CN101678025A - 四氢生物蝶呤组合物及其测量方法 - Google Patents

四氢生物蝶呤组合物及其测量方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及施用四氢生物蝶呤的治疗方法，包括口服剂型、静脉注射制剂和与食物一同施用。本发明还公开了测量样品中生物蝶呤和生物蝶呤的代谢物的量的生物蝶呤测定。

Description

四氢生物蝶呤组合物及其测量方法
相关申请的交叉引用
本申请要求分别于2007年4月11日提交的美国临时申请第60/922,821号和于2008年1月8日提交的美国临时申请的第61/019,753号的优先权，通过引用将上述各申请的全部内容并入本文。
技术领域
本发明主要涉及治疗对BH4响应的紊乱的组合物和方法，以及检测和量化生物蝶呤的方法和组合物。
背景技术
四氢生物蝶呤(本文称为BH4)是天然存在的蝶呤家族的生物胺，其为包括苯丙氨酸羟化酶(PAH)、酪氨酸羟化酶、色氨酸羟化酶和一氧化氮合成酶在内的多种不同酶的辅助因子。蝶呤以还原和氧化的形式存在于生理体液和组织中，然而，只有5，6，7，8-四氢生物蝶呤具有生物活性。其为手性分子，并且已经知道，该辅助因子的6R对映体是生物活性对映体。有关BH4的合成和紊乱的详细评论，参考Blau等于2001年发表的文献(Disorders of tetrahydrobiopterin and related biogenic amines.自：Scriver CR，Beaudet AL，Sly WS，Valle D，Childs B，Vogelstein B，编.TheMetabolic and Molecular Bases of Inherited Disease.第8版.New York：McGraw-Hill，2001：1275-1776)。
Fiege等(Molecular Genetics and Metabolism 81：45-51(2004))研究了口服四氢生物蝶呤(BH4)的药代动力学，并提出“口服BH4具有相当大的变化性，原因可能在于胃肠内的不同吸收和/或首过效应”。
已经提出将四氢生物蝶呤用于治疗各种不同的疾病状态，因而对替代的和改进的施用该药物的方法存在需求。
发明内容
本发明涉及以改善或最大化其口服生物利用率和/或改善或优化从一次施用到下一次施用的口服生物利用率的一致性的方式，施用6R-(L-赤式)-5，6，7，8-四氢生物蝶呤(BH4)或其药用可接受盐的方法。这些方法可用于任何对BH4响应的紊乱的治疗，包括代谢疾病、心血管疾病、贫血症和神经精神异常的治疗。有利的是，本发明的方法可以更好地控制临床症状，例如可使血浆苯丙氨酸水平、血压、神经递质水平或其它临床参数的波动降低。
本文所用的BH4是指6R-(L-赤式)-5，6，7，8-四氢生物蝶呤。也可以将本文所用的术语BH4理解为：除非上下文中另有指出，否则可选地表示6R-(L-赤式)-5，6，7，8-四氢生物蝶呤的药用可接受盐。
在第一方面中，本发明提供了使有需要的患者口服BH4的纯化制剂的方法。
在示例性实施方式中，所述方法包括以下步骤，即，告知患者：与不和食物一同摄入时相比，与食物一同摄入时四氢生物蝶呤的吸收得到提高。在一些实施方式中，患者被告知在餐后(例如高脂肪、高热量餐后)不久摄入，会导致以下参数中的任意一个、两个、三个或全部得到提高：平均血药浓度、Cmax、AUC、AUC(0-t)和/或AUC(inf)。在示例性实施方式中，患者被告知：与不和食物一同施用(禁食状态)相比，和高脂肪膳食一同施用BH4会使Cmax和AUC增加。在一些实施方式中，相对增加可为至少20％或30％，或者更高。
在替代性实施方式或者附加于前述实施方式的实施方式中，施用四氢生物蝶呤的方法包括告知患者：与溶解于液体后摄入相比，以完整的片剂摄入时会提高四氢生物蝶呤的吸收。在一些实施方式中，患者被告知摄入完整的片剂会导致以下任何参数的升高：平均血药浓度、Cmax、AUC、AUC(0-t)或AUC(inf)。在示例性实施方式中，患者被告知：与溶解于液体后施用BH4相比，以完整的片剂施用BH4会使Cmax和AUC增加。在一些实施方式中，相对增加可达至少20％，或者更高。
任何前述方法都可以通过以下方式进行：在包含印刷的标签的容器中提供或施用四氢生物蝶呤，所述标签告知患者上述吸收参数的变化。
可选的是，本发明的方法还包括向有需要的患者提供治疗有效量的四氢生物蝶呤的步骤。所述治疗有效量随需治疗的病情而变化，并可以由治疗医生根据所需临床症状的改善容易地确定。
在一个示例性实施方式中，所述方法涉及以溶解的形式施用BH4，其中，将制剂溶解在包括但不限于水、橙汁和苹果汁的液体中。在一个示例性实施方式中，对禁食情况(即空腹)的患者施用溶解的BH4。本发明还设想了每日1次或更多次，在指定时间(包括但不限于早上、白天和晚上，每日都于相同时间)空腹施用溶解的BH4。在示例性实施方式中，在空腹之时对患者施用所述组合物，例如在餐前至少30分钟、45分钟或至少1小时，和/或在餐后至少90分钟、2小时、2.5小时或3小时施用。由此，BH4可以以液体产品摄入，或者在摄入前由固体或半固体剂型预溶解而摄入。在另一实施方式中，BH4还可以在口腔中由固体或半固体剂型溶解，然后吞咽该溶解的溶液。
在又一示例性实施方式中，所述方法涉及施用包括但不限于片剂、胶囊剂、糖丸(candy)、锭剂、散剂和颗粒剂的固体剂型的BH4，或者包括但不限于口腔喷洒为胶冻剂的半固体型的BH4，其在无需于吞咽之前溶解于包括但不限于水、橙汁和苹果汁的液体中的情况下被吞咽。在一个实施方式中，对禁食情况(即空腹)的患者施用吞咽型BH4。本发明还设想了每日1次或更多次，在指定时间(包括但不限于早上、白天和晚上，每日都于相同时间)空腹施用以固体或半固体剂型吞咽的BH4。在示例性实施方式中，在患者空腹之时对其施用所述组合物，例如在餐前至少30分钟、45分钟或至少1小时，和/或在餐后至少90分钟、2小时、2.5小时或3小时施用。
在另一实施方式中，所述方法涉及与食物一同施用以固体或半固体剂型吞咽或者溶解于液体中的BH4，所述食物例如为高脂肪食物或高脂肪和/或高热量膳食。本发明还设想了每日1次或更多次，在指定时间(包括但不限于早上、白天和晚上，每日都于相同时间)，与例如高脂肪食物或者高脂肪和/或高热量膳食等食物一同施用吞咽型或溶解的BH4。在示例性实施方式中，每日于餐后立即摄入一次固体剂型的BH4。在优选实施方式中，固体剂型被配制为片剂或胶囊剂。在更具示例性的实施方式中，在进餐的约0分钟～30分钟或者5分钟～20分钟内摄入BH4。无论以固体剂型、液体剂型还是溶解的溶液摄入，与禁食对照相比，在餐后立即摄入时BH4的体内暴露量(或者生物利用率)更高。
BH4和食物可以几乎同时摄入，或者BH4可以在食物之前或之后摄入。进食与施用吞咽型或溶解的BH4之间的时间段可以是至少5分钟。例如，可以在餐前或餐后60分钟、30分钟、25分钟、20分钟、15分钟、10分钟或5分钟施用BH4。
在又一实施方式中，对于某些患者(例如成年人)或者某些疾病状态(例如心血管疾病或者与NOS机能障碍有关的其它疾病)，为改善生物利用率，本发明的方法涉及施用完整的片剂，而不是将片剂溶解于液体中。
在第二方面中，本发明设想了通过例如使用质子交换聚合物来降低肠内的pH，从而稳定患者肠道中的BH4的方法。还设想了包含BH4和诸如质子交换聚合物等酸化赋形剂的相应产品。
本发明的第三方面设想了延长BH4的胃肠停留时间的方法，所述方法包括但不限于使用诸如脂肪酸和/或甘油脂肪酸酯等减缓胃肠运动的试剂来减缓胃肠运动。这种疏水剂可以延长BH4保留在胃肠中的时长，并可以增加被吸收的BH4的量。与不具有所述试剂的BH4制剂相比，使用所述试剂配制时BH4保留在胃肠中的时长可以长至少1.5倍、至少2倍、至少3倍、至少4倍或至少5倍。适宜的脂肪酸包括油酸、硬脂酸、花生酸、棕榈酸、花生四烯酸、亚油酸、亚麻酸、芥酸、肉豆蔻酸、月桂酸、肉豆蔻脑酸(myristolic acid)和棕榈炔酸。还设想了为了延长BH4的胃肠停留时间，而利用藻酸来引起胃滞留和利用聚卡波非来引起生物粘着。设想了包含BH4和减缓胃肠运动的试剂的相应产品。
本发明的第四方面设想了利用诸如HPMC和卡波姆等缓释制剂调节BH4的释放的方法。还设想了作为缓释制剂的相应产品。
在第五方面中，本发明设想了通过口服以外的途径施用无菌液体或无菌固体剂型的BH4，所述途径包括但不限于局部、静脉内、皮下、肌肉内、鞘内、眼和吸入等施用途径。设想了适于这些施用途径的相应组合物和装备包，以及制造它们的方法。例如，设想了包含BH4的分别用于透皮或口腔施用的透皮贴或口腔贴(buccal patch)。还设想了包含BH4的舌下片。设想了适宜的装备包，包括包含BH4的吸入器或者包含BH4和点滴器或喷雾器的装备包。
一个实施方式包括四氢生物蝶呤(BH4)或其药用可接受的盐的液体制剂，所述制剂包含BH4或其药用可接受的盐、抗氧化剂和pH缓冲剂的水溶液。
另一实施方式包括四氢生物蝶呤(BH4)或其药用可接受的盐的液体制剂的制造方法，所述方法包括提供含有BH4或其药用可接受的盐的水溶液、向该含有BH4或其药用可接受的盐的溶液加入抗氧化剂和pH缓冲剂、在加入抗氧化剂和pH缓冲剂之前或之后利用惰性气体或二氧化碳使含有BH4或其药用可接受的盐的水溶液鼓泡，和将经鼓泡的含有BH4或其药用可接受的盐、抗氧化剂和pH缓冲剂的溶液密封在容器中。
在第六方面中，本发明设想了一种测量BH4的改进的方法，所述方法利用串联质谱法并计算经还原的生物蝶呤的量。该方法可以提供对于BH4的灵敏度为5ng/mL～1000ng/mL的BH4检测，其准确度与精度例如为：变异系数(CV)％低于15％(在定量下限(LLOQ)为20％)。在示例性实施方式中，利用与串联质谱联用的HPLC(RP)(LC/MS/MS)测量BH4的方法包括以下步骤：(1)将血液、血浆、组织匀浆或尿的样品进行氧化；(2)对氧化的样品进行碘量滴定法；(3)使所述氧化的样品通过离子交换柱；(4)利用HPLC和串联质谱测量所述样品中的总生物蝶呤和氧化的生物蝶呤；并计算还原的生物蝶呤的量，其为所述总蝶呤与所述氧化形式之差。在一个实施方式中，以酸性氧化处理样品，其中，所述方法包括以下步骤：(1)使用KCl、HCl或TCA处理所述样品；(2)对所述经酸氧化的样品进行碘量滴定法；(3)使所述经氧化的样品通过离子交换柱；(4)利用HPLC和串联质谱测量所述样品中包含6R-BH4、R-q-DHBP(其在体内立即还原为6R-BH4，使得测量的还原的生物蝶呤主要是基于6R-BH4)、DHBP和BP的总生物蝶呤。在另一实施方式中，通过碱性氧化处理样品，其中，所述方法包括：(1)使用KI、I或NaOH处理所述样品；(2)使用HCl或TCA对所述经碱性氧化的样品进行酸化；(3)对所述经氧化的样品进行碘量滴定法；(4)使所述样品通过离子交换柱；(5)利用HPLC和串联质谱测量包含DHBP和BP的氧化的生物蝶呤；和(6)计算还原的生物蝶呤(6R-BH4+R-q-DHBP)的量，其为总生物蝶呤与氧化形式之差。
本发明的另一方面是用于二氢生物蝶呤、生物蝶呤和其类似物的反相HPLC分离的流动相溶液，所述溶液包括包含甲醇、乙酸钠、柠檬酸、EDTA和1，4-二硫代赤藓醇的水溶液。类似的是，设想了从含有基础形式和二氢形式的混合物中分离二氢生物蝶呤和生物蝶呤或它们的类似物的方法，所述方法包括利用包括水溶液的流动相，对含有二氢生物蝶呤和生物蝶呤或二氢生物蝶呤的类似物和生物蝶呤的类似物的混合物进行反相HPLC，所述水溶液包含甲醇、乙酸钠、柠檬酸、EDTA和1，4-二硫代赤藓醇。
本发明的另一方面是一种量化生物蝶呤物种的混合物中的生物蝶呤的方法，所述方法包括：提供这样一种混合物，所述混合物包含生物蝶呤以及二氢生物蝶呤和四氢生物蝶呤两者中的至少一种，或者生物蝶呤的类似物以及二氢生物蝶呤和四氢生物蝶呤两者中的至少一种的类似物；通过反相HPLC分离混合物中的生物蝶呤物种，在四氢生物蝶呤及其类似物的情况下，将存在于第一电极附近的四氢生物蝶呤及其类似物氧化为醌型二氢生物蝶呤的形式，然后将醌型形式还原回四氢生物蝶呤及其类似物，其存在于第二电极处，和测量还原反应所产生的电流以确定物种的浓度，由此进行电化学检测；和/或在二氢生物蝶呤、其类似物、生物蝶呤或其类似物的情况下，在二氢生物蝶呤物种经柱后氧化为生物蝶呤之后通过荧光检测测量这些物种。
关于本文所述的组合物和方法、优选组分及其组成范围，可以从本文所提供的各种实施例中选择。
通过下文的详细描述，本发明的其它特征和优点将变得显而易见。然而，应当了解，详细描述和具体实施例虽然指明了本发明的优选实施方式，却仅以说明的方式给出，因为对于本领域技术人员而言，通过本文的详细描述，在本发明的精神和范围内的各种变化和修改都是显而易见的。
附图说明
图1显示了晶体多晶型B型6R-(L-赤式)-5，6，7，8-四氢生物蝶呤的粉末X-射线衍射图案特征。
图2是A型(6R)-L-赤式-四氢生物蝶呤二盐酸盐显示的特征X-射线衍射图案的图。
图3是F型(6R)-L-赤式-四氢生物蝶呤二盐酸盐显示的特征X-射线衍射图案的图。
图4是J型(6R)-L-赤式-四氢生物蝶呤二盐酸盐显示的特征X-射线衍射图案的图。
图5是K型(6R)-L-赤式-四氢生物蝶呤二盐酸盐显示的特征X-射线衍射图案的图。
图6是(6R)-L-赤式-四氢生物蝶呤二盐酸盐的C型水合物显示的特征X-射线衍射图案的图。
图7是(6R)-L-赤式-四氢生物蝶呤二盐酸盐的D型水合物显示的特征X-射线衍射图案的图。
图8是(6R)-L-赤式-四氢生物蝶呤二盐酸盐的E型水合物显示的特征X-射线衍射图案的图。
图9是(6R)-L-赤式-四氢生物蝶呤二盐酸盐的H型水合物显示的特征X-射线衍射图案的图。
图10是(6R)-L-赤式-四氢生物蝶呤二盐酸盐的O型水合物显示的特征X-射线衍射图案的图。
图11是(6R)-L-赤式-四氢生物蝶呤二盐酸盐的G型溶剂化物显示的特征X-射线衍射图案的图。
图12是(6R)-L-赤式-四氢生物蝶呤二盐酸盐的I型溶剂化物显示的特征X-射线衍射图案的图。
图13是(6R)-L-赤式-四氢生物蝶呤二盐酸盐的L型溶剂化物显示的特征X-射线衍射图案的图。
图14是(6R)-L-赤式-四氢生物蝶呤二盐酸盐的M型溶剂化物显示的特征X-射线衍射图案的图。
图15是(6R)-L-赤式-四氢生物蝶呤二盐酸盐的N型溶剂化物显示的特征X-射线衍射图案的图。
图16是测量生物蝶呤的流程图。
图17是验证生物蝶呤测定的总结。
图18是显示在使大鼠单次口服沙丙蝶呤(BH4)后血浆中总生物蝶呤的药代动力学参数的表。
图19显示了在对大鼠单剂施用沙丙蝶呤(BH4)后血浆生物蝶呤浓度与还原形式的比例。
图20显示了在对猴单剂施用沙丙蝶呤(BH4)后血浆生物蝶呤浓度与还原形式的比例。
图21是显示在对猴单剂施用沙丙蝶呤(BH4)后血浆中总生物蝶呤的药效学参数的表。
图22显示了用于评价安全性的事项的一览表。
图23显示了健康的志愿者在禁食情况下以溶解的和完整的片剂口服和在餐后以完整的片剂口服10mg/kg的BH4后BH4的平均血药浓度——线性坐标轴。
图24显示了健康的志愿者在禁食情况下以溶解的和完整的片剂口服和在餐后以完整的片剂口服10mg/kg的BH4后BH4的平均血药浓度——半对数坐标轴。
图25显示了总结健康的志愿者在禁食情况下以溶解的和完整的片剂口服和在餐后以完整的片剂口服10mg/kg的BH4后BH4的药代动力学参数的表。
图26显示了健康的志愿者在禁食情况下以溶解的和完整的片剂口服和在餐后以完整的片剂口服10mg/kg的BH4后BH4的药代动力学参数的统计学比较。
图27显示了使用5％的甘露醇水溶液配制的BH4在-20℃储存两周之前和之后的稳定性研究。
图28显示了BH4胶囊制剂在40℃储存54天之前和之后的溶出曲线。
图29显示了两种BH4制剂——BH4生物粘附片剂和BH4生物粘附颗粒剂的溶出曲线。
图30显示了BH4的各种缓释制剂的溶出曲线。
图31显示了BH4的各种缓释制剂的溶出曲线。
图32显示了BH4的漂浮型制剂的示意图。
图33显示了各种漂浮型制剂的溶出曲线。
图34显示了BH4的气体生成剂型的示意图。
图35显示了各种BH4制剂的药代动力学曲线。
图36显示了静脉注射用BH4制剂在pH 4经35天后的稳定性研究。
图37显示了各种静脉注射用BH4制剂经350小时后的稳定性研究。
图38显示了各种BH4浓度的静脉注射用BH4制剂的稳定性研究。
具体实施方式
本发明提供了口服6R-(L-赤式)-5，6，7，8-四氢生物蝶呤(包括其药用可接受的盐)的纯化制剂的改进的方法。本发明基于以下发现：口服四氢生物蝶呤(BH4)具有低胃肠道吸收性，这是BH4的生物利用率低的主要起作用的因素。
6R-(L-赤式)-5，6，7，8-四氢生物蝶呤(BH4)的化学结构如下所示：
Figure A20088001159400171
四氢生物蝶呤是具有低脂溶性的水溶性有机化合物。根据利用BioLoom软件(版本1.5，来自Claremont California的Biobyte Corp)的计算机实验分析(silico experimental analysis)，BH4的辛醇-水分配系数被确定为-1.17。以辛醇/水分配系数近似的生物膜的最优渗透在log P为2或者比脂溶性高100-x倍左右时实现。虽然低ClogP可使该底物在生理条件下容易溶解，但是底物渗透生物膜中的脂双层的能力受到限制，这会限制口服利用率(oral availability)。
本文所述的大鼠和猴的体内研究显示，与以相同剂量静脉内施用BH4相比，只有8％～11％的BH4在胃肠内吸收，而大部分在粪便中排出。BH4吸收上的这种差异在本文所述的食物对健康人的BH4生物利用率的影响的研究中也有显示。虽然禁食情况下施用在水和橙汁中的BH4会得到类似的平均血药浓度和Cmax和AUC(0-t)的平均值，但是，当在水中施用BH4时，与高脂肪、高热量膳食同时施用BH4会导致平均血药浓度和Cmax和AUC(0-t)的平均值的显著升高。
尽管存在大量描述餐后生物利用率提高的文献，但是这种食物效应通常见于亲脂性(即，脂溶性)水不溶性药物，而不常见于高水溶性的活性物质，如BH4。在进餐后对亲脂性化合物的生物利用率提高的常见解释在于，由于“相似相溶原理”，高脂肪膳食有助于溶解药物，这使其能被吸收。另一可能的解释在于，高脂肪膳食刺激了胆汁酸的分泌，胆汁酸是帮助溶解和乳化我们所吃的脂肪以助于其消化的天然生物表面活性剂。这些胆汁酸也被认为能够增溶水不溶性化合物，从而使其能被吸收。然而，BH4不需要增溶以被吸收，因为其溶解度高于1000mg/mL，并且该化合物是已知的最易溶的药物之一。因此，高脂肪、高能量膳食对其生物利用率的增强与这种已知机理不一致。
然而，以固体或半固体剂型和/或与高脂肪膳食一同施用可以通过延长BH4在胃和上胃肠道(GIT)的酸性环境中(BH4在此处具有化学稳定性)的停留时间而使生物利用率最大化。BH4的稳定性随着pH的增加而降低，其在pH 6.8(这约为小肠的pH)的缓冲溶液中的半衰期约为15分钟。在pH 3.1时，浓度为1mg/mL的BH4的稳定性超过3小时，pH 3.1处于正常志愿者的胃的典型pH范围内。当胃的pH下降至低于pH 3.1时，BH4的化学稳定性可以进一步升高。因此，延长的胃停留时间将完好的药物提供给胃壁以用于吸收，而迅速排空入肠会降解BH4，使其因此而不能被吸收。
由此，为在每次施用时最大化BH4的口服生物利用率，应该将BH4与食物，例如高脂肪食物或高脂肪和/或高热量膳食一同进食。作为另外一种选择，为最大化两次施用之间口服生物利用率的一致性，应该空腹服用BH4(例如在餐前1小时或餐后2小时)。
本文所用的术语“生物利用率”是指施用剂量的药物中进入体循环的比例。如果药物是静脉内施用的，那么其生物利用率理论上为100％。然而，如果通过其它途径施用药物(例如口服)，则其生物利用率将低于100％，这是例如胃肠道中的不完全吸收、在吸收之前的降解或代谢和/或肝的首过效应的结果。
术语“高脂肪膳食”通指具有至少约700千卡和至少约45％脂肪(作为脂肪的千卡的相对百分比)的膳食，或者作为另外一种选择，指具有至少约900千卡和至少约50％脂肪的膳食。术语“高脂肪食物”通指包含至少20g脂肪，或者至少25g、30g、35g、40g、45g或50g脂肪和/或至少约45％或50％脂肪的食物。一份FDA指南将“高脂肪膳食”定义为膳食的总热量含量约50％，而“高热量膳食”为约800卡～1000卡。FDA推荐将高脂肪和高热量膳食作为用于食品影响生物利用率和进食生物等效性(fed bioequivalence)研究的试验膳食。该试验膳食应该分别从蛋白质、糖类和脂肪中获得约150卡、250卡和500卡～600卡的热量。一份示例性试验膳食由两个奶油煎蛋、两条熏肉、4盎司薯饼(hash brown potato)和8盎司全脂牛奶构成。如果来自蛋白质、碳水化合物和脂肪的相似量的热量具有类似的膳食体积和粘度，则可以进行替换(Guidance for Industry，Food-Effect Bioavailability and Fed Bioequivalence Studies，U.S.美国卫生及公共服务部，食品药品管理局，药品评价与研究中心(CDER)，2002年12月)。
在第一方面中，本发明提供了口服6R-(L-赤式)-5，6，7，8-四氢生物蝶呤(BH4)(包括其药用可接受盐)的纯化制剂的方法。
在一些实施方式中，所述方法涉及告知患者：与食物一同施用四氢生物蝶呤对于药代动力学具有影响。在示例性实施方式中，所述方法包括以下步骤，即，告知患者：与不和食物一同摄入时相比，与食物一同摄入时四氢生物蝶呤的吸收得到提高。在一些实施方式中，患者被告知在餐后(例如高脂肪、高热量餐后)不久摄入，会导致以下参数中的任意一个、两个、三个或全部提高：平均血药浓度、Cmax、AUC、AUC(0-t)和/或AUC(inf)。在示例性实施方式中，患者被告知：与不和食物一同施用(禁食情况)相比，和高脂肪膳食一同施用BH4会使Cmax和AUC升高。在一些实施方式中，相对增量可达至少20％或30％，或者更高。
在替代性实施方式或者附加于前述实施方式之外的实施方式中，施用四氢生物蝶呤的方法包括告知患者：与溶解于液体后摄入时相比，以完整的片剂摄入时会提高四氢生物蝶呤的吸收。在一些实施方式中，患者被告知摄入完整的片剂会导致以下任何参数的升高：平均血药浓度、Cmax、AUC、AUC(0-t)或AUC(inf)。在示例性实施方式中，患者被告知：与溶解于液体后施用BH4相比，以完整的片剂施用BH4会使Cmax和AUC升高。在一些实施方式中，相对增量可达至少20％，或者更高。
任何前述方法都可以通过以下方式进行：在包含印刷的标签的容器中提供或施用四氢生物蝶呤，所述标签告知患者上述吸收参数的变化。
可选的是，本发明的方法还包括向有需要的患者提供治疗有效量的四氢生物蝶呤的步骤。所述治疗有效量随需治疗的病情而变化，并可由治疗医生根据所需临床症状的改善容易地确定。
在一个示例性实施方式中，所述方法涉及施用溶解形式的BH4，其中，将该制剂溶解在包括但不限于水、橙汁和苹果汁的液体中。在一个实施方式中，对禁食情况(即空腹)的患者施用溶解的BH4。本发明还设想了每日1次或更多次，在指定时间(包括但不限于早上、白天和晚上，每日都于相同时间)空腹施用溶解的BH4。在示例性实施方式中，在患者空腹时对其施用所述组合物，例如在餐前至少30分钟、45分钟或至少1小时，和/或在餐后至少90分钟、2小时、2.5小时或3小时施用。由此，BH4可以以液体产品摄入，或者在摄入前由固体或半固体剂型预溶解。在另一实施方式中，BH4还可以在口腔中由固体或半固体剂型溶解，然后吞咽该溶解的溶液。
通过确保在输送至其吸收部位(主要是胃和肠)之前BH4完全溶解在溶液或生物流体中，这些方法最大化了吸收率和生物利用率。将活性药物成分或药物溶解在溶液中是吸收到体(血液和淋巴)循环中的先决条件。当口服如片剂和胶囊剂等固体剂型时，在吸收到体循环中之前，这些固体剂型将依次通过诸如崩解为颗粒、解聚为粉末和溶出等一系列步骤。施用液体、半固体和速溶的固体剂型将绕过这一系列步骤。因此活性物质可以较早被吸收，并且，因为不能保证固体剂型在经过吸收位置前会释放其内部所含有的所有活性物质，所以其中活性物质在到达吸收位置之前以溶解的形式存在的制剂通常表现出较高的生物利用率。
这些剂型降低了血药水平的变化性，因为它们回避了在人体内的剂型崩解和溶出所带来的变化性。旨在于胃中速释的BH4的固体剂型的体内崩解和溶出的速率取决于人与人之间胃液的pH的差异(已进食和未进食(禁食))和胃的搅拌强度的大小，后者由胃运动的强度和胃排空进入小肠的速率决定。由于液体、半固体、锭剂/糖丸和速溶固体剂型不必进行崩解和溶出，因而与以速释的固体剂型(片剂和胶囊)提供的BH4相比，其血药水平变化较小。
在又一示例性实施方式中，所述方法涉及施用包括但不限于片剂、胶囊剂、糖丸、锭剂、散剂和颗粒剂的固体剂型的BH4，或者包括但不限于口腔喷洒为胶冻剂的半固体型的BH4，其在无需于吞咽之前溶解于包括但不限于水、橙汁和苹果汁的液体中的情况下被咀嚼或吞咽。在一个实施方式中，对禁食情况(即空腹)的患者施用吞咽型BH4。本发明还设想了每日1次或更多次，在指定时间(包括但不限于早上、白天和晚上，每日都于相同时间)空腹施用以固体或半固体剂型吞咽的BH4。在示例性实施方式中，在患者空腹时对其施用所述组合物，例如在餐前至少30分钟、45分钟或至少1小时，和/或在餐后至少90分钟、2小时、2.5小时或3小时施用。
在另一实施方式中，所述方法涉及与食物一同施用以固体或半固体剂型吞咽或者溶解于液体中的BH4，所述食物例如为高脂肪食物或高脂肪和/或高热量膳食。本发明还设想了每日1次或更多次，在指定时间(包括但不限于早上、白天和晚上，每日都于相同时间)，与例如高脂肪食物或者高脂肪和/或高热量膳食等食物一同施用吞咽型或溶解的BH4。在示例性实施方式中，每日于餐后立即摄入一次固体剂型的BH4。在优选实施方式中，固体剂型被配制为片剂或胶囊剂。在更具示例性的实施方式中，在进餐的约0分钟～60分钟、约0分钟～30分钟或5分钟～20分钟内摄入BH4。无论以固体剂型、液体剂型还是溶解的溶液摄入，与禁食对照相比，在餐后立即摄入时BH4的体内暴露量(或者生物利用率)更高。
BH4和食物可以几乎同时摄入，或者BH4可以在食物之前或之后摄入。进食(例如高脂肪食物或高脂肪和/或高热量膳食)与服用吞咽型或溶解的BH4之间的时间段可以是至少5分钟。可以在进餐后60分钟、30分钟、25分钟、20分钟、15分钟、10分钟或5分钟施用BH4。
在又一实施方式中，对于某些患者(例如成年人)或者某些疾病状态(例如心血管疾病或者与NOS机能障碍有关的其它疾病)，为改善生物利用率，本发明的方法涉及施用完整的片剂，而不是将片剂溶解于液体中。
根据本发明的方法施用BH4，将导致平均血药浓度和/或胃肠吸收率、和/或Cmax和/或AUC(0-t)和/或AUC (inf)的平均值超过在禁食情况下施用BH4时的值。
相对于溶解的片剂，在禁食情况下施用完整的片剂会导致Cmax和AUC升高平均20％。在高脂肪/高热量膳食之后施用在水或橙汁中溶解的片剂或者完整的片剂，会导致Cmax和AUC升高约30％(完整的片剂)～80％(水)。与不和食物一同施用相比，在高脂肪和高热量膳食之后施用完整的片剂的BH4会导致吸收程度提高约30％。与施用溶解的片剂相比，施用完整的片剂的BH4会导致吸收程度提高约20％。
“平均血药浓度”是指在一系列血浆样品中浓度读数的平均值。
“Cmax”是指血药浓度的最大观察值。
“AUC”是指血药浓度-时间曲线下的面积。
“AUC0-t”是从时间0至最后的可测量的浓度的时间的血药浓度-时间曲线下的面积。
“AUC(inf)”是指从时间0至无穷时的血药浓度-时间曲线下的计算面积。
BH4的“胃肠吸收率”通过利用以下公式，由施用BH4后血浆总生物蝶呤浓度增加(ΔCp)-时间曲线(ΔAUC)下的面积估计：
吸收率(％)＝
(口服给药后的ΔAUC/静脉内给药后的ΔAUC)×(静脉内给药量/口服给药量×100)
优选使用纯度至少为99.5％的6R-BH4。可以根据本发明的方法和组合物使用包括二盐酸盐在内的BH4的任何盐和任何晶型的BH4。通过援引将美国专利公报第2006/0040946号所述的各种盐和晶型整体并入本文，和/或也通过援引将国际公报第WO 06/55511号所述的稳定的固体制剂总体并入本文。各种晶型可以方便地形成口服用片剂、散剂或其它固体。
在第二方面中，本发明设想了通过使用质子交换聚合物降低肠内pH从而稳定BH4的方法。每日口服作为包含下述活性成分的固体或液体剂型的BH4，所述活性成分通过降低肠内的pH来使超出胃的BH4的稳定性增加，由此防止BH4被迅速氧化。因为BH4在酸性介质中比在碱性介质中更稳定，所以将酸化赋形剂(acidifying excipients)/非活性成分包含在固体剂型(片剂和胶囊剂等)BH4的制剂中以降低肠液的pH，由此提高化学稳定性。通过将据信限于胃和十二指肠的当前受限的吸收窗口(windowof obsorption)扩展至肠，可用于吸收的更大的面积或窗口的胃肠道(GIT)将优化吸收的一致性。这种剂型包括但不限于泡腾片剂、散剂和颗粒剂(施用之前重悬于液体中)以及酸化剂材料。不同于小分子酸，大的聚合酸在GIT中保留更久且不被GIT吸收，但是可以将其质子提供给胃肠道流体，以降低环境的pH。包含于制剂中的赋形剂/非活性成分的实例为羧酸小分子如马来酸、富马酸和柠檬酸，或者无机小分子如磷酸、乙酸和它们的盐形式。其它实例为诸如聚合羧酸类等药用可接受的酸，包括聚甲基丙烯酸、卡波姆、聚卡波非、Eudragit、酸式交联羧甲基纤维素(crosscarmelose)和淀粉乙醇酸等。所述制剂还包含增加稳定性的其它赋形剂如抗氧化剂(例如，硫醇类，如半胱氨酸和N-乙酰半胱氨酸等；抗坏血酸；甲硫氨酸；等等)和赋予可制造性并提高制剂的品质和性能特征的商业上已知的其它赋形剂。
本发明的第三方面设想了延长BH4的胃肠停留时间的方法，所述方法包括但不限于使用诸如脂肪酸和/或甘油脂肪酸酯等能够减缓BH4的胃肠运动的试剂来减缓胃肠运动。脂肪酸可以包括油酸、硬脂酸、花生酸、棕榈酸、花生四烯酸、亚油酸、亚麻酸、芥酸、肉豆蔻酸、月桂酸、肉豆蔻脑酸和棕榈炔酸。还设想了为延长BH4的胃肠停留时间，而利用藻酸来引起胃滞留和利用聚卡波非来引起生物粘着。在一个实施方式中，BH4的剂型作为在胃液中以限定的方式漂浮和释放BH4的口服漂浮制剂施用，并可以在胃中停留更久，因为与不漂浮的或迅速在胃中迅速溶解的制剂相比，所述制剂更耐受由胃进行的胃排空。这一设计方法基于剂型的胃滞留，其方式是在剂型中使用生成气体的赋形剂、在剂型中使用使剂型在胃肠道流体中漂浮的低密度赋形剂或气体和低密度材料的组合，以使剂型能够在GIT的流体内容物中漂浮。剂型在胃环境(其中BH4在其酸性流体中更稳定)中延长的滞留和释放将既增加剂型在胃中的停留时间，又提高BH4的稳定性，由此与标准片剂和胶囊剂型相比，可使BH4在胃和十二指肠中有更长时间可被吸收。BH4制剂将包含一种或多种抗氧化剂、本领域中已知的使固体剂型能够制造和崩解/溶出的赋形剂和当制剂与水介质或胃肠道流体接触时会生成气体或气体混合物(例如二氧化碳)的其它赋形剂。优选水溶性抗氧化剂，例如抗坏血酸、甲硫氨酸和硫醇类(半胱氨酸、N-乙酰半胱氨酸和谷胱氨酸)，或者在GIT中转化为可溶性抗氧化剂的抗氧化剂，例如在GIT中转化为抗坏血酸的抗坏血酸棕榈酸酯。加至制剂中的赋形剂包括可直接与BH4反应以形成二氧化碳的碳酸盐和碳酸氢盐以及前述小分子酸和聚合酸以与碳酸盐和碳酸氢盐反应从而可以根据需要产生额外的二氧化碳。
