BRPI0809470A2 - Métodos de administrar tetraidrobiopterina, composições associadas, e métodos de medição - Google Patents

Description

“MÉTODOS DE ADMINISTRAR TETRAIDROBIOPTERINA, COMPOSIÇÕES ASSOCIADAS, E MÉTODOS DE MEDIÇÃO”

REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS

Este pedido reivindica prioridade ao Pedido Provisória U.S. N— 60/922.821, depositado em 11 de abril de 2007, e 61/019.753, depositado em 8 de janeiro de 2008, as descrições das quais estão aqui incorporadas através de referência em sua totalidade.

ANTECEDENTE

Campo

A presente invenção é geralmente direcionada às composições e métodos para tratar distúrbios responsivos à BH4, e métodos e composições para detectar e quantificar biopterinas.

Antecedente da Tecnologia Relacionada

Tetraidrobiopterina (referida aqui como BH4) é uma amina biogênica da família de pterina de ocorrência natural que é um co-factor para várias enzimas diferentes, incluindo 15 fenilalanina hidroxilase (PAH), tirosina hidroxilase, triptofano hidroxilase e óxido nítrico sintase. Pterinas estão presentes em fluidos fisiológicos e tecidos em forma reduzida e oxidada, porém, só a 5,6,7,8, tetraidrobiopterina é biologicamente ativa. É uma molécula quiral e o enantiômero 6R do co-fator é conhecido ser o enantiômero biologicamente ativo. Para uma revisão detalhada da síntese e distúrbios de BH4 ver Blau e outro, 2001 (Disorders of te20 trahydrobiopterin and related biogenic amines. In: Scriver CR, Beaudet AL, Sly WS, Valle D, Childs B, Vogelstein B, eds,. The Metabolic and Molecular Bases of Inherited Disease, 8a ed. New York: McGraw-HiII1 2001: 1275-1776).

Fiege, e outro, Molecular Genetics and Metabolism 81:45-51 (2004) estudou farmacocinéticos de tetraidrobiopterina oralmente administrada (BH4) e sugestionou uma "variabiIidade bastante grande de BH4 oralmente administrado, provavelmente devido à absorção diferente no intestino e/ou ao primeiro efeito de passagem”.

Uso de tetraidrobiopterina foi proposto para tratar uma variedade de estados de doença diferentes, e existe uma necessidade quanto a métodos alternativos e melhorados de administrar este fármaco.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

A presente invenção refere-se a métodos de administrar 6R-(L-eritro)-5,6,7,8- tetraidrobiopterina (BH4), ou um sal farmaceuticamente aceitável da mesma, de uma maneira que melhora ou maximiza sua biodisponibilidade oral e/ou melhora ou otimiza a consistência de biodisponibilidade oral de uma administração ao próximo. Tais métodos podem ser 35 aplicados no tratamento de qualquer distúrbio responsivo à BH4, incluindo doenças metabólicas, doenças cardiovasculares, anemia, e transtornos neuropsiquiátricos. Os métodos da invenção vantajosamente permitem o melhor controle de sintomas clínicos, por exemplo, flutuação reduzida em níveis de fenilalanina de plasma, pressão sanguínea, níveis de neurotransmissores, ou outros parâmetros clínicos.

Como usado aqui, BH4 refere-se a 6R-(L-eritro)-5,6,7,8-tetraidrobiopterina. O termo BH4 como usado aqui deve da mesma forma ser entendido para opcionalmente significar um sal farmaceuticamente aceitável de 6R-(L-eritro)-5,6,7,8-tetraidrobiopterina, a menos que o contexto dite de outra maneira.

Em um primeiro aspecto, a invenção fornece métodos de administrar oralmente a um paciente em necessidade dos mesmos uma preparação purificada de BH4.

Em uma modalidade exemplar, os métodos compreendem a etapa de informar o 10 paciente que a absorção de tetraidrobiopterina é aumentada quando é ingerida com alimento comparado quando ingerida sem alimento. Em algumas modalidades, o paciente é informado que a ingestão imediatamente depois de uma refeição, por exemplo, uma refeição com alto teor de gordura, de alto teor calórico, resulta em um aumento em qualquer um, dois, três ou todos os parâmetros seguintes: concentração de plasma média, Cmáx, AUC, 15 AUC(O-t) e/ou AUC(inf). Em modalidades exemplares, o paciente é informado que a administração de BH4 com uma refeição com alto teor de gordura aumenta a Cmáx e AUC comparado à administração de BH4 sem alimento (em uma condição em jejum). Em algumas modalidades, o aumento relativo pode ser pelo menos 20% ou 30% ou mais.

Em modalidades alternativas ou além das modalidades precedentes, o método de 20 administrar tetraidrobiopterina compreende informar ao paciente que a absorção de tetraidrobiopterina é aumentada quando ingerida como um comprimido intata comparada quando ingeriu depois que fosse dissolvido em líquido. Em algumas modalidades, o paciente é informado que ingestão de resultados de comprimidos intatos em um aumento em quaisquer dos seguintes parâmetros: concentração de plasma média, Cmáx, AUC, AUC(O-t) ou 25 AUC(inf). Em modalidades exemplares, o paciente é informado que a administração de BH4 como um comprimido intacto aumenta ae Cmáx e AUC comparado à administração de BH4 depois de ser dissolvida em um líquido. Em algumas modalidades, o aumento relativo pode ser pelo menos 20% ou mais.

Quaisquer dos métodos precedentes pode ser realizado fornecendo-se ou administrando-se tetraidrobiopterina em um recipiente que contém a rotulagem impressa que informa ao paciente da mudança nos parâmetros de absorção descritos acima.

Opcionalmente, os métodos da invenção da mesma forma compreendem a etapa de fornecer ao paciente em necessidade dos mesmos uma quantidade terapeuticamente eficaz de tetraidrobiopterina. A quantidade terapeuticamente eficaz variará, dependendo da condição a ser tratada, e pode ser determinada facilmente pelo médico de tratamento com base na melhoria dos sintomas clínicos desejados.

Em uma modalidade exemplar, tais métodos envolvem administrar BH4 em uma forma dissolvida, em que a formulação é dissolvida em um líquido que inclui porém não limitado à água, suco de laranja e suco de maçã. Em uma modalidade exemplar, BH4 dissolvida é administrada ao paciente em uma condição em jejum, isto é, em um estômago vazio. A invenção também considera que a BH4 dissolvida, é administrada em um tempo especifica5 do que inclui porém não limitado à manhã, dia, noite, mesma hora do dia, em um estômago vazio, uma ou mais vezes por dia. Em modalidades exemplares, a composição é administrada ao paciente quando o estômago está vazio, por exemplo, pelo menos 30 minutos, 45 minutos, ou pelo menos uma hora antes de, e/ou pelo menos 90 minutos, ou duas horas, ou 2,5 horas, ou três horas depois de uma refeição. Desse modo, BH4 pode ser ingerida como 10 um produto líquido ou pré-dissolvido de uma forma de dosagem sólida ou semi-sólida antes da ingestão. Em uma modalidade adicional, BH4 pode da mesma forma ser dissolvida na cavidade oral de uma forma de dosagem sólida ou semi-sólida antes de engolir a solução dissolvida.

Em outra modalidade exemplar, tais métodos envolvem administrar BH4 em uma forma de dosagem sólida incluindo porém não limitada a comprimidos, cápsulas, doces, pastilhas, pós, e grânulos, ou forma semi-sólida, incluindo porém não limitada a pequenas quantidades orais em geléia que é engolida sem dissolver em um líquido que inclui porém não limitado a água, suco de laranja e suco de maçã, antes de engolir. Em uma modalidade, BH4 engolida é administrada ao paciente em uma condição em jejum, isto é, em um estômago vazio. A invenção também considera que a BH4 engolida como uma forma de dosagem sólida ou semi-sólida, é administrada em um tempo especificado que inclui mas não limitado a manhã, dia, noite, mesma hora do dia, em um estômago vazio, uma ou mais vezes por dia. Em modalidades exemplares, a composição é administrada ao paciente quando o estômago está vazio, por exemplo, pelo menos 30 minutos, 45 minutos, ou pelo menos uma hora antes de, e/ou pelo menos 90 minutos, ou duas horas, ou 2,5 horas, ou três horas depois de uma refeição.

Em outra modalidade, tais métodos envolvem administrar BH4, seja engolida como uma forma de dosagem sólida ou semi-sólida, ou dissolvida em um líquido, com alimento, por exemplo uma refeição com alto teor de gordura ou alto teor calórico. A invenção também 30 considera que BH4, se engolida ou dissolvida, é administrada em um tempo especificado que inclui porém não limitado a manhã, dia, noite, mesma hora do dia, com alimento, por exemplo, um alimento com alto teor de gordura ou uma refeição com alto teor de gordura e/ou alto teor calórico, uma ou mais vezes ao dia. Em uma modalidade exemplar, BH4 é ingerida uma vez por dia como uma forma de dosagem sólida logo após as refeições. Em 35 uma modalidade preferida, a forma de dosagem sólida é um comprimido ou cápsula formulado. Em mais modalidades exemplares, BH4 é ingerida dentro de aproximadamente 0 a 30 minutos, ou 5 a 20 minutos, de comer uma refeição. Independente de se ingerida como uma forma de dosagem sólida, forma de dosagem líquida ou como uma solução dissolvida, a exposição in vivo (ou biodisponibilidade) de BH4 é mais alta quando ingerida logo após as refeições comparadas aos controles em jejum.

A BH4 e o alimento podem ser ingeridos aproximadamente ao mesmo tempo, ou a BH4 pode ser ingerida antes ou depois da alimentação. O período de tempo entre o consumo do alimento e tomar BH4, engolida ou dissolvida, pode ser pelo menos 5 minutos. Por exemplo, BH4 pode ser administrada 60 minutos, 30 minutos, 25 minutos, 20 minutos, 15 minutos, 10 minutos, ou 5 minutos antes ou depois de uma refeição.

Em outra modalidade, para alguns pacientes, por exemplo adultos, ou alguns estados de doença, por exemplo, doenças cardiovasculares ou outras doenças associadas com disfunção de NOS, os métodos da invenção envolvem administrar um comprimido intacto em vez de dissolver o comprimido em um líquido para melhorar a biodisponibilidade.

Em um segundo aspecto, a invenção considera um método de estabilizar BH4 no trato intestinal de um paciente diminuindo o pH intestinal, por exemplo, usando polímeros de troca de próton. Produtos correspondentes compreendendo BH4 e excipientes acidificantes, tal como polímeros de troca de próton, são da mesma forma considerados.

Um terceiro aspecto da invenção considera um método de aumentar o tempo de residência no intestino para BH4, incluindo porém não limitado a redução da motilidade intestinal usando um agente que reduz a motilidade intestinal, tal como um ácido graxo e/ou um éster de ácido graxo de glicerol. Tais agentes hidrofóbicos podem aumentar a duração do tempo que BH4 permanece no intestino e podem aumentar a quantidade de BH4 que é absorvida. A duração do tempo que BH4 permanece no intestino, quando formulada com tal(ais) agente(s), pode ser pelo menos uma e meia hora, pelo menos duas horas, pelo menos três horas, pelo menos quatro horas, ou pelo menos cinco horas mais que uma formulação de BH4 que não tem um tal agente. Ácidos graxos adequados incluem ácido oléico, ácido esteárico, ácido araquídico, ácido palmítico, ácido arquidóico, ácido linoléico, ácido Iinolênico, ácido erucídico, ácido mirístico, ácido láurico, ácido miristólico, e ácido palmitólico. Da mesma forma considerado para aumentar o tempo de residência do intestino para BH4 é a indução da retenção gástrica usando ácido algínico, e bioadesão usando polycarbophil. Produtos correspondentes que compreendem BH4 e agentes que reduzem a motilidade intestinal são considerados.

Um quarto aspecto da invenção considera um método de modificar a liberação de BH4 usando uma formulação de liberação sustentada tal como HPMC, carbômero, etc. Produtos correspondentes que são formulações de liberação sustentada são considerados.

Em um quinto aspecto, a invenção considera administrar BH4 em forma de dosagem sólida estéril ou líquida estéril por rotinas diferentes de administração oral que incluem porém não limitadas às rotinas tópica, intravenosa, subcutânea, intramuscular, intratecal, oftálmica, e inalante. Composições correspondentes e kits adequados para tais rotinas de administração, e métodos de preparar as mesmas, são consideradas. Por exemplo, um emplastro transdérmico ou bucal para administração transdérmica ou bucal, respectivamente, compreendendo BH4 são considerados. Comprimidos sublinguais compreendendo BH4 são 5 da mesma forma considerados. Kits adequados são considerados, incluindo um dispositivo de inalador que compreende BH4, ou um kit que compreende BH4 e um conta-gotas ou pulverizador.

Uma modalidade inclui uma formulação líquida de tetraidrobiopterina (BH4) ou um sal farmaceuticamente aceitável da mesma, incluindo uma solução aquosa de BH4 ou sal farmaceuticamente aceitável da mesma, um antioxidante, e um tampão de pH.

Outra modalidade inclui um método de preparar uma formulação líquida de tetraidrobiopterina (BH4) ou um sal farmaceuticamente aceitável da mesma, incluindo fornecer uma solução aquosa que contém BH4 ou sal farmaceuticamente aceitável da mesma, adicionar um antioxidante e um tampão de pH à solução que contém BH4 ou sal farmaceutica15 mente aceitável da mesma, pulverizar a solução aquosa que contém BH4 ou sal farmaceuticamente aceitável da mesma, antes ou depois da adição de antioxidante e tampão de pH, com um gás inerte ou dióxido de carbono, e selar a solução pulverizada que contém BH4 ou sal farmaceuticamente aceitável da mesma, antioxidante, e tampão de pH em um recipiente.

Em um sexto aspecto, a invenção considera um método melhorado de medir BH4 utilizando espectrometria de massa em série e calcular a quantidade de biopterina reduzida. Tais métodos podem fornecer detecção de BH4 em uma sensibilidade por BH4 na faixa de 5 - 1000 ng/mL, com uma exatidão e precisão como exemplificado por um coeficiente de variação (CV)% abaixo de 15% (20% no limite inferior de quantificação, LLOQ). Em uma modalidade exemplar, um método de medir BH4 usando HPLC (RP) acoplada com espectrometria de massa em série (LC/MS/MS) compreende as etapas de: (1) submeter amostras de sangue, plasma, homogenados de tecido, ou urina à oxidação; (2) submeter as amostras oxidadas à iodometria; (3) passar as referidas amostras oxidadas através de uma coluna de troca iônica; (4) medir biopterina total e oxidada nas referidas amostras usando HPLC e espectrometria de massa em série; e calcular a quantidade de biopterina reduzida como a diferença entre as referidas biopterinas totais menos a referida forma oxidada. Em uma modalidade, amostras são tratadas com oxidação ácida, em que o método compreende as etapas de (1) tratar as referidas amostras com KCI, HCI ou TCA; (2) submeter as referidas amostras oxidadas por ácido à iodometria; (3) conduzir as referidas amostras oxidadas através de uma coluna de troca iônica; (4) medir a biopterina total que compreende 6R-BH4, R-q-DHBP (que é imediatamente reduzida in vivo para 6R-BH4 tal que a biopterina reduzida medida é principalmente baseada em 6R-BH4), DHBP, e BP nas referidas amostras usando HPLC e espectrometria de massa em série. Em outra modalidade, amostras são tratadas através de oxidação alcalina, em que o método compreende: (1) tratar as referidas amostras com Kl, I ou NaOH; (2) submeter as referidas amostras oxidadas alcalinas à acidificação com HCI ou TCA; (3) submeter as referidas amostras oxidadas à iodometria; (4) conduzir as referidas amostras através de uma coluna de troca iônica; (5) medir a biopterina oxidado compreen5 dendo DHBP e BP usando HPLC e espectrometria de massa em série; e (6) calcular a quantidade de biopterina reduzida (6R-BH4 + R-q-DHBP) como a diferença entre as biopterinas totais menos a forma oxidada.

Outro aspecto da invenção é uma solução de fase móvel para separação por HPLC de fase reversa de diidrobiopterina, biopterina, e análogos da mesma, incluindo uma solução 10 aquosa incluindo metanol, acetato de sódio, ácido cítrico, EDTA, e 1,4-ditioeritritol. Semelhantemente considerado é um método de separar diidrobiopterina e biopterina, ou análogos das mesmas, de uma mistura que contém formas de diidro e base, incluindo realizar HPLC de fase reversa usando uma fase móvel que compreende uma solução aquosa incluindo metanol, acetato de sódio, ácido cítrico, EDTA, e 1,4-ditioeritritol, em uma mistura que con15 tém diidrobiopterina e biopterina, ou um análogo de diidrobiopterina e um análogo de biopterina.

Outro aspecto da invenção é um método de quantificar biopterinas em uma mistura de espécies de biopterina, incluindo fornecer uma mistura que compreende biopterina e pelo menos uma dentre diidrobiopterina e tetraidrobiopterina, ou análogos de biopterina e pelo 20 menos uma dentre diidrobiopterina e tetraidrobiopterina, separar as espécies de biopterina na mistura através de HPLC de fase reversa, e no caso de tetraidrobiopterina e análogos da mesma, realizar a detecção eletroquímica oxidando-se a tetraidrobiopterina e análogos da mesma presentes por um primeiro eletrodo às formas de diidrobiopterina quinonóides, seguido reduzindo-se as formas quinonóides outra vez à tetraidrobiopterina e análogos da 25 mesma presentes em um segundo eletrodo, e medir a corrente gerada pela reação de redução para determinar a concentração de espécies, e/ou no caso de diidrobiopterina, análogos da mesma, biopterina, ou análogos da mesma, medir tais espécies através da detecção por fluorescência depois da oxidação pós-coluna de espécies de diidrobiopterina à biopterina.

Para as composições e métodos descritos aqui, componentes preferidos, e faixas 30 composicionais dos mesmos, podem ser selecionados a partir de vários exemplos fornecidos aqui. Outras características e vantagens da invenção ficarão evidentes a partir da seguinte descrição detalhada. Deveria, portanto, ser entendido que a descrição detalhada e os exemplos específicos, indicando modalidades preferidas da invenção, são fornecidos apenas por meio de ilustração, porque várias mudanças e modificações dentro do espírito e 35 escopo da invenção ficarão evidentes para aqueles versados na arte desta descrição detalhada.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS Figura 1 mostra um padrão de difração de pó de raios x característico de polimorfo cristalino forma B de 6R-(L-eritro)-5,6,7,8-tetraidrobiopterina.

Figura 2 é um gráfico do padrão de difração de raios x característico exibido por forma A de dicloridrato de (6R)-L-eritro-tetraidrobiopterina.

Figura 3 é um gráfico do padrão de difração de raios x característico exibido por

forma F de dicloridrato de (6R)-L-eritro-tetraidrobiopterina.

Figura 4 é um gráfico do padrão de difração de raios x característico exibido por forma J de dicloridrato de (6R)-L-eritro-tetraidrobiopterina.

Figura 5 é um gráfico do padrão de difração de raios x característico exibido por forma K de dicloridrato de (6R)-L-eritro-tetraidrobiopterina.

Figura 6 é um gráfico do padrão de difração de raios x característico exibido por hidrato forma C de dicloridrato de (6R)-L-eritro-tetraidrobiopterina.

Figura 7 é um gráfico do padrão de difração de raios x característico exibido por hidrato forma D de dicloridrato de (6R)-L-eritro-tetraidrobiopterina.

Figura 8 é um gráfico do padrão de difração de raios x característico exibido por hi

drato forma E de dicloridrato de (6R)-L-eritro-tetraidrobiopterina.

Figura 9 é um gráfico do padrão de difração de raios x característico exibido por hidrato forma H de dicloridrato de (6R)-L-eritro-tetraidrobiopterina.

Figura 10 é um gráfico do padrão de difração de raios x hidrato forma O de dicloridrato de (6R)-L-eritro-tetraidrobiopterina.

Figura 11 é um gráfico do padrão de difração de raios x solvato forma G de dicloridrato de (6R)-L-eritro-tetraidrobiopterina.

Figura 12 é um gráfico do padrão de difração de raios x solvato forma I de dicloridrato de (6R)-L-eritro-tetraidrobiopterina.

Figura 13 é um gráfico do padrão de difração de raios x

solvato forma L de dicloridrato de (6R)-L-eritro-tetraidrobiopterina.

Figura 14 é um gráfico do padrão de difração de raios x solvato forma M de dicloridrato de (6R)-L-eritro-tetraidrobiopterina.

Figura 15 é um gráfico do padrão de difração de raios x solvato forma N de dicloridrato de (6R)-L-eritro-tetraidrobiopterina.

Figura 16 é um fluxograma para a medida de biopterina.

Figura 17 é um resumo da validação do ensaio de biopterina.

Figura 18 é uma tabela que mostra parâmetros farmacocinéticos de biopterinas totais no plasma depois de uma única administração oral de sapropterina (BH4) em ratos.

Figura 19 mostra a concentração de biopterina de plasma e relação de forma redu

zida depois da administração em dose única de sapropterina (BH4) em ratos.

Figura 20 mostra a concentração de biopterina de plasma e relação de forma redu

característico exibido por característico exibido por característico exibido por característico exibido por característico exibido por característico exibido por zida depois da administração em dose única de sapropterina (BH4) em macacos.

Figura 21 é uma tabela que mostra os parâmetros farmacodinâmicos de biopterinas totais no plasma depois da administração em dose única de sapropterina (BH4) em macacos.

Figura 22 mostra o horário dos casos para a avaliação de segurança.

Figura 23 mostra as concentrações de plasma médias de BH4 depois da administração oral de 10 mg/kg de BH4 como comprimidos dissolvidos e intactos sob condições em jejum e comprimidos intactos sob condições alimentadas em voluntários saudáveis - eixos lineares.

Figura 24 mostra as concentrações de plasma médias de BH4 depois da adminis

tração oral de 10 mg/kg de BH4 como comprimidos dissolvidos e intactos sob condições em jejum e comprimidos intactos sob condições alimentadas em voluntários saudáveis - eixos semi-logarítmicos.

Figura 25 mostra uma tabela que resume os parâmetros farmacocinéticos para BH4 depois da administração oral de 10 mg/kg de BH4 como comprimidos dissolvidos e intactos sob condições em jejum e comprimidos intactos sob condições alimentadas em voluntários saudáveis.

Figura 26 mostra uma comparação estatística de parâmetros farmacocinéticos para BH4 depois da administração oral de 10 mg/kg de BH4 como comprimidos dissolvidos e intactos sob condições em jejum e comprimidos intactos sob condições alimentadas em voluntários saudáveis.

Figura 27 mostra um estudo de estabilidade de BH4 formulado com manitol a 5% em uma solução aquosa tanto antes quanto depois que duas semanas armazenada a 20°C.

Figura 28 mostra um perfil de dissolução de uma formulação em cápsula de BH4

tanto antes quanto depois do armazenamento durante 54 dias a 40°C.

Figura 29 mostra um perfil de dissolução de duas formulações de BH4 - um comprimido bioadesivo de BH4 e grânulos bioadesivos de BH4.

Figura 30 mostra um perfil de dissolução de várias formulações de liberação sustentada de BH4.

Figura 31 mostra um perfil de dissolução de várias formulações de liberação sustentada de BH4.

Figura 32 mostra um diagrama esquemático de uma formulação de dosagem flutuante de BH4.

Figura 33 mostra um perfil de dissolução de várias formulações de dosagem flutu

antes.

Figura 34 mostra um diagrama esquemático de formas de dosagem geradoras de gás de BH4.

Figura 35 mostra um perfil farmacocinético de várias formulações de BH4.

Figura 36 mostra um estudo de estabilidade de formulações de BH4 intravenosas em pH 4 durante 35 dias.

Figura 37 mostra um estudo de estabilidade de várias formulações de BH4 intrave

nosas durante 350 horas.

Figura 38 mostra um estudo de estabilidade de formulações de BH4 intravenosas em várias concentrações de BH4.

DESCRIÇÃO DAS MODALIDADES PREFERIDAS A invenção fornece métodos melhorados de administrar oralmente uma preparação

purificada de 6R-(L-eritro)-5,6,7,8-tetraidrobiopterina, incluindo um sal farmaceuticamente aceitável da mesma. A invenção é baseado na descoberta que tetraidrobiopterina (BH4) oralmente administrada tem absorção gastrointestinal baixa, que é um fator contribuidor principal à baixa biodisponibilidade de BH4.

A estrutura química de 6R-(L-eritro)-5,6,7,8-tetraidrobiopterina (BH4) é mostrada

abaixo:

H

Tetraidrobiopterina é um composto orgânico solúvel em água com baixa solubilidade de lipídio. Com base em uma análise experimental de sílico usando o software BioLoom (versão 1.5 de Biobyte Corp in Claremont Califórnia), o coeficiente de divisão de octanol20 água de BH4 foi determinado ser de -1,17. Penetração ideal de membranas biológicas quando aproximada pelo coeficiente de divisão de octanol/água ocorre ao redor de um Iog P de 2 ou 100-x a solubilidade de lipídio superior. Embora um CIogP baixo permita este substrate solubilizar facilmente sob condições fisiológicas, a capacidade do substrato para penetrar as camadas bilípidicas dentro de membranas biológicas é restringida, a qual pode limitar 25 a disponibilidade oral.

Estudos in vivo em ratos e macacos descritos aqui mostraram que apenas 8-11% de BH4 são absorvidos no intestino com a maioria que é excretada nas fezes quando comparado à administração intravenosa de BH4 em doses similares. Tal variabilidade na absorção de BH4 foi da mesma forma mostrada em um estudo descrito aqui no efeito de alimento 30 sobre a biodisponibilidade de BH4 em humanos saudáveis. Embora a administração de BH4 em água e suco de laranja sob condições em jejum resultadas em concentrações de plasma médias comparáveis e valores médios para Cmáx e AUC(O-t), a administração de BH4 simultaneamente com uma refeição com alto teor calórico, com alto teor de gordura resultou em um aumento significante nas concentrações de plasma médias e valores médios para Cmáx e AUC(O-t) quando BH4 foi administrada em água.

Embora exista uma ampla literatura que descreve a biodisponibilidade aumentada

em condições alimentadas, este efeito de alimento é tipicamente visto com fármacos insolúveis em água, lipofílicos (isto é, solúvel em lipídio) e não normalmente com substância ativa altamente solúvel em água tal como BH4. A explicação habitual para aumentos na biodisponibilidade sob condições alimentadas para compostos lipofílicos é que as refeições com alto 10 teor de gordura ajuda a solubilizar o fármaco desde que "Hke dissolve like” e estas tornem-se disponíveis para absorção. Outra possível explicação é que as refeições com alto teor de gordura estimulam a secreção de ácidos biliares que são bio-surfactantes naturais que ajudam a solubilizar e emulsificar as gorduras que nós comemos para ajudar sua digestão. Estes ácidos biliares são da mesma forma pensados solubilizar compostos insolúveis em água 15 desse modo os tornando disponíveis para absorção. Entretanto, BH4 não precisa de solubilização para ser absorvida visto que sua solubilidade é maior que 1000 mg/mL e o composto é um dos fármacos mais solúveis conhecidos. Portanto, o realce de sua biodisponibilidade através de refeições altamente energéticas, com alto teor de gordura não é consistente com tal mecanismo conhecido.

Entretanto, a administração como uma forma de dosagem sólida ou semi-sólida

e/ou com uma refeição com alto teor de gordura pode maximizar a biodisponibilidade aumentando-se o tempo de residência de BH4 no ambiente ácido do estômago e trato gastrointestinal superior (GIT) onde BH4 é quimicamente estável. A estabilidade de BH4 diminui com pH crescente e sua meia-vida em solução de tampão de pH 6,8, que é aproximada25 mente o pH do intestino delgado, é cerca de 15 minutos. Em pH 3,1, que está dentro do domínio do pH típico do estômago em voluntários normais, a estabilidade de BH4 em uma concentração de 1 mg/mL é de mais de 3 horas. A estabilidade química de BH4 pode também aumentar quando o pH do estômago cair abaixo do pH 3,1. Portanto, o tempo de residência do estômago prolongado fornece o fármaco intacto à parede do estômago para ab30 sorção, considerando que o esvaziamento ráoido no intestino degrada a BH4 e não está desse modo disponível para ser absorvido.

Desse modo, para maximizar a biodisponibilidade oral de BH4 a cada administração, BH4 deve ser tomada com alimento, por exemplo, um alimento com alto teor de gordura ou uma refeição com alto teor de gordura e/ou alto teor calórico. Alternativamente, para maximizar a consistência da biodisponibilidade oral entre as administrações, BH4 deve ser tomada com o estômago vazio (por exemplo, 1 hora antes ou 2 horas depois da refeição).

Como aqui usado, o termo "biodisponibilidade" refere-se à fração de uma dose administrada de um fármaco que entra na circulação sistêmica. Se o fármaco foi administrado intravenosamente, em seguida sua biodisponibilidade seria teoricamente 100%. Entretanto, se o fármaco foi administrado por outras rotinas (tal como oralmente), em seguida sua biodisponibilidade seria menor que 100% como resultado, por exemplo, da absorção incomple5 ta no trato Gl, degradação ou metabolismo antes da absorção, e/ou efeito de primeiro passo hepático.

O termo "refeição com alto teor de gordura" geralmente refere-se a uma refeição de pelo menos cerca de 700 kcal e pelo menos cerca de 45% de gordura (porcentagem relativa de kcal que é gordurosa), ou alternativamente pelo menos cerca de 900 kcal e pelo menos 10 cerca de 50% de gordura. O termo "alimento com alto teor de gordura" geralmente refere-se a uma alimento que compreende pelo menos 20 g de gordura, ou pelo menos 25, 30, 35, 40, 45, ou 50 g de gordura, e/ou pelo menos cerca de 45% ou 50% de gordura. Uma Orientação da FDA define uma "refeição com alto teor de gordura” como aproximadamente 50% de teor calórico total da refeição, considerando que uma "refeição com alto calórico” é aproximada15 mente 800 a 1000 calorias. A FDA recomenda uma refeição com alto teor calórico e alto teor de gordura como uma refeição teste para estudos de bioequivalência alimentada e biodisponibilidade de efeito do alimento. Esta refeição teste deve derivar aproximadamente 150, 250, e 500-600 calorias de proteína, carboidrato e gordura, respectivamente. Um exemplo de refeição teste consiste em dois ovos fritos na manteiga, duas tiras de toucinho, quatro 20 onças de batatas picadas e fritas e oito onças de leite integral. A substituição é possível se uma quantidade similar de calorias de proteína, carboidrato, e gordura tiver viscosidade e volume de refeição comparáveis (Guidance for lndustry, Food-Effect Bioavailability and Fed Bioequivalence Studies, U.S. Departament of Health and Human Services, Food and Drug Administration, Centerfor Drug Evaluation and Research (CDER), Dezembro de 2002).

Em um primeiro aspecto, a invenção fornece métodos de administrar oralmente

uma preparação purificada de 6R-(L-eritro)-5,6,7,8-tetraidrobiopterina (BH4), incluindo um sal farmaceuticamente aceitável da mesma.

Em algumas modalidades, os métodos envolvem informar ao paciente que a administração de tetraidrobiopterina com alimento tem um efeito sobre farmacocinéticos. Em uma 30 modalidade exemplar, os métodos compreendem a etapa de informar ao paciente que a absorção de tetraidrobiopterina é aumentada quando é ingerida com alimento comparada a quando ingerida sem alimento. Em algumas modalidades, o paciente é informado que a ingestão que segue imediatamente depois de uma refeição, por exemplo, uma refeição com alto teor calórico, alto teor de gordura, resulta em um aumento em qualquer um, dois, três ou 35 todos os seguintes parâmetros: concentração de plasma média, Cmáx, AUC, AUC(O-t) e/ou AUC(inf). Em modalidades exemplares, o paciente é informado que a administração de BH4 com uma refeição com alto teor de gordura aumenta a Cmáx e AUC comparadas à administração de BH4 sem alimento (em uma condição de jejum). Em algumas modalidades, o aumento relativo pode ser pelo menos 20% ou 30% ou mais.

Em modalidades alternativas ou além das modalidades precedentes, o método de administrar tetraidrobiopterina compreende informar ao paciente que a absorção de tetraidrobiopterina é aumentada quando ingerida como um comprimido intacto comparada quando ingerida depois que foi dissolvida em líquido. Em algumas modalidades, o paciente é informado que a ingestão de resultados de comprimidos intactos em um aumento em quaisquer dos seguintes parâmetros: concentração de plasma média, Cmáx, AUC, AUC(O-t) ou AUC(inf). Em modalidades exemplares, o paciente é informado que a administração de BH4 como um comprimido intacto aumenta a Cmáx e AUC comparadas á administração de BH4 depois que foi dissolvida em um líquido. Em algumas modalidades, o aumento relativo pode ser pelo menos 20% ou mais.

Quaisquer dos métodos precedentes podem ser realizados fornecendo-se ou administrando-se tetraidrobiopterina em um recipiente que contém rotulagem impressa informando ao paciente da mudança nos parâmetros de absorção descritos acima.

Opcionalmente, os métodos da invenção também compreendem a etapa de fornecer ao paciente em necessidade dos mesmos uma quantidade terapeuticamente eficaz de tetraidrobiopterina. A quantidade terapeuticamente eficaz variará, dependendo da condição a ser tratada, e pode ser determinada facilmente pelo médico de tratamento com base na em melhora dos sintomas clínicos desejados.

Em uma modalidade exemplar, tais métodos envolvem administrar BH4 em uma forma dissolvida, em que a formulação é dissolvida em um líquido que inclui porém não limitado a água, suco de laranja e suco de maçã. Em uma modalidade, BH4 dissolvida é administrada ao paciente em uma condição de jejum, isto é, em um estômago vazio. A invenção também considera que a BH4 dissolvida, é administrada em um tempo especificado que inclui porém não limitado a manhã, dia, noite, mesma hora do dia, em um estômago vazio, um ou mais vezes por dia. Em modalidades exemplares, a composição é administrada ao paciente quando o estômago está vazio, por exemplo, pelo menos 30 minutos, 45 minutos, ou pelo menos uma hora antes, e/ou pelo menos 90 minutos, ou duas horas, ou 2,5 horas, ou três horas depois de uma refeição. Desse modo, BH4 pode ser ingerida como um produto líquido ou ser pré-dissolvida de uma forma de dosagem sólida ou semi-sólida antes da ingestão. Em uma modalidade adicional, BH4 pode da mesma forma ser dissolvido na cavidade oral de uma forma de dosagem sólida ou semi-sólida antes de engolir a solução dissolvida.

Estas abordagens maximizam a taxa de absorção e biodisponibilidade assegurando-se que BH4 é dissolvida completamente na solução ou fluidos biológicos antes de ser liberada aos seus sítios de absorção, que são principalmente o estômago e o intestino. A dissolução de ingredientes farmacêuticos ativos ou fármaco na solução é uma condição prévia para absorção na circulação sistêmica (sangue e linfático). Quando as formas de dosagem sólidas tais como comprimidos e cápsulas são administradas oralmente, elas passam por uma série seqüencial de etapas tal como desintegração em grânulos, desagregação em 5 pós e dissolução antes da absorção na circulação sistêmica. Estas séries de etapas são desviadas administrando-se formas de dosagem sólidas de dissolução rápida, semi-sólidas e líquidas. Desse modo, a substância ativa está disponível precocemente para absorção, e porque não há nenhuma garantia que uma forma de dosagem sólida liberará toda a substância ativa contida dentro desta antes de transitar pelos sítios absorventes, as formulações 10 nas quais a substância ativa está presente em forma dissolvida antes de alcançar os sítios absorventes normalmente exibe a maior biodisponibilidade.

Estas formas de dosagem reduzem a variabilidade nos níveis de sangue porque a variabilidade é a desintegração da forma de dosagem e a dissolução in vivo no humano é prevenida. A taxa de desintegração in vivo e dissolução de uma forma de dosagem vendida 15 de BH4 alvejada para liberação no estômago depende da variabilidade de humano-parahumano no pH do fluido gástrico - alimentado e não alimentado (em jejum) - e a força da intensidade de agitação do estômago como determinado pela força da motilidade gástrica e taxas esvaziamento gástrico no intestino delgado. Considerando que as formas de dosagem líquida, semi-sólida, pastilha/confeito e sólida de dissolução rápida não têm que ser subme20 tidas à desintegração e dissolução, seus níveis de sangue são menos variáveis que quando a BH4 é administrada como formas de dosagem sólidas de liberação imediata (comprimidos e cápsulas).

Em outra modalidade exemplar, tais métodos envolvem administrar BH4 em uma forma de dosagem sólida incluindo porém não limitada a comprimidos, cápsulas, confeitos, pastilhas, pós, e grânulos, ou forma semi-sólida, incluindo porém não limitada a quantidades orais em geléia, que são mastigadas ou engolidas sem dissolver em um líquido que inclui porém não limitado a água, suco de laranja e suco de maçã, antes de engolir. Em uma modalidade, BH4 engolido é administrado ao paciente em uma condição de jejum, isto é, em um estômago vazio. A invenção também considera que a BH4 engolida como uma forma de dosagem sólida ou semi-sólida, é administrada em um tempo especificado que inclui porém não limitado a manhã, dia, noite, mesma hora do dia, em um estômago vazio, uma ou mais vezes por dia. Em modalidades exemplares, a composição é administrada ao paciente quando o estômago está vazio, por exemplo, pelo menos 30 minutos, 45 minutos, ou pelo menos uma hora antes de, e/ou pelo menos 90 minutos, ou duas horas, 2,5 horas, ou três horas depois de uma refeição.

