KR960015455B1 - 2-케토-l-굴론산의 제조방법 - Google Patents

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Abstract

내용없음

Description

2-케토-L-굴론산의 제조방법
본 발명은 L-아스코르브산의 합성용 중간체로 유용한 2-케토-L-굴론산의 발효 제조방법에 관한 것이다.
L-아스코르브산의 합성용 중간체로 유용한 2-케토-L-굴론산은 공업적으로 확립된 소위 라이히스타인 방법[Helvetica Chimica Acta, 17, 311(1934)]에 의해 제조된다. 그러나, 이 방법은 많은 단계를 요구하고 대량의 용매를 필요로 하므로, 오늘날의 공업 기술에는 불충분하다.
한편, 라이히스타인 방법 대신에, 주로 미셍물을 사용하는 몇가지 방법이 제안되었다. 예를 들면 D-글루코즈를 미생물적 산화하여 5-케토-D-글루콘산을 제조하고, 이를 화학적 또는 미생물적으로 환원시켜 L-이돈산을 수득한후, 생성물을 미생물적으로 산화하여 2-케토-L-굴론산을 수득하는 방법[미합중국 특허 제2,421,611호]; 및 D-글루코즈를 미생물적 산화하여 2,5-디케토-D-글루콘산을 제조하고, 이를 미생물적 또는 화학적으로 환원시켜 2-케토-L-굴론산을 수득하는 방법[일본국 특허 공고 제 39-14493호, 제53-25033호, 제56-15877호 및 제59-35920호] 이 연구되었다.
그러나, 이들 방법에 이용된 화학적 환원 단계, 즉 전자의 방법의 경우 5-케토-D-글루콘산에서 이돈산으로의 환원 및 후자의 방법의 경우 2,5-디케토-D-글루콘산에서 2-케토-L-굴론산으로의 환원은 입체특이성의 문제점을 수반하며, 각각 부산물로 D-글루콘산 및 2-케토-D-글루콘산을 생성하게 되므로 수율이 감소하게 된다. 더우기, 상기의 환원을 미생물적으로 수행할때, 과량의 글루시드를 환원 에너지원으로서 미생물에 공급해야 하기 때문에 또한 수율이 저하된다. 각각에서, L-소르보즈를 출발물질로 사용할때 산화단계만으로도 2-케토-L-굴론산이 제조될 수 있다.
사실, 이러한 장점을 이용하는 몇가지 시도가 글루코노박터(Gluconobacter), 슈도모나스(Pseudomonas), 세라티아(Serratia), 아크로모박터(Achromobacter) 및 알칼리게네스(Alcaligenes)속에 속하는 박테리아를 이용함으로써 이루어졌다[Biotechnology and Bioengineering, 14, 799(1972) ; 일본국 특허 공고 제41-159호 및 제41-160호; 미합중국 특허 제3,043,749호; 소련 특허 제526,660호; 일본국 특허 공고 제49-39838호; Acta Microbiological Sinica, 20, 246(1980) 및 21, 185(1981); 일본국 특허 공개 제62-48389호].
그러나 상기에 기재된 균주들은 충분한 수율을 나타내지 못하므로 공업적으로 이용하기에는 불충분하다.
최근, 코리네박테리움(Corynebacterium) 에 속하는 미생물의 2,5-디케토-D-글루콘산 리덕타제 유전자를 DNA 재조합 기술에 따라 에르위니아(Erwinia)에 속하는 미생물에 도입함으로써 수득된 한 박테리아 균주를 사용함으로써 D-글루코즈로부터 2-케토-L-굴론산을 제조하는 방법이 보고되었다[Science, 230, 144(1985)]. 그러나 이 방법 또한 생성된 2-케토-L-굴론산의 양의 면에서 볼때 공업적으로 이용하기에는 불충분하다.
이러한 상황하에, 본 발명자들은 2-케토-L-굴론산을 제조하기 위한 공업적으로 유리한 방법을 확립하기 위해 광범위하게 연구하였다. 그 결과 본 발명자들은 토양으로부터 분리된 슈도글루코노박터 사카로케토케네스(Pseudogluconobacter saccharoketogenes)로 명명된 박테리아가 소르보즈로부터 상당량의 2-케토-L-굴론산을 생산할 수 있다는 것을 이미 발견하였다(유럽 특허 공개 제221,707호). 그리고 이 방법을 개량하기 위해 연구하는 과정에서 예기치 않게, 박테리아를 희토류 원소를 첨가한 배양배지에서 배양함으로써 발효시간이 단축되고, L-소르보즈로부터 2-케토-L-굴론산의 생산 수율이 현저하게 향상될 수 있다는 것을 발견하였다. 희토류 원소가 이러한 발효 촉진 효과를 나타낼 수 있다는 것은 아직 알려진 바 없다.
