KR101160225B1 - 자궁 내막증 치료용 약제 - Google Patents

Abstract

본 발명은 자궁 내막증의 치료 또는 예방을 위한 약제 제조에 있어서의 도파민 작용제의 용도에 관한 것이다.

Description

자궁 내막증 치료용 약제{MEDICAMENT FOR THE TREATMENT OF ENDOMETRIOSIS}

본 발명은 자궁 내막증 치료용 약제에 관한 것이다.

자궁 내막증은 양성의, 만성적인 부인과 질병이다. 이는 선상피와 기질 모두를 포함하는 자궁 내막 조직이 자궁강 외부에 존재하는 것으로서 규정될 수 있다. 이는 양성의 부인과 질병으로, 일부 여성 환자 집단에서는 공격적인 질환으로 진행될 수 있다. 자궁 내막증은 월경 곤란증, 이상성감증, 골반 통증 및 가임성 감소 등의 다양한 스트레스성 증상들과 관련있다.

혈관신생(새로운 혈관이 기존 혈관으로부터 생성되는 과정)은 자궁 내막증의 발병에 중요할 수 있으며, 혈관 투과성 인자/혈관 내피 성장 인자(VP/VEGF)는 혈관 생성과, 생리적 혈관신생 및 병리적 혈관신생 모두에 있어 소정의 역할을 담당하고 있다. 자궁 내막증 치료에 있어 항-혈관신생 요법의 잠재적 효능은 면역-저하(immuno-compromised) 누드 마우스에 이식한 인간 자궁 내막 조직을 이용한 연구로 분석되었다. 4종의 여러가지 항-혈관신생 제제를, 자궁 내막 이식편을 이식하고 3주일 후에 투여하였다(Nap et al., 2004). 이들 4가지 저해제 모두 확립된 이식편의 크기를 줄일 수 있었으며, 새로운 혈관 형성은 중지되었다. 그러나, 공지된 항-혈관신생 제제는 독성이 매우 높아, 인간의 임상 상황에 도입하기 어렵다.

현재 도파민 작용제를 포함하는 조성물을 이용하여 자궁 내막증을 치료할 수 있음이 예기치 않게 확인되었다.

따라서, 본 발명은 자궁 내막증의 치료 및/또는 예방용 약제 제조에 있어 도파민 작용제의 용도를 제공한다. 또한, 본 발명은 자궁 내막증의 치료 및/또는 예방에 있어 도파민 작용제의 용도를 제공한다. 여기서, "자궁 내막증의 치료"는 자궁강 외부에 존재하는 자궁 내막 조직의 양을 줄이기(또는 제거를) 위한 치료(예, 자궁 내막성 병변의 감소 또는 제거), 및/또는 자궁 내막증과 관련된 한가지 이상의 증상을 경감 및/또는 개선시키기 위한 치료를 포함한다(예, 월경 곤란증의 증상을 개선 및/또는 경감하기 위한 치료; 이상성감증의 증상을 개선 및/또는 경감하기 위한 치료; 및/또는 골반 통증을 개선 및/또는 약화시키기 위한 치료). 용어 "자궁 내막증의 치료"는 자궁강 외부에 존재하는 자궁 내막 조직의 갯수 및/또는 크기를 감소시키기 위한 치료(예, 자궁 내막증 병변의 수 및/또는 크기 감소)를 포함한다. 용어 "자궁 내막증의 치료"는 자궁 내막선(endometrial gland)의 수를 줄이기 위한 치료를 포함한다. 용어 "자궁 내막증의 치료"는 활성형 자궁 내막성 병변의 퍼센트의 현저한 감소, 자궁 내막 병변에서 위축성 또는 퇴행성 조직의 현저한 세포 충실성(cellularity) 및 조직성(organisation)의 현저한 감소, 및 자궁 내막 병변에서의 신생 혈관의 현저한 수적 감소 등의 한가지 이상을 발생시키는 치료를 포함한다. "자궁 내막증의 치료"라는 용어는 난소, 자궁 막힌관(uterine cul-de-sac), 자궁천골 인대(uterosacral ligament), 자궁의 후면(posterior surface), 광인대(broad ligament), 나머지 골반 복막, 장, 비뇨관(방광 및/또는 요관 포함) 중 한 곳 이상의 위치에서의 자궁 내막성 병변의 수 및/또는 크기를 감소시키는 치료를 포함한다.

용어 자궁 내막증은, 예컨대 복막 자궁 내막증, 난소 자궁 내막증 및 심재성 자궁 내막증을 포함한다.

본원에서, 용어 "도파민 작용제"는 도파민처럼 작용하는 화합물, 예컨대 도파민 수용체와 상호작용(예, 특이적으로 결합)하여 도파민 작용을 모방하는 약물을 의미한다. 도파민 작용제는 오직 "도파민성 물질"인 화합물, 즉 여러가지 작용 메카니즘을 통해 도파민의 수준을 증가시키는 화합물만을 포함하는 것은 아니다. 용어 "도파민 작용제"는 US 6359130에 기재된 브릿지된 인데노피롤로카르바졸을 포함하진 않는다.

도파민 작용제는 난소 과다자극 증후군(OHSS: ovarian hyperstimulation syndrome)의 치료 또는 예방에 유용한 것으로 확인되었다(WO2006117608). 이는 모세관의 혈관 투과성을 현저하게 증가시키는 병태이다. 도파민 작용제는 이러한 작용을 회복시킬 수 있는 것으로 확인되었다. 그러나, 자궁 내막증의 병태와 자궁 내막증 치료에 있어 항-혈관신생 요법의 잠재적인 효능은 개시되어 있지 않다.

