAU CUU | SEQ ID NO: 39 |
| 인간 CNNM4 siRNA 서열 n2 FW | AGG CAG AGC UCA AGG GAG AUU | SEQ ID NO: 40 |
| 인간 CNNM4 siRNA 서열 n2 RV | UCU CCC UUG AGC UCU GCC UUU | SEQ ID NO: 41 |
| 인간 CNNM4 siRNA 서열 n3 FW | GAU UGU AGC UGU UAA GAA AUU | SEQ ID NO: 42 |
| 인간 CNNM4 siRNA 서열 n3 RV | UUU CUU AAC AGC UAC AAU CUU | SEQ ID NO: 43 |
| 인간 CNNM4 siRNA 서열 n4 FW | CGA UGG AGA UUU AGA GUA UUU | SEQ ID NO: 44 |
| 인간 CNNM4 siRNA 서열 n4 RV | AUA CUC UAA AUC UCC AUC GUU | SEQ ID NO: 45 |
| 인간 CNNM4 siRNA 서열 n5 FW | GCU GAU GAG UGC AAA GAA AUU | SEQ ID NO: 46 |
| 인간 CNNM4 siRNA 서열 n5 RV | UUU CUU UGC ACU CAU CAG CUU | SEQ ID NO: 47 |
| 인간 CNNM4 siRNA 서열 n6 FW | CCU CAA AGC UCA AGG CAC AUU | SEQ ID NO: 48 |
| 인간 CNNM4 siRNA 서열 n6 RV | UGU GCC UUG AGC UUU GAG GUU | SEQ ID NO: 49 |
다른 구현예에서, CNNM4 억제제는 shRNA이다. 본원에서 용어 "shRNA" 또는 짧은 헤어핀 RNA"는 두 가닥들이 한 가닥의 3' 말단과 다른 가닥의 5' 말단 사이의 뉴클레오티드를 가로막지 않으면서 가닥에 의하여 결합되어 듀플렉스 구조를 형성하는 이중 가닥 RNA(dsRNA)를 의미한다. shRNAs가 일단 가공되면 RNA-유도 침묵 복합체(RISC)에 대하여 위치하여 RISC를 상보 서열을 가지는 mRNA에 표적화하므로, shRNAs는 RNA 간섭을 통한 표적 유전자 발현을 침묵하는데 사용될 수 있다. RISC는 이러한 mRNA를 절단하거나 그 번역을 억제할 수 있다. 특정 구현예에서, 상기 shRNA는 서열 번호 52의 서열을 포함한다.
다른 구현예에서, CNNM4 억제제는 sgRNA이다. 본원에서 용어 단일 가이드 RNA ("sgRNA")는 유전자 영역을 특이적으로 인식하는 표적화 서열 (crRNA 서열), 및 CRISPR 효소를 함유하는 키메릭 비-코딩 RNA를 의미한다. 상기 crRNA 영역은 관심 유전자 영역에 상동이고, CRISPR 효소 활성을 디렉트할 20-핵산 서열이다. 본원에서 CRISPR 효소는 Cas9 및 Cpf1과 같은, 종래 기술에 공지된 임의의 것일 수 있다.
본원에서 CRISPR은 게놈 에디팅 방법이다. 게놈 에디팅에서 이러한 기술의 이용은 당업계에, 예를 들어 미국 특허 제 8,697,359호 및 본원에 인용되는 문헌들에 충분히 기재되어 있다. 간략히, CRISPR은 침입 파지(phage) 및 플라스미드에 대한 방어에 수반되는 미생물 뉴클레아제 시스템이다. 미생물 숙주 내 CRISPR 로커스(loci)는 CRISPR-결합 (Cas) 유전자, 및 CRISPR-매개 핵산 절단의 특이성을 프로그래밍할 수 있는 비-코딩 RNA 요소(sgRNA)의 조합을 포함한다. 세 개의 유형(I-III)의 CRISPR시스템이 광범위한 세균 숙주를 통하여 확인되었다. 각각의 CRISP 로커스의 한가지 주요한 특징은 비-반복적 서열의 짧은 스트레치(스페이서)가 사이에 위치하는 반복 서열(직접 반복) 배열의 존재이다. 상기 비-코딩 CRISPR 배열은 직접 반복 서열 내에서 개별 스페이서 서열을 함유하는 짧은 crRNA로 전사 및 절단되며, 이는 Cas 뉴클레아제를 표적 부위로 디렉트한다 (프로토스페이서). 타입 II CRISPR은 더 나은 특징을 가지는 시스템 중 하나이고, 네 개의 순차적 단계로 표적화된 DNA 이중 가닥 절단을 수행한다. 첫 번째, 두 개의 비-코딩 RNA, pre-crRNA 배열 및 tracrRNA가 CRISPR 로커스로부터 전사된다. 두 번째, tracrRNA가 pre-crRNA의 반복 영역에 혼성화하고 pre-crRNA의 각각의 스페이서 서열을 함유하는 성숙한 crRNAs로 가공을 매개한다. 세 번째, 성숙한 crRNA:tracrRNA 복합체가 crRNA 상의 스페이서와 표적 인식을 위한 추가적 요건인 프로토스페이서 인접 모티프(protospacer adjacent motif, PAM) 옆의 표적 DNA 상의 프로토스페이서 간의 Watson-Crick 염기 페어링을 통하여 Cas9를 표적 DNA로 디렉트한다. 마지막으로, Cas9가 표적 DNA의 절단을 매개하여 프로토스페이서 내 이중 가닥 절단을 만든다.
종래의 유전자 표적화 및 기타 프로그램 가능한 엔도뉴클레아제와 비교하여, CRISPR-Cas9 시스템의 한가지 주요 이점은, 복수의 유전자가 단순히 각각 다른 유전자를 표적화하는 복수의 sgRNA를 사용함으로써 동시에 변이될 수 있는, 멀티플렉싱의 용이성이다. 또한, 두 개의 sgRNAs가 게놈 영역 플랭킹에 사용되는 경우, 개재 부분이 결실 또는 역위될 수 있다.
Cas9는 따라서, 타입 II CRISPR-Cas 시스템의 홀마크 단백질이고, 두 개의 비-코딩 RNAs: CRISPR RNA (crRNA) 및 트랜스-활성화 crRNA (tracrRNA)의 복합체에 의한 PAM 서열 모티프에 인접하는 DNA 표적 서열에 가이드되는 큰 모노머성 DNA 뉴클레아제이다. 상기 Cas9 단백질은 RuvC 및 HNH 뉴클레아제에 상동인 두 개의 뉴클레아제 도메인을 함유한다. HNH 뉴클레아제 도메인은 상보 DNA 가닥을 절단하는 반면, RuvC-유사 도메인은 비-상보적 가닥을 절단하며, 그 결과, 블런트 컷이 표적 DNA 내에 도입된다. sgRNA와 함께 Cas9의 이형 발현은 부위-특이적 이중 가닥 절단(DSBs)을 다양한 생물로부터의 살아 있는 세포의 게놈 DNA 내로 도입할 수 있다. 진핵 생물 내 적용을 위하여, 세균 스트렙토코커스 파이오게네스(Streptococcus pyogenes)로부터 유래되는, Cas9의 코돈 최적화 버전이 사용되었으나, 스태필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus) Cas9 (SaCas9), 캄필로박터 제주니(Campylobacter jejuni) Cas9 (CjCas9)와 같은, 기타 적합한 Cas9 오르토로그(orthologues)가 대신 사용될 수 있다.
단일 가이드 RNA(sgRNA)는 Cas9 뉴클레아제와 복합체를 형성하는 CRISPR/Cas 시스템의 두 번째 컴포넌트이다. sgRNA는 crRNA를 tracrRNA와 융합함으로써 만들어지는 합성 RNA 키메라이다. 그의 5' 말단에 위치하는 sgRNA 가이드 서열은 DNA 표적 특이성을 부여한다. 따라서, 가이드 서열을 변형함으로써, 상이한 표적 특이성을 가지는 sgRNAs를 만드는 것이 가능하다. 가이드 서열의 표준 길이는 20 bp이다. 식물 내에서, sgRNA는 U6 및 U3과 같은 식물 RNA 폴리머라제 III 프로모터를 이용하여 발현되었다.
본 발명의 방법에 사용하기 위한 Cas9 발현 플라스미드는 당업계에 기재된 바와 같이 제작될 수 있다.
"crRNA" 또는 CRISPR RNA는 프로토스페이서 요소 및 tracrRNA에 상보적인 추가 뉴클레오티드를 함유하는 RNA 서열을 의미한다.
"tracrRNA" (transactivating RNA)는 crRNA에 혼성화하고, Cas9와 같은, CRISPR 효소에 결합함으로써, 뉴클레아제 복합체를 활성화하여 알파-, 감마- 및/또는 오메가 글리아딘(gliadin) 중 적어도 하나의 게놈 서열 내 특정 부위에 이중-가닥 절단을 도입하는 RNA 서열을 의미한다.
"프로토스페이서(protospacer) 요소"는 대개 약 20 뉴클레오티드 길이의, 게놈 DNA 표적 서열에 상보적인 crRNA (또는 sgRNA) 부분을 의미한다. 이는 또한 스페이서 또는 표적화 서열로도 알려져 있다.
"sgRNA" (단일-가이드 RNA)는, 바람직하게 링커 루프 (tracrRNA와 crRNA를 단일 분자로 결합하는)를 또한 포함하는, 단일 RNA 분자 내 tracrRNA 및 crRNA의 조합을 의미한다. "sgRNA"는 또한 "gRNA"로도 언급될 수 있으며, 본 발명의 문맥상, 상기 용어들은 상호 교환 가능하다. sgRNA 또는 gRNA는 Cas 뉴클레아제에 대한 표적화 특이성 및 스캐폴딩/결합 능력을 모두 제공한다. gRNA는 crRNA 분자 및 tracrRNA 분자를 포함하는 이중 RNA 분자를 의미할 수 있다. sgRNA는 RNA 분자로서 또는 기능적 sgRNA로 전사되는 DNA 분자로서 제공될 수 있다.
"CRISPR 효소"는 CRISPR 시스템과 결합될 수 있는 RNA-가이드 DNA 엔도뉴클레아제를 의미한다. 구체적으로, 이러한 효소는 tracrRNA 서열에 결합한다. 일 구현예에서, CRISPR 효소는 Cas 단백질 (CRISPR 결합 단백질), 바람직하게 Cas9 또는 Cpf1이다.
다른 구현예에서, CNNM4 억제제는 압타머(aptamer)이다. 본원에서 용어 압타머는 표적 리간드에 선택적으로 결합하나, 그 후의 화학적 반응을 촉매화하지 않는 올리고뉴클레오티드를 의미한다. 용어 "펩타이드 압타머"는 단백질 스캐폴드에 양 말단에서 부착되고, 특정 표적 분자에 결합하는 짧은 가변 펩타이드 도메인을 의미한다. 가변 루프 길이는 전형적으로 10 내지 12 아미노산으로 구성되고, 스캐폴드는 좋은 용해도 및 압축 특성을 가지는 임의의 단백질일 수 있다. 본원에서 용어 "핵산 압타머" 또는 "DNA 압타머"는 반복된 라운드의 선택을 통하여 특정 분자 표적에 결합하도록 조작된 DNA의 짧은 가닥을 의미한다.
다른 구현예에서, CNNM4 억제제는 DNAzyme이다. 본원에서 용어 "DNAzyme"은 특정 화학 반응, 대개 촉매 반응을 수행할 수 있는 DNA 올리고뉴클레오티드를 의미한다.
다른 구현예에서, CNNM4 억제제는 리보자임이다. 본원에서 용어 "리보자임" 또는 "RNA 효소" 또는 "촉매 RNA"는 화학 반응을 촉매하는 RNA 분자를 의미한다. 리보자임은 다른 RNAs 내 포스포디에스테르 결합을 가수분해하는 데에 사용될 수 있다. CNNM4 발현을 억제하는 능력을 가지는 핵산은 뉴클레오베이스 내, 당 내, 및/또는 뉴클레오티드 사이의 결합 내에 하나 이상의 변형을 함유할 수 있다.
다른 구현예에서, CNNM4 억제제는 트리플렉스 형성 올리고뉴클레오티드이다. 본원에서 용어 "트리플렉스 형성 올리고뉴클레오티드(TFO)"는 수소 결합의 형성을 통하여 서열-특이적 방식으로 듀플렉스 DNA의 주요 그루브 내에 결합하는 트리플렉스를 형성할 수 있는 올리고뉴클레오티드이다. 앞서 기재된 모든 억제제에 하나 이상의 변형이 가해질 수 있다. 핵산 백본의 하나 이상의 잔기에 대한 변형은 다음 중 하나 이상을 포함할 수 있다: 2'-O-메틸 (2'-OMe), 2'-O-메톡시에틸 (2'-MOE), 2'-O-메톡시에톡시, 2'-플루오로 (2'-F), 2'-알릴, 2'-O-[2-(메틸아미노)-2-옥소에틸], 2'-O-(N-메틸카바메이트)와 같은, 2'에서 당의 변형; 4'-티오, 4'-CH2-O-2' 브릿지, 4-(CH2)2-O-2' 브릿지를 포함하는, 4'에서 당의 변형; 잠금 핵산(LNA); 펩타이드 핵산(PNA); 삽입 핵산(INA); 트위스트 삽입 핵산(TINA); 헥시톨 핵산(HNA); 아라비노핵산(ANA); 시클로헥센 핵산(CNAs); 시클로헥세닐 핵산(CeNA); 트레오스 핵산(TNA); 모르폴린 올리고뉴클레오티드; 갭머(Gapmers); 믹스머(Mixmers); 아르기닌-풍부 펩타이드의 도입; 합성 RNAs에 5'-포스페이트의 첨가; RNA 압타머 (Que-Gewirth NS, Gene Ther. 2007 Feb;14(4):283-91.); 특정 RNA 압타머의 대상 내 안티도트-조절된 RNA 압타머 (ref. Oney S, Oligonucleotides. 2007 Fall; 17(3):265-74), 또는 이의 임의의 조합.
핵산의 하나 이상의 뉴클레오시드 결합에 대한 변형은 다음 중 하나 이상을 포함할 수 있다: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 포스포라미데이트, 포스포로디아미데이트, 포스포로디티오에이트, 포스포로셀레노에이트, 포스포로디셀레노에이트, 포스포로아닐로티오에이트, 및 포스포로아닐리데이트, 또는 이의 임의의 조합.
접근 불가 RNA로 통상적으로 언급되는 잠금 핵산(LNA)은 변형된 RNA 뉴클레오티드이다. LNA 뉴클레오티드의 리보오스기는 탄소 2' 및 4'를 연결하는 추가 브릿지(O2', C4'-메틸렌 브릿지)로 변형된다. 상기 브릿지는 3'-엔도 구조적 형태로 리보오스를 "잠금"하며, 이는 대개 DNA 또는 RNA의 A 형태에서 발견된다. LNA 뉴클레오티드는 원할 때 핵산 내 DNA 또는 RNA 염기와 혼합될 수 있다. 이러한 올리고머는 상업적으로 이용 가능하다.
펩타이드 핵산(PNA)은 인공적으로 합성된 폴리머이고, 그 백본은 펩타이드 결합에 의하여 연결되는 N-(2-아미노에틸)-글리신의 반복 단위로 구성된다. 상이한 퓨린 및 피리미딘 염기가 메틸렌-카보닐 결합에 의하여 백본에 연결된다.
삽입 핵산(intercalating nucleic acid)(INA)은 소수성 삽입에 공유 결합되는 보통의 디옥시리보뉴클레오티드를 포함하는 변형된 핵산 유사체이다.
헥시톨 핵산(HNAs)은 천연 뉴클레오베이스 및 포스포릴레이티드 1,5-안하이드로헥시톨 백본으로 형성되는 뉴클레오티드이다. HNA 및 RNA 사이의 분자 결합은 HNA 및 DNA 사이 및 천연 핵산들 (dsDNA, dsRNA, DNA/RNA) 사이의 것보다 더 안정하다. 기타 합성적으로 변형된 올리고뉴클레오티드는 ANA(아라비노핵산), CNAs(시클로헥센 핵산), CeNA(시클로헥세닐 핵산), 및 TNA(트레오스 핵산)을 포함한다.
모르폴리노는 천연 핵산 구조를 리디자인한 산물인 합성 분자이다. 구조적으로, 모르폴리노와 DNA 또는 RNA 간의 차이점은, 모르폴리노는 표준 뉴클레오베이스를 가지나, 그 염기들이 디옥시리보스/리보오스 고리 대신 6-원 모르폴린 고리에 연결되고, 서브유닛 사이의 비-이온성 포스포로디아미데이트 결합이 음이온성 포스포디에스테르 결합을 대신한다는 점이다. 모르폴리노는 종종 PMO(포스포로디아미데이트 모르폴리노 올리고뉴클레오티드)로 언급된다. 6 원 모르폴리노 고리는 화학식 O (CH2 CH2)2 NH을 가진다.
