KR20030086429A

KR20030086429A - 최적의 진핵 세포 발현 벡터

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Publication number: KR20030086429A
Application number: KR1020030028080A
Authority: KR
Inventors: 성영철; 하상준; 김두진; 진현탁
Original assignee: 주식회사 제넥신
Priority date: 2002-05-01
Filing date: 2003-05-01
Publication date: 2003-11-10

Abstract

본 발명은 유전자 치료 또는 DNA 백신에 있어서 최적의 조건을 가지는 벡터 (vector)에 관한 것이다. 더 구체적으로는, 벡터를 구성하는 다양한 구성 요소들을 조합하여 최적의 조건을 가지도록 개발된 진핵 세포 발현 벡터에 관한 것이다. 또한, 본 발명의 개발된 다양한 진핵 세포 발현 벡터들에 인간 인터루킨-12 변형체 유전자 (hIL-12m)를 삽입하였을 경우, 인간 인터루킨-12 변형체 유전자의 발현을 높게 유도할 수 있는 pGX30 벡터 및 pACP20 벡터에 관한 것이다.

또한, 본 발명의 최적의 벡터는 목적 유전자를 삽입하여 유전자 치료 또는 DNA 백신에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

최적의 진핵 세포 발현 벡터 {Optimal Eukaryotic Expression Vector}

본 발명은 유전자 치료 또는 DNA 백신에 있어서 최적의 조건을 가지는 벡터 (vector)에 관한 것이다. 더 구체적으로는, 다양한 구성 요소들을 조합하여 최적의 조건을 가지도록 개발된 진핵 세포 발현 벡터들에 관한 것으로 개발된 다양한 진핵 세포 발현 벡터들에 인간 인터루킨-12 변형체 유전자(hIL-12m)를 삽입하였을 경우, 여러 진핵 세포 발현 벡터들 중 인간 인터루킨-12 변형체 유전자의 발현을 높게 유도할 수 있는 pGX30 벡터 및 pACP20 벡터에 관한 것이다.

또한, 본 발명의 pGX30 및 pACP20 벡터는 목적 유전자를 삽입하여 유전자 치료 또는 DNA 백신에 유용하게 사용될 수 있다.

기존의 면역 치료제로 개발되어 사용되고 있는 여러 종류의 화학 약품들은 그 효과가 한시적이고, 또한 여러 부작용이 수반되는 한계를 가지고 있으며, 주로 사이토킨(cytokine) 또는 항체들이 대부분인 단백질 제재들은 생체 외(in vitro)에서 대량 생산하는데 막대한 비용이 들 뿐 아니라, 오랜 기간 동안 인체에 대한 안전성 실험을 해야 한다는 점들이 개발의 큰 걸림돌이 되고 있다. 현재 다수의 난치성 및 감염성 질환들의 치료에는 화학 요법 또는 단백질 제재 등이 주로 사용되고 있으나 완치가 어려운 실정이다. 예를 들면, 최근 완치가 가능하다고 여겨졌던결핵이 급증하고 있는 이유도 어떤 종류의 화학 치료제에도 저항성을 가지는 새로운 종류의 결핵균이 발생하고 있기 때문이다.

이러한 화학 약품 및 단백질 제재 등의 단점을 극복할 수 있는 새로운 치료 방법이 DNA, 즉 유전자를 이용한 치료 및 예방법으로 이러한 방법은 내성이 생기지 않을 뿐 아니라, 저렴하면서도 효과적으로 감염성 질환 치료, 유전자 결손에 의한 질병 치료 및 예방 백신 등에 이용될 수 있는 가능성을 보여주고 있다. 특히 DNA를 이용하여 면역 치료에 사용하는 DNA 백신은 항원 특이적인 체액성 면역 반응 및 세포성 면역반응을 모두 유도할 수 있으며, 특히 강력한 Th1 및 CTL 반응을 일으킬 수 있어 치료를 위해서 세포성 면역 반응이 필수적으로 요구되는 여러 가지 만성 질환의 치료 및 예방에 응용될 수 있다.

일반적으로, DNA를 이용한 면역화 방법에 있어서 가장 중요한 요건은 발현시키고자 하는 목적 유전자 (target)를 세포 내로 얼마나 효율적으로 전달할 수 있느냐이다. DNA 면역화 방법은 생체 내로의 전달 효율이 낮아 바이러스를 이용한 벡터 시스템이 각광받고 있으나, 현재 그 안전성 문제로 사용이 제한되고 있는 실정이다. 반면 네이키드(naked) DNA와 같은 비 바이러스성 벡터를 이용하는 시도는 안전하지만, 생체 내로의 전달 효율이 비교적 낮다. 따라서 이러한 비 바이러스성 벡터를 이용한 DNA 면역화 방법에 있어서 관건이 될 수 있는 것이 최적의 벡터의 개발을 통한 목적 유전자의 발현 증진과 그 안정성의 극대화 여부이다.

DNA 면역화 방법에 사용되는 비 바이러스성 플라스미드(plasmid) 벡터의 효율에 영향을 주는 여러 가지 요인들이 보고 되어 왔다. 가장 중요한 요인은 벡터가 얼마나 안정적으로 많은 양의 목적 단백질을 생체 내에서 발현시킬 수 있느냐에 있다. 이러한 목적 유전자 발현 및 안정화에 영향을 줄 수 있는 요인들은 첫째, 바이러스 프로모터 (promoter)와 인핸서 (Enhancer)로서, 벡터 내 각각 목적 유전자의 전사 개시(transcription initiation) 조절 및 전사 효율 증진을 통해 그 발현을 향상시킬 수 있다. 둘째, 인트론 (intron) 및 poly(A) (poly adenylation) 서열은 mRNA의 안정화를 유도함으로써 목적 유전자의 발현을 증진시킬 수 있다. 높은 수준의 목적 유전자 발현은 강력한 면역 반응을 유도할 수 있다고 알려져 있으며 (Barry et al., Vaccine 15:788-91, 1997; Leitner et al., J. Immunol. 159:6112-9, 1997), 유전자 결손 질병 치료에 있어서도 필수적인 요소이다. 셋째, 번역 (translation) 효율이나 DNA 자체의 안정성을 증진시킴으로써 목적 유전자의 발현을 증진시킬 수 있는 서열이 벡터의 구성 요소가 될 수 있다. 이 외에도, 벡터 백본(backbone) 내에 존재하는 비메틸화 (unmethylated) CpG 디뉴클레오티드 (dinucleotide)로 구성된 DNA 모티프 (motif)가 면역 시스템을 자극할 수 있음이 알려져 있다 (Krieg et al., Nature, 374:546-9, 1995). 이러한 면역자극 서열 (immunostimulatory sequence: ISS)은 Th1 면역 반응을 유도함으로써 DNA 면역 치료 등의 효율을 높일 수 있다 (Roman et al., Nat. Med. 3:849-54, 1997; Chu et al., J. Exp. Med. 186:1623-31, 1997). 따라서, 이러한 여러 가지 요소들의 가장 적절한 조합이 이루어 졌을 때 최적의 유전자 발현 효율 및 면역 치료 효율이 얻어질 수 있을 것이다.

본 발명에서는 현재까지 알려진 다양한 프로모터/인핸서 서열, poly(A) 서열및 인트론 서열 등을 조합하여 목적 유전자의 발현 수준을 증가시키고 생체 내에서 면역반응 유도에 적합한 벡터들을 개발하고자 하였다. 또한 아데노 관련 바이러스 (adeno-associated virus; AAV)의 반전 말단 반복부(inverted terminal repeat) (ITR) 서열 등을 삽입하여 더욱 개선된 플라스미드 DNA 벡터들을 제작하였다. 기존의 여러 보고들을 토대로 하여 다음 요소들을 선별하였다.

