CN115845043A - 一种模板DNA分子及其在制备mRNA和疫苗中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种用于体外转录的模板DNA分子，根据所述模板DNA分子转录获得的mRNA，其制备方法和mRNA在疾病预防和治疗中的应用，其中所述模板DNA分子依次包括启动子、5’端非翻译区(5’UTR)、Kozak序列、多肽或蛋白编码区、3’端非翻译区(3’UTR)和多聚腺苷酸(polyA)序列；通过所述启动子可以将所述5’端非翻译区、所述Kozak序列、所述多肽或蛋白编码区、所述3’端非翻译区和所述多聚腺苷酸序列共同转录产生共同转录物。本发明提供的模板DNA分子或mRNA分子可以用于制备疫苗和治疗疾病的药物。

Description

一种模板DNA分子及其在制备mRNA和疫苗中的应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种模板DNA分子及其在制备mRNA和疫苗中的应用。

背景技术

mRNA疫苗的转录模板设计是成功制备mRNA疫苗的关键条件之一，其设计要点主要包括抗原编码区上游非翻译区(5’UTR)、下游非翻译区(3’UTR)以及多聚腺苷酸(polyA)尾巴。当前，mRNA疫苗转录模板设计专利主要为国外mRNA疫苗公司掌控，并且polyA尾巴的长度在100个以上，在使用质粒进行模板扩增过程中非常容易发生重组丢失。

mRNA不稳定易被降解，设计mRNA疫苗时要尽可能地保证后续生产出的mRNA具有较高的稳定性，mRNA的结构与其在细胞内的稳定性和表达效率密切相关。编码区两侧的UTR是mRNA结构中的关键区域，5’UTR及其帽子(Cap)结构是影响mRNA稳定性和翻译效率的重要因素，帽子结构既可保护mRNA免遭核酸酶的降解又能够参与到真核生物转录起始复合物的结合而影响翻译效率，5’UTR主要参与转录起始复合物的识别结合影响mRNA的翻译效率(GrayNK,et al.1998)。mRNA大部分的非稳定因素位于3’UTR，3'UTR序列和结构决定着mRNA的稳定性、定位和表达(Schlake T,et al.,2011；Goodarzi H,et al.,2012)。3’端polyA尾结构是除了5’端帽子以外对mRNA稳定性最重要的因素，大多数mRNA的降解是从polyA尾开始。

目前，国际上新型冠状病毒mRNA疫苗转录模板使用的大多是alpha和beta球蛋白(Globin)的UTR或是以此为基础改造的UTR，BioNTech公司使用了2个串联的beta球蛋白3’UTR和有间隔的120个腺苷酸的polyA尾来增强mRNA的稳定性，并申请了相关专利(US2019/0062762A1)。

然而以上mRNA表达载体不够稳定，而且过长的polyA也容易发生重组丢失。

发明内容

本发明提出了一种新的mRNA疫苗转录模板设计策略。通过该策略，能够实现高水平mRNA表达，且质粒扩增稳定，polyA尾巴不易发生重组丢失。具体的，

本发明第一方面，提供一种模板DNA分子，所述模板DNA分子包括5’端非翻译区(5’UTR)、目的多肽或蛋白编码区、3’端非翻译区(3’UTR)和多聚腺苷酸(polyA)区，所述UTR序列来源于人类基因组具有翻译功能的UTR。

优选的，所述5’UTR序列长度为20-70bp，其序列结构要松散，不易形成二级结构。

优选的，所述5’UTR序列长度为20-70bp范围内的任意范围或者任意整数数值，例如长度为22-68bp，25-65bp，28-65bp，20、22、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70等等。

优选的，所述3’UTR序列包括50-400bp，其序列结构要避免AU、AUUUA或GU富集序列。

更优选的，所述3’UTR序列长度为50-400bp范围内的任意范围或者任意整数数值，例如长度为60-380bp，70-350bp，90-300bp等等，例如50、55、60、67、75、90、106、130、150、175、200、220、249、275、300、320、360、375、390、400bp等等。

更优选的，所述5’UTR序列如SEQ ID NO:3、9-14任一所示，所述3’UTR序列SEQ IDNO:6、15-23任一所示。

在一个具体的实施方式中，所述5’UTR序列如SEQ ID NO:3所示，所述3’UTR序列SEQ ID NO:6、15-23任一所示。

在一个具体的实施方式中，所述5’UTR序列如SEQ ID NO:3、9-14任一所示，所述3’UTR序列SEQ ID NO:6所示。

优选的，所述polyA不超过100bp。所述polyA不超过100bp的任意数值，例如不超过100、95、90、85、80、79、78、76、75、72、70、68、65、63、60、58、56、54、52、50、49、48、46、45、43、41、40、39、37、35、33、31、30、29、28、25、23、20、17等等。

优选的，所述目的多肽或蛋白来源于任意生物体。

进一步优选的，所述目的多肽或蛋白来源于病毒、古细菌、原核生物、真核生物；更优选的，所述目的多肽或蛋白来源于病毒，例如水痘－带状疱疹病毒(varicella-zostervirus，VZV)、新型冠状病毒(SARS-CoV-2)、狂犬病毒、呼吸道合胞病毒、流感病毒，或者，所述目的多肽或蛋白来源于动物或者人类疾病相关的抗原，例如变应原蛋白、自体抗原、肿瘤特异性抗原等等。

