JP2022539779A - 腫瘍を治療するための医薬組成物、キット及び方法 - Google Patents

Abstract

治療有効量の、ＣＴＬＡ４を標的とするｍｉＲＮＡを担持するエクソソームと、治療有効量の、免疫刺激剤又は免疫刺激剤と抗ＰＤ－１抗体の両方を発現する腫瘍溶解性単純ヘルペスウイルスとを含む対象の腫瘍を治療するための組成物が提供される。エキソモチーフは前記ＣＴＬＡ４を標的とするｍｉＲＮＡのシード配列に作動可能に連結されて前記ＣＴＬＡ４を標的とするｍｉＲＮＡの前記エクソソームへのパッケージングを増強する。

Description

本発明は、腫瘍を治療するための医薬組成物に関し、特に、治療有効量の、ＣＴＬＡ４を標的とするｍｉＲＮＡを担持するエクソソームと、治療有効量の腫瘍溶解性単純ヘルペスウイルス（ｏＨＳＶ）とを含む医薬組成物に関する。本発明はまた、ＣＴＬＡ４を標的とするｍｉＲＮＡを担持するエクソソームとｏＨＳＶとを含むキット、並びに前記医薬組成物及び前記キットを使用して腫瘍を治療する方法に関する。

がんとは特定の治療法に屈するものや様々な治療法に耐性を生じるものがあって、多面的な疾患として知られている。腫瘍内の細胞のサブセットは従来の治療法に耐性があり、疾患を再発させる原因でもある。

がんの外科的治療は一般的な局所治療である。白血病やリンパ腫などの血液系のいくつかの悪性腫瘍に加えて、他の様々な悪性腫瘍として外科的に除去できる１種又は複数種の有形の固形腫瘍がある。ただし、手術はリスクを伴うもので、多くの場合は他の合併症や潜在的な臓器機能障害がある。

これまでに、がんの非外科的治療（主に従来の化学療法、標的化生物学的療法及び放射線療法）は完全に満足のいく結果を生み出していない。問題として取り上げられてきているものとしては、標的選択性の低さ、薬剤耐性、転移性疾患に効果的に対処できないこと、重篤な副作用がある。対照的に、腫瘍に対する全身性応答を誘発するために全体的に宿主免疫を誘発する免疫療法は、当面臨床的に大いに見込まれている。

腫瘍溶解性単純ヘルペスウイルス（ｏＨＳＶ）は、固形腫瘍の治療のために広く研究されている。それは一群のものとして従来のがん治療法に比べて多くの利点がある。具体的には、ｏＨＳＶは一般に自然免疫の何らかの側面による阻害を受けやすくする突然変異を具現化している。結果として、それらは感染に対する１腫又は複数種の自然免疫応答が損なわれているがん細胞では複製されるが、自然免疫応答が損なわれていない正常な細胞では複製されない。ｏＨＳＶは通常、ウイルスが複製できる腫瘍塊に直接送達される。全身ではなく標的組織に送達されるため、抗がん剤の特性ともいうべき副作用は持たない。ウイルスは、複数回投与されるとその能力を低下させる獲得免疫応答を特徴的に誘発する。ｏＨＳＶは、効力の喪失や炎症反応などの有害事象を誘発する証拠なしに幾たびも腫瘍に投与されている。ＨＳＶは、そのゲノムに外来ＤＮＡを組み込み、腫瘍への投与時にこれらの遺伝子の発現を調節することができる大きなＤＮＡウイルスである。ｏＨＳＶにおける使用に適する外来遺伝子は腫瘍に対する獲得免疫応答を誘発するために役立つ遺伝子である。

細胞の自然免疫応答を克服するという欠陥は、当該ウイルスが抗がん剤として腫瘍溶解ｏＨＳＶとしても働く腫瘍の範囲を決定している。欠失が広範であるほど、欠失したウイルス遺伝子の機能に依存するｏＨＳＶが有効となるがん細胞の範囲は狭い。最新のｏＨＳＶの殆どには、抗がん作用を強化するための少なくとも１つの細胞遺伝子が組み込まれている。

ｏＨＳＶベースの治療法の成功はがん細胞の破壊の程度にかかっている。ｏＨＳＶの開発の初期には、ＨＳＶだけでは固形腫瘍の全てのがん細胞を殺すことができず、ｏＨＳＶ治療で全てのがん細胞を効果的に排除する可能性は低く、臨床試験からｏＨＳＶによる腫瘍の破壊には腫瘍に対する獲得免疫応答を必要とするということが認識されていた。さらなる研究により、感染した腫瘍細胞の破片によって生成される抗腫瘍免疫応答はサイトカインの組み込みによって増強される可能性があるということが示されている。サイトカイン遺伝子が欠けたｏＨＳＶと免疫刺激性サイトカインを組み込んだｏＨＳＶとの比較により、この仮説が確認され、最終的には黒色腫の治療のために開発されたｏＨＳＶへのＧＭ－ＣＳＦの組み込みにつながったのである。

免疫刺激性サイトカインをコードする遺伝子を組み込むと、腫瘍に対する免疫応答が増強されるが、抗腫瘍効果にとって重要なＴ細胞によって引き起こされる細胞毒性の効果的な増強は認められなかった。腫瘍はＰＤ－１及びＣＴＬＡ４阻害経路を利用して免疫系を沈黙させる。ＰＤ－１は活性化Ｔ細胞及びその他の造血細胞において発現され、ＣＴＬＡ４は制御性Ｔ細胞を含め活性化Ｔ細胞において発現される。腫瘍はＰＤ－１及びＣＴＬＡ４阻害経路を利用して宿主免疫応答を回避する。

前臨床及び臨床的な設定下で広範な研究と試験があるにも関わらず、腫瘍の治療方法にはニーズが満たされていないままである。

概要
本発明の一態様は、治療有効量の、ＣＴＬＡ４を標的とするｍｉＲＮＡを担持するエクソソームと、治療有効量の、免疫刺激剤又は免疫刺激剤と抗ＰＤ－１抗体の両方を発現する腫瘍溶解性単純ヘルペスウイルス（ｏＨＳＶ）とを含む医薬組成物に関する。

前記エクソソームは、前記ＣＴＬＡ４を標的とするｍｉＲＮＡに、任意選択でリンカーによって作動可能に連結されたエクソソームパッケージング関連モチーフ（以下、「エキソモチーフ」ともいう）を含む。一実施形態において、前記エクソソームは阻害量のＣＴＬＡ４を標的とするｍｉＲＮＡを含み、ただし前記ＣＴＬＡ４を標的とするｍｉＲＮＡはＣＴＬＡ４のｍＲＮＡに結合するシード配列を有し、且つエキソモチーフは、ＣＴＬＡ４を標的とするｍｉＲＮＡのシード配列に作動可能に連結されて前記ＣＴＬＡ４を標的とするｍｉＲＮＡのエクソソームへのパッケージングを増強する。いくつかの実施形態において、前記エキソモチーフは、ＣＴＬＡ４を標的とするｍｉＲＮＡのシード配列の下流に位置し、且つそれと共有結合している。いくつかの実施形態において、前記エキソモチーフは、前記ＣＴＬＡ４を標的とするｍｉＲＮＡのシード配列の下流に位置し、且つリンカーによってそれとリンクされている。いくつかの実施形態において、前記エキソモチーフは前記ＣＴＬＡ４を標的とするｍｉＲＮＡのシード配列以外の１つ又は複数の核酸の突然変異によって得られる。いくつかの実施形態において、前記エキソモチーフは、２つの単一のエキソモチーフの組み合わせによって生成される２つ折りのモチーフである。いくつかの実施形態において、作動可能に連結された場合、前記ＣＴＬＡ４を標的とするｍｉＲＮＡと前記エキソモチーフは少なくとも１つ又は２つのヌクレオチドを共有する。

ｏＨＳＶは、免疫刺激剤又は免疫刺激剤と抗ＰＤ－１抗体の両方を発現する組換え腫瘍溶解性ＨＳＶ－１である。

本発明の別の態様は、治療有効量の、ＣＴＬＡ４を標的とするｍｉＲＮＡを担持するエクソソームと、治療有効量のｏＨＳＶと、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物に関する。前記エクソソームは、前記ＣＴＬＡ４を標的とするｍｉＲＮＡに、任意選択でリンカーによって作動可能に連結されたエクソソームパッケージング関連モチーフを含む。前記ｏＨＳＶは、免疫刺激剤又は免疫刺激剤と抗ＰＤ－１抗体の両方を発現する。

本発明の別の態様は、ＣＴＬＡ４を標的とするｍｉＲＮＡを担持するエクソソームと、免疫刺激剤又は免疫刺激剤と抗ＰＤ－１抗体の両方を発現するｏＨＳＶとを含む腫瘍を治療するためのキットに関する。前記キットは、腫瘍を治療するための前記エクソソーム及び前記ｏＨＳＶの使用の説明書をさらに含んでもよい。

本発明のさらなる態様は、治療有効量の、ＣＴＬＡ４を標的とするｍｉＲＮＡを担持する前記エクソソームと、治療有効量の、免疫刺激剤又は免疫刺激剤と抗ＰＤ－１抗体の両方を発現するｏＨＳＶとを同時に対象に投与することを含む対象の腫瘍を治療するための方法に関する。

本発明のさらなる態様は、それを必要とする対象に、ｏＨＳＶ療法に加えて、治療有効量の、本発明のＣＴＬＡ４を標的とするｍｉＲＮＡを担持するエクソソームを投与することを含む、対象におけるｏＨＳＶ療法の有効性を増強するための方法に関する。

