JP4486167B2 - 薬剤性腎障害の予防または治療剤 - Google Patents
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Description
発明の分野
本発明は、式（Ｉ）：
［式中、Ｒ1およびＲ2は、それぞれ水素原子を表すか、または一緒になって単結合を表し、Ｒ1およびＲ2が水素原子を表す場合には、Ｒ3は−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ3、−ＣＨ（ＯＣＯＣＨ3）ＣＨ（ＯＣＯＣＨ3）ＣＨ3、−ＣＨ3、−ＣＨ2ＯＨ又はフェニル基を表し、Ｒ1およびＲ2が一緒になって単結合を表す場合には、Ｒ3は−ＣＯＣＨ（ＯＨ）ＣＨ3を表す］
で表される化合物又はその薬学的に許容される塩を有効成分とする、薬剤性腎障害を予防および／または治療するための薬剤に関する。
発明の背景
薬剤による腎障害は臨床的には主としてネフローゼ症候群（軽度の場合は蛋白尿）と腎機能の障害として現れる。例えば、金製剤による膜性腎症に代表される糸球体障害の場合にはネフローゼ症候群となり、シスプラチンに代表される腎毒性物質による尿細管障害の場合には急性腎不全となる。尿細管での輸送機能の障害が特異的に見られる場合はＦａｎｃｏｎｉ症候群、尿細管性アシドーシス、腎性尿崩症などの臨床症状を呈する。メチシリンなどによる急性間質性腎炎の場合には腎機能障害として現れる。このように、薬剤による腎障害は、薬剤の種類により、またはその障害部位により種々の臨床症状を呈する（Ｍｅｄｉｃａｌ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｖｏｌ．１４ ｎｏ．８、１９９７，ｐ．１２７３）。
例えば、シクロスポリンＡは、移植時に汎用されている免疫抑制剤であるが、腎毒性が強く、発症頻度は、血中濃度依存性ではあるが、５０％以上である。シクロスポリンＡによる腎障害の発現型としては、急性腎不全、慢性腎不全、溶血性尿毒症性症候群（ｈｅｍｏｌｙｔｉｃ ｕｒｅｍｉｃ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、血栓性細小血管症（ｔｈｒｏｍｂｏｔｉｃ ｍｉｃｒｏａｎｇｉｏｐａｔｈｙ）、高血圧、電解質異常（例えば、高Ｋ血症、代謝性アシドーシス、低Ｍｇ血症等）など様々である。急性腎不全型をとる場合には、急性拒絶反応との鑑別が難しく、腎生検にて確認しなければならない。投与初期の糸球体濾過値（ＧＦＲ）の低下にはレニン・アンジオテンシン系の亢進、交感神経系の刺激、トロンボキサンＡ2産生亢進、エンドセリンの関与が考えられている。一方、腎移植患者ではシクロスポリンの長期投与により慢性腎不全型を呈することが多いが、慢性拒絶反応との鑑別が困難で、腎生検でも鑑別できない場合もある。シクロスポリンによる組織変化は、主に葉間動脈から輸入細動脈にかけての内皮細胞障害で、腎硬化像、間質の細胞浸潤と繊維化が主体である。さらに、シクロスポリン投与では、低Ｍｇ血症を伴うことが多く、極度の低Ｍｇ血症はシクロスポリンによる全身痙攣の原因とも考えられている（黒川清編集、腎臓学病態生理からのアプローチ、南江堂、ｐ．４１９−４２８，１９９５）。
一方、血管内皮は血管トーヌスや血栓の形成に重要な役割を果たす場であることは知られていたが、１９８０年に初めて内皮由来弛緩因子（ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｕｍ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｒｅｌａｘｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ：ＥＤＲＦ）の存在が報告された。その後、１９８７年にＥＤＲＦの本体が一酸化窒素（ＮＯ）であることが証明された。ＮＯはガス状ラジカルであり、細胞膜を簡単に通り抜け、循環制御、神経伝達、血小板凝集阻止、殺菌あるいは抗ガン作用など極めて多彩な作用を示すことが明らかにされつつある。ＮＯは、ヘム酵素やＳＨ酵素群などど反応して代謝を制御するのみならず、スーパーオキシド（Ｏ2 -）を初めとする活性酸素種、生体チオール、アスコルビン酸などとクロストークしながら生理機能と病理活性を発揮している。しかしながら、これらの分子種はいずれも不安定なため、生体内でのその分子論的実体はなお不明な点が多い。
上述したように多彩な作用を有するＮＯは、Ｌ−アルギニンが酸化され、ＮG−ヒドロキシル−Ｌ−アルギニンからＬ−シトルリンになる際に産生され、その反応はＮＯ合成酵素（ＮＯｓｙｎｔｈａｓｅ：ＮＯＳ）という酵素によって触媒される。ＮＯＳには、血管内皮型、神経型および誘導型のアイソフォームがあり、血管内皮型は主に血管内皮、腎臓などに、神経型は神経系に存在する。また、誘導型は炎症や組織障害時などに誘導されるマクロファージなどに存在し、既にいずれもそれらの遺伝子がクローニングされ、構造解析が行われている。その結果、ＮＯＳ遺伝子には補酵素として、カルモジュリン（ＣａＭ）、フラビン、ＮＡＤＰＨの結合部位に加えて、本発明の有効成分である式（Ｉ）の化合物に含まれる、（６Ｒ）−Ｌ−エリスロ−５，６，７，８−テトラヒドロビオプテリン（以下、「ＢＨ４」という）の結合部位が存在することが判明した。さらに、ＢＨ４が実際にＮＯＳの機能制御に関与することも示唆されている。
このように、従来、ＮＯの血管弛緩作用、ならびにＢＨ４によるＮＯＳ機能制御についてはある程度知見が得られていた。しかしながら、ＮＯの作用およびＮＯＳの活性と薬剤性腎障害との関連は明らかにされておらず、薬剤性腎障害と生体内のＢＨ４との関係は当然全く知られていなかった。
