JP2010523708A - テトラヒドロビオプテリンを投与する方法、関連する組成物および測定方法 - Google Patents

テトラヒドロビオプテリンを投与する方法、関連する組成物および測定方法 Download PDF

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Abstract

本発明は、経口投薬形、静脈内調合物を含めたテトラヒドロビオプテリンを、食品と共に投与する治療方法に関する。また本明細書では、サンプル中のビオプテリンおよびビオプテリンの代謝産物の量を測定するアッセイも開示される。詳細には、本発明は、６Ｒ−（Ｌ−エリスロ）−５，６，７，８−テトラヒドロビオプテリン（ＢＨ４）、またはその製薬的に許容される塩を、その経口生物学的利用能を改善または最大化する、および／あるいは１回の投与から次の投与までの経口生物学的利用能の一貫性を改善または最適化する方式で投与する方法に関する。このような方法は、代謝性疾患、循環器疾患、貧血、および精神神経障害を含む、いずれのＢＨ４反応性障害の治療にも利用可能である。

Description

関連出願への相互参照
この出願は、２００７年４月１１日に出願された米国仮出願第６０／９２２，８２１号および２００８年１月８日に出願された米国仮出願第６１／０１９，７５３号（これらの開示は、その全体が参考として本明細書に援用される）への優先権を主張する。
分野
本発明は一般に、ＢＨ４反応性障害を治療する組成物および方法、ならびにビオプテリンを検出および定量する方法および組成物に関するものである。
関連技術の背景
テトラヒドロビオプテリン（本明細書ではＢＨ４と呼ぶ）は、フェニルアラニン水酸化酵素（ＰＡＨ）、チロシン水酸化酵素、トリプトファン水酸化酵素および一酸化窒素シンターゼを含む、いくつかの異なる酵素の補助因子である、天然発生型プテリンファミリーの生体アミンである。プテリンは、生理液および組織中に還元形および酸化形で存在するが、５，６，７，８テトラヒドロビオプテリンのみが生物活性である。それはキラル分子であり、補助因子の６Ｒエナンチオマーは、生物活性エナンチオマーであることが公知である。ＢＨ４の合成および障害の詳細な総説については、非特許文献１を参照。
非特許文献２は、経口投与されたテトラヒドロビオプテリン（ＢＨ４）の薬物動態を研究して、「おそらく腸での異なる吸収による、および／または初回通過効果による、経口投与されたＢＨ４のやや大きい変動性」を示唆した。
テトラヒドロビオプテリンの使用は、各種の異なる疾患状態を治療するために提案されており、この薬物を投与する代わりの改良された方法への要求が存在する。
Ｂｌａｕら、Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ ｏｆ ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｂｉｏｐｔｅｒｉｎ ａｎｄ ｒｅｌａｔｅｄ ｂｉｏｇｅｎｉｃ ａｍｉｎｅｓ．Ｉｎ：Ｓｃｒｉｖｅｒ ＣＲ，Ｂｅａｕｄｅｔ ＡＬ，Ｓｌｙ ＷＳ，Ｖａｌｌｅ Ｄ，Ｃｈｉｌｄｓ Ｂ，Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎ Ｂ，ｅｄｓ．Ｔｈｅ Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂａｓｅｓ ｏｆ Ｉｎｈｅｒｉｔｅｄ Ｄｉｓｅａｓｅ．第８版、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ（２００１）１２７５〜１７７６ Ｆｉｅｇｅら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ（２００４）８１：４５〜５１
本発明は、６Ｒ−（Ｌ−エリスロ）−５，６，７，８−テトラヒドロビオプテリン（ＢＨ４）、またはその製薬的に許容される塩を、その経口生物学的利用能を改善または最大化する、および／あるいは１回の投与から次の投与までの経口生物学的利用能の一貫性を改善または最適化する方式で投与する方法に関するものである。このような方法は、代謝性疾患、循環器疾患、貧血、および精神神経障害を含む、いずれのＢＨ４反応性障害の治療にも利用可能である。本発明の方法は、臨床症状のより良好な制御、たとえば血漿フェニルアラニンレベル、血圧、神経伝達物質レベル、または他の臨床パラメータの変動縮小を好都合に可能にする。
本明細書で使用するように、ＢＨ４は、６Ｒ−（Ｌ−エリスロ）−５，６，７，８−テトラヒドロビオプテリンを指す。ＢＨ４という用語は、本明細書で使用するように、文脈が別途指示しない限り、６Ｒ−（Ｌ−エリスロ）−５，６，７，８−テトラヒドロビオプテリンの製薬的に許容される塩を場合により意味することが理解されるはずである。
第１の態様において、本発明は、ＢＨ４の精製調製物をその必要がある患者に経口投与する方法を提供する。
例示的な実施形態において、方法は、テトラヒドロビオプテリンを食品と共に摂取したときに、食品なしで摂取したときと比較して、テトラヒドロビオプテリンの吸収が上昇することを患者に通知するステップを含む。一部の実施形態において、患者は、食事、たとえば高脂肪高カロリー食の直後に摂取すると、以下のパラメータ：平均血漿濃度、Ｃｍａｘ、ＡＵＸ、ＡＵＣ（０−ｔ）および／またはＡＵＣ（ｉｎｆ）のうちいずれか１、２、３個または全部の上昇が生じることを通知される。例示的な実施形態において、患者は、高脂肪食と同時のＢＨ４の投与によって、食品なしのＢＨ４の投与と比較してＣｍａｘおよびＡＵＣが上昇することを通知される。一部の実施形態において、相対的な上昇は、少なくとも２０％または３０％またはそれ以上であることもありうる。
代わりの実施形態において、または先行実施形態に加えて、テトラヒドロビオプテリンを投与する方法は、未処置錠剤として摂取したときには、液体に溶解させた後に摂取したときと比較してテトラヒドロプテリンの吸収が上昇することを患者に通知するステップを含む。一部の実施形態において、患者は、未処置錠剤の摂取によって、次のパラメータ：平均血漿濃度、Ｃｍａｘ、ＡＵＸ、ＡＵＣ（０−ｔ）またはＡＵＣ（ｉｎｆ）のいずれかの上昇が引き起こされることを通知される。例示的な実施形態において、患者は、未処置錠剤としてのＢＨ４の投与によって、液体に溶解させた後のＢＨ４の投与と比較してＣｍａｘおよびＡＵＣが上昇することを通知される。一部の実施形態において、相対的な上昇は、少なくとも２０％またはそれ以上でありうる。
先行する方法のいずれも、患者に上述の吸収パラメータの変化を通知する印刷ラベル表示を含有する容器内のテトラヒドロビオプテリンを供給または投与することによって実施されることがある。
場合により、本発明の方法は、テトラヒドロビオプテリンの治療的有効量をその必要がある患者に提供するステップをさらに含む。治療的有効量は、治療される状態に応じて変わり、所望の臨床症状の改善に基づいて治療担当医がただちに決定することが可能である。
例示的な一実施形態において、このような方法は、ＢＨ４を溶解形で投与するステップを含み、調合物は、これに限定されるわけではないが、水、オレンジジュースおよびリンゴジュースを含む液体に溶解される。例示的な一実施形態において、溶解したＢＨ４は、絶食条件の、すなわち空腹の患者に投与する。本発明は、溶解したＢＨ４を、これに限定されるわけではないが、朝、日中、夜、１日の同じ時刻を含む空腹時の規定の時刻に、１日１回以上投与する。例示的な実施形態において、胃が空であるときに、たとえば食事の少なくとも３０分前、４５分前、または少なくとも１時間前、および／または食事の少なくとも９０分後、または２時間後、または２．５時間後、または３時間後に、組成物を患者に投与する。それゆえ、ＢＨ４は液体製品として、または摂取前に固体または半固体形から事前に溶解した形で摂取してもよい。さらなる実施形態において、ＢＨ４は、溶解溶液を嚥下する前に口腔内で固体形または半固体形から溶解されることもある。
別の例示的な実施形態において、このような方法は、嚥下前にこれに限定されるわけではないが、水、オレンジジュースおよびリンゴジュースを含む液体に溶解させずに嚥下される、これに限定されるわけではないが、錠剤、カプセル剤、キャンディ剤、口内錠、粉剤、および顆粒剤を含む固体投薬形の、またはこれに限定されるわけではないが、ゼリー中の経口スプリンクルを含む半固体形のＢＨ４を投与するステップを含む。一実施形態において、嚥下ＢＨ４は、絶食条件の、すなわち空腹の患者に投与する。本発明は、固体投薬形または半固体投薬形として嚥下されるＢＨ４を、これに限定されるわけではないが、朝、日中、夜、１日の同じ時刻を含む空腹時の規定の時刻に、１日１回以上投与することもさらに考慮する。例示的な実施形態において、胃が空であるときに、たとえば食事の少なくとも３０分前、４５分前、または少なくとも１時間前、および／または食事の少なくとも９０分後、または２時間後、または２．５時間後、または３時間後に、組成物を患者に投与する。
別の実施形態において、このような方法は、固体または半固体投薬形として嚥下されるか、あるいは液体中に溶解されるかにかかわらず、ＢＨ４を食品、たとえば高脂肪食または高脂肪および／または高カロリー食と共に投与するステップを含む。本発明は、ＢＨ４を、嚥下されるか、または溶解されるかにかかわらず、これに限定されるわけではないが、朝、日中、夜、１日の同じ時刻を含む規定の時間に食品、たとえば高脂肪食または高脂肪および／または高カロリー食と共に、１日１回以上投与することもさらに考慮する。例示的な実施形態において、ＢＨ４は毎日１回、固体投薬形として、食事の直後に摂取する。好ましい実施形態において、固体投薬形は錠剤またはカプセル剤として調合される。さらに例示的な実施形態において、ＢＨ４は、食事を摂って約０〜３０分以内、または５〜２０分以内に摂取する。固体投薬形、液体投薬形として、または溶解溶液として摂取されるかにかかわらず、ＢＨ４の生体内曝露（または生物学的利用能）は、絶食対照と比較すると、食事直後に摂取したときのほうが高い。
ＢＨ４および食品は、ほぼ同時に摂取してもよいし、またはＢＨ４を食品の前後に摂取してもよい。食品の消費と、嚥下または溶解のどちらかでのＢＨ４の摂取との間の期間は、少なくとも５分間である。たとえば、ＢＨ４は、食事の前後６０分、３０分、２５分、２０分、１５分、１０分、または５分に投与されることがある。
別の実施形態において、一部の患者、たとえば成人、あるいは一部の疾患状況、たとえば心血管疾患またはＮＯＳ機能不全に関連する他の疾患の場合、本発明の方法は、生物学的利用能を改善するために、液体に錠剤を溶解させるのではなく未処置錠剤を投与するステップを含む。
第２の態様において、本発明は、たとえばプロトン交換ポリマーを使用して腸内ｐＨを低下させることによって、患者の腸管内でＢＨ４を安定化する方法を考慮する。ＢＨ４およびプロトン交換膜などの酸性化賦形剤を含む相当する製品も考慮する。
本発明の第３の態様は、これに限定されるわけではないが、脂肪酸および／またはグリセロール脂肪酸エステルなどの腸運動性を低速化する薬剤を使用する腸運動性の低速化を含む、ＢＨ４の腸貯留時間を延長する方法を考慮する。このような疎水性剤は、ＢＨ４が腸内に留まる時間の長さを延長することが可能であり、吸収されるＢＨ４の量を増加させることが可能である。ＢＨ４が腸内に留まる時間の長さは、このような（複数の）薬剤を用いて調合されるときに、このような薬剤を含まないＢＨ４調合物よりも少なくとも１．５倍、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、または少なくとも５倍長いことが可能である。適切な脂肪酸としては、オレイン酸、ステアリン酸、アラキジン酸、パルミチン酸、アラキドン酸、リノール酸、リノレン酸、エルシジン酸、ミリスチル酸、ラウリン酸、ミリストレイン酸、およびパルミトレイン酸が挙げられる。アルギン酸を使用する胃貯留の誘導、およびポリカルボフィルを使用する生体接着も、ＢＨ４の腸貯留時間を延長するために考慮される。ＢＨ４および腸運動性を低速化する薬剤を含む対応する製品が考慮される。
本発明の第４の態様によって、ＨＰＭＣ、カルボマーなどの持続放出調合物を使用してＢＨ４の放出を調節する方法が考慮される。持続放出調合物である対応する製品が考慮される。
第５の態様において、本発明は、ＢＨ４を滅菌液体または滅菌固体投薬形で、これに限定されるわけではないが、局所、静脈内、皮下、筋肉内、髄腔内、眼科、および吸入投与経路を含む、経口投与以外の経路で投与することを考慮する。このような投与経路に適切な対応する組成物およびキット、ならびにそれを作製する方法が考慮される。たとえば、ＢＨ４をそれぞれ含む経皮または頬側投与用の経皮または頬側パッチが考慮される。ＢＨ４を含む舌下錠も考慮される。ＢＨ４含む吸入器、あるいはＢＨ４および点滴器または噴霧器を備えたキットを含む、適切なキットが考慮される。
一実施形態は、ＢＨ４またはその製薬的に許容される塩の水溶液を含む、テトラヒドロビオプテリン（ＢＨ４）またはその製薬的に許容される塩、抗酸化剤、およびｐＨ緩衝剤の液体調合物を含む。
別の実施形態は、ＢＨ４またはその製薬的に許容される塩を含有する水溶液を提供するステップと、ＢＨ４またはその製薬的に許容される塩を含有する溶液に抗酸化剤およびｐＨ緩衝剤を添加するステップと、抗酸化剤およびｐＨ緩衝剤の添加の前またはその後に、ＢＨ４またはその製薬的に許容される塩を含有する水溶液に不活性ガスまたは二酸化炭素を注入するステップと、ＢＨ４またはその製薬的に許容される塩、抗酸化剤、およびｐＨ緩衝剤を含有する注入溶液を容器内に密閉するステップとを含む、テトラヒドロビオプテリン（ＢＨ４）またはその製薬的に許容される塩の液体調合物を産生する方法を含む。
第６の態様において、本発明は、タンデム質量分析法を利用して、還元型ビオプテリンの量を計算することによってＢＨ４を測定する、改良された方法を考慮する。このような方法は、１５％より低い変動係数（ＣＶ）％（定量下限、ＬＬＯＱにて２０％）によって例示される正確度および精度で、５〜１０００ｎｇ／ｍＬの範囲内のＢＨ４感度まで、ＢＨ４を検出することが可能である。例示的な実施形態において、タンデム質量分析法と組み合わされたＨＰＬＣ（ＲＰ）（ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ）を使用してＢＨ４を測定する方法は：（１）血液、血漿、組織ホモジネート、または尿を酸化に供するステップと；（２）酸化されたサンプルをヨウ素滴定に共するステップと；（３）前記酸化されたサンプルをイオン交換カラムに通過させるステップと；（４）ＨＰＬＣおよびタンデム質量分析法を使用して、前記サンプル中の総ビオプテリンおよび酸化ビオプテリンを測定するステップと；前記酸化形を除いた前記総ビオプテリン間の差として還元型ビオプテリンの量を計算するステップと；を含む。一実施形態において、サンプルは酸性酸化によって処理され、方法は：（１）前記サンプルをＫＣｌ、ＨＣｌまたはＴＣＡで処理するステップと；（２）前記酸性酸化サンプルヨウ素滴定を受けさせるステップと；（３）前記酸化サンプルをイオン交換カラムに通過させるステップと；（４）ＨＰＬＣおよびタンデム質量分析法を使用して、前記サンプル中の６Ｒ−ＢＨ４、Ｒ−ｑ−ＤＨＢＰ（生体内でただちに６Ｒ−ＢＨ４に還元されるので、測定した還元型ビオプテリンは主に６Ｒ−ＢＨ４に基づいている）、ＤＨＢＰ、およびＢＰを含む総ビオプテリンを測定するステップと；を含む。別の実施形態において、サンプルはアルカリ性酸化によって処理され、方法は：（１）前記サンプルをＫＩ、ＩまたはＮａＯＨで処理するステップと；（２）前記アルカリ酸化されたサンプルにＨＣｌまたはＴＣＡによる酸化を受けさせるステップと；（３）前記酸性酸化サンプルヨウ素滴定を受けさせるステップと；（４）前記酸化サンプルをイオン交換カラムで展開させるステップと；（５）ＨＰＬＣおよびタンデム質量分析法を使用して、ＤＨＢＰおよびＢＰを含む酸化型ビオプテリンを測定するステップと；（６）酸化形を除いた総ビオプテリン間の差として、還元型ビオプテリン（６Ｒ−ＢＨ４＋Ｒ−ｑ−ＤＨＢＰ）の量を計算するステップと；を含む。
本発明の別の態様は、メタノール、酢酸ナトリウム、クエン酸、ＥＤＴＡ、および１，４−ジチオエリスリトールを含む水溶液を含む、ジヒドロビオプテリン、ビオプテリン、およびその類似体の逆相ＨＰＬＣ分離のための移動相溶液である。メタノール、酢酸ナトリウム、クエン酸、ＥＤＴＡ、および１，４−ジチオエリスリトールを含む水溶液を含む移動相を使用して、ジヒドロビオプテリンおよびビオプテリン、またはジヒドロビオプテリンの類似体およびビオプテリンの類似体を含有する混合物に逆相ＨＰＬＣを実施するステップを含む、ジヒドロビオプテリンおよびビオプテリン、ならびにその類似体を塩基形およびジヒドロ形の両方を含有する混合物から分離する方法が同様に考慮される。
本発明の別の態様は、ジヒドロビオプテリンおよびテトラヒドロビオプテリン、またはビオプテリンならびにジヒドロビオプテリンおよびテトラヒドロビオプテリンの少なくとも１つの類似体を含む混合物を提供するステップと、逆相ＨＰＬＣによって混合物中のビオプテリン種を分離するステップと、テトラヒドロプテリンおよびその類似体の場合に、存在するテトラヒドロプテリンおよびその類似体を第１の電極によってキノノイドジヒドロビオプテリン形に酸化して、続いてキノノイド形を第２の電極にてテトラヒドロビオプテリンおよびその類似体に還元して戻すことによって電気化学検出を行うステップと、種の濃度を決定するために還元反応によって発生した電流を測定するステップと、および／またはジヒドロビオプテリン、その類似体、ビオプテリン、またはその類似体の場合、ジヒドロビオプテリン種のビオプテリンへのカラム後酸化の後に蛍光検出によってこのような種を測定するステップと；を含む、ビオプテリン種の混合物中のビオプテリンを定量する方法である。
本明細書に記載した組成物および方法の場合、好ましい成分、およびその組成範囲は、本明細書で与える各種の実施例より選択可能である。
本発明の他の特徴および利点は、以下で詳説する説明から明らかになるであろう。しかし、本発明の精神および範囲内の各種の変更および修飾がこの詳説する説明から当業者に明らかになるので、詳説する説明および具体的な実施例は、本発明の好ましい実施形態を示すが、例証のためだけに与えられることを理解すべきである。
６Ｒ−（Ｌ−エリスロ）−５，６，７，８−テトラヒドロビオプテリンの結晶多形形態Ｂを特徴とする、粉末Ｘ線回折パターンを示す。 （６Ｒ）−Ｌ−エリスロ−テトラヒドロビオプテリン二塩酸塩の形態Ａによって示された特徴的なＸ線回折パターンのグラフである。 （６Ｒ）−Ｌ−エリスロ−テトラヒドロビオプテリン二塩酸塩の形態Ｆによって示された特徴的なＸ線回折パターンのグラフである。 （６Ｒ）−Ｌ−エリスロ−テトラヒドロビオプテリン二塩酸塩の形態Ｊによって示された特徴的なＸ線回折パターンのグラフである。 （６Ｒ）−Ｌ−エリスロ−テトラヒドロビオプテリン二塩酸塩の形態Ｋによって示された特徴的なＸ線回折パターンのグラフである。 （６Ｒ）−Ｌ−エリスロ−テトラヒドロビオプテリン二塩酸塩の水和物形態Ｃによって示された特徴的なＸ線回折パターンのグラフである。 （６Ｒ）−Ｌ−エリスロ−テトラヒドロビオプテリン二塩酸塩の水和物形態Ｄによって示された特徴的なＸ線回折パターンのグラフである。 （６Ｒ）−Ｌ−エリスロ−テトラヒドロビオプテリン二塩酸塩の水和物形態Ｅによって示された特徴的なＸ線回折パターンのグラフである。 （６Ｒ）−Ｌ−エリスロ−テトラヒドロビオプテリン二塩酸塩の水和物形態Ｈによって示された特徴的なＸ線回折パターンのグラフである。 （６Ｒ）−Ｌ−エリスロ−テトラヒドロビオプテリン二塩酸塩の水和物形態Ｏによって示された特徴的なＸ線回折パターンのグラフである。 （６Ｒ）−Ｌ−エリスロ−テトラヒドロビオプテリン二塩酸塩の溶媒和物形態Ｇによって示された特徴的なＸ線回折パターンのグラフである。 （６Ｒ）−Ｌ−エリスロ−テトラヒドロビオプテリン二塩酸塩の溶媒和物形態Ｉによって示された特徴的なＸ線回折パターンのグラフである。 （６Ｒ）−Ｌ−エリスロ−テトラヒドロビオプテリン二塩酸塩の溶媒和物形態Ｌによって示された特徴的なＸ線回折パターンのグラフである。 （６Ｒ）−Ｌ−エリスロ−テトラヒドロビオプテリン二塩酸塩の溶媒和物形態Ｍによって示された特徴的なＸ線回折パターンのグラフである。 （６Ｒ）−Ｌ−エリスロ−テトラヒドロビオプテリン二塩酸塩の溶媒和物形態Ｎによって示された特徴的なＸ線回折パターンのグラフである。 ビオプテリン測定のフローチャートである。 ビオプテリンアッセイの検証のまとめである。 サプロプテリン（ＢＨ４）のラットへの１回経口投与後の血漿中での総ビオプテリンの薬物動態パラメータを示す表である。 サプロプテリン（ＢＨ４）のラットへの１回経口投与後の、血漿ビオプテリン濃度と還元形率を示す。 サルでのサプロプテリン（ＢＨ４）の１回経口投与後の、血漿ビオプテリン濃度と還元形率を示す。 サプロプテリン（ＢＨ４）のサルへの１回経口投与後の血漿中での総ビオプテリンの薬物動態パラメータを示す表である。 安全性評価のためのイベントのスケジュールを示す。 健常志願者への絶食条件下での溶解錠剤および未処置錠剤ならびに摂食条件下での未処置錠剤としての１０ｍｇ／ｋｇ ＢＨ４の経口投与後の、ＢＨ４の平均血漿濃度を示す−線形軸。 健常志願者への絶食条件下での溶解錠剤および未処置錠剤ならびに摂食条件下での未処置錠剤としての１０ｍｇ／ｋｇ ＢＨ４の経口投与後の、ＢＨ４の平均血漿濃度を示す−片対数軸。 健常志願者への絶食条件下での溶解錠剤および未処置錠剤ならびに摂食条件下での未処置錠剤としての１０ｍｇ／ｋｇ ＢＨ４の経口投与後の、ＢＨ４の薬物動態パラメータをまとめた表を示す。 健常志願者への絶食条件下での溶解錠剤および未処置錠剤ならびに摂食条件下での未処置錠剤としての１０ｍｇ／ｋｇ ＢＨ４の経口投与後の、ＢＨ４の薬物動態パラメータの統計的比較を示す。 −２０℃での２週間にわたる貯蔵の前後両方の水溶液中の５％マンニトールによって調合されたＢＨ４の安定性試験を示す。 ４０℃での５４日間にわたる貯蔵の前後両方のＢＨ４カプセル調合物の溶解プロフィールを示す。 ２つのＢＨ４調合物−ＢＨ４生体接着錠剤およびＢＨ４生体接着顆粒剤の溶解プロフィールを示す。 ＢＨ４の各種の持続放出調合物の溶解プロフィールを示す。 ＢＨ４の各種の持続放出調合物の溶解プロフィールを示す。 ＢＨ４の浮遊投薬調合物の概略図を示す。 各種の浮遊投薬調合物の溶解プロフィールを示す。 ＢＨ４のガス発生投薬調合物の概略図を示す。 各種のＢＨ４調合物の薬物動態プロフィールを示す。 ｐＨ４にて３５日間にわたる静脈内ＢＨ４調合物の安定性試験を示す。 ３５０時間にわたる各種の静脈内ＢＨ４調合物の安定性試験を示す。 各種のＢＨ４濃度における静脈内ＢＨ４調合物の安定性試験を示す。
本発明は、その製薬的に許容される塩を含む、６Ｒ−（Ｌ−エリスロ）−５，６，７，８−テトラヒドロビオプテリンの精製調製物を経口投与する改良方法を提供する。本発明は、経口投与されたテトラヒドロビオプテリン（ＢＨ４）の消化管吸収が低く、これがＢＨ４の生物学的利用能が低い主な要因であることに基づいている。
６Ｒ−（Ｌ−エリスロ）−５，６，７，８−テトラヒドロビオプテリン（ＢＨ４）の化学構造を下に示す：
テトラヒドロビオプテリンは、脂溶性の低い水溶性有機化合物である。ＢｉｏＬｏｏｍソフトウェア（カリフォルニア州クレアモントのＢｉｏｂｙｔｅ Ｃｏｒｐによるバージョン１．５）を使用するコンピュータでの実験解析に基づいて、ＢＨ４のオクタノール−水分配係数は−１．１７と決定された。オクタノール−水分配係数によって概算した生体膜の最適な浸透は、２のｌｏｇＰまたは１００倍高い脂溶性の付近で起こる。低いＣｌｏｇＰによってこの基質を生理学的条件下でただちに溶解させることができるが、基質が生体膜内の脂質二重層に浸透する能力は限定されており、これにより経口利用能を制限されることがある。
本明細書に記載するラットおよびサルでの生体内試験により、同様の用量でのＢＨ４の静脈内投与と比較して、ＢＨ４のわずか８〜１１％が腸で吸収され、大部分が糞便中に排出されていることが示された。ＢＨ４吸収のこのような可変性は、本明細書に記載した、健康なヒトでのＢＨ４の生物学的利用能に対する食品の効果に関する試験でも示された。絶食条件下での水およびオレンジジュース中のＢＨ４の投与によって、比較可能な平均血漿濃度ならびにＣｍａｘおよびＡＵＣ（０−ｔ）の平均値が生じるが、高脂質高カロリー食と同時のＢＨ４の投与では、ＢＨ４を水中で投与したときに平均血漿濃度ならびにＣｍａｘおよびＡＵＣ（０−ｔ）の平均値の著しい上昇が生じる。
摂食条件での生物学的利用能の向上について記載した十分な文献はあるが、この食品の効果は通例、親油性（すなわち油溶性）非水溶性薬で見られ、ＢＨ４などの高水溶性活性物質では通常見られない。摂食条件下での親油性化合物の生物学的利用能が上昇することは、「似たものは似たものを溶解させる」ので高脂肪食が薬物の可溶化を助長して、このことによって薬物が吸収に利用できるようになるためであると、通常は説明されている。別の考えられる説明は、高脂肪食が天然の生物界面活性剤である胆汁酸の分泌を刺激して、我々が食べる脂肪を乳化してその消化を助けるということである。これらの胆汁酸も、非水溶性化合物であると考えられ、そのことにより胆汁酸が吸収に利用できるようなる。しかし、ＢＨ４はその溶解性が１０００ｍｇ／ｍＬより大きく、公知の最も溶解性の薬物の１つであるため、ＢＨ４は吸収されるために可溶化する必要はない。したがって高脂肪高エネルギー食によるその生物学的利用能の向上は、このような公知の機構と一致していない。
しかし、固体または半固体投薬形としての、および／または高脂肪食との投与によって、ＢＨ４が化学的に安定である酸性環境の胃および上部消化管（ＧＩＴ）でのＢＨ４の貯留時間を延長することによって、生物学的利用能が最大化することがある。ＢＨ４の安定性は、ｐＨの上昇と共に低下して、おおよそ小腸のｐＨであるｐＨ６．８緩衝溶液中でのその半減期は、約１５分である。健常志願者の胃の代表的なｐＨの範囲内であるｐＨ３．１では、１ｍｇ／ｍＬの濃度におけるＢＨ４の安定性は３時間を超える。ＢＨ４の化学安定性は、胃のｐＨがｐＨ３．１以下に低下するときにさらに上昇することがある。したがって胃貯留時間の延長によって未処置の薬物を吸収のために胃壁に供給するが、腸への迅速な放出によってＢＨ４が分解され、それゆえ吸収に利用することができない。
それゆえ、各投与でのＢＨ４の経口生物学的利用能を最大化するために、ＢＨ４を食品、たとえば高脂肪食品あるいは高脂肪および／または高カロリー食と共に摂取すべきである。あるいは、投与間での経口生物学的利用能の一貫性を最大化するために、ＢＨ４は胃が空の状態で（たとえば食事の１時間前または２時間後）に摂取すべきである。
本明細書で使用するように、「生物学的利用能」という用語は、体循環に入る薬物の投与された用量の割合を指す。薬物が静脈内投与された場合、ここでその生物学的利用能は理論的に１００％であろう。しかし、薬物が他の経路（経口的など）によって投与された場合、ここでその生物学的利用能は、たとえば消化管での不完全な吸収、吸収前の分解または代謝、および／または肝臓の初回通過効果の結果として、１００％未満であろう。
「高脂肪食」という用語は一般に、少なくとも約７００ｋｃａｌで、脂肪が少なくとも約４５％（脂肪であるｋｃａｌの相対パーセンテージ）、あるいは少なくとも約９００ｋｃａｌで脂肪が少なくとも約５０％の食事を指す。「高脂肪食品」という用語は一般に、脂肪を少なくとも２０ｇ、または脂肪を少なくとも２５、３０、３５、４０、４５、または５０ｇ、および／または脂肪を少なくとも４５％または５０％含む食品を指す。ＦＤＡ指針の１つは、「高脂肪食」を食事の総カロリー量の約５０％として定義しているが、「高カロリー食」は約８００〜１０００カロリーである。ＦＤＡは、高脂肪および高カロリー食を、食品効果生物学的利用能および摂食生物学的同等性評価の試験食として、推奨している。この試験食は、タンパク質、炭水化物および脂肪それぞれから約１５０、２５０、および５００〜６００カロリーを得るべきである。試験食の一例は、バターで作った目玉焼き２個、ベーコン２切れ、ハッシュ・ブラウン・ポテト４オンスおよび全乳８オンスを含む。タンパク質、炭水化物、および脂肪から同様のカロリー量が比較可能な食事の量および粘度を有する場合、代用も可能である（Ｇｕｉｄａｎｃｅ ｆｏｒ Ｉｎｄｕｓｔｒｙ，Ｆｏｏｄ−Ｅｆｆｅｃｔ Ｂｉｏａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ Ｆｅｄ Ｂｉｏｅｑｕｉｖａｌｅｎｃｅ Ｓｔｕｄｉｅｓ，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，Ｆｏｏｄ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ，Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｄｒｕｇ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（ＣＤＥＲ），Ｄｅｃｅｍｂｅｒ ２００２）。
第１の態様において、本発明は、その製薬的に許容される塩を含む、６Ｒ−（Ｌ−エリスロ）−５，６，７，８−テトラヒドロビオプテリン（ＢＨ４）の精製調製物を経口投与する方法を提供する。
一部の実施形態において、方法は、食品と一緒のテトラヒドロビオプテリンの投与が薬物動態に影響を有することを患者に通知することを含む。例示的な実施形態において、方法は、テトラヒドロビオプテリンを食品と共に摂取したときに、食品なしで摂取したときと比較して、テトラヒドロビオプテリンの吸収が上昇することを患者に通知するステップを含む。一部の実施形態において、患者は、食事、たとえば高脂肪高カロリー食の直後に摂取すると、以下のパラメータ：平均血漿濃度、Ｃｍａｘ、ＡＵＸ、ＡＵＣ（０−ｔ）および／またはＡＵＣ（ｉｎｆ）のうちいずれか１、２、３個または全部の上昇が生じることを通知される。例示的な実施形態において、患者は、高脂肪食と同時のＢＨ４の投与によって、食品なしの（絶食状態での）ＢＨ４の投与と比較してＣｍａｘおよびＡＵＣが上昇することを通知される。一部の実施形態において、相対的な上昇は、少なくとも２０％または３０％またはそれ以上であることもある。
代表的な実施形態において、または先行実施形態に加えて、テトラヒドロビオプテリンを投与する方法は、未処置錠剤として摂取したときには、液体に溶解させた後に摂取したときと比較してテトラヒドロプテリンの吸収が上昇することを患者に通知するステップを含む。一部の実施形態において、患者は、未処置錠剤の摂取によって、次のパラメータ：平均血漿濃度、Ｃｍａｘ、ＡＵＣ、ＡＵＣ（０−ｔ）またはＡＵＣ（ｉｎｆ）のいずれかの上昇が引き起こされることを通知される。例示的な実施形態において、患者は、未処置錠剤としてのＢＨ４の投与によって、液体に溶解させた後のＢＨ４の投与と比較してＣｍａｘおよびＡＵＣが上昇することを通知される。一部の実施形態において、相対的な上昇は、少なくとも２０％またはそれ以上であることもある。