본 발명자들은 이러한 현상을 광범위하게 연구하고 그 결과 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
본 발명의 주요 목적은 L-소르보즈로부터 2-케토-L-굴론산의 개량 제조방법을 제공하는 것이다.
이 목적 및 기타 본 발명의 목적 및 이점은 하기의 실시예로부터 이 분야에 통상의 지식을 가진자에게 명백해질 것이다.
본 발명에 따라, L-소르보즈를 2-케토-L-굴론산으로 산화시키는 능력을 갖는 슈도글루코노박터 속의 미생물을 L-소르보즈 존재하에 희토류 원소를 첨가한 배양배지에서 배양함을 특징으로 하는, 2-케토-L-굴론산의 개량 제조방법이 제공된다.
L-소르보즈를 2-케토-L-굴론산으로 산화시키는 능력을 갖는 슈도글루코노박터 속의 미생물을 희토류 원소 존재하에 배양함으로써, L-아스코르브산 합성을 위한 중요한 출발물질인 2-케토-L-굴론산이 효과적으로 제조될 수 있다.
본 발명에 사용된 슈도글루코노박터의 미생물은 예를 들면 유럽 특허 공개 제221,707호에 기재된 하기의 균주이다 :
슈도글루코노박터 사카로케토게네스 K591s : FERM BP-1130, IFO 14464, KFCC 10275;
슈도글루코노박터 사카로케토게네스 12-5 : FERM BP-l129, IFO 14465, KFCC 10274;
슈도글루코노박터 사카로케토게네스 TH14-86 : FERM BP-1128, IFO l4466, KFCC 10273;
슈도글루코노박터 사카로케토게네스 12-l5 : FERM BP-1132, IFO l4482, KFCC 10277;
슈도글루코노박터 사카로케토게네스 12-4 : FERM BP-1131, IFO 14483, KFCC 10276 ;
슈도글루코노박터 사카로케토게네스 22-3 : FERM BP-1l33, IFO 14484, KFCC 10278;
상기의 미생물들은 한국 종균 협회에 상기의 KFCC 수탁번호로 1986년 9월 22일자로 기탁되어 있다.
이후, 이들 슈도글루코노박터 사카로케토게네스 박테리아는 산화박테리아로 약칭할 수도 있다.
본 발명에 사용된 희토류 원소는 예를 들면 스칸듐(Sc), 이트륨(Y), 란타늄(La), 세륨(Ce), 프라세오디뮴(Pr), 네오디뮴(Nd), 사마륨(Sm), 유로피움(Eu), 가돌리늄(Gd), 테르븀(Tb), 디스프로슘(Dy), 홀뮴(Ho), 에르븀(Er), 툴륨(Tm), 이테르븀(Yb) 및 루테륨(Lu)이다. 이들 희토류 원소는 금속 분말 또는 금속편의 형태로 첨가될 수 있다. 또는, 그의 염화물, 탄산염, 황산염, 질산염, 산화물 및 옥살산염과 같은 화합물의 형태로 사용될 수도 있다. 이들은 단독으로 또는 물 이상의 희토류 원소를 배합하여 사용할 수 있으며, 예를 들면 탄산 세륨 및 염화란타늄이 동시에 사용될 수 있다. 더우기, 각 원소의 분리 및 정제단계 동안 수득된 조생성물도 사용될 수 있다.
배양배지에 첨가하는 희토류 원소의 양은 사용된 미생물의 성장을 억제하지 않는 범위내에서 선택될 수 있다. 일반적으로, 효과적인 양은 0.00000l∼0.1%(w/v), 바람직하게는 0.0001∼0.05%(w/v)이다.
배양배지에 원소를 첨가하는 방법은, 배양배지에 미리 첨가하거나, 배양동안 간헐적으로 또는 연속적으로 첨가할 수 있다.
본 발명의 방법에서, 출발물질, 즉 L-소르보즈를 배양배지에 가할때, 배양 개시시에 그의 총량을 배양 배지에 가하거나, 액체 배양액에 여러번에 나누어서 또는 연속적으로 가할 수 있다. 배양배지에서 L-소르보즈의 농도는 배양배지를 기준으로 2∼40%(w/v), 바람직하게는 5∼30%(w/v)이다.
상기의 산화박테리아의 배양을 위해 사용된 배양배지에서, 박테리아 균주에 의해 이용될 수 있는 영양원, 즉 균주에 의해 이용될 수 있는 탄소원, 질소원, 무기염, 유기염 및 미량 영양물질을 사용할 수 있다.
탄소원으로는 L-소르보즈가 그 자체로 사용될 수 있다. 또한 보충 탄소원으로, 예를 들면 글루코즈, 프럭토즈, 글리세린, 슈크로즈, 락토즈, 말토즈, 당밀 등이 사용될 수 있다.