在另一实施方式中，BH4的剂型被施用为以延长的时间粘附于GIT的粘膜表面(即，生物粘附性制剂)，所述胃肠道优选但绝不限于胃，由于胃液的酸性，BH4在胃中比在肠中稳定。BH4以受控的方式从生物粘附性剂型中释放。所述固体剂型被设计为包含BH4、一种或多种抗氧化剂、本领域中已知的能够制造高品质的剂型和控制剂型的崩解/溶出的赋形剂和生物粘附性添加剂，所述生物粘附性添加剂例如为游离酸或作为盐形式的聚卡波非。可以将诸如聚甲基丙烯酸、卡波姆和纤维素衍生物(例如，HPMC和HPC等)等其它聚合酸与聚卡波非组合，或者替代聚卡波非。抗氧化剂优选为可溶性抗氧化剂，例如为抗坏血酸、甲硫氨酸、半胱氨酸、N-乙酰半胱氨酸和谷胱甘肽，或者优选在GIT中可转化为诸如抗坏血酸等可溶性抗氧化剂，例如抗坏血酸棕榈酸酯。在一个实施方式中，将制剂的组分混合在一起，并制为固体剂型，例如片剂或胶囊剂。固体剂型可以包被肠溶衣以将BH4经过胃输送至肠内，或者是未包被肠溶衣以计划在胃中释放BH4。在另一实施方式中，可以将固体剂型的组分再分为不同部分，并将各部分在加工前单独混合以便形成多层剂型。多层剂型可以在包覆含有BH4的其它层(即，在生物粘附性包膜内的活性区域)的片剂的最外层中含有生物粘附剂和很少的赋形剂，或者将其作为填入胶囊的包覆的圆柱形填塞物，其中，在所述生物粘附性包膜之下或之中汇集有一个或多个其它层。作为另外一种选择，片剂或胶囊填塞物中的生物粘合剂和其它层可以以平行的双层或多层构造层叠。这些设计使得生物粘附剂可以与GI膜或GI膜粘液相互作用从而将剂型锚定在所述膜上，减缓其经过胃肠道的通过，由此延长停留时间。这种剂型也包被肠溶衣。使用BH4的方法的又一实施方式采用具有可与胃肠道粘液结合的官能团的聚合非活性成分(赋形剂)，从而延迟剂型对胃肠道的经过。使用巯基化聚合物赋形剂(聚合物-SH)，例如聚卡波非-半胱氨酸、聚聚甲基丙烯酸-半胱氨酸、羧甲基纤维素-半胱氨酸和壳聚糖衍生物-半胱氨酸等来配制BH4的剂型。这些巯基化聚合物会对BH4赋予生物粘合性和抗氧化性，由此显著提高吸收性。这些制剂中包含的其它赋形剂为抗氧化剂和增进性能和辅助制造的赋形剂。
在另一实施方式中，使用含有非活性赋形剂或活性成分的口服剂型来减缓胃运动。减缓BH4剂型经过胃肠道的速度将延长分子的停留时间，由此使更大比例的施用的剂量能被吸收。口服制剂中所采用的旨在延迟胃排空和/或延迟肠运动的公认安全的(GRAS)赋形剂优选包含膳食脂肪，例如脂肪酸、脂肪酸的甘油酯以及脂肪酸和甘油酯的衍生物，如CremophorTM(聚烃氧基蓖麻油衍生物)等。活性赋形剂包括减缓胃肠运动的试剂，例如通用或选择性(M3)抗毒蕈碱剂或胆碱能阻断剂。
本发明的第四方面设想了利用诸如HPMC和卡波姆等缓释制剂调节BH4的释放的方法。这一概念包括通过将BH4的释放由速释调节或改变为慢释、延释、控释和/或定时释放而将BH4剂型输送至胃肠道。慢释、延释和控释通过使用本领域中已知的赋形剂实现，在诸如抗氧化剂等稳定性增强剂的存在下BH4被保护在输送系统中而不会发生化学降解。所述方法能够最大化生物利用率，因为BH4在制剂中和在制剂周围的环境中被稳定化，这使活性分子能够随着制剂在GIT全程中的经过而被完整地吸收至体循环中。此方法提供了更大的GIT吸收窗口，并通过防止BH4在较高的pH环境中降解从而使BH4可被吸收而实现这一点。应将抗氧化剂包含在制剂中以保护药物，使其不会因肠液接近中性pH而在肠液中降解。慢释、延释和控释输送也会将BH4输送至胃肠道的低氧张力区。定时释放通过使用本领域中已知的赋形剂来实现，所述赋形剂例如为仅当pH达到某一值时溶解的pH敏感性聚合物，其中在所述值下该聚合物是可溶的。
在另一实施方式中，本发明设想了BH4剂型的肠溶衣，以确定将酸性赋形剂包含在BH4制剂中是否确实通过降低肠内的pH并由此在肠内稳定BH4以可被吸收从而提高BH4的吸收。因此，将使用肠溶衣来使赋形剂与药物在预计赋形剂会保护BH4的位置处保持在一起。如果允许BH4剂型可在胃中崩解，则酸性赋形剂不会一起排空至胃中，并不会提供保护。
肠溶衣保护易于在胃中受酸催化降解的化合物，使其得以避免在胃中被酸降解。因为肠溶衣材料不溶于酸，所以肠溶衣材料可防止片剂或胶囊剂在胃中释放活性化合物。一旦肠溶衣剂型达到pH值为pH 5～8的肠，该材料将变为可溶并在肠内释放活性物质。相反，缓释制剂被设计为尽可能长地在胃肠道的长度/面积内释放药剂。只有当缓释制剂中所含的药剂是酸不稳定的时，才有必要对在一经过胃即释放的缓释制剂进行包衣。
在第五方面中，本发明设想了通过口服以外的途径施用无菌液或无菌固体剂型的BH4，所述途径包括但不限于局部、静脉内、皮下、肌肉内、鞘内、眼和吸入等施用途径。以所需的适当浓度将BH4配制为无菌液或固体剂型。
用于静脉内施用的BH4的无菌液剂型的优点可包括：(1)更可预测的动力学，可以具有较高血清水平；(2)不需要有功能的胃肠道；(3)不需要患者参预；和(4)不存在不顺应的问题。BH4的静脉内制剂对于下述处理条件尤其有利，所述处理条件需要将流体和药剂迅速输送到全身或者输送至通过口服或其它形式的施用通常难以到达的身体部分，所述处理条件包括但不限于狂犬病、脑膜炎、器官移植/保存、蛛网膜下腔出血、脑外伤、中风、冠状动脉旁路手术、脑血管痉挛、输血/血液保存、肺动脉高压、镰状细胞病、子痫前期、化疗后血管疾病。
BH4在水溶液和生理pH的水溶液中极易氧化(Davis等，Eur.J.Biochem.173，345-351(1988)；Kirsch等，J.Biol.Chem.278，24481-24490(2003))。BH4稳定性的大多数测试都是在中性至弱碱性pH 7.4溶液中进行，以模拟在生理血浆pH条件下BH4的可能的稳定性行为。虽然欧洲专利申请第1757293A号公开了液体或糖浆制剂，但是这些制剂由需要在口服之前以水重构(reconstitution)的固体状态粉末混合物或颗粒构成。本发明的此方面设想了不限于用于构建的粉末或颗粒的液体制剂。本发明还设想了下述混合液体制剂，所述制剂能够在环境温度下以足够长的时间保持稳定，以允许在无菌产品填充/封口(finish)设备中作为液体产品被处理至安瓿瓶、瓶或药剂瓶中，或者填充至药剂瓶中以冷冻干燥为冻干产品。
液体制剂和重构用冻干制剂也可以通过鼻、眼和耳道输送以获得治疗效果。冻干产品的配制需要先将BH4溶解在液体，优选水性液体中，并在无菌设备中处理该液体产物(即，混合、无菌过滤和将经无菌过滤的液体填充至药剂瓶中，然后再将经填充的该药剂瓶装进用于冻干的冻干机中)。对于制造满足经填充封口的产品的杂质规格的冻干产品而言，在无菌处理过程中保持溶解的BH4的稳定性和防止其降解是重要先决条件。因此，冻干产品的组成含有适当的稳定剂，所述稳定剂将填充封口处理过程中的BH4降解降至最低，或使其得到避免。此处所述的制剂将在作为需花费至少6小时的工序的无菌填充/封口制造过程中稳定BH4溶液并提供商业化的稳定产品。
所述制剂包括优选浓度为0.1mg/mL～10mg/mL的BH4。由于BH4的高溶解性，也可以制备例如浓度至多为约100mg/mL的制剂。此处所述的一般相对组成结构和方法适用于高浓溶液的制备。
BH4的液体制剂优选在pH 1～8的缓冲溶液，更优选在pH 2～7的的缓冲溶液中配制。所选pH缓冲剂为能够在所需特定pH下提供充分的缓冲能力的缓冲化合物，所述缓冲能力由一个或多个缓冲剂电离常数与液体制剂的所需pH的接近程度来判定。因此，可以使用任何缓冲化合物，只要化合物电离常数中的一个或多个接近制剂的所需pH即可。可用在pH 1～8范围内的缓冲剂的实例包括各种酸/碱和它们的共轭酸/碱或盐形式，包括但不限于：盐酸(pH 1～2)、马来酸(pH 1～3)、磷酸(pH 1～3)、柠檬酸(pH 3～6)、乙酸(pH 4.7±1.0)、磷酸氢二钠(pH 6～8)和氨丁三醇(TRIS，pH 8.3±1.0)等。
静脉内制剂
静脉内制剂利用一种抗氧剂或两种以上抗氧剂的组合来稳定。抗氧剂的组合可以协同避免制剂的不稳定性。以惰性气体和/或二氧化碳鼓泡从而从溶液中除去溶解的氧是可选的，但是在使用低浓度抗氧化剂时是优选的，并且在所用BH4和抗氧化剂的浓度均低时是更优选的。BH4在水溶液中的稳定性受BH4的浓度与抗氧化剂和pH的相互作用的影响。因此，例如高浓度的BH4比低浓度的BH4需要更低的抗氧化剂浓度。此外，BH4在低pH下比在高pH下更稳定。因此，需要的高pH制剂优选具有较高的抗氧化剂浓度，更优选具有2或3种以上抗氧化剂的组合，进而更优选以非氧化性气体(例如，惰性气体或二氧化碳)鼓泡，然后于非氧化性气体(例如，惰性气体或二氧化碳)氛围中气密密封主容器或使其近乎气密密封，以进一步提高药品的稳定性。
BH4液体制剂的实例范围在表1和表2中给出。可选的是，将配制或混合的溶液以惰性气体(例如，氩气或氮气)或二氧化碳在混合箱中鼓泡，并且优选于惰性气体或二氧化碳覆盖层中密封主容器以从容器顶部空间除去氧。利用适当的放大系数可以将各组分的量加倍，由此可将制剂放大至任意体积。
表1低pH(例如，pH 4.0)制剂的组成范围的一般实例
  组分   量(mg)   重量/体积百分比   功能
  BH4   0.10-100   0.01-10.00   活性物质
  L-半胱氨酸   0.00-50.00   0.00-5.00   抗氧化剂
  抗坏血酸   0.00-500.00   0.00-50.00   抗氧化剂
  焦亚硫酸钠   0.00-300.00   0.00-30.00   抗氧化剂
  柠檬酸   0.26-19.87   0.03-1.99   缓冲剂
  柠檬酸钠二水合物   2.57-192.75   0.26-19.27   缓冲剂
  注射用水补至   1.00mL   1.00mL   稀释剂
表2中性pH(例如，pH 7.0)制剂的组成范围的一般实例
  组分   量(mg)   重量/体积百分比   功能
  BH4   0.10-100   0.01-10.00   活性物质
  L-半胱氨酸   0.00-50.00   0.00-5.00   抗氧化剂
  抗坏血酸   0.00-500.00   0.00-50.00   抗氧化剂
  焦亚硫酸钠   0.00-300.00   0.00-30.00   抗氧化剂
  磷酸二氢钠一水合物   0.50-11.02   0.05-1.02   缓冲剂
  磷酸氢二钠   0.44-17.80   0.04-1.78   缓冲剂
  注射用水补至   1.00mL   1.00mL   稀释剂
用于液体制剂的抗氧化剂优选为选自硫醇类(例如，L-半胱氨酸)、抗坏血酸和亚硫酸盐类(例如焦亚硫酸钠)化合物中的一种或多种。溶液优选以惰性气体或二氧化碳鼓泡以将氧从BH4溶液中驱除，然后于惰性气体(例如，氩气、氮气)或诸如二氧化碳等非惰性气体的覆盖层中气密密封于安瓿瓶或气密盖的药剂瓶和使用饮料啤酒型金属盖(metallic beveragebeer-type cap)的瓶中，以防止容器顶部空间中鼓泡气体的泄露。口服液体制剂优选另外包含甜味剂和食用香料以改善制剂的适口性。
在一个实施方式中，作为液体剂型，BH4由抗氧化剂稳定和/或通过以非氧化性(优选无菌)气体鼓泡以从制剂中除去分子氧而稳定，所述非氧化性气体例如有惰性气体(例如，氮气、氩气和氦气等)和/或诸如二氧化碳等非惰性气体。该产品优选在惰性气体覆盖层下填充，以尽可能减少或防止分子氧再溶解于制剂中。将液体填充至容器(例如，药剂瓶、安瓿瓶等)中并气密密封，以防止氧进入容器。在另一实施方式中，作为用于肠胃外施用的无菌固体剂型，将BH4溶液冻干并在施用之前在临床中重构。在又一实施方式中，在无菌干粉填充设备中，将BH4的无菌粉末药物直接包装在无菌容器(例如，药剂瓶、袋、瓶或安瓿瓶)中。因此，本发明的另一方面是用于构建在水溶液中的四氢生物蝶呤(BH4)或其药用可接受盐的干粉制剂，包括BH4或其药用可接受盐、抗氧化剂和pH缓冲剂的干粉混合物。
口服液体制剂组合物
口服液体制剂除了包含一般液体和静脉内制剂中所用的组分之外，还包含甜味剂和调味剂。以足以产生可接受的甜味和香味的量加入甜味剂和调味剂。口服液体制剂包含一种或多种稳定剂。可选的是，口服液体制剂含有抗微生物的防腐剂。它们优选被缓冲在低pH，例如pH 1～4，并且缓冲剂经选择而与调味剂匹配，由此提高口服液体制剂的感官特性。优选的缓冲剂(酸和共轭碱)的实例为：与它们的共轭碱或盐形式组合的柠檬酸、酒石酸和马来酸。
甜味剂的实例包括糖(例如，蔗糖、葡萄糖、山梨醇、甘露醇和果糖等)，强烈的非糖甜味剂(例如，阿斯巴甜、安赛蜜K、甜蜜素、糖精、三氯蔗糖、甘草甜素、阿力甜、钮甜、新橙皮苷DC(neohesperidine DC)、甜味蛋白(thaumatin)和莫内林等)。
在又一实施方式中，为了鼻、眼和耳部施用，BH4如所述被配置为肠胃外剂型，可选的是，其为无菌产品。可以将这些剂型提供在装备包中以供几日之用。该装备包内的每一单元均可由一个药剂瓶或安瓿瓶和一个喷雾器(用于鼻用剂型)或一个点滴器(用于眼或耳部用剂型)构成。一旦打开药剂瓶或安瓿瓶，即将喷雾器或点滴器旋拧在药剂瓶或安瓿瓶上，并将以前的盖丢弃。在指定的期限内用完该剂型产品并丢弃，打开新药剂瓶或安瓿瓶以进行使用。另一实施方式将溶液填充在通过成型-填充-和密封制造工艺生产的气密塑料一次性使用无菌容器中。打开这些包装，通过挤出其中含有的液体，利用所需施用途径输送该溶液。这些剂型每日施用一次，并通过鼻孔(鼻用产品)或通过眼(眼药)或通过将液滴滴入听道(耳部用产品)来提供。对于以填充和密封包形式包装的药剂，将药剂挤出至施用途径。
在另一实施方式中，使用配制的药带、药贴或药膜、或者作为放置于输送位置上的局部产品通过口腔和经皮途径施用BH4。将舌下片放置在舌下。这些剂型每日施用一次，并且或者贴附于输送位置膜(口腔和经皮途径)，或者作为固体或半固体剂型放置在舌下位置。为防止刺激输送位置，涂覆诸如碳酸钠或碳酸氢钠等碱性化合物并将其与BH4混合，以防止与BH4相互作用进而使BH4不稳定。作为另外一种选择，可在恰好于使用前加入碱性化合物，以升高BH4的极低的pH。在制造时加入碱性赋形剂而不涂覆碱性颗粒以防止与BH4相互作用，将导致BH4不稳定。另一实施方式使用含有碱性或碱物质的涂布液涂覆BH4的核心舌下片。在舌下部分中，碱性化合物首先溶解，然后与BH4相互作用以提高介质的pH。
用于包装BH4液体制剂的主容器
BH4液体制剂的主包装容器优选不能渗透氧、二氧化碳、氮和惰性气体。在将经鼓泡的BH4的液体剂型填充至主容器中之后，优选在氮气覆盖层下将该容器优选气密密封以将鼓泡气体保持在液体和容器的顶部空间中，并防止鼓泡气体的损失和防止氧进入容器。
优选的主容器是气密密封的安瓿瓶和使用金属盖气密密封的瓶或药剂瓶，所述金属盖例如为在密封汽水和啤酒饮料瓶中所使用的那些金属盖。在使用过程中，将安瓿瓶切开并在几小时(例如约12小时)内使用。可将安瓿瓶用于注射用静脉内产品和无菌产品。无菌注射用液体和冻干产品也可以包装在橡胶密封物密封的药剂瓶中，所述药剂瓶利用卷边的铝盖保护。为了产品的保存期限，制剂中的抗氧化剂保护液体和冻干产品，防止极缓慢的鼓泡气体的损失或氧气进入药剂瓶中。
优选使用饮料金属盖或利用以卷边铝封口保护的橡胶塞来气密密封填充至用于口、眼或耳使用的瓶或药剂瓶中的BH4液体制剂。可以对瓶或药剂瓶的凹处进行开槽以接受螺旋盖。除去气密密封物后，使用带有或不带有点滴器的螺旋盖替换该密封物。制剂中抗氧化剂的存在使得螺旋加盖的制剂在例如打开气密密封物后至少2周内使用是稳定的。
I.四氢生物蝶呤的合成
合成四氢生物蝶呤、前体、衍生物和类似物的各种方法在本领域中是已知的。美国专利第5,698,408号；第2,601,215号；第3505329号；第4,540,783号；第4,550,109号；第4,587,340号；第4,595,752号；第4,649,197号；第4,665,182号；第4,701,455号；第4,713,454号；第4,937,342号；第5,037,981号；第5,198,547号；第5,350,851号；第5,401,844号；第5,698,408号、加拿大申请CA 2420374、欧洲申请EP 079574、EP 191335和Suntory的日本专利公报JP 4-082888、JP 59-021685和JP 9-157270，以及Sugimoto和Matsuura，Bull.Chem.Soc.Japan，48(12)：3767-3768(1975)、Sugimoto和Matsuura，Bull.Chem.Soc.Japan，52(1)：181-183(1979)、Matsuura等，Chem.Lett.(Japan)，735-738(1984)、Matsuura等，Heterocycles，Vol.23，No.12，3115-3120，1985和Whiteley等，Anal Biochem.137(2)：394-6(1984)(上述文献均通过援引并入本文)都描述了制造可用作用于本发明的组合物的二氢生物蝶呤、BH4及其衍生物的方法。
通过援引以其整体并入本文的国际公报第WO2005049614号、美国专利第4,540,783号、日本专利第59-021685号、Schircks等，Helv.Chim.Acta，60：211(1977)、Sugimoto等，Bull.Chem.Soc.Jp，52(1)：181(1979)、Sugimoto等，Bull.Chem.Soc.Jp，48(12)：3767(1975)、Visontini等，Helv.Chim.Acta，52：1225(1969)和Matsuura等，Chem.Lett.，p 735(1984)描述了合成BH4的方法。
II.6R-四氢生物蝶呤盐酸盐的晶型
(6R)-L-赤式-四氢生物蝶呤二盐酸盐以不同的晶型存在，这些晶型包括多晶型和溶剂化物，其中一些晶型比其它晶型更稳定。
(6R)L-四氢生物蝶呤二盐酸盐的晶体多晶型
多晶型B
在此将已发现的最稳定的结晶多晶型称为“B型”，或者称为“多晶型B”。在(6R)-L-赤式-四氢生物蝶呤二盐酸盐的研究和开发过程中所得的结果显示已制备了几种已知的结晶固体，但无人认识到同质多晶现象和该同质多晶现象对BH4晶体的稳定性的影响。
多晶型B是略有吸湿性的无水物，在约20℃以上具有最高的热力学稳定性。此外，由于B型的热稳定性、可通过目标条件制备的可能性、其合适的形态和粒径，因而B型易于加工和处理。B型的熔点约为260℃(ΔHf＞140J/g)，但由于其在熔融前和熔融过程中就会分解，所以无法测定确切的熔点。这些突出的特性使得多晶型B特别适用于高温制备的药物用途。可得到细粉状的多晶型B，粒径可以是0.2μm～500μm。
B型显示的X-射线粉末衍射图案用d值
Figure A20088001159400321
表示为：8.7(vs)，6.9(w)，5.90(vw)，5.63(m)，5.07(m)，4.76(m)，4.40(m)，4.15(w)，4.00(s)，3.95(m)，3.52(m)，3.44(w)，3.32(m)，3.23(s)，3.17(w)，3.11(vs)，3.06(w)，2.99(w)，2.96(w)，2.94(m)，2.87(w)，2.84(s)，2.82(m)，2.69(w)，2.59(w)，2.44(w)。图1是B型(6R)-L-赤式-四氢生物蝶呤二盐酸盐显示的特征X-射线衍射图案的图。
此处所用的括号内的下述缩写表示：(vs)＝极高强度；(s)＝高强度；(m)＝中等强度；(w)＝弱强度；(vw)＝极弱强度。特征X-射线粉末衍射图案如图1中所示。
已发现BH4的其它多晶型具有令人满意的化学和物理稳定性，在制造和配制过程中可安全地处理，并且在其纯的形式或制剂形式都提供较高的储存稳定性。此外，已发现可以以极大量(例如，100千克规模)制备BH4的B型和其它多晶型，并将其储存较长的时间。
所有的晶型(多晶型、水合物和溶剂化物)，包括晶型B，都可用于制备最稳定的多晶型B。可通过无定形形式或除了多晶型B以外的其它形式(例如多晶型A)在合适的极性非水溶剂中的悬浮物的相平衡来得到多晶型B。因此，本文所述的药物制备是指(6R)-L-赤式-四氢生物蝶呤二盐酸盐的多晶型B的制备。
可通过在室温将BH4的其它形式分散在溶剂中，在环境温度将悬浮液搅拌至足以产生多晶型B的时间，而后分离结晶的B型，并除去分离出的B型中的溶剂，从而将BH4的其它形式转化为B型。此处所用的环境温度指0℃～60℃、优选为15℃～40℃的温度。在处理和搅拌过程中可通过逐步降低温度或连续降低温度来改变所施加的温度。用于将其它形式转化为B型的适宜的溶剂包括但不局限于甲醇、乙醇、异丙醇、其它C3和C4醇、乙酸、乙腈、四氢呋喃、甲基叔丁基醚、1，4-二噁烷、乙酸乙酯、乙酸异丙酯、其它C3～C6-乙酸酯、甲基乙基酮和其它甲基-C3～C5烷基酮。完成相平衡的时间可以最高达30小时，优选为至多20小时或小于20小时。
也可通过从含至多约5％水的溶剂混合物，特别是乙醇、乙酸和水的混合物中结晶而得到多晶型B。已发现可通过将(6R)-L-赤式-四氢生物蝶呤二盐酸盐的优选为能量比B型低的固体形式或B型溶解在包含乙醇、乙酸和水的混合溶剂中，必要时该溶解可在较高温度进行，然后将晶种加入所述溶液中，将所得的悬浮液冷却，并分离所形成的晶体，从而制备(6R)-L-赤式-四氢生物蝶呤二盐酸盐的多晶型B。溶解可在室温进行，或在最高70℃、优选为最高50℃进行。可以用最终的混合溶剂来溶解，也可以将起始材料先溶解在水中，然后一起添加其它溶剂，或逐一添加其它溶剂。溶剂混合物的组成可以是体积比为1∶3∶2～1∶9∶4(优选为1∶5∶4)的水∶乙酸∶四氢呋喃。优选的是搅拌所述溶液。冷却可以指温度降至-40℃～0℃，优选为降至10℃～30℃。合适的晶种是其它批次的多晶型B或具有相似或相同形态的晶体。分离后，可用诸如丙酮或四氢呋喃等非溶剂洗涤结晶的B型，并以通常方式干燥。
也可通过添加诸如甲醇、乙醇和乙酸等非溶剂从水溶液中结晶得到多晶型B。有利的是，可在室温进行结晶和分离过程，而不必冷却溶液。因此该方法非常适合以工业规模进行。
在此处所述的组合物和方法的一个实施方式中，通过将(6R)-L-赤式-四氢生物蝶呤二盐酸盐的除了B型以外的其它固体形式或B型在环境温度溶解在水中，以足以形成悬浮液的量添加非溶剂，必要时将所述悬浮物搅拌一定时间，随后将所形成的晶体分离，从而制备包含(6R)-L-赤式-四氢生物蝶呤二盐酸盐的多晶型B的组合物。可将所述组合物进一步修饰成如下所述的药物组合物。
相对于溶液，(6R)-L-赤式-四氢生物蝶呤二盐酸盐在水溶液中的浓度可以是10重量％～80重量％，更优选为20重量％～60重量％。优选的非溶剂(即，在制备BH4的悬浮液中所用的溶剂)是甲醇、乙醇和乙酸。可将所述非溶剂添加到水溶液中。更优选的是，将所述水溶液添加到非溶剂中。形成悬浮液后的搅拌时间可以是至多30小时，优选为至多20小时或少于20小时。如上所述以已知方式进行过滤分离和干燥。
多晶型B是非常稳定的结晶形式，易于过滤、干燥和研磨至药物制剂所需的粒径。这些突出的特性使得多晶型B特别适用于药物用途。
多晶型A
已发现(6R)-L-赤式-四氢生物蝶呤二盐酸盐的另一种晶体多晶型是用于本文所述的药物制备的BH4的优选的稳定形式，在此将其称为“A型”或“多晶型A”。多晶型A略具吸湿性，吸水量约为3重量％，当以10℃/分钟的速率加热时，所吸收的水在50℃～200℃间连续释放。多晶型A是吸湿性无水物，相对于B型而言是一种亚稳定形式；然而，如果保存在紧密密封的容器中，它可以在环境条件下稳定数月。A型特别适合作为制备稳定多晶型的中间体和起始原料。可将多晶型A制备成具有通常为1μm～约500μm的所需中位粒径范围的固体粉末。
多晶型A显示的特征X-射线粉末衍射图案的特征峰用d-值
Figure A20088001159400341
表示为：15.5(vs.)，12.0(m)，6.7(m)，6.5(m)，6.3(w)，6.1(w)，5.96(w)，5.49(m)，4.89(m)，3.79(m)，3.70(s)，3.48(m)，3.45(m)，3.33(s)，3.26(s)，3.22(m)，3.18(m)，3.08(m)，3.02(w)，2.95(w)，2.87(m)，2.79(w)，2.70(w)。图2是A型(6R)-L-赤式-四氢生物蝶呤二盐酸盐显示的特征X-射线衍射图案的图。
多晶型A显示的特征拉曼光谱带用波数(cm-1)表示为：2934(w)，2880(w)，1692(s)，1683(m)，1577(w)，1462(m)，1360(w)，1237(w)，1108(w)，1005(vw)，881(vw)，813(vw)，717(m)，687(m)，673(m)，659(m)，550(w)，530(w)，492(m)，371(m)，258(w)，207(w)，101(s)，87(s)cm-1。
可通过将(6R)-L-赤式-四氢生物蝶呤二盐酸盐的水溶液冷冻干燥或去除水从而得到多晶型A。可通过在环境温度将(6R)-L-赤式-四氢生物蝶呤二盐酸盐溶解在水中，(1)将所述溶液冷却到低温以使溶液固化，并减压除水，或(2)从所述水溶液中去除水，从而制备(6R)-L-赤式-四氢生物蝶呤二盐酸盐的多晶型A。
可通过过滤分离结晶的A型，然后干燥以使所吸收的水从产物中挥发。干燥条件和方法是已知的，分离物的干燥或按照此处所述的变化方案(2)的除水可在施加高温的条件例如最高80℃、优选为30℃～80℃下进行，或在真空下进行，或在高温真空下进行。在将变化方案(2)中得到的沉淀分离前，可将悬浮液搅拌一定时间以使相平衡。相对于溶液，(6R)-L-赤式-四氢生物蝶呤二盐酸盐在水溶液中的浓度可以是5重量％～40重量％。
优选进行快速冷却以得到固溶体作为原料。进行减压直到完全去除溶剂。冷冻干燥是本领域众所周知的技术。完成溶剂去除的时间取决于所施加的真空度(可以是0.01mbar～1mbar)、所使用的溶剂和冷冻温度。
多晶型A在实质上无水的条件下在室温或低于室温时是稳定的，这可以通过在室温将四氢呋喃或叔丁基甲基醚中的悬浮液在氮气下分别搅拌5天和18小时而进行的相平衡测试得到证实。室温时进行过滤和风干得到未变化的多晶型A。
多晶型F
已发现(6R)-L-赤式-四氢生物蝶呤二盐酸盐的另一种晶体多晶型是用于本文所述的药物制备的BH4的优选的稳定形式，在此将其称为“F型”或“多晶型F”。多晶型F略具吸湿性，吸水量为约3重量％，当以10℃/分钟的速率加热时，所吸收的水在50℃～200℃间连续释放。多晶型F是亚稳定形式，并且是吸湿性无水物，在较低的环境温度时比A型更稳定，在较高的温度时不如B型稳定，且F型特别适合作为制备稳定多晶型的中间体和原料。可将多晶型F制备成具有通常为1μm～约500μm的所需中位粒径范围的固体粉末。
多晶型F显示的特征X-射线粉末衍射图案的特征峰用d-值
Figure A20088001159400361
表示为：17.1(vs.)，12.1(w)，8.6(w)，7.0(w)，6.5(w)，6.4(w)，5.92(w)，5.72(w)，5.11(w)，4.92(m)，4.86(w)，4.68(m)，4.41(w)，4.12(w)，3.88(w)，3.83(w)，3.70(m)，3.64(w)，3.55(m)，3.49(s)，3.46(vs)，3.39(s)，3.33(m)，3.31(m)，3.27(m)，3.21(m)，3.19(m)，3.09(m)，3.02(m)和2.96(m)。图3是F型(6R)-L-赤式-四氢生物蝶呤二盐酸盐显示的特征X-射线衍射图案的图。
可通过多晶型A在合适的极性非水溶剂中的悬浮液的相平衡得到多晶型F，所述溶剂几乎不溶解所述的低能量形式，尤其可以是诸如甲醇、乙醇、丙醇和异丙醇等醇类。也可通过在低于室温时将A型(6R)-L-赤式-四氢生物蝶呤二盐酸盐的固体颗粒分散于几乎不溶解所述(6R)-L-赤式-四氢生物蝶呤二盐酸盐的非水溶剂中，在所述温度将该悬浮物搅拌至足以产生多晶型F的时间，然后分离结晶的F型并从所分离的F型中除去溶剂，从而得到(6R)-L-赤式-四氢生物蝶呤二盐酸盐的多晶型F。溶剂的去除和干燥可在室温或低于室温(例如低至0℃)在空气、干燥空气或诸如氮气或稀有气体等干燥保护气体下进行。相平衡过程中的温度优选为5℃～15℃，最优选为约10℃。
多晶型J
已发现(6R)-L-赤式-四氢生物蝶呤二盐酸盐的另一种晶体多晶型是用于本文所述的药物制备的BH4的优选的稳定形式，在此将其称为“J型”或“多晶型J”。多晶型J略具吸湿性，当在空气湿度下处理时吸水。多晶型J是亚稳定形式，并且是吸湿性无水物，可将其转化回如下所述的E型，E型是通过将J型暴露在高相对湿度(例如高于75％的相对湿度)的条件下得到的。J型特别适合作为制备稳定多晶型的中间体和原料。可将多晶型J制备成具有通常为1μm～约500μm的所需中位粒径范围的固体粉末。
J型显示的特征X-射线粉末衍射图案的特征峰用d-值
Figure A20088001159400371
表示为：14.6(m)，6.6(w)，6.4(w)，5.47(w)，4.84(w)，3.29(vs)和3.21(vs)。图4是J型(6R)-L-赤式-四氢生物蝶呤二盐酸盐显示的特征X-射线衍射图案的图。
可通过在中等温度时在真空下将E型脱水得到J型。具体而言，可通过取得E型并在真空干燥器中处理E型以除去E型中的水而在中等温度得到J型，从而制备(6R)-L-赤式-四氢生物蝶呤二盐酸盐的多晶型J，所述中等温度可以是25℃～70℃，最优选为30℃～50℃。
多晶型K
已发现(6R)-L-赤式-四氢生物蝶呤二盐酸盐的另一种晶体多晶型是用于本文所述的药物制备的BH4的优选的稳定形式，在此将其称为“K型”或“多晶型K”。多晶型K略具吸湿性，吸水量为约2.0重量％，当以10℃/分钟的速率加热时，所吸收的水在50℃～100℃间连续释放。多晶型K是亚稳定形式，并且是吸湿性无水物，在较高温度时不如B型稳定，且K型特别适合作为制备稳定多晶型(特别是B型)的中间体和原料。可将多晶型K制备成具有通常为1μm～约500μm的所需中位粒径范围的固体粉末。
