CN110669132B - 一种提高IgG1抗体产量的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种提高IgG1抗体产量的方法，包括如下步骤：(1)基因的体外合成和扩增：得到优化后的lgG1的轻链和重链的核苷酸序列，连接成一条核苷酸序列；(2)将核苷酸序列连接到p2A4载体中得到p2A4‑HL；(3)sRNA的设计和组装：(4)分别将连接到sRNA接收体的sRNA序列连接到p3C5载体；(5)分别与p2A4‑HL一起导入大肠杆菌中，得到重组菌1、重组菌2、重组菌3、重组菌4和重组菌5；(6)将重组菌分别发酵，得到高产量IgG1抗体。本发明的方法能提高单克隆抗体在大肠杆菌中的表达量，针对性的抑制三羧酸循环代谢路径的相关酶，会使用来合成冗余酶的氨基酸更多的合成IgG1抗体，从而增加IgG1的产量。

Description

一种提高IgG1抗体产量的方法

技术领域

本发明涉及生物领域，具体涉及一种提高IgG1抗体产量的方法。

背景技术

目前，大量生产单克隆抗体的方法主要分为三类,一是体内法，即将杂交瘤细胞注射到基因型相容的动物腹腔内从腹水中得到单抗；二是体外法,即通过在体外大量培养杂交瘤细胞, 生产单抗；三是基因工程抗体技术,即通过墓因操作技术将单抗杂交瘤细胞中的抗体基因克隆或者通过抗体库技术直接得到抗体的基因，然后在其他表达载体中大量表达。但杂交瘤细胞并不适于所有实验室，同时哺乳动物细胞耐受性差，生产成本高。大肠杆菌表达系统具有规模大、速度快、成本低等特点，成为一个比较方便快速的生产系统。但是现阶段，只是从发酵工艺及单抗自身出发来优化产量，并没有人研究过大肠杆菌自身的三羧酸循环途径(如图 1所示)对单抗产量的影响。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种提高IgG1抗体产量的方法。

本发明的技术方案概述如下：

一种提高IgG1抗体产量的方法，包括如下步骤：

(1)基因的体外合成和扩增：

从NCBI数据库获得来源于西妥昔单抗的lgG1的轻链和lgG1的重链，所述lgG1的轻链和重链的氨基酸序列分别在JCAT网站，通过输入：避免XbaI，NdeI，SpeI和HindIII限制性酶切位点为条件，得到优化后的lgG1的轻链和优化后的lgG1的重链的核苷酸序列，在体外合成和扩增；并将优化后的lgG1的轻链和优化后的重链连接成一条核苷酸序列；lgG1的轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；lgG1的重链的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；优化后的lgG1的轻链的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；优化后的lgG1的重链的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；

(2)将步骤(1)获得的核苷酸序列连接到p2A4载体中得到p2A4-HL；p2A4载体的核苷酸序列如SEQ ID NO.31所示；

(3)sRNA的设计和组装：选择大肠杆菌三羧酸途径中5个相关基因序列并在JCAT网站，通过输入：避免XbaI，NdeI，SpeI和HindIII限制性酶切位点为条件，得到优化后的gltA、sdhA、 sucB、sucD和fumC，5个相关基因的核苷酸序列；所述优化后的gltA的核苷酸序列如SEQ ID NO.5 所示；所述优化后的sdhA的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；所述优化后的sucB的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；所述优化后的sucD的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；所述优化后的 fumC的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示；再分别从所述优化后的5个相关基因的核苷酸序列的 ATG开始选择20-30nt寡核苷酸为模板，设计正向引物和反向引物，在正向引物5’端加上粘性末端TTGC，在反向引物5’端加上粘性末端GAAA，并通过自由能检测网站测结合自由能，使之在-30至-40k cal/mol，通过PCR，得到5个与所述20-30nt的寡核苷酸反向互补的核苷酸序列sRNA，分别为sRNA-1、sRNA-2、sRNA-3、sRNA-4和sRNA-5；使用golden gate方法将5个sRNA序列连接到sRNA接收体得到5个核苷酸序列，所述sRNA接收体的核苷酸序列如SEQ ID NO.20所示；

(4)分别将连接到sRNA接收体的sRNA序列连接到p3C5载体，分别得到p3C5-gltA、p3C5-sdhA、p3C5-sucB、p3C5-sucD、p3C5-fumC；所述p3C5载体的核苷酸序列如SEQ IDNO.32 所示；

(5)将p3C5-gltA、p3C5-sdhA、p3C5-sucB、p3C5-sucD、p3C5-fumC分别与p2A4-HL一起导入大肠杆菌中，依次得到重组菌1、重组菌2、重组菌3、重组菌4和重组菌5；

(6)将重组菌1、重组菌2、重组菌3、重组菌4、重组菌5分别发酵，得到高产量IgG1抗体。

本发明的优点：

本发明的方法能提高单克隆抗体在大肠杆菌中的表达量，针对性的抑制三羧酸循环代谢路径的相关酶，会使用来合成冗余酶的氨基酸更多的合成IgG1抗体，从而增加IgG1的产量。

