ES2709105T3 - ARNs de regulación de síntesis y procedimiento de preparación del mismo - Google Patents

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Abstract

Un ARNs para inhibir la expresión génica en procariotas, comprendiendo el ARNs: (i) un sitio de unión a Hfq del ARNs de MicC; y (ii) una región que empareja sus bases con el ARNm del gen diana en el que la región que empareja sus bases con el ARNm del gen diana se construye de forma que la energía de unión al ARNm del gen diana esté en el intervalo de -20 kcal/mol a -40 kcal/mol; y en el que la región que empareja sus bases con los pares de bases del ARNm del gen diana con parte del sitio de unión del ribosoma del ARN del gen diana y la región tiene una longitud de 19-37 nucleótidos.

Description

DESCRIPCION
ARNs de regulacion de smtesis y procedimiento de preparacion del mismo
Campo tecnico
La presente invencion se refiere a un nuevo ARNs hecho a medida que reduce la expresion genica en celulas procariotas, a un procedimiento de preparacion del mismo, y al uso del mismo, y mas en particular, a un ARNs sintetico que comprende un sitio de union de Hfq, derivado del ARNs de MicC, y una region que empareja sus bases con el ARNm del gen diana, y a un procedimiento de preparacion del mismo y al uso del mismo.
Antecedentes de la tecnica
En los ultimos anos, las preocupaciones a nivel mundial sobre temas ambientales y el agotamiento de los recursos limitados han aumentado rapidamente. Como alternativa para solucionar tales problemas, la construccion de sistemas de produccion basados en organismos respetuosos con el medio ambiente y renovables ha sido de interes creciente. Tales sistemas se pueden construir mediante la regulacion de vfas metabolicas en organismos para optimizar los flujos metabolicos para los metabolitos deseados, y se requieren diversas tecnicas de biologfa molecular en este procedimiento para regular vfas metabolicas.
Los procedimientos para regular las vfas metabolicas incluyen un procedimiento de aumentar la expresion de enzimas requeridas para los procedimientos biosinteticos para mejorar los flujos metabolicos, y un procedimiento de prevencion de flujos metabolicos que se usan para el crecimiento celular y la produccion de otros metabolitos y genes de delecion con el fin de producir metabolitos deseados. Un procedimiento de delecion genica que actualmente es ampliamente usado es un procedimiento en el que el gen a delecionar se sustituye por cualquier secuencia homologa a la misma usando recombinasa, de manera que la funcion del gen se pierde (Datsenko y col., PNAS, 97(12): 6640-6645, 2000). Sin embargo, este procedimiento de delecion tiene los siguientes problemas. En primer lugar, el tiempo requerido que es para la delecion de genes es relativamente largo. Teniendo en cuenta el tiempo requerido para reemplazar el gen cromosomico con la secuencia homologa y el tiempo requerido para eliminar un gen de resistencia a antibioticos, que se utiliza para seleccionar las celulas de las que se elimino la eliminacion del gen, del cromosoma, se requiere un tiempo de una semana o mas para eliminar un gen. Este tiempo duradero en la delecion genica interfiere con el desarrollo de la ingeniena metabolica centrado en la produccion eficaz de metabolitos mediante la regulacion de la via metabolica, en comparacion con la tecnologfa de la biologfa molecular que se ha desarrollado rapidamente en los ultimos anos.
En segundo lugar, la delecion genica provoca la perdida completa de la funcion del gen. Esto sugiere que el nivel de expresion del gen no se puede regular a un nivel deseado. Con el fin de producir de forma eficaz un metabolito deseado en una via metabolica intracelular, la delecion genica trata de bloquear un flujo metabolico que va hacia la via metabolica. Sin embargo, si el flujo metabolico bloqueado produce una sustancia esencial para el crecimiento celular, el crecimiento de las celulas en las que se deleciono el gen se inhibira significativamente o no tendra lugar. Con el fin de maximizar la eficacia de la produccion de un metabolito deseado, las celulas que producen el metabolito deseado se debenan cultivar facilmente mientras que tambien se debe optimizar un flujo metabolico hacia el metabolito deseado. Por tanto, existe una necesidad por un procedimiento capaz de producir una sustancia deseada mientras que se mantiene el crecimiento celular regulando el nivel de expresion genica, en lugar de delecionar simplemente el gen con el fin de regular el flujo metabolico.
En tercer lugar, el gen delecionado del cromosoma mediante un procedimiento convencional de delecion genica es diffcil de restaurar. Ademas, si la delecion del mismo gen se intenta en otras cepas, todos los procesos se debenan intentar de nuevo y, por lo tanto, se requerinan grandes cantidades de tiempo y esfuerzo.
Hiroshi Kawamoto y col: "Base-pairing requirement for RNA silencing by a bacterial small RNA and acceleration of duplex formation by Hfq", MOLECULAR MICROBIOLOGY, vol. 61, n.° 4, 1 de agosto de 2006 (01-08-2006), paginas 1013-1022, XP055157275, ISSN: 0950-382X, DOI: 10.1111/j.1365-2958.2006.05288.x desvela un analisis mutacional sistematico de los ARNs ptsG y SgrS que revelo que seis pares de bases alrededor de la secuencia SD de ptsG son particularmente importantes para la accion de SgrS y tambien se demostro in vitro que SgrS forma un duplex estable con el ARNm de ptsG y que Hfq facilita notablemente la tasa de formacion de duplex.
Zhang Y y col: "Identifying Hfq-binding small RNA targets in Escherichia coli", BIOCHEMICAL AND BIOPHYSICAL RESEARCH COMMUNICATIONS, ACADEMIC PRESS INC. ORLANDO, FL, EE.UU., vol. 343, n.° 3, 12 de mayo de 2006 (12-05-2006), paginas 950-955, XP024924800, ISSN: 0006-291X, DOI: 10.1016/J.BBRC.2006.02.196 desvela dianas de Hfq que se unen a pequenos ARN a escala genomica e identifican las dianas mas conocidas reguladas negativamente de Hfq que se unen a los ARNs usando un nuevo algoritmo de alineacion.
Coleman J et al: "The use of RNAs complementary to specific mRNAs to regulate the expression of individual bacterial genes", CELL, CELL PRESS, EE.UU., vol. 37, n.° 2, 1 de junio de 1984 (01-06-1984), paginas 429-436, XP023912039, ISSN: 0092-8674, DOI: 10.1016/0092-8674(84)90373-8 desvela la construccion de plasmido que produce un ARN complementario al ARNm de E. coli lpp (ARN de mic[lpp]) y que la induccion del gen mic(lpp) bloqueo eficazmente la produccion de lipoprotema y redujo la cantidad de ARNm de Ipp.
Vandana Sharma y col: "Engineering Artificial Small RNAs for Conditional Gene Silencing in Escherichia coli", ACS SYNTHETIC BIOLOGY, vol. 1, n.° 1, 29 de agosto de 2011 (29-08-2011), paginas 6-13, XP055205233, ISSN: 2161­ 5063, DOI: 10.1021/sb200001q; y Vandana Sharma y col.: "Supporting Information: Engineering Artificial Small RNAs for Conditional Gene Silencing in Escherichia coli Supporting Figures", 25 de agosto de 2011 (25-08-2011), XP55205382, recuperado de internet: URL:http://pubs.acs.org/doi/suppl/10.1021/sb200001q/suppl fil e/sb200001q si 001.pdf [recuperado el 29-07-2015] desvela una estrategia para usar ARNs artificiales que pueden regular genes endogenos deseados en Escherichia coli. Usando un gen reportero que se fusiono de forma transitoria con una secuencia lfder de ARNm 5' natural, los ARNs artificiales activos se seleccionaron de bibliotecas en las que los andamiajes de ARNs naturales se fusionaron a un dominio antisentido aleatorizado. Se anticipo que los ARNs artificiales seran utiles para el control dinamico y el ajuste de precision de la expresion de genes endogenos en bacterias para aplicaciones en biologfa de smtesis.
S. Man y col.: "Artificial trans-encoded small non-coding RNAs specifically silence the selected gene expression in bacteria", NUCLEIC ACIDS RESEARCH, vol. 39, n.° 8, 3 de febrero de 2011 (03-02-2011), paginas e50-e50, XP55205230, ISSN: 0305-1048, DOI: 10.1093/nar/gkr034; y Shuai Man y col.l: "Supplementary Data: Artificial transencoded small noncoding RNAs specifically silence the selected gene expression in bacteria", 3 de febrero de 2011 (03-02-2011), XP55205344, recuperado de internet: URL:http://nar.oxfordjournals.org/content/suppl/2011/01/24/gk r034.DC1/revised supplementary data.pdf [recuperado el 29-07-2015] describe el uso de ARNs artificiales transcodificados (ARNats) para el silenciamiento de genes espedficos en bacterias. Se diseno y se sintetizo una serie de ARNats que se dirige a genes espedficos, y algunos de ellos suprimieron notablemente la expresion de genes diana de forma dependiente de Hfq.
S. Chen y col.: "MicC, a Second Small-RNA Regulator of Omp Protein Expression in Escherichia coli", Journal of Bacteriology, vol. 186, n.° 20, 15 de octubre de 2004 (15-10-2004), paginas 6689-6697, XP055358563 desvela que MicC, que se conserva en Shigella, Salmonella, y Klebsiella, inhibe la expresion de ompC a nivel postranscripcional. Por tanto, con el fin de superar las limitaciones del procedimiento convencional de delecion genica, debena ser posible reducir el nivel de expresion del gen de interes sin modificar la secuencia cromosomica de la cepa. Asimismo, debena ser posible regular el nivel de expresion del gen y aplicar facilmente la regulacion de la expresion del mismo gen a otras cepas. Ademas, se requiere construir y aplicar el sistema regulador del gen de forma rapida y conveniente.
Por consiguiente, los presentes inventores trataron de construir un ARNs sintetico de longitud corta hecho a medida usando un procedimiento que satisface los requisitos descritos anteriormente.
Actualmente se conocen un total de 101 ARNs de E. coli (Pichon y col., Nucleic Acids Research, DOI:10.1093/nar/gkr1141, 2011), y actualmente se estan estudiando los mecanismos de los mismos. Hasta la fecha se ha documentado que un gran numero de ARNs forman una estructura secundaria espedfica, incluso aunque tengan diferentes secuencias y que la protema Hfq reconoce y se une a los ARNs. Las funciones de Hfq son aumentar la semivida del ARNs para que el ARNs funcione de manera eficaz incluso en una pequena cantidad, y ayudar a la union del ARNs al ARNm diana para que el ARNm diana funcione de manera rapida, y unir RNasa al ARNm diana para promover la degradacion del ARNm diana para reducir de este modo la expresion genica de forma mas eficaz.
Las funciones basicas del ARNs de E. coli se han estudiado constantemente, pero hay pocos o no hay informes del uso de los mecanismos descritos anteriormente para construir ARNs sinteticos. De acuerdo con los informes actuales de la construccion de ARNs de E. coli, se han construido ARNs eficaces mediante mutagenesis aleatorizada y cribado (Sharma y col, ACS Synthetic Biology, DOI: 10.1021/sb200001q, 2011).
Por consiguiente, los presentes inventores han hecho un gran esfuerzo para construir un nuevo ARNs sintetico de cadena corta y hecho a medida con el fin de superar las limitaciones del procedimiento convencional de delecion genica, y como resultado, han construido un ARNs sintetico que comprende un sitio de union de Hfq, que deriva de MicC y una region homologa al ARNm diana tal como ARNm de DsRed2, ARNm de AraC, ARNm de KanR o ARNm de LuxR, y han descubierto que los resultados del ensayo para la expresion del ARNm diana indican que se puede construir un ARNs eficaz sin recaer en los procedimientos aleatorios convencionales. Ademas, los presentes inventores han construido ARNs sinteticos que inhiben la expresion de tyrR (regulador de tirosina), csrA (regulador del almacenamiento de carbono), pgi (glucosa-6-fosfato isomerasa), ppc (fosfoenolpiruvato carboxilasa) y similares, y han descubierto que estos ARNs muestran efectos similares a los de la delecion genica real y se pueden usar para regular la produccion de un metabolito deseado, completando por tanto la presente invencion.
Divulgacion de la invencion
PROBLEMA TECNICO
Es un objeto de la presente invencion proporcionar un nuevo ARNs sintetico de cadena corta hecho a medida, que supere las limitaciones del procedimiento convencional de la delecion genica y que se pueda usar para regular la expresion del ARNm de diversos genes diana con alta eficacia, un procedimiento de preparacion de los mismos y el uso de los mismos.
SOLUCION TECNICA
Con el fin de conseguir el objeto anterior, la presente invencion proporciona un ARNs (ARN regulador pequeno) para la inhibicion de la expresion genica en procariotas, comprendiendo el ARNs:
(i) un sitio de union a Hfq del ARNs de MicC; y
(ii) una region que empareja sus bases con el ARNm del gen diana
en la que la region que empareja sus bases con el ARNm del gen diana se construye de forma que la energfa de union al ARNm del gen diana este en el intervalo de -20 kcal/mol a -40 kcal/mol; y
en la que la region que empareja sus bases con los pares de bases del ARNm del gen diana con parte del sitio de union del ribosoma del ARN del gen diana y la region tiene una longitud de 19-37 nucleotidos.
La presente invencion tambien describe un acido nucleico aislado que codifica el ARNs.
La presente invencion tambien describe un vector de expresion que comprende el acido nucleico aislado que codifica el ARNs.
La presente invencion tambien proporciona un microorganismo recombinante que tiene el ARNs introducido en el mismo.
La presente invencion tambien se refiere al ARNs tal como se define anteriormente, en el que el ARNm del gen diana es un ARNm de un gen seleccionado del grupo que consiste en el gen de resistencia a la kanamicina, regulador de tirosina, fosfoenolpiruvato carboxilasa, regulador del almacenamiento de carbono, glucosa-6-fosfato isomerasa, citrato sintasa, acetil-CoA carboxiltransferasa, subunidad alfa, protema biotinilada transportadora de biotina-carboxilo, acetil-CoA carboxilasa, acetil-CoA carboxiltransferasa, subunidad beta, piruvato deshidrogenasa, actividad de propionato cinasa / acetato cinasa, adiY, acetilglutamato cinasa, N-acetilglutamilfosfato reductasa, argininosuccinato sintasa, argininosuccinato liasa, aspartato amomaco-liasa, fosfopentomutasa, desoxirribosafosfato aldolasa, KASIII, -cetoacil-ACP sintasas, acil-CoA sintetasa grasa, fructosa-1,6-bisfosfatasa, succinato semialdetndo deshidrogenasa dependiente de NADP+, transportador de APC, 4-aminobutirato aminotransferasa, subunidad A de glutamato descarboxilasa, subunidad B de glutamato descarboxilasa, transportador de APC GABA, glicerol cinasa, represor de sn-Glicerol-3-fosfato, fructosa 1,6-bisfosfatasa II, citrato sintasa, regulador de lisogenizacion, acetohidroxibutanoato sintasa / acetolactato sintasa, acetohidroxiacido isomerorreductasa, dihidroxiacido deshidratasa, acetolactato sintasa / acetohidroxibutanoato sintasa, acetohidroxibutanoato sintasa / acetolactato sintasa, UDP-3-O-acil-N-acetilglucosamina deacetilasa, L-aspartato oxidasa, regulador de respuesta de nitrato/nitrito, fosfoenolpiruvato carboxicinasa, fosfoenolpiruvato sintetasa, fosfato acetiltransferasa, adenilosuccinato sintetasa, adenilosuccinato liasa, 4-aminobutirato aminotransferasa, transportador ABC de ribosa, ribosa piranasa, ribocinasa, alfa-cetoglutarato reductasa / D-3-fosfoglicerato deshidrogenasa, fosfohidroxitreonina aminotransferasa / 3-fosfoserina aminotransferasa, glucosa 6-fosfato-1-deshidrogenasa, asparagina sintetasa A, carbamoil fosfato sintetasa, D-alanina-D-alanina ligasa B, timidina fosforilasa / uracil fosforilasa, L-2-hidroxiglutarato oxidasa, Lipoamida deshidrogenasa, O-succinilhomoserina liasa / O-succinilhomoserina(tiol)-liasa, aspartato cinasa / homoserina deshidrogenasa, fosfo-N-acetilmuramoil-pentapeptido transferasa, UDP-N-acetilmuramoilalanil-D-glutamato 2,6-diaminopimelato ligasa, enzima de adicion de D-alanil-D-alanina, N-acetilglucosaminil transferasa, quinolinato sintasa, pantotenato sintetasa, Aspartato 1-descarboxilasa, 6-fosfogluconolactonasa, dihidroorotasa, ribulosa fosfato 3-epimerasa, transaldolasa A, aspartato cinasa / homoserina deshidrogenasa, homoserina cinasa, treonina sintasa, transcetolasa I y transcetolasa II.
La presente invencion tambien proporciona un microorganismo recombinante transformado con el vector de expresion.
La presente invencion tambien describe un procedimiento para preparar un ARNs, comprendiendo el procedimiento la union de un acido nucleico, que codifica una region que empareja sus bases con el ARNm del gen diana, con un acido nucleico que codifica un sitio de union de Hfq derivado del ARNs de MicC.
La presente invencion tambien proporciona un procedimiento para inhibir la expresion de un gen diana, comprendiendo el procedimiento las etapas de: introducir o expresar el ARNs en un procariota; e inhibir la expresion del ARNm del gen diana.
La presente invencion tambien describe una composicion para inhibir la expresion genica en procariotas, comprendiendo la composicion el ARNs tal como se define anteriormente.
La presente invencion tambien proporciona un procedimiento de seleccion de un gen que necesita ser delecionado para producir una sustancia util, comprendiendo el procedimiento las etapas de:
(a) inhibir la expresion de al menos un gen entre los genes, que estan presentes en una cepa para la produccion de la sustancia util y participa en la via de biosmtesis de la sustancia util, usando el ARNs tal como se define anteriormente que direcciona al gen; y
(b) seleccionar el gen cuya expresion se inhibio, como el gen que necesita ser delecionado para producir la sustancia util, en el caso en el que el rendimiento de la produccion de la sustancia util aumenta mediante la inhibicion de la expresion del gen.
La presente invencion tambien proporciona un procedimiento para mejorar una cepa para producir una sustancia util, comprendiendo el procedimiento las etapas de:
(a) inhibir la expresion de al menos un gen entre los genes, que estan presentes en una cepa para la produccion de la sustancia util y participa en la via de biosmtesis de la sustancia util, usando el ARNs tal como se define anteriormente que direcciona al gen;
(b) seleccionar el gen cuya expresion se inhibio, como el gen que necesita ser delecionado para producir la sustancia util, si el rendimiento de la produccion de la sustancia util aumenta mediante la inhibicion de la expresion del gen; y
(c) construir una cepa recombinante que tiene una delecion del gen seleccionado o una combinacion de los genes seleccionados.
La presente invencion tambien proporciona un microorganismo recombinante que tiene una capacidad mejorada para producir tirosina, obteniendose el microorganismo recombinante mediante la inactivacion de las funciones de los genes tyrR y crsA en una celula hospedadora que tiene la via de biosmtesis de tirosina, en la que las funciones de los genes tyrR y csrA se inactivan mediante la introduccion o la expresion de un ARNs sintetico tal como se define anteriormente en una celula hospedadora que tiene la via de biosmtesis de tirosina para inhibir la expresion de los genes tyrR y csrA y, en el que el microorganismo recombinante comprende dicho ARNs sintetico.
La presente invencion tambien proporciona un microorganismo recombinante que tiene una capacidad para producir fenol, obteniendose el microorganismo recombinante mediante la introduccion o amplificacion de un gen tpl en el microorganismo recombinante descrito anteriormente.
La presente invencion tambien describe un procedimiento para producir un microorganismo recombinante que tiene una capacidad mejorada para producir tirosina, comprendiendo el procedimiento la inactivacion de las funciones de los genes tyrR y crsA en una celula hospedadora que tiene la via de biosmtesis de tirosina.
La presente invencion tambien proporciona un microorganismo recombinante que tiene una capacidad mejorada para producir cadaverina, obteniendose el microorganismo recombinante mediante la inactivacion de la funcion de al menos un gen en una celula hospedadora que tiene la via de biosmtesis de cadaverina, en la que las funciones de los genes se inactivan mediante la introduccion o la expresion de un ARNs sintetico tal como se define anteriormente en una celula hospedadora que tiene la via de biosmtesis de cadaverina para inhibir la expresion de al menos un gen seleccionado del grupo que consiste e murE, metB, thrL y ackA y, en el que el microorganismo recombinante comprende dicho ARNs sintetico.
La presente invencion tambien describe un procedimiento para producir un microorganismo recombinante que tiene una capacidad mejorada para producir cadaverina, comprendiendo el procedimiento la inactivacion de la funcion de al menos un gen, seleccionado de murE, metB, thrL y ackA.
Otras caractensticas y realizaciones de la presente invencion seran mas evidentes a partir de las siguientes descripciones detalladas y de las reivindicaciones adjuntas.
Breve descripcion de los dibujos
La FIG. 1 muestra un procedimiento para la seleccion de estructuras basicas para la funcion eficaz de los ARNs sinteticos.
La FIG. 2 muestra las secuencias de SgrS (referencial), MicC y MicF (referencial), la secuencia del ARNm de DsRed2 reportero y una secuencia complementaria que se une al SUR de la misma.
La FIG. 3 es un diagrama grafico que muestra la inhibicion de la expresion de DsRed2 despues de la union por complementariedad entre MicC, MicF (referencial) o SgrS (referencial) y el SUR de DsRed2.
La FIG. 4 muestra diversas secuencias complementarias que se unen a DsRed2.
La FIG. 5 es un diagrama grafico que muestra el grado de inhibicion de DsRed2 tras la union del sitio de union de Hfq de MicC a diversas secuencias complementarias que se unen a DsRed2.
La FIG. 6 muestra las secuencias de ARNm de AraC, LuxR y KanR y las secuencias complementarias al SUR que se unen a los ARNs sinteticos para unirse a las mismas.
La FIG. 7 es un diagrama grafico que muestra la reactividad cruzada entre AraC, LuxR o KanR y un ARNs sintetico que inhibe AraC, LuxR o KanR.
La FIG. 8 muestra los resultados de calcular la energfa de union entre AraC, LuxR o KanR y un ARNs sintetico, construido para unirse a AraC, LuxR o KanR, usando el programa informatico mfold.
La FIG. 9 muestra la via de biosmtesis de tirosina en un microorganismo. En la FIG. 9, el recuadro verde indica el gen a sobreexpresar, el recuadro rojo indica el gen a silenciar por un ARNs sintetico, y 0 indica la eliminacion de la inhibicion de retroalimentacion.
La FIG. 10 es una vision esquematica de un plasmido construido para la produccion de tirosina.
La FIG. 11 es un diagrama grafico que muestra los resultados obtenidos mediante la amplificacion de la expresion de los genes asociados a la via de biosmtesis de tirosina para la produccion de tirosina, la inhibicion de la expresion de tyrR, ppc, csrA y pgi con ARNs sinteticos, y despues comparando la produccion de tirosina en diversas cepas de E. coli (pgi tambien incluye un ARNs sintetico adicional (anti-pgi-DI, -D2) cuya expresion se regulo).
La FIG. 12 muestra las curvas de crecimiento de las cepas S17-1 y TOP10 de acuerdo con los ARNs sinteticos anti-pgi-DI y anti-pgi-D2.
La FIG. 13 muestra las secuencias de union de anti-pgi, anti-pgi-DI y anti-pgi-D2.
La FIG. 14 es un diagrama grafico que muestra la inhibicion de la expresion de un gen diana en S17-1 y TOP10 por anti-tyrR, anti-csrA, anti-ppc, anti-pgi, anti-pgi-Dl y anti-pgi-D2.
La FIG. 15 es un diagrama grafico que muestra los resultados de la fermentacion de los microorganismos recombinantes S17-1 (pTyr-a(anti-csrA), pTyr-b(anti-tyrR)).
La FIG. 16 es un diagrama grafico que muestra las concentraciones de fenol producidas en diversas cepas de E. coli.
La FIG. 17 muestra la via de biosmtesis de cadaverina en E. coli. El recuadro rojo indica los genes diana que se van a silenciar por ARNs sintetico.
La FIG. 18 es una vision esquematica que muestra un plasmido que se va a transformar para aumentar la produccion de cadaverina.
La FIG. 19 es un diagrama grafico que muestra los cambios en la produccion de cadaverina tras la introduccion de ARNs sinteticos (el control contiene un plasmido de p15CadA en una cepa XQ56 y no contiene ARNs sintetico. La concentracion de cadaverina en el control es 1,3 g/l).
La FIG. 20 es una vision esquematica de un vector pWA.
La FIG. 21 es una vision esquematica de un vector pR15CA.
La FIG. 22 muestra el principio de funcionamiento de un ARNs sintetico.
La FIG. 23 muestra los resultados experimentales obtenidos mediante la preparacion de ARNs sinteticos, que inhiben la expresion de los genes DsRed2 y LacZ con diversas energfas de union, y que examinan si el uso de los ARNs sinteticos regulan la expresion de los genes a diversos niveles.
La FIG. 24 muestra los resultados de un experimento realizado para examinar si la introduccion de ARNs inhibe la expresion de las protemas y el crecimiento celular en microorganismos.
La FIG. 25 muestra los resultados de examinar la produccion de tirosina usando Anti-csrA con diversas energfas de union. La FIG. 26 muestra los resultados de medir la produccion de tirosina despues de introducir ARNs sinteticos que inhiben los genes implicados en las vfas metabolicas clave de las celulas.
La FIG. 27 muestra la via de biosmtesis de cadaverina en E. coliy la concentracion de cadaverina producida tras la inhibicion por los ARNs sinteticos.
La FIG. 28 muestra los resultados de medir los efectos de los ARNs sinteticos anti-murE que tienen diversas energfas de union en la produccion de cadaverina.
La FIG. 29 muestra los resultados de un experimento realizado para examinar si diversos ARNs sinteticos influyen en la produccion real de protema MurE.
La FIG. 30 muestra los resultados de la fermentacion de una cepa final que contiene anti-murE.
MEJOR MODO DE LLEVAR A CABO LA INVENCION
A menos que se defina lo contrario, todos los terminos tecnicos y cientfficos usados en el presente documento tienen el mismo significado que un experto en la materia a la que la invencion pertenece entiende habitualmente. En general, la nomenclatura usada en el presente documento es bien conocida y se usa comunmente en la materia. La definicion de los terminos principales usados en la descripcion detallada de la invencion es tal como sigue.
Tal como se usa en el presente documento, el termino "ARNs" (s de ARN small, pequeno), se refiere a un ARN de longitud corta, que normalmente es de 200 nucleotidos o menos de longitud, no se traduce a protema e inhibe de forma eficaz la traduccion de un ARNm espedfico mediante union por complementariedad.
Tal como se usa en el presente documento, la expresion "sitio de union de ribosoma (SUR)" se refiere a un sitio en el que se une el ribosoma al ARNm para la transcripcion del ARNm.
Tal como se usa en el presente documento, el termino "gen" pretende tener el significado mas amplio, y el gen puede codificar una protema estructural o una protema reguladora. En el presente documento, la protema reguladora incluye un factor transcripcional, una protema de choque termico, o una protema que esta implicada en la replicacion, transcripcion y/o traduccion de ADN/ARN. Asimismo, el gen diana cuya expresion se va a inhibir puede estar presente como un elemento extracromosomico.
En un aspecto, la presente invencion se dirige a un nuevo ARNs regulador de la smtesis de longitud corta. Es decir, la presente invencion se dirige a un ARNs (ARN regulador pequeno) para la inhibicion de la expresion genica en procariotas, comprendiendo el ARNs:
(i) un sitio de union a Hfq del ARNs de MicC; y
(ii) una region que empareja sus bases con el ARNm del gen diana
en la que la region que empareja sus bases con el ARNm del gen diana se construye de forma que la energfa de union al ARNm del gen diana este en el intervalo de -20 kcal/mol a -40 kcal/mol; y
en la que la region que empareja sus bases con los pares de bases del ARNm del gen diana con parte del sitio de union del ribosoma del ARN del gen diana y la region tiene una longitud de 19-37 nucleotidos.
En la presente invencion, se seleccionaron las estructuras que garantizan la funcion estable de los ARNs sinteticos, y despues se selecciono un sitio de union para la inhibicion mas eficaz de la expresion del ARNm diana. Asimismo, se examino si es posible preparar ARNs sinteticos para inhibir los ARNm diana que no fuesen ARNm de DsRed2. Ademas, se realizo un ensayo de reactividad cruzada para examinar si el ARNs construido puede inhibir la expresion de ARNm que no fuesen el ARNm diana. Como resultado, se desarrollaron nuevas estructuras de ARNs sintetico de acuerdo con la presente invencion y un procedimiento de preparacion de las mismas.
En primer lugar, con el fin de establecer secuencias estructurales que se unen a Hfq para la funcion estable de los ARNs sinteticos e inhibir de manera eficaz la expresion de los genes diana, se selecciono un grupo de candidatos de estructura de ARNs adecuados para el fin a partir de 101 ARNs presentes en E. coli, y se realizaron operaciones continuas de seleccion, seleccionando finalmente de este modo tres ARNs (FIG. 1).
Los res ARNs seleccionados son MicC, SgrS (referencial) y MicF (referencial). MicC se une al ARNm de OmpC que ayuda en el paso de iones o de sustancias hidrofilas a traves de la membrana celular de E. coli. SgrS se une al ARNm de la protema PtsG que esta presente en la membrana celular y sirve para transferir glucosa, y MicF se une a e inhibe la expresion del ARNm de la protema de membrana OmpF que pasa aminoacidos, iones, azucares y similares, que tienen un peso molecular de 600 Da o menos (Wadler y col., PNAS, 104(51):20254-20459, 2007; Chen y col., J. Bacteriology, 186(20): 6689, 2004).
En un ejemplo de la presente invencion, los sitios de los tres ARNs, que se unen al ARNm diana, se eliminaron, y se construyeron los ARNs para su union al SUR del ARNm de DsdRed2 para medir la capacidad delos ARNs para inhibir la expresion (FIG. 2). En la FIG. 2, la secuencia de union a ARNm diana de cada uno de los ARNs candidatos esta subrayada y se indica mediante color rojo, y se reemplazo con la secuencia indicada por Anti-DsRed2. Tal como se usa en el presente documento, la expresion "SUR de DsRed2" se refiere a un sitio de union real que esta cubierto fisiologicamente por el ribosoma, que se une al ARNm de manera que el sitio no puede ser reconocido por otras protemas. El SUR se define como una region de 36 pb desde el punto inicial de la secuencia de Shine-Dalgarno en la direccion del extremo 3'. Se puede predecir usando los resultados de los estudios documentados previamente (Na y col., BMC Systems Biology, 4(1):71, 2010). Los ARNs sinteticos construidos inhibieron la expresion de DsRed2 al 86 % cuando se uso el sitio de union de Hfq de SgrS (referencial), al 85 % cuando se uso el sitio de union de Hfq de MicF (referencial), y al 90 % cuando se uso el sitio de union de Hfq de MicC (FIG. 3). Por tanto, en la presente invencion, preferentemente se uso el sitio de union de Hfq de MicC.