K型显示的特征X-射线粉末衍射图案的特征峰用d-值表示为：14.0(s)，9.4(w)，6.6(w)，6.4(w)，6.3(w)，6.1(w)，6.0(w)，5.66(w)，5.33(w)，5.13(vw)，4.73(m)，4.64(m)，4.48(w)，4.32(vw)，4.22(w)，4.08(w)，3.88(w)，3.79(w)，3.54(m)，3.49(vs)，3.39(m)，3.33(vs)，3.13(s)，3.10(m)，3.05(m)，3.01(m)，2.99(m)和2.90(m)。图5是K型(6R)-L-赤式-四氢生物蝶呤二盐酸盐显示的特征X-射线衍射图案的图。
可通过在存在少量抗坏血酸的情况下从含少量水的极性溶剂混合物中结晶而得到多晶型K。溶剂混合物所用的溶剂可以选自乙酸和诸如甲醇、乙醇、正丙醇或异丙醇等醇。特别而言，可通过在较高温度时将(6R)-L-赤式-四氢生物蝶呤二盐酸盐溶解在包含少量水和少量抗坏血酸的乙酸和醇或四氢呋喃的混合物中，将温度降低到低于室温以使所述二盐酸盐结晶，分离沉淀，并在较高温度干燥分离出的沉淀，必要时可在真空下进行所述干燥，从而制备(6R)-L-赤式-四氢生物蝶呤二盐酸盐的多晶型K。合适的醇是例如甲醇、乙醇、丙醇和异丙醇，优选的是乙醇。乙酸与醇或四氢呋喃的比例可以是2∶1～1∶2，优选为约1∶1。可在存在更高含量的水的情况下进行(6R)-L-赤式-四氢生物蝶呤二盐酸盐的溶解，并可添加更多的抗溶剂混合物(anti-solvent mixture)，从而得到完全的沉淀。相对于所述溶剂混合物，最终组合物中的水的量可以是0.5重量％～5重量％，抗坏血酸的量可以是0.01重量％～0.5重量％。溶解温度可以是30℃～100℃，优选为35℃～70℃，干燥温度可以是30℃～50℃。分离后(例如过滤后)可用诸如乙醇等醇洗涤沉淀。可通过高于室温时(例如30℃～40℃的温度)在例如异丙醇中的相平衡将多晶型K容易地转化为最稳定的B型，必要时以B型晶体作为晶种。
(6R)-L-四氢生物蝶呤二盐酸盐的水合物形式
如同下面所进一步描述的，已发现(6R)-L-赤式-四氢生物蝶呤二盐酸盐存在多种结晶的水合物，在此对其进行描述并将其定义为C型、D型、E型、H型和O型。这些水合物形式可用作本文所述的药物制备用BH4的稳定形式，并可用在包含BH4的稳定晶体多晶型的组合物的制备中。
C型水合物
已发现(6R)-L-赤式-四氢生物蝶呤二盐酸盐的一种水合物晶体形式是用于本文所述的药物制备的BH4的优选的稳定形式，在此将其称为“C型”或“水合物C”。C型水合物略具吸湿性，含水量为约5.5重量％，表明C型是单水合物。水合物C的熔点为约94℃(ΔHf为约31J/g)，且C型水合物特别适合作为制备稳定多晶型的中间体和原料。可将多晶型C制备成具有通常为1μm～约500μm的所需中位粒径范围的固体粉末。
C型显示的特征X-射线粉末衍射图案的特征峰用d-值
Figure A20088001159400381
表示为：18.2(m)，15.4(w)，13.9(vs)，10.4(w)，9.6(w)，9.1(w)，8.8(m)，8.2(w)，8.0(w)，6.8(m)，6.5(w)，6.05(m)，5.77(w)，5.64(w)，5.44(w)，5.19(w)，4.89(w)，4.76(w)，4.70(w)，4.41(w)，4.25(m)，4.00(m)，3.88(m)，3.80(m)，3.59(s)，3.50(m)，3.44(m)，3.37(m)，3.26(s)，3.19(vs)，3.17(s)，3.11(m)，3.06(m)，3.02(m)，2.97(vs)，2.93(m)，2.89(m)，2.83(m)和2.43(m)。图6是(6R)-L-赤式-四氢生物蝶呤二盐酸盐的C型水合物显示的特征X-射线衍射图案的图。
可通过非溶剂中的诸如多晶型B等多晶型的悬浮液在环境温度的相平衡得到C型水合物，其中相对于所述溶剂，所述悬浮液中包含优选为约5重量％的水。可通过将(6R)-L-赤式-四氢生物蝶呤二盐酸盐悬浮在诸如庚烷、C1～C4醇(例如甲醇、乙醇、正丙醇或2-丙醇)、乙酸酯(例如乙酸乙酯)、乙腈、乙酸或醚(例如四氢呋喃、二噁烷、叔丁基甲基醚)等非溶剂或这样的非溶剂的二元混合物或三元混合物中，向其中添加足以形成单水合物的水，并在环境温度或低于环境温度(例如，0℃～30℃)将该悬浮液搅拌至足以形成单水合物的时间，从而制备(6R)-L-赤式-四氢生物蝶呤二盐酸盐的C型水合物。相对于溶剂的量，足够的水可以是1重量％～10重量％、优选为3重量％～8重量％的水。可将固体滤出，并在约为室温时在空气中干燥。所述固体可能吸收一些水，因而具有比5.5重量％的理论值更高的含水量。相对于D型和B型，C型水合物并不稳定，约40℃时在空气中且在较低的相对湿度下容易转化为多晶型B。可通过室温时的悬浮液平衡将C型转化为更稳定的水合物D。
D型水合物
已发现(6R)-L-赤式-四氢生物蝶呤二盐酸盐的另一种水合物晶体形式是用于本文所述的药物制备的BH4的优选的稳定形式，在此将其称为“D型”或“水合物D”。D型水合物略具吸湿性，可具有约5.0重量％～7.0重量％的含水量，表明D型是单水合物。水合物D的熔点为约153℃(ΔHf为约111J/g)，具有比C型高得多的稳定性，甚至当在环境温度暴露于空气湿度时都是稳定的。因此可将D型水合物用于制备制剂或用作制备稳定多晶型的中间体和原料。可将多晶型D制备成具有通常为1μm～约500μm的所需中位粒径范围的固体粉末。
D型显示的特征X-射线粉末衍射图案的特征峰用d-值
Figure A20088001159400391
表示为：8.6(s)，6.8(w)，5.56(m)，4.99(m)，4.67(s)，4.32(m)，3.93(vs)，3.88(w)，3.64(w)，3.41(w)，3.25(w)，3.17(m)，3.05(s)，2.94(w)，2.92(w)，2.88(m)，2.85(w)，2.80(w)，2.79(m)，2.68(w)，2.65(w)，2.52(vw)，2.35(w)，2.34(w)，2.30(w)和2.29(w)。图7是(6R)-L-赤式-四氢生物蝶呤二盐酸盐的D型水合物显示的特征X-射线衍射图案的图。
可通过在约室温时将(6R)-L-赤式-四氢生物蝶呤二盐酸盐的浓缩水溶液添加到过量的非溶剂或非溶剂的混合物中，并在环境温度下搅拌该悬浮液，从而得到D型水合物，所述非溶剂例如为己烷、庚烷、二氯甲烷、正丙醇或2-丙醇、丙酮、乙酸乙酯、乙腈、乙酸或诸如四氢呋喃、二噁烷、叔丁基甲基醚等醚。可将该结晶的固体滤出，然后于环境温度在干燥氮气下干燥。优选的非溶剂是异丙醇。水溶液的添加可逐滴进行，以避免急剧沉淀。可通过在约室温将(6R)-L-赤式-四氢生物蝶呤二盐酸盐的浓缩水溶液添加到过量的非溶剂中，并在环境温度下搅拌该悬浮液，从而制备(6R)-L-赤式-四氢生物蝶呤二盐酸盐的D型水合物。过量的非溶剂可以是指水溶液与非溶剂的比例为1∶10～1∶1000。D型包含相对于单水合物稍稍过量的水，据信该水由于该晶体水合物的轻微吸湿性而是吸附水。D型水合物被认为是在环境温度和小于70％的相对湿度下已知的水合物中最稳定的一种。D型水合物可用于在该水合物稳定的条件下所制备的制剂。环境温度可以是指20℃～30℃。
E型水合物
已发现(6R)-L-赤式-四氢生物蝶呤二盐酸盐的另一种水合物晶体形式是用于本文所述的药物制备的BH4的优选的稳定形式，在此将其称为“E型”或“水合物E”。E型水合物的含水量约为10重量％～14重量％，表明E型是二水合物。水合物E在低于室温的温度下形成。E型水合物特别适合作为制备稳定多晶型的中间体和原料。E型特别适合通过在氮气下(或必要时在真空下)干燥来制备无水的J型。E型不具吸湿性，在相当高的相对湿度(即，高于约60％且最高约85％的相对湿度)下仍是稳定的。可将多晶型E制备成具有通常为1μm～约500μm的所需中位粒径范围的固体粉末。
E型显示的特征X-射线粉末衍射图案的特征峰用d-值
Figure A20088001159400401
表示为：15.4(s)，6.6(w)，6.5(w)，5.95(vw)，5.61(vw)，5.48(w)，5.24(w)，4.87(w)，4.50(vw)，4.27(w)，3.94(w)，3.78(w)，3.69(m)，3.60(w)，3.33(s)，3.26(vs)，3.16(w)，3.08(m)，2.98(w)，2.95(m)，2.91(w)，2.87(m)，2.79(w)，2.74(w)，2.69(w)和2.62(w)。图8是(6R)-L-赤式-四氢生物蝶呤二盐酸盐的E型水合物显示的特征X-射线衍射图案的图。
可通过将(6R)-L-赤式-四氢生物蝶呤二盐酸盐的浓缩水溶液添加到过量的且已冷却到约10℃～-10℃、优选0℃～10℃的非溶剂中，并在所述温度搅拌该悬浮液，从而得到E型水合物。可将该结晶的固体滤出，然后于环境温度下在干燥氮气下干燥。非溶剂是，例如己烷、庚烷、二氯甲烷、正丙醇或2-丙醇、丙酮、乙酸乙酯、乙腈、乙酸或诸如四氢呋喃、二噁烷、叔丁基甲基醚等醚，或这样的非溶剂的混合物。优选的非溶剂是异丙醇。水溶液的添加可逐滴进行，以避免急剧沉淀。可通过将(6R)-L-赤式-四氢生物蝶呤二盐酸盐的浓缩水溶液添加到过量的且冷却到约10℃～-10℃的温度的非溶剂中，并在环境温度搅拌该悬浮物，从而制备(6R)-L-赤式-四氢生物蝶呤二盐酸盐的E型水合物。过量的非溶剂可以是指水溶液与非溶剂的比例为1∶10～1∶1000。优选的非溶剂是四氢呋喃。另一种制备方法包括将多晶型B暴露于相对湿度为70％～90％，优选为约80％的空气氛围中。E型水合物被认为是二水合物，从而可吸附一些额外的水。可通过在中等温度在真空下(可以是温度为20℃～50℃，压力为0mbar～100mbar)干燥而将多晶型E转化为多晶型J。由于E型在较高的相对湿度中的稳定性，它特别适合用于半固体形式的制剂。
H型水合物
已发现(6R)-L-赤式-四氢生物蝶呤二盐酸盐的另一种水合物晶体形式是用于本文所述的药物制备的BH4的优选的稳定形式，在此将其称为“H型”或“水合物H”。H型水合物的含水量约为5.0重量％～7.0重量％，表明H型是吸湿性的单水合物。H型水合物在低于室温的温度下形成。H型水合物特别适合作为制备稳定多晶型的中间体和原料。可将多晶型H制备成具有通常为1μm～约500μm的所需中位粒径范围的固体粉末。
H型显示的特征X-射线粉末衍射图案的特征峰用d-值
Figure A20088001159400411
表示为：8.615.8(vs)，10.3(w)，8.0(w)，6.6(w)，6.07(w)，4.81(w)，4.30(w)，3.87(m)，3.60(m)，3.27(m)，3.21(m)，3.13(w)，3.05(w)，2.96(m)，2.89(m)，2.82(w)和2.67(m)。图9是(6R)-L-赤式-四氢生物蝶呤二盐酸盐的H型水合物显示的特征X-射线衍射图案的图。
可通过在环境温度下将(6R)-L-赤式-四氢生物蝶呤二盐酸盐溶解在乙酸和水的混合物中，然后添加非溶剂以沉淀出结晶固体，将所得的悬浮液冷却并将冷却的悬浮液搅拌一定时间，从而得到H型水合物。将所述结晶固体滤出，然后在真空下在环境温度中干燥。非溶剂例如是己烷、庚烷、二氯甲烷、正丙醇或2-丙醇、丙酮、乙酸乙酯、乙腈、乙酸或诸如四氢呋喃、二噁烷、叔丁基甲基醚等醚，或这样的非溶剂的混合物。优选的非溶剂是四氢呋喃。可通过在环境温度将(6R)-L-赤式-四氢生物蝶呤二盐酸盐溶解在乙酸和比乙酸的量少的水的混合物中，添加非溶剂并将所得的悬浮液冷却到-10℃～10℃，优选为-5℃～5℃，并在所述温度将该悬浮液搅拌一定时间，从而制备(6R)-L-赤式-四氢生物蝶呤二盐酸盐的H型水合物。一定时间可以指1小时～20小时。乙酸与水的重量比可以是2∶1～25∶1，优选为5∶1～15∶1。乙酸/水与非溶剂的重量比可以是1∶2～1∶5。H型水合物似乎是因吸湿性而含有稍稍过量的吸附水的单水合物。
O型水合物
已发现(6R)-L-赤式-四氢生物蝶呤二盐酸盐的另一种水合物晶体形式是用于本文所述的药物制备的BH4的优选的稳定形式，在此将其称为“O型”或“水合物O”。O型水合物在接近室温的温度形成。O型水合物特别适合作为制备稳定多晶型的中间体和原料。可将多晶型O制备成具有通常为1μm～约500μm的所需中位粒径范围的固体粉末。
O型显示的特征X-射线粉末衍射图案的特征峰用d-值
Figure A20088001159400421
表示为：15.9(w)，14.0(w)，12.0(w)，8.8(m)，7.0(w)，6.5(w)，6.3(m)，6.00(w)，5.75(w)，5.65(m)，5.06(m)，4.98(m)，4.92(m)，4.84(w)，4.77(w)，4.42(w)，4.33(w)，4.00(m)，3.88(m)，3.78(w)，3.69(s)，3.64(s)，3.52(vs)，3.49(s)，3.46(s)，3.42(s)，3.32(m)，3.27(m)，3.23(s)，3.18(s)，3.15(vs)，3.12(m)，3.04(vs)，2.95(m)，2.81(s)，2.72(m)，2.67(m)和2.61(m)。图10是(6R)-L-赤式-四氢生物蝶呤二盐酸盐的O型水合物显示的特征X-射线衍射图案的图。
可通过将多晶型F在所得相对湿度为约52％的含水蒸汽的氮气氛围中暴露约24小时，从而制备O型水合物。F型是略具吸湿性的无水物，可用于在52％的相对湿度下制备O型，这一事实表明O型是水合物，在环境温度和潮湿条件下比F型更稳定。
(6R)-L-赤式-四氢生物蝶呤二盐酸盐的溶剂化物形式
如同下面将进一步描述的，已发现(6R)-L-赤式-四氢生物蝶呤二盐酸盐存在多种结晶的溶剂化物形式，在此将对其进行描述，并将其定义为G型、I型、L型、M型和N型。这些溶剂化物形式可用作本文所述的药物制备用BH4的稳定形式，并可用在包含BH4的稳定晶体多晶型的组合物的制备中。
G型溶剂化物
已发现(6R)-L-赤式-四氢生物蝶呤二盐酸盐的一种乙醇溶剂化物晶体形式是用于本文所述的药物制备的BH4的优选的稳定形式，在此将其称为“G型”或“水合物G”。G型乙醇溶剂化物的乙醇含量为约8.0重量％～12.5重量％，表明G型是吸湿性单乙醇溶剂化物。G型溶剂化物在低于室温的温度形成。G型特别适合作为制备稳定多晶型的中间体和原料。可将多晶型G制备成具有通常为1μm～约500μm的所需中位粒径范围的固体粉末。
G型显示的特征X-射线粉末衍射图案的特征峰用d-值
Figure A20088001159400431
表示为：14.5(vs)，10.9(w)，9.8(w)，7.0(w)，6.3(w)，5.74(w)，5.24(vw)，5.04(vw)，4.79(w)，4.41(w)，4.02(w)，3.86(w)，3.77(w)，3.69(w)，3.63(m)，3.57(m)，3.49(m)，3.41(m)，3.26(m)，3.17(m)，3.07(m)，2.97(m)，2.95(m)，2.87(w)和2.61(w)。图11是(6R)-L-赤式-四氢生物蝶呤二盐酸盐的G型溶剂化物显示的特征X-射线衍射图案的图。
可通过将L-赤式-四氢生物蝶呤二盐酸盐溶解在水中，并添加大过量的乙醇，将所得的悬浮液在环境温度或低于环境温度的温度搅拌，并在大致室温时将分离出的固体在空气或氮气下干燥，从而得到G型乙醇溶剂化物。在此，大过量的乙醇是指所得的乙醇和水的混合物中的水少于10％，优选为约3％～6％。可通过在约室温～75℃的温度将(6R)-L-赤式-四氢生物蝶呤二盐酸盐溶解在水或水与乙醇的混合物中，将经加热的溶液冷却到室温并降至5℃～10℃，必要时可添加乙醇以完成沉淀，在20℃～5℃的温度搅拌所得的悬浮液，滤出白色结晶固体，并在大致室温时将所述固体在空气下或诸如氮气等保护气体下干燥，从而制备(6R)-L-赤式-四氢生物蝶呤二盐酸盐的G型乙醇化物。第一变化方案中，该方法可这样进行：在约室温下将(6R)-L-赤式-四氢生物蝶呤二盐酸盐溶解在少量的水中，然后添加过量的乙醇，然后将所得的悬浮液搅拌至足以相平衡的时间。在第二变化方案中，可将(6R)-L-赤式-四氢生物蝶呤二盐酸盐悬浮在乙醇中，必要时添加少量的水，并将该悬浮液加热，使(6R)-L-赤式-四氢生物蝶呤二盐酸盐溶解，将该溶液冷却到约5℃～15℃的温度，向该悬浮物中添加另外的乙醇，然后将所得的悬浮液搅拌至足以相平衡的时间。
I型溶剂化物
已发现(6R)-L-赤式-四氢生物蝶呤二盐酸盐的一种乙酸溶剂化物晶体形式是用于本文所述的药物制备的BH4的优选的稳定形式，在此将其称为“I型”或“水合物I”。I型乙酸溶剂化物的乙酸含量为约12.7重量％，表明I型是吸湿性乙酸单溶剂化物。I型溶剂化物在低于室温的温度形成。I型乙酸溶剂化物特别适合作为制备稳定多晶型的中间体和原料。可将多晶型I制备成具有通常为1μm～约500μm的所需中位粒径范围的固体粉末。
I型显示的特征X-射线粉末衍射图案的特征峰用d-值
Figure A20088001159400441
表示为：14.5(m)，14.0(w)，11.0(w)，7.0(vw)，6.9(vw)，6.2(vw)，5.30(w)，4.79(w)，4.44(w)，4.29(w)，4.20(vw)，4.02(w)，3.84(w)，3.80(w)，3.67(vs)，3.61(m)，3.56(w)，3.44(m)，3.27(w)，3.19(w)，3.11(s)，3.00(m)，2.94(w)，2.87(w)和2.80(w)。图12是(6R)-L-赤式-四氢生物蝶呤二盐酸盐的I型溶剂化物显示的特征X-射线衍射图案的图。
可通过将L-赤式-四氢生物蝶呤二盐酸盐于高温溶解在乙酸和水的混合物中，向所述溶液中进一步添加乙酸，冷却到约10℃的温度，然后将所形成的悬浮液加热到约15℃，然后将所得到的悬浮液搅拌至足以相平衡的时间，搅拌时间可以持续高达3天，从而得到I型乙酸溶剂化物。然后滤出该结晶固体，并在空气或诸如氮气等保护气体下在约室温的温度干燥。
L型溶剂化物
已发现(6R)-L-赤式-四氢生物蝶呤二盐酸盐的一种混合的乙醇溶剂化物/水合物晶体形式是用于本文所述的药物制备的BH4的优选的稳定形式，在此将其称为“L型”或“水合物L”。L型可含4％、最高至13％的乙醇和0％～约6％的水。当在约0℃～20℃的温度在乙醇中处理时，L型可转化为G型。此外，当在环境温度(10℃～60℃)在有机溶剂中处理时，L型可转化为B型。可将多晶型L制备成具有通常为1μm～约500μm的所需中位粒径范围的固体粉末。
L型显示的特征X-射线粉末衍射图案的特征峰用d-值
Figure A20088001159400451
表示为：14.1(vs)，10.4(w)，9.5(w)，9.0(vw)，6.9(w)，6.5(w)，6.1(w)，5.75(w)，5.61(w)，5.08(w)，4.71(w)，3.86(w)，3.78(w)，3.46(m)，3.36(m)，3.06(w)，2.90(w)和2.82(w)。图13是(6R)-L-赤式-四氢生物蝶呤二盐酸盐的L型溶剂化物显示的特征X-射线衍射图案的图。
可通过将E型水合物于室温下悬浮在乙醇中，并在0℃～10℃、优选为约5℃的温度将该悬浮液搅拌至足以相平衡的时间，搅拌时间可以是10小时～20小时，从而得到L型。然后将结晶固体滤出并优选在30℃减压干燥或在氮气下干燥。TG-FTIR分析表明L型可能含有不定量的乙醇和水，即，它可作为多晶型(无水物)存在，或作为乙醇溶剂化物/水合物的混合体存在，或者甚至作为水合物存在。
M型溶剂化物
已发现(6R)-L-赤式-四氢生物蝶呤二盐酸盐的一种乙醇溶剂化物晶体形式是用于本文所述的药物制备的BH4的优选的稳定形式，在此将其称为“M型”或“水合物M”。M型可含4％、最高至13％的乙醇和0％～约6％的水，表明M型是略具吸湿性的乙醇溶剂化物。M型溶剂化物在室温形成。因为当在约-10℃～15℃的温度在乙醇中处理时，M型可转化为G型，当在诸如乙醇、C3醇和C4醇或环醚(例如THF和二噁烷)等有机溶剂中处理时，M型可转化为B型，因此M型特别适合用作制备稳定多晶型的中间体和原料。可将多晶型M制备成具有通常为1μm～约500μm的所需中位粒径范围的固体粉末。
M型显示的特征X-射线粉末衍射图案的特征峰用d-值
Figure A20088001159400461
表示为：18.9(s)，6.4(m)，6.06(w)，5.66(w)，5.28(w)，4.50(w)，4.23(w)和3.22(vs)。图14是(6R)-L-赤式-四氢生物蝶呤二盐酸盐的M型溶剂化物显示的特征X-射线衍射图案的图。
可通过在环境温度(即，10℃～40℃)将L-赤式-四氢生物蝶呤二盐酸盐溶解在乙醇中并在氮气下使溶液蒸发，从而得到M型乙醇溶剂化物。也可通过在速度为约20ml/分钟～100ml/分钟的干燥氮气微气流下将G型干燥从而得到M型。取决于氮气下干燥的程度，乙醇的残余量可以是变化的，即约3％～13％。
N型溶剂化物
已发现(6R)-L-赤式-四氢生物蝶呤二盐酸盐的另一种溶剂化物晶体形式是用于本文所述的药物制备的BH4的优选的稳定形式，在此将其称为“N型”或“水合物N”。N型总共可含最高10％的异丙醇和水，表明N型是略具吸湿性的异丙醇溶剂化物。可通过以异丙醇洗涤D型，然后在约30℃真空干燥而得到N型。N型特别适合用作制备稳定多晶型的中间体和原料。可将多晶型N制备成具有通常为1μm～约500μm的所需中位粒径范围的固体粉末。
N型显示的特征X-射线粉末衍射图案的特征峰用d-值
Figure A20088001159400462
表示为：19.5(m)，9.9(w)，6.7(w)，5.15(w)，4.83(w)，3.91(w)，3.56(m)，3.33(vs)，3.15(w)，2.89(w)，2.81(w)，2.56(w)和2.36(w)。图15是(6R)-L-赤式-四氢生物蝶呤二盐酸盐的N型溶剂化物显示的特征X-射线衍射图案的图。
可通过将L-赤式-四氢生物蝶呤二盐酸盐溶解在异丙醇和水的4.0ml混合物(混合体积比为例如4∶1)中，从而得到异丙醇型N。向该溶液缓慢添加异丙醇(IPA，例如约4.0ml)，将所得悬浮液冷却到0℃，并在该温度搅拌数小时(例如，约10小时～18小时)。在室温将该悬浮物过滤，并用异丙醇洗涤固体残留物。然后将所得的晶体材料在环境温度(例如，约20℃～30℃)减压(约2mbar～10mbar)干燥数小时(例如，约5小时～20小时)。TG-FTIR显示在25℃～200℃之间有9.0％的重量损失，这是异丙醇和水共同造成的。该结果表明N型可以以异丙醇溶剂化物的形式存在，也可以以混合的异丙醇溶剂化物/水合物的形式存在，或者以包含少量水的非溶剂化形式存在。
对于多晶型的制备，可以采用本领域公知的结晶技术，例如搅拌悬浮液(相平衡)、沉淀、重结晶、蒸发、溶剂(如水)吸附法或溶剂化物的分解。可以用稀释的、饱和的或过饱和的溶液进行结晶，可以加入带有合适的成核剂的晶种，也可以不加入晶种。可采用最高100℃的温度以形成溶液。可进行降至-100℃，优选降至-30℃的冷却以引发结晶和沉淀。可使用亚稳定的多晶型或伪多晶型来制备溶液或悬浮液(该溶液或悬浮液用于制备更稳定形式)，以及达到更高的溶液浓度。
令人惊讶的是，发现D型水合物是水合物中最稳定的形式，B型和D型特别适合用在药物制剂中。B型和D型具备一些优点，例如目标性制备、因适宜的晶体大小和形态而具有的良好的处理性、在各种类型制剂的生产条件下的非常好的稳定性、储存稳定性、更高的溶解度和较高的生物利用率。因此，在此所公开的组合物和方法的一个实施方式是包含(6R)-L-赤式-四氢生物蝶呤二盐酸盐的多晶型B和/或D型水合物以及药用可接受的载体或稀释剂的药物组合物。
III.药物制剂
优选的是将此处所述的制剂作为口服制剂施用。口服制剂优选为诸如胶囊剂、片剂、丸剂和锭剂等固体制剂，或诸如水性悬浮液、酏剂和糖浆剂等液体制剂。可将此处所述的BH4的各种形式以粉末(经微粉化的颗粒)、颗粒、悬浮液或溶液直接使用，或者可将其与其它药用可接受的成分以下述方式组合到一起：将所述组分混合，必要时将其细分，然后装入由例如硬明胶或软明胶组成的胶囊，或者压制成片剂、丸剂或锭剂，或者将其悬浮或溶解在用于悬浮液、酏剂和糖浆的载体中。压制成丸剂后可涂布包衣。
用于各种类型的制剂的药用可接受的成分是众所周知的，例如，可以是用于各种制剂类型的诸如天然或合成聚合物等粘合剂、赋形剂、润滑剂、表面活性剂、甜味剂和调味剂、包衣材料、防腐剂、染料、增稠剂、佐剂、抗微生物剂、抗氧化剂和载体。短语“药用或药学可接受的”是指由美国食品和药物管理局或相应的外国管理机构批准可对人施用的的分子实体和组合物。此处所用的“药用可接受的载体”包括任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂以及等渗压和吸收延迟剂等。将这些介质和试剂用于药用活性物质在本领域内是众所周知的。除了与治疗组合物不相容的任何常规介质或试剂之外，其它的都被设想用在治疗组合物中。也可以将辅助活性成分(supplementary active ingredient)结合在所述组合物中。
用于制备制剂的(6R)-L-赤式-四氢生物蝶呤的初始量例如可以为制剂的约30重量％～约40重量％，或者为约32重量％～约35重量％，或者为约33重量％。此处所设想的BH4在制剂中的具体量包括80mg、100mg、200mg、300mg、400mg和500mg。
粘合剂帮助维持固体制剂。在一些情况下，使用无水粘合剂保持多晶型的无水状态。在一些情况下，粘合剂可以起到干燥剂的作用。示例性粘合剂包括无水磷酸氢钙及其一水合物。可用于此处所述的组合物中的粘合剂的其它非限制性实例包括黄蓍胶、阿拉伯树胶、淀粉、明胶和生物降解性聚合物，例如二羧酸、亚烷基二醇、聚亚烷基二醇和/或脂肪族羟基羧酸的均聚聚酯或共聚聚酯；二羧酸、亚烷基二胺和/或脂肪族氨基羧酸的均聚或共聚聚酰胺；相应的聚酯-聚酰胺共聚物、聚酐、聚原酸酯、聚磷腈和聚碳酸酯。生物降解性聚合物可以是直链、支化或交联的。具体实例为聚乙醇酸、聚乳酸和聚-d，l-丙交酯/乙交酯。聚合物的其它实例为水溶性聚合物，例如聚氧化亚烷基(聚氧化乙烯、聚氧化丙烯和它们的混合聚合物)、聚丙烯酰胺类和羟基烷基化聚丙烯酰胺、聚马来酸及其酯或酰胺、聚丙烯酸及其酯或酰胺、聚乙烯醇及其酯或醚、聚乙烯基咪唑、聚乙烯基吡咯烷酮和天然聚合物如壳聚糖。
崩解剂通过吸收水和膨胀而帮助固体制剂迅速崩解。示例性崩解剂包括聚乙烯吡咯烷酮(PVP，例如以商品名POVIDONE销售)、交联型聚维酮(CPVP，例如以商品名CROSPOVIDONE销售)、交联型羧甲基纤维素钠(NaCMC，例如以商品名AC-DI-SOL销售)和其它改性纤维素和改性淀粉。与使用PVP配制的片剂相比，使用CPVP配制的片剂显示出更迅速的崩解。
可以将抗氧化剂包含进来，其有助于稳定四氢生物蝶呤产品(特别是在溶解后)。与中或高pH下的溶液相比，低pH的API水溶液更稳定。将抗氧化剂包含在此处所述的制剂中可防止因氧化而劣化。抗氧化剂通常分为三类。
第一类被认为是真正的抗氧化剂，其通过与自由基反应阻断链反应而抑制氧化。实例包括：酚类抗氧化剂，其包括丁基化羟基茴香醚(BHA)、丁基化羟基甲苯(BHT)、叔丁基氢醌(TBHQ)、4-羟甲基-2，6-二-叔丁基苯酚(HMBP)和2，4，5-三羟基苯丁酮(THBP)；烷基没食子酸酯，包括没食子酸丙酯；没食子酸；去甲二氢愈创木酸；和生育酚，包括α-生育酚。
第二类由还原剂构成，氧化还原电势低于其所要保护的药物，因此更容易被氧化。还原剂也可以通过与自由基反应而发挥作用。实例包括抗坏血酸，巯基乙酸(TGA)、抗坏血酸棕榈酸酯、包括亚硫酸的钾盐和钠盐的亚硫酸盐(例如亚硫酸钾、亚硫酸钠、焦亚硫酸钠和亚硫酸氢钠)和硫甘油。
第三类由抗氧化剂增效剂构成，所述抗氧化剂增效剂通常本身具有适度的抗氧化剂效果，但是可能会通过与催化氧化的重金属离子反应而增加第一类或第二类中的抗氧化剂的作用。这种抗氧化剂增效剂和螯合剂的实例包括柠檬酸、苹果酸、乙二胺四乙酸及其盐、卵磷脂和酒石酸。
示例性酸性抗氧化剂包括抗坏血酸、抗坏血酸的脂肪酸酯如抗坏血酸棕榈酸酯和抗坏血酸硬脂酸酯，和抗坏血酸盐如抗坏血酸钠、抗坏血酸钙或抗坏血酸钾。也可以在稳定的片剂制剂中使用非酸性抗氧化剂。非酸性抗氧化剂的非限制性实例包括β-胡萝卜素、α-生育酚。可以添加酸性添加剂以增加片剂制剂的稳定，所述酸性添加剂包括柠檬酸或苹果酸。小分子抗氧化剂包括但不限于硫醇类，例如半胱氨酸、N-乙酰半胱氨酸和谷胱苷肽等，或巯基化聚合物(聚合物-SH)，例如聚卡波非-半胱氨酸、聚甲基丙烯酸-SH、羧甲基纤维素-半胱氨酸等，或小分子抗氧化剂如抗坏血酸、甲硫氨酸和抗坏血酸棕榈酸酯等。这些抗氧化剂赋予剂型经过GIT期间的稳定性，特别是在GIT的pH随距胃距离的增加而增加时更是如此。
在一个实施方式中，优选至少两种还原剂抗氧化剂的组合。在另一实施方式中，优选至少两种还原剂抗氧化剂与酸抗氧化剂增效剂和/或螯合剂的组合。
润滑剂可改善固体制剂的稳定性、硬度和均匀性。示例性润滑剂包括硬脂基富马酸酯(或盐)和硬脂酸镁。润滑剂的其它非限制性实例包括天然或合成的油、脂肪、蜡或脂肪酸盐，例如硬脂酸镁。
可选的是，本发明的稳定的制剂也可以包含其它赋形剂，例如甘露醇、羟丙基纤维素、微晶纤维素或其它非还原糖，例如蔗糖、海藻糖、松三糖、车前糖和棉子糖。还原糖可以与BH4反应。可用于本文所述的组合物中的赋形剂的其它非限制性实例包括磷酸盐，例如磷酸二钙。
此处所述的组合物中所用的表面活性剂可以是阳离子的、阴离子的、两性的或中性的。此处所述的组合物中所用的表面活性剂的非限制性实例包括卵磷脂、磷脂、硫酸辛酯、硫酸癸酯、硫酸十二烷基酯、硫酸十四烷基酯、硫酸十六烷基酯和硫酸十八烷基酯、油酸钠或癸酸钠、1-酰氨基乙烷-2-磺酸(例如1-辛酰氨基乙烷-2-磺酸、1-癸酰氨基乙烷-2-磺酸、1-十二烷酰氨基乙烷-2-磺酸、1-十四烷酰氨基乙烷-2-磺酸、1-十六烷酰氨基乙烷-2-磺酸和1-十八烷酰氨基乙烷-2-磺酸)，以及牛磺胆酸和牛磺脱氧胆酸、胆汁酸以及它们的盐，例如胆酸、脱氧胆酸和甘胆酸钠、癸酸钠或月桂酸钠、油酸钠、十二烷基硫酸钠、十六烷基硫酸钠、硫酸化蓖麻油和二辛基磺基琥珀酸钠、椰油酰胺丙基甜菜碱和月桂基甜菜碱、脂肪醇、胆固醇、单硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯、单油酸甘油酯或二油酸甘油酯，和单棕榈酸甘油酯或二棕榈酸甘油酯，以及聚氧乙烯硬脂酸酯。
此处所述的组合物中所用的甜味剂的非限制性实例包括蔗糖、果糖、乳糖或阿斯巴甜。此处所述的组合物中所用的调味剂的非限制性实例包括薄荷、冬青油或诸如樱桃或桔子香料等水果香料。此处所述的组合物中所用的包衣材料的非限制性实例包括明胶、蜡、虫胶、糖或其它生物降解性聚合物。此处所述的组合物中所用的防腐剂的非限制性实例包括对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯、山梨酸、氯代丁醇、苯酚和硫柳汞。