갭머(Gapmers) 또는 "갭을 가지는 올리고머성 화합물"은 DNA 윈도우 또는 갭이 "윙"으로 알려진 정상적 또는 변형된 RNA 올리고뉴클레오티드 내에 삽입되는, RNA-DNA-RNA 키메릭 올리고뉴클레오티드 프로브이다. 이러한 변형은 생체내 올리고뉴클레오티드의 안정성을 증가시키고, 프로브를 표적과 상호 작용하기 쉽게 만들어, 짧은 프로브일수록 효과적으로 사용될 수 있다. 바람직하게, 윙은 내부 블록을 뉴클레아제 분해로부터 보호하는, 변형된 2'-O-메틸 (OMe) 또는 2'-O-메틸옥시에틸 (MOE) 올리고뉴클레오티드이다. 나아가, 갭 또는 윙을 형성하는 뉴클레오티드는 포스포디에스테르 결합에 의하여 또는 포스포로티오에이트 결합에 의하여 연결될 수 있어, 이들을 RNAse 분해에 저항성으로 만든다. 나아가, 윙을 형성하는 뉴클레오티드는 또한 3'-메틸포스포네이트 결합에 의하여 연결되는 염기들의 도입에 의하여 변형될 수 있다.
다른 구현예에서, CNNM4 억제제는 소분자이다. 본원에서 용어 "소분자"는 생물학적 공정을 조절할 수 있는 저분자량 (<900 달톤) 유기 화합물을 의미한다. 소분자는 단백질의 특정 기능을 억제하거나 단백질-단백질 상호 작용을 방해할 수 있다. 바람직한 구현예에서, 소분자는 7-아미노-2-페닐-5H-티에노[3,2-c]피리딘-4-온 (PubChem CID 91383855) 또는 Park, H., et al. 2008. Bioorg Med Chem Lett. 18(7):2250-5 (Chemspider ID 1014170)에 기재되는 바와 같은 2-[5-(4-옥소-2-티옥소-티아졸리딘-5-일리덴메틸)-퓨란-2-일]-벤조산으로 알려진 로다닌 유도체이다.
다른 구현예에서, CNNM4 억제제는 전술한 억제제들의 임의의 조합이다.
본원에서 용어 "치료(treatment)", "치료하는" 등은 본원에 기재된 임상 상태에 대한 민감성을 종결, 방지, 개선 및/또는 감소시키는 것을 목적으로 하는, 임의의 유형의 치료법을 포함한다. 따라서, "치료", "치료하는" 등은 본원에서 인간을 포함하는 포유 동물 내 병리 상태 또는 질환의 임의의 치료를 포함하는, 원하는 약리학적 및/또는 생리학적 효과를 얻음을 의미한다. 상기 효과는 질환 또는 그 증상을 완전히 또는 부분적으로 방지하는 측면에서 예방적일 수 있고 및/또는 질환 및/또는 그 질환에 기인하는 부작용에 대한 부분적 또는 완전한 치유의 측면에서 치료적일 수 있다. 이는 포유 동물, 바람직하게 인간 내 질환의 치료를 포함하고, (a) 생존 시간 증가; (b) 질환으로 인한 사망 위험 감소; (c) 그 질환에 걸리기 쉬우나 아직 그 질환을 가지는 것으로 진단되지 않은 대상 내 질환 발생 방지; (d) 질환 억제, 즉 그 진행을 저지 (예를 들어, 질환 진행의 속도를 감소); 및 (e) 질환 완화, 즉 질환 퇴행 야기를 포함한다.
본원에서 "질환(disease)"은 살아 있는 동물의 또는 정상적인 기능을 손상시키는 그 부분들 중 하나의 상태를 의미하며, 전형적으로 특징적인 신호 및 증상에 의하여 나타난다. 바람직한 구현예의 동물은 포유 동물, 바람직하게 인간이다.
본원에서 "급성 질환(acute disease)"은 심각하고 개시가 갑작스러운 상태를 의미한다.
본원에서 "만성 질환(chronic disease)"은 오래 발병하는 상태를 의미한다. 급성 질환이 만성 질환으로 될 수 있다.
본원에서 용어 "대상(subject)", "환자(patient)" 또는 "개체(individual)"는 동물계의 일원을 나타내기 위하여 상호 교환 가능하게 사용되며, 인간, 비-인간 영장류, 말, 돼지, 토끼, 개, 양, 염소, 소, 고양이, 기니아 피그 또는 설치류를 포함하는, 포유류, 어류, 조류, 파충류 또는 양서류와 같은 척추 동물일 수 있다. 바람직하게, 대상은 포유 동물, 더 바람직하게 인간이다.
본 발명에 따르면, 상기 질환은 간 질환, 신장 질환 및 폐 질환으로 이루어지는 군으로부터 선택된다. 일 구현예에서, 상기 질환은 비-증식성 질환이다 (즉, 암 이외의 질환).
본원에서 "간 질환(liver disease)"은 대개 감염, 부상, 약물 또는 독성 화합물, 알코올, 음식물 내 불순물에 노출, 및 혈액 내 정상적 물질의 비정상적 축적, 자가면역 프로세스, 또는 유전적 결함(혈색소증과 같은)에 의하여 야기되는, 간에 대한 급성 또는 만성 손상이다. 때때로, 손상의 정확한 원인은 알려져 있지 않을 수 있다. 간 질환은 질환 지속 기간에 따라 급성 또는 만성 간 질환으로 분류될 수 있다. 급성 간염 및 급성 간 부전(ALF)과 같은 급성 간 질환에서, 그 질환의 히스토리는 6 개월을 넘지 않는다. 더 긴 지속 기간의 간 질환은 만성 간 질환으로 분류된다. 통상적인 간 질환의 비-제한적 예는 간경변증, 간 섬유증, 비-알코올성 지방간 질환 (NAFLD), 비-알코올성 지방간염 (NASH), 간 허혈 재관류 손상(hepatic ischemia reperfusion injury), 원발성 담즙성 경변증(primary biliary cirrhosis (PBC)), 및 바이러스 및 알코올성 간염을 포함하는, 간염을 포함한다. 가장 통상적인 형태의 바이러스 간염은 간염 B 및 C (각각 HBV 및 HVC)이다. 만성 간염은 간경변증을 초래할 수 있다. 아포토시스(apoptosis)로 알려진 공정을 통한 간 세포의 사멸은 모든 형태의 간 질환에 있어서 통상적이다. 간 세포 사멸은 간 섬유증 및 기타 간 질환과 연관된다.
간 질환, 특히 약물에 의하여 유발되는 간 질환(약인성 간 손상(drug-induced liver injury) 또는 DILI)은 특별히 유용한 정보가 아닌 그 자체로 임상적으로 다양한 증상으로 나타난다. 증상의 비-제한적 예는 식욕 손실, 탈진, 현기증, 체중 감소, 메스꺼움, 구토, 열, 상부 우측 복부 통증, 관절통, 근육통, 소양감, 발진, 배설물 변색, 눈 및 피부 황변을 포함한다.
이 분야의 전문가에게 알려져 있듯이, 활성 간 질환의 존재는 종종 혈액 내 상승된 효소 수준의 존재에 의하여 발견된다. 구체적으로, 임상적으로 허용되는 정상 범위 위의 ALT (알라닌 아미노트랜스퍼라아제) 및 AST (아스파테이트 아미노트랜스퍼라아제)의 혈액 수준은 진행 중인 간 손상의 지표인 것으로 알려져 있다. 간 질환 환자의 ALT 및 AST 혈액 수준에 대한 규칙적 모니터링을 임상적으로 이용하여 의학적 치료 동안 간 질환의 진행을 측정한다. 상승된 ALT 및 AST의 허용되는 정상 범위 내로 감소는 간 손상이 진행 중인 환자의 심각성 감소를 반영하는 임상적 증거로서 간주된다. 특정 구현예에서, 간 질환은 임의의 유형의 간 손상에 의하여 야기된다.
본원에서 "간 손상(liver damage)"은 간 세포 또는 조직 내 존재하는 병적 변화뿐 아니라 만성 및 급성 외상을 포함하는 임의의 유형의 간 외상 (부상)을 나타내기 위하여 사용된다. 간 손상의 임상 상태는, 이에 제한되지 않으나, 살아있는 세포의 퇴화(degeneration), 간의 혈관염(vasculitis), 간 내 존재하는 산재 괴사(spoty necrosis) 또는 소상 괴사(focal necrosis), 간 및 간문맥 영역 내 염증성 세포 침윤(inflammatory cell infiltration) 또는 섬유아세포 증식(fibroblast proliferation), 또는 간비대(hepatomegaly), 및 간경변(hepatocirrhosis), 심각한 간 손상으로부터 초래되는 간세포암(hepatoma) 등을 포함할 수 있다. 간 질환은 간 부상으로부터 초래된다. 간 부상은 알코올, 일부 약물, 음식물 내 불순물을 포함하는 독소, 혈액 내 정상적 물질의 비정상적 축적에 의하여, 감염에 의하여 또는 자가면역 질환에 의하여 야기될 수 있다. 어떠한 경우, 간 부상으로부터 초래되는 간 손상은, 이에 제한되지 않으나, 지방간, 간경병증, 원발성 담즙성 경변증(primary biliary cirrhosis), 원발 경화성 담관염(primary sclerosing cholangitis), 및 알파1-안티트립신 결핍을 포함한다. 간 손상은, 이에 제한되지 않으나, 간경변증, 간 섬유증, 비-알코올성 지방간 질환(NAFLD), 비-알코올성 지방간염(NASH), 간 허혈 재관류 손상, 바이러스 및 알코올성 간염을 포함하는 간염, 및 원발성 담즙성 경변증(PBC)를 포함한다.
바람직한 구현예에서, 간 질환은 간 섬유증(liver fibrosis), 간정맥폐색성질환(veno-occlusive liver disease), 약인성 간손상(drug-induced liver injury (DILI)), 지방증(steatosis), 비알코올성 지방간염(non-alcoholic steatohepatitis (NASH)), 간경병증(cirrhosis), 간세포암종(hepatocellular carcinoma (HCC)), 버드-키아리 증후군(Budd-Chiari syndrome) 및 간염(hepatitis), 또는 이의 조합으로부터 선택된다. 더 바람직한 구현예에서, 간 질환은 간 섬유증, 간정맥폐색성 질환, 약인성 간손상(DILI), 비-알코올성 지방간염(NASH), 간경변증, 간세포암종(HCC), 버드-키아리 증후군 및 간염, 또는 이의 조합으로부터 선택된다. 더 바람직하게 구현예에서, 간 질환은 약인성 간손상(DILI), 비-알코올성 지방간염(NASH), 간경병증, 간세포암종(HCC) 또는 이의 조합으로부터 선택된다. 더 바람직한 구현예에서, 간 질환은 약인성 간손상(DILI), 비-알코올성 지방간염(NASH), 간경병증 또는 이의 조합으로부터 선택된다.
본원에서 "섬유증(fibrosis)"은 회복 또는 반응 공정에서 장기 또는 조직 내 과도한 섬유성 결합 조직의 형성이다. 이는 반응성, 양성, 또는 병적 상태일 수 있다. 부상에 반응하여, 이는 반흔화(scarring)로 불리우며, 섬유증이 단일 세포주로부터 발생하는 경우, 이는 섬유종(fibroma)으로 불리운다. 생리학적으로, 섬유증은 근본적인 장기 또는 조직의 정상적 구성 및 기능을 간섭하거나 전적으로 억제할 수 있는, 결합 조직을 축적하는 작용을 한다. 섬유증은 치유 중인 결합 조직 축적 공정뿐 아니라 과도한 섬유성 조직의 축적의 병적 상태를 기재하기 위하여 사용될 수 있다. 세포외 기질(ECM) 단백질의 병적 축적에 의하여 정의하면, 섬유증은 반흔화 및 영향 받은 조직의 비후화를 초래하고, 본질적으로 정상적인 장기 기능을 간섭하는 과장된 상처 치유 반응이다. 섬유증은 임의의 장기에 영향을 미칠 수 있다. 바람직한 구현예에서, 섬유증은 간 섬유증이다.
본원에서 "간 섬유증"은 부상에 대한 간의 반응을 나타내는 반흔화 과정이다. 콜라겐 및 기타 기질 구성 성분의 축적을 통한 피부 및 기타 장기 상처 치유와 마찬가지로, 간은 새로운 콜라겐 축적을 통하여 부상을 회복한다. 간 섬유증은 간 반흔화의 첫 번째 단계이다. 간이 더 반흔화되면, 후에 이는 간 경변증을 초래할 수 있다.
본원에서 "간정맥폐색성질환" 또는 "간 굴혈관 폐쇄 증후군(hepatic sinusoidal obstruction syndrome (SOS))"은 간비대 우측 상부 사분면 통증, 황달 및 복수를 특징으로 하고, 대부분 조혈세포이식(hematopoietic cell transplantation (HCT))이 진행 중인 환자 내에서 종종 발생하고, 비-이식 장소에서 특정 화학요법제 사용, 알칼로이드 독소 섭취, 고용량 방사선 요법 후, 또는 간 이식 후 덜 통상적이다. SOS에서 간정맥 유출 폐색은 말단 간정맥 및 간 굴혈관의 폐색으로 인한 것이다.
본원에서 "약인성 간 손상(DILI)"은 하나 이상의 약물 사용 후 발생하는 간에 대한 손상을 의미한다.
본원에서 "지방증"은 지방 변화로도 불리우며, 세포 내 비정상적 지질의 보유를 기재하는 과정이다. 이는 트리글리세라이드 지방의 합성 및 제거의 정상적인 과정의 손상을 반영한다. 과도한 지질은 세포질을 변위하는 소포 내 축적된다. 소포가 핵을 비틀기에 충분히 클 때, 그 상태는 거대 소포성 지방증(macrovesicular steatosis)으로 알려져 있다. 가벼운 경우 특별히 세포에 유해하지는 않지만, 다량 축적은 세포 구성 성분을 파괴할 수 있고, 심각한 경우 세포가 파열될 수도 있다. 지방증과 관련되는 위험 인자들은 변하며, 당뇨병, 단백질 영양 부족, 고혈압, 세포 독소, 비만, 산소결핍증, 및 수면 무호흡증을 포함한다. 간은 지질 대사의 일차 장기이므로, 이는 가장 자주 지방증과 연관되나; 임의의 장기, 통상적으로 신장, 심장 및 근육 내에서도 일어날 수 있다. 바람직한 구현예에서, 지방증은 간 내에서 야기된다.
본원에서 "비-알코올성 지방간염(NASH)"은 알코올릭이 아닌 환자에서 발생하는 증후군이며; 이는 알코올성 간염과 조직학적으로 구별 불가한 간 손상을 야기한다. 이는 다음 위험 인자들 중 적어도 하나를 가지는 환자 내에서 가장 자주 일어난다: 비만, 이상지질혈증, 내당능장애(glucose intolerance). 발병 과정은 잘 이해되지 않으나, 인슐린 저항성(예를 들어, 비만 또는 대사 증후군에서와 같은)과 연관되는 것으로 보인다. 대부분의 환자는 무증상이다. 실험실 발견은 아미노트랜스퍼라제 수준 증가를 포함한다. 진단 확인을 위하여 생검이 요구된다.
본원에서 "간경병증"은 간 구조의 변형 및 재생성 결절의 형성을 특징으로 하는, 진행성 간 섬유증의 말기를 의미한다. 일반적으로, 이는 진전된 단계에서 비가역적인 것으로 간주되며, 이 시점에서 유일한 치료 옵션은 간 이식일 수 있다. 간경병증의 (그 초기에서) 반전이 근본적인 원인의 치료 후 몇몇 형태의 간 질환에서 가능하다. 간경병증 환자는 다양한 복합증에 걸리기 쉬우며, 그들의 수명은 대개 현저히 감소된다.
본원에서 "간세포암종(HCC)"은 만성 간 질환 및 간경병증 환경에서 종종 일어나는 공격적 종양을 의미한다. 이는 전형적으로 말기에 진단되고, 진단 후 중간 생존률은 대략 6 내지 20 개월이다. 치료법의 메인스테이는 수술적 절제이나, 대부분의 환자는 종양 정도 또는 간 장애로 인하여 할 수 없다.
본원에서 "버드-키아리 증후군(BCS)"은, 패색이 심장 질환, 심낭 질환, 또는 굴현관 폐쇄 증후군(정맥 폐색성 질환)으로 인한 것이 아닌, 폐색 수준 또는 메커니즘과 무관하게, 간 정맥 유출관 폐색으로 정의된다. 일차 버드-키아리 증후군은 주로 정맥 과정으로 인한 폐색이 있을 때 (혈전증 또는 정맥염) 존재하는 반면, 이차 버드-키아리 증후군은 정맥 외부에서 기원하는 병변(예를 들어, 악성 종양)에 의한 간 정맥 및/또는 하대정맥(inferior vena cava)의 압축 또는 침습이 있을 때 존재한다.
본원에서 "간염"은 그 원인과 무관하게 간의 염증을 의미한다. 간염은 약물 독성, 면역 질환 및 바이러스를 포함하는 많은 상태에 의하여 야기될 수 있다. 이는 황달, 간 확대, 및 열을 특징으로 한다.