En otro ejemplo de la presente invencion, se examino de forma experimental si diversas secuencias localizadas alrededor del SUR de la secuencia de ARNm del gen diana eran adecuadas como sitios de union. De manera espedfica, a partir de los ARNs sinteticos que se unen al SUR del ARNm diana, se construyeron ARNs que se unen al SUR, una parte del mismo, o regiones que no fueran el SUR, y estos sitios de union teman diversas longitudes de 19 a 37 nucleotidos (FIG. 4). Como resultado, se mostro que los ARNs sinteticos que se unen a al menos una parte del SUT mostraron un efecto inhibidor de al menos el 90 % y que los ARNs sinteticos que no se unen al SUR tambien teman una eficacia inhibidora del 47-90 % (FIG. 5). En otras palabras, los ARNs que se unen a al menos una parte del SUR presentan excelentes efectos inhibidores de la expresion. Por tanto, en la presente invencion, la region que empareja sus bases con el ARNm del gen diana puede emparejar sus bases con parte del SUR del ARNm del gen diana y tiene una longitud de 19 a 37 nucleotidos. Tal como se usa en el presente documento, la expresion "empareja sus pares de bases con parte" significa que se emparejan las bases con el SUR del ARNm del gen diana con una energfa de union de -30 kcal/mol o mas (aproximadamente 20 nucleotidos o mas) y tambien significa un emparejamiento de bases con parte del SUR del ARNm del gen diana o una region localizada alrededor de la misma, tal como se muestra en la FIG. 4. En el presente documento, la region que empareja sus bases con el SUR consiste en uno o mas nucleotidos, y preferentemente 9 o mas nucleotidos. En la presente invencion, cuando un ARNs sintetico se une a regiones que no sean el SUR, el efecto de los mismos puede ser relativamente bajo, pero este ARNs sintetico tambien se puede usar para regular el nivel de expresion. Mientras tanto, incluso cuando la region que empareja sus bases con el ARNm del gen diana tiene diversas longitudes de 19-37 nucleotidos, el ARNs de acuerdo con la presente invencion mostro efectos inhibidores de la expresion. Por tanto, la region que empareja sus bases con el ARNm del gen diana puede tener un tamano mmimo que puede emparejar sus bases con el gen diana. La region tiene una longitud de 19-37 nucleotidos.
En otro ejemplo de la presente invencion, se descubrio que, cuando un sitio que no se une al ARNm del gen diana se formo mediante la delecion de uno o dos nucleotidos de la region que empareja sus bases con el ARNm del gen diana, se podfa regular el grado de inhibicion de la expresion. Por tanto, en la presente invencion, se puede formar un sitio que no se une al ARNm del gen diana se formo mediante la delecion o la sustitucion de uno o mas nucleotidos en la region que empareja sus bases con el ARNm del gen diana. Ademas, tambien se puede formar un sitio que no se une al ARNm de la diana mediante la insercion o la delecion de uno o mas nucleotidos en la region que empareja sus bases con el ARNm del gen diana. En el presente documento, con el fin de emparejar las bases con el ARNm del gen diana, se debenan delecionar, sustituir o insertar 1-10 nucleotidos, preferentemente 1-5 nucleotidos de manera que la energfa de union este entre -30 kcal/mol y -13 kcal/mol.
En otro ejemplo de la presente invencion, se realizo un experimento para examinar si el ARNs sintetico no solo inhibe simplemente la expresion del ARNm diana, sino que tambien regula la expresion a diversos niveles para regular la produccion de protema a diversos niveles, regulando de este modo las vfas metabolicas celulares de forma mas precisa. De manera espedfica, se construyo un ARNs sintetico que inhibe la expresion del gen DsRed2, y un ARNs sintetico que inhibe la expresion del gen lacZ. Asimismo, se construyeron ARNs sinteticos para unirse a cada ARNm con una energfa de union que vana de 0 a -60 kcal/mol, y se midio el grado de inhibicion de la expresion del ARNm diana por cada uno de los ARNs sinteticos (FIG. 23). Como resultado, se podna ver que, en el intervalo de aproximadamente -10 kcal/mol a -40 kcal/mol, la expresion del ARNm diana se redujo de forma lineal, y a -40 kcal/mol o menos, no tuvo lugar una reduccion adicional en la expresion. Esto indica que, cuando el ARNs sintetico de acuerdo con la presente invencion se construye para que se una al ARNm diana con una energfa de union que vana de -10 kcal/mol a -40 kcal/mol, puede inhibir la expresion del ARNm diana a un nivel deseado. Por tanto, en la presente invencion, la region que empareja sus bases con el ARNm del gen diana se construye de forma que la energfa de union al ARNm del gen diana este en el intervalo de -20 kcal/mol a -40 kcal/mol.
Mientras tanto, cuando el ARNs sintetico se introduce adicionalmente en un plasmido con el fin de regular la expresion del gen diana y se produce en celulas, el ARNs puede interferir con el crecimiento de las celulas mediante el uso de la fuente de energfa de las celulas. Por tanto, en otro ejemplo de la presente invencion, se examino si el ARNs sintetico introducido de forma adicional tiene alguna influencia en el crecimiento celular y en la expresion de protemas intracelulares (FIG. 24). Se introdujeron 0, 1,2, 3 y 4 ARNs sinteticos en un plasmido que tiene un origen de replicacion CoIE1, y se midio el cambio en el nivel de expresion del gen DsRed2 en el plasmido. Como resultado, se pudo ver que la introduccion de hasta tres ARNs sinteticos no influyo en la expresion de DsRed2 (FIG. 24b). Asimismo, se midio si la introduccion de 0, 1, 2, 3, y 4 ARNs sinteticos tiene alguna influencia sobre la tasa de crecimiento de las celulas. En este caso, se midio la densidad optica (a 600 nm) en la fase de crecimiento logantmico de las celulas y se ajusto en la siguiente ecuacion de la curva de crecimiento celular para calcular la constante de crecimiento celular (k) por tiempo:
y=yo exp(kt)
en la que y0 es el valor D.O.600 inicial y t es el tiempo. Como resultado, se podna ver que, cuando se introdujeron hasta tres ARNs sinteticos, el valor de k se redujo ligeramente, pero la reduccion no fue significativa. Esto indica que la introduccion de hasta tres ARNs en las celulas no influye de manera significativa en el crecimiento de las celulas (FIG. 24c).
En otro ejemplo de la presente invencion, se realizo un experimento para examinar si se podfa construir otros ARNs sinteticos para inhibir otros ARNm diana basandose en el procedimiento descrito anteriormente para la construccion de ARNs sintetico y si los efectos inhibidores de los otros ARNs sinteticos eran suficientes. Por ejemplo, se construyeron ARNs sinteticos para inhibir el ARNm de AraC, KanR y LuxR que no fuese de DsRed2 (FlG. 6). Se hicieron combinaciones de los tres ARNs y tres genes, y se examino la inhibicion de la expresion por cada una de las combinaciones. Para este examen, la protema DsRed2 se fusiono con cada uno de los genes para emitir fluorescencia roja. Los resultados del experimento indicaron que las tasas de inhibicion de la expresion de los ARNm diana por los ARNs fueron uniformes (el 80-86 %) y que la expresion de otros ARNm no difirio del caso en el que se no se uso ARNs sintetico.
Se estimo la energfa de union entre los tres ARNs sinteticos y el respectivo ARNm diana. Como resultado, la energfa de union de la diana pretendida estaba en el intervalo de -53,7 a -59,5 kcal/mol, mientras que la energfa de union a otros ARNm estaba en el intervalo de -12,2 a -13,5 kcal/mol. Los resultados del analisis indican que, cuando la energfa de union al ARNm diana es de aproximadamente -50 kcal/mol o menos y la energfa de union a otros ARNm es de -13 kcal/mol o mayor, el ARNs puede inhibir de manera suficiente solo la diana deseada sin reactividad cruzada. En otras palabras, el ARNs sintetico construido de acuerdo con el procedimiento de la presente invencion se caracteriza porque inhibe de manera suficiente la expresion del ARNm diana y no inhibe la expresion de otros ARNm.
Debe de entenderse que el SUR del ARNm transcrito puede se predecir de manera suficiente de los resultados de los estudios previamente documentados y que se puede hacer ARNs sintetico construido a partir de MicC para unirse a cualquier ARNm.
Asimismo, sera obvio para los expertos en la materia que el procedimiento para preparar ARNs sintetico de acuerdo con la presente invencion se puede aplicar a genes que no sean DsRed2, AraC, kanR y LuxR, incluidos en los ejemplos de la presente invencion, del mismo modo, y por lo tanto, el ambito de la presente invencion no se limita a estos genes. Ademas, de los resultados del estudio mencionado anteriormente que indican que los sitios SUR se pueden predecir en procariotas del mismo modo y que el ARNs se conserva evolutivamente en procariotas, se puede ver que el procedimiento para preparar el ARNs sintetico tambien se aplica a otros procariotas, incluyendo Rhizobium, Bifidobacterium, Rhodococcus, Candida, Erwinia, Enterobacter, Pasteurella, Mannheimia, Actinobacillus, Aggregatibacter, Xanthomonas, Vibrio, Pseudomonas, Azotobacter, Acinetobacter, Ralstonia, Agrobacterium, Rhizobium, Rhodobacter, Zymomonas, Bacillus, Staphylococcus, Lactococcus, Streptococcus, Lactobacillus, Clostridium, Corynebacterium, Streptomyces, Bifidobacterium, y Cyclobacterium, ademas de E. coli.
En la presente invencion, el sitio de union de Hfq derivado del ARNs de MicC se puede localizar sucesivamente desde la region que empareja sus bases con el ARNm del gen diana o se puede unir a la region mediante un enlazador tal como un fragmento de acido nucleico. Tal como se usa en el presente documento, "emparejar sus bases" significa un emparejamiento de bases entre las secuencias de acido nucleico. La region que empareja sus bases con el ARNm del gen diana puede tener una secuencia complementaria de aproximadamente el 70-80 % o mas, preferentemente aproximadamente el 80-90 % o mas, e incluso mas preferentemente el 95-99 % o mas, con el ARNm del gen diana.
Ademas, el ARNs de la presente invencion se puede sintetizar de acuerdo con un procedimiento general, pero no se limita al mismo. En otras palabras, el ARNs se puede sintetizar qmmicamente o enzimaticamente.
El ARNs de acuerdo con la presente invencion puede comprender una modificacion qmmica. La modificacion qmmica puede ser la sustitucion del grupo hidroxilo en la posicion 2' de la ribosa de al menos un nucleotido incluido en el ARNs mediante uno cualquiera de un atomo de hidrogeno, un atomo de fluor, un grupo -O-alquilo, un grupo -O-acilo y un grupo amino. Ademas, la modificacion qmmica tambien puede ser la sustitucion del grupo hidroxilo mediante uno cualquiera de -Br, -Cl, -R, -R'OR, -SH, -SR,-N3 y -CN (R=alquilo, arilo o alquileno) con el fin de aumentar la capacidad para administrar el ARNs. Ademas, la modificacion qmmica puede ser la sustitucion de la estructura principal de fosfato de al menos un nucleotido por uno cualquiera de una forma de fosforotioato, una forma de fosforoditioato, una forma de alquilfosfonato, una forma de fosforoamidato y una forma de boranofosfato. Ademas, la modificacion qmmica puede ser la sustitucion de al menos un nucleotido incluido en el ARNsi mediante uno cualquiera de LNA (del ingles locked nucleic acid, acido nucleico bloqueado), UNA (del ingles, unlocked nucleic acid, acido nucleico desbloqueado), morfolino y PNA (acido peptidonucleico).
En otro aspecto, la presente invencion describe un acido nucleico aislado que codifica el ARNs, y un vector de expresion que comprende el acido nucleico aislado que codifica el ARNs.
En la presente invencion, "acido nucleico" puede ser ARN, ADN, ARN estabilizado o ADN estabilizado. Tal como se usa en el presente documento, el termino "codificante" se refiere a una secuencia de acido nucleico que codifica el ARNs y complementaria al ARNs.
Tal como se usa en el presente documento, el termino "vector" significa una construccion de ADN que contiene una secuencia de ADN unida de forma operativa a una secuencia de control adecuada capaz de efectuar la expresion del ADN en un hospedador adecuado. El vector puede ser un plasmido, una partfcula de fago o simplemente una posible insercion genomica. Una vez que se incorpora en un hospedador adecuado, el vector se puede replicar y funcionar de manera independiente del genoma del hospedador o, en algunos casos, se puede integrar en el propio genoma. En la presente memoria descriptiva, "plasmido" y "vector" se usan a veces de manera intercambiable, ya que el plasmido es la forma mas comunmente usada de vector. Para los fines de la presente invencion, preferentemente se usa un vector de plasmido. Un vector de plasmido que se puede usar para este fin contiene: (a) un origen de replicacion mediante el cual, la replicacion tiene lugar de forma eficaz, de manera que se crean varios cientos de vectores de plasmido por celula hospedadora; (b) un gen de resistencia a antibioticos mediante el cual, las celulas transformadas con el vector del plasmido se pueden seleccionar; y (c) sitios de corte de enzima de restriccion en los que se pueden insertar fragmentos de ADN extrano. Incluso si los sitios adecuados de corte de enzimas de restriccion no estan presentes en el vector, el uso de un adaptador o enlazador convencional de oligonucleotidos sinteticos permite la union facil entre el vector y los fragmentos de ADN extrano. Tras la union, el vector se debena transformar en celulas hospedadoras adecuadas. La transformacion se puede lograr facilmente mediante el procedimiento del cloruro de calcio o la electroporacion (Neumann, y col., EMBO J., 1:841, 1982). Como el vector que se usa para la expresion de ARNs de acuerdo con la presente invencion, se puede usar un vector de expresion conocido en la materia.
Una secuencia de nucleotidos se une de manera operativa cuando se dispone en una relacion funcional con otra secuencia de acido nucleico. La secuencia de nucleotidos puede ser un gen y una(s) secuencia(s) de control enlazadas para ser capaces de expresar el gen cuando se une a una(s) secuencia(s) de control (por ejemplo, protema de activacion de la transcripcion). Por ejemplo, el ADN para una presecuencia o un lfder secretor esta unido de manera operativa a ADN que codifica un polipeptido cuando se expresa como preprotema que participa en la secrecion de polipeptido; un promotor o un potenciador esta unido de manera operativa a una secuencia codificante cuando afecta a la transcripcion de la secuencia; y un SUR esta unido de manera operativa a una secuencia codificante cuando afecta a la transcripcion de la secuencia o a una secuencia codificante cuando se dispone para facilitar la traduccion. En general, el termino "unido de manera operativa" se refiere a que las secuencias unidas de ADN son contiguas, y en el caso de la lfder secretora, son contiguas y estan presentes en un marco de lectura. Sin embargo, un potenciador no es necesariamente contiguo. El enlace entre estas secuencias se realiza mediante ligamiento en un sitio conveniente de enzimas de restriccion. Sin embargo, cuando no existe el sitio, se usa un adaptador de oligonucleotido sintetico o un enlazador de acuerdo con un procedimiento convencional.
En otro aspecto mas, la presente invencion se dirige a un microorganismo recombinante transformado con el vector de expresion que comprende un acido nucleico aislado que codifica el ARNs tal como se define anteriormente. Tal como se usa en el presente documento, el termino "transformacion" significa que el ADN se puede replicar como un factor fuera del cromosoma o por medio de la finalizacion de todo el cromosoma mediante la introduccion de ADN en un hospedador.
Por supuesto, debena entenderse que no todos los vectores funcionan igual al expresar secuencias de ADN de acuerdo con la presente invencion. De manera similar, no todos los hospedadores funcionan del mismo modo con respecto al mismo sistema de expresion. Sin embargo, un experto en la materia se puede seleccionar de forma apropiada entre diversos vectores, secuencias de control de la expresion y hospedadores sin salir del ambito de la presente invencion o portar una excesiva carga experimental. Por ejemplo, se debe seleccionar un vector considerando un hospedador, dado que el vector se debe replicar en el hospedador. De manera espedfica, el numero de copias del vector, la capacidad de regulacion del numero de copias y la expresion de las otras protemas codificadas por el correspondiente vector (por ejemplo, la expresion de un marcador de antibioticos) tambien se debena de considerar.
En otro aspecto mas, la presente invencion se refiere a la inhibicion eficaz de la expresion de un gen intracelular sin delecion del gen para cambiar el flujo de las vfas metabolicas para aumentar de este modo la produccion de un metabolito deseado. En un ejemplo de la presente invencion, se descubrio que el flujo de las vfas metabolicas se puede regular de forma artificial mediante la inhibicion de la expresion de un gen diana intracelular usando el ARNs sintetico, mediante lo cual se pueden producir tirosina y fenol con alta eficacia en E. coli. En otro ejemplo de la presente invencion, se descubrio que se puede producir cadaverina con alta eficacia en E. coli usando el mismo principio. Por consiguiente, la presente invencion se dirige a un procedimiento para inhibir la expresion de un gen diana, comprendiendo el procedimiento las etapas de: la introduccion o expresion del ARNs tal como se define anteriormente en un procariota; y la inhibicion de la expresion del ARNm del gen diana.
En otro aspecto mas, la presente invencion se dirige a un procedimiento para inhibir la expresion de un gen diana, comprendiendo el procedimiento las etapas de: la introduccion o expresion del ARNs tal como se define anteriormente en un procariota; e inhibir la expresion del ARNm del gen diana.
Preferentemente, la expresion del ARNs se puede inducir mediante un promotor que opera de acuerdo con la union de un inductor tal como arabinosa o se puede inhibir mediante un factor de transcripcion termosensible tal como cl. De manera espedfica, para la expresion correcta del ARNs sintetico, la expresion del ARNs se puede regular doblemente usando un inductor exogeno y un factor de transcripcion termosensible. De manera espedfica, el ARNs sintetico se puede expresar mediante el promotor PR del fago lambda, y la expresion del mismo se puede controlar de manera segura usando la concentracion de arabinosa y la temperatura expresando la protema termosensible cl(ts2) de un promotor pBAD.
El ARNs de acuerdo con la presente invencion se puede usar para seleccionar un gen que necesita ser delecionado para producir una sustancia util. El procedimiento para seleccionar el gen que necesita ser delecionado para producir una sustancia util comprende la etapa de: (a) inhibir la expresion de al menos un gen entre los genes, que estan presentes en una cepa para la produccion de la sustancia util y participa en la via de biosmtesis de la sustancia util, usando el ARNs tal como se define anteriormente que direcciona al gen; y (b) seleccionar el gen cuya expresion se inhibio, como el gen que necesita ser delecionado para producir la sustancia util, si el rendimiento de la produccion de la sustancia util aumenta mediante la inhibicion de la expresion del gen. Tal como se usa en el presente documento, el termino "delecionado" se refiere a incluir mutar, sustituir o delecionar parte del gen de interes o introducir uno o mas nucleotidos en el gen, o introducir un gen, una enzima o una sustancia qrnmica, que inhibe la expresion o la actividad de la enzima de interes, inhibiendo de este modo la actividad de la enzima. Ademas, el gen seleccionado para ser delecionado tambien se puede usar para mejorar la cepa para producir la sustancia util. En un aspecto adicional, la presente invencion se dirige a un procedimiento para mejorar una cepa para producir una sustancia util, comprendiendo el procedimiento las etapas de:
(a) inhibir la expresion de al menos un gen entre los genes, que estan presentes en una cepa para la produccion de la sustancia util y participa en la via de biosmtesis de la sustancia util, usando el ARNs tal como se define anteriormente que direcciona al gen;
(b) seleccionar el gen cuya expresion se inhibio, como el gen que necesita ser delecionado para producir la sustancia util, si el rendimiento de la produccion de la sustancia util aumenta mediante la inhibicion de la expresion del gen; y
(c) construir una cepa recombinante que tiene una delecion del gen seleccionado o una combinacion de los genes seleccionados.
En un ejemplo de la presente invencion, se descubrio que, cuando se inhibio la expresion de tyrR y csrA en una celula hospedadora que tiene la via de biosmtesis de tirosina usando el ARNs de acuerdo con la presente invencion, aumento la produccion de tirosina en la celula.
Aun en un aspecto adicional, la presente invencion se dirige a un microorganismo recombinante que tiene una capacidad mejorada para producir tirosina, obteniendose el microorganismo recombinante mediante la inactivacion de las funciones de los genes tyrR y crsA en una celula hospedadora que tiene la via de biosmtesis de tirosina, en la que las funciones de los genes tyrR y csrA se inactivan mediante la introduccion o la expresion de un ARNs sintetico tal como se define anteriormente en una celula hospedadora que tiene la via de biosmtesis de tirosina para inhibir la expresion de los genes tyrR y csrA y, en la que el microorganismo recombinante expresa el ARNs sintetico tal como se define anteriormente.
Tal como se usa en el presente documento, el termino "inactivacion de la funcion" se refiere a incluir mutar, sustituir o delecionar parte del gen de interes o introducir uno o mas nucleotidos en el gen, o introducir un gen, una enzima o una sustancia qmmica, que inhibe la expresion o la actividad de la enzima de interes, inhibiendo de este modo la actividad de la enzima. Por tanto, un procedimiento de inactivacion de la funcion de un gen espedfico no se limita a ningun procedimiento particular, siempre que la actividad del gen espedfico de interes y la actividad de la enzima que esta codificada por el gen se inhiben por procedimientos convencionales, incluyendo la inhibicion de la expresion mediante ARN antisentido, recombinacion homologa, recombinacion homologa mediante la expresion de diversas enzimas recombinantes (lambda recombinasa, etc.) y la insercion de una secuencia espedfica usando transcriptasa inversa y ARN.
Ademas, en un ejemplo de la presente invencion, se construyo un plasmido recombinante, que sobreexpresa los siguientes genes implicados en la biosmtesis de tirosina (FIG. 10): ppsA que codifica la policetido sintasa A de tipo I de smtesis de fenoltiocerol; tktA que codifica la transcetolasa; aroG y aroF que codifican la 3-desoxi-7-fosfoheptulonato sintasa; aroK que codifica la shikimato cinasa I; tyrA que codifica la corismato mutasa; y tyrC que codifica la prefenato deshidrogenasa derivada de Zymomonas mobilis. Particularmente, la presente invencion proporciona un plasmido recombinante construido mediante la realizacion de mutagenesis de sitio dirigido de uno o mas restos de aminoacidos en aroG y tyrA resistentes a la retroalimentacion para aumentar la activacion de la via metabolica de tirosina (aroG A146N y tyrA A354V/M53I, LutkeEversloh y col., Applied Microbiology and Biotechnology, 75:103, 1999).
El plasmido recombinante construido tal como se describe anteriormente se transformo en 14 cepas diferentes de E. coli (cepas K-12 (C600, DH5a, ER2925, JM110, MG1655, S17-1, T1R (One shot(R) ccdB SurvivalTM2 T1R, Invitrogen), TG1, TOP10, W3110, XL1-Blue), cepa B (BL21(DE3), cepa W y un hforido (HB101) de las cepas K-12 y B)), y despues se midio la produccion de tirosina en cada una de las cepas transformadas (FIG. 11).
Aunque 14 cepas microbianas que pertenecen al genero Escherichia se ilustran en la presente invencion, el ambito de la presente invencion no se limita a estas 14 cepas microbianas, dado que es evidente que el ARNs sintetico y el plasmido recombinante de la presente invencion funcionan del mismo modo en Escherichia, Bacillus, Rhizobium, Bifidobacterium, Rhodococcus, Candida, Erwinia, Enterobacter, Pasteurella, Mannheimia, Actinobacillus, Aggregatibacter, Xanthomonas, Vibrio, Pseudomonas, Azotobacter, Acinetobacter, Ralstonia, Agrobacterium, Rhizobium, Rhodobacter, Zymomonas, Bacillus, Staphylococcus, Lactococcus, Streptococcus, Lactobacillus, Clostridium, Corynebacterium, Streptomyces, Bifidobacterium y Cyclobacterium.
Se puede ver que las cepas mostraron diferentes capacidades para producir tirosina, incluso aunque la via de biosmtesis de tirosina se activo mediante la misma via de biosmtesis. Esto sugiere que incluso las cepas que pertenecen a la especie E. coli tienen diferentes actividades intracelulares. Por tanto, esto indica que, para el diseno metabolico, la produccion de un compuesto deseado en todas las cepas diferentes se debena examinar con el fin de alcanzar el maximo rendimiento del compuesto deseado. Por consiguiente, se puede ver que es diffcil realizar este examen modificando la secuencia cromosomica de acuerdo con el procedimiento convencional lento de delecion. Por lo tanto, se puede ver que la tecnologfa de reducir la expresion de un gen diana de forma similar al procedimiento de delecion genica sin modificar la secuencia cromosomica, es decir, la tecnologfa del ARNs sintetico de acuerdo con la presente invencion, es altamente util.
En la presente invencion, el ARNs sintetico de anti-tyrR que se dirige al ARNm de tyrR se clono en el plasmido recombinante construido tal como se describe anteriormente, y se examinaron del mismo modo los efectos de los mismos en 14 cepas diferentes. Cada uno de los tres ARNs sinteticos restantes que regulan otros flujos metabolicos se clonaron en el mismo plasmido recombinante, y se examinaron los efectos de los mismos en combinacion (FIG.
11). Como resultado, se podna ver que, cuando se inhibio tyrR, la produccion de tirosina en la mayona de las cepas aumentaba. Sin embargo, cuando se introduda adicionalmente un ARNs sintetico que inhibe la expresion de ppc o pgi, la produccion de tirosina se reduda en lugar de aumentar. Particularmente, se podna ver que, cuando se inhibfa la expresion de pgi, la tasa de crecimiento de la cepa de E. coli se reduda de manera significativa, y por este motivo, disminma la produccion global de tirosina en la cepa.
En la presente invencion, el grado de inhibicion de la expresion del gen pgi se diversifico mas con el fin de equilibrar el crecimiento de la celula hospedadora y el flujo metabolico a tirosina, aumentando de este modo la produccion global de tirosina. A tal fin, parte de la secuencia de union del gen regulador de la smtesis anti-pgi se deleciono con el fin de reducir la capacidad de union. De manera espedfica, como se muestra en la FIG. 13, se delecionaron uno o dos nucleotidos de la secuencia de union, y despues se observaron los cambios en el crecimiento celular y en la produccion de tirosina. Como resultado, como se puede ver en la FIG. 11, a medida que el grado de inhibicion del gen disminma, la produccion de tirosina aumento, mientras que la tasa de crecimiento de la celula hospedadora tambien aumento. Con respecto a esto, la FIG. 12 muestra una cepa S17-1 que tiene la mayor capacidad para producir tirosina y una cepa TOP10 que tiene la menor capacidad para producir tirosina.
A traves de los procedimientos descritos anteriormente realizados en la presente invencion, se descubrio que la cepa S17-1 de E. coli en la que se inhibio la expresion de los genes tyrR y csrA mostro la mayor capacidad para producir tirosina (2 g/l).
Se realizo la fermentacion usando la cepa recombinante S17-1 construida en la presente invencion, y como resultado, se demostro que la produccion de tirosina podna alcanzar hasta 21,9 g/l (FIG. 15).
Con el fin de verificar la produccion del compuesto deseado, la tirosina vana en funcion de la capacidad metabolica de las celulas incluso para el mismo diseno metabolico y para demostrar que el ARNs sintetico construido inhibe eficazmente la expresion de su ARN diana, se midieron los grados de inhibicion de expresion del ARN diana en las cepas S17-1 y TOP10 (FIG. 14). Como resultado, se demostro que la expresion del ARNm diana en las dos cepas se inhibfa de forma eficaz en aproximadamente el 80-90 %. Esto indica que el ARNs sintetico presenta efectos inhibidores similares independientemente de las cepas.
En la presente invencion, se descubrio que el ARNs sintetico se puede usar para regular los flujos metabolicos y que, debido a esta ventaja de que elimina la necesidad de modificar la secuencia cromosomica, las cantidades de produccion de tirosina causadas por la inhibicion de la expresion del gen diana en diversas cepas de E. coli se pueden determinar de manera eficaz al mismo tiempo.
En la presente invencion, se clono adicionalmente la tirosina fenol liasa (TPL) en el plasmido construido con el fin de cambiar la tirosina a fenol y producir fenol. Asimismo, el plasmido construido se introdujo en las 14 cepas diferentes de E. coli probadas tal como se describe anteriormente, y despues se midio la produccion de fenol en las cepas de E. coli. Como resultado, se demostro que la produccion de fenol en la cepa W3110 era de 357,6 mg/l, y que la produccion de fenol en la cepa S17-1 que mostro la mayor capacidad para producir tirosina era 68,8 mg/l. Esta es la primera produccion exitosa de fenol en E. coli.
En otro aspecto mas, la presente invencion se dirige a un microorganismo recombinante que tiene una capacidad para producir fenol, obteniendose el microorganismo recombinante mediante la introduccion o la amplificacion de un gen tpl en el microorganismo recombinante descrito anteriormente.
En otro ejemplo de la presente invencion, se examino si un flujo metabolico se puede regular mediante el ARNs sinteti
Con el fin de aumentar la cantidad de metabolitos requeridos para la produccion de cadaverina, se seleccionaron los siguientes ocho genes candidatos a inhibir: gltA (citrato sintasa), thrA (aspartato cinasa I), thrB (homoserina cinasa), thrC (treonina sintasa), thrL (peptido lfder de operon thr), metB (cistationina gamma sintasa), murE (UDP-N-acetilmuramoil-L-alanil-D-glutamato-L-lisina ligasa), y murF (UDP-N-acetilmuramoilalanil-D-glutamil-2,6-diaminopimelato-D-alanil-D-alanino ligasa).
Tras la transformacion con el plasmido recombinante que contiene el ARNs sintetico construido, se midio la produccion de cadaverina. La produccion de cadaverina en la cepa basica fue de 1,4±0,05 g/l, y cuando se tomo como el 100 %, las cepas en las que las expresiones de cada uno de murE, metB y thrL entre los ocho genes candidatos estaban inhibidos mostraron aumentos en la produccion de cadaverina del 55 % (2,15 g/l) para murE, el 24 % (1,73 g/l) para metB y el 34 % (1,87 g/l) para thrL (FIG. 19).
