CN113388558A - 高产IgG1的重组菌及构建方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了高产IgG1的重组菌及构建方法，利用合成生物学中的sRNA技术对大肠杆菌的糖酵解途径和三羧酸循环途径中基因表达进行微调，以提高IgG1抗体在大肠杆菌中的表达量。相较于以前的研究成果，目前缺少大肠杆菌的糖酵解途径和三羧酸循环途径对全长IgG1抗体表达影响的相关研究。本发明的重组菌可以提高IgG1的表达量；本发明的方法具有操作简便，方便，为大肠杆菌规模化生产IgG1抗体提供了新思路。

Description

高产IgG1的重组菌及构建方法

技术领域

本发明属于生物工程领域，特别是涉及一种IgG1的重组菌及构建方法。

背景技术

2016年生物制药市场营业额已达到2000亿美元，这一极高的市场营业额主要来自单克隆抗体和抗体片段，治疗性单克隆抗体占生物制药市场总销售额的40％以上。在已获得美国FDA和欧洲EMEA批准的单克隆抗体中，免疫球蛋白G(IgG)占绝大多数，因此人们对IgG的生产最为关注。

Cetuximab(西妥昔单抗)是一种与表皮生长因子受体(EGFR)结合的嵌合IgG1，可以用于治疗头颈癌，转移性结直肠癌和非小细胞肺癌。EGFR是表皮生长因子受体家族成员之一，是原癌基因C-ERBB1的表达产物。EGFR可以在细胞核中积累聚集，并对细胞增殖、DNA修复、肿瘤发生、炎症等产生影响。

目前，大多数IgG1抗体是在哺乳动物细胞系统中生产的。然而，由于糖基化的异质性、生产周期长，难以获得高产细胞系等原因，哺乳动物生产IgG1的发展受到了限制。与哺乳动物细胞相比，大肠杆菌具有生长快速、成本低廉、分子操作简单、可以实现高密度发酵等优势，成为生产IgG1抗体的潜在热门替代宿主。

糖酵解途径和三羧酸循环途径是大肠杆菌中碳源代谢的主要途径。糖酵解途径将葡萄糖转化为3-磷酸甘油醛、磷酸烯醇式丙酮酸、丙酮酸和乙酰辅酶A，从而为细胞生物合成提供关键的前体和能量。三羧酸循环是一系列催化乙酰辅酶A转化为二氧化碳的化学反应，用于释放储存的能量并为生物合成过程提供能量和某些氨基酸的前体。2003年发表在Metabolic Engineering期刊上的文献The effects of alternate optimal solutionsin constraint-based genome-scale metabolic models.发现了大肠杆菌总是存在功能上相似的替代性代谢路径。2014年发表在Plos Computational Biology期刊上的文献Essential plasticity and redundancy of metabolism unveiledby syntheticlethality analysis.公开了大肠杆菌中存在的替代性代谢路径用于增强环境变化前细胞的稳定性，但在特定的培养基条件下，一些代谢路径不是必需的。

但是目前缺少大肠杆菌碳源代谢对全长IgG1抗体表达影响的相关研究。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种高产IgG1的重组菌。

本发明的第二个目的是提供一种高产IgG1的重组菌的构建方法。

本发明的技术方案概述如下：

高产IgG1的重组菌的构建方法，包括如下步骤：

(1)基因的体外合成和扩增

从NCBI数据库获得来源于人源的西妥昔单抗轻链的氨基酸序列和西妥昔单抗重链的氨基酸序列，将所述西妥昔单抗轻链简称LC，将所述西妥昔单抗重链简称HC；

将所述LC的氨基酸序列在JCAT网站，通过输入：避免XbaI，NdeI，SpeI和HindIII限制性酶切位点为条件，得到优化后的LC；在优化后的LC的核苷酸序列5'、3'端分别加入NdeI限制性酶切位点和SpeI限制性酶切位点，得到加酶切位点的LC，在体外合成和扩增；

将所HC的氨基酸序列在JCAT网站，通过输入：避免XbaI，NdeI，SpeI和HindIII限制性酶切位点为条件，得到优化后的HC，在优化后的HC的核苷酸序列5'、3'端分别加入NdeI限制性酶切位点和SpeI限制性酶切位点，得到加酶切位点的HC，在体外合成和扩增；

所述LC的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；

所述HC的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；

所述加酶切位点的LC的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；

所述加酶切位点的HC的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；

sRNA接收体含有PR启动子、sRNA支架序列和转录终止子，

在sRNA接收体核苷酸序列5'端加入XbaI限制性酶切位点，3'端加入SpeI限制性酶切位点，得到加酶切位点的sRNA接收体，在体外合成和扩增；

所述加酶切位点的sRNA接收体的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；

(2)将步骤(1)获得的加酶切位点的LC和加酶切位点的HC分别连接到p2A4UV5载体中，得到p2A4UV5-LC和p2A4UV5-HC；将p2A4UV5-LC用SpeI和PstI限制酶进行酶切，将p2A4UV5-HC用XbaI和PstI限制酶进行酶切，将p2A4UV5-HC酶切的核苷酸片段连接到p2A4UV5-LC酶切的核苷酸片段的3'端，得到p2A4UV5-AB；将步骤(1)获得的所述加酶切位点的sRNA接收体的核苷酸序列连接到p3C5载体中得到p3C5sRNA；

