DE3878747T2 - Verfahren zur herstellung von 2-keto-l-gulonsaeure. - Google Patents

Verfahren zur herstellung von 2-keto-l-gulonsaeure.

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DE3878747T2 DE8888305406T DE3878747T DE3878747T2 DE 3878747 T2 DE3878747 T2 DE 3878747T2 DE 8888305406 T DE8888305406 T DE 8888305406T DE 3878747 T DE3878747 T DE 3878747T DE 3878747 T2 DE3878747 T2 DE 3878747T2
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Description

    GEBIET DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung betrifft ein Fermentations-Verfahren zur Herstellung von 2-Keto-L-gulonsäure, die als Zwischenprodukt für die Synthese der L-Ascorbinsäure von Wert ist.
    • HINTERGRUND DER ERFINDUNG
  • 2-Keto-L-gulonsäure, die als Zwischenprodukt für die Synthese der L-Ascorbinsäure wertvoll ist, wird bisher mit Hilfe des industriell eingeführten Verfahrens von Reichstein [Helvetica Chimica Acta 17, 311 (1934)] hergestellt. Dieses Verfahren umfaßt jedoch viele Schritte, erfordert eine große Menge Lösungsmittel und ist aus diesem Grunde als heutige industrielle Technologie unbefriedigend.
  • Auf der anderen Seite hat man an Stelle des Reichstein'schen Verfahrens mehrere Verfahren vorgeschlagen, die hauptsächlich Mikroorganisinen einsetzen. Untersucht wurden beispielsweise ein Verfahren, das die mikrobiologische Oxidation von D-Glucose zu 5-Keto-D-gluconsäure, die Reduktion derselben, entweder chemisch oder mikrobiologisch, zu L-Idonsäure und dann deren mikrobiologische Oxidation zu 2-Keto-L-gulonsäure umfaßt [siehe US-Patent 2 421 611], und ein anderes Verfahren, das die mikrobiologische Oxidation von Glucose zu 2,5-Diketo-D-gluconsäure und deren mikrobiologische oder chemische Reduktion zu 2-Keto-L-gulonsäure umfaßt [siehe die JP-Patentveröffentlichungen Nr. 39-14493, 53-25033, 56-15877 und 59-35920].
  • Die Schritte der chemischen Reduktion bei diesen bekannten Verfahren, d.h. die Reduktion der 5-Keto-D-gluconsäure zu L-Idonsäure bei dem erstgenannten Verfahren und die Reduktion der 2,5-Diketo-D-gluconsäure zu 2-Keto-L-gulonsäure in dein letztgenannten Verfahren sind mit Problemen hinsichtlich der Stereospezifität behaftet und erzeugen D-Gluconsäure bzw. 2-Keto-D-gluconsäure als Nebenprodukte, was zu einer Minderung der Ausbeute führt. Wenn die oben bezeichnete Reduktion mit Hilfe eines Mikroorganismus durchgeführt wird, sollte weiterhin der Mikroorganismus mit einem überschuß an Glucose als Quelle für die Reduktions-Energie versorgt werden, was ebenfalls eine Erniedrigung der Ausbeute nach sich zieht. In dieser Hinsicht kann bei Einsatz von L- Sorbose als Ausgangsstoff 2-Keto-L-Gulonsäure nur durch einen Schritt der Oxidation produziert werden.
  • Tatsächlich hat man mehrere Versuche zur Ausnutzung dieses Vorteils unternommen, bei denen zu den Genera Gluconobacter, Pseudomonas, Serratia, Achromobacter und Alcaligenes gehörende Bakterien eingesetzt wurden [siehe Biotechnology and Bioengineering 14, 799 (1972), die JP-Patentveröffentlichungen Nr. 41-159 und 41-160, das US-Patent 3 043 749, das USSR-Patent 526 660, die JP-Patentveröffentlichung Nr. 49-39838, Acta Microbiologica Sinica 20, 246 (1980) und 21, 185 (1981), und die JP-Patent-Offenlegungsschrift Nr. 62-48389].
  • Die offenbarten Stämme liefern jedoch unzureichende Ausbeuten und sind aus diesem Grunde für die industrielle Nutzung unzureichend.
  • Kürzlich wurde über ein Verfahren zur Herstellung von 2-Keto-L-gulonsäure aus D-Glucose unter Einsatz eines Bakterien-Stammes berichtet, der durch Einführen eines 2,5-Diketo-D-gluconsäure-Reduktase-Gens eines zu Corynebacterium gehörenden Mikroorganismus in einen zu Erwinia gehörenden Mikroorganismus mit Hilfe einer DNA-Rekombinationstechnik erhalten wurde [siehe Science 230, 144 (1985)]. Dieses Verfahren ist jedoch ebenfalls unter dem Gesichtspunkt der produzierten 2-Keto-L-gulonsäure für eine industrielle Nutzung unzureichend.
    • ZIELE DER ERFINDUNG
  • Unter diesen Umständen haben die Erfinder der vorliegenden Erfindung eingehende Untersuchungen angestellt, um ein industriell vorteilhaftes Verfahren zur Produktion von 2-Keto-L-gulonsäure zu erhalten. Als Ergebnis fanden wir bereits, daß aus dem Boden isolierte und als Pseudogluconobacter saccharoketogenes bezeichnete Bakterien eine beträchtliche Menge 2-Keto-L-gulonsäure aus L-Sorbose zu erzeugen vermögen (siehe die veröffentlichte Europäische Patentanmeldung 0 221 707). Dann haben wir bei Untersuchungen über eine Verbesserung jenes Verfahrens überraschenderweise gefunden, daß die Fermentations-Zeit dadurch abgekürzt wird und die Produktions-Ausbeute an 2-Keto-L-gulonsäure aus L-Sorbose in bemerkenswerter Weise dadurch verbessert wird, daß die Bakterien in einem mit einem Seltenerdelement ergänzten Kulturmedium kultiviert werden. Bisher wurde nicht gefunden, daß ein Seltenerdelement einen solchen, die Fermentation fördernden Effekt zeigen kann. Wir haben diese Erscheinung eingehend untersucht und als Ergebnis die folgende Erfindung erreicht.
