KR20180035739A - 조직 재생 및 저하된 조직 기능의 회복을 자극하기 위한 제제로서의 디카르복시산의 비스아미드 유도체 - Google Patents

조직 재생 및 저하된 조직 기능의 회복을 자극하기 위한 제제로서의 디카르복시산의 비스아미드 유도체 Download PDF

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Abstract

본 발명은 의약 분야에 관한 것이고, 조직 재생 및 저하된 조직 및 기관 기능의 회복을 자극하는 제제에 관한 것이다. 대사 증후군, 내당능 장애, 간염, 특히 만성 간염 및 독성 간염, 특발성 폐 섬유증(IPF), 폐기종, 만성 폐색성 폐 질환(COPD) 및 악액질, 특히 내당능 장애, 폐 섬유증, 만성 폐색성 폐 질환, 암 및 기타 질환의 결과로서 악액질을 포함하는 군으로부터 선택되는 병리학적 상태의 치료 및/또는 예방을 위한 의약 제제는 트레아미드를 기반으로 하는 제제 형태로 제안된다. 트레아미드는 하기 화학식 (I)의 디카르복시산의 비스아미드 유도체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염이다.
화학식 (I)

Description

조직 재생 및 저하된 조직 기능의 회복을 자극하기 위한 제제로서의 디카르복시산의 비스아미드 유도체
본 발명은 약학 분야, 특히 약리학, 비뇨기과, 남성의학, 내분비학, 기도학, 위장병학 분야에 관한 것이고, 조직 재생 및 조직과 기관의 기능 저하의 회복을 자극하는 제제에 관한 것이다.
더 구체적으로, 본 발명은 조직 재생 및 조직과 기관의 저하된 기능의 회복을 자극하는 방법, 더 구체적으로는 췌장 조직, 간 조직, 폐 조직, 근육 조직, 정자형성 조직, 정소 조직 및 전립선 조직의 저하된 기능의 회복 및 재생에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 생식선 기능 저하증, 특히 저생식선자극호르몬 또는 고생식선자극호르몬 생식선 기능저하증, 정자무력증, 발기부전, 상관성 정소 기능장애, 정소 기능장애 및 기타 장애와 같은 병리학적 상태에 의해 유발될 수 있는 저하된 남성 생식력을 정상화(남성 불임의 치료)하기 위한 제제에 관한 것이다.
본 발명은 대사 증후군, 내당능 장애, 간염, 특히 만성 간염, 특발성 폐 섬유증, 폐기종, 만성 폐색성 폐질환, 악액질, 생식선 기능저하증, 바람직하게는 저생식선자극호르몬 생식선 기능저하증 또는 고생식선자극호르몬 생식선 기능저하증, 전립선염, 양성 전립선 비대증, 상관성 정소 기능장애 및 자가면역성 정소염을 포함하는 군으로부터 선택되는 병리학적 상태의 치료 및 예방에 사용될 수 있다.
또한, 본 발명은 정자 운동성을 회복시키는 제제에 관한 것이다.
많은 병리학적 상태, 예컨대 대사 증후군, 내당능 장애, 간염, 폐기종, 만성 폐색성 폐질환, 전립선염, 양성 전립선 비대증, 생식선 기능저하증, 정소 기능장애, 정자무력증은 이환 기관의 기능적 활성의 저하 및 구조적 손상을 동반한다.
대사 증후군은 다양한 대사 및 호르몬 장애를 포함하는 병리학적 증상-컴플렉스이다. "대사 증후군"이란 진단은 복부 비만과 다음과 같은 요인들 중 2가지 이상의 존재에 의해 내려진다: 1) 트리글리세라이드 수준의 증가, ≥150 mg/dl 1.7mM/1), 2) 고밀도 지단백(HDL) 콜레스테롤 수준의 저하, <40 mg/dl(1.03 mM/1)(남성), <50 mg/dl(1.29mM/1)(여성), 3) 동맥고혈압(동맥 압력(AP) ≥ 130/85 mmHg 또는 저혈압약에 의해 조절된 정상 AP), 및 4) 혈당 수치의 증가 ≥ 100 mg/dl(5.6mM/l). 오늘날, 대사증후군은 남성과 여성에서 거의 동일하게 흔하고; 그 빈도는 예컨대 미국에서 39%에 달한다[Flegal K.M., Carroll M.D., Ogden C.L., et al. Prevalence and trends in obesity among US adults, 1999-2000// The Journal of the American Medical Association. 2002. Vol. 288(14). P. 1723-1727].
다른 저자들의 데이터에 따르면, 생식선기능저하증(테스토스테론 결핍)은 비만과 다른 증상의 대사 증후군(테스토스테론 결핍)이 있는 남성의 30 내지 50%에서 발견된다. 많은 연구자들은 대사 증후군이 있는 남성에서 생식선기능저하증의 높은 우세뿐만 아니라 총 테스토스테론 혈장 수준과 대사 증후군의 증상들간의 관계를 발견했다. 과체중과 낮은 테스토스테론 수준 사이의 관계뿐만 아니라 인슐린 내성과 비만이 있는 남성의 혈청 중 저하된 테스토스테론 수준의 관계에 대한 보고들이 있다[Svartberg J., von Muhlen D., Sundsfjord J., et al. Waist circumference and testosterone levels in community dwelling men. The Tromso study// European Journal of Epidemiology. 2004. Vol. 19(7). P. 657-667]. 남성의 인슐린 내성과 대사 증후군의 혈청 테스토스테론 수준의 저하는 정소 조직의 기능 활성 장애의 결과이다. 이에 따라, 개별 질환 및 대사 증후군과 관련된 질환으로서 생식선기능저하증을 치료하기 위한 정소 조직의 재생 방법은 현재 유력한 것이다.
성인 췌장은 약 109 세포를 함유한다. 보통 기능이 다한 β-세포는 췌장에서 증식하는 새 β-세포로 지속적으로 교체된다(Minami K., Seino S. Current status of regeneration of pancreatic β-cells. Journal of Diabetes investigation. Volume 4, Issue 2. pages 131-141 March 2013). 다양한 췌장 장애, 예컨대 자가면역 또는 독성 장애에서, 랑게르한스섬의 β-세포는 먼저 인슐린 생산 감소로 자명해지는 기능 활성의 저하를 특징으로 하며, 이후 단계들로 사망한다. 췌장 조직 손상의 명백한 증상은 90%가 넘는 β-세포가 파괴되고 인슐린 결핍이 영구적이 되어 외부에서 주입된 인슐린에 완전한 의존성을 초래할 때 나타난다.
인슐린 요법은 랑게르한스섬이 정상적으로 기능할 때 제공되는 혈당 조절을 정확하지 못하게 한다. 손상된 췌장은 랑게르한스섬, β-세포 및 전체 기관의 이식으로 치료하려는 시도들이 여전히 존재한다. 하지만, 이식은 항상 성공적인 것은 아니다(종종 이식 거부가 일어난다). 성공적인 이식 시, 환자는 이어서 면역억제 약물을 지속적으로 필요로 할 것이다.
다른 문제는 내당능 장애이다. 이는 내인성 또는 외인성 인슐린에 대한 대사반응의 장애이다.이 상태는 기존 포도당 농도의 생리학적 수치 대비 인슐린 혈장 농도를 증가시킨다. 근육, 지방 및 간 조직에서 내당능 장애는 가장 임상적으로 중요하다. 근육 조직에서의 내당능 장애는 혈액으로부터 근세포로의 포도당의 흡수 및 근육 세포에서의 이용성을 저하시키고, 지방 조직에서의 내당능 장애는 인슐린의 항-지방분해 작용에 대한 저항성으로 자명해져 유리 지방산(FFA) 및 글리세롤을 축적시킨다. FFA는 간으로 들어가서 초저밀도 죽종형성 지단백(VLDAL) 형성의 주요 근원이 된다. 간조직에서의 내당능 장애는 글리코겐 합성 저하 및 글리코겐의 포도당으로의 분해(글리코겐분해) 활성화 및 아미노산, 젖산염, 피루브산염 및 글리세롤로부터 포도당의 새로운 합성(당신생)을 특징으로 한다. 따라서, 조직들에서 내당능 장애의 치료는 조직의 기능 활성이 복원될 수 있게 한다.
간은 활력 신체 샘(gland)이다. 간은 소화, 독성 물질의 불활성화, 혈액 응고 성분의 합성, 단백질, 아미노산, 지방, 탄수화물, 핵산, 비타민, 미량원소의 대사 등의 과정들을 지원하는 약 500가지의 고유 기능을 수행한다. 간 조직은 종종 화학적, 미생물학적, 외상적, 약학적 및 기타 부작용 요인들에 의해 손상된다. 이는 기능성 간세포의 수를 감소시킨다. 다양한 병인의 만성 간염은 수년 동안 지속될 수 있고, 간경변 및 만성 간부전으로 발달할 가능성이 급증할 때 종종 만성 간염 후기로 진단된다[Jung Y1, Witek RP, Syn WK. Signals from dying hepatocytes trigger growth of liver progenitors// Gut. - 2010. - Vol. 5. P. 655-65].
공지된 간세포보호제는 Essentiale, 리포산, Sirepar 및 α-토코페롤이다. 하지만, 이 약물들은 모두 간염 발병의 별개의 단계들에만 작용하기 때문에 간세포의 막, 미토콘드리아 및 다른 구조들의 기능 장애를 완전히 보호하거나 복원할 수 없다. 이와 관련하여, 복합 치료법은 혈액보호제(hemoprotector)의 사용을 수반한다. 하지만, 간염 치료에 대한 이러한 시도는 다중약물요법으로 인한 약물의 상호작용 및 질병 과정 자체의 합병증으로 인해 위험하다. 또한, 이 그룹의 거의 모든 약물은 사용을 제한하는 부작용이 있다. 이러한 관점에서, 간 재생을 효과적으로 자극할 수 있는 방법의 개발이 현재 진행중이다.
남성 불임의 가장 빈번한 임상 병리상태 중 하나는 부성선(sex accessory gland)의 염증 질환이다.
부성선의 염증 질환은 염증과 관련있는 전립선의 질환, 예컨대 급성 세균 전립선염, 만성 세균 전립선염, BPH(양성 전립선 비대증), 뿐만 아니라 정낭 염증, 예컨대 급성 또는 만성 정낭염을 포함한다. 또한, 전립선 질환은 만성 무균성 전립선염, 만성 비-염증성 전립선염 및 카테고리 3B 전립선염도 포함한다[Ludwig M, Vidal A, Diemer Th, Pabst W, Failing K, Weidner W. Chronic prostatitis/chronic pelvic pain syndrome: seminal markers of inflammation.// World J Urol. 2003. Vol. 21, N2. P. 82-85].
상기 병리상태는 남성의 40 내지 70%에서 일어난다. 병리정자증을 가진 남성의 40%는 만성 전립선염을 갖고 있고, 이 중 80%는 무균성이다(Benway B.M., Moon T.D.//Urol Clin North Am 2008 Feb; 35(1): 23-32).
특히, 전립선의 만성 염증은 양성 전립선 비대증(BPH)과 빈번하게 관련이 있다는 것을 유념해야 한다. BPH-관련된 고프로락틴혈증은 발기 부전, 희소정자증을 야기한다. 이것은 물론 남성 생식능력을 감소시킨다[Johri A.M., Heaton J.P., Morales A. Severe erectile dysfunction is a marker for hyperprolactinemia // Int J Import Res. 2001. Vol. 13 N3. P. 176-82].
전립선 질환의 많은 양태들은 전립선이 무엇보다 정자 운동성을 지지하는 인자들을 방출하기 때문에 사정 성능에 영향을 미친다. 이와 관련하여, 전립선 질환의 발전 동안 상관성 정소 기능장애(2차 불임)가 밝혀진다. 따라서, 전립선 질환의 치료는 남성 불임에 유리한 영향을 미친다.
현재, 만성 무균성 전립선염 및 BPH의 과정과 관련이 있는 인자들에 양성 효과를 미치는 약물로는 식물 추출물 - Prostamol Uno[Bayane C.W., Ross M., Donnelly F., Habib F.K.// J.Urol. 2000. Vol. 164, N3, Pt.1. P.876-881]를 포함한다. 하지만, 이들은 항상 꽤 효과적인 것은 아니다.
또한, 안드로겐의 형성의 억제(생식선 기능저하증)는 남성 생식력을 저하시킨다[Dohie G.R., Diemer A., Giwerman A., Jungwith A., Kora Z., Kraus C. Man Infertility, European Association of Urology 2014.7].
남성 생식선 기능저하증은 현재 4백만명 내지 5백만명에서 발견된다. 저생식선자극호르몬 생식선 기능저하증(또는 이차 생식선기능저하증)은 생식선자극호르몬 결핍에 의해 유발된다. 일차 생식선기능저하증은 정소(고환) 기능이상에 의해 유발된다. 이의 비-유전성 형태(후천적 저생식선자극호르몬 생식선 기능저하증)는 외부 작용, 약물 투여(합성대사 스테로이드, 메토클로프라미드, 페노티아지드, 마약 등), 및 방사선 치료의 결과일 수 있다[Filicori M. Endocrine basis of reproductive function. - Bologna: Monduzzi Editore, 2000. - R 605; Meczekalski B., Tonetti A., Monteleone R. et al. Hypothalamic amenorrhea with normal body weight : ACTH, allopregnanolone and cortisol responses to corticotrophin - releasing hormone test // Eur. J. Endocrinol. - 2000. - V.142. - R. 280-285].
이차 생식선기능저하증을 가진 환자는 테스토스테론을 처방 받는다[Dohie G.R., Diemer A., Giwerman A., Jungwith A., Kora Z., Kraus C. Man Infertility, European Association of Urology 2014, p.35]. 하지만, 테스토스테론은 많은 투약금기 사항과 부작용이 있다.
공지된 약물인 Tribestan(제조사, Sopharma(Bulgaria))은 남성에서 테스토스테론의 생산을 자극하고 정자 운동성을 증가시키지만, 이 약물의 유효성이 항상 높은 것은 아니다.
성선 병인에 의하여 유발되는 생식선기능저하증(저생식선자극호르몬 생식선기능저하증 또는 정소 기능장애)은 남성 생식력 저하의 가장 흔한 형태이다[Dohie G.R., Diemer A., Giwerman A., Jungwith A., Kora Z., Kraus C. Man Infertility, European Association of Urology 2014, p.8].
이의 출현 원인들 중 하나는 세포증식억제제를 비롯한 약물, 방사선, 온도 증가와 같은 외인성 인자들의 작용이다. 완전 정지까지 떨어지는 정자형성 생산성의 장기간 감소는 A형 정조세포에 영향을 미치는 손상의 결과이다. 이 세포에 의해서만 손상 후 정자형성의 복원이 가능하다. 이 세포는 자신을 정자형성의 전구물질로서 불가역적으로 식별되었고, 줄기 세포처럼 콜로니형성능을 갖고 있기 때문에 정자 세포의 특이성을 잃지 않는다. 이 세포는 정자형성 조직의 재생 능력의 강한 보유력(deep reserve)을 구성한다.
정자형성의 증식 가능성이 정자형성 세포의 이식에 의해 복원될 수 있다는 것은 공지되어 있다. 고생식선자극호르몬 생신선 기능저하증의 약물 요법은 테스토스테론이 권장된다. 이것은 정자감수분열의 최종 단계, 즉, 유사분열후 분열을 자극하여, 정자세포수를 증가시키고 최종 단계를 자극하여 정자형성 생산성을 증가시킨다. 이 약물의 단점은 공지된 것처럼 유사분열적으로 분열되는 정조세포의 자극 불능성이다.
의약 시장에는 정자형성 조직의 재생 능력의 강한 보유력의 고갈을 원인으로 하는 남성 불임의 치료 및 수임된(committed) 콜로니 형성 정자형성 세포 수의 회복을 위한 약물은 없다. 본 발명에 따라 줄기세포 손상으로 인한 정소 부족 시에 남성 생식력을 회복하기 위한 제제는 이 병리상태를 치료하기 위한 기존 치료제들 간에 유사성이 전혀 없다.
많은 경우, 남성 생식력의 감소는 정자의 질 저하가 원인이다. 가장 일반적인 사정 병리상태는 정자무력증이다(Kao S.H. et al. Increase of oxidative stress in human sperm with lower motility. Fertil. and Steril. 2008; 89: 5: 1183-1190). 정자 형성의 정자무력증형 부전은 별개의 질병분류학적 형태로 생각된다. 이는 나이 관련 변화, 흡연, 염증, 호르몬이상 장애, 및 독성과 고온에 대한 노출의 결과이다. 정자무력증의 치료는 그 출현의 원인에 따라 달라진다. 하지만, 이러한 호르몬 약물은 심각한 부작용을 유발하고 금기사항이 있다.
정자무력증은 정자형성을 자극하고 정자 운동성을 증가시키는 Speman 약물로의 치료가 권장된다. 이 약물은 고가이고, 세계 여러 나라에서 자라서 원료 스톡이 제한적인 약초의 복잡한 조성으로 이루어진다. 단점으로서, 크게 효과적이지 않다는 점을 유의해야 한다.
폐기종, 만성 폐색성 폐질환(COPD) 및 특발성 폐 섬유증(IPF)은 장년층 환자(주로 남성)들에서 만성 및 진행성 과정을 특징으로 하는 중증 다인성 폐 질환이다. COPD의 임상 패턴 및 발병은 IPF와 다르다. COPD의 약간 가역성이고 점진성인 기도 폐쇄의 원인은 기도 염증 및 폐포 및 세기관지의 기종성 비대이고[Hogg JC, Timens W: The pathology of chronic obstructive pulmonary disease. Annu rev Pathol 2009, 4: 435-459], 반면 IPF의 폐 기능의 제한은 간질 섬유증의 발달 및 "봉소" 폐의 형성이 원인이다[American Thoracic Society: Idiopathic pulmonary fibrosis: diagnosis and treatment. International consensus statement. American Thoracic Society(ATS), and the European Respiratory Society(ERS). Am J Respir Crit Care Med 2000, 161: 646-664]. 이 2가지 폐 질환의 유병률은 완전히 다르다. 하지만, 매년 IPF의 발생률 및 유병률은 꾸준히 증가하고, 이는 특히 진단 도구의 향상과 관련이 있다. 결과적으로, COPD의 유병률은 항상 매우 높았다. 이 질환은 외부 유해물질(주로 흡연으로 인한)의 흡입과 상당한 관련이 있다.
충분히 많은 수의 실험 및 임상 연구에도 불구하고, 폐기종 및 COPD의 발병의 이해는 제한적이고; 이 질환의 치료에 대한 유효한 시도들은 인식된 것이 없다. 기존의 IPF에 대한 약물 세트는 당코르티코이드, 사이클로포스파미드, 면역억제제 및 항응고제에 제한되고, 합병증의 치료를 목적으로 하며, 본질적으로 유지 요법이다. 현재, Pirfenidone과 같은 치료제만이 IPF 치료용으로 승인되었다. 한편, 임상 실험에서 Pirfenidone은 이 질환의 발달된 단계에서 예측되는 높은 항섬유증 활성을 나타내지 않았다. 또한, 이 약물은 많은 부작용이 있고 고 용량을 필요로 한다.
IPF, COPD, 악성 종양 및 많은 다른 만성 질환의 발달은 급격한 체중 감소와 관련이 있다. 가장 큰 위험은 극도의 쇠약 - 악액질이다. 임상적으로, 악액질은 진행중인 질환 과정, 보통 불균형성 골격근 위축과 관련된 과도한 체중 감소로 명백하게 나타난다.
악액질을 초래하는 질환은 정소 조직의 기능 활성의 감소 및 결과적으로 테스토스테론 수준의 감소를 특징으로 한다. 테스토스테론은 근원세포를 자극하고 위성 세포의 수를 증가시켜 손상된 근육의 단백질 합성 및 회복에 기여한다[Bhasin S., Taylor W.E., Singh R. et al. The mechanisms of androgen effects on body composition: mesenchymal pluripotent cell as the target of androgen action. J. Gerontol Med Sci 2003; 58A: M1103-1110]. 또한, 테스토스테론은 염증유발 사이토킨 IL-1, IL-6, TNFα의 합성을 억제하고, 항염증성 사이토킨 IL-10의 생산을 자극한다. 다양한 질환에서 극도의 쇠약은 염증과 관련이 있다. 염증성 매개인자는 악액질에서 근육 단백질의 합성을 방해하고 지방분해 및 지방산의 베타-산화에 연루되어 있다[Ryden M., Arvidsson E., Blomqvist L., Perbeck L., Dicker A., ArnerP. Targets for TNF-alpha-induced lipolysis in human adipocytes. Biochem Biophys Res Commun 2004; 318: 168-175].
불행하게도, 악액질의 치료에 대한 인정된 단독 접근법은 여전히 없다. 이 상태를 교정하기 위해 수많은 시도들이 이루어졌다. 체중 감소가 심한 환자의 치료법으로는 테스토스테론, 성장 호르몬(소마트로핀), 식욕 자극제(세로토닌 길항물질, 프로제스토겐, 드로나비놀), 및 당신생 억제제(하이드라진 설페이트)의 투약을 포함하지만, 각 효과는 불충분하다.