所述p2A4UV5载体的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；

所述p3C5载体的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；

(3)设计引物anti-aceE-F和anti-aceE-R，通过Golden Gate方法将引物中的sRNA靶点结合序列插入p3C5sRNA的sRNA接收体的PR启动子和sRNA支架序列之间，得到包含有sRNA靶点的质粒p3C5sRNA-aceE；设计引物anti-aceF-F和anti-aceF-R，通过Golden Gate方法将引物中的sRNA靶点结合序列插入p3C5sRNA的sRNA接收体的PR启动子和sRNA支架序列之间，得到包含有sRNA靶点的质粒p3C5sRNA-aceF；设计引物anti-gltA-F和anti-gltA-R，通过Golden Gate方法将引物中的sRNA靶点结合序列插入p3C5sRNA的sRNA接收体的PR启动子和sRNA支架序列之间，得到包含有sRNA靶点的质粒p3C5sRNA-gltA；设计引物anti-acnA-F和anti-acnA-R，通过Golden Gate方法将引物中的sRNA靶点结合序列插入p3C5sRNA的sRNA接收体的PR启动子和sRNA支架序列之间，得到包含有sRNA靶点的质粒p3C5sRNA-ancA；设计引物anti-sucD-F和anti-sucD-R，通过Golden Gate方法将引物中的sRNA靶点结合序列插入p3C5sRNA的sRNA接收体的PR启动子和sRNA支架序列之间，得到包含有sRNA靶点的质粒p3C5sRNA-sucD；设计引物anti-fumC-F和anti-fumC-R，通过Golden Gate方法将引物中的sRNA靶点结合序列插入p3C5sRNA的sRNA接收体的PR启动子和sRNA支架序列之间，得到包含有sRNA靶点的质粒p3C5sRNA-fumC；

anti-aceE-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示,anti-aceE-R的核苷酸序列如SEQID NO.9所示；

anti-aceF-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示,anti-aceF-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示；

anti-gltA-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示,anti-gltA-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示；

anti-acnA-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示,anti-acnA-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示；

anti-sucD-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.16所示,anti-sucD-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.17所示；

anti-fumC-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.18所示,anti-fumC-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.19所示；

(4)将p2A4UV5-AB和p3C5sRNA-aceE导入大肠杆菌中，得到重组菌2；将p2A4UV5-AB和p3C5sRNA-aceF导入大肠杆菌中，得到重组菌3；将p2A4UV5-AB和p3C5sRNA-gltA导入大肠杆菌中，得到重组菌4；将p2A4UV5-AB和p3C5sRNA-acnA导入大肠杆菌中，得到重组菌5；将p2A4UV5-AB和p3C5sRNA-sucD导入大肠杆菌中，得到重组菌6；将p2A4UV5-AB和p3C5sRNA-fumC导入大肠杆菌中，得到重组菌7。

上述方法构建的高产IgG1的重组菌。

本发明的优点：

本发明的重组菌可以提高IgG1的表达量；本发明的重组菌的构建方法可以快速筛选出高表达IgG1的重组菌。

附图说明

图1为重组菌的IgG1表达量。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。

大肠杆菌MG1655(Escherichia coli MG1655)市售。

实施例1

高产IgG1的重组菌的构建方法，包括如下步骤：

(1)基因的体外合成和扩增

从NCBI数据库获得来源于人源的西妥昔单抗轻链的氨基酸序列和西妥昔单抗重链的氨基酸序列，将西妥昔单抗轻链简称LC，将西妥昔单抗重链简称HC；

将LC的氨基酸序列在JCAT网站，通过输入：避免XbaI，NdeI，SpeI和HindIII限制性酶切位点为条件，得到优化后的LC；在优化后的LC的核苷酸序列5'、3'端分别加入NdeI限制性酶切位点和SpeI限制性酶切位点，得到加酶切位点的LC，在体外合成和扩增；

将HC的氨基酸序列在JCAT网站，通过输入：避免XbaI，NdeI，SpeI和HindIII限制性酶切位点为条件，得到优化后的HC，在优化后的HC的核苷酸序列5'、3'端分别加入NdeI限制性酶切位点和SpeI限制性酶切位点，得到加酶切位点的HC，在体外合成和扩增；

LC的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；

HC的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；

加酶切位点的LC的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；

加酶切位点的HC的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；

sRNA接收体含有PR启动子、sRNA支架序列和转录终止子，

在sRNA接收体核苷酸序列5'端加入XbaI限制性酶切位点，3'端加入SpeI限制性酶切位点，得到加酶切位点的sRNA接收体，在体外合成和扩增；

所述加酶切位点的sRNA接收体的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；

(2)将步骤(1)获得的加酶切位点的LC和加酶切位点的HC分别连接到p2A4UV5载体中，得到p2A4UV5-LC和p2A4UV5-HC；将p2A4UV5-LC用SpeI和PstI限制酶进行酶切，将p2A4UV5-HC用XbaI和PstI限制酶进行酶切，将p2A4UV5-HC酶切的核苷酸片段连接到p2A4UV5-LC酶切的核苷酸片段的3'端，得到p2A4UV5-AB；将步骤(1)获得的所述加酶切位点的sRNA接收体的核苷酸序列连接到p3C5载体中得到p3C5sRNA；

