JP2019512205A - 癌の治療に用いる腫瘍溶解性単純ヘルペスウイルス（ｏＨＳＶ）偏性ベクター及びその構築体の構築 - Google Patents

Abstract

臨床上免疫治療剤と共に用いる安全で、より効果的なｏＨＳＶを提供する。本発明は、改変されたウイルスＤＮＡゲノムを含む偏性ｏＨＳＶベクターを提供し、さらに偏性ｏＨＳＶベクターと、免疫刺激剤及び／又は免疫治療剤をコードする外来核酸配列とを含む組み換えｏＨＳＶ−１構築体を提供する。本発明による組み換えｏＨＳＶ−１構築体を含む組成物は、癌の治療に用いることができる。

Description

本発明は、腫瘍溶解性単純ヘルペスウイルス（ｏＨＳＶ）による癌の治療に関し、詳しく言えば、免疫刺激剤及び／又は免疫治療剤をコードする遺伝子を複数担持して発現する偏性（ｏｂｌｉｇａｔｅ）ＨＳＶベクターの製造に関し、さらに、癌を治療するための様々な治療遺伝子を担持して発現するベクターとして新規設計されるゲノムに関する。

腫瘍溶解性単純ヘルペスウイルス（ｏＨＳＶ）による治療は、従来の癌の治療方法と比べて多くの利点があり（非特許文献１参照）、腫瘍溶解性単純ヘルペスウイルスを用いる固形腫瘍治療に関する研究は今盛んに行われている。具体的に言えば、ｏＨＳＶには、一般に突然変異を含むため自然免疫によって抑制されやすく、癌細胞の中では、感染に対する一種又は多種の自然免疫応答が破壊されており、正常な細胞ではこのような免疫応答が完全であるため、正常な細胞では複製できず、癌細胞の中では複製が可能である。一般的には、ｏＨＳＶが腫瘍実体に直接輸送されて腫瘍実体の中で複製する。また、ウイルスを全身投与するのではなく標的組織に輸送するため、このような抗癌剤を用いると副作用を一切伴わない。ウイルスは獲得免疫応答を誘導するという性質があるため、反復投与の場合には利用できないが、ｏＨＳＶを腫瘍に反復投与すると、その効力が消失したり、炎症反応などの有害事象を誘導したりすることは認められない。ＨＳＶは大型ＤＮＡウイルスで、外来ＤＮＡをそのゲノムに組み入れて腫瘍に投与すると、遺伝子の発現を調節することができる。腫瘍に対する獲得免疫応答を誘導するように働きかける遺伝子はｏＨＳＶと共に用いる外来遺伝子として好適である。

細胞の自然免疫応答の克服における欠陥は、当該ウイルスを抗癌剤として用いる時の腫瘍を溶解する範囲を決定する。欠失された配列が多ければ多いほど、治療可能な癌細胞の範囲は狭くなり、ｏＨＳＶの有効性は、欠失されたウイルス遺伝子の機能により決定される。最近では、ｏＨＳＶの抗癌作用を実現するために、細胞の遺伝子を少なくとも１つ加えるのが一般的である（非特許文献２参照）。

研究の便宜を図るために、ｏＨＳＶの構造（バックボーンと称する）と挿入するのに好適な外来遺伝子を個別に検討する。上記から分かるように、バックボーンの構造は感染しやすい癌の範囲を决定し、外来遺伝子により宿主は、癌細胞を獲得免疫応答における正当な標的として扱う。

ＨＳＶ−１ゲノムは、ＬとＳという共有結合されている２つの成分からなる。各成分はユニーク配列（Ｌ成分はＵ_Ｌ、Ｓ成分はＵ_Ｓ）からなり、ユニーク配列の両側は逆方向反復配列である。Ｌ成分の逆方向反復配列はａｂとｂ’ａ’と呼ばれ、Ｓ成分の逆方向反復配列はａ’ｃ’とｃａと呼ばれる。逆方向反復配列ｂ’ａ’とａ’ｃ’は内部逆方向反復領域を構成する。Ｌ成分とＳ成分の逆方向反復領域は、２コピーの５種の遺伝子及び転写するがタンパク質をコードしない大量のＤＮＡを含み、この５種の遺伝子はそれぞれタンパク質ＩＣＰ０、ＩＣＰ４、ＩＣＰ３４．５、ＯＲＦ Ｐ及びＯＦＲ Ｏをコードする。

現在では、癌患者でテストされるウイルスは３つのタイプに大別される。タイプ１はＩＣＰ３４．５遺伝子の欠失がウイルスの毒性を緩和するという知見に基づき設計されるものである（非特許文献３参照）。悪性神経膠腫の治療に用いる時の安全性を確保するために、Ｇ２０７（患者でテストされた初めてのウイルス）において、ウイルスのリボヌクレオチド還元酵素をコードする遺伝子の中でさらに突然変異させることで弱毒化させる（非特許文献４参照）。一方、ＩＣＰ３４．５の突然変異とリボヌクレオチド還元酵素遺伝子の突然変異を含むＧ２０７は余りにも毒性が弱いため、野生型プロテインキナーゼＲを発現する癌細胞の中では、複製が完全に停止する（非特許文献５参照）。

タイプ２は、Ｕｓ１１ウイルスタンパク質が感染の初期に発現されると、ＩＣＰ３４．５の欠失による不良な結果を一部補償し、野生型プロテインキナーゼＲを発現する細胞の中で成長する能力を回復するという事実に基づき設計されるものである（非特許文献６参照）。このようなウイルスのバックボーンの設計は、Ｕｓ１２遺伝子とＵｓ１１のプロモーターが削除され、Ｃａｓｓａｄｙ（非特許文献７参照）が発表した結果に合致する。これにより、Ｕｓ１１は後期遺伝子ではなく最初期遺伝子として発現される。

タイプ３のウイルスのバックボーンは、最初にＲ７０２０と呼ばれるが、後にＮＶ１０２０と名前を変えた。自発的な自然突然変異により修飾されて形成されるものであり、最初には弱毒生ワクチンとしてテストされた（非特許文献８参照）。当該突然変異により、内部逆方向反復領域（ｂ’ａ’とａ’ｃ’からなり、遺伝子ＩＣＰ０、ＩＣＰ４、ＩＣＰ３４．５、ＯＲＦ Ｐ及びＯＲＦ Ｏの１つのコピーをコードする）及びＵ_Ｌ５６とＵ_Ｌ２４をコードする遺伝子が欠失される。またそれは、細菌性配列を有し、且つ本来ワクチン用として製造されたため、複数種のＨＳＶ−２糖タンパク質をコードする遺伝子も含まれている。結腸癌の肝移転患者を対象に、Ｒ７０２０について大量のテストを実施した。この他に、頭頸部扁平上皮癌モデル、前立腺癌異種移植ヌードマウスモデル及び胆嚢腫瘍モデルにおいてもテストされた（非特許文献９参照）。

ｏＨＳＶによる治療が成功するか否かは、癌細胞に対する破壊の度合いにより決定される。ｏＨＳＶでの治療を開発する当初に、ＨＳＶだけでは、固形腫瘍における癌細胞をすべて死滅させられず、ｏＨＳＶを用いればすべての癌細胞を効果的に消滅させる可能性が低いことが判明し、臨床試験により、ｏＨＳＶによる腫瘍の破壊には腫瘍に対する獲得免疫応答が必要であることが明らかになった。また、さらなる研究により、感染された腫瘍細胞の残屑で引き起こされる抗腫瘍免疫応答が、サイトカインを導入することで増強されることが示唆され、これはサイトカイン遺伝子のないｏＨＳＶと免疫刺激性のサイトカインを導入したｏＨＳＶを比較する結果によって裏付けられた（非特許文献１０参照）。結果的に、ＧＭ−ＣＳＦをｏＨＳＶに導入して悪性黒色腫を治療するに至った（非特許文献１１参照）。

ｏＨＳＶの安全性は、感染に対する宿主の自然免疫応答を遮断する機能を非活化するウイルスの１つ又は複数の遺伝子の欠失状況により決定される。すでに発表されたデータを分析すると、ｏＨＳＶを用いるこれまでの臨床試験では、例外なく過度に弱毒化されて改善する余地があることが分かった（非特許文献１２参照）。

免疫刺激性のサイトカインをコードする遺伝子を導入すると、腫瘍に対する免疫応答を促進できるが、抗腫瘍作用にとって特に重要な、Ｔ細胞が誘導する細胞傷害性の効果的な促進は認められない。腫瘍は、ＰＤ−１とＣＴＬＡ−４抑制経路によって免疫系を沈黙させる。ＰＤ−１は活性化Ｔ細胞及びその他の造血細胞に発現され、ＣＴＬＡ−４は制御性Ｔ細胞を含む活性化Ｔ細胞に発現される（非特許文献１３参照）。また、腫瘍はＰＤ−１とＣＴＬＡ−４抑制経路で宿主免疫応答を回避する。抗腫瘍応答を最大にするために、ＰＤ−１抗体でＰＤ−１を中和し、場合によっては、Ｔ細胞の表面に存在するＣＴＬＡ４を中和することで細胞傷害性Ｔ細胞を活性化する必要がある（非特許文献１４参照）。ＰＤ−１又はＣＴＬＡ４の一本鎖抗体の全身投与はｏＨＳＶの治療効果を効果的に促進できるが、常に副作用が伴うため長期にわたって反復投与することはできない。

Markert et al., 2000; Russell et al., 2012; Shen and Nemunaitis, 2006 Cheema et al., 2013; Goshima et al., 2014; Markert et al., 2012; Walker et al., 2011 Andreansky et al., 1997; Chou et al., 1995; Chou et al., 1990; Chou and Roizman, 1992 Mineta et al., 1995 Smith et al., 2006 Cassady et al., 1998a Cassady et al., 1998b Meignier et al., 1988; Weichselbaum et al., 2012 Cozzi et al., 2002; Cozzi et al., 2001; Currier et al., 2005; Fong et al., 2009; Geevarghese et al., 2010; Kelly et al., 2008; Kemeny et al., 2006; Wong et al., 2001 Andreanski et al. Andtbacka et al., 2015 Miest and Cattaneo, 2014 Fife and Pauken, 2011; Francisco et al., 2010; Keir et al., 2008; Krummel and Allison, 1995; Walunas et al., 1994 Topalian et al., 2015

そこで、臨床においては、免疫治療剤と共に用いる安全で、より効果的なｏＨＳＶを開発することが求められている。

本発明の一つの態様は、改変されたＨＳＶ−１ゲノムを含む改変された単純ヘルペスＩ型（以下、ＨＳＶ−１、偏性ベクター、ベクター、ＨＳＶ−１ウイルスともいう）に関する。改変は、野生型ＨＳＶ−１ゲノムにおけるＵ_Ｌ５６遺伝子のプロモーターからＵ_Ｓ１のプロモーターの間の配列を欠失させることにより、（ｉ）すべての２コピー遺伝子における１つのコピーが存在せず、なお且つ（ｉｉ）前記欠失後のウイルスＤＮＡに存在するすべてのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を発現するために必要な配列が完全である、ものを含む

本発明のもう一つの態様は、ウイルスゲノムにおけるすべての単一コピーのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を発現するために必要な配列（ｉ）と、ウイルスゲノムにおけるすべての２コピー遺伝子のそれぞれの１つのコピー（ｉｉ）と、ノンコーディングＲＮＡをコードする重複ＤＮＡ（ｄｕｐｌｉｃａｔｅｄ ＤＮＡ）の１つのコピー（ｉｉｉ）とを含む腫瘍溶解性単純ヘルペスＩ型（ＨＳＶ−１）構築体に関する。

本発明のもう一つの態様は、野生型ＨＳＶ−１ゲノムにおけるＵ_Ｌ５６遺伝子のプロモーターからＵ_Ｓ１遺伝子のプロモーターの間の配列を欠失させることにより、（ｉ）すべての２コピー遺伝子における１つのコピーが欠失し、なお且つ（ｉｉ）前記欠失後のウイルスＤＮＡに存在するすべてのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を発現するために必要な配列が完全であることを含む改変されたＨＳＶ−１ゲノム（ａ）と、少なくとも前記改変されたＨＳＶ−１ゲノムの欠失された領域に安定的に導入され、免疫刺激剤及び／又は免疫治療剤をコードする外来核酸配列（ｂ）とを含む組み換え腫瘍溶解性単純ヘルペスＩ型（ＨＳＶ−１）に関する。