본 발명의 측면에서, 도파민 작용제로는, 아만타딘(amantadine), 브로모크립틴(bromocryptine), 카베르골린(cabergoline), 퀴나골리드(quinagolide), 리수리드(lisunde), 페르골리드(pergolide), 로피니롤(ropinirole) 및 프라미펙솔(pramipexole)이 있으나, 이들로 한정되는 것은 아니다. 본 발명에 이용하기에 바람직한 도파민 작용제는 카베르골린이다. 본 발명에 이용하기에 바람직한 도파민 작용제는 퀴나골리드이다. 이른바 "도파민 부분 작용제"(예, 테르구리드)도 본 발명에 사용할 수 있다. 그러나, 도파민 작용제를 사용하는 것이 바람직하다.

바람직하기로는, 단독의 도파민 작용제를 사용한다.

도파민 작용제는 25 ㎍/day 내지 80 mg/day, 바람직하기로는 50 ㎍/day 내지 5 mg/day, 더 바람직하기로는 300 ㎍/day 내지 1 mg/day의 투여량(예, 인간 환자에 대한 경구 투여량)으로 투여될 수 있으며, 이 범위 내에서 적절한 투여량은 당업자들에게 자명한 바와 같이, 사용될 도파민 작용제에 의존적이다.

바람직한 예에 있어서, 도파민 작용제는 카베르골린이다. 바람직하기로는, 카베르골린은 0.01 내지 12.5 mg/week, 바람직하기로는 0.1 내지 10 mg/week, 더 바람직하기로는 0.5 내지 5 mg/week, 더 바람직하기로는 3.5 내지 4 mg/week의 투여량(인간 환자에 대한 경구 투여량)으로 투여된다. 도파민 작용제는, 예컨대 매일 1회 투여(예컨대, 0.1 mg/day 내지 5 mg/day, 0.2 mg/day 내지 1 mg/day, 예컨대 0.5 mg/day)로 투여할 수 있으며, 또는 1일 투여량을 2회 이상의 투약으로 나누어 24시간에 걸쳐 여러 시간대에 복용시킬 수 있다. 도파민 작용제(카베르골린)는 상기한 수준으로 매일 투여하거나 또는 매주, 1주일에 2번 또는 이틀마다 등가의 투여량으로 투여할 수 있다. 한가지 요법으로, 도파민 작용제(예, 카베르골린)를 1주일에 총 투여량 3.5 내지 12.5 mg/week로 투여한다(예, 4 mg/week, 7 mg/week, 10 mg/week).

다른 예로, 도파민 작용제는 퀴나골리드이다. 바람직하게는, 퀴나골리드는 25 - 1000 ㎍/day, 바람직하기로는 25 - 500 ㎍/day, 더 바람직하기로는 25 - 300 ㎍/day의 투여량(인간 환자에 대한 경구 투여량)으로 투여된다. 도파민 작용제는, 예컨대 매일 1회 투여되거나, 또는 1일 투여량을 2회 이상의 투약으로 나누어 24시간에 걸쳐 여러 시간대에 복용시킬 수 있다. 도파민 작용제(퀴나골리드)는 상기한 수준으로 매일 투여하거나 또는 매주, 1주일에 2번 또는 이틀마다 등가의 투여량으로 투여할 수 있다.

다른 예에서, 도파민 작용제는 브로모크립틴이다. 바람직하기로는, 브로모크립틴은 10 - 80 ㎍/day, 바람직하기로는 10 - 40 mg/day의 투여량(인간 환자에 대한 경구 투여량)으로 투여된다.

일 예에서, 도파민 작용제는 자궁 내막증의 단독의 의학 치료제로 사용된다. 즉, 도파민 작용제는 그외 의학적 또는 외과적 치료제 없이 사용될 수 있다(예, 다나졸 없이).

다른 예에서, 도파민 작용제의 투여는 자궁 내막증의 다른 의학적 치료 또는 외과 치료[예, NSAID 및/또는 호르몬 치료제(다나졸, OC, 메드록시프로게스테론 아세테이트, 그외 프로게스틴, GnRH 작용제와 길항제, 아로마타제 저해제)]와 조합될 수 있다. 다른 예로, 외과 치료 또는 의학적 치료는 도파민 작용제를 처리하기 전에, 처리하는 동안에 또는 처리한 후 사용할 수 있다. 이러한 예들은 하기 실시예들에서 보다 상세하게 논의된다.

또한, 이를 필요로하는 환자에게 도파민 작용제를 투여하여, 예컨대 활성 자궁 내막성 병변 %의 현저한 감소, 자궁 내막성 병변에서의 위축성 또는 퇴행성 조직의 특징인 세포 충실성 및 조직성의 현저한 감소 및 자궁 내막성 병변에 신생 혈관의 현저한 수적 감소 등의, 실질적인 임상적 이점을 제공할 수 있는 것으로 확인되었다.

도파민 작용제를 기반으로한 약제 역시 고투여량을 허용하는 이점 뿐만 아니라 안전하며 임상적인 사용 기록도 잘 기재되어 있다.