所述p2A4UV5载体的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；

所述p3C5载体的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；

(3)设计引物anti-aceE-F和anti-aceE-R，通过Golden Gate方法将引物中的sRNA靶点结合序列插入p3C5sRNA的sRNA接收体的PR启动子和sRNA支架序列之间，得到包含有sRNA靶点的质粒p3C5sRNA-aceE；设计引物anti-aceF-F和anti-aceF-R，通过Golden Gate方法将引物中的sRNA靶点结合序列插入p3C5sRNA的sRNA接收体的PR启动子和sRNA支架序列之间，得到包含有sRNA靶点的质粒p3C5sRNA-aceF；设计引物anti-gltA-F和anti-gltA-R，通过Golden Gate方法将引物中的sRNA靶点结合序列插入p3C5sRNA的sRNA接收体的PR启动子和sRNA支架序列之间，得到包含有sRNA靶点的质粒p3C5sRNA-gltA；设计引物anti-acnA-F和anti-acnA-R，通过Golden Gate方法将引物中的sRNA靶点结合序列插入p3C5sRNA的sRNA接收体的PR启动子和sRNA支架序列之间，得到包含有sRNA靶点的质粒p3C5sRNA-ancA；设计引物anti-sucD-F和anti-sucD-R，通过Golden Gate方法将引物中的sRNA靶点结合序列插入p3C5sRNA的sRNA接收体的PR启动子和sRNA支架序列之间，得到包含有sRNA靶点的质粒p3C5sRNA-sucD；设计引物anti-fumC-F和anti-fumC-R，通过Golden Gate方法将引物中的sRNA靶点结合序列插入p3C5sRNA的sRNA接收体的PR启动子和sRNA支架序列之间，得到包含有sRNA靶点的质粒p3C5sRNA-fumC；

anti-aceE-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示,anti-aceE-R的核苷酸序列如SEQID NO.9所示；

anti-aceF-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示,anti-aceF-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示；

anti-gltA-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示,anti-gltA-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示；

anti-acnA-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示,anti-acnA-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示；

anti-sucD-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.16所示,anti-sucD-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.17所示；

anti-fumC-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.18所示,anti-fumC-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.19所示；

Golden Gate方法：

本实施例中的6对引物中的正向引物5’端都加上粘性末端TTGC，在反向引物5’端都加上粘性末端GAAA。

PCR反应如下(以anti-aceE-F、anti-aceE-R引物对为例)：

a.将anti-aceE-F和anti-aceE-R引物分别重悬于水中，使其浓度为100μM；

b.将5μL正向引物、5μL反向引物和90μL 30mM HEPES(pH＝7.8)混合；

c.放入PCR仪中，95℃5min，然后以0.1℃/秒的速度降至4℃

即可获得sRNA靶点结合序列。

Golden gate反应混合液：

p3C5sRNA——1μL(200ng/μL)

稀释后的sRNA靶点结合序列(上述sRNA靶点结合序列稀释十倍)——0.5μL

T4 Ligase Buffer——2μL

T4 ligase——1μL

BsaI——1μL

水——14.5μL

Golden gate PCR程序：

1.37℃10min，然后16℃10min，步骤1循环10次；2.50℃5min；3.65℃20min；4.降温至4℃。

本实施例中的其它对引物都按Golden Gate方法分别得到得到包含有sRNA靶点的质粒。

(4)将p2A4UV5-AB和p3C5sRNA导入大肠杆菌MG1655中，得到重组菌1(对照)

将p2A4UV5-AB和p3C5sRNA-aceE导入大肠杆菌MG1655中，得到重组菌2；

将p2A4UV5-AB和p3C5sRNA-aceF导入大肠杆菌MG1655中，得到重组菌3；

将p2A4UV5-AB和p3C5sRNA-gltA导入大肠杆菌MG1655中，得到重组菌4；

将p2A4UV5-AB和p3C5sRNA-acnA导入大肠杆菌MG1655中，得到重组菌5；

将p2A4UV5-AB和p3C5sRNA-sucD导入大肠杆菌MG1655中，得到重组菌6；

将p2A4UV5-AB和p3C5sRNA-fumC导入大肠杆菌MG1655中，得到重组菌7。

实施例2

实施例1制备的重组菌1、重组菌2、重组菌3、重组菌4、重组菌5、重组菌6、重组菌7发酵：

(1)将重组菌1(对照)、重组菌2、重组菌3、重组菌4、重组菌5、重组菌6、重组菌7分别发酵，得到发酵液WT、saceE、saceF、sgltA、sacnA、ssucD、sfumC；

发酵过程：将重组菌1(对照)、重组菌2、重组菌3、重组菌4、重组菌5、重组菌6、重组菌7，分别在含有(100μg/ml氨苄青霉素和34μg/ml氯霉素)的LB液体加葡萄糖的培养基(1升LB液体培养基中加10克葡萄糖)中培养，37℃和220rpm下培养16小时；将培养物以1:100比例转接入含有50mLLB培养基的250mL摇瓶中，并在37℃下生长。当600nm处的光密度(OD600)达到约0.6时，加入异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)，使其终浓度为1mM，并在25℃和200rpm下生长16小时。

(2)粗蛋白液的提取；

将得到的WT、saceE、saceF、sgltA、sacnA、ssucD、sfumC发酵液在4℃和6500rpm下离心收集沉淀。细胞用0.01M PBS(pH＝7.0)洗涤。WT、saceE、saceF、sgltA、sacnA、ssucD、sfumC沉淀用0.01M PBS(pH＝7.0)重悬细胞并进行超声破碎处理，5s脉冲，10s间歇，总工作时间为20分钟。然后，将细胞裂解物在10,000rpm和4℃下离心10分钟，收集上清液。然后使用0.45μm滤膜进行过滤。得到粗蛋白液WT、saceE、saceF、sgltA、sacnA、ssucD、sfumC。

