JP2002516113A - New method for ccc plasmid DNA isolation - Google Patents
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Abstract
(57)【要約】 本発明は、バッチ条件下で抗生物質を含まないバッチ培地を含むバイオリアクター中での細菌形質転換体を培養し、バッチ段階の終了時に、ＤＯの閾値設定点を越える上昇の後、フィードバック条件下でフィードバック培地の一部を供給することを特徴とするｃｃｃプラスミドＤＮＡの単離のためのバイオマスの生産に関する。前記フィードバック培地は炭素源以外に、好ましくは約２０ｍＭ以上の濃度でマグネシウム塩を含んでいる。また好ましくは、細菌形質転換体を培養終了後に回収し、凍結又は凍結乾燥する。細菌を回収した後に、ｃｃｃプラスミドＤＮＡを任意に直接単離する。 (57) [Summary] The present invention provides for culturing bacterial transformants in a bioreactor containing batch media without antibiotics under batch conditions and, at the end of the batch phase, following a rise above the DO threshold set point, under feedback conditions. And supplying a part of the feedback medium. The feedback medium contains a magnesium salt, preferably at a concentration of about 20 mM or more, in addition to the carbon source. Also preferably, the bacterial transformant is recovered after completion of the culture, and is frozen or freeze-dried. After recovering the bacteria, the ccc plasmid DNA is optionally directly isolated.
Description
【０００１】 本発明は、バッチ条件下で、抗生物質を含まないバッチ培地を含むバイオリア
クター中で、細菌形質転換体を培養すること、及び閾値設定点を超えてＤＯが上
昇した後、バッチ段階の最後にフィードバック条件下で流加培地(feed medium)
の一部を供給することを含むｃｃｃプラスミドＤＮＡ単離のためのバイオマスの
生産に関する。前記流加培地は、炭素及び窒素源以外に、マグネシウム塩を好ま
しくは約２０ｍＭ以上の濃度で含む。好ましくは、細菌形質転換体は培養の終了
後に回収され、そして凍結又は凍結乾燥される。また好ましくは、ｃｃｃプラス
ミドＤＮＡは、細菌の回収後に任意に直接単離される。[0001] The present invention relates to the cultivation of bacterial transformants in a bioreactor containing a batch medium without antibiotics under batch conditions, and a batch step after DO rises above a threshold set point. At the end of the feed medium under feedback conditions
For production of biomass for ccc plasmid DNA isolation, including providing a portion of the DNA. The feed medium contains a magnesium salt, preferably at a concentration of about 20 mM or more, in addition to the carbon and nitrogen sources. Preferably, the bacterial transformants are recovered after completion of the culture and frozen or lyophilized. Also preferably, the ccc plasmid DNA is optionally isolated directly after recovery of the bacteria.
【０００２】 いくつかの文書が、この明細書の本文を通して引用されている。ここで引用さ
れた各文書（いずれかの製造元の明細書、説明書等をも含む）が本明細書に参照
として組み込まれる。しかし引用されたどの文書も、本発明の従来技術そのもの
であると認められてはいない。Several documents are cited throughout the text of this specification. Each document cited herein (including the specifications, instructions, etc., of any manufacturer) is incorporated herein by reference. However, none of the cited documents is admitted to be the prior art of the present invention.
【０００３】 食品材料生産や医学的治療のような種々の分野への組換えＤＮＡ技術の到来と
進歩によって、大量の高純度ＤＮＡに対する要望が絶えず挙がっている。ゲノム
又はプラスミドＤＮＡを精製する伝統的な方法（例えばサムブロック（Ｓａｍｂ
ｒｏｏｋ）ら、“分子クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ）、
ラボラトリー・マニュアル（Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）” Ｃ
ＳＨプレス（ＣＳＨ Ｐｒｅｓｓ）、第２版、１９８９、コールド・スプリング
・ハーバー・ニューヨーク（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｈａｒｂｏｒ Ｎｅ
ｗ Ｙｏｒｋ）を参照）は、ＤＮＡがＲＮＡや他の混入した(contaminating)有
機化合物を含まないべきであるならば、通例複雑な方法を必要とする。特に、ｃ
ｃｃプラスミドＤＮＡを純粋な形で得る方法は、同様に生成された他のプラスミ
ドトポロジーを所望の生成物から分離しななければならないという欠点を常に有
する。例えば、ラヒジャニ（Ｌａｈｉｊａｎｉ）ら、ヒト遺伝子治療（Ｈｕｍａ
ｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ） ７（１９９６），１９７１−１９８０におい
て、ＣｏｌＥ１の複製開始点からの複製の負の制御に影響をおよぼす温度感受性
単一点突然変異(temperature sensitive single-point mutation)を含むプラス
ミドを用いる場合に、ヒトの遺伝子治療を目的とするｐＢＲ３２２−由来プラス
ミドを高収率で得ることができることが報告されている。この方法を用いること
によって、プラスミドDNAが１０リッターの流加培地醗酵から２．２ｇの収量で
得られることが報告されている。しかし、登録(registration)及びその後のヒト
での使用を不適切にするであろう抗生物質カナマイシンの存在下で細菌の形質転
換体が成育された。抗生物質の使用を避けるために、他のアプローチが試みられ
た；例えば、チェン（Ｃｈｅｎ）ら、Ｊ．インダストリアル・ミクロバイオロジ
ー・アンド・バイオテクノロジー（Ｊ．Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉ
ｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ） １８（１９９７），４３
−４８を参照。この報告において、スーパーコイルプラスミドＤＮＡの生産のた
めの溶解酸素及びｐＨに基づく、フィードバック制御を伴う自動流加醗酵が開示
されている。このＤＮＡはＤＮＡワクチンのために有用であると提案されている
。しかしながら、例えば図４において報告された結果は、このプラスミドＤＮＡ
がワクチンの目的には適さないことを示唆する。これは、これらの条件下でｃｃ
ｃプラスミドＤＮＡ以外に、様々な他のプラスミド形態が生産されるという事実
に起因している。さらに、この方法ではゲノムＤＮＡが多量に混入し、それに対
してプラスミドは少量しか得ることが出来きない。[0003] With the advent and advancement of recombinant DNA technology in various fields such as food material production and medical treatment, there is a constant demand for large amounts of high purity DNA. Traditional methods for purifying genomic or plasmid DNA (eg, Sambrock)
look, et al., "Molecular Cloning,
Laboratory Manual (A Laboratory Manual) "C
SH Press, Second Edition, 1989, Cold Springer Harbor Ne.
w York)) usually requires complex methods if the DNA should be free of RNA and other contaminating organic compounds. In particular, c
The method of obtaining cc plasmid DNA in pure form always has the disadvantage that other plasmid topologies produced in the same way must be separated from the desired product. For example, Lahijani et al., Human Gene Therapy (Huma)
n Gene Therapy) 7 (1996), 1971-1980, when using a plasmid containing a temperature sensitive single-point mutation that affects the negative control of replication from the ColE1 origin of replication. Reports that a pBR322-derived plasmid for human gene therapy can be obtained in high yield. It is reported that by using this method, plasmid DNA can be obtained from a 10 liter fed-batch fermentation in 2.2 g yield. However, bacterial transformants were grown in the presence of kanamycin, an antibiotic that would make registration and subsequent use in humans unsuitable. Other approaches have been tried to avoid the use of antibiotics; see, for example, Chen et al. Industrial Microbiology and Biotechnology (J. Industrial Microbi)
technology and Biotechnology) 18 (1997), 43
See -48. In this report, an automatic fed-batch fermentation with feedback control based on dissolved oxygen and pH for the production of supercoiled plasmid DNA is disclosed. This DNA has been proposed to be useful for DNA vaccines. However, for example, the results reported in FIG.
Are not suitable for vaccine purposes. This means that under these conditions cc
In addition to c-plasmid DNA, a variety of other plasmid forms are produced. Furthermore, in this method, a large amount of genomic DNA is mixed, whereas only a small amount of plasmid can be obtained.
【０００４】 従って、従来技術の方法によって製造されるｃｃｃプラスミドＤＮＡは、得ら
れた生成物の不均質性及び／又は生成工程中の抗生物質の使用により、医学的目
的のような種々の目的には適当でない。それ故に、本発明が有する技術的課題は
、これらの従来技術の困難を克服し、かつ他のプラスミド形が同時に生成するこ
となくｃｃｃＤＮＡを製造することを可能にし、さらには医学的目的に適当な方
法を提供することであった。前記技術的課題に対する解決は、請求項において特
徴づけられる態様を提供することによって達成される。[0004] Accordingly, ccc plasmid DNA produced by prior art methods may be used for various purposes, such as medical purposes, due to the heterogeneity of the resulting product and / or the use of antibiotics during the production process. Is not appropriate. Therefore, the technical problem of the present invention is to overcome these difficulties of the prior art, and to make it possible to produce cccDNA without the simultaneous formation of other plasmid forms, and furthermore to make it suitable for medical purposes. Was to provide a way. The solution to the technical problem is achieved by providing the embodiments characterized in the claims.
【０００５】 このように本発明は、 （ａ） バッチ培養条件下で （ａａ）炭素源、 （ａｂ）無機塩混合物、 （ａｃ）窒素源 を含む抗生物質を含まないバッチ培地を含むバイオリアクター中で細菌形質転換
体を培養し； （ｂ） 閾値設定点を超えてＤＯが上昇した後、バッチ段階の最後にフィードバ
ック条件下で、 （ｂａ）炭素源及び （ｂｂ）マグネシウム塩 を含む流加培地の一部を（ａ）の前記培養液に供給し； （ｃ） 細菌形質転換体に前記流加培地を代謝させることを含む ｃｃｃプラスミドＤＮＡの単離のためのバイオマス製造方法に関するものである
。[0005] Thus, the present invention relates to a bioreactor comprising a batch medium containing no antibiotics containing (a) a carbon source, (ab) a mixture of inorganic salts, and (ac) a nitrogen source under batch culture conditions. (B) a feed medium comprising (ba) a carbon source and (bb) a magnesium salt under feedback conditions at the end of the batch phase after the DO rises above a threshold set point. And (c) metabolizing the feed medium into a bacterial transformant. The present invention relates to a method for producing biomass for isolating ccc plasmid DNA.