Em outra modalidade, tais métodos envolvem administrar BH4, seja engolida como uma forma de dosagem sólida ou semi-sólida, ou dissolvida em um líquido, com alimento, por exemplo, um alimento com alto teor de gordura ou uma refeição com alto teor de gordura e/ou alto teor calórico. A invenção também considera que BH4, seja engolida ou dissolvida, é administrada em um tempo especificado que inclui porém não limitado a manhã, dia, noite, mesma hora do dia, com alimento, por exemplo, um alimento com alto teor de gordura 5 ou uma refeição com alto teor d gordura e/ou alto teor calórico, uma ou mais vezes por dia. Em uma modalidade exemplar, BH4 é ingerida uma vez por dia como uma forma de dosagem sólida logo após as refeições. Em uma modalidade preferida, a forma de dosagem sólida é uma cápsula ou comprimido formulado. Em mais modalidades exemplares, BH4 é ingerida dentro de aproximadamente O a 60 minutos, aproximadamente 0 a 30, ou 5 a 20 minu10 tos de comer uma refeição. Independente se for ingerida como uma forma de dosagem sólida, forma de dosagem líquida ou como uma solução dissolvida, a exposição in vivo (ou biodisponibilidade) de BH4 é mais alta quando ingerida logo após as refeições comparadas aos controles de jejum.

BH4 e o alimento podem ser ingeridos aproximadamente ao mesmo tempo, ou a 15 BH4 pode ser ingerida antes ou depois do alimento. O período de tempo entre consumir o alimento, por exemplo, um alimento com alto teor de gordura ou uma refeição com alto teor de gordura e/ou alto teor calórico e tomar BH4 engolido ou dissolvido pode ser pelo menos 5 minutos. BH4 pode ser administrado 60 minutos, 30 minutos, 25 minutos, 20 minutos, 15 minutos, 10 minutos, ou 5 minutos depois da ingestão de uma refeição.

Em outra modalidade, para alguns pacientes, por exemplo adultos, ou alguns esta

dos de doença, por exemplo, doenças cardiovasculares ou outras doenças associadas com a disfunção de NOS, os métodos da invenção envolvem administrar um comprimido intacto em vez de dissolver o comprimido em um líquido para melhorar a biodisponibilidade.

A administração de BH4 de acordo com os métodos da invenção resulta em concentrações de plasma médias e/ou a taxa de absorção gastrointestinal e/ou valores médios para Cmáx AUC(O-t) e/ou AUC (inf) que excede os valores quando BH4 é administrada sob condições em jejum.

A administração de um comprimido intacto sob condições em jejum resultadas em um aumento de 20% médio em Cmáx e AUC relativo aos comprimidos dissolvidos. A admi30 nistração de um comprimido dissolvido em água ou suco de laranja ou um comprimido intacto depois que uma refeição com alto teor de gordura/alto teor calórico resultou asse em aumentos em Cmáx e AUC que variaram de aproximadamente 30% (comprimido intacto) a 80% (água). A administração de BH4 como um comprimido intacto depois de uma refeição com alto teor de gordura e alto teor calórico em um aumento aproximado de 30% na exten35 são da absorção comparada à administração sem alimento. A administração de BH4 como um comprimido intacto resultou em um aumento aproximado de 20% na extensão da absorção comparada à administração de comprimidos dissolvidos. “Concentração de plasma média" significa a média de leituras de concentração em uma série de amostras de plasma.

"Cmáx" significa a concentração de plasma observada máxima.

"AUC" significa a área sob a curva de concentração-tempo de plasma.

"AUCo-t" significa a área sob a curva de concentração-tempo de plasma de tempo 0

ao tempo da última concentração mensurável.

"AUC (inf)" signifca a área calculada sob a curva de concentração-tempo de plasma de tempo 0 para infinidade.

A "taxa de absorção gastrointestinal" de BH4 é calculada da área sob a curva de tempo-aumento (ACp) de concentração de biopterina total de plasma (AAUC) depois da administração de BH4 usando a seguinte fórmula:

taxa de Absorção (%) =

(AAUC depois da dose p.o. /AAUC depois da dose i.v. dose) X (dose i.v./dose p.o. x

100)

Preferivelmente pelo menos 99,5% de 6R-BH4 puro são usados. Qualquer sal, in

cluindo o sal de dicloridrato, e qualquer forma cristalina de BH4 pode ser utilizada de acordo com os métodos e composições da invenção. Uma variedade de sais e formas cristalinas é descrita na Publicação de Patente U.S. No. 2006/0040946, incorporada aqui por referência em sua totalidade, e/ou a formulação sólida estável descrita na Publicação Int1I No. WO 20 06/55511, da mesma forma incorporada aqui por referência em sua totalidade. As várias formas cristalinas podem ser formadas convenientemente em um comprimido, pó ou outro sólido para administração oral.

Em um segundo aspecto, a invenção considera um método de estabilizar BH4 diminuindo-se o pH intestinal usando polímeros de troca de próton. BH4 é administrado oralmente diariamente como uma forma de dosagem sólida ou líquida que compreende ingredientes inativos que realçam a estabilidade de BH4 além do estômago diminuindo-se o pH do intestino e desse modo preservando-se ο BH4 de ser oxidado rapidamente. Desde que BH4 seja mais estável em meios ácidos do que em meios básicos, ingredientes inativos/excipientes acidificantes são incluídos em formulações de dosagem sólida (comprimidos, cápsulas, etc) de BH4 para diminuir o pH dos fluidos intestinais e desse modo realçar a estabilidade química. A área maior ou janela do trato gastrointestinal (GIT) disponível para absorção otimiza a consistência de absorção ampliando-se a janela limitada atual de absorção acreditada estar limitada ao estômago e ao duodeno ao intestino. Tais formas de dosagem incluem porém não são limitadas a comprimidos efervescentes, pós e grânulos (ser ressuspensos em líquido antes da administração) e materiais acidificantes. Ácidos de molécula pequena distintos, ácidos polímeros em volume permanecem no GIT por mais tempo e não são absorvidos pelo GIT, mas doam seus prótons aos fluidos de GIT para dimunuir o pH ambiental. Exemplos de ingredientes inativos/ excipientes que compreendem a formulação são moléculas pequenas de ácido carboxílico tais como ácido maléico, fumárico e cítrico ou moléculas pequenas inorgânicas tais ácido fosfórico, ácido acético e suas formas de sal. Outros exemplos são ácidos farmaceuticamente aceitáveis tais como classes de ácido car5 boxílico poliméricos incluindo ácidos polimetacrílicos, carbômeros, polycarbophil, Eudragits, formas ácidas de croscarmelose e ácido amido glicólico, etc. As formulações também contêm excipientes adicionais para aumentar a estabilidade tais como antioxidantes (por exemplo, tióis tais como cisteína, N-acetil cisteína, etc; ácido ascórbico; metionina; etc.) e outros excipientes conhecidos no comércio para permitir a manufaturabilidade e aumentar a quali10 dade e qualidades de desempenho da formulação.

Um terceiro aspecto da invenção considera um método de aumentar o tempo de residência do intestino para BH4, enquanto incluindo porém não limitado a redução da motilidade do intestino usando um agente que é capaz de reduzir a motilidade do intestino de BH4, tal como um ácido graxo e/ou um éster de ácido graxo de glicerol. Ácidos graxos po15 dem incluir ácido oléico, ácido esteárico, ácido araquídico, ácido palmítico, ácido arquidóico, ácido linoléico, ácido linolênico, ácido erucídico, ácido mirístico, ácido láurico, ácido miristólico, e ácido palmitólico. Da mesma forma considerado aumentar o tempo de residência no intestino de BH4 é a indução da retenção gástrica usando ácido algínico e bioadesão usando polycarbophil. Em uma modalidade, formas de dosagem de BH4 são administradas como 20 formulações flutuantes orais que flutuam e liberam BH4 em um aspecto definido no fluido gástrico e são retidas por mais tempo no estômago porque elas são mais resistentes ao esvaziamento gástrico do estômago do que as formulações que são não flutuantes ou dissolvem rapidamente no estômago. Esta abordagem do projeto é com base na gastro-retenção da forma de dosagem pelo uso de um excipiente gerador de gás dentro da forma de dosa25 gem, excipientes de baixa densidade que torna a forma de dosagem flutuante em fluidos do GIT ou uma combinação de um gás e materiais de baixa densidade em uma forma de dosagem para permitir a flutuação da forma de dosagem nos conteúdos de fluidos do GIT. Retenção prolongada e liberação da forma de dosagem no ambiente do estômago em que BH4 é mais estável em seus fluidos ácidos aumentarão igualmente o tempo de residência da 30 forma de dosagem no estômago e a estabilidade de BH4 e desse modo torna a BH4 disponível para uma absorção de período mais longo no estômago e duodeno do que o comprimido padrã e formas de dosagem em cápsula. Formulações de BH4 compreenderão de um ou mais antioxidantes, excipientes conhecidos no campo para permitir a fabricação e desintegração/dissolução da forma de dosagem sólida e excipientes adicional que geram um gás 35 ou mistura de gases (por exemplo, dióxido de carbono) no contato da formulação com meios aquosos e ou fluidos do GIT. Antioxidantes solúveis em água são preferidos, por exemplo, ácido ascórbico, metionina, e tióis (cisteína, N-acetil cisteína e glutationa) ou antioxidantes que são convertidos em um antioxidante solúvel no GIT, por exemplo, palmitato de ascorbila que é convertido em ácido ascórbico no GIT. Excipientes adicionados à formulação incluem carbonato e bicarbonato que reagem diretamente com BH4 para formar dióxido de carbono e ácidos pequenos e polímeros descritos previamente para reagir com os carbonatos e bicarbonatos para produzir dióxido de carbono quando necessário.

Em outra modalidade, formas de dosagem de BH4 são administradas as quais aderem durante um tempo prolongado às superfícies mucosas do GIT (isto é, formulação bioadesiva), preferivelmente em, porém absolutamente limitadas ao estômago onde devido à acidez dos fluidos gástricos, BH4 é mais estável do que no intestino. BH4 é liberada de uma maneira controlada da forma de dosagem bioadesiva. A forma de dosagem sólida é projetada para conter BH4, um ou mais antioxidantes, excipientes conhecidos no campo para permitir a fabricação das formas de dosagem de qualidade e controlar a desintegração/dissolução da forma de dosagem e um aditivo bioadesivo tal como polycarbophil em sua forma de ácido livre ou como uma forma de sal. Outros ácidos poliméricos tais como ácidos polimetacrílicos, carbômeros e derivados de celulose, por exemplo, HPMC, HPC, etc. podem ser combinados com ou podem ser substituídos por polycarbophil. Os antioxidantes são preferivelmente solúveis, por exemplo, ácido ascórbico, metionina, cisteína, N-acetil cisteína e glutationa ou podem ser convertidos em um antioxidante solúvel tal como ácido ascórbico no GIT, por exemplo, palmitato de ascorbila. Em uma modalidade, os componentes da formulação são misturados juntos e fabricados como uma forma de dosagem sólida, por exemplo, comprimidos ou cápsulas. A forma de dosagem sólida pode ser revestida entérica para liberar BH4 perto do estômago no intestino ou não revestido entérico projetada para liberar BH4 no estômago. Em outra modalidade, os componentes da forma de dosagem sólida podem ser subdivididos em porções diferentes e as várias porções são misturadas separadamente antes deles serem processados para formar formas de dosagem de múltiplas camadas. A forma de dosagem de múltiplas camadas pode conter o bioadesivo e alguns excipientes na camada externa de um comprimido, embrulhado em torno de outras camadas que contêm BH4 (isto é, região ativa dentro de um envelope bioadesivo) ou como um tampão cilíndrico junto ao pacote preenchido em uma cápsula em que uma ou mais outras camadas são reunidas abaixo ou dentro do envelope bioadesivo. Alternativamente, o bioadesivo e outras camadas nos tampões da cápsula ou comprimido podem ser estendidos em camadas em uma configuração de bi ou múltiplas camadas paralela. Estes projetos permitem o bioadesivo interagir com a membrana de Gl ou muco da membrana Gl para ancorar a forma de dosagem à membrana que reduz seu trânsito pelo trato Gl e assim aumentar o tempo de residência. Tais formas de dosagem podem ser da mesma forma revestidas entéricas. Ainda outra modalidade do método usado com BH4 é empregar ingredientes inativos poliméricos (excipientes) com grupos funcionais que ligam-se ao muco do GIT para atrasar o trânsito da forma de dosagem pelo GIT. Formas de dosagem de BH4 são formuladas com excipientes de polímero tiolados (polímero-SH) tais como polycarbophil-cisteina, ácido polipolimetacrílico-cisteína, carboximetil celulose-cisteína, derivados de quitosanacisteína, etc. Estes polímeros tiolados conferem igualmente as propriedades bioadesivas e 5 antioxidantes em BH4 realçando consideravelmente a absorção. Outros excipients incluídos nestas formulações são antioxidantes e excipientes auxiliares de desempenho e fabricação.

Em ainda outra modalidade, as formas de dosagem oral contendo excipientes inativos ou ingredientes ativos são usaos para reduzir a motilidade gástrica. A redução do trânsito da forma de dosagem de BH4 pelo trato GIT aumentará o tempo de residência da molé10 cuia e assim permitirá a fração maior da dose administrada a ser absorvida. Geralmente considerados como excipientes seguros (GRAS) empregados em formulações orais para atrasar o esvaziamento gástrico e/ou atrasar a motilidade intestinal preferivelmente compreende gorduras dietéticas tais como ácidos graxos, glicerídeos de ácidos graxos, e derivados de ácidos graxos e glicerídeos tal como Cremophor™ (derivados de óleo de rícino de polio15 xila), etc. Excipientes ativos incluem os agentes que reduzem a motilidade de intestino tal como agentes anticolinérgicos ou antimuscarínicos seletivos (M3) ou gerais.

Um quarto aspecto da invenção considera um método de modificar a liberação de BH4 usando uma formulação de liberação sustentada tal como HPMC, carbômero, etc. Este conceito compreende liberar as formas de dosagem de BH4 ao trato Gl modificando-se ou 20 alterando-se a liberação de BH4 de liberação imediata para reduzir a liberação prolongado, controlado e ou cronometrada. Liberação lenta, prolongada e controlada é obtida usando excipientes conhecidos na arte e BH4 é protegida dentro do sistema de liberação da degradação química pela presença de realçadores de estabilidade tais como antioxidantes. Tais métodos podem maximizar a biodisponibilidade desde que BH4 seja estabilizado dentro da 25 formulação e no ambiente que cerca a formulação para permitir a molécula ativa ser absorvida intacta na circulação sistêmica visto que a formulação transita o comprimento inteiro do GIT. Esta abordagem fornece uma janela maior do GIT para absorção e assim prevenindose a degradação de BH4 no ambiente do pH mais alto de forma que BH4 esteja disponível para ser absorvido. Antioxidantes serão incluídos na formulação para proteger o fármaco de 30 degradar-se em fluidos intestinais devido ao pH neutro próximo dos fluidos intestinais. Liberação lenta, prolongada e controlada liberará da mesma forma BH4 em regiões de tensão de oxigênio baixa do GIT. Liberação cronometrada é obtida usando excipientes conhecidos na arte tais como polímeros sensíveis a pH que só dissolvem quanto o pH alcança um valor em que o polímero é solúvel.

Em outra modalidade, a invenção considera o revestimento entérico da forma de

dosagem de BH4 para averiguar se incluir excipientes ácidos em uma formulação de BH4 realmente aumenta a absorção de BH4 diminuindo-se o pH do intestino e desse modo estabilizando-se BH4 no intestino a estar disponível para absorção. Desse modo, o revestimento entérico será usado para manter os excipientes e fármaco juntos no sítio onde o excipiente é esperado proteger BH4. Se a forma de dosagem de BH4 foi permitida desintegrar no estômago, os excipientes ácidos podem não esvaziar juntos no estômago e podem não fornecer proteção.

O revestimento entérico protege os compostos suscetíveis à degradação catalisada por ácido no estômago de ficar degradados pelo ácido no estômago. Materiais de revestimento entérico impedem o comprimido ou cápsula de libertar o composto ativo no estômago porque os materiais de revestimento entérico são insolúveis em ácido. Logo que a forma de 10 dosagem revestida entérica alcança o intestino onde o valor de pH varia de pH 5 - 8, os materiais ficam solúveis e liberam a substância ativa no intestino. Em comparação, as formulações de liberação sustentada são projetadas para liberar os medicamentos em um comprimento/área do GIT tão longo quanto possível. O revestimento de uma formulação de liberação sustentada para liberar justamente perto do estômago pode ser necessário apenas se 15 os medicamentos contidos nele forem instáveis ao ácido.

Em um quinto aspecto, a invenção considera administrar ο BH4 em forma de dosagem sólida estéril ou líquida estéril por rotinas diferentes de administração oral incluindo porém não limitadas a administração tópica, intravenosa, subcutânea, intramuscular, intratecal, oftálmica, e inalacional. BH4 é formulada como uma forma de dosagem sólida ou líquida estéril na concentração apropriada desejada.

As vantagens de uma forma de dosagem líquida estéril de BH4 para administração intravenosa podem incluir: (1) cinéticos mais previsível, com o potencial para níveis de soro mais altos; (2) nenhuma exigência de um trato gastrointestinal funcional; (3) nenhuma exigência para participação do paciente; e (4) ausência de uma preocupação de descumpri25 mento. As formulações intravenosas de BH4 podem ser particularmente benéficas em condições de manuseio que requerem liberação acelerada de fluidos e medicamentos por todo o corpo ou para compartimentos do corpo normalmente difíceis de acessar via oral ou outras formas de administração, incluindo porém não limitadas a raiva, meningite, transplante/preservação de órgão, sub- hemorragias sub-aracnoidais, trauma cerebral, acidente vas30 cular, cirurgia de bypass de artéria coronária, vasoespasmo cerebrovascular, transfusão/preservação de sangue, hipertensão pulmonar, doença da célula falciforme, préeclampsia e doença vascular pós-quimioterapia.

BH4 é altamente suscetível à oxidação em solução aquosa e em soluções de pH aquoso fisiológico (Davis, e outro, Eur. J. Biochem. 173, 345-351 (1988); Kirsch, e outro, J. Biol. Chem. 278, 24481-24490 (2003)). A maioria das determinações de estabilidade de BH4 foi realizadas em soluções pH 7.4 neutro a ligeiramente alcalino para imitar o comportamento de estabilidade provável de BH4 sob condição de pH de plasma fisiológico. Embora o Pedido de Patente Européia No. 1 757 293 A descreva formulações líquidas ou em xarope, tais formulações consistem em misturas em pó em estado sólido ou granulações que requerem reconstituição com água antes de ingestão oral. O presente aspecto da invenção considera formulações líquidas não limitadas a pós ou granulações para constituição. A invenção 5 também considera formulações líquidas compostas capazes de permanecer estáveis em temperatura ambiente durante um período suficiente de tempo para permitir o processo em instalações de enchimento/acabamento de produto estéril, a ser enchidas em ampolas, garrafas ou fraconetes como um produto líquido ou enchidas em fraconetes a serem secados por congelamento em produtos liofilizados.

As formulações líquidas e Iiofilizadas para reconstituição podem ser da mesma for

ma liberadas pelo canal nasal, oftálmico e otológico para efeitos terapêuticos. A formulação de um produto Iiofilizado requer dissolução anterior de BH4 em um líquido, preferivelmente aquoso, e o processo do produto líquido em uma instalação estéril (isto é, componsição, filtragem estéril e enchimento do líquido filtrado estéril em fraconetes antes do carregamento 15 dos fraconetes enchidos em um Iiofilizador para liofilização). Manter a estabilidade de BH4 solubilizada durante o processo estéril e prevenir sua degradação são pré-requisitos fundamentais para fabricação de produto Iiofilizado que satisfaz especificação de impurezas quanto ao produto enchido-acabado. Portanto a composição do produto Iiofilizado contém estabilizadores apropriados que minimizam ou previnem a degradação de BH4 durante o processo 20 de enchimento-acabamento. As formulações aqui descritas estabilizariam soluções de BH4 durante fabricação por enchimento/acabamento estéril, um processo que leva um mínimo de seis horas, e da mesma forma forneceria produto comercialmente estável.

As formulações incluem BH4, preferivelmente em concentração em uma faixa de 0,1 mg/mL a 10 mg/mL. Devido à alta solubilidade de BH4, formulações com concentrações até cerca de 100 mg/mL, por exemplo, podem ser da mesma forma preparadas. A preparação composicional relativa geral e métodos aqui descritos são aplicáveis para preparar soluções altamente concentradas.

As formulações líquidas de BH4 são formuladas preferivelmente em soluções de tampão de pH 1 a 8, preferivelmente em soluções de tampão de pH 2 a 7. Os tampões de 30 pH selecionados são compostos de tampão capazes de fornecer capacidade de tamponamento significativa em um pH particular desejado, como julgado a quanto aproximadamente as constantes ou constante de ionização de tampão estão do pH desejado da formulação líquida. Desse modo, qualquer composto de tampão pode ser empregado contanto que uma ou mais das constantes de ionização do composto estejam próximas do pH desejado da 35 formulação. Exemplos de tampões que podem ser empregados na faixa de pH 1 - 8 compreende vários ácidos/bases e seus respectivos ácidos/bases conjugados ou formas de sal, incluindo mas não limitados a: ácido clorídrico (pH 1 - 2), ácido maleico (pH 1 - 3), ácido fosfórico (pH 1 - 3), ácido cítrico (pH 3 - 6), ácido acético (pH 4,7 + 1,0), fosfato de sódio dibásico (pH 6 - 8), trometamina (TRIS, pH 8,3 + 1,0) e similares.

Formulações Intravenosas

Formulações intravenosas são estabilizadas usando um antioxidante ou uma com5 binação de 2 ou mais antioxidantes. Combinações de antioxidantes podem ser sinergísticas na prevenção da instabilidade da formulação. A pulverização com gases inertes e ou dióxido de carbono para remover oxigênio dissolvido da solução é opcional, porém é preferido quando baixas concentrações de antioxidantes forem preferivelmente usadas, e também preferivelmente quando igualmente baixas concentrações de BH4 e antioxidantes forem 10 empregadas. Estabilização de BH4 em solução aquosa é influenciada pelas interações da concentração de BH4 com o antioxidante e pH. Desse modo, por exemplo, altas concentrações de BH4 requerem menos concentrações de antioxidante do que baixas concentrações de BH4. Além disso, BH4 é mais estável em pH baixo do que em pH alto. Portanto, formulações de pH alto desejadas têm concentrações de antioxidante mais altas, mais preferivel15 mente uma combinação de 2, 3 ou mais antioxidantes, e ainda também preferivelmente pulverização com gás de não oxidação (por exemplo, gás inerte ou dióxido de carbono) seguida por selagem hermeticamente ou quase hermeticamente do recipiente primário em uma atmosfera de um gás de não oxidação (por exemplo, gás inerte ou dióxido de carbono) para também realçar a estabilidade do produto de fármaco.

As faixas de exemplo para formulações líquidas de BH4 são determinadas nas Ta

belas 1 e 2. As soluções formuladas ou compostas são opcionalmente pulverizadas com um gás inerte (por exemplo, argônio ou nitrogênio) ou dióxido de carbono no tanque correspondente e recipientes primários preferivelmente são selados em uma manta de gás inerte ou dióxido de carbono para remover oxigênio do topo livre do recipiente. A formulação pode ser 25 graduada em qualquer volume multiplicando-se as quantidades de componente por um fator de graduação apropriado.

Tabela 1 Exemplos Gerais de faixas de composição em uma formulação de pH bai

xo (por exemplo, pH 4,0)

Componentes Quantidade (mg) % Função Peso/Volume BH4 0,10-100 0,01 -10,00 Substância ativa L-Ciste ína 0,00 - 50,00 0,00 - 5,00 Antioxidante Ácido Ascórbico 0,00 - 500,00 0,00 - 50,00 Antioxidante Metabissulfito de Sódio 0,00 - 300,00 0,00 - 30,00 Antioxidante Acido Cítrico 0,26-19,87 0,03-1,99 Agente de tamponamento Citrato de Sódio, Diidra- 2,57-192,75 0,26-19,27 Agente de tamponamento Ij-. Agua para Injeção qs 1,00 mL 1,00 mL Diluente Tabela 2 - Exemplos gerais de faixas de composição de uma formulação de pH

neutro (por exemplo, pH 7,0)

Componentes Quantidade (mg) % Função Peso/Volume BH4 0,10-100 0,01-10,00 Substância ativa L-Cisteina 0,00 - 50,00 0,00 - 5,00 Antioxidante Ácido Ascórbico 0,00 - 500,00 0,00 - 50,00 Antioxidante Metabissulfito de Sódio 0,00- 300,00 0,00 - 30,00 Antioxidante Fosfato Monobásico Sódico, 0,50-11,02 0,05-1,02 Agente de tamponamento Monoidrato Fosfato Dibásico Sódico 0,44-17,80 0,04-1,78 Agente de tamponamento Agua para Injeção qs 1,00 mL 1,00 mL Diluente Os antioxidantes empregados para formulações líquidas preferivelmente são selecionados a partir de um ou mais com base em tiol (por exemplo, L-cisteína), ácido ascórbico 5 e compostos com base em sulfito (por exemplo, metabissulfito de sódio). Soluções são preferivelmente pulverizadas com gases inertes ou dióxido de carbono para expelir oxigênio das soluções de BH4, e em seguida hermeticamente seladas em ampolas ou fraconetes hermeticamente tampados e garrafas que usam tampas semelhante a da cerveja metálica em uma manta de gases inertes (por exemplo, argônio, nitrogênio) ou gás não inerte tal co10 mo dióxido de carbono para manter os gases pulverizados nos topos livres do recipiente do escapamento. Formulações líquidas orais contêm preferivelmente adicionalmente adoçantes e flavorizantes para melhorar a palatabilidade das formulações.

Em uma modalidade, como uma forma de dosagem líquida, BH4 é estabilizada por antioxidantes e/ou por pulverização com gase de não oxidação, preferivelmente esteriliza15 dos, tais como gases inertes (por exemplo, nitrogênio, argônio, hélio, etc.) e/ou um gás não inerte tal como, dióxido de carbono para remover oxigênio molecular da formulação. O produto é preferivelmente enchido sob uma manta de gases inertes para minimizar ou prevenir oxigênio molecular da redissolução na formulação. O líquido é enchido em um recipiente (por exemplo, frasconetes, ampolas, etc.) e hermeticamente selado para prevenir o oxigênio 20 de entrar no recipiente. Em outra modalidade, como uma forma de dosagem sólida estéril para administração parenteral, uma solução de BH4 é Iiofilizada e reconstituída na clínica antes da administração. Em ainda outra modalidade, a substância de fármaco em pó estéril de BH4 é empacotada diretamente em recipientes estéreis (por exemplo, frasconetes, sacos, garrafas ou ampolas) em uma instalação de enchimento de pó seco estéril. Desse modo, outro aspecto da invenção é uma formulação de pó seca de tetraidrobiopterina (BH4) ou 5 um sal farmaceuticamente aceitável da mesma, para constituição em uma solução aquosa, incluindo uma mistura em pó seca de BH4 ou sal farmaceuticamente aceitável da mesma, um antioxidante, e um tampão de pH.

Composições de Formulação Líquida Oral

As formulações líquidas orais compreendem além dos componentes empregados 10 no líquido geral e formulações intravenosas, adoçantes e agentes flavorizantes. Adoçantes e flavorizantes são adicionados em quantidades suficientes para produzir sabor e doçura aceitáveis. Formulações líquidas orais contêm um ou mais estabilizadores. Opcionalmente, elas contêm preservativos antimicrobianos. Elas são preferencialmente tamponadas em pH baixo por exemplo, pH 1 - 4, e os agentes de tamponamento são selecionados para rivalizar com 15 o agente flavorizante, desse modo realçando as propriedades organolépticas da formulação líquida oral. Os exemplos de tampões preferidos (bases conjugadas e de ácido) são: ácido cítrico, ácido tartárico, ácido málico em combinação com suas bases conjugadas ou formas de sal.

Os exemplos de adoçantes incluem açúcares (por exemplo, sucrose, glicose, sorbitol, manitol, frutose, etc.), adoçantes de não açúcar intensos (por exemplo, aspartame, acessulfame K, ciclamato, sacarina, sucralose, glicirizina, alitame, neotame, neoesperidina DC, taumatina, monellina, e similares).

Em uma outra modalidade, para administrações nasais, oftálmicas e óticas, BH4 é formulada como discutido para forma de dosagem parenteral, e é opcionalmente um produto estéril. Estes formas de dosagem podem ser fornecida em uma apresentação de pacote de kit com vários dias de fornecimento. Cada unidade dentro do kit pode ser compreendida de um fraconete ou ampola e um pulverizador (para forma de dosagem nasal) ou um contagotas (no caso de forma de dosagem oftálmica e ótica). Uma vez que o fraconete ou ampola é aberta, o pulverizador ou conta-gotas é atarraxado no fraconete ou ampola e a tampa anterior é descartada. O produto de forma de dosagem é usado dentro de um período de vencimento prescrito e descartado, e um novo fraconete ou ampola é aberta para uso. Outra modalidade é para encher as soluções em recipientes estéreis disponíveis de uso único de plástico herméticos produzidos por um processo de fabricação de molde-enchimentoselagem. Estes pacotes são abertos e as soluções liberadas usando a rotina desejada de administração, comprimindo-se o líquido contido dentro deles. Estes formas de dosagem são administradas uma vez ao dia e são dadas pelas narinas (produto nasal), ou pelos olhos (oftálmico) ou gotículas são instiladas no canal audível (produto ótico). Com respeito a medicamento empacotado em molde, um pacote de enchimento e selagem, o medicamento é comprimido na rotina de administração.

Em uma outra modalidade, BH4 é administrada por meio de rotinas bucais e transdérmicas usando tiras, emplastros ou películas formuladas ou como produtos tópicos colocados sobre o sítio de liberação. Comprimidos sublinguais são colocados em baixo da língua. Estas formas de dosagem são administradas uma vez por dia e ou são ligadas à membrana do sítio de liberação (rotinas bucal e transdérmica) ou colocadas como um forma sólido ou de semi-dosagem no sítio sublingual. Para prevenir irritação do sítio de liberação, um composto básico tal como carbonato ou bicarbonato de sódio é revestido e misturado com BH4 para prevenir interação com BH4 que o tornaria instável. Alternativamente, o composto básico é adicionado logo antes do uso para elevar o pH de BH4, que é bastante baixo. Adicionando o excipiente básico na momento de fabricação sem revestir as partículas alcalinas para prevenir a interação com BH4, conduzirá a instabilidade de BH4. Outra modalidade é revestir um comprimido sublingual de núcleo de BH4 com uma solução de revestimento que contém uma substância básica ou alcalina. No compartimento sublingual, o composto básico dissolve primeiro, e interage com BH4 para elevar o pH do meio.

Empacotamento de Recipiente Primário para Formulações Líquidas de BH4

Os recipientes de empacotamento primários para formulações líquidas de BH4 são preferivelmente impermeáveis ao oxigênio, dióxido de carbono, nitrogênio e gases inertes. 20 Depois do enchimento de formulações líquidas pulverizadas de BH4 no recipiente primário, preferivelmente sob uma manta de nitrogênio, os recipientes são preferivelmente hermeticamente selados para manter o gás de pulverização no líquido e topo livre do recipiente e previnir a perda do gás de pulverização e ingresso de oxigênio no recipiente.

Os recipientes primários preferidos são ampolas hermeticamente seladas bem co25 mo garrafas e fraconetes hermeticamente selados com tampa metálica, tal como aqueles empregados na selagem de garrafas de refrigerante e cerveja. Durante o uso, as ampolas são abertas por corte e usadas dentro de algumas horas, por exemplo, cerca de 12 horas. As ampolas podem ser usadas para produtos intravenoso e estéreis para injeções. Os líquidos injetáveis estéreis e produtos Iiofilizados podem da mesma forma ser empacotados em 30 fraconetes selados por fechamento de borracha que são protegidos com tampa de alumínio plissada. Os antioxidantes nas formulações protegem o líquido e produtos Iiofilizados da perda imperceptivelmente lenta de gás pulverizado ou ingresso de oxigênio no fraconete para a vida de prateleira do produto.

As formulações líquidas de BH4 enchidas em garrafas ou fraconetes para uso oral, oftálmico ou ótico preferivelmente são protegidas hermeticamente com uma tampa metálica de bebida ou uma rolha de borracha protegida com selo de alumínio plissado. As estrias das garrafas ou fraconetes podem ser sulcadas para aceitar uma tampa de rosca. Quando o selo hermético for removido, é substituído com um tampa de rosca com ou sem um contagotas. A presença de antioxidantes na formulação pode permitir a formulação tampada por rosca ser estável para uso durante pelo menos duas semanas, por exemplo, depois que o selo hermético for quebrado.

1. Síntese de tetraidrobiopterina

Uma variedade de métodos é conhecida na arte por síntese de tetraidrobiopterinas, precursores, derivados e análogos. Patente U.S Nos. 5.698.408; 2.601.215; 3.505.329; 4.540.783; 4.550.109; 4.587.340; 4.595.752; 4.649.197; 4.665.182; 4.701.455; 4.713.454; 4.937.342; 5.037.981; 5.198.547; 5.350.851; 5.401.844; 5.698.408. Pedido Canadense CA 10 2420374, Pedido Europeu nos. EP 079 574, EP 191 335 e publicações de patente Japonesa Suntory JP 4-082888, JP 59-021685 e JP 9-157270, bem como, Sugimoto e Matsuura, Buli. Chem. Soc. Japan, 48(12):3767-3768 (1975), Sugimoto e Matsuura, Buli. Chem. Soc. Japan, 52(1):181-183 (1979), Matsuura e outro, Chem. Lett. (Japan), 735-738 (1984), Matsuura e outro, Heterocicles, Vol. 23, No. 12, 3115-3120, 1985 e Whiteley e outro, Anal Biochem. 15 137(2):394-6 (1984) (cada qual aqui incorporado por referência) cada qual descreve métodos de preparar diidrobiopterinas, BH4 e derivados dos mesmos que podem ser usados como composições para a presente invenção.

Publicação lnt'l No. W02005049614, Patente U.S. No. 4.540.783, Patente Japonesa No. 59-021685, Schircks e outro, Helv. Chim. Acta, 60: 211 (1977), Sugimoto e outro, 20 Buli. Chem. Soc. Jp, 52(1):181 (1979), Sugimoto e outro, Buli. Chem. Soc. Jp, 48(12):3767 (1975), Visontini e outro, Helv. Chim. Acta, 52:1225 (1969) e Matsuura e outro, Chem. Lett., p 735 (1984), aqui incorporados por referência em suas totalidades, descrevem métodos de sintetizar BH4.

II. Formas Cristalinas de sal de cloridrato de 6R-tetraidrobiopterina Dicloridrato de (6R)-L-eritro-tetraidrobiopterina existe em formas cristalinas diferen

tes, incluindo formas polimórficas e solvatos, alguns dos quais são mais estáveis que outros.

Formas Polimorfo de Cristal de Sal de Dicloridrato de (6R) L-Tetraidrobiopterina

Forma B de Polimorfo

O polimorfo de cristal que foi constatado ser o mais estável, é chamado aqui como “forma B” ou alternativamente como “polimorfo B”. Resultados obtidos durante investigação e desenvolvimento de dicloridrato de (6R)-L-eritro-tetraidrobiopterina revelou que há que vários sólidos cristalinos conhecidos que foram preparados, porém nenhum reconheceu o polimorfismo e seu efeito na estabilidade dos cristais de BH4.

O polimorfo B é um anidrato ligeiramente higroscópico com a estabilidade termodinâmica mais alta acima de cerca de 20°C. Além disso, a forma B pode ser processada facilmente e manuseada devido a sua estabilidade térmica, possibilidade para preparação por condições alvejadas, sua morfologia adequada e tamanho de partícula. O ponto de fusão está próximo a 260°C (AHf >140 J/g), porém nenhum ponto de fusão claro pode ser detectado devido a decomposição antes e durante a fusão. Estas propriedades excelentes produzem a forma B de polimorfo especialmente possível para aplicação farmacêutica, que é preparada em temperaturas elevadas. O polimorfo B pode ser obtido como um pó fino com um tamanho de partícula que pode variar de 0,2 /ym a 500 //m.

A forma B exibe um padrão de difração de pó de raios X, expresso em valores d (Á) em: 8,7 (vs), 6,9 (w), 5,90 (vw), 5,63 (m), 5,07 (m), 4,76 (m), 4,40 (m), 4,15 (w), 4,00 (s), 3,95 (m), 3,52 (m), 3,44 (w), 3,32 (m), 3,23 (s), 3,17 (w), 3,11 (vs), 3,06 (w), 2,99 (w), 2,96 (w), 2,94 (m), 2,87 (w), 2,84 (s), 2,82 (m), 2,69 (w), 2,59 (w), 2,44 (w). A figura 1 é um gráfico 10 do padrão de difração de raios X característico exibido pela forma B de dicloridrato de (6R)L-eritro-tetraidrobiopterina.

Quando aqui usado, as seguintes abreviações entre parênteses significa: (vs) = intensidade muito forte; (s) = intensidade forte; (m) = intensidade média; (w) = intensidade fraca; e (vw) = intensidade muito fraca. Um padrão de difração de pó de raios X característico é exibido na Figura 1.

