DE10106493A1 - Verfahren zur Herstellung von Nukleinsäuren - Google Patents
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Abstract
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Nukleinsäuren, insbesondere superspiralisierte Nukleinsäuren. Die Kultivierung der transformierten Bakterienzellen zu hohen Zelldichten wird vorzugsweise im Satzverfahren in einem definierten, synthetischen wäßrigen Medium durchgeführt, welches keine komplexen Bestandteile oder Bestandteile enthält, die aus Tieren gewonnen werden. Die aus den Bakterienzellen isolierten und gereinigten Nukleinsäuren sind zur Verwendung in nicht-viraler Gentherapie, Zelltherapie oder genetischer Impfung geeignet.
Description
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung bakterieller
Biomasse, die superspiralisierte Nukleinsäuren enthält. Die Kultivierung der transformierten
Bakterienzellen zu hohen Zelldichten wird im Satzverfahren in einem definierten,
synthetischen wäßrigen Medium durchgeführt, welches keine komplexen Bestandteile
und/oder Bestandteile enthält, die aus Tieren gewonnen werden. Die aus den Bakterienzellen
isolierten und gereinigten Nukleinsäuren sind zur Verwendung in nicht-viraler Gentherapie,
Zelltherapie oder genetischer Impfung geeignet.
Die Produktion von Nukleinsäuren hat durch die Verwendung dieser Biomoleküle als
Transportsysteme (Vektoren) für therapeutische Gene in modernen Therapieformen wie
Zelltherapie, Gentherapie oder genetische Impfung (DNA-Vakzinierung) große Bedeutung
erlangt. Zahlreiche Nukleinsäure-Vakzine und Gentherapeutika werden derzeit in klinischen
Studien getestet. Bei diesen Therapieformen werden Nukleinsäuren als nicht-virale Vektoren
eingesetzt. Der Gentransfer kann durch direkte Injektion der Nukleinsäuren in Gewebe bzw.
Zellen oder mit Hilfe einer Gene Gun erfolgen. Die DNA kann dabei als "nackte"
Nukleinsäure vorliegen oder in Formulierung mit anderen Substanzen (z. B. Liposomen), die
den Gentransfer bzw. die Effizienz erhöhen.
Mikroorganismen besitzen die Eigenschaft, extra-chromosomale, zirkuläre Nukleinsäuren,
wie beispielsweise Plasmide oder Cosmide replizieren zu können. Diese Eigenschaft kann zur
Herstellung der Nukleinsäuren in großen Mengen genutzt werden.
Plasmide sind extrachromosomale, meist zirkuläre, doppelsträngige DNA Moleküle. Sie
haben eine Größe zwischen ca. 200 und 100000 Basenpaaren (Bp), existieren in den Zellen
neben dem bakteriellen Chromosom und werden autonom von diesem repliziert. Plasmide
liegen oft in mehreren Kopien pro Zelle vor. Ihre Anzahl variiert zwischen 2 bis 20 Kopien
pro Zelle (low-copy Plasmide) oder mehreren hundert Kopien pro Zelle (high-copy Plasmide).
Die zusätzliche genetische Information durch die Plasmide verleiht dem Wirtsorganismus
einen Selektionsvorteil gegenüber plasmidfreien Zellen, wie z. B. die Resistenz gegen ein
Antibiotikum. In der Biotechnologie finden Plasmide zahlreiche Anwendungen als
Klonierungs- und Expressionsvektoren. Sie besitzen ein Replikationssystem, ein oder mehrere
Selektionsmarkergene und einen Klonierungsabschnitt zur Aufnahme fremder Genabschnitte.
Die Produktion großer Mengen dieser Nukleinsäuren in hoher Qualität erlangt durch die
zunehmende Verwendung der Nukleinsäuren in prä-klinischen, klinischen oder
veterinärmedizinischen Anwendungen der Zell- und Gentherapie bzw. DNA-Vakzinierung
ein besonderes Interesse.
Zur Produktion von bakterieller Biomasse zur Herstellung von Nukleinsäuren von
pharmazeutischer Qualität werden die Bakterienzellen auf Nährmedien zu hohen Zelldichten
bei gleichzeitiger hoher Produktkonzentration in den Zellen und hoher Qualität des Produktes
herangezogen. Die hierbei verwendeten Medien bestehen aus Kohlenstoff und
Stickstoffquellen, sowie einer Mineralsalzmischung. In Verfahren aus dem Stand der Technik
werden Nährmedien verwendet, deren Kohlenstoff und/oder Stickstoffquellen ein oder
mehrere nicht definierte komplexe Bestandteile sind, wie Extrakte oder Hydrolysate von
Naturprodukten (siehe beispielsweise Wan et al., US 005487986 (1996) oder Rainikainen et
al., Biotechnol. Bioeng. 33 (1989), 386-393, O'Kennedy et al., J. Biotechnol. 76 (2000),
175-183). Im Stand der Technik werden auch Nährmedien verwendet die Komponenten aus
tierischen Quellen enthalten. Auch andere mögliche toxische Substanzen können durch die
nicht definierten, komplexen Komponenten in das Nährmedium und damit in Kontakt mit
dem Nukleinsäureprodukt gelangen. Außerdem variiert die Bildung von Biomasse und
Produkt stark mit der Zusammensetzung und Qualität der verwendeten komplexen
Komponente, die von Charge zu Charge verschieden sein können.
Während der Kultivierung werden durch die Verstoffwechselung der Medienkomponenten
Biomasse, das Produkt als Teil der Zellmasse und zusätzlich Stoffwechselenergie erzeugt. Bei
Verfahren aus dem Stand der Technik werden auch hohe Substratkonzentrationen zu Beginn
der Kultivierung vorgelegt, um hohe Biomasse- und Produktkonzentrationen zu erzeugen. Es
werden aber stattdessen wachstums- und produktbildungsinhibierende Stoffwechsel
komponenten, wie Acetat gebildet (siehe Kleman et al., Appl. Environ. Microbiol. 60 (1994),
3952-3958). Die Bildung dieser unerwünschten Stoffwechselnebenprodukte wird beim Stand
der Technik durch die Anwendung sogenannter Zulaufkultivierungsverfahren umgangen.
Hierbei werden die Substrate zu Beginn der Kultivierung in geringeren Konzentrationen
vorgelegt. Nach dem Verbrauch dieser Substrate erfolgt ein Zulauf von frischem,
konzentrierten Nährmedium, der kontinuierlich oder geregelt erfolgen kann (siehe
beispielsweise Chen et al., J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 18 (1997), 43-48; Lahijani et al.,
Hum. Gen. Ther. 7 (1996), 1971-1980; Schmidt et al. WO 99/61633 (1999)). Der
entscheidende Nachteil dieser Zulaufverfahren besteht in der aufwendigen, technischen
Umsetzung der Steuerungs- und Regelungsverfahren für den Zulauf von Medium. Außerdem
wird durch den Wechsel zwischen Substratüberschuß und Substratmangel ein physiologischer
Stress auf die Bakterienzellen ausgeübt, der sich negativ auf den Produktbildungsprozess
auswirken kann.