따라서, 본 발명의 목적은 조직의 감소된 기능들의 회복 및 재생을 위한 제제를 제공하는 것이다. 이러한 제제는 특히 내당능 장애, 간염, 폐기종, 만성 폐색성 폐질환, 특발성 폐섬유증, 악액질의 치료를 촉진할 것이고, 남성의 생식 기능의 회복을 촉진할 것이며, 전술한 공지된 제제들의 단점들을 극복할 것이다.
더 구체적으로, 본 발명의 제1 목적은 조직, 특히 췌장, 간, 폐, 정소, 전립선 및 근육 조직들의 재생을 촉진하는 제제를 제공하는 것이다. 특히, 본 발명에 따른 제제는 정소 조직 및 전립선 조직의 재생을 촉진해야 한다.
본 발명의 다른 목적은 특히 대사 증후군 또는 내당능 장애와 같은 병리학적 상태로 인해 증가된 혈당 수치를 저하시키기 위한 제제를 제공하는 것이다.
본 발명의 한가지 추가 목적은 특히 바이러스성 만성 간염과 같은 병리학적 상태로 인해 저하된 간 기능을 회복시키기 위한 제제를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 특히 생식선 기능저하증, 상관성 정소 기능장애 및 정소 기능장애와 같은 병리상태에 의해 유발되는 저하된 남성 성활동을 정상화시키기 위한 제제를 제공하는 것이다.
본 발명의 추가 목적은 특히 대사 증후군, 전립선염, 생식선 기능저하증, 정자무력증, 정소 기능장애 및 기타 질환으로 인해 저하된 정자 형성(정자 이동성 포함)을 회복시키기 위한 제제를 제공하는 것이다.
본 발명의 한가지 추가 목적은 특히 기종, 특발성 폐 섬유증 및 만성 폐색성 폐질환과 같은 병리상태에 의해 유발되는 폐조직의 장애성 조직건축학 및 기능을 회복시키기 위한 제제를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 간 구조 및 기능을 회복시키기 위한 제제를 제공하는 것이다.
본 발명의 다음 목적은 대사 증후군 및 내당능 장애와 같은 질환에 의해 영향을 받은 췌장 구조 및 기능을 회복시키기 위한 제제를 제공하는 것이다.
이러한 목적들은 상기 병리학적 상태들의 치료 및/또는 예방을 위한 제제로서 사용되는 트레아미드(Treamid)계 약물의 사용으로 인해 달성된다. 이 제제는 하기 화학식 (I)로 표시되는 디카르복시산의 비스아미드 유도체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염이다:
화학식 (I)
Figure pct00001
이 화합물은 금속 킬레이트화 활성과 관련이 있는 질환을 비롯하여 금속 킬레이트화제로서 사용하기에 적합한 신규 화합물에 관한 RU301116822(2014년 10월 20일 공개)에 기술되어 있다.
본 발명자는 먼저 트레아미드(Treamid)가 조직을 효과적으로 재생시키고 감소된 기능을 복원시킬 수 있다는 것을 발견했고; 이것은 특히 남성 생식계 조직에 관한 것이다. 트레아미드는 무균성 전립선염 및 BPH에서 전립선 샘의 형태학적 변화의 중증도를 감소시키고, 정자 운동성을 복원시키며, 성 욕구 및 성교 활동을 증진시키며, 결국 복합적으로 남성 생식 기능을 회복시킨다.
도 1은 무손상(intact) 대조군, 미처리 대사 장애(병리학적 대조군) 70일째, 및 대사 장애군에 트레아미드를 10mg/kg 용량으로 처리하여 70일째인 수컷 C57B1/6 마우스 췌장의 형태학적 패턴이다. 헤마톡실린 및 에오신으로 염색했다.
A: 트레아미드 10mg/kg 용량(x100); B: 무손상 대조군(x100); 병리학적 대조군(x100); D: 트레아미드 10mg/kg 용량(x400); E: 무손상 대조군(x100); F: 무손상 대조군(x400).
도 2는 무손상 대조군, 미처리 대사 장애(병리학적 대조군) 70일째, 및 대사 장애군에 트레아미드를 10mg/kg 용량으로 처리하여 70일째인 수컷 C57B1/6 마우스의 췌장의 형태학적 패턴이다. 반 기슨(Van Gieson)에 의한 피크로푸신(picrofuxin)으로 염색했다.
A: 트레아미드 10mg/kg 용량(x100); B: 무손상 대조군(x100); 병리학적 대조군(x100); D: 트레아미드 10mg/kg 용량(x400); E: 무손상 대조군(x100); F: 병리학적 대조군(x400).
도 3은 무손상 대조군, 만성 독성 간염의 병리학적 대조군, 및 트레아미드 10mg/kg 용량 처리군의 수컷 C57B1/6 마우스의 간의 형태학적 패턴이다; 배율은 100x이고; 표본은 연구 28일째 제조했다.
A, B 및 C는 헤모톡실린 및 에오신으로 염색한 것이고; D, E 및 F는 반 기슨에 의한 피크로푸신으로 염색한 것이며; A와 D는 무손상 대조군이고; B 및 E는 병리학적 대조군이고; C 및 F는 트레아미드 10mg/kg 용량으로 처리된 간염 동물이다.
도 4는 무손상 대조군, 14일 및 30일째 기종을 가진 마우스의 병리학적 대조군 및 30일째에 트레아미드 10mg/kg 용량으로 처리된 동물 군의 수컷 C57B1/6 마우스의 폐의 형태학적 패턴이다. 배율은 100x이다; 헤모톡실린과 에오신으로 염색했다.
무손상 대조군: A - 폐 정점; B - 중간 폐 영역, 및 C - 하부 폐 영역. 병리학적 대조군(14일): D - 폐 정점; E - 중간 폐 영역 및 F 하부 폐 영역. 병리학적 대조군(30일): H - 폐 정점; K - 중간 폐 영역, 및 L - 하부 폐 영역. 트레아미드로 처리된 동물군: M - 폐 정점; N - 중간 폐 영역, 및 O - 하부 폐 영역.
도 5는 무손상 대조군의 수컷 C57Bl/6 마우스(A), 병리학적 대조군(B) 및 10mg/kg 용량의 트레아미드로 처리된 폐섬유증 마우스군의 폐의 형태학적 패턴이다. 반기슨에 의한 피크로푸신으로 염색했다(100x 배율); 표본은 실험 21일째 준비했다.
본 발명은 하기 화학식 (I)의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염의 유효량 및 약학적으로 허용가능한 담체를 함유하는, 조직 재생용 약학적 조성물에 관한 것이다:
화학식 (I)
Figure pct00002
또한, 본 발명은 화학식 (I)의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염인 조직 재생용 약제에 관한 것이다.
본 발명의 한 양태에서, 조직은 췌장 조직, 간 조직, 폐 조직, 근육 조직, 정자형성 조직, 정소 조직 및 전립선 조직을 함유하는 군으로부터 선택된다.
또한, 본 발명은 조직 재생을 필요로 하는 환자에게 화학식 (I)의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염의 유효량을 투여하는 단계를 함유하는, 조직 재생 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 조직 재생에 사용되는, 화학식 (I)의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염의 용도에 관한 것이다. 본 발명의 한 양태에서, 조직은 췌장 조직, 간 조직, 폐 조직, 근육 조직, 정자형성 조직, 정소 조직 및 전립선 조직을 함유하는 군으로부터 선택된다. 또한, 본 발명은 조직의 구조 손상과 관련된 병리학적 상태의 치료에 사용되는 화학식 (I)의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염의 용도에 관한 것이다. 본 발명의 한 양태에서, 병리학적 상태는 대사증후군, 내당능 장애, 간염, 특히 만성 간염 및 독성 간염, 특발성 폐섬유증(IPF), 폐기종, 만성 폐색성 폐질환(COPD) 및 악액질, 특히 내당능 장애, 특발성 폐섬유증, 만성 폐색성 폐 질환, 암 및 기타 질환의 결과로서 악액질을 포함하는 군으로부터 선택된다. 본 발명의 다른 양태에서 질환은 생식선 기능저하증 및 관련된 발기 이상 및/또는 성욕 부전, 전립선염 및 관련 발기이상 및/또는 성욕 부전, 양성 전립선 비대증, 상관성 정소 기능장애 또는 자가면역 정소염이고, 이때 생식선 기능저하증은 바람직하게는 저생식선자극호르몬성 생식선 기능저하증 또는 고생식선자극호르몬성 생식선 기능저하증이다. 전립선염은 무균성 전립선염, 자가면역 전립선염 또는 카테고리 3B 전립선염일 수 있다.
또한, 본 발명은 유효량의 화학식 (I)의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염의 유효량 및 약학적으로 허용가능한 담체를 함유하는, 저하된 남성 생식력을 정상화하기 위한 약학적 조성물에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 화학식 (I)의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염인, 저하된 남성 생식력을 정상화하기 위한 약제에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 치료를 필요로 하는 환자에게 유효량의 화학식 (I)의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 투여하는 단계를 포함하여, 저하된 남성 생식력을 정상화하는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 저하된 남성 생식력을 정상화하기 위해 사용되는 화학식 (I)의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염의 용도에 관한 것이다. 바람직한 양태에서, 저하된 남성 생식력은 생식선 기능저하증, 바람직하게는 저생식선자극호르몬성 생식선 기능저하증 또는 고생식선자극호르몬성 생식선 기능저하증, 정자무력증, 발기부전, 정소 기능장애, 및 기타 질환을 포함하는 병리학적 상태에 의해 유발된다. 저하된 남성 생식력은 또한 억제된 성교 활성 및 성욕에 의해 유발될 수 있고, 특히 전술한 질환들에 의해 촉발될 수 있다.
또한, 본 발명은 유효량의 화학식 (I)의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는, 정자 운동성을 회복시키기 위한 약학적 조성물에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 화학식 (I)의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염인 정자 운동성을 회복시키는 약제에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 치료를 필요로 하는 환자에게 유효량의 화학식 (I)의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 투여하는 단계를을 포함하여, 정자 운동성을 회복시키는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 정자 운동성 저하의 원인이 생식선 기능저하증, 정자무력증, 상관성 정소 기능장애 및 정소 기능장애일 수 있는, 정자 운동성을 회복시키는데 사용되는 화학식 (I)의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염의 용도에 관한 것이다. 또한, 운동성의 저하는 다양한 병인의 성교 활성 및 성욕의 억제에 의해 유발될 수 있다.
또한, 본 발명은 병리학적 상태의 치료 및/또는 예방시 혈당 수치를 감소시키는, 유효량의 화학식 (I)의 화합물을 함유하는 약학적 조성물에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 화학식 (I)의 화합물인, 혈당 수치 감소용 약제에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 치료를 필요로 하는 개체에 치료적 유효량의 화학식 (I)의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 투여하는 단계를 포함하여, 병리학적 상태의 치료 및/또는 예방시 혈당 수치를 감소시키는 방법에 관한 것이다. 병리학적 상태는 대사증후군 및 내당능 장애를 포함하는 군으로부터 선택될 수 있다. 또한, 본 발명은 혈당 수치를 감소시키는데 사용되는 화학식 (I)의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염의 용도에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 병리학적 상태의 치료 및/또는 예방시 간 구조 및 기능을 회복시키는, 유효량의 화학식 (I)의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 및 약학적으로 허용가능한 담체를 함유하는 약학적 조성물에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 간 구조 및 기능을 회복시키기 위한, 화학식 (I)의 화합물인 약제에 관한 것이다. 병리학적 상태는 간염, 특히 만성 간염 및 독성 간염을 포함하는 군으로부터 선택될 수 있다. 또한, 본 발명은 간 구조 및 기능의 회복에 사용되는, 화학식 (I)의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염의 용도에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 유효량의 화학식 (I)의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는, 병리학적 상태의 치료 및/또는 예방시 폐 구조 및 기능을 회복시키는 약학적 조성물에 관한 것이다. 병리학적 상태는 만성 폐색성 폐질환(COPD), 폐기종 및 특발성 폐섬유증을 포함하는 군으로부터 선택된다. 또한, 본 발명은 폐 구조 및 기능을 회복시키기 위한, 화학식 (I)의 화합물인 약제에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 폐 구조 및 기능의 회복에 사용되는 화학식 (I)의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염의 용도에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 유효량의 화학식 (I)의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는, 병리학적 상태의 치료 및/또는 예방시 췌장 구조 및 기능을 회복시키기 위한 약학적 조성물에 관한 것이다. 병리학적 상태는 대사 증후군 및 내당능 장애를 포함하는 군으로부터 선택될 수 있다.
또한, 본 발명은 화학식 (I)의 화합물인, 췌장 구조 및 기능의 회복을 위한 약제에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 췌장 구조 및 기능의 회복에 사용되는, 화학식 (I)의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염의 용도에 관한 것이다.
발명의 상세한 설명
본 발명은 조직 및 기관의 저하된 기능을 회복하고 조직 재생을 자극하기 위한 제제; 더 구체적으로 췌장 조직, 간 조직, 폐 조직, 근육 조직, 정자형성 조직, 정소 조직 및 전립선 조직의 재생 및 저하된 기능의 회복에 관한 것이다.
본 발명의 목적은 조직, 특히 남성 생식선의 활성에 관련된 조직의 재생을 촉진하는 제제이다. 이 제제는 화학식 (I)의 디카르복시산의 비스아미드 유도체, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염으로, 트레아미드(Treamid)로도 알려져 있다:
화학식 (I)
Figure pct00003
본 발명에 따른 화학식 (I)의 화합물의 약학적으로 허용가능한 염은 유기산 부가 염(예컨대, 포름산염, 아세트산염, 말레산염, 타르트르산염, 메탄설폰산염, 벤젠설폰산염, 톨루엔설폰산염 등), 무기 산 부가염(예컨대, 염산염, 브롬화수소산염, 황산염, 인산염 등), 아미노산의 염(예컨대, 아스파르트산의 염, 글루탐산의 염 등), 바람직하게는 염산염 및 아세트산염을 포함한다.
본 발명자는 먼저 트레아미드가 조직을 효과적으로 재생시키고 조직, 특히 남성 생식선의 활성에 관여하는 조직의 저하된 기능을 복원시키는 능력이 있다는 것을 발견했다.
남성 생식선의 활성에 관여하는 조직으로는 다양한 상피 조직, 특히 곱슬정제관의 상피(정소 조직), 전립선 구조 단위(전립선 조직)의 상피(세엽세포의 상피), 및 다양한 결합 조직을 포함한다.
또한, 본 발명자는 트레아미드가 특히 생식선 기능저하증, 상관성 정소 기능장애 및 정소 기능장애와 같은 병리상태에 의해 유발되는 저하된 남성 성 활성을 효과적으로 정상화한다는 것을 발견했다.
또한, 본 발명자는 트레아미드가 특히 생식선 기능저하증, 정자무력증, 상관성 정소 기능장애 및 정소 기능장애와 같은 병인에 의해 유발된 정자 운동성을 효과적으로 회복시킨다는 것을 발견했다.
화학식 (I)의 화합물은 바람직한 치료 효과를 제공하는 유효량으로 투여된다.
화학식 (I)의 화합물은 구강, 국소, 비경구, 비내, 흡입 및 직장을 통해 비독성 약학적으로 허용가능한 담체를 함유하는 단위 용량 형태로 투여될 수 있다. 본원에 사용된 "비경구 투여"란 용어는 피하, 정맥내, 근육내 또는 흉강내 주사 또는 주입을 의미한다.
본 발명에 따른 화학식 (I)의 화합물은 인간 체중 kg당 0.1 내지 100mg의 1일 용량으로, 바람직하게는 1일당 1회 이상으로 0.01 내지 25mg/kg의 용량으로 환자에게 투여될 수 있다.
특히, 특정 환자의 특정 용량은 많은 요인들, 예컨대 사용된 화합물의 활성, 환자 나이, 체중, 성별, 일반적인 건강 상태 및 식이 요법; 약물 투여 시간 및 경로, 인체 배설 속도; 특히 사용된 약물 조합 및 치료받는 개체의 질환 중증도에 따라 달라질 것이다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 화학식 (I)의 화합물을 원하는 결과를 달성하기에 효과적인 양으로 함유하고, 활성제로서 본 발명에 따른 화합물을 근육내, 정맥내, 구강, 설하 투여, 흡입 투여, 비내 및 직장내 투여하기에 적합한 담체 또는 부형제와의 혼합물로 함유하는 단위 투약 형태(예컨대, 고체, 반고체 또는 액체 형태)로 투여될 수 있다. 활성제는 용액, 정제, 환제, 캡슐, 코팅된 환제, 좌약, 에멀젼, 현탁제, 연고, 겔, 패치 및 임의의 다른 투약 형태를 생산하기에 적합한 상용되는 무독성 약학적으로 허용가능한 담체와 함께 조성물에 포함될 수 있다.
다양한 화합물이 부형제로 사용될 수 있고, 그 예로는 당류, 예컨대 포도당, 유당, 또는 자당; 만니톨 또는 소르비톨; 셀룰로오스 유도체; 및/또는 칼슘 포스페이트, 예컨대 트리칼슘 포스페이트 또는 칼슘 하이드로포스페이트가 있다. 결합제로서 적합한 화합물로는 전분 페이스트(예컨대, 옥수수, 밀, 쌀 또는 감자 전분), 젤라틴, 트라가칸트, 메틸셀룰로오스, 하이드록시프로필 메틸셀룰로오스, 소듐 카르복시메틸셀룰로오스, 및/또는 폴리비닐피롤리돈을 포함한다. 필요하다면, 붕해제가 사용될 수 있고, 그 예로는 전술한 전분 및 카르복시메틸전분, 가교된 폴리비닐피롤리돈, 아가 또는 알긴산 또는 이의 염, 예컨대 알긴산 나트륨이 있다. 경우에 따라 사용되는 첨가제로는 유동성 조절제 및 윤활제, 예컨대 실리카, 탈크, 스테아르산 및 이의 염, 예컨대 마그네슘 스테아레이트 또는 칼슘 스테아레이트, 및/또는 프로필렌 글리콜을 포함한다. 코팅된 환제의 코어는 보통 위산 작용에 안정한 층으로 코팅된다. 이 목적을 위해, 경우에 따라 검 아라빅, 탈크, 폴리비닐피롤리돈, 폴리에틸렌 글리콜 및/또는 이산화티탄, 및 적당한 유기 용매 또는 이의 혼합물을 함유할 수 있는, 당류의 농축 용액을 사용하는 것이 가능하다.
안정화제, 증점제, 착색제 및 향미제도 첨가제로서 사용될 수 있다.
연고 베이스로는 탄화수소 연고 베이스, 예컨대 백색 바셀린(바셀리눔 알범) 및 황색 바셀린(바셀리눔 플라범), 바셀린 오일(올레움 바셀리니), 및 백색 및 액체 연고(운켄텀 알범 및 운켄텀 플라범)를 사용하는 것이 가능하고, 고체 파라핀 및 왁스는 점조도 증가 첨가제로 유용하며; 흡수성 연고 베이스, 예컨대 친수성 바셀린(바셀리눔 하이드로필리컴), 라놀린(라놀리눔), 및 콜드 크림(운켄텀 레니엔스); 수-제거성 연고 베이스, 예컨대 친수성 연고(운켄텀 하이드로필럼); 및 수용성 연고 베이스, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜 연고(운켄텀 글리콜리스 폴리아에틸레니); 벤토나이트 베이스 등을 사용하는 것이 가능하다.
메틸셀룰로오스, 카르복시메틸셀룰로오스 나트륨 염, 옥시프로필셀룰로오스, 폴리에틸렌 글리콜 또는 폴리에틸렌 옥사이드, 및 카르보폴은 겔의 베이스로 사용될 수 있다.
좌약용 베이스는 불수용성 베이스, 예컨대 코코아 버터; 수용성 또는 수-혼화성 베이스, 예컨대 젤라틴-글리세롤 또는 폴리에틸렌 옥사이드 베이스; 및 혼합 비누-글리세롤 베이스일 수 있다.
단위 투약 형태를 제조하는데 있어서, 담체와 함께 사용된 활성제의 양은 치료받는 수용체 및 치료제의 특정 투여 경로에 따라 달라질 수 있다.
예를 들어, 본 발명에 따른 화합물이 주사용 용액의 형태로 사용될 때, 이 용액에서 활성제의 양은 최대 5wt%이다. 사용된 희석제는 0.9% 염화나트륨 용액, 증류수, 주사용 노보카인 용액, 링거액, 포도당 용액 및 특수 용해 보조제일 수 있다.
본 발명에 따른 화합물이 정제 또는 좌약 형태로 투여될 때, 그 양은 최대 200mg/단위 투약 형태이다.
본 발명에 따른 투약 형태는 블렌딩, 과립화, 코팅된 환제 성형, 용해 및 동결건조와 같은 표준 방법으로 생산된다.
또한, 트레아미드의 유효성은 이하 실험 실시예에서 입증되며, 이 실시예는 본 발명의 양태들을 예시하기 위한 것이지 그 범위를 제한하는 것이 아니다.