En otro ejemplo de la presente invencion, se realizo el mismo experimento en 130 genes candidatos, y como resultado, como se muestra en la FIG. 27, se descubrio que la inhibicion de la expresion de un total de 37 genes enumerados en la Tabla 5 dieron como resultado un aumento en la produccion de cadaverina. La produccion de cadaverina en la cepa basica fue de 1,4±0,05 g/l, y cuando se tomo como el 100 %, las cepas en las que las expresiones de cada uno de los genes murE y ack estaba inhibida mostraron aumentos en la produccion de cadaverina del 55 % (2,15 g/l) para murE y del 40 % (1,96 g/l) para ack (FIG. 27).
Por tanto, en otro aspecto adicional, la presente invencion se dirige a un microorganismo recombinante que tiene una capacidad mejorada para producir cadaverina, obteniendose el microorganismo recombinante mediante la inactivacion de la funcion de al menos un gen, en una celula hospedadora que tiene la via de biosmtesis de cadaverina, en la que las funciones de los genes se inactivan mediante la introduccion o la expresion de un ARNs sintetico tal como se define anteriormente en una celula hospedadora que tiene la via de biosmtesis de cadaverina para inhibir la expresion de al menos un gen seleccionado del grupo que consiste e murE, metB, thrL y ackA.
Preferentemente, el microorganismo recombinante se obtiene mediante la inactivacion de la funcion de al menos un gen seleccionado del grupo que consiste en murE, metB, thrL y ackA. Los ejemplos de una celula hospedadora que tiene la via de biosmtesis de cadaverina incluyen E. coli, Rhizobium, Bifidobacterium, Rhodococcus, Candida, Erwinia, Enterobacter, Pasteurella, Mannheimia, Actinobacillus, Aggregatibacter, Xanthomonas, Vibrio, Pseudomonas, Azotobacter, Acinetobacter, Ralstonia, Agrobacterium, Rhizobium, Rhodobacter, Zymomonas, Bacillus, Staphylococcus, Lactococcus, Streptococcus, Lactobacillus, Clostridium, Corynebacterium, Streptomyces, Bifidobacterium, y Cyclobacterium.
Ejemplos
En lo sucesivo en el presente documento, la presente invencion se describira en mayor detalle con referencia a los ejemplos.
Ejemplo 1: Examen del rendimiento del ARNs sintetico
1-1: Construccion de ARNs sintetico y construccion del plasmido pWAS para la regulacion de la expresion
Se construyo un plasmido basico tal como se muestra en la FIG. 18, en el que se inhibio la expresion de un ARNs sintetico, pero se podna expresar de forma eficaz si se requena.
En el plasmido pWAS de la FIG. 18, el ARNs sintetico se puede construir mediante la insercion de una region de union al ARNm del gen diana en un promotor (Pr) y una region de union de Hfq MicC mediante mutagenesis de sitio dirigido.
Las enzimas de restriccion usadas en este Ejemplo y en los siguientes Ejemplos se encargaron a New England Labs (EE.UU.) y la polimerasa de la PCR se encargo a Invitrogen (EE.UU.). Otros reactivos se indicaron por separado.
En primer lugar, la PCR se realizo usando un plasmido pKD46 (GenBank AY048746.1 (Datsenko y col., PNAS, 97(12): 6640-6645, 2000)) como molde y los cebadores de las SEQ ID NO: 2 y 3, y el promotor araC-PBAD se clono en un plasmido pWA (FIG. 20, SEQ ID NO: 1) usando SacI/EcoRI. Asimismo, se realizo la PCR usando los cebadores de las SEQ ID NO: 4 y 5 del cromosoma del fago lambda (Bioneer, Corea; GenBank NC_001416.1), y se obtuvo el gen cI mediante escision con PacI/EcoRI y despues se unio. Ademas, se clono adicionalmente una secuencia T1/TE como una secuencia de terminacion de la transcripcion en el plasmido tras la realizacion de la PCR. En el presente documento, la secuencia T1/TE se obtuvo mediante PCR usando los cebadores de las SEQ ID NO: 6 y 7 sin molde, y se escindio con EcoRI/XbaI y despues se unio al vector que contiene araC-pBAD-cl introducido en el mismo, de manera que la terminacion de cI se pudiese terminar. Usando como molde el vector construido anteriormente, se amplifico la T1/TE mediante PCR usando los cebadores de las SEQ ID NO: 8 y 9, despues de lo cual se escindio con Xhol/KpnI y se unio al vector construido anteriormente, de manera que la transcripcion del ARNs podna terminar de forma independiente. Se realizo la mutagenesis de sitio dirigido usando el vector construido como un molde y los cebadores de las SEQ ID NO: 10 y 11, modificando de este modo el gen cl de tipo silvestre al gen cl mutante termosensible (ts2).
Secuencias de los cebadores usados
[SEQ ID NO: 2] 5'-AAGCTGGAGC TCAATACTAG TCGATTTATT
ATGACAACTT GACGGCTACA TC-3'
[SEQ ID NO: 3] 5'-GAATTCAATT AATTAATTAA AATTCCCAAA
AAAACGGGTA TGGAGAA-3'
[SEQ ID NO: 4] 5'-GGGAATTTTA ATTAAAAGGA GACCCGGGAT
ATGAGCACAA AAAAGAAACC ATTAACA-3'
[SEQ ID NO: 5] 5'-AATTATGAAT TCTTAGCCAA ACGTCTCTTC AGG-
3 '
[SEQ ID NO: 6] 5'-AATAT GAATTCCCAG GCATCAAATA AAACGAAAGG
CTCAGTCGAA AGACTGGGCC TTTCGTTTTA TCTGTTGTTT GTCGGTGAAC
GCTCTCTACT AGAGTC-3'
[SEQ ID NO: 7] 5'-AATAT TCTAGATATA AACGCAGAAA GGCCCACCCG
AAGGTGAGCC AGTGTGACTC TAGTAGAGAG CGTTCACCGA CAAACAACAG
ATAAAACGAA AG-3'
[SEQ ID NO: 8] 5'-TTTTTTCTCG AGCCAGGCAT CAAATAAAAC GAA-
3'
[SEQ ID NO: 9] 5'-GAATTGGGTA CCTATAAACG CAGAAAGGCC CACC-
3'
[SEQ ID NO: 10] 5'-gAAGTTAT CGCTAGTCAG TGGCC -3'
[SEQ ID NO: 11] 5'-CCCCACAACG GAACAACTCT -3'
A continuacion, se construyo una secuencia para su uso como una estructura a base de ARNs sintetico y un promotor PR mediante PCR del siguiente modo. Para una estructura de MicC, se realizo la PCR usando el cromosoma de E. coli W3110 (GenBank AP009048) como un molde y los cebadores de las SEQ ID NO: 12 y 13, y el producto de la PCR se clono usando un kit de clonacion TOPO (Invitrogen), se secuencio y despues se unio al vector construido anteriormente usando PstI/Xhol. Para una estructura de SgrS (referencial), se realizo la PCR usando el mismo molde que antes y los cebadores de las SEQ ID NO: 14 y 15, y el producto de la PCR se clono usando un kit de clonacion TOPO, se secuencio y despues se clono en el vector construido anteriormente usando PstI/Xhol. Para una estructura de MicF (referencial), se realizo la PCR usando los cebadores de las SEQ ID NO: 16 y 17 sin molde, y el producto de PCR se clono usando un kit de clonacion TOPO, se secuencio y despues se clono en el vector usando PstI/Xhol. De esta manera, se pudieron construir tres vectores que tienen estructuras fundamentales diferentes. Cada una de las estructuras de ARNs se muestra en la FIG. 2. Se realizo una PCR para conformar la clonacion en este plasmido o la secuenciacion usando los cebadores de las SEQ ID NO: 18 y 19.
Secuencias de los cebadores usados
[SEQ ID NO: 12] 5'-CTGCAGGAAT TCTAACACCG TGCGTGTTGA
CTATTTTACC TCTGGCGGTG ATAATGGTTG CTTTCTGTTG GGCCATTGCA TTGC-
3 '
[SEQ ID NO: 13] 5-CTCGAGAAAA AAAGCCCGGA CGACTGTTC-3'
[SEQ ID NO: 14] 5'-CTGCAGGAAT TCTAACACCG TGCGTGTTGA
CTATTTTACC TCTGGCGGTG ATAATGGTTG CGATGAAGCA AGGGGGTGC-3'
[SEQ ID NO: 15 ] 5 ' -CTCGAGAAAA AAAACCAGCA GGTATAATCT
G C T G - 3 '
[SEQ ID NO: 16] 5'-CTGCAGGAAT TCTAACACCG TGCGTGTTGA
CTATTTTACC TCTGGCGGTG ATAATGGTTG CTCATTTCTG AATG-3
[SEQ ID NO: 17] 5'-TCGAGAAAAA AAACCGAATG CGAGGCATCC
GGTTGAAATA GGGGTAAACA GACATTCAGA AATGAGCAAC CATTATCAC-3'
[SEQ ID NO: 18] 5-AGTGGGAACC TAGACACTAA-3'
[SEQ ID NO: 19] 5-CTAGGTAAAC CCAGGAGG-3'
Como resultado, se construyo el plasmido pWAS tal como se muestra en la FIG. 20. El promotor PR es un promotor de fago lambda y cI(ts2) es un gen del fago lambda que funciona para suprimir el promotor PR y es una protema mutante termosensible que normalmente opera a 25 °C y que pierde su funcion a 37 °C (Jana y col., Protein Engineering, 13(3): 225-233, 1999). Cuando se cultivo el plasmido en medio LB que contiene arabinosa al 1 % (triptona al 1 %, NaCl al 1 %, extracto de levadura al 0,5 %) a 25 °C, se expreso cI(ts2) lo suficiente y su funcion se mantuvo intacta, y por lo tanto, suprime el promotor PR de manera que el ARNs sintetico no se expresa. Sin embargo, cuando el plasmido se cultivo a 37 °C en ausencia de arabinosa, no se expreso suficiente cI(ts2) y pierde su funcion debido a su inestabilidad a la temperatura y por lo tanto, fracasa al suprimir el promotor PR, de manera que se expresa ARNs sintetico.
1-2: Construccion del plasmido reportero para probar el rendimiento del ARNs sintetico
Se construyo un plasmido reportero para examinar la funcion del ARNs sintetico. Un plasmido basico para clonar un reportero fue pR15CA. La estructura del plasmido basico se muestra en la FIG. 21, y la secuencia del mismo se establece en la SEQ ID NO: 20.
T1/TE que es la secuencia de terminacion de la transcripcion del gen reportero se amplifico mediante PCR usando el plasmido pWAS (construido en el Ejemplo 1-2) como molde y los cebadores de las SEQ ID NO: 21 y 22, y el producto de la PCR se escindio con Xhol/KpnI y despues se clono en un plasmido pR15CA. El promotor Iac para la expresion del gen DsRed2 se amplifico usando pBluescript SK+ (Stratagene) como molde y los cebadores de las SEQ ID NOS: 23 y 24, y el producto de la PCR se clono en el plasmido usando EcoRI/xhol. Finalmente, el gen DsRed2 se amplifico mediante PCR usando pDsRed2-N1 (Clontech) como molde y los cebadores de las SEQ ID NO: 25 y 26, y el producto de la PCR se clono en el vector pR15CA usando PacI/Xhol, construyendo asf un plasmido reportero.
Secuencias de los cebadores usados
[SEQ ID NO: 21] 5'-ATAATTCTCG AGCCAGGCAT CAAATAAAAC
GAAAGGCT-3'
[SEQ ID NO: 22] 5'-AATTAGGTAC CTATAAACGC AGAAAGGCCC ACC-
3'
[SEQ ID NO: 23] 5'-AATTA
GAATTCGTGGATAACCGTATTACCGCCTTTG-3'
[SEQ ID NO: 24 ] 5'-AATTACTCGA GAATTATTTA ATTAATAAAG
TTAATTTTTT TTTTTTGTGT GAAATTGTTA TCCGCTC-3'
[SEQ ID NO: 25 ] 5 ' -AATTATTAAT TAAAAGGAGG ACAAATATAT
G G C G A G C -3'
t SEQ ID NO: 2 6 ] 5 ' -AATTACTCGA GTTACGCCAC CAGGGCATAG
TTTTCATCAT TTGCCGCCAG GAACAGGTGG TGGCGGCCCT CGGT-3'
1-3: Construccion de ARNs para la seleccion estructuras a base de ARNs sintetico y examen del rendimiento de las mismas
Con el fin de insertar una secuencia, que se dirige al sitio de union del ribosoma (SUR) del ARNm de DsdRed2, en cada uno de los tres plasmidos de pWAS construidos en el Ejemplo 1-1 y que contiene las estructuras basadas en ARNs (MicC, SgrS (referencial) y MicF (referencial)), respectivamente, se realizo la PCR usando los siguientes cebadores. El SUR de DsRed2 y la secuencia que se une al mismo se muestran en la FIG. 2.
En primer lugar, se realizo la mutagenesis de sitio dirigido mediante PCR usando el plasmido del Ejemplo 1-1 (que contiene la estructura basada en MicC en pWAS) y los cebadores de las SEQ ID NO: 27 y 28 para insertar una secuencia de union complementaria de direccionamiento a DsRed2 en el frente de la estructura a base de MicC, construyendo de este modo un ARNs sintetico que tiene una estructura MicC de direccionamiento de DsRed2. El productor de la PCR para la mutagenesis de sitio dirigido se purifico en gel de ADN, se trato con Dpnl durante 1 hora, y despues se trato con T4 polinucleotido cinasa y T4 ADN ligasa durante 4 horas, seguido por la transformacion en DH5-alpha. De acuerdo con el mismo procedimiento como el descrito anteriormente, la mutagenesis de sitio dirigido se realizo usando el vector que contiene la estructura a base de SgrS pWAS (referencial) como un molde y los cebadores de las SEQ ID NO: 29 y 30, construyendo de este modo un ARNs sintetico que tiene una estructura a base de SgrS. Asimismo, la mutagenesis de sitio dirigido se realizo usando el vector que contiene la estructura a base de MicF pWAS (referencial) como un molde y los cebadores de las SEQ ID NO: 31 y 32, construyendo de este modo un ARNs sintetico que tiene una estructura a base de MicF. Cada uno de los tres ARNs sinteticos diferentes construidos tal como se describe anteriormente se transformo en E. coli DH5-alpha (Invitrogen, EE.UU.) transformada con el plasmido reportero, y despues, las celulas de E. coli se cultivaron en un medio LB que contiene 35 pg/ml de cloranfenicol y 50 pg/ml de ampicilina a 37 °C a fase estacionaria, y despues se midio la fluorescencia en un sistema de citometna de flujo FACSCalibur (Becton Dickinson).
Secuencias de los cebadores usados
[SEQ ID NO: 27] 5'-
GCGAGCAGTGAGAACGTCATAAGTCAACTTTCAGAATTGCGGTCATCCCA-3'
[SEQ ID NO: 28] 5'
CATATATTTGTCCTCCTTAAATCACCCGCCAGCAGATTATACCTG-3'
[SEQ ID NO: 29 5'-
GCGAGCAGTGAGAACGTCATGCAACCATTATCACCGCCAGAGGTAAAA-3'
[SEQ ID NO: 30] 5'
CATATATTTGTCCTCCTTTCATTTCTGAATGTCTGTTTACCCCTA-3'
[SEQ ID NO: 31] 5'
GCGAGCAGTGAGAACGTCATGCAACCATTATCACCGCCAGAGGTAAAA-3'
[SEQ ’ ID NO: 32] 5'-
CATATATTTGTCCTCCTTTCATTTCTGAATGTCTGTTTACCCC-3'
Como resultado, como se puede ver en la FIG. 3, el ARNs sintetico obtenido mediante la insercion de la secuencia que se dirige al SUR del ARNm de DsRed2 en el sitio de union de Hfq de SgrS (referencial) inhibio la expresion de DsRed2 al 85 %, y el ARNs sintetico obtenido mediante insercion de la secuencia que se dirige al SUR del ARNm de DsRed2 en el sitio de union de Hfq de MicC inhibio la expresion de DsRed2 al 90 %. En otras palabras, se demostro que las tres estructuras seleccionadas ayudaron a la inhibicion eficaz de la expresion y, en particular, el efecto de la estructura de ARNs que comprende el sitio de union de Hfq de MicC (invencion) fue mejor.
Ejemplo 2: Seleccion de la posicion de ARNm eficaz para la funcion del ARNs sintetico
Con el fin de determinar la posicion de la union al ARNm, eficaz para la funcion estable de los ARNs sinteticos, se construyeron los ARNr sinteticos usando el plasmido pWAS como un molde para la union a diversos sitios de DsRed2.
Las regiones, que se introducen en cada uno de los ARNs sinteticos y emparejan sus bases con el ARNm de DsRed2, se amplificaron mediante PCR usando los siguientes cebadores del mismo modo tal como se describe en el Ejemplo 1-3 y se introdujeron en el plasmido pWAS que comprende el sitio de union de Hfq de MicC.
En la FIG. 4, la secuencia A se obtuvo usando los cebadores de las SEQ ID NO: 27 y 28; la secuencia B1 se obtuvo usando los cebadores de las SEQ ID NO: 33 y 34; la secuencia B2 se obtuvo usando los cebadores de las SEQ ID NO: 35 y 36; la C1 se obtuvo usando los cebadores de las SEQ ID NO: 37 y 38; la C2 se obtuvo usando los cebadores de las SEQ ID NO: 39 y 40; la D1 se obtuvo usando los cebadores de las SEQ ID NO: 41 y 42; la D2 se obtuvo usando los cebadores de las SEQ ID NO: 43 y 44; la E1 se obtuvo usando los cebadores de las SEQ ID NO: 45 y 46; la E2 se obtuvo usando los cebadores de las SEQ ID NO: 47 y 48; la F1 se obtuvo usando los cebadores de las SEQ ID NO: 49 y 50; la F2 se obtuvo usando los cebadores de las SEQ ID NO: 51 y 52; la G1 se obtuvo usando los cebadores de las SEQ ID NO: 53 y 54; y la G2 se obtuvo usando los cebadores de las SEQ ID NO: 55 y 56.
Secuencias de los cebadores usados
Figure imgf000017_0001
Figure imgf000018_0001
Cada uno de los ARNs sinteticos se transformo en una cepa de DH5-alpha transformada con el plasmido reportero construido en el Ejemplo 1-2 y se midio un descenso en la fluorescencia de DsRed2 en cada una de las cepas.
Como resultado, como se puede ver en la FIG. 5, cuando el ARNs estaba unido a parte o todo el SUR del ARNm de DsRed2, la expresion del ARNm de DsRed2 se inhibio al 90-99 %. Cuando el ARNs estaba unido a regiones que no fuesen el SUR, la inhibicion de la expresion del ARNm de DsRed2 fue irregular (47-90 %). Tales resultados sugieren que, cuando el ARNs comprende una region que se puede unir por complementariedad con el SUR del ARNm del gen diana, es mas eficaz para la inhibicion de la expresion del ARNm del gen diana.
Ejemplo 3: Construccion de ARNs para otros ARNm y medicion de la reactividad cruzada
Con el fin de examinar si el ARNs de acuerdo con la presente invencion puede inhibir la expresion de ARNm de genes que no sean DsRed2, se inserto una secuencia complementaria al SUR del ARNm de cada uno de los genes LuxR, AraC y KanR en la estructura de MicC mediante mutagenesis de sitio dirigido para unirse al SUR. La secuencia complementaria al SUR de cada uno de los ARNm diana esta subrayada y se indica mediante un color rojo en la FIG. 6.
El ARNs sintetico Anti-LuxR se construyo mediante mutagenesis de sitio dirigido usando el plasmido pWAS (que contiene la estructura a base de MicC) como molde y los cebadores de las SEQ ID NO: 57 y 58 y Anti-AraC se construyo usando los cebadores de las SEQ ID NO: 59 y 60, y Anti-KanR se construyo usando los cebadores de las SEQ ID NO: 61 y 62. Con el fin de examinar el nivel de expresion de cada uno de los genes, se construyo una protema de fusion de cada gen con DsRed2. A tal fin, la PCR se amplifico usando el plasmido reportero del Ejemplo 1-2 que contiene la secuencia codificante de DsRed como molde y los cebadores de las SEQ ID NO: 64 y 26 y el producto de la PCR se escindio con las enzimas de restriccion PacI/Xhol y despues se introdujo en el plasmido reportero del Ejemplo 1-2.
El gen LuxR se amplifico por PCR usando el cromosoma ES114 de Vibrio fisheri (GenBank CP000020.2, CP000021.2) como molde y los cebadores de las SEQ ID NO: 65 y 66, y el producto de PCR se trato con PacI/Clal y despues se clono en un nuevo plasmido reportero construido en el Ejemplo 1-2, construyendo de este modo una protema de fusion Lux-DsRed2. Los genes AraC y KanR se amplificaron por PCR usando un par de cebadores de las SEQ ID NO: 67 y 68 y un par de cebadores de las SEQ ID NO: 69 y 70, respectivamente, y despues se clono del mismo modo que se describe anteriormente.
Secuencias de los cebadores usados
Figure imgf000019_0001
Figure imgf000020_0001
A continuacion, tal como se muestra en la FIG. 7A, cada uno de los plasmidos construidos que contienen los tres ARNs sinteticos y los tres genes diana, respectivamente, se transformo en una cepa de DH5-alpha y despues, la fluorescencia relativa de DsRed2 en la cepa, y los resultados de la medicion se muestran en la FIG. 7B.
Como resultado, se pudo ver que el ARNs sintetico construido mediante el procedimiento de la presente invencion mostro un efecto inhibidor de la expresion del 80-86 % frente al gen diana. Ademas, el nivel de expresion de los genes no dirigidos fue similar al de en el caso en el que no contuviese ARNs.
Tales resultados indican que el ARNs sintetico de acuerdo con el procedimiento de la preparacion de la presente invencion puede inhibir de manera eficaz solo la expresion de ARNm del gen diana. Ademas, como se muestra en la FIG. 8, cuando la energfa de union al ARNm diana es de -53 kcal/mol o menos y cuando la energfa de union a otros ARNm es de -13 kcal/mol o mayor, no tendra lugar reactividad cruzada.
Ejemplo 4: Produccion de microorganismos recombinantes productores de tirosina usando ARNs sintetico
Con el fin de construir un microorganismo recombinante para producir el compuesto aromatico tirosina, se realizo un experimento para seleccionar una cepa que tiene la mayor capacidad para producir tirosina y una combinacion de genes inhibidos en la cepa: (1) construyendo un plasmido que sobreexpresa las enzimas implicadas en la via de biosmtesis de compuestos aromaticos, en particular, tirosina, para mejorar los flujos metabolicos hacia los compuestos; (2) construyendo ARNs sinteticos con el fin de inhibir la expresion de genes que codifican las enzimas y las protemas que pueden ir a vfas opuestas a la via de biosmtesis de tirosina, con el fin de dirigir los flujos metabolicos intracelulares hacia la via de biosmtesis de la tirosina; y (3) transformando el plasmido en 14 cepas diferentes de E. coli, y despues transformando adicionalmente diversas combinaciones de ARNs sinteticos en las cepas.
4-1: Construccion del plasmido basico para mejorar la actividad de la via de biosmtesis de compuestos aromaticos
En primer lugar, se construyo un plasmido que sobreexpresa enzimas requeridas para mejorar la actividad de la via de biosmtesis de compuestos aromaticos.
Los genes diana usados en este Ejemplo fueron ppsA, que codifica la policetido sintasa A de tipo I de smtesis de fenoltiocerol, tktA que codifica la transcetolasa, aroG y aroF que codifican la 3-desoxi-7-fosfoheptulonato sintasa, aroK que codifica la shikimato cinasa I, y tyrA que codifica la corismato mutasa, y C que codifica la prefenato deshidrogenasa derivada de Zymomonas mobilis (FIG. 9).
En primer lugar, como se muestra en la FIG. 10, se construyo un plasmido pTyr-b que no contiene ARNs sintetico. De manera espedfica, se uso un plasmido pTac15k (Hiszczynska-Sawicka y col., Plasmid 38:174, 1997) como un plasmido basico, y se amplifico el gen aroF mediante PCR usando el cromosoma W3110 de E. coli (GenBank AP009048) como molde y los cebadores de las SEQ ID NO: 71 y 72, y despues se clono en el plasmido pTac15k usando EcoRI/SacI. A continuacion, se amplifico el gen tktA mediante PCR usando el cromosoma W3110 de E. coli como molde y los cebadores de las SEQ ID NO: 73 y 74, y despues se clono en el plasmido usando XbaI/SphI. A continuacion, se amplifico el gen ppsA mediante PCR usando el cromosoma W3110 de E. coli como molde y los cebadores de las SEQ ID NO: 75 y 76 y despues se escindio con SacI/SpeI, despues de lo cual, el gen escindido se unio al vector del plasmido escindido con SacI/XbaI. De esta forma, se construyo un plasmido pTyr-b que no contiene ARNs sintetico.
Secuencias de los cebadores usados
Figure imgf000020_0002
Figure imgf000021_0001
A continuacion, los genes restantes que estan implicados en la biosmtesis de tirosina se clonaron construyendo un plasmido pTyr-a (FIG. 10). Estos genes se iban a expresar mediante un promotor BBa_JJ23113 registrado en el Registro MIT (http://partsregistry.org). De manera espedfica, el promotor de interes se construyo por PCR usando los cebadores de la SEQ ID NO: 77 y 78 sin molde. El promotor construido se clono usando un kit de clonacion TOPO y se secuencio para confirmar el error, tras lo cual se escindio con SacI/NotI y despues se unio al plasmido pWA del Ejemplo 1. La secuencia de terminacion de la transcripcion T1/TE se amplifico mediante PCR usando el plasmido pWAS del Ejemplo 1 como molde y los cebadores de las SEQ ID NO: 79 y 80, y despues se unio aguas abajo del promotor. De esta forma, se construyo un plasmido pWA-J23113-T1/TE y, despues, se clonaron los genes restantes en este plasmido. Despues, la region que va desde el promotor hasta T1/TE se amplifico mediante PCR y se clono en un plasmido pWA, construyendo de este modo un plasmido pTyr-a tal como se muestra en la FIG. 10. Secuencias de los cebadores usados
Figure imgf000021_0002
De manera espedfica, se amplifico el gen tyrA mediante PCR usando el cromosoma W3110 de E. coli como molde con los cebadores de las SEQ ID NO: 81 y 82 y se escindio con PacI/EcoRI y se clono en el plasmido pWA-J23113-T1/TE, construyendo de este modo un gen que consiste en la secuencia codificante del promotor-secuencia de terminacion de la transcripcion. El gen tyrA es sensible a la inhibicion de retroalimentacion por tirosina, y por este motivo, con el fin de eliminar la inhibicion de la retroalimentacion, se eliminaron dos restos de aminoacidos de tyrA mediante mutagenesis de sitio dirigido con A354V/M53I. En el presente documento, Se intento la mutacion A354V usando cebadores de las SEQ ID NO: 83 y 84, y el plasmido resultante se sometio a la mutacion M53I usando cebadores de las SEQ ID NO: 85 y 86, eliminando de este modo la inhibicion de retroalimentacion (Lutke-Eversloh y col., Applied Microbiology and Biotechnology, 75:103, 1999).
[SEQ ID NO: 81] 5'-AATCATTTAATTAAACGGCTCGCGTGGCTTAAG-3'
[SEQ ID NO: 82] 5'-AATTAAGAATTCTTACTGGCGATTGTCATTCGCC-3'
[SEQ ID NO: 83] 5'-TTTGGCCTCGCGTCGTGCA-3'
[SEQ ID NO: 84] 5'-ATAGATGCCTCGCGCTCCG-3'
[SEQ ID NO: 85] 5'-TGCAGCGTTTTCAGAGTGAAAGCC-3'
[SEQ ID NO: 86] 5'-CGTAATCGCCGAACCAGTGCTC-3'
Del mismo modo que el descrito anteriormente, se clonaron aroG, aroK y tyrC. De manera espedfica, se amplifico aroG mediante PCR usando el cromosoma W3110 de E. coli como molde y los cebadores de las SEQ ID NO: 87 y 88, y se amplifico aroK mediante PCR usando los cebadores de las SEQ ID NO: 89 y 90, y tyrC se amplifico por PCR usando el cromosoma de Zymomonas mobilis (cepa ZM6, ATCC29191) como molde y los cebadores de las SEQ ID NO: 91 y 92. Los productos de la PCR se escindieron con PacI/EcoRI y despues se clonaron en pWA-J23113-T1/TE. Entre estos genes, aroG tambien es sensible a la inhibicion por retroalimentacion, y por lo tanto, se sometio a la mutacion de aminoacidos A146N. Esta mutacion se realizo mediante mutagenesis de sitio dirigido usando los cebadores de las SEQ ID NO: 93 y 94, de manera similar al caso de tyrA (Lutke-Eversloh y col., Applied Microbiology and Biotechnology, 75:103, 1999).
Figure imgf000022_0001
El pWA-J23113-tyrA (A354V/M53I) (o aroG (A146N), aroK, tyrC)-T1/TE construido tal y como se describe anteriormente se sometio a PCR con cebadores de las SEQ ID NO: 95 y 96 para amplificar la region total que va desde el promotor hasta T1/TE y el producto de la PCR se escindio con SpeI/SacI y se clono en pWA escindido con XbaI/SacI. XbaI y SpeI se caracterizan por que se pueden unir de manera complementaria entre sf, pero desaparecen una vez que se unen, ya que la secuencia de la region escindida es diferente. Dado que el cebador de la s Eq ID NO: 96 incluye XbaI y SacI, el gen amplificado por PCR se puede clonar de manera infinita usando SpeI/SacI, y el vector se puede clonar de forma infinita usando XbaI/SacI.
[SEQ ID NO: 95] 5-AATTAAACTA GTCTGATGGC TAGCTCAGT-3'
Figure imgf000022_0002
De esta forma, tyrA(A354/M53I), aroG(A146N), tyrC y aroK se clonaron secuencialmente en pWA.