本発明のもう一つの態様は、すべてのオープンリーディングフレーム（すなわちＵ_Ｌ１からＵ_Ｌ５６及びＵ_Ｓ１からＵ_Ｓ１２）の１つのコピーを含み且つゲノムの末端に位置する「ａ」配列を含むウイルスベクターに関し、前記ウイルスベクターは、偏性ベクターであって、すなわちそれ自体は感染しやすいＶｅｒｏ細胞の中で複製できない。細胞ＤＮＡのコード配列又はノンコーディング配列（ａ）、又はノンコーディング配列を含有するウイルスＤＮＡ（ｂ）を含むＤＮＡを挿入すると、前記ベクターは複製できる。当該偏性ベクターに許容する総ＤＮＡ長さは少なくとも１５ＫＢで、又は２２ＫＢに達してもよい。

本発明のもう一つの態様は、有効量の本発明による組み換え腫瘍溶解性ＨＳＶ−１と薬学的に許容可能な担体とを含む医薬組成物に関し、当該組成物は、腫瘍内投与用のものとして製造されてもよい。

本発明のもう一つの態様は、治療を必要とする対象に対する有効量の本発明による前記組み換え腫瘍溶解性ＨＳＶ−１、又は前記医薬組成物の投与を含む癌の治療方法に関する。本発明はさらに、癌の治療方法における前記組み換え腫瘍溶解性ＨＳＶ−１の応用に関する。

本発明のもう一つの態様は、抗癌剤の製造における前記組み換え腫瘍溶解性ＨＳＶ−１、又は医薬組成物の応用に関する。

本発明の上記の態様と利点、及びその他の態様と利点は、図面に関する以下の詳細な記載から明らかになる。

ＨＳＶ−１ウイルスの概略図である。このうち、ＨＳＶ−１は、野生型ＨＳＶ−１のゲノム構造であり、ｂｐ１１７００５とｂｐ１３２０９６の間の内部逆方向反復領域ｂ’ａ’−ａ’ｃ’を示す。ＩＭＭＶ２０１は、ｏＨＳＶ−１のゲノム構造であり、偏性ベクターとも呼ばれる。ＩＭＭＶ２０２は、マウスＩＬ １２を発現するｏＨＳＶ−１である。ＩＭＭＶ２０３は、ＩＬ １２を発現するｏＨＳＶ−１である。ＩＭＭＶ３０３は、ヒトＣＴＬＡ−４ ｓｃＦｖを発現するｏＨＳＶ−１である。ＩＭＭＶ４０３は、ヒトＰＤ−１ ｓｃＦｖを発現するｏＨＳＶ−１である。 免疫刺激剤及び／又は免疫治療剤を発現する、偏性ベクターに基づく腫瘍溶解性ＨＳＶ−１ウイルスの概略図である。このうち、ＩＭＭＶ５０２は、ヒト抗ＰＤ−１ ｓｃＦｖ及びマウスＩＬ １２を発現するｏＨＳＶ−１である。ＩＭＭＶ５０４は、マウス抗ＣＴＬＡ−４ ｓｃＦｖ及びマウスＩＬ １２を発現するｏＨＳＶ−１である。ＩＭＭＶ５０３は、ヒト抗ＰＤ−１ ｓｃＦｖ及びヒトＩＬ １２を発現するｏＨＳＶ−１である。ＩＭＭＶ５０５は、ヒト抗ＣＴＬＡ−４ ｓｃＦｖ及びヒトＩＬ １２を発現するｏＨＳＶ−１である。ＩＭＭＶ５０７は、ヒト抗ＣＴＬＡ−４ ｓｃＦｖ及びヒト抗ＰＤ−１ ｓｃＦｖを発現するｏＨＳＶ−１である。ＩＭＭＶ６０３は、ヒト抗ＣＴＬＡ−４ ｓｃＦｖ、ヒト抗ＰＤ−１ ｓｃＦｖ及びヒトＩＬ １２を発現するｏＨＳＶ−１である。 分泌をテストする構築体からの抗ＰＤ−１ ｓｃＦｖの発現状態を示す。ＨｉｓタグｓｃＦｖ−ａｎｔｉ−ＰＤ−１はＣＭＶプロモーターにより駆動されて異なる自然資源からのシグナルペプチドコーディング領域と共に発現される。細胞溶解液と上澄み液を収集しＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、抗Ｈｉｓ抗体でウェスタンブロッティングする。レーン１は、ＧＭ−ＣＳＦシグナルペプチドに対応し、レーン２は、ガウシアルシフェラーゼシグナルペプチドに対応し、レーン３は、Ｈｉｄｄｅｎ Ｍａｒｋｏｖ Ｍｏｄｅｌ ３８（ＨＭＭ３８）シグナルペプチドに対応し、レーン４は、抗体Ｖ遺伝子シグナルペプチドに対応する。 ＰＤ−１を標的とするｓｃＦｖ−ａｎｔｉ−ＰＤ−１の親和性アッセイの結果を示す。ＣＭＶプロモーターにより駆動されたＨｉｓタグｓｃＦｖ−ａｎｔｉ−ＰＤ−１及びＨＭＭ３８シグナルペプチドに対するＥＬＩＳＡアッセイである。上澄み液を収集してＥＬＩＳＡアッセイを行い、抗Ｈｉｓ抗体で検出する。 ｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞生存アッセイの結果を示す。このうち、（図５ａ）はヒト膀胱癌細胞Ｔ２４の結果である。 ｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞生存アッセイの結果を示す。このうち、（図５ｂ）はヒト食道癌細胞ＥＣＡ１０９の結果である。 ｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞生存アッセイの結果を示す。このうち、（図５ｃ）はヒト鼻咽頭癌細胞ＣＮＥ１の結果である。 ｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞生存アッセイの結果を示す。このうち、（図５ｄ）はヒト結腸癌細胞ＨＣＴ１１６の結果である。 ｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞生存アッセイの結果を示す。このうち、（図５ｅ）はヒト喉頭癌細胞Ｈｅｐ２の結果である。 ｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞生存アッセイの結果を示す。このうち、（図５ｆ）はヒト乳癌細胞ＭＤ−ＭＢ−２３１の結果である。 ｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞生存アッセイの結果を示す。このうち、（図５ｇ）はヒト腺癌細胞Ｈｅｌａの結果である。 ｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞生存アッセイの結果を示す。このうち、（図５ｈ）はヒト肺癌上皮細胞Ａ５４９の結果である。 ｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞生存アッセイの結果を示す。このうち、（図５ｉ）はヒト非小細胞肺癌細胞Ｈ４６０の結果である。

関連定義
本明細書における「一」又は「１つ」の実体という用語は、当該実体のうちの１つ又は複数を指す。例えば、「組み換え腫瘍溶解性ＨＳＶ−１」は、１つ又は複数の組み換え腫瘍溶解性ＨＳＶ−１ウイルスを表すものと理解される。よって、「１つ」、「１つ又は複数」及び「少なくとも１つ」といった用語は、本明細書で相互に置き換えて用いることができる。

「相同性」、「同一性」又は「類似性」といった用語は、２つのペプチドの間又は２つの核酸分子の間の配列類似性を指す。各配列におけるマッチング可能な位置を比較することで相同性を決定してもよい。比較対象配列における位置に同一の塩基又はアミノ酸が占めると、当該分子は当該位置において相同であるとする。配列の間の相同性の度合いは、配列間に共有するマッチング位置又は相同位置の数に関連する。「非関連」又は「非相同」の配列は、本明細書で１つの配列との同一性が４０％より小さいものを指し、好ましくは、同一性が２５％より小さい。

１つのポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド領域ともう１つの配列の間で特定の百分率（例えば６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％又は９９％）の「配列同一性」を有するとは、マッチングする際、２つの配列を比較する時に当該百分率の塩基（又はアミノ酸）が同一であるものを指す。当該マッチングと百分率相同性又は配列同一性は、当業者に知られているソフトウェアで決定してもよい。

本明細書における「抗体」又は「抗原結合ポリペプチド」という用語は、１種又は複数種の抗原を特異的に認識してそれらに結合するポリペプチド又はポリペプチド複合体を指す。このうち、抗体は完全抗体、及びそのいかなる抗原結合性フラグメント、又はその一本鎖であってもよい。よって、「抗体」という用語には、抗原と結合する生理活性をもつあらゆる免疫グロブリン分子の少なくとも一部のタンパク質又はペプチドが含まれている。例えば、重鎖もしくは軽鎖の相補性決定領域（ＣＤＲ）、又はそのリガンド結合部位、重鎖もしくは軽鎖の可変領域、重鎖もしくは軽鎖の定常領域、フレームワーク（ＦＲ）領域又はそのあらゆる部位、又は結合タンパク質の少なくとも一部を含むが、これらのみに限られない。「抗体」という用語には、活性化されると抗原結合能を有するポリペプチド又はポリペプチド複合体も含まれている。

本明細書における「抗体フラグメント」又は「抗原結合性フラグメント」という用語は、抗体の一部、例えばＦ（ａｂ’）_２、Ｆ（ａｂ）_２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓｃＦｖなどを指す。構造に関わらず、抗体フラグメントは完全抗体によって認識される同一の抗原と結合する。「抗体フラグメント」という用語には、アプタマー、鏡像異性体及び二重特異性抗体が含まれており、特定の抗原と結合して複合体を形成することで抗体と類似する作用を果たすいかなる合成又は遺伝子組み換えタンパク質も含まれている。

本明細書における抗体、抗原結合ポリペプチド又はそれらの変異型や誘導体には、ポリクロナル抗体、モノクローナル抗体、多特異性抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、霊長類化抗体やキメラ抗体、一本鎖抗体、エピトープ結合フラグメント（例えばＦａｂ、Ｆａｂ’とＦ（ａｂ’）_２）、Ｆｄ、Ｆｖ、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、一本鎖抗体、ジスルフィド結合で連結されるＦｖ（ｓｄＦｖ）、ＶＫ又はＶＨドメインを含むフラグメント、Ｆａｂ発現ライブラリーにより生成されるフラグメント及び抗イディオタイプ（抗−Ｉｄ）抗体が含まれているが、これらのみに限られない。本明細書における「免疫グロブリン」又は「抗体分子」という用語は、免疫グロブリン分子のいかなるタイプ（例えばＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ及びＩｇＹ）、又はいかなるサブクラス（例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２）であってもよい。

「特異的結合」又は「特異性を有する」という用語は、一般的に抗体はその抗原結合ドメインによってエピトープに結合され、且つ当該結合において抗原結合ドメインとエピトープの間に一定の相補性が求められることを指す。当該定義によれば、抗体は任意で非関連のエピトープに結合されるよりもその抗原結合ドメインによってエピトープに結合される方が容易である場合、当該抗体がエピトープに「特異的結合」されるものと考えられる。本明細書における「特異性」という用語は、ある抗体があるエピトープと結合される時の相対的親和力について定量的に説明するために用いられる。例えば、抗体「Ａ」は所定のエピトープに対して抗体「Ｂ」よりも高い特異性を有すると考えてもよく、又は抗体「Ａ」に関しては、関連エピトープ「Ｄ」に結合されるよりも特異的にエピトープ「Ｃ」に結合されると記述してもよい。

本明細書で相互に置き換えて用いられる「癌」と「腫瘍」という用語は、本明細書の内容に従って治療可能で細胞の異常成長に係る一連の疾患を指し、体内に侵入し、あるいは拡散する可能性がある。あらゆる腫瘍はすべて発癌性というわけではなく、このうち良性腫瘍は体内のその他部位に拡散しない。可能な症状／所見には、新しく生じた塊、異常出血、遅延性咳や慢性咳、原因不明な体重軽減と排便習慣の変化などが含まれている。今までには、ヒトに発生可能な癌が１００種以上確認されている。本明細書の内容は、固形腫瘍の治療に適用するのが好ましい。腫瘍と癌の非限定例には、胆嚢癌、基底細胞癌、胆管癌、結腸癌、子宮内膜癌、食道癌、ユーイング肉腫、前立腺癌、胃癌、神経膠腫、肝細胞癌、ホジキンリンパ腫、喉頭癌、肝癌、肺癌、悪性黒色腫、中皮腫、膵癌、直腸癌、腎癌、甲状腺癌、悪性末梢神経細胞腫、悪性末梢神経鞘腫（ＭＰＮＳＴ）、皮膚／叢状神経線維腫、平滑筋腺腫様腫瘍、線維腫、子宮筋腫、平滑筋肉腫、甲状腺乳頭癌、甲状腺未分化癌、甲状腺髄様癌、甲状腺濾胞癌、ヒュルトレ細胞癌、甲状腺癌、腹水、悪性腹水、中皮腫、唾液腺腫瘍、唾液腺粘表皮癌、唾液腺腺房細胞癌、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）、体内の潜在性空間液体貯留を引き起こす腫瘍、胸水、心嚢水、腹水、巨細胞腫（ＧＣＴ）、骨ＧＣＴ、色素性絨毛性結節性滑膜炎（ＰＶＮＳ）、腱滑膜巨細胞腫（ＴＧＣＴ）、腱鞘巨細胞腫（ＴＧＣＴ−ＴＳ）及びその他肉腫が含まれている。好ましい実施形態として、本発明を食道癌、肺癌、前立腺癌又は膀胱癌の治療に用いる。