在一个具体的实施方式中，所述目的多肽或蛋白为水痘－带状疱疹病毒的gE蛋白或其突变体；或者新型冠状病毒S蛋白或其突变体、狂犬病毒CTN-1毒株G蛋白(RVG)或其变体、呼吸道合胞病毒F蛋白或其突变体、流感病毒HA蛋白或其突变体、变应原蛋白、自体抗原、肿瘤特异性抗原等。

在一个具体的实施方式中，所述水痘－带状疱疹病毒的gE蛋白的编码序列如SEQID NO:25所示，或者SEQ ID NO:25的变体，所述变体具有编码gE蛋白的功能。

在一个具体的实施方式中，所述新型冠状病毒S蛋白的编码序列如SEQ ID NO:26所示，或者SEQ ID NO:26的变体，所述变体具有编码新型冠状病毒S蛋白的功能。

优选的，所述编码区还包括报告基因，更优选的，所述的报告基因包括但不限于氯霉素乙酰基转移酶基因(CAT)、人生长激素基因(hGH)、分泌型碱性磷酸酶基因(SEAP)、红色荧光蛋白基因(RFP)、绿色荧光蛋白基因(GFP)、增强绿色荧光蛋白基因(EGFP)、β-半乳糖苷酶基因(β-Gal)或萤火虫荧光素酶基因。进一步优选的，所述的报告基因为EGFP或GFP。

优选的，所述DNA分子还包括5’帽子结构。更优选的，所述5’帽子结构序列为标准帽子结构m7G(5’)ppp(5’)G或3’-O-Me-m7G(5’)ppp(5’)G防反帽结构或修饰帽子结构，所述修饰帽子结构包括m7G(5’)ppp(5’)(2’OMeA)pG、m7G(3’OMeG)(5’)ppp(5’)(2’OMeA)pG、m7G(5’)ppp(5’)(2’OMeG)pG、m7G(5’)ppp(5’)(2’OMe，m6A)pG、m7G(3’OMeG)(5’)ppp(5’)(2’OMeG)pG等等。

优选的，所述模板DNA分子还包括Kozak序列，更优选的，所述Kozak序列位于多肽或蛋白编码区的上游，进一步优选的，所述Kozak序列包括GCCACC。

本发明第二方面，提供一种mRNA分子，所述mRNA分子包括5’端非翻译区(5’UTR)多肽或蛋白编码区、3’端非翻译区(3’UTR)和多聚腺苷酸(polyA)区，所述UTR序列来源于人类基因组具有翻译功能的UTR。

优选的，所述mRNA分子有上述模板DNA分子转录获得。

优选的，所述mRNA分子可以是天然或修饰的RNA；更优选的，可以通过用修饰的尿苷部分或全部取代天然尿苷对RNA进行修饰；进一步优选的，可以通过用1-甲基-假尿苷对天然尿苷进行全部替换。

本发明第三方面，提供一种载体，所述载体包括上述模板DNA分子。

优选的，上述载体可以是环形DNA，也可以是线性DNA。

更优选的，上述环形DNA包括复制序列(ori)、筛选标记(例如，卡那霉素、氨苄青霉素、氯霉素或其它抗生素抗性基因)、转录mRNA用的启动子和编码上述mRNA分子的DNA序列，启动子可为T3启动子或T7启动子或SP6启动子等；具体可为T7启动子。

更优选的，上述线性DNA可以通过限制性内切酶酶切上述环形DNA获得，也可以以上述DNA分子为模板通过PCR扩增获得。

本发明第四方面，提供上述mRNA分子的制备方法，所述制备方法包括以上述模板DNA分子进行转录。

优选的，所述制备方法还包括加帽步骤，对mRNA进行加帽，更优选的，所述加帽步骤包括共转录加帽或酶促加帽步骤。

所述共转录加帽反应体系(20μl)为：0.1-2μg上述DNA分子、2-4μl T7 EnzymeMix、2-4μl 5×Reaction buffer、核苷酸(ATP、CTP、GTP、PseudoUTP)各1.6μl(单个浓度均为100mM)、1.6μl帽子结构(100mM)、无RNA酶水补至20μl。混匀后37℃孵育0.5-6小时。

所述酶促加帽反应分两步进行，第一步体外转录，第二步体外加帽。

具体的，所述酶促加帽体系(20μl)为：0.1-2μg上述DNA分子、2μl mScript T7Enzyme Slution、2μl 10×mScript T7 Transcription Buffer、2μl DTT(100mM)、0.5μlScriptGuard RNase Inhibitor、7.2μl NTP solution,无RNA酶水补至20μl，混匀后37℃孵育0.5-4小时。然后，加入1μl RNase-Free DNaseI混匀后37℃孵育0.5-2小时。反应完毕后，通过乙酸铵或磁珠纯化mRNA，72μl RNase-Free water溶解纯化的mRNA,65℃孵育5-15分钟后移至冰上备用。第二步体加帽体系(100μl)为：72μl纯化的mRNA、2μl 10×ScriptcapCapping Buffer、5μl GTP(20mM)、2.5μl SAM(20mM)、2.5μl ScriptGuard RNaseInhibitor、4μl Scriptcap 2’-O-Methyltransferase(100U/μl)、4μl Scriptcap CappingEnzyme(10U/μl)。混匀后37℃孵育0.5-2小时。