4-2: Examen de la productividad de tirosina de 14 cepas diferentes de E. coli usando plasmidos
Los dos plasmidos construidos tal como se describen anteriormente se transformaron en las siguientes 14 cepas diferentes de E. coli que no contienen ARNs sintetico: cepas K-12 (C600 (ATCC 23738), DH5a (Invitrogen), ER2925 (New England Labs), JM110 (Agilent Technologies), MG1655 (Invitrogen), S17-1 (ATCC 47055), T1R(One shot(R) ccdB SurvivalTM2 T1R, Invitrogen), TG1 (ZymoResearch), t Op 10 (Invitrogen), W3110 (ATCC 39936), XL1-Blue (Agilent Technologies)), cepa B (b L21(De 3, Promega), cepa W (At Cc 9637), y un dbrido de las cepas K-12 y B (HB101, Promega).
Los microorganismos recombinantes resultantes se cultivaron en un medio de LB que contiene 50/ml de ampicilina y 50/ml de kanamicina a la fase estacionaria, y despues se transfirieron a una relacion de volumen de 1/100 a un matraz que contiene 50 ml del medio. Despues, las celulas microbianas se cultivaron a 37 °C hasta 48, y se midio la concentracion maxima de tirosina durante el cultivo.
Tabla 1
Figure imgf000023_0001
Tabla 2
Figure imgf000023_0002
Se tomo una muestra del matraz a intervalos de 6-horas, se ajusto a un pH de 1 mediante la adicion de HCl a la misma y despues se incubo a temperatura ambiente durante 30 minutos. A continuacion, la muestra se centrifugo durante 5 minutos, y se midio la concentracion de tirosina en el sobrenadante mediante HPLC (Agilent Technologies). La columna usada fue una columna Zorbax SB-Aq (3 x 250 mm; Agilent Technologies).
"Sin ARNs" indicado en la primera columna de la FIG. 11 indica la produccion de tirosina en las cepas de E. coli que tienen solo los dos plasmidos construidos tal como se describe anteriormente. Las 14 cepas diferentes de E. coli produjeron diversas concentraciones (0-1,0 h/l) de tirosina. Esto sugiere que las diferentes cepas de E. coli tienen diferentes capacidades metabolicas y que, con el fin de maximizar la produccion de metabolitos, es importante seleccionar una cepa adecuada ademas de descubrir un gen adecuado cuyo flujo en las redes metabolicas hay que regular. En este Experimento, la cepa S17-1 mostro la produccion mas alta de tirosina.
4-3: Construccion de ARNs sintetico para la identificacion del gen que contribuye al aumento en la produccion de tirosina v construccion del plasmido final pTvr-a/pTvr-b
En los Ejemplos anteriores, se demostro que la actividad de la via de biosmtesis de tirosina basica es suficiente para producir tirosina. En este Ejemplo, se realizo un experimento para identificar el gen, que se va a silenciar con el fin de aumentar adicionalmente la productividad, mediante ARNs sinteticos. De manera espedfica, con el fin de silenciar el gen tyrR que inhibe la expresion de enzimas implicadas en la via de biosmtesis de tirosina y para dirigir mas flujo hacia la via de biosmtesis de tirosina, se silenciaron csrA y pgi, y ppc que codifica la enzima para convertir a fosfoenolpiruvato y aumentar la cantidad de fosfoenolpiruvato se silencio para aumentar la cantidad de fosfoenolpiruvato.
Se construyo anti-tyrR mediante mutagenesis de sitio dirigido usando el plasmido pWAS construido anteriormente como molde y los cebadores de las SEQ ID NO: 97 y 98. Del mismo modo, se construyo anti-ppc usando los cebadores de la SEQ ID NO: 99 y 100, y se construyo anti-csrA usando los cebadores de las SEQ iD NO: 101 y 102 y se construyo anti-pgi usando los cebadores de las SEQ ID NO: 103 y 104.
Secuencias de los cebadores usados
[SEQ ID NO: 97] 5'-AGTCTTTTGTGCAACCATTATCACCGCC-3'
[SEQ ID NO: 98] 5'-TCCAGACGCATTTTCTGTTGGGCCATTGCATT-3'
[SEQ ID NO: 99] 5-TATTCCGCATTG GCAACCATTATCACCGCC-3'
[SEQ ID NO: 100] 5'-TTGTTCGTTCATTTTCTGTTGGGCCATTGC-3'
[SEQ ID NO: 101] 5'-ACTCGTCGAGTT GCAACCATTATCACCGCC-3'
[SEQ ID NO: 102] 5'-CAGAATCAGCATTTTCTGTTGGGCCATTGC-3'
[SEQ ID NO: 103] 5'-AAT CCAACGCAGGCAACCATTATCACCGCC-3'
[SEQ ID NO: 104] 5'-GAT GTTTTTCATTTTCTGTTGGGCCATTGC-3'
El sistema pBAD, cI(ts) introducido en el pWAS con el fin de aumentar el efecto regulador de la expresion del ARNs sintetico se introdujo en un pTyr-a que no contiene ARNs. De manera espedfica, la PCR se realizo usando pWAS como molde y los cebadores de las SEQ ID NO: 105 y 96, y el producto de la PCR se escindio con SpeI/SacI y se unio con el vector construido escindido con XbaI/SacI.
A continuacion, del mismo modo que anteriormente, se amplificaron anti-csrA, anti-pgi o anti-ppc usando los cebadores de las SEQ ID NO: 104 y 94, el producto de la PCR (ARNs) se escindio con SpeI/SacI y se unio con el vector construido escindido con XbaI/SacI. De esta forma, se construyeron tres plasmidos pTyr-a que tienen diferentes ARNs (FIG. 10). Sin embargo, el gen tpI mostrado en la FIG. 10 se uso para la produccion de fenol, y por lo tanto, no se clono en esta etapa. El gen tpI se describira en detalle en el Ejemplo relacionado con la produccion de fenol.
Se clono anti-tyrR en pTyr-b. De manera espedfica, se amplifico anti-tyrR mediante PCR usando los cebadores de las SEQ ID NO: 106 y 107 y despues se escindio con SpeI/NheI. Asimismo, el vector pTyr-b construido que no contiene ARNs se escindio con NheI, y despues se unio con el anti-tyrR, construyendo de este modo un vector pTyrb que contiene el ARNs.
Secuencias de los cebadores usados
[SEQ ID NO: 105] 5'-TAATTTACTA GTATGGCTGA AGCGCAAAAT GATCC-3'
[SEQ ID NO: 106] 5'-AATTAAACTA GTTAACACCG TGCGTGTTGA-3'
[SEQ ID NO: 107] 5'-AATTAAGCTA GCTATAAACG CAGAAAGGCC CA-3'
4-4: Experimento en la produccion de tirosina en 14 cepas recombinantes de E. coli diferentes con ARNs sintetico
Un total de cuatro combinaciones, incluyendo una combinacion del pTyr-b construido que contiene anti-tyrR y pTyr-b que no contiene ARNs, y una combinacion del pTyr que contiene anti-tyrR y pTyr-b que contiene cada uno de los ARNs, se transformaron en 14 cepas diferentes de E. coli. Las cepas se cultivaron del mismo modo que el procedimiento de cultivo en matraz descrito anteriormente, y se midio la concentracion de tirosina mas alta en 48 horas despues del comienzo del cultivo.
Como resultado, como se muestra en la FIG. 11, la mejor combinacion fue el caso en el que los genes tyrR y csrA en la cepa S17-1 se silenciaron. Esta combinacion mostro tirosina en una concentracion de 2,0 g/l en el matraz.
Entre las combinaciones, la combinacion de anti-tyrR+anti-ppc y la combinacion de anti-tyrR-anti-pgi mostro un descenso en la produccion de tirosina. Particularmente, como se puede ver en la FIG. 12, se inhibio el crecimiento de las celulas hospedadoras introducidas con anti-pgi, y por lo tanto, la produccion global de tirosina se redujo.
4-5: Restauracion del crecimiento celular y aumento en la produccion de tirosina mediante la regulacion de la expresion usando ARNs sintetico
Tal como se describe en el Ejemplo 4-4, cuando se inhibfa la expresion de pgi, se inhibio el crecimiento de celulas, dando como resultado un descenso en la produccion global de tirosina. Esto sugiere que, cuando el crecimiento de las celulas se restaura de algun modo incluso aunque se pierde el flujo metabolico que entra en la via de biosmtesis de tirosina, la produccion global de tirosina puede aumentar. Basandose en esta propuesta, se regulo la expresion del gen pgi. Esta regulacion se realizo mediante la delecion de parte de (uno o dos) nucleotidos de la secuencia de union a pgi y de la secuencia de anti-pgi para reducir la energfa de union. De manera espedfica, el uso de pWAS clonado con anti-pgi como un molde, se construyo anti-pgi-DI que comprende una delecion de un nucleotido mediante mutagenesis de sitio dirigido usando cebadores de las SEQ ID NO: 108 y 104, y anti-pgi-D2 que comprende una delecion de dos nucleotidos mediante mutagenesis de sitio dirigido usando cebadores de las SEQ ID NO: 109 y 104 (FIG. 13).
Secuencias de los cebadores usados
[SEQ ID NO: 108] 5'-ATCCAACGCAGGCAACCATTATCACCGCC-3'
[SEQ ID NO: 109] 5'-TCCAACGCAGGCAACCATTATCACCGCC-3'
Cada uno de los genes construidos se clono en el plasmido pTyr-a del mismo modo que se describe en el Ejemplo 4-3, y cada uno de los plasmidos se clono en 14 cepas de E. coli diferentes. Despues, se examino la produccion de tirosina en cada una de las cepas.
Como resultado, como se puede ver en la FIG. 11, cuando uno o mas nucleotidos de la secuencia de union del ARNs sintetico se delecionaron para reducir la energfa de union, aumento la produccion de tirosina en todas las cepas recombinantes de E. coli. Particularmente, como se puede ver en la FIG. 11, cuando la tasa de crecimiento de la cepa TOP10 que tiene la capacidad mas baja para producir tirosina se comparo con la de la cepa S17-1 que tiene la capacidad mas alta para producir tirosina, se puede ver que, cuando se redujo la energfa de union del ARNs, la tasa de crecimiento de los microorganismos hospedadores se restauro gradualmente.
A lo largo de este Ejemplo, se puede ver que el ARNs sintetico de acuerdo con la presente invencion se puede usar para inhibir la expresion del gen diana y se puede regular su capacidad para inhibir la expresion del gen diana, lo que sugiere que el gen del ARNs se puede usar para regular la expresion de diversos genes diana.
4-6: Comparacion de la inhibicion de la expresion del gen diana mediante ARNs sintetico entre cepas
A partir de los resultados de los Ejemplos anteriores, se puede ver que la produccion de tirosina difiere entre las cepas, lo que sugiere que es importante seleccionar la cepa mas adecuada. Ademas, se puede ver que el procedimiento de delecion genica convencional es lento, mientras que el ARNs sintetico de acuerdo con la presente invencion se puede construir facilmente y se puede aplicar rapidamente a diversas cepas, lo que sugiere que el ARNs sintetico es muy adecuado para la medicion de las capacidades metabolicas de las cepas y la seleccion de la cepa mas adecuada. Sin embargo, aunque los ARNs evolutivamente estan altamente conservados en celulas procariotas conocidas y, por lo tanto, la posibilidad de diferencia en el efecto inhibidor del gen diana del ARNs sintetico entre cepas es baja. Con el fin de verificar este hecho, se llevo a cabo el siguiente experimento.
En este Ejemplo, se construyeron genes del mismo modo que se describe en el Ejemplo 3. En el Ejemplo 3, se fusiono DsRed2 con cada uno de los genes luxR, araC y kanR, pero en este Ejemplo, se fusiono DsRed2 con cada uno de los genes pgi, csrA, tyrR y ppc, y se midio el grado de expresion de cada gen mediante fluorescencia. En el presente documento, se realizo la comparacion de la expresion genica entre la cepa S17-1 que tiene la productividad mas alta de tirosina y la cepa TOP10 que tiene la productividad mas baja de tirosina. Si no hay diferencia en la expresion genica entre la cepa S17-1 y la cepa TOpIO, no habra diferencia en la expresion genica entre las otras cepas.
Para la clonacion de pgi, pgi se amplifico mediante PCR usando el cromosoma de S17-1 como molde y los cebadores de las SEQ ID NO: 110 y 111, y el producto de la PCR se escindio con Pacl/Xhol, y despues se clono en el plasmido reportero de DsRed2 del Ejemplo 3. Del mismo modo, se amplifico tyrR mediante PCR usando los cebadores de las SEQ ID NO: 112 y 113, se amplifico csrA mediante PCR usando los cebadores de las SEQ ID NO: 114 y 115, se amplifico ppc mediante PCR usando los cebadores de las SEQ ID NO: 116 y 117 y se clonaron los productos de PCR. Cuando se iba a medir la inhibicion de la expresion del gen de interes en la cepa S17-1, se realizo la clonacion en el cromosoma de S17-1, y cuando se iba a medir en la cepa TOP10, se realizo la clonacion en el cromosoma de TOP10.
Secuencias de los cebadores usados
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Como resultado, como se puede ver en la FIG. 14, el anti-tyrR mostro tasas de inhibicion del 85,6±9,4 % y el 80,0±9,1 % en S17-1 y TOP10, respectivamente, y el anti-csrA mostro tasas de inhibicion del 84,9±9,8 % y el 87,8±6,7 %. Los ARNs restantes mostraron tasas de inhibicion similares a las mostradas por estos ARNs. Esto sugiere que los ARNs sinteticos muestran tasas de inhibicion similares entre cepas y presentan el mismo efecto en diversas cepas.
4-7: Fermentacion de la cepa S17-1 transformada con el plasmido pTvr-a(anti-csrA)/pTvr-b(anti-tvrR)
La cepa S17-1 seleccionada finalmente se transformo con cada uno de los plasmidos pTyr-a(anti-csrA) y pTyr-b(antityrR), y los microorganismos recombinantes se sometieron a fermentacion de lote alimentado.
De manera espedfica, se cultivaron 200 ml de los microorganismos recombinantes en un medio LB que contiene arabinosa al 1 %, 25 pg/ml de ampicilina y 25 pg/ml de kanamicina a 37 °C, y el cultivo se realizo en un fermentador de 2 litros (Bioflo 3000, New Brunswick Scientific Co., Edison, NJ). En el presente documento, la DO inicial fue 0,5. La solucion de alimentacion estaba compuesta de 600 g/l de glucosa, 7,5 g/l de (NH^SO 4, 2 g/l de KH2PO4 y 5 g/l de extracto de levadura, y cuando el medio en el fermentador cambio de 0,01 a 6,8, se ajusto el pH mediante la adicion de NH4OH al 25 % (v/v). Asimismo, la concentracion de oxfgeno disuelto se mantuvo a un nivel constante del 40 % suministrando 1 vvm (volumen de aire/volumen de funcionamiento/min), y la velocidad de agitacion se controlo de forma automatica hasta una rpm de hasta 1000.
El cultivo se realizo durante un total de 110 horas. La DO de las celulas y la produccion de tirosina se muestran en la FIG. 15. Tal como se puede ver en la Figura 15, se produjo tirosina a una concentracion de hasta 21,9 g/l.
4-8: Produccion de fenol en diversas cepas de E. coli
Se realizo un experimento en la conversion de tirosina producida a fenol. De manera espedfica, para la expresion del gen tpl que convierte tirosina a fenol, se sintetizo un promotor placlQ usando los cebadores de las SEQ ID NO: 118 y 119 sin molde, y el promotor sintetizado se escindio con SacI/PacI y despues se clono en pWA-J23113-T1/TE para sustituir al promotor. Asimismo, se amplifico el gen tyrA mediante PCR a partir del cromosoma de Pasteurella multocida (GenBank, 002663.1) usando los cebadores de las SEQ ID NO: 120 y 121, y despues se clono en pWA-placIQ-T1/TE usando PacI/EcoRI. El gen construido tal como se describe anteriormente se amplifico por PCR usando los cebadores de las SEQ ID NO: 122 y 96, y se escindio con SpeI/SacI, y despues se unio al plasmido pTyra (anti-csrA) escindido con XbaI/SacI, construyendo de este modo un plasmido pTyr-a (anti-csrA)-TPL.
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El plasmido construido junto con el plasmido pTyr-b (anti-tyrR) se transformo en las 14 cepas diferentes de E. coli probadas en el Ejemplo 4-2 y despues se realizo el cultivo en matraces de cada cepa recombinante del mismo modo que el procedimiento de cultivo de tirosina descrito anteriormente, y se midio la produccion de fenol mas alta durante las 48 horas de cultivo.
Como resultado, como se puede ver en la FIG. 16, la cepa W3110 presento la produccion mas alta de fenol (357,6 mg/l) y la cepa S17-1 que presento la productividad de tirosina mas alta en el ejemplo anterior presento una produccion de fenol de 68,8 mg/l.
Ejemplo 5: Produccion de microorganismos recombinantes productores de cadaverina usando ARNs sintetico
En este Ejemplo, se mejoro el flujo metabolico de la via de biosmtesis de lisina, y despues, se realizo la seleccion del gen a silenciar con el fin de aumentar adicionalmente la produccion de cadaverina en un microorganismo recombinante que convierte lisina a cadaverina usando lisina descarboxilasa (CadA).
La FIG. 16 muestra vfas de biosmtesis de cadaverina a partir de glucosa. Estas vfas de biosmtesis incluyen vfas de consumo para la produccion de otros metabolitos. Para aumentar la produccion de cadaverina, se prefirio bloquear las redes que consumen metabolitos.
En este Ejemplo, se seleccionaron 8 genes candidatos capaces de suprimir estas redes, y se construyeron ARNs sinteticos capaces de inhibir la expresion de estos genes. Los genes candidatos seleccionados fueron los siguientes: gltA (citrato sintasa), thrA (aspartato cinasa I), thrB (homoserina cinasa), thrC (treonina sintasa), thrL (peptido lfder de operon thr), metB (cistationina gamma sintasa), murE (UDP-N-acetilmuramoil-L-alanil-D-glutamato-L-lisina ligasa), y murF (UDP-N-acetilmuramoilalanil-D-glutamil-2,6-diaminopimelato-D-alanil-D-alanino ligasa).
De manera espedfica, se construyo anti-glt (ARNs sintetico) mediante mutagenesis de sitio dirigido usando pWAS (construido en el Ejemplo 1) como molde y los cebadores de las SEQ ID NO: 123 y 124. Del mismo modo, se construyo anti-metB usando los cebadores de las SEQ ID NO: 125 y 126; se construyo anti-murE usando los cebadores de las SEQ ID NO: 127 y 128; se construyo anti-murF usando los cebadores de las SEQ ID NO: 129 y 130; se construyo anti-thrA usando los cebadores de las SEQ ID NO: 131 y 132; se construyo anti-thrB usando los cebadores de las SEQ ID NO: 133 y 134; se construyo anti-thrC usando los cebadores de las SEQ ID NO: 135 y 136; y se construyo anti-thrL usando los cebadores de las SEQ ID NO: 137 y 138.
Secuencias de los cebadores usados
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Los genes construidos mediante mutagenesis de sitio dirigido usando las secuencias de los cebadores se transformaron en celulas DH5a (Invitrogen) del siguiente modo. Se realizo el cultivo usando un medio de placa que contiene LB-agar, arabinosa al 1 % y 100 pg/ml de ampicilina a 25 °C durante 2 dfas, y las colonias resultantes se cultivaron en medio LB lfquido que contiene agarosa al 1 % y 100 pg/ml de ampicilina. Despues, se purificaron los plasmidos de las celulas y se secuenciaron, y se uso un plasmido correcto en un experimento posterior. Este cultivo en presencia de arabinosa al 1 % y a 25 °C inhibe de forma eficaz la expresion del ARNs sintetico, y por lo tanto es un procedimiento esencial. Ademas, si el gen cromosomico que esta dirigido por el ARNs sintetico tiene una influencia muy significativa sobre el crecimiento de las celulas hospedadoras, el crecimiento de las celulas sera insuficiente cuando no se inhiba la expresion del ARNs sintetico. Esta influencia del ARNs sintetico puede provocar dificultades en experimentos posteriores, y por lo tanto, se evita. Sin embargo, si el ARNs sintetico no tiene influencia sobre el crecimiento celular, el cultivo se puede realizar en ausencia de arabinosa o a 37 °C. Cuando se realiza el cultivo para la produccion de un producto metabolico deseado, el ARNs sintetico se debena de expresar lo suficiente, y por lo tanto, en este caso, el cultivo se realizo en ausencia de arabinosa y a 37 °C.
Cada uno de los ARNs sinteticos construidos tal como se describe anteriormente se transformo en el microorganismo recombinante XQ56 (que contiene un plasmido p15CadA) que produce cadaverina con alta eficacia. La cepa XQ56 usada en este Ejemplo se construyo mediante el procedimiento de Qian (Qian, Biotechnology and Bioengineering, 108(1):93-103, 2011). En resumen, con el fin de producir cadaverina, los genes speE, speG, puuA e ygiG que son enzimas de degradacion de cadaverina se delecionaron de E. coli, y con el fin de aumentar la produccion de los metabolitos precursores de cadaverina, tambien se deleciono icIR. Ademas, con el fin de eliminar la inhibicion de la retroalimentacion por lisina que es un precursor inmediato de cadaverina, se modifico el cromosoma de manera que los promotores de los genes dapA, dapB y lysA se expresaron de manera constitutiva sin que esten inhibidos por lisina. Finalmente, con el fin de producir suficiente cadaverina, se sobreexpreso el gen cadA que produce cadaverina a partir de lisina en la forma de un plasmido (p15CadA). De esta forma, se construyo la cepa x Q56 usada en la presente invencion.
Tras la transformacion, las colonias resultantes se transfirieron a medio LB lfquido (arabinosa al 1 %, 25 pg/ml de ampicilina, y 25 pg/ml de kanamicina) y se cultivaron a 25 °C hasta la fase estacionaria. Despues, las celulas se transfirieron a una proporcion de volumen de 1/100 a un matraz que contiene 50 ml de medio (vease la Tabla 3 a continuacion) y despues se cultivaron a 37 °C durante 24 horas. Despues, se muestreo el sobrenadante del cultivo, y se midio la concentracion de cadaverina por analisis de HPLC. De manera espedfica, se permitio que la muestra reaccionase con o-ftaldialdehfdo, y despues se analizo mediante HPLC de fase inversa (Qian, Biotechnology and Bioengineering, 108(1):93-103, 2011).
Tabla 3
Figure imgf000028_0002
continuacion
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Tabla 4
Figure imgf000029_0003
Como resultado, como se puede ver en la FIG. 19, la produccion de cadaverina en la cepa basica (XQ56 que contiene un plasmido p15CadA) fue de 1,4±0,05 g/l, y cuando se tomo como el 100 %, las cepas en las que las expresiones de cada uno de murE, metB y thrL entre los ocho genes candidatos estaban inhibidos mostraron aumentos en la produccion de cadaverina del 55 % (2,15 g/l) para murE, el 24 % (1,73 g/l) para metB y el 34 % (1,87 g/l) para thrL. Tales resultados experimentales sugieren que el ARNs sintetico de acuerdo con la presente invencion se puede usar para regular la expresion de ARNm de diversos genes diana.
Ejemplo 6: Regulacion de la eficacia inhibidora de los ARNs sinteticos y mediciones del cambio en el crecimiento celular con cambio en el numero de ARNs sinteticos introducidos
6-1: Regulacion de la eficacia inhibidora de los ARNs sinteticos del Ejemplo 3
Con el fin de verificar que la eficacia inhibidora del ARNs sintetico se puede controlar mediante la regulacion de la energfa de union entre el ARNs sintetico y el ARNm diana, se construyeron ARNs sintetico anti-DsRed2 y ARNs anti-LacZ con diversas energfas de union usando, como molde, un plasmido que contiene la estructura MicC y el promotor PR para la expresion del mismo en el plasmido pWAS.
En el caso del ARNs anti-DsRed2, las secuencias del sitio de union se produjeron aleatoriamente tal como se describe a continuacion con el fin de producir un intervalo de energfa amplio, y en el caso del ARN anti-lacZ, cada secuencia de union que se corresponde con el intervalo de energfa se diseno tal como se describe a continuacion usando el programa UNAFold. Cuando se uso DsRed2, se produjeron ARNs anti-DsRed2 mediante la mutagenesis de sitio dirigido descrita anteriormente usando los cebadores de las SEQ ID NO: 169 y 170 y cuando se uso LacZ, se produjeron diversos ARNs anti-LacZ mediante mutagenesis de sitio dirigido usando cebadores directos/inversos tales como los cebadores de las SEQ ID NO: 171/172, 173/174, ... 195/196.
Cebadores para las variantes de anti-dsRed2
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(N es cualquier nucleotido).
Cebadores para las variantes de anti-LacZ
[SEQ ID NO: 171] 5'-ATGATGCAACCATTATCACCGCCAGAGGTAAAA-3'
[SEQ ID NO: 172] 5-GGTCAT TTTCTGTTGGGCCATTGCATTGCCAC-3'
Figure imgf000030_0001
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De manera espedfica, diversos ARNs que se unen a cada ARNm con una ene^a de union que vana de 0 a -60 kcal/mol, y se midio el grado de inhibicion de la expresion del ARNm diana por cada uno de los ARNs sinteticos.
En el caso de DsRed2, las celulas se cultivaron en medio LB hasta la fase exponencial, y despues se centrifugo 1 ml del medio a 5.000 rpm para eliminar el componente del medio mientras que se permite que permanezcan solo las celulas. Se anadio 1 ml de tampon PBS a las celulas restantes, de manera que las celulas se mezclasen facilmente, y despues la protema DsRed2 en las celulas se excito a una longitud de onda de 563 nm, y se midio la fluorescencia emitida a partir de las mismas mediante FACS a 582 nm. La intensidad de la fluorescencia emitida se corrigio restando la intensidad de fluorescencia emitida a partir de las celulas cultivadas en condiciones sin DsRed2. Se tomo como 1 el valor mas alto entre las intensidades medidas, y se normalizaron otras intensidades de fluorescencia basadas en el valor.
En el caso de LacZ, se cultivaron las celulas en el mismo medio a la misma fase que las usadas en el caso de DsRed2, y despues se anadieron 800 pl de una solucion de permeabilizacion (Na2HPO460 mM, NaH2PO340 mM, KCl 10 mM, MgSO4 1 mM, 3,56 ul/ml de betamercaptoetanol) a 20 pl del cultivo. Tambien se anadieron 200 ul de una solucion de sustrato (Na2HPO460 mM, NaH2PO440 mM, 2 mg/ml de o-nitrofenil-beta-D-galactosido (ONPG)). A continuacion, se permitio que las celulas reposasen a 37 °C durante un tiempo suficiente como para que la reaccion de desarrollo del color tuviese lugar, y despues se anadieron 500 pl de una solucion de parada (Na2CO3 1M) para parar la reaccion, y se midio la absorbancia a 420 nm. El valor mas alto entre los valores del desarrollo de color de LacZ medido a partir de diversos ARNs se tomo como 1, y se normalizaron otros valores basandose en el valor para determinar los valores relativos.
Como resultado, tal como se puede ver en la FIG. 23 que muestra los resultados de los dos experimentos, cuando la energfa de union oscilo desde aproximadamente -10 kcal/mol a -40 kcal/mol, la expresion del gen diana se inhibio de forma lineal. Esto indica que, cuando el ARNs sintetico de acuerdo con la presente invencion se construyo de tal manera que se une al ARNm diana con una energfa de union de entre -10 kcal/mol y -40 kcal/mol, puede inhibir la expresion del ARNm diana al nivel deseado.
6-2: Medicion del cambio en el crecimiento celular con cambio en el numero de ARNs sintetico introducido del Ejemplo 3
Cuando un ARNs sintetico se introduce adicionalmente en un plasmido con el fin de regular la expresion del gen diana y se produce en celulas, puede interferir con el crecimiento de las celulas mediante el uso de la fuente de energfa de las celulas. Por tanto, se examinaron los efectos del ARNs sintetico adicionalmente introducido sobre el crecimiento celular y la expresion de protema intracelular (FIG. 24a). De manera espedfica, Se introdujeron de 0 a 4 ARNs en un plasmido que tiene un origen de replicacion ColE1, y despues se midio un cambio en el nivel de expresion del gen DsRed2 en el plasmido. Se introdujo un ARNs sintetico en los sitios de EcoRI y Kpnl de un plasmido que tiene un origen de replicacion CoIE1, construyendo de este modo un plasmido (Rmo) que contiene un ARNs. Usando como molde el plasmido construido, se realizo la PCR con los cebadores de las SEQ ID NO: 197 y 198 y el producto de la PCR se escindio con SacI y BgIII y se introdujo en el plasmido Rmo, construyendo de este modo un plasmido (Rmo2) que contiene dos ARNs. Usando el Rmo como molde, se realizo la PCR con los cebadores de las SEQ ID NO: 199 y 200 y el producto de la PCR se escindio con SpeI/BamHI y despues se introdujo en el plasmido Rmo2, construyendo de este modo un plasmido (Rmo3) que contiene tres ARNs. Usando el Rmo como molde, se realizo la PCR con los cebadores de las SEQ ID NO: 201 y 202, y el producto de PCR se escindio con SphI y Sall, y despues se introdujo en el plasmido Rmo3, construyendo de este modo un plasmido (Rmo4) que contiene cuatro ARNs. Los niveles de expresion de DsRed2 de los plasmidos que contienen 0-4 ARNs se determinaron midiendo la intensidad de fluorescencia tal como se describe anteriormente.
[SEQ ID NO: 197] 5'-AATTAA AGATCT TAACACCGTGCGTGTTGA -3'
[SEQ ID NO: 198] 5'-GAGCTC TATAAACGCAGAAAGGCCCA -3'
[SEQ ID NO: 199] 5'-ACTAGT TAACACCGTGCGTGTTGA -3'
[SEQ ID NO: 200] 5'-GGATCC TATAAACGCAGAAAGGCCCA -3'
[SEQ ID NO: 201] 5'-GCATGC TAACACCGTGCGTGTTGA -3'
[SEQ ID NO: 202] 5'-GTCGAC TATAAACGCAGAAAGGCCCA -3'
Como resultado, se puede ver que, incluso cuando se introdujeron hasta tres ARNs sinteticos, no influyen en la expresion del DsRed2 (FIG. 24b). Ademas, se midio si la introduccion de 0-4 ARNs sinteticos tiene alguna influencia sobre la tasa de crecimiento de las celulas. En este caso, se midio la densidad optica (a 600 nm) en la fase de crecimiento logantmico de las celulas y se ajusto en la siguiente ecuacion de la curva de crecimiento celular para calcular la constante de crecimiento celular (k) por tiempo:
y=yo exp(kt)
en la que yo es el valor D.O.600 inicial y t es el tiempo. Como resultado, se podna ver que, cuando se introdujeron hasta tres ARNs sinteticos, el valor de k se redujo ligeramente, pero la reduccion no fue significativa. Esto indica que la introduccion de hasta tres ARNs en las celulas no influye de manera significativa en el crecimiento de las celulas (FIG. 24c).