また、薬剤性腎障害の予防または治療の目的は、単に腎障害を予防または治療するにとどまらず、腎障害の原因となる薬剤の使用を可能にし、患者の生命を延長し、かつ充実した生活を送らせることにある。しかしながら、現在、薬剤性腎障害に対しては、急性腎不全の場合には腎機能の回復のために薬剤の投与を中断せざるをえず、また慢性腎不全では透析または腎移植に頼らなければならず、疾患または症状の改善は望めない。このように、薬剤性腎障害の治療は未だ確立しておらず、その予防薬はもとより治療薬も存在しないのが現状である。従って、副作用や長期連用の安全性、またＱＯＬ（ｑｕａｌｉｔｙ ｏｆ ｌｉｆｅ）の改善という点で、全てを十分に満たした薬剤が求められている。
以上のように、真に望ましい条件を備えた治療薬が要望され、また、腎保護作用を持つ予防薬剤の開発も切望されている。
なお、本発明の治療剤の有効成分である式（Ｉ）の化合物は公知化合物であり、悪性高フェニルアラニン血症、うつ病、パーキンソン病、その他の治療薬としての用途が知られている。例えば、特開昭５９−２５３２３号公報、同５９−７６０８６号公報、同６１−２７７６１８号公報、同６３−２６７７８１号公報を参照。
発明の概要
本発明は、薬剤性腎障害に対し、内皮細胞機能調節作用により循環動態、臓器機能を改善させ、諸合併症の進展を抑制し、患者の日常生活の質を高めるべく、副作用がなく安全な治療剤を提供することを目的とする。
本発明者らは、薬剤性腎障害のモデルとしてシクロスポリン性腎障害ラットを作成し、当該モデルラットにおいてＮＯＳの機能の異常を見出した。そして、当該シクロスポリン性腎障害ラットではＮＯＳ活性レベルが亢進し、さらにＢＨ４レベルも亢進していることを認めた。そして種々の検討の結果、驚くべきことにＢＨ４を投与すると、内皮細胞機能を回復してＮＯＳの機能を正常化することによって、生理的に極めて自然な優れた腎保護効果が得られることを見いだし、本発明を完成させるに至った。すなわち、本発明は、ＢＨ４類製剤による、薬剤性腎障害の効果的な予防または治療に関するものである。
発明の詳細な説明
本発明は、式（Ｉ）：
［式中、Ｒ1およびＲ2は、それぞれ水素原子を表すか、または一緒になって単結合を表し、Ｒ1およびＲ2が水素原子を表す場合には、Ｒ3は−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ3、−ＣＨ（ＯＣＯＣＨ3）ＣＨ（ＯＣＯＣＨ3）ＣＨ3、−ＣＨ3、−ＣＨ2ＯＨ又はフェニル基を表し、Ｒ1およびＲ2が一緒になって単結合を表す場合には、Ｒ3は−ＣＯＣＨ（ＯＨ）ＣＨ3を表す］
で表される化合物またはその薬学的に許容される塩を有効成分とする、薬剤性腎障害を予防または治療するための薬剤である。
本明細書において薬剤性腎障害とは、腎臓に病変の起こった状態を広く含み、そのうち薬剤に起因するものを意味する。薬剤による腎障害は臨床的には主としてネフローゼ症候群（軽度の場合は蛋白尿）と腎機能の障害として現れる。本明細書における薬剤性腎障害は、腎機能低下が原因となって発症する疾患、腎機能低下が症状を悪化させる疾患、腎機能低下が治癒を遅らせる疾患等を広く含む。薬剤性腎障害の臨床症状としては、腎前性急性腎不全、腎性急性腎不全、腎後性急性腎不全等の急性腎不全、および腎機能障害がさらに進んで末期腎不全となった慢性腎不全に大別される。腎性急性腎不全は、血管炎、糸球体病変、急性糸球体腎炎、急速進行性腎炎、溶血性尿毒症症候群、悪性高血症、腎皮質壊死、播種性血管内凝固、強皮症、急性間質性腎炎、ネフローゼ症候群または急性腎盂腎炎等の症状を引き起こしうる。さらに、障害部位により、例えば、細動脈の場合には細動脈収縮、内皮障害、細動脈血栓、糸球体の場合は膜性腎症、尿細管・間質の場合は尿細管壊死、尿細管機能異常、急性間質性腎炎、尿細管閉塞等の組織病変が観察される。
また、本明細書において薬剤性腎障害の起因となりうる薬剤は、特に限定されない。あらゆる薬剤が腎障害を来しうる。例えば、限定されるわけではないが、抗生物質（ペニシリン、マイトマイシン、シクロスポリン、アムホテリシンＢ、メチシリン、セファロスポリン、アミノグリコシド等）、非ステロイド系抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、抗腫瘍剤（シスプラチン、イホスファミド、メトトレキサート等）、金製剤、重金属（水銀）、造影剤、農薬（パラコート等）などが挙げられる。
ＢＨ４は、薬剤性腎障害を有する患者に投与されたとき、低下した内皮細胞の機能を回復させることによりＮＯＳの機能を正常化して、これらの疾患を予防または治療することができる。
本発明の有効成分である式（Ｉ）で表される化合物には次のものおよびそれらの薬学的に許容される塩が含まれる：
（６Ｒ）−Ｌ−エリスロ−５，６，７，８−テトラヒドロビオプテリン（ＢＨ４）
（６Ｒ，Ｓ）−５，６，７，８−テトラヒドロビオプテリン
１’，２’−ジアセチル−５，６，７，８−テトラヒドロビオプテリン
セピアプテリン
６−メチル−５，６，７，８−テトラヒドロプテリン
６−ヒドロキシメチル−５，６，７，８−テトラヒドロプテリン
６−フェニル−５，６，７，８−テトラヒドロプテリン
以上の化合物で、好ましい化合物は５，６，７，８−テトラヒドロビオプテリン類又はその塩であり、更にそのうちでも最も好ましい化合物はＢＨ４又はその塩である。
本発明で有効成分として使用する式（Ｉ）で表される化合物は公知化合物である。例えば、特開昭５９−２５３２３号公報、同５９−７６０８６号公報、同６１−２７７６１８号公報、同６３−２６７７８１号公報参照。これらは適当な塩として用いてもよく、そのような塩としては薬理的に無毒性の酸、例えば、塩酸、リン酸、硫酸、ホウ酸等の鉱酸、及び、酢酸、ギ酸、マレイン酸、フマル酸、メシル酸等の有機酸との塩が例示される。
本発明の薬剤は前記した疾患に有効である。即ち、薬剤に起因する腎臓に病変の起こった状態を広く対象とする。
本発明の治療剤は、式（Ｉ）で表される化合物を一般の医薬製剤に用いられる担体と、常法によって経口、直腸又は非経腸（静脈内、髄液中への投与を含む）投与に適する製剤形態にすることにより製造される。
これら医薬製剤に用いられる担体としては、用いられる剤形によるが、一般的に賦形剤、結合剤、崩壊剤などが挙げられる。