  • Das Hauptziel der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung eines verbesserten Verfahrens zur Herstellung von 2-Keto-L-gulonsäure aus L-Sorbose.
  • Dieses Ziel und andere Ziele und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden für Fachleuten aus der folgenden Beschreibung deutlich.
    • ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein verbessertes Verfahren zur Herstellung von 2-Keto-L-gulonsäure bereitgestellt, das das Kultivieren eines zum Genus Pseudogluconobacter gehörenden Mikroorganismus umfaßt, der befähigt ist, L-Sorbose zu 2-Keto-L-gulonsäure in einem durch ein Seltenerdelement ergänzten Kulturmedium in Gegenwart von L-Sorbose zu oxidieren.
  • Durch Kultivieren eines zum Genus Pseudogluconobacter gehörenden Mikroorganismus, der befähigt ist, L-Sorbose in Anwesenheit eines Seltenerdelements zu 2-Keto-L-gulonsäure zu oxidieren, kann 2-Keto-L-gulonsäure, die ein wichtiger Ausgangsstoff für die Synthese von L-Ascorbinsäure ist, effizient hergestellt werden.
    • AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
  • Der in der vorliegenden Erfindung eingesetzte Mikroorganismus von Pseudogluconobacter schließt beispielsweise die folgenden, in der veröffentlichten Europäischen Patentanmeldung 0 221 707 beschriebenen Stämme ein:
  • Pseudogluconobacter saccharoketogenes K591s: FERM BP-1130, IFO 14464;
  • Pseudogluconobacter saccharoketogenes 12-5: FERM BP1129, IFO 14465;
  • Pseudogluconobacter saccharoketogenes TH14-86: FERM BP-1128, IFO 14466;
  • Pseudogluconobacter saccharoketogenes 12-15: FERM BP1132, IFO 14482;
  • Pseudogluconobacter saccharoketogenes 12-4: FERM BP1131, IFO 14483;
  • Pseudogluconobacter saccharoketogenes 22-3: FERM BP1133, IFO 14484.
  • Im folgenden können diese Bakterien von Pseudogluconobacter saccharoketogenes auch als Oxidations-Bakterien angesprochen werden.
  • Zu den in der vorliegenden Erfindung eingesetzten Seltenerdelementen zählen beispielsweise Scandium (Sc), Yttrium (Y), Lanthan (La), Cer (Ce), Praseodym (Pr), Neodym (Nd), Samarium (Sm), Europium (Eu), Gadolinium (Gd), Terbium (Tb), Dysprosium (Dy), Holmium (Ho), Erbium (Er), Thulium (Tm), Ytterbium (Yb) und Lutetium (Lu). Diese Seltenerdmetalle können in Form eines Metall-Pulvers oder -Klumpens ergänzend zugeführt werden. Oder sie können in Form ihrer Verbindungen wie der Chloride, Carbonate, Sulfate, Nitrate, Oxide und Oxalate eingesetzt werden. Sie können für sich allein oder in Form einer Kombination aus zwei oder mehr Seltenerdelementen, verwendet werden; beispielsweise können Cercarbonat und Lanthanchlorid simultan eingesetzt werden. Weiterhin kann auch ein Rohprodukt verwendet werden, das im Zuge der Schritte der Isolierung und Reinigung der jeweiligen Elemente erhalten wurde.
  • Die Menge des dem Kulturmedium ergänzend zugeführten Seltenerdelement kann aus einem solchen Bereich gewählt werden, der das Wachstum des eingesetzten Mikroorganismus nicht hemmt. Im alllgemeinen liegt die wirksame Menge im Bereich von 0,000001 bis 0,1 % (Gew./Vol.), vorzugsweise von 0,0001 bis 0,05 % (Gew./Vol.).
  • Als Verfahrensweise zur ergänzenden Zuführung des Elements zu dem Kulturmedium kann die vorherige Zugabe desselben zu dem Kulturmedium oder dessen intermittierende oder kontinuierliche Zugabe während des Kultivierens gewählt werden.
  • Wenn in dem Verfahren der vorliegenden Erfindung das Ausgangsmaterial, d.h. L-Sorbose, dem Kulturmedium zugesetzt wird, kann die gesamte Menge desselben dem Kulturmedium zu Beginn der Kultivierung zugesetzt werden, oder es kann in mehreren Anteilen oder kontinuierlich der Flüssig-Kultur zugesetzt werden. Die Konzentration der L-Sorbose in dem Kulturmedium kann 2 bis 40 Gew./Vol.-%, vorzugsweise 5 bis 30 Gew./Vol.-%, bezogen auf das Kulturmedium, betragen.
  • In dem für die Kultivierung der obigen Oxidations-Bakterien verwendeten Kultur-Medium können Nährstoff-Quellen, die die Bakterien-Stämme auszunutzen vermögen, d.h. Kohlenstoff- Quellen, Stickstoff-Quellen, anorganische Salze, organische Salze und Spuren-Nährstoffe, die von den Stämmen verwertet werden können, verwendet werden.
  • Als Kohlenstoff-Quelle kann L-Sorbose, so wie sie ist, eingesetzt werden. Zusätzlich können als ergänzende Kohlenstoff-Quellen beispielsweise Glucose, Fructose, Glycerin, Sucrose, Lactose, Maltose, Melasse und dergleichen eingesetzt werden.
  • Zu den Stickstoff-Quellen gehören beispielsweise verschiedene Arten von Ammonium-Salzen (z.B. Ammonium-Sulfat, Ammoniumnitrat, Ammoniumchlorid, Ammoniumphosphat etc.), anorganische und organische, Stickstoff enthaltende Verbindungen wie Maisquellflüssigkeit (im folgenden gelegentlich als CSL bezeichnet), Pepton, Fleischextrakt, Hefeextrakt, getrocknete Hefe, Sojabohnenmehl, Baumwollsamenöl, Harnstoff und dergleichen.
