JP6700312B2 - 組織再生及び衰えた組織機能の回復を刺激するための作用物質としてのジカルボン酸のビスアミド誘導体 - Google Patents

Description

本発明は、医学の分野、特に薬理学、泌尿器学、男性病学、内分泌学、呼吸器学、消化器病学に関し、組織再生並びに組織及び器官の衰えた機能の回復を刺激する作用物質に関する。

より詳細には、本発明は、組織再生並びに組織及び器官の衰えた機能の回復、より詳細には、膵臓組織、肝臓組織、肺組織、筋肉組織、精子形成組織、精巣組織、及び前立腺組織の再生及び衰えた機能の回復を刺激するための方法に関する。

本発明は、性腺機能低下症、特に低ゴナドトロピン性又は高ゴナドトロピン性性腺機能低下症、精子無力症、勃起不全、相関的な精巣機能不全、精巣機能不全、及び他の障害等の病態によって引き起こされうる低減した男性の生殖能力を正常化する(男性不妊症の処置)作用物質にも関する。

本発明は、メタボリックシンドローム、グルコース耐性異常、肝炎、特に慢性肝炎、特発性肺線維症、肺気腫、慢性閉塞性肺疾患、カヘキシー、性腺機能低下症、好ましくは低ゴナドトロピン性性腺機能低下症又は高ゴナドトロピン性性腺機能低下症、前立腺炎、良性の前立腺肥大症、相関的な精巣機能不全及び自己免疫精巣炎を含む群から選択される病態の処置及び予防のために使用することができる。

本発明は、精子運動能の回復のための作用物質にも関する。

メタボリックシンドローム、グルコース耐性異常、肝炎、肺気腫、慢性閉塞性肺疾患、前立腺炎、良性の前立腺肥大症、性腺機能低下症、精巣機能不全、精子無力症を含む多くの病態は、機能活性の低下及び罹患した器官の構造損傷を伴う。

メタボリックシンドロームは、種々の代謝障害及びホルモン障害を含む病的症状群である。「メタボリックシンドローム」の診断は、中心となる肥満並びに以下の因子:1)トリグリセリドレベルの上昇が≧150mg/dl(1.7mM/l)、2)高密度リポタンパク質(HDL)コレステロールレベルの低減が<40mg/dl(1.03mM/l)(男性)、<50mg/dl(1.29mM/l)(女性)、3)動脈性高血圧(動脈圧(AP)が≧130/85mmHg又は降圧薬によって制御された正常AP)、及び4)血漿グルコースレベルの上昇が≧100mg/dl(5.6mM/l)の少なくとも2つの存在においてなされる。今日、メタボリックシンドロームは、男性と女性にほぼ等しく共通しており、その頻度は、例えば、米国において39%に及ぶ[Flegal K.M.、Carroll M.D.、Ogden C.L.ら、Prevalence and trends in obesity among US adults、1999〜2000//The Journal of the American Medical Association. 2002. 288巻(14). 1723〜1727頁]

異なる著者のデータによると、性腺機能低下症(テストステロン欠乏症)は、肥満及びメタボリックシンドロームの他の症状(テストステロン欠乏症)を有する男性の30〜50%において発覚する。多くの研究者は、メタボリックシンドロームを有する男性における性腺機能低下症の高い罹患率だけでなく、総テストステロン血漿レベルとメタボリックシンドロームの症状の間の関係についても見出してきた。過体重と低テストステロンレベルの間の関係並びに男性のインスリン抵抗性及び血清におけるテストステロンレベルの低下と肥満の関係の両方についての報告が存在する[Svartberg J.、von Muhlen D.、Sundsfjord J.ら、Waist circumference and testosterone levels in community dwelling men. The Tromso study//European Journal of Epidemiology. 2004. 19巻(7). 657〜667頁]。男性のメタボリックシンドロームにおける血清テストステロンレベルの低減及びインスリン抵抗性は、精巣組織の機能活性不全の結果である。これに従って、独立した疾患として及びメタボリックシンドロームに伴う疾患としての両方で、性腺機能低下症の処置を意図した精巣組織の再生方法が、現在重要である。

成人の膵臓は、およそ10⁹個の細胞を含有する。通常、古くなったβ細胞は、膵臓で増殖される新しいものに絶えず置き換えられる(Minami K.、Seino S. Current status of regeneration of pancreatic β-cells. Journal of Diabetes investigation. 4巻、2号. 131〜141頁 2013年3月)。自己免疫障害又は中毒性障害等の種々の膵臓障害において、ランゲルハンス島のβ細胞は、インスリン産生の減少に現れる機能活性の低減によってまず特徴付けられ、後期には死滅する。膵臓組織の損傷の明白な症状は、90%超のβ細胞が破壊されると出現し、インスリン欠乏が永続するため、外部からのインスリン注射に完全に依存することになる。

インスリン療法では、ランゲルハンス島が通常機能する場合にもたらされる正確な血糖調節は可能とならない。損傷した膵臓を、器官全体、ランゲルハンス島、及びβ細胞の移植により処置するための試みが依然として存在する。しかし、移植は常に成功するわけではない(移植拒絶が起こることが多い)。移植が成功しても、患者は、引き続き、継続して免疫抑制薬を必要とすることになる。

別の問題は、グルコース耐性異常である。これは、内因性又は外因性インスリンに対する代謝応答が損なわれることである。この状態は、既存のグルコース濃度に対する生理値と比較して増加したインスリンの血漿中濃度をもたらす。筋肉、脂肪、及び肝臓組織におけるグルコース耐性異常は、臨床的に最も重大である。筋肉組織においてグルコースへの耐性が損なわれると、血中から筋細胞へのグルコースの取り込み及び筋肉細胞におけるその利用が減少され、脂肪組織では、インスリンの抗脂肪分解作用への抵抗性が現れ、結果として遊離脂肪酸(FFA)とグリセロールが蓄積される。FFAは肝臓に入り、そこで、超低密度アテローム形成リポタンパク質(VLDAL)の形成の主な供給源となる。肝臓組織におけるグルコース耐性異常は、グリコーゲン合成の減少、並びにグリコーゲンのグルコースへの分解(グリコーゲン分解)の活性化、並びにアミノ酸、乳酸、ピルビン酸、及びグリセロールからのグルコースのde novo合成(糖新生)によって特徴付けられる。したがって、組織におけるグルコース耐性異常の処置は、組織の機能活性の修復を可能にする。

肝臓は、極めて重要な身体の腺である。肝臓は、消化プロセス、毒性物質の不活性化、血液凝固成分の合成、タンパク質、アミノ酸、脂質、炭水化物、核酸、ビタミン、微量元素等の代謝をサポートする約500の独特の機能を実施する。肝臓組織は、化学的因子、微生物因子、外傷性因子、薬学的因子及び他の有害因子によって損傷を受けることが多い。このことによって、機能性肝細胞数が減少される。種々の病因の慢性肝炎は、何年間も続く可能性があり、疾患の後期に診断されることが多く、その場合には、肝硬変や慢性肝不全を発症する傾向が劇的に増加する[Jung Y1、Witek RP、Syn WK. Signals from dying hepatocytes trigger growth of liver progenitors//Gut. - 2010. - 5巻. 655〜65頁]。

公知の肝保護剤は、Essentiale、リポ酸、Sirepar、及びα-トコフェロールである。しかしながら、これらの薬物は、そのいずれもが、肝炎の発病の別々の段階にのみ作用するため、肝細胞の膜、ミトコンドリア及び他の構造の損なわれた機能を完全に保護するか又は修復させることができない。これに関連して、複合療法には、ヘマトプロテクターの使用が含まれる。しかしながら、肝炎の処置に対するこのようなアプローチは、多剤併用による薬物の相互作用及び疾患プロセス自体の合併症のため、危険である。更に、この群のほとんどすべての薬物は、それらの使用を限定する副作用を有する。上記観点から、肝再生を有効に刺激することができる方法の開発は、まさに現在進行中である。

男性不妊の最も頻度の高い臨床病理の1つは、副生殖腺の炎症性疾患である。

副生殖腺の炎症性疾患として、炎症を伴う前立腺の疾患、例えば急性細菌性前立腺炎、慢性細菌性前立腺炎、BPH(良性前立腺肥大症)、及び精嚢の炎症、例えば急性又は慢性の精嚢炎が挙げられる。前立腺の疾患として、慢性非細菌性前立腺炎、慢性非炎症性前立腺炎及びカテゴリーIIIBの前立腺炎も挙げられる[Ludwig M、Vidal A、Diemer Th、Pabst W、Failing K、Weidner W. Chronic prostatitis/chronic pelvic pain syndrome: seminal markers of inflammation.//World J Urol. 2003. 21巻、2号 82〜85頁]。

上記病理は、男性の40〜70%で生じる。パソスペルミア(pathospermia)を有する男性の40%は、慢性前立腺炎を有し、症例の80%が非細菌性である(Benway B.M.、Moon T.D.//Urol Clin North Am 2008年2月;35(1):23〜32頁)。

前立腺の慢性炎症は、良性前立腺肥大症(BPH)を伴うことが非常に多いことに留意すべきである。BPHに関連する高プロラクチン血は、勃起不全、精子減少症を引き起こす。これは、当然ながら、男性の生殖能を低減させる[Johri A.M.、Heaton J. P.、Morales A. Severe erectile dysfunction is a marker for hyperprolactinemia//Int J Import Res. 2001. 13巻 3号 176〜82頁]。

前立腺疾患の多くの態様は、前立腺が、とりわけ、精子運動能をサポートする因子を放出するため、射出精液の質に影響を及ぼす。この点において、相関的な精巣機能不全(続発性不妊)が、前立腺疾患の発症中に明らかとなる。したがって、前立腺疾患の処置は、男性の生殖能力に有利に影響を及ぼす。

現在、慢性非細菌性前立腺炎及びBPHの経過に関連する因子へのプラスの効果を有する薬物として、植物抽出物-Prostamol Unoが挙げられる[Bayane C.W.、Ross M.、Donnelly F.、Habib F.K.//J. Urol. 2000. 164巻、3号、パート1. 876〜881頁]。しかしながら、これらは常に非常に有効であるわけではない。

アンドロゲン形成阻害(性腺機能低下症)もまた、男性の生殖能力の低減をもたらす[Dohie G.R.、Diemer A.、Giwerman A.、Jungwith A.、Kora Z.、Kraus C. Man Infertility、European Association of Urology 2014. 7]。

男性の性腺機能低下症は、現在、4〜5百万人に見られる。低ゴナドトロピン性性腺機能低下症(又は続発性性腺機能低下症)は、ゴナドトロピン欠乏によって引き起こされる。原発性性腺機能低下症は、精巣(睾丸)機能障害によって引き起こされる。その非遺伝性形態(後天的低ゴナドトロピン性性腺機能低下症)は、外部からの作用、薬物(アナボリックステロイド、メトクロプラミド、フェノチアジド、麻酔薬等)の投与、及び放射線療法の結果である場合がある[Filicori M. Endocrine basis of reproductive function. - Bologna: Monduzzi Editore、2000. - R 605; Meczekalski B.、Tonetti A.、Monteleone R.ら、Hypothalamic amenorrhea with normal body weight: ACTH、allopregnanolone and cortisol responses to corticotrophin - releasing hormone test//Eur. J. Endocrinol. - 2000. - 142巻 - R. 280〜285頁]。

続発性性腺機能低下症を有する患者は、テストステロンを処方される[Dohie G.R.、Diemer A.、Giwerman A.、Jungwith A.、Kora Z.、Kraus C. Man Infertility、European Association of Urology 2014、35頁]。しかしながら、テストステロンは、多くの禁忌及び副作用を有する。

公知の薬物であるTribestan(製造業者Sopharma(Bulgaria))は、男性におけるテストステロンの産生を刺激し、精子運動能を増大させるが、この薬物の有効性は常に高いわけではない。

生殖腺病理(高ゴナドトロピン性性腺機能低下症又は精巣機能不全)によって引き起こされる性腺機能低下症は、男性の生殖能力の低減の最も一般的形態を指す[Dohie G.R.、Diemer A.、Giwerman A.、Jungwith A.、Kora Z.、Kraus C. Man Infertility、European Association of Urology 2014、8頁]。

細胞分裂阻害剤、放射線、温度上昇を含む、薬物等の外因性因子の作用は、その出現の原因の1つである。その完全な停止にまで至る、長期にわたる精子形成の生産性の低減は、A型精原細胞が損傷を受けた結果である。損傷後の精子形成の修復は、これらの細胞に起因する場合のみ可能である。これらは、不可逆的に、精子形成の前駆体として特定され、幹細胞のように、コロニー形成能を有するため、精子細胞の特異性を失わない。これらの細胞は、精子形成組織の再生能の強い予備能を構成する。

精子形成という増殖能は、精子形成細胞の移植によって修復することができることが知られている。高ゴナドトロピン性性腺機能低下症の薬物療法では、テストステロンを用いることが推奨される。テストステロンは、精子の減数分裂、すなわち有糸分裂後の分裂の最終段階を刺激し、それによって、精母細胞数を増加させ、その最終段階を刺激することによって精子形成の生産性を増大させる。この作用物質の不利な点は、有糸分裂により分裂することが知られている精原細胞を刺激するには非効率的であることである。

医薬品市場では、精子形成組織の再生能の強い予備能の枯渇、及び関与するコロニー形成精子形成細胞数の回復によって引き起こされる男性不妊の処置のための薬物は存在しない。本発明による、幹細胞の損傷により引き起こされる睾丸機能不全における男性の生殖能力の回復のための作用物質は、この病理の処置のための既存の治療剤の中に類似体を有さない。

多くの場合、男性の生殖能力の低減は、精子の質の悪化によって引き起こされる。最も一般的な射出精液病理は、精子無力症である(Kao S. H.ら、Increase of oxidative stress in human sperm with lower motility. Fertil. and Steril. 2008;89:5:1183〜1190頁)。精子形成の精子無力症型機能不全は、個別の疾病分類学的形態と考えられる。これは、加齢変化、喫煙、炎症、内分泌障害、並びに毒性物質及び高温への曝露の結果である。精子無力症の処置は、その出現の原因によって変わる。しかしながら、これらのホルモン薬は、重大な副作用を引き起こし、禁忌を有する。

精子形成を刺激し、精子運動能を増大させるSpeman薬品を用いて精子無力症を処置することが推奨される。この薬物は高価であり、世界中の様々な国で生育する薬用ハーブの複雑な組成からなり、原料が限定されている。欠点として、効果が高くないことが留意されるべきである。