先行する方法のいずれも、患者に上述の吸収パラメータの変化を通知する印刷ラベル表示を含有する容器内のテトラヒドロビオプテリンを供給または投与することによって実施されることがある。
場合により、本発明の方法は、テトラヒドロビオプテリンの治療的有効量をその必要がある患者に提供するステップをさらに含む。治療的有効量は、治療される状態に応じて変わり、所望の臨床症状の改善に基づいて治療担当医がただちに決定することが可能である。
例示的な一実施形態において、このような方法は、ＢＨ４を溶解形で投与するステップを含み、調合物は、これに限定されるわけではないが、水、オレンジジュースおよびリンゴジュースを含む液体に溶解される。一実施形態において、溶解したＢＨ４は、絶食条件の、すなわち空腹の患者に投与する。本発明は、溶解したＢＨ４を、これに限定されるわけではないが、朝、日中、夜、１日の同じ時刻を含む規定の時刻の空腹時に、１日１回以上投与する。例示的な実施形態において、胃が空であるときに、たとえば食事の少なくとも３０分前、４５分前、または少なくとも１時間前、および／または食事の少なくとも９０分後、または２時間後、または２．５時間後、または３時間後に、組成物を患者に投与する。それゆえ、ＢＨ４は液体製品として、または摂取前に固体または半固体形から事前に溶解した形で摂取してもよい。さらなる実施形態において、ＢＨ４は、溶解溶液を嚥下する前に口腔内で固体形または半固体形から溶解されることもある。
このような手法は、ＢＨ４が、主に胃または腸であるその吸収部位に送達される前に溶液または生体液に完全に溶解させることによって、吸収率および生物学的利用能を最大化する。活性製薬的成分または薬物を溶液に溶解することは、体（血液およびリンパ液）循環への吸収の前提条件である。錠剤およびカプセル剤などの固体投薬形が経口投与されるとき、固体投薬形は、顆粒への崩壊、粉末への脱凝集および体循環への吸収前の溶解などの連続した一連のステップを通過する。このような一連のステップは、液体、半固体および高速溶解固体投薬形を投与することによってバイパスされる。それゆえ活性成分は吸収のためにより早期に利用可能であり、固体投薬形がそれに含有される活性物質すべてを、固体投薬形が吸収部位を通過する前に放出するという保証はないため、活性物質が吸収部位に到達する前に溶解形で存在する調合物は通常、より大きい生物学的利用能を示す。
このような投薬形が血中濃度の可変性を低下させるのは、可変性が投薬形の崩壊であり、ヒトでの生体内溶解が不必要になるためである。胃での即時放出を標的としたＢＨ４の固体投薬形の生体内崩壊および溶解の速度は、摂食時および非摂食時（空腹時の）胃液のｐＨのヒト間での可変性と、胃運動性の強度および小腸への胃排出速度によって決定される胃の撹拌強さの強度とによって変わる。液体、半固体、口内錠／キャンディ剤および高速溶解固体投薬形は、崩壊または溶解を受ける必要がないので、その血中濃度は、ＢＨ４が即時放出固体投薬形（たとえば錠剤およびカプセル剤）として投与されるときよりも、変化しにくい。
別の例示的な実施形態において、このような方法は、嚥下前にこれに限定されるわけではないが、水、オレンジジュースおよびリンゴジュースを含む液体に溶解させずに咀嚼または嚥下される、これに限定されるわけではないが、錠剤、カプセル剤、キャンディ剤、口内錠、粉剤、および顆粒剤を含む固体投薬形の、またはこれに限定されるわけではないが、ゼリー中の経口スプリンクルを含む半固体形のＢＨ４を投与するステップを含む。一実施形態において、嚥下ＢＨ４は、絶食条件の、すなわち空腹の患者に投与する。本発明は、固体投薬形または半固体投薬形として嚥下されるＢＨ４を、これに限定されるわけではないが、朝、日中、夜、１日の同じ時刻を含む空腹時の規定の時刻に、１日１回以上投与することもさらに考慮する。例示的な実施形態において、胃が空であるときに、たとえば食事の少なくとも３０分前、４５分前、または少なくとも１時間前、および／または食事の少なくとも９０分後、または２時間後、２．５時間後、または３時間後に、組成物を患者に投与する。
別の実施形態において、このような方法は、固体または半固体投薬形として嚥下されるか、あるいは液体中に溶解されるかにかかわらず、ＢＨ４を食品、たとえば高脂肪食または高脂肪および／または高カロリー食と共に投与するステップを含む。本発明は、ＢＨ４を、嚥下されるか、または溶解されるかにかかわらず、これに限定されるわけではないが、朝、日中、夜、１日の同じ時刻を含む規定の時刻に、食品、たとえば高脂肪食または高脂肪および／または高カロリー食と共に、１日１回以上投与することもさらに考慮する。例示的な実施形態において、ＢＨ４は毎日１回、固体投薬形として、食事の直後に摂取される。好ましい実施形態において、固体投薬形は錠剤またはカプセル剤として調合される。さらに例示的な実施形態において、ＢＨ４は、食事を取って約０〜６０分以内、約０〜３０分以内、または５〜２０分以内に摂取する。固体投薬形、液体投薬形として、または溶解溶液として摂取されるかにかかわらず、ＢＨ４の生体内曝露（または生物学的利用能）は、絶食対照と比較すると、食事直後に摂取したときのほうが高い。
ＢＨ４および食品は、ほぼ同時に摂取してもよいし、またはＢＨ４を食品の前後に摂取してもよい。食品、たとえば高脂肪食品あるいは高脂肪および／または高カロリー食の消費と、嚥下または溶解のどちらかでのＢＨ４の摂取との間の期間は、少なくとも５分間である。ＢＨ４は、食事の摂取後６０分、３０分、２５分、２０分、１５分、１０分、または５分に投与されることがある。
別の実施形態において、一部の患者、たとえば成人、あるいは一部の疾患状況、たとえば心血管疾患またはＮＯＳ機能不全に関連する他の疾患の場合、本発明の方法は、生物学的利用能を改善するために、液体に錠剤を溶解させるのではなく未処置錠剤を投与するステップを含む。
本発明の方法によるＢＨ４の投与によって、ＢＨ４が絶食条件下で投与されるときの値を超える、平均血漿濃度ならびに／あるいは胃腸吸収率ならびに／あるいはＣｍａｘおよび／またはＡＵＣ（０−ｔ）および／またはＡＵＣ（ｉｎｆ）の平均値が得られる。
絶食条件下での未処置錠剤の投与によって、溶解した錠剤と比較して、ＣｍａｘおよびＡＵＣの平均２０％の上昇が生じた。水またはオレンジジュースのどちらかの中での溶解した錠剤の、あるいは高脂肪／高カロリー食後の未処置錠剤の投与によって、約３０％（未処置錠剤）〜８０％（水）に及ぶＣｍａｘおよびＡＵＣの上昇が生じた。高脂肪および高カロリー食後の未処置錠剤としてのＢＨ４の投与によって、食品なしの投与と比較して、吸収の程度の約３０％の上昇が生じた。未処置錠剤としてのＢＨ４の投与によって、溶解した錠剤の投与と比較して、吸収の程度の約２０％の上昇が生じた。
「平均血漿濃度」は、一連の血漿サンプル中の濃度の測定値の平均を意味する。
「Ｃｍａｘ」は、最大の観測された血漿濃度を意味する。
「ＡＵＣ」は、血漿濃度−時間曲線下面積を意味する。
「ＡＵＣ０−ｔ」は、時間０から最後の測定可能な濃度の時間までの血漿濃度−時間曲線下面積を意味する。
「ＡＵＣ（ｉｎｆ）」は、時間０から無限までの計算された血漿濃度−時間曲線下面積を意味する。
ＢＨ４の「胃腸吸収率」は、ＢＨ４投与後の血漿総ビオプテリン濃度上昇（ΔＣｐ）−時間曲線下面積（ΔＡＵＣ）から、次の式を使用して概算される：
吸収率（％）＝（経口投薬後のΔＡＵＣ／静脈内投薬後のΔＡＵＣ）×（静脈内投薬／経口投薬×１００）
好ましくは、少なくとも９９．５％の純６Ｒ−ＢＨ４を使用する。ＢＨ４の二塩酸塩を含むいずれの塩、およびいずれの結晶形も、本発明の方法および組成物に従って利用できる。多様な塩および結晶形がその全体が、参照により本明細書に組み込まれている米国特許出願公開第２００６／００４０９４６号明細書に記載されており、および／または安定な固体調合物は、その全体が参照によりまた本明細書に組み込まれている国際公開第０６／５５５１１号パンフレットに記載されている。多様な結晶形が、経口投与用の錠剤、粉剤または他の固体に好都合に形成されることがある。
第２の態様において、本発明は、プロトン交換ポリマーを使用して腸ｐＨを低下させることによってＢＨ４を安定化する方法を考慮する。ＢＨ４は、腸のｐＨを低下させて、それによりＢＨ４が迅速に酸化されるのを防止することによって胃を越えるＢＨ４の安定性を向上させる不活性成分を含む、固体また液体投薬形として毎日経口投与される。ＢＨ４は塩基性媒質中よりも酸性媒質中で安定であるため、酸性化賦形剤／不活性成分は、腸液のｐＨを低下させて、それにより化学安定性を向上させるために、ＢＨ４の固体投薬（錠剤、カプセル剤など）調合物に含まれる。吸収に利用可能な胃腸管（ＧＩＴ）のより大きな面積またはウィンドウは、胃および十二指腸から腸に限定されると考えられる、現在の制限された吸収ウィンドウを拡張することによって、吸収の一貫性を最適化する。このような投薬形は、これに限定されるわけではないが、発泡錠、粉剤および顆粒剤（投与前に液体中で再懸濁される）、および酸性化剤物質が挙げられる。小型分子酸とは異なり、かさ高いポリマー酸はＧＩＴ中により長く残存して、ＧＩＴによって吸収されないが、そのプロトンをＧＩＴ液に供与して環境ｐＨを低下させる。調合物を構成する賦形剤／不活性成分の例は、マレイン酸、フマル酸およびクエン酸などのカルボン酸小型分子またはリン酸、酢酸およびその塩形などの無機小型分子である。他の例は、ポリメタクリル酸、カルボマー、ポリカルボフィル、オイドラギット、クロスカルメロースおよびデンプングリコール酸などの酸形を含むポリマーカルボン酸クラスなどの製薬的に許容される酸である。調合物は、抗酸化剤（たとえばシステイン、Ｎ−アセチルシステインなどのチオール；アスコルビン酸；メチオニンなど）などの安定性を向上させるためのさらなる賦形剤ならびに製造性を可能にして、調合物の品質および性能属性を向上させるために当分野で公知の他の賦形剤も含有する。
本発明の第３の態様は、これに限定されるわけではないが、脂肪酸および／またはグリセロール脂肪酸エステルなどの、ＢＨ４の腸運動性の低速化が可能である薬剤を使用する腸運動性の低速化を含む、ＢＨ４の腸貯留時間を延長する方法を考慮する。脂肪酸としては、オレイン酸、ステアリン酸、アラキジン酸、パルミチン酸、アラキドン酸、リノール酸、リノレン酸、エルシジン酸、ミリスチル酸、ラウリン酸、ミリストレイン酸、およびパルミトレイン酸が挙げられる。アルギン酸を使用する胃貯留の誘導、およびポリカルボフィルを使用する生体接着も、ＢＨ４の腸貯留時間を延長するために考慮される。一実施形態において、ＢＨ４の投薬形は、胃液中で浮遊して定義された方法でＢＨ４を放出して経口浮遊調合物として投与され、経口浮遊調合物は、胃中で浮遊しないまたは迅速に溶解する調合物よりも、胃からの胃排出に耐性であるために、胃中により長期間保持される。この設計手法は、投薬形内の気体発生賦形剤、投薬形をＧＩＴ液中で浮遊させる低密度賦形剤またはＧＩＴの液体内容物中での投薬形の浮遊を可能にするための投薬形中のガスおよび低密度物質の組合せによる、投薬形の胃内保持に基づいている。ＢＨ４がその酸性液中でより安定である胃環境での投薬形の長期保持および放出によって、胃での投薬形の貯留時間が延長されるともに、ＢＨ４の安定性が向上して、それゆえ標準の錠剤およびカプセル剤投薬形よりも、ＢＨ４が胃および十二指腸でのより長期の吸収に利用できるようになる。ＢＨ４の調合物は、１種以上の抗酸化剤、固体投薬形の製造および崩壊／溶解を可能にするための当分野で公知の賦形剤ならびに調合物と水性媒質およびまたはＧＩＴ液の接触時に気体または気体混合物（たとえば二酸化炭素）を発生するさらなる賦形剤を含むであろう。水溶性抗酸化剤、たとえばアスコルビン酸、メチオニン、およびチオール（システイン、Ｎ−アセチルシステインおよびグルタチオン）またはＧＩＴ中で水溶性抗酸化剤に変換される抗酸化剤、たとえばＧＩＴ中でアスコルビン酸に変換されるパルミチン酸アスコルビルが好ましい。調合物に添加される賦形剤としては、ＢＨ４と直接反応して二酸化炭素を形成する炭酸塩および重炭酸塩ならびに炭酸塩および重炭酸塩と反応して必要に応じてさらなる二酸化炭素を産生する、先に記載した小型およびポリマー酸が挙げられる。
別の実施形態において、ＧＩＴの粘膜表面に長時間付着するＢＨ４の投薬形（すなわち生体接着調合物）は、好ましくは、しかし決してこれに限定されるわけではないが、胃液の酸性度のために、ＢＨ４が腸よりも安定である胃内に投与される。ＢＨ４は生体接着投薬形から制御された方式で放出される。固体投薬形は、ＢＨ４、１種以上の抗酸化剤、良質の投薬形の製造を可能にして、投薬形の崩壊／溶解を制御する当分野で公知の賦形剤およびその遊離酸形または塩形のポリカルボフィルなどの生体接着剤を含有するように設計される。ポリメタクリル酸、カルボマーおよびセルロース誘導体などの他のポリマー酸、たとえばＨＰＭＣ、ＨＰＣなどをポリカルボフィルと組合せても、またはポリカルボフィルに代えてもよい。抗酸化剤、たとえばアスコルビン酸、メチオニン、システイン、Ｎ−アセチルシステインおよびグルタチオンは好ましくは溶解性であるか、またはＧＩＴ中で溶解性の抗酸化剤、たとえばパルミチン酸アスコルビルに変換可能である。一実施形態において、調合物の成分は共にブレンドされて、固体投薬形、たとえば錠剤またはカプセル剤として製造される。固体投薬形は、胃を通過して腸内までＢＨ４を送達するために腸溶コーティングしてもよく、または胃内でＢＨ４を放出するために腸溶コーティングしない設計でもよい。別の実施形態において、固体投薬形の成分は各種の部分に再分割されることがあり、各種の部分が個別にブレンドされてから、処理されて多層投薬形を形成する。多層投薬形は、ＢＨ４を含有する他の層（すなわち生体接着エンベロープ内部の活性領域）を包囲した錠剤の最外層中に、または１つ以上の他の層が生体接着エンベロープの下または中に集められたカプセル中に充填された包囲円筒栓として、生体接着剤および２、３の賦形剤を含有することがある。あるいは、錠剤またはカプセル栓中の生体接着剤および他の層は、平行２層または多層構造として積層されることがある。これらの設計により、生体接着剤はＧＩ膜またはＧＩ膜粘液と相互作用して投薬形を膜に固着させ、消化管内のその通過を低速化させて、それゆえ貯留時間を延長する。このような投薬形は腸溶コーティングしてもよい。ＢＨ４で使用される方法のなお別の実施形態は、ＧＩＴ粘液に結合して投薬形の消化管内の通過を遅らせる官能基を備えたポリマー活性成分（賦形剤）を利用することである。ＢＨ４の投薬形は、ポリカルボフィル−システイン、ポリポリメタクリル酸−システイン、カルボキシメチルセルロース−システイン、キトサン誘導体−システインなどのチオール化ポリマー賦形剤（ポリマー−ＳＨ）を用いて調合される。チオール化ポリマーは、ＢＨ４に生物接着特性および抗酸化特性を与え、吸収をかなり向上させる。これらの調合物に含まれる他の賦形剤は、抗酸化剤ならびに性能および製造補助賦形剤である。
なお別の実施形態において、不活性賦形剤または活性成分を含有する経口投薬形を使用して胃運動性を低速化させる。ＧＩＴ管内のＢＨ４投薬形による通過の低速化は、分子の貯留時間を延長して、それゆえ投薬した用量のより大きい割合を吸収させることができるであろう。胃排出を遅延させるおよび／または腸運動性を遅延させるために経口調合物で利用される一般的に安全と認められる（ＧＲＡＳ）賦形剤は、好ましくは、脂肪酸、脂肪酸のグリセリド、および脂肪酸の誘導体などの食物脂肪およびクレモホール（商標）（ポリオキシルヒマシ油誘導体）などのグリセリドを含む。活性賦形剤としては、一般的または選択的（Ｍ３）抗ムスカリン剤または抗コリン剤などの腸運動性を低速化する薬剤が挙げられる。
本発明の第４の態様によって、ＨＰＭＣ、カルボマーなどの持続放出調合物を使用してＢＨ４の放出を調節する方法が考慮される。この概念は、ＢＨ４の放出を即時放出から低速、長期、制御およびまたは持続放出に改良または変更することによって、ＢＨ４投薬形を消化管に送達することを含む。低速、長期、および制御放出は、当分野で公知の賦形剤を使用して達成され、ＢＨ４は送達形内で化学分解から抗酸化剤などの安定性向上剤の存在によって保護される。このような方法は、ＢＨ４が調合物中および調合物を取り巻く環境で安定化されて、調合物がＧＩＴの全長を通過するときに活性分子が未処置のまま体循環に吸収できるようにするため、生物学的利用能を最大化することができる。この手法は、ＧＩＴのより大きなウィンドウを与え、ＢＨ４に吸収に利用できるようにより高いｐＨ環境でのＢＨ４の分解を防止することによって、ＧＩＴのより大きなウィンドウを与える。腸液の中性に近いｐＨのために薬物が腸液中で分解されるのを防止するために、抗酸化剤が調合物に含まれるであろう。低速、長期および制御送達は、ＢＨ４をＧＩＴの低酸素圧領域にも送達するであろう。持続放出は、ポリマーが溶解性である値にｐＨが達したときにのみ溶解するｐＨ感受性ポリマーなどの、当分野で公知の賦形剤を使用して達成される。
別の実施形態において、本発明は、ＢＨ４の調合物に酸性賦形剤を含めることが腸のｐＨを低下させ、それによりＢＨ４を吸収に利用できるように腸内で安定化させることによって、ＢＨ４の吸収が実際に向上するか否かを確認するために、ＢＨ４投薬形の腸溶コーティングを考慮する。それゆえ、腸溶コーティングは、賦形剤がＢＨ４を保護することを期待される部位にて賦形剤および薬物を共に保持するために使用されるであろう。ＢＨ４投薬形が胃内で崩壊される場合、酸性賦形剤は共に胃内へ排出されず、保護を与えないことがある。
腸溶コーティングは、胃内で酸触媒崩壊を受けやすい化合物が胃内で酸によって分解されるのを防止する。腸溶コーティング物質は酸に不溶性物質であるため、腸溶コーティング物質は錠剤またはカプセル剤が胃内で活性化合物を放出するのを防止する。ｐＨ値がｐＨ５〜８で変化する腸に腸溶コーティング投薬形が到達すると、物質は溶解性となり、活性物質を腸で放出する。対照的に、持続放出調合物は、薬剤をＧＩＴの長さ／面積にわたって可能な限り長く放出するように設計される。胃を通過したところで放出する持続放出調合物のコーティングは、その中に含有される薬剤が酸に不安定である場合のみに必要である。
第５の態様において、本発明は、ＢＨ４を滅菌液体または滅菌固体投薬形で、これに限定されるわけではないが、局所、静脈内、皮下、筋肉内、髄腔内、眼科、および吸入投与経路を含む、経口投与以外の経路で投与することを考慮する。ＢＨ４は、所望の適切な濃度で滅菌液体または固体投薬形として調合される。
静脈内投与用のＢＨ４の滅菌液体投与形の利点としては：（１）より高い血清中濃度の可能性と共に、より予測しやすい動態；（２）機能的な消化管の必要なし；（３）患者が関与する必要なし；（４）服薬不履行の懸念なし；が挙げられる。ＢＨ４の静脈内調合物は、これに限定されるわけではないが、狂犬病、髄膜炎、臓器移植／保存、くも膜下出血、脳外傷、脳卒中、冠動脈バイパス手術、脳血管痙攣、輸血／保存、肺高血圧、鎌状赤血球症、子癇前症、および化学療法後血管疾患を含む、全身または経口または他の送達形式によるアクセスが通常困難な体の部分への流体または薬剤の迅速な送達を必要とする状態を管理するのに特に有益である可能性がある。
ＢＨ４は、水溶液中または生理的ｐＨ水溶液中での酸化を非常に受けやすい（Ｄａｖｉｓら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１７３，３４５−３５１（１９８８）；Ｋｉｒｓｃｈら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８，２４４８１−２４４９０（２００３））。ＢＨ４安定性の決定はたいてい、生理的血漿ｐＨ条件下でのＢＨ４の起こりうる安定性挙動を模倣するために、中性から弱アルカリ性のｐＨ７．４溶液中で実施されてきた。欧州特許出願第１ ７５７ ２９３Ａ号明細書は液体またはシロップ調合物を開示しているが、このような調合物は経口摂取前に水による再構成を必要とする固体状態粉末ブレンドおよび顆粒より成る。本発明の本態様は、構成のための粉末または顆粒に限定されない液体調合物を考慮する。本発明は、液体製品としてアンプル、ボトルまたはバイアルに充填される、または凍結乾燥させて凍結乾燥製品とするためにバイアルに充填される滅菌製品充填／仕上げ設備での処理を可能にするのに十分な時間にわたって、周囲温度にて安定なままであることが可能な配合液体調合物も考慮する。
再構成のための液体および凍結乾燥調合物は、治療効果のために鼻、眼および外耳道によって送達することも可能である。凍結乾燥製品の調合には、液体、好ましくは水性液体へのＢＨ４を事前に溶解させることと、滅菌設備での液体製品を処理すること（すなわち配合、滅菌濾過、および滅菌濾過液体のバイアルへの充填、その後の凍結乾燥のための凍結乾燥装置への充填済みバイアルの装填）とが必要である。滅菌処理中の可溶化ＢＨ４の安定性の維持およびその劣化防止は、充填仕上げ製品の不純物仕様を満足する凍結乾燥製品を製造するための主な前提条件である。したがって凍結乾燥製品の組成は、充填仕上げ処理中のＢＨ４劣化を最小化または防止する適切な安定剤を含有する。本明細書に記載する調合物は、最低６時間はかかる処理である滅菌充填／仕上げ製造中のＢＨ４溶液を安定化して、市販用の安定な製品も供給するであろう。
調合物は、ＢＨ４を、好ましくは０．１ｍｇ／ｍＬ〜１０ｍｇ／ｍＬの範囲の濃度で含む。ＢＨ４の高い溶解性のために、たとえば約１００ｍｇ／ｍＬまでの濃度の調合物も調製できる。本明細書に記載する一般的な相対的組成構成および方法は、高濃度溶液を作成するために適用できる。
ＢＨ４の液体調合物は好ましくは、ｐＨ１〜８緩衝溶液、好ましくはｐＨ２〜７緩衝溶液で調合される。選択されるｐＨ緩衝剤は、（複数の）緩衝イオン化定数が液体調合物の所望のｐＨにどれだけ近いかによって判定されるように、所望の特定のｐＨにおける実質的な緩衝能力を与えることができる緩衝化合物である。それゆえいずれの緩衝化合物も、化合物のイオン化定数の１つ以上が調合物の所望のｐＨに近い限り利用される可能性がある。ｐＨ１〜８の範囲で利用される緩衝剤の例としては、これに限定されるわけではないが：塩酸（ｐＨ１〜２）、マレイン酸（ｐＨ１〜３）、リン酸（ｐＨ１〜３）、クエン酸（ｐＨ３〜６）、酢酸（ｐＨ４．７±１．０）、リン酸二ナトリウム（ｐＨ６〜８）、トロメタミン（ＴＲＩＳ、ｐＨ ８．３±１．０）などを含む、各種の酸／塩基、およびそのそれぞれの共役酸／塩基または塩形が挙げられる。
静脈内調合物
静脈内調合物は、抗酸化剤または２種以上の抗酸化剤の組合せを使用して安定化させる。抗酸化剤の組合せは、調合物の不安定性を防止するのに相乗作用が可能である。溶解した酸素を溶液から除去するための不活性気体およびまたは二酸化炭素の散布は任意であるが、低濃度の抗酸化剤を使用するときに好ましく、ＢＨ４および抗酸化剤をどちらも低濃度で使用するときにはさらに好ましい。水溶液中でのＢＨ４の安定化は、ＢＨ４の濃度と抗酸化剤およびｐＨとの相互作用によって影響を受ける。それゆえ、たとえば高濃度のＢＨ４は、低濃度のＢＨ４よりも低い抗酸化剤濃度を必要とする。さらに、ＢＨ４は高いｐＨよりも低いｐＨで安定である。したがって所望の高いｐＨの調合物は、好ましくはより高い抗酸化剤濃度を、さらに好ましくは２、３種以上の抗酸化剤の組合せを、なおさらに好ましくは非酸化気体（たとえば不活性気体または二酸化炭素）の散布と、それに続く非酸化気体（たとえば不活性気体または二酸化炭素）のブランケット中での１次容器の完全密封またはほぼ密封とを用いて、薬物製品の安定性をさらに向上させる。
ＢＨ４液体調合物の範囲の例を表１および２に示す。調合または配合溶液は場合により、配合タンクに不活性気体（たとえばアルゴンまたは窒素）あるいは二酸化炭素が散布され、１次容器は好ましくは、容器のヘッドスペースから酸素を除去するために不活性気体または二酸化炭素ブランケット中で密封される。調合物は、構成成分量に適切なスケールアップ因子を乗算することによって、いずれの体積にでもスケールアップ可能である。
液体調合物に利用した抗酸化剤は好ましくは、チオールベース（たとえばＬ−システイン）、アスコルビン酸および亜硫酸塩ベース（たとえばメタ重亜硫酸ナトリウム）化合物の１種以上より選択される。溶液は、ＢＨ４溶液から酸素を排出するために好ましくは不活性気体または二酸化炭素が散布され、次に、容器のヘッドスペース中の気体が漏れないようにするために、不活性気体（たとえばアルゴン、窒素）または二酸化炭素などの非不活性気体のブランケット中で、金属製飲料ビール型キャップを使用してアンプルまたは密封キャップ付きバイアルおよびボトル内に完全密封される。経口液体調合物は好ましくは、調合物の嗜好性を改善するために甘味料および着香料をさらに含有する。
一実施形態において、ＢＨ４は液体投薬形として、抗酸化剤によって、および／または分子酸素を調合物から除去するために、不活性気体（たとえば窒素、アルゴン、ヘリウムなど）および／または二酸化炭素などの非不活性気体などの、非酸化性の、好ましくは滅菌された気体を散布することによって安定化される。製品は、分子酸素が調合物に再溶解するのを最小化または防止するために、好ましくは不活性気体のブランケット中で充填される。液体を容器（たとえばバイアル、アンプルなど）に充填して、酸素が容器に進入するのを防止するために完全密閉する。別の実施形態において、非経口投与のための滅菌固体投薬形としてのＢＨ４の溶液は、凍結乾燥されて、診療所で投与前に再構成される。なお別の実施形態において、ＢＨ４の滅菌粉末薬物物質は、滅菌乾燥粉末充填設備で滅菌容器（たとえばバイアル、バッグ、ボトルまたはアンプル）中へ直接包装される。それゆえ本発明の別の態様は、ＢＨ４またはその製薬的に許容される塩、抗酸化剤、およびｐＨ緩衝剤を含む、水溶液中への構成のためのテトラヒドロビオプテリン（ＢＨ４）またはその製薬的に許容される塩の乾燥粉末調合物である。
経口液体調合組成物
経口液体調合物は、一般的な液体および静脈内調合物で利用される成分に加えて、甘味料および矯味矯臭剤を含む。甘味料および矯味矯臭剤は、許容される甘味および風味を得るのに十分な量で添加される。経口液体調合物は１種以上の安定剤を含有する。場合により、それらは抗菌保存料を含有する。それらは、低いｐＨ、たとえばｐＨ１〜４で優先的に緩衝され、緩衝剤は矯味矯臭剤に適合するように選択されて、それゆえ経口液体調合物の感覚受容特性を向上させる。好ましい緩衝剤の例（酸または共役塩基）は：その共役塩または塩形と組合せたクエン酸、酒石酸、リンゴ酸である。
甘味料の例としては、糖（たとえばスクロース、グルコース、ソルビトール、マンニトール、フルクトースなど）、強力非糖質性甘味料（たとえばアスパルテーム、アセスルファムＫ、シクラメート、サッカリン、スクラロース、グリチルリジン、アリテーム、ネオテーム、ネオヘスペリジンＤＣ、タウマチン、モネリンなど）が挙げられる。
さらなる実施形態において、鼻、眼および耳投与では、ＢＨ４は非経口投薬形について議論されたように調合され、場合により滅菌製品である。これらの投薬形は、数日分の供給物を含むキット包装形式で供給可能である。キット内の各ユニットは、バイアルまたはアンプル１個および噴霧器１個（鼻投薬形）または点滴器１個（眼および耳投薬形の場合）より成ることが可能である。バイアルまたはアンプルを開いたら、噴霧器または点滴器をバイアルまたはアンプルにねじ込んで、先のキャップを廃棄する。投薬形製品は所定の有効期限以内に使用して、廃棄し、新たなバイアルまたはアンプルを開けて使用する。別の実施形態は、製袋充填密封製造プロセスによって、密封プラスチック１回使用使い捨て滅菌容器に溶液を充填することである。これらのパッケージは開かれ、溶液はそれを含有する液体を絞り出すことによって所望の投与経路を使用して送達される。これらの投薬形は１日１回投与され、鼻孔（鼻用製品）を通じて、または眼（眼用）を通じて与えられるか、あるいは液滴が耳道内に滴下される（耳用製品）。製袋、充填および密封パッケージに包装された薬剤では、薬剤は投与経路に絞り出される。
さらなる実施形態において、ＢＨ４は、調合されたストリップ、パッチまたはフィルムを使用して、あるいは送達部位に配置された局所製品として、頬側および経皮経路によって投与される。舌下錠は舌の下に配置される。これらの投薬形は１日１回投与され、送達部位膜（頬側および経皮経路）に付着されるか、あるいは固体または半固体形として舌下部位に配置されるかのどちらかである。送達部位の刺激を防止するために、炭酸ナトリウムまたは重炭酸ナトリウムなどの塩基性化合物でＢＨ４をコーティングし、ＢＨ４と混合して、ＢＨ４を不安定にするであろうＢＨ４との相互作用を防止する。あるいは塩基性化合物を使用直前に添加して、かなり低いＢＨ４のｐＨを上昇させる。ＢＨ４との相互作用を防止するために、アルカリ性粒子をコーティングせずに製造時に塩基性賦形剤を添加すると、ＢＨ４の不安定性を引き起こすであろう。別の実施形態は、塩基性またはアルカリ性物質を含有するコーティング溶液でＢＨ４のコア舌下錠をコーティングすることである。舌下部では、塩基性化合物が最初に溶解し、ＢＨ４と相互作用して、媒質のｐＨを上昇させる。
ＢＨ４液体調合物の１次容器包装
ＢＨ４液体調合物の１次包装容器は、好ましくは酸素、二酸化炭素、窒素および不活性気体に対して不浸透性である。散布を行ったＢＨ４の液体調合物を好ましくは窒素ブランケット下で１次容器に充填した後に、液体および容器ヘッドスペースの散布気体を保持して、散布気体の消失および容器への酸素の侵入を防止するために、容器を好ましくは完全密封する。
好ましい１次容器は、完全密封アンプルはもちろんのこと、ソーダおよびビール飲料ボトルを密封するのに利用されるキャップなどの金属製キャップによって完全密封されたボトルおよびバイアルでもある。使用中に、アンプルを切断して開き、数時間、たとえば約１２時間以内に使用する。アンプルは注射用の静脈内および滅菌製品に使用可能である。滅菌注射用液体および凍結乾燥製品は、圧着アルミニウムキャップで固定したゴム閉止具シールバイアル内に包装することも可能である。調合物中の抗酸化剤は、製品の貯蔵寿命のために、ごく低速の散布気体の消失またはバイアル内への酸素の侵入から液体および凍結乾燥製品を保護する。
経口、眼または耳への使用のためにボトルまたはバイアル中に充填されたＢＨ４液体調合物は好ましくは、飲料用金属キャップおよび圧着アルミニウムシールによって固定されたゴムストッパによって完全密封して保管される。ボトルまたはバイアルの細長部にはスクリューキャップを嵌めるために溝を付けることが可能である。密封シールを除去したときには、点滴器付きまたは点滴器のないスクリューキャップを代わりにする。調合物中での抗酸化剤の存在によって、スクリューキャップ付き調合物は、たとえば密封シールを破った後に、使用のために少なくとも２週間にわたって安定にしておくことが可能である。
Ｉ．テトラヒドロビオプテリンの合成