본원에서 "신장 질환(kidney disease)"은 신장에 대한 급성 또는 만성 손상이다. 이는 외인성 인자, 내재성 인자, 유전적 인자 등을 포함하는 다양한 원인으로 인한 신장 내 발생하는 질환을 의미한다. 신장 질환의 비-제한적 예는: 신장염(nephritis), 신증(nephrosis), 신장 섬유증(renal fibrosis), 비박형 사구체 기저막(thin glomerular basement membrane (TGBM)), 미세변화 질환(minimal change disease (MCD)), 막사구체신염(membranous glomerulonephritis (MGN)), 국소분절 사구체 경화증(focal segmental glomerulosclerosis (FSGS)), DM 신장병증, IgA 신장병증(IgAN), 요세관간질성신염(tubulointerstitial nephritis (TIN)), 헤노호-쉔라인 자반병성 신염(Henoch-Schonlein Purpura (HSP) nephritis), 급성 요세관 손상(acute tubular injury), BK 바이러스 신장병증, 급성 세포 거부반응(acute cellular rejection), 만성 항체 매개 거부반응(chronic antibody mediated rejection), 만성 활성 항체 매개 거부반응(chronic active antibody mediated rejection), 만성 칼시뉴린 억제제 독성(chronic calcineurin inhibitor toxicity), 급성 신장 손상(acute kidney injury), 만성 신장 질환(chronic kidney disease), 허혈 신장 질환(ischemic renal disease), 사구체신염(glomerulonephritis), 루푸스 신염(lupus nephritis), 다낭성 신장병(polycystic kidney disease), 신우신염(pyelonephritis), 신장결석(nephrolith), 신장 결핵(renal tuberculosis), 신장 종양(renal tumor), 만성 신부전(chronic renal failure), 말기 신부전(end stage renal failure), 패혈증(sepsis), 간손상에 의하여 야기되는 신장 손상 등을 포함한다.
바람직한 구현예에서, 신장 질환은 급성 신장 손상(AKI), 만성 신장 질환, 신장염, 신증 및 신장 섬유증으로부터 선택된다.
본원에서 "급성 신장 손상(AKI)" 또는 급성 신부전(ARF)"은 7일 이내 발생하는 신장 기능의 돌연한 손실이다. 비-제한적 원인은 다음을 포함한다: 임의의 원인으로부터(예를 들어, 저혈압) 감소된 신장 혈류(신장 허혈)에 의하여 야기되는 신장 조직 손상, 신장에 해로운 물질에 노출, 신장 내 염증성 과정, 또는 소변의 흐름을 저해하는 요로 폐색. AKI는 상승된 혈액 우레아 질소 및 크레아티닌, 또는 신장의 충분한 양의 소변 생산 불능과 같은, 특징적 실험실 발견에 기초하여 진단된다. AKI는 대사성산성증, 고칼슘 수준, 요독증, 체액 균형 변화, 및 사망을 포함하는 기타 기관계에 대한 영향을 포함하는, 다수의 합병증을 초래할 수 있다. AKI를 경험한 사람은 향후에 만성 신장 질환 위험이 증가될 수 있다.
본원에서 "만성 신장 질환(CDK)"은 수 개월 또는 수 년에 걸친 신장 기능의 점진적 손실이 있는 신장 질환 유형을 의미한다. 초기에 전형적으로 증상이 없다. 후기에, 다리 부종, 피로감, 구토, 식욕 감소, 착란(confusion)이 전개될 수 있다. 합병증은 심장 질환, 고혈압, 골 질환 또는 빈혈을 포함한다. 만성 신장 질환의 비-제한적 원인은 당뇨병, 고혈압, 사구체신염, 및 다낭성 신장병을 포함한다. 위험 인자는 가족력을 포함한다. 진단은 일반적으로 사구체 여과율을 측정하기 위한 혈액 테스트 및 알부민 측정을 위한 소변 테스트에 의한다. 초음파 또는 신장 생검과 같은 추가적인 테스트를 행하여 근본적인 원인을 결정할 수 있다.
본원에서 "신장염"은 신장의 염증을 의미하며, 사구체, 세뇨관 및 사구체 및 세뇨관을 둘러싸는 간질 조직을 수반할 수 있다. 비-제한적 원인은 감염, 독소 및 자가면역 장애를 포함한다. 신장염은 사구체신염(사구체 염증) 및 간질성 신염 또는 세뇨관-간질 신장염(세뇨관 사이의 공간의 염증)을 포함한다.
본원에서 "신증"은 신장 세뇨관의 임의의 퇴행성 질환을 의미한다. 신증은 신장 질환에 의하여 야기될 수 있거나, 다른 장애, 특히 당뇨병의 합병증일 수 있다. 진단은 단백질 존재에 대한 소변 테스트, 단백질의 정상보다 낮은 수준에 대한 혈액 테스트, 및 부종 관찰을 통하여 행하여진다.
바람직한 구현예에서, 섬유증은 신장 섬유증이다. 본원에서 "신장 섬유증"은 신장에 영향을 미치는 섬유증을 의미한다.
본원에서 "호흡기 질환(respiratory disease)"은 고등 생물에서 가스 교환을 가능케 하는 장기 및 조직에 영향을 미치는 병적 상태를 의미하고, 상기도, 기관, 기관지, 세기관지, 폐포, 흉막 및 흉막강, 및 호흡 신경 및 근육 질환을 포함한다.
본원에서 "폐 질환(lung disease)"은 폐에 영향을 미치는 호흡기 질환이다. 폐 질환은 폐에 대한 급성 또는 만성 손상일 수 있다. 폐 질환의 비-제한적 예는 천식, 만성 폐쇄성 폐질환, 만성 또는 급성 기관지염, 낭포성 섬유증, 폐기종, 급성 호흡곤란 증후군, 세균성 폐렴, 결핵, 폐색전증 및 폐암을 포함한다.
바람직한 구현예에서, 폐 질환은 폐 섬유증이다. 본원에서 "폐 섬유증"은 반흔이 폐 조직 내에 형성되어 호흡 문제를 초래하는 호흡기 질환을 의미한다. 반흔 형성, 과도한 섬유성 결합 조직 축적 (섬유증으로 불리우는 과정)은 벽의 비후화를 초래하고, 혈액 내 산소 공급 감소를 야기한다. 결과적으로, 환자는 숨이 찰 수 있다. 폐 섬유증의 증상은 다음을 포함한다: 숨이 참, 만성 건조, 잦은 마른 기침, 피로 및 허약, 가슴 통증을 포함하는 가슴 불편함, 식욕 손실 및 빠른 체중 감소. 본원에서 폐 섬유증은 다른 질환 및/또는 비내 투여 및 경구 흡입 투여와 같은 치료제의 폐에 전신 및 국소 전달을 위한 비-침습성 투여를 포함하는 특정 치료의 이차적 영향일 수 있다. 이차적 영향으로서 폐 섬유증을 야기할 수 있는 질환 및 상태의 비-제한적 예는 다음을 포함한다: 석면폐 내 금속과 같은 환경 및 직업과 관련된 오염 물질의 흡입, 규폐증 및 특정 가스에 노출; 가장 흔하게 세균, 곰팡이 또는 동물 산물로 오염된 먼지 흡입으로부터 초래되는 과민성 폐렴; 담배 흡연; 류마티스 관절염과 같은 일부 결합 조직 질환, 전신 홍반 루푸스(Systemic lupus erythematosus(SLE)) 및 피부경화증, 사르코이드증 및 다발혈관염을 가지는 육아종증; 감염증; 일부 약제, 예를 들어, 아미오다론(amiodarone), 블레오마이신(bleomycin)(핑양마이신(pingyangmycin), 부설판(busulfan), 메토트렉세이트(methotrexate), 아포모르핀(apomorphine) 및 니트로푸란토인(nitrofurantoin); 가슴에 대한 방사선 요법.
특정 구현예에서, 본 발명의 용도를 위한 CNNM4 억제제는 약학적 조성물의 일부를 형성하여 투여될 수 있으며, 여기서 CNNM4 억제제는 약학적으로 허용 가능한 부형제와 함께 투여된다. 따라서, 본 발명은 약제 내 사용하기 위한 (즉, 치료로서) 본원에 기재된 CNNM4 억제제 및 약학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하는 약학적 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 나아가, 대상 내에서 급성 또는 만성 질환 치료에 사용하기 위한, 본원에 기재되는 CNNM4 억제제 및 약학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하는 약학적 조성물에 관한 것으로, 상기 질환은 바람직하게 간 질환, 신장 질환 및 폐 질환으로 이루어지는 군으로부터 선택된다.
본원에서 "약학적 조성물"은 생리학적으로 허용되고, 인간 또는 동물에 투여될 때 전형적으로 알러지 반응 또는 위 장애, 현기증 등과 같은 유사한 유리하지 않은 반응을 생산하지 않는 조성물 및 분자를 의미한다. 바람직하게, 용어 "약학적으로 허용 가능한"은 주 또는 연방 정부의 규제 기관에 의하여 승인되거나 미국 약전 또는 동물, 더 구체적으로 인간 내 사용을 위하여 기타 일반적으로 인지되는 약전에 포함됨을 의미한다.
용어 "부형제"는 활성 성분과 함께 투여되는 베히클, 희석제 또는 보조제를 의미한다. 그러한 약학적 부형제는 물, 및 피넛 오일, 대두유, 미네랄 오일, 참깨 오일 등과 같은, 석유, 동물성, 식물성 또는 합성 기원의 것들을 포함하는 오일과 같은 살균액일 수 있다. 특히 주사 용액을 위한 물 또는 식염수 및 덱트스로스 및 글리세롤 수용액이 바람직하게 베히클로서 사용된다. 적합한 약학적 베히클이 E.W. Martin, 21st Edition, 2005의 "Remington's Pharmaceutical Sciences"에; 또는 "Handbook of Pharmaceutical Excipients" Rowe C. R.; Paul J. S.; Marian E. Q., sixth Edition에 기재되어 있다.
적절한 양의 상기 억제제는 약학적으로 허용 가능한 부형제 및/담체와 함께 제제화되어 약제 내 사용하기 위한, 특히 간 질환, 신장 질환 및/또는 폐 질환 치료에 사용하기 위한 약학적 조성물을 제공할 수 있다.
적합한 약학적으로 허용 가능한 베히클은, 예를 들어, 물, 염 용액, 알코올, 식물성 오일, 폴리에틸렌 글리콜, 젤라틴, 락토스, 아밀로스, 마그네슘 스테아레이트, 활석, 계면활성제, 규산, 점성 파라핀, 퍼퓸 오일, 지방산의 모노글리세라이드 및 디글리세라이드, 지방산 에스테르 페트로에트랄(petroetrals), 히드록시메틸 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈 등을 포함한다.
상기한 억제제를 포함하는 약학적 조성물은 선택된 투여 경로, 예를 들어 전신 (예를 들어, 정맥내, 피하, 근육내 주사), 경구, 비경구 또는 국소 투여에 적합한 것으로 간주되는 임의의 약학적 제형일 수 있으며, 이를 위하여 이는 원하는 투여 방법의 제제화에 필요한 약학적으로 허용 가능한 부형제를 포함할 것이다. 또한, 상기 억제제를 포함하는 조성물을 비내(intranasally) 또는 설하(sublingually) 투여하는 것 또한 가능하며, 이는 비-침습 방식 투여에 의한 전신 투여를 허용한다. 정맥내 투여 또한 적절할 수 있다. 바람직한 구현예에서, 투여 경로는 정맥내 경로이다. 대안적으로 바람직한 구현예에서, 투여 경로는 피하 경로이다.
필요할 경우, 본 발명의 사용을 위한 억제제는 가용화제 및 국소 마취제를 또한 포함하는 조성물 내 포함되어 주사 부위에서 통증을 완화한다. 일반적으로, 성분들은 개별적으로 공급되거나, 또는 예를 들어, 활성 제제의 양을 나타내는 앰풀 또는 봉지와 같은 완전 밀봉된 용기 내에 동결건조된 분말 또는 물이 없는 농축액으로서, 단위 제형 내에 함께 혼합된다. 조성물이 주입에 의하여 투여되고자 할 경우, 이는 약학적 등급 살균수 또는 식염수를 함유하는 주입 보틀을 이용하여 분배될 수 있다. 조성물이 주사에 의하여 투여되는 경우, 투여 전 성분들이 혼합될 수 있도록 주사용 살균수 또는 식염수의 앰풀이 제공될 수 있다.
정맥내 투여 이외의 경우, 조성물은 소량의 습윤 또는 유화제, 또는 pH 완충제를 함유할 수 있다. 상기 조성물은 액체 용액, 현탁액, 에멀젼, 겔, 폴리머, 또는 지속 방출 제제일 수 있다. 상기 조성물은 당업계에 알려진 전형적인 바인더 및 담체와 함께 제제화될 수 있다. 제제는 약학적 등급의 만니톨, 락토스, 전분, 마그네슘 스테아레이트, 소듐 사카라이드, 셀룰로스, 마그네슘 카보네이트 등과 같은 표준 담체, 약제 제조에 있어 잘 확립된 기능성을 가지는 불활성 담체를 포함할 수 있다. 리포솜, 미립자, 미세캡슐 등 내 캡슐화를 포함하는 다양한 전달 시스템이 알려져 있으며, 이를 이용하여 본 발명의 치료제를 투여할 수 있다.
경구 투여를 위한 고체 제형은 전형적인 캡슐제, 지속 방출 캡슐제, 전통적인 정제, 지속 방출 정제, 씹어 먹는 정제, 설하정, 발포정, 환제, 현탁액, 분말, 과립 및 겔을 포함할 수 있다. 이러한 고체 제형에서, 활성 화합물은 수크로스, 락토오스 또는 전분과 같은 적어도 하나의 불활성 부형제와 혼합될 수 있다. 이러한 제형은 또한, 정상적 실행으로서, 불활성 희석제 이외의 추가적인 물질, 예를 들어 마그네슘 스테아레이트와 같은 윤활제를 포함할 수 있다. 캡슐제, 정제, 발포정 및 환제의 경우, 그 제형들은 또한 완충제를 포함할 수 있다. 정제 및 환제는 장용 코팅을 가지고 제조될 수 있다.
경구 투여를 위한 액체 제형은 물과 같이 당업계에서 통상적으로 사용되는 약학적으로 허용 가능한 불활성 희석제를 함유하는 에멸젼, 용액, 현탁액, 시럽 및 엘릭시르제를 포함할 수 있다. 이들 조성물은 또한 습윤제, 유화 및 현탁제, 및 감미제, 향료 및 향수와 같은 보조제를 포함할 수 있다.
주사용 제제, 예를 들어, 수성 또는 유성 현탁액, 살균 주사액이 적합한 분산제, 습윤제 및/또는 현탁제를 이용하여 공지 기술에 따라 제제화될 수 있다. 사용될 수 있는 허용 가능한 베히클 및 용매 중, 물, 링거액 및 등장성 염화나트륨 용액이 있다. 살균 오일 또한 용매 또는 현탁 매질로서 통상적으로 사용된다.
국소 투여를 위하여, 본 발명의 화합물은, 예를 들어, 유화제, 계면활성제, 증점제, 착색제 및 이의 조합과 같은 적합한 부형제를 사용하는 전형적인 방법에 따라 제제화될 수 있는, 크림, 겔, 로션, 액제, 포마드, 분무액, 분산액, 고체 바, 에멀젼, 마이크로에멀젼 등으로 제제화될 수 있다.
부가적으로, 상기 억제제는 경피 패치 또는 이온도입 장치 형태로 투여될 수 있다. 적합한 경피 패치는 당업계에 알려져 있다.
예를 들어, 리포솜 내 캡슐화, 마이크로버블, 에멀젼, 미립자, 마이크로캡슐, 양이온성 지질 등을 포함하는, 몇몇 약물 전달 시스템이 공지되어 있으며, 이를 이용하여 상기 억제제를 투여할 수 있다. 양이온성 지질은 "bolaamphiphiles" 또는 "bolas"로도 언급되며, 하나 이상의 양전하로 하전된 헤드기를 각각의 말단에 가지는 소수성 사슬로 구성된다. 요구되는 투여량을 단일 단위로서 또는 지속 방출 형태로 투여할 수 있다. 비-침습성 특정 치료의 비-제한적 예는: 렌티바이러스 및 아데노바이러스와 같은, 폐에 기도 유전자 전달을 위한 바이러스 벡터의 사용, 및 흡입에 의하여 폐에 국소적으로 투여될 수도 있는, 폴리머에 기초한 나노기술을 포함한다. 투여 방식은 네뷸라이저, 정량식 흡입기(metered-dose inhaler), 및 건조 분말 흡입기를 포함하는, 호흡기 전달을 위하여 가장 통상적으로 사용되는 장치들 중 임의의 것을 이용하는 것들과 같이, 당업계에 알려진 임의의 기법일 수 있다.