肺気腫、慢性閉塞性肺疾患(COPD)及び特発性肺線維症(IPF)は、年配の患者において(圧倒的に男性において)慢性及び進行性の経過によって特徴付けられる重篤な多因子性肺障害である。COPDの臨床パターンと発病は、IPFと異なる。COPDのやや可逆的であるが進行性の気道閉塞の原因は、気道の炎症並びに肺胞及び細気管支の気腫の拡張である[Hogg JC、Timens W:The pathology of chronic obstructive pulmonary disease. Annu Rev Pathol 2009、4:435〜459頁]が、IPFの肺機能の制限は、間質性線維症の発症及び「蜂巣」肺の形成によって引き起こされる[American Thoracic Society:Idiopathic pulmonary fibrosis:diagnosis and treatment. International consensus statement. American Thoracic Society (ATS)、及びthe European Respiratory Society (ERS). Am J Respir Crit Care Med 2000、161:646〜664頁]。これら2種の肺疾患の罹患率は、完全に異なる。しかしながら、毎年、IPFの発生率及び罹患率は着実に増加しており、これは、とりわけ診断ツールの改良に関係している。次に、COPDの罹患率は、常に非常に高いわけではない。この疾患は、大部分は、有害な外部物質の吸入(主に喫煙による)に関連する。

十分に多大な実験及び臨床研究にもかかわらず、肺気腫及びCOPDの発病についての理解は限定されており:この疾患の処置に対する有効な手法は認識されていない。IPFに対する既存の薬物のセットは、グルココルチコイド、シクロフォスファミド、免疫抑制剤、及び抗凝固剤に限定され、合併症を処置することを目的とし、並びに本質的に維持療法である。現在、Pirfenidone等の治療剤のみが、IPFの処置に対して承認されている。一方、臨床治験では、Pirfenidoneは、この疾患の発症段階において、期待される高い抗線維化活性を示さなかった。更に、薬物は多くの副作用を有し、高用量を必要とする。

IPF、COPD、悪性新生物及び多くの他の慢性疾患の発症は、体重の激減を伴う。最も危険なのは、極度の憔悴-カヘキシーである。臨床的に、カヘキシーは、進行する疾患プロセス、通常は不均衡な骨格筋萎縮に伴う過剰な体重減少によって現れる。

カヘキシーをもたらす疾患は、精巣組織の機能活性の低下、及び結果として、テストステロンのレベルの低下によって特徴付けられる。テストステロンは、筋芽細胞を刺激し、サテライト細胞数を増加させ、それによってタンパク質合成及び損傷した筋肉の回復に寄与する[Bhasin S.、Taylor W.E.、Singh R.ら、The mechanisms of androgen effects on body composition:mesenchymal pluripotent cell as the target of androgen action. J Gerontol Med Sci 2003;58A:M1103〜1110頁]。テストステロンはまた、炎症性サイトカインIL-1、IL-6、TNFαの合成を抑制し、抗炎症性サイトカインIL-10の産生を刺激する。種々の疾患における極度の憔悴は、炎症を伴う。炎症性メディエーターは、カヘキシーにおいて筋肉タンパク質の合成を妨げ、脂肪酸の脂肪分解及びベータ酸化に関与する[Ryden M.、Arvidsson E.、Blomqvist L.、Perbeck L.、Dicker A.、Arner P. Targets for TNF-alpha-induced lipolysis in human adipocytes. Biochem Biophys Res Commun 2004;318:168〜175頁]。

あいにく、カヘキシーの処置に対する認識された手法は依然として1つも存在しない。この状態を正すために数々の試みがなされてきた。重篤な体重減少を有する患者の療法には、テストステロン、成長ホルモン(ソマトロピン)、食欲刺激薬(セロトニン拮抗薬、黄体ホルモン剤、ドロナビノール)、及び糖新生阻害剤(硫酸ヒドラジン)の薬品が含まれるが、これらの有効性は十分ではない。

RU301116822

Flegal K.M.、Carroll M.D.、Ogden C.L.ら、Prevalence and trends in obesity among US adults、1999〜2000//The Journal of the American Medical Association. 2002. 288巻(14). 1723〜1727頁 Svartberg J.、von Muhlen D.、Sundsfjord J.ら、Waist circumference and testosterone levels in community dwelling men. The Tromso study//European Journal of Epidemiology. 2004. 19巻(7). 657〜667頁 Minami K.、Seino S. Current status of regeneration of pancreatic β-cells. Journal of Diabetes investigation. 4巻、2号. 131〜141頁 2013年3月 Jung Y1、Witek RP、Syn WK. Signals from dying hepatocytes trigger growth of liver progenitors//Gut. - 2010. - 5巻. 655〜65頁 Ludwig M、Vidal A、Diemer Th、Pabst W、Failing K、Weidner W. Chronic prostatitis/chronic pelvic pain syndrome: seminal markers of inflammation.//World J Urol. 2003. 21巻、2号 82〜85頁 Benway B.M.、Moon T.D.//Urol Clin North Am 2008年2月;35(1):23〜32頁 Johri A.M.、Heaton J. P.、Morales A. Severe erectile dysfunction is a marker for hyperprolactinemia//Int J Import Res. 2001. 13巻 3号 176〜82頁 Bayane C.W.、Ross M.、Donnelly F.、Habib F.K.//J. Urol. 2000. 164巻、3号、パート1. 876〜881頁 Dohie G.R.、Diemer A.、Giwerman A.、Jungwith A.、Kora Z.、Kraus C. Man Infertility、European Association of Urology 2014. 7 Filicori M. Endocrine basis of reproductive function. - Bologna: Monduzzi Editore、2000. - R 605; Meczekalski B.、Tonetti A.、Monteleone R.ら、Hypothalamic amenorrhea with normal body weight: ACTH、allopregnanolone and cortisol responses to corticotrophin - releasing hormone test//Eur. J. Endocrinol. - 2000. - 142巻 - R. 280〜285頁 Dohie G.R.、Diemer A.、Giwerman A.、Jungwith A.、Kora Z.、Kraus C. Man Infertility、European Association of Urology 2014 35頁 Dohie G.R.、Diemer A.、Giwerman A.、Jungwith A.、Kora Z.、Kraus C. Man Infertility、European Association of Urology 2014、8頁 Kao S. H.ら、Increase of oxidative stress in human sperm with lower motility. Fertil. and Steril. 2008;89:5:1183〜1190頁 Hogg JC、Timens W:The pathology of chronic obstructive pulmonary disease. Annu Rev Pathol 2009、4:435〜459頁 American Thoracic Society:Idiopathic pulmonary fibrosis:diagnosis and treatment. International consensus statement. American Thoracic Society (ATS)、及びthe European Respiratory Society (ERS). Am J Respir Crit Care Med 2000、161:646〜664頁 Bhasin S.、Taylor W.E.、Singh R.ら、The mechanisms of androgen effects on body composition:mesenchymal pluripotent cell as the target of androgen action. J Gerontol Med Sci 2003;58A:M1103〜1110頁 Ryden M.、Arvidsson E.、Blomqvist L.、Perbeck L.、Dicker A.、Arner P. Targets for TNF-alpha-induced lipolysis in human adipocytes. Biochem Biophys Res Commun 2004;318:168〜175頁 Xi Chu、Ekaterina S. Zhavbert、Julia L. Dugina、Irina A. Kheyfets、Svetlana A. Sergeeva、Oleg I. Epstein、Anders Agmo Sindenafil and a compound stimulating endothelial NO synthase modity sexual incentive motivation and copulatory behavior in male wistar and fisher 344//J Sex Med. - 2008. - 5. - P.2085 - 2009 Van Coppenolle Fabien、Christian Slomianny、Francoise Carpentier Effects of hyperprolactinemia on rat prostate growth:evidence of androgeno - dependence.//Physiol. Endocrinol. Metab. - 2001. - 120〜129頁 A.J. Richards、G.C.Enders、J.L Resnick//Biol. Reprod. - 1999. 61巻 - 1146〜1151頁 Szkudelski T. The Mechanism of Alloxan and Streptozotocin Action in B Cells of the Rat Pancreas//Physiological Research. - 2001. - 50巻 - 536〜546頁 Current Protocols in Pharmacology (2005) Animal Models of Disease//Contributed by Petter Hedlund、Kenshi Matsumoto、及びKarl-Erik Andersson Luthje L.、Raupach T.、Michels H.ら//Respiratory Research 2009、10:7 ArrateMunoz-Barrutia、Mario Ceresa、Xabier Artaechevarria、Luis M.Montuenga、及びCarlos Ortiz-de-Solorzano. Quantification of Lung Damage in an Elastase-Induced Mouse Model of Emphysema//International Journal of Biomedical Imaging. 2012巻、論文ID734734、11頁; Susumu Sato、Erzsebet Bartolak-Suki、Harikrishnan Parameswaran、Hiroshi Hamakawa1及びBela Suki. Scale dependence of structure-function relationship in the emphysematous mouse lung//Front. Physiol. 6:146. doi: 10.3389/fphys.2015.00146 Yu-Chou T.、Samuel K.K.、I-Lu L.ら、Preclinical Investigation of the Novel Histone Deacetylase Inhibitor AR-42 in the Treatment of Cancer-Induced Cachexia//JNCI J Natl Cancer Inst (2015) 107(12)

したがって、本発明の目的は、組織再生及び衰えた機能の回復のための作用物質を提供することである。このような作用物質は、特に、グルコース耐性障害、肝炎、肺気腫、慢性閉塞性肺疾患、特発性肺線維症、カヘキシーの処置を促進させ、男性の性機能の回復を促進させ、上記公知の作用物質の欠点を克服する。

より詳細には、本発明の第1の目的は、組織、特に膵臓組織、肝組織、肺組織、精巣組織、前立腺組織、及び筋肉組織の再生を促進する作用物質を提供することである。特に、本発明による作用物質は、精巣組織及び前立腺組織の再生を促進するものである。

本発明の別の目的は、特にメタボリックシンドローム又はグルコース耐性異常等の病態によって上昇した血中グルコースレベルを低下させるための作用物質を提供することである。

本発明のもう1つの目的は、特にウイルス性慢性肝炎等の病態によって低減された肝機能の回復のための作用物質を提供することである。

特に性腺機能低下症、相関的な精巣機能不全及び精巣機能不全等の病理によって引き起こされる男性の性的活動の低減を正常化するための作用物質を提供することは、本発明の別の目的である。

本発明の更なる目的は、特に、メタボリックシンドローム、前立腺炎、性腺機能低下症、精子無力症、精巣機能不全、及び他の疾患等の病理によって低減された精子形成(精子運動能を含む)の回復のための作用物質を提供することである。

本発明のもう1つの目的は、特に気腫、突発性肺線維症及び慢性閉塞性肺疾患等の病理によって引き起こされる肺組織の妨害された組織構築学及び機能の回復のための作用物質を提供することである。

本発明の別の目的は、肝臓の構造及び機能の回復のための作用物質を提供することである。

メタボリックシンドローム及びグルコース耐性異常等の疾患によって影響を受けた膵臓の構造及び機能の回復のための作用物質を提供することは、本発明の次の目的である。

これらの目的は、上記病態の処置及び/又は予防のための作用物質としてのTreamid系薬物の使用より達成される。前記作用物質は、式(I):

のジカルボン酸のビスアミド誘導体、又はその薬学的に許容される塩である。

この化合物は、RU301116822(2014年10月20日に公開された)に記載されており、疾患の処置のために含まれ、金属キレート活性を伴う金属キレーターとして使用するために適する新規化合物に関する。

本発明者は、最初に、Treamidは組織を効率的に再生させることができ、組織の衰えた機能を修復することができ、これは、特に、男性の生殖系組織に関するということを発見した。Treamidは、非細菌性前立腺炎及びBPHにおける前立腺の形態学的変化の重症度を低減させ、精子運動能を修復し、性動機付け及び交尾の活性を増大させ、Treamidは、組み合わせて、男性の性機能の回復をもたらす。

本発明は、有効量の式(I):

の化合物、その薬学的に許容される塩及び薬学的に許容される担体を含む、組織再生のための医薬組成物に関する。本発明は、式(I)の化合物又はその薬学的に許容される塩である、組織再生のための医薬にも関する。

本発明の一実施形態では、組織は、膵臓組織、肝臓組織、肺組織、筋肉組織、精子形成組織、精巣組織、及び前立腺組織を含む群から選択される。

本発明は、有効量の式(I)の化合物又はその薬学的に許容される塩を、それを必要とする患者に投与する工程を含む、組織を再生するための方法にも関する。更に、本発明は、組織再生のための、式(I)の化合物及びその薬学的に許容される塩の使用に関する。本発明の一実施形態では、組織は、膵臓組織、肝臓組織、肺組織、筋肉組織、精子形成組織、精巣組織、及び前立腺組織を含む群から選択される。本発明は、組織の構造的損傷に関連する病態の処置のための、式(I)の化合物及びその薬学的に許容される塩の使用にも関する。本発明の一実施形態では、病態は、メタボリックシンドローム、グルコース耐性異常、肝炎、特に慢性肝炎及び中毒性肝炎、特発性肺線維症(IPF)、肺気腫、慢性閉塞性肺疾患(COPD)、並びに、特にグルコース耐性異常、特発性肺線維症、慢性閉塞性肺疾患、がん及び他の疾患により引き起こされるカヘキシーを含む群から選択される。本発明の別の実施形態では、疾患は、性腺機能低下症及び関連する勃起不全及び/又は性欲減退、前立腺炎及び関連する勃起不全及び/又は性欲減退、良性前立腺肥大症、相関的な精巣機能不全、又は自己免疫精巣炎であり、性腺機能低下症は、好ましくは低ゴナドトロピン性性腺機能低下症又は高ゴナドトロピン性性腺機能低下症である。前立腺炎は、非細菌性前立腺炎、自己免疫性前立腺炎、又はカテゴリーIIIBの前立腺炎であってよい。

更に、本発明は、有効量の式(I)の化合物又はその薬学的に許容される塩及び薬学的に許容される担体を含む、低減した男性の生殖能力を正常化するための医薬組成物に関する。