本发明第五方面，提供一种上述模板DNA分子、mRNA分子或者载体在表达目的多肽或蛋白中的用途，所述目的多肽或蛋白蛋白来源于任意生物体。

优选的，来源于病毒、古细菌、原核生物、真核生物，更优选的，所述生物体来源于病毒，例如水痘－带状疱疹病毒(varicella-zoster virus，VZV)，新型冠状病毒(SARS-CoV-2)、狂犬病毒、呼吸道合胞病毒、流感病毒，或者，所述目的多肽或蛋白来源于动物或者人类疾病相关的抗原，例如变应原蛋白、自体抗原、肿瘤特异性抗原。

在一个具体的实施方式中，所述目的多肽或蛋白包括水痘－带状疱疹病毒的gE蛋白或其突变体、新型冠状病毒S蛋白或其突变体、狂犬病毒CTN-1毒株G蛋白(RVG)或其变体、呼吸道合胞病毒F蛋白或其突变体、流感病毒HA蛋白或其突变体、变应原蛋白、自体抗原、肿瘤特异性抗原等。

更优选的，所述肿瘤特异性抗原包括来自于任意肿瘤的特异性抗原，OX40L、KRAS、TP53等等。

本发明第六方面，提供一种上述模板DNA分子、mRNA分子或者载体在制备疫苗中的用途。

优选的，所述疫苗用于预防或者治疗目的多肽或蛋白相关的疾病，例如来源于病毒、古细菌、原核生物、真核生物等引起的疾病。更优选的，所述疾病来源于病毒引起的感染，例如水痘－带状疱疹病毒(varicella-zoster virus，VZV)，新型冠状病毒(SARS-CoV-2)、狂犬病毒、呼吸道合胞病毒、流感病毒等等。或者，所述疾病为过敏性疾病，自身免疫性疾病或者肿瘤等等。

本发明第七方面，提供一种mRNA疫苗，所述mRNA疫苗包括上述mRNA分子。

优选的，所述mRNA疫苗编码水痘－带状疱疹病毒的gE蛋白或其突变体。

更优选的，所述mRNA疫苗用于预防水痘－带状疱疹病毒感染。

优选的，所述mRNA疫苗编码新型冠状病毒S蛋白或其突变体。

更优选的，所述mRNA疫苗用于预防新型冠状病毒感染。

优选的，所述mRNA疫苗还包括递送系统，优选的，所述递送系统包括阳离子脂质纳米颗粒、阳离子脂质体或阳离子聚合物等，更优选的，所述递送系统为阳离子脂质纳米颗粒(LNP)。

优选的，所述LNP组分包括可质子化阳离子脂质、结构脂质、辅助脂质和PEG脂质。

优选的，可质子化阳离子脂质的摩尔比为50-65％，结构脂质的摩尔比为30-40％，辅助脂质的摩尔比为4-10％，PEG脂质的摩尔比为0.5-2％。

优选的，可质子化阳离子脂质与mRNA的质量比为(8-10):1。

优选的，所述可质子化阳离子脂质包括SM-102、ALC-0315、Dlin-MC3-DMA、Dlin-KC2-DMA、DODMA、C12-200或DlinDMA等，优选为SM-102。

优选的，所述结构脂质包括胆固醇、胆固醇酯、固醇类激素、固醇类维生素或胆汁酸等，优选为胆固醇。

优选的，所述辅助脂质包括DSPC，DOPE，DOPC或DOPS等，优选为DSPC。

优选的，所述PEG脂质包括ALC-0159，DMG-PEG2000或PEG-DSPE等，优选为DMG–PEG2000。

本发明第八方面，提供一种上述mRNA疫苗制备方法，所述制备方法包括将上述mRNA分子包裹在递送系统中。

所述递送系统如上限定所示。

优选的，所述递送系统为LNP，所述LNP包裹mRNA的制备方法包括，

1)将mRNA溶于缓冲液中，缓冲液为乙酸缓冲液或柠檬酸缓冲液，pH值为3-6，优选为乙酸缓冲液，mRNA浓度为0.05-1mg/ml。

2)按配方比例将可质子化阳离子脂质、结构脂质、辅助脂质和PEG脂质溶解于有机溶液，得到有机相。优选的，有机溶液为C1-C4低碳醇，优选为乙醇。

3)水相和有机相的体积比为3:1。

4)采用微流控设备混合水相和有机相，流速不低于3ml/min。

5)混合完成后，用稀释缓冲液稀释10-50倍超滤浓缩，稀释缓冲液为生理盐水、PBS或Tris缓冲液等，优选为Tris缓冲液。

更优选的，所述mRNA疫苗还包括药学上可接受的赋形剂。所述药学上可接受的赋形剂可以是载体、稀释剂、佐剂或编码佐剂核苷酸序列、增溶剂、粘合剂、润滑剂、助悬剂、转染促进剂等。

