KR20230082790A - Itga7을 포함하거나 조절하는 파킨슨병용 약제학적 조성물 및 그 치료제 - Google Patents

Abstract

본 명세서는 파킨슨병에 사용하여 파킨슨병에 우수한 치료 효과를 제공하는 파킨슨병용 약제학적 조성물 및 그 치료제, 그 진단키트를 개시한다.

Description

ITGA7을 포함하거나 조절하는 파킨슨병용 약제학적 조성물 및 그 치료제{Parkinson's disease pharmaceutical composition and its therapeutic agent containing or modulating ITGA7}

본 명세서는 퇴행성 뇌질환에서 도파민세포와 알파시누클레인을 조절하는 ITGA7을 포함하거나 조절하는 약리학적 조성물(Pharmaceutical composition and its therapeutic agent containing or modulating ITGA7 that modulates dopaminergic cells and alpha synuclein in degenerative brain disease) 및 그 치료제를 제공한다.

파킨슨병(Parkinson's disease(PD))은 만성 진행성 신경 퇴행성 질환이다. 주요 병리학적 특징은 주로 SN(Substantia Nigra)에서 도파민성 뉴런의 극적인 손실이며, 세포질 내성 루이 소체(intracytoplasmic Lewy bodies) 및 영양 장애 성 신경 돌기(dystrophic neurites)의 형성이다.

그러나, 도파민성 뉴런의 손실 배후의 메카니즘은 아직 명확하지 않다.

본 실시예들은 파킨슨병에 사용하여 파킨슨병에 우수한 치료 효과를 제공하는 파킨슨병용 약제학적 조성물 및 그 치료제를 제공한다.

일 실시예는, 퇴행성 뇌질환에서 도파민세포와 알파-시누클레인을 조절하는 ITGA7 유전자 발현에 의한 물질을 유효성분으로 포함하는 파킨슨병 약제학적 조성물을 제공한다.

다른 실시예는, 퇴행성 뇌질환에서 도파민세포와 알파시누클레인을 조절하는 ITGA7 유전자를 일부 변형하여 최적화시킨 발현에 의한 물질을 유효성분으로 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.

이때, ITGA7 유전자 발현에 의한 물질은 세린/아르기닌이 풍부한 단백질 특이적 키나아제 3인 ITGA7일 수 있다. 이때, 상기 ITGA7 유전자 발현에 의한 물질로 단백질 혹은 mRNA를 포함할 수 있다.

다른 실시예는, 퇴행성 뇌질환에서 도파민세포와 알파-시누클레인을 조절하는 ITGA7 유전자 발현에 의한 물질을 유효성분으로 포함하는 파킨슨병 약제학적 조성물, 및 약제학적 조성물을 담는 담체를 포함하는 파킨슨병 치료제를 제공한다.

다른 실시예는, 퇴행성 뇌질환에서 도파민세포와 알파-시누클레인을 조절하는 ITGA7 유전자의 발현 정도에 영향을 미치는 물질들을 파킨슨병 치료제의 후보물질로 스크리닝하는 방법을 제공한다.

이 파킨슨병 치료제의 후보물질로 스크리닝하는 방법은 다음의 단계를 포함한다.

(a) 파킨슨병 모델로 생성된 실험 동물에 적어도 하나의 후보 물질을 투여하는 단계; 및

(b) ITGA7 유전자의 발현량을 측정하는 단계, 상기 ITGA7 유전자의 발현 수준이 조절되는 경우에는 상기 후보 물질은 파킨슨병 예방 또는 치료용 물질로 판정된다.

또 다른 실시예는, 대상체로부터 검체를 분리하는 단계, 검체로부터 ITGA7 유전자의 발현량을 측정하는 단계 및 ITGA7 유전자의 발현 수준이 조절되는 경우 상기 대상체에 대해 파킨슨병으로 진단하는 단계를 포함하는 파킨슨병 진단방법을 제공한다.

본 실시예들에 따르면, 파킨슨병용 약제학적 조성물 및 그 치료제를 파킨슨병에 사용하여 파킨슨병에 우수한 치료 효과를 제공한다.

본 실시예에 따르면, 파킨슨병 진단키트는 피키슨병을 조기에 진단하여 파킨슨병 치료 및 예방에 우수한 효과를 제공한다.

본 실시예에 따르면, 파킨슨병 치료제의 후보물질로 스크리닝하는 방법은 파킨슨병 치료제의 후보물질을 스크리닝하여 파킨슨병 치료 및 예방을 할 수 있는 효과가 있다.

도 1은 대조군(CTL) 및 1-메틸-4-페닐-1,2,3,6-테트라하이드로피리딘 처리(MPTP) 그룹에서 흑색질(SN; 도 1a, 도 1c) 및 선조체(ST; 도 1b, 도 1d)에서 티로신 수산화효소(TH) 발현의 면역조직화학 분석 결과를 나타낸다.
도 2는 인테그린 알파 7(ITGA7) 발현이 SN의 대조군(CTL)에 비해 MPTP 그룹(MPTP)에서 감소한 것을 나타낸다.
도 3은 만성 1-메틸-4-페닐-1,2,3,6-테트라하이드로피리딘(MPTP) 유발 파킨슨병마우스 모델에서 SN의 ITGA7 및 a-시누클레인(a-syn) 발현을 나타낸다.
도 4는 MPTP 유발 파킨슨병 마우스 모델에서 SN의 a-syn과 공동 국소화된 ITGA7의 면역형광 이미지이다.
도 5는 웨스턴 블롯 분석으로 ITGA7 siRNA의 투여가 ITGA7과 TH 발현을 감소시켰지만 SH-SY5Y 세포에서 a-synuclein(a-syn) 발현을 증가시켰음을 나타낸다.
도 6는 웨스턴 블롯 분석으로 ITGA7 siRNA의 투여가 SH-SY5Y 세포에서 bcl2 발현을 유의하게 감소시키고 bax/bcl2 비율을 증가시키는 것으로 나타냈다.
도 7는 SH-SY5Y 세포에서 a-syn과 공동 국소화된 ITGA7의 면역형광 분석을 나타낸다.

