RU1788967C

RU1788967C - Способ получени 2-кето-L-гулоновой кислоты

Info

Publication number: RU1788967C
Application number: SU884355956A
Authority: RU
Inventors: Ногами Икуо; Ямагути Такамаса; Ока Масахиде; Сирафудзи Хидео
Original assignee: Такеда Кемикал Индастриз, Лтд
Priority date: 1987-06-19
Filing date: 1988-06-17
Publication date: 1993-01-15
Also published as: ES2053735T3; IE881846L; EP0295861A3; CA1308051C; DK328488A; DE3878747T2; DE3878747D1; HU203787B; DK171713B1; IE63092B1; EP0295861A2; US4877735A; DK328488D0; ATE86304T1; CN1025049C; HUT47322A; EP0295861B1; KR890000668A; CN1030789A; KR960015455B1

Abstract

Изобретение относитс к способам ферментативного получени 2-кето-1 -гулоновой кислоты, примен емой в качестве промежуточного соединени в синтезе L-аскорбиновой кислоты. Цель изобретени - повышение выхода целевого продукта. Способ получени 2-кето-Ыулоновой кислоты включает культивирование микроорганизмов рода Pseudogluconobacter в питательной среде с L-сорбозой, при этом на стадии ферментации в питательную среду внос т редкоземельный элемент в количестве 0,000001-0,1 мас.%, при этом в процессе культивировани поддерживают концентрацию L - сорбозы 2-40%. рН среды 5-9 и температуру 25-35&deg;С, а культивирование осуществл ют в течение 10-120 ч. 7 табл. (Л С

Description

Насто щее изобретение относитс к способу ферментативного получени 2-ке- TO-L-гулоновой кислоты, примен емой в качестве промежуточного соединени в синтезе L-аскорбиновой кислоты.

Известен способ получени 2-кето-1.-гу- лоновой кислоты из Р-ГЛЮКОЗЫ с использованием единичного бактериального штамма, полученного введением гена ре- дуктазы 2,5-дикето-О-гликоновой кислоты микроорганизма рода Corynebacterium в микроорганизм рода Erwinia применением методов генной инженерии, Однако этот способ неприемлем дл использовани в промышленности с точки зрени количеств образующейс 2-кето-1-гулоновой кислоты.

Наиболее близким техническим решением вл етс способ получени 2-кето-Ь гулоновой кислоты путем культивировани рода Pseudogluconobacter в питательной среде с L-сорбозой.

Цель изобретени - повышение выхода целеього продукта.

Микроорганизм, используемый в насто щем изобретении, включает, например, следующие штаммы, описанные в опубликованной за вке на Европейский патент N° 221707:

Beudogluconobacter Saccharoketogenes K591:FERMBP-1130 JFO 14464,

Pseudogluconobacter Saccharoketogenes 12-5:FERM BP-1129, JFO 14465Pseudogluconobacter Saccharoketogenes TH 14-86:FERM BP-1.128 14466,

Pseudogluconobacter Saccharoketogenes 12-15, FERM BP-1132, JFO 14482,

Pseudogluconobacter Saccharoketogenes 12-4:FERM BP-1131, JFO 14483,

vi

00

о

CN VI

CJ

Pse. udogluconobacter Saccharoketogenes 12-3: PERM BP-1133, JFO 14484, : v

В последующем такие бактерии рода Pse udogluconobacter Saccharoketogenes могут называтьс бактери ми окислени ,

Используемые в насто щем изобретении редкоземельные элементы включают, например: скандий (Sc), иттрий (Y), лантан (La), церий (Се), празеодим (Pr), неодий(1х№), самарий (Sm), европий (Ей), гадолиний (Gd),

тербий (ТЬ), диспрозий (Dy), гольмий (НЬ), эрбий (Ег), тулий (Тт), иттербий (Yb), лютёций (Lu)..; : .:.-.:.;У- /...-,.: : .

