DK171713B1

DK171713B1 - Fremgangsmåde til fremstilling af 2-keto-L-gulonsyre

Info

Publication number: DK171713B1
Application number: DK328488A
Authority: DK
Inventors: Ikuo Nogami; Takamasa Yamaguchi; Masahide Oka; Hideo Shirafuji
Original assignee: Takeda Chemical Industries Ltd
Priority date: 1987-06-19
Filing date: 1988-06-16
Publication date: 1997-04-01
Also published as: DK328488A; DE3878747D1; EP0295861B1; US4877735A; ES2053735T3; HUT47322A; CN1025049C; DK328488D0; DE3878747T2; KR960015455B1; ATE86304T1; EP0295861A2; KR890000668A; IE881846L; CN1030789A; IE63092B1; CA1308051C; EP0295861A3; HU203787B; RU1788967C

Description

DK 171713 B1

Den foreliggende opfindelse angår en særlig fremgangsmåde, nemlig en gæringsfremgangsmåde til fremstilling af 2-keto-L-gulonsyre, en forbindelse der er nyttig som mellemprodukt ved syntese af L-askorbinsyre.

5 2-Keto-L-gulonsyre har man til brug som mellem produkt til syntese af L-askorbinsyre fremstillet ved den industrielt indarbejdede Reichstein-metode (se Helvetica Chimica Acta, J_7, 31 1 , 1934). Denne metode indebærer imidlertid mange trin og behøver stor mængde op-10 løsningsmiddel, hvorfor den ikke er tilstrækkelig god til nutidens industrielle teknologi.

I stedet for Reichstein-metoden har man på den anden side foreslået adskillige fremgangsmåder, i hovedsagen med anvendelse af mikroorganismer. Fx kendes der 15 en fremgangsmåde ved hvilket man underkaster mikrobiologisk oxidation til dannelse af 5-keto-D-glukonsyre, reducerer denne kemisk eller mikrobiologisk til dannelse af L-idonsyre og derefter oxiderer denne resulterende forbindelse mikrobiologisk til dannelse af 2-keto-L-20 gulonsyre (se US-patentskrift nr. 2.421.611); og en fremgangsmåde som indebærer at man oxiderer D-glukose mikrobiologisk til dannelse af 2,5-diketo-D-glukonsyre og reducerer denne forbindelse mikrobiologisk eller kemisk til dannelse af 2-keto-L-gulonsyre (se de japanske 25 patentpublikationer nr. 39-14493, 53-25033, 56-15877 og 59-35920) .

Koniske reduktionstrin som anvendes ved disse fremgangsmåder, dvs. reduktionen af 5-keto-D-glukonsyre til idonsyre ved førstnævnte fremgangsmåde og reduktionen 30 af 2,5-diketo-D-glukonsyre til 2-keto-L-gulonsyre i sidstnævnte, er imidlertid ledsaget med problemer med hensyn til stereospecificiteten, og de medfører dannelse af henholdsvis D-glukonsyre og 2-keto-D-glukonsyre som biprodukter, hvilket medfører nedgang i udbytterne.

35 Når ovennævnte reduktion udføres mikrobiologisk skal der endvidere udføres en meget stor mængde glucid til mikroorganismer som kilde til reduktionsenergi, hvilket også 2 DK 171713 B1 medfører nedsættelse af udbytterne. Desuden gælder det når L-sorbose bruges som udgangsmateriale, så kan 2-ke-to-L-gulonsyre kun fremstilledes ved et oxidationstrin.

Faktisk har der været gjort flere forsøg på at 5 udnytte denne fordel ved anvendelse af bakterier hørende til slægterne Gluconobacter, Pseudomonas, Serratia, Achromobacter og Alcaligenes (se Biotechnology and Bioengineering, 799, 1972; de japanske patentpublika tioner nr. 41-159 og 41-160; US patentskrift nr.

10 3.034.749; USSR patentskrift nr. 526.660; japansk pa tentpublikation nr. 49-39838; Acta Microbiological Sini-ca, 2^.' 246 ( 1980) og 2J_, 185 ( 1981); og japansk offent-liggjort patentpublikation nr. 62-48389).

De anførte stammer giver imidlertid utilstrække-15 ligt udbytte og er derfor utilfredsstillende til industriel anvendelse.

Der er fornyligt rapporteret en fremgangsmåde til fremstilling af 2-keto-L-gulonsyre ud fra D-glukose ved anvendelse af en bakteriestamme frembragt ved indføring af 20 2,5-diketo-D-glukonsyre-reduktasegenet fra en mikroor ganisme hørende til slægten Corynebacterium i en mikroorganisme hørende til slægten Erwinia, idet denne indføring er sket ved en DNA-rekombinationsteknik (se Science, 230, 144 (1985)). Denne fremgangsmåde er imidlertid også 25 utilfredsstillende til industriel udnyttelse i betragtning af den mængde 2-keto-L-gulonsyre der frembringes derved.