Es war daher eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von
Nukleinsäuren, insbesondere superspiralisierten Nukleinsäuren, von pharmazeutischer
Qualität bereitzustellen.
Gelöst wird die Aufgabe durch das erfindungsgemäße Verfahren, das bei der Herstellung von
Nukleinsäuren auf komplexe Nährmedienbestandteile vollständig verzichtet. Das
erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung von Nukleinsäuren umfasst die Kultivierung
von die Nukleinsäure enthaltenen Bakterienzellen in einem Medium ohne komplexe
Bestandteile und die Isolierung der Nukleinsäuren. In einer bevorzugten Ausführungsform
umfasst das Medium ohne komplexe Bestandteile die folgenden synthetischen Bestandteile:
- a) organische Kohlenstoffquelle,
- b) anorganische Stickstoffquelle
- c) Mineralsalzmischung und
- d) eine zusätzliche, definierte stickstoff-haltige Komponente, die den Produktstoffwechsel der Bakterienzellen verstärkt.
Das erfindungsgemäße Verfahren läßt sich besonders vorteilhaft im Satzverfahren
durchführen und führt bei hohen Nährstoffkonzentrationen zu großen Produktmengen.
Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht die Herstellung von Nukleinsäuren,
insbesondere superspiralisierten Nukleinsäuren in großen Mengen und gewährleistet
Nukleinsäuren in hoher Qualität, die in prä-klinischen, klinischen oder
veterinärmedizinischen Anwendungen der Zell- und Gentherapie bzw. DNA-Vakzinierung
eingesetzt werden können.
Vorzugsweise Liegen superspiralisierte Nukleinsäuren zu mindestens 70-90%, insbesondere
zu mehr als 90% in der superspiralisierten ccc-Form vor. Bei der ccc-Form (covalently closed
circular) handelt es sich um eine kompakte, kovalent-geschlossene zirkuläre Nukleinsäure
struktur, die in Mikroorganismen durch Topoisomerasen erzeugt wird.
Insbesondere werden durch das erfindungsgemäße Verfahren Kontaminationen durch
unerwünschte Substanzen, die schwer nachzuweisen sind und damit in das Nährmedium
gelangen, vermieden, was z. B. im Zuge der BSE-Problematik von elementarer Bedeutung ist.
Das erfindungsgemäße Verfahren verzichtet ganz auf den Einsatz komplexer Bestandteile.
Die Konzentrationen der Bestandteile im Medium betragen für die organische
Kohlenstoffquelle 1 bis 500 g/L, vorzugsweise 10 bis 300 g/L und insbesondere 50 bis 100 g/L,
für die anorganische Stickstoffquelle 10 bis 200 mM, vorzugsweise 20 bis 80 mM und
insbesondere 40 mM und für die zusätzliche, definierte stickstoff-haltige Komponente 25 bis
1000 mM, vorzugsweise 50 bis 250 mM.
Die zusätzliche, definierte stickstoff-haltige Komponente, die den Produktstoffwechsel
verstärkt, ist eine Vorstufe in der Biosynthese der Nukleotidbasen der Nukleinsäuren.
Auch bei der zusätzlichen stickstoff-haltige Komponente handelt es sich um eine nicht
komplexen Bestandteil.
Die vorliegende Erfindung beschreibt daher ein Verfahren zur Herstellung von
Nukleinsäuren. Dabei wird die Kultivierung der transformierten Bakterienzellen in einem
Medium, vorzugsweise im Satzverfahren (= Satzkultivierungsverfahren) durchgeführt,
welches keine komplexen Bestandteile enthält.
Ein Satzkultivierungsverfahren ist ein diskontinuierliches Kultivierungsverfahren bei dem alle
Komponenten des Nährmediums vor dem Zufügen der Mikroorganismen im Kulturgefäß
vorliegen.
Komplexe Bestandteile von Nährmedien sind nicht definierte Naturprodukte bzw. aus diesen
gewonnenen Extrakte zur Kultivierung von Mikroorganismen, wie zum Beispiel
Hefeautolysat, Hefeextrakt, Peptone, Malz- oder Fleischextrakte.
Die Kultivierung der transformierten Bakterienzellen erfolgt in einem Medium, welches die
definierten, synthetischen Bestandteile organische Kohlenstoffquelle, anorganische
Stickstoffquelle, Mineralsalzmischung und eine zusätzliche, definierte stickstoff-haltige
Komponente enthält, die den Produktstoffwechsel verstärkt. Während der Kultivierung
produzieren die transformierten Bakterienzellen Nukleinsäuren.
Die besondere Zusammensetzung des voll-synthetischen Mediums ermöglicht die
Kultivierung im Satzprozess zu hohen Zelldichten bzw. Biomassekonzentrationen (optische
Dichte (600 nm) ≧ 75) in Verbindung mit hohen Produktausbeuten (Plasmidkonzentration ≧
65 mg/L), die bisher nur im Rahmen von technisch aufwendigeren Zulaufprozessen in meist
komplexen Medien erreicht wurden. Durch die Verwendung rein synthetischer Bestandteile
und den Verzicht auf komplexe und tierische Komponenten ist das Medium optimal für die
Herstellung von Nukleinsäuren in pharmazeutischer Qualität für zum Beispiel Zell- und
Gentherapie oder genetische Impfung geeignet.
Die vorliegende Erfindung beschreibt ein Verfahren zur Herstellung von Nukleinsäuren
insbesondere superspiralisierten Nukleinsäuren, wobei die Kultivierung der Bakterienzellen
vorzugsweise im Satzverfahren erfolgt. Im Satzverfahren werden von Beginn der
Kultivierung an alle Nährstoffquellen den Bakterienzellen im Medium bereitgestellt. Der
Einsatz hoher Substratkonzentrationen führt jedoch bei Verfahren, die dem Stand der Technik
entsprechen, nicht gleichzeitig im Gegensatz zur vorliegenden Erfindung zu hohen
Zelldichten und Produktmengen, weil Stoffwechselprodukte, wie beispielsweise Acetat
gebildet werden, die weiteres Zellwachstum inhibieren (siehe zum Beispiel Kleman et al.,
Appl. Environ. Microbiol. 60 (1994), 3952-3958). Deshalb können zur Vermeidung von
Substratinhibierung bei Kultivierungen zu hohen Zelldichten sogenannte Zulaufverfahren
eingesetzt werden, bei denen den Bakterienzellen am Anfang der Kultivierung nur geringe
Mengen an Nährstoffen zur Verfügung stehen und bei Verbrauch dieser Nährstoffe frisches
Medium zuläuft. Diese Zulaufverfahren sind bekannt und entsprechen dem Stand der Technik
(siehe zum Beispiel Chen et al., J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 18 (1997), 43-48, Lahijani et
al., Hum. Gen. Ther. 7 (1996), 1971-1980, Schmidt et al. WO 99/61633 (1999)). Nachteile
dieser Verfahren sind die aufwendige, technische Umsetzung der Steuerung bzw. Regelung
des Zulaufes von frischen Medium, der physiologische Stress den die Bakterienzellen durch
abwechselnde Substratüberschuss- und Substratmangelbedingungen ausgesetzt sind, die
Verwendung komplexer, nicht definierter Mediumsbestandteile oder die geringen
Plasmidmengen innerhalb der Bakterienzellen (Plasmidmassenanteil). Die ausgewogene
Zusammensetzung des Nährmediums der vorliegenden Erfindung ermöglicht die Kultivierung
im Satzverfahren zu hohen Zelldichten mit gleichzeitig hoher Produktkonzentration bzw.
hohen Plasmidmassenanteil ohne das wachstums-inhibierende Stoffwechselnebenprodukte
gebildet werden.