Эти редкоземельные элементы могут быть введены в. виде металлического порошка или ила. Или же эти элементы могут быть Исподьзопаны в виде их соединений,

таких как их хлориды, карбонаты, сульфаты,

Нитраты, оксиды и оксэлаты. Элементы могут быть использованы по отдельности йл-и Сочетанием одного или более редкоземельного элемента, например, одновременно могут быть использованы карбонат цё ри с хлоридом лантана Кроме того, может быть использован сырой продукт, полученный в ходе выделени и1 очистки соответствующих элём ентоЬ,. . .- .: : ,

Количество редкоземельного элемента,

вводимого в культурную среду, выбирают Q

таком интервале концентраций, которые не ингибйруюТ рдст Используемого мйкроорга и изм а. Ка к пр а вил о, э ффе кти в н оё кол ичёство находитс в интервале от 0,000001 до 0,1, предпочтительно от 0,0001 до 0,05% (мас./об.). . .: . . ; : :Что касаетс способа введени элемента в культуральйую среду;то элемент может быть введен в культурную срейу предварительно или же может подаватьс периоди-

ё. с к и :: или ; Не п р е р ы в н 6 в ходе

кулЬТЙВИрОВанИЯ, -; ; / ,;: ;. -.

уч В предлагаемом способе при добавленйи к культуральной среде исхо дногЬ продукта (L-сорбозы) все количество его может быть добавлено к культурной Ьреде в начале культивировани ,или же L-сорбоза может быть добавлена; несколькими порци ми. или. йёпрёрывНо к жйдкой культуре. Концентраци L-сорбозы в культуральной среде может составл ть (мас./об.), предпочтительно (мас./об.) в пересчёте на культурную среду.; .

В культуральной среде, используемой дл культЙШрбвани вышеуказанной бактерии окислени ,, источниками питани ,усваиваемыми бактериальными штаммами,

вл ютс источники углерода, источники

азота, неорганические соли, органические соли и следовые питательные вещества.

В качестве источника углерода может

быть использована L-сорбоза как такова .

Кроме того, в качестве дополнительного источника углерода могут быть использованы,

например: глюкоза, фруктоза, глицерин, сахароза , лактоза, мальтоза, мелассы и т.п.

Источники азота включают, например: различные аммониевые соли (например, сульфат аммони , нитрат аммони , хлорид

аммони , фосфат аммони ), содержащие азот неорганические или органические сое- динёни , такие как: замоченный кукурузный экстракт (далее сокращенно обозначаемый как ЗКЭ), пептон, м сной экстракт, дрожжевой экстракт, сухие дрожжи, соева мука, мука из хлопковых сем н, мочевина и т.п.

: В качестве не-органических солей в дополнение к вышеперечисленным сол м редкоземельных элементов могут быть

использованы соли кали , натри , кальци , магни , ж елеза, марганца, кобальта, цинка, меди и фосфорной кислоты..

:В. качестве следовых питательных веществ нельз Не указать на такие добавл емыё вещества, вл ющиес существенным фактором ро:ста вышеуказанных бактерий, как СоА, пант огенова кислота, биотип, ти- амин и рибофла вин. Кроме того, может быть добавлен флавино.вый мононуклеотид (далее сокращенно.рбозначаемый ФМН), про вл ющий промотирующее действие на рост образование 2-кето-Ь-гулоновой кислоты , другие витамины, L-цистеин, L-глута- минова кислота, тиосульфат натри и т.п. в

виде отдельных соединений или срдержа- щих их пр иродных продуктов..

.Эти компоненты культуральной среды могут быть предварительно добавлены в культ ур.альную среду одной порцией, Или

же часть этих компонентов или все их количество может быть добавлено в жидкую культуру периодически или непрерывно,

В качестве способа культивировани может быть использована стационарна

культура, встр хиваема культура или перемешиваема культура и т.п. Однако дл массового производства рекомендуетс так называема погруженна культура.