게다가, 도파민 작용제(예, 카베르골린)는 장기간(예, 1 - 3주일(예, 1 - 21일, 예컨대 1 - 14일), 1일 내지 3달, 1일 내지 6달, 1일 내지 12달, 또는 1일 내지 2년 또는 그 이상) 투여할 수 있으며, 치료학적으로 이로운 효과를 줄 수 있으며, 부작용 발생 위험도도 낮다. 투여는 매일 또는 매주 투여로 계속되거나, 또는 예컨대 몇 주간(예, 1-3주) 또는 몇달간(예, 1-3개월) 등의, 1회 이상의 중단이 개입될 수 있다. 도파민 작용제는 통증(또는 증상)이 계속되는 동안 투여될 수 있다.

도파민 작용제(예, 카베르골린, 퀴나골리드)는 임산부에게 투여될 수 있다.

자궁 내막증의 치료 또는 예방은 자궁 내막선의 양적 감소와 관련있을 수 있다.

본 발명의 예에 있어서, 혈관 내피 성장 인자(VEGF)는 자궁 내막증 발병의 요인으로서, 도파민 작용제의 타겟이 될 수 있다. 이소형인 VEGF₁₂₁과 VEGF₁₆₅는 혈관신생 과정에 주로 관여하는 것으로 보인다(Watkins, R H , et al , Am J Physiol 1999, vol 276, pp 858-67). VEGF에 대한 2가지 특이적인 내피 세포막 수용체인, VEGF 수용체-1(VEGFR-1, Flt-1) 및 VEGFR-2(FIk-1/KDR)가 동정되었다. VEGFR-2는 혈관신생과 혈관형성을 조절하는데 주로 관여하는 것으로 보인다.

VEGFR-2(KDR)는 자궁 내막증의 발병에 하나의 요인으로서 도파민 작용제의 타겟이 될 수 있다. Notch-4도 자궁 내막증의 발병에 하나의 요인으로서 도파민 작용제의 타겟이 될 수 있다. VEGF, VEGFR-2 및 Notch-4는 자궁 내막증 발병에 하나의 요인으로서 도파민 작용제의 타겟이 될 수 있다. 도파민 작용제의 다른 작용 메카니즘도 본 발명의 범위에 포함된다.

도파민 작용제는 약제학적으로 허용가능한 조제물로서 투여된다. 조제물은 선택적으로 약제학적으로 허용가능한 염, 완충제, 보존제 및 부형제를 포함할 수 있는, 약제학적으로 허용가능한 조성물로서 본 발명에 따라 투여될 수 있다. 활성 성분으로서 도파민 작용제(들)를 포함하는 약제학적 조제물은 당업계에 잘 알려져 있으며, 상업적으로 구입가능하다. 예컨대, 카베르골린은 공식적으로 등록된 상표 Cabaser 및 Sogilen/Dostinex로 구입할 수 있다. 자궁 내막증 치료에 있어 이러한 시판되는 도파민 작용제 조제물의 사용은 본 발명에 따른다.

선택되는 투여 방식은 치료중인 병태의 예민성(acuteness)과 중증도, 및 필요 투여량에 따라 결정될 것이다. 허용불가능한 부작용없이 원하는 치료 효과를 발생시키는 모든 투약 방식은, 본 발명의 실시에 적절하다. 이러한 투여 방식은 경구, 직장, 국소, 경피, 설하, 근육내, 비경구, 정맥내, 강내(intracavity), 질 및 수술중에 사용되는 부착성 매트릭스(adhesive matrix)를 포함할 수 있다. 본 발명에 따라 이용하기 위한 조성물의 다양한 제형화 방법은 Handbook of Pharmaceutical Excipients, Third Edition, American Pharmaceutical Association, USA and Pharmaceutical Press UK (2000), 및 Pharmaceutics - The Science of Dosage Form Design, Churchill Livingston (1988)에 기술되어 있다.

바람직한 예에서, 투여는 경구 투여이다. 경구 투여에 적합한 조성물은 캡슐제, 카세제(cachet), 정제, 시럽제, 엘리시르제 또는 로젠제를 포함한다.

본 발명에 따른 다른 측면에 있어서, 도파민 작용제를 필요로하는 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 자궁 내막증의 치료 또는 예방 방법을 제공한다.

바람직하기로는, 도파민 작용제는 활성 성분으로서 1종 이상의 도파민 작용제를 포함하는 약제학적 조제물의 형태로 투여된다.

도파민 작용제는, 25 ㎍/day - 80 mg/day, 바람직하기로는 50 ㎍/day - 5 mg/day, 더 바람직하기로는 300 ㎍/day - 1 mg/day의 투여량(인간 환자에 대한 경구 투여량)으로 투여될 수 있으며, 이 범위 내에서 적절한 투여량은 당업자들에게 자명한 바와 같이, 사용될 도파민 작용제에 의존적이다.

바람직한 예에 있어서, 도파민 작용제는 카베르골린이다. 바람직하기로는,카베르골린은 0.01 - 12.5 mg/week, 바람직하기로는 0.1 - 10 mg/week, 더 바람직하기로는 0.5 mg - 5 mg/week, 더 바람직하기로는 3.5 mg/week - 4 mg/week의 투여량(인간 환자에 대한 경구 투여량)으로, 투여된다. 도파민 작용제는, 예컨대 매일 1회 투약(예컨대, 0.1 mg/day - 5 mg/day, 0.2 mg/day - 1 mg/day, 0.5 mg/day)하거나, 또는 1일 투여량을 2회 이상의 투약으로 나누어 24시간에 걸쳐 여러 시간대에 복용시킬 수 있다. 도파민 작용제(카베르골린)를 상기 범위로 매일 투약하거나, 또는 예컨대 등가의 투여량으로, 예컨대 매주, 매주 2회, 이틀마다 투여할 수 있다. 한가지 요법으로, 도파민 작용제(예, 카베르골린)는 총 투여량 3.5 - 12.5 mg/week(예, 4 mg/week, 7 mg/week, 10 mg/week)로 투여된다.