本明細書における「治療」という用語は、癌の進行など望ましくない生理的変化又は障害を予防、又は遅延（軽減）させるための治療措置及び予防的措置を指すものである。有益又は望ましい臨床結果には、検出可能と検出不可の両方の場合を含め、症状の寛解、疾患の度合い軽減、疾患状態の安定化（すなわち悪化しない）、疾患進行の遅延又は軽減、疾患状態の改善もしくは寛解、又は症状の消失（一部でも全部でもよい）が含まれているが、これらのみに限られない。「治療」という用語は、治療を受けない場合の期待生存期間と比べて生存期間が延長することも意味する。治療を必要とする患者には、すでに疾患に罹患したもしくは症状が認められたヒト、疾患に罹患しやすいもしくは症状を生じやすいヒト、又は疾患もしくは症状に対する予防措置をとるヒトが含まれている。

「対象」、「個体」、「動物」、「患者」又は「哺乳動物」という用語は、診断、予後の評価、治療を希望するすべての対象、特に哺乳動物対象を指すものである。哺乳動物対象にはヒト、家畜、農場で飼育される動物と動物園の観賞用動物、競技用動物又はペット、例えばイヌ、ネコ、モルモット、ウサギ、ラット、マウス、ウマ、畜牛（ｃａｔｔｌｅ）、乳牛（ｃｏｗ）などが含まれている。

本明細書における「治療を必要とする患者」又は「治療を必要とする対象」などの用語には、本明細書における例えば検出、診断手順及び／又は治療に用いる抗体もしくは組成物を投与することで利益を受ける対象、例えば哺乳動物対象が含まれている。

当業者に自明なように、本明細書に開示される改変されたゲノムを修飾することで、塩基配列においてそれらから誘導される改変されたポリヌクレオチドと異なるようにすることができる。例えば、所定のＤＮＡ配列から誘導されるポリヌクレオチド配列又は塩基配列は類似してもよく、例えば開始配列と一定の百分率同一性を有し、例えば、開始配列と６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％又は９９％同一のものであってもよい。

また、ヌクレオチドやアミノ酸の置換、欠失又は挿入を行うことで、「非必須」領域で保存的置換又は変異を行ってもよい。例えば、所定のタンパク質から誘導されるポリペプチド又はアミノ酸配列において、１つ又は複数の単一アミノ酸の置換、挿入又は欠失（例えば１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１５個、２０個又はより多くの単一アミノ酸の置換、挿入又は欠失）を除き、残りの部分は開始配列と同一であってもよい。いくつかの実施形態では、所定のタンパク質から誘導されるポリペプチド又はアミノ酸配列は開始配列と比べて１個から５個、１個から１０個、１個から１５個又は１個から２０個の単一アミノ酸の置換、挿入又は欠失がなされている。

抗体は、化学発光化合物に共有結合することで検出可能に標識してもよい。そして化学反応の過程における発光の有無を検出することにより化学発光的に標識される抗原結合ポリペプチドの有無を検出することができる。特に有用な化学発光標識化合物には、例えば、ルミノール、イソルミノール、セロマチック（ｔｈｅｒｏｍａｔｉｃ）アクリジニウムエステル、イミダゾール、アクリジニウム塩及びシュウ酸エステルが挙げられる。

改変されたＨＳＶ−１偏性ベクター
本発明の一態様として、改変されたＨＳＶ−１ゲノムを含むＨＳＶ−１ウイルスを提供し、ＨＳＶ−１偏性ベクターとも呼ばれる。ＨＳＶ−１ゲノムは共有結合する２つの成分（ＬとＳと称する）からなる。各成分はユニーク配列（Ｌ成分はＵ_Ｌ、Ｓ成分はＵ_Ｓ）からなり、両側は逆方向反復配列である。Ｌ成分の逆方向反復配列はａｂとｂ’ａ’と呼ばれ、Ｓ成分の逆方向反復配列はａ’ｃ’とｃａと呼ばれる。逆方向反復領域には２コピーの転写単位が含まれている。本分野では、少なくとも５つの２コピーを有するオープンリーディングフレームが知られており、これらのタンパク質はそれぞれＩＣＰ０、ＩＣＰ４、ＩＣＰ３４．５、ＯＲＦ Ｐ及びＯＲＦ Ｏと名づけられる。逆方向反復配列ｂ’ａ’とａ’ｃ’（ｂ’ａ’−ａ’ｃ’）が結合して内部逆方向反復領域を形成する。そして、逆方向反復配列ａｂとｃａは本明細書で外部反復領域と呼ばれる。

本発明の一実施形態では、前記修飾が、野生型ＨＳＶ−１ゲノムにおけるＵ_Ｌ５６遺伝子のプロモーターとＵ_Ｓ１遺伝子のプロモーターの間の配列欠失を含む。実際に、欠失された配列は、
少なくとも５種のタンパク質（ＩＣＰ０、ＩＣＰ４、ＩＣＰ３４．５、ＯＲＦ−Ｏ及びＯＲＦ−Ｐ）をコードする転写単位の１つのコピー（ただし残りすべてのオープンリーディングフレームが保持される）（ａ）、
ｂ’ａ’−ａ’ｃ’配列内に全体で包含される転写単位（ｂ）、及び
ユニーク領域から始まり、欠失された領域まで延伸する転写単位（ｃ）を含む。

本発明において、正確に前記欠失を行うことにより、欠失後のウイルスＤＮＡに存在するあらゆるオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の発現に必要な配列が完全であるように確保する。このような場合、「存在するあらゆるオープンリーディングフレームの発現に必要な配列」とは、ＯＲＦ自体及び各ＯＲＦの発現に必要な調節配列（例えばプロモーター及びエンハンサー）を含むことで、ＯＲＦの発現が成功し、且つ翻訳により得られるタンパク質が機能性であるように確保する。「完全」という用語は、このように定義される配列は少なくとも機能性であることを意味するが、必ずしも配列は自然状態の配列と１００％同一であるとは意味しない。「非必須」領域に例えば保守的置換や変異を含ませることで、当該配列は、自然状態の配列と比べて塩基配列に少し変異があってもよい。このような場合、当該配列は自然状態の配列と９０％、９５％、９８％又は９９％の同一性を有してもよい。

当業者に自明なように、本発明における欠失されたヌクレオチドの正確な開始位置と終止位置は、ＨＳＶ−１ウイルスの菌株とゲノム異性体により決定され、しかも本分野に知られている技術で容易に決定することができる。なお、本明細書の内容は、ＨＳＶ−１ウイルス株又は特定のゲノム異性体に限定されることを意図しない。一実施形態では、欠失によりゲノムにおけるヌクレオチド１１７００５から１３２０９６が除去される。また自明なように、ゲノムＤＮＡが配列決定されているものであれば、その他菌株も本発明に用いることができる。配列決定技術は、文献や市販物から容易に知ることができる。例えば、もう一つの実施形態として、ＨＳＶ−１ウイルス株１７において欠失を行い、そのゲノムはＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿００１８０６．２にて得ることができる。もう一つの実施形態として、ＫＯＳ １．１ウイルス株において欠失を行い、そのゲノムはＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＫＴ８９９７４４にて得ることができる。またもう一つの実施形態として、ウイルス株Ｆにおいて欠失を行い、そのゲノムはＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＧＵ７３４７７１．１にて得ることができる。

いくつかの実施形態において、所定位置で欠失を正確に行うことにより、Ｌ成分における最後１つの既知遺伝子（例えばＵ_Ｌ５６）のプロモーターからＳ成分における第１の既知遺伝子（例えばＵ_Ｓ１）のプロモーター配列までのＤＮＡフラグメントを除去する。これにより、Ｕ_Ｌ成分におけるＵ_Ｌ１からＵ_Ｌ５６遺伝子とＵ_Ｓ成分におけるＵ_Ｓ１からＵ_Ｓ１２のすべてのＯＲＦ及びこれらのＯＲＦの発現に必要な配列はいずれも完全である。前記正確な除去及び欠失を経たウイルスＤＮＡに存在するあらゆるオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の発現に必要な配列を保持することにより、多くの利点がもたらされる。「保持」という用語は改変されたベクターにユニーク配列（Ｕ_Ｌ及びＵ_Ｓ）におけるあらゆる遺伝子、及びあらゆる２コピー遺伝子（例えばＩＣＰ０、ＩＣＰ４、ＩＣＰ３４．５、ＯＲＦ Ｐ及びＯＲＦ Ｏの遺伝子）の１つのコピーだけを含むことを指す。なお、欠失された配列は殆どタンパク質をコードするものではなく、欠失された領域を占める重複するノンコーディング配列（例えば、ＩＣＰ０のイントロン、ＬＡＴドメイン、「ａ」配列など）である。本発明の偏性ベクターにおいても前記重複するノンコーディング配列の１つのコピーだけを含むことを意図する。

あらゆるＯＲＦを保持することにより、より強力なウイルスを得ることができ、外来遺伝子を挿入する前にも挿入した後にも、温度、圧力、ＵＶ光などの環境要因への耐性が最大になる。また、前記腫瘍溶解性ＨＳＶ−１の抗癌範囲も最大になる。

本分野で知られている各種の遺伝子操作方法、例えば、細菌人工染色体（ＢＡＣ）技術は、本明細書に記載の改変されたＨＳＶ−１ベクターを得るために用いることができる（例えばHorsburgh BC, Hubinette MM, Qiang D, et al. Allele replacement: an application that permits rapid manipulation of herpes simplex virus type 1 genome. Gene Ther, 1999, 6(5):922-30を参照する）。別の一例として、ＣＯＳプラスミドも本発明に用いることができる（例えばvan Zijl M., Quint W, Briaire J, et al. Regeneration of herpes viruses from molecularly cloned subgenomic fragments. J Virol, 1988, 62(6):2191-5を参照する）。

本明細書に記述される構築体の一つの鍵なる特徴は、偏性ベクターとして用いられることである。このような構築体に関しては、感染しやすい細胞の中で増殖しないが、ウイルス又は細胞ＤＮＡ配列が挿入されると増殖し、そのためベクター配列に挿入される遺伝子を発現するベクターとして用いるように定義する。

組み換え腫瘍溶解性ＨＳＶ−１ウイルス
外来ＤＮＡ配列を野生型ウイルスに挿入すると、ＤＮＡをビリオンにパッケージすることが干渉されるため、その挿入量に制限がある。所定の領域における正確な欠失により、外来ＤＮＡ配列を挿入するのに好適なスペースが与えられる。本発明の一実施形態によれば、前記欠失により、腫瘍溶解性ウイルスベクターから少なくとも１５Ｋｂｐが除去され、これにより相当量の外来ＤＮＡ配列を受け入れることができる。また他の関連研究によると、野生型ゲノムは７ＫＢのＤＮＡをさらに受け入れることができる。

これを踏まえ、本発明のもう一つの態様は、組み換え腫瘍溶解性単純ヘルペスウイルス１型（ＨＳＶ−１）を提供する。当該ウイルスは、野生型ＨＳＶ−１ゲノムにおけるＵ_Ｌ５６遺伝子のプロモーターからＵ_Ｓ１遺伝子のプロモーターの間の配列を欠失させることにより、（ｉ）すべての２コピー遺伝子における１つのコピーが欠失し、なお且つ（ｉｉ）前記欠失後のウイルスＤＮＡに存在するすべてのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を発現するために必要な配列が完全であることを含む改変されたＨＳＶ−１ゲノム（ａ）と、少なくとも前記改変されたＨＳＶ−１ゲノムの欠失された領域に安定的に導入され、免疫刺激剤及び／又は免疫治療剤をコードする外来核酸配列（ｂ）とを含む。

一実施形態では、組み換え腫瘍溶解性ＨＳＶ−１は、免疫刺激剤をコードする外来核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、前記免疫刺激剤は、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ ２、ＩＬ ５、ＩＬ １２、ＩＬ １５、ＩＬ ２４及びＩＬ ２７から選択される。一実施形態では、前記免疫刺激剤はＩＬ １２である。一実施形態では、前記免疫刺激剤はヒトＩＬ １２又はヒト化ＩＬ １２である。一実施形態では、前記免疫刺激剤はマウスＩＬ １２である。もう一つの実施形態では、前記免疫刺激剤はＩＬ １５である。