附图说明

图1为大肠杆菌自身的三羧酸循环途径。

图2为5种不同的重组菌发酵产生IgG1的浓度结果图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。

实施例1

一种提高IgG1抗体产量的方法，包括如下步骤：

(1)基因的体外合成和扩增：

从NCBI数据库获得来源于西妥昔单抗(Cetuximab)的lgG1的轻链和lgG1的重链，所述lgG1的轻链和重链的氨基酸序列分别在JCAT网站，通过输入：避免XbaI，NdeI，SpeI和HindIII限制性酶切位点为条件，得到优化后的lgG1的轻链和优化后的lgG1的重链的核苷酸序列，在体外合成和扩增；并将优化后的lgG1的轻链和优化后的重链连接成一条核苷酸序列；

lgG1的轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；

lgG1的重链的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；

优化后的lgG1的轻链的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；

优化后的lgG1的重链的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；

(2)将步骤(1)获得的核苷酸序列连接到包含pBR322复制子的p2A4载体中得到p2A4-HL； p2A4载体的核苷酸序列如SEQ ID NO.31所示；

(3)sRNA的设计和组装：

选择大肠杆菌(大肠杆菌MG1655，市售)三羧酸途径中5个相关基因序列并在JCAT网站，通过输入：避免XbaI，NdeI，SpeI和HindIII限制性酶切位点为条件，得到优化后的gltA、 sdhA、sucB、sucD和fumC，5个相关基因的核苷酸序列；所述优化后的gltA的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；所述优化后的sdhA的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；所述优化后的sucB 的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；所述优化后的sucD的核苷酸序列如SEQ IDNO.8所示；所述优化后的fumC的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示；

再分别从5个优化后的相关基因的核苷酸序列的ATG开始选择20-30nt寡核苷酸为模板 (分别是：第1条寡核苷酸24nt，第2条寡核苷酸24nt，第3条寡核苷酸24nt，第4条寡核苷酸27nt，第5条寡核苷酸24nt)，设计正向引物和反向引物，在正向引物5’端加上粘性末端TTGC(简称修饰的正向引物)，在反向引物5’端加上粘性末端GAAA(简称修饰的反向引物)，修饰的正向引物和修饰的反向引物分别为：sgltA-F(SEQ ID NO.21)、sgltA-R(SEQ IDNO.22)、ssdhA-F(SEQ ID NO.23)、ssdhA-R(SEQ ID NO.24)、ssucB-F(SEQ ID NO.25)、ssucB-R(SEQ ID NO.26)、ssucD-F(SEQ ID NO.27)、ssucD-R(SEQ ID NO.28)、sfumC-F(SEQ ID NO.29)、sfumC-R(SEQ ID NO.30)；

并通过自由能检测网站测结合自由能，使之在-30至-40k cal/mol，(五个自由能分别为：gltA：-35k cal/mol，sdhA：-33.9k cal/mol，sucB：-37k cal/mol，sucD：-35.3kcal/mol， fumC：-35k cal/mol)通过PCR，得到5个与所述20-30nt的寡核苷酸反向互补的核苷酸序列sRNA，分别为sRNA-1(SEQ ID NO.10，24nt)、sRNA-2(SEQ ID NO.11，24nt)、sRNA-3(SEQ ID NO.12，24nt)、sRNA-4(SEQ ID NO.13，27nt)和sRNA-5(SEQ ID NO.14，24nt)；使用golden gate方法将5个sRNA序列分别连接到sRNA接收体得到5个核苷酸序列(依次为：SEQID NO.15、SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.19)，所述 sRNA接收体的核苷酸序列如SEQ ID NO.20所示；

sRNA的核苷酸还可以在20-30nt中任选一个，并进行正向引物5’端和反向引物5’端的加上粘性末端的步骤，并测结合自由能，使之在-30至-40k cal/mol，通过PCR，得到5个sRNA序列，并使用golden gate方法将5个sRNA序列连接到sRNA接收体得到5个核苷酸序列。

PCR程序如下：

a.将一对寡核苷酸(正向引物5’端加上粘性末端TTGC，反向引物5’端加上粘性末端GAAA) 分别溶于水中，使其浓度为100μM；

b.将5μL(正向引物5’端加上粘性末端TTGC)的水溶液、5μL(反向引物5’端加上粘性末端GAAA)的水溶液和90μL 30mM HEPES(pH＝7.8)混合；

c.放入PCR仪中，95℃5min，然后以0.1℃/秒的速度降至4℃。

Golden gate方法反应体系如下：

sRNA接收体质粒(该质粒中含有sRNA接收体)——1μL(100ng)

sRNA序列——0.5μL(上述PCR的产物稀释十倍)

T4 Ligase Buffer——2μL

T4 ligase——1μL

BsaI——1μL

水——14.5μL

Golden gate PCR程序：

1.37℃10min，然后16℃10min，循环10次；

2.50℃5min；

3.65℃20min；

4.降温至4℃。

(4)将SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.19所示的5个序列分别连接到包含p15A复制子的p3C5载体，分别得到p3C5-gltA、p3C5-sdhA、p3C5-sucB、p3C5-sucD、p3C5-fumC；

所述p3C5载体的核苷酸序列如SEQ ID NO.32所示；

(5)将p3C5-gltA、p3C5-sdhA、p3C5-sucB、p3C5-sucD、p3C5-fumC分别与p2A4-HL一起导入大肠杆菌中，依次得到重组菌1、重组菌2、重组菌3、重组菌4和重组菌5；

(6)将重组菌1、重组菌2、重组菌3、重组菌4、重组菌5分别发酵，得到高产量IgG1抗体。

发酵过程：将重组菌1-5，分别在含有(100μg/ml氨苄青霉素和34μg/ml氯霉素) 的LB液体加葡萄糖的培养基(1升LB液体培养基中加20克葡萄糖)中培养，37℃和220rpm 下培养12小时；将培养物以1:100比例转接入含有50mLLB培养基的250mL摇瓶中，并在37℃下生长。当600nm处的光密度(OD600)达到约0.6时，加入异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)，使其终浓度为1mM，并在25℃和200rpm下生长16小时。

纯化过程：将发酵后的培养物，4℃和6500rpm下离心收集沉淀。细胞用0.01M PBS(pH ＝7.3)洗涤。用PBS重悬细胞并进行超声破碎处理，5s脉冲，10s间歇，总工作时间为20分钟。然后，将细胞裂解物在4℃和10,000rpm下离心30分钟，收集上清液。然后使用0.45 μm滤膜进行过滤，过滤后进行ELSIA反应测定单抗浓度。