【０００６】 本発明の文脈中で用いられる場合の「バイオマス」という用語は、再生が可能
である細胞又は有機体からの、又はそれから発生するいずれの生物学的材料にも
関する。 「ｃｃｃプラスミドＤＮＡ」という用語は、典型的に、しかし必ずしもそうで
はないが、リラックス型分子(relaxed molecule)に対して下方に巻き込まれる(u
nderwound)環状プラスミドであるイソ型プラスミド(plasmid isoform)を指して
いる。 これにより共有結合で閉環したスーパーコイルプラスミドＤＮＡとして記載さ
れるさらに凝集した構造(compact conformity)が結果的に得られる。大腸菌細胞
において、２種類の酵素がＤＮＡの高次らせん化(supercoiling)を調節している
。ギラーゼは負の高次らせん回転をその分子中に導入し、一方トポイソメラーゼ
Ｉは一本鎖の開裂を導入することによってそのＤＮＡを緩める。単量体の形態の
ｃｃｃプラスミドＤＮＡが製造されることが本発明の方法に従い最も好ましい。
事実、本発明の方法は、通常全体のプラスミド生産の９０％を超える量で、この
とりわけ望まれるタイプのプラスミドを提供する。あまり好ましくないが、二量
体ｃｃｃプラスミドＤＮＡの生産もまた有用である。 「バッチ培地」という用語は、バッチ培養において、すなわち細菌形質転換体
又は他の微生物の不連続培養において用いられる培地を指している。この不連続
培養は、栄養素と基質が使い尽くされるまで行われる培養の開始時における新鮮
な培地（バッチ培地）への単一接種によって特徴づけられる。 「フィードバック条件」という用語は、微生物の増殖と関連する、例えばＤＯ
、ｐＨ等のような培養パラメーターに依存する流加培養(fed-batch medium)中の
培地濃度の補充に関する。 本発明の文脈中の「閾値設定点」という用語は、流加培養中にモニターされる
パラメーターに対する限定値を意味するよう意図されている。その値を超える場
合又は達しない場合は、モニターシグナルが培養の制御における反応を開始する
。当業者は、通常の知識及び本発明の教示に基づき、そのような限定値を決定す
ることができる；例えば、実施例１を参照。 「ＤＯ」（溶解酸素濃度）という用語は、これにより飽和濃度パーセントで表
した溶液中の酸素量を指している。 上記で規定された流加培養条件下で、流加培地中に含まれるような栄養素が消
費された後、細菌形質転換体の培養中に、溶解酸素濃度（ＤＯ）が上昇する。そ
れ故、本発明は、好ましい態様において、細菌形質転換体培養液の供給が、ＤＯ
が閾値設定点を超えて上昇する後毎に繰り返される供給サイクルを含む方法に関
する。培地のｐＨ、細菌形質転換体の特異的増殖速度、呼吸係数又はその他のも
ののような他の制御パラメーターによって供給を制御及び / 又は測定できるこ
とは、当業者に周知である。と言うものの、これらのパラメーター全ては相互に
関係し、ＤＯの指標である。それ故、どのパラメーターが実際に読み出し系とし
て使われているかと関係なく、それはＤＯの値について直接的（又は間接的）結
論を出すことを可能にする。従って、ＤＯが閾値設定点を超えて上昇することに
関連して結論づけられる限りにおいて、前記パラメーターのいずれの測定もが本
発明によって包含される。 「細菌形質転換体に前記流加培地を代謝させる」という用語は、前記流加培地
の部分的又は完全な代謝、好ましくは前記流加培地の本質的に完全な代謝に関す
る。[0006] The term "biomass" as used in the context of the present invention relates to any biological material from or originating from cells or organisms that are capable of regeneration. The term "ccc plasmid DNA" is typically, but not necessarily, wrapped down relative to a relaxed molecule (u
nderwound) refers to isoform plasmids that are circular plasmids. This results in a more compact conformation described as a covalently closed supercoiled plasmid DNA. In E. coli cells, two enzymes regulate the supercoiling of DNA. Gyrase introduces a negative higher spiral turn into the molecule, while topoisomerase I relaxes the DNA by introducing a single strand break. Most preferably, ccc plasmid DNA in monomeric form is produced according to the method of the present invention.
In fact, the method of the present invention provides this particularly desirable type of plasmid, usually in amounts greater than 90% of total plasmid production. Although less preferred, production of dimeric ccc plasmid DNA is also useful. The term "batch medium" refers to a medium used in batch culture, ie, in discontinuous culture of bacterial transformants or other microorganisms. This discontinuous culture is characterized by a single inoculation of fresh medium (batch medium) at the beginning of the culture, which is performed until nutrients and substrates are exhausted. The term "feedback condition" relates to the growth of microorganisms, e.g.
Replenishment of the medium concentration in a fed-batch medium depending on the culture parameters such as pH, pH and the like. The term "threshold set point" in the context of the present invention is intended to mean a limiting value for a parameter monitored during a fed-batch culture. If that value is exceeded or not reached, the monitor signal initiates a reaction in controlling the culture. One skilled in the art can determine such limiting values based on common knowledge and the teachings of the present invention; see, for example, Example 1. The term "DO" (Dissolved Oxygen Concentration) refers to the amount of oxygen in a solution, expressed as a percent saturated concentration. After the nutrients contained in the fed-batch medium are consumed under the fed-batch culture conditions defined above, the dissolved oxygen concentration (DO) increases during the culture of the bacterial transformant. Therefore, the present invention provides that in a preferred embodiment, the supply of the bacterial transformant
Comprises a supply cycle that is repeated every time after the pressure rises above a threshold set point. It is well known to those skilled in the art that the supply can be controlled and / or measured by other control parameters such as the pH of the medium, the specific growth rate of the bacterial transformant, the respiration coefficient or others. However, all of these parameters are interrelated and are indicators of DO. Therefore, regardless of which parameter is actually used as the readout system, it allows to make a direct (or indirect) conclusion about the value of DO. Thus, any measurement of any of the above parameters is encompassed by the present invention, as long as it is concluded in connection with the DO rising above the threshold set point. The term “metabolizing the feed medium to bacterial transformants” relates to partial or complete metabolism of the feed medium, preferably essentially complete metabolism of the feed medium.
【０００７】 本発明により、ここで開示された方法によって高濃度プラスミドの生成及び、
典型的には９０％を超えるｃｃｃモノマーのＤＮＡ均質性を持つプラスミドがも
たらされることが見出された。示された高い均質性を有するｃｃｃモノマーが抗
生物質による選択圧(selection pressure)の存在なしに得られるため、その結果
はさらに驚くべきものである。当業者は、ここで開示されたｃｃｃＤＮＡの製造
方法を、幅広いタイプ又はサイズのプラスミドに対して使用することができる。
さらに本発明の方法は細菌培養液から、従来技術によって可能であるよりもさら
に大量の所望のプラスミドの単離を可能にする。もし同じ量のプラスミドが生成
されなければならないならば、従来技術の方法と比較して、より小さい醗酵槽を
採用することが出来るので、これにより醗酵方法の重要なコスト削減もまたもた
らされる。According to the present invention, the production of high-concentration plasmids by the methods disclosed herein, and
It has been found that plasmids with DNA homogeneity of ccc monomers typically greater than 90% are provided. The results are even more surprising as ccc monomers with the indicated high homogeneity are obtained without the presence of antibiotic selection pressure. One skilled in the art can use the methods for producing cccDNA disclosed herein for a wide variety of plasmid types and sizes.
Furthermore, the method of the present invention allows for the isolation of larger quantities of the desired plasmid from bacterial cultures than is possible with the prior art. This also results in significant cost savings in the fermentation process, as smaller fermenters can be employed if the same amount of plasmid must be produced, as compared to prior art methods.
【０００８】 ｃｃｃプラスミドＤＮＡの単離のためのバイオマスの生産のための、本発明の
方法のさらに重要な利点は、培地から抗生物質が除いてあるという事実に関する
ものである。このように、得られたｃｃｃＤＮＡには抗生物質が明らかに存在せ
ず、そして時間がかかり、かつ経費的にもさらに労力のかかる精製スケジュール
なしに、抗生物質の混入を避けなければならない医学的治療に用いることができ
ることである。[0008] A further important advantage of the method of the invention for the production of biomass for the isolation of ccc plasmid DNA relates to the fact that the antibiotic has been removed from the medium. Thus, the resulting cccDNA is apparently free of antibiotics, and medical treatments in which contamination with antibiotics must be avoided without a time-consuming and costly more laborious purification schedule. It can be used for
【０００９】 イースト抽出液又は天然源由来の他の複合アミノ酸源が除かれたバッチ又は流
加培地を用いることが、本発明の方法において最も好ましい。これは、このよう
な完全合成培地における培養は、起源に関連する不純物の混入の危険性を受けず
、かつより高い再生率の利点を持つからである。他の好ましい選択(option)は、
例えば、イースト抽出液、植物抽出液、ペプトンの補足及びその他を含む半合成
培地を使用することであろう。これらの合成又は半合成培地は、形質転換体の培
養の一つ又はそれ以上の段階において用いることが出来る。これはまた後述する
前培養段階を包含する。様々な培養段階において、様々なタイプの培地中で／様
々なタイプの培地を供給することもまた、本発明によって企図されたものである
。以下ここで考察するように、繰り返し供給サイクルが使用される場合、様々な
培地を供給することも出来る。これらの培地は、オートクレーブにかけ得ること
(autoclavable)が最も好ましい。マグネシウム塩は別にオートクレーブにかける
べきである。It is most preferred in the method of the present invention to use a batch or fed-batch medium from which the yeast extract or other complex amino acid sources from natural sources have been removed. This is because culturing in such a totally synthetic medium is free from the risk of contamination of the source related impurities and has the advantage of a higher regeneration rate. Other preferred options are
For example, a semi-synthetic medium containing yeast extract, plant extract, peptone supplements and the like would be used. These synthetic or semi-synthetic media can be used in one or more stages of culturing the transformants. This also includes the pre-culture step described below. It is also contemplated by the present invention to provide / in different types of media at different stages of culture. As discussed herein below, a variety of media can also be supplied if a repeated supply cycle is used. These media can be autoclaved
(autoclavable) is most preferred. Magnesium salts should be autoclaved separately.
【００１０】 上で概略を述べたように、本発明の方法の好ましい態様において、段階（ｂ）
は閾値設定点を超えるＤＯの各上昇の後の繰り返し供給サイクルを含む。本発明
のこの態様は、大量のｃｃｃプラスミドＤＮＡの単離を可能にするバイオマスの
高収量の生産を可能にするために、とりわけ有用である。[0010] As outlined above, in a preferred embodiment of the method of the present invention, step (b)
Includes a repeated supply cycle after each rise of DO above the threshold set point. This aspect of the invention is particularly useful for enabling high yield production of biomass that allows isolation of large amounts of ccc plasmid DNA.
【００１１】 本発明の方法において用いられる細菌形質転換体は、グラム陰性菌またはグラ
ム陽性菌のどちらでも可能である。グラム陽性菌の例はバシラス（Ｂａｃｉｌｌ
ｕｓ）属の細菌、例えば枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）である
。好ましい態様においては細菌形質転換体は大腸菌細胞である。[0011] The bacterial transformant used in the method of the present invention can be either a gram-negative bacterium or a gram-positive bacterium. An example of a gram-positive bacterium is Bacill.
us), such as Bacillus subtilis. In a preferred embodiment, the bacterial transformant is an E. coli cell.
【００１２】 当業者は適した炭素源を考案又は調製出来るが故に、本発明の方法においては
、グリセロールが炭素源として好ましくは使用されている。Glycerol is preferably used as a carbon source in the method of the present invention because a person skilled in the art can devise or prepare a suitable carbon source.
【００１３】 本発明の方法では、種々の周知かつ確立された窒素源を使用することが出来る
。本発明のさらに好ましい態様において使用される窒素源はＮＨ3である。[0013] Various well-known and established sources of nitrogen can be used in the method of the present invention. Nitrogen source used in a further preferred embodiment of the present invention is NH 3.
【００１４】 本発明の方法のさらに好ましい態様においては、バッチ培地中の炭素源の（初
期最終）濃度は１００ｇ／ｌ以下である。In a further preferred embodiment of the method according to the invention, the (initial final) concentration of the carbon source in the batch medium is not more than 100 g / l.
【００１５】 本発明の方法の他の好ましい態様においては、流加培地中の炭素源の（初期最
終）濃度は１０００ｇ/ｌ以下である。In another preferred embodiment of the method according to the invention, the (initial final) concentration of the carbon source in the feed medium is less than 1000 g / l.