실험 연구에서 수득된 모든 데이터는 비모수적 만-휘트니(Mann-Whitney) U-시험에 의해 통계적으로 처리되었다. 연구에서, 0.05의 유의 수준을 통계적으로 유효한 것으로 간주했다.
실시예 1
정자무력증에서 정자 운동성을 회복시키는 트레아미드의 효과 연구
정자무력증은 현저한 산화촉진제(prooxidant) 성질을 나타내는 에토포사이드(Etoposide)를 사용하여 모의했다. 유리 라디칼 수준의 증가를 유도하는 상기 약물의 사용은 현대 사상에 따라 정자무력증의 직접적인 원인이 산화적 스트레스라는 사실 때문이었다(Kao S.H. et al. Increase of oxidative stress in human sperm with lower motility. Fertil. and Steril. 2008; 89: 5: 1183-1190).
트레아미드는 성숙한 정자의 운동성이 저하된 수컷 래트에게 치료 과정(에토포사이드 투여 후 10일 동안) 및 예방 요법 과정(에토포사이드 투여전 5일 및 투여후 5일 동안)에 5mg/kg의 용량으로 투여했다.
이 실험은 50마리의 수컷 비스타(Wistar) 래트(3개월령)에 대해 수행했다. 에토포사이드는 30mg/kg의 최대 허용 용량으로 정맥내로 한번에 투여했다.
트레아미드의 효과는 부고환에서 분리된 운동성 정자 형태의 퍼센트로 평가했다.
1차 시리즈로, 연구 결과는 140mg/kg의 용량으로 위내 투여한 참조 약물, Speman의 투여로 수득된 것과 비교했다.
연구 결과는 표 1과 2에 제시된다.
에토포사이드를 투여하기 전 5일과 투여후 5일 동안 트레아미드를 공급받은(예방 요법 과정) 동물의 운동성 정자 세포의 수(%)
번호 배경군 대조군 트레아미드, 5.0 mg/kg Speman
1 87.37 75.58 74.67 78.04
2 94.74 66.54 85.26 74.67
3 96.84 70.11 77.42 78.15
4 83.12 63.06 79.09 66.67
5 91.35 58.95 82.72 70.18
X±m 90.68±2.48 66.85±2.86 # 79,83±1,88#*◇ 73,54±2,25 #*
주: 표 1 및 이하 표:
# - 차이가 배경군 대비 유의적이다;
* - 차이가 대조군 대비 유의적이다;
◇ - 차이가 참조 약물 대비 유의적이다.

수컷번호		 그룹명
 배경군 대조군 에토포사이드 투여 후 10일 동안 트레아미드 5.0mg/kg
1 78.10 60.26 65.52
2 74.42 53.79 75.34
3 75.90 57.58 74.55
4 73.63 52.98 69.44
5 79.66 54.38 70.20
M±m 76.34±1.13 55.80±1.36 # 71.01±1.80*
제시된 실험 데이터는 에토포사이드를 투여한 후 5일 및 10일째에(대조군), 운동성 정자 세포의 퍼센트가 유의적으로 감소했고, 배경값의 73 내지 74%였음을 보여주었다. 각각의 실험 시리즈에서, 운동성 정자 세포의 퍼센트는 트레아미드의 투여 시에 대조군(에토포사이드)에 비해, 그리고 1차 시리즈에서는 Speman 약물에 비해 크게 증가했다. 이 실험의 2차 시리즈에서는 실험군에 운동성 정자 세포의 퍼센트는 무손상 동물(배경군)과 다르지 않았다. 수득된 데이터는 트레아미드가 정자 운동성의 회복에 효과적인 제제임을 암시한다.
실시예 2
저생식선자극호르몬성 생식선 기능저하증에서 정자 운동성을 회복시키는 트레아미드의 효과 연구
저생식선자극호르몬성 생식선 기능저하증은 시네스트롤을 투여하여 모의했다. 에스트로겐은 LH(황체형성 호르몬) 및 FSH(난포 자극호르몬)의 분비를 억제할 수 있다. 남성 신체에서 에스트로겐 농도의 증가는 성별 스테로이드 결합 글로불린의 함량 증가를 동반하여, 유리 테스토스테론의 농도를 감소시키고 정자무력증을 출현시킨다.
실험은 36마리의 수컷 비스타 래트(3개월령)에서 수행했다. 실험 시작 후 30일 동안, 모든 수컷 래트(배경군 제외)에게 시네스트롤(Synestrol)을 50 U/kg/일의 용량으로 근육내 주사했다. 또한, 실험 31일부터 45일까지 실험군의 동물들에게는 시네스트롤 외에, 0.5mg/kg 용량의 트레아미드 또는 70mg/kg 용량의 트리베스탄(Tribestan) 참조 약물을 복강내로 투여했다. 트레아미드의 효과는 부고환에서 분리된 운동성 정자 형태의 수(운동성 정자 형태의 퍼센트)로 평가했다. 연구 결과는 시네스트롤(대조군) 및 참조 약물 트리베스탄의 투여군과 비교했다.
연구 결과는 표 3에 제시했다.
운동성 정자 세포 수(%)
번호 배경군 대조군 트레아미드 트리베스탄
1 85.43 0.00 72.63 0.00
2 83.69 53.06 66.67 0.00
3 85.26 55.97 66.99 60.21
4 74.72 58.87 85.55 50.00
5 77.66 21.43 68.08 57.53
6 87.64 65.91 67.04 0.00
7 80.22 47.22 56.84 44.93
8 80.89 50.00 78.65 67.04
9 75.26 64.93 59.09 9.09
X±m 81.20±1.55 46.38±7.27 # 69.06±2.98#*◇ 32.09±9.69#
주: 표 1 및 이하 표:
# - 차이가 배경군 대비 유의적이다;
* - 차이가 대조군 대비 유의적이다;
◇ - 차이가 참조 약물 대비 유의적이다.
제시된 실험 데이터는 무손상 래트에게 운동성 정자 형태의 퍼센트가 81.20±1.55였고, 이는 정상 종에 대응하는 것임을 보여준다. 시네스트롤(Synestrol)을 투여한 동물(대조군)은 운동성 정자 형태의 수가 46.38±7.27%로 현저히 감소했고, 이는 배경값의 57%였다. 실험 동물군에서. 이 지수는 통계상 유의적으로 대조군 값보다 49% 초과했다. 트리베스탄은 효과를 나타내지 않았다.
따라서, 저생식선자극호르몬성 생식선 기능저하증에서 트레아미드는 정자 운동성을 효과적으로 회복시킨다.
실시예 3
성교 활성을 회복시키는 트레아미드의 효과 연구
안드로겐 결핍으로 인한 성교 활성의 감소는 수컷 래트에게 시네스트롤을 투여하여 모의했다.
이 모델은 안드로겐 호르몬 및 에스트로겐 호르몬의 길항작용을 기반으로 한다. 수컷 래트에 시네스트롤의 투여는 동물에서 성적 활성을 억제시킨다.
실험은 36마리의 수컷 비스타 래트(3개월령)에 대해 수행했다. 실험 시작 후 30일 동안, 모든 수컷 래트(무손상군(배경) 제외)는 시네스트롤(Synestrol)을 50 U/kg/일의 용량으로 근육내 주사를 맞았다. 또한, 실험 31일부터 45일까지 실험군의 동물들은 시네스트롤 외에, 1.5mg/kg 용량의 트레아미드 또는 70mg/kg 용량의 트리베스탄(Tribestan) 참조 제제를 복강내로 투여받았다. 성교 활성은 성 행동의 쌍검사로 추정했다. 이 목적을 위해, 이 실험에 시네스트롤을 사전에 4배 주사하여 유발한 발정 단계의 암컷 래트를 포함시켰다. 트레아미드의 효과는 다음과 같은 지표로 추정했다: 최초 교미 시도까지의 잠복기(LFM), 교미 시도 횟수(마운트(mount)), 및 사정 횟수. 수득된 데이터는 실험 전의 같은 동물의 값(1차 시험) 및 대조군의 데이터(2차 시험)와 비교했다.
연구 결과는 표 4에 제시했다.
시네스트롤로 처리된 수컷 래트의 성 행동 지표에 미치는 트레아미드의 효과
번호 1차 시험 2차 시험
LFM, sec 마운트 횟수, abs. 사정하는
동물, %		 LFM, sec 마운트 횟수,
abs.		 사정하는 동물, %
배경군 145.89±84. 42 4.56±0.71 22.22% 84.67±34.91 9.22±1.19 44.44
대조군 387.78±122.24# 7.11±2.86 0.00%# 234.44±55.69# 5.00±1.46# 0.00#
트레아미드 1.5 373.89±112.89# 5.89±1.91 0.00%# 381.22±115.18# 8.00±3.12 ◇44.44*
트리베스탄 425.67±123.67# 5.00±1.56 0.00%# 381.89±123.85# 5.00±1.41# ◇22.22*
주: # - 차이가 P≤0.005에서 배경군 대비 유의적이다, 1회 시험 비교;
* - 차이가 P≤0.005에서 대조군 대비 유의적이다, 1회 시험 비교;
◇ - 차이가 1차 및 2차 시험의 비교 시, 그룹 내 P≤0.005에서 유의적이다.
제시된 실험 데이터는 시네스트롤만을 투여받은 수컷 래트가 무 사정 및 증가된 LFA를 특징으로 한다는 것을 보여주었다. 트레아미드로 처리된 동물에서는 사정이 환자의 44%(및 무손상 동물에서도)에서 기록되었다. 이 숫자는 대조군 값 및 1차 시험에서 동일한 동물의 값을 초과했다. 또한, 실험군에서 교미 시도의 횟수도 대조군 수준으로 복원되었다. 참조 약물 트리베스탄의 효과는 덜 현저했다. 즉, 트레아미드는 안드로겐 결핍 동물의 성교 활성을 효과적으로 복원시킨다.
실시예 4
수컷 래트에서 연령 관련 변화로 인해 저하된 성교 기능 및 성 욕구의 회복에 대한 트레아미드의 효과 연구
발기 부전은 늦은 그리고 노령의 생식 연령(14 내지 19개월)의 동물을 사용하여 모의했다. 성 욕구의 억제는 늦은 생식 연령(14개월)의 동물을 사용하여 모의했다.
트레아미드가 성교 활성에 미치는 효과를 연구하는 실험은 76마리의 비스타 래트(14개월 및 19개월)에 대해 수행했다. 트레아미드는 5mg/kg의 용량으로 14일 동안 위내로 투여했다. 또한, 참조 약물 실데나필(Sildenafil)(100mg, PFIZER PGM, 프랑스)도 주당 2회 3mg/kg의 용량으로 임상용에 해당하는 위내로 투여했다. 성 활성은 성 행동의 쌍-시험으로 평가했다. 이 목적을 위해 시네스트렐을 예비적으로 4배 주사하여 유발시킨 발정기의 암컷 래트를 실험에 포함시켰다. 트레아미드의 효과는 다음과 같은 지표로 평가했다: 1차 교미 시도(LFM)까지의 잠복기, 교미 시도의 횟수(MN), 및 사정 횟수(EN). 수득한 데이터는 트레아미드를 투여하기 전의 동일 동물의 데이터(1차 시험) 및 대조군의 데이터(2차 시험)와 비교했다.
트레아미드가 성 욕구에 미치는 효과를 연구하는 실험은 40마리의 수컷 비스타 래트(14개월령)에 대해 수행했다. 이 병리상태의 치료에서 신규 제제의 목표 연구의 모델은 래트의 성 유발 욕구의 실험 모델로서 사용했다[Xi Chu, Ekaterina S. Zhavbert, Julia L. Dugina, Irina A. Kheyfets, Svetlana A. Sergeeva, Oleg I. Epstein, Anders Agmo Sindenafil and a compound stimulating endothelial NO synthase modity sexual incentive motivation and copulatory behavior in male wistar and fisher 344 // J Sex Med. - 2008. - 5. - P. 2085 - 2009]. 이 모델은 래트가 사회적 동물이고, 성 접촉뿐만 아니라 사회적 접촉을 추구한다는 사실을 기반으로 한다. 성 욕구의 평가는 성 자극 부근에서 소비한 시간 및 "사회적" 및 "성" 자극과 직접적인 접촉 없이 동물의 선호 점수를 측정하는 것을 수반한다. 성 자극은 발정기의 암컷 래트였고, 사회적 자극은 수컷 래트였다.
늦은 생식 연령 및 노령 연령의 동물에 대해 수행한 트레아미드가 성교 행동 및 성 욕구에 미치는 효과의 연구 결과는 표 5 내지 8에 제시했다.
늦은 생식 연령(14개월)의 수컷 래트의 성교 행동의 지표
동물 연령
(개월)		 그룹 1차 시험, 약물 투여전
LFM MN EN
3 배경군 166.00±26.41 7.25±1.22 0.25±0.16
14 대조군 592.83±87.68 # 1.50±0.53 # 0.00±0.00 #
트레아미드
(5 mg/kg)		 559.08±93.55# 1.42±0.50 # 0.00±0.00 #
실데나필
(3 mg/kg)		 610.08±88.34 # 1.58±0.56 # 0.00±0.00 #
트레아미드 투여 후, 늦은 생식 연령(14개월)의 수컷 래트의 성교 행동 지표
동물 연령(개월) 그룹 2차 시험, 14일 투여 코스 후
LFM MN EN
3 배경군 155.88±32.66 11.25±1.88 0.25±0.16
14 대조군 455.91±92.22 # 3.36±0.75 # 0.00±0.00 #
트레아미드
(5 mg/kg)		 364.80±127.66 6.90±1.88 ◇ 0.60±0.22 ◇*
실데나필
(3 mg/kg)		 171.09±78.08 ◇* 6.27±1.27 ◇# 0.00±0.00 #
주:
1 - LFM, 최초 마운트까지의 잠복기.
2 - MN, 마운트 횟수
3 - EN, 사정 횟수.
4 - # - 차이가 동일 시험에서 배경군 대비 유의적이다(p<0.05, 만-휘트니 U 시험)
5 - * - 차이가 동일 시험에서 대조군 대비 유의적이다(p<0.05, 만-휘트니 U 시험)
6 - ◇ - 차이가 1차 시험 그룹 내에서 비교 시 유의적이다(p<0.05, 만-휘트니 U 시험).
표 5와 6에 제시된 데이터는 늦은 생식 연령의 래트가 성 활성의 저하된 지표를 나타낸다는 것을 보여주었다(최초 마운트까지 잠복기의 증가, 마운트 횟수의 감소 및 사정 동물 무검출, 표 5). 트레아미드를 투여받은 동물에서는 최초 마운트까지의 잠복기가 현저하게 감소했고, 마운트 횟수도 증가했으며, 사정 동물이 기록되었다(표 6). 실데나필의 투여는 동물의 성 활성을 더 적은 정도로 향상시켰다: 최초 마운트까지의 잠복기가 감소했고, 마운트 횟수는 증가했지만, 사정 동물은 기록되지 않았다.
즉, 트레아미드는 늦은 생식 연령의 동물의 성교 활성을 회복시키는데 효과적인 제제이다.
초로기 동물(19개월)에 대해 수행된 연구 결과는 표 7에 제시된다.
트레아미드 투여 전 및 투여 후 14일째 초로기 연령(19개월)의 수컷 래트의 성교 행동의 지표
동물 연령
(개월)		 그룹명 1차 시험
(약물 투여 전)		 2차 시험
(14일 투여 코스 후)
LFM (sec) MN (abs.) EN (abs.) LFM (sec) MN (abs.) EN
3 배경군 134.80±28.31 8.90±1.66 0.44±0.18 66.70±10.56 10.20±1.58 0.20±0.13
19 대조군 318.55±100.11# 4.00±0.83 # 0.00±0.00 # 283.91±106.39 6.09±1.52 0.00±0.00 #
트레아미드(5.0 mg/kg) 310.27±94.59 # 4.27±1.04 # 0.00±0.00 # 297.20±117.04 7.90±1.45
◇ 		0.20±0.13 ◇*
주:
1 - LFM, 최초 마운트까지의 잠복기,
2 - MN, 마운트 횟수
3 - EN, 사정 횟수.
4 - # - 차이가 동일 시험에서 배경군 대비 유의적이다(p<0.05, 만-휘트니 U 시험)
5 - * - 차이가 동일 시험에서 대조군 대비 유의적이다(p<0.05, 만-휘트니 U 시험)
6 - ◇ - 차이가 1차 시험군 내에서 비교 시 유의적이다(p<0.05, 만-휘트니 U 시험).
표 7에 제시된 데이터는 대조군의 동물에서 최초 마운트까지의 잠복기가 증가했고, 마운트 횟수가 감소했으며, 사정 동물이 없음을 보여준다. 5mg/kg 용량의 트레아미드를 14일 투여한 후, 마운트 횟수의 증가는 유의적이었고, 사정 동물이 기록되었다.
즉, 본 연구는 트레아미드가 5mg/kg의 용량으로 14일 동안 투여되었을 때 늦은 연령 및 초로기 연령의 래트에서 성교 활동을 회복시킨다는 것을 보여주었다.
트레아미드 투여 전 및 트레아미드 투여 14일 후 늦은 생식 연령의 수컷 래트의 성 욕구의 지표
동물 연령
(개월)		 그룹 2차 시험, 시험 화합물의 투여 후
A, sec B, sec PS, s.u. A, sec B, sex PS, s.u.
3 배경군 240.10±26.38 85.30±25.78 0.74±0.07 261.60±36.58 64.00±7.32 0.77±0.04
14 대조군 106.92±21.20# 113.75±25.31 0.48±0.07# 157.73±46.24# 170.00±42.18# 0.49±0.09#
트레아미드
(5mg/kg)		 132.30±23.69# 113.60±13.77 0.51±0.06# 154.00±41.83#◇ 95.60±29.66 0.64±0.09◇
실데나필
(3mg/kg)		 166.83±26.27# 113.58±22.60 0.59±0.06# 143.18±48.64# 231.18±62.80# 0.41±0.12
#
주:
1 - A, "성" 자극 구역에서 소비한 시간,
2 - B, "사회적" 자극 구역에서 소비한 시간,
3 - PS, 선호 점수 = A/(A+B) x 100,
4 - 교차 사각형 수,
5 - # - 차이가 동일 시험에서 배경군 대비 유의적이다(p<0.05, 만-휘트니 U 시험)
6 - # - 차이가 동일 시험에서 대조군 대비 유의적이다(p<0.05, 만-휘트니 U 시험)
7 - ◇ - 차이가 1차 시험 그룹 내에서 비교 시 유의적이다(p<0.05, 만-휘트니 U 시험).
표 8에 제시된 데이터는 대조군에서 성 자극 부근에서 소비한 시간 및 선호 점수가 무손상 동물에서와 비교 시 더 낮았다는 것을 보여준다(1차 시험). 수득된 데이터는 14개월 동물을 사용하여 제공되는 성 욕구의 억제 모델이 대조군에서 수득되었음을 증명한다. 이는 약물의 시험을 가능하게 한다.
성 자극 구역에서 연구된 수컷 래트가 소비한 측정된 시간 및 실험 개시 전에 계산된 선호 점수는 실험군 및 대조군에서 상기 지표의 값들이 서로 크게 다르지 않다는 것을 보여주었다. 이는 수행된 무작위배정의 정확성 및 암컷 래트가 수컷을 피하지 않고 수컷에 민감하다는 사실을 확인시켜준다.
1차 시험 및 2차 시험에서 수득한 선호 점수 및 사회적 자극 및 성 자극 구역에서 무손상 수컷 래트(배경)가 소비한 평균 시간의 분석은 통계적으로 서로 크게 다르지 않다는 것을 보여주었다. 이는 실험에 사용된 수컷 래트의 욕구 행동의 안정성을 시사하고, 특정 시간 기간(최대 55일) 동안 성 욕구가 동일 수준으로 유지된다는 문헌 데이터를 확인시켜준다.
대조군에 속하는 래트의 1차 및 2차 시험에서 연구된 지표들의 분석은 동물의 성 욕구 수준이 변함없이 유지된다는 것을 보여주었다.
트레아미드는 5mg/kg의 용량으로 투여되었을 때, "성" 자극 부근에서 소비한 시간이 약물의 투여 전에 동일한 동물에서 수득한 값에 비해 증가했다. 동시에, "사회적" 자극 구역에서 소비한 시간은 대조군에 비해 감소했다(2배). 선호 점수는 1차 시험에서보다 통계상 유의적으로 높았고 0.64±0.09에 이르렀다. 수득한 데이터는 5mg/kg의 용량에서 트레아미드 투여가 늦은 생식기의 수컷 래트의 성 욕구에 자극 효과가 있음을 나타낸다. 특히, 이 그룹의 래트에서 선호 점수는 무손상 래트, 즉 "젊은" 동물의 점수와 통계상 유의적으로 다르다는 점을 유념해야 한다.
참조 약물 실데나필(3mg/kg)로 처리된 래트 군에서, 암컷 래트 부근에서 소비한 평균 시간은 증가하지 않았다. 하지만, 사회적 자극 부근에서 소비한 시간은 증가했다. 선호 점수는 초기 수준과 크게 다르지 않았다. 이는 실데나필이 수컷 래트의 성 욕구에 효과가 없음을 나타낸다.