Der er derfor foretaget intensiv undersøgelse med henblik på at tilvejebringe en industriel fordelag-30 tig fremgangsmåde til fremstilling af 2-keto-L-gulonsyre. Som resultat heraf har det vist sig,at bakterier isoleret fra jorden og benævnt Pseudogluconobacter saccharoketo-genes kan frembringe en anselig mængde 2-keto-L-gulonsyre ud fra L-sorbose (se Europæisk offentliggjort patentan-35 søgning nr. 221.707). Under videre undersøgelser med henblik på at forbedre denne fremgangsmåde har det overraskende vist sig at gæringstiden forkortes og produk- DK 171713 B1 3 tionsudbyttet af 2-keto-L-gulonsyre ud fra L-sorbose forbedres bemærkelsesværdigt ved dyrkning af bakterierne i et dyrkningsmedium suppleret med et af de sjældne jordarters grundstoffer. Det har ikke tidligere været 5 kendt, at de sjældne jordarters grundstoffer kan udvise en sådan gæringsfremmende virkning. Nærværende opfindere har foretaget intensiv undersøgelse over dette fænomen og er herved kommet frem til den foreliggende opfindelse, hvis formål er at tilvejebringe en forbedret 10 fremgangsmåde til fremstilling af 2-keto-L-gulonsyre ud fra L-sorbose.

Opfindelsen angår således en fremgangsmåde til fremstilling af 2-keto-L-gulonsyre ved at man dyrker en mikroorganisme hørende til slægten Pseudogluconobacter og med evne til at oxidere L-sorbose til 2-keto-L-gulonsyre i et X 5 dyrkningsmedium i nærværelse af L-sorbose, hvilken fremgangsmåde er ejendommelig ved at dyrkningsmediet indeholder mindst ét af de sjældne jordarters metaller.

Ved dyrkning af mikroorganisme hørende til slægten Pseudogluconobacter og med evne til at oxidere L-20 sorbose til 2-keto-L-gulonsyre i nærværelse af et sjældent jordartsmetal kan 2-keto-L-gulonsyre, der er et vigtigt udgangsmateriale til syntese af L-askorbinsyre, produceres effektivt.

Mikroorganismen af slægten Pseudogluconobacter 25 som anvendes ved den foreliggende opfindelse kan fx være en af de følgende stammer, der er beskrevet i offentliggjort europæisk patentansøgning nr. 221.707 og dansk patentansøgning nr. 4896/86:

Pseudogluconobacter saccharoketogenes K591s: 30 FERM BP-1130, IFO 14464,

Pseudogluconobacter saccharoketogenes 12-5: FERM BP-1129, IFO 14465,

Pseudogluconobacter saccharoketogenes TH14-86: FERM BP-1128, IFO 14466, 35 Pseudogluconobacter saccharoketogenes 12-15: FERM BP-1132, IFO 14482, 4 DK 171713 B1

Pseudogluconobacter saccharoketogenes 12-4: FERM BP-1131, IFO 14483,

Pseudogluconobacter saccharoketogenes 22-3: FERM BP-1133, IFO 14484.

5 I det følgende vil disse bakterier hørende til arten Pseudogluconobacter saccharoketogenes blive omtalt som oxidationsbakterier.

De sjældne jordarters grundstoffer kan bruges ved den foreliggende fremgangsmåde er fx scandium (Sc), yt-10 trium (Y), lanthan (La), cerium (Ce), praseodym (Pr), neodym (Nd), samarium (Sm), europium (Eu), gadolinium (Gd), terbium (Tb), dysprosium (Dy), holmium (Hd), erbium (Er), thulium (Tm), ytterbium (Yb) og lutetium (Lu). Disse sjældne jordarters grundstoffer kan tilføres 15 i form af metalpulver eller metalstykker. De kan også bruges i form af forbindelser deraf såsom klorider, karbonater, sulfater, nitrater, oxider eller oxalater. De kan bruges alene eller i kombination af to eller flere af de sjældne jordarters metaller; fx kan ceriumkarbonat 20 og lanthanklorid bruges samtidig. Desuden kan der bruges et råprodukt dannet under isolerings- og rensningstrin for de respektive grundstoffer.

Den mængde sjældent jordartsmetal som føres til dyrkningsmediet kan være en hvilket som helst mængde 25 blot den ikke hæmmer væksten af den almene organisme. I almindelighed rangerer de effektive mængder fra 0,000001 til 0,1% v/v, fortrinsvis fra 0,0001 til 0,5% . v/v (dvs. vægt i gram pr. volumen i milliliter) . til 0,05% v/v.

^ Hvad angår tilførslen af det sjældne jordarts me tal til dyrkningsmediet kan det være tilført i forvejen til dyrkningsmedium, eller det kan tilføres med mellemrum eller kontinuerligt under dyrkningen.

Når udgangsmaterialet ifølge fremgangsmåden for den 3 5 J foreliggende opfindelse, altså L-sorbose sættes til dyrkningsmediet, kan hele mængden-sættes til dyrkningsmediet ved dyrkningens begyndelse eller den kan tilsættes por- 5 DK 171713 B1 tionsvis eller kontinuerligt til det væskeformige dyrkningsmedium. Koncentrationen af L-sorbose i dyrkningsmediet kan være 2-40% v/v, fortrinsvis 5-30% v/v, regnet på mængden af dyrkningsmedium.

5 I det dyrkningsmedium der bruges til dyrkning af de nævnte oxidationsbakterier skal der være næringskilder til stede, som kan udnyttes af bakteriestammerne, dvs. kilder til kulstof, kilder til nitrogen, uorganiske salte, organiske salte og spor-næringsstoffer som kan 10 udnyttes af vedkommende stamme.

Som kulstofkilde kan L-sorbose bruges som det er. Desuden kan der indgå supplerende kulstofkilder som fx glukose, fruktose, glycerol, sakkarose, laktose, maltose, melasse og lignende stoffer.

