CN104762311A - 基因密码锁的设计与应用 - Google Patents
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Abstract
为了对生命科学研究及生物技术产业中具有优良性状的菌种进行保护，本发明设计了一种基因密码锁，属于生物工程领域。这种基因密码锁是通过细胞分裂抑制系统、多层与门基因线路和sRNA调控系统这三个基因线路实现细胞生长的可控调节。通过构建细胞分裂抑制系统的基因线路维持细胞数量，实现生物细胞分裂的可控调节；通过构建多种信号分子诱导的多层与门基因线路实现多密码的输入；设计对多层与门和细胞分裂抑制系统基因线路中目标基因具有抑制作用的sRNA和sRNA调控系统实现密码的顺序输入。本发明在生物安全、生物安保和微生物菌种保护方面具有广泛的应用。
Description
技术领域
本发明涉及生物基因线路的设计与构建，属于生物工程领域。
背景技术
生物作为科学研究中重要的研究、开发和利用对象，其价值不言而喻，生物是生态环境的重要组成部分，与工农业生产和人们的日常生活密切相关，在食品、医药、农业生产和环境保护等方面具有广泛的应用，并且为生命科学的迅速发展提供了丰富的资源。然而，生命科学在给人类带来惠益的同时，也带来了一系列的生物安全问题及相关争论。
随着生命科学的迅速发展，生物企业之间的竞争越来越激烈，为了获取最大的经济效益，具有优良性状的生物是企业觊觎的对象，具有优良性状的生物的流失会使企业遭受巨大的经济损失，有些生物对人类具有潜在的危险，会严重威胁人类健康和社会稳定。因此，如何对生物进行保护成为生物安全问题中的重要内容，并且引起了高度的重视。但是目前只是在法律道德层面上约束人们的行为，在基因水平上对生物进行保护和控制是一个具有挑战性的全新思想，本发明在生物安全、生物安保和微生物菌种保护方面具有广泛的应用。
发明内容
本发明的目的是保护具有优良性状的生物，提供一种基因密码锁的设计方法对生物进行保护。为实现上述目的，这种基因密码锁通过细胞分裂抑制系统、多层与门基因线路和sRNA调控系统这三个基因线路实现细胞生长的可控调节。构建基因线路保护生物的方法通过以下步骤实现：一、构建细胞分裂抑制系统实现生物细胞分裂的可控调节。二、构建信号分子诱导的多层与门基因线路实现多密码的输入。三、设计对目标基因具有抑制作用的sRNA和sRNA调控系统实现密码的顺序输入。
本发明的目的通过以下技术方案实现：
一、构建细胞分裂抑制系统实现生物细胞分裂的可控调节：克隆控制和调节抑制细胞分裂相关的基因(包括slmA、sulA、minC、minD和minE及其突变基因等)，组装得到minCD、minDE、minCE、minCDE等各种组合的功能元器件，并将其构建到细胞分裂抑制系统的基因线路中。细胞分裂抑制系统的基因线路顺序由组成型启动子I(P-I)、核糖体结合位点I(RBS-I)、降解信号分子的基因、终止子I(T-I)，组成型启动子II(P-II)、核糖体结合位点II(RBS-II)、信号分子结合蛋白基因(包括LuxR和lasl及其突变基因等)、终止子II(T-II)，信号分子与结合蛋白作用抑制的启动子III(P-III包括LuxpL和pBAD及其突变启动子等)、核糖体结合位点III(RBS-III)、抑制细胞分裂的组合功能基因元器件组成。二、构建信号分子诱导的多层与门基因线路实现多密码的输入：以不同的信号分子(包括阿拉伯糖Ara和异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷IPTG等)作为密码分别激活不同的诱导型启动子I(P-I包括pBAD、pTac和pTet及其突变启动子等)调控的伴侣蛋白基因(包括ipgC和sicA及其突变基因等)和转录因子(包括mxiE和invF及其突变体等)的表达，伴侣蛋白和转录因子可以形成蛋白复 合体，从而激活下游诱导型启动子II(P-II包括pipaH和psicA及其突变启动子等)；第一层与门基因线路的组成为：诱导型启动子I调控表达的伴侣蛋白和转录因子相互作用形成蛋白复合体能够激活下游诱导型启动子II；第二层与门基因线路的组成为：诱导型启动子II调控表达的伴侣蛋白和诱导型启动子I调控表达的转录因子相互作用形成蛋白复合体能够激活下游诱导型启动子III；以此类推可构建多层与门基因线路。