사이토메갈로 바이러스 (Cytomegalovirus; CMV) 초기(early) 인핸서/프로모터 (pCMV)는 가장 강력한 조절 요소로 알려져 왔고, 다양한 세포에서 활성을 지닌다 (Schmidt et al., Mol. Cell. Biol. 10:4406-11, 1990). 따라서, pCMV는 대부분의 포유동물 세포 발현 벡터에 사용되어 왔다.

시미안 바이러스 (Simian virus 40 ; SV40) 후기 poly(A) 서열은 SV40 초기 poly(A) 서열보다 RNA를 5배 더 안정화시킬 수 있다고 알려져 있다 (Carswell et al., Mol. Cell. Biol. 9:4248-58, 1989).

또한, 소 성장인자 (bovine growth hormone ; bGH) poly(A) 서열은 SV40 초기 poly(A)나 인간 콜라겐(human collagen) poly(A) 보다 3배 더 높은 목적 유전자 발현을 나타내었다 (Pfarr et al., DNA 5:115-22, 1986).

SV40 인핸서는 DNA에 결합하는 RNA 중합효소 II (RNA polymerase II)의 수를 증가시킴으로써 전사효율을 높이는 것으로 알려져 있다 (Treisman et al., Nature, 315:73-5, 1985).

아데노바이러스의 삼부 리더(tripartite leader) (TPL) 서열은 번역 (translation) 효율을 증가시키는 것으로 알려져 있다 (Logan et al., Proc. Natl.Acad. Sci. USA. 81:3655-9, 1984).

AAV의 ITR 서열은 AAV 타입 2로부터 유래되었으며, 두 개의 ITR (ITRs) 서열들은 서로 팔린드롬 (palindrome) 구조를 가지고 있기 때문에 (Ren et al., Nucleic Acids Res. 27:1985-90, 1999), 자가 염기쌍 (self-base pairing)을 이루어 Y 또는 T 형태의 구조를 형성한다 (Ashktorab et al., J. Virol. 63:3034-9, 1989). 이러한 보고들을 근거로 할 때, ITR은 DNA의 안정성에 기여할 것으로 보여지며, 이와 일치하게 ITR을 포함하는 AAV 벡터에서 목적 유전자의 발현 수준이 증가하였다는 보고가 있다 (Flotte et al., Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 7:349-56, 1992).

또한, 벡터를 제조하는 과정 중 유념해야 할 부분은 대장균에서 대량으로 플라스미드를 얻는 과정에 사용될 항생제 저항성 유전자 (antibiotics resistant gene), 예를 들어 암피실린(ampicillin) 저항성 유전자 (Amp) 또는 카나마이신 (kanamycin) 저항성 유전자 (Kan)의 선택이다. 두 가지 항생제 저항성 유전자는 서로 CpG 모티프의 삽입된 정도도 다르고, 또한 항원의 발현에도 어느 정도 영향을 준다고 알려져 있고, 생쥐 모델에서 서로 다른 면역 반응을 유도한다고 알려져 있다. 특히, 인간의 난치성 질환을 치료하는데 쓰일 네이키드 DNA 벡터 개발을 위해서는 인간 임상에서 사용될 수 있는 카나마이신 유전자가 널리 사용되어 왔다.

이러한 벡터를 구성하는 요소들의 조합을 통해 높은 수준의 목적 유전자 발현을 나타내는 최적의 벡터를 선별하기 위하여, 본 발명에서는 인간 인터루킨-12 변형체(hIL-12m) 유전자를 개발된 각 벡터에 삽입하고 각 벡터를 포유동물 세포에형질감염(transfection)시킨 후, 인터루킨-12 발현 수준을 측정하였다.

목적 유전자로 사용된 인간 인터루킨-12 변형체 유전자 (hp35/IRES/hp40-N222L; hIL-12m)는 인간 IL-12p40 소 단위체의 당쇄화 부분인 Asn-222 아미노산이 돌연변이화된 유전자로 이 유전자의 발현은 활성형의 IL-12p70의 발현을 증가시키면서 IL-12p40의 분비는 감소시키는 것으로 알려져 있으며, 이에 상응하는 생쥐 인터루킨-12 변형체 유전자 또한 소 동물(small animal) 모델인 생쥐에 HCV E2 유전자와 함께 DNA 면역화하는 경우 최적의 세포 매개성 면역 반응, 특히 오랜 기간이 지난 뒤에도 이러한 면역반응이 지속적으로 유도되는 사실이 보고되었다 (Ha et al., Nat. Biotechnol. 20:381-6, 2002).

본 발명은 이러한 면역 조절 사이토카인 유전자를 최적 벡터 선별의 목적 유전자로 사용함으로써 면역 유전자 요법 및 DNA 백신에도 응용할 수 있는 벡터 제작 가능성을 제시한다. 본 발명에서는 인간 인터루킨-12 변형체 유전자의 높은 발현 수준을 나타내는 벡터들을 선별하였고, 이 벡터에 생쥐 인터루킨-12 변형체 유전자를 삽입한 후, 이를 소 동물 모델인 생쥐에 HCV E2 유전자와 함께 DNA 면역화하여 최적의 세포 매개성 면역 반응을 나타낼 수 있는지를 관찰하였다. 이러한 연구를 통하여 본 발명의 pGX30 벡터와 pACP20 벡터가 최적의 플라스미드 벡터로서 유용하게 사용될 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

상기와 같은 연구를 통하여, 본 발명은 다양한 벡터 구성 요소들의 목적 유전자 발현 증진에 있어서의 효과를 비교하여 선별된 최적의 벡터 구성 요소를 제공한다.

또한, 본 발명은 선별된 벡터 구성 요소 조합을 통해 높은 수준의 목적 유전자 발현을 유도할 뿐 아니라, 생체 내에서 효율적인 면역 반응을 유도할 수 있는 벡터를 제공한다.

또한, 본 발명은 제작된 벡터에 인간 인터루킨-12 유전자를 삽입한 벡터를 제공한다.

도 1은 본 발명에서 사용된 다양한 진핵 세포 발현 벡터들 내에 인간 인터루킨-12 변형체 (hIL-12m) 유전자가 삽입된 모식도이다.

도 2는 본 발명의 진핵 세포 발현 벡터로 사용된 벡터 pGX0의 작제도이다.

도 3a는 본 발명의 진핵 세포 발현 벡터의 작제에 사용된 중간체 벡터 pGX1의 작제도이다.

도 3b는 본 발명의 진핵 세포 발현 벡터로 사용된 벡터 pGX10의 작제도이다.

도 4는 본 발명의 진핵 세포 발현 벡터로 사용된 벡터 pGX15의 작제도이다.

도 5a는 본 발명의 진핵 세포 발현 벡터의 작제에 사용된 중간체 벡터 pGX11의 작제도이다.

도 5b는 본 발명의 진핵 세포 발현 벡터로 사용된 벡터 pGX30의 작제도이다.

도 6은 본 발명의 진핵 세포 발현 벡터로 사용된 벡터 pACP의 작제도이다.

도 7은 본 발명의 진핵 세포 발현 벡터로 사용된 벡터 pACP20의 작제도이다.

도 8은 본 발명의 진핵 세포 발현 벡터로 사용된 벡터 pACP25의 작제도이다.

도 9는 본 발명의 진핵 세포 발현 벡터로 사용된 벡터 pACP30의 작제도이다.

도 10a는 본 발명의 진핵 세포 발현 벡터의 작제에 사용된 중간체 벡터 pSK-hp35/IRES/hp40의 작제도이다.

도 10b는 본 발명의 진핵 세포 발현 벡터의 작제에 사용된 중간체 벡터 pSK-hp35/IRES/hp40-N222L(pSK-hIL-12m)의 작제도이다.

도 10c는 본 발명의 진핵 세포 발현 벡터로 사용된 벡터 pGX0-hIL-12m의 작제도이다.

도 11은 본 발명의 진핵 세포 발현 벡터로 사용된 벡터 pGX10-hIL-12m의 작제도이다.

도 12는 본 발명의 진핵 세포 발현 벡터로 사용된 벡터 pGX15-hIL-12m의 작제도이다.