이하, 본 발명의 일부 실시예들을 예시적인 도면을 통해 상세하게 설명한다. 각 도면의 구성요소들에 참조부호를 부가함에 있어서, 동일한 구성요소들에 대해서는 비록 다른 도면상에 표시되더라도 가능한 한 동일한 부호를 가지도록 하고 있음에 유의해야 한다. 또한, 본 발명의 실시예들을 설명함에 있어, 관련된 공지 구성 또는 기능에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 흐릴 수 있다고 판단되는 경우에는 그 상세한 설명은 생략한다.

본 발명에서 사용되는 용어 "치료", "억제" 및 "약화"란, 본 발명의 조성물을 개체에 사용하여, 특정 세포의 분화나, 특정 물질의 수준, 특정 질병 또는 질환의 진행을 감소시키거나 지연시키는 모든 행위를 의미한다.

본 발명에서 사용되는 용어 "개체"란, 인간을 포함한 모든 동물을 의미한다.

이하, 본 발명의 실시예들에 따른 파킨슨병에 사용하여 파킨슨병에 우수한 치료 효과를 제공하는 파킨슨병용 약제학적 조성물 및 그 치료제에 대하여 설명한다.

실시예 1: 약제학적 조성물 및 그 치료제

파킨슨병(Parkinson's disease(PD))은 만성 진행성 신경 퇴행성 질환이다. 파킨슨병(PD)은 노인에서 두 번째로 흔한 퇴행성 뇌 질환이다.

아래 실험예를 통해 알 수 있는 바와 같이, 본 발명자는 메틸-4-페닐-1,2,3,6-테트라하이드로피리딘(MPTP) 유발 파킨슨병(PD) 마우스 모델에서 인테그린 a7(ITGA7)과 알파-시누클레인(a-syn) 사이의 잠재적 연관성을 조사했다. 파킨슨병(PD)의 병리학적 특징을 알아보기 위해 뇌의 흑질(SN)에서 티로신 수산화효소(Tyrosine hydroxylase(TH)), ITGA7, a-syn 발현을 관찰하였다. ITGA7과 PD 사이의 관계를 확인하기 위해 SH-SY5Y 세포에서 ITGA7 siRNA 녹다운 후 TH와 a-syn의 발현을 조사했다.

ITGA7 마이크로어레이 신호는 MPTP 그룹의 SN에서 감소하여 대조군에 비해 ITGA7 발현이 감소되었음을 나타낸다. 면역조직화학염색에서 대조군의 ITGA7과 MPTP군의 a-syn 발현 양상은 유사하였다. ITGA7 siRNA 투여에 의한 ITGA7 발현의 감소는 SH-SY5Y 세포에서 TH 발현의 감소와 a-syn 발현의 증가를 유도하였다. ITGA7의 감소된 발현은 SH-SY5Y 세포에서 bcl2의 발현을 유의하게 감소시켰고 bax/bcl2 비율을 증가시켰다. 이러한 결과는 감소된 ITGA7 발현이 MPTP-유도 PD 마우스 모델에서 증가된 a-syn 발현 및 도파민성 세포의 세포자멸과 관련될 수 있음을 시사한다.

이러한 연구에 기반하여, 본 명세서는, 퇴행성 뇌질환에서 도파민세포와 알파-시누클레인(alpha-synuclein)을 조절하는 ITGA7을 포함하거나 조절하는 약리학적 조성물을 제안한다.

일 실시예는, 퇴행성 뇌질환에서 도파민세포와 알파-시누클레인을 조절하는 ITGA7 유전자 발현에 의한 물질을 유효성분으로 포함하는 파킨슨병 약제학적 조성물을 제공한다.

본 명세서에서 ITGA7 유전자 발현에 의한 물질은 ITGA7　유전자 서열에 의해 발현되는 단백질이나, 이 단백질　발현이 잘 되도록 ITGA7 유전자에 일부 변형을 주어 발현시킨 단백질을 의미할 수 있다.

이때, ITGA7 유전자 발현에 의한 물질은 세린/아르기닌이 풍부한 단백질 특이적 키나아제 3인 ITGA7일 수 있다. 이때, 상기 ITGA7 유전자 발현에 의한 물질로 단백질 혹은 mRNA를 포함할 수 있다.

알파-시누클레인은 인간의 뇌에 풍부한 단백질이다. 소량은 심장, 근육 및 다른 조직에서도 발견된다. 뇌에서, 알파-시누클레인은 시냅스전말단이라 불리는 특수한 구조의 신경 세포 (뉴런)의 끝에서 주로 발견된다. 인간의 알파-시누 클레인 단백질은 140 개의 아미노산으로 이루어지고, SNCA유전자에 의해 코딩된다.

다른 실시예는, 퇴행성 뇌질환에서 도파민세포와 알파-시누클레인을 조절하는 ITGA7 유전자 발현에 의한 물질을 유효성분으로 포함하는 파킨슨병 약제학적 조성물, 및 그 약제학적 조성물을 담는 담체를 포함하는 파킨슨병 치료제를 제공한다.