賦形剤の代表的な例としては澱粉、乳糖、白糖、ブドウ糖、マンニトール、セルロース等があり、結合剤としてはポリビニルピロリドン、澱粉、白糖、ヒドロキシプロピルセルロース、アラビアゴムなどがある。又、崩壊剤の例としてはデンプン、寒天、ゼラチン末、セルロース、ＣＭＣなどがあるが、一般に用いられている賦形剤、結合剤、崩壊剤であればこれら以外でもよい。
本発明の治療剤は、好ましくは上記担体以外に、有効成分を安定化するための酸化防止剤を含有する。酸化防止剤は医薬製剤に一般に使用されているものから適宜選択され、例えば、アスコルビン酸、Ｎ−アセチルシステイン、Ｌ−システイン、ｄｌ−α−トコフェロール、天然トコフェロール等があげられる。使用する量は、活性成分（１種またはそれ以上）を安定化させる量であればよいが、一般的には活性成分１に対し重量で０．２ないし２．０が好ましい。
経口投与に適する本発明の製剤は各々所定量の活性成分（１種またはそれ以上）を含有する錠剤、舌下錠、カプセル剤、粉末、散剤、顆粒剤もしくは細粒剤として、またはシロップ、エマルジョン若しくは頓服剤のような非水性液中の懸濁液として提供できる。
例えば、顆粒剤は、活性成分（１種またはそれ以上）と１種またはそれ以上の前記担体、酸化防止剤等の補助成分を均一に混合して造粒し、ふるいを用いてメッシュをそろえることにより提供される。錠剤は、活性成分（１種またはそれ以上）を、場合により１種またはそれ以上の補助成分と共に、圧縮または成形により製造できる。カプセル剤は、活性成分（１種またはそれ以上）を、場合により１種またはそれ以上の補助成分と均一に混合した粉末または顆粒を適当なカプセルに充填機等を用いて充填して製造する。直腸投与用の製剤は、カカオ脂などの慣用の担体を使用し、座薬として提供できる。非経腸投与用製剤は、殺菌窒素浄化容器中に活性成分（１種またはそれ以上）を乾燥固体として密封して提供できる。この乾燥固体製剤は非経腸投与時に、所定量の無菌水に分散もしくは溶解して患者に投与することができる。
これらの製剤の製造においては、有効成分及び通常の担体の他に前述の酸化防止剤を加えて製剤することが好ましく、又所望により緩衝剤、風味付与剤、表面活性剤、増粘剤、潤滑剤、滑沢剤等から選ばれる１種またはそれ以上の補助成分をさらに含有してもよい。
活性成分、すなわち、式（Ｉ）で表される化合物の投与量は投与経路、処置される症状、および処置を受ける患者によって変わることは勿論のことであるが、最終的には医師の判断にまかせられる。
例えば、薬剤性腎障害を処置するのに適当な投与量は、投与の目的、対象者の年齢、体重、状態等により異なるが、経口投与の場合、０．１〜５０ｍｇ／ｋｇ（体重）／日の範囲にあり、代表的な好適投与量は０．５〜１０ｍｇ／ｋｇ（体重）／日である。
所望の投与量は上記の活性成分を１日１回投与してもよいが、１日中の適当な間隔で２〜４回分割投与してもよい。
活性成分は単独で、そのまま他の成分と混合せずに投与することもできるが、投与量の調節を容易にするため等の理由から適用疾患に応じた他の活性成分を医薬製剤として投与することもできる。
また、本発明の製剤は、有効成分として式（Ｉ）で表される化合物と共に、ＮＯＳの基質または補酵素もしくは補因子の、例えばＬ−アルギニン、フラビン類（例えば、ＦＡＤ、ＦＭＮ等）およびカルシウムよりなる群から選ばれる少なくとも１種を補助的有効成分として含有してもよい。これら、有効成分の混合により、式（Ｉ）で表される化合物の単独使用に比べて、一層優れた治療効果を期待できる。本発明製剤中における上記各成分の比率は特に限定されないが、例えば、重量で式（Ｉ）で表される化合物の１に対して、Ｌ−アルギニン、フラビン類およびカルシウムよりなる群から選ばれる少なくとも１種を０．１〜１０の範囲、好ましくは０．５〜２の範囲とすることができる。
この混合製剤により、例えば薬剤性腎障害を治療する際の適当な投与量は、投与の目的、対象者の年齢、体重、状態等により異なるが、経口投与の場合、有効成分の合計量として０．１〜５０ｍｇ／ｋｇ（体重）／日の範囲にあり、好ましくは０．５〜１０ｍｇ／ｋｇ（体重）／日である。
治療に当たり、式（Ｉ）で表される化合物を単独で有効成分として含む製剤および他の有効成分とともに含む製剤の選択は、年齢、症状等に応じて医師により適宜選択される。
本発明に用いられる活性成分は、（６Ｒ）−Ｌ−エリスロ−５，６，７，８−テトラヒドロビオプテリン（ＢＨ４）およびその塩が最も好ましいが、（６Ｒ，Ｓ）−５，６，７，８−テトラヒドロビオプテリン、１’，２’−ジアセチル−５，６，７，８−テトラヒドロビオプテリン、セピアプテリン、６−メチル−５，６，７，８−テトラヒドロプテリン、６−ヒドロキシメチル−５，６，７，８−テトラヒドロプテリンまたは６−フェニル−５，６，７，８−テトラヒドロプテリンおよびそれらの塩等の類似化合物でもよい。しかし、生体内に存在する天然体であるＢＨ４が好ましいことは言うまでもない。このＢＨ４・２塩酸塩のラットに対する急性毒性は経口投与で２ｇ／ｋｇ（体重）以上であり、ほとんど毒性は見い出されない。また、光学活性体でない（６Ｒ，Ｓ）−５，６，７，８−テトラヒドロビオプテリンも、特開昭５９−２５３２３号公報におけるパーキンソン病の治療にも見られるように毒性は弱く、本発明の治療に用いられることは可能である。これら以外の式（Ｉ）に属する化合物も、急性毒性は殆ど見いだされない。
以下の実施例に従ってさらに詳細に説明するが、本発明は、これらの実施例に限定されるものではない。
実施例
実施例１ （顆粒剤、細粒剤）
ポリビニルピロリドン（コリドン３０）１部（重量部）を滅菌精製水に溶かし、これにアスコルビン酸１０部およびＬ−システイン・塩酸塩５部を加え均一な溶液とした後、ＢＨ４・２塩酸塩１０部を加え均一とした。
この溶液を賦形剤（マンニトールまたは乳糖）５９部および崩壊剤［コーンスターチまたはヒドロキシプロピルセルロース（ＬＨ−２２）］１５部に加え、練合、造粒、乾燥した後、篩別した。
実施例２ （錠剤）
実施例１で作った活性成分の均一溶液に乳糖５８部、微結晶セルロース１５部を混合したのち、さらにステアリン酸マグネシウム１部を加え混合し打錠した。
実施例３ （カプセル剤）