本発明は、式(I)の化合物又はその薬学的に許容される塩である、低減した男性の生殖能力の正常化のための医薬にも関する。

本発明は、有効量の式(I)の化合物又はその薬学的に許容される塩を、それを必要とする患者に投与する工程を含む、低減した男性の生殖能力を正常化するための方法にも関する。更に、本発明は、低減した男性の生殖能力を正常化するための、式(I)の化合物又はその薬学的に許容される塩の使用に関する。好ましい実施形態では、低減した男性の生殖能力は、性腺機能低下症、好ましくは低ゴナドトロピン性性腺機能低下症又は高ゴナドトロピン性性腺機能低下症、精子無力症、勃起不全、精巣機能不全、及び他の疾患を含む病態によって引き起こされる。低減した男性の生殖能力は、特に、上記疾患によって惹起されうる抑制された交尾活動及び性欲によっても引き起こされる。

更に、本発明は、有効量の式(I)の化合物又はその薬学的に許容される塩及び薬学的に許容される担体を含む、精子運動能の回復のための医薬組成物に関する。本発明は、式(I)の化合物又はその薬学的に許容される塩である、精子運動能の回復のための医薬にも関する。本発明は、更に、有効量の式(I)の化合物又はその薬学的に許容される塩を、それを必要とする患者に投与する工程を含む、精子運動能の回復のための方法に関する。本発明は、精子運動能の回復のための式(I)の化合物又はその薬学的に許容される塩の使用であって、前記低減が、性腺機能低下症、精子無力症、相関的な精巣機能不全、及び精巣機能不全によって引き起こされる場合がある使用に関する。運動能の低減は、種々の原因論の交尾活動及び性欲の抑制によって引き起こされる場合もある。

本発明は、有効量の式(I)の化合物を含む、病態の処置及び/又は予防において血中グルコースレベルを低減させるための医薬組成物にも関する。本発明は、式(I)の化合物である、血中グルコースレベルを低減させるための医薬にも関する。更に、本発明は、治療有効量の式(I)の化合物又はその薬学的に許容される塩を、それを必要とする対象に投与する工程を含む、病態の処置及び/又は予防において血中グルコースレベルを低減させるための方法に関する。病態は、メタボリックシンドローム及びグルコース耐性異常を含む群から選択されてよい。本発明は、血中グルコースレベルを低減させるための式(I)の化合物又はその薬学的に許容される塩の使用にも関する。

更に、本発明は、有効量の式(I)の化合物又はその薬学的に許容される塩、及び薬学的に許容される担体を含む、病態の処置/又は予防における肝構造及び機能の回復のための医薬組成物に関する。

本発明は、式(I)の化合物である、肝構造及び機能の回復のための医薬にも関する。病態は、肝炎、特に慢性肝炎及び中毒性肝炎を含む群から選択されてよい。本発明は、肝構造及び機能の回復のための式(I)の化合物又はその薬学的に許容される塩の使用にも関する。

更に、本発明は、有効量の式(I)の化合物又はその薬学的に許容される塩及び薬学的に許容される担体を含む、病態の処置及び/又は予防における肺構造及び機能の回復のための医薬組成物に関する。病態は、慢性閉塞性肺疾患(COPD)、肺気腫、及び突発性肺線維症を含む群から選択される。本発明は、式(I)の化合物である、肺構造及び機能の回復のための医薬にも関する。更に、本発明は、肺構造及び機能の回復のための式(I)の化合物又はその薬学的に許容される塩の使用に関する。

更に、本発明は、有効量の式(I)の化合物又はその薬学的に許容される塩及び薬学的に許容される担体を含む、病態の処置及び/又は予防における膵構造及び機能の回復のための医薬組成物に関する。病態は、メタボリックシンドローム及びグルコース耐性異常を含む群から選択されてよい。

本発明は、式(I)の化合物である、膵構造及び機能の回復のための医薬にも関する。更に、本発明は、膵構造及び機能の回復のための式(I)の化合物又はその薬学的に許容される塩の使用に関する。

未処置の代謝障害の70日目(病理対照)及び10mg/kgの用量のTreamidで処置した代謝障害の70日目の、インタクト対照の雄のC57Bl/6マウスにおける膵臓の形態学的パターンの図である。ヘマトキシリンエオジンを用いた染色。 A:10mg/kgの用量のTreamid(×100);B:インタクト対照(×100);C:病理対照(×100);D:10mg/kgの用量のTreamid(×400);E:インタクト対照(×100);F:インタクト対照(×400) 未処置の代謝障害の70日目(病理対照)及び10mg/kgの用量のTreamidで処置した代謝障害の70日目の、インタクト対照の雄のC57Bl/6マウスにおける膵臓の形態学的パターンの図である。Van Giesonによるpicrofuxinを用いた染色。 A:10mg/kgの用量のTreamid(×100);B:インタクト対照(×100);C:病理対照(×100);D:10mg/kgの用量のTreamid(×400);E:インタクト対照(×400);F:病理対照(×400) インタクト対照群、慢性中毒性肝炎の病理対照群、及び10mg/kgの用量のTreamidで処置した群の雄のC57Bl/6マウスにおける肝臓の形態学的パターンの図であり、倍率は100×であり、調製物は、研究の28日目に調製した。 A、B、及びCは、ヘマトキシリンエオジンを用いた染色であり、D、E、及びFは、Van Giesonによるpicrofuxinを用いた染色である。A及びDはインタクト対照であり、B及びEは病理対照であり、C及びFは10mg/kgの用量のTreamidで処置した肝炎を有する動物である。 インタクト対照群、14日目及び30日目の気腫を有するマウスの病理対照群、並びに30日目に10mg/kgの用量のTreamidで処置した動物群の雄のC57Bl/6マウスにおける肺の形態学的パターンの図である。倍率は、100×である。ヘマトキシリンエオジンを用いた染色である。 インタクト対照:A-肺尖、B-中肺野、及びC-下肺野。病理対照(14日目):D-肺尖、E-中肺野、及びF-下肺野。病理対照(30日目):H-肺尖、K-中肺野、及びL-下肺野。Treamidで処置した動物群:M-肺尖、N-中肺野、及びO-下肺野。 インタクト対照(A)、病理対照(B)、及び10mg/kgの用量のTreamidで処置した肺線維症を有するマウスの群(C)の雄のC57Bl/6マウスにおける肺の形態学的パターンの図である。Van Giesonによるpicrofuxinを用いた染色であり(100×の倍率)、調製物は、実験の21日目に調製した。

本発明は、組織再生並びに組織及び器官の衰えた機能の回復の刺激のための作用物質、より詳細には、膵臓組織、肝臓組織、肺組織、筋肉組織、精子形成組織、精巣組織、及び前立腺組織の再生及び衰えた機能回復に関する。

本発明の対象は、組織、特に男性性腺の活動に関与する組織の再生を促進する作用物質である。この作用物質は、Treamidとして知られる式(I):

のジカルボン酸のビスアミド誘導体又はその薬学的に許容される塩である。

本発明による式(I)の化合物の薬学的に許容される塩は、有機酸付加塩(例えば、ギ酸塩、酢酸塩、マレイン酸塩、酒石酸塩、メタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、トルエンスルホン酸塩等)、無機酸付加塩(例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、リン酸塩等)、アミノ酸との塩(例えば、アルパラギン酸、グルタミン酸の塩等)、好ましくは塩酸塩及び酢酸塩を含む。

本発明者は、最初に、Treamidが、効率的に、組織を再生させ、組織、特に男性性腺の活動に関与する組織の衰えた機能を修復する能力を有することを発見した。

男性性腺の活動に関与する組織は、種々の上皮組織、特に曲精細管(精巣組織)の上皮、前立腺構造単位(前立腺組織)の(腺房の)上皮、及び種々の結合組織を含む。

本発明者は、Treamidが、特に、性腺機能低下症、相関的な精巣機能不全、及び精巣機能不全等の病理によって引き起こされる低減した男性の性的活動を効果的に正常化させることも発見した。

更に、本発明者は、Treamidが、特に、性腺機能低下症、精子無力症、相関的な精巣機能不全、及び精巣機能不全等の病理によって引き起こされる精子運動能を効果的に回復させることを見出した。

式(I)の化合物は、所望の治療効果をもたらす有効量で投与される。

式(I)の化合物は、非毒性の薬学的に許容される担体を含有する単位剤形で、経口的に、局所的に、非経口的に、経鼻的に、吸入により、直腸性に投与することができる。用語「非経口投与」は、本明細書で使用する場合、皮下、静脈内、筋肉内又は胸腔内注射又は注入を意味する。

本発明による式(I)の化合物は、ヒト体重1kg当たり0.1〜100mgの1日用量で、好ましくは、1日に1回又は複数回で0.01〜25mg/kgの用量で患者に投与されてよい。

特定の患者に対する特定の用量は、使用される化合物の活性、患者の年齢、体重、性別、全身の健康状態、及び食餌レジメン、投薬の時間及び経路、身体からのその排出速度、特に使用された薬物の組合せ、並びに処置される個人の疾患の重症度を含む多くの因子によって変わることに留意すべきである。

本発明による医薬組成物は、所望の結果を実現するために有効な量で式(I)の化合物を含み、筋肉内、静脈内、経口、舌下投与、吸入による投与、経鼻及び直腸内投与に適する担体又は賦形剤を有する混合物中の活性剤として本発明による化合物を含む単位剤形(例えば、固体、半固体、又は液体形態)で投与されてよい。活性剤は、液剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、コーティングされた丸剤、坐剤、乳剤、懸濁剤、軟膏剤、ゲル剤、パッチ剤、及び任意の他の剤形を製造するために適する通常使用される非毒性の薬学的に許容される担体と一緒に、組成物に含まれてよい。

種々の化合物は、賦形剤、例えばグルコース、ラクトース、若しくはスクロース等の糖類、マンニトール若しくはソルビトール、セルロース誘導体、及び/又はリン酸カルシウム、例えばリン酸三カルシウム若しくはヒドロリン酸カルシウムとして使用されてもよい。結合剤として適する化合物として、デンプン糊(例えば、コーン、コムギ、コメ、又はジャガイモのデンプン)、ゼラチン、トラガカント、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、及び/又はポリピニルピロリドンが挙げられる。必要であれば、上述のデンプン及びカルボキシメチルデンプン、架橋ポリビニルピロリドン、寒天、又はアルギン酸若しくはその塩、例えばアルギン酸ナトリウム等の崩壊剤を使用してもよい。任意選択で使用される添加剤として、シリカ、タルク、ステアリン酸及びその塩、例えばステアリン酸マグネシウム若しくはステアリン酸カルシウム、並びに/又はプロピレングリコール等の流動性制御剤及び潤沢剤が挙げられる。コーティングされた丸剤の中心は、胃酸の作用に対して安定である層で通常コーティングされる。この目的のために、アラビアガム、タルク、ポリビニルピロリドン、ポリエチレングリコール及び/又は二酸化チタン、並びに適切な有機溶媒又はそれらの混合物を任意選択で含有することができる糖類の濃縮溶液を使用することが可能である。

安定剤、増粘剤、着色剤、及び香料も、添加剤として使用してよい。

軟膏基剤として、炭化水素軟膏基剤、例えば白色ワセリン及び黄色ワセリン(それぞれ、Vaselinum album及びVaselinum flavum)、ワセリン油(Oleum Vaselini)、並びに白色及び液体軟膏(Unguentum album及びUnguentum flavum)を使用することが可能であり、固形パラフィン及びワックスは、粘度を増加させる添加剤;吸水軟膏基剤、例えば親水ワセリン(Vaselinum hydrophylicum)、ラノリン(Lanolinum)、及びコールドクリーム(Unguentum leniens);撥水性軟膏基剤、例えば親水軟膏(Unguentum hydrophylum);及び水溶性軟膏基剤、例えばポリエチレングリコール軟膏(Unguentum Glycolis Polyaethyleni);ベントナイト基剤;並びにその他として有用である。

メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム塩、オキシプロピルセルロース、ポリエチレングリコール又はポリエチレンオキシド、及びカルボポールをゲル用の基剤として使用してもよい。

坐剤用の基剤は、水不溶性基剤、例えばカカオバター;水溶性又は水混和性基剤、例えばゼラチン-グリセロール又はポリエチレンオキシド基剤;及び石鹸とグリセロールを組み合わせた基剤であってよい。

単位剤形の調製において、担体と組み合わせて使用される活性剤の量は、処置されるレシピエント、及び治療剤の特定の投与経路に応じて変わる場合がある。

例えば、本発明による化合物を注射用溶液の形態で使用する場合、この溶液中の活性剤の量は、最大5wt%である。使用される希釈剤は、0.9%塩化ナトリウム溶液、蒸留水、注射用ノボカイン溶液、リンゲル液、グルコース溶液、及び特定の可溶化アジュバントであってよい。

本発明による化合物が、錠剤又は坐剤の形態で投与される場合、それらの量は、単位剤形当たり最大200mgである。

本発明による剤形は、ブレンド、造粒、コーティングされた丸剤の形成、溶解、及び凍結乾燥等の標準の方法によって製造される。

更に、Treamidの有効性が、本発明の実施形態を例証する本明細書の実験例において実証されるが、これは本発明の範囲を限定するものではない。

実験的研究において得られたすべてのデータについて、ノンパラメトリックMann-Whitney U検定を使用して統計処理した。研究において、有意水準0.05を統計的に有意とみなした。

(実施例1)
精子無力症における精子運動能の回復のためのTreamidの有効性についての研究
精子無力症は、顕著なプロオキシダント特性を呈するエトポシドを使用することによってシミュレーションした。フリーラジカルのレベルの上昇を誘導する薬物を使用したのは、近代思想により、精子無力症の直接的原因が酸化ストレスであるという事実によるものであった(Kao S. H.ら、Increase of oxidativestress in human sperm with lower motility. Fertil. and Steril. 2008;89:5:1183〜1190頁)。

Treamidは、低減した運動能の成熟精子を有する雄のラットに対し、処置過程(エトポシドの投与後10日間)において、及び予防治療の過程(エトポシドの投与前5日間及び投与後5日間)において5mg/kgの用量で投与した。

50頭の雄のWistarラット(3カ月齢)について実験を行った。エトポシドを、30mg/kgの最大耐容用量で静脈内に一回投与した。

Treamidの有効性を精巣上体から単離した運動精子形態の割合によって評価した。

第1シリーズでは、研究の結果を、140mg/kgの用量で胃内投与した基準薬、Spemanの投与に対して得られた結果と比較した。

研究の結果は、Table 1〜Table 2(表1〜表2)に表す。

表された実験データにより、エトポシドの投与の5日目及び10日目に(対照)、運動精子細胞の割合が有意に減少し、バックグラウンド値の73〜74%であったことが示された。実験の各シリーズにおいて、運動精子細胞の割合は、Treamidを投与した場合、対照(エトポシド)と比較して、及び第1シリーズではSpeman薬と比較して有意に増加した。実験の第2シリーズでは、実験群の運動精子細胞の割合は、インタクト動物(バックグラウンド)の割合と異ならなかった。得られたデータにより、Treamidが、精子運動能の回復のために有効な作用物質であることが示唆される。