질소원은 예를 들면 각종 암모늄염(예, 황산암모늄, 질산암모늄, 염화암모늄, 질산암모늄), 옥수수 침지액(이후 CSL로 약칭한다.), 펩톤, 육류 추출물, 이스트 추출물, 건조이스트, 대두분, 면실밀 및 우레아 등과 같은 질소를 함유한 무기 또는 유기 화합물이다.
상기의 희토류 원소와 더불어 무기염으로 포타슘, 소듐, 칼슘, 마그네슘, 철, 망간, 코발트, 아연, 구리 및 인산의 염이 사용될 수 있다.
미량 영양 물질로는 말할 나위 없이 상기 박테리아의 필수 성장 인자인 CoA, 펜토텐산, 비오틴, 티아민 및 리보플라빈을 가할 수 있다. 덧붙여, 성장 촉진 활성 및 2-케토-L-굴론산의 생산성을 나타내는 플라빈 모노뉴클레오티드(이후 FMN으로 약칭한다.), 기타 비타민, L-시스테인, L-글루탐산 및 티오황산나트륨 등을 화합물 또는 이들을 함유한 천연 생성물로 적당히 가할 수 있다.
이러한 배양배지의 성분은 미리 한번에 배양배지에 가하거나, 이들 전제 또는 일부를 간헐적으로 또는 연속적으로 액체 배양액에 가할 수 없다.
배양 방법으로는 정치 배양, 진탕 배양 또는 교반 배양 등을 사용할 수 있다. 그러나 대량 생산을 위해 심부 통기 교반 배양이 바람직하다.
물론, 배양 조건은 균주의 종류, 배양배지의 조성 등에 따라 변화되며, 간략하면 목적 생성물이 고 효율로 생성될 수 있도록 경우에 따라 선택될 수 있다. 예를 들어, 배양 온도는 25∼35℃가 바람직하고, 배양배지의 pH는 약 5∼9가 바람직하다.
상기의 조건하에 10∼120시간 배양할때,2-케토-L-굴론산이 높은 농도로 축적될 수 있다. 이 경우에, pH는 목적 생성물이 축적됨에 따라 일반적으로 저하되기 때문에, 적당한 염기성 물질, 예를 들면 수산화나트륨, 수산화칼륨 또는 암모니아를 가하여, 2-케토-L-굴론산의 미생물적 제조에 최적 pH를 항상 유지할 수 있다. 그렇지 않으면, 적당한 완충액을 배양배지에 가하여 최적 pH를 유지할 수 있다.
본 발명에 있어서, 슈도글루코노박터 속의 미생물을 L-소르보즈를 함유한 액체 배지에서 희토류 원소 존재하에 배양하여 배양배지내에서 2-케토-L-굴론산을 생산 및 축적할때, 상기의 산화박테리아를 또다른 미생물과 혼합함으로써 산화박테리아, 즉 슈도글루코노박터만을 사용할때에 비해 축적된 2-케토-L-굴론산의 양이 현저하게 증가할 수 있다.
혼합될 미생물로는, 예를 들면 바실루스, 슈도모나스, 프로테우스, 시트로박터, 엔테로박터, 에르위니아, 크산토모나스, 플라보박데리움, 미크로코쿠스, 에스케리키아 등의 속에 속하는 박테리아가 있다. 더욱 특별하게는 하기의 박테리아가 있다.