也可以将BH4形式配制为泡腾片或粉末，它们在含水环境中崩解以提供饮用溶液。为了在胃肠道中实现与体液接触的活性剂的受控释放，并在血浆中提供基本恒定且有效的水平的活性剂，也可以制备慢释制剂。为此目的，可在生物降解性聚合物、水溶型聚合物或两者的混合物的聚合物基质中包埋晶体形式以及必要时也可包含的合适表面活性剂。在这里包埋可以指将微粒结合在聚合物基质中。通过由已知的分散或乳化包衣技术包封分散的微粒或乳化的微滴而也可获得控释制剂。
优选将此处所述的组合物中所用的BH4配制为二盐酸盐，然而，设想了BH4的其它盐形式也具有需要的生物活性，因而可以使用BH4的其它盐形式。具体而言，优选无机或有机酸的BH4盐。可替代的BH4盐形式的非限制性实例包括乙酸、柠檬酸、草酸、酒石酸、富马酸和扁桃酸的BH4盐。
药用可接受的碱加成盐可以由金属或胺，例如碱金属和碱土金属或有机胺形成。也可以使用药用可接受的阳离子制备药用可接受的化合物的盐。对于本领域技术人员而言，适宜的药用可接受的阳离子是其所熟知的，包括碱金属阳离子、碱土金属阳离子、铵阳离子和季铵阳离子。也可以是碳酸盐或碳酸氢盐(hydrogen carbonate)。用作阳离子的金属的实例有钠、钾、镁、铵、钙或三价铁等。适宜的胺的实例包括异丙胺、三甲胺、组氨酸、N，N’-二苯甲基乙二胺、氯普鲁卡因、胆碱、二乙醇胺、二环己胺、乙二胺、N-甲基葡糖胺和普鲁卡因。
药用可接受的酸加成盐包括无机或有机酸盐。适宜的酸盐的实例包括盐酸盐、乙酸盐、柠檬酸盐、水杨酸盐、硝酸盐和磷酸盐。对于本领域技术人员而言，其它适宜的药用可接受盐是其所熟知的，包括例如由以下酸形成的盐：乙酸、柠檬酸、草酸、酒石酸或扁桃酸、盐酸、氢溴酸、硫酸或磷酸；和有机羧酸、磺酸(sulfonic acid)、硫代酸(sulfo acid)或膦酸或者N取代的氨基磺酸，例如乙酸、丙酸、羟基乙酸、琥珀酸、马来酸、羟基马来酸、甲基马来酸、富马酸、苹果酸、酒石酸、乳酸、草酸、葡萄糖酸、葡糖二酸、葡萄糖醛酸、柠檬酸、苯甲酸、肉桂酸、扁桃酸、水杨酸、4-氨基水杨酸、2-苯氧基苯甲酸、2-乙酰氧基苯甲酸、扑酸、烟酸或异烟酸；和氨基酸，例如参与蛋白质合成的20种天然α氨基酸，如谷氨酸或天门冬氨酸；以及苯乙酸、甲磺酸、乙磺酸、2-羟基乙磺酸、乙烷-1，2-二磺酸、苯磺酸、4-甲基苯磺酸、萘-2-磺酸、萘-1，5-二磺酸、2-或3-磷酸甘油酸盐、葡萄糖-6-磷酸盐、N-环己基氨基磺酸(伴有环磺酸盐的形成)，或其它酸性有机化合物，如抗坏血酸。
示例性稳定的口服制剂含有一种或多种下述可改善制剂的稳定性和其它特性的附加成分：粘合剂、崩解剂、酸性抗氧化剂或润滑剂或者它们的组合。示例性的稳定片剂制剂包含粘合剂和崩解剂和非必选的酸性抗氧化剂，以及包含亦为非必选的润滑剂。粘合剂的示例性浓度为约1重量％～约5重量％，或者为约1.5重量％～3重量％；粘合剂与BH4的示例性的重量比为约1∶10～约1∶20。崩解剂的示例性浓度为约1重量％～约20重量％；崩解剂与BH4的示例性重量比为约1∶5～约1∶10。抗氧化剂的示例性浓度为约1重量％～约3重量％；抗氧化剂与BH4的示例性重量比为约1∶5～1∶30。在一个实施例中，抗坏血酸为抗氧化剂，并以小于1∶1，例如1∶2以下或1∶10以下的对BH4的比例使用。本发明的稳定的片剂制剂中润滑剂的示例性浓度为约0.1重量％～约2重量％；润滑剂与BH4的示例性重量比为约1∶25～1∶65。
稳定的固体制剂可以非必选地包含适于所要治疗的状态的其它治疗剂，例如叶酸盐，包括叶酸盐前体、叶酸或叶酸盐衍生物；和/或精氨酸；和/或维生素，例如维生素C和/或维生素B2(核黄素)和/或维生素B12；和/或神经递质前体，例如L-多巴或卡比多巴；和/或5-羟基色氨酸。
美国专利第6,011,040号和第6,544,994号公开了示例性叶酸盐，包括叶酸盐前体、叶酸或叶酸盐衍生物，通过援引将这两个专利并入本文，所述示例性叶酸盐包括叶酸(游离叶酸)、二氢叶酸、四氢叶酸、5-甲基四氢叶酸、5，10-亚甲基四氢叶酸、5，10-次甲基四氢叶酸、5，10-亚胺甲基四氢叶酸、5-甲酰四氢叶酸(亚叶酸)、10-甲酰四氢叶酸、10-甲基四氢叶酸、一种或多种叶酰聚谷氨酸(folylpolyglutamate)、其中叶酸或叶酰聚谷氨酸的蝶呤部分的吡嗪环被还原从而得到二氢叶酸盐或四氢叶酸盐的化合物，或其中N-5或-10位携带一个以不同程度氧化的碳单元的所有前述化合物的衍生物，或它们的药用相容的盐，或它们的两种以上的组合。示例性四氢叶酸盐包括5-甲酰-(6S)-四氢叶酸、5-甲基-(6S)-四氢叶酸、5，10-亚甲基-(6R)-四氢叶酸、5，10-次甲基-(6R)-四氢叶酸、10-甲酰-(6R)-四氢叶酸、5-亚胺甲基-(6S)-四氢叶酸或(6S)-四氢叶酸，和它们的药用可接受盐。示例性盐包括钠盐、钾盐、钙盐或铵盐。
BH4比叶酸盐比精氨酸的示例性相对重量比可以为约1∶10∶10～约10∶1∶1。
本发明的稳定的制剂例如可以作为片剂或丸剂或胶囊提供，其装在具有干燥剂胶囊或袋的HDPE(高密聚乙烯)瓶中；或者根据商业需要，装在两面是箔的泡罩包装(foil-on-foil blister packaging)中或包含透明的聚合物膜的泡罩包装中。
IV.对BH4响应的疾病的治疗
高苯丙氨酸血症、神经心理异常或神经精神异常
本发明的方法可用于治疗与高苯丙氨酸水平或低酪氨酸或色氨酸水平相关的疾病，所述疾病可能由例如低苯丙氨酸羟化酶、酪氨酸羟化酶或色氨酸羟化酶活性所引起。与高苯丙氨酸水平相关的疾病具体包括轻型和典型的苯丙酮酸尿症和此处所述的高苯丙氨酸血症，示例性患者群体包括此处所述的患者亚群和表现出高于正常水平的苯丙氨酸水平的任何其它患者。
与低酪氨酸或色氨酸水平相关的疾病包括神经递质缺乏、神经病或精神病，例如帕金森症、张力障碍、脊髓小脑退化、疼痛、疲劳、抑郁、其它情感障碍和精神分裂症。中风、偏头痛、头痛、阿耳茨海默氏病和对吗啡的耐受和依赖涉及由nNOS过量产生NO。可以对任何这些疾病施用BH4。可施用BH4的其它示例性神经精神异常包括帕金森症、阿耳茨海默氏病、精神分裂症、分裂样精神病、分裂情感障碍、短期性精神失常、妄想症、共有型精神失常、一般疾患所致精神失常、物质引起的精神失常，其它精神疾病、迟发性运动障碍、马查多-约瑟夫病、脊髓小脑退化、小脑共济失调、张力障碍、慢性疲劳综合征、急性或慢性抑郁症、慢性应激综合症、纤维肌痛、偏头痛、注意力缺失多动障碍、躁郁症(bipolardisease)和孤独症。
稳定的制剂还可用于治疗例如因BH4合成途径中的缺陷而罹患BH4缺乏的患者，包括但不限于多巴响应性张力障碍(DRD)、墨蝶呤还原酶(SR)缺乏或二氢喋啶还原酶(DHPR)缺乏。
可使用本发明的稳定的制剂治疗的适宜对象包括在不治疗时具有高苯丙氨酸血浆浓度的对象，例如其苯丙氨酸血浆浓度高于1800μM/L，或高于1600μm、高于1400μm、高于1200μM、高于1000μM、高于800μM、高于600μM、高于420μM、高于300μM、高于200μM或高于180μM。通常轻型PKU被划分为血浆苯丙氨酸浓度为至多600μM/L，中型PKU被划分为血浆苯丙氨酸浓度为600μM/L～约1200μM/L，典型或重型PKU被划分为血浆苯丙氨酸浓度为高于1200μM/L。优选的是，单独使用稳定的制剂治疗或将其与限蛋白饮食一同进行治疗，会将受试对象的血浆苯丙氨酸浓度降至小于600μM，或小于500μM，或360μM±15μM以下，或小于200μM，或小于100μM。其它适宜的受试对象包括诊断为苯丙氨酸羟化酶(PAH)活性降低、与BH4缺乏相关的非典型性或恶性苯丙酮酸尿症、与肝病相关的高苯丙氨酸血症和与疟疾相关的高苯丙氨酸血症的受试对象。低PAH活性可能得自于PAH酶突变，例如PAH的催化域的突变或选自由F39L、L48S、I65T、R68S、A104D、S110C、D129G、E178G、V190A、P211T、R241C、R261Q、A300S、L308F、A313T、K320N、A373T、V388M、E390G、A395P、P407S和Y414C组成的组的一种或多种突变；或者作为孕妇、打算怀孕的育龄妇女或者0岁～3岁或0岁～2岁、0岁～1.5岁或0岁～1岁的婴儿的受试对象；或者被诊断为对于单剂量BH4负荷试验或者诸如4剂量等多剂量负荷试验或7天负荷试验在24小时内无反应性的受试对象。示例性患者群体和示例性BH4负荷试验如国际公报第WO 2005/049000号所述，通过援引将其总体并入本文。
美国专利第4,752,573号；第4,758,571号；第4,774,244号；第4,920,122号；第5,753,656号；第5,922,713号；第5,874,433号；第5,945,452号；第6,274,581号；第6,410,535号；第6,441,038号；第6,544,994号和美国专利公报US 20020187958；US 20020106645；US 2002/0076782；US 20030032616(均通过援引并入本说明书中)都描述了用于非PKU治疗的BH4组合物的施用方法。将这些专利作为提供了本领域技术人员已知的施用BH4组合物的方法的一般教导而以引用方式并入本文，这些教导适用于本说明书中所述的治疗。
虽然个体需要不同，但是各组分的有效量的最优范围的确定属于本领域中已知的技术。BH4的典型剂量包括每日约1mg/kg体重～20mg/kg体重，这通常相当于约5mg/日(1mg/kg×5kg体重)～3000mg/日(30mg/kg×100kg体重)。虽然设想了连续的每日施用，但对HPA而言，需要的是当苯丙氨酸水平的症状被降至低于某一阈值水平时停止BH4治疗。当然，当苯丙氨酸水平再次升高时，可以重新启动治疗。通过利用建立的测试确定苯丙氨酸的血药水平结合相关剂量响应数据，可以确定适当的剂量。
在示例性实施方式中，设想了本发明的方法将为有需要的患者提供约10mg/kg～约20mg/kg的BH4的每日剂量。当然，本领域技术人员可以根据施用所实现的功效对此剂量进行上调或下调。可以以单剂量或者以便利的时间间隔下的多剂量施用每日剂量。在示例性实施方式中，每日剂量可以是1mg/kg、2mg/kg、3mg/kg、4mg/kg、5mg/kg、6mg/kg、7mg/kg、8mg/kg、9mg/kg、10mg/kg、11mg/kg、12mg/kg、13mg/kg、14mg/kg、15mg/kg、16mg/kg、17mg/kg、18mg/kg、19mg/kg、20mg/kg、22mg/kg、24mg/kg、26mg/kg、28mg/kg、30mg/kg、32mg/kg、34mg/kg、36mg/kg、38mg/kg、40mg/kg、42mg/kg、44mg/kg、46mg/kg、48mg/kg、50mg/kg或更高的mg/kg。
低剂量方案
在本发明的低剂量疗法中，设想了例如每日0.1mg/kg～5mg/kg剂量的低剂量，包括0.1mg/kg～2mg/kg或0.1mg/k～3mg/kg或1mg/kg～5mg/kg的剂量。优选每日小于5mg/kg的剂量。根据本发明，预期这种剂量会提供对相关研究终点的改善，并预期BH4衍生物较之此剂量的天然BH4具有改进的生物学特性。具体而言，本发明设想了此处所述的1’，2’-二酰基-(6R，S)-5，6，7，8-四氢-L-生物蝶呤或类脂四氢生物蝶呤中的任一种会在低剂量时表现出改进的生物学特性。
本发明还具体设想了以0.1mg/kg体重/日～5mg/kg体重/日的剂量通过任何施用途径使用BH4或其前体或衍生物治疗对BH4响应的疾病，所述施用途径包括但不限于以每日一次的剂量或每日分为多次(例如2、3或4)的剂量口服，持续时间为至少1、2、3或4周或者更长时间，或者1、3、4、5、6个月或者更长时间。示例性剂量包括少于5mg/kg/日、4.5mg/kg/日以下、4mg/kg/日以下、3.5mg/kg/日以下、3mg/kg/日以下、2.5mg/kg/日以下、2mg/kg/日以下、1.5mg/kg/日以下、1mg/kg/日以下或0.5mg/kg/日以下。还设想了单位体表面积的等同剂量。
对于具有平均体重/体表面积(例如70kg)的人，本发明还设想了小于400mg的总每日剂量。示例性的所述总每日剂量包括360mg/日、350mg/日、300mg/日、280mg/日、210mg/日、180mg/日、175mg/日、150mg/日或140mg/日。例如，350mg/日或175mg/日很容易通过每日一次或两次175mg的口服剂型来施用。其它示例性总每日剂量包括320mg/日以下、160mg/日以下，或80mg/日以下。这种剂量很容易通过80mg或160mg的口服剂型来施用。其它示例性总每日剂量包括45mg/日、90mg/日、135mg/日、180mg/日、225mg/日、270mg/日、315mg/日或360mg/日以下，很容易通过45mg或90mg的口服剂型来施用。另一示例性总每日剂量包括60mg/日、120mg/日、180mg/日、240mg/日、300mg/日或360mg/日，很容易通过60mg或120mg的口服剂型来施用。其它示例性总每日剂量包括70mg/日、140mg/日、210mg/日、280mg/日或350mg/日，很容易通过70mg或140mg的口服剂型来施用。示例性总每日剂量还包括55mg/日、110mg/日、165mg/日、220mg/日、275mg/日或330mg/日，很容易通过55mg的口服剂型来施用。其它示例性总每日剂量包括65mg/日、130mg/日、195mg/日、260mg/日或325mg/日，或者75mg/日、150mg/日、225mg/日、300mg/日或375mg/日，例如可以以65mg或75mg的剂型施用。
与一氧化氮合成酶功能障碍相关的疾病
本发明还设想了本发明的稳定的制剂可以用于治疗罹患可得益于一氧化氮合成酶活性增强的疾病的受试对象，和罹患血管病、缺血性或炎症性疾病或者胰岛素抵抗的患者。所述治疗例如可以减轻一氧化氮合成酶活性的不足，例如将一氧化氮合成酶活性提高到正常水平之上。有人提出，罹患一氧化氮合成酶活性不足的患者将受益于与叶酸盐，包括叶酸盐前体、叶酸或叶酸盐衍生物的联合治疗。
一氧化氮由血管内皮细胞组成性地产生，其在血压和血管紧张度调节方面发挥着重要的生理作用。有人提出，一氧化氮生物活性不足涉及在血管功能障碍的发病机制之中，所述血管功能障碍包括冠心病、任何动脉(包括冠状动脉、颈动脉、脑动脉或周围血管动脉)的动脉粥样硬化、缺血-再灌注损伤、高血压、糖尿病、糖尿病血管并发症、心血管疾病、周围血管疾病或源于缺血和/或炎症的诸如中风等神经退行性疾病，这种发病机制包括受损的内皮、没有足够的氧流入器官和组织、升高的全身血管阻力(血压高)、血管平滑肌增殖、血管狭窄(变窄)和炎症的进展。因此，根据本发明的方法设想了对这些疾病中的任何疾病的治疗。
还有人提出，一氧化氮合成酶活性的增强还会导致降低过高的超氧化物水平、增加胰岛素敏感性并减少与胰岛素抵抗相关的血管机能障碍，如美国专利第6,410,535号所述，通过援引将其并入本文。因此，根据本发明设想了对糖尿病(I型或II型)、高胰岛素血症或胰岛素抵抗的治疗。具有与胰岛素抵抗相关的血管机能障碍的疾病或紊乱包括由胰岛素抵抗引起的或因胰岛素抵抗而恶化的那些疾病或紊乱，或者因胰岛素抵抗而妨碍痊愈的那些疾病或紊乱，包括但不限于异常的血管顺应性、内皮机能障碍和高血压，胰岛素敏感性和血糖控制的紊乱、异常的外周灌注，例如间歇性跛行、低外周灌注、低皮肤血流量、有缺陷的伤口愈合和外周循环障碍、高脂血、动脉硬化、冠状动脉血管狭窄型心绞痛、劳力型心绞痛、脑血管收缩性病变、脑血管供血不足、脑血管痉挛、经皮腔内冠状血管成形术(PTCA)或冠状动脉旁路移植术(CABG)后的冠状动脉狭窄、肥胖症、非胰岛素依赖性糖尿病、高胰岛素血症、血脂代谢异常、冠心病动脉硬化性心脏病、充血性心力衰竭、伴随或不伴随充血性心衰的肺动脉高压、与活动相关的心绞痛、冠心病和相关的动脉粥样硬化；眼部疾病，例如视神经萎缩和糖尿病性视网膜疾病；和肾病，例如糖尿病肾病中的微量蛋白尿、肾衰和低肾小球滤过率。
设想了当对患有这些疾病的患者施用时，BH4能够通过激活NOS的功能、促进NO的产生和抑制活性氧种的产生来改善血管内皮细胞的紊乱，从而防止或治疗这些疾病。
本发明提供了治疗被诊断为患有与糖尿病无关的血管疾病的受试对象，所述血管疾病选自由肺血管疾病、溶血性贫血、中风和相关的缺血性血管疾病(如中风、心脏病或冠心病、动脉硬化或周围血管疾病)、血栓症、移植相关的内皮机能障碍，和心脏病或冠心病组成的组。在一个实施方式中，肺血管疾病包括但不限于镰状细胞贫血和其它血红蛋白病中的肺动脉压(pulmonary tension)、特发性肺动脉高压和新生儿的持续肺动脉高压(PPHN)。在另一实施方式中，溶血性贫血包括遗传性溶血性贫血和获得性溶血性贫血。遗传性溶血性贫血包括但不限于镰刀状细胞贫血、地中海贫血、因G6PD缺乏引起的溶血性贫血、丙酮酸激酶缺乏症、遗传性椭圆形红细胞增多症、遗传性球形红细胞增多症、遗传性口形红细胞增多、遗传性卵形红细胞症、阵发性睡眠性血红蛋白尿、和血红蛋白SC病。获得性溶血性贫血包括但不限于微血管病性溶血性贫血、特发性自身免疫性溶血性贫血、由化学或物理试剂或装置(左心室辅助装置、人工心脏瓣膜和旁路装置)导致的非免疫性溶血性贫血，和二次免疫溶血性贫血。
在另一实施方式中，中风和相关的缺血性血管疾病包括但不限于血管痉挛，例如中风后的脑血管痉挛。血栓症包括但不限于血栓形成、血栓症、块凝(clotting)和凝结。在又一实施方式中，移植相关的内皮机能障碍包括但不限于实体器官移植后的血管机能障碍和环孢霉素A诱发的内皮机能障碍。在另一实施方式中，心脏病或冠心病包括但不限于充血性心力衰竭、与高胆固醇血症相关的血管机能障碍和心绞痛，和与吸烟相关的血管机能障碍和心绞痛。
BH4还可以预防或治疗其它与反应性氧种的生产过剩或涉及反应性氧种的损坏相关的疾病，其包括但不限于败血症。
应当理解，本发明的组合物的适宜的剂量取决于接受者的年龄、健康状况和体重、同期治疗的种类(如果存在)、治疗的频率和所需效果的性质(即，所需的血浆苯丙氨酸浓度的降低量)。给药的频率还取决于对苯丙氨酸水平的药效学效果。最好单一剂量的效果可以持续24小时。然而，如本领域技术人员所知和可确定的，可以为个体对象制定最优选的剂量，而无需进行过度的实验。这通常涉及对标准剂量的调整，例如如果患者体重较轻，则应减少剂量。
BH4给药的频率将取决于试剂的药代动力学参数和施用途径。最优的药物制剂将由本领域技术人员根据施用途径和所需剂量而确定。例如参见Remington′s Pharmaceutical Sciences，第18版(1990，Mack Publ.Co，Easton PA 18042)pp 1435 1712，通过援引将其并入本文。所述制剂会影响施用试剂的物理状态、稳定性、体内释放速率和体内清除率。取决于施用途径，可根据体重、体表面积或器官大小计算适宜的剂量。对于本领域技术人员而言，可以常规地对确定适当的治疗剂量所需的计算进行进一步细化而无需过度实验，所述细化特别是根据此处所公开的剂量信息和测试以及在动物或人类临床试验中所观测到的药代动力学数据来进行。
最终剂量方案将由主治医生根据影响药物作用的因素来确定，所述因素例如为药物的比活性、患者的损伤严重性和响应性、患者的年龄、病状、体重、性别和膳食、任何感染的严重性、施用时间和其它临床因素。随着研究的进行，还将出现关于适当的剂量水平和具体疾病和症状的治疗持续时间的进一步信息。
V.联合治疗
本发明的某些方法涉及将本发明的稳定制剂与一种或多种其它治疗剂的联用。
在这种联合治疗中，本发明的稳定制剂的施用可以在施用第二治疗剂的同时进行或者之前或之后，例如以使二者间隔数分钟至数小时的方式进行，只要在重叠时期这两种试剂都能发挥其疗效即可。由此，本发明设想了将本发明的稳定剂型与第二治疗剂一起使用。本发明还设想了将第二治疗剂用在药剂的制备中，以与本发明的稳定的四氢生物蝶呤、前体、衍生物或类似物制剂一同施用。
可以将四氢生物蝶呤治疗与膳食蛋白限制结合以影响患有各种形式HPA的患者的治疗结果。例如，可以以可有效产生所需治疗结果(即，降低血浆苯丙氨酸浓度和/或耐受更大量的苯丙氨酸/蛋白质摄入而不产生血浆苯丙氨酸浓度随同升高的能力)的联合用量，对受试对象施用BH4组合物和低苯丙氨酸药用蛋白组合物。该方法可涉及同时施用BH4组合物和膳食蛋白治疗组合物。这可以通过施用单一组合物或药学蛋白质制剂来实现，所述组合物或制剂包含所有所需要的膳食蛋白，并且在所述蛋白制剂中也包含BH4。作为另外一种选择，可以大约与BH4的药学制剂(片剂、注射剂或饮剂)同时服用膳食蛋白(补剂或正常的蛋白膳食)。
在一些实施方式中，限蛋白膳食是补充有氨基酸，例如酪氨酸、缬氨酸、异亮氨酸和亮氨酸的一种膳食。患者可以联合施用低苯丙氨酸蛋白的补剂，其可包含浓度为20mg/100g补剂的L-酪氨酸、L-谷氨酰胺、L-肉碱，和浓度为40mg/100g补剂的L-牛磺酸，和硒。其可以进一步包含推荐的每日剂量的矿物质，例如钙、磷和镁。补剂还可以包含推荐的每日剂量的选自由L-亮氨酸、L-脯氨酸、L-赖氨酸醋酸盐、L-缬氨酸、L-异亮氨酸、L-精氨酸、L-丙氨酸、甘氨酸、L-天冬酰胺一水合物、L-色氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-组氨酸、L-甲硫氨酸、L-谷氨酸和L-天冬氨酸组成的组的一种或多种氨基酸。另外，可以使用推荐的每日剂量的维生素A、D和E来加强补剂。可选的是，补剂包含提供补剂能量的至少40％的脂肪含量。可以以粉末补剂或蛋白棒的形式提供这种补剂。在某些实施方式中，限蛋白膳食包含蛋白补剂，并且BH4与蛋白补剂一样提供在相同组合物中。
在其它替代形式中，BH4治疗可以在膳食蛋白治疗之前或之后进行，二者间隔数分钟至数小时。在分开施用蛋白和BH4组合物的实施方式中，人们通常可以确保各次服用时间之间不会间隔很长的时段，从而使BH4将仍能对患者发挥有利的作用。在这种情况下，设想了应该在膳食蛋白摄入(之前或之后)的约2～6小时内施用BH4，例如延迟时间仅为约1小时以下。在某些实施方式中，设想了将BH4治疗作为连续治疗，无限期地对患者施用每日剂量的BH4。在其它情况下，例如对于只具有较轻形式的PKU和HPA的孕妇，BH4治疗可以仅持续至与妇女怀孕期和/或哺乳期同等时长。
此外，除了仅根据BH4的服用和膳食蛋白调节的治疗之外，本发明的方法还设想了与专门针对HPA的一种或多种症状的第三组合物的联合治疗。例如，已经知道，由PHA引起的酪氨酸缺乏会导致神经递质多巴胺和血清素不足。由此，在本发明的说明中，设想了可以将基于BH4和膳食蛋白的方法进一步与施用L-多巴、卡比多巴和5-羟色氨酸等神经递质联合，以纠正膳食中的低酪氨酸量所导致的不足。
另外，本领域技术人员已经设想了同时使用PAH(Christensen等，Mol.Gent.And Metabol.76：313-318，2002；Christensen等，Gene Therapy，7：1971-1978，2000)和苯丙氨酸解氨酶(ammonia-lyase)(PAL Liu等，Arts.Cells.Blood.Subs and Immob.Biotech.30(4)243-257，2002)的基因治疗。这种基因治疗技术可与本发明的基于BH4/膳食蛋白限制的联合治疗联用。在其它联合治疗中，设想了可以将苯丙氨酸解氨酶(phenylase)提供为注射用酶，以破坏患者体内较低的苯丙氨酸浓度。因为苯丙氨酸解氨酶的施用将不产生酪氨酸(不同于PAH的施用)，所以这种治疗还将使酪氨酸成为此类患者的必需氨基酸。因此，接受与BH4治疗联用的苯丙氨酸解氨酶的患者需要膳食补充酪氨酸。
根据本发明的方法，可以将BH4与一种或多种其它神经精神病活性剂联合施用，以用于神经心理异常或神经精神异常，所述神经精神病活性剂包括抗抑郁药、神经递质前体，例如如色氨酸、酪氨酸、血清素、激活去甲肾上腺素系统的试剂，例如洛非帕明、地昔帕明、瑞波西汀、酪氨酸、优先作用于血清素的试剂、去甲肾上腺素和血清素吸收的联合抑制剂，例如文拉法辛、度洛西汀或米那普仑，或者作为多巴胺和去甲肾上腺素再吸收的联合抑制剂的药物，例如安非他酮。
在相关实施方式中，BH4与常用于治疗糖尿病、血管疾病和高脂血症的其它治疗剂一同施用。用于治疗糖尿病的试剂包括但不限于改善胰岛素敏感性的药剂，例如PPAR-γ-配体(噻唑烷二酮类、格列酮类、曲格列酮类、罗格列酮(Avandia)、吡格列酮)，胰岛素分泌刺激剂，例如磺脲类(格列喹酮、甲苯磺丁脲、格列美脲、氯磺丙脲、格列甲嗪、格列本脲、醋磺己脲)和格列奈类(美格列奈、瑞格列奈，那格列奈)和降低葡萄糖的肝脏生产的药剂，例如二甲双胍。用于治疗血管疾病的药剂包括但不限于常用于治疗高血压和其它内皮功能障碍相关的疾病的内皮素受体拮抗剂，例如波生坦(bosentan)、达芦生坦、恩拉生坦、替唑生坦、阿曲生坦、安贝生坦、西他生坦；平滑肌松弛剂，例如PDE5抑制剂(间接作用)和米诺地尔(直接作用)；血管紧张素转换酶(ACE)抑制剂，例如卡托普利、依那普利、赖诺普利、福辛普利、培哚普利、喹那普利、群多普利、苯那普利、雷米普利；血管紧张素II受体阻断剂，例如厄贝沙坦、氯沙坦、缬沙坦、依普沙坦、奥美沙坦、坎地沙坦、替米沙坦；β-阻断剂，例如阿替洛尔、美托洛尔、纳多洛尔、比索洛尔、吲哚洛尔、醋丁洛尔、倍他索洛尔、普萘洛尔；利尿剂类，例如氢氯噻嗪、呋喃苯胺酸、托拉塞米、美托拉宗；钙通道阻断剂，例如氨氯地平、非洛地平、尼索地平、硝苯地平、维拉帕米、地尔硫卓；α-受体阻断剂多沙唑嗪、特拉唑嗪、阿夫唑嗪、坦索罗辛；和中枢性α-激动剂，例如氯压定。用于治疗高脂血症的试剂包括但不限于低级LDL(低密度脂蛋白)，例如他汀类(阿伐他汀、氟伐他汀、洛伐他汀、普伐他汀、罗伐他汀钙、辛伐他汀)和烟酸、胆固醇酯转运蛋白抑制剂(例如托彻普(torcetrapib))、刺激PPAR-α的药剂，例如贝特类、吉非罗齐、非诺贝特、苯扎贝特、环丙贝特，结合并防止胆汁酸再吸附并降低胆固醇水平的药剂，例如胆汁酸螯合剂、消胆胺和考来替泼，和胆固醇吸收抑制剂。
BH4还可以与可单独或与治疗剂组合而增强或正常化血管扩张剂一氧化氮(NO)的产生的因子或因子的组合一同施用。在一个实施方式中，所述因子增强了BH4从头生物合成的活性或表达，并选自由鸟苷三磷酸环化水解酶I(GTPCH1)、6-丙酮酰四氢蝶呤合成酶(PTPS)和墨蝶呤还原酶组成的组。在本发明的优选实施方式中，通过利用下述物质中的任何一种或多种来提高GTPCH1表达的表达从而促进BH4的合成：环腺苷酸(cAMP)类似物或激动剂，包括福斯高林(forskolin)、8-溴cAMP或起促进cAMP介导的细胞信号转导的作用的其它试剂，如细胞因子和生长因子，包括白细胞介素-1、干扰素-γ(IFN-γ)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、c-反应蛋白、HMG-CoA-还原酶(类似阿伐他汀等他汀)神经生长因子(NGF)、表皮生长因子(EGF)、激素，包括肾上腺髓质素和雌二醇苯甲酸酯，和其它化合物，例如NADPH和NADPH类似物、咖啡因、环孢霉素A甲基-黄嘌呤，包括3-异丁基-1-甲基黄嘌呤、茶碱、利血平、过氧化氢。
因此，本发明的一个实施方式涉及通过使用包括PDE1、PDE3和PDE5的11磷酸二酯酶族(PDE1-11)的抑制剂来抑制3′5’-环核苷酸的降解，由此提高GTPCH1水平。本发明的PDE抑制剂包括伟哥/西地那非、西力士/他达那非、伐地那非/艾力达、乌地那非、8-甲氧基甲基-IBMX、UK-90234、地塞米松、检皮素、橙皮素、伊索拉定、长春西汀、环己喹酰胺、咯利普兰、乙基-β-咔啉-3-羧酸盐(β-CCE)、四氢-β-咔啉衍生物和3-O-甲基槲皮苷等。
本发明的另一实施方式涉及通过基因治疗或BH4合成器的多核苷酸的内皮靶向输送来提高BH4合成酶的水平，从而提高BH4的水平。本发明的又一实施方式涉及通过补充BH4合成酶GTPCH1、PTPS、SR、PCD、DHPR和DHFR来提高BH4的水平。设想了BH4合成酶涵盖包括蛋白质突变体的所有天然和非天然形式的酶。
本发明的另一实施方式涉及通过抑制碱性磷酸酯酶(AP)活性来将底物7，8-二氢新蝶呤三磷酸转向BH4合成酶PTPS而非AP，从而提高BH4水平。抑制AP活性的药剂或化合物包括磷酸盐类似物、左旋咪唑和L-苯丙氨酸。本发明的又一实施方式涉及抑制碱性磷酸酯酶的试剂或化合物包括小干扰RNA(siRNA)、反义RNA、dsDNA、小分子、中和抗体、单链抗体、嵌合抗体/人源化抗体和抗体片段以抑制碱性磷酸酯酶合成。
本发明的又一实施方式包括增强下述催化剂或辅助因子的活性的试剂或化合物，所述催化剂或辅助因子为BH4合成的从头合成路线的酶的合成所需要。
本发明的另一实施方式包括防止BH4合成所需的酶降解的试剂或化合物。本发明的又一实施方式包括防止BH4及其合成酶(包括GTPCH1、PTPS和SR)的合成所需的催化剂降解的试剂和化合物。
本发明的另一实施方式涉及通过补救途径提高BH2的还原，从而提高BH4的水平。在体内，BH4被氧化为BH2。以醌形式(qBH2)和7，8-二氢蝶呤存在的BH2分别通过DHPR和DHFR被还原为BH4。本发明的一个实施方式涉及通过使用途径的NADPH、硫醇、全氯汞苯甲酸酯和过氧化氢等试剂或化合物调节PCD、DHPR和DHFR等酶的活性和合成，从而提高由BH2至BH4的再生或补救。
本发明的另一实施方式涉及使用诸如抗氧化剂等试剂或化合物降低BH4的氧化从而稳定BH4的试剂，所述抗氧化剂包括抗坏血酸(维生素C)、α-生育酚(维生素E)、生育酚(如维生素A)、硒、β-胡萝卜素、类胡萝卜素、黄酮、类黄酮、叶酸盐、黄酮、黄酮烷、异黄酮烷、儿茶素、花青素和查耳酮。
在又一实施方式中，所述因子可以提高一氧化氮合成酶的活性或表达，从而增加NO的产生。
在另一实施方式中，本发明设想了抑制GTPCH反馈调节蛋白GERP的因子。本发明的一个实施方式涉及抑制BH4与GTPCH1/GFRP复合体结合从而防止由BH4造成的反馈抑制的试剂或化合物。本发明的试剂或化合物包括竞争性抑制剂，例如具有对复合体的改变的亲和力的其它形式的BH4、结构类似物等。本发明的另一实施方式包括增强L-苯丙氨酸与诱发BH4合成的CTPCH1/GFRP的结合的试剂或化合物。本发明的又一实施方式包括提高L-苯丙氨酸的水平的试剂或化合物，例如L-苯丙氨酸的前体，其起到抑制由GFRP和BH4所造成的CTPCH1的反馈抑制的作用。
本发明的另一实施方式涉及调节GFRP的活性或合成的试剂或化合物。本发明的一个实施方式包括抑制GFRP的活性的试剂或化合物。本发明的另一实施方式包括使用siRNA、小分子、抗体、抗体片段等来抑制GFRP的合成。
VI.生物蝶呤测试