(3)ELISA(酶联免疫吸附剂测定，采用Matriks Biotek Cetuximab ElisaSHIKARI Q-CET试剂盒)；

第一步：96孔板，每孔加入100μl Assay Buffer，分别将10μl步骤(2)获得的粗蛋白液放入孔中，3个平行；再将10μl浓度分别是0μg/ml、10μg/ml、30μg/ml、100μg/ml、300μg/ml西妥昔单抗标准品加入孔中，3个平行；轻轻摇板进行简单混合，用封板膜封住反应孔，室温下孵化30min。

第二步：揭掉封板膜，吸弃孔内液体。用300μl稀释的Wash Buffer洗涤3次，在干净的纸上拍干。

第三步：每孔加入100μl准备好的HRP Conjugate。

第四步：用新的封板膜密封。室温孵化30min。

第五步：重复第二步。

第六步：每孔加入100μl TMB Substrate Solution。

第七步：黑暗条件下室温孵化10min(不封膜)。

第八步：加入100μl Stop Solution停止反应。轻轻摇板进行简单混合，孔内颜色由蓝变黄。

第九步：以空白孔调零，30min内使用酶标仪在450nm测定每孔的吸光度，见图1。

序列表

<110> 天津大学

<120> 高产IgG1的重组菌及构建方法

<160> 19

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 237

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens )

<400> 1

Met Lys Lys Asn Ile Ala Phe Leu Leu Ala Ser Met Phe Val Phe Ser

1 5 10 15

Ile Ala Thr Asn Ala Tyr Ala Asp Ile Leu Leu Thr Gln Ser Pro Val

20 25 30

Ile Leu Ser Val Ser Pro Gly Glu Arg Val Ser Phe Ser Cys Arg Ala

35 40 45

Ser Gln Ser Ile Gly Thr Asn Ile His Trp Tyr Gln Gln Arg Thr Asn

50 55 60

Gly Ser Pro Arg Leu Leu Ile Lys Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser Gly

65 70 75 80

Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu

85 90 95

Ser Ile Asn Ser Val Glu Ser Glu Asp Ile Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln

100 105 110

Gln Asn Asn Asn Trp Pro Thr Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu

115 120 125

Leu Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser

130 135 140

Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn

145 150 155 160

Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala

165 170 175

Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys

180 185 190

Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp

195 200 205

Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu

210 215 220

Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

225 230 235

<210> 2

<211> 471

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens )

<400> 2

Met Lys Lys Asn Ile Ala Phe Leu Leu Ala Ser Met Phe Val Phe Ser

1 5 10 15

Ile Ala Thr Asn Ala Tyr Ala Gln Val Gln Leu Lys Gln Ser Gly Pro

20 25 30

Gly Leu Val Gln Pro Ser Gln Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser

35 40 45

Gly Phe Ser Leu Thr Asn Tyr Gly Val His Trp Val Arg Gln Ser Pro

50 55 60

Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp Ser Gly Gly Asn Thr

65 70 75 80

Asp Tyr Asn Thr Pro Phe Thr Ser Arg Leu Ser Ile Asn Lys Asp Asn

85 90 95

Ser Lys Ser Gln Val Phe Phe Lys Met Asn Ser Leu Gln Ser Asn Asp

100 105 110

Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Arg Ala Leu Thr Tyr Tyr Asp Tyr Glu