実施例１で作成した剤形のものをカプセルに充填した。但し滑沢剤としてステアリン酸マグネシウムを０．２％添加して製剤したものを用いた。
実施例４ （注射用剤）
ＢＨ４・２塩酸塩 1.5ｇ
アスコルビン酸 1.5ｇ
Ｌ−システイン・塩酸塩 0.5ｇ
マンニトール 6.5ｇ
上記成分を滅菌精製水に溶かし、１００ｍｌとし除菌したものを、１ｍｌ又は２ｍｌずつバイアル又はアンプルにとり凍結乾燥密封した。
実施例５ （注射用剤）
ＢＨ４・２塩酸塩２．０ｇを無酸素で滅菌精製水に溶かし、１００ｍｌとした溶液を、除菌し、実施例４と同様に密封した。
実施例６ （座薬用剤）
ＢＨ４・２塩酸塩 150部
アスコルビン酸 150部
Ｌ−システイン・塩酸塩 50部
上記成分を用い、均一な粉末にしたものをカカオ脂９９５０部に分散させた。
実施例７ （顆粒剤）
ＢＨ４・２塩酸塩 ５部
アスコルビン酸 ５部
Ｌ−システイン・塩酸塩 ２部
上記成分を用いて均一な溶液とした。
一方マンニトール５５部、ポリビニルピロリドン１部、ヒドロキシプロピルセルロース１４部、ならびにＬ−アルギニンもしくはカルシウム５部を均一に混合したものに上記の溶液を加え、練合、造粒、乾燥した後、篩別した。
実施例８ （顆粒剤）
ＢＨ４・２塩酸塩 ５部
アスコルビン酸 ５部
Ｌ−システイン・塩酸塩 ５部
マンニトール ５２部
ポリビニルピロリドン（コリドン３０） １部
ヒドロキシプロピルセルロース（ＬＨ−２２） １２部
Ｌ−アルギニンまたはカルシウム １０部
上記成分を用い実施例７と同様に造粒し、篩別した。
実施例９ （顆粒剤）
ＢＨ４・２塩酸塩 ５部
アスコルビン酸 ５部
Ｌ−システイン・塩酸塩 ２部
上記成分を使用し均一溶液とした。
一方、Ｌ−アルギニンまたはカルシウム１０部、マンニトール５０部、ポリビニルピロリドン（コリドン３０）１部およびヒドロキシプロピルセルロース（ＬＨ−２２）９部を均一に混合したものに上記溶液を練合、造粒、乾燥した後、篩別した。
実施例１０
８−１０週齢のＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒから入手）（３００ｇ）を用い、以下の３つの実験群にわけて比較検討した。なお、実験期間６週間において、飼育は低塩（０．０５％）飼料を用い、実験２週目以降終了までの５週間下記の投与を行った。
１）ＣｙＡ群：
シクロスポリン１５ｍｇ／ｋｇ（体重）／日（皮下投与、オリーブオイルに配合）、ｎ＝８
２）ＢＨ４群：
シクロスポリン１５ｍｇ／ｋｇ（体重）／日（皮下投与、オリーブオイルに配合）＋ＢＨ４・２塩酸塩１０ｍｇ／ｋｇ（体重）／日（経口投与）、ｎ＝８
３）対照群：
オリーブオイルのみ、ｎ＝６
各群を実験期間である６週間観察した。以下に記載した方法により、血圧、腎皮質ＮＯＳ活性、および血中のＢＰ量を測定した。６週間後、フェノバルビタール麻酔下で腹部大動脈より採血、その後腎臓を生理食塩水で潅流後摘出し、組織学的検討を行い、ＢＨ４投与がシクロスポリン性腎障害に与える影響について検討した。
血圧測定
血圧はtail-cuff法により、実験開始時、２週間後、４週間後、６週間後において測定した。
腎皮質ＮＯＳ活性
3Ｈ−アルギニンを用い、腎組織ＮＯＳにより生成される3Ｈ−シトルリンを測定し、ＮＯＳ活性とした。
血中ＢＰ測定
観察終了時、Ｆｕｋｕｓｈｉｍａ ａｎｄ Ｎｉｘｏｎの方法（Anal. Biochem. 102;176-188, 1980）に基づきＨＰＬＣ分析を行い、ＢＨ４の代謝物であるビオプテリン（ＢＰ）を測定した。血中ＢＰの値によりＢＨ４投与の影響を考察する。
腎組織化学
凍結腎組織より薄切切片を作成し、ＮＯＳ活性を組織上でみるため、ＮＡＤＰＨ−ジアフォラーゼ（ｄｉａｐｈｏｒａｓｅ）染色を行った。また、マクロファージ細胞膜抗原ＥＤ−１に対するモノクローナル抗体を用いて組織染色を行い、ＮＯＳアイソフォームの検討を行った。
病理組織学的所見
６週間後の採尿、血圧測定を終了した後、麻酔下で開腹して腹部大動脈から脱血し、同部より生理食塩水を注入、灌流を行った。摘出した腎臓を１０％ホルムアルデヒド中で固定し、パラフィン包埋後、ミクロトームにて４μｍに薄切りし、腎組織標本を作製した。ヘマトキシリン・エオジン（ＨＥ）染色およびｐｅｒｉｏｄｉｃ ａｃｉｄ−Ｓｈｉｆｆ染色を行った。ラット腎組織標本内に見られる病理学的所見、すなわち、細動脈血管障害（ａｒｔｅｒｉｏｐａｔｈｙ）の出現頻度を比較検討した。
統計
群間の統計はｔｗｏ−ｗａｙＡＮＯＶＡにより行った。以下、ｐ＜０．０５を有意水準とした。
結果
血圧は、ＣｙＡ群、ＢＨ４群のいずれも観察終了時まで対照群と同様に正常血圧にとどまった。
腎皮質ＮＯＳ活性は、ＣｙＡ群では対照群に対し、２６０．８１４ｍｍｏｌ／日（平均）有意に増加した。これに対し、ＢＨ４群では対照群に対し、１４０．６００ｍｍｏｌ／日（平均）増加した。
血中ＢＰ量は、ＣｙＡ群では有意に増加した（対照群に対し、０．００６ｎｍｏｌ（平均））。これに対し、ＢＨ４群ではこれを減少させた（ＣｙＡ群に対し、０．００２ｎｍｏｌ（平均））。
腎組織化学は、ＣｙＡ群では、ＮＡＤＰＨ−ジアフォラーゼ染色性が低下し、ＥＤ−１陽性細胞の浸潤が多くみられた。これに対して、ＢＨ４群ではＮＡＤＰＨ−ジアフォラーゼ染色性が回復し、ＥＤ−１陽性細胞の浸潤が少ないことから血管内皮型のＮＯＳの機能が正常化した。
腎組織標本内に見られる病理組織学的所見の出現頻度を表１に示す。ＢＨ４群では、ＣｙＡ群で有意（ｐ＜０．０００１）に出現した細動脈血管障害を、有意（ｐ＜０．０００１）に抑制した。
以上、当該モデルラットにおいては、ＣｙＡ群で細動脈血管障害の病理組織学的所見が見られた。さらに、マクロファージ由来の誘導型ＮＯＳ活性レベルが上昇していることが明らかにされた。一方、経口投与したＢＨ４により病理組織学的所見の顕著な改善が見られ、血管内皮型のＮＯＳ活性レベルが上昇したことから、ＢＨ４が内皮細胞の機能を回復させることにより、ＮＯＳの機能を正常化して薬剤性腎障害の治療に有用であることが示された。