도 13은 본 발명의 진핵 세포 발현 벡터로 사용된 벡터 pGX30-hIL-12m의 작제도이다.

도 14는 본 발명의 진핵 세포 발현 벡터로 사용된 벡터 pTV2-hIL-12m의 작제도이다.

도 15는 본 발명의 진핵 세포 발현 벡터로 사용된 벡터 pACP-hIL-12m의 작제도이다.

도 16은 본 발명의 진핵 세포 발현 벡터로 사용된 벡터 pACP20-hIL-12m의 작제도이다.

도 17은 본 발명의 진핵 세포 발현 벡터로 사용된 벡터 pACP25-hIL-12m의 작제도이다.

도 18은 본 발명의 진핵 세포 발현 벡터로 사용된 벡터 pACP30-hIL-12m의 작제도이다.

도 19는 본 발명에서 인간 인터루킨-12 변형체 (hIL-12m) 유전자를 포함한 발현 벡터들의 세포 내 형질전환 후 얻어진 세포 배양 상층액(supernatant)에서 수행한 인터루킨-12에 대한 ELISA 결과를 상대적으로 도시한 것이다. X 축은 세포 배양 상층액에서의 인간 인터루킨-12의 상대적 발현도(%)를, Y 축은 다양한 진핵 세포 발현 벡터를 나타낸다.

도 20은 본 발명에서 인간 인터루킨-12 변형체 (hIL-12m) 유전자를 포함한 발현 벡터들의 세포 내 형질전환 후 얻어진 세포 파쇄물 (cell lysate)에서 수행한 인터루킨-12에 대한 ELISA 결과를 상대적으로 도시한 것이다. X 축은 세포 파쇄액에서의 인간 인터루킨-12의 상대적 발현도(%)를, Y 축은 다양한 진핵 세포 발현 벡터를 나타낸다.

도 21은 생쥐 DNA 백신 모델에서 생쥐 인터루킨-12 변형체 (mIL-12m) 유전자를 포함한 재조합 플라스미드로 사용되는 본 발명에 따른 pACP20-mIL-12m의 작제도이다.

도 22는 본 발명의 DNA 벡터로 면역화된 생쥐의 비장 세포 중 E2 특이적인 CD8+ CTL 빈도를 시간에 따라 조사한 결과이다. pTV2-mIL-12m는 100 ㎍의 pTV2-E2 및 100 ㎍의 pTV2-mIL-12m으로 면역화된 생쥐를, pACP20-mIL-12m은 100 ㎍의 pTV2-E2 및 100 ㎍의 pACP20-mIL-12m으로 면역화된 생쥐를 나타낸다. X 축은 면역화한 후의 시간의 경과(주)를, Y 축은 비장 세포(spleen cell) 1x10⁷당 전구물질 CTL의빈도를 나타낸다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 다양한 벡터 구성 요소 및 이 구성 요소들의 조합으로 이루어진 최적의 진핵 세포 발현 벡터를 제공한다.

또한, 본 발명은 인간 또는 생쥐 인터루킨-12 변형체 유전자들을 포함하는 최적의 진핵 세포 발현 벡터를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 벡터들이 DNA 백신 면역화 또는 유전자 치료에 이용되는 것을 특징으로 한다.

상기와 같이, 본 발명의 벡터를 DNA 백신으로 사용하는 경우, 치료학적 유효량의 외래 유전자를 함유하는 본 발명의 DNA 백신 벡터 성분과 함께, 바람직하게는, 약제학적으로 허용되는 담체, 예를 들면, 인산염 완충용액(PBS), 염수, 포도당, 물, 글리세롤, 에탄올 또는 이들의 혼합물이 포함될 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 벡터는 인산염 완충용액과 함께 사용할 수 있다. 그외에 당해 분야에공지된 보조제 성분들을 추가로 사용할 수 있다.

DNA 백신 벡터 및 이를 포함하는 백신 조성물은 다양한 방식 예를 들어, 경구, 비내, 폐, 근육내, 피하내 또는 피내 경로를 포함하지만 이에 제한되지 않는 경로로 투여될 수 있다. 이들은 주입가능한 조성물로서, 예를 들어, 멸균 수성 현탁액, 바람직하게는 등장액으로서 개체에 투여될 수 있다.

본 발명의 벡터를 함유하는 백신 조성물의 적용 방식은 처리되는 동물의 크기 및 종, 투여되는 DNA 백신 벡터의 구성물 또는 조성물의 양, 투여 경로, 사용된 보조제 화합물의 효능과 용량, 및 당해 분야의 숙련자에게 자명한 기타 요인에 따라 변화될 수 있다는 것을 이해할 것이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 ITR, pCMV, TPL, SV40 poly(A), SV40 인핸서, bGH poly(A), 항생제 내성 마커 유전자 Kan 및 Amp와 같은 플라스미드 벡터의 구성 요소들을 여러 가지 제한 효소를 이용하여 다양하게 조합함으로써 진핵 세포 내 발현에 사용될 수 있는 벡터들을 제공한다. 또한, 본 발명은 제작된 각 벡터들에 인간 인터루킨-12 변형체 유전자(hIL-12m)를 삽입한 벡터들을 제공한다. 인간 인터루킨-12 변형체 유전자가 삽입된 벡터의 구성 요소는 도 1에 나타나 있다. 벡터들은 크게 항생제 저항성 유전자의 종류에 따라 카나마이신(kanamycin) 저항성 유전자를 가지는 pGX류 및 암피실린 (ampicillin) 저항성 유전자를 가지는 pACP류로 구분될 수 있다.

제작된 벡터는 다음의 구성 요소의 순서대로 배열되어 있다.

pGX0-hIL-12m : pCMV, TPL, hIL-12m, SV40 poly(A), Kan

pGX10-hIL-12m : pCMV, TPL, hIL-12m, SV40 poly(A), SV40 인핸서, Kan

pGX15-hIL-12m : pCMV, TPL, hIL-12m, bGH poly(A), SV40 인핸서, Kan

pGX30-hIL-12m : ITR, pCMV, TPL, hIL-12m, SV40 poly(A), SV40 인핸서, ITR, Kan

pTV2-hIL-12m : pCMV, hIL-12m, SV40 poly(A), Amp

pACP-hIL-12m : ITR, pCMV, hIL-12m, bGH poly(A), ITR, Amp

pACP20-hIL-12m : ITR, pCMV, TPL, hIL-12m, bGH poly(A), ITR, Amp

pACP25-hIL-12m : ITR, pCMV, hIL-12m, SV40 poly(A), SV40 인핸서, ITR, Amp

pACP30-hIL-12m : ITR, pCMV, TPL, hIL-12m, SV40 poly(A), SV40 인핸서, ITR, Amp

상기의 인간 인터루킨-12 변형체 유전자를 발현하는 벡터들 중 pGX30-hp35/IRES/hp40-N222L(pGX30-hIL-12m) 및 pACP20-hp35/IRES/hp40-N222L (pACP20-hIL-12m)은 2002년 4월 18일자로 한국생명공학연구원 유전자은행에 기탁되었다 (수탁 번호: KCTC 10232BP 및 KCTC 10233BP).