바실루스 세레우스(Bacillus cereus) IFO 3131 ;
바실루스 리케니포르미스(Bacillus licheniformis) IFO 12201;
바실루스 메가테리움(Bacillus megaterium) IFO 12108 ;
바실루스 푸밀루스(Bacillus pumilus) IFO 12090 ;
바실루스 아밀로리퀘파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens ) IFO 3022 ;
바실루스 서브틸리스(Bacillus subtilis) IFO 13719 ;
바실루스 시르쿨란스(Bacillus circulans) IFO 3967 ;
슈도모나스 트리폴리이(Pseudomonas trifolii) IFO 12056 ;
슈도모나스 말토필리아(Pseudomonas maltophilia )IFO 12692 ;
프로테우스 인콘스탄스(Proteus inconstans) IFO 12930 ;
시트로박터 프레운디이(Citrobacter freundii) IFO 13544 ;
엔테로박터 클로아카에(Enterobacter cloacae) IFO 3320 ;
에르위니아 헤르비콜라(Erwinia herbicola) IFO 12686 ;
크산토모나스 피시(Xanthomonas pisi) IFO 13556 ;
크산토모나스 시트리(Xanthomonas citri) IFO 3835 ;
플라보박테리움 메닝고셉티쿰(Flavobacterium meningosepticum ) IFO 12535 ;
미크로코쿠스 바리안스(Micrococcus varians) IFO 3765 ;
에스케리키아 콜리(Escherichia coli) IFO 3366 ;
이들 박테리아중 어느것을 적당한 배지에서 20∼40℃로 1∼4일 동안 배양함으로써 수득된 액체 배양액을 혼합된 미생물의 종배양액으로 사용할 수 있다. 일반적으로, 접종량은 산화박테리아(Pseudogluconobacter)의 1/10∼1/1000이 바람직하다. 혼합될 미생물을 접종될 양으로 산화박테리아와 혼합함으로써 혼합 배양을 수행할때, 산화박테리아의 성장이 촉진될 수 있으며, 그럼으로써 산화박테리아만을 사용한 배양에 비해서 더 짧은 시간내에 높은 농도의 L-소르보즈를 2-케토-L-굴론산으로 산화시킬 수 있다. 혼합된 미생물로 사용되는 박테리아는 본 발명의 출발물질인 L-소르보즈 또는 본 발명의 목적 생성물인 2-케토-L-굴론산을 동화시키는 특성을 전혀 갖고 있지 않거나 약하게 갖고 있는 것이 바람직하다. 기타의 배양 조건은 산화박테리아만을 사용하는 경우와 동일하다.
덧불여, 상기의 산화박테리아 이외의 특정 박테리아의 멸균 배양액을 배양배지의 성분으로 유효하게 이용할 수 있다. 이용될 수 있는 박테리아는, 예를 들면 바실루스, 슈도모나스, 시트로박터, 에스케리키아 및 에르위니아 속의 것이 있다. 더욱 특별하게는 하기의 박테리아가 있다.
바실루스 세레우스(Bacillus cereus) IFO 3131;
바실루스 서브틸리스 (Bacillus subtilis) IFO 3023 ;
바실루스 푸밀루스(Bacillus pumilus) IFO 12089 ;
바실루스 메가테리움(Bacillus megaterium) IFO 12108 ;
바실루스 아밀로리퀘파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) IFO 3022 ;
슈도모나스 트리폴리이 (Pseudomonas trifolii) IFO l2056 ;
시트로박터 프레운디이(Citrobacter freundii) IFO 12681 ;
에스케리키아 콜리(Escherichia coli) IFO 3546 ;
에르위니아 헤르비콜라(Erwinia herbicola) IFO 12686
이들 박테리아를 배지에서 20∼40℃로 2∼4일 동안 배양할 수 있다. 생성된 배양액을 멸균하고, 0.5∼5.0%(w/v)의 양으로 본 발명의 산화박테리아의 배양배지에서 가하여 산화박테리아의 성장을 촉진시킬 수 있다.
이렇게 배양배지에 생성 및 축적된 2-케토-L-굴론산을 그의 특성을 이용하는 공지 수단에 의해 분리 및 정제할 수 있다.
2-케토-L-굴론산을 유리산 형태로 분리할 수 있다. 또는, 예를 들면 소듐, 포타슘, 칼슘 또는 암모늄과의 염으로 분리할 수 있다.
분리 방법으로는, 예를 들면, 배양배지로부터 필요한 여과 또는 원심분리에 의해 박테리아 세포를 제거하고, 이어서 활성탄 처리후 또는 활성탄 처리하지 않고 용액을 농축한후, 분리된 결정을 여과 수거하고, 재결정하여 목적 생성물을 수득하는 방법 ; 용매 추출 ; 크로마토그래피 ; 염석 등을 이용할 수 있다. 이들 방법은 단독으로, 적당히 배합하여 또는 반복하여 이용할 수 있다.
2-케토-L-굴론산을 유리된 형태로 수득할때, 예를 들면 소듐, 포타슘, 칼슘, 암모늄 등의 염으로 전환될 수 있으며, 염으로 수득될때, 적당한 방법에 의해 유리된 형태 또는 다른 염으로 전환될 수 있다.
배양배지에 생성된 2-케토-L-굴론산을 하기의 조건하에 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 결정한다.
고성능 액체 크로마토그래피의 측정 조건 :
HPLC : 655A 시스템(일본국 히다찌 세이사꾸쇼 제)
컬럼 : SCR 101H(술폰화 폴리스티렌겔), 300×7.9mm(일본국 시마즈 세이사꾸쇼 제)
유속 : 0.8ml/분(압력 : 50kg/㎠)
이동상 : 묽은 황산(pH 2.1)
검출기 : UV(214nm) 및 미분회절기
체류시간 : 2-케토-L-굴론산은 7.20분 및 L-소르보즈는 8.33분
하기의 실시예는 본 발명을 더욱 상세히 설명하는 것이며, 본 발명의 범위를 제한하는 것은 아니다. 배양배지에 사용된 모든 퍼센트는 특별한 설명이 없는 한 %(w/v)이다. 실시예에서의 배양 수율은 사용된 L-소르보즈의 양을 기준으로 생성된 2-케토-L-굴론산의 양을 몰 전환 수율로 표시한 것이다.