Foi constatado que outros polimorfos de BH4 têm uma substância química satisfatória e estabilidade física para um manuseio seguro durante a fabricação e formulação, bem como fornecer uma estabilidade de armazenamento alta em sua forma pura ou em formulações. Além disso, foi constatado que a forma B, e outros polimorfos de BH4 podem ser pre20 parados em quantidades muito grandes (por exemplo, escala de 100 kilo) e armazenados durante um período prolongado de tempo.

Todas as formas de cristal (polimorfos, hídratos e solvatos), incluindo forma de cristal B, podem ser usadas para a preparação do polimorfo B mais estável. O polimorfo B pode ser obtido por equilíbrio de fase de suspensões de formas amorfas ou outras do que a forma B de 25 polimorfo, tal como polimorfo A, em solventes polares e não aquosos adequados. Desse modo, as preparações farmacêuticas aqui descritas referem-se a uma preparação de forma B de polimorfo de dicloridrato de (6R)-L-eritro-tetraidrobiopterina.

Outras formas de BH4 podem ser convertidas para a forma B, dispersando-se a outra forma de BH4 em um solvente em temperatura ambiente, agitando a suspensão em tem30 peraturas ambientes durante um tempo suficiente para produzir a forma B de polimorfo, por conseguinte isolando a forma cristalina B e removendo o solvente da forma isolada B. Temperaturas ambientes, quando aqui usadas, significam temperaturas em uma faixa de O0C a 60°C, preferivelmente 15°C a 40°C. Atemperatura aplicada pode ser mudada durante o tratamento e agitação diminuindo-se a temperatura etapa a etapa ou continuamente. Solventes 35 adequados para a conversão de outras formas para a formar B incluem mas não são limitados a, metanol, etanol, isopropanol, outros C3- e C4-álcoóis, ácido acético, acetonitrila, tetraidrofurano, éter meti-t-butílico, 1,4-dioxano, acetato de etila, acetato de isopropila, outros C3-C6-acetatos, metil etil cetona e outros metil-C3-C5 alquil-cetonas. O tempo para completar o equilíbrio de fase pode ser até 30 horas e preferivelmente até 20 horas ou menos de 20 horas.

O polimorfo B pode ser da mesma forma obtido por cristalização de misturas de solvente, que contêm até cerca de 5% de água, especialmente de misturas de etanol, ácido acético e água. Foi constatado que a forma B de polimorfo de dicloridrato de (6R)-L-eritrotetraidrobiopterina pode ser preparada por dissolução, opcionalmente em temperaturas elevadas, preferivelmente de uma forma de energia menor de sólido do que a forma B ou de forma B de dicloridrato de (6R)-L-eritro-tetraidrobiopterina em uma mistura de solvente que compreende etanol, ácido acético e água, adição de sementes à solução, resfriamento da suspensão obtida e isolamento dos cristais formados. A dissolução pode ser realizada em temperatura ambiente ou até 70°C, preferivelmente até 50°C. Pode ser usada a mistura de solvente final para dissolução ou o material de partida pode ser dissolvido primeiro em água e os outros solventes podem então ser adicionados ambos ou um depois do outro solvente. A composição da mistura de solvente pode compreender uma relação de volume de água:ácido acético:tetraidrofurano de 1:3:2 a 1:9:4 e preferivelmente 1:5:4. A solução é preferivelmente agitada. O resfriamento pode significar temperaturas até -40°C a 0°C, preferivelmente até 10°C a 30°C. As sementes adequadas são forma B de polimorfo de outra batelada ou cristais que têm uma morfologia similar ou idêntica. Depois do isolamento, a forma de cristal B pode ser lavada com um não solvente tal como, acetona ou tetraidrofurano, e pode ser secada de maneira habitual.

O polimorfo B pode ser da mesma forma obtido por cristalização de soluções aquosas através da adição de não solventes tais como, metanol, etanol e ácido acético. O procedimento de cristalização e isolamento pode ser realizado vantajosamente em temperatura ambiente sem resfriar a solução. Este processo é portanto muito adequado para ser realizado em uma escala industrial.

Em uma modalidade das composições e métodos aqui descrita, uma composição incluindo a forma B de polimorfo de dicloridrato de (6R)-L-eritro-tetraidrobiopterina é preparada por dissolução de uma forma sólida diferente da forma B ou da forma B de dicloridrato de (6R)-L-eritro-tetraidrobiopterina em água em temperaturas ambientes, adicionando um não solvente em uma quantidade suficiente para formar uma suspensão, opcionalmente agitando a suspensão durante um certo tempo, e depois disso isolamento dos cristais formados. A composição é também modificada em uma composição farmacêutica como descrito abaixo.

A concentração de dicloridrato de (6R)-L-eritro-tetraidrobiopterina na solução aquosa pode ser de 10 a 80 por cento em peso, mais preferivelmente de 20 a 60 por cento em peso, por referência à solução. Não solventes preferidos (isto é, solventes úteis na preparação de suspensões de BH4) são metanol, etanol e ácido acético. O não solvente pode ser adicionado à solução aquosa. Mais preferivelmente, a solução aquosa é adicionada ao não solvente. O tempo de agitação depois da formação da suspensão pode ser até 30 horas e preferivelmente até 20 horas ou menos de 20 horas. O isolamento por filtração e secagem são realizados de maneira conhecida como descrito acima.

A forma B de polimorfo é uma forma cristalina muito estável, que pode ser facilmente filtrada, secada e moída em tamanhos de partícula desejados para formulações farmacêuticas. Estas propriedades excelentes produzem a forma B de polimorfo especialmente possível para aplicação farmacêutica.

Forma de Polimorfo A

Foi constatado que outro polimorfo de cristal de dicloridrato de (6R)-L-eritrotetraidrobiopterina é uma forma preferida estável de BH4 para uso em uma preparação farmacêutica aqui descrita, que será referida aqui como “forma A” ou “polimorfo A”. O polimorfo A é ligeiramente higroscópico e adsorve água em um teor de cerca de 3 por cento em peso, 15 que é libertado continuamente entre 50°C e 200°C, quando aquecido em uma taxa de 10°C/minuto. O polimorfo A é um anidrato higroscópico, que é uma forma meta-estável com respeito a forma B; entretanto, é estável durante vários meses em condições ambientes se mantido em um recipiente firmemente selado. A forma A é especialmente adequada como intermediário e material de partida para produzir formas de polimorfo estáveis. A forma A de 20 polimorfo pode ser preparada como um pó sólido com faixa de tamanho de partícula médio desejada, que está variando tipicamente de 1 //m a cerca de 500 μχη.

O polimorfo A que exibe um padrão de difração de pó de raios X característico com picos característicos expressos em valores d (Á) de: 15,5 (vs.), 12,0 (m), 6,7 (m), 6,5 (m), 6,3 (w), 6,1 (w), 5,96 (w), 5,49 (m), 4,89 (m), 3,79 (m), 3,70 (s), 3,48 (m), 3,45 (m), 3,33 (s), 25 3,26 (s), 3,22 (m), 3,18 (m), 3,08 (m), 3,02 (w), 2,95 (w), 2,87 (m), 2,79 (w), 2,70 (w). A Figura 2 é um gráfico do padrão de difração de raios X característico exibido pela forma A de dicloridrato de (6R)-L-eritro-tetraidrobiopterina. O polimorfo A exibições uma faixa de espectro Raman característica, expressa em números de onda (cm-1) em: 2934 (w), 2880 (w), 1692 (s), 1683 (m), 1577 (w), 1462 (m), 1360 (w), 1237 (w), 1108 (w), 1005 (vw), 881 (vw), 30 813 (vw), 717 (m), 687 (m), 673 (m), 659 (m), 550 (w), 530 (w), 492 (m), 371 (m), 258 (w), 207 (w), 101 (s), 87 (s) cm-1.

A forma A de polimorfo pode ser obtida por secagem por congelamento ou remoção de água de soluções de dicloridrato de (6R)-L-eritro-tetraidrobiopterina em água. A forma A de polimorfo de dicloridrato de (6R)-L-eritro-tetraidrobiopterína pode ser preparada dissol35 vendo-se dicloridrato de (6R)-L-eritro-tetraidrobiopterina em temperaturas ambientes em água, (1) resfriando-se a solução em baixas temperaturas para solidificar a solução, e removendo-se água sob pressão reduzida, ou (2) removendo-se água da referida solução aquosa.

A forma A de cristal pode ser isolada por filtração, e em seguida secada para evaporar água absorvida do produto. As condições de secagem e métodos são conhecidos, e secagem do produto isolado ou remoção de água de acordo com a variante (2) aqui descri5 ta, pode ser realizada aplicando temperaturas elevadas, por exemplo até 80°C, preferivelmente na faixa de 30°C a 80°C, sob vácuo ou temperaturas elevadas e vácuo. Antes do isolamento de um precipitado obtido na variante (2), a suspensão pode ser agitada durante um certo tempo para equilíbrio de fase. A concentração de dicloridrato de (6R)-L-eritrotetraidrobiopterina na solução aquosa pode ser de 5 a 40 por cento em peso, por referência 10 à solução.

Um rápido resfriamento é preferido para obter soluções sólidas como material de partida. Uma pressão reduzida é aplicada até que o solvente seja completamente removido. Secagem por congelamento é uma tecnologia bem conhecida na arte. O tempo para completar a remoção do solvente é dependente do vácuo aplicado, que pode ser de 0,01 a 1 mbar, do solvente usado e da temperatura de congelamento.

A forma A de polimorfo é estável em temperatura ambiente ou abaixo da temperatura ambiente sob condições substancialmente livres de água, que é demonstrada com testes de equilíbrio de fase de suspensões em tetraidrofurano ou éter butil metílico terciário agitados durante cinco dias e 18 horas respectivamente sob nitrogênio em temperatura ambiente. Filtração e secagem a ar em temperatura ambiente produz forma A de polimorfo inalterada.

Forma F de Polimorfo

Foi constatado que outro polimorfo de cristal de dicloridrato de (6R)-L-eritrotetraidrobiopterina é uma forma preferida estável de BH4 para uso em uma preparação farmacêutica aqui descrita, que será referida aqui como “forma F” ou “polimorfo F”. O polimorfo 25 Fé ligeiramente higroscópico e adsorve água em um teor de cerca de 3 por cento em peso, que é libertado continuamente entre 50°C e 200°C, quando aquecido a uma taxa de 10°C/minuto. O polimorfo F é uma forma meta-estável e um anidrato higroscópico, que são mais estáveis do que a forma A em temperaturas ambientes mais baixas e menos estável do que a forma B em temperaturas mais altas, e a forma F é especialmente adequada como 30 intermediário e material de partida, para produzir formas de polimorfo estáveis. A forma de polimorfo F pode ser preparada como um pó sólido com faixa de tamanho de partícula médio desejada, que está variando tipicamente de 1 μηη a cerca de 500 /vm.

O polimorfo F exibe um padrão de difração de pó de raios X característico com picos característicos expressos em valores d (Á) em: 17,1 (vs.), 12,1 (w), 8,6 (w), 7,0 (w), 6,5 (w), 6,4 (w), 5,92 (w), 5,72 (w), 5,11 (w), 4,92 (m), 4,86 (w), 4,68 (m), 4,41 (w), 4,12 (w), 3,88 (w), 3,83 (w), 3,70 (m), 3,64 (w), 3,55 (m), 3,49 (s), 3,46 (vs), 3,39 (s), 3,33 (m), 3,31 (m), 3,27 (m), 3,21 (m), 3,19 (m), 3,09 (m), 3,02 (m) e 2,96 (m). A Figura 3 é um gráfico do padrão de difração de raios X característico exibido pela forma F de dicloridrato de (6R)-Leritro-tetra id robiopterina.

O polimorfo F pode ser obtido por equilíbrio de fase de suspensões de forma A de polimorfo em solventes polares e não aquosos adequados, que quase não dissolvem as referidas formas energia mais baixas, especialmente álcoóis tais como metanol, etanol, propanol e isopropanol. A forma de polimorfo F de dicloridrato de (6R)-L-eritrotetraidrobiopterina pode ser preparada da mesma forma dispersando-se partículas de forma sólida A de dicloridrato de (6R)-L-eritro-tetraidrobiopterina em um solvente não aquoso que quase não dissolve o referido dicloridrato de (6R)-L-eritro-tetraidrobiopterina abaixo da temperatura ambiente, agitando a suspensão nas referidas temperaturas durante um tempo suficiente para produzir a forma de polimorfo F, depois disso isolando a forma de cristal F e removendo o solvente da forma isolada F. Remoção de solvente e secagem podem ser realizadas sob ar, ar seco ou um gás de proteção seco tais como nitrogênio ou gases nobres e em ou abaixo da temperatura ambiente, por exemplo até 0°C. A temperatura durante equilíbrio de fase é preferivelmente de 5 a 15°C e preferivelmente cerca de 10°C.

Forma J de Polimorfo

Foi constatado que outro polimorfo de cristal de dicloridrato de (6R)-L-eritrotetraidrobiopterina é uma forma preferida estável de BH4 para uso em uma preparação farmacêutica aqui descrita, que será referida aqui como “forma J” ou “polimorfo J”. O polimorfo 20 J é ligeiramente higroscópico e adsorve água quando manuseado em umidade do ar. O polimorfo J é uma forma meta-estável e um anidrato higroscópico, e pode ser transformado outra vez na forma E descrita abaixo, da qual é obtido em exposição a condições de umidade relativa alta, tal como acima de 75% de umidade relativa. A forma J é especialmente adequada como intermediário e material de partida, para produzir formas de polimorfo está25 veis. A forma de polimorfo J pode ser preparada como um pó sólido com faixa de tamanho de partícula médio desejada, que está variando tipicamente de 1 /vm a cerca de 500 //m.

A forma J exibe um padrão de difração de pó de raios X característico com picos característicos expressos em valores d (Á) em: 14,6 (m), 6,6 (w), 6,4 (w), 5,47 (w), 4,84 (w), 3,29 (vs) e 3,21 (vs). A Figura 4 é um gráfico do padrão de difração de raios X característico exibido pela forma J de dicloridrato de (6R)-L-eritro-tetraidrobiopterina.

O polimorfo J pode ser obtido por desidratação da forma E em temperaturas moderadas sob vácuo. Em particular, a forma de polimorfo J de dicloridrato de (6R)-L-eritrotetraidrobiopterina pode ser preparada pegando-se a forma E e removendo a água da forma E, tratando-se a forma E em um secador a vácuo para obter a forma J em temperaturas mo35 deradas, que podem significar uma temperatura na faixa de 25 a 70°C, e preferivelmente 30 a 50°C.

Forma K de Polimorfo Foi constatado que outro polimorfo de cristal de dicloridrato de (6R)-L-eritrotetraidrobiopterina é uma forma preferida estável de BH4 para uso em uma preparação farmacêutica aqui descrita, que será referida aqui como “forma K” ou “polimorfo K”. O polimorfo K é ligeiramente higroscópico e adsorve água em um teor de cerca de 2,0 por cento em pe5 so, que é libertado continuamente entre 50°C e 100°C, quando aquecido a uma taxa de 10°C/minuto. O polimorfo K é uma forma meta-estável e um anidrato higroscópico que são menos estáveis do que a forma B em temperaturas mais altas, e a forma K é especialmente adequada como intermediário e material de partida, para produzir formas de polimorfo estáveis, em particular forma B. A forma de polimorfo K pode ser preparada como um pó sólido 10 com faixa de tamanho de partícula médio desejada, que está variando tipicamente de 1 /vm a cerca de 500 //m.

A forma K exibe um padrão de difração de pó de raios X característico com picos característicos expressos em valores d (Á) em: 14,0 (s), 9,4 (w), 6,6 (w), 6,4 (w), 6,3 (w), 6,1 (w), 6,0 (w), 5,66 (w), 5,33 (w), 5,13 (vw), 4,73 (m), 4,64 (m), 4,48 (w), 4,32 (vw), 4,22 (w), 15 4,08 (w), 3,88 (w), 3,79 (w), 3,54 (m), 3,49 (vs), 3,39 (m), 3,33 (vs), 3,13 (s), 3,10 (m), 3,05 (m), 3,01 (m), 2,99 (m) e 2,90 (m). A Figura 5 é um gráfico do padrão de difração de raios X característico exibido pela forma K de dicloridrato de (6R)-L-eritro-tetraidrobiopterina. O polimorfo K pode ser obtido por cristalização das misturas de solventes polares que contêm quantidades pequenas de água, e na presença de quantidades pequenas de ácido ascórbi20 co. Os solventes para a mistura de solvente podem ser selecionados a partir de ácido acético e um álcool tal como metanol, etanol, n - ou isopropanol. Em particular, a forma de polimorfo K de dicloridrato de (6R)-L-eritro-tetraidrobiopterina pode ser preparada dissolvendose dicloridrato de (6R)-L-eritro-tetraidrobiopterina em uma mistura de ácido acético e um álcool ou tetraidrofurano que contêm quantidades pequenas de água e uma quantidade pe25 quena de ácido ascórbico em temperaturas elevadas, diminuindo a temperatura abaixo da temperatura ambiente para cristalizar o referido dicloridrato, isolando o precipitado e secando o precipitado isolado em temperatura elevada opcionalmente sob vácuo. Álcoóis adequados são por exemplo metanol, etanol, propanol e isopropanol, dos quais etanol é preferido. A relação de ácido acético para álcool ou tetraidrofurano pode ser de 2:1 a 1:2 e preferi30 velmente cerca de 1:1. A dissolução de dicloridrato de (6R)-L-eritro-tetraidrobiopterina pode ser realizada na presença de um teor de água mais alto e a maior parte da mistura antisolvente pode ser adicionada para obter precipitação completa. A quantidade de água na composição final pode ser de 0,5 a 5 por cento em peso, e a quantidade de ácido ascórbico pode ser de 0,01 a 0,5 por cento em peso, ambos por referência à mistura de solvente. A 35 temperatura para dissolução pode estar na faixa de 30 a 100 e preferivelmente 35 a 70°C, e a temperatura de secagem pode estar na faixa de 30 a 50°C. O precipitado pode ser lavado com um álcool tal como, etanol depois do isolamento, por exemplo, filtração. O polimorfo K pode ser facilmente convertido na forma B mais estável por equilíbrio de fase em por exemplo, isopropanol e opcionalmente semeando com cristais de forma B em temperatura ambiente acima, tais como temperaturas de 30 a 40 °C.

Formas de Hidrato de Sai de Dicloridrato de (6R) L-Tetraidrobiopterina Como também descrito acima, foi constatado que dicloridrato de (6R)-L-eritro

tetraidrobiopterina existe como vários hidratos cristalinos, que serão descritos e serão definidos aqui como formas C, D, E, H e O. Estas formas de hidrato são úteis como uma forma estável de BH4 para as preparações farmacêuticas aqui descritas, e na preparação de composições que incluem polimorfos de cristal estáveis de BH4.

FormaCdeHidrato

Foi constatado que uma forma de cristal de hidrato de dicloridrato de (6R)-L-eritrotetraidrobiopterina é uma forma preferida estável de BH4 para uso em uma preparação farmacêutica aqui descrita, que será referida aqui como “forma C” ou “hidrato C”. A forma C de hidratoé ligeiramente higroscópica e tem um teor de água de aproximadamente 5,5 por cen15 to em peso, que indica que a forma C é um monoidrato. O hidrato C tem um ponto de fusão próximo de 94°C (AHf é cerca de 31 J/g), e a forma C de hidratoé especialmente adequada como intermediário e material de partida para produzir formas polimórficas estáveis. A forma de polimorfo C pode ser preparada como um pó sólido com faixa de tamanho de partícula médio desejada que está variando tipicamente de 1 μιη a cerca de 500 μνη.

A forma C exibe um padrão de difração de pó de raios X característico com picos

característicos expressos em valores d (Á) em: 18,2 (m), 15,4 (w), 13,9 (vs), 10,4 (w), 9,6 (w), 9,1 (w), 8,8 (m), 8,2 (w), 8,0 (w), 6,8 (m), 6,5 (w), 6,05 (m), 5,77 (w), 5,64 (w), 5,44 (w), 5,19 (w), 4,89 (w), 4,76 (w), 4,70 (w), 4,41 (w), 4,25 (m), 4,00 (m), 3,88 (m), 3,80 (m), 3,59 (s), 3,50 (m), 3,44 (m), 3,37 (m), 3,26 (s), 3,19 (vs), 3,17 (s), 3,11 (m), 3,06 (m), 3,02 (m), 25 2,97 (vs), 2,93 (m), 2,89 (m), 2,83 (m) e 2,43 (m). A Figura 6 é um gráfico do padrão de difração de raios X característico exibido pela forma C de hidratode dicloridrato de (6R)-Leritro-tetraidrobiopterina.

A forma C de hidratopode ser obtida por equilíbrio de fase em temperaturas ambientes de uma forma de polimorfo tal como suspensão de polimorfo B em um não solvente, 30 que contém água em uma quantidade de preferivelmente cerca de 5 por cento em peso por referência ao solvente. A forma C de hidratode dicloridrato d (6R)-L-eritro-tetraidrobiopterina pode ser preparada suspendendo-se dicloridrato de (6R)-L-eritro-tetraidrobiopterina em um não solvente tal como, heptano, C1-C4-álcoóis tal como metanol, etanol, 1 ou 2-propanol, acetato, tal como acetato de etila, acetonitrila, ácido acético ou éteres tal como, teraidrofura35 no, dioxano, éter butil metílico terciário, ou misturas binárias ou ternárias de tais não solventes, em que água suficiente é adicionada para formar um monoidrato, e agitando-se a suspensão em ou abaixo das temperaturas ambientes (por exemplo, 0 a 30 °C) durante um tempo suficiente para formar um monoidrato. Água suficiente pode significar de 1 a 10 e preferivelmente de 3 a 8 por cento em peso de água, por referência à quantidade de solvente. Os sólidos podem ser filtrados e secados em ar em temperatura ambiente acima. O sólido pode absorver um pouco de água e portanto pode possuir um teor de água mais alto do 5 que o valor teórico de 5,5 por cento em peso. A forma C de hidratoé instável com respeito às formas D e B, e facilmente convertida na forma B de polimorfo em temperaturas de cerca de 40°C em ar e umidade relativa mais baixa. A forma C pode ser transformada no hidrato D mais estável por equilíbrio de suspensão em temperatura ambiente.

Forma D de Hidrato

Foi constatado que outra forma de cristal de hidrato de dicloridrato de (6R)-L-eritro

tetraidrobiopterina é uma forma preferida estável de BH4 para uso em uma preparação farmacêutica aqui descrita, que será referida aqui como “forma D” ou “hidrato D”. A forma D de hidrato é ligeiramente higroscópica e pode ter um teor de água de aproximadamente 5,0 a 7,0 por cento em peso, que sugere que a forma D é um monoidrato. O hidrato D tem um 15 ponto de fusão próximo a 153°C (AHf é cerca de 111 J/g), e é de mais estável estabilidade mais estável mais alta do que a forma C, e é ainda estável quando exposto à umidade do ar em temperatura ambiente. A forma D de hidrato pode ser portanto empregada para preparar formulações ou como intermediário e material de partida, para produzir formas de polimorfo estáveis. A forma D de polimorfo pode ser preparada como um pó sólido com faixa de tama20 nho de partícula médio desejada que está variando tipicamente de 1 /ym a cerca de 500 μη\.

A forma D exibe um padrão de difração de pó de raios X característico com picos característicos expressos em valores d (Á) em: 8,6 (s), 6,8 (w), 5,56 (m), 4,99 (m), 4,67 (s), 4,32 (m), 3,93 (vs), 3,88 (w), 3,64 (w), 3,41 (w), 3,25 (w), 3,17 (m), 3,05 (s), 2,94 (w), 2,92 (w), 2,88 (m), 2,85 (w), 2,80 (w), 2,79 (m), 2,68 (w), 2,65 (w), 2,52 (vw), 2,35 (w), 2,34 (w), 25 2,30 (w) e 2,29 (w). A Figura 7 é um gráfico do padrão de difração de raios X característico exibido pela forma D de hidrato de dicloridrato de (6R)-L-eritro-tetraidrobiopterina.

A forma D de hidrato pode ser obtida adicionando-se em torno da temperatura ambiente, soluções aquosas concentradas de dicloridrato de (6R)-L-eritro-tetraidrobiopterina em um excesso de um não solvente tal como hexano, heptano, diclorometano, 1 ou 2- 30 propanol, acetona, acetato de etila, acetonitrila, ácido acético ou éteres, tais como teraidrofurano, dioxano, éter butil metílico terciário, ou misturas de tais não solventes, e agitando-se a suspensão em temperaturas ambientes. O sólido cristalino pode ser filtrado e em seguida secado sob nitrogênio seco em temperaturas ambientes. Um não solvente preferido é isopropanol. A adição da solução aquosa pode ser realizada gota a gota para evitar uma preci35 pitação súbita. A forma D de hidrato de dicloridrato de (6R)-L-eritro-tetraidrobiopterina pode ser preparada adicionando-se em torno da temperatura ambiente, uma solução aquosa concentrada de dicloridrato de (6R)-L-eritro-tetraidrobiopterina em um excesso de um não solvente e agitando-se a suspensão em temperaturas ambientes. O excesso de não solvente pode significar uma relação de aquoso para o não solvente de 1:10 a 1:1000. A forma D contém um pequeno excesso de água, relacionado ao monoidrato, e acredita-se que é água absorvida devido ao natureza ligeiramente higroscópica deste hidrato cristalino. A forma D 5 de hidrato é julgada ser a mais estável sob os hidratos conhecidos em temperaturas ambientes e uma umidade relativa de menos de 70%. A forma D de hidrato pode ser usada para formulações preparadas sob condições, onde este hidrato é estável. A temperatura ambiente pode significar 20 a 30°C.

Forma E de Hidrato

Foi constatado que outra forma de cristal de hidrato de dicloridrato de (6R)-L-eritro

tetraidrobiopterina é uma forma preferida estável de BH4 para uso em uma preparação farmacêutica aqui descrita, que será referida aqui como “forma E” ou “hidrato E”. A forma de hidrato E tem um teor de água de aproximadamente 10 a 14 por cento em peso, que sugere que a forma E é um diidrato. O hidrato E é formado em temperaturas abaixo da temperatura 15 ambiente. A forma de hidrato E é especialmente adequada como intermediário e material de partida, para produzir formas de polimorfo estáveis. É especialmente adequada para produzir a forma J livre de água ao secar sob nitrogênio ou opcionalmente sob vácuo. A forma E é não higroscópica e estável sob umidades relativas bastante altas, isto é, em umidades relativas acima de cerca de 60% e até cerca de 85%. A forma de polimorfo E pode ser prepara20 da como um pó sólido com faixa de tamanho de partícula médio desejada, que está variando tipicamente de 1 //m a cerca de 500 //m.

A forma E exibe um padrão de difração de pó de raios X característico com picos característicos expressos em valores d (Á) em: 15,4 (s), 6,6 (w), 6,5 (w), 5,95 (vw), 5,61 (vw), 5,48 (w), 5,24 (w), 4,87 (w), 4,50 (vw), 4,27 (w), 3,94 (w), 3,78 (w), 3,69 (m), 3,60 (w), 25 3,33 (s), 3,26 (vs), 3,16 (w), 3,08 (m), 2,98 (w), 2,95 (m), 2,91 (w), 2,87 (m), 2,79 (w), 2,74 (w), 2,69 (w) e 2,62 (w). A Figura 8 é um gráfico do padrão de difração de raios X característico exibido pela forma de hidrato E de dicloridrato de (6R)-L-eritro-tetraidrobiopterina.

Forma E de hidrato pode ser obtido adicionando-se soluções aquosas concentradas de dicloridrato de (6R)-L-eritro-tetraidrobiopterina em um excesso de um não solvente resfri30 ado em temperaturas de cerca de 10 a -10°C e preferivelmente entre 0 a 10°C e agitando a suspensão nas referidas temperaturas. O sólido cristalino pode ser filtrado e em seguida secado sob nitrogênio seco em temperaturas ambientes. Não solventes são, por exemplo, tal como hexano, heptano, diclorometano, 1- ou 2-propanol, acetona, acetato de etila, acetonitrila, ácido acético ou éteres tal como teraidrofurano, dioxano, éter butil metílico terciário 35 ou misturas de tais não solventes. Um não solvente preferido é isopropanol. A adição da solução aquosa pode ser realizada gota a gota para evitar uma precipitação súbita. Forma E de hidrato de dicloridrato de (6R)-L-eritro-tetraidrobiopterina pode ser preparada adicionando-se soluções aquosas concentradas de dicloridrato de (6R)-L-eritro-tetraidrobiopterina em um excesso de um não solvente, que é resfriado em temperaturas de cerca de 10 a -10°C, e agitando a suspensão em temperaturas ambientes. Excesso de não solvente pode significar uma relação de aquoso para o não solvente de 1:10 a 1:1000. Um não solvente preferi5 do é tetraidrofurano. Outro processo de preparação compreende expor forma B de polimorfo em uma atmosfera de ar com uma umidade relativa de 70 a 90%, preferivelmente cerca de 80%. Forma E de hidrato é julgado ser um diidrato, por meio da qual um pouco de água adicional pode ser absorvida. Forma E de polimorfo pode ser transformada em polimorfo J ao secar sob vácuo em temperaturas moderadas, que podem significar entre 20°C e 50°C em 10 pressões entre 0 e 100 mbar. Forma E é especialmente adequada para formulações em formas semi-sólidas por causa de sua estabilidade em umidades relativas altas.

Forma H de Hidrato

Foi constatado que outra forma de cristalina de hidrato de dicloridrato de (6R)-Leritrotetraidrobiopterina é uma forma preferida estável de BH4 para uso em uma preparação 15 farmacêutica descrita aqui, que será referida aqui como "forma H" ou "hidrato H". A forma H de hidrato tem um teor de água de aproximadamente 5,0 a 7,0 por cento em peso, que sugere que forma H é um monoidrato higroscópico. A forma H de hidrato é formada em temperaturas abaixo da temperatura ambiente. Forma H de hidrato é especialmente adequada como material de partida e intermediário para produzir formas polimorfas estáveis. Forma H 20 de polimorfo pode ser preparada como um pó sólido com faixa de tamanho de partícula média desejada que está variando tipicamente de 1 μπι a cerca de 500 μιη.

Forma H exibe um padrão de difração de pó de raios X característico com picos característicos expressos em valores d (Λ) em: 8,6 15,8 (vs), 10,3 (w), 8,0 (w), 6,6 (w), 6,07 (w), 4,81 (w), 4,30 (w), 3,87 (m), 3,60 (m), 3,27 (m), 3,21 (m), 3,13 (w), 3,05 (w), 2,96 (m), 2,89 (m), 2,82 (w), e 2,67 (m). Figura 9 é um gráfico do padrão de difração de raios x característico exibido por forma H de hidrato de dicloridrato de (6R)-L-eritro-tetraidrobiopterina.

Forma H de hidrato pode ser obtida dissolvendo-se em temperaturas ambientes dicloridrato de (6R)-L-eritro-tetraidrobiopterina em uma mistura de ácido acético e água, adicionando em seguida um não solvente para precipitar um sólido cristalino, resfriando a sus30 pensão obtida e agitando a suspensão resfriada durante um certo tempo. O sólido cristalino é filtrado e em seguida secado sob vazio em temperaturas ambientes. Não-solventes são, por exemplo, tal como hexano, heptano, dichlorometano, 1- ou 2-propanol, acetona, acetato de etila, acetonitrila, ácido acético ou éteres tal como tetraidrofurano, dioxano, éter butil metílico terciário, ou misturas de tais não-solventes. Um não solvente preferido é tetraidrofura35 no. Forma H de hidrato de dicloridrato de (6R)-L-eritrotetraidrobiopterina pode ser preparada dissolvendo-se em temperaturas ambientes dicloridrato de (6R)-L-eritro-tetraidrobiopterina em uma mistura de ácido acético e uma quantidade menor que aquela de ácido acético de água, adicionando-se um não solvente e resfriando-se a suspensão obtida em temperaturas na faixa de -10 a 10°C, e preferivelmente -5 a 5°C, e agitando a suspensão na referida temperatura durante um certo tempo. Certo tempo pode significar 1 a 20 horas. A relação de peso de ácido acético para água pode ser de 2:1 a 25:1 e preferivelmente 5:1 a 15:1. A rela5 ção de peso de ácido acético/água para o não solvente pode ser de 1:2 a 1:5. Forma H de hidrato parece ser um monoidrato com um excesso leve de água absorvida devido à natureza higroscópica.

Forma O de Hidrato

Foi constatado que outra forma de cristal de hidrato de dicloridrato de (6R)-L10 eritrotetraidrobiopterina é uma forma preferida estável de BH4 para uso em uma preparação farmacêutica descrita aqui, que será referida aqui como "forma O" ou "hidrato O." A forma O de hidrato é formada em temperaturas próximas em temperatura ambiente. Forma O de hidrato é especialmente adequada como material de partida e intermediário para produzir formas de polimorfo estáveis. Forma O de polimorfo pode ser preparada como um pó sólido 15 com faixa de tamanho de partícula média desejada que está variando tipicamente de 1 μίτι a cerca de 500 μΐη.

Forma O exibe um padrão de difração de pó de raios X característico com picos característicos expressos em valores d (A) em: 15,9 (w), 14,0 (w), 12,0 (w), 8,8 (m), 7,0 (w), 6,5 (w), 6,3 (m), 6,00 (w), 5,75 (w), 5,65 (m), 5,06 (m), 4,98 (m), 4,92 (m), 4,84 (w), 4,77 (w), 20 4,42 (w), 4,33 (w), 4,00 (m), 3,88 (m), 3,78 (w), 3,69 (s), 3,64 (s), 3,52 (vs), 3,49 (s), 3,46 (s), 3,42 (s), 3,32 (m), 3,27 (m), 3,23 (s), 3,18 (s), 3,15 (vs), 3,12 (m), 3,04 (vs), 2,95 (m), 2,81 (s), 2,72 (m), 2,67 (m), e 2,61 (m). Figura 10 é um gráfico do padrão de difração de raios X característico exibido por forma O de hidrato de dicloridrato de (6R)-L-eritrotetraidrobiopterina.

Forma O de hidrato pode ser preparada por exposição de forma F polimórfica em

uma atmosfera de nitrogênio contendo vapor de água com uma umidade relativa resultante de cerca de 52% durante cerca de 24 horas. O fato que forma F, que é um anidrato ligeiramente higroscópico, pode ser usada para preparar forma O sob 52% de umidade relativa sugere que forma O seja um hidrato, que é mais estável que a forma F sob temperatura ambiente e condições de umidade.

Formas de Solvato de Sal de Dicloridrato de (6R) L-Tetraidrobiopterina

Como também descrito abaixo, foi constatado que dicloridrato de (6R)-Leritrotetraidrobiopterina existe como várias formas de solvato cristalinas, que serão descritas e definidas aqui como formas G, I, L, M, e N. Estas formas de solvato são úteis como uma forma estável de BH4 para as preparações farmacêuticas descritas aqui e na preparação de composições que incluem polimorfos de cristal estáveis de BH4.

Forma G de Solvato Foi constatado que uma forma de cristal de solvato de etanol de dicloridrato de (6R)-L-eritrotetraidrobiopterina é uma forma preferida estável de BH4 para uso em uma preparação farmacêutica descrita aqui, que será referida aqui como "forma G" ou "hidrato G". A forma G de solvato de etanol tem um teor de etanol de aproximadamente 8,0 a 12,5 por cen5 to em peso, que sugere que forma G seja um solvato de mono etanol higroscópico. A forma G de solvato é formada em temperaturas abaixo da temperatura ambiente. Forma G é especialmente adequada como material de partida e intermediário para produzir formas de polimorfo estáveis. Forma G de polimorfo pode ser preparada como um pó sólido com uma faixa de tamanho de partícula média desejada que está variando tipicamente de 1 μιτι a cerca 10 de 500 μηη.

Forma G exibe um padrão de difração de pó de raios X característico com picos característicos expressos em valores d (A) em: 14,5 (vs), 10,9 (w), 9,8 (w), 7,0 (w), 6,3 (w), 5,74 (w), 5,24 (vw), 5,04 (vw), 4,79 (w), 4,41 (w), 4,02 (w), 3,86 (w), 3,77 (w), 3,69 (w), 3,63 (m), 3,57 (m), 3,49 (m), 3,41 (m), 3,26 (m), 3,17 (m), 3,07 (m), 2,97 (m), 2,95 (m), 2,87 (w), e 15 2,61 (w). Figura 11 é um gráfico do padrão de difração de raios x característico exibido por forma G de solvato de dicloridrato de (6R)-L-eritro-tetraidrobiopterina.

