CN107109396A

CN107109396A - 使用合成调节性sRNA精细调节基因表达的方法

Info

Publication number: CN107109396A
Application number: CN201480081132.XA
Authority: CN
Inventors: 李相烨; 卢敏浩; 柳承珉
Original assignee: Korea Advanced Institute of Science and Technology KAIST
Current assignee: Korea Advanced Institute of Science and Technology KAIST
Priority date: 2014-06-11
Filing date: 2014-06-11
Publication date: 2017-08-29
Anticipated expiration: 2034-06-11
Also published as: CN107109396B; US10196644B2; WO2015190627A1; US20170130235A1

Abstract

本发明涉及在原核细胞中使用合成调节性sRNA精细调节基因表达水平的方法且更具体地涉及能够通过调节sRNA表达水平或sRNA与Hfq之间的结合亲和力进而精细调节靶基因表达水平来精细调节靶基因表达水平的合成调节性sRNA。根据本发明使用合成调节性sRNA精细调节基因表达水平的方法可通过调节sRNA表达水平或sRNA和Hfq之间的结合亲和力精细调节对靶基因表达的抑制程度且由此可同时、容易和快速地将多种靶基因组合通过用于调节基因表达的合成调节性sRNA应用于多种菌株而无需基因缺失且因此非常适于测量每种菌株的代谢能力并选择最佳菌株。另外，所述方法具有的优点是容易并快速地选择用于抑制基因表达的靶基因并表达所选基因至所需程度并因此可用于产生用于有效产生多种代谢物的重组菌株并建立用于有效产生的方法且因此是非常有用的。

Description

使用合成调节性sRNA精细调节基因表达的方法

技术领域

本发明涉及在原核细胞中使用合成调节性sRNA精细调节基因表达水平的方法且更具体地涉及能够通过调节sRNA表达水平或sRNA与Hfq之间的结合亲和力进而精细调节靶基因表达来精细调节靶基因表达的合成调节性sRNA。

背景技术

与环境问题和有限资源消耗有关的事项近年来在全球范围内快速增加。因此，构建环境友好和以可再生的生物体为基础的产生系统作为这些事项的替代越来越引起人们的兴趣。所述系统能够如下构建：调节生物体中的代谢途径来优化代谢流以产生所需代谢物，其中该过程需要多种分子生物学技术。有两种主要技术用于调节代谢途径，其中一种技术是增加生物合成过程所需要的酶的表达以加强代谢物产生所需要的代谢流，而另一种技术是阻断用于细胞生长和其它代谢物产生的代谢流并缺失用于靶代谢物产生的基因。目前广泛使用的基因敲除方法是待缺失的基因通过重组酶用任何具有同源序列的序列代替，由此使其功能丧失(Datsenko等人,PNAS,97(12):6640-6645,2000)。然而，该基因敲除方法具有多个问题。

首先，基因敲除方法需要数周至数月且基因表达仅能够通过开-关调节且基因缺失需要对每种菌株进行重复以应用于数种菌株。因此，其为代谢工程化研究中最费时的过程，其中多种情况必须通过实验确认。将突变引入到存在于染色体上的基因的启动子中以弱化活性的方法或用多种能够调节基因表达的启动子代替已有启动子的方法用作调节和抑制基因表达水平的方法。然而，这些方法也通过与基因敲除方法相同或类似的过程实施且因此其具有基因敲除方法由于染色体重组而带来的限制且与基因敲除方法不同，其还难以在突变启动子所引起的表达水平被直接鉴定前预测结果。因此，这些方法与简单的基因敲除方法相比可能需要更多的努力和时间。

为了克服该常规基因抑制方法的限制，已开发出短长度定制合成sRNA技术(Na,D等人,Nat.Biotechnol.,31(2),170-174,2013；Yoo,SM等人,Nat.Protoc.,8(9),1694-1707,2013)，其具有的优点是可容易地通过使用质粒而无需修饰靶菌株的染色体序列来减少靶基因表达并容易地以多重同时方式将相同的基因表达抑制应用于多种菌株。另外，该技术就构建、储存和应用而言是快速和简单的。

sRNA由Hfq结合序列和用于与靶基因的mRNA互补结合的碱基配对区(以下称作BPR)构成。为了调节靶基因表达，在常规技术中对BPR部分的结合游离能量进行计算以控制碱基序列长度和突变。这是有利的，因为BPR部分能够以靶基因的碱基序列信息为基础进行设计且合成sRNA能够通过一般基因重组方法容易地设计和构建。然而，为了精细调节基因表达至所需水平，sRNA的BPR部分需要针对每种靶基因重新设计且sRNA需要以重新设计的BPR部分为基础重新设计。另外，使用结合游离能量的策略具有的限制是难以精确地预测sRNA活性的变化。结合游离能量以sRNA和mRNA的序列为基础进行计算。在sRNA与mRNA的实际结合中，预测精确性可由于Hfq蛋白有助于sRNA与mRNA的结合而降低。另外，当结合序列由于sRNA和mRNA的二级结构而发生结构变化时，不可能预测表达抑制活性的程度。为了克服这些问题，应开发能够调节基因表达至所需水平而无论靶基因类型或BPR序列的通用系统。

因此，本发明人做出了努力以构建满足上述要求的通用基因表达调节系统且因此尝试了使其它元件突变同时固定BPR且因此通过引入具有多种强度活性的启动子并将突变应用于sRNA支架中的Hfq结合位点构建了通用基因表达调节系统。所确认的是，靶基因表达可通过引入多种组成性启动子以调节sRNA表达水平来调节且当引入诱导性启动子时，所确认的是，靶基因表达可通过将突变引入到sRNA支架的Hfq结合位点中来精细调节，由此完成本发明。

发明内容

本发明的目的是提供使用定制合成sRNA精细调节基因表达水平的方法，其能够精细调节靶基因mRNA表达且同时克服抑制基因表达的常规方法的限制。

附图说明

图1显示了包含基于pKK223-3质粒(其为用于sRNA表达的商购质粒)的SgrS支架的sRNA的重组。

图2显示了作为sRNA的SgrS的部分结构且显示了诱导突变的潜在靶标。在该序列的3’末端的‘UUUUUUUU’序列也为转录终止子和Hfq结合位点。

图3显示了用于表达基于pACYC184质粒(其为用于sRNA靶基因表达的商购质粒)的DsRed2基因的重组。

图4显示包含SgrS支架的合成sRNA有效地抑制DsRed2的表达。

图5显示靶向于DsRed2的合成sRNA的抑制能力是由碱基配对区(BPR)引起的。

图6显示抑制靶基因表达的效果的对数值与sRNA表达水平呈线性比例。

图7显示了当Hfq结合位点的茎环中茎的序列变化时sRNA表达抑制活性的变化。

图8显示了当Hfq结合位点的茎环中茎的长度变化时sRNA表达抑制活性的变化。

图9显示了当Hfq结合位点的茎环中环的序列变化时sRNA表达抑制活性的变化。

图10显示了当Hfq结合位点的UAUU序列变化时sRNA表达抑制活性的变化。

图11显示了当作为转录终止子和Hfq结合位点的U尾的长度变化时sRNA表达抑制活性的变化。

具体实施方式

除非另有定义，本说明书使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的技术人员所通常理解相同的含义。通常，本说明书使用的命名法和下述实验方法为本领域已知和常用的。