本発明の他の態様は、以下の説明を読むことで容易に得るものであろう。

パネルＡはＣＴＬＡ４を標的とするｍｉＲＮＡをコードするプラスミドの模式図である。前記プラスミドは、その３’－ＵＴＲにＣＴＬＡ４遺伝子を標的とするように設計されたｍｉＲＮＡ（ｍｉＲ－ＣＴＬＡ－４）をコードする配列を含むＥＧＦＰをコードする配列から構成されている。パネルＢは、マウスＣＴＬＡ４遺伝子を標的とするｍｉＲＮＡのヌクレオチド配列を示す。太字、斜体、下線で強調表示されているヌクレオチドはエクソソームパッケージング関連モチーフ（エキソモチーフ）を表す。パネルＣは設計されたｍｉＲＮＡによるＣＴＬＡ４のダウンレギュレーションを示す。２４ウェルプレートに播種されたＨＥｐ－２細胞に、ＣＴＬＡ４（１＃－１０＃）に対するｍｉＲＮＡ又は非標的ｍｉＲＮＡ（ＮＴ）をコードする１０のＤＮＡ配列を発現する０．２５μｇのプラスミドと、Ｈｉｓタグ付きマウスＣＴＬＡ４（Ｈｉｓタグ付きＣＴＬＡ４）をコードする０．２５μｇのプラスミドとをコトランスフェクトしていた。７２時間のトランスフェクション後に細胞を回収した。ＣＴＬＡ４及びＧＡＰＤＨの蓄積は、当業者に知られているように測定された。 ｍｉＲ－ＣＴＬＡ－４を担持するエクソソームの特性研究である。Ｔ１５０フラスコに播種されたＨＥｐ－２細胞に１０μｇのｍｉＲ－ＣＴＬＡ－４－３＃プラスミド又は非標的ｍｉＲＮＡ（ＮＴ）を発現するプラスミドをトランスフェクトし、その後、無血清培地でインキュベートした。４８時間後、培地を収集し、材料と方法で説明されているようにエクソソームを精製した。精製されたエクソソームは２つの一連の分析にかけられた。まず（パネルＡ）、エクソソームを生成する等量の細胞と等量のエクソソームが可溶化され、変性ゲルで電気泳動にかけられ、ＣＤ９、フロチリン－１（Ｆｌｏｔｉｌｉｎ－１）及びカルネキシン（Ｃａｌｎｅｘｉｎ）に対する抗体によってプローブされた。一般的に、精製されたエクソソームにはＣＤ９、フロチリン－１（Ｆｌｏｔｉｌｉｎ－１）が含まれており、カルネキシン（Ｃａｌｎｅｘｉｎ）は含まれない。トランスフェクトされた細胞によって生成されたエクソソーム（パネルＢ）のサイズ分布は、材料と方法で説明されているように得られたものである。 ｍｉＲ－ＣＴＬＡ－４を担持するエクソソームを単独で投与した場合（パネルＡ）、又はＴ１０１２Ｇ（パネルＢ）、Ｔ２８５０（パネルＣ）又はＴ３８５５（パネルＤ）と同時に投与した場合のＭＦＣ腫瘍の成長への影響である。ＭＦＣ腫瘍細胞をＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスの右脇腹に皮下注射した。平均８０ｍｍ^３のＭＦＣ腫瘍を、８匹１群の動物に１０μｇのエクソソームと単独で注射し、又は５０μＬの１×１０^７ｐｆｕのＴ１０１２Ｇ、Ｔ２８５０又はＴ３８５５と同時に注射した。全ての研究が同時に行われており、結果は４つのパネルに示す。腫瘍体積は各群の８匹の動物の平均値±ＳＥＭとして示されている。

定義
「一」又は「１つ」の実体という表現は当該実体の１つ又は複数を指すということに留意されたい。例えば、「エクソソーム」は１つ又は複数のエクソソームを表すと理解されている。したがって、用語「１つ」、「１つ又は複数」及び「少なくとも１つ」は本明細書で入れ替わって使用される。

「相同性」、「同一性」又は「類似性」とは２つのペプチド間又は２つの核酸分子間の配列類似性を指す。相同性は比較のために整列され得る各配列の位置を比較することによって決定することができる。比較された配列の位置が同じ塩基又はアミノ酸で占められている場合、当該分子はその位置において相同である。配列間の相同性の程度は配列によって共有される一致する又は相同の位置の数の関数である。「無関係の」又は「非相同の」配列は本開示の配列の１つと、４０％未満の同一性、好ましくは２５％未満の同一性を共有する。

ポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド領域（又は１つのポリペプチド又はポリペプチド領域）が別の配列と特定のパーセンテージ（例えば、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％又は９９％）の「配列同一性」を有するとは、整列された時、当該２つの配列を比較する際に塩基（又はアミノ酸）の当該パーセンテージが同じであることを意味する。この整列及びパーセンテージ相同性又は配列同一性は、当技術分野で知られているソフトウェアプログラムを使用して決定することができる。

本明細書で使用される「リンカー」という用語は、同じ又は異なる２つ又はそれ以上のヌクレオチドを含むヌクレオチド配列の短い断片を指し、前記ヌクレオチドはアデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）及びウラシル（Ｕ）からなる群より選択される。

本明細書で使用される「治療」（“treat”または“treatment”）という用語は、治療目的の処置と予防的な手段の両方を指し、目的は腫瘍の進行などの望ましくない生理学的変化又は障害を予防又は減速（軽減）することである。有益な又は望ましい臨床結果には、症状の緩和、疾患の程度の軽減、腫瘍の安定した（すなわち、悪化しない）状態、腫瘍成長の阻害、腫瘍の体積の減少、腫瘍の進行の遅延又は減速、腫瘍の状態の改善又は軽減及び寛解（部分的又は全体的）が含まれるが、これらに限定されず、しかも検出可能か検出不可能かは問わない。治療を必要とする者には、既に腫瘍を持っている者だけでなく、腫瘍が生じがちの者も含まれる。

「対象」又は「個体」又は「動物」又は「患者」又は「哺乳動物」とは、診断、予後又は治療が望まれる任意の対象、特に哺乳動物対象を意味する。哺乳動物対象には、人間、家畜、農場動物、動物園の動物、競技動物又は愛玩動物、例えば、イヌ、ネコ、モルモット、ウサギ、ラット、マウス、ウマ、ウシ、乳牛などが含まれる。本明細書で対象としてヒトは好ましい。

本明細書で使用される「治療を必要とする患者」又は「治療を必要とする対象」などの表現には、例えば、検出、診断手順及び／又は治療のための本開示の組成物の投与から利益を得る対象、例えば、哺乳動物対象が含まれる。

本発明では、とりわけＣＴＬＡ４をコードする核酸分子の機能又は効果を調節するために、アンチセンスオリゴマー及び類似の種が使用される。本発明のオリゴマーとその標的核酸のハイブリダイゼーションは、一般に「アンチセンス」と呼ばれる。結果として、本発明のいくつかの好ましい実施形態の実施に含まれると考えられる好ましいメカニズムは、本明細書では「アンチセンス阻害」と呼ばれる。そのようなアンチセンス阻害は、典型的にはオリゴヌクレオチド鎖又はセグメントの水素結合に基づくハイブリダイゼーションに基づくもので、その結果、少なくとも１つの鎖又はセグメントが切断、分解され又はその他の方法で作動不能になる。これに関しては、現在そのようなアンチセンス阻害のために特定の核酸分子及びそれらの機能を標的とすることが好ましい。

干渉されるＲＮＡの機能には、タンパク質翻訳部位へのＲＮＡの転移、ＲＮＡ合成部位から離れている細胞内の部位へのＲＮＡの転移、ＲＮＡからのタンパク質の翻訳、１つ又は複数のＲＮＡ種を生成するためのＲＮＡのスプライシング、ＲＮＡに関与し又は促進される可能性のあるＲＮＡが関与する触媒活性又は複合体の形成が含まれてもよい。標的核酸の機能に対するそのような干渉の好ましい結果は、ＣＴＬＡ４の発現の調節である。本発明の文脈において、「調節」及び「発現の調節」は、遺伝子、例えば、ＤＮＡ又はＲＮＡをコードする核酸分子の量又はレベルの減少（阻害）を意味する。ｍＲＮＡは常に好ましい標的核酸である。

本発明の文脈において、「ハイブリダイゼーション」は、オリゴマーの相補的な鎖の対形成を意味する。本発明において、対形成の好ましいメカニズムは、オリゴマー化合物の鎖の相補的なヌクレオシド又はヌクレオチド塩基（核酸塩基）間の、ワトソンクリック（Ｗａｔｓｏｎ－Ｃｒｉｃｋ）、フーグスティーン（Ｈｏｏｇｓｔｅｅｎ）又は逆フーグスティーン（ｒｅｖｅｒｓｅｄ Ｈｏｏｇｓｔｅｅｎ）水素結合といった水素結合を含む。例えば、アデニンとチミンは水素結合の形成を通じて対になる相補的核酸塩基である。ハイブリダイゼーションは様々な状況において発生する。

本発明において、「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」又は「ストリンジェントな条件」という表現は、本発明の化合物がその標的配列に、しかも最小数の他の配列にハイブリダイズする条件を指す。ストリンジェントな条件は配列に依存し、状況が異なればそれが異なり、本発明の文脈において、オリゴマー化合物が標的配列にハイブリダイズする「ストリンジェントな条件」は、オリゴマーの性質及び組成並びにそれらを研究するアッセイによって決定される。

本明細書で使用される「相補的」は、オリゴマー化合物の２つの核酸塩基間の正確な対形成のための能力を指す。例えば、オリゴヌクレオチド（オリゴマー化合物）の特定の位置にある核酸塩基が、標的核酸の特定の位置にある核酸塩基と水素結合できる場合、前記標的核酸はＤＮＡ、ＲＮＡ又はオリゴヌクレオチド分子である。その場合、オリゴヌクレオチドと標的核酸との間の水素結合の位置は相補的な位置と見なされる。当該オリゴヌクレオチド及び更なるＤＮＡ、ＲＮＡ又はオリゴヌクレオチド分子は、各分子内の十分な数の相補的な位置が互いに水素結合できる核酸塩基によって占められている場合に、互いに相補的である。したがって、「特異的にハイブリダイズ可能」及び「相補的」は、オリゴヌクレオチドと標的核酸との間に安定的かつ特異的な結合が起こるように、十分な数の核酸塩基に対する十分な程度の正確な対形成又は相補性を表すために使用される用語である。

当技術分野において、アンチセンスオリゴマーの配列は、特異的にハイブリダイズ可能となるためにその標的核酸の配列に対して１００％相補的である必要がないことが理解される。さらに、オリゴヌクレオチドは、介在又は隣接するセグメントがハイブリダイゼーションイベント（例えば、ループ構造又はヘアピン構造）に関与しないように、１つ又は複数のセグメントにわたってハイブリダイズしてもよい。本発明のアンチセンス化合物は、標的核酸内の標的領域に対して少なくとも７０％、又は少なくとも７５％、又は少なくとも８０％、又は少なくとも８５％の配列相補性を含むことが好ましく、それらは少なくとも９０％の配列相補性を含むことがより好ましく、それらは標的とされる標的核酸配列内の標的領域に対して少なくとも９５％又は少なくとも９９％の配列相補性を含むことがさらに好ましい。例えば、アンチセンスオリゴマーの２０個の核酸塩基のうち１８個が標的領域に相補的であり、したがって特異的にハイブリダイズするアンチセンス化合物は、９０％の相補性を表すものであろう。この例では、残りの非相補的核酸塩基は、相補的な核酸塩基とクラスター化されるか又は散在している可能性があり、互いに又は相補的な核酸塩基に隣接している必要はない。したがって、標的核酸と完全に相補的な２つの領域に隣接する４つの非相補的な核酸塩基を有する長さが１８個の核酸塩基のアンチセンスオリゴマーは、標的核酸と７７．８％の全体的な相補性を有し、したがって本発明の範囲に属する。当技術分野で知られているＢＬＡＳＴプログラム（基本的な局所整列検索ツール）及びＰｏｗｅｒＢＬＡＳＴプログラムを使用して標的核酸の領域とのアンチセンス化合物の相補パーセンテージを決定することができる。

本発明の文脈において、「オリゴヌクレオチド」という用語は、リボ核酸（ＲＮＡ）又はデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）のオリゴマー又はポリマー、あるいはその模倣物、キメラ、類似体及び同族体を指す。当該用語には、天然に存在する核酸塩基、糖及び共有ヌクレオシド間（骨格）結合から構成されるオリゴヌクレオチド、並びに同じように機能する非天然に存在する部分を有するオリゴヌクレオチドが含まれる。そのような改変又は置換されたオリゴヌクレオチドは、例えば、増強された細胞への取り込み、標的核酸に対する増強された親和性、及びヌクレアーゼの存在下で増加した安定性などの望ましい特性により一般に天然の形態よりも好ましい。