15 Som eksempler på nitrogenkilder kan nævnes for skellige slags ammoniumsalte (fx ammoniumsulfat, ammoniumnitrat, ammoniumklorid og ammoniumfosfat), uorganiske eller organiske materialer indeholdende nitrogen såsom majsstøbevand (i det følgende også betegnet CSL), 20 pepton, kødekstrakt, gærekstrat, tørret gær, sojamel, bomuldsfrømel og urinstof.

Som uorganiske salte kan der foruden de ovenfor nævnte salte af de sjældne jordarters metaller nævnes salte af kalium, natrium, kalcium, magnesium, jern, man-25 gan, kobolt, zink, kobber og fosforsyre.

Som spor-næringsstoffer kan der naturligvis tilføres CoA, pantothensyre, biotin, tiamin og riboflavin som er essentielle vækstfaktorer for ovennævnte bakterier. Desuden kan der i passende omfang tilsættes flavin-mono-30 nuklotid (i det følgende også betegnet FMN) som har fremmende virkning på bakterievæksten og produktionen af 2-keto-L-gulonsyre, andre vitaminer, L-cystein, L-glu-taminsyre og natriumtiosulfat såvel som forbindelser eller naturprodukter indeholdende disse forbindelser.

35 Disse bestanddele af dyrkningsmediet kan være sat til dyrkningsmediet fra begyndelsen. Det er også muligt at tilsætte en del af dem eller det hele med mel- 6 DK 171713 B1 lemrum eller kontinuerligt til den væskeformige kultur.

Hvad angår dyrkningsbetingelserne kan der bruges stationær kultur, rystekultur eller kultur under omrøring. Til masseproduktion foretrækkes den såkaldte sub-5 merge dyrkning.

Dyrkningsbetingelserne kan variere naturligvis afhængigt af den særlige bakteriestamme der anvendes og dyrkningsmediets specielle sammensætning, og kort fortalt kan de vælges for hvert enkelt særligt tilfælde på en sådan må-10 de at det ønskede produkt frembringes med den største effektivitet. Fx er dyrkningstemperaturen fortrinsvis 25-35°C og dyrkningsmediets pH-værdi hensigtsmæssigt 5-9.

Efter dyrkning i 10-120 timer under ovennævnte betingelser kan 2-keto-L-gulonsyre være akkumuleret i 15 højst mulig koncentration. Da pH-værdien i almindelighed går ned efterhånden som det ønskede produkt akkumuleres kan der tilsættes et passende basisk materiale som fx natriumhydroxid, kaliumhydroxid eller ammoniak for til stadighed at opretholde den optimale pH-værdi for mikro-20 biologisk produktion af 2-keto-L-gulonsyre. Der kan eventuelt også sættes en passende puffer til dyrkningsmediet for at opretholde den optimale pH-værdi.

Når mikroorganismen af slægten Pseudogluconobac-ter dyrkes i nærværelse af et af de sjældne jordarters 25 metaller i et væskeformigt medium indeholdende L-sorbose for at producere og akkumulere 2-keto-L-gulonsyre i et dyrkningsmedie,kan man ved den foreliggende fremgangsmåde forøge mængde af akkumuleret 2-keto-L-gulonsyre bemærkelsesværdigt ved at blande ovennævnte oxidationsbak-30 terier med en anden mikroorganisme i sammenligning med den mængde der akkumuleres ved anvendelse af oxidationsbakterierne, dvs. mikroorganismer hørende til slægten Pseudogluconobacter, alene.

De mikroorganismer som kan bruges sammen med 35 Pseudogluconobacter kan fx være bakterier hørende til en af slægterne Bacillus, Pseudomonas, Proteus, Citro-bacter, Enterobacter, Erwinia, Xanthomonas, Flavobacte- 7 DK 171713 B1 rium, Micrococcus eller Escherichia. Særlig kan man anvende følgende bakterier:

Bacillus cereus IFO 3131 5 Bacillus licheniformis IFO 12201

Bacillus megaterium IFO 12108 Bacillus pumilus IFO 12090 Bacillus amyloliquefaciens IFO 3022 Bacillus subtilis IFO 13719 10 Bacillus circulans IFO 3967

Pseudomonas trifolii IFO 12056 Pseudomonas maltophilia IFO 12692 Proteus inconstans IFO 12930 Citrobacter freundii IFO 13544 15 Enterobacter cloacae IFO 3320

Erwinia herbicola IFO 12686 Xanthomonas pisi IFO 13556 Xanthomonas citri IFO 3835 Flavobacterium meningosepticum IFO 12535 20 Micrococcus varians IFO 3765

Escherichia coli IFO 3366

En væskeformig kultur opnået ved dyrkning af en hvilken som helst af disse bakterier i et passende medi-25 um ved 20-40°C i 1-4 dage kan bruges som udsædskultur af den til indblanding bestemte mikroorganisme. I almindelighed andrager den mængde som skal podes i et dyrkningsmedium hensigtsmæssigt 1/10 til 1/1000 af mængden af oxidationsbakterien (Pseudogluconobacter). Når blan-30 dingsdyrkningen udføres ved at man blander den anden mikroorganisme med oxidationsbakterien i den mængde der skal indpodes, fremmes væksten af oxidationsbakterien og derved kan L-sorbose i højere koncentration end ellers oxideres til 2-keto-L-gulonsyre på kortere tid end 35 tilfældet er med dyrkning under anvendelse af oxidationsbakterien alene. De bakterier som skal bruges som anden mikroorganisme til blanding med oxidationsbakte- 8 DK 171713 B1 rien er hensigtsmæssig en sådan, der ikke har nogen eller kun svag assimileringsevne for L-sorbose, udgangsmaterialet for den foreliggende fremgangsmåde, eller 2-keto-L-gulonsyre som er det ønskede produkt af dyrknin-5 gen. Andre dyrkningsbetingelser er de samme som når man bruger oxidationsbakterien alene.