Ein besonderer Vorteil der Erfindung ist, dass das Medium zur Kultivierung der
Bakterienzellen keine komplexen, nicht definierten Bestandteile enthält wie beispielsweise
Hefeextrakte, Peptone oder Tierhydrolysate bzw. andere Bestandteile, die aus Tieren
gewonnen werden, die bei Verfahren gemäß dem Stand der Technik verwendet werden (siehe
zum Beispiel Wan et al., US 005487986 (1996), O'Kennedy et al., J. Biotechnol. 76 (2000),
175-183). Komplexe Medienbestandteile können mit unerwünschten Substanzen verunreinigt
sein, die schwer nachzuweisen sind und damit in das Nährmedium gelangen. Im Zuge der
BSE-Problematik ist der vollkommene Verzicht auf tierische Komponenten bei der
Produktion von Pharmazeutika sehr vorteilhaft.
Ein anderer Nachteil bei der Verwendung komplexer Medienbestandteile betrifft die
unterschiedliche Qualität des Ausgangsmaterials. Von Charge zu Charge können große
Unterschiede in der Zusammensetzung auftreten, so dass die Kultivierung nicht
reproduzierbar durchgeführt werden kann. Deshalb ist ein das erfindungsgemäße Verfahren
zur Herstellung von plasmidhaltiger Biomasse in einem synthetischen Medium dem Stand der
Technik überlegen. Die definierten Bestandteile, die synthetisch hergestellt werden, können in
höchster Reinheit ohne Verunreinigung mit unerwünschten Substanzen eingesetzt werden und
variieren auch nicht in ihrer Zusammensetzung.
Die ausgewogene Zusammensetzung des definierten, synthetischen Mediums aus organischer
Kohlenstoffquelle, anorganischer Stickstoffquelle, Mineralsalzmischung und einer
zusätzlichen, definierten stickstoff-haltigen Komponente, die den Produktstoffwechsel
verstärkt, ist ein entscheidender Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens und erlaubt es den
transformierten Bakterienzellen, die Substrate zu verstoffwechseln und Nukleinsäuren in
großen Mengen zu produzieren, ohne das wachstums-inhibierende Nebenprodukte gebildet
werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden die
Bakterienzellen aus dem Kultivierungsmedium isoliert. Dieses kann durch Filtration,
Zentrifugation oder anderen Methoden geschehen, die dem Stand der Technik entsprechen.
Nach der Isolierung können die Bakterienzellen zusätzlich noch mit einer Flüssigkeit
gewaschen werden, die die Zellen nicht verändert, um Reste des Kultivierungsmedium zu
entfernen.
Die Nukleinsäuren werden innerhalb der Bakterienzellen produziert. Deshalb werden in einer
weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung die Nukleinsäuren aus den
Bakterienzellen isoliert und von den Zellen und anderen Zellinhaltsstoffen gereinigt. Die
Zelllyse und die Reinigung kann dabei durch im Stand der Technik beschriebenen Verfahren,
wie alkalische Lyse mit anschließendem Chromatographie-Schritt erfolgen (siehe zum
Beispiel Marquet et al., Biopharm 8 (1995), 26-37) oder Colpan et al., US 5990301, 1999
oder Ferreira et al., J. Mol. Recogn. 11 (1998), 250-251 oder Green et al., Biopharm 10
(1997), 52-62)). Mit Hilfe dieser Verfahren können die Nukleinsäuren in pharmazeutischer
Qualität isoliert werden, so dass sie als Wirkstoff in Zell- bzw. Gentherapie und genetischer
Impfung verwendet werden können.
In einer anderen bevorzugten Verkörperung der Methode der Erfindung werden die Zellen
nach der Kultivierung eingefroren oder gefriergetrocknet. Dieses ist sehr nützlich, wenn eine
sofortige Isolierung und Reinigung der Nukleinsäuren nicht gewünscht ist und die
Bakterienzellen Längere Zeit gelagert werden sollen.
Die Bakterienzellen können gram-positiv oder gram-negativ sein. In einer bevorzugten
Ausführungsform der vorliegenden Erfindung sind die transformierten Bakterienzellen
Escherichia coli-Zellen. Insbesondere wird ein E.coli K12-Stamm mit Genotyp recA- oder
recA1 verwendet. Diese Bakterienstämme produzieren sehr homogene Nukleinsäuren.
Deshalb ist ein großer Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahren, dass die Nukleinsäuren in
den Zellen superspiralsiert sind, insbesondere zu mehr als 90% in der ccc-Form vorliegen.
Ein weiterer, entscheidender Vorteil der Erfindung ist, dass die gereinigten Nukleinsäuren in
pharmazeutischer Qualität als Wirkstoff in Zell- bzw. Gentherapie und genetischer Impfung
eingesetzt werden können. Es werden bei der Herstellung keine unerwünschten bzw. toxische
Substanzen benutzt, die die Verwendung als Pharmazeutikum in der Klinik ausschließen.
Ein entscheidender Vorteil des Verfahrens der Erfindung betrifft die Tatsache, dass eine
Vielzahl von zirkulären Nukleinsäuren, wie Plasmide, Cosmide oder noch größere
Nukleinsäuremoleküle damit hergestellt werden können. Die Größe der Moleküle hat dabei
keinen Einfluss auf die Ausbeute oder Qualität der Produkte.
Die definierte, organische Kohlenstoffquelle ist vorzugsweise aus der Gruppe der
Monosaccharide, Disaccharide, Polysaccharide oder Polyole, insbesondere wird Glucose,
Maltose, Raffinose, Galactose, Trehalose, Sucrose, Fructose, Mannose, Sorbose, Fucose,
Rhamnose, Arabinose, Xylose, Ribose, Manitol, Sorbitol oder Glycerin als organische
Kohlenstoffquelle verwendet. In einer bevorzugten Form des erfindungsgemäßen Verfahren
wird die Kohlenstoffquelle im Medium in einer Konzentration im von 1 bis 500 g/L,
vorzugsweise 10 bis 300 g/L und insbesondere 50 bis 100 g/L eingesetzt. Die Kohlenstoffquellen
können in höchsten Reinheitsstufen chemisch synthetisiert werden und sind deshalb nicht mit
unerwünschten Substanzen bzw. tierischen Bestandteilen verunreinigt.
