KR20170037676A - 테트라하이드로바이오프테린 투여 방법, 관련 조성물 및 측정 방법 - Google Patents

테트라하이드로바이오프테린 투여 방법, 관련 조성물 및 측정 방법 Download PDF

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다니엘 아이. 오펜하이머
알레잔드로 도렌바움
아우구스투스 옥하마페
에릭 포에르
시아나 캐스틸로
폴 존 코스텔
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바이오마린 파머수티컬 인크.
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Abstract

본 발명은 경구 투약형, 정맥 주사, 및 음식과 함께인 것을 포함하는 테트라하이드로바이오프테린 투여의 치료 방법을 나타낸다. 또한 본 명세서에 개시된 것은 샘플 내 바이오프테린과 바이오프테린의 대사물을 측정하기 위한 바이오프테린 분석이다.

Description

테트라하이드로바이오프테린 투여 방법, 관련 조성물 및 측정 방법{METHODS OF ADMINISTERING TETRAHYDROBIOPTERIN, ASSOCIATED COMPOSITIONS, AND METHODS OF MEASURING}
본 발명은 전체적으로 BH-4 반응성 장애를 치료하기 위한 조성물 및 방법, 및 바이오프테린을 검출하고 정량하기 위한 방법 및 조성물을 나타낸다.
본 출원 청구범위는 2007년 4월 11일에 출원된 미국 가출원 제60/922,821호와 2008년 1월 8일에 출원된 미국 가출원 제61/019,753호를 기초로 우선권을 주장하며, 상기 개시한 것들은 그들 전체가 참조로서 본 명세서에 채용된다.
테트라하이드로바이오프테린(tetrahydrobiopterin)(본 명세서에서 이하 BH4로 언급된다)은 천연적으로 생성되는 프테린 계열의 생물 기원 아민이고, 페닐알라닌 하이드록시라제(PAH), 티로신 하이드록시라제, 트립토판 하이드록시라제 및 산화 질소 신타아제를 포함한 많은 다른 효소를 위한 보조 인자이다. 프테린은 생리적 유동액 및 조직에서 환원되고 산화된 형으로 존재하지만, 5,6,7,8, 테트라하이드로바이오프테린만은 생물학적으로 활성이다. 보조 인자의 키랄 분자 및 6R 이성질체는 생물학적으로 활성 이성질체가 되는 것으로 알려진다. BH4의 합성과 장애에 대한 자세한 리뷰는 브라우 등(Blau et al.), 2001(테트라하이드로바이오프테린 및 관련 생물 기원 아민의 장애. In:Scriver CR, Beaudet AL, Sly WS, Valle D, Childs B, Vogelstein B, eds. 유전된 질환의 대사 및 분자 베이스. 8th ed. 뉴욕: 맥그로우-힐, 2001: 1275-1776)을 보라.
피에게 등(Fiege, et al.), 분자 유전학 및 대사 81:45-51(2004)는 경구 투여된 테트라하이드로바이오프테린(BH4)의 약물 동태를 연구하였고 "경구 투여된 BH4의 다소 큰 변동성은 아마도 소화관에서 다른 흡수 및/또는 초회 통과 효과에 기인하는 것 같다"라고 시사했다.
다양한 다른 질환 상태를 치료하기 위한 목적으로 테트라하이드로바이오프테린을 사용해 왔으며, 본 약물을 투여하는 대안적이고 개선된 방법이 필요하다.
[발명의 간단한 설명]
본 발명은 6R-(L-에리스로)-5,6,7,8-테트라하이드로바이오프테린(BH4), 또는 그의 약학적으로 허용 가능한 염을 투여하는 방법, 이의 경구 생체 이용률(oral bioavailability)을 개선하거나 최대화하는 방법 및/또는 1회 투여에서 다음 투여까지 경구 생체 이용률의 유지를 개선하거나 최대화하는 방법과 관련된다. 이러한 방법은 대사 질환, 심혈관계 질환, 빈혈, 및 신경정신병적 장애를 포함하는 모든 BH4-반응성 장애의 치료에 적용될 수 있다. 본 발명의 방법은 임상 증상의 더 나은 조절을 유리한 방향으로 이끄는데, 예를 들어, 플라즈마(plasma) 페닐알라닌 농도, 혈압, 신경전달물질 농도, 또는 다른 임상적 파라미터의 변동을 감소시킨다.
본 명세서에서 BH4는 6R-(L-에리스로)-5,6,7,8-테트라하이드로바이오프테린을 의미한다. 본 명세서에서 사용된 상기 용어 BH4는 또한, 본 내용에서 다른 것을 지시하지 않는 한 6R-(L-에리스로)-5,6,7,8-테트라하이드로바이오프테린의 약학적으로 허용 가능한 염을 임의적으로 의미하는 것으로 이해될 수 있다.
제 1 관점에서, 본 발명은 BH4의 정제된 제조물을 이것이 필요한 환자들에게 경구로 투여하는 방법을 제공한다.
예시적인 일실시예에서, 상기 방법은 환자에게 테트라하이드로바이오프테린을 음식 없이 복용할 때에 비해 음식과 함께 복용하는 경우 그의 흡수가 증가한다는 정보가 제공되는 단계를 포함한다. 몇몇 실시예에서, 상기 환자는 식사, 예를 들어, 고-지방, 고-칼로리 식사 이후에 바로 복용하는 정보를 제공받는데, 이는 다음 중 1, 2, 3, 또는 모든 파라미터의 증가를 가져온다: 평균 플라즈마 농도, Cmax, AUC, AUC(0-t) 및/또는 AUC(inf). 예시적인 실시예에서, 상기 환자에게 고-지방 식사와 함께 BH4를 투여받는 경우 음식 없이 BH4를 투여받는 경우(금식 상태)에 비해 Cmax와 AUC가 증가한다는 정보가 제공된다. 몇몇 실시예에서, 상기 상대적인 증가는 적어도 20% 또는 30% 또는 그 이상이 될 수 있다.
선택적인 실시예 또는 상기 실시예에 부가하여, 테트라하이드로바이오프테린 투여 방법은 환자에게 테트라하이드로바이오프테린의 흡수는 액체에 용해된 후에 복용할 때보다 정제 그대로(intact tablet) 복용할 때 증가된다는 정보가 제공되는 것을 포함한다. 몇몇 실시예에서, 상기 환자에게 정제 그대로 복용하는 것은 다음의 파라미터 중 어느 것이 상승하는 결과를 낳는다는 정보가 제공된다: 평균 플라즈마 농도, Cmax, AUC, AUC(0-t) 또는 AUC(inf). 예시적인 실시예에서, 상기 환자에게 정제 그대로로서 BH4를 복용하는 것은 액체에 용해된 후에 복용하는 것보다 Cmax와 AUC가 증가한다는 정보가 제공된다. 몇몇 실시예에서, 상기 상대적인 증가는 적어도 20% 또는 그 이상이 될 수 있다.
상기 방법 중 어느 것은 상기 설명된 흡수 파라미터의 변화를 환자에게 알리는 프린트된 라벨을 포함하는 용기에 든 테트라하이드로바이오프테린을 제공하거나 복용함에 의해 수행될 수 있다.
선택적으로, 본 발명의 방법은 테트라하이드로바이오프테린의 치료적으로 유효한 양을 그것이 필요한 환자들에게 제공하는 단계를 또한 포함한다. 상기 치료적으로 유효한 양은 치료되는 상태에 따라 다양할 것이고, 의도된 임상 증상의 개선을 기초로 담당 의사에 의해 쉽게 결정될 수 있다.
하나의 예시적인 실시예에서, 이러한 방법은 용해된 형으로 BH4를 투여하는 것을 포함하며, 상기 제형은 물, 오렌지 주스, 및 사과 주스를 포함하나 이에 제한되지 않는 액체에 용해된 것이다. 하나의 예시적인 실시예에서, 용해된 BH4는 금식 상태, 즉 공복 상태의 환자에게 투여된다. 본 발명은 용해된 BH4가, 아침, 낮, 밤, 하루의 동일한 시각, 공복 상태, 하루에 한 번 또는 그 이상을 포함하나 이에 제한되지 않는 구체적 시간에 투여되는 것을 더 제시할 수 있다. 예시적인 실시예에서, 상기 조성물은 위가 비었을 때, 예를 들어 식사 전 최소 30분, 45분 또는 최소 1시간, 및/또는 식사 후 최소 90분, 또는 2시간, 또는 2.5시간, 또는 3시간에 환자에게 투여된다. 그러므로, BH4는 액체 제품으로, 또는 고체 또는 반고체 투약형에서 복용 전 미리-용해되어 복용될 수 있다. 부가적인 실시예에서, 또한 BH4는 상기 용해된 용액을 삼키기 전에 입 안에서 고체 또는 반고체 투약형으로부터 용해될 수 있다.
다른 예시적인 실시예에서, 이러한 방법은 정제, 캡슐, 캔디, 로진즈(lozenge), 분말, 및 과립(granule)을 포함하나 이에 제한되지 않는 고체 투약형, 또는 삼키기 전에 물, 오렌지 주스, 및 사과 주스를 포함하나 이제 제한되지 않는 액체에 용해하지 않고 삼켜지는 젤리 내에 뿌려진 경구 제제(oral sprinkle into jelly)를 포함하나 이에 제한되지 않는 반고체형으로 BH4를 투여하는 것을 포함한다. 일실시예에서, 삼켜진 BH4는 금식 상태, 즉 공복 상태의 환자에게 투여된다. 본 발명은 고체 또는 반고체 투약형으로 삼키는 BH4가 아침, 낮, 밤, 하루의 동일한 시각, 공복 상태, 하루에 한 번 또는 그 이상을 포함하나 이에 제한되지 않는 구체적 시간에 투여되는 것을 더 제시한다. 예시적인 실시예에서, 상기 조성물은 위가 비었을 때, 예를 들어 식사 전 최소 30분, 45분 또는 최소 1시간, 및/또는 식사 후 최소 90분, 또는 2시간, 또는 2.5시간, 또는 3시간에 환자에게 투여된다.
다른 실시예에서, 이러한 방법은 고체 또는 반고체 투약형으로 삼키는 또는 액체에 용해된 형태이던지 간에 음식과 함께하는, 예를 들어, 고-지방 음식 또는 고-지방 및/또는 고-칼로리 식사와 함께하는 BH4 투여를 포함한다. 본 발명은 삼키는 또는 용해된 BH4가 아침, 낮, 밤, 하루의 동일한 시각, 음식과 함께, 예를 들어 고-지방 음식 또는 고-지방 및/또는 고-칼로리 식사와 함께, 하루에 한 번 또는 그 이상을 포함하나 이에 제한되지 않는 구체적 시간에 투여되는 것을 더 제시한다. 예시적인 실시예에서, BH4는 식사 후 바로 고체 투약형으로 하루에 한 번 복용된다. 바람직한 실시예에서, 고체 투약형은 제형화된 정제나 캡슐이다. 더 예시적인 실시예에서, BH4는 식사의 약 0 내지 30분 또는 5 내지 20분 이내에 복용된다. 고체 투약형, 액체 투약형으로 또는 용해된 용액으로 복용되는지 여부를 불문하고, BH4의 생체 내 노출(생체 이용률)은 금식 상태에서 보다 식사 후 바로 복용될 때 더 높다.
BH4와 음식은 대략 동일한 시간에 복용될 수 있고 또는 BH4가 음식 전 또는 후에 복용될 수 있다. 음식의 섭취와 삼키는 또는 용해된 BH4의 복용 간 시간 간격은 5분 이상이 될 수 있다. 예를 들어, BH4는 식사 전 또는 후의 60분, 30분, 25분, 20분, 15분, 10분, 또는 5분에 투여될 수 있다.
다른 실시예에서, 어떤 환자들, 예를 들어 성인에게 있어, 또는 어떤 질환의 상태, 예를 들어 심혈관계 질환 또는 NOS 기능 장애와 관련된 다른 질환을 가진 사람에게 있어, 본 발명의 방법은 생체 이용률을 향상시키기 위하여 액체에 정제를 용해시키는 것보다 정제 그대로를 투여하는 것을 포함한다.
제 2 관점에서, 본 발명은 장 내 pH를 낮춤에 의해, 예를 들어 양성자(proton) 교환 폴리머를 사용함에 의해 환자의 장관(intestinal tract)에서 BH4를 안정화하는 방법을 제시한다.
본 발명의 제 3 관점은 소화관 운동을 느리게 하는 제제, 예를 들어 지방산 및/또는 글리세롤 지방산 에스터를 사용하여 소화관 운동을 느리게 하는 것을 포함하나 이에 제한되지 않는 BH4의 소화관 체류 시간을 증가하는 방법을 제시한다. 이러한 소수성 제제는 BH4가 소화관에 남는 시간의 길이를 증가시킬 수 있고 BH4가 흡수되는 양을 증가시킬 수 있다. BH4가 소화관에 남는 시간의 길이는, 이러한 제제(들)과 제형화될 때 이러한 제제를 가지지 않은 BH4 제형에 비해 1.5배 이상, 2배 이상, 3배 이상, 4배 이상, 또는 5배 이상 더 길어질 수 있다. 적절한 지방산은 올레산, 스테아르산, 아라키드산, 팔미트산, 아르키도산, 리놀레산, 리놀렌산, 에루시드산, 미리스트산, 라우르산, 미리스톨산, 및 팔미톨산을 포함한다. 또한 BH4의 소화관 체류 시간을 증가시키는 것은 알긴산, 및 폴리카르보필(polycarbophil)을 사용한 바이오흡착제를 사용하여 위장 체류를 유도하는 것을 제시한다.
본 발명의 제 4 관점은 HPMC, 카보머 등과 같은 서방제형을 사용하여 BH4 방출을 조절하는 방법을 제시한다. 서방제형인 상응하는 제품이 제시된다.
제 5 관점에서, 본 발명은 경구 투여 보다는 국부, 정맥, 피하, 근육, 척추, 안과적, 및 흡입 경로의 투여를 포함하나 이에 제한되지 않는 다른 경로를 통해 멸균 액체 또는 멸균 고체 투약형으로 BH4를 투여하는 것을 제시한다. 이러한 투여 경로에 적합한 상응하는 조성물 및 키트, 및 이를 제조하는 방법이 제시된다. 예를 들어, BH4를 포함하고 각각 경피 또는 구강 투여를 위한 경피 또는 구강 패치가 제시된다. BH4를 포함하는 설하정 또한 제시된다. BH4를 포함하는 흡입기 또는 BH4 및 점적기 또는 스프레이를 포함하는 적절한 키트가 제시된다.
일실시예는 테트라하이드로바이오프테린(BH4) 또는 그의 약학적으로 허용 가능한 염, 항산화제, 및 pH 버퍼를 포함하는 BH4 또는 그의 약학적으로 허용 가능한 염의 액체 제형을 포함한다.
다른 실시예는 BH4 또는 그의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 수용성 용액을 준비하고, BH4 또는 그의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 상기 용액에 항산화제 및 pH 버퍼를 부가하며, 항산화제 및 pH 버퍼를 부가하기 전이나 후에, BH4 또는 그의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 용액에 불활성 가스 또는 이산화탄소를 살포하고, BH4 또는 그의 약학적으로 허용 가능한 염, 항산화제, 및 pH 버퍼를 포함하는 살포된 용액을 용기에 밀봉하는 것을 포함하는 테트라하이드로바이오프테린(BH4) 또는 그의 약학적으로 허용 가능한 염의 액체 제형 제조 방법을 포함한다.
제 6 관점에서, 본 발명은 텐덤 질량 분석기를 사용하고 환원된 바이오프테린의 양을 계산하는 것에 의해 BH4를 측정하는 개선된 방법을 제시한다. 이러한 방법은 5 - 1000ng/mL의 범위에서 15% 미만의 변동 계수(CV)%에 의해 실증된 정확도와 정밀도를 가지는(최저 정량 한계, LLOQ에서 20%) BH4의 민감도에 대한 BH4 검출을 제공할 수 있다. 예시적인 실시예에서, 텐덤 질량 분석기와 결합된 HPLC(RP)를 사용하여 BH4를 측정하는 방법은: (1) 혈액, 플라즈마, 조직 호모제네이트(homogenate), 또는 뇨 샘플을 산화하는 단계; (2) 산화된 샘플을 요오드 적정하는 단계; (3) 산화된 샘플이 이온 교환 컬럼을 통과하는 단계; (4) HPLC 및 텐덤 질량 분석기를 사용하여 상기 샘플에서 전체 및 산화된 바이오프테린을 측정하는 단계를 포함한다. 일실시예에서, 샘플은 산성 산화로 처리되고, 상기 방법은 (1) KCl, HCl 또는 TCA로 상기 샘플을 처리하는 단계; (2) 상기 산-산화된 샘플을 요오드 적정하는 단계; (3) 상기 산화된 샘플을 이온 교환 컬럼을 통하여 가동하는 단계; (4) HPLC 및 텐덤 질량 분석기(LC/MS/MS)를 사용하여 상기 샘플에서 6R-BH4, R-q-DHBP(이는 6R-BH4로 생체 내에서 즉시 환원되고 그래서 측정된 환원 바이오프테린은 주로 6R-BH4에 기초된다), DHBP, 및 BP를 포함하는 전체 바이오프테린을 측정하는 단계를 포함한다. 다른 실시예에서, 샘플들은 알칼리성 산화에 의해 처리되고, 상기 방법은: (1) 상기 샘플을 KI, I 또는 NaOH로 처리하는 단계: (2) 상기 알칼리성 산화된 샘플을 HCl 또는 TCA로 산화하는 단계; (3) 상기 산화된 샘플을 요오드 적정하는 단계; (4) 상기 샘플을 이온 교환 컬럼을 통하여 가동하는 단계; (5) HPLC 및 텐덤 질량 분석기를 사용하여 DHBP 및 BP를 포함한 산화된 바이오프테린을 측정하는 단계; 및 (6) 산화된 형을 뺀 전체 바이오프테린 간의 차이를 이용하여 환원된 바이오프테린(6R-BH4 + R-q-DHBP)의 양을 계산하는 단계를 포함한다.