ELSIA(酶联免疫吸附剂测定)反应过程：

1.稀释样品(此步骤选做)。

2.每孔加入100μl Assay Buffer，分别将10μl样品或不同浓度标准品加入相应孔中，轻轻摇板进行简单混合，用封板膜封住反应孔，室温下孵化30min。

3.揭掉封板膜，吸弃孔内液体。用300μl稀释的Wash Buffer洗涤3次，在干净的纸上拍干。

4.每孔加入100μl准备好的HRP Conjugate。

5.用新的封板膜密封。室温孵化30min。

6.重复步骤3。

7.每孔加入100μl TMB Substrate Solution。

8.黑暗条件下室温孵化10分钟(不封膜)。

9.加入100μl Stop Solution停止反应。轻轻摇板进行简单混合，孔内颜色由蓝变黄。

10.以空白孔调零，30min内使用酶标仪在450nm测定每孔的吸光度，通过标准曲线计算样品浓度。结果见图2。(NTO为原始菌)

表1：修饰的正向引物和修饰的反向引物序列

/>

序列表

<110> 天津大学前沿技术研究院

<120> 一种提高IgG抗体产量的方法

<160> 32

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 214

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Asp Ile Leu Leu Thr Gln Ser Pro Val Ile Leu Ser Val Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Val Ser Phe Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Thr Asn

20 25 30

Ile His Trp Tyr Gln Gln Arg Thr Asn Gly Ser Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Lys Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn Ser Val Glu Ser

65 70 75 80

Glu Asp Ile Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Asn Asn Trp Pro Thr

85 90 95

Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 2

<211> 714

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atgaaaaaga acatagcgtt tcttcttgca tctatgttcg ttttttctat tgctacaaac 60

gcgtatgcag acatcctgct gacccagtct ccggttatcc tgtctgtttc tccgggtgaa 120

cgtgtttctt tctcttgccg tgcttctcag tctatcggta ccaacatcca ctggtaccag 180

cagcgtacca acggttctcc gcgtctgctg atcaaatacg cttctgaatc tatctctggt 240

atcccgtctc gtttctctgg ttctggttct ggtaccgact tcaccctgtc tatcaactct 300

gttgaatctg aagacatcgc tgactactac tgccagcaga acaacaactg gccgaccacc 360

ttcggtgctg gtaccaaact ggaactgaaa cgtaccgttg ctgctccgtc tgttttcatc 420

ttcccgccgt ctgacgaaca gctgaaatct ggtaccgctt ctgttgtttg cctgctgaac 480

aacttctacc cgcgtgaagc taaagttcag tggaaagttg acaacgctct gcagtctggt 540

aactctcagg aatctgttac cgaacaggac tctaaagact ctacctactc tctgtcttct 600

accctgaccc tgtctaaagc tgactacgaa aaacacaaag tttacgcttg cgaagttacc 660

caccagggtc tgtcttctcc ggttaccaaa tctttcaacc gtggtgaatg ctaa 714

<210> 3

<211> 448

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Gln Val Gln Leu Lys Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Gln Pro Ser Gln

1 5 10 15

Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asn Tyr

20 25 30

Gly Val His Trp Val Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu

35 40 45

Gly Val Ile Trp Ser Gly Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Thr Pro Phe Thr

50 55 60

Ser Arg Leu Ser Ile Asn Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Phe

65 70 75 80

Lys Met Asn Ser Leu Gln Ser Asn Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Arg Ala Leu Thr Tyr Tyr Asp Tyr Glu Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe

115 120 125

Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu

130 135 140

Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp

145 150 155 160

Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu

165 170 175

Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser

180 185 190

Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro

195 200 205

Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Asp Lys Thr

210 215 220

His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser

225 230 235 240

Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg

245 250 255

Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro

260 265 270

Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala

275 280 285

Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val

290 295 300

Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr

305 310 315 320

Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr

325 330 335

Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu

340 345 350

Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys

355 360 365

Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser

370 375 380

Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp

385 390 395 400

Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser

405 410 415

Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala

420 425 430

Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

435 440 445

<210> 4

<211> 1412

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

atgaaaaaga acatagcgtt tcttcttgca tctatgttcg ttttttctat tgctacaaac 60

gcgtatgcac aggttcagct gaaacagtct ggtccgggtc tggttcagcc gtctcagtct 120

ctgtctatca cctgcaccgt ttctggtttc tctctgacca actacggtgt tcactgggtt 180

cgtcagtctc cgggtaaagg tctggaatgg ctgggtgtta tctggtctgg tggtaacacc 240

gactacaaca ccccgttcac ctctcgtctg tctatcaaca aagacaactc taaatctcag 300

gttttcttca aaatgaactc tctgcagtct aacgacaccg ctatctacta ctgcgctcgt 360

gctctgacct actacgacta cgaatttgct tactggggtc agggtactct cgttaccgta 420

agcgctgctt ctaccaaagg tccgtctgtt ttcccgctgg ctccgtcttc taaatctacc 480

tctggtggta ccgctgctct gggttgcctg gttaaagact acttcccgga accggttacc 540

gtttcttgga actctggtgc tctgacctct ggtgttcaca ccttcccggc tgttctgcag 600

tcttctggtc tgtactctct gtcttctgtt gttaccgttc cgtcttcttc tctgggtacc 660

cagacctaca tctgcaacgt taaccacaaa ccgtctaaca ccaaagttga caaacgtgtt 720

gaaccgaaat ctgacaaaac ccacacctgc ccgccgtgcc cggctccgga actgctgggt 780

ggtccgtctg ttttcctgtt cccgccgaaa ccgaaagaca ccctgatgat ctctcgtacc 840

ccggaagtta cctgcgttgt tgttgacgtt tctcacgaag acccggaagt taaattcaac 900

tggtacgttg acggtgttga agttcacaac gctaaaacca aaccgcgtga agaacagtac 960

aactctacct accgtgttgt ttctgttctg accgttctgc accaggactg gctgaacggt 1020

aaagaataca aatgcaaagt ttctaacaaa gctctgccgg ctccgatcga aaaaaccatc 1080

tctaaagcta aaggtcagcc gagggagccg caggtataca ccctcccgcc gtctcgtgac 1140

gaactgacca aaaaccaggt ttctctgacc tgcctggtta aaggtttcta cccgtctgac 1200

atcgctgttg aatgggaatc taacggtcag ccggaaaaca actacaaaac caccccgccg 1260

gttctggact ctgacggttc tttcttcctg tactctaaac tgaccgttga caaatctcgt 1320

tggcagcagg gtaacgtttt ctcttgctct gttatgcacg aagctctgca caaccactac 1380

acccagaaat ctctgtctct gtctccgggt aa 1412

<210> 5

<211> 1284

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

atggctgata caaaagcaaa actcaccctc aacggggata cagctgttga actggatgtg 60

ctgaaaggca cgctgggtca agatgttatt gatatccgta ctctcggttc aaaaggtgtg 120

ttcacctttg acccaggctt cacttcaacc gcatcctgcg aatctaaaat tacttttatt 180

gatggtgatg aaggtatttt gctgcaccgc ggtttcccga tcgatcagct ggcgaccgat 240

tctaactacc tggaagtttg ttacatcctg ctgaatggtg aaaaaccgac tcaggaacag 300

tatgacgaat ttaaaactac ggtgacccgt cataccatga tccacgagca gattacccgt 360

ctgttccatg ctttccgtcg cgactcgcat ccaatggcag tcatgtgtgg tattaccggc 420

gcgctggcgg cgttctatca cgactcgctg gatgttaaca atcctcgtca ccgtgaaatt 480

gccgcgttcc gcctgctgtc gaaaatgccg accatggccg cgatgtgtta caagtattcc 540

attggtcagc catttgttta cccgcgcaac gatctctcct acgccggtaa cttcctgaat 600

atgatgttct ccacgccgtg cgaaccgtat gaagttaatc cgattctgga acgtgctatg 660

gaccgtattc tgatcctgca cgctgaccat gaacagaacg cctctacctc caccgtgcgt 720

accgctggct cttcgggtgc gaacccgttt gcctgtatcg cagcaggtat tgcttcactg 780

tggggacctg cgcacggcgg tgctaacgaa gcggcgctga aaatgctgga agaaatcagc 840

tccgttaaac acattccgga atttgttcgt cgtgcgaaag acaaaaatga ttctttccgc 900

ctgatgggct tcggtcaccg cgtgtacaaa aattacgacc cgcgcgccac cgtaatgcgt 960