지속 방출 형태 및 그 제조를 위한 적절한 물질 및 방법은 예를 들어 "Modified-Release Drug Delivery Technology", Rathbone, M. J. Hadgraft, J. and Roberts, M. S. (eds.), Marcel Dekker, Inc., New York (2002), "Handbook of Pharmaceutical Controlled Release Technology", Wise, D. L. (ed.), Marcel Dekker, Inc. New York, (2000)에 기재되어 있다. 본 발명의 일 구현예에서, 본 발명에 따른 억제제의 경구 투여 형태는 적어도 하나의 코팅 또는 매트릭스를 더 포함하는 지속 방출 형태이다. 상기 코팅 또는 지속 방출 매트릭스는, 제한없이, 천연 폴리머, 반합성 또는 합성 수-불용성, 개질된 왁스, 지방, 지방 알코올, 지방산, 천연, 반합성 또는 합성 가소제, 또는 이의 조합을 포함한다. 예를 들어, Johnson, J. L., "Pharmaceutical tablet coating", Coatings Technology Handbook (Second Edition), Satas, D. and Tracton, A. A. (eds), Marcel Dekker, Inc. New York, (2001), Carstensen, T., "Coating Tablets in Advanced Pharmaceutical Solids", Swarbrick, J. (ed.), Marcel Dekker, Inc. New York (2001), 455-468에 기재된 바와 같은, 당업계의 전문가에게 공지된 전형적인 공정을 시용하여 장용 코팅을 적용할 수 있다.
구현예에서, CNNM4 억제제는 siRNA이다. siRNA의 생체내 전달 방법은 당업계에 공지되어 있다 (Davis, M. E. et al., Nature 2010 April 15; 464(7291): 1067-1070).
구현예에서, siRNA는 적어도 하나의 리간드에 컨쥬게이션된다. 상기 리간드는 바람직하게 표적 세포 표면 상에 노출되는 수용체에 특이적이다. 간세포에 표적화될 siRNAs에 대하여, 상기 적어도 하나의 리간드는 바람직하게 GalNAc 또는 GalNAc 유도체이다.
특정 구현예에서, siRNA는 0.1μg/μl 내지 2,5 μg/ml의 농도로 사용된다. 바람직한 구현예에서, siRNA는 적어도 0.1μg/μl, 적어도 0.2μg/μl, 적어도 0.3μg/μl, 적어도 0.4μg/μl, 적어도 0.5μg/μl, 적어도 0.6μg/μl, 적어도 0.7μg/μl, 적어도 0.8μg/μl, 적어도 0.9μg/μl, 적어도 1 μg/μl, 적어도, 1.1 μg/μl, 적어도 1.2μg/μl, 적어도 1.3μg/μl, 적어도 1.4μg/μl, 적어도 1.5μg/μl, 적어도 1.6μg/μl, 적어도 1.7μg/μl, 적어도 1.8μg/μl, 적어도 1.9μg/μl, 적어도 2 μg/μl, 적어도 2.1μg/μl, 적어도 2.2μg/μl, 적어도 2.3μg/μl, 적어도 2.4μg/μl, 적어도 2.5 μg/μl, 또는 그 이상의 농도로 사용된다. 다른 바람직한 구현예에서, siRNA는 0.75 μg/μl의 농도로 사용된다.
특정 구현예에서, siRNA는 환자 kg 당 0.1 내지 10 mg의 투여량으로 사용된다. 바람직한 구현예에서, siRNA는 적어도 0.1 mg/kg, 적어도 0.5 mg/kg, 적어도 1 mg/kg, 적어도 5 mg/kg, 적어도 10 mg/kg의 투여량으로 사용된다.
바람직한 구현예에서, CNNM4 억제제는 1일 1회, 1일 2회, 1일 3회, 또는 그 이상 투여된다. 다른 바람직한 구현예에서, CNNM4 억제제는 1주 1회, 1주 2회, 1주 3회, 1주 4회, 1주 5회, 1주 6회, 1주 7회, 또는 그 이상 투여된다. 더 바람직한 구현예에서, CNNM4 억제제는 1주 2회 투여된다.
대안적으로, 본 발명은 본 발명에 따른 CNNM4 억제제 또는 약학적 조성물을 이를 필요로 하는 대상에 투여하는 단계를 포함하는, 간 질환, 신장 질환 및/또는 폐 질환의 치료 방법에 관한 것이다. 앞서 기재된 모든 용어 및 구현예들이 본 발명의 이러한 측면에 동일하게 적용될 수 있다.
대안적으로, 본 발명은 간 질환, 신장 질환 및/또는 폐 질환 치료용 약제 제조를 위한, 본 발명에 따른 CNNM4 억제제 또는 약학적 조성물에 관한 것이다. 앞서 기재된 모든 용어 및 구현예들이 본 발명의 이러한 측면에 동일하게 적용될 수 있다.
간 질환, 신장 질환 또는 폐 질환의 진단 방법
다른 측면에서, 본 발명은
(a) 대상으로부터의 샘플 내 CNNM4 발현 수준을 측정하는 단계, 및
(b) 상기 수준을 기준값과 비교하는 단계
를 포함하는, 대상에서 간 질환, 신장 질환 또는 폐 질환을 진단하는 시험관내 방법으로서,
상기 기준값에 대한 상기 샘플 내 증가된 CNNM4 발현 수준은 그 환자가 간 질환, 신장 질환 또는 폐 질환을 겪는다는 것을 나타내는, 방법에 관한 것이다.
용어 "간 질환", "신장 질환", "폐 질환", "대상", "CNNM4 유전자" 및 "기준값"은 본 발명의 다른 측면과 관련하여 앞서 정의되었다. 본 발명의 다른 측면들의 모든 특정 및 바람직한 구현예들이 이 측면에 전적으로 적용된다.
본원에서 용어 "진단"은 대상 내 가능한 질환을 결정 및/또는 확인하려는 과정, 즉 진단적 절차, 및 이러한 과정에 의하여 도달되는 의견, 즉 진단 의견 모두에 관한 것이다. 이와 같이, 이는 또한 개체의 상태를 처리 및 예후에 대한 의학적 결정이 내려지는 것을 허용하는 별개의 구분된 카테고리로 분류하는 시도로서 간주될 수 있다. 당업자가 이해하는 바와 같이, 이러한 진단은 진단 대상의 100%에 대하여 정확할 수는 없을 수 있으나, 바람직하게 그러하다. 그러나, 상기 용어는 대상들의 통계학적으로 유의한 부분이 질환, 특히 본 발명의 문맥상 간 질환, 신장 질환 또는 폐 질환을 겪거나, 이에 걸리기 쉬운 것으로 확인될 수 있음을 요한다. 당업자는 잘 알려진 통계학적 평가 도구를 이용하여, 예를 들어, 신뢰 구간 결정, p-값 결정, Student's-test, Mann-Whitney 등 (Dowdy and Wearden, 1983 참조)에 의하여, 부분이 통계학적으로 유의한지 여부를 결정할 수 있을 것이다. 바람직한 신뢰 구간은 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%>, 적어도 80%>, 적어도 90%, 또는 적어도 95%이다. p-값은 바람직하게 0.05, 0.025, 0.01 또는 그 이하이다. 본원에서 용어 "진단하는"은 어떠한 질환 또는 상태가 개인의 증상 및 신호를 설명하는지를 결정하는 과정을 의미한다.
특정 구현예에서, 본 발명의 간, 신장 또는 폐 질환 진단 방법은 CNNM4 발현 수준을 측정하는 단계를 포함한다. CNNM4 발현 수준을 측정하는 방법은 본원에 어딘가에 개시된다. 바람직한 구현예에서, 본 발명의 간, 신장 또는 폐 질환 진단 방법은 CNNM4 단백질 발현 수준을 측정하는 단계를 포함한다. 더 바람직한 구현예에서, 본 발명의 간, 신장 또는 폐 질환 진단 방법은 면역조직화학에 의하여 CNNM4 단백질 발현 수준을 측정하는 단계를 포함한다.
구현예에서, CNNM4 단백질의 발현 수준이 기준값에 대하여 증가될 때, 환자는 간 질환, 신장 질환 및/또는 폐 질환을 겪는다. CNNM4 발현 수준을 측정하는 방법은 앞서 개시되었다. 구현예에서, CNNM4의 발현 수준이 기준값에 대하여 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 100%, 또는 그 이상 증가할 때, 환자는 간 질환, 신장 질환 및/또는 폐 질환을 겪는 것으로 진단된다.
본원에서 "샘플" 또는 "생물학적 샘플"은 대상으로부터 분리된 생물학적 물질을 의미한다. 샘플은 유전자 발현 수준을 검출하는데 적합한 임의의 물질을 함유할 수 있고, 대상의 유전 물질을 포함하는 물질일 수 있다. 상기 생물학적 샘플은 대상의 세포 및/또는 비-세포성 물질, 바람직하게 세포성 물질을 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 상기 샘플은 연구 중인 대상의 유전 물질, 예를 들어, DNA, 게놈 DNA (gDNA), 상보 DNA (cDNA), RNA, mRNA 등을 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 유전 물질은 RNA이다. 상기 샘플은 예를 들어 혈액, 타액, 혈장, 혈청, 소변, 뇌척수액(CSF), 대변, 코, 구강 또는 구강-인두 면봉 시료, 시편, 생검으로부터 얻어진 시편, 및 파라핀 내 임베드된 조직 샘플, 간, 폐 또는 신장 조직과 같은, 임의의 생물학적 조직 또는 유체로부터 분리될 수 있다. 샘플을 분리하기 위한 절차는 당업자에게 잘 알려져 있다. 상기 생물학적 샘플은 CNNM4 발현 수준을 검출하기에 적합한 임의의 생물학적 물질을 함유할 수 있고, 대상으로부터 세포성 및/또는 비-세포성 물질을 포함할 수 있다. 바람직하게, CNNM4 발현 수준 측정을 위하여 사용되는 샘플은 최소 침습 절차를 이용하여 얻어질 수 있는 샘플이다. 바람직한 구현예에서, 샘플은 간, 신장 및/또는 폐 샘플 또는 생검이다.
샘플을 분석하기 전에, 상기 샘플을 제조하여 샘플 내에 있는 다른 분자들로부터 측정될 분자를 분리하는 하나 이상의 작업을 수행하는 것이 종종 바람직할 것이다. 특정 구현예에서, 상기 분자들은 핵산, DNA 및/또는 RNA이다. 이러한 샘플 제조 작업은 세포내 물질(예를 들어, 조직 샘플로부터의 핵산/ 전세포 등)의 농축, 현탁, 추출, 핵산 증폭, 단편화, 전사, 라벨링 및/또는 연장 반응과 같은, 조작을 포함한다. 이러한 방법들은 당업자에게 잘 알려져 있다. 제한없이, Qiagen의 miRNeasy Mini Kit, miRNA Life Technologies isolation kits, Sigma-Aldrich의 mirPremier the microRNA isolation kit, 및 Roche의 High Pure miRNA Isolation Kit를 포함하는, mRNA 정제를 위한 상업적 키트가 또한 이용 가능하다. 특정 구현예에서, RNA의 온전성이 Agilent 2100 bionalizer (Agilent Technologies, Palo Alto, CA, USA) 내 RNA 600 Nano Chips를 이용하여 분석된다.
구현예에서, 환자가 간 질환, 신장 질환 및/또는 폐 질환을 겪는 것으로 진단될 때, 치료적으로 효과적인 양의 CNNM4 억제제가 상기 환자에 투여된다.
본원에서 용어 "치료적으로 효과적인 양"은 CNNM4의 발현을 억제할 수 있는 본 발명에 따른 억제제의 임의의 양으로서 이해된다. 바람직한 구현예에서, CNNM4 발현이 기준값에 대하여 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 100% 증가한 것으로 발견되는 경우, CNNM4 억제제의 치료적으로 효과적인 양이 환자에 투여된다.
바람직한 구현예에서, 상기 억제제는 중화 항체 또는 그의 기능성 단편, 길항제, 가용성 결합 단백질, 가용성 변이 수용체, 비-기능성 유도체, 안티센스 폴리뉴클레오티드, RNA 간섭 올리고뉴클레오티드, 포스포로디아미데이트 모르폴리노 올리고머(PMO), miRNA, siRNA, shRNA, sgRNA, 안티센스 RNA, 다이서-기질 27-머 듀플렉스, 압타머, DNAzyme, 리보자임, 트리플렉스 형성 올리고뉴클레오티드(TFO), 소분자 및 이의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택된다. 더 바람직한 구현예에서, siRNA는 서열 번호 13, 서열 번호 14, 서열 번호 50, 또는 서열 번호 51의 핵산 서열 중 적어도 하나 또는 표 1에 나타내는 서열 번호들을 가지는 서열들 중 임의의 것을 포함한다. 더 바람직한 구현예에서, siRNA는 서열 번호 7 및 서열 번호 8의 핵산 서열을 포함한다.
바람직한 구현예에서, 간 질환은 간 섬유증, 간정맥폐색성질환, 약인성 간손상(DILI), 지방증, 비알코올성 지방간염(NASH)), 간경병증, 간세포암종(HCC), 버드-키아리 증후군, 및 간염으로부터 선택된다. 다른 바람직한 구현예에서, 신장 질환은 급성 신손상(AKI)), 만성 신장 질환, 신장염, 신증 및 신장 섬유증으로부터 선택된다. 다른 바람직한 구현예에서, 폐 질환은 폐 섬유증이다.
앞서 기재된 모든 용어 및 구현예들이 본 발명의 이러한 측면에 동일하게 적용될 수 있다.
질환의 시험관내 진단을 위한 시약의 용도
추가적 측면에서, 본 발명은 대상 내에서 간 질환, 신장 질환 또는 폐 질환을 시험관내 진단하기 위한, CNNM4 발현 수준 측정에 특이적인 시약의 용도에 관한 것이다.
CNNM4 발현 수준 측정에 특이적인 시약은 키트 포맷으로 제시될 수 있다. 본 발명의 문맥상, "키트" 또는 "분석 장치"는 그의 운반 및 저장을 허용하도록 패킹된, CNNM4 발현 수준 측정 방법을 수행하기 위하여 필요한 상이한 시약들을 함유하는 제품 또는 장치로서 이해된다. 상기 키트의 컴포넌트들을 패킹하는데 적합한 물질은 결정, 플라스틱 (폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리카보네이트 등), 보틀, 바이알, 페이퍼, 엔빌로프 등을 포함한다. 부가적으로, 상기 키트는 키트 내에 있는 상이한 성분들의 동시, 순차적 또는 개별 사용을 위한 설명서를 포함할 수 있다. 상기 설명서는 인쇄된 물질 형태, 또는 전자 저장 매체(자기 디스크, 테이프 등), 광학 매체(CD-ROM, DVD) 등과 같은, 대상이 이를 읽을 수 있도록 설명서를 저장할 수 있는 전자 지원 형태일 수 있다. 부가적으로 또는 대안적으로, 상기 매체는 상기 설명서를 제공하는 인터넷 주소를 포함할 수 있다.
"CNNM4 발현 수준 측정에 특이적인 시약"이라는 표현은 mRNA 수준 측정에 의하여 또는 단백질 수준 측정에 의하여, 유전자 발현 수준의 측정을 허용하는 화합물 또는 화합물들의 세트를 의미한다. 따라서, 첫 번째 유형의 시약들은 상기 유전자에 의하여 인코딩되는 mRNAs와 특이적으로 혼성화할 수 있는 프로브를 포함한다. 두 번째 유형의 시약들은 마커 유전자에 의하여 인코딩되는 단백질과 특이적으로 결합하는 화합물들을 포함하고, 바람직하게 항체를 포함하나, 이들은 특이적 압타머일 수 있다.
따라서, 특정 구현예에서, CNNM4 발현 수준 측정에 특이적인 시약은 CNNM4의 mRNA에 특이적으로 혼성화하는 프로브들의 세트, 및 CNNM4의 mRNAs를 특이적으로 증폭시킬 수 있는 프라이머 쌍들의 세트로 이루어지는 군으로부터 선택되거나, 상기 CNNM4 발현 수준 측정에 특이적인 시약은 CNNM4 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하는 항체이다.
바람직한 구현예에서, 상기 CNNM4 발현 수준 측정에 적합한 시약들은 그 키트를 형성하는 유전자들의 발현 수준을 측정하는데 적합한 시약들의 총량의 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 또는 적어도 100%를 포함한다.
바람직한 구현예에서, 본 발명의 키트의 첫 번째 컴포넌트는 앞서 언급한 유전자에 특이적으로 혼성화할 수 있는 프로브를 포함한다.
본원에서 용어 "특이적으로 혼성화하는"은 고도로 엄격한 조건 또는 중간 정도로 엄격한 조건 하에 두 폴리뉴클레오티드의 혼성화를 허용하는 상태를 의미한다.