根据Fukishima等的方法(Anal.Biochem.102：176(1980)，确定血浆、血液和其它组织中的总生物蝶呤和氧化的生物蝶呤的浓度。生物蝶呤具有四种不同形式，包括：两种形式的还原的生物蝶呤即R-四氢生物蝶呤(BH4)和醌型R-二氢生物蝶呤(q-BH2)，和两种形式的氧化的生物蝶呤即二氢生物蝶呤(BH2)和生物蝶呤(B)。在这四种形式中，只有还原的形式的生物蝶呤具有辅酶活性。还原的生物蝶呤在酸性条件下通过碘酰化(iodylation)而转化为B，而在碱性条件下其转化为蝶呤。氧化的生物蝶呤在酸性和碱性条件下通过碘酰化而转化为B。通过利用这一性质，可根据酸性条件下的碘酰化确定总生物蝶呤的量，和根据碱性条件下的碘酰化确定氧化的生物蝶呤的量，使得还原的生物蝶呤的量可由二者的量差来计算。用作辅酶时，BH4被转化为q-BH2。q-BH2被二氢蝶呤还原酶立即转化为BH4，或者，在未被还原的情况下，其被氧化为BH2或DHPT。由于在体内生物蝶呤难以以q-BH2的形式存在，因此还原的生物蝶呤可以很容易地被取代为BH4。
使用酸性氧化溶液(0.6N HCl水溶液，含有0.6％碘化钾(KI)、0.3％碘(I2)和0.6N的三氯乙酸(TCA))和碱性氧化溶液(0.7N的氢氧化钠(NaOH))对收集的血浆和全血样品立即进行氧化。通过HPLC进行B的确定，并使用液体闪烁计数器测量放射性。
利用与串联质谱联用的反相HPLC(RP)(LC/MS/MS)测量BH4：反相高效液相色谱(RP)与串联质谱(LC/MS/MS)的联用对于人血浆中的BH4表现出选择性，其对BH4的敏感范围为5ng/mL～1000ng/mL。由于收集和储存期间的氧化，该方法与约50％的BH4转化相关。样品可以以乙二胺四乙酸的二钾盐(K2EDTA)血浆的形式稳定存在超过3个月。自预处理步骤的回收率为约75％。该方法的准确度与精度被确定为变化异数(CV)％低于15％(在定量下限(LLOQ)为20％)。
HPLC与串联质谱的联用显示出对单独使用HPLC确定BH4测试品的改进，原因在于其具有：(1)提高的对药物-BH4的选择性(而HPLC测量总生物蝶呤)(2)较宽的定量范围，(3)确定的转换率，(4)广泛的表征性并被证明可用于人类对象，和(5)对不同物种和基体的新型和有用的测量。
改进的方法包括以下步骤：对血液、血浆、组织匀浆或尿液进行酸性或碱性氧化。酸性氧化时，(1)使用氯化钾(KCl)、盐酸(HCl)或TCA处理样品1小时；(2)然后对该经酸氧化的样品进行碘量滴定法；(3)使样品通过离子交换柱；(4)利用HPLC和串联质谱仪测量包含BH4、q-BH2(其在体内立即被还原为BH4，使得所测量的还原的生物蝶呤主要是基于BH4)、BH2和B的总生物蝶呤。碱性氧化时，(1)使用KI、I2或NaOH处理样品一小时；(2)然后使用HCl或TCA对该经碱氧化的样品进行酸化；(3)进行碘量滴定法；(4)使样品通过离子交换柱；(5)测量包含BH2和B的经氧化的生物蝶呤；(6)利用HPLC和串联质谱测量不同的物种；和(7)计算还原的生物蝶呤(BH4+q-BH2)的量，其为总生物蝶呤与氧化形式之差。
生物蝶呤测量和分析验证总结的流程图提供在图16和图17中。
优化分析
采用电化学检测(ECD)和荧光(FL)检测的HPLC法是有利的，因为其可以测量各离散的生物蝶呤化合物(BH4、BH2和B)和类似物。
BH4是产生一氧化氮(NO)的酶系统一氧化氮合成酶(NOS)的辅助因子。NO的产生对于保持血管内稳态很重要。当细胞内的BH4的水平受到限制时，NO产量降低(由于NOS活性降低)并会导致损害性自由基超氧化物(O2-)的生成。过量的O2-可导致内皮细胞机能障碍，并有助于将BH4氧化为BH2。BH4与BH2之比较低会促进内皮的损伤，而BH4与BH2之比较高会促进内皮的健康。因此，表征BH4与BH2之比可以起到预测内皮健康程度的作用。
通过首先利用反相HPLC进行分离，然后利用ECD和FL检测，可确定不同的生物蝶呤(BH4、BH2和B)或类似物的浓度。
利用ECD测量作为氧化还原敏感的非荧光性分子的BH4。使用ECD测量BH4(及其类似物)，其中BH4(或类似物)被电极1氧化为醌型二氢生物蝶呤形式(例如，qBH2)(其为短寿的二氢生物蝶呤中间体)，醌型二氢生物蝶呤形式随后在电极2处被还原回BH4(或类似物)。然后该检测器利用此还原反应产生的电流确定BH4或其类似物的浓度(内源的qBH2可忽略不计)。
可以通过荧光检测，以相同注射测量BH2、B和它们的类似物。在最佳电势下，利用调节保护电池的BH2或其类似物的后ECD氧化将BH2或其类似物氧化为B或相应的生物蝶呤类似物。这是理想的，因为BH2不是荧光活性或者容易测量的，因此，必须转化为容易利用荧光测量的B。内源的BH2一旦转化为B后，和内源的B可以通过两个分开的荧光峰彼此得以区分，这是因为每种分子在HPLC柱中有不同的保留时间。
总而言之，可以使用所述方法测量物种BH4、BH2和B，以及它们的类似物。如此处所述，优选使用含2％MeOH的流动相测量生物蝶呤。诸如缬氨酸生物蝶呤衍生物等生物蝶呤类似物更适于流动相中较高的甲醇含量，例如含10％MeOH的流动相。
因此，检测生物蝶呤物种混合物中的生物蝶呤的方法可包括(a)通过反相HPLC分离混合物中的生物蝶呤物种；在BH4及其类似物的情况下，(b1)将存在于第一电极附近的BH4及其类似物氧化为醌型二氢生物蝶呤的形式，然后在第二电极处将醌型形式还原回BH4及其类似物，并测量还原反应所产生的电流以确定物种的浓度，由此进行电化学检测；和/或(b2)在BH2、其类似物、生物蝶呤或其类似物的情况下，在BH2物种经柱后氧化为生物蝶呤之后通过荧光检测测量这些物种。优选的是，流动相是此处所公开的一种。
在一个实施方式中，优选的流动相包括乙酸钠、柠檬酸、EDTA和1，4-二硫代赤藓醇(DTE)以及甲醇。优选的浓度为50mM的乙酸钠、5mM的柠檬酸、48μm的EDTA和160μM的DTE以及2％的甲醇。
VII.实施例
将以下实施例包括在本文中以说明本发明的优选实施方式。本领域技术人员应当知道，遵循本发明人开发的代表性技术的实施例中所公开的技术可在本发明的实施中发挥良好作用，因此认为所述技术构成了其实施的优选方式。然而，本领域技术人员应当知道，根据本发明所公开的内容，可以对公开的具体实施方式进行许多改变并仍能获得相同或相似的结果，而不会背离本发明的精神和范围。
实施例1
大鼠单剂口服后血浆中生物蝶呤的浓度时间曲线
本研究的目的旨在评估大鼠单次口服后BH4的药代动力学。使雄性Sprague Dawley大鼠(6周龄)在禁食情况下口服单剂的BH4(10mg/kg和100mg/kg)。
结果
给药2小时和1小时后血浆中最大总生物蝶呤浓度分别为108ng/ml(即，为内源水平的约3倍)和1227ng/ml(即，为内源水平的约30倍)(图18)。之后，生物蝶呤具有约1.1小时的消除半衰期(t1/2)，以10mg/kg的剂量给药9小时后和以100mg/kg的剂量给药24小时后返回至内源水平(图18)。
根据通过减去10mg/kg静脉内施用期间的内源水平而获得的血药浓度-时间曲线下的面积(ΔAUC)，口服10mg/kg和100mg/kg后的生物利用率(F)分别为6.8％和11.8％。利用尿中的放射性标记物测量时胃肠吸收率为8.8％。根据这些数据，估计口服生物利用率的实际值为约10％。
血浆中经还原的生物蝶呤与总生物蝶呤之比(即还原形式的比例)相对稳定(73％～96％)(图19)。
实施例2
猴单剂口服后血浆中生物蝶呤的浓度时间曲线
本研究的目的旨在评估食蟹猴单剂口服后沙丙蝶呤的药代动力学。使雌性食蟹猴(每组3只)在禁食情况下口服单剂的沙丙蝶呤(10mg/kg)。
结果
给药3小时后总血浆生物蝶呤浓度(ΔC)达到最大值(344ng/ml，为内源水平的约20倍)(图20)。生物蝶呤的血浆消除半衰期为约1.4小时，给药后24小时内返回至内源水平。测试期间还原的生物蝶呤与总生物蝶呤之比几乎不变。使雌猴口服10mg/kg后以ΔAUC口服/静脉注射比测量的生物利用率(F)为约9％(图21)。
实施例3
将片剂溶解在水中后施用或以完整的片剂施用后四氢生物蝶呤(BH4)的相对生物利用率和食物对健康受试对象的吸收的影响
目的
本研究的主要目的在于：(1)评价在将片剂溶解在水中后施用或以完整的片剂施用时四氢生物蝶呤(BH4，沙丙蝶呤二盐酸盐)的相对生物利用率；(2)比较健康受试对象中食物对BH4的生物利用率的影响。本研究的第二个目的旨在评估健康受试对象中单口服剂量的BH4的安全性和耐受性。
方法
本研究是开放标记的、随机、三次处理、六序列、三期交叉研究，其中有30名受试对象将完成3个单剂量给药期，并被随机分配为六个序列组(组1、2、3、4、5和6)中的一组。
组1：a、b、c
组2：b、c、a
组3：c、a、b
组4：a、c、b
组5：b、a、b
组6：c、b、a
其中所有给药组如下接受10mg/kg的BH4口服给药：
a：禁食情况下施用，在禁食时将片剂溶解在水中后施用
b：禁食情况下施用，在禁食时以完整的片剂施用
c：餐后情况下施用，在开始摄入高热量、高脂肪膳食的30分钟后以完整的片剂施用
在各治疗期，各受试对象都接受10mg/kg的单剂BH4。将各剂量施用以至少7日的清除期分隔开。在第三处理期的排出(discharge)后，进行5～7日的研究后评估。每一研究期中在以下的预定收集时间抽取用于药代动力学(PK)分析的血液样品：给药前30分钟内和给药后0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、5.0、6.0、8.0、10.0、12.0、18.0和24.0小时。
剂量和施用形式
在每治疗期，以10mg/kg的剂量施用BH4片剂。片剂通过以下方式施用：a)溶解在水中在禁食情况时提供，b)以完整的片剂在禁食情况时提供，或c)餐后以完整的片剂提供。
制备各给药的研究药物，并将其以与水混合的液体(溶液)形式施用。所提供的水是环境温度的自来水。在预定的给药时间的15分钟内制备给药溶液。片剂在液体中的溶解用时约1分钟～3分钟。在溶解之前，先在给药杯中将片剂打碎或粉碎以提高溶解速率。
在指定的早晨给药时间，口服以片剂数等于10mg/kg的剂量、溶解在120mL水或橙汁中的BH4。各受试对象都应严格遵守在制备15分钟内饮入全部的120mL的剂量。饮入该剂量后，立即使用60mL的水冲洗给药杯，并使受试对象饮入该冲洗液。向给药杯中再次加入60mL的冲洗水，然后使受试对象再次饮入。整个给药过程在1分钟的时间内完成。在完成给药后，立即由具有资质的人员检查给药杯和各受试对象的口腔，以确保饮入了全部剂量。作为另外一种选择，受试对象吞入含有BH4的丸剂，而不将其溶解在水中。对于每一个体，给药期为：两次给药之间至少间隔7天。
食物摄取计划
在受试对象报到的晚上提供一份快餐。然后，要求所有受试对象在给药之前至少10小时内禁食。
禁食情况
在经过最少10小时的过夜禁食后向在禁食情况下施用的接受治疗的受试对象给药。
在给药后受试对象继续禁食4小时。除了从给药前1小时到给药后1小时之外，研究过程中允许不受限制地饮水。在药物施用后约4小时和10小时和在之后的适当时间提供标准膳食。
非禁食情况
在非禁食情况下施用的接受治疗的受试对象在吃完高热量、高脂肪的早餐后给药。受试对象接受以下的标准高脂肪(占膳食总热量含量的约50％)、高热量(约1000卡)早餐，该早餐开始于预定的剂量施用之前的30分钟并在给药前5分钟内结束(吃完最后一口)。
2个奶油煎蛋
2条熏肉
2片奶油烤面包
4盎司薯饼
8盎司全脂牛奶
该餐食含有约150蛋白质热量、250碳水化合物热量和500～600脂肪热量。记录菜单和热含量，从而代替相应的膳食。
然后，受试对象在给药后禁食4小时。除了从给药前1小时到给药后1小时之外，研究过程中允许不受限制地饮水。在药物施用后约4小时和10小时和在之后的适当时间提供标准膳食。
治疗持续时间
各单剂治疗期之间至少间隔7日。
在最后的治疗访问后的5～7日，进行随访。
安全性变量：评价和方法
对服用至少一剂的BH4的所有受试对象评价安全性。
评估的功效和安全性测量和流程图
通过记录不良事件的发生、12-导联ECG参数的变化、生命特征和体检结果以及实验室测试值的基线变化来评价安全性。这些评估的计划如图22中所示。
体检和生命特征
各受试对象都需由研究调查人员进行常规体检。体检包括评价头、眼、耳、鼻、喉、颈、心、胸、肺、腹、四肢、周围血管搏动、神经功能和皮肤，并评价其他需要注意的身体状况。本研究方案不需进行泌尿生殖器检查。
测量身高(厘米)和体重(公斤)，并计算体重指数(BMI)(BMI＝体重(kg)/[身高(m)]2)。
根据美国心脏协会的推荐，以坐姿测量血压。令受试对象将脚放在地上以坐姿休息5分钟，然后测量血压。
在受试对象采取坐姿时测量心率(脉搏)。
在筛选和在研究结束时作出标准12导联心电图(ECG)记录。由有资质研究者评价ECG。保存ECG和评价报告的复印件，将其作为各受试对象的文件的一部分。
由研究主管审核和评价受试对象的病史、临床实验室测试结果和ECG图像，以确定各受试对象参与本研究的临床适合性。
临床实验室评估
血液学：
评价以下内容：血红蛋白、血细胞比容、总白细胞计数和分白细胞计数、红细胞(RBC)和血小板计数。
另外，检测血液的乙型肝炎表面抗原、丙型肝炎抗体和人体免疫缺陷病毒(HIV)。
化学：
评价以下内容：白蛋白、血尿素氮(BUN)、肌酸酐、总胆红素、碱性磷酸酶(ALP)、天冬氨酸转氨酶(AST)、丙氨酸转氨酶(ALT)、钠(Na+)、钾(K+)、氯(Cl-)、乳酸脱氢酶(LDH)、尿酸和血糖。
尿分析：
通过尿试纸法评价以下内容：pH、比重、蛋白质、葡萄糖、酮、胆红素、血、亚硝酸盐和尿胆素原。如果蛋白质、潜血或亚硝酸盐值超出范围，则进行显微镜检查。
还对尿样检测药物滥用(安非他明、巴比妥酸盐、苯二氮、大麻，可卡因和阿片类)。
不良事件
在本研究中，将不良事件(AE)定义为以任何剂量施用BH4的受试对象或临床研究受试对象的任何不良药物反应，而无论该剂量的BH4与所述事件是否有因果关系。因此，AE可以是与使用BH4时间上相关而无论其是否与BH4相关的任何不适的和无意识的迹象(包括反常的实验室发现)、症状或疾病。这一定义包括预先存在的疾病的继发性疾病或伤害和恶化(频率增加、严重度或特异性加重)。
AE的报告期始于第一次施用BH4。严重的不良事件(SAE)的报告期开始得更早——始于签署知情同意书时。稍后将在这一部分定义SAE。研究者监控所有AE，直至将其解决为止，或者当确定AE为慢性的时直至鉴定出其原因为止。如果AE在得出本研究结论时仍未得到解决，则由研究主管和医疗监控者做出临床评估，说明是否有理由对该AE进行连续追踪，并记录结果。评估严重性是评价AE和SAE时研究者的任务之一。研究者肩负以下任务：利用他或她的临床判断来评估各AE与BH4的因果关系。
严重的不良事件
严重的不良事件(SAE)被定义为具有以下结果中的至少一种的任何AE。
导致死亡
使生命受到威胁，即，从事件出现时将患者置于由该事件引起的立即死亡的风险之下
这一定义不包括当以更严重的形式出现时会导致死亡的反应
要求入院病人住院治疗或延长现有的住院治疗
接纳受试对象因AE而作为入院病人入院，即使受试对象经住院治疗鉴定后而于当日出院。在急诊室看病不构成住院治疗。
导致持久的或严重的残疾或缺陷。
只要涉及到对受试对象实行正常生活功能的能力的实际干扰而被鉴定为导致持久的或严重的残疾或缺陷的事件。这一定义并不意在包括具有较小或临时性医疗意义的情况。
先天异常或出生缺陷，即，发生于在受孕之前或孕期接触研究药物的受试对象的小孩或胎儿身上的AE
不符合任何上述标准但可能危害受试对象或需要内科或外科干预以防止上列结果之一的重要医疗事件。
超过一种的上述结果可适用于任何具体事件。
测量的适当性
本研究中的安全性测量是常规的体检、生命特征、不良事件发生率和严重程度以及临床及实验室程序。
药物浓度测量
在研究药物的每次给药后评估血液(血浆)药代动力学(PK)特性。给药后4小时，所有受试对象都以直立的姿势保持坐位。在给药前30分钟内和给药后0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、5.0、6.0、8.0、10.0、12.0、18.0和24.0小时抽取血液样品。将样品收集在适当地贴有标签的6mL K2-EDTA紫头(purple top)
Figure A20088001159400741
管中。在4℃以约3000rpm离心血液样品10分钟。从获得的血浆中，使用吸管从各样品中取出恰好1mL并将其加入容有0.1％重量/体积的二硫代赤藓醇的等分管中。将样品盖上盖，并使用VWR小型涡流器以第6档的速度涡旋约10秒钟。完成这些步骤后，在异丙基/干冰浴中闪速冷冻(flash frozen)样品，并将其放置在-70℃的冷冻机中以备分析。
在各治疗期抽取约80mL的血液(每个时间点5mL)用于PK分析。
药代动力学：
使用非室法进行血浆BH4浓度-时间数据的药代动力学(PK)分析，以获得对以下PK参数的估计：
峰值血药浓度(Cmax)和到达峰值浓度的时间(Tmax)，由数据而非插值直接获得；
表观末期清除速率常数λz，通过末期血药浓度的对数线性回归确定；
从时间0至最后可测量浓度的时间的血药浓度-时间曲线下的面积[AUC(0-t)]，通过线性梯形法计算；
表观清除半衰期(t1/2)，以0.693/λz计算；
从时间0至无穷大的血药浓度-时间曲线下的面积[AUC(inf)]，其中AUC(inf)＝AUC(0-t)+Ct/λz并且Ct是最后可测量的浓度。
对吸收率的估计
向受试对象提供10mg/kg口服或静脉注射剂量的BH4，然后连续测量血浆总生物蝶呤浓度，以通过血浆总生物蝶呤浓度增加(ΔCp)-时间曲线下的面积(ΔAUC)来确定胃肠道对BH4的吸收率。已经预料到，为获得相似的生物利用率水平，与口服BH4相比，静脉注射施用时所需的BH4剂量较低。例如，需要口服10mg/kg的BH4来获得与静脉注射施用1mg/kg的BH4的相同的生物利用率水平。由于施用方式提高了生物利用率，因此可以只需要5mg/kg的BH4，即可获得与1mg/kg IV给药的BH4相同的生物利用率水平。
胃肠道对BH4的吸收率通过利用以下公式，由施用BH4后血浆总生物蝶呤浓度增加(ΔCp)-时间曲线下的面积(ΔAUC)估计：
由AUC估计
吸收率(％)＝(口服给药后的ΔAUC/静脉内给药后的ΔAUC)×(静脉内给药/口服给药×100)
统计方法：
以序列、序列内的受试对象、治疗和时期为分类变量，使用参数的自然对数作为因变量，使用方差分析(ANOVA)模型对BH4的药代动力学参数Cmax、AUC(0-t)和AUC(inf)进行比较。所关注的比较在禁食情况下的溶解的和完整的片剂与在餐后和禁食下服用完整的片剂之间进行。
将完成至少两个研究期的所有受试对象的数据都包括在PK统计分析中。将接受至少1剂研究药物的所有受试对象都包括在安全性分析中。
使用用于的9.1.3或更高版本的
Figure A20088001159400752
完成所有PK和相关统计分析。
为充分实现本研究的目的，使样本大小为30个均经历了3个治疗期的受试对象，这被认为足以提供对所关注的差异比较的估计。未进行常规的样本大小计算。
结果
药代动力学
完整的片剂与溶解的片剂
与完整的片剂相比，以溶解的片剂施用BH4时，BH4的平均血浆浓度较低(图23和图24)。与AUC(0-t)和AUC(inf)的平均值相似，完整的片剂的平均Cmax较高(图25)。完整的片剂与溶解的片剂之间的几何平均比为118％～121％，并且相应的90％置信区间的上限大于125％(图26)，这表明在溶解的和完整的片剂施用之间，当完整的片剂和高热量、高脂肪的膳食一同施用时吸收的差异具有统计显著性增长。溶解的和完整的片剂的Tmax的中值和范围基本相似(图25)，表明对于完整的片剂所观察到的增加是吸收程度的增加，而不是吸收速率的增加。
高热量、高脂肪食物对药物吸收的影响
如所预料的，与标准高脂肪、高热量膳食一同施用完整的片剂导致平均血浆BH4浓度(图23)和Cmax、AUC(0-t)和AUC(inf)的平均值(图25)的实质性增加。几何平均比(餐后比禁食情况)为126％～139％(图26)，因此，相应的90％置信区间的上限大于125％，这表明与完整的片剂相比，食物对于吸收的影响具有统计显著性差异。餐后和禁食情况下的Tmax的中值和范围基本相似(图25)，表明对于食物所观察到的增加是吸收程度的增加，而不是吸收速率的增加。
安全性：
本研究中没有严重的不良事件(SAE)。五(5)位受试对象报告了总共9种不良事件(AE)。在严重度方面，这9种AE中有八(8)种被评估为轻度，1种被评估为中度。最常见的AE为头痛；1位受试对象体验到中度头痛，但该头痛被评估为与研究药物无关，一位受试对象体验到发生两次的轻度头痛，这两次头痛被评估为可能有关。总共有五种事件被判断为与研究药物无关，4种事件被判断为可能与研究药物有关。完成研究退出评估、ECG和体检评价，无临床重要发现。
结论：
与溶解的片剂相比，施用完整的片剂的BH4会导致吸收程度提高约20％。
与禁食情况相比，在餐后和高热量、高脂肪膳食一同施用作为完整的片剂BH4导致吸收程度提高约30％。
在本研究人群中未鉴定出临床重要问题和安全性参数的安全问题。在本研究中不认为存在严重的AE。在报告的9种AE中，除一例头痛之外其它全部为轻度，并且该例头痛被评估为与研究药物无关。疲劳和头痛的情况是仅有的可能与研究药物有关的AE，但其严重度被评估为轻度。
实施例4
增强BH4的生物利用率的配制方法
选择2个对照制剂(BH4静脉注射制剂和用于口服液的BH4片剂)和6个试验制剂进行动物研究测试。各制剂原型剂含有80mg或100mg的BH4。
BH4静脉注射制剂
表3列出了静脉注射制剂的组成。在使用之前将BH4通过#20目的不锈钢筛网，同时将甘露醇用作接受物。将该制剂作为粉末填入瓶中，并在施用之前使用注射用无菌水配制。各瓶都将100mg的BH4和5g甘露醇盛放在具有白色高密聚乙烯(HDPE)螺旋顶盖的透明聚对苯二甲酸乙二醇酯共聚酯(PETG)瓶中。在施用之前，使用100mL注射用无菌水配制制剂，以使最终浓度为1mg/mL。将IV制剂作为干粉提供在瓶中，并且每瓶都容有API和甘露醇。在通过IV途径施用之前，将粉末溶解在注射用无菌水中并过滤。
表3BH4IV制剂的组成
  成分   ％(w/v)   mg/mL
  BH4   0.1   1.0
  甘露醇(低内毒素含量)，USP/Ph.Eur.   5.0   50.0
  注射用无菌水   补至100mL   补至1mL
口服液用BH4片剂
表4列出了口服液制剂的组成。将十(10)个BH4片剂(100mg)放入具有白色HDPE盖的125mL带刻度的PETG瓶中。在施用之前，使用100mL注射用无菌水配制制剂，以使最终浓度为10mg/mL。
表4BH4片剂(100mg)的组成
  成分   重量％   mg/片
  BH4   33.33   99.99
  抗坏血酸，USP/EP   1.67   5.01
  交联聚维酮，USP/EP   4.5   13.5
  无水磷酸二钙，USP/EP   2.18   6.54
  甘露醇(Parteck M 200)，UPS/EP   57.06   171.18
  通用核黄素，USP/EP   0.01   0.03
  硬脂基富马酸钠(PRUV)，NF/EP   1.25   3.75
  总计   100.00   300.00
减缓胃肠运动的制剂原型剂
表5列出了延迟胃排空时间的原型剂的组成。在使用之前将BH4通过#20目不锈钢筛网。在37℃的水浴中将Capmul GMO-50熔融。称量BH4和抗坏血酸，并将它们在剧烈搅拌的同时缓缓加入熔融的Capmul中。使用滴管将该固体分散液逐滴加入尺寸为#2的胶囊中。将三个经填充的胶囊放入具有热感应(heat induction)密封盖的100cc高密聚乙烯(HDPE)瓶中。
表5BH4延迟胃排空时间口服胶囊制剂的组成
  成分   重量％   mg/胶囊
  BH4   25   80
  甘油单/二油酸酯(Capmul GMO-50)   65   208
  抗坏血酸细粉   10   32
  总计   100   320
生物粘附性原型剂
表6列出了生物粘附性原型剂的组成。将除卡伯波71G之外的所有材料通过#20目不锈钢筛网。称量所有材料，并将它们加入具有拉链式封口的塑料袋中，然后摇动其几分钟，直至混合物显得均匀为止。使用GlobePharma MTCM-I手动压力机上的1/4″标准、圆形、凹面、平面B工具，以600psi将该粉末压成片剂。将三个片剂与硅胶干燥剂罐一同包装在具有热感应密封盖的100cc的HDPE瓶中。
表6BH4生物粘附性口服片剂制剂的组成
  成分   重量％   mg/片
  BH4   48.5   80.00
  卡伯波71G   20.0   32.99
  聚卡波非(Noveon AA1)   20.0   32.99
  抗坏血酸细粉   10.0   16.49
  硬脂基富马酸钠(PRUV)   1.5   2.47
  总计   100.0   164.94
缓释原型剂
表7列出了用于猴测试的缓释原型剂的组成。将除Methocel K100MPremium CR之外的所有材料通过#20目不锈钢筛网。称量所有材料，并将它们加入具有拉链式封口的塑料袋中，然后摇动其几分钟，直至混合物显得均匀为止。使用Globe Pharma MTCM-I手动压力机上的1/4″标准、圆形、凹面、平面B工具，以1200psi将该粉末压成片剂。将片剂与硅胶干燥剂罐一同包装在具有热感应密封盖的100cc的HDPE瓶中。
表7BH4缓释片剂制剂的组成
  成分   重量％   mg/片
  BH4   53.5   80.00
  Methocel K100M premium CR   35.0   52.34
  抗坏血酸细粉   10.0   14.95
  硬脂基富马酸钠(PRUV)   1.5   2.24
  总计   100.0   149.53
质子给体聚合物原型剂
表8列出了用于猴测试的质子给体聚合物原型剂的组成。使用#20目不锈钢筛网对除了Eudragit L100-55和Kollidon CL之外的所有材料进行预筛分。称量所有材料，并将它们加入具有拉链式封口的塑料袋中，然后摇动其几分钟，直至混合物显得均匀为止。将预称量的量的粉末填入尺寸为#2的胶囊中。
通过将Eudragit L100-55和Carbowax PEG 4600溶解在乙醇中制备包衣液。称量Eudragit L100-55和Carbowax PEG 4600，并将它们加入125mL的带刻度的聚对苯二甲酸乙二醇酯共聚酯(PETG)瓶中。向该PETG瓶中加入乙醇，并将其放入40℃的水浴中，通过超声直至溶液澄清。
手工将经填充粉末的胶囊浸入包衣液中，并使其在40℃干燥20分钟。称量经干燥的胶囊，然后在Syloid FP244中滚动，以除去残留的粘性。将三个胶囊包装在具有热感应密封盖的100cc的HDPE瓶中。
表8BH4质子给体胶囊制剂的组成
 成分胶囊的组成 重量％ mg/胶囊
 BH4   40.0   80
 Eudragit L 100-55   44.5   89
 交联聚维酮(Kollidon CL)   4.0   8
 抗坏血酸细粉   10.0   20
 硬脂基富马酸钠(PRUV)   1.5   3
 总计   100.0   200
 成分胶囊包衣的组成 重量％ mg/胶囊1
 Eudragit L100-55   5.0   ND
 聚乙二醇4600(Carbowax Sentry)   5.0   ND
 乙二醇，200proof   100mL   ND
1涂覆并在40℃于烘箱中干燥胶囊后，胶囊获得了约1重量％～3重量％的聚合物包衣。
ND＝未确定
漂浮性输送系统
表9列出了漂浮性输送系统的组成。将除Eudragit L100-55之外的所有材料通过#20目不锈钢筛网。该片剂原型剂包括三层；中间层含有药物，其夹在两个水不溶性外层之间。称量内部和外部材料，并将它们分开加入具有拉链式封口的塑料袋中，然后对其进行摇动，直至混合物显得均匀为止。
称量两个外层(各12mg)和内层(14.5mg)。将一个外层加至压机，然后是内层，然后是最后的外层。使用Globe Pharma MTCM-I手动压力机上的3/16″圆形、斜面、平面B工具，以200psi将这些层压成片剂。
通过将Ethocel和PEG 4600溶解在乙醇和纯化水的混合物中而制备包衣液。将这些成分加入PETG瓶中，将其混合并放入40℃的水浴中，通过超声直至溶液显得澄清。
手工将片剂浸入包衣液中，并使其在40℃干燥20分钟。包衣后再次称量每一片剂。将七(7)个片剂放入尺寸均为#2的加长型胶囊中。将三个胶囊包装在具有热感应密封盖的100cc的HDPE瓶中。
表9BH4漂浮性剂量制剂的组成
  成分外层1和3   重量％   mg/片
  Eudragit L100-55   49.5   5.94
  硬脂酸   49.5   5.94
  硬脂基富马酸钠(PRUV)   1.0   0.12
  总计   100.0   12.00
  成分中间层2   重量％   mg/片
  BH4   79.0   11.46
  硬脂酸   10.0   1.45
  抗坏血酸细粉   10.0   1.45
  硬脂基富马酸钠   1.0   0.15
  总计   100.0   14.51
  成分胶囊中的7个片剂   重量％   mg/胶囊
  BH4   29.8   80.19
  硬脂酸   34.6   93.31
  抗坏血酸细粉   3.8   10.15
  Eudragit L100-55   30.8   83.16
  硬脂基富马酸钠(PRUV)   1.0   2.70
  总计   100.0   269.51
  成分片剂包衣液   重量％   mg/胶囊1
  Ethocel Standard 10FP   5.0   ND
  Carbowax PEG 4600   5.0   ND
  乙醇，200proof   95.0mL   ND
  纯化水   5.0mL   ND
1包衣并在40℃于烘箱中干燥胶囊后，胶囊获得了约3重量％～8重量％的聚合物包衣。
ND＝未确定
生成气体的漂浮性输送系统
表10列出了生成气体的漂浮性输送系统的组成。该制剂由生成气体的外层所包围的含有药物的核心片剂组成。使用#20目不锈钢筛网对除了碳酸氢钠和Methocel K100M CR之外的所有材料进行预筛分。称量内部核心材料和外层材料，并将它们分开加入具有拉链式封口的塑料袋中，然后将其密封并对其进行摇动，直至混合物显得均匀为止。使用GlobePharma MTCM-I手动压力机上的1/8″圆形、斜面、平面B工具，以800psi将用于内部核心的混合粉末(35mg)压成片剂。