[표1]
Figure kpo00001
D-글루코즈 2.0%, 펩톤 1.0%, 건조이스트 1.0% 및 CaCO3(Akadama, 일본국 시라이시칼슘 가부시끼가이샤 제품) 2.0%로 구성된 종배양배지(20ml)를 200ml 삼각 플라스크에 넣고, 120℃에서 20분 동안 오토클레이브 한다. 이 플라스크에, 표 1에 나타낸 사면 배지에서 30℃로 3일 동안 성장된 슈도글루코노박터 사카로케토게네스 K591s 균주(IFO l4464, FERM BP-1130) 1 루우프를 접종시키고, 30℃에서 2일 동안 진탕(200rpm)배양한다. 생성된 배양액(2ml)를 상기에 동일한 배지에 옮겨 같은 조건하에 배양하여 제2종배양액을 수득한다.
CSL 2.0%, 건조이스트 0.5%, 황산암모늄 0.3%, Na2S2O3·5H2O 0.05%, FeSO4·7H2O 0.1%, CeC137H2O 0.005%, CaCO3(Akadama) 3.5% 및 L-소르보즈 9.5%(따로 멸균)로 구성된 발효 배지(25ml)를 200ml 삼각 플라스크에 넣고, 120℃에서 20분 동안 오토클레이브 한다. 여기에 상기의 제2종배양액(1.25ml)을 접종하고,30℃에서 2일 동안 진탕 배양한다. 이렇게 수득된 발효 용액을 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 결정하면 86.4mg/ml의 2-케토-L-굴론산(수율 : 84.4%)을 함유한다. 51.0mg/ml의 2-케토-L-굴론산을 함유한 배지에 염화세륨을 가하지 않는 것을 제외하고는 같은 방법으로 배양함으로써 발효 용액을 수득한다(수율 49.8%).
(실시예 2)
슈도글루코노박터 사카로케토게네스 12-4(IFO 14483, FERM BP-1131), 12-5(IFO 14465, FERM BP-1129), 12-15(IFO 14482, FERM BP-1132) 및 22-3(IFO 14484, FERM BP-1133) 균주를 실시예 1과 같은 방법으로 배양하여 제2종배양액을 수득한다.
CSL 2.0%, 건조이스트 0.5%, 황산암모늄 0.3%, Na2S2O3·5H2O 0.05%, FeSO2·7H2O 0.01%, Ce2(CO3)3·8H2O 0.05%, CaCO3(Akadama) 3.5% 및 L-소르보즈 9.5%(따로 멸균)으로 구성된 발효 배지(25ml)를 200ml 삼각 플라스크에 넣고, 120℃에서 20분간 오토클레이브 한다.
상기 제2종배양액(1.25ml) 각각을 발효 배지를 함유한 삼각 플라스크에 옮기고, 30℃에서 3일 동안 진탕 배양한다. 이렇게 수득된 발효 용액을 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 측정한다. 결과는 생성된 2-케토-L-굴론산의 양(mg/ml)을 Ce2(CO3)3·8H2O를 가하지 않은 배지에서 배양함으로써 수득된 양과 함께 표 2에 나타낸다.
[표 2]
Figure kpo00002
괄호안의 데이타는 수율을 의미한다.
(실시예 3)
슈도글루코노박터 사카로케토게네스 TH14-86(IFO 14466, FERM BP-1128)를 실시예 1과 같은 방법으로 배양하여 제 2 종배양액을 수득한다.
CSL 2.0%, 건조이스트 0.5%, 황산암모늄 0.3%, Na2S2O3·5H2O 0.05%, FeSO4·7H2O 0.1%, CaCO3(Akadama) 5% 및 L-소르보즈 10.5%(따로 멸균)로 구성된 발효 배지(25ml)를 200ml의 삼각 플라스크에 넣고, 120℃에서 20분 동안 오토클레이브 한다. 상기의 제2종배양액(1.25ml)를 발효 배지를 함유한 삼각 플라스크에 옮기고,30℃에서 2일 동안 진탕 배양한다. 이러한 조건하에, 0.01%의 이트륨, 란타늄, 세륨, 네오디뮴, 사마륨, 유로피움, 가돌리늄, 테르븀, 디스프로슘, 홀뮴, 에르븀 또는 이테르븀의 염산염 또는 프라세오디뮴 산화물, 또는 0.05%의 스칸듐 산화물을 첨가함으로써 30℃에서 2일 동안 진탕 배양을 수행한다. 이렇게 수득된 발효 용액을 고성능 액제 크로마토그래피에 의해 측정한다. 배양배지에 생성된 2-케토-L-굴론산의 양(mg/ml)은 표 3에 나타낸다.