以上説明したとおり、本発明は薬剤性腎障害を有効に予防および／または改善する治療剤を提供するものである。また、本発明の治療剤の有効成分は生体内にもともと存在する物質なので長期間使用しても副作用等の心配がない。
本発明は、式（Ｉ）：
で表される化合物又はその薬学的に許容される塩を有効成分とする、薬剤性腎障害を予防および／または治療するための薬剤に関する。
発明の背景
薬剤による腎障害は臨床的には主としてネフローゼ症候群（軽度の場合は蛋白尿）と腎機能の障害として現れる。例えば、金製剤による膜性腎症に代表される糸球体障害の場合にはネフローゼ症候群となり、シスプラチンに代表される腎毒性物質による尿細管障害の場合には急性腎不全となる。尿細管での輸送機能の障害が特異的に見られる場合はＦａｎｃｏｎｉ症候群、尿細管性アシドーシス、腎性尿崩症などの臨床症状を呈する。メチシリンなどによる急性間質性腎炎の場合には腎機能障害として現れる。このように、薬剤による腎障害は、薬剤の種類により、またはその障害部位により種々の臨床症状を呈する（Ｍｅｄｉｃａｌ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｖｏｌ．１４ ｎｏ．８、１９９７，ｐ．１２７３）。
例えば、シクロスポリンＡは、移植時に汎用されている免疫抑制剤であるが、腎毒性が強く、発症頻度は、血中濃度依存性ではあるが、５０％以上である。シクロスポリンＡによる腎障害の発現型としては、急性腎不全、慢性腎不全、溶血性尿毒症性症候群（ｈｅｍｏｌｙｔｉｃ ｕｒｅｍｉｃ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、血栓性細小血管症（ｔｈｒｏｍｂｏｔｉｃ ｍｉｃｒｏａｎｇｉｏｐａｔｈｙ）、高血圧、電解質異常（例えば、高Ｋ血症、代謝性アシドーシス、低Ｍｇ血症等）など様々である。急性腎不全型をとる場合には、急性拒絶反応との鑑別が難しく、腎生検にて確認しなければならない。投与初期の糸球体濾過値（ＧＦＲ）の低下にはレニン・アンジオテンシン系の亢進、交感神経系の刺激、トロンボキサンＡ2産生亢進、エンドセリンの関与が考えられている。一方、腎移植患者ではシクロスポリンの長期投与により慢性腎不全型を呈することが多いが、慢性拒絶反応との鑑別が困難で、腎生検でも鑑別できない場合もある。シクロスポリンによる組織変化は、主に葉間動脈から輸入細動脈にかけての内皮細胞障害で、腎硬化像、間質の細胞浸潤と繊維化が主体である。さらに、シクロスポリン投与では、低Ｍｇ血症を伴うことが多く、極度の低Ｍｇ血症はシクロスポリンによる全身痙攣の原因とも考えられている（黒川清編集、腎臓学病態生理からのアプローチ、南江堂、ｐ．４１９−４２８，１９９５）。
一方、血管内皮は血管トーヌスや血栓の形成に重要な役割を果たす場であることは知られていたが、１９８０年に初めて内皮由来弛緩因子（ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｕｍ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｒｅｌａｘｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ：ＥＤＲＦ）の存在が報告された。その後、１９８７年にＥＤＲＦの本体が一酸化窒素（ＮＯ）であることが証明された。ＮＯはガス状ラジカルであり、細胞膜を簡単に通り抜け、循環制御、神経伝達、血小板凝集阻止、殺菌あるいは抗ガン作用など極めて多彩な作用を示すことが明らかにされつつある。ＮＯは、ヘム酵素やＳＨ酵素群などど反応して代謝を制御するのみならず、スーパーオキシド（Ｏ2 -）を初めとする活性酸素種、生体チオール、アスコルビン酸などとクロストークしながら生理機能と病理活性を発揮している。しかしながら、これらの分子種はいずれも不安定なため、生体内でのその分子論的実体はなお不明な点が多い。
上述したように多彩な作用を有するＮＯは、Ｌ−アルギニンが酸化され、ＮG−ヒドロキシル−Ｌ−アルギニンからＬ−シトルリンになる際に産生され、その反応はＮＯ合成酵素（ＮＯｓｙｎｔｈａｓｅ：ＮＯＳ）という酵素によって触媒される。ＮＯＳには、血管内皮型、神経型および誘導型のアイソフォームがあり、血管内皮型は主に血管内皮、腎臓などに、神経型は神経系に存在する。また、誘導型は炎症や組織障害時などに誘導されるマクロファージなどに存在し、既にいずれもそれらの遺伝子がクローニングされ、構造解析が行われている。その結果、ＮＯＳ遺伝子には補酵素として、カルモジュリン（ＣａＭ）、フラビン、ＮＡＤＰＨの結合部位に加えて、本発明の有効成分である式（Ｉ）の化合物に含まれる、（６Ｒ）−Ｌ−エリスロ−５，６，７，８−テトラヒドロビオプテリン（以下、「ＢＨ４」という）の結合部位が存在することが判明した。さらに、ＢＨ４が実際にＮＯＳの機能制御に関与することも示唆されている。
このように、従来、ＮＯの血管弛緩作用、ならびにＢＨ４によるＮＯＳ機能制御についてはある程度知見が得られていた。しかしながら、ＮＯの作用およびＮＯＳの活性と薬剤性腎障害との関連は明らかにされておらず、薬剤性腎障害と生体内のＢＨ４との関係は当然全く知られていなかった。
また、薬剤性腎障害の予防または治療の目的は、単に腎障害を予防または治療するにとどまらず、腎障害の原因となる薬剤の使用を可能にし、患者の生命を延長し、かつ充実した生活を送らせることにある。しかしながら、現在、薬剤性腎障害に対しては、急性腎不全の場合には腎機能の回復のために薬剤の投与を中断せざるをえず、また慢性腎不全では透析または腎移植に頼らなければならず、疾患または症状の改善は望めない。このように、薬剤性腎障害の治療は未だ確立しておらず、その予防薬はもとより治療薬も存在しないのが現状である。従って、副作用や長期連用の安全性、またＱＯＬ（ｑｕａｌｉｔｙ ｏｆ ｌｉｆｅ）の改善という点で、全てを十分に満たした薬剤が求められている。
以上のように、真に望ましい条件を備えた治療薬が要望され、また、腎保護作用を持つ予防薬剤の開発も切望されている。
