CN108813410B

CN108813410B - 一种降低发酵香肠中生物胺的方法及其应用

Info

Publication number: CN108813410B
Application number: CN201810739765.5A
Authority: CN
Inventors: 王彦波; 傅玲琳; 黎凡; 王飞飞; 吴哲铭; 王翀; 周瑾茹
Original assignee: Zhejiang Gongshang University
Current assignee: Zhejiang Gongshang University
Priority date: 2018-07-06
Filing date: 2018-07-06
Publication date: 2021-12-14
Anticipated expiration: 2038-07-06
Also published as: CN108813410A

Abstract

本发明公开了一种降低发酵香肠中生物胺的方法及其应用，包括以下步骤：(1)根据发酵香肠中主要产胺菌产气肠杆菌和阴沟肠杆菌产胺相关基因luxR序列设计并制备小干扰核糖核酸(siRNA)；(2)以siRNA为被包封物，制备脂质体得到稳定siRNA‑阳离子脂质体；(3)将siRNA‑阳离子脂质体按一定的比例于发酵前期加入发酵香肠中。该方法不影响发酵香肠的风味和色泽，并且抑制生物胺效果显著，对发酵香肠中生物胺的控制具有重要意义。

Description

一种降低发酵香肠中生物胺的方法及其应用

技术领域

本发明属于食品质量与安全领域，具体涉及一种siRNA-脂质体复合物的制备方法及其在降低发酵香肠中生物胺的应用。

背景技术

肉品加工业是我国大的食品产业之一，占食品产值的12％以上。发酵香肠作为发酵肉制品中的典型代表，因其营养价值高、风味独特、食用方便而深受消费者的喜爱。发酵香肠是将绞碎的肉和动物脂肪同盐、糖和香料等混合后灌进肠衣，经过微生物发酵而制成的具有典型的发酵风味特性的肉制品。在生产中，其丰富的蛋白质在蛋白酶和复杂的微生物群落的共同作用下，极易产生生物胺，包括酪胺，组胺，尸胺，腐胺等。研究表明，生物胺的产生需要满足3方面的条件：(1)蛋白质分解产物游离氨基酸；(2)有发生脱羧反应的条件和适宜微生物生长的环境；(3)产氨基酸脱羧酶微生物的存在。其中已经证实肠杆菌是发酵香肠中一种重要的具有氨基酸脱酸酶活性的微生物，同时也是发酵香肠中生物胺的主要产生菌，进一步研究发现主要为产气肠杆菌和阴沟肠杆菌。因此，抑制以上两类肠杆菌生物胺脱羧酶的表达是减少生物胺合成的有效途径。

生物胺是由氨基酸脱羧或醛和酮氨基化形成的具有生物活性的小分子量含氮有机化合物。人体摄入过量的生物胺会产生中毒现象，如头晕、头痛、高血压、心悸和呼吸紊乱等。此外，生物胺还是生成致癌物质亚硝胺类的前体物质，腐胺和尸胺不仅能加强组胺的毒性，而且还会与亚硝酸盐反应生成杂环类致癌亚硝胺。生物胺性质稳定，在高温下不易降解，目前降低生物胺的主要方法有高压法、辐照法、外源添加化合物等。这些方法存在着操作要求高，成本高，效果不明显，易降低食品品质等缺点，难以在生产中应用和推广。

RNA干扰技术是通过具有同源性的双链RNA诱导序列特异的目标基因的沉默，阻断其基因活性。根据碱基互补配对原则，小干扰RNA(siRNA)有着很高的特异性，只对同源的靶基因起到干扰作用，对不相关的序列不起作用。同时siRNA又存在着高效性，少量的siRNA就对基因表达沉默有着很高的效率。

目前，发酵香肠中降低生物胺的含量主要是通过工艺改良方法实现的，但是不能从根本上解决问题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种siRNA-脂质体复合物，能够对香肠发酵过程中主要产胺菌产胺相关基因的表达起抑制作用，从而降低香肠中生物胺的含量。针对香肠制品目前所存在的质量安全问题提供了一种高效、易操作的生物胺含量降低方法，提高了发酵香肠的食用安全性。