三、设计对目标基因具有抑制作用的sRNA和sRNA调控系统实现密码的顺序输入：设计对特定基因具有抑制作用的sRNA，sRNA由mRNA结合区和支架结构等组成，sRNA的mRNA结合区可以与特定基因区域互补配对，与核糖体竞争mRNA结合位点，从而有效地抑制特定基因的表达。sRNA调控系统构建到载体(包括pSB1C3和pET28a等)上，由两部分组成，第一部分由组成型启动子I(P-I)、sRNA和终止子I(T-I)组成，第二部分由组成型启动子II(P-II)、被抑制基因和报告基因(包括rfp和lacz等)组成。
本发明中设计基因密码锁的分子调控方法，具有以下优点：
1、本发明构建的细胞分裂抑制系统实现了生物细胞分裂的可控调节。
2、本发明构建的多层与门基因线路实现了密码的输入。
3、本发明设计的对目标基因具有抑制作用的sRNA和sRNA调控系统实现了密码的顺序
输入。
4、本发明中保护生物的方法为生物安全和生物安保问题提供了新的思路。
附图说明
图1：是利用电子显微镜验证细胞分裂抑制基因功能的细胞形态图。左图是对照组大肠杆菌的细胞形态图，右图是实验组大肠杆菌的细胞形态图。
图2:是细胞分裂抑制系统的基因线路图。J23119为组成型启动子，B0034为核糖体结合位点，Aii基因表达的蛋白质可以分解AHL(酰基高丝氨酸内酯)，AHL与LuxR表达的蛋白质相互作用可以激活启动子LuxpL，min基因对大肠杆菌细胞分裂具有抑制作用。
图3：是单层与门基因线路图。J23119为组成型启动子，Ara为信号分子阿拉伯糖，可以激活诱导型启动子pBAD，IPTG为信号分子异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷，可以激活诱导型启动子pTac。ipgC基因表达的伴侣蛋白和mxiE基因表达的转录因子相互作用形成蛋白复合体能够激活下游诱导型启动子pipaH。rfp基因表达的红色荧光蛋白作为报告基因验证与门基因线路的功能。
图4：是设计的抑制ipgC的sRNA-ipgC结构图。sRNA由mRNA结合区和支架结构组成。
图5：是构建的sRNA调控系统载体图。sRNA调控系统由构建到载体pSB1C3上的BOX1和BOX2两部分组成，BOX1由组成型启动子J23119、sRNA和终止子B0015组成；BOX2由组成型启动子J23119、基因ipgC和报告基因rfp组成。
图6：是基因密码锁的整体线路关系图。由细胞分裂抑制系统、多层与门基因线路和sRNA调控系统组成。
图7：是基因密码锁整体基因线路在氨基酸生产菌大肠杆菌中的应用。对照是加入正确 顺序信号分子的大肠杆菌在37℃的生长曲线，工程菌是加入错误顺序信号分子的大肠杆菌在37℃的生长曲线。
具体实施方式
下面结合实施例，对本发明的具体实施方式进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施实例1：单功能元件组装
1.以大肠杆菌为研究对象，通过NCBI数据库已完成测序的大肠杆菌MG1655中查阅对大肠杆菌细胞分裂具有抑制作用的功能基因，选取大肠杆菌中minC基因、minD基因、minE基因作为功能元件。从大肠杆菌基因组上克隆得到对细胞分裂具有抑制作用的基因minC、minD、minE。minC、minD、minE两端分别设置EcoR Ⅰ和Xho Ⅰ酶切位点。
引物序列为：
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minC-R：5’>CCGCTCGAGTCAATTTAACGGTTGAACGGTC<3’，下划线序列为Xho Ⅰ酶切位点和保护碱基。