즉, 성숙한 생식기 연령(14개월)의 수컷 래트의 성 욕구 자극제로서 트레아미드 시험은 이 화합물이 늦은 생식 연령의 동물의 성 욕구를 자극한다는 것을 보여주었다. 이 효과는 5mg/kg의 용량에서 명백하게 나타났고; 최적의 치료 기간은 14일이다.
참조 약물 실데나필은 성 욕구 시험에서 활성을 나타내지 않았다. 성교 활성 시험에서 효과는 충분하게 현저하지 않았고 단기적이었다.
실시예 5
성교 활성의 계절적 억제 조건하에 무손상 동물의 수컷 래트의 성교 활성을 회복시키기 위한 트레아미드의 효과 연구
생식 활성의 계절적 억제는 동절기(12월말)에 실험을 수행하여 모의했다. 배경군으로 무손상 동물(3개월령)을 6월에 시험했다.
실험은 생식 연령(3개월)의 27마리 수컷 비스타 래트에서 수행했다. 5mg/kg 용량의 트레아미드 및 참조 약물 실데나필(3mg/kg 용량)을 주당 2회, 15일 동안은 매일 1회씩 위내로 투여했다. 성 활성은 성 행동의 쌍-시험으로 추정했다. 이 시험은 2회, 즉 투여 전 및 트레아미드 최종 투여 1시간후에 수행했다. 용매를 투여받은 대조군의 래트는 실험군의 동물과 동시에 시험했다.
또한, 이 실험은 시네스트렐의 예비 4배 주사로 유발된 발정기의 암컷 래트의 사용을 포함했다. 트레아미드의 효과는 다음과 같은 지표로 추정했다: 최초 교미 시도까지의 잠복기(LFM), 교미 시도 횟수(MN), 및 사정 횟수(EN). 수득한 데이터는 시험 화합물을 투여하기 전인 동일 동물의 데이터 및 대조군의 데이터(2차 시험)와 비교했다.
대조군 및 실험군에 속하는 동물의 성교 활성의 비교 결과는 표 9에 제시했다.
계절적 억제 모델에서 수컷 래트의 성교 행동 지표에 미치는 트레아미드의 효과
번호 1차 및 2차 시험
LFM, sec 마운트 횟수,
abs.		 사정 횟수
%		 LFM, sec 마운트 횟수,
abs.		 사정 횟수,
%
대조군 466.56±114.21 3.44±1.23 0% 331.11±116.11 4.56±1.28 11%
트레아미드
5.0 mg/kg		 462.00±117.81 3.67±1.34 0% 251.33±103.86◆ 6.56±1.68 33%◆
비아그라 473.00±137.58 3.33±1.27 0% 308.22±117.73 5.67±1.76 0%
◆ - 차이가 1차 시험 대비, 즉 유도체 투여 전 및 후에 유의적이다.
배경군의 수컷 래트를 시험한 결과는 이 동물이 충분히 높고 안정한 비율의 성 활성을 특징적으로 나타냈음을 보여주었다. 최초 마운트까지의 평균 잠복기는 114초였고, 마운트 횟수는 14.7이었으며, 교미 횟수는 0.33이었다. "동절기"와 "하절기"의 시험 지표의 비교는 "동절기"에 최초 교미 시도까지의 잠복기가 4배 증가하고 교미 시도 횟수도 3.4배 감소한다는 것을 보여준다(P≤0.05). 또한, 동절기에 대조군의 수컷에서 사정은 관찰되지 않았다(P≤0.05).
실데나필의 투여는 성 활성의 계절적 억제하에 수컷 래트의 성 행동에 큰 영향을 미치지 않았다. 투여 전 및 후에, 연구된 지표들은 그룹 내에서 차이가 없었고 대조군의 지표와 다르지 않았다. 5mg/kg 용량의 트레아미드로 처리된 수컷 래트의 성 활성을 모니터한 결과, 최초 마운트까지의 잠복기가 투여 후, 시험 전과 비교 시, 1.8배 정도 크게 감소했고, 이는 약물이 성적 유인 센터에서 어느 정도는 성교 활성에 미치는 자극 효과가 있음을 나타낸다. 교미 시도의 총 횟수는 1.8배 증가했지만, 차이는 통계적으로 무의미했다. 사정이 관찰된 그룹 내 동물의 계산된 수는 트레아미드의 투여 후 33%에서 사정이 검출된 반면, 약물 투여 전에는 이 동물들은 사정을 하지 않았음을 보여주었다(P≤0.05).
즉, 수득된 데이터는 성 활성에 계절적 감소의 조건 하에서 수컷 래트의 성 활성을 회복시키는 트레아미드의 능력에 대한 확실한 증거이다.
실시예 6
만성 무균성 전립선염(CAP) 또는 양성 전립선 비대증( BPH )에서 전립선 조직의 구조를 재생 및 정상화하기 위한 트레아미드의 효과 연구
이것은 상기 질환들에 전형적인 형태학적 변화의 중증도 감소로 인해 명백하게 나타난다. CAP는 샘의 배측엽(ventral lobe)을 견사로 봉합하여 모의했고, BPH는 설피라이드(Sulpiride)를 투여하여 모의했다. 참조 약물은 프로스타몰 우노(Prostamol Uno)였다.
트레아미드는 CAP 동물에게 0.5mg/kg의 용량을 15일 동안 위내 투여했다.
BPH 동물에게는 테라미드(Teramide)를 0.5mg/kg의 용량으로 2개월 동안 위내 투여했다.
1. 만성 무균성 전립선염(CAP) 모델에서 전립선 조직의 구조 정상화 및 재생을 위한 트레아미드의 효과 연구
실험은 40마리의 수컷 비스타 래트(3개월령)에 대해 수행했다. 만성 무균성 전립선염을 모의하기 위해, 전립선의 배측 엽을 견사로 봉합했다(마취하에). 양성 전립선 비대증(BHP) 모델은 수컷 래트에게 설피라이드를 40mg/kg 용량으로 매일 2개월 동안 복강내 주사하여 고프로락틴혈증을 유도한 래트로 모의했다(Eglonil, Sanofi Winthrop Industry, France).
수술 1개월 후, 실험군의 동물에게 트레아미드를 0.5mg/kg의 용량으로 매일 1회씩 15일 동안 복강내 투여했다. 투여 과정 마지막에 동물의 체중을 재고 CO2 방에서 안락사시켰다. 그 뒤, 샘의 배측 엽을 절개하고, 무게를 재고, 부피를 측정한 뒤, 중량 계수를 계산하고, 형태학적 분석을 수행했다. 이 목적을 위해, 전립선은 포르말린에 고정시키고 파라핀 내로 투입했다. 5㎛ 두께의 파라핀 절편을 결합 조직에 대한 반 기슨법에 따른 헤마톡실린-에오신으로 염색하여, 상피의 상대적 면적을 계산했다. 또한, 위축성 과정 및 발달하는 경화증의 중증도는 정성적으로 평가했다. 이 평가는 샘 절편의 기준 면적에 대하여 컴퓨터 그래픽 분석(AxioCam Erc5s 카메라가 장착된 AxioLab A1 현미경(x10 렌즈, x10 접안렌즈)으로 "AxioVision LE", Carl Zeiss의 이미지 전달 소프트웨어를 사용하여 수행한 10장의 연속 시야의 현미경사진)을 사용하여 수행했다. 분비성 부위에서 결합 조직 격막의 콜라겐 섬유가 점유한 면적을 측정했다. 약물의 효과는 다음과 같은 기준으로 평가했다: 만성 무균성 전립선염의 형태학적 증상(위축 및 경화증)의 더 낮은 강도: 분비성 절편에서 결합 조직 격막의 콜라겐 섬유가 점유한 면적.
연구 결과는 표 10과 11에 제시했다.
CAP를 겪는 래트의 전립선 배측엽의 중량 및 부피에 미치는 트레아미드 효과
그룹 실험 마지막에 동물 체중 전립선 배측
엽의 중량, mg		 전립선 배측엽의 중량 계수, mg/g 전립선 배측엽의 부피, ㎤
배경군 517.40±34.24 682.00±91.56 1.33±0.20 0.66±0.10
대조군 454.40±36.34 536.00±111.29 1.15±0.22 0.49±0.11
0.5mg/kg 용량의 트레아미드 497.60±34.03 976.00±226.62 1.97±0.47 0.90±0.20
프로스타몰 우노,
50mg/kg		 518.40±24.82 728.00±61.27 1.40±0.09 0.71±0.06
주:
1 - # - 차이가 배경군 대비 유의적이다(p<0.05, 만-휘트니 U-시험)
2 - # - 차이가 대조군 대비 유의적이다(p<0.05, 만-휘트니 U-시험)
3 - Ω - 차이가 프로스타몰 우노 군 대비 유의적이다(p<0.05, 만-휘트니 U-시험).
만성 무균성 전립선 염증을 겪고 있는 래트에서 전립선의 배측 부분의 형태측정성 매개변수, %
그룹 콜라겐 섬유 면적 세엽 상피 면적
배경군 0.66±0.27 33.08±4.12
대조군 3.12±0.63# 21.89±2.45#
0.5mg/kg 용량의 트레아미드 2.64±0.12# 26.33±2.63
프로스타몰 우노, 50mg/kg 4.12±0.74# 24.84±3.62#
주:
1 - # - 차이가 배경군 대비 유의적이다(p<0.05, 만-휘트니 U-시험)
2 - # - 차이가 동일 시험의 대조군 대비 유의적이다(p<0.05, 만-휘트니 U-시험)
3 - Ω - 차이가 프로스타몰 우노 군 대비 유의적이다(p<0.05, 만-휘트니 U-시험)
제시된 실험 데이터는 비교된 모든 그룹들에서 샘의 중량, 중량 계수 및 부피가 서로 유의적으로 다르지 않다는 것을 보여준다(표 10). 형태학적 분석(표 11)은 대조군 래트의 전립선에서 세엽 상피 면적이 유의적으로 감소했고(위축) 및 콜라겐 섬유의 면적이 증가했음(경화증)을 보여주었다. 수컷 래트에 0.5mg/kg 용량의 트레아미드의 투여는 세엽 상피 면적을 증가시켰다(22%). 이 매개변수의 값은 배경군의 값과 크게 다르지 않았지만, 대조군에서는 배경군에 비해 현저히 낮았다. 콜라겐 섬유의 면적은 감소하는 경향이 있었다. 수득한 데이터를 프로스타몰 우노의 투여 시 수득한 데이터와 비교했을 때, 프로스타몰 우노는 세엽 상피의 면적에 영향을 미치지 않는 것으로 발견되었다. 수득된 데이터로부터 CAP를 가진 래트에 0.5mg/kg 용량의 트레아미드의 사용이 전립선 상피 조직의 재생을 촉진한다는 결론을 내릴 수 있다. 이는 위축 과정의 심화 감소로 표현된다. 심화 감소는 명백히 세엽 상피의 기능 활성을 증가시킬 것이고 정액의 정성적 특징들의 복원을 촉진할 것이다.
2. 양성 전립선 비대증( BPH ) 모델에서 전립선 조직의 구조의 정상화 및 재생에 미치는 트레아미드의 효과 연구
전립선의 구조를 정상화하는 트레아미드의 능력은 설피라이드(Sulpiride) 투여의 존재하에 연구되었다. 이 목적을 위해, 트레아미드는 설피라이드와 동시에 0.5mg/kg의 용량으로 2개월 동안 위내로 투여했다. 대조용 동물에게는 용매(2% 전분 점액)를 동일한 부피로 투여했다. 비교군의 동물에게는 프로스타몰 우노 용액을 50mg/kg의 용량으로 위내 주사했다. 투여 과정 말에, 동물의 체중을 재고 CO2 방에서 안락사시켰다. 설피라이드는 래트의 샘의 측부 엽에서 BPH의 발달을 유발하는 것으로 알려져 있다[Van Coppenolle Fabien, Christian Slomianny, Francoise Carpentier Effects of Hyperprolactinemia on rat prostate growth: evidence of androgeno - dependence. // Physiol. Endocrinol. Metab. - 2001. - P.120-129]. 이와 관련하여, 이 엽을 절개했다. 이의 중량, 중량 계수 및 부피를 측정했다. 또한, 형태학적 분석을 수행했다. 전립선 샘의 측부 엽은 10% 포르말린에 고정시키고 파라핀에 투입한 뒤, 5㎛ 두께의 절편으로 제조했다. 파라핀 제거한 샘의 절편을 헤마톡실린 및 에오신으로 염색했다. 조직학적 절편에서 기준 절편 면적당 증식 중추 및 딸 세엽의 존재가 측정되었다. 또한, 상피 및 간질 구조의 면적이 조직 절편의 기준 면적에서 측정되었다. 이 매개변수들은 조직학적 절편의 기준 면적에서 컴퓨터 그래픽 분석을 사용함으로써 측정되었다(AxioCam Erc5s 카메라가 장착된 AxioLab A1 현미경(x10 렌즈, x10 접안렌즈)으로 "AxioVision LE", Carl Zeiss의 이미지 전달 소프트웨어를 사용하여 수행한 10장의 연속 시야의 현미경사진). 간질-상피 비는 상피 면적에 대한 간질 면적의 비로 정의되었다.
시험 화합물의 효과는 다음과 같은 기준으로 평가했다: 양성 전립선 비대증의 형태학적 증상들의 더 낮은 강도 - 증식 중추 및 딸 세엽 수의 감소 및 상피 면적 감소.
연구 결과는 표 12 내지 16에 제시했다.
양성 비대증(BPH)을 겪는 래트의 체중; 전립선 샘의 측부 엽의 중량 및 부피
그룹명 실험 마지막에 동물의 체중, g 전립선 측부 엽의 중량, mg 전립선 샘의 측부 엽의 중량 계수, mg/g 전립선 샘의 측부 엽의 부피, ㎤
배경군 559.00±13.39 74.00±9.27 0.13±0.02 0.16±0.02
대조군 약물 564.17±28.17 363.33±31.69# 0.59±0.08# 0.67±0.07#
0.5mg/kg 용량의 트레아미드 540.673±42.78 381.67±70.30# 0.69±0.12# 0.62±0.14#
프로스타몰 우노 496.20±20.34# 396.00±82.98# 0.81±0.18*# 0.70±0.17#
주:
1 - # - 차이가 동일 시험에서 배경군 대비 유의적이다(p<0.05, 만-휘트니 U-시험)
2 - # - 차이가 동일 시험에서 대조군 대비 유의적이다(p<0.05, 만-휘트니 U-시험)
3 - Ω - 차이가 프로스타몰 우노 그룹 대비 유의적이다(p<0.05, 만-휘트니 U-시험)
비대증이 있는 수컷 래트의 전립선 샘의 측부 엽 절편의 기준 면적에 존재하는 세엽 상피의 상대적 면적(%)

동물번호		 그룹 배경군 대조군 0.5mg/kg 용량의 트레아미드 프로스타몰 우노
1 16.24 18.87 8.61 24.02
2 7.11 17.02 10.26 18.02
3 21.33 23.10 14.09 16.63
4 13.78 21.49 16.30 29.10
5 18.67 22.45 20.19 20.05
M±m 15.43±2.43 20.59±1.15# 13.89±2.08* 21.56±2.26
주: 표 13 및 이하 표
1 - # - 차이가 동일 시험에서 배경군 대비 유의적이다(p<0.05, 만-휘트니 U-시험)
2 - # - 차이가 동일 시험에서 대조군 대비 유의적이다(p<0.05, 만-휘트니 U-시험)
3 - Ω - 차이가 프로스타몰 우노 그룹 대비 유의적이다(p<0.05, 만-휘트니 U-시험)
비대증이 있는 수컷 래트의 전립선 샘의 측부 엽 절편의 기준 면적에 존재하는 서로 밀접한 2 내지 3개의 소선으로 이루어진 구조의 수(abs.)

동물번호		 그룹 배경군 대조군 0.5mg/kg 용량의 트레아미드 프로스타몰 우노
1 0 3 0 6
2 0 0 1 3
3 0 2 3 0
4 0 3 4 0
5 0 3 0 0
M±m 0.00±0.00 2.20±0.58# 1.60±0.81# 1.80±1.20
비대증이 있는 수컷 래트의 전립선 샘의 측부 엽 절편의 기준 면적에 존재하는 딸 증식 중추의 수(abs.)

동물번호		 그룹 배경군 대조군 0.5mg/kg 용량의 트레아미드 프로스타몰 우노
1 0 8 3 1
2 0 3 3 2
3 0 4 1 1
4 0 3 0 3
5 0 3 1 2
M±m 0.00±0.00 4.20±0.97# 1.60±0.60# 1.80±0.37#*
비대증이 있는 수컷 래트의 전립선 샘의 측부 엽의 절편의 기준 면적에 존재하는 간질의 상대적 면적(%)

동물번호		 그룹 배경군 대조군 0.5mg/kg 용량의 트레아미드 프로스타몰 우노
1 32.15 46.03 51.82 49.97
2 40.26 45.87 48.61 51.21
3 23.27 45.78 45.59 48.39
4 36.55 40.40 44.14 41.84
5 41.42 39.53 38.12 40.93
M±m 34.73±3.29 43.52±1.46# 45.66±2.30# 46.47±2.13#
주:
1 - # - 차이가 동일 시험에서 배경군 대비 유의적이다(p<0.05, 만-휘트니 U-시험)
2 - # - 차이가 동일 시험에서 대조군 대비 유의적이다(p<0.05, 만-휘트니 U-시험)
3 - Ω - 차이가 프로스타몰 우노 그룹 대비 유의적이다(p<0.05, 만-휘트니 U-시험)
제시된 실험 데이터는 비교된 모든 그룹에서 전립선 샘의 중량 및 이의 중량 계수가 서로 크게 다르지 않았음을 보여주었다(표 12). 정량적 형태학적 분석은 설피라이드의 투여가 기준 절편 면적에서 세엽 상피 면적을 33% 유의적으로 증가시켰음을 보여주었고(표 13), 이는 이 상피의 증진된 증식의 증거이다. 형태학적으로는, 무엇보다도 상피의 유두모양의 돌출의 왕성한 증식으로 표현된다. 설피라이드를 투여받은 래트의 전립선에는 서로 인접한 2 내지 3개의 소선으로 이루어진 구조가 있었다(표 14). 또한, 약 3 내지 8개의 딸 증식 중추가 기준 절편 면적에서 기록되었다(표 15). 간질 구조의 상대적 면적은 유의적으로 22% 증가했다.
BPH의 증상은 트레아미드를 투여한 경우에 덜 현저했다. 즉, 이 그룹의 동물들의 전립선에서는 세엽 상피 면적의 현저한 감소(표 14) 및 딸 증식 중추 수의 감소(표 15)가 관찰되었다. 이 데이터는 시험 화합물의 항증식 성질의 존재를 시사한다. 또한, 참조 약물인 프로스타몰 우노는 치료 효과도 나타냈다. 즉, 설피라이드를 투여받은 수컷 래트에 프로스타몰 우노의 투여는 딸 증식 중추 수를 감소시켰다(표 15). 하지만, 그 효과는 시험 화합물보다 낮았는데, 이는 참조 약물의 투여에서는 검출되지 않았던 상피 면적을 감소시키는 시험 화합물의 능력으로 입증되었다.
따라서, 0.5mg/kg 용량의 트레아미드는 설피라이드 투여의 존재하에 전립선 샘의 형태학적 상태를 효과적으로 복원시키는데, 이는 실험 동물에서 BPH 증상의 중증도 감소로 명백해진다. 그 효과는 참조 약물인 프로스타몰 우노의 효과를 능가한다.
실시예 7
정자형성의 증식 풀의 고갈에 의해 유발된 정소 기능장애의 치료 및 정소 조직의 수복 재생 과정을 강화시키기 위한 트레아미드의 효과 연구
정자형성의 증식 풀의 고갈은 세포증식억제 약물인 파클리탁셀(Mitotax, Dr. Reddy's, India)을 수컷 래트(3개월령)에게 1회 주사하여 모의했다. 이 약물의 선택은 정자형성의 전구체인 줄기 세포를 손상시키는 약제들 중 하나라는 사실 때문이었다.
파클리탁셀은 대조군 및 시험군의 동물에게 최대 허용 용량인 7.6mg/kg을 정맥내로 1회 투여했다. 트레아미드는 파클리탁셀을 투여하고 한 달 후에 실험군의 동물에게 5mg/kg의 용량으로 2% 전분 점액 중의 현탁액 형태로 15일 동안 위내 투여했다. 대조 동물에게는 시험 화합물 대신에 동등한 부피의 용매(2% 전분 점액)를 투여했다.
정자형성 조직의 재생의 강한 보유력(deep reserve)에 미치는 트레아미드의 효과는 수임된 정자형성 줄기 세포의 수를 측정할 수 있게 하는 콜로니 형성력을 평가하는 방법으로 연구했다[A.J. Richards, G.C.Enders, J.L Resnick // Biol. Reprod. - 1999. - Vol. 61. - P. 1146-1151].