本发明的说明书使用的主要术语的定义等如下所述。

本申请使用的小RNA(以下称作“sRNA”)是在长度上通常具有200或更少碱基序列的短长度RNA，其不被翻译成蛋白且通过互补结合有效地抑制特异mRNA的翻译。

本申请使用的术语“基因”应以最广泛的含义理解且可编码结构性或调节性蛋白。在本申请中，调节性蛋白包括转录因子、热激蛋白或参与DNA/RNA复制、转录和/或翻译的蛋白。在本发明中，待作为用于抑制表达的靶标的靶基因可作为染色体外组分存在。

在一个方面，本发明涉及载体，其包含(a)启动子；(b)对与靶基因mRNA形成互补的碱基对的区进行编码的核酸；(c)对Hfq结合位点进行编码的由源自SgrS的sRNA的SEQ IDNO:91表示的核酸的野生型或突变sRNA支架；和(d)转录终止子。

本发明的启动子优选为仅当诱导剂存在时才发挥作用的诱导性启动子、总是发挥作用的组成性启动子和源自这些启动子的启动子(trc启动子或tac启动子)。当调节这些启动子的活性时，sRNA表达水平发生变化，由此可调节靶基因表达程度。在大多数基因中，sRNA表达水平通过引入多种组成性启动子控制且因此靶基因表达也可受到调节。作为组成性启动子，可使用由Chris Anderson生产的在Anderson启动子集合(http://partsregistry.org/Promoters/Catalog/Anderson)中建议的各种启动子。

本发明的突变sRNA支架控制sRNA和Hfq之间的结合亲和力以精细调节靶基因表达水平。当就微生物的存活而言至关重要的基因或抑制生长率的基因的表达被抑制时，需要构建其中表达sRNA的系统，仅当在诱导性启动子下需要时。然而，当引入诱导性启动子时，表达水平不容易控制。因此，在本发明中，靶基因表达水平优选通过Hfq结合位点的诱变来精细调节。

在本发明中，SgrS的sRNA支架的一些序列(图2)由SEQ ID NO:91表示并引起突变。sRNA和Hfq之间的结合亲和力如下调节：将作为第一茎区的在SEQ ID NO:91的5-8位的GGUG序列转换为GGAC、CCUG和CCUC或将GGUG 4nt转换为6nt和8nt。另外，其特征在于将作为SgrS的sRNA支架的第一环区的在SEQ ID NO:91的10-13位的AAAA序列转换为CCGG、CCCC、CCUU、GGGG、GGCC、GGUU、UUGG和UUUU或将作为Hfg结合位点的在SEQ ID NO:91的1-4位的UAUU序列转换为GAUU、UCUU、UACU、UAAU、UAUC、UAUA、GCCC、GCAC、GACC和GAAC。另外，其特征在于将作为转录终止子和SgrS的sRNA支架的Hfq结合位点的在SEQ ID NO:91的42-49位的U尾长度转换为4-8。

[SEQ ID NO:91]

5’-UAUUGGUGUAAAAUCACCCGCCAGCAGAUUAUACCUGCUGGUUUUUUUU-3’

本申请使用的术语“核酸”可指RNA、DNA、稳定化RNA或稳定化DNA。在本发明中，“编码”是指编码sRNA和与sRNA互补的核酸序列。

在本发明中，“载体”是指DNA构建体，其包含与适当的能够在适当的宿主中表达DNA的控制序列可操作地连接的DNA序列。载体可为质粒、噬菌体颗粒或仅为有效的基因组插入体。当载体在适当的宿主中转化时，载体可复制和发挥作用而无论宿主基因组或在一些情况下可与基因组本身合并。质粒是目前最常用的载体形式，由此本说明书的“质粒”和“载体”有时可互换使用。本发明优选使用质粒载体。可用于该目的的典型质粒载体具有的结构包含(a)用于有效复制进而在每个宿主细胞中包含数个至数百个质粒载体的复制区、(b)用于对用质粒载体转化的宿主细胞进行选择的抗生素抗性基因和(c)其中能够插入外源DNA片段的限制性酶裂解位点。即使不存在适当的限制性酶裂解位点，载体和外源DNA之间的连结也可如下容易地实现：根据一般方法使用合成寡核苷酸接头或连接子。连结后，需要将载体转化到适当的宿主细胞中。转化可容易地通过氯化钙法或电穿孔实现(Neumann等人,EMBO J.,1:841,1982)。作为根据本发明用于sRNA表达的载体，可使用本领域已知的表达载体。

核酸的碱基序列当其与另一个核酸序列以功能关系排列时被可操作地连接。例如，启动子或增强子直接影响序列的转录且置于适当的位置或与适当的位置连接进而在编码序列中是可操作的；且核糖体结合位点影响序列的转录并与编码序列连接进而在编码序列中是可操作的。编码前序列或分泌前导序列的DNA编码参与多肽分泌的前蛋白且与靶基因直接连接。通常，术语“可操作地连接”意为DNA序列是物理上连接的。另外，就分泌前导序列而言，其意为在前导框中接触和存在。然而，增强子不需要具有接触。这些序列之间的连接通过在方便的限制性酶位点进行连结(连接)来实施。当所述位点不存在时，根据常规方法使用合成寡核苷酸接头或连接子。

在另一个方面，本发明涉及用上述载体转化的重组微生物。

本申请使用的术语“转化”意为DNA作为染色体外在因子是可复制的或通过将DNA引入到宿主中来完成染色体整合而是可复制的。

应理解的是，各种载体在表达本发明的DNA序列中不等同地发挥作用。类似地，各种宿主细胞不等同地作用于相同的表达系统。然而，本领域技术人员能够适当地选择各种载体、表达控制序列和宿主而不偏离本发明的范围且无需承受过度的实验负担。例如，在选择载体时需要考虑宿主，这是因为载体需要在宿主中复制。还需要考虑载体的复制数、控制复制数的能力和由载体编码的其它蛋白例如抗生素标志物的表达。

在另一个方面，本发明涉及通过将载体引入到原核生物中或在原核生物中表达载体对靶基因mRNA表达水平进行精细调节的方法。

在另一个方面，本发明涉及对用于产生靶产物的靶基因进行筛选的方法，所述筛选方法包括：

(a)根据上述方法对存在于用于产生靶产物的靶菌株中且参与靶产物的生物合成途径的基因中的任何一种或多种基因的表达水平进行精细调节；和

(b)当靶产物的产率通过精细调节表达水平而改善时，选择其中表达得以调节的基因作为用于产生靶产物的靶基因。

在另一个方面，本发明涉及对靶产物产生菌株进行改善的方法，所述方法包括：

(a)根据上述方法对存在于用于产生靶产物的靶菌株中且参与靶产物的生物合成途径的基因中的任何一种或多种基因的表达进行精细调节；

(b)当靶产物的产率通过精细调节表达而改善时，筛选其中表达得以调节的基因作为用于产生靶产物的靶基因；和

(c)引入表达程度的所筛选的基因以产生重组菌株。

实施例

在下文中将参考以下实施例更详细地描述本发明。这些实施例仅用于示例本发明且对于本领域技术人员显而易见的是，本发明的范围不限于这些实施例。

实施例1：合成sRNA性能的确认

1-1：合成sRNA的构建和所使用的sRNA表达质粒的构建

为了确保sRNA表达的方便，构建了如图1所示的质粒。对于后续实验，图1的质粒中的sRNA或启动子通过定点诱变修饰并使用。

本实施例和下述实施例使用的限制性酶购自New England BioLabs(U.S.A.)和Enzynomics(Korea)且PCR聚合酶购自Solgent(Korea)。引物购自Macrogen(Korea)且其它酶购自Enzynomics(Korea)。其它事项分别标识。