  • Als anorganische Salze können, zusätzlich zu den oben bezeichneten Seltenerdelementen, Salze von Kalium, Natrium, Calcium, Magnesium, Eisen, Mangan, Cobalt, Zink, Kupfer und Phosphorsäure verwendet werden.
  • Als Spuren-Nährstoffe können CoA, Pantothensäure, Biotin, Thiamin und Riboflavin, die keiner besonderen Erwähnung bedürfen, da sie essentielle Wachstumsfaktoren für die genannten Bakterien sind, zugesetzt werden. Daneben können Flavinmononucleotid (im folgenden gelegentlich als FMN bezeichnet), das Aktivitäten in bezug auf die Förderung des Wachstums und die Produktion von 2-Keto-L-gulonsäure zeigt, andere Vitamine, L-Cystein, L-Glutaminsäure, Natriumthiosulfat und dergleichen, entweder als Verbindungen oder als sie enthaltende Naturprodukte, in geeigneter Weise zugesetzt werden.
  • Diese Komponenten des Kulturmediums können dem Kulturmedium vorher auf einmal zugesetzt werden, oder ein Teil oder alle von ihnen können intermittierend oder kontinuierlich zu der Flüssig-Kultur hinzugefügt werden.
  • Was die Kultur-Methode betrifft, so kann jedes Verfahren der unbewegten Kultur, Schüttelkultur, Rührkultur oder dergleichen angewandt werden. Für die Massen-Produktion wird jedoch die sogenannte Submerskultur bevorzugt.
  • Die Kultur-Bedingungen variieren naturgemäß in Abängigkeit von der besonderen Art der Stämme, einer besonderen Zusammensetzung des Mediums und dergleichen, und sie können, kurz gesagt, für jeden besonderen Fall so gewählt werden, daß die Ziel-Verbindung mit dem höchsten Wirkungsgrad erzeugt werden kann. So liegt zum Beispiel die Kultur-Temperatur vorzugsweise im Bereich von 25 ºC bis 35 ºC, und der pH-Wert des Kultur-Mediums beträgt wünschenswerterweise etwa 5 bis 9.
  • Wenn die Kultivierung unter den vorstehenden Bedingungen 10 bis 120 h durchgeführt wird, kann die 2-Keto-L-gulonsäure in der höchsten Konzentration angereichert werden. Da der pH-Wert des Mediums im allgemeinen mit der Anreicherung des Ziel-Produkts sinkt, kann ein geeignetes basisches Material, beispielsweise Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid oder Ammoniak zugesetzt werden, um stets den optimalen pH-Wert für die mikrobiologische Erzeugung von 2-Keto-L-gulonsäure aufrechtzuerhalten. Oder ein geeignetes Puffermittel kann dem Kultur-Medium zugesetzt werden, um den optimalen pH-Wert aufrechtzuerhalten.
  • Wenn in der vorliegenden Erfindung der zu dem Genus Pseudogluconobacter gehörende Mikroorganismus in Gegenwart eines Seltenerdelements in einem L-Sorbose enthaltenden flüssigen Medium kultiviert wird, um 2-Keto-L-gulonsäure zu produzieren und in dem Kulturmedium anzureichern, kann die Menge der angereicherten 2-Keto-L-gulonsäure dadurch, daß die obigen Oxidations-Bakterien mit einem anderen Mikroorganismus vermischt werden, im Vergleich zu einer Verwendung der Oxidations-Bakterien, d.h. der zu Pseudogluconobacter gehörenden Mikroorganismen, für sich allein in bemerkenswertem Maße erhöht werden.
  • Zu den zuzumischenden Mikroorganismen zählen Bakterien, die zu den Genera Bacillus, Pseudomonas, Proteus, Citrobacter, Enterobacter, Erwinia, Xanthomonas, Flavobacterium, Micrococcus, Escherichia und dergleichen gehören. Besonders eingeschlossen sind die folgenden Bakterien.
  • Bacillus cereus IFO 3131
  • Bacillus licheniformis IFO 12201
  • Bacillus megaterium IFO 12108
  • Bacillus pumilus IFO 12090
  • Bacillus amyloliquefaciens IFO 3022
  • Bacillus subtilis IFO 13719
  • Bacillus circulans IFO 3967
  • Pseudomonas trifolii IFO 12056
  • Pseudomonas maltophilia IFO 12692
  • Proteus inconstans IFO 12930
  • Citrobacter freundii IFO 13544
  • Enterobacter cloacae IFO 3320
  • Erwinia herbicola IFO 12686
  • Xanthomonas pisi IFO 13556
  • Xanthomonas citri IFO 3835
  • Flavobacterium menigosepticum IFO 12535
  • Micrococcus varians IFO 3765
  • Escherichia coli IFO 3366
  • Eine Flüssig-Kultur, die durch 1 bis 4 Tage Kultivieren jedes dieser Stämme in einem geeigneten Medium bei 20 ºC bis 40 ºC erhalten wurde, kann als Impfkultur des zuzumischenden Mikroorganismus eingesetzt werden. Im allgemeinen beträgt die zu inokulierende Menge wünschenswerterweise 1/10 bis 1/1000 derjenigen der Oxidations-Bakterien (Pseudogluconobacter). Wenn die Misch-Kultur in der Weise durchgeführt wird, daß der mit den Oxidations-Bakterien zu mischende Mikroorganismus in einer solchen, zu inokulierenden Menge vermischt wird, kann das Wachstum der Oxidations-Bakterien gefördert werden und dadurch, im Vergleich zu einer Kultur unter Verwendung der Oxidations-Bakterien allein, L-Sorbose in einer höheren Konzentration in einem kürzeren Zeitraum zu 2-Keto-L-gulonsäure oxidiert werden. Die als zuzumischender Mikroorganismus einzusetzenden Bakterien haben vorzugsweise keine oder nur eine schwache Fähigkeit, L-Sorbose, die der Ausgangsstoff der vorliegenden Erfindung ist, und 2-Keto-L- gulonsäure, die das Ziel-Produkt der vorliegenden Erfindung ist, zu assimilieren. Die anderen Kultur-Bedingungen sind die gleichen wie diejenigen bei Verwendung der Oxidations- Bakterien allein.