【００１６】 本発明の方法のさらに他の好ましい態様においては、窒素源の（初期最終）濃
度は３０％以下である。In yet another preferred embodiment of the method of the present invention, the (initial final) concentration of the nitrogen source is less than 30%.
【００１７】 本発明の方法のさらに好ましい態様においては、無機塩混合物はＮａ2ＨＰＯ4 を６ｇ/ｌ以下、ＫＨ2ＰＯ4を３ｇ/ｌ以下、ＮａＣｌを０．５ｇ/ｌ以下及びク
エン酸・Ｈ2Ｏを１．５ｇ/ｌ以下含んでいる。これは培地中の初期最終濃度、即
ち醗酵開始時に培地中に存在した最終濃度を指している。In a further preferred embodiment of the method according to the invention, the inorganic salt mixture comprises Na 2 HPO 4 up to 6 g / l, KH 2 PO 4 up to 3 g / l, NaCl up to 0.5 g / l and citric acid. Contains 1.5 g / l or less of H 2 O. This refers to the initial final concentration in the medium, ie, the final concentration present in the medium at the start of fermentation.
【００１８】 最も好ましくは、前記無機塩混合物は、例えば水と錯形成したマグネシウム塩
、好ましくはＭｇＳＯ4をも含んでいる。この場合、約０．３ｇ/ｌ又はそれ以下
の初期濃度が好ましい。マグネシウム塩は別にオートクレーブにかけられること
も望ましい。Most preferably, the inorganic salt mixture also comprises, for example, a magnesium salt complexed with water, preferably MgSO 4 . In this case, an initial concentration of about 0.3 g / l or less is preferred. It is also desirable that the magnesium salt be separately autoclaved.
【００１９】 本発明の方法の他の好ましい態様においては、ステップ（ｂ）においてマグネ
シウム塩濃度は５−１００ｍＭの範囲内にある。これはまた培地中の初期最終濃
度を指している。In another preferred embodiment of the method of the present invention, in step (b), the magnesium salt concentration is in the range of 5-100 mM. It also refers to the initial final concentration in the medium.
【００２０】 本発明の方法の特に好ましい態様において、ステップ（ｂ）におけるマグネシ
ウム塩濃度は８０ｍＭである。本発明によれば、マグネシウム塩、好ましくはＭ
ｇＳＯ4の濃度が、例えば８０ｍＭのようにやや高い場合に、ｃｃｃプラスミド
モノマーの均質性に関して優れた結果がもたらされることが、驚くべきことに明
らかになった。In a particularly preferred embodiment of the method according to the invention, the magnesium salt concentration in step (b) is 80 mM. According to the invention, a magnesium salt, preferably M
It has surprisingly been found that when the concentration of gSO 4 is rather high, for example 80 mM, excellent results are obtained with regard to the homogeneity of the ccc plasmid monomers.
【００２１】 本発明によって使用できるマグネシウム塩はＭｇＣｌ2、Ｍｇ（ＮＯ3）2、Ｍ
ｇＳＯ4等を含む。本発明の好ましい態様において、マグネシウム塩はＭｇＳＯ4 である。The magnesium salts that can be used according to the invention are MgCl 2 , Mg (NO 3 ) 2 , M
gSO 4 and the like. In a preferred embodiment of the present invention the magnesium salt is MgSO 4.
【００２２】 本発明の他の好ましい態様においては、微量元素の溶液がステップ（ａ）及び
/又は（ｂ）において加えられる。微量元素の添加はプラスミドの収量をさらに
高めることができる。In another preferred embodiment of the invention, the solution of the trace element is prepared in step (a) and
/ Or added in (b). Addition of trace elements can further increase plasmid yield.
【００２３】 本発明の方法の他の態様においては、微量元素の溶液は以下の各化合物を含む
： 最終濃度が好ましくは５４．０ｍｇ／ｌ以下のＦｅＣｌ3・６Ｈ2Ｏ 最終濃度が好ましくは１３．８ｍｇ／ｌ以下のＺｎＳＯ4・７Ｈ2Ｏ 最終濃度が好ましくは１８．５ｍｇ／ｌ以下のＭｎＳＯ4・Ｈ2Ｏ 最終濃度が好ましくは５．６ｍｇ／ｌ以下のＣｏＳＯ4・７Ｈ2Ｏ 最終濃度が好ましくは１．７ｍｇ／ｌ以下のＣｕＣｌ2 最終濃度が好ましくは１０ｍｇ／ｌ以下のＨ3ＢＯ3 最終濃度が好ましくは２５ｍｇ／ｌ以下のＮａ2ＭｏＯ4・２Ｈ2Ｏ、及び 最終濃度が５０ｍｇ／ｌ以下のクエン酸In another embodiment of the method of the invention, the solution of the trace elements comprises the following compounds: FeCl 3 .6H 2 O with a final concentration of preferably 54.0 mg / l or less, a final concentration of preferably 13 .8mg / l or less of ZnSO 4 · 7H 2 O the final concentration of preferably 18.5 mg / l or less of MnSO 4 · H 2 O the final concentration of preferably CoSO 4 · 7H 2 O following final concentrations 5.6 mg / l Preferably, a final concentration of CuCl 2 of 1.7 mg / l or less, preferably a final concentration of H 3 BO 3 of 10 mg / l or less, preferably 25 mg / l or less of Na 2 MoO 4 .2H 2 O, and a final concentration of 50 mg / L or less citric acid
【００２４】 細菌又は原核生物増殖培地は、アミノ酸源を有利に補充することが出来る。そ
れ故に、本発明の方法のさらに好ましい態様において、バッチ培地はアミノ酸源
を含んでいる。The bacterial or prokaryotic growth medium can be advantageously supplemented with a source of amino acids. Therefore, in a further preferred embodiment of the method of the invention, the batch medium contains a source of amino acids.
【００２５】 本発明の方法の他の好ましい態様において、流加培地はアミノ酸源を含んでい
る。アミノ酸源は当業者に周知であり、イースト抽出液、植物抽出液、ペプトン
補充物等を含むことが出来る（サムブロック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、ｌｏｃ．
Ｃｉｔ．を参照）In another preferred embodiment of the method of the invention, the feed medium contains a source of amino acids. Amino acid sources are well known to those skilled in the art and can include yeast extracts, plant extracts, peptone supplements, and the like (Sambrook et al., Loc.
Cit. See
【００２６】 本発明の方法のさらなる態様において、細菌形質転換体の培養は３０℃から４
２℃の温度範囲で実施される。In a further embodiment of the method of the present invention, the culturing of the bacterial transformant is carried out at 30 ° C. to 4 ° C.
It is performed in a temperature range of 2 ° C.
【００２７】 本発明の方法の特に好ましい態様において、その温度範囲は３５℃から３８℃
である。In a particularly preferred embodiment of the process according to the invention, the temperature range is between 35 ° C. and 38 ° C.
It is.
【００２８】 細菌形質転換体の栄養要求(auxotrophic requirements)を補うために、本発明
の方法ではバッチ培地は細菌宿主株に特異的な補足成分(bacterial host strain
specific supplement)を含んでいることが望ましい。異なった細菌宿主株のた
めの種々の特異的補足成分が記載されており、例えば、チアミン欠乏性細菌形質
転換体に対するチアミンのように、従来技術において周知である。To supplement the auxotrophic requirements of the bacterial transformants, in the method of the present invention, the batch medium comprises a bacterial host strain-specific supplemental component (bacterial host strain).
specific supplement). Various specific supplemental components for different bacterial host strains have been described and are well known in the art, for example, thiamine for thiamine deficient bacterial transformants.
【００２９】 本発明の方法のさらに好ましい態様においては、宿主細胞はステップ（ｃ）の
後に、前記培養物から回収される。細菌形質転換体の回収は、醗酵及び分子生物
学的技術における通常の方法の一つである。形質転換体の回収は、従来技術にお
いて周知である、濾過、遠心分離又は同様な方法を含むことが出来る。In a further preferred embodiment of the method according to the invention, the host cells are recovered from said culture after step (c). Recovery of bacterial transformants is one of the common methods in fermentation and molecular biology techniques. Recovery of transformants can involve filtration, centrifugation or similar methods well known in the art.
【００３０】 本発明の方法のさらに他の好ましい態様においては、宿主細胞はステップ（ｃ
）の後、回収の前後に洗浄ステップを通る。これらの洗浄ステップは、その細胞
の完全性に影響を与えず、その細胞から培養化合物を取り除く溶液中で行われる
ことが出来る。[0030] In yet another preferred embodiment of the method of the present invention, the host cell comprises the step (c).
), Followed by a washing step before and after collection. These washing steps can be performed in a solution that removes culture compounds from the cells without affecting the integrity of the cells.
【００３１】 本発明の方法の他の好ましい態様においては、さらなるステップは、ステップ
（ｃ）の後又はさらに好ましい態様のいずれかの中で示されたステップの後のそ
の形質転換体の凍結又は凍結乾燥を含む。ｃｃｃプラスミドをすぐに単離する必
要がない場合、この実施形態は特に有用である。凍結又は凍結乾燥した細胞は、
その後都合よく出荷又は使用するまで貯蔵出来る。In another preferred embodiment of the method of the present invention, the further step is freezing or freezing the transformant after step (c) or after the steps indicated in any of the more preferred embodiments. Including drying. This embodiment is particularly useful when it is not necessary to isolate the ccc plasmid immediately. Frozen or lyophilized cells,
It can then be stored until convenient shipment or use.
【００３２】 本発明の方法のさらに他の好ましい態様においては、さらなるステップはｃｃ
ｃＤＮＡの単離を含む。In yet another preferred embodiment of the method of the present invention, the further step is cc
Includes cDNA isolation.
【００３３】 ｃｃｃＤＮＡを単離する様々な方法は、当業者に周知である。これらはＣｓＣ
ｌ勾配遠心分離及びクロマトグラフィー精製法を包含する（例えば、サムブロッ
ク（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら 、“分子クローニング、ラボラトリー・マニュアル
（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕ
ａｌ）”、ＣＳＨプレス（ＣＳＨ Ｐｒｅｓｓ）第２版、１９８９、コールド・
スプリング・ハーバー・ニューヨーク（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｈａｒｂ
ｏｒ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）を参照）。Various methods for isolating cccDNA are well known to those skilled in the art. These are CsC
l Includes gradient centrifugation and chromatographic purification methods (see, for example, Sambrook et al., "Molecular Cloning, Laboratory Manual (Molecular Cloning, A Laboratory Manual)."
al) ", CSH Press Second Edition, 1989, Cold
Cold Springer Harb
or New York)).
【００３４】 上で述べられているように、９０％を超えるｃｃｃモノマーから成る単離され
たプラスミドＤＮＡを得ることが出来る。本発明の教示を用いる場合、当業者は
、遺伝子治療及び核酸ワクチンアプローチのためのプラスミドＤＮＡの品質基準
を満たす大量のｃｃｃＤＮＡを、例えば抗生物質を取り除くための次の労力のか
かる精製ステップなしに得ることが出来る（スコール（Ｓｃｈｏｒｒ）ら、ＤＮ
Ａワクチン（ＤＮＡ Ｖａｃｃｉｎｅｓ）、７７２（１９９５）、２７１−２７
３を参照）。このように、本発明の得られたｃｃｃＤＮＡを、従来技術、例えば
ダビス（Ｄａｖｉｓ）ら、ワクチン（Ｖａｃｃｉｎｅ） １２（１９９４）、１
５０３−１５０９に記載されているような核酸ワクチンに、又はカオ（Ｃａｏ）
ら、ヒト遺伝子治療（Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ） ６（１９９５
）、１４９７−１５０１で開示されているような遺伝子治療戦略のために使用す
ることが可能である。As mentioned above, isolated plasmid DNA consisting of more than 90% ccc monomers can be obtained. Using the teachings of the present invention, those skilled in the art will obtain large quantities of cccDNA that meet the quality standards of plasmid DNA for gene therapy and nucleic acid vaccine approaches without the need for subsequent laborious purification steps, e.g., to remove antibiotics. Can be done (Schorr et al., DN
A vaccine (DNA Vaccines), 772 (1995), 271-27
3). Thus, the obtained cccDNA of the present invention can be prepared by conventional techniques, for example, Davis et al., Vaccine 12 (1994), 1
Nucleic acid vaccines as described in 503-1509 or Cao
Et al., Human Gene Therapy 6 (1995).