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minE-F：5’>CCGGAATTCATGGCATTACTCGATTTCTTTCTCT<3’，下划线序列为EcoR Ⅰ酶切位点和保护碱基。
minE-R：5’>CCGCTCGAGTTATTTCAGCTCTTCTGCTTCCGGT<3’，下划线序列为Xho Ⅰ酶切位点和保护碱基。
2.通过OE-PCR连接组装得到minCD、minDE、minCE、minCDE。minC、minD、minE、minCD、minDE、minCE、minCDE两端分别设置EcoR Ⅰ和Xho Ⅰ酶切位点，将得到的所有基因与pET-28a(+)载体双酶切后连接载体pET-28a，热激转化大肠杆菌，实现元件与大肠杆菌的集成，以抑制大肠杆菌的细胞分裂。
(1)minC与minD通过OE-PCR连接组装得到minCD的引物序列为：
minC-F：5’>CCGGAATTCATGTCAAACACGCCAATCGAGCTT<3’，下划线序列为EcoRⅠ酶切位点和保护碱基。
minC-R(C+D)：5’>CGAAGTAACAACAATAATGCGTGCCATTTTCTCCTCTTTTCAATT TAACGGTTGAACGG<3’，下划线序列为与基因minD重叠序列。
minD-F(C+D)：5’>GCTTTGACCGTTCAACCGTTAAATTGAAAAGAGGAGAAAATGGC ACGCATTATTGTTGT<3’，下划线序列为与基因minC重叠序列。
minD-R：5’>CCGCTCGAGTTATCCTCCGAACAAGCGTTTGAGG<3’，下划线序列为Xho Ⅰ酶切位点和保护碱基。
(2)minD与minE通过OE-PCR连接组装得到minDE的引物序列为：
minD-F：5’>CCGGAATTCATGGCACGCATTATTGTTGTTACTT<3’，下划线序列为EcoR Ⅰ酶切位点和保护碱基。
minD-R(D+E)：5’>CGAGAGAAAGAAATCGAGTAATGCCATTTTCTCCTCTTTTTATCC TCCGAACAAGCGTT<3’，下划线序列为与基因minE重叠序列。
minE-F(D+E)：5’>TTCCTCAAACGCTTGTTCGGAGGATAAAAAGAGGAGAAAATG GCATTACTCGATTTCTT<3’，下划线序列为与基因minD重叠序列。
minE-R：5’>CCGCTCGAGTTATTTCAGCTCTTCTGCTTCCGGT<3’，下划线序列为Xho Ⅰ酶切位点和保护碱基。
(3)minC与minE通过OE-PCR连接组装得到minCE的引物序列为：
minC-F：5’>CCGGAATTCATGTCAAACACGCCAATCGAGCTT<3’，下划线序列为EcoR Ⅰ酶切位点和保护碱基。
minC-R(C+E)：5’>CGAGAGAAAGAAATCGAGTAATGCCATTTTCTCCTCTTTTCAATT TAACGGTTGAACGG<3’，下划线序列为与基因minE重叠序列。
minE-F(C+E)：5’>GCTTTGACCGTTCAACCGTTAAATTGAAAAGAGGAGAAAATGG CATTACTCGATTTCTT<3’，下划线序列为与基因minC重叠序列。
minE-R：5’>CCGCTCGAGTTATTTCAGCTCTTCTGCTTCCGGT<3’，下划线序列为Xho Ⅰ酶切位点和保护碱基。
(4)minC与minDE通过OE-PCR连接组装得到minCDE的引物序列为：
minC-F：5’>CCGGAATTCATGTCAAACACGCCAATCGAGCTT<3’，下划线序列为EcoR Ⅰ酶切位点和保护碱基。
minC-R(C+DE)：5’>CGAAGTAACAACAATAATGCGTGCCATTTTCTCCTCTTTTCAAT TTAACGGTTGAACGG<3’，下划线序列为与基因minDE重叠序列。