  • Weiterhin können die sterilisierten Kulturen bestimmter anderer Arten von Bakterien als die der obigen Oxidations- Bakterien in wirksamer Weise als Bestandteil des Kultur- Mediums verwerter werden. Zu den Bakterien, die auf diese Weise ausgenutzt werden können, zählen solche der Genera Bacillus, Pseudomonas, Citrobacter, Escherichia und Erwinia. Speziell eingeschlossen sind die folgenden Bakterien:
  • Bacillus cereus IFO 3131
  • Bacillus subtilis IFO 3023
  • Bacillus pumilus IFO 12089
  • Bacillus megaterium IFO 12108
  • Bacillus amyloliquefaciens IFO 3022
  • Pseudomonas trifolii IFO 12056
  • Citrobacter freundii IFO 12681
  • Escherichia coli IFO 3456
  • Erwinia herbicola IFO 12686
  • Diese Bakterien können in einem Medium kultiviert werden, in dem sie bei 20 ºC bis 40 ºC in 2 bis 4 Tagen wachsen können.
  • Die resultierende Kultur kann sterilisiert und dem Kultur-Medium der anwesenden Oxidations-Bakterien in einer Menge von 0,5 bis 5,0 Vol./Vol.-% zugesetzt werden, um das Wachstum der Oxidations-Bakterien zu fördern.
  • Die auf diese Weise erzeugte und in dem Kultur-Medium angereicherte 2-Keto-L-gulonsäure kann mittels bekannter Arbeitsweisen unter Ausnutzung ihrer Eigenschaften isoliert und gereinigt werden.
  • 2-Keto-L-gulonsäure kann in Form der freien Säure isoliert werden, oder sie kann in Form ihres Salzes mit, beispielsweise, Natrium, Kalium, Calcium oder Ammonium isoliert werden.
  • Als Verfahren zur Isolierung kann beispielsweise ein Verfahren eingesetzt werden, bei dem die Bakterien-Zellen aus dem Kultur-Medium, entsprechend den Erfordernissen, durch Filtration oder Zentrifugation entfernt werden, die Lösung ohne oder nach Behandlung mit Aktivkohle konzentriert wird und die abgetrennten Kristalle durch Filtration gesammelt und zur Gewinnung der Ziel-Verbindung umkristallisiert werden; weiterhin angewandt werden können die Lösungsmittel-Extraktion, die Chromatographie oder das Aussalzen und dergleichen. Diese Verfahrensweisen können für sich allein, in geeigneter Kombination oder in Wiederholung angewandt werden.
  • Wenn 2-Keto-L-gulonsäure in freier Form erhalten wird, kann sie beispielsweise in ein Salz, des Natriums, Kaliums, Calciums, Ammoniums oder dergleichen, überführt werden, und wenn sie in Form eines Salzes gewonnen wird, kann dieses mit Hilfe eines geeigneten Verfahrens in die freie Säure oder in ein anderes Salz überführt werden.
  • Die in dem Kultur-Medium erzeugte 2-Keto-L-gulonsäure wurde mittels Hochleistungs-Flüssigkeits-Chromatographie unter den folgenden Bedingungen bestimmt.
    • Meßbedingungen der Hochleistungs-Flüssigkeits-Chromatographie:
  • HPLC: 655A-System (hergestellt von Hitachi Seisakusho, Japan)
  • Säule: SCR 101H (sulfoniertes Polystyrol-Gel) (300 mm x 7,9 mm) (hergestellt von Shimadzu Seisakusho, Japan)
  • Fließgeschwindigkeit: 0,8 ml/min (Druck: 50 kg/cm²)
  • Mobile Phase: Verdünnte Schwefelsäure (pH 2,1)
  • Detektor: UV (214 nm) und Differential-Refraktometer
  • Retentions-Zeit: 7,20 min für 2-Keto-L-gulonsäure und 8,33 min für L-Sorbose.
  • Die folgenden Beispiele erläutern die vorliegende Erfindung im einzelnen, sind jedoch nicht als Beschränkung aufzufassen. Alle für die Kultur-Medien verwendeten Prozentzalen sind Gew./Vol.-%, sofern nichts anderes angegeben ist. Die Ausbeuten für die Kulturen in den Beispielen sind als Ausbeute der molaren Umwandlung der produzierten Menge der 2-Keto-L-gulonsäure, bezogen auf diejenige der verwendeten L-Sorbose, angegeben. Beispiel 1 Tabelle 1: Schräg-Medium D-Sorbit Pepton Hefeextrakt Agar pH 7,0
  • Ein aus 2,0 % D-Glucose, 1,0 % Pepton, 1,0 % getrockneter Hefe und 2,0 % CaCO&sub3; (Akadama, hergestellt von Shiraishi Calcium K.K., Japan) bestehendes Impfkultur-Medium (20 ml) wurde in einem 200 ml-Erlenmeyer-Kolben verteilt und 20 min bei 120 ºC autoklaviert. Dieser Kolben wurde mit einer Ösenfüllung Pseudogluconobacter saccharoketogenes K591s (IFO 14464, FERM BP-1130), der auf dem in der Tabelle 1 angegebenen Schrägmedium 3 d bei 30 ºC kultiviert worden war, beimpft und 2 d bei 30 ºC unter Schütteln (200 UpM) kultiviert. Die resultierende Kultur (2 ml) wurde in das gleiche Medium, wie es oben beschrieben ist, überführt und unter den gleichen Bedingungen kultiviert, wonach eine zweite Impfkultur erhalten wurde.