使用SEQ ID NO:1和2的引物对pBluescript II KS+(Stratagene)的多克隆位点进行PCR并插入到由Pharmacia生产的pKK223-3质粒的HindIII/NaeI位点中。多克隆位点的PCR产物用PvuII和NaeI消化且质粒pKK223-3用HindIII和NaeI消化。然后质粒pKK223-3 KS如下构建：使用Klenow聚合酶形成钝端并将两个DNA片段接合。将Pr启动子和转录终止子T1/TE插入到以上构建的质粒中用于sRNA支架及其表达，由此构建用于sRNA表达的质粒。Pr启动子、转录终止子T1/TE和sRNA支架的序列如下克隆：在先前研究所使用的Rlowcat-PrMicC*Ter中使用SEQ ID NO:3和4的引物进行PCR(Na,D等人,Nat Biotechnol.,31(2),170-174,2013)。Pr启动子-MimC结构-T1/TE转录终止子的PCR产物用BamHI和NotI消化且pKK223-3 KS也用BamHI/NotI消化并连结这两个DNA片段。本申请使用的Pr启动子的序列是以BBa_R0051登记在Registry of Standard Biological Parts数据库(http://parts.igem.org/)中的序列且T1/TE启动子是以BBa_B0015登记在上述数据库中的序列。在以碱基配对区表示的BPR中，24聚体核苷酸序列由DsRed2荧光蛋白的起始密码子添加。将如上产生的质粒命名为pKK223-3 KS Pr MDsRed2。BPR通过反向PCR使用SEQ ID NO:5和6的引物插入。SgrS序列的支架的序列如图2所示且也通过反向PCR使用SEQ ID NO:7和8的引物产生。将如上产生的质粒命名为pKK223-3 KS Pr SDsRed2。具有SrgS序列的质粒的图谱如图1所示且大肠杆菌DH5α菌株用于质粒构建。

<所使用的引物序列>

[SEQ ID NO.1]

5’-GGCCAATTCAGCTGGTACCGGGCCCCCCCTCG-3’

[SEQ ID NO.2]

5’-GGCCAATTGCCGGCGAGCTCCACCGCGGTGG-3’

[SEQ ID NO.3]

5’-GGCCTTAAGCGGCCGCTAACACCGTGCGTGTTGAC-3’

[SEQ ID NO.4]

5’-CCGGAATTGGATCCTATAAACGCAGAAAGGCCC-3’

[SEQ ID NO.5]

5’-CTCGCCATATATTTGTCTTTCTGTTGGGCCATTGCATTGC-3’

[SEQ ID NO.6]

5’-CAGTGAGAACGTCATGCAACCATTATCACCGCCAGAGG-3’

[SEQ ID NO.7]

5’-GCCAGCAGATTATACCTGCTGGTTTTTTTTCTCGAGCCAGGCATCAAATAAAACG-3’

[SEQ ID NO.8]

5’-GGGTGATTTTACACCAATAGACAAATATATGGCGAGCAGTGAGAACGTCATGCAACCATTATCACCGCCAGAGG-3’

1-2：用于研究合成sRNA性能的靶基因质粒的构建

选择荧光蛋白DsRed2作为用于容易地确认sRNA性能的靶基因且构建了如图3所示的报告质粒用于表达DsRed2基因。使用SEQ ID NO:1和2的引物对pBluescript II KS+(Stratagene)的多克隆位点进行PCR并插入到由Pharmacia生产的pACYC184(New EnglandBioLabs,U.S.A.)质粒的XbaI/NaeI位点中。多克隆位点的PCR产物用PvuII和NaeI消化且质粒pACYC184用XbaI和NaeI消化。然后质粒pACYC184 KS如下构建：使用Klenow聚合酶形成钝端并连结两个DNA片段。构建了具有荧光蛋白作为sRNA的靶基因的质粒。将乳糖启动子、荧光蛋白DsRed2基因和作为转录终止子的T1/TE序列插入到多克隆位点的ApaI/SalI位点中。本申请使用的乳糖启动子、DsRed2基因和T1/TE转录终止子如下构建：在先前研究所使用的Rlowcat-Plac-DsRed2中使用SEQ ID NO:9和10进行PCR(Na,D等人,Nat Biotechnol.,31(2),170-174,2013)。乳糖启动子通过使用pBluescript SK+(Stratagene)作为模板进行PCR来构建且DsRed2基因通过使用pDsRed2-N1(Clontech)作为模板进行PCR来构建。T1/TE转录终止子是登记在上述Registry of Standard Biological Parts数据库(http://parts.igem.org/)中的BBa_R0015序列。大肠杆菌DH5α用于质粒构建。

<所使用的引物序列>

[SEQ ID NO.9]

5’-GGCCTTAAGGGCCCGTGGATAACCGTATTACCGC-3’

[SEQ ID NO.10]

5’-CCGGAATTGTCGACTATAAACGCAGAAAGGCCC-3’

1-3：合成sRNA性能的研究

使用以上构建的质粒进行用于研究通过sRNA对靶基因的表达抑制性能的实验。将实施例1-2构建的报告质粒和实施例1-1构建的具有SgrS支架且具有包含DsRed2作为靶蛋白的sRNA的质粒同时转化到DH5α中。然后使用包含氨苄西林(Ap)和氯霉素(Cm)抗生素的LB板对具有两种质粒的集落进行选择，然后接种在包含Ap和Cm的LB培养基上。然后将菌株培养至静止期并测量是否表达荧光。如图4所示，与对照组相比，具有SgrS支架的抗DsRed2合成sRNA显示出99％的表达抑制效率。两种菌株都具有pACYC184 KS Plac DsRed2且对照组和SgrS菌株分别具有pKK223-3 KS和pKK223-3 KS SDsRed2。使用用于荧光测量的对照组即具有pACYC184 KS和pKK223-3 KS的菌株。

1-4：合成sRNA特异性的研究

进行实验以确认通过sRNA对靶基因的表达抑制是否通过BPR特异性地实现。该实验使用具有以下sRNA的质粒(pKK223-3 KS SDsRed2)，所述sRNA具有SgrS支架并包含由24个核苷酸构成的BPR。使用pKK223-3 KS SDsRed2作为模板和SEQ ID NO:11和12的引物通过反向PCR构建无BPR的质粒，将其命名为pKK223-3 KS SO。在以下数据中将其用于经样品标记的非靶向sRNA。另外，以与实施例1-3相同的方式进行实验。结果如图5所示。与对照组相比，无BPR的sRNA对荧光蛋白显示出2％的表达抑制效率且具有由24个核苷酸构成的BPR的sRNA对荧光蛋白显示出98％的表达抑制效率。这表明特异性基因通过BPR而非通过合成sRNA支架来抑制。

<所使用的引物序列>

[SEQ ID NO.11]

5’-TATTGGTGTAAAATCACCCGCCAGCAG-3’

[SEQ ID NO.12]

5’-GCAACCATTATCACCGCCAGAGG-3’