[표 3]
Figure kpo00003
괄호안의 데이타는 수율을 의미한다.
(실시예 4)
실시예 1의 방법에 따라, 표 4에 기재된 양의 란타늄 산화물, 염산염, 탄산염, 질산염 또는 옥살산염, 또는 세륨 산화물, 염산염, 황산염 또는 탄산염을 가한 실시예 1과 같은 발효 배지를 사용하여 슈도글루코노박터 사카로케트게네스 TH14-86 균주를 배양한다. 이 경우에, 배양기간은 30시간이다. 수득된 발효 용액에 생성된 2-케토-L-굴론산의 양(mg/ml)을 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 결정한다. 결과는 희토류 원소를 가하지 않고 배양하여 수득된 양과 함께 표 4에 나타낸다.
[표 4]
Figure kpo00004
괄호안의 데이다는 수율을 의미한다.
(실시예 5)
표 1에 나타낸 사면 배지에서 28℃로 2일 동안 성장시킨 바실루스 메가테리움(IFO 12108)의 미생물 세포를 10ml의 멸균수에 현탁시키고, 이들 모두를 실시예 1의 종배양배지(500ml)를 합유한 사까구찌 플라스크에 옮긴후, 28℃에서 2일 동안 왕복 진탕(85spm) 배양하여 바실루스 메가테리움의 종배양액을 수득한다. 슈크로즈 4.0%, 면실밀 4.0%, K2HPO40.65%, KH2PO40.05%, 황산암모늄 0.05%, NaCl 0.05%, MgSO4·7H2O 0.05% 및 칼슘 판토텐산 0.05%로 구성된 배지(30ℓ, pH 7.0)를 50ℓ 발효기에 채우고, 125℃에서 20분 동안 오토클레이브 한다. 발효기를 바실루스 메가테리움(1l)의 종배양액으로 접종시키고, 하기의 조건하에 4일 동안 배양한다 : 교반 200rpm, 통기 24ℓ/분, 내부압력 1.0kg/㎠ 및 온도 28℃. 생성된 배양액을 120℃에서 20분 동안 오토클레이브 하고, 냉소에 보관한후, 바실루스 메가테리움의 멸균 배양액(이후 메가브로스로 약칭한다)의 발효 배지의 성분중 하나로 사용한다.
실시예 1의 종배양액(20ml)를 200ml 삼각 플라스크에 넣고, 120℃에서 20분 동안 오토클레이브 한다. 표 1에 나타낸 사면 배지에서 28℃로 4일 동안 성장된 슈도글루코노박터 사카로케토게네스 TH14-86의 미생물 세포 1 루우프를 상기 플라스크에 접종시키고, 30℃에서 2일 동안 진탕 배양한다.
수득된 배양액을, D-글루코즈, 2.0%, 메가브로스 3.0%(w/v), CSL 1.0%, 이스트 추출물 0.5%, 펩톤 0.1%, 황산암모늄 0.3% 및 CaCO3(Akadama) 2.0%로 구성된 배양배지(200ml)를 함유한 1ℓ 삼각 플라스크에 넣고, 30℃에서 2일 동안 진탕 배양하여 TH14-86 균주의 제2종배양액을 수득한다.
한편 실시예 2의 종배양액(20ml)을 합유한 삼각 플라스크 200ml를, 사면 배지에서 28℃로 2일 동안 성장된 바실루스 메가테리움 IFO 12108의 미생물 1 세포 1 루우프로 접종시키고, 28℃에서 2일 동안 진탕 배양하여 혼합된 미생물의 종배양액을 수득한다.
L-소르보즈(72g)을 물에 용해시켜 부피를 300ml로 만든다. CSL(60g), 건조이스트(6g), 황산암모늄(9g), FeSO4·7H2O(3g), FMN(3mg), 티아민(3mg), 비오틴(1.5mg) 및 악토콜(일본국 다께다야꾸힝고오교 가부시끼가이샤 제품)(0.5g)을 물에 용해 또는 현탁시켜 부피를 800ml로 만든다.
한편, CaCO3(Akadama, 240mg) 및 Ce2(CO3)3·8H2O(150mg)을 물에 현탁시켜 1000ml로 만든다. 각배지를 120℃에서 20분 동안 오토클레이브한 후, 미리 멸균된 5ℓ 발효기에 채운다.
상기 TH14-86 균주의 제2종배양액(300ml) 및 혼합된 미생물의 종배양액(4ml)을 이 발효기에 접종시키고, 하기의 조건하에 배양을 시작한다: 온도 30℃, 통기 2.4ℓ/분 및 교반 800rpm.