(実施例2)
低ゴナドトロピン性性腺機能低下症における精子運動能の回復のためのTreamidの有効性についての研究
低ゴナドトロピン性性腺機能低下症は、Synestrolの投与によってシミュレーションした。エストロゲンは、LH(黄体ホルモン)及びFSH(卵胞刺激ホルモン)の分泌を阻害することができる。雄の体におけるエストロゲン濃度の増加は、遊離テストステロンの濃度の減少及び精子無力症の出現を導く性ステロイド結合グロブリンの含有量の増加を伴う。

36頭の雄のWistarラット(3カ月齢)について実験を行った。実験開始後30日間、すべての雄のラット(バックグラウンド群を除いて)に、50U/kg/日の用量でSynestrolを筋肉内に注射した。更に、実験の31日目から45日目まで、実験群の動物に、Synestrolに加えて、0.5mg/kgの用量のTreamid又は70mg/kgの用量の基準薬Tribestanを腹腔内に投与した。Treamidの有効性を精巣上体から単離した運動精子形態の数(運動精子形態の割合)によって評価した。研究の結果をSynestrol(対照)及び基準薬(Tribestan)の投与に対する結果と比較した。

研究の結果は、Table 3(表3)に表す。

表された実験データにより、インタクトラットにおける運動精子形態の割合は81.20±1.55であり、種の標準に対応することが示された。動物へのSynestrolの投与(対照群)は、運動精子形態の数を46.38±7.27%にまで有意に減少させ、これはバックグラウンドの57%であった。実験動物群において、この指数は、対照値を49%統計的に有意に超えるものであった。Tribestanは効果を有さなかった。

したがって、低ゴナドトロピン性性腺機能低下症において、Treamidは、精子運動能を有効に回復させる。

(実施例3)
交尾活動の回復のためのTreamidの有効性についての研究
アンドロゲン欠乏によって引き起こされる交尾活動の低減は、雄のラットへのSynestrolの投与によってシミュレーションした。

モデルは、アンドロゲン及びエストロゲンホルモンの拮抗作用に基づく。雄のラットへのSynestrolの投与は、動物における性的活動の抑制を導く。

36頭の雄のWistarラット(3カ月齢)について実験を行った。実験開始後30日間、すべての雄のラット(インタクト群(バックグラウンド)を除いて)に、50U/kg/日の用量でSynestrolを筋肉内に注射した。更に、実験の31日目から45日目まで、実験群の動物に、Synestrolに加えて、1.5mg/kgの用量のTreamid及び70mg/kgの用量の基準調製物Tribestanを腹腔内に投与した。性挙動の2点試験法により、性的活動を推定した。この目的のために、予め4倍のSynestrolを注射することによって引き起こされた発情段階の雌ラットが実験に含まれた。Treamidの有効性は以下の指数によって推定した:最初の交尾を試みるまでの待機時間(LFM)、交尾を試みた数(マウント)、及び射精の数。得られたデータは、実験前の同じ動物のデータ(第1試験)及び対照群におけるデータ(第2試験)と比較した。

研究の結果は、Table 4(表4)に表す。

表された実験データにより、Synestrolだけを受けた雄のラットは、射精なし及びLFA増加によって特徴付けられることが示された。Treamidで処置した動物において、44%の事例で射精が記録された(インタクト動物と同様)。これらの数値は、対照値及び第1試験の同じ動物の値を超えていた。更に、実験群における交尾の試みの数は、対照レベルにまで修復された。基準薬Tribestanの有効性はそれほど明らかではなかった。したがって、Treamidは、アンドロゲン欠乏の動物における交尾活動を有効に修復する。

(実施例4)
雄のラットにおいて、加齢変化により低減した交尾機能及び性的動機付けの回復のためのTreamidの有効性についての研究
勃起不全は、後期及び老齢の生殖可能年齢(14〜19カ月)の動物を使用してシミュレーションした。性的動機付けの抑制は、後期生殖可能年齢(14カ月)の動物を使用してシミュレーションした。

交尾活動に関するTreamidの効果を研究する実験を、76頭のWistarラット(14カ月及び19カ月齢)について行った。Treamidを5mg/kgの用量で14日間胃内に投与した。基準薬Sildenafil(100mg、PFIZER PGM社、France)も、臨床使用に対応する、週に2回3mg/kgの用量で胃内投与した。性挙動の2点試験法により、性的活動を推定した。この目的のために、予め4倍のSynestrolを注射することによって引き起こされた発情段階の雌ラットが実験に含まれた。Treamidの有効性は以下の指数によって推定した:最初の交尾を試みるまでの待機時間(LFM)、交尾を試みた数(MN)、及び射精の数(EN)。得られたデータは、Treamidの投与前の同じ動物のデータ(第1試験)及び対照群におけるデータ(第2試験)と比較した。

性的動機付けに関するTreamidの効果を研究する実験を、40頭のWistarラット(14カ月齢)について行った。この病理の治療用の新規作用物質に対する標的調査のためのモデルを、ラットの性的誘因動機付けの実験モデルとして使用した[Xi Chu、Ekaterina S. Zhavbert、Julia L. Dugina、Irina A. Kheyfets、Svetlana A. Sergeeva、Oleg I. Epstein、Anders Agmo Sindenafil and a compound stimulating endothelial NO synthase modity sexual incentive motivation and copulatory behavior in male wistar and fisher 344//J Sex Med. - 2008. - 5. - P.2085 - 2009]。このモデルは、ラットが社会的動物であり、性的接触だけではなく社会的接触を求めるという事実に基づく。性的動機付けの評価は、性的刺激の近くで過ごす時間及び「社会的」及び「性的」刺激と直接接触しない動物における嗜好のスコアを決定することを含む。性的刺激は発情段階の雌ラットであり、社会的刺激は雄のラットであった。

後期生殖可能年齢及び老齢の動物で実行された交尾挙動及び性的動機付けに関するTreamidの効果の研究の結果を、Table 5、Table 6、Table 7及びTable 8(表5、表6、表7及び表8)に表す。

Table 5及びTable 6(表5及び表6)に表されたデータは、後期生殖可能年齢のラットの性的活動の指数が低減したことを示した(最初のマウントまでの待機時間の増加、マウント数の減少、及び射精する動物が検出されなかった、Table 5(表5))。Treamidを受けた動物では、最初のマウントまでの待機時間は有意に低減し、マウント数は増加し、射精する動物が記録された(Table 6(表6))。Sildenafilの投与により、動物の性的活動は改善されたが、程度は低かった:最初のマウントまでの待機時間は減少し、マウント数は増加したが、射精する動物は記録されなかった。

したがって、Treamidは、後期生殖可能年齢の動物における交尾活動の回復に対する有効な作用物質である。

初老動物(19カ月)で実行された研究の結果は、Table 7(表7)に表す。

Table 7(表7)に表されたデータは、対照群の動物において、最初のマウントまでの待機時間が増加し、マウント数が減少し、射精する動物が存在しなかったことを示す。5mg/kgの用量でTreamidを14日投与した後、マウント数の増加が有意であり、射精する動物が記録された。

したがって、この研究により、5mg/kgの用量で14日間投与した場合、Treamidは、後期及び初老のラットの交尾活動の回復をもたらすことが示された。

Table 8(表8)に表されたデータは、対照における性的刺激の近くでの経過時間及び嗜好スコアが、インタクト動物におけるものと比較して低かったことを示す(第1試験)。得られたデータは、14カ月の動物の使用によってもたらされた性的動機付けの抑制モデルが対照において得られたことを証明する。このことによって、薬物の試験が可能となる。

性的刺激ゾーンにおいて研究された雄のラットによって決定された経過時間及び実験の開始前の計算された嗜好スコアにより、実験におけるこれらの指数の値と対照におけるこれらの指数の値は、互いに有意には異ならないことが示された。このことによって、行われた無作為化の適正と雌ラットが雄を避けず、それらを受け入れたという事実が確認される。

社会的及び性的刺激のゾーンにおけるインタクト雄のラット(バックグラウンド)による平均経過時間並びに第1及び第2試験において得られた嗜好スコアの解析により、それらは互いに統計的に有意に異ならないことが示された。このことによって、実験において使用された雄のラットの動機付けとなる挙動の安定性が示され、性的動機付けがある特定の期間(最大55日)同じレベルのままであるという文献データが確認される。

対照群のラットの第1及び第2試験の研究された指数の解析により、動物の性的動機付けのレベルは変化しないままであることが示された。

Treamidが5mg/kgの用量で投与された場合、「性的」刺激の近くでの経過時間は、薬物の投与前の同じ動物のものと比較して増加した。同時に、「社会的」刺激ゾーンにおける経過時間は、対照と比較して減少した(2分の1)。嗜好スコアは、第1試験におけるより有意に高く、0.64±0.09に到達した。得られたデータは、5mg/kgの用量のTreamidの投与が、後期生殖可能期の雄のラットの性的動機付けについて刺激効果を有することを示す。この群のラットの嗜好スコアは、インタクトラット、すなわち「若齢」動物におけるものと統計的に有意に異なることに留意すべきである。

基準薬Sildenafil(3mg/kg)で処置されたラットの群において、雌ラットの近くでの平均経過時間は増加しなかった。しかしながら、社会的刺激の近くでの経過時間は増加した。嗜好スコアは、最初のレベルと有意に異ならなかった。このことにより、Sildenafilは、雄のラットの性的動機付けに効果を有さなかったことが示される。

したがって、成熟した生殖可能年齢の雄のラット(14カ月)の性的動機付けの刺激剤としてのTreamidの試験は、化合物が、後期生殖可能年齢の動物の性的動機付けを刺激することを示した。効果は、5mg/kgの用量で現れ、治療の最適期間は14日である。

基準薬、Sildenafilは、性的動機付けに対する試験において活性を示さなかった。交尾活動に対する試験において、その効果は不十分なものであり、一時的であった。

(実施例5)
交尾活動の季節による抑制状態でのインタクト動物の雄のラットの交尾活動の回復のためのTreamidの有効性についての研究
生殖活動の季節による抑制は、冬期間(12月の終わり)に実験を行うことによってシミュレーションした。バックグラウンド群として、インタクト動物(3カ月齢)を6月に試験した。

27頭の生殖可能年齢の雄のWistarラット(3カ月)について実験を行った。5mg/kgの用量のTreamidと基準薬Sildenafil(3mg/kgの用量で)を、週に2回、1日1回15日間胃内投与した。性挙動の2点試験法により、性的活動を推定した。試験は2回行った:投与前及びTreamidの最終投与の1時間後。溶媒を受けた対照群のラットを実験群の動物と同時に試験した。

実験はまた、予め4倍のSynestrolを注射することによって引き起こされた発情段階の雌ラットの使用を含んだ。Treamidの有効性を以下の指数によって推定した:最初の交尾を試みるまでの待機時間(LFM)、交尾を試みた数(MN)、及び射精の数(EN)。得られたデータは、試験化合物の投与前の同じ動物のデータ及び対照群におけるデータ(第2試験)と比較した。

対照及び実験群の動物の交尾活動の比較の結果は、Table 9(表9)に表す。

バックグラウンド群の雄のラットを試験した結果により、動物は、十分に高い、安定した割合の性的活動によって特徴付けられることが示された。最初のマウントまでの平均待機時間は114秒であり、マウント数は14.7であり、交尾の数は0.33であった。「夏」時間における試験指数と「冬期間」における試験指数の比較により、最初の交尾の試みまでの待機時間は4倍増加し、交尾の試みの数は3.4分の1に減少した(P≦0.05)。更に、冬には、対照群の雄における射精はなかった(P≦0.05)。

Sildenafilの投与は、雄のラットの性的活動の季節による抑制下で雄のラットの性的挙動に有意な影響を有さなかった。その投与の前後に、試験指数は、その群内で、及び対象群のものと異ならなかった。5mg/kgの用量のTreamidで処置した雄のラットの性的活動を監視した結果により、最初のマウントまでの待機時間は、試験前と比較して、投与後に1.8分の1に有意に減少することが示され、これは、性的衝動に関する薬物の刺激効果は、ある特定の程度まで、交尾活動に集中することを示す。交尾の試みの総数は1.8倍まで増加したが、差は、統計的に有意ではなかった。射精が観察された群の動物の計算値により、Treamidの投与後、射精が33%で検出され、一方、薬物の投与前、これらの動物は射精しなかった(P≦0.05)。

したがって、得られたデータは、性的活動の季節による低減状態下の雄のラットにおける性的活動を修復するためのTreamidの能力の説得力のある証拠である。

(実施例6)
慢性非細菌性前立腺炎(CAP)又は良性前立腺肥大症(BPH)における前立腺組織の構造の再生及び正常化のためのTreamidの有効性についての研究
これは、これらの疾患に典型的な重度の形態的変化の減少において現れる。CAPは、腹側葉の腺を絹糸で縫合することによってシミュレーションし、BPHは、Sulpirideの投与によってシミュレーションした。基準薬は、Prostamol Unoであった。

Treamidを、CAPを有する動物に、0.5mg/kgの用量で15日間胃内投与した。

BPHを有する動物は、0.5mg/kgの用量で2カ月間、Treamidを胃内に受けた。

1.慢性非細菌性前立腺炎(CAP)のモデルに関する前立腺組織の構造の再生及び正常化のためのTreamidの有効性についての研究
40頭の雄のWistarラット(3カ月齢)について実験を行った。慢性非細菌性前立腺炎をシミュレーションするために、前立腺の腹側葉を絹糸で縫合した(麻酔下)。良性前立腺肥大症(BPH)のモデルは、雄のラットに40mg/kgの用量のSulpirideを2カ月間毎日腹腔内注射して(Eglonil、Sanofi Winthrop Industry社、France)、高プロラクチン血漿を誘導することによって、ラットにおいてシミュレーションした。