Desuden kan der med fordel bruges steriliserede kulturer af visse andre slags bakterier end ovennævnte oxidationsbakterier som bestanddel af dyrkningsmediet.

10 Bakterier som kan bruges til dette formål er fx stammerne Bacillus, Pseudomonas, Citrobacter, Escherichia og Erwinia. Nærmere betegnet kan følgende bakterier ind-» ga:

Bacillus cereus IFO 3131 15 Bacillus subtilis IFO 3023

Bacillus pumilus IFO 12089 Bacillus megaterium IFO 13108 Bacillus amyloliquefaciens IFO 3022 Pseudomonas trifolii IFO 12056 20 Citrobacter freundii IFO 12681

Escherichia coli IFO 3546 Erwinia herbicola IFO 12686.

Disse bakterier kan dyrkes i et medium i hvilket 25 de kan vokse, ved 20-40°C i 2-4 dage. Den resulterende kultur kan steriliseres og sættes til dyrkningsmediet for de foreliggende oxidationsbakterier i en mængde på 0,5-5,0% (rumfang) for at fremme oxidationsbakteriernes vækst.

30 2-Keto-L-gulonsyre der er dannet på denne måde og akkumuleret i dyrkningsmediet kan isoleres og renses på kendt måde under udnyttelse af dens egenskaber.

2-Keto-L-gulonsyre kan isoleres som fri syre. Den kan imidlertid også isoleres som fx et salt med natri-35 um, kalium, kalcium eller ammonium.

Til isolering af produktet kan man fx bruge en fremgangsmåde ved hvilken bakteriecellerne fjernes fra 9 DK 171713 B1 dyrkningsmediet ved filtrering eller centrifugering efter behov, hvorpå opløsningen koncentreres uden eller efter behandling med aktiveret kul og de fraskilte krystaller opsamles ved filtrering og omkrystalliseres til 5 frembringelse af det ønskede produkt; desuden kan der ved isoleringen indgå ekstraktion med opløsningsmidler, kromatografering, udsaltning og lignende isoleringsmetoder. Disse metoder kan bruges alene, i passende kombinationer eller gentagne gange.

10 Når 2-keto-L-gulonsyre vindes i den fri form kan den omdannes til fx et salt med natrium, kalium, kalcium eller ammonium, og når den vindes i form af et salt kan den omdannes til den frie form eller et andet salt på kendt måde.

15 2-Keto-L-gulonsyre frembragt i dyrkningsmediet bestemtes ved højtydende væskekromatografering (HPLC) under nedstående betingelser.

Betingelserne ved HPLC-bestemmelser var; HPLC; 655A system (fabrikeret af Hitachi Seisa- 20 kusho, Japan)

Kolonne; SCR 101H (sulfoneret polystyrengel), 300 x 7,9 mm (fabrikeret af Simadzu Seisakusho, Japan)

Strømningshastighed; 0,8 ml/minut (tryk; 50 kg/ cm2) 25 Mobil fase; fortyndet svovlsyre (pH 2,1)

Detektering: UV (214 nm) og differentielt refrak- tometer

Retentionstid: 7,20 minutter for 2-keto-L-gulonsyre og 8,33 minutter for L-sorbose.

30 De følgende eksempler tjener til nærmere belys ning af fremgangsmåden ifølge opfindelsen. Alle procenter til beskrivelse af dyrkningsmedierne er % v/v med mindre andet er angivet. Udbytterne af dyrkningen i eksemplerne udtrykt ved mol-udbyttet af den mængde 2-keto- 35 L-gulonsyre der dannedes ved omdannelse af den anvendte molmængde L-sorbose.

10 DK 171713 B1

Eksempel 1

Tabel 1 Skråkultursmedium, g/i D-sorbitol 25

Pepton 10 5 Gærekstrakt 10

CaC03 2

Agar 20 pH 7,0 10 Et udsæds-dyrkningsmedium (20 ml) indeholdende 2,0% D-glukose, 1,0% pepton, 1,0% tørret gær og 2,0%

CaC03 (Akadama, fremstillet af Shiraishi Calcium K.K.,

Japan) blev anbragt i en 200 ml stor Erlenmeyer-kolbe og autoklaveredes ved 120°C i 20 minutter. Denne kolbe blev 15 derefter podet med én løkkefuld Pseudogluconobacter sac-charoketogenes K591s (IFO 14464, FERM BP-1130), der var blevet dyrket på det i ovenstående tabel 1 viste skråkulturmedium ved 30°C i 3 dage, og der dyrkedes under rystning (200 opm) ved 30°C i 2 dage. Den resulterende 20 kultur (2 ml) overførtes til samme medium som beskrevet ovenfor og dyrkedes under samme betingelser til frembringelse af en anden udsædskultur.

Et gæringsmedium (25 ml) indeholdende 2,0% CSL, 0,5% tørret gær, 0,3% ammoniumsulfat, 0,05% ^2820^*5H20, 25 0,1% FeS04-7H20, 0,005% CeCl3 .7H20, 3,5% CaC03 (Akadama) og 9,5% L-sorbose (særskilt steriliseret) anbragtes i en 200 ml stor Erlenmeyer-kolbe og autoklaveredes ved 120°C i 20 minutter.