Разумеетс , услови состо ни культуры мен ютс в зависимости от конкретного вида штамма, конкретного вида штамма, конкретного Состава культуральной среды и т.п. Короче, услови могут быть выбраны дл каждого конкретного случа такими, при которых целевой продукт может быть получен

с наибольшей эффективностью. Например, рекомендуют температуру культивировани р 25-35°С и значение рИ культуральной среды желательно в 5-9,

При культивировании в рекомендованных услови х в течение 10-120 ч 2-кето-1 -гу- лонова кислота накапливаетс в самой высокой концентрации. В этом случае, поскольку по мере накоплени целевого продукта , значение рН падает, дл поддержани оптимального уровн рН, требуемого дл микробиологического получени 2-кето-1 -гулоновой кислоты, могут быть добавлены соответствующие основные соединени , например, гидроксид натри , гид- роксид кали или аммиак. Или же дл поддержани оптимального уровн рН к культуральной среде может быть добавлена соответствующа буферна система.

В насто щем изобретении при культивировании .. микроорганизма рода Pseudogluconobacter в жидкой среде, содержащей L-сорбозу в присутствии редкоземельного элемента с образованием и накоплением 2-кето-1 -гулоновой кислоты в культуральной среде, количество аккумулируемой 2-кето-1 -гулоновой кислоты может быть значительно увеличено путем смешивани вышеуказанной бактерии окислени с другим микроорганизмом по сравнению с использованием одной только бактерии окислени , то есть микроорганизма, принадлежащего к роду Pseudogluconobacter. Перемешиваемые бактерии включают, например, бактерии, принадлежащие к родам Bacillus, Pseudomonas, Proteus, gitrobacter, Enterobacter, Erwinia, Xanthomonas, Flavobacterium, Mfckococcus, Escherichia и т.п.

Более конкретно используют следующие бактерии:

Bacillus cereus JFO 3131, Bacillus cereus JFO 12201 Bacillus.Licheniformis JFO 12108, Bacillus megaterum JFO 12090, Bacillus pumilus JFO 3022, Bacillus amyloliquefaciens JFO 13719, Bacillus subtilis JFO 3967 Pseudomonas mallophilia JFO 12056 . Proteus ineostans JFO 12692 Proteus Inconstans JFO 12930, Citrobacter freundii JFO 13544, Enterobacter cloacae JFO 3320, . Erwinia herbicola JFO 12686 Xanthomonas pisi JFO 13556 Flavobacterium meningosepticum JFO 12535.

Micrococcus variaus JFO 3765, Echerichiacoli JFO 3366. Жидка культура, полученна культивированием любой из перечисленных бактерий в соответствующей среде при 20-40°С в течение 1-4 дней, может быть использована в качестве затравочной культуры подмешиваемого микроорганизма. Как правило, рекомендуют примен ть дл засева количество , составл ющее 1/10-1/1000 от бактерии окислени (Pseudogluconobacter). При 5 проведении смешанного культивировани - путем подмешивани к бактерии окислени подмешиваемого микроорганизма в таком количестве, которое промотирует рост .бактерии окислени , в результате происходит 0 окисление L-сорбозы в 2-кето- -гулоновую кислоту при более высокой концентрации сорбозы и в течение более короткого периода времени по сравнению с использованием одной только бактерии окислени . 5 Бактери , используема в качестве подмешиваемого микроорганизма, желательно, не обладает или обладает слабой способностью ассимилировать L-сорбозу, вл ющуюс исходным продуктом насто щего 0 изобретени , или 2-кето-1 -гулоновую кислоту , вл ющуюс целевым соединением насто щего изобретени . Другие услови культивировани такие же, что и в случае применени одной только бактерии окисле- 5 ни .