Forma G de solvato de etanol pode ser obtida por cristalização de dicloridrato de Leritro-tetraidrobiopterina dissolvido em água e adicionando um excesso grande de etanol, agitando a suspensão obtida em ou abaixo das temperaturas ambientes e secando o sólido 20 isolado sob ar ou nitrogênio em cerca da temperatura ambiente. Aqui, um excesso grande de etanol significa uma mistura resultante de etanol e água com menos de 10% de água, preferivelmente cerca de 3 a 6%. Forma G de etanolato de dicloridrato de (6R)-L-eritrotetraidrobiopterina pode ser preparada dissolvendo-se em cerca da temperatura ambiente em temperaturas de 75°C dicloridrato de (6R)-L-eritrotetraidrobiopterina em água ou em uma 25 mistura de água e etanol, resfriando uma solução aquecida em temperatura ambiente e até 5 a 10°C, adicionando opcionalmente etanol em precipitação completa, agitando a suspensão obtida em temperaturas de 20 a 5°C, filtrando o sólido cristalino, branco e secando o sólido sob ar ou um gás de proteção tal como nitrogênio em temperaturas de cerca da temperatura ambiente. O processo pode ser realizado em uma primeira variante dissolvendo 30 dicloridrato de (6R)-L-eritro-tetraidrobiopterina em cerca da temperatura ambiente em uma quantidade mais baixa de água e em seguida adicionando um excesso de etanol e em seguida agitando a suspensão obtida durante um tempo suficiente para equilíbrio de fase. Em uma segunda variante, dicloridrato de (6R)-L-eritro-tetraidrobiopterina podem ser suspensos em etanol, opcionalmente adicionando uma quantidade mais baixa de água, e aquecendo a 35 suspensão e dicloridrato de (6R)-L-eritrotetraidrobiopterina dissoluto, arrefecendo a solução em temperaturas de cerca de 5 a 15°C, adicionando etanol adicional à suspensão e em seguida agitando a suspensão obtida durante um tempo suficiente para equilíbrio de fase. Forma I de Solvato

Foi constatado que uma forma de cristal de solvato de ácido acético de dicloridrato de (6R)-L-eritrotetraidrobiopterina é uma forma preferida estável de BH4 para uso em uma preparação farmacêutica descrita aqui, que será referida aqui como "forma I", ou "hidrato I".

A forma I de solvato de ácido acético tem um teor de ácido acético de aproximadamente 12,7 por cento em peso que sugere que a forma I seja um mono solvato de ácido acético higroscópico. A forma I de solvato é formada em temperaturas abaixo da temperatura ambiente. Forma I de solvato de ácido acético é especialmente adequada como material de partida e intermediário para produzir formas de polimorfo estáveis. Forma I de polimorfo pode 10 ser preparado como um pó sólido com faixa de tamanho de partícula média desejada que está variando tipicamente de 1 μίτι a cerca de 500 μηη.

Forma I exibe um padrão de difração de pó de raios X característico com picos característicos expressos em valores d (Â) em: 14,5 (m), 14,0 (w), 11,0 (w), 7,0 (vw), 6,9 (vw), 6,2 (vw), 5,30 (w), 4,79 (w), 4,44 (w), 4,29 (w), 4,20 (vw), 4,02 (w), 3,84 (w), 3,80 (w), 3,67 15 (vs), 3,61 (m), 3,56 (w), 3,44 (m), 3,27 (w), 3,19 (w), 3,11(s), 3,00 (m), 2,94 (w), 2,87 (w), e 2,80 (w). Figura 12 é um gráfico do padrão de difração de raios x característico exibido por forma I de solvato de dicloridrato de (6R)-L-eritro-tetraidrobiopterina.

Forma I de solvato de ácido acético pode ser obtido por dissolução de dicloridrato de L-eritro-tetraidrobiopterina em uma mistura de ácido acético e água em temperatura ele20 vada, adicionando ácido acético adicional à solução, arrefecendo em uma temperatura de cerca de 10°C, em seguida aquecendo a suspensão formada em cerca de 15°C, e em seguida agitando a suspensão obtida durante um tempo suficiente para equilíbrio de fase, que pode durar até 3 dias. O sólido cristalino é em seguida filtrado e secado sob ar ou um gás de proteção tal como nitrogênio em temperaturas de cerca de temperatura ambiente.

Forma L de Solvato

Foi constatado que uma forma de cristal de hidrato/cristal de etanol de dicloridrato de (6R)-L-eritro-tetraidrobiopterina é uma forma preferida estável de BH4 para uso em uma preparação farmacêutica descrita aqui, que será referida aqui como "forma L" ou "hidrato L". Forma L pode conter 4% mas até 13% de etanol e 0% a cerca de 6% de água. Forma L po30 de ser transformada em forma G quando tratada em etanol em temperaturas de cerca de O0C a 20°C. Além disso, forma L pode ser transformada em forma B quando tratada em um solvente orgânico em temperaturas ambientes (10°C a 60°C). Forma L de polimorfo pode ser preparada como um pó sólido com faixa de tamanho de partícula média desejada que está variando tipicamente de 1 μίτι a cerca de 500 μηη.

Forma L exibe um padrão de difração de pó de raios X característico com picos ca

racterísticos expressos em valores d (Á) em: 14,1 (vs), 10,4 (w), 9,5 (w), 9,0 (vw), 6,9 (w),

6,5 (w), 6,1 (w), 5,75 (w), 5,61 (w), 5,08 (w), 4,71 (w), 3,86 (w), 3,78 (w), 3,46 (m), 3,36 (m), 3,06 (w), 2,90 (w), e 2,82 (w). Figura 13 é um gráfico do padrão de difração de raios x característico exibido por forma L de solvato de dicloridrato de (6R)-L-eritro-tetraidrobiopterina.

Forma L pode ser obtida suspendendo-se a forma E de hidrato em temperatura ambiente em etanol e agitando a suspensão em temperaturas de 0 a 10°C, preferivelmente 5 cerca de 5°C, durante um tempo suficiente para equilíbrio de fase que pode ser de 10 a 20 horas. O sólido cristalino é em seguida filtrado e secado preferivelmente sob pressão reduzida a 30°C ou sob nitrogênio. Análise por TG-FTIR sugere que a forma L possa conter quantidades variáveis de etanol e água, isto é, possa existir como um polimorfo (anidrato), como um hidrato/solvato de etanol misturado, ou até mesmo como um hidrato.

Forma M de Solvato

Foi constatado que uma forma de cristal de solvato de etanol de dicloridrato de (6R)-L-eritrotetraidrobiopterina é uma forma preferida estável de BH4 para uso em uma preparação farmacêutica descrita aqui, que será referida aqui como "forma M" ou "hidrato M". Forma M pode conter 4% porém até 13% de etanol e 0% a cerca de 6% de água que sugere 15 que forma M seja um solvato de etanol ligeiramente higroscópico. O forma de solvato M é formada em temperatura ambiente. Forma M é especialmente adequada como material de partida e intermediário para produzir formas de polimorfo estáveis, desde que a forma M possa ser transformada em forma G quando tratada em etanol em temperaturas entre cerca de -IO0C a 15°C, e em forma B quando tratada em solventes orgânicos tais como etanol, 20 álcoois de C3 e C4, ou éteres cíclicos tais como THF e dioxana. Forma M de polimorfo pode ser preparada como um pó sólido com faixa de tamanho de partícula média desejada que está variando tipicamente de 1 μη a cerca de 500 μίτι.

Forma M exibe um padrão de difração de pó de raios X característico com picos característicos expressos em valores d (Â) em: 18,9 (s), 6,4 (m), 6,06 (w), 5,66 (w), 5,28 (w), 4,50 (w), 4,23 (w), e 3,22 (vs). Figura 14 é um gráfico do padrão de difração de raios x característico exibido por forma M de solvato de dicloridrato de (6R)-L-eritro-tetraidrobiopterina.

Forma M de solvato de etanol pode ser obtida por dissolução de dicloridrato de Leritro-tetraidrobiopterina em etanol e evaporação da solução sob nitrogênio em temperatura ambiente, isto é, entre 10°C e 40°C. Forma M pode ser obtida da mesma forma por secagem 30 da forma G sob um fluxo leve de nitrogênio seco em uma taxa de cerca de 20 a 100 mL/min. Dependendo da extensão da secagem sob nitrogênio, a quantidade restante de etanol pode ser variável, isto é, de cerca de 3% a 13%.

Forma N de Solvato

Foi constatado que outra forma de cristal de solvato de dicloridrato de (6R)-Leritrotetraidrobiopterina é uma forma preferida estável de BH4 para uso em uma preparação farmacêutica descrita aqui, que será referida aqui como "forma N" ou "hidrato N". Forma N pode conter no em total até 10% de isopropanol e pode molhar que sugere que forma N é um solvato de isopropanol ligeiramente higroscópico. Forma N pode ser obtida através da lavagem de forma D com isopropanol e secagem subseqüente em vácuo em cerca de 30°C. Forma N é especialmente adequada como material de partida e intermediário para produzir formas de polimorfo estáveis. Forma N de polimorfo pode ser preparada como um pó sólido 5 com faixa de tamanho de partícula média desejada que está variando tipicamente de 1 μη a cerca de 500 μη. Forma N exibe um padrão de difração de pó de raios X característico com picos característicos expressos em valores d (A) em: 19,5 (m), 9,9 (w), 6,7 (w), 5,15 (w), 4,83(w), 3,91 (w), 3,56 (m), 3,33 (vs), 3,15 (w), 2,89 (w), 2,81 (w), 2,56 (w), e 2,36 (w). Figura 15 é um gráfico do padrão de difração de raios x característico exibido por forma N de 10 solvato de dicloridrato de (6R)-L-eritro-tetraidrobiopterina.

A forma N de isopropanol pode ser obtida por dissolução de dicloridrato de L-eritrotetraidrobiopterina em 4,0 ml de uma mistura de isopropanol e água (misturando a relação de volume, por exemplo 4:1). A esta solução é adicionado lentamente isopropanol (IPA, por exemplo cerca de 4,0 ml) e a suspensão resultante é resfriada a O0C e agitada durante vá15 rias horas (por exemplo, cerca de 10 a 18 horas) nesta temperatura. A suspensão é filtrada e o resíduo sólido lavado com isopropanol em temperatura ambiente. O material cristalino obtido é em seguida secado em temperatura ambiente (por exemplo, cerca de 20 a 30°C) e pressão reduzida (cerca de 2 a 10 mbar) durante várias horas (por exemplo, cerca de 5 a 20 horas). TG-FTIR mostra uma perda de peso de 9,0% entre 25 a 200°C, que é atribuída ao 20 isopropanol e água. Este resultado sugere que forma N possa existir em forma de um solvato de isopropanol, ou em forma de hidrato/solvato de isopropanol misturado, ou como uma forma não solvatada contendo uma quantidade pequena de água.

Para a preparação da forma de polimorfo, pode ser usado técnicas de cristalização bem conhecidas na arte, tal como agitação de uma suspensão (equilíbrio de fase em), pre25 cipitação, re-cristalização, evaporação, solvente como métodos de absorção de água ou decomposição de solvatos. Soluções saturadas ou super-saturadas, diluídas podem ser usadas para cristalização, com ou sem semeação com agentes de nucleação adequados. Temperaturas até 100°C podem ser aplicadas para formar as soluções. O resfriamento para iniciar a cristalização e precipitação até -1OO0C e preferivelmente até -30°C pode ser apli30 cado. Polimorfos meta-estáveis ou formas pseudo-polimórficas podem ser usados para preparar soluções ou suspensões para a preparação de formas mais estáveis e alcançar concentrações mais altas nas soluções.

Foi surpreendentemente constatado que forma D de hidrato é a forma mais estável sob os hidratos e formas BeD são especialmente adequadas para ser usadas nas formulações farmacêuticas. Formas BeD apresentam algumas vantagens como uma fabricação apontada, boa manipulação devido à morfologia e tamanho de cristal conveniente, estabilidade muito boa sob condições de produção de vários tipos de formulação, estabilidade de armazenamento, solubilidade mais alta, e biodisponibilidade alta. Desta maneira, uma modalidade das composições e métodos descritos aqui é a composição farmacêutica incluindo forma B de polimorfo e/ou forma D de hidrato de dicloridrato de (6R)-L-eritrotetraidrobiopterina e um diluente ou portador farmaceuticamente aceitável

III. Formulações Farmacêuticas

As formulações descritas aqui são preferivelmente administradas como formulações orais. Formulações orais são preferivelmente formulações sólidas tais como cápsulas, comprimidos, pílulas e trociscos, ou formulações líquidas tais como suspensões aquosas, elixires e xaropes. As várias formas de BH4 descritas aqui podem ser usadas diretamente como pó (partículas micronizadas), grânulos, suspensões ou soluções, ou podem ser combinadas com outros ingredientes farmaceuticamente aceitáveis misturando-se os componentes e opcionalmente finamente dividindo-os, e em seguida preenchendo as cápsulas, compostas por exemplo de gelatina dura ou macia, prensando-se os comprimidos, pílulas ou trociscos, ou suspendendo-os ou dissolvendo-os em portadores para suspensões, elixires e xaropes. Os revestimentos podem ser aplicados depois da compressão para formar as pílulas.

Ingredientes farmaceuticamente aceitáveis são bem conhecidos pelos vários tipos de formulação e podem ser, por exemplo, aglutinantes tais como polímeros naturais ou sintéticos, excipientes, lubrificantes, surfactantes, agentes adoçantes e flavorizantes, materiais de revestimento, preservativos, tinturas, espessantes, adjuvantes, agentes antimicrobianos, antioxidantes e portadores para os vários tipos de formulação. A frase "farmaceuticamente ou farmacologicamente aceitável" refere-se às entidades moleculares e composições que são aprovadas pela U.S. Food and Drug Administration ou um órgão fiscalizador estrangeiro correspondente para administração em humanos. Como usado aqui, "portador farmaceuticamente aceitável" inclui qualquer e todos os solventes, meios de dispersão, revestimentos, agentes antibacteriano e antifúngicos, agentes de atraso e absorção e isotônico e similares. O uso de tais meios e agentes para substâncias farmaceuticamente ativas é bem conhecido na arte. Exceto na medida em que qualquer meio convencional ou agente é incompatível com as composições terapêuticas, seu uso em composições terapêuticas é considerado. Ingredientes ativos adicionais também podem ser incorporados nas composições.

A quantidade inicial de (6R)-L-eritro-tetraidrobiopterina usada para preparar a formulação pode estar, por exemplo, na faixa de cerca de 30 % em peso a cerca de 40 % em peso da formulação, ou na faixa de cerca de 32 % em peso a cerca de 35 % em peso, ou em cerca de 33 % em peso. Quantidades específicas de BH4 em uma formulação considerada aqui incluem 80 mg, 100 mg, 200 mg, 300 mg, 400 mg, e 500 mg.

Aglutinantes ajudam na manutenção de uma formulação sólida. Em alguns casos, aglutinantes anidrosos são usados para preservar o estado anidroso de formas de polimorfo. Em alguns casos, o aglutinante pode agir como um agente de secagem. Aglutinantes exempiares incluem fosfato de cálcio dibásico anidroso e seu monoidrato. Outros exemplos não Iimitantes de aglutinantes úteis em uma composição descrita aqui incluem goma tragacanto, acácia, amido, gelatina, e polímeros degradantes biológicos tais como homo- ou copoliésteres de ácidos dicarboxílicos, alquileno glicóis, polialquileno glicóis e/ou ácidos hidro5 xil carboxílicos alifáticos; homo- ou co-poliamidas de ácidos dicarboxílicos, alquileno diaminas, e/ou ácidos amino carboxílicos alifáticos; co-polímeros de poliéster-poliamida correspondentes, polianidridos, poliortoésteres, polifhosfazeno e policarbonatos. Os polímeros degradantes biológicos podem ser lineares, ramificados ou reticulados. Exemplos específicos são ácido poli-glicólico, ácido poli-láctico, e poli-d,l-lactídeo/glicolídeo. Outros exemplos 10 para polímeros são polímeros solúveis em água tais como polioxaalquilenos (polioxaetileno, polioxapropileno e polímeros misturados dos mesmos, poli-acrilamidas e poliacrilamidas hidroxilalquiladas, ácido poli-maléica e ésteres ou -amidas dos mesmos, ácido poli-acrílico e ésteres ou -amidas dos mesmos, poli-vinilálcool e ésteres ou éteres dos mesmos, polivinilimidazol, poli-vinilpyrrolidona, e polímeros naturais como quitosana.

Agentes de desintegração ajudam na desintegração rápida das formulações sólidas

absorvendo-se água e expandindo-se. Agentes de desintegração exemplares incluem polivinilpyrrolidona (PVP, por exemplo, vendida sob o nome comercial POVIDONE), uma forma reticulada de povidona (CPVP, por exemplo, vendida sob o nome CROSPOVIDONE), uma forma reticulada de carboximetilcelulose sódica (NaCMC, por exemplo, vendida sob o nome 20 AC-DI-SOL), outras celuloses modificadas, e amido modificado. Comprimidos formulados com CPVP exibiram desintegração muito mais rápida do que os comprimidos formulados com PVP.

Antioxidantes podem ser incluídos e ajudados para estabilizar o produto de tetraidrobiopterina, especialmente depois da dissolução. Soluções aquosas de pH baixo API são mais estáveis do que são as soluções em pH neutro ou alto. Antioxidantes são incluídos em uma formulação descrita aqui para prevenir a deterioração a partir da oxidação. Antioxidantes podem geralmente ser classificados em 3 grupos.

O primeiro grupo é conhecido como verdadeiros antioxidantes, e inibe a oxidação reagindo-se com radicais livres bloqueiando a reação de cadeia. Exemplos incluem antioxi30 dantes fenólicos, incluindo hidroxianisol butilado (BHA), hidroxitolueno butilado (BHT), tercbutil-hidroquinona (TBHQ), 4-hidroximetil-2,6-di-terc-butilfenol (HMBP), e 2,4,5- triidroxibutirofenona (THBP); alquigalatos, incluindo gaiato de propila; ácido gálico; ácido nordiidroguaiarético; e tocoferóis, incluindo alfa-tocoferol.

O segundo grupo, consistindo em reduzir os agentes, tem potenciais de redox mais baixos do que o fármaco cujo eles são pretendidos proteger, e são portanto mais facilmente oxidados. Agentes de redução podem agir da mesma forma reagindo-se com radicais livres. Exemplos incluem ácido ascórbico, ácido tioglicólico (TGA), palmitato de ascorbila, sulfitos, incluindo sais de sódio e potássio de ácido sulfuroso (por exemplo, sulfito de potássio, sulfito de sódio, metabissulfito de sódio, e bissulfito de sódio), e tioglicerol.

O terceiro grupo consiste em sinergistas antioxidantes que normalmente têm um efeito antioxidante modesto eles porém provavelmente aumentam a ação de antioxidantes no primeiro ou segundo grupo reagindo-se com íons de metal pesado que catalisam oxidação. Exemplos de tais sinergistas antioxidantes e agentes de quelação incluem ácido cítrico, ácido málico, ácido edítico e seus sais, lecitina, e ácido tartárico.

Antioxidantes ácidos exemplares incluem ácido ascórbico, ésteres de ácido graxo de ácido ascórbico tal como palmitato de ascorbila e estearato de ascorbila, e sais de ácido ascórbico tal como ascorbate de sódio, cálcio, ou potássio. Antioxidantes não ácidos podem da mesma forma ser usados nas formulações de comprimido estáveis. Exemplos não Iimitantes de antioxidantes não ácidos incluem beta-caroteno, alfa-tocoferol. Aditivos ácidos podem ser adicionados para realçar estabilidade da formulação de comprimido, incluindo ácido cítrico ou ácido málico. Antioxidantes de molécula pequena incluem porém não são limitados a tióis, por exemplo, cisteína, N-acetil cisteína, glutationa, etc., ou polímeros tiolados (polímero-SH), por exemplo, policarbofil-cisteína, polimetacrílico-SH, carboximetilcelulose-cisteína, etc. ou antioxidantes de molécula pequena tal como ácido ascórbico, metionina, palmitato de ascorbila, etc. Estes antioxidantes conferem estabilidade na forma de dosagem durante o trânsito através do GIT, particularmente quando o pH do GIT aumenta com distância do estômago.

Em uma modalidade, uma combinação de pelo menos dois antioxidantes de agente de redução é preferida. Em outra modalidade, uma combinação de pelo menos dois antioxidantes de agente de redução juntamente com um sinergista antioxidante de ácido e/ou agente de quelação é preferida.

Lubrificantes melhoram estabilidade, dureza e uniformidade de formulações sólidas. Lubrificantes exemplares incluem fumarato de estearila e estearato de magnésio. Outros exemplos não Iimitantes de lubrificantes incluem óleos naturais ou sintéticos, gorduras, ceras, ou sais de ácido graxo tal como estearato de magnésio.

Opcionalmente as formulações estáveis da invenção podem da mesma forma compreender outros excipientes tais como manitol, hidroxil propil celulose, celulose microcristalina, ou outros açúcares de não redução tal como sacarose, trealose, melezitose, planteose, e rafinose. Açúcares de redução podem reagir com BH4. Outros exemplos não Iimitantes de excipientes úteis em uma composição descrita aqui incluem fosfatos tal como fosfato de dicálcio.

Tensoativos para uso em uma composição descrita aqui podem ser aniônicos, anfotéricos ou neutros. Exemplos não Iimitantes de tensoativos úteis em uma composição descrita aqui incluem lecitina, fosfolipídeos, sulfato de octila, sulfato de decila, sulfato de dodeciIa, sulfato de tetradecila, sulfato de hexadecila e sulfato de octadecila, oleato de Na ou caprato de Na, ácidos 1-acilaminoetano-2-sulfônicos, tal como ácido 1-octanoilaminoetano-2- sulfônico, ácido 1-decanoilaminoetano-2-sulfônico, ácido 1-dodecanoilaminoetano-2- sulfônico, ácido 1-tetradecanoilaminoetano-2-sulfônico, ácido 1-hexadecanoilaminoetano-2- 5 sulfônico, e ácido 1-octadecanoilaminoetano-2-sulfônico, e ácido taurocólico e ácido taurodeoxicólico, ácidos biliares e seus sais, tal como ácido cólico, ácido desoxicólico e glicocolatos de sódio, caprato de sódio ou Iaurato de sódio, oleato de sódio, Iauril sulfato de sódio, cetil sulfato de sódio, óleo de rícino sulfatado e dioctilsulfossucinato de sódio, cocamidopropilbetaína e laurilbetaína, álcoois graxos, colesteróis, mono- ou distearato de de glicerol, 10 mono- ou dioleato de de glicerol e mono- ou -dipalmitato de glicerol, e estearato de polioxietileno.

Exemplos não Iimitantes de agentes adoçantes úteis em uma composição descrita aqui incluem sacarose, frutose, Iactose ou aspartame. Exemplos não Iimitantes de agentes flavorizantes para uso em uma composição descrita aqui incluem hortelã, óleo de gualtéria 15 ou sabores de fruta tal como sabor de cereja ou laranja. Exemplos não Iimitantes de materiais de revestimento para uso em uma composição descrita aqui incluem gelatina, cera, goma-laca, açúcar ou outros polímeros degradáveis biológicos. Exemplos não Iimitantes de preservativos para uso em uma composição descrita aqui inclua metila ou propilparabenos, ácido sórbico, clorobutanol, fenol e timerosal.

A forma de BH4 pode da mesma forma ser formulada como comprimido eferves

cente ou em pó, que desintegra em um ambiente aquoso para fornecer uma solução de bebida. Formulações de liberação lenta podem da mesma forma ser preparadas para obter uma liberação controlada do agente ativo em contato com os fluidos corporais no trato gastro intestinal, e fornecer uma constante substancial e nível eficaz do agente ativo no plasma 25 de sangue. A forma cristalina pode ser embebida para este propósito em uma matriz de polímero de um polímero degradável biológico, um polímero solúvel em água ou uma mistura de ambos, e opcionalmente tensoativos adequados. O embebimento pode significar neste contexto a incorporação de micro-partículas em uma matriz de polímeros. Formulações de liberação controlada são da mesma forma obtidas através de encapsulação de micro30 partículas dispersas ou micro-gotículas emulsificadas por meio de tecnologias de revestimentos de dispersão ou emulsão conhecidas.

O BH4 usado em uma composição descrita aqui é preferivelmente formulado como um sal de diidrocloreto, entretanto, é considerado que outras formas de sal de BH4 possuem a atividade biológica desejada, e consequentemente, outras formas de sal de BH4 podem 35 ser usadas. Especificamente, sais de BH4 com ácidos inorgânicos ou orgânicos são preferidos. Exemplos não Iimitantes de forma de sais de BH4 alternativos inclui sais de BH4 de ácido acético, ácido cítrico, ácido oxálico, ácido tartárico, ácido fumárico, e ácido mandélico. Sais de adição de base farmaceuticamente aceitáveis podem ser formados com metais ou aminas, tais como metais de álcali e alcalinos terrosos ou aminas orgânicas. Sais farmaceuticamente aceitáveis de compostos podem da mesma forma ser preparados com um cátion farmaceuticamente aceitável. Cátions farmaceuticamente aceitáveis são bem co5 nhecidos por aqueles versados na arte e incluem cátions alcalinos terrosos, alcalinos, de amônio e de amônio quaternário. Carbonatos ou carbonatos de hidrogênio são da mesma forma possíveis. Exemplos de metais usados como cátions são sódio, potássio, magnésio, amônio, cálcio, ou férrico, e similares. Exemplos de aminas adequadas incluem isopropilamina, trimetilamina, histidina, Ν,Ν’-dibenziletilenodiamina, cloroprocaína, colina, dietanola10 mina, dicicloexilamina, etilenodiamina, N-metilglucamina, e procaína. Sais de adição de ácido farmaceuticamente aceitáveis incluem sais de ácido inorgânicos ou orgânicos. Exemplos de sais de ácido adequados incluem os cloridratos, acetatos, citratos, salicilatos, nitratos, fosfatos. Outros sais farmaceuticamente aceitáveis adequados são bem conhecidos por aqueles versados na arte e incluem, por exemplo, ácidos acéticos, cítricos, oxálicos, tartári15 cos, ou mandélicos, ácido clorídrico, ácido bromídrico, ácido sulfúrico ou ácido fosfórico; com orgânico carboxílico, sulfônico, sulfo ou fosfo ácidos ou ácidos de sulfâmicos N substituídos, por exemplo ácido acético, ácido propiônico, ácido glicólico, ácido sucínico, ácido maléico, ácido hidroximaléico, ácido metilmaléico, ácido fumárico, ácido málico, ácido tartárico, ácido láctico, ácido oxálicoi, ácido glucônico, ácido glucárico, ácido glucurônico, ácido 20 cítrico, ácido benzóico, ácido cinâmico, ácido mandélico, ácido salicílico, ácido 4 aminosalicílico, ácido 2 fenoxibenzóico, ácido 2 acetoxibenzóico, ácido embônico, ácido nicotínico ou ácido isonicotínico; e com aminoácidos, tais como os 20 alfa aminoácidos envolvidos na síntese de proteínas na natureza, por exemplo ácido glutâmico ou ácido aspártico, e da mesma forma com ácido fenilacético, ácido metanossulfônico, ácido etanossulfônico, ácido 2 25 hidroxietanossulfônico, ácido etano 1,2 dissulfônico, ácido benzenossulfônico, ácido 4 metilbenzenossulfônico, ácido naftaleno 2 sulfônico, ácido naftaleno 1,5 dissulfônico, 2 ou 3 fosfoglicerato, glicose 6 fosfato, ácido N-cicloexilsulfâmico (com a formação de ciclamatos), ou com outros compostos orgânicos de ácido, tal como ácido ascórbico.

Formulações orais estáveis exemplares contêm um ou mais dos seguintes ingredi30 entes adicionais que melhoram a estabilidade ou outras características da formulação: aglutinante, agente de desintegração, antioxidante ácido, ou lubrificante ou combinações dos mesmos. Formulações de comprimido estáveis exemplares incluem um aglutinante e agente de desintegração, opcionalmente com um antioxidante ácido, e opcionalmente também incluindo um lubrificante. Concentrações exemplares de aglutinante estão entre cerca de 1% 35 em peso a cerca de 5% em peso, ou entre cerca de 1,5 e 3% em peso; uma relação de peso exemplar de aglutinante para BH4 está na faixa de cerca de 1:10a cerca de 1:20. Concentrações exemplares de agente de desintegração estão entre cerca de 1% em peso a cerca de 20% em peso; uma relação de peso exemplar de agente de desintegração para BH4 está na faixa de cerca de 1:5 a cerca de 1:10. Concentrações exemplares de antioxidante estão entre cerca de 1 % em peso e cerca de 3% em peso; uma relação de peso exemplar de antioxidante para BH4 está na faixa de cerca de 1:5 a 1:30. Em um exemplo, ácido ascórbico é 5 o antioxidante e é usado em uma relação para BH4 de menos do que 1:1, por exemplo 1:2 ou menos, ou 1:10 ou menos. Concentrações exemplares de lubrificante em uma formulação de comprimido estável da presente invenção estão entre cerca de 0,.1% em peso e cerca de 2% em peso; uma relação de peso exemplar de lubrificante para BH4 está na faixa de cerca de 1:25 a 1:65.

A formulação sólida estável pode opcionalmente incluir outros agentes terapêuticos

adequados para a condição a ser tratada, por exemplo folatos, incluindo precursores de folato, ácidos fólicos, ou derivados de folato; e/ou arginina; e/ou vitaminas, tais como vitamina C e/ou vitamina B2 (riboflavina) e/ou vitamina B 12; e/ou precursores neurotransmissores tais como L-dopa or carbidopa; e/ou 5-hidroxitriptofano.

Folatos exemplares, incluindo precursores de folato, ácidos fólicos, ou derivados de

folato são descritos em, Patente U.S. Ns. 6.011.040 e 6.544.994, ambos dos quais estão incorporados aqui por referência e incluem ácido fólico (pteroilmonoglutamato), ácido diidrofólico, ácido tetraidrofólico, ácido 5-metiltetraidrofólico, ácido 5,10-metilenotetraidrofólico, ácido 5,10-meteniltetraidrofólico, ácido 5,10-formiminotetraidrofólico, ácido 5- formiltetraidrofólico (leucovorina), ácido 10-formiltetraidrofólico, ácido 10-metiltetraidrofólico, um ou mais dos folilpoliglutamatos, compostos em que o anel de pirazina da porção de pterina de ácido fólico ou dos folilpoliglutamatos é reduzido para produzir diidrofolatos ou tetraidrofolatos, ou derivado de todos os compostos anteriores em que as posições N-5 ou N-10 levam uma unidade de carbono a vários níveis de oxidação, ou sais farmaceuticamente compatíveis dos mesmos, ou uma combinação de dois ou mais do mesmo. Tetraidrofolatos exemplares incluem ácido 5-formil-(6S)-tetraidrofólico, ácido 5-metil-(6S)-tetraidrofólico, ácido 5,10-metileno-(6R)-tetraidrofólico, ácido 5,10-metenil-(6R)-tetraidrofólico, ácido 10-formil(6R)-tetraidrofólico, ácido 5-formimino-(6S)-tetraidrofólico ou ácido (6S)-tetraidrofólico, e sais farmaceuticamente aceitáveis dos mesmos. Sais exemplares incluem sais de sódio, potássio, cálcio ou amônio.

Relações em peso relativas exemplares de BH4 para folatos a arginina podem ser de cerca de 1:10:10 a cerca de 10:1:1.

As formulações estáveis da invenção podem ser fornecidas, por exemplo como comprimidos ou pílulas ou cápsulas em garrafas de HDPE fornecidas com uma cápsula dessecante ou bolsa; ou em empacotamento em bolha de folha em folha, ou empacotamento em bolha compreendendo ver através da película de polímero, se comercialmente desejável. IV. Tratamento de responsivas a BH4

Distúrbios de Hiperfenilalaninemial Neuropsicológicos ou Neuropsiquiátricos

Os métodos da invenção podem ser usados para tratamento de condições associadas com níveis de fenilalanina elevados ou tirosina diminuída ou níveis de triptofano que 5 pode ser causado por exemplo, por fenilalanina hidroxilase reduzida, tirosina hidroxilase, ou atividade de hidroxilase de triptofano. Condições associadas com níveis de fenilalanina elevados especificamente incluem fenilcetonúria, igualmente moderado e clássico, e hiperfeniIalaninemia como descrito aqui, e populações de pacientes exemplares incluem os subgrupos de pacientes descritos aqui bem como qualquer outro paciente que exibe níveis de feni10 Ialanina acima do normal.

Condições associadas com níveis de tirosina ou triptofano diminuídos incluem deficiência de neurotransmissor, distúrbios neurológicos e psiquiátricos tais como Parkinson1 distonia, degeneração espinocerebelar, dor, fadiga, depressão, outros distúrbios afetivos e esquizofrenia. Superprodução de NO por nNOS foi implicada em acidente vascular cerebral, 15 enxaqueca, doença de Alzheimer, e com tolerância a e dependência de morfina. BH4 pode ser administrada para quaisquer destas condições. Outros distúrbios neuropsiquiátricos exemplares dos quais BH4 pode ser administrada incluem doença de Parkinson, doença de Alzheimer, esquizofrenia, transtorno esquizofreniforme, transtorno esquizoafetivo, transtorno psicótico breve, transtorno ilusional, transtorno psicótico compartilhado, transtorno psicótico 20 devido a uma condição médica geral, transtorno psicótico induzido por substância, outros transtornos psicóticos, discinesia tardia, doença de Machado-Joseph, degeneração espinocerebelar, ataxia cerebelar, distonia, síndrome da fadiga crônica, depressão aguda ou crônica, síndrome da angústia crônica, fibromialgia, enxaqueca, transtorno de déficit de atenção/hiperatividade, transtorno bipolar, e autismo.

As formulações estáveis podem da mesma forma ser usadas para tratar pacientes

que sofrem de deficiência de BH4, por exemplo, devido a um défict na série de reação para sua síntese, incluindo porém não limitado a distonia responsiva à dopa (DRD), deficiencia de sepiapterina reductase (SR), ou deficiência de diidropteridina reductase (DHPR).

Indivíduos adequados para tratamento com as formulações estáveis da invenção 30 incluem indivíduos com uma concentração de Phe de plasma elevada na ausência do terapêutico, por exemplo maior do que 1800 μΜ/L, ou maior do que 1600 μΜ, maior do que 1400 μΜ, maior do que 1200 μΜ, maior do que 1000 μΜ, maior do que 800 μΜ, ou maior do que 600 μΜ, maior do que 420 μΜ, maior do que 300 μΜ, maior do que 200 μΜ, ou maior do que 180 μΜ. PKU moderado é geralmente classificado como concentrações de Phe de 35 plasma de até 600 μΜ/L, PKU moderado como concentrações de Phe de plasma dentre 600 μΜ/L a cerca de 1200 μΜ/L e PKU clássico ou severo quando concentrações de Phe de plasma que são maiores do que 1200 μΜ/L. Preferivelmente tratamento com as formulações estáveis sozinhas ou com dieta restringida a proteína diminui a concentração de fenilalanina de plasma do indivíduo a menos do que 600 μΜ, ou menos do que 500 μΜ, ou 360 μΜ + 15 μΜ ou menos, ou menos do que 200 μΜ, ou menos do que 100 μΜ. Outros indivíduos adequados incluem indivíduos diagnosticados como tendo uma atividade de fenilalanina hidroxi5 Iase reduzida (PAH), fenilcetonúria atípica ou maligna associada com deficiência de BH4, hiperfenilalaninemia associada com distúrbio do fígado, e hiperfenilalaninemia associada com malária. Atividade de PAH reduzida pode resultar em uma mutação na enzima PAH, por exemplo, uma mutação no domínio catalítico de PAH ou uma ou mais mutações selecionadas a partir do grupo que consiste em F39L, L48S, I65T, R68S, A104D, S110C, 10 D129G, E178G, V190A, P211T, R241C, R261Q, A300S, L308F, A313T, K320N, A373T, V388M E390G, A395P, P407S, e Y414C; ou indivíduos que são fêmeas grávidas, fêmeas de idade de gravidez que estão considerando gravidez, ou crianças entre 0 e 3 anos de idade, ou 0-2, 0-1,5 ou 0-1; ou indivíduos diagnosticados como indiferente dentro de 24 horas a um teste de carregamento de BH4 de única dose ou um teste de carregamento de dose múl15 tipla, tal como um teste de carregamento de 4 doses ou 7 dias. Populações de pacientes exemplares e testes de carregamento de BH4 exemplar são descritas em Publicação lnt'1. No. WO 2005/049000, incorporada aqui por referência em sua totalidade.

Patente U.S. Nos. 4.752.573; 4.758.571; 4.774.244; 4.920.122; 5.753.656; 5.922.713; 5.874.433; 5.945.452; 6.274.581; 6.410.535; 6.441.038; 6.544.994; e Publica20 ções de Patentes U.S. US 20020187958; US 20020106645; US 2002/0076782; US 20030032616 (cada qual incorporada aqui por referência) cada qual descreve métodos de administrar composições de BH4 para tratamentos de não PKU. Cada uma dessas patentes está incorporada aqui por referência como fornecendo um ensinamento geral de métodos de administrar composições de BH4 conhecido a aqueles versados na arte, que pode ser adap25 tada para o tratamento como descrito aqui.

Enquanto necessidades individuais variam, determinação de faixas ideais de quantidades eficazes de cada componente está dentro da experiência da técnica. Dosagens típicas do BH4 compreendem cerca de 1 a cerca de 20 mg/kg de peso corporal por dia que normalmente chegará a cerca de 5 (1 mg/kg x 5kg de peso corporal) a 3000 mg/dia (30 30 mg/kg x 100 kg de peso corporal). Enquanto contínua, administração diária é considerada, para HPA pode ser desejável cessar a terapia de BH4 quando os sintomas de níveis de Phe são reduzidos para abaixo de um certo nível de limiar. Claro que, a terapia pode ser reiniciada no evento que níveis de Phe subam novamente. Dosagens apropriadas podem ser averiguadas pelo uso de ensaios estabelecidos para determinar níveis de sangue de Phe jun35 tamente com dados de resposta de dose relevantes.