파크릴탁셀을 투여하고 1일째(24시간 경과), 45일째 및 65일째에 동물을 안락사시키고, 이들의 정소 표본을 만들었다. 또한, 정소에 존재하는 정자형성의 선조 세포의 함량은 시험관내 클로닝 방법으로 측정했다. 연구된 기관의 선조 세포는 부착성 분획 세포로 표현되는 하층을 사용하여 배양했다. 부착 세포의 하층은 무손상 동물의 하나의 정소를 DMEM 배지에서 균질화하고 원심분리(1500 rpm, 10min)로 세척하여 5% CO2 및 37℃의 조건하에서 제조했다. 그 다음, 최종 세포 슬러리를 부착성 분획과 미부착성 분획으로 나누었다. 이를 위해, 제조된 새포 현탁액 0.5ml를 전구체 세포의 배양 배지 중에 1x106 /ml의 농도로 24웰 평판의 각 웰에 넣고, 다시 CO2 항온배양기에서 37℃, 5% CO2 및 100% 대기 습도 하에 1시간 동안 항온배양했다. 항온배양 후, 세포의 미부착성 일부를 수확했다. 정자형성성 선조 세포를 배양하기 위한 배지를 부착성 세포 분획을 함유하는 웰에 0.5ml의 양으로 넣고, 37℃, 5% CO2 및 100% 대기 습도의 CO2 항온배양기에서 7일 동안 항온배양했다. 7일 후, 배양 배지를 교체한 후, 실험 동물의 정소의 미부착성 세포의 층을 최종 간질 위에 형성시켰다. 이 목적을 위해, 전술한 절차에 따라 세포를 부착성 및 미부착성 분획으로 나누었다. 기관의 균질액을 페트리 접시에서 37℃, 5% CO2 및 100% 대기 습도 하의 CO2 항온배양기에서 1시간 동안 항온배양했다. 그 다음, 미부착성 세포 분획을 수집하고, 세포 수(세포/ml)를 고리에프(Goriaev) 챔버에서 계수했다. 미부착성 세포는 웰당 0.5ml의 부피로 최종 간질 위에 2x105/ml의 농도로 층상화했다. 항온배양은 37℃, 5% CO2 및 100% 대기습도의 CO2 항온배양기에서 7일 동안 지속했다. 항온배양 후, 정자형성성 콜로니 형성 단위(CFU-Sp)의 수(다양한 직경과 둥근 모양의 30개 초과 세포의 클러스터)를 계수했다. 사용된 제제의 효과에 대한 기준은 대조군과 비교하여 시험 동물의 정소 조직에서 CFU-Sp를 발생시키는 세포 수의 유의적인 증가였다.
정자형성 조직의 마이크로환경에서 세포의 콜로니 자극 활성(세르톨리(Sertoli) 세포에 의한 정자형성의 체액 조절인자의 생산)은 다음과 같이 측정했다. 전술한 절차를 사용하여 정소 균질액을 제조하고, 이로부터 부착성 세포 분획을 분리했다. 부착성 세포는 37℃, 5% CO2 및 100% 대기 습도 하에 완전 배양 배지 중에서 24시간 동안 배양했다. 1일 후, 상청액을 수집하고, 20℃의 온도에 저장했다. 상청액에 존재하는 정자형성의 체액 인자의 수준은 무손상 래트의 정소에 대한 CFU-Sp의 시험 시스템으로 시험했다. 수득한 결과는 층상화된 미부착성 세포의 수(105 세포/웰)로부터 증식된 콜로니의 수로 나타냈다.
트레아미드의 효과는 대조군에 비해, 시험 동물의 상청액 세포의 작용 하에 시험 시스템의 세포로부터 증식된 콜로니의 유의적인 증가로 추정했다.
연구된 기관의 전구체 세포는 전술한 바와 같이 미리 96웰 평판에 준비된 하층(부착성 분획의 세포를 나타냄)을 사용하여 배양했다.
또한, 정자형성성 조직의 미부착성 세포 분획은 2 그룹의 동물(무손상 동물 및 연구하기 24시간 전에 정맥내로 파클리탁셀을 투여받은 동물)로부터 분리하고, 완전 배양 배지(80% DMEM, 20% FCS, L-글루타민, 항생제, 헤파린)에서 2x105/ml의 농도로 최종 하층으로 전달했다. 완전 배양 배지에서 항온배양하기 전에, 트레아미드를 1 ng/ml, 3 ng/ml, 10 ng/ml, 30 ng/ml, 100 ng/ml, 300 ng/ml 및 1000 ng/ml의 농도로 첨가했다. 항온배양은 37℃, 5% CO2 및 100% 대기 습도의 CO2 항온배양기에서 7일 동안 지속했다. 항온배양 후, 정자형성성 콜로니 형성 단위(CFU-Sp)의 수(다양한 직경과 둥근 모양의 30개 초과 세포의 클러스터)를 계수했다.
트레아미드의 효과는 대조군에 비해 시험 화합물이 첨가된 배양물에서 CFU-Sp를 발생시키는 세포 수의 유의적인 증가로 추정했다.
정자형성 조직의 형태학적 및 기능적 상태는 수임 줄기 세포의 형성을 자극하는 효능을 추가로 확인하기 위해 평가했다.
이것은 다음과 같은 지표들에 의해 추정되었다: 정조 집단의 세포 수, 세르톨리 세포의 평균수, 정자형성 층의 성숙도, 레이디히(Leydig) 세포 수, 정소의 내분비 활성, 부고환당 정자 세포의 총수 및 운동성 정자 형태의 퍼센트. 이를 위해, 실험 45일, 65 및 90일째 안락사 시에, 부고환 및 정소의 미부를 절제하여 분리했다. 하나의 정소의 부고환은 따뜻한(37℃) 생리학적 식염수에서 균질화하고, 부고환 세포의 현탁액에서 운동성 정자 형태의 수를 측정했다. 부고환(TNS)당 정자 세포의 총수는 백혈구 계수 피펫 및 고리에프 챔버를 사용하여 투여량의 생리학적 식염수 중에서 제2 부고환의 균질화된 세포 현탁액을 사용하여 계산했다.
래트 정소의 형태학적 분석은 카르누아(Carnoy) 액에 고정시키고, 파라핀 절편을 만들어 수행했다. 5㎛ 두께의 탈파라핀화된 절편은 헤모톡실린-에오신으로 염색했다. 정조 집단의 세포 수, 세르톨리 세포 수, 및 레이디히 세포 수는 정소 절편에서 계수했고, 레이디히 세포의 내분비 활성을 측정했다. 정자형성 층의 성숙도는 세르톨리 세포의 계수를 기반으로 하여 계산했다. 계산은 실험군의 경우에는 다음과 같은 식: y = 5.95 - 0.18x에 따라 수행했고; 무손상 동물 그룹의 경우에는 y = 6.7 - 0.23x에 따라 수행했다(여기서, x는 곱슬정세관의 횡단면에 있는 세르톨리 세포의 평균수이고, y는 정자형성 층의 성숙도를 특징적으로 나타내는 지수이다). 연구를 위한 시간을 선택할 때, 한달 반인 래트의 정자형성 기간을 감안했다. 파클리탁셀을 투여한 후 45일 및 65일의 기간은 정조 세포 집단에 대한 효과의 발현에 해당한다.
정소 조직의 재생 과정의 자극의 기준은 정조 집단 중 세포 수의 증가, 세르톨리 세포 수, 정자형성 층의 성숙도 감소 및 정자형성 생산성 증가였다. 정자 세포의 기능적 활성의 기준은 운동성 형태의 퍼센트이다.
연구 결과는 표 17과 18에 제시된다.
파클리탁셀 및 시험 화합물인 트레아미드의 투여 시, 래트 정소에 있는 CFU-Sp 함량의 동역학
연구 시간, 일 그룹 2x105 당 CFU-Sp
(M; SD, n=10)
배경군 5.8; 0.70
1일 파클리탁셀 3.5; 0.69*
45일 파클리탁셀 2.9; 0.48*
트레아미드 4.2; 0.29#
65일 파클리탁셀 2.3; 0.42*
트레아미드 3.4; 0.4#
주:
1. * - 무손상 대조군(배경군)과 시험군 간 지표의 차이가 유의적이었다(p<0.05, 만-휘트니 U-시험)
2. # - 대조군(파클리탁셀)과 시험군 간 차이가 유의적이었다(p<0.05, 만-휘트니 U-시험).
제시된 실험 데이터는 파클리탁셀을 투여한 후 래트 정소에 있는 정자형성 조직의 전구체의 함량에 대한 연구가 실험 1일, 45일 및 65일째에 콜로니(CFU-Sp)를 발생시키는 세포 수의 통계상 유의적인 감소를 나타냈음을 보여주었다(표 17). 즉, 실험 말에 콜로니 형성 세포의 수는 거의 40% 감소했다.
트레아미드의 투여는 조사된 모든 시점에서(실험 45일 및 65일째) 세포증식억제 대조군과 비교 시, 콜로니 형성 세포 수의 유의적인 증가(44 내지 48%)와 관련이 있었다(표 17).
파클리탁셀 및 시험 화합물인 트레아미드의 투여 시, 정소 세포(x105 세포) 적응 배지의 콜로니 자극 활성 수준의 변화
연구 시간, 일 그룹 2x105 당, CFU-Sp
(M; SD, n=10)
배경군 9.25; 0.67
1일 파클리탁셀 3.0; 0.53*
45일 파클리탁셀 6.37; 0.32*
트레아미드 6.12; 0.29*
65일 파클리탁셀 3.25; 0.45*
트레아미드 5.88; 0.52*#
주:
1. * - 무손상 대조군과 지수의 차이가 유의적이었다(p<0.01, 만-휘트니 U 시험),
2. # - 대조군(파클리탁셀)과 시험군 간에 차이가 유의적이었다(p<0.01, 만-휘트니 U 시험)
파클리탁셀의 투여 후 줄기 세포의 콜로니 형성 활성을 감소시키는 기전의 연구는 연구 1일, 45일 및 65일째 정자형성 조직의 전구체로부터 콜로니의 성장을 자극하는, 정자형성 조직의 마이크로환경의 세포들에 의한 체액 인자의 생산 감소를 나타냈다(표 18). 수임 정자형성 세포의 콜로니 형성에 있어서 호르몬 조절의 가장 유의적인 억제(2.8배 및 3배)는 실험 1일과 65일째 검출되었다. 수득된 데이터는 파클리탁셀이 줄기 정조세포에 직접적인 독성 효과를 미칠 뿐만 아니라 마이크로환경 세포의 기능 활성을 억제하여 정자형성 조직의 강한 보유력을 구성하는 세포 재생에 대한 자극 효과를 감소시킨다는 것을 시사한다. 이것은 파클리탁셀의 작용 하에 줄기 정조세포 기능의 호르몬 조절이 억제된다는 것을 시사한다.
실험 65일째, 마이크로환경 세포의 분비 활성이 대조군 대비 트레아미드로 처리된 래트군에서 통계상 유의적으로 증가(80%)하는 것이 관찰되었다(표 18). 이는 트레아미드의 작용 하에 마이크로환경 세포의 기능적 상태가 활성화된다는 것을 시사한다.
정자형성 조직의 전구체에 미치는 트레아미드의 직접적인 작용은 트레아미드를 1, 30, 100 및 1000 ng/ml의 농도로 세포 배양물에 첨가하여 시험관내에서 연구되었다.
이 실험의 결과는 표 19에 제시된다.
시험관내 첨가 시, CFU-Sp로부터 콜로니의 성장에 미치는 트레아미드의 작용(M; SD, n=6)
배양물 중 트레아미드의 농도 4x104 핵당 CFU-Sp
무손상 래트의
정소 세포		 파클리탁셀을 IV 투여한 후
1일째 래트 정소 세포
대조군 7.0±0.58 2.67; 0.33*
트레아미드(1 ng/ml) 6.83±0.48 6.83; 0.60#
트레아미드(30 ng/ml) 6.0±0.36 5.17; 0.65#
트레아미드(100 ng/ml) 8.50±0.42* 4.67; 0.61#
트레아미드(1000 ng/ml) 11.67±1.81* 5.67; 0.33#
주:
1 - ◇ - 차이가 무손상 대조군 대비 유의적이다(p<0.05, 만-휘트니 U 시험);
2 - # - 차이가 세포증식억제 대조군 대비 유의적이다(p<0.05, 만-휘트니 U 시험).
파클리탁셀을 투여한 후 래트 정소에 있는 정자형성 조직의 전구체 함량을 측정한 결과로서, 1일째 콜로니 형성의 통계적으로 유의적인(표 19) 감소가 관찰되었고, 이는 앞서 수득된 데이터에 대응했다.
트레아미드는 무손상 동물의 정자형성 조직의 전구체를 함유하는 완전 배양 배지에 첨가되었을 때(100 ng/ml 및 1000 ng/ml 농도), CFU-Sp 함량의 유의적인 증가가 기록되었다.
파클리탁셀을 정맥내 투여하고 1일 후에 래트 정소에서 유래되는 세포로부터 정자형성 콜로니의 형성에 미치는 시험관내 트레아미드의 직접 작용의 연구는 시험된 모든 농도에서 투여된 시험 화합물의 작용하에 콜로니 형성의 증가를 보여주었다(표 19).
수득된 데이터는 트레아미드가 정자형성 조직의 선조 세포들의 기능적 활성을 직접적으로 자극하는 능력이 있다는 것을 시사한다.
즉, 파클리탁셀의 투여는 정소의 재생력을 감소시켰고, 이는 수임된 콜로니 형성 정자형성 세포 수의 감소로 표현된다. 이것은 정자형성의 증식 풀(pool)의 근원에 대한 파클리탁셀의 직접 독성 효과뿐만 아니라 이 세포의 증식을 자극하는 체액 인자의 억제 때문이다. 트레아미드의 투여는 조직의 재생력을 증가시켰다. 또한, 트레아미드는 정자형성의 증식 풀의 신규 근원(줄기 세포)의 형성을 직접 자극할뿐만 아니라 그 형성을 자극하는 체액 인자의 효과도 증강시켰다.
실험 개시 후 45일째 정자형성 조직의 형태학적 및 기능적 상태를 연구할 때, 파클리탁셀의 투여는 정조 집단의 세포 수를 유의적으로 감소(30% 넘게)시켰고, TNS로 판단된 정자형성 생산성은 배경군 대비 40% 넘게 감소시킨 것으로 발견되었다(표 19).
파클리탁셀 투여 후 45일째 래트의 정자형성 평가
그룹 정조세포의
평균 수
(abs.)		 세르톨리 세포의 평균 수(abs.) 정자형성 층의
성숙도
(표준 단위)		 줄기 세포의
총 수(x106)		 운동성 정자
세포 수(%)
배경군(무손상 동물) 18.47±0.28 1.07±0.03 6.45±0.01 213.00±0.81 80.05±3.20
대조군(파클리탁셀) 11.88±0.35* 1.51±0.02* 5.68±0.00* 125.00±5.82* 63.68±1.50*
실험군: 파클리탁셀
+ 트레아미드		 14.56±0.19*# 1.61±0.03*# 5.66±0.01# 146.00±9.53* 71.57±3.19#
주:
* - 차이가 배경군 대비 유의적이다
# - 차이가 대조군 대비 신뢰성이 있다.
성숙한 배아 세포의 총수가 감소하는 동시에 운동성 퍼센트도 통계상 유의적으로 감소했다. 즉, 파클리탁셀 투여 45일 후, 정소 기능장애가 수컷 불임의 원인들 중 하나인 병리정자증(pathospermia)의 형태로 관찰되었다. 45일의 기간은 정소 세포 집단에 독성 효과의 발현에 대응한다. 이 경우, 정자형성을 위한 전구 세포 수가 감소(40%)한다는 점을 감안하여, 본 연구에서는 정자형성의 증식 풀의 근원을 고갈시켜 유발되는 정소 기능장애의 모델을 수득했다. 정자형성 층의 성숙도 및 세르톨리 세포의 수와 같은 지표들로 판단해보면, 대조 동물은 정소 조직의 수복 재생 과정의 활성화 특징을 나타낸다. 즉, 마이크로환경 세포의 수가 증가하고, 정자형성 층의 성숙도가 감소한다(표 20). 하지만, 마이크로환경 세포의 기능적 활성은 감소한다. 수득된 데이터는 파클리탁셀만을 투여받은 동물의 정자형성 조직의 재생력이 낮다는 것을 나타낸다.
파클리탁셀과 트레아미드의 복합 투여 후 45일 째(표 20), 정조세포의 평균 수는 대조군(파클리탁셀)에 비해 통계상 유의적으로 증가했고, 정자형성의 생산성은 통계적으로 증가하지 않았지만, 운동성 정자 세포의 퍼센트는 증가했다. 정조세포 총 수의 증가는 정자형성 조직의 수임 콜로니 형성 세포 수의 증가와 분명한 관련이 있다. 실험군에서는 대조군에 비해 세르톨리 세포의 평균수가 유의적으로 증가했지만, 이의 기능적 활성은 대조군에서 저하된 상태를 유지했다. 정자형성 층의 성숙도는 대조군에 비해 감소하지 않았다. 즉, 약물의 투여는 병리정자증의 중증도를 감소시켰고(운동성 형태의 퍼센트로 판단할 때), 정조세포 수를 증가시켰다.
파클리탁셀만을 투여받은 래트의 정자형성 조직의 형태학적 기능적 상태의 연구는 실험 65일째, 정조 집단내 세포 수 및 정자형성 생산성의 감소를 나타냈다(표 21).
파클리탁셀의 투여 후 65일째 래트의 정자형성의 평가
그룹 정조세포 평균수(abs.) 세르톨리 세포 평균수(abs.) 정자형성층의 성숙도(표준단위) 총 정자세포수(x106) 정소의 내분비활성 레이디히 세포수 운동성 정자세포수
(%)
배경군(무손상 동물) 16.95±0.05 2.18±0.06 6.18±0.02 188.40±8.68 4.33±0.10 9.72±0.19 85.66±2.61
대조군(파클리탁셀) 12.20±0.19* 1.68±0.09* 5.65±0.01# 101.40±12.13* 5.49±0.33 9.21±0.36# 60.48±2.57*
실험군:
파클리탁셀+트레아미드		 13.07±0.28* 2.30±0.03# 5.54±0.00*# 145.20±15.15*# 4.31±0.24* 9.48±0.21 79.81±1.61*
주:
* - 차이가 배경군 대비 유의적이다
# - 차이가 대조군 대비 유의적이다.
이것은 분명히 전술한 정자형성의 선조 세포 집단의 고갈 및 선조 세포의 증식을 자극하는 체액 인자의 억제의 결과이다. 성숙한 성 세포의 운동성 퍼센트는 감소된 상태를 유지했고, 이는 이 세포의 부분 열등성을 나타낸다. 따라서, 정자형성의 증식 풀 근원이 감소하여 유발되는 정소 기능장애도 이 관찰 시기(실험 후 65일째)에 검출되었고, 즉 병리학적 과정의 실험 모델이 재현되었다. 레이디히 세포의 수는 동일한 수준으로 남아 있었다. 레이디히 세포의 내분비 활성은 증가했다. 수복 재생 과정의 강도는 증가하지 않았다. 즉, 정자형성 층의 성숙도는 대조군에 비해 감소되었지만, 이전 연구 기간에 비해서는 감소하지 않았고, 세르톨리 세포의 수도 증가하지 않았다. 재생 과정 동안 양성 동역학의 부족은 정자형성 조직의 낮은 수의 수임 콜로니 형성 세포와 분명한 연관이 있다.
연구 65일째 트레아미드로 처리된 동물에서는 대조군에 비해 정조세포 집단내 세포 수가 증가하지 않았지만, TNS로 판단컨대 정자형성의 생산성은 증가했다(43%)(표 21 참조). 또한, 운동성 정자 형태의 퍼센트도 증가했다(32%). 이 지수는 배경군의 값과 통계상 유의적으로 다르지 않았다. 레이디히 세포의 수는 대조군 수준이었다. 레이디히 세포의 내분비 활성은 정상화되었고 대조군 값에 도달했다. 수복성 조직 재생 과정의 중증도를 평가할 때 세르톨리 세포 수는 증가했고 정자형성 층의 성숙도는 저하된 것으로 발견되었다. 정자형성 층의 성숙도는 반대로 현저히 감소했다. 이 데이터는 정자형성의 선조 세포 수의 증가에 대한 데이터와 함께 파클리탁셀을 투여받은 래트에게 트레아미드의 투여가 정자형성 조직의 수복적 재생 과정을 자극했음을 암시한다. 운동성 형태의 퍼센트로 판단되는 정소 기능장애는 더 적게 드러났다. 정자형성의 선조 세포 수의 증가 및 이 세포의 활력적인 활성의 체액 조절의 증가에도 불구하고, 정조세포 집단내 세포 수에 미치는 양성 효과의 부재는, 선조 세포에 대한 효과가 출현하기 위해서는 더 오랜 시간이 필요하다는 것을 분명하게 시사하는 것임을 유념해야 한다. 이를 위해, 정자형성 조직의 형태학적 및 기능적 상태는 실험 90일째 평가했다.