Кроме того, могут быть эффективно использованы и стерилизованные культуры определенных видов бактерий, отличных от вышеуказанных бактерий окислени , в каче- 0 стве компонента культуральной среды. Используемые бактерии включают, например, бактерии рода Bacillus. Pseudomonas, Citrobacter, Escherichia и Erwinia. Более конкретно используют следующие бактерии: 5 Bacillus cereus JFO 3131 Bacillus subtilis. JFO 3023, Bacillus pumilus JFO 12089 Bacillus megaterium JFO 12108 Bacillus amyloliquefaciens JFO 3022 0Pseudomonas frifolii JFO 12056 Citrobacter freundii JFO 12681 Escherichia coli JFO 3546 Erwinia herb icola JFO 12686 Эти бактерии могут быть культивирова- 5 ны в средах, в которых происходит их рост при 20-40°С в течение 2-4 дней. Полученна культура может быть стерилизована и добавлена к культуральной среде бактерии окислени насто щего изобретени в коли- 0 честве 0,5-5 об.% с целью промотировать рост бактерии окислени .

Образовавша с и аккумулированна в результате 2-кето-1 -гулонова кислота может быть выделена и очищена известными 5 способами, основанными на использовании ее свойств..

2-кето-1 -гуло.нова кислота может быть выделена в виде свободной кислоты или же она может быть выделена, например, в виде

натриевой, калиевой, кальциевой или аммониевой соли.

В качестве способа выделени может быть использован, например, способ, в котором бактериальные клетки уда л ют фильтрованием или центрифугированием по мере необходимости, после чего раствор концентрируют с добавлением активированного угл или без добавлени его и отде- лением образовавшихс кристаллов фильтрованием и их перекристаллизацией с получением целевого соединени , может быть использована экстракци растворителем , хроматографи , высаливание и т.п. Эти способы могут быть использованы по отдельности , в сочетании или повтором.

При получении 2-кето-Ь-гулоновой кислоты в свободном состо нии она может быть превращена, например, в натриевую, калиевую, кальциевую или аммониевую соль, а при получении кислоты в виде соли, та может быть превращена соответствующим способом в свободную кислоту или другую соль.

Образующуюс в культуральной среде 2-кето-Ьтулоновую кислоту определ ют с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии в следующих услови х.

Услови проведени высокоэффективной жидкостной хроматографии:

ВЭЖХ - система 655А.

Колонка - SCH 101Н (сульфонирован- ный полистирольный гель), 300 х 7,9 мм.

Скорость потока 0,8 мл/мин деление - 50 кг/см2.

. Подвижна фаза - разбавленна серна кислота (рН 2,1).

Детектирование - УФ (214 нм) и дифференциальный рефрактометр.

Врем удерживани - 7.2 мин дл 2-ке- To-L-гулоновой кислоты и 8,33 мин дл L- сорбозы.

Нижеследующие примеры дополнительно в подробност х иллюстрируют насто щее изобретение, но без ограничени его объема. Все приведенные дл культу- ральных сред процентные отношени даны в мае./об,, если нет особых указаний. Выхода дл культур в примерах соответствуют мольному выходу 2-кето-1 -гулоновой кислоты в пересчете на используемую L-сорбозу.

Пример, Среду затравочной культуры (20 мл), содержащую 2% D-глюкозы, 1% пептона, 1% сухих дрожжей и 2% СаСОз, помещают в колбу Эрленмейера на 200 мл и выдерживают 20 минут при 120°С в автоклаве . Колбу засевают одной петелькой штамма Pseudogluconobacter Saccharoketogenes (JFO 14464. FERM BP-1130), выращенного в среде скошенного агара (табл. 1) при 30°С в течение

3 дней и культивированного при встр хивании (200 об/мин), при 30°С в течение 2 дней. Полученную культуру (2 мл) перенос т в ту же среду, что была описана выше, и культивируют в тех же услови х с получением вто . рой затравочной культуры..