상기 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용 가능한 담체를 추가로 포함할 수 있으며, 상기 담체와 함께 제제화되어 식품, 의약품, 사료 첨가제 및 음용수 첨가제 등으로 제공될 수 있다. 본 발명에서 사용되는 용어 "약학적으로 허용 가능한 담체"란 생물체를 자극하지 않으면서, 투여되는 화합물의 생물학적 활성 및 특성을 저해하지 않는 담체 또는 희석제를 의미한다.

본 발명에서 용어, "약학적으로 허용 가능한 담체"란 생물체를 자극하지 않고 투여 화합물의 생물학적 활성 및 특성을 저해하지 않는 담체 또는 희석제를 말한다. 액상 용액으로 제제화되는 조성물에 있어서 허용되는 약제학적 담체로는, 멸균 및 생체에 적합한 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다.

본 명세서의 파킨슨병 치료용 조성물은 이를 유효성분으로 포함하는 어떠한 제형으로도 적용가능하며, 경구용 또는 비경구용 제형으로 제조할 수 있다. 본 명세서의 약학적 제형은 구강(oral), 직장(rectal), 비강(nasal), 국소(topical; 볼 및 혀 밑을 포함), 피하, 질(vaginal) 또는 비경구(parenteral; 근육내, 피하 및 정맥내를 포함) 투여에 적당한 것 또는 흡입(inhalation) 또는 주입(insufflation)에 의한 투여에 적당한 형태를 포함한다.

본 명세서의 조성물을 유효성분으로 포함하는 경구 투여용 제형으로는, 예를 들어 정제, 트로키제, 로렌지, 수용성 또는 유성현탁액, 조제분말 또는 과립, 에멀젼, 하드 또는 소프트 캡슐, 시럽 또는 엘릭시르제로 제제화할 수 있다. 정제 및 캡슐 등의 제형으로 제제화하기 위해, 락토오스, 사카로오스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아밀로펙틴, 셀룰로오스 또는 젤라틴과 같은 결합제, 디칼슘 포스페이트와 같은 부형제, 옥수수 전분 또는 고구마 전분과 같은 붕괴제, 스테아르산 마스네슘, 스테아르산 칼슘, 스테아릴푸마르산 나트륨 또는 폴리에틸렌글리콜 왁스와 같은 윤활유를 포함할 수 있으며, 캡슐제형의 경우 상기 언급한 물질 외에도 지방유와 같은 액체 담체를더 함유할 수 있다.

본 명세서의 조성물을 유효성분으로 포함하는 비경구 투여용 제형으로는, 피하주사, 정맥주사 또는 근육내 주사 등의 주사용 형태, 좌제 주입방식 또는 호흡기를 통하여 흡입이 가능하도록 하는 에어로졸제 등 스프레이용으로 제제화할 수 있다. 주사용 제형으로 제제화하기 위해서는 본 발명의 조성물을 안정제 또는 완충제와 함께 물에서 혼합하여 용액 또는 현탁액으로 제조하고, 이를 앰플 또는 바이알의 단위 투여용으로 제제화할 수 있다. 좌제로 주입하기 위해서는, 코코아버터 또는 다른 글리세라이드 등 통상의 좌약 베이스를 포함하는 좌약 또는 관장제와 같은 직장투여용 조성물로 제제화할 수 있다. 에어로졸제 등의 스프레이용으로 제형화하는 경우, 수분산된 농축물 또는 습윤 분말이 분산되도록 추진제 등이 첨가제와 함께 배합될 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물 및 그 치료제의 투여방법은 특별히 제한되는 것은 아니나, 목적하는 방법에 따라 정맥 내, 피하, 복강 내, 흡입, 피부도포, 패치제 또는 국소적용과 같이 비경구 투여하거나 경구 투여할 수 있다.

투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하다. 일일 투여량은 치료를 필요로 하는 개체에 투여됨으로써 경감된 질병 상태에 대한 치료에 충분한 본 발명의 치료용 물질의 양을 의미한다. 치료용 물질의 효과적인 양은 특정 화합물, 질병 상태 및 그의 심각도, 치료를 필요로 하는 개체에 따라 달라지며, 이는 당업자에 의해 통상적으로 결정될 수 있다. 비제한적 예로서, 본 발명에 의한 조성물의 인체에 대한 투여량은 환자의 나이, 몸무게, 성별, 투여 형태, 건강 상태 및 질환 정도에 따라 달라질 수 있다.

이하, 실험예를 기술함으로써 본 발명을 보다 상세히 설명한다. 다만, 하기의 실험예는 본 발명의 일 예시에 불과하며, 본 발명의 내용이 이에 한정되는 것으로 해석되어서는 아니된다.

실험예: 약제학적 조성물

1. 개요

기대수명과 퇴행성 뇌질환의 유병률이 증가함에 따라 알츠하이머병에 이어 두 번째로 흔한 퇴행성 뇌질환인 파킨슨병(PD) 환자가 급증하고 있다. PD의 주요 증상은 느린 움직임, 떨림, 강직 및 자세 불안정을 포함한 운동 기능 관련 증상이다. 파킨슨병은 중뇌에 위치한 흑질(SN)에서 도파민을 분비하는 뉴런의 소실을 특징으로 하지만 이러한 감소의 원인은 아직까지 밝혀지지 않았다.

PD의 주요 조직병리학적 특징은 루이소체의 침착이며, 이러한 세포 내 침착의 주요 단백질 성분은 a-시누클레인(a-syn)의 원섬유형 응집체이다. PD 및 PD 동물 모델을 가진 환자 모두에서 a-syn의 발현 증가가 관찰되었으며 PD 병리와 밀접한 관련이 있는 것으로 보고되었다. 이러한 단백질의 자가 응집은 양친매성 나선 구조의 형성으로 이어져 막 결합을 유발할 수 있다.