6-3: Regulacion de la eficacia inhibidora de los ARNs sinteticos del Ejemplo 4-5
Como en el caso de pgi del Ejemplo 4-5, la secuencia de union de ARNs anti-csrA se modifico para cambiar la energfa de union, de tal manera que el nivel de expresion del gen csrA estaba diversificado. De manera espedfica, se realizo una PCR usando un plasmido pWAS-anti-csrA como molde y los siguientes pares de cebadores, sustituyendo de este modo la secuencia de union.
[SEQ ID NO: 203] 5'-TTCCTCGTCG GCAACCATTA TCACCGCC-3'
[SEQ ID NO: 204] 5'-GAATCAGCATTTTCTGTTGGGCCATTGC-3'
[SEQ ID NO: 205] 5'-GACTCGTCGA GGCAACCATT ATCACCGCC-3'
[SEQ ID NO: 206] 5'-AGAATCAGCATTTTCTGTTGGGCCATTGC-3'
[SEQ ID NO: 207] 5'-TAACTCGTCG GCAACCATTA TCACCGCC-3'
[SEQ ID NO: 208] 5'-GAATCAGCATTTTCTGTTGGGCCATTGC-3'
Figure imgf000033_0001
GCC 3
[SEQ ID NO: 210] 5-TCAGA ATCAGCATTTTCTGTTGGGCCATTGC-3'
Figure imgf000033_0002
[SEQ ID NO: 212] 5-TCAGA ATCAGCATTTTCTGTTGGGCCATTGC-3'
Figure imgf000034_0001
Diversos anti-csrAs construidos tal como se describe anteriormente se amplificaron mediante PCR usando pWAS como un molde y los cebadores de las SEQ ID NO: 105 y 96, y los productos de PCR se escindieron con SpeI/SacI y se unieron con un vector pTyr escindido con XbaI/SacI. De esta forma, se construyeron diversos ARNs anti-csrA con una energfa de union que oscila de -30 kcal/mol a -50 kcal/mol. Los ARNs sinteticos construidos de este modo se introdujeron en la cepa de E. coli S17-1, mostrando el rendimiento mas alto, y se midio la produccion de tirosina del mismo modo que se describe en el Ejemplo 4-4.
Como resultado, como se puede ver en la FIG. 25, el rendimiento mas alto se mostro a un valor energetico de -39,2 kcal/mol. Este valor de energfa de union es identico al de en el caso de los ARNs anti-csrA construidos anteriormente.
Esto sugiere que los ARNs sinteticos se pueden usar para inhibir la expresion del gen diana y que la eficacia inhibidora de la misma se puede regular.
Ejemplo 7: Identificacion de genes adicionales para aumentar la produccion de tirosina
En este Ejemplo, con el fin de identificar genes que no sean los genes tyrR/csrA, que tienen efectos positivos en la produccion de tirosina cuando esta inhibida, se construyeron 84 ARNs, que pueden controlar genes que estan implicados en la glucolisis y redes del TCA y los reguladores de la transcripcion que regulan la expresion de los mismos.
Los genes se enumeran a continuacion.
accA (acetil-CoA carboxiltransferasa, subunidad alfa)
accB (protema biotinilada transportadora de biotina-carboxilo)
accC (acetil-CoA carboxilasa)
accD (acetil-CoA carboxiltransferasa, subunidad beta)
aceE (subunidad del componente E1p del complejo piruvato deshidrogenasa)
aceF (piruvato deshidrogenasa)
ackA (actividad de propionato cinasa / acetato cinasa)
adiY (AdiY es un regulador transcripcional positivo de union a ADN que controla la arginina) sistema descarboxilasa (adi))
argB (acetilglutamato cinasa)
argC (N-acetilglutamilfosfato reductasa)
argG (argininosuccinato sintasa)
argH (argininosuccinato liasa)
asnC (regulador transcripcional que activa la expresion de asnA, un gen implicado en la smtesis de asparagina) aspA (aspartato amomaco-liasa)
crp (regulador transcripcional doble CRP)
csiD (protema predicha. CsiD es el producto de un gen inducido por la carencia de carbono)
csiR (represor transcripcional de union a ADN)
cytR (factor de transcripcion requerido para el transporte y la utilizacion de ribonucleosidos y desoxirribonucleosidos)
dcuA (el transportador DcuA es uno de los tres transportadores conocidos por ser responsable dela absorcion de C4-dicarboxilatos
tales como fumarato en condiciones anaerobicas)
deoB (fosfopentomutasa)
deoC (desoxirribosa-fosfato aldolasa)
deoR (EL represor transcripcional DeoR, para el "regulador de desoxirribosa", esta implicado en la expresion negativa de genes relacionados con el transporte y el catabolismo de nucleotidos desoxirribonucleosidos) fabH (KASIII, p-cetoacil-ACP sintasas)
fadD (acil-CoA sintetasa grasa)
fadR (el regulon de la degradacion de acidos grasos FadR es un regulador multifuncional doble que ejerce un control negativo sobre el regulon degradativo de los acidos grasos [Simons80, Simons80a] y el metabolismo de acetato)
fbp (fructosa-1,6-bisfosfatasa)
fnr (FNR es el regulador transcripcional primario que media la transicion de crecimiento aerobico a anaerobico) fruR (FruR es un factor transcripcional doble que desempena un papel pleiotropico para modular la direccion del flujo de carbono
a traves de las diferentes vfas metabolicas del metabolismo energetico, pero independientemente del regulador CRP)
ftsL (protema de division celular esencial FtsL)
ftsQ (protema de division celular esencial FtsQ)
ftsW (protema de division celular esencial FtsW)
ftsZ (protema de division celular esencial FtsZ)
fur (regulador transcripcional doble de union a ADN Fur-Fe+2)
gabD (succinato semialdetndo deshidrogenasa, dependiente de NADP+)
gabP (transportador de APC)
gabT (4-aminobutirato aminotransferasa)
gadA (subunidad A de glutamato descarboxilasa)
gadB (subunidad B de glutamato descarboxilasa)
gadC (transportador de APC GABA)
glcC (regulador transcripcional de la familia GntR, activador transcripcional del operon glc)
glpK (glicerol cinasa)
glpR (represor de sn-Glicerol-3-fosfato)
glpX (fructosa 1,6-bisfosfatasa II)
gltA (citrato sintasa)
hfld (regulador de lisogenizacion)
ihfa (IHF, el factor de integracion del hospedador, es una protema reguladora global)
ihfb (IHF, el factor de integracion del hospedador, es una protema reguladora global)
ilvB (acetohidroxibutanoato sintasa / acetolactato sintasa)
ilvC (acetohidroxiacido isomerorreductasa)
ilvD (dihidroxiacido deshidratasa)
ilvG_1 (acetolactato sintasa II, subunidad grande, fragmento de N-ter (pseudogen))
ilvG_2 (acetolactato sintasa II, subunidad grande, fragmento de C-ter (pseudogen))
ilvH (acetolactato sintasa / acetohidroxibutanoato sintasa)
ilvL (peptido lfder del operon ilvGEDA)
ilvM (acetohidroxibutanoato sintasa / acetolactato sintasa)
ilvN (acetohidroxibutanoato sintasa / acetolactato sintasa)
ilvX (protema pequena predicha)
lexA (LexA reprime la transcripcion de varios genes implicados en la respuesta celular al dano del ADN) IpxC (UDP-3-O-acil-N-acetilglucosamina deacetilasa)
marA (MarA participa en el control de varios genes implicados en la resistencia a antibioticos, el estres oxidativo, los disolventes organicos y los metales pesados)
metJ (represor transcripcional MetJ)
modE (ModE es el regulador principal que controla la transcripcion de operones implicados en el transporte de molibdeno y la smtesis de molibdoenzimas y funciones relacionadas con el molibdato)
nadB (L-aspartato oxidasa)
narL (regulador pck (fosfoenolpiruvato carboxicinasa) de respuesta de nitrato/nitrito)
PdhR (PdhR, "regulador del complejo piruvato deshidrogenasa", regula genes implicados en el complejo de piruvato deshidrogenasa)
phoP (PhoP-regulador transcripcional doble de union a ADN fosforilado. Miembro del sistema regulador de dos componentes phoQ/phoP implicado en la adaptacion a ambientes bajos en Mg2+ y el control de genes de resistencia a acido)
pnuC (transportador de NMN PnuC)
ppsA (fosfoenolpiruvato sintetasa)
pta (fosfato acetiltransferasa)
purA (adenilosuccinato sintetasa)
purB (adenilosuccinato liasa)
purR (PurR-represor transcripcional de union a ADN de hipoxantina. El dfmero PurR controla varios genes implicados en la biosmtesis del nucleotido purina y en su propia smtesis)
puuE (4-aminobutirato aminotransferasa)
rbsA (transportador ABC de ribosa)
rbsB (transportador ABC de ribosa)
rbsD (ribosa piranasa)
rbsK (ribocinasa)
rbsR (el factor de transcripcion RbsR, para el "represor de ribosa", se autorregula de manera negativa y controla la transcripcion del operon implicado en el catabolismo y el transporte de ribosa)
rcsB (RcsB-activador transcripcional de union a ADN BgIJ. La protema RcsB para la "smtesis B de la capsula del regulador", es un regulador de respuesta que pertenece al sistema de fosforo multicomponente RcsF/RcsC/RcsD/RcsA-RcsB y esta implicado en la regulacion de la smtesis de la capsula de acido colanico, la division celular, las protemas periplasmicas, la motilidad y el ARN pequeno)
rutR (RutR regula los genes implicados directa o indirectamente en la via del complejo del metabolismo de pirimidina)
serA (alfa-cetoglutarato reductasa / D-3-fosfoglicerato deshidrogenasa)
serC (fosfohidroxitreonina aminotransferasa / 3-fosfoserina aminotransferasa)
soxS (activador transcripcional doble y participa en la eliminacion de superoxido y de oxido mtrico)
sroD (ARN pequeno de SroD)
zwf (glucosa 6-fosfato-1 -deshidrogenasa)
Ademas, las secuencias de los cebadores usados para construir los genes son las siguientes:
anti-accA
[SEQ ID NO: 219] 5'-TTCCTTGATTTTGCAACCATTATCACCGCC-3'
Figure imgf000036_0001
anti-accB
[SEQ ID NO: 221] 5'-AAGATTAAAAAAGCAACCATTATCACCGCC-3'
Figure imgf000036_0002
anti-accC
[SEQ ID NO: 223] 5'-ATTGTTATTGCCGCAACCATTATCACCGCC-3'
Figure imgf000036_0003
anti-accD
[SEQ ID NO: 225] 5'-GAACGAATTAAAGCAACCATTATCACCGCC-3'
Figure imgf000036_0004
anti-aceE
[SEQ ID NO: 227] 5'-TTCCCAAATGACGCAACCATTATCACCGCC-3'
Figure imgf000037_0001
anti-aceF
[SEQ ID NO: 229] 5'-ATCAAAGTACCGGCAACCATTATCACCGCC-3'
Figure imgf000037_0002
anti-ackA
[SEQ ID NO: 231] 5'-GCAACGTTAGTCGCAACCATTATCACCGCC-3'
Figure imgf000037_0003
anti-adiY
[SEQ ID NO: 233] 5'-AGCGACCAACCTGCAACCATTATCACCGCC-3'
Figure imgf000037_0005
anti-argB
[SEQ ID NO: 235] 5'-ATT ATCAAACTGGCAACCATTATCACCGCC-3'
Figure imgf000037_0004
anti-argC
[SEQ ID NO: 237] 5'-CTGATTGTGGGTGCAACCATTATCACCGCC-3'
Figure imgf000037_0006
anti-argG
[SEQ ID NO: 239] 5'-CTCAAGCATCTCGCAACCATTATCACCGCC-3'
Figure imgf000037_0007
anti-argH
[SEQ ID NO: 241] 5'-GGCGGGCGTTTTGCAACCATTATCACCGCC-3'
Figure imgf000037_0008
anti-asnC
[SEQ ID NO: 243] 5'-CTGATCGACAATGCAACCATTATCACCGCC-3'
Figure imgf000038_0001
anti-aspA
[SEQ ID NO: 245] 5'-ATTCGTATCGAAGCAACCATTATCACCGCC-3'
Figure imgf000038_0002
anti-crp
[SEQ ID NO: 247] 5'-AAACCGCAAACAGCAACCATTATCACCGCC-3'
Figure imgf000038_0003
anti-csiD
[SEQ ID NO: 249] 5'-ACCGCCGTACAAGCAACCATTATCACCGCC-3'
Figure imgf000038_0004
anti-csiR
[SEQ ID NO: 251] 5'-TCTCTGGATGGCGCAACCATTATCACCGCC-3'
Figure imgf000038_0005
anti-cytR
[SEQ ID NO: 253] 5'-AAGCAGGAAACTGCAACCATTATCACCGCC-3'
Figure imgf000038_0006
anti-dcuA
[SEQ ID NO: 255] 5'-GAACTCATCATAGCAACCATTATCACCGCC-3'
Figure imgf000038_0007
anti-deoB
[SEQ ID NO: 257] 5'-TTTATTATGGTGGCAACCATTATCACCGCC-3'
Figure imgf000038_0008
anti-deoC
[SEQ ID NO: 259] 5'-AAAGCAAGCAGCGCAACCATTATCACCGCC-3'
Figure imgf000039_0001
anti-deoR
[SEQ ID NO: 261] 5'-CGCGAAGAGCGTGCAACCATTATCACCGCC-3'
Figure imgf000039_0002
anti-fabH
Figure imgf000039_0003
anti-fadD
[SEQ ID NO: 265] 5'-TGGCTTAACCGTGCAACCATTATCACCGCC-3'
Figure imgf000039_0004
anti-fadR
[SEQ ID NO: 267] 5'-GCGCAAAGCCCGGCAACCATTATCACCGCC-3'
Figure imgf000039_0005
anti-fbp
[SEQ ID NO: 269] 5'-GGTGAATTTATTGCAACCATTATCACCGCC-3'
Figure imgf000039_0006
anti-fnr
[SEQ ID NO: 271] 5'-AAGCGAATTATAGCAACCATTATCACCGCC-3'
Figure imgf000039_0007
anti-fruR
[SEQ ID NO: 273] 5'-GAAATCGCTCGGGCAACCATTATCACCGCC-3'
Figure imgf000040_0001
anti-ftsL
[SEQ ID NO: 275] 5'-GTGACAGAAGCTGCAACCATTATCACCGCC-3'
Figure imgf000040_0002
anti-ftsQ
[SEQ ID NO: 277] 5'-GCTCTGAACACGGCAACCATTATCACCGCC-3'
Figure imgf000040_0003
anti-ftsW
[SEQ ID NO: 279] 5'-CTCCCTCGCCTGGCAACCATTATCACCGCC-3'
Figure imgf000040_0004
anti-ftsZ
[SEQ ID NO: 281] 5'-ATGGAACTTACCGCAACCATTATCACCGCC-3'
Figure imgf000040_0005
anti-fur
[SEQ ID NO: 283] 5'-AATACCGCCCTAGCAACCATTATCACCGCC-3'
Figure imgf000040_0006
anti-gabD
[SEQ ID NO: 285] 5'-GACAGTAACTTAGCAACCATTATCACCGCC-3'
Figure imgf000040_0007
anti-gabP
[SEQ ID NO: 287] 5'-TCGCAACCACATGCAACCATTATCACCGCC-3'
Figure imgf000040_0008
anti-gabT
[SEQ ID NO: 289] 5'-AAAGAGTTAATGGCAACCATTATCACCGCC-3'
Figure imgf000041_0001
anti-gadA
[SEQ ID NO: 291] 5'-CTGTTAACGGATGCAACCATTATCACCGCC-3'
Figure imgf000041_0002
anti-gadB
[SEQ ID NO: 293] 5'-CAAGTAACGGATGCAACCATTATCACCGCC-3'
Figure imgf000041_0003
anti-gadC
[SEQ ID NO: 295] 5'-GTACAGACAGGTGCAACCATTATCACCGCC-3'
Figure imgf000041_0004
anti-glcC
Figure imgf000041_0005
anti-glpK
[SEQ ID NO: 299] 5'-AAATATATCGTTGCAACCATTATCACCGCC-3'
Figure imgf000041_0006
anti-glpR
[SEQ ID NO: 301] 5'-CAACGTCACAACGCAACCATTATCACCGCC-3'
Figure imgf000041_0007
anti-glpX
[SEQ ID NO: 303] 5'-CTTGCCATCGAAGCAACCATTATCACCGCC-3'
Figure imgf000042_0001
anti-gltA
[SEQ ID NO: 305] 5'-AAAGCAAAACTCGCAACCATTATCACCGCC-3'
Figure imgf000042_0007
anti-hfld
[SEQ ID NO: 307] 5'-TACTATGACATCGCAACCATTATCACCGCC-3'
Figure imgf000042_0002
anti-ihfa
Figure imgf000042_0003
anti-ihfb
Figure imgf000042_0004
anti-ilvB
[SEQ ID NO: 313] 5'-GGCACAACATCGGCAACCATTATCACCGCC-3'
Figure imgf000042_0005
anti-ilvC
[SEQ ID NO: 315] 5'-TTCAATACACTGGCAACCATTATCACCGCC-3'
Figure imgf000042_0006
anti-ilvD
[SEQ ID NO: 317] 5'-CGTTCCGCCACCGCAACCATTATCACCGCC-3'
Figure imgf000043_0001
anti-ilvG_1
[SEQ ID NO: 319] 5'-CACAGTGGGTGGGCAACCATTATCACCGCC-3'
[SEQ ID NO: 320] 5'-CGCCATTCATTTTCTGTTGGGCCATTGCATTG-3'
anti-ilvG_2
[SEQ ID NO: 321] 5'-AACAACTGTCGGGCAACCATTATCACCGCC-3'
[SEQ ID NO: 322] 5'-TTAACAACAATTTCTGTTGGGCCATTGCATTG-3'
anti-ilvH
[SEQ ID NO: 323] 5'-TTATCAGTCTTAGCAACCATTATCACCGCC-3'
Figure imgf000043_0002
anti-ilvL
[SEQ ID NO: 325] 5'-CTACGAGTGATTGCAACCATTATCACCGCC-3'
Figure imgf000043_0003
anti-ilvM
[SEQ ID NO: 327] 5'-CAGGTCAATGTAGCAACCATTATCACCGCC-3'
Figure imgf000043_0004
anti-ilvN
[SEQ ID NO: 329] 5'-ACTCATGACAACGCAACCATTATCACCGCC-3'
Figure imgf000043_0006
anti-ilvX
[SEQ ID NO: 331] 5'-ACAAAATTCTGTGCAACCATTATCACCGCC-3'
Figure imgf000043_0005
anti-lexA
[SEQ ID NO: 333] 5'-ACGGCCAGGCAAGCAACCATTATCACCGCC-3'
Figure imgf000043_0007
anti-lpxC
[SEQ ID NO: 335] 5'-AGGACACTTAAAGCAACCATTATCACCGCC-3'
Figure imgf000044_0001
anti-marA
[SEQ ID NO: 337] 5'-GCAACGTTAGTCGCAACCATTATCACCGCC-3'
Figure imgf000044_0002
anti-metJ
[SEQ ID NO: 339] 5'-AGCGGCGAATATGCAACCATTATCACCGCC-3'
Figure imgf000044_0003
anti-modE
[SEQ ID NO: 341] 5'-ATCCTTCTCACCGCAACCATTATCACCGCC-3'
Figure imgf000044_0004
anti-nadB
[SEQ ID NO: 343] 5'-CCTGAACATTCAGCAACCATT ATCACCGCC-3'
Figure imgf000044_0005
anti-nagC
Figure imgf000044_0006
anti-narL
[SEQ ID NO: 347] 5'-GAACCGGCTACTGCAACCATTATCACCGCC-3'
Figure imgf000044_0007
anti-pck
[SEQ ID NO: 349] 5'-AATGGTTTGACCGCAACCATTATCACCGCC-3'
Figure imgf000045_0001
anti-PdhR
[SEQ ID NO: 351] 5'-AAAATCCGCCAAGCAACCATTATCACCGCC-3'
Figure imgf000045_0002
anti-phoP
[SEQ ID NO: 353] 5'-GTTGTTGAAGACGCAACCATTATCACCGCC-3'
Figure imgf000045_0003
anti-pnuC
[SEQ ID NO: 355] 5'-AGTGTGCAGAATGCAACCATTATCACCGCC-3'
Figure imgf000045_0004
anti-ppsA
[SEQ ID NO: 357] 5'-GGCTCGTCACCGGCAACCATTATCACCGCC-3'
Figure imgf000045_0005
anti-purA
[SEQ ID NO: 359] 5'-GTCGTCGTACTGGCAACCATTATCACCGCC-3'
Figure imgf000045_0006
anti-purB
[SEQ ID NO: 361] 5'-TCACTGACCGCCGCAACCATTATCACCGCC-3'
Figure imgf000045_0007
anti-purR
[SEQ ID NO: 363] 5'-AAAGATGTAGCGGCAACCATTATCACCGCC-3'
Figure imgf000045_0008
anti-puuE
[SEQ ID NO: 365] 5'-GAATTCCATCAGGCAACCATTATCACCGCC-3'
Figure imgf000046_0001
anti-rbsA
[SEQ ID NO: 367] 5'-CTTCAGCTTAAAGCAACCATTATCACCGCC-3'
Figure imgf000046_0002
anti-rbsB
[SEQ ID NO: 369] 5'-AAACTGGCTACCGCAACCATTATCACCGCC-3'
Figure imgf000046_0003
anti-rbsD
[SEQ ID NO: 371] 5'-ACCGTTCTTAATGCAACCATTATCACCGCC-3'
Figure imgf000046_0004
anti-rbsK
[SEQ ID NO: 373] 5'-GGCAGCCTCGTTGCAACCATTATCACCGCC-3'
Figure imgf000046_0005
anti-rbsR
[SEQ ID NO: 375] 5'-AAAGATGTTGCCGCAACCATTATCACCGCC-3'
Figure imgf000046_0006
anti-rcsB
[SEQ ID NO: 377] 5'-AACGTAATTATTGCAACCATTATCACCGCC-3'
Figure imgf000046_0007
anti-rutR
[SEQ ID NO: 379] 5'-GCAGTGAAAACAGCAACCATTATCACCGCC-3'
Figure imgf000046_0008
anti-serA
[SEQ ID NO: 381] 5'-TCGCTGGAGAAAGCAACCATTATCACCGCC-3'
Figure imgf000047_0001
anti-serC
[SEQ ID NO: 383] 5'-TTCAATTTTAGTGCAACCATTATCACCGCC-3'
Figure imgf000047_0002
anti-soxS
[SEQ ID NO: 385] 5'-AAAATTATTCAGGCAACCATTATCACCGCC-3'
Figure imgf000047_0003
anti-sroD
[SEQ ID NO: 387] 5'-GCGCGCGGCAAAGCAACCATTATCACCGCC-3'
Figure imgf000047_0004
anti-zwf
[SEQ ID NO: 389] 5'-CAAACAGCCCAGGCAACCATTATCACCGCC-3'
Figure imgf000047_0005
De manera espedfica, la secuencia de union de los genes se sustituyo mediante mutagenesis de sitio dirigido usando un plasmido de anti-csrA pWAS como molde y los cebadores descritos anteriormente. Los genes construidos mediante mutagenesis de sitio dirigido se transformaron en celulas DH5a (Invitrogen) del siguiente modo. Se realizo el cultivo usando un medio de placa que contiene LB-agar, arabinosa al 1 % y 100 pg/ml de ampicilina a 25 °C durante 2 dfas, y las colonias resultantes se cultivaron en medio LB lfquido que contiene agarosa al 1 % y 100 pg/ml de ampicilina. Despues, se purificaron los plasmidos de las celulas y se secuenciaron, y se uso un plasmido correcto en un experimento posterior. Este cultivo en presencia de arabinosa al 1 % y a 25 °C inhibe de forma eficaz la expresion del ARNs sintetico, y por lo tanto es un procedimiento esencial. Ademas, si el gen cromosomico que esta dirigido por el ARNs sintetico tiene una influencia muy significativa sobre el crecimiento de las celulas hospedadoras, el crecimiento de las celulas sera insuficiente cuando no se inhiba la expresion del ARNs sintetico. Esta influencia del ARNs sintetico puede provocar dificultades en experimentos posteriores, y por lo tanto, se evita. Sin embargo, si el ARNs sintetico no tiene influencia sobre el crecimiento celular, el cultivo se puede realizar en ausencia de arabinosa o a 37 °C. Cuando se realiza el cultivo para la produccion de un producto metabolico deseado, el ARNs sintetico se debena de expresar lo suficiente, y por lo tanto, en este caso, el cultivo se realizo en ausencia de arabinosa y a 37 °C.
El plasmido construido tal como se describe anteriormente se sometio a PCR usando los cebadores de las SEQ ID NO: 105 y 96, el producto de PCR se escindio con SpeI/SacI y se unio con un vector pTyr escindido con XbaI/SacI, introduciendo adicionalmente de este modo ARNs.
Como resultado, como se puede ver en la FIG. 26, la produccion de tirosina vario en funcion del tipo de gen diana, no se encontro un gen que presente una productividad mayor que la combinacion genica tyrR/csrA. Por tanto, se pudo ver que la combinacion genica tyrR/csrA era la diana optima para la produccion de tirosina en la cepa S17-1. Es obvio que esta seleccion de gen de alto rendimiento se puede usar en la produccion no solo de tirosina, sino tambien de diversos productos metabolicos.
Ejemplo 8: Produccion de microorganismo recombinante usando ARNs sintetico y optimizacion de la produccion de cadaverina mediante la regulacion por etapas de la expresion del gen murE
8-1: Produccion de microorganismos recombinantes productores de cadaverina usando ARNs sintetico
Ademas del Ejemplo 5, se potencio el flujo metabolico de la via de biosmtesis de lisina, y despues se realizo la seleccion de un gen a silenciar para aumentar adicionalmente la produccion de cadaverina en un microorganismo recombinante que convierte la lisina a cadaverina usando lisina descarboxilasa (CadA). La FIG. 27 muestra las vfas de biosmtesis de cadaverina a partir de glucosa, y estas vfas de biosmtesis incluyen las vfas de consumo para la produccion de otros metabolitos. En este Ejemplo, con el fin de aumentar la produccion de cadaverina, se seleccionaron 130 genes candidatos capaces de redes que consumen metabolitos de forma natural, y se construyeron ARNs sinteticos capaces de inhibir la expresion de los genes candidatos. Los 130 genes candidatos incluyen los 84 genes candidatos del Ejemplo 7, y se podnan construir mediante los cebadores usados en el Ejemplo 7. Mientras tanto, los 46 genes candidatos adicionales y los cebadores usados para la construccion de los mismos son los siguientes.
asnA (asparagina sintetasa A)
asnB (asparagina sintetasa B)
carA (carbamoil fosfato sintetasa)
carB (carbamoil fosfato sintetasa)
ddlB (D-alanina-D-alanina ligasa B)
deoA (timidina fosforilasa / uracil fosforilasa)
deoD (purina nucleosido fosforilasa de tipo deoD)
dpiA (regulador transcripcional doble implicado en el catabolismo anaerobico de citrato)
fis (Fis, "factor para la estimulacion de la inversion", es una pequena protema de flexion y de union a ADN cuyo papel principal parece ser la organizacion y el mantenimiento de la estructura de nucleotidos)
gadE (GadE controla la transcripcion de los genes implicados en el sistema dependiente de glutamato) gadW (GadW controla la transcripcion de los genes implicados en el sistema dependiente de glutamato) gadX (GadX controla la transcripcion de los genes implicados en el sistema dependiente de glutamato) glpF (canal GIpF de glicerol MiP)
ilvY (IlvY, regulador transcripcional doble de union a ADN)
ivbL (El peptido lfder del operon ilvB (IvbL))
lhgO (L-2-hidroxiglutarato oxidasa)
lpd (Lipoamida deshidrogenasa)
lrp (Lrp es un regulador transcripcional doble para al menos el 10 % de los genes en Escherichia coli. Estos genes estan implicados en la biosmtesis y el catabolismo de los aminoacidos, en el transporte de nutrientes, en la smtesis de fimbrias y otras funciones celulares, incluyendo el metabolismo de 1-carbono)
metB (O-succinilhomoserina liasa / O-succinilhomoserina(tiol)-liasa)
metL (aspartato cinasa / homoserina deshidrogenasa)
mraY (fosfo-N-acetilmuramoil-pentapeptido transferasa)
mraZ (Funcion desconocida)
murE (UDP-N-acetilmuramoilalanil-D-glutamato 2,6-diaminopimelato ligasa)
murF (enzima de adicion de D-alanil-D-alanina)
murG (N-acetilglucosaminil transferasa)
nac (Nac regula, sin un efector, genes implicados en el metabolismo del nitrogeno en condiciones limitantes de nitrogeno) nadA (quinolato sintasa)
nsrR (NsrR, el "represor sensible a nitrito" regula los genes implicados en la proteccion celular frente al oxido mtrico (NO))
panC (pantotenato sintetasa)
panD (Aspartato 1-descarboxilasa)
pgl (6-fosfogluconolactonasa)
pyrB (aspartato carbamoiltransferasa, subunidad PyrB)
pyrC (dihidroorotasa)
pyrL (aspartato carbamoiltransferasa, subunidad Pyrl)
rob (Rob es regulador transcripcional doble. Su dominio de N-terminal comparte el 49 % de identidad con MarA y SoxS. Estas protemas activan un conjunto comun de aproximadamente 50 genes, el regulon marA/soxS/rob, implicado en la resistencia a antibioticos, la resistencia a superoxido, y la tolerancia a disolventes organicos y a metales pesados).