进一步优选，所述转染促进剂包括但不限于表面活性剂如免疫刺激复合物、弗氏(Freunds)不完全佐剂、LPS类似物(例如单磷酰酯A)、胞壁肽、苯醌类似物、角鲨烯、透明质酸、脂质、脂质、钙离子、病毒蛋白质、阳离子、聚阳离子(例如聚-L-谷氨酸(LGS))或纳米粒子或其他已知的转染促进剂。

所述的编码佐剂的核苷酸序列为编码如下至少一种佐剂的核苷酸序列：GM-CSF、IL-17、IFNg、IL-15、IL-21、抗PD1/2、乳铁蛋白、鱼精蛋白、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12、INF-α、INF-γ、Lymphotoxin-α、hGH、MCP-1、MIP-1a、MIP-1p、IL-8、RANTES、L-选择蛋白、P-选择蛋白、E-选择蛋白、CD34、GlyCAM-1、MadCAM-1、LFA-1、VLA-1、Mac-1、pl50.95、PECAM、ICAM-1、ICAM-2、ICAM-3、CD2、LFA-3、M-CSF、、CD40、CD40L、血管生长因子、成纤维细胞生长因子、神经生长因子、血管内皮生长因子、Apo-1、p55、WSL-1、DR3、TRAMP、Apo-3、AIR、LARD、NGRF、DR4、DR5、KILLER、TRAIL-R2、TRICK2、DR6、半胱天冬酶ICE、Fos、c-jun、Sp-1、Ap-1、Ap-2、p38、p65Rel、MyD88、IRAK、TRAF6、IkB、无活性的NIK、SAPK、SAP-1、JNK、NFkB、Bax、TRAIL、TRAILrec、TRAILrecDRC5、TRAIL-R3、TRAIL-R4、RANK、RANKLIGAND、Ox40、Ox40LIGAND、NKG2D、MICA、MICB、NKG2A、NKG2B、NKG2C、NKG2E、NKG2F、TAP1、TAP2以及其功能性片段。

本发明第九方面，提供一种治疗或者预防疾病的方法，所述方法包括将所述mRNA分子或者mRNA疫苗施予个体。

优选的，所述疾病包括目的多肽或者蛋白相关的疾病，例如来源于病毒、古细菌、原核生物、真核生物等引起的疾病。更优选的，所述疾病来源于病毒引起的感染，例如水痘－带状疱疹病毒(varicella-zoster virus，VZV)、新型冠状病毒(SARS-CoV-2)、狂犬病毒、呼吸道合胞病毒、流感病毒等等。或者，所述疾病为过敏性疾病，自身免疫性疾病或者肿瘤等等。

本发明的有益效果在于：

1、改进后的模板DNA分子，通过一定原则筛选5’UTR和3’UTR，例如限定UTR的长度和序列结构，可以提高mRNA的表达效率，高效表达各种目的多肽或蛋白,包括例如来源于病毒、真核生物等的目的多肽或蛋白。

2、以UTR骨架搭配不超过100A的polyA，最短40A的polyA就可以有效表达目的蛋白序列，从而避免了在扩增过程中polyA容易重组丢失的不利影响；

3、本发明的模板DNA分子、mRNA分子、或者载体可用于制备DNA疫苗或mRNA疫苗，可以高效表达抗原，产生高滴度抗体，表明利用本发明的疫苗可以有效的产生体液和细胞免疫保护作用。

4、本发明的模板DNA分子、mRNA分子或者载体可用于制备或者表达目的多肽或蛋白的药物。

以上只是概括了本发明的一些方面，不是也不应该认为是在任何方面限制本发明。

本说明书提到的所有专利和出版物都是通过参考文献作为整体而引入本发明的。本领域的技术人员应认识到，对本发明可作某些改变并不偏离本发明的构思或范围。

下面的实施例进一步详细说明本发明，不能认为是限制本发明或本发明所说明的具体方法的范围。

附图说明

以下，结合附图来详细说明本发明的实施例，其中：

图1所示为mRNA疫苗转录模板设计示意图；

图2所示为不同5’UTR和3’UTR组合表达结果；

图3所示为beta球蛋白的5’UTR和3’UTR作为对照的表达结果；

图4所示为不同5’UTR替换后转染24h后细胞的荧光率百分比；

图5所示为不同3’UTR替换后转染24h后细胞的荧光率百分比；

图6所示为不同长度polyA表达结果；

图7所示为带状疱疹gE蛋白mRNA疫苗免疫后28天gE特异性抗体结果；

图8所示为带状疱疹gE蛋白mRNA疫苗免疫后28天IFN-γ和IL-2激活水平；

图9所示为新型冠状病毒S蛋白mRNA疫苗免疫后28天S蛋白特异性抗体结果。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

在下述每一实施例中，主要设备和材料是从以下所指出的几家公司获得：

表1：主要设备

表2：主要材料

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实施例1：mRNA制备模板构建策略

本发明方案中，作为mRNA制备用的模板的DNA分子依次包括启动子、5’UTR序列、Kozak序列、抗原编码区(CDS)序列、3’UTR序列和多聚腺苷酸(polyA)序列；在所述启动子驱动下，所述5’UTR序列、Kozak序列、抗原编码区序列、3’UTR序列和多聚腺苷酸(polyA)序列可被共同转录产生共同转录物。如图1所示。