テトラヒドロプテリン、前駆物質、誘導体および類似体を合成する各種方法が当分野で公知である。米国特許第５，６９８，４０８号明細書；第２，６０１，２１５号明細書；第３５０５３２９号明細書；第４，５４０，７８３号明細書；第４，５５０，１０９号明細書；第４，５８７，３４０号明細書；第４，５９５，７５２号明細書；第４，６４９，１９７号明細書；第４，６６５，１８２号明細書；第４，７０１，４５５号明細書；第４，７１３，４５４号明細書；第４，９３７，３４２号明細書；第５，０３７，９８１号明細書；第５，１９８，５４７号明細書；第５，３５０，８５１号明細書；第５，４０１，８４４号明細書；第５，６９８，４０８号明細書、カナダ特許出願第２４２０３７４号明細書、欧州特許出願第０７９ ５７４号明細書、第１９１ ３３５号明細書ならびにサントリーの日本特許出願公開第４−０８２８８８号明細書、第５９−０２１６８５号明細書および第９−１５７２７０号明細書はもちろんのこと、Ｓｕｇｉｍｏｔｏ ａｎｄ Ｍａｔｓｕｕｒａ，Ｂｕｌｌ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｊａｐａｎ，４８（１２）：３７６７−３７６８（１９７５）、Ｓｕｇｉｍｏｔｏ ａｎｄ Ｍａｔｓｕｕｒａ，Ｂｕｌｌ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｊａｐａｎ，５２（１）：１８１−１８３（１９７９）、Ｍａｔｓｕｕｒａら、Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．（Ｊａｐａｎ），７３５−７３８（１９８４）、Ｍａｔｓｕｕｒａら、Ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｅｓ，Ｖｏｌ．２３，Ｎｏ．１２，３１１５−３１２０，１９８５およびＷｈｉｔｅｌｅｙら、Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．１３７（２）：３９４−６（１９８４）（それぞれ参照により本明細書に組み込まれている）は、それぞれ本発明の組成物として使用されるジヒドロビオプテリン、ＢＨ４およびその誘導体を生成する方法を記載している。
その全体が参照により本明細書に組み込まれている、国際公開第２００５０４９６１４号パンフレット、米国特許第４，５４０，７８３号明細書、Ｊａｐａｎｅｓｅ Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ．５９−０２１６８５、Ｓｃｈｉｒｃｋｓら、Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ，６０：２１１（１９７７）、Ｓｕｇｉｍｏｔｏら、Ｂｕｌｌ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｊｐ，５２（１）：１８１（１９７９）、Ｓｕｇｉｍｏｔｏら、Ｂｕｌｌ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｊｐ，４８（１２）：３７６７（１９７５）、Ｖｉｓｏｎｔｉｎｉら、Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ，５２：１２２５（１９６９）、およびＭａｔｓｕｕｒａら、Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．ｐ７３５（１９８４）は、ＢＨ４を合成する方法について記載している。
ＩＩ．６Ｒ−テトラヒドロビオプテリン二塩酸塩の結晶形
（６Ｒ）−Ｌ−エリスロ−テトラヒドロビオプテリン二塩酸塩は、多形形態および溶媒和物を含む、異なる結晶形で存在し、その一部は他よりも安定である。
（６Ｒ）−Ｌテトラヒドロビオプテリン二塩酸塩の結晶多形形態
多形形態Ｂ
最も安定であることが見出された結晶多形は、本明細書では「形態Ｂ」、あるいは「多形Ｂ」と呼ばれる。（６Ｒ）−Ｌ−エリスロ−テトラヒドロビオプテリン二塩酸塩開発の調査および開発中に得られた結果によって、調製された公知の結晶性固体がいくつかあることが明らかになったが、いずれによっても多形およびＢＨ４結晶の安定性に対するその効果は認識されていない。
多形Ｂは、わずかに吸湿性の無水物であり、２０℃超で最大の熱力学的安定性を備えている。さらに、形態Ｂはその熱安定性、標的とする条件による調製の可能性、その適切な形態および粒子サイズのために、容易な処理および取扱いが可能である。融点は２６０℃付近（ΔＨｆ＞１４０Ｊ／ｇ）であるが、溶融の前および間の分解により、明確な融点は検出できない。これらの顕著な特性により、多形形態Ｂは、高温で調製される製薬用途には特に適したものとなっている。多形Ｂは、０．２μｍ〜５００μｍに及ぶことがある微細粉末として入手可能である。
形態Ｂは、８．７（ｖｓ）、６．９（ｗ）、５．９０（ｖｗ）、５．６３（ｍ）、５．０７（ｍ）、４．７６（ｍ）、４．４０（ｍ）、４．１５（ｗ）、４．００（ｓ）、３．９５（ｍ）、３．５２（ｍ）、３．４４（ｗ）、３．３２（ｍ）、３．２３（ｓ）、３．１７（ｗ）、３．１１（ｖｓ）、３．０６（ｗ）、２．９９（ｗ）、２．９６（ｗ）、２．９４（ｍ）、２．８７（ｗ）、２．８４（ｓ）、２．８２（ｍ）、２．６９（ｗ）、２．５９（ｗ）、２．４４（ｗ）のｄ値（Å）で表されるＸ線粉末回折パターンを示す。図１は、（６Ｒ）−Ｌ−エリスロ−テトラヒドロビオプテリン二塩酸塩の形態Ｂによって示された特徴的なＸ線回折パターンのグラフである。
本明細書で示すように、以下のカッコ内の省略形は：（ｖｓ）＝非常に強い強度；（ｓ）＝強い強度；（ｍ）＝中程度の強度；（ｗ）＝弱い強度；および（ｖｗ）＝非常に弱い強度を意味する。特徴的なＸ線粉末回折パターンを図１に示す。
ＢＨ４の他の多形が製造および調合中の安全な取扱いのために十分な化学的および物理的安定性を有するのはもちろんのこと、その純粋形または調合物での高い貯蔵安定性を与えることが見出されている。加えて、形態Ｂ、およびＢＨ４の他の多形が非常に大量で（たとえば１００キロスケール）で調製され、長期間にわたって貯蔵できることが見出されている。
すべての結晶形（多形、水和物および溶媒和物）は、結晶形態Ｂを含めて、最も安定な多形Ｂの調製に使用可能である。多形Ｂは、適切な極性および非極性水性溶媒によるアモルファス形態または多形Ａなどの多形形態Ｂ以外の他の形態の懸濁物の相平衡によって得られることがある。それゆえ、本明細書に記載する製薬調製物は、（６Ｒ）−Ｌ−エリスロ−テトラヒドロビオプテリン二塩酸塩の多形形態Ｂの調製物を指す。
ＢＨ４の他の形態は、ＢＨ４の他の形態を室温で溶媒中に分散させて、懸濁物を周囲温度で多形形態Ｂを産生するのに十分な時間にわたって撹拌し、その後、結晶性形態Ｂを単離して、単離形態Ｂから溶媒を除去することによって、形態Ｂに変換することが可能である。周囲温度は、本明細書で使用するように、０℃〜６０℃、好ましくは１５℃〜４０℃の範囲の温度を意味する。利用される温度は、温度を段階的または連続的に低下させることによって、処理および撹拌中に変更してもよい。他の形態を形態Ｂに変換するための適切な溶媒としては、これに限定されるわけではないが、メタノール、エタノール、イソプロパノール、他のＣ３−およびＣ４−アルコール、酢酸、アセトニトリル、テトラヒドロフラン、メチル−ｔ−ブチルエーテル、１，４−ジオキサン、酢酸エチル、酢酸イソプロピル、他のＣ３〜Ｃ６酢酸、メチルエチルケトンおよび他のメチル−Ｃ３〜Ｃ５アルキル−ケトンが挙げられる。相平衡が完了する時間は、最長３０時間、好ましくは最長２０時間、または２０時間未満である場合がある。
多形Ｂは、最大約５％の水を含有する溶媒混合物、特にエタノール、酢酸および水の混合物からの結晶化によっても得られることがある。（６Ｒ）−Ｌ−エリスロ−テトラヒドロビオプテリン二塩酸塩の多形形態Ｂが、場合により高温における、好ましくは形態Ｂよりも低いエネルギーの固体形の、または（６Ｒ）−Ｌ−エリスロ−テトラヒドロビオプテリン二塩酸塩の形態Ｂの、エタノール、酢酸および水を含む溶媒混合物中への溶解と、溶液への種晶の添加と、得られた懸濁物の冷却と、形成された結晶の単離によって調製できることが見出されている。溶解は室温または７０℃までで、好ましくは５０℃までで実施されることがある。溶解のために最終溶媒混合物を使用するか、または開始物質を最初に水に溶解させて、残りの溶媒を次に両方ともまたは残りの溶媒を順々に添加してもよい。溶媒混合物の組成物は、水：酢酸：テロラヒドロフランを１：３：２〜１：９：４、好ましくは１：５：４の体積比で構成されることがある。溶液は好ましくは撹拌される。冷却は、−４０℃〜０℃までの、好ましくは１０℃〜３０℃まで下がった温度を意味する。適切な種晶は、別のバッチによる多形形態Ｂあるいは同様または同一の形態を有する結晶である。単離後、結晶形態Ｂをアセトンまたはテトラヒドロフランなどの非溶媒で洗浄して、通常の方式で乾燥させることが可能である。
多形Ｂは、メタノール、エタノールおよび酢酸などの非溶媒の添加による水溶液からの結晶化によっても得られることがある。結晶化および単離手順は、溶液を冷却せずに室温にて好都合に実施することが可能である。本プロセスはしたがって、工業スケールで実施するのに非常に適している。
本明細書に記載した組成物および方法の一実施形態において、（６Ｒ）−Ｌ−エリスロ−テトラヒドロビオプテリン二塩酸塩の多形形態Ｂを含む組成物は、形態Ｂ以外の固体形態の、または（６Ｒ）−Ｌ−エリスロ−テトラヒドロビオプテリン二塩酸塩の形態Ｂの室温の水への溶解と、懸濁物を形成するのに十分な量の非溶媒の添加と、場合によりある時間にわたっての懸濁物の撹拌と、その後の形成された結晶の単離とによって調製される。組成物は、以下に記載するようにさらに修飾して製薬組成物となる。
水溶液中の（６Ｒ）−Ｌ−エリスロ−テトラヒドロビオプテリン二塩酸塩の濃度は、溶液への参照により、１０〜８０重量パーセント、さらに好ましくは２０〜６０重量パーセントであってもよい。好ましい非溶媒（すなわちＢＨ４の懸濁物を調製するのに有用な溶媒）は、メタノール、エタノールおよび酢酸である。非溶媒は、水溶液に添加してもよい。さらに詳細には、水溶液は非溶媒に添加される。懸濁物形成後の撹拌時間は、最長３０時間、好ましくは最長２０時間、または２０時間未満である場合がある。濾過による単離および乾燥は、上述のような公知の方式で実施される。
多形形態Ｂは、容易に濾過、乾燥され、製薬調合物に望ましい粒径に粉砕することが可能である、非常に安定な結晶形態である。これらの顕著な特性により、多形形態Ｂは、製薬用途に特に適したものとなっている。
多形形態Ａ
（６Ｒ）−Ｌ−エリスロ−テトラヒドロビオプテリン二塩酸塩の別の結晶多形は、本明細書に記載する製薬調製物で使用するためのＢＨ４の安定な好ましい形態であることが見出されており、本明細書では「形態Ａ」または「多形Ａ」と呼ぶものとする。多形Ａはわずかに吸湿性であり、約３重量％の含有率まで水を吸収し、この水は１０℃／分の割合で加熱されたときに５０℃〜２００℃で連続的に放出される。多形Ａは吸湿性無水物であり、形態Ｂに比べて準安定形態である；しかし、しっかり密封した容器内に保管した場合、周囲温度では数ヶ月にわたって安定である。形態Ａは、安定な多形形態を産生するための中間体および開始物質として特に適切である。多形形態Ａは、通例は１μｍ〜約５００μｍに及ぶ所望の中程度の粒径範囲の固体粉末として調製可能である。
形態Ａは、１５．５（ｖｓ．）、１２．０（ｍ）、６．７（ｍ）、６．５（ｍ）、６．３（ｗ）、６．１（ｗ）、５．９６（ｗ）、５．４９（ｍ）、４．８９（ｍ）、３．７９（ｍ）、３．７０（ｓ）、３．４８（ｍ）、３．４５（ｍ）、３．３３（ｓ）、３．２６（ｓ）、３．２２（ｍ）、３．１８（ｍ）、３．０８（ｍ）、３．０２（ｗ）、２．９５（ｗ）、２．８７（ｍ）、２．７９（ｗ）、２．７０（ｗ）のｄ値（Å）で表される特徴的なピークを持つ、特徴的なＸ線粉末回折パターンを示す。図２は、（６Ｒ）−Ｌ−エリスロ−テトラヒドロビオプテリン二塩酸塩の形態Ａによって示された特徴的なＸ線回折パターンのグラフである。
多形Ａは、２９３４（ｗ）、２８８０（ｗ）、１６９２（ｓ）、１６８３（ｍ）、１５７７（ｗ）、１４６２（ｍ）、１３６０（ｗ）、１２３７（ｗ）、１１０８（ｗ）、１００５（ｖｗ）、８８１（ｖｗ）、８１３（ｖｗ）、７１７（ｍ）、６８７（ｍ）、６７３（ｍ）、６５９（ｍ）、５５０（ｗ）、５３０（ｗ）、４９２（ｍ）、３７１（ｍ）、２５８（ｗ）、２０７（ｗ）、１０１（ｓ）、８７（ｓ）ｃｍ−１の波数（ｃｍ−１）で表される、特徴的なラマンスペクトルバンドを示す。
多形形態Ａは、（６Ｒ）−Ｌ−エリスロ−テトラヒドロビオプテリン二塩酸塩の水溶液の凍結乾燥または水除去によって得られることがある。（６Ｒ）−Ｌ−エリスロ−テトラヒドロビオプテリン二塩酸塩の多形形態Ａは、（６Ｒ）−Ｌ−エリスロ−テトラヒドロビオプテリン二塩酸塩を周囲温度で水に溶解させ、（１）溶液を固化させるために溶液を低温まで冷却させて、減圧下で水を除去すること、または（２）前記水溶液から水を除去することによって調製可能である。
結晶形態Ａは、濾過によって単離して、次に乾燥させて生成物から吸収された水を蒸発させることが可能である。乾燥の条件と方法は公知であり、本明細書に記載した変形（２）に従って単離された生成物の乾燥または水除去は、真空下で、たとえば最高８０℃、好ましくは３０℃〜８０℃の範囲の高温を、または高温および真空を加えて実施されることもある。変形（２）で得た沈殿の単離前に、相平衡のためにある時間にわたって懸濁物を撹拌してもよい。水溶液中の（６Ｒ）−Ｌ−エリスロ−テトラヒドロビオプテリン二塩酸塩の濃度は、溶液への参照により、５〜４０重量パーセントであってもよい。
開始物質として固溶体を得るために迅速な冷却が好ましい。溶媒が完全に除去されるまで減圧を加える。凍結乾燥は当分野で周知の技術である。溶媒除去を完了する時間は、０．０１〜１ｍｂａｒである印加された圧力、使用した溶媒および凍結温度によって変わる。
多形形態Ａは、実質的に水のない条件下では室温または室温より下で安定であり、このことは室温にて窒素下でそれぞれ５日間および１８時間撹拌したテトラヒドロフランまたは３級ブチルメチルエーテルの懸濁物の相平衡試験によって証明される。室温での濾過および風乾により不変の多形形態Ａが得られる。
多形形態Ｆ
（６Ｒ）−Ｌ−エリスロ−テトラヒドロビオプテリン二塩酸塩の別の結晶多形は、本明細書に記載する製薬調製物で使用するためのＢＨ４の安定な好ましい形態であることが見出されており、本明細書では「形態Ｆ」または「多形Ｆ」と呼ぶものとする。多形Ｆはわずかに吸湿性であり、約３重量％の含有率まで水を吸収し、この水は１０℃／分の割合で加熱されたときに５０℃〜２００℃で連続的に放出される。多形Ｆは準安定形態で吸湿性無水物であり、より低い周囲温度にて形態Ａよりも安定であり、より高い温度では形態Ｂより安定でなく、形態Ｆは、安定な多形形態を産生するための中間体および開始物質として特に適切である。多形形態Ｆは、通例は１μｍ〜約５００μｍに及ぶ所望の中程度の粒径範囲の固体粉末として調製可能である。
形態Ｆは、１７．１（ｖｓ．）、１２．１（ｗ）、８．６（ｗ）、７．０（ｗ）、６．５（ｗ）、６．４（ｗ）、５．９２（ｗ）、５．７２（ｗ）、５．１１（ｗ）、４．９２（ｍ）、４．８６（ｗ）、４．６８（ｍ）、４．４１（ｗ）、４．１２（ｗ）、３．８８（ｗ）、３．８３（ｗ）、３．７０（ｍ）、３．６４（ｗ）、３．５５（ｍ）、３．４９（ｓ）、３．４６（ｖｓ）、３．３９（ｓ）、３．３３（ｍ）、３．３１（ｍ）、３．２７（ｍ）、３．２１（ｍ）、３．１９（ｍ）、３．０９（ｍ）、３．０２（ｍ）、および２．９６（ｍ）のｄ値（Å）で表される特徴的なピークを持つ、特徴的なＸ線粉末回折パターンを示す。図３は、（６Ｒ）−Ｌ−エリスロ−テトラヒドロビオプテリン二塩酸塩の形態Ｆによって示された特徴的なＸ線回折パターンのグラフである。
多形Ｆは、前記より低いエネルギー形をほとんど溶解させない適切な極性および非極性水性溶媒、特にメタノール、エタノール、プロパノールおよびイソプロパノールなどのアルコールによる多形Ａの懸濁物の相平衡によって得られることがある。（６Ｒ）−Ｌ−エリスロ−テトラヒドロビオプテリン二塩酸塩の多形Ｆは、（６Ｒ）−Ｌ−エリスロ−テトラヒドロビオプテリン二塩酸塩の固体形態Ａの粒子を、室温より下で前記（６Ｒ）−Ｌ−エリスロ−テトラヒドロビオプテリン二塩酸塩をほとんど溶解させない非水性溶媒に分散させて、懸濁物を前記温度にて多形形態Ｆを産生するのに十分な時間にわたって撹拌し、その後、多形形態Ｆを単離して、単離された形態Ｆから溶媒を除去することによっても調製可能である。溶媒の除去および乾燥は、空気中、乾燥空気あるいは窒素または希ガスなどの乾燥保護気体中で、室温またはそれ以下、たとえば最低０℃で実施してもよい。相平衡の間の温度は、好ましくは５〜１５℃、最も好ましくは約１０℃である。
多形形態Ｊ
（６Ｒ）−Ｌ−エリスロ−テトラヒドロビオプテリン二塩酸塩の別の結晶多形は、本明細書に記載する製薬調製物で使用するためのＢＨ４の安定な好ましい形態であることが見出されており、本明細書では「形態Ｊ」または「多形Ｊ」と呼ぶものとする。多形Ｊはわずかに吸湿性であり、空気湿度にて取り扱われると水を吸収する。多形Ｊは準安定形態で吸湿性無水物であり、後述する形態Ｅに再度変換することが可能であり、形態Ｅからは７５％超の相対湿度などの高い相対湿度条件への曝露時に得られる。形態Ｊは、安定な多形形態を産生するための中間体および開始物質として特に適切である。多形形態Ｊは、通例は１μｍ〜約５００μｍに及ぶ所望の中程度の粒径範囲の固体粉末として調製可能である。
形態Ｊは、１４．６（ｍ）、６．６（ｗ）、６．４（ｗ）、５．４７（ｗ）、４．８４（ｗ）、３．２９（ｖｓ）、および３．２１（ｖｓ）のｄ値（Å）で表される特徴的なピークを持つ、特徴的なＸ線粉末回折パターンを示す。図４は、（６Ｒ）−Ｌ−エリスロ−テトラヒドロビオプテリン二塩酸塩の形態Ｊによって示された特徴的なＸ線回折パターンのグラフである。
多形Ｊは、真空下での中程度の温度での形態Ｅの脱水によって得られることもある。特に、（６Ｒ）−Ｌ−エリスロ−テトラヒドロビオプテリン二塩酸塩の多形形態Ｊは、形態Ｅを取り、２５〜７０℃の、最も好ましくは３０〜５０℃の範囲の温度を意味するであろう中程度の温度にて形態Ｊを得るために、形態Ｅを真空乾燥機内で処理して形態Ｅから水を除去することによって調製可能である。
多形形態Ｋ
（６Ｒ）−Ｌ−エリスロ−テトラヒドロビオプテリン二塩酸塩の別の結晶多形は、本明細書に記載する製薬調製物で使用するためのＢＨ４の安定な好ましい形態であることが見出されており、本明細書では「形態Ｋ」または「多形Ｋ」と呼ぶものとする。多形Ｋはわずかに吸湿性であり、約２．０重量％の含有率まで水を吸収し、この水は１０℃／分の割合で加熱されたときに５０℃〜１００℃で連続的に放出される。多形Ｋは準安定形態で吸湿性無水物であり、より高温では形態Ｂよりも安定でなく、形態Ｋは、安定な多形形態、特に形態Ｂを産生するための中間体および開始物質として特に適切である。多形形態Ｋは、通例は１μｍ〜約５００μｍに及ぶ所望の中程度の粒径範囲の固体粉末として調製可能である。
形態Ｋは、１４．０（ｓ）、９．４（ｗ）、６．６（ｗ）、６．４（ｗ）、６．３（ｗ）、６．１（ｗ）、６．０（ｗ）、５．６６（ｗ）、５．３３（ｗ）、５．１３（ｖｗ）、４．７３（ｍ）、４．６４（ｍ）、４．４８（ｗ）、４．３２（ｖｗ）、４．２２（ｗ）、４．０８（ｗ）、３．８８（ｗ）、３．７９（ｗ）、３．５４（ｍ）、３．４９（ｖｓ）、３．３９（ｍ）、３．３３（ｖｓ）、３．１３（ｓ）、３．１０（ｍ）、３．０５（ｍ）、３．０１（ｍ）、２．９９（ｍ）、および２．９０（ｍ）のｄ値（Å）で表される特徴的なピークを持つ、特徴的なＸ線粉末回折パターンを示す。図５は、（６Ｒ）−Ｌ−エリスロ−テトラヒドロビオプテリン二塩酸塩の形態Ｋによって示された特徴的なＸ線回折パターンのグラフである。
多形Ｋは、少量の水を含有する極性溶媒の混合物からの結晶化によって、少量のアスコルビン酸の存在下で得られることがある。溶媒混合物の溶媒は、酢酸およびメタノール、エタノール、ｎ−またはイソプロパノールなどのアルコールからなる群より選択してもよい。特に、（６Ｒ）−Ｌ−エリスロ−テトラヒドロビオプテリン二塩酸塩の多形Ｋは、（６Ｒ）−Ｌ−エリスロ−テトラヒドロビオプテリン二塩酸塩を、少量の水および少量のアスコルビン酸を含有する、酢酸およびアルコールまたはテトラヒドロフランの混合物に高温で溶解させて、前記二塩酸塩を結晶化させるために温度を室温よりも下に低下させ、沈殿を単離して、単離された沈殿を場合により真空下の高温で乾燥させることによって調製可能である。適切なアルコールは、たとえばメタノール、エタノール、プロパノールおよびイソプロパノールであり、それによりエタノールが好ましい。酢酸のアルコールまたはテトラヒドロフランに対する比は、２：１〜１：２、好ましくは約１：１でもよい。（６Ｒ）−Ｌ−エリスロ−テトラヒドロビオプテリン二塩酸塩の溶解は、高い含水量の存在下で実施可能であり、反溶媒混合物をさらに添加して、完成した沈殿を得ることができる。最終組成物中の水の量は０．５〜５重量パーセントであってもよく、アスコルビン酸の量は０．０１〜０．５重量パーセントであってもよく、どちらも溶媒混合物への参照による。溶解温度は３０〜１００℃の、好ましくは３５〜７０℃の範囲内であり、乾燥温度は３０〜５０℃の範囲内でよい。単離、たとえば濾過の後に沈殿をエタノールなどのアルコールで洗浄することもある。多形Ｋは、たとえばイソプロパノール中の相平衡と、場合により３０〜４０℃の温度などの室温より高い温度で形態Ｂ結晶を添加することによって、最も安定な形態Ｂに容易に変換可能である。
（６Ｒ）−Ｌテトラヒドロビオプテリン二塩酸塩の水和形態
さらに後述するように、（６Ｒ）−Ｌテトラヒドロビオプテリン二塩酸塩は、いくつかの結晶性水和物として存在し、本明細書でこれを形態Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｈ、およびＯとして記載および定義するものとする。これらの水和物形態は、本明細書に記載する製薬調製物のための、そしてＢＨ４の安定性結晶多形を含む組成物の調製における、ＢＨ４の安定性形態として有用である。
水和物形態Ｃ
（６Ｒ）−Ｌ−エリスロ−テトラヒドロビオプテリン二塩酸塩の水和物結晶形態は、本明細書に記載する製薬調製物で使用するためのＢＨ４の安定な好ましい形態であることが見出されており、本明細書では「形態Ｃ」または「水和物Ｃ」と呼ぶものとする。水和物形態Ｃはやや吸湿性であり、約５．５重量パーセントの含水量を有し、このことは形態Ｃが一水和物であることを示す。水和物Ｃは９４℃付近の融点を有し（ΔＨｆは約３１Ｊ／ｇである）、水和物形態Ｃは、安定な多形形態を産生するための中間体および開始物質として特に適切である。多形形態Ｃは、通例は１μｍ〜約５００μｍに及ぶ所望の中程度の粒径範囲の固体粉末として調製可能である。
形態Ｃは、１８．２（ｍ）、１５．４（ｗ）、１３．９（ｖｓ）、１０．４（ｗ）、９．６（ｗ）、９．１（ｗ）、８．８（ｍ）、８．２（ｗ）、８．０（ｗ）、６．８（ｍ）、６．５（ｗ）、６．０５（ｍ）、５．７７（ｗ）、５．６４（ｗ）、５．４４（ｗ）、５．１９（ｗ）、４．８９（ｗ）、４．７６（ｗ）、４．７０（ｗ）、４．４１（ｗ）、４．２５（ｍ）、４．００（ｍ）、３．８８（ｍ）、３．８０（ｍ）、３．５９（ｓ）、３．５０（ｍ）、３．４４（ｍ）、３．３７（ｍ）、３．２６（ｓ）、３．１９（ｖｓ）、３．１７（ｓ）、３．１１（ｍ）、３．０６（ｍ）、３．０２（ｍ）、２．９７（ｖｓ）、２．９３（ｍ）、２．８９（ｍ）、２．８３（ｍ）、および２．４３（ｍ）のｄ値（Å）で表される特徴的なピークを持つ、特徴的なＸ線粉末回折パターンを示す。図６は、（６Ｒ）−Ｌ−エリスロ−テトラヒドロビオプテリン二塩酸塩の水和物形態Ｃによって示された特徴的なＸ線回折パターンのグラフである。
水和物形態Ｃは、溶媒への参照により、水を好ましくは約５重量パーセントの量で含有する、非溶媒による多形Ｂの懸濁物などの多形形態の周囲温度での相平衡によって得られることがある。（６Ｒ）−Ｌ−エリスロ−テトラヒドロビオプテリン二塩酸塩の水和形態Ｃは、（６Ｒ）−Ｌ−エリスロ−テトラヒドロビオプテリン二塩酸塩をヘプタン、メタノール、エタノール、１−または２−プロパノールなどのＣ１〜Ｃ４アルコール、酢酸エチルなどの酢酸塩、アセトニトリル、酢酸、またはテトラヒドロフラン、ジオキサン、３級ブチルメチルエーテルなどのエーテルなどの非溶媒、あるいはこのような非溶媒の二元または三元混合物に懸濁させて、一水和物を形成するのに十分な水を添加して、懸濁物を周囲温度またはそれ以下（たとえば０〜３０℃）にて一水和物を形成するのに十分な時間にわたって撹拌することによって調製可能である。十分な水とは、溶媒の量への参照により、１〜１０重量パーセントの、好ましくは３〜８重量パーセントの水を意味することがある。固体は濾過して、ほぼ室温にて空気中で乾燥させてもよい。固体は多少の水を吸収する可能性があり、したがって５．５重量パーセントの理論値よりも高い含水率を有する。水和物形態Ｃは、形態ＤおよびＢに関して不安定であり、約４０℃の温度およびより低い相対湿度にて多形形態Ｂへ容易に変換される。形態Ｃは、室温での懸濁平衡によって、より安定な水和物Ｄに変換することが可能である。
水和物形態Ｄ
（６Ｒ）−Ｌ−エリスロ−テトラヒドロビオプテリン二塩酸塩の別の水和物結晶形態は、本明細書に記載する製薬調製物で使用するためのＢＨ４の安定な好ましい形態であることが見出されており、本明細書では「形態Ｄ」または「水和物Ｄ」と呼ぶものとする。水和物形態Ｄはやや吸湿性であり、約５．０〜７．０重量パーセントの含水量を有することがあり、このことは形態Ｄが一水和物であることを示す。水和物Ｄは１５３℃付近の融点を有し（ΔＨｆは約１１１Ｊ／ｇである）、形態Ｃよりもはるかに高い安定性であり、室温で空気湿度に曝露されても安定である。したがって水和物形態Ｄは、調合物を調製するために、または安定な多形形態を産生するための中間体および開始物質としてのどちらかで使用することが可能である。多形形態Ｄは、通例は１μｍ〜約５００μｍに及ぶ所望の中程度の粒径範囲の固体粉末として調製可能である。
形態Ｄは、８．６（ｓ）、６．８（ｗ）、５．５６（ｍ）、４．９９（ｍ）、４．６７（ｓ）、４．３２（ｍ）、３．９３（ｖｓ）、３．８８（ｗ）、３．６４（ｗ）、３．４１（ｗ）、３．２５（ｗ）、３．１７（ｍ）、３．０５（ｓ）、２．９４（ｗ）、２．９２（ｗ）、２．８８（ｍ）、２．８５（ｗ）、２．８０（ｗ）、２．７９（ｍ）、２．６８（ｗ）、２．６５（ｗ）、２．５２（ｖｗ）、２．３５（ｗ）、２．３４（ｗ）、２．３０（ｗ）、および２．２９（ｗ）のｄ値（Å）で表される特徴的なピークを持つ、特徴的なＸ線粉末回折パターンを示す。図７は、（６Ｒ）−Ｌ−エリスロ−テトラヒドロビオプテリン二塩酸塩の水和物形Ｄによって示された特徴的なＸ線回折パターンのグラフである。
水和物形態Ｄは、ほぼ室温にて（６Ｒ）−Ｌ−エリスロ−テトラヒドロビオプテリン二塩酸塩の濃縮水溶液を、ヘキサン、ヘプタン、ジクロロメタン、１−または２−プロパノール、アセトン、酢酸エチル、アセトニトリル、酢酸またはテトラヒドロフラン、ジオキサン、３級ブチルメチルエーテルなどのエーテル、あるいはこのような溶媒和物の混合物の過剰量に添加して、懸濁物を周囲温度にて撹拌することによって得られる場合がある。結晶性固体を濾過して、次に周囲温度にて乾燥窒素下で乾燥させることが可能である。好ましい非溶媒はイソプロパノールである。水溶液の添加は、突然の沈殿を防止するために滴加して行った。（６Ｒ）−Ｌ−エリスロ−テトラヒドロビオプテリン二塩酸塩の水和物形態Ｄは、ほぼ室温にて（６Ｒ）−Ｌ−エリスロ−テトラヒドロビオプテリン二塩酸塩の濃縮水溶液を非溶媒の過剰量に添加して、懸濁物を周囲温度にて撹拌することによって調製することが可能である。非溶媒の過剰量は、１：１０〜１：１０００の水性溶媒の非溶媒に対する比を意味することがある。形態Ｄは、一水和物に関連して、水を少ない過剰量で含有し、この結晶性水和物のわずかな吸湿性の性質のためにそれは吸収された水であると考えられる。水和物形態Ｄは、周囲温度および７０％未満の相対湿度における公知の水和物の中で最も安定な水和物であると見なされる。水和物形態Ｄは、この水和物が安定である条件下で調製される調合物に使用してもよい。周囲温度は２０〜３０℃を意味することがある。
水和物形態Ｅ
（６Ｒ）−Ｌ−エリスロ−テトラヒドロビオプテリン二塩酸塩の別の水和物結晶形態は、本明細書に記載する製薬調製物で使用するためのＢＨ４の安定な好ましい形態であることが見出されており、本明細書では「形態Ｅ」または「水和物Ｅ」と呼ぶものとする。水和物形態Ｅは、約１０〜１４重量パーセントの含水率を有し、これは形態Ｅが二水和物であることを示唆する。水和物Ｅは室温よりも低い温度にて形成される。水和物形態Ｅは、安定な多形形態を産生するための中間体および開始物質として特に適切である。窒素下または場合により真空下での乾燥時に水を含まない形態Ｊを産生することが特に好ましい。形態Ｅは非吸湿性であり、むしろ高い相対湿度にて、すなわち約６０％を超えて約８５％までの相対湿度にて安定である。多形形態Ｅは、通例は１μｍ〜約５００μｍに及ぶ所望の中程度の粒径範囲の固体粉末として調製可能である。
形態Ｅは、１５．４（ｓ）、６．６（ｗ）、６．５（ｗ）、５．９５（ｖｗ）、５．６１（ｖｗ）、５．４８（ｗ）、５．２４（ｗ）、４．８７（ｗ）、４．５０（ｖｗ）、４．２７（ｗ）、３．９４（ｗ）、３．７８（ｗ）、３．６９（ｍ）、３．６０（ｗ）、３．３３（ｓ）、３．２６（ｖｓ）、３．１６（ｗ）、３．０８（ｍ）、２．９８（ｗ）、２．９５（ｍ）、２．９１（ｗ）、２．８７（ｍ）、２．７９（ｗ）、２．７４（ｗ）、２．６９（ｗ）、および２．６２（ｗ）のｄ値（Å）で表される特徴的なピークを持つ、特徴的なＸ線粉末回折パターンを示す。図８は、（６Ｒ）−Ｌ−エリスロ−テトラヒドロビオプテリン二塩酸塩の水和物形Ｅによって示された特徴的なＸ線回折パターンのグラフである。
水和物形態Ｅは、（６Ｒ）−Ｌ−エリスロ−テトラヒドロビオプテリン二塩酸塩の濃縮水溶液を約１０〜−１０℃の、好ましくは０〜１０℃の温度まで冷却した非溶媒の過剰量に添加して、懸濁物を前記温度にて撹拌することによって得られることがある。結晶性固体を濾過して、次に周囲温度にて乾燥窒素下で乾燥させることが可能である。非溶媒は、たとえばヘキサン、ヘプタン、ジクロロメタン、１−または２−プロパノール、アセトン、酢酸エチル、アセトニトリル、酢酸またはテトラヒドロフラン、ジオキサン、３級ブチルメチルエーテルなどのエーテルなど、あるいはこのような非溶媒の混合物である。好ましい非溶媒はイソプロパノールである。水溶液の添加は、突然の沈殿を防止するために滴加して行った。（６Ｒ）−Ｌ−エリスロ−テトラヒドロビオプテリン二塩酸塩の水和物形態Ｅは、（６Ｒ）−Ｌ−エリスロ−テトラヒドロビオプテリン二塩酸塩の濃縮水溶液を非溶媒の過剰量に添加して、これを約１０〜−１０℃の温度まで冷却し、懸濁物を周囲温度にて撹拌することによって調製することが可能である。非溶媒の過剰量は、１：１０〜１：１０００の水性溶媒の非溶媒に対する比を意味することがある。好ましい非溶媒はテトラヒドロフランである。別の調製プロセスは、多形形態Ｂを７０〜９０％の、好ましくは約８０％の相対湿度の空気ブランケットに曝露させることを含む。水和物形態Ｅは二水和物と見なされ、これにより多少のさらなる水が吸収されることがある。多形形態Ｅは、０〜１００ｍｂａｒの圧力にて２０℃〜５０℃を意味する中程度の温度にて、真空下で乾燥させるときに、多形Ｊに変換することが可能である。形態Ｅは、高い相対湿度でのその安定性のために、半固体形態の調合物に特に適切である。