实施例2：通过引入各种启动子调节sRNA表达及其作用

用于精细调节靶基因抑制的实验如下进行：使用显示出各种基因表达强度的启动子来调节sRNA表达水平。使用实施例1的质粒和实验方法并通过使用反向PCR对sRNA的启动子进行克隆并使用SEQ ID NO.13-46的引物对Anderson启动子集合的启动子进行克隆。SgrS用作sRNA支架且启动子为J23100、J23101、J23102、J23103、J23104、J23105、J23106、J23107、J23109、J23111、J23112、J23113、J23114、J23115、J23116、J23117和J23118。结果如图6所示且能够认识的是，启动子的强度与蛋白抑制效率的对数值成比例。

<用于克隆启动子的引物序列>

J23100：

[SEQ ID NO.13]

5’-GACTGAGCTAGCCGTCAAGCGGCCGCCACCGCGGTGGAGC-3’

[SEQ ID NO.14]

5’-CTAGGTACAGTGCTAGCGATGACGTTCTCACTGCTCGCC-3’

J23101：

[SEQ ID NO.15]

5’-CTAGGTATTATGCTAGCGATGACGTTCTCACTGCTCGCC-3’

[SEQ ID NO.16]

5’-GACTGAGCTAGCTGTAAAGCGGCCGCCACCGCGGTGGAGC-3’

J23102：

[SEQ ID NO.17]

5’-CTAGGTACTGTGCTAGCGATGACGTTCTCACTGCTCGCC-3’

[SEQ ID NO.18]

5’-GACTGAGCTAGCTGTCAAGCGGCCGCCACCGCGGTGGAGC-3’

J23103：

[SEQ ID NO.19]

5’-CTAGGGATTATGCTAGCGATGACGTTCTCACTGCTCGCC-3’

[SEQ ID NO.20]

5’-GACTGAGCTAGCTATCAGGCGGCCGCCACCGCGGTGGAGC-3’

J23104：

[SEQ ID NO.21]

5’-CTAGGTATTGTGCTAGCGATGACGTTCTCACTGCTCGCC-3’

[SEQ ID NO.22]

5’-GACTGAGCTAGCTGTCAAGCGGCCGCCACCGCGGTGGAGC-3’

J23105：

[SEQ ID NO.23]

5’-GACTGAGCTAGCCGTAAAGCGGCCGCCACCGCGGTGGAGC-3’

[SEQ ID NO.24]

5’-CTAGGTACTATGCTAGCGATGACGTTCTCACTGCTCGC-3’

J23106：

[SEQ ID NO.25]

5’-CTAGGTATAGTGCTAGCGATGACGTTCTCACTGCTCGCC-3’

[SEQ ID NO.26]

5’-GACTGAGCTAGCCGTAAAGCGGCCGCCACCGCGGTGGAGC-3’

J23107：

[SEQ ID NO.27]

5’-CTAGGTATTATGCTAGCGATGACGTTCTCACTGCTCGCC-3’

[SEQ ID NO.28]

5’-GGCTGAGCTAGCCGTAAAGCGGCCGCCACCGCGGTGGAGC-3’

J23109：

[SEQ ID NO.29]

5’-GACTGAGCTAGCTGTAAAGCGGCCGCCACCGCGGTGGAGC-3’

[SEQ ID NO.30]

5’-CTAGGGACTGTGCTAGCGATGACGTTCTCACTGCTCGC-3’

J23111：

[SEQ ID NO.31]

5’-CTAGGTATAGTGCTAGCGATGACGTTCTCACTGCTCGCC-3’

[SEQ ID NO.32]

5’-GACTGAGCTAGCCGTCAAGCGGCCGCCACCGCGGTGGAGC-3’

J23112：

[SEQ ID NO.33]

5’-CTAGGGATTATGCTAGCGATGACGTTCTCACTGCTCGCC-3’

[SEQ ID NO.34]

5’-GACTGAGCTAGCTATCAGGCGGCCGCCACCGCGGTGGAGC-3’

J23113：

[SEQ ID NO.35]

5’-CTAGGGATTATGCTAGCGATGACGTTCTCACTGCTCGCC-3’

[SEQ ID NO.36]

5’-GACTGAGCTAGCCATCAGGCGGCCGCCACCGCGGTGGAGC-3’

J23114：

[SEQ ID NO.37]

5’-GACTGAGCTAGCCATAAAGCGGCCGCCACCGCGGTGGAGC-3’

[SEQ ID NO.38]

5’-CTAGGTACAATGCTAGCGATGACGTTCTCACTGCTCGC-3’

J23115：

[SEQ ID NO.39]

5’-CTTGGTACAATGCTAGCGATGACGTTCTCACTGCTCGCC-3’

[SEQ ID NO.40]

5’-GGCTGAGCTAGCTATAAAGCGGCCGCCACCGCGGTGGAGC-3’

J23116：

[SEQ ID NO.41]

5’-CTAGGGACTATGCTAGCGATGACGTTCTCACTGCTCGCC-3’

[SEQ ID NO.42]

5’-GACTGAGCTAGCTGTCAAGCGGCCGCCACCGCGGTGGAGC-3’

J23117：

[SEQ ID NO.43]

5’-CTAGGGATTGTGCTAGCGATGACGTTCTCACTGCTCGCC-3’

[SEQ ID NO.44]

5’-GACTGAGCTAGCTGTCAAGCGGCCGCCACCGCGGTGGAGC-3’

J23118：

[SEQ ID NO.45]

5’-CTAGGTATTGTGCTAGCGATGACGTTCTCACTGCTCGCC-3’

[SEQ ID NO.46]

5’-GACTGAGCTAGCCGTCAAGCGGCCGCCACCGCGGTGGAGC-3’

实施例3：通过sRNA支架突变对靶基因抑制进行微小调节

用于精细调节靶基因抑制的实验如下进行：在sRNA支架上进行诱变以改变其活性。使用实施例1的质粒和实验方法且sRNA的启动子为J23105，其在先前实验中显示出74％的抑制率。仅在图8的实验中使用J23108。用J23108启动子表达sRNA的质粒通过反向PCR使用SEQ ID NO:51和52构建。然后通过反向PCR使用下列序列的引物使支架突变。对照组为无sRNA支架的pKK223-3 KS和无BPR的pKK223-3 KS SO。mRNA SgrS支架的茎环中茎的序列突变(图7)、茎长度的变化(图8)、环的序列(图9)、UAUU序列的突变(图10)和U尾的长度(图11)都可减弱或增强sRNA活性。U尾还是转录终止子和Hfq结合位点。据信这些突变的组合可进一步减弱或增强sRNA的抑制活性。

<在图7所示的突变中使用的引物序列>

一般使用的引物：

[SEQ ID NO.47]

5’-AATCACCCGCCAGCAGATTATACCTGCTGG-3’

GGAC：

[SEQ ID NO.48]

5’-TTAGTCCAATAATGGCGAGCAGTGAGAAC-3’

CCUG：

[SEQ ID NO.49]

5’-TTACAGGAATAATGGCGAGCAGTGAGAAC-3’

CCUC：

[SEQ ID NO.50]

5’-TTAGTGGAATAATGGCGAGCAGTGAGAAC-3’

<在图8所示的突变中使用的引物序列>

J23108构建引物：

[SEQ ID NO.51]

5’-GACTGAGCTAGCTGTCAGGCGGCCGCCACCGCGGTGGAGC-3’

[SEQ ID NO.52]

5’-CTAGGTATAATGCTAGCGATGACGTTCTCACTGCTCGCC-3’