本明細書で使用される用語「ｍｉｃｒｏＲＮＡ」、「ｍｉＲＮＡ」又は「ｍｉＲ」とは、一般に標的メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）転写物の３つのプライム（３’）非翻訳領域（３’ＵＴＲｓ）の相補配列に結合することによって、一般に遺伝子サイレンシングを引き起こす、遺伝子の発現を調節するために転写後に機能するＲＮＡを指す。ｍｉＲＮＡは、典型的には長さが２１又は２２のヌクレオチドの小さな調節ＲＮＡ分子である。用語「ｍｉｃｒｏＲＮＡ」、「ｍｉＲＮＡ」及び「ｍｉＲ」は入れ替わって使用される。

本明細書で使用される「腫瘍」という用語は、制御不能に成長する形質転換細胞を含む悪性組織（すなわち、過剰増殖性疾患）を指す。腫瘍には、白血病、リンパ腫、骨髄腫、形質細胞腫など、及び固形腫瘍が含まれる。本発明に基づいて治療できる固形腫瘍の例には、肉腫及びがん腫、例えば、黒色腫、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨形成性肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング肉腫（Ｅｗｉｎｇ’ｓ ｔｕｍｏｒ）、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸がん、膵がん、乳がん、卵巣がん、前立腺がん、扁平上皮がん、基底細胞がん、腺がん、汗腺がん、脂腺がん、乳頭がん、乳頭腺がん、嚢胞腺がん、髄様がん、気管支原性がん、腎細胞がん、肝がん、胆管がん、絨毛がん、セミノーマ、胚性がん、ウィルムス腫瘍（Ｗｉｌｍｓ’ ｔｕｍｏｒ）、子宮頸がん、精巣腫瘍、肺がん、小細胞肺がん、膀胱がん、上皮がん、神経膠腫、星状細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、血管芽腫、聴神経腫、乏突起神経膠腫、髄膜腫、神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫、胃がん及び前胃がんが含まれるが、これらに限定されない。

本明細書で使用される「ＣＴＬＡ４」という用語は、共刺激を阻害し、且つ阻害シグナルをＴ細胞に伝達することによってＴ細胞活性化を弱めることができる多くの共抑制分子の１つである「細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４」を指す。ＣＴＬＡ４のアミノ酸配列は、アクセッション番号ＮＰ＿０３３９７３．２又はＮＰ＿００１２６８９０５．１にてＮＣＢＩより利用できる。ＣＴＬＡ４はＣｔｌａ－４、Ｃｄ１５２又はＬｙ－５６としても知られる。ＣＴＬＡ４のＮＣＢＩ配列アクセッション番号はＮＣ＿００００６７．６で、遺伝子ＩＤは１２４７７である。ヒトＣＴＬＡ４遺伝子は免疫グロブリンスーパーファミリーに属する２３３のアミノ酸のタンパク質をコードする。ＣＴＬＡ４は２つの疎水性領域に隣接する１つのＶ様ドメインで構成されている。ＣＴＬＡ４はＴ細胞の増殖とＣＴＬＡ４の分化で極めて重要な役割を果たす免疫シナプスの構造を変化させることもできる。ＣＴＬＡ４の多型はＩ型糖尿病、原発性胆汁性肝硬変、バセドウ病（Ｇｒａｖｅｓ’ ｄｉｓｅａｓｅ）などの複数の疾患に対する感受性と関連している。

本明細書で使用される「ＩＬ－１２」という用語は、強力な抗腫瘍効果を有するサイトカインである「インターロイキン１２」を指す。したがって、ＩＬ－１２がＴＨ－１タイプの免疫応答を誘発し、これは永続的な抗腫瘍効果をもたらす可能性がある。ＩＬ－１２は、インビボでの抗血管新生活性を有し、これもその抗腫瘍効果に寄与することが報告されている。ＩＬ－１２は、ＣＴＬ、ナチュラルキラー細胞及びマクロファージの活性化の刺激やクラスＩＩＭＨＣ抗原の発現の誘発／増強といった能力を含む複数の免疫調節効果を持つＩＦＮ－γの高レベル産生を刺激することが最近報告されている。ＩＦＮ－γは、腫瘍部位へのＴ細胞の遊走を誘発するプロセスにおいて重要な役割を果たす。ＩＦＮ－γの腫瘍内レベルの増加は腫瘍量のサイズの減少と関連している。

プログラム細胞死１（ＰＤ－１）はアポトーシスを起こしているマウスＴ細胞株のサブトラクティブハイブリダイゼーションによって最初に同定された５０－５５ｋＤａのＩ型膜貫通型受容体である（Ｉｓｈｉｄａ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｅｍｂｏ Ｊ．１１：３８８７－９５）。ＣＤ２８遺伝子ファミリーのメンバーであるＰＤ－１は活性化されたＴ、Ｂ細胞及び骨髄系細胞において発現される（Ｇｒｅｅｎｗａｌｄ ｅｔ ａｌ．，２００５．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２３：５１５－４８；Ｓｈａｒｐｅ ｅｔ ａｌ．，２００７，Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．８：２３９－４５）。ヒトとマウスのＤ－１は約６０％のアミノ酸同一性を共有し、しかもＩｇ－Ｖドメインを定義する４つの潜在的なＮ－グリコシル化部位と残基が保存されている。ＰＤ－１はＴ細胞の活性化を負に調節し、当該阻害機能はその細胞質ドメインの免疫受容体チロシンベースの抑制モチーフ（ＩＴＩＭ）と関連している（Ｐａｒｒｙ ｅｔ ａｌ．，２００５，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２５：９５４３－５３）。ＰＤ－１のこの阻害機能の崩壊は自己免疫につながる可能性がある。

本明細書で使用される「抗体」又は「抗原結合ポリペプチド」は、１つ又は複数の抗原を特異的に認識してそれと結合するポリペプチド又はポリペプチド複合体を指す。抗体は、全抗体及びその任意の抗原結合断片又はその一本鎖であってもよい。したがって、「抗体」という用語は、抗原に結合する生物学的活性を有する免疫グロブリン分子の少なくとも一部を含む任意のタンパク質又はペプチド含有分子を含む。その例には、重鎖又は軽鎖の相補性決定領域（ＣＤＲ）又はそのリガンド結合部分、重鎖又は軽鎖可変領域、重鎖又は軽鎖定常領域、フレームワーク（ＦＲ）領域又はその任意の部分、又は結合タンパク質の少なくとも１つの部分が含まれるが、これらに限定されない。抗体という用語にはまた、活性化時に抗原結合能力を有するポリペプチド又はポリペプチド複合体が含まれる。

「治療有効量」とは、本開示の腫瘍溶解ウイルス及び／又はエクソソームが、上記の「治療」に十分な量で投与されることを意味する。特定の個体の障害又は状態の治療に治療的に有効な量は疾患の症状及び重症度に依存し、且つ標準的な臨床技術によって決定することができる。さらに、最適な用量範囲を決定することの手助けとして、インビトロ又はインビボアッセイを任意選択で使用することができる。製剤に使用される正確な用量は投与経路、及び疾患又は障害の重症度にも依存し、開業医の判断及び各患者の状況に応じて決定すべきである。有効な用量は、インビトロ又は動物モデル試験システムから得られた用量反応曲線から推定することができる。

ＣＴＬＡ４を標的とするｍｉＲＮＡ
本明細書で入れ替わって使用される「ＣＴＬＡ４を標的とする複数のｍｉＲＮＡ」、「ＣＴＬＡ４を標的とする１つのｍｉＲＮＡ」、「ＣＴＬＡ４を標的とするｍｉＲＮＡ」といった用語は、細胞内でのＣＴＬＡ４の転写、翻訳そして発現が損なわれるか、減少するか又は排除されるよう、タンパク質ＣＴＬＡ４をコードするｍＲＮＡを標的とし又はそれと特異的に結合するように設計された小さな非コードＲＮＡ（ｍｉｃｒｏＲＮＡ又はｍｉＲＮＡ）を指す。上記で説明されているように、ｍｉＲＮＡは必ずしも１００％の特異性で標的ｍＲＮＡに結合するとは限らない。ｍｉＲＮＡは、標的ｍＲＮＡへの結合の特異性を決定するシード配列（５’末端から２つ－８つのヌクレオチド）を持っていることが知られているが、残りのヌクレオチドは必ずしも標的ｍＲＮＡと正確に相補的ではない。したがって、一実施形態において、前記ｍｉＲＮＡは、配列番号１、配列番号２、配列番号３又は配列番号４のヌクレオチド配列のいずれかのシード配列を有する。いくつかの実施形態において、ＣＴＬＡ４を標的とするｍｉＲＮＡは、細胞に送達された後、細胞におけるＣＴＬＡ４タンパク質の発現を遮断する。

ＣＴＬＡ４を標的とするｍｉＲＮＡを担持するエクソソーム
エクソソームは細胞膜に由来する小さくて比較的均一なサイズの小胞である。例えば、エクソソームは約３０－約１００ｎｍの直径を有する。それらはいくつかの重要なタンパク質（例えば、ＣＤ９、ＣＤ６３、ＣＤ８１、ＣＤ８２、アネキシン、フロチリン（Ｆｌｏｔｉｌｌｉｎ）など）を含み、さらにそれらはタンパク質、ｍＲＮＡ、長鎖ノンコーディングＲＮＡ及びｍｉＲＮＡをパッケージングする。エクソソームはペイロードを１つの細胞から別の細胞に輸送する。レシピエント細胞に入ると、エクソソームペイロードが細胞質に放出される。

いくつかの実施形態において、ＣＴＬＡ４を標的とするｍｉＲＮＡは、エクソソームを介して細胞に送達される。したがって、一実施形態において、上記で説明されているようなＣＴＬＡ４を標的とするｍｉＲＮＡのいずれかを担持するエクソソームが提供される。本発明では、「エキソモチーフ」と呼ばれるヌクレオチド配列の断片を使用してｍｉＲＮＡのエクソソームへのパッケージングを促進又は増強する。一実施形態において、前記エキソモチーフは表１に記載されているいずれかの配列から選択される。