通过将Ethocel和PEG 4600溶解在乙醇中制备包衣液。手工将内部核心片剂浸入包衣液中，并使其在40℃干燥20分钟。称量用于外层的混合粉末(40mg)。将外层的一半加至压机，然后是内部核心片剂，之后是外层的另一半。使用Globe Pharma MTCM-I手动压力机上的3/16″圆形、斜面、平面B工具，以800psi压制片剂。将四(4)个片剂放入尺寸均为#2的胶囊。
表10BH4生成气体的漂浮性剂量制剂的组成
  成分内部片剂核心   重量％   mg/片
  BH4   58.3   20.39
  抗坏血酸细粉   19.4   6.80
  HPMC K100MCR   19.4   6.80
  硬脂基富马酸钠(PRUV)   2.9   1.02
  总计   100   35.01
  成分外部片剂层   重量％   mg/片
  HPMC K100MCR   46.1   18.46
  无水柠檬酸   34.2   13.68
  碳酸氢钠   17.1   6.84
  硬脂基富马酸钠   2.6   1.03
  总计   100   40.01
  成分胶囊中的四个片剂   重量％   mg/胶囊
  BH4   27.2   81.55
  抗坏血酸细粉   9.1   27.18
  HPMC K100MCR   33.7   101.03
  无水柠檬酸   18.2   54.70
  碳酸氢钠   9.1   27.35
  硬脂基富马酸钠   2.7   8.18
  总计   100   299.99
  成分包衣液   重量％   mg/胶囊1
  Ethocel Standard 10FP   5.0   ND
1涂覆并在40℃于烘箱中干燥胶囊后，胶囊获得了聚合物包衣的重量。
ND＝未确定
生物粘附性颗粒原型剂
表11列出了生物粘附性颗粒原型剂的组成。使用#20目不锈钢筛网对除了Methocel K100M CR之外的所有材料进行预筛分。称量除了硬脂基富马酸钠(PRUV)之外的所有材料，并将它们放入尺寸为#1的制粒机的辊筒(LB Bohle Mini Granulator BMG)中。以300rpm的推进器速度和2500rpm的切碎器速度混合该粉末5分钟，直至该混合物显得均匀。保持该推进器和切碎器速度，并向混合物中逐滴加入5mL乙醇，直至形成颗粒。从制粒辊筒中取出湿的物质，并通过18目的不锈钢筛网对其进行筛分。收集颗粒，并将其放在40℃的烘箱内干燥1小时。干燥1小时后，确定颗粒的干燥损失，其为1.93％。称量颗粒并将其放入具有拉链式封口的塑料袋中。向袋中干燥的颗粒加入硬脂基富马酸钠(PRUV)。封闭该袋并晃动，直至硬脂基富马酸钠(PRUV)显得均匀地分布在颗粒中。称量颗粒(134mg)。使用部分颗粒与部分氢化的植物油滴(350μL)交替填充尺寸为2的加长型胶囊。将三个胶囊包装在具有热感应密封盖的100cc的HDPE瓶中。
表11BH4生物粘附性颗粒胶囊制剂的组成
  成分   重量％   mg/胶囊
  BH4   60   80.00
  Methocel K100M CR   19   25.33
  卡伯波971   10   13.33
  抗坏血酸细粉   10   13.33
  硬脂基富马酸钠(PRUV)   1   1.33
  Pureco HSC-1油   350μL
  总计   100   133.33
体外药物释放
根据USP 27仪器II说明书使用Distek 2100C Dissolution Tester(Distek，Inc.，North Brunswick，NJ)和Agilent紫外可见分光系统(AgilentTechnologies，Santa Clara，CA)进行由片剂的体外药物释放测试。用于BH4释放测试的溶出介质是900mL的0.1N HCl。在溶出测试中，各容器中的介质保持在37℃±0.5℃，并以50rpm搅拌。在预定的时间点取出体积为5mL的样品。为确定样品中BH4的浓度，使用500μL的0.1N HCl稀释250μL各样品，并使用紫外分光计(8453UV-VisibleSpectrophotometer，Agilent Technologies，Santa Clara，CA)在265nm测量吸收。利用ChemStation软件(Rev.A.09.01[76]，Agilent Technologies，Santa Clara，CA)收集数据。所有溶出试验均执行三次。
片剂浮力测试
通过将片剂放在具有25mL～50mL的0.1N HCl的塑料杯中首先确定漂浮性原型剂片剂的浮力。该试验确定片剂漂浮所需的时间及其在没有搅拌的情况下的漂浮持续时间。将漂浮至少4小时的那些原型剂进行溶出测试。在溶出测试期间，使用桨法以50rpm的转速确定片剂的浮力。在各个时间点目视检查片剂的状态。
崩解测试
根据USP-27崩解试验规范使用Distek 3100Series DisintegrationTester(Distek Inc.，North Brunswick，NJ)进行崩解测试。所用崩解介质是900mL的0.1N HCl或900mL的0.2M磷酸钾(pH 5.8)。在崩解测试期间，将容器中的介质保持为37℃±0.5℃。目视检查片剂和胶囊的崩解。
片剂硬度测试
使用Dr.Schleuniger Pharmatron 8M Tablet Hardness Tester(Dr.
Figure A20088001159400841
Pharmatron Inc.，Manchester，NH)确定片剂硬度。将片剂放入硬度测试仪的叉钳中，以千克力(Kp)为单位测量硬度。
片剂厚度
使用Mitutoyo Digimatic Indicator(Mitutoyo Absolute，Dr.SchleunigerPharmatron Inc.，Manchester，NH)测试片剂厚度。将片剂放置在测厚仪下并以毫米(mm)为单位记录所示值。
结果和讨论
基于以下三个概念开发出几种原型剂：胃滞留、改变肠内pH的质子给体聚合物和缓释剂型。以下部分描述各原型剂的制剂开发。
BH4静脉注射制剂——在无菌水配制后，获得的溶液是等渗压的，pH3.2并含有1mg/mL的BH4，在通过0.22微米的过滤器无菌过滤后适于静脉注射施用。每小时都通过HPLC分析在环境温度储存的1mg/mL溶液的稳定性，分析3小时。然后将老化的溶液样品储存在-20℃下并在2周后通过HPLC分析。图27表明配制后在环境温度下至少3小时溶液是稳定的，并且在-20℃储存至少2周是稳定的。
口服液用BH4片剂
将各瓶包装为容有十(10)个100mg的BH4片剂。将一百(100)mL纯化水或注射用无菌水加入各瓶的内容物中。剧烈摇动瓶，然后片剂在5分钟内迅速崩解。获得的溶液含有10mg/mL的口服用BH4。片剂中不是所有成分都是可溶的，虽然最终的溶液显得混浊或半透明，但活性药用成分已被完全溶解，而细颗粒是难溶的非活性成分。
减缓胃肠运动的制剂原型剂
由BH4和抗坏血酸构成的该胶囊制剂分散在半固体脂肪酸衍生物中(甘油单/二油酸酯，熔点为86°F(30℃))。也选择甘油单/二油酸酯(GMO)是因为GMO与BH4化学相容。图28中绘出的溶出曲线显示，超过90％的药物在2小时内释放，胶囊在40℃储存57天后溶出曲线保持不变。
将熔融的GMO(半固体)中的药物分散体手工填充到硬质明胶胶囊中。该半固体的密度大于1g/mL，可以将至少80mg剂量以25％的药物装载量填入尺寸为#2的胶囊。预计尺寸为#0的胶囊应该能够容有至少200mg使用同一制剂的药物。在40℃储存过程中观察到脂肪酸从胶囊中泄露。优选的是，绑扎胶囊或软凝胶胶囊制剂以避免脂肪酸在储存期间泄露。
生物粘附性原型剂
许多生物粘附剂是由合成或天然聚合物制得的。大多数现有的合成生物粘附性聚合物是聚丙烯酸或纤维素衍生物。聚丙烯酸类聚合物的实例包括但不限于卡伯波、聚卡波非、聚丙烯酸(PAAc)等。纤维素塑料包括但不限于羟丙基纤维素和羟丙基甲基纤维素(HPMC)。开发了两种用于动物研究测试的生物粘附性原型剂。第一种原型剂是生物粘附性片剂制剂，第二种是含有生物粘附性颗粒的胶囊。
选择聚卡波非和卡波姆聚合物用于开发第一种生物粘附性片剂原型剂。卡伯波71G是卡波姆的颗粒形式并具有良好的粉末流动性。所有批次的所制造的片剂都具有良好的品质，以及可接受的药物含量(在溶出曲线中有接近100％的药物释放可以证明这一点)和可接受的硬度。表12列出了含有卡波姆和聚卡波非的生物粘附性原型剂的代表性片剂重量、厚度和硬度。
表12含有卡波姆和聚卡波非的生物粘附性原型剂的代表性片剂重量、厚度和硬度
  片剂批号  压制压力(psi)   重量(mg)   厚度(mm)   硬度(Kp)
  11210-83   600   165.4   5.24   10.5
  11229-4   600   166.7   5.64   10.3
  11229-4   800   164.1   5.27   14.4
  11229-4   1000   164.9   5.12   18
HPMC和卡波姆聚合物被用于第二种生物粘附性颗粒的开发。选择HPMC是因为可将其用作低密水解胶体系统和独立于pH的药物控释。选择颗粒而非片剂是为了通过增加剂型的表面积来提高获得生物粘附的几率。为便于溶解介质中的填充了颗粒的胶囊的分离，部分地以氢化油涂覆颗粒。若不涂覆该油，颗粒会水合并形成胶囊形状基质，而不会崩解为各个颗粒。
两种生物粘合性原型剂(片剂和颗粒)的释放曲线如图29所示，其显示片剂的释放曲线比颗粒的长。片剂和颗粒生物粘合性剂型的药物释放分别为在4小时内为约90％和在1小时内为约95％。经在40℃的环境湿度下不进行防潮(无热感应密封)储存1个月，片剂原型剂表现出药物溶解的减速(图29)。对于含有卡波姆的原型剂，应采取防潮措施以保护片剂，使其避免可能过早发生的水合。缓释剂原型剂
使用羟丙基甲基纤维素(HPMC)作为用于制备口服控释药物系统的亲水性载体(Colombo，Adv.Drug Deliv.Rev.，1993，11，37)。已经知道HPMC基质可以控制多种药物的释放(Chattaraj等，Drug Develop.Ind.Pharm.，1996，22，555；Pabon等，Drug Develop.Ind.Pharm.，1992，18，2163；Lee等，Drug Develop.Ind.Pharm.，1999，25，493；Basak等，Indian J.Pharm.Sci.，2004，66，827；Rajabi-Siabhoomi等，J.Pharm.Pharmacol.，1992，44，1062)。本研究中评价了各种粘度等级的HPMC(K4M、K15M和K100M)对BH4释放的控制。由各种等级的HPMC制得的片剂的溶出曲线如图30所示。当HPMC为20％时药物释放曲线相似而与粘度等级无关；有超过80％的药物在2小时内释放。将HPMC聚合物接触水性介质时，其进行迅速的水合和链松弛，从而形成凝胶层(Naruhashi等，Pharm Res.2003，19：1415-1421)。HPMC为20％时不会形成显著延缓BH4释放的充分的凝胶阻碍层。
使用各种浓度(20％～40％)的高粘度等级的HPMC(Methocel K100MCR)制造的片剂的溶解曲线如图30所示。发现含有35％～40％MethocelK100M CR的片剂将药物释放减缓至多达4小时，而20％HPMC则在2小时内释放了药物(图31)。选择含有35％HPMC(Methocel K100M)的片剂作为用于动物研究测试的原型剂，因为其含有将药物释放减缓至多达4小时所需的最少量的HPMC。因此，该片剂具有良好的品质，以及可接受的药物含量，这一点如在溶解曲线中接近100％的药物释放所证实。
质子给体聚合物原型剂
为增加BH4的口服吸收，一种方法是通过降低近端小肠的pH来稳定药物。为控制肠内腔的pH，选择了常用于肠溶衣的质子释放聚合物Eudragit L100-55。该聚合物由于具有羧基，因而在酸性条件下不可溶，在弱酸性(pH＞5.5)至碱性条件下变为可溶并释放质子，由此可以将肠内腔的pH控制为酸性。Naruhashi等(2003)发现，内腔的pH以依赖于Eudragit L100-55的浓度的方式降低，并且在酸性聚合物存在下回肠环路对头孢羟氨苄和头孢克肟的吸收会增加(Nozawa等，J.Pharm Sci.2003，92(11)，2208-2216)。Nozawa等(2003)显示Eudragit可降低肠内回路中的pH，并增加头孢羟氨苄和头孢克肟在回路中的消失。
将如表8中所示的含有BH4和Eudragit L100-55的粉末制剂压为片剂并填入胶囊。在溶出测试期间，在模拟胃液(SGF)中该片剂制剂1小时内释放约27％的药物。然而，在崩解测试中，该片剂在SGF和pH 5.8的磷酸盐缓冲剂(PB)中保持完整至少2小时。即使在高崩解剂(交联聚维酮或交联羧甲基纤维素)存在下，该片剂也无法崩解。该药物可能在酸化Eudragit、产生低的微观pH环境，由此使聚合物保持为未电离的和不可溶。
填充粉末的胶囊药物-Eudragit制剂在SGF中迅速崩解。为针对近端小肠中的质子释放，对胶囊应用肠溶衣。涂覆并在40℃于烘箱中干燥胶囊后，胶囊获得了约1重量％～3重量％的聚合物包衣。当以50rpm的转速使用USP溶解装置II(桨)和保持为37℃的溶解介质0.1N HCl测试时，经包衣的胶囊在1小时内释放约25％的药物。在历时1小时的酸(0.1NHCl)预处理后，将经包衣的胶囊放置在具有500mL pH 5.8的保持为37℃的磷酸盐缓冲液的USP崩解装置中，经包衣的胶囊在约1小时内崩解。与片剂或未经包衣的胶囊相比，更优选肠溶衣胶囊原型剂，因为肠溶衣胶囊更容易向靶标部位输送质子释放性聚合物。
漂浮性输送系统
开发两种漂浮性输送系统。第一种原型剂是漂浮性多单位剂型；该剂型的目的是提高这些单位之一保留在胃部的几率，并由此延长药物的胃停留时间。该剂型由胶囊中的七个三层的片剂构成；夹在两个水不溶性外层之间的中间层含有药物(图32)。外层含有硬脂酸、疏水性和水不溶性脂肪酸，其为漂浮性片剂提供必需的浮力。各片剂都使用乙基纤维素和聚乙二醇MW 4600(PEG)的醇溶液手工涂覆。乙基纤维素形成围绕片剂和PEG的水不溶性膜，该膜起到孔形成物的作用并调节释放速率。涂覆有乙基纤维素和各种浓度(20％～40％)的PEG溶液的的片剂的溶出曲线如图33所示。注意到经涂覆的三层片剂实现了接近于0级的释放动力学。如所预料的，药物溶解速率随PEG浓度的增加而增加。在溶解研究期间，该片剂漂浮在模拟胃介质中至少4小时。表9显示了动物研究中所测试的制剂的组成。
第二种原型剂是生成气体的剂型。对其经配制使得当与酸性胃内容物进行接触时，将有二氧化碳放出并为膨胀的水解胶体所捕获，这将对该剂型提供浮力(图33)。在溶解研究期间，该制剂漂浮在模拟胃介质中至少4小时。然而，为使这种系统能够连续地运转，片剂必须是在低湿度环境下制造的，以便防止过早发生酸和碱反应。储存期间片剂中的BH4和碳酸氢钠之间会存在可能的相互作用。基于此原因，未在动物研究中测试该剂型。
对于动物生物利用率研究，开发了六种原型剂测试制剂，这些制剂结合了各种配制方法，包括降低肠内pH的质子给体聚合物、胃滞留剂型和缓释制剂。
实施例5新型BH4制剂的生物利用率
本研究的目的在于通过开发延长药物在胃肠(GI)道中的停留时间的剂型来提高BH4的吸收。
方法：将三只体重为3kg～4kg的健康的食蟹猴用于开放式8期非交叉研究中，来确定与对照的溶解的BH4制剂相比，七种制剂的生物利用率。在过夜禁食后，在分开的场合使猴接受单剂80mg的相同的新型口服或静脉注射制剂，在进行各种新型制剂研究之间需要间隔至少1周的清除期。对于静脉注射施用，在给药之前收集血液样品和在给药后5、15和30分钟以及1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、12和24小时收集血液样品。对于口服，在给药之前收集血液样品和在各给药后15和30分钟以及1.0、2.0、3.0、4.0、6.0、8.0、12和24小时收集血液样品。在通过离心分离分离血浆之后，立即将200μL等分量的各样品转移到含有0.1％DTE的单独试管中，并在-70℃冷冻，直至可测试总L-生物蝶呤为止。
研究制剂：施用的制剂如表13中所示。有三种制剂在概念上通过生物粘附性或漂浮性机理设计为胃停留性的，以延长GI停留时间(卡波姆类、多粒子漂浮性颗粒和生物粘附性颗粒)。其它概念基于减缓胃肠运动以延长制剂的停留时间(甘油单油酸酯)、降低小肠的pH以增强BH4化学稳定性从而能够吸收完好的药物(质子泵)或缓释制剂，由此确定其是否增强能够增强吸收。
表13
  阶段   原型剂   剂型   概念   成分
  阶段I   IV制剂   IV溶液，1mg/mL   对照   BH4，D(-)-Mannitol
  阶段II   溶液用Kuvan片剂   口服液，10mg/mL   对照   由Lyne制造的BH4片剂(批号140651)
  阶段III   甘油单油酸酯   胶囊，80mg   减缓GI运动   BH4、Capmul GMO-50、抗坏血酸
  阶段IV   卡波姆原型剂   片剂，80mg   胃停留、生物粘附性   BH4、卡伯波71G、NoveonAA1、抗坏血酸、PRUV
  阶段V   HPMC原型剂   片剂，80mg   缓释   BH4、Methocel  K100MPremium CR、抗坏血酸、PRUV
  阶段VI   Eudragit原型剂   胶囊，80mg   降低GI pH的质子给体聚合物   BH4、Eudragit L100-55、抗坏血酸、Kollidon CL、PRUV，包衣(Eudragit L100-55、Carbowax PEG 4600、乙醇200proof)
  阶段VII   多漂浮性单元   胶囊中的多个片剂，80mg   胃停留、漂浮性   内层(BH4、抗坏血酸、硬脂酸、PRUV)、外层(硬脂酸、Eudragit L100-55、PRUV)、包衣(Ethocel Standard 10FP、Carbowax PEG 4600、95％乙醇)
  阶段VIII   生物粘合性颗粒   胶囊中的颗粒，80mg   胃停留、生物粘附性   粒间(BH4、Methocel K100MPremium CR、卡伯波971、抗坏血酸)、粒外(PRUV、Pureco HSC-1油)
生物蝶呤的血浆测试：通过使用经验证的特定反相LC/MS/MS法确定血浆中的BH4浓度。在50ng/mL～2500ng/mL浓度范围内，标准曲线为线性。L-生物蝶呤的定量下限为50ng/mL，变异系数显示的当日精度小于5％。使用0.1％DTE稳定的在-70℃冷冻的猴血浆，直至测试前都是稳定的。BH4浓度由确定的L-生物蝶呤浓度计算。
药代动力学和统计分析：在施用口服制剂和静脉注射制剂之后确定血浆BH4的药代动力学参数。药代动力学参数如表14中所示。
表14
  阶段，制剂   AUClast(ng-hr/mL)   AUC∞(ng-hr/mL)   Cmax(ng/mL)   Clast a(ng/mL)   Tmax(hr)   t1/2(hr)
  2，溶解的片剂 641(88) 805(36) 93.6(31.3) 9.60(2.20) 2.33(0.58)   11.7(2.1)
  3，甘油单油酸酯 716(154) 858(317) 133(83) 6.47(3.60) 2.00(0)   12.1(10.3)
  4，生物粘合性聚合物 593(50.6) 648(114) 108(15) 4.46(3.36) 2.67(0.58)   6.89(3.51)
  5，缓释 355(134) 472(36) 86.0(43.1) 12.9(12.4) 3.33(0.58)   5.30(1.73)
  6，质子给体 276(49.8) 282(49) 68.3(25.3) 2.97(0.71) 3.33(0.58)   1.59(0.74)
  7，漂浮性剂型 304(78) b 59.9(31.8) 5.90(0.94) 4.00(2.00) b
  8，生物粘合性颗粒 292(79) 366(40.6) 42.5(12.6) 5.11(2.43) 3.0(0)   15.3(8.2)
结果
本研究的目的是鉴定与对照的溶解的片剂制剂相比，可增强BH4的生物利用率的制剂。口服BH4之后各种剂型和对照制剂的平均血浆BH4浓度-时间曲线如图35所示，来自血浆药物浓度-时间曲线的BH4药代动力学参数如表14中所提供。对照制剂(阶段2)是溶解的片剂。
如图35所示，甘油单油酸酯制剂提供了最高的AUClast和AUC∞，其分别为716ng-hr/mL和858ng-hr/mL。对照的溶解的BH4片剂制剂显示出的AUClast和AUC∞分别为641ng-hr/mL和805ng-hr/mL(表14)。制剂从生物利用性最强到生物利用性最弱的顺序为：甘油单油酸酯＞溶解的片剂＞生物粘附性聚合物片剂＞缓释片剂＞漂浮性剂型＞生物粘附性颗粒胶囊产品＞质子给体胶囊产品。
实施例6
四氢生物蝶呤的静脉内制剂的制备
预制剂稳定性评价
一般说来，本研究的目的是评价在pH为pH1～7范围内的缓冲液中(见表15)和在抗氧化剂存在或不存在下和在反应溶液中有或没有惰性气体时(参考表16)BH4的稳定性。
表15用于BH4预制剂稳定性研究的缓冲液的组分和组成
  组分   量
  pH 1.2缓冲剂(0.1N HCl)浓HCl(12N)氯化钠补足的蒸馏水/去离子水 8.33mL2.92g1000mL
  pH 2.1缓冲剂(0.01N HCl)pH 1.2(0.1N HCl)缓冲剂氯化钠补足的蒸馏水/去离子水 100mL7.79g1000mL
  pH 3缓冲剂磷酸，15M，85％无水磷酸二氢钠(NaH2PO4)氯化钠补足的蒸馏水/去离子水 .347mL6.17g6.16g1000mL
  pH 4缓冲剂冰醋酸，100％乙酸钠三水合物氯化钠补足的蒸馏水/去离子水 2.38mL1.29g8.22g1000mL
  pH 5缓冲剂冰醋酸，100％乙酸钠三水合物氯化钠补足的蒸馏水/去离子水 .87mL4.78g6.72g1000mL
  pH 6缓冲剂4-吗啉乙磺酸(MES acid)一水合物MES钠盐氯化钠补足的蒸馏水/去离子水 4.99g5.75g7.23g1000mL
  pH 7缓冲剂磷酸二氢钠一水合物(NaH2PO4)无水磷酸氢二钠(Na2HPO4)氯化钠补足的蒸馏水/去离子水 2.56g4.44g2.18g1000mL
表16含有BH4、具有或不具有抗氧化剂并进行或不进行气体鼓泡的用于稳定性研究的缓冲液的组成
Figure A20088001159400931
更具体地，评价了在存在或不存在惰性气体下将两种抗氧化剂组合的影响，其在pH 4时支持液体产品的制剂，并在pH 7时确定了生理pH下的不稳定性具有降低猴和人类对于化合物的生物利用率的作用(见表17和18)。估计BH4的稳定性是随温度而变的。因此，在2℃～8℃、25℃、30℃和37℃评价了化合物的稳定性，以支持对化合物在不同温度下的预期的长存放期的确定。在37℃的生理温度的化合物的稳定性的确定，提供了支持对配制的口服剂型在胃肠道的吸收区中的稳定性寿命的估计的数据。
表17用于BH4的pH 4稳定性研究的缓冲液的组成
  pH4   pH4
  缓冲剂+抗坏血酸+L-半胱氨酸研究   缓冲剂+抗坏血酸+L-半胱氨酸+氩气鼓泡研究
  在pH 4的缓冲剂中的1mg/mL BH4和1mg/mL抗坏血酸和1mg/mL L-半胱氨酸   在氩气鼓泡和氩气包覆密封的pH 4的缓冲剂中的1mg/mL BH4+1mg/mL抗坏血酸和+1mg/mL L-半胱氨酸
表18用于BH4的pH 7稳定性研究的缓冲液的组成
  pH7   pH7
  缓冲剂+抗坏血酸+L-半胱氨酸研究   缓冲剂+抗坏血酸+L-半胱氨酸+氩气鼓泡研究
  在pH 7的缓冲剂中的1mg/mL BH4和1mg/mL抗坏血酸和1mg/mL L-半胱氨酸   在氩气鼓泡和氩气包覆密封的pH 7的缓冲剂中的1mg/mL BH4+1mg/mL抗坏血酸和+1mg/mL L-半胱氨酸
通过将在pH 3.1时的单一研究的半衰期与Davis等在pH 6.8的Tris和磷酸盐缓冲剂中获得的数据(1988；Eur.J.Biochem.173，345-351，(1988))比较，估计在各种缓冲液中进行的研究的建议取样时间。pH 3.1的溶液的稳定性研究得到的t1/2估计值为17769分钟(12.3天)，而Davis等的工作得到的在磷酸盐pH 6.8的缓冲剂中的t1/2为10分钟，在pH 6.8的Tris缓冲剂中的t1/2为14分钟。这两项研究表明pH每增加1时BH4半衰期减小一个数量级(即，反应性增加一个数量级)(见表19)。根据该近似，pH1.2～pH 3的溶液最初每周取样，并可根据需要在收集最早的两个数据点之后进行取样时间修正。估计的在25℃的取样时间如表19中所提供。
表19基于测量的BH4的半衰期及来自它们的理论上的半衰期的在各种pH下建议的取样时间
  pH   测量的t1/2(分钟)   基于在pH 3时获得的t1/2估计的t1/2(分钟)a   最初建议的取样时间c
  1.0   -   1776900.0(1234天)   每7天
  2.0   -   177690.0(123.4天)   每7天
  3.0   17769.0(12.34天)   17769.0(12.34天)   每96小时
  4.0   -   1776.9(1.23天)   每12小时
  5.0   -   177.7(0.12天)   每1/2小时
  6.0   -   17.7(0.01天)   每5分钟d
  6.8b   10(磷酸盐)14(Tris)
  7.0   -   1.8   每1/2分钟d
a基于在pH 3.0时获得的半衰期在pH每变化1时变化一个数量级估计的t1/2。数量级以逐步的方式在pH＜3时增加而在pH＞3时降低，大致与Davis等获得的pH 6.8时的数据匹配。
bDavis等获得的数据，1988；Eur.J.Biochem.，173，345-351，(1988)
c可以修改取样
d对反应溶液进行取样并使其尽快被终止，需要秒表和2个人，其中一人取样/终止，另一人在笔记本上以分钟和/或秒为单位精确地记录时间
于5℃、25℃、30℃和37℃在pH 1～7的缓冲溶液中进行研究。虽然这些研究是在非气密密封容器中进行，但是单独一种抗氧化剂(抗坏血酸或L-半胱氨酸)或组合(抗坏血酸+L-半胱氨酸)会降低BH4的损失速率或降解速率(见图36和图37)。鼓泡同时含有抗坏血酸和L-半胱氨酸的溶液可充分增加BH4的稳定性。
BH4的降解速率依赖于浓度(参见图38)。因此BH4的高剂量高浓度制剂显示出需要较低浓度的稳定剂用于制剂的协同稳定。
该结果证明根据此处所述的方法和组成可以制造具有长存放寿命的稳定的液体制剂，包括用于构成制剂的无菌注射液、口服液和冻干和无菌粉末。
实施例7
口服和胃肠外使用的四氢生物蝶呤的液体和冻干制剂
制剂的示例性组成
表20以抗坏血酸作为稳定剂在pH 4下缓冲的具体制剂
  组分   量(mg)   ％重量/体积   作用
  BH4   1.00   0.10   活性物质
  抗坏血酸   10.00   1.00   抗氧化剂
  柠檬酸   6.56   0.66   缓冲剂
  柠檬酸钠二水合物   5.53   0.55   缓冲剂
  补足的注射用水   1.00mL   1.00mL   稀释剂
表21含有以下两种稳定剂的组合的在pH 4.0下缓冲的制剂：抗坏血酸和焦亚硫酸钠
  组分   量(mg)   ％重量/体积   作用
  BH4   1.00   0.10   活性物质
  抗坏血酸   2.50   0.25   抗氧化剂
  焦亚硫酸钠   2.50   0.25   抗氧化剂
  柠檬酸   6.56   0.66   缓冲剂
  柠檬酸钠二水合物   5.53   0.55   缓冲剂
  补足的注射用水   1.00mL   1.00mL   稀释剂
表22含有以下三种稳定剂的组合的在pH 4.0下缓冲的制剂：L-半胱氨酸、抗坏血酸和焦亚硫酸钠
  组分   量(mg)   ％重量/体积   作用
  BH4   1.00   0.10   活性物质
  抗坏血酸   2.00   0.20   抗氧化剂
  焦亚硫酸钠   2.00   0.20   抗氧化剂
  L-半胱氨酸   4.00   0.40   抗氧化剂
  柠檬酸   6.56   0.66   缓冲剂
  柠檬酸钠二水合物   5.53   0.55   缓冲剂
  补足的注射用水   1.00mL   1.00mL   稀释剂
表23仅含抗坏血酸作为稳定剂的在pH 7.0下缓冲的制剂
  组分   量(mg)   ％重量/体积   作用
  BH4   10.00   1.00   活性物质
  抗坏血酸   50.00   5.00   抗氧化剂
  磷酸二氢钠一水合物   10.24   0.10   缓冲剂
  磷酸氢二钠   17.76   0.18   缓冲剂
  补足的注射用水   1.00mL   1.00mL   稀释剂
表24含有抗坏血酸和焦亚硫酸钠作为稳定剂的在pH 7.0下缓冲的制剂
  组分   量(mg)   ％重量/体积   作用
  BH4   10.00   1.00   活性物质
  抗坏血酸   20.00   2.00   抗氧化剂
  焦亚硫酸钠   15.00   1.50   抗氧化剂
  磷酸二氢钠一水合物   10.24   0.26   缓冲剂
  磷酸氢二钠   17.76   0.44   缓冲剂
  补足的注射用水   1.00mL   1.00mL   稀释剂
表25含有抗坏血酸、焦亚硫酸钠和L-半胱氨酸作为稳定剂的在pH7.0下缓冲的制剂
  组分   量(mg)   ％重量/体积   作用
  BH4   10.00   1.00   活性物质
  抗坏血酸   20.00   2.00   抗氧化剂
  焦亚硫酸钠   15.00   1.50   抗氧化剂
  L-半胱氨酸   10.00   1.00   抗氧化剂
  磷酸二氢钠一水合物   10.24   0.26   缓冲剂
  磷酸氢二钠   17.76   0.44   缓冲剂
  补足的注射用水   1.00mL   1.00mL   稀释剂
高剂量液体制剂
表26仅含抗坏血酸作为稳定剂的在pH 6.0下缓冲的制剂
  组分   量(mg)   ％重量/体积   作用
  BH4   50.00   0.10   活性物质
  抗坏血酸   7.50   0.75   抗氧化剂
  柠檬酸   5.30   0.53   缓冲剂