실험 90일째 정자형성 조직의 형태학적 및 기능적 상태의 연구는 정조세포 집단내 세포 수, TNS 및 파클리탁셀만을 투여받은 래트에서 운동성 형태의 퍼센트가 대조군의 값들에 비해 감소했고, 이전 연구 기간에 비해 증가하지 않았음을 보여주었다(표 22). 이 데이터는 정자형성의 증식성 풀 근원의 고갈에 의해 유발된 정소 기능장애가 남아있음을 시사한다. 레이디히 세포 수는 크게 감소했지만, 내분비 활성은 증가했다. 세르톨리 세포 수(표 22)는 증가하지 않았고, 대조군에 비해 감소했다. 하지만, 정자형성 층의 성숙도(이 지수는 배경군의 10%가 감소했다, 표 22)로 판단컨대, 조직 수복적 재생 과정의 약간의 활성에 대해서는 말할 수 있지만, 그 강도는 초기 선조세포 수 및 정자형성 과정을 전체적으로 복원시키기에는 분명히 불충분한 것이다.
파클리탁셀의 투여 후 90일째 래트의 정자형성의 평가
그룹 정조세포 평균수(abs.) 세르톨리 세포의 평균 수
(abs.)		 정자형성층의 성숙도 (표준 단위) 정자 세포의 총 수(106) 레이디히 세포의 평균 수 내분비 활성 운동성 정자 세포 수(%)
배경군 (무손상
동물)		 17.25±0.25 2.26±0.04 6.18±0.01 202.00±7.17 10.49±0.20 4.66±0.09 77.94±4.69
대조군 (파클리탁셀) 12.73±0.09* 1.72±0.05* 5.64±0.01* 127.70±14.91* 9.65±0.19# 5.65±0.20# 54.24±6.10*
실험군:
파클리탁셀+트레아미드		 14.43±0.21*# 2.10±0.06*# 5.57±0.01*# 186.20±12.74# 9.93±0.08# 4.74±4.04* 67.80±1.14*#
주:
* - 차이가 배경군 대비 유의적이다.
트레아미드로 처리된 동물 그룹에서, 정조세포의 양은 대조군에 비해 통계적으로 상승되었고, 이는 분명히도 앞서 논의한 바와 같이 정자형성의 증식 풀 근원 수의 증가 및 그 증식을 자극하는 체액 인자의 증가의 결과이다. TNS로 판단하는 정자형성의 생산성은 대조군에 비해 증가했고(46%), 배경군 값에 이르렀다. 정자 세포의 기능적 활성도 증가했다(운동성 정자 세포의 수가 대조군 값보다 유의적으로 더 높았다). 이 데이터는 치료 효과의 증거이다. 레이디히 세포의 수는 대조군 값과 유사했다. 내분비 활성은 정상화되었다. 수복적 조직 재생 과정의 강도(정자형성 층의 성숙도 및 세르톨리 세포수에 의해 판단)는 대조군에 비해 통계상 유의적으로 증가했다. 이는 약물 투여 시 조직의 재생력이 높은 수준으로 남아있고 아직 고갈되지 않았다는 증거이다.
제시된 데이터는 트레아미드가 수임된 콜로니 형성 세포 수의 감소로 인해 억제된 정소 조직의 수복적 재생을 효과적으로 자극한다는 것을 보여준다. 트레아미드의 효과는 정소 조직의 형태학적 분석의 데이터로 확인된다.
실시예 8
스트렙토조토신에 의해 유도된 췌장 병변의 모델에서 췌장 세포의 재생에 미치는 트레아미드의 효과 연구
본 연구는 4주령의 수컷 C57BL/6 마우스에 대해 수행했다. 췌장 손상은 스트렙토조토신(streptozotocin)을 5일동안 매일 인산염 완충액 0.25ml 중의 40mg/kg 용량으로 복강내 주사하여 유도했다[Szkudelski T. The Mechanism of Alloxan and Streptozotocin Action in B Cells of the Rat Pancreas//Physiological Research. - 2001. - Vol. 50. - P. 536 - 546].
1mg/kg 용량의 트레아미드는 연구 7 내지 20일 동안 매일 1회씩 위내 투여했다.
연구 0일, 6일, 10일, 13일, 16일, 19일, 21일, 24일 및 28일째, 혈당을 측정했다. 혈당 수치는 4시간 금식 후, 혈당계(SencoCard glucometer, "77 Electronics Kft", Hungary)로 측정했다.
연구 28일째, 동물은 CO2 챔버에서 안락사시키고, 췌장을 형태학적 조사한 뒤, 췌장 균질액을 일반 콜로겐 및 I형 콜라겐의 효소 면역흡착 분석으로 연구했다.
형태학적 연구를 위해, 비장 옆에 있는 췌장의 일부를 10% 포르말린에 고정시키고 파라핀에 투입했다. 탈파라핀화된 샘의 절편을 헤마톡실린 및 에오신으로 염색했다. 이 절편에 대해 10회 연속 랑게르한스섬의 면적을 그래픽 컴퓨터 분석으로 측정하고, 여기서 총 세포 수와 밀집된(pyknotized) 세포 수를 계수했다. 그 다음, 단위 섬 면적당 세포 수 및 밀집된 세포 퍼센트를 계산했다.
췌장 조직내 염증 세포(호중구, 림프구, 대식세포) 및 이의 조성은 조직학적 절편을 헤마톡실린-에오신 및 아주르(azur)-에오신으로 염색하여 연구했다.
폐 균질액에 존재하는 마우스 I형 콜라겐의 수준은 효소면역흡착 분석(Cusabio Biotech CO., LTD, 중국)으로, 폐 조직 균질액은 제조업자, Cusabio Biotech CO., LTD.(중국)의 프로토콜에 따라 제조했다.
폐 균질액에 존재하는 총 콜라겐의 수준은 SIRCOL Collagen Assay Kit(Biocolor Ltd, UK)를 사용하여 제조업자의 지침에 따라 콜라겐을 염료에 결합시키고 산 및 펩신 용액으로 처리함으로써 콜라겐을 측정했다. 폐 조직 균질액은 제조업자의 시험 시스템의 포로토콜에 따라 제조했다.
연구 결과는 표 23 내지 25에 제시한다.
스트렙토조토신이 투여된 C57BL/6 마우스의 혈당 수치(mM/L)에 미치는 Ch-268-BH의 효과(M ± m)
그룹 초기 수준 연구시간
(스트렙토조토신의 마지막 투여 후 경과일)
6 10 13 16 19 21 24 28
병리상태 대조군 5.8±0.4 11.7±1.7* 14.0±1.8* 15.0±2.3* 12.3±1.9* 13.9±1.6* 15.3±1.4* 17.2±1.8* 16.4±1.7*
트레아미드, 1 mg/kg 5.1±0.1 10.8±0.4* 11.2±0.2* 11.6±0.3*● 10.4±1.4* 12.0±0.1* 12.1±0.4*● 12.2±1.0*● 12.6 ± 1.1*
주:
* - 차이가 배경군 대비 유의적이다(P<0.05)
● - 차이가 병리학적 대조군 대비 유의적이다(P<0.05).
스트렙토조토신이 투여된 C57B1/6 마우스의 랑게르한스섬에 존재하는 총 세포 수, 랑게르한스 섬의 면적 및 밀집된 세포 수에 미치는 트레아미드의 효과, 연구 28일째(M ± m)
그룹 랑게르한스 섬에 있는 총 세포 수(x104) 섬 조직의 면적(픽셀) 섬 당 밀집된 세포 수
(픽셀)
무손상 동물 116.2 ± 7.55 695404 ± 49971 0.97 ± 0.11
병리상태의 대조군 54.7 ±5.4* 314295 ± 30521* 3.50 ± 0.40*
트레아미드, 1 mg/kg 109.9 ± 12.6● 635770 ± 56163● 1.75 ± 0.14●
주:
* - 차이가 무손상 동물 대비 유의적이다(P<0.05)
● - 차이가 병리학적 대조군 대비 유의적이다(P<0.05).
췌장 손상이 있는 C57BL/6 마우스의 췌장에 존재하는 총 콜라겐 및 I형 콜라겐의 함량에 미치는 트레아미드의 효과, 연구 28일(M±m)
연구된 그룹 I형 콜라겐(ng/ml) 총 콜라겐(mg/ml)
무손상 동물 341 ± 28 33 ± 36
병리상태의 대조군 856 ± 76* 57 ± 5*
트레아미드, 1 mg/kg 665 ± 55*● 41 ± 4●
주:
* - 차이가 무손상 대조군 대비 유의적이다(P<0.05)
● - 차이가 병리학적 대조군 대비 유의적이다(P<0.05)
혈당 수치는 관찰 기간 동안(스트렙토조토신의 최종 주사 후 6일, 10일, 13일, 16일, 19일, 21일, 24일, 28일) 마우스에 스트렙토조토신의 투여 과정 이후 유의적으로 증가했다(표 23). 형태학적 연구는 고혈당증의 피크(21일, 28일)에서 췌장 조직에 부종 및 충혈이 관찰되었음을 확인할 수 있게 해주었다: 호중구, 대식세포 및 림프구에 의한 췌장 침윤이 기록되었다. 또한, 스트렙토조토신의 최종 주사 후 6일 후부터 실험군의 마우스는 무손상 대조군에 비해 섬 조직의 면적의 감소가 증가하는 것으로 입증되었다. 28일째, 이 매개변수의 감소가 가장 현저했다: 섬의 총 세포충실성은 무손상 마우스에 비해 50% 넘게 감소했고, 이에 반해 밀집화된 세포의 퍼센트는 유의적으로 증가했으며(2.3배), 손상된 섬에서 섬 기관 경화증의 발달 지표인 섬유아세포가 나타났다(표 24). 병리학적 대조군의 췌장 균질액의 면역효소 분석은 연구 28일째 무손상 동물 대비 I형 콜라겐 및 총 콜라겐의 증가된 수준을 나타냈다(표 25).
연구 13일, 21일 및 24일에 스트렙토조토신을 투여받은 마우스에서 1mg/kg 용량의 트레아미드의 투여는 혈당 수치를 현저하게 감소시켰다(표 1). 연구 28일째 수행한 췌장의 형태학적 검사는 트레아미드가 아픈 동물의 랑게르한스 섬에서 밀집된 췌장세포의 수를 감소시켰고, 섬 조직의 면적 및 세포충실성을 증가시켰으며(표 24), 병리학적 대조군 대비 실험 동물에서 췌장의 총 콜라겐 및 I형 콜라겐의 농도를 감소시켰음(표 25)을 보여주었다.
수득된 결과들은 스트렙토조토신-유도된 췌장 병변의 모델에서 트레아미드가 췌장 조직에 재생 작용을 발휘한다는 결론을 내리게 한다. 결과적으로, 랑게르한스 섬에 존재하는 세포 수는 복원되고, 섬 조직의 면적도 증가시키며, 랑게르한스 섬에 존재하는 밀집된 세포 수는 정상화되고, 췌장 조직의 섬유성 변화가 감소하여, 결과적으로 혈당 수치가 감소한다. 트레아미드는 내당능 장애의 치료에 사용될 수 있다.
실시예 9
대사 증후군 모델에서 수컷 마우스의 정소 조직의 기능 회복 및 췌장 세포의 재생에 미치는 트레아미드의 효과 연구
대사 장애는 다음과 같이 모의되었다: 출생 후 2일째, 수컷 C57B1/6 마우스에 스트렙토조토신을 200mg/kg 용량으로 두 어깨사이 융기 영역에 피하로 1회 주사했고, 주사된 용액의 부피는 30㎕였다. 출생 후 4주째부터 동물을 고지방 식이로 변경했다. 이 목적을 위해, 사용된 사료에 중질 포화 지방(30% 지방)(Siff EF R/M + 30% Fat Cat No. E15116-34, 독일)을 증가시켰다. 고지방 식이의 공급 기간은 42일(실험 28일부터 7일까지)이었다. 트레아미드는 10mg/kg의 용량으로 실험 49일부터 70일까지 매일 1일 1회 위내 투여했다. 대조 동물에게는 시험 화합물 대신 동등한 부피의 용매(2% 전분 점액)를 투여했다.
연구 28일, 35일, 42일, 49일, 56일, 63일 및 70일째, 혈당을 측정했다. 혈당 수치는 혈당계(Accu-Chek Performs Nanu ("Roche Diagnostes GmbH", Germany)로 측정했다. 혈당은 16시간 금식 후의 동물에서 측정했다; 이후 모든 혈당 수치의 측정들도 16시간 금식 후에 수행했다.
70일째, 동물은 CO2 챔버에서 안락사시켰다. 그 다음, 무혈청 테스토스테론 수준을 연구했고, 췌장의 형태학적 검사를 수행했다.
혈청에 유리 테스토스테론의 수준은 제조업자의 시험 시스템의 프로토콜에 따라 효소면역분석법으로 평가했다.
형태학적 연구를 위해, 비장에 인접한 췌장의 일부를 10% 포르말린에 고정시키고 표준 방법에 따라 파라핀에 투입했다.
샘의 탈파라핀화된 절편을 헤마톡실린 및 에오신으로 염색했다. 절편에서 10회의 연속 랑게르한스 섬의 면적을 그래픽 컴퓨터 분석으로 측정하고, 여기서 총 세포수와 밀집된 세포 수를 계수했다. 그 다음, 단위 섬 면적당 세포 수 및 밀집된 세포의 퍼센트를 계산했다. 췌장 조직 내 염증 세포(호중구, 림프구, 대식세포) 및 이들의 조성은 조직학적 절편을 헤마톡실린-에오신으로 염색하여 연구했다.
이 연구의 결과는 대사 증후군의 모의 실험군이 실험 70일째 C57B1/6 수컷 마우스의 췌장 조직에서 부종 및 충혈을 유발했음을 보여주었다(도 1). 또한, 이 모델 조건하에 마우스는 무손상 대조군의 동물과 비교했을 때, 세엽 세포의 작은 액적 및 중간 액적의 지방 변성 및 소엽사이 격막의 비대 및 증식, 염증 세포에 의한 섬 조직의 침윤, 총 랑게르한스섬 수의 감소, 이의 면적 및 세포충실성의 감소를 기록했다; 하지만, 섬 내에서 밀집된 세포의 퍼센트는 증가했다(도 2, 표 26).
연구 49일부터 70일까지 10mg/kg 용량의 트레아미드의 위내 투여는 모의된 대사 장애를 가진 마우스의 췌장 파괴를 방지했다. 트레아미드는 췌장 내 랑게르한스섬의 수 및 이의 세포충실성을 증가시켰고, 세엽 세포의 지방 변성의 발달을 방지했고, 대사 장애를 가진 마우스의 랑게르한스섬에서 밀집된 세포의 수를 유의적으로 감소시켰다. 또한, 트레아미드는 부종의 강도 및 섬 조직의 염증 세포에 의한 침윤을 감소시켰다(도 1 및 2, 표 26).
모의 대사 장애의 70일째 마우스 췌장의 형태학(M±m)
그룹 30개의 시야에서 섬의 수 랑게르한스 섬에 있는 밀집된 세포의 % 랑게르한스섬에 있는 세포 수 섬의 면적(픽셀)
무손상(n=10) 7.0±0.42 1.11±0.06 152.8±3.6 1240813 ± 48607
대조군 (n=10) 3.3±0.26* 3.17±0.24* 72.3± 1.4* 596043 ± 9924*
트레아미드
(1 mg/kg) (n=8)		 7.4±0.37● 0.99±0.06● 101.8± 3.0*● 743399 ± 21134*●
주:
1 - # - 차이가 배경군 대비 유의적이다(P<0.05, 만-휘트니 U 시험),
2 - # - 차이가 대조군 대비 유의적이다(P<0.05, 만-휘트니 U-시험).
마우스의 혈청에서 혈당 연구의 결과는 대사 장애의 모의가 실험 42일부터 수컷 C57BL/6 마우스의 혈당 수치를 지속적으로 증가시켰음을 보여주었다. 70일까지 높은 혈당 수치가 지속되었다. 이 지수의 최대 값은 실험 63일째 기록되었고, 기준치를 3.8배 초과했고, 70일째에는 4.2배 초과했다(표 27).
실험 49일부터 70일까지 10mg/kg 용량의 트레아미드의 위내 투여는 56일과 63일에 마우스의 혈당 수치를 감소시켰다(표 27).
따라서, 10mg/kg 용량의 트레아미드의 투여 과정은 모의된 대사 장애를 가진 수컷 C57BL/6 마우스의 저혈당 효과를 유발했다.
대사 장애의 모의 조건 및 10mg/kg 용량의 트레아미드 사용 하에 마우스의 혈당 농도(mmol/L)(M±m)
분석 시간 무손상(n=10) 병리학적 대조군(n=10) 트레아미드, 10mg/kg(n=8)
28 일 4.72±0.81 6.02±2.02 5.36±1.28*
35 일 4.6±0.87 4.74±1.87 4.21±1.81*
42 일 4.91±0.96 10.84±1.97* 12.75±2.6*
49 일 5.33±0.89 10.47±1.96* 13.59±2.41*
56 일 5.07±0.86 19.58±6.34* 12.91±4.48*●
63 일 5.43±0.81 20.51±3.85* 14.47±3.21*●
70 일 4.64±0.92 19.77±4.99* 21.82±5.83*
주:
1 - # - 차이가 배경군 대비 유의적이다(p<0.05, 만-휘트니 U 시험),
2 - # - 차이가 대조군 대비 유의적이다(p<0.05, 만-휘트니 U 시험).
마우스 혈청에서 유리 테스토스테론의 연구 결과는 무손상 동물에 비해 병리학적 대조군의 수컷에서 호르몬 함량 감소(1.6배)를 나타냈다. 수득된 데이터는 인간의 임상 그림을 재현하는, 대사 장애를 가진 실험실 수컷에서 생식선기능저하증의 형성을 시사한다.
10mg/kg 용량의 트레아미드의 투여 과정은 혈액내 유리 테스토스테론의 농도를 무손상 동물의 수준으로 복원시켰다(표 28). 따라서, 연구된 약학적 물질은 대사 장애에 의해 유도된 생식선기능저하증의 발달을 방지했다.
모의 대사 장애 70일째 마우스내 유리 테스토스테론의 혈청 수준(M±m)
그룹 유리 테스토스테론(pg/ml)
무손상 (n=10) 3.06±0.49
병리학적 대조군 (n=10) 1,97±0,31*
트레아미드, 10 mg/kg (n=8) 3.70±0.46●
주:
1 - # - 차이가 배경군 대비 유의적이다(p<0.05, 만-휘트니 U 시험),
2 - # - 차이가 대조군 대비 유의적이다(p<0.05, 만-휘트니 U 시험).
수득된 결과는 수컷 마우스 대사 증후군 모델에서 트레아미드가 췌장 조직에 재생 작용을 발휘한다고 결론지을 수 있게 한다. 결과적으로, 랑게르한스섬의 세포 수는 복원되고, 섬 조직의 면적이 증가하며, 랑게르한스섬에서 밀집된 세포의 수가 정상화되고, 췌장 조직의 섬유성 변화가 감소하고, 결과적으로 혈당 수치가 감소한다. 또한, 트레아미드는 정소 조직의 기능을 복원시켜 생식선기능저하증의 발달을 방지한다. 즉, 트레아미드는 대사 증후군 및 생식선기능저하증의 치료에 사용될 수 있다.
실시예 10
대사 증후군 모델의 수컷 래트에서 정소 조직의 기능 복원 및 췌장 세포의 재생에 미치는 트레아미드의 효과 연구
대사 증후군은 수컷 비스타 래트(260 내지 280g)에서 12주 동안 동물을 고지방 식이("카페테리아 식이")로 유지시켜 모의했다. "카페테리아 식이"는 현행 약리학 프토토콜[Current Protocols in Pharmacology(2005) Animal Models of Disease//Contributed by Petter Hedlund, Kenshi Matsumoto, and Karl-Erik Andersson]에 따라 균형을 맞추었다. 이 식이는 설치류의 표준 식이외에 25 내지 35%의 지방과 25 내지 30%의 소화되기 쉬운 탄수화물을 함유했다. 트레아미드는 이 식이를 공급하고 7주부터 11주까지 0.5mg/kg의 용량으로 매일 1일 1회 위내 투여했다. 참조 약물인 메트포민은 동일한 식이요법에 따라 200mg/kg의 용량으로 위내 투여했다.
병리상태의 발달 및 트레아미드의 치료 효과는 다음과 같은 매개변수로 추정했다: 혈액 생화학적 매개변수(포도당, 콜레스테롤, 트리글리세라이드(TG), HDL, LDL, 죽종형성 지수), 내당능 시험, 내장 지방 중량, 운동성 정자 형태의 총 수 및 퍼센트.
혈당은 OneNouch Select 당도계(스위스)로 측정했다.
트리글리세라이드, TCh 및 HDL의 수준은 진단 키트(Olvex Diagnosticum, 러시아)를 사용하여 측정했다.
LDL의 수준은 수학식 1로 측정했다.
수학식 (1)
LDL = TCh - (HDL + TG/2.2)
여기서, LDL은 저밀도 지단백질 콜레스테롤이고
HDL은 고밀도 지단백질 콜레스테롤이며;
TCh는 총 콜레스테롤이고;
TG는 트리글리세라이드이다.