다른 예로, 도파민 작용제는 퀴나골리드이다. 바람직하기로는, 퀴나골리드는 25 - 1000 ㎍/day, 바람직하기로는 25 - 500 ㎍/day, 더 바람직하기로는 25 - 300 ㎍/day의 투여량(인간 환자에 대한 경구 투여량)으로 투여된다. 도파민 작용제는, 예컨대 매일 1회 투여되거나, 또는 1일 투여량을 24시간 동안 여러 시간대에 복용하도록 2 또는 그 이상의 횟수로 분할할 수 있다. 도파민 작용제(퀴나골리드)는 상기한 수준으로 매일 투여하거나, 또는 매주, 1주일에 2번 또는 이틀마다 등가의 투여량으로 투여할 수 있다.

다른 예에서, 도파민 작용제는 브로모크립틴이다. 바람직하기로는, 브로모크립틴은 10 - 80 mg/day, 바람직하기로는 10 - 40 mg/day의 투여량(인간 환자에 대한 경구 투여량)으로 투여된다.

도파민 작용제의 투여는 자궁 내막증의 다른 의학적 치료 또는 외과 치료(예, NSAID 및/또는 호르몬 치료제(다나졸, OC, 메드록시프로게스테론 아세테이트, 그외 프로게스틴, GnRH 작용제와 길항제, 아로마타제 저해제)와 조합될 수 있다. 다른 예로, 외과 치료 또는 의학적 치료는 도파민 작용제를 처리하기 전에, 처리하는 동안에 또는 처리한 후 사용할 수 있다.

출원인은, 도파민 작용제(예, 카베르골린)를 장기간(예, 1 - 3주일(예, 1 - 21일, 예컨대 1 - 14일), 1일 내지 3달, 1일 내지 6달, 1일 내지 12달, 또는 1일 내지 2년 또는 그 이상) 투여할 수 있으며, 치료학적으로 이로운 효과를 줄 수 있으며 부작용 발생 위험도도 낮다는 것을, 확인하였다. 투여는 매일 또는 매주 투여로 계속되거나, 또는 예컨대 몇 주일간(예, 1-3주) 또는 몇달간(예, 1-3개월)의 1회 이상의 중단이 개입될 수다. 도파민 작용제는 통증(또는 다른 증상)이 계속되는 동안 투여될 수 있다.

환자는 임산부일 수 있다.

자궁 내막증의 치료 또는 예방은 자궁 내막선의 양적 감소와 관련있을 수 있다.

본 발명을 실시예와 하기 도면을 참조하여 설명할 것이다.

도 1은 하기에서 검토한 동물 실험에 따른 대조군 및 카베르골린의 저 투여량 군(0.05 mg/kg/day)과 카베르골린의 고 투여량 군(0.1 mg/kg/day)의 활성 병변(active lesion) %을 나타낸 것으로, 도 1a는 3가지 확립된 군들에서의 선(gland)/기질의 비를 나타낸다[카베르골린 저 투여량 군 및 고 투여량 군("Cb2")은 대조군에 비해 기질이 더 많고 선은 적었다(*P<0.05)].

도 2는 대조군, 저 투여량군과 고 투여량군의 혈관(mm³)을 나타낸 것이다.

도 3은 대조군, 저 투여량군 및 고 투여량군 동물에서의 "성숙" 및 "신생" 혈관 퍼센트를 나타낸 것이다.

도 4는 대조군, 저 투여량군 및 고 투여량군의 증식 지수를 나타낸 것이다.

도 5는 대조군, 저 투여량군 및 고 투여량군에서의 VEGF, VEGFR-2(KDR), Notch-4, Ang 1 및 Wnt-1의 상대적인 발현을 나타낸 것이다.

도 6a는 확립된 3가지 군(대조군, 저 투여량군 및 고 투여량군)에서 동물의 자궁 내막 이식편내 도파민 수용체2(Dp-r2) 및 VEGF의 존재를 나타낸 것이다.

도 6b는 자궁 내막성 병변(좌측 컬럼) 및 자궁 내막(우측 컬럼)에서의 VEGF, VEGFR-2(KDR) 및 D2R의 상대적인 발현을 나타낸 것이다.

실시예 1

인간 자궁 내막 단편을 삽입하여, 누드 마우스에서 자궁 내막증 실험 동물 모델을 만들었다. 암컷 마우스(Hsd: Athimic Nude-nu, Harlan lberica S L, Barcelona, Spain)를 각각 자동멸균한 케이지에서 사육하고 층류 여과 후드(laminar flow filtered hood)에서 재웠다. 동물실은 26 ℃, 12시간의 명 및 12시간의 암 주기로 유지시키고, 마우스가 자동 멸균된 실험 설치류 먹이와 산성수를 자유롭게 섭취하도록 하였다. 모든 취급은 층류 여과 후드내에서 수행하였다. 케타민/메데토미딘(케타민 75 μg/g 및 메데토미딘 1 μg/g)(Ketolar^®, Parke-Davis, Espana; Domtor^®, Pfizer, Spam) 혼합물을 복막내 주사하여, 침습적 시술을 시술하기 전에 마우스를 마취시키고, 침습적 시술 이후에 멸균 기구를 이용하여 어티파메졸(Antisedan^®, SmithKline Beecham, Spain) 1 μg/g을 복막내 주사하여 마취 효과로부터 회복시켰다.