具体构建和mRNA制备方法包括：

一、体外转录

将启动子、5’UTR序列、Kozak序列、抗原编码区(CDS)序列、3’UTR序列和多聚腺苷酸(polyA)序列串联组成的核酸序列合成至pUC57-kana载体(南京金斯瑞生物科技有限公司)上，通过EcoRI和BspQI对pUC57-kana载体进行线性化，合成时不保留EcoRI和BapQI酶切序列，合成序列的polyA序列下游含有BapQI酶切序列。合成的质粒通过大肠杆菌进行扩增，制备体外转录模板时，可以通过BspQI酶切质粒产生体外转录模板，也可以已合成的质粒为模板通过PCR扩增获得体外转录模板，本发明采用BspQI酶切质粒制备体外转录模板。

二、体外转录

体外转录模板制备完成后，使用共转录加帽方式进行mRNA制备。

共转录加帽制备mRNA方法如下：

所述共转录加帽反应体系(20μl)为：0.1-2μg上述DNA分子、2-4μl T7 EnzymeMix、2-4μl 5×Reaction buffer、核苷酸(ATP、CTP、GTP、PseudoUTP)各1.6μl(单个浓度均为100mM)、1.6μl帽子结构(100mM)、无RNA酶水补至20μl。混匀后37℃孵育0.5-6小时。

也可以采用酶促加帽反应进行加帽。

酶促加帽反应分两步进行，第一步体外转录，第二步体外加帽。

具体的酶促加帽体系(20μl)为：

体外转录：

0.1-2μg上述DNA分子、2μl mScript T7 Enzyme Slution、2μl 10×mScriptT7Transcription Buffer、2μl DTT(100mM)、0.5μl ScriptGuard RNase Inhibitor、7.2μlNTP solution,无RNA酶水补至20μl，混匀后37℃孵育0.5-4小时。然后，加入1μl RNase-Free DNaseI混匀后37℃孵育0.5-2小时。反应完毕后，通过乙酸铵或磁珠纯化mRNA，72μlRNase-Free water溶解纯化的mRNA,65℃孵育5-15分钟后移至冰上备用。

体外加帽体系(100μl)：72μl纯化的mRNA、2μl 10×Scriptcap Capping Buffer、5μl GTP(20mM)、2.5μl SAM(20mM)、2.5μl ScriptGuard RNase Inhibitor、4μl Scriptcap2’-O-Methyltransferase(100U/μl)、4μl Scriptcap Capping Enzyme(10U/μl)。

三、mRNA表达的检测

mRNA表达后以荧光观察或免疫学方法进行检测，检测方法如下：

若编码区包括报告基因，可以通过检测报告基因编码的蛋白来检测目的多肽或者蛋白的表达，例如报告基因编码的蛋白为增强绿色荧光蛋白(EGFP)时，可以通过荧光显微镜观察绿色荧光蛋白的表达情况，通过流式细胞仪分析绿色荧光蛋白表达细胞的比例；

若编码区不包括报告基因时，可以通过ELISA方法检测多肽或者蛋白的表达。

具体方法为如下：

1.将HEK293细胞接种至12孔板中，将细胞数量控制在200000个/孔。

2.将12孔板于细胞培养箱中37℃培养12-16小时后观察，细胞密度达到60-80％汇合度时即可进行mRNA转染。

3.使用Lipofectamine MessengerMAX转染试剂将mRNA转染到HEK293细胞中，转染试剂体积与mRNA质量的比值为3μl:1μg，具体操作按照转染试剂说明书进行。于细胞培养箱中37℃培养24小时。

4.转染24小时后，在荧光显微镜下直接观察12孔板中细胞绿色荧光表达情况并拍照。

5.流式细胞仪分析时，弃去细胞培养基，利用PBS洗一次细胞，加入100μl胰酶消化细胞，然后用500μl完全培养基中和胰酶消化。将细胞重悬液转移到1.5ml离心管中，离心机1000g离心2分钟，弃去上清，用500μl PBS重悬细胞，即可上机进行流式仪检测，将没有转染mRNA的细胞设为阴性对照组，利用流式细胞仪检测阴性对照细胞并在点状图上圈出目的细胞信号，利用直方图读取FITC荧光信号，并调整检测器灵敏度及电压在直方图上确定绿色荧光阳性细胞荧光信号的范围，以此圈门。依次检测各样本记录绿色荧光阳性细胞百分比，每个样本读取10000个信号。

6.ELISA方法检测抗原表达时，弃去细胞培养基，利用PBS洗一次细胞，加入100μl胰酶消化细胞，然后用500μl完全培养基中和胰酶消化。将细胞重悬液转移到1.5ml离心管中，离心机1000g离心2分钟，弃去上清，加入150μL NP-40细胞裂解液重悬细胞，于冰上裂解10-30分钟。4℃离心机12000rpm离心3min，取上清，进行后续ELISA实验。将细胞裂解上清加入已预先包被一抗的酶标板中，室温静置孵育2小时。孵育结束后，0.05％PBST洗液洗板3次，300μL/孔，并于洁净纸拍干。加入HRP标记的二抗，室温静置孵育1小时。孵育结束后，0.05％PBST洗液洗板4次，300μL/孔，并于洁净纸拍干。加入ELISA显色液显色，100μL/孔，室温静置孵育10min。显色结束后，加入50μL/孔终止液，检测波长450nm，参比波长630nm，记录OD值。