本发明的技术方案如下：

本发明提供一种降低发酵香肠中生物胺的方法，根据发酵香肠中的产胺菌产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes KCTC 2190)(NC_015663)产胺相关基因luxR(EAE_ 14370Gene ID:10793096)基因序列(SEQ NO:1)和阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacaesubsp.cloacae ATCC 13047)(NC_014121)产胺相关基因luxR(ECL_04308Gene ID:9126783)基因序列(SEQ NO:2)，分别设计E-siRNA并制备siRNA-脂质体复合物，再按比例加入发酵香肠中以降低生物胺。

进一步，所述E-siRNA为双链，产气肠杆菌的序列为：

正义链：UUAAUAUGCAAGUUUAGCGAG；

反义链：CGCUAAACUUGCAUAUUAAGA。

进一步，所述E-siRNA为双链，

阴沟肠杆菌的序列分别为：

正义链：UUAACACGUCUAUUUGUCGCG；

反义链：CGACAAAUAGACGUGUUAAAU。

进一步，取大豆磷脂，N-(1-(2,3二油酰氧基)丙基)-N,N,N-三甲基氯化铵，胆固醇，二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000溶解于溶于溶剂中，旋转蒸发成膜得到薄脂质膜；将薄脂质膜在葡萄糖溶液中水合，得到脂质体混合液；脂质体溶液中的脂质体粒径大小为100nm。

进一步，制备脂质体的各成分质量百分数为：N-(1-(2,3二油酰氧基)丙基)-N,N,N-三甲基氯化铵(DOTAP)20～40％；大豆磷脂30～40％；胆固醇35～50％；二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺(PEG)2～5％。

进一步，siRNA和脂质体混合液稀释，然后将稀释后的脂质体混合液逐滴加入siRNA溶液中，使得正负电荷比为1:1～10:1，孵育得到siRNA-脂质体复合物；siRNA-脂质体复合物粒径为200-300nm，冷冻干燥备用。

进一步，将靶基因为产气肠杆菌的siRNA-脂质体复合物和靶基因为阴沟肠杆菌的siRNA-脂质体复合物按照2:1～1:1的比例混合，再按照每千克肉添加0.8～2.5mg混合后的siRNA-脂质体在发酵前期加入发酵香肠中。

进一步，本发明的方法包括以下步骤：

(1)根据发酵香肠中主要产胺菌产气肠杆菌产胺相关基因(luxR)序列(参见附录1序列表)5′-CTCGCTAAACTTGCATATTAAGA-3′和阴沟肠杆菌产胺相关基因(luxR)序列5′-CGCGACAAATAGACGTGTTAAAT-3′，分别设计E-siRNA序列。

(2)E-siRNA的制备：T7启动子序列为：5′-TAATACGACTCACTATAG-3′，将300μmol正义链和300μmol T7启动子混合，90～100℃预变性2～5min，冰浴15～30min，再加入1～5μL10x Klenow缓冲液，5～10μL三磷酸脱氧核苷(dNTP)(10μmol/L)，1～4μL去离子水，1～5μLKlenow酶(2U/μL)，30～40℃水浴20～40min。取6μL反应液，加入3～6μL缓冲液，4～7μL三磷酸核苷(rNTP)混合物(25mmo1/L)，1～4μL去离子水和1～5μL T7 RNA聚合酶，30～40℃水浴1～3h。相同的方法制备反义链DNA产物。将两种DNA转录产物混合，30～40℃下水浴15～20h。通过体外转录试剂盒的方法消化DNA模板后，纯化siRNA分子，将其置于-80℃下备用。