  • Ein Fermentations-Medium (25 ml), das aus 2,0 % CSL, 0,5 % getrockneter Hefe, 0,3 % Ammoniumsulfat, 0,05 % Na&sub2;S&sub2;O&sub3; 5 H&sub2;O, 0,1 % FeSO&sub4; 7 H&sub2;O, 0,005 % CeCl&sub3; 7 H&sub2;O, 3,5 % CaCO&sub3; (Akadama) und 9,5 % L-Sorbose (getrennt sterilisiert) bestand, wurde in einem 200 ml-Erlenmeyer-Kolben verteilt und 20 min bei 120 ºC autoklaviert.
  • Dieses Medium wurde mit der obigen zweiten Impfkultur (1,25 ml) inokuliert und 2 d unter Schütteln bei 30 ºC kultiviert. Die auf diese Weise erhaltene Fermentationslösung enthielt 86,4 mg/ml 2-Keto-L-gulonsäure (Ausbeute: 84,4 %), gemäß der Bestimmung mittels Hochleistungs-Flüssigkeits-Chromatographie. Eine durch Kultivieren in der gleichen Weise, jedoch mit der Abänderung, daß dem Medium kein CeCl&sub3; ergänzend zugesetzt worden war, erhaltene Fermentationslösung enthielt 51,0 mg/ml 2-Keto-L-gulonsäure (Ausbeute: 49,8 %)
    • Beispiel 2
  • Pseudogluconobacter saccharoketogenes 12-4 (IFO 14483, FERM BP-1131), 12-5 (IFO 14465, FERM BP-1129), 12-15 (IFO 14482, FERM BP-1132) und 22-3 (IFO 14484, FERM BP-1133) wurden in der gleichen Weise, wie in Beispiel 1 beschrieben ist, kultiviert, um zweite Impfkulturen zu erhalten.
  • Ein aus 2,0 % CSL, 0,5 % getrockneter Hefe, 0,3 % Ammoniumsulfat, 0,05 % Na&sub2;S&sub2;CO&sub3; 5 H&sub2;O, 0,05 % FeSO&sub4; 7 H&sub2;O, 0,01 % Ce&sub2;(CO&sub3;)&sub3; 8 H&sub2;O, 3,5 % CaCO&sub3; (Akadama) und 9,5 % L-Sorbose (getrennt sterilisiert) bestehendes Fermentations-Medium (25 ml) wurde in einem 200 ml-Erlenmeyer-Kolben verteilt und 20 min bei 120 ºC autoklaviert.
  • Jede der vorstehenden zweiten Impfkulturen (1,25 ml) wurde in einen das Fermentations-Medium enthaltenden Erlenmeyer- Kolben überführt und 3 d unter Schütteln bei 30 ºC kultiviert. Die auf diese Weise erhaltene Fermentations-Lösung wurde mittels Hochleistungs-Flüssigkeits-Chromatographie bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 als Menge der produzierten 2-Keto-L-gulonsäure (mg/ml) zusammen mit denjenigen angegeben, die durch Kultivieren eines Mediums ohne Zusatz von Ce&sub2;(CO&sub3;)&sub3; 8 H&sub2;O erhalten worden waren. Tabelle 2: Cercarbonat Stamm nicht zugesetzt zugesetzt Die Daten in Klammern bezeichnen Ausbeuten.
    • Beispiel 3
  • Pseudogluconobacter saccharoketogenes TH14-86 (IFO 14466, FERM BP-1128) wurde in der gleichen Weise, wie in Beispiel 1 beschrieben ist, kultiviert, um eine zweite Impfkulturen zu erhalten.
  • Ein aus 2,0 % CSL, 0,5 % getrockneter Hefe, 0,3 % Ammoniumsulfat, 0,05 % Na&sub2;S&sub2;O&sub3; 5 H&sub2;O, 0,1 % FeSO&sub4; 7 H&sub2;O, 5 % CaCO&sub3; (Akadama) und 10,5 % L-Sorbose (getrennt sterilisiert) bestehendes Fermentations-Medium (25 ml) wurde in einem 200 ml-Erlenmeyer-Kolben verteilt und 20 min bei 120 ºC autoklaviert. Die obige zweite Impfkultur (1,25 ml) wurde in den das Fermentationsmedium enthaltenden Erlenmeyer-Kolben überführt und 2 d unter Schütteln bei 30 ºC kultiviert. Unter diesen Bedingungen erfolgte die Schüttelkultur unter ergänzendem Zusatz von 0,01 % eines Chlorids von Yttrium, Lanthan, Cer, Neodym, Samarium, Europium, Gadolinium, Terbium, Dysprosium, Holmium, Erbium oder Ytterbium oder von Praseodymoxid oder 0,05 % Scandiumoxid 2 d bei 30 ºC. Die auf diese Weise erhaltene Fermentations-Lösung wurde mittels Hochleistungs-Flüssigkeits-Chromatographie bestimmt. Die Menge der in dem Kultur-Medium produzierten 2-Keto-L-gulon-Säure (mg/ml) ist in der Tabelle 3 aufgeführt. Tabelle 3: Seltenerdelement Menge der produzierten 2-Keto-L-gulonsäure nicht zugesetzt Die Daten in Klammern bezeichnen Ausbeuten.
    • Beispiel 4
  • In der gleichen Weise, wie in Beispiel 1 beschrieben ist, wurde der Stamm Pseudogluconobacter saccharoketogenes TH14-86 kultiviert unter Verwendung des gleichen Fermentations-Mediums, wie es in Beispiel 1 beschrieben ist, dem Lanthanoxid, -chlorid, -carbonat, -nitrat oder -oxalat oder Ceroxid, -chlorid, -sulfat oder -carbonat in der in Tabelle 4 angegebenen Menge zugesetzt worden war. In diesem Fall betrug die Kultur-Dauer 30 h. Die Menge der erhaltenen, in der Fermentations-Lösung produzierten 2-Keto-L-gulonsäure (mg/ml) wurde mittels Hochleistungs-Flüssigkeits-Chromatographie bestimmt. Die Ergenisse sind zusammen mit denjenigen, die durch Kultur ohne ergänzenden Zusatz eines Seltenerdelements erhalten wurden, in der Tabelle 4 aufgeführt. Tabelle 4: Seltenerdelement Zugesetzte Menge (%) Menge der produzierten 2-Keto-L-gulonsäure nicht zugesetzt Die Daten in Klammern bezeichnen Ausbeuten.