なお、本発明の治療剤の有効成分である式（Ｉ）の化合物は公知化合物であり、悪性高フェニルアラニン血症、うつ病、パーキンソン病、その他の治療薬としての用途が知られている。例えば、特開昭５９−２５３２３号公報、同５９−７６０８６号公報、同６１−２７７６１８号公報、同６３−２６７７８１号公報を参照。
発明の概要
本発明は、薬剤性腎障害に対し、内皮細胞機能調節作用により循環動態、臓器機能を改善させ、諸合併症の進展を抑制し、患者の日常生活の質を高めるべく、副作用がなく安全な治療剤を提供することを目的とする。
本発明者らは、薬剤性腎障害のモデルとしてシクロスポリン性腎障害ラットを作成し、当該モデルラットにおいてＮＯＳの機能の異常を見出した。そして、当該シクロスポリン性腎障害ラットではＮＯＳ活性レベルが亢進し、さらにＢＨ４レベルも亢進していることを認めた。そして種々の検討の結果、驚くべきことにＢＨ４を投与すると、内皮細胞機能を回復してＮＯＳの機能を正常化することによって、生理的に極めて自然な優れた腎保護効果が得られることを見いだし、本発明を完成させるに至った。すなわち、本発明は、ＢＨ４類製剤による、薬剤性腎障害の効果的な予防または治療に関するものである。
発明の詳細な説明
本発明は、式（Ｉ）：
で表される化合物またはその薬学的に許容される塩を有効成分とする、薬剤性腎障害を予防または治療するための薬剤である。
本明細書において薬剤性腎障害とは、腎臓に病変の起こった状態を広く含み、そのうち薬剤に起因するものを意味する。薬剤による腎障害は臨床的には主としてネフローゼ症候群（軽度の場合は蛋白尿）と腎機能の障害として現れる。本明細書における薬剤性腎障害は、腎機能低下が原因となって発症する疾患、腎機能低下が症状を悪化させる疾患、腎機能低下が治癒を遅らせる疾患等を広く含む。薬剤性腎障害の臨床症状としては、腎前性急性腎不全、腎性急性腎不全、腎後性急性腎不全等の急性腎不全、および腎機能障害がさらに進んで末期腎不全となった慢性腎不全に大別される。腎性急性腎不全は、血管炎、糸球体病変、急性糸球体腎炎、急速進行性腎炎、溶血性尿毒症症候群、悪性高血症、腎皮質壊死、播種性血管内凝固、強皮症、急性間質性腎炎、ネフローゼ症候群または急性腎盂腎炎等の症状を引き起こしうる。さらに、障害部位により、例えば、細動脈の場合には細動脈収縮、内皮障害、細動脈血栓、糸球体の場合は膜性腎症、尿細管・間質の場合は尿細管壊死、尿細管機能異常、急性間質性腎炎、尿細管閉塞等の組織病変が観察される。
また、本明細書において薬剤性腎障害の起因となりうる薬剤は、特に限定されない。あらゆる薬剤が腎障害を来しうる。例えば、限定されるわけではないが、抗生物質（ペニシリン、マイトマイシン、シクロスポリン、アムホテリシンＢ、メチシリン、セファロスポリン、アミノグリコシド等）、非ステロイド系抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、抗腫瘍剤（シスプラチン、イホスファミド、メトトレキサート等）、金製剤、重金属（水銀）、造影剤、農薬（パラコート等）などが挙げられる。
ＢＨ４は、薬剤性腎障害を有する患者に投与されたとき、低下した内皮細胞の機能を回復させることによりＮＯＳの機能を正常化して、これらの疾患を予防または治療することができる。
本発明の有効成分である式（Ｉ）で表される化合物には次のものおよびそれらの薬学的に許容される塩が含まれる：
（６Ｒ）−Ｌ−エリスロ−５，６，７，８−テトラヒドロビオプテリン（ＢＨ４）
１’，２’−ジアセチル−５，６，７，８−テトラヒドロビオプテリン
本発明で有効成分として使用する式（Ｉ）で表される化合物は公知化合物である。例えば、特開昭５９−２５３２３号公報、同５９−７６０８６号公報、同６１−２７７６１８号公報、同６３−２６７７８１号公報参照。これらは適当な塩として用いてもよく、そのような塩としては薬理的に無毒性の酸、例えば、塩酸、リン酸、硫酸、ホウ酸等の鉱酸、及び、酢酸、ギ酸、マレイン酸、フマル酸、メシル酸等の有機酸との塩が例示される。
本発明の薬剤は前記した疾患に有効である。即ち、薬剤に起因する腎臓に病変の起こった状態を広く対象とする。
本発明の治療剤は、式（Ｉ）で表される化合物を一般の医薬製剤に用いられる担体と、常法によって経口、直腸又は非経腸（静脈内、髄液中への投与を含む）投与に適する製剤形態にすることにより製造される。
これら医薬製剤に用いられる担体としては、用いられる剤形によるが、一般的に賦形剤、結合剤、崩壊剤などが挙げられる。
賦形剤の代表的な例としては澱粉、乳糖、白糖、ブドウ糖、マンニトール、セルロース等があり、結合剤としてはポリビニルピロリドン、澱粉、白糖、ヒドロキシプロピルセルロース、アラビアゴムなどがある。又、崩壊剤の例としてはデンプン、寒天、ゼラチン末、セルロース、ＣＭＣなどがあるが、一般に用いられている賦形剤、結合剤、崩壊剤であればこれら以外でもよい。
本発明の治療剤は、好ましくは上記担体以外に、有効成分を安定化するための酸化防止剤を含有する。酸化防止剤は医薬製剤に一般に使用されているものから適宜選択され、例えば、アスコルビン酸、Ｎ−アセチルシステイン、Ｌ−システイン、ｄｌ−α−トコフェロール、天然トコフェロール等があげられる。使用する量は、活性成分（１種またはそれ以上）を安定化させる量であればよいが、一般的には活性成分１に対し重量で０．２ないし２．０が好ましい。
経口投与に適する本発明の製剤は各々所定量の活性成分（１種またはそれ以上）を含有する錠剤、舌下錠、カプセル剤、粉末、散剤、顆粒剤もしくは細粒剤として、またはシロップ、エマルジョン若しくは頓服剤のような非水性液中の懸濁液として提供できる。
例えば、顆粒剤は、活性成分（１種またはそれ以上）と１種またはそれ以上の前記担体、酸化防止剤等の補助成分を均一に混合して造粒し、ふるいを用いてメッシュをそろえることにより提供される。錠剤は、活性成分（１種またはそれ以上）を、場合により１種またはそれ以上の補助成分と共に、圧縮または成形により製造できる。カプセル剤は、活性成分（１種またはそれ以上）を、場合により１種またはそれ以上の補助成分と均一に混合した粉末または顆粒を適当なカプセルに充填機等を用いて充填して製造する。直腸投与用の製剤は、カカオ脂などの慣用の担体を使用し、座薬として提供できる。非経腸投与用製剤は、殺菌窒素浄化容器中に活性成分（１種またはそれ以上）を乾燥固体として密封して提供できる。この乾燥固体製剤は非経腸投与時に、所定量の無菌水に分散もしくは溶解して患者に投与することができる。