(3)阳离子脂质体的制备：称取大豆磷脂2～5mg，N-(1-(2,3二油酰氧基)丙基)-N,N,N-三甲基氯化铵(DOTAP)2～5mg，胆固醇1～3mg，二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000(DSPE-PEG2000)1～3mg溶解于溶于氯仿-甲醇(体积比3:2)中，旋转蒸发成膜。将薄脂质膜在5％葡萄糖溶液中水合，随后振荡并将所得脂质体通过100nm聚碳酸酯膜过滤器挤出11次。得到粒径大小在100nm左右的脂质体混合液，获得约10mg/mL的脂质体溶液。

(4)L-E-siRNA的构建：siRNA和脂质体混合液分别用体积分数1％的无菌DEPC水溶液稀释，然后将稀释后的脂质体混合液逐滴加入siRNA溶液中，使得正负电荷比约为1:1～10:1，涡旋5min，室温下孵育15～20min形成粒径为200～300nm siRNA-脂质体复合物，冷冻干燥备用。

(5)将靶基因为产气肠杆菌的siRNA-脂质体复合物和靶基因为阴沟肠杆菌的siRNA-脂质体复合物按照3:2的比例混合，再按照每千克肉添加0.8～2.5mg L-E-siRNA的比例在发酵前期加入发酵香肠中。

优选地，步骤(3)中所述的siRNA阳离子复合物的浓度为10mg/mL。

优选地，步骤(4)中所述的脂质体混合液与siRNA溶液的电荷比为1:1～1:10。孵育时间为15～20min。

优选地，步骤(5)中将靶基因为产气肠杆菌和靶基因为阴沟肠杆菌的siRNA-脂质体复合物混合比例为2:1～1:1，每千克发酵香肠中添加的L-E-siRNA的量为0.8～2.5mg。

本发明还提供一种siRNA-脂质体复合物在降低发酵香肠中生物胺中的应用，所述siRNA-脂质体复合物的制备方法如上述。

进一步，siRNA-脂质体复合物在降低发酵香肠中生物胺中的应用，靶基因为产气肠杆菌的siRNA-脂质体复合物和靶基因为阴沟肠杆菌的siRNA-脂质体复合物按照2:1～1:1的比例混合，再按照每千克肉添加0.8～2.5mg L-E-siRNA的比例在发酵前期加入发酵香肠中。

与现有技术相比，本发明具有如下优点：

本发明制备了一种用于降低发酵香肠中生物胺合成的siRNA-脂质体复合物，其通过特异靶向产气肠杆菌和阴沟肠杆菌产胺相关基因的mRNA分子，与mRNA分子特异性结合后使mRNA分子降解，阻止了生物胺相关基因的表达，可从根本上抑制生物胺的合成。

经过大量实验证明，使用本发明的方法对发酵香肠中生物胺的含量具有显著的降低作用。得到的产品与对照组相比，生物胺含量下降70％以上。根据发酵香肠卫生标准中感官指标要求，siRNA-脂质体复合物处理后的产品在色泽、香气、滋味和质构等方面与对照组无显著差异。

本发明设计的siRNA是一类特殊的双链RNA分子，siRNA的序列与所作用的靶mRNA序列具有同源性。选用改良之后的脂质体作为传递siRNA的载体，可以使siRNA顺利穿越细胞膜并对核酸酶的降解具有抗性。制备的用于降低发酵香肠中生物胺合成的siRNA-脂质体复合物，其根据碱基互补配对原则，特异靶向发酵香肠中主要产胺菌产气肠杆菌和阴沟肠杆菌的产胺相关基因，通过与靶基因的mRNA分子特异性结合后使mRNA分子降解，从而达到使目的基因沉默的目的，从根本上抑制了生物胺的合成。

经实验证明，siRNA-脂质体复合物具有效率高、靶向性强的特点，使用本发明的方法对发酵香肠中生物胺的含量与对照组相比，显著下降了70％以上。在不影响香肠风味、色泽的情况下，能够安全用于抑制发酵香肠中生物胺的产生和含量，具有非常广泛的应用前景。