본 발명의 다른 관점은 메탄올, 소듐 아세테이트, 시트르산, EDTA, 및 1,4-디티오에리스리톨을 포함하는 수용성 용액을 포함하는 디하이드로바이오프테린, 바이오프테린, 및 그의 유사물의 역-상 HPLC 분리를 위한 이동상 용액이다. 유사하게 디하이드로바이오프테린 및 바이오프테린, 또는 디하이드로바이오프테린의 유사물 및 바이오프테린의 유사물을 포함하는 혼합물 상에서 메탄올, 소듐 아세테이트, 시트르산, EDTA, 및 1,4-디티오에리스리톨을 포함하는 수용성 용액을 포함하는 이동상을 사용하여 역상 HPLC를 수행하는 것을 포함하여 디하이드로바이오프테린 및 바이오프테린, 또는 그의 유사물을 베이스(base) 및 디하이드로 형 모두를 포함하는 혼합물로부터 분리하는 방법이 제시된다.
본 발명의 다른 관점은 바이오프테린 및 디하이드로바이오프테린 및 테트라하이드로바이오프테린 중 하나 이상, 또는 바이오프테린 및 디하이드로바이오프테린 및 테트라하이드로바이오프테린 중 하나 이상의 유사물을 포함하는 혼합물을 준비하고, 역상 HPLC로 혼합물에서 바이오프테린 종류를 분리하며, 및 테트라하이드로바이오프테린 및 그의 유사물의 경우, 테트라하이드로바이오프테린 및 그의 유사물을 산화하여 퀴노노이드 디하이드로바이오프테린 형으로 제 1 전극에 나타내고, 이후 퀴노노이드 형을 테트라하이드로바이오프테린 및 그의 유사물로 되돌려 제 2 전극에 나타나게 하고, 환원 반응에 의해 생성된 전류를 측정하여 종류의 농도를 결정하는 전기화학적 검출을 수행하고 및/또는 디하이드로바이오프테린, 그의 유사물, 바이오프테린, 또는 그의 유사물의 경우, 디하이드로바이오프테린 종류를 바이오프테린으로 후-컬럼 산화한 후 형광 검출에 의해 이러한 종류를 측정하는 것을 포함하는 바이오프테린 종류의 혼합물에서 바이오프테린을 정량하는 방법이다.
본 명세서에서 설명된 조성물 및 방법을 위해, 바람직한 성분 및 그들의 조성상 범위는 본 명세서에서 제공된 여러 실시예로부터 선택될 수 있다.
본 발명의 다른 특징 및 장점은 하기 상세한 설명에서 명백해질 것이다. 그러나, 상세한 설명 및 구체적인 실시예는 본 발명의 바람직한 실시예를 나타내는 한편, 오직 설명하기 위한 목적으로 주어진 것으로 이해되어야 하는데, 이는 본 발명의 본질 및 범위 이내에서의 다양한 변경과 수정이 본 상세한 설명으로부터 당업자에게 명백할 것이기 때문이다.
[바람직한 실시예의 설명]
본 발명은 그의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 6R-(L-에리스로)-5,6,7,8-테트라하이드로바이오프테린의 정제된 제조물을 경구로 투여하는 개선된 방법을 제공한다. 본 발명은 BH4의 낮은 생체 이용률에 기여하는 주요 요소인 낮은 위장관 흡수를 가지는 경구 투여된 테트라하이드로바이오프테린(BH4)에 대한 관찰에 기초된다.
6R-(L-에리스로)-5,6,7,8-테트라하이드로바이오프테린(BH4)의 화학 구조는 아래에 보여진다:
Figure pat00001
테트라하이드로바이오프테린은 낮은 지용성을 가지는 수용성 유기 화합물이다. 바이오룸(BioLoom) 소프트웨어(클레어몬트 캘리포니아의 바이오바이트 코프(Biobyte Corp in Claremont California)의 버전 1.5)를 사용한 인실리코(in silico) 실험 분석에 기초하여, BH4는 옥타놀-물 분배 계수가 -1.17로 결정되었다. 상기 옥타놀/물 분배 계수에 의해 대략화된 생물학적 막의 최적 침투는 log P의 2 또는 100-x 배 더 높은 지용성 근처에서 일어난다. 비록 낮은 Clog P는 본 기질을 생리학적 상태 아래에서 쉽게 용해되도록 하지만, 상기 기질의 생물학적 막 내 이중 지질층을 침투하는 능력은 한정되고, 이는 경구 이용률을 제한할 수 있다.
본 명세서에 설명된 쥐와 원숭이의 생체 내 실험은 유사 용량으로 정맥 투여 될 때에 비해 단지 BH4의 8-11%만이 소화관에서 흡수되고 그 중 대다수는 배설물로 배출된다는 것을 보여준다. 이러한 BH4 흡수의 변동성은 또한 건강한 인간에게 있어 BH4에 대한 음식의 영향에 관한 본 명세서에서 설명된 실험에서 보여졌다. 금식 상태 하에서 물 및 오렌지 주스와 BH4를 투여하는 것은 유사한 평균 플라즈마 농도 및 Cmax 및 AUC(0-t) 평균값을 낳는 반면, BH4가 물로 투여되는 경우, 고 지방, 고 칼로리 식사와 동시에 BH4를 투여하는 것은 평균 플라즈마 농도 및 Cmax 및 AUC(0-t) 평균값이 상당히 증가한다.
비록 식이 상태에서 증가된 생체 이용률을 설명하는 충분한 문헌들이 있지만, 본 음식 영향은 지방 친화성(예를 들어, 지용성) 물-불용성 약물이고 BH4와 같이 높은 수용성 활성 성분을 대개 가지지 않은 것에서 전형적으로 보여진다. 지방 친화성 화합물이 식이 상태 하에서 생체 이용률이 증가하는 것에 대한 일반적인 설명은 "같은 것을 용해하기 좋음"이기 때문에 고 지방 식이가 상기 약물을 용해하는 것을 도와주고 이는 약물을 흡수되어 이용 가능하도록 만든다는 것이다. 다른 가능한 설명은 고 지방 식사가 우리가 먹은 지방을 용해하고 유화하는 천연 바이오-계면 활성제인 담즙산의 분비를 촉진하여 그들의 소화를 돕기 때문이라는 것이다. 이러한 답즙산은 또한 물-불용성 화합물을 용해하여 그들이 흡수되어 이용 가능하도록 만든다고도 생각된다. 그러나, BH4는 이의 용해성이 1000 mg/mL 이상이고 상기 화합물이 가장 잘 녹는 약물로 알려진 것 중 하나이기 때문에 흡수되기 위해 용해될 필요가 없다. 그러므로 고 지방, 고-에너지 식사에 의한 생체 이용률의 강화는 이러한 알려진 메커니즘과 일치하지 않는다.
그러나, 고체 또는 반-고체 투약형 및/또는 고-지방 식사와 함께 투여하는 것은 BH4가 화학적으로 안정한 위와 위장관 상부 트랙(GIT)의 산성 환경에서 BH4의 체류 시간을 증가시킴으로써 생체 이용률을 최대화할 수 있다. BH4의 안정성은 pH가 증가할 때 감소하고, 대략 소장의 pH인 pH 6.8 버퍼 용액에서의 반감기가 약 15분이다. 보통 자원자 위의 전형적 pH 범위 이내인 pH 3.1에서, 1 mg/mL 농도의 BH4 안정성은 3시간을 넘었다. BH4의 화학적 안정성은 위의 pH가 pH 3.1 아래로 떨어질 때 더 증가할 수 있다. 그러므로 연장된 위 체류 시간은 정제 그대로가 위벽에 흡수되는 것을 제공하고, 반면 소장으로 빨리 배출되는 것은 BH4를 분해시키고 그래서 흡수되어 이용될 수 없다.
그러므로, 각 투여시 BH4의 경구 생체 이용률을 최대화하기 위해, BH4는 음식, 예를 들어 고 지방 음식 또는 고 지방 및/또는 고 칼로리 식사와 함께 복용되어야 한다. 선택적으로, 투여 간 경구 생체 이용률의 일관성을 최대화하기 위해서, BH4는 공복 상태에서(예를 들어 식사 전 1시간 또는 식사 후 2시간) 복용되어야 한다.
본 명세서에서 사용된 용어 "생체 이용률(bioavailability)"는 투여된 전신적(systemic) 순환에 들어간 약물과 투여 용량의 분율을 의미한다. 만일 약물이 정맥으로 투여되었다면, 이때 이의 생체 이용률을 이론적으로 100%가 될 것이다. 그러나, 만일 약물이 다른 경로(경구와 같은)로 투여되었다면, 이때 이의 생체 이용률은 예를 들어 GI 트랙에서의 불완전한 흡수, 흡수 전 분해 또는 대사, 및/또는 간 초회 통과 효과의 결과로 100%에 미치지 않을 것이다.
용어 "고 지방 식사"는 일반적으로 약 700 kcal 이상이고 약 45% 이상 지방(지방의 상대적 kcal 퍼센트), 또는 선택적으로 약 900 kcal 이상이고 약 50% 이상 지방의 식사를 의미한다. 용어 "고 지방 음식"은 일반적으로 20g 이상의 지방, 또는 25, 30, 35, 40, 45, 또는 50g 이상의 지방 및/또는 약 45% 또는 50% 이상 지방을 포함하는 음식을 의미한다. FDA 안내서는 "고-지방 식사"를 식사 총 칼로리 용량의 약 50%로 정의하고 있는 반면, "고-칼로리 식사"는 대략 800 내지 1000 칼로리로 정의하고 있다. FDA는 음식-영향 생체 이용률 및 식이 생물학적 등가성 시험을 위한 테스트 식사로 고-지방 및 고-칼로리 식사를 추천한다. 본 테스트 식사는 단백질, 탄수화물 및 지방으로부터 각각 대략 150, 250, 및 500-600 칼로리를 얻어야 한다. 예시적인 테스트 식사는 버터로 한 달걀 후라이 2개, 베이컨 조각 2개, 해시 브라운 포테이토 4온스 및 전지 우유 8온스로 구성된다. 만약 단백질, 탄수화물, 및 지방에서 얻은 유사한 양의 칼로리가 유사한 식사 부피 및 점도를 가진다면 대체하는 것도 가능하다(산업 안내서, 음식-영향 생체 이용률 및 식이 생물학적 등가성 시험, 미국 보건복지부, 약물 평가 연구 센터(CDER), 2002년 12월).
제 1 관점에서, 본 발명은 그의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 6R-(L-에리스로)-5,6,7,8-테트라하이드로바이오프테린(BH4)의 정제된 제조물의 경구 투여 방법을 제공한다.
몇몇 실시예에서, 상기 방법은 환자에게 음식과 함께 테트라하이드로바이오프테린을 투여하는 것은 약물 동태에 영향을 준다는 것에 대한 정보를 주는 것을 포함한다. 예시적인 실시예에서, 상기 방법은 환자에게 음식 없이 복용할 때에 비해 음식과 함께 복용할 때 테트라하이드로바이오프테린의 흡수가 증가된다는 정보를 주는 단계를 포함한다. 몇몇 실시예에서, 상기 환자에게 식사, 예를 들어 고-지방, 고-칼로리 식사에 뒤이어 바로 복용하는 것은 다음의 파라미터 중 1, 2, 3 또는 전부의 증가를 가져온다는 정보가 주어진다: 평균 플라즈마 농도, Cmax, AUC, AUC(0-t) 및/또는 AUC(inf). 예시적인 실시예에서, 상기 환자에게 고-지방 식사와 함께 BH4를 투여하는 것은 음식 없이(금식 상태에서) BH4를 투여하는 것에 비해 Cmax 및 AUC가 증가한다는 정보가 주어진다. 몇몇 실시예에서, 상기 상대적 증가는 20% 또는 30% 또는 그 이상이 될 수 있다.
선택적인 실시예 또는 상기 실시예에 부가하여, 테트라하이 드로바이오프테린을 투여하는 방법은 환자에게 테트라하이드로바이오프테린의 흡수는 액체에 용해된 후에 복용할 때에 비해 정제 그대로로 복용할 때 증가된다는 정보가 주어지는 것을 포함한다. 몇몇 실시예에서, 상기 환자에게 정제 그대로를 복용하는 것은 다음의 파라미터 중 어느 것의 상승을 가져온다는 정보가 주어진다: 평균 플라즈마 농도, Cmax, AUC, AUC(0-t) 또는 AUC(inf). 예시적인 실시예에서. 상기 환자에게 정제 그대로로 BH4가 투여되는 것은 액체에 용해된 후에 BH4가 투여될 때에 비해 Cmax와 AUC가 증가한다는 정보가 주어진다. 몇몇 실시예에서, 상대적 증가는 적어도 20% 또는 그 이상이 될 수 있다.
상기 방법 중 어느 것은 상기 설명된 흡수 파라미터의 변화를 환자에게 알리는 프린트된 라벨링을 포함하는 용기에 테트라하이드로바이오프테린을 제공하거나 투여하는 것에 의해 수행될 수 있다.
선택적으로, 본 발명의 방법은 테트라하이드로바이오프테린의 치료적으로 유효한 양이 필요한 환자들에게 제공되는 단계를 또한 포함한다. 상기 치료적으로 유효한 양은 치료되는 상태에 따라 다양할 것이고, 의도된 임상적 증상의 개선을 기초로 치료하는 의사에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
하나의 예시적인 실시예에서, 이러한 방법은 용해된 제형으로 BH4를 투여하는 것을 포함하고, 상기 제형은 물, 오렌지 주스 및 사과 주스를 포함하나 이제 제한되지 않는 액체에 용해된다. 일실시예에서, 용해된 BH4는 금식 상태, 즉 공복 상태에서 환자에게 투여된다. 본 발명은 용해된 BH4를 아침, 낮, 밤, 하루의 동일한 시각, 공복 상태, 하루에 한 번 또는 그 이상을 포함하나 이에 제한되지 않는 구체적 시간에 투여되는 것을 더 제시한다. 예시적인 실시예에서, 상기 조성물은 위가 비었을 때, 예를 들어 식사 전 최소 30분, 45분, 또는 1시간 및/또는 식사 후 최소 90분, 또는 2시간, 또는 2.5시간, 또는 3시간에 환자에게 투여된다. 그러므로, BH4는 액체 제품 또는 복용 전 고체 또는 반고체 투약형에서 미리-용해된 것으로 복용될 수 있다. 다른 실시예에서, BH4는 또한 상기 용해된 용액을 삼키기 전에 고체 또는 반고체 투약형에서부터 구강 내에서 용해될 수 있다.
이러한 접근은 BH4가 주로 위와 장인 그것의 흡수 부위로 전달되기 전에 용액 또는 생물학적 유동액에서 완전하게 용해되는 것을 보장함으로써 흡수율 및 생체 이용률을 최대화한다. 용액에서 활성 약학적 성분 또는 약물의 용해는 전신적(혈액 및 림프액) 순환 내로 흡수되기 위해 필수적이다. 정제와 캡슐과 같은 고체 투약형이 경구로 투여될 때, 그들은 전신적 순환 내로 흡수되기 전에 과립으로 분해, 분말로 해체 및 용해되는 것과 같은 일련의 단계를 겪는다. 이러한 일련의 단계를 액체, 반고체 및 속붕해(fast-dissolving) 고체 투약형으로 투여됨으로써 뛰어넘게 된다. 그러므로 상기 활성 성분은 흡수되어 보다 빨리 이용될 수 있고, 고체 투약형이 흡수 부위를 통과하여 지나기 전에 그 안에 포함된 모든 유효 성분을 방출할 것이라는 보장이 없기 때문에 활성 성분이 들어 있는 상기 제형은 보다 큰 생체 이용률을 보통 나타내는 흡수 부위에 도달하기 전에 용해된 형태로 존재한다.
이러한 투약형은 변동성이 투약형 분해이기 때문에 혈중 농도의 변동성을 감소시키고, 인간 생체 내에서 용해는 미연에 방지된다. 위에서 즉시-방출을 목표로 하는 BH4 고체 투약형의 생체 내 분해 및 용해 비율은 위액의 pH-식이 및 비식이(금식)- 및 위 운동성의 강도 및 위에서 소장으로 배출 속도에 의해 결정되는 위의 교반 세기 강도의 각 사람 간 다양성에 달려 있다. 액체, 반고체, 로진즈/캔디 및 속붕해 고체 투약형은 분해 및 용해되도록 하지 않기 때문에, 그들의 혈중 농도는 BH4가 즉시 방출 고체 투약형(정제 및 캡슐)으로 주어졌을 때보다 변동이 적다.