), 1497-1501, can be used for gene therapy strategies.
【００３５】 さらに、他の好ましい態様においては、本発明は抗生物質を含まない培地中で
細菌形質転換体を前培養するステップ（ａ’）をさらに含む方法に関する。In another preferred embodiment, the present invention relates to a method further comprising a step (a ′) of pre-culturing the bacterial transformant in an antibiotic-free medium.
【００３６】 本発明の方法の特に好ましい態様において、前記前培養の終了後、細菌形質転
換体は指数増殖期(exponential growth phase)にある。指数増殖期は従来技術に
よって、例えば培養液の光学的濃度を測定することによって評価することが出来
る。[0036] In a particularly preferred embodiment of the method of the present invention, after the completion of said pre-culture, the bacterial transformant is in an exponential growth phase. Exponential growth can be assessed by conventional techniques, for example by measuring the optical density of the culture.
【００３７】 図は下記を示している 図１： ＤＯフィードバック制御流加培養時のバイオリアクター中でモニタ
ーした場合の溶解酸素、攪拌速度及び流加培地の時間経過。３０Ｌ−バイオリア
クター中での大腸菌ＤＨ５αのプラスミドｐＵＫ２１ＣＭＶβの培養を示す。３
０％の閾値設定点を超えると、ＤＯは攪拌速度を増加させることによって制御さ
れる。４５％閾値設定点を下回ると、ＤＯはバイオリアクター中への栄養溶液の
供給によって制御される。 図２： 半限定（ｓｅｍｉ−ｄｅｆｉｎｅｄ）グリセロール・イースト抽出
培地中での大腸菌ＤＨ５αのｐＵＫ２１ＣＭＶβの流加培養時の乾燥細胞重量（
ＤＣＷ）及びプラスミド濃度。細菌形質転換体は３０Ｌ−バイオリアクター中で
培養された。 図３： ３０リッター培養した場合の様々な培養時間（１０−４０ｈ）での
プラスミドＤＮＡ（約２５０ｎｇずつ）の０．８％アガロースゲル電気泳動。プ
ラスミドＤＮＡは、キアゲン・ミニプレップ（ＱＩＡＧＥＮ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ
）キットを用いて、限定（ｄｅｆｉｎｅｄ）培養液より単離された。 図４： 合成グリセロール培地を用いたｐＵＫ２１ＣＭＶβを含む大腸菌Ｄ
Ｈ５αの流加培養時の乾燥細胞重量及びプラスミド濃度。醗酵は５Ｌ−バイオリ
アクター中で実施された。 図５： ７リッター培養した場合の様々な培養時間（１０−４４ｈ）でのプ
ラスミドＤＮＡ（約２５０ｎｇずつ）の０．８％アガロースゲル電気泳動。プラ
スミドＤＮＡは、キアゲン・ミニプレップ（ＱＩＡＧＥＮ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ）
キットを用いて、限定（ｄｅｆｉｎｅｄ）培養液より単離された。 図６： 細胞が回収された場合の、４１時間培養したときのｐＵＴ ６４５
プラスミドＤＮＡサンプル（２００ｎｇ/４個の別の単離物）の０．８％アガロ
ースゲル電気泳動。プラスミドＤＮＡはキアゲン・ミニプレップ（ＱＩＡＧＥＮ
Ｍｉｎｉｐｒｅｐ）キット（Ｔｉｐ−１００）を用いて別々に単離された。 図７： イースト抽出（ＹＥ）培地中のいくつかの培養条件の最終バイオマ
ス。実施例１に記載のように、又はチェン（Ｃｈｅｎ）らによるＪ．インダスト
リアル・ミクロバイオロジー・アンド・バイオテクノロジー（Ｊ．Ｉｎｄｕｓｔ
ｒｉａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）
１８（１９９７）、４３−４８若しくはラヒジャニ（Ｌａｈｉｊａｎｉ）らに
よるヒト遺伝子治療（Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ） ７（１９９６
）、１９７１−１９８０において記載されているように培養を実施した。 図８： イースト抽出（ＹＥ）培地中でのいくつかの培養の最終プラスミド
濃度。実施例１に記載されているように培養を実施し、そしてチェン（Ｃｈｅｎ
）らによるＪ．インダストリアル・ミクロバイオロジー・アンド・バイオテクノ
ロジー（Ｊ．Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉ
ｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ） １８（１９９７）、４３−４８又はラヒジャニ（Ｌ
ａｈｉｊａｎｉ）らによるヒト遺伝子治療（ＨｕｍａｎＧｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐ
ｙ） ７（１９９６）、１９７１−１９８０において記載されているような培養
と比較した。 図９： 細胞回収時のイースト抽出（ＹＥ）培地中でのいくつかの培養のバ
イオマスあたりのプラスミド収量。実施例１に記載されているように培養を実施
し、そしてチェン（Ｃｈｅｎ）らによるＪ．インダストリアル・ミクロバイオロ
ジー・アンド・バイオテクノロジー（Ｊ．Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｍｉｃｒｏｂ
ｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ） １８（１９９７）、４
３−４８又はラヒジャニ（Ｌａｈｉｊａｎｉ）らによるヒト遺伝子治療（Ｈｕｍ
ａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ） ７（１９９６）、１９７１−１９８０にお
いて記載されているような培養と比較した。 図１０： プラスミドｐＵＫ２１ＣＭＶβの制限マップ 図１１〜１６： プラスミドｐＵＫ２１ＣＭＶβ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）
のＤＮＡ配列 図１７： プラスミドｐＵＴ６４９の制限マップ 図１８〜２１： プラスミドｐＵＴ６４９の（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）のＤ
ＮＡ配列The figures show the following: FIG. 1: Dissolved oxygen, agitation speed and time course of fed-batch medium as monitored in the bioreactor during DO feedback controlled fed-batch culture. Figure 2 shows the culture of plasmid pUK21CMVβ of E. coli DH5α in a 30L-bioreactor. 3
Above the 0% threshold set point, DO is controlled by increasing the agitation speed. Below the 45% threshold set point, DO is controlled by the supply of nutrient solution into the bioreactor. Figure 2: Dry cell weight during fed-batch culture of pUK21CMVβ of E. coli DH5α in semi-defined glycerol yeast extraction medium (
DCW) and plasmid concentration. Bacterial transformants were cultured in a 30 L-bioreactor. FIG. 3: 0.8% agarose gel electrophoresis of plasmid DNA (approximately 250 ng each) at various culture times (10-40 h) when culturing 30 liters. Plasmid DNA was from Qiagen Miniprep.
) Isolated from defined culture using kit. Figure 4: E. coli D containing pUK21CMVβ using synthetic glycerol medium
Dry cell weight and plasmid concentration during fed-batch culture of H5α. Fermentation was performed in a 5 L bioreactor. FIG. 5: 0.8% agarose gel electrophoresis of plasmid DNA (approximately 250 ng each) at various culture times (10-44 h) when cultured in 7 liters. Plasmid DNA was from Qiagen Miniprep.
It was isolated from a defined culture using a kit. Figure 6: pUT 645 after 41 hours of culture with cells harvested
0.8% agarose gel electrophoresis of plasmid DNA samples (200 ng / 4 other isolates). Plasmid DNA is Qiagen Miniprep (QIAGEN)
Separately using the Miniprep kit (Tip-100). Figure 7: Final biomass of several culture conditions in yeast extraction (YE) medium. As described in Example 1, or as described by Chen et al. Industrial Microbiology and Biotechnology (J. Indust
real Microbiology and Biotechnology)
18 (1997), 43-48 or Lahijani et al. (Human Gene Therapy) 7 (1996).
), 1971-1980. Figure 8: Final plasmid concentration of several cultures in yeast extraction (YE) medium. Cultures were performed as described in Example 1 and Chen
J. et al. Industrial Microbiology and Biotechnology (J. Industrial Microbiology and Bi)
technology 18 (1997), 43-48 or Rahijani (L
ahijani et al. (HumanGene Therap)
y) Compared to cultures as described in 7 (1996), 1971-1980. Figure 9: Plasmid yield per biomass of several cultures in yeast extraction (YE) medium during cell harvest. Cultures were performed as described in Example 1 and described by Chen et al. Industrial Microbiology and Biotechnology (J. Industrial Microb)
iology and Biotechnology) 18 (1997), 4
Human gene therapy (Hum) by 3-48 or Lahijani et al.