한편, L-소르보즈(528g) 및 LaCl3·7H2O(150mg)을 물에 용해시켜 부피를 900ml로 만든다. 황산암모늄(6g) 및 FeSO4·7H2O(3g)을 물에 용해시켜 부피를 100ml로 만든다. 이들을 각각 120℃에서 20분 동안 오토클레이브 하고, 무균적으로 혼합한다. 배양 개시후 6시간부터, 이 혼합물을 발효기에 연속적으로 가하고, 24시간 내에 첨가를 완결한다. 혼합물의 첨가 완결후, 8시간 동안 배양을 더 수행(총 배양기간 : 38시간)하여 배양액중의 L-소르보즈를 완전히 소비시키고 3.16ℓ의 발효 용액을 수득한다. 발효 용액은 176.0mg/ml의 2-케토-L-굴론산(수율 : 86.0%)를 함유한다.
한편, Ce2(CO3)3·8H2O 및 LaCl3·7H2O를 첨가하지 않는 것을 제외하고, 상술한 조건하에 배양을 수행한다. 이 경우에, 혼합물 첨가후 22시간 동안 더 배양할때 L-소르보즈가 완전히 소비된다(총 배양 기간 : 52시간).
161.4mg/ml의 2-케토-L-굴론산이 상기에서 수득된 발효 용액(3.09ℓ)에 생성된다(수율 : 77.1%).
(실시예 6)
약 260ml의 6N 황산을 교반하면서 176.0mg/ml의 2-케토-L-굴론산을 함유한 실시예 5에서 수득된 발효 용액(1ℓ)에 교반하면서 가하고, 플라스터 및 세포와 같은 형성된 불용물을 원심분리 제거한다. 생성된 상층액(1150ml)을 양이온 교환 수지 IR120B(H+형, 미합중국 롬 앤드 하스 제품)(200ml)으로 패킹된 컬럼에 통과시키고, 컬럼을 증류수(150ml)로 세척한다. 용출물 및 세척물을 합하여 크로마토그래피용 시라사기 탄소(일본국 다께다야꾸힝고오교 가부시끼가이샤 제품)(200ml)로 패킹된 컬럼에 통과시키고, 컬럼을 증류수(150ml)로 세척한다. 용출액 및 세척물(1450ml)의 합한 용액을 약 50℃에서 감압하 250ml로 농축한다. 농축물을 5℃에서 밤새 방치하여 2-케토-L-굴론산을 분리한다. 수득된 결정을 여과 수거하고, 소량의 냉수, 50% 냉메탄올 및 냉메탄올로 세척한다. 생성물을 감압하 오산화인으로 건조시키고 무색결정상의 2-케토-L-굴론산 1수화물 156g을 수득한다.
수율 : 81.1%
융점 : 171℃(분해)
원소분석(%) : C6H10O7· H2O
계산치(%) : C ; 33.97, H ; 5.62
실측치(%) : C ; 33.91, H ; 5.65
비선광도[α]D 18=(-48。[C=1.0, H2O)
(실시예 7)
슈도글루코노박터 사카로케토게네스 TH14-86 균주의 미생물 세포 1 루우프를, L-글루코즈 2.0%, 메가브로스 3. %(v/v), CSL 1.0%, 이스트 추출물 0.5%, 펩톤 0.1%, 황산암모늄 0.3% 및 CaCO3(일본국 마루오칼슘 가부시끼가이샤제슈퍼 #1700) 2.0%로 구성된 배지(20ml)를 함유한 200ml 삼각 플라스크에 접종하고, 30℃에서 2일 동안 진탕 배양한다. 수득된 배양액(2ml)을 동일한 배지(20ml)를 함유한 200ml 삼각 플라스크에 옮기고, 같은 방법으로 배양을 수행하여 산화박테리아의 제2종배양액을 수득한다.
CSL 2.0%, 건조이스트 0.5%, 황산암모늄 0.3%, Na2S3O3·5H2O 0.05%, FeSO4·7H2O 0.1%, CaCO3(일본국 마루오칼슘 가부시끼가이샤제 슈퍼 #1700) 5% 및 L-소르보즈 12.5%(따로 멸균)로 구성된 발효 배지(25ml)를 200ml 삼각 플라스크에 넣고, 120℃에서 20분간 오토클레이브 한다. 표 5에 나타낸 량의 따로 멸균된 CeC13·7H2O를 이 발효 배지를 함유한 삼각 플라스크에 가하고, 플라스크를 상술한 제2종배양액(1.25ml) 및 실시예 5에서 수득된 혼합될 미생물의 종배양액(0.1ml)로 접종한다.