手術の1カ月後に、実験群の動物に、0.5mg/kgの用量のTreamidを1日に1回15日間腹腔内投与した。投与過程の終了時に、動物を秤量し、CO₂チャンバー内で安楽死させた。次いで、腹側葉の腺を解剖し、秤量して、その体積を測定し、続いて質量係数を計算して、形態学的解析に供した。この目的のために、前立腺をホルマリンで固定し、パラフィンを注いだ。厚さ5μmのパラフィン切片を、結合組織に関するVan Giesonに従いヘマトキシリンエオジンで染色し、上皮の相対面積を計算した。更に、萎縮プロセス及び硬化の発症の重症度を定性的に評価した。評価は、コンピューターグラフィック解析を使用することによって腺切片の標準面積について行った(画像転送ソフト「AxioVision LE」、Carl Zeiss社を有するAxioLab A1顕微鏡(x10レンズ、x10接眼レンズ)に搭載されたAxioCam Erc5sカメラによって行われた10連続視野の顕微鏡写真)。面積は分泌部位で占められ、結合組織隔壁のコラーゲン線維が決定された。薬物の有効性は、以下の基準によって推定した:慢性非細菌性前立腺炎の形態学的症状(萎縮及び硬化)の強度低下:分泌切片によって占められる面積、結合組織隔壁のコラーゲン線維。

研究の結果は、Table 10〜Table 11(表10〜表11)に表す。

表された実験データにより、すべての比較群における腺の質量、その質量係数及び体積は、互いに有意に異ならなかったことが示される(Table 10(表10))。形態学的解析(Table 11(表11))により、対照ラットの前立腺において、腺房上皮面積が有意に減少し(萎縮)、コラーゲン線維の面積が増加した(硬化)ことが示された。0.5mg/kgの用量での雄のラットへのTreamidの投与は、腺房上皮面積の増加(22%まで)をもたらした。このパラメーターの値は、バックグラウンド値と有意に異ならなかったが、対照において、バックグラウンドと比較して有意に低下した。コラーゲン線維の面積は減少傾向にあった。得られたデータをProstamol Unoの投与に対して得られたデータと比較した場合、Prostamol Unoは、腺房上皮面積に影響を及ぼさなかったことが分かった。得られたデータにより、CAPを有するラットにおける0.5mg/kgの用量のTreamidの使用は、前立腺上皮組織の再生を促進するという結論付けが可能となる。これは、萎縮プロセスの重症度の低下で表される。後者は、明らかに、腺房上皮の機能活性の上昇を導き、射精の質的特徴の修復を促進する。

2.良性前立腺肥大症(BPH)のモデルに関する前立腺組織の構造の再生及び正常化のためのTreamidの有効性についての研究
前立腺の構造を正常化するためのTreamidの能力を、Sulpiride投与の存在下で研究した。この目的のために、Treamidを、Sulpirideと同時に、0.5mg/kgの用量で2カ月間胃内投与した。対照動物は、等量の溶媒(2%のデンプン粘液)を受けた。比較群の動物を、50mg/kgの用量のProstamol Unoの溶液で胃内注射した。投与過程の終了時に、動物を秤量し、CO₂チャンバー内で安楽死させた。Sulpirideは、ラットの腹側葉の腺におけるBHPの発症を引き起こすことが知られている[Van Coppenolle Fabien、Christian Slomianny、Francoise Carpentier Effects of hyperprolactinemia on rat prostate growth:evidence of androgeno - dependence.//Physiol. Endocrinol. Metab. - 2001. - 120〜129頁]。この点において、この葉を解剖した。その質量、質量係数、及び体積を決定した。更に、これを形態学的解析に供した。前立腺の腹側葉を10%のホルマリンで固定し、パラフィンを注ぎ、続いて厚さ5μmの切片を調製した。腺の脱パラフィン切片をヘマトキシリンエオジンで染色した。組織学的切片に関して、増殖中心及び娘腺房の存在が、標準断面積に対して決定された。更に、上皮及び間質性構造の面積を、組織学的切片の標準面積に関して測定した。これらのパラメーターを、組織学的切片の標準面積についてコンピューターグラフィック解析を使用することによって決定した(画像転送ソフト「AxioVision LE」、Carl Zeiss社を有するAxioLab A1顕微鏡(x10レンズ、x10接眼レンズ)に搭載されたAxioCam Erc5sカメラによって行われた10連続視野の顕微鏡写真)。間質-上皮の比は、間質の面積の上皮面積に対する比として定義した。

試験化合物の有効性は、以下の基準によって推定した:良性前立腺肥大症の形態学的症状の強度の低下:- 増殖中心及び娘腺房の数の減少、及び上皮面積の減少。

研究の結果は、Table 12〜Table 16(表12〜表16)に表す。

表された実験データにより、すべての比較群における前立腺の質量及びその質量係数は互いに有意に異ならなかったことが示された(Table 12(表12))。定量的な形態学的解析により、Sulpirideの投与により、標準断面積における腺房上皮面積の33%の有意な増加がもたらされ(Table 13(表13))、これは、増殖の増強の証拠である。形態学的には、まず第1に、上皮の乳頭突起の過剰増殖において表される。Sulpirideを受けたラットの前立腺において、互いに隣接した2〜3個の小腺からなる構造が存在した(Table 14(表14))。更に、約3〜8個の娘増殖中心が、標準断面積に記録された(Table 15(表15))。間質構造の相対面積は、有意に22%増加した。

BPHの症状は、Treamidを投与する場合にはあまり顕著ではなかった。したがって、腺房上皮面積の有意な減少(Table 14(表14))及び娘増殖中心の数の減少(Table 15(表15))は、この群の動物の前立腺で観察された。これらのデータは、試験化合物の抗増殖特性の存在を示す。基準薬物であるProstamol Unoも治療効果を有した。したがって、Sulpirideを受けている雄のラットへのその投与によって、娘増殖中心の数の減少をもたらした(Table 15(表15))。しかしながら、その有効性は、基準薬物の投与に対して検出されなかった、上皮面積を低減させる後者の能力によって証明されるように、試験化合物の有効性より低かった。

したがって、0.5mg/kgの用量のTreamidは、Sulpiride投与の存在下で前立腺の形態学的状態を有効に修復し、これは、実験動物におけるBHP症状の重症度の低下で現れる。その有効性は、基準薬物、Prostamol Unoの有効性を超えている。

(実施例7)
精巣組織の修復再生のプロセス及び精子形成の増殖プールの枯渇によって引き起こされる精巣機能不全の処置の強化のためのTreamidの有効性についての研究
後者は、雄のラット(3カ月齢)への細胞分裂阻害薬パクリタキセル(Mitotax、Dr. Reddy's社、India)の単回注射によってシミュレーションした。薬物の選択は、これが、精子形成-幹細胞の前駆体に損傷を与える医薬の1つであるという事実による。

パクリタキセルは、7.6mg/kgの最大耐容用量で、対照及び試験群の動物に静脈内に1回投与した。Treamidは、パクリタキセルの投与後、1カ月に15日間、2%のデンプン粘液中の懸濁液の形態で、5mg/kgの用量で、実験群の動物に胃内投与した。対照動物は、試験化合物の代わりに、等量の溶媒(2%のデンプン粘液)を受けた。

精子形成組織の再生の強い予備能に関するTreamidの効果を、関与する精子形成幹細胞数の決定を可能とする、コロニー形成能を評価するための方法によって研究した[A.J. Richards、G.C.Enders、J.L Resnick//Biol. Reprod. - 1999. 61巻 - 1146〜1151頁]。

パクリタキセルの投与後1日目に(24時間で)、45日目及び65日目と同様に、動物を安楽死させ、それらの精巣の調製物を作製した。更に、精巣の精子形成の前駆細胞の含有量を、in vitroクローニング方法によって決定した。研究した器官の前駆細胞を、接着分画細胞によって表された下層を使用することによって培養した。接着細胞の下層は、インタクト動物の1つの精巣をDMEM培地中でホモジナイズし、遠心分離(1500rpm、10分)で洗浄することによって、5%のCO₂及び37℃の条件下で調製した。次いで、得られた細胞のスラリーを、接着及び非接着分画に分けた。このために、0.5mlの調製した細胞懸濁液を、前駆細胞用培養培地に1×10⁶/mlの濃度で、24ウェルプレートの各ウェルに入れ、更に、CO₂インキュベーター内で、37℃、5%のCO₂及び100%の大気湿度において、1時間インキュベートした。インキュベーション後、細胞の非接着部分を採取した。精子形成前駆細胞を培養するための培地を、接着細胞の分画を含有するウェルに0.5mlの量で入れ、CO₂インキュベーター内で、37℃、5%のCO₂及び100%の大気湿度において、7日間インキュベートした。7日後、培養培地を再度入れ、続いて実験動物の精巣の非接着細胞を得られた間質に層状に重ねた。この目的のために、上述の手順に従い、細胞を、接着及び非接着分画に分けた。器官のホモジネートを、37℃、5%のCO₂及び100%の大気湿度で、CO₂インキュベーター内で、1時間、ペトリ皿でインキュベートした。次いで、細胞の非接着分画を回収し、細胞数(細胞/ml)をGoriaevチャンバー内でカウントした。非接着細胞を、1ウェル当たり0.5mlの体積で、得られた間質に2×10⁵/mlの濃度で層状に重ねた。インキュベーションを、37℃、5%のCO₂及び100%の大気湿度で、CO₂インキュベーター内で7日間続けた。インキュベーション後、コロニー形成単位、精子形成(CFU-Sp)-円形の及び種々の直径の30個超の細胞のクラスター-の数をカウントした。使用した作用物質の有効性に対する基準は、試験動物の精巣組織におけるCFU-Spをもたらす細胞数の、対照における細胞数と比較した有意な増加であった。

精子形成組織の微小環境の細胞のコロニー刺激活性(セルトリ細胞による精子形成の液性調節剤の製造)を次のように決定した。上述の手順を使用して、細胞の接着分画が単離される精巣ホモジネートを調製した。接着細胞を、37℃、5%のCO₂及び100%の大気湿度で、完全培養培地において24時間培養した。次の日に、上清を回収し、これを20℃の温度で保存した。上清における精子形成の液性因子のレベルを、インタクトラットの精巣のCFU-Spの試験システムによって試験した。得られた結果を、層状非接着細胞数から成長したコロニーの数によって表した(10⁵個の細胞/ウェル)。

Treamidの有効性を、試験動物の上清細胞の作用の下、試験システムの細胞から成長したコロニーにおける、対照におけるものと比較した有意な増加によって推定した。

研究した器官の前駆細胞を、上述のように、96ウェルプレートで前もって調製した下層(接着分画の細胞によって表される)を使用することによって培養した。

更に、精子形成組織の非接着細胞分画を2つの群の動物(インタクト動物と研究前の24時間にパクリタキセルを静脈内に受けた動物)から単離し、完全培養培地(80%のDMEM、20%のFCS、L-グルタミン、抗生物質、ヘパリン)中の得られた下層に、2×10⁵/mlの濃度で移した。完全培養培地でのインキュベーション前に、Treamidを、1ng/ml、3ng/ml、10ng/ml、30ng/ml、100ng/ml、300ng/ml及び1000ng/mlの濃度で添加した。インキュベーションを、37℃、5%のCO₂及び100%の大気湿度で、CO₂インキュベーター内で7日間続けた。インキュベーション後、コロニー形成単位、精子形成(CFU-Sp)-円形の及び種々の直径の30個超の細胞のクラスター-の数をカウントした。

Treamidの有効性を、試験化合物を添加した培養におけるCFU-Spをもたらす細胞数の、対照における細胞数と比較した有意な増加によって推定した。

精子形成組織の形態学的及び機能的状態を、関与する幹細胞の形成を刺激する効率の更なる確認を得るために評価した。

これは、以下の指数によって推定した:精原集団における細胞数、セルトリ細胞の平均数、精子形成層の成熟度、ライディッヒ細胞の数、精巣の内分泌活性、精巣上体に対する精子細胞の総数、及び運動精子形態の割合。このために、実験の45日目、65日目、及び90日目の安楽死において、精巣上体及び精巣の尾部を解剖で単離した。1つの精巣の精巣上体を温めた(37℃)生理食塩水中でホモジナイズし、運動精子形態の数を、精子上体細胞の懸濁液中で決定した。精巣上体に対する精子細胞の総数(TNS)を、白血球カウントピペット及びGoryaevチャンバーを使用して、投薬量の生理食塩水中で第2の精巣上体のホモジナイズされた細胞懸濁液を使用して計算した。

ラットの精巣の形態学的アッセイを、カルノア液中でそれを固定し、パラフィン切片を調製することによって行った。厚さ5μmの脱パラフィン切片をヘマトキシリンエオジンで染色した。精原集団における細胞数、セルトリ細胞の数、及びライディッヒ細胞の数を、精巣切片においてカウントし、ライディッヒ細胞の内分泌活性を決定した。精子形成層の成熟度を、セルトリ細胞のカウントに基づいて計算した。計算は、実験群に対しては:y=5.95-0.18x;インタクト動物の群に対しては:y=6.7-0.23xの式(xは、曲精細管の断片におけるセルトリ細胞の平均数であり、yは、精子形成層の成熟度を特徴付ける指数である)に従って行った。研究の時間を選択する場合、1カ月と半月であるラットにおける精子形成の期間を考慮に入れた。パクリタキセルの投与後45及び65日の期間は、精原細胞集団に関する効果の出現に対応する。

精巣組織の再生プロセスの刺激に対する基準は、精原集団における細胞数の増加、セルトリ細胞の数、精子形成層の成熟度の低下、及び精子形成の生産性の増加であった。精子細胞の機能活性の基準は、それらの運動形態の割合である。

研究の結果は、Table 17及びTable 18(表17及び表18)に表す。

表された実験データは、パクリタキセルの投与後のラット精巣における精子形成組織に対する前駆体の含有量の研究は、実験の1日目、45日目及び65日目にコロニー(CFU-Sp)をもたらす細胞数が統計的に有意に減少したことを明らかにした(Table 17(表17))ことを示した。したがって、実験の終了時に、コロニー形成細胞数は、およそ40%まで減少した。

Treamidの投与は、全ての調査時点(実験の45日目及び65日目)におけるコロニー形成細胞数の、細胞分裂阻害対照と比較した有意な増加(44〜48%)を伴う(Table 17(表17))。