实施例2：不同5’UTR序列和3’UTR序列的筛选

设计不同的5’UTR和3’UTR以筛选合适的序列表达目的抗原CDS。其它参照实施例1。

从人基因组中筛选合适的UTR组合，如下所示，其中，

1、ZF2101

5’UTR(HLA-A)：SEQ ID NO:1，3’UTR(HLA-A)：SEQ ID NO:2。

2、ZF2102

5’UTR(HLA-DMA)：SEQ ID NO:3，3’UTR(HLA-DMA)：SEQ ID NO:4。

3、ZF2103

5’UTR(HLA-A)：SEQ ID NO:1，3’UTR(HLA-DMA)：SEQ ID NO:4。

4、ZF2104

5’UTR(HLA-F)：SEQ ID NO:5，3’UTR(HLA-F)：SEQ ID NO:6。

5、ZF2105

5’UTR(HLA-DMA)：SEQ ID NO:3，3’UTR(HLA-F)：SEQ ID NO:6。

以beta球蛋白的5’UTR和3’UTR作为对照，

5’UTR(beta球蛋白)：SEQ ID NO:7，3’UTR(beta球蛋白)：SEQ ID NO:8。

CDS选择报告基因dEGFP，该序列含有降解信号，使EGFP的半衰期有17小时降至2小时(X Li,X Zhao,Y Fang,et al.,1998；S Holtkamp,S Kreiter,A Selmi,et al.,2006.)。

polyA的长度为17bp。

免疫荧光结果如图2和3所示，其中图2分别为ZF2101、ZF2102、ZF2103、ZF2104、ZF2105的免疫荧光结果，图3为对照的免疫荧光结果。结果表明ZF2105的荧光表达效率与对照组接近，表达效果最好。

以ZF2105为骨架，将polyA序列替换为A40+GTGAGTCTTC+A60,命名为ZF2105.1。然后，以ZF2105.1为基础分别对5’UTR序列和3’UTR序列进行替换，筛选其它可用的5’UTR序列和3’UTR序列。

表3：替换的5'UTR

5'UTR名称	序列编号	序列(5ˊ-3ˊ)
			CLCN6	5UTR1	SEQ ID NO:9
NADK	5UTR2	SEQ ID NO:10
			DFFA	5UTR3	SEQ ID NO:11
EXOSC10	5UTR4	SEQ ID NO:12
			CCDC27	5UTR5	SEQ ID NO:13
DFFA	5UTR6	SEQ ID NO:14

以表3中的5'UTR替换ZF2105.1中的5'UTR，分别获得多个骨架，将其表达dEGFP，参照上述方法转染24小时后进行检测。

结果如图4和表4所示，上述各个骨架的荧光细胞比率与ZF2105.1相当，统计学上无明显差异(p>0.001)，可以用于表达多肽或蛋白。

表4：5'UTR替换后细胞荧光率百分比

5'UTR名称

序列编号

重复1

重复2

重复3

平均值

p value

阳性对照

ZF2105.1

61.18％

61.35％

59.29％

60.61％

CLCN6

5UTR1

56.64％

58.59％

56.10％

57.11％

0.0253

NADK

5UTR2

60.48％

59.57％

61.75％

60.60％

0.9945

DFFA

5UTR3

55.08％

52.87％

53.79％

53.91％

0.0019

EXOSC10

5UTR4

54.71％

58.77％

57.80％

57.09％

0.0649

CCDC27

5UTR5

55.55％

53.46％

50.57％

53.19％

0.0095

DFFA

5UTR6

53.14％

53.91％

55.63％

54.23％

0.003

表5：替换的3'UTR

3'UTR名称	序序列编号	序列(5ˊ-3ˊ)
			SAMD11	3UTR1	SEQ ID NO:15
HES4	3UTR2	SEQ ID NO:16
			ISG15	3UTR3	SEQ ID NO:17
TTLL10	3UTR4	SEQ ID NO:18
			AURKAIP1	3UTR5	SEQ ID NO:19
MIB2	3UTR6	SEQ ID NO:20
			MMP23B	3UTR7	SEQ ID NO:21
CDK11B	3UTR8	SEQ ID NO:22
			TMEM52	3UTR9	SEQ ID NO:23