Dette medium podedes med ovennævnte anden udsæds-30 kultur (1,25 ml) og dyrkedes under rystning ved 30°C i 2 dage. Den på denne måde vundne gæringsopløsning indeholdt 86,4 mg/ml 2-keto-L-gulonsyre (udbyte 84,4%) ifølge bestemmelse ved HPLC. En gæringsopløsning dannet ved dyrkning på samme måde, blot med den forskel at der 35 ikke førtes noget ceriumklorid til mediet, indeholdt 51,0 mg/ml 2-keto-L-gulonsyre (udbytte 49,8%).

1 1 DK 171713 B1

Eksempel 2

Stammerne Pseudogluconobacter saccharoketogenes 12-4 (IPO 14483, FERM BP-1131), 12-5 (IFO 14465, FERM BP-1129), 12-15 (IFO 14482, FERM BP-1132) og 22-3 (IFO 5 14484, FERM BP-1133) dyrkedes hver for sig på samme må de som beskrevet i eksempel 1 til frembringelse af hver sin anden udsædskultur.

Et gæringsmedium (25 ml) indeholdende 2,0% CSL, 0,5% tørret gær, 0,3% ammoniumsulfat, 0,05% Na2S303*5Η30, 10 0,01% FeS04*7H20, 0,05% Ce2 (C03) 3* 8^0, 3,5% CaC03 (Aka- dama) og 9,5% L-sorbose (særskilt destilleret) blev anbragt i en 200 ml stor Erlenmeyer-kolbe og autoklaveret ved 120°C i 20 minutter.

Hver af de ovennævnte anden udsædskultur (1,25 15 ml) blev overført til Erlenmeyer-kolben indeholdende et sådant gæringsmedium og dyrkedes . under rystning ved 30°C i 3 dage. Den på denne måde vundne gæringsopløsning bestemtes ved HPLC. Resultaterne fremgår af tabel 2 som mængden af produceret 2-keto-L-gulonsyre (mg/ml) 20 sammen med de mængder der opnåedes ved dyrkning på et i øvrigt identisk medium, men uden tilsætning af Ce2(C03)3·8H20.

Tabel 2 25 Stamme Ceriumkarbonat

Ikke tilsat Tilsat 12-4 51,0 (49,8%) 63,0 (61,5%) 12-5 75,9 (74,1%) 87,6 (85,6%) 12-15 45,2 (44,1%) 67,3 (65,7%) 30 22-3 69,8 (68,1%) 88,1 (86,1%)

De i parentes anførte data er udbytterne i %.

Eksempel 3 35

Pseudogluconobacter saccharoketogenes TH14-86 (IFO 14466, FERM BP-1128) dyrkedes på samme måde som be- 12 DK 171713 B1 skrevet i eksempel 1 til frembringelse af en anden udsædskultur .

Et gæringsmedium (25 ml) indeholdende 2,0% CSL, 0,5% tørret gær, 0,3% ammoniumsulfat, 0,05% Na2S203* 5H20, 5 0,1% FeSO^·7H20, 5% CaCO^ (Akadama) og 10,5% L-sorbose (særskilt steriliseret) blev anbragt i en 200 ml stor Erlenmeyer-kolbe og autoklaveredes ved 120°C i 20 minutter. 1,25 ml af ovennævnte udsædskultur overførtes til Erlenmeyer-kolben indeholdende gæringsmediet og dyr-10 keredes under rystning ved 30°C i 2 dage. Under disse betingelser udførtes rystekulturen under supplering af mediet med 0,01% klorid af yttrium, lanthan, cerium, neodym, samarium, europium, gadolinium, terbium, dysprosium, holmium, erbium eller ytterbium, eller praseodym-15 oxid, eller 0,05% scandiumoxid, ved 30°C i 2 dage. Den på denne måde vundne gæringsopløsning bestemtes ved HPLC. Den mængde 2-keto-L-gulonsyre der frembragtes i dyrkningsmediet er vist i tabel 3 som mg/ml og er anført i % i parentes.

20 Tabel 3

Sjældent jordartsmetal Mængde dannet 2-keto-L-gulonsyre

Intet 78,5 (69,4%) YC13-6H20 86,9 (76,8%) 25 LaCl3-7H20 97,6 (86,3%)

CeCl3*7H20 97,6 (86,3%)

NdCl3-6H20 90,1 (79,6%)

SmCl3-6H20 84,1 (74,3%)

EuCl3'6H20 83,0 (73,4%) 30 GdCl3-6H20 81,9 (72,4%)

TbCl3'xH20 82,0 (72,5%)

DyCl3*6H20 82,1 (72,6%)

HoC13*6H20 81,9 (72,4%)

ErCl3*6H20 82,2 (72,6%) 35 YbCl3-6H20 82,2 (72,6%)

Pr6On 94,6 (83,6%)

Sc203 80,6 (71,2%)

Eksempel 4 13 DK 171713 B1 På den i eksempel 1 beskrevne måde blev stammen Pseudogluconobacter saccharoketogenes TH 14-86 dyrket i samme gæringsmedium som beskrevet i eksempel 1, men 5 hvortil der var sat lanthanoxid, -klorid, -karbonat, -nitrat eller -oxalat, eller ceriumoxid, -klorid, -sulfat eller -karbonat, alt i de mængder der er vist i tabel 4. I dette tilfælde var dyrkningsperioden 30 timer.

Den mængde 2-keto-L-gulonsyre der dannedes i gæringsme-10 dium blev bestemt ved HPLC og er vist i tabel 4, udtrykt i mg/ml, sammen med det udbytte der opnåedes ved dyrkning uden tilførsel af det sjældne jordartsmetal. Udbytterne er anført i parentes.