水和物形態Ｈ
（６Ｒ）−Ｌ−エリスロ−テトラヒドロビオプテリン二塩酸塩の別の水和物結晶形態は、本明細書に記載する製薬調製物で使用するためのＢＨ４の安定な好ましい形態であることが見出されており、本明細書では「形態Ｈ」または「水和物Ｈ」と呼ぶものとする。水和物形態Ｈは、約５．０〜７．０重量パーセントの含水率を有し、これは形態Ｈが吸湿性一水和物であることを示唆する。水和物形態Ｈは室温よりも低い温度にて形成される。水和物形態Ｈは、安定な多形形態を産生するための中間体および開始物質として特に適切である。多形形態Ｈは、通例は１μｍ〜約５００μｍに及ぶ所望の中程度の粒径範囲の固体粉末として調製可能である。
形態Ｈは、８．６ １５．８（ｖｓ）、１０．３（ｗ）、８．０（ｗ）、６．６（ｗ）、６．０７（ｗ）、４．８１（ｗ）、４．３０（ｗ）、３．８７（ｍ）、３．６０（ｍ）、３．２７（ｍ）、３．２１（ｍ）、３．１３（ｗ）、３．０５（ｗ）、２．９６（ｍ）、２．８９（ｍ）、２．８２（ｗ）、および２．６７（ｍ）で表される特徴的なピークを持つ、特徴的なＸ線粉末回折パターンを示す。図９は、（６Ｒ）−Ｌ−エリスロ−テトラヒドロビオプテリン二塩酸塩の水和物形Ｈによって示された特徴的なＸ線回折パターンのグラフである。
水和物形態Ｈは、周囲温度にて（６Ｒ）−Ｌ−エリスロ−テトラヒドロビオプテリン二塩酸塩を酢酸および水の混合物に溶解させて、次に非溶媒を添加して結晶性固体を沈殿させ、得られた懸濁物を冷却して、冷却した懸濁物をある時間にわたって撹拌することによって得られることがある。結晶性固体を濾過して、次に周囲温度にて真空下で乾燥させる。非溶媒は、たとえばヘキサン、ヘプタン、ジクロロメタン、１−または２−プロパノール、アセトン、酢酸エチル、アセトニトリル、酢酸またはテトラヒドロフラン、ジオキサン、３級ブチルメチルエーテルなどのエーテルなど、あるいはこのような非溶媒の混合物である。好ましい非溶媒はテトラヒドロフランである。（６Ｒ）−Ｌ−エリスロ−テトラヒドロビオプテリン二塩酸塩の水和物形態Ｈは、周囲温度にて（６Ｒ）−Ｌ−エリスロ−テトラヒドロビオプテリン二塩酸塩を酢酸と酢酸の量よりも少ない量の水との混合物に溶解させて、非溶媒を添加し、得られた懸濁物を−１０〜１０℃の、好ましくは−５〜５℃の範囲の温度まで冷却して、懸濁物を前記温度にてある時間にわたって撹拌することによって調製することが可能である。ある時間は１〜２０時間を意味することがある。酢酸の水に対する重量比は２：１〜２５：１、好ましくは５：１〜１５：１でもよい。酢酸／水の非溶媒に対する重量比は１：２〜１：５でもよい。水和物形態Ｈは一水和物と思われ、わずかに過剰な水は吸湿性性質のために吸収される。
水和物形態Ｏ
（６Ｒ）−Ｌ−エリスロ−テトラヒドロビオプテリン二塩酸塩の別の水和物結晶形態は、本明細書に記載する製薬調製物で使用するためのＢＨ４の安定な好ましい形態であることが見出されており、本明細書では「形態Ｏ」または「水和物Ｏ」と呼ぶものとする。水和物形態Ｏは室温付近の温度にて形成される。水和物形態Ｏは、安定な多形形態を産生するための中間体および開始物質として特に適切である。多形形態Ｏは、通例は１μｍ〜約５００μｍに及ぶ所望の中程度の粒径範囲の固体粉末として調製可能である。
形態Ｏは、１５．９（ｗ）、１４．０（ｗ）、１２．０（ｗ）、８．８（ｍ）、７．０（ｗ）、６．５（ｗ）、６．３（ｍ）、６．００（ｗ）、５．７５（ｗ）、５．６５（ｍ）、５．０６（ｍ）、４．９８（ｍ）、４．９２（ｍ）、４．８４（ｗ）、４．７７（ｗ）、４．４２（ｗ）、４．３３（ｗ）、４．００（ｍ）、３．８８（ｍ）、３．７８（ｗ）、３．６９（ｓ）、３．６４（ｓ）、３．５２（ｖｓ）、３．４９（ｓ）、３．４６（ｓ）、３．４２（ｓ）、３．３２（ｍ）、３．２７（ｍ）、３．２３（ｓ）、３．１８（ｓ）、３．１５（ｖｓ）、３．１２（ｍ）、３．０４（ｖｓ）、２．９５（ｍ）、２．８１（ｓ）、２．７２（ｍ）、２．６７（ｍ）、および２．６１（ｍ）のｄ値（Å）で表される特徴的なピークを持つ、特徴的なＸ線粉末回折パターンを示す。図１０は、（６Ｒ）−Ｌ−エリスロ−テトラヒドロビオプテリン二塩酸塩の水和物形態Ｏによって示された特徴的なＸ線回折パターンのグラフである。
水和物形態Ｏは、多形形態Ｆを水蒸気を含有して、生じた相対湿度が約５２％の窒素ブランケットに約２４時間曝露することによって調製可能である。５２％相対湿度で形態Ｏを調製するためにやや吸湿性の無水物である形態Ｆを使用することが可能であるという事実により、形態Ｏは、周囲温度および湿度条件下で形態Ｆよりも安定な水和物であるということが示唆される。
（６Ｒ）−Ｌ−テトラヒドロビオプテリンジ二塩酸塩の溶媒和物形態
さらに後述するように、（６Ｒ）−Ｌテトラヒドロビオプテリン二塩酸塩は、いくつかの結晶性溶媒和物形態として存在し、本明細書でこれを形態Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、およびＮとして記載および定義するものとする。これらの溶媒和物形態は、本明細書に記載する製薬調製物のための、そしてＢＨ４の安定性結晶多形を含む組成物の調製における、ＢＨ４の安定性形態として有用である。
溶媒和物形態Ｇ
（６Ｒ）−Ｌ−エリスロ−テトラヒドロビオプテリン二塩酸塩のエタノール溶媒和物結晶形態は、本明細書に記載する製薬調製物で使用するためのＢＨ４の安定な好ましい形態であることが見出されており、本明細書では「形態Ｇ」または「水和物Ｇ」と呼ぶものとする。エタノール溶媒和物形態Ｇは、約８．０〜１２．５重量パーセントのエタノール含有率を有し、これにより形態Ｇが吸湿性一エタノール溶媒和物であることが示唆される。溶媒和物形態Ｇは室温よりも低い温度にて形成される。形態Ｇは、安定な多形形態を産生するための中間体および開始物質として特に適切である。多形形態Ｇは、通例は１μｍ〜約５００μｍに及ぶ所望の中程度の粒径範囲の固体粉末として調製可能である。
形態Ｇは、１４．５（ｖｓ）、１０．９（ｗ）、９．８（ｗ）、７．０（ｗ）、６．３（ｗ）、５．７４（ｗ）、５．２４（ｖｗ）、５．０４（ｖｗ）、４．７９（ｗ）、４．４１（ｗ）、４．０２（ｗ）、３．８６（ｗ）、３．７７（ｗ）、３．６９（ｗ）、３．６３（ｍ）、３．５７（ｍ）、３．４９（ｍ）、３．４１（ｍ）、３．２６（ｍ）、３．１７（ｍ）、３．０７（ｍ）、２．９７（ｍ）、２．９５（ｍ）、２．８７（ｗ）、および２．６１（ｗ）のｄ値（Å）で表される特徴的なピークを持つ、特徴的なＸ線粉末回折パターンを示す。図１１は、（６Ｒ）−Ｌ−エリスロ−テトラヒドロビオプテリン二塩酸塩の溶媒和物形態Ｇによって示された特徴的なＸ線回折パターンのグラフである。
エタノール溶媒和物形態Ｇは、水に溶解させたＬ−エリスロ−テトラヒドロビオプテリン二塩酸塩を結晶化させ、エタノールの大過剰量を添加して、得られた懸濁物を周囲温度またはそれ以下で撹拌して、単離された固体をほぼ室温にて空気または窒素下で乾燥することによって得てもよい。ここでエタノールの大過剰量とは、水が１０％未満、好ましくは約３〜６％の、エタノールおよび水の得られた混合物を意味する。（６Ｒ）−Ｌ−エリスロ−テトラヒドロビオプテリン二塩酸塩のエタノラート形態Ｇは、ほぼ室温〜７５℃の温度にて（６Ｒ）−Ｌ−エリスロ−テトラヒドロビオプテリン二塩酸塩を水または水およびエタノールの混合物に溶解させて、加熱した溶液を室温および５〜１０℃に冷却して、沈殿を完了させるために場合によりエタノールを添加し、得られた沈殿を２０〜５℃にて撹拌して、白色の結晶性固体を濾過し、ほぼ室温にて空気または窒素などの保護気体下で固体を乾燥させることによって調製可能である。プロセスは、第１の変形において、（６Ｒ）−Ｌ−エリスロ−テトラヒドロビオプテリン二塩酸塩をほぼ室温にてより少ない量の水に溶解させて、次にエタノールの過剰量を追加して、さらに得られた懸濁物を相平衡に十分な時間にわたって撹拌して実施される。第２の変形では、（６Ｒ）−Ｌ−エリスロ−テトラヒドロビオプテリン二塩酸塩をエタノールに懸濁させ、場合により少ない量の水を添加して、懸濁物を加熱して（６Ｒ）−Ｌ−エリスロ−テトラヒドロビオプテリン二塩酸塩を溶解させて、溶液を約５〜１５℃の温度まで冷却し、懸濁物にさらなるエタノールを添加して、次に得られた懸濁物を相平衡に十分な時間にわたって撹拌する。
溶媒和物形態Ｉ
（６Ｒ）−Ｌ−エリスロ−テトラヒドロビオプテリン二塩酸塩の酢酸溶媒和物結晶形態は、本明細書に記載する製薬調製物で使用するためのＢＨ４の安定な好ましい形態であることが見出されており、本明細書では「形態Ｉ」または「水和物Ｉ」と呼ぶものとする。酢酸溶媒和物形態Ｉは、約１２．７重量パーセントの酢酸含有率を有し、このことは形態Ｉが吸湿性酢酸一溶媒和物であることを示唆している。溶媒和物形態Ｉは室温よりも低い温度にて形成される。酢酸溶媒和物形態Ｉは、安定な多形形態を産生するための中間体および開始物質として特に適切である。多形形態Ｉは、通例は１μｍ〜約５００μｍに及ぶ所望の中程度の粒径範囲の固体粉末として調製可能である。
形態Ｉは、１４．５（ｍ）、１４．０（ｗ）、１１．０（ｗ）、７．０（ｖｗ）、６．９（ｖｗ）、６．２（ｖｗ）、５．３０（ｗ）、４．７９（ｗ）、４．４４（ｗ）、４．２９（ｗ）、４．２０（ｖｗ）、４．０２（ｗ）、３．８４（ｗ）、３．８０（ｗ）、３．６７（ｖｓ）、３．６１（ｍ）、３．５６（ｗ）、３．４４（ｍ）、３．２７（ｗ）、３．１９（ｗ）、３．１１（ｓ）、３．００（ｍ）、２．９４（ｗ）、２．８７（ｗ）、および２．８０（ｗ）のｄ値（Å）で表される特徴的なピークを持つ、特徴的なＸ線粉末回折パターンを示す。図１２は、（６Ｒ）−Ｌ−エリスロ−テトラヒドロビオプテリン二塩酸塩の溶媒和物形Ｉによって示された特徴的なＸ線回折パターンのグラフである。
酢酸溶媒和物形態Ｉは、（６Ｒ）−Ｌ−エリスロ−テトラヒドロビオプテリン二塩酸塩を高温の酢酸および水の混合物に溶解させて、さらなる酢酸を溶液に添加し、約１０℃の温度まで冷却して、次に形成された懸濁物を約１５℃まで加温し、次に得られた懸濁物を最大３日間続く相平衡に十分な時間にわたって撹拌することによって得てもよい。結晶性固体を次に濾過して、空気または窒素などの保護気体下でほぼ室温の温度にて乾燥させる。
溶媒和物形態Ｌ
（６Ｒ）−Ｌ−エリスロ−テトラヒドロビオプテリン二塩酸塩の混合されたエタノール溶媒和物／水和物結晶形態は、本明細書に記載する製薬調製物で使用するためのＢＨ４の安定な好ましい形態であることが見出されており、本明細書では「形態Ｌ」または「水和物Ｌ」と呼ぶものとする。形態Ｌは、４％の、しかし１３％までのエタノールと、０％〜約６％の水を含有することがある。形態Ｌは、約０℃〜２０℃の温度でエタノール中で処理したときに形態Ｇに変換されることがある。さらに、形態Ｌは、周囲温度（１０℃〜６０℃）にて有機溶媒中で処理したときに形態Ｂに変換されることがある。多形形態Ｌは、通例は１μｍ〜約５００μｍに及ぶ所望の中程度の粒径範囲の固体粉末として調製可能である。
形態Ｌは、１４．１（ｖｓ）、１０．４（ｗ）、９．５（ｗ）、９．０（ｖｗ）、６．９（ｗ）、６．５（ｗ）、６．１（ｗ）、５．７５（ｗ）、５．６１（ｗ）、５．０８（ｗ）、４．７１（ｗ）、３．８６（ｗ）、３．７８（ｗ）、３．４６（ｍ）、３．３６（ｍ）、３．０６（ｗ）、２．９０（ｗ）、および２．８２（ｗ）のｄ値（Å）で表される特徴的なピークを持つ、特徴的なＸ線粉末回折パターンを示す。図１３は、（６Ｒ）−Ｌ−エリスロ−テトラヒドロビオプテリン二塩酸塩の溶媒和物形態Ｌによって示された特徴的なＸ線回折パターンのグラフである。
形態Ｌは、水和物形態Ｅを室温でエタノールに懸濁させて、懸濁物を０〜１０℃の、好ましくは約５℃にて１０〜２０時間である相平衡に十分な時間にわたって撹拌することによって得てもよい。結晶性固体を次に濾過して、好ましくは３０℃の減圧下または窒素下で乾燥する。ＴＧ−ＦＴＩＲによる分析によって、形態Ｌは可変量の水およびエタノールを含有する可能性があること、すなわち多形（無水物）として、混合されたエタノール溶媒和物／水和物として、あるいは水和物としてさえ存在可能であることが示唆される。
溶媒和物形態Ｍ
（６Ｒ）−Ｌ−エリスロ−テトラヒドロビオプテリン二塩酸塩のエタノール溶媒和物結晶形態は、本明細書に記載する製薬調製物で使用するためのＢＨ４の安定な好ましい形態であることが見出されており、本明細書では「形態Ｍ」または「水和物Ｍ」と呼ぶものとする。形態Ｍは、４％の、しかし１３％までのエタノールと、０％〜約６％の水を含有し、このことは形態Ｍがわずかに吸湿性のエタノール溶媒和物であることを示唆している。溶媒和物形態Ｍは室温よりも低い温度にて形成される。形態Ｍが、安定な多形形態を産生するための中間体および開始物質として特に適切であるのは、形態Ｍが、約−１０℃〜１５℃の温度のエタノール中で処理したときに形態Ｇへ、エタノール、Ｃ３およびＣ４アルコール、またはＴＨＦおよびジオキサンなどの環式エーテルなどの有機溶媒中で処理したときに形態Ｂへ変換することが可能であるためである。多形形態Ｍは、通例は１μｍ〜約５００μｍに及ぶ所望の中程度の粒径範囲の固体粉末として調製可能である。
形態Ｍは、１８．９（ｓ）、６．４（ｍ）、６．０６（ｗ）、５．６６（ｗ）、５．２８（ｗ）、４．５０（ｗ）、４．２３（ｗ）、および３．２２（ｖｓ）のｄ値（Å）で表される特徴的なピークを持つ、特徴的なＸ線粉末回折パターンを示す。図１４は、（６Ｒ）−Ｌ−エリスロ−テトラヒドロビオプテリン二塩酸塩の溶媒和物形態Ｍによって示された特徴的なＸ線回折パターンのグラフである。
エタノール溶媒和物形Ｍは、（６Ｒ）−Ｌ−エリスロ−テトラヒドロビオプテリン二塩酸塩をエタノールに溶解させることと、溶液を室温、すなわち１０℃〜４０℃にて窒素下で蒸発させることによって得てもよい。形態Ｍは、形態Ｇを約２０〜１００ｍｌ／分の速度の弱い乾燥窒素流で乾燥させることによって得られることもある。窒素下での乾燥の程度に応じて、エタノールの残存量は変わり、すなわち約３％〜１３％である。
溶媒和物形態Ｎ
（６Ｒ）−Ｌ−エリスロ−テトラヒドロビオプテリン二塩酸塩の別の溶媒和物結晶形態は、本明細書に記載する製薬調製物で使用するためのＢＨ４の安定な好ましい形態であることが見出されており、本明細書では「形態Ｎ」または「水和物Ｎ」と呼ぶものとする。形態Ｎは、総量が１０％までのイソプロパノールおよび水を含有することがあり、これにより形態Ｎがわずかに吸湿性のイソプロパノール溶媒和物であることが示唆される。形態Ｎは、形態Ｄをイソプロパノールで洗浄して、次に約３０℃の真空中で乾燥させることによって得てもよい。形態Ｎは、安定な多形形態を産生するための中間体および開始物質として特に適切である。多形形態Ｎは、通例は１μｍ〜約５００μｍに及ぶ所望の中程度の粒径範囲の固体粉末として調製可能である。
形態Ｎは、１９．５（ｍ）、９．９（ｗ）、６．７（ｗ）、５．１５（ｗ）、４．８３（ｗ）、３．９１（ｗ）、３．５６（ｍ）、３．３３（ｖｓ）、３．１５（ｗ）、２．８９（ｗ）、２．８１（ｗ）、２．５６（ｗ）、および２．３６（ｗ）のｄ値（Å）で表される特徴的なピークを持つ、特徴的なＸ線粉末回折パターンを示す。図１５は、（６Ｒ）−Ｌ−エリスロ−テトラヒドロビオプテリン二塩酸塩の溶媒和物形態Ｎによって示された特徴的なＸ線回折パターンのグラフである。
イソプロパノール形態Ｎは、（６Ｒ）−Ｌ−エリスロ−テトラヒドロビオプテリン二塩酸塩をイソプロパノールおよび水の混合物（たとえば４：１の混合比）４．０ｍｌに溶解することによって得てもよい。この溶液にイソプロパノール（ＩＰＡ、たとえば約４．０ｍｌ）を滴加して、得られた懸濁物を０℃に冷却し、この温度で数時間（たとえば約１０〜１８時間）撹拌する。懸濁物を濾過して、固体残渣を室温のイソプロパノールで洗浄する。得られた結晶性物質を次に周囲温度（たとえば約２０〜３０℃）および減圧下（約２〜１０ｍｂａｒ）で数時間（たとえば約５〜２０時間）で乾燥させる。ＴＧ−ＦＴＩＲによって、イソプロパノールおよび水の両方に起因する、２５〜２００℃での９．０％の重量損失が示される。この結果により、形態Ｎはイソプロパノール溶媒和物の形態、または混合されたイソプロパノール溶媒和物／水和物の形態のどちらとしても、あるいは少量の水を含有する非溶媒和形態として存在可能であることが示唆される。
多形形態の調製では、懸濁物の撹拌（相平衡）、沈殿、再結晶化、蒸発、水などの溶媒吸着法または溶媒和物の分解などの、当分野で周知の結晶化技法を使用してもよい。希釈、飽和または過飽和溶液は、適切な核形成剤による核添加を用いて、または用いずに結晶化に使用してもよい。１００℃までの温度を加えて溶液を形成する。結晶化および沈殿を開始するために、−１００℃まで、好ましくは−３０℃までの冷却を加えてもよい。準安定多形または偽多形形態を使用して、より安定な形態の調製のための溶液または懸濁物を調製して、溶液でより高濃度を達成することが可能である。
驚くべきことに、水和物形態Ｄは水和物の中で最も安定な形態であり、形態ＢおよびＤは、製薬調合物で使用するのに特に適切であることが見出された。形態ＢおよびＤは、目的とする製品、在来の結晶サイズおよび形態による取り扱いやすさ、多様な種類の調合物の産生条件下での非常に良好な安定性、貯蔵安定性、より高い溶解度、および高い生物学的利用能などの一部の利点を示す。したがって、本明細書で開示する組成物および方法の一実施形態は、（６Ｒ）−Ｌ−エリスロ−テトラヒドロビオプテリン二塩酸塩の多形形態Ｂおよび／または水和物形態Ｄならびに製薬的に許容される担体または希釈剤を含む製薬組成物である。
ＩＩＩ．製薬調合物
本明細書に記載する調合物は、好ましくは経口調合物として投与される。経口調合物は好ましくは、カプセル剤、錠剤、丸剤およびトローチ剤などの固体調合物、または水性懸濁剤、エリキシル剤およびシロップ剤などの液体調合物である。本明細書に記載するＢＨ４の多様な形態は、粉剤（微粉化粒子）、顆粒剤、懸濁剤または液剤として直接使用可能であるか、あるいは構成成分と混合して、場合によりそれらを微粉化して、次にたとえば硬または軟ゼラチンより成るカプセルを充填する、錠剤、丸剤またはトローチ剤を圧縮する、あるいはそれらを懸濁剤、エリキシル剤およびシロップ剤のための担体に溶解させる際に、それを他の製薬的に許容される成分と組合せてもよい。丸剤を形成する圧縮の後に、コーティングを施してもよい。
製薬的に許容される成分は、多様な種類の調合物について周知であり、多様な種類の調合物のための、たとえば天然または合成ポリマーなどの結合剤、賦形剤、潤滑剤、界面活性剤、甘味料および着香料、コーティング剤、保存料、染料、増粘剤、アジュバント、抗菌剤、抗酸化剤および担体であってもよい。「製薬的にまたは薬理学的に許容される」という句は、米国食品医薬品局または相当する海外の規制当局によってヒトへの投与が承認される分子的実体および組成物を指す。本明細書で使用するように、「製薬的に許容される担体」は、ありとあらゆる溶媒、分散媒、コーティング、抗菌および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などを含む。製薬活性物質へのこのような媒体または薬剤の使用は、当分野で周知である。いずれの従来の媒体または薬剤が治療組成物と不適合である場合を除いて、治療組成物でのその使用が考慮される。補助活性成分も組成物中に包含されうる。
調合物を調製するのに使用される６Ｒ−（Ｌ−エリスロ）−テトラヒドロビオプテリンの初期量はたとえば、調合物の約３０重量％〜約４０重量％の範囲、または約３２重量％〜約３５重量％の範囲、または約３３重量％であってもよい。本明細書で考慮される調合物中のＢＨ４の詳細な量としては、８０ｍｇ、１００ｍｇ、２００ｍｇ、３００ｍｇ、４００ｍｇ、および５００ｍｇが挙げられる。
結合剤は固体調合物を保持するのを補助する。一部の場合では、多形形態の無水状態を保存するために無水結合剤を使用する。一部の場合では、結合剤は乾燥剤として作用することがある。例示的な結合剤としては、無水第二リン酸水素カルシウムおよびその一水和物が挙げられる。本明細書に記載する組成物で有用な結合剤の他の非制限的な例としては、トラガカントガム、アラビアゴム、デンプン、ゼラチン、およびジカルボン酸、アルキレングリコール、ポリアルキレングリコールおよび／または脂肪族ヒドロキシカルボン酸のホモ−またはコ−ポリエステルなどの生分解性ポリマー；ジカルボン酸、アルキレンジアミン、および／または脂肪族アミノカルボン酸のホモ−またはコ−ポリアミド；対応するポリエステル−ポリアミド−コ−ポリマー、ポリ無水物、ポリオルトエステル、ポリホスファゼンおよびポリカーボネートが挙げられる。生分解性ポリマーは直鎖、分枝または架橋でもよい。詳細な例はポリグリコール酸、ポリ乳酸、およびポリ−ｄ，ｌ−ラクチド／グリコリドである。ポリマーの他の例は、ポリオキサアルキレン（ポリオキサエチレン、ポリオキサプロピレン、およびその混合ポリマー、ポリ−アクリルアミドおよびヒドロキシルアルキル化ポリアクリルアミド、ポリマレイン酸およびそのエステルまたはアミド、ポリアクリル酸およびそのエステルまたはアミド、ポリ−ビニルアルコールおよびそのエステルまたはエーテル、ポリビニルイミダゾール、ポリビニルピロリドン、およびキトサンなどの天然ポリマーなどの水溶性ポリマーである。
崩壊剤は、水を吸収して膨張することによって、固体調合物の迅速な崩壊を補助する。例示的な崩壊剤としては、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ、たとえばポビドンという名称で販売）、ポビドンの架橋形（ＣＰＶＰ、たとえばクロスポビドンという名称で販売）、カルボキシメチルセルロースナトリウムの架橋形（ＮａＣＭＣ、たとえばＡＣ−ＤＩ−ＳＯＬという名称で販売）、他の修飾セルロース、および修飾デンプンが挙げられる。ＣＰＶＰを用いて調合した錠剤は、ＰＶＰを用いて調合した錠剤よりもはるかに迅速な崩壊を示した。
抗酸化剤が含まれることもあり、テトラヒドロビオプテリン生成物を特に溶解後に安定化するのを助ける。ＡＰＩの低ｐＨ水溶液は、中〜高ｐＨの溶液よりも安定である。抗酸化剤は、酸化による劣化を防止するために本明細書に記載する調合物に含まれている。抗酸化剤は一般に３つの群に分類可能である。
第１の群は、真の抗酸化剤として公知であり、フリーラジカルと反応して連鎖反応を妨害することによって酸化を抑制する。例としては、ブチル化ヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、ｔｅｒｔ−ブチル−ヒドロキノン（ＴＢＨＱ）、４−ヒドロキシメチル−２，６−ジ−ｔｅｒｔ−ブチルフェノール（ＨＭＢＰ）、および２，４，５−トリヒドロキシブチロフェノン（ＴＨＢＰ）を含むフェノール性抗酸化剤；没食子酸プロピルを含む没食子酸アルキル；没食子酸；ノルジヒドログアイアレチン酸；およびアルファトコフェロールを含むトコフェロールが挙げられる。
還元剤から成る第２群は、それらが保護しようとする薬物よりも低い酸化還元電位を有し、したがってより容易に酸化される。
還元剤もフリーラジカルと反応することによって作用することがある。例としては、アスコルビン酸、チオグリコール酸（ＴＧＡ）、パルミチン酸アスコルビル、亜硫酸のカリウムおよびナトリウム塩を含む亜硫酸塩（たとえば亜硫酸カリウム、亜硫酸ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、および亜硫酸水素ナトリウム）、ならびにチオグリセロールが挙げられる。
第３の群は、それ自体は通常、中程度の抗酸化効果を有するが、酸化を触媒する重金属イオンと反応することによって第１または第２の群の抗酸化剤の作用をおそらく向上させる、抗酸化共力薬から成る。このような抗酸化共力薬およびキレート剤の例としては、クエン酸、リンゴ酸、エデト酸およびその塩、レシチン、および酒石酸が挙げられる。
例示的な酸性抗酸化剤としては、アスコルビン酸、パルミチン酸アスコルビルおよびステアリン酸アスコルビルなどのアスコルビン酸の脂肪酸エステル、ならびにアスコルビン酸ナトリウム、カルシウム、またはカリウムなどのアスコルビン酸の塩が挙げられる。非酸性抗酸化剤も安定な錠剤調合物で使用されることがある。非酸性抗酸化剤の非制限的な例としては、ベータカロテン、アルファトコフェロールが挙げられる。クエン酸またはリンゴ酸を含む酸性添加剤は、錠剤成功物の安定性を向上させるために添加してもよい。小型分子抗酸化剤としては、これに限定されるわけではないが、チオール、たとえばシステイン、Ｎ−アセチルシステイン、グルタチオンなど、またはチオール化ポリマー（ポリマー−ＳＨ）、たとえばポリカルボフィル−システイン、ポリメタクリル酸−ＳＨ、カルボキシメチルセルロース−システインなど、あるいはアスコルビン酸、メチオニン、パルミチン酸アスコルビルなどの小型分子抗酸化剤が挙げられる。これらの抗酸化剤は、ＧＩＴ内の移動中に、特にＧＩＴのｐＨが胃からの距離と共に上昇するときに、投薬形に安定性を与える。
一実施形態において、少なくとも２種の還元剤抗酸化剤の組合せが好ましい。別の実施形態において、少なくとも２種の還元剤抗酸化剤と酸抗酸化剤共力薬および／またはキレート剤との組合せが好ましい。
潤滑剤は固体調合物の安定性、硬度および均質性を改善する。例示的な潤滑剤としては、フマル酸ステアリルおよびステアリン酸マグネシウムが挙げられる。潤滑剤の他の非制限的な例としては、天然または合成油、脂肪、ワックスまたはステアリン酸マグネシウムなどの脂肪酸塩が挙げられる。
場合により、本発明の安定調合物は、マンニトール、ヒドロキシプロピルセルロース、微結晶性セルロース、またはスクロース、トレハロース、メレジトース、プランテオース、およびラフィノースなどの他の非還元糖などの、他の賦形剤も含むことが可能である。還元糖はＢＨ４と反応することがある。本明細書に記載した組成物で有用な賦形剤の他の非制限的な例としては、リン酸二カルシウムなどのリン酸塩が挙げられる。
本明細書に記載した組成物で使用するための界面活性剤は、アニオン性、アニオン性、両性または中性であることが可能である。本明細書に記載する組成物で有用な界面活性剤の非制限的な例としては、レシチン、リン脂質、硫酸オクチル、硫酸デシル、硫酸ドデシル、硫酸テトラデシル、硫酸ヘキサデシルおよび硫酸オクタデシル、オレイン酸Ｎａまたはカプリン酸Ｎａ、１−オクタノイルアミノエタン−２−スルホン酸、１−デカノイルアミノエタン−２−スルホン酸、１−ドデカノイルアミノエタン−２−スルホン酸、１−テトラデカノイルアミノエタン−２−スルホン酸、１−ヘキサデカノイルアミノエタン−２−スルホン酸、および１−オクタデカノイルアミノエタン−２−スルホン酸などの１−アシルアミノエタン−２−スルホン酸、ならびにタウロコール酸およびタウロデオキシコール酸、コール酸、デオキシコール酸およびグリココール酸ナトリウムなどの胆汁酸およびその塩、カプリン酸ナトリウムまたはラウリン酸ナトリウム、オレイン酸ナトリウム、ラウリル硫酸ナトリウム、セチル硫酸ナトリウム、硫酸化ヒマシ油およびジオクチルスルホコハク酸ナトリウム、コカミドプロピルベタインおよびラウリルベタイン、脂肪アルコール、コレステロール、モノまたはジステアリン酸グリセロール、モノまたはジオレイン酸グリセロールおよびモノまたはジパルミチン酸グリセロール、ならびにステアリン酸ポリオキシエチレンが挙げられる。
本明細書に記載する組成物で有用な甘味料の非制限的な例としては、スクロース、フルクトース、ラクトースまたはアスパルテームが挙げられる。本明細書に記載する組成物で使用するための着香料の非制限的な例としては、ペパーミント、ウインターグリーン油あるいはチェリーまたはオレンジフレーバなどのフルーツフレーバが挙げられる。本明細書に記載する組成物で使用するためのコーティング剤の非制限的な例としては、ゼラチン、ワックス、シェラック、糖または他の生分解性ポリマーが挙げられる。本明細書に記載する組成物で使用するための保存料の非制限的な例としては、メチルまたはプロピルパラベン、ソルビン酸、クロロブタノール、フェノールおよびチメロサールが挙げられる。
ＢＨ４形態は、水性環境で崩壊して飲用溶液を与える発泡錠剤または粉剤として調合してもよい。胃腸管内の体液と接触した活性剤の制御放出を達成するために、そして血漿中の活性成分を一定で有効なレベルで提供するために、低速放出調合物も調製されることがある。結晶形態はこの目的で、生分解性ポリマー、水溶性ポリマーまたは両方の混合物、および場合により適切な界面活性剤のポリマーマトリクス中に埋め込んでもよい。埋め込むとは、この文脈では微粒子をポリマーのマトリクス内に包含させることを意味しうる。制御放出調合物は、公知の分散またはエマルジョンコーティング技法による分散微粒子または乳化微小液滴のカプセル化によっても得られる。
本明細書に記載する組成物で使用されるＢＨ４は、好ましくは二塩酸塩として調合されるが、ＢＨ４の他の塩の形態が所望の生物活性を所有することが考慮され、結果として、ＢＨ４の他の塩の形を使用することが可能である。特に、無機酸または有機酸によるＢＨ４が好ましい。代わりのＢＨ４塩の非制限的な例としては、酢酸、クエン酸、シュウ酸、酒石酸、フマル酸、およびマンデル酸のＢＨ４塩を含む。
製薬的に許容される塩基添加塩は、アルカリ金属およびアルカリ土類金属または有機アミンなどの金属またはアミンを用いて形成してもよい。化合物の製薬的に許容される塩は、製薬的に許容されるカチオンを用いて調製されることもある。適切な製薬的に許容されるカチオンは当業者に周知であり、アルカリ、アルカリ土類、アンモニウムおよび４級アンモニウムカチオンが含まれる。炭酸塩または炭酸水素塩も可能である。カチオンとして使用される金属の例は、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、アンモニウム、カルシウム、または第２鉄などである。適切なアミンの例としては、イソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、Ｎ，Ｎ’ジベンジルエチレンジアミン、クロロプロカイン、コリン、ジエタノールアミン、ジシクロヘキシルアミン、エチレンジアミン、Ｎメチルグルカミン、およびプロカインが挙げられる。