一実施形態では、組み換え腫瘍溶解性ＨＳＶ−１は、免疫治療剤をコードする外来核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、前記免疫治療剤は抗ＰＤ−１剤及び抗ＣＴＬＡ−４剤から選択される。一実施形態では、前記免疫治療剤は抗ＰＤ−１剤である。もう一つの実施形態では、前記免疫治療剤は抗ＣＴＬＡ−４剤である。

免疫刺激剤又は免疫治療剤をコードする外来核酸配列が１つだけ挿入される場合、当該外来核酸配列をゲノムの欠失された領域に組み入れることが好ましい。一実施形態では、当該外来核酸配列は、欠失された領域とほぼ同一の長さを有する。一実施形態では、当該外来核酸配列の長さは欠失された領域よりも２０％長く又は短い。もう一つの実施形態では、当該外来核酸配列の長さは欠失された領域よりも１５％、１０％、５％、４％、３％、２％又は１％長く又は短い。

一実施形態では、当該外来核酸配列の長さは約１８Ｋｂｐ、約１７Ｋｂｐ又は約１６Ｋｂｐよりも短い。一実施形態では、当該外来核酸配列の長さは約１０Ｋｂｐ、１１Ｋｂｐ、１２Ｋｂｐ、１３Ｋｂｐ又は１４Ｋｂｐよりも長い。一実施形態では、当該外来核酸配列の長さは約１４Ｋｂｐから約１６Ｋｂｐの間である。一実施形態では、当該外来核酸配列の長さは約１５Ｋｂｐである。

いくつかの実施形態では、組み換え腫瘍溶解性ＨＳＶ−１は免疫刺激剤及び／又は免疫治療剤をコードする外来核酸配列を少なくとも２種含む。またいくつかの実施形態では、組み換え腫瘍溶解性ＨＳＶ−１は、２種の異なる免疫刺激剤をコードする外来核酸配列を含む。例えば、一実施形態では、組み換え腫瘍溶解性ＨＳＶ−１はＩＬ−１２及びＧＭ−ＣＳＦをコードする外来核酸配列を含む。もう一つの実施形態では、組み換え腫瘍溶解性ＨＳＶ−１はＩＬ−１５及びＧＭ−ＣＳＦをコードする外来核酸配列を含む。またもう一つの実施形態では、組み換え腫瘍溶解性ＨＳＶ−１はＩＬ１２及びＩＬ１５をコードする外来核酸配列を含む。

いくつかの実施形態では、組み換え腫瘍溶解性ＨＳＶ−１は２種の異なる免疫治療剤をコードする外来核酸配列を含む。一実施形態では、例えば、組み換え腫瘍溶解性ＨＳＶ−１は抗ＰＤ−１剤及び抗ＣＴＬＡ−４剤をコードする外来核酸配列を含む。

いくつかの実施形態では、組み換え腫瘍溶解性ＨＳＶ−１は３種の異なる免疫刺激剤及び／又は免疫治療剤をコードする外来核酸配列を含む。例えば、一実施形態では、組み換え腫瘍溶解性ＨＳＶ−１はＩＬ１２、抗−ＣＴＬＡ４剤及び抗ＰＤ−１剤をコードする外来核酸配列を含む。

免疫刺激剤及び／又は免疫治療剤をコードする外来核酸配列を１種以上導入するとき、第１の外来核酸配列をゲノムの欠失領域に挿入するのが好ましい。第２又は他の外来核酸配列は、ゲノムのＬ成分に挿入してもよい。一実施形態では、第２の外来核酸配列をＬ成分のＵ_Ｌ３とＵ_Ｌ４遺伝子の間に挿入する。一実施形態では、第２の外来核酸配列をＬ成分のＵ_Ｌ３７とＵ_Ｌ３８遺伝子の間に挿入する。

一実施形態では、第１の外来核酸配列をゲノムの欠失領域に挿入し、第２の外来核酸配列をＵ_Ｌ３とＵ_Ｌ４遺伝子の間に挿入する。一実施形態では、第１の外来核酸配列をゲノムの欠失された内部逆方向反復領域に挿入し、第２の外来核酸配列をＬ成分のＵ_Ｌ３７とＵ_Ｌ３８遺伝子の間に挿入する。一実施形態では、第１の外来核酸配列をゲノムの欠失された内部逆方向反復領域に挿入し、第２の外来核酸配列をＵ_Ｌ３遺伝子とＵ_Ｌ４遺伝子の間に挿入し、第３の外来核酸配列をＬ成分のＵ_Ｌ３７遺伝子とＵ_Ｌ３８遺伝子の間に挿入する。

一実施形態では、第１の外来核酸配列はＩＬ １２をコードする。一実施形態では、第２の外来核酸配列は抗−ＣＴＬＡ４剤又は抗ＰＤ−１剤をコードする。一実施形態では、第３の外来核酸配列は抗ＰＤ−１剤又は抗ＣＴＬＡ４剤をコードする。

自明なように、１つ又は複数の外来核酸配列を腫瘍溶解性ＨＳＶ−１ゲノムに挿入しても自然ＨＳＶ−１遺伝子の発現に干渉せず、外来核酸配列を改変されたＨＳＶ−１ゲノムに安定的に組み入れると、外来核酸配列の機能的発現を予測することができる。

免疫刺激剤及び／又は免疫治療剤をコードする組み換え遺伝子は、タンパク質をコードする核酸及びタンパク質の発現における調節エレメントを含む。一般には、組み換え遺伝子に存在する調節エレメントは発現対象核酸配列と作動可能に連結されるとともに、発現するのに用いる宿主細胞に基づき選択され、転写プロモーター、リボソーム結合部位及びターミネーターを含んでもよい。組み換え発現ベクターにおいて、「作動可能な連結」という用語は、所望の塩基配列が塩基配列の発現（例えばｉｎ ｖｉｔｒｏ転写／翻訳システムにおける発現、又は宿主細胞へのウイルス導入時における宿主細胞での発現）が可能な方式で調節配列に連結されることを意味するために用いられる。「調節配列」という用語は、プロモーター、エンハンサー及びその他の発現調節エレメント（例えばポリアデニル化シグナル）を含むことを意図するものである。調節配列には、様々なタイプの宿主細胞における塩基配列の構成的発現を指導する調節配列、及び一部の宿主細胞でのみ塩基配列の発現を指導する調節配列（例えば、組織特異性調節配列）が含まれている。

また最近、インスレーター（ｉｎｓｕｌａｔｏｒ）という調節配列が発見され、当該配列は細胞の染色体に発見される１種類のＤＮＡエレメントを含み、染色体の１つの領域における遺伝子が他の領域の調節から影響を受けないように保護する。Ａｍｅｌｉｏらは、ＬＡＴ領域の中からＣＴＣＦモチーフのクラスターを含有する１．５−ｋｂ領域を発見し、当該領域はインスレーター活性、特にエンハンサーを遮断し沈黙させる作用を有している（Amelio et al.. A Chromatin Insulator-Like Element in the Herpes Simplex Virus Type 1 Latency-Associated Transcript RegionBinds CCCTC-Binding Factor and Displays Enhancer-Blocking and Silencing Activities. Journal of Virology, Vol. 80, No. 5, Mar. 2006, p. 2358-2368）。

プロモーターはＤＮＡへのＲＮＡポリメラーゼの結合を指導し、ＲＮＡ合成を開始させるＤＮＡ配列であり、健やかなプロモーターはｍＲＮＡの頻繁な作動を引き起こすことができる。真核細胞における加工の場合は、ポリアデニル化シグナルが好適なエレメントである。抗体に関連するイントロンが存在する可能性もある。抗体又は抗体フラグメントを製造するための発現カセットの例は、本分野で周知のものである（例えば、Persic et al., 1997, Gene 187:9-18; Boel et al., 2000, J Immunol. Methods 239:153-166; Liang et al., 2001, J. Immunol. Methods 247:1 19-130; Tsurushita et al., 2005, Methods 36:69-83.）。

当業者は、例えば所望の組織特異性と発現レベルによって適切な調節エレメントを選択することができる。例えば、細胞タイプ特異性又は腫瘍特異性プロモーターは、遺伝子産物の発現を特定の細胞タイプに限定するために用いることができる。組織特異性プロモーターを用いる他に、ウイルスの局所投与は、局所で発現し効果を果たすことを実現できる。利用可能な非組織特異性プロモーターには例えば、初期サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター（米国特許登録第４，１６８，０６２号）及びラウス肉腫ウイルスプロモーターが挙げられる。また、ＨＳＶプロモーター、例えばＨＳＶ−１Ｅプロモーターを用いることもできる。いくつかの実施形態では、プロモーターは、次表に示すプロモーターから選択される。

例えば、本発明に利用可能な組織特異性プロモーターの例は、前立腺細胞に対して特異的な前立腺特異抗原（ＰＳＡ）プロモーター、筋細胞に対して特異的なデスミンプロモーター、神経細胞に対して特異的なエノラーゼプロモーター、赤血球系細胞に対して特異的なβグロビンプロモーター、同じく赤血球系細胞に対して特異的なｔａｕ−ｇｌｏｂｉｎプロモーター、下垂体細胞に対して特異的な成長ホルモンプロモーター、膵β細胞に対して特異的なインスリンプロモーター、アストロサイトに対して特異的なグリア線維性酸性タンパク質プロモーター、カテコールアミン作動性神経細胞に対して特異的なチロシンヒドロキシラーゼプロモーター、神経細胞に対して特異的なアミロイド前駆体タンパク質プロモーター、ノルアドレナリン作動性／アドレナリン作動性神経細胞に対して特異的なドーパミンβ−モノオキシゲナーゼプロモーター、セロトニン／松果体細胞に対して特異的なトリプトファンヒドロキシラーゼプロモーター、コリン作動性神経細胞に対して特異的なコリンアセチルトランスフェラーゼプロモーター、カテコラミン作動性／５−ＨＴ／Ｄ型細胞に対して特異的な芳香族Ｌ−アミノ酸脱炭酸酵素（ＡＡＤＣ）プロモーター、神経細胞／精原細胞・精巣上体細胞に対して特異的なプロエンケファリンプロモーター、結腸／直腸腫瘍及び膵臓／腎細胞に対して特異的なｒｅｇ（膵石タンパク質）プロモーター、及び肝／盲腸腫瘍、神経鞘腫、腎細胞、膵細胞と副腎細胞に対して特異的な副甲状腺ホルモン関連タンパク質（ＰＴＨｒＰ）プロモーターを含む。

腫瘍細胞の中で特異的に作用するプロモーターの例は、乳癌細胞に対して特異的なストロメリシン３プロモーター、非小細胞肺癌細胞に対して特異的な肺サーファクタントタンパク質Ａプロモーター、ＳＬＰＩを発現する癌種に対して特異的な分泌型白血球ペプチダーゼ阻害物質（ＳＬＰＩ）プロモーター、悪性黒色腫細胞に対して特異的なチロシナーゼプロモーター、繊維肉腫／発癌性細胞に対して特異的なストレス誘導性のｇｒｐ７８／ＢｉＰプロモーター、脂肪細胞に対して特異的なＡＰ２エンハンサー、肝細胞に対して特異的なα−１抗アンチトリプシン・トランスサイレチンプロモーター、多形性膠芽腫に対して特異的なインターロイキン−１０プロモーター、膵臓、乳腺、胃、卵巣及び非小細胞肺癌細胞に対して特異的なｃ−ｅｒｂＢ−２プロモーター、脳腫瘍細胞に対して特異的なα−Ｂ−クリスタリン／熱ショックタンパク質２７プロモーター、神経膠腫及び髄膜腫細胞に対して特異的な塩基性線維芽細胞増殖因子プロモーター、扁平上皮癌、神経膠腫及び乳腺腫瘍細胞に対して特異的な上皮成長因子受容体プロモーター、乳癌細胞に対して特異的なムチン様糖タンパク質（ＤＦ３、ＭＵＣ１）プロモーター、転移性腫瘍に対して特異的なｍｔｓ１プロモーター、小細胞肺癌細胞に対して特異的なＮＳＥプロモーター、小細胞肺癌細胞に対して特異的なソマトスタチン受容体プロモーター、乳癌細胞に対して特異的なｃ−ｅｒｂＢ−３／ｃ−ｅｒｂＢ−２プロモーター、乳癌／胃癌に対して特異的なｃ−ｅｒｂＢ４プロモーター、甲状腺癌細胞に対して特異的なサイログロブリンプロモーター、肝癌細胞に対して特異的なα−フェトプロテイン（ＡＦＰ）プロモーター、胃癌細胞に対して特異的なｖｉｌｌｉｎプロモーター、肝癌細胞に対して特異的なアルブミンプロモーターを含む。もう一つの実施形態では、ＴＥＲＴプロモーター又はサバイビン（ｓｕｒｖｉｖｉｎ）プロモーターを用いる。