다른 예시적인 실시예에서, 그러한 방법은 정제, 캡슐, 캔디, 로진즈(lozenge), 분말, 및 과립을 포함하나 이에 제한되지 않는 고체 투약형, 또는 삼키기 전에 물, 오렌지 주스, 및 사과 주스를 포함하나 이제 제한되지 않는 액체에 용해하지 않고 씹거나 삼켜지는 젤리 내 뿌려진 경구 제제(oral sprinkle into jelly)를 포함하나 이에 제한되지 않는 반고체형으로 BH4를 투여하는 것을 포함한다. 일실시예에서, 삼켜진 BH4는 금식 상태, 즉 공복 상태의 환자에게 투여된다. 본 발명은 고체 또는 반고체 투약형으로 삼켜진 BH4가 아침, 낮, 밤, 하루의 동일한 시각, 공복 상태, 하루에 1번 또는 그 이상을 포함하나 이에 제한되지 않는 구체적 시간에 투여되는 것을 더 제시한다. 예시적인 실시예에서, 상기 조성물은 환자에게, 위가 비어있을 때, 예를 들어, 식사 전 최소 30분, 45분, 또는 최소 1시간, 및/또는 식사 후 최소 90분, 또는 2시간, 2.5시간, 또는 3시간에 투여된다.
다른 실시예에서, 이러한 방법은 고체 또는 반고체 투약형으로 삼키는 또는 액체에 용해된 형태로, 음식과 함께하는, 예를 들어, 고-지방 음식 또는 고-지방 및/또는 고-칼로리 식사와 함께하는 BH4 투여를 포함한다. 본 발명은 삼키는 또는 용해된 BH4가 아침, 낮, 밤, 하루의 동일한 시각, 음식과 함께, 예를 들어 고-지방 음식 또는 고-지방 및/또는 고-칼로리 식사와 함께, 하루에 한 번 또는 그 이상을 포함하나 이에 제한되지 않는 구체적 시간에 투여되는 것을 더 제시한다. 예시적인 실시예에서, BH4는 식사 후 바로 고체 투약형으로 하루에 한 번 복용된다. 바람직한 실시예에서, 고체 투약형은 정제나 캡슐로 제형화된다. 더 예시적인 실시예에서, BH4는 식사의 약 0 내지 60분, 약 0 내지 30분 또는 5 내지 20분 이내에 복용된다. 고체 투약형, 액체 투약형으로 또는 용해된 용액으로 복용되는지 여부를 불문하고, BH4의 생체 내 노출(생체 이용률)은 금식 상태에서 보다 식사 후 바로 복용될 때 더 높다.
BH4와 음식은 대략 동일한 시간에 복용될 수 있고 또는 BH4가 음식 전 또는 후에 복용될 수 있다. 고-지방 음식 또는 고-지방 및/또는 고-칼로리 식사를 예로 들 수 있는 음식의 섭취와 삼키는 또는 용해된 BH4의 복용 사이 시간 간격은 5분 이상이 될 수 있다. 예를 들어, BH4는 식사 전 또는 후의 60분, 30분, 25분, 20분, 15분, 10분, 또는 5분에 투여될 수 있다.
다른 실시예에서, 어떤 환자들, 예를 들어 성인에게 있어, 또는 어떤 질환의 상태, 예를 들어 심혈관계 질환 또는 NOS 기능 장애와 관련된 다른 질환을 가진 사람에게 있어, 본 발명의 방법은 생체 이용률을 향상시키기 위하여 액체에 정제를 용해시키는 것보다 정제 그대로를 투여하는 것을 포함한다.
본 발명의 방법에 따른 BH4의 투여는 평균 플라즈마 농도 및/또는 위장 흡수 비율 및/또는 Cmax 및/또는 AUC(0-t) 및/또는 AUC(inf)의 평균값이 BH4가 금식 상태 하에서 투여되었을 때 값을 초과하는 결과를 낳는다.
금식 상태 하에서 정제 그대로의 투여는 용해된 정제와 비교할 때 Cmax 및 AUC의 평균 20% 증가를 가져온다. 물 또는 오렌지 쥬스 중 하나에 용해된 정제나 정제 그대로를 고 지방/고 칼로리 식사 후에 투여하는 것은 대략 30%(정제 그대로) 내지 80%(물) 범위의 Cmax 및 AUC 증가를 가져온다. 고 지방 및 고 칼로리 식사 후에 정제 그대로로 BH4를 투여하는 것은 음식 없이 투여할 때에 비해 대략 30%의 흡수 정도 증가를 야기한다. 정제 그대로로 BH4를 투여하는 것은 용해된 정제를 투여할 때에 비해 대략 20%의 흡수 정도 증가를 야기한다.
"평균 플라즈마 농도"는 일련의 플라즈마 샘플 중 기록 농도의 평균을 의미한다.
"Cmax"는 관찰된 플라즈마 농도의 최대치를 의미한다.
"AUC"는 플라즈마 농도-시간 곡선 아래 면적을 의미한다.
"AUC0-t"는 0시간에서 마지막 측정 가능한 농도의 시간까지의 플라즈마 농도-시간 곡선 아래 면적을 의미한다.
"AUC(inf)"는 0시간에서 무한까지의 플라즈마 농도-시간 곡선 아래 계산된 면적을 의미한다.
BH4의 "위장관 흡수 비율"는 BH4 투여 후 플라즈마 총 바이오프테린 농도 증가(△Cp)-시간 곡선 아래 면적(△AUC)으로부터 다음 공식을 사용하여 평가된다.
[수학식 1]
흡수 비율(%)=(경구 투여 후 △AUC / 정맥 투여 후 △AUC) × (정맥 투여량 / 경구 투여량 × 100)
바람직하게 99.5% 이상 정제 6R-BH4가 사용된다. 디하이드로클로라이드 염을 포함하는 어떤 염 및 BH4의 어떤 크리스탈린 형은 본 발명의 방법 및 조성물에 따라 이용될 수 있다. 여러 가지 염과 크리스탈린 형은 이의 전체에서 참조로 본 명세서에 도입된 미국 특허 공개 No.2006/0040946에 설명되고 및/또는 안정한 고체 제형은 역시 이의 전체에서 참조로 본 명세서에 도입된 국제 공개 번호 WO06/55511에 설명된다. 여러 크리스탈린 형은 정제, 분말 또는 경구 투여를 위한 다른 고체 내로 편리하게 형성될 수 있다.
제 2 관점에서, 본 발명은 양성자 교환 폴리머를 사용하여 장의 pH를 낮춤으로써 BH4를 안정화하는 방법을 제시한다. BH4는 장의 pH를 낮춤에 의해 위를 지난 BH4의 안정성을 강화하고 그럼으로써 BH4가 급속히 산화되는 것을 방지한 활성 성분을 포함하는 고체 또는 액체 투약형으로 매일 경구 투여된다. BH4가 염기성 매질보다는 산성 매질에서 더 안정적이기 때문에, 산성화된 부형제/활성 성분이 BH4의 고체 투약(정제, 캡슐, 등) 제형에 포함되어 장액의 pH를 더 낮추고 그럼으로써 화학적 안정성을 강화한다. 흡수에 이용되는 위장관 트랙(GIT)의 보다 넓은 면적 또는 창은 흡수창이 위 및 십이지장에서 장에 제한된 것으로 여겨지는 제한된 경향을 확장함으로써 흡수의 일관성을 최적화한다. 이러한 투약형은 활성 정제, 분말 및 과립(투여 전에 액체에서 재현탁되는) 및 산성화 물질을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 소분자 산과는 달리, 큰 폴리머산은 GIT에 더 오래 남아 있고 GIT에 의해 흡수되지 않으나 GIT 액에 그들의 양성자를 제공하여 주변 pH를 낮춘다. 부형제/활성 성분의 예는 말레, 푸마르 및 시트르산과 같은 카르복시산 소분자 또는 인산, 아세트산 및 그들의 염 형태와 같은 무기 소분자인 제형을 포함한다. 다른 예는 폴리메타아크릴산, 카보머, 폴리카르보필, 유드라짓(Eudragit) 크로스카멜로스(cross carmellose)의 산 형태 및 전분 글리콜산 등을 포함하는 폴리머 카르복시산 종류와 같은 약학적으로 허용 가능한 산이다. 상기 제형은 또한 항산화제(예를 들어, 시스테인, N-아세틸 시스테인, 등; 아스코르브산; 메티오닌; 등) 및 제조를 가능하게 하고 제형의 품질 및 수행 특성을 강화하는 것으로 시장에 알려진 다른 첨가물과 같은 안정성을 강화하는 부가적인 첨가물 또한 포함한다.
본 발명의 제 3 관점은 지방산 및/또는 글리세롤 지방산 에스터와 같은 BH4의 소화관 운동성을 늦추는 것이 가능한 제제를 사용하여 소화관 운동성을 낮추는 것을 포함하나 이에 제한되지 않는 BH4의 소화관 체류 시간을 증가시키는 방법을 제시한다. 지방산은 올레산, 스테아르산, 아라키드산, 팔미트산, 아르키도산, 리놀레산, 리놀렌산, 에루시드산, 미리스트산, 라우르산, 미리스톨산, 및 팔미톨산을 포함할 수 있다. 또한 BH4의 소화관 체류 시간을 증가시키기 위해 제시되는 것은 알긴산 및 폴리카르보필을 사용한 바이오흡착제를 사용한 위 체류 유도이다. 일실시예에서, BH4의 투약형은 위액에서 정의된 방법으로 BH4를 띄우고 방출하는 경구 부형 제형으로 투여되고 비-부형이거나 위에서 급속하게 용해되는 제형보다 위에서부터의 위 배출 속도를 더 느리게 하게 때문에 위에서 더 오래 보유된다. 본 디자인 접근은 투약형 내 가스-생성 첨가물, GIT 액에서 투약형을 떠오르게 하는 저-밀도 첨가물, 또는 GIT 액 내용물에서 투약형의 부유(floating)를 가능하는 투약형 내 가스 및 저-밀도인 물질들의 조합의 사용을 통한 투약형의 위-체류를 기초로 한다. BH4가 위의 산성 액에서 더 안정하여 위 환경에서 투약형의 연장된 체류 및 방출은 위에서 투약형의 체류 시간과 BH4의 안정성 모두를 강화하고 그럼으로써 BH4가 일반 정제 및 캡슐 투약형보다 위와 십이지장에서 더 긴 흡수 기간을 가지도록 만든다. BH4의 제형은 항산화제, 제조 및 고체 투약형의 분해/용해를 가능하게 하는 상기 분야에 알려진 첨가물 및 수용성 매질 및/또는 GIT 액과 제형이 접촉하면 가스 또는 가스 혼합물(예를 들어, 이산화탄소)을 생성하는 부가적인 첨가물 중 하나 이상을 포함할 것이다. 수용성 항산화제, 예를 들어 아스코르브산, 메티오닌, 및 티올(시스테인, N-아세틸 시스테인 및 글루타티온) 또는 GIT에서 용해성 항산화제로 전환되는 항산화제, 예를 들어 GIT에서 아스코르브산으로 전환되는 아스코르빌 팔미테이트가 바람직하다. 제형에 부가되는 첨가물은 BH4와 직접 반응하여 이산화탄소를 형성하는 카보네이트와 바이카보네이트 및 필요한 경우 부가적인 이산화탄소를 생성하기 위한 카보네이트 및 바이카보네이트와 반응하는 것으로 앞서 설명된 작은 폴리머산들을 포함한다.
다른 실시예에서, BH4의 투약형은 GIT의 점액질 표면에 오랜 기간 부착되도록 투여(즉, 바이오흡착 제형)되고, 바람직하게는 위액의 산도에 기인하여 위에서 만으로 결코 한정되지 않으나 BH4는 장에서보다 더 안정하다. BH4는 바이오흡착 투약형으로부터 조절된 방법으로 방출된다. 고체 투약형은 BH4, 하나 또는 그 이상의 항산화제, 우량 투약형의 제조와 투약형의 분해/용해의 조절을 가능하게 하는 당업계에 알려진 첨가물 및 그것의 자유 산 형 또는 염형의 폴리카르보필과 같은 바이오흡착 첨가물을 포함하는 것으로 디자인된다. 폴리메타크릴산, 카보머 및 셀룰로오스 유도체, 예를 들어 HPMC, HPC 등과 같은 다른 폴리머 산이 폴리카르보필과 함께 조합되거나 대체될 수 있다. 상기 항산화제는 예를 들어 아스코르브산, 메티오닌, 시스테인, N-아세틸 시스테인 및 글루타티온과 같이 바람직하게 용해성이고, 예를 들어 아스코르빌 팔미테이트와 같이 GIT에서 아스코르브산과 같은 용해성 항산화제로 전환될 수 있다. 일실시예에서, 상기 제형의 성분은 함께 블렌드되고 예를 들어 정제나 캡슐과 같이 고체 투약형으로 제조된다. 상기 고체 투약형은 위를 지나 장 내로 BH4를 전달하도록 장용 코팅되거나, 위에서 BH4를 방출하도록 디자인되어 장용 코팅이 되지 않을 수 있다. 또 다른 실시예에서, 고체 투약형의 성분은 다른 부분으로 세분될 수 있고, 상기 여러 부분은 그들이 다층 투약형을 형성하도록 처리되기 전에 따로 블렌드된다. 상기 다층 투약형은 정제의 가장 바깥층에 바이오흡착제 및 몇몇 첨가물을 포함하고, 이는 BH4를 포함하는 다른 층 주위를 싸거나(즉, 바이오흡착제 외피 내에 활성 부분) 또는 주변을 싸는 캡슐 내 충전된 원통 모양의 플러그(plug)이고, 상기에서 하나 또는 그 이상의 다른 층이 바이오흡착제 외피 아래 또는 내부에 조합된 것일 수 있다. 선택적으로, 정제 또는 캡슐 플러그의 바이오흡착 및 다른 층은 나란한 2 또는 다층 배열로 층상화될 수 있다. 이러한 디자인은 바이오흡착층이 GI막 또는 GI 점액 막과 상호 반응하도록 하고 이 투약형을 고정하여 GI 트랙을 통한 그것의 통과를 늦추어 체류 시간을 증가시킨다. 이러한 투약형은 또한 장용 코팅될 수 있다. 그러나, BH4를 사용한 본 방법의 실시예는 GIT 점액과 결합하여 GIT를 통한 투약형의 이동을 지연시키는 기능기를 가진 폴리머 비활성 성분(첨가물)이 도입된다. BH4의 투약형은 폴리카르보필-시스테인, 폴리폴리메타크릴산-시스테인, 카르복시메틸 셀룰로오스-시스테인, 키토산 유도체-시스테인 등과 같은 티올화 폴리머 첨가물(폴리머-SH)로 제형화된다. 이러한 티올화된 폴리머는 BH4가 상당히 강화된 흡수를 가지도록 바이오흡착과 항-산화 특성 모두를 준다. 이러한 제형에 포함된 다른 첨가물은 항산화제 및 수행과 제조를 돕는 첨가물이다.
또 다른 실시예에서, 불활성 첨가물 또는 활성 성분을 포함하는 경구 투약형은 위 운동성을 늦추기 위해 사용된다. GIT 트랙을 통한 BH4 투약형의 이동을 늦추는 것은 분자의 체류 시간을 증가시킬 것이고 그리하여 투여된 용량의 보다 큰 분율이 흡수되는 것을 가능하게 한다. 위 배출 및/또는 장 운동을 지연시키기 위해 경구 제형에 도입된 일반적으로 안전하다고 여겨지는(GRAS) 첨가물은 바람직하게 지방산, 지방산의 글리세라이드, 및 크레모포르™(Cremophor™)(폴리옥실 캐스터 오일 유도체)와 같은 지방산 및 글리세라이드의 유도체 등과 같은 식이 지방을 포함한다. 활성 첨가물은 일반적 또는 선택적(M3) 항무스카린성 또는 항콜린성 제제와 같이 소화관 운동성을 늦추는 제제를 포함한다.
본 발명의 제 4 관점은 HPMC, 카보머 등과 같은 서방제형을 사용하여 BH4의 방출을 변형하는 방법을 제시한다. 본 개념은 즉시-방출에서 느리고, 연장되고, 조절되고/되거나 정기적인 방출을 하도록 BH4의 방출을 수정하거나 변경함으로써 GI 트랙으로 BH4 투약형을 전달하는 것을 포함한다. 느리고, 연장되고 조절된 방출은 당업계에 알려진 첨가물을 사용하여 수행되고, BH4는 전달 시스템 내에서 항-산화제와 같은 안정성 강화제의 존재에 의해 화학적 분해로부터 보호된다. 이러한 방법은 BH4가 제형 내 및 제형 주변 환경에서 안정화하여 제형이 GIT 전체 길이를 이동할 때 전신적 순환 내로 활성 분자가 그대로 흡수되는 것이 가능하게 하기 때문에 생체이용률을 최대로 할 수 있다. 본 접근은 GIT의 더 큰 흡수창을 제공하고 그리하여 더 높은 pH 환경에서 BH4의 분해를 막아 BH4가 흡수되어 이용되도록 한다. 항산화제는 장액의 중성에 가까운 pH로 인해 약물이 장액에서 분해되는 것을 보호하기 위해 제형 내에 포함될 것이다. 느리고, 연장되고, 조절된 전달은 또한 GIT의 저산소 압력 부위로 BH4를 전달할 것이다. 정기적인 방출은 폴리머가 용해성인 pH 수치에 도달할 때에만 용해하는 pH 민감성 폴리머와 같은 당업계에 알려진 첨가물을 사용하여 이루어진다.