gaaacctgcc atgaagtgct gaaagagctg ggcacgaagg atgacctgct ggaagtggct 1020

atggagctgg aaaacatcgc gctgaacgac ccgtacttta tcgagaagaa actgtacccg 1080

aacgtcgatt tctactctgg tatcatcctg aaagcgatgg gtattccgtc ttccatgttc 1140

accgtcattt tcgcaatggc acgtaccgtt ggctggatcg cccactggag cgaaatgcac 1200

agtgacggta tgaagattgc ccgtccgcgt cagctgtata caggatatga aaaacgcgac 1260

tttaaaagcg atatcaagcg ttaa 1284

<210> 6

<211> 1767

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

atgaaattgc cagtcagaga atttgatgca gttgtgattg gtgccggtgg cgcaggtatg 60

cgcgcggcgc tgcaaatttc ccagagcggc cagacctgtg cgctgctctc taaagtcttc 120

ccgacccgtt cccataccgt ttctgcgcaa ggcggcatta ccgttgcgct gggtaatacc 180

catgaagata actgggaatg gcatatgtac gacaccgtga aagggtcgga ctatatcggt 240

gaccaggacg cgattgaata tatgtgtaaa accgggccgg aagcgattct ggaactcgaa 300

cacatgggcc tgccgttctc gcgtctcgat gatggtcgta tctatcaacg tccgtttggc 360

ggtcagtcga aaaacttcgg cggcgagcag gcggcacgca ctgcggcagc agctgaccgt 420

accggtcacg cactgttgca cacgctttat cagcagaacc tgaaaaacca caccaccatt 480

ttctccgagt ggtatgcgct ggatctggtg aaaaaccagg atggcgcggt ggtgggttgt 540

accgcactgt gcatcgaaac cggtgaagtg gtttatttca aagcccgcgc taccgtgctg 600

gcgactggcg gagcagggcg tatttatcag tccaccacca acgcccacat taacaccggc 660

gacggtgtcg gcatggctat ccgtgccggc gtaccggtgc aggatatgga aatgtggcag 720

ttccacccga ccggcattgc cggtgcgggc gtactggtca ccgaaggttg ccgtggtgaa 780

ggcggttatc tgctgaacaa acatggcgaa cgttttatgg agcgttatgc gccgaacgcc 840

aaagacctgg cgggccgtga cgtggttgcg cgttccatca tgatcgaaat ccgtgaaggt 900

cgcggctgtg atggtccgtg ggggccacac gcgaaactga aactcgatca cctgggtaaa 960

gaagttctcg aatcccgtct gccgggtatc ctggagcttt cccgtacctt cgctcacgtc 1020

gatccggtga aagagccgat tccggttatc ccaacctgtc actacatgat gggcggtatt 1080

ccgaccaaag ttaccggtca ggcactgact gtgaatgaga aaggcgaaga tgtggttgtt 1140

ccgggactgt ttgccgttgg tgaaatcgct tgtgtatcgg tacacggcgc taaccgtctg 1200

ggcggcaact cgctgctgga cctggtggtc tttggtcgcg cggcaggtct gcatctgcaa 1260

gagtctatcg ccgagcaggg cgcactgcgc gatgccagcg agtctgatgt tgaagcgtct 1320

ctggatcgcc tgaaccgctg gaacaataat cgtaacggtg aagatccggt ggcgatccgt 1380

aaagcgctgc aagaatgtat gcagcataac ttctcggtct tccgtgaagg tgatgcgatg 1440

gcgaaagggc ttgagcagtt gaaagtgatc cgcgagcgtc tgaaaaatgc ccgtctggat 1500

gacacttcca gcgagttcaa cacccagcgc gttgagtgcc tggaactgga taacctgatg 1560

gaaacggcgt atgcaacggc tgtttctgcc aacttccgta ccgaaagccg tggcgcgcat 1620

agccgcttcg acttcccgga tcgtgatgat gaaaactggc tgtgccactc cctgtatctg 1680

ccagagtcgg aatccatgac gcgccgaagc gtcaacatgg aaccgaaact gcgcccggca 1740

ttcccgccga agattcgtac ttactaa 1767

<210> 7

<211> 1218

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

atgagtagcg tagatattct ggtccctgac ctgcctgaat ccgtagccga tgccaccgtc 60

gcaacctggc ataaaaaacc cggcgacgca gtcgtacgtg atgaagtgct ggtagaaatc 120

gaaactgaca aagtggtact ggaagtaccg gcatcagcag acggcattct ggatgcggtt 180

ctggaagatg aaggtacaac ggtaacgtct cgtcagatcc ttggtcgcct gcgtgaaggc 240

aacagcgccg gtaaagaaac cagcgccaaa tctgaagaga aagcgtccac tccggcgcaa 300

cgccagcagg cgtctctgga agagcaaaac aacgatgcgt taagcccggc gatccgtcgc 360

ctgctggctg aacacaatct cgacgccagc gccattaaag gcaccggtgt gggtggtcgt 420

ctgactcgtg aagatgtgga aaaacatctg gcgaaagccc cggcgaaaga gtctgctccg 480

gcagcggctg ctccggcggc gcaaccggct ctggctgcac gtagtgaaaa acgtgtcccg 540

atgactcgcc tgcgtaagcg tgtggcagag cgtctgctgg aagcgaaaaa ctccaccgcc 600

atgctgacca cgttcaacga agtcaacatg aagccgatta tggatctgcg taagcagtac 660

ggtgaagcgt ttgaaaaacg ccacggcatc cgtctgggct ttatgtcctt ctacgtgaaa 720

gcggtggttg aagccctgaa acgttacccg gaagtgaacg cttctatcga cggcgatgac 780

gtggtttacc acaactattt cgacgtcagc atggcggttt ctacgccgcg cggcctggtg 840

acgccggttc tgcgtgatgt cgataccctc ggcatggcag acatcgagaa gaaaatcaaa 900

gagctggcag tcaaaggccg tgacggcaag ctgaccgttg aagatctgac cggtggtaac 960

ttcaccatca ccaacggtgg tgtgttcggt tccctgatgt ctacgccgat catcaacccg 1020

ccgcagagcg caattctggg tatgcacgct atcaaagatc gtccgatggc ggtgaatggt 1080

caggttgaga tcctgccgat gatgtacctg gcgctgtcct acgatcaccg tctgatcgat 1140

ggtcgcgaat ccgtgggctt cctggtaacg atcaaagagt tgctggaaga tccgacgcgt 1200

ctgctgctgg acgtgtag 1218

<210> 8

<211> 870

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

atgtccattt taatcgataa aaacaccaag gttatctgcc agggctttac cggtagccag 60

gggactttcc actcagaaca ggccattgca tacggcacta aaatggttgg cggcgtaacc 120

ccaggtaaag gcggcaccac ccacctcggc ctgccggtgt tcaacaccgt gcgtgaagcc 180

gttgctgcca ctggcgctac cgcttctgtt atctacgtac cagcaccgtt ctgcaaagac 240