minDE-F(C+DE)：5’>GCTTTGACCGTTCAACCGTTAAATTGAAAAGAGGAGAAAATG GCACGCATTATTGTTGT<3’，下划线序列为与基因minC重叠序列。
minE-R：5’>CCGCTCGAGTTATTTCAGCTCTTCTGCTTCCGGT<3’，下划线序列为XhoⅠ酶切位点和保护碱基。
实施实例2：min基因的功能验证
构建到pET-28a载体上的基因minC、minD、minE、minCD、minDE、minCE、minCDE转化到大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，筛选阳性克隆进行功能验证。以BL21(DE3)菌株为对照，种子液转接后OD600值为0.6时加入诱导剂IPTG(终浓度为0.1mmol/L)，每小时取样绘制大肠杆菌的生长曲线；通过电子显微镜观察大肠杆菌细胞形态变成长的纤维丝状(图 1)；通过稀释涂板法测定活菌数，结果如表1所示，诱导后实验组(minC、minD)大肠杆菌在37℃的活菌数约为106CFU/mL，诱导后对照组大肠杆菌BL21(DE3)在37℃的活菌数约为
109CFU/mL，为实验组的1000倍。证明min基因对生物细胞分裂具有很强的抑制作用。
表1稀释涂板法测定大肠杆菌在37℃的活菌数(CFU/mL)
实施实例3：细胞分裂抑制系统基因线路的构建和功能验证
将启动子J23119、核糖体结合位点B0034、Aii基因、终止子B0015、启动子J23119、核糖体结合位点B0034、LuxR基因、终止子B0015、启动子LuxpL、核糖体结合位点B0034、min基因通过OE-PCR连接组装和酶切连接的方法连接基因线路(图2)。将基因线路构建到PSB1C3载体上转化到大肠杆菌中。细胞分裂抑制系统基因线路被激活后，由于min基因具有抑制细胞分裂的功能，大肠杆菌不能正常地生长繁殖，与对照相比，活菌数大幅度减少；当加入AHL(酰基高丝氨酸内酯)后，AHL能够与LuxR基因表达的蛋白相互作用抑制启动子LuxpL，min基因的表达受到抑制，大肠杆菌能够正常地生长繁殖，活菌数开始增加；Aii基因表达的蛋白具有降解AHL的功能，当AHL浓度降低到阈值以下，AHL不能与LuxR基因表达的蛋白相互作用，此时min基因表达，大肠杆菌不能正常地生长繁殖，活菌数再次减少。设计对min基因具有抑制作用的sRNA，sRNA的mRNA结合区可以与min基因的转录起始区互补配对，与核糖体竞争mRNA结合位点，从而有效地抑制min基因的表达，此时大肠杆菌能够正常地生长繁殖。实现了微生物细胞分裂的可控调节。
实施实例4：多层与门基因线路的构建
以单层与门的构建为例，将启动子J23119、核糖体结合位点B0034、araC基因、终止子B0015、启动子pBAD、核糖体结合位点B0034、ipgC基因、终止子B0015、启动子J23119、核糖体结合位点B0034、lacI基因、终止子B0015、启动子pTac、核糖体结合位点B0034、mxiE基因、终止子B0015、启动子pipaH、核糖体结合位点B0034、rfp基因通过OE-PCR连接组装和酶切连接的方法连接基因线路(图3)。信号分子Ara(阿拉伯糖)和IPTG(异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷)分别激活诱导型启动子pBAD和诱导型启动子pTac，基因ipgC表达的伴侣蛋白与基因mxiE表达的转录因子相互作用形成的ipgC–mxiE蛋白复合体能够激活pipaH启动子，通过测定RFP的荧光强度可以验证与门基因线路的功能。依据上述原理可以实现多层与门的构建。
实施实例5：sRNA的设计与多层与门基因线路的顺序调控