これらの製剤の製造においては、有効成分及び通常の担体の他に前述の酸化防止剤を加えて製剤することが好ましく、又所望により緩衝剤、風味付与剤、表面活性剤、増粘剤、潤滑剤、滑沢剤等から選ばれる１種またはそれ以上の補助成分をさらに含有してもよい。
活性成分、すなわち、式（Ｉ）で表される化合物の投与量は投与経路、処置される症状、および処置を受ける患者によって変わることは勿論のことであるが、最終的には医師の判断にまかせられる。
例えば、薬剤性腎障害を処置するのに適当な投与量は、投与の目的、対象者の年齢、体重、状態等により異なるが、経口投与の場合、０．１〜５０ｍｇ／ｋｇ（体重）／日の範囲にあり、代表的な好適投与量は０．５〜１０ｍｇ／ｋｇ（体重）／日である。
所望の投与量は上記の活性成分を１日１回投与してもよいが、１日中の適当な間隔で２〜４回分割投与してもよい。
活性成分は単独で、そのまま他の成分と混合せずに投与することもできるが、投与量の調節を容易にするため等の理由から適用疾患に応じた他の活性成分を医薬製剤として投与することもできる。
また、本発明の製剤は、有効成分として式（Ｉ）で表される化合物と共に、ＮＯＳの基質または補酵素もしくは補因子の、例えばＬ−アルギニン、フラビン類（例えば、ＦＡＤ、ＦＭＮ等）およびカルシウムよりなる群から選ばれる少なくとも１種を補助的有効成分として含有してもよい。これら、有効成分の混合により、式（Ｉ）で表される化合物の単独使用に比べて、一層優れた治療効果を期待できる。本発明製剤中における上記各成分の比率は特に限定されないが、例えば、重量で式（Ｉ）で表される化合物の１に対して、Ｌ−アルギニン、フラビン類およびカルシウムよりなる群から選ばれる少なくとも１種を０．１〜１０の範囲、好ましくは０．５〜２の範囲とすることができる。
この混合製剤により、例えば薬剤性腎障害を治療する際の適当な投与量は、投与の目的、対象者の年齢、体重、状態等により異なるが、経口投与の場合、有効成分の合計量として０．１〜５０ｍｇ／ｋｇ（体重）／日の範囲にあり、好ましくは０．５〜１０ｍｇ／ｋｇ（体重）／日である。
治療に当たり、式（Ｉ）で表される化合物を単独で有効成分として含む製剤および他の有効成分とともに含む製剤の選択は、年齢、症状等に応じて医師により適宜選択される。
本発明に用いられる活性成分は、（６Ｒ）−Ｌ−エリスロ−５，６，７，８−テトラヒドロビオプテリン（ＢＨ４）およびその塩が最も好ましいが、（６Ｒ，Ｓ）−５，６，７，８−テトラヒドロビオプテリン、１’，２’−ジアセチル−５，６，７，８−テトラヒドロビオプテリン、セピアプテリン、６−メチル−５，６，７，８−テトラヒドロプテリン、６−ヒドロキシメチル−５，６，７，８−テトラヒドロプテリンまたは６−フェニル−５，６，７，８−テトラヒドロプテリンおよびそれらの塩等の類似化合物でもよい。しかし、生体内に存在する天然体であるＢＨ４が好ましいことは言うまでもない。このＢＨ４・２塩酸塩のラットに対する急性毒性は経口投与で２ｇ／ｋｇ（体重）以上であり、ほとんど毒性は見い出されない。また、光学活性体でない（６Ｒ，Ｓ）−５，６，７，８−テトラヒドロビオプテリンも、特開昭５９−２５３２３号公報におけるパーキンソン病の治療にも見られるように毒性は弱く、本発明の治療に用いられることは可能である。これら以外の式（Ｉ）に属する化合物も、急性毒性は殆ど見いだされない。
以下の実施例に従ってさらに詳細に説明するが、本発明は、これらの実施例に限定されるものではない。
実施例
実施例１ （顆粒剤、細粒剤）
ポリビニルピロリドン（コリドン３０）１部（重量部）を滅菌精製水に溶かし、これにアスコルビン酸１０部およびＬ−システイン・塩酸塩５部を加え均一な溶液とした後、ＢＨ４・２塩酸塩１０部を加え均一とした。
この溶液を賦形剤（マンニトールまたは乳糖）５９部および崩壊剤［コーンスターチまたはヒドロキシプロピルセルロース（ＬＨ−２２）］１５部に加え、練合、造粒、乾燥した後、篩別した。
実施例２ （錠剤）
実施例１で作った活性成分の均一溶液に乳糖５８部、微結晶セルロース１５部を混合したのち、さらにステアリン酸マグネシウム１部を加え混合し打錠した。
実施例３ （カプセル剤）
実施例１で作成した剤形のものをカプセルに充填した。但し滑沢剤としてステアリン酸マグネシウムを０．２％添加して製剤したものを用いた。
実施例４ （注射用剤）
ＢＨ４・２塩酸塩 1.5ｇ
アスコルビン酸 1.5ｇ
Ｌ−システイン・塩酸塩 0.5ｇ
マンニトール 6.5ｇ
上記成分を滅菌精製水に溶かし、１００ｍｌとし除菌したものを、１ｍｌ又は２ｍｌずつバイアル又はアンプルにとり凍結乾燥密封した。
実施例５ （注射用剤）
ＢＨ４・２塩酸塩２．０ｇを無酸素で滅菌精製水に溶かし、１００ｍｌとした溶液を、除菌し、実施例４と同様に密封した。
実施例６ （座薬用剤）
ＢＨ４・２塩酸塩 150部
アスコルビン酸 150部
Ｌ−システイン・塩酸塩 50部
上記成分を用い、均一な粉末にしたものをカカオ脂９９５０部に分散させた。
実施例７ （顆粒剤）
ＢＨ４・２塩酸塩 ５部
アスコルビン酸 ５部
Ｌ−システイン・塩酸塩 ２部
上記成分を用いて均一な溶液とした。
一方マンニトール５５部、ポリビニルピロリドン１部、ヒドロキシプロピルセルロース１４部、ならびにＬ−アルギニンもしくはカルシウム５部を均一に混合したものに上記の溶液を加え、練合、造粒、乾燥した後、篩別した。
実施例８ （顆粒剤）
ＢＨ４・２塩酸塩 ５部
アスコルビン酸 ５部
Ｌ−システイン・塩酸塩 ５部
マンニトール ５２部
ポリビニルピロリドン（コリドン３０） １部
ヒドロキシプロピルセルロース（ＬＨ−２２） １２部
Ｌ−アルギニンまたはカルシウム １０部