rpe (ribulosa fosfato 3-epimerasa)
talA (transaldolasa A)
thrA (aspartato cinasa / homoserina deshidrogenasa)
thrB (homoserina cinasa)
thrC (treonina sintasa)
thrL (peptido lfder del operon thr)
tktA (transcetolasa I)
tktB (transcetolasa II)
torR (sistema de dos componentes, familia OmpR, regulador TorR de la respuesta del operon torCAD) Secuencias de los cebadores usados para la construccion de ARNs
anti-asnA
[SEQ ID NO: 391] 5'-TACATTGCCAAAGCAACCATTATCACCGCC-3'
Figure imgf000049_0001
anti-asnB
[SEQ ID NO: 393] 5'-TTTGGCGTATTCGCAACCATTATCACCGCC-3'
Figure imgf000049_0002
anti-carA
[SEQ ID NO: 395] 5'-GCGCTATTGGTTGCAACCATTATCACCGCC-3'
Figure imgf000049_0003
anti-carB
[SEQ ID NO: 397] 5'-ACAGATATAAAAGCAACCATTATCACCGCC-3'
Figure imgf000049_0004
anti-ddlB
[SEQ ID NO: 399] 5'-ATCGCGGTCCTGGCAACCATTATCACCGCC-3'
Figure imgf000049_0005
anti-deoA
[SEQ ID NO: 401] 5'-CAAGAAATTATTGCAACCATTATCACCGCC-3'
Figure imgf000049_0006
anti-deoD
[SEQ ID NO: 403] 5'-CACATTAATGCAGCAACCATTATCACCGCC-3'
Figure imgf000049_0007
anti-dpiA
Figure imgf000050_0001
anti-fis
[SEQ ID NO: 407] 5'-CGCGTAAATTCTGCAACCATTATCACCGCC-3'
Figure imgf000050_0002
anti-gadE
[SEQ ID NO: 409] 5'-ATGACGAAAGATGCAACCATTATCACCGCC-3'
Figure imgf000050_0003
anti-gadW
[SEQ ID NO: 411] 5'-TGCTCGGTGATCGCAACCATTATCACCGCC-3'
Figure imgf000050_0004
anti-gadX
[SEQ ID NO: 413] 5'-CATGGGAATTGTGCAACCATTATCACCGCC-3'
Figure imgf000050_0005
anti-glpF
[SEQ ID NO: 415] 5'-TCAACCTTGAAAGCAACCATTATCACCGCC-3'
Figure imgf000050_0006
anti-ilvY
[SEQ ID NO: 417] 5'-GATCTGAAAACCGCAACCATTATCACCGCC-3'
Figure imgf000050_0007
anti-ivbL
[SEQ ID NO: 419] 5'-ATGCTCAACGCAGCAACCATTATCACCGCC-3'
Figure imgf000051_0001
anti-IhgO
[SEQ ID NO: 421] 5'-GTGATTATTGGCGCAACCATTATCACCGCC-3'
Figure imgf000051_0002
anti-lpd
[SEQ ID NO: 423] 5'-ATCAAAACTCAGGCAACCATTATCACCGCC-3'
Figure imgf000051_0003
anti-l ^
[SEQ ID NO: 425] 5’-AAGAAGCGCCCTGCAACCATTATCACCGCC-3’
Figure imgf000051_0004
anti-metB
[SEQ ID NO: 427] 5'-ACAGGCCACCATGCAACCATTATCACCGCC-3'
[SEQ ID NO: 428] 5-TTACGCGTCATTTTCTGTTGGGCCATT GCATTG-3'
anti-metL
[SEQ ID NO: 429] 5'-GCGCAGGCAGGGGCAACCATTATCACCGCC-3'
Figure imgf000051_0005
anti-mraY
[SEQ ID NO: 431] 5'-CTGGCCGAACATGCAACCATTATCACCGCC-3'
Figure imgf000051_0006
anti-mraZ
[SEQ ID NO: 433] 5'-GCAACGTTAGTCGCAACCATTATCACCGCC-3'
Figure imgf000051_0007
anti-murE
[SEQ ID NO: 435] 5'-AATTTGCGCGACGCAACCATTATCACCGCC-3'
Figure imgf000052_0001
anti-murF
[SEQ ID NO: 437] 5'-AACCCTTAGCCAGCAACCATTATCACCGCC-3'
[SEQ ID NO: 438] 5'-ACGCTAATCATTTTCTGTTGGGCCATTGCATTG-3' anti-murG
[SEQ ID NO: 439] 5'-GGAAAGCGATTAGCAACCATTATCACCGCC-3'
Figure imgf000052_0002
anti-nac
[SEQ ID NO: 441] 5'-CGCCTGAAATACGCAACCATTATCACCGCC-3'
Figure imgf000052_0003
anti-nadA
[SEQ ID NO: 443] 5'-TTTGATCCAGACGCAACCATTATCACCGCC-3'
Figure imgf000052_0004
anti-nsrR
Figure imgf000052_0005
anti-panC
[SEQ ID NO: 447] 5'-GAAACCCTGCCGGCAACCATTATCACCGCC-3'
Figure imgf000052_0006
anti-panD
[SEQ ID NO: 449] 5'-ATGCTGCAGGGCGCAACCATTATCACCGCC-3'
Figure imgf000052_0007
anti-pgl
[SEQ ID NO: 451] 5'-GTTTATATCGCCGCAACCATTATCACCGCC-3'
Figure imgf000053_0001
anti-pyrB
[SEQ ID NO: 453] 5'-CTATATCAGAAAGCAACCATTATCACCGCC-3'
Figure imgf000053_0002
anti-pyrC
[SEQ ID NO: 455] 5'-TCCCAGGTATTAGCAACCATTATCACCGCC-3'
Figure imgf000053_0003
anti-pyrI
[SEQ ID NO: 457] 5'-AATAAATTGCAGGCAACCATT ATCACCGCC-3'
Figure imgf000053_0004
anti-rob
[SEQ ID NO: 459] 5'-GGCATTATTCGCGCAACCATTATCACCGCC-3'
Figure imgf000053_0005
anti-rpe
[SEQ ID NO: 461] 5'-TTGATTGCCCCCGCAACCATTATCACCGCC-3'
Figure imgf000053_0006
anti-talA
[SEQ ID NO: 463] 5'-GACGGCATCAAAGCAACCATTATCACCGCC-3'
Figure imgf000053_0007
anti-talB
[SEQ ID NO: 465] 5'-TTGACCTCCCTTGCAACCATTATCACCGCC-3'
Figure imgf000053_0008
anti-thrA
[SEQ ID NO: 467] 5'-AAGTTCGGCGGTGCAACCATTATCACCGCC-3'
Figure imgf000054_0001
anti-thrC
[SEQ ID NO: 469] 5'-AATCTGAAAGATGCAACCATTATCACCGCC-3'
Figure imgf000054_0002
anti-thrL
[SEQ ID NO: 471] 5'-AGCACCACCATTGCAACCATTATCACCGCC-3'
Figure imgf000054_0003
anti-tktA
[SEQ ID NO: 473] 5'-AAAGAGCTTGCCGCAACCATTATCACCGCC-3'
Figure imgf000054_0004
anti-tktB
[SEQ ID NO: 475] 5'-GACCTTGCCAATGCAACCATTATCACCGCC-3'
Figure imgf000054_0005
anti-torR
[SEQ ID NO: 477] 5'-ATT GTTATTGTTGCAACCATTATCACCGCC-3'
Figure imgf000054_0006
La construccion de cada ARNs sintetico, la transformacion del ARNs sintetico en XQ56 (que contiene un plasmido pI5CadA), y la medicion de la concentracion de cadaverina se realizaron del mismo modo que se describe en el Ejemplo 5.
Como resultado, cuando la produccion de cadaverina en la cepa basica se tomo como el 100 % del mismo modo que el Ejemplo 5, la inhibicion del gen murE mostro la produccion de cadaverina mas alta (el 55 %, 2,15 g/l) y la inhibicion de ack mostro una produccion de cadaverina de 1,96 g/l (el 40 %). Los resultados globales se muestran en la FIG. 27, y los 37 genes diana que aumentan la produccion de cadaverina se muestran en la Tabla 5 a continuacion.
Tabla 5: 37 genes diana que aumentan la produccion de cadaverina
Figure imgf000054_0007
(continuacion)
Figure imgf000055_0001
(continuacion)
Figure imgf000056_0001
* La produccion de cadaverina (1,4 g/l) en una cepa de E. coli disenada geneticamente documentada en las referencias [Qian, Z. -G. y col. Biotechnol Bioeng 108:93-103, 2011] se tomo como el 100 %.
** Gen esencial: gen esencial para la supervivencia de la celula. Vease los datos de http://tubic.tju.edu.cn/deg/ para la informacion del mismo.
8-2: Optimizacion de la produccion de cadaverina mediante la regulacion por etapas de la expresion del gen murE
Como en el caso de anti-csrA mencionado en el Ejemplo 6, en este Ejemplo, la energfa de union de anti-murE estaba diversificada de tal manera que la expresion del gen murE se regulaba por etapas, y se examino si la regulacion de la expresion del gen murE tema alguna influencia sobre la produccion final de cadaverina.
De acuerdo con el procedimiento de preparacion de ARNs sintetico descrito en el Ejemplo anterior, se construyeron diversos anti-murE (ARNs sinteticos) mediante mutagenesis de sitio dirigido usando los siguientes pares de cebadores, y los plasmidos pWAS de anti-murE construidos (FIG. 18) se transformaron en la cepa XQ56 que contiene el plasmido pI5CadA.
[SEQ ID NO: 479] 5'-GATCGTGCAACCATTATCACCGCC-3'
[SEQ ID NO: 480] 5'-TGCCACTTTCTGTTGGGCCATTGCATTG-3'
[SEQ ID NO: 481] 5'-GTCGTAAGCAACCATTATCACCGCC-3'
[SEQ ID NO: 482] 5'-CTGCCACTTTCTGTTGGGCCATTGCATTG-3'
[SEQ ID NO: 483] 5'-TCGTAATTGCAACCATTATCACCGCC-3'
[SEQ ID NO: 484] 5'-TCTGCCACTTTCTGTTGGGCCATTGCATTG-3'
[SEQ ID NO: 485] 5'-TAATTTGCGCGGCAACCATTATCACCGCC-3'
[SEQ ID NO: 486] 5'-CGATCTGCCACTTTCTGTTGGGCCATTGCATTG-3'
[SEQ ID NO: 487] 5'-ATTTGCGCGACCTGCAACCATTATCACCGCC-3'
[SEQ ID NO: 488] 5'-TACGATCTGCCACTTTCTGTTGGGCCATTGCATTG-
3'
[SEQ ID NO: 489] 5'-TTTGCGCGACCTTCGCAACCATTATCACCGCC-3”
Figure imgf000057_0001
[SEQ ID NO: 491] 5'-TTGCGCGACCTTCTTGCAACCATTATCACCGCC-3'
Figure imgf000057_0002
Como resultado, como se puede ver en la FIG. 28, la energfa de union oscilo desde -20 kcal/mol a -50 kcal/mol. Como en el caso de anti-csrA, el anti-murE basico construido (recuadro azul, FIG. 28) presento la produccion mas alta de cadaverina, y a los valores de energfa de union mayores o menores que el del anti-murE basico, se redujo la produccion de cadaverina.
En este Ejemplo, con el fin de examinar si la cantidad de protema murE realmente cambia por anti-murE que tiene diferente energfa de union, se cultivo la cepa XQ56 transformada con el plasmido p15CadA/pWAS-anti-murE, seguido por el analisis 2D-PAGE. En este Ejemplo, la eliminacion de solo anti-murE, y los anti-murE que tienen valores de energfa de union de -19,2, -36,5, -40,9 y -48,7 kcal/mol, se usaron. De manera espedfica, se recolectaron las celulas de cada muestra cultivada en matraz y se resuspendieron en un tampon de resuspension (Tris-HCl 10 mM (a pH 8,0), MgCh 1,5 mM, KCl 10 mM, ditiotreitol 0,5 mM, y dodecil sulfato de sodio (SDS) al 0,1 % en p/v). La suspension se mezclo con tampon de lisis (urea 7 M, tiourea 2 M, Tris 40 mM, ditiotreitol 65 mM, y 3-[(3-colamidopropil) dimetilamonio]-1-propanosulfonato (CHAPS) al 4 % en p/v), y despues se centrifugo a 13000X g y 4 °C durante 10 minutos, y se recolecto el sobrenadante. Se midio la concentracion de protema en el sobrenadante mediante el procedimiento Bradford (Bradford MM, Anal Biochem 72, 248254, 1976), y se mezclaron 150 ug de la protema con 340 ul de tampon de rehidratacion (urea 7 M, tiourea 2 M, ditiotreitol 20 mM, CHAPS al 2 % p/v, tampon de gradiente de pH inmovilizado al 0,8 % en p/v (Amersham Biosciences, Uppsala, Suiza), y mezcla de inhibidor de proteasa al 1 % en v/v) y despues se cargo en geles de tiras secas de inmovilina (IPG) (18 cm, a pH 3-10 NL; Amersham Biosciences). La tira de IPG cargada con la muestra se rehidrato en el Protean IEF Cell durante 12 horas, se centro a 20 °C y 250 V durante 3 horas, y despues se mantuvo a 6000 V hasta que alcanzo 65 kV h. La tira se equilibro en una solucion (que contiene urea 6 M, Tris-HCl 0,375 M (a pH 8,8), glicerol al 20 % en p/v, SDS al 2 % en p/v, ditiotreitol 130 mM, y azul de bromofenol al 0,002 % en p/v) a temperatura ambiente durante 15 minutos, y se equilibro de nuevo en una solucion (que tiene la misma composicion que la mencionada anteriormente, excepto en que contiene iodoacetamida 135 mM en lugar de DTT) a temperatura ambiente durante 15 minutos. Despues, la tira se transfirio a gel de SDS-poliacrilamida al 12 % en p/v. La mancha de la protema se examino con el kit de tincion PlusOnes Silver Staining Kit (Amersham Biosciences) y se analizo cuantitativamente con colorante de azul brillante de Coomassie.
Para la cuantificacion de la protema MurE, se midio la cantidad de protema MurE en relacion con el nivel de expresion de la protema de mantenimiento EF-Tu, y se compararon los valores medidos.
Como resultado, como se puede ver en la FIG. 29, a medida que la energfa de union de anti-murE (ARNs sintetico) usado aumentaba, la cantidad de protema MurE disminma. Por tanto, se puede ver que la cantidad de protema diana se puede diversificar de forma eficaz mediante el diseno adecuado de la energfa de union del ARNs sintetico. La XQ56 con el anti-murE seleccionado finalmente se fermento en las mismas condiciones que las documentadas en las referencias (Qian y col., Biotechnol. Bioeng. 108, 93-103 (2011)). Como resultado, como se muestra en la FIG. 30, se podna obtener un total de 12,6 g/l de cadaverina, y esta produccion era aproximadamente el 31 % mayor que la produccion documentada anteriormente (9,6 g/l), documentada en las referencias. En el experimento de fermentacion, se cultivaron colonias individuales en medio R/2 que contiene 10 g/l de glucosa, 10 g/l de arabinosa y 3 g/l de (NH4)SO4 a 25 °C, y despues se sometieron a fermentacion de lote alimentado en un frasco de 6,6 l que tiene 2 l de los mismos componentes del medio (salvo arabinosa) que se describen anteriormente. El pH se mantuvo a un pH constante de 6,8 con KOH 10 M y la solucion de alimentacion contema 577 g/l de glucosa, 7 g/l de MgSO4-7H2O, y 115 g/l de (NH4)2SO4. El medio R/2 contema 2 g/l de (NH4)2HPO4, 6,75 g/l de KH2PO4, 0,85 g/l de acido dtrico, 0,7 g/l de MgSO4'7H2O, y 5 ml/l de solucion de metales traza (Tabla 2).
Aplicabilidad industrial
Como se ha descrito anteriormente, la presente invencion proporciona un ARNs sintetico que puede inhibir de manera eficaz la expresion del gen diana sin modificar la secuencia del gen diana, a diferencia del procedimiento de delecion genica, y un procedimiento para preparar el ARNs sintetico. El ARNs sintetico de acuerdo con la presente invencion tiene la ventaja de que el grado de inhibicion del gen diana se puede controlar regulando la capacidad del ARNs sintetico para unirse al ARNm del gen diana. El uso del ARNs sintetico que regula la expresion del gen diana hace posible construir de manera eficaz un microorganismo recombinante sin usar un procedimiento de delecion genica y reducir la expresion del gen diana y, por lo tanto, el ARNs sintetico es util para la produccion de microorganismos recombinantes. Asimismo, el ARNs sintetico se puede aplicar rapidamente a diversas cepas, y por lo tanto, es muy adecuado para la medicion de las capacidades metabolicas de las cepas y la seleccion de la cepa mas adecuada. Ademas, los microorganismos recombinantes, que se obtienen mediante la manipulacion del flujo metabolico usando el ARNs sintetico y producir tirosina o cadaverina con alta eficacia, son utiles en los campos de los farmacos e industrial. En otras palabras, el uso del ARNs de acuerdo con la presente invencion puede hacer facil seleccionar genes diana cuya expresion se va a inhibir para la produccion altamente eficaz de metabolitos. Por consiguiente, el ARNs sintetico se puede usar para construir cepas recombinantes para la produccion eficaz de diversos metabolitos y establecer procedimientos eficaces para la produccion de diversos metabolitos, y por lo tanto, es altamente util.
<110> Korea Advanced Institute of Science and Technology
<120> Nuevo ARN pequeno de regulacion de la smtesis y el procedimiento para preparar el mismo
<130> PP-B1178
<150> KR 10-2012-0003609
<151> 11/01/2012
<160> 492
<170> KopatentIn 1.71
<210> 1
<211> 2561
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> plasmido pWA
<400> 1
Figure imgf000059_0001
Figure imgf000060_0001
<210>2
<211> 52
<212>ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador
<400>2
aagctggagc tcaatactag tcgatttatt atgacaactt gacggctaca tc 52
<210> 3
<211> 47
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador
<400> 3
gaattcaatt aattaattaa aattcccaaa aaaacgggta tggagaa 47
<210>4
<211> 57
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador
<400> 4
gggaatttta attaaaagga gacccgggat atgagcacaa aaaagaaacc attaaca 57
<210>5
<211> 33
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador
<400> 5
aattatgaat tcttagccaa acgtctcttc agg 33
<210>6
<211> 101
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador
<400> 6
Figure imgf000061_0001
<210>7
<211> 97
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador
<400> 7
Figure imgf000061_0002
<210>8
<211> 33
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador
<400> 8
ttttttctcg agccaggcat caaataaaac gaa 33
<210>9
<211> 34
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador
<400>9
gaattgggta cctataaacg cagaaaggcc cacc 34
<210> 10
<211> 23
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador
<400> 10
gaagttatcg ctagtcagtg gcc 23
<210> 11
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador
<400> 11
ccccacaacg gaacaactct 20
<210> 12
<211> 84
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador
<400> 12
Figure imgf000062_0001
<210> 13
<211> 29
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador
<400> 13
ctcgagaaaa aaagcccgga cgactgttc 29
<210> 14
<211> 79
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador
<400> 14
Figure imgf000062_0002
<210> 15
<211> 34
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador
<400> 15
ctcgagaaaa aaaaccagca ggtataatct gctg 34
<210> 16
<211> 74
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador
<400> 16
Figure imgf000063_0001
<210> 17
<211> 79
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador
<400> 17
Figure imgf000063_0002
<210> 18
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador
<400> 18
agtgggaacc tagacactaa 20
<210> 19
<211> 18
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador
<400> 19
ctaggtaaac ccaggagg 18
<210> 20
<211> 2179
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> pR15CA
<400> 20
Figure imgf000064_0001
<210>21
<211> 38
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador
<400> 21
ataattctcg agccaggcat caaataaaac gaaaggct 38
<210> 22
<211> 33
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador
<400> 22
aattaggtac ctataaacgc agaaaggccc acc 33
<210> 23
<211> 36
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador
<400> 23
aattagaatt cgtggataac cgtattaccg cctttg 36
<210> 24
<211> 67
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador
<400> 24
Figure imgf000065_0001
<210> 25
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<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador
<400> 25
aattattaat taaaaggagg acaaatatat ggcgagc 37
<210> 26
<211> 74
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador
<400> 26
Figure imgf000066_0001
<210> 27
<211> 50
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador
<400> 27
gcgagcagtg agaacgtcat aagtcaactt tcagaattgc ggtcatccca 50
<210> 28
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<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador
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catatatttg tcctccttaa atcacccgcc agcagattat acctg 45
<210> 29
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<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador
<400> 29
gcgagcagtg agaacgtcat gcaaccatta tcaccgccag aggtaaaa 48
<210> 30
<211> 45
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador
<400> 30
catatatttg tcctcctttc atttctgaat gtctgtttac cccta 45
<210> 31
<211> 48
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador
<400> 31
gcgagcagtg agaacgtcat gcaaccatta tcaccgccag aggtaaaa 48
<210> 32
<211> 43
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador
<400> 32
catatatttg tcctcctttc atttctgaat gtctgtttac ccc 43 <210> 33
<211> 26
<212>ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador
<400> 33
gacaaatata tggcgagcag tgagaa 26 <210> 34
<211> 23
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador
<400> 34
tttctgttgg gccattgcat tgc 23 <210> 35
<211> 27
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador
<400> 35
caccgagcaa ccattatcac cgccaga 27 <210> 36
<211> 22
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador
<400> 36
atgacgttct cactgctcgc ca 22 <210> 37
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador
<400> 37
gcgagcagtg agaacgtcat 20 <210> 38
<211> 23
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador
<400> 38
tttctgttgg gccattgcat tgc 23 <210> 39
<211> 39
<212>ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador
<400> 39
caccgagttc atgcgcttgc aaccattatc accgccaga 39 <210> 40
<211> 22
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador
<400> 40
atgacgttct cactgctcgc ca 22 <210> 41
<211> 38
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador
<400> 41
tgttcaccgg gcaaccatta tcaccgccag aggtaaaa 38 <210> 42
<211> 35
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador
<400> 42
gctcctcgct ttctgttggg ccattgcatt gccac 35 <210> 43
<211> 37
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador
<400> 43
catcctggtg caaccattat caccgccaga ggtaaaa 37 <210> 44
<211> 33
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador
<400> 44
ggcaccaccc cggtgaacag ctcctcgctt tct 33 <210> 45
<211> 38
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador
<400> 45
gggtggtgcc gcaaccatta tcaccgccag aggtaaaa 38 <210> 46
<211> 35
<212>ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador
<400> 46
cggtgaacat ttctgttggg ccattgcatt gccac 35 <210> 47
<211> 37
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador
<400> 47
cgagctggag caaccattat caccgccaga ggtaaaa 37 <210> 48
<211> 33
<212>ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador
<400> 48
accaggatgg gcaccacccc ggtgaacatt tct 33 <210> 49
<211> 38
<212>ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador
<400> 49
catcctggtc gcaaccatta tcaccgccag aggtaaaa 38 <210> 50
<211> 35
<212>ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador
<400> 50
ggcaccacct ttctgttggg ccattgcatt gccac 35 <210> 51
<211> 37
<212>ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador
<400> 51
ggcgacgtag caaccattat caccgccaga ggtaaaa 37 <210> 52
<211> 31
<212>ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador
<400> 52
gtccagctcg accaggatgg gcaccacctt t 31 <210> 53
<211> 33
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador
<400> 53
actacaagaa gcgcaaccat tatcaccgcc aga 33 <210> 54
<211> 35
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador
<400> 54
cggggatgtc ggtttctgtt gggccattgc attgc 35 <210> 55
<211> 33
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador
<400> 55
caagaagctg tcgcaaccat tatcaccgcc aga 33 <210> 56
<211> 34
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador
<400> 56
tagtcgggga ttttctgttg ggccattgca ttgc 34 <210> 57
<211> 74
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador
<400> 57
Figure imgf000071_0001
<210> 58
<211> 34
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador
<400> 58
aatactccgc ggtataaacg cagaaaggcc cacc 34
<210> 59
<211> 41
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador
<400> 59
tcattttgat tgctcctttt tctgttgggc cattgcattg c 41
<210> 60
<211> 39
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador
<400> 60
ctgaagcgca aaatgatcgc aaccattatc accgccaga 39
<210> 61
<211> 41
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador
<400> 61
ccatccgttt ttctcctttt tctgttgggc cattgcattg c 41
<210> 62
<211> 37
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador
<400> 62
gaacaagatg gattgcgcaa ccattatcac cgccaga 37
<210> 63
<211> 43
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador
<400> 63
aatcatgtaa acgactcctt tttctgttgg gccattgcat tgc 43
<210> 64
<211> 79
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador
<400> 64
Figure imgf000072_0001
<210> 65
<211> 49
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador
<400> 65
aattattaat taaggagcaa tcaaaatgaa catcaagaac atcaacgcg 49
<210> 66
<211> 40
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador
<400> 66
aattaatcga tatttttaag gtatggacaa ttaatggcgc 40
<210> 67
<211> 34
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador
<400> 67
aattattaat taaaaggaga aaaacggatg gctg 34
<210> 68
<211> 37
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador
<400> 68
aattaatcga ttgacaactt gacggctaca tcattca 37
<210> 69
<211> 50
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador
<400> 69
aattattaat taaggagtcg tttacatgat tgaacaagat ggattgcacg 50 <210> 70
<211> 35
<212>ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador
<400> 70
aattaatcga tgaagaactc gtcaagaagg cgata 35
<210> 71
<211> 36
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador
<400> 71
aattatgaat tcatgcaaaa agacgcgctg aataac 36
<210> 72
<211> 31
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador
<400> 72
taattgagct cttaagccac gcgagccgtc a 31
<210> 73
<211> 41
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador
<400> 73
atcatatcta gaaggaggtt attcatgtcc tcacgtaaag a 41
<210> 74
<211> 29
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador
<400> 74
ttcgttgcat gcttacagca gttcttttg 29
<210> 75
<211> 46
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador
<400> 75
aattaagagc tcttaattaa cggttaaata tgcaaagata aatgcg 46
<210> 76
<211> 34
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador
<400> 76
aattaaacta gattatttct tcagttcagc cagg 34
<210> 77
<211> 90
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador
<400> 77
Figure imgf000074_0001
<210> 78
<211> 90
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador
<400> 78
Figure imgf000074_0002
<210> 79
<211> 37
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador
<400> 79
ataattgaat tcccaggcat caaataaaac gaaaggc 37
<210> 80
<211> 37
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador
<400> 80
cgaattgggt acctataaac gcagaaaggc ccacccg 37
<210> 81
<211> 33
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador
<400> 81
aatcatttaa ttaaacggct cgcgtggctt aag 33 <210> 82
<211> 34
<212>ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador
<400> 82
aattaagaat tcttactggc gattgtcatt cgcc 34 <210> 83
<211> 19
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador
<400> 83
tttggcctcg cgtcgtgca 19 <210> 84
<211> 19
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador
<400> 84
atagatgcct cgcgctccg 19 <210> 85
<211> 24
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador
<400> 85
tgcagcgttt tcagagtgaa agcc 24 <210> 86
<211> 22
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador
<400> 86
cgtaatcgcc gaaccagtgc tc 22 <210> 87
<211> 43
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador
<400> 87
ttaattaaag gagaaaaaat gaattatcag aacgacgatt tac 43 <210> 88
<211> 25
<212>ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador
<400> 88
gaattcttac ccgcgacgcg ctttt 25 <210> 89
<211> 34
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador
<400> 89
aattaattaa ttaagactct cgcaatatct tatg 34 <210> 90
<211> 33
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador
<400> 90
aattaagaat tcttagttgc tttccagcat gtg 33 <210> 91
<211> 43
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador
<400> 91
ttaattaagg agaaaaaaat gaccgtcttt aagcatattg cca 43 <210> 92
<211> 34
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador
<400> 92
gaattcttaa gggtgaatat cgtggtctgt tttt 34 <210> 93
<211> 25
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador
<400> 93
aatatgatca ccccacaata tctcg 25 <210> 94
<211> 19
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador
<400> 94
gagaaactca cctgccgct 19 <210> 95
<211> 29
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador
<400> 95
aattaaacta gtctgatggc tagctcagt 29 <210> 96
<211> 42
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador
<400> 96
attaatgagc tcataatttc tagatataaa cgcagaaagg cc 42 <210> 97
<211> 28
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador
<400> 97
agtcttttgt gcaaccatta tcaccgcc 28 <210> 98
<211> 32
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador
<400> 98
tccagacgca ttttctgttg ggccattgca tt 32 <210> 99
<211> 30
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador
<400> 99
tattccgcat tggcaaccat tatcaccgcc 30 <210> 100
<211> 30
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador
<400> 100
ttgttcgttc attttctgtt gggccattgc 30 <210> 101
<211> 30
<212>ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador
<400> 101
actcgtcgag ttgcaaccat tatcaccgcc 30 <210> 102
<211> 30
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador
<400> 102
cagaatcagc attttctgtt gggccattgc 30 <210> 103
<211> 30
<212>ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador
<400> 103
aatccaacgc aggcaaccat tatcaccgcc 30 <210> 104
<211> 30
<212>ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador
<400> 104
gatgtttttc attttctgtt gggccattgc 30 <210> 105
<211> 35
<212>ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador
<400> 105
taatttacta gtatggctga agcgcaaaat gatcc 35 <210> 106
<211> 30
<212>ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador
<400> 106
aattaaacta gttaacaccg tgcgtgttga 30 <210> 107
<211> 32
<212>ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> AATTAAGCTA GCTATAAACG CAGAAAGGCC CA <400> 107
aattaagcta gctataaacg cagaaaggcc ca 32 <210> 108
<211> 29
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador
<400> 108
atccaacgca ggcaaccatt atcaccgcc 29 <210> 109
<211> 28
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador
<400> 109
tccaacgcag gcaaccatta tcaccgcc 28 <210> 110
<211> 43
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador
<400> 110
aattattaat taaacaattc tcaaaatcag aagagtattg cta 43 <210> 111
<211> 31
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador
<400> 111
aattactcga gcagcatctg atcgtcgaag g 31 <210> 112
<211> 43
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador
<400> 112
aattattaat taataattgt tcttttttca ggtgaaggtt ccc 43 <210> 113
<211> 34
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador
<400> 113
aattactcga gaccgcgtaa atcaatgcct ctta 34
<210> 114
<211> 40
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador
<400> 114
aattattaat taactctttt aatctttcaa ggagcaaaga 40
<210> 115
<211> 32
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador
<400> 115
aattactcga gacgctggta gatctcttca cg 32
<210> 116
<211> 37
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador
<400> 116
aattattaat taaataagat ggggtgtctg gggtaat 37
<210> 117
<211> 31
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador
<400> 117
aattactcga gatcattgcc agcgcgtgaa g 31
<210> 118
<211> 90
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador
<400> 118
Figure imgf000080_0001
<210> 119
<211> 89
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador
<400> 119
Figure imgf000081_0001
<210> 120
<211> 48
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador
<400> 120
ttaattaaag gagaaagatt atgagaaact atcctgcaga accttata 48
<210> 121
<211> 53
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador
<400> 121
gaattcttaa tggtgatgat ggtgatgcgc ttacgctttc ggttcaaaac gcg 53
<210> 122
<211> 30
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador
<400> 122
cattaactag ttggtgcaaa acctttcgcg 30
<210> 123
<211> 30
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador
<400> 123
aaagcaaaac tcgcaaccat tatcaccgcc 30
<210> 124
<211> 34
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador
<400> 124
tgtatcagcc attttctgtt gggccattgc attg 34
<210> 125
<211> 30
<212>ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador
<400> 125
acaggccacc atgcaaccat tatcaccgcc 30 <210> 126
<211> 33
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador
<400> 126
ttacgcgtca ttttctgttg ggccattgca ttg 33 <210> 127
<211> 30
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador
<400> 127
aatttgcgcg acgcaaccat tatcaccgcc 30 <210> 128
<211> 34
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador
<400> 128
acgatctgcc actttctgtt gggccattgc attg 34 <210> 129
<211> 30
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador
<400> 129
aacccttagc cagcaaccat tatcaccgcc 30 <210> 130
<211> 33
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador
<400> 130
acgctaatca ttttctgttg ggccattgca ttg 33 <210> 131
<211> 30
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador
<400> 131
aagttcggcg gtgcaaccat tatcaccgcc 30 <210> 132
<211> 34
<212>ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador
<400> 132
caacactcgc attttctgtt gggccattgc attg 34 <210> 133
<211> 30
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador
<400> 133
tatgccccgg ctgcaaccat tatcaccgcc 30 <210> 134
<211> 34
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador
<400> 134
aactttaacc attttctgtt gggccattgc attg 34 <210> 135
<211> 30
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador
<400> 135
aatctgaaag atgcaaccat tatcaccgcc 30 <210> 136
<211> 34
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador
<400> 136
gtagagtttc attttctgtt gggccattgc attg 34 <210> 137
<211> 30
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador
<400> 137
agcaccacca ttgcaaccat tatcaccgcc 30
<210> 138
<211> 34
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador
<400> 138
aatgcgtttc attttctgtt gggccattgc attg 34
<210> 139
<211> 227
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> SgrS
<400> 139
Figure imgf000084_0001