and Gene Therapy) 7 (1996), 1971-1980. Figure 10: Restriction map of plasmid pUK21CMVβ Figure 11-16: Plasmid pUK21CMVβ (SEQ ID NO: 2)
Figure 17: Restriction map of plasmid pUT649 Figures 18-21: D of (SEQ ID NO: 1) of plasmid pUT649
NA array
【００３８】[0038]
下記実施例により本発明を説明する。 実施例１：グリセロール／イースト培地中で７．６ｋｂｐ ｃｃｃプラスミドの
高品質かつ高生産量の生産 ｃｃｃプラスミドＤＮＡ単離のためのバイオマスの生産方法は、２３リッター
の作業容量を持つ３０Ｌ−バイオリアクター（ＬＡＢ ３０Ｌ、ＭＢＲ、スイス
）中で、プラスミドｐＵＫ２１ＣＭＶβ（７６１２ ｂｐ）（図１０〜１６）を
含む大腸菌ＤＨ５αのフィードバック制御流加培養によって実施された。 半限定（ｓｅｍｉ−ｄｅｆｉｎｅｄ）バッチ培地（１５リッター）はグリセロ
ール１０ｇ/ｌ、イースト抽出液５．０ｇ/ｌ、Ｎａ2ＨＰＯ4 ６．０ｇ/ｌ、ＫＨ 2 ＨＰＯ4 ３．０ｇ/ｌ、ＮａＣｌ ０．５ｇ/ｌ、クエン酸１．５ｇ/ｌ、ＭｇＳ
Ｏ4・７Ｈ2０ ０．３ｇ/ｌ、チアミン塩酸塩５ｍｇ/ｌ及び微量元素溶液１０ｍ
ｌ/ｌから成るものであった。チアミン塩酸塩溶液及び微量元素の保存液（Ｆｅ
Ｃｌ3・Ｈ2Ｏ ５．４０ｇ/ｌ、ＺｎＳＯ4・７Ｈ2Ｏ １．３８ｇ/ｌ、ＭｎＳＯ 4 ・Ｈ2Ｏ １．８５ｇ/ｌ、ＣｏＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０．５６ｇ/ｌ、ＣｕＣｌ2 ０
．１７ｇ/ｌ、Ｈ3ＢＯ3 １．０ｇ/ｌ、Ｎａ2ＭｏＯ4・２Ｈ2Ｏ ２．５ｇ/ｌ、
及びクエン酸５．０ｇ/ｌ）を別々に滅菌した。バイオリアクターの滅菌（２５
分間、１２１℃）の前に、ＮａＯＨを用いて培地のｐＨを６．７に調整した。 培養は３７℃、０．５ｂａｒで実施した。通気は３０ ｌ/分の速度に維持し
、ｐＨは１０％Ｈ3ＰＯ4及び／又は２５％ＮＨ4ＯＨによって制御した。消泡剤
として（プルロニック）Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）ＰＥ−８１００（ＢＡＳ
Ｆ）を用いた。最小攪拌速度は１００ｒｐｍであった。 ｐＵＫ２１ＣＭＶβを含む大腸菌ＤＨ５αの凍結グリセロール株を用いて、１
０００ｍｌ振騰フラスコ中の２００ｍｌのルリア−ベルタニ（Ｌｕｒｉａ−Ｂｅ
ｒｔａｎｉ（ＬＢ））種培地に接種した。培養液を１８０ｒｐｍのオービタル(o
rbital)振騰機上で３７℃で８時間培養した。ＯＤ600０．３−０．５の細胞密度
に達した後、この前培養液の５０ｍｌ分量をバイオリアクターに移した。 培養中は、溶解酸素濃度が３０％の閾値設定点より低くなったときは、攪拌速
度を前より１％増加させることによって、溶解酸素（ＤＯ）を３０％空気飽和状
態に自動的に維持した。ＤＯ濃度が３０％を超えたときは、攪拌速度を一定にし
た。ＤＯが４５％空気飽和の閾値設定点に達したときは、栄養(nutrient)ポンプ
を自動的に作動させ、グリセロール６００ｇ/ｌ、イースト抽出液９０ｇ/ｌ及び
ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ２０ｇ/ｌの濃縮溶液を培養液に供給した。栄養ポンプの
最大流速は５０ｍｌ/分であった。ＤＯが４５％より低くなったときは、供給を
中断した。 ２時間毎に、６００ｎｍにおける光学的密度及び乾燥細胞重量を測定して、細
胞の増殖を調べた。製造元の説明書に従ってキアゲン・ミニプレップ（ＱＩＡＧ
ＥＮ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ）キット（Ｔｉｐ−２０）を用いて、限定（ｄｅｆｉｎ
ｅｄ）ペレット状培養物からプラスミドＤＮＡを単離した後に、プラスミド濃度
を測定した。制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩによる消化の後、シュミット（
Ｓｃｈｍｉｄｔ）ら、Ｊ．バイオテクノロジー（Ｊ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．
）４９（１９９６）、２１９−２２９により記載されているようなキャピラリー
ゲル電気泳動によって、これらのＤＮＡサンプルの定量を実施した。プラスミド
の形状分布の分析のため、及び品質管理として、全ての未消化サンプルの電気泳
動を０．８％アガロースゲル上で実施した。 The following examples illustrate the invention. Example 1 of a 7.6 kbp ccc plasmid in glycerol / yeast medium
High quality and high yield production Biomass production methods for ccc plasmid DNA isolation are 23 liters
30L bioreactor with LAB working capacity (LAB 30L, MBR, Switzerland)
)), The plasmid pUK21CMVβ (7612 bp) (FIGS. 10-16)
This was carried out by feedback-controlled fed-batch culture of E. coli DH5α containing E. coli. Semi-defined batch medium (15 liters) is glycero
10 g / l, yeast extract 5.0 g / l, NaTwoHPOFour6.0 g / l, KH Two HPOFour3.0 g / l, NaCl 0.5 g / l, citric acid 1.5 g / l, MgS
OFour・ 7HTwo0 0.3 g / l, thiamine hydrochloride 5 mg / l and trace element solution 10 m
1 / l. Thiamine hydrochloride solution and trace element storage solution (Fe
ClThree・ HTwoO 5.40 g / l, ZnSOFour・ 7HTwoO 1.38 g / l, MnSO Four ・ HTwoO 1.85 g / l, CoSOFour・ 7HTwoO 0.56 g / l, CuClTwo0
. 17g / l, HThreeBOThree1.0 g / l, NaTwoMoOFour・ 2HTwoO 2.5 g / l,
And 5.0 g / l of citric acid) were sterilized separately. Sterilization of bioreactor (25
The pH of the medium was adjusted to 6.7 with NaOH before (min, 121 ° C.). The culture was performed at 37 ° C. and 0.5 bar. Aeration is maintained at a rate of 30 l / min.
PH is 10% HThreePOFourAnd / or 25% NHFourControlled by OH. Defoamer
As Pluronic® PE-8100 (BAS
F) was used. The minimum stirring speed was 100 rpm. Using a frozen glycerol strain of Escherichia coli DH5α containing pUK21CMVβ, 1
200 ml Luria-Belt in a 000 ml shake flask
rtani (LB)) seed medium. The culture solution was orbitalized at 180 rpm (o
(rbital) The cells were cultured at 37 ° C. for 8 hours on a shaker. OD6000.3-0.5 cell density
, A 50 ml aliquot of this preculture was transferred to the bioreactor. During the culture, when the dissolved oxygen concentration falls below the threshold set point of 30%, the stirring speed is changed.
30% air-saturated dissolved oxygen (DO) by increasing the degree by 1%
State automatically maintained. When the DO concentration exceeds 30%, keep the stirring speed constant.
Was. Nutrient pump when DO reaches 45% air saturation threshold set point
Is automatically activated, glycerol 600 g / l, yeast extract 90 g / l and
MgSOFour・ 7HTwoA 20 g / l concentrated solution was supplied to the culture. Nutrition pump
The maximum flow rate was 50 ml / min. When the DO falls below 45%,
Interrupted. Every 2 hours, the optical density at 600 nm and the dry cell weight were measured to determine
The vesicle growth was examined. Qiagen Miniprep (QIAG) according to manufacturer's instructions
EN Miniprep kit (Tip-20)
ed) After isolating the plasmid DNA from the pellet culture, the plasmid concentration
Was measured. After digestion with the restriction endonuclease EcoRI, Schmid (
Schmidt) et al. Biotechnology (J. Biotechnol.
) 49 (1996), capillaries as described by 219-229
Quantification of these DNA samples was performed by gel electrophoresis. Plasmid
Electrophoresis of all undigested samples for analysis of the shape distribution of the sample and for quality control
Runs were performed on a 0.8% agarose gel.
【００３９】 図１は、ＤＯフィードバック制御流加培養時の、バイオリアクター中でモニタ
ーされた場合のＤＯレベル、攪拌速度及び培地溶液値を示している。栄養が失わ
れた１４時間後、ＤＯ濃度は劇的に増加し、供給ループ(feeding loop)が開始す
る。この流加段階の間は、ＤＯ濃度は供給閾値設定点（４５％）と攪拌速度増加
閾値設定点（３０％）の間をゆれ動いた(oscillated)。FIG. 1 shows DO levels, agitation speeds and medium solution values as monitored in a bioreactor during DO feedback controlled fed-batch culture. Fourteen hours after nutrient loss, the DO concentration increases dramatically and the feeding loop begins. During this fed-batch phase, the DO concentration oscillated between the feed threshold set point (45%) and the agitation speed increase threshold set point (30%).
【００４０】 図２は培養中のバイオマス（乾燥細胞重量）及びプラスミドＤＮＡの形成を示
している。培養開始から３６時間経過するまで細胞の増殖が起こった。乾燥細胞
重量（ＯＤ600＝１４０）で４８ｇ/ｌの最終バイオマスが得られた。この反応槽
で生産されたプラスミド濃度は４．６ｇのプラスミドＤＮＡに相当する約２００
ｍｇ/ｌであった。細胞重量あたりのプラスミドの量は約４．２ｍｇ/ｇであった
。選択のための抗生物質を使用しないにもかかわらず、全培養期間中プラスミド
濃度は増加した。FIG. 2 shows the formation of biomass (dry cell weight) and plasmid DNA during culture. Cell proliferation occurred until 36 hours from the start of culture. A final biomass of 48 g / l on dry cell weight (OD 600 = 140) was obtained. The concentration of plasmid produced in this reactor is approximately 200, corresponding to 4.6 g of plasmid DNA.
mg / l. The amount of plasmid per cell weight was about 4.2 mg / g. Despite the absence of antibiotics for selection, plasmid concentrations increased during the entire culture.
【００４１】 アガロースゲル電気泳動は、培養時間全体に渡る高品質のプラスミド生成を示
した（図３）。単離されたプラスミドＤＮＡは９０％を超えるｃｃｃ分子から成
り、かつ遺伝子治療及び核酸ワクチンのアプローチのためのプラスミドＤＮＡの
品質基準を満たしていた（スコール（Ｓｃｈｏｒｒ）ら、ＤＮＡワクチン（ＤＮ
Ａ Ｖａｃｃｉｎｅｓ） ７７２（１９９５）、２７１−２７３）。Agarose gel electrophoresis showed high quality plasmid production over the entire culture time (FIG. 3). The isolated plasmid DNA consisted of over 90% ccc molecules and met plasmid DNA quality standards for gene therapy and nucleic acid vaccine approaches (Schorr et al., DNA Vaccine (DN).
A Vaccines) 772 (1995), 271-273).