5주령에, 18 mg 17β-에스트라디올(Innovative Research of America, Sarasota, FL)을 포함하는 멸균 60-일 방출성 캡슐을, 각 동물의 목에 피하 장착하였다. 제조사의 지침서에 따라, 캡슐은 발정 주기 동안에 마우스에서 생리적 농도 범위에서 혈청 농도 150-250 pmol/L로 호르몬을 연속 방출시킨다. 이러한 에스트로겐의 안정적인 생리학적 농도는 이식된 인간 자궁 내막의 증식을 촉진시키고, 여러가지 발정 주기 단계와 관련있는 마우스간 차이를 방지한다.

에스트로겐 펠렛을 삽입하고 4일 후, 하복부내 정중선(midline)에서 복강을 열고, 난자 채취(ovum pick-up) 공여체로부터 취한 신선한 인간 자궁 내막을 삽입하였다. 이 단편을 접착제로 복막에 붙였다(Vetabond^®, 3M Animal Care products, USA). 이러한 프로토콜로 자궁 내막증 여성 환자들에서 발생하는 병리적인 역류성 월경 상태를 모방할 수 있다.

이식하고 3주 후, 동물을 3가지 군으로 나누었다. 제1군은 대조군이고, 제2군은 카베르골린을 0.05 mg/kg/day로 경구 처리하는 저 투여량 군이고, 나머지 군은 카베르골린을 0.1 mg/kg/day로 경구 처리하는 고 투여량 군이다. 처리하고 2주 후, 동물을 치사시키고, 자궁 내막증 병변의 샘플을 취하여 하기에 기술한 바와 같이 분석하였다. 그 결과는 도 1, 1a 및 2-6b에 나타내었다.

도파민 작용제의 항-혈관신생 효과를, 공초첨 현미경에서 내피 세포 및 혈관 평활근 세포에 존재하는 본 빌레브란트 인자(vWF 단일항체 IgG1, DAKO Corp, Denmark)에 대한 항체(단일항체 lgG2 α-SMA-FITC 접합됨, Sigma, St Louis, USA) 를 이용한 면역형광으로 평가하였다. 새롭게 형성되지 않은 혈관은, 이에 성숙을 부여하는 평활근 층으로 둘러싸여 있으며, 성숙 혈관은 α-SMA 양성 염색으로 동정하였다. 따라서, vWF+ /αSMA- 혈관은 신생이거나 미성숙인 것으로 간주하였으며, vWF+ /αSMA+ 혈관은 오래되었거나 성숙 혈관으로 분류하였다.

이식편의 면적과 세포 밀도를 측정하기 위해 형태 연구를 수행하였다. 이식편의 증식 활성을 평가하기 위해, Ki-67(단일클론 IgGI DAKO Corp, Denmark) 항체를 이용한 면역세포화학을 수행하였다. 조직병리학적 및 세포내 초미세 구조 변화를 광학 현미경(OM), 투과 전자 현미경(TEM) 및 조직화학 염색으로 검출하였다. 광학 현미경(OM), 투과 전자 현미경(TEM) 및 형태측정을 수행하여, 자궁 내막선 및 기질의 존재를 확인하고, 초미세 구조 변화, 이식편의 면적 및 세포 밀도를 연구하였다.

TaqMan 실시간 PCR 및 2^{-ΔΔ Ct} 방법을 사용하여, 혈관신생을 촉진시키는 3종의 상이한 마커(VEGF, VEGFR-2, Notch-4); 기존 혈관의 확장과 누출 내구성을 조장하는 항-혈관신생 마커인 안지오포이에틴-1(Ang-1); 및 Wnt-1의 유전자 발현 프로파일을 분석하였다. 실험 이식편인 인간 복막 자궁 내막성 병변과 자궁 내막에서 VEGF 및 도파민 2형 수용체(Dp-r2)의 발현 여부의 확인은, TaqMan 실시간 PCR 및 2^-ΔΔCt 방법으로 수행하였다(도 6a, 6b). 마찬가지로, 이러한 방법을 이용하여 인간 복막의 자궁 내막성 병변과 자궁 내막에서의 VEGFR-2 발현 존재를 확인하였다(도 6b).

GraphPad lnstat V3.0(GraphPad Software, San Diego, CA, USA)을 이용하여 통계 분석을 수행하였다. 처리군과 대조군 간에 분석한 여러가지 마커들의 차이를 검출하기 위한 실험을 설계하였다. 범주형 데이타는 수와 퍼센트로서 나타내었고, 수 데이타는 명시된 경우를 제외하고는 평균 ± 평균의 표준 편차(SEM)로 나타내었다. 유의성은 P<0.05로 규정하였다. 일원배치 분산분석(one-way analysis of the variance)을 통계 분석에 사용하였다.

독성

카베르골린을 투여한 후 실험 중에 죽은 마우스는 없었다. 여러 처리 군들에서 마우스의 무게는 유의하게 달라지지 않았기 때문에, 카베르골린은 마우스의 전체적인 건강에 변화를 야기하지 않는 것으로 보였다(데이타 미기재).