    • Beispiel 5
  • Mikroben-Zellen des Bacillus megaterium (IFO 12108), der 2 d bei 28 ºC auf dem in Tabelle 1 angegebenen Schrägmedium wachsen gelassen worden war, wurden in 10 ml sterilisiertem Wasser suspendiert, und das Ganze wurde in einen das Impfkultur-Medium (500 ml) aus Beispiel 1 enthaltenden Sakaguchi-Kolben überführt und auf einem Hin-und-Her-Schüttelgerät (85 Cyclen pro Minute) 2 d bei 28 ºC kultiviert, um eine Impfkultur von Bacillus megaterium zu erhalten. Ein Medium (30 l; pH 7,0), das aus 4,0 % Sucrose, 4,0 Baumwollsamenmehl, 0,65 % K&sub2;HPO&sub4;, 0,55 % KH&sub2;PO&sub4;, 0,05 % Ammoniumsulfat, 0,05 % NaCl, 0,05 % MgSO&sub4; 7 H&sub2;O und 0,05 % Calciumpantothensäure wurde in einen 50 l-Fermenter gefüllt und 20 min bei 120 ºC autoklaviert. Der Fermenter wurde mit der Impfkultur des Bacillus megaterium (1 Liter) beimpft und 4 d unter den folgenden Bedingungen kultiviert: Rühren 200 UPM, Belüftung 24 l/min, innerer Druck 1,0 kg/cm² und Temperatur 28 ºC. Die resultierende Kultur wurde 20 min bei 120 ºC autoklaviert, an einem kalten Ort aufbewahrt, und die sterilisierte Kultur des Bacillus megaterium (im folgenden als Mega-Brühe bezeichnet) wurde als eine der Komponenten des Fermentations-Mediums verwendet.
  • Die Impfkultur aus Beispiel 1 (20 ml) wurde in einem 200 ml- Erlenmeyer-Kolben verteilt und 20 min bei 120 ºC autoklaviert. Eine Ösenfüllung Mikroben-Zellen des Stammes Pseudogluconobacter saccharoketogenes THl4-86, der 4 d bei 28 ºC auf dem in Tabelle 1 angegebenen Schrägmedium wachsen gelassen worden war, wurde in den obigen Kolben inokuliert und 2 d unter Schütteln bei 30 ºC kultiviert. Die erhaltene Kultur (20 ml) wurde in einen 1 Liter-Erlenmeyer-Kolben gefüllt, der ein aus 2,0 % D-Glucose, 3,0 % (Vol./Vol.) Mega-Brühe, 1,0 % CSL, 0,5 % Hefeextrakt, 0,1 % Pepton, 0,3 % Ammoniumsulfat und 2,0 % CaCO&sub3; (Akadama) bestehendes Kulturmedium (200 ml) enthielt, und 2 d unter Schütteln bei 30 ºC kultiviert, um eine zweite Impfkultur von TH14-86 zu erhalten.
  • Getrennt wurde ein die Impfkultur aus Beispiel 2 (20 ml) enthaltender 200 ml-Erlenmeyer-Kolben mit einer Ösenfüllung von Mikroben-Zellen des Bacillus megaterium IFO 12108, die 2 d bei 28 ºC auf einem Schrägmedium wachsen gelassen worden waren, beimpft und 2 d bei 28 ºC der Schüttelkultur unterworfen, um eine Impfkultur des zuzumischenden Mikroorganismus zu erhalten.
  • L-Sorbose (72 g) wurde in Wasser zu einem Volumen von 300 ml gelöst. Dann wurden CSL (60 g), getrocknete Hefe (6 g), Ammoniumsulfat (9 g), FeSO&sub4; 7 H&sub2;O (3 g), FMN (3 mg), Thiamin (3 mg), Biotin (1,5 mg) und Actocol (hergestellt von Takeda Chemical Industries, Ltd., Japan) (0,5 g) in Wasser gelöst oder suspendiert, um das Volumen auf 800 ml zu bringen. Getrennt wurden CaCO&sub3; (Akadam, 240 g) und Ce&sub2;(CO&sub3;)&sub3; 8 H&sub2;O (150 mg) in Wasser zu 1 000 ml suspendiert. Nach 20 min Autoklavieren jedes Mediums wurden die Medien in einen 5 Liter-Fermenter gefüllt, der zuvor sterilisiert worden war. Die zweite Impfkultur des obigen Stammes TH14-86 (300 ml) und die Impfkultur des zuzumischenden Mikroorganismus (4 ml) wurden in diesen Fermenter inokuliert, und die Kultur wurde unter den folgenden Bedingungen begonnen: Temperatur 30 ºC; Belüftung 2,4 l/min; Rühren 800 UpM.
  • Getrennt wurden L-Sorbose (528 g) und LaCl&sub3; 7 H&sub2;O (150 mg) in Wasser gelöst, um das Volumen auf 900 ml zu bringen. Ammoniumsulfat (6 g) und FeSO&sub4; 7 H&sub2;O (3 g) wurden in Wasser gelöst, um das Volumen auf 100 ml zu bringen. Diese Lösungen wurden jeweils 20 min bei 120 ºC autoklaviert und dann aseptisch miteinander vermischt. Von der 6. Stunde nach Beginn der Kultur wurde diese Mischung kontinuierlich in den Fermenter eingeleitet, und die Zugabe wurde in 24 h vervollständigt. Nachdem die Zugabe der Mischung beendet worden war, wurde die Kultur weitere 8 h durchgeführt (Gesamt- Kultur-Dauer: 38 h), wodurch die L-Sorbose in der Lösung vollständig verbraucht wurde und 3,16 l einer Fermentationslösung erhalten wurden. Die Fermentationslösung enthielt 176,0 mg/l 2-Keto-L-gulonsäure (Ausbeute: 86,0 %).