또한, 본 발명자들은 제작된 발현 벡터들의 목적 유전자인 인간 인터루킨-12 변형체 유전자의 시험관 내 발현 정도를 조사하기 위하여, 각각의 발현 벡터들로 포유동물 세포인 COS-7 세포에 형질전환시킨 후 이로부터 얻은 배양 상층액(supernatant) 및 세포 파쇄물(cell lysate)을 이용하여 인간 인터루킨-12 p70에 대한 ELISA 분석을 수행하였다 (도 19 및 20). 카나마이신 저항성 유전자를가지고 있는 발현 벡터들의 형질전환 후 상층액에서 얻어지는 인터루킨-12 발현을 비교해 보면, pGX0-hIL-12m은 가장 낮은 인터루킨-12 수준을 나타내었다. 이 발현 벡터에 SV40 인핸서가 더 첨가된 pGX10-hIL-12m은 pGX0-hIL-12m에 비해 배양 상층액에서 약 8배 가량 높은 발현 수준을 보여주었으며, 이는 SV40 인핸서의 영향임을 예상할 수 있다. 또한, pGX10-hIL-12m에서 SV40 poly(A) 대신 bGH poly(A)가 치환된 pGX15-hIL-12m의 경우 pGX10-hIL-12m과 유사한 발현 수준을 나타내었다. 즉, SV40 poly(A)와 bGH poly(A)가 pGX backbone에서 비슷한 발현 효율을 나타내고 있음을 설명한다. pGX15-hIL-12m에 ITR이 첨가된 pGX30-hIL-12m의 경우 pGX류 벡터들 중 가장 높은 수준의 발현 효율을 나타내는데, 이는 ITR 서열에 의한 DNA 안정화의 영향으로 생각할 수 있다. 세포 파쇄물(cell lysates)을 이용한 ELISA에서도 유사한 결과를 얻을 수 있는데(도 20), 이러한 결과들을 통해 카나마이신 저항성 유전자를 포함한 pGX류 벡터들 중에서 pGX30 벡터가 인간 인터루킨-12 변형체 유전자의 발현에 최적의 벡터라는 것을 알 수 있다.

암피실린 저항성 유전자를 포함한 pACP류의 발현 효율을 비교해 보면, pTV2-hIL-12m에 비해 pACP-hIL-12m의 발현 수준은 약 40% 정도로 높음을 알 수 있고, 이것은 목적 유전자의 발현 효율 증진에 있어서 ITR 및 bGH poly(A)의 조합이 TPL 및 SV40 poly(A)의 조합보다 강력한 작용을 할 수 있음을 의미한다. 기존 보고를 토대로 할 때, ITR에 의한 DNA 안정성의 증가가 발현 효율의 증가로 나타났을 가능성이 있으며, 또한 SV40 poly(A)에 비해 bGH poly(A)가 더 강력한 발현 효율 증진 능력을 가질 가능성이 있다. pACP-hIL-12m에 비해 pACP20-hIL-12m의 경우가 발현 효율이 증가되어 있는데, 이는 TPL의 영향임을 추측할 수 있다. 배양 상층액 및 세포 파쇄물에서 발현 정도를 비교해 볼 때, pACP-hIL-12m의 발현 효율은 이 벡터의 구성 요소인 bGH poly(A)가 SV40 poly(A) 및 인핸서로 교체된 pACP25-hIL-12m의 발현 효율보다 오히려 높은데, 이는 bGH poly(A)의 발현 효율 증진 능력이 SV40 poly(A)와 인핸서 혼합 요소에 비해 더 높음을 반증하고 있다. 이는 앞서 pTV2와 pACP 벡터를 비교하였을 경우에도 제시되었던 가능성이다. 이러한 결과에 비추어 볼 때, pGX10-hIL-12m 및 pGX15-hIL-12m에서의 발현 효율이 비슷하게 나타난 것은 백본(backbone)에 따른 영향일 가능성 이외에, bGH poly(A)의 발현 효율 증진 능력이 SV40 인핸서와 함께 존재할 때 오히려 증진 능력이 방해를 받음으로써 pGX15-hIL-12m과 pGX10-hIL-12m의 발현 효율이 유사하게 나타났을 가능성이 있음을 나타낸다. pACP25-hIL-12m 및 pACP30-hIL-12m을 비교하는 경우, 후자의 발현 효율 증진이 더 강하게 보이는데, 이것은 TPL의 영향임을 나타내 준다. 결과적으로 pACP류 플라스미드 벡터 중에는 pACP20가 인간 인터루킨-12 변형체 유전자의 발현 효율을 증진시키는데 가장 적합한 벡터라고 할 수 있다.

pGX류 및 pACP류의 백본의 영향을 비교해 볼 수 있는 벡터는 pGX0-hIL-12m 및 pTV2-hIL-12m 그리고 pGX30-hIL-12m 및 pACP30-hIL-12m인데, 전자의 두 벡터의 경우 배양 상층액에서 약 4배의 발현 수준 차이를 보여준다. 이러한 결과는 암피실린 저항성 유전자를 가지고 있는 백본(backbone) 벡터가 카나마이신 저항성 유전자를 가지고 있는 백본 벡터에 비해 안정된 발현 효율을 나타낼 수 있음을 의미한다. 반면, pGX30-hIL-12m 및 pACP30-hIL-12m 간의 발현 정도는 비슷하게 나타났다. 이러한 현상은 두 백본 벡터 간의 발현 영향 요인이 ITR의 삽입으로 인해 발현 수준이 증대됨으로써 그 영향 요인이 가려졌을 가능성을 보여준다.

마지막으로, 본 발명은 상기 선별된 벡터 중 pACP20의 생체 내 면역 증진 효율을 관찰하기 위하여, 기존의 보고와 유사한 방법으로 소 동물인 생쥐에서 HCV E2에 대한 DNA 백신 모델에서 세포성 면역 반응을 관찰하였다 (Ha et al., Nat. Biotechnol. 20:381-6, 2002). 이전의 보고에 따르면, HCV-E2 항원 (pTV2-gDsE2t)을 암호화하는 플라스미드 DNA 예방접종이 접종 3주 후에, 항원-특이적인 체액성 (antigen-specific humoral) 및 세포-매개성 면역 반응 (cell-mediated immune response)을 유도하는데 충분함이 확인되었다 (Lee et al., J. Virol. 72:8430-6.1998). pACP20에 생쥐 인터루킨-12 변형체 유전자(mp35/IRES/mp40-N220L ; mIL-12m)를 삽입한 pACP20-mIL-12m (도 20) 및 이에 대한 비교 대상인 pTV2-mIL-12m (Ha et al., Nat. Biotechnol. 20:381-6, 2002, 도 20 참조)을 각각 pTV2-E2 벡터와 함께 면역화한 후, E2 특이적인 CD8+ CTL 세포의 전구세포의 개수를 시간에 따라 측정함으로써 세포성 면역 반응의 정도와 지속성 여부를 비교하였다 (도 22). pTV2 벡터는 pACP20 벡터와 비교할 때, 백본은 유사하지만 ITR이 결여되어 있으며, poly(A) 서열이 bGH poly(A) 대신 SV40 poly(A)로 치환되어 있는 벡터(도 1)이다. 면역화 후 6주째 세포성 면역 반응의 정도 측면에서 보면, pACP20-mIL-12m이 함께 면역화된 생쥐에서 pTV2-mIL-12m이 면역화된 생쥐에 비해 약 2배 정도 높은 CTL 빈도를 나타내었고, 시간이 지나면서 그 정도 차이가 더 커지고 있음을 관찰하였다. 또한, 21주째에 두 생쥐 그룹 간의 CTL 빈도를 보면 pTV2-mIL-12m 그룹의 빈도는현저히 감소하였음에 비해 pACP20-mIL-12m 그룹의 빈도는 여전히 지속되고 있음을 알 수 있었다. 이러한 결과는 pACP20 벡터가 시험관 내 발현 효율 증진 결과와 상응하게 생체 내에서도 효과적으로 생쥐 인터루킨-12 변형체를 발현시킴으로써 E2 항원에 대한 면역 반응을 효과적으로 증진시키며 그 면역 반응의 지속에서도 효과적으로 작용하는 벡터임을 증명하는 것이다. 이러한 pACP20 벡터의 이러한 작용은 bGH poly(A) 및 ITR 서열이 각각 목적 유전자인 생쥐 인터루킨-12 변형체 유전자의 mRNA 안정화 및 DNA 안정화에 기여할 수 있음을 예측하게 한다.

따라서, pACP20 벡터는 이것에 제한되는 것은 아니지만, AIDS, C형 및 B형 간염, 암, 독감, 결핵, 말라리아 등 인체 내 면역력 증가에 의해 치유될 수 있는 질병의 예방 및 치료에 있어 항원 유전자나 면역 조절 인자 유전자 등을 삽입할 수 있는 벡터로 유용하게 사용될 수 있다.