결과

도 1은 전술한 동물 실험을 수행한 후, 대조군 및 카베르골린의 저 투여량 군(0.05 mg/kg/day)과 카베르골린의 고 투여량 군(0.1 mg/kg/day)의 활성 병변(active lesion) %을 나타낸 것이다. 저 투여량(58.6 ± 9.7%) 및 고 투여량(60.4 ± 8.4%)으로 처리한 동물에서의 활성 병변은 대조군(89.6 ± 5.7%)에 비해 현저하게 감소(p = 0.0169)되었다. 카베르골린(저 투여량군 및 고 투여량군)을 처리한 동물은, 대조군에 비해 활성 병변이 현저하게 적었다. 즉, 카베르골린의 처리는 이 모델에서 활성 자궁 내막성 병변의 갯수를 줄이는 것으로 보인다. OM 및 TEM 실험에서, 대조군의 경우, 자궁 내막성 병변은, 전형적인 인간 자궁 내막증 병변에서 볼 수 있는 바와 같이, 많은 세포성 기질과 완전한 재조직 및 구조 등의 조직학적 측면을 나타내었다. 그러나, 처리한 병변에서는(카베르골린을 저 투여량 및 고 투여량으로 처리) 세포 충실성 및 조직화가 감소된 lax 기질이 관찰되었는데, 이는 위축성 또는 퇴행성 조직의 특징이다. 선 주변의 인간 자궁 내막 기질은 근육-결합 뮤라인 조직과 쉽게 구별되었다.

이러한 조직학적 결과는 형태 분석으로 검증하였다(도 1a). 군들 간에 세포 밀도에 대한 통계적 차이는 없었지만, 도 1a에서 볼 수 있는 바와 같이, 선/기질 비율이 군들간에 차이가 있었으며, 카베르골린 저 투여량 군 및 고 투여량 군에서는 대조군에 비해 기질은 더 많고 선은 더 적었다(*p<0.05). 이는, 카베르골린 처리가 자궁 내막선의 양적 감소 또는 줄어듬과 관련있을 수 있음을 의미한다.

도 2는 "성숙" 혈관과 "신생" 혈관으로 나누어, 대조군, 저 투여량 군 및 고 투여량 군의 혈관(mm³)을 나타낸 것이다. 대조군에서는 신생 혈관의 비율이 더 높았지만(이는 혈관신생이 현저함을 나타냄), 저 투여량 군 및 고 투여량 군에서는 성숙 혈관의 비율이 현저하게 높아, 혈관신생이 매우 감소된 것으로 나타났다. 또한, 이는 조직학적으로도 입증되었다(결과 미기재). 이러한 결과는, 카베르골린이 이 모델에서 신생 혈관의 형성(혈관 신생)을 감소시킴을 의미한다.

도 3은 대조군, 저 투여량 군 및 고 투여량 군에서의 혈관 퍼센트를 나타낸 것이다. 대조군의 신생 혈관은 총 혈관을 기준으로 약 74% 였는데, 이는 혈관신생이 현저함을 의미한다. 저 투여량 군 및 고 투여량 군은 성숙 혈관이 총 혈관의 약 85 내지 89%에 해당되어, 혈관신생이 현저하지 않음을 의미한다. 이러한 결과 는, 카베르골린이 새로운 혈관 형성(혈관신생)을 본 모델에서 현저하게 감소시킴을 의미한다.

도 4는 증식 실험의 결과를 나타낸 것이다. Ki-67 항체를 이용한 면역세포화학적 실험으로, 당업계에 공지된 방법을 이용하여 이식편의 증식 활성을 평가하였다. 이미지 카운팅 소프트웨어를 사용하여 Ki-67 양성 세포를 계수하고, 각 그룹의 증식 지수를 계산하였다. 카베르골린을 처리한 동물(저 투여량 군 및 고 투여량 군 둘다)의 경우, 대조군 대비 병변 증식의 현저한 감소가 관찰되었다(P<0.001).

병변의 혈관신생 상태는 먼저 항체를 이용한 면역형광을 이용하여 분석하여, 공초점 현미경(Leica Confocal Software)으로 신생 혈관(vWF+/αSMA-)과 오래된 혈관(vWF+/αSMA+)을 식별하였다. 내피 세포와 혈관 평활근 세포(α- SMA)에 존재하는 본 빌레브란트 인자(vWF)에 대한 항체를 이용한 면역형광으로, 항-혈관신생 작용 Cb2를 테스트할 수 있다. 새롭게 형성된 것이 아닌 혈관은 이에 성숙을 부여하는 평활근으로 둘러싸여 있다. 내피 세포의 식별은 vWF를 이용하여 수행하였고, 성숙 혈관은 α-SMA 양성 염색으로 식별하였다. 따라서, vWF+ /αSMA- 혈관은 신생 또는 미성숙 혈관으로 간주하였고, vWF+ /αSMA+ 혈관은 오래된 혈관이거나 성숙 혈관으로 분류하였다.

대조군의 경우, 이식편에는, 전형적인 자궁 내막증 병변에서 볼 수 있는 많은 세포성 기질과 완전한 재조직 및 구조 등의 조직학적 측면이 나타났지만, 저 투여량 군과 고 투여량 군의 마우스에서는 이식편에서 위축성/퇴행성 조직의 특징인, 세포 충실성 및 조직화가 감소된 lax 기질이 나타났다. 형태 측정에서는 군들 간에 세포 밀도 및 기질/선 면적에는 차이가 없었다.