6nt茎：

[SEQ ID NO.53]

5’-TTACCCACCAATAATGGCGAGCAGTGAGAAC-3’

[SEQ ID NO.54]

5’-AATCCCACCCGCCAGCAGATTATACCTGCTGG-3’

8nt茎：

[SEQ ID NO.55]

5’-TTACCCCCACCAATAATGGCGAGCAGTGAGAAC-3’

[SEQ ID NO.56]

5’-AATCCCCCACCCGCCAGCAGATTATACCTGCTGG-3’

<在图9所示的突变中使用的引物序列>

CCGG：

[SEQ ID NO.57]

5’-GGACACCAATAATGGCGAGC-3’

[SEQ ID NO.58]

5’-GGTCACCCGCCAGCAGATTATAC-3’

CCCC：

[SEQ ID NO.59]

5’-GGACACCAATAATGGCGAGC-3’

[SEQ ID NO.60]

5’-CCTCACCCGCCAGCAGATTATAC-3’

CCUU：

[SEQ ID NO.61]

5’-GGACACCAATAATGGCGAGC-3’

[SEQ ID NO.62]

5’-TTTCACCCGCCAGCAGATTATAC-3’

GGGG：

[SEQ ID NO.63]

5’-CCACACCAATAATGGCGAGC-3’

[SEQ ID NO.64]

5’-GGTCACCCGCCAGCAGATTATAC-3’

GGCC：

[SEQ ID NO.65]

5’-CCACACCAATAATGGCGAGC-3’

[SEQ ID NO.66]

5’-CCTCACCCGCCAGCAGATTATAC-3’

GGUU：

[SEQ ID NO.67]

5’-CCACACCAATAATGGCGAGC-3’

[SEQ ID NO.68]

5’-TTTCACCCGCCAGCAGATTATAC-3’

UUGG：

[SEQ ID NO.69]

5’-AAACACCAATAATGGCGAGC-3’

[SEQ ID NO.70]

5’-GGTCACCCGCCAGCAGATTATAC-3’

UUCC：

[SEQ ID NO.71]

5’-AAACACCAATAATGGCGAGC-3’

[SEQ ID NO.72]

5’-CCTCACCCGCCAGCAGATTATAC-3’

UUUU：

[SEQ ID NO.73]

5’-AAACACCAATAATGGCGAGC-3’

[SEQ ID NO.74]

5’-TTTCACCCGCCAGCAGATTATAC-3’

<在图10所示的突变中使用的引物序列>

一般使用的引物：

[SEQ ID NO.75]

5’-GACAAATATATGGCGAGCAG-3’

GAUU：

[SEQ ID NO.76]

5’-GATTGGTGTAAAATCACCCGCCAGCAG-3’

UCUU：

[SEQ ID NO.77]

5’-GTCTTGGTGTAAAATCACCCGCCAGCAG-3’

UACU：

[SEQ ID NO.78]

5’-TACTGGTGTAAAATCACCCGCCAGCAG-3’

UAAU：

[SEQ ID NO.79]

5’-TAATGGTGTAAAATCACCCGCCAGCAG-3’

UAUC：

[SEQ ID NO.80]

5’-TATCGGTGTAAAATCACCCGCCAGCAG-3’

UAUA：

[SEQ ID NO.81]

5’-TATAGGTGTAAAATCACCCGCCAGCAG-3’

GCCC：

[SEQ ID NO.82]

5’-GCCCGGTGTAAAATCACCCGCCAGCAG-3’

GCAC：

[SEQ ID NO.83]

5’-GCACGGTGTAAAATCACCCGCCAGCAG-3’

GACC：

[SEQ ID NO.84]

5’-GACCGGTGTAAAATCACCCGCCAGCAG-3’

GAAC：

[SEQ ID NO.85]

5’-GACCGGTGTAAAATCACCCGCCAGCAG-3’

<在图11所示的突变中使用的引物序列>

一般使用的引物：

[SEQ ID NO.86]

5’-CTCGAGCCAGGC-3’

U7：

[SEQ ID NO.87]

5’-AAAAAAACCAGCAGGTATAATCTGCTGGCG-3’

U6：

[SEQ ID NO.88]

5’-AAAAAACCAGCAGGTATAATCTGCTGGCG-3’

U5：

[SEQ ID NO.89]

5’-AAAAACCAGCAGGTATAATCTGCTGGCG-3’

U4：

[SEQ ID NO.90]

5’-AAAACCAGCAGGTATAATCTGCTGGCG-3’

工业应用性

根据本发明使用合成调节性sRNA精细调节基因表达水平的方法能够通过调节sRNA表达水平或sRNA和Hfq之间的结合亲和力精细调节对靶基因的表达进行抑制的程度且由此可同时、容易和快速地将多种靶基因组合通过用于调节基因表达的合成调节性sRNA应用于多种菌株而无需基因缺失且因此非常适于测量每种菌株的代谢能力并选择最佳菌株。所述方法具有的优点是容易并快速地选择抑制基因表达的靶基因并表达所选基因至所需程度，其在产生用于有效产生多种代谢物的重组菌株并建立有效的产生方法中是非常有用的且所述方法因此是非常有用的。

本发明的具体实施方案如上所详细描述。然而，对于本领域技术人员显而易见的是，该具体描述仅为描述性和示例性实施方案且不应被理解为是对本发明范围的限制。本发明的实质范围将由所附权利要求书及其等同形式所定义。