115 120 125

Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Ser

130 135 140

Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr

145 150 155 160

Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro

165 170 175

Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val

180 185 190

His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser

195 200 205

Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile

210 215 220

Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val

225 230 235 240

Glu Pro Lys Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro

245 250 255

Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys

260 265 270

Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val

275 280 285

Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp

290 295 300

Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr

305 310 315 320

Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp

325 330 335

Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu

340 345 350

Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg

355 360 365

Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys

370 375 380

Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp

385 390 395 400

Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys

405 410 415

Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser

420 425 430

Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser

435 440 445

Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser

450 455 460

Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

465 470

<210> 3

<211> 722

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

catatgaaaa agaacatagc gtttcttctt gcatctatgt tcgttttttc tattgctaca 60

aacgcgtatg cagacatcct gctgacccag tctccggtta tcctgtctgt ttctccgggt 120

gaacgtgttt ctttctcttg ccgtgcttct cagtctatcg gtaccaacat ccactggtac 180

cagcagcgta ccaacggttc tccgcgtctg ctgatcaaat acgcttctga atctatctct 240

ggtatcccgt ctcgtttctc tggttctggt tctggtaccg acttcaccct gtctatcaac 300

tctgttgaat ctgaagacat cgctgactac tactgccagc agaacaacaa ctggccgacc 360

accttcggtg ctggtaccaa actggaactg aaacgtaccg ttgctgctcc gtctgttttc 420

atcttcccgc cgtctgacga acagctgaaa tctggtaccg cttctgttgt ttgcctgctg 480

aacaacttct acccgcgtga agctaaagtt cagtggaaag ttgacaacgc tctgcagtct 540

ggtaactctc aggaatctgt taccgaacag gactctaaag actctaccta ctctctgtct 600

tctaccctga ccctgtctaa agctgactac gaaaaacaca aagtttacgc ttgcgaagtt 660

acccaccagg gtctgtcttc tccggttacc aaatctttca accgtggtga atgctaacta 720

gt 722

<210> 4

<211> 1424

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

catatgaaaa agaacatagc gtttcttctt gcatctatgt tcgttttttc tattgctaca 60

aacgcgtatg cacaggttca gctgaaacag tctggtccgg gtctggttca gccgtctcag 120

tctctgtcta tcacctgcac cgtttctggt ttctctctga ccaactacgg tgttcactgg 180

gttcgtcagt ctccgggtaa aggtctggaa tggctgggtg ttatctggtc tggtggtaac 240

accgactaca acaccccgtt cacctctcgt ctgtctatca acaaagacaa ctctaaatct 300

caggttttct tcaaaatgaa ctctctgcag tctaacgaca ccgctatcta ctactgcgct 360

cgtgctctga cctactacga ctacgaattt gcttactggg gtcagggtac tctcgttacc 420

gtaagcgctg cttctaccaa aggtccgtct gttttcccgc tggctccgtc ttctaaatct 480

acctctggtg gtaccgctgc tctgggttgc ctggttaaag actacttccc ggaaccggtt 540

accgtttctt ggaactctgg tgctctgacc tctggtgttc acaccttccc ggctgttctg 600

cagtcttctg gtctgtactc tctgtcttct gttgttaccg ttccgtcttc ttctctgggt 660

acccagacct acatctgcaa cgttaaccac aaaccgtcta acaccaaagt tgacaaacgt 720

gttgaaccga aatctgacaa aacccacacc tgcccgccgt gcccggctcc ggaactgctg 780

ggtggtccgt ctgttttcct gttcccgccg aaaccgaaag acaccctgat gatctctcgt 840

accccggaag ttacctgcgt tgttgttgac gtttctcacg aagacccgga agttaaattc 900

aactggtacg ttgacggtgt tgaagttcac aacgctaaaa ccaaaccgcg tgaagaacag 960

tacaactcta cctaccgtgt tgtttctgtt ctgaccgttc tgcaccagga ctggctgaac 1020

ggtaaagaat acaaatgcaa agtttctaac aaagctctgc cggctccgat cgaaaaaacc 1080

atctctaaag ctaaaggtca gccgagggag ccgcaggtat acaccctccc gccgtctcgt 1140

gacgaactga ccaaaaacca ggtttctctg acctgcctgg ttaaaggttt ctacccgtct 1200

gacatcgctg ttgaatggga atctaacggt cagccggaaa acaactacaa aaccaccccg 1260

ccggttctgg actctgacgg ttctttcttc ctgtactcta aactgaccgt tgacaaatct 1320

cgttggcagc agggtaacgt tttctcttgc tctgttatgc acgaagctct gcacaaccac 1380

tacacccaga aatctctgtc tctgtctccg ggtaaataac tagt 1424

<210> 5

<211> 292

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

tctagataac accgtgcgtg ttgactattt tacctctggc ggtgataatg gttgcagaga 60

ccaaaggtct cgtttctgtt gggccattgc attgccactg attttccaac atataaaaag 120

acaagcccga acagtcgtcc gggctttttt tctcgagcca ggcatcaaat aaaacgaaag 180

gctcagtcga aagactgggc ctttcgtttt atctgttttt gtcggtgaac gctctctact 240

agagtcacac tggctcacct tcgggtgggc ctttctgcgt ttatatacta gt 292

<210> 6

<211> 3544

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ggatccttga gatccttttt ttctgcgcgt aatctgctgc ttgcaaacaa aaaaaccacc 60