이하, 본 발명을 하기 실시예에서 좀더 상세히 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 범위를 한정하고자 하는 것은 아니다.

실시예

실시예 1

다양한 플라스미드(plasmid) 벡터의 제조

A. pGX0의 제조 (도 2)

벡터 pZero-2 (Invitrogen)를 주형으로 하여, 하기 프라이머로 PCR 증폭방법으로 PCR하고 그 증폭된 산물을 XmnI으로 분해시킨 다음, 얻어진 DNA 단편 (1.2kb)을, 벡터 pTV2 (Leeet al., J. Virol. 72:8430-36, 1998)를 XmnI으로 절단한 부위에 삽입함으로써 pGX0 (6.0 kb)을 제조하였다.

KanXmF: TTG GAA AAC GTT CTT CGG GCG GCC TAT TGG TTA AAA AAT GAG C (서열번호 1)(센스)

KanXmR: CTT GAA CGT TTT CCT TTT CAC GTA GAA AGC (서열번호 2)(안티센스)

B. pGX10의 제조 (도 3)

1. 벡터 pTV3의 작제

벡터 pMT3 (Sambrook, et al., Molecular cloning 2nd Ed., vol 3: 16.20; Kaufman RJ, et al., Mol. Cell Biol. 9,946-958, (1989)) 2 ug을 HpaI (20 unit) 및 NheI (20 unit)으로 제한효소 처리법으로 잘라내고 클레노우(Klenow) 단편 (New England Biolabs)(5 unit)과 최종 100 μM이 되도록 dNTP (Takara)를 넣은 후 25℃에서 30분 처리하여 평활말단 (blunt end)을 만들었다. 아가로즈 겔 전기영동한 후 0.7kb 단편 (VAI 전체와 SV40 polyA 일부를 포함)을 벡터 pTV2 (Lee, et al., J. Virol., 72,8430-36, (1998))의 SV40 polyA 부분의 독특한 HpaI 부위에 삽입 접합하여 5.3kb의 벡터 pTV3을 제조하였다.

2. 벡터 pGX1의 작제(도 3a)

상기 작제된 벡터 pTV3을 주형으로 하여 하기 프라이머로 중합효소 연쇄반응(PCR)하고 PCR 산물 (2.0kb)을 NruI으로 앞서 기재한 제한효소의 처리 방법에 따라 절단하였다.

CMV5: 5'-TCG CGA CCC GGG CGA CGG CCA GTG AAT TGT ACC G-3' (서열번호 3)(센스)

VA3: 5'-TCG CGA GGC GCG CCA CGA GCC GCC GCG CCT GGA AGG-3' (서열번호 4)(안티센스)

또한, 벡터 pZero-2 (Invtrogen)을 주형으로 하여 하기 프라이머로 앞에 기재된 PCR 증폭 방법으로 증폭시키고 그 증폭된 산물을 SspI으로 분해시킨 다음 DNA 단편 (1.8kb)을 위의 PCR 단편 (2.0kb)과 연결하여 3.8kb의 벡터 pGX1(도 3a)을 제조하였다.

Zero5: 5'-AAT ATT GTC GAC TTC AGA AGA ACT CGT CAA GAA G-3' (서열번호 5)(센스)

Zero3: 5'-AAT ATT GGG CCC GAA CAT GTG AGC AAA AGG CCA G-3' (서열번호 6)(안티센스)

3. 벡터 pGX10의 제조

벡터 pGX-1을 제한효소 XbaI 및 SalI으로 자른 후, 두 개의 절편 중 큰 크기 (3.1kb)의 DNA를 상기 DNA 절편의 접합 및 대장균의 형질전환 방법에서와 같이 분리하였다. 벡터 pGL3-Enhancer (Promega)를 제한효소 XbaI 및 SalI으로 잘라서 생성되는 두 개의 절편 중 작은 절편 (0.5kb)을 위와 같은 방법으로 분리하였다. 두 분리된 절편을 결합하여 벡터 pGX10 (도 3b)을 얻었다 (서열번호 7).

C. pGX15의 제조 (도 4)

벡터 pRC/CMV (Invitrogen)을 제한효소 PvuII 및 XbaI으로 절단하여 생성된 DNA 절편 (0.25kb)을, pGX10를 ClaI으로 자르고 클레노우(Klenow) 단편 처리하여 평활 말단을 만든 뒤 다시 XbaI으로 절단하여 생긴 DNA 절편(3.4kb)과 결합시킴으로써 벡터 pGX15 (3.65kb)를 얻었다 (서열번호 8).

D. pGX30의 제조 (도 5)

1. 벡터 pGX10-ITR_LΔTPL의 작제

삼성 의료원으로부터 입수한 벡터 pACP (도 6 및 서열번호 10)를 PvuII와 EcoRI으로 절단하여 얻어진 유전자 단편 (0.95kb)을, pGX10를 SmaI과 EcoRI으로 절단하여 생기는 DNA 절편 (2.4kb)과 결합시킴으로써 벡터 pGX10-ITR_LΔTPL (3.35kb)을 얻었다.

2. 벡터 pSK-ITR_L의 작제

벡터 pACP를 PvuII와 SpeI으로 절단하여 얻어진 유전자 단편 (0.3kb)을,pBluescript SK (pSK; Stratagene, USA)를 EcoRV와 SpeI으로 절단하여 생기는 DNA 절편 (3.0kb)과 결합시킴으로써 벡터 pSK-ITR_L(3.3kb)을 얻었다.

3. 벡터 pGX11의 작제

상기 제작된 벡터 pSK-ITR_L를 SnaBI과 SalI으로 절단하여 얻어진 유전자 단편 (0.2kb)을, pGX10-ITR_LΔTPL을 BamHI으로 자르고 클레노우 단편 처리하여 평활 말단을 만든 뒤 다시 SalI으로 절단하여 생기는 DNA 절편 (3.35kb)과 결합시킴으로써 벡터 pGX11 (3.55kb)(도 5a)을 얻었다.

4. 벡터 pGX30의 작제

벡터 pACP20 (도 7 참조)을 Asp718로 자르고 클레노우 단편 처리하여 평활 말단을 만든 뒤 다시 SpeI으로 절단하여 생기는 DNA 절편 (1.1kb)을, 상기 pGX11을 제한효소 EcoRV와 SpeI으로 절단하여 생성된 DNA 절편(2.4kb)과 결합시킴으로써 벡터 pGX30 (3.5kb)(도 5b)을 얻었다 (서열번호 9).

E. pACP의 제조 (도 6)

벡터 pACP는 삼성의료원으로부터 분양받았다 (서열번호 10).

F. pACP20의 제조 (도 7)

벡터 pTV2를 제한효소 NcoI과 EcoRI으로 절단하여 생성된 DNA 절편 (0.8kb)을, pACP를 같은 제한효소들로 절단하여 생성되는 DNA 절편 (4.84kb)과 결합시킴으로써 벡터 pACP20 (5.64kb)을 얻었다 (서열번호 11).

G. pACP25의 제조 (도 8)

벡터 pGX10을 제한효소 XbaI과 BamHI으로 절단하여 생성된 DNA 절편 (0.55kb)을, pACP를 같은 제한효소들(XbaI과 BamHI)로 절단하여 생성되는 DNA 절편 (4.89kb)과 결합시킴으로써 벡터 pACP25 (5.45kb)를 얻었다 (서열번호 12).

H. pACP30의 제조 (도 9)

벡터 pGX10을 제한효소 BamHI으로 절단하여 생성된 DNA 절편 (0.55kb)을, pACP20을 같은 제한효소(BamHI)로 절단하여 생성되는 DNA 절편 (5.39kb)과 결합시킴으로써 벡터 pACP30 (5.94kb)을 얻었다 (서열번호 13).