인테그린 서브유닛 알파 7 및 인테그린 알파 7 사슬 3으로도 알려진 인테그린 a7(ITGA7)은 세포외 기질(ECM) 결합 단백질을 암호화한다. 인테그린은 ECM 부착을 매개하는 세포 표면 수용체의 주요 계열이며 배아 발달, 종양 세포 성장 및 전이, 프로그램된 세포 사멸을 비롯한 다양한 세포 기능의 조절에 밀접하게 관련되어 있다. 이 단백질은 골격근모세포와 근섬유 표면의 기저막 단백질인 라미닌-1에 대한 수용체로 기능한다.

비정상적인 인테그린 발현은 여러 인간 질병과 관련이 있다. ITGA7의 결함은 선천성 근병증과 관련이 있다. ITGA7이 결핍된 마우스는 동맥과 세동맥의 현저한 증식과 비대, 골격근의 기형을 나타낸다. 또한 ITGA7 결핍은 근이영양증 및 근병증에서 흔하다.

이러한 이전 연구를 기반으로 ITGA7 발현이 PD의 병리학적 변화에 관여한다는 가설을 세웠다. PD의 주요 증상은 운동 기능 관련 증상이다. 따라서 본 명세서는 PD의 운동 기능 관련 증상이 ITGA7 발현의 감소로 인한 근병증과 관련될 수 있다고 추측했다. 여기에서 본 명세서는 ITGA7 발현이 1-메틸-4-페닐-1,2,3,6-테트라하이드로피리딘(MPTP) 유발 파킨슨병 마우스 모델에서 SN에서 감소됨을 보고한다. 우리는 또한 ITGA7 발현의 감소가 MPP+로 처리된 SH-SY5Y 세포에서 a-syn 발현의 증가를 유도한다는 것을 보여주었다.

2. 결과

2.1 만성 MPTP 유발 PD의 마우스 모델에서 티로신 수산화효소 발현 감소

대조군(CTL) 및 MPTP 그룹에서 MPTP 및 식염수를 각각 1일 1회 복강내 주사하였다. 4주 후, 만성 MPTP 유발 PD 마우스 모델이 확립되었는지 확인하기 위해 SN 및 선조체(ST)에서 티로신 수산화효소(TH) 발현의 변화를 분석했다. TH의 발현은 SN과 ST 모두에서 CTL 마우스와 비교하여 MPTP 마우스에서 유의하게 감소했다(도 1c 및 d). 웨스턴 블롯 분석 결과와 유사하게 MPTP를 처리한 SN과 ST(p<0.005)에서 TH의 발현이 유의하게 감소함을 확인하였다(도 1).

도 1은 대조군(CTL) 및 1-메틸-4-페닐-1,2,3,6-테트라하이드로피리딘 처리(MPTP) 그룹에서 흑색질(SN; 도 1a, 도 1c) 및 선조체(ST; 도 1b, 도 1d)에서 티로신 수산화효소(TH) 발현의 면역조직화학 분석 결과를 나타낸다. TH 발현은 MPTP 처리된 마우스의 뇌의 ST 및 SN 영역에서 감소하였다. 웨스턴 블롯 분석(도 1e)은 TH 발현이 MPTP 처리된 마우스(도 1f)에서 유의하게 감소되었음을 보여주었다. **는 CTL과 비교하여 p < 0.005를 나타낸다.

2.2 흑질에서 ITGA7의 마이크로어레이 분석 및 웨스턴 블롯 분석

SN에 대한 마이크로어레이 신호 분석은 MPTP 처리 마우스의 ITGA7 신호가 CTL의 ITGA7 신호에 비해 감소되었음을 확인했다(p < 0.05, n=2, 도 2b). 따라서, ITGA7 발현을 웨스턴 블롯 분석으로 평가한 결과, ITGA7의 발현이 CTL 군에 비해 MPTP 군에서 유의하게 감소되었음을 확인하였다(p < 0.05, n=3, 도 2a 및 b)

도 2는 인테그린 알파 7(ITGA7) 발현이 SN의 대조군(CTL)에 비해 MPTP 그룹(MPTP)에서 감소한 것을 나타낸다. 도 2a에서 웨스턴 블롯 분석은 MPTP 처리 마우스에서 ITGA7의 감소된 발현을 확인했다. 도 2b에서 히스토그램은 웨스턴 블롯 분석으로 감지된 ITGA7 발현의 현저한 감소와 CTL 그룹과 비교하여 MPTP 그룹의 마이크로 어레이의 감소된 신호를 보여준다. *는 CTL과 비교하여 p < 0.05를 나타낸다.

2.3 만성 MPTP 유발 PD의 마우스 모델에서 흑색질에서 ITGA7 발현 감소 및 a-syn 발현 증가

면역 조직 화학 분석(IHC)은 SN에서 ITGA7의 발현이 CTL 그룹(도 3a 및 도 3b)과 비교할 때 MPTP 그룹(도 3c 및 도 3d)에서 유의하게 감소되었음을 보여주었다. 반대로, a-syn의 발현은 MPTP 그룹에서 현저하게 증가했다(도 3g 및 도 3h)(도 3e 및 도 3f). ITGA7과 a-syn의 발현은 반비례하지만 패턴은 유사하였다.