gctaccagcg gtggtttgtt tgccggatca agagctacca actctttttc cgaaggtaac 120

tggcttcagc agagcgcaga taccaaatac tgtccttcta gtgtagccgt agttaggcca 180

ccacttcaag aactctgtag caccgcctac atacctcgct ctgctaatcc tgttaccagt 240

ggctgctgcc agtggcgata agtcgtgtct taccgggttg gactcaagac gatagttacc 300

ggataaggcg cagcggtcgg gctgaacggg gggttcgtgc acacagccca gcttggagcg 360

aacgacctac accgaactga gatacctaca gcgtgagcta tgagaaagcg ccacgcttcc 420

cgaagggaga aaggcggaca ggtatccggt aagcggcagg gtcggaacag gagagcgcac 480

gagggagctt ccagggggaa acgcctggta tctttatagt cctgtcgggt ttcgccacct 540

ctgacttgag cgtcgatttt tgtgatgctc gtcagggggg cggagcctat ggaaaaagct 600

tgaagatcct ttgatctttt ctacggggtc tgacgctcag tggaacgaaa actcacgtta 660

agggattttg gtcatgagat tatcaaaaag gatcttcacc tagatccttt taaattaaaa 720

atgaagtttt aaatcaatct aaagtatata tgagtaaact tggtctgaca gttaccaatg 780

cttaatcagt gaggcaccta tctcagcgat ctgtctattt cgttcatcca tagttgcctg 840

actccccgtc gtgtagataa ctacgatacg ggagggctta ccatctggcc ccagtgctgc 900

aatgataccg cgagacccac gctcaccggc tccagattta tcagcaataa accagccagc 960

cggaagggcc gagcgcagaa gtggtcctgc aactttatcc gcctccatcc agtctattaa 1020

ttgttgccgg gaagctagag taagtagttc gccagttaat agtttgcgca acgttgttgc 1080

cattgctaca ggcatcgtgg tgtcacgctc gtcgtttggt atggcttcat tcagctccgg 1140

ttcccaacga tcaaggcgag ttacatgatc ccccatgttg tgcaaaaaag cggttagctc 1200

cttcggtcct ccgatcgttg tcagaagtaa gttggccgca gtgttatcac tcatggttat 1260

ggcagcactg cataattctc ttactgtcat gccatccgta agatgctttt ctgtgactgg 1320

tgagtactca accaagtcat tctgagaata gtgtatgcgg cgaccgagtt gctcttgccc 1380

ggcgtcaata cgggataata ccgcgccaca tagcagaact ttaaaagtgc tcatcattgg 1440

aaaacgttct tcggggcgaa aactctcaag gatcttaccg ctgttgagat ccagttcgat 1500

ataacccact cgtgcaccca actgatcttc agcatctttt actttcacca gcgtttctgg 1560

gtgagcaaaa acaggaaggc aaaatgccgc aaaaaaggga ataagggcga cacggaaatg 1620

ttgaatactc atactcttcc tttttcaata ttattgaagc atttatcagg gttattgtct 1680

catgagcgga tacatatttg aatgtattta gaaaaataaa caaatagggg ttccgcgcac 1740

atttccccga aaagtgccac ctgacgtcgc gttgcgctca ctgcccgctt tccagtcggg 1800

aaacctgtcg tgccagctgc attaatgaat cggccaacgc gcggggagag gcggtttgcg 1860

tattgggcgc cagggtggtt tttcttttca ccagtgagac gggcaacagc tgattgccct 1920

tcaccgcctg gccctgagag agttgcagca agcggtccac gctggtttgc cccagcaggc 1980

gaaaatcctg tttgatggtg gttaacggcg ggatataaca tgagctgtct tcggtatcgt 2040

cgtatcccac taccgagata tccgcaccaa cgcgcagccc ggactcggta atggcgcgca 2100

ttgcgcccag cgccatctga tcgttggcaa ccagcatcgc agtgggaacg atgccctcat 2160

tcagcatttg catggtttgt tgaaaaccgg acatggcact ccagtcgcct tcccgttccg 2220

ctatcggctg aatttgattg cgagtgagat atttatgcca gccagccaga cgcagacgcg 2280

ccgagacaga acttaatggg cccgctaaca gcgcgatttg ctggtgaccc aatgcgacca 2340

gatgctccac gcccagtcgc gtaccgtctt catgggagaa aataatactg ttgatgggtg 2400

tctggtcaga gacatcaaga aataacgccg gaacattagt gcaggcagct tccacagcaa 2460

tggcatcctg gtcatccagc ggatagttaa tgatcagccc actgacgcgt tgcgcgagaa 2520

gattgtgcac cgccgcttta caggcttcga cgccgcttcg ttctaccatc gacaccacca 2580

cgctggcacc cagttgatcg gcgcgagatt taatcgccgc gacaatttgc gacggcgcgt 2640

gcagggccag actggaggtg gcaacgccaa tcagcaacga ctgtttgccc gccagttgtt 2700

gtgccacgcg gttgggaatg taattcagct ccgccatcgc cgcttccact ttttcccgcg 2760

ttttcgcaga aacgtggctg gcctggttca ccacgcggga aacggtctga taagagacac 2820

cggcatactc tgcgacatcg tataacgtta ctggtttcac attcaccacc ctgaattgac 2880

tctcttccgg gcgctatcat gccataccgc gaaaggtttt gcgccattcg atggtgtccg 2940

ggatctattt cagataaaaa aaatccttag ctttcgctaa ggatgatttc tggaattcgc 3000

cgctcctagg ccgatggcgc gccgagaggc tttacacttt atgcttccgg ctcgtataat 3060

gtgtggaatt gtgagcggat aacaatttct agaaataatt ttgtttaact ttaagaagga 3120

gatatacata tgtaactagt gactcgagcc aggcatcaaa taaaacgaaa ggctcagtcg 3180

aaagactggg cctttcgttt tatctgtttt tgtcggtgaa cgctctctac tagagtcaca 3240

ctggctcacc ttcgggtggg cctttctgcg tttatagcta gcgcctctgc agtccggcaa 3300

aaaagggcaa ggtgtcacca ccctgccctt tttctttaaa accgaaaaga ttacttcgcg 3360

ttatgcaggc ttcctcgctc actgactcgc tgcgctcggt cgttcggctg cggcgagcgg 3420

tatcagctca ctcaaaggcg gtaatacggt tatccacaga atcaggggat aacgcaggaa 3480

agaacatgtg agcaaaaggc cagcaaaagg ccaggaaccg taaaaaggcc gcgttgctgg 3540

cgtt 3544

<210> 7

<211> 2778

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

tgccacctga cgtctaagaa aaggaatatt cagcaatttg cccgtgccga agaaaggccc 60

acccgtgaag gtgagccagt gagttgattg ctacgtaatt agttagttag cccttagtga 120