序列表

<110> 韩国科学技术院

<120> 使用合成调节性sRNA精细调节基因表达的方法

<130> PF-B1818-CN

<140> PCT/KR2014/005120

<141> 2014-06-11

<160> 91

<170> PatentIn version 3.2

<210> 1

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> p1

<400> 1

ggccaattca gctggtaccg ggccccccct cg 32

<210> 2

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> p2

<400> 2

ggccaattgc cggcgagctc caccgcggtg g 31

<210> 3

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> p3

<400> 3

ggccttaagc ggccgctaac accgtgcgtg ttgac 35

<210> 4

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> p4

<400> 4

ccggaattgg atcctataaa cgcagaaagg ccc 33

<210> 5

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> p5

<400> 5

ctcgccatat atttgtcttt ctgttgggcc attgcattgc 40

<210> 6

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> p6

<400> 6

cagtgagaac gtcatgcaac cattatcacc gccagagg 38

<210> 7

<211> 55

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> p7

<400> 7

gccagcagat tatacctgct ggtttttttt ctcgagccag gcatcaaata aaacg 55

<210> 8

<211> 74

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> p8

<400> 8

gggtgatttt acaccaatag acaaatatat ggcgagcagt gagaacgtca tgcaaccatt 60

atcaccgcca gagg 74

<210> 9

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> p9

<400> 9

ggccttaagg gcccgtggat aaccgtatta ccgc 34

<210> 10

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> p10

<400> 10

ccggaattgt cgactataaa cgcagaaagg ccc 33

<210> 11

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> p11

<400> 11

tattggtgta aaatcacccg ccagcag 27

<210> 12

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> p12

<400> 12

gcaaccatta tcaccgccag agg 23

<210> 13

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> J23100-f

<400> 13

gactgagcta gccgtcaagc ggccgccacc gcggtggagc 40

<210> 14

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> J23100-r

<400> 14

ctaggtacag tgctagcgat gacgttctca ctgctcgcc 39

<210> 15

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> J23101-f

<400> 15

ctaggtatta tgctagcgat gacgttctca ctgctcgcc 39

<210> 16

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> J23101-r

<400> 16

gactgagcta gctgtaaagc ggccgccacc gcggtggagc 40

<210> 17

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> J23102-f

<400> 17

ctaggtactg tgctagcgat gacgttctca ctgctcgcc 39

<210> 18

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> J23102-r

<400> 18

gactgagcta gctgtcaagc ggccgccacc gcggtggagc 40

<210> 19

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> J23103-f

<400> 19

ctagggatta tgctagcgat gacgttctca ctgctcgcc 39

<210> 20

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> J23103-r

<400> 20

gactgagcta gctatcaggc ggccgccacc gcggtggagc 40

<210> 21

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> J23104-f

<400> 21

ctaggtattg tgctagcgat gacgttctca ctgctcgcc 39

<210> 22

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> J23104-r

<400> 22

gactgagcta gctgtcaagc ggccgccacc gcggtggagc 40

<210> 23

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> J23105-f

<400> 23

gactgagcta gccgtaaagc ggccgccacc gcggtggagc 40

<210> 24

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> J23105-r

<400> 24

ctaggtacta tgctagcgat gacgttctca ctgctcgc 38

<210> 25

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> J23106-f

<400> 25

ctaggtatag tgctagcgat gacgttctca ctgctcgcc 39

<210> 26

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> J23106-r

<400> 26

gactgagcta gccgtaaagc ggccgccacc gcggtggagc 40

<210> 27

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> J23107-f

<400> 27

ctaggtatta tgctagcgat gacgttctca ctgctcgcc 39

<210> 28

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> J23107-r

<400> 28

ggctgagcta gccgtaaagc ggccgccacc gcggtggagc 40

<210> 29

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> J23109-f

<400> 29

gactgagcta gctgtaaagc ggccgccacc gcggtggagc 40

<210> 30

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> J23109-r

<400> 30

ctagggactg tgctagcgat gacgttctca ctgctcgc 38

<210> 31

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> J23111-f

<400> 31

ctaggtatag tgctagcgat gacgttctca ctgctcgcc 39

<210> 32

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> J23111-r

<400> 32

gactgagcta gccgtcaagc ggccgccacc gcggtggagc 40

<210> 33

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> J23112-f

<400> 33

ctagggatta tgctagcgat gacgttctca ctgctcgcc 39

<210> 34

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> J23112-r

<400> 34

gactgagcta gctatcaggc ggccgccacc gcggtggagc 40

<210> 35

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> J23113-f

<400> 35

ctagggatta tgctagcgat gacgttctca ctgctcgcc 39

<210> 36

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> J23113-r

<400> 36

gactgagcta gccatcaggc ggccgccacc gcggtggagc 40

<210> 37

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> J23114-f

<400> 37

gactgagcta gccataaagc ggccgccacc gcggtggagc 40

<210> 38

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> J23114-r

<400> 38

ctaggtacaa tgctagcgat gacgttctca ctgctcgc 38

<210> 39

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> J23115-f

<400> 39

cttggtacaa tgctagcgat gacgttctca ctgctcgcc 39

<210> 40

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> J23115-r

<400> 40

ggctgagcta gctataaagc ggccgccacc gcggtggagc 40

<210> 41

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> J23116-f

<400> 41

ctagggacta tgctagcgat gacgttctca ctgctcgcc 39

<210> 42

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> J23116-r

<400> 42

gactgagcta gctgtcaagc ggccgccacc gcggtggagc 40

<210> 43

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> J23117-f

<400> 43

ctagggattg tgctagcgat gacgttctca ctgctcgcc 39

<210> 44

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> J23117-r

<400> 44

gactgagcta gctgtcaagc ggccgccacc gcggtggagc 40

<210> 45

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> J23118-f

<400> 45

ctaggtattg tgctagcgat gacgttctca ctgctcgcc 39

<210> 46

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> J23118-r

<400> 46

gactgagcta gccgtcaagc ggccgccacc gcggtggagc 40

<210> 47

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> p47

<400> 47

aatcacccgc cagcagatta tacctgctgg 30

<210> 48

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> p48

<400> 48

ttagtccaat aatggcgagc agtgagaac 29

<210> 49

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> p49

<400> 49

ttacaggaat aatggcgagc agtgagaac 29

<210> 50

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> p50

<400> 50

ttagtggaat aatggcgagc agtgagaac 29

<210> 51

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> J23108-f

<400> 51

gactgagcta gctgtcaggc ggccgccacc gcggtggagc 40

<210> 52

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> J23108-r

<400> 52

ctaggtataa tgctagcgat gacgttctca ctgctcgcc 39

<210> 53

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 6nt-53

<400> 53

ttacccacca ataatggcga gcagtgagaa c 31

<210> 54

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 6nt-54

<400> 54

aatcccaccc gccagcagat tatacctgct gg 32

<210> 55

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 8nt-55

<400> 55

ttacccccac caataatggc gagcagtgag aac 33

<210> 56

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 8nt-56

<400> 56

aatcccccac ccgccagcag attatacctg ctgg 34

<210> 57

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 57

<400> 57

ggacaccaat aatggcgagc 20

<210> 58

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> p58

<400> 58

ggtcacccgc cagcagatta tac 23

<210> 59