いくつかの実施形態において、前記エキソモチーフは組み合わせて使用される。例えば、表に記載されている２つ又はそれ以上のエキソモチーフを組み合わせて２つ折りのエキソモチーフを形成する。当該モチーフは、あるエキソモチーフの５’末端を別のエキソモチーフの３’末端にリンクすることによって線形結合されてもよい。これに関連して、あるエキソモチーフの５’末端の最初のヌクレオチドが別のエキソモチーフの３’末端の最後のヌクレオチドと同じである場合に、同じヌクレオチドの１つを省略できるように設計することができる。例えば、「ＧＧＡＧ」（配列番号２１）が「ＧＧＡＣ」（配列番号２２）と組み合わされて２つ折りのエキソモチーフ「ＧＧＡＧＧＡＣ」（配列番号４８）を形成する。あるエキソモチーフの５’末端の最初のヌクレオチドが別のエキソモチーフの３’末端の最後のヌクレオチドと異なる場合に、当該２つのエキソモチーフはリンカーによって又は共有結合によって直接的に接続されてもよい。例えば、「ＧＧＡＣ」（配列番号２２）はリンカー「ＵＧ」によって「ＧＧＡＧ」（配列番号２１）と組み合わされて２つ折りのエキソモチーフ「ＧＧＡＣＵＧＧＧＡＧ」（配列番号４９）を形成することができ、「ＧＧＡＣ」（配列番号２２）はまた、共有結合によって「ＧＧＡＧ」（配列番号２１）と組み合わされて２つ折りのエキソモチーフ「ＧＧＡＣＧＧＡＧ」（配列番号５１）を形成することができる。本発明ではまた、３つ折り又はそれ以上のエキソモチーフ、すなわち配列番号２１から配列番号４７の３つ又はそれ以上のモチーフからなるエキソモチーフも検討される。したがって、本明細書で使用される「エキソモチーフ」という用語は、配列番号２１から配列番号４７のいずれかの単一のエキソモチーフ、単一のモチーフの組み合わせによって生成されるいずれかの２つ折り（例えば、配列番号４８－５２のいずれか）、３つ折り又はそれ以上のエキソモチーフを含む、エクソソームへのｍｉＲＮＡのパッケージングを増強又は促進することができるヌクレオチド配列を含むことを意図する。

本発明において、エキソモチーフはｍｉＲＮＡのシード配列に作動可能に連結されている。「作動可能にリンク」という用語は、エクソソームへのｍｉＲＮＡのパッケージングが増強又は促進される、調節配列（例えば、エクソモチーフ）と核酸配列（例えば、ｍｉＲＮＡのシード配列）との間の機能的なリンクを指す。例えば、第１核酸配列が第２核酸配列と機能的な関係に置かれる場合に、第１核酸配列は第２核酸配列に作動可能に連結される。作動可能に連結されたＲＮＡ配列は互いに隣接してもよいし、リンカーによって接続されてもよい。

いくつかの実施形態において、エキソモチーフはｍｉＲＮＡのシード配列の下流に位置する。いくつかの実施形態において、エキソモチーフはｍｉＲＮＡのシード配列の上流に位置する。いくつかの実施形態において、前記ｍｉＲＮＡのシード配列はエキソモチーフに隣接している。一実施形態において、エキソモチーフはｍｉＲＮＡのシード配列に作動可能に連結されている。一実施形態において、エキソモチーフはｍｉＲＮＡのシード配列以外の１つ又は複数のヌクレオチド配列の突然変異によって得られる。一実施形態において、エキソモチーフを有する前記ＣＴＬＡ４を標的とするｍｉＲＮＡは配列番号５、配列番号６、配列番号７又は配列番号８のヌクレオチド配列を含む。一実施形態において、エキソモチーフを有する前記ＣＴＬＡ４を標的とするｍｉＲＮＡは配列番号５、配列番号６、配列番号７又は配列番号８のヌクレオチド配列である。

エキソモチーフがｍｉＲＮＡのシード配列の下流に位置するいくつかの実施形態において、シード配列の３’末端の最後のヌクレオチドとエキソモチーフの５’末端の最初のヌクレオチドは同じヌクレオチド、例えば、グアニンヌクレオチド「Ｇ」を共有する。例えば、配列番号６はエキソモチーフとシード配列との間のグアニンヌクレオチド「Ｇ」の共有を示している。エキソモチーフがｍｉＲＮＡのシード配列の下流に位置するいくつかの実施形態において、シード配列の３’末端の最後の２つのヌクレオチドとエキソモチーフの５’末端の最初の２つのヌクレオチドは２つの同じヌクレオチド、例えば、２つのグアニンヌクレオチド「ＧＧ」を共有する。例えば、配列番号８はエキソモチーフとシード配列との間の２つのグアニンヌクレオチド「ＧＧ」の共有を示している。

いくつかの実施形態において、エキソモチーフはｍｉＲＮＡのシード配列の下流に位置し、リンカー、例えば、「ＧＣ」によってｍｉＲＮＡのシード配列に接続される。例えば、配列番号７はエキソモチーフとシード配列がリンカー「ＧＣ」によって接続されていることを示している。

シード配列とエキソモチーフに加えて、ｍｉＲＮＡにはｍＲＮＡの標的領域への結合を促進する追加の核酸配列も含まれている。これらの追加の核酸は通常、エキソモチーフの下流に位置し、しかも数ヌクレオチド、例えば、１つから１０のヌクレオチドの長さを有する。追加の核酸配列は好ましくは標的ｍＲＮＡの対応するセグメントに相補的であるが、上記で説明されているように、必ずしも１００％相補的であるとは限らない。

実施例に記載されるように、ｍｉＲＮＡ発現ベクター及びＣＴＬＡ４をコードするプラスミドで細胞をコトランスフェクトするなど、ｍｉＲＮＡをエクソソームに転移するための方法は当技術分野で利用可能である。エクソソームの分離、同定又は特性研究は当技術分野で技術的に実現が可能である。ＣＤ９、ＣＤ６３、ＣＤ８１、ＣＤ８２、アネキシン、フロチリン（Ｆｌｏｔｉｌｌｉｎ）などのいくつかのタンパク質は、エクソソームのマーカーとして使用できる。ｍｉＲＮＡをエクソソームにパッケージングするための他の方法も本発明に適用できる。

本発明のエクソソームは、阻害量のＣＴＬＡ４を標的とするｍｉＲＮＡを含む。阻害量とは、対象となるｍｉＲＮＡが腫瘍細胞に送達された後、タンパク質ＣＴＬＡ４の発現を阻害するのに十分な量を意味する。

以下の表は、本発明の実施例で使用されるｍｉＲＮＡ、シード配列、及びｍｉＲＮＡ－モチーフの核酸配列を示している。

腫瘍溶解性単純ヘルペスウイルス（ｏＨＳＶ）
本明細書で使用される腫瘍溶解性単純ヘルペスウイルス（ｏＨＳＶ）は、腫瘍細胞の破壊に利用可能で又は効果的であるように設計される、当技術分野で知られている任意の腫瘍溶解性単純ヘルペスウイルスＩ型（ＨＳＶ－１）を指す。さらに、本発明で使用されるｏＨＳＶはまた、天然のｏＨＳＶの１つ又は複数の特徴が削除されるように遺伝子操作することができる。さらに又は代わりに、天然に存在するｏＨＳＶは、免疫療法又は免疫刺激特性などのウイルスの１つ又は複数の追加の機能を提供するように、ウイルスのゲノムにコード配列の１つ又は複数の外因性断片を導入するように遺伝子操作されてもよい。

本開示に従って削除されるヌクレオチドの正確な開始位置及び終了位置はＨＳＶ－１ウイルスの株及びゲノム異性体に依存しており、当技術分野の既知の技術によって容易に決定されるということは当業者が理解しているであろう。いくつかの実施形態において、欠失はゲノムのヌクレオチド１１７００５から１３２０９６の切除を引き起こす。いくつかの実施形態において、ｏＨＳＶは、ＨＳＶ－１の株１７（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ００１８０６．２）、株ＫＯＳ１．１（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＫＴ８９９７４４）又は株Ｆ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＧＵ７３４７７１．１）から選択される。いくつかの実施形態において、ｏＨＳＶはＨＳＶ－１の株Ｆである。

いくつかの実施形態において、前記ｏＨＳＶはＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－２、ＩＬ－５、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－２４及びＩＬ－２７から選択される免疫刺激剤を発現する遺伝子操作されたＨＳＶ－１ Ｆ株である。いくつかの実施形態において、前記ｏＨＳＶはＩＬ－１２のみを発現する遺伝子操作されたＨＳＶ－１ Ｆ株である。いくつかの実施形態において、前記ｏＨＳＶはＩＬ－１２と抗ＰＤ－１抗体の両方を発現する遺伝子操作されたＨＳＶ－１ Ｆ株である。

方法と治療法
本開示の一態様は、それを必要とする対象に、治療有効量の、ＣＴＬＡ４を標的とするｍｉＲＮＡを担持するエクソソームと治療有効量の、免疫刺激剤又は免疫刺激剤と抗ＰＤ－１抗体の両方を発現するｏＨＳＶとを投与することを含む、対象の腫瘍の治療方法を提供する。

本開示の一態様は、それを必要とする対象に、ｏＨＳＶ療法に加えて治療有効量の本発明のＣＴＬＡ４を標的とするｍｉＲＮＡを担持するエクソソームを投与することを含む、対象におけるｏＨＳＶ療法の有効性を増強するための方法を提供する。いくつかの実施形態において、ｏＨＳＶは免疫刺激剤を発現する、又は免疫刺激剤と抗ＰＤ－１抗体の両方を発現する。いくつかの実施形態において、ｏＨＳＶは、ＩＬ－１２のみを発現する。いくつかの実施形態において、ｏＨＳＶはＩＬ－１２及び抗ＰＤ－１抗体を発現する。

いくつかの実施形態において、本開示の方法では、ＣＴＬＡ４を標的とするｍｉＲＮＡを担持するエクソソームと免疫刺激剤又は免疫刺激剤と抗ＰＤ－１抗体の両方を発現するｏＨＳＶの投与は、治療有効量の、ＣＴＬＡ４を標的とするｍｉＲＮＡを担持するエクソソームと、治療有効量の、免疫刺激剤又は免疫刺激剤と抗ＰＤ－１抗体の両方を発現するｏＨＳＶと、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物を対象に投与することによって実行される。

いくつかの実施形態において、本開示の方法では、ＣＴＬＡ４を標的とするｍｉＲＮＡを担持するエクソソーム及び免疫刺激剤又は免疫刺激剤と抗ＰＤ－１抗体の両方を発現するｏＨＳＶの投与は、ＣＴＬＡ４を標的とするｍｉＲＮＡを担持するエクソソームと、免疫刺激剤又は免疫刺激剤と抗ＰＤ－１抗体の両方を発現するｏＨＳＶをそれぞれ対象に投与することによって実行される。いくつかの実施形態において、ＣＴＬＡ４を標的とするｍｉＲＮＡを担持するエクソソームは、免疫刺激剤又は免疫刺激剤と抗ＰＤ－１抗体の両方を発現するｏＨＳＶの投与の前、それと同時又はその後に投与される。そのような場合には、互いに約１２から７２時間以内に２つの形態で対象に投与してもよいということは考えられる。状況によっては、治療期間を大幅に延長することが望ましい場合があるが、それぞれの投与の間には数日（２、３、４、５、６又は７日）から数週間（１、２、３、４、５、６、７又は８）が経過する。

いくつかの実施形態において、ＣＴＬＡ４を標的とするｍｉＲＮＡを担持するエクソソームは、免疫刺激剤又は免疫刺激剤と抗ＰＤ－１抗体の両方を発現するｏＨＳＶと同時に投与される。いくつかの実施形態において、ＣＴＬＡ４を標的とするｍｉＲＮＡを担持するエクソソームは、治療有効量の、ＣＴＬＡ４を標的とするｍｉＲＮＡを担持するエクソソームと薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物の形態で投与され、且つ免疫刺激剤又は免疫刺激剤と抗ＰＤ－１抗体の両方を発現するｏＨＳＶは治療有効量の、免疫刺激剤又は免疫刺激剤と抗ＰＤ－１抗体の両方を発現するｏＨＳＶと薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物の形態で投与される。そのような実施形態において、治療有効量の、ＣＴＬＡ４を標的とするｍｉＲＮＡを担持するエクソソームと薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物と、治療有効量の、免疫刺激剤又は免疫刺激剤と抗ＰＤ－１抗体の両方を発現するｏＨＳＶと薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物を１つのキットにパッケージングすることができる。