为了保证信号分子输入顺序的正确性，以实施实例4中的单层与门为例，设计对与门线路中的伴侣蛋白ipgC具有抑制作用的sRNA可以实现密码的顺序调控。sRNA由mRNA结合区和支架结构组成，设计sRNA-ipgC的大小为15nt(图4)，sRNA的mRNA结合区可以与ipgC基因的转录起始区互补配对，与核糖体竞争mRNA结合位点，从而有效地抑制ipgC基因的表达，输入正确顺序的信号分子才可以实现与门基因线路的激活。
实施实例6：sRNA调控系统的构建与功能验证
sRNA调控系统由构建到载体pSB1C3上的BOX1和BOX2两部分组成，BOX1由启动子J23119、sRNA和终止子B0015组成；BOX2由启动子J23119、基因ipgC和报告基因rfp组成(图5)。将构建好的质粒转化大肠杆菌，通过测定RFP的荧光强度可以确定sRNA对基因ipgC的抑制效率。
实施实例7：基因密码锁在工业菌种保护中的应用
将设计的基因密码锁整体线路(图6)构建到氨基酸生产菌大肠杆菌中，加入了正确顺序的信号分子的对照菌株正常生长，而加入错误顺序的信号分子的工程菌株生长受到控制，实现了对大肠杆菌生长的控制(图7)。
Claims (5)
1.一种基因密码锁的设计方法与应用，其特征在于，这种基因密码锁通过细胞分裂抑制系统、多层与门基因线路和sRNA调控系统这三个基因线路实现细胞生长的可控调节。
2.如权利要求1所述的细胞分裂抑制系统，其特征在于，克隆控制和调节抑制细胞分裂相关的基因(包括slmA、sulA、minC、minD和minE及其突变基因等)，组装得到minCD、minDE、minCE、minCDE等各种组合的功能元器件，并将其构建到细胞分裂抑制系统的基因线路中；细胞分裂抑制系统的基因线路顺序由组成型启动子I(P-I)、核糖体结合位点I(RBS-I)、降解信号分子的基因、终止子I(T-I)，组成型启动子II(P-II)、核糖体结合位点II(RBS-II)、信号分子结合蛋白基因(包括LuxR和lasl及其突变基因等)、终止子II(T-II)，信号分子与结合蛋白作用抑制的启动子III(P-III包括LuxpL和pBAD及其突变启动子等)、核糖体结合位点III(RBS-III)、抑制细胞分裂的组合功能基因元器件组成；信号分子(包括AHL即酰基高丝氨酸内酯等)与信号分子结合蛋白结合可以抑制启动子III，使抑制细胞分裂的基因不能表达，因此细胞可以正常生长；当信号分子被降解信号分子的蛋白降解，信号分子不能与信号分子结合蛋白结合，使抑制细胞分裂的基因表达，因此细胞不能正常生长；这样实现了生物细胞生长的可控调节。
3.如权利要求1所述的多层与门基因线路，其特征在于，以不同的信号分子(包括阿拉伯糖Ara和异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷IPTG等)作为密码分别激活不同的诱导型启动子I(P-I包括pBAD、pTac和pTet及其突变启动子等)调控的伴侣蛋白基因(包括ipgC和sicA及其突变基因等)和转录因子(包括mxiE和invF及其突变体等)的表达，伴侣蛋白和转录因子可以形成蛋白复合体，从而激活下游诱导型启动子II(P-II包括pipaH和psicA及其突变启动子等)；第一层与门基因线路的组成为：诱导型启动子I调控表达的伴侣蛋白和转录因子相互作用形成蛋白复合体能够激活下游诱导型启动子II；第二层与门基因线路的组成为：诱导型启动子II调控表达的伴侣蛋白和诱导型启动子I调控表达的转录因子相互作用形成蛋白复合体能够激活下游诱导型启动子III；以此类推可构建多层与门基因线路。
4.如权利要求1所述的sRNA调控系统，其特征在于，通过设计对目标基因(包括多层与门基因线路中的伴侣蛋白基因ipgC、sicA和细胞分裂抑制系统中抑制细胞分裂的min基因及其突变基因等)具有抑制作用的sRNA来调控基因密码锁的密码顺序。
5.如权利要求1所述的方法在生物安全、生物安保和微生物菌种保护方面的应用。
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