또 다른 실시예에서, 본 발명은 BH4 제형에 산성 첨가물을 포함하는 것이 장의 pH를 낮추고 장 내 BH4를 안정화하여 흡수되어 이용될 수 있도록 함으로써 BH4의 흡수를 실제로 증가시키는지 여부를 확인하기 위하여 BH4 투약형의 장용 코팅을 제시한다. 그러므로 장용 코팅은 첨가물이 BH4를 보호할 것으로 예상되는 위치에서 첨가물과 약물이 함께 유지되도록 하기 위해 사용될 것이다. 만일 BH4 투약형이 위에서 분해되도록 하였다면, 상기 산성 첨가물은 위 내로 함께 배출될 수 없으며 보호를 제공할 수 없다.
장용 코팅은 위에서 산-촉매성 분해가 되기 쉬운 화합물이 위 내 산에 의해 분해되는 것으로부터 보호한다. 장용 코팅 물질은 정제 또는 캡슐이 위에서 활성 화합물을 방출하는 것을 방지하고, 이는 장용 코팅 물질이 산에서 불용성이기 때문이다. 일단 장용-코팅된 투약형이 pH 값이 pH 5-8에 있는 장에 도달하면, 상기 물질은 용해되고 장 내에 상기 활성 물질을 방출한다. 반대로, 서방제형은 가능한 한 GIT의 긴 길이/면적에 걸쳐 약을 방출하도록 디자인된다. 그 안에 포함된 상기 약물이 산-불안정한 경우에만 위를 막 지나 방출하는 서방제형 코팅을 필요로 할 것이다.
제 5 관점에서, 본 발명은 국소, 정맥, 피하, 근육, 경막, 안과적 및 흡입 의 투여 경로를 포함하나 이에 제한되지 않는 경구 투여 이외의 경로를 통한 멸균 액체 또는 멸균 고체 투약형의 BH4 투여를 제시한다. BH4는 의도된 적절한 농도에서 멸균 액체 또는 고체 투약형으로 제형화된다.
정맥 투여를 위한 BH4의 멸균 액체 투약형의 장점은 다음을 포함할 수 있다: (1) 더 높은 세럼 농도의 잠재성을 가진 보다 예측 가능한 동태; (2) 기능적인 위장 트랙이 요구되지 않음; (3) 환자의 참여가 요구되지 않음; 그리고 (4) 불이행에 대한 걱정이 없음. BH4의 정맥 주사 제형은, 광견병, 뇌막염, 장기 이식/보존, 지주막하 출혈(sub-arachnoidal hemorrhage), 외상성 뇌장애, 뇌졸중, 관상동맥 우회 수술, 뇌혈관 경련(cerebrovascular vasospasm), 수혈/보존, 폐고혈압, 적혈구 질환, 임신 중독증, 및 화학치료 후 혈관성 질환을 포함하나 이에 제한되지 않는, 신체 또는 경구나 다른 투여 제형을 통한 접근이 일반적으로 어려운 신체 부분을 통한 액과 약물의 신속한 전달이 요구되는 상태를 조절함에 있어 특별히 이득이 될 수 있다.
BH4는 수용성 용액 및 생리적 수용성 pH 용액에서 산화되기 매우 쉽다(Davis, et al., Eur J. Biochem. 173, 345-351(1988); Kirsch, et. al., J. Biol. Chem. 278, 24481-24490(2003)). BH4 안정성에 대한 대부분의 결정은 생리학적 플라즈마 pH 조건 하 유사한 BH4의 안정성 거동을 모방하기 위해 중성 내지 온화한 알칼리성 pH 7.4 용액에서 수행되었다. 비록 유럽 특허 출원 번호 1 757 293 A는 액체 또는 시럽 제형을 개시하고 있지만, 이러한 제형은 경구 복용 되기 전에 물로 재구성되는 것을 요구하는 고체 상태 분말 블렌드 또는 과립으로 구성된다. 발명의 본 관점은 구성을 위한 분말 또는 과립으로 제한되지 않는 액체 제형을 제시한다. 본 발명은 액체 제품으로서 앰플, 병 또는 바이알로 충전되게 하거나 동결 건조된 제품으로 동결-건조되도록 바이알에 충전되게 하는 멸균 제품 충전/완료 시설에서 처리되도록 하기 위해 충분한 시간 동안 주변 온도에서 안정하게 유지되는 것이 가능한 컴파운드된(compounded) 액체 제형을 또한 제시한다.
재구성을 위한 상기 액체 및 동결 건조된 제형은 또한 치료 효과를 위해 코, 안과적 및 귀 도관을 통해 전달될 수 있다. 동결 건조된 제품은 바람직하게는 수용성이며 액체에 BH4가 용해되기 전에, 멸균 시설에서 액체 제품의 처리가 요구된다(즉, 동결 건조를 위한 동결 건조기 내로 충전된 바이알이 로딩되기 이전에 컴파운딩(compounding), 멸균 여과 및 바이알 내로 멸균-여과된 액체 충전이 됨). 멸균 처리 동안 용해된 BH4의 안정성을 유지하고 그것의 분해를 방지하는 것은 충전-완료된 제품에 대한 불순도 규정을 만족하는 동결 건조 제품을 제조하기 위한 주요 필수사항이다. 그러므로 동결 건조된 제품의 조성물은 충전 완료 처리 동안 BH4 분해를 최소화하거나 방지하는 적절한 안정제를 포함한다. 본 명세서에 설명된 제형은 최소 6시간이 소요되는 처리, 멸균 충전/완료 제조 동안 BH4 용액을 안정화시킬 것이고, 또한 상업적으로 안정한 제품을 제공한다.
상기 제형은 바람직하게 농도 범위가 0.1 mg/mL 내지 10 mg/mL인 BH4 제형을 포함한다. BH4의 높은 용해성 때문에, 예를 들면, 약 100 mg/mL 이하의 농도를 가진 제형 또한 제조될 수 있다. 본 명세서에 설명된 일반적이고 상대적인 조성물 구성 및 방법은 매우 농축된 용액을 만드는데 응용될 수 있다.
BH4 액체 제형은 바람직하게 pH 1 내지 8 버퍼 용액, 바람직하게 pH 2 내지 7 버퍼 용액에서 제형화된다. 상기 선택된 pH 버퍼는 버퍼 이온화 상수 또는 상수들이 액체 제형의 의도된 pH에 근접한 정도에 의해 결정되는, 의도된 특정 pH에서 실질적인 버퍼링 능력을 제공할 수 있는 버퍼 화합물이다. 그러므로 어떤 버퍼 화합물은 화합물의 이온화 상수 중 하나 또는 그 이상이 제형의 의도된 pH에 근접한 이상 도입될 수 있다. pH 1-8 범위에서 도입될 수 있는 버퍼의 예는 다양한 산/염기 및 그들의 각각 짝산/염기 또는 염 형을 포함하고, 다음을 포함하나 이에 제한되지 않는다: 염산(pH 1 - 2), 말레산(pH 1 - 3), 인산(pH 1 - 3), 시트르산(pH 3 - 6), 아세트산(pH 4.7±1.0), 이염기성 인산나트륨(pH 6-8), 트로메타민(TRIS, pH 8.3±1.0) 등.
정맥 주사 제형
정맥 주사 제형은 항-산화제 또는 2 이상의 항산화제의 조합을 사용하여 안정화된다. 항-산화제의 조합은 제형의 불안정성을 방지함에 있어 상승 효과가 이루어질 수 있다. 용액으로부터 용해된 산소를 제거하기 위해 불활성 가스 및/또는 이산화탄소의 살포는 선택적이나, 낮은 농도의 항산화제가 사용될 때에 바람직하고, BH4 및 항산화제 모두 낮은 농도로 사용될 때에는 더 바람직하다. 수용액에서 BH4의 안정화는 BH4의 농도와 항산화제 및 pH의 상호 작용에 의해 영향을 받는다. 그러므로, 예를 들면, 고농도의 BH4는 낮은 농도의 BH4에 비해 더 낮은 농도의 항산화제가 필요하다. 더 나아가, BH4는 높은 pH일 때보다 낮은 pH에서 더 안정된다. 그러므로, 바람직한 높은 pH 제형은 바람직하게 더 높은 농도의 항산화제를 가지고, 더 바람직하게는 2,3, 또는 그 이상의 항산화제의 조합을 가지며, 더욱 더 바람직하게는 비-산화성 가스(예를 들어, 불활성 가스 또는 이산화탄소)의 살포 후에, 약물 제품의 안정성을 더 강화하기 위해 비-산화성 가스(예를 들어, 불활성 가스 또는 이산화탄소) 분위기에서 1차 용기를 밀봉하여 또는 거의 밀봉하여 봉한다.
BH4 액체 제형의 예시적인 범위는 표 1과 2에 주어진다. 제형화된 또는 컴파운드된 용액에 선택적으로 컴파운딩 탱크에서 불활성 가스(예를 들어, 아르곤 또는 질소) 또는 이산화탄소가 살포되고 1차 용기는 용기 빈 공간의 산소를 제거하기 위해 바람직하게 불활성 가스 또는 이산화탄소로 덮개로 봉인된다. 상기 제형은 적절한 확대 계수에 의해 화합물 양을 다양하게 하여 어떤 부피로도 확대될 수 있다.
낮은 pH(예를 들어 pH 4.0) 제형 중 조성물 범위의 일반적인 예
성분 양(mg) % 중량/부피 작용
BH4 0.10-100 0.01-10.00 활성 성분
L-시스테인 0.00-50.00 0.00-5.00 항산화제
아스코르브산 0.00-500.00 0.00-50.00 항산화제
소듐 메타바이설파이트 0.00-300.00 0.00-30.00 항산화제
시트르산 0.26-19.87 0.03-1.99 버퍼링 제제
소듐 시트레이트, 디하이드레이트 2.57-192.75 0.26-19.27 버퍼링 제제
주사용수 qs 1.00mL 1.00mL 희석제
중성 pH(예를 들어, pH 7.0) 제형 중 조성물 범위의 일반적인 예
성분 양(mg) % 중량/부피 작용
BH4 0.10-100 0.01-10.00 활성 성분
L-시스테인 0.00-50.00 0.00-5.00 항산화제
아스코르브산 0.00-500.00 0.00-50.00 항산화제
소듐 메타바이설파이트 0.00-300.00 0.00-30.00 항산화제
소듐 모노베이식 포스페이트, 모노하이드레이트 0.50-11.02 0.05-1.02 버퍼링 제제
소듐 디베이식 포스페이트 0.44-17.80 0.04-1.78 버퍼링 제제
주사용수 qs 1.00mL 1.00mL 희석제
액체 제형에 도입된 항산화제는 바람직하게 티올-베이스(예를 들어, L-시스테인), 아스코르브산 및 설파이트-베이스(예를 들어, 소듐 메타바이설파이트) 화합물 중 하나 이상으로부터 선택된다. 용액에 바람직하게 BH4 용액으로부터 산소를 제거하기 위해 불활성 가스나 이산화탄소가 살포되고, 이후 불활성 가스(예를 들어, 아르곤, 질소) 또는 이산화탄소와 같은 비-불활성 가스가 덮인 상태에서 앰플에 밀봉하여 봉해지거나 금속의 음료 맥주-타입 캡을 사용하여 밀봉하여 바이알이 닫혀져 용기의 빈 공간에서 살포된 가스가 배출되는 것을 방지한다. 경구 액체 제형은 바람직하게 제형의 좋은 맛을 향상시키는 감미료 및 향미제를 부가적으로 포함한다.
일실시예에서, 액체 투약형인 경우, BH4는 항산화제 및/또는 제형으로부터 산소 분자를 제거하기 위해 비-산화성, 바람직하게, 멸균된, 뷸활성 가스(예를 들어, 질소, 아르곤, 헬륨, 등)과 같은 가스 및/또는 이산화탄소와 같은 비-불활성 가스가 살포됨에 의해 안정화된다. 상기 제품은 바람직하게 불활성 가스 덮개 하에서 충전되어 산소 분자가 제형에 재용해되는 것을 최소화하거나 방지한다. 상기 액체는 용기(예를 들어, 바이알, 앰플, 등)에 충전되고 용기에 들어가는 산소를 막기 위해 밀봉하여 봉인된다. 다른 실시예에서, 비경구적인 투여를 위한 멸균 고체 투약형인 경우, BH4 용액은 동결 건조되고 투여 전 병원에서 재구성된다. 또 다른 실시예에서, BH4의 멸균 분말 약물 성분은 멸균 건조 분말 충전 시설에서 멸균 용기(예를 들어, 바이알, 백, 병, 또는 앰플) 내로 직접 팩킹(packing)된다. 그러므로, 본 발명의 다른 관점은 수용성 용액 내로 재구성하기 위한 테트라하이드로바이오프테린(BH4) 또는 그의 약학적으로 허용 가능한 염의 건조 분말 제형으로, BH4 또는 그의 약학적으로 허용 가능한 염의 건조 분말 혼합물, 항산화제, 및 pH 버퍼를 포함한다.
경구 액체 제형 조성물
경구 액체 제형은 일반적 액체 및 정맥 주사 제형에 도입된 성분에 부가하여 감미료와 향미제를 포함한다. 감미료와 향미제는 허용될 수 있는 감미와 향을 얻기에 충분한 양으로 첨가된다. 경구 액체 제형은 하나 이상의 안정화제를 포함한다. 선택적으로, 그들은 항균성 보존제를 포함한다. 그들은 바람직하게 낮은 pH, 예를 들어 pH 1-4에서 버퍼링되고. 상기 버퍼링 제제는 향미제와 조화를 이루도록 선택되며 그리하여 경구 액체 제형의 감각적 특성이 강화된다. 바람직한 버퍼(산 및 짝 염기)의 예는 다음과 같다: 그들의 짝염기 또는 염 형과 조합된 시트르산, 타르타르산, 말산.
감미료의 예는 설탕(예를 들어, 수크로오스, 글루코오스, 소르비톨, 만니톨, 프럭토오스, 등), 강한 비-설탕 감미료(예를 들어, 아스파탐, 아세설팜 K, 시클라메이트, 사카린, 수크라로오스, 글라이시리진, 알리탐, 네오탐, 네오헤스페리딘 DC, 타우마틴, 모네린 등)를 포함한다.
다른 실시에에서, 코, 안과적 및 귀 투여를 위해, BH4는 비경구적인 투약형으로 논의된 바와 같이 제형화되고 선택적으로 멸균 제품이다. 이러한 투약형은 며칠 간 이용할 수 있는 키트 패키지 형태로 제공될 수 있다. 키트 내의 각 단위는 하나의 바이알 또는 앰플 및 하나의 스프레이(코 투약형용) 또는 하나의 점적기(안과적 및 귀 투약형의 경우)로 구성될 수 있다. 일단 바이알 또는 앰플이 개봉되면, 상기 스프레이 또는 점적기는 바이알 또는 앰플 위로 고정되고 상기 이전 캡은 버려진다. 상기 투약형 제품은 처방된 만료 기간 내에 사용되고 버려지며 새 바이알 또는 앰플이 사용되기 위해 개봉된다. 다른 실시예는 성형-충전-및-밀봉 제조 과정에 의해 생산된 밀봉 플라스틱 1회용 멸균 용기에 용액이 충전된다. 이러한 패키지는 개봉되고 그들 내에 포함된 액체를 짜냄에 의해 의도된 투여 경로를 이용하여 전달되는 용액들이다. 이러한 투약형은 하루에 한 번 투여되고 콧구멍(코 제품), 또는 눈(안과적) 또는 귀 도관으로 떨어뜨려진 방울(귀 제품)을 통하여 주어진다. 성형, 충전 및 밀봉 패키지로 패키지화된 약물 치료에 대하여, 상기 약물이 투여 경로 위로 짜내어진다.
다른 실시예에서, BH4는 전달 부위에 놓여진 제형화된 스트립, 패치 또는 필름 또는 국소적 제품을 사용하여 구강 및 경피 경로를 통해 투여된다. 설하정은 혀 아래 놓여진다. 이러한 투약형은 하루에 한 번 투여되고 전달 부위 막(구강 및 경피 경로)에 부착되거나 설하 부위에 고체 또는 반-투약형으로 놓여진다. 전달 부위의 염증을 방지하기 위해, 소듐 카보네이트 또는 바이카보네이트와 같은 염기성 화합물이 코팅되고 BH4와 혼합되어 그것을 불안정하게 하는 BH4와의 상호 작용을 방지한다. 선택적으로 상기 염기성 화합물은 BH4의 pH를 상승하도록 사용되기 바로 직전에 부가되고, 이는 꽤 낮다. BH4와 상호 작용을 방지하기 위해 알칼리성 입자를 코팅하지 않고 제조 시간에 염기성 첨가물을 부가하는 것은 BH4의 불안정함을 야기할 것이다. 다른 실시예는 염기성 또는 알칼리성 물질을 포함하는 코팅 용액으로 BH4의 핵심 설하정이 코팅된다. 설하 구획에서, 상기 염기성 화합물이 먼저 용해하고, BH4와 상호 작용하여 매질의 pH를 높인다.
BH4 액체 제형을 위한 1차 용기 패키징
BH4 액체 제형용 1차 패키징 용기는 바람직하게 산소, 이산화탄소, 질소 및 불활성 가스가 통과될 수 없다. 1차 용기 내로 BH4의 살포된 액체 제형의 충전 후에, 바람직하게 질소 덮개 하에, 상기 용기는 바람직하게 밀봉하여 봉해져 액체와 용기 빈 공간에 살포된 가스가 유지되고 용기 내 살포 가스의 손실 및 산소 진입을 방지한다.