<210> 140
<211> 115
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> MicC
<400> 140
Figure imgf000084_0002
<210> 141
<211> 93
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> MicF
<400> 141
Figure imgf000084_0003
<210> 142
<211> 60
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Fragmento de ARNm de DsRed2
<400> 142
Figure imgf000085_0001
<210> 143
<211> 38
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Anti-DsRed2
<400> 143
atgacgttct cactgctcgc catatatttg tcctcctt 38
<210> 144
<211> 86
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Fragmento de ARNm de DsRed2
<400> 144
Figure imgf000085_0002
<210> 145
<211> 28
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Fragmento de ARNm de DsRed2
<400> 145
ccgacatccc cgactacaag aagctgtc 28
<210> 146
<211> 38
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> region A de emparejamiento de bases
<400> 146
atgacgttct cactgctcgc catatatttg tcctcctt 38
<210> 147
<211> 32
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> region B1 de emparejamiento de bases
<400> 147
atgacgttct cactgctcgc catatatttg tc 32
<210> 148
<211> 38
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> region B2 de emparejamiento de bases
<400> 148
tcggtgatga cgttctcact gctcgccata tatttgtc 38 <210> 149
<211> 20
<212>ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> region C1 de emparejamiento de bases
<400> 149
atgacgttct cactgctcgc 20 <210> 150
<211> 38
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> region C2 de emparejamiento de bases
<400> 150
aagcgcatga actcggtgat gacgttctca ctgctcgc 38 <210> 151
<211> 19
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> region D1 de emparejamiento de bases
<400> 151
aactcggtga tgacgttct 19 <210> 152
<211> 37
<212>ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> region D2 de emparejamiento de bases
<400> 152
cgcaccttga agcgcatgaa ctcggtgatg acgttct 37 <210> 153
<211> 19
<212>ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> region E1 de emparejamiento de bases
<400> 153
aagcgcatga actcggtga 19 <210> 154
<211> 37
<212>ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> region E2 de emparejamiento de bases <400> 154
ccctccatgc gcaccttgaa gcgcatgaac tcggtga 37
<210> 155
<211> 19
<212>ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> GCGCACCTTGAAGCGCATG
<400> 155
gcgcaccttg aagcgcatg 19
<210> 156
<211> 37
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> region F2 de emparejamiento de bases
<400> 156
gttcacggtg ccctccatgc gcaccttgaa gcgcatg 37
<210> 157
<211> 24
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> region G1 de emparejamiento de bases
<400> 157
gcttcttgta gtcggggatg tcgg 24
<210> 158
<211> 23
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> region G2 de emparejamiento de bases
<400> 158
gacagcttct tgtagtcggg gat 23
<210> 159
<211> 55
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> ARNm de AraC
<400> 159
ttaattaaaa ggagaaaaac ggatggctga agcgcaaaat gatcccctgc tgccg 55 <210> 160
<211> 36
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Anti-AraC
<400> 160
gatcattttg cgcttcagcc atccgttttt ctcctt 36
<210> 161
<211> 55
<212>ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> ARNm de LuxR
<400> 161
ttaattaaaa ggagcaatca aaatgaacat caagaacatc aacgcgaacg agaag 55 <210> 162
<211> 36
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Anti-LuxR
<400> 162
cgttgatgtt cttgatgttc attttgattg ctcctt 36
<210> 163
<211> 55
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> ARNm de KanR
<400> 163
ttttaattaa ggagtcgttt acatgattga acaagatgga ttgcacgcag gttct 55
<210> 164
<211> 36
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Anti-KanR
<400> 164
gcaatccatc ttgttcaatc atgtaaacga ctcctt 36
<210> 165
<211> 24
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> ARNm de pgi
<400> 165
atgaaaaaca tcaatccaac gcag 24
<210> 166
<211> 24
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> ARNs (anti-pgi)
<400> 166
ctgcgttgga ttgatgtttt tcat 24
<210> 167
<211> 23
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> ARNs (anti-pgi-DI)
<400> 167
ctgcgttgga tgatgttttt cat 23 <210> 168
<211> 22
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> ARNs (anti-pgi-D2)
<400> 168
ctgcgttgga gatgtttttc at 22 <210> 169
<211> 35
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Variantes de anti-dsRed2
<220>
<221 > misc_feature
<222> (1)..(16)
<223> A, T, C o G
<400> 169
nnnnnnnnnn nnnnnngcaa ccattatcac cgcca 35 <210> 170
<211> 35
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Variantes de anti-dsRed2
<220>
<221 > misc-feature
<222> (1)..(16)
<223> A, T, C o G
<400> 170
nnnnnnnnnn nnnnnngcaa ccattatcac cgcca 35 <210> 171
<211> 33
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador directo de anti-LacZ
<400> 171
atgatgcaac cattatcacc gccagaggta aaa 33 <210> 172
<211> 32
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador inverso de anti-LacZ
<400> 172
ggtcattttc tgttgggcca ttgcattgcc ac 32 <210> 173
<211> 34
<212>ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador directo de anti-LacZ
<400> 173
atgattgcaa ccattatcac cgccagaggt aaaa 34 <210> 174
<211> 32
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador inverso de anti-LacZ
<400> 174
ggtcattttc tgttgggcca ttgcattgcc ac 32 <210> 175
<211> 34
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador directo de anti-LacZ
<400> 175
tgattagcaa ccattatcac cgccagaggt aaaa 34 <210> 176
<211> 33
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador inverso de anti-LacZ
<400> 176
tggtcatttt ctgttgggcc attgcattgc cac 33 <210> 177
<211> 35
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador directo de anti-LacZ
<400> 177
tgattacgca accattatca ccgccagagg taaaa 35 <210> 178
<211> 33
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador inverso de anti-LacZ
<400> 178
tggtcatttt ctgttgggcc attgcattgc cac 33 <210> 179
<211> 35
<212>ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador directo de anti-LacZ
<400> 179
gattacggca accattatca ccgccagagg taaaa 35 <210> 180
<211> 34
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador inverso de anti-LacZ
<400> 180
atggtcattt tctgttgggc cattgcattg ccac 34 <210> 181
<211> 36
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador directo de anti-LacZ
<400> 181
gattacgggc aaccattatc accgccagag gtaaaa 36 <210> 182
<211> 34
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador inverso de anti-LacZ
<400> 182
atggtcattt tctgttgggc cattgcattg ccac 34 <210> 183
<211> 36
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador directo de anti-LacZ
<400> 183
attacggagc aaccattatc accgccagag gtaaaa 36 <210> 184
<211> 35
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador inverso de anti-LacZ
<400> 184
catggtcatt ttctgttggg ccattgcatt gccac 35 <210> 185
<211> 37
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador directo de anti-LacZ
<400> 185
ttacggattg caaccattat caccgccaga ggtaaaa 37 <210> 186
<211> 36
<212>ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador inverso de anti-LacZ
<400> 186
tcatggtcat tttctgttgg gccattgcat tgccac 36 <210> 187
<211> 38
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador directo de anti-LacZ
<400> 187
ttacggattc gcaaccatta tcaccgccag aggtaaaa 38 <210> 188
<211> 36
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador inverso de anti-LacZ
<400> 188
tcatggtcat tttctgttgg gccattgcat tgccac 36 <210> 189
<211> 38
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador directo de anti-LacZ
<400> 189
tacggattca gcaaccatta tcaccgccag aggtaaaa 38 <210> 190
<211> 37
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador inverso de anti-LacZ
<400> 190
atcatggtca ttttctgttg ggccattgca ttgccac 37 <210> 191
<211> 39
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador directo de anti-LacZ
<400> 191
tacggattca cgcaaccatt atcaccgcca gaggtaaaa 39 <210> 192
<211> 37
<212>ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador inverso de anti-LacZ
<400> 192
atcatggtca ttttctgttg ggccattgca ttgccac 37 <210> 193
<211> 40
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador directo de anti-LacZ
<400> 193
acggattcac tggcaaccat tatcaccgcc agaggtaaaa 40 <210> 194
<211> 38
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador inverso de anti-LacZ
<400> 194
aatcatggtc attttctgtt gggccattgc attgccac 38 <210> 195
<211> 42
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador directo de anti-LacZ
<400> 195
ggattcactg gccggcaacc attatcaccg ccagaggtaa aa 42 <210> 196
<211> 40
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador inverso de anti-LacZ
<400> 196
gtaatcatgg tcattttctg ttgggccatt gcattgccac 40 <210> 197
<211> 30
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador Rmo
<400> 197
aattaaagat cttaacaccg tgcgtgttga 30 <210> 198
<211> 26
<212>ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador Rmo
<400> 198
gagctctata aacgcagaaa ggccca 26 <210> 199
<211> 24
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador Rmo
<400> 199
actagttaac accgtgcgtg ttga 24 <210> 200
<211> 26
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador Rmo
<400> 200
ggatcctata aacgcagaaa ggccca 26 <210> 201
<211> 24
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador Rmo
<400> 201
gcatgctaac accgtgcgtg ttga 24 <210> 202
<211> 26
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador Rmo
<400> 202
gtcgactata aacgcagaaa ggccca 26 <210> 203
<211> 28
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador pWAS-anti-csrA
<400> 203
ttcctcgtcg gcaaccatta tcaccgcc 28 <210> 204
<211> 28
<212>ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador pWAS-anti-csrA
<400> 204
gaatcagcat tttctgttgg gccattgc 28 <210> 205
<211> 29
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador pWAS-anti-csrA
<400> 205
gactcgtcga ggcaaccatt atcaccgcc 29 <210> 206
<211> 29
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador pWAS-anti-csrA
<400> 206
agaatcagca ttttctgttg ggccattgc 29 <210> 207
<211> 27
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador pWAS-anti-csrA
<400> 207
taactcgtcg gcaaccatta tcaccgc 27 <210> 208
<211> 28
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador pWAS-anti-csrA
<400> 208
gaatcagcat tttctgttgg gccattgc 28 <210> 209
<211> 33
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador pWAS-anti-csrA
<400> 209
tcgtcgagtt ggtgggcaac cattatcacc gcc 33 <210> 210
<211> 31
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador pWAS-anti-csrA
<400> 210
tcagaatcag cattttctgt tgggccattg c 31 <210> 211
<211> 33
<212>ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador pWAS-anti-csrA
<400> 211
ccgtcgagtt ggtgggcaac cattatcacc gcc 33 <210> 212
<211> 31
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador pWAS-anti-csrA
<400> 212
tcagaatcag cattttctgt tgggccattg c 31 <210> 213
<211> 33
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador pWAS-anti-csrA
<400> 213
agtcgagttg gtgaggcaac cattatcacc gcc 33 <210> 214
<211> 33
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador pWAS-anti-csrA
<400> 214
cgtcagaatc agcattttct gttgggccat tgc 33 <210> 215
<211> 33
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador pWAS-anti-csrA
<400> 215
gtcgagttgg tgagggcaac cattatcacc gcc 33 <210> 216
<211> 33
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador pWAS-anti-csrA
<400> 216
agtcagaatc agcattttct gttgggccat tgc 33 <210> 217
<211> 32
<212>ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador pWAS-anti-csrA
<400> 217
tcgagttggt gagggcaacc attatcaccg cc 32 <210> 218
<211> 34
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador pWAS-anti-csrA
<400> 218
cggtcagaat cagcattttc tgttgggcca ttgc 34 <210> 219
<211> 30
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador directo de anti-accA
<400> 219
ttccttgatt ttgcaaccat tatcaccgcc 30 <210> 220
<211> 34
<212>ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador inverso de anti-accA
<400> 220
attcagactc attttctgtt gggccattgc attg 34 <210> 221
<211> 30
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador directo de anti-accB
<400> 221
aagattaaaa aagcaaccat tatcaccgcc 30 <210> 222
<211> 34
<212>ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador inverso de anti-accB
<400> 222
acgaatatcc attttctgtt gggccattgc attg 34 <210> 223
<211> 30
<212>ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador directo de anti-accC
<400> 223
attgttattg ccgcaaccat tatcaccgcc 30 <210> 224
<211> 34
<212>ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador inverso de anti-accC
<400> 224
tttatccagc attttctgtt gggccattgc attg 34 <210> 225
<211> 30
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador directo de anti-accD
<400> 225
gaacgaatta aagcaaccat tatcaccgcc 30 <210> 226
<211> 34
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador inverso de anti-accD
<400> 226
aatccagctc attttctgtt gggccattgc attg 34 <210> 227
<211> 30
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador directo de anti-accE
<400> 227
ttcccaaatg acgcaaccat tatcaccgcc 30 <210> 228
<211> 34
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador inverso de anti-accE
<400> 228
acgttctgac attttctgtt gggccattgc attg 34 <210> 229
<211> 30
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador directo de anti-accF
<400> 229
atcaaagtac cggcaaccat tatcaccgcc 30 <210> 230
<211> 34
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador inverso de anti-accF
<400> 230
ttcgatagcc attttctgtt gggccattgc attg 34 <210> 231
<211> 30
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador directo de anti-ackA
<400> 231
gcaacgttag tcgcaaccat tatcaccgcc 30 <210> 232
<211> 38
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador inverso de anti-ackA
<400> 232
tccccggaac attcattttc tgttgggcca ttgcattg 38 <210> 233
<211> 30
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador directo de anti-adiY
<400> 233
agcgaccaac ctgcaaccat tatcaccgcc 30 <210> 234
<211> 34
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador inverso de anti-adiY
<400> 234
gcaaatcctc attttctgtt gggccattgc attg 34 <210> 235
<211> 30
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador directo de anti-argB
<400> 235
attatcaaac tggcaaccat tatcaccgcc 30 <210> 236
<211> 34
<212>ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador inverso de anti-argB
<400> 236
taatggattc attttctgtt gggccattgc attg 34 <210> 237
<211> 30
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador directo de anti-argC
<400> 237
ctgattgtgg gtgcaaccat tatcaccgcc 30 <210> 238
<211> 34
<212>ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador inverso de anti-argC
<400> 238
cgtattcaac attttctgtt gggccattgc attg 34 <210> 239
<211> 30
<212>ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador directo de anti-argG
<400> 239
ctcaagcatc tcgcaaccat tatcaccgcc 30 <210> 240
<211> 34
<212>ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador inverso de anti-argG
<400> 240
aatcgtcgtc attttctgtt gggccattgc attg 34 <210> 241
<211> 30
<212>ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador directo de anti-argH
<400> 241
ggcgggcgtt ttgcaaccat tatcaccgcc 30 <210> 242
<211> 34
<212>ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador inverso de anti-argH
<400> 242
ccaaagtgcc attttctgtt gggccattgc attg 34 <210> 243
<211> 30
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador directo de anti-asnC
<400> 243
ctgatcgaca atgcaaccat tatcaccgcc 30 <210> 244
<211> 34
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador inverso de anti-asnC
<400> 244
ataattttcc attttctgtt gggccattgc attg 34 <210> 245
<211> 30
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador directo de anti-aspA
<400> 245
attcgtatcg aagcaaccat tatcaccgcc 30 <210> 246
<211> 34
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador inverso de anti-aspA
<400> 246
gttgtttgac attttctgtt gggccattgc attg 34 <210> 247
<211> 30
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador directo de anti-crp
<400> 247
aaaccgcaaa cagcaaccat tatcaccgcc 30 <210> 248
<211> 34
<212>ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador inverso de anti-crp
<400> 248
gccaagcacc attttctgtt gggccattgc attg 34 <210> 249
<211> 30
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador directo de anti-csiD
<400> 249
accgccgtac aagcaaccat tatcaccgcc 30 <210> 250
<211> 34
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador inverso de anti-csiD
<400> 250
cagtgcattc attttctgtt gggccattgc attg 34 <210> 251
<211> 30
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador directo de anti-csiR
<400> 251
tctctggatg gcgcaaccat tatcaccgcc 30 <210> 252
<211> 34
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador inverso de anti-csiR
<400> 252
cgtaatggtc attttctgtt gggccattgc attg 34 <210> 253
<211> 30
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador directo de anti-cytR
<400> 253
aagcaggaaa ctgcaaccat tatcaccgcc 30 <210> 254
<211> 34
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador inverso de anti-cytR
<400> 254
cttcgctttc actttctgtt gggccattgc attg 34 <210> 255
<211> 30
<212>ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador directo de anti-dcuA
<400> 255
gaactcatca tagcaaccat tatcaccgcc 30 <210> 256
<211> 34
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador inverso de anti-dcuA
<400> 256
tacaactagc attttctgtt gggccattgc attg 34 <210> 257
<211> 30
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador directo de anti-deoB
<400> 257
tttattatgg tggcaaccat tatcaccgcc 30 <210> 258
<211> 34
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador inverso de anti-deoB
<400> 258
tgcacgtttc attttctgtt gggccattgc attg 34 <210> 259
<211> 30
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador directo de anti-deoC
<400> 259
aaagcaagca gcgcaaccat tatcaccgcc 30 <210> 260
<211> 34
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador inverso de anti-deoC
<400> 260
cagatcagtc attttctgtt gggccattgc attg 34 <210> 261
<211> 30
<212>ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador directo de anti-deoR
<400> 261
cgcgaagagc gtgcaaccat tatcaccgcc 30 <210> 262
<211> 34
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador inverso de anti-deoR
<400> 262
acgtgtttcc attttctgtt gggccattgc attg 34 <210> 263
<211> 37
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador directo de anti-fabH
<400> 263
taatggagct gtcattttct gttgggccat tgcattg 37 <210> 264
<211> 36
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador inverso de anti-fabH
<400> 264
accctattga tcgttgcaac cattatcacc gccaga 36 <210> 265
<211> 30
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador directo de anti-fadD
<400> 265
tggcttaacc gtgcaaccat tatcaccgcc 30 <210> 266
<211> 34
<212>ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador inverso de anti-fadD
<400> 266
aaccttcttc aatttctgtt gggccattgc attg 34 <210> 267
<211> 30
<212>ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador directo de anti-fadR
<400> 267
gcgcaaagcc cggcaaccat tatcaccgcc 30 <210> 268
<211> 34
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador inverso de anti-fadR
<400> 268
cttaatgacc attttctgtt gggccattgc attg 34 <210> 269
<211> 30
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador directo de anti-fbp
<400> 269
ggtgaattta ttgcaaccat tatcaccgcc 30 <210> 270
<211> 34
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador inverso de anti-fbp
<400> 270
taacgttttc attttctgtt gggccattgc attg 34 <210> 271
<211> 30
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador directo de anti-fnr
<400> 271
aagcgaatta tagcaaccat tatcaccgcc 30 <210> 272
<211> 34
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador inverso de anti-fnr
<400> 272
ttccgggatc attttctgtt gggccattgc attg 34 <210> 273
<211> 30
<212>ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador directo de anti-fruR
<400> 273
gaaatcgctc gggcaaccat tatcaccgcc 30 <210> 274
<211> 34
<212>ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador inverso de anti-fruR
<400> 274
atccagtttc actttctgtt gggccattgc attg 34 <210> 275
<211> 30
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador directo de anti-ftsL
<400> 275
gtgacagaag ctgcaaccat tatcaccgcc 30 <210> 276
<211> 34
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador inverso de anti-ftsL
<400> 276
tctgctgatc attttctgtt gggccattgc attg 34 <210> 277
<211> 30
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador directo de anti-ftsQ
<400> 277
gctctgaaca cggcaaccat tatcaccgcc 30 <210> 278
<211> 34
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador inverso de anti-ftsQ
<400> 278
agcctgcgac attttctgtt gggccattgc attg 34 <210> 279
<211> 30
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador directo de anti-ftsW
<400> 279
ctccctcgcc tggcaaccat tatcaccgcc 30 <210> 280
<211> 34
<212>ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador inverso de anti-ftsW
<400> 280
agataaacgc attttctgtt gggccattgc attg 34 <210> 281
<211> 30
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador directo de anti-ftsZ
<400> 281
atggaactta ccgcaaccat tatcaccgcc 30 <210> 282
<211> 34
<212>ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador inverso de anti-ftsZ
<400> 282
tggttcaaac attttctgtt gggccattgc attg 34 <210> 283
<211> 30
<212>ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador directo de anti-fur
<400> 283
aataccgccc tagcaaccat tatcaccgcc 30 <210> 284
<211> 34
<212>ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador inverso de anti-fur
<400> 284
gttatcagtc attttctgtt gggccattgc attg 34 <210> 285
<211> 30
<212>ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador directo de anti-gabD
<400> 285
gacagtaact tagcaaccat tatcaccgcc 30 <210> 286
<211> 34
<212>ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador inverso de anti-gabD
<400> 286
gttaagtttc attttctgtt gggccattgc attg 34 <210> 287
<211> 30
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador directo de anti-gabP
<400> 287
tcgcaaccac atgcaaccat tatcaccgcc 30 <210> 288
<211> 34
<212>ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador inverso de anti-gabP
<400> 288
tgattgcccc attttctgtt gggccattgc attg 34 <210> 289
<211> 30
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador directo de anti-gabT
<400> 289
aaagagttaa tggcaaccat tatcaccgcc 30 <210> 290
<211> 34
<212>ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador inverso de anti-gabT
<400> 290
attgctgttc attttctgtt gggccattgc attg 34 <210> 291
<211> 30
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador directo de anti-gadA
<400> 291
ctgttaacgg atgcaaccat tatcaccgcc 30 <210> 292
<211> 34
<212>ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador inverso de anti-gadA
<400> 292
cttctggtcc attttctgtt gggccattgc attg 34 <210> 293
<211> 30
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador directo de anti-gadB
<400> 293
caagtaacgg atgcaaccat tatcaccgcc 30 <210> 294
<211> 34
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador inverso de anti-gadB
<400> 294
cttcttatcc attttctgtt gggccattgc attg 34 <210> 295
<211> 30
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador directo de anti-gadC
<400> 295
gtacagacag gtgcaaccat tatcaccgcc 30 <210> 296
<211> 34
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador inverso de anti-gadC
<400> 296
tgatgtagcc attttctgtt gggccattgc attg 34 <210> 297
<211> 37
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador directo de anti-gIcC
<400> 297
acgttcatct ttcattttct gttgggccat tgcattg 37 <210> 298
<211> 36
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador inverso de anti-gIcC
<400> 298
cgccctattt gcgaagcaac cattatcacc gccaga 36 <210> 299
<211> 30
<212>ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador directo de anti-gIpK
<400> 299
aaatatatcg ttgcaaccat tatcaccgcc 30 <210> 300
<211> 34
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador inverso de anti-gIpK
<400> 300
tttttcagtc attttctgtt gggccattgc attg 34 <210> 301
<211> 30
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador directo de anti-gIpR
<400> 301
caacgtcaca acgcaaccat tatcaccgcc 30 <210> 302
<211> 34
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador inverso de anti-gIpR
<400> 302
tgtttgtttc attttctgtt gggccattgc attg 34 <210> 303
<211> 30
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador directo de anti-gIpX
<400> 303
cttgccatcg aagcaaccat tatcaccgcc 30 <210> 304
<211> 34
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador inverso de anti-gIpX
<400> 304
ttctcgtctc attttctgtt gggccattgc attg 34 <210> 305
<211> 30
<212>ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador directo de anti-gItA
<400> 305
aaagcaaaac tcgcaaccat tatcaccgcc 30 <210> 306
<211> 34
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador inverso de anti-gItA
<400> 306
tgtatcagcc attttctgtt gggccattgc attg 34 <210> 307
<211> 30
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador directo de anti-hfld
<400> 307
tactatgaca tcgcaaccat tatcaccgcc 30 <210> 308
<211> 34
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador inverso de anti-hfld
<400> 308
attctttgcc actttctgtt gggccattgc attg 34 <210> 309
<211> 37
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador directo de anti-ihfa
<400> 309
ttttgtaagc gccattttct gttgggccat tgcattg 37 <210> 310
<211> 36
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador inverso de anti-ihfa
<400> 310
gctgaaatgt cagaagcaac cattatcacc gccaga 36 <210> 311
<211> 37
<212>ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador directo de anti-ihfb
<400> 311
ttctgacttg gtcattttct gttgggccat tgcattg 37 <210> 312
<211> 36
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador inverso de anti-ihfb
<400> 312
ttgatagaaa gacttgcaac cattatcacc gccaga 36 <210> 313
<211> 30
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador directo de anti-ilvB
<400> 313
ggcacaacat cggcaaccat tatcaccgcc 30 <210> 314
<211> 34
<212>ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador inverso de anti-ilvB
<400> 314
cgaacttgcc attttctgtt gggccattgc attg 34 <210> 315
<211> 30
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador directo de anti-ilvC
<400> 315
ttcaatacac tggcaaccat tatcaccgcc 30 <210> 316
<211> 34
<212>ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador inverso de anti-ilvC
<400> 316
gtagttagcc attttctgtt gggccattgc attg 34 <210> 317
<211> 30
<212>ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador directo de anti-ilvD
<400> 317
cgttccgcca ccgcaaccat tatcaccgcc 30 <210> 318
<211> 34
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador inverso de anti-ilvD
<400> 318
gtacttaggc attttctgtt gggccattgc attg 34 <210> 319
<211> 30
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador directo de anti-ilvG_ 1
<400> 319
cacagtgggt gggcaaccat tatcaccgcc 30 <210> 320
<211> 32
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador inverso de anti-ilvG_ 1
<400> 320
cgccattcat tttctgttgg gccattgcat tg 32 <210> 321
<211> 30
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador directo de anti-ilvG_2
<400> 321
aacaactgtc gggcaaccat tatcaccgcc 30 <210> 322
<211> 32
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador inverso de anti-ilvG_2
<400> 322
ttaacaacaa tttctgttgg gccattgcat tg 32 <210> 323
<211> 30
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador directo de anti-ilvH
<400> 323
ttatcagtct tagcaaccat tatcaccgcc 30 <210> 324
<211> 34
<212>ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador inverso de anti-ilvH
<400> 324
tatccggcgc attttctgtt gggccattgc attg 34 <210> 325
<211> 30
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador directo de anti-ilvL
<400> 325
ctacgagtga ttgcaaccat tatcaccgcc 30 <210> 326
<211> 34
<212>ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador inverso de anti-ilvL
<400> 326
aagggctgtc attttctgtt gggccattgc attg 34 <210> 327
<211> 30
<212>ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador directo de anti-ilvM
<400> 327
caggtcaatg tagcaaccat tatcaccgcc 30 <210> 328
<211> 34
<212>ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador inverso de anti-ilvM
<400> 328
atgttgcatc attttctgtt gggccattgc attg 34 <210> 329
<211> 30
<212>ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador directo de anti-ilvN
<400> 329
actcatgaca acgcaaccat tatcaccgcc 30 <210> 330
<211> 34
<212>ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador inverso de anti-ilvN
<400> 330
tgtgttttgc attttctgtt gggccattgc attg 34 <210> 331
<211> 30
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador directo de anti-ilvX
<400> 331
acaaaattct gtgcaaccat tatcaccgcc 30 <210> 332
<211> 34
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador inverso de anti-ilvX
<400> 332
gctgttattc attttctgtt gggccattgc attg 34 <210> 333
<211> 30
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador directo de anti-lexA
<400> 333
acggccaggc aagcaaccat tatcaccgcc 30 <210> 334
<211> 34
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador inverso de anti-lexA
<400> 334
taacgctttc attttctgtt gggccattgc attg 34 <210> 335
<211> 30
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador directo de anti-lpxC
<400> 335
aggacactta aagcaaccat tatcaccgcc 30 <210> 336
<211> 34
<212>ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador inverso de anti-lpxC
<400> 336
ttgtttgatc attttctgtt gggccattgc attg 34 <210> 337
<211> 30
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador directo de anti-marA
<400> 337
gcaacgttag tcgcaaccat tatcaccgcc 30 <210> 338
<211> 34
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador inverso de anti-marA
<400> 338
tccccggaac attttctgtt gggccattgc attg 34 <210> 339
<211> 30
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador directo de anti-metJ
<400> 339
agcggcgaat atgcaaccat tatcaccgcc 30 <210> 340
<211> 34
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador inverso de anti-metJ
<400> 340
ccattcagcc attttctgtt gggccattgc attg 34 <210> 341
<211> 30
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador directo de anti-modE
<400> 341
atccttctca ccgcaaccat tatcaccgcc 30 <210> 342
<211> 34
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador inverso de anti-modE
<400> 342
ttcggcctgc attttctgtt gggccattgc attg 34 <210> 343
<211> 30
<212>ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador directo de anti-nadB
<400> 343
cctgaacatt cagcaaccat tatcaccgcc 30 <210> 344
<211> 34
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador inverso de anti-nadB
<400> 344
gagagtattc attttctgtt gggccattgc attg 34 <210> 345
<211> 36
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador directo de anti-nagC
<400> 345
ccgcctggtg tcattttctg ttgggccatt gcattg 36 <210> 346
<211> 36
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador inverso de anti-nagC
<400> 346
acaagctcag atagggcaac cattatcacc gccaga 36 <210> 347
<211> 30
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador directo de anti-narL
<400> 347
gaaccggcta ctgcaaccat tatcaccgcc 30 <210> 348
<211> 34