ctcgaattcg cggccgcttc tagaaataat tttgtttaac tttaagaagg agatatacat 180

atgtaactag tagcggccgc ctgcaggagt cactaagggt tagttagtta gattagcaga 240

aagtcaaaag cctccgaccg gaggcttttg actaaaactt cccttggggt tatcattggg 300

gctcactcaa aggcggtaat cagataaaaa aaatccttag ctttcgctaa ggatgatttc 360

tgctagagat ggaatagact ggatggaggc ggataaagtt gcaggaccac ttctgcgctc 420

ggcccttccg gctggctggt ttattgctga taaatctgga gccggtgagc gtgggtctcg 480

cggtatcatt gcagcactgg ggccagatgg taagccctcc cgtatcgtag ttatctacac 540

gacggggagt caggcaacta tggatgaacg aaatagacag atcgctgaga taggtgcctc 600

actgattaag cattggtaac tgtcagacca agtttactca tatatacttt agattgattt 660

aaaacttcat ttttaattta aaaggatcta ggtgaagatc ctttttgata atctcatgac 720

caaaatccct taacgtgagt tttcgttcca ctgagcgtca gaccccttaa taagatgatc 780

ttcttgagat cgttttggtc tgcgcgtaat ctcttgctct gaaaacgaaa aaaccgcctt 840

gcagggcggt ttttcgaagg ttctctgagc taccaactct ttgaaccgag gtaactggct 900

tggaggagcg cagtcaccaa aacttgtcct ttcagtttag ccttaaccgg cgcatgactt 960

caagactaac tcctctaaat caattaccag tggctgctgc cagtggtgct tttgcatgtc 1020

tttccgggtt ggactcaaga cgatagttac cggataaggc gcagcggtcg gactgaacgg 1080

ggggttcgtg catacagtcc agcttggagc gaactgccta cccggaactg agtgtcaggc 1140

gtggaatgag acaaacgcgg ccataacagc ggaatgacac cggtaaaccg aaaggcagga 1200

acaggagagc gcacgaggga gccgccaggg gaaacgcctg gtatctttat agtcctgtcg 1260

ggtttcgcca ccactgattt gagcgtcaga tttcgtgatg cttgtcaggg gggcggagcc 1320

tatggaaaaa cggctttgcc gcggccctct cacttccctg ttaagtatct tcctggcatc 1380

ttccaggaaa tctccgcccc gttcgtaagc catttccgct cgccgcagtc gaacgaccga 1440

gcgtagcgag tcagtgagcg aggaagcgga atatatcctg tatcacatat tctgctgacg 1500

caccggtgca gccttttttc tcctgccaca tgaagcactt cactgacacc ctcatcagtg 1560

ccaacatagt aagccagtat acactccgct agcgctgagg tctgcctcgt gaagaaggtg 1620

ttgctgactc ataccaggcc tgaatcgccc catcatccag ccagaaagtg agggagccac 1680

ggttgatgag agctttgttg taggtggacc agttggtgat tttgaacttt tgctttgcca 1740

cggaacggtc tgcgttgtcg ggaagatgcg tgatctgatc cttcaactca gcaaaagttc 1800

gatttattca acaaagccac gttgtgtctc aaaatctctg atgttacatt gcacaagata 1860

aaaatatatc atcatgaaca ataaaactgt ctgcttacat aaacagtaat acaaggggtg 1920

tttactagag gttgatcggg cacgtaagag gttccaactt tcaccataat gaaataagat 1980

cactaccggg cgtatttttt gagttatcga gattttcagg agctaaggaa gctaaaatgg 2040

agaaaaaaat cacgggatat accaccgttg atatatccca atggcatcgt aaagaacatt 2100

ttgaggcatt tcagtcagtt gctcaatgta cctataacca gaccgttcag ctggatatta 2160

cggccttttt aaagaccgta aagaaaaata agcacaagtt ttatccggcc tttattcaca 2220

ttcttgcccg cctgatgaac gctcacccgg agtttcgtat ggccatgaaa gacggtgagc 2280

tggtgatctg ggatagtgtt cacccttgtt acaccgtttt ccatgagcaa actgaaacgt 2340

tttcgtccct ctggagtgaa taccacgacg atttccggca gtttctccac atatattcgc 2400

aagatgtggc gtgttacggt gaaaacctgg cctatttccc taaagggttt attgagaata 2460

tgttttttgt ctcagccaat ccctgggtga gtttcaccag ttttgattta aacgtggcca 2520

atatggacaa cttcttcgcc cccgttttca cgatgggcaa atattatacg caaggcgaca 2580

aggtgctgat gccgctggcg atccaggttc atcatgccgt ttgtgatggc ttccatgtcg 2640

gccgcatgct taatgaatta caacagtact gtgatgagtg gcagggcggg gcgtaataat 2700

actagctccg gcaaaaaaac gggcaaggtg tcaccaccct gccctttttc tttaaaaccg 2760

aaaagattac ttcgcgtt 2778

<210> 8

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

ttgcgtcatt tgggaaacgt tctgacat 28

<210> 9

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

gaaaatgtca gaacgtttcc caaatgac 28

<210> 10

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

ttgccggtac tttgatttcg atagccat 28

<210> 11

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

gaaaatggct atcgaaatca aagtaccg 28

<210> 12

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

ttgcgagttt tgcttttgta tcagccat 28

<210> 13

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

gaaaatggct gatacaaaag caaaactc 28

<210> 14

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

ttgcttctcg tagggttgac gacat 25

<210> 15

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

gaaaatgtcg tcaaccctac gagaa 25

<210> 16

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

ttgcggtgtt tttatcgatt aaaatggaca t 31

<210> 17

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

gaaaatgtcc attttaatcg ataaaaacac c 31

<210> 18

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

ttgctttttc gctgcgtact gtattcat 28

<210> 19

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

gaaaatgaat acagtacgca gcgaaaaa 28

Claims (2)