  柠檬酸钠二水合物   51.4   5.14   缓冲剂
  补足的注射用水   1.00mL   1.00mL   稀释剂
表27含有以下两种稳定剂的组合的在pH 6.0下缓冲的制剂：抗坏血酸和焦亚硫酸钠
  组分   量(mg)   ％重量/体积   作用
  BH4   50.00   5.00   活性物质
  抗坏血酸   2.50   0.25   抗氧化剂
  焦亚硫酸钠   2.50   0.25   抗氧化剂
  柠檬酸   5.30   0.53   缓冲剂
  柠檬酸钠二水合物   51.4   5.14   缓冲剂
  补足的注射用水   1.00mL   1.00mL   稀释剂
表28含有以下三种稳定剂的组合的在pH 6.0下缓冲的制剂：L-半胱氨酸、抗坏血酸和焦亚硫酸钠
  组分   量(mg)   ％重量/体积   作用
  BH4   50.00   0.10   活性物质
  抗坏血酸   2.00   0.20   抗氧化剂
  焦亚硫酸钠   2.00   0.20   抗氧化剂
  L-半胱氨酸   1.00   0.10   抗氧化剂
  柠檬酸   5.30   0.53   缓冲剂
  柠檬酸钠二水合物   51.4   5.14   缓冲剂
  补足的注射用水   1.00mL   1.00mL   稀释剂
表29仅含抗坏血酸作为稳定剂的在pH 3.0的柠檬酸盐中缓冲时的口服制剂
  组分   量(mg)   ％重量/体积   作用
  BH4   10.00   1.00   活性物质
  抗坏血酸   20.00   2.00   抗氧化剂
  蔗糖   200.00   20.00   甜味剂
  橙类香精   1.00   0.10   增香剂
  柠檬酸   8.98   0.90   缓冲剂
  柠檬酸钠二水合物   2.13   0.21   缓冲剂
  补足的注射用水   1.00mL   1.00mL   稀释剂
表30含有抗坏血酸和焦亚硫酸钠作为稳定剂的在pH 3.5的酒石酸盐中缓冲的口服制剂
  组分   量(mg)   ％重量/体积   作用
  BH4   10.00   1.00   活性物质
  抗坏血酸   20.00   2.00   抗氧化剂
  焦亚硫酸钠   5.00   0.50   抗氧化剂
  蔗糖   200.00   20.00   甜味剂
  葡萄香精   1.00   0.10   增香剂
  酒石酸   1.34   0.13   缓冲剂
  酒石酸二钠二水合物   8.39   0.84   缓冲剂
  补足的注射用水   1.00mL   1.00mL   稀释剂
表31含有抗坏血酸和焦亚硫酸钠作为稳定剂的在pH 3.5的苹果酸类缓冲剂中缓冲的口服制剂
  组分   量(mg)   ％重量/体积   作用
  BH4   10.00   1.00   活性物质
  抗坏血酸   20.00   2.00   抗氧化剂
  焦亚硫酸钠   15.00   1.50   抗氧化剂
  蔗糖   200.00   20.00   甜味剂
  苹果香精   1.00   0.10   增香剂
  苹果酸   3.07   0.31   缓冲剂
  苹果酸二钠   4.91   0.49   缓冲剂
  补足的注射用水   1.00mL   1.00mL   稀释剂
可选的是，将前述配制或混合的溶液以混合箱中的惰性气体(例如，氩气或氮气)或二氧化碳一同鼓泡，并且优选于惰性气体或二氧化碳覆盖层中密封主容器以从容器顶部空间除去氧。利用适当的放大系数可以成倍增加各组分的量，由此可将制剂放大至任意体积。
实施例8
通过测量在碱性条件下氧化时L-生物蝶呤浓度来由LC/MS/MS确定人血浆中的四氢生物蝶呤(BH4)
四氢生物蝶呤(BH4)是用于治疗苯丙酮酸尿症(PKU)的小分子治疗剂。具有测量人血浆中BH4浓度的准确和特异的方法很重要。然而，由于BH4的内源性浓度低和不稳定性，定量人血浆中的BH4很有挑战性。在碱性条件下，BH4被氧化为二氢生物蝶呤(BH2)并最终成为L-生物蝶呤。此外，BH4至L-生物蝶呤的氧化转换率可在直至23周几乎恒定。因此，通过测量在碱性条件下氧化时的L-生物蝶呤浓度和应用摩尔转化率，可以可靠地确定人血浆中的BH4浓度。
公开的方法基于由Fukushima和Nixon(Anal.Biochem.，102，176-188(1980))开发的使用通过荧光检测的HPLC的经典方法。在LC/MS/MS法中，使用抗氧化剂稳定人血浆样品，使用内标(IS)溶液加标人血浆样品并使用氢氧化钠溶液碱化人血浆样品，然后使用碘溶液氧化人血浆样品。在室温下于黑暗中孵育时，加入抗坏血酸以还原过量的碘。通过蛋白质沉淀提取氧化的样品。通过使用具有Turbo Ion
Figure A20088001159400991
MS/MS检测的反相HPLC来分析重构的提取物中的L-生物蝶呤。以MRM方式监测L-生物蝶呤的负离子。使用标准的药物-IS峰面积比利用1/x2加权最小平方回归分析建立线性校准曲线。
在以下多个时间点评价BH4至L-生物蝶呤的氧化转化率：0、1、2、4、8、12和23周，并发现所有测试时间点具有一致性，由前三个连续的时间点确定的名义摩尔转化率为47.3％。其它时间点和该名义值的转化率之间的差异在-2.3％～6.3％范围内。经验证LC/MS/MS法可以在5ng/mL～1000ng/mL(相当于11ng/mL～2114ng/mL的BH4)的线性校准范围内定量K2EDTA人血浆中的L-生物蝶呤。利用质量对照样品(QC)评价测试的精度和准确度，结果显示当日精度在4.7CV％～14.5CV％之间；当日准确度在-7.1％～7.4％名义值之间；并且日间精度和准确度分别为7.4CV％～16.4CV％和-8.3％～3.7％名义值。L-生物蝶呤的平均提取回收率为65.3％。在K2EDTA人血浆中，发现L-生物蝶呤在室温可以稳定至少4小时，在4次冻融循环之后并在-70℃下可以稳定至少275天。
实施例9
使用具有电化学和荧光检测的HPLC确定BH4/BH2/B。
进行研究以开发利用具有荧光检测(FD)和电化学检测(ECD)的反相高效液相色谱(HPLC)确定人血浆中的四氢生物蝶呤(BH4)、二氢生物蝶呤(BH2)和生物蝶呤(B)浓度的方法。所述方法基于Cai等(CardiovascularResearch 55：838-849，2002)。
将BH4(在20mM HCl中)、BH2和B(在DMSO中)的储备溶液制成为最终浓度为10mM，并在-80℃储存。由经0.1％(w/v)的1，4-二硫代赤藓醇改性的100nM、10nM、7.5nM、5nM、2.5nM和1nM在K2EDTA人血浆中的储备溶液制备校准标准工作溶液。在经0.1％(w/v)的DTE改性的K2EDTA人类血浆中以5nM、8nM、25nM和50nM制备BH4、BH2和B的质量对照工作溶液并储存在-80℃。
对于样品处理，将血浆在重悬浮缓冲剂中1∶10稀释。向180μl的稀释的血浆中加入20μl 10×的沉淀缓冲剂。这一血浆稀释和沉淀过程应用于所有血浆标准、血浆样品和血浆QC。在加入10×的沉淀缓冲剂后，在4℃以最大速度离心样品5分钟，以除去非特定的血浆沉渣。然后将150mL上清液转移至样品瓶中，随后将其置于用于100mL注射的自动取样器中。
使用13.6g乙酸钠(50mM)、2.1g柠檬酸(5mM)、36mg EDTA(48mM)、49.4mg DTE(160mM)和在水中的2体积％的甲醇制备流动相(2L)。将pH调整为5.22。使用20mL的PBS pH 7.4(50mM)、20uL的1MDTE(1mM)和100mL的100uM EDTA制得重悬浮缓冲剂(20mL)。使用2.88mL磷酸(1M)、9.39g三氯乙酸(2M)和20mL 1M DTE(1mM)新制备10×的沉淀缓冲剂(25mL)。
利用反相HPLC分离来分离四氢生物蝶呤(BH4)、二氢生物蝶呤(BH2)和生物蝶呤(B)。利用电化学检测测量BH4，在电化学检测中BH4被电极1氧化为醌型二氢生物蝶呤(qBH2)，然后在电极2处被还原回BH4。然后，检测器利用该还原反应产生的电流确定BH4的浓度。可利用荧光检测在同一注射液中测量BH2和B。利用调节保护电池在最佳电势下的柱后氧化BH2，将BH2氧化为生物蝶呤。
用ACE C-18(250mm×4.6mm)柱，5μM，以1.3mL/分钟的流速和13分钟的运行时间来进行HPLC分离。电化学检测设置为E1：+100mV(背景电流+500nA～+600nA)和E2：-300mV(背景电流-50nA～-60nA)。将柱后氧化设置为900mV。将荧光检测设置为激发波长：350nM，发射波长：450nM。
基于血浆和缓冲液中的标准的精度和准确度评估方法的线性和范围。使用每种分析物的至少4～6个非零浓度建立标准曲线浓度。标准的浓度为1nM、2.5nM、5nM、7.5nM、10nM和100nM。结果显示由1nM～100nM的BH4、BH2和B的线性拟合，R2＞0.99。
通过重复分析含有已知量(2、8、25和50nM)的分析物的质量对照样品来确定准确度并以百分比准确度表达。还基于来自质量对照的数据计算精度。基于CV％评价测试内精度和测试间精度。在三个分开的实验运行中，在血浆中制备各分析物的浓度并进行分析。此外，将10nM的BH4、BH2和B“加标(spiked)”人血浆样品中，以确定准确度和回收率。在8nM、25nM和50nM的BH4、BH2和B的测量表明了准确度为112％～89％，并表明了精度(CV％)为2.5％～20％。使用在人类血浆的临床样品中的10nM的BH4、BH2和B的加标回收实验证明回收率为70％～130％。结果证明对于浓度大于2nM的样品该方法是准确的、精确的。
为检查在六种不同批次的血浆中是否存在内源的干扰，向六种不同批次的血浆中加标10nM的BH4、BH2和B，并对各血浆样品确定准确度和精度。选择性实验显示，六种个体具有在可定量限度以下～2.48nM的内源基线BH4水平。类似地，BH2和B浓度在0.02nM～10nM范围内。10nM的加标的分析物的回收率在69％～87％范围内。以10nM加标时各血浆样品和分析物之间的变异率(CV％)为23％～37％。BH4、BH2和B的内源水平的变异率在0nM～9.96nM范围内。总之，这些结果表明存在提取期间有基质干扰或损失的倾向，但未表明个体之间存在强选择性。
要测量基质作用，需比较在血浆或缓冲剂中制备的标准曲线的准确度(回收率)、线性和相关性。在血浆中制备的标准与在缓冲剂中制备的标准的比较表明了适度的基质作用和一般良好的相关性。所有三种分析物对于血浆和缓冲剂都具有优异的线性拟合性。BH4和B未表明在浓度范围内存在显著的基质影响。然而，BH2在最高标准浓度(100nM)具有较低的回收率。在缓冲剂和血浆中制备的质量对照样品证实了良好的准确度。总之，基质影响似乎很低，并具有在缓冲剂中比在血浆中回收率较低的倾向。由于BH4和BH2容易被氧化，因此收集的血浆和样品缓冲剂应该含有抗氧化剂并在可能的情况下具有低pH。
为测试准确地稀释加标有250nM的BH4、BH2和B的血浆和缓冲剂样品的能力，使用空白血浆将血浆稀释为三倍稀释的序列。分析稀释的样品，并将其与应用稀释因子后的名义值进行比较。高浓度BH4、BH2和B的稀释可以准确地进行。对于BH4，83.33nM～3.07nM的浓度在稀释后观察的浓度的准确度为83％～104％。在定量范围(83nM～3nM)内BH2的准确度为74％～80％。在定量范围(83nM～3nM)内B的准确度为119％～113％。因此，可以精确地稀释高于定量限的样品。
在血浆中制备四种浓度的分析物(2nM、8nM、25nM和50nM)，并在一个循环内冷冻至少24小时，并在其它循环内冷冻至少12小时，并且执行至少三个循环。在冷冻期之间使样品在室温下无辅助的融化。评估在每次和所有自由融化循环后的准确度和变异率，以确定样品可经受的最大循环数。含有BH4、BH2和B的样品可以经受至多3个冻融循环，而不会显著改变测量的准确度和精度。8nM～50nM BH4的血浆样品的准确度为121％～91％，并且CV％小于10％。类似地，在测试的定量范围内BH2测量的准确度为77％～88％。在定量范围内B测量的准确度为98％～99％，精度(CV％)为5％～8％。在反复冻融后BH4、BH2和B的2nM样品未证明准确度或精度。因此，标准、质量对照和研究样品可以冷冻和融化至多3次。
由于分析物对氧化敏感，我们检验了在模拟预期的储存条件下的长期冷冻稳定性。在血浆中制备四种浓度水平(2nM、8nM、50nM和100nM)的BH4、BH2和B并在-70℃储存8周。测试新鲜的、在第3周、5周、6周和8周的样品的稳定性。BH4和B具有良好的长期冷冻稳定性。BH2证实了在延长的储存后具有降低的样品浓度。在储存8周后，BH4的血浆样品的准确度为93％～94％，并具有31％～0.21％的CV％，在2nM浓度时观察到最大的变化。在测试浓度范围内BH2测量的准确度为63％～85％，在2nM和100nM浓度时准确度降低。这些样品的精度(CV％)在37％～18％范围内。在测试浓度范围内B测量的准确度为88％～101％，精度(CV％)为23％～0.14％，在2nM浓度时变化率最大。总之，此数据支持储存样品多达8周而不会产生分析物浓度的明显损失的建议。看起来BH2最易于降解(氧化)。
为测量BH4、BH2和B在自动取样器中的稳定性，将在重构溶剂中8nM的各分析物存放在自动取样器中0.25小时、4小时和11小时。比较测量的准确度和精度。观察的BH4测量在各时间点的准确度在理论值的5％范围内，在所有三个测量中准确度和精度分别为102％和0.054％。在4小时后BH2测量具有降低的准确度和提高的变化率。11小时后在自动取样器中测量到约50％的BH2。这表明在运行缓冲剂中的不良的自动取样器稳定性。B的测量在11小时后准确度仍在理论值的125％内。因此，推荐运行时间不超过4小时。
为确定注射遗留，在最高标准浓度100nM后插入提取的基线血浆样品。这样做是为了模拟因遗留引起的低浓度样品中的过估计的分析物的浓度的可能性。BH4、BH2和B的注射遗留非常少，未超过定量的100nM上限的峰面积的1％。基于由低质量对照(2nM)获得的平均峰面积，注射遗留占定量的下限的约5％～20％。因此，优选的是，样品应按由最低到高的顺序排列(即，首先是前剂量，然后是后剂量样品)，优选在运行期间定期进行清理柱的额外清洗，以降低潜在的遗留。
开发了一种健壮、特异、准确和精确的合格方法。该方法适于为药代动力学和药物研究而量化血浆中的BH4、BH2和B的水平。
本文所引用的所有专利、公报和参考文献通过援引完全并入本说明书中。当本发明的公开内容与并入的专利、公报和参考文献之间存在冲突时，应以本发明的公开内容为准。

Claims (53)

1.一种口服施用四氢生物蝶呤(BH4)的方法，所述方法包括对有需要的人施用治疗有效量的BH4或其药用可接受盐，并告知所述的人与不和食物一同摄入时相比，与食物一同摄入时所述BH4或其药用可接受盐的吸收会提高。
2.如权利要求1所述的方法，其中，所述的人被告知：与在禁食情况下施用所述BH4或其药用可接受盐时相比，与高脂肪、高热量膳食一同施用所述BH4或其药用可接受盐时会使Cmax和AUC升高约30％。
3.如权利要求1～2中任一项所述的方法，其中，所述BH4或其药用可接受盐的纯度至少为99.5％。
4.如权利要求3所述的方法，其中，所述纯化的BH4是作为盐酸盐的晶体多晶型，所述晶体多晶型显示的X-射线粉末衍射图案具有以d-值表示的下述特征峰：8.7(vs)，5.63(m)，4.76(m)，4.40(m)，4.00(s)，3.23(s)，3.11(vs)，优选8.7(vs)，6.9(w)，5.90(vw)，5.63(m)，5.07(m)，4.76(m)，4.40(m)，4.15(w)，4.00(s)，3.95(m)，3.52(m)，3.44(w)，3.32(m)，3.23(s)，3.17(w)，3.11(vs)，3.06(w)，2.99(w)，2.96(w)，2.94(m)，2.87(w)，2.84(s)，2.82(m)，2.69(w)，2.59(w)和2.44(w)。
5.如权利要求1～4中任一项所述的方法，其中，所述BH4或其药用可接受盐以至少2mg/kg的每日剂量施用。
6.如权利要求1～4中任一项所述的方法，其中，所述BH4或其药用可接受盐以至少5mg/kg的每日剂量施用。
7.如权利要求1～4中任一项所述的方法，其中，所述BH4或其药用可接受盐以至少10mg/kg的每日剂量施用。
8.如权利要求1～4中任一项所述的方法，其中，所述BH4或其药用可接受盐以至少20mg/kg的每日剂量施用。
9.如权利要求1～8中任一项所述的方法，其中，所述的人已经被诊断患有高苯丙氨酸血症。
10.如权利要求1～8中任一项所述的方法，其中，所述的人已经被诊断患有神经精神异常。
11.如权利要求1～8中任一项所述的方法，其中，所述的人已经被诊断患有心血管疾病。
12.如权利要求1～8中任一项所述的方法，其中，所述的人已经被诊断患有贫血症。
13.一种延长四氢生物蝶呤(BH4)或其药用可接受盐在受试对象中的胃肠停留时间的方法，所述方法包括对所述受试对象施用制剂，所述制剂包含(1)BH4或其药用可接受盐和(2)减缓胃肠运动的试剂，
其中，通过所述制剂施用的所述BH4或其药用可接受盐与不具有减缓胃肠运动试剂的BH4或其药用可接受盐的对照制剂相比，具有较长的胃肠停留时间。
14.如权利要求13所述的方法，其中，所述BH4或其药用可接受盐的胃肠停留时间与所述对照制剂相比，至少为两倍长。
15.如权利要求13～14中任一项所述的方法，其中，所述试剂为脂肪酸、甘油脂肪酸酯或它们的组合。
16.如权利要求15所述的方法，其中，所述脂肪酸选自由油酸、硬脂酸、花生酸、棕榈酸、花生四烯酸、亚油酸、亚麻酸、芥酸、肉豆蔻酸、月桂酸、肉豆蔻脑酸和棕榈炔酸组成的组。
17.如权利要求15所述的方法，其中，所述甘油脂肪酸酯是单酯、二酯、三酯或它们的组合。
18.如权利要求17所述的方法，其中，所述甘油脂肪酸酯是甘油单酯和甘油二酯的组合。
19.如权利要求18所述的方法，其中，所述试剂是甘油单油酸酯和甘油二油酸酯的组合。
20.一种四氢生物蝶呤(BH4)或其药用可接受盐的口服制剂，所述口服制剂包含BH4或其药用可接受盐和减缓胃肠运动的试剂。
21.如权利要求20所述的制剂，其中，所述试剂为脂肪酸、甘油脂肪酸酯或它们的组合。
22.如权利要求21所述的制剂，其中，所述脂肪酸选自由油酸、硬脂酸、花生酸、棕榈酸、花生四烯酸、亚油酸、亚麻酸、芥酸、肉豆蔻酸、月桂酸、肉豆蔻脑酸和棕榈炔酸组成的组。
23.如权利要求20所述的制剂，所述甘油脂肪酸酯是单酯、二酯、三酯或它们的组合。
24.如权利要求23所述的制剂，其中，所述甘油脂肪酸酯是甘油单酯和甘油二酯的组合。
25.如权利要求24所述的制剂，其中，所述试剂是甘油单油酸酯和甘油二油酸酯的组合。
26.一种四氢生物蝶呤(BH4)或其药用可接受盐的液体制剂，所述液体制剂包含BH4或其药用可接受盐、抗氧化剂和pH缓冲剂的水溶液。
27.一种四氢生物蝶呤(BH4)或其药用可接受盐的用于配制成水溶液的干粉制剂，所述干粉制剂包含BH4或其药用可接受盐、抗氧化剂和pH缓冲剂的干粉混合物。
28.如权利要求26或27所述的制剂，其中，所述BH4或其药用可接受盐的存在量为至多10％重量/体积。
29.如权利要求26～28中任一项所述的制剂，其中，所述抗氧化剂包含至少两种抗氧化剂。
30.如权利要求26～29中任一项所述的制剂，其中，所述至少两种抗氧化剂包含还原剂抗氧化剂。
31.如权利要求29～30中任一项所述的制剂，所述制剂还包含酸抗氧化剂增效剂和/或螯合剂。
32.如权利要求26～31中任一项所述的制剂，其中，所述抗氧化剂的存在量为至多5％重量/体积。
33.如权利要求26～32中任一项所述的制剂，所述制剂提供于密封容器中并且还包含非氧化性气体覆盖层。
34.如权利要求33所述的制剂，其中，所述非氧化性气体选自由氩气、氮气、二氧化碳和它们的组合组成的组。
35.如权利要求26～34中任一项所述的制剂，所述制剂具有酸性pH。
36.如权利要求35所述的制剂，所述制剂还包含甜味剂和调味剂。
37.如权利要求26～34中任一项所述的制剂，所述制剂具有中性pH。
38.一种制造四氢生物蝶呤(BH4)或其药用可接受盐的液体制剂的方法，所述方法包括
提供含有BH4或其药用可接受盐的水溶液；
向含有BH4或其药用可接受盐的所述溶液中加入抗氧化剂和pH缓冲剂；
在加入所述抗氧化剂和所述pH缓冲剂之前或之后，将含有BH4或其药用可接受盐的所述水溶液以惰性气体或二氧化碳鼓泡；和
将含有BH4或其药用可接受盐、抗氧化剂和pH缓冲剂的经鼓泡的溶液密封在容器中。
39.如权利要求38所述的方法，所述方法还包括在所述容器中于所述溶液上方提供非氧化性气体覆盖层。
40.如权利要求38或39所述的方法，所述方法还包括冻干含有BH4或其药用可接受盐、抗氧化剂和pH缓冲剂的所述溶液，以生产干产品。
41.如权利要求38～40中任一项所述的方法，其中，所述BH4或其药用可接受盐包含沙丙蝶呤二盐酸盐。
42.一种用于二氢生物蝶呤、生物蝶呤和它们的类似物的反相HPLC分离的流动相溶液，所述流动相溶液包含：
包含甲醇、乙酸钠、柠檬酸、EDTA和1，4-二硫代赤藓醇的水溶液。
43.如权利要求42所述的溶液，其中，所述甲醇的存在量为2体积％。
44.如权利要求43所述的溶液，所述溶液包含50mM的乙酸钠、5mM的柠檬酸、48μM的EDTA和160μM的1，4-二硫代赤藓醇。
45.一种由含有生物蝶呤的基本形式和二氢形式的混合物分离二氢生物蝶呤和生物蝶呤或它们的类似物的方法，所述方法包括：
使用含有水溶液的流动相，对含有二氢生物蝶呤和生物蝶呤或二氢生物蝶呤的类似物和生物蝶呤的类似物的混合物进行反相HPLC，所述水溶液包含甲醇、乙酸钠、柠檬酸、EDTA和1，4-二硫代赤藓醇。
46.如权利要求45所述的方法，其中，所述流动相中所使用的所述甲醇的存在量为2体积％。
47.如权利要求46所述的方法，其中，所述流动相包含50mM的乙酸钠、5mM的柠檬酸、48μM的EDTA和160μM的1，4-二硫代赤藓醇。
48.如权利要求45～47中任一项所述的方法，其中，所述混合物包含血液、血浆、组织匀浆或尿的样品。
49.一种利用与串联质谱联用的反相HPLC(LC/MS/MS)测量生物蝶呤的方法，所述方法包括：
对含有生物蝶呤的血液、血浆、组织匀浆或尿的样品进行氧化；
对经氧化的所述样品进行碘量滴定法；
使经氧化的所述样品通过离子交换柱；
利用HPLC和串联质谱测量所述样品中的总生物蝶呤和经氧化的生物蝶呤；和
计算经还原的生物蝶呤的量，其为所述总生物蝶呤与经氧化的形式之差。
50.如权利要求49所述的方法，所述方法还包括在碘量滴定法之前使用KCl、HCl或TCA处理所述样品。
51.如权利要求49所述的方法，所述方法还包括使用KI、I或NaOH处理所述样品，和在碘量滴定法之前使用HCl或TCA对经碱氧化的所述样品进行酸化。
52.一种生物蝶呤物种的混合物中的生物蝶呤的定量方法，所述方法包括：
提供混合物，所述混合物包含生物蝶呤以及二氢生物蝶呤和四氢生物蝶呤此二者中的至少一种，或生物蝶呤的类似物以及二氢生物蝶呤和四氢生物蝶呤此二者中的至少一种的类似物；
通过反相HPLC分离所述混合物中的所述生物蝶呤物种；和
在四氢生物蝶呤及其类似物的情况下，将存在于第一电极附近的所述四氢生物蝶呤及其类似物氧化为醌型二氢生物蝶呤的形式，然后在第二电极处将所述醌型形式还原回四氢生物蝶呤及其类似物，并测量所述还原反应所产生的电流以确定物种的浓度，由此进行电化学检测；和/或
在二氢生物蝶呤、其类似物、生物蝶呤或其类似物的情况下，在二氢生物蝶呤物种经柱后氧化为生物蝶呤之后通过荧光检测测量这些物种。
53.如权利要求52所述的方法，其中，包含生物蝶呤物种或其类似物的所述混合物包含血液、血浆、组织匀浆或尿的样品。
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Cited By (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103458900A (zh) * 2011-03-01 2013-12-18 鲁必康研究私人有限公司 四氢生物蝶呤的稳定组合物
CN106572976A (zh) * 2014-03-31 2017-04-19 瓦索珐姆有限公司 包含生物蝶呤衍生物的固体药物组合物及此类组合物的用途
CN108813410A (zh) * 2018-07-06 2018-11-16 浙江工商大学 一种降低发酵香肠中生物胺的方法及其应用
CN109946412A (zh) * 2017-12-21 2019-06-28 上海产业技术研究院 一种体液蝶呤谱检测试剂盒及其使用
CN110312721A (zh) * 2016-11-29 2019-10-08 显莎制药公司 墨蝶呤的多晶型物
US10722631B2 (en) 2018-02-01 2020-07-28 Shifamed Holdings, Llc Intravascular blood pumps and methods of use and manufacture
CN112057423A (zh) * 2020-10-21 2020-12-11 兆科药业（广州）有限公司 一种含有盐酸沙丙蝶呤的颗粒剂药物及其制备方法
CN112697919A (zh) * 2020-12-22 2021-04-23 北京和合医学诊断技术股份有限公司 度洛西汀的检测方法
US11185677B2 (en) 2017-06-07 2021-11-30 Shifamed Holdings, Llc Intravascular fluid movement devices, systems, and methods of use
US11511103B2 (en) 2017-11-13 2022-11-29 Shifamed Holdings, Llc Intravascular fluid movement devices, systems, and methods of use
US11654275B2 (en) 2019-07-22 2023-05-23 Shifamed Holdings, Llc Intravascular blood pumps with struts and methods of use and manufacture
US11724089B2 (en) 2019-09-25 2023-08-15 Shifamed Holdings, Llc Intravascular blood pump systems and methods of use and control thereof
US11752154B2 (en) 2017-09-01 2023-09-12 Ptc Therapeutics Mp, Inc. Pharmaceutical compositions comprising sepiapterin and uses thereof
US11773097B2 (en) 2016-11-29 2023-10-03 Ptc Therapeutics Mp, Inc. Polymorphs of sepiapterin and salts thereof
US11964145B2 (en) 2019-07-12 2024-04-23 Shifamed Holdings, Llc Intravascular blood pumps and methods of manufacture and use

Families Citing this family (37)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SI3138566T1 (sl) 2003-11-17 2022-04-29 Biomarin Pharmaceutical Inc. Postopki in sestavki za zdravljenje presnovnih motenj
ES2397746T3 (es) 2007-04-11 2013-03-11 Biomarin Pharmaceutical Inc. Métodos de administración de tetrahidrobiopterina, composiciones asociadas y métodos de medición
RU2011109210A (ru) * 2008-08-12 2012-09-20 Орфа Свисс Гмбх (Ch) Лекарственная форма, содержащая тетрагидробиоптерин
US9089573B2 (en) 2009-07-22 2015-07-28 University Of Massachusetts Methods and compositions to reduce oxidative stress
WO2011132435A1 (ja) 2010-04-22 2011-10-27 学校法人日本大学 脳機能障害予防・改善用の薬剤及び飲食物
KR102105857B1 (ko) * 2010-12-03 2020-05-04 오렉시젠 세러퓨틱스 인크. 날트렉손 요법에서 약물 생체이용률의 증가
US9549563B2 (en) 2011-10-24 2017-01-24 Kickass Candy Llc Sweet tart energy tablet
US9216178B2 (en) * 2011-11-02 2015-12-22 Biomarin Pharmaceutical Inc. Dry blend formulation of tetrahydrobiopterin
SI2806877T1 (sl) 2012-01-23 2020-01-31 Sage Therapeutics, Inc. Nevroaktivne steroidne formulacije, ki obsegajo kompleks alopregnanolona in sulfobutil etra beta-ciklodekstrina
ES2646197T3 (es) 2012-01-26 2017-12-12 Vanda Pharmaceuticals Inc. Tratamiento de trastornos del ritmo circadiano
US11918557B2 (en) 2012-01-26 2024-03-05 Vanda Pharmaceuticals Inc. Treatment of circadian rhythm disorders