tccattctgg aagccatcga cgcaggcatc aaactgatta tcaccatcac tgaaggcatc 300

ccgacgctgg atatgctgac cgtgaaagtg aagctggatg aagcaggcgt tcgtatgatc 360

ggcccgaact gcccaggcgt tatcactccg ggtgaatgca aaatcggtat ccagcctggt 420

cacattcaca aaccgggtaa agtgggtatc gtttcccgtt ccggtacact gacctatgaa 480

gcggttaaac agaccacgga ttacggtttc ggtcagtcga cctgtgtcgg tatcggcggt 540

gacccgatcc cgggctctaa ctttatcgac attctcgaaa tgttcgaaaa agatccgcag 600

accgaagcga tcgtgatgat cggtgagatc ggcggtagcg ctgaagaaga agcagctgcg 660

tacatcaaag agcacgttac caagccagtt gtgggttaca tcgctggtgt gactgcgccg 720

aaaggcaaac gtatgggcca cgcgggtgcc atcattgccg gtgggaaagg gactgcggat 780

gagaaattcg ctgctctgga agccgcaggc gtgaaaaccg ttcgcagcct ggcggatatc 840

ggtgaagcac tgaaaactgt tctgaaataa 870

<210> 9

<211> 1404

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

atgaatacag tacgcagcga aaaagattcg atgggggcga ttgatgtccc ggcagataag 60

ctgtggggcg cacaaactca acgctcgctg gagcatttcc gcatttcgac ggagaaaatg 120

cccacctcac tgattcatgc gctggcgcta accaagcgtg cagcggcaaa agttaatgaa 180

gatttaggct tgttgtctga agagaaagcg agcgccattc gtcaggcggc ggatgaagta 240

ctggcaggac agcatgacga cgaattcccg ctggctatct ggcagaccgg ctccggcacg 300

caaagtaaca tgaacatgaa cgaagtgctg gctaaccggg ccagtgaatt actcggcggt 360

gtgcgcggga tggaacgtaa agttcaccct aacgacgacg tgaacaaaag ccaaagttcc 420

aacgatgtct ttccgacggc gatgcacgtt gcggcgctgc tggcgctgcg caagcaactc 480

attcctcagc ttaaaaccct gacacagaca ctgaatgaga aatcccgtgc ttttgccgat 540

atcgtcaaaa ttggtcgtac tcacttgcag gatgccacgc cgttaacgct ggggcaggag 600

atttccggct gggtagcgat gctcgagcat aatctcaaac atatcgaata cagcctgcct 660

cacgtagcgg aactggctct tggcggtaca gcggtgggta ctggactaaa tacccatccg 720

gagtatgcgc gtcgcgtagc agatgaactg gcagtcatta cctgtgcacc gtttgttacc 780

gcgccgaaca aatttgaagc gctggcgacc tgtgatgccc tggttcaggc gcacggcgcg 840

ttgaaagggt tggctgcgtc actgatgaaa atcgccaatg atgtccgctg gctggcctct 900

ggcccgcgct gcggaattgg tgaaatctca atcccggaaa atgagccggg cagctcaatc 960

atgccgggga aagtgaaccc aacacagtgt gaggcattaa ccatgctctg ctgtcaggtg 1020

atggggaacg acgtggcgat caacatgggg ggcgcttccg gtaactttga actgaacgtc 1080

ttccgtccaa tggtgatcca caatttcctg caatcggtgc gcttgctggc agatggcatg 1140

gaaagtttta acaaacactg cgcagtgggt attgaaccga atcgtgagcg aatcaatcaa 1200

ttactcaatg aatcgctgat gctggtgact gcgcttaaca cccacattgg ttatgacaaa 1260

gccgccgaga tcgccaaaaa agcgcataaa gaagggctga ccttaaaagc tgcggccctt 1320

gcgctggggt atcttagcga agccgagttt gacagctggg tacggccaga acagatggtc 1380

ggcagtatga aagccgggcg ttaa 1404

<210> 10

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

gagttttgct tttgtatcag ccat 24

<210> 11

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

aaattctctg actggcaatt tcat 24

<210> 12

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

gaccagaata tctacgctac tcat 24

<210> 13

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

ggtgttttta tcgattaaaa tggacat 27

<210> 14

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

tttttcgctg cgtactgtat tcat 24

<210> 15

<211> 299

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

actagttaac accgtgcgtg ttgactattt tacctctggc ggtgataatg gttgcgagtt 60

ttgcttttgt atcagccatt ttctgttggg ccattgcatt gccactgatt ttccaacata 120

taaaaagaca agcccgaaca gtcgtccggg ctttttttct cgagccaggc atcaaataaa 180

acgaaaggct cagtcgaaag actgggcctt tcgttttatc tgtttttgtc ggtgaacgct 240

ctctactaga gtcacactgg ctcaccttcg ggtgggcctt tctgcgttta tatctgcag 299

<210> 16

<211> 299

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

actagttaac accgtgcgtg ttgactattt tacctctggc ggtgataatg gttgcaaatt 60

ctctgactgg caatttcatt ttctgttggg ccattgcatt gccactgatt ttccaacata 120

taaaaagaca agcccgaaca gtcgtccggg ctttttttct cgagccaggc atcaaataaa 180

acgaaaggct cagtcgaaag actgggcctt tcgttttatc tgtttttgtc ggtgaacgct 240

ctctactaga gtcacactgg ctcaccttcg ggtgggcctt tctgcgttta tatctgcag 299

<210> 17

<211> 299

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

actagttaac accgtgcgtg ttgactattt tacctctggc ggtgataatg gttgcgacca 60

gaatatctac gctactcatt ttctgttggg ccattgcatt gccactgatt ttccaacata 120

taaaaagaca agcccgaaca gtcgtccggg ctttttttct cgagccaggc atcaaataaa 180

acgaaaggct cagtcgaaag actgggcctt tcgttttatc tgtttttgtc ggtgaacgct 240

ctctactaga gtcacactgg ctcaccttcg ggtgggcctt tctgcgttta tatctgcag 299

<210> 18

<211> 302

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

actagttaac accgtgcgtg ttgactattt tacctctggc ggtgataatg gttgcggtgt 60

ttttatcgat taaaatggac attttctgtt gggccattgc attgccactg attttccaac 120