製薬的に許容される酸添加塩としては、無機酸塩または有機酸塩が挙げられる。適切な酸添加塩の例としては、塩酸塩、酢酸塩、クエン酸塩、サリチル酸塩、硝酸塩、リン酸塩が挙げられる。他の適切な製薬的に許容される塩は、当業者に周知であり、たとえば酢酸、クエン酸、シュウ酸、酒石酸、またはマンデル酸、塩酸、臭化水素酸、硫酸またはリン酸による；有機カルボン酸、スルホン酸、スルホまたはホスホ酸あるいはＮ置換スルファミン酸、たとえば酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、コハク酸、マレイン酸、ヒドロキシマレイン酸、メチルマレイン酸、フマル酸、リンゴ酸、酒石酸、乳酸、シュウ酸、グルコン酸、グルカル酸、グルクロン酸、クエン酸、安息香酸、桂皮酸、マンデル酸、サリチル酸、４アミノサリチル酸、２フェノキシ安息香酸、２アセトキシ安息香酸、エンボン酸、ニコチン酸またはイソニコチン酸による；天然におけるタンパク質合成に関与する２０アルファアミノ酸、たとえばグルタミン酸またはアスパラギン酸などのアミノ酸、またフェニル酢酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、２ヒドロキシエタンスルホン酸、エタン１，２ジスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、４メチルベンゼンスルホン酸、ナフタレン２スルホン酸、ナフタレン１，５ジスルホン酸、２または３ホスホグリセラート、フルコース６ホスフェート、Ｎシクロヘキシルスルファミン酸（シクラメートの形成による）による、またはアスコルビン酸などの他の酸有機化合物による塩を含む。
例示的な安定経口調合物は、調合物の安定性または他の特徴を改善する以下の追加の成分：結合剤、崩壊剤、酸性抗酸化剤、または潤滑剤あるいはその組合せの１種以上を含有する。例示的な安定錠剤調合物は、結合剤および崩壊剤を場合により酸性抗酸化剤と共に含み、場合により潤滑剤をさらに含む。結合剤の例示的な濃度は、約１重量％〜約５重量％、または約１．５〜３重量％であり；結合剤のＢＨ４に対する例示的な重量比は、約１：１０〜約１：２０の範囲である。崩壊剤の例示的な濃度は、約１重量％〜約２０重量％である；崩壊剤のＢＨ４に対する例示的な重量比は、約１：５〜約１：１０の範囲である。抗酸化剤の例示的な濃度は、約１重量％〜約３重量％である；抗酸化剤のＢＨ４に対する例示的な重量比は、約１：５〜約１：３０の範囲である。一例において、アスコルビン酸は抗酸化剤であり、１：１未満の、たとえば１：２以下の、または１：１０以下のＢＨ４に対する比で使用される。本発明の安定な錠剤調合物中の潤滑剤の例示的な濃度は、約０．１重量％〜約２重量％である；潤滑剤のＢＨ４に対する例示的な重量比は、約１：２５〜１：６５の範囲である。
安定な固体調合物は場合により、治療される状態に適切な他の治療剤、たとえば葉酸塩前駆物質、葉酸、または葉酸塩誘導体を含む葉酸塩；ならびに／あるいはアルギニン；ならびに／あるいはビタミンＣおよび／またはビタミンＢ１２（リボフラビン）および／またはビタミンＢ１２などのビタミン；ならびに／あるいはＬ−ドーパまたはカルビドパなどの神経伝達物質前駆物質；ならびに／あるいは５−ヒドロキシトリプトファンを含んでもよい。
葉酸塩前駆物質、葉酸、または葉酸塩誘導体を含む例示的な葉酸塩は、そのどちらも参照により本明細書に組み込まれている米国特許第６，０１１，０４０号明細書および第６，５４４，９９４号明細書に開示され、葉酸（プテロイルグルタミン酸塩）、ジヒドロ葉酸、テトラヒドロ葉酸、５−メチルテトラヒドロ葉酸、５，１０−メチレンテトラヒドロ葉酸、５，１０−メテニルテトラヒドロ葉酸、５，１０−ホルムイミノテトラヒドロ葉酸、５−ホルミルテトラヒドロ葉酸（ロイコボリン）、１０−ホルミルテトラヒドロ葉酸、１０−メチルテトラヒドロ葉酸、葉酸ポリグルタミン酸塩の１種以上、葉酸または葉酸ポリグルタミン酸塩のプテリン部分のピラジン環が還元されてジヒドロ葉酸塩またはテトラヒドロ葉酸塩を与える化合物、あるいはＮ−５またはＮ−１０位置が各種の酸化レベルの一炭素ユニットを担持する先行化合物すべての誘導体、あるいはその製薬的に適合する塩、またはその２種以上の組合せを含む。例示的なテトラヒドロ葉酸塩としては、５−ホルミル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸、５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸、５，１０−メチレン−（６Ｒ）−テトラヒドロ葉酸、５，１０−メテニル−（６Ｒ）−テトラヒドロ葉酸、１０−ホルミル−（６Ｒ）−テトラヒドロ葉酸、５−ホルムイミノ−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸または（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸、およびその製薬的に許容される塩が挙げられる。例示的な塩としては、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩またはアンモニウム塩が挙げられる。
ＢＨ４の葉酸塩およびアルギニンに対する例示的な相対重量比は、約１：１０：１０〜約１０：１：１でもよい。
本発明の安定な調合物は、たとえば乾燥剤カプセルを含むＨＤＰＥボトルまたはパウチ内の；あるいは商業的に望ましい場合には、ホイル・オン・ホイル（ｆｏｉｌ−ｏｎ−ｆｏｉｌ）ブリスタ包装内の、または透明ポリマーフィルムを含むブリスタ包装内の錠剤または丸剤またはカプセル剤として提供されることもある。
ＩＶ．ＢＨ４応答性疾患の治療
高フェニルアラニン血症、神経心理学的または神経精神医学的障害
本発明の方法は、たとえばフェニルアラニン水酸化酵素、チロシン水酸化酵素、またはトリプトファン水酸化酵素活性能の低下によって引き起こされることがある、フェニルアラニンレベルの上昇あるいはチロシンまたはトリプトファンレベルの低下に関連する状態の治療に使用されることがある。フェニルアラニンレベルの上昇に関連する状態としては特に、軽度および古典的フェニルケトン尿症の両方、ならびに本明細書に記載するような高フェニルアラニン血症が挙げられ、例示的な患者集団は、本明細書に記載するような患者サブグループはもちろんのこと、正常より高いフェニルアラニンレベルを示す他のいずれの患者も含む。
チロシンまたはトリプトファンレベルの低下に関連する状態としては、神経伝達物質の欠乏、パーキンソン病などの神経および精神障害、ジストニア、脊髄小脳変性症、疼痛、疲労、うつ病、他の情動障害および統合失調症が挙げられる。ｎＮＯＳによるＮＯ過剰産生は、脳卒中、片頭痛、アルツハイマー病、ならびにモルヒネへの耐性および依存に関与してきた。ＢＨ４はこのような状態のいずれに投与してもよい。ＢＨ４が投与されることのある他の例示的な精神神経障害としては、パーキンソン病、アルツハイマー病、統合失調症、統合失調症様障害、統合失調性感情障害、短期精神病性障害、妄想性障害、共有精神病障害、全身状態による精神病性障害、物質誘発性精神病性障害、他の精神病性障害、遅発性ジスキネジア、マチャド−ジョセフ病、脊髄小脳変性症、小脳性運動失調、ジストニア、慢性疲労症候群、急性または慢性うつ病、慢性ストレス症候群、線維筋痛症、片頭痛、注意欠陥多動性障害、双極性疾患、および自閉症が挙げられる。
安定調合物は、これに限定されるわけではないが、ドーパ反応性ジストニア（ＤＲＤ）、セピアプテリンレダクターゼ（ＳＲ）欠乏、またはジヒドロプテリジンレダクターゼ（ＤＨＰＲ）欠乏を含む、たとえばＢＨ４の合成経路の欠陥のためのＢＨ４欠乏に苦しむ患者を治療するためにも使用されることがある。
本発明の安定調合物による治療に適切な対象としては、治療薬の非存在下で、たとえば１８００μＭ／Ｌを超える、または１６００μＭを超える、１４００μＭを超える、１２００μＭを超える、１０００μＭを超える、８００μＭ超える、または６００μＭを超える、４２０μＭを超える、３００μＭを超える、２００μＭを超える、または１８０μＭを超える高い血漿Ｐｈｅ濃度を有する対象が挙げられる。軽度のＰＫＵは一般に、最高６００μＭ／Ｌの血漿Ｐｈｅ濃度として、中程度のＰＫＵは６００μＭ／Ｌ〜約１２００μＭ／Ｌの血漿Ｐｈｅ濃度として、古典的または重度のＰＫＵは１２００μＭ／Ｌを超える血漿Ｐｈｅ濃度として分類される。単独の、またはタンパク質制限食と組合せた安定調合物による好ましい治療によって、対象の血漿フェニルアラニン濃度は、６００μＭ未満、または５００μＭ未満、または３６０μＭ±１５μＭ以下、または２００μＭ未満、または１００μＭ未満に低下する。他の適切な対象としては、フェニルアラニン水酸化酵素（ＰＡＨ）活性の低下、ＢＨ４欠乏に関連する非定型または悪性フェニルケトン尿症、肝障害に関連する高フェニルアラニン血症、およびマラリアに関連する高フェニルアラニン血症を有すると診断された対象が挙げられる。ＰＡＨ活性の低下は、ＰＡＨ酵素における突然変異、たとえばＰＡＨの触媒ドメインにおける突然変異またはＦ３９Ｌ、Ｌ４８Ｓ、Ｉ６５Ｔ、Ｒ６８Ｓ、Ａ１０４Ｄ、Ｓ１１０Ｃ、Ｄ１２９Ｇ、Ｅ１７８Ｇ、Ｖ１９０Ａ、Ｐ２１１Ｔ、Ｒ２４１Ｃ、Ｒ２６１Ｑ、Ａ３００Ｓ、Ｌ３０８Ｆ、Ａ３１３Ｔ、Ｋ３２０Ｎ、Ａ３７３Ｔ、Ｖ３８８Ｍ Ｅ３９０Ｇ、Ａ３９５Ｐ、Ｐ４０７Ｓ、およびＹ４１４Ｃからなる群より選択される１つ以上の突然変異；あるいは妊婦、妊娠が考えられる出産適齢期の女性、または０〜３歳、または０〜２歳、０〜１．５歳または０〜１歳の幼児である対象；あるいは１回投薬ＢＨ４負荷試験あるいは４回投薬または７日間負荷試験などの複数回投薬負荷試験に対して２４時間以内に無応答性であると診断された対象から生じることがある。例示的な患者集団および例示的なＢＨ４負荷試験は、その全体が参照により本明細書に組み込まれている、国際公開第２００５／０４９０００号パンフレットに記載されている。
米国特許第４，７５２，５７３号明細書；第４，７５８，５７１号明細書；第４，７７４，２４４号明細書；第４，９２０，１２２号明細書；第５，７５３，６５６号明細書；第５，９２２，７１３号明細書；第５，８７４，４３３号明細書；第５，９４５，４５２号明細書；第６，２７４，５８１号明細書；第６，４１０，５３５号明細書；第６，４４１，０３８号明細書；第６，５４４，９９４号明細書；および米国特許公開第２００２０１８７９５８号明細書；第２００２０１０６６４５号明細書；第２００２／００７６７８２号明細書；第２００３００３２６１６号明細書（参照によりそれぞれ本明細書に組み込まれている）はそれぞれ非ＰＫＵ治療のためにＢＨ４組成物を投与する方法について記載している。これらの特許はそれぞれ、本明細書に記載する治療に適合される、当業者に公知であるＢＨ４組成物を投与する方法の一般的な教示を提供するとして本明細書に組み込まれている。
個別の要求は変化することがあるが、各構成成分の有効量の最適範囲は当分野の技術の範囲内である。ＢＨ４の代表的な投薬量は１日当り約１〜約２０ｍｇ／ｋｇ体重で構成され、これは通常、約５（１ｍｇ／ｋｇ×５ｋｇ体重）〜３０００ｍｇ／日（３０ｍｇ／ｋｇ×１００ｋｇ体重）に相当する。ＨＰＡでは連続した連日投与が考慮されるが、Ｐｈｅレベルの症状がある閾値レベルより下に低下したときにはＢＨ４治療を中止するのが望ましいことがある。もちろん、Ｐｈｅレベルが再度上昇した場合には、治療を再度開始してもよい。適切な投薬量は、Ｐｈｅの血中レベルを決定するための樹立されたアッセイを関連する用量応答データと併せて使用することによって確認してもよい。
例示的な実施形態において、本発明の方法により、その必要がある患者に約１０ｍｇ／ｋｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇのＢＨ４の１日用量が供給されるであろう。もちろん、当業者は投与によって達成される効力に応じて、この用量を増減してもよい。１日用量は１回投薬で投与しても、あるいは好都合に空けた間隔にて複数回投薬で投与してもよい。例示的な実施形態において、１日用量は１ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、４ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、６ｍｇ／ｋｇ、７ｍｇ／ｋｇ、８ｍｇ／ｋｇ、９ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、１１ｍｇ／ｋｇ、１２ｍｇ／ｋｇ、１３ｍｇ／ｋｇ、１４ｍｇ／ｋｇ、１５ｍｇ／ｋｇ、１６ｍｇ／ｋｇ、１７ｍｇ／ｋｇ、１８ｍｇ／ｋｇ、１９ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ、２２ｍｇ／ｋｇ、２４ｍｇ／ｋｇ、２６ｍｇ／ｋｇ、２８ｍｇ／ｋｇ、３０ｍｇ／ｋｇ、３２ｍｇ／ｋｇ、３４ｍｇ／ｋｇ、３６ｍｇ／ｋｇ、３８ｍｇ／ｋｇ、４０ｍｇ／ｋｇ、４２ｍｇ／ｋｇ、４４ｍｇ／ｋｇ、４６ｍｇ／ｋｇ、４８ｍｇ／ｋｇ、５０ｍｇ／ｋｇまたはそれ以上でもよい。
低用量レジメン
本発明の低用量治療方法において、０．１〜２ｍｇ／ｋｇ、または０．１〜３ｍｇ／ｋｇ、または１ｍｇ／ｋｇ〜５ｍｇ／ｋｇを含む低用量、たとえば１日当り０．１〜５ｍｇ／ｋｇの用量が考慮される。１日当り５ｍｇ／ｋｇ未満の用量が好ましい。本発明により、このような用量は関連する試験のエンドポイントによる改善を与えることが期待され、ＢＨ４誘導体はこのような用量での天然ＢＨ４に対する生物学的特性を改善することが期待される。特に、本発明により、本明細書に記載する１’，２’−ジアシル−（６Ｒ，Ｓ）−５，６，７，８−テトラヒドロ−Ｌ−ビオプテリンまたは類脂質テトラヒドロビオプテリンのいずれも低用量で生物学的特性の改善を示すことが考慮される。
本発明によって、少なくとも１、２、３、または４週以上、あるいは１、２、３、４、５、６ヶ月以上の期間にわたる、１日１回投薬または１日当り複数回（たとえば２、３または４）分割投薬での、これに限定されるわけではないが経口投与を含むいずれかの投与経路による、０．１〜５ｍｇ／ｋｇ体重／日の範囲の用量での、ＢＨ４応答性疾患を治療するためのＢＨ４、あるいはその前駆物質または誘導体の使用も特に考慮される。例示的な用量としては、５ｍｇ／ｋｇ／日未満、４．５ｍｇ／ｋｇ／日以下、４ｍｇ／ｋｇ／日以下、３．５ｍｇ／ｋｇ／日以下、３ｍｇ／ｋｇ／日以下、２．５ｍｇ／ｋｇ／日以下、２ｍｇ／ｋｇ／日以下、１．５ｍｇ／ｋｇ／日以下、１ｍｇ／ｋｇ／日以下、または０．５ｍｇ／ｋｇ／日以下が挙げられる。体表面積当りの等価用量も考慮される。
平均体重／体表面積（たとえば７０ｋｇ）のヒトでは、本発明により、４００ｍｇ未満の総１日用量も考慮される。例示的なこのような総１日用量としては、３６０ｍｇ／日、３５０ｍｇ／日、３００ｍｇ／日、２８０ｍｇ／日、２１０ｍｇ／日、１８０ｍｇ／日、１７５ｍｇ／日、１５０ｍｇ／日、または１４０ｍｇ／日が挙げられる。たとえば、３５０ｍｇ／日または１７５ｍｇ／日は、１日１回または２回の１７５ｍｇの経口投薬調合物によって容易に投与可能である。他の例示的な総１日用量としては、３２０ｍｇ／日以下、１６０ｍｇ／日以下、または８０ｍｇ／日以下が挙げられる。このような用量は、８０または１６０ｍｇの経口投薬調合物によって容易に投与可能である。他の例示的な総１日用量としては、４５または９０ｍｇの経口投薬調合物によって容易に投与可能である、４５、９０、１３５、１８０、２２５、２７０、３１５または３６０ｍｇ／日が挙げられる。なお他の例示的な総１日用量としては、６０または１２０ｍｇの経口投薬調合物によって容易に投与可能である、６０、１２０、１８０、２４０、３００、または３６０ｍｇ／日が挙げられる。他の例示的な総１日用量としては、７０または１４０ｍｇの経口投薬調合物によって容易に投与可能である、７０、１４０、２１０、２８０、または３５０ｍｇ／日が挙げられる。例示的な総１日用量としては、５５ｍｇの経口投薬調合物によって容易に投与可能である、５５、１１０、１６５、２２０、２７５または３３０ｍｇ／日が挙げられる。他の例示的な総１日用量としては、たとえば６５ｍｇまたは７５ｍｇの投薬調合物では６５、１３０、１９５、２６０、または３２５ｍｇ／日、あるいは７５、１５０、２２５、３００または３７５ｍｇ／日が挙げられる。
一酸化窒素シンターゼ機能障害に関連する疾患
本発明によって、本発明の安定調合物が一酸化窒素シンターゼ活性の上昇から利益を得るであろう状態に罹患している対象および血管疾患、虚血または炎症性疾患、あるいはインスリン抵抗性に罹患している患者の治療に使用される可能性があることが考慮される。治療はたとえば、一酸化窒素シンターゼ活性の欠乏を軽減するか、またはたとえば正常レベルを超える一酸化窒素シンターゼ活性の上昇をもたらす可能性がある。一酸化窒素シンターゼ活性の欠乏に罹患している患者は、葉酸塩前駆物質、葉酸、または葉酸塩誘導体を含む葉酸塩による同時治療から利益を得るであろうことが示唆されてきた。
一酸化窒素は、それが血圧および血管緊張の調節で主な生理学的役割を果たす血管内皮細胞によって構成的に産生される。一酸化窒素生物活性の欠乏が冠動脈疾患、冠動脈、頸動脈、脳動脈、または末梢血管動脈を含むいずれかの動脈のアテローム性動脈硬化、虚血再灌流傷害、高血圧、糖尿病、糖尿病性血管障害、心血管疾患、末梢血管疾患、あるいは脳卒中などの虚血および／または炎症から生じる神経変性状態を含む血管機能障害の病因に関与していることと、このような病因が内皮損傷、臓器および組織への不十分な酸素流、全身血管抵抗の上昇（高血圧）、血管平滑筋増殖、血管狭窄（狭小化）および炎症の進行を含むこととが示唆されてきた。それゆえ、本発明の方法によるこれらの状態のいずれの治療も考慮される。
参照により本明細書に組み込まれる米国特許第６，４１０，５３５号明細書に記載されているように、一酸化窒素シンターゼ活性の上昇は、スーパーオキシドレベル上昇の低減、インスリン感受性の上昇、およびインスリン抵抗性に関連する血管機能障害の低減も生じることも示唆されている。それゆえ糖尿病（Ｉ型およびＩＩ型）、高インスリン血症、またはインスリン抵抗性の治療が本発明によって考慮される。インスリン抵抗性に関連する血管機能障害を有する疾患または障害としては、インスリン抵抗性によって引き起こされる、またはインスリン抵抗性によって悪化する疾患または障害、あるいはインスリン抵抗性によって治癒が妨げられる疾患または障害が挙げられ、これに限定されるわけではないが、異常血管コンプライアンス、内皮機能障害および高血圧、インスリン感受性およびグルコース制御の障害、間欠性跛行などの異常末梢灌流、末梢灌流減少、皮膚血流減少、創傷治癒障害および末梢循環障害、高脂血症、動脈硬化症、冠血管収縮狭心症、労作性狭心症、脳血管収縮病変、脳血管不全、脳血管攣縮、経皮経管冠動脈形成（ＰＴＣＡ）または冠動脈バイパス移植術（ＣＡＢＧ）後の冠動脈再狭窄、肥満、インスリン非依存性糖尿病、高インスリン血症、脂質代謝異常、冠動脈硬化性心疾患、鬱血性心不全、鬱血性心不全を伴うまたは伴わない肺性高血圧、運動関連狭心症、冠動脈疾患および関連するアテローム性動脈硬化；視神経萎縮および糖尿病性網膜疾患などの眼科疾患；ならびに糖尿病性腎疾患でのミクロアルブミン尿症、腎不全および糸球体濾過速度低下などの腎疾患が挙げられる。
これらの疾患がある患者に投与すると、ＢＨ４は、ＮＯＳの機能を活性化して、ＮＯ産生を向上させ、活性酸素種の産生を抑制して血管内皮細胞の障害を改善することによって、これらの疾患を予防または治療することが可能である。
本発明は、肺血管疾患、溶血性貧血、脳卒中および関連する虚血性血管疾患（脳卒中、心臓または冠動脈疾患、動脈硬化症、または末梢血管疾患など）、血栓症、移植関連内皮機能障害、および心臓または冠動脈疾患からなる群より選択される糖尿病に関連のない血管疾患を有するとして診断された対象を治療する方法を提供する。一実施形態において、肺血管疾患は、これに限定されるわけではないが、鎌状赤血球性貧血および他の異常血色素症における肺緊張、特発性肺性高血圧症、新生児遷延性肺高血圧症（ＰＰＨＮ）が挙げられる。さらなる実施形態において、溶血性貧血としては、遺伝性溶血性貧血および後天性溶血性貧血が挙げられる。遺伝性溶血性貧血としては、これに限定されるわけではないが、鎌状赤血球性貧血、サラセミア、Ｇ６ＰＤ欠乏による溶血性貧血、ピルビン酸キナーゼ欠乏症、遺伝性楕円赤血球症、遺伝性球状赤血球症、遺伝性有口赤血球症、遺伝性楕円赤血球症、発作性夜間血色素尿症、およびヘモグロビンＳＣ症が挙げられる。後天性溶血性貧血としては、これに限定されるわけではないが、微小血管障害性溶血性貧血、特発性自己免疫性溶血性貧血、化学的または物理的因子あるいは装置（左心補助装置）機械心臓弁、バイパス装置）によって引き起こされた非免疫性溶血性貧血、および二次免疫溶血性貧血が挙げられる。
別の実施形態において、脳卒中および関連する虚血性血管疾患としては、これに限定されるわけではないが、脳卒中後の脳血管攣縮などの血管攣縮が挙げられる。血栓症としては、これに限定されるわけではないが、血栓形成、血栓症、凝固、および凝血が挙げられる。さらなる実施形態において、移植関連内皮機能障害としては、これに限定されるわけではないが、固形臓器移植後の血管機能障害およびシクロスポリンＡ誘発性内皮機能障害が挙げられる。なお別の実施形態において、心臓または冠動脈疾患としては、これに限定されるわけではないが、鬱血性心不全、高コレステロール血症に関連する血管機能障害および狭心症、ならびに喫煙に関連する血管機能障害および狭心症が挙げられる。
ＢＨ４は、活性酸素種の過剰産生または活性酸素種に関係する損傷に関連する他の障害を予防または治療することも可能である。
本発明による組成物の適切な用量は、レシピエントの年齢、健康および体重、もしあれば併用治療の種類、治療の頻度、ならびに所望の効果の性質（すなわち所望の血漿Ｐｈｅ濃度の低下の量）によって変わるであろうことが理解される。投薬の頻度は、Ｐｈｅレベルの薬力学的効果によっても変わる。効果が１回投薬から２４時間継続する場合。しかし最も好ましい投薬量は、過度の実験なしに当業者によって理解および決定できるように、個々の対象に適合させることが可能である。これは通例、標準用量の調整、たとえば患者の低体重である場合、用量の削減を含む。
ＢＨ４の投薬の頻度は、薬剤の薬物動態学的パラメータおよび投薬経路によって変わるであろう。最適の製薬調合物は、投与経路および所望の投薬量に応じて当業者によって決定されるであろう。たとえば、参照により本明細書に組み込まれている、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ Ｅｄ．（１９９０，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌ．Ｃｏ，Ｅａｓｔｏｎ ＰＡ １８０４２） ｐｐ１４３５ １７１２を参照。このような調合物は、投与した薬剤の物理的状態、安定性、生体内放出の速度および生体内クリアランスの速度に影響することがある。投薬経路に応じて、適切な用量は体重、体表面積または臓器サイズに従って計算されることもある。適切な治療用量を決定するのに必要な計算のさらなる改善は、過度の実験なしで、特に本明細書に開示した投薬情報およびアッセイはもちろんのこと、動物またはヒト臨床試験で観察された薬物動態学的データも考慮して、当業者によって日常的に行われる。
最終投薬レジメンは、薬物の作用、たとえば薬物の詳細な活性、損傷の重症度および患者の応答性、患者の年齢、状態、体重、性別および食事、何らかの感染の重症度および他の臨床因子を変更する因子を考慮して、担当医によって決定されるであろう。試験が実施されるときに、具体的な疾患および状態に対する適切な投薬レベルおよび治療期間に関するさらなる情報が判明するであろう。
Ｖ．併用療法
本発明のある方法は、本発明の安定調合物および１種以上の他の治療剤の併用使用を含む。
このような併用療法では、本発明の安定調合物の投与は、両方の薬剤がその治療効果を重複期間に発揮可能である限り、第２の治療剤の投与と同時であるか、あるいは数分から数時間にわたる間隔で第２の治療剤の投与に先行または後続してもよい。それゆえ本発明により、第２の治療剤と使用するための本発明の安定調合物が考慮される。本発明により、本発明の安定テトラヒドロビオプテリン、前駆物質、誘導体または類似体調合物との投与のための、薬剤の調製での第２の治療剤の使用も考慮される。
テトラヒドロビオプテリン療法は、各種の形態のＨＰＡを有する患者での治療成績をもたらすために、食事タンパク質制限と組合せてもよい。たとえば、対象にＢＨ４組成物および低フェニルアラニン医用タンパク質組成物を、所望の治療成績（すなわち血漿Ｐｈｅ濃度の低下および／または血漿Ｐｈｅ濃度の同時上昇を生じることなく、より多い量のＰｈｅ／タンパク質摂取に耐える能力）を生じるのに有効な併用量で投与することが可能である。本プロセスは、ＢＨ４組成物および食事タンパク質治療組成物を同時に投与することを含む場合がある。これは、食事タンパク質要件すべてを含み、前記タンパク質調合物中にＢＨ４も含む、単一の組成物または薬理学的タンパク質調合物を投与することによって達成される場合がある。あるいは、食事タンパク質（補助または通常タンパク質食）は、ＢＨ４の薬理学的調合物（錠剤、注射剤または飲料）とほぼ同時に摂取される。
一部の実施形態において、タンパク質制限食は、チロシン、バリン、イソロイシンおよびロイシンなどのアミノ酸が補助された食事である。患者は、２０ｍｇ／１００ｇサプリメントの濃度のＬ−チロシン、Ｌ−グルタミン、Ｌ−カルニチン、４０ｍｇ／１００ｇ サプリメントの濃度のＬ−タウリンおよびセレンを含むことがある、低Ｐｈｅタンパク質サプリメントを同時投与されることもある。サプリメントは、無機物、たとえばカルシウム、リンおよびマグネシウムの推奨される１日用量をさらに含んでいてもよい。サプリメントは、Ｌ−ロイシン、Ｌ−プロリン、酢酸Ｌ−リジン、Ｌ−バリン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−アラニン、グリシン、Ｌ−アスパラギン一水和物、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−セリン、Ｌ−トレオニン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−グルタミン酸、およびＬ−アスパラギン酸からなる群より選択される１種以上のアミノ酸の推奨される１日用量をさらに含むことがある。さらに、サプリメントはビタミンＡ、ＤおよびＥの推奨される１日用量によって強化されることもある。場合により、サプリメントは、サプリメントのエネルギーの少なくとも４０％を供給する脂肪含有量を含む。このようなサプリメントは、粉末サプリメントの形またはプロテインバーの形で提供されることもある。ある実施形態において、タンパク質制限食はタンパク質サプリメントを含み、ＢＨ４はタンパク質サプリメントと同じ組成で提供される。
他の代案において、ＢＨ４治療は、数分から数時間にわたる間隔で食事タンパク質療法に先行または後続してもよい。タンパク質およびＢＨ４組成物が別々に投与される実施形態では、一般に、ＢＨ４が患者に有利な効果をなお及ぼすことが可能であるように、各送達時刻の間に長い期間が経過させないようにする。このような例では、わずか約１時間以下の遅延時間で、食事タンパク質摂取（前後）の約２〜６時間以内にＢＨ４を投与することが考慮される。ある実施形態において、ＢＨ４療法は、ＢＨ４の１日用量が患者に無期限に投与される連続療法となるであろうことが考慮される。他の状況のおいて、たとえば妊婦より軽症型のＰＫＵおよびＨＰＡを有する妊婦では、ＢＨ４療法はその女性が妊娠および／または授乳している間のみ継続されることがある。
さらに、ＢＨ４および食事タンパク質調節の送達のみに基づく療法に加えて、本発明の方法では、ＨＰＡの症状の１つ以上を特異的に標的とする第３の組成物を用いた併用療法も考慮される。たとえば、ＨＰＡによって引き起こされたチロシンの欠乏により、神経伝達物質のドーパミンおよびセロトニンの欠乏が生じることが公知である。それゆえ、本発明の文脈において、ＢＨ４および食事タンパク質に基づく方法が、食事中のチロシン量の減少から生じた欠陥を補正するために、Ｌ−ドーパ、カルビドパおよび５−ヒドロキシトリプトファン神経伝達物質の投与とさらに組合せ可能であることが考慮される。
さらに、ＰＡＨ（Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎら、Ｍｏｌ．Ｇｅｎｔ．Ａｎｄ Ｍｅｔａｂｏｌ．７６：３１３−３１８，２００２；Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，７：１９７１−１９７８，２０００）およびフェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ Ｌｉｕら、Ａｒｔｓ．Ｃｅｌｌｓ．Ｂｌｏｏｄ．Ｓｕｂｓ ａｎｄ Ｉｍｍｏｂ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．３０（４）２４３−２５７，２００２）の両方を用いた遺伝子療法が、当業者によって考慮されている。このような遺伝子療法技法は、本発明の併用ＢＨ４／食事タンパク質制限ベース療法と組合せて使用できる。さらなる併用療法では、患者における低Ｐｈｅ濃度を破壊する注射用酵素としてフェニラーゼが供給されることが考慮される。フェニラーゼの投与によってチロシンが生成されないので（ＰＡＨの投与とは異なり）、このような治療によって、チロシンはこのような患者にとってなお必須のアミノ酸となるであろう。したがって、ＢＨ４治療と組合せてフェニラーゼを投与されている患者には、食事によるチロシン補給が望ましいことがある。
ＢＨ４は、精神心理または精神神経障害のために、本発明の方法に従って、抗うつ薬、トリプトファン、チロシン、セロトニンなどの神経伝達物質前駆物質、ロフェプラミン、デシプラミン、レボキセチン、チロシンなどのノルアドレナリン作動系を活性化する薬剤、セロトニンに優先的に作用する薬剤、ベンラフェキシン、デュロキセチンまたはミルナシプランなどのノルアドレナリンおよびセロトニン取込みの両方の併用阻害薬、あるいはブプロピオンなどのドーパミンおよびノルアドレナリン再取込みの両方の併用阻害薬である薬物を含む１種以上の他の精神神経活性剤と共に同時投与されることがある。