실시예 2

인간 인터루킨-12 변형체 (hIL-12m) 유전자 삽입된 벡터의 제조

A. pGX0-hIL-12m의 제조 (도 10)

1. pSK-hp35와 pSK-hp40의 제조

PMA (phorbol myrystic acetate)에 의해 활성화된 사람 B 세포인 NC37 세포로부터 상보적 프라이머를 이용한 RT-PCR (역전사효소-중합효소 연쇄 반응)(PCR System 2400, Perkin Elmer) 방법을 이용하여 820 bp인 사람 p35 소단위체와 1050 bp인 p40 소단위체의 cDNA를 클로닝하고 PCR로 증폭하였다. 사람 p35 소단위체 증폭을 위해 사용된 상보적 프라이머는 다음과 같다.

hp35: 5'-CCCGGGAAAGTCCTGCCGCGCCTCG-3' (서열번호 14)(센스)

hp35: 5'-ACAACGGTTTGGAGGGA-3' (서열번호 15)(안티센스)

사람 p40 소단위체 증폭을 위해 사용된 상보적 프라이머는 다음과 같다.

hp40: 5'-AGAGCACCATGGGTCACCAGCAGTTGG-3' (서열번호 16) (센스)

hp40: 5'-CGATGCGGCCGCACCTAACTGCAGGG-3' (서열번호 17)(안티센스)

증폭된 cDNA를 각각 출발벡터인 pSK (Stratagene)에 삽입 (subcloning)하고, p35 및 p40 소단위체 유전자 모두 벡터 pSK (Stratagene)의 SmaI 부분에 각각 삽입함으로써 pSK-hp35 (3.8kb)와 pSK-hp40 (4.0kb)을 제조하였다.

2. pSK-IRES의 제조

p35와 p40 소단위체를 암호화하는 유전자를 함께 발현하는 벡터 (bicistronic vector)를 제작하기 위하여, 먼저 EMCV의 IRES 유전자를 RT-PCR을 통해 얻고 이를 EcoRV로 절단한 후 벡터 pBluescriptSK+ (Stratagene)의 EcoRV 제한효소 부위에 삽입하여 벡터 pSK-IRES (3.5kb)를 제조하였다. 이때 사용된 상보적 프라이머는 다음과 같다.

IRES: 5'-AAGATATCGAATTCCCCCTC-3' (서열번호 18)(센스)

IRES: 5'-TTGCCATGGCCATATTTATCA-3' (서열번호 19)(안티센스)

3. pSK-hp35/IRES/hp40의 제조

벡터 pSK-IRES를 제한효소 EcoRV로 절단하고 얻은 DNA 절편 (3.5kb)에 pSK-hp35를 제한효소 SmaI과 NotI으로 절단한 후 T4 DNA 중합효소로 채워 얻어진 hp35 단편 (0.8kb)을 삽입함으로써 pSK-hp35/IRES (4.3kb)를 제조하였다. pSK-hp40을 NcoI과 NotI으로 절단하여 얻어진 hp40 단편 (1.0kb)은 pSK-hp35/IRES를 동일한 제한효소로 절단한 부위에 삽입함으로써 p35와 p40 소단위체를 암호화하는 유전자를 함께 발현하는 벡터를 제조하였다. 이 벡터를 제한효소 SmaI과 ClaI을 처리한 후 리가제를 이용하여 재봉합시킴으로써 hp35 앞쪽 제한효소 부위를 일부 제거하였고 이렇게 제조된 벡터를 pSK-hp35/IRES/hp40 (5.3kb)(도 10a)라 명명하였다.

4. pSK-hp40-N222L의 제조

hp40의 222번째 아미노산인 아스파라긴산을 루신으로 치환하기 위하여 pSK-hp40을 주형으로 하고 T7 프라이머와 hp40-N222L 안티센스 프라이머를 사용하여PCR을 수행하였다. 이와 유사하게, T3 프라이머와 hp40-N222L 센스 프라이머를 사용하여 이차 PCR을 수행하였다. 이로부터 돌연변이 지점 (mutational point)을 포함하는 공통 부위 (common site)를 공유하는 두 개의 PCR 단편들이 형성되었다. 이차 PCR은 상기 단편들의 혼합물을 주형으로 하고 플랭킹 프라이머 (flanking primer)들을 사용하여 수행하였으며, 그 결과로 이들의 융합 단편 (fusion product)이 형성되었고 상기 단편을 제한효소 NcoI과 NotI으로 절단한 후 제한효소 SmaI으로 절단한 벡터 pSK (Stratagene) (3.0kb)에 삽입함으로써 플라스미드 pSK-hp40-N222L (4.0kb)을 제조하였다. 사용된 프라이머는 다음과 같다.

T7: 5'-GTAATACGACTCACTATAGGGC-3' (서열번호 20)(센스)

hp40-N222L: 5'-TAT GAGCTC TACACCAGCAGC-3' (서열번호 21)(안티센스)

T3: 5'-AATTAACCCTCACTAAAGGG-3' (서열번호 22)(안티센스)

hp40-N222L: 5'-GGTGTA GAGCTC ATACTTGAG-3' (서열번호 23)(센스)

볼드체로 표시된 부분은 야생형 hp40과 바뀌어진 염기서열이며, 밑줄친 부분은 돌연변이화에 의해서 생성된 SacI 제한효소 부위를 나타낸다.

5. pSK-hp35/IRES/hp40-N222L(pSK-hIL-12m)의 제조

제한효소 NcoI과 NotI를 이용하여 플라스미드 pSK-hp40-N222L의 hp40-N222L단편을 플라스미드 pSK-hp35/IRES/hp40의 hp40 단편과 치환시켜 플라스미드 pSK-hIL-12m (5.3kb)(도 10b)을 제조하였다.

6. pGX0-hIL-12m의 제조

상기 벡터 pSK-hIL-12m을 ApaI으로 자르고 클레노우 단편 처리하여 평활 말단을 만든 뒤 다시 NotI으로 절단하여 생기는 hIL-12m 유전자 단편 (2.3kb)을, pGX0을 SpeI으로 자르고 클레노우 단편 처리하여 평활 말단을 만든 뒤 다시 NotI 으로 절단하여 생기는 DNA 절편(6.0kb)과 결합시킴으로써 벡터 pGX0-hIL-12m (8.3kb)(도 10c)을 얻었다.

B. pGX10-hIL-12m의 제조 (도 11)

상기 벡터 pSK-hIL-12m을 주형으로 하여 하기 프라이머로 PCR 증폭방법으로 PCR하고 그 증폭된 산물을 XhoI으로 분해시킨 다음 얻어진 DNA 단편 (2.3kb)을, 벡터 pGX10을 XhoI으로 절단한 부위에 삽입함으로써 pGX10-hIL-12m (5.9 kb)을 제조하였다.

hIL-12: 5'-AAC TCG AGG TCG ACG GTA TC-3' (서열번호 24)(센스)

hIL-12: 5'-TTC TCG AGC GGC CGC ACC T-3' (서열번호 25)(안티센스)

C. pGX15-hIL-12m의 제조 (도 12)

벡터 pGX10-hIL-12m을 XhoI으로 절단하여 생기는 hIL-12m 유전자 단편 (2.3kb)을, pGX15를 같은 제한 효소로 절단하여 생기는 DNA 절편 (3.65kb)과 결합시킴으로써 벡터 pGX15-hIL-12m (5.95kb)을 얻었다.

D. pGX30-hIL-12m의 제조 (도 13)

벡터 pGX10-hIL-12m을 XhoI으로 절단하여 생기는 hIL-12m 유전자 단편 (2.3kb)을, pGX30을 같은 제한 효소로 절단하여 생기는 DNA 절편 (3.5kb)과 결합시킴으로써 벡터 pGX30-hIL-12m (5.8kb)을 얻었다.

E. pTV2-hIL-12m의 제조 (도 14)

벡터 pGX10-hIL-12m을 XhoI으로 절단하여 생기는 hIL-12m 유전자 단편 (2.3kb)을, pTV2를 같은 제한 효소로 절단하여 생기는 DNA 절편(4.8kb)과 결합시킴으로써 벡터 pTV2-hIL-12m (7.1kb)을 얻었다.