例えば、いくつかの実施形態では、外来核酸配列が、例えばＣＭＶプロモーター又はＥｇｒプロモーターなどのプロモーターに作動可能に連結されている。一実施形態では、ｍＩＬ１２をコードする塩基配列がＥｇｒプロモーターに作動可能に連結される。もう一つの実施形態では、ｓｃＦｖ−抗−ｈＰＤ１をコードする塩基配列がＣＭＶプロモーターに作動可能に連結される。

免疫刺激剤又は免疫抑制剤
いくつかの実施形態では、本発明によるｏＨＳＶ−１は、サイトカイン（例えばＩＬ−２、ＩＬ４、ＩＬ−１２、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＦＮγ）、ケモカイン（例えばＭＩＰ−１、ＭＣＰ−１、ＩＬ−８）及び成長因子（例えばＦＬＴ３リガンド）を含む１種又は複数種の免疫刺激剤（免疫刺激分子とも呼ばれる）をコードする。

場合によってはさらに、本発明によるｏＨＳＶ−１は、ＰＤ−１に特異的結合する抗ＰＤ１抗体又はＣＴＬＡ−４に特異的結合する抗ＣＴＬＡ−４抗体などの抗体又はそのフラグメントを含むＰＤ−１結合剤（又は抗ＰＤ−１剤）、ＣＴＬＡ−４結合剤（又は抗ＣＴＬＡ−４剤）など１種又は複数種の免疫治療剤をコードする。このうち抗ＰＤ−１抗体は、ＰＤ−１の活性に拮抗する一本鎖抗体であってもよい。他の実施形態では、腫瘍溶解性ウイルスはＰＤ−１リガンドと受容体との結合に拮抗する試薬、例えば抗ＰＤ−Ｌ１抗体及び／又はＰＤ−Ｌ２抗体、ＰＤ−Ｌ１及び／又はＰＤ−Ｌ２デコイ、もしくは可溶性ＰＤ−１受容体を発現する。

ＰＤ−１シグナル伝達経路は、腫瘍関連の免疫機能障害において重要な作用を果たす。腫瘍細胞の感染と溶解は、特異性の高い抗腫瘍免疫応答を引き起こすことができ、腫瘍を接種した細胞及び遠隔に確立された未接種の腫瘍細胞を死滅させることができる。腫瘍とその微小環境では、自然の抗腫瘍免疫応答を回避し、抑制し不活性化する機構が形成されている。例えば、腫瘍は標的受容体をダウンレギュレーションさせ、繊維性の細胞外マトリックスによってそれ自体を被覆させ、又は制御性免疫細胞の活性化や動員に関与する宿主受容体又はリガンドをアップレギュレーションさせる。自然及び／又は適応的な制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）は腫瘍が仲介する免疫抑制に関与する。いかなる理論にも拘束されることを望むものではないが、ＰＤ−１遮断は、Ｔｒｅｇの活性を抑制し腫瘍反応性ＣＴＬの効果を改善できると考えられる。当該技術の他の態様については、以下により詳しく記述する。ＰＤ−１遮断はまた、Ｔ細胞（ＣＴＬとヘルパー細胞）の遮断及びＢ細胞の非活性化によって抗腫瘍免疫応答を刺激することもできる。

本発明の一つの態様として、ＰＤ−１結合剤をコードする遺伝子を担持する腫瘍溶解性ウイルスを提供する。プログラム細胞死１（ＰＤ−１）は、アポトーシスを経たマウスＴ細胞系のサブトラクティブハイブリダイゼーションで最初に同定された５０−５５ ｋＤａ Ｉ型膜貫通型受容体である（Ishida et al., 1992, Embo J. 11:3887-95）。ＣＤ２８遺伝子ファミリーのメンバーであるＰＤ−１は、活性化されたＴ細胞、Ｂ細胞と骨髄系細胞で発現される（Greenwald et al., 2005, Annu. Rev. Immunol. 23:515-48; Sharpe et al., 2007, Nat. Immunol. 8:239-45）。ヒトとマウスのＰＤ−１の間では、約６０％のアミノ酸同一性を有するとともに、４つの潜在的なＮ−グリコシル化部位とＩｇ−Ｖドメインを定義する残基における保守性を有する。すでにＰＤ−１の２種のリガンド、すなわちＰＤリガンド１（ＰＤ−Ｌ１）及びリガンド２（ＰＤ−Ｌ２）が同定されており、いずれもＢ７スーパーファミリーに属する。このうち、ＰＤ−Ｌ１はＴ細胞、Ｂ細胞、内皮細胞、上皮細胞及び抗原提示細胞を含む様々なタイプの細胞で発現される。ＰＤ−Ｌ２は、プロフェッショナル抗原提示細胞（例えば樹状細胞やマクロファージ）でのみ発現される。

ＰＤ−１はＴ細胞の活性化を負に調節し、また当該抑制機能はその細胞質ドメインの免疫受容体抑制性チロシンモチーフ（ＩＴＩＭ）に関連する（Parry et al., 2005, Mol. Cell. Biol. 25:9543-53）。ＰＤ−１のこのような抑制機能が破壊されると自己免疫を引き起こす。逆の場合でも有害の可能性がある。多くの病理的状況、例えば腫瘍の免疫回避と慢性ウイルス感染において、ＰＤ−１による持続的な負のシグナルは、Ｔ細胞の機能障害に関与する。

宿主の抗腫瘍免疫性は、主に腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）によって左右される（Galore et al., 2006, Science 313:1960-4）。多くの証拠から、ＴＩＬがＰＤ−１により抑制的に調節されることが裏付けられている。第一に、多くのヒト又はマウス腫瘍系において、ＰＤ−Ｌ１の発現が確認されており、また当該発現はｉｎ ｖｉｔｒｏでＩＦＮ−γによってさらにアップレギュレーションされ得る（Dong et al., 2002, Nat. Med. 8:793-800）。第二に、腫瘍細胞が発現するＰＤ−Ｌ１は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで抗腫瘍Ｔ細胞の溶解に対するその抵抗性に直接関連している（Blank et al., 2004, Cancer Res. 64:1 140-5）。第三に、ＰＤ−１ノックアウトマウスは腫瘍の攻撃に対して抵抗性を有し（Iwai et al., 2005, Int. Immunol. 17:133-44）、ＰＤ−１ノックアウトマウスに由来するＴ細胞は担癌マウスに養子移入されると、腫瘍拒絶において非常に有効である（Ｂｌａｎｋら、同上）。第四に、モノクローナル抗体によってＰＤ−１抑制性シグナルを遮断するとマウスにおける宿主抗腫瘍免疫性を促進することができる（Iwai et al., supra; Hirano et al., 2005, Cancer Res. 65:1089-96）。第五に、腫瘍における高度なＰＤ−Ｌ１発現は（免疫組織化学染色法で検出）は、ヒトにおける様々なタイプの癌の予後不良に関連している（Hamanishi et al. , 2007, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 104:3360-5）。

腫瘍溶解性ウイルス療法は、腫瘍の溶解性後に放出された腫瘍特異性抗原に対して特異的なＴ細胞又はＢ細胞集団を増幅させることにより宿主免疫系を形成するのに効果的な方法である。腫瘍特異性抗原の免疫原性はほぼ宿主免疫受容体（Ｂ細胞受容体又はＴ細胞受容体）の抗原エピトープに対する親和力と宿主の寛容閾値により決定される。親和力の高い相互作用は、複数回の増殖と分化により宿主免疫細胞が長期記憶細胞に変わるように働きかける。宿主の免疫寛容機構は、こうした増殖と拡張を相殺することにより、局所的な免疫活性化による潜在的な組織損傷を最小にする。ＰＤ−１抑制シグナルは、このような宿主の免疫寛容機構を構成する部分であり、これは以下に示す証拠からも裏付けられている。第一に、活発に増殖するＴ細胞、特に最終分化表現型（エフェクター表現型）を有するＴ細胞の中ではＰＤ−１の発現が高まる。エフェクター細胞は、一般的に効果的な細胞傷害性機能とサイトカインの生成に関係する。第二に、ＰＤ−Ｌ１は末梢性寛容と過活動のＴ細胞に対する局所的制限を保持することにおいて重要な役割を果たす。よって、腫瘍微小環境の中で発現されたＰＤ−１結合剤を用いてＰＤ−１抑制を行うことは、ＴＩＬの活性を高めるとともに効果的で長期にわたって存続する抗腫瘍免疫応答を引き出すのに効果的な方法である。

細胞傷害性Ｔリンパ球抗原４（ＣＴＬＡ−４）は免疫グロブリン（Ｉｇ）スーパーファミリーのメンバーである。Ｉｇスーパーファミリーは、Ｉｇ分子の可変（Ｖ）又は定常（Ｃ）ドメインの鍵なる構造特徴を有する一連のタンパク質である。Ｉｇスーパーファミリーのメンバーは、免疫グロブリン自体、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）分子（すなわちクラスＩとクラスＩＩＭＨＣ）及びＴＣＲ分子を含むが、これらのみに限られない。Ｔ細胞において、その活性化、そしてエフェクター機能への分化のために抗原提示細胞（ＡＰＣ）による２タイプのシグナルが必要である。その一つは、Ｔ細胞におけるＴＣＲとＡＰＣにおけるペプチドを提示するＭＨＣ分子の間の相互作用により生じる抗原特異性シグナルであって、もう一つは、ＣＤ２８とＢ７ファミリー（Ｂ７−１（ＣＤ８０）又はＢ７−２（ＣＤ８６））のメンバーとの相互作用が仲介する抗原非依存性シグナルである。ＣＴＬＡ−４が免疫応答の環境に組み込まれる最初は回避的である（ｅｖａｓｉｖｅ）。マウスＣＴＬＡ−４は細胞傷害性Ｔリンパ球で好ましく発現される分子の探索の一環としてＢｒｕｎｅｔらによって最初に同定・クローンされた（Brunet et al. Nature 328:267-270 (1987)）。Ｄａｒｉａｖａｃｈらは、ヒトＣＴＬＡ−４を発見し、続いてそのクローンに成功した（Dariavach et al. Eur. J. Immunol. 18:1901-1905 (1988)）。マウスとヒトＣＴＬＡ−４分子の間では、約７６％の全体的配列相同性を有するとともに、その細胞質ドメインではほぼ完全な配列同一性を有する（Dariavach et al. Eur. J. Immunol. 18:1901-1905 (1988)）。

研究者は、１９９３年にＴ細胞の刺激におけるＣＴＬＡ−４の作用の釈明を着手し、１９９５年に大きな成果を収めた。Ｗａｌｕｎａｓら（Walunas et al. Immunity 1:405-13 (1994)）は抗ＣＴＬＡ−４のモノクローナル抗体を用いて、ＣＴＬＡ−４をＴ細胞の活性化の負の調節薬として利用できる証拠を初めて提示した。

癌に関しては、Kwonら（Kwon et al. PNAS USA 94:8099-103 (1997)）は同系マウス前立腺癌モデルを確立し、促進されたＴ細胞共刺激によって抗前立腺癌応答を引き出すために次の２種の異なる操作、（ｉ）Ｂ７．１リガンドを発現する前立腺癌細胞の形質導入による直接共刺激の提供、及び（ｉｉ）Ｔ細胞のダウンレギュレーションを抑制する、ｉｎ ｖｉｖｏ抗体が仲介するＴ細胞ＣＴＬＡ−４の遮断を検証した。ＣＴＬＡ−４のｉｎ ｖｉｖｏ抗体が仲介する遮断により抗前立腺癌における免疫応答が促進されることはすでに証明された。Yangら（Yang et al. Cancer Res 57:4036-41 (1997)）は、ＣＴＬＡ−４機能の遮断が腫瘍成長の異なる段階における抗腫瘍Ｔ細胞応答の促進を引き起こすか否かについて研究した。ｉｎ ｖｉｔｒｏ結果とｉｎ ｖｉｖｏ結果に基づき、彼らは、担癌個体におけるＣＴＬＡ−４遮断が、抗腫瘍Ｔ細胞応答を生成する能力を促進するが、モデルの中でこうした促進作用は、腫瘍成長の初期段階にのみ認められることを発見した。この他に、Hurwitzら（Hurwitz et al. Proc Natl Acad Sci USA 95:10067-71 (1998)）は、Ｔ細胞が仲介する抗腫瘍応答の生成が、主要組織適合遺伝子複合体／抗原によるＴ細胞受容体の拘束とＣＤ２８へのＢ７のライゲーションに依存することについて研究した。一部の腫瘍（例えばＳＭ１乳癌）の場合、抗ＣＴＬＡ−４免疫療法は満足のいく効果を得ることができない。このため、ＣＴＬＡ−４遮断剤と顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子を発現するＳＭ１細胞からなるワクチンを用いる併用療法により、親のＳＭ１腫瘍の退縮が認められたが、どちらか一方だけでの治療は効果がなかった。このような併用療法は、ＳＭ１に対して長期にわたって存続する免疫性を有し、ＣＤ４（＋）とＣＤ８（＋）Ｔ細胞の両方に依存する。この発見により、ＣＴＬＡ−４の遮断は宿主由来の抗原提示細胞のレベルにおいて作用することが示唆された。