atataaaaag acaagcccga acagtcgtcc gggctttttt tctcgagcca ggcatcaaat 180

aaaacgaaag gctcagtcga aagactgggc ctttcgtttt atctgttttt gtcggtgaac 240

gctctctact agagtcacac tggctcacct tcgggtgggc ctttctgcgt ttatatctgc 300

ag 302

<210> 19

<211> 299

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

actagttaac accgtgcgtg ttgactattt tacctctggc ggtgataatg gttgcttttt 60

cgctgcgtac tgtattcatt ttctgttggg ccattgcatt gccactgatt ttccaacata 120

taaaaagaca agcccgaaca gtcgtccggg ctttttttct cgagccaggc atcaaataaa 180

acgaaaggct cagtcgaaag actgggcctt tcgttttatc tgtttttgtc ggtgaacgct 240

ctctactaga gtcacactgg ctcaccttcg ggtgggcctt tctgcgttta tatctgcag 299

<210> 20

<211> 292

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

actagttaac accgtgcgtg ttgactattt tacctctggc ggtgataatg gttgcagaga 60

ccaaaggtct cgtttctgtt gggccattgc attgccactg attttccaac atataaaaag 120

acaagcccga acagtcgtcc gggctttttt tctcgagcca ggcatcaaat aaaacgaaag 180

gctcagtcga aagactgggc ctttcgtttt atctgttttt gtcggtgaac gctctctact 240

agagtcacac tggctcacct tcgggtgggc ctttctgcgt ttatatctgc ag 292

<210> 21

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

ttgcgagttt tgcttttgta tcagccat 28

<210> 22

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

gaaaatggct gatacaaaag caaaatc 27

<210> 23

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

ttgcaaattc tctgactggc aatttcat 28

<210> 24

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

gaaaatgaaa ttgccagtca gagaattt 28

<210> 25

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 25

ttgcgaccag aatatctacg ctactcat 28

<210> 26

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 26

gaaaatgagt agcgtagata ttctggtc 28

<210> 27

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 27

ttgcggtgtt tttatcgatt aaaatggaca t 31

<210> 28

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 28

gaaaatgtcc attttaatcg ataaaaacac c 31

<210> 29

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 29

ttgctttttc gctgcgtact gtattcat 28

<210> 30

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 30

gaaaatgaat acagtacgca cgaaaaa 27

<210> 31

<211> 2167

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 31

ggatccttga gatccttttt ttctgcgcgt aatctgctgc ttgcaaacaa aaaaaccacc 60

gctaccagcg gtggtttgtt tgccggatca agagctacca actctttttc cgaaggtaac 120

tggcttcagc agagcgcaga taccaaatac tgtccttcta gtgtagccgt agttaggcca 180

ccacttcaag aactctgtag caccgcctac atacctcgct ctgctaatcc tgttaccagt 240

ggctgctgcc agtggcgata agtcgtgtct taccgggttg gactcaagac gatagttacc 300

ggataaggcg cagcggtcgg gctgaacggg gggttcgtgc acacagccca gcttggagcg 360

aacgacctac accgaactga gatacctaca gcgtgagcta tgagaaagcg ccacgcttcc 420

cgaagggaga aaggcggaca ggtatccggt aagcggcagg gtcggaacag gagagcgcac 480

gagggagctt ccagggggaa acgcctggta tctttatagt cctgtcgggt ttcgccacct 540

ctgacttgag cgtcgatttt tgtgatgctc gtcagggggg cggagcctat ggaaaaagct 600

tgaagatcct ttgatctttt ctacggggtc tgacgctcag tggaacgaaa actcacgtta 660

agggattttg gtcatgagat tatcaaaaag gatcttcacc tagatccttt taaattaaaa 720

atgaagtttt aaatcaatct aaagtatata tgagtaaact tggtctgaca gttaccaatg 780

cttaatcagt gaggcaccta tctcagcgat ctgtctattt cgttcatcca tagttgcctg 840

actccccgtc gtgtagataa ctacgatacg ggagggctta ccatctggcc ccagtgctgc 900

aatgataccg cgagacccac gctcaccggc tccagattta tcagcaataa accagccagc 960

cggaagggcc gagcgcagaa gtggtcctgc aactttatcc gcctccatcc agtctattaa 1020

ttgttgccgg gaagctagag taagtagttc gccagttaat agtttgcgca acgttgttgc 1080

cattgctaca ggcatcgtgg tgtcacgctc gtcgtttggt atggcttcat tcagctccgg 1140

ttcccaacga tcaaggcgag ttacatgatc ccccatgttg tgcaaaaaag cggttagctc 1200

cttcggtcct ccgatcgttg tcagaagtaa gttggccgca gtgttatcac tcatggttat 1260

ggcagcactg cataattctc ttactgtcat gccatccgta agatgctttt ctgtgactgg 1320

tgagtactca accaagtcat tctgagaata gtgtatgcgg cgaccgagtt gctcttgccc 1380

ggcgtcaata cgggataata ccgcgccaca tagcagaact ttaaaagtgc tcatcattgg 1440

aaaacgttct tcggggcgaa aactctcaag gatcttaccg ctgttgagat ccagttcgat 1500

ataacccact cgtgcaccca actgatcttc agcatctttt actttcacca gcgtttctgg 1560

gtgagcaaaa acaggaaggc aaaatgccgc aaaaaaggga ataagggcga cacggaaatg 1620

ttgaatactc atactcttcc tttttcaata ttattgaagc atttatcagg gttattgtct 1680

catgagcgga tacatatttg aatgtattta gaaaaataaa caaatagggg ttccgcgcac 1740

atttccccga aaagtgccac ctgacgtcta agaaaccatt attatcatga cattaaccta 1800

taaaaatagg cgtatcacga ggcagaattt cagataaaaa aaatccttag ctttcgctaa 1860