  • Getrennt wurde eine Kultur unter den gleichen Bedingungen durchgeführt, wie sie oben beschrieben sind, jedoch mit der Abweichung, daß Ce&sub2;(CO&sub3;)&sub3; 8 H&sub2;O und LaCl&sub3; 7 H&sub2;O nicht ergänzend zugeführt wurden. In diesem Fall wurde die L-Sorbose verbraucht, wenn die Kultur nach der Zugabe der Mischung weitere 22 h durchgeführt wurde (Gesamt-Kultur- Dauer: 52 h),
  • 161,4 mg/ml 2-Keto-L-gulonsäure wurden in der so erhaltenen Fermentationslösung (3,09 l) produziert (Ausbeute: 77,1 %).
    • Beispiel 6
  • Etwa 260 ml 6N Schwefelsäure wurden unter Rühren zu der in Beispiel 5 erhaltenen, 176,0 mg/ml 2-Keto-L-gulonsäure enthaltenden Fermentationslösung (1 Liter) hinzugefügt, und die entstandenen unlöslichen Stoffe wie Gips und Zellen wurden durch Zentrifugation entfernt. Der resultierende Überstand (1 150 ml) wurde durch eine mit einem Kationenaustausch-Harz IR 120B (H&spplus;-Typ, hergestelllt von Rohm und Haas, USA) (200 ml) geleitet, und die Säule wurde mit destilliertem Wasser (150 ml) gewaschen. Das Eluat und die Waschflüssigkeiten wurden vereinigt und durch eine mit Shirasagi-Kohlenstoff für die Chromatographie (hergestellt von Takeda Chemical Industries, Ltd., Japan) (200 ml) gepackte Säule geleitet, und die Säule wurde mit destilliertem Wasser (150 ml) gewaschen. Die vereinigte Lösung aus Eluat und Waschflüssigkeiten (1 450 ml) wurde unter vermindertem Druck bei etwa 50 ºC auf 250 ml eingeengt. Das Konzentrat ließ man bei 5 ºC über Nacht stehen, um 2-Keto-L-gulonsäure abzutrennen. Die erhaltenen Kristalle wurden durch Filtration gesammelt und mit einer kleinen Menge gekühltem Wasser, kaltem 50-proz. Methanol und kaltem Methanol gewaschen. Das resultierende Produkt wurde über Phosphorpentoxid unter vermindertem Druck getrocknet, wonach 156 g 2-Keto-L-gulonsäuremonohydrat in Form farbloser Kristalle erhalten wurde.
  • Ausbeute: 81,1 %.
  • Schmelzpunkt: 171 ºC (Zers.).
  • Elementaranalyse (C&sub6;H&sub1;&sub0;O&sub7; H&sub2;O)
  • ber.: C: 33,97 %; H: 5,62 %;
  • gef.: C: 33,91 %; H: 5,65 %.
  • Optische Drehung: [α]18D -48º (c = 1,0, in H&sub2;O).
    • Beispiel 7
  • Eine Ösenfüllung Mikroben-Zellen des Stammes Pseudogluconobacter saccharoketogenes TH14-86 wurde in einen 200 ml- Erlenmeyer-Kolben inokuliert, der ein aus 2,0 % D-Glucose, 3,0 % Mega-Brühe (Vol./Vol.), 1,0 % CSL, 0,5 % Hefeextrakt, 0,1 % Pepton, 0,3 % Ammoniumsulfat und 2,0 % CaCO&sub3; (Super #1700, hergestellt von Maruo Calcium K.K., Japan) bestehendes Medium (20 ml) enthielt, und 2 d bei 30 ºC einer Schüttelkultur unterworfen. Die erhaltene Kultur (2 ml) wurde in einen 200 ml-Erlenmeyer-Kolben überführt, der das gleiche Medium (20 ml) enthielt, und in der gleichen Weise wurde die Kultur durchgeführt, um eine zweite Impfkultur der Oxidations-Bakterien zu erhalten.
  • Das aus 2,0 % CSL, 0,5 % getrockneter Hefe, 0,3 % Ammoniumsulfat, 0,05 % Na&sub2;S&sub2;O&sub3; 5 H&sub2;O, 0,1 % FeSO&sub4; 7 H&sub2;O, 5 % CaCO&sub3; (Super #1700, hergestellt von Maruo Calcium K.K., Japan) und 12,5 % L-Sorbose (getrennt sterilisiert) bestehende Fermentations-Medium (25 ml) wurde in einem 200 ml-Erlenmeyer-Kolben verteilt und 20 min bei 120 ºC autoklaviert. Getrennt sterilisiertes CeCl&sub3; 7 H&sub2;O in der in Tabelle 5 angegebenen Menge wurde zu dem dieses Fermentations-Medium enthaltenden Erlenmeyer-Kolben hinzugefügt, und der Kolben wurde mit der oben beschriebenen zweiten Impfkultur (1,25 ml) und der in Beispiel 5 erhaltenen Impfkultur des zuzumischenden Mikroorganismus (0,1 ml) beimpft.
  • Die Menge der in der Fermentationslösung durch 3 d Schüttelkultur bei 30 ºC erhaltenen 2-Keto-L-gulonsäure (mg/ml) ist in der Tabelle 5 angegeben. Tabelle 5: Zugesetzte Menge CeCl&sub3; 7 H&sub2;O (%) Menge der produzierten 2-Keto-L-gulonsäure Die Daten in Klammern bezeichnen Ausbeuten.