抗ＰＤ−１剤と抗ＣＴＬＡ−４剤
本発明の一態様として、抗ＰＤ−１剤及び／又は抗ＣＴＬＡ−４剤をコードする外来核酸を含む腫瘍溶解性ウイルスを提供する。いくつかの実施形態では、抗ＰＤ−１剤又は抗ＣＴＬＡ−４剤には、ＰＤ−１又はＣＴＬＡ−４エピトープに特異的結合する抗体可変領域が含まれている。抗体可変領域は、例えば完全抗体、抗体フラグメント及び抗体又は抗体フラグメントの組み換え誘導体に存在してもよい。「抗体」という用語は、天然、一部合成又は全体合成の免疫グロブリンを指すものである。よって、本発明の抗ＰＤ−１剤又は抗ＣＴＬＡ−４剤は、ＰＤ−１又はＣＴＬＡ−４エピトープに特異的結合する結合ドメインを有するあらゆるポリペプチド又はタンパク質を含む。

抗体の種類が異なればその構造も異なるが、ＩｇＧを参照して異なる抗体領域について説明してもよい。ＩｇＧ分子は、２本の長めの重鎖及びジスルフィド結合で相互連結される２本の短めの軽鎖という４本のポリペプチド鎖を含む。重鎖及び軽鎖はそれぞれ、定常領域と可変領域を含む。重鎖は重鎖可変領域（Ｖ_Ｈ）と重鎖定常領域（ＣＨ１、ＣＨ２とＣＨ３）からなる。軽鎖は軽鎖可変領域（Ｖ_Ｌ）と軽鎖定常領域（Ｃ_Ｌ）からなる。可変領域内には、抗原の特異性に関わる３つの高度可変領域がある。（例えばBreitling et al., Recombinant Antibodies, John Wiley & Sons, Inc. and Spektrum Akademischer Verlag, 1999; and Lewin, Genes IV, Oxford University Press and Cell Press, 1990.を参照する）

高度可変領域は通常、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれ、フレームワーク領域（ＦＷ）と呼ばれるより保存的な隣接領域の間に位置する。ＮＨ２末端からＣＯＯＨ末端にかけて４つのＦＷ領域と３つのＣＤＲがあり、つまり、ＦＷ１、ＣＤＲ１、ＦＷ２、ＣＤＲ２、ＦＷ３、ＣＤＲ３、ＦＷ４である。フレームワーク領域とＣＤＲに関連するアミノ酸は、Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S. Department of Health and Human Services, 1991; C. Chothia and A. M. Lesk, J Mol Biol 196(4):901 (1987); or B. Al-Lazikani, et al., J Mol Biol 273(4): 27, 1997に記載の方法で番号付きとマッチングを行うことができる。例えば、フレームワーク領域とＣＤＲは、ＫａｂａｔとＣｈｏｔｈｉａの定義で同定することが考えられる。重鎖と軽鎖の可変領域は抗原と相互作用する結合ドメインを含む。２つの重鎖カルボキシル領域はジスルフィド結合で連結された、Ｆｃ領域を生成する定常領域である。Ｆｃ領域は、エフェクター機能の提供において重要な役割を果たす（Presta, Advanced Drug Delivery Reviews 58:640-656, 2006.）。Ｆｃ領域を構成する２本の重鎖はそれぞれヒンジ領域によって異なるＦａｂ領域まで延伸している。

抗ＰＤ−１剤又は抗ＣＴＬＡ−４剤は一般的に、抗体可変領域を含む。このような抗体フラグメントは、（ｉ）Ｖ_Ｈ、Ｖ_Ｌ、Ｃ_ＨとＣ_Ｌドメインからなる一価フラグメントであるＦａｂフラグメント、（ｉｉ）ヒンジ領域でジスルフィド結合によって連結される２つのＦａｂフラグメントである二価フラグメントを含むＦａｂ_２フラグメント、（ｉｉｉ）Ｖ_ＨとＣ_Ｈ１ドメインからなるＦｄフラグメント、（ｉｖ）抗体のシングルアームのＶ_ＨとＶ_ＬドメインからなるＦｖフラグメント、（ｖ）Ｖ_Ｈ又はＶ_Ｌドメインを含むｄＡｂフラグメント、（ｖｉ）Ｖ_ＨとＶ_Ｌ及びＣ_１又はＣ_Ｈ１を含む抗体フラグメントを含むｓｃＡｂ、及び（ｖｉｉ）フィブロネクチンＩＩＩ型ポリペプチド抗体（例えば米国特許登録第６，７０３，１９９号）を含むがこれらのみに限られない足場タンパク質に基づく人工抗体を含むが、これらのみに限られない。また、Ｆｖフラグメントの２つのドメインＶ_ＬとＶ_Ｈは個別の遺伝子でコードされるが、組み換えの方法を用いてリンカー連結を合成することにより、単一のタンパク質鎖を形成させることができ、このうち、Ｖ_ＬとＶ_Ｈ領域がマッチングして、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）と呼ばれる一価分子を形成する。このために、抗体可変領域は、組み換え誘導体に存在してもよい。組み換え誘導体の例には、一本鎖抗体、二重特異性抗体、三重特異性抗体、四重特異性抗体及び小型抗体を含む。抗ＰＤ−１剤又は抗ＣＴＬＡ−４剤も、同一又は異なるエピトープを認識する１つ又は複数の可変領域を含んでもよい。

いくつかの実施形態では、抗ＰＤ−１剤又は抗ＣＴＬＡ−４剤は、核酸組み換え技術を用いて生成する腫瘍溶解性ウイルスでコードされる。様々な技術によって、例えばリンカー配列によって連結されるＶＨ領域とＶＬ領域を含む一本鎖タンパク質（例えばｓｃＦｖ）及びその抗体又はフラグメント、及び個別のポリペプチドにＶ_ＨとＶ_Ｌ領域を含む多重鎖タンパク質を含む異なる抗ＰＤ−１薬剤を生成することができる。核酸組み換え技術は、タンパク質の合成に用いる核酸テンプレートの構築に係る。適切な核酸組み換え技術は本分野で一般的に知られている（例えばAusubel, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley, 2005; Harlow et al., Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988を参照する）。抗ＰＤ−１抗体又は抗ＣＴＬＡ−４抗体をコードする組み換え核酸は、腫瘍溶解性ウイルスによって感染された細胞の中で発現され、ウイルス溶解後に腫瘍微小環境の中に放出される。ここで、細胞は実際にタンパク質をコードする工場として用いられる。

抗ＰＤ−１又は抗ＣＴＬＡ−４剤のＶ_Ｈ領域又はＶ_Ｌ領域のうち一方又は両方をコードする１つ又は複数の組み換え遺伝子を含む核酸は、ＰＤ−１／ＣＴＬＡ−４に結合する完全タンパク質／ポリペプチドの生成に用いることができる。例えば、単一の遺伝子を用いてリンカーによって連結されるＶ_Ｈ領域とＶ_Ｌ領域を含む一本鎖タンパク質（例えばｓｃＦｖ）をコードし、又は複数の組み換え領域を用いてＶ_Ｈ領域とＶ_Ｌ領域を生成することにより、完全な結合剤を生成してもよい。

本発明に利用可能な抗ＰＤ−１抗体、抗ＣＴＬＡ−４抗体又はそのフラグメント、誘導体として示す例は本分野から得ることができる（例えばＷＯ２００６／１２１１６８、ＷＯ２０１４／０５５６４８、ＷＯ２００８／１５６７１２、ＵＳ２０１４／０２３４２９６又は米国特許登録第６，９８４，７２０号を参照する）。

本発明において、組み換えｏＨＳＶ−１は、全身にわたって輸送するのではなく、治療を必要とする腫瘍の中でのみ正確に免疫促進タンパク質を輸送する。また、腫瘍におけるタンパク質の製造を緩和し、且つ特にタンパク質の摂取を緩和することにより、細胞傷害性の表現が大いに緩和されたり、ひいては認められない可能性が非常に高い。

組成物
腫瘍溶解性ウイルスは、適切な薬学的に許容可能な担体又は賦形剤の中で製造することができる。通常の保管と使用条件では、これらの製剤には微生物の成長を防止する防腐剤が含まれている。注射用に好適な投与剤型は、無菌水溶液や、分散液又は無菌注射溶液や分散液の仮調製に用いる無菌粉末（米国特許登録第５，４６６，４６８号）を含む。あらゆる場合において、製剤は無菌でなくてはならず、且つ注射を容易にするために流体としなければならない。製造と保管の条件において安定する状態を保たなければならず、且つ細菌と真菌などの微生物による汚染も防止しなければならない。

担体は、例えば水、エタノール、ポリオール（例えばグリセリン、プロピレングリコールと液体ポリエチレングリコールなど）、それらの適切な混合物及び／又は植物油を含む溶媒又は分散媒であってもよい。例えばレシチンなどのコーティングを用いるか、又は分散状態において所定の粒度を維持するか、又は界面活性剤を用いることにより適切な流動性を保持する。各種抗菌剤と抗真菌剤、例えばパラオキシ安息香酸エステル、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどで抗微生物作用を発揮してもよい。多くの場合、好ましくは等張化剤、例えば糖や塩化ナトリウムも含まれている。組成物に吸収を遅延する試薬（例えばモノステアリン酸アルミニウムとゼラチン）を用いて注射用組成物に対する吸収を遅延させてもよい。

水溶液における非経口投与の場合、例えば、必要に応じて溶液を適切に緩衝しておき、十分な量の生理食塩水又は葡萄糖を用いて液体希釈剤を等張化する必要がある。これらの特定の水溶液は、特に静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、腫瘍内投与及び腹腔内投与に適する。これについて、本発明の内容によれば、利用可能な無菌水性媒体は当業者に知られている。例えば、１回の用量を等張ＮａＣｌ溶液１ｍＬに溶解し、そして皮下投与液１０００ｍＬに加えるか、又は推奨する輸液部位に注射してもよい（例えば「Remington’s Pharmaceutical Sciences」 15th Edition, pages 1035-1038 and 1570-1580を参照する）。治療を受ける対象の状况によって用量は必然に変わるが、いずれの場合も、投与実施者は個体被験者にとっての適切な用量を決定する。また、人体投与の場合、製剤はＦＤＡの生物学的製品基準に求められる無菌性、無発熱原性、一般的安全性及び純度基準を満たすべきである。

所定量の活性化合物と上記に示す各種のその他成分を必要に応じて適切な溶媒で合わせて、濾過、滅菌することにより無菌の注射溶液を製造する。通常は、各種の滅菌後の活性成分を基本分散媒と上記に示す必要なその他成分を含む無菌担体に加えることにより分散液を調製する。無菌の注射溶液を調製するための無菌粉末の場合、真空干燥と凍結乾燥が好ましい調製方法であり、その前に無菌濾過した溶液の中から活性成分と他のすべての必要な成分を含む粉末を製造する。

本明細書に開示される組成物は、中性の形態や塩の形態として製造されてもよい。薬学的に許容可能な塩は、タンパク質の遊離アミノ基と形成する酸付加塩及び無機酸（例えば塩酸又はリン酸）又は有機酸（例えば酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸など）と形成する塩を含む。遊離カルボキシ基と形成される塩は、無機塩基、例えばナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム又は水酸化鉄、及び有機塩基、例えばイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカインなどから誘導されるものでもよい。調製時は、溶液を用量や剤型に適合する方式及び治療上の有効量で使用する。当該製剤は各種剤型（例えば注射用溶液、薬物徐放カプセル）などで投与してもよい。

本明細書における「担体」という用語は、いずれか又はあらゆる溶媒、分散媒、キャリア、コーティング、希釈剤、抗菌剤と抗真菌剤、等張化剤と吸収遅延剤、緩衝剤、担体溶液、懸濁剤、コロイドなどを含む。薬物活性的物質として用いられる媒体と薬剤は本分野で広く知られている。活性成分に適合しない従来の媒体や試薬を除き、その他媒体又は試薬は前記治療組成物に利用可能であることが予想される。補助の活性成分も組成物に加えてもよい。