附图说明

图1为本发明L-E-siRNA复合物化学结构。

图2为实施例1中自然发酵香肠中处理前后生物胺的含量对比。

图3为实施例2中西式发酵香肠中处理前后生物胺的含量对比。

图4为处理前后自然发酵香肠风味对比。

图5为处理前后西式发酵香肠风味对比。

具体实施方式

下面将结合具体实施实例，对本发明的技术方案进行完整的描述。本发明实例选取自然发酵香肠和西式发酵香肠两个品种进行试验，研究表明生物胺含量普遍显著降低70％以上。

实施例1：

L-E-siRNA复合物在自然发酵香肠中的作用

自然发酵香肠制作工艺流程为：原料肉→预处理→绞碎→添加配料→腌制→灌肠→发酵→成熟→产品。

自然发酵香肠中生物胺的含量如表1所示。

表1自然发酵香肠中生物胺的含量(mg/kg)

本实施例中L-E-siRNA复合物并应用。

(1)设计E-siRNA序列。

(2)E-siRNA的制备。

(3)称取大豆磷脂4mg，DOTAP 4mg，胆固醇2mg，DSPE－PEG2000 2mg制备阳离子脂质体。

(4)L-E-siRNA的构建：siRNA混合液和脂质体混合液正负电荷比约2:1，涡旋5min，室温下孵育15min形成siRNA-脂质体复合物。产气肠杆菌和阴沟肠杆菌siRNA-脂质体复合物粒径分别为232nm和254nm。得到的L-E-siRNA结构如图1所示。

(5)将产气肠杆菌和阴沟肠杆菌的siRNA-脂质体复合物按照3:2的比例混合后，再以每千克发酵香肠中2mg siRNA-脂质体复合物的比例添加在腌制后期。

(6)成熟30d时，用HPLC检测产品中生物胺的含量，结果如表2所示；同时做空白对照，结果如表1所示。对自然发酵香肠进行感官评价，根据色泽、香气、滋味、质构进行评分，最强为9分，“未感觉到”为0分，平均分为样品得分，同时做空白对照，结果如图4所示。

表2L-E-siRNA复合物处理后自然发酵香肠中生物胺的含量(mg/kg)

由表1和表2生物胺含量比较得：L-E-siRNA复合物对自然发酵香肠中生物胺的抑制达到75.7％左右。

图2为实施例1中自然发酵香肠中处理前后生物胺的含量对比。图2可以看出，L-E-siRNA复合物对自然发酵香肠中腐胺、尸胺、酪胺、总胺的合成有极显著的抑制作用，对组胺的合成有显著的抑制作用。

图4为处理前后自然发酵香肠风味对比。由图4可以看出，L-E-siRNA复合物对自然发酵香肠的色泽、香气、质构、滋味无明显影响。

实施例2：L-E-siRNA复合物在西式发酵香肠中的作用

西式发酵香肠制作工艺流程为：原料肉→预处理→绞碎→添加配料→腌制→灌肠→发酵→成熟→产品。

表3西式发酵香肠中生物胺的含量(mg/kg)

本实施例中L-E-siRNA复合物并应用：

(1)设计E-siRNA序列。

(2)E-siRNA的制备。

(3)称取大豆磷脂3mg，DOTAP 3mg，胆固醇1.5mg，DSPE－PEG2000 1.5mg制备阳离子脂质体。

(4)L-E-siRNA的构建：siRNA混合液和脂质体混合液正负电荷比约1:1，涡旋5min，室温下孵育20min形成siRNA-脂质体复合物。产气肠杆菌和阴沟肠杆菌siRNA-脂质体复合物粒径分别为241nm和235nm。

(5)将产气肠杆菌和阴沟肠杆菌的siRNA-脂质体复合物按照3:2的比例混合后，再以每千克发酵香肠1.8mg siRNA-脂质体复合物的比例添加在腌制后期。

(6)成熟30d时，用HPLC检测产品中生物胺的含量，结果如表4所示；同时做空白对照，结果如表3所示。对西式发酵香肠进行感官评价，根据色泽、香气、滋味、质构进行评分，最强为9分，“未感觉到”为0分，平均分为样品得分，同时做空白对照，结果如图5所示。