特定の実施形態において、医薬組成物のいずれかは非経口的又は経口的に、例えば、腫瘍内、静脈内、筋肉内、経皮的又は皮内に投与される。いくつかの実施形態において、医薬組成物のいずれかは、好ましくは腫瘍内に投与される。

特定の実施形態において、腫瘍の治療方法は、例えば、腫瘍の成長を阻害すること、及び／又は腫瘍の体積を減少することに関して、ｏＨＳＶ療法の抗腫瘍有効性を増強することである。したがって、いくつかの実施形態において、本開示は、上記で説明されているように、それを必要とする対象に治療有効量のエクソソームを、治療有効量のｏＨＳＶと組み合わせて投与することを含む腫瘍の治療方法を提供する。特定の実施形態において、腫瘍の治療方法は腫瘍に関連する症状の発症、進行及び／又は再発を予防する。したがって、いくつかの実施形態において、対象の腫瘍に関連する症状を予防するための方法は、上記で説明されている治療有効量のエクソソーム及び治療有効量のｏＨＳＶを、それを必要とする対象に投与することを含む。

いくつかの実施形態において、前記ｏＨＳＶはＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－２、ＩＬ－５、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－２４及びＩＬ－２７から選択される免疫刺激剤を発現する遺伝子操作されたＨＳＶ－１ Ｆ株である。いくつかの実施形態において、前記ｏＨＳＶはＩＬ－１２のみを発現する遺伝子操作されたＨＳＶ－１ Ｆ株である。いくつかの実施形態において、前記ｏＨＳＶはＩＬ－１２と抗ＰＤ－１抗体の両方を発現する遺伝子操作されたＨＳＶ－１ Ｆ株である。

本開示の方法は、様々な腫瘍、特には固形腫瘍を治療するために考案される。本発明に基づいて治療できる固形腫瘍の例には、肉腫及びがん腫、例えば、黒色腫、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨形成性肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング肉腫、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸がん、膵がん、乳がん、卵巣がん、前立腺がん、扁平上皮がん、基底細胞がん、腺がん、汗腺がん、脂腺がん、乳頭がん、乳頭腺がん、嚢胞腺がん、髄様がん、気管支原性がん、腎細胞がん、肝がん、胆管がん、絨毛がん、セミノーマ、胚性がん、ウィルムス腫瘍、子宮頸がん、精巣腫瘍、肺がん、小細胞肺がん、膀胱がん、上皮がん、神経膠腫、星状細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、血管芽腫、聴神経腫、乏突起神経膠腫、髄膜腫、神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫、胃がん及び前胃がんが含まれるが、これらに限定されない。

医薬組成物とキット
本開示の一態様は、上記で説明されている治療有効量のエクソソームと治療有効量のｏＨＳＶと、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物を提供する。当該医薬組成物は、対象における腫瘍の予防又は治療に有用である。当該医薬組成物は、薬学的に許容される適切な担体又は賦形剤で調製することができる。

本開示の別の態様は、上記で説明されている治療有効量のエクソソームと、薬学的に許容される担体とを含む第１医薬組成物を提供する。さらに、上記で説明されている治療有効量のｏＨＳＶと、薬学的に許容される担体とを含む第２医薬組成物が提供される。そのような態様において、単一のパッケージングに第１医薬組成物と第２医薬組成物とを含むキットが提供される。当該キットには、医師が臨床的使用中に参照できる使用仕様がさらに含まれてもよい。

いくつかの実施形態において、前記ｏＨＳＶはＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－２、ＩＬ－５、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－２４及びＩＬ－２７から選択される免疫刺激剤を発現する遺伝子操作されたＨＳＶ－１ Ｆ株である。いくつかの実施形態において、前記ｏＨＳＶはＩＬ－１２のみを発現する遺伝子操作されたＨＳＶ－１ Ｆ株である。いくつかの実施形態において、前記ｏＨＳＶはＩＬ－１２と抗ＰＤ－１抗体の両方を発現する遺伝子操作されたＨＳＶ－１ Ｆ株である。

通常の保管及び使用条件では、これらの製剤／組成物には微生物の成長を防ぐための防腐剤が含まれている。注射可能な使用に適する剤形には、無菌の水溶液又は分散液及び無菌注射溶液又は分散液の即時調製のための無菌粉末が含まれる。全ての場合において、このような形態は無菌でなければならず、且つ注射しやすいように所定の流動性を有する。製造及び保管の条件下で安定しており、且つ細菌や真菌などの微生物の汚染作用から保護されている必要がある。

担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコールなど）、それらの適切な混合物及び／又は植物油を含む溶媒又は分散媒体であってもよい。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用によって、分散の場合に必要な粒子サイズの維持によって、及び界面活性剤の使用によって維持されてもよい。微生物の作用の防止は、様々な抗菌剤及び抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどによってもたらされる。多くの場合は、等張剤、例えば、糖、塩化ナトリウム又はリン酸緩衝生理食塩水を含めることが好ましいであろう。注射可能な組成物の長期の吸収は、吸収を遅らせる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムとゼラチンの組成物での使用によってもたらされる。

水溶液での非経口投与の場合は、例えば、必要に応じて溶液を適切に緩衝し、液体希釈剤を最初に十分な生理食塩水又はグルコースで等張にすべき場合がある。これらの特定の水溶液は静脈内、筋肉内、皮下、腫瘍内及び腹腔内投与には特に適する。これに関連して、使用可能な滅菌水性媒体は本開示に照らせば当業者が知るものであろう。例えば、１回の用量を１ｍＬの等張ＮａＣｌ溶液に溶解して、それを１０００ｍＬの皮下注射液に加えるか、又は推奨された注入部位に注射することができる（例えば、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」第１５版、１０３５－１０３８及び１５７０－１５８０ページを参照）。用量は、治療される対象の状態に応じて変わるものである。いずれにせよ、投与責任者は個々の対象に適切な用量を決定する。さらに、人間への投与の場合は、製剤はＦＤＡが要求する無菌性、発熱性、一般的な安全性及び純度の基準を満たす必要がある。

滅菌注射液は、必要な量の活性化合物を適切な溶媒に、必要に応じて上記に列挙した他の様々な成分とともに組み込んだ後、濾過滅菌することによって調製される。一般に、分散液は、様々な滅菌された有効成分を基本的な分散媒体及び上に列挙されたものからの必要な他の成分を含む滅菌ビヒクルに組み込むことによって調製される。無菌の注射可能な溶液を調製するための無菌粉末の場合は、好ましい調製方法は真空乾燥及び凍結乾燥技術であり、これにより事前に滅菌濾過された溶液から有効成分及び任意の追加の所望の成分の粉末が得られる。

本明細書に開示される組成物は中性又は塩の形態で提供されてもよい。薬学的に許容される塩には、（タンパク質の遊離アミノ基と形成される）酸付加塩が含まれ、これは例えば、塩酸もしくはリン酸などの無機酸、又は酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸などの有機酸と形成される。遊離カルボキシ基と形成される塩は、例えば、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、又は水酸化第二鉄などの無機塩基、及びイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカインなどの有機塩基から誘導されてもよい。製剤化の時は、溶液は剤形と適合性のある方法で治療的に有効な量で投与される。当該製剤は、注射可能な溶液、薬物放出カプセルなどの様々な剤形で容易に投与される。

本明細書で使用される「担体」には、ありとあらゆる溶媒、分散媒、ビヒクル、コーティング、希釈剤、抗菌剤及び抗真菌剤、等張剤及び吸収遅延剤、緩衝液、担体溶液、懸濁液、コロイドなどが含まれる。医薬活性物質へのそのような媒体及び薬剤の使用は、当技術分野でよく知られることである。任意の従来の媒体又は薬剤が有効成分と適合しない場合を除いて、前記治療用組成物におけるその使用が予想される。補助的な有効成分も組成物に組み込まれてもよい。

「薬学的に許容される」という表現は、ヒトに投与された時にアレルギー性又は同様の有害な反応を生じない分子実体及び組成物を指す。有効成分としてタンパク質を含む水性組成物の調製は当技術分野でよく理解されることである。典型的には、そのような組成物は、液体溶液又は懸濁液のいずれかとして注射剤として調製され、注射前の液体への溶解又は懸濁に適する固体形態として調製されてもよい。

実施例
ＣＴＬＡ４チェックポイントをコードするｍＲＮＡが標的となるように特別に設計されたｍｉＲＮＡを担持し、それを腫瘍細胞に放出するように設計されたエクソソームからなる補助療法の開発について説明する。

エクソソームは、サイズとタンパク質の含有量によって治療用途の目的として定義された細胞外小胞である。それらは、それらを生成する細胞にＲＮＡとタンパク質をパッケージングし、且つそれらがさらされる細胞にそれを届ける。このレポートで説明されている研究では、エクソソームのペイロードがｍｉＲＮＡであることが望ましい。

ｍｉＲＮＡは、原理的には特定のタンパク質をコードするＲＮＡの複製を制御するために使用できる強力なツールである。目的は、細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４の複製を遮断でき、且つエクソソームを介して感染細胞に送達されるｍｉＲＮＡを設計することである。ＣＴＬＡ４をコードするｍＲＮＡを標的とする１０個のｍｉＲＮＡを設計した。当該１０個のｍｉＲＮＡのうち、ｍｉＲ－ＣＴＬＡ４－１＃、ｍｉＲ－ＣＴＬＡ４－２＃、ｍｉＲ－ＣＴＬＡ４－３＃及びｍｉＲ－ＣＴＬＡ４－６＃は感受性細胞へのトランスフェクション後にＣＴＬＡ４の蓄積を効果的に遮断した。ｍｉＲＮＡのエクソソームへのパッケージングを促進するために、ｍｉＲ－ＣＴＬＡ４－３＃の配列をエクソソームパッケージングモチーフに組み込んだ。これまでの研究と同様に、ｍｉＲ－ＣＴＬＡ４－３＃はエクソソームにパッケージングされ、エクソソームによって感受性細胞に正常に送達され、しかも感受性細胞において少なくとも７２時間安定していた。さらに、エクソソームを介して腫瘍に送達されたｍｉＲ－ＣＴＬＡ４－３＃は、ＣＴＬＡ４の発現を効果的に減少させた。

エクソソームへのＲＮＡの組み込みは配列に依存し、且つエクソソームの成分のｈｎＲＮＰＡ２Ｂ１によって促進される。ｈｎＲＮＰＡ２Ｂ１は、２種の既知のエクソソームパッケージングモチーフ（エキソモチーフ）の１種を含むエクソソームＲＮＡに分類される。ｈｎＲＮＰＡ２Ｂ１の重要な機能は、ＲＮＡ輸送配列（ＲＴＳ）と呼ばれる２１－ｎｔのＲＮＡ配列に結合することによって媒介される、神経細胞の軸索へのｍＲＮＡ輸送を調節することである。当該配列には両方のエキソモチーフが含まれている。