1 5 Tabel 4

Sjældent Mængde Mængde dannet jordartsmetal tilsat,% 2-keto-L-gulonsyre

Intet 0 60,8 (59,4%)

LaCl3-7H20 0,002 74,3 (72,6%) 20 La2(C03)3 0,002 74,0 (72,3%)

La(N03)3-6H20 0,002 73,6 (71,9%)

La2(C204)3‘9H20 0,002 73,1 (71,4%)

La303 0,05 74,5 (72,8%)

CeCl3*7H20 0,002 73,1 (71,4%) 25 Ce2(C03)3*8H20 0,002 73,8 (72,1%)

Ce2(S04)3*nH20 0,002 73,2 (71,5%)

Ce(S04)2-NH20 0,002 75,1 (73,4%)

Ce02 0,05 64,5 (63,0%) 30 Eksempel 5

Celler af Bacillus megaterium (IFO 12108) dyrket på det i tabel 1 viste skråkultursmedium ved 28°C i 2 dage blev suspenderet i 10 ml steriliseret vand, og 33 alle cellerne overførtes til en Sakaguchi-kolbe indeholdende 500 ml udsæds-dyrkningsmedium som angivet i eksempel 1 og dyrket under frem- og tilbagegående ryst- 14 DK 171713 B1 ning (85 slag pr. minut) ved 28°C i 2 dage til frembringelse af en udsædskultur af Bacillus megaterium. 30 1 medium (pH 7,0) indeholdende 4,0% sakkarose, 4,0% bomuldsfrømel, 0,65% I^HPO^, 0,55% KH2PO4, 0,05% ammonium-5 sulfat, 0,05% NaCl, 0,05% MgS04«7H20 og 0,05% kalcium-pantotenat anbragtes i en 50 1 stor gæringsbeholder og autoklaveredes ved 125°C i 20 minutter. Gæringsbeholderen podedes med 1 1 af udsædskulturen af Bacillus megaterium og der dyrkeredes i 4 dage under følgende be-10 tingelser: omrøring 200 opm, luftning 24 1/minut, indre tryk 1,0 kg/cin og temperatur 28°C. Den resulterende kultur autoklaveredes ved 120°C i 20 minutter og opbevaredes på et koldt sted, og den steriliserede kultur af Bacillus megaterium (i det følgende betegnet megasuppe) brugtes 15 som en af komponenterne i gæringsmediet.

20 ml af den i eksempel 1 beskrevne udsædskultur anbragtes i en 200 ml stor Erlenmeyer-kolbe og autoklaveredes ved 120°C i 20 minutter. Én løkkefuld mikroorganismeceller af stammen Pseudogluconobacter saccharoke-20 togenes TH 14-86, dyrket på det i tabel 1 beskrevne skråkultursmedium ved 28°C i 4 dage, podedes ind i ovennævnte kolbe og der dyrkeredes under rystning ved 30°C i 2 dage. Den vundne kultur (20 ml) anbragtes i en 1 1 stor Erlenmeyer-kolbe hvori der befandt sig 200 ml dyrk-25 ningsmedium indeholdende 2,0% D-glukose, 3,0 rumfangs% megasuppe, 1,0% CSL, 0,5% gærekstrakt, 0,1% pepton, 0,3% ammoniumsulfat og 2,0% CaCO^ (Akadama), og der dyrkedes under rystning ved 30°C i 2 dage til frembringelse af en anden udsædskultur af stammen TH 14-86.

30 Særskilt blev en 200 ml stor Erlenmeyer-kolbe in deholdende 20 ml af udsædskulturen ifølge eksempel 2 podet med én løkkefuld mikroorganismeceller af Bacillus megaterium IFO 12108, dyrket på et skråkultursmedium på 28°C i 2 dage, og underkastedes rystedyrkning ved 35 28°C i 2 dage til frembringelse af en udsædskultur af den til blanding bestemte mikroorganisme.

72 g L-sorbose opløstes i vand for at supplere 15 DK 171713 B1 rumfanget til 300 ml. Derefter opløstes eller suspenderes 60 g CSL, 6 tørret gær, 9 g ammoniumsulfat, 3 g FeS0^*7H20, 3 mg FMN, 3 mg tiamin, 1,5 mg biotin og 0,5 g "Actocol" (fremstillet af Takeda Chemical Industries, 5 Ltd., Japan) i vand til et samlet rumfang på 800 ml.

Særskilt blev 240 g CaCO^ (Akadama) og 150 mg Ce2(C03)3* 8H20 suspenderet i vand op til 1000 ml. Efter autoklavering af hvert af medierne ved 120°C i 20 minutter blev de anbragt i en i forvejen steriliseret 5 1 stor gæ-10 ringsbeholder.

300 ml af den anden udsædskultur af ovennævnte stamme TH14-86 og 4 ml udsædskultur af den til indblanding bestemte mikroorganisme blev indpodet i gæringsbeholderen og dyrkningen blev sat i gang under følgende 15 betingelser: temperatur 30°C, luftning 2,4 1/minut, om røring 800 opm.

Særskilt blev 528 g L-sorbose og 150 mg LaCl^* 7Η2<3 opløst i vand til et rumfang på 900 ml. Seks g anmoniumsul-fat og 3 g FeSO^^I^O blev opløst i vand til et rumfang 20 på 100 ml. Disse to opløsninger blev autoklaveret ved 120°C i 20 minutter og derefter sammenblandet aseptisk.