Em modalidades exemplares, é considerado que os métodos da presente invenção fornecerão a um paciente em necessidade do mesmo, uma dose diária dentre cerca de 10 mg/kg a cerca de 20 mg/kg de BH4. Claro que, alguém versado na arte pode ajustar esta dose para cima ou abaixo dependendo da eficácia a ser obtida pela administração. A dose diária pode ser administrada em uma única dose ou alternativamente pode ser administrada em doses múltiplas em intervalos convenientemente espaçados. Em modalidades exempla5 res, a dose diária pode ser 1 mg/kg, 2 mg/kg, 3 mg/kg, 4 mg/kg, 5 mg/kg, 6 mg/kg, 7 mg/kg, 8 mg/kg, 9 mg/kg, 10 mg/kg, 11 mg/kg, 12 mg/kg, 13 mg/kg, 14 mg/kg, 15 mg/kg, 16 mg/kg, 17 mg/kg, 18 mg/kg, 19 mg/kg, 20 mg/kg, 22 mg/kg, 24 mg/kg, 26 mg/kg, 28 mg/kg, 30 mg/kg, 32 mg/kg, 34 mg/kg, 36 mg/kg, 38 mg/kg, 40 mg/kg, 42 mg/kg, 44 mg/kg, 46 mg/kg, 48 mg/kg, 50 mg/kg, ou mais mg/kg.

Regimes de dose baixa

Em um método terapêutico de dose baixa da invenção, doses baixas, por exemplo, doses de 0,1 a 5 mg/kg por dia são consideradas, incluindo doses de 0,1 a 2 mg/kg, ou 0,1 a 3 mg/kg, ou 1 mg/kg a 5 mg/kg. Doses de menos do que 5 mg/kg por dia são preferidas. De acordo com a invenção, tais doses são esperadas fornecer melhorias com pontos finais de 15 estudo relevantes, e derivados de BH4 são esperados melhorar propriedades biológicas relativo a BH4 natural em tais doses. Em particular, a invenção considera que qualquer das 1',2'-diacil-(6R,S)-5,6,7,8-tetraidro-L-biopterinas ou tetraidrobiopterinas Iipoidais descritas aqui exibem propriedades biológicas melhoradas em doses baixas.

A invenção da mesma forma especificamente considera o uso de BH4, ou um pre20 cursor ou derivado do mesmo, para tratar doenças responsivas a BH4 em uma dose na faixa de 0,1 a 5 mg/kg de peso corpora / dia, por qualquer rotina de administração incluindo porém não limitada a administração oral, em um uma dose diária ou múltipla (por exemplo 2 , 3 ou 4) doses divididas por dia, durante uma duração de pelo menos 1, 2, 3, ou 4 semanas ou mais tempo, ou 1, 2, 3, 4, 5, 6 meses ou mais tempo. Doses exemplares incluem menos 25 do que 5 mg/kg/dia, 4,5 mg/kg/dia ou menos, 4 mg/kg/dia ou menos, 3,5 mg/kg/dia ou menos, 3 mg/kg/dia ou menos, 2,5 mg/kg/dia ou menos, 2 mg/kg/dia ou menos, 1,5 mg/kg/dia ou menos, 1 mg/kg/dia ou menos, ou 0,5 mg/kg/dia ou menos. Doses equivalentes por área de superfície corporam são da mesma forma consideradas.

Para a pessoa de peso médio/área de superfície corporal (por exemplo 70 kg), a in30 venção da mesma forma considera a dose diária total de menos do que 400 mg. Tais doses diárias totais exemplares incluem 360 mg/dia, 350 mg/dia, 300 mg/dia, 280 mg/dia, 210 mg/dia, 180 mg/dia, 175 mg/dia, 150 mg/dia, ou 140 mg/dia. Por exemplo, 350 mg/dia ou 175 mg/dia é facilmente administrável com uma formulação de dosagem oral de 175 mg, uma vez ou duas vezes por dia. Outras doses diárias totais exemplares incluem 320 mg/dia 35 ou menos, 160 mg/dia ou menos, ou 80 mg/dia ou menos. Tais doses são facilmente administráveis com uma formulação de dosagem oral de 80 ou 160 mg. Outras doses diárias totais exemplares incluem 45, 90, 135, 180, 225, 270, 315 ou 360 mg/dia ou menos, facilmente administráveis com uma formulação de dosagem oral de 45 ou 90 mg. Ainda outras doses diárias totais exemplares incluem 60, 120, 180, 240, 300, ou 360 mg/dia, facilmente administráveis com uma formulação de dosagem oral de 60 ou 120 mg. Outras doses diárias totais exemplares incluem 70, 140, 210, 280, ou 350 mg/dia, facilmente administráveis 5 com uma formulação de dosagem oral de 70 ou 140 mg. Doses diárias totais exemplares da mesma forma incluem 55, 110, 165, 220, 275 ou 330 mg/dia, facilmente administráveis com uma formulação de dosagem oral de 55 mg. Outras doses diárias totais exemplares incluem 65, 130, 195, 260, ou 325 mg/dia, ou 75, 150, 225, 300 ou 375 mg/dia, por exemplo em formulações de dosagem de 65 mg ou 75 mg.

Doenças Associadas com Disfunção de Óxido Nítrico Sintase

A invenção também considera que formulações estáveis da invenção podem ser usadas para o tratamento de indivíduos que sofrem de condições que beneficiariam-se do realce de atividade de óxido nítrico sintase e pacientes que sofrem de doenças vasculares, doenças inflamatórias ou isquêmicas, ou resistência à insulina. O tratamento pode, por e15 xemplo, aliviar uma deficiência em atividade de óxido nítrico sintase ou pode, por exemplo, fornecer um aumento em atividade de óxido nítrico sintase em níveis normais. Foi sugerido que um paciente que sofre de uma deficiência em atividade de óxido nítrico sintase se beneficiaria de co-tratamento com folatos, incluindo precursores de folato, ácidos fólicos, ou derivados de folato.

Óxido nítrico é constitutivamente produzido por células endoteliais vasculares onde

desempenha um papel fisiológico fundamental no regulamento de pressão arterial e tônus vascular. Foi sugerido que uma deficiência em bioatividade de óxido nítrico está envolvida na patogênese de disfunções vasculares, incluindo doença da artéria coronária, aterosclerose de qualquer artéria, incluindo artérias vasculares coronárias, carótidas, cerebrais, ou peri25 féricas, lesão por isquemia-reperfusão, hipertensão, diabetes, vasculopatia diabética, doença cardiovascular, doença vascular periférica, ou condições neurodegenerativas originando a partir de isquemia e/ou inflamação, tal como acidente vascular cerebral, e aquelas tais patogêneses incluem endotélio danificado, fluxo de oxigênio insuficiente para órgãos e tecidos, resistência vascular sistêmica elevada (pressão alta), proliferação do músculo liso vas30 cular, progressão de estenose vascular (estreitamento) e inflamação. Desse modo, tratamento de quaisquer destas condições é considerado de acordo com métodos da invenção.

Foi da mesma forma sugerido que o realce da atividade de óxido nítrico sintase da mesma forma resulta em redução de níveis de superóxido elevados, sensibilidade a insulina aumentada, e redução em disfunção vascular associada com resistência à insulina, como 35 descrito em Patente U.S. No. 6.410.535, incorporada aqui por referência. Desse modo, tratamento de diabetes (tipo I ou tipo II), hiperinsulinemia, ou resistência à insulina é considerado de acordo com a invenção. Doenças ou distúrbios tendo disfunção vascular associada com resistência à insulina incluem aqueles causados por resistência à insulina ou agravados por resistência à insulina, ou aqueles para os quais cura é retardada por resistência à insulina, inclui porém não é limitado a complacência vascular anormal, disfunção endotelial e hipertensão, distúrbios de sensibilidade à insulina e controle de glicose, perfusão periférica 5 anormal tal como claudicação intermitente, perfusão periférica reduzida, fluxo de sangue de pele diminuído, cura de ferida defeituosa e distúrbio de circulação periférica, hiperlipidemia, arteriosclerose, angina vasoconstritiva coronária, angina de esforço, lesão de constritiva cerebrovascular, insuficiência cerebrovascular, vasoespasmo cerebral, arteriorestenose coronária seguindo angioplastia coronária transluminal percutânea (PTCA) ou enxerto de by10 pass de artéria coronária (CABG)1 obesidade, diabetes insulino independente, hiperinsulinemia, anormalidade de metabolismo de lipídio, doença cardíaca arteriosclerótica coronária, insuficiência cardíaca congestiva, hipertensão pulmonar com ou sem insuficiência cardíaca congestiva, angina associada a exercício, doença da artéria coronária e aterosclerose relacionada; doença oftálmica tal como atrofia ótica e doença retinal diabética; e doença renal 15 tal como microalbuminuria em doença renal diabética, insuficiência renal e taxa de filtração glomerular diminuída.

É considerado que quando administrado a pacientes com estas doenças, BH4 pode prevenir ou tratar estas doenças ativando-se as funções de NOS, aumentando-se produção de NO e suprimindo-se a produção de espécies de oxigênio ativas para melhorar distúrbios de células endoteliais vasculares.

A invenção fornece um método para tratar um indivíduo diagnosticado como tendo doença vascular não relacionada a diabetes selecionada a partir do grupo que consiste em doença vascular pulmonar, anemias hemolíticas, acidente vascular cerebral e doença vascular isquêmica relacionada (tal como acidente vascular cerebral, cardiopatia ou doença 25 coronária, arteriosclerose, ou doença vascular periférica), trombose, disfunção endotelial relacionada a transplante, e cardiopatia ou doença coronária. Em uma modalidade, doença vascular pulmonar inclui porém não é limitada a tensão pulmonar em anemia de célula falciforme e outras hemoglobinopatias, hipertensão pulmonar idiopática, hipertensão pulmonar persistente do recém-nascido (PPHN). Em uma outra modalidade, anemias hemolíticas in30 cluem anemias hemolíticas hereditárias e anemia hemolítica adquirida. Anemias hemolíticas hereditárias incluem porém não são limitadas a anemia de célula falciforme, talassemia, anemia hemolítica devido à deficiência de G6PD, deficiência de piruvato cinase, eliptocitose hereditária, esferocitose hereditária, estomatocitose hereditária, ovalocitose hereditária, hemoglobinúria noturna paroxismal, e doença de SC de hemoglobina. Anemias hemolíticas 35 adquiridas incluem porém não são limitadas a anemia hemolítica microangiopática, anemia hemolítica autoimune idiopática, anemia hemolítica não imune causada por química ou agentes físicos ou dispositivos (dispositivos de ajuda ventricular esquerda), válvulas do coração mecânicas e dispositivos de bypass), e anemia hemolítica imune secundária.

Em outra modalidade, acidente vascular cerebral e doença vascular isquêmica relacionada inclui porém não é limitada a vasoespasmo, tal como espasmo cerebrovascular pos acidente vascular cerebral. Trombose inclui porém não é limitada a trombogênese, trombo5 se, coagulação(clotting), e coagulação(coagulation). Em uma outra modalidade, disfunção endotelial relacionada a transplante inclui porém não é limitada a disfunção vascular depois do transplante de órgão sólido e ciclosporina A induziu a disfunção endotelial. Em ainda outra modalidade, cardiopatia ou doença coronária inclui porém não é limitada a insuficiência cardíaca congestiva, disfunção vascular e angina associada com hipercolesterolemia, e dis10 função vascular e angina associada com fumo de tabaco.

BH4 pode da mesma forma prevenir ou tratar outros distúrbios associados com a superprodução de ou dano relacionado a espécies de oxigênio reativas, incluindo porém não limitado a sepse.

É compreendido que a dose adequada de uma composição de acordo com a pre15 sente invenção dependerá da idade, saúde e peso do recipiente, tipo de tratamento concorrente, se qualquer, frequência de tratamento, e da natureza do efeito desejado (isto é, a quantidade de diminuição em concentração de Phe de plasma desejado). A frequência de dose é da mesma forma dependente de efeitos farmacodinâmicos em níveis de Phe. Se o efeito permanece durante 24 horas a partir de uma única dose. Entretanto, a dosagem mais 20 preferida pode ser adaptada ao indivíduo individual, como é entendido e determinável por alguém versado na arte, sem experimentação indevida. Isto tipicamente envolve ajuste de uma dose padrão, por exemplo, redução da dose se o paciente tem um peso corporal baixo.

A frequência de dose de BH4 dependerá dos parâmetros farmacocinéticos do agente e das rotinas de administração. A formulação farmacêutica ideal será determinada por alguém de experiência na arte dependendo da rotina de administração e da dosagem desejada. Veja por exemplo Remington’s Pharmaceuticals Sciences, 18a Ed. (1990, Mack Publ. Co, Easton PA 18042) pp 1435 1712, incorporado aqui por referência. Tais formulações podem influenciar o estado físico, estabilidade, taxa de liberação in vivo e taxa de liberação in vivo dos agentes administrados. Dependendo da rotina de administração, uma dose adequada pode ser calculada de acordo com peso corporal, áreas de superfície corporal ou tamanho do órgão. Além disso refinamento dos cálculos necessários para determinar a dose de tratamento apropriada é habitualmente feita por aqueles de experiência ordinária na arte sem experimentação indevida, especialmente levando em conta as informações de dosagem e ensaios descritos aqui bem como os dados farmacocinéticos observados em animais ou tentativas clínicas humanas.

O regime de dosagem final será determinado pelo médico assistente, considerando fatores que modificam a ação de fármacos, por exemplo, a atividade específica dos fármacos, severidade do dano e a sensibilidade do paciente, a idade, condição, peso corporal, sexo e dieta do paciente, a severidade de qualquer infecção, tempo de administração e outros fatores clínicos. Quando estudos são conduzidos, outras informações emergirão relativas a níveis de dosagem apropriados e duração de tratamento por doenças específicas e condições.

V. Terapia de Combinação

Certos métodos da invenção envolvem o uso combinado das formulações estáveis da invenção e um ou mais outros agentes terapêuticos.

Em tal terapia de combinação, administração das formulações estáveis da invenção 10 pode ser simultânea com ou pode preceder ou seguir a administração do segundo agente terapêutico, por exemplo, por intervalos que variam de minutos a horas, contanto que ambos os agentes sejam capazes de exercer seu efeito terapêutico na sobreposição de períodos de tempo. Desse modo, a invenção considera as formulações estáveis da invenção para uso com um segundo agente terapêutico. A invenção da mesma forma considera uso de um 15 segundo agente terapêutico em preparação de um medicamento para administração com a tetraidrobiopterina estável, precursor, derivado ou formulações análogas da invenção.

Terapia de tetraidrobiopterina pode ser combinada com restrição de proteína dietética para efetuar um resultado terapêutico em pacientes com várias formas de HPA. Por exemplo, alguém poderia administrar ao indivíduo a composição de BH4 e uma composição 20 de proteína médica de fenilalanina baixa em uma quantidade combinada eficaz para produzir o resultado terapêutico desejado (isto é, uma redução de concentração de Phe de plasma e/ou a capacidade para tolerar quantidades maiores de entrada de Phe/proteína sem produzir um aumento concomitante em concentrações de Phe de plasma). Este processo pode envolver administrar a composição de BH4 e a composição terapêutica de proteína 25 dietética. Isto pode ser obtido administrando uma única composição ou formulação de proteína farmacológica que incluem todas as exigências de proteína dietéticas e da mesma forma incluem a BH4 dentro da referida formulação de proteína. Alternativamente, a proteína dietética (suplemento ou refeição de proteína normal) é empregada em torno do mesmo tempo como uma formulação farmacológica (comprimido, injeção ou bebida) de BH4.

Em algumas modalidades, a dieta restringida a proteína é uma que é suplementada

com aminoácidos, tal como tirosina, valina, isoleucina e leucina. O paciente pode ser coadministrado um suplemento de proteína de Phe baixo, que pode incluir L-tirosina, Lglutamina, L-carnitina em uma concentração de suplemento de 20 mg/100 g, L-taurina em uma concentração de 40 mg/100 g de suplemento e selênio. Pode também compreender as 35 doses diárias indicadas de minerais, por exemplo, cálcio, fósforo e magnésio. O suplemento também pode compreender a dose diária indicada de um ou mais aminoácidos selecionados a partir do grupo que consiste em L-leucina, L-prolina, acetato de L-lisina, L-valina, Lisoleucina, L-arginina, L-alanina, glicina, monoidrato de L-asparagina, L-triptofano, L-serina, L-treonina, L-histidina, L-metionina, ácido L-glutâmico, e ácido L-aspártico. Além disso, o suplemento pode ser fortalecido com a dosagem diária indicada de vitaminas A, D e E. Opcionalmente, o suplemento compreende um teor de gordura que fornece pelo menos 40% 5 da energia do suplemento. Tais suplementos podem ser fornecidos na forma de um suplemento em pó ou na forma de uma barra de proteína. Em certas modalidades, dieta restringida à proteína compreende um suplemento de proteína e a BH4 é fornecida na mesma composição como o suplemento de proteína.

Em outras alternativas, o tratamento de BH4 pode preceder ou seguir a terapia de proteína dietética por intervalos que variam de minutos a horas. Em modalidades onde a proteína e as composições de BH4 são administradas separadamente, alguém geralmente garantiria que um período significante de tempo não expirou entre o tempo de cada liberação, tal que a BH4 ainda será capaz de exercer vantajosamente um efeito no paciente. Em tais exemplos, é considerado que administraria a BH4 dentro de cerca de 2-6 horas (antes ou depois) da entrada de proteína dietética, por exemplo, com um tempo de atraso de apenas cerca de 1 hora ou menos. Em certas modalidades, é considerado que a terapia de BH4 será uma terapia contínua onde uma dose diária de BH4 é administrada ao paciente indefinidamente. Em outras situações, por exemplo, em mulheres grávidas tendo apenas as formas mais moderadas de PKU e HPA, pode ser aquela terapia de BH4 é apenas continuada contanto que a mulher está grávida e/ou amamentando.

Além disso, além de terapias com base em somente na liberação de BH4 e regulamento de proteína dietética, os métodos da presente invenção da mesma forma consideram terapia de combinação com uma terceira composição que especificamente alveja um ou mais dos sintomas de HPA. Por exemplo, é conhecido que o déficit em tirosina causada por 25 resultados de HPA em uma deficiência em neurotransmissores dopamina e serotonina. Desse modo, no contexto da presente invenção, é considerado que BH4 e proteína dietética com base em métodos poderiam ser também combinadas com administração de neurotransmissores L-dopa, carbidopa e 5-hidroxitriptofano para corrigir os defeitos que resultam em quantidades diminuídas de tirosina na dieta.

Além disso, terapia de gene com ambos PAH (Christensen e outros, Mol. Gent. E

Metabol. 76: 313-318, 2002; Christensen e outros, Gene Therapy, 7:1971-1978, 2000) e fenilalanina amônia-liase (PAL Liu e outros, Arts. Cells, Blood. Subs and Immob. Biotech. 30(4)243-257, 2002) foi considerado por aqueles de experiência na arte. Tais técnicas de terapia de gene poderiam ser usadas em combinação com a restrição de proteína 35 BH4/dietética com base em terapias da invenção. Em outras terapias de combinação, é considerado que fenilase pode ser fornecida como uma enzima injetável para destruir concentrações de Phe mais baixas no paciente. Como a administração de fenilase não geraria tirosina (administração distinta de PAH), tal tratamento ainda resultará em tirosina sendo um aminoácido essencial para tais pacientes. Portanto, suplementação dietética com tirosina pode ser desejável para pacientes recebendo fenilase em combinação com a terapia de BH4.

BH4 pode ser co-administrado para transtornos neuropsicológicos ou neuropsiquiá

tricos de acordo com o método da invenção com um ou mais outros agentes ativos neuropsiquiátricos, incluindo antidepressivos, precursores neurotransmissores tal como triptofano, tirosina, serotonina, agentes que ativam sistemas noradrenérgicos, tal como lofepramina, desipramina, reboxetina, tirosina, agentes que agem preferencialmente em serotonina, inibi10 dores combinados de captação de noradrenalina e serotonina, tal como venlafaxina, duloxetina ou milnaciprano, ou fármaco que são inibidores combinados de recaptação de dopamina e noradrenalina tal como bupropiona.

Em uma modalidade relacionada, BH4 é administrado com outros agentes terapêuticos geralmente usados para tratar diabetes, doença vascular, hiperlipidemia. Agentes usados para tratar diabetes, incluíam porém não Iimitaados a agentes que melhoram sensibilidade à insulina tal como Iigantes de PPAR gama (tiazolidinedonas, glitazonas, troglitazonas, rosiglitazona (Avandia), pioglitazona), estimuladores de secreção de insulina tal como sulfoniluréias (gliquidona, tolbutamida, glimeprida, clorpropamida, glipizida, gliburida, acetoexamida) e meglitinidas (meglitinida, repaglinida, nateglinida) e agentes que reduzem produção do fígado de glicose tal como metformina. O agente usado para tratar doença vascular, incluí porém não limitado a antagonistas de receptor de endotelina geralmente usado para o tratamento de hipertensão e outros distúrbios relacionados a disfunção endotelial, tal como bosentan, darusentan, enrasentan, tezosentan, atrasentan, ambrisentan sitaxsentan; relaxantes do músculo liso tal como inibidores de PDE5 (ação indireta) e minoxidila (ação direta); inibidores de enzima de conversão de angiotensina (ACE) tal como captopril, enalapril, lisinopril, fosinopril, perindopril, quinapril, trandolapril, benazepril, ramipril; bloqueadores de receptor de angiotensina Il tais como irbesartana, losartana, valsartana, eprosartana, olmesartana, candesartana, telmisartan; beta bloqueadores tal como atenolol, metoprolol, nadolol, bisoprolol, pindolol, acebutolol, betaxolol, propranolol; diuréticos tais como hidroclorotiazida, furosemida, torsemida, metolazona; bloqueadores de canal de cálcio tal como amlodipina, felodipina, nisoldipina, nifedipina, verapamil, diltiazem; bloqueadores de alfa receptor doxazosina, terazosina, alfuzosina, tamsulosina; e alfa agonistas centrais tal como clonidina. Agentes usados para tratar hiperlipidemia, incluem porém não limitados a agentes que baixam LDL tal como estatinas (atorvastatina, fluvastatina, lovastatina, pravastatina, cálcio de rosuvastatina, sinvastatina) e ácido nicotínico, inibidores de proteína de transferência de éster de colesterila (tal como torcetrapib), agentes que estimulam PPAR alfa tal como fibratos, genfibrozil, fenofibrato, bezafibrato, ciprofibrato, agentes que ligam e previnem reabsorção de ácidos biliares e reduzem níveis de colesterol tal como sequestrantes de ácido de bílis, colestiramina e colestipol, e inibidores de absorção de colesterol.

BH4 pode da mesma forma ser administrada com um fator ou combinação de fatores que realçam ou normalizam a produção do vasodilatador óxido nítrico (NO) sozinho ou 5 em combinação com um agente terapêutico. Em uma modalidade, tais fatores(s) realça(m) a atividade ou expressão da biogênese de novo de BH4 e é(são) selecionado(s) a partir do grupo que consiste em guanosina trifosfato cicloidrolase I (GTPCHI), 6- piruvoiltetraidropterina sintase (PTPS) e sepiapterina reductase. Em uma modalidade preferida da invenção, síntese de BH4 é aumentada aumentando-se a expressão de expressão 10 de GTPCHI pelo uso de qualquer um ou mais análogos ou agonistas de monofosfato de adenosina cíclica (cAMP) incluindo forscolina, 8-bromo cAMP ou outros agentes que funcionam para aumentar sinalização de célula mediada por cAMP, por exemplo, citocinas e fatores de crescimento incluindo interleucina-1, interferon-gama (IFN-γ), fator de necrose de tumor alfa (TNF-α), proteína c-reativa, HMG-CoA-reductases (estatinas como atorvastatina) 15 fator de crescimento de nervo (NGF), fator de crescimento epidérmico (EGF), hormônios incluindo adrenomedulina e benzoato de estradiol, e outros compostos tais como NADPH e análogos de NADPH, cafeína, ciclosporina A metil-xantinas incluindo 3-isobutil-1-metil xantina, teofilina, reserpina, peróxido de hidrogênio.

Uma modalidade da invenção portanto refere-se a níveis de GTPCHI crescentes i20 nibindo-se a degradação de nucleotídeos 3'5'-cíclicos usando inibidores das onze famílias de fosfodiesterases (PDEI-11) incluindo PDE1, PDE3, PDE5. Os inibidores de PDE da presente invenção incluem Viagra / sildanefila, cialis / tadalafila, vardenafil / levitra, udenafil, 8- Metoximetil-IBMX, UK-90234, dexametasona, hesperetina, hesperedinas, Irsogladina, vinpocetina, cilostamida, rolipram, beta-carbolina-3-carboxilato de etila (beta-CCE), derivados 25 de tetraidro-beta-carbolina, 3-O-metilquercetina e similares.

Outra modalidade da invenção refere-se para aumentar os níveis de BH4 aumentando-se os níveis de sintetização BH4 por terapia de gene ou liberação alvejada por endotélio de polinucleotídeos da maquinaria sintética de BH4. Ainda outra modalidade da invenção refere-se para aumentar os níveis de BH4 por suplementação com enzimas de sinteti30 zação de BH4- GTPCHI, PTPS, SR, PCD, DHPR e DHFR. É considerado que enzimas de sintetização de BH4 abrangem todas as formas naturais e não naturais das enzimas incluindo mutantes das proteínas.

Outra modalidade da invenção refere-se a níveis de BH4 crescentes desviando-se o substrato trifosfato de 7,8-diidroneopterina para enzima de sintetização de BH4 PTPS em vez de fosfatase alcalina (AP) inibindo-se atividade de AP. Os agentes ou compostos que inibem a atividade de AP incluem análogos de fosfato, levamisol, e L-Phe. Outra modalidade da invenção refere-se a agentes ou compostos que inibem fosfatase alcalina inclui o RNA inibitório pequeno (siRNA), RNA antisentido, dsDNA, moléculas pequenas, anticorpos de neutralização, única cadeia, quiméricas, humanizadas e fragmentos de anticorpo para inibir a síntese de fosfatase alcalina.

Outra modalidade da invenção inclui agentes ou compostos que realçam a atividade de catalisadores ou co-fatores necessários para a síntese de enzimas da série de reação de síntese de novo de síntese de BH4.

Outra modalidade da invenção inclui agentes ou compostos que previnem a degradação das enzimas necessárias para a síntese de BH4. Ainda outra modalidade da invenção inclui agentes ou compostos que previnem a degradação dos catalisadores necessários para a síntese de BH4 e suas enzimas sintéticas incluindo GTPCHI, PTPS e SR.

Outra modalidade da invenção refere-se para aumentar os níveis de BH4 aumentando-se a redução de BH2 pela série de reação de salvamento. In vivo, BH4 é oxidado a BH2. BH2 que existem como a forma quinóide (qBH2) e como a 7,8-diidropterina que é reduzida em BH4 por DHPR e DHFR respectivamente. Uma modalidade da invenção refere15 se a aumentar a regeneração ou salvamento de BH4 de BH2 modulando-se a atividade e síntese das enzimas PCD, DHPR e DHFR usando agentes ou compostos que série de reação NADPH, tióis, percloromercuribenzoato, peróxido de hidrogênio e similares.

Outra modalidade da invenção refere-se a com agentes que estabilizam BH4 diminuindo-se a oxidação de BH4 usando agentes ou compostos tais como antioxidantes incluindo ácido ascórbico (vitamina C), alfa tocoferol (vitamina E), tocoferóis (por exemplo vitamina A), selênio, beta-caroteno, carotenóides, flavonas, flavonóides, folatos, flavonas, flavanonas, isoflavonas, catequinas, antocianidinas, e calconas.

Em uma outra modalidade, tais facore(s) pode(m) aumentar a atividade ou expressão de óxido nítrico sintase e desse modo pode realçar a geração de NO.

Em ainda outra modalidade, a invenção considera fatores que inibem a proteína re

guladora de realimentação de GTPCH, GFRP. Uma modalidade da invenção refere-se a agentes ou compostos que inibem a ligação de BH4 ao complexo de GTPCH1/GFRP, desse modo prevenindo a inibição de reavaliação por BH4. Agentes ou compostos desta invenção incluem inibidores competitivos tal como formas alternadas de BH4 com afinidades alteradas 30 pelo complexo, análogos estruturais etc. Ainda outra modalidade da invenção inclui agentes ou compostos que realçam a ligação de L-fenilalanina a CTPCH1/GFRP induzindo a síntese de BH4. Outra modalidade da invenção inclui agentes ou compostos que aumentam os níveis de L-Phe tal como precursores de L-Fenilalania, que serve para inibir a inibição de reavaliação de GTPCHI por GFRP e BH4.

Ainda outra modalidade da invenção refere-se a agentes ou compostos que modu

lam a atividade ou a síntese de GFRP. Uma modalidade da invenção inclui agentes ou compostos que inibem a atividade de GFRP. Outra modalidade da invenção inclui o uso de siRNA, moléculas pequenas, anticorpos, fragmentos de anticorpo e similares para inibir a síntese de GFRP.

VI. Ensaio de biopterina

A concentração de biopterina total e biopterina oxidada no plasma, sangue e outros tecidos é determinada com base no método de Fukishima e outros (Anal. Biochem. 102:176 (1980). Biopterina tem quatro formas diferentes incluindo duas formas de biopterina reduzida, R-tetraidrobiopterina (BH4) e R-diidrobiopterina quinonóide (q-BH2) e duas formas de biopterina oxidada, diidrobiopterina (BH2) e biopterina (B). Destas quatro formas, apenas as formas reduzidas de biopterina têm atividade coenzimática. Biopterina reduzida é convertida a B por iodilação sob condições ácidas, visto que sob condições alcalinas, é convertida a pterina. Biopterina oxidada é convertida em B por iodilação sob condições ácidas e alcalinas. Tirando-se vantagem desta propriedade, a quantidade de biopterina total é determinada em iodilação sob condições ácidas e que a partir de biopterina oxidada é determinada em iodilação sob condições alcalinas, de forma que a quantidade de biopterina reduzida é calculada a partir da diferença em quantidade da mesma. Quando usado como uma coenzima, BH4 é convertida em q-BH2. O q-BH2 é imediatamente convertido em BH4 por diidropterina reductase ou se não reduzida, é oxidada em BH2 ou DHPT. Porque é difícil para biopterina existir na forma de q-BH2 in vivo, a biopterina reduzida pode ser bem deslocada como BH4.

Amostras de sangue totais e plasma coletadas são imediatamente submetidas a oxidação com solução de oxidação ácida (0,6N de solução de HCI em água contendo 0,6% de iodeto de potássio (Kl), 0,3% de iodo (12) e 0,6N de ácido tricloroacético (TCA)) e solução de oxidação alcalina (0,7N de hidróxido de sódio (NaOH)). Determinação de B é realizada por HPLC e a radioatividade é medida usando uma contadora de cintilação líquida.

Medida de BH4 usando HPLC de Fase Reversa (RP) Acoplada com Espectrometria de Massa Tandem (LC/MS/MS): O uso combinado de cromatografia líquida de alto desempenho de fase reversa (RP) e espectrometria de massa tandem (LC/MS/MS) foi mostrada ser seletiva para BH4 em plasma humano, sensível para BH4 na faixa de 5 - 1000 ng/mL. O método é associado com cerca de 50% de conversão de BH4 devido à oxidação durante coleção e armazenamento. Amostras são estáveis durante mais do que 3 meses em sal de dipotássio de plasma de ácido etilenodiaminatetraacético (K2EDTA). Recuperação das etapas de pré-tratamento é cerca de 75%. A exatidão e precisão do método foi determinada para ter coeficiente de variação (CV)% abaixo de 15% (20% no limite inferior de quantitação, LLOQ).

O uso combinado de HPLC e espectrometria de massa tandem foi mostrado para ser uma melhoria em HPLC apenas determinando-se o artigo de teste BH4 por causa de: (1) sua seletividade aumentada para fármaco-BH4 (visto que HPLC mede biopterina total), (2) faixa qualitativa mais ampla, (3) relação de conversão estabelecida, (4) caracterização extensa e fornece utilidade em indivíduos humanos, e (5) medida novos e útil em matrizes e espécies diferentes.

O método melhorado compreende as seguintes etapas. Amostras de sangue, plasma, homogenados de tecido, ou urina são submetidos a oxidação ácida ou alcalina. Com oxidação ácida, (1) as amostras são tratadas com cloreto de potássio (KCI), ácido clorídrico (HCI) ou TCA durante uma hora; (2) as amostras oxidadas de ácido são em seguida submetidas à iodometria; (3) as amostras são conduzidas por uma coluna de troca iônica; (4) biopterina total compreendendo BH4, q-BH2 (que é imediatamente reduzida in vivo para BH4 tal que a biopterina reduzida medido é principalmente baseada em BH4), BH2, e B são medidas usando HPLC e espectrometria de massa tandem. Com oxidação alcalina, (1) as amostras são tratadas com K1, 12 ou NaOH durante uma hora; (2) as amostras oxidadas alcalinas são em seguida submetidas à acidificação com HCI ou TCA; (3) submetidas à iodometria; (4) as amostras são conduzidas através de uma coluna de troca iônica; (5) biopterina oxidada compreendendo BH2 e B são medidos; (6) espécies diferentes são medidas usando HPLC e espectrometria de massa tandem; e (7) a quantidade de biopterina reduzida (BH4 + q-BH2) é calculada como a diferença entre biopterinas totais menos a forma oxidada.

Fluxogramas para medida de biopterina e sumário de validação de ensaio são fornecidos nas Figuras 16 e 17.

Ensaio Otimizado

Um método de HPLC usando Detecção Electroquímica (ECD) e detecção de Fluo

rescência (FL) é vantajoso quando permite a medida de cada um dos compostos de biopterina discretos (BH4, BH2 e B) bem como análogos.

BH4 é um co-fator para o óxido nítrico de sistema de enzima sintase (NOS), que produz óxido nítrico (NO). A produção de NO é importante para manter a homeostasia vas25 cular. Quando níveis intracelulares de BH4 são limitados, produção de NO é diminuída (devido a atividade de NOS diminuída) e leva à geração do superóxido de radical livre prejudicial (O2-). O2- em excesso pode levar à disfunção endotelial e pode contribuir à oxidação de BH4 a BH2. Uma relação baixa de BH4 a BH2 pode promover lesão endotelial, visto que uma relação de BH4 a BH2 alta pode promover saúde endotelial. Portanto, caracterizando a 30 relação de BH4 a BH2 podem servir como um prognosticador de saúde de endotelial.

As concentrações de biopterinas diferentes (BH4, BH2 e B) ou análogos são determinadas inicialmente usando-se HPLC de fase reversa para separação, seguido por detecção de ECD e FL.

BH4 que é uma molécula sensível a redox, não fluorescente é medida usando ECD. BH4 (e análogos do mesmo) é medido usando ECD em que BH4 (ou análogo) é oxidado por eletrodo 1 em uma forma de diidrobiopterina quinonóide (por exemplo, qBH2), um intermediário de diidrobiopterina de vida curta, que é em seguida reduzido outra vez a BH4 (ou análogo) em eletrodo 2. O detector em seguida usa a corrente gerada por esta reação de redução para determinar a concentração de BH4 ou análogo do mesmo (qBH2 endógeno é despresível).

BH2, B, e análogos dos mesmos podem ser medidos na mesma injeção por detec5 ção de de fluorescência. Oxidação pós ECD de BH2 ou um análogo do mesmo usando uma célula de guarda de condicionamento no potencial ideal oxida BH2 ou um análogo do mesmo a B ou o análogo de biopterina correspondente. Isto é desejável porque BH2 não é fluorescentemente ativo ou facilmente medido e deve ser convertido em B que é facilmente medido usando fluorescência. BH2 endógeno, uma vez convertido a B, e B endógeno são dis10 tintos um do outro por dois picos fluorescentes separados, devido aos tempos de retenção diferentes na coluna de HPLC para cada molécula.

No total os métodos podem ser usados para medir as espécies BH4, BH2, e B, e análogos das mesmas. As biopterinas preferivelmente são medidas usando uma fase móvel contendo MeOH a 2%, como descrito aqui. Análogos de biopterina, tais como derivados de biopterina de valina, podem ser melhor adequados a teores de metanol mais altos na fase móvel, por exemplo uma fase móvel contendo MeOH a 10%.

Desse modo, um método para detectar biopterinas em uma mistura de espécies de biopterina pode incluir (a) separar espécies de biopterina na mistura por HPLC de fase reversa; e no caso de BH4 e análogos do mesmo, (b1) realizando detecção eletroquímica oxi20 dando-se a BH4 e análogos do mesmo presentes por um primeiro eletrodo para formas de diidrobiopterina quinonóide, seguido por redução das formas quinonóides a BH4 e análogos dos mesmos presentes em um segundo eletrodo, e medindo corrente gerada pela reação de redução para determinar a concentração de espécies; e/ou (b2) no caso de BH2, análogos do mesmo, biopterina, ou análogos da mesma, medindo tais espécies por detecção de fluo25 rescência seguindo oxidação pós-coluna de espécies de BH2 a biopterina. Preferivelmente, a fase móvel é uma descrita aqui.

Em uma modalidade, a fase móvel preferida inclui acetato de sódio, ácido cítrico, EDTA, e 1,4-ditioeritritol (DTE) com metanol. Concentrações preferidas são 50 mM de acetato de sódio, 5 de mM de ácido cítrico, 48 μΜ de EDTA, e 160 μΜ de DTE com 2% de metanol.