「薬学的に許容可能」という用語は、ヒトに投与するとき、アレルギー又は類似する有害事象を生じない分子実体又は成分を指すものである。タンパク質を活性成分とする水性組成物の調製に関しては本分野で広く知られている。一般的に、このような組成物は、溶液又は懸濁液形態の注射剤として調製され、又は注射前に液体へ溶解又は分散するのに好適な固体形態として製造されてもよい。

療法
本発明のもう一つの態様は、治療を必要とする被験者に組み換え腫瘍溶解性ＨＳＶ−１ウイルス又は上記組み換え腫瘍溶解性ＨＳＶ−１ウイルスを含む医薬組成物の有効量の投与を含む、癌を治療又は寛解する方法を提供する。また本発明は、上記の癌を治療又は寛解する方法に用いる腫瘍溶解性ＨＳＶ−１ウイルスを合わせて提供する。

いくつかの実施形態では、前記組み換え腫瘍溶解性ＨＳＶ−１ウイルス又は医薬組成物は腫瘍内方式で投与される。一実施形態では、ＨＳＶ−１ウイルス又は医薬組成物を注射溶液の形態で腫瘍塊に直接注射する。

いくつかの実施形態では、免疫刺激剤及び／又は免疫治療剤をコードする遺伝子を担持する腫瘍溶解性ウイルスと癌の治療に有効なその他薬剤を組み合わせてもよい。例えば、癌の治療にあたって腫瘍溶解性ウイルスとその他抗癌療法（例えば抗癌剤又は手術）を用いて実施することができる。本発明では、腫瘍溶解性ウイルス療法が化学療法剤、放射療法剤、免疫治療剤又はその他生物学的干渉手段と併用できると予想される。

「抗癌」剤は被験者における癌を負に影響することができ、例えば癌細胞を死滅させ、癌アポトーシスを誘導し、癌細胞の成長速率を低減し、転移発生率又はその発生回数を低下させ、腫瘍のサイズを低減し、腫瘍の成長を抑制し、腫瘍又は癌細胞に対する血液供給を低減し、癌細胞又は腫瘍に対する免疫応答を促進し、癌の進行を予防又は抑制し、癌患者の寿命を延長させることができる。抗癌剤は、生物学的製剤（生物治療）、化学治療剤及び放射治療剤を含む。より一般的には、これらのその他組成物は細胞の死滅又は増殖抑制に有効な組み合わせ量で提供される。当該プロセスは、細胞を発現構築体と試薬又は様々な因子と同時に接触させることに係り得る。これは、細胞を２種の薬剤を含む単一組成物又は薬理学的製剤と接触させるか、又は細胞を２種の異なる組成物もしくは製剤と同時に接触させることにより実現してもよく、このうち１種の組成物は発現構築体を含み、もう１種は試薬を含む。

いくつかの実施形態では、免疫刺激剤及び／又は免疫治療剤をコードする遺伝子を担持する腫瘍溶解性ウイルスと補助剤を組み合わせる。一実施形態では、補助剤は非メチル化ＣｐＧモチーフを含むオリゴヌクレオチドである。細菌のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）における非メチル化ジヌクレオチドＣｐＧモチーフは、複数種の免疫細胞を刺激してサイトカインを分泌させて自然免疫と適応免疫を促進するという利点を有する。

その他薬物治療前又は治療後の何分間から何週間のうちにウイルス療法を行ってもよい。その他薬剤と腫瘍溶解性ウイルスをそれぞれ細胞に投与する実施形態では、一般的に毎回投与の間の間隔を適切な長さにすることにより、薬剤とウイルスが細胞へ複合効果を好ましく発揮するようにする。このような状況において、約１２〜２４時間の間隔をあけて細胞を２種の療法と接触させてもよいと予想される。ただし、一部の状況では、各回の投与の間に数日（２日、３日、４日、５日、６日又は７日）から何週（１週、２週、３週、４週、５週、６週、７週又は８週）の間隔をあけると、治療期間を大いに延長させる必要がある場合がある。

免疫刺激遺伝子又は免疫治療遺伝子を発現するｏＨＳＶの構築

改変されたｏＨＳＶ−１偏性ベクター（ＩＭＭＶ２０１）の構築
細菌人工染色体（ＢＡＣ）技術による偏性ベクター−ＩＭＭＶ２０１の生成において、３つの終止（ＳＴＯＰ）コドンを生成するＣＭＶプロモーターカセットであるＡＴＧＣＡＧＧＴＧＣＡＧＴＡＡＴＡＧＴＡＡカセットをＴ−Ｅａｓｙベクターの中に挿入した。プロトタイプ（Ｐ）配置のＨＳＶ−１を用いられる。それぞれ２セットのプライマー（ＧＡＡＧＡＴＣＴＡＡＴＡＴＴＴＴＴＡＴＴＧＣＡＡＣＴＣＣＣＴＧ、ＣＴＡＧＣＴＡＧＣＴＴＡＴＡＡＡＡＧＧＣＧＣＧＴＣＣＣＧＴＧＧ）と（ＧＣＴＣＴＡＧＡＴＴＧＣＧＡＣＧＣＣＣＣＧＧＣＴＣ、ＣＣＴＴＡＡＴＴＡＡＧＧＴＴＡＣＣＡＣＣＣＴＧＴＡＧＣＣＣＣＧＡＴＧＴ）によってＨＳＶ−１ウイルスゲノムから、上流側がヌクレオチド１１７００５に連結され、下流側がヌクレオチド１３２０９６に連結される遺伝子カセットをＰＣＲ増幅させ、上記ＣＭＶと３つの終止コドンを含むプラスミドの中に挿入し、そして当該遺伝子置き換えプラスミドをｐＫＯ５の中に構築することにより、ｐＫＯ−ＣＭＶ−ＳＴＯＰを得た。ｐＫＯ−ＣＭＶ−ＳＴＯＰを電気穿孔法によってＢＡＣ ＨＳＶを担持する大腸菌ＲｅｃＡ ＋の中に導入することによりＩＭＭＶ２０１を得た。

哺乳動物の細胞におけるＢＡＣ−ＩＭＭＶ２０１によるウイルス増殖失敗
ＯｐｔｉＭＥＭ ａｇｅｎｃｙ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を用いて説明書に従って、上記のように構築されたＢＡＣ−ＩＭＭＶ２０１の２〜３μｇを７０％コンフルエント状態のＶｅｒｏ細胞の中にトランスフェクトした。３７℃、５％ＣＯ_２のインキュベーターの中で４時間インキュベーション。インキュベーション後、新鮮な完全成長培地（５％新生仔ウシ血清／ＤＭＥＭ）４ｍＬで置換。３〜４日以内にウイルスのプラークが認められなかった。実験を３回繰り返すところ、ウイルスのプラークが認められなかった。

単一の免疫刺激又は免疫治療遺伝子を発現するｏＨＳＶ−１（ＩＭＭＶ２０２、２０３、３０３、４０３）の構築
ｐＫＯ遺伝子カセットを電気穿孔法によってＩＭＭＶ２０１を担持する大腸菌ＲｅｃＡ ＋の中に導入することにより、免疫刺激遺伝子（マウスＩＬ１２、ヒトＩＬ１２）又は免疫治療遺伝子（ヒトＰＤ−１ ｓｃＦＶ（配列番号１又は３）、ヒトＣＴＬＡ−４ ｓｃＦＶ（配列番号５）を駆動するＣＭＶプロモーター遺伝子カセットを得た（図１参照）。

２種の免疫刺激遺伝子又は免疫治療遺伝子を発現するｏＨＳＶ−１（ＩＭＭＶ５０２、５０３、５０４、５０５、５０７）の構築
免疫刺激遺伝子（ＩＬ１２）と免疫治療遺伝子（ＰＤ−１ ｓｃＦＶ、ＣＴＬＡ−４ ｓｃＦＶ）を駆動するＣＭＶプロモーターカセットを、さらに、ＩＭＭＶ２０２、２０３、３０３、４０３ベクターにおけるＵＬ３とＵＬ４遺伝子の間に挿入することにより免疫刺激遺伝子（ＩＬ１２）と免疫治療遺伝子の組み合わせを発現する組み換えｏＨＳＶを生成した（図２参照）。

１種の免疫刺激遺伝子と２種の免疫治療遺伝子を発現するｏＨＳＶ−１（ＩＭＭＶ６０３）の構築
ＩＭＭＶ５０３ベクター（図２参照）におけるＵＬ３７とＵＬ３８遺伝子の間にＣＴＬＡ−４ ｓｃＦＶを挿入することにより、ヒトＩＬ１２、ＰＤ−１ ｓｃＦＶとＣＴＬＡ−４ ｓｃＦＶをコードする３種の免疫刺激ｃＤＮＡ及び免疫治療ｃＤＮＡを発現するＩＭＭＶ６０３を構築した。

ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイ

ＰＤ−１ ｓｃＦＶの発現
本明細書に記載の一連の実験では、モック又はプラスミドでトランスフェクトされる２×１０^６個のＨ２９３Ｔ細胞は、ＣＭＶプロモーターにより駆動されＨｉｓタグｓｃＦＶ−抗−ＰＤ−１をコードするｃＤＮＡ及び各種自然源に由来するシグナルペプチドコーディング領域を含む。トランスフェクト４６時間後、細胞溶解物と上澄み液を収集し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行って抗Ｈｉｓ抗体によってウェスタンブロッティングを行った。上澄み液２ｍＬから４０μＬ、細胞溶解物２００μＬから３０μＬを取り出して１２％のＰＡＧＥゲルにロードした。細胞培養の上澄み液の中に蓄積されるＰＤ−１ ｓｃＦＶの量（図３参照）は異なるシグナルペプチドの効率を反映している。

ＰＤ−１へのＰＤ−１ ｓｃＦＶの結合親和力
モック又はプラスミドでトランスフェクトされる２×１０^６個のＨ２９３Ｔ細胞はＣＭＶプロモーターにより駆動されＨｉｓタグｓｃＦＶ−抗ＰＤ−１をコードするｃＤＮＡ及びＨＭＭ３８シグナルペプチドを含む。トランスフェクト４６時間後、上澄み液を収集し、そしてＥＬＩＳＡアッセイを行い、抗Ｈｉｓ抗体を用いて検出した（図４参照）。分泌されたＰＤ−１ ｓｃＦＶは用量依存的にＰＤ−１と結合する。

成長アッセイにおけるｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞生存性
モック（陰性対照）又はＩＭＭＶ５０７（ＰＤ−１抗体及びＣＴＬＡ−４抗体を発現するｏＨＳＶ−１）を用いて、それぞれ各細胞に対する０．０１、０．１、１、１０、１００の倍率のＰＦＵで、９６ウェルプレートに接種した５×１０^３個の次に示すヒト腫瘍細胞を感染した。ＣＣＫ−８キットを用いて、成長の細胞生存性を、９６時間が経過するまで２４時間ごとに測定した（図５参照）。マイクロプレートリーダー（ＢｉｏｔｅｋＥｐｏｃｈ社）を用いて４５０ｎｍでの吸光度を測定した。

これらの研究に用いる腫瘍細胞系は、ヒト膀胱癌Ｔ２４、ヒト食道癌ＥＣＡ１０９、ヒト鼻咽頭癌ＣＮＥ１、ヒト結腸癌ＨＣＴ１１６、ヒト喉頭癌Ｈｅｐ２、ヒト乳癌ＭＤ−ＭＢ−２３１、ヒト腺癌Ｈｅｌａ、ヒト肺癌上皮細胞Ａ５４９、ヒト非小細胞肺癌細胞Ｈ４６０である。

ＩＭＭＶ５０７は用量依存的に腫瘍細胞を死滅させた。腫瘍細胞はｏＨＳＶ−１ウイルスと接触すると経時的に減少した。

当業者に自明なように、本発明は、本明細書に言及される又は本明細書に固有の目的や利点を得るのに特に好適である。本明細書で従来の代表的で好ましい実施形態として記載される方法、変異形態と組成物はあくまでも例示的なものであって、本発明の範囲に対する限制は一切ない。当業者にとっては、変更や他の用途での適用も可能であるが、これらも添付の特許請求の範囲により限定される本発明の趣旨にも含まれるものとする。

本明細書で例示的に記載される技術的手段の具体的な内容は、本明細書で具体的に開示されていない１つ又は複数の要素、１つ又は複数の制限条件が存在しない状況において適宜実施することができる。用いられる用語や表現は、限定を加えるためではなく説明のためにだけ用いられ、これらの用語や表現を用いるときに、表示又は記載される特徴又はその一部のいかなる均等物も除外を意図せず、なお且つ各種改変も本発明の範囲に含まれる可能性もある。よって、好適な実施形態と場合によっては含まれる特徴を用いて本発明を具体的に開示しているが、当業者は本明細書に開示されている概念に対して修正や変更を行うことができ、これらの修正や変更も添付の特許請求の範囲により限定される本発明の範囲に含まれるものとする。