関連する実施形態において、ＢＨ４は、糖尿病、血管疾患、高脂血症を治療するために一般に使用される他の治療剤と共に投与される。糖尿病を治療するために使用される薬剤としては、これに限定されるわけではないが、ＰＰＡＲガンマリガンドなどのインスリン感受性を改善する薬剤（チアゾリジンジオン、グリタゾン、トログリタゾン、ロシグリタゾン（アバンディア）、ピオグリタゾン）、スルホニル尿素（グリキドン、トルブタミド、グリメプリド、クロルプロパミド、グリピジド、グリブリド、アセトヘキサミド）およびメグリチニド（メグリチニド、レパグリニド、ナテグリニド）などのインスリン分泌の刺激薬ならびにメトホルミンなどのグルコースの肝産生を減少させる薬剤が挙げられる。血管疾患を治療するのに使用される薬剤は、これに限定されるわけではないが、ボセンタン、ダルセンタン、エンラセンタン、テゾセンタン、アトラセンタン、アンブリセンタン、シタクスセンタンなどの高血圧および他の内皮機能障害関連障害の治療に一般に使用されるエンドセリン受容体拮抗薬；ＰＤＥ５阻害薬（間接作用）およびミノキシジル（直接作用）などの平滑筋弛緩薬；カプトプリル、エナラプリル、リシノプリル、フォシノプリル、ペリンドプリル、キナプリル、トランドラプリル、ベナゼプリル、ラミプリルなどのアンギオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害薬；イルベサルタン、ロサルタン、バルサルタン、エプロサルタン、オルメサルタン、カンデサルタン、テルミサルタンなどのアンギオテンシンＩＩ受容体ブロッカ；アテノロール、メトプロロール、ナドロール、ビソプロロール、ピンドロール、アセブトロール、ベタキソロール、プロプラノロールなどのベータブロッカ；ヒドロクロロチアジド、フロセミド、トルセミド、メトラゾンなどの利尿薬；アムロジピン、フェロジピン、ニソルジピン、ニフェジピン、ベラパミル、ジルチアゼムなどのカルシウムチャネルブロッカ；ドキサゾシン、テラゾシン、アルフゾシン、タムスロシンなどのアルファ受容体ブロッカ；およびクロニジンなどの中枢性α作用薬が挙げられる。高脂血症を治療するために使用される薬剤は、これに限定されるわけではないが、スタチン（アトルバスタチン、フルバスタチン、ロバスタチン、プラバスタチン、ロスバスタチンカルシウム、シンバスタチン）およびニコチン酸などのＬＤＬを低下させる薬剤、コレステリルエステル転送タンパク質阻害薬（トルセトラピブなど）、フィブラート、ゲムフィブロジル、フェノフィブラート、ベザフィブラート、シプロフィブラートなどのＰＰＡＲアルファを刺激する薬剤、胆汁酸封鎖剤、コレスチラミンおよびコレスチポールなどの胆汁酸を結合して、胆汁酸の再吸着を防止し、コレステロールレベルを低下させる薬剤、ならびにコレステロール吸収阻害薬が挙げられる。
ＢＨ４は、単独でまたは治療剤と組み合わされた血管拡張薬一酸化窒素（ＮＯ）を上昇または正常化する因子または因子の組合せと共に投与されることもある。一実施形態において、このような（複数の）因子は、ＢＨ４のデノボ生合成の活性および発現を上昇させ、グアノシン三リン酸シクロヒドラーゼＩ（ＧＴＰＣＨ１）、６−ピルボイルテトラヒドロプテリンシンターゼ（ＰＴＰＳ）およびセピアプテリンレダクターゼからなる群より選択される。本発明の好ましい実施形態において、ＢＨ４合成は、フォルスコリン、８−ブロモｃＡＭＰあるいはｃＡＭＰ介在細胞シグナル伝達を上昇させるように機能する他の薬剤、たとえばインターロイキン−１、インターフェロン−ガンマ（ＩＮＦ−γ）、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ−α）、ｃ−反応性タンパク質、ＨＭＧ−ＣｏＡ−レダクターゼ（アトルバスタチンなどのスタチン）神経成長因子（ＮＧＦ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）を含むサイトカインおよび成長因子、アドレノメデュリンおよび安息香酸エストラジオールを含むホルモン、ならびにＮＡＤＰＨおよびＮＡＤＰＨ類似体、カフェイン、３−イソブチル−１−メチルキサチンを含むシクロスポリンＡメチル−キサンチン、テオフィリン、レセルピン、過酸化水素などの他の化合物を含む、いずれかの１種以上の環式アデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ）類似体または作用薬を使用して、ＧＴＰＣＨ１発現の発現を上昇させることによって増強される。
したがって発明の一実施形態は、ＰＤＥ１、ＰＤＥ３、ＰＤＥ５を含む１１種のホスホジエステラーゼファミリー（ＰＤＥ１−１１）を使用して３’５’−環式ヌクレオチドの分解を抑制することによって、ＧＴＰＣＨ１レベルを上昇させることに関連する。本発明のＰＤＥ阻害薬としては、バイアグラ／シルデナフィル、シアリス／タダラフィル、バルデナフィル／レビトラ、ウデナフィル、８−メトキシメチル−ＩＢＭＸ、ＵＫ−９０２３４、デキサメタゾン、ヘスペレチン、ヘスペレジン、イルソグラジン、ビンポセチン、シロスタミド、ロリプラム、エチルベータ−カルボリン−３−カルボキシラート（ベータ−ＣＣＥ）、テトラヒドロ−ベータ−カルボリン誘導体、３−Ｏ−メチルケルセチンなどが挙げられる。
本発明の別の実施形態は、遺伝子治療またはＢＨ４の合成機構のポリヌクレオチドの内皮標的化送達によってＢＨ４合成酵素のレベルを上昇させることにより、ＢＨ４のレベルを上昇させることに関する。本発明のなお別の実施形態は、ＢＨ４合成酵素ＧＴＰＣＨ１、ＰＴＰＳ、ＳＲ、ＰＣＤ、ＤＨＰＲおよびＤＨＦＲの添加によって、ＢＨ４のレベルを上昇させることに関する。ＢＨ４合成酵素が、タンパク質のミュータントを含む酵素の天然および非天然形すべてを含むことが考慮される。
本発明の別の実施形態は、ＡＰ活性を抑制してアルカリホスファターゼ（ＡＰ）の代わりにＢＨ４合成酵素ＰＴＰＳに基質７，８−ジヒドロネオプテリン三リン酸を向けることによって、ＢＨ４のレベルを上昇させることに関する。ＡＰの活性を抑制する薬剤または化合物としては、リン酸塩類似体、レバミソール、およびＬ−Ｐｈｅが挙げられる。本発明の別の実施形態は、アルカリホスファターゼの合成を抑制する低分子抑制性ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、アンチセンスＲＮＡ、ｄｓＤＮＡ、小型分子、中和抗体、単鎖、キメラ、ヒト化および抗体フラグメントを含む、アルカリホスファターゼを抑制する薬剤または化合物に関する。
本発明の別の実施形態は、ＢＨ４合成のデノボ合成経路の酵素の合成に必要な触媒または補助因子の活性を上昇させる薬剤または化合物を含む。
本発明の別の実施形態は、ＢＨ４の合成に必要な酵素の分解を防止する薬剤または化合物を含む。本発明のなお別の実施形態としては、ＢＨ４およびＧＴＰＣＨ１、ＰＴＰＳおよびＳＲを含むその合成酵素に必要な触媒の分解を防止する薬剤または化合物を含む。
本発明の別の実施形態は、サルベージ経路を介してＢＨ２の還元を増大させることによって、ＢＨ４のレベルを上昇させることに関する。生体内では、ＢＨ４がＢＨ２酸化されるようになる。ＢＨ２は、キノノイド形（ｑＢＨ２）および７，８−ジヒドロプテリンとして存在して、それぞれＤＨＰＲおよびＤＨＦＲによってＢＨ４に還元される。本発明の一実施形態は、酵素ＰＣＤ、ＤＨＰＲおよびＤＨＦＲの活性および合成を調節することによって、ＮＡＤＰＨ、チオール、ペルクロロ安息香酸水銀、過酸化水素などを経路する薬剤または化合物を使用して、ＢＨ２からのＢＨ４の再生またはサルベージを上昇させることに関する。
本発明の別の実施形態は、アスコルビン酸（ビタミンＣ）、アルファトコフェロール（ビタミンＥ）、トコフェロール（たとえばビタミンＡ）、セレン、ベータカロテン、カロテノイド、フラボン、フラボノイド、葉酸塩、フラボン、フラバノン、イソフラボン、カテキン、アントシアニジン、およびカルコンを含む抗酸化剤などの薬剤または化合物を使用して、ＢＨ４の酸化を低下させることによって、ＢＨ４を安定化させる薬剤に関する。
さらなる実施形態において、このような（複数の）因子は、一酸化窒素シンターゼの活性または発現を上昇させ、それによりＮＯの産生を増加させることがある。
なお別の実施形態において、本発明はＧＴＰＣＨフィードバック調節タンパク質、ＧＦＲＰを抑制する因子を考慮する。本発明の実施形態は、ＢＨ４のＧＴＰＣＨ１／ＧＦＲＰ複合体への結合を抑制して、それによりＢＨ４によるフィードバック抑制を防止する薬剤または化合物に関する。本発明の薬剤または化合物としては、複合体への親和性が変化したＢＨ４の代わりの形態などの競合阻害薬、構造類似体などを含む。本発明のまた別の実施形態としては、ＢＨ４の合成を誘起するＣＴＰＣＨ１／ＧＦＲＰへのＬ−フェニルアラニンの結合を増加させる薬剤または化合物を含む。本発明の別の実施形態は、ＧＦＲＰおよびＢＨ４によってＧＴＰＣＨ１のフィードバック抑制を抑制するように作用する、Ｌ−フェニルアラニンの前駆物質などの、Ｌ−Ｐｈｅのレベルを上昇させる薬剤または化合物を含む。
本発明のなお別の実施形態は、ＧＦＲＰの活性または合成を調節する薬剤または化合物に関する。本発明の実施形態は、ＧＦＲＰの活性を抑制する薬剤または化合物を含む。本発明の別の実施形態は、ＧＦＲＰの合成を抑制するｓｉＲＮＡ、小型分子、抗体、抗体フラグメントなどの使用を含む。
ＶＩ．ビオプテリンのアッセイ
血漿、血液および他の組織中の総ビオプテリンおよび酸化ビオプテリンの濃度は、Ｆｕｋｉｓｈｉｍａら（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０２：１７６（１９８０）の方法に基づいて決定する。ビオプテリンは、還元ビオプテリンの２種の形態、Ｒ−テトラヒドロビオプテリン（ＢＨ４）およびキノノイドＲ−ジヒドロビオプテリン（ｑ−ＢＨ２）ならびに酸化ビオプテリンの２種の形態、ジヒドロビオプテリン（ＢＨ２）およびビオプテリン（Ｂ）を含む、４種の異なる形態を有する。４種の形態のうち、ビオプテリンの還元形のみが補酵素活性を有する。還元ビオプテリンは、酸性条件下でのヨージル化によってＢに変換されるが、アルカリ性条件下ではプテリンに変換される。酸化ビオプテリンは、酸性およびアルカリ性条件下でのヨージル化によってＢに変換される。この特性を利用することにより、総ビオプテリンの量は酸性条件下でのヨージル化時に決定され、酸化ビオプテリンの量はアルカリ性条件下でのヨージル化時に決定されるので、還元ビオプテリンの量はその量の違いから計算させる。補酵素として使用される場合、ＢＨ４はｑ−ＢＨ２に変換される。ｑ−ＢＨ２はジヒドロプテリンレダクターゼによってＢＨ４にただちに変換されるか、還元されない場合、それはＢＨ２またはＤＨＰＴに変換される。ビオプテリンが生体内でｑ−ＢＨ２の形態で存在するのは困難であるため、還元ビオプテリンはおそらくＢＨ４として置換されるであろう。
収集した血漿および全血サンプルには、酸性酸化溶液（０．６％ヨウ化カリウム（ＫＩ）、０．３％ヨウ素（Ｉ２）および０．６Ｎトリクロロ酢酸（ＴＣＡ）を含有する０．６Ｎ ＨＣｌ水溶液）およびアルカリ性酸化溶液（０．７Ｎ水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ））による酸化を受けさせる。Ｂの決定はＨＰＬＣによって実施し、放射能は液体シンチレーションカウンタを使用して測定する。
タンデム質量分析法を組合せた逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ）（ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ）を使用するＢＨ４の測定：逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ）およびタンデム質量分析法の併用（ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ）によって、ヒト血清中のＢＨ４に選択的であり、５〜１０００ｎｇ／ｍＬの範囲のＢＨ４に感受性であることが示された。方法は、収集および貯蔵中の酸化によるＢＨ４の約５０％の変換と関連している。サンプルは、エチレンジアミン四酢酸２カリウム塩（Ｋ２ＥＤＴＡ）血漿中で３ヶ月を超えて安定である。前処理ステップからの回収は約７５％である。方法の正確度および精度は、１５％より低い変動係数（ＣＶ）％（定量下限、ＬＬＯＱにて２０％）を有することが決定された。
ＨＰＬＣおよびタンデム質量分析法の併用は、（１）薬物−ＢＨ４に対するその選択性の向上（これに対してＨＰＬＣは総ビオプテリンを測定する）、（２）より広い定性範囲、（３）確立された変換率、（４）ヒト対象での広範囲のキャラクタリゼーションおよび証明された有用性、（５）異なる種およびマトリクスでの新規の有用な測定、のために、ＢＨ４試験項目を決定するのに、ＨＰＬＣ単独よりも改善されていることが示された。
改善された方法は、以下のステップを含む。血液、血漿、組織ホモジネート、または尿のサンプルには、酸性またはアルカリ性酸化を受けさせる。酸性酸化では、（１）サンプルを塩素カリウム（ＫＣｌ）、塩酸（ＨＣｌ）またはＴＣＡによって１時間処理して；（２）酸性酸化サンプルを次にヨウ素滴定を受けさせて；（３）サンプルをイオン交換カラムで展開させ；（４）ＢＨ４、ｑ−ＢＨ２（生体内でただちにＢＨ４に還元されるので、測定した還元ビオプテリンは主にＢＨ４に基づく）、ＢＨ２、およびＢを含む総ビオプテリンをＨＰＬＣおよびタンデム質量分析法で測定する。アルカリ性酸化では、（１）サンプルをＫＩ、Ｉ２またはＮａＯＨによって１時間処理して；（２）アルカリ性酸化されたサンプルを次にＨＣｌまたはＴＣＡによる酸化を受けさせ；（３）ヨウ素滴定を受けさせて；（４）サンプルをイオン交換カラムで展開させ；（５）ＢＨ２およびＢを含む酸化ビオプテリンを測定して；（６）ＨＰＬＣおよびタンデム質量分析法を使用して異なる種を測定し；（７）還元ビオプテリン（ＢＨ４＋ｑ−ＢＨ２）を酸化形よりも低い総ビオプテリン間の相違として計算する。
ビオプテリン測定のフローチャートおよびアッセイ検証のまとめを図１６および１７に示す。
最適化アッセイ
電気化学検出（ＥＣＤ）および蛍光（ＦＬ）検出を使用するＨＰＬＣ方法は、個々のビオプテリン化合物（ＢＨ４、ＢＨ２およびＢ）のそれぞれはもちろんのこと、その類似体の測定も可能にするため好都合である。
ＢＨ４は、一酸化窒素（ＮＯ）を産生する、酵素系一酸化窒素シンターゼ（ＮＯＳ）の補助因子である。ＮＯの産生は血管恒常性を維持するのに重要である。ＢＨ４の細胞内レベルが制限されるとき、ＮＯ産生は減少して（ＮＯＳ活性の低下のため）、損傷を及ぼすフリー・ラジカル・スーパーオキシド（Ｏ２−）の発生を引き起こす。
過剰なＯ２−は内皮機能障害を引き起こすことが可能であり、ＢＨ４のＢＨ２への酸化に寄与することがある。ＢＨ４のＢＨ２に対する比が低いと内皮傷害が促進されることがあるが、ＢＨ４のＢＨ２に対する比が高いと内皮の健康が促進されることがある。したがってＢＨ４のＢＨ２に対する比のキャラクタリゼーションは、内皮の健康を予測するものとして作用することがある。
各種のビオプテリン（ＢＨ４、ＢＨ２およびＢ）または類似体の濃度は、最初に分離のために逆相ＨＰＬＣを、続いてＥＣＤおよびＦＬ検出を使用することによって決定される。
酸化還元感受性の非蛍光分子であるＢＨ４は、ＥＣＤを使用して測定する。ＢＨ４（およびその類似体）はＥＣＤを使用して測定され、ＥＣＤでは、ＢＨ４（およびその類似体）が電極１によって、短寿命のジヒドロビオプテリン中間体であるキノノイドジヒドロビオプテリン形態（たとえばｑＢＨ２）に酸化され、これが次に電極２でＢＨ４（または類似体）に還元されて戻る検出装置は次に、この還元反応によって発生した電流を使用して、ＢＨ４またはその類似体の濃度を決定する（内因性のｑＢＨ２は無視される）。
ＢＨ２、Ｂ、およびその類似体は、蛍光検出により同じ注入で測定することが可能である。最適電位にてコンディショニング・ガード・セルを使用する、ＢＨ２またはその類似体のＥＣＤ後酸化は、ＢＨ２またはその類似体をＢまたは対応するビオプテリン類似体に変換する。このことは、ＢＨ２が蛍光活性でないか、または容易に測定されず、蛍光を使用して容易に測定されるＢに変換されねばならないために望ましい。かつてＢに変換された内因性ＢＨ２と、内因性Ｂは、各分子のＨＰＬＣカラムでの保持時間が異なるために、２つの別個の蛍光ピークによって相互に区別される。
全体として、該方法を使用して、種ＢＨ４、ＢＨ２、およびＢ、ならびにその類似体を測定することが可能である。ビオプテリンは好ましくは、本明細書に記載するように、２％ ＭｅＯＨ含有移動相を使用して測定される。バリンビオプテリン誘導体などのビオプテリン類似体は、移動相中のより高いメタノール含有率、たとえば１０％ ＭｅＯＨ含有移動相により適していることがある。
それゆえ、ビオプテリン種の混合物中でビオプテリンを検出する方法は、（ａ）逆相ＨＰＬＣによって混合物中のビオプテリン種を分離するステップと、；ＢＨ４およびその類似体の場合；（ｂ１）存在するＢＨ４およびその類似体を第１の電極によって酸化し、続いてキノノイド形態を再びＢＨ４およびその類似体に還元して、種の濃度を決定するために還元反応によって発生した電流を測定することによって、電気化学検出を実施するステップと；および／または（ｂ２）ＢＨ２、その類似体、ビオプテリン、またはその類似体の場合、蛍光検出と、続いてのＢＨ２種のビオプテリンへのカラム後酸化によって、このような種を測定するステップと；を含むことが可能である。好ましくは、移動相は、本明細書で開示した移動相である。
一実施形態において、好ましい移動相としては、酢酸ナトリウム、クエン酸、ＥＤＴＡ、およびメタノールを含む１，４−ジチオエリスリトール（ＤＴＥ）が挙げられる。好ましい濃度は、５０ｍＭ酢酸ナトリウム、５ｍＭクエン酸、４８μＭ ＥＤＴＡ、および２％メタノールを含む１６０μＭ ＤＴＥである。
ＶＩＩ．実施例
以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態を示すために含まれている。当業者によって、続く実施例に開示されている技法が、本発明の実施に際して十分に機能することが本発明者によって見出された技法を示すことが認識されるであろう。しかし当業者は、本開示に照らして開示され、なお同様または類似の結果を得る具体的な実施形態において、本発明の精神および範囲から逸脱せずに多くの変更を行えることを認識するであろう。
（実施例１）
ラットでの１回経口投薬後の血漿中のビオプテリンの濃度時間曲線
本試験の目的は、ラットでの１回経口投与後のＢＨ４の薬物動態を評価することであった。ＢＨ４（１０および１００ｍｇ／ｋｇ）の１回投薬は、オスのスプラーグ・ドーリー・ラット（６週齢）に空腹条件下で経口投与した。
結果
投薬の２時間および１時間後の血漿中の最大総ビオプテリン濃度はそれぞれ、１０８ｎｇ／ｍｌ（すなわち約３×内因性レベル）および１２２７ｎｇ／ｍｌ（すなわち約３０×内因性レベル）であった（図１８）。その後、ビオプテリンは、約１．１時間の排出半減期（ｔ１／２）を有し、１０ｍｇ／ｋｇ用量では投薬９時間後に、１００ｍｇ／ｋｇ用量では投薬２４時間後に内因性レベルに戻った（図１８）。
１０および１００ｍｇ／ｋｇ経口投与後の生物学的利用能（Ｆ）は、１０ｍｇ／ｋｇ静脈内投与中の内因性レベルを引くことによって得られた血漿濃度−時間曲線（ΔＡＵＣ）下面積に基づいて、それぞれ６．８％および１１．８％であった。ＧＩ吸収率は、尿中で放射性マーカを使用して測定したときに８．８％であった。実際の値の概算値は、これらのデータに基づいて約１０％の経口生物学的利用能であろう。
血漿中での低下したビオプテリンの総ビオプテリンに対する比は（すなわち還元型率）は、比較的静的（７３％〜９６％）であった（図１９）。
（実施例２）
サルへの１回経口投薬後の血漿中でのビオプテリンの濃度時間曲線
本試験の目的は、カニクイザルでの１回経口投与後のサプロプテリンの薬物動態を評価することであった。サプロプテリンの１回投薬（１０ｍｇ／ｋｇ）を、絶食条件下のメスカニクイザル（３匹／群）に経口投与した。
結果
総血漿ビオプテリン濃度（ΔＣ）は、投薬３時間後にその最大値に達した（３４４ｎｇ／ｍｌ、約２０×内因性レベル）（図２０）。ビオプテリンの血漿排出半減期は約１．４時間で、投薬後２４時間以内に内因性レベルに戻った。低下したビオプテリンの総ビオプテリンに対する比は、試験期間にわたってほぼ一定であった。メスザルへの１０ｍｇ／ｋｇ経口投与後の生物学的利用能（Ｆ）は、ΔＡＵＣ経口／ｉｖ比として測定され、約９％であった（図２１）。
（実施例３）
（複数の）錠剤の溶解後に投与した、または（複数の）未処置錠剤として投与したテトラヒドロビオプテリン（ＢＨ４）の相対生物学的利用能、および健常対象における吸収に対する食品の効果
目的
試験の第１の目的は：（１）（複数の）錠剤の水への溶解後に投与したとき、または（複数の）未処置錠剤として投与したときの、テトラヒドロプテリン（ＢＨ４、二塩酸サプロプテリン）の相対生物学的利用能を評価することと；（２）健常対象におけるＢＨ４の生物学的利用能に対する食品の効果を比較すること；であった。試験の第２の目的は、健常対象におけるＢＨ４の１回経口投薬の安全性および耐容性を評価することであった。
方法
本試験は、非盲検、ランダム化、３処置、６シーケンス、３期のクロスオーバー試験であり、対象３０名に１回投薬の投薬期間を３回完了させて、対象を６つの連続群（群１、２、３、４、５、および６）にランダム化した。
群１：ａ、ｂ、ｃ
群２：ｂ、ｃ、ａ
群３：ｃ、ａ、ｂ
群４：ａ、ｃ、ｂ
群５：ｂ、ａ、ｃ
群６：ｃ、ｂ、ａ
ここですべての投薬群に、ＢＨ４ １０ｍｇ／ｋｇを以下のように経口投与した：
ａ：絶食条件下で絶食中に与えられた、水への（複数の）錠剤の溶解後に投与
ｂ：絶食条件下で絶食中に与えられた（複数の）未処置錠剤として投与
ｃ：摂食条件下で高カロリー高脂肪食の摂取開始３０分後に与えられた（複数の）未処置錠剤として投与。
各対象には、各処置期間中に１０ｍｇ／ｋｇのＢＨ４の１回投薬を投与した。各投薬期間の間は、少なくとも７日間の休薬期間を設けた。試験後の評価は、第３の治療期間の終了から５〜７日後に実施した。薬物動態（ＰＫ）解析用の血液サンプルを各試験期間中の予定された収集時間に採取した：投薬前３０分以内、および投薬後０．５、１．０、１．５、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、５．０、６．０、８．０、１０．０、１２．０、１８．０、および２４．０時間。
用量および投薬方式
ＢＨ４錠剤を治療期間ごとに１０ｍｇ／ｋｇの投薬量として投与した。錠剤は、ａ）絶食状態で与えられる水での溶解、ｂ）絶食状態で与えられる未処置錠剤、またはｃ）摂食状態で与えられる未処置状態によって投与した。
試験薬の各用量は、水と混合した液体（溶液）形で調製および投与した。供給された水は周囲温度の水道水であった。投薬溶液は予定した投薬時間の１５分以内に調製した。液体中への錠剤の溶解は約１〜３分かかった。溶解速度を改善するために、溶解前に錠剤を投薬カップ内で分割または破砕した。
指定された朝の投薬時刻に、ＢＨ４を水またはオレンジジュース１２０ｍＬに溶解させて、１０ｍｇ／ｋｇ用量に等しい数の錠剤として経口投与した。１２０ｍＬ用量全部が調製１５分以内に消費されるときに、各患者を厳密に監視した。用量が消費された直後に、投薬カップを水６０ｍＬですすぎ、対象はすすぎ液を消費した。２回目の水すすぎ液６０ｍＬを投薬カップに加え、次に対象は２回目のすすぎ液を消費した。投薬手順全体は１分の期間で完了した。有資格のスタッフ要員が投薬完了直後に投薬カップおよび各対象の口を検査して、全用量が確実に消費されるようにした。あるいは、対象は、ＢＨ４を水に溶解させるのではなく、ＢＨ４を含有する丸剤を嚥下した。各個人では、投薬期間は、投薬から投薬まで最低７日間空けて行われた。
食品摂取スケジュール
チェックインの晩に軽食が出された。次にすべての対象は、投薬前の少なくとも１０時間にわたって絶食を要求された。
絶食条件
絶食条件下で投与される処置を受ける対象は、最低１０時間の一晩にわたる絶食を完了した後に投薬された。
対象は投薬後４時間にわたって絶食を続けた。水は、投薬１時間前から投薬１時間後を除いて、試験中自由に与えられた。薬物投与の約４時間後および１０時間後と、その後の適切な時刻に、標準食が提供された。
非絶食条件
非絶食条件下で投与された処置を受ける対象は、高カロリー高脂肪の朝食を消費した後に投薬された。対象は、以下の標準高脂肪（食事の総カロリー量の約５０％）、高カロリー（約１０００カロリー）の朝食を与えられ、用量の予定された投与の３０分前に開始して、投薬前５分以内に終了した（最後の１口を摂取する）。
バターを使った目玉焼き２個
ベーコン２切れ
バター付きトースト２枚
ハッシュ・ブラウン・ポテト４オンス
全乳８オンス
この食事は、約１５０タンパク質カロリー、２５０炭水化物カロリー、および５００〜６００脂肪カロリーを含有していた。メニューおよびカロリー量の文書化によって、同等の食事を代用した。
対象は次に、投薬後４時間にわたって絶食した。水は、投薬１時間前から投薬１時間後を除いて、試験中自由に与えられた。薬物投与の約４時間後および１０時間後と、その後の適切な時刻に、標準食が提供された。
処置の期間
３回の１回投薬処置期間はそれぞれ最低７日間空けた。
最後の処置受診の５〜７日後に、追跡受診を実施した。
安全性変数：評価および方法
ＢＨ４の少なくとも１用量を投与された対象すべてについて安全性を評価した。
評価された効力および安全性測定ならびにフローチャート
安全性は、有害事象の発生、１２リードＥＣＧパラメータの変化、バイタルサインおよび健康診断の結果、ならびに検査室試験値のベースラインの変化を記録することによって評価した。これらの評価のスケジュールを図２２に示す。
健康診断およびバイタルサイン
各対象は試験研究者によって定期的な健康診断を受けた。健康診断には、頭部、眼、耳、鼻、咽喉、頸部、心臓、胸部、肺、腹部、四肢、末梢脈拍、神経学的状態、皮膚の評価が含まれ、注目すべき他の身体的状態も評価された。本試験プロトコルには尿生殖器検査は不要であった。
身長（センチメートル）および体重（キログラム）を測定して、ボディ・マス・インデックス（ＢＭＩ）を計算した（ＢＭＩ＝体重（ｋｇ）／［身長（ｍ）］２）。
米国心臓協会の勧告に従って、血圧を座位で測定した。血圧を測定するときに、対象は座位で足を床上に５分間静止させた。
対象が座位にある間に、心（脈）拍を測定した。
標準１２リード心電図（ＥＣＧ）記録をスクリーニング時と試験終了時に取った。ＥＣＧは、有資格の研究者が評価した。ＥＣＧおよび評価報告書の写しは、各対象のファイルの一部として保管した。
病歴、臨床検査室試験結果および（複数の）ＥＣＧトレース試験結果を治験責任医師が検討および評価して、各対象が試験に参加する臨床適格性を判定した。
臨床検査室評価
血液学：
以下を評価した：ヘモグロビン、ヘマトクリット、総および分類白血球数、赤血球（ＲＢＣ）および血小板数。
加えて、血液をＢ型肝炎表面抗原、Ｃ型肝炎抗原およびヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）について検査した。
化学：
以下を評価した：アルブミン、血中尿素窒素（ＢＵＮ）、クレアチニン、総ビリルビン、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）、アスパラギン酸トランスアミナーゼ（ＡＳＴ）、アラニントランスアミナーゼ（ＡＬＴ）、ナトリウム（Ｎａ＋）、カリウム（Ｋ＋）、塩化物（Ｃｌ−）、乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）、尿酸、およびグルコース。
尿検査：
以下を尿試験紙法によって評価した：ｐＨ、比重、タンパク質、グルコース、ケトン、ビリルビン、血液、亜硝酸塩、およびウロビリノーゲン。タンパク質、潜血、または亜硝酸塩値が範囲外である場合、顕微鏡検査を実施する。
尿サンプルは、乱用薬物（アンフェタミン、バルビツール酸塩、ベンゾジアゼピン、カンナビノイド、コカインおよびアヘン剤）についても検査した。
有害事象
本試験では、有害事象（ＡＥ）は、投与と事象との因果関係の有無にかかわらず、任意の用量でＢＨ４が投与された対象または臨床試験対象におけるあらゆる好ましくない医療上の事象として定義した。ＡＥはしたがって、ＢＨ４との関係の有無にかかわらず、ＢＨ４の使用に一時的に関連した好ましくないまたは意図しない徴候（臨床検査結果の異常を含む）、症状、または疾患である。この定義は、併発性疾病または傷害および既存症状の増悪（頻度、重症度または特異性の上昇）を含んでいた。
ＡＥの報告期間は、ＢＨ４の初回投与から開始した。重篤有害事象（ＳＡＥ）の報告期間はより早く、インフォームドコンセントの署名時に開始した。ＳＡＥは本節より後に定義した。治験医は、すべてのＡＥを回復まで、またはＡＥが慢性であると判断された場合には、原因が特定されるまで監視した。ＡＥが試験終了時まで回復しないままである場合、治験責任医師および医療モニターは、ＡＥの連続追跡が是認されるか否かについて臨床的評価を行い、結果を記録した。重症度の判定は、ＡＥおよびＳＡＥの評価における治験医の責務の１つであった。治験医は、各ＡＥのＢＨ４との因果関係を判定するその臨床上の判断を下す責任があった。
重篤有害事象
重篤有害事象（ＳＡＥ）は、以下の結果の少なくとも１つを有するいずれかのＡＥとして定義した：
死亡に至った
生命が脅された、すなわち事象が発生したときに、対象が事象による直接の死亡リスクにさらされた。
本定義は、さらに重篤な形態で発生したら、死亡を引き起こす可能性があるという反応は含まなかった。
入院患者の入院または既存の入院の延長を要した
ＡＥの結果として、対象の入院患者としての入院、対象が同日に退院しても入院と見なした。救急救命室受診は入院にはならなかった。
永続的または重大な障害または不能を生じた
対象が通常の生活機能を行う能力を実質的に妨害することを含む場合に、永続的または重大な障害または不能を生じると見なされた事象。本定義は、比較的軽いまたは一時的な医学的重大性の経験を含むことを意図しない。
先天性異常または出生時欠損、すなわち受胎前または妊娠中に試験薬に曝露された対象の子供または胎児に発生したＡＥであった
上の基準のいずれも満足しなかったが、対象を危険にさらす可能性があった、あるいは上に挙げた結果の１つを防止するために医療的または外科的介入を必要とした、重大な医療事象であった
上の結果の２つ以上がいずれの特定の事象にも当てはまる可能性があった。
測定値の妥当性
本試験における安全性の尺度は、日常的な健康診断、バイタルサイン、有害事象の発生および重症度、ならびに臨床および検査室手順であった。
薬物濃度測定値
血液（血漿）薬物動態（ＰＫ）特徴は、試験薬剤の各投薬の後に判定した。対象はすべて、投薬後４時間にわたって直立位置で着席したままであった。血液サンプルは、投薬前３０分以内、および投薬後０．５、１．０、１．５、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、５．０、６．０、８．０、１０．０、１２．０、１８．０、および２４．０時間に採取した。サンプルは、適切にラベルが貼られた６ｍＬ Ｋ２−ＥＤＴＡ紫色キャップのバキュテイナ（登録商標）管に収集した。血液サンプルを４℃にて約３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離にかけた。得られた血漿から、ピペットを用いて各サンプルより正確に１ｍＬを取り、０．１％ ｗ／ｖジチオエリスリトールを含有する分割管に入れた。サンプルにキャップをして、ＶＷＲミニボルテクサをスピード６で使用して、約１０秒間ボルテックスにかけた。これらのステップの完了後、サンプルをイソプロピル／ドライアイス浴で急速凍結して、解析まで−７０℃のフリーザに入れた。
薬物動態解析のために、血液約８０ｍＬを各処置期間の間に採取した（時点ごとに５ｍＬ）。
薬物動態
血漿ＢＨ４濃度−時間データの薬物動態（ＰＫ）解析は、以下のＰＫパラメータの概算値を得るためにノンコンパートメント法を使用して実施した。
内挿なしでデータから直接得た、ピーク血漿濃度（Ｃｍａｘ）およびピーク濃度までの時間（Ｔｍａｘ）；