VII. Exemplos

Os seguintes exemplos estão incluídos para demonstrar modalidades preferidas da invenção. Deveria ser apreciado por aqueles de experiência na arte que as técnicas descritas nos exemplos que seguem representam técnicas descritas pelo inventor para funcionar 35 bem na prática da invenção, e desse modo pode ser considerado que constituem modos preferidos para sua prática. Entretanto, aqueles de experiência na arte devem, levando em conta a presente descrição, apreciar que muitas mudanças podem ser feitas nas modalidades específicas que são descritas e ainda obtêm um resultado igual ou similar sem afastarse do espírito e escopo da invenção.

EXEMPLO 1

Curva de Concentração-Tempo para Biopterina no Plasma Depois de uma Única Dose Oral no Rato

O propósito deste estudo foi avaliar os farmacocinéticos de BH4 depois de uma Cínica administração oral em ratos. Únicas doses de BH4 (10 e 100 mg/kg) foram administradas oralmente a ratos Sprague Dawley machos (6 semanas de idade) sob condições de jejum.

Resultados

As concentrações de biopterina totais máximas em plasma 2 horas e 1 hora pósdosagem foram 108 ng/ml (isto é, cerca de 3x o nível endógeno) e 1227 ng/ml (isto é, cerca de 30 x o nível endógeno), respectivamente (Figura 18). Depois disso, biopterina teve uma meia-vida de eliminação (t1/2) de cerca de 1,1 hora, retornando ao nível endógeno 9 horas 15 pós-dosagem para a dose de 10 mg/kg e 24 horas pós-dosagem para a dose de 100 mg/kg (Figura 18).

A biodisponibilidade (F) depois de um 10 e 100 mg/kg de administração oral foram 6,8% e 11,8%, respectivamente, com base na área sob a curva de Concentração-Tempo de plasma (AAUC) obtida subtraindo-se o nível endógeno durante uma administração intrave20 nosa de 10 mg/kg. Taxa de absorção de Gl foi 8,8% quando medida usando marcadores radioativos em urina. Uma estimativa do valor real seria aproximadamente 10% de biodisponibilidade oral com base nestes dados.

A relação de biopterina reduzida para biopterinas totais em plasma (isto é, a relação de forma reduzida) foi relativamente estática (73%-96%) (Figura 19).

EXEMPLO 2

Curva de Concentração-Tempo Para Biopterina Em Plasma Depois de Única Dose Oral para Macaco

O propósito deste estudo foi avaliar farmacocinéticas de sapropterina depois de uma única administração oral em macacos cinomolgos. Uma única dose de sapropterina (10 mg/kg) foi administrada oralmente a macacos cinomolgos fêmeas (3/grupo) sob condições de jejum.

Resultados

A concentração de biopterina de plasma total (AC) alcançou seu valor máximo 3 horas pós-dosagem (344 ng/ml, aproximadamente 20 x níveis endógenos) (Figura 20). A meiavida de eliminação de plasma de biopterina foi cerca de 1,4 horas, retornando ao nível endógeno dentro de 24 horas pós-dosagem. A relação de biopterina reduzida para biopterinas totais foi quase constante durante o período de teste. A biodisponibilidade (F) seguindo uma administração oral de 10 mg/kg a macacos fêmeas foi cerca de 9%, medido como relações de AAUC oral/iv (Figura 21).

EXEMPLO 3

Biodisponibilidade Relativa de Tetraidrobiopterina (BH4) Administrada Depois da Dissolução de Comprimido(s) em Água ou Administrada como Comprimido(s) Intacto(s), e Efeito de Alimentação em Absorção em Indivíduos Saudáveis Objetivos

Os objetivos primários do estudo foram: (1) avaliar a biodisponibilidade relativa de tetraidrobiopterina (BH4, diidrocloreto de sapropterina) quando administrada depois da dissolução de comprimido(s) em água ou administrada como comprimido(s) intacto(s); (2) comparar o efeito da alimentação na biodisponibilidade de BH4 em indivíduos saudáveis. O objetivo secundário do estudo foi avaliar a segurança e tolerabilidade de únicas doses orais de BH4 em indivíduos saudáveis.

Metodologia

Este estudo foi um estudo de reticulação de três períodos, seis seqüências, três tratamentos, aleatorizado de rótulo aberto em que 30 indivíduos foram completar 3 períodos de dosagem de única dose e foram aleatorizados para um de seis grupos de seqüências (Grupos 1, 2, 3, 4, 5, e 6):

Grupo 1: a, b, c Grupo 2: b, c, a Grupo 3: c, a, b Grupo 4: a, c, b Grupo 5: b, a, c Grupo 6: c, b, a

onde todos os grupos de dosagem receberam 10 mg/kg de BH4 oralmente como

segue:

a: administrado depois da dissolução de comprimido(s) em água determinado em jejum sob condições de jejum

b: administrado como comprimido(s) intacto(s) determinado em jejum sob condições de jejum

c: administrado como comprimido(s) intacto(s) determinado 30 minutos depois de começar a ingerir uma refeição com alto teor calórico, alto teor de gordura em condições alimentadas

Cada indivíduo recebeu uma única dose de 10mg/kg de BH4 durante cada período de tratamento. Um período de solapamento de pelo menos sete dias separou cada administração de dose. Uma avaliação pós-estudo foi realizada 5-7 dias depois da descarga do terceiro período de tratamento. Amostras de sangue para análise Farmacocinética (PK) foram tiradas em tempos de coleção marcados durante cada período de estudo: dentro de 30 minutos antes da dose, e 0,5, 1,0, 1,5, 2,0, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 5,0, 6,0, 8,0, 10,0, 12,0, 18,0, e 24,0 horas pós-dose.

Dose e Modo de Administração Comprimidos de BH4 foram administrados como 10 mg/kg de dosagens por período

de tratamento. Comprimidos foram administrados por a) dissolução em água determinada em um estado de jejum, b) como comprimidos intactos determinados em um estado de jejum, ou c) como comprimidos intactos determinados em um estado de alimentação.

Cada dose de fármaco de estudo foi preparada e administrada na forma líquida (so10 lução) misturada com água. O fornecimento de água foi água de torneira em temperatura ambiente. Soluções de dosagem foram preparadas dentro de 15 minutos de tempo de dose marcado. Dissolução do comprimido em líquido levou aproximadamente 1 a 3 minutos. Os comprimidos foram quebrados ou esmagados o copo de dosagem antes da dissolução para melhorar taxa de dissolução.

No tempo de dosagem matinal designado, BH4 foi administrada oralmente como o

número de comprimidos equivalentes a uma dose de 10 mg/kg, dissolvida em 120 mL de água ou suco de laranja. Cada indivíduo foi observado de perto como uma dose de 120 mL inteira foi consumida dentro de 15 minutos de preparação. Imediatamente depois que a dose foi consumida, o copo de dosagem foi enxaguado com 60 mL de água e o indivíduo consu20 miu o enxague. Um segundo enxague de água de 60 mL foi adicionado ao copo de dosagem e em seguida o indivíduo consumiu o segundo enxague. O procedimento de dosagem inteiro foi completado em um período de tempo de 1 minuto. Uma pessoa auxiliar qualificado inspecionou o copo de dosagem e a boca de cada indivíduo imediatamente depois da conclusão da dose para assegurar que a dose inteira foi consumida. Alternativamente, o indiví25 duo engoliu uma pílula que contém a BH4 em vez de dissolvê-la em água. Para cada indivíduo, os períodos de dosagem ocorreram com um mínimo de 7 dias entre doses.

Horário de Entrada de Alimento

Um lanche foi servido ao entardecer da verificação. Todos os indivíduos foram em seguida exegidos jejuar durante pelo menos 10 horas antes da dosagem.

Condições de Jejum

Indivíduos que recebem tratamentos administrados sob condições de jejum foram dosados depois que eles completaram um jejum durante a noite de 10 horas no mpinimo.

Os indivíduos continuaram a jejuar durante 4 horas pós-dose. Água foi permitida ad Iib durante o estudo exceto durante 1 hora anterior por 1 hora pós-dose. Refeições padronizadas foram fornecidas a cerca de 4 e 10 horas depois da administração de fármaco e em tempos apropriados depois disso.

Condições de Não Jejum Indivíduos recebendo tratamentos administrados sob condições de não jejum foram dosados depois de consumir refeição de café da manhã com alto teor de gordura, de alto teor calórico. Indivíduos receberam a seguir o café da manhã com alto teor de gordura (aproximadamente 50% de teor calórico total da refeição), e alto teor calórico (aproximada5 mente 1000 calorias) que começou 30 minutos antes da administração marcada da dose e terminou (última mordida tirada) dentro de 5 minutos antes da dosagem.

2 ovos fritos na manteiga

2 tiras de bacon

2 fatias de torrada com manteiga 4 onças de batatas picadas e fritas

8 onças de leite total

Esta refeição continha cerca de 150 calorias de proteína, 250 calorias de carboidrato, e 500-600 calorias de gordura. Uma refeição equivalente foi substituída com documentação do cardápio e teor calórico.

Os indivíduos em seguida jejuaram durante 4 horas pós-dose. Água foi permitida ad

Iib durante o estudo exceto durante 1 hora anterior por 1 hora pós-dose. Refeições padrões foram fornecidas em cerca de aproximadamente 4 e 10 horas depois da administração de fármaco e em tempos apropriados depois disso.

Duração de Tratamento

Três períodos de tratamento em única dose foram cada qual separados por um mí

nimo de 7 dias.

Uma visita de acompanhamento foi conduzida 5 a 7 dias depois da última visita de tratamento.

Variáveis de segurança: Avaliação e Métodos Segurança foi avaliada para todos os indivíduos que levam pelo menos uma dose

de BH4.

Eficácia e Medidas de Segurança Avaliadas e Fluxograma

Segurança foi avaliada registrando a incidência de eventos adversos, mudanças em parâmetros de ECG de 12 lead, sinais vitais e resultados de exame físico, e mudanças na referência em valores de teste de laboratório. O horário para estas avaliações é mostrado na Figura 22.

Exames Físicos e Sinais Vitais

Cada indivíduo sofreu um exame físico de rotina pelo investigador do estudo. O exame físico incluiu avaliação de cabeça, olhos, orelhas, nariz, garganta, pescoço, coração, tórax, pulmões, abdômen, extremidades, pulsos periféricos, estado neurológico, pele, e outras condições físicas de nota são avaliados. Este protocolo de estudo não requer exames genitourinários. Altura (em centímetros) e peso (em quilogramas) foram medidos e o índice de massa corporal (BMI) foi calculado (BMI = peso (kg)/[altura(m)]2).

Pressão arterial foi medida na posição sentada de acordo com as recomendações de American Heart Association. Indivíduos estavam em repouso com seus pés no chão durante 5 minutos na posição sentada quando a pressão arterial foi medida.

Frequência cardíaca (pulso) foi medida enquanto o indivíduo estava na posição

sentada.

Um registro de eletrocardiograma de 12 Iead padronizado (ECG) foi levado em avaliação e em descarga de estudo. ECGs foram avaliados por um investigador qualificado. Cópias do ECG e relatórios de avaliação foram mantidos como parte do arquivo de cada indivíduo.

A história médica, resultados de teste de laboratório clínico e sinal(ais) de ECG foram revisados e avaliados pelo Investigador Principal para determinar a elegibilidade clínica de cada indivíduo para participar no estudo.

Avaliações de Laboratório Clínico

Hematologia:

Os seguintes foram avaliados: hemoglobina, hematócrito, contagem de leucócito total e diferencial, eritrócito (RBC) e contagem de plaqueta.

Além disso, sangue foi testado quanto a Antígeno de Superfície de Hepatite B, Anticorpo de Hepatite C e Vírus da Imunodeficiência Humana (HIV).

Química:

Os seguintes foram avaliados: albumina, nitrogênio uréia do sangue (BUN), cretinina, bilirrubina total, fosfatase alcalina (ALP), aspartato transaminase (AST), alanina transaminase (ALT), sódio (Na+), potássio (K+), cloreto (Cl'), desidrogenase láctica (LDH), ácido úrico, e glicose.

Urinálise:

Os seguintes foram avaliados pelo método de dipstick de urina: pH, gravidade específica, proteína, glicose, cetonas, bilirrubina, sangue, nitrito, e urobilinogênio. Se proteína, sangue oculto, ou valores de nitrito estão fora da faixa, um exame microscópico é realizado. Amostras de urina foram da mesma forma testadas quanto a fármaco de abuso (an

fetaminas, barbituratos, benzodiazepinas, canabinóides, cocaína e opiáceos).

Eventos Adversos

Neste estudo, um evento adverso (AE) foi definido como qualquer ocorrência médica desfavorável em um indivíduo ou indivíduo de investigação clínica administrado BH4, em qualquer dose, se ou não tem uma relação causai com o evento. Um AE pode portanto ser qualquer sinal desfavorável e não intencionado (incluindo uma descoberta de laboratório anormal), sintoma, ou doença temporariamente associada com o uso de BH4, se ou não relacionada à BH4. Esta definição incluiu doenças intercorrentes ou lesões e exacerbação (aumento em frequência, severidade ou especificidade) de condições pré-existentes.

O período relatado para AEs começou com a primeira administração de BH4. O período relatado para eventos adversos sérios (SAEs) começou mais cedo, a partir do tempo 5 de sinalização do Consentimento Informado. SAEs foram definidos depois nesta seção. O investigador monitorou todos os AEs sob resolução ou, se o AE fosse determinado ser crônico, uma causa foi identificada. Se um AE permanecesse não resolvido à conclusão do estudo, o Pl e Monitor Médico fizeram uma avaliação clínica sobre quanto a se o acompanhamento continuado de AE estava garantido, e documentou os resultados. Avaliação de 10 severidade foi uma das responsabilidades do investigador na avaliação de AEs e SAEs. O investigador foi responsável para aplicar o seu julgamento clínico para avaliar a relação causai de cada AE a BH4.

Eventos Adversos Sérios

Um evento adverso sério (SAE) foi definido como qualquer AE que tem pelo menos um dos seguintes resultados:

Resultou em morte

Foi ameaçador à vida, isto é, colocou os indivíduos em risco imediato de morte do caso quando ocorreu

Esta definição não incluiu uma reação que, tivesse ocorrido em uma forma mais severa, poderia causar a morte

Requereu hospitalização de paciente ou prolongamento da hospitalização existente,

Admissão de um indivíduo ao hospital como um paciente como resultado de um AE, ainda se o indivíduo fosse liberado no mesmo dia, qualificado como hospitalização. Uma visita ao ambiente de emergência não constituiu hospitalização.

Resultou na incapacidade ou inaptidão persistente ou significante.

Um caso qualificado quando resultando em uma incapacidade ou inaptidão persistente ou significante se envolvido um rompimento substancial da capacidade do indivíduo realizar funções da vida habituais. Esta definição não é pretendida incluir experiências de significância médica relativamente secundária ou temporária.

Teve uma anomalia congênita ou defeito de nascimento, isto é, um AE que ocorreu

na criança ou feto do indivíduo expôsto ao fármaco de estudo antes da concepção ou durante gravidez

Teve um evento médico importante que não conheceu qualquer dos critérios anteriores, porém poderia expor o indivíduo ou requerer a intervenção médica ou cirúrgica para prevenir um dos resultados listados acima.

Mais do que um dos resultados anteriores poderia aplicar-se a qualquer evento específico. Conveniência de Medidas

As medidas de segurança neste estudo foram exames físicos rotineiros, sinais vitais, incidência de evento adversa e severidade, e procedimentos clínicos e de laboratório.

Medidas de Concentração de Fármaco Características farmacocinéticas de sangue (plasma) (PK) foram avaliadas depois

de cada dose de medicamento de estudo. Todos os indivíduos permaneceram sentados em uma posição vertical durante 4 horas pós-dose. As amostras de sangue foram retiradas dentro de 30 minutos antes da dose e em 0,5, 1,0, 1,5, 2,0, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 5,0, 6,0, 8,0, 10,0, 12,0, 18,0, e 24,0 horas pós-dose. Amostras foram coletadas em tubos Vacutainer® de topo 10 K2EDTA roxo de 6 mL apropriadamente rotulados. Amostras de sangue foram centrifugadas em aproximadamente 3000 rpm a 4°C durante 10 minutos. A partir do plasma resultante, exatamente 1mL foi removido de cada amostra usando uma pipeta, e colocado em um tubo de alíquota contendo 0,1% em p/v de ditioeritritol. A amostra foi tampada e vortexada durante cerca de 10 segundos usando um VWR Mini Vortexer em velocidade 6. Depois da con15 clusão destas etapas, a amostra foi congelada flash em um banho de isopropila / gelo seco e colocada em uma análise pendente de congelador a -70°C.

Aproximadamente 80 mL de sangue foram retirados durante cada período de tratamento (5 mL por ponto de tempo) para a análise de PK.

Farmacocinéticas:

Análise farmacocinética (PK) de dados de Concentração-Tempo de BH4 de plasma

foi realizada usando métodos não compartmentais para obter estimativas dos seguintes parâmetros de PK:

Concentração de plasma de pico (Cmáx) e tempo para concentração de pico (Tmáx), obtido diretamente a partir dos dados sem interpolação;

λζ, a taxa de eliminação terminal aparente constante, determinada por regressão li

near de Iog das concentrações de plasma terminais;

Área sob a curva de Concentração-Tempo de plasma a partir de tempo zero para o tempo da última concentração mensurável [AUC(O-t)], calculada pelo método trapezoidal linear;

A meia-vida de eliminação aparente (t1/2), calculada como 0,693/λζ;

Área sob a curva de Concentração-Tempo de plasma a partir do tempo 0 para infinidade [AUC(inf)] onde AUC(inf) = AUC(O-t) + CtZlz e C1 é a última concentração mensurável.

Estimação de taxa de absorção Indivíduos foram determinados uma dose oral ou intravenosa de 10 mg/kg de BH4,

seguido por medidas seriais de concentração de biopterina total de plasma para determinar a taxa de absorção de BH4 do trato gastrointestinal da área sob o aumento de concentração de biopterina total de plasma (ACp)-curva de tempo (AAUC). Foi antecipado que uma dose mais baixa de BH4 foi requerida quando administrada intravenosamente em comparação com BH4 administrado oralmente para obter o mesmo nível de biodisponibilidade. Por exemplo, pode requerer 10 mg/kg de BH4 determinados oralmente para obter o mesmo nível 5 de biodisponibilidade como 1 mg/kg de BH4 administrado intravenosamente. Porque a maneira de administração realçou biodisponibilidade, pode requerer apenas 5 mg/kg de BH4 para obter o mesmo nível de biodisponibilidade como um 1 mg/kg de dose IV de BH4.

A taxa de absorção de BH4 do trato gastrointestinal foi calculada a partir da área sob o aumento de concentração de biopterina total de plasma (ACp)-curva de tempo (AAUC) depois da administração BH4 usando as seguintes fórmulas:

Estimativa a partir de AUC

Taxa de Absorção (%) =

(AAUC depois da dose p.o. / AAUC depois da dose i.v.) X (dose i.v. / dose p.o. x

100)

Métodos Estatísticos:

Comparação dos parâmetros farmacocinéticos Cmáx, AUC(O-t), e AUC(inf) para BH4 foi administrada usando uma análise de modelo de variação (ANOVA) com seqüência, submetido dentro de seqüência, tratamento, e período como as variáveis de classificação usando os logaritmos naturais dos parâmetros como as variáveis dependentes. As comparações 20 de interesse estavam entre o comprimido dissolvido e intacto no estado jejuado e o comprimido intacto nos estados alimentados e jejuados.

Os dados a partir de todos os indivíduos completando dois períodos de estudo foram incluídos nas análises estatísticas de PK. Todos os indivíduos receberam pelo menos uma dose de fármaco de estudo foram incluídos nas análises de segurança.

Todos os PK e análises estatísticas associadas foram feitos usando SAS® para

Windows® Versão 9.1.3 ou superior.

Para fornecer poder suficiente para conhecer os objetivos do estudo, um tamanho de amostra de aproximadamente 30 indivíduos, cada qual com 3 períodos de tratamento, foi considerado adequado para fornecer estimativas das comparações de diferenças de interesse. Nenhum cálculo de tamanho de amostra formal foi conduzido.

Resultados

Farmacocinéticos

Comprimidos Intactos versus Dissolvidos

Concentrações de plasma médias de BH4 foram mais baixas quando BH4 foi administrada como um comprimido dissolvido comparado ao comprimido intacto (Figura 23 e 24). Cmáx média foi mais alta para o comprimido intacto como foram os valores médios para AUC(O-t) e AUC(inf) (Figura 25). As relações de média geométrica, comprimido intacto a dissolvido, variaram de 118% a 121% e os limites superiores dos intervalos de confiança de 90% associados foram maiores do que 125% (Figura 26), indicando um aumento estatisticamente significante em absorção quando o comprimido intato é administrado com diferença de refeição com alto teor de gordura, de alto teor calórico na absorção entre a administração de comprimido dissolvido e intacto. A média e faixa para Tmáx foram essencialmente a mesma para os comprimidos dissolvidos e intactos (Figura 25), sugerindo que o aumento visto com o comprimido intacto estava na extensão porém não na taxa de absorção.

Efeito de Alimento de Alto Teor Calórico, Alto Teor de gordura na Absorção de

Fármaco

Como esperado, administração do comprimido intacto com uma refeição de alto teor de gordura, alto teor calórico padrão resultou em um aumento substancial nas concentrações de BH4 de plasma médias (Figura 23) e valores médios para Cmáx, AUC(O-t), e AUC(inf) (Figura 25). As relações de média geométrica (alimentado para jejuado) variaram de 126% a 139% (Figura 26) e, por conseguinte, os limites superiores dos intervalos de confiança associados de 90% foram maiores do que 125%, indicando uma diferença estatisticamente significante no efeito de alimento em absorção comparado a comprimidos intactos. A média e faixa para Tmáx foram essencialmente as mesmas sob condições alimentadas e em jejum (Figura 25), sugerindo que o aumento visto com alimento estava na extensão, porém, não na taxa de absorção.

Seauranca:

Não houve eventos adversos sérios (SAEs) neste estudo. Cinco (5) indivíduos relataram um total de 9 eventos adversos (AE)s. Oito (8) destes 9 AEs foram avaliados como moderado e 1 foi avaliado como moderado na severidade. O AE mais comum foi dor de cabeça; 1 indivíduo que experimentou uma dor de cabeça moderada que foi avaliada como não relatada ao fármaco de estudo, e um indivíduo que experimentou dor de cabeça moderada em duas ocasiões, ambos dos quais foram avaliadas como possivelmente relacionado. Em todos, cinco eventos foram julgados estar não relacionado e 4 foram julgados estar possivelmente relacionada ao fármaco de estudo. Avaliações de saída do estudo, ECG e avaliações de exame físico foram completadas sem resultados clinicamente significantes.

Conclusões'.

Administração de BH4 como um comprimido intacto resultou em um 20% de aumento aproximado na extensão de absorção comparada a um comprimido dissolvido.

Administração de BH4 como um comprimido intacto com uma refeição com alto teor calórico, alto teor de gordura sob condições alimentadas resultou em um aumento aproximado de 30% na extensão de absorção comparada a condições jejuadas.

Nenhum assunto clinicamente significante e assuntos de parâmetros de segurança foram identificados nesta população de estudo. Não houve AEs considerados sério neste estudo. Entre os 9 AEs relatados, todos menos um, um exemplo de dor de cabeça, foi moderado, e foi avaliado não estar relacionado ao fármaco de estudo. Exemplos de fadiga e dor de cabeça foram os únicos AEs que estavam possivelmente relacionados ao fármaco de estudo, porém e estes foram avaliados como moderado em severidade.

EXEMPLO 4

Abordagens de Formulação Para Realçar a Biodisponibilidade de BH4 Duas formulações de controle (formulação intravenosa de BH4 e comprimido de BH4 para solução oral) e seis formulações de teste foram selecionadas para testar em estudos de animal. Cada protótipo de formulação continha 80 mg ou 100 mg de BH4.

Formulações Intravenosas de BH4

Tabela 3 lista a composição de uma formulação intravenosa. BH4 foi passado através de uma peneira inoxidável de malha #20 antes do uso enquanto manitol foi usado quando recebido. Esta formulação foi carregada como um pó em um frasco e constituída com água estéril para injeção antes da administração. Cada garrafa continha 100 mg de BH4 e 5 15 g de manitol em um frasco de copoliéster de tereftalato de polietileno clara (PETG) com um fechamento de topo de parafuso de polietileno de alta densidade branco (HDPE). Antes da administração, a formulação foi constituída com 100 mL de água estéril para injeção para produzir uma concentração final de 1 mg/mL. A formulação IV foi fornecida como um pó seco em uma garrafa, e cada garrafa continha o API e manitol. O pó foi dissolvido em água 20 estéril para injeção e filtrado antes da administração por rotina IV.

Tabela 3 - Composição de Formulação IV de BH4

Ingredientes % (p/v) mg/mL BH4 0,1 1,0 Manitol (baixo em 5,0 50,0 endotoxina), USP/Ph.Eur. Agua estéril para injeção qs 100 mL qs 1 mL Comprimido de BH4 para Solução Oral

Tabela 4 lista a composição de uma formulação de solução oral. Dez (10) comprimidos de BH4 (100 mg) foram colocados em um frasco de PETG granulada de 125 mL com um fechamento de HDPE branco. Antes da administração, a formulação foi constituída com 100 mL de água estéril para injeção para produzir uma concentração final de 10 mg/mL.

Tabela 4 Composição de Comprimido de BH4, 100 mg

Ingredientes % (P/P) mg/comprimido BH4 33,33 99,99 Acido ascórbico, USP/EP, 1,67 5,01 Crospovidona, USP/EP, 4,5 13,5 Fosfato de Dicálcio Anidroso, USP/EP 2,18 6,54 Manitol (Parteck M 200), UPS/EP 57,06 171,18 Riboflavina universal, USP/EP 0,01 0,03 Fumarato de Estearila de Sódio (PRUV), 1,25 3,75 NF/EP Total 100,00 300,00 Protótipo de Formulação para Reduzir a Motilidade Gastro-Intestinal Tabela 5 lista a composição de um protótipo de tempo esvaziamento gástrico atrasado. BH4 foi passado através de uma peneira inoxidável de malha #20 antes do uso. O Capmul GMO-50 foi fundido em um banho de água a 37°C. BH4 e ácido ascórbico foram 5 pesados e adicionados lentamente ao Capmul fundido enquanto agitando vigorosamente. A dispersão sólida foi adicionada gota a gota em uma cápsula de tamanho #2 usando uma pipeta. Três cápsulas cheias foram colocadas em um frasco de polietileno de alta densidade 100 cc (HDPE) com um fechamento de selo por indução de calor.

Tabela 5 Composição de Formulação de Cápsula Oral de Tempo de Esvaziamento Gástrico Atrasado de BH4

Ingredientes %(p/p) mg/cápsula BH4 25 80 Mono/di-oleato de glicerila 65 208 (Capmul GMO-50) Pó fino de ácido ascórbico 10 32 Total 100 320 Protótipo Bioadesivo

Tabela 6 lista a composição de um protótipo bioadesivo. Todos os materiais, exceto para Carbopol 71G, foram passados através de uma peneira de aço inoxidável de malha #20. Todos os materiais foram pesados e adicionados a uma sacola plástica tendo um fe15 chamento zip-locking que foi em seguida agitado durante alguns minutos até que a mistura parecesse uniforme. O pó foi prensado em um comprimido usando uma ferramenta padrão Ya”, redonda, côncava, de face plana B em uma prensa manual Globe Pharma MTCM-I em 42,18 kg/cm2. Três comprimidos juntamente com uma vasilha dessecante em sílica gel foram empacotados em um HDPE de 100 cc com um fechamento de selo por indução de ca20 lor.

Tabela 6 Composição de Formulação de Comprimido Oral Bioadesiva de BH4

Ingredientes % (P/P) mg/comprimido BH4 48,5 80,00 Carbopol 71 G 20,0 32,99 Polycarbophil (Noveon AA1) 20,0 32,99 Pó fino de ácido ascórbico 10,0 16,49 Fumarato de Estearila de sódio (PRUV) 1.5 2,47 100,0

164,94

Total

Protótipo de Liberação Prolongada

Tabela 7 lista a composição de um protótipo de liberação prolongada testado no macaco. Todos os materiais, exceto para Methocel KIOOM Premium CR, foram passados através de uma peneira de aço inoxidável de malha #20. Todos os materiais foram pesados e adicionados a um sacola plástica tendo fechamento zip-locking, que foi em seguida agitado durante alguns minutos até que a mistura parecesse uniforme. O pó foi prensado em um comprimido usando uma ferramenta padrão Ví", redonda, côncava, de face plana B em uma prensa manual Globe Pharma MTCM-I em 8,43 kg/cm2. Os comprimidos juntamente com uma vasilha dessecante em sílica gel foi empacotada em um frasco de 100 HDPE com fechamento de selo por indução de calor.

Tabela 7 Composição de Formulação Comprimido Liberação Prolongada de BH4

Ingredientes % (P/P) mg/comprimido BH4 53,5 βΟ,ΟΟ Methocel K100M premium CR 35,0 52,34 Pó fino de ácido ascórbico 10,0 14,95 Fumarato de Estearila de Sódio (PRUV) 1,5 2,24 Total 100,0 149,53 Protótipo de Polímero Doador de Próton

Tabela 8 lista a composição de um protótipo de polímero doador próton testado no macaco. Todos os materiais, exceto para Eudragit L100-55 e Kollidon CL, foram avaliados 15 usando uma peneira de aço inoxidável de malha #20. Todos os materiais foram pesados e adicionados a uma sacola plástica tendo um fechamento zip-closing, que foi em seguida agitado durante alguns minutos até que a mistura parecesse uniforme. Uma quantidade prépesada de pó foi carregada em uma cápsula de tamanho #2.

Uma solução de revestimento foi preparada dissolvendo-se Eudragit L100-55 e Carbowax PEG 4600 em Álcool Etílico. O Eudragit L100-55 e Carbowax PEG 4600 foram pesados e adicionados a um frasco de copoliéster de tereftalato de polietileno granulado de 125 mL (PETG). O Álcool etílico foi adicionado ao frasco de PETG, e foi colocada em um banho de água a 40°C com sonicação até que a solução ficasse clara.

As cápsulas carregadas em pó foram manualmente imersas na solução de revestimento e permitdas secar a 40°C durante 20 minutos. As cápsulas secadas foram pesadas e em seguida roladas em Siloid FP244 para remover a viscosidade residual. Três cápsulas foram empacotadas em um frasco de HDPE 100 cc com um fechamento de selo por indução de calor.

Tabela 8 Composição de Formulação de Cápsula Doadora de Próton de BH4 Ingredientes % (P/P) mg/cápsula Composição de Cápsula BH4 40,0 80 EudragitLI 00-55 44,5 89 Crospovidona (Kollidon CL) 4,0 8 Pó fino de ácido ascórbico 10,0 20 Fumarato de Estearila de Sódio (PRUV) 1,5 3 Total 100,0 200 Ingredientes % (P/P) mg/cápsula1 Composição de Revestimento de Cápsula Eudragit L100-55 5,0 ND Polietileno glicol 4600 5,0 ND (Carbowax Sentry) Álcool etílico, de graduação 200 100 mL ND 1 Seguindo revestimento e secagem da cápsula no forno a 40°C, a cápsula ganha 1 a 3% de peso em revestimento de polímero.

ND = Não Determinado

Sistema de Liberação Flutuante Tabela 9 lista a composição de um sistema de liberação flutuante. Todos os materi

ais, exceto para Eudragit L100-55, foram pesados através de uma peneira de aço inoxidável de malha #20. Este protótipo de comprimido compreendeu três camadas; a camada mediana continha a substância de fármaco, que foi intercalada entre duas camadas externas insolúveis em água. Os materiais internos e exteriores foram pesados e separadamente adicio10 nados a sacolas plásticas tendo fechamentos zip-locking, que foram em seguida agitados até que as misturas pareceram uniformes.

As duas camadas externas (12 mg cada) e camada interna (14,5 mg) foram pesadas. Um das camadas externas foi adicionada à prensa, seguida pela camada interna, e em seguida a última camada externa. As camadas foram prensadas em um comprimido usando uma Estampagem B de face plana, chanfrado, redondo 3/16", em uma prensa manual Globe Pharma MTCM-I em 14,06 kg/cm2.

Uma solução de revestimento foi preparada dissolvendo-se Etocel e PEG 4600 em uma mistura de álcool etílico e água purificada. Os ingredientes foram adicionados a um frasco de PETG, que foi misturada e colocada em um banho de água a 40°C com sonicação até que a solução pareceu clara.

Os comprimidos foram manualmente imersos na solução de revestimento e permitidos secar durante 20 minutos a 40°C. Cada comprimido foi re-pesado depois do revestimento. Sete (7) comprimidos foram colocados em cada uma das cápsulas alongadas de tamanho #2. Três cápsulas foram empacotadas em um frasco 100 cc HDPE com um fechamento de selo por indução de calor.

Tabela 9 Composição de Formulação de Dosagem Flutuante de BH4

Ingredientes % (P/P) mg/comprimido Camada Exterior 1 e 3 Eudragit L100-55 49,5 5,94 Acido Esteárico 49,5 5,94 Fumarato de Estearila de Sódio (PRUV) 1,0 0,12 Total 100,0 12,00 Ingredientes % (P/P) mg/comprimido Camada mediana 2 BH4 79,0 11,46 Acido Esteárico 10,0 1,45 Pó fino de ácido ascórbico 10,0 1,45 Fumarato de Estearila de sódio 1,0 0,15 Total 100,0 14,51 Ingredientes % (p/p) mg/cápsula 7 comprimidos em uma Cápsula BH4 29,8 80,19 Acido Esteárico 34,6 93,31 Pó fino de ácido ascórbico 3,8 10,15 Eudragit L100-55 30,8 83,16 Fumarato de Estearila de sódio (PRUV) 1,0 2,70 Total 100,0 269,51 Ingredientes % (P/P) mg/cápsula1 Solução de Revestimento de Comprimido Ethocel Padrão 10 FP 5,0 ND Carbowax PEG 4600 5,0 ND Etanol de graduação 200 95,0 mL ND Agua purificada 5,0 mL ND 1 Seguindo o revestimento de cápsula e secagem no forno a 40°C, a cápsula ganha cerca de 3 a 8% em peso de revestimento de polímero.

ND = Não Determinado

Sistema de Liberação Flutuante de Geração de Gás

Tabela 10 lista a composição de um sistema de liberação flutuante de geração de gás. Esta formulação foi composta de um comprimido de núcleo contendo a substância de fármaco cercado por uma camada externa de geração de gás. Todos os materiais, exceto 10 para bicarbonato de sódio e Methocel K100M CR, foram pré-avaliados usando uma peneira de aço inoxidável de malha #20. O núcleo interno e materiais de camada externaes foram pesados e adicionados separadamente em sacolas plásticas tendo fechamentos zip-locking, que foram fechados e agitados até que a mistura parecesse uniforme. O pó misturado ao núcleo interno (35 mg) foi prensado em um comprimido usando uma ferramenta redonda de 1/8", inclinada, de face plana B em uma prensa manual Globe Pharma MTCM-I em 56,24 kg/cm2.

Uma solução de revestimento foi preparada dissolvendo-se usando Ethocel e PEG 4600 em álcool etílico. Os comprimidos de núcleo interno foram manualmente imersos na 5 solução de revestimento e permitidos secar durante 20 minutos a 40CC. O pó misturado para a camada externa (40 mg) foi pesado. Uma metade foi adicionada à prensa, seguido pelo comprimido de núcleo interno, e em seguida a segunda metade da camada externa. O comprimido foi comprimido usando uma ferramenta redonda de 3/16", inclinada, de face plana B em uma prensa manual Globe Pharma MTCM-I em 56,24 kg/cm2. Quatro (4) comprimidos 10 foram colocados em cada cápsula de tamanho #2.

Tabela 10 Composição de Formulação de Dosagem Flutuante de Geração de Gás

de BH4

Ingredientes % (P/P) mg/comprimido Núcleo de Comprimido Interno BH4 58,3 20,39 Pó fino de ácido ascórbico 19,4 6,80 HPMC K1OOMCR 19,4 6,80 Fumarato de Estearila de sódio (PRUV) 2,9 1,02 Total 100 35,01 Ingredientes % (p/p) mg/comprimido Camada de Comprimido Externa HPMC K1OOMCR 46,1 18,46 Ácido cítrico anidroso 34,2 13,68 Bicarbonato de sódio 17,1 6,84 Fumarato de Estearila de sódio 2,6 1,03 Total 100 40,01 Ingredientes % (P/P) mg/cápsula Quatro comprimidos em uma Cápsula BH4 27,2 81,55 Pó fino de ácido ascórbico 9,1 27,18 HPMC K1OOMCR 33,7 101,03 Ácido cítrico anidroso 18,2 54,70 Bicarbonato de sódio 9,1 27,35 Fumarato de Estearila de sódio 2,7 8,18 Total 100 299,99 Ingredientes % (P/P) mg/cápsula1 Solução de revestimento Ethocel Padrão 10 FP 5,0 ND 1 Seguindo revestimento e secagem da cápsula no forno a 40°C, a cápsula ganha peso no revestimento de polímero.