F. pACP-hIL-12m의 제조 (도 15)

벡터 pGX10-hIL-12m을 SalI으로 자르고 클레노우 단편 처리하여 평활 말단을 만든 뒤 다시 NotI으로 절단하여 생기는 hIL-12m 유전자 단편(2.3kb)을, pACP를 EcoRV와 NotI으로 절단하여 생기는 DNA 절편(5.14kb)과 결합시킴으로써 벡터 pACP-hIL-12m (7.44kb)을 얻었다.

G. pACP20-hIL-12m의 제조 (도 16)

벡터 pGX10-hIL-12m을 SalI으로 자르고 클레노우 단편 처리하여 평활 말단을 만든 뒤 다시 NotI으로 절단하여 생기는 hIl-12m 유전자 단편 (2.3kb)을, pACP20을 EcoRV와 NotI으로 절단하여 생기는 DNA 절편 (5.64kb)과 결합시킴으로써 벡터 pACP-hIL-12m (7.94kb)을 얻었다.

H. pACP25-hIL-12m의 제조 (도 17)

벡터 pGX10-hIL-12m을 XhoI으로 절단하여 생기는 hIL-12m 유전자 단편 (2.3kb)을, pACP25를 같은 제한 효소(XhoI)로 절단하여 생기는 DNA 절편(5.45kb)과 결합시킴으로써 벡터 pACP25-hIL-12m (7.75kb)을 얻었다.

I. pACP30-hIL-12m의 제조 (도 18)

벡터 pGX10-hIL-12m을 XhoI으로 절단하여 생기는 hIL-12m 유전자 단편 (2.3kb)을, pACP30을 같은 제한 효소(XhoI)로 절단하여 생기는 DNA 절편 (5.94kb)과 결합시킴으로써 벡터 pACP30-hIL-12m (8.24kb)을 얻었다.

실험 실시예 1

플라스미드 벡터의 시험관 내 효능 분석

제작된 벡터들에는 인간 인터루킨-12 변형체(hIL-12m) 유전자가 삽입되어 이 유전자의 발현수준을 시험관 내 세포 배양 시스템(in vitro cell culture system)에서 조사하기 위하여 포유동물 세포에 형질전환한 뒤 ELISA를 이용하여 인간 인터루킨-12(hIL-12m)의 발현 수준을 조사하였다.

열로 비 활성화된 FBS (fetal bovine serum, GIBCO-BRL Co.) 10%를 함유하고 있는 DMEM 배지 (Dulbecco's modified Eagle's medium, GIBCO-BRL Co.)로 배양된 COS-7 세포 (ATTC)로의 형질전환은 전기 천공법 (electroporation, Biorad Co.)에 의해 이루어졌다. 배양 배지 약 300 ㎕에 5×10⁶개의 COS-7 세포 및 인간 인터루킨-12 변형체(hIL-12m) 유전자가 삽입된 다양한 벡터 각 20 ㎍, 그리고 알카라인 탈인산화 효소 (alkaline phosphatase)를 암호화함으로써 대조군의 역할을 할 수 있는 pNEB-SEAP (pNEB-Secreted Alkaline Phosphatase, New England Biolabs) 2 ㎍을 큐벳에 넣고, 250 V, 960 ㎌의 조건으로 전기 천공법을 수행하였다. 전기 천공법을 통한 형질전환 후 24시간이 지난 다음, 배지는 혈청이 첨가되지 않은 CHO-SFMII 배지 (GIBCO-BRL Co.) 1.5 ㎖로 갈아주었고, 배지 교환 24시간 후에는 세포를 수확하여 원심 분리한 후, 상층액은 그대로 회수하였고 펠렛 (pellet)은 200 ㎕의 세포 용혈 용액 (cell lysis solution, Promega co.)에 현탁시켰다. 상층액과 펠렛에 존재하는 인간 인터루킨-12 변형체(hIL-12m)의 수준은 인간 인터루킨-12를 측정할 수 있는 ELISA로 측정되었다 (R&D system Co.).

도 19의 수치는 ELISA를 통해 측정된 pACP20-hIL-12m 형질전환된 세포 배양액에서의 인간 인터루킨-12의 발현 정도를 100%로 보았을 때 상대적인 발현 양을 나타낸 것이고, 도 20의 수치는 ELISA를 통해 측정된 pACP20-hIL-12m 형질전환된세포 파쇄액에서의 인간 인터루킨-12의 발현 정도를 100%로 보았을 때 상대적인 발현 양을 나타낸 것이다.

구체적으로 결과를 살펴보면, pGX0-hIL-12m이 가장 낮은 인터루킨-12 수준을 나타내었고, 이 발현 벡터에 SV40 인핸서가 더 첨가된 pGX10-hIL-12m은 pGX0-hIL-12m에 비해 배양 상층액에서 약 8배 가량 높은 발현 수준을 보여주었다. 이는 SV40 인핸서의 영향임을 예상할 수 있었다. pGX10-hIL-12m에서 SV40 poly(A) 대신 bGH poly(A)가 치환된 pGX15-hIL-12m의 경우 pGX10-hIL-12m과 유사한 발현 수준을 나타내었는데, SV40 poly(A)와 bGH poly(A)가 pGX 백본(backbone)에서 비슷한 발현 효율을 나타내고 있음을 설명한다. pGX15-hIL-12m에 ITR이 첨가된 pGX30-hIL-12m의 경우 pGX류 벡터들 중 가장 높은 수준의 발현 효율을 나타내는데, 이는 ITR 서열에 의한 DNA 안정화의 영향으로 생각할 수 있었다. 세포 파쇄물을 이용한 ELISA에서도 유사한 결과(도 20)를 얻을 수 있는데, 이러한 결과들을 통해 카나마이신 저항성 유전자를 포함한 pGX류 벡터들 중에서 pGX30 벡터가 인간 인터루킨-12 변형체 유전자의 발현에 최적의 벡터라는 사실을 알 수 있었다.

또한, pTV2-hIL-12m에 비해 pACP-hIL-12m의 발현 수준은 약 40% 정도 높음을 알 수 있었는데, 이것은 목적 유전자의 발현 효율 증진에 있어서 ITR 및 bGH poly(A)의 조합이 TPL 및 SV40 poly(A)의 조합보다 강력한 작용을 할 수 있음을 의미한다. pACP-hIL-12m에 비해 pACP20-hIL-12m의 경우가 발현 효율이 증가되어 있는데, 이는 TPL의 영향임을 알 수 있었다. 배양 상층액 및 세포 파쇄물에서 발현 정도를 비교해 볼 때, pACP-hIL-12m의 발현 효율은 이 벡터의 구성 요소인 bGHpoly(A)가 SV40 poly(A) 및 인핸서로 교체된 pACP25-hIL-12m의 발현 효율보다 오히려 높은데, 이는 bGH poly(A)의 발현 효율 증진 능력이 SV40 poly(A)와 인핸서 혼합 요소에 비해 더 높음을 알 수 있다. 이는 앞서 pTV2와 pACP 벡터를 비교하는 경우에도 제시되었던 가능성을 뒷받침한다. 이러한 결과에 비추어 볼 때, pGX10-hIL-12m 및 pGX15-hIL-12m에서의 발현 효율이 비슷하게 나타난 것은 백본(backbone)에 따른 영향일 가능성 이외에, bGH poly(A)의 발현 효율 증진 능력이 SV40 인핸서와 함께 존재할 때 오히려 증진 능력이 방해를 받음으로써 pGX15-hIL-12m과 pGX10-hIL-12m의 발현 효율이 유사하게 나타났을 가능성이 있음을 나타낸다. pACP25-hIL-12m 및 pACP30-hIL-12m을 비교하는 경우, 후자의 발현 효율 증진이 더 강하게 보이는데, 이것은 TPL의 영향임을 나타내 준다. 결과적으로 pACP류 벡터 중에는 pACP20이 인간 인터루킨-12 변형체 유전자의 발현 효율을 증진시키는데 가장 적합한 벡터라고 할 수 있다.