도 3은 만성 1-메틸-4-페닐-1,2,3,6-테트라하이드로피리딘(MPTP) 유발 파킨슨병마우스 모델에서 SN의 ITGA7 및 a-시누클레인(a-syn) 발현을 나타낸다. ITGA7(a-d)의 발현은 MPTP 군에서 감소(도 3c, 도 3d)하였고 a-syn(도 3e-도 3h)의 발현은 증가(도 3g, 도 3h)하였다. 도 3b, 도 3d, 도 3f, 도 3h의 이미지는 도 3a, 도 3c, 도 3e, 도 3g의 정사각형을 확대한 이미지이다.

2.4 흑질에서 a-syn과 함께 국소화된 ITGA7의 면역형광 분석

ITGA7 및 a-syn의 면역형광 분석은 공동 국소화를 나타내었고 ITGA7 발현이 MPTP 그룹(도 4f)보다 CTL 그룹(도 4a)에서 더 강하다는 것을 보여주었다. 반대로, a-syn은 CTL 그룹보다 MPTP 그룹에서 더 강하게 발현되었다(도 4b 및 도 4g). ITGA7과 a-syn이 병합되었을 때(도 4c, 도 4d, 도 4h 및 도 4i), ITGA7의 발현은 CTL 그룹(도 4d)에서 더 강했던 반면, a-syn의 발현은 MPTP 그룹에서 더 강했다(도 4c, 도 4d, 도 4h 및 도 4i).

도 4는 MPTP 유발 파킨슨병 마우스 모델에서 SN의 a-syn과 공동 국소화된 ITGA7의 면역형광 이미지이다. SN 영역은 Rhodamine Avidin(도 4a 및 도 4d, 적색)을 사용하여 항-ITGA7(도 4b 및 도 4g) 및 항-a-syn(도 4a 및 도 4f) 항체로 면역형광 중심으로 표지한 다음 Fluorescein Avidin (도 4b 및 도 4g, 녹색)을 사용하여 ITGA7 항체로 이중 면역 표지했다.. 중간 패널(도 4c 및 도 4h)은 개별 a-syn(도 4a 및 도 4f) 및 ITGA7(도 4b 및 도 4g) 패널의 병합된 이미지를 보여준다. 대조군(도 4c)에서는 ITGA7이 더 강하게 발현되었고(녹색), MPTP군(도 4h)에서는 강렬한 적색 형광이 관찰되었다. 도 4d 및 도 4i는 DAPI와 병합된 이미지를 보여준다. 도 4e와 도 4j의 이미지는 도 4d와 도 4i의 정사각형을 확대한 이미지(스케일 바, 10 μm)이다.

2.5 ITGA7 siRNA에 의해 유도된 SH-SY5Y 세포의 웨스턴 블롯 분석

ITGA7 siRNA 투여는 SH-SY5Y 세포에서 ITGA7 및 TH 발현을 감소시켰으나(p < 0.05, n=3), a-syn 발현은 증가시켰다(p < 0.05, n=3)(도 5a 및 도 5b). 또한 ITGA7 siRNA 투여는 bcl2의 발현을 감소시킨 반면(p < 0.05), bax 발현은 유의하게 증가하지 않아 bax/bcl2 비율이 유의하게 증가하였다(도 6a).

도 5는 웨스턴 블롯 분석으로 ITGA7 siRNA의 투여가 ITGA7과 TH 발현을 감소시켰지만 SH-SY5Y 세포에서 a-synuclein(a-syn) 발현을 증가시켰음을 나타낸다. NC, 음성 대조군 siRNA 처리(2일 동안 100nM); 10, ITGA7 siRNA 처리(2일 동안 10nM); 100, ITGA7 siRNA 처리(2일 동안 100nM). *는 NC와 비교하여 p < 0.05를 나타낸다.

도 6는 웨스턴 블롯 분석으로 ITGA7 siRNA의 투여가 SH-SY5Y 세포에서 bcl2 발현을 유의하게 감소시키고 bax/bcl2 비율을 증가시키는 것으로 나타냈다. NC, 음성 대조군 siRNA 처리(2일 동안 100nM); 10, ITGA7 siRNA 처리(2일 동안 10nM); 100, ITGA7 siRNA 처리(2일 동안 100nM). *는 NC와 비교하여 p < 0.05 및 ** p < 0.001을 나타낸다.

2.6 ITGA7의 면역형광 분석은 SH-SY5Y 세포에서 a-syn과의 공동 국소화를 나타냈습니다.

ITGA7 및 a-syn의 면역형광 분석은 공동 국소화를 나타내었고 ITGA7의 발현은 MPP+ 처리된 SH-SY5Y 세포보다 CTL에서 더 강력했다(도 7b 및 도 7f). ITGA7, a-syn 및 DAPI에 대한 염색을 결합하면 ITGA7의 발현이 막 근처에 국한되는 것으로 확인되었다(도 7d). 반대로, a-syn의 발현은 CTL 그룹보다 MPP+ 처리 그룹에서 더 강했다(도 7a 및 도 7e). CTL에서 a-syn과 ITGA7이 결합된 경우 CTL 그룹에서 ITGA7 발현이 강하고 MPP+ 처리 그룹에서 a-syn이 강하게 발현되었다(도 7c 및 도 7g).

도 7는 SH-SY5Y 세포에서 a-syn과 공동 국소화된 ITGA7의 면역형광 분석을 나타낸다. 세포를 Rhodamine Avidin(도 7a 및 도 7e, red)을 사용하여 항-ITGA7(도 7b 및 도 7f) 및 항-a-시누클레인(도 7a 및 도 7e) 항체로 면역형광 표지한 다음 Fluorescein Avidin(b)을 사용하여 ITGA7 항체로 이중 면역 표지했다(도 7f, 녹색). 오른쪽 패널(도 7c 및 도 7g)은 개별 왼쪽(도 7a 및 도 7e) 및 중간(도 7b 및 도 7f) 패널의 병합된 이미지를 보여준다. 도 7d 및 도 7h는 DAPI로 병합된 이미지(스케일 바, 10 μm)를 보여준다.