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador inverso de anti-narL
<400> 348
ctgattactc attttctgtt gggccattgc attg 34 <210> 349
<211> 30
<212>ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador directo de anti-pck
<400> 349
aatggtttga ccgcaaccat tatcaccgcc 30 <210> 350
<211> 34
<212>ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador inverso de anti-pck
<400> 350
gttaacgcgc attttctgtt gggccattgc attg 34 <210> 351
<211> 30
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador directo de anti-PdhR
<400> 351
aaaatccgcc aagcaaccat tatcaccgcc 30 <210> 352
<211> 34
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador inverso de anti-PdhR
<400> 352
gctgtaggcc attttctgtt gggccattgc attg 34 <210> 353
<211> 30
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador directo de anti-phoP
<400> 353
gttgttgaag acgcaaccat tatcaccgcc 30 <210> 354
<211> 34
<212>ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador inverso de anti-phoP
<400> 354
cagtacgcgc attttctgtt gggccattgc attg 34 <210> 355
<211> 30
<212>ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador directo de anti-pnuC
<400> 355
agtgtgcaga atgcaaccat tatcaccgcc 30 <210> 356
<211> 34
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador inverso de anti-pnuC
<400> 356
aaaaaaatcc attttctgtt gggccattgc attg 34 <210> 357
<211> 30
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador directo de anti-ppsA
<400> 357
ggctcgtcac cggcaaccat tatcaccgcc 30 <210> 358
<211> 34
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador inverso de anti-ppsA
<400> 358
attgttggac attttctgtt gggccattgc attg 34 <210> 359
<211> 30
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador directo de anti-purA
<400> 359
gtcgtcgtac tggcaaccat tatcaccgcc 30 <210> 360
<211> 34
<212>ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador inverso de anti-purA
<400> 360
gttgttaccc attttctgtt gggccattgc attg 34 <210> 361
<211> 30
<212>ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador directo de anti-purB
<400> 361
tcactgaccg ccgcaaccat tatcaccgcc 30 <210> 362
<211> 34
<212>ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador inverso de anti-purB
<400> 362
ggataattcc attttctgtt gggccattgc attg 34 <210> 363
<211> 30
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador directo de anti-purR
<400> 363
aaagatgtag cggcaaccat tatcaccgcc 30 <210> 364
<211> 34
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador inverso de anti-purR
<400> 364
tattgttgcc attttctgtt gggccattgc attg 34 <210> 365
<211> 30
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador directo de anti-puuE
<400> 365
gaattccatc aggcaaccat tatcaccgcc 30 <210> 366
<211> 34
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador inverso de anti-puuE
<400> 366
attgttgctc attttctgtt gggccattgc attg 34 <210> 367
<211> 30
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador directo de anti-rbsA
<400> 367
cttcagctta aagcaaccat tatcaccgcc 30 <210> 368
<211> 34
<212>ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador inverso de anti-rbsA
<400> 368
taatgcttcc attttctgtt gggccattgc attg 34 <210> 369
<211> 30
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador directo de anti-rbsB
<400> 369
aaactggcta ccgcaaccat tatcaccgcc 30 <210> 370
<211> 34
<212>ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador inverso de anti-rbsB
<400> 370
tttcatgttc attttctgtt gggccattgc attg 34 <210> 371
<211> 30
<212>ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador directo de anti-rbsD
<400> 371
accgttctta atgcaaccat tatcaccgcc 30 <210> 372
<211> 34
<212>ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador inverso de anti-rbsD
<400> 372
gccttttttc attttctgtt gggccattgc attg 34 <210> 373
<211> 30
<212>ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador directo de anti-rbsK
<400> 373
ggcagcctcg ttgcaaccat tatcaccgcc 30 <210> 374
<211> 34
<212>ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador inverso de anti-rbsK
<400> 374
tgcgttttgc attttctgtt gggccattgc attg 34 <210> 375
<211> 30
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador directo de anti-rbsR
<400> 375
aaagatgttg ccgcaaccat tatcaccgcc 30 <210> 376
<211> 34
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador inverso de anti-rbsR
<400> 376
cattgtagcc aatttctgtt gggccattgc attg 34 <210> 377
<211> 30
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador directo de anti-rcsB
<400> 377
aacgtaatta ttgcaaccat tatcaccgcc 30 <210> 378
<211> 34
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador inverso de anti-rcsB
<400> 378
catattgttc attttctgtt gggccattgc attg 34 <210> 379
<211> 30
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador directo de anti-rutR
<400> 379
gcagtgaaaa cagcaaccat tatcaccgcc 30 <210> 380
<211> 34
<212>ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador inverso de anti-rutR
<400> 380
gccttgcgtc attttctgtt gggccattgc attg 34 <210> 381
<211> 29
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador directo de anti-serA
<400> 381
tcgctggaga aagcaaccat tatcaccgc 29 <210> 382
<211> 34
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador inverso de anti-serA
<400> 382
tacctttgcc attttctgtt gggccattgc attg 34 <210> 383
<211> 30
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador directo de anti-serC
<400> 383
ttcaatttta gtgcaaccat tatcaccgcc 30 <210> 384
<211> 34
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador inverso de anti-serC
<400> 384
gatttgagcc attttctgtt gggccattgc attg 34 <210> 385
<211> 30
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador directo de anti-soxS
<400> 385
aaaattattc aggcaaccat tatcaccgcc 30 <210> 386
<211> 34
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador inverso de anti-soxS
<400> 386
ctgatgggac attttctgtt gggccattgc attg 34 <210> 387
<211> 30
<212>ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador directo de anti-sroD
<400> 387
gcgcgcggca aagcaaccat tatcaccgcc 30 <210> 388
<211> 34
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador inverso de anti-sroD
<400> 388
ttcgtcacgt aatttctgtt gggccattgc attg 34 <210> 389
<211> 30
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador directo de anti-zwf
<400> 389
caaacagccc aggcaaccat tatcaccgcc 30 <210> 390
<211> 34
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador inverso de anti-zwf
<400> 390
cgttaccgcc attttctgtt gggccattgc attg 34 <210> 391
<211> 30
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador directo de anti-asnA
<400> 391
tacattgcca aagcaaccat tatcaccgcc 30 <210> 392
<211> 34
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador inverso de anti-asnA
<400> 392
agcggttttc attttctgtt gggccattgc attg 34 <210> 393
<211> 30
<212>ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador directo de anti-asnB
<400> 393
tttggcgtat tcgcaaccat tatcaccgcc 30 <210> 394
<211> 34
<212>ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador inverso de anti-asnB
<400> 394
aattgaacac attttctgtt gggccattgc attg 34 <210> 395
<211> 30
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador directo de anti-carA
<400> 395
gcgctattgg ttgcaaccat tatcaccgcc 30 <210> 396
<211> 34
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador inverso de anti-carA
<400> 396
tgacttaatc aatttctgtt gggccattgc attg 34 <210> 397
<211> 30
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador directo de anti-carB
<400> 397
acagatataa aagcaaccat tatcaccgcc 30 <210> 398
<211> 34
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador inverso de anti-carB
<400> 398
acgttttggc attttctgtt gggccattgc attg 34 <210> 399
<211> 30
<212>ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador directo de anti-ddlB
<400> 399
atcgcggtcc tggcaaccat tatcaccgcc 30 <210> 400
<211> 34
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador inverso de anti-ddIB
<400> 400
tttatcagtc attttctgtt gggccattgc attg 34 <210> 401
<211> 30
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador directo de anti-deoA
<400> 401
caagaaatta ttgcaaccat tatcaccgcc 30 <210> 402
<211> 34
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador inverso de anti-deoA
<400> 402
tgcgagaaac aatttctgtt gggccattgc attg 34 <210> 403
<211> 30
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador directo de anti-deoD
<400> 403
cacattaatg cagcaaccat tatcaccgcc 30 <210> 404
<211> 34
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador inverso de anti-deoD
<400> 404
tggggtagcc attttctgtt gggccattgc attg 34 <210> 405
<211> 37
<212>ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador directo de anti-dpiA
<400> 405
taatggagct gtcattttct gttgggccat tgcattg 37 <210> 406
<211> 36
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador inverso de anti-dpiA
<400> 406
accctattga tcgttgcaac cattatcacc gccaga 36 <210> 407
<211> 30
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador directo de anti-fis
<400> 407
cgcgtaaatt ctgcaaccat tatcaccgcc 30 <210> 408
<211> 34
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador inverso de anti-fis
<400> 408
ttgttcgaac attttctgtt gggccattgc attg 34 <210> 409
<211> 30
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador directo de anti-gadE
<400> 409
atgacgaaag atgcaaccat tatcaccgcc 30 <210> 410
<211> 34
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador inverso de anti-gadE
<400> 410
gagaaaaatc attttctgtt gggccattgc attg 34 <210> 411
<211> 30
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador directo de anti-gadW
<400> 411
tgctcggtga tcgcaaccat tatcaccgcc 30 <210> 412
<211> 34
<212>ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador inverso de anti-gadW
<400> 412
gacatgagtc attttctgtt gggccattgc attg 34 <210> 413
<211> 30
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador directo de anti-gadX
<400> 413
catgggaatt gtgcaaccat tatcaccgcc 30 <210> 414
<211> 34
<212>ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador inverso de anti-gadX
<400> 414
tagtgattgc attttctgtt gggccattgc attg 34 <210> 415
<211> 30
<212>ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador directo de anti-glpF
<400> 415
tcaaccttga aagcaaccat tatcaccgcc 30 <210> 416
<211> 34
<212>ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador inverso de anti-glpF
<400> 416
tgtttgactc attttctgtt gggccattgc attg 34 <210> 417
<211> 30
<212>ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador directo de anti-ilvY
<400> 417
gatctgaaaa ccgcaaccat tatcaccgcc 30 <210> 418
<211> 34
<212>ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador inverso de anti-ilvY
<400> 418
gcgtaaatcc actttctgtt gggccattgc attg 34 <210> 419
<211> 30
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador directo de anti-ilvbL
<400> 419
atgctcaacg cagcaaccat tatcaccgcc 30 <210> 420
<211> 34
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador inverso de anti-ilvbL
<400> 420
ggaagtagtc attttctgtt gggccattgc attg 34 <210> 421
<211> 30
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador directo de anti-IhgO
<400> 421
gtgattattg gcgcaaccat tatcaccgcc 30 <210> 422
<211> 34
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador inverso de anti-IhgO
<400> 422
aaaatcatac attttctgtt gggccattgc attg 34 <210> 423
<211> 30
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador directo de anti-Ipd
<400> 423
atcaaaactc aggcaaccat tatcaccgcc 30 <210> 424
<211> 34
<212>ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador inverso de anti-Ipd
<400> 424
ttcagtactc attttctgtt gggccattgc attg 34 <210> 425
<211> 30
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador directo de anti-Irp
<400> 425
aagaagcgcc ctgcaaccat tatcaccgcc 30 <210> 426
<211> 34
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador inverso de anti-Irp
<400> 426
gctatctacc attttctgtt gggccattgc attg 34 <210> 427
<211> 30
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador directo de anti-metB
<400> 427
acaggccacc atgcaaccat tatcaccgcc 30 <210> 428
<211> 33
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador inverso de anti-metB
<400> 428
ttacgcgtca ttttctgttg ggccattgca ttg 33 <210> 429
<211> 30
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador directo de anti-metL
<400> 429
gcgcaggcag gggcaaccat tatcaccgcc 30 <210> 430
<211> 34
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador inverso de anti-metL
<400> 430
aatcacactc attttctgtt gggccattgc attg 34 <210> 431
<211> 30
<212>ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador directo de anti-mraY
<400> 431
ctggccgaac atgcaaccat tatcaccgcc 30 <210> 432
<211> 34
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador inverso de anti-mraY
<400> 432
ccaaactaac attttctgtt gggccattgc attg 34 <210> 433
<211> 30
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador directo de anti-mraZ
<400> 433
gcaacgttag tcgcaaccat tatcaccgcc 30 <210> 434
<211> 34
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador inverso de anti-mraZ
<400> 434
tccccggaac attttctgtt gggccattgc attg 34 <210> 435
<211> 30
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador directo de anti-murE
<400> 435
aatttgcgcg acgcaaccat tatcaccgcc 30 <210> 436
<211> 34
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador inverso de anti-murE
<400> 436
acgatctgcc actttctgtt gggccattgc attg 34 <210> 437
<211> 30
<212>ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador directo de anti-murF
<400> 437
aacccttagc cagcaaccat tatcaccgcc 30 <210> 438
<211> 33
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador inverso de anti-murF
<400> 438
acgctaatca ttttctgttg ggccattgca ttg 33 <210> 439
<211> 30
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador directo de anti-murG
<400> 439
ggaaagcgat tagcaaccat tatcaccgcc 30 <210> 440
<211> 34
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador inverso de anti-murG
<400> 440
ttgaccactc attttctgtt gggccattgc attg 34 <210> 441
<211> 30
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador directo de anti-nac
<400> 441
cgcctgaaat acgcaaccat tatcaccgcc 30 <210> 442
<211> 34
<212>ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador inverso de anti-nac
<400> 442
tctgaagttc attttctgtt gggccattgc attg 34 <210> 443
<211> 30
<212>ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador directo de anti-nadA
<400> 443
tttgatccag acgcaaccat tatcaccgcc 30 <210> 444
<211> 34
<212>ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador inverso de anti-nadA
<400> 444
cattacgctc attttctgtt gggccattgc attg 34 <210> 445
<211> 37
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador directo de anti-nsrR
<400> 445
actcgttaac tgcactttct gttgggccat tgcattg 37 <210> 446
<211> 36
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador inverso de anti-nsrR
<400> 446
ttcactgatt acggagcaac cattatcacc gccaga 36 <210> 447
<211> 30
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador directo de anti-panC
<400> 447
gaaaccctgc cggcaaccat tatcaccgcc 30 <210> 448
<211> 34
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador inverso de anti-panC
<400> 448
gataattaac actttctgtt gggccattgc attg 34 <210> 449
<211> 30
<212>ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador directo de anti-panD
<400> 449
atgctgcagg gcgcaaccat tatcaccgcc 30 <210> 450
<211> 34
<212>ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador inverso de anti-panD
<400> 450
cgtgcgaatc attttctgtt gggccattgc attg 34 <210> 451
<211> 30
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador directo de anti-pgI
<400> 451
gtttatatcg ccgcaaccat tatcaccgcc 30 <210> 452
<211> 34
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador inverso de anti-pgI
<400> 452
tgtttgcttc attttctgtt gggccattgc attg 34 <210> 453
<211> 30
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador directo de anti-pyrB
<400> 453
ctatatcaga aagcaaccat tatcaccgcc 30 <210> 454
<211> 34
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador inverso de anti-pyrB
<400> 454
cggattagcc attttctgtt gggccattgc attg 34 <210> 455
<211> 30
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador directo de anti-pyrC
<400> 455
tcccaggtat tagcaaccat tatcaccgcc 30 <210> 456
<211> 34
<212>ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador inverso de anti-pyrC
<400> 456
tggtgcagtc attttctgtt gggccattgc attg 34 <210> 457
<211> 30
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador directo de anti-pyrI
<400> 457
aataaattgc aggcaaccat tatcaccgcc 30 <210> 458
<211> 34
<212>ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador inverso de anti-pyrI
<400> 458
atcgtgtgtc attttctgtt gggccattgc attg 34 <210> 459
<211> 30
<212>ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador directo de anti-rob
<400> 459
ggcattattc gcgcaaccat tatcaccgcc 30 <210> 460
<211> 34
<212>ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador inverso de anti-rob
<400> 460
ggcctgatcc attttctgtt gggccattgc attg 34 <210> 461
<211> 30
<212>ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador directo de anti-rpe
<400> 461
ttgattgccc ccgcaaccat tatcaccgcc 30 <210> 462
<211> 34
<212>ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador inverso de anti-rpe
<400> 462
atactgtttc attttctgtt gggccattgc attg 34 <210> 463
<211> 30
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador directo de anti-talA
<400> 463
gacggcatca aagcaaccat tatcaccgcc 30 <210> 464
<211> 34
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador inverso de anti-talA
<400> 464
taactcgttc attttctgtt gggccattgc attg 34 <210> 465
<211> 30
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador directo de anti-talB
<400> 465
ttgacctccc ttgcaaccat tatcaccgcc 30 <210> 466
<211> 34
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador inverso de anti-talB
<400> 466
tttgtccgtc attttctgtt gggccattgc attg 34 <210> 467
<211> 30
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador directo de anti-thrA
<400> 467
aagttcggcg gtgcaaccat tatcaccgcc 30 <210> 468
<211> 34
<212>ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador inverso de anti-thrA
<400> 468
caacactcgc attttctgtt gggccattgc attg 34 <210> 469
<211> 30
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador directo de anti-thrC
<400> 469
aatctgaaag atgcaaccat tatcaccgcc 30 <210> 470
<211> 34
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador inverso de anti-thrC
<400> 470
gtagagtttc attttctgtt gggccattgc attg 34 <210> 471
<211> 30
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador directo de anti-thrL
<400> 471
agcaccacca ttgcaaccat tatcaccgcc 30 <210> 472
<211> 34
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador inverso de anti-thrL
<400> 472
aatgcgtttc attttctgtt gggccattgc attg 34 <210> 473
<211> 30
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador directo de anti-tktA
<400> 473
aaagagcttg ccgcaaccat tatcaccgcc 30 <210> 474
<211> 34
<212>ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador inverso de anti-tktA
<400> 474
acgtgaggac attttctgtt gggccattgc attg 34 <210> 475
<211> 30
<212>ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador directo de anti-tktB
<400> 475
gaccttgcca atgcaaccat tatcaccgcc 30 <210> 476
<211> 34
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador inverso de anti-tktB
<400> 476
ttttcgggac attttctgtt gggccattgc attg 34 <210> 477
<211> 30
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador directo de anti-torR
<400> 477
attgttattg ttgcaaccat tatcaccgcc 30 <210> 478
<211> 34
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador inverso de anti-torR
<400> 478
gtgatgtggc attttctgtt gggccattgc attg 34 <210> 479
<211> 24
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador directo de anti-murE
<400> 479
gatcgtgcaa ccattatcac cgcc 24 <210> 480
<211> 28
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador inverso de anti-murE
<400> 480
tgccactttc tgttgggcca ttgcattg 28 <210> 481
<211> 25
<212>ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador directo de anti-murE
<400> 481
gtcgtaagca accattatca ccgcc 25 <210> 482
<211> 29
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador inverso de anti-murE
<400> 482
ctgccacttt ctgttgggcc attgcattg 29 <210> 483
<211> 26
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador directo de anti-murE
<400> 483
tcgtaattgc aaccattatc accgcc 26 <210> 484
<211> 30
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador inverso de anti-murE
<400> 484
tctgccactt tctgttgggc cattgcattg 30 <210> 485
<211> 29
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador directo de anti-murE
<400> 485
taatttgcgc ggcaaccatt atcaccgcc 29 <210> 486
<211> 33
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador inverso de anti-murE
<400> 486
cgatctgcca ctttctgttg ggccattgca ttg 33 <210> 487
<211> 31
<212>ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador directo de anti-murE
<400> 487
atttgcgcga cctgcaacca ttatcaccgc c 31 <210> 488
<211> 35
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador inverso de anti-murE
<400> 488
tacgatctgc cactttctgt tgggccattg cattg 35 <210> 489
<211> 32
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador directo de anti-murE
<400> 489
tttgcgcgac cttcgcaacc attatcaccg cc 32 <210> 490
<211> 36
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador inverso de anti-murE
<400> 490
ttacgatctg ccactttctg ttgggccatt gcattg 36 <210> 491
<211> 33
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador directo de anti-murE
<400> 491
ttgcgcgacc ttcttgcaac cattatcacc gcc 33 <210> 492
<211> 37
<212>ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador inverso de anti-murE
<400> 492
attacgatct gccactttct gttgggccat tgcattg 37

Claims (1)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Un ARNs para inhibir la expresion genica en procariotas, comprendiendo el ARNs:
    (i) un sitio de union a Hfq del ARNs de MicC; y
    (ii) una region que empareja sus bases con el ARNm del gen diana
    en el que la region que empareja sus bases con el ARNm del gen diana se construye de forma que la energfa de union al ARNm del gen diana este en el intervalo de -20 kcal/mol a -40 kcal/mol; y
    en el que la region que empareja sus bases con los pares de bases del ARNm del gen diana con parte del sitio de union del ribosoma del ARN del gen diana y la region tiene una longitud de 19-37 nucleotidos.
    2. El ARNs de la reivindicacion 1, en el que un sitio que no se une al ARNm del gen diana se forma mediante insercion, delecion o sustitucion de uno o mas nucleotidos en la region que empareja sus bases con el ARNm del gen diana.
    3. El ARNs de la reivindicacion 1, en el que los procariotas se seleccionan del grupo que consiste en E. coli, Rhizobium, Bifidobacterium, Rhodococcus, Candida, Erwinia, Enterobacter, Pasteurella, Mannheimia, Actinobacillus, Aggregatibacter, Xanthomonas, Vibrio, Pseudomonas, Azotobacter, Acinetobacter, Ralstonia, Agrobacterium, Rhizobium, Rhodobacter, Zymomonas, Bacillus, Staphylococcus, Lactococcus, Streptococcus, Lactobacillus, Clostridium, Corynebacterium, Streptomyces, Bifidobacterium, y Cyclobacterium.
    4. El ARNs de la reivindicacion 1, en el que el ARNm del gen diana es un ARNm de un gen seleccionado del grupo que consiste en el gen de resistencia a la kanamicina, regulador de tirosina, fosfoenolpiruvato carboxilasa, regulador del almacenamiento de carbono, glucosa-6-fosfato isomerasa, citrato sintasa, acetil-CoA carboxiltransferasa, subunidad alfa, protema biotinilada transportadora de biotina-carboxilo, acetil-CoA carboxilasa, acetil-CoA carboxiltransferasa, subunidad beta, piruvato deshidrogenasa, actividad de propionato cinasa / acetato cinasa, adiY, acetilglutamato cinasa, N-acetilglutamilfosfato reductasa, argininosuccinato sintasa, argininosuccinato liasa, aspartato amomaco-liasa, fosfopentomutasa, desoxirribosa-fosfato aldolasa, KASIII, -cetoacil-ACP sintasas, acil-CoA sintetasa grasa, fructosa-1,6-bisfosfatasa, succinato semialdetudo deshidrogenasa dependiente de NADP+, transportador de APC, 4-aminobutirato aminotransferasa, subunidad A de glutamato descarboxilasa, subunidad B de glutamato descarboxilasa, transportador de APC GABA, glicerol cinasa, represor de sn-Glicerol-3-fosfato, fructosa 1,6-bisfosfatasa II, citrato sintasa, regulador de lisogenizacion, acetohidroxibutanoato sintasa / acetolactato sintasa, acetohidroxiacido isomerorreductasa, dihidroxiacido deshidratasa, acetolactato sintasa / acetohidroxibutanoato sintasa, acetohidroxibutanoato sintasa / acetolactato sintasa, UDP-3-O-acil-N-acetilglucosamina deacetilasa, L-aspartato oxidasa, regulador de respuesta de nitrato/nitrito, fosfoenolpiruvato carboxicinasa, fosfoenolpiruvato sintetasa, fosfato acetiltransferasa, adenilosuccinato sintetasa, adenilosuccinato liasa, 4-aminobutirato aminotransferasa, transportador ABC de ribosa, ribosa piranasa, ribocinasa, alfa-cetoglutarato reductasa / D-3-fosfoglicerato deshidrogenasa, fosfohidroxitreonina aminotransferasa / 3-fosfoserina aminotransferasa, glucosa 6-fosfato-1-deshidrogenasa, asparagina sintetasa A, carbamoil fosfato sintetasa, D-alanina-D-alanina ligasa B, timidina fosforilasa / uracil fosforilasa, L-2-hidroxiglutarato oxidasa, Lipoamida deshidrogenasa, O-succinilhomoserina liasa / O-succinilhomoserina(tiol)-liasa, aspartato cinasa / homoserina deshidrogenasa, fosfo-N-acetilmuramoil-pentapeptido transferasa, UDP-N-acetilmuramoilalanil-D-glutamato 2,6-diaminopimelato ligasa, enzima de adicion de D-alanil-D-alanina, N-acetilglucosaminil transferasa, quinolinato sintasa, pantotenato sintetasa, Aspartato 1-descarboxilasa, 6-fosfogluconolactonasa, dihidroorotasa, ribulosa fosfato 3-epimerasa, transaldolasa A, aspartato cinasa / homoserina deshidrogenasa, homoserina cinasa, treonina sintasa, transcetolasa I y transcetolasa II.
    5. Un procedimiento para inhibir la expresion de un gen diana, comprendiendo el procedimiento las etapas de: introducir o expresar el ARNs de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 en un procariota; e inhibir la expresion del ARNm del gen diana.
    6. Un procedimiento de seleccion de un gen que necesita ser delecionado para producir una sustancia util, comprendiendo el procedimiento las etapas de:
    (a) inhibir la expresion de al menos un gen entre los genes, que estan presentes en una cepa para la produccion de la sustancia util y participa en la via de biosmtesis de la sustancia util, mediante el uso del ARNs de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 que se dirige al gen; y
    (b) seleccionar el gen cuya expresion se inhibio, como el gen que necesita ser delecionado para producir la sustancia util, en el caso en el que el rendimiento de la produccion de la sustancia util aumenta mediante la inhibicion de la expresion del gen.
    7. Un procedimiento para mejorar una cepa para producir una sustancia util, comprendiendo el procedimiento las etapas de:
    (a) inhibir la expresion de al menos un gen entre los genes, que estan presentes en una cepa para la produccion de la sustancia util y participa en la via de biosmtesis de la sustancia util, mediante el uso del ARNs de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 que se dirige al gen;
    (b) seleccionar el gen cuya expresion se inhibio, como el gen que necesita ser delecionado para producir la sustancia util, si el rendimiento de la produccion de la sustancia util aumenta mediante la inhibicion de la expresion del gen; y
    (c) construir una cepa recombinante que tiene una delecion del gen seleccionado o una combinacion de los genes seleccionados.
    8. Un microorganismo recombinante que tiene una capacidad mejorada para producir tirosina, obteniendose el microorganismo recombinante mediante la inactivacion de las funciones de los genes tyrR y crsA en una celula hospedadora que tiene la via de biosmtesis de tirosina, en la que las funciones de los genes tyrR y csrA se inactivan mediante la introduccion o la expresion de un ARNs sintetico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 en una celula hospedadora que tiene la via de biosmtesis de tirosina para inhibir la expresion de los genes tyrR y csrA y, en el que el microorganismo recombinante comprende dicho ARNs sintetico.
    9. El microorganismo recombinante de la reivindicacion 8, en el que el microorganismo tiene uno o mas genes seleccionados del grupo que consiste en policetido sintasa A de tipo I de smtesis de fenoltiocerol, transcetolasa, 3-desoxi-7-fosfoheptulonato sintasa, shikimato cinasa I, y prefenato deshidrogenasa que se introducen o se amplifican en el mismo.
    10. El microorganismo recombinante de la reivindicacion 8, en el que la policetido sintasa A de tipo I de smtesis de fenoltiocerol o la transcetolasa se expresa mediante un promotor fuerte, y la 3-desoxi-7-fosfoheptulonato sintasa, shikimato cinasa I, o prefenato deshidrogenasa se expresan por un promotor debil.
    11. El microorganismo recombinante de la reivindicacion 8, en el que la celula hospedadora se selecciona del grupo que consiste en E. coli, Rhizobium, Bifidobacterium, Rhodococcus, Candida, Erwinia, Enterobacter, Pasteurella, Mannheimia, Actinobacillus, Aggregatibacter, Xanthomonas, Vibrio, Pseudomonas, Azotobacter, Acinetobacter, Ralstonia, Agrobacterium, Rhizobium, Rhodobacter, Zymomonas, Bacillus, Staphylococcus, Lactococcus, Streptococcus, Lactobacillus, Clostridium, Corynebacterium, Streptomyces, Bifidobacterium, y Cyclobacterium. 12. Un microorganismo recombinante que tiene una capacidad para producir fenol, obteniendose el microorganismo recombinante mediante la introduccion o la amplificacion de un gen tpI en el microorganismo recombinante de una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 11.
    13. Un microorganismo recombinante que tiene una capacidad mejorada para producir cadaverina, obteniendose el microorganismo recombinante mediante la inactivacion de la funcion de al menos un gen en una celula hospedadora que tiene la via de biosmtesis de cadaverina, en la que las funciones de los genes se inactivan mediante la introduccion o la expresion de un ARNs sintetico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 en una celula hospedadora que tiene la via de biosmtesis de cadaverina para inhibir la expresion de al menos un gen seleccionado del grupo que consiste e murE, metB, thrL y ackA y, en el que el microorganismo recombinante comprende dicho ARNs sintetico.
    14. El microorganismo recombinante de la reivindicacion 13, en el que la celula hospedadora se selecciona del grupo que consiste en E. coli, Rhizobium, Bifidobacterium, Rhodococcus, Candida, Erwinia, Enterobacter, Pasteurella, Mannheimia, Actinobacillus, Aggregatibacter, Xanthomonas, Vibrio, Pseudomonas, Azotobacter, Acinetobacter, Ralstonia, Agrobacterium, Rhizobium, Rhodobacter, Zymomonas, Bacillus, Staphylococcus, Lactococcus, Streptococcus, Lactobacillus, Clostridium, Corynebacterium, Streptomyces, Bifidobacterium, y Cyclobacterium.
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