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> p59

<400> 59

ggacaccaat aatggcgagc 20

<210> 60

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> p60

<400> 60

cctcacccgc cagcagatta tac 23

<210> 61

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> p61

<400> 61

ggacaccaat aatggcgagc 20

<210> 62

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> p62

<400> 62

tttcacccgc cagcagatta tac 23

<210> 63

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> p63

<400> 63

ccacaccaat aatggcgagc 20

<210> 64

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> p64

<400> 64

ggtcacccgc cagcagatta tac 23

<210> 65

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> p65

<400> 65

ccacaccaat aatggcgagc 20

<210> 66

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> p66

<400> 66

cctcacccgc cagcagatta tac 23

<210> 67

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> p67

<400> 67

ccacaccaat aatggcgagc 20

<210> 68

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> p68

<400> 68

tttcacccgc cagcagatta tac 23

<210> 69

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> p69

<400> 69

aaacaccaat aatggcgagc 20

<210> 70

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> p70

<400> 70

ggtcacccgc cagcagatta tac 23

<210> 71

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> p71

<400> 71

aaacaccaat aatggcgagc 20

<210> 72

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> p72

<400> 72

cctcacccgc cagcagatta tac 23

<210> 73

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> p73

<400> 73

aaacaccaat aatggcgagc 20

<210> 74

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> p74

<400> 74

tttcacccgc cagcagatta tac 23

<210> 75

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> p75

<400> 75

gacaaatata tggcgagcag 20

<210> 76

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> p76

<400> 76

gattggtgta aaatcacccg ccagcag 27

<210> 77

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> p77

<400> 77

gtcttggtgt aaaatcaccc gccagcag 28

<210> 78

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> p78

<400> 78

tactggtgta aaatcacccg ccagcag 27

<210> 79

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> p79

<400> 79

taatggtgta aaatcacccg ccagcag 27

<210> 80

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> p80

<400> 80

tatcggtgta aaatcacccg ccagcag 27

<210> 81

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> p81

<400> 81

tataggtgta aaatcacccg ccagcag 27

<210> 82

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> p82

<400> 82

gcccggtgta aaatcacccg ccagcag 27

<210> 83

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> p83

<400> 83

gcacggtgta aaatcacccg ccagcag 27

<210> 84

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> p84

<400> 84

gaccggtgta aaatcacccg ccagcag 27

<210> 85

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> p85

<400> 85

gaccggtgta aaatcacccg ccagcag 27

<210> 86

<211> 12

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> p86

<400> 86

ctcgagccag gc 12

<210> 87

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> u7-87

<400> 87

aaaaaaacca gcaggtataa tctgctggcg 30

<210> 88

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> u6-88

<400> 88

aaaaaaccag caggtataat ctgctggcg 29

<210> 89

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> u5-89

<400> 89

aaaaaccagc aggtataatc tgctggcg 28

<210> 90

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> u4-90

<400> 90

aaaaccagca ggtataatct gctggcg 27

<210> 91

<211> 49

<212> RNA

<213> 人工

<220>

<223> SgrS-sRNA

<400> 91

uauuggugua aaaucacccg ccagcagauu auaccugcug guuuuuuuu 49

Claims

1.一种载体，其包含(a)启动子；(b)对与靶基因mRNA形成互补的碱基对的区进行编码的核酸；(c)对Hfq结合位点进行编码的由源自SgrS的sRNA的SEQ ID NO:91表示的核酸的野生型或突变sRNA支架；和(d)转录终止子。

2.权利要求1的载体，其中所述突变sRNA支架选自(i)sRNA支架，其中在SEQ ID NO:91的第1-4位的一个或多个碱基被取代；(ii)sRNA支架，其中在SEQ ID NO:91的第5-8位的一个或多个碱基被取代；(iii)sRNA支架，其中2或4个碱基被插入到SEQ ID NO:91的第5-8位中；(iv)sRNA支架，其中在SEQ ID NO:91的第10-13位的4个碱基被取代；和(v)sRNA支架，其中在SEQ ID NO:91的第42-49位的1-4个碱基被缺失。

3.权利要求1的载体，其中所述启动子选自trc启动子、tac启动子、作为组成性启动子的Anderson启动子集合、作为诱导性启动子的阿拉伯糖操纵子启动子和乳糖操纵子启动子。

4.权利要求1的载体，其中与所述靶基因mRNA形成互补结合的所述区为10-100bp。

5.权利要求1的载体，其中所述靶基因mRNA选自DsRed2、LuxR、AraC、KanR(卡那霉素抗性基因)、tyrR(酪氨酸调节物)、ppc(磷酸烯醇丙酮酸羧化酶)、csrA(碳储存调节物)、pgi(葡萄糖-6-磷酸异构酶)、glt(柠檬酸合酶)、accA(乙酰辅酶A羧基转移酶,α-亚基)、accB(生物素化生物素-羧基载体蛋白)、accC(乙酰辅酶A羧化酶)、accD(乙酰辅酶A羧基转移酶,β-亚基)、aceE(丙酮酸脱氢酶复合物的E1p组分的亚基)、aceF(丙酮酸脱氢酶)、ackA(丙酸激酶/乙酸激酶活性)、adiY(AdiY是控制精氨酸的阳性DNA结合转录调节物)脱羧酶(adi)系统)、argB(乙酰谷氨酸激酶)、argC(N-乙酰谷氨酰磷酸还原酶)、argG(精氨酸琥珀酸合酶)、argH(精氨酸琥珀酸裂解酶)、asnC(使asnA即参与天冬酰胺合成的基因的表达得以活化的转录调节物)、aspA(天冬氨酸氨裂解酶)、crp(CRP转录双重调节物)、csiD(预测的蛋白,CsiD是由碳饥饿诱导的基因产物)、csiR(DNA结合转录抑制子)、cytR(转运和利用核糖核苷和脱氧核糖核苷所需要的转录因子)、dcuA(DcuA转运子是已知负责在厌氧条件下吸收C4二羧酸例如富马酸的三种转运子之一)、deoB(磷酸戊糖变位酶)、deoC(脱氧核糖-磷酸醛缩酶)、deoR(“脱氧核糖调节物”的转录抑制子DeoR参与与脱氧核糖核苷酸的运输和分解代谢有关的基因的阴性表达)、fabH(KASIII,brta-酮酰-ACP合酶)、fadD(脂肪酰辅酶A合成酶)、fadR(FadR脂肪酸降解调节子是对脂肪酸降解调节子和乙酸代谢产生负性控制的多功能双重调节物)、fbp(果糖-1,6-二磷酸酶)、fnr(FNR是介导由有氧生长过渡到厌氧生长的初级转录调节物)、fruR(FruR是发挥多效作用以调节碳流的方向通过能量代谢的不同代谢途径但不依赖于CRP调节物的双重转录调节物)、ftsL(必需的细胞分裂蛋白FtsL)、ftsQ(必需的细胞分裂蛋白FtsQ)、ftsW(必需的细胞分裂蛋白FtsW)、ftsZ(必需的细胞分裂蛋白FtsZ)、fur(Fur-Fe+2DNA结合转录双重调节物)、gabD(琥珀酸半醛脱氢酶,NADP+依赖性)、gabP(APC转运子)、gabT(4-氨基丁酸转氨酶)、gadA(谷氨酸脱羧酶A亚基)、gadB(谷氨酸脱羧酶B亚基)、gadC(GABA APC转运子)、glcC(GntR家族转录调节物,glc操纵子转录激活子)、glpK(甘油激酶)、glpR(sn-甘油-3-磷酸抑制子)、glpX(果糖-1,6-二磷酸酶II)、gltA(柠檬酸合酶)、hfld(溶原化调节物)、ihfa(IHF即整合宿主因子是一种整体调节蛋白)、ihfb(IHF即整合宿主因子是一种整体调节蛋白)、ilvB(乙酰羟基丁酸合酶/乙酰乳酸合酶)、ilvC(乙酰羟酸异构还原酶)、ilvD(二羟酸脱水酶)、ilvG_1(乙酰乳酸合酶II,大亚基,N末端片段(假基因))、ilvG_2(乙酰乳酸合酶II,大亚基,C末端片段(假基因))、ilvH(乙酰乳酸合酶/乙酰羟基丁酸合酶)、ilvL(ilvGEDA操纵子前导肽)、ilvM(乙酰羟基丁酸合酶/乙酰乳酸合酶)、ilvN(乙酰羟基丁酸合酶/乙酰乳酸合酶)、ilvX(预测的小蛋白)、lexA(LexA抑制参与对DNA损伤的细胞响应的数种基因的转录)、lpxC(UDP-3-O-乙酰基-N-乙酰葡糖胺脱乙酰酶)、marA(MarA参与控制涉及对抗生素、氧化应激、有机溶剂和重金属的抗性的数种基因)、metJ(MetJ转录抑制子)、modE(ModE是对参与钼运输和钼酶合成及钼酸相关功能的操纵子的转录进行控制的主要调节物)、nadB(L-天冬氨酸氧化酶)、narL(硝酸/亚硝酸响应调节物)、pck(磷酸烯醇丙酮酸羧激酶)、PdhR(PdhR即“丙酮酸脱氢酶复合物调节物”对参与丙酮酸脱氢酶复合物的基因进行调节)、phoP(PhoP磷酸化DNA结合转录双重调节物,参与对低Mg2+环境的适应和对酸抗性基因的控制的双组分调节系统phoQ/phoP的成员)、pnuC(PnuC NMN转运子)、ppsA(磷酸烯醇丙酮酸合成酶)、pta(磷酸乙酰转移酶)、purA(腺苷酸琥珀酸合成酶)、purB(腺苷酸琥珀酸裂解酶)、purR(PurR-次黄嘌呤DNA结合转录抑制子,PurR二聚体对参与嘌呤核苷酸生物合成及其自身合成的数种基因进行控制)、puuE(4-氨基丁酸转氨酶)、rbsA(核糖ABC转运子)、rbsB(核糖ABC转运子)、rbsD(核糖吡喃酶)、rbsK(核糖激酶)、rbsR(针对“核糖抑制子”的转录因子RbsR是负性自调节的并对参与核糖分解代谢和运输的操作子的转录进行控制)、rcsB(RcsB-BglJ DNA结合转录激活子,针对“调节物荚膜合成B”的RcsB蛋白是属于多组分RcsF/RcsC/RcsD/RcsA-RcsB磷酸中继系统且参与对可拉酸荚膜合成、细胞分裂、周质蛋白、运动性和小RNA的调节的响应调节物)、rutR(RutR对直接或间接参与嘧啶代谢的复合途径的基因进行调节)、serA(α-酮戊二酸还原酶/D-3-磷酸甘油酸脱氢酶)、serC(磷酸羟基苏氨酸转氨酶/3-磷酸丝氨酸转氨酶)、soxS(双重转录激活子并参与去除超氧化物和一氧化氮)、sroD(SroD小RNA)、zwf(葡萄糖-6-磷酸-1-脱氢酶)、asnA(天冬酰胺合成酶A)、asnB(天冬酰胺合成酶B)、carA(氨甲酰磷酸合成酶)、carB(氨甲酰磷酸合成酶)、ddlB(D-丙氨酸-D-丙氨酸连接酶B)、deoA(胸苷磷酸化酶/尿嘧啶磷酸化酶)、deoD(嘌呤核苷磷酸化酶deoD型)、dpiA(参与厌氧柠檬酸分解代谢的双重转录调节物)、fis(Fis即“倒位刺激因子”是主要功能表现为类核结构的组织和维持的小DNA结合和弯曲蛋白)、gadE(GadE对参与谷氨酸依赖性系统的基因的转录进行控制)、gadW(GadW对参与谷氨酸依赖性系统的基因的转录进行控制)、gadX(GadX对参与谷氨酸依赖性系统的基因的转录进行控制)、glpF(GlpF甘油MIP通道)、ilvY(IlvY DNA结合转录双重调节物)、ivbL(ilvB操纵子前导肽(IvbL))、lhgO(L-2-羟基戊二酸氧化酶)、pd(硫辛酰胺脱氢酶)、lrp(Lrp是针对大肠杆菌中至少10％的基因的双重转录调节物,这些基因参与氨基酸生物合成和分解代谢、营养物运输、纤毛合成和包括1-碳代谢在内的其它细胞功能)、metB(O-琥珀酰高丝氨酸裂解酶/O-琥珀酰高丝氨酸(硫醇)裂解酶)、metL(天冬氨酸激酶/高丝氨酸脱氢酶)、mraY(磷酸-N-乙酰基胞壁酰基-五肽转移酶)、mraZ(未知的功能)、murE(UDP-N-乙酰基胞壁酰基丙酰基-D-谷氨酸-2,6-二氨基庚二酸连接酶)、murF(D-丙氨酰基-D-丙氨酸添加酶)、murG(N-乙酰基葡萄糖氨基转移酶)、nac(Nacregulate,无共效应子,在氮限制条件下参与氮代谢的基因)、nadA(喹啉酸合酶)、nsrR(NsrR即“亚硝酸敏感性抑制子”对参与针对一氧化氮(NO)的细胞保护的基因进行调节)、panC(泛酸合成酶)、panD(天冬氨酸-1-脱羧酶)、pgl(6-磷酸葡糖酸内酯酶)、pyrB(天冬氨酸氨甲酰基转移酶,PyrB亚基)、pyrC(二氢乳清酸酶)、pyrL(天冬氨酸氨甲酰基转移酶,PyrI亚基)、rob(Rob是转录双重调节物,其N末端结构域与MarA和SoxS具有49％同一性,这些蛋白活化由约50种靶基因构成的共同组,marA/soxS/rob调节子,参与抗生素抗性、超氧化物抗性及对有机溶剂和重金属的耐受性)、rpe(核酮糖磷酸-3-差向异构酶)、talA(转醛醇酶A)、thrA(天冬氨酸激酶/高丝氨酸脱氢酶)、thrB(高丝氨酸激酶)、thrC(苏氨酸合酶)、thrL(thr操纵子前导肽)、tktA(转酮酶I)、tktB(转酮酶II)和torR(双组分系统,OmpR家族,torCAD操纵子响应调节物TorR)。