我々は、ｏＨＳＶのネズミＴ１、Ｔ２及びＴ３シリーズに対する腫瘍溶解活性に比較的耐性のあるネズミ腫瘍を同定した。ｏＨＳＶのＴ１シリーズは免疫調節剤（以下、「Ｔ１０１２Ｇ」とも呼ばれる）を発現しないＨＳＶ－１ Ｆ株である。ｏＨＳＶのＴ２シリーズはＩＬ－１２のみを発現するＨＳＶ－１ Ｆ株である（以下、「Ｔ２８５０」とも呼ばれる）。ｏＨＳＶのＴ３シリーズはＩＬ－１２及び抗ＰＤ－１抗体（以下、「Ｔ３８５５」とも呼ばれる）を同時に発現するＨＳＶ－１ Ｆ株である。

実施例は、Ｔ３８５５（又はＴ２８５０）及びＣＴＬＡ４をコードするｍＲＮＡを標的とするように設計されたｍｉＲＮＡを担持するエクソソームを含む組成物を介して腫瘍に送達することによって、Ｔ２８５０、特にＴ３８５５の抗腫瘍有効性を増強し、腫瘍の体積を減少させることができることを示している。

材料と方法
同系マウスモデルである。ＭＦＣ腫瘍を受け入れるために同系マウスはＢａｌｂ／ｃとした。

ｍｉＲ－ＣＴＬＡ－４を発現するプラスミドである。マウスＣＴＬＡ４に対する標的ｍｉＲＮＡ配列は、Ｌｉｆｅ ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓのＢＬＯＣＫ－ｉＴ（商標）ＲＮＡｉ Ｄｅｓｉｇｎｅｒを使用して設計され、Ｉｇｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（中国広州）によって合成された。合成されたｍｉＲＮＡ断片を制限酵素ＢａｍＨＩ及びＸｈｏＩで消化し、ｐｃＤＮＡ６．２－ＧＷ／ＥｍＧＦＰ－ｍｉＲ－ｎｅｇコントロールプラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の対応する部位にクローニングした。ｍｉＲＮＡの配列は次のとおりである。

ｍｉＲ－ＣＴＬＡ４－１＃：
５’－ＡＡＣＣＴＴＣＡＧＴＧＧＡＧＴＴＧＧＣＧＡＧＴＴＴＴＧＧＣＣＡＣＴＧＡＣＴＧＡＣＴｃＧＣＣＡＡＣＣＡＣＴＧＡＡＧＧＴＴ－３’（配列番号５３）、
ｍｉＲ－ＣＴＬＡ４－２＃：
５’－ＣＴＴＣＡＧＴＧＧＡＧＴＴＧＧＣＧＡＧＣＡＧＴＴＴＴＧＧＣＣＡＣＴＧＡＣＴＧＡＣＴＧＣＴＣＧＣＣＣｔＣＣＡＣＴＧＡＡＧ－３’（配列番号５４）、
ｍｉＲ－ＣＴＬＡ４－３＃：
５’－ＡＣＴＧＴＧＣＴＧＣＧＧＡＧＧＡＣＡＡＡＴＧＴＴＴＴＧＧＣＣＡＣＴＧＡＣＴＧＡＣＡＴＴＴＧＴＣＣＣＧＣＡＧＣＡＣＡＧＴ－３’（配列番号５５）、
ｍｉＲ－ＣＴＬＡ４－４＃：
５’－ＣＧＡＣＡＴＴＣＡＣＧＧＡＧＧＡＧＡＡＴＡＧＴＴＴＴＧＧＣＣＡＣＴＧＡＣＴＧＡＣＴＡＴＴＣＴＣＣＣＧＴＧＡＡＴＧＴＣＧ－３’（配列番号５６）、
ｍｉＲ－ＣＴＬＡ４－５＃：
５’－ＧＡＡＣＣＴＣＡＣＣＣＴＣＣＡＡＧＧＡＣＴＧＴＴＴＴＧＧＣＣＡＣＴＧＡＣＴＧＡＣＡＧＴＣＣＴＴＧＧＧＧＴＧＡＧＧＴＴＣ－３’（配列番号５７）、
ｍｉＲ－ＣＴＬＡ４－６＃：
５’－ＡＴＣＣＡＡＧＧＡＣＴＧＧＧＡＧＣＴＧＴＴＧＴＴＴＴＧＧＣＣＡＣＴＧＡＣＴＧＡＣＡＡＣＡＧＣＴＣＡＧＴＣＣＴＴＧＧＡＴ－３’（配列番号５８）、
ｍｉＲ－ＣＴＬＡ４－７＃：
５’－ＡＣＴＣＡＴＧＴＡＣＣＣＴＣＣＧＣＣＡＴＡＧＴＴＴＴＧＧＣＣＡＣＴＧＡＣＴＧＡＣＴＡＴＧＧＣＧＧＧＧＴＡＣＡＴＧＡＧＴ－３’（配列番号５９）、
ｍｉＲ－ＣＴＬＡ４－８＃：
５’－ＧＧＣＡＡＣＧＧＧＡＧＧＣＧＧＡＧＴＴＡＴＧＴＴＴＴＧＧＣＣＡＣＴＧＡＣＴＧＡＣＡＴＡＡＣＴＣＣＣＴＣＣＣＧＴＴＧＣＣ－３’（配列番号６０）、
ｍｉＲ－ＣＴＬＡ４－９＃：
５’－ＧＧＧＣＡＡＣＧＧＧＡＣＧＧＡＧＡＴＴＴＡＧＴＴＴＴＧＧＣＣＡＣＴＧＡＣＴＧＡＣＴＡＡＡＴＣＴＣＴＣＣＣＧＴＴＧＣＣＣ－３’（配列番号６１）、
ｍｉＲ－ＣＴＬＡ４－１０＃：
５’－ＴＧＡＣＴＧＴＧＣＴＧＣＧＧＣＧＧＡＣＡＡＧＴＴＴＴＧＧＣＣＡＣＴＧＡＣＴＧＡＣＴＴＧＴＣＣＧＣＣＡＧＣＡＣＡＧＴＣＡ－３’（配列番号６２）。
下線は成熟したｍｉＲＮＡ配列を示す。

Ｈｉｓタグ付きマウスＣＴＬＡ４を発現するプラスミド（ｍＣＴＬＡ４－ｈｉｓ）は、ＹｏｕＢｉｏ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（中国長沙）から購入した。

細胞株である。ＨＥｐ－２細胞はアメリカンタイプカルチャーコレクションから取得され、５％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を添加したＤＭＥＭ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）において日常的に培養した。ＭＦＣ（マウス前胃がん）細胞はＪＯＩＮＮ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．（中国北京）から提供された。Ｂ１６（マウス黒色腫）はＳｈｅｎｚｈｅｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（中国深セン）から提供された。

抗体である。本研究で使用される抗体は抗Ｈｉｓタグ（カタログ番号６６００５－１－Ｉｇ、Ｐｒｏｔｅｉｎｔｅｃｈ Ｇｒｏｕｐ）及び抗ＧＡＰＤＨ（カタログ番号２１１８、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）であった。

エクソソームの分離である。ＨＥｐ－２細胞（５×１０^６）にｍｉＲ－ＣＴＬＡ－４を発現する１０μｇのプラスミドをトランスフェクトした。４時間のインキュベーション後、細胞をＰＢＳで３回リンスして、血清中のエクソソームの汚染の可能性を排除し、細胞を無血清培地でさらに４８時間培養した。総エクソソーム分離キット薬剤（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、カタログ番号４４７８３５９）の推奨用量と混合して上澄み液を回収し、４℃下で一晩保管した後、１時間遠心分離した。次に、ペレット化したエクソソームを２００μＬのＰＢＳに再懸濁するか、又はＲＩＰＡバッファーで溶解し、製造元の説明に従って増強型ＢＣＡタンパク質検出キット（中国Ｂｅｙｏｔｉｍｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を使用してＢＣＡアッセイで定量した。エクソソームタンパク質の含有量は、ウシ血清アルブミン標準濃度に対して５６２ｎｍでの吸光度をプロットすることによって作成された標準曲線に対する較正によって決定された。

エクソソームのサイズと定量分析である。エクソソームのサイズ分布分析は、ｑＮａｎｏシステム（ニュージーランド・クライストチャーチ、Ｉｚｏｎ）を使用して行われた。ＩｚｏｎのｑＮａｎｏ技術（ｗｗｗ．ｉｚｏｎ．ｃｏｍ）は単一分子電気泳動によってナノポアを通過する細胞外小胞を検出するために利用される。実際には、粒子サイズを平均化することなく、エクソソームのサイズが７５から１５０ｎｍの小胞の粒子ごとの正確な特性研究が可能である。精製したエクソソームを、０．０５％のＴｗｅｅｎ－２０とＰＢＳによって１：１０に希釈し、激しく振とうし、製造元の説明に従ってＮＰ１５０（Ａ４５５４０）ナノポアアパーチャを使用して測定した。データ処理と分析は、ソフトウェアＩｚｏｎ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｓｕｉｔｅ ｖ３．３（Ｉｚｏｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ）において実行された。

イムノブロットアッセイである。イムノブロットアッセイによるＨｉｓタグ付きＣＴＬＡ－４、ＧＡＰＤＨ及びエクソソームメーカータンパク質の検出である。細胞を回収し、１ｍＭプロテアーゼ阻害剤のフェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）（Ｂｅｙｏｔｉｍｅ）及びホスファターゼ阻害剤（Ｂｅｙｏｔｉｍｅ）を添加したＲＩＰＡ溶解バッファー（Ｂｅｙｏｔｉｍｅ）で溶解した。細胞溶解物を熱変性させ、ＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分離し、ポリフッ化ビニリデンメンブレン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に転写した。まず適切な一次抗体、続いて西洋ワサビペルオキシダーゼ結合二次抗体（Ｐｉｅｒｃｅ）及びＥＣＬ薬剤（Ｐｉｅｒｃｅ）とのインキュベーションによってタンパク質を検出し、フィルムに露光するか、又はＣｈｅｍｉＤｏｃ Ｔｏｕｃｈ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を使用して画像をキャプチャし、次にソフトウェアＩｍａｇｅＬａｂを用いて処理した。ソフトウェアＩｍａｇｅＪを使用して対応するバンドの密度を定量化した。

ｏＨＳＶの構築である。例示的なｏＨＳＶ（例えば、Ｔ２８５０及びＴ３８５５）の構築は、（ａ）野生型ＨＳＶ－１ゲノムのＵ_Ｌ５６遺伝子のプロモーターとＵ_Ｓ１遺伝子のプロモーターとの間の欠失を含むことによって、（ｉ）全てのダブルコピー遺伝子の１つコピーが欠けており、且つ（ｉｉ）全ての既存のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の発現に必要な、前記欠失後のウイルスＤＮＡにおける配列は無傷である改変されたＨＳＶ－１ゲノム、及び（ｂ）免疫刺激剤及び／又は免疫療法剤をコードし、上記のように改変されたＨＳＶ－１ゲノムの少なくとも欠失領域に安定的に組み込まれた異種核酸配列を含む、組換え腫瘍溶解性単純ヘルペスウイルスＩ型（ＨＳＶ－１）を含む。免疫刺激剤又は免疫療法剤をコードする異種核酸配列が１つのみ挿入される場合は、当該異種核酸配列は、ゲノムの欠失領域に組み込まれることが好ましい。免疫刺激剤及び／又は免疫療法剤をコードする異種核酸配列が２つ以上挿入される場合は、第１の異種核酸配列は、ゲノムの欠失領域に挿入されることが好ましい。第２の又はその次の異種核酸配列はゲノムのＬ成分に挿入される。腫瘍溶解性単純ヘルペスウイルス（ｏＨＳＶ）の構築とその特性の詳細については、ＷＯ２０１７／１８１４２０を参照する。