혼성화의 "엄격성"은 당업자에 의하여 쉽게 결정될 수 있으며, 일반적으로 프로브 길이, 세척 온도 및 염 농도에 따른 경험적 계산이다. 일반적으로, 더 긴 프로브는 적절한 어닐링을 위하여 더 높은 온도를 필요로 하는 반면, 더 짧은 프로브는 더 낮은 온도를 필요로 한다. 혼성화는 일반적으로 상보적 가닥이 그 용융 온도 아래 환경에 존재할 때 변성된 DNA가 재결합(reanneal)하는 능력에 따른다. 프로브와 혼성화 가능한 서열 사이의 원하는 상동 정도가 높을수록, 사용 가능한 상대 온도가 높다. 그 결과, 더 높은 상대 온도는 반응 조건을 더 엄격하게 만드는 경향이 있는 반면, 더 낮은 온도는 덜 엄격하게 만드는 경향이 있다. 혼성화 반응의 엄격성에 대한 추가적인 세부 사항 및 설명에 대해서는, Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers, (1995)를 참조한다.
본원에서 정의되는 "엄격한 조건" 또는 "높은 엄격성 조건"은 전형적으로: (1) 세척을 위하여 낮은 이온 강도 및 고온, 예를 들어 50℃에서 0.015 M 염화나트륨/0.0015 M 시트르산 나트륨/0.1% 소듐 도데실 설페이트를 사용하거나; (2) 42℃에서, 포름아미드, 예를 들어, 750 mM 염화나트륨, 75 mM 시트르산 나트륨과, 0.1% 소 혈청 알부민/0.1% Ficoll/0.1% 폴리비닐피롤리돈/50 mM 인산나트륨 완충액 pH 6.5를 가지는 50%(v/v) 포름아미드와 같은, 변성제를 혼성화 동안 사용하거나; (3) 42℃에서 50% 포름아미드, 5xSSC (0.75 M NaCl, 0.075 M 시트르산 나트륨), 50 mM 인산나트륨 (pH 6.8), 0.1% 피로인산나트륨, 5x Denhardt's 용액, 초음파 처리된 salmon sperm DNA (50 ㎍/ml), 0.1% SDS, 및 10% 덱스트란 설페이트와, 0.2xSSC (염화나트륨/시트르산나트륨) 및 50% 포름아미드 내에서 42℃에서 세척 후, 55℃에서 EDTA를 함유하는 0.1xSSC로 이루어지는 고-엄격성 세척을 사용한다.
"중간 정도로 엄격한 조건"은 by Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Press, 1989에 기재되는 바와 같이 확인될 수 있으며, 앞서 기재한 것보다 덜 엄격한 세척액 및 혼성화 조건(예를 들어, 온도, 이온 강도 및 %SDS)의 사용을 포함한다. 중간 정도로 엄격한 조건의 예는 20% 포름아미드, 5xSSC (150 mMNaCl, 15 mM 트리소듐 시트레이트, 50 mM 인산나트륨(pH 7.6), 5x Denhardt's 용액, 10% 덱스트란 설페이트, 및 20 mg/ml 변성 전단화된 salmon sperm DNA를 포함하는 용액 내에서 37℃에서 밤새 인큐베이션 후, 약 37-50℃에서 1xSSC 내 필터 세척이다. 당업자는 프로브 길이 등과 같은 인자를 조정하기 위하여, 필요에 따라 어떻게 온도, 이온 강도 등을 조절하는지를 인식할 것이다.
상기 유전자에 의하여 인코딩되는 폴리펩타이드 수준을 측정함으로써 CNNM4 발현 수준이 측정되는 경우, 본 발명에 따른 키트는 상기 폴리펩타이드에 특이적으로 결합할 수 있는 시약들을 포함한다. 이를 위하여, De Wildt et al. (2000) Nat. Biotechnol. 18:989-994; Lueking et al. (1999) Anal. Biochem. 270:103-111; Ge et al. (2000) Nucleic Acids Res. 28, e3, I-VII; MacBeath and Schreiber (2000) Science 289:1760-1763; WO 01/40803 및 WO 99/51773A1에 기재된 것들과 같은 항체 배열이 유용할 수 있다. 상기 배열의 항체는 IgG, IgM, IgA, IgD and IgE, 및 Fab', Fab, F(ab')2와 같은 항원 결합 부위를 가지는 항체와 유사한 분자, 단일 도메인 항체 또는 DABS, Fc, scFv 등을 포함하는, 고친화성으로 리간드에 결합할 수 있는 임의의 면역제를 포함한다. 상기 항체의 제조를 위한 기법은 당업자에게 매우 잘 알려져 있으며, Ausubel et al. (Current Protocols in Molecular Biology, eds. Ausubel et al, John Wiley & Sons (1992))에 기재된 방법들을 포함한다.
상기 배열의 항체는 예를 들어 상업적으로 이용 가능한 로봇 시스템(예를 들어, Genetic Microsystems 또는 Biorobotics에서 생산된 것들)을 이용하여, 고속으로 적용될 수 있다. 상기 배열의 기질은 니트로셀룰로스, 플라스틱, 결정일 수 있거나, 또는 예를 들어, 아크릴아미드, 아가로스 또는 다른 폴리머와 같은 다공성 물질일 수 있다. 다른 구현예에서, 배열 필터 내 배양에 의하여 본 발명의 단백질을 검출하기 위하여 특이적 항체를 생산하는 세포를 이용할 수 있다. 항체 발현 유도 후, 이는 생산 세포가 위치하는 배열 포지션에서 필터 내 고정된다. 항체 배열은 표지된 표적과 접촉될 수 있고, 고정된 항체에 대한 표적의 결합 수준이 측정될 수 있다. 표적이 표지되지 않은 경우, 지지체 내 고정되는 폴리펩타이드에 결합하는 폴리펩타이드에 특이적인 두 번째 표지된 항체가 사용되는, 샌드위치 타입 분석을 이용할 수 있다. 배열의 각각의 지점에서 샘플 내 존재하는 폴리펩타이드의 양의 정량을 발현 프로필로서 데이터베이스 내에 저장할 수 있다. 항체 배열은 이중으로 생산되고, 두 가지 다른 샘플들의 결합 프로필을 비교하는 데에 이용될 수 있다.
구현예에서, 본 발명은 CNNM4 유전자에 의하여 인코딩되는 폴리펩타이드의 평균 발현 수준의 측정에 적합한 시약을 포함하는 키트 또는 분석 장치의 용도에 관한 것으로, 시약은 상기 유전자에 의하여 인코딩되는 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항체들의 세트이고, 상기 시약은 상기 키트 내에 존재하는 시약들의 적어도 10%를 구성한다.
특정 측면에서, 본 발명은 간, 신장 또는 폐 질환을 겪는 환자의 예후의 결정을 위한 본 발명의 키트의 용도에 관한 것이다. 바람직한 구현예에서, 상기 간 질환은 간 섬유증, 간정맥폐색성질환, 약인성 간손상(DILI), 지방증, 비알코올성 지방간염(NASH)), 간경병증, 간세포암종(HCC), 버드-키아리 증후군, 및 간염으로부터 선택된다. 다른 바람직한 구현예에서, 신장 질환은 급성 신손상(AKI)), 만성 신장 질환, 신장염, 신증 및 신장 섬유증으로부터 선택된다. 다른 바람직한 구현예에서, 폐 질환은 폐 섬유증이다.
앞서 기재된 모든 용어 및 구현예들이 본 발명의 이러한 측면에 동일하게 적용될 수 있다.
유발된 질환 또는 상태의 감소 방법
마지막 측면에서, 본 발명은 세포 내에 유발된 질환 또는 상태를 감소시키는 시험관내 방법으로서, 상기 방법은 상기 세포를 특이적 CNNM4 억제제와 상기 세포 내 CNNM4 활성, 수준 또는 기능을 감소시키기에 효과적인 양으로 접촉시키는 단계를 포함한다.
본원에서 용어 "세포 내에 유발된 질환 또는 상태를 감소시키는 방법"은 상기 질환의 세포 모델 내에 유발된 질환의 특징적인 바이오마커 수준 증가 또는 감소를 관찰하는 방법을 의미한다. 특정 구현예에서, 상기 세포 내에 유발된 질환 또는 상태는 유발된 CNNM4-매개 질환 또는 상태이고, 상기 질환은 기준값에 대하여 증가된 CNNM4 발현에 부합한다. 구현예에서, 기준값에 대하여 증가된 CNNM4 발현에 부합하는, 상기 유발된 CNNM4-매개 질환 또는 상태는 기준값에 대하여 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 100%, 또는 그 이상 증가된 CNNM4 발현 수준을 특징으로 한다. 구현예에서, 상기 기준값은 상기 CNNM4-매개 질환 또는 상태가 유발되지 않은, 동일 세포계 내 CNNM4 발현 수준에 해당한다. 상기 CNNM4-매개 질환 또는 상태가 유발되지 않은 동일 세포계는 대조군으로서 사용될 수 있다.
구현예에서, 세포 내에 유발된 질환 또는 상태는 DILI, 지방증, NASH, 간경병증, HCC, 간 섬유증, 신장 섬유증 또는 폐 섬유증 연구를 위한 질환 모델이다. 구현예에서, 세포 내에 유발된 질환 또는 상태는 배양 내 모델 세포계를 의미한다. 구현예에서, 상기 세포 배양은 일차 세포 배양이다. 구현예에서, 상기 유발된 질환 또는 상태는 세포 배양 전에 동물 모델 내에 유발된다. 특정 실시예에서, 상기 세포 내에 유발된 질환 또는 상태는 일차 간세포 내 유발된 NASH이다.
특정 구현예에서, 상기 동물 모델은, 상기 동물에 (즉, C57BL/6J 야생형 마우스) 메티오닌(0.1%) 및 콜린(0%) 결핍 식이를 4 주 동안 제공한 다음, 간을 수확하고 관련 세포를 배양함으로써 NAFLD가 유발된, NAFLD 동물 모델이다.
특정 구현예에서, 상기 동물 모델은, 상기 동물을 (즉, C57BL/6J 야생형 마우스) 담관 결찰하고, 1 내지 21일 후 상기 동물을 희생시키고, 간을 수확하고, 관련 세포를 배양함으로써, 간경변증이 유발된, 간경병증 동물 모델이다.
특정 구현예에서, 상기 동물 모델은, HCC 동물 모델, 어덜트 GNMT-/- 마우스에 자발적으로 HCC가 발생한, 간세포암종(HCC) 동물 모델이다. 동물을 7 내지 9 개월 동안 유지하고, 희생시키고, 간을 수확하고, 관련 세포를 배양한다.
특정 구현예에서, 상기 동물 모델은, 상기 동물을 (즉, 어덜트 C57BL/6J 야생형 마우스)을 아세트아미노펜(APAP), 500 mg/kg으로 처리하여 급성 간 손상을 유발함으로써 DILI가 유발된, 약인성 간 손상(DILI) 동물 모델이다. 48 시간 후, 동물을 희생하고, 간을 수확하고, 관련 세포를 배양한다.
본원에서 용어 "바이오마커"는 특정 질환 모델에서 진행을 모니터링하기 위하여 요구되는 관련 판독 출력(read-out)을 의미한다. 특정 구현예에서, 상기 바이오마커는 CNNM4의 발현 수준이다. 특정 구현예에서, 상기 바이오마커는 상대 지질 축적이다. 특정 구현예에서, 상기 바이오마커는 상대 미토콘드리아 ROS (반응성 산소종)이다. 특정 구현예에서, 상기 바이오마커는 TUNEL 양성 세포의 백분율 값이다. 특정 구현예에서, 상기 바이오마커는 세포내 마그네슘 축적 수준이다.
다른 구현예에서, 본 발명은 세포 내에 유발된 CNNM4-매개 질환 또는 상태를 감소시키는데 잠재적으로 유용한 화합물을 확인하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 상기 세포를 후보 화합물과 상기 세포 내 CNNM4 활성, 수준 또는 기능을 감소시키기에 효과적인 양으로, 또는 기준값에 대하여 상대 지질 축적을 감소시키거나상대 미토콘드리아 ROS를 감소시키기에 효과적인 양으로 접촉시키는 단계를 포함하고, 여기서 세포 내 유발된 CNNM4-매개 질환 또는 상태에서, CNNM4 활성을 억제하고, 기준값에 대하여 상대 지질 축적을 감소시키거나 기준값에 대하여 상대 미토콘드리아 ROS를 감소시키는 후보 화합물은 CNNM4-매개 간, 신장 및/또는 폐 질환 치료 및/또는 예방에 잠재적으로 유용한 화합물로서 확인된다. 구현예에서, 상기 기준값은 CNNM4-매개 질환 또는 상태가 유발되었으나 상기 화합물에 노출되지 않은 동일 세포계 내 지질 축적 수준 또는 미토콘드리아 ROS 수준에 해당한다. CNNM4-매개 질환 또는 상태가 유발되지 않은 동일 세포계가 대조군으로 사용될 수 있다.
상기 세포 모델 시스템 내 지질 축적 또는 세포계 내 미토콘드리아 ROS 수준은 그 수준이 기준값에 대하여 적어도 5%, by 적어도 10%, by 적어도 15%, by 적어도 20%, by 적어도 25%, by 적어도 30%, by 적어도 35%, by 적어도 40%, by 적어도 45%, by 적어도 50%, by 적어도 55%, by 적어도 60%, by 적어도 65%, by 적어도 70%, by 적어도 75%, by 적어도 80%, by 적어도 85%, by 적어도 90%, by 적어도 95% or by 적어도 99% 감소할 때 감소된 것으로 간주된다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 CNNM4-매개 간, 신장 및/또는 폐 질환을 치료 및/또는 예방하는데 잠재적으로 유용한 화합물을 확인하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은:
(a) 상기 질환의 세포 모델을 후보 화합물과 접촉시키는 단계, 및
(b) 상기 후보 화합물의 존재 하에 마커를 분석하는 단계를 포함하고, 상기 마커는 화합물의 존재 하에 CNNM4 활성, 기준값에 대한 상대 지질 축적, 또는 기준값에 대한 상대 미토콘드리아 ROS로 이루어지는 군으로부서 선택되고,
CNNM4 활성을 억제하거나, 기준값에 대하여 상대 지질 축적을 감소시키거나, 기준값에 대하여 상대 미토콘드리아 ROS를 감소시키는 후보 화합물은 간 질환, 신장 질환 및/또는 폐 질환 치료 및/또는 예방에 잠재적으로 유용한 화합물로 확인된다.
특정 구현예에서, 상기 후보 화합물은 중화 항체 또는 그의 기능적 단편, 길항제, 가용성 결합 단백질, 가용성 변이 수용체, 비-기능성 유도체, 안티센스 폴리뉴클레오티드, RNA 간섭 올리고뉴클레오티드, 포스포로디아미데이트 모르폴리노 올리고머(PMO), miRNA, siRNA, shRNA, sgRNA, 안티센스 RNA, 다이서-기질 27-머 듀플렉스, 압타머, DNAzyme, 리보자임, 트리플렉스 형성 올리고뉴클레오티드(TFO), 소분자 및 이의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택된다.
앞서 기재된 모든 용어 및 구현예들이 본 발명의 이러한 측면에 동일하게 적용될 수 있다.
본 발명은 나아가 다음 측면들을 개시한다:
1. 약제 내 사용하기 위한 CNNM4 억제제.
2. 대상 내에서 급성 또는 만성 질환의 치료에 사용하기 위한 CNNM4 억제제로서, 상기 질환은 간 질환, 신장 질환 및 폐 질환으로 이루어지는 군으로부터 선택되는, CNNM4 억제제.
3. 측면 2에 있어서,
- 상기 간 질환은 간 섬유증(liver fibrosis), 간정맥폐색성질환(veno-occlusive liver disease), 약인성 간손상(drug-induced liver injury (DILI)), 지방증(steatosis), 비알코올성 지방간염(non-alcoholic steatohepatitis (NASH)), 간경병증(cirrhosis), 간세포암종(hepatocellular carcinoma (HCC)), 버드-키아리 증후군(Budd-Chiari syndrome) 및 간염(hepatitis)으로부터 선택되고;
- 상기 신장 질환은 급성 신손상(acute kidney injury (AKI)), 만성 신장 질환(chronic kidney disease), 신장염(nephritis), 신증(nephrosis) 및 신장 섬유증and renal fibrosis)으로부터 선택되고;
- 상기 폐 질환은 폐 섬유증(pulmonary fibrosis)인, CNNM4 억제제.
4. 측면 1 내지 3 중 어느 하나에 있어서,
상기 억제제는 중화 항체 또는 그의 기능적 단편, 길항제, 가용성 결합 단백질, 가용성 변이 수용체, 비-기능성 유도체, 안티센스 폴리뉴클레오티드, RNA 간섭 올리고뉴클레오티드, 포스포로디아미데이트 모르폴리노 올리고머(PMO), miRNA, siRNA, shRNA, sgRNA, 안티센스 RNA, 다이서-기질 27-머 듀플렉스, 압타머, DNAzyme, 리보자임, 트리플렉스 형성 올리고뉴클레오티드(TFO), 소분자 및 이의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택되는, CNNM4 억제제.
5. 측면 4에 있어서,
상기 소분자는 7-아미노-2-페닐-5H-티에노[3,2-c]피리딘-4-온 또는 2-[5-(4-옥소-2-티옥소-티아졸리딘-5-일리덴메틸)-퓨란-2-일]-벤조산인, CNNM4 억제제.