    • Beispiel 8
  • Eine zweite Impfkultur der Oxidations-Bakterien des Stammes Pseudogluconobacter saccharoketogenes TH14-86 wurde durch Kultur in der gleichen Weise erhalten, wie in Beispiel 7 beschrieben ist. Das aus 2,0 % CSL, 0,5 % getrockneter Hefe, 0,3 % Ammoniumsulfat, 0,05 % Na&sub2;S&sub2;O&sub3; 5 H&sub2;O, 0,1 % FeSO&sub4; 7 H&sub2;O, 2,5 % CaCO&sub3; (garantiertes Reagens, hergestellt von Wako Pure Chemical Industries, Japan) und 7,5 % L-Sorbose (getrennt sterilisiert) bestehende Fermentations-Medium (25 ml) wurde in einem 200 ml-Erlenmeyer-Kolben verteilt und sterilisiert. Getrennt sterilisiertes CeCl&sub3; 7 H&sub2;O in der in Tabelle 6 angegebenen Menge wurde zu dem dieses Fermentations-Medium enthaltenden Erlenmeyer-Kolben hinzugefügt, und der Kolben wurde mit der oben beschriebenen zweiten Impfkultur (1,25 ml) beimpft.
  • Die Menge der in der Fermentationslösung durch 3 d Schüttelkultur bei 30 ºC erhaltenen 2-Keto-L-gulonsäure (mg/ml) ist in der Tabelle 6 angegeben. Tabelle 6: Zugesetzte Menge CeCl&sub3; 7 H&sub2;O (%) Menge der produzierten 2-Keto-L-gulonsäure Die Daten in Klammern bezeichnen Ausbeuten.
    • Beispiel 9
  • Eine zweite Impfkultur der Oxidations-Bakterien des Stammes Pseudogluconobacter saccharoketogenes TH14-86 wurde durch Kultur in der gleichen Weise erhalten, wie in Beispiel 7 beschrieben ist. Das aus 2,0 % CSL, 0,5 % getrockneter Hefe, 0,3 % Ammoniumsulfat, 0,05 % Na&sub2;S&sub2;O&sub3; 5 H&sub2;O, 0,1 % FeSO&sub4; 7 H&sub2;O, 5,0 % CaCO&sub3; (Super #1700), 12,0 % L-Sorbose (getrennt sterilisiert) und Additiven, die in Tabelle 7 angegeben sind, in den angegebenen Mengen bestehende Fermentations-Medium (20ml) wurde in einem 200 ml-Erlenmeyer- Kolben verteilt und sterilisiert. Der Kolben wurde mit der obigen zweiten Impfkultur (1 ml) beimpft und 2 d bei 30 ºC der Schüttelkultur unterworfen. Die Menge der in der erhaltenen Kultur erzeugten 2-Keto-L-gulonsäure (mg/ml) wurde durch Hochleistungs-Flüssigkeits-Chromatographie bestimmt. Die Ergbenisse sind in der Tabelle 7 zusammen mit denjenigen angegeben, die durch Kultur ohne Zusätze erhalten wurden. Tabelle 7: Zusätze Zugesetzte Menge (%) Menge der produzierten 2-Keto-L-gulonsäure Nichts Lanthan1) (Klumpen) Neodym2) (Metall) Rohes Seltenerdmetallchlorid3) Gemischtes Seltenerdmetalloxid4) Die Daten in Klammern bezeichnen Ausbeuten. 1) und 2): hergestellt von Wako Pure Chemical Industries, Japan; 3): Rohes Seltenerdmetallchlorid: hergestellt von Mitsubishi Kasei K.K., Japan, enthaltend, als Seltenerdelemente, Ce (18,3 %), La (10,0 %), Nd (7,1 %) und Pr (2,0 %). 4): Gemischtes Seltenerdmetalloxid: hergestellt von Santoku Kinzoku Kogyo K.K., Japan, mit der Zusammensetzung 29,5 % La&sub2;O&sub3;, 50,0 % CeO&sub2;, 4,9 % Pr&sub6;O&sub1;&sub1;, 16,0 % Nd&sub2;O&sub3; und nicht mehr als 0,03 % Sm&sub2;O&sub3;.

Claims (7)

1. Verfahren zur Herstellung von 2-Keto-L-gulonsäure, umfassend das Kultivieren eines zum Genus Pseudogluconobacter gehörenden Mikroorganismus, der befähigt ist, L-Sorbose zu 2-Keto-L-gulonsäure zu oxidieren, in einem durch ein Seltenerdelement ergänzten Kulturmedium in Gegenwart von L-Sorbose.
2. Verfahren nach Anspruch 1, worin das Seltenerdelement ein aus der aus Scandium, Yttrium, Lanthan, Cer, Praseodym, Neodym, Samarium, Europium, Gadolinium, Terbium, Dysprosium, Holmium, Erbium, Thulium, Ytterbium und Lutetium bestehenden Gruppe ausgewähltes Element ist.
3. Verfahren nach Anspruch 1, worin eines oder mehrere der Seltenerdelemente in Form von Metall-Pulver, Metall- Klumpen, Chloriden, Carbonaten, Sulfaten, Nitraten, Oxiden und Oxalaten ergänzend zugeführt werden.
4. Verfahren nach Anspruch 1, worin das Seltenerdelement in einer Menge von 0,000001 bis 0,1 % (Gew./Vol.), bezogen auf das Medium, ergänzend zugeführt wird.
5. Verfahren nach Anspruch 4, worin das Seltenerdelement in einer Menge von 0,0001 bis 0,05 % (Gew./Vol.) ergänzend zugeführt wird.
6. Verfahren nach Anspruch 1, worin der Mikroorganismus Pseudogluconobacter saccharoketogenes ist.
7. Verfahren nach Anspruch 6, worin der Mikroorganismus Pseudogluconobacter saccharoketogenes K591s (FERM BP-1130), 12-5 (FERM BP-1129), TH 14-86 (FERM BP-1128) , 12-15 (FERM BP-1132) 12-4 (FERM BP-1131) oder 22-3 (FERM BP-1133) ist.
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