ND = Não Determinado Protótipo de Grânulo Bioadesivo

Tabela 11 lista a composição de um protótipo de grânulo bioadesivo. Todos os materiais, exceto para Methocel K100M CR, foram pré-avaliados usando uma peneira de aço inoxidável de malha #20. Todos os materiais, exceto do fumarato de estearila de sódio (PRUV), foram pesados e colocados em uma tigela de granulador de tamanho #1 (LB Bohle Mini Granulator BMG). O pó foi misturado em uma velocidade impulsora de 300 rpm e uma velocidade de corte de 2500 rpm durante cinco minutos até que a mistura parecesse uniforme. Mantendo as velocidades impulsora e de corte, 5 mL de álcool etílico foram adicionados gota a gota à mistura até que os grânulos se formassem. A massa úmida foi removida da tigela de granulação e avaliada através de uma peneira de aço inoxidável de malha 18. Os grânulos foram coletados e colocados em um forno a 40°C para secar durante uma hora. A perda em secagem dos grânulos foi determinada para ser 1,93% depois de uma hora de secagem. Os grânulos foram pesados e colocados em uma sacola plástica tendo um fechamento zip-locking. Fumarato de estearila de sódio (PRUV) foi adicionado aos grânulos secados na bolsa. A bolsa foi fechada e agitada até que o fumarato de estearila de sódio (PRUV) parecesse uniformemente distribuído entre os grânulos. Os grânulos foram pesados (134 mg). As cápsulas alongadas de tamanho 2 foram carregadas com porções dos grânulos alternando com gotas de óleo vegetal parcialmente hidrogenado (350 μί). Três cápsulas foram empacotadas em um frasco de HDPE de 100 cc com um fechamento de selo por indução de calor.

Tabela 11 - Composição de Formulação de Cápsula de Grânulo Bioadesivo de BH4

Ingredientes % (P/P) mg/cápsula BH4 60 80.00 Methocel K100M CR 19 25,33 Carbopol 971 10 13,33 Pó fino de Acido Ascórbico 10 13,33 Fumarato de Estearila Sódico (PRUV) 1 1,33 Óleo Pureco HSC-1 350 pL Total 100 133,33 Liberação de Fármaco In Vitro

Teste de liberação de fármaco In vitro de comprimidos foi conduzido de acordo com as especificações de aparato Il USP 27 usando um Verificador de Dissolução Distek 2100C 25 (Distek, Inc., North Brunswick, NJ), junto com um sistema de espectroscopia Visível a UV Agilent (Agilient Technologies, Santa Clara, CA). O meio de dissolução usado para o teste de liberação de BH4 foi 900 mL de 0,1 N de HCI. Durante o teste de dissolução, os meios em cada vaso foram mantidos a 37°C + 0,5°C e agitados em 50 rpm. Um volume de amostra de 5 mL foi retirado em pontos de tempo pré-determinados. Para determinar a concentração de 30 BH4 nas amostras, 250 μί de cada amostra foram diluídos com 500 μί de 0,1 N de HCI e a absorção foi medida em 265 nm usando um espectrômetro UV (8453 UV - Visible Spectrophotometer, Agilent Technologies, Santa Clara, CA). Os dados foram coletados usando o software ChemStation (Rev. A.09.01 [76], Agilent Technologies, Santa Clara, CA). Todos os testes de dissolução foram realizados em triplicata.

Teste de Flutuabilidade do Comprimido

A flutuabilidade dos comprimidos de protótipo flutuantes foi primeiro determinada colocando-se os comprimidos em copos plásticos com 25-50 mL de 0,1 N de HCI. Este teste determinou o tempo necessário para os comprimidos flutuarem bem como a duração de sua flutução sem agitação. Esses protótipos que flutuaram durante pelo menos quatro horas 10 foram submetidos ao teste de dissolução. Durante o teste de dissolução, a flutuabilidade dos comprimidos foi determinada empregando-se o método de pá em uma velocidade de rotação de 50 rpm. O estado dos comprimidos foi conferido visualmente em vários pontos de tempo.

Teste de Desintegração

Teste de desintegração foi conduzido de acordo com as especificações de teste

USP-27 usando um Verificador de Desintegração Distek 3100 Series (Distek Inc., North Brunswick, NJ). Os meios de desintegração usados foram 900 mL de 0,1 N de HCI ou 900 rnL de 0,2M de Fosfato de Potássio pH 5,8. Durante o teste de desintegração, os meios nos vasos foram mantidos a 37°C + 0,5°C. Os comprimidos e cápsulas foram inspecionados visualmente para desintegração.

Teste de Dureza do Comprimido

A dureza do comprimido foi determinada usando-se um Verificador de Dureza do Comprimido Dr. Schleuniger Pharmatron 8M (Dr. Schleuniger® Pharmatron Inc., Manchester, NH). Os comprimidos foram colocadas no mordente do testador de dureza, e a dureza foi medida em kiloponds (Kp).

Densidade do Comprimido

A espessura dos comprimidos foi medida usando um um Indicador Digimático Mitutoyo (Mitutoyo Absolute, Dr. Schleuniger Pharmatron Inc., Manchester, NH). Os comprimidos foram colocados sob a medida da espessura e o valor indicado foi registrado em milímetros (mm).

Resultados e Discussão

Vários protótipos foram desenvolvidos com base em três conceitos: gastrorretentivo, polímero doador de próton para mudar o pH intestinal, e formas de dosagem de liberação sustentada. As seções abaixo descreveram o desenvolvimento de formulação de cada protótipo.

Formulação Intravenosa de BH4 - Depois da constituição de água estéril, a solução resultante foi isotônica, pH 3,2 e continha 1 mg/mL de BH4, e foi adequada para administração intravenosa depois da filtração estéril através de um filtro de 0,22 mícrons. Estabilidade da solução de 1 mg/mL armazenada em temperatura ambiente foi analisada por HPLC durante cada três horas. As amostras de solução envelhecidas foram em seguida armazenadas a -20°C e analisadas por HPLC depois de 2 semanas. Figura 27 indica que a solução 5 foi estável em temperatura ambiente durante pelo menos 3 horas após constituição e foi estável durante pelo menos 2 semanas durante o armazenamento a -20°C.

Comprimido de BH4 para Solução Oral

Cada frasco foi empacotado para conter dez (10) comprimidos de BH4, 100 mg. Cem (100) mL de água purificada ou água estéril para injeção foram adicionados aos conte10 údos de cada frasco. Depois da agitação vigorosa do frasco, os comprimidos desintegraramse rapidamente dentro de 5 minutos. A solução resultante continha 10 mg/mL de BH4 para administração oral. Nem todos os ingredientes no comprimido foram solúveis, e embora a solução final parecesse nebulosa ou translúcida, o ingrediente farmacêutico ativo foi dissolvido completamente e os particulados finos foram ingredientes inativos pobremente solúveis. 15 Protótipo de formulação para Reduzir a Motilidade Gastro-intestinal

Esta formulação em cápsula compreendida de BH4 e ácido ascórbico disperso em um derivado de ácido graxo semi-sólido (mono/di-oleato de glicerila, ponto de fusão de 86°C (30°C)). Mono/di-oleato de glicerila (GMO) foi da mesma forma selecionado porque GMO é quimicamente compatível com BH4. O perfil de dissolução descrito na Figura 28 mostrou 20 que mais de 90% do fármaco foi libertado em 2 horas e o perfil de dissolução permaneceu inalterado depois que as cápsulas foram armazenadas a 40°C durante 57 dias.

A dispersão de fármaco em GMO derretido, um semi-sólido, foi preenchida em cápsulas de gelatina dura manualmente. A densidade do semi-sólido é maior que 1 g/mL, e foi possível encher pelo menos a dose de 80 mg em 25% de carregamento de fármaco em um 25 cápsula de tamanho #2. Espera-se que uma cápsula de tamanho #0 deva conter pelo menos 200 mg de fármaco usando a mesma formulação. O vazamento do ácido graxo da cápsula foi observado durante o armazenamento a 40°C. Preferivelmente, as cápsulas ou formulações de cápsula softgel serão marcadas para evitar o vazamento de ácido graxo durante o armazenamento.

Protótipo Bioadesivo

Muitos bioadesivos são feitos de polímeros sintéticos ou naturais. A maioria dos polímeros bioadesivos sintéticos atuais é ácido poliacrílico ou derivados de celulose. Exemplos de polímeros com base em ácido poliacrílico incluem porém não são limitados a carbopol, polycarbophil, ácido poliacrílico (PAAc), etc. Celulósicos incluem porém não são limitados a 35 hidroxipropil celulose e hidroxipropilmetil celulose (HPMC). Dois protótipos bioadesivos foram desenvolvidos para testar em estudos de animal. O primeiro protótipo foi uma formulação de comprimido bioadesivo e o segundo uma cápsula que contém grânulos bioadesivos. Polycarbophil e polímeros de carbômero foram selecionados para o desenvolvimento do primeiro protótipo de comprimido bioadesivo. Carbopol 71 G é uma forma granular de carbômero e tem propriedades de fluxo de pó boas. Todos as bateladas dos comprimidos fabricados foram de boa qualidade com teor de fármaco aceitável (evidente por aproxima5 damente 100% de liberação de fármaco em perfis de dissolução) e dureza aceitável. Tabela 12 lista o peso do comprimido representativo, espessura, e dureza do protótipo bioadesivo que contém carbômero e polycarbophil.

Tabela 12 - Peso de Comprimido Representativo, Densidades e Dureza para Protótipo Bioadesivo contendo Carbômero e Polycarbophil

Número do Lote Pressão por Peso (mg) Densidades Dureza (Kp) do Comprimido Compressão (psi) (mm) 11210-83 600 165,4 5,24 10,5 11229-4 600 166,7 5,64 10,3 11229-4 800 164,1 5,27 14,4 11229-4 1000 164,9 5,12 18 HPMC e polímeros de carbômero foram empregados para o desenvolvimento os

segundos grânulos bioadesivos. HPMC foi selecionado porque é usado como sistema de hidrocolóide de baixo-densidade e liberação de fármaco controlada independente de pH. Os grânulos foram selecionados em comprimido para aumentar a chance de bioadesão aumentando-se a área de superfície da forma de dosagem. Para facilitar a separação da cápsula 15 preenchida de grânulos em meio de dissolução, os grânulos foram revestidos parcialmente com óleo hidrogenado. Sem o revestimento de óleo, os grânulos hidrataram e formaram uma matriz em forma de cápsula sem desintegrar em grânulos individuais.

Os perfis de liberação dos dois protótipos bioadesivos (comprimidos e grânulos) são mostrados na Figura 29, que mostra que o perfil de liberação da comprimido foi mais 20 longo que os grânulos. A liberação do fármaco foi de cerca de 90% em quatro horas e 95% em uma hora para as formas de dosagem bioadesivas em comprimido e grânulos, respectivamente. No armazenamento a 40°C e umidade ambiente durante um mês sem proteção de umidade (nenhum selo de indução de calor), o protótipo de comprimido exibiu uma diminuição na dissolução de fármaco (Figura 29). Para protótipos que contêm carbômero, precau25 ção de proteção de umidade deve ser tomada para proteger o comprimido de possivelmente hidratar prematuramente.

Protótipo de Liberação Sustentada

Hidroxipropilmetilcelulose (HPMC) é usada como um veículo hidrofílico para a preparação de sistemas de liberação de fármaco controlados orais (Colombo, Adv. Drug Deliv. Rev., 1993, 11, 37). Matrizes de HPMC são conhecidas para controlar a liberação de uma variedade de fármacos (Chattaraj, e outro, Drug Develop. Ind. Pharm., 1996, 22, 555; Pabon, e outro, Drug Develop. Ind. Pharm., 1992, 18, 2163; Lee, e outro, Drug Develop. Ind. Pharm., 1999, 25, 493; Basak, e outro, Indian J. Pharm. Sci., 2004, 66, 827; RajabiSiabhoomi, e outro, J. Pharm. Pharmacol., 1992, 44, 1062). Vários graus de viscosidade de HPMC (K4M, K15M e K100 M) para controlar a liberação de BH4 foram avaliados neste es5 tudo. Os perfis de dissolução de comprimidos feitos com vários graus de HPMC são mostrados na Figura 30. Perfis de liberação de fármaco foram similares a 20% de HPMC independente do grau de viscosidade; mais de 80% do fármaco foi liberado em 2 horas. Quando o polímero de HPMC foi exposto ao meio aquoso, ele sofreu hidratação rápida e relaxamento de cadeia para formar a camada de gel (Naruhashi, e outro, Pharm Res. 2003,19:1415- 10 1421). A HPMC a 20% pode não formar uma camada de barreira de gel significativa para reduzir a liberação de BH4 significativamente.

Os perfis de dissolução de comprimidos produzidos com concentrações variadas (20% a 40%) de um grau de viscosidade alto de HPMC (Methocel K100M CR) são apresentados na Figura 30. Um comprimido que contém 35% a 40% de Methocel K100M CR foi 15 constatado reduzir a liberação de fármaco por até quatro horas considerando que 20% de HPMC liberou o fármaco em duas horas (Figura 31). Um comprimido que contém 35% de HPMC (Methocel KIOOM) foi selecionado como o protótipo para testar em estudos animais porque continha a quantidade menor de HPMC exigida para reduzir a liberação de fármaco por até quatro horas. Como tal, os comprimidos foram de boa qualidade com teor de fárma20 co aceitável como evidente por aproximadamente 100% de liberação de fármaco em perfis de dissolução.

Protótipo de Polímero Doador de Próton

Para aumentar a absorção oral de BH4, uma abordagem é estabilizar o fármaco diminuindo o pH do intestino delgado proximal. Para manipular o pH Iuminal intestinal, Eu25 dragit L100-55, um polímero de liberação de próton geralmente usado para revestimento entérico, foi selecionado. Este polímero não é solúvel sob condições ácidas, e fica solúvel e liberta prótons sob condições fracamente ácidas (pH > 5,5) à alcalinas devido a seus grupos carboxila, desse modo controlando o pH Iuminal intestinal para ficar ácido. Naruhashi, e outro (2003) constatou que o pH no lúmen foi diminuído de uma maneira dependente de con30 centração Eudragit L100-55 e a absorção de cefadroxil e cefixima da alça ileal foi aumentada na presença do polímero ácido (Nozawa, e outro, J. Pharm Sei. 2003, 92 (11), 2208- 2216). Nozawa, e outro, (2003) mostrou que Eudragit diminuiu o pH nas alças intestinais, e aumentou o desaparecimento de cefadroxil e cefixima das alças.

Formulações que contêm BH4 e Eudragit L100-55 como mostrado na Tabela 8 foram prensadas em comprimidos e preenchidas em cápsulas. A formulação de comprimido liberou cerca de 27% de fármaco em uma hora em fluido gástrico simulado (SGF) durante o teste de dissolução. Entretanto, durante o teste de desintegração, o comprimido permaneceu intacto em SGF e tampão de fosfato de pH 5,8 (PB) durante pelo menos 2 horas. Mesmo na presença de um super-desintegrante (crospovidona ou croscarmelose), o comprimido não desintegrou. É possível que o fármaco possa estar acidificando o Eudragit, criando um ambiente de pH micro baixo tal que o polímero permaneceu não ionizado e insolúvel.

A formulação de fármaco-Eudragit de cápsula preenchida com pó desintegrou-se

rapidamente em SGF. Para alvejar a liberação de próton no intestino proximal, um revestimento entérico foi aplicado à cápsula.

Seguindo o revestimento e secagem da cápsula no forno a 40°C, a cápsula ganhou cerca de 1 a 3% em peso no revestimento de polímero. Quando testado usando o aparato 10 de dissolução USP Il (pá), o meio de dissolução 0,1 N de HCI mantido a 37°C em uma velocidade rotacional de 50 rpm, a cápsula revestida liberou cerca de 25% de fármaco em uma hora. Depois de 1 hora de pré-tratamento com ácido (0,1 N de HCI), a cápsula revestida foi colocada em um Aparato de desintegração USP com 500 mL de tampão de fosfato de pH 5,8 mantido a 37°C, a cápsula revestida desintegrou-se em cerca de 1 hora. O protótipo da 15 cápsula revestido entéricamente foi selecionado no comprimido ou na cápsula não revestida porque a cápsula revestida entericamente foi mais provável de liberar o polímero de liberação de próton ao sítio alvo.

Sistema de Liberação Flutuante

Dois sistemas de liberação flutuantes foram desenvolvidos. O primeiro protótipo era uma forma de dosagem de unidade múltipla flutuante; o propósito desta forma de dosagem foi aumentar a chance que uma das unidades permanecerá na região gástrica e conseqüentemente prolongará o tempo de residência gástrico de fármaco. Esta forma de dosagem consistiu em sete comprimidos de camada tripla em uma cápsula; a camada mediana continha a substância de fármaco, que foi intercalada entre duas camadas externas insolúveis em água (Figura 32). As camadas externas continham ácido esteárico, um hidrofóbico e ácido graxo insolúvel em água, que forneceu a flutuabilidade necessária ao comprimido flutuante. Cada comprimido foi revestido manualmente com uma solução alcoólica de etilceluIose e polietileno glicol MW 4600 (PEG). Etilcelulose formou uma película insolúvel em água ao redor do comprimido e PEG, que agiu como um formador de poro, e modulou a taxa de liberação. Os perfis de dissolução dos comprimidos revestidos com etilcelulose e várias concentrações (20% a 40%) de soluções de PEG são apresentados na Figura 33. Foi notado que o comprimido de camada tripla revestido obteve cinéticas de liberação perto da ordem zero. Como esperado, a taxa de dissolução de fármaco aumentou quando a concentração de PEG aumentou. Os comprimidos flutuaram em meio gástrico simulado durante pelo menos quatro horas durante estudos de dissolução. Tabela 9 mostra a composição da formulação testada em estudos animais.

O segundo protótipo foi uma forma de dosagem geradora de gás. Foi formulado de uma tal maneira que quando entrou em contato com os teores gástricos ácidos, dióxido de carbono foi liberado e capturado nos hidrocolóides inchado, que forneceu flutuabilidade à forma de dosagem (Figura 33). Esta formulação flutuou em meio gástrico simulado durante pelo menos quatro horas durante estudos de dissolução. Entretanto, para um tal sistema 5 funcionar constantemente, os comprimidos têm que ser produzidos em um ambiente de baixa umidade para impedir ácido prematuro e reação de base. Pode haver interação potencial entre BH4 e bicarbonato de sódio no comprimido durante o armazenamento. Por estas razões, esta forma de dosagem não foi testada em estudos animais.

Seis formulações teste de protótipo que incorporaram várias abordagens de formulação incluindo polímero doador de próton para diminuir o pH intestinal, formas de dosagem gastrorretentivas, e formulações libertadas sustentadas, foram desenvolvidas para estudos de biodisponibilidade animal.

EXEMPLO 5

Biodisponibilidade de Novas Formulações de BH4 O objetivo deste estudo foi realçar a absorção de BH4 desenvolvendo-se formas de

dosagem que aumentam o tempo de residência do fármaco no trato gastrointestinal (Gl).

Métodos: Três macacos cinomolgos saudáveis pesando 3 - 4 kg foram usados em estudo sem cruzamento de 8 períodos, aberto para determinar a biodisponibilidade de sete formulações comparadas a uma formulação de BH4 dissolvida de controle. Depois de um 20 jejum durante a noite, os macacos receberam, em ocasiões separadas, uma única dose de 80 mg da mesma nova formulação oralmente ou intravenosamente com um intervalo de pelo menos um período de solapamento de 1 semana entre as várias novas formulações estudadas. Para administração intravenosa, amostras de sangue foram coletadas antes da dosagem e em seguida a 5, 15 e 30 min e 1,0, 2,0, 4,0, 6,0, 8,0, 12 e 24 hr pós-dose. Para admi25 nistração oral, amostras de sangue foram retiradas antes da dosagem e em seguida 15 e 30 min e 1,0, 2,0, 3,0, 4,0, 6,0, 8,0, 12, e 24 hr depois de cada dose. Depois da separação do plasma através de centrifugação, alíquotas de 200 μΙ_ de cada amostra foram prontamente transferidas em tubos individuais contendo 0,1% de DTE e congeladas a -70°C até que prontas para L-biopterina total.

Formulações de Estudo: As formulações administradas são encontradas na Tabela

13. Três das formulações foram projetadas conceptualmente para ser gastrorretentivas por mecanismos flutuantes ou bioadesivos para aumentar o tempo de residência Gl (grânulos bioadesivos, grânulos flutuantes de múltiplos particulados, com base em carbômero). Outros conceitos foram com base na redução da motilidade Gl para aumentar o tempo de residên35 cia da formulação (mono-oleato de glicerila), reduzindo o pH do intestino delgado e desse modo realçando a estabilidade química de BH4 para permitir a absorção de fármaco intato (bomba de próton) ou formulação de liberação sustentada para averiguar se realçará a absorção.

Tabela 13

Fase Protótipo Forma de Dosagem Conceito Ingredientes Formulação IV 1 mg/m L Controle BH4, D (-)-Manitol Fase Il Comprimidos Solução oral, Controle Comprimidos de BH4 Kuvan para 10 mg/ml fabricado por Lyne Solução (Lote #140651) Fase Ill Mono Cápsula, Motilidade BH4, Capmul GMO-50, Oleato de 80 mg Gl lenta Ácido Ascórbico Glicerol Fase IV Protótipo de Comprimido, Bioadesivo BH4, Carbopol 71G, Carbômero 80 mg Gastro- Noveon AA1, Ácido Ascórbico, retentivo, PRUV, Fase V Protótipo de Comprimido, Liberação BH4, Methocel K100M, HPMC 80 mg sustentada Premium CR, Ácido Ascórbico, PRUV, Fase Vl Protótipo de Cápsula, Polímero BH4, EudragitLI 00-55, Eudragit 80 mg doador de Ácido ascórbico, Kollidon, próton CL, PRW, Rvestimento, em pH Gl (Eudragit L100-55, Fase Vll Unidades mul- Múltiplos Gastro Camada interna (BH4, ti- comprimidos em retentivo, Ácido Ascórbico, Ácido Esteáriflutuantes cápsula, flutuante co, PRUV), Camada Externa 80 mg (Ácido Esteárico, Eudragit, L100-55, PRUV), Revestimento (Ethocel Standard 10FP, Carbowax PEG 4600, Etanol a 95%) Fase Vlll Grânulos Bio¬ Grânulos em cáp¬ Gastro Intergranular (BH4, adesivos sula, 80 mg retentivo, Methocel K100M Bioadesivo Premium CR, Carbopol, 971, Ácido Ascórbico), Ensaio de Plasma para Biopterina: Concentrações de BH4 no plasma foram determinadas usando-se um método de LC/MS/MS de fase reversa, específico, validado. A curva padrã foi linear sobre a faixa de concentração de 50 ng/mL a 2500 ng/mL. O limite inferior de quantificação para L-biopterina foi de 50 ng/mL com precisão intraday mostrada por coeficientes de variação menores que 5%. L-biopterina é estável em plasma de macaco congelado estabilizada com 0,1% de DTE a -70°C até que analisada. Concentrações de BH4 foram calculadas a partir das concentrações de L-biopterina determinadas.

Análise Farmacocinética e Estatística: Parâmetros farmacocinética foram determinados para BH4 de plasma depois da administração das formulações orais e intravenosas. Os parâmetros farmacocinética são fornecidos na Tabela 14.

Tabela 14

Fase, AUCjitima AUC00 Cmáx r a T máx t-l/2 Formulação (ng-hr/mL) (ng-hr/mL) (ng/mL) '-'ultimo (hr) (hr) (ng/mL) 2, comprimido dis¬ 641 (88) 805 (36) 93,6 (31,3) 9,60 (2,20) 2,33 (0,58) 11,7 solvido (2,1) 3, mono-oleato de 716(154) 858 (317) 133 (83) 6,47 (3,60) 2,00 (0) 12,1 glicerila (10,3) 4, 593 (50.6) 648(114) 108 (15) 4,46 (3,36) 2,67 (0,58) 6,89 polímero bioadesivo (3,51) 5, liberação susten¬ 355 (134) 472 (36) 86,0 (43,1) 12,9(12,4) 3,33 (0,58) 5,30 tada. (1.73) 6, doador de próton 276 (49.8) 282 (49) 68,3 (25,3) 2,97 (0,71) 3,33 (0,58) 1,59 m 7A\ 7, forma de dosagem 304 (78) b 59,9 (31,8) 5,90 (0,94) 4,00 (2,00) b flutuante 8, 292 (79) 366 (40,6) 42,5(12,6) 5,11 (2,43) 3,0 (0) 15,3 granulações bioade- (8,2) sivas Resultados

O objetivo deste estudo foi identificar as formulações que realçam a biodisponibili10 dade de BH4 comparada à formulação de comprimido dissolvida de controle. Os perfis de tempo-concentração de BH4 de plasma média das várias formas de dosagem e a formulação de controle que segue a administração oral de BH4 são mostrados na Figura 35, e os parâmetros farmacocinéticos de BH4 derivados dos perfis de tempo-concentração de fármaco de plasma são determinados na Tabela 14. A formulação de controle (fase 2) é o com15 primido dissolvido.

Como mostrado na Figura 35, a formulação de mono-oleato de glicerila forneceu a AU Cl úitima e AUC00 mais altas que são 716 ng-hr/mL e 858 ng-hr/mL respectivamente. A formulação de comprimido de BH4 dissolvido de controle exibiu AUCuitima e AUCco que são 641 ng-hr/mL e 805 ng-hr/mL respectivamente (Tabela 14). A ordem de classificação das formu20 lações da maior para a menor biodisponibilidade é: mono-oleato de glicerila > comprimido dissolvido > comprimido de polímero bioadesivo > comprimido de liberação sustentada > formas de dosagem flutuantes > produto de cápsula de granulações bioadesiva > produto de cápsula doador de próton.

EXEMPLO 6

Preparação de Formulação Intravenosa de Tetraidrobiopterina

Avaliação da Estabilidade de Pré-formuiação Em geral, o objetivo deste estudo foi avaliar a estabilidade de BH4 em soluções de

tampão variando em pH de pH 1 a 7 (Veja Tabela 15) e na presença e ausência de antioxidantes e com ou sem gás inerte nas soluções de reação (Veja Tabela 16).

Tabela 15 - Componentes e Composição de Soluções de Tampão a ser usadas para Estudos de Estabilidade de Pré-formulação de BH4

Componentes Quantidades TamDão de dH 1.2 (0.1 N de HCI) 8,33 mL HCI concentrado (12 N) Cloreto de sódio Água Destilada/Deionizada qs TamDão de dH 2.1 (0.01 N de HCh 100 mL Tampão de pH 1,2 (0,1 N de HCI) Cloreto de sódio Água Destilada/Deionizada qs Tampão de pH 3 ,347 mL Acido Fosfórico, 15 M, 85%, Fosfato Monobásico Sódico, anidroso (NaH2PO4) Cloreto de sódio Água Destilada/Deionizada qs Tampão de pH 4 2,38 mL Acido acético, Glacial, 100% Acetato de sódio, Triidrato, Cloreto de sódio Água Destilada/Deionizada qs Tampão de pH 5 ,87 mL Acido acético, Glacial, 100% Acetato de sódio, Triidrato, Cloreto de sódio Água Destilada/Deionizada qs Tampão de pH 6 4,99 g Monoidrato de Aeido 4-Morfolinoetanossulfônieo (MES) Sal Sódico de MÊS Cloreto de sódio Água Destilada/Deionizada qs Tampão de pH 7 2,56 g Fosfato Monobásico Sódio, Monoidrato (NaH2PO4) Fosfato Dibásico Sódio, anidroso (Na2HPO4) Cloreto de sódio Água Destilada/Deionizada qs 10 Tabela 16 - Composição de Soluções de Tampão para Estudos de Estabilidade

Contendo BH4 Com ou Sem Antioxidante e se Submetida à Pulverização de Gás ou Não

PH Número de Grupo de Estudo 1 2 3 5 6 Estudo com Estudo com Tam¬ Estudo com Estudo com Estudo com Tampão + Tampão pão + Tampão + L- Tampão + Pulverização de Oxi¬ Ácido Ascórbico Ciste ína Pulverização de gênio Argônio 1 1 mg/mLde 1 mg/mL de BH4 1 mg/mL de 1 mg/mL de 1 mg/mL de BH4 BH4 em Tam¬ e 1 mg/mL de BH4 BH4 em pH 1.2 pão de pH 1,2 Ácido Ascórbico e 1 mg/mL de em Tampão de Tampão e em Tampão de pH L-cisteína em pH 1,2 e Pulverizado com Oxi¬ 1,2 Tampão de Pulverizado com gênio pH 1,2 Argônio e Selado com manta e selado com de O2 manta de Argô¬ nio 2 1 mg/mL de 1 mg/mL de BH4 1 mg/mL de 1 mg/mL de 1 mg/mL de BH4 BH4 em Tam¬ e 1 mg/mL de BH4 BH4 em Tampão de pH 2,1 pão de pH 2,1 Ácido ascórbico e 1 mg/mL de em Tampão de e em Tampão de pH L-cisteína em pH 2,1 e Pulverizado com Oxi¬ 2,1 Tampão de Pulverizado com gênio pH 2,1 Argônio e Selado com manta e Selado com de O2 manta de Argô¬ nio 3 1 mg/mL 1 mg/mL de BH4 1 mg/mL de 1 mg/mL de 1 mg/mL de BH4 BH4 em Tam¬ e 1 mg/mL de BH4 BH4 em Tampão de pH 3 pão de pH 3 Ácido ascórbico e 1 mg/mL de em Tampão de e Pulverizado com em Tampão de pH L-cisteína em pH 3 e Pulveri¬ Oxigênio e Selado 3 Tampão de zado com Argô¬ com Manta de O2 pH 3 nio e Selado com Manta de Argônio 4 1 mg/mL 1 mg/mL de BH4 1 mg/mL de 1 mg/mL de 1 mg/mL de BH4 BH4 em Tam¬ e 1 mg/mL de BH4 BH4 em Tampão de pH 4 pão de pH 4 Ácido Ascórbico e 1 mg/mL de em Tampão de e Pulverizado com em Tampão de pH Ácido Ascór¬ pH 4 Oxigênio e 4 bico e Pulverizado Selado com Manta de em Tampão com Argônio e 02 de pH 4 Selado com Manta de Argô¬ nio 1 mg/mL 1 mg/mL de BH4 1 mg/mL de 1 mg/mL de 1 mg/mL de BH4 BH4 em Tam¬ e 1 mg/mL de BH4 BH4 em Tampão de pH 5 pão de pH 5 Ácido Ascórbico e 1 mg/mL de em Tampão de e Pulverizado com em Tampão de pH L-cisteína em pH 5 Oxigênio 5 Tampão de e Pulverizado e Selado com Manta pH 5 com Argônio e de O2 Selado com Manta de Argô¬ nio 6 1 mg/mL 1 mg/mL de BH4 1 mg/mL de 1 mg/mL de 1 mg/mL de BH4 BH4 em Tam¬ e 1 mg/mL de BH4 BH4 em Tampão de pH 6 pão de pH 6 Ácido Ascórbico e 1 mg/mL de em Tampão de e Pulverizado com em Tampão de pH L-cisteína em pH 6 Oxigênio 6 Tampão de e Pulverizado e Selado com Manta pH 6 com Argônio e de O2 Selado com Manta de Argô¬ nio 7 1 mg/mL 1 mg/mL de BH4 1 mg/mL de 1 mg/mL de 1 mg/mL de BH4 BH4 em Tam¬ e 1 mg/mL de Áci¬ BH4 BH4 em Tampão de pH 7 e pão de pH 7 do ascórbico em e 1 mg/mL de em Tampão de Pulverizado com Oxi¬ Tampão de pH 7 L-cisteína em pH 7e Argônio gênio e Selado com Tampão de Pulverizado com Manta de O2 pH 7 Argônio e Sela¬ do com Manta de Argônio Mais especificamente, a influência de combinar dois antioxidantes na presença ou ausência de gás inerte foi avaliada em pH 4 para suportar a formulação de um produto líquido, e em um pH 7 para averiguar a contribuição de instabilidade em pH fisiológico à baixa biodisponibilidade do composto em macacos e humanos (Veja Tabelas 17 e 18). Espera-se que a estabilidade de BH4 seja dependente de temperatura. Portanto, a estabilidade de 5 composto foi avaliada a 2-8°C, 25°C, 30°C e 37°C para suportar a determinação de vidas de prateleira à longo prazo previsíveis para o composto em temperaturas diferentes. Determinação da estabilidade do composto na temperatura fisiológica de 37°C fornece dados para suportar a estimação da duração de vida da estabilidade de uma forma de dosagem oral formulada nas regiões absorventes do trato Gl.

Tabela 17 - Composição de Soluções de Tampão para o Estudo de Estabilidade de

pH 4 de BH4

pH 4 pH 4 Estudo com Tampão + Estudo com Tampão + Ácido Ácido Ascórbico + L- Ascórbico + L-Cisteina + Cisteína Pulverização com Argônio 1 mg/mL de BH4 e 1 1 mg/mL de BH4 + 1 mg/mL de mg/mL de Ácido Ascórbico Ácido Ascórbico +1 mg/mL de e 1 mg/mL de L-Cisteina L-cisteína em Tampão de pH 4 em Tampão de pH 4 e Pulverizado com Argônio e Selado com Manta de Argônio Tabela 18 - Composição de Soluções de Tampão para o Estudo de pH 7 de BH4

pH 7 pH 7 Estudo com Tampão + Estudo com Tampão + Ácido Ácido Ascórbico + de L- Ascórbico + L-Cisteina + Pulve¬ Cisteína rização com Argônio 1 mg/mL de BH4 e 1 1 mg/mL de BH4 + 1 mg/mL de mg/mL de Ácido Ascórbi¬ Ácido ascórbico + 1 mg/mL de co e 1 mg/mL de L- L-cisteína em Tampão de pH cisteína em Tampão de 7 e Pulverizado com Argônio e pH 7 Selado com Manta de Argônio Tempos de amostragem propostos para estudos a ser administrados em várias soluções de tampão foram calculados comparando-se a meia-vida de um único estudo em pH 3,1 com dados obtidos por Davis, e outro (1988; Eur. J. Biochem. 173, 345-351, (1988)), em pH 6,8 Tris e tampões de fosfato. O estudo de estabilidade de uma solução de pH 3,1 produziu um ti/2 calculado de 17769 min (12,3 dias) e o trabalho de Davis e outro produziu um t1/2 de 10 min em tampão de pH 6,8 de de fosfato e 14 min em tampão Tris de pH 6,8. Estes dois estudos sugerem uma ordem de redução de magnitude em meia-vida (isto é, uma ordem de aumento de magnitude na reatividade) de BH4 para cada aumento de uma vez em 5 pH (veja Tabela 19). Com base nesta aproximação, soluções de pH 1,2 a pH 3 foram testadas semanalmente inicialmente e as correções de tempo de amostragem foram feitas se necessário depois que os primeiros 2 pontos de dados foram coletados. Os tempos de amostragem calculados a 25°C são fornecidos na Tabela 19.

Tabela 19 - Tempos de Amostragem Sugeridos em Vários pH com base em MeiaVida Medida de BH4 e Meias-Vidas Teóricas Derivadas Deles

PH T-1/2 medido (Min) T1/2 calculado com base em T1/2 Ob¬ Tempo de Amostragem tido em pH 3 (Min)a Inicialmente Sugerido c 1,0 - 776900,0 (1234 dias) Cada 7 dias 2,0 - 177690,0 (123,4 dias) Cada 7 dias 3,0 17769,0 (12,34 dias) 17769,0(12,34 dias) Cada 96 horas 4,0 - 1776,9(1,23 dias) Cada 12 horas 5,0 - 177,7 (0,12 dias) Cada Vi Hora 6,0 - 17,7(0,01 dias) Cada 5 minutosd P 10 (fosfato) OO 14 (Tris) σ 7,0 - 1,8 Cada Vi minutosd a t1/2 calculado é com base na mudança por uma ordem de magnitude, a meia-vida obtida em pH 3,0 para cada mudança de uma-vez em pH. pH < são aumentados ascendentemente enquanto pH > 3 são diminuídos descendentemente por uma ordem de magnitude

de uma maneira em etapas para comparar aproximadamente os dados de pH 6,8 obtidos por Davis e outro.

bDados obtidos de Davis, e outro, 1988; Eur. J. Biochem., 173, 345-351, (1988) c Amostragem pode ser modificada

d Soluções de reação são experimentadas e extinguidas tão rápido quanto possível e requerem um cronômetro e 2 pessoas, uma amostrando/extinguindo e a outra registrando com precisão o tempo em um caderno em minutos e/ou segundos

Estudos foram conduzidos em soluções de tampão de pH 1 - 7 e a 5°C, 25°C, 30°C e 37°C. Embora estes estudos tenham sido conduzidos em recipientes não hermeticamente selados, antioxidantes sozinhos (ácido ascórbico ou L-cisteína) ou combinados juntos (ácido ascórbico + L- cisteína) reduziram a taxa de perda ou degradação de BH4 (veja Figura 36 e 25 Figura 37). A pulverização de uma solução que contém ácido ascórbico e L-cisteína substancialmente realçou a estabilidade de BH4.

A taxa de degradação de BH4 é dependente de concentração (veja Figura 38). Portanto, formulações altamente concentradas, de dose alta de BH4 foram mostradas para requerer concentração mais baixa de estabilizadores para estabilização sinergística das formulações.