바람직한 1차 용기는 밀봉하여 봉인된 앰플뿐만 아니라 봉인된 소다 및 맥주 음료 병에 도입된 것과 같은 금속의 캡으로 밀봉하여 봉인된 병과 바이알이다. 사용하는 동안, 상기 앰플은 잘려져 개봉되고 몇 시간, 예를 들어 약 12시간 이내에 사용된다. 앰플은 정맥 주사용과 주사용 멸균 제품으로 사용될 수 있다. 멸균 주사 가능한 액체 및 동결 건조된 제품은 또한 클림프(climped)된 알루미늄 캡으로 잠긴 고무 마감-봉인된 바이알 내로 팩킹될 수 있다. 제형 내 항산화제는 제품의 보관 기간 동안 지각할 수 없이 느린 살포된 가스의 손실 또는 바이알 내로의 산소 진입으로부터 액체 및 동결 건조된 제품을 보호한다.
경구, 안과적 또는 귀 용으로 병 또는 바이알 내로 충전된 BH4 액체 제형은 바람직하게 음료 금속 캡 또는 클림프된 알루미늄 봉인으로 잠긴 고무 마개로 밀봉하여 잠겨진다. 병 또는 바이알의 입구는 스크류 캡이 허용되도록 패일 수 있다. 밀봉한 봉인이 제거될 때, 점적기가 있거나 없거나 스크류 캡으로 대체된다. 제형 내 항산화제의 존재는 밀봉된 봉인이 파쇄된 후, 예를 들어 최소 2주 동안 사용하기에 안정되도록 스크류-마개된 제형을 가능하게 할 수 있다.
Ⅰ. 테트라하이드로바이오프테린의 합성
테트라하이드로바이오프테린, 전구체, 유도체 및 유사물의 합성을 위한 여러가지 방법이 당업계에 알려져 있다. 미국 특허 번호 5,698,408; 2,601,215;3505329;4,540,783;4,550,109;4,587,340;4,595,752;4,649,197;4,665,182;4,701,455;4,713,454;4,937,342;5,037,981;5,198,547;5,350,851;5,401,844;5,698,408; 캐나다 출원 CA 2420374, 유럽 출원 번호 EP 079 574, EP 191 335 및 산토리 일본 특허 공개 JP 4-082888, JP 59-021685 및 JP 9-157270뿐만 아니라 수지모토와 마츄라, Bull. Chem. Soc. Japan, 48(12):3767-3768(1975), 수지모토와 마츄라, Bull. Chem. Soc. Japan, 52(1):181-183(1979), 마츄라 등, Chem. Lett.(일본), 735-738(1984), 마츄라 등, Heterocycles, Vol.23, No.12, 3115-3120, 1985 및 Whiteley et al., Anal Biochem. 137(2):394-6(1984)(각각은 참조에 의해 본 명세서에 도입됨) 각각은 본 발명의 조성물로 사용될 수 있는 디하이드로바이오프테린, BH4 및 그의 유도체를 만드는 방법을 설명한다.
국제 공개 번호 WO2005049614, 미국 특허 번호 4,540,783, 일본 특허 번호 59-021685, Schircks et al., Helv. Chim. Acta, 60: 211(1977), 수지모토 등, Bull. Chem. Soc. Jp, 52(1):181(1979), 수지모토 등, Bull. Chem. Soc. Jp, 48(12):3767(1975), Visontini et al., Helv. Chim. Acta, 52:1225(1969), 및 마츄라 et al., Chem. Lett., p735(1984), 그들 전체가 참조로 본 명세서에 도입되고 BH4 합성 방법을 설명한다.
Ⅱ. 6R-테트라하이드로바이오프테린 하이드로클로라이드 염의 크리스탈린 형
(6R)-L-에리스로-테트라하이드로바이오프테린 디하이드로클로라이드는 다형체 형 및 용매화물을 포함하는 다른 크리스탈린 형에 존재하고, 이들 중 몇몇은 다른 것에 비해 더 안정하다.
(6R)-L-테트라하이드로바이오프테린 디하이드로클로라이드 염의 크리스탈 다형체 형
다형체 형 B
가장 안정한 것으로 밝혀진 크리스탈 다형체는 본 명세서에서 "형 B", 또는 선택적으로 "다형체 B"로 언급된다. (6R)-L-에리스로-테트라하이드로바이오프테린 디하이드로클로라이드 개발의 연구와 개발 동안 얻어진 결과는 제조된 여러 알려진 크리스탈린을 나타내나 누구도 다형체 및 BH4 크리스탈의 안정성에 미치는 효과를 인식하지 않았다.
다형체 B는 약 20℃ 이상에서 가장 높은 열역학적 안정성을 가진 다소 흡습성 안하이드레이트이다. 더욱이, 형 B는 그것의 열적 안정성, 목표된 상태로 제조될 가능성, 그것의 적절한 형태(morphology) 및 입자 크기로 인해 쉽게 처리되고 다루어질 수 있다. 녹는점은 260℃ 근처이나(△Hf > 140 J/g) 녹기 전 및 녹는 동안 분해되기 때문에 명확한 녹는점은 탐지될 수 없다. 이러한 뛰어난 특성은 다형체 형 B가 특히 상승 온도에서 제조되는 약학적 용도에 적합하도록 한다. 다형체 B는 0.2 μm 내지 500 μm의 범위에 있을 수 있는 입자 크기를 가진 미세 분말로 얻어질 수 있다.
형 B는 d-값(Å)으로 표현되는 엑스-레이 분말 회절 패턴을 나타낸다: 8.7(vs), 6.9(w), 5.90(vw), 5.63(m), 5.07(m), 4.76(m), 4.40(m), 4.15(w), 4.00(s), 3.95(m), 3.52(m), 3.44(w), 3.32(m), 3.23(s), 3.17(w), 3.11(vs), 3.06(w), 2.99(w), 2.96(w), 2.94(m), 2.87(w), 2.84(s), 2.82(m), 2.69(w), 2.59(w) 및 2.44(w). 도 1은 (6R)-L-에리스로-테트라하이드로바이오프테린 디하이드로클로라이드의 형 B에 의해 나타나는 특징적인 엑스-레이 회절 패턴의 그래프이다.
본 명세서에서 사용될 때, 상기 괄호 안의 약어는 다음을 의미한다: (vs) = 매우 강한 강도; (s) = 강한 강도; (m) = 중간 강도; (w) = 약한 강도; 및 (vw) = 매우 약한 강도. 특징적인 엑스-레이 분말 회절 패턴은 도 1에 나타나진다.
BH4의 다른 다형체는 제조 및 제형 동안 안전하게 다룰 수 있을 뿐만 아니라 그것의 정제(pure) 형 또는 제형 내에서 높은 저장 능력을 제공하여 만족스러운 화학적 그리고 물리적 안정성을 가지는 것이 밝혀졌다. 게다가, 형 B 및 BH4의 다른 다형체는 매우 많은 양으로(예를 들어, 100 킬로 규모)으로 제조될 수 있고 장기간에 걸쳐 저장될 수 있다는 것이 밝혀졌다.
크리스탈 형 B를 포함한 모든 크리스탈 형(다형체, 수화물 및 용매화물)은 가장 안정한 다형체 B의 제조에 사용될 수 있다. 다형체 B는 적절한 극성 및 비 수용성 용매에서, 무정형 또는 다형체 A와 같이 다형체 형 B이 아닌 다른 형의 현탁액의 상 평형에 의해 얻어질 수 있다. 그러므로, 본 명세서에 설명된 약학적 제조는 (6R)-L-에리스로-테트라하이드로바이오프테린 디하이드로클로라이드 형 B의 제조를 의미한다.
BH4의 다른 형은 실온에서 용매에 BH4의 다른 형을 분산시키고, 다형체 형 B를 생산하기에 충분한 시간 동안 주변 온도에서 현탁액을 교반하며, 이후 크리스탈린 형 B를 분리하고 분리된 형 B에서 용매를 제거함으로써 형 B로 전환될 수 있다. 본 명세서에 사용된 주변 온도는 0℃ 내지 60℃, 바람직하게 15℃ 내지 40℃의 범위 내의 온도를 의미한다. 상기 적용된 온도는 온도를 단계적으로 또는 연속적으로 감소시킴에 의해서 처리 및 교반하는 동안 변할 수 있다. 다른 형을 형 B로 전환하기에 적절한 용매는 메탄올, 에탄올, 이소프로파놀, 다른 C3- 및 C4-알코올, 아세트산, 아세토니트릴, 테트라하이드로퓨란, 메틸-t-부틸 에테르, 1,4-디옥산, 에틸 아세테이트, 이소프로필 아세테이트, 다른 C3-C6-아세테이트, 메틸 에틸 케톤 및 다른 메틸-C3-C5 알킬-케톤을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 상 평형을 완료하기까지 시간은 30시간 이하일 수 있고 바람직하게 20시간 이하 또는 20시간 보다 적을 수 있다.
형 B는 또한 약 5% 이하의 물을 포함하는 용매 혼합물로부터, 특히 에탄올, 아세트산 및 물의 혼합물로부터 크리스탈화에 의해 얻어질 수 있다. (6R)-L-에리스로-테트라하이드로바이오프테린 디하이드로클로라이드의 다형체 형 B는, 선택적으로 상승 온도에서, 에탄올, 아세트산 및 물을 포함하는 용매 혼합물에, 바람직하게 형 B이 아닌 더 낮은 에너지 고체 형을 또는 (6R)-L-에리스로-테트라하이드로바이오프테린 디하이드로클로라이드의 형 B를 용해하고, 용액에 시드(seed)를 부가하며, 상기 얻은 현탁액을 냉각하고, 형성된 크리스탈을 분리함으로써 제조될 수 있다. 용해는 실온 또는 70℃ 이하, 바람직하게 50℃ 이하에서 수행될 수 있다. 용해를 위한 최종 용매 혼합물이 사용될 수 있고 또는 출발 물질이 먼저 물에 녹고, 다른 용매가 양자 모두 또는 하나씩 부가될 수 있다. 용매 혼합 조성물은 부피 비가 1 : 3: 2 내지 1: 9 : 4이고, 바람직하게는 1 : 5: 4인 물 : 아세트산: 테트라하이드로퓨란을 포함한다. 용액은 바람직하게 교반된다. 냉각은 -40℃ 내지 0 ℃, 바람직하게 10 ℃ 내지 30℃로 온도를 내리는 것을 의미할 수 있다. 적절한 시드는 다른 배치(batch)로부터의 다형체 형 B 또는 유사한 또는 동일한 형태를 가지는 크리스탈이다. 분리 후에, 크리스탈린 형 B는 아세톤 또는 테트라하이드로퓨란과 같은 비-용매으로 세척되고 통상의 방법으로 건조된다.
다형체 B는 또한 메탄올, 에탄올 및 아세트산과 같은 비-용매의 부가를 통해 수용성 용액으로부터 크리스탈화에 의해 얻어질 수 있다, 크리스탈화 및 분리 과정은 용액을 냉각하지 않고 실온에서 유리하게 수행될 수 있다. 본 과정은 그러므로 산업적인 규모에서 수행되기 매우 적절하다.
본 명세서에서 설명된 조성물 및 방법의 일실시예에서, (6R)-L-에리스로-테트라하이드로바이오프테린 디하이드로클로라이드의 다형체 형 B를 포함하는 조성물은 주변 온도에서 물에 형 B가 아닌 다른 고체 형 또는 (6R)-L-에리스로-테트라하이드로바이오프테린 디하이드로클로라이드의 형 B를 용해시키고, 현탁액을 형성하기에 충분한 양의 비-용매를 부가하고, 선택적으로 구체적 시간 동안 현탁액을 교반하며, 이후 형성된 크리스탈의 분리에 의해 제조된다. 상기 조성물은 아래 설명된 바와 같이 약학적 조성물로 더 변형된다.
수용성 용액에서 (6R)-L-에리스로-테트라하이드로바이오프테린 디하이드로클로라이드의 농도는 용액과의 관계에서 10 내지 80 중량 퍼센트, 더 바람직하게 20 내지 60 중량 퍼센트가 될 수 있다. 바람직한 비-용매(즉, BH4의 현탁액을 제조하기에 유용한 용매)는 메탄올, 에탄올 및 아세트산이다. 상기 비-용매는 수용성 용액에 부가될 수 있다. 더 바람직하게, 상기 수용성 용액이 비-용매에 부가된다. 현탁액의 형성 후 교반 시간은 30시간 이하 그리고 바람직하게는 20시간 이하 또는 20시간 미만이 될 수 있다. 여과와 건조에 의한 분리는 상기 설명한 바와 같이 알려진 방법으로 수행된다.
다형체 형 B는 매우 안정한 크리스탈린 형으로 쉽게 여과되고, 건조되며 약학적 제형용으로 의도된 입자 사이즈로 분쇄될 수 있다. 이러한 뛰어난 특성은 다형체 형 B가 특히 약학적 용도로 쉽게 사용될 수 있게 한다.
다형체 형 A
(6R)-L-에리스로-테트라하이드로바이오프테린 디하이드로클로라이드의 다른 크리스탈 다형체는 본 명세서에서 설명된 약학적 제조에 사용되기에 안정한 바람직한 BH4의 형이라는 것이 발견되었고, 이것은 본 명세서에서 "형 A" 또는 "다형체 A"로 언급될 것이다. 다형체 A는 다소 흡습성이고 약 3 중량 퍼센트의 용량으로 물을 흡수하며, 이는 10℃/분의 속도로 가열될 때, 50℃ 내지 200℃ 사이에서 연속적으로 방출된다. 다형체 A는 흡습성 안하이드레이트이고, 이것은 형 B에 비해 메타-안정한 형이다; 그러나 이것은 만일 단단하게 밀봉된 용기에 둔다면 주변 상태에서 몇 개월 넘게 안정하다. 형 A는 특히 안정한 다형체 형을 생산하기 위한 중간물 및 출발물질로 적절하다. 다형체 형 A는 의도된 중간 입자 크기 범위가 전형적으로 1μm 내지 약 500μm인 고체 분말로 제조될 수 있다.
다형체 A는 d-값(Å)으로 표현되는 특징적 피크를 가지는 특징적 엑스-레이 분말 회절 패턴을 나타낸다: 15.5(vs.), 12.0(m), 6.7(m), 6.5(m), 6.3(w), 6.1(w), 5.96(w), 5.49(m), 4.89(m), 3.79(m), 3.70(s), 3.48(m), 3.45(m), 3.33(s), 3.26(s), 3.22(m), 3.18(m), 3.08(m), 3.02(w), 2.95(w), 2.87(m), 2.79(w), 2.70(w). 도 2는 (6R)-L-에리스로-테트라하이드로바이오프테린 디하이드로클로라이드의 형 A에 의해 나타나는 특징적인 엑스-레이 회절 패턴의 그래프이다.
다형체 A는 파장 숫자(cm-1)로 표현되는 특징적 라만(Raman) 스펙트라 밴드를 나타낸다: 2934(w), 2880(w), 1692(s), 1683(m), 1577(w), 1462(m), 1360(w), 1237(w), 1108(w), 1005(vw), 881(vw), 813(vw), 717(m), 687(m), 673(m), 659(m), 550(w), 530(w), 492(m), 371(m), 258(w), 207(w), 101(s), 87(s) cm-1.
다형체 형 A는 물의 (6R)-L-에리스로-테트라하이드로바이오프테린 디하이드로클로라이드 용액에서 동결-건조 또는 물을 제거함에 의해 얻어질 수 있다. (6R)-L-에리스로-테트라하이드로바이오프테린 디하이드로클로라이드의 다형체 형 A는 물 중 주변 온도에서 (6R)-L-에리스로-테트라하이드로바이오프테린 디하이드로클로라이드의 용해, (1) 용액을 고체화하기 위해 감소된 온도까지 용액을 냉각하고 낮아진 압력 하에서 물을 제거하거나 (2) 상기 수용성 용액으로부터 물을 제거함에 의해 제조될 수 있다.
크리스탈린 형 A는 여과에 의해 분리될 수 있고 이후 제품으로부터 흡수된 물을 증발시키기 위해 건조될 수 있다. 건조 조건 및 방법은 알려져 있고 분리된 제품의 건조나 본 명세서에서 설명된 변형 (2)에 따른 물의 제거는 상승된 온도, 예를 들어 80℃ 이하, 바람직하게는 30℃ 내지 80℃를 적용하고, 진공 또는 상승된 온도 및 진공 하에서 수행될 수 있다. 변형 (2)에서 얻어진 침전의 분리에 앞서, 상기 현탁액은 상 평형을 위한 구체적 시간 동안 교반될 수 있다. 수용성 용액에서 (6R)-L-에리스로-테트라하이드로바이오프테린 디하이드로클로라이드의 농도는 상기 용액에 대하여 5 내지 40 중량 퍼센트일 수 있다.
빠른 냉각은 출발 물질로 고체 용액을 얻기에 바람직하다. 감소된 압력은 용매가 완전하게 제거될 때까지 적용된다. 동결 건조는 당 업계에 잘 알려진 기술이다. 완전한 용매 제거까지 걸리는 시간은 0.01 내지 1 mbar가 될 수 있는 적용된 진공, 사용된 용매 및 동결 온도에 따라 다르다.