以表5中的3'UTR替换ZF2105.1中的3'UTR，获得多个骨架，将其表达dEGFP，参照上述方法转染24小时后进行检测。

结果如图5和表6所示，上述各个骨架的荧光细胞比率与ZF2105.1接近或明显高于ZF2105.1，可以用于表达多肽或蛋白。

表6：3'UTR替换后细胞荧光率百分比

3'UTR名称

序列编号

重复1

重复2

重复3

平均值

p value

阳性对照

ZF2105.1

61.18％

61.35％

59.29％

60.61％

SAMD11

3UTR1

67.02％

64.13％

65.03％

65.39％

0.0114

HES4

3UTR2

61.99％

60.34％

58.21％

60.18％

0.7552

ISG15

3UTR3

57.32％

60.10％

61.95％

59.79％

0.6148

TTLL10

3UTR4

69.79％

61.20％

70.35％

67.11％

0.0986

AURKAIP1

3UTR5

79.23％

74.99％

74.71％

76.31％

0.0006

MIB2

3UTR6

67.15％

67.70％

63.62％

66.16％

0.0182

MMP23B

3UTR7

58.10％

58.76％

59.66％

58.84％

0.0918

CDK11B

3UTR8

76.46％

65.81％

73.81％

72.03％

0.025

TMEM52

3UTR9

66.61％

64.28％

63.71％

64.87％

0.0183

实施例3:不同长度polyA筛选

以ZF2105的UTR组合为基础筛选polyA的长度。

选择3组不同长度polyA进行筛选，40个连续A(A40)、60个连续A(A60)、100个A(A100)，其中A100为40个连续A和60个连续A串联中间间隔10个碱基，所述间隔的10个碱基结构如GTGAGTCTTC(SEQ ID NO:24)。对照采用没有转染的细胞。

其它如实施例2。

结果如图6所示，表明3组实验组荧光比例无明显差异，选用ZF2105 UTR骨架时，可搭配更短的polyA的长度，例如A40，荧光细胞的百分比可达到80％以上，而A60荧光细胞的百分比可达到90％以上，基本可以达到A100的表达效果。

经大肠杆菌传代25次后，质粒仍稳定，制备的模板体外转录生产的mRNA性能稳定，荧光细胞的百分比均可达到80％以上。

实施例4：带状疱疹gE蛋白mRNA疫苗免疫原性

用ZF2105 UTR骨架与A60搭配使用进行带状疱疹gE蛋白mRNA疫苗(ZF006)免疫活性检测，其中gE蛋白编码区是在原始序列(Gene ID:1487709)基础上进行了优化，序列如SEQ ID NO:25。

利用LNP包裹mRNA，制备方法包括，

1)将mRNA溶于缓冲液中，缓冲液为乙酸缓冲液或柠檬酸缓冲液，pH值为3-6，优选为乙酸缓冲液，mRNA浓度为0.05-1mg/ml。

2)按配方比例将可质子化阳离子脂质、结构脂质、辅助脂质和PEG脂质溶解于有机溶液，得到有机相。优选的，有机溶液为C1-C4低碳醇，优选为乙醇。

3)水相和有机相的体积比为3:1。

4)采用微流控设备混合水相和有机相，流速不低于3ml/min。

5)混合完成后，用稀释缓冲液稀释10-50倍超滤浓缩，稀释缓冲液为生理盐水、PBS或Tris缓冲液等，优选为Tris缓冲液。

6-8周龄BALB/C小鼠，提前一个月皮下免疫水痘病毒造模，一个月后肌肉注射带状疱疹gE蛋白mRNA疫苗，免疫剂量为5μg/100μl/只，两针间隔28天。小鼠免疫两针后28天在血清中以ELISA方法检测gE特异性抗体。

ELISA检测方法如实施例1所述，酶标板用gE蛋白包被，然后加入免疫后的小鼠血清孵育，HRP标记二抗孵育及加底物显色。

结果如图7所示，本发明的疫苗gE特异性抗体滴度可达1.77×10⁶，得到了高水平的gE特异性抗体，本发明的疫苗不含有辅助机体激活的佐剂，但产生的抗体水平与已上市含有佐剂的GSK带状疱疹疫苗相当。

同时，检测二免后28天CD4+T细胞分泌的IFN-γ和IL-2激活水平。其中，以注射生理盐水为对照组(NEG)。

结果如图8所示，细胞免疫方面，IFN-γ和IL-2激活水平显著高于对照已上市GSK带状疱疹疫苗，分别能够达到18975和20677。

以上结果表明以ZF2105 UTR骨架与A60搭配作为mRNA疫苗骨架表达gE抗原能够有效激活体液免疫和细胞免疫。

实施例5：新型冠状病毒奥密克戎株S蛋白mRNA疫苗免疫原性

用ZF2105 UTR骨架与A100搭配使用进行新型冠状病毒S蛋白mRNA疫苗(ZF008)免疫活性检测，其中，新型冠状病毒S蛋白编码区是在原始序列(Gene ID:43740568)基础上进行了优化，序列如SEQ ID NO:26。

疫苗制备方法参照实施例4。

4-6周龄BALB/C小鼠，免疫剂量为3μg/100μl/只，两针间隔28天。小鼠免疫两针后28天在血清中以ELISA方法检测S蛋白特异性抗体，方法如上所述。

结果如图9所示，本发明的疫苗S蛋白特异性抗体滴度可达6.4×10⁶，得到了高水平的S蛋白特异性抗体(参见图9左图)；假病毒中和实验结果表明，免疫后血清对奥密克戎株假病毒的ID50值大于65610(参见图9右图)。