Estes resultados demonstram que a formulação das formulações líquidas, estáveis de longa vida de prateleira pode ser produzida de acordo com os métodos e composições descritos aqui, incluindo líquidos injetáveis estéreis, líquidos orais, e Iiofilizados e pós estéreis para formulações de constituição.

EXEMPLO 7

Formulações Líquidas e Liofilizadas de Tetraidrobiopterina para Uso Oral e Paren

teral

Composições de Exemplo das Formulações

Tabela 20 - Formulação específica tamponada em pH 4 tendo ácido ascórbico como estabilizador

Componentes Quantidade (mg) % Função Peso/Volume BH4 1,00 0,10 Substância ativa Acido Ascórbico 10,00 1,00 Antioxidante Acido Cítrico 6,56 0,66 Agente de tamponamento Citrato de Sódio, Diidrato, 5,53 0,55 Agente de tamponamento Agua para Injeção qs 1,00 mL 1,00 mL Diluente Tabela 21 - Formulação tamponada em pH 4,0 contendo uma combinação de dois estabilizadores: ácido ascórbico e metabissulfito de sódio

Componentes Quantidade % Função (mg) Peso/Volume BH4 1,00 0,10 Substância ativa Acido ascórbico 2,50 0,25 Antioxidante Metabissulfito de sódio 2,50 0,25 Antioxidante Acido cítrico 6,56 0,66 Agente de tamponamento Citrato de sódio, Diidrato, 5,53 0,55 Agente de tamponamento Agua para Injeção qs 1,00 mL 1,00 mL Diluente Tabela 22 - Formulação tamponada em pH 4,0 contendo uma combinação de três estabilizadores: L-cisteína, ácido ascórbico e metabissulfito de sódio

Componentes Quantidade (mg) % Função Peso/Volume BH4 1,00 0,10 Substância ativa Acido ascórbico 2,00 0,20 Antioxidante Metabissulfito de sódio 2,00 0,20 Antioxidante L-cisteína 4,00 0,40 Antioxidante Acido cítrico 6,56 0,66 Agente de tamponamento Citrato de sódio, Diidrato, 5,53 0,55 Agente de tamponamento Água para Injeção qs 1,00mL 1,00mL Diluente Tabela 23 - Formulação tamponada em pH 7,0 contendo apenas ácido ascórbico como estabilizador

Componentes Quantidade (mg) % Função Peso/Volume BH4 10,00 1,00 Substância ativa Acido ascórbico 50,00 5,00 Antioxidante Fosfato Monobásico 10,24 0,10 Agente de tamponaSódico, Monoidrato mento Fosfato Dibásico Sódico 17,76 0,18 Agente de tamponamento Água para Injeção qs 1,00mL 1,00 mL Diluente Tabela 24 - Formulação tamponada em pH 7,0 contendo ácido ascórbico, metabis

sulfito de sódio como estabilizadores

Componentes Quantidade (mg) % Função Peso/Volume BH4 10,00 1,00 Substância ativa Acido ascórbico 20,00 2,00 Antioxidante Metabissulfito de sódio 15,00 1,50 Antioxidante Sódio Monobásico 10,24 0,26 Agente de tamponaFosfato, Monoidrato, mento Fosfato Dibásico Sódico 17,76 0,44 Agente de tamponamento Agua para Injeção qs 1,00 mL 1,00 mL Diluente Tabela 25 - Formulação tamponada em pH 7,0 contendo ácido ascórbico, metabissulfito de sódio e L-Cisteina como estabilizadores

Componentes Quantidade (mg) % Função Peso/Volume BH4 10,00 1,00 Substância ativa Acido ascórbico 20,00 2,00 Antioxidante Metabissulfito de sódio 15,00 1,50 Antioxidante L-cisteína 10,00 1,00 Antioxidante Fosfato Monobásico Sódio, 10,24 0,26 Agente de tamponaMonoidrato, mento Fosfato Dibásico Sódico 17,76 0,44 Agente de tamponamento Agua para Injeção qs 1,00 mL 1,00mL Diluente Formulações Líquidas de Dose Alta

Tabela 26 - Formulação tamponada em pH 6,0 contendo apenas ácido ascórbico como estabilizador

Componentes Quantidade (mg) % Função Peso/Volume BH4 50,00 0,10 Substância ativa Acido ascórbico 7,50 0,75 Antioxidante Acido cítrico 5,30 0,53 Agente de tamponamento Citrato de sódio, Diidrato, 51,4 5,14 Agente de tamponamento Agua para Injeção qs 1,00mL 1,00 mL Diluente Tabela 27 - Formulação tamponada em pH 6,0 contendo uma combinação de dois estabilizadores: ácido ascórbico e metabissulfito de sódio Componentes Quantidade (mg) % Função Peso/Volume BH4 50,00 5,00 Substância ativa Ácido ascórbico 2,50 0,25 Antioxidante Metabissulfito de sódio 2,50 0,25 Antioxidante Acido cítrico 5,30 0,53 Agente de tamponamento Citrato de sódio, Diidrato, 51,4 5,14 Agente de tamponamento Agua para Injeção qs 1,00 mL 1,00mL Diluente Tabela 28 - Formulação tamponada em pH 6,0 contendo uma combinação de três estabilizadores: L-cisteína, ácido ascórbico e metabissulfito de sódio

Componentes Quantidade (mg) % Função Peso/Volume BH4 50,00 0,10 Substância ativa Acido ascórbico 2,00 0,20 Antioxidante Metabissulfito de sódio 2,00 0,20 Antioxidante L-cisteína 1,00 0,10 Antioxidante Acido cítrico 5,30 0,53 Agente de tamponamento Citrato de sódio, Diidrato, 51,4 5,14 Agente de tamponamento Agua para Injeção qs 1,00 mL 1,00 mL Diluente Tabela 29 - Formulação oral tamponada em tampão de citrato de pH 3,0 e contendo apenas ácido ascórbico como estabilizador

Componentes Quantidade (mg) % Função Peso/Volume BH4 10,00 1,00 Substância ativa Acido ascórbico 20,00 2,00 Antioxidante Sacarose 200,00 20,00 Adoçante Sabor laranja 1,00 0,10 Agente de condimen¬ to Acido Cítrico 8,98 0,90 Agente de tamponamento Citrato de sódio, Diidrato, 2,13 0,21 Agente de tamponamento Agua para Injeção qs 1,00 mL 1,00 mL Diluente Tabela 30: Formulação oral tamponada em tampão de tartarato de pH 3,5 e contendo ácido ascórbico e metabissulfito de sódio como estabilizadores

Componentes Quantidade (mg) % Função Peso/Volume BH4 10,00 1,00 Substância ativa Acido ascórbico 20,00 2,00 Antioxidante Metabissulfito de sódio 5,00 0,50 Antioxidante Sacarose 200,00 20,00 Adoçante Sabor de uva 1,00 0,10 Agente flavorizante Acido tartárico 1,34 0,13 Agente de tamponamento Diidrato Dibásico de Tartara¬ 8,39 0,84 ^gente de tamponamento to de Sódio Agua para Injeção qs 1,00 mL 1,00mL Diluente Tabela 31: Formulação oral tamponada em pH 3,5 em tampão com base em ácido málico e contendo ácido ascórbico e metabissulfito de sódio como estabilizadores

Componentes Quantidade (mg) % Função Peso/Volume BH4 10,00 1,00 Substância ativa Acido ascórbico 20,00 2,00 Antioxidante Metabissulfito de sódio 15.00 1.50 Antioxidante Saearose £00,00 20,00 Adoçante Sabor Maçã 1,00 0,10 Agente de condimento Acido Málico 3,07 0,31 Agente de tamponamento Malato de Sódio Dibásico 4,91 0,49 Agente de tamponamento Agua para Injeção qs 1,00 mL 1,00 mL Diluente As soluções formuladas ou compotas anteriores são opcionalmente pulverizadas

com um gás inerte (por exemplo, argônio ou nitrogênio) ou dióxido de carbon no tanque de composição e recipientes primários preferivelmente são selados em uma manta de gás inerte ou dióxido de carbono para remover o oxigênio do topo livre do recipiente. As formulações podem ser escaladas até qualquer volume multiplicando-se as quantidades de componente por um fator de graduação apropriado.

EXEMPLO 8

Determinação de LC/MS/MS de Tetraidrobiopterina (BH4) em Plasma Humano Medindo-se a Concentração de L-Biopterina na Oxidação sob Condições Básicas Tetraidrobiopterina (BH4) é uma pequena molécula terapêutica para o tratamento

de pacientes com fenilcetonúria (PKU). É importante ter um método preciso e específico para medir as concentrações de BH4 no plasma humano. Porém, é um desafio quantificar BH4 no plasma humano por causa de sua baixa concentração endógena e instabilidade. Sob condições básicas, BH4 é oxidada em diidrobiopterina (BH2) e finalmente L-Biopterina. 10 Além disso, a relação de conversão de oxidação de BH4 para L-Biopterina é quase constante até 23 semanas. Portanto, medindo-se a concentração de L-Biopterina na oxidação sob condição básica, e aplicando uma relação de conversão molar, podemos determinar as concentrações de BH4 confiantemente no plasma humano.

Métodos publicados são com base no método clássico desenvolvido por Fukushima 15 e Nixon (Anal. Biochem., 102, 176-188(1980)) usando HPLC com detecção por fluorescência. No método de LC/MS/MS, a amostra de plasma humano foi estabilizada com antioxidante, reforçando-se com uma solução de padrão interno (IS) e basificada com solução de hidróxido de sódio, em seguida oxidada com solução de iodo. Na incubação no escuro em temperatura ambiente, ácido ascórbico é adicionado para reduzir o iodo em excesso. Amos20 tras oxidadas foram extraídas por precipitação de proteína. L-Biopterina nos extratos reconstituídos foi analisada usando-se HPLC de fase reversa com detecção de MS/MS Turbo Ion Spray®. íons negativos para L-Biopterina foram monitorados em modo de MRM. Relações de área de pico de Fármaco-para-IS os padrões foram empregadas para criar uma curva de calibre linear usando análise de regressão de mínimos quadrados pesada de 1/x2.

A relação de conversão de oxidação de BH4 para L-Biopterina foi avaliada em múl

tiplos pontos de tempo: 0, 1, 2, 4, 8, 12 e 23 semanas, e constatou ser consistente em todos os pontos de tempo testados com uma relação de conversão molar nominal de 47,3% determinado dos primeiros três pontos de tempo sucessivos. A diferença entre a relação de conversão em outros pontos de tempo e o valor nominal varia de -2,3 a 6,3%. O método de 30 LC/MS/MS foi validado para quantificar L-Biopterina em plasma humano K2 EDTA na faixa de calibre linear de 5 a 1000 ng/mL (equivalente a 11 a 2114 ng/mL para BH4). A precisão e exatidão do ensaio foram avaliadas com amostras de controle de qualidade (QCs) e os resultados mostraram precisão intraday entre 4,7 a 14,5% de CV; exatidão intraday entre -7,1 a 7,4% de valores nominais; e precisão e exatidão interday de 7,4 a 16,4% de CV e -8,3 a 35 3,7% de valores nominais, respectivamente. A recuperação de extração média para LBiopterina foi de 65,3%. No plasma humano K2 EDTA, L-Biopterina foi constatada ser estável em temperatura ambiente durante pelo menos 4 horas e depois de 4 ciclos de congelamento descongelamento, e a -70°C durante pelo menos 275 dias.

EXEMPLO 9

Determinação de BH4/BH2/B Usando HPLC com Detecção de Fluorescência e Eletroquímica

Um estudo foi realizado para desenvolver um método de determinar concentrações

de tetraidrobiopterina (BH4), diidrobiopterina (BH2) e biopterina (B) no plasma humano usando cromatografia líquida de alto desempenho de fase reversa (HPLC) com detecção por fluorescência (FD) e detecção eletroquímica (ECD). O método é com base em Cai, e outro (Cardiovascular Research 55: 838-849, 2002).

Soluções de matéria prima de BH4 (em 20 mM de HCI), BH2 e B (em DMSO) foram

feitas a uma concentração final de 10 mM e armazenadas a -80°C. Soluções de funcionamento padrãs de calibre foram preparadas de solução de matéria-prima em 100, 10, 7,5, 5, 2,5, e 1 nM em plasma humano K2 EDTA modificado por 0,1% (p/v) de 1,4-Ditioeritritol (DTE). Soluções de funcionamento de controle de qualidade de BH4, BH2 e B foram prepa15 radas em 5, 8, 25 e 50 nM no plasma humano de K2 EDTA modificado por 0,1% (p/v) de DTE e armazenadas a -80°C.

Para processo de amostra, o plasma foi diluído 1:10 em tampão de re-suspensão. Para 180 μί de plasma diluído, 20 μί do tampão de precipitação 10 X foram adicionados. Este processo de diluição de plasma e precipitação foi aplicado a todos os padrões de 20 plasma, amostras de plasma e QCs de plasma. Depois da adição do tampão de precipitação 10 X, a amostra foi centrifugada em velocidade de máximo a 4°C durante 5 min para remover os resíduos de plasma não específico. 150 mL de sobrenadante foram em seguida transferidos para um frasconete de amostra e em seguida colocados em um amostrador automático para uma injeção de 100 mL.

A fase móvel (2L) foi preparada com 13,6 g de acetato de sódio (50 mM), 2,1 g de

ácido cítrico (5 mM) 36 mg de EDTA (48 mM), 49,4 mg de DTE (160 mM), e 2% de metanol por volume em água. O pH foi ajustado em 5,22. Tampão de re-suspensão (20 mL) foi preparado com 20 mL de PBS pH 7,4 (50 mM), 20 uL de 1M de DTE (1 mM), e 100 mL de 100 uM de EDTA. O tampão de precipitação 10X (25 mL) foi preparado fresco com 2,88 mL de ácido fosfórico (1M), 9,39 g de ácido tricloroacético (2 M) e 20 mL de 1M de DTE (1 mM).

Tetraidrobiopterina (BH4), diidrobiopterina (BH2), e Biopterina (B) foram separadas usando separação por HPLC de fase reversa. BH4 foi medida usando detecção eletroquímica em que BH4 é oxidada por eletrodo 1 em diidrobiopterina quinonóíde (qBH2) e em seguida reduzida outra vez em BH4 no eletrodo 2. O detector em seguida usa a corrente gerada 35 por esta reação de redução para determinar a concentração de BH4. BH2 e B podem ser medidos na mesma injeção usando detecção por fluorescência. Coluna pós-coluna de BH2 usando uma célula de defesa de condicionamento no potencial idal, oxida BH2 em Biopterina.

Separação por HPLC foi realizada em uma coluna ACE C-18 (250 mm x 4,6 mm), 5 μΜ, em uma taxa de fluxo de 1,3 mL/min com um tempo de funcionamento de 13 minutos. Aplicações de detecção eletroquímica foram El: + 100 mV (corrente antecedente +500 nA a 5 +600 nA) e E2: -300 mV (corrente antecedente -50 nA a -60 nA). Oxidação pós-coluna foi fixada em 900 mV. Aplicações de detecção por fluorescência foram comprimento de onda de excitação: 350 nM e comprimento de onda de emissão: 450 nM.

Linearidade e faixa do método foram avaliadas com base na precisão e exatidão dos padrões no plasma e tampão. A concentração de curva padrão foi estabelecida usando pelo menos concentrações não zero de 4-6 para cada analisado. A concentração dos padrões foi 1, 2,5, 5, 7,5, 10, e 100 nM. Os resultados mostraram um ajuste linear de 1 a 100 nM para BH4, BH2, e B com R2 de >0,99.

A extaidão foi determinada por análise de replicação de amostras de controle de qualidade contendo quantidades conhecidas (2, 8, 25, e 50 nM) do analisado e expressa 15 como um percentual de precisão. A precisão é da mesma forma é calculada com base nos dados dos controles de qualidade. A precisão de intra-ensaio e precisão de inter-ensaio foram avaliadas com base no % de CV. Em três ciclos experimentais separadas, experiências de cada analisado foram preparadas no plasma e analisadas. Além disso, 10 nM de BH4, BH2, e B foram "reforçados" em amostras de plasma humano para determinar a exatidão e 20 recuperação. As medidas de BH4, BH2, e B em 8, 25, e 50 nM mostraram ser precisas dentro de 112%-89% e demonstraram precisão (% de CV) de 2,5%-20%. As experiências de recuperação reforçadas usando 10 nM de BH4, BH2, e B em amostras clínicas de plasma humano demonstraram recuperações entre 70%-130%. Os resultados demonstram que o método é exato e preciso para amostras com concentrações maiores que 2 nM.

Paara conferir quanto a presença de interferência endógena em seis lotes diferen

tes de plasma, 10 nM de BH4, BH2, e B foram reforçados em seis lotes diferentes de plasma e a exatidão e precisão foram determinadas para cada amostra de plasma. Experiências de seletividade mostram que os seis indivíduos tiveram níveis de BH4 de referência endógenos entre abaixo do limite quantificável a 2,48 nM. Semelhantemente, concentrações de 30 BH2 e B variaram de 0,02 para 10 nM. A recuperação do 10 nM de analisados reforçados variou de 69%-87%. A variabilidade (% de CV) pelas amostras de plasma individuais e analisados quando reforçados em 10 nM variou de 23%-37%. A variabilidade dos níveis endógenos de BH4, BH2 e B variou de 0-9,96 nM. Conjuntamente, os resultados indicam uma tendência que sugestiona a interferência matriz ou perda durante a extração, porém não 35 indica seletividade forte entre os indivíduos.

Para medir o efeito matriz, curvas padrãs preparadas no plasma ou tampão foram comparadas quanto a exatidão (recuperação), linearidade e correlação. A comparação dos padrões preparados no plasma versus padrões preparados em tampão demonstra um efeito matriz modesto e correlação geralmente boa. Todos o três analisados tiveram ajustes lineares excelentes para plasma e tampão. BH4 e B não demonstraram efeitos matriz significantes pela faixa de concentração. Porém, BH2 teve menos recuperação na concentração pa5 drão mais alta (100 nM). As amostras de controle de qualidade preparadas em tampão e plasma demonstraram boa precisão. Efeitos matriz, global parecem mínimos, com uma tendência a menos recuperação em tampão quando comparada ao plasma. Porque BH4 e BH2 são facilmente oxidados, tampões de amostra e plasma coletados deveriam conter antioxidantes e deveriam ter baixo pH quando possível.

Para testar a capacidade para diluir com precisão uma amostra de tampão e plas

ma reforçada com 250 nM de BH4, BH2 e B, o plasma foi diluído usando solução absoluta em uma série de diluição de 3 vezes. As amostras diluídas foram analisadas e comparadas ao valor nominal depois que o fator de diluição foi aplicado. A diluição de concentrações altas de BH4, BH2, e B pode ser feita com precisão. Para BH4, as concentrações observa15 das depois da diluição estiveram entre 83% - 104% de precisão para concentrações entre 83,33 nM e 3,07 nM. BH2 estava entre 74%-80% de precisão do outro lado da faixa quantitativa (83 nM-3 - nM). B estava entre 119%-113% de precisão do outro lado da faixa quantitativa (83 nM-3 nM). Portanto, uma amostra que está acima do limite quantitativo pode ser diluída com precisão.

Quatro concentrações de analisados (2 ,8, 25 e 50 nM) foram preparadas no plas

ma e congeladas por um mínimo de 24 horas para um ciclo e um mínimo de 12 horas para outros ciclos para um mínimo de três ciclos. Amostras foram descongeladas sem auxílio em temperatura ambiente entre períodos congelados. A exatidão e variabilidade depois de cada e todos os ciclos de congelamento-descongelamento foram avaliadas para estabelecer o 25 número máximo de ciclos que uma amostra poderia sofrer. As amostras contendo BH4-, BH2-, e B podem sofrer até 3 ciclos de congelamento-descongelamento sem mudança significante na exatidão ou precisão da medida. Amostras de plasma com 8 nM-50 nM de BH4 são de 121 %-91 % de precisão e o % de CV menor que 10%. Semelhantemente, medidas de BH2 estavem entre 77% - 88% de precisão pela faixa quantitativa do ensaio. Medidas de 30 B estavam entre 98%-99% de precisão do outro lado da faixa quantitativa com precisão (% de CV) de 5%-8%. A amostra de 2 nM de BH4, BH2, e B não mostrou ser exata e precisadepois do congelamento-descongelamento repetido. Portanto, padrões, controles de qualidade e amostras de estudo podem ser congeladas e descongeladas até 3 vezes.

Porque os analisados são sensíveis à oxidação, nós examinamos a estabilidade congelada a longo prazo para imitar as condições de armazenamento esperadas. Quatro níveis de concentração (2, 8, 50, e 100 nM) de BH4, BH2, e B foram preparados no plasma e armazenados a -70°C durante 8 semanas. Amostras de estabilidade foram analisadas frescas e nas semanas 3, 5, 6, e 8. BH4 e B tiveram boa estabilidade congelada a longo prazo. BH2 demonstrou concentração de amostra reduzida depois do armazenamento prolongado. Durante as 8 semanas de armazenamento, amostras de plasma com BH4 estavam entre 93%-94% de precisão e tiveram % de CV entre 31 %-0,21 %, com o a maioria da varia5 ção vista na concentração de 2 nM. Medidas de BH2 estavam entre 63%-85% de precisão do outro lado das concentrações testadas com precisão reduzida nas concentrações de 2 nM e 100 nM. A precisão (% de CV) variou de 37% para 18% para estas amostras. Medidas de B estavam entre 88%-101% de precisão do outro lado das concentrações testadas com precisão (% de CV) de 23%-0,14%, com a variabilidade mais alta na concentração de 2 nM. 10 Conjuntamente, estes dados suportam a recomendação para armazenar amostras por até 8 semanas sem perda apreciável de concentração de analisado. BH2 parece ser a mais suscetível à degradação (oxidação).

Para medir a estabilidade de BH4, BH2, e B no amostrador automático, 8 nM de cada analisado em solvente de reconstituição ficaram no amostrador automático durante 15 0,25, 4, e 11 horas. A medida de BH4 observada estava precisa dentro de 5% de teórico em cada ponto de tempo com exatidão e precisão por todas as três medidas de 102% e 0,054% respectivamente. A medida de BH2 teve exatidão decrescente e variabilidade crescente depois de 4 horas. Depois de 11 horas no amostrador automático, cerca de 50% de BH2 foram medidos. Isto indica a estabilidade de amostrador automático inferior em tampão de funcio20 namento. A medida de B permaneceu exata dentro de 125% de teórico depois de 11 horas. Portanto, tempos de funcionamento de não mais que 4 horas são recomendados.

Para determinar o excedente da injeção, uma amostra de plasma de referência extraída foi inserida depois da concentração padrao mais alta de 100 nM. Isto foi feito para imitar a possibilidade de superestimar a concentração de analisado em uma amostra de bai25 xa concentração devido ao excedente. O excedente da injeção de BH4, BH2, e B é mínimo e não responde por mais que 1% da área de pico do limite superior de 100 nM de quantificação. O excedente da injeção responde por aproximadamente 5%-20% do limite inferior de quantificação, com base na área de pico média obtida do controle de qualidade baixo (2 nM). Portanto, preferivelmente as amostras devem ser ordenadas do mais baixo ao mais 30 alto (isto é, primeira pré-dose, seguido por amostras pós-dose) e lavagens adicionais para limpar a coluna periodicamente durante um ciclo preferivelmente serão feitas para minimizar o excedente potencial.

Um método qualificado que foi forte, específico, exato e preciso foi desenvolvido. Este método é apropriado para quantificar os níveis de BH4, BH2 e B no plasma para estudos de fármaco e farmacocinéticos.

Todas as patentes, publicações e referências citadas aqui são por este meio completamente incorporadas por referência. No caso de conflito entre a descrição presente e patentes incorporadas, publicações e referências, a presente descrição verificará.

Claims (53)

REIVINDICAÇÕES

1. Método de administrar tetraidrobiopterina oralmente (BH4), CARACTERIZADO pelo fato de compreender administrar a um humano em necessidade do mesmo uma quantidade terapeuticamente eficaz de BH4 ou um sal farmaceuticamente aceitável, e informar ao referido humano que a absorção da referida BH4 ou sal farmaceuticamente aceitável do mesmo é aumentada quando é ingerido com alimento comparado a quando ingerido sem alimento.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato do humano ser informado que Cmáx e AUC são aumentadas por aproximadamente 30% quando a BH4 ou sal farmaceuticamente aceitável da mesma é administrado com uma refeição com alto teor calórico, alto teor de gordura comparada a quando a BH4 ou sal farmaceuticamente aceitável da mesma é administrado sob condições em jejum.

3. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 2, CARACTERIZADO pelo fato da referida BH4 ou sal farmaceuticamente aceitável da mesma ser pelo menos 99,5% puro.

4. Método, de acordo com a reivindicação 3, CARACTERIZADO pelo fato da referida BH4 purificada ser um polimorfo cristalino, como um sal de cloridrato, que exibe um padrão de difração de pó de raios X com os seguintes picos característicos expressos em valores d (A): 8,7 (vs), 5,63 (m), 4,76(m), 4,40 (m), 4,00 (s), 3,23 (s), 3,11 (vs), preferivelmente 8,7 (vs), 6,9 (w), 5,90 (vw), 5,63 (m), 5,07 (m), 4,76 (m), 4,40 (m), 4,15 (w), 4,00 (s), 3,95 (m), 3,52 (m), 3,44 (w), 3,32 (m), 3,23 (s), 3,17 (w), 3,11 (vs), 3,06 (w), 2,99 (w), 2,96 (w), 2,94 (m), 2,87 (w), 2,84 (s), 2,82 (m), 2,69 (w), 2,59 (w), e 2,44 (w).

5. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, CARACTERIZADO pelo fato da BH4 ou sal farmaceuticamente aceitável da mesma ser administrado em uma dose diária de pelo menos 2 mg/kg.

6. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, CARACTERIZADO pelo fato da BH4 ou sal farmaceuticamente aceitável da mesma ser administrado em uma dose diária de pelo menos 5 mg/kg.

7. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, CARACTERIZADO pelo fato da BH4 ou sal farmaceuticamente aceitável da mesma ser administrado em uma dose diária de pelo menos 10 mg/kg.

8. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, CARACTERIZADO pelo fato do BH4 ou sal farmaceuticamente aceitável da mesma ser administrado em uma dose diária de pelo menos 20 mg/kg.

9. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, CARACTERIZADO pelo fato do humano ter sido diagnosticado com hiperfenilalaninemia.

10. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, CARACTERIZADO pelo fato do humano ter sido diagnosticado com um distúrbio neuropsiquiátrico.

11. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, CARACTERIZADO pelo fato do humano ter sido diagnosticado com uma doença cardiovascular.

12. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, CARACTERIZADO pelo fato do humano ter sido diagnosticado com anemia.

13. Método de aumentar o tempo de retenção do intestino de tetraidrobiopterina (BH4) ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo em um indivíduo, CARACTERIZADO pelo fato de compreender administrar uma formulação ao referido indivíduo, a referida formulação compreendendo (1) BH4 ou sal farmaceuticamente aceitável do mesmo e (2) um agente que reduz a motilidade intestinal, em que a BH4 ou sal farmaceuticamente aceitável do mesmo administrado pela formulação tem um tempo de retenção do intestino mais longo comparado com uma formulação de controle de BH4 ou sal farmaceuticamente aceitável do mesmo não tendo um agente que reduz a motilidade intestinal.

14. Método, de acordo com a reivindicação 13, CARACTERIZADO pelo fato do tempo de retenção intestinal do BH4 ou sal farmaceuticamente aceitável do mesmo ser pelo menos duas vezes mais longo em comparação à formulação de controle.

15. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 13 a 14, CARACTERIZADO pelo fato do agente ser um ácido graxo, um éster de ácido graxo de glicerol, ou combinação dos mesmos.

16. Método, de acordo com a reivindicação 15, CARACTERIZADO pelo fato do ácido graxo ser selecionado a partir do grupo que consiste em ácido oléico, ácido esteárico, ácido araquídico, ácido palmítico, ácido arquidóico, ácido linoléico, ácido linolênico, ácido erucídico, ácido mirístico, ácido láurico, ácido miristólico, e ácido palmitólico.

17. Método, de acordo com a reivindicação 15, CARACTERIZADO pelo fato do éster de ácido graxo de glicerol ser um monoéster, diéster, triéster, ou combinação dos mesmos.

18. Método, de acordo com a reivindicação 17, CARACTERIZADO pelo fato do éster de ácido graxo de glicerol ser uma combinação de monoéster de glicerol e diéster de glicerol.

19. Método, de acordo com a reivindicação 18, CARACTERIZADO pelo fato do agente ser uma combinação de monooleato de glicerol e dioleato de glicerol.

20. Formulação oral de tetraidrobiopterina (BH4) ou um sal farmaceuticamente aceitável da mesma, CARACTERIZADA pelo fato de compreender BH4 ou sal farmaceuticamente aceitável da mesma e um agente que reduz a motilidade intestinal.

21. Formulação, de acordo com a reivindicação 20, CARACTERIZADA pelo fato do agente ser um ácido graxo, éster de ácido graxo de glicerol, ou combinação dos mesmos.

22. Formulação, de acordo com a reivindicação 21, CARACTERIZADA pelo fato do ácido graxo ser selecionado a partir do grupo que consiste em ácido oléico, ácido esteárico, ácido araquídico, ácido palmítico, ácido arquidóico, ácido linoléico, ácido linolênico, ácido erucídico, ácido mirístico, ácido láurico, ácido miristólico, e ácido palmitólico.

23. Formulação, de acordo com a reivindicação 20, CARACTERIZADA pelo fato do éster de ácido graxo de glicerol ser um monoéster, diéster, triéster, ou combinação dos mesmos.

24. Formulação, de acordo com a reivindicação 23, CARACTERIZADA pelo fato do éster de ácido graxo de glicerol ser uma combinação de monoéster de glicerol e diéster de glicerol.

25. Formulação, de acordo com a reivindicação 24, CARACTERIZADA pelo fato do agente ser uma combinação de monooleato de glicerol e dioleato de glicerol.

26. Formulação líquida de tetraidrobiopterina (BH4) ou um sal farmaceuticamente aceitável da mesma, CARACTERIZADA pelo fato de compreender uma solução aquosa de BH4 ou sal farmaceuticamente aceitável da mesma, um antioxidante, e um tampão de pH.

27. Formulação de pó seca de tetraidrobiopterina (BH4) ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo para constituição em uma solução aquosa, CARACTERIZADA pelo fato de compreender uma mistura de pó seca de BH4 ou sal farmaceuticamente aceitável da mesma, um antioxidante, e um tampão de pH.

28. Formulação, de acordo com a reivindicação 26 ou 27, CARACTERIZADA pelo fato da BH4 ou sal farmaceuticamente aceitável da mesma estar presente em uma quantidade até 10% em p/v.

29. Formulação, de acordo com qualquer uma das reivindicações 26 a 28, CARACTERIZADA pelo fato do antioxidante compreender pelo menos dois antioxidantes.

30. Formulação de acordo com qualquer uma das reivindicações 26 a 29, CARACTERIZADA pelo fato de pelo menos dois antioxidantes compreenderem antioxidantes de agente de redução.

31. Formulação, de acordo com qualquer uma das reivindicações 29 a 30, CARACTERIZADA pelo fato de compreender um sinergista de antioxidante ácido e/ou um agente de quelação.

32. Formulação, de acordo com qualquer uma das reivindicações 26 a 31, CARACTERIZADA pelo fato do antioxidante estar presente em uma quantidade até5% em p/v.

33. Formulação, de acordo com qualquer uma das reivindicações 26 a 32, CARACTERIZADA pelo fato de ser fornecida em um recipiente selado e também compreender uma manta de um gás não oxidante.

34. Formulação, de acordo com a reivindicação 33, CARACTERIZADA pelo fato do referido gás não oxidante ser selecionado a partir do grupo que consiste em argônio, nitrogênio, gás carbônico, e combinações dos mesmos.

35. Formulação, de acordo com qualquer uma das reivindicações 26 a 34, CARACTERIZADA pelo fato de ter um pH ácido.

36. Formulação, de acordo com a reivindicação 35, CARACTERIZADA pelo fato de também compreender um adoçante e um agente flavorizante.

37. Formulação, de acordo com qualquer uma das reivindicações 26 a 34, CARACTERIZADA pelo fato de ter um pH neutro.

38. Método de preparar uma formulação líquida de tetraidrobiopterina (BH4) ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, CARACTERIZADO pelo fato de compreender fornecer uma solução aquosa que contém BH4 ou sal farmaceuticamente aceitável da mesma; adicionar um antioxidante e um tampão de pH à solução que contém BH4 ou sal farmaceuticamente aceitável da mesma; pulverizar a solução aquosa contendo BH4 ou sal farmaceuticamente aceitável da mesma, antes ou depois da adição de antioxidante e tampão de pH, com um gás inerte ou dióxido de carbono; e selar a solução pulverizada contendo BH4 ou sal farmaceuticamente aceitável da mesma, antioxidante, e tampão de pH em um recipiente.

39. Método, de acordo com a reivindicação 38, CARACTERIZADO pelo fato de compreender fornecer uma manta de gás não oxidante no recipiente sobre a solução.

40. Método, de acordo com a reivindicação 38 ou 39, CARACTERIZADO pelo fato de também compreender Iiofilizar a solução que contém BH4 ou sal farmaceuticamente aceitável da mesma, antioxidante, e tampão de pH, para produzir um produto seco.

41. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 38 a 40, CARACTERIZADO pelo fato da BH4 ou sal farmaceuticamente aceitável da mesma compreender dicloridrato de sapropterina.

42. Solução de fase móvel para separação de HPLC de fase reversa de diidrobiopterina, biopterina, e análogos das mesmas, CARACTERIZADA pelo fato de compreender: uma solução aquosa que compreende metanol, acetato de sódio, ácido cítrico, EDTA, e 1,4-ditioeritritol.

43. Solução, de acordo com a reivindicação 42, CARACTERIZADA pelo fato do metanol estar presente em uma quantidade de 2% em volume.

44. Solução, de acordo com a reivindicação 43, CARACTERIZADA pelo fato de compreender 50 mM de acetato de sódio, 5 mM de ácido cítrico, 48 μΜ de EDTA, e 160 μΜ de 1,4-ditioeritritol.

45. Método de separar diidrobiopterina e biopterina, ou análogos das mesmas, de uma mistura que contém tanto formas de base quanto diidro, CARACTERIZADO pelo fato de compreender: realizar HPLC de fase reversa usando uma fase móvel que compreende uma solução aquosa que compreende metanol, acetato de sódio, ácido cítrico, EDTA, e 1,4-ditioeritritol, em uma mistura que contém diidrobiopterina e biopterina, ou um análogo de diidrobiopterina e um análogo de biopterina.

46. Método, de acordo com a reivindicação 45, CARACTERIZADO pelo fato do metanol usado na fase móvel estar presente em uma quantidade de 2% em volume.

47. Método, de acordo com a reivindicação 46, CARACTERIZADO pelo fato da fase móvel compreender 50 mM de acetato de sódio, 5 mM de ácido cítrico, 48 μΜ de EDTA, e 160 μΜ de 1,4-ditioeritritol.

48. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 45 a 47, CARACTERIZADO pelo fato da mistura compreender uma amostra de sangue, plasma, homogenados de tecido, ou urina.

49. Método de medir biopterinas usando HPLC de fase reversa acoplada com espectrometria de massa em série (LC/MS/MS), CARACTERIZADO pelo fato de compreender: submeter as amostras de sangue, plasma, homogenados de tecido, ou urina compreendendo biopterinas à oxidação; submeter as amostras oxidadas à iodometria; passar as amostras oxidadas através de uma coluna de troca iônica; medir as biopterinas totais e oxidadas nas amostras usando HPLC e espectrometria de massa em série; e calcular a quantidade de biopterina reduzida como a diferença entre as biopterinas totais menos a forma oxidada.

50. Método, de acordo com a reivindicação 49, CARACTERIZADO pelo fato de também compreender tratar as amostras com KCI, HCI ou TCA antes da iodometria.

51. Método, de acordo com a reivindicação 49, CARACTERIZADO pelo fato de também tratar as amostras com Kl, I ou NaOH e submeter as amostras oxidadas alcalinas à acidificação com HCI ou TCA, antes da iodometria.

52. Método de quantificar biopterinas em uma mistura de espécies de biopterina, CARACTERIZADO pelo fato de compreender: fornecer uma mistura que compreende biopterina e pelo menos uma dentre diidrobiopterina e tetraidrobiopterina, ou análogos de biopterina e pelo menos uma dentre diidrobiopterina e tetraidrobiopterina; separar as espécies de biopterina na mistura por HPLC de fase reversa; e no caso de tetraidrobiopterina e análogos da mesma, realizar detecção eletroquímica oxidando-se a tetraidrobiopterina e análogos da mesma presentes por um primeiro eletrodo às formas de diidrobiopterina quinonóides, seguido reduzindo-se as formas quinonóides outra vez em tetraidrobiopterina e análogos da mesma presentes em um segundo eletrodo, e medindo-se a corrente gerada pela reação de redução para determinar a concentração de espécies; e/ou no caso de diidrobiopterina, análogos da mesma, biopterina, ou análogos da mesma, medir tais espécies através de detecção por fluorescência seguindo oxidação póscoluna de espécies de diidrobiopterina em biopterina.

53. Método, de acordo com a reivindicação 52, CARACTERIZADO pelo fato da mistura compreendendo espécies de biopterina ou análogos da mesma compreender uma amostra de sangue, plasma, homogenados de tecido, ou urina dos mesmos.