結果
ｍｉＲ－ＣＴＬＡ－４を含むエクソソーム（ｍｉＲ－ＣＴＬＡ－４ ｅｘｏ）の設計と製造
最初の一連の実験の目的はＣＴＬＡ４を標的とするｍｉＲＮＡを含むエクソソームを設計及び製造することであった。そのためには、最初にｍｉＲ－ＣＴＬＡ４－１＃、ｍｉＲ－ＣＴＬＡ４－２＃、ｍｉＲ－ＣＴＬＡ４－３＃、ｍｉＲ－ＣＴＬＡ４－４＃、ｍｉＲ－ＣＴＬＡ４－５＃、ｍｉＲ－ＣＴＬＡ４－６＃、ｍｉＲ－ＣＴＬＡ４－７＃、ｍｉＲ－ＣＴＬＡ４－８＃、ｍｉＲ－ＣＴＬＡ４－９＃及びｍｉＲ－ＣＴＬＡ４－１０＃と呼ばれる１０個のｍｉＲＮＡを構築した。図１に示す各ｍｉＲＮＡの配列には、ｍｉＲＮＡのシード配列の下流にエクソソームパッケージング関連モチーフ（ｅｘｏ－ｍｏｔｉｆｓ）を具体化する追加の配列が含まれている。図１Ａに示すように、ｍｉＲＮＡは、材料と方法で説明されているように、「ｐｃＤＮＡ６．２－ＧＷ／ＥｍＧＦＰ－ｍｉＲ－ｎｅｇコントロールプラスミド」と名づけたｍｉＲＮＡ発現ベクターに、ＥＧＦＰをコードするオープンリーディングフレームの下流にクローニングされた。

次に、ｍｉＲＮＡをテストするために、ＨＥｐ－２細胞に上記のｍｉＲＮＡ発現ベクター（ｍｉＲｍＣＴＬＡ４－１＃、ｍｉＲｍＣＴＬＡ４－２＃、ｍｉＲｍＣＴＬＡ４－３＃、ｍｉＲｍＣＴＬＡ４－４＃、ｍｉＲｍＣＴＬＡ４－５＃、ｍｉＲｍＣＴＬＡ４－６＃、ｍｉＲｍＣＴＬＡ４－７＃、ｍｉＲｍＣＴＬＡ４－８＃、ｍｉＲｍＣＴＬＡ４－９＃、ｍｉＲｍＣＴＬＡ４－１０＃）及びＣ末端にＨｉｓタグ付けされたＣＴＬＡ４をコードするプラスミド（ｍＣＴＬＡ４－Ｈｉｓ）をコトランスフェクトした。図１Ｂに示すように、ＣＴＬＡ４の蓄積を抑制する上で、１０の構築体の中でｍｉＲ－ＣＴＬＡ４－３＃が最も効果的であった。結果は、ＣＴＬＡ４の蓄積がｍｉＲ－ＣＴＬＡ４－３＃によってより高い効率で阻害されることを示している。ｍｉＲ－ＣＴＬＡ４－１＃、ｍｉＲ－ＣＴＬＡ４－２＃、ｍｉＲ－ＣＴＬＡ４－４＃、ｍｉＲ－ＣＴＬＡ４－５＃、ｍｉＲ－ＣＴＬＡ４－６＃、ｍｉＲ－ＣＴＬＡ４－７＃は中程度の効果を示す一方、非標的（ＮＴ）、ｍｉＲ－ＣＴＬＡ４－８＃、ｍｉＲ－ＣＴＬＡ４－９＃及びｍｉＲ－ＣＴＬＡ４－１０＃プラスミドは、ＣＴＬＡ４の蓄積に影響を与えなかったのである（図１Ｂ）。したがって、ｍｉＲ－ＣＴＬＡ４－３＃がさらなる研究のために選ばれた。

次のステップでは、選んだｍｉＲ－ＣＴＬＡ－４をコードするエクソソームを構築した。Ｔ１５０フラスコに播種されたＨＥｐ－２細胞に、ｍｉＲ－ＣＴＬＡ４－３＃をコードする１０μｇのプラスミド又は非標的ｍｉＲＮＡ（ＮＴ）を発現するプラスミドをトランスフェクトした。４８時間後、細胞外培地を回収し、材料と方法で説明されているようにエクソソームを精製した。

ｍｉＲ－ＣＴＬＡ－４を担持するエクソソームの特性研究
ｍｉＲ－ＣＴＬＡ－４を担持するエクソソームの特性を検討するためにいくつかの実験を実行した。まず、エクソソームを生成する等量の細胞と等量のエクソソームが可溶化され、変性ゲルで電気泳動にかけられ、ＣＤ９、フロチリン－１（Ｆｌｏｔｉｌｉｎ－１）及びカルネキシン（Ｃａｌｎｅｘｉｎ）に対する抗体によってプローブされた。予想の通り、結果（図２Ａ）は、エクソソームにＣＤ９とフロチリン－１（Ｆｌｏｔｉｌｉｎ－１）が含まれているが、カルネキシン（Ｃａｌｎｅｘｉｎ）は含まれていないことを示す。

次に、ｍｉＲ－ＣＴＬＡ４をコードする１０μｇのプラスミド又は非標的ｍｉＲＮＡを発現するプラスミドによってトランスフェクトされたＨＥｐ－２細胞から精製されたエクソソームは、ＩｚｏｎのｑＮａｎｏ技術を用いるナノ粒子トラッキング分析によってそのサイズに関して測定された。結果（図２Ｂ）は、トランスフェクトされた細胞によって生成されたエクソソームの直径が平均１００－２００ｎｍであることを示している。

「ｍｉＲ－ＣＴＬＡ－４を担持するエクソソームとｏＨＳＶのＭＦＣ移植腫瘍への同時投与が、Ｔ１又はＴ２ ｏＨＳＶではなくＴ３ ｏＨＳＶの腫瘍溶解活性を増強させた。」

この一連の実験の最初のステップでは、ＨＥｐ－２の複製培養物にｍｉＲ－ＣＴＬＡ４－３＃のプラスミドをトランスフェクトし、細胞を４８時間培養した。次に、ＨＥｐ－２で生成されたエクソソーム（ｍｉＲ－ＣＴＬＡ－４ ｅｘｏ）を、材料と方法で説明されているように精製した。

その次のステップでは、材料と方法で説明されているようにｏＨＳＶ Ｔ１０１２Ｇ、Ｔ２８５０及びＴ３８５５を構築した。次に、８匹１群の８群のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスに腫瘍を発生させるために右脇腹にマウス前胃がん（ＭＦＣ）細胞を皮下注射した。腫瘍が平均８０ｍｍ^３に達すると、腫瘍内に１×１０^７ｐｆｕのＴ１０１２Ｇ（図３Ｂ）、Ｔ２８５０（図３Ｃ）又はＴ３８５５（図３のＤ）を単独の１回で、又は１０μｇのｍｉＲ－ＣＴＬＡ－４エクソソームと組み合わせて注射した。

最後に、注射後２６日まで３日又は４日ごとに腫瘍体積を測定した。結果は、注射後に各群で腫瘍体積が徐々に増加したことを示している。図３Ａは、ｍｉＲＮＡ－ＣＴＬＡ４ ｅｘｏを注射したマウスの腫瘍体積がコントロールの腫瘍体積とほぼ同じ速さで増加し、注射後２６日で、ｍｉＲＮＡ－ＣＴＬＡ４ ｅｘｏを注射したマウスの腫瘍体積がコントロールの腫瘍体積よりも大きいことを示している。図３Ｂは、注射後にコントロール群、Ｔ１０１２Ｇ群及びＴ１０１２Ｇ＋ｍｉＲＮＡ－ＣＴＬＡ４ ｅｘｏ群の腫瘍体積が徐々に増加したことを示している。注射後２６日で、Ｔ１０１２Ｇ＋ｍｉＲＮＡ－ＣＴＬＡ４ ｅｘｏを注射したマウスの腫瘍体積はコントロール群及びＴ１０１２Ｇ群の腫瘍体積よりも小さかった。図３Ｃでは、Ｔ２８５０群及びＴ２８５０＋ｍｉＲＮＡ－ＣＴＬＡ４ ｅｘｏ群の腫瘍体積はコントロール群の腫瘍体積よりも増加が遅かった。注射後２６日で、Ｔ２８５０群及びＴ２８５０＋ｍｉＲＮＡ－ＣＴＬＡ４ ｅｘｏ群の腫瘍体積はコントロール群の腫瘍体積より小さく、しかもＴ２８５０＋ｍｉＲＮＡ－ＣＴＬＡ４ ｅｘｏ群の腫瘍体積はＴ２８５０単独群の腫瘍体積と有意差がなかった。図３のＤでは、Ｔ３８５５＋ｍｉＲＮＡ－ＣＴＬＡ４ ｅｘｏ群の腫瘍体積の増加が最も遅く、次はＴ３８５５群、最後はコントロール群となった。注射後２６日で、コントロール群の腫瘍体積が最も大きく、次はＴ３８５５群で、Ｔ３８５５＋ｍｉＲＮＡ－ＣＴＬＡ４ ｅｘｏ群の腫瘍体積が最も小さかった。

この一連の実験の結果は、Ｔ２８５０とＴ３８５５が腫瘍の成長を効果的に阻害でき、Ｔ３８５５とｍｉＲＮＡ－ＣＴＬＡ４ ｅｘｏの腫瘍内同時投与がＴ３８５５の抗腫瘍有効性を高め、腫瘍の成長を阻害したことを示している。

結果は、ｍｉＲ－ＣＴＬＡ４－３＃がＣＴＬＡ－４を標的とし、且つＣＴＬＡ－４の発現をダウンレギュレートすることを示している。また、ｍｉＲ－ＣＴＬＡ４－３＃がエクソソームにパッケージングされており、且つ精製されたエクソソームにはＣＤ９、フロチリン－１（Ｆｌｏｔｉｌｉｎ－１）が含まれていたが、カルネキシン（Ｃａｌｎｅｘｉｎ）は含まれていなかった。プラスミドｍｉＲ－ＣＴＬＡ４－３＃又は非標的ｍｉＲＮＡ（ＮＴ）によってトランスフェクトされたＨｅｐ－２細胞によって生成されたエクソソームは平均直径が１００－２００ｎｍであった。本明細書の結果はまた、ＩＬ－１２単独又はＩＬ－１２と抗ＰＤ－１抗体の両方を発現するｏＨＳＶが腫瘍の成長を効果的に阻害できることを示している。最後に、ＣＴＬＡ４を標的とするｍｉＲＮＡを担持するエクソソームとＩＬ－１２と抗ＰＤ－１抗体の両方を発現するｏＨＳＶの腫瘍内同時投与が、ｏＨＳＶの抗腫瘍有効性を高め、腫瘍の成長を阻害することを示している。