なお、本発明の特徴又は態様は、マーカッシュグループ又はその他代替的なグループの形で記述されているとき、本発明は当該マーカッシュグループ又はその他グループにおけるいずれか単一のメンバー又はサブグループのメンバーの形で記載されると同等であるということは、当業者にとって自明である。

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一実施形態では、組み換え腫瘍溶解性ＨＳＶ−１は、免疫治療剤をコードする外来核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、前記免疫治療剤は抗ＰＤ−１剤及び抗ＣＴＬＡ−４剤から選択される。一実施形態では、前記免疫治療剤は抗ＰＤ−１剤である。もう一つの実施形態では、前記免疫治療剤は抗ＣＴＬＡ−４剤である。したがって、本実施形態は、ＩＬ−１２をコードする外来核酸配列を含み、また、抗ＰＤ−１剤をコードする外来核酸配列を含むこと、抗ＣＴＬＡ−４剤をコードする外来核酸配列を含むことを特徴とする組み換え腫瘍溶解性ＨＳＶ−１に関する。また、ＩＬ−１２をコードする第１の外来核酸配列及び抗ＰＤ−１剤をコードする第２の外来核酸配列を含む、若しくは、ＩＬ−１２をコードする第１の外来核酸配列及び抗ＣＴＬＡ−４剤をコードする第２の外来核酸配列を含むことを特徴とする組み換え腫瘍溶解性ＨＳＶ−１に関する。

免疫刺激剤及び／又は免疫治療剤をコードする外来核酸配列を１種以上導入するとき、第１の外来核酸配列をゲノムの欠失領域に挿入するのが好ましい。第２又は他の外来核酸配列は、ゲノムのＬ成分に挿入してもよい。一実施形態では、第２の外来核酸配列をＬ成分のＵ_Ｌ３とＵ_Ｌ４遺伝子の間に挿入する。したがって、本実施形態では、ＩＬ−１２をコードする第１の外来核酸配列及び抗ＣＴＬＡ−４剤をコードする第２の外来核酸配列を含むことを特徴とする組み換え腫瘍溶解性ＨＳＶ−１において、前記第１の外来核酸配列が前記改変されたＨＳＶ−１ゲノムの欠失された領域に挿入されており、且つ前記第２の外来核酸配列が前記改変されたＨＳＶ−１ゲノムにおけるＵ _Ｌ 成分のＵ _Ｌ ３とＵ _Ｌ ４遺伝子の間に挿入されていることを特徴とする。また、抗ＰＤ−１剤をコードする第１の外来核酸配列及び抗ＣＴＬＡ−４剤をコードする第２の外来核酸配列を含むことを特徴とする組み換え腫瘍溶解性ＨＳＶ−１において、前記第１の外来核酸配列が前記改変されたＨＳＶ−１ゲノムの欠失された領域に挿入されており、且つ前記第２の外来核酸配列が前記改変されたＨＳＶ−１ゲノムにおけるＵ _Ｌ 成分のＵ _Ｌ ３とＵ _Ｌ ４遺伝子の間に挿入されていることを特徴とする。一実施形態では、第２の外来核酸配列をＬ成分のＵ_Ｌ３７とＵ_Ｌ３８遺伝子の間に挿入する。

Claims (32)

1. 改変された単純ヘルペスウイルスＩ型（ＨＳＶ−１）であって、
   野生型ＨＳＶ−１ゲノムにおけるＵ_Ｌ５６遺伝子のプロモーターからＵ_Ｓ１遺伝子のプロモーターの間の配列を欠失させることにより、（ｉ）すべての２コピー遺伝子における１つのコピーが存在せず、なお且つ（ｉｉ）前記欠失後のウイルスＤＮＡに存在するすべてのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を発現するために必要な配列が完全であることを含む改変されたＨＳＶ−１ゲノムを含み、細胞性遺伝子又はウイルス性遺伝子のベクターとして作用することができることを特徴とする改変された単純ヘルペスウイルスＩ型（ＨＳＶ−１）。
2. 前記２コピー遺伝子は、ＩＣＰ０、ＩＣＰ４、ＩＣＰ３４．５、ＯＲＦ Ｐ及びＯＲＦ Ｏをコードする遺伝子及び欠失された領域を占める重複するノンコーディング配列を含むことを特徴とする請求項１に記載の改変されたＨＳＶ−１。
3. 前記ＨＳＶ−１は、プロトタイプ（Ｐ）のゲノム異性体を備えることを特徴とする請求項１に記載の改変されたＨＳＶ−１。
4. 前記ＨＳＶ−１は、Ｆウイルス株、ＫＯＳウイルス株及び１７ウイルス株を含む既存のあらゆるＨＳＶウイルス株から選択されることを特徴とする請求項１に記載の改変されたＨＳＶ−１。
5. 前記欠失により、Ｆウイルス株ゲノムにおけるヌクレオチド位置１１７００５から１３２０９６が除去されることを特徴とする請求項３に記載の改変されたＨＳＶ−１。
6. 組み換え腫瘍溶解性単純ヘルペスウイルスＩ型（ＨＳＶ−１）であって、
   野生型ＨＳＶ−１ゲノムにおけるＵ_Ｌ５６遺伝子のプロモーターからＵ_Ｓ１遺伝子のプロモーターの間の配列を欠失させることにより、（ｉ）すべての２コピー遺伝子における１つのコピーが存在せず、なお且つ（ｉｉ）前記欠失後のウイルスＤＮＡに存在するすべてのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を発現するために必要な配列が完全であることを含む改変されたＨＳＶ−１ゲノムと、
   少なくとも前記改変されたＨＳＶ−１ゲノムの欠失された領域に安定的に導入され、免疫刺激剤及び／又は免疫治療剤をコードする外来核酸配列、とを含むことを特徴とする組み換え腫瘍溶解性単純ヘルペスウイルスＩ型（ＨＳＶ−１）。
7. 前記免疫刺激剤はＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ ２、ＩＬ ５、ＩＬ １２、ＩＬ １５、ＩＬ ２４及びＩＬ ２７から選択されることを特徴とする請求項６に記載の組み換え腫瘍溶解性ＨＳＶ−１。
8. 前記免疫治療剤は抗ＰＤ−１剤及び抗ＣＴＬＡ−４剤から選択されることを特徴とする請求項６に記載の組み換え腫瘍溶解性ＨＳＶ−１。
9. ＩＬ−１２をコードする外来核酸配列を含むことを特徴とする請求項６に記載の組み換え腫瘍溶解性ＨＳＶ−１。
10. 抗ＰＤ−１剤をコードする外来核酸配列を含むことを特徴とする請求項６に記載の組み換え腫瘍溶解性ＨＳＶ−１。
11. 抗ＣＴＬＡ−４剤をコードする外来核酸配列を含むことを特徴とする請求項６に記載の組み換え腫瘍溶解性ＨＳＶ−１。
12. ＩＬ−１２をコードする第１の外来核酸配列及び抗ＰＤ−１剤をコードする第２の外来核酸配列を含むことを特徴とする請求項６に記載の組み換え腫瘍溶解性ＨＳＶ−１。
13. ＩＬ−１２をコードする第１の外来核酸配列及び抗ＣＴＬＡ−４剤をコードする第２の外来核酸配列を含むことを特徴とする請求項６に記載の組み換え腫瘍溶解性ＨＳＶ−１。
14. 抗ＰＤ−１剤をコードする第１の外来核酸配列及び抗ＣＴＬＡ−４剤をコードする第２の外来核酸配列を含むことを特徴とする請求項６に記載の組み換え腫瘍溶解性ＨＳＶ−１。
15. ＩＬ−１２をコードする第１の外来核酸配列、抗ＰＤ−１剤をコードする第２の外来核酸配列及び抗ＣＴＬＡ−４剤をコードする第３の外来核酸配列を含むことを特徴とする請求項６に記載の組み換え腫瘍溶解性ＨＳＶ−１。
16. 前記外来核酸配列に作動可能に連結されるプロモーター配列をさらに含むことを特徴とする請求項６に記載の組み換え腫瘍溶解性ＨＳＶ−１。
17. 前記第１の外来核酸配列が前記改変されたＨＳＶ−１ゲノムの欠失された領域に挿入されており、且つ前記第２の外来核酸配列が前記改変されたＨＳＶ−１ゲノムにおけるＵ_Ｌ成分のＵ_Ｌ３とＵ_Ｌ４遺伝子の間に挿入されていることを特徴とする請求項１２に記載の組み換え腫瘍溶解性ＨＳＶ−１。
18. 前記第１の外来核酸配列が前記改変されたＨＳＶ−１ゲノムの欠失された領域に挿入されており、且つ前記第２の外来核酸配列が前記改変されたＨＳＶ−１ゲノムにおけるＵ_Ｌ成分のＵ_Ｌ３とＵ_Ｌ４遺伝子の間に挿入されていることを特徴とする請求項１３に記載の組み換え腫瘍溶解性ＨＳＶ−１。
19. 前記第１の外来核酸配列が前記改変されたＨＳＶ−１ゲノムの欠失された領域に挿入されており、且つ前記第２の外来核酸配列が前記改変されたＨＳＶ−１ゲノムにおけるＵ_Ｌ成分のＵ_Ｌ３とＵ_Ｌ４遺伝子の間に挿入されていることを特徴とする請求項１４に記載の組み換え腫瘍溶解性ＨＳＶ−１。
20. 前記第１の外来核酸配列が前記改変されたＨＳＶ−１ゲノムの欠失された領域に挿入されており、前記第２の外来核酸配列が前記改変されたＨＳＶ−１ゲノムにおけるＵ_Ｌ成分のＵ_Ｌ３とＵ_Ｌ４遺伝子の間に挿入されており、且つ第３の外来核酸配列が前記改変されたＨＳＶ−１ゲノムにおけるＵ_Ｌ成分のＵ_Ｌ３７とＵ_Ｌ３８遺伝子の間に挿入されていることを特徴とする請求項１５に記載の組み換え腫瘍溶解性ＨＳＶ−１。
21. 前記第１の外来核酸配列が前記改変されたＨＳＶ−１ゲノムの欠失された領域に挿入されており、前記第２の外来核酸配列が前記改変されたＨＳＶ−１ゲノムにおけるＵ_Ｌ成分のＵ_Ｌ３７とＵ_Ｌ３８の間に挿入されており、且つ第３の外来核酸配列が前記改変されたＨＳＶ−１ゲノムにおけるＵ_Ｌ成分のＵ_Ｌ３とＵ_Ｌ４遺伝子の間に挿入されていることを特徴とする請求項１５に記載の組み換え腫瘍溶解性ＨＳＶ−１。
22. 前記プロモーター配列はＣＭＶプロモーター又はＥｇｒプロモーターであることを特徴とする請求項１６に記載の組み換え腫瘍溶解性ＨＳＶ−１。
23. 前記免疫刺激剤及び／又は免疫治療剤はヒト化されていることを特徴とする請求項６に記載の組み換え腫瘍溶解性ＨＳＶ−１。
24. 前記抗ＰＤ−１剤又は前記抗ＣＴＬＡ−４剤は、それぞれＰＤ−１又はＣＴＬＡ−４エピトープに特異的結合するための抗体可変領域を含むことを特徴とする請求項８に記載の組み換え腫瘍溶解性ＨＳＶ−１。
25. 前記抗体可変領域は、完全抗体、抗体フラグメント、又は前記抗体もしくは抗体フラグメントの組み換え誘導体であることを特徴とする請求項２４に記載の組み換え腫瘍溶解性ＨＳＶ−１。
26. 医薬組成物であって、
    有効量の請求項６〜２５のいずれか一項に記載の組み換え腫瘍溶解性ＨＳＶ−１及び薬学的に許容可能な担体を含むことを特徴とする医薬組成物。
27. 前記組成物は腫瘍内投与用として調製されることを特徴とする請求項２６に記載の医薬組成物。
28. 癌を治療又は寛解するための方法であって、
    治療を必要とする対象に対する請求項２６又は２７に記載の医薬組成物の有効量の投与を含むことを特徴とする癌を治療又は寛解するための方法。
29. 前記医薬組成物の投与前、投与中、投与後に第２の療法を実施することを特徴とする請求項２８に記載の方法。
30. 前記第２の療法は、化学療法、放射的療法、免疫療法又は手術的介入から選択されることを特徴とする請求項２９に記載の方法。
31. 前記対象はヒトであることを特徴とする請求項２８に記載の方法。
32. 前記癌は、食道癌、肺癌、前立腺癌及び膀胱癌から選択されることを特徴とする請求項２８に記載の方法。

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