실험 실시예 2

플라스미드 DNA 벡터의 DNA 백신(vaccine) 모델에서 생체 외 효능 조사

A. DNA 백신 벡터 pTV2-E2 및 pTV2-mp35/IRES/mp40-N220L (pTV2-mIL-12m)의 제작

pTV2 벡터 (Song et al., J. Virol. 74:2920-5, 2000, 도 2 참조)에 HCV E2 유전자 및 생쥐 인터루킨-12 변형체 유전자를 삽입한 pTV2-E2 및 pTV2-mIL-12m 벡터는 문헌[Song et al., J. Virol.74:2920-5, 2000, ; Ha et al., Nat. Biotechnol. 20:381-6, 2002]에 기록된 방법에 의해 제작되었다(도 21).

B. pACP20-mp35/IRES/mp40-N220L (pACP20-mIL-12m)의 제조 (도 21)

벡터 pTV2-mIL-12m을 SalI으로 자르고 클레노우 단편 처리하여 평활 말단을 만든 뒤 다시 NotI으로 절단하여 생기는 mIL-12m 유전자 단편 (2.3kb)을, pACP20을 EcoRV 및 NotI으로 절단하여 생기는 DNA 절편 (5.64kb)과 결합시킴으로써 벡터 pACP20-mIL-12m (7.94kb)을 얻었다.

C. DNA 면역화

상기 제조된 본 발명의 생쥐 인터루킨-12 변형체(hIL-12m) 유전자를 포함한 발현 벡터인 pTV2-mIL-12m 및 pACP20-mIL-12m에 의하여 E2 특이적 면역 반응 증진을 조사하기 위하여, pTV2-E2 DNA 100 ㎍을 pTV2-mIL-12m DNA 100 ㎍ 또는 pACP20-mIL-12m DNA 100 ㎍과 함께 100 ㎕ 인산염 완충용액 (phosphate-buffered saline solution)에 용해시킨 후 생후 약 6-8주 연령의 암컷 BALB/c 생쥐의 전경골근 (anterior tibialis muscles)에 주사하였다.

D. 면역화 된 생쥐의 비장 세포에서 E2 특이적 CD8+ CTL 세포 빈도 조사 (도 22)

E2 특이적인 CD8+ CTL 세포 빈도를 알아보기 위해 DNA를 주입하고 6주, 12주, 21주, 27주째에 제한 희석법 (limiting dilution assay: LDA)을 통해 HCV E2 특이적인 CD8+ T 세포의 용혈 능력을 이용한 항원 특이적인 CD8+ T 세포의 빈도를 측정하였다 (Kuzushima, K. et al.,Blood, 94:3094-3100, 1999). 즉, DNA로 추가 접종된 생쥐의 비장 세포를 다양한 농도로 제한 희석한 후, U-바닥모양의 96-웰 플레이트에 희석 당 20개씩의 웰이 되도록 하였다. E2를 발현하는 CT26 세포를 마이토마이신 C (mitomycin C, 500 ㎍/㎖) 처리를 통해 세포 분열을 억제시키고, 희석된 비장 세포와 함께 약 5일간 활성화시켰다. CTL 빈도를 측정하기 위해서 5일간 활성화시킨 각 웰의 비장 세포의 1/3을 51Cr으로 표지된 표적 세포 (5 ×10³)를 상기 웰 플레이트의 각 웰에 첨가한 후, 6시간 동안 37℃에서 배양하였다. 이로부터 상층액을 회수하여 사용하고 반응 후 얻어지는 51Cr의 방출을 γ-측정기 (γ-counter, Wallac, Turku, Finland)로 측정함으로써 CTL 면역 반응을 조사하였다. 특정 용혈의 수준이 최소 용혈의 평균값과 그 표준 편차의 3배를 가산한 값을 초과할 경우 양성으로 간주하여 CTL의 빈도를 계산하였다 (Kuzushimaet al., Blood, 94:3094-100, 1999).

면역화 후 6주째 세포성 면역 반응 정도를 보면, pACP20-mIL-12m이 함께 면역화된 생쥐에서, pTV2-mIL-12m이 면역화된 생쥐에 비해 약 2배 정도 높은 CTL 빈도를 나타내었고, 시간이 경과함에 따라 그 차이가 더 커지고 있음을 알 수 있었다. 또한, 21주째에 두 생쥐 그룹 간의 CTL 빈도를 보면 pTV2-mIL-12m이 면역화된 그룹의 빈도는 현저히 감소하였음에 비해, pACP20-mIL-12m이 면역화된 그룹의 빈도는 여전히 지속되고 있음을 알 수 있었다. 이러한 결과로 pACP20 벡터가 시험관내 발현 효율 증진 결과와 상응하게 생체 내에서도 효과적으로 생쥐 인터루킨-12 변형체를 발현시킴으로써 E2 항원에 대한 면역 반응을 효과적으로 증진시키며, 그 면역 반응의 지속에서도 효과적으로 작용하는 벡터임을 알 수 있었다. 이러한 pACP20 벡터의 작용은 bGH poly(A) 및 ITR 서열이 각각 목적 유전자인 생쥐 인터루킨-12 변형체 유전자의 mRNA 안정화 및 DNA 안정화에 기여할 수 있음을 예측할 수 있다.

본 발명은 유전자 치료 또는 DNA 백신에 있어서 최적의 조건을 가지는 벡터 (vector)를 제공한다. 또한, 본 발명의 개발된 다양한 진핵 세포 발현 벡터들에 인간 인터루킨-12 변형체 유전자(hIL-12m)를 삽입하는 경우, 여러 진핵 세포 발현 벡터들 중 인간 인터루킨-12 변형체 유전자의 발현을 높게 유도할 수 있다.

또한, 본 발명의 최적의 벡터는 목적 유전자를 삽입하여 유전자 치료 또는DNA 백신에 유용하게 사용될 수 있다.

Claims

ITR, pCMV, TPL, SV40 poly(A), SV40 인핸서, ITR 및 kan을 순서대로 포함함을 특징으로 하는, 외래 유전자 발현용 벡터.
제1항에 있어서, 서열번호 9의 pGX30인 벡터.
인간 인터루킨-12 변형체 hIL-12m을 암호화하는 유전자가 제1항에 따른 벡터의 TPL 서열 뒤에 작동 가능하게 삽입된 재조합 벡터.
제3항에 있어서, pGX30-hIL-12m인 재조합 벡터.
제4항에 따른 재조합 벡터 pGX30-hIL-12m로 형질전환된 대장균 E. Coli DH5α/pGX30-hp35/IRES/hp40-N222L (KCTC 10232BP).
제3항의 재조합 벡터를 포함하는 백신 면역화 또는 유전자 치료용 조성물.
제6항에 있어서, 재조합 벡터가 pGX30-hIL-12m인 것을 특징으로 하는 조성물.
ITR, pCMV, TPL, bGH poly(A), ITR 및 Amp를 순서대로 포함함을 특징으로 하는, 외래 유전자 발현용 벡터.
제8항에 있어서, 서열번호 11의 pACP20인 벡터.
인간 인터루킨-12 변형체 hIL-12m을 암호화하는 유전자가 제8항에 따른 벡터의 TPL 서열 뒤에 작동 가능하게 삽입된 재조합 벡터.
제10항에 있어서, pACP20-hIL-12m인 재조합 벡터.
제11항에 따른 재조합 벡터 pACP20-hIL-12m로 형질전환된 대장균 E. Coli DH5α/pACP20-hp35/IRES/hp40-N222L (KCTC 10233BP).
제10항의 재조합 벡터를 포함하는 백신 면역화 또는 유전자 치료용 조성물.
제13항에 있어서, 재조합 벡터가 pACP20-hIL-12m인 것을 특징으로 하는 조성물.