TaqMan 실시간 PCR 및 2^{-ΔΔ Ct} 방법을 이용하여, 혈관신생을 촉진시키는 3종의 상이한 마커(VEGF, VEGFR-2, Notch-4); 기존 혈관의 확장과 누출 내구성을 조장하는 항-혈관신생 마커인 안지오포이에틴-1(Ang-1); 및 Wnt-1의 유전자 발현 프로파일을 분석하였다. 타겟 유전자 Ct 값을 표준화하기 위해 하우스키핑 18S rRNA 유전자를 사용하였다. 각 군의 Ct 수치는 대조군의 Ct 수치(캘리브레이터)에 대해 상대적으로 나타내어, 2^{-ΔΔ Ct} 방법으로 상대 발현을 계산하였다. VEGF 및 VEGFR-2 유전자 발현에서, 육종 180 종양 세포(S-180) 및 인간 탯줄 정맥 내피 세포(HUVEC)로부터 수득한 cDNA를 각각 음성 대조군 및 양성 대조군으로 사용하였다. Ang-1 및 Wnt-1에 대한 양성 대조군으로 비장을 사용하였고, Notch-4 양성 대조군으로 폐를 사용하였다.

표 1은 프로-혈관신생 마커(VEGF, VEGFR-2 및 Notch-4)의 유전자 발현 프로파일이 대조군에 비해 카르베골린("Cb2")을 저 투여량 및 고 투여량으로 처리한 이식편에서 하향 조절됨을 나타낸다. Ang-1 및 Wnt-1은 항-혈관신생 마커로 간주하였으며, 이의 발현 프로파일은 대조군에 비해 Cb2을 저 투여량 및 고 투여량으로 처리한 이식편에서 상향 조절되어, 이는, 카베르골린 처리가 혈관신생 저해와 관련있음을 의미한다. 표의 상대적인 발현 데이타는 도 5에 그래프로 나타내었다.

표 1: 혈관신생 유전자 발현 프로파일

혈관신생 마커	유전자	대조군	비히클	저투여량(0.05 mg/kg/day)	고투여량(0.1 mg/kg/day)	P 값	발현
+	VEGF	HUVEC	1.2 + 0.3	0.5 + 0.2	0.4 + 0.1	<0.05	Cb2 처리 군에서 하향 조절됨
+	VEGFR-2(KDR)	HUVEC	1.0 + 0.1	0.4 + 0.1	0.3 + 0.1	<0.05	Cb2 처리 군에서 하향 조절됨
+	Notch-4	폐	1.0 + 0.1	0.5 + 0.1	0.4 + 0.1	<0.05	Cb2 처리 군에서 하향 조절됨
-	Ang-1	비장	1.1 + 0.2	3.2 + 0.6	3.7 + 0.6	<0.05	Cb2 처리 군에서 상향 조절됨
-	Wnt-1	비장	1.0 + 0.1	3.4 + 0.2	3.3 + 0.6	=0.07	Cb2 처리 군에서 상향 조절됨

데이타는 평균 + SD로 나타냄

도파민 2형 수용체가 수술(복강경 시술)받은 여성의 인간 자궁 내막 조직과 자궁 내막 이식편에 존재하는지를 조사하였다. TaqMan 실시간 PCR 및 2^{-ΔΔ Ct} 방법을 사용하여, 인간 자궁 내막 조직, 이식편(도 6a) 뿐만 아니라 복강경 시술받은 여성 10명으로부터 수득한 복막 자궁 내막성 병변에서(도 6b - 이는 또한 VEGFR-2에 대한 데이타도 포함), 도파민 수용체 (2"Dp-r2", "D2R") 및 VEGF의 존재를 확인하였다. Dp-r2 에 대한 양성 대조군 및 음성 대조군은 각각 HUVEC 및 S-180 cDNA 세포이다. 마우스에서, 대조군 Ct 값을 캘리브레이터로 사용하였고, 인간 복막 병변에서는 HUVEC Ct 수치를 캘리브레이터로 사용하여, 2^-ΔΔCt 방법에 의해 상대적인 발현을 계산하였다.

도 6a는 확립한 3종의 군에서, 동물의 자궁 내막 이식편에서의 VEGF와 Dp-r2의 존재를 나타낸 것이다. 카베르골린의 투여량을 증가시키면서 동물에 투여함에 따라 Dp-r2의 발현은 증가되는 경향이 있다. 동물에 카베르골린의 투여량을 증가시키면서 투여함에 따라 VEGF 발현은 감소되는 경향이 있다.

도 6b는 여러 타입의 자궁 내막성 병변에서의 VEGF, VEGFR-2 (KDR) 및 D2R ("Dp-r2")의 상대적인 발현을 레드, 화이트 및 블랙으로 나타낸 것이다(좌측 컬럼). 병변 타입에 따라 VEGF, VEGFR-2 및 Dp-r2 발현에 명백한 차이가 있다.

또한, 도 6b는 자궁 내막에서의 VEGF, VEGFR-2 (KDR) 및 D2R ("Dp-r2")의 상대적인 발현을 나타낸 것이다(우측 컬럼). 자궁 내막증 환자의 자궁 내막에서의 VEGF 및 VEGFR-2의 상대적인 발현은 자궁 내막증이 없는 개체 보다 높고, 자궁 내막증 환자의 자궁 내막에서의 Dp-r2의 상대적인 발현은 그렇지 않은 개체 보다 낮다.