죽종형성성 지수(AI)는 수학식 2로 계산했다.
수학식 (2)
AI = (TCh-HDL)/HDL
여기서, AI는 죽종형성성 지수이고;
HDL은 고밀도 지단백질 콜레스테롤이다.
죽종형성성 지수는 각 동물마다 개별적으로 계산했고, 그 다음 그룹의 산술적 평균 값을 계산했다.
정자 분석을 위해, 동물을 졸레틸과 자일라의 혼합물(0.2ml 졸레틸(Zoletil) +0.8ml 자일라(Xyla))을 100g의 중량당 70㎕의 부피로 복강내 주사하여 마취시켰다. 부고환을 분리했다. 부고환 머리를 꼬리로부터 절단해내고, 무게를 잰 뒤, 5개의 절제물로 만들고(정자 수율을 높이기 위해), 37℃로 가열된 인산염 완충 식염수 10ml를 담고 있는 관에 넣었다. 이 관은 37℃에서 10분 동안 유지시켰다. 그 다음, 관을 진탕기 위에서 진탕시키고, 액체 20㎕를 취하여 37℃로 가열된 유리 슬라이드에 적용하여, 현미경 하에서 운동성 정자 세포의 수를 평가했다. 계산은 최대 100개의 정자 세포까지 수행했다.
부고환이 담긴 시험관에 있는 정자 세포의 총 수는 다음과 같이 계산했다: 진탕 후 액체 20㎕를 취하고 400㎕ 생리식염수를 함유한 관에 첨가했다. 이 관을 진탕시킨 후, 내용물(20㎕)을 꺼내어 고리에프 챔버에 넣었다. 정자 세포의 수는 100개의 사각형 내에서 계수했다. 부고환 머리에 있는 정자 세포의 수는 다음과 같은 식으로 계산했다:
정자 세포 수 = 고리에프 챔버의 100개의 큰 사각형에 있는 정자 세포 수 * 0.525(희석 및 고리에프 챔버 부피의 계산에서 나온 인수)/부고환 머리의 중량.
연구 결과는 표 29 내지 32에 제시된다.
실험 동물의 내장 지방 중량의 측정은 고지방 식이 섭취군에서 신장, 장 및 정소 부근에서 내장 지방이 균일하게 증가한다는 것을 보여주었다: 각각 1.7배, 1.5배 및 2.0배(표 29). 대조군에서 내장 지방의 총량은 무손상 동물 대비 약 1.7배로 증가했다. 수득된 결과는 고지방 식이가 유지된 실험 동물에서 대사 증후군의 증상들 중 하나인 복부 비만이 발달했다는 결론에 대한 기반을 제공했다.
수컷 래트에 트레아미드(0.5mg/kg 용량)의 투여는 내장 지방 중량의 증가를 대조군 대비 1.3배 감소시켰다. 메트포민은 유사한 효과를 나타냈다(표 29).
체중을 기반으로 한 내장 지방의 상대적 중량 %(M±m, n=8)
그룹 신장 부근의 지방 장 부근의 지방 정소 부근의 지방 총 지방
무손상 0.49±0.06 0.80±0.09 0.64±0.08 1.94±0.15
대조군 0.81±0.1* 1.20±0.15* 1.29±0.19* 3.30±0.27*
트레아미드 (0.5 mg/kg) 0.48±0.05& 0.94±0.07 1.03±0.14* 2.46±0.15*&
메트포민
(200 mg/kg)		 0.52±0.05& 1.07±0.08* 0.98±0.12* 2.57±0.18*&
주:
* - 차이가 무손상 동물 대비 통계상 유의적이다(p<0.05);
& - 차이가 대조군 대비 통계상 유의적이다(p<0.05)
래트의 전혈에서 당 측정(절식)의 결과는 표 30에 제공된다. 1차 측정은 연구 6주째 동물에게 약물을 투여하기 전에 수행했다. 표 30은 표준 식이의 무손상 래트에서 식이 6주째 당 수준이 3.9±0.3 mmol/l였고, 식이 12주째 6.8±0.93 mmol/l였음을 보여준다. 또한, 고지방 식이를 유지시킨 래트에서는 당 수준이 식이 6주째 6.7±0.3mmol/l였고, 식이 12주째 11.6±0.9mmol/l였다. 즉, 고지방 식이를 공급받은 동물에서는 대사 증후군의 다른 증상인 고혈당이 현저했다.
고지방 식이 7주부터 실험 동물에게 트레아미드를 위내 투여한 결과, 혈당 수치의 증가가 억제되었다. 트레아미드의 효과는 치료 3주후에 나타났고, 연구 마지막까지 유지되었다(표 30).
수컷 래트의 혈당 수치의 동역학, mmol/l
그룹 수컷 래트의 혈당 수치, mmol/L
약물 투여 전 약물 투여 3주 후 약물 투여 5주 후 약물 중단 1주 후
무손상 3,9±0,3 3.7±0.2 4.5±0.2 6.8±0.9
대조군 6,7±0,3* 8.7±0.4* 9.1±0.4* 11.6±0.9*
트레아미드 (0.5 mg/kg) 6.4±0.2* 6.5±0.2*& 7.8±0.2*& 8.3±0.7&
메트포민
(200 mg/kg)		 6.2±0.1* 6.9±0.3*& 8.0±0.2*& 7.8±0.6&
주:
1 - * 차이가 무손상 동물 대비 통계상 유의적이다(p<1);
2 - & 차이가 대조군 대비 통계상 유의적이다(p<2).
지질 대사에 미치는 트레아미드의 효과는 연구 12주째 TCh, TG, LDL, HDL 및 죽종형성성 지수를 측정하여 평가했다.
동물에 "카페테리아 식이"의 사용은 총 콜레스테롤, TG, LDL 수준의 현저한 통계상 유의적인 증가 및 무손상 동물 대비 HDL 수준의 감소를 초래했다(표 31). 대조군 동물에서 계산된 지수인 죽종형성성 지수는 무손상 동물보다 4.2배 높았다. 트레아미드의 위내 투여는 HDL의 수준을 1.5±0.2로부터 1.9±0.2로 증가시켰고, 죽종형성성 지수는 2.1±0.4로부터 0.9±0.2로 감소시켰다. 이는 트레아미드의 장기 투여가 죽종형성방지 효과를 제공한다는 결론에 대한 기반을 제공한다(표 31).
12주 동안 고지방 식이를 유지한 수컷 래트의 혈액 지질 스펙트럼(M±m, n=8)
평가된 지수 무손상
(표준 식이)		 대조군
(고지방 식이)		 트레아미드
(0.5 mg/kg)		 메트포민
(200 mg/kg)
총 콜레스테롤, mM/l 2.6±0.1 3.3±0.2* 3.5±0.1* 2.8±0.3
HDL, mM/l 1.7±0 1.1±0.1* 1.9±0.2& 1.8±0&
LDL, mM/l 0.5±0.1 1.6±0.3* 1.2±0.2* 0.7±0.3&
죽종형성성 지수 0.5±0.04 2.1±0.4* 0.9±0.2*& 0.6±0.1&
트리글리세라이드, mM/l 0.7±0 1.1±0.0* 0.9±0.1* 0.7±0.1&
주:
* - 차이가 무손상 동물 대비 통계상 유의적이다(p<0.05);
& - 차이가 대조군 대비 통계상 유의적이다(p<0.05)
표 31은 "카페테리아 식이"를 공급받은 그룹에서 정자 세포의 총 수 및 운동성 정자 형태의 퍼센트가 표준 식이를 유지한 동물에서보다 2배 더 낮다는 것을 보여준다. 이는 대사 장애를 가진 수컷의 정자 질에 유해하다는 임상 데이터에 대응한다. 트레아미드의 위내 투여는 정자 세포의 총 수를 1.7배 증가시켰고, 운동성 정자 형태의 퍼센트를 1.5배 증가시켰으며, 이 지수들은 무손상 동물의 수준에 이르는 것이다. 따라서, 트레아미드는 대사 증후군의 주요 증상들에 치료 효과가 있을 뿐만 아니라, 기존 병리상태에 의해 저하된 정자의 질을 복원시킨다는 결론을 내릴 수 있다.
또한, 메트포민 치료는 정자 세포의 총 수를 1.8배 증가시켰지만, 트레아미드와 달리 운동성 정자 형태의 퍼센트에는 영향을 미치지 않았다(표 32).
고지방 식이에 의해 유도된 대사 증후군 모델에서 수컷 래트의 운동성 정자 형태의 퍼센트 및 정자 세포의 총수(M±m, n=8)
그룹 정자 세포의 총 수 운동성 정자 형태의 퍼센트
무손상(표준 식이) 304.2±46.2 42.43±4.09
대조군(고지방 식이) 154.5±17.6* 22.71±3.13*
트레아미드(0.5 mg/kg) 260.0±38.7& 34.43±3.15&
메트포민(200 mg/kg) 276.6±44.6& 24.43±3.99*
주:
* - 차이가 무손상 동물 대비 통계상 유의적이다(p<0.05);
& - 차이가 대조군 대비 통계상 유의적이다(p<0.05).
즉, 수컷 대사 증후군에서 트레아미드는 혈당 증가를 감소시켰고, 죽종형성성 지수를 감소시켰으며, 병리상태의 존재하에 증가된 내장 지방의 양을 감소시켰고, 정자 세포의 총 수 및 내분비 장애로 인해 저하된 정자 세포 운동성 형태의 퍼센트를 복원시켰다. 이는 췌장 및 정소 조직의 기능을 복원시키는 트레아미드의 능력을 확인시켜 준다. 트레아미드는 정소 조직의 저하된 기능 및 대사 증후군에 투여하는 것이 권장된다.
실시예 11
대사 증후군 모델에서 수컷 마우스의 생식력에 미치는 트레아미드의 효과 연구
대사 장애는 다음과 같이 모의되었다: 출생 2일째, 수컷 57Bl/6 마우스에게 스트렙토조토신을 200mg/kg 용량으로 어깨사이 융기 부위에 피하로 한번에 주사했고, 주사액의 부피는 30㎕였다. 출생 4주후부터 동물을 고지방 식이로 변경했다. 이 목적을 위해, 사용된 사료는 중질 포화 지방(30% 지방)이 농축된 것이었다(Siff EF R/M + 30% Fat Cat No. E15116-34, 독일). 42일 동안(연구 28일부터 70일까지) 동물을 고지방 식이로 유지시켰다. 트레아미드는 실험 49일째부터 80일까지 매일 10mg/kg 용량으로 1일 1회 위내로 투여했다. 대조군 동물에게는 시험 화합물 대신 용매를 동등한 부피로 투여했다.
수컷의 생식력은 다음과 같이 평가했다: 연구 70일부터 80일까지의 기간 동안 무손상 암컷을 실험군의 수컷에게 1:2의 비율로 배치했다. 이 기간 동안, 실험군의 수컷에게는 트레아미드를 10mg/kg의 용량으로 매일 1회씩 계속 위내 투여했다.
교미 기간 말인, 연구 80일째, 수컷은 CO2 챔버에서 안락사시켰다. 동물의 혈액을 취하여 효소면역분석으로 유리 테스토스테론의 혈청 수준을 분석했다. 안락사는 9:30부터 11:00 사이의 오전 시간에 수행했다.
암컷은 임신 18일째 CO2 챔버에서 희생시켰다. 자궁 내 태아를 조사했다. 생식력 지수(FI)는 생식력 평가를 위해 다음과 같이 계산되었다: FI = 임신 암컷 수/수컷과 함께 배치된 암컷 수 x 100%.
대사 장애를 모의하고 트레아미드를 10mg/kg 용량으로 투여한 수컷 C57Bl/6 마우스의 혈청에 존재하는 유리 테스토스테론의 실험 80일째 연구 결과는 표 33에 제시된다. 대사 장애의 모의는 실험 80일째 혈청내 유리 테스토스테론의 농도를 무손상 동물군 대비 1.8배 감소시켰다(표 33).
10mg/kg 용량의 트레아미드의 코스 투여는 대사 장애가 있는 마우스의 혈청내 유리 테스토스테론의 수준을 병리학적 대조군 대비 2배 증가시켰고, 무손상 동물 대비 16% 증가시켰다.
따라서, 10mg/kg 용량의 트레아미드는 대사 장애가 있는 마우스의 혈청내 유리 테스토스테론의 수준을 복원시켰다.
대사 장애에 의해 유발된 생식선기능저하증이 있는 마우스의 혈청내 유리 테스토스테론의 함량(M±m, n=10)
그룹 혈청내 유리 테스토스테론(pg/ml)
무손상 동물 2.99±1.89
병리학적 대조군 1.66±0.43*
트레아미드(10 mg/kg) 3.46±1.87*●
주:
1 - # - 차이가 배경군 대비 유의적이다(p<0.05, 만-휘트니 U 시험),
2 - # - 차이가 대조군 대비 유의적이다(p<0.05, 만-휘트니 U 시험).
대사 장애의 모의 및 10mg/kg 용량의 트레아미드의 투여 후 70일 내지 80일째 마우스의 생식력에 대한 연구 결과는 표 34에 제시된다.
연구 70 내지 80일째 대사 장애가 있는 수컷의 생식력 지수는 무손상 대조군 대비 2.8배 감소한 것으로 발견되었다. 49일부터 80일까지 10mg/kg 용량의 트레아미드를 투여받은 대사 장애가 있는 수컷에서, 생식력 지수는 무처리된 대사 장애가 있는 수컷(병리학적 대조군)보다 1.8배 더 높았다(표 34).
대사 장애의 모의 조건 및 10mg/kg 용량의 트레아미드의 투여 하의 수컷 마우스의 생식력 지수(n=20)
그룹 생식력 지수, %
무손상 대조군 85
병리학적 대조군 30*
트레아미드(10mg/kg) 55*●
주:
* - 차이가 배경군 대비 유의적이다(p<0.05, 피셔 시험에 준함);
● - 차이가 대조군 대비 유의적이다(p<0.05, 피셔 시험에 준함).
즉, 대사 증후군 모델에서, 트레아미드는 수컷 마우스의 정소 조직의 기능을 효과적으로 복원시켰고, 이는 동물의 생식력 증가를 유도했다. 트레아미드는 대사 증후군, 생식선기능저하증 및 수컷 불임 치료에 권장된다.
실시예 12
만성 독성 간염 모델에서 간 조직의 회복에 미치는 트레아미드의 효과 연구
만성 독성 간염은 연구 0일, 3일, 7일, 10일, 14일 및 17일째 0.2ml/마우스의 부피로 올리브 오일 중의 20% 사염화탄소(CCl4) 용액을 위내 투여하여 수컷 CBA/CaLac 마우스에 유도되었다. 트레아미드는 연구 14일부터 27일까지 매일 한번씩 10mg/kg 용량으로 위내 투여했다. 28일째, 동물은 CO2 챔버에서 안락사시켰고, 간 생검 샘플을 취해 조직 분석했다.
조직 검사를 위해 간은 10% 중성 포르말린 용액에 고정시키고, 그 뒤 표준 방법으로 파라핀에 투입했다. 두께가 5㎛인 탈파라핀화된 절편을 다음과 같이 염색했다: 1) 통상의 조직 검사를 위한 표준 절차에 따라 헤마톡실린과 에오신을 이용하여; 2) 그래픽 데이터 처리 소프트웨어를 사용하여 결합조직의 면적을 계산하기 위해 피크로푸신(picrofuxin)을 이용하여.
연구 결과는 CCl4를 마지막으로 주사하고 2주 후, 독성 간염에 특이적인 형태학적 변화가 마우스 간에서 기록되었음을 보여주었다. 즉, 헤마톡실린과 에오신으로 염색된 표본은 작은 그리고 중간 액적의 지방 변성, 간세포의 단세포적, 그리고 가교(bridge) 같은 괴사, 뿐만 아니라 다른 중증도의 간 실질의 염증 세포(주로, 대식세포 및 림프구)에 의한 침윤의 발달을 나타냈다(도 3). 또한, 간의 빔(beam) 구조는 부종 및 정맥 다혈증으로 인해 파괴되었다. 정맥 다혈증은 CCl4가 투여된 마우스의 간에 존재하는 혈류역학 장애를 나타낸다.
피크로푸신에 의한 간 표본의 염색은 독성 간염이 있는 동물에서 문맥 공간으로부터 격막 콜라겐의 증식 및 문맥주위 구역에 결합조직의 함량 증가를 기록하게 했다(도 3).
동물에게 10mg/kg 용량의 트레아미드의 위내 투여는 질환이 있는 간의 염증 세포에 의한 침윤의 중증도를 유의적으로 감소시켰고, 단세포 괴사의 양 및 지방 변성의 강도를 감소시켰으며, 병리학적 대조군 대비 병든 동물의 간에서 결합 조직의 함량을 현저하게 감소시켰다. 실험 28일째 처리된 동물의 간의 조직학적 패턴은 무손상 대조군과 다르지 않았다(도 3).
따라서, 만성 독성 간염 모델에서 트레아미드는 간 조직에 재생 효과가 있었고, 즉 섬유증을 감소시켰고, 지방 변성의 강도를 감소시켰으며, 괴사의 발생을 방지했다. 이는 트레아미드가 간 조직의 구조적 및 기능적 특성을 복원시키는 약물로 사용될 수 있다는 결론을 내리게 한다.
실시예 13
폐기종 모델에서 폐 조직의 회복에 미치는 트레아미드의 효과 연구
폐기종은 암컷 C57Bl/6 마우스에게 엘라스타제(Sigma, USA)를 0.9% NaCl 30㎕ 중의 0.6 U/마우스의 용량으로 단일 기관지내 투여하여 유도했다[Luthje L., Raupach T., Michels H. et al.//Respiratory Research 2009, 10:7]. 수술일을 실험 0일로 간주했다. 트레아미드는 연구 7일부터 60일까지 매일 1회씩 10mg/kg 용량으로 위내 투여했다. 7일, 14일, 30일 및 60일째, 동물은 CO2 챔버에서 안락사시키고, 폐를 분리했다.
폐 조직에 발생된 기종의 동역학 및 중증도를 조직 표본에서 평가했다. 이를 위해, 폐는 10% 중성 포르말린 용액에 고정시킨 뒤, 표준 방법으로 파라핀에 투입했다. 탈파라핀화된 절편으로부터 두께 5㎛의 폐 정점, 중간 폐 영역, 하위 폐 영역의 표본을 준비하고, 표준 절차에 따라 헤마톡실린 및 에오신으로 염색했다. 또한, 폐 정점, 중간 폐 영역 및 하위 폐 영역의 사진을 찍고, 기종의 위치 및 면적을 그래픽 처리 소프트웨어로 연구했다. 기종성 확장된 폐 조직의 면적(정상 조직의 %)은 추정되는 기종의 발달 점수로 측정했고, 혈관 및 기관지는 계산에서 배제했다[ArrateMunoz-Barrutia, Mario Ceresa, Xabier Artaechevarria, Luis M. Montuenga, and Carlos Ortiz-de-Solorzano. Quantification of Lung Damage in an Elastase-Induced Mouse Model of Emphysema// International Journal of Biomedical Imaging. Volume 2012, Article ID 734734, 11 pages; Susumu Sato, Erzsebet Bartolak-Suki, Harikrishnan Parameswaran, Hiroshi Hamakawal and Bela Suki. Scale dependence of structure-function relationship in the emphysematous mouse lung//Front. Physiol. 6:146. doi: 10.3389/fphys.2015.00146].
실험들은 엘라스타제가 폐포 및 세기관지의 벽을 얇아지게 하고, 내강 면적을 유의적으로 확대시켰으며, 7일째 폐포 벽의 파열을 유발했음을 보여주었다(표 13). 기관지 및 세기관지의 점막은 부채꼴모양의 윤곽을 가졌고, 실린더형 및 입방형(세기관지에서) 호흡기 타입 상피가 내면을 이루고 있고, 심하지 않은 박리 변화가 있었다. 또한, 이 폐의 조직 표본은 폐포간 격막의 모세관들의 심하지 않은 충혈 및 미세순환 장애를 나타냈다: 폐의 폐포간 격막의 모세관 및 미세순환 층의 혈관의 심하지 않은 다혈증이 있었다.
엘라스타제를 기관내 투여받은 암컷 C57Bl/6 마우스에서 폐기종적 확대된 폐 조직의 면적(정상의 %)(M±m, n=10)
그룹 폐 정점 중간 폐 영역 하위 폐 영역
무손상 대조군 0 0 0
실험 7일째
폐기종 1.3 ± 0.03* 6.5 ± 0.98* 43.0 ± 5.85*
트레아미드(10 mg/kg)로 처리된 폐기종 0.9 ± 0.12*● 5.4 ± 0.55* 41.3 ± 1.82*
실험 14일째
폐기종 1.9 ± 0.06* 34.1 ± 4.42* 53.6 ± 6.57*
트레아미드(10 mg/kg)로 처리된 폐기종 0.7 ± 0.09*● 29.03 ± 1.76* 42.6 ± 1.79*●
실험 30일째
폐기종 11.8 ± 1.83* 26.2 ± 1.84* 68.2 ± 7.61*
트레아미드(10 mg/kg)로 처리된 폐기종 2.4 ± 1.6*● 18.5 ± 2.91* 32.8 ± 3.78*●
실험 60일째
폐기종 7.7 ± 0.68* 23.8 ± 2.51* 56.9 ± 6.41*
트레아미드(10 mg/kg)로 처리된 폐기종 3.6 ± 0.26*● 24.9 ± 3.11* 40.0 ± 3.57*●
주:
* - 차이가 무손상 대조군 대비 유의적이다(P<0.05);
● - 차이가 병리학적 대조군 대비 유의적이다(P<0.05).