다형체 형 A는 실질적으로 물이 없는 조건 하에서 실온에서 또는 실온 아래에서 안정하며, 이는 실온 중 질소 하에서 각각 5일 및 18시간 교반된 테트라하이드로퓨란 또는 3차-부틸 메틸 에테르 현탁액의 상 평형 테스트로 설명된다. 실온에서 여과 및 공기-건조는 변형되지 않은 다형체 형 A를 수득한다.
다형체 형 F
(6R)-L-에리스로-테트라하이드로바이오프테린 디하이드로클라이드의 다른 크리스탈 다형체는 본 명세서에서 설명된 약학적 제조에서 사용되기에 안정한 바람직한 BH4의 형이라는 것이 발견되었고, 이는 본 명세서에서 "형 F" 또는 "다형체 F"로 언급될 것이다. 다형체 F는 다소 흡습성이고 약 3 중량 퍼센트의 용량으로 물을 흡수하며, 이는 10℃/분의 속도로 가열될 때, 50℃ 내지 200℃ 사이에서 연속적으로 방출된다. 다형체 F는 메타-안정한 형이며 흡습성 안하이드레이트이고, 이는 주변의 더 낮은 온도에서 형 A보다 더 안정하며 더 높은 온도에서 형 B보다 덜 안정하고, 형 F는 안정한 다형체 형을 생산하기 위한 중간물 및 출발 물질로 특히 적절하다. 다형체 형 F는 의도된 중간 입자 크기 범위가 전형적으로 1μm 내지 약 500μm인 고체 분말로 제조될 수 있다.
형 F는 d-값(Å)으로 표현되는 특징적 피크를 가지는 특징적 엑스-레이 분말 회절 패턴을 나타낸다: 17.1(vs.), 12.1(w), 8.6(w), 7.0(w), 6.5(w), 6.4(w), 5.92(w), 5.72(w), 5.11(w), 4.92(m), 4.86(w), 4.68(m), 4.41(w), 4.12(w), 3.88(w), 3.83(w), 3.70(m), 3.64(w), 3.55(m), 3.49(s), 3.46(vs), 3.39(s), 3.33(m), 3.31(m), 3.27(m), 3.21(m), 3.19(m), 3.09(m), 3.02(m), 및 2.96(m). 도 3은 (6R)-L-에리스로-테트라하이드로바이오프테린 디하이드로클로라이드의 형 F에 의해 나타나는 특징적인 엑스-레이 회절 패턴의 그래프이다.
다형체 F는 상기 더 낮은 에너지 형을 거의 용해하지 않는 적절한 극성 및 비-수용성 용매, 특히 메탄올, 에탄올, 프로판올 및 이소프로판올과 같은 알코올에서 다형체 형 A 현탁액의 상 평형에 의해 얻어질 수 있다. (6R)-L-에리스로-테트라하이드로바이오프테린의 다형체 형 F는 상기 (6R)-L-에리스로-테트라하이드로바이오프테린을 실온 아래에서 거의 용해하지 않는 비-수용성 용액에서 (6R)-L-에리스포-테트라하이드로바이오프테린의 고체 형 A의 입자를 분산하고, 다형체 형 F를 생산하기에 충분한 시간 동안 상기 온도에서 현탁액을 교반하며, 이후 크리스탈린 형 F를 분리하고 분리된 형 F에서 용매를 제거함에 의해 또한 제조될 수 있다. 용매의 제거와 건조는 공기, 건조한 공기 또는 질소 또는 희가스와 같은 건조 보호 가스 하, 예를 들어, 0℃ 아래의 실온이나 그보다 낮은 온도에서 수행될 수 있다. 상 평형동안 상기 온도는 바람직하게 5 내지 15℃이고, 가장 바람직하게 약 10℃이다.
다형체 형 J
(6R)-L-에리스로-테트라하이드로바이오프테린 디하이드로클로라이드의 다른 크리스탈 다형체는 본 명세서에서 설명된 약학적 제조에서 사용되기에 안정한 바람직한 BH4의 형이라는 것이 발견되었고, 이는 본 명세서에서 "형 J" 또는 "다형체 J"로 언급될 것이다. 다형체 J는 다소 흡습성이고 공기 습도에서 다룰 때 물을 흡수한다. 다형체 J는 메타-안정한 형이고 흡습성 안하이드레이트이며, 하기 설명된 75% 이상 상대 습도와 같은 높은 상대 습도 조건에 노출될 때 얻어질 수 있는 형 E로 다시 돌아갈 수 있다. 형 J는 안정한 다형체 형을 생산하기 위한 중간물 및 출발물질로 특히 적절하다. 다형체 형 J는 의도된 중간 입자 크기 범위가 전형적으로 1μm 내지 약 500μm인 고체 분말로 제조될 수 있다.
형 J는 d-값(Å)으로 표현되는 특징적 피크를 가지는 특징적 엑스-레이 분말 회절 패턴을 나타낸다: 14.6(m), 6.6(w), 6.4(w), 5.47(w), 4.84(w), 3.29(vs), 및3.21(vs). 도 4는 (6R)-L-에리스로-테트라하이드로바이오프테린 디하이드로클로라이드의 형 J에 의해 나타나는 특징적인 엑스-레이 회절 패턴의 그래프이다.
다형체 J는 진공 하 적절한 온도에서 형 E의 탈수에 의해 얻어질 수 있다. 구체적으로, (6R)-L-에리스로-테트라하이드로바이오프테린의 다형체 형 J는 형 E를 얻고 적정한 온도, 25 내지 70℃, 가장 바람직하게 30 내지 50℃ 범위의 온도에서, 형 J를 얻기 위해 진공 건조기에서 형 E를 처리함으로써 형 E에서 물을 제거하여 제조될 수 있다.
다형체 형 K
(6R)-L-에리스로-테트라하이드로바이오프테린 디하이드로클로라이드의 다른 크리스탈 다형체는 본 명세서에서 설명된 약학적 제조에 사용되기에 안정한 바람직한 BH4 형이라는 것이 발견되었고, 이는 본 명세서에서 "형 K" 또는 "다형체 K"로 언급될 것이다. 다형체 K는 다소 흡습성이고 약 2.0 중량 퍼센트의 용량으로 물을 흡수하며, 이는 10℃/분의 속도로 가열될 때, 50℃ 내지 100℃ 사이에서 연속적으로 방출된다. 다형체 K는 메타-안정한 형이며 흡습성 안하이드레이트이고, 이는 더 높은 온도에서 형 B보다 덜 안정하며, 형 K는 안정한 다형체 형을, 구체적으로 형 B를 생산하기 위한 중간물 및 출발 물질로 특히 적절하다. 다형체 형 K는 의도된 중간 입자 크기 범위가 전형적으로 1μm 내지 약 500μm인 고체 분말로 제조될 수 있다.
형 K는 d-값(Å)으로 표현되는 특징적 피크를 가지는 특징적 엑스-레이 분말 회절 패턴을 나타낸다: 14.0(s), 9.4(w), 6.6(w), 6.4(w), 6.3(w), 6.1(w), 6.0(w), 5.66(w), 5.33(w), 5.13(vw), 4.73(m), 4.64(m), 4.48(w), 4.32(vw), 4.22(w), 4.08(w), 3.88(w), 3.79(w), 3.54(m), 3.49(vs), 3.39(m), 3.33(vs), 3.13(s), 3.10(m), 3.05(m), 3.01(m), 2.99(m), 및 2.90(m). 도 5는 (6R)-L-에리스로-테트라하이드로바이오프테린 디하이드로클로라이드의 형 K에 의해 나타나는 특징적인 엑스-레이 회절 패턴의 그래프이다.
다형체 K는 소량의 아스코르브산이 있으면서 소량의 물을 포함하는 극성 용매의 혼합물로부터 크리스탈화에 의해 얻어질 수 있다. 용매 혼합물을 위한 용매는 아세트산 및 메탄올, 에탄올, n- 또는 이소프로판올과 같은 알코올로부터 선택될 수 있다. 구체적으로, (6R)-L-에리스로-테트라하이드로바이오프테린 디하이드로클로라이드의 다형체 형 K는 상승된 온도에서 소량의 물과 소량의 아스코르브산을 포함하는 아세트산 및 알코올 또는 테트라하이드로퓨란의 혼합물 내 (6R)-L-에리스로-테트라하이드로바이오프테린 디하이드로클로라이드를 용해하고, 실온 아래로 온도를 낮추어 상기 디하이드로클로라이드를 크리스탈화하며, 침전물을 분리하고, 상승된 온도, 선택적으로 진공 하에서 상기 분리된 침전물을 건조함에 의해 제조될 수 있다. 적절한 알코올은 예를 들어 메탄올, 에탄올, 프로판올 및 이소판올이고, 상기에서 에탄올이 바람직하다. 아세트산과 알코올 또는 테트라하이드로퓨란의 비는 2:1 내지 1:2이고 바람직하게 약 1:1일 수 있다. (6R)-L-에리스로-테트라하이드로바이오프테린 디하이드로클로라이드의 용해는 더 높은 용량의 물의 존재 중 수행될 수 있고 더 많은 항-용매 혼합물이 완전한 침전을 얻기 위해 부가될 수 있다. 최종 조성물에서 양자 모두 용매 혼합물을 기준으로, 물의 양은 0.5 내지 5 중량 퍼센트일 수 있고 아스코르브산의 양은 0.01 내지 0.5 중량 퍼센트일 수 있다. 용해를 위한 온도는 30 내지 100 및 바람직하게 35 내지 70℃ 범위일 수 있고, 건조 온도는 30 내지 50℃의 범위일 수 있다. 상기 침전은 분리, 예를 들어 여과 후에 에탄올과 같은 알코올로 세척될 수 있다. 상기 다형체 K는 온도 30 내지 40℃와 같은 상온 위에서, 예를 들어 이소프로판올에서, 그리고 선택적으로 형 B 크리스탈을 시드(seed)로 하여 가장 안정한 형 B로 쉽게 전환될 수 있다.
(6R)-L-에리스로-테트라하이드로바이오프테린 디하이드로클로라이드 염의 수화물 형
하기에서 더 설명된 바와 같이, (6R)-L-에리스로-테트라하이드로바이오프테린 디하이드로클로라이드는 여러 크리스탈린 수화물로 존재하고, 이는 본 명세서에서 형 C, D, E, H, 및 O로 설명되고 정의될 것이다. 이러한 수화물 형은 본 명세서에서 설명된 약학적 제조 및 BH4의 안정한 크리스탈 다형체를 포함하는 조성물의 제조를 위한 안정한 BH4의 형으로 유용하다.
수화물 형 C
(6R)-L-에리스로-테트라하이드로바이오프테린 디하이드로클로라이드의 수화물 크리스탈 형은 본 명세서에서 설명된 약학적 제조에서 사용되기 안정한 바람직한 BH4의 형이라는 것이 발견되었고, 이는 본 명세서에서 "형 C" 또는 "수화물 C"로 언급될 것이다. 수화물 C는 다소 흡습성이고 약 5.5 중량 퍼센트 양의 물을 지니며, 형 C는 모노하이드레이트인 것을 가리킨다. 수화물 C는 94℃(△Hf는 약 31 J/g) 근처의 녹는점을 가지며, 수화물 형 C는 안정한 다형체 형을 생산하기 위한 중간물 및 출발 물질로 특히 적절하다. 다형체 형 C는 의도된 중간 입자 크기 범위가 전형적으로 1μm 내지 약 500μm인 고체 분말로 제조될 수 있다.
형 C는 d-값(Å)으로 표현되는 특징적 피크를 가지는 특징적 엑스-레이 분말 회절 패턴을 나타낸다: 18.2(m), 15.4(w), 13.9(vs), 10.4(w), 9.6(w), 9.1(w), 8.8(m), 8.2(w), 8.0(w), 6.8(m), 6.5(w), 6.05(m), 5.77(w), 5.64(w), 5.44(w), 5.19(w), 4.89(w), 4.76(w), 4.70(w), 4.41(w), 4.25(m), 4.00(m), 3.88(m), 3.80(m), 3.59(s), 3.50(m), 3.44(m), 3.37(m), 3.26(s), 3.19(vs), 3.17(s), 3.11(m), 3.06(m), 3.02(m), 2.97(vs), 2.93(m), 2.89(m), 2.83(m), 및 2.43(m). 도 6은 (6R)-L-에리스로-테트라하이드로바이오프테린 디하이드로클로라이드의 수화물 형 C에 의해 나타나는 특징적인 엑스-레이 회절 패턴의 그래프이다.
수화물 형 C는 다형체 B 현탁액과 같은 다형체 형을 용매를 기준으로, 바람직하게 5 중량 퍼센트의 물의 양을 포함하는 비-용매에서 주변 온도 중 상 평형에 의해 얻어질 수 있다. (6R)-L-에리스로-테트라하이드로바이오프테린 디하이드로클로라이드의 수화물 형 C는 헵탄, 메탄올, 에탄올, 1- 또는 2-프로판올과 같은 C1-C4-알코올, 에틸 아세테이트, 아세토니트릴, 아세트산과 같은 아세테이트, 또는 테트로하이드로퓨란, 디옥산, 3차 부틸 메틸 에테르와 같은 에테르와 같은 비-용매 또는 이러한 비-용매의 2차 또는 3차 혼합물에서 (6R)-L-에리스로-테트라하이드로바이오프테린 디하이드로클로라이드를 현탁하고 모노하이드레이트를 형성하기 위해 충분한 물을 부가하며, 모노하이드레이트를 형성하기에 충분한 시간 동안 주변 온도에서 또는 그 아래에서(예를 들어 0 내지 30℃) 현탁액을 교반함에 의해 제조될 수 있다. 충분한 물은 용매의 양을 참조로, 1 내지 10 및 바람직하게 3 내지 8 중량 퍼센트의 물을 의미한다. 상기 고체는 여과될 수 있고, 약 실온에서 공기 중에 건조될 수 있다. 상기 고체는 얼마간의 물을 흡수할 수 있으며, 그래서 이론적 수치인 5.5 중량 퍼센트 보다 더 높은 양의 물을 보유할 수 있다. 수화물 형 C는 형 D 및 B에 비해 불안정하고 공기 중, 더 낮은 상대 습도, 약 40℃의 온도에서 다형체 형 B로 쉽게 전환된다, 형 C는 실온에서 현탁 평형에 의해 더 안정한 수화물 D로 변환될 수 있다.
수화물 형 D
(6R)-L-에리스로-테트라하이드로바이오프테린 디하이드로클로라이드의 다른 수화물 크리스탈 형은 본 명세서에서 설명된 약학적 제조에서 사용되기 안정한 바람직한 BH4의 형이라는 것이 발견되었고, 이는 본 명세서에서 "형 D" 또는 "수화물 D"로 언급될 것이다. 수화물 D는 다소 흡습성이고 약 5.0 내지 7.0 중량 퍼센트 양의 물을 지니며, 형 D는 모노하이드레이트인 것을 제시한다. 수화물 D는 153℃(△Hf는 약 111 J/g) 근처의 녹는점을 가지며, 수화물 형 C보다 흴씬 높게 안정적이고, 주변 온도에서 공기 습도에 노출되었을 때 매우 안정적이다. 수화물 형 D는 그러므로 제형을 제조하기 위해 사용되거나 안정한 다형체 형을 생산하기 위한 중간물 및 출발 물질로 사용될 수 있다. 다형체 형 D는 의도된 중간 입자 크기 범위가 전형적으로 1μm 내지 약 500μm인 고체 분말로 제조될 수 있다.
형 D는 d-값(Å)으로 표현되는 특징적 피크를 가지는 특징적 엑스-레이 분말 회절 패턴을 나타낸다: 8.6(s), 6.8(w), 5.56(m), 4.99(m), 4.67(s), 4.32(m), 3.93(vs), 3.88(w), 3.64(w), 3.41(w), 3.25(w), 3.17(m), 3.05(s), 2.94(w), 2.92(w), 2.88(m), 2.85(w), 2.80(w), 2.79(m), 2.68(w), 2.65(w), 2.52(vw), 2.35(w), 2.34(w), 2.30(w), 및 2.29(w). 도 7은 (6R)-L-에리스로-테트라하이드로바이오프테린 디하이드로클로라이드의 수화물 형 D에 의해 나타나는 특징적인 엑스-레이 회절 패턴의 그래프이다.
수화물 형 D는 대략 실온에서 헥산, 헵탄, 디클로로메탄, 1- 또는 2-프로판올, 아세톤, 에틸 아세테이트, 아세토니트릴, 아세트산 또는 테트라하이드로퓨란, 디옥산, 3차-부틸 메틸 에테르와 같은 비-용매 또는 이러한 비-용매의 혼합물 과량에 (6R)-L-에리스로-테트라하이드로바이오프테린 디하이드로클로라이드의 농축된 수용성 용액을 부가하고, 주변 온도에서 현탁액을 교반함으로써 얻어질 수 있다. 상기 크리스탈린 고체는 여과되고, 이후 주변 온도에서 건조 질소 하에 건조된다. 바람직한 비-용매는 이소프로판올이다. 수용성 용액의 부가는 갑작스런 침전을 방지하기 위해 드랍 방식(drop-wise)으로 수행될 수 있다. (6R)-L-에리스로-테트라하이드로바이오프테린 디하이드로클로라이드의 수화물 형 D는 대략 실온에서 과량의 비-용매에 (6R)-L-에리스로-테트라하이드로바이오프테린 디하이드로클로라이드의 농축된 수용성 용액을 부가하고, 주변 온도에서 상기 현탁액을 교반함에 의해 제조될 수 있다. 과량의 비-용매는 수용성과 비-용매의 비가 1:10 내지 1:1000인 것을 의미할 수 있다. 형 D는 모노하이드레이트에 비해서 작은 과량의 물을 포함하고, 이는 본 크리스탈린 수화물의 다소 흡습성 본질 때문에 물을 흡수하기 때문으로 여겨진다. 수화물 형 D는 주변 온도 및 70% 이하의 상대 습도에서 알려진 수화물 중 가장 안정한 것으로 생각된다. 주변 온도는 20 내지 30℃를 의미할 수 있다.