上記成分を用い実施例７と同様に造粒し、篩別した。
実施例９ （顆粒剤）
ＢＨ４・２塩酸塩 ５部
アスコルビン酸 ５部
Ｌ−システイン・塩酸塩 ２部
上記成分を使用し均一溶液とした。
一方、Ｌ−アルギニンまたはカルシウム１０部、マンニトール５０部、ポリビニルピロリドン（コリドン３０）１部およびヒドロキシプロピルセルロース（ＬＨ−２２）９部を均一に混合したものに上記溶液を練合、造粒、乾燥した後、篩別した。
実施例１０
８−１０週齢のＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒから入手）（３００ｇ）を用い、以下の３つの実験群にわけて比較検討した。なお、実験期間６週間において、飼育は低塩（０．０５％）飼料を用い、実験２週目以降終了までの５週間下記の投与を行った。
１）ＣｙＡ群：
シクロスポリン１５ｍｇ／ｋｇ（体重）／日（皮下投与、オリーブオイルに配合）、ｎ＝８
２）ＢＨ４群：
シクロスポリン１５ｍｇ／ｋｇ（体重）／日（皮下投与、オリーブオイルに配合）＋ＢＨ４・２塩酸塩１０ｍｇ／ｋｇ（体重）／日（経口投与）、ｎ＝８
３）対照群：
オリーブオイルのみ、ｎ＝６
各群を実験期間である６週間観察した。以下に記載した方法により、血圧、腎皮質ＮＯＳ活性、および血中のＢＰ量を測定した。６週間後、フェノバルビタール麻酔下で腹部大動脈より採血、その後腎臓を生理食塩水で潅流後摘出し、組織学的検討を行い、ＢＨ４投与がシクロスポリン性腎障害に与える影響について検討した。
血圧測定
血圧はtail-cuff法により、実験開始時、２週間後、４週間後、６週間後において測定した。
腎皮質ＮＯＳ活性
3Ｈ−アルギニンを用い、腎組織ＮＯＳにより生成される3Ｈ−シトルリンを測定し、ＮＯＳ活性とした。
血中ＢＰ測定
観察終了時、Ｆｕｋｕｓｈｉｍａ ａｎｄ Ｎｉｘｏｎの方法（Anal. Biochem. 102;176-188, 1980）に基づきＨＰＬＣ分析を行い、ＢＨ４の代謝物であるビオプテリン（ＢＰ）を測定した。血中ＢＰの値によりＢＨ４投与の影響を考察する。
腎組織化学
凍結腎組織より薄切切片を作成し、ＮＯＳ活性を組織上でみるため、ＮＡＤＰＨ−ジアフォラーゼ（ｄｉａｐｈｏｒａｓｅ）染色を行った。また、マクロファージ細胞膜抗原ＥＤ−１に対するモノクローナル抗体を用いて組織染色を行い、ＮＯＳアイソフォームの検討を行った。
病理組織学的所見
６週間後の採尿、血圧測定を終了した後、麻酔下で開腹して腹部大動脈から脱血し、同部より生理食塩水を注入、灌流を行った。摘出した腎臓を１０％ホルムアルデヒド中で固定し、パラフィン包埋後、ミクロトームにて４μｍに薄切りし、腎組織標本を作製した。ヘマトキシリン・エオジン（ＨＥ）染色およびｐｅｒｉｏｄｉｃ ａｃｉｄ−Ｓｈｉｆｆ染色を行った。ラット腎組織標本内に見られる病理学的所見、すなわち、細動脈血管障害（ａｒｔｅｒｉｏｐａｔｈｙ）の出現頻度を比較検討した。
統計
群間の統計はｔｗｏ−ｗａｙＡＮＯＶＡにより行った。以下、ｐ＜０．０５を有意水準とした。
結果
血圧は、ＣｙＡ群、ＢＨ４群のいずれも観察終了時まで対照群と同様に正常血圧にとどまった。
腎皮質ＮＯＳ活性は、ＣｙＡ群では対照群に対し、２６０．８１４ｍｍｏｌ／日（平均）有意に増加した。これに対し、ＢＨ４群では対照群に対し、１４０．６００ｍｍｏｌ／日（平均）増加した。
血中ＢＰ量は、ＣｙＡ群では有意に増加した（対照群に対し、０．００６ｎｍｏｌ（平均））。これに対し、ＢＨ４群ではこれを減少させた（ＣｙＡ群に対し、０．００２ｎｍｏｌ（平均））。
腎組織化学は、ＣｙＡ群では、ＮＡＤＰＨ−ジアフォラーゼ染色性が低下し、ＥＤ−１陽性細胞の浸潤が多くみられた。これに対して、ＢＨ４群ではＮＡＤＰＨ−ジアフォラーゼ染色性が回復し、ＥＤ−１陽性細胞の浸潤が少ないことから血管内皮型のＮＯＳの機能が正常化した。
腎組織標本内に見られる病理組織学的所見の出現頻度を表１に示す。ＢＨ４群では、ＣｙＡ群で有意（ｐ＜０．０００１）に出現した細動脈血管障害を、有意（ｐ＜０．０００１）に抑制した。
以上説明したとおり、本発明は薬剤性腎障害を有効に予防および／または改善する治療剤を提供するものである。また、本発明の治療剤の有効成分は生体内にもともと存在する物質なので長期間使用しても副作用等の心配がない。
Claims (5)
- 式（Ｉ）：
［式中、Ｒ1およびＲ2は、それぞれ水素原子を表すか、または一緒になって単結合を表し、Ｒ1およびＲ2が水素原子を表す場合には、Ｒ3は−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ3、−ＣＨ（ＯＣＯＣＨ3）ＣＨ（ＯＣＯＣＨ3）ＣＨ3、−ＣＨ3、−ＣＨ2ＯＨ又はフェニル基を表し、Ｒ1およびＲ2が一緒になって単結合を表す場合には、Ｒ3は−ＣＯＣＨ（ＯＨ）ＣＨ3を表す］
で表される化合物又はその薬学的に許容される塩を有効成分とする、薬剤性腎障害の予防または治療剤。 - 式（Ｉ）のＲ3がＬ−エリスロ−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ3である、請求項１に記載の予防または治療剤。
- 急性腎不全の予防または治療剤である、請求項１または２に記載の予防または治療剤。
- 慢性腎不全の予防または治療剤である、請求項１または２に記載の予防または治療剤。
- 式（Ｉ）：
［式中、Ｒ1およびＲ2は、それぞれ水素原子を表すか、または一緒になって単結合を表し、Ｒ1およびＲ2が水素原子を表す場合には、Ｒ3は−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ3、−ＣＨ（ＯＣＯＣＨ3）ＣＨ（ＯＣＯＣＨ3）ＣＨ3、−ＣＨ3、−ＣＨ2ＯＨ又はフェニル基を表し、Ｒ1およびＲ2が一緒になって単結合を表す場合には、Ｒ3は−ＣＯＣＨ（ＯＨ）ＣＨ3を表す］
で表される化合物又はその薬学的に許容される塩の、薬剤性腎障害の予防または治療剤の製造のための使用。
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