В колбу Эрленмейера на 200 мл помещают ферментативную среду (25 мл), содержащую 2% ЗКЭ, 0.5% сухих дрожжей. 0,3% сульфата аммони , 0,05% ЫааЗгОз .5НаО,

0 0,1 % FeSCMJHaO, 0,005% CeCI3.7H20, 3,5% СаСОз (Ака dama) и 9,5% L-сорбозы (стерилизуют отдельно) и выдерживают 20 мин при 120°С в автоклаве,

Полученную среду засевают вышеука5 занной второй затравочной культурой (1,25 мл) и культивируют при встр хивании и 30°С в течение 2 дней. Полученный в результате ферментативный раствор содержит 86,4 мг/мл 2-кето-1.-гулоновой кислоты (выход

0 84,4%) в соответствии с анализом с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии. Ферментативный раствор, полученный в результате культивировани тем же способом, но без добавлени в среду

5 .хлорида цези , содержит 51 мг/мл 2-кето- - гулоновой кислоты (выход 49,8%).

П рим ер2. Штаммы Pseudoluconobacter Saccharoketogenes 12-4 {JFO 14483, FERM BP-1131), 12-5 (JFO 14465, PERM BP-1129),

0 12-15(JFO-14482, FERM BP-1132)и 22-3 (JFO 14484, FERIV1 BP-1133) культивируют способом пример а 1 с получением вторых затравочных культур.

В колбу Эрленмейера на 200 мл помё5 щают ферментативную среду (25 мл), содержащую 2% ЗКЭ, 0,5% сухих дрожжей, 0,3% сульфата аммони . 0,05% Na2S03.5H20, 0,01% FeS04.7H20. 0,05% Се2(СОз):8Н20. 3,5% СаСОз (Ака dama) и 9,5% L-сорбозы

0 (стерилизуют отдельно), и выдерживают в автоклаве 20 мин при 120°С.

Каждую из вышеуказанных вторых затравочных культур (1,25 мл) помещают в колбу Эрленмейера, содержащую

5 ферментативную среду, и культивируют 3 дн при встр хивании и 30°С. Полученный в результате ферментативный раствор анализируют с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии.

0

Полученные результаты приведены в табл.2, где указаны количества образовавшейс 2-кето-1 -гулоновой кислоты (мг/мл) вместе с количествами, полученными при

5 кул ьтивировании в среде без добавлени Се(СОз)з.

П римерЗ. Штамм Pseudogluconobacter Saccharoketogenes TH14-86 (JFO 14466, FERM BP-1128) культивируют по методике.

описанной в примере 1, с получением второй затравочной, культуры.

В колбу Эрленмейера на 200 мл помещают ферментативную среду (25 мл), содержащую 2% ЗКЭ, 0,5% сухих дрожжей, 0,3% сульфата аммони , 0,05% Na2.S203.5H20, 0,1% РеЗОл, 5% СаСОз (Ака dama) и 10,5% L-сорбозы (стерилизована отдельно), и выдерживают 20 минут в автоклаве при 120°С. Вышеуказанную вторую затравочную культуру (1,25 мл) перенос т в колбу Эрленмейера с ферментативной средой и культивируют 2 дн при встр хивании и 30°С. В этих услови х культивирование встр хиваемой культуры провод т путем добавлени 0,0.1% хлорида иттри , лантана, цери , неоди , самари , европи , гадолини , терби , диспрози ,гольми , эрби или иттерби , или оксида празеоди или 0,05% оксида сканди при 30°С в течение 2 дней. Полученный в результате ферментативный раствор анализируют с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии.

Количество образовавшейс 2-кето-Ь гулоновой кислоты в культурэльной среде (мг/мл) приведено в табл.3. .