6. (a) 대상으로부터의 샘플 내 CNNM4 발현 수준을 측정하는 단계, 및
(b) 상기 수준을 기준값과 비교하는 단계
를 포함하는, 대상에서 간 질환, 신장 질환 또는 폐 질환을 진단하는 시험관내 방법으로서,
상기 기준값에 대한 상기 샘플 내 증가된 CNNM4 발현 수준은 그 환자가 간 질환, 신장 질환 또는 폐 질환을 겪는다는 것을 나타내는, 시험관내 방법.
7. 측면 6에 있어서,
상기 샘플은 간, 신장 또는 폐 생검인, 방법.
8. 측면 6 또는 7에 있어서,
- 상기 간 질환은 간 섬유증, 간정맥폐색성질환, 약인성 간손상(DILI), 지방증, 비알코올성 지방간염(NASH), 간경병증, 간세포암종(HCC) 및 버드-키아리 증후군, 간염으로부터 선택되고;
- 상기 신장 질환은 급성 신손상(AKI), 만성 신장 질환, 신장염, 신증 및 신장 섬유증으로부터 선택되고;
- 상기 폐 질환은 폐 섬유증인, 방법.
9. 대상에서 간 질환, 신장 질환 또는 폐 질환을 시험관내 진단하기 위한, CNNM4 발현 수준 측정에 특이적인 시약의 용도.
10. 측면 9에 있어서,
- 상기 간 질환은 간 섬유증, 간정맥폐색성질환, 약인성 간손상(DILI), 지방증, 비알코올성 지방간염(NASH), 간경병증, 간세포암종(HCC), 버드-키아리 증후군 및 간염으로부터 선택되고;
- 상기 신장 질환은 급성 신손상(AKI), 만성 신장 질환, 신장염, 신증 및 신장 섬유증으로부터 선택되고;
- 상기 폐 질환은 폐 섬유증인, 용도.
11. 측면 9 또는 10에 있어서,
상기 CNNM4 발현 수준 측정에 특이적인 시약은 CNNM4의 mRNA를 특이적으로 혼성화하는 프로브들의 세트, 및 CNNM4의 mRNAs를 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머 쌍들의 세트로 이루어지는 군으로부터 선택되거나, 상기 CNNM4 발현 수준 측정에 특이적인 시약은 CNNM4 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체인, 용도.
12. 세포 내에서 유발된 질환 또는 상태를 감소시키는 시험관내 방법으로서, 상기 유도된 질환 또는 상태는 DILI 연구를 위한 질환 모델, 지방증, NASH, 간경병증, HCC, 간 섬유증, 신장 섬유정 또는 폐 섬유증이고, 상기 방법은 상기 세포를 상기 세포 내 CNNM4 활성, 수준 또는 기능을 감소시키기에 효과적인 양의 특이적 CNNM4 억제제와 접촉시키는 단계를 포함하는, 시험관내 방법.
13. 세포 내에서 유발된 CNNM4-매개 질환 또는 상태를 감소시키는데 잠재적으로 유용한 화합물을 확인하는 시험관내 방법으로서,
상기 방법은 상기 세포를 후보 화합물과 상기 세포 내 CNNM4 활성, 수준 또는 기능을 감소시키기에 효과적인 양으로, 또는 기준값에 대하여 상대적 지질 축적을 감소시키거나 상대적 미토콘드리아 ROS를 감소시키기에 효과적인 양으로 접촉시키는 단계를 포함하고,
세포 내에서 유발된 CNNM4-매개 질환 또는 상태에서 CNNM4 활성을 억제하거나, 기준값에 대하여 상대적 지질 축적을 감소시키거나, 기준값에 대하여 상대적 미토콘드리아 ROS를 감소시키는 후보 화합물은 CNNM4-매개 간, 신장 및/또는 폐 질환을 치료 및/또는 예방하는데 잠재적으로 유용한 화합물로서 확인되는, 방법.
14. 측면 12 또는 13에 있어서,
상기 억제제 또는 상기 화합물은 중화 항체 또는 그의 기능적 단편, 길항제, 가용성 결합 단백질, 가용성 변이 수용체, 비-기능성 유도체, 안티센스 폴리뉴클레오티드, RNA 간섭 올리고뉴클레오티드, 포스포로디아미데이트 모르폴리노 올리고머(PMO), miRNA, siRNA, shRNA, sgRNA, 안티센스 RNA, 다이서-기질 27-머 듀플렉스, 압타머, DNAzyme, 리보자임, 트리플렉스 형성 올리고뉴클레오티드(TFO), 소분자 및 이의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택되는, 방법.
본 발명을 또한 다음 실시예에 의하여 기재할 것이며, 이 실시예들은 단지 예시적인 것이며 본 발명의 범위를 제한하지 않는 것으로 간주된다.
실시예
재료 및 방법
인간 샘플
모든 연구를 Declaration of Helsinki에 따라 및 현지 국법에 따라 수행하였다. 각각의 병원의 인간 윤리 위원회가 연구 절차를 승인하였으며, 연구에 포함되기 전에 모든 환자로부터 서면 동의를 얻었다.
8 건강한 샘플, 31 비만-진단 환자의 코호트 및 43 임상 시험 코호트로부터의 인간 혈청 샘플로부터 마그네슘을 정량하였다. 환자를 상이한 마커에 의하여 비-알코올성 지방간 질환(NAFLD), 알코올성 질환 및 바이러스성 간염에 대하여 평가하였다.
42 명의 환자: 건강한 환자 10명, 지방증 진단 환자 20 명, 및 NAFLD 진단 환자 12명, 의 코호트에서 비-알코올성 지방간 질환 NAFLD에서 인간 CNNM4 발현을 측정하였다.
5 명이 건강하고 7 명이 간경병증으로 진단된 12 명의 환자의 코호트에서 간경병증 환자 내 CNNM4 수준을 측정하였다.
47 명의 간세포암종(HCC) 환자의 CNNM4 수준 또한 측정하였다: 6 명의 환자는 건강하였고 41 명의 환자는 HCC 진단되었다.
11 명의 약인성 간 손상(DILI) 환자의 코호트 내에서 CNNM4 수준을 측정하고, 3 명의 건강한 환자와 비교하였다.
마지막으로, 신장 섬유증 인간 샘플 14 개를 분석하여 CNNM4 발현을 측정하였다. 7 샘플은 건강하였고, 다른 7 샘플은 신장 섬유증으로 진단되었다.
동물 실험
모든 동물 실험을 Spanish Guide for Care and use of Laboratory animals에 따라, 및 International Care and Use Committee Standards에 따라 수행하였다. 모든 절차는 CIC bioGUNE's Animal Care and Use Committee 및 감독 관청 (Diputacion de Bizkaia)에 의하여 승인되었다. 마우스를 12-시간 명/암 사이클 내에서 온도-조절된 동물 시설(AAALAC-인가) 내에 수용하였다. G-상기 동물들에게 임의로 물과 표준 식이(Harlan Tekland)를 공급하였다.
NAFLD 동물 모델: CNNM4 측정을 위한 0.1% 메티오닌 및 콜린-결핍 식이(0.1% MCDD)
C57BL/6J 야생형 마우스에 메티오닌(0.1%) 및 콜린(0%) 결핍 식이를 4 주 동안 공급하였다. 처리 완료시 동물을 희생시키고, RNA 또는 단백질 추출, 조직학 및 면역조직화학 또는 대사 분석을 위한 포르말린 고정을 포함하는 차후 분석을 위하여 간을 몇 조각으로 분할하였다.
예비 임상 연구: siRNA 치료법으로 처리된 NAFLD 동물 모델
C57BL/6J 야생형 마우스에 메티오닌(0.1%) 및 콜린(0%) 결핍 식이를 4 주 동안 공급하였다. 식이 시작 2주 후, 마우스를 두 개의 군으로 나누고, 제조업자의 설명서에 따라 Invivofectamine® 3.0 Reagent (Invitrogen, USA)를 이용하여, 생체내 CNNM4 침묵하거나 또는 관련없는 siRNA 대조군이고, CNNM4-특이적 생체내 siRNA (Custom Ambion, USA) 또는 대조 siRNA (Sigma-Aldrich, USA)의 용액 0.75 μg/μl 중 200μll을 투여하였다. 꼬리 정맥 주사를 4주까지 1주에 2회 수행하였다. 처리 후 동물을 희생시키고, RNA 또는 단백질 추출, 조직학 및 면역조직화학 또는 대사 분석을 위한 포르말린 고정를 포함하는 차후 분석을 위하여 간을 몇 조각으로 분할하였다. 혈청 분석을 위한 혈액을 처리 동안 1주 1회 수집하였다.
간경변증 동물 모델: 담관 결찰 (BDL)
어덜트 C57BL/6J 야생형 마우스를 앞서 기재한 바와 같이 BDL하였다 ((Fern andez-Alvarez et al., 2015. Lab Invest. 95(2):223-36). 간략히, 마우스를 O2 내 1.5% 이소플루오란으로 마취하고 복부를 개방하였다. 담관을 간문맥 및 간동맥으로부터 분리하여, 담관 주위를 봉합하고 외과적으로 획득하였다. 마지막으로, 복부를 닫고 마우스를 24h, 48h, 72h, 3일 및 21일에 희생시켰다. RNA 또는 단백질 추출, 조직학 및 면역조직화학 또는 대사 분석을 위한 포르말린 고정를 포함하는 차후 분석을 위하여 간을 몇 조각으로 분할하였다. 혈청 분석을 위한 혈액을 처리 동안 1주 1회 수집하였다.
간세포암종 동물 모델(HCC): GNMT-/-마우스
어덜트 GNMT-/- 마우스를 7 내지 9 개월 성장시켰으며, 이 때 이들은 자발적으로 HCC가 발생한 것으로 기재되었다 (Wagner et al., 2009. Toxicol Appl Pharmacol. 1;237(2):246; author reply 247). 그 때, 동물을 희생시키고, RNA 또는 단백질 추출, 조직학 및 면역조직화학 또는 대사 분석을 위한 포르말린 고정를 포함하는 차후 분석을 위하여 간을 몇 조각으로 분할하였다. 혈청 분석을 위한 혈액을 처리 동안 1주 1회 수집하였다.
약인성 간 손상(DILI): 아세트아미노펜(APAP) 과다복용
어덜트 C57BL/6J 야생형 마우스를 아세트아미노펜(APAP) 500 mg/kg으로 처리하여 급성 간 손상을 유발하였다. 처리 48 시간 후, 마우스를 희생시키고, RNA 또는 단백질 추출, 조직학 및 면역조직화학 또는 대사 분석을 위한 포르말린 고정를 포함하는 차후 분석을 위하여 간을 몇 조각으로 분할하였다. 혈청 분석을 위한 혈액을 처리 동안 1주 1회 수집하였다.
일차 간세포 분리, 배양 및 처리
콜라게나제 타입 I (Worthington, USA) 관류에 의하여 3-개월령 야생형 (C57BL/6J) 마우스로부터 일차 간세포를 분리하였다. 간략히, 동물을 이소플루란(O2 내 1.5% 이소플루란)으로 마취시켰다. 다음, 복부를 개방하고 카테터를 하대정맥 내로 삽입하였다. 간을 완충액 A (1x PBS, 5mM EGTA, 37℃ 및 산소화)로 관류하고(perfused), 간문맥을 절단하였다. 다음, 간을 완충액 B (1x PBS, 1mM CaCl2 37℃ 및 산소화)로 관류하여 EGTA를 제거하고, 마지막으로 완충액 C (1x PBS, 2mM CaCl2, 0.65 BSA, 콜라세나제 타입 I, 37℃ 및 산소화)로 관류하였다. 완충액 C 관류 후, 간을 신체 나머지로부터 분리하고 MEM (Gibco, USA)과 페트리 디쉬 내에 놓았다. 쓸개를 조심스럽게 제거한 다음, 간을 겸자로 기계적으로 분해하였다(disaggregated). MEM 내 희석된 분해된 간을 살균 거즈를 통하여 여과하고, 여과된 간 세포를 수집하고 MEME 보충된 10% FBS (Gibco)/1% PSG (Gibco) 내에서 3회 세척하여 (400RPM에서 1x4' 및 500RPM에서 2x5'), 모든 상청액 쿠퍼(Kupffer) 및 간성상 세포(Hepatic Stellate cells) 분리를 보존하였다. 최종 세척 후, 펠릿 내 함유된 간세포를 차후 배양을 위하여 10% FBS 1% PSG MEM 내 재현탁시켰다.
일차 간세포를 MEM 보충된 10% FBS/1% PSG 내에 7600 세포/mm2의 밀도로 미리 콜라겐-코팅된 배양 접시 위에 시딩하고, 37℃, 5%CO2-95% 공기에서 인큐베이터 내에 놓았다. 부착 6 시간 후, 목표 처리를 위하여 배지 및 미부착 간세포를 새로운 0% FBS/1% PSG MEM으로 제거하였다.
| 시약 | 투여량 | 베히클 | 시간 | 기능 |
%
FBS |
공급업자 |
| 아세트아미노펜(APAP) | 10 mM | PBS 1x | 6h | DILI 시험관내 모델 | 0% FBS | Sigma Aldrich |
| 마그네슘 결핍 배지 | 0mM | 24h | 마그네슘없는 배지 | 0% FBS | GE HealthCare | |
| 마그네슘 풍부 배지 | 5mM | MEM/MCD 배지 | 24h | 마그네슘 강화 배지 | 0% FBS | Sigma Aldrich |
| 메티오닌 및 콜린 결핍(MCD) 배지 | 24h | 간세포 지질 함량 증가 | 0% FBS | Gibco | ||
| 7-아미노-2-페닐-5H-티에노[3,2-c]피리딘-4-온 (티에노피리돈) | 5nM-10mM | DMSO | 24h | CNNM4 잠재적 억제제 | 0% FBS | Enamine |
THLE2 세포
THLE-2 세포를 ATCC (ATCC® CRL-2706TM)로부터 구입하였다. 이를 BEGM Bullet KitTM (Lonza) 및 10%FBS 보충된 기관지 상피 증식 배지 (BEGMTM, Lonza) 상에 유지하였다. 이를 0.05% 트린시-EDTA로 분할하고, BEGM 내 수집하였다. 123g에서 5 분 동안 원심분리 후, 상청액을 폐기하고 펠릿을 재현탁하였다.
플라스미드 트랜스펙션(transfection)
제조업자의 프로토콜에 따라 jetPRIME® (Polyplus, USA) 트랜스펙션 시약을 이용하여 플라스미드를 과발현을 위한 일차 마우스 간세포 내로 트랜스펙션하였다. 24-웰 플레이트 내에서, 플라스미드 0.5 μg을 jetPRIME® 완충액에 첨가하고, 1 μl jetPRIME® 시약을 첨가하기 전에 10s 볼텍싱하였다. 상기 믹스를 10s 볼텍싱하고, 스핀 다운하고, RT에서 10' 인큐베이션하였다. 달리 기재하지 않는 한, 트랜스펙션을 세포 현탁 배지 내에서 수행하고, 트랜스펙션 6 시간 후 트랜스펙션 믹스를 새로운 배지로 교체하였다.
siRNA 전달에 의한 유전자 침묵
제조업자 프로토콜에 따라 DharmaFECT 1 시약(Dharmacon)을 사용하여, 세포를 특이적 siRNA로 100nM의 최종 농도로 트랜스펙션하였다. DharmaFECT 1 및 siRNA를 RT에서 5'동안 0% FBS/1% PSG MEM 내에 별도로 희석시켰다. 그 다음, 희석액을 혼합하고 RT에서 20' 인큐베이션하였다. 그 다음, siRNA 트랜스펙션 믹스를 세포 현탁 배지에 첨가하고, 6 시간 후 새로운 배지로 교체하였다. 6-웰 플레이트에 대하여 나타낸 siRNA 트랜스펙션 볼륨 및 서열을 표 3에 요약한다.