3. 논의

a-syn 발현의 증가는 PD의 병리학에서 중요한 단계라고 이전에 보고되었으며, 본 명세서의 연구 결과는 이러한 증가의 원인 중 하나가 ITGA7 발현의 감소일 수 있음을 시사한다. 증가된 a-syn 발현에 따라 도파민성 세포 파괴가 일어나는 기전은 신경전달물질 방출을 조절하는 막 융합 기계에 미치는 영향과 관련이 있는 것으로 보고되었다. a-syn은 가용성 상태와 막 결합 상태 모두에서 시냅스 전 신경 말단에 고도로 집중되어 있다. a-syn에 의한 막 결합은 a-syn이 막을 리모델링하기 때문에 생리학적으로 중요할 수 있다. 더욱이, 막은 a-syn의 신경병리학적 효과에 중요한 것으로 밝혀졌다. 중요하게도, 여러 연구에서 세포 독성에 비정상적인 a-syn-membrane 상호 작용이 관련되어 있음을 보여주었다. a-syn의 자가 응집은 막 파괴를 촉진하는데, 이는 a-syn의 양친매성 나선 구조의 형성으로 인해 발생할 수 있다.

ITGA7은 ECM 결합 단백질을 인코딩한다. 인테그린은 ECM 접착을 매개하는 세포 표면 수용체의 주요 계열이며 프로그램된 세포 사멸을 포함한 다양한 세포 기능의 조절에 강하게 연루되어 있다. 이러한 이전 연구와 일관되게, 본 명세서의 연구 결과는 ITGA7 siRNA 투여에 의해 유도된 ITGA7 발현 감소가 SH-SY5Y 세포에서 TH 발현을 감소시켰지만 a-syn 발현을 증가시켰다는 것을 입증했다. 또한 ITGA7의 발현 감소는 bcl2의 발현을 감소시켰고 bax/bcl2 비율을 유의하게 증가시켰다. 이러한 결과는 ITGA7의 감소된 발현이 a-syn의 증가된 발현 및 도파민성 세포의 자가사멸과 관련될 수 있음을 시사한다. 또한, ITGA7에 의해 암호화된 단백질이 막에 관여하고 a-syn의 응집된 형태가 막 파괴를 촉진하기 때문에 ITGA7 발현 감소로 인한 a-syn 발현의 증가는 막관통 발병에 기여할 수 있다. 특히, ITGA7은 a-syn이 막에 작용하는 메커니즘에 관여할 수 있다. SN 영역의 면역형광 분석은 ITGA7과 a-syn이 막 근처에 국한되어 있음을 보여주었으며, MPTP 그룹은 CTL 그룹보다 더 강한 a-syn 발현과 약한 ITGA7 발현을 보였다.

세포막 a-syn 발현의 증가가 도파민성 세포의 파괴로 이어진다는 점을 고려할 때, a-syn 발현의 증가는 세포막에 존재하는 ITGA7의 발현 감소에 기인할 수 있다.

이 실험의 IHC 결과에서 CTL 그룹에서 ITGA7의 발현 패턴은 MPTP 그룹에서 발현된 a-syn의 발현 패턴과 상당히 유사하였다. SH-SY5Y 세포에서 ITGA7 siRNA를 사용하여 유도된 ITGA7 발현의 감소는 a-syn의 발현이 역으로 증가하는 것을 확인하였다. 이러한 결과를 바탕으로 ITGA7 발현의 감소를 대체하기 위해 a-syn 발현이 증가하는지에 대한 추가 연구가 필요하다고 생각한다.

4. 재료 및 방법

4.1 MPTP 유발 파킨슨병 마우스 모델

연구 프로토콜은 상지대학교의 기관 동물 관리 및 사용 위원회(IACUC)의 승인을 받았습니다(IACUC 2018-6). 4주령의 수컷 C57BL/6 마우스(20-22g; DBL, Korea)를 사용하였다. 마우스를 대조군(CTL) 그룹과 MPTP 그룹의 두 그룹으로 나누었습니다. CTL 그룹의 마우스는 4주 동안 24시간마다 1회 0.9%(100μL) 식염수를 복강 내 투여했다. MPTP군에서는 0.9%(100μL) 식염수에 MPTP-HCl(20mg/kg 유리염기)을 24시간 간격으로 4주 동안 1일 1회 복강내 주사하였다.

4.2 세포주 및 배양

인간 유래 SH-SY5Y 세포는 10% 소태아혈청(FBS, Bio Whittaker), 100U/mL의 페니실린 및 100mg/mL의 스트렙토마이신이 보충된 5% 최소 필수 배지(MEM; 남천면 Welgen)에서 가습된 CO₂ 환경에서 37?C에서 성장했다.

4.3 ITGA7 작은 간섭 RNA

ITGA7에 대한 Stealth siRNA(5`-GAC AUG CAC UAC CUC GUC U -3`) 및 음성 대조군 이중체(즉, ITGA7에 대한 스크램블된 siRNA, 5-UUC UCC GAA CGU GUC ACG UTT -3')는 바이오니아에서 구입했다. 주식회사 한국. SH-SY5Y 세포를 24시간 동안 ITGA7 siRNA로 처리하였다.

4.4 MPP+ 처리

SH-SY5Y 세포를 500μM MPP + 요오드화물(Sigma, MO, USA)로 18시간 동안 처리하였다.