パクリタキセルの投与後の幹細胞のコロニー形成活性を低減させるためのメカニズムの研究は、研究の1日目、45日目及び65日目に、精子形成組織に対する前駆体からのコロニーの成長を刺激する、精子形成組織の微小環境の細胞による液性因子の生成の低下を示した(Table 18(表18))。関与する精子形成細胞のコロニー形成の液性調節の最も顕著な抑制(2.8及び3分の1)が、実験の1日目及び65日目に検出された。得られたデータは、パクリタキセルは、幹精原細胞に直接的な毒性作用を有しただけでなく、微小環境の細胞の機能活性も抑制し、それによって、精子形成組織の強い予備能を構成する細胞の更新に関する刺激効果を低減させたことを示す。このことによって、パクリタキセルの作用の下、幹精原細胞の機能の液性調節の抑制が示される。

実験の65日目に、対照と比較して、微小環境の細胞の分泌活性の統計的に有意な増加(80%)が、Treamidで処置したラットの群で観察された(Table 18(表18))。このことによって、Treamidの作用の下、微小環境の細胞の機能状態の活性化が示される。

精子形成組織に対する前駆体に関するTreamidの直接的作用を、in vitroで、Treamidを1、30、100、及び1000ng/mlの濃度で細胞培養に添加することによって研究した。

実験の結果は、Table 19(表19)に表す。

パクリタキセルの投与後のラット精巣における精子形成組織に対する前駆体の含有量を決定した結果として、1日目に、コロニー形成における統計的に有意な(Table 19(表19))減少が観察され、これは、以前に得られたデータに対応する。

Treamidを、インタクト動物の精子形成組織に対する前駆体を含有する完全培養培地に添加(100及び1000ng/mlの濃度で)した場合、CFU-Spの含有量の有意な増加が記録された。

パクリタキセルの静脈内投与の1日後のラット精巣に由来する細胞からの精子形成コロニーの形成に関するin vitroでのTreamidの直接的作用の研究により、全ての試験濃度(Table 19(表19))で投与された場合、試験化合物の作用の下、コロニー形成の増加が示された。

得られたデータは、Treamidが、精子形成組織に対する前駆細胞の機能活性を直接的に刺激する能力を有することを示す。

したがって、パクリタキセルの投与は、精巣の再生能の低下をもたらし、これは、関与するコロニー形成精子形成細胞の数の減少に表れる。これは、精子形成の増殖プールの供給源に関するパクリタキセルの直接的毒性作用によるだけでなく、これらの細胞の増殖を刺激する液性因子の抑制にもよる。Treamidの投与により、組織再生能が増大した。更に、Treamidは、精子形成の増殖プールの新たな供給源(幹細胞)の形成を直接的に刺激するだけでなく、それらの形成を刺激する液性因子の作用を増強させた。

実験の開始後45日の精子形成組織の形態学的及び機能的状態を研究する場合、パクリタキセルの投与により、精原集団における細胞数の有意な減少(30%超)がもたらされ、精子形成の生産性は、TNSによって判断されたように、バックグラウンドと比較して40%超減少した(Table 19(表19))。

成熟生殖細胞の総数における減少と同時に、それらの運動能の割合に統計的に有意な減少が存在した。したがって、パクリタキセル投与後45日で、男性不妊の原因の1つである、精巣機能不全がパソスペルミアの形態で観察された。45日の期間は、精原細胞集団への毒性作用の出現に対応する。この場合、精子形成に対する前駆細胞数の減少(40%)が存在することを考慮して、精子形成の増殖プールの供給源の枯渇によって引き起こされる精巣機能不全のモデルを、この研究で得た。精子形成層の成熟度及びセルトリ細胞の数等の指数によって判断して、対照動物は、精巣組織の修復再生プロセスの活性化の特徴を示す。したがって、微小環境の細胞数は増加し、精子形成層の成熟度は低下する(Table 20(表20))。しかしながら、微小環境の細胞の機能活性は低減する。得られたデータは、パクリタキセルだけを受けた動物の精子形成組織の低い再生能を示す。

パクリタキセルとTreamidの併用投与(Table 20(表20))後45日に、精原細胞の平均数は、対照(パクリタキセル)と比較して、統計的に有意に増加し、精子形成の生産性は統計的に有意に増加しなかったが、運動精子細胞の割合は増加した。精原細胞の総数の増加は、精子形成組織の関与するコロニー形成細胞数の増加と明らかに関連する。実験群では、対照と比較して、セルトリ細胞の平均数の有意な増加が存在したが、それらの機能活性は、対照において低減されたままであった。精子形成層の成熟度は、対照値と比較して低下しなかった。したがって、薬物の投与は、パソスペルミアの重症度における低下(運動形態の割合によって判断すると)、及び精原細胞数の増加をもたらした。

パクリタキセルだけを受けたラットの精子形成組織の形態学的機能状態の研究により、実験の65日間において、精原集団における細胞数及び精子形成の生産性が減少したことが示された(Table 21(表21))。

これは、明らかに、精子形成の前駆細胞集団の上記枯渇及びそれらの増殖を刺激する液性因子抑制の結果である。成熟生殖細胞の運動能の割合は減少し、これはそれらの部分的劣性を示す。したがって、精子形成の増殖プールの供給源の減少によって引き起こされる精巣機能不全が、この時点(実験後65日)の観察においても検出され、すなわち病理プロセスの実験モデルが再生成された。ライディッヒ細胞数は同じレベルのままであった。ライディッヒ細胞の内分泌活性は増加した。修復再生プロセスの強度は増大しなかった。したがって、精子形成層の成熟度(これは、対照と比較して減少したが)は、研究前の期間と比較して減少せず、セルトリ細胞の数も増加しなかった。再生プロセスの間の陽性力学の欠如は、明らかに、精子形成組織の関与するコロニー形成細胞数の低下と関連する。

研究の65日目にTreamidで処置した動物において、精原集団における細胞数は、対照と比較して増加しなかったが、精子形成の生産性は、TNSによって判断されたように、増大した(43%)(Table 21(表21)参照)。運動精子形態の割合も増大した(32%)。この指数は、バックグラウンド値と統計的に有意に異ならなかった。ライディッヒ細胞の数は対照レベルであった。ライディッヒ細胞の内分泌活性を正常化させ、対照値に到達させた。修復組織再生のプロセスの重要性を評価する場合、セルトリ細胞の数は増加し、精子形成層の成熟度は低減したことが分かった。反対に、精子形成層の成熟度は有意に低下した。これらのデータは、精子形成の前駆細胞数の増加に関するデータと一緒に、パクリタキセルを受けたラットへのTreamid投与が、精子形成組織の修復再生プロセスを刺激することを示唆する。精巣機能不全は、運動形態の割合によって判断すると、低い程度までそれ自体現れた。精子形成の前駆細胞数の増加及びそれらの生命活動の液性調節における増加にもかかわらず、精原集団における細胞数に関する陽性作用の非存在は、前駆細胞の作用の出現のために、長期間が要されることに留意されたい。この目的のために、精子形成組織の形態学的及び機能的状態を、実験の90日目に評価した。

実験の90日目の精子形成組織の形態学的及び機能的状態の研究により、パクリタキセルだけを受けたラットにおける精原集団における細胞数、TNS、及び運動形態の割合が、対照におけるこれらの値と比較して低減し、研究前の期間と比較して増加しなかったことが示された(Table 22(表22))。これらのデータは、精子形成の増殖プール供給源の枯渇によって引き起こされる精巣機能不全がそのままであったことを示す。ライディッヒ細胞の数は有意に減少したが、それらの内分泌活性は増大した。セルトリ細胞の数(Table 22(表22))は増加せず、対照と比較して低減された。しかしながら、精子形成層の成熟度によって判断すると(この指数は、バックグラウンドの10%まで低減される、Table 22(表22))、組織修復再生のプロセスの一部の活性について話すことが可能であるが、それらの強度は、全体として、精子形成の前駆細胞の初期数及びプロセスを修復するには明らかに不十分である。

Treamidで処置した動物群において、精原細胞の量は、対照と比較して統計的に上昇し、これは、上述したように、明らかに、精子形成の増殖プールの供給源数の増加及びそれらの増殖を刺激する液性因子の増加の結果である。精子形成の生産性は、TNSによって判断すると、対照と比較して増大し(46%)、バックグラウンド値に達した。精子細胞の機能活性も増大した(運動精子細胞数は、対照値より有意に高かった)。これらのデータは、処置の有効性の証拠である。ライディッヒ細胞の数は対照値と同様であった。これらの内分泌活性は正常化された。組織修復再生プロセスの強度は(精子形成層の成熟度及びセルトリ細胞の数によって判断すると)、対照と比較して統計的に有意に増大した。これは、薬物投与における組織再生能が高レベルのままであり、消耗されていなかった証拠である。

表されたデータにより、Treamidは、関与するコロニー形成細胞数の減少により抑制された精巣組織の修復再生の効果的な刺激を可能にすることが示される。Treamidの有効性は、精巣組織の形態学的解析のデータによって確認される。

(実施例8)
ストレプトゾトシンに誘導される膵臓病変のモデルの膵臓細胞の再生に関するTreamidの効果についての研究
研究は、4週齢の雄のC57BL/6マウスについて行った。膵臓の損傷は、0.25mlのリン酸緩衝液中40mg/kgの用量のストレプトゾトシンを5日間毎日腹腔内注射することによって誘導した[Szkudelski T. The Mechanism of Alloxan and Streptozotocin Action in B Cells of the Rat Pancreas//Physiological Research. - 2001. - 50巻 - 536〜546頁]。

1mg/kgの用量のTreamidを、研究の7〜20日目に1日1回、毎日胃内投与した。

研究の0、6、10、13、16、19、21、24、及び28日目に、血中グルコースを決定した。血中グルコースレベルを、血糖値測定器(SencoCard glucometer、「77 Electronics Kft社」、Hungary)を用いて、4時間食餌をはく奪した後に決定した。

研究の28日目に、動物をCO₂チャンバー内で安楽死させ、膵臓を形態学的検査に供し、膵臓ホモジネートを、通常のコラーゲンとI型コラーゲンに対して酵素結合免疫吸着測定法で研究した。

形態学的研究のために、脾臓に隣接する膵臓の一部を10%のホルマリンで固定し、パラフィンを注いだ。腺の脱パラフィン切片を、ヘマトキシリンエオジンで染色した。切片に、コンピューターグラフィック解析により、10個の連続したランゲルハンス島の面積を決定し、細胞の総数と凝縮細胞数をその中でカウントした。次いで、単位島面積当たりの細胞数及び凝縮細胞の割合を計算した。

膵臓組織における炎症性細胞(好中球、リンパ球、マクロファージ)及びそれらの組成について、ヘマトキシリンエオジン及びアズールエオジンを用いた組織切片の染色によって研究した。

肺ホモジネートにおけるマウスI型コラーゲンのレベルを酵素結合免疫吸着測定法(Cusabio Biotech CO., LTD社、China)によって決定した。製造業者Cusabio Biotech CO., LTD社(China)のプロトコルに従って、肺組織ホモジネートを調製した。

肺ホモジネートにおける総コラーゲンのレベルを、SIRCOL Collagen Assay kit (Biocolor Ltd社、UK)を使用して、製造業者の指示に従って、コラーゲンを色素に結合させ、酸及びペプシン溶液で処理することによってコラーゲンを決定することによって決定した。肺組織ホモジネートは、製造業者の試験システムのプロトコルに従って調製した。

研究の結果は、Table 23〜Table 25(表23〜表25)に表す。

観察期間を通したマウスへのストレプトゾトシンの投与過程後(ストレプトゾトシンの最後の投与後6、10、13、16、19、21、24、28日目)に、血中グルコースレベルは有意に増加した(Table 23(表23))。形態学的研究により、高血糖のピーク(21、28日目)に、浮腫及び充血が膵臓組織で観察されたことを確証することが可能となり、好中球、マクロファージ及びリンパ球による膵臓の浸潤が記録された。更に、ストレプトゾトシンの最後の注射の6日後から開始し、実験群のマウスは、インタクト対照と比較した島組織の面積減少を増大させることを実証した。28日目に、このパラメーターの下降が最も顕著であった:島の全細胞性が、インタクトマウスと比較して50%超低減し、逆に、凝縮細胞の割合が有意に増大し(2、3倍)、損傷した島では、線維芽細胞が出現し、これは、島装置の硬化の発症の指標であった(Table 24(表24))。病理対照群における膵臓ホモジネートの免疫酵素解析により、研究の28日目のインタクト動物と比較して、I型コラーゲン及び総コラーゲンのレベルの上昇が明らかとなった(Table 25(表25))。

1mg/kgの用量のTreamid投与により、研究の13、21、及び24日目にストレプトマイシンを受けたマウスにおける血中グルコースレベルを有意に低減させた(Table 1(表1))。研究の28日目に行われた膵臓の形態学的検査により、Treamidは、病理対照と比較して、病気の動物のランゲルハンス島における凝縮した膵細胞数を低減させ、島組織の面積及び細胞性を増大させ(Table 24(表24))、実験動物の膵臓における総コラーゲン及びI型コラーゲンの濃度を低減させたことが示された(Table 25(表25))。

得られた結果は、ストレプトマイシンに誘導された膵臓病変のモデルで、Treamidが膵臓組織に再生作用を及ぼすという結論を可能にする。結果として、ランゲルハンス島における細胞数は修復され、島組織の面積は増大し、ランゲルハンス島における凝縮細胞数は正常化され、膵臓組織における線維性変化は減少し、結果として血中グルコースレベルは低下する。Treamidは、グルコース耐性異常の処置において使用することができる。

(実施例9)
メタボリックシンドロームモデルの雄のマウスにおける膵臓細胞の再生及び精巣組織の機能回復に関するTreamidの効果についての研究
代謝障害は次のようにシミュレーションした:誕生の2日後に、雄のC57Bl/6マウスに、甲領域において、200mg/kgの用量のストレプトゾトシンで1回皮下注射し、注射した溶液の体積は30μlであった。誕生の4週間後から、動物を高脂肪食に移した。この目的のために、使用した食餌は、重い飽和脂肪が豊富であった(30%の脂肪)(30%の脂肪を有するSiff EF R/M Cat No. E15116-34、Germany)。高脂肪食を用いる給餌期間は42日であった(実験の28日目から70日目まで)。Treamidを、実験の49日目から70日目まで毎日、1日1回、10mg/kgの用量で胃内投与した。対照動物は、試験化合物の代わりに等量の溶媒(2%デンプン粘液)を受けた。