Im erfindungsgemäßen Verfahren werden vorzugsweise Ammoniumsalze, wie zum Beispiel
Ammoniumchlorid, Ammoniumphosphate, Ammoniumsulfat oder Ammoniumnitrat bzw.
Ammoniak selbst als anorganische Stickstoffquelle verwendet. Ammoniumionen bilden in
höheren Konzentrationen zusammen mit Phosphat- und Magnesiumionen, die ebenfalls in
einem definierten, synthetischen Medium enthalten sein können, schwerlösliches
Magnesiumammoniumphosphat. Um während der Zubereitung des Mediums oder während
der Kultivierung die Bildung dieser Salzausfällung zu vermeiden, werden die
Ammoniumsalze vorzugsweise in einer Konzentration von 10 bis 200 mM, vorzugsweise 20
bis 80 mM und insbesondere 40 mM eingesetzt.
Mineralsalze sind ein wichtiger Bestandteil bakterieller Nährmedien. Im erfindungsgemäßen
Verfahren werden mindestens wasserlösliche anorganische Phosphaten, Chloride, Natriumsalzen,
Kaliumsalze und Magnesiumsalze, vorzugsweise Kaliumdihydrogenphosphat, Dikalium
hydrogenphosphat, Natriumchlorid und Magnesiumsulfat als Mineralsalzmischung eingesetzt.
Insbesondere werden die Salze in den Konzentrationen Kaliumdihydrogenphosphat 1 bis
50 g/L, vorzugsweise 1,5 bis 10 g/L, Dikaliumhydrogenphosphat 1 bis 75 g/L, vorzugsweise 2, 3
bis 15 g/L, Natriumchlorid 1 bis 20 g/L, vorzugsweise 2,5 bis 10 g/L und Magnesiumsulfat 0,1 bis
20 g/L, vorzugsweise 0,3 bis 10 g/L.
In einer besonderen Ausführungsform der Erfindung wird der Mineralsalzmischung
zusätzlich noch eine Spurenelement-Lösung bestehend aus Eisen(III)chlorid, Zinksulfat,
Mangansulfat, Kobaltsulfat, Kupferchlorid, Borsäure, Natriummolybdat und Zitronensäure
zugesetzt, insbesondere Eisen(III)chlorid in einer Konzentration von 20 mM, Zinksulfat in einer
Konzentration von 5 mM, Mangansulfat in einer Konzentration von 11 mM, Kobaltsulfat in einer
Konzentration von 2 mM, Kupferchlorid in einer Konzentration von 1 mM, Borsäure in einer
Konzentration von 16 mM, Natriummolybdat in einer Konzentration von 11 mM und
Zitronensäure in einer Konzentration von 24 mM.
In einer weiteren Verkörperung der Erfindung werden dem Medium wirtsstamm-spezifische
Supplementierungen, z. B. Vitamine oder andere Komponenten, die der verwendete Wirtsstamm
nicht selbst synthetisieren kann, zugesetzt. Zahlreiche Bakterienstämme besitzen beispielsweise
eine Thiamin-Auxotrophie, wie zum Beispiel E.coli DH1 oder E.coli DH5α, weshalb bei der
Verwendung dieser Wirtsstämme das Vitamin dem Medium zugesetzt wird.
Mit dem Verfahren der vorliegenden Erfindung können in einem definierten synthetischen
Medium im Satzbetrieb große Mengen Biomasse und Nukleinsäureprodukt gewonnen
werden. Mit Satzkultivierungsverfahren aus dem Stand der Technik (siehe beispielsweise
Wan et al., US 005487986 (1996) oder Rainikainen et al., Biotechnol. Bioeng. 33 (19989),
386-393, O'Kennedy et al., J. Biotechnol. 76 (2000), 175-183) werden mit komplexen
Nährmedien deutlich geringere Biomasse- und Nukleinsäureproduktmengen erhalten, weil die
eingesetzten Nährquellen auch in Stoffwechselprodukte umgewandelt werden, die
Bakterienwachstum und Produktbildung inhibieren können. Deshalb ist ein entscheidender
Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens der Einsatz einer zusätzlichen, definierten
stickstoff-haltigen Komponente, die den Produktstoffwechsel verstärkt.
Die zusätzliche, definierte stickstoff-haltige Komponente ist idealerweise eine Vorstufe in der
Biosynthese der Nukleotidbasen der Nukleinsäuren und trägt damit zum Aufbau der Purin- und
Pyrimidinbasen im Stoffwechsel der Bakterienzellen bei. In einer bevorzugten Verkörperung
der Erfindung ist die zusätzliche, definierte stickstoff-haltige Komponente ausgewählt aus der
Gruppe bestehend aus Aminosäuren, Peptide, Kohlensäureamiden, und Nukleotide bzw. die
Phosphate dieser Verbindungen. Insbesondere ist die zusätzliche definierte Komponente
ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: Aspartat, Glutamat, Glutamin, Glycin, Adenosin,
Cytosin, Guanin, Thymin, oder Harnstoff bzw. die Phosphate dieser Verbindungen. Die
Verwendung dieser Verbindungen ist vorteilhaft, weil diese chemisch synthetisiert hergestellt
werden können. Die Konzentration der zusätzlichen, definierten stickstoff-haltigen Komponente
im Medium ist 25 bis 1000 mM, vorzugsweise 50 bis 250 mM.
Ein besonderer Vorteil der vorliegenden Erfindung ist die Tatsache, dass zur Kultivierung der
transformierten Bakterienzellen keine Antibiotika zur Erhöhung der Plasmidstabilität dem
Medium zugesetzt werden müssen. Vor allem für eine Verwendung der gereinigten
Nukleinsäuren als Wirkstoff in Zell- und Gentherapie oder genetischer Impfung ist dieses
vorteilhaft.
In einer bevorzugten Ausführung des erfindungsgemäßen Verfahrens können die Kohlenstoff-
und/oder die Stickstoffquelle vollständig verstoffwechselt werden. Die Bakterienzellen
können auch vorher vom Medium getrennt werden, vorteilhafter ist aber eine Trennung nach
vollständiger Verstoffwechslung der Nährquellen, weil in diesem Fall Biomasse- und
Produktkonzentration am höchsten sind.
Eine besondere Verkörperung des Verfahren der Erfindung ist die Durchführung der
Kultivierung in einem temperierbaren Bioreaktor. Dabei wird die Kultivierung in einem
Temperaturbereich von 25-42°C, vorzugsweise im Bereich von 36-38°C durchgeführt. In
einer besonderen Ausführung werden die Bakterienzellen während der Kultivierung durch das
Einblasen von Luft in das Medium mit Sauerstoff versorgt.