【００４２】 実施例２：合成グリセロール培地中でのｃｃｃプラスミドＤＮＡの高品質生産 ｐＵＫ２１ＣＭＶβ（７６１２ｂｐ；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）を含む大腸菌
ＤＨ５αのＤＯフィードバック制御流加培養を、５．５リッターの作業量を持つ
７Ｌ−バイオリアクター中（ＬＡＢ ７Ｌ、ＭＢＲ、スイス）で実施した。合成
グリセロール培地をこの醗酵に用いた。 限定（ｄｅｆｉｎｅｄ）バッチ培地（３．５ ｌ）は グリセロール ２０ｇ
/ｌ、Ｎａ2ＨＰＯ4 ６．０ｇ/ｌ、ＫＨ2ＨＰＯ4 ３．０ｇ/ｌ、ＮａＣｌ ０．
５ｇ/ｌ、クエン酸 １．５ｇ/ｌ、 ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０．３ｇ/ｌ 及び
、ＦｅＣｌ3・６Ｈ2Ｏ ５．４０ｇ/ｌ、 ＺｎＳＯ4・７Ｈ2Ｏ １．３８ｇ/ｌ
、 ＭｎＳＯ4・Ｈ2Ｏ １．８５ｇ/ｌ、 ＣｏＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０．５６ｇ/ｌ
、 ＣｕＣｌ2 ０．１７ｇ/ｌ、 Ｈ3ＢＯ3 １．０ｇ/ｌ、 Ｎａ2ＭｏＯ4・２
Ｈ2Ｏ ２．５ｇ/ｌ 及びクエン酸５．０ｇ/ｌを含む微量元素溶液１０ｍｌ/ｌ
から成るものであった。チアミン塩酸塩５ｍｇ/ｌを濾過により別に滅菌し、バ
イオリアクターに移した。バイオリアクターを滅菌する（１２１0Cで２５分間）
前に、培地のｐＨを６．７に調整した。 培養は３７0C、０．５ｂａｒで実施した。通気は１０ ｌ/分に維持し、ｐＨ
は１０％Ｈ3ＰＯ4及び／又は２５％ＮＨ4ＯＨで制御した。消泡剤はプルロニッ
ク（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ）（登録商標）ＰＥ−８１００（ＢＡＳＦ）であった。最
小攪拌速度は１５０ｒｐｍであった。 ｐＵＫ２１ＣＭＶβを含む大腸菌ＤＨ５αの凍結グリセロール株を用い、３０
０ｍｌ振騰フラスコ中の５５ｍｌＬＢ種培地に接種した。１８０ｒｐｍのオービ
タル振騰機上で、培養液を３７℃で８時間培養した。ＯＤ600０．３−０．５の
細胞密度に達した後、この前培養液５０ｍｌをバイオリアクターに移した。 培養中、溶解酸素（ＤＯ）濃度が３０％より低くなったときは、攪拌速度を前
より１％増加させることにより、溶解酸素を３０％空気飽和の状態に自動的に維
持した。ＤＯ濃度が３０％空気飽和を超えるときは、攪拌速度を一定にした。Ｄ
Ｏが４５％空気飽和を超えるときは、グリセロール１０００ｇ/ｌ及びＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2Ｏ ２０ｇ/ｌの濃縮溶液が培養液に供給するために栄養ポンプを自動的
に動かした。栄養ポンプの最大流速は３０ｍｌ/分であった。ＤＯが４５％より
低くなった場合には供給を停止した。 ６００ｎｍにおける光学的密度及び乾燥細胞重量を測定することにより、２時
間毎の細胞の増殖を測定した。製造元の説明書に従ってキアゲン・ミニプレップ
（ＱＩＡＧＥＮ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ）キット（Ｔｉｐ−２０）を用いて、限定（
ｄｅｆｉｎｅｄ）ペレット状培養物からプラスミドＤＮＡを単離した後、プラス
ミド濃度を測定した。制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩで消化した後、シュミ
ット（Ｓｃｈｍｉｄｔ）ら、１９９６（シュミット（Ｓｃｈｍｉｄｔ）ら、Ｊ．
バイオテクノロジー（Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．）４９（１９９６），２１９
−２２９）によって記載されているようにキャピラリーゲル電気泳動によって、
これらのＤＮＡサンプルの定量を実施した。プラスミドの形状分布の解析のため
および品質管理として、全ての未消化サンプルの電気泳動を０．８％アガロース
ゲル上で実施した。 図４は培養中のバイオマス及びプラスミドＤＮＡの形成を示す。培養開始から
４１時間経過するまで、細胞の増殖が起こった。合成培地を用いることによって
、乾燥細胞重量（ＯＤ600＝１４５）で４８ｇ/ｌの最終バイオマスが得られた。
生成されたプラスミド濃度は約１００ｍｇ/ｌであり、これは５５０ｍｇのプラ
スミドＤＮＡに相当していた。細胞重量当りで得られたプラスミド量は約２．１
ｍｇ/ｇであった。 アガロースゲル電気泳動によって明らかになったように、培養時間全体に渡り
プラスミド生成物が高い収量で得られた（図５）。単離されたプラスミドＤＮＡ
はｃｃｃモノマーとして得られた。コンカテマー(concatemers)として存在する
ｃｃｃダイマーが少量検出された。ＤＮＡサンプルは、遺伝子治療及び核酸ワク
チンアプローチのためのプラスミドＤＮＡの品質基準を満たしていた。Example 2: High quality production of ccc plasmid DNA in synthetic glycerol medium Do feedback controlled fed-batch cultivation of E. coli DH5α containing pUK21CMVβ (7612 bp; SEQ ID NO: 2) with 5.5 liters of work In a 7L-bioreactor with LAB (LAB 7L, MBR, Switzerland). Synthetic glycerol medium was used for this fermentation. Defined batch medium (3.5 l) is glycerol 20 g
/ l, Na 2 HPO 4 6.0g / l, KH 2 HPO 4 3.0g / l, NaCl 0.
5 g / l, citric acid 1.5g / l, MgSO 4 · 7H 2 O 0.3g / l and, FeCl 3 · 6H 2 O 5.40g / l, ZnSO 4 · 7H 2 O 1.38g / l
, MnSO 4 · H 2 O 1.85g / l, CoSO 4 · 7H 2 O 0.56g / l
, CuCl 2 0.17g / l, H 3 BO 3 1.0g / l, Na 2 MoO 4 · 2
Trace element solution 10 ml / l containing 2.5 g / l H 2 O and 5.0 g / l citric acid
Consisted of Thiamine hydrochloride 5 mg / l was sterilized separately by filtration and transferred to the bioreactor. Sterilize the bioreactor (25 minutes at 121 0 C)
Before, the pH of the medium was adjusted to 6.7. The culture was carried out at 37 0 C, 0.5 bar. Aeration is maintained at 10 l / min, pH
Was controlled with 10% H 3 PO 4 and / or 25% NH 4 OH. The defoamer was Pluronic® PE-8100 (BASF). The minimum stirring speed was 150 rpm. Using a frozen glycerol strain of Escherichia coli DH5α containing pUK21CMVβ, 30
55 ml LB seed medium in a 0 ml shake flask was inoculated. The culture was incubated at 37 ° C. for 8 hours on an orbital shaker at 180 rpm. After reaching a cell density of OD 600 0.3-0.5, 50 ml of this pre-culture was transferred to the bioreactor. During the culture, when the dissolved oxygen (DO) concentration was lower than 30%, the dissolved oxygen was automatically maintained at 30% air saturation by increasing the stirring speed by 1% from the previous time. When the DO concentration exceeded 30% air saturation, the stirring speed was kept constant. D
O is when more than 45% air saturation, a concentrated solution of glycerol 1000 g / l and MgSO 4 · 7H 2 O 20g / l is automatically moved nutrient pump for supplying the culture solution. The maximum flow rate of the nutrient pump was 30 ml / min. The supply was stopped when the DO fell below 45%. Cell growth was measured every 2 hours by measuring optical density at 600 nm and dry cell weight. Using a Qiagen Miniprep kit (Tip-20) according to the manufacturer's instructions,
After isolation of the plasmid DNA from the defined culture, the plasmid concentration was determined. After digestion with the restriction endonuclease EcoRI, Schmidt et al., 1996 (Schmidt et al., J. Am.
Biotechnology (J. Biotechnol.) 49 (1996), 219
-229) by capillary gel electrophoresis as described by
Quantification of these DNA samples was performed. For analysis of plasmid shape distribution and for quality control, electrophoresis of all undigested samples was performed on 0.8% agarose gel. FIG. 4 shows the formation of biomass and plasmid DNA during culture. Cell proliferation occurred until 41 hours after the start of culture. By using the synthetic medium, a final biomass of 48 g / l on dry cell weight (OD 600 = 145) was obtained.
The resulting plasmid concentration was approximately 100 mg / l, which corresponded to 550 mg of plasmid DNA. The amount of plasmid obtained per cell weight was about 2.1
mg / g. High yields of plasmid product were obtained over the entire culture time, as revealed by agarose gel electrophoresis (FIG. 5). Isolated plasmid DNA
Was obtained as ccc monomer. A small amount of ccc dimer present as concatemers was detected. DNA samples met plasmid DNA quality standards for gene therapy and nucleic acid vaccine approaches.
【００４３】 実施例３：高塩濃度醗酵による遺伝子治療アプローチのためのプラスミ
ドの高品質生産 ｐＵＴ６４９（図１２〜２１）（４６１８ｂｐ；配列番号（ＳＥＱ ＩＤ Ｎ
Ｏ：）１）（ｐＵＴ６４９ベクターはユーロゲンテック−カタログ（Ｅｕｒｏｇ
ｅｎｔｅｃ−ｃａｔａｌｏｇｕｅ） １９９４（ユーロゲンテック、リージェ（
Ｅｕｒｏｇｅｎｔｉｅｃ，Ｌｉeｇｅ）ベルギー）の中のカタログ番号ＶＥ−１
１３４−ａの項に記載されている）を含む大腸菌ＤＨ５αのＤＯフィードバック
制御流加培養を、実施例１に記載されたものと同じグリセロールイースト抽出培
地（７．５リッターバッチ培地）を用いて実施した。実施例１に記載されたもの
と同様の培養条件が適用され、培養は１０リッターの作業容量を持つバイオリア
クター（ＢＲＡＵＮ ＢｉｏＥ）中で行われた。通気は１５ ｌ/ 分であった。
バッチ段階では攪拌速度は８００ｒｐｍに設定した。流加段階では、ＤＯが３０
％の閾値設定点より低くなったときは、この速度を１００ｒｐｍ上昇させた。Ｄ
Ｏが４５％の閾値設定点に達した時、流加培地をバイオリアクター中にポンプで
送り込んだ（流速１０ｍｌ/分）。 １リッター振騰フラスコ中でｐＵＴ６４９を含む大腸菌ＤＨ５αの５００μｌ
グリセロール株を１００ｍｌバッチ培地に接種した。培養はオービタル振騰機の
上で、３７℃で５時間行った。前培養液の１．５ｍｌ接種物をバイオリアクター
に移した。 細菌形質転換体が定常段階に達した培養開始から４１時間後に、最終バイオマ
スは乾燥細胞重量で６０ｇ/ｌ及び２３０ｍｇ/ｌのプラスミドをもたらした、９
０％を超えるｃｃｃモノマープラスミドＤＮＡのプラスミドＤＮＡが単離できた
（図６）。Example 3 Plasmid for Gene Therapy Approach by High Salt Fermentation
High quality production of pUT649 (FIGS. 12-21) (4618 bp; SEQ ID NO:
O :) 1) (pUT649 vector is available from Eurogentech-Catalog (Eurog
entec-catalogue) 1994 (Eurogentech, Liege (
Catalog No. VE-1 (Eurogentiec, Liege) Belgium).
134-a) (described in section 134-a) using the same glycerol yeast extraction medium (7.5 liter batch medium) as described in Example 1 for the DO feedback controlled fed-batch culture of E. coli DH5α. did. Culture conditions similar to those described in Example 1 were applied, and the culture was performed in a bioreactor (BRAUN BioE) with a working volume of 10 liters. Aeration was 15 l / min.
In the batch stage, the stirring speed was set at 800 rpm. In the fed-batch stage, DO is 30
When below the% threshold set point, the speed was increased by 100 rpm. D
When O reached the threshold set point of 45%, the fed-batch medium was pumped into the bioreactor (flow rate 10 ml / min). 500 μl of E. coli DH5α containing pUT649 in a 1 liter shake flask
The glycerol strain was inoculated into a 100 ml batch medium. The culture was performed on an orbital shaker at 37 ° C. for 5 hours. A 1.5 ml inoculum of the preculture was transferred to the bioreactor. 41 hours after the start of culture when the bacterial transformants reached the stationary phase, the final biomass yielded 60 g / l and 230 mg / l plasmid by dry cell weight, 9
Plasmid DNA of more than 0% of ccc monomer plasmid DNA could be isolated (FIG. 6).
【００４４】 実施例４：異なったバッチ及び流加培養条件の比較 ７Ｌ−バイオリアクター中でのルリア−ベルタニ（Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎ
ｉ）−（ＬＢ）培地（サムブロック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、ｌｏｃ．ｃｉｔ．
）におけるバッチ培養、実施例１に記載されたような流加培養及び従来技術にお
いて開示されているような流加培養を比較した。チェン（Ｃｈｅｎ）ら、（Ｊ．
インダストリアル・ミクロバイオロジー・アンド・バイオテクノロジー（Ｊ．Ｉ
ｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏ
ｌｏｇｙ） １８（１９９７）、４３−４８）はバッチ段階でデキストロースイ
ースト抽出液培地を使用し、グルコースイースト抽出液流加培地を加えたが、ラ
ヒジャニ（Ｌａｈｉｊａｎｉ）ら（ヒト遺伝子治療（Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔ
ｈｅｒａｐｙ） ７（１９９６），１９７１−１９８０）は、細菌形質転換体中
で温度制御可能な点変異（point mutation）を用いて、バッチ及び流加培養を抗
生物質を含むグルコースイースト抽出液培地中で実施した。Example 4: Comparison of different batch and fed-batch conditions Luria-Bertani in a 7 L-bioreactor
i)-(LB) medium (Sambrook et al., loc.cit.