6.权利要求1的载体，其中所述sRNA支架和Hfq之间的结合亲和力通过sRNA支架的突变来调节。

7.权利要求1的载体，其中所述转录终止子的U尾的长度为4-8。

8.一种重组微生物，其用权利要求1的载体转化。

9.通过将权利要求1的载体引入到原核生物中或在原核生物中表达权利要求1的载体对靶基因mRNA表达水平进行精细调节的方法。

10.权利要求9的方法，其中所述原核生物选自大肠杆菌属(E.Coli)、根瘤菌属(Rhizobium)、双歧杆菌属(Bifidobacterium)、红球菌属(Rhodococcus)、念珠菌属(Candida)、欧文氏菌属(Erwinia)、肠杆菌属(Enterobacter)、巴斯德氏杆菌属(Pasteurella)、曼海姆菌属(Mannheimia)、放线杆菌属(Actinobacillus)、凝聚杆菌属(Aggregatibacter)、黄单胞菌属(Xanthomonas)、弧菌属(Vibrio)、假单胞菌属(Pseudomonas)、固氮菌属(Azotobacter)、不动杆菌属(Acinetobacter)、青枯菌属(Ralstonia)、土壤杆菌属(Agrobacterium)、根瘤菌属(Rhizobium)、红色细菌属(Rhodobacter)、发酵单胞菌属(Zymomonas)、芽孢杆菌属(Bacillus)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、乳球菌属(Lactococcus)、链球菌属(Streptococcus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、梭菌属(Clostridium)、棒状杆菌属(Corynebacterium)、链霉菌属(Streptomyces)、双歧杆菌属(Bifidobacterium)和环状杆菌属(Cyclobacterium)。

11.对用于产生靶产物的靶基因进行筛选的方法，所述方法包括：

(a)根据权利要求9的方法对存在于用于产生所述靶产物的靶菌株中且参与所述靶产物的生物合成途径的基因中的任何一种或多种基因的表达水平进行精细调节；和

(b)当所述靶产物的产率通过精细调节所述表达水平而改善时，选择其中表达得以调节的基因作为用于产生所述靶产物的靶基因。

12.对靶产物产生菌株进行改善的方法，所述方法包括：

(a)根据权利要求9的方法对存在于用于产生所述靶产物的靶菌株中且参与所述靶产物的生物合成途径的基因中的任何一种或多种基因的表达水平进行精细调节；

(b)当所述靶产物的产率通过精细调节所述表达水平而改善时，筛选其中表达得以调节的基因作为用于产生所述靶产物的靶基因；和

(c)通过引入表达程度的所筛选的基因来产生重组菌株。