수화물 형 E
(6R)-L-에리스로-테트라하이드로바이오프테린 디하이드로클로라이드의 다른 수화물 크리스탈 형은 본 명세서에서 설명된 약학적 제조에서 사용되기 안정한 바람직한 BH4의 형이라는 것이 발견되었고, 이는 본 명세서에서 "형 E" 또는 "수화물 E"로 언급될 것이다. 수화물 형 E는 약 10 내지 14 중량 퍼센트 양의 물을 지니며, 형 E가 디하이드레이트인 것을 제시한다. 수화물 E는 실온 미만의 온도에서 형성된다. 수화물 형 E는 안정한 다형체 형을 생산하기 위한 중간물 및 출발 물질로 특히 적절하다. 질소 하 또는 선택적으로 진공 하에서 건조되면 물이 없는 형 J를 생산하기에 특히 적절하다. 형 E는 흡습성이지 않고, 보다 높은 상대 습도, 즉, 상대 습도가 약 60% 이상에서 약 85% 이하일 때 안정하다. 다형체 형 E는 의도된 중간 입자 크기 범위가 전형적으로 1μm 내지 약 500μm인 고체 분말로 제조될 수 있다.
형 E는 d-값(Å)으로 표현되는 특징적 피크를 가지는 특징적 엑스-레이 분말 회절 패턴을 나타낸다: 15.4(s), 6.6(w), 6.5(w), 5.95(vw), 5.61(vw), 5.48(w), 5.24(w), 4.87(w), 4.50(vw), 4.27(w), 3.94(w), 3.78(w), 3.69(m), 3.60(w), 3.33(s), 3.26(vs), 3.16(w), 3.08(m), 2.98(w), 2.95(m), 2.91(w), 2.87(m), 2.79(w), 2.74(w), 2.69(w), 및 2.62(w). 도 8은 (6R)-L-에리스로-테트라하이드로바이오프테린 디하이드로클로라이드의 수화물 형 E에 의해 나타나는 특징적인 엑스-레이 회절 패턴의 그래프이다.
수화물 형 E는 (6R)-L-에리스로-테트라하이드로바이오프테린 디하이드로클로라이드의 농축된 수용성 용액을, 약 10 내지 -10℃, 바람직하게 0 내지 10℃의 온도까지 냉각한 과량의 비-용매에 부가하고, 상기 온도에서 현탁액을 교반함에 의해 얻어질 수 있다. 상기 크리스탈린 고체는 여과될 수 있고, 이후 주변 온도에서 건조 질소 하 건조될 수 있다. 비-용매는 예를 들어, 헥산, 헵탄, 디클로로메탄, 1- 또는 2-프로판올, 아세톤, 에틸 아세테이트, 아세토니트릴, 아세트산 또는 테트라하이드로퓨란, 디옥산, 3차-부틸 메틸 에테르와 같은 에테르 또는 이러한 비-용매의 혼합물과 같은 것이다. 바람직한 비-용매는 이소프로판올이다. 수용성 용액의 부가는 갑작스런 침전을 방지하기 위해 드랍 방식으로 수행될 수 있다. (6R)-L-에리스로-테트라하이드로바이오프테린 디하이드로클로라이드의 수화물 형 E는 과량의 비-용매에 (6R)-L-에리스로-테트라하이드로바이오프테린 디하이드로클로라이드의 농축된 수용성 용액을 부가하고, 이를 약 10 내지 -10℃ 온도로 냉각하며, 주변 온도에서 상기 현탁액을 교반함에 의해 제조될 수 있다. 과량의 비-용매는 수용성과 비-용매의 비가 1:10 내지 1:1000인 것을 의미할 수 있다. 바람직한 비-용매는 테트라하이드로퓨란이다. 다른 제조 과정은 70 내지 90%, 바람직하게 약 80% 상대 습도의 공기에 다형체 형 B를 노출하는 것을 포함한다. 수화물 형 E는 디하이드레이트로 되는 것으로 생각되고, 여기에 얼마간의 부가적인 물이 흡수될 수 있다. 다형체 형 E는 0 내지 100 mbar 사이의 압력에서 20℃ 내지 50℃ 사이를 의미할 수 있는 적절한 온도, 진공 하에서 건조되면 다형체 J로 변환될 수 있다. 형 E는 그것의 높은 상대 습도에서의 안정성으로 인해 반 고체 형의 제형에 특히 적합하다.
수화물 형 H
(6R)-L-에리스로-테트라하이드로바이오프테린 디하이드로클로라이드의 다른 수화물 크리스탈 형은 본 명세서에서 설명된 약학적 제조에서 사용되기 안정한 바람직한 BH4의 형이라는 것이 발견되었고, 이는 본 명세서에서 "형 H" 또는 "수화물 H"로 언급될 것이다. 수화물 H는 약 5.0 내지 7.0 중량 퍼센트 양의 물을 지니며, 형 E가 흡습성 모노하이드레이트인 것을 제시한다. 수화물 H는 실온 미만의 온도에서 형성된다. 수화물 형 H는 안정한 다형체 형을 생산하기 위한 중간물 및 출발 물질로 특히 적절하다. 다형체 형 H는 의도된 중간 입자 크기 범위가 정형적으로 1μm 내지 약 500μm인 고체 분말로 제조될 수 있다.
형 H는 d-값(Å)으로 표현되는 특징적 피크를 가지는 특징적 엑스-레이 분말 회절 패턴을 나타낸다: 8.6 15.8(vs), 10.3(w), 8.0(w), 6.6(w), 6.07(w), 4.81(w), 4.30(w), 3.87(m), 3.60(m), 3.27(m), 3.21(m), 3.13(w), 3.05(w), 2.96(m), 2,89(m), 2.82(w), 및 2.67(m). 도 9는 (6R)-L-에리스로-테트라하이드로바이오프테린 디하이드로클로라이드의 수화물 형 H에 의해 나타나는 특징적인 엑스-레이 회절 패턴의 그래프이다.
수화물 형 H는 주변 온도에서 아세트산과 물의 혼합물에 (6R)-L-에리스로-테트라하이드로바이오프테린 디하이드로클로라이드를 용해하고, 이후 크리스탈린 고체를 침전시키기 위해 비-용매를 부가하며, 상기 얻어진 현탁액을 냉각하고 특정 시간 동안 냉각된 현탁액을 교반하여 얻어질 수 있다. 상기 크리스탈린 고체는 여과되고 이후 주변 온도에서 진공 하 건조된다. 비-용매는 예를 들어, 헥산, 헵탄, 디클로로메탄, 1- 또는 2-프로판올, 아세톤, 에틸 아세테이트, 아세토니트릴, 아세트산 또는 테트라하이드로퓨란, 디옥산, 3차-부틸 메틸 에테르와 같은 에테르, 또는 이러한 비-용매의 혼합물과 같은 것이다. 바람직한 비-용매는 테트라하이드로퓨란이다. (6R)-L-에리스로-테트라하이드로바이오프테린 디하이드로클로라이드의 수화물 형 H는 아세트산 및 아세트산보다 적은 양의 물의 혼합물에 (6R)-L-에리스로-테트라하이드로바이오프테린 디하이드로클로라이드를 주변 온도에서 용해하고, 비-용매를 부가하며, -10 내지 10℃, 바람직하게 -5 내지 5℃ 범위의 온도까지 상기 얻은 현탁액을 냉각하고, 특정 시간 동안 상기 온도에서 현탁액을 교반함에 의해 제조될 수 있다. 특정 시간은 1 내지 20시간을 의미할 수 있다. 아세트산과 물의 중량비는 2:1 내지 25:1이고, 바람직하게 5:1 내지 15:1일 수 있다. 아세트산/물과 비-용매의 중량비는 1:2 내지 1:5일 수 있다. 수화물 형 H는 상기 흡습성 특질로 인해 다소 과량의 흡수된 물을 가진 모노하이드레이트로 된 것으로 생각된다.
수화물 형 O
(6R)-L-에리스로-테트라하이드로바이오프테린 디하이드로클로라이드의 다른 수화물 크리스탈 형은 본 명세서에서 설명된 약학적 제조에서 사용되기 안정한 바람직한 BH4의 형이라는 것이 발견되었고, 이는 본 명세서에서 "형 O" 또는 "수화물 O"로 언급될 것이다. 수화물 형 O는 실온 근처의 온도에서 형성된다. 수화물 형 O는 안정한 다형체 형을 생산하기 위한 중간물 및 출발 물질로 특히 적절하다. 다형체 형 O는 의도된 중간 입자 크기 범위가 정형적으로 1μm 내지 약 500μm인 고체 분말로 제조될 수 있다.
형 O는 d-값(Å)으로 표현되는 특징적 피크를 가지는 특징적 엑스-레이 분말 회절 패턴을 나타낸다: 15.9(w), 14.0(w), 12.0(w), 8.8(m), 7.0(w), 6.5(w), 6.3(m), 6.00(w), 5.75(w), 5.65(m), 5.06(m), 4.98(m), 4.92(m), 4.84(w), 4.77(w), 4.42(w), 4.33(w), 4.00(m), 3.88(m), 3.78(w), 3.69(s), 3.64(s), 3.52(vs), 3.49(s), 3.46(s), 3.42(s), 3.32(m), 3.27(m), 3.23(s), 3.18(s), 3.15(vs), 3.12(m), 3.04(vs), 2.95(m), 2.81(s), 2.72(m), 2.67(m), 및 2.61(m). 도 10은 (6R)-L-에리스로-테트라하이드로바이오프테린 디하이드로클로라이드의 수화물 형 O에 의해 나타나는 특징적인 엑스-레이 회절 패턴의 그래프이다.
수화물 형 O는 다형체 형 F를 약 24시간 동안 약 52%의 상대 습도 결과를 가지는 수증기를 포함하는 질소 대기에 노출함에 의해 제조될 수 있다. 다소 흡습성 안하이드레이트인 형 F는 52%의 상대 습도 하에서 형 O를 제조하는데 이용될 수 있다는 사실은 형 O가 수화물이라는 것을 제시하며, 이는 주변 온도 및 습도 조건 하에서 형 F보다 더 안정하다는 것이다.
(6R)-L-에리스로-테트라하이드로바이오프테린 디하이드로클로라이드 염의 용매화물 형
하기에서 더 설명된 바와 같이, (6R)-L-에리스로-테트라하이드로바이오프테린 디하이드로클로라이드는 여러 크리스탈린 용매화물로 존재하고, 이는 본 명세서에서 형 G, I, L, M, 및 N으로 설명되고 정의될 것이다. 이러한 용매화물 형은 본 명세서에서 설명된 약학적 제조 및 BH4의 안정한 크리스탈 다형체를 포함하는 조성물의 제조를 위한 안정한 BH4의 형으로 유용하다.
용매화물 형 G
(6R)-L-에리스로-테트라하이드로바이오프테린 디하이드로클로라이드의 에탄올 용매화물 크리스탈 형은 본 명세서에서 설명된 약학적 제조에서 사용되기 안정한 바람직한 BH4의 형이라는 것이 발견되었고, 이는 본 명세서에서 "형 G" 또는 "수화물 G"로 언급될 것이다. 에탄올 용매화물 형 G는 약 8.0 내지 12.5 중량 퍼센트의 에탄올 함량을 가지고, 이는 형 G가 흡습성 모노 에탄올 용매화물이라는 것을 제시한다. 용매화물 형 G는 실온 아래의 온도에서 형성된다. 형 G는 안정한 다형체 형을 생산하기 위한 중간물 및 출발 물질로 특히 적절하다. 다형체 형 G는 의도된 중간 입자 크기 범위가 정형적으로 1μm 내지 약 500μm인 고체 분말로 제조될 수 있다.
형 G는 d-값(Å)으로 표현되는 특징적 피크를 가지는 특징적 엑스-레이 분말 회절 패턴을 나타낸다: 14.5(vs), 10.9(w), 9.8(w), 7.0(w), 6.3(w), 5.74(w), 5.24(vw), 5.04(vw), 4.79(w), 4.41(w), 4.02(w), 3.86(w), 3.77(w), 3.69(w), 3.63(m), 3.57(m), 3.49(m), 3.41(m), 3.26(m), 3.17(m), 3.07(m), 2.97(m), 2.95(m), 2,87(w), 및 2.61(w). 도 11은 (6R)-L-에리스로-테트라하이드로바이오프테린 디하이드로클로라이드의 용매화물 형 G에 의해 나타나는 특징적인 엑스-레이 회절 패턴의 그래프이다.
에탄올 용매화물 형 G는 물에 용해된 L-에리스로-테트라하이드로바이오프테린 디하이드로클로라이드의 크리스탈화 및 큰 과량의 에탄올을 부가하고, 주변 온도에서 또는 그 미만에서 얻은 현탁액을 교반하며, 대략 실온, 공기 또는 질소 하에서 상기 분리된 고체를 건조함에 의해 얻어질 수 있다. 여기서 큰 과량의 에탄올은 10% 미만, 바람직하게는 3 내지 6%의 물을 가진 에탄올과 물의 결과 혼합물을 의미한다. (6R)-L-에리스로-테트라하이드로바이오프테린 디하이드로클로라이드의 에타놀레이트 형 G는 물 또는 물과 에탄올의 혼합물에서 75℃ (6R)-L-에리스로-테트라하이드로바이오프테린 디하이드로클로라이드의 온도까지 실온에서 용해하고, 가열된 용액을 실온까지 및 5 내지 10℃ 아래까지 냉각하며, 완전한 침전을 위해 선택적으로 에탄올을 부가하고, 20 내지 5℃의 온도에서 얻은 현탁액을 교반하며, 흰, 크리스탈린 고체를 여과하고, 대략 실온의 온도에서 공기 또는 질소와 같은 보호 기체 하에서 고체를 건조함에 의해 제조될 수 있다. 상기 과정에서 첫 번째 변형은 대략 실온에서 더 적은 양의 물에 (6R)-L-에리스로-테트라하이드로바이오프테린 디하이드로클로라이드를 용해시키고, 이후 과량의 에탄올을 부가하고, 다음으로 상 평형에 충분한 시간 동안 획득한 현탁액을 교반하는 것에 의해 수행될 수 있다. 두 번째 변형은 (6R)-L-에리스로-테트라하이드로바이오프테린 디하이드로클로라이드가 에탄올에 현탁될 수 있고, 선택적으로 더 적은 양의 물을 부가하며, 상기 현탁액 및 불용질 (6R)-L-에리스로-테트라하이드로바이오프테린 디하이드로클로라이드를 가열하고, 약 5 내지 15℃ 온도까지 상기 용액을 냉각하며, 현탁액에 부가적인 에탄올을 부가하고, 이후 상 평형에 충분한 시간 동안 얻은 현탁액을 교반한다.
용매화물 형 I
(6R)-L-에리스로-테트라하이드로바이오프테린 디하이드로클로라이드의 아세트산 용매화물 크리스탈 형은 본 명세서에서 설명된 약학적 제조에서 사용되기 안정한 바람직한 BH4의 형이라는 것이 발견되었고, 이는 본 명세서에서 "형 I" 또는 "수화물 I"로 언급될 것이다. 아세트산 용매화물 형 I는 약 12.7 중량 퍼센트의 아세트산 함량을 가지고, 이는 형 I가 흡습성 아세트산 모노 용매화물이라는 것을 제시한다. 용매화물 형 I는 실온 미만의 온도에서 형성된다. 형 I는 안정한 다형체 형을 생산하기 위한 중간물 및 출발 물질로 특히 적절하다. 다형체 형 I는 의도된 중간 입자 크기 범위가 정형적으로 1μm 내지 약 500μm인 고체 분말로 제조될 수 있다.
형 I는 d-값(Å)으로 표현되는 특징적 피크를 가지는 특징적 엑스-레이 분말 회절 패턴을 나타낸다: 14.5(m), 14.0(w), 11.0(w), 7.0(vw), 6.9(vw), 6.2(vw), 5.30(w), 4.79(w), 4.44(w), 4.29(w), 4.20(vw), 4.02(w), 3.84(w), 3.80(w), 3.67(vs), 3.61(m), 3.56(w), 3.44(m), 3.27(w), 3.19(w), 3.11(s), 3.00(m), 2.94(w), 2.87(w), 및 2.80(w). 도 12는 (6R)-L-에리스로-테트라하이드로바이오프테린 디하이드로클로라이드의 용매화물 형 I에 의해 나타나는 특징적인 엑스-레이 회절 패턴의 그래프이다.