Fra 6. time efter dyrkningens igangsættelse blev denne blanding kontinuerligt sat til gæringsbeholderen og tilsætningen var fuldført på 24 timer. Efter at tilsætnin-25 gen af blandingen var fuldført gennemførtes dyrkningen i yderligere 8 timer (samlet dyrkningsperiode: 38 timer), hvorved L-sorbose i mediet blev fuldstændigt konsumeret og der vandtes 3,16 1 gæringsopløsning. Gæringsopløsningen indeholdt 176,0 mg/ml 2-keto-L-gulonsyre (udbyt-30 te 86,0%).

Særskilt udførtes der dyrkning under samme betingelser som beskrevet ovenfor, blot med den forskel at der ikke tilførtes Ce2(C03)3»8H20 og LaCl3*7H20. I dette tilfælde blev L-sorbose fuldstændigt konsummeret når 35 dyrkningen udførtes i yderligere 22 timer efter tilsætning af den beskrevne blanding; samlet dyrkningsperiode: 52 timer).

16 DK 171713 B1

Der frembragtes 161,4 mg/ml 2-keto-L-gulonsyre i den derved dannede gæringsopløsning (3,09 1), svarende til et udbytte på 77,1%.

5 Eksempel 6

Under omrøring sattes der ca. 260 ml 6N svovlsyre til den i eksempel 5 vundne gæringsopløsning indeholdende 176,0 mg/ml 2-keto-L-gulonsyre (1 liter) og .j q dannet uopløseligt materiale såsom gips og celler blev fjernet ved centrifugering. Den resulterende ovenstående væske, 1150 ml, førtes gennem en kolonne pakket med 200 ml kationbytterharpiks IR 120B (H+-type, fremstillet og Rohm og Haas, USA) og kolonnen vaskedes med 150 ml de-1stilleret vand. Eluatet og vaskevæskerne forenedes og førtes gennem en kolonne pakket med 200 ml Shirasagi-kul til kromatografering (fremstillet af Takeda Chemical Industries, Ltd., Japan) og kolonnen vaskedes med 150 ml destilleret vand. Eluatet og vaskevæskerne for-20 enedes (1450 ml) og koncentreredes til 250 ml under nedsat tryk ved ca. 50°C. Koncentratet henstod ved 5°C natten over til udskillelse af 2-keto-L-gulonsyre. De vundne krystaller opsamledes ved filtrering og vaskedes med en meget lille mængde afkølet vand, 50%s kold metanol 2^ og kold metanol. Det resulterende materiale tørredes over fosforpentoxid under nedsat tryk, og der vandtes herved 156 g 2-keto-L-gulonsyre-monohydrat som farveløse krystaller. Udbytte 81,1%. Smeltepunkt 171°C (sønderdeling). Optisk drejning, [a]^® = -48° (c=1,0 i H20).

2Q Beregnet for C 33,97 H 5,62

Fundet: C 33,91 H 5,65%

Eksempel 7 1 løkkefuld mikroorganismecelle af stammen Pseu-^ dogluconobacter saccharoketogenes TH14-86 podedes i en 200 ml stor Erlenmeyer-kolbe hvori der var anbragt 20 ml 17 DK 171713 B1 medium indeholdende 2,0% D-glukose, 3,0 rumfangs% mega-suppe, 1,0% CSL, 0,5% gærekstrakt, 0,1% pepton, 0,3% ammoniumsulfat og 2,0% CaCO^ (Super nr. 1700, fremstillet af Maruo Calcium K.K., Japan) og underkastedes ry-5 stedyrkning ved 30°C i 2 dage. To ml af den dannede kultur overførtes til en 200 ml Erlenmeyer-kolbe indeholdende 20 ml af samme medium, og på samme måde udførtes der dyrkning til frembringelse af en anden udsædskultur af oxidationsbakterien.

10 25 ml gæringsmedium indeholdende 2,0% CSL, 0,5% tørret gær, 0,3% anmoniunsulfat, 0,05% Na2S20j· 51^0, 0,1% FeSO^^I^O, 5% CaCO-j (Super nr. 1700, fremstillet af Maruo Calcium K.K., Japan) og 12,5% særskilt steriliseret L-sorbose anbragtes i en 200 ml stor Erlenmeyer-15 kolbe og autoklaveredes ved 120°C i 20 minutter. Særskilt steriliseret CeCl^^HjO sattes i de i tabel 5 viste mængder til ens sådanne gæringsmedier i Erlenmeyer-kol-ber og kolberne podedes med hver 1,25 ml af den ovenfor beskrevne anden udsædskultur samt 0,1 ml udsædskultur 20 af den ifølge eksempel 5 dannede indblandings-mikroor-ganismekultur.

Den vundne mængde 2-keto-L-gulonsyre, udtrykt i mg/ml, i gæringsopløsningerne vundet ved rystet dyrkning ved 30°C i 3 dage fremgår af tabel 5.

25

Tabel 5

Tilsat mængde Dannet mængde 2-

CeCl^-7^0, % keto-L-gulonsyre 0 105,3 (78,2%) 0,002 116,3 (86,3%) 30 0,01 119,7 (88,9%) 0,05 118,2 (87,8%)

De i parentes viste data angiver udbytterne.