B), fed-batch culture as described in Example 1 and fed-batch culture as disclosed in the prior art. Chen et al., (J.
Industrial Microbiology and Biotechnology (JI
ndustrial Microbiology and Biotechno
No. 18 (1997), 43-48) used a dextrose yeast extract medium in a batch stage and added a glucose yeast extract feed medium, but Lahijani et al. (Human Gene T (Human Gene T.)).
Herapy) 7 (1996), 1971-1980), using temperature-controllable point mutations in bacterial transformants, to perform batch and fed-batch cultures in glucose yeast extract medium containing antibiotics. Carried out.
【００４５】 図７は、細胞が定常増殖段階に達した時の最終バイオマスを示す。ＬＢ培地中
又はラヒジャニ（Ｌａｈｉｊａｎｉ）らにより記載されたバッチ培養におけるバ
イオマスの収量は低かった。チェン（Ｃｈｅｎ）らによって記載されているよう
に、又は本発明中で記載されているように、栄養液の供給はより高いバイオマス
収量をもたらした。FIG. 7 shows the final biomass when the cells have reached the stationary growth phase. Biomass yield was low in LB media or in batch cultures as described by Lahijani et al. Feeding the nutrient solution, as described by Chen et al. Or as described in the present invention, resulted in higher biomass yield.
【００４６】 図８において示されるように、ＬＢ培地中でのバッチ培養と比較して、ラヒジ
ャニ(Ｌａｈｉｊｉａｎｉ)らにより記載されたようなグルコースイースト抽出液
培地を用いた、又は本発明中で記載されたようなグリセロールイースト抽出液培
地を用いた流加醗酵においては、プラスミド濃度は３５−４０倍増加した。しか
しながら、チェン（Ｃｈｅｎ）らによって実施されたような流加培養はより低い
プラスミド濃度をもたらした。As shown in FIG. 8, compared to batch culture in LB medium, a glucose yeast extract medium as described by Lahijiani et al. Was used or described in the present invention. In such a fed-batch fermentation using a glycerol yeast extract medium, the plasmid concentration was increased 35 to 40 times. However, fed-batch cultures as performed by Chen et al. Resulted in lower plasmid concentrations.
【００４７】 ラヒジャニ（Ｌａｈｉｊａｎｉ）らは培養中にカナマイシン抗生物質を用い、
抗生物質を含まないグリセロールイースト抽出液培地を用いる本発明の方法で得
られたものと同等のプラスミド濃度を得た。ラヒジャニ（Ｌａｈｉｊａｎｉ）ら
は得られたバイオマスに関して、どのような数値も開示していないので、バイオ
マスの比較は出来なかった。 図９に示されるように、ＬＢ培地中でのバッチ条件と比較して、グリセロール
イースト抽出液培地中での流加培養は、バイオマス当たりより高いプラスミドの
収量をもたらす。バイオマス当たりの最も高いプラスミド収量は、グルコースイ
ースト抽出液培地中でのバッチ培養によって得ることが出来たが、全体のプラス
ミド収量は少なかった。[0047] Lahijani et al. Used kanamycin antibiotics during culture,
Plasmid concentrations equivalent to those obtained with the method of the invention using glycerol yeast extract medium without antibiotics were obtained. Lahijani et al. Did not disclose any values for the biomass obtained, and thus did not make a comparison of the biomass. As shown in FIG. 9, fed-batch culture in glycerol yeast extract medium results in higher plasmid yield per biomass compared to batch conditions in LB medium. The highest plasmid yield per biomass could be obtained by batch culture in glucose yeast extract medium, but the overall plasmid yield was low.
【００４８】 単離したプラスミドＤＮＡの均質性及び純度は、本発明に従って実施した培養
条件下で最良であった（図３、５、６）。ラヒジャニ（Ｌａｈｉｊａｎｉ）らは
、単離されたＤＮＡは大量のＲＮＡ及び鎖状(concatenated)ダイマーを含んでい
ると報告したが、一方でチェン（Ｃｈｅｎ）らは大量の混入ゲノムＤＮＡを得て
いた。それ故、そのような混入非ｃｃｃＤＮＡ、ＲＮＡ又はゲノムＤＮＡの除去
には追加の操作段階を必要し、時間がかかり、かつ従来技術によって単離したＤ
ＮＡの収量をさらに減少させる。The homogeneity and purity of the isolated plasmid DNA was best under the culture conditions performed according to the present invention (FIGS. 3, 5, 6). Lahijani et al. Reported that the isolated DNA contained large amounts of RNA and concatenated dimers, while Chen et al. Had obtained large amounts of contaminating genomic DNA. Therefore, the removal of such contaminating non-cccDNA, RNA or genomic DNA requires additional manipulation steps, is time consuming, and requires isolation of D
The NA yield is further reduced.
【００４９】 要約すれば、データの分析により、所望の生成物の純度に関して、任意に又は
好ましくは得られた所望の最終生成物の量と関連付けることにより、本発明の方
法が従来技術より優れていることをはっきりと結論付けることができる。本発明
の方法は他のプラスミドへ応用でき、また同様又は同様の有利な結果をもたらす
。In summary, the analysis of the data makes the process of the present invention superior to the prior art by optionally or preferably relating the purity of the desired product to the amount of the desired end product obtained. Can be clearly concluded. The method of the present invention is applicable to other plasmids and produces similar or similar advantageous results.
【配列表】 [Sequence list]
【図１】 ＤＯフィードバック制御流加培養時のバイオリアクター中でモニター
した場合の溶解酸素、攪拌速度及び流加培地の時間経過。３０Ｌ−バイオリアク
ター中での大腸菌ＤＨ５αのプラスミドｐＵＫ２１ＣＭＶβの培養を示す。３０
％の閾値設定点を超えると、ＤＯは攪拌速度を増加させることによって制御され
る。４５％閾値設定点を下回ると、ＤＯはバイオリアクター中への栄養溶液の供
給によって制御される。FIG. 1: Dissolved oxygen, agitation speed and time course of fed-batch media as monitored in a bioreactor during fed-feed fed-batch culture. Figure 2 shows the culture of plasmid pUK21CMVβ of E. coli DH5α in a 30L-bioreactor. 30
Beyond the% threshold set point, DO is controlled by increasing the agitation speed. Below the 45% threshold set point, DO is controlled by the supply of nutrient solution into the bioreactor.
【図２】 半限定（ｓｅｍｉ−ｄｅｆｉｎｅｄ）グリセロール・イースト抽出培
地中での大腸菌ＤＨ５αのｐＵＫ２１ＣＭＶβの流加培養時の乾燥細胞重量（Ｄ
ＣＷ）及びプラスミド濃度。細菌形質転換体は３０Ｌ−バイオリアクター中で培
養された。FIG. 2: Dried cell weight (D) of fed-culture of pUK21CMVβ of E. coli DH5α in semi-defined glycerol yeast extraction medium
CW) and plasmid concentration. Bacterial transformants were cultured in a 30 L-bioreactor.
【図３】 ３０リッター培養した場合の様々な培養時間（１０−４０ｈ）でのプ
ラスミドＤＮＡ（約２５０ｎｇずつ）の０．８％アガロースゲル電気泳動。プラ
スミドＤＮＡは、キアゲン・ミニプレップ（ＱＩＡＧＥＮ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ）
キットを用いて、限定（ｄｅｆｉｎｅｄ）培養液より単離された。FIG. 3: 0.8% agarose gel electrophoresis of plasmid DNA (about 250 ng each) at various culture times (10-40 h) when cultivating 30 liters. Plasmid DNA was from Qiagen Miniprep.
It was isolated from a defined culture using a kit.
【図４】 合成グリセロール培地を用いたｐＵＫ２１ＣＭＶβを含む大腸菌ＤＨ
５αの流加培養時の乾燥細胞重量及びプラスミド濃度。醗酵は５Ｌ−バイオリア
クター中で実施された。FIG. 4. Escherichia coli DH containing pUK21CMVβ using synthetic glycerol medium
Dry cell weight and plasmid concentration during fed-batch culture of 5α. Fermentation was performed in a 5 L bioreactor.
【図５】 ７リッター培養した場合の様々な培養時間（１０−４４ｈ）でのプラ
スミドＤＮＡ（約２５０ｎｇずつ）の０．８％アガロースゲル電気泳動。プラス
ミドＤＮＡは、キアゲン・ミニプレップ（ＱＩＡＧＥＮ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ）キ
ットを用いて、限定（ｄｅｆｉｎｅｄ）培養液より単離された。FIG. 5: 0.8% agarose gel electrophoresis of plasmid DNA (about 250 ng each) at various cultivation times (10-44 h) when culturing 7 liters. Plasmid DNA was isolated from defined cultures using the QIAGEN Miniprep kit.
【図６】 細胞が回収された場合の、４１時間培養したときのｐＵＴ ６４５プ
ラスミドＤＮＡサンプル（２００ｎｇ/４個の別の単離物）の０．８％アガロー
スゲル電気泳動。プラスミドＤＮＡはキアゲン・ミニプレップ（ＱＩＡＧＥＮ
Ｍｉｎｉｐｒｅｐ）キット（Ｔｉｐ−１００）を用いて別々に単離された。FIG. 6: 0.8% agarose gel electrophoresis of pUT 645 plasmid DNA sample (200 ng / 4 other isolates) when cells were harvested and cultured for 41 hours. Plasmid DNA is Qiagen Miniprep (QIAGEN)
Separately using the Miniprep kit (Tip-100).
【図７】 イースト抽出（ＹＥ）培地中のいくつかの培養条件の最終バイオマス
。実施例１に記載のように、又はチェン（Ｃｈｅｎ）らによるＪ．インダストリ
アル・ミクロバイオロジー・アンド・バイオテクノロジー（Ｊ．Ｉｎｄｕｓｔｒ
ｉａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）
１８（１９９７）、４３−４８若しくはラヒジャニ（Ｌａｈｉｊａｎｉ）らによ
るヒト遺伝子治療（Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ） ７（１９９６）
、１９７１−１９８０において記載されているように培養を実施した。FIG. 7. Final biomass of several culture conditions in yeast extraction (YE) medium. As described in Example 1, or as described by Chen et al. Industrial Microbiology and Biotechnology (J. Industry)
ial Microbiology and Biotechnology)
18 (1997), 43-48 or Lahijani et al. (Human Gene Therapy) 7 (1996).
, 1971-1980.
【図８】 イースト抽出（ＹＥ）培地中でのいくつかの培養の最終プラスミド濃
度。実施例１に記載されているように培養を実施し、そしてチェン（Ｃｈｅｎ）
らによるＪ．インダストリアル・ミクロバイオロジー・アンド・バイオテクノロ
ジー（Ｊ．Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏ
ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ） １８（１９９７）、４３−４８又はラヒジャニ（Ｌａ
ｈｉｊａｎｉ）らによるヒト遺伝子治療（Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐ
ｙ） ７（１９９６）、１９７１−１９８０において記載されているような培養
と比較した。FIG. 8: Final plasmid concentration of several cultures in yeast extraction (YE) medium. Cultures were performed as described in Example 1 and Chen
J. et al. Industrial Microbiology and Biotechnology (J. Industrial Microbiology and Bio
technology 18 (1997), 43-48 or Lahijani (La
Higene et al. (Human Gene Therap)
y) Compared to cultures as described in 7 (1996), 1971-1980.