细胞免疫方面，也有很好地激活，IFN-γ和IL-2激活水平分别能够达到14169和20187。

以上结果表明以ZF2105 UTR骨架与A100搭配作为mRNA疫苗骨架表达新型冠状病毒S蛋白抗原能够有效激活体液免疫和细胞免疫。

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。

另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。

此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。

Claims (17)

1.一种模板DNA分子，其特征在于，所述模板DNA分子包括5’端非翻译区(5’UTR)、目的多肽或蛋白编码区、3’端非翻译区(3’UTR)和多聚腺苷酸(polyA)区，所述UTR序列来源于人类基因组具有翻译功能的UTR。

2.根据权利要求1所述的模板DNA分子，其特征在于，所述5’UTR序列长度为20-70bp，其序列结构松散不易形成二级结构，所述3’UTR序列长度为50-400bp，序列结构要避免AU、AUUUA或GU富集序列，优选的，所述5’UTR序列如SEQ ID NO:3、9-14任一所示，所述3’UTR序列SEQ ID NO:6、15-23任一所示。

3.根据权利要求1-2任一所述的模板DNA分子，其特征在于，所述polyA不超过100bp。

4.根据权利要求1-3任一所述的模板DNA分子，其特征在于，所述模板DNA分子还包括5’帽子结构,优选的，所述5’帽子结构序列为标准帽子结构或修饰帽子结构。

5.根据权利要求1-4任一所述的模板DNA分子，其特征在于，所述目的多肽或蛋白来源于任意生物体，优选的，来源于病毒、古细菌、原核生物、真核生物，更优选的，所述生物体来源于病毒，例如水痘－带状疱疹病毒(varicella-zoster virus，VZV)，新型冠状病毒(SARS-CoV-2)、狂犬病毒、呼吸道合胞病毒、流感病毒，或者，所述目的多肽或蛋白来源于动物或者人类疾病相关的抗原，例如变应原蛋白、自体抗原、肿瘤特异性抗原，进一步优选的，所述目的多肽或蛋白包括水痘－带状疱疹病毒的gE蛋白或其突变体、新型冠状病毒S蛋白或其突变体、狂犬病毒CTN-1毒株G蛋白(RVG)或其变体、呼吸道合胞病毒F蛋白或其突变体、流感病毒HA蛋白或其突变体、变应原蛋白、自体抗原、肿瘤特异性抗原。

6.一种mRNA分子，其特征在于，所述mRNA分子由权利要求1-5任一的模板DNA分子转录获得。

7.根据权利要求6所述的mRNA分子，其特征在于，所述mRNA分子是天然或修饰的RNA。

8.一种载体，其特征在于，所述载体包括权利要求1-5任一所述的模板DNA分子。

9.权利要求6-7所述的mRNA分子的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括将权利要求1-5任一的模板DNA分子进行转录。

10.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法还包括加帽步骤，对mRNA进行加帽，优选的，所述加帽步骤包括共转录加帽或酶促加帽步骤。

11.权利要求1-5任一所述的模板DNA分子、权利要求6-7任一所述的mRNA分子或者权利要求8所述的载体在表达目的多肽或蛋白中的用途。

12.根据权利要求11所述的用途，其特征在于，所述目的多肽或蛋白来源于任意生物体，优选的，来源于病毒、古细菌、原核生物、真核生物，更优选的，所述生物体来源于病毒，例如水痘－带状疱疹病毒(varicella-zoster virus，VZV)，新型冠状病毒(SARS-CoV-2)、狂犬病毒、呼吸道合胞病毒、流感病毒，或者，所述目的多肽或蛋白来源于动物或者人类疾病相关的抗原，例如变应原蛋白、自体抗原、肿瘤特异性抗原，进一步优选的，所述目的多肽或蛋白包括水痘－带状疱疹病毒的gE蛋白或其突变体、新型冠状病毒S蛋白或其突变体、狂犬病毒CTN-1毒株G蛋白(RVG)或其变体、呼吸道合胞病毒F蛋白或其突变体、流感病毒HA蛋白或其突变体、变应原蛋白、自体抗原、肿瘤特异性抗原。

13.权利要求1-5任一所述的模板DNA分子、权利要求6-7任一所述的mRNA分子或者权利要求8所述的载体在制备疫苗中的用途，优选的，所述疫苗用于预防或者治疗目的多肽或蛋白相关的疾病。

14.一种mRNA疫苗，其特征在于，所述mRNA疫苗包括权利要求6-7任一所述的mRNA分子。

15.根据权利要求14所述的mRNA疫苗，其特征在于，所述mRNA编码水痘－带状疱疹病毒的gE蛋白或其突变体、新型冠状病毒S蛋白或其突变体、狂犬病毒CTN-1毒株G蛋白(RVG)或其变体、呼吸道合胞病毒F蛋白或其突变体、流感病毒HA蛋白或其突变体、变应原蛋白、自体抗原、肿瘤特异性抗原。

16.根据权利要求14-15任一所述的mRNA疫苗，其特征在于，所述mRNA疫苗还包括递送系统，优选的，所述递送系统包括阳离子脂质纳米颗粒、阳离子脂质体或阳离子聚合物。

17.权利要求14-16所述的mRNA疫苗的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括将mRNA分子包裹在递送系统中。

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