最終血漿濃度の対数線形回帰によって決定した、λｚ、見かけの最終消失速度定数；
線形台形法によって計算した、時間ゼロから最終測定可能濃度の時間までの血漿濃度−時間曲線下面積［ＡＵＣ（０−ｔ）］；
０．６９３／λｚとして計算した、見かけの排出半減期（ｔ１／２）；
時間ゼロから無限までの血漿濃度−時間曲線下面積［ＡＵＣ（ｉｎｆ）］、ここでＡＵＣ（ｉｎｆ）＝ＡＵＣ（０−ｔ）＋Ｃｔ／λｚ、Ｃｔは最終測定可能濃度である。
吸収速度の概算
対象にＢＨ４の１０ｍｇ／ｋｇ経口または静脈内投薬を与え、血漿総ビオプテリン濃度の連続測定を続けて、血漿総ビオプテリン濃度上昇（ΔＣｐ）−時間曲線下面積（ΔＡＵＣ）により消化管からのＢＨ４吸収速度を決定した。静脈内投与したときに同じレベルの生物学的利用能を達成するためには、経口投与されたＢＨ４と比較してより少ないＢＨ４の用量が必要とされることが予想された。たとえば、静脈内投与された１ｍｇ／ｋｇ ＢＨ４と同じレベルの生物学的利用能を達成するためには、１０ｍｇ／ｋｇ ＢＨ４が経口投与されることが必要とされる可能性がある。投薬の方式が生物学的利用能を向上させたので、１ｍｇ／ｋｇ ＢＨ４静脈内用量と同じレベルの生物学的利用能を達成するためには、ＢＨ４を５ｍｇ／ｋｇのみ必要とする可能性がある。
ＢＨ４の消化管からの吸収率は、ＢＨ４投与後の血漿総ビオプテリン濃度上昇（ΔＣｐ）−時間曲線下面積（ΔＡＵＣ）から、次の式を使用して概算する：
ＡＵＣからの概算
吸収率（％）＝（経口投薬後のΔＡＵＣ／静脈内投薬後のΔＡＵＣ）×（静脈内投薬／経口投薬×１００）
統計的方法：
ＢＨ４の薬物動態パラメータＣｍａｘ、ＡＵＣ（０−ｔ）、およびＡＵＣ（ｉｎｆ）の比較は、独立変数としてパラメータの自然対数を用い、分類変数としてのシーケンス、シーケンス内の対象、処置、および期間と共に分散分析（ＡＮＯＶＡ）モデルを使用して実施した。興味のある比較は、絶食状態での溶解錠剤および未処置錠剤ならびに摂食状態および絶食状態での未処置錠剤の間であった。
少なくとも２回の試験期間を完了する全対象からのデータを薬物動態統計分析に含めた。試験薬を少なくとも１用量投与された全対象を安全性解析に含めた。
すべての薬物動態解析および関連する統計解析は、ＳＡＳ（登録商標）ｆｏｒ Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）バージョン９．１．３以上を使用して行った。
試験の目的を満足するのに十分な力を与えるために、興味のある差異比較の概算値を与えるためには、３回の処置期間それぞれで対象約３０名のサンプルサイズを十分であると見なした。正式なサンプルサイズの計算は実施しなかった。
結果
薬物動態
未処置錠剤および溶解錠剤
ＢＨ４の平均血漿濃度は、ＢＨ４が溶解錠剤として投与されたときに未処置錠剤と比較して低かった（図２３および２４）。平均Ｃｍａｘは、ＡＵＣ（０−ｔ）およびＡＵＣ（ｉｎｆ）の平均値と同様に、未処置錠剤で高かった（図２５）。未処置錠剤の溶解錠剤に対する幾何平均比は１１８％〜１２１％の範囲であり、関連する９０％信頼区間の上限は１２５％を超え（図２６）、未処置錠剤が高カロリー高脂質食と共に投与されるときの吸収の統計的に有意な上昇、溶解錠剤投与と未処置錠剤投与との間の吸収の相違が示された。Ｔｍａｘの中央値および範囲は、溶解錠剤および未処置錠剤で本質的に同じであり（図２５）、未処置錠剤では程度の上昇は見られたが、吸収率の上昇は見られなかった。
薬物吸収に対する高カロリー高脂肪食の効果
予想したように、標準高脂肪高カロリー食と共に未処置錠剤を投与すると、平均血漿ＢＨ４濃度（図２３）およびＣｍａｘ、ＡＵＣ（０−ｔ）、およびＡＵＣ（ｉｎｆ）の平均値（図２５）の実質的な上昇が生じた。幾何平均比（摂食対絶食）は１２６％〜１３９％の範囲であり（図２６）、結果として、関連する９０％信頼区間の上限は１２５％を超え、未処置錠剤と比較して、吸収に対する食品の効果の統計的有意差が示された。Ｔｍａｘの中央値および範囲は、摂食条件および絶食条件下で本質的に同じであり（図２５）、食品による程度の上昇は見られたが、吸収率の吸収率の上昇は見られなかった。
安全性：
本試験では重篤有害事象（ＳＡＥ）はなかった。対象５名が合計９件の有害事象（ＡＥ）を報告した。これらの９件のＡＥのうち、重症度は８件で軽度、１件で中等度と判定された。最も一般的なＡＥは頭痛であった；対象１名は、試験薬に無関係と判定された中等度の頭痛を経験し、対象１名は、どちらもおそらく関係すると判定された軽度の頭痛を２回経験した。全体として、５回の事象が試験薬に無関係と判定され、４回が試験薬におそらく関係すると判定された。試験終了判定、ＥＣＧおよび健康診断評価は完了して、臨床的に有意な発見はなかった。
結論：
未処置錠剤としてのＢＨ４の投与によって、溶解した錠剤と比較して、吸収の程度の約２０％の上昇が生じた。
摂食条件下での高カロリー高脂肪食と同時の未処置錠剤としてのＢＨ４の投与によって、絶食条件と比較して、吸収の程度の約３０％の上昇が生じた。
臨床的に有意な問題点および安全パラメータ安全性問題点は、本試験集団では確認されなかった。本試験では重篤と見なされるＡＥはなかった。報告された９件のＡＥのうち、１件を除いて、頭痛の例は軽度であり、試験薬と無関係であると判定された。疲労および頭痛の例だけが試験薬におそらく関係するＡＥであったが、これらは重症度が中等度と判定された。
（実施例４）
ＢＨ４の生物学的利用能を向上させる調合手法
２種の対照調合物（ＢＨ４静脈内調合物および経口溶解のためのＢＨ４錠剤）および６種の試験調合物を動物研究での試験用に選択した。各調合物プロトタイプはＢＨ４ ８０ｍｇまたは１００ｍｇを含有していた。
ＢＨ４静脈内調合物
表３に静脈内調合物の組成を示す。ＢＨ４は使用前に＃２０メッシュステンレスふるいに通したが、マンニトールは納入されたままの状態で使用した。本調合物を粉剤としてボトルに充填して、投与前に注射用滅菌水を用いて構成した。各ボトルは、白色高密度ポリエチレン（ＨＤＰＥ）ネジ式上部閉止具を備えた透明ポリエチレンテレフタレートコポリエステル（ＰＥＴＧ）ボトル内にＢＨ４ １００ｍｇおよびマンニトール５ｇを含有していた。投与前に、調合物を注射用滅菌水１００ｍＬで構成して、最終濃度１ｍｇ／ｍＬを得た。静脈内調合物はボトルに入った乾燥粉剤として提供され、各ボトルはＡＰＩおよびマンニトールを含有していた。静脈経路による投与前に、粉剤を注射用滅菌水に溶解させて濾過した。
経口溶解用ＢＨ４錠剤
表４は、経口溶解調合物の組成を示す。ＢＨ４錠剤（１００ｍｇ）１０錠を、白色ＨＤＰＥ閉止具を備えた１２５ｍＬ目盛付きＰＥＴＧボトルに入れた。投与前に調合物を注射用滅菌水１００ｍＬで構成して、最終濃度１０ｍｇ／ｍＬを得た。
消化管運動を低速化する調合物プロトタイプ
表５に遅延胃排出時間プロトタイプの組成を示す。ＢＨ４は、使用前に＃２０メッシュステンレス鋼ふるいに通した。カプムル ＧＭＯ−５０を３７℃水浴で溶解させた。ＢＨ４およびアスコルビン酸を秤量して、溶融したカプムルに激しく撹拌しながらゆっくり添加した。ピペットを使用してサイズ＃２カプセルに固体分散物を滴加した。充填したカプセル３個を、熱誘導シール閉止具を備えた１００ｃｃ高密度ポリエチレン（ＨＤＰＥ）ボトルに入れた。
生体接着プロトタイプ
表６に生体接着プロトタイプの組成を示す。カーボポール７１Ｇを除くすべての物質を、＃２０メッシュステンレス鋼ふるいに通した。すべての物質を秤量して、ジップロック閉止具を有するプラスチック袋に添加し、次に袋を混合物が均一になるまで２、３分間震盪した。Ｇｌｏｂｅ Ｐｈａｒｍａ ＭＴＣＭ−Ｉ手動プレス機で６００ｐｓｉにて１／４”標準丸型凹状平面Ｂツーリングを使用して、粉末を圧縮して錠剤にした。錠剤３個をシリカゲル乾燥キャニスタと共に、熱誘導シール閉止具を備えた１００ｃｃ ＨＤＰＥで包装した。
持続放出プロトタイプ
表７にサルで試験した持続放出プロトタイプの組成を示す。メトセルＫ１００ＭプレミアムＣＲを除くすべての物質を、＃２０メッシュステンレス鋼ふるいに通した。すべての物質を秤量して、ジップロック閉止具を有するプラスチック袋に添加し、次に袋を混合物が均一になるまで２、３分間震盪した。Ｇｌｏｂｅ Ｐｈａｒｍａ ＭＴＣＭ−Ｉ手動プレス機で１２００ｐｓｉにて１／４”標準丸型凹状平面Ｂツーリングを使用して、粉末を圧縮して錠剤にした。錠剤をシリカゲル乾燥キャニスタと共に、熱誘導シール閉止具を備えた１００ＨＤＰＥボトルで包装した。
プロトン供与体ポリマープロトタイプ
表８にサルで試験したプロトン供与体ポリマープロトタイプの組成を示す。オイドラギットＬ１００−５５およびコリドンＣＬを除くすべての物質を、＃２０メッシュステンレス鋼ふるいを使用して事前にふるいにかけた。すべての物質を秤量して、ジップロック閉止具を有するプラスチック袋に添加し、次に袋を混合物が均一になるまで２、３分間震盪した。粉末の事前に秤量した量をサイズ＃２カプセルに充填した。
オイドラギットＬ１００−５５およびカーボワックスＰＥＧ４６００をエチルアルコールに溶解させることによって、コーティング溶液を調製した。オイドラギットＬ１００−５５およびカーボワックスＰＥＧ４６００を秤量して、１２５ｍＬ目盛付きポリエチレンテレフタレートコポリエステルボトル（ＰＥＴＧ）に添加した。エチルアルコールをＰＥＴＧボトルに添加して、これを超音波処理付きの４０℃水浴に、溶液が透明になるまで置いた。
粉末充填カプセルを手動でコーティング溶液に浸漬して、４０℃にて２０分間乾燥させた。乾燥カプセルを秤量して、次にシロイドＦＰ２４４に巻込んで残留粘着性を除去した。カプセル３個を、熱誘導シール閉止具を備えた１００ｃｃ ＨＤＰＥボトルで包装した。
浮遊送達系
表９は浮遊送達系の組成を示す。オイドラギットＬ１００−５５を除くすべての物質を、＃２０メッシュステンレス鋼ふるいに通した。本錠剤プロトタイプは３つの層で構成された；中間層は、薬物物質を含有して、２つの非水溶性外層の間に挟まれていた。内部物質および外部物質を秤量して、ジップロック閉止具を有するプラスチック袋に別々に添加し、次に袋を混合物が均一になるまで震盪した。
２つの外層（それぞれ１２ｍｇ）および内層（１４．５ｍｇ）を秤量した。プレス機に外層の一方を、続いて内層、次に最後の外層を添加した。Ｇｌｏｂｅ Ｐｈａｒｍａ ＭＴＣＭ−Ｉ手動プレス機で２００ｐｓｉにて３／１６”丸型傾斜平面Ｂツーリングを使用して、層を圧縮して錠剤にした。
エトセルおよびＰＥＧ４６００をエチルアルコールおよび精製水混合物に溶解させることによって、コーティング溶液を調製した。成分をＰＥＴＧボトルに添加して、これを混合して、超音波処理付きの４０℃水浴に溶液が透明になるまで置いた。
錠剤を手動でコーティング溶液に浸漬して、４０℃にて２０分間乾燥させた。コーティング後に、各錠剤を再度秤量した。錠剤７錠をサイズ＃２細長カプセルそれぞれに入れた。カプセル３個を、熱誘導シール閉止具を備えた１００ｃｃ ＨＤＰＥボトルで包装した。
気体発生浮遊送達系
表１０に気体発生浮遊送達系の組成を示す。本調合物は、気体発生外層に包囲された、薬物物質を含有するコア錠剤で構成されていた。重炭酸ナトリウムおよびメトセルＫ１００Ｍ ＣＲを除くすべての物質を、＃２０メッシュステンレス鋼ふるいを使用して事前にふるいにかけた。内側コア物質および外層物質を秤量して、ジップロック閉止具を有するプラスチック袋に別々に添加し、次に袋を閉じ、混合物が均一になるまで震盪した。Ｇｌｏｂｅ Ｐｈａｒｍａ ＭＴＣＭ−Ｉ手動プレス機で８００ｐｓｉにて１／８”丸型傾斜平面Ｂツーリングを使用して、内側コア用のブレンド粉末（３５ｍｇ）を圧縮して錠剤にした。
エトセルおよびＰＥＧ４６００をエチルアルコールに溶解させることによって、コーティング溶液を調製した。内側コアを手動でコーティング溶液に浸漬して、４０℃にて２０分間乾燥させた。外層用のブレンド粉末（４０ｍｇ）を秤量した。プレス機に外層の半分を、続いて内側コア錠剤、次に外層の残り半分を添加した。Ｇｌｏｂｅ Ｐｈａｒｍａ ＭＴＣＭ−Ｉ手動プレス機で８００ｐｓｉにて３／１６”丸型傾斜平面Ｂツーリングを使用して、錠剤を圧縮した。錠剤４錠を各サイズ＃２カプセル内に入れた。
生体接着顆粒プロトタイプ
表１１に生体接着顆粒プロトタイプの組成を示す。メトセルＫ１００Ｍ ＣＲを除くすべての物質を、＃２０メッシュステンレス鋼ふるいを使用して事前にふるいにかけた。フマル酸ステアリルナトリウム（ＰＲＵＶ）を除くすべての物質を秤量して、サイズ＃１造粒機ボール（ＬＢ Ｂｏｈｌｅ Ｍｉｎｉ Ｇｒａｎｕｌａｔｏｒ ＢＭＧ）に入れた粉末を混合物が均質に見えるまで、インペラ速度３００ｒｐｍおよびチョッパ速度２５００ｒｐｍで５分間混合した。インペラ速度とチョッパ速度を維持しながら、顆粒が形成されるまでエチルアルコール５ｍＬを混合物に滴加した。湿潤塊を造粒ボールから除去して、１８メッシュステンレス鋼ふるいに通した。顆粒を収集して、４０℃の乾燥器に入れて１時間乾燥させた。乾燥１時間後に、顆粒の乾燥による減量は１．９３％と決定された。顆粒を秤量して、ジップロック閉止具を有するプラスチック袋に入れた。フマル酸ステアリルナトリウム（ＰＲＵＶ）を袋内の乾燥顆粒に添加した。袋を閉じ、フマル酸ステアリルナトリウム（ＰＲＵＶ）が顆粒の間に均等に分散して見えるまで震盪した。顆粒を秤量した（１３４ｍｇ）。サイズ２細長カプセルに、顆粒の一部を部分水素添加植物油数滴（３５０μＬ）と交互に充填した。カプセル３個を、熱誘導シール閉止具を備えた１００ｃｃ ＨＤＰＥボトルで包装した。
試験管内薬物放出
錠剤からの試験管内薬物放出試験は、ＵＳＰ ２７装置ＩＩ仕様に従って、Ｄｉｓｔｅｋ ２１００Ｃ溶出試験器（Ｄｉｓｔｅｋ，Ｉｎｃ．，ノースブルンスウィック、ニュージャージー州）を、ＡｇｉｌｅｎｔＵＶ−可視分光法システム（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，サンタクララ、カリフォルニア州）と共に使用して実施した。ＢＨ４の放出試験に使用した溶出媒体は、０．１Ｎ ＨＣｌ ９００ｍＬであった。溶出試験の間、各容器内の媒体は３７℃±０．５℃に維持して、５０ｒｐｍにて撹拌した。サンプル量５ｍＬを所定の時点で採取した。サンプル中のＢＨ４の濃度を決定するために、各サンプル２５０μＬを０．１Ｎ ＨＣｌ ５００μＬで希釈して、ＵＶ分光計（８４５３ＵＶ−可視分光光度計、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，サンタクララ、カリフォルニア州）を使用して２６５ｎｍの吸収を測定した。データはＣｈｅｍＳｔａｔｉｏｎソフトウェア（Ｒｅｖ．Ａ．０９．０１［７６］、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，サンタクララ、カリフォルニア州）を使用して収集した。すべての溶出試験は３通り実施した。
錠剤浮力試験
浮遊プロトタイプ錠剤の浮力は、最初に錠剤を０．１Ｎ ＨＣｌ ２５〜５０ｍＬを含むプラスチックカップに入れることによって決定した。本試験により、錠剤が浮遊するのに必要な時間はもちろんのこと、撹拌なしのその浮遊期間も決定された。少なくとも４時間浮遊したこれらのプロトタイプに溶出試験を受けさせた。溶出試験の間、回転速度５０ｒｐｍにてパドル法を使用して錠剤の浮力を決定した。各種の時点で錠剤の状態を目視点検した。
崩壊試験
崩壊試験は、ＵＰＳ−２７崩壊試験仕様に従って、Ｄｉｓｔｅｋ ３１００ Ｓｅｒｉｅｓ崩壊試験器（Ｄｉｓｔｅｋ Ｉｎｃ．，ノースブルンスウィック、ニュージャージー州）を使用して実施した。崩壊媒体には０．１Ｎ ＨＣｌ ９００ｍＬまたは０．２Ｍリン酸カリウムｐＨ５．８ ９００ｍＬを使用した。崩壊試験の間に、容器内の媒体を３７℃±０．５℃に維持した。錠剤およびカプセルを崩壊について目視検査した。
錠剤硬度試験
錠剤硬度は、Ｄｒ．Ｓｃｈｌｅｕｎｉｇｅｒ Ｐｈａｒｍａｔｒｏｎ ８Ｍ錠剤硬度試験器（Ｄｒ．Ｓｃｈｌｅｕｎｉｇｅｒ（登録商標）Ｐｈａｒｍａｔｒｏｎ Ｉｎｃ．，マンチェスター、ニューハンプシャー州）を使用して決定した。錠剤を硬度試験器のジョー内に置いて、硬度をキロポンド（Ｋｐ）で測定した。
錠剤厚さ
錠剤の厚さは、Ｍｉｔｕｔｏｙｏデジマチックインジケータ（Ｍｉｔｕｔｏｙｏ Ａｂｓｏｌｕｔｅ，Ｄｒ．Ｓｃｈｌｅｕｎｉｇｅｒ Ｐｈａｒｍａｔｒｏｎ Ｉｎｃ．，マンチェスター、ニューハンプシャー州）を使用して測定した。錠剤を厚さゲージの下に置いて、表示された値をミリメートル（ｍｍ）で記録した。
結果および考察
複数のプロトタイプが３つの概念：胃内滞留性、腸ｐＨを変化させるプロトン供与体ポリマー、および持続放出投薬形に基づいて開発された。下の節で、各プロトタイプの調合物開発について記載した。
ＢＨ４静脈内調合物−滅菌水による構成の後、得られた溶液は等張性、ｐＨ３．２であり、ＢＨ４を１ｍｇ／ｍＬで含有して、０．２２ミクロンフィルタでの滅菌濾過後に静脈内投与に適切であった。周囲温度で貯蔵した１ｍｇ／ｍＬ溶液の安定性をＨＰＬＣによって１時間ごとに３時間にわたって分析した。熟成溶液サンプルを次に−２０℃で貯蔵して、２週間後にＨＰＬＣで分析した。図２７は、溶液が周囲温度にて構成後の少なくとも３時間にわたって安定であり、−２０℃での貯蔵中に少なくとも２週間にわたって安定であったことを示す。
経口溶解用ＢＨ４錠剤
１０個のＢＨ４錠剤、１００ｍｇを含有するように各ボトルを包装した。精製水または注射用滅菌水１００ｍＬを各ボトルの中身に添加した。ボトルを激しく震盪した後、錠剤は５分以内に迅速に崩壊した。得られた溶液は経口投与用のＢＨ４を１０ｍｇ／ｍＬで含有していた。錠剤のすべての成分が溶解性であるというわけでなく、最終溶液は濁って見えるか、または半透明に見えたが、活性製薬成分は完全に溶解され、微粒子は溶解性の低い不活性成分であった。
消化管運動を低速にする調合物プロトタイプ
本カプセル調合物は、半固体脂肪酸誘導体（モノ／ジオレイン酸グリセリル、融点８６°Ｆ（３０℃）に分散したＢＨ４およびアスコルビン酸より構成されていた。モノ／ジオレイン酸グリセリル（ＧＭＯ）はＢＨ４と適合性であるため、ＧＭＯも選択された。図２８に示した溶出特性は、薬物の９０％超が２時間で放出され、カプセルが４０℃にて５７日間にわたって貯蔵された後に溶出特性は不変のままであった。
溶融ＧＭＯ中の薬物分散物は半固体で、硬ゼラチンカプセルに手動で注入した。半固体の密度は１ｇ／ｍＬより大きく、サイズ＃２カプセルに２５％薬物装填で少なくとも８０ｍｇ用量を充填することが可能であった。サイズ＃０カプセルは同じ調合物を使用して薬物を少なくとも２００ｍｇ含有できるはずであることが予想される。カプセルからの脂肪酸の漏出は４０℃での貯蔵中に見られた。好ましくは、貯蔵中の脂肪酸の漏出を避けるために、カプセルまたはソフトジェルカプセル調合物にバンドが付けられるであろう。
生体接着プロトタイプ
多くの生体接着剤は、合成ポリマーまたは天然ポリマーのどちらかから成る。現在の合成生体接着ポリマーの大半は、ポリアクリル酸またはセルロース誘導体のどちらかである。ポリアクリル酸ベースポリマーの例としては、これに限定されるわけではないが、カーボポール、ポリカーボフィル、ポリアクリル酸（ＰＡＡｃ）などが挙げられる。セルロース誘導体は、これに限定されるわけではないが、ヒドロキシプロピルセルロースおよびヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）が挙げられる。２種の生体接着プロトタイプが動物研究での試験のために開発された。第１のプロトタイプは生体接着錠剤調合物であり、第２のプロトタイプは生体接着顆粒を含有するカプセル剤であった。
ポリカーボフィルおよびカルボマーポリマーは、第１の生体接着錠剤プロトタイプの開発のために選択された。カーボポール７１Ｇは、カルボマーの顆粒形であり、良好な粉末流動特性を有する。製造した錠剤のバッチすべてが、許容される薬物含有率（溶出特性で１００％に近い薬物放出によって明らか）および許容される硬度を備えた、良好な品質であった。表１２に、カルボマーおよびポリカーボフィルを含有する生体接着プロトタイプの代表的な錠剤重量、厚さおよび硬度を示す。
ＨＭＰＣおよびカルボマーポリマーを第２の生体接着顆粒の開発に使用した。ＨＰＭＣは低密度親水コロイド系およびｐＨに無関係な制御薬剤放出として使用されるので、ＨＰＭＣを選択した。投薬形の表面積を増大させることによって、生体接着の機会を増加させるために、錠剤よりも顆粒を選択した。溶出媒体中での顆粒充填カプセルの分離を促進するために、顆粒を水素添加油によって一部コーティングした。オイルコーティングがないと、顆粒は水和して、個々の顆粒に崩壊せずにカプセル形状マトリクスを形成した。
２種の生体接着プロトタイプ（錠剤および顆粒）の放出特性を図２９に示すが、錠剤の放出特性が顆粒よりも長いことが示されている。薬物放出は、錠剤および顆粒生物接着投薬形それぞれで、４時間後に約９０％および１時間後に９５％であった。４０℃および周囲湿度にて防湿せずに（熱誘導シールなし）１ヶ月間貯蔵すると、錠剤プロトタイプは、薬物溶出の低下を示した（図２９）。カルボマーを含有するプロトタイプでは、錠剤がおそらく早期に水和するのを防止するために、防湿予防策を講じるべきである。
持続放出プロトタイプ
ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）は、経口制御薬物送達系の調製のための親水性ビヒクルとして使用される（Ｃｏｌｏｍｂｏ，Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．，１９９３，１１，３７）。ＨＰＭＣマトリクスは、各種の薬物の放出を制御することが公知である（Ｃｈａｔｔａｒａｊら、Ｄｒｕｇ Ｄｅｖｅｌｏｐ．Ｉｎｄ．Ｐｈａｒｍ．，１９９６，２２，５５５；Ｐａｂｏｎら、Ｄｒｕｇ Ｄｅｖｅｌｏｐ．Ｉｎｄ．Ｐｈａｒｍ．，１９９２，１８，２１６３；Ｌｅｅら、Ｄｒｕｇ Ｄｅｖｅｌｏｐ．Ｉｎｄ．Ｐｈａｒｍ．，１９９９，２５，４９３；Ｂａｓａｋら、Ｉｎｄｉａｎ Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．，２００４，６６，８２７；Ｒａｊａｂｉ−Ｓｉａｂｈｏｏｍｉら、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，１９９２，４４，１０６２）。ＢＨ４の放出を制御するために、本試験では各種の粘度グレードのＨＰＭＣ（Ｋ４Ｍ、Ｋ１５ＭおよびＫ１００Ｍ）を評価した。各種のグレードのＨＰＭＣを用いて作製した錠剤の溶出特性を図３０に示す。薬物放出特性は２０％ ＨＰＭＣでは粘度グレードとは無関係に類似していた；薬物の８０％超が２時間で放出された。ＨＰＭＣポリマーが水性媒体に曝露されると、ＨＰＭＣポリマーは迅速な水和と鎖緩和を受けて、ゲル層を形成した（Ｎａｒｕｈａｓｈｉら、Ｐｈａｒｍ Ｒｅｓ．２００３，１９：１４１５−１４２１）。２０％のＨＰＭＣは、ＢＨ４の放出を著しく低下させる実質的なゲルバリア層を形成しないことがある。
高い粘度グレードのＨＰＭＣ（メトセルＫ１００Ｍ ＣＲ）の可変濃度（２０％〜４０％）を用いて作製した錠剤の溶出特性を図３０に示す。３５％〜４０％メトセルＫ１００Ｍ ＣＲを含有する錠剤は、薬物放出を最大４時間遅延させることが見出されたが、２０％ ＨＰＭＣは薬物を２時間で放出した（図３１）。３５％ ＨＰＭＣ（メトセルＫ１００Ｍ）を含有する錠剤を動物研究での試験用のプロトタイプとして選択したのは、それが薬物放出を最大４時間遅延させるのに必要なＨＰＭＣの最小量を含有していたためであった。したがって錠剤は、溶出特性で１００％に近い薬物放出によって明白であるような許容される薬物含有量の、良好な品質であった。
プロトン供与体ポリマープロトタイプ
ＢＨ４の経口吸収を向上させるために、１つの手法は近位小腸のｐＨを低下させることによって薬剤を安定化させることである。小腸内腔ｐＨを操作するために、腸溶コーティングに一般に使用されるタンパク質放出ポリマーであるオイドラギットＬ１００−５５を選択した。本ポリマーは酸性条件下で不溶性であり、弱酸性（ｐＨ＞５．５）からアルカリ性条件下ではそのカルボキシル基のために溶解性となり、タンパク質を放出して、それにより小腸内腔ｐＨが酸性であるように制御する。Ｎａｒｕｈａｓｈｉら（２００３）は、内腔でのｐＨがオイドラギットＬ１００−５５濃度に依存する方式で低下して、その酸性ポリマーの存在下で回腸ループからのセファドロキシルおよびセフィキシムの吸収が上昇したことを見出した（Ｎｏｚａｗａら、Ｊ．Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ．２００３，９２（１１），２２０８−２２１６）。Ｎｏｚａｗａら（２００３）は、オイドラギットが小腸ループ内のｐＨを低下させて、ループからのセファドロキシルおよびセフィキシムの消失を増大させることを示した。
表８に示すようなＢＨ４およびオイドラギットＬ１００−５５を含有する粉末調合物を圧縮して錠剤とし、カプセル内に充填した。錠剤調合物は、溶出試験中に人工胃液（ＳＧＦ）中にて１時間で約２７％を放出した。しかし、崩壊試験の間、錠剤はＳＧＦおよびｐＨ５．８のリン酸緩衝液（ＰＢ）中では少なくとも２時間にわたって変化がなかった。超崩壊剤（クロスポビドンまたはクロスカルメロース）の存在下でも、錠剤は崩壊できなかった。薬物がオイドラギットを酸性化して、ポリマーがイオン化されず、不溶性のままであるような低微小ｐＨ環境を生成する可能性があることが考えられる。
粉末充填カプセル薬−オイドラギット調合物はＳＧＦ中で迅速に崩壊した。近位小腸でのタンパク質放出を目的として、腸溶コートをカプセルに施した。カプセルコーティングおよび４０℃の乾燥器での乾燥の後、カプセルはポリマーコーティングで約１〜３重量％増加した。ＵＳＰ溶出装置ＩＩ（パドル）、回転速度５０ｒｐｍにて３７℃に維持した溶出媒体０．１Ｎ ＨＣｌを使用して試験したとき、コートカプセルは１時間で薬物の約２５％を放出した。酸（０．１Ｎ ＨＣｌ）による事前処理の１時間後、コートカプセルをＵＳＰ崩壊装置に、３７℃に維持したｐＨ５．８リン酸緩衝液５００ｍＬと共に入れると、コートカプセルは約１時間で崩壊した。腸溶コートカプセルがタンパク質放出ポリマーを標的部位により送達しやすいため、錠剤または未コートカプセルよりも腸溶コートカプセルのプロトタイプを選択した。
浮遊送達系
浮遊送達系を開発した。最初のプロトタイプは、浮遊複数単位投薬形であった、本投薬形の目的は、単位の１つが胃領域に留まる可能性を上昇させて、それゆえ薬物の胃貯留時間を延長することであった。本投薬形は、カプセル内の３層錠剤７個より成る；中間層は薬物物質を含有して、２つの非水溶性外層に挟まれている（図３２）。外層は、浮遊錠剤に必要な浮力を与える、疎水性および水不溶性脂肪酸であるステアリン酸を含有していた。各錠剤は、エチルセルロースおよびポリエチレングリコールＭＷ４６００（ＰＥＧ）を手動でコーティングした。エチルセルロースは錠剤周囲に非水溶性膜を形成し、孔形成剤として作用したＰＥＧは放出速度を調節した。エチルセルロースおよび各種濃度（２０％〜４０％）のＰＥＧ溶液でコーティングした錠剤の溶出特性を図３３に示す。コートされた３層錠剤がほぼゼロ次放出動態を達成したことに注目した。予想通り、薬物溶出速度は、ＰＥＧ濃度の上昇と共に上昇した。錠剤は、溶出試験中に人工胃液に少なくとも４時間浮遊した。表９は、動物研究で試験した調合物の組成を示す。
第２のプロトタイプは、気体発生投薬形であった。気体発生投薬形は、酸性胃内容物と接触したときに、二酸化炭素が遊離され、膨潤した親水コロイド中に捕捉されて、そのことが投薬形に浮力を与えるような方法で調合された（図３３）。本調合物は、溶出試験中に人工胃液に少なくとも４時間浮遊した。しかし、このような系が一貫して作用するために、錠剤は、早期の酸および塩基反応を防止するために、低湿度環境で産生されねばならない。貯蔵中のＢＨ４と重炭酸ナトリウムとの間には潜在的な相互作用がありうる。このような理由で、本投薬形は動物研究での試験を行わなかった。
小腸ｐＨを低下させるためのプロトン供与体ポリマー、胃内滞留性投薬形、および持続放出調合物を含む各種の調合物を含む、６種のプロトタイプ試験調合物を動物生物学的利用能試験のために開発した。
（実施例５）
新規ＢＨ４調合物の生物学的利用能
本試験の目的は、消化（ＧＩ）管における薬物の貯留時間を延長する投薬形を開発することによって、ＢＨ４の吸収を向上させることであった。
方法：体重３〜４ｋｇの健常カニクイザル３匹を、オープン、８期の非クロスオーバー試験で使用して、対照溶解ＢＨ４調合物と比較した７種の調合物の生物学的利用能を判定した。一晩絶食後、サルには同じ新規調合物の１回用量８０ｍｇを別個の機会に、試験した各種の新規調合物の間に少なくとも１週間の休薬期間を置いて、経口または静脈投与した。静脈内投与では、血液サンプルを投薬前、次に投薬５、１５および３０分、ならびに１．０、２．０、４．０、６．０、８．０、１２および２４時間後に収集した。経口投与では、血液サンプルを投薬前、次に投薬１５および３０分、ならびに１．０、２．０、３．０、４．０、６．０、８．０、１２および２４時間後に収集した。遠心分離による血漿の分離後、各サンプルの２００μＬ分割量を、０．１％ ＤＴＥを含有する個々の管に迅速に移し、総Ｌ−ビオプテリンのアッセイの準備が整うまで−７０℃で凍結した。
試験調合物：投与した調合物を表１３に示す。調合物のうち３種は、胃貯留時間を延長するための生体接着または浮遊機構（カルボマーベース、多微粒子浮遊顆粒および生体接着顆粒）によって胃内滞留性となるように概念的に設計した。他の概念は、調合物の貯留時間を延長するために消化管運動性を低速化させること（モノオレイン酸グリセリル）、未処置薬物の吸収を可能にするために小腸のｐＨを低下させて、それによりＢＨ４化学安定性を向上させること（プロトンポンプ）または吸収を上昇させるか否かを確認する持続放出調合物に基づいている。
ビオプテリンの血漿アッセイ：ＢＨ４の血漿濃度は、有効な特異的逆相ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ法を使用することによって決定した。標準曲線は、５０ｎｇ／ｍＬ〜２５００ｎｇ／ｍＬの濃度範囲で線形であった。Ｌ−ビオプテリンの定量下限は５０ｎｇ／ｍＬであり、変動係数によって示された日内精度は５％未満であった。Ｌ−ビオプテリンは、アッセイするまで−７０℃で凍結された、０．１％ ＤＴＥによって安定化されたサル血漿中で安定である。ＢＨ４濃度は、決定したＬ−ビオプテリン濃度から計算した。
薬物動態および統計解析：経口および静脈内調合物の投与後に、血漿ＢＨ４の薬物動態パラメータを決定した。薬物動態パラメータを表１４に示す。
結果
本試験の目的は、対照溶解錠調合物と比較してＢＨ４の生物学的利用能を向上させる調合物を同定することであった。ＢＨ４の経口投与後の各種の投薬形および対照調合物の平均血漿ＢＨ４濃度−時間特性を表２５に示し、血漿薬物濃度−時間特性より得たＢＨ４薬物動態パラメータを表１４に与える。対照調合物（フェーズ２）は溶解錠である。