엘라스타제 폐 조직의 상당 부분은 폐포간 격막이 파괴된 기종성 확대 폐포가 점유하고 있다. 하위 폐 영역에서 기종성 확대 조직의 면적은 정상 폐 면적의 43%, 중간 폐 영역의 6.5% 및 폐 정점의 1.3%에 이르렀다. 관찰할 수 있듯이, 기종은 주로 하위 폐 영역에 위치했다. 폐포의 팽창 외에, 폐포 격막의 파열이 있었다. 기종성 확대 폐포는 미변화된 폐포를 압축시켰고, 그 결과 폐에 국소적인 무기폐를 초래한다. 7일째, 엘라스타제 폐에 있는 결합 조직 면적은 무손상 대조군에 비해 3배 넘게 감소했다(P<0.05). 또한, 특히 엘라스타제는 간질 조직의 염증성 침윤 및 림포-대식세포 침윤으로 인해 폐포 벽의 비대를 초래했다. 또한, 개별적인 폐포의 내강에는 대식세포와 림프구가 채워져 있었다(표 35).
14일째, 기종의 진행이 관찰되었다: 중간 및 하위 폐 영역에서 기종성 확대 폐포 면적의 증가는 각각 34.1% 및 53.6%에 이르렀고, 각각의 벽들은 박막화되었다(표 35. 도 4). 이는 폐포 모세관의 박막화 및 황폐화를 초래했다. 관찰 30일까지, 폐 정점 및 하위 폐 영역에서 기종성 확대 조직의 퍼센트는 증가했다. 60일째, 상기 지표 값은 30일째 지수 값에 비해 약간 낮았다.
마우스에 트레아미드의 투여는 관찰 기간 전반에 폐 실질의 염증성 침윤 강도를 감소시켰다. 이 약물은 폐 정점(7일, 14일, 30일 및 60일) 및 하위 폐 영역(14일, 30일 및 60일)에서 병리학적 대조군에 비해 기종성 확대 폐포 면적을 감소시켰다(표 35, 도 4).
따라서, 트레아미드의 경구 투여는 엘라스타제-유도성 폐기종 모델에서 폐 조직에 재생 효과를 나타냈다: 기종성 확대 폐 조직의 면적의 감소가 기록되었다. 이는 트레아미드가 폐 조직의 구조적 및 기능적 특성을 복원시키는 약물로 사용될 수 있다는 결론을 내리게 한다.
실시예 14
폐 섬유증의 발달에 미치는 트레아미드의 효과 연구
폐 섬유증을 유발하는 폐의 폐포 상피의 독성 손상은 세포증식억제제인 블레오마이신을 30㎕의 생리학적 식염수에서 80㎍/마우스의 용량으로 1회 기관지내 투여하여 모의했다. 수술 중에 마취는 에테르 흡입으로 달성했다. 수술장은 70% 에탄올 용액으로 소독했고 이 수술장에서 털을 제거했다. 목의 피부, 피하 조직 및 목 고유의 근막을 목의 중선을 따라 해부했다. 근육은 조직의 무딘 분리 방법으로 기관의 배측에서 떼어냈다. 블레오마이신의 주사는 Hamilton 주사기로 기류를 따라 흡입시켜 수행했다. 상처를 봉합한 후, 수술장은 소독제로 처리했다. 블레오마이신의 투여는 실험 0일로 간주했다.
트레아미드의 효과 및 폐 섬유증의 재생은 폐의 조직건축학뿐만 아니라 폐에 결합조직의 합성 강도 및 수로 추정했다.
수행된 실험은 블레오마이신의 단독 기관지내 투여 후 수컷 C57BL/6 마우스의 폐의 형태학적 패턴의 변화가 폐섬유증에 특이적인 변화와 유사하다는 것을 보여주었다. 따라서, 반기슨에 따른 피크로푸신에 의한 C57BL/6 마우스 폐의 조직학적 표본의 염색 및 후속적인 결합 조직의 가시화는 주로 혈관 및 세기관지 주위에 있는 결합 조직의 유의적인 증식을 기록할 수 있었다(도 5, 표 36). 또한, 무손상 대조군 및 병리학적 대조군의 동물들의 폐 균질액은 효소면역분석으로 조사했다. 표 37에서 볼 수 있듯이, 블레오마이신의 기관지내 투여는 I형 콜라겐, 총 콜라겐 및 하이드록시프롤린의 수준을 유의적으로 증가시켰다.
실험 21일째 폐 섬유증이 있는 C57Bl/6 마우스의 폐에 존재하는 결합 조직의 함량(%)(M±m, n=10)
무손상 대조군 폐 섬유증(병리학적 대조군) 10mg/kg 용량의 Ch-26B-BG로 처리된 폐 섬유증
0.91±0.09 2.29±0.13* 1.17±0.20●
주:
* - 차이가 무손상 대조군 대비 유의적이다(P<0.05);
● - 차이가 병리학적 대조군 대비 유의적이다(P<0.05).
실험 21일째 폐 섬유증이 있는 C57Bl/6 마우스의 폐에 존재하는 총 콜라겐, I형 콜라겐 및 하이드록시프로필의 수준(M±m, n=10)
연구 그룹 I형 콜라겐
(ng/ml)		 총 콜라겐
(mg/ml)		 하이드록시프롤린
(㎍/ml)
무손상 대조군 204 ± 17 22.3 ± 1.5 26.12 ± 2.3
폐섬유증
(병리학적 대조군)		 248.4 ± 21
*		 32.6 ± 2.2
*		 39.01 ± 2.6
*
Ch-268-BG 10 mg/kg 용량으로 처리된 폐 섬유증 201.6 ± 18
●		 23.4 ± 1.7
●		 27.97 ± 2.2
●
주:
* - 차이가 무손상 대조군 대비 유의적이다(P<0.05);
● - 차이가 병리학적 대조군 대비 유의적이다(P<0.05).
10mg/kg 용량의 트레아미드는 폐 섬유증의 치료에 효과적이었다: 혈관 및 세기관지 주위에 침착된 콜라겐 섬유의 양은 무손상 대조군의 수준으로 감소했다(도 5, 표 37). 트레아미드의 항섬유증 효과에 대한 추가 특징은 폐 섬유증이 있는 마우스의 폐 균질액에 존재하는 콜라겐, I형 콜라겐 및 하이드록시프롤린 농도의 현저한 저하였다(표 37).
수득된 결과들은 폐 섬유증에서 트레아미드가 콜라겐 섬유에 의한 섬유아세포 생산의 정상화로 자명한 항섬유증 효과가 있다는 결론을 내리게 한다. 이는 폐 조직의 섬유아세포를 재생시키는 트레아미드의 능력을 시사한다. 즉, 트레아미드는 폐 조직의 재생에 기여하고 폐 섬유증의 발달을 방지하는 약물로 사용될 수 있다.
실시예 15
종양이 있는 동물의 악액질의 발달에 미치는 트레아미드의 효과 연구
혈행 전이성 루이스 폐 암종(LLC)을 모의할 때 수컷 C57Bl/6 마우스에서는 악액질이 발달되었다. 종양 세포는 0.1ml 생리학적 식염수 중의 5x106 농도로 마우스에게 한번에 피하 주사했다(Yu-Chou T., Samuel K.K., I-Lu L. et al. Preclinical Investigation of the Novel Histone Deacetylase Inhibitor AR-42 in the Treatment of Cancer-Induced Cachexia//JNCI J Natl Cancer Inst(2015) 107(12)).
종양 세포 주사일을 실험 1일로 간주했다. 트레아미드는 연구 15일부터 28일까지 매일 10mg/kg 용량으로 1일 1회 위내 투여했다. 동물은 종양 세포 주입 1일 전(0일) 및 실험 28일째 체중을 쟀다. 28일째 동물은 CO2 챔버에서 안락사시키고, 혈액을 수집했다. 유리 테스토스테론의 수준은 혈청에서 효소면역분석법으로 측정했다.
연구 결과는 원시 종양 결절의 중량을 뺀 것을 포함하여 루이스 폐 암종 세척후 28일째 동물(병리학적 대조군)의 체중은 건강한 동물군에 비해 1.2배 유의적으로 감소했음을 보여주었다(표 38). 트레아미드의 위내 투여는 루이스 폐 암종을 가진 동물의 체중 손실을 완전하게 방지했다(표 38).
실험 28일째 원시 종양 결절(d)의 감산을 고려한, 루이스 폐 암종에 의해 유도된 악액질을 가진 수컷 C57Bl/6 마우스의 체중(M±m, n=10)
그룹 체중, 종양 중량은 감산됨
무손상 대조군 23.95 ± 0.39
루이스 폐 암종 20.44 ± 0.88*
트레아미드(10 mg/kg)로 처리된 루이스 폐 암종 23.83 ± 0.57●
주:
* - 차이가 무손상 대조군 대비 유의적이다(P<0.05);
● - 차이가 병리학적 대조군(루이스 폐 암종) 대비 유의적이다(P<0.05).
혈청의 면역효소 분석은 연구 28일째 루이스 폐 암종을 가진 병리학적 대조 동물에서 혈청 테스토스테론 수준이 현저하게 감소(무손상 대조군의 14.8% 이하)했음을 보여주었다(표 39). 트레아미드의 코스 투여는 LLC를 가진 동물의 혈청에서 유리 테스토스테론의 농도를 유의적으로 증가시켰다.
실험 28일째 루이스 폐 암종에 의해 유도된 악액질을 가진 수컷 C57Bl/6 마우스의 혈청에 존재하는 유리 테스토스테론 수준(pg/ml)(M±m, n=10)
매개변수 무손상 대조군 루이스 폐 암종 트레아미드로 처리된 루이스 폐 암종(10mg/kg)
유리 테스토스테론 11.36±1.2 1.68±0.22* 3.2±0.3*●
주:
* - 차이가 무손상 대조군 대비 유의적이다(P<0.05);
● - 차이가 병리학적 대조군(루이스 폐 암종) 대비 유의적이다(P<0.05)
따라서, 루이스 폐 암종의 발달 하에, 트레아미드의 경구 투여는 악액질의 발달을 방지했다. 트레아미드의 치료 효과는 병든 동물의 유리 테스토스테론 혈청 수준의 회복으로 표현되는 근육 및 정소 조직의 기능 회복에 기인하는 것이다. 이는 트레아미드가 악액질의 발달을 방지하는 약물로 사용될 수 있다는 결론을 내리게 한다.
약학적 조성물(정제당 조성, mg)
성분 mg mg
트레아미드(활성제) 5.00 50.00
첨가제:
미세결정형 셀룰로오스(NF, Ph.Eur., JP) 60.00 300.00
사전젤라틴화된 전분(Ph.Eur., USP, NF) 27.80 114.00
소듐카르복시메틸 전분(Ph.Eur., NF, JP) 4.00 20.00
탈크(Ph.Eur., USP, JP) 2.00 10.00
마그네슘 스테아레이트(USP, NF) 1.00 5.00
이산화규소, 콜로이드성 0.20 1.00
필름 코팅 Opadry®II 31F280007 3.00 15.00
코팅된 정제 중량 103.00 515.00
본 발명자는 트레아미드가 만성 무균성 전립선염(CAP) 및 양성 전립선 비대증(BPH)의 모델에 대해 전립선 조직의 구조의 정상화 및 조직 재생을 촉진한다는 것을 발견했다. 수득된 데이터는 트레아미드의 사용이 전립선 상피 조직의 재생을 촉진한다는 결론을 내리게 한다. 이는 위축 과정의 중증도 감소로 표현된다. 이는 명백하게도 세엽 상피의 기능적 활성을 증가시킬 것이고, 정액의 정성적 특징의 복원을 촉진할 것이다.
또한, 본 출원인은 트레아미드의 투여 시, BPH의 증상이 덜 현저했음을 실험적으로 생체내에서 입증했다. 이 데이터는 트레아미드의 항증식 성질을 확인시켜 준다.
또한, 본 발명자는 트레아미드가 정소 조직의 수복적 재생 과정을 증진시키고 정자형성의 증식 풀의 고갈에 의해 유발되는 정소 기능장애의 치료에 사용될 수 있는 제제라는 것을 발견했다.
수득된 데이터는 트레아미드가 정자형성 조직의 선조 세포의 기능적 활성을 직접 자극하는 능력이 있음을 증명한다.
또한, 출원인은 트레아미드가 정소의 재생능을 회복시키는데 잠재적인 제제임을 실험적으로 확인했다. 트레아미드의 투여는 조직의 재생능을 증가시켰다. 이 약물은 정자형성의 증식 풀의 새로운 근원(줄기 세포)의 형성을 직접 자극할 뿐만 아니라, 이 세포의 형성을 자극하는 체액 인자의 효과를 증진시켰다.
또한, 본 출원인은 트레아미드가 파클리탁셀의 투여로 인하여 감소된 정자 운동성을 복원시킨다는 것을 실험적으로 입증했다.
본 발명자에 의해 제시된 데이터는 트레아미드가 수임 콜로니 형성 세포의 수의 저하로 억제된 정소 조직의 수복적 재생을 효과적으로 자극한다는 것을 보여준다.
또한, 본 출원인은 정자무력증에서 정자 세포의 운동성을 복원시키는 트레아미드의 능력을 보여주었다. 수득된 데이터는 트레아미드가 정자 운동성의 회복에 효과적인 제제임을 암시한다.
또한, 본 발명자는 트레아미드가 생식선기능저하증에서 관찰되는 정자 운동성을 복원시킨다는 것을 발견했다.
수많은 실험들은 트레아미드가 다양한 병인(예컨대, 활성의 나이 관련 저하, 계절적 활성 저하 등)의 교미 활성을 회복시키는데 효과적인 제제임을 확인시켜준다.
트레아미드는 췌장 조직에 재생 작용을 발휘하는 것으로 밝혀졌다. 트레아미드는 내당능 장애 및 대사 증후군을 치료하는데 사용될 수 있다.
또한, 트레아미드는 간 조직의 구조적 및 기능적 특성을 복원시키는 약물로 사용될 수 있는 것으로 실험적으로 확인되었다.
또한, 트레아미드는 암 조직의 구조적 및 기능적 특성을 복원시키는 약물로 사용될 수 있는 것으로 입증되었다.

Claims (31)

  1. 하기 화학식 (I)의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염의 유효량 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는, 조직 재생 자극용 약학적 조성물:
    화학식 (I)
    Figure pct00004
  2. 제1항에 있어서, 상기 조직은 췌장 조직, 간 조직, 폐 조직, 근육 조직, 정자형성 조직, 정소 조직 및 전립선 조직을 함유하는 군으로부터 선택되는 것인, 약학적 조성물.
  3. 하기 화학식 (I)의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염인, 조직 재생 자극용 약제:
    화학식 (I)
    Figure pct00005
  4. 제3항에 있어서, 상기 조직은 췌장 조직, 간 조직, 폐 조직, 근육 조직, 정자형성 조직, 정소 조직 및 전립선 조직을 함유하는 군으로부터 선택되는 것인, 약제.
  5. 하기 화학식 (I)의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염의 유효량을 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 조직 재생 방법:
    화학식 (I)
    Figure pct00006
  6. 제5항에 있어서, 상기 조직은 췌장 조직, 간 조직, 폐 조직, 근육 조직, 정자형성 조직, 정소 조직 및 전립선 조직을 함유하는 군으로부터 선택되는 것인, 방법.
  7. 조직 재생에 사용되는 하기 화학식 (I)의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염의 용도:
    화학식 (I)
    Figure pct00007
  8. 제7항에 있어서, 상기 조직은 췌장 조직, 간 조직, 폐 조직, 근육 조직, 정자형성 조직, 정소 조직 및 전립선 조직을 함유하는 군으로부터 선택되는, 용도.
  9. 조직의 구조적 또는 기능적 손상과 관련된 병리학적 상태를 치료하는데 사용되는 하기 화학식 (I)의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염의 용도:
    화학식 (I)
    Figure pct00008
  10. 제9항에 있어서, 상기 조직은 췌장 조직, 간 조직, 폐 조직, 근육 조직, 정자형성 조직, 정소 조직 및 전립선 조직을 함유하는 군으로부터 선택되는 것인, 용도.
  11. 제10항에 있어서, 상기 병리학적 상태는 대사 증후군, 내당능 장애, 간염, 특발성 폐 섬유증, 폐기종, 만성 폐색성 폐질환, 악액질, 생식선기능저하증, 전립선염, 양성 전립선 비대증, 상관성 정소 기능장애 및 자가면역 정소염을 포함하는 군으로부터 선택되는 것인, 용도.
  12. 제11항에 있어서, 상기 전립선염은 만성 전립선염, 특히 무균성 만성 전립선염; 또는 카테고리 3B 전립선염 또는 자가면역 전립선염인 용도.
  13. 하기 화학식 (I)의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염의 유효량 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는, 남성 생식력의 저하를 정상화하기 위한 약학적 조성물:
    화학식 (I)
    Figure pct00009
  14. 남성 생식력의 저하를 정상화하기 위해 사용되는, 하기 화학식 (I)의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염의 용도:
    화학식 (I)
    Figure pct00010
  15. 제14항에 있어서, 상기 남성 생식력의 저하는 생식선기능저하증, 정자무력증, 발기부전, 상관성 정소 기능장애 및 정소 기능장애를 함유하는 군으로부터 선택되는 병리학적 상태에 의해 유발되는 것인 용도.
  16. 하기 화학식 (I)의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염의 유효량 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는, 정자 운동성을 회복시키기 위한 약학적 조성물:
    화학식 (I)
    Figure pct00011
  17. 정자 운동성을 회복시키기 위한 하기 화학식 (I)의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염의 용도:
    화학식 (I)
    Figure pct00012
  18. 제17항에 있어서, 상기 정자 운동성은 생식선기능저하증, 정자무력증, 상관성 정소 기능장애 및 정소 기능장애를 함유하는 군으로부터 선택되는 병리학적 상태에 의해 저하된 것인, 용도.
  19. 하기 화학식 (I)의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염의 유효량 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는, 병리학적 상태의 치료 및/또는 예방시 혈당 수치를 감소시키기 위한 약학적 조성물:
    화학식 (I)
    Figure pct00013
  20. 하기 화학식 (I)의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염의 치료적 유효량을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 병리학적 상태의 치료 및/또는 예방시 혈당 수치를 감소시키는 방법:
    화학식 (I)
    Figure pct00014
  21. 제20항에 있어서, 상기 병리학적 상태는 대사 증후군 및 내당능 장애를 포함하는 군으로부터 선택되는 것인, 방법.
  22. 혈당 수치를 감소시키는데 사용되는 하기 화학식 (I)의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염의 용도:
    화학식 (I)
    Figure pct00015
  23. 제22항에 있어서, 상기 혈당 수치는 대사 증후군 및 내당능 장애를 포함하는 군으로부터 선택되는 병리학적 상태에 의해 증가된 것인 용도.
  24. 하기 화학식 (I)의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염의 유효량 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는, 병리학적 상태의 치료 및/또는 예방시 간 구조 및 기능을 회복시키기 위한 약학적 조성물:
    화학식 (I)
    Figure pct00016
  25. 병리학적 상태의 치료 및/또는 예방시 간 구조 및 기능의 회복에 사용되는, 하기 화학식 (I)의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염의 용도:
    화학식 (I)
    Figure pct00017
  26. 제25항에 있어서, 상기 병리학적 상태는 간염, 특히 만성 간염 및 독성 간염을 포함하는 군으로부터 선택되는 것인 용도.
  27. 하기 화학식 (I)로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염의 유효량 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는, 병리학적 상태의 치료 및/또는 예방에서 폐 구조 및 기능을 회복시키기 위한 약학적 조성물:
    화학식 (I)
    Figure pct00018
  28. 병리학적 상태의 치료 및/또는 회복에서 폐 구조 및 기능을 회복시키는데 사용되는 하기 화학식 (I)의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염의 용도:
    화학식 (I)
    Figure pct00019
  29. 제28항에 있어서, 상기 병리학적 상태는 만성 폐색성 폐질환(COPD), 폐기종 및 특발성 폐 섬유증을 포함하는 군으로부터 선택되는 것인 용도.
  30. 하기 화학식 (I)의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염의 유효량 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는, 병리학적 상태의 치료 및/또는 예방시 췌장 구조 및 기능을 회복시키기 위한 약학적 조성물:
    화학식 (I)
    Figure pct00020
  31. 췌장의 구조적 및 기능적 장애에 의해 유발된 병리학적 상태의 치료 및/또는 예방에 사용되는 하기 화학식 (I)의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염의 용도:
    화학식 (I)
    Figure pct00021
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