ggatgatttc tggaattcgc ggccgcttct agagtactag tagcggccgc tgcagtccgg 1920

caaaaaaggg caaggtgtca ccaccctgcc ctttttcttt aaaaccgaaa agattacttc 1980

gcgttatgca ggcttcctcg ctcactgact cgctgcgctc ggtcgttcgg ctgcggcgag 2040

cggtatcagc tcactcaaag gcggtaatac ggttatccac agaatcaggg gataacgcag 2100

gaaagaacat gtgagcaaaa ggccagcaaa aggccaggaa ccgtaaaaag gccgcgttgc 2160

tggcgtt 2167

<210> 32

<211> 2070

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 32

tactagtagc ggccgctgca gtccggcaaa aaagggcaag gtgtcaccac cctgcccttt 60

ttctttaaaa ccgaaaagat tacttcgcgt tatgcaggct tcctcgctca ctgactcgct 120

gcgctcggtc gttcggctgc ggcgagcggt atcagctcac tcaaaggcgg taatacggtt 180

atccacagaa tcaggggata acgcaggaaa gaacatgtga gcaaaaggcc agcaaaaggc 240

caggaaccgt aaaaaggccg cgttgctggc gtttttccac aggctccgcc cccctgacga 300

gcatcacaaa aatcgacgct caagtcagag gtggcgaaac ccgacaggac tataaagata 360

ccaggcgttt ccccctggaa gctccctcgt gcgctctcct gttccgaccc tgccgcttac 420

cggatacctg tccgcctttc tcccttcggg aagcgtggcg ctttctcata gctcacgctg 480

taggtatctc agttcggtgt aggtcgttcg ctccaagctg ggctgtgtgc acgaaccccc 540

cgttcagccc gaccgctgcg ccttatccgg taactatcgt cttgagtcca acccggtaag 600

acacgactta tcgccactgg cagcagccac tggtaacagg attagcagag cgaggtatgt 660

aggcggtgct acagagttct tgaagtggtg gcctaactac ggctacacta gaagaacagt 720

atttggtatc tgcgctctgc tgaagccagt taccttcgga aaaagagttg gtagctcttg 780

atccggcaaa caaaccaccg ctggtagcgg tggttttttt gtttgcaagc agcagattac 840

gcgcagaaaa aaaggatctc aagaagatcc tttgatcttt tctacggggt ctgacgctca 900

gtggaacgaa aactcacgtt aagggatttt ggtcatgaga ttatcaaaaa ggatcttcac 960

ctagatcctt ttaaattaaa aatgaagttt taaatcaatc taaagtatat atgagtaaac 1020

ttggtctgac agctcgaggc ttggattctc accaataaaa aacgcccggc ggcaaccgag 1080

cgttctgaac aaatccagat ggagttctga ggtcattact ggatctatca acaggagtcc 1140

aagcgagctc gatatcaaat tacgccccgc cctgccactc atcgcagtac tgttgtaatt 1200

cattaagcat tctgccgaca tggaagccat cacaaacggc atgatgaacc tgaatcgcca 1260

gcggcatcag caccttgtcg ccttgcgtat aatatttgcc catggtgaaa acgggggcga 1320

agaagttgtc catattggcc acgtttaaat caaaactggt gaaactcacc cagggattgg 1380

ctgagacgaa aaacatattc tcaataaacc ctttagggaa ataggccagg ttttcaccgt 1440

aacacgccac atcttgcgaa tatatgtgta gaaactgccg gaaatcgtcg tggtattcac 1500

tccagagcga tgaaaacgtt tcagtttgct catggaaaac ggtgtaacaa gggtgaacac 1560

tatcccatat caccagctca ccgtctttca ttgccatacg aaattccgga tgagcattca 1620

tcaggcgggc aagaatgtga ataaaggccg gataaaactt gtgcttattt ttctttacgg 1680

tctttaaaaa ggccgtaata tccagctgaa cggtctggtt ataggtacat tgagcaactg 1740

actgaaatgc ctcaaaatgt tctttacgat gccattggga tatatcaacg gtggtatatc 1800

cagtgatttt tttctccatt ttagcttcct tagctcctga aaatctcgat aactcaaaaa 1860

atacgcccgg tagtgatctt atttcattat ggtgaaagtt ggaacctctt acgtgcccga 1920

tcaactcgag tgccacctga cgtctaagaa accattatta tcatgacatt aacctataaa 1980

aataggcgta tcacgaggca gaatttcaga taaaaaaaat ccttagcttt cgctaaggat 2040

gatttctgga attcgcggcc gcttctagag 2070

Claims (1)

1.一种提高IgG1抗体产量的方法，其特征是包括如下步骤：

(1)基因的体外合成和扩增：

从NCBI数据库获得来源于西妥昔单抗的lgG1的轻链和lgG1的重链，所述lgG1的轻链和重链的氨基酸序列分别在JCAT网站，通过输入：避免XbaI，NdeI，SpeI和HindIII限制性酶切位点为条件，得到优化后的lgG1的轻链和优化后的lgG1的重链的核苷酸序列，在体外合成和扩增；并将优化后的lgG1的轻链和优化后的重链连接成一条核苷酸序列；lgG1的轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；lgG1的重链的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；优化后的lgG1的轻链的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；优化后的lgG1的重链的核苷酸序列如SEQID NO.4所示；

(2)将步骤(1)获得的核苷酸序列连接到p2A4载体中得到p2A4-HL；p2A4载体的核苷酸序列如SEQ ID NO.31所示；

(3)sRNA的设计和组装：选择大肠杆菌三羧酸途径中5个相关基因序列并在JCAT网站，通过输入：避免XbaI，NdeI，SpeI和HindIII限制性酶切位点为条件，得到优化后的gltA、sdhA、sucB、sucD和fumC，5个相关基因的核苷酸序列；所述优化后的gltA的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；所述优化后的sdhA的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；所述优化后的sucB的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；所述优化后的sucD的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；所述优化后的fumC的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示；再分别从所述优化后的5个相关基因的核苷酸序列的ATG开始选择20-30nt寡核苷酸为模板，设计正向引物和反向引物，在正向引物5’端加上粘性末端TTGC，在反向引物5’端加上粘性末端GAAA，并通过自由能检测网站测结合自由能，使之在-30至-40k cal/mol，通过PCR，得到5个与所述20-30nt的寡核苷酸反向互补的核苷酸序列sRNA，分别为sRNA-1、sRNA-2、sRNA-3、sRNA-4和sRNA-5；使用golden gate方法将5个sRNA序列连接到sRNA接收体得到5个核苷酸序列，所述sRNA接收体的核苷酸序列如SEQ ID NO.20所示；

(4)分别将连接到sRNA接收体的sRNA序列连接到p3C5载体，分别得到p3C5-gltA、p3C5-sdhA、p3C5-sucB、p3C5-sucD、p3C5-fumC；所述p3C5载体的核苷酸序列如SEQ ID NO.32所示；

(5)将p3C5-gltA、p3C5-sdhA、p3C5-sucB、p3C5-sucD、p3C5-fumC分别与p2A4-HL一起导入大肠杆菌中，依次得到重组菌1、重组菌2、重组菌3、重组菌4和重组菌5；

(6)将重组菌1、重组菌2、重组菌3、重组菌4、重组菌5分别发酵，得到高产量IgG1抗体。

Images