Im erfindungsgemäßen Verfahren erfolgt die Kultivierung in einem pH-Bereich von 6,0-8,0,
vorzugsweise im Bereich von 6,5 bis 7,5. Insbesondere wird während der Kultivierung das pH
durch Zugabe einer Säure und/oder Base geregelt. Außerdem kann während der Kultivierung
gegebenenfalls Antischaummittel zugegeben werden, um ein Überschäumen zu vermeiden.
Ein weiterer entscheidender Vorteil des beschriebenen Verfahrens betrifft die Tatsache, dass
schon die Vorkultivierung in einem definierten, synthetischen Medium erfolgen kann. Damit
ist ein Kontakt der Bakterienzellen mit komplexen Mediumsbestandteilen völlig
ausgeschlossen.
Die Erfindung wird weiterhin durch die folgenden Abbildungen erläutert:
Die Abbildungen zeigen
Gelöstsauerstoffkonzentration (pO2), Rührerfrequenz und
Kohlendioxidgehalt der Reaktorabluft bei der Kultivierung von
pUK21CMVβ in E.coli DH5α in einem definerten, synthetischen Medium
mit 2 g L-1 Ammoniumchlorid im 7 L-Bioreaktor.
Plasmidmassenanteil, Biotrockenmasse- und Plasmidkonzentration
während der Kultivierung von pUK21CMVβ in E.coli DH5α in dem
synthetischen Medium im 7 L-Bioreaktor.
Verlauf der Glutamat-, Glycerin,- Ammonium- und Acetatkonzentration
der Kultivierung von pUK21CMVβ in E.coli DH5α in dem synthetischen
Medium im 7 L-Bioreaktor.
0,8%iges Agarosegel der pUK21CMVβ Proben aus der Kultivierung in
dem synthetischen Medium im 7 L-Bioreaktor (M: λ-DNA, BStE II
geschnitten, R: pUK21CMVβ-Referenz).
Wichtige Betriebsvariablen bei der Kultivierung von pUT649 in E.coli
DH5α in dem synthetischen Medium mit 2 g L-1 Ammoniumchlorid im
30 L-Bioreaktor.
0,8%iges Agarosegel der pUT649 Proben der Kultivierung in dem
definierten, synthetischem Medium mit 2 g L-1 Ammoniumchlorid im
30 L-Bioreaktor nach 19 und 22 h (M: λ-DNA, BStE II geschnitten).
Qualitätsanalyse des Plasmids pUT649 der Kultivierung im 30 L-
Bioreaktor mittels Kapillargelelektrophorese.
Plasmidkonzentration, Plasmidmassenanteil und Biotrockenmasse
konzentration bei der Kultivierung von pUK21CMVβ in E.coli DH5α in
dem synthetischen Medium im 7 L-Bioreaktor.
Glutamat-, Glycerin,- Ammoniumionen- und Acetatkonzentration im
Verlauf der Kultivierung von pUK21CMVβ in E.coli DH5α in dem
synthetischen Glycerinmedium im 7 L-Bioreaktor.
Plasmidmassenanteil, Biotrockenmasse- und Plasmidkonzentration bei der
Kultivierung von E.coli DH5α mit dem Plasmid pUK21CMVβ in
synthetischem Medium mit 4 g L-1 Ammoniumchlorid im 7 L-Bioreaktor.
Satzkultivierung von E.coli DH5α pUK21CMVβ in M9-Minimalmedium
im 7 L-Bioreaktor.
Plasmid-, Biotrockenmassekonzentration und Plasmidmassenanteil
während der Kultivierung von pUK21CMVβ in E.coli DH5α im
halbsynthetischem Vollmedium mit Glutamat im 7 L-Bioreaktor.
Die folgenden Beispiele dienen der Veranschaulichung der Erfindung und sind nicht in
beschränkender Weise aufzufassen.
Zur Herstellung des 7,6 kBp großen Plasmids pUK21CMVβ wurde der E.coli-Stamm DH5α
(Clontech, Heidelberg, Deutschland, Cat.-Nr. C2007-1) verwendet. Das Plasmid
pUK21CMVβ ist ein pUC21-Abkömmling mit Kanamycin-Resistenz (siehe Viera et al.,
Gene 100 (1991), 189-195) und enthält die β-Galactosidase aus E.coli unter dem CMV
(Cytomegalus)-Promotor. Die Kultivierung wurde in einem 7 L-Bioreaktor (MBR, Wetzikon,
Schweiz) in einem wäßrigen, antibiotika-freien, definierten synthetischen Medium bestehend
aus 60 g L-1 Glycerin (87%), 2 g L-1 Ammoniumchlorid, 30 g L-1 Natrium-L-Glutamat, 1,5 g
L-1 KH2PO4, 2,3 g L-1 K2HPO4, 2,5 g L-1 NaCl, 5 g L-1 Zitronensäure × H2O, 1,0 g L-1 MgSO4
× 7 H2O, 10 mg L-1 Thiaminhydrochlorid und 2 mL L-1 Spurenelementekonzentrat
durchgeführt. Das Spurenelementekonzentrat bestand aus 5,4 g L-1 FeCl3 × 6 H2O, 1,38 g L-1
ZnSO4 × 7 H2O, 1,85 g L-1 MnSO4 × H2O, 0,56 g L-1 CoSO4 × 7 H2O, 0,17 g L-1 CuCl2, 1,0 g
L-1 H3BO3, 2,5 g L-1 NaMoO4 × 2 H2O und 5,0 g L-1 Citronensäure × H2O.
Alle Medienkomponenten mit Ausnahme von Magnesiumsulfat, Thiaminhydrochlorid und
der Spurenelementelösung wurden im Bioreaktor hitzesterilisiert. Das Thiaminhydrochlorid
wurde in Wasser aufgenommen, sterilfiltriert und zur sterilen Spurenelementelösung gegeben.
Das Magnesiumsulfat wurde in Wasser gelöst, separat hitzesterilisiert und dann ebenfalls zur
sterilen Spurenelementelösung gegeben. Die so hergestellte Mischung aus
Spurenelementekonzentrat, Magnesiumsulfat und Thiaminhydrochlorid wurde über einen
Animpfkolben zum sterilen Medium im Bioreaktor hinzugefügt.
Zur Herstellung der Inokulationskultur wurden 200 mL eines sterilen Mediums mit einer
Glycerinkultur von pUK21CMVβ in DH5α beimpft. Nach 8 Stunden Inkubation auf einem
Tischschüttler bei n = 150 min-1 und einer Temperatur von T = 37°C wurden 5 L des sterilen,
synthetischen Mediums im 7 L-Bioreaktor mit 50 mL der Inokulationskultur beimpft.
Die Kultivierung im Bioreaktor wurde bei 37°C und 0,2 bar Reaktorinnendruck durchgeführt.