本開示は、好ましい実施形態及び任意の特徴によって具体的に開示されているが、本明細書に開示される内容の修正、改善及び変形は当業者に想定されるもので、そのような修正、改善及び変形は本開示の範囲内であると見なされる。ここに提供される材料、方法、及び実施例は、好ましい実施形態の代表であり、例示的なものであり、本開示の範囲を制限することを意図するものではない。

本明細書で言及される全ての刊行物、特許出願、特許、及び他の参考文献は、それぞれが参照により個別に組み込まれるのと同じ程度に、その全体が参照により明示的に組み込まれる。矛盾する場合は、定義を含め本明細書が優先される。本明細書に例示的に記載されている開示は、本明細書に具体的に開示されていない要素、制限がない場合に適切に実施することができる。したがって、例えば、「含む」、「備える」などの用語は、広範に理解されかつ限定的なものではない。さらに、本明細書で使用される用語及び表現は、説明の用語として使用されており限定ではなく、しかもここに説明される特徴又はその一部の同等物を除外する意図はないが、本開示の範囲内で様々な修正が可能であることは自明である。

Claims (42)

1. 対象の腫瘍を治療するための医薬組成物であって、
   治療有効量のエクソソームと、
   治療有効量の腫瘍溶解性単純ヘルペスウイルスと、
   薬学的に許容される担体とを含み、
   ここで、前記エクソソームは、阻害量のＣＴＬＡ４を標的とするｍｉＲＮＡと、前記ＣＴＬＡ４を標的とするｍｉＲＮＡのシード配列に作動可能に連結されて前記ＣＴＬＡ４を標的とするｍｉＲＮＡの前記エクソソームへのパッケージングを増強するエキソモチーフとを含み、
   前記腫瘍溶解性単純ヘルペスウイルスは、免疫刺激剤を発現する、又は免疫刺激剤と抗ＰＤ－１抗体の両方を発現する、医薬組成物。
2. 前記ＣＴＬＡ４を標的とするｍｉＲＮＡのシード配列が、配列番号１から配列番号４の核酸配列のいずれか１つを含む、請求項１に記載の組成物。
3. 前記エキソモチーフが、配列番号２１から配列番号４９の核酸配列からなる群より選択される、請求項１又は２に記載の組成物。
4. 前記エキソモチーフが、前記ＣＴＬＡ４を標的とするｍｉＲＮＡのシード配列の下流に位置し、且つそれと共有結合している、請求項１から３のいずれか一項に記載の組成物。
5. 前記エキソモチーフが、前記ＣＴＬＡ４を標的とするｍｉＲＮＡのシード配列以外の１つ又は複数の核酸の突然変異によって得られる、請求項１から４のいずれか一項に記載の組成物。
6. 前記エキソモチーフが、２つの単一のエキソモチーフの組み合わせによって生成される２つ折りのモチーフであり、前記２つの単一のエキソモチーフのいずれかが、配列番号２１から配列番号４７の核酸配列からなる群より選択される、請求項１から５のいずれか一項に記載の組成物。
7. 前記２つ折りのモチーフが、配列番号４８の核酸配列を有する、請求項１から６のいずれか一項に記載の組成物。
8. 作動可能に連結された場合、前記ＣＴＬＡ４を標的とするｍｉＲＮＡと前記エキソモチーフは、少なくとも１つのヌクレオチドもしくは２つのヌクレオチドを共有するか、又はリンカーによって接続される、請求項１から７のいずれか一項に記載の組成物。
9. 前記リンカーが、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）及びウラシル（Ｕ）からなる群より選択される２つ又はそれ以上のヌクレオチドからなる、請求項８に記載の組成物。
10. 前記リンカーが－ＧＣ－である、請求項９に記載の組成物。
11. 作動可能に連結された場合、前記ＣＴＬＡ４を標的とするｍｉＲＮＡと前記エキソモチーフは、配列番号７の核酸配列を有する、請求項１から１０のいずれか一項に記載の組成物。
12. 前記免疫刺激剤が、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－２、ＩＬ－５、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－２４及びＩＬ－２７から選択される、請求項１から１１のいずれか一項に記載の組成物。
13. 前記免疫刺激剤がＩＬ－１２である、請求項１２に記載の組成物。
14. 前記腫瘍溶解性単純ヘルペスウイルスがＩＬ－１２を発現する、請求項１から１３のいずれか一項に記載の組成物。
15. 前記腫瘍溶解性単純ヘルペスウイルスがＩＬ－１２と抗ＰＤ－１抗体の両方を発現する、請求項１から１４のいずれか一項に記載の組成物。
16. 前記腫瘍溶解性単純ヘルペスウイルスがＩＬ－１２及び抗ＰＤ－１抗体を発現するＨＳＶ－１である、請求項１から１５のいずれか一項に記載の組成物。
17. 前記ＨＳＶ－１がＨＳＶ－１のＦ株である、請求項１６に記載の組成物。
18. 天然骨格の１１７００５から１３２０９６までのヌクレオチド配列の断片が削除されている、請求項１７に記載の組成物。
19. 前記腫瘍が悪性腫瘍である、請求項１から１８のいずれか一項に記載の組成物。
20. 前記悪性腫瘍が、黒色腫、線維肉腫、粘液肉腫、軟骨肉腫、骨形成性肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング肉腫、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸がん、膵がん、乳がん、卵巣がん、前立腺がん、扁平上皮がん、基底細胞がん、腺がん、汗腺がん、脂腺がん、乳頭がん、乳頭腺がん、嚢胞腺がん、髄様がん、気管支原性がん、腎細胞がん、肝がん、胆管がん、絨毛がん、セミノーマ、胚性がん、ウィルムス腫瘍、子宮頸がん、精巣腫瘍、肺がん、小細胞肺がん、膀胱がん、上皮がん、神経膠腫、星状細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、血管芽腫、聴神経腫、乏突起神経膠腫、髄膜腫、神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫、胃がん及び前胃がんからなる群より選択される、請求項１９に記載の組成物。
21. 前記対象がヒトである、請求項１から２０のいずれか一項に記載の組成物。
22. （ａ）治療有効量のエクソソームであって、阻害量のＣＴＬＡ４を標的とするｍｉＲＮＡと、前記ＣＴＬＡ４を標的とするｍｉＲＮＡのシード配列に作動可能に連結されて前記ＣＴＬＡ４を標的とするｍｉＲＮＡの前記エクソソームへのパッケージングを増強するエキソモチーフとを含む、前記治療有効量のエクソソームと、
    （ｂ）免疫刺激剤を発現する、又は免疫刺激剤と抗ＰＤ－１抗体の両方を発現する、治療有効量の腫瘍溶解性単純ヘルペスウイルスとを含む、対象の腫瘍を治療するためのキットであって、
    （ｃ）使用説明書を含んでいてもよい、キット。
23. 前記ＣＴＬＡ４を標的とするｍｉＲＮＡのシード配列が、配列番号１から配列番号４の核酸配列のいずれか１つを含む、請求項２２に記載のキット。
24. 前記エキソモチーフが配列番号２１から配列番号４９の核酸配列からなる群より選択される、請求項２２又は２３に記載のキット。
25. 前記エキソモチーフが前記ＣＴＬＡ４を標的とするｍｉＲＮＡのシード配列の下流に位置し、且つそれと共有結合している、請求項２２から２４のいずれか一項に記載のキット。
26. 前記エキソモチーフが、前記ＣＴＬＡ４を標的とするｍｉＲＮＡのシード配列以外の１つ又は複数の核酸の突然変異によって得られる、請求項２２から２５のいずれか一項に記載のキット。
27. 前記エキソモチーフが２つの単一のエキソモチーフの組み合わせによって生成される２つ折りのモチーフであり、前記２つの単一のエキソモチーフのいずれかが配列番号２１から配列番号４７の核酸配列からなる群より選択される、請求項２２から２６のいずれか一項に記載のキット。
28. 前記２つ折りのモチーフが配列番号４８の核酸配列を有する、請求項２２から２７のいずれか一項に記載のキット。
29. 作動可能に連結された場合、前記ＣＴＬＡ４を標的とするｍｉＲＮＡと前記エキソモチーフは少なくとも１つのヌクレオチドもしくは２つのヌクレオチドを共有するか、又はリンカーによって接続される、請求項２２から２８のいずれか一項に記載のキット。
30. 前記リンカーが、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）及びウラシル（Ｕ）からなる群より選択される２つ又はそれ以上のヌクレオチドからなる、請求項２９に記載のキット。
31. 前記リンカーが－ＧＣ－である、請求項３０に記載のキット。
32. 作動可能に連結された場合、前記ＣＴＬＡ４を標的とするｍｉＲＮＡと前記エキソモチーフは、配列番号７の核酸配列を有する、請求項２２から３１のいずれか一項に記載のキット。
33. 前記免疫刺激剤がＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－２、ＩＬ－５、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－２４及びＩＬ－２７から選択される、請求項２２から３２のいずれか一項に記載のキット。
34. 前記免疫刺激剤がＩＬ－１２である、請求項３３に記載のキット。
35. 前記腫瘍溶解性単純ヘルペスウイルスがＩＬ－１２を発現する、請求項２２から３４のいずれか一項に記載のキット。
36. 前記腫瘍溶解性単純ヘルペスウイルスがＩＬ－１２と抗ＰＤ－１抗体の両方を発現する、請求項２２から３５のいずれか一項に記載のキット。
37. 前記腫瘍溶解性単純ヘルペスウイルスがＩＬ－１２及び抗ＰＤ－１抗体を発現するＨＳＶ－１である、請求項２２から３６のいずれか一項に記載のキット。
38. 前記ＨＳＶ－１がＨＳＶ－１のＦ株である、請求項３７に記載のキット。
39. 天然骨格の１１７００５から１３２０９６までのヌクレオチド配列の断片が削除されている、請求項３８に記載のキット。
40. 前記腫瘍が悪性腫瘍である、請求項２２から３９のいずれか一項に記載のキット。
41. 前記悪性腫瘍が、黒色腫、線維肉腫、粘液肉腫、軟骨肉腫、骨形成性肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング肉腫、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸がん、膵がん、乳がん、卵巣がん、前立腺がん、扁平上皮がん、基底細胞がん、腺がん、汗腺がん、脂腺がん、乳頭がん、乳頭腺がん、嚢胞腺がん、髄様がん、気管支原性がん、腎細胞がん、肝がん、胆管がん、絨毛がん、セミノーマ、胚性がん、ウィルムス腫瘍、子宮頸がん、精巣腫瘍、肺がん、小細胞肺がん、膀胱がん、上皮がん、神経膠腫、星状細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、血管芽腫、聴神経腫、乏突起神経膠腫、髄膜腫、神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫、胃がん及び前胃がんからなる群より選択される、請求項４０に記載のキット。
42. 前記対象がヒトである、請求項２２から４１のいずれか一項に記載のキット。

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