図３５に示すように、モノオレイン酸グリセリル調合物は、それぞれ７１６ｎｇ−時／ｍＬおよび８５８ｎｇ−時／ｍＬである最大ＡＵＣｌａｓｔおよびＡＵＣ∞を与えた。対照溶解ＢＨ４錠剤調合物は、それぞれ６４１ｎｇ−時／ｍＬおよび８０５ｎｇ−時／ｍＬである最大ＡＵＣｌａｓｔおよびＡＵＣ∞を示した（表１４）。生物学的利用能が高いほうから低いほうへの調合物の順位は：モノオレイン酸グリセリル＞溶解錠＞生体接着ポリマー錠＞持続放出錠＞浮遊投薬形＞生体接着顆粒カプセル製品＞プロトン供与体カプセル製品である。
（実施例６）
テトラヒドロビオプテリンの静脈内調合物の調製
調合前安定性評価
一般に、本試験の目的は、ｐＨ１〜７のｐＨ範囲の緩衝液中での（表１５を参照）、抗酸化剤の存在下または非存在下での、そして反応溶液中の不活性気体の有無による（表１６を参照）、ＢＨ４の安定性を評価することであった。
さらに詳細には、不活性気体の存在下または非存在下での２種の抗酸化剤を組合せることの影響を、液体製品の調合を補助するためにｐＨ４にて、そしてサルおよびヒトの低い生物学的利用能への生理的ｐＨでの不安定性の寄与を確認するためにｐＨ７にて評価した（表１７および１８を参照）。ＢＨ４の安定性は温度依存性であることが予想される。したがって化合物安定性は、各種の温度における化合物の予想される長期貯蔵寿命の判定を補助するために、２〜８℃、２５℃、３０℃および３７℃で評価した。３７℃の生理学的温度における化合物の安定性の判定により、消化管の吸収領域における調合経口投薬形の安定性寿命の推定を補助するためのデータが与えられる。
各種の緩衝溶液中で実施される試験のために提案されたサンプリング時間は、ｐＨ３．１における１回試験の半減期を、ｐＨ６．８ Ｔｒｉｓおよびリン酸緩衝液でＤａｖｉｓら（１９８８；Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１７３，３４５−３５１，（１９８８））が得たデータと比較することによって概算した。ｐＨ３．１溶液の安定性試験によって、１７７６９分（１２．３日）の概算ｔ１／２が得られ、Ｄａｖｉｓらの研究により、リン酸ｐＨ６．８緩衝液中で１０分の、ｐＨ６．８ Ｔｒｉｓ緩衝液中で１４分のｔ１／２が得られた。これらの２つの試験は、ｐＨが１つ増加するごとに、ＢＨ４の半減期が１桁短縮されたこと（すなわち反応性が１桁上昇したこと）を示唆する（表１９を参照）。この概算に基づいて、ｐＨ１．２〜ｐＨ３溶液を最初に毎週サンプリングして、最初の２つのデータ点が収集された後に、必要ならばサンプリング時間の修正を行った。２５℃の概算されたサンプリング時間を表１９に示す。
試験はｐＨ１〜７緩衝溶液中で、５℃、２５℃、３０℃および３７℃にて実施した。これらの試験は完全密封されていない容器内で実施したが、単独の（アスコルビン酸またはＬ−システイン）または共に組み合わされた（アスコルビン酸＋Ｌ−システイン）抗酸化剤によって、ＢＨ４の消失または分解速度が低下した（図３６および図３７を参照）。アスコルビン酸およびＬ−システインを両方含有する溶液の散布によって、ＢＨ４の安定性が向上した。
ＢＨ４の分解速度は濃度依存性である（図３８を参照）。したがってＢＨ４の高用量の高度に濃縮された調合物は、調合物の相乗効果的な安定化のためにより低い濃度の安定剤を必要とすることが示された。
この結果は、滅菌注射用液剤、経口液剤、ならびに構成調合物用凍結乾燥および滅菌粉剤を含む長期貯蔵寿命、安定性、液体調合物の調合が、本明細書に記載した方法および組成によって産生可能であることを示している。
（実施例７）
経口および非経口使用のためのテトラヒドロプテリンの液体および凍結乾燥調合物
調合組成例
高用量液体調合物
上述の調合または配合溶液は場合により、配合タンクに不活性気体（たとえばアルゴンまたは窒素）あるいは二酸化炭素が注入され、１次容器は好ましくは、容器のヘッドスペースから酸素を除去するために不活性気体または二酸化炭素ブランケット中で密封される。調合物は、構成成分量に適切なスケールアップ因子を乗算することによって、いずれの体積にでもスケールアップ可能である。
（実施例８）
塩基性条件下での酸化時のＬ−ビオプテリン濃度を測定することによるヒト血漿中のテトラヒドロビオプテリン（ＢＨ４）のＬＣ／ＭＳ／ＭＳ決定
テトラヒドロビオプテリン（ＢＨ４）は、フェニルケトン尿症（ＰＫＵ）の患者の治療のための小型分子治療薬である。ヒト血漿中のＢＨ４濃度を測定する正確で具体的な方法を有することが重要である。しかし、ヒト血漿中のＢＨ４を定量することは、その低い内因性濃度および不安定性のために困難である。塩基性条件下では、ＢＨ４は酸化されて、ジヒドロビオプテリン（ＢＨ２）に、最終的にはＬ−ビオプテリンになる。さらに、ＢＨ４のＬ−ビオプテリンへの酸化変換は２３週までほぼ一定である。したがって、塩基性条件下での酸化時に、Ｌ−ビオプテリン濃度を測定して、モル変換率を当てはめることによって、本発明者らはヒト血漿中のＢＨ４濃度を確実に決定できる。
公開した方法は、ＨＰＬＣを蛍光検出と共に使用するＦｕｋｕｓｈｉｍａおよびＮｉｘｏｎ（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１０２，１７６−１８８（１９８０））によって開発された古典的方法に基づく。ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ法では、ヒト血漿サンプルを抗酸化剤によって安定化し、内部標準（ＩＳ）液でスパイクして、水酸化ナトリウム溶液によって塩基性化してから、ヨウ素溶液で酸化した。暗所での室温におけるインキュベーション時に、アスコルビン酸を添加して過剰なヨウ素を減少させた。酸化したサンプルをタンパク質沈殿によって抽出した。再構成抽出物中のＬ−ビオプテリンは、逆相ＨＰＬＣをターボ・イオン・スプレー（登録商標）ＭＳ／ＭＳ検出と共に使用することによって分析した。Ｌ−ビオプテリンの陰イオンはＭＲＭモードで監視した。標準の薬物対ＩＳピーク面積比を使用して、１／ｘ２重み付け最小二乗回帰分析を使用して、直線較正曲線を作成した。
ＢＨ４のＬ−ビオプテリンに対する酸化変換率は、複数の時点：０、１、２、４、８、１２および２３週にて評価して、試験したすべての時点で一致していることが見出され、最初の３つの連続する時点から決定した名目上のモル変換率は４７．３％であった。他の時点の変換率と名目上の値との間の差は、−２．３〜６．３％の範囲であった。ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ法を検証して、５〜１０００ｎｇ／ｍＬ（ＢＨ４ １１〜２１１４ｎｇ／ｍＬと等しい）の直線較正範囲でＫ２ ＥＤＴＡヒト血漿中のＬ−ビオプテリンを定量した。アッセイの精度および正確度は品質管理サンプル（ＱＣ）によって評価して、結果によって４．７〜１４．５％ＣＶの日内精度；名目値−７．１〜７．４％の日内正確度；ならびに名目値７．４〜１６．４％ＣＶの日内精度および名目値−８．３〜３．７％日内正確度それぞれが示された。Ｌ−ビオプテリンの平均抽出回収率は６５．３％であった。Ｋ２ ＥＤＴＡヒト血漿において、Ｌ−ビオプテリンは室温にて少なくとも４時間にわたって４回の凍結解凍サイクルの後に、そして−７０℃にて少なくとも２７５日にわたって安定であることが見出された。
（実施例９）
ＨＰＬＣを電気化学及び蛍光検出と共に使用した、ＢＨ４／ＢＨ２／Ｂの決定
逆相高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を蛍光検出（ＦＤ）および電気化学検出（ＥＣＤ）と共に使用して、ヒト血漿中のテトラヒドロビオプテリン（ＢＨ４）、ジヒドロビオプテリン（ＢＨ２）、およびビオプテリン（Ｂ）濃度を決定する方法を開発するために試験を実施した。方法は、Ｃａｉら（Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５５：８３８−８４９，２００２）に基づく。
ＢＨ４の原液（２０ｍＭ ＨＣｌ中）、ＢＨ２およびＢ（ＤＭＳＯ）中を最終濃度１０ｍＭで調製して、−８０℃にて貯蔵した。較正標準使用液は、原液から０．１％（ｗ／ｖ）１，４−ジチオエリスリトール（ＤＴＥ）によって調節したＫ２ ＥＤＴＡヒト血漿により１００、１０、７．５、５、２．５、および１ｎＭの濃度で調製した。ＢＨ４、ＢＨ２およびＢの品質管理使用液は、０．１％（ｗ／ｖ）ＤＴＥによって調整したＫ２ ＥＤＴＡヒト血漿により５、８、２５および５０ｎＭにて調製して、−８０℃にて貯蔵した。
サンプル処理のために、血漿を再懸濁緩衝液によって１：１０で希釈した。希釈血漿１８０μｌに１０×沈殿緩衝液２０μｌを添加した。この血漿希釈および沈殿の処理をすべての血漿標準、血漿サンプルおよび血漿ＱＣに適用した。１０×沈殿緩衝液の添加後に、サンプルを最大速度で４℃にて５分間遠心分離にかけて、非特異的血漿残屑を除去した。上清１５０ｍＬを次にサンプルバイアルに移し、さらに１００ｍＬ注入のためのオートサンプラに移した。
水中の酢酸ナトリウム１３．６ｇ（５０ｍＭ）、クエン酸２．１ｇ（５ｍＭ）、ＥＤＴＡ ３６ｍｇ（４８ｍＭ）、ＤＴＥ ４９．４ｍｇ（１６０ｍＭ）、および２体積％メタノールによって移動相（２Ｌ）を調製した。ｐＨを５．２２に調整した。再懸濁緩衝液（２０ｍＬ）は、ＰＢＳ ｐＨ７．４ ２０ｍＬ（５０ｍＭ）、１Ｍ ＤＴＥ ２０ｕＬ（１ｍＭ）、および１００ｕＭ ＥＤＴＡ １００ｍＬによって調製した。１０×沈殿緩衝液（２５ｍＬ）は、リン酸２．８８ｍＬ（１Ｍ）、トリクロロ酢酸９．３９ｇ（２Ｍ）および１Ｍ ＤＴＥ ２０ｍＬ（１ｍＭ）を用いて新しく調製した。
テトラヒドロビオプテリン（ＢＨ４）、ジヒドロビオプテリン（ＢＨ２）、およびビオプテリン（Ｂ）は、逆相ＨＰＬＣ分離を使用して分離した。ＢＨ４は、ＢＨ４が電極１によってキノノイドジヒドロビオプテリン（ｑＢＨ２）に酸化され、次に電極２にて還元されてＢＨ４に戻る、電気化学検出を使用して測定した。検出器は次に、この還元反応によって生成された電流を使用して、ＢＨ４の濃度を決定する。ＢＨ２およびＢは、蛍光検出を使用して同じ注入で測定することが可能である。最適電位にてコンディショニング・ガード・セルを使用するＢＨ２のカラム後酸化によって、ＢＨ２がビオプテリンに酸化される。
ＨＰＬＣ分離は、ＡＣＥ Ｃ−１８（２５０ｍｍ×４．６ｍｍ）カラム、５μＭで、流量１．３ｍＬ／分、ランタイム１３分にて実施した。電気化学検出設定は、Ｅ１：＋１００ｍＶ（バックグラウンド電流＋５００ｎＡ〜＋６００ｎＡ）およびＥ２：−３００ｍＶ（バックグラウンド電流−５０ｎＡ〜−６０ｎＡ）であった。カラム後酸化は９００ｍＶに設定した。蛍光検出設定は、励起波長：３５０ｎＭおよび放射波長：４５０ｎＭであった。
方法の直線性および範囲を、血漿および緩衝液中の標準の精度および正確度に基づいて判定した。標準曲線濃度は、各検体について少なくとも４〜６種のゼロでない濃度を使用して確立した。標準の濃度は、１、２．５、５、７．５、１０、および１００ｎＭであった。結果は、Ｒ２が＞０．９９のＢＨ４、ＢＨ２、およびＢでは１〜１００ｎＭで直線適合を示した。
正確度は、検体の既知量（２、８、２５、および５０ｎＭ）を含有する品質管理サンプルの反復分析によって決定して、正確度のパーセントで表した。精度も品質管理によるデータに基づいて計算した。アッセイ内精度およびアッセイ間精度をＣＶ％に基づいて評価した。３回の独立した実験連続作業単位で、血漿で各検体の濃度を調製し、分析した。さらに、ＢＨ４、ＢＨ２、およびＢ １０ｎＭをヒト血漿サンプル中に「スパイク」して、正確度および回収率を決定した。８、２５、および５０ｎＭにおけるＢＨ４、ＢＨ２、およびＢの測定により、１１２％〜８９％の正確度であることが判明して、２．５％〜２０％の精度（ＣＶ％）が示された。ヒト血漿の臨床サンプル中の１０ｎＭ ＢＨ４、ＢＨ２、およびＢを使用するスパイク回収率実験によって、７０％〜１３０％の回収率が示された。結果により、２ｎＭを超える濃度のサンプルでは方法が正確かつ精密であることが示された。
血漿の６種の異なるロットでの内因性干渉の存在について点検するために、１０ｎＭ ＢＨ４、ＢＨ２、およびＢを血漿の６種の異なるロット中にスパイクして、各血漿サンプルについて正確度および精度を決定した。選択性実験により、６名の個人が定量限界〜２．４８ｎＭの内因性ベースラインＢＨ４レベルを有したことが示される。同様に、ＢＨ２およびＢ濃度は０．０２〜１０ｎＭの範囲であった。１０ｎＭスパイク検体の回収率は６９％〜８７％の範囲であった。１０ｎＭでスパイクしたときの個々の血漿サンプルと検体での可変性（ＣＶ％）は２３％〜３７％の範囲であった。ＢＨ４、ＢＨ２およびＢの内因性レベルの可変性は０〜９．９６ｎＭの範囲であった。まとめると、結果により、抽出中のマトリクス干渉または消失を示唆する傾向が示されるが、個人間には強い選択性は示されない。
マトリクス効果を測定するために、血漿または緩衝液で作成した標準曲線を正確度（回収率）、直線性および相関について比較した。血漿で調製した標準と緩衝液で調製した標準との比較によって、中程度のマトリクス効果と、一般に良好な相関が示される。３種の検体すべてが、血漿および緩衝液について優れた直線適合を有していた。ＢＨ４およびＢは、濃度範囲にわたって著しいマトリクス効果を示さなかった。しかし、ＢＨ２は最高標準濃度（１００ｎＭ）にてより低い回収率を有した。緩衝液および血漿で調製した品質管理サンプルは良好な正確度を示した。全体として、マトリクス効果は最小限であるように思われ、血漿と比較して緩衝液では回収率が低い傾向がある。ＢＨ４およびＢＨ２はただちに酸化されるため、収集した血漿およびサンプル緩衝液は、可能なときは抗酸化剤を含有して、低いｐＨを有するべきである。
２５０ｎＭ ＢＨ４、ＢＨ２およびＢでスパイクした血漿および緩衝液サンプルを正確に希釈する能力を試験するために、ブランク血漿を使用して血漿を３倍希釈系列で希釈した。希釈したサンプルを分析して、希釈因数を適用した後に名目上の値と比較した。高濃度のＢＨ４、ＢＨ２およびＢの希釈は正確に行うことが可能である。ＢＨ４では、希釈後に観測された濃度は、８３．３３ｎＭ〜３．０７ｎＭの濃度に対して８３％〜１０４％の正確度であった。ＢＨ２は、定量的範囲（８３ｎＭ〜３ｎＭ）にわたって７４％〜８０％の正確度であった。Ｂは、定量的範囲（８３ｎＭ〜３ｎＭ）にわたって１１９％〜１１３％の正確度であった。したがって、定量限界を超えるのサンプルは正確に希釈することが可能である。
検体の４種の濃度（２、８、２５および５０ｎＭ）を血漿で調製して、最低３サイクルのうち、１サイクルは最低２４時間、他のサイクルは最低１２時間にわたって凍結させた。サンプルを凍結期間の間に室温で補助せずに解凍した。各々のおよびすべての凍結−解凍（ｆｒｅｅ−ｔｈａｗ）サイクルの後の正確度および可変性を判定して、サンプルが受けられるサイクルの最大数を確立した。ＢＨ４、ＢＨ２、およびＢ含有サンプルは、測定の正確度および精度に著しい変化を伴わずに、最大３回の凍結−解凍サイクルを受けることが可能であった。８ｎＭ〜５０ｎＭ ＢＨ４血漿サンプルは、１２１％〜９１％の正確度で、ＣＶ％は１０％未満であった。同様に、ＢＨ２測定値は、アッセイの定量範囲にわたって７７％〜８８％の正確度であった。Ｂ測定値は定量範囲にわたって９８％〜９９％の正確度であり、精度（ＣＶ％）は５％〜８％であった。ＢＨ４、ＢＨ２、およびＢの２ｎＭサンプルは、凍結−解凍の反復後には正確または精密でなかった。したがって、標準、品質管理および試験サンプルを３回まで凍結および解凍してもよい。
検体は酸化を受けやすいため、本発明者らは予想される貯蔵条件を模倣するために長期凍結安定性を検討した。ＢＨ４、ＢＨ２、およびＢの４種の濃度レベル（２、８、５０、および１００ｎＭ）を血漿で調製して、−７０℃にて８週間貯蔵した。安定性サンプルを調製後、および第３、５、６、および８週にアッセイした。ＢＨ４およびＢは長期凍結安定性を有していた。ＢＨ２は、長期貯蔵後にサンプル濃度の低下を示した。貯蔵８週間にわたって、ＢＨ４による血漿サンプルは９３％〜９４％の正確度で、３１％〜０．２１％のＣＶ％を有し、２ｎＭ濃度で最も大きい変動が見られた。ＢＨ２測定値は、試験濃度では６３％〜８５％の正確度で、２ｎＭおよび１００ｎＭ濃度で正確度が低下した。これらのサンプルでは精度（ＣＶ％）は３７％〜１８％の範囲であった。Ｂ測定値は、試験濃度にて８８％〜１０１％の正確度で、精度（ＣＶ％）は２３％〜０．１４％であり、最高の変動は２ｎＭ濃度で見られた。まとめると、これらのデータは、検体濃度を感知されうるほど低下させずにサンプルを貯蔵できるのは８週間までという勧告を裏付けている。ＢＨ２は最も分解（酸化）を受けやすいように思われる。
オートサンプラでＢＨ４、ＢＨ２、およびＢの安定性を測定するために、８ｎＭの各検体の再構成溶媒をオートサンプラに０．２５、４、および１１時間配置した。測定値の正確度および精度を比較した。観測したＢＨ４測定値は、各時点で理論値の５％以内の正確度であり、３回の測定値すべてで正確度および精度はそれぞれ１０２％および０．０５４％であった。ＢＨ２の測定値は、４時間後には正確度が低下して、可変性が上昇した。オートサンプラでの１１時間後に、ＢＨ２の約５０％を測定した。このことは、展開緩衝液中ではオートサンプラ安定性が低いことを示す。Ｂの測定値は、１１時間後に理論値の１２５％以内の正確度を維持した。したがって４時間を超えないランタイムが推奨される。
注入キャリーオーバーを決定するために、最高標準濃度１００ｎＭの後に抽出ベースライン血漿サンプルを挿入した。これは、低濃度サンプル中の検体濃度をキャリーオーバーのために過剰評価する可能性を模倣するために実施した。ＢＨ４、ＢＨ２、およびＢの注入キャリーオーバーは最小限であり、１００ｎＭ定量上限のピーク面積の１％超を占めることはない。注入キャリーオーバーは、低品質対照（２ｎＭ）から得た平均ピーク面積に基づいて、定量下限の約５％〜２０％に相当する。したがって、好ましいサンプルは低いほうから高いほうに順序付けすべきであり（すなわち最初に投薬前サンプル、続いて投薬後サンプル）、展開中にカラムを定期的に清浄にするためにさらに洗浄を行って、潜在的なキャリーオーバーを最小限にすることが好ましい。
強力で、特異的で、正確かつ精密である適切な方法が開発された。本方法は、薬物動態および薬物研究のために血漿中のＢＨ４、ＢＨ２およびＢのレベルを定量するのに適している。
本明細書で引用する、特許、刊行物および参考文献は、参照により本明細書に完全に組み込まれている。本開示と組み込まれた特許、刊行物および参考文献に矛盾がある場合には、本開示が優先するであろう。

Claims (53)

  1. テトラヒドロビオプテリン（ＢＨ４）またはその製薬的に許容される塩の治療的有効量をそれを必要とするヒトに投与するステップと、食品なしで摂取したときと比較して食品と共に摂取したときに、該ＢＨ４またはその製薬的に許容される塩の吸収が上昇することを該ヒトに通知するステップとを含む、ＢＨ４を経口投与する方法。
  2. 前記ＢＨ４またはその製薬的に許容される塩を絶食条件下で投与したときと比較して、該ＢＨ４またはその製薬的に許容される塩を高脂肪高カロリー食と共に投与したときにＣｍａｘおよびＡＵＣが約３０％上昇することが前記ヒトに通知される、請求項１に記載の方法。
  3. 前記ＢＨ４またはその製薬的に許容される塩が少なくとも９９．５％純粋である、請求項１または２のいずれか一項に記載の方法。
  4. 前記精製されたＢＨ４が、以下の：８．７（ｖｓ）、５．６３（ｍ）、４．７６（ｍ）、４．４０（ｍ）、４．００（ｓ）、３．２３（ｓ）、３．１１（ｖｓ）、好ましくは８．７（ｖｓ）、６．９（ｗ）、５．９０（ｖｗ）、５．６３（ｍ）、５．０７（ｍ）、４．７６（ｍ）、４．４０（ｍ）、４．１５（ｗ）、４．００（ｓ）、３．９５（ｍ）、３．５２（ｍ）、３．４４（ｗ）、３．３２（ｍ）、３．２３（ｓ）、３．１７（ｗ）、３．１１（ｖｓ）、３．０６（ｗ）、２．９９（ｗ）、２．９６（ｗ）、２．９４（ｍ）、２．８７（ｗ）、２．８４（ｓ）、２．８２（ｍ）、２．６９（ｗ）、２．５９（ｗ）、および２．４４（ｗ）のｄ値（Ａ）で表される特徴的なピークを持つ、Ｘ線粉末回折パターンを示す、塩酸塩としての結晶性多形である、請求項３に記載の方法。
  5. 前記ＢＨ４またはその製薬的に許容される塩が少なくとも２ｍｇ／ｋｇの１日用量で投与される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
  6. 前記ＢＨ４またはその製薬的に許容される塩が少なくとも５ｍｇ／ｋｇの１日用量で投与される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
  7. 前記ＢＨ４またはその製薬的に許容される塩が少なくとも１０ｍｇ／ｋｇの１日用量で投与される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
  8. 前記ＢＨ４またはその製薬的に許容される塩が少なくとも２０ｍｇ／ｋｇの１日用量で投与される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
  9. 前記ヒトが高フェニルアラニン血症と診断されている、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
  10. 前記ヒトが精神神経障害と診断されている、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
  11. 前記ヒトが心血管疾患と診断されている、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
  12. 前記ヒトが貧血と診断されている、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
  13. 対象におけるテトラヒドロビオプテリン（ＢＨ４）またはその製薬的に許容される塩の腸貯留時間を増大させる方法であって、該対象に調合物を投与するステップを含み、該調合物が（１）ＢＨ４またはその製薬的に許容される塩と、（２）腸運動性を低速化させる薬剤とを含み、該調合物によって投与されるＢＨ４またはその製薬的に許容される塩が腸運動性を低速化させる薬剤を含まないＢＨ４またはその製薬的に許容される塩の対照調合物と比較して、より長い腸貯留時間を有する、方法。
  14. 前記ＢＨ４またはその製薬的に許容される塩の腸貯留時間が前記対照調合物と比較して少なくとも２倍長い、請求項１３に記載の方法。
  15. 前記薬剤が脂肪酸、グリセロール脂肪酸エステル、またはその組合せである、請求項１３または１４のいずれか一項に記載の方法。
  16. 前記脂肪酸がオレイン酸、ステアリン酸、アラキジン酸、パルミチン酸、アラキドン酸、リノール酸、リノレン酸、エルシジン酸、ミリスチル酸、ラウリン酸、ミリストレイン酸、およびパルミトレイン酸からなる群より選択される、請求項１５に記載の方法。
  17. 前記グリセロール脂肪酸エステルがモノエステル、ジエステル、トリエステル、またはその組合せである、請求項１５に記載の方法。
  18. 前記グリセロール脂肪酸エステルがグリセロールモノエステルおよびグリセロールジエステルの組合せである、請求項１７に記載の方法。
  19. 前記薬剤がモノオレイン酸グリセロールおよびジオレイン酸グリセロールである、請求項１８に記載の方法。
  20. テトラヒドロビオプテリン（ＢＨ４）またはその製薬的に許容される塩および腸運動性を低速化させる薬剤を含む、ＢＨ４およびその製薬的に許容される塩の経口調合物。
  21. 前記薬剤が脂肪酸、グリセロール脂肪酸エステル、またはその組合せである、請求項２０に記載の調合物。
  22. 前記脂肪酸がオレイン酸、ステアリン酸、アラキジン酸、パルミチン酸、アラキドン酸、リノール酸、リノレン酸、エルシジン酸、ミリスチル酸、ラウリン酸、ミリストレイン酸、およびパルミトレイン酸からなる群より選択される、請求項２１に記載の方法。
  23. 前記グリセロール脂肪酸エステルがモノエステル、ジエステル、トリエステル、またはその組合せである、請求項２０に記載の調合物。
  24. 前記グリセロール脂肪酸エステルがグリセロールモノエステルおよびグリセロールジエステルの組合せである、請求項２３に記載の調合物。
  25. 前記薬剤がモノオレイン酸グリセロールおよびジオレイン酸グリセロールである、請求項２４に記載の調合物。
  26. テトラヒドロビオプテリン（ＢＨ４）またはその製薬的に許容される塩の水溶液、抗酸化剤、およびｐＨ緩衝剤を含む、ＢＨ４またはその製薬的に許容される塩の液体調合物。
  27. テトラヒドロビオプテリン（ＢＨ４）またはその製薬的に許容される塩、抗酸化剤、およびｐＨ緩衝剤の乾燥粉末混合物を含む、水溶液中への構成のためのＢＨ４またはその製薬的に許容される塩の乾燥粉末調合物。
  28. 前記ＢＨ４またはその製薬的に許容される塩が１０％ｗ／ｖまでの量で存在する、請求項２６または２７に記載の調合物。
  29. 前記抗酸化剤が少なくとも２種の抗酸化剤を含む、請求項２６〜２８のいずれか一項に記載の調合物。
  30. 前記少なくとも２種の抗酸化剤が還元剤抗酸化剤を含む、請求項２６〜２９のいずれか一項に記載の調合物。
  31. 酸抗酸化剤共力薬および／またはキレート剤をさらに含む、請求項２９〜３０のいずれか一項に記載の調合物。
  32. 前記抗酸化剤が５％ｗ／ｖまでの量で存在する、請求項２６〜３１のいずれか一項に記載の調合物。
  33. 密封容器で提供され、非酸化性ガスのブランケットを含む、請求項２６〜３２のいずれか一項に記載の調合物。
  34. 前記非酸化性ガスがアルゴン、窒素、二酸化炭素、およびその組合せからなる群より選択される、請求項３３に記載の調合物。
  35. 酸性ｐＨを有する、請求項２６〜３４のいずれか一項に記載の調合物。
  36. 甘味料および矯味矯臭剤をさらに含む、請求項３５に記載の調合物。
  37. 中性ｐＨを有する、請求項２６〜３４のいずれか一項に記載の調合物。
  38. テトラヒドロビオプテリン（ＢＨ４）またはその製薬的に許容される塩を含有する水溶液を提供するステップと；
    ＢＨ４またはその製薬的に許容される塩を含有する該溶液に抗酸化剤およびｐＨ緩衝剤を添加するステップと；
    抗酸化剤およびｐＨ緩衝剤の添加の前またはその後に、ＢＨ４またはその製薬的に許容される塩を含有する該水溶液に不活性ガスまたは二酸化炭素を散布するステップと；
    ＢＨ４またはその製薬的に許容される塩、抗酸化剤、およびｐＨ緩衝剤を含有する該散布溶液を容器内に密閉するステップと；
    を含む、ＢＨ４またはその製薬的に許容される塩の液体調合物を作製する方法。
  39. 前記容器内で前記溶液の上に非酸化性ガスのブランケットを提供するステップをさらに含む、請求項３８に記載の方法。
  40. 乾燥製品を作製するためにＢＨ４またはその製薬的に許容される塩、抗酸化剤、およびｐＨ緩衝剤を含有する前記溶液を凍結乾燥するステップをさらに含む、請求項３８または３９に記載の方法。
  41. 前記ＢＨ４またはその製薬的に許容される塩が二塩酸サプロプテリンを含む、請求項３８〜４０のいずれか一項に記載の方法。
  42. メタノール、酢酸ナトリウム、クエン酸、ＥＤＴＡ、および１，４−ジチオエリスリトールを含む水溶液を含む、ジヒドロビオプテリン、ビオプテリン、およびその類似体の逆相ＨＰＬＣ分離のための移動相溶液。
  43. 前記メタノールが２体積％の量で存在する、請求項４２に記載の溶液。
  44. ５０ｍＭ酢酸ナトリウム、５ｍＭクエン酸、４８μＭ ＥＤＴＡ、および１６０μＭ １，４−ジチオエリスリトールを含む、請求項４３に記載の溶液。
  45. メタノール、酢酸ナトリウム、クエン酸、ＥＤＴＡ、および１，４−ジチオエリスリトールを含む水溶液を含む移動相を使用して、ジヒドロビオプテリンおよびビオプテリン、またはジヒドロビオプテリンの類似体およびビオプテリンの類似体を含有する混合物に逆相ＨＰＬＣを実施するステップ；
    を含む、ジヒドロビオプテリンおよびビオプテリン、またはその類似体を塩基形およびジヒドロ形の両方を含有する混合物から分離する方法。
  46. 前記移動相に使用されるメタノールが２体積％の量で存在する、請求項４５に記載の方法。
  47. 前記移動相が、５０ｍＭ酢酸ナトリウム、５ｍＭクエン酸、４８μＭ ＥＤＴＡ、および１６０μＭ １，４−ジチオエリスリトールを含む、請求項４６に記載の方法。
  48. 前記混合物が血液、血漿、組織ホモジネート、または尿のサンプルを含む、請求項４５〜４７のいずれか一項に記載の方法。
  49. ビオプテリンを含む血液、血漿、組織ホモジネート、または尿のサンプルを酸化に供するステップと；
    該酸化されたサンプルをヨウ素滴定に共するステップと；
    該酸化されたサンプルをイオン交換カラムに通過させるステップと；
    ＨＰＬＣおよびタンデム質量分析法を使用して、該サンプル中の総ビオプテリンおよび酸化ビオプテリンを測定するステップと；
    該酸化形を除いた該総ビオプテリン間の差として、還元型ビオプテリンの量を計算するステップと；
    を含む、タンデム質量分析法と組み合わされた逆相ＨＰＬＣ（ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ）を使用してビオプテリンを測定する方法。
  50. ヨウ素滴定の前に前記サンプルをＫＣｌ、ＨＣｌまたはＴＣＡによって処理するステップをさらに含む、請求項４９に記載の方法。
  51. ヨウ素滴定の前に、前記サンプルをＫＩ、ＩまたはＮａＯＨで処理するステップと、該アルカリ性の酸化サンプルをＨＣｌまたはＴＣＡによる酸性化に供するステップとをさらに含む、請求項４９に記載の方法。
  52. ビオプテリンならびにジヒドロビオプテリンおよびテトラヒドロビオプテリンのうちの少なくとも１つ、またはビオプテリンならびにジヒドロビオプテリンおよびテトラヒドロビオプテリンのうちの少なくとも１つの類似体を含む混合物を提供するステップと；
    逆相ＨＰＬＣによって該混合物中のビオプテリン種を分離するステップと；
    テトラヒドロプテリンおよびその類似体の場合に、存在する該テトラヒドロプテリンおよびその類似体を第１の電極によってキノノイドジヒドロビオプテリン形に酸化して、続いて該キノノイド形を第２の電極に存在するテトラヒドロビオプテリンおよびその類似体に還元して戻すことによって電気化学検出を行うステップと；種の濃度を決定するために還元反応によって発生した電流を測定するステップと、および／または
    ジヒドロビオプテリン、その類似体、ビオプテリン、またはその類似体の場合、ジヒドロビオプテリン種のビオプテリンへのカラム後酸化の後に蛍光検出によってこのような種を測定するステップと；
    を含む、ビオプテリン種の混合物中のビオプテリンを定量する方法。
  53. ビオプテリン種またはその類似体を含む前記混合物が血液、血漿、組織ホモジネート、または尿のサンプルを含む、請求項５２に記載の方法。
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