.П р и м е р 4. По методике примера 1 культивируют штамм Pseudogluconobacter Saccharoketogenes TH14-86 использованием той же ферментативной среды, что и в примере 1, в которую добавлен оксид, хлорид , карбонат, нитрат или оксалатлантана, или оксид, хлорид, сульфат или карбонат, нитрат или оксалат лантана, или оксид, хлорид , сульфат или карбонат цери в количествах , указанных в табл.,4. В данном случае врем культивировани 30 ч..Количество образовавшейс в ферментативном растворе 2-кето-1 -гулоновой кислоты (мг/мл) определ ют с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии.

Полученные результаты приведены в табл.4, где также даны результаты дл культур без добавки редкоземельного элемента.

П р и м е р 5. Микробиэльные клетки Bacillus megaterium (JFO 12108), выращенные в среде скошенного агара (состав в табл.1) при28°С в течение 2 дней, суспенди- руют в ТО мл стерилизованной воды и все количество перенос т в колбу Сакагучи, .содержащую затравочную культуру примера 1 (500 мл), и культивируют при возвратно-поступательном встр хивании (85 встр хиваний в мин) и 28°С в течение 2 дней с получением затравочной культуры Bacillus megaterium. Среду (30 литров, рН 7), содержащую 4% сахарозы, 0,65% foHPO), 0,05% сульфата аммони ,-4% муки хлопковых сем н , 0,05% NaCI, 0,05% MgSO.7H20 и 0,05% кальциевой соли пантогеновой кислоты , загружают в ферментатор на 50 литров и выдерживают в автоклаве 20 мин при 125°С. Ферментатор засеивают затравочной культурой Bacillus megaterium (1 л) и 5 культивируют 4 дн в следующих услови х: перемешивание 200 об/мин, аэраци - 24 л/мин, внутреннее давление 1 кг/см2, температура 28°С. Полученную культуру выдерживают в автоклаве 20 мин при 120°С.

0 хран т в холодном месте и в качестве одного из компонентов ферментативной среды используют стерилизованную культуру Bacillus megaterium (далее называемой ме- га-бульоном).

5 Затравочную культуру примера 1 (20 мл) помещают в колбу Эрленмейера на 200 мл и выдерживают20 мин в автоклаве при 120°С. Одной петелькой микробиальных клеток Pseudogluconobacter ТН14-86, выращенных

0 на среде скошенного агара (состав табл.1) при 28°С в течение 4 дней, засевают содержимое вышеуказанной колбы и культивируют 2 дн при 30°С и встр хивании. Полученную культуру (20 мл) помещают в

5 колбу Эрленмейера на 1 л, содержащую культуральную среду (200 мл), в которой содержитс 2% D-глюкозы, 3% (об./об.) мега- бульона, 1% ЗКЭ, 0,5% дрожжевого экстракта, 0,1 % пептона, 0,3% сульфата ам0 мони и 2% СаСОз (Acadama), и культивируют 2 дн при 30°С и встр хивании с получением второй затравочной культуры штамма ТН14-86.

Отдельно в колбу Эрленмейера на 200

5 мл с затравочной культурой примера 2 (20 мл) высевают одну петельку микробиальных клеток Bacillus megaTerium JFO 12108, выращенных в течение 2 дней при 28°С на среде скошенного агара, и подвергают культиви0 рованию при встр хивании и 28°С в течение 2 дней с получением культуры подмешиваемого микроорганизма.

L-сорбозу (72 г) раствор ют в воде до объема в 300 мл, после чего в воде раство5 р ют или суспендируют ЗКЭ (60 г), сухие дрожжи (6 г), сульфат аммони (9 г), Fe2SO i.7H20 (3 г), ФМН (3 мг), тиамин (3 мг), биотип (1,5 мг) и актокол (0,5 г) до общего объема в 800 мл. Отдельно суспендируют в

0 воде до объема 1000 мл СаСОз (240 г, Acadama) и Се2(СОз)з.8НгО (150 мг). После выдерживани каждой из сред 20 минут в автоклаве при 120°С их загружают в ферментатор на 5 литров, который предвари5 тельно стерилизуют.