研究の28、35、42、49、56、63、及び70日目に、血中グルコースを決定した。血中グルコースレベルは、血糖値測定器(Accu-Chek Performs Nanu(「Roche Diagnostes GmbH社」、Germany)を用いて決定した。血中グルコースは、16時間食餌をはく奪した後の動物において測定し、引き続き行ったグルコースレベルのすべての測定も、16時間食餌をはく奪した後に行った。

70日目に、動物をCO₂チャンバー内で安楽死させた。次いで、血清中遊離テストステロンレベルについて研究し、膵臓の形態学的検査を行った。

血清中の遊離テストステロンレベルは、製造業者の試験システムのプロトコルに従って、酵素免疫検定法によって評価した。

形態学的研究のために、標準方法に従って、脾臓に隣接する膵臓の一部を10%ホルマリンで固定し、パラフィンを注いだ。

腺の脱パラフィン切片を、ヘマトキシリンエオジンで染色した。切片に、コンピューターグラフィック解析により、10個の連続したランゲルハンス島の面積を決定し、細胞の総数と凝縮細胞数をその中でカウントした。次いで、単位島面積当たりの細胞数及び凝縮細胞の割合を計算した。膵臓組織における炎症性細胞(好中球、リンパ球、マクロファージ)及びそれらの組成について、ヘマトキシリンエオジンを用いた組織切片の染色によって研究した。

研究の結果により、メタボリックシンドロームのシミュレーションにより、実験70日目のC57Bl/6雄のマウスの膵臓組織において、浮腫及び充血が起こったことが示された(図1)。更に、モデル条件下のマウスについて、インタクト対照の動物におけるものと比較すると、腺房細胞の小及び中程度の脂肪滴変性、小葉間隔壁の肥厚及び増殖、炎症性細胞による島組織の浸潤、ランゲルハンス島の総数の減少、それらの面積及び細胞性の低下が記録されたが、島における凝集細胞の割合は増加した(図2、Table 26(表26))。

研究の49日目から70日目までの10mg/kgの用量のTreamidの胃内投与により、シミュレーションした代謝障害を有するマウスの膵臓の破壊が予防された。Treamidは、膵臓におけるランゲルハンス島の数及びそれらの細胞性を増加させ、腺房細胞の脂肪変性の発生を予防し、代謝障害を有するマウスのランゲルハンス島における凝集細胞の数を有意に低減させた。更に、Treamidは、浮腫の強度及び炎症性細胞による島組織の浸潤を低減させた(図1及び図2、Table 26(表26))。

マウスの血清におけるグルコースについての研究結果は、代謝障害のシミュレーションにより、実験42日目から開始し、雄のC57BL/6マウスにおける血中グルコースレベルの持続的な上昇がもたらされたことを示した。高グルコースレベルは、最大70日間持続した。指数の最大値は、実験63日目に記録され、ベースラインを3.8倍超え、70日目には4.2倍を超えた(Table 27(表27))。

実験の49日目から70日目までの10mg/kgの用量のTreamidの胃内投与は、56及び63日目のマウスの血中のグルコースのレベルを低減させた(Table 27(表27))。

したがって、10mg/kgの用量のTreamidの投与過程により、シミュレーションした代謝障害を有する雄のC57BL/6マウスにおける血糖低下作用がもたらされた。

マウス血清中の遊離テストステロンについての研究の結果、インタクト動物と比較して、病理対照群の雄におけるホルモン含有量の減少(1.6分の1)が示された。得られたデータは、ヒトにおける臨床像を再現する、代謝障害を有する実験室の雄における性腺機能低下症の形成を示す。

10mg/kgの用量のTreamidの投与過程により、血中の遊離テストステロンの濃度が、インタクト動物のレベルに修復された(Table 28(表28))。したがって、研究した医薬物質は、代謝障害によって誘導される性腺機能低下症の発症を予防した。

得られた結果により、雄のマウスのメタボリックシンドロームモデルで、Treamidは、膵臓組織に再生作用を及ぼすという結論が可能となる。結果として、ランゲルハンス島における細胞数は修復され、島組織の面積は増大し、ランゲルハンス島における凝縮細胞数は正常化され、膵臓組織における線維性変化は減少し、結果として血中グルコースレベルは低下する。Treamidは、性腺機能低下症の発症を予防する精巣組織の機能も修復する。したがって、Treamidは、メタボリックシンドローム及び性腺機能低下症の処置において使用することができる。

(実施例10)
メタボリックシンドロームモデルの雄のラットにおける膵臓細胞の再生及び精巣組織の機能回復に関するTreamidの効果についての研究
メタボリックシンドロームを、動物を高脂肪食(「カフェテリアダイエット」)で12週間維持することによって、雄のWistarラット(260〜280g)においてシミュレーションした。「カフェテリアダイエット」については、Current Protocols in Pharmacologyに従って、バランスをとった[Current Protocols in Pharmacology (2005) Animal Models of Disease//Contributed by Petter Hedlund、Kenshi Matsumoto、及びKarl-Erik Andersson]。食餌は、げっ歯類の標準の食餌に加えて、25〜35%の脂肪及び25〜30%の可消化炭水化物を含有した。Treamidは、食餌の7週目〜11週目に毎日、1日1回、0.5mg/kgの用量で胃内投与した。基準薬メトフォルミンを、同じレジメンに従って、200mg/kgの用量で胃内投与した。

病理発症及びTreamidの治療効果を、以下のパラメーターによって推定した:血液の生化学パラメーター(グルコース、コレステロール、トリグリセリド(TG)、HDL、LDL、アテローム形成指数)、グルコース耐性試験、内臓脂肪質量、運動精子形態の総数及び割合。

グルコースは、OneNouch Select血糖値測定器(Switzerland)を用いて決定した。

トリグリセリド、TCh及びHDLのレベルは、診断キット(Olvex Diagnosticum社、Russia)を使用して決定した。
LDLのレベルは、式2によって決定した。
LDL=TCh-(HDL+TG/2.2) (1)、
ここで、LDLは、低密度リポタンパク質コレステロールであり、
HDLは、高密度リポタンパク質コレステロールであり、
TChは、総コレステロールであり、
TGは、トリグリセリドである。

アテローム形成指数(AI)は、式3によって計算した。
AI=(TCh-HDL)/HDL (2)、
ここで、AIは、アテローム形成指数であり、
HDLは、高密度リポタンパク質コレステロールである。

アテローム形成指数は、各動物それぞれについて計算し、群の算術平均値を計算した。

精子の解析のために、体重100g当たり70μlの体積のZolletil及びXylaの混合物(0.2mlのZoletil+0.8mlのXyla)の腹腔内注射により、動物に麻酔した。精巣上体を単離した。精巣上体の頭部を尾部から切り離し、秤量して、5つの切開を作製し(精子収量を改善するため)、37℃に加熱した10mlのリン酸緩衝液を含有する管に入れた。管を37℃で10分間維持した。次いで、管を振盪器で振盪させ、20μlの液体を取り、37℃に加熱したスライドガラスに載せて、運動精子細胞数を顕微鏡下で評価した。計算は、最大100個の精子細胞について行った。

精巣上体について、試験管内の精子細胞総数を次のように計算した:振盪後に20μlの液体を取り、400μlの生理食塩水を含有する管に加えた。管を振盪した後、それらの内容物(20μl)を取り出し、Goryaevチャンバー内に導入した。精子細胞数を100個のラージスクエアでカウントした。精巣上体の頭部における精子細胞数を以下の式で計算した:
精子細胞数=Goryaevチャンバーの100個のラージスクエアにおける精子細胞数*0.525(希釈液とGoryaevチャンバーの体積の計算からの因子)/精巣上体頭部の質量。

研究の結果は、Table 29〜Table 32(表29〜表32)に表す。

実験動物における内臓脂肪質量の測定により、高脂肪食を受ける際に、腎臓、小腸及び精巣付近の内臓脂肪が、それぞれ1.7、1.5及び2.0倍に均等に成長したことが示された(Table 29(表29))。対照群における内臓脂肪の総質量は、インタクト動物と比較して、およそ1.7倍増加した。得られた結果により、高脂肪食を維持した実験動物において、メタボリックシンドロームの症状の1つである腹部肥満が発症したと結論付ける根拠が与えられた。

雄のラットへのTreamid(0.5mg/kgの用量)の投与により、対照群と比較して、得られた内臓脂肪質量が1.3分の1に低減された。メトフォルミンも同様の効果を有した(Table 29(表29))。

ラットの全血におけるグルコース測定(絶食)の結果をTable 30(表30)に示す。最初の測定は、研究の6週目に、動物への薬物投与前に行った。Table 30(表30)では、標準食のインタクトラットにおいて、食餌6週目のグルコースレベルは3.9±0.3mmol/l、食餌12週目では6.8±0.93mmol/lであった。次に、高脂肪食を維持したラットにおいて、食餌6週目のグルコースレベルは6.7±0.3mmol/l、食餌12週目では11.6±0.9mmol/lであった。したがって、高脂肪食を受けた動物は、メタボリックシンドロームの別の症状である、顕著な高血糖を有した。

実験動物へのTreamidの胃内投与は、高脂肪食の7週目から開始し、血中のグルコースレベルの上昇を阻害した。Treamidの効果は、治療の3週間後に出現し、研究終了まで保持されたTable 30(表30)。

脂質代謝に関するTreamidの効果を、研究12週目に、TCh、TG、LDL、HDL、及びアテローム形成指数を測定することによって推定した。

動物における「カフェテリアダイエット」の使用は、インタクト動物と比較して、総コレステロール、TG、LDLのレベルの顕著に統計的に有意な上昇と、HDLのレベルの低下をもたらした(Table 31(表31))。対照群の動物における計算指数である、アテローム形成指数は、インタクト動物の指数より4.2倍高かった。Treamidの胃内投与により、HDLのレベルは1.5±0.2から1.9±0.2に上昇し、アテローム形成指数は2.1±0.4から0.9±0.2に減少した。このことにより、Treamidの長期投与は抗アテローム形成効果をもたらすと結論付ける根拠が与えられる(Table 31(表31))。

Table 31(表31)は、「カフェテリアダイエット」を受けた群において、精子細胞総数及び運動精子形態の割合が、標準食を維持した動物より2分の1低かったことを示す。これは、代謝障害の男性における精子の質の衰えに関する臨床データに対応する。Treamidの胃内投与により、精子細胞総数は1.7倍、運動精子形態の割合は1.5倍増加し、これらの指数をインタクト動物のレベルにもたらした。したがって、Treamidは、メタボリックシンドロームの主な症状に治療効果を有するだけでなく、既存の病理によって衰えた精子の質を修復すると結論付けることができる。

メトフォルミン治療も精子細胞総数を1.8倍増加させたが、Treamidと異なり、運動精子形態の割合には影響を及ぼさなかった(Table 32(表32))。

したがって、雄のメタボリックシンドロームにおいて、Treamidは、血中グルコースの上昇を低減させ、アテローム形成指数を低減させ、病理の存在下で増加した内臓脂肪の量を低減させ、内分泌障害により低減した精子細胞総数及びそれらの運動形態の割合を修復する。これは、Treamidの膵臓及び精巣組織の機能を修復する能力を確認するものである。Treamidは、メタボリックシンドローム及び精巣組織の機能低減において、投与が推奨される。

(実施例11)
メタボリックシンドロームモデルの雄のマウスの生殖能力に関するTreamidの効果についての研究
代謝障害は、次のようにシミュレーションした:誕生の2日後に、雄のC57Bl/6マウスに、甲領域において、200mg/kgの用量のストレプトゾトシンで1回皮下注射し、注射した溶液の体積は30μlであった。誕生の4週間後から、動物を高脂肪食に移した。この目的のために、使用した食餌は、重い飽和脂肪が豊富であった(30%の脂肪)(30%の脂肪を有するSiff EF R/M Cat No. E15116-34、Germany)。動物には、42日間高脂肪食を維持した(研究の28日目から70日目まで)。Treamidを、実験の49日目から80日目まで毎日、1日1回、10mg/kgの用量で胃内投与した。対照動物は、試験化合物の代わりに等量の溶媒を受けた。

雄の生殖能力は、次のように推定した:インタクトの雌を、研究の70日目から80日目までの期間、1:2の比で、雄の実験群に入れた。この期間、実験群の雄には、1日1回、10mg/kgの用量でTreamidを胃内投与し続けた。

交尾期間終了時の研究の80日目に、雄をCO₂チャンバー内で安楽死させた。動物の血液を採取し、酵素免疫検定法により遊離テストステロンの血清中レベルについて解析した。安楽死は、朝9:30〜11:00の時間に行った。

雌は、妊娠18日目にCO₂チャンバー内で屠殺した。子宮内の胎仔を検査した。生殖能力指数(FI)を計算して生殖能力を評価した:FI=受精した雌の数/雄と一緒に入れられた雌の数×100%。

代謝障害のシミュレーションと実験80日目の10mg/kgの用量のTreamid投与後のC57Bl/6マウスの雄の血清中の遊離テストステロンについての研究の結果は、Table 33(表33)に表す。代謝障害のシミュレーションにより、インタクト動物の群と比較して、1.8分の1の実験80日目の血清中の遊離テストステロンの濃度の低下が生じた(Table 33(表33))。

10mg/kgの用量のTreamidの投与過程により、代謝障害を有するマウスの血清中の遊離テストステロンのレベルは、病理対照と比較して2倍、インタクト動物と比較して16%上昇した。

したがって、10mg/kgの用量のTreamidは、代謝障害を有するマウスの血清中の遊離テストステロンのレベルを修復する。

代謝障害のシミュレーション及び10mg/kgの用量のTreamid投与の70〜80日後のマウスの生殖能力についての研究の結果は、Table 34(表34)に表す。

研究70〜80日目の代謝障害を有する雄の生殖能力指数は、インタクト対照と比較して2.8分の1に低減したことが分かった。49日目から80日目までに10mg/kgの用量のTreamidを受けた代謝障害を有する雄において、生殖能力指数は、代謝障害が未処置の雄(病理対照)より1.8倍高かったTable 34(表34)。

したがって、メタボリックシンドロームモデルでは、Treamidは、雄のマウスの精巣組織の機能を有効に修復し、動物の生殖能力を増大させる。Treamidは、メタボリックシンドローム、性腺機能低下症及び男性不妊の処置に対して推奨される。