4.5 웨스턴 블롯

SN 및 ST 영역 및 SH-SY5Y 세포를 웨스턴 블롯 분석을 위해 얼음 위의 방사성 면역 침전 분석 완충액(RIPA)에서 30분 동안 균질화하였다. 용해물을 12,000 rpm, 4℃, 20분간 원심분리한 후 상등액의 단백질 농도를 BCA(bicinchoninic acid) 방법으로 측정하였다.

단백질은 나트륨 도데실 설페이트-폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE)(4-15% Tris-Bis 미니 겔)으로 분리하고 폴리비닐리덴 플루오라이드 막으로 옮겼다. 막을 3% BSA로 37?C에서 1시간 30분 동안 차단한 다음 anti-ITGA7(1:1,000), anti-TH(1:2,000), anti-bcl2(1,000), anti-bax (1:1,000), β-액틴 항체(1:2,000) 또는 항-a-syn(1:500) 항체를 4?C에서 밤새 인큐베이션하였다. 이어서, TBST로 15분간 3회 세척한 후, HRP(horseradish peroxidase) 결합 항-마우스 또는 항-토끼 IgG 항체(1:5,000)를 사용하여 1시간 동안 막을 처리하였다. TBST로 세척한 후, 멤브레인은 화학발광 기질을 사용하여 시각화되었다. 멤브레인 밴드 밀도는 ImageJ(https://rsbweb.nih.gov/ij/)를 사용하여 결정되었다.

4.6 면역 조직 화학

마우스 뇌를 4% 파라포름알데히드를 함유하는 0.05 M 인산나트륨 완충액에 4% 파라포름알데히드에 고정하고 4?C에서 24시간 동안 고정하고 4?C에서 밤새 자당으로 탈수한 다음 동결절단하였다. 뇌의 관상 섹션(40μm 두께)은 cryomicrotome을 사용하여 절단되었다. 이어서, 각 슬라이스에 항-인테그린 알파 7(1:1000, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA), 항-TH 항체(1:2000, Santa Cruz Biotechnology) 및 항-a-syn 항체를 처리하였다. (1:500, Santa Cruz Biotechnology) 이후 4?C에서 밤새 인큐베이션되었다. 그런 다음 섹션을 비오틴화 항-마우스 IgG, 아비딘-비오틴-과산화효소 복합체 및 디아미노벤-지딘-과산화수소 용액으로 처리했다.

4.7 면역형광

1차 항체 및 비오틴화된 항-마우스 IgG와 함께 인큐베이션한 후, 각 섹션을 플루오레세인 아비딘 DCS(Vector Laboratories, CA, USA)로 처리하였다. 그런 다음 섹션을 avidin/biotin 차단 키트와 M.O.M 마우스 Ig 차단 시약(Vector Laboratories)으로 처리한 후 4℃에서 밤새 항a-syn 또는 항ITGA7 IgG로 염색했다. 각 섹션은 biotinylated anti-mouse IgG로 처리한 다음 rhodamine avidin D(Vector Laboratories, CA, USA)와 함께 배양했다. 사진 문서화는 Nikon X-cite 시리즈 120 Q 현미경(Nikon, Japan)을 사용하여 수행되었으며 노출 매개변수는 각 샘플 그룹에 대해 동일했다.

4.8 통계 분석

통계 분석은 SPSS 25(SPSS Inc., USA) 소프트웨어로 스튜던트 t-검정 또는 분산 분석(ANOVA)을 사용하여 수행되었다. 모든 값은 평균 ± 표준 오차로 표시된다.

5. 결론

이 명세서에서 ITGA7 발현은 MPTP에 의해 유발된 파킨슨병 마우스 모델의 SN에서 감소된 것으로 밝혀졌다. 또한, ITGA7의 감소된 발현은 a-syn의 발현 증가 및 도파민성 세포의 자가사멸과 관련될 수 있다. 본 명세서의 연구 결과는 ITGA7 발현의 감소가 PD 병리를 유도하는 a-syn 발현 증가의 원인 중 하나일 수 있음을 시사한다.

이러한 실험예를 통해, 퇴행성 뇌질환에서 도파민세포와 알파-시누클레인을 조절하는 ITGA7 유전자 발현에 의한 물질을 유효성분으로 포함하는 파킨슨병 약제학적 조성물 및 그 치료제를 파킨슨병에 사용하여 파킨슨병에 우수한 치료 효과를 제공하는 것을 알 수 있다.

이하, 전술한 실험예를 참조하여, 다른 실시예들에 따른 파킨슨병 치료제의 후보물질로 스크리닝하는 방법 및 파킨슨병을 진단하는 진단 방법, 그 진단 키트에 대해 상세히 설명한다.

실시예2: 스크리닝하는 방법

다른 실시예는, 퇴행성 뇌질환에서 도파민세포와 알파-시누클레인을 조절하는 ITGA7 유전자의 발현 정도에 영향을 미치는 물질들을 파킨슨병 치료제의 후보물질로 스크리닝하는 방법을 제공한다.

전술한 실험예에서, ITGA7 발현은 MPTP- 유도 PD 마우스 모델에서 ITGA7 수준이 감소되고 PD의 병리학적 특징이 감소된 ITGA7 수준에 의해 유도되었다는 점에서 PD와 관련되는 것을 알 수 있다. 또한, siITGA7의 농도가 증가함에 따라, apoptosis 수준도 증가하였으므로, ITGA7은 뉴런의 apoptosis와 관련되고 PD에서 apoptosis 세포 사멸과 관련되는 것을 확인할 수 있었다.

다른 실시예는, 다음의 단계를 포함하는 파킨슨병 예방 또는 치료용 물질의 스크리닝 방법을 제공한다.