Вторую затравочную культуру вышеуказанного штамма ТН 14-86 (300 мл) и затравочную культуру подмешиваемого микроорганизма (4 мл) высевают в ферментатор и начинают культивирование в следующих услови х: температура 30°С, аэраци 2,4 л/мин, скорость перемешивани 800 об./мин.

Отдельно раствор ют в воде до объема 900 мл L-сорбозу (528 г) и аС1з.7Н20 (150 мг). Раствор ют в воде до общего объема в 100 мл сульфата аммони (6 г) и FeS04.7H20 (3 г). Полученные растворы выдерживают 20 мин в автоклаве при 120°С, после чего сме- шивают в асептических услови х. На 6-й час после начала культивировани эту смесь непрерывно добавл ют в фермёнтатор и добавление заканчивают за 24 ч. ПоЈле завершени добавлени смеси культивирование продолжают еще 8 ч (общее врем культивировани 38 ч). За это врем усвоение L-сорбозы в культуре полностью завершаетс и в результате получают 3,16 литра ферментативного раствора, содержащего 176 мг/мл 2-кето-Ьтулоновой кислоты (вы- ход 86%).

Отдельно в вышеописанных услови х провод т культивирование, однако ни Се2(СОз)з.8Н20, ни .7Н2.0 не добавл ют . В этом случае при продолжении культи- вировани еще 22 ч после добавлени смеси происходит полное усвоение L-сорбозы (полное врем культивировани 52 ч). В полученном в результате ферментативном растворе (3,09 л) содержитс 161,4 мг/мл 2-кето-Ь-гулоновой кислоты (выход 77,1 %).

Пример 6. К перемешиваемому ферментативному раствору примера 5, содержащему 176 мг/мл 2-кето-1-гулоновой кислоты (1 л), добавл ют примерно 260 мл 6N серной кислоты и образовавшиес нерастворимые вещества, такие как сульфаты и клетки, удал ют центрифугированием. Полученный раствор (1150 мл) пропускают черезколонку , заполненную катионообменной смолой 1R120 В (Н+-тип) (200 мл), после чего колонку промывают дистиллированной водой (150 мл). Элюат и промывные растворы объедин ют и пропускают через колонку, заполненную углем дл хроматографии (200 мл), после чего колонку промывают дистиллированной водой (150 мл). Объединенный раствор элюата и промывных вод (1450 мл) концентрируют до 250мл при пониженном давлении и пример- но при 50°С. Концентрат оставл ют на сутки при 5°С с отделением 2-кето-и-гулоновой кислоты. Образовавшиес кристаллы отдел ют фильтрованием, промывают небольшим количеством охлажденной воды, 50%-ным холодным метёнолом и хол одным метанолом. Полученное вещество сушат над п тиокисью фосфора при пониженном давлении с получением 156 г (выход 81,1%) бесцветных кристаллов моногидрата 2-кето-1-гулоновой кислоты. Температура плавлени 171°С (с разложением).

Элементный анализ дл СбНю07.Н20

(%)

Вычислено: С 33,97; Н 5,62

Найдено: С 33,91, Н 5,65

Удель.ное вращение - ( а)о18 - 48° (.0,Н20)

Пример. Одной петелькой микроби- альных клеток штамма Pseudogluconobacter Saccharoketogenes TH14-86 засевают колбу Эрленмейера на 200 мл со средой (20 мл), содержащей 2% D-глЮкозы, З об.% мега- бульона, 1% ЗКЭ, 0,5% дрожжевого экстракта , 0,1% пептона, 0,3% сульфата аммони и 2% СаСОз и подвергают культивированию в течение 2 дней при 30°С и встр хивании. Полученную культуру (2 мл) перенос т в колбу Эрленмейера на 200 мл с той же средой (20 мл) и культивирование провод т тем же способом с получением второй затравочной культуры бактерии окислени .