CN102650621B (zh) * 2012-05-02 2014-06-25 安徽农业大学 一种从蚕体提取的墨蝶呤的鉴定方法
WO2014124392A1 (en) * 2013-02-08 2014-08-14 University Of Iowa Research Foundation Diagnostic tools to predict onset of preeclampsia
US11090285B2 (en) 2013-11-12 2021-08-17 Vanda Pharmaceuticals Inc Treatment of circadian rhythm disorders
US10376487B2 (en) 2013-11-12 2019-08-13 Vanda Pharmaceuticals Inc. Method of treatment
US20150204834A1 (en) * 2014-01-22 2015-07-23 Sarfaraz K. Niazi Thermodynamic equivalence surrogate test (test) for bioequivalence
MA41124A (fr) * 2014-12-05 2017-10-10 Sun Pharmaceutical Ind Ltd Compositions en suspension à libération prolongée à rétention gastrique
US10744088B2 (en) 2015-10-06 2020-08-18 G-Treebnt Co., Ltd. Method for preparing ophthalmic preparation containing thymosin beta-4
JOP20170059B1 (ar) 2016-03-08 2021-08-17 Sage Therapeutics Inc ستيرويدات وتركيبات نشطة عصبيًا واستخداماتها
CN108627576A (zh) * 2017-03-17 2018-10-09 武汉宏韧生物医药科技有限公司 一种人血浆中他达拉非的定量分析方法
JP7277005B2 (ja) * 2017-07-06 2023-05-18 ツリーウェイ ティーダブリュー００１ ビー．ブイ． 酸化ストレス媒介性の神経変性障害の経口治療におけるエダラボンの使用
US20200268657A1 (en) * 2017-07-13 2020-08-27 Michael Gulyas Supplement tablet and packaging
EP3713577A4 (en) * 2017-11-20 2021-08-18 MediBeacon Inc. PROCESS FOR THE PREPARATION AND ANALYSIS OF FLUORESCENT COMPOUNDS IN PLASMA
EP3766356A4 (en) * 2018-03-16 2021-11-24 Eco-Geo Bio-Technology Company Limited MULTI-PH BUFFER FORMULATION AND COMPOSITION TO FACILITATE PROTEIN DIGESTION, AND USE OF THEM
CN110269099B (zh) * 2018-03-16 2023-01-31 共生地球生物科技有限公司 多重pH缓冲配方与蛋白质消化助剂的组合物及其用途
EP3807279A4 (en) * 2018-05-30 2022-04-06 PTC Therapeutics MP, Inc. PHARMACEUTICALLY ACCEPTABLE SALTS OF SEPIAPTERINE
JP2021525729A (ja) * 2018-05-30 2021-09-27 ピーティーシー セラピューティクス エムピー，インコーポレイテッド セピアプテリン血漿曝露を増加させるための方法
EP3801534A4 (en) * 2018-05-30 2022-03-16 PTC Therapeutics MP, Inc. COMPOSITIONS AND METHODS FOR INCREASE TETRAHYDROBIOPTERINE PLASMA EXPOSURE
JP2020068734A (ja) * 2018-11-01 2020-05-07 国立大学法人東京工業大学 Ｓｐｒをコードするポリヌクレオチドを含む組換えベクター、及びそれを含む組成物
US20200276200A1 (en) * 2019-02-28 2020-09-03 Clark Gerald Sullivan Treatment of cns and developmental disorders using high-dose 5-formyl-(6s)-tetrahydrofolate
WO2021011177A1 (en) * 2019-07-15 2021-01-21 R.P. Scherer Technologies, Llc Enteric proton pump inhibitor softgel capsule
TR201914416A1 (tr) 2019-09-23 2021-04-21 Sanovel Ilac Sanayi Ve Ticaret Anonim Sirketi Sapropteri̇n di̇hi̇droklorürün efervesan formülasyonlari
CN111505179B (zh) * 2020-04-07 2021-07-13 厦门大学 海洋水体中生物蝶呤的检测方法
WO2022204517A1 (en) * 2021-03-26 2022-09-29 Emory University Managing the acute and long-term effects of coronaviral infections and compositions related thereto
CN113607870A (zh) * 2021-07-22 2021-11-05 中国食品药品检定研究院 一种头孢羟氨苄原料药及其制剂中聚合物杂质的检测方法
CN114814036B (zh) * 2022-05-09 2024-02-20 上海谱锐赛思生物技术有限公司 血浆中阿齐沙坦和氨氯地平浓度的测定方法
WO2024084421A1 (en) * 2022-10-18 2024-04-25 Qrgenetics Ltd. Treatment of vascular diseases associated with genetic variations in acta2

Family Cites Families (56)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6021A (en) * 1849-01-09 Cast-iron cab-wheel
US6019A (en) * 1849-01-09 Cast-iron car-wheel
US2601215A (en) 1948-03-17 1952-06-17 American Cyanamid Co Process of preparing dihydropterins
US3505329A (en) 1968-02-06 1970-04-07 Smithkline Corp Process for the synthesis of biopterin
JPS5883691A (ja) 1981-11-13 1983-05-19 Kanegafuchi Chem Ind Co Ltd １′，２′−ジアシル−（６ｒ，ｓ）−５，６，７，８−テトラヒドロ−ｌ−ビオプテリンおよびその製法
JPS5925323A (ja) 1982-03-03 1984-02-09 鐘淵化学工業株式会社 プテリン誘導体からなる脳内神経伝達物質の関わる疾病の治療剤
JPS5921685A (ja) 1982-07-28 1984-02-03 Suntory Ltd Ｌ―エリスロ―バイオプテリンの製造法
ZA836957B (en) 1982-09-20 1985-04-24 Wellcome Found Neurologically active chemical compounds
GB8318833D0 (en) 1983-07-12 1983-08-10 Wellcome Found Chemical compounds
US5196533A (en) 1983-04-11 1993-03-23 South Alabama Medical Science Foundation, Usa Cyclization of 5 amino-pyrimidines to quinoid 6,6 disubstituted dihydropteridines
US4587340A (en) 1983-09-19 1986-05-06 Burroughs Wellcome Co. Biopterin analogs
JPS60178887A (ja) 1984-02-23 1985-09-12 Kanegafuchi Chem Ind Co Ltd ５，６，７，８−テトラヒドロ−ｌ−ビオプテリンの製造法
JPS60199889A (ja) 1984-03-24 1985-10-09 Kanegafuchi Chem Ind Co Ltd ５，６，７，８−テトラヒドロ−ｌ−エリスロ−ビオプテリンの硫酸塩およびその製法
US4550109A (en) * 1984-05-31 1985-10-29 The Board Of Regents, The University Of Texas System Lipoidal biopterin compounds
DE3437944A1 (de) 1984-10-17 1986-07-31 Biotest-Serum-Institut Gmbh, 6000 Frankfurt Verwendung von pterinen zur steigerung der aktivitaet von lymphokinen und anderen blutfaktoren, sowie ein diagnostisches oder therapeutisches praeparat, das pterine in kombination mit lymphokinen enthaelt
CA1262347A (en) 1985-01-28 1989-10-17 Suntory Limited Preparation process of (6r)-tetrahydro-l-biopterin
JPS61277618A (ja) 1985-06-04 1986-12-08 Suntory Ltd 自閉症治療剤
JPS621688A (ja) * 1985-06-28 1987-01-07 Nippon Kokan Kk <Nkk> ばら積船
WO1987001038A1 (en) * 1985-08-22 1987-02-26 Commonwealth Scientific And Industrial Research Or Peptide analogues of mammalian insulin-like growth factor-1
DE3853711T2 (de) 1987-11-30 1996-01-11 Vitamin Kenkyusho Kk Zwischenverbindungen für die Synthese von 5,6,7,8-Tetrahydro-L-erythro-biopterin und seiner Derivate.
JP3137333B2 (ja) 1990-07-21 2001-02-19 サントリー株式会社 テトラヒドロビオプテリンの製法およびそれに用いる酵素
JP2534423B2 (ja) 1991-12-26 1996-09-18 コーネル・リサーチ・ファンデーション・インコーポレイテッド 酸化窒素の過剰生産から生じる血管失調を阻止する阻害剤
US5198547A (en) 1992-03-16 1993-03-30 South Alabama Medical Science Foundation, Usa Process for N5-formylating tetrahydropteridines
DE4308739C1 (de) 1993-03-19 1994-06-23 Henning Berlin Gmbh Pterinderivate, ihre Herstellung und ihre Verwendung
US5945452A (en) 1993-06-11 1999-08-31 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Treatment of vascular degenerative diseases by modulation of endogenous nitric oxide production or activity
US5502050A (en) 1993-11-29 1996-03-26 Cornell Research Foundation, Inc. Blocking utilization of tetrahydrobiopterin to block induction of nitric oxide synthesis
ATE218345T1 (de) 1994-08-05 2002-06-15 Suntory Ltd Arzneimittel gegen spinocerebellare degeneration
JP2711828B2 (ja) 1996-06-25 1998-02-10 白鳥製薬株式会社 （６ｒ）−テトラヒドローｌ−バイオプテリン塩酸塩の製造法
US20020076782A1 (en) 1996-07-05 2002-06-20 John P.N. Rosazza Purified nitric oxide synthase
GB9617990D0 (en) 1996-08-29 1996-10-09 Scotia Holdings Plc Treatment of pain
CH693255A5 (de) 1997-06-13 2003-05-15 Eprova Ag Verwendung von Tetrahydrofolaten in der natürlichenstereoisomeren Form zur Herstellung einer pharmazeutischenZubereitung geeignet zur Beeinflussung des Homocystein-Spiegels.
US5922713A (en) 1997-06-26 1999-07-13 Werner; Ernst Inhibition of nitric oxide synthase
US6723560B2 (en) * 1998-10-08 2004-04-20 Mayo Foundation For Medical Education And Research Using polyamide nucleic acid oligomers to engender a biological response
EP1004308B1 (en) 1998-02-27 2005-05-11 Daiichi Suntory Pharma Co., Ltd. Preventives or remedies for drug-induced renal disturbance
JP4306825B2 (ja) 1998-02-27 2009-08-05 アスビオファーマ株式会社 インスリン抵抗性が関与する血管機能異常を伴う疾患の予防または治療剤
US6200758B1 (en) 1999-02-19 2001-03-13 New York State Office Of Mental Health Phenylalanine hydroxylase gene variants, and amino acid and pterin homeostasis, in the definition, detection, treatment and prevention of psychotic, mood and personality disorders
WO2000056328A1 (en) 1999-03-19 2000-09-28 Enos Pharmaceuticals, Inc. Increasing cerebral bioavailability of drugs
GB2355191A (en) 1999-10-12 2001-04-18 Laxdale Ltd Combination formulations for fatigue, head injury and strokes
US6544994B2 (en) 2000-06-07 2003-04-08 Eprov Ag Pharmaceutical preparation for treating or preventing cardiovascular or neurological disorders by modulating of the activity of nitric oxide synthase
US20040014167A1 (en) * 2000-08-31 2004-01-22 Masayuki Yabuta Process for producing biopterin
RU2180233C1 (ru) * 2001-06-26 2002-03-10 Общество с ограниченной ответственностью "Протеиновый контур" Способ получения жидких лекарственных форм рекомбинантных белков
US20040058962A1 (en) * 2002-06-14 2004-03-25 Amedeo Leonardi Phenylalkylamines and pyridylalkylamines
DE10260263A1 (de) * 2002-12-20 2004-07-15 Biocrates Life Sciences Gmbh Verwendung von Tetrahydrobiopterinderivaten zur Behandlung und Ernährung von Patienten mit Aminosäurestoffwechselstörungen
EP1667656A4 (en) * 2003-09-01 2011-12-28 Mayne Pharma Int Pty Ltd COMPOSITIONS AND METHODS OF DISTRIBUTING BIOLOGICALLY ACTIVE AGENTS
SI3138566T1 (sl) 2003-11-17 2022-04-29 Biomarin Pharmaceutical Inc. Postopki in sestavki za zdravljenje presnovnih motenj
CA2678165C (en) 2003-11-17 2013-11-05 Merck Eprova Ag Crystalline forms of (6r)-l-erythro-tetrahydrobiopterin dihydrochloride
AU2004290692A1 (en) 2003-11-17 2005-06-02 Biomarin Pharmaceutical Inc. Processes for preparing tetrahydrobiopterin, and analogs of tetrahydrobiopterin
ES2393785T3 (es) 2004-05-11 2012-12-28 Daiichi Sankyo Company, Limited Remedios para hiperfenilalaninemia sensible a BH4
CA2601716C (en) 2004-06-25 2011-05-31 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods and compositions for the treatment of attention deficit hyperactivity disorder and hyperphenylalanemia
AU2005286763A1 (en) 2004-09-17 2006-03-30 Biomarin Pharmaceutical, Inc. Variants and chemically-modified variants of phenylalanine ammonia-lyase
JP2008520574A (ja) 2004-11-17 2008-06-19 バイオマリン ファーマシューティカル インコーポレイテッド テトラヒドロビオプテリンの安定性錠剤処方物
US20060194808A1 (en) * 2005-01-14 2006-08-31 Chronorx Llc, An Alaska Limited Liability Company Clinical applications of tetrahydrobiopterin, lipoic acid and their salts and methods of preparing tetrahydrobiopterin bis-lipoate
WO2007072911A1 (ja) 2005-12-22 2007-06-28 Asubio Pharma Co., Ltd. 塩酸サプロプテリンの生体内吸収性を向上させた製剤
US20080075666A1 (en) 2006-08-25 2008-03-27 Dudley Samuel C Jr Methods and compositions for treating diastolic dysfunction
EP2131679B1 (en) 2007-02-22 2019-03-27 Children's Hospital & Research Center at Oakland Fatty acid formulations and methods of use thereof
ES2397746T3 (es) 2007-04-11 2013-03-11 Biomarin Pharmaceutical Inc. Métodos de administración de tetrahidrobiopterina, composiciones asociadas y métodos de medición

Cited By (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103458900A (zh) * 2011-03-01 2013-12-18 鲁必康研究私人有限公司 四氢生物蝶呤的稳定组合物
CN106572976A (zh) * 2014-03-31 2017-04-19 瓦索珐姆有限公司 包含生物蝶呤衍生物的固体药物组合物及此类组合物的用途
CN110312721A (zh) * 2016-11-29 2019-10-08 显莎制药公司 墨蝶呤的多晶型物
US11773097B2 (en) 2016-11-29 2023-10-03 Ptc Therapeutics Mp, Inc. Polymorphs of sepiapterin and salts thereof
US11185677B2 (en) 2017-06-07 2021-11-30 Shifamed Holdings, Llc Intravascular fluid movement devices, systems, and methods of use
US11717670B2 (en) 2017-06-07 2023-08-08 Shifamed Holdings, LLP Intravascular fluid movement devices, systems, and methods of use
US11752154B2 (en) 2017-09-01 2023-09-12 Ptc Therapeutics Mp, Inc. Pharmaceutical compositions comprising sepiapterin and uses thereof
US11511103B2 (en) 2017-11-13 2022-11-29 Shifamed Holdings, Llc Intravascular fluid movement devices, systems, and methods of use
CN109946412A (zh) * 2017-12-21 2019-06-28 上海产业技术研究院 一种体液蝶呤谱检测试剂盒及其使用
US11229784B2 (en) 2018-02-01 2022-01-25 Shifamed Holdings, Llc Intravascular blood pumps and methods of use and manufacture
US10722631B2 (en) 2018-02-01 2020-07-28 Shifamed Holdings, Llc Intravascular blood pumps and methods of use and manufacture
CN108813410B (zh) * 2018-07-06 2021-12-14 浙江工商大学 一种降低发酵香肠中生物胺的方法及其应用
CN108813410A (zh) * 2018-07-06 2018-11-16 浙江工商大学 一种降低发酵香肠中生物胺的方法及其应用
US11964145B2 (en) 2019-07-12 2024-04-23 Shifamed Holdings, Llc Intravascular blood pumps and methods of manufacture and use
US11654275B2 (en) 2019-07-22 2023-05-23 Shifamed Holdings, Llc Intravascular blood pumps with struts and methods of use and manufacture
US11724089B2 (en) 2019-09-25 2023-08-15 Shifamed Holdings, Llc Intravascular blood pump systems and methods of use and control thereof
CN112057423A (zh) * 2020-10-21 2020-12-11 兆科药业（广州）有限公司 一种含有盐酸沙丙蝶呤的颗粒剂药物及其制备方法
CN112697919A (zh) * 2020-12-22 2021-04-23 北京和合医学诊断技术股份有限公司 度洛西汀的检测方法

Also Published As

Publication number Publication date
HUE053107T2 (hu) 2021-06-28
US20090076014A1 (en) 2009-03-19
HK1139864A1 (en) 2010-09-30
EP3461503B1 (en) 2022-02-09
USRE43797E1 (en) 2012-11-06
AU2008240259B2 (en) 2013-07-11
EP2545939B1 (en) 2020-12-16
LT3461503T (lt) 2022-03-10
ES2397746T3 (es) 2013-03-11
RU2486899C2 (ru) 2013-07-10
HRP20220188T3 (hr) 2022-04-29
HRP20210239T1 (hr) 2021-04-02
CY1124976T1 (el) 2022-11-25
WO2008128049A3 (en) 2009-11-19
US20110281880A1 (en) 2011-11-17
US20170000793A1 (en) 2017-01-05
EP3461503B9 (en) 2022-05-11
AU2008240259C1 (en) 2022-11-24
SI2545939T1 (sl) 2021-04-30
AU2008240259A1 (en) 2008-10-23
CA2682598A1 (en) 2008-10-23
KR101721198B1 (ko) 2017-03-29
IL201101A0 (en) 2010-05-17
JP2013163691A (ja) 2013-08-22
KR20100016445A (ko) 2010-02-12
KR20160065998A (ko) 2016-06-09
KR20170037676A (ko) 2017-04-04
EP4029519A1 (en) 2022-07-20
DK2545939T3 (da) 2021-02-15
ES2906582T3 (es) 2022-04-19
CY1113543T1 (el) 2016-06-22
DK3461503T3 (da) 2022-02-14
JP2010523708A (ja) 2010-07-15
PT2545939T (pt) 2021-02-17
EP2139485A2 (en) 2010-01-06
DE22154751T1 (de) 2022-09-08
EP3461503A1 (en) 2019-04-03
HUE058030T2 (hu) 2022-06-28
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