| siRNA |
DharmaFECT 1
(X ml 배지 내 부피) |
siRNA (100 μM)
(X ml 배지 내 부피) |
서열 |
최종 부피
배지 |
| Cnnm1 Mus musculus | 0.2ml 내 8㎕ | 0.2ml 내 1㎕ | SEQ ID NO 1: Sense 5'- GAUCCUGAAUGCUGUAAUATT -3' SEQ ID NO 2: Antisense 5'- UAUUACAGCAUUCAGGAUCCG -3' SEQ ID NO 3: Sense 5'- ACGUGAUCCAGGAGCUUAATT -3' SEQ ID NO 4: Antisense 5'- UUAAGCUCCUGGAUCACGUTG -3' |
2 ml |
| Cnnm2 mus musculus | 0.2ml 내 8㎕ | 0.2ml 내 1㎕ | SEQ ID NO 5: Sense 5'- CTCAATTTGCATGAAATTTAA -3' SEQ ID NO 6: Antisense 5'- UUAAAUUUCAUGCAAAUUGAG -3' SEQ ID NO 7: Sense 5'- CGGAGAAAGAGAAGAAUUATT -3' SEQ ID NO 8: Antisense 5'- UAAUUCUUCUCUUUCUCCGTG -3' |
2 ml |
| Cnnm3 mus musculus | 0.2ml 내 8㎕ | 0.2ml 내 1㎕ | SEQ ID NO 9:Sense 5'- GAUGAUGAAUAUAAAGUAATT -3' SEQ ID NO 10: Antisense 5'- UUACUUUAUAUUCAUCAUCAG -3' SEQ ID NO 11: Sense 5'- GGGCAGAGUCGAGGUCGAATT -3' SEQ ID NO 12: Antisense 5'- UUCGACCUCGACUCUGCCCTG -3' |
2 ml |
| Cnnm4 mus musculus | 0.2ml 내 8㎕ | 0.2ml 내 1㎕ | SEQ ID NO 13:Sense 5'-CACUAUUGUUCUCACCAAATT-3' SEQ ID NO 14: Antisense 5'- UUUGGUGAGAACAAUAGUGTT- 3' |
2 ml |
| CNNM4 homo sapiens | 0.2ml 내 8㎕ | 0.2ml 내 1㎕ | SEQ ID NO 50:Sense 5'- CCAUGUCGGAGAUAAUGGATT -3' SEQ ID NO 51: Antisense 5'- UCCAUUAUCUCCGACAUGGTG- 3' |
2 ml |
shRNA 전달에 의한 유전자 침묵
제조업자 설명서에 따른 프로토콜에 따라 lipofectamine® 3000 (Thermofisher)을 사용하여 세포를 특이적 shRNAs로 트랜스펙션하였다. 리포펙타민 7.5 μl 및 3shRNA를 0.2ml 배지 내에 별도로 희석시키고, 실온에서 5' 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 이들을 다시 혼합하고, 세포에 전달하기 전에 실온에서 30' 동안 인큐베이션하였다. shRNA 트랜스펙션 볼륨을 6-웰 플레이트에 대하여 나타내며, 서열은 서열 번호 52이다:
5'- UCUCUGCCUUCAAGGAUGCGGACAAUGAG -3' (SEQ ID NO 52)
RNA 분리 및 cDNA 발현 측정
RNA 분리
제조업자의 지시에 따라 TRIzol 시약(Invitrogen)을 사용하여 전체 간 또는 배양 세포로부터 전체 RNA를 분리하였다. 세포 mRNA 추출의 경우, RNA 침전 단계에서 Glycogen (Ambion, USA) 5 μg을 사용하여 RNA 펠릿의 가시성을 촉진시켰다. RNA 농도를 Nanodrop ND-100 분광광도계(ThermoFisher Scientific, USA)를 이용하여 분광광도학적으로 측정하였다.
역전사
분리된 RNA 1-2 μg을 DNAse I (Invitrogren)로 처리하고, 이를 이용하여 랜덤 프라이머 및 RNAseOUT (모두 Invitrogen)의 존재 하에 M-MLV 역전사효소에 의하여 cDNA를 합성하였다. 결과 cDNA를 RNAse 자유수 (Sigma-Aldrich) 내에 1/10 희석하였다 (2 μg 사용시 1/20).
실시간 정량 PCR (RT-qPCR)
ViiA 7 또는 SYBR Select Master Mix와 QS6 Real time PCR System (Applied Biosystems, USA)을 이용하여 qPCRs을 수행하였다. 384-웰 플레이트 내 총 반응 부피 6.5 μl에 대하여, cDNA 1.5 μl를 사용하였으며, 특이적 프라이머를 포함하였다. 모든 반응을 삼중으로 수행하였다. 프라이머에 대한 PCR 조건을 최적화하고, 60℃ 용융 온도 및 단계 당 30s로 40 사이클을 이용하였다. 호모사피엔스(Homo Sapiens)및 무스 무스쿨루스(Mus musculus) 프라이머 모두 NCBI-Nucleotide 웹페이지 (www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide)를 통하여 Primer 3 소프트웨어를 이용하여 설계되었고, Sigma Aldrich에 의하여 합성되었다. 프라이머 서열을 표 4 및 표 5에 상세히 기재한다. PCR 산물의 특이성을 용융 곡선으로 점검한 후, 데이터를 하우스키핑 유전자(GAPDH, ARP) 발현에 대하여 정규화하였다.
| 유전자 기호 | 정방향 서열 | 역방향 서열 |
| Arp | SEQ ID NO 15: CGACCTGGAAGTCCAACTAC | SEQ ID NO 16: ATCTGCTGCATCTGCTTG |
| Cnnm1 | SEQ ID NO 17:CAACGAGGGTGAAGGAGACC | SEQ ID NO 18: CGTCGAGGATCTCCGACTTG |
| Cnnm2 | SEQ ID NO 19:GCGAGGCTATCCTGGACTTC | SEQ ID NO 20: TGTTGGAACGTTCTCCCTCG |
| Cnnm3 | SEQ ID NO 21:CTATCGTTGAGCCCGAGGAC | SEQ ID NO 22: GGACAGCGTCCAGTTTGGTA |
| Cnnm4 | SEQ ID NO 23:AGGTGAACAATGAGGGCGA | SEQ ID NO 24: CCGGGTCCGATTATCAGTGTA |
| 유전자 기호 | 정방향 서열 | 역방향 서열 |
| Arp | SEQ ID NO 53: CGACCTGGAAGTCCAACTAC |
SEQ ID NO 54: ATCTGCTGCATCTGCTTG |
| CNNM4 | SEQ ID NO 55:GAGCTGCAACAACTCGTGTG | SEQ ID NO 56: TCCACCTCGGTGAAGGAGAT |
단백질
단백질 추출 및 분석
총 단백질 추출을 다음과 같이 수행하였다. 세포를 차가운 PBS 완충액으로 세척하고, RIPA 용해 완충액 (1.6 mM NaH2PO4, 8.4 mM Na2HPO4, 0.5% Azide, 0.1 M NaCl, 0.1% SDS, 0.1% Triton X-100, 5 mg/ml sodium deoxycholate) 200 μl 내에 재현탁하였다. 상기 용해 완충액은 프로테아제 및 포스파타제 억제제 칵테일 (Roche, Switzerland)로 보충되었다. 이를 원심분리하고 (13000 rpm, 4℃에서 20'), 상청액 (단백질 추출물)을 Bradford 단백질 분석 (Bio-Rad)에 의하여 총 단백질 함량에 대하여 정량하고 Spectramax M3 분광광도계 (Molecular Devices, USA)를 이용하여 측정하였다.
동결 간 조직의 경우, 대략 50 μg의 조직을 500 μl 완충액 내에서 Precellys 24 조직 균질화기 (Precellys, France)를 사용하여 균질화하였다. 모든 경우, 용해물을 원심분리하고 (13000 rpm, 20 분, 4℃), 상청액 (단백질 추출물)을 사용된 용해 완충액의 유형에 따라 Bradford 단백질 분석에 의하여 또는 BCA 단백질 분석 (Pierce, USA)에 의하여 총 단백질 함량에 대하여 정량하고, Spectramax M3 분광광도계를 이용하여 측정하였다.
웨스턴 블롯팅
단백질 추출물을 SDS-PAGE 샘플 완충액 (250 mM Tris-HCl pH 6.8, 500 mM β-머캅토에탄올, 50% 글리세롤, 10% SDS 및 브로모페놀 블루) 내에서 5 분 동안 95℃에서 비등시켰다. 단백질 양(abundance) 및 항체 민감성에 따라 적절한 양의 단백질 (5 내지 50 μg)을 Mini-PROTEAN Electrophoresis System (Bio-Rad)을 사용하여 3% 내지 15% 아크릴아미드 겔 내에서 (관심 단백질의 분자량에 따라) 소듐 도데실 설페이트-폴리아크릴아미드 겔 전기 영동(SDS-PAGE)에 의하여 분리하였다. 겔을 Mini Trans-Blot cell (Bio-Rad)을 사용하여 일렉트로블롯팅에 의하여 니트로셀룰로스 막 위로 옮겼다. 막을 0.1% Tween-20을 함유하는 TBS pH 8 내 (Sigma Aldrich) (TBST-0.1%) 5% 탈지 우유로 RT에서 1 시간 동안 블록킹하고, 10' 동안 TBST-0.1%로 3회 세척하고, 상업적 일차 항체와 4℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 일차 항체 및 그의 최적 인큐베이션 조건을 표 6에 상세히 기재한다. 그 다음, 막을 10' 동안 TBST-0.1%로 3회 세척하고, 호스래디쉬-퍼옥시다아제 (HRP, 표 6)에 컨쥬게이션된 이차 항체를 함유하는 블록킹 용액 내에서 RT에서 1 시간 동안 인큐베이션하였다. Western Lightning Enhanced Chemiluminescence 시약(ECL, PerkinElmer, USA)을 사용하여 면역 반응성 단백질을 검출하고, Curix 60 Developer (AGFA, Belgium) 내에서 Super Rx-N X-레이 필름 (Fuji, Japan)에 노출시켰다.
| 항체 | Id | 공급업자 | 희석 | 인큐베이션 용액 |
| CNNM4 | 14066-1-AP | Proteintech | 1/1000 | TBST-0.1% 내 5% 탈지 우유 |
| GAPDH | AB8245 | Abcam | 1/10000 | TBST-0.1% 내 5% 탈지 우유 |
| HRP-opnjugated secondary antibody to mouse | #7076 | Cell Signalling | 1/1000 | TBST-0.1% 내 5% 탈지 우유 |
| HRP-conjugated secondary antibody to rabbit | #7074 | Cell Signalling | 1/1000 | TBST-0.1% 내 5% 탈지 우유 |
염색 분석
지질 염색을 위한 수단 레드
O.C.T-포함된 동결 간 샘플을 10 μ㎛ 섹션으로 절단하였다. 섹션들을 50% 이소프로판올 내 세척한 다음, 프레쉬 Sudan III (이소프로판올 내 0.5%; Sigma Aldrich) 용액으로 30 분 동안 염색하였다. 그 다음, 샘플들을 60% 이소프로판올 내에 다시 세척한 다음, 헤마톡실린 및 에오신으로 대비염색하였다. 그 다음, 상기 섹션들을 증류수로 세척하고, DPX 봉입제 내에 봉입하였다. 정립 광학 현미경 (Zeiss)을 사용하여 이미지를 촬영하였다.
DHE에 의한 ROS 측정
O.C.T-임베디드 8 ㎛ 섹션을 RT에서 1 시간 MnTBAP 150 μM과 인큐베이션하였다. 그 다음, 샘플들을 디하이드로에티디움 (DHE) 5 μM과 37℃에서 30 분 동안 인큐베이션하고, 섹션들을 0.7 mg/l의 DAPI를 함유하는 Fluoromount-G (Southern Biotech, USA)로 봉입하여 핵을 대비염색하였다. Axioimager D1 (Zeiss)를 사용하여 이미지를 촬영하였다.
CNNM4 측정을 위한 면역조직화학
파라핀-임베디드 섹션들 (5 ㎛ 두께)을 사용될 일차 항체에 따라 언마스킹하고, 퍼옥사이드 블록킹하였다 (PBS 내 3% H2O2, 10',RT). 마우스 조직 내 마우스-호스티드 항체 염색을 위하여, 샘플을 고트 항-마우스 Fab 단편 (Jackson Immunoresearch, USA)으로 블록킹하고 (1:10, 1h, RT), 5% 고트 혈청으로 블록킹하였다 (30', RT). 그 다음, 섹션들을 1:100의 DAKO 항체 희석제 (DAKO) 내 CNNM4 일차 항체 (Ab191207, Abcam)와 습한 체임버 내에서 인큐베이션한 다음, 다음 Envision anti rabbit (DAKO) HRP-컨쥬게이티드 이차 항체 인큐베이션하였다 (30', RT). Vector VIP chromogen (Vector)으로 비색 검출하고, 섹션들을 헤마톡실린으로 대비염색하였다. 샘플을 DPX 봉입제를 사용하여 봉입하였다. 정립 광학 현미경 (Zeiss)을 사용하여 이미지를 촬영하였다.
αSMA 판별을 위한 면역형광법
αSMA 염색을 위하여, O.C.T-임베디드 10 ㎛ 섹션들을 Cy3에 컨쥬게이션된 일차 항체의 0.01%PBS-아지드 내 2%BSA 내 1/200 희석액 ((C6198, Sigma Aldrich)으로 인큐베이션하고, 0.7 mg/l의 DAPI를 함유하는 Fluoromount-G (Southern Biotech)로 봉입하여 핵을 대비염색하였다. Axioimager D1 (Zeiss)를 사용하여 이미지를 촬영하였다.
일차 간세포 내 지질 정량을 위한 BODIPY
고지질 함량 배지(OA) 또는 메티오닌/콜린 결핍 배지(MDMC) 내에서 배양된 일차 간세포를 PBS 내 4% 파라포름알데히드 내에 고정하고 (10', RT), BODIPY 493/503 (Molecular Probes, Invitrogen) 1 mg/ml로 인큐베이션하였다 (1h, RT). Axioimager D1 (Zeiss) 현미경을 사용하여 BODIPY 면역세포형광 이미지를 촬영하였다. Frida Software를 사용하여 지질체 정량을 수행하고, 총 세포수 당 평균 면적으로 나타냈다.
데이터 분석
FRIDA 소프트웨어를 사용하여 각각의 샘플의 강도의 평균 합계 또는 염색 면적 백분율을 계산하였다 (http://bui3.win.ad.jhu.edu/frida/, John Hopkins University).
간 지질 정량
동결된 간 30 mg을 포터 균질화기 내에서 얼음-냉각된 PBS 10 volumes으로 균질화하였다. Wako Chemicals 키트 (Richmond, VA)를 사용하여 호모제네이트 내 지방산을 측정하고, 지질을 기재된 바와 같이 정량하였다 (Folch et al., 1957. J Biol Chem. 226(1):497-509). 간략히, 지질을 간 호모제네이트로부터의 단백질 1.5 mg으로부터 추출하였다. 포스파티딜콜린 (PC), 포스파티딜에탄올아민 (PE), 지방산 (FAs) 및 콜레스테롤 (Ch)을 박층 크로마토그래피 (TLC)에 의하여 분리하고 기재된 바와 같이 정량하였다 (Ruiz and Ochoa, 1997). A. Menarini Diagnostics (Italy) 키트를 사용하여 지질 추출물 내 트리글리세라이드 (TGs)를 측정하였다.
마그네슘 측정 분석
세포내 마그네슘 수준
글라스 커버슬립 내에서 성장한 일차 간세포에 0% FBS/1% PSG 배지 내 2 μM Mag-S-Tz 또는 1 μM Mag-S-Tz-AM 희석 REF (Gruskos et al., 2016. J. Am. Chem. Soc. 138 (44), pp 14639-14649)를 로딩하고, 30' 또는 1 시간 동안 각각 37℃ 및 5% CO2에서 인큐베이션하였다. 염료-함유 배지를 제거한 후, 0% FBS/1% PSG 내 30' 인큐베이션을 수행하였다. 그 다음, 커버슬립을 20mM Tris-HCl, 2.4 mM CaCl2, 10mM 글루코스, pH 7.4 완충액으로 세척하고, Eclipse TE 300-based microspectrofluorometer (Nikon, USA) 상에서 thermostatitez perfusion chamber 상에 봉입하고, 40x 오일-침지 형광(oil-immersion fluorescence)으로 가시화하였다. 세포내 Mg2+ 수준을 Grynkiewicz (Grynkiewiz et al., 1985. J Biol Chem. 260(6):3440-50)에 기재된 방법을 이용하여 측정하였다. 340/380 nm 여기광 비율을 Delta 시스템 (Photon Technologies International, Princeton)으로 측정하고, 표준 식으로부터 Mg2+ 농도로 전환하였다:
상기 식에서, Kd는 Mag-S-Tz (3.2 mM) 및 Mag-S-Tz-AM (8.9 mM)의 해리 상수이고, Q는 380 nm에서 최소/최대 형광 강도 비이다.
세포외 마그네슘 수준
세포외 마그네슘을 QuantiCromTM 마그네슘 분석 키트 (BioAssay Systems, USA)를 사용하여 정량하였다. 간략히, 혈청 또는 배지 5 μl를 시약 A 및 시약 B의 1:1 믹스 200 μl와 혼합하였다. RT에서 2' 인큐베이션 후, Spectramax M3 분광광도계 (Molecular Devices, USA)를 사용하여 500 nm 길이에서 OD를 측정하였다. 그 다음, EDTA 10 μl를 첨가하고, OD500를 다시 측정하였다. 표준 농도(2mg/ml)로부터 상기 OD500를 비교함으로써, 마그네슘 농도를 마지막으로 계산하였다.
시험관내 분석
미토콘드리아 ROS 측정
제조업자 지시에 따라 MitoSOXTM Red 시약 (Life Technologies)을 사용하여 미토콘드리아 ROS를 측정하였다. 간략히 일차 간세포 및 간암(hepatoma) 세포를 정상 배지 내에서 MitoSOX 시약 (2.5 μM, 10', 37℃, CO2 인큐베이터 내)과 인큐베이션하였다. 그 다음, 세포를 PBS로 2회 세척하고, 분광광도계를 사용하여 510 nm의 여기 및 595 nm의 발광에서 형광을 측정하였다. 마지막 값을 총 단백질 농도에 대하여 정규화하였다.