Ферментативную среду (25 мл), содержащую 2% ЗКЭ, 0,5% сухих дрожжей, 0,3% сульфата аммони , 0,05% х а2520з.5Н20, 0.1% FeS04.7H20, 5% СаСОзи 12,5% L-сорбозы (стерилизуют отдельно), помещают в колбу Эрленмейера на 200 мл и выдерживают 20 мин в автоклаве при 120°С. Отдельно стерилизованный .7Н20 в количестве, указанном в табл.5, добавл ют в колбу Эрленмейера , содержащую вышеприведенную ферментативную среду, и содержимое колбы засевают вышеописанной второй затравочной культурой (1,25 мл) и затравочной культурой подмешиваемого микроорганизма , приготовленного в примере 5 (0,1 мл).

Количества образовавшейс при культивировании встр хиванием ферментативного раствора (30°С, .3 дн ), 2-кето-Ь-гулоновой кислоты приведены в табл.5.

П р и м е р 8. По методике примера 1 культивированием штамма ТН14-86 бактерий окислени получают вторую затравочную культуру. Ферментативную среду (25 мл), содержащую 2% ЗКЭ, 0,5% сухих дрожжей , 0,3% сульфата аммони , 0,05% Na2S203.5H20, 0,1% FeS04.7H20, 2.5% СаСОз и 7,5% L-сорбозы (стерилизуют отдельно ), помещают в колбу Эрленмейера на 200 мл и стерилизуют. Отдельно стерилизованный .7Н20 в количестве, указанном -в табл.6, помещают в колбу Эрленмейера в указанную ферментативную среду, которую засевают выше приведенной второй затравочной (1,25 мл).

Количества 2-кетоЧ -гулоновой кислоты (мг/мл) в ферментативном растворе, полученном культивированием встр хиванием при 30°С в течение 3 дней, приведены в табл.6.

П р и м е р 9. По методике примера 7 культивированием штамма ТН14-86 бактерии окислени получают вторую затравочную культуру. Ферментативную среду (20 мл), содержащую 2% ЗКЭ.0,5% сухих дрожжей , 0,3% сульфата аммони , 0,05% Na2S203.5H20, 0,1% Ре5См.7Н20, 5% СаСОз, 12% L-сорбозы, а также добавки, указанные в табл,7, в соответствующих количествах помещают в колбу Эрленмейера на 200 мл и стерилизуют. Содержимое колбы засевают вышеуказанной второй затравочной культурой (1 мл) и подвергают культивированию в течение 2 дней при 30°С и встр хивании, Количество образующейс 2-кето-1 -гулоновой кислоты (мг/мл) в полученной культуре определ ют с помощью

высокоэффективной жидкостной хроматог- рафии.

Полученные результаты приведены в

табл.7, где также указаны результаты, полученные при культивировании без добавок.

Claims

Формула изобретени Способ получени 2-кето-Ьгулоновой кислоты путем культивировани микроорганизмов рода Pseudogluconobacter в питательной среде с L-сорбозой, отличающийс тем, что, с целью повышени выхода целевого продукта, на стадии ферментации в питательную среду внос т

редкоземельный элемент в количестве 0,000001-0,1 мас.%, при этом в процессе культивировани поддерживают концентрацию L-сорбозы 2-40%, рН среды от 5 до 9 и температуру 25-35°С. а культивирование

осуществл ют в течение 10-120 ч.

Цифры в скобках означают усредненный выход.

Таблица 1

Таблица 2

Цифры в скобках означают усредненный выход.

Таблица 3

Цифры в скобках означают усредненный выход.

Количество добавленного -7Н20

О

0,00001 0,0001 0,001 0,01 - OJ

Цифры в скобках показывают усредненный выход.

Таблица 5

Таблица б

Количество образующейс 2-кето- -гулоно- вой кислоты, мг/мл

30,0/37,1%/ 61,2 /75,7%/ 67,1 /83,0%/ 70,7/87,5%/ 70,6 /87,4%/ 70,5/87.2%/

Таблица 7