1.高产IgG1的重组菌的构建方法，其特征是包括如下步骤：

(1)基因的体外合成和扩增

从NCBI数据库获得来源于人源的西妥昔单抗轻链的氨基酸序列和西妥昔单抗重链的氨基酸序列，将所述西妥昔单抗轻链简称LC，将所述西妥昔单抗重链简称HC；

将所述LC的氨基酸序列在JCAT网站，通过输入：避免XbaI，NdeI，SpeI和HindIII限制性酶切位点为条件，得到优化后的LC；在优化后的LC的核苷酸序列5'、3'端分别加入NdeI限制性酶切位点和SpeI限制性酶切位点，得到加酶切位点的LC，在体外合成和扩增；

将所HC的氨基酸序列在JCAT网站，通过输入：避免XbaI，NdeI，SpeI和HindIII限制性酶切位点为条件，得到优化后的HC，在优化后的HC的核苷酸序列5'、3'端分别加入NdeI限制性酶切位点和SpeI限制性酶切位点，得到加酶切位点的HC，在体外合成和扩增；

所述LC的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；

所述HC的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；

所述加酶切位点的LC的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；

所述加酶切位点的HC的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；

sRNA接收体含有PR启动子、sRNA支架序列和转录终止子，

在sRNA接收体核苷酸序列5'端加入XbaI限制性酶切位点，3'端加入SpeI限制性酶切位点，得到加酶切位点的sRNA接收体，在体外合成和扩增；

所述加酶切位点的sRNA接收体的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；

(2)将步骤(1)获得的加酶切位点的LC和加酶切位点的HC分别连接到p2A4UV5载体中，得到p2A4UV5-LC和p2A4UV5-HC；将p2A4UV5-LC用SpeI和PstI限制酶进行酶切，将p2A4UV5-HC用XbaI和PstI限制酶进行酶切，将p2A4UV5-HC酶切的核苷酸片段连接到p2A4UV5-LC酶切的核苷酸片段的3'端，得到p2A4UV5-AB；将步骤(1)获得的所述加酶切位点的sRNA接收体的核苷酸序列连接到p3C5载体中得到p3C5sRNA；

所述p2A4UV5载体的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；

所述p3C5载体的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；

(3)设计引物anti-aceE-F和anti-aceE-R，通过GoldenGate方法将引物中的sRNA靶点结合序列插入p3C5sRNA的sRNA接收体的PR启动子和sRNA支架序列之间，得到包含有sRNA靶点的质粒p3C5sRNA-aceE；设计引物anti-aceF-F和anti-aceF-R，通过GoldenGate方法将引物中的sRNA靶点结合序列插入p3C5sRNA的sRNA接收体的PR启动子和sRNA支架序列之间，得到包含有sRNA靶点的质粒p3C5sRNA-aceF；设计引物anti-gltA-F和anti-gltA-R，通过GoldenGate方法将引物中的sRNA靶点结合序列插入p3C5sRNA的sRNA接收体的PR启动子和sRNA支架序列之间，得到包含有sRNA靶点的质粒p3C5sRNA-gltA；设计引物anti-acnA-F和anti-acnA-R，通过GoldenGate方法将引物中的sRNA靶点结合序列插入p3C5sRNA的sRNA接收体的PR启动子和sRNA支架序列之间，得到包含有sRNA靶点的质粒p3C5sRNA-ancA；设计引物anti-sucD-F和anti-sucD-R，通过GoldenGate方法将引物中的sRNA靶点结合序列插入p3C5sRNA的sRNA接收体的PR启动子和sRNA支架序列之间，得到包含有sRNA靶点的质粒p3C5sRNA-sucD；设计引物anti-fumC-F和anti-fumC-R，通过GoldenGate方法将引物中的sRNA靶点结合序列插入p3C5sRNA的sRNA接收体的PR启动子和sRNA支架序列之间，得到包含有sRNA靶点的质粒p3C5sRNA-fumC；

anti-aceE-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示,anti-aceE-R的核苷酸序列如SEQ IDNO.9所示；

anti-aceF-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示,anti-aceF-R的核苷酸序列如SEQ IDNO.11所示；

anti-gltA-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示,anti-gltA-R的核苷酸序列如SEQ IDNO.13所示；

anti-acnA-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示,anti-acnA-R的核苷酸序列如SEQ IDNO.15所示；

anti-sucD-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.16所示,anti-sucD-R的核苷酸序列如SEQ IDNO.17所示；

anti-fumC-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.18所示,anti-fumC-R的核苷酸序列如SEQ IDNO.19所示；

(4)将p2A4UV5-AB和p3C5sRNA-aceE导入大肠杆菌中，得到重组菌2；将p2A4UV5-AB和p3C5sRNA-aceF导入大肠杆菌中，得到重组菌3；将p2A4UV5-AB和p3C5sRNA-gltA导入大肠杆菌中，得到重组菌4；将p2A4UV5-AB和p3C5sRNA-acnA导入大肠杆菌中，得到重组菌5；将p2A4UV5-AB和p3C5sRNA-sucD导入大肠杆菌中，得到重组菌6；将p2A4UV5-AB和p3C5sRNA-fumC导入大肠杆菌中，得到重组菌7。

2.权利要求1的构建方法构建的高产IgG1的重组菌。

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