30℃에서 3일 동안 진탕 배양함으로써 수득된 발효 용액중의 2-케토-L-굴론산의 양(mg/ml)은 표 5에 나타낸다.
[표 5]
Figure kpo00005
괄호안의 데이타는 수율을 의미한다.
(실시예 8)
실시예 7과 같은 방법으로 배양함으로써 산화박테리아 THl4-86의 제2종배양액을 수득한다. CSL 2.0%, 건조이스트 0.5%, 황산암모늄 0.3%, Na2S2O3·5H2O 0.05%, FeSO4·7H2O 0.1%, CaCO3(일본국 와코퓨어케미칼사제 보증시약) 2.5% 및 L-소르보즈 7.5%(따로 멸균)로 구성된 발효 배지(25ml)를 200ml 삼각 플라스크에 넣어 멸균한다. 표 6에 나타낸 량의 따로 멸균된 CeC13·7H2O를 이 발효 배지를 함유한 삼각 플라스크에 가하고, 상기의 제2종배양액(125ml)으로 접종시킨다. 30℃에서 3일 동안 진탕 배양함으로써 수득된 발효 용액중의 2-케토-L-굴론산의 양(mg/ml)은 표 6에 나타낸다.
[표6]
Figure kpo00006
괄호안의 데이타는 수율을 의미한다.
(실시예 9)
실시예 7과 같은 방법으로 배양함으로써 산화박테리아 TH14-86의 제2종배양액을 수득한다. CSL 2.0%, 건조이스트 0.5%, 황산암모늄 0.3%, Na2S2O3·5H2O 0.05%, FeSO4·7H2O 0.1%, CaCO3(슈퍼 #1700) 5.0%, L-소르보즈 12.0%(따로 멸균) 및 표 7에 나타낸 량의 첨가제로 구성된 발효 배지(20ml)를 200ml 삼각 플라스크에 넣어 멸균시킨다.
플라스크를 상기의 제2종배양액(1ml)로 접종시키고, 30℃에서 2일 동안 진탕 배양한다. 수득된 배양액중에 생성된 2-케토-L-굴론산의 양(mg/ml)을 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 측정한다. 결과는 첨가하지 않고 배양하여 수득된 양과 함께 표 7에 나타낸다.
[표 7]
Figure kpo00007
Figure kpo00008
주:1) 및 2): 일본국 와코퓨어케미칼사 제품
3):조 희토류 염산염(희토류 원소로 Ce(18.3%), La(10.0%), Nd(7.1%) 및 Pr(2.0%)를 함유한 일본국 미쓰비시가세이사 제품)
4):혼합된 희토류 산화물(La2O329.5%, CeO250.0%, Pr6O114.9%, Nd2O316.0% 및 Sm2O30.03% 이하의 조성을 갖는 일본국 산도꾸 긴조꾸 고오교사 제품)
괄호안의 데이타는 수율을 의미한다.

Claims (7)

  1. L-소르보즈를 2-케토-L-굴론산으로 산화시키는 능력을 갖는 슈도글루코노박터(Pseudogluconobacter)속의 미생물을 L-소르보즈 존재하에 희토류 원소를 첨가한 배양배지에서 배양함을 특징으로 하는 2-케토-L-굴론산의 제조방법.
  2. 제1항에 있어서, 희토류 원소가 스칸듐, 이트륨, 란타늄, 세륨, 프라세오디뮴, 네오디뮴, 사마륨, 유로피움, 가돌리늄, 테르븀, 디스프로슘, 홀뮴, 에르븀, 툴륨, 이테르븀 및 루데륨의 군에서 선태된 원소인 방법.
  3. 제1항에 있어서, 하나 또는 다수의 희토류 원소를 금속분말, 금속편, 염산염, 탄산염,황산염, 질산염, 산화물 및 옥살산염의 형태로 첨가하는 방법.
  4. 제1항에 있어서, 희토류 원소를 배지를 기준으로 0.000001∼0.1%(w/v)의 양으로 첨가하는 방법.
  5. 제4항에 있어서, 양이 0.0001∼0.05%(w/v)인 방법.
  6. 제1항에 있어서, 미생물이 슈도글루코노박터 사카로케토게네스(Pseudogluconobacter saccharoketogenes) 인 방법.
  7. 제6항에 있어서, 미생물이 슈도글루코노박더 사카로케토게네스 K591s(FERM BP-1130 ; KFCC 10275), 12-5(FERM BP-1129 ; KFCC 10274), TH14-86(FERM BP-1128; KFCC 10273),12-15(FERM BP-1132 ; KFCC 10277), 12-4(FERM BP-1131; KFCC 10276) 또는 22-3(FERM BP-1133 ; KFCC l0278) 인 방법.
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