Die Luftzufuhr erfolgte mit 5 L min-1 und das pH wurde auf 7,0 durch automatische Zugabe
von ortho-Phosphorsäure (10%) und/oder Ammoniaklösung (25%) geregelt. Die Drehzahl
des Rührers wurde ausgehend von einer Minimalfrequenz von 150 min 1 durch die
Gelöstsauerstoffkonzentration (pO2) geregelt. Die Probennahme zur Prozesskontrolle erfolgte
im Abstand von 2 Stunden. Dabei wurde die Biotrockenmassekonzentration und die
Plasmidkonzentration mittels Kapillarelektrophorese (siehe Schmidt et al., J. Biotechnol. 49
(1996), 219-229) nach der Isolierung mit einem handelsüblichen Kit nach Vorschrift des
Herstellers ermittelt. Weiterhin wurde die Konzentration von Mediumsbestandteilen verfolgt.
In Abb. 1 ist der typische Verlauf der wichtigsten Kultivierungsparameter
Rührerfrequenz, Gelöstsauerstoffkonzentration (pO2) und der Kohlendioxidkonzentration in
der Abluft dargestellt. Abb. 2 zeigt den Verlauf der Biotrockenmasse-, der
Plasmidkonzentration und des Plasmidmassenanteils während dieser Kultivierung. Die
Biotrockenmassekonzentration nahm exponentiell zu und erreichte einen maximalen Wert
von X = 20 g L-1. Die maximale Produktkonzentration betrug P = 50 mg L-1 bei einem
Plasmidmassenanteil von wp = 3 mg g-1. Nach 34 Stunden Kultivierungsdauer waren die
Substrate Ammoniumstickstoff, Glutamat und Glycerin vollständig verbraucht (siehe
Abb. 3) und die Bakterienzellen erreichten die stationäre Phase, d. h. es wurde keine
weitere Zunahme der Biomasse erhalten. Auch die maximale Produktkonzentration von P =
50 mg L-1 wurde zu diesem Zeitpunkt erreicht. Das 0,8%ige Agarosegel der isolierten
Plasmid DNA zu verschiedenen Kultivierungszeitpunkten ist in Abb. 4 dargestellt. Die
Plasmid-DNA weist eine sehr hohe Homogenität auf und Lag während des gesamten
Kultivierungszeitraums fast ausschließlich in der ccc-Monomerform (ca. 94%). Aus 5 L
Kulturlösung konnten 250 mg DNA isoliert werden. Diese Produktausbeute ist deutlich höher
als bisher mit synthetischen Medien im Satzverfahren erhalten wurden (siehe Beispiel 4).
Zur Herstellung des 4,6 kBp großen Plasmids pUT649 (Eurogentec, Liege, Belgien) im
Grammmaßstab wurde das antibiotika-freie, definierte, synthetische Medium, welches in
Beispiel 1 beschrieben ist, verwendet. Als Inokulationskultur wurden 200 mL eines sterilen
Mediums mit einer Glycerinkultur von pUT649 in E.coli DH5α beimpft. Nach 8 Stunden
Inkubation auf einem Tischschüttler bei n = 150 min 1 und einer Temperatur von T = 37°C
wurden 20 L des sterilen Mediums, dessen Zusammensetzung in Beispiel 1 beschrieben ist,
im 30 L-Bioreaktor (MBR, Wetzikon, Schweiz) mit 200 mL der Inokulationskultur beimpft.
Die Kultivierung im Bioreaktor wurde bei 37°C und 0,2 bar Reaktorinnendruck durchgeführt.
Die Luftzufuhr erfolgte mit 30 L min-1 und das pH wurde auf 7,0 durch automatische Zugabe
von ortho-Phosphorsäure und/oder Ammoniaklösung geregelt. Die Rührerfrequenz betrug zu
Beginn der Kultivierung n0 = 150 min-1 und wurde mit Hilfe der
Gelöstsauerstoffkonzentration auf einen Sollwert von 40% geregelt. In Abb. 5 sind die
typischen Kultivierungsparameter Rührerfrequenz, Gelöstsauerstoffkonzentration und der
Kohlendioxidgehalt der Reaktorabluft dargestellt. Nach Erreichen der stationären
Wachstumsphase nach 22 Stunden Kultivierungszeit wurden X = 21,9 g L-1 Biotrockenmasse
und eine sehr hohe Plasmidkonzentration von P = 68 mg L-1 erreicht. Dies entspricht einem
Plasmidmassenanteil von wp = 3,1 mg g-1. Die isolierte DNA wies eine sehr hohe
Homogenität auf, was durch das Agarosegel in Abb. 6 dargestellt ist. Die
Qualitätsanalyse der DNA mittels Kapillargelelektrophorese zeigt, dass mehr als 97% der
DNA in der ccc-Monomerform vorliegen. Dieses Beispiel zeigt, dass das erfindungsgemäße
Verfahren auf unterschiedliche Plasmide anwendbar ist und auch einfach in einen größeren
Prozessmaßstab übertragen werden kann. In einem Kultivierungsmaßstab von 20 L können
mit Hilfe der Erfindung 1,3 g sehr homogener Plasmid DNA gewonnen werden. Die erhaltene
Produktkonzentration P = 68 mg L-1 ist die bislang höchste, die durch
Satzkultivierungsverfahren auf synthetischen Medien erhalten wurde. Im Stand der Technik
werden vergleichbar hohe Produktausbeuten nur mit Hilfe von Zulaufkultivierungsverfahren
erhalten.
Im folgenden Beispiel wird der Einfluss der Konzentration der anorganischen Stickstoffquelle
bei der Satzkultivierung von E.coli DH5α mit dem Plasmid pUK21CMVβ in dem gleichen
synthetischen Medium aus Beispiel 1 und 2 im 7 L-Bioreaktor illustriert. Die Kultivierung
wurde unter gleichen Bedingungen, wie in Beispiel 1 beschrieben durchgeführt. Lediglich die
Ammoniumchloridkonzentration im Medium wurde vor der Kultivierung geändert.
Abb. 8 zeigt den Verlauf der Kultivierung ohne Zusatz von Ammoniumchlorid. Nur
durch die pH-Regulierung wurden geringe Mengen Ammonik dem Medium zugeführt. Die
Biotrockenmassekonzentration erreichte nach 40 Stunden einen maximalen Wert von X =
17,5 g L-1. Die Produktkonzentration erreichte bereits nach 30 Stunden einen maximalen Wert
von P = 20 mg L-1, fiel aber im folgenden Verlauf der Kultivierung auf 15 mg L-1 ab. Der
Plasmidmassenanteil blieb nicht konstant, sondern stieg zunächst auf einen maximalen Wert
von wp = 2,7 mg g-1 an und fiel nach 22 h Kultivierungszeit auf Werte unter wp = 1 mg g-1
stark ab. Abb. 9 zeigt den Verbrauch von Ammoniumionen, Glycerin und Glutamat,
sowie die Bildung von Acetat. Nach 22 Stunden Kultivierungsdauer konnte
Ammoniumstickstoff im Medium nicht mehr nachgewiesen werden. Parallel dazu stieg die
Konzentration von Acetat von 0,3 g L-1 auf 1 g an. Da zu diesem Zeitpunkt waren
Glutamat und Glycerin noch ausreichend vorhanden, so dass Ammonium als Limitierendes
Substrat identifiziert wurde.