【図９】 細胞回収時のイースト抽出（ＹＥ）培地中でのいくつかの培養のバイ
オマスあたりのプラスミド収量。実施例１に記載されているように培養を実施し
、そしてチェン（Ｃｈｅｎ）らによるＪ．インダストリアル・ミクロバイオロジ
ー・アンド・バイオテクノロジー（Ｊ．Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉ
ｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ） １８（１９９７）、４３
−４８又はラヒジャニ（Ｌａｈｉｊａｎｉ）らによるヒト遺伝子治療（Ｈｕｍａ
ｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ） ７（１９９６）、１９７１−１９８０におい
て記載されているような培養と比較した。FIG. 9. Plasmid yield per biomass of several cultures in yeast extraction (YE) medium at cell harvest. Cultures were performed as described in Example 1 and described by Chen et al. Industrial Microbiology and Biotechnology (J. Industrial Microbi)
technology and Biotechnology) 18 (1997), 43
-48 or human gene therapy (Huma) by Lahijani et al.
n Gene Therapy) 7 (1996), 1971-1980.
【図１０】 プラスミドｐＵＫ２１ＣＭＶβの制限マップFIG. 10: Restriction map of plasmid pUK21CMVβ
【図１１】 プラスミドｐＵＫ２１ＣＭＶβ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）のＤＮ
Ａ配列FIG. 11. DN of plasmid pUK21CMVβ (SEQ ID NO: 2)
A array
【図１２】 プラスミドｐＵＫ２１ＣＭＶβ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）のＤＮ
Ａ配列FIG. 12. DN of plasmid pUK21CMVβ (SEQ ID NO: 2)
A array
【図１３】 プラスミドｐＵＫ２１ＣＭＶβ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）のＤＮ
Ａ配列FIG. 13. DN of plasmid pUK21CMVβ (SEQ ID NO: 2)
A array
【図１４】 プラスミドｐＵＫ２１ＣＭＶβ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）のＤＮ
Ａ配列FIG. 14: DN of plasmid pUK21CMVβ (SEQ ID NO: 2)
A array
【図１５】 プラスミドｐＵＫ２１ＣＭＶβ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）のＤＮ
Ａ配列FIG. 15: DN of plasmid pUK21CMVβ (SEQ ID NO: 2)
A array
【図１６】 プラスミドｐＵＫ２１ＣＭＶβ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）のＤＮ
Ａ配列FIG. 16: DN of plasmid pUK21CMVβ (SEQ ID NO: 2)
A array
【図１７】 プラスミドｐＵＴ６４９の制限マップFIG. 17: Restriction map of plasmid pUT649
【図１８】 プラスミドｐＵＴ６４９の（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）のＤＮＡ配
列FIG. 18: DNA sequence of (SEQ ID NO: 1) of plasmid pUT649
【図１９】 プラスミドｐＵＴ６４９の（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）のＤＮＡ配
列FIG. 19: DNA sequence of (SEQ ID NO: 1) of plasmid pUT649
【図２０】 プラスミドｐＵＴ６４９の（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）のＤＮＡ配
列FIG. 20: DNA sequence of (SEQ ID NO: 1) of plasmid pUT649
【図２１】 プラスミドｐＵＴ６４９の（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）のＤＮＡ配
列FIG. 21: DNA sequence of (SEQ ID NO: 1) of plasmid pUT649
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，Ｅ Ａ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ， ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，Ｇ Ｅ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ， ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，Ｍ Ｎ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ， ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，Ｚ Ａ，ＺＷ (72)発明者 フラッシェル エルヴィン ドイツ連邦国、ビーレフェルド Ｄ− 33619、テルグター シュトラーセ ２ (72)発明者 シュリーフ マルティン ドイツ連邦国、ビーレフェルド Ｄ− 33739、アム ベルグシーク Ｆターム(参考） 4B024 AA20 CA01 DA06 EA04 GA19 4B065 AA26X AB01 AC20 BB02 BB03 BB06 BB12 BC12 BC14 BD09 BD11 CA60 ──────────────────────────────────────────────────続 き Continuation of front page (81) Designated country EP (AT, BE, CH, CY, DE, DK, ES, FI, FR, GB, GR, IE, IT, LU, MC, NL, PT, SE ), OA (BF, BJ, CF, CG, CI, CM, GA, GN, GW, ML, MR, NE, SN, TD, TG), AP (GH, GM, KE, LS, MW, SD, SL, SZ, UG, ZW), EA (AM, AZ, BY, KG, KZ, MD, RU, TJ, TM), AE, AL, AM, AT, AU, AZ, BA, BB, BG, BR , BY, CA, CH, CN, CU, CZ, DE, DK, EE, ES, FI, GB, GD, GE, GH, GM, HR, HU, ID, IL, IN, IS , JP, KE, KG, KP, KR, KZ, LC, LK, LR, LS, LT, LU, LV, MD, MG, MK, MN, MW, MX, NO, NZ, PL, PT, RO, RU, SD, SE, SG, SI, SK, SL, TJ, TM, TR, TT, UA, UG, US, UZ, VN, YU, ZA, ZW (72) Inventor FLASHELL ELVIN, Germany Bielefeld D-33619, Telgter Strasse 2 (72) Inventor Shrif Martin Bielefeld D-33739, Germany, Am Bergseek F-term (reference) 4B024 AA20 CA01 DA06 EA04 GA19 4B065 AA26X AB01 AC20 BB02 BB03 BC12 BC12 BC12 BC12 BC12
Claims (28)
転換体を培養し； （ｂ） ＤＯが閾値設定点を越えて上昇した後、バッチ段階の最後に、（ａ）の
前記培養液にフィードバック条件下で、 （ｂａ）炭素源；及び （ｂｂ）マグネシウム塩； を含む流加培地の一部を供給し； （ｃ） 細菌形質転換体に前記流加培地を代謝させることを含むｃｃｃプラスミ
ドＤＮＡの単離のためのバイオマス製造方法。1. Bacteria in a bioreactor containing an antibiotic-free batch medium comprising: (a) a carbon source; (ab) a mixture of inorganic salts; (ac) a nitrogen source; Culturing the transformants; (b) at the end of the batch phase after the DO has risen above the threshold set point, under feedback conditions to the culture of (a), (ba) a carbon source; and (bb) A) feeding a part of a feed medium comprising: magnesium salt; (c) a method for producing biomass for isolating ccc plasmid DNA, comprising metabolizing the feed medium into bacterial transformants.
返し供給サイクルを含む請求項１に記載の方法。2. The method of claim 1, wherein step (b) comprises a repeated supply cycle after each rise of DO above a threshold set point.
。3. The method according to claim 1, wherein the bacterial transformant is an E. coli cell.
方法。4. The method according to claim 1, wherein glycerol is used as a carbon source.
に記載の方法。5. The method according to claim 1, wherein NH 3 is used as a nitrogen source.
から５のいずれか１項に記載の方法。6. The method according to claim 1, wherein the carbon source in the batch medium has a concentration of 100 g / l or less.
The method according to any one of claims 1 to 5.
から６のいずれか１項に記載の方法。7. The method according to claim 1, wherein the carbon source in the feed medium has a concentration of 1000 g / l or less.
7. The method according to any one of claims 1 to 6.
に記載の方法。8. The method according to claim 1, wherein the nitrogen source is at a concentration of 30% or less.
ｌ以下、ＮａＣｌを０．５ｇ/ｌ以下及びクエン酸・Ｈ2Ｏを１．５ｇ/ｌ以下含
む請求項１から８のいずれか１項に記載の方法。9. An inorganic salt mixture containing Na 2 HPO 4 at 6 g / l or less and KH 2 PO 4 at 3 g / l.
l or less, The method according to any one of the NaCl from claim 1 comprising 0.5 g / l of the following and citric acid · H 2 O 1.5g / l or less 8.
の方法。10. The method of claim 9, wherein said inorganic salt mixture also comprises a magnesium salt.
請求項１０に記載の方法。11. The method of claim 10, wherein said magnesium salt is MgSO 4 at a concentration of about 0.3 g /.
Ｍの範囲内にある請求項１から１１のいずれか１項に記載の方法。12. In step (b), the magnesium salt concentration is from 5 to 100 m.
The method according to any one of claims 1 to 11, which is in the range of M.
請求項１２に記載の方法。13. The method according to claim 12, wherein the magnesium salt concentration in step (b) is 80 mM.
か１項に記載の方法。14. The method according to claim 1, wherein the magnesium salt is MgSO 4 .
加される請求項１から１４のいずれか１項に記載の方法。15. The method according to claim 1, wherein the solution of the trace element is added in step (a) and / or (b).
ｎＳＯ4・Ｈ2Ｏ、ＣｏＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、ＣｕＣｌ2、Ｈ3ＢＯ3、Ｎａ2ＭｏＯ4・
２Ｈ2Ｏ及びクエン酸を含む請求項１から１５のいずれかに記載の方法。16. trace element solution is FeCl 3 · 6H 2 O, ZnSO 4 · 7H 2 O, M
nSO 4 .H 2 O, CoSO 4 .7H 2 O, CuCl 2 , H 3 BO 3 , Na 2 MoO 4.
The method according to any of claims 1 15 comprising a 2H 2 O and citric acid.
記載の方法。17. The method according to claim 1, wherein the batch medium contains a source of amino acids.
載の方法。18. The method according to claim 1, wherein the feed medium contains a source of amino acids.
れる請求項１から１８のいずれか１項に記載の方法。19. The method according to any one of claims 1 to 18, wherein the culturing of the bacterial transformant is performed at a temperature in the range of 30 ° C to 42 ° C.
方法。20. The method according to claim 1, wherein the temperature range is from 35 ° C. to 38 ° C.
のいずれかに記載の方法。21. The batch medium comprising bacterial host strain-specific supplements.
The method according to any of the above.
求項１から２１のいずれか１項に記載の方法。22. The method according to claim 1, wherein the host cells are recovered from the culture after step (c).
付される特徴とする請求項２２に記載の方法。23. The method of claim 22, wherein after step (c), the host cells are subjected to a washing step before and after collection.
凍結乾燥を含む請求項１から２３のいずれか１項に記載の方法。24. The method of any one of claims 1 to 23, wherein a further step after step (c) comprises freezing or lyophilizing the host cells.
プの後のさらなるステップは、ｃｃｃＤＮＡの単離を含む請求項１から２４のい
ずれかに記載の方法。25. The method of any of claims 1 to 24, wherein after step (c) or a further step after the steps of claims 22 to 24 comprises the isolation of cccDNA.
プ（ａ’）をさらに含む請求項１から２５のいずれかに記載の方法。26. The method according to any one of claims 1 to 25, further comprising a step (a ') of preculturing the bacterial transformant in an antibiotic-free medium.
項２６に記載の方法。27. The method according to claim 26, wherein after the completion of the preculture, the bacterial transformant is in an exponential growth phase.
成又は半合成培地である請求項１から２７のいずれかに記載の方法。28. The method according to claim 1, wherein the batch medium, the fed medium and / or the medium used for the preculture is a synthetic or semi-synthetic medium.
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