(a) 파킨슨병 모델로 생성된 실험 동물에 적어도 하나의 후보 물질을 투여하는 단계; 및

(b) ITGA7 유전자의 발현량을 측정하는 단계, 상기 ITGA7 유전자의 발현 수준이 조절되는 경우에는

상기 후보 물질은 파킨슨병 예방 또는 치료용 물질로 판정된다.

파킨슨병 모델은 실험예에서 설명한 파킨슨증의 MPTP 모델일 수 있으나 본 발명은 이에 제한되지 않는다. 아울러, 실험 동물은 실험예에서 설명한 마우스일 수 있으나 본 발명은 이에 제한되지 않는다.

발현량의 측정은 실험예에서 기재한 바와 같이 실시할 수 있으나, 일반적인 다른 방법들에 의해 실시할 수도 있다.

실시예3: 진단 방법

또 다른 실시예는, 퇴행성 뇌질환에서 도파민세포와 알파-시누클레인을 조절하는 ITGA7 유전자의 발현 정도로 파킨슨병을 진단하는 진단 방법을 제공한다.

또 다른 실시예에 따른 파킨슨병 진단 방법은, 대상체, 예를 들어 인간이나 동물로부터 분리한 물질, 예를 들어 혈액이나 세포 등에서 ITGA7의 발현량을 측정해서 파킨슨병을 진단할 수 있다.

구체적으로, 다른 실시예에 따른 파키슨병 진단 방법은, 대상체로부터 검체를 분리하는 단계, 검체로부터 ITGA7 유전자의 발현량을 측정하는 단계 및 ITGA7 유전자의 발현 수준이 조절되는 경우 대상체에 대해 파킨슨병으로 진단하는 단계를 포함한다.

전술한 바와 같이 검체는 대상체로부터 분리된 어떤 물질, 예를 들어 혈액이나 세포 등일 수 있다. 대상체는 인간을 포함하는 동물일 수 있다.

검체를 분리하는 단계는 일반적으로 대상체로부터 자연스럽게 분리되거나 주사기 등을 이용하여 인위적으로 검체를 분리하는 방식들을 포함할 수 있다.

검체로부터 ITGA7 유전자의 발현량을 측정하는 단계에서 ITGA7 유전자의 발현량을 측정하는 것은 실험예에서 설명한 일반적인 방식들일 수 있다.

대상체에 대해 파킨슨병으로 진단하는 단계에서, ITGA7 유전자의 발현 수준이 통계적으로 유의미하게 조절되는 경우 대상체에 대해 파킨슨병으로 진단할 수 있다.

다른 실시예는, 퇴행성 뇌질환에서 도파민세포와 알파-시누클레인을 조절하는 ITGA7 유전자의 발현 정도로 파킨슨병을 진단하는 진단 키트를 제공한다. 이 진단 키트는 전술한 진단 방법을 수행하는 키트로, 일반적인 진단 키트의 구성을 가질 수 있다.

또한 본 발명은, 특정유전자의 발 현정도에 영향을 미치는 물질들을 치료의 후보 물질로 스크리닝하는 방법 및 ITGA7 gene expressionlevel로 PD를 진단하는 방법 또는 진단 키트 등을 제공할 수 있습니다.

이상 도면을 참조하여 실시예들을 설명하였으나 본 발명은 이에 제한되지 않으며, 상기 설명은 본 발명의 기술 사상을 예시적으로 설명한 것에 불과한 것으로서, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 다양한 수정 및 변형이 가능할 것이다. 따라서, 본 발명에 개시된 실시예들은 본 발명의 기술 사상을 한정하기 위한 것이 아니라 설명하기 위한 것이고, 이러한 실시예에 의하여 본 발명의 기술 사상의 범위가 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 보호 범위는 아래의 청구범위에 의하여 해석되어야 하며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 기술 사상은 본 발명의 권리범위에 포함되는 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims (6)

1. 퇴행성 뇌질환에서 도파민 세포와 알파-시누클레인을 조절하는 ITGA7 유전자 발현에 의한 물질을 유효성분으로 포함하는 파킨슨병 약제학적 조성물.
2. 제1항에 있어서,
   상기 ITGA7 유전자 발현에 의한 물질은 세린/아르기닌이 풍부한 단백질 특이적 키나아제 3인 ITGA7인 파킨슨병용 약제학적 조성물.
3. 퇴행성 뇌질환에서 도파민 세포와 알파-시누클레인을 조절하는 ITGA7 유전자 발현에 의한 물질을 유효성분으로 포함하는 파킨슨병 약제학적 조성물; 및
   상기 약제학적 조성물을 담는 담체를 포함하는 파킨슨병 치료제.
4. 제3항에 있어서,
   상기 ITGA7 유전자 발현에 의한 물질로 단백질 혹은 mRNA를 포함하는 파킨슨병 치료제.
5. 다음의 단계를 포함하는 파킨슨병 치료제의 후보물질로 스크리닝하는 방법을 제공한다:
   (a) 파킨슨병 모델로 생성된 실험 동물에 적어도 하나의 후보 물질을 투여하는 단계; 및
   (b) ITGA7 유전자의 발현량을 측정하는 단계, 상기 ITGA7 유전자의 발현 수준이 조절되는 경우에는 상기 후보 물질은 파킨슨병 예방 또는 치료용 물질로 판정된다.
6. 대상체로부터 검체를 분리하는 단계:
   상기 검체로부터 ITGA7 유전자의 발현량을 측정하는 단계; 및
   상기 ITGA7 유전자의 발현 수준이 조절되는 경우 상기 대상체에 대해 파킨슨병으로 진단하는 단계를 포함하는 파킨슨병 진단방법.

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