Deshalb wurde in einer weiteren Kultivierung die Ammoniummenge durch Einsatz von 4 g L-1
Ammoniumchlorid deutlich erhöht. Die Biotrockenmassekonzentration nach 34 h
Kultivierungsdauer betrug X = 26,6 g L-1 (siehe Abb. 10). Die Produktkonzentration
stieg parallel zur Biotrockenmassekonzentration an und erreichte nach 30 Stunden einen
maximalen Wert von P = 41 mg L-1 was einem Plasmidmassenanteil von wp = 1,5 mg g-1
entspricht. Gegenüber der Kultivierung mit 2 g L-1 Ammoniumchlorid (Beispiele 1 und 2)
konnte keine weitere Erhöhung der Produktmenge erreicht werden, so dass bei diesen kein
limitierender Einfluss vorlag.
Dieses Beispiel zeigt eine Satzkultivierung in einem synthetischen Medium, welches dem
Stand der Technik entspricht. Dazu wurde wie in Beispiel 1 und 3 das Plasmid pUK21CMVβ
in E.coli DH5α wurde durch Kultivierung im Literaturbeschriebenen, synthetischen M9-
Minimalmedium (Sambrock et al., Molecular Cloning, CSH Press, 2nd edition, 1989, Cold
Spring Harbor New York), bestehend aus 11 g L-1 Glucose × H2O, 1,0 g L-1 Na2HPO4 × 7
H2O, 3,0 g L-1 KH2PO4, 0,5 g L-1 NaCl, 2,5 g L-1 (NH4)2SO4, 1,4 mg L-1 ZnSO4 × 7 H2O, 5,4 mg
L-1 FeCl2 × 6 H2O, 1,6 mg L-1 MnSO4, 0,167 mg L-1 CuCl2, 0,56 g L-1 CoSO4 × 7 H2O,
0,22 g L-1 MgCl2 × 7 H2O und 14,7 mg L-1 CaCl2 im 7 L-Bioreaktor produziert.
Zur Anfertigung einer Vorkultur wurden 200 mL steriles Medium mit einer Glycerinkultur
beimpft und bei 37°C für 8 Stunden unter Rühren auf einem Tischschüttler bei n = 150 min-1
inkubiert. Mit 50 mL dieser Vorkultur wurden 5 L steriles M9-Medium in einem 7 L-
Bioreaktor inokuliert. Die Kultivierung im Bioreaktor wurde bei 37°C und 0,2 bar
Reaktorinnendruck durchgeführt. Die Luftzufuhr erfolgte mit 5 L min-1 und das pH wurde auf
7,0 durch automatische Zugabe von ortho-Phosphorsäure und/oder Ammoniaklösung
geregelt.
Der Verlauf der Prozessparameter Biotrockenmassekonzentration, Plasmidkonzentration und
Plasmidmassenanteil über die gesamte Kultivierungsdauer von 46 Stunden ist in Abb.
11 dargestellt. Während einer Kultivierungszeit von 44 h wurde eine Biomasse von X = 3,55 g
L-1 erhalten. Die Produktkonzentration auf P = 4,65 mg L-1 nach 44 Stunden beim Erreichen
der stationären Phase an. Der Plasmidmassenanteil war mit wp = 1,3 mg g-1 nach 44 Stunden
deutlich geringer als mit dem erfindungsgemäßen Verfahren in den Beispielen 1 und 2. In
diesen Beispielen wurde eine fünffach höhere Biomassemenge und sogar eine zehnfach
höhere Plasmidkonzentration erhalten.
Zur Illustration der Erhöhung der Produktausbeute durch Zugabe von Glutamat wurde das
Plasmid pUK21CMVβ in E.coli DH5α in einem 7 L-Bioreaktor in einem reichen
halbsynthetischen Vollmedium, welches Glycerin, Sojapepton und Hefeextrakt enthielt, mit
und ohne Glutamat hergestellt.
Zur Herstellung einer Inokulationskultur wurden 200 mL Medium mit einer Glycerinkultur
beimpft und auf einem Tischschüttler bei n = 150 min-1 und 37°C für 10 Stunden inkubiert.
Im 7 L-Bioreaktor wurden 5 L des sterilen Mediums mit 50 mL der Inokulationskultur
beimpft. Die Kultivierung wurde bei 37°C und 0,2 bar Reaktorinnendruck durchgeführt. Die
Luftzufuhr erfolgte mit 5 L min-1 und das pH wurde auf 7,0 durch automatische Zugabe von
ortho-Phosphorsäure und/oder Ammoniaklösung einreguliert.
Ohne Glutamat-Zusatz wurde am Ende der Kultivierung nach 20 Stunden eine
Biotrockenmassekonzentration von X = 7,6 g L-1 und eine Plasmidkonzentration von P = 26 mg
L-1 erhalten.
Durch Zugabe von 30 g L-1 Glutamat zu dem halbsynthetischen Vollmedium in einer weiteren
Kultivierung konnte die Produktausbeute deutlich erhöht werden (siehe Abb. 12). Nach
20 Stunden Kultivierungsdauer wurde eine maximale Biotrockenmassekonzentration von X =
23,9 g L-1 erhalten und dabei die Produktkonzentration deutlich auf P = 45 mg L-1 erhöht.
Dieses Beispiel zeigt, dass selbst bei der Kultivierung in halbsynthetischen Vollmedien die
Produktmenge durch Glutamatzugabe noch deutlich gesteigert werden kann. Glutamat ist ein
wichtiger Medienbestandteil bei der Produktion von Nukleinsäuren und deshalb ein wichtiger
Bestandteil im erfindungsgemäßen Verfahren.
Claims (36)
1. Ein Verfahren zur Herstellung von Nukleinsäuren umfassend die folgenden Schritte
- a) Kultivierung von die Nukleinsäure enthaltenen Bakterienzellen in einem Medium ohne komplexe Bestandteile und
- b) Isolierung der Nukleinsäure.
2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei
das Medium die folgenden synthetischen Bestandteile umfaßt:
- a) organische Kohlenstoffquelle,
- b) anorganische Stickstoffquelle
- c) Mineralsalzmischung und
- d) eine zusätzliche, definierte stickstoff-haltige Komponente, die den Produktstoffwechsel verstärkt.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei für die Zubereitung des Mediums auch
keine Komponenten verwendet werden, die aus Tieren gewonnen werden.
4. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1-3, wobei die Nukleinsäuren superspralisierte
Nukleinsäuren sind.