(実施例12)
慢性中毒性肝炎モデルの肝臓組織の回復に関するTreamidの効果についての研究
慢性中毒性肝炎は、雄のCBA/CaLacマウスにおいて、研究の0、3、7、10、14、及び17日目にマウス1頭当たり0.2mlの体積で、オリーブ油中20%の四塩化炭素(CCl₄)溶液を胃内投与することにより誘導した。Treamidは、研究の14日目から27日目までに、毎日、1日1回、10mg/kgの用量で胃内投与した。28日目に、動物をCO₂チャンバー内で安楽死させ、肝生検試料を組織解析のために採取した。

組織学的検査のために、肝臓を10%の中性ホルマリン溶液で固定し、次いで、標準方法によってパラフィンを注いだ。厚さ5μmの脱パラフィン切片を染色した:1)通常の組織学的検査のための標準手順に従ってヘマトキシリンエオジンを用いる、2)グラフィックデータ処理ソフトウェアを使用して、結合組織の面積を計算するためにpicrofuxinを用いた。

研究の結果により、CCl₄の最後の注射の2週間後に、中毒性肝炎に特異的な形態学的変化がマウスの肝臓において記録された。したがって、ヘマトキシリンエオジンで染色した調製物は、小及び中程度の脂肪滴変性、肝細胞の単細胞及び架橋様ネクローシス、並びに異なる重症度の肝実質の炎症性の細胞(主にマクロファージ及びリンパ球)による浸潤の発症を示した(図3)。更に、肝臓のビーム構造は、浮腫及び静脈過多により崩壊した。後者は、CCl₄を投与したマウスの肝臓における血流力学的障害を示す。

picrofuxinを用いる肝臓調製物の染色は、中毒性肝炎を有する動物において、門脈周囲ゾーンにおける結合組織の含有量の増加及び門脈スペースからの中隔コラーゲンの増殖の記録を可能にした(図3)。

動物への10mg/kgの用量のTreamidの胃内投与により、病理対照と比較して、罹患した肝臓の炎症性細胞の浸潤の重症度は有意に低減され、単細胞ネクローシスの量及び脂肪変性の強度は低減され、病気の動物の肝臓の結合組織の含有量は著しく低減された。実験28日目に処置された動物の肝臓の組織学的パターンは、インタクト対照のものと異ならなかった(図3)。

したがって、慢性中毒性肝炎モデルでは、Treamidは、肝臓組織の再生効果を有し、線維形成を低減させ、脂肪変性の強度を低減させ、ネクローシスの発症を予防した。これは、Treamidは、肝臓組織の構造及び機能的特徴を修復する薬物として使用することができるとの結論を可能にする。

(実施例13)
肺気腫モデルの肺組織の回復に関するTreamidの効果についての研究
肺気腫は、0.9%のNaCl 30μl中マウス1頭当たり0.6uの用量でエラスターゼ(Sigma社、USA)を単回気管内投与することによって、雌のC57Bl/6マウスにおいて誘導された[Luthje L.、Raupach T.、Michels H.ら//Respiratory Research 2009、10:7]。操作日を実験0日目とした。Treamidは、研究の7日目から60日目までに、毎日、1日1回、10mg/kgの用量で胃内投与した。7、14、30及び60日目に、動物をCO₂チャンバー内で安楽死させ、それらの肺を単離した。

肺組織において発症した気腫の力学及び重症度を、組織学的調製物について評価した。このために、肺を10%の中性ホルマリン溶液で固定し、次いで、標準方法により、パラフィンを注いだ。厚さ5μmの肺尖、中肺野、及び下肺野の調製物を脱パラフィン切片から調製し、標準手順によりヘマトキシリンエオジンで染色した。更に、肺尖、中肺野、及び下肺野の写真を作製し、気腫の位置及び面積をグラフィック処理ソフトウェアを使用することによって研究した。気腫により拡大した肺組織の面積(正常組織の%)を気腫発症の推定スコアとして測定し、血管及び気管支を計算から除外した[ArrateMunoz-Barrutia、Mario Ceresa、Xabier Artaechevarria、Luis M.Montuenga、及びCarlos Ortiz-de-Solorzano. Quantification of Lung Damage in an Elastase-Induced Mouse Model of Emphysema//International Journal of Biomedical Imaging. 2012巻、論文ID734734、11頁; Susumu Sato、Erzsebet Bartolak-Suki、Harikrishnan Parameswaran、Hiroshi Hamakawa1及びBela Suki. Scale dependence of structure-function relationship in the emphysematous mouse lung//Front. Physiol. 6:146. doi: 10.3389/fphys.2015.00146]。

実験により、エラスターゼは、肺胞及び細気管支の壁を肥厚させ、腔面積を有意に拡大させ、7日目には肺胞壁を破壊させることが示された(Table 13(表13))。気管支及び細気管支の粘膜は、扇状の縁を有し、円柱状及び立方体の(細気管支において)呼吸系上皮が並び、中程度の剥離性変化が存在した。更に、肺の組織学的調製物は、肺胞間中隔の毛細血管の中程度のうっ血及び微小循環の乱れを示し、肺における微小循環床の血管及び肺胞間中隔の毛細血管の過多が存在した。

エラスターゼ肺組織の重要な部分は、破壊された肺胞間中隔を有する気腫により拡大した肺胞によって占められていた。下肺野における気腫により拡大した組織の面積は、正常な肺の面積の43%に達し、中肺野では6.5%、肺尖では1.3%であった。承知のように、気腫は、主に下肺野に位置した。肺胞の膨張に加えて、肺胞中隔の破壊が存在した。気腫により拡大した肺胞により、変化していない肺胞が圧縮され、肺における局在性無気肺が生じた。7日目に、エラスターゼ肺における結合組織面積は、インタクト対照と比較して3分の1超に(P<0.05)減少した。更に、エラスターゼは、小腸組織のリンパ-マクロファージ浸潤及び炎症性浸潤による肺胞壁の肥厚をもたらしたことに留意されたい。個々の肺胞の腔はまた、マクロファージ及びリンパ球で満たされていた(Table 35(表35))。

14日目に、気腫の進行が観察された:中及び下肺野における気腫により拡大した肺胞の面積の増加が、それぞれ34.1%及び53.6%に達し、それらの壁は肥厚した(Table 35(表35)、図4)。これは、肺胞毛細血管の肥厚と荒廃をもたらした。観察の30日目まで、肺尖及び下肺野における気腫により拡大した組織の割合が増加した。60日目に、指数の値は、30日目におけるものと比較して若干低下した。

マウスへのTreamid投与は、観察期間を通して、肺実質の炎症性浸潤の強度を低下させた。薬物は、病理対照群と比較して、肺尖(7、14、30、及び60日目)及び下肺野(14、30、及び60日目)における気腫により拡大した肺胞の面積を低減させた(Table 35(表35)、図4)。

したがって、Treamidの経口投与は、エラスターゼに誘導された肺気腫モデルの肺組織に関する再生効果を有し、気腫により拡大した肺組織の面積の減少が記録された。これは、Treamidを、肺組織の構造及び機能的特徴を修復する薬物として使用することができるとの結論を可能にする。

(実施例14)
肺線維症の発症に関するTreamidの効果についての研究
肺線維症を引き起こす肺胞上皮の毒性損傷を、30μlの生理食塩水中マウス1頭当たり80μgの用量で、1回、細胞分裂阻害薬であるブレオマイシンを気管内投与することによってシミュレーションした。操作中の麻酔は、吸入エーテルを使用することによって実現させた。術野は、70%エタノール溶液で消毒し、術野の体毛は除去した。皮膚、皮下組織及び首の筋膜を、首の中心線に沿って解剖した。筋肉は、組織の鈍分離の方法によって、器官の腹側で取り外した。ブレオマイシン注射を、Hamiltonシリンジによって、エアフローに沿った吸入で行った。傷を縫合した後、術野を消毒薬で処置した。ブレオマイシン投与を実験0日目とした。

Treamidの有効性及び肺線維症の再生成を、肺における結合組織合成の数及び強度、並びに肺の組織構造学によって推定した。

行われた実験により、ブレオマイシンの単回気管内投与後の雄のC57BL/6マウスの肺の形態学的パターンの変化は、肺線維症に特異的な変化と同様であることが示された。したがって、C57BL/6マウスの肺の組織調製物のVan Giesonに従うpicrofuxinを用いた染色、それに続く結合組織の可視化によって、主に血管及び細気管支周辺の結合組織の顕著な増殖を記録することが可能となる(図5、Table 36(表36))。更に、インタクト対照及び病理対照の動物の肺ホモジネートを酵素免疫検定法によって調査した。Table 37(表37)から分かるように、ブレオマイシンの気管内投与は、I型コラーゲン、総コラーゲン、及びヒドロキシプロリンのレベルを有意に上昇させた。

10mg/kgの用量のTreamidは、肺線維症の処置において有効であった:血管及び細気管支周囲に沈着したコラーゲン線維の量は、インタクト対照のレベルまで低減した(図5、Table 37(表37))。Treamidの抗線維化作用の更なる特徴は、肺線維症を有するマウスの肺ホモジネートにおけるコラーゲン、I型コラーゲン、及びヒドロキシプロリンの濃度の有意な降下であった(Table 37(表37))。

得られた結果により、肺線維症において、Treamidが、コラーゲン線維による線維芽細胞の生成の正常化に現れる抗線維化作用を有するという結論付けが可能となる。これは、肺組織の線維芽細胞を再生するTreamidの能力を示す。したがって、Treamidを、肺線維症の発症を予防し、肺組織の再生に寄与する薬物として使用することができる。

(実施例15)
腫瘍を有する動物のカヘキシーの発症に関するTreamidの効果についての研究
血行性転移するルイス肺癌(LLC)をシミュレーションする場合、雄のC57Bl/6マウスにおいて、カヘキシーが発症した。腫瘍細胞を、0.1mlの生理食塩水中5×10⁶の濃度で、1回、マウスに皮下注射した(Yu-Chou T.、Samuel K.K.、I-Lu L.ら、Preclinical Investigation of the Novel Histone Deacetylase Inhibitor AR-42 in the Treatment of Cancer-Induced Cachexia//JNCI J Natl Cancer Inst (2015) 107(12))。

腫瘍細胞の注射の日を実験1日目とした。Treamidを、研究の15日目から28日目まで毎日、1日1回、10mg/kgの用量で胃内投与した。動物を、腫瘍細胞の導入の1日前(0日目)及び実験の28日目に秤量した。28日目に、動物をCO₂チャンバー内で安楽死させ、血液を回収した。遊離テストステロンのレベルを、酵素免疫検定法によって血清中で決定した。

研究の結果により、原発腫瘍節の質量の減算を含む、ルイス肺癌洗浄の28日後の動物の質量は(病理対照)、健康な動物の群における質量と比較して、1.2分の1に有意に減少したことが示された(Table 38(表38))。Treamidの胃内投与により、ルイス肺癌を有する動物の体重損失は完全に予防された(Table 38(表38))。

血清の免疫酵素解析により、研究の28日目のルイス肺癌を有する病理対照動物において、血清中テストステロンレベルが著しく減少した(インタクト対照の14.8%まで)ことが示された(Table 39(表39))。Treamidの投与過程により、LLCを有する動物の血清中の遊離テストステロンの濃度が有意に増加した。

したがって、ルイス肺癌の発症下で、Treamidの経口投与は、カヘキシーの発症を予防した。Treamidの治療効果は、罹患した動物における遊離テストステロンの血清中レベルの回復で表される、筋肉及び精巣組織の機能の回復による。このことにより、Treamidを、カヘキシーの発症を予防する薬物として使用することができるという結論付けが可能となる。

(実施例40)
医薬組成物

本発明者は、Treamidが、組織再生並びに慢性非細菌性前立腺炎(CAP)及び良性前立腺肥大症(BPH)モデルの前立腺組織の構造の正常化を促進することを見出した。得られたデータにより、Treamidの使用により前立腺上皮組織の再生が促進されるという結論付けが可能となる。これは、萎縮プロセスの重症度の低下に表れる。後者は、明らかに、腺房上皮の機能活性の増加をもたらし、射精の質的特徴の修復を促進することになる。

本出願人は、Treamid投与において、BPHの症状はあまり顕著ではなかったことを、in vivoで実験的に実証した。これらのデータによって、Treamidの抗増殖特性が確認される。

更に、本発明者は、Treamidが、精巣組織の修復再生のプロセスを増強する作用物質であり、精子形成の増殖プールの枯渇によって引き起こされる精巣機能不全の処置において使用することができることを見出した。

得られたデータにより、Treamidが、精子形成組織に対する前駆細胞の機能活性を直接刺激する能力を有することが実証される。

更に、本出願人は、Treamidが、精巣の再生能を回復するための潜在的作用物質であることを実験により確認した。Treamidの投与により、組織再生能が増大した。この薬物は、精子形成の増殖プールの新たな供給源(幹細胞)の形成を直接刺激するだけでなく、それらの形成を刺激する液性因子の作用を増強する。

本出願人はまた、Treamidが、パクリタキセルの投与により低減された精子運動能を修復するということを実験により証明した。

本発明者が表すデータは、Treamidが、関与するコロニー形成細胞の数の減少によって抑制された精巣組織の修復再生を効果的に刺激することが可能であることを示す。

更に、本出願人は、精子無力症の精子細胞の運動能を修復するTreamidの能力を示した。得られたデータにより、Treamidが、精子運動能の回復に対する有効な作用物質であることが示唆される。

更に、本発明者は、Treamidが、性腺機能低下症で観察される精子運動能を修復することを見出した。

多数の実験により、Treamidが、種々の病因(加齢による活動の減退、季節による活動の減退、その他を含む)の交尾活動の回復に対する有効な作用物質であることが確認される。

Treamidが、膵臓組織に再生作用を及ぼすことも示された。Treamidは、グルコース耐性異常及びメタボリックシンドロームを処置するために使用することができる。

Treamidを、肝臓組織の構造及び機能的特徴を修復する薬物として使用することができることも実験により示された。

更に、Treamidを、がん組織の構造及び機能的特徴を修復する薬物として使用することができることが実証された。

Claims (2)

1. 有効量の式(I):
   

   

   の化合物又はその薬学的に許容される塩、及び薬学的に許容される担体を含む、組織再生を刺激するための医薬組成物であって、
   前記組織が、膵臓組織、肝臓組織、肺組織、精子形成組織、精巣組織、及び前立腺組織を含む群から選択される、医薬組成物。
2. 有効量の式(I):
   

   

   の化合物又はその薬学的に許容される塩を含む、組織を再生するための組成物であって、
   前記組織が、膵臓組織、肝臓組織、肺組織、精子形成組織、精巣組織、及び前立腺組織を含む群から選択される、組成物。

Images