이러한 결과는 하기 표 2에 나타낸다.

유전자	자궁 내막				자궁 내막성 병변
	자궁 내막증 무	중간	중증	P 수치	레드	화이트	블랙	P 수치
VEGF	1.0 + 0.1	2.2 + 1.7	2.1 + 0.4	NS	17.8 + 5.8	10.1 + 4.8	11.1 + 3.9	NS
KDR	1.0 + 0.1	2.1 + 0.6	1.9 + 0.3	NS	47.4 + 15.0	26.9 + 12.2	23.6 + 7.2	NS
D2R	1.0 + 0.1	0.3 + 0.1	0.2 + 0.1	=0.07	0.2 + 0.1	0.3 + 0.2	0.6 + 0.3	NS

결과는, 도파민 작용제인 카베르골린을 투여량 0.05 및 0.1 mg/kg/day로 투여하였을 때,

(a) 활성 자궁 내막성 병변의 수를 현저하게 감소시키고;

(b) 자궁 내막 이식편내 위축성 또는 퇴행성 조직의 특징인 세포 충실성 및 조직성의 감소를 유발하며;

(c) 자궁 내막 이식편내 신생 혈관의 수를 현저하게 감소시키고;

(d) 혈관신생 및 세포 증식과 관련있는 마커의 발현을 현저하게 감소시키고;

(e) 조직 퇴행을 증가시키고 자궁 내막을 감소시킬 수 있음을 나타낸다.

인간 및 설치류 VEGF 시스템 간에 높은 상동성이 존재하므로, 상기 설치류 모델에서 나타난 활성은 인간 모델에도 적용가능하다. 이 결과는, 도파민 작용제의 투여가, 아마 혈관신생에 대한 작용과 연결되어 있는, 자궁 내막증에 유의한 효과를 가짐을 의미한다. 결과는 정상 및 자궁외 자궁 내막 조직의 도파민 수용체의 존재와 관련있을 수 있다.

실시예 2

경구용 정제 제형은 카베르골린 0.5 mg이다(시판 Dostinex^®, Pfizer, Spain).

추가 실시예들

사례 A: 환자는 만성적인 복통을 앓은 후 진단 복강경 검사를 받고 있으며, 3형 자궁 내막증으로 진단받았다. 복강경 검사시, 환자에게서 가능한 병변은 절제하는 등의 외과적 시술을 받고, 카베르골린의 투여를 시작하였다.

사례 B: 환자는 예전에 자궁 내막증으로 진단받았으며, 복통과 월경 장애가 있다. 카베르골린을 수술 없이 투여하기 시작하였다.

사례 C: 환자는 자궁 내막증으로 진단받아 GnRH 작용제(또는 다나졸 또는 아로바타제 저해제)로 치료 중에 있으며, 일정 기간 동안 카베르골린의 투여를 시작하였다(GnRH 작용제를 계속 사용하면서). 요법을 수행하지 않으면서 3달 또는 6달을 보낸 후, 환자에게 카르베골린 투여를 다시 일정 기간 동안 시작하였다.

Claims (17)

1. 도파민 작용제를 포함하는 자궁 내막증의 치료 또는 예방을 위한 약학 조성물로서, 상기 도파민 작용제는 카베르골린(cabergoline) 또는 퀴나골리드(quinagolide)인 약학 조성물.
2. 삭제
3. 삭제
4. 제1항에 있어서, 상기 도파민 작용제가 카베르골린이며, 0.01 내지 12.5 mg/week의 투여량으로 투여되는 약학 조성물.
5. 제1항에 있어서, 상기 도파민 작용제가 퀴나골리드이며, 25 내지 1000 ㎍/day의 투여량으로 투여되는 약학 조성물.
6. 삭제
7. 제1항, 제4항 및 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 1일 내지 2년간 투여되는 약학 조성물.
8. 제1항, 제4항 및 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 다른 외과적 또는 의학적 자궁 내막증 치료제와 조합하여 투여되는 약학 조성물.
9. 제1항, 제4항 및 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 임산부에 있어서의 자궁 내막증의 치료 또는 예방을 위한 약학 조성물.
10. 제1항, 제4항 및 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 혈관 내피 성장 인자(VEGF)를 타겟으로 하는 약학 조성물.
11. 제1항, 제4항 및 제5항 중 어느 한 항에 있어서, VEGFR-2를 타겟으로 하는 약학 조성물.
12. 제1항, 제4항 및 제5항 중 어느 한 항에 있어서, Notch-4를 타겟으로 하는 약학 조성물.
13. 제1항, 제4항 및 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 자궁 내막증의 치료 또는 예방은 자궁 내막선(endometrial gland)의 양적 감소와 관련 있는 약학 조성물.
14. 제1항, 제4항 및 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 자궁 내막증의 치료 또는 예방은 자궁강(uterine cavity) 외부에 존재하는 자궁 내막 조직을 양적으로 감소 또는 제거시키거나; 및/또는 자궁 내막증과 관련 있는 한 가지 이상의 증상을 경감 또는 개선시키는 약학 조성물.
15. 제1항, 제4항 및 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 경구로 투여되며, 캡슐, 카세(cachet), 정제, 시럽, 엘리시르 또는 로젠제 형태인 약학 조성물.
16. 삭제
17. 삭제

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