表4L-E-siRNA复合物处理后西式发酵香肠中生物胺的含量(mg/kg)

由表3和表4生物胺含量比较可得：L-E-siRNA复合物对西式发酵香肠中生物胺的抑制达到71.2％左右。

图3为实施例2中西式发酵香肠中处理前后生物胺的含量对比。由图3可以看出，L-E-siRNA复合物对西式发酵香肠中总胺的合成有极显著的抑制作用，对尸胺的合成有显著的抑制作用，腐胺和酪胺的含量也明显减少。

图5为处理前后西式发酵香肠风味对比。由图4可以看出，L-E-siRNA复合物对西式发酵香肠的色泽、香气、质构、滋味无明显影响。

SEQUENCE LISTING

<110> 浙江工商大学

<120> 一种降低发酵香肠中生物胺的方法及其应用

<130> 2018

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 555

<212> DNA

<213> 产胺菌产气肠杆菌（Enterobacter aerogenes ）

<400> 1

atgttcagta aacacacgca catttgttcc gaacgctatg acctgtggat tgacaaccac 60

tttctgatga gtggtatcag ccttattctg cgcacgctgc cagaaagttg ctttcgcaaa 120

aagcatgttt tctttaccag cgatagctat ttctcggtgt tgcaacacaa atacaatcgt 180

cgggaaacga tttttatttt attaaccgaa ggcaacgatc ttaatttcct tagcgaactg 240

ccaatgttac gcattcccgc cagatcgacc cctgctgaat taaaaacatt tctcaatcaa 300

ccgacccgtt attataaatc gcatacttct cctggcgaac tgatacagtt taccgagcga 360

gaaaagaagg tcattcagct catcagtaat ggcgaagcca ttgccagcat tggtcgctcg 420

ctaaacttgc atattaagac aatttatcaa atccgtttga atctgataaa aaaactgggc 480

tgcagcggca ggaccgattt ctttaatatc agccgtagcg aaacatttaa gtcctggagt 540

caaatccatc tgtga 555

<210> 2

<211> 633

<212> DNA

<213> 阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae subsp. cloacae )

<400> 2

ttggggcaga attatgcgtt ggtcgttgat gaccatccat tggtagcaag cggtatcgcc 60

aattttctga ttacacattg ccgatttaag caggcgagtg tggtgacgaa tgaggatgat 120

tgctaccgtc aaattaggga taatggcccg ccacgtttgc tggtaatcga tttttggctc 180

tcgtccggta ccgcgttgaa attactcaaa gaagtaaaac aactttaccc acaggtaagg 240

ctcctggtgg ttagtgggga tgacaataac gatatctggc agaaagttca cgccgccggg 300

gggcacggtt tcgtattgaa aagcgagcca cctgaaatgt tttcacgggc cgtttttgcc 360

ctcactgata atctcacctg gtttcctgag ggaaacgaat tttccgttga gtcgaataat 420

gagaagttaa gtaaatttaa cttaacgccg cgacaaatag acgtgttaaa tatgattatg 480

cgtggcctgc caaataaaag aattgccgcg caactttcta tttctgagcc tacagtcaaa 540

gagcacatca gcaatatatt gaaaaagata ggcgttaaca gtcgggtcga agccatcacg 600

cttctgcatg gcaaacggga accgtcggaa tga 633

Claims

1.一种降低发酵香肠中生物胺的方法，其特征在于，根据发酵香肠中的产胺菌产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)KCTC2190和阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacaesubsp.cloacae)ATCC13047产胺基因luxR序列，分别设计E-siRNA并制备siRNA-脂质体复合物，再按比例加入发酵香肠中以降低生物胺；