35

Eksempel 8 18 DK 171713 B1

En anden udsædskultur af bakteriestammen TH14-86 opnåedes ved dyrkning på samme måde som beskrevet i eksempel 7. Gæringsmediet, 25 ml, indeholdende 2,0% CSL, 5 0,5% tørret gær, 0,3% ammoniumsulfat, 0,05% ^2820^ *5^0, 0,1% FeSO^^71^0, 2,5% CaCO^ (garanteret reagens fremstillet af Wako Pure Chemical Industries, Japan) og 7,5% særskilt steriliseret L-sorbose anbragtes og steriliseredes i en 200 ml Erlenmeyer-kolbe. Det særskilt steri-10 liserede CeCl^* 71^0 tilførtes i de i tabel 6 viste mængder til Erlenmeyer-kolber indeholdende dette gæringsmedium og podedes med 1,25 ml af ovennævnte anden udsædskultur. Mængden af 2-keto-L-gulonsyre, udtrykt i mg/ml, i gæringsopløsningen vundet ved rystedyrkning ved 30°C 15 i 3 dage er vist i tabel 6 .

Tabel 6

Tilsat mængde Dannet mængde 2-

CeCl2 71^0 keto-L-gulonsyre 0 30,0 (37,1%) 7 fl u 0,00001 61,2 (75,7%) 0,0001 67,1 (83,0%) 0,001 70,7 (87,5%) 0,01 70,6 (87,4%) 0,1 70,5 (87,2%) 25

De i parentes viste data angiver udbytterne.

Eksempel 9

En anden udsædskultur af oxidationsbakteriestammen TH14-86 frembragtes ved dyrkning på samme måde som beskrevet i eksempel 7. Gæringsmediet på 20 ml indeholdt 2,0% CSL, 0,5% tørret gær, 0,3% ammoniumsulfat, 0,05% ^282()3 * 5H2O, 0,1% FeSO^^f^O, 5,0% CaCO^ (Super nr.

1700), 12,0% særskilt steriliseret L-sorbose og additiver som vist i tabel 7 anbragtes og steriliseredes i 200 ml store Erlenmeyer-kolber. Kolberne podedes med hver 19 DK 171713 B1 1 ml af ovennævnte anden udsædskultur og underkastedes rystedyrkning ved 30°C i 2 dage. Mængden af dannet 2-keto-L-gulonsyre, udtrykt i mg/ml, i den opnåede kultur bestemtes ved HPLC. Resultaterne er vist i tabel 7 sam-5 men med resultatet ved dyrkning uden tilsætning. Tallene i parentes angiver udbytteprocenten.

Tabel 7

Additiv Tilsat mængde, % Produceret mængde .j q 2-keto-L-gulonsyre

Intet 0 85,1 (65,8%)

LaCl3*7H20 0,005 105,4 (81,5%

NdCl3-6H20 0,005 105,4 (81,5%)

CeCl3-7H20 0,005 105,8 (81,8%) 15 NdCl3'6H20 0,005 105,8 (81,8%)

HoC13-6H20 0,005 105,8 (81,8%)

Lanthan1* 0,005 102,9 (79,6%) (Klump)

Neodym^ 0,005 99,4 (79,6%) 20 (metal) Råt sjældent jordartsklorid"^ 0,005 103,6 (80,1%)

Blandet sjældent jordartsoxid4^ 0,005 101,9 (78,8%) 25

Note: 1) og 2): fremstillet af Wako Pure Chemical

Industries, Japan 3) : Råt sjældent jordartsklorid (fremstillet af Mitsubishi Kasei K.K., Japan) indeholder som sjældne 3q jordartsmetaller 18,3% Ce, 10,0% La, 7,1% Nd og 2,0% Pr.

4) : blandet sjældent jordartsoxid (fremstillet af Santoku Kinzoku Kogyo K.K., Japan) er sammensat af 29,5% La203, 50,0% Ce02, 4,9% Prg01 1, 16,0% Nd2C>3 og højst 0,03% Sm203.

De i parentes anførte data angiver procentudbyttet .

35

Claims

1. Fremgangsmåde til fremstilling af 2-keto-L-gulon-syre ved dyrkning af en mikroorganisme hørende til slægten Pseudogluconobacter og med evne til at oxidere L- 5 sorbose til 2-keto-L-gulonsyre i et dyrkningsmedium i nærværelse af L-sorbose, kendetegnet ved at dyrkningsmediet indeholder mindst ét af de sjældne jordarters metaller.

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendeteg-10 net ved at det sjældne jordarts metal er scandium, yttrium, lanthan, cerium, praseodym, neodym, samarium, europium, gadolinium, terbium, dysprosium, holmium, erbium, thulium, ytterbium og/eller lutetium.

3. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendeteg-15 net ved at et eller flere af de sjældne jordarts metaller er til stede i dyrkningsmediet i form af metalpulver, metalstykker, klorider, karbonater, sulfater, nitrater, oxider og/eller oxalater.

4. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendeteg-20 net ved at det sjældne jordarts metal tilføres i en mængde på 0,000001 til 0,1% v/v» regnet på mediets rumfang.

5. Fremgangsmåde ifølge krav 4, kendetegnet ved at mængden er 0,0001 til 0,05% v/v.

6. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendeteg net ved at mikroorganismen er Pseudogluconobacter saccharoketogenes.

7. Fremgangsmåde ifølge krav 6, kendeteg net ved at mikroorganismen er Pseudogluconobacter 30 saccharoketogenes K591s (FERM BP-1130), 12-5 (FERM BP-1129), TH14-86 (FERM BP-1128), 12-15 (FERM BP-1132), 12-4 (FERM BP-1131) eller 22-3 (FERM BP-1133). 35