5. Ein Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1-4, wobei Isolierung der Nukleinsäuren,
die Isolierung der Bakterienzellen aus dem Medium und gegebenenfalls das Waschen
der Bakterienzellen, den Aufschluss der Bakterienzellen und Trennung der
Nukleinsäuren von anderen Zellinhaltsstoffen umfaßt.
6. Ein Verfahren gemäß Anspruch 5, wobei die Trennung der Nukleinsäuren von anderen
Zellinhaltstoffen durch chromatographische Methoden erfolgt.
7. Ein Verfahren gemäß Anspruch 5, wobei die Bakterienzellen vor oder nach der
Isolierung der Bakterienzellen aus dem Medium eingefroren oder gefriergetrocknet
werden.
8. Ein Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1-7, wobei die transformierten
Bakterienzellen Escherichia coli-Zellen sind.
9. Ein Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1-8, wobei ein E.coli K12-Stamm mit
Genotyp recA- oder recA1 verwendet wird.
10. Ein Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1-9, wobei die Nukleinsäuren Plasmide,
Cosmide oder andere größere zirkuläre Nukleinsäuren sind.
11. Ein Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1-10, wobei die gereinigten Nukleinsäuren
in pharmazeutischer Qualität als Wirkstoff in Zell- bzw. Gentherapie und genetischer
Impfung eingesetzt werden können.
12. Ein Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1-1, wobei die organische
Kohlenstoffquelle aus der Gruppe der Monosaccharide, Disaccharide, Polysaccharide
oder Polyole ist.
13. Ein Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1-12, wobei vorzugsweise Glucose,
Maltose, Raffinose, Galactose, Trehalose, Sucrose, Fructose, Mannose, Sorbose,
Fucose, Rhamnose, Arabinose, Xylose, Ribose, Manitol, Sorbitol oder Glycerin als
organische Kohlenstoffquelle verwendet wird.
14. Ein Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1-13, wobei die Konzentration der
Kohlenstoffquelle im Medium 1 bis 500 g/L, vorzugsweise 10 bis 300 g/L und
insbesondere 50 bis 100 g/L ist.
15. Ein Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1-14, wobei Ammoniumsalze, wie zum
Beispiel Ammoniumchlorid, Ammoniumphosphate, Ammoniumsulfat oder
Ammoniumnitrat bzw. Ammoniak selbst als anorganische Stickstoffquelle verwendet
werden.
16. Ein Verfahren gemäß Anspruch 1-15, wobei die Konzentration des Ammoniumsalzes
im Medium 10 bis 200 mM, vorzugsweise 20 bis 80 mM und insbesondere 40 mM ist.
17. Ein Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1-16, wobei die Mineralsalzmischung
mindestens aus wasserlöslichen anorganischen Phosphaten, Chloriden, Natriumsalzen,
Kaliumsalzen und Magnesiumsalzen besteht.
18. Ein Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1-17, wobei die Mineralsalzmischung
vorzugsweise mindestens Kaliumdihydrogenphosphat, Dikaliumhydrogenphosphat,
Natriumchlorid und Magnesiumsulfat enthält.
19. Ein Verfahren gemäß Ansprüche 1-18, wobei die Mineralsalze in den folgenden
Konzentrationen eingesetzt werden: Kaliumdihydrogenphosphat 1 bis 50 g/L,
vorzugsweise 1,5 bis 10 g/L, Dikaliumhydrogenphosphat 1 bis 75 g/L, vorzugsweise
2,3 bis 15 g/L, Natriumchlorid 1 bis 20 g/L, vorzugsweise 2,5 bis 10 g/L und
Magnesiumsulfat 0,1 bis 20 g/L, vorzugsweise 0,3 bis 10 g/L.
20. Ein Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1-19, wobei die Mineralsalzmischung
zusätzlich noch eine Spurenelement-Lösung enthält, umfassend Eisen(III)chlorid,
Zinksulfat, Mangansulfat, Kobaltsulfat, Kupferchlorid, Borsäure, Natriummolybdat
und Zitronensäure.
21. Ein Verfahren gemäß Anspruch 21, wobei die Spurenelement-Lösung
Eisen(III)chlorid in einer Konzentration von 20 mM, Zinksulfat in einer Konzentration
von 5 mM, Mangansulfat in einer Konzentration von 11 mM, Kobaltsulfat in einer
Konzentration von 2 mM, Kupferchlorid in einer Konzentration von 1 mM, Borsäure
in einer Konzentration von 16 mM, Natriummolybdat in einer Konzentration von 11 mM
und Zitronensäure in einer Konzentration von 24 mM enthält.
22. Ein Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1-21, wobei dem Medium wirtsstamm
spezifische Komponenten, z. B. Vitamine oder andere Komponenten, die der
verwendete Wirtsstamm nicht selbst synthetisieren kann, zugesetzt werden.
23. Ein Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1-22, wobei die zusätzliche, definierte
stickstoff-haltige Komponente eine Vorstufe in der Biosynthese der Nukleotidbasen
der Nukleinsäuren ist.
24. Ein Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1-23, wobei die zusätzliche, definierte
stickstoff-haltige Komponente ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus
Aminosäuren, Peptide, Kohlensäureamiden, oder Nukleotide bzw. die Phosphate
dieser Verbindungen.
25. Ein Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1-24, wobei die zusätzliche, definierte
stickstoff-haltige Komponente vorzugsweise ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend
aus: Aspartat, Glutamat, Glutamin, Glycin, Adenosin, Cytosin, Guanin, Thymin, oder
Harnstoff bzw. die Phosphate dieser Verbindungen.
26. Ein Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1-25, wobei die Konzentration der
zusätzlichen, definierten stickstoff-haltigen Komponente im Medium 25 bis
1000 mM, vorzugsweise 50 bis 250 mM ist.
27. Ein Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1-26, wobei das Medium antibiotika-frei
ist.
28. Ein Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1-27, wobei die Kohlenstoffquelle und/
oder die Stickstoffquellen vollständig verstoffwechselt wird.
29. Ein Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1-28, wobei die Kultivierung in einem
temperierbaren Bioreaktor durchgeführt wird.
30. Ein Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1-29, wobei die Kultivierung in einem
Temperaturbereich von 25-42°C, vorzugsweise im Bereich von 36-38°C,
insbesondere 37°C durchgeführt wird.
31. Ein Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1-30, wobei die Bakterienzellen während
der Kultivierung durch das Einblasen von Luft in das Medium mit Sauerstoff versorgt
werden.
32. Ein Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1-31, wobei die Kultivierung in einem pH-
Bereich von 6,0-8,0, vorzugsweise im Bereich von 6,5 bis 7,5 erfolgt.
33. Ein Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1-32, wobei während der Kultivierung das
pH durch Zugabe einer Säure und/oder einer Base geregelt wird.
34. Ein Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1-33, wobei während der Kultivierung
gegebenenfalls Antischaummittel zugegeben wird.
35. Ein Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1-34, wobei die Vorkultivierung in einem
definierten, synthetischen Medium erfolgt.
36. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1-35, wobei die Kultivierung im Satzverfahren
(Satzkultivierungsverfahren) erfolgt.
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