TUNEL에 의한 세포사 측정
상기한 바와 같이 제조업자 지시에 따라 in situ 세포사 검출 키트 (Roche)를 사용하여 세포사를 분석하였다. 세포를 37℃에서 1 시간 동안 FITC-컨쥬게이티드 일차 항체 (희석 1/50)를 함유하는 TUNEL 희석 완충액과 인큐베이션하기 전에 퍼옥사이드 블록 (메탄올 내 3% H2O2)을 3 분 동안 가하였다. 섹션을 Dak 형광 봉입제 (Dako) 내에 봉입하였다. Axioimager D1 (Zeiss) 현미경을 사용하여 이미지를 촬영하였고, TUNEL 양성 세포의 %를 측정함으로써 세포 생존률을 계산하였다.
결과
간 질환에서 CNNM4 과발현
만성 간 질환은 상이한 병리들의 군을 포함한다. 인간 간 생검 및 마우스 동물 모델로부터의 간 내 면역조직화학(IHC)에 의하여 CNNM4 발현을 측정하는 방법이 개발되었다. 여기서, CNNM4 발현은 인간 생검 및 동물 모델 모두에서 DILI 및 만성 간 질환의 모든 단계의 특징이며, 모든 질환에서 단백질 과발현이 관찰되었다 (도 1). 이러한 결과를 지방증 및 NASH 환자로부터의 샘플과 비교하여 건강한 대상으로부터의 인간 간 샘플 내 CNNM4 mRNA 수준의 qPCR에 의하여 CNNM4 발현을 검출하는 방법에 의하여 확인하였다 (도 2a). CNNM4 발현은 또한 시험관내 NASH 마우스 모델 (도 2c) 뿐 아니라 생체내 NASH 마우스 모델 (도 2b) 내 CNNM4 mRNA 수준의 qPCR에 의하여 측정될 수 있었다.
CNNM4, 간 질환 치료를 위한 새로운 표적
앞서 보인 IHC에 의한 CNNM4 측정에서 관찰되는 과발현은 DILI 및 만성 질환 모두에 대하여 CNNM4를 간 질환 치료를 위한 잠재적 표적으로 제안한다. 시험관내 연구를 수행하여 일차 간세포 내 NASH를 유발하고 이를 siRNA CNNM4 치료법으로 처리하였다. NASH 모델-일차 간세포의 경우, 지질 함량 및 반응성 산소종(ROS)에 의한 염증을 측정하였으며, 이들 모두 siRNA 치료법으로 처리된 NASH 간세포 내에서 회복되는 것으로 관찰되었다 (도 3a 및 3b). 아세트아미노펜 과다복용에 의한 DILI을 에뮬레이팅하는 다른 시험관내 연구 또한 수행되었으며, DILI 모델 간세포 내에서 예상되는 세포사 및 상기 세포를 표적화된 siRNA 치료법으로 처리시 회복이 관찰되었다 (도 3c). 또한, 인간 세포 내 NASH를 유발하고 이를 siRNA CNNM4 치료법 또는 shRNA CNNM4 치료법으로 처리하는 시험관내 연구를 수행하고, 지질 함량을 측정하였으며, 상대 지질 축적이 siRNA 치료법으로 처리된 (도 4a) NASH-유발 인간 세포 (THLE2 세포) 및 shRNA 치료법으로 처리된 (도 4b) NASH-유발 인간 세포에서 모두 회복되는 것으로 관찰되었다.
CNNM4 표적화의 특이성 및 필요성
NASH 및 DILI에 대한 siRNA CNNM4-치료법의 보호 효과가 관찰되었으므로, 다른 CNNM 패밀리 단백질 (CNNM1, CNNM2 및 CNNM3)의 표적화 침묵의 효과를 확인하였다. NASH를 일차 간세포 내에 유발하고, 이를 siRNA CNNM1, CNNM2 및 CNNM3로 처리하였다. siRNA CNNM4 치료법과 달리, 다른 CNNM 패밀리의 단백질 침묵은 효과가 없었으며, 이는 CNNM 패밀리 단백질이 아닌 CNNM4만을 기반으로 한 치료의 특이성을 나타낸다 (도 5a). 나아가, CNNM4-기반 치료의 필요성을 입증하기 위하여 실험을 실행하였다. 첫 번째로, NASH 환자 및 동물 모델에서 관찰되는 것과 유사하게, CNNM4 과발현에 의하여 일차 간세포 내에 지질 축적을 유발한 다음, 마그네슘을 보충하였다. 마그네슘 보충은 siRNA CNNM4 처리와 유사하게 지질 축적을 감소시키는 효과가 없었다 (도 5b). 두 번째로, CNNM4 과발현에서와 유사한 생리학적 조건인 일차 간세포 내 마그네슘 결핍에 의하여 지질 축적을 유발하였다. 이 경우, siRNA CNNM4 치료법은 지질 축적을 감소시켰다 (도 5c). 뒤의 두 결과를 고려하면, 마그네슘 보충은 NASH 치료를 위하여 충분하지 않으므로, CNNM4-기반 치료법에 대한 요구가 있다.
siRNA CNNM4-기반 치료법의 예비 임상 연구
세포에서뿐 아니라 동물에서도 CNNM4 조절의 효과성에 접근을 위하여, 만성 간 질환의 첫 번째 단계인 NAFLD를 발생시켰다. 마우스에 NAFLD를 발생시키기 위하여 0.1% 메티오닌 및 콜린-결핍 식이 (0.1% MCDD)를 2 주 동안 공급하였다. 이 때, 하나의 군을 siRNA CNNM4 치료법으로 처리하고, 다른 군을 siCtrL RNA로 처리한 다음, 0.1% MCDD로 2 주 동안 처리하였다. 동물들을 희생시키고, NAFLD 진행을 분석하기 위하여 상이한 바이오마커들을 측정하였다. 수단 레드 염색은 지질 축적을 측정하였고 (도 6a), 혈청 내 트랜스아미나제는 간 손상을 나타내고 (도 6b), DHE 염색은 ROS에 의하여 야기되는 염증을 정량하고 (도 6c), α-평활근 액틴(αSMA)은 섬유증의 진행을 나타낸다 (도 6d). siRNA CNNM4 치료법으로 처리된 동물 군에서, NAFLD가 감소되는 것으로 관찰될 수 있다.
CNNM4의 약학적 억제
siRNA 치료법 외에, CNNM4 활성은 약학적으로 조절될 수 있다. 일차 간세포 내에 NASH를 유발하고 이를 7-아미노-2-페닐-5H-티에노[3,2-c]피리딘-4-온으로 알려진 화합물로 처리하는 시험관내 분석을 수행하였다. NASH-유발된 간세포 내에서 CNNM4의 약학적 억제는 siRNA 치료법과 동일한 효과를 가지는 것으로 관찰될 수 있었으며, 이는 그 지질 함량을 감소시키고 (도 7a) 마그네슘이 축적되게 한다 (도 7b).
상이한 장기의 병리에서 CNNM4 과발현
도 1에 도시되는 바와 같이, CNNM4는 동물 모델 및 인간 샘플 모두에서 상이한 간 병리에서 과발현되는 것으로 발견되었다. 특히, 간 뿐아니라 신장과 같은 다른 장기에서도 섬유증이 발생하였으며, 섬유증 발생이 두 조직에서 가질 수 있는 몇가지 유사성을 고려하면, CNNM4는 또한 이 장기를 조절곤란(dysregulated)하게 할 수 있다. 신장 섬유증 마우스 모델 내 CNNM4 과발현이 관찰되었으며, 이는 CNNM4-기반 치료법이 상기 질환 치료를 위하여 효과적인 것임을 나타낸다 (도 8). 또한, TCGA (The Cancer Genome Atlas) 데이터 분석은 CNNM4가 정상 조직과 비교하여 간세포암종(LIHC)의 원발 종양 샘플 내 및 폐 선암종(LUAD)의 원발 종양 샘플 내에서 과발현됨을 보인다 (도 9a 및 9b).
요약하면, 제시된 결과는 CNNM4가 NAFLD 진행을 예방하기 위한 적합한 표적임을 입증하며, 다른 간 병리(DILI, 간경변증 및 HCC), 신장 섬유증 및 폐암을 또한 개선할 수 있음을 나타낸다. DILI의 경우, 시험관내 연구는 APAP 과다복용에 대하여 siRNA 치료법의 보호 효과를 보이며, 기타 병리에서, CNNM4 측정은 이들 모두에서 과발현을 보인다. 따라서, siRNA 치료법에 의하여 또는 약학적으로 상기 단백질 또는 그 파트너를 억제 또는 침묵시키는 것은 간 질환, 신장 섬유증 및 폐암을 치료하기 위하여 적합한 방법이다.
SEQUENCE LISTING
<110> Asociacion Centro de Investigacion Cooperation en
Biociencias-CIC bioGUNE
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KIDNEY OR LUNG DISEASE
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<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Human CNNM4 siRNA sequence n4 RV
<400> 45
auacucuaaa ucuccaucgu u 21
<210> 46
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Human CNNM4 siRNA sequence n5 FW
<400> 46
gcugaugagu gcaaagaaau u 21
<210> 47
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Human CNNM4 siRNA sequence n5 RV
<400> 47
uuucuuugca cucaucagcu u 21
<210> 48
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Human CNNM4 siRNA sequence n6 FW
<400> 48
ccucaaagcu caaggcacau u 21
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<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Human CNNM4 siRNA sequence n6 RV
<400> 49
ugugccuuga gcuuugaggu u 21
<210> 50
<211> 21
<212> DNA-RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CNNM4 (homo sapiens) sense
<400> 50
ccaugucgga gauaauggat t 21
<210> 51
<211> 21
<212> DNA-RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CNNM4 (homo sapiens) antisense
<400> 51
uccauuaucu ccgacauggt g 21
<210> 52
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<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> shRNA sequence
<400> 52
ucucugccuu caaggaugcg gacaaugag 29
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Arp (homo sapiens) forward
<400> 53
cgacctggaa gtccaactac 20
<210> 54
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Arp (homo sapiens) reverse
<400> 54
atctgctgca tctgcttg 18
<210> 55
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CNNM4 (homo sapiens) forward
<400> 55
gagctgcaac aactcgtgtg 20
<210> 56
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CNNM4 (homo sapiens) reverse
<400> 56
tccacctcgg tgaaggagat 20
Claims (13)
- 대상 내에서 급성 또는 만성 질환의 치료에 사용하기 위한 CNNM4 억제제로서, 상기 질환은 간 질환, 신장 질환 및 폐 질환으로 이루어지는 군으로부터 선택되는, CNNM4 억제제.
- 제1항에 있어서,
- 상기 간 질환은 간 섬유증(liver fibrosis), 간정맥폐색성질환(veno-occlusive liver disease), 약인성 간손상(drug-induced liver injury (DILI)), 지방증(steatosis), 비알코올성 지방간염(non-alcoholic steatohepatitis (NASH)), 간경병증(cirrhosis), 간세포암종(hepatocellular carcinoma (HCC)), 버드-키아리 증후군(Budd-Chiari syndrome) 및 간염(hepatitis)으로부터 선택되고;
- 상기 신장 질환은 급성 신손상(acute kidney injury (AKI)), 만성 신장 질환(chronic kidney disease), 신장염(nephritis), 신증(nephrosis) 및 신장 섬유증and renal fibrosis)으로부터 선택되며;
- 상기 폐 질환은 폐 섬유증(pulmonary fibrosis)인, CNNM4 억제제. - 제1항 또는 제2항에 있어서,
상기 억제제는 중화 항체 또는 그의 기능적 단편, 길항제, 가용성 결합 단백질, 가용성 변이 수용체, 비-기능성 유도체, 안티센스 폴리뉴클레오티드, RNA 간섭 올리고뉴클레오티드, 포스포로디아미데이트 모르폴리노 올리고머(PMO), miRNA, siRNA, shRNA, sgRNA, 안티센스 RNA, 다이서-기질 27-머 듀플렉스, 압타머, DNAzyme, 리보자임, 트리플렉스 형성 올리고뉴클레오티드(TFO), 소분자 및 이의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택되는, CNNM4 억제제. - 제3항에 있어서,
상기 소분자는 7-아미노-2-페닐-5H-티에노[3,2-c]피리딘-4-온 또는 2-[5-(4-옥소-2-티옥소-티아졸리딘-5-일리덴메틸)-퓨란-2-일]-벤조산인, CNNM4 억제제. - (a) 대상으로부터의 샘플 내 CNNM4 발현 수준을 결정하는 단계, 및
(b) 상기 수준을 기준값과 비교하는 단계
를 포함하는, 대상에서 간 질환, 신장 질환 또는 폐 질환을 진단하는 시험관내 방법으로서,
상기 기준값에 대한 상기 샘플 내 증가된 CNNM4 발현 수준은 그 환자가 간 질환, 신장 질환 또는 폐 질환을 겪는다는 것을 나타내는, 시험관내 방법. - 제5항에 있어서,
상기 샘플은 간, 신장 또는 폐 생검인, 방법. - 제5항 또는 제6항에 있어서,
- 상기 간 질환은 간 섬유증, 간정맥폐색성질환, 약인성 간손상(DILI), 지방증, 비알코올성 지방간염(NASH), 간경병증, 간세포암종(HCC), 버드-키아리 증후군 및 간염으로부터 선택되고;
- 상기 신장 질환은 급성 신손상(AKI), 만성 신장 질환, 신장염, 신증 및 신장 섬유증으로부터 선택되고;
- 상기 폐 질환은 폐 섬유증인, 방법. - 대상에서 간 질환, 신장 질환 또는 폐 질환을 시험관내 진단하기 위한, CNNM4 발현 수준 결정에 특이적인 시약의 용도.
- 제8항에 있어서,
- 상기 간 질환은 간 섬유증, 간정맥폐색성질환, 약인성 간손상(DILI), 지방증, 비알코올성 지방간염(NASH), 간경병증, 간세포암종(HCC), 버드-키아리 증후군 및 간염으로부터 선택되고;
- 상기 신장 질환은 급성 신손상(AKI), 만성 신장 질환, 신장염, 신증 및 신장 섬유증으로부터 선택되고;
- 상기 폐 질환은 폐 섬유증인, 용도. - 제8항 또는 제9항에 있어서,
상기 CNNM4 발현 수준 결정에 특이적인 시약은 CNNM4의 mRNA에 특이적으로 혼성화하는 프로브 세트, 및 CNNM4의 mRNAs를 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머 쌍들의 세트로 이루어지는 군으로부터 선택되거나, 상기 CNNM4 발현 수준 결정에 특이적인 시약은 CNNM4 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체인, 용도. - 세포 내에 유발된 질환 또는 상태를 감소시키는 시험관내 방법으로서, 상기 유도된 질환 또는 상태는 DILI, 지방증, NASH, 간경병증, HCC, 간 섬유증, 신장 섬유정 또는 폐 섬유증 연구를 위한 질환 모델이고, 상기 방법은 상기 세포를 상기 세포 내 CNNM4 활성, 수준 또는 기능을 감소시키기에 효과적인 양의 특이적 CNNM4 억제제와 접촉시키는 단계를 포함하는, 시험관내 방법.
- 세포 내에 유발된 CNNM4-매개 질환 또는 상태를 감소시키는데 잠재적으로 유용한 화합물을 확인하는 시험관내 방법으로서,
상기 방법은 상기 세포를 상기 세포 내 CNNM4 활성, 수준 또는 기능을 감소시키기에 효과적인 양으로, 또는 기준값에 대하여 상대 지질 축적을 감소시키거나 상대 미토콘드리아 ROS를 감소시키기에 효과적인 양의 후보 화합물과 접촉시키는 단계를 포함하고,
세포 내에 유발된 CNNM4-매개 질환 또는 상태에서, CNNM4 활성을 억제하거나, 기준값에 대하여 상대 지질 축적을 감소시키거나, 기준값에 대하여 상대 미토콘드리아 ROS를 감소시키는 후보 화합물은 CNNM4-매개 간, 신장 및/또는 폐 질환을 치료 및/또는 예방하는데 잠재적으로 유용한 화합물로서 확인되는, 방법. - 제11항 또는 제12항에 있어서,
상기 억제제 또는 상기 화합물은 중화 항체 또는 그의 기능적 단편, 길항제, 가용성 결합 단백질, 가용성 변이 수용체, 비-기능성 유도체, 안티센스 폴리뉴클레오티드, RNA 간섭 올리고뉴클레오티드, 포스포로디아미데이트 모르폴리노 올리고머(PMO), miRNA, siRNA, shRNA, sgRNA, 안티센스 RNA, 다이서-기질 27-머 듀플렉스, 압타머, DNAzyme, 리보자임, 트리플렉스 형성 올리고뉴클레오티드(TFO), 소분자 및 그의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택되는, 방법.
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