E-siRNA为双链，

根据产气肠杆菌的luxR序列设计的E-siRNA分别序列为：

正义链：UUAAUAUGCAAGUUUAGCGAG；

反义链：CGCUAAACUUGCAUAUUAAGA；

根据阴沟肠杆菌的luxR序列设计的E-siRNA序列分别为：

正义链：UUAACACGUCUAUUUGUCGCG；

反义链：CGACAAAUAGACGUGUUAAAU。

2.根据权利要求1中的降低发酵香肠中生物胺的方法，其特征在于，取大豆磷脂，N-(1-(2,3二油酰氧基)丙基)-N,N,N-三甲基氯化铵，胆固醇，二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000溶解于溶剂中，旋转蒸发成膜得到薄脂质膜；将薄脂质膜在葡萄糖溶液中水合，得到脂质体混合液；脂质体溶液中的脂质体粒径大小为100nm。

3.根据权利要求2中的降低发酵香肠中生物胺的方法，其特征在于，制备脂质体的各成分质量百分数为：N-(1-(2,3二油酰氧基)丙基)-N,N,N-三甲基氯化铵20～40％；大豆磷脂30～40％；胆固醇35～50％；2～5％的二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000。

4.根据权利要求2中的降低发酵香肠中生物胺的方法，其特征在于，siRNA和脂质体混合液稀释，然后将稀释后的脂质体混合液逐滴加入siRNA溶液中，使得正负电荷比为1:1～10:1，孵育得到siRNA-脂质体复合物；siRNA-脂质体复合物粒径为200-300nm。

5.根据权利要求1中的降低发酵香肠中生物胺的方法，其特征在于，将靶基因为产气肠杆菌的siRNA-脂质体复合物和靶基因为阴沟肠杆菌的siRNA-脂质体复合物按照2:1～1:1的比例混合，再按照每千克肉添加0.8～2.5mg混合后的siRNA-脂质体在发酵前期加入发酵香肠中。

6.根据权利要求1中的降低发酵香肠中生物胺的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

步骤a，根据发酵香肠中主要产胺菌产气肠杆菌产胺相关基因序列5′-CTCGCTAAACTTGCATATTAAGA-3′和阴沟肠杆菌产胺相关基因序列5′-CGCGACAAATAGACGTGTTAAAT-3′，分别设计E-siRNA序列；

步骤b，E-siRNA的制备：T7启动子序列为：5′-TAATACGACTCACTATAG-3′，将正义链和T7启动子混合，90～100℃预变性2～5min，冰浴15～30min，再加入1～5μL10xKlenow缓冲液，5～10μL三磷酸脱氧核苷，1～4μL去离子水，1～5μLKlenow酶，30～40℃水浴20～40min；取6μL反应液，加入3～6μL缓冲液，4～7μL三磷酸核苷混合物，1～4μL去离子水和1～5μLT7RNA聚合酶，30～40℃水浴1～3h；相同的方法制备反义链DNA产物；将两种DNA转录产物混合，30～40℃下水浴15～20h；通过体外转录试剂盒的方法消化DNA模板后，纯化siRNA分子，将其置于-80℃下备用；

步骤c，阳离子脂质体的制备：按以下质量百分数称取各原料，N-(1-(2,3二油酰氧基)丙基)-N,N,N-三甲基氯化铵20～40％；大豆磷脂30～40％；胆固醇35～50％；2～5％的二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000，溶解于氯仿-甲醇中，旋转蒸发成膜；将薄脂质膜在5％葡萄糖溶液中水合，振荡并将所得脂质体通过100nm聚碳酸酯膜过滤器挤出11次；得到脂质体混合液，获得10mg/mL的脂质体溶液；

步骤d，L-E-siRNA的构建：siRNA和脂质体混合液分别用体积分数1％的无菌DEPC水溶液稀释，然后将稀释后的脂质体混合液逐滴加入siRNA溶液中，使得正负电荷比为1:1～10:1，涡旋5min，室温下孵育15～20min形成粒径为200～300nmsiRNA-脂质体复合物，冷冻干燥备用；

步骤e，将靶基因为产气肠杆菌的siRNA-脂质体复合物和靶基因为阴沟肠杆菌的siRNA-脂质体复合物按照2:1～1:1的比例混合，再按照每千克肉添加0.8～2.5mgL-EsiRNA的比例在发酵前期加入发酵香肠中。