아세트산 용매화물 형 I는 상승된 온도에서 아세트산과 물의 혼합물에 L-에리스로-테트라하이드로바이오프테린 디하이드로클로라이드를 용해하고, 용액에 아세트산을 더 부가하며, 약 10℃의 온도까지 냉각시키고, 이후 약 15℃까지 형성된 현탁액을 따뜻하게 하며, 이후 3일 이하까지 지속될 수 있는 상 평형에 충분한 시간 동안 상기 얻은 현탁액을 교반함에 의해 얻어질 수 있다. 이후 상기 크리스탈린 고체를 여과하고 공기 또는 질소와 같은 보호 기체 하 대략 실온의 온도에서 건조한다.
용매화물 형 L
(6R)-L-에리스로-테트라하이드로바이오프테린 디하이드로클로라이드의 혼합된 에탄올 용매화물/수화물 크리스탈 형은 본 명세서에서 설명된 약학적 제조에서 사용되기 안정한 바람직한 BH4의 형이라는 것이 발견되었고, 이는 본 명세서에서 "형 L" 또는 "수화물 L"로 언급될 것이다. 형 L은 4%이지만 13% 이하의 에탄올 및 0% 내지 약 6%의 물을 포함할 수 있다. 형 L은 약 0℃ 내지 20℃ 온도에서 에탄올에 처리될 때 형 G로 변환될 수 있다. 형 L의 부가는 주변 온도(10℃ 내지 60℃)에서 유기 용매에 처리될 때 형 B로 변환될 수 있다. 다형체 형 L은 의도된 중간 입자 크기 범위가 정형적으로 1μm 내지 약 500μm인 고체 분말로 제조될 수 있다.
형 L은 d-값(Å)으로 표현되는 특징적 피크를 가지는 특징적 엑스-레이 분말 회절 패턴을 나타낸다: 14.1(vs), 10.4(w), 9.5(w), 9.0(vw), 6.9(w), 6.5(w), 6.1(w), 5.75(w), 5.61(w), 5.08(w), 4.71(w), 3.86(w), 3.78(w), 3.46(m), 3.36(m), 3.06(w), 2.90(w), 및 2.82(w). 도 13은 (6R)-L-에리스로-테트라하이드로바이오프테린 디하이드로클로라이드의 용매화물 형 L에 의해 나타나는 특징적인 엑스-레이 회절 패턴의 그래프이다.
형 L은 실온에서 수화물 형 E를 에탄올에 현탁하고 0 내지 10℃, 바람직하게 약 5℃ 온도에서 10 내지 20 시간이 될 수 있는 상 평형에 충분한 시간 동안 상기 현탁액을 교반함에 의해 얻어질 수 있다, 상기 크리스탈린 고체를 이후 여과하고 바람직하게 감소된 압력 하 30℃에서, 또는 질소 하에서 건조한다. TG-FTIR에 의한 분석은 형 L이 다양한 양의 에탄올 및 물을 포함할 수 있다는 것, 즉 다형체(안하이드레이트)로서, 혼합된 에탄올 용매화물/수화물로서, 또는 수화물로서조차 존재할 수 있다는 것을 제시한다.
용매화물 형 M
(6R)-L-에리스로-테트라하이드로바이오프테린 디하이드로클로라이드의 에탄올 용매화물 크리스탈 형은 본 명세서에서 설명된 약학적 제조에서 사용되기 안정한 바람직한 BH4의 형이라는 것이 발견되었고, 이는 본 명세서에서 "형 M" 또는 "수화물 M"로 언급될 것이다. 형 M은 4%이지만 13% 이하의 에탄올 및 0% 내지 약 6%의 물을 포함할 수 있고 이는 형 M이 다소 흡습성 에탄올 용매화물이라는 것을 제시한다. 상기 수화물 형 M은 실온에서 형성된다. 형 M은 안정한 다형체 형을 생산하기 위한 중간물 및 출발 물질로 특히 적절한데, 이는 형 M이 약 -10 내지 15℃ 사이의 온도에서 에탄올에 처리될 때 형 G로 변환될 수 있고, 에탄올, C3 및 C4 알코올, 또는 THF 및 디옥산과 같은 사이클릭 에테르와 같은 유기 용매에서 처리될 때 형 B로 변환될 수 있기 때문이다. 다형체 형 M은 의도된 중간 입자 크기 범위가 정형적으로 1μm 내지 약 500μm인 고체 분말로 제조될 수 있다.
형 M은 d-값(Å)으로 표현되는 특징적 피크를 가지는 특징적 엑스-레이 분말 회절 패턴을 나타낸다: 18.9(s), 6.4(m), 6.06(w), 5.66(w), 5.28(w), 4.50(w), 4.23(w), 및 3.22(vs). 도 14는 (6R)-L-에리스로-테트라하이드로바이오프테린 디하이드로클로라이드의 용매화물 형 M에 의해 나타나는 특징적인 엑스-레이 회절 패턴의 그래프이다.
에탄올 용매화물 형 M은 에탄올에 L-에리스로-테트라하이드로바이오프테린 디하이드로클로라이드의 용해 및 주변 온도, 즉 10℃와 40℃ 사이에서 질소 하 용액의 증발에 의해 얻어질 수 있다. 형 M은 또한 약 20 내지 100ml/분의 속도인 건조 질소의 약한 흐름 하에 형 G의 건조에 의해 얻어질 수 있다. 질소 하 건조 정도에 따라, 나머지 에탄올의 양이 다양, 즉 약 3% 내지 13%일 수 있다.
용매화물 형 N
(6R)-L-에리스로-테트라하이드로바이오프테린 디하이드로클로라이드의 다른 용매화물 크리스탈 형은 본 명세서에서 설명된 약학적 제조에서 사용되기 안정한 바람직한 BH4의 형이라는 것이 발견되었고, 이는 본 명세서에서 "형 N" 또는 "수화물 N"로 언급될 것이다. 형 N은 총 10% 이하의 이소프로판올 및 물을 포함할 수 있고, 이는 형 N이 다소 흡습성 이소프로판올 용매화물이라는 것을 제시한다. 형 N은 이소프로판올로 형 D를 세정하고, 다음에 약 30℃의 진공에서 건조함을 통해 얻어질 수 있다. 형 N은 안정한 다형체 형을 생산하기 위한 중간물 및 출발 물질로 특히 적절하다. 다형체 형 N은 의도된 중간 입자 크기 범위가 정형적으로 1μm 내지 약 500μm인 고체 분말로 제조될 수 있다.
형 N은 d-값(Å)으로 표현되는 특징적 피크를 가지는 특징적 엑스-레이 분말 회절 패턴을 나타낸다: 19.5(m), 9.9(w), 6.7(w), 5.15(w), 4.83(w), 3.91(w), 3.56(m), 3.33(vs), 3.15(w), 2.89(w), 2.81(w), 2.56(w), 및 2.36(w). 도 15는 (6R)-L-에리스로-테트라하이드로바이오프테린 디하이드로클로라이드의 용매화물 형 N에 의해 나타나는 특징적인 엑스-레이 회절 패턴의 그래프이다.
이소프로판올 형 N은 4.0 mL의 이소프로판올과 물의 혼합물(예를 들어 4:1의 부피 비로 혼합)에 L-에리스로-테트라하이드로바이오프테린 디하이드로클로라이드를 용해함으로써 얻어질 수 있다. 본 용액을 위해 서서히 이소프로판올(IPA, 예를 들어 약 4.0 mL)이 부가되고 상기 결과 현탁액이 0℃까지 냉각되며, 본 온도에서 몇 시간 동안(예를 들어 약 10 내지 18 시간) 교반된다. 상기 현탁액이 여과되고 고체 잔여물을 실온에서 이소프로판올로 세척하였다. 상기 얻은 크리스탈린 물질이 이후 주변 온도(예를 들어 약 20 내지 30℃) 및 감소된 기압(약 2 내지 10 mbar)에서 몇 시간 동안(예를 들어 약 5 내지 20시간) 건조된다. TG-FTIR은 25 내지 200℃ 사이에서 9.0%의 중량 손실을 보여주고, 이는 이소프로판올과 물 모두에 기인한다. 본 결과는 형 N이 이소프로판올 용매화물의 형태 또는 혼합된 이소프로판올 용매화물/수화물의 형태, 또는 소량의 물을 포함하는 비-용매된 형 중 하나로 존재할 수 있다는 것을 제시한다.
다형체 형을 제조하기 위해, 현탁액의 교반(상 평형), 침전, 재-크리스탈화, 증발, 물과 같은 용매 수착법(sorption method) 또는 용매의 분해 같이 당업계에 잘 알려진 크리스탈화 기술이 사용되어질 수 있다. 희석되고, 포화되고 또는 수퍼-포화된 용액은 크리스탈화를 위해, 적절한 기핵제(nuleating)를 씨드로 하거나 하지 않고, 사용될 수 있다. 100℃ 이하의 온도가 용액을 형성하는데 적용될 수 있다. 초기 크리스탈화 및 침전을 위해 -100℃까지, 바람직하게 -30℃까지 냉각하는 것이 적용될 수 있다. 메타-안정한 다형체 또는 슈도-다형체 형이 안정한 형의 제조를 위한 용액 또는 현탁액의 제조에 사용될 수 있고, 용액 내 더 높은 농도를 이루기 위해 사용될 수 있다.
수화물 형 D가 수화물 중 가장 안정한 형이고 형 B 및 D가 약학적 제형에 사용되기에 특히 적절하다는 것이 놀랍게도 발견되었다. 형 B 및 D는 목적하는 제조, 편리한 크리스탈 사이즈 및 형태에 기인한 우수한 취급, 다양한 제형 생산 조건 아래 매우 우수한 안정성, 보관 안정성, 더 높은 용해성, 및 높은 생체 이용률과 같은 몇몇 장점을 나타낸다. 따라서, 본 명세서에 개시된 상기 조성물 및 방법 중 일실시예는 (6R)-L-에리스로-테트라하이드로바이오프테린 디하이드로클로라이드 및 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 희석제의 다형체 형 B 및/또는 수화물 형 D를 포함하는 약학적 조성물이다.
Ⅲ. 약학적 제형
본 명세서에 설명된 제형은 바람직하게 경구 제형으로 투여되는 것이다. 경구 제형은 바람직하게 캡슐, 정제, 환제 및 트로키제와 같은 고체 제형, 또는 수용성 현탁액, 엘릭시르(elixir) 및 시럽과 같은 액체 제제이다. 본 명세서에서 설명된 여러 BH4의 형은 분말(미세화된 입자), 과립, 현탁액 또는 용액으로 직접 사용될 수 있고 또는 다른 약학적으로 허용 가능한 성분과 함께 상기 구성에 혼합하여 섞고 선택적으로 이들을 미세하게 분리하며, 이후 예를 들어 경질 또는 연질 젤라틴으로 이루어진 캡슐에 충전하고 정제, 환제 또는 트로키제를 압축하고, 또는 현탁액, 엘릭시르 및 시럽용 담체에 이들을 현탁하거나 용해하여 조합될 수 있다. 코팅이 환제를 형성하기 위한 압축 후에 적용될 수 있다.
약학적으로 허용 가능한 성분은 다양한 유형의 제형용으로 잘 알려져 있고, 예를 들어 천연 또는 합성 폴리머와 같은 결합제, 첨가제, 윤활제, 계면활성제, 감미료 및 향미제, 코팅 물질, 보존제, 염료, 점증제, 보조제, 항생제, 항산화제 및 여러 제형 유형용 담체가 될 수 있다. 상기 "약학적으로 또는 약리학적으로 허용 가능한"이라는 어구는 미국 식약청 또는 인간에 대한 투여를 위한 상응하는 외국 정규 기관에 의해 승인된 물질(molecular entities)과 조성물을 의미한다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, "약학적으로 허용 가능한 담체"는 모든 용매, 분산 매질, 코팅, 항박테리아 및 항곰팡이 제제, 등장 및 흡수 지연 제제 등과 같은 것 중 어느 것을 포함한다. 약학적으로 활성 성분을 위한 이러한 매질 및 제제의 사용은 당업계에 잘 알려져 있다. 치료적 조성물과 부적합한 어떤 전통적인 매질 또는 제제를 제외하고, 치료적 조성물에 이를 사용하는 것이 제시된다. 보충적인 활성 성분이 또한 상기 조성물 내로 도입될 수 있다.
상기 제형을 제조하기 위해 사용된 (6R)-L-에리스로-테트라하이드로바이오프테린 디하이드로클로라이드의 초기 양은, 예를 들어, 상기 제형의 약 30 wt% 내지 약 40 wt%의 범위, 또는 약 32 wt% 내지 약 35 wt%, 또는 약 33 wt%일 수 있다. 본 명세서에 제시된 제형 중 BH4의 양은 80mg, 100mg, 200mg, 300mg, 400mg, 및 500mg을 포함한다.
결합제는 고체 제형을 유지하는 것을 돕는다. 몇몇 경우에서, 무수 결합체는 다형체 형의 무수 상태를 보존하기 위해 사용된다. 몇몇 경우에서, 상기 결합제는 건조제로 작용할 수 있다. 예시적인 결합제는 무수 디베이식 칼슘 포스페이트 및 이의 모노하이드레이트를 포함한다. 본 명세서에 설명된 조성물에서 유용한 다른 예시적인 결합제는 검 트라가칸스, 아카시아, 전분, 젤라틴, 및 디카르복시산, 알킬렌 글리콜, 폴리알킬렌 글리콜 및/또는 알리패틱 하이드록시 카르복시산의 호모- 또는 코-폴리에스터와 같은 생물학적 분해 가능한 폴리머; 디카르복시산, 알킬렌 디아민, 및/또는 알리패틱 아미노 카르복시산의 호모- 또는 코-폴리아마이드; 상응하는 폴리에스터-폴리아마이드-코-폴리머, 폴라안하이드라이드, 폴리오르소에스터, 폴리포스파젠 및 폴리카보네이트를 포함한다. 상기 생물학적 분해 가능한 폴리머는 선형, 분지된 또는 크로스링크된 것일 수 있다. 구체적 예는 폴리-글리콜산, 폴리-락트산, 및 폴리-d,l-락타이드/글리콜라이드이다. 폴리머의 다른 예는 폴리옥사알킬렌(폴리옥사에틸렌, 폴리옥사프로필렌 및 이들의 혼합된 폴리머), 폴리-아크릴아마이드 및 하이드록시알킬화된 폴리아크릴아마이드, 폴리-말레산 및 에스터 또는 이들의 -아마이드, 폴리-아크릴산 및 에스터 또는 이들의 -아마이드, 폴리-비닐알코올 및 에스터 또는 이들의 -에테르, 폴리-비닐이미다졸, 폴리-비닐피롤리돈, 및 키토산과 같은 천연 폴리머와 같은 수용성 폴리머이다.
분해 제제는 물을 흡수하고 팽창함에 의해 고체 제형의 신속한 분해를 돕는다. 예시적인 분해 제제는 폴리비닐피롤리돈(PVP, 예를 들어 상표명 POVIDONE으로 팔리는 제품), 포비돈의 크로스-링크된 형(CPVP, 예를 들어 상표명 CROSPOVIDONE으로 팔리는 제품), 소듐 카르복시메틸셀룰로오스의 크로스-링크된 형(NaCMC, 예를 들어 상표명 AC-DI-SOL로 팔리는 제품), 다른 변형된 셀룰로오스, 및 변형된 전분을 포함한다. CPVP로 제형화된 정제는 PVP로 제형화된 정제에 비해 매우 더 신속한 분해를 나타낸다.
항산화제가 포함될 수 있고 특히 용해 후에, 테트라하이드로바이오프테린 제품을 안정화하는 것을 돕는다. API의 낮은 pH 수용성 용액은 중성 또는 높은 pH에서의 용액보다 더 안정하다. 본 명세서에서 설명된 제형에 포함된 항산화제는 산화로부터의 퇴보를 방지한다. 항산화제는 일반적으로 3 그룹으로 분류될 수 있다.
첫 번째 그룹은 본래 항산화제로 알려진 것으로, 연쇄 반응을 막는 자유 라디칼과 반응에 의해 산화를 저지한다. 예는 부틸레이트 하이드록시아니솔(BHA), 부틸레이트 하이드록시톨루엔(BHT), tert-부틸-하이드로퀴논(TBHQ), 4-하이드록시메틸-2,6-디-tert-부틸페놀(HMBP), 및 2,4,5-트리하이드록시부티로페논(THBP)를 포함하는 페놀성 항산화제; 프로필 갈레이트(propyl gallate)를 포함하는 알킬갈레이트; 갈산(gallic acid); 노르디하이드로구아이아레트산(nordihydroguaiaretic acid); 및 알파-토코페롤을 포함하는 토코페롤을 포함한다.
두 번째 그룹은, 환원제로 구성되고, 그들이 보호하고자 의도된 약물보다 더 낮은 환원 전위를 가지므로, 더 쉽게 산화된다. 환원제도 또한 자유 라디칼과 반응에 의해 작용할 수 있다. 예는 아스코르브산, 티오글라이콜산(TGA), 아스코르빌 팔미테이트, 아황산의 포타슘 및 소듐 염을 포함하는 설파이트(예를 들어, 포타슘 설파이트, 소듐설파이트, 소듐 메타바이설파이트, 및 소듐 바이설파이트), 및 티오글리세롤을 포함한다.
세 번째 그룹은 그들 자신은 보통 가장 온화한 항산화 효과를 가지나 아마도 산화를 촉매하는 중금속 이온과 함께 반응함으로써 첫 번째 또는 두 번째 그룹의 항산화제 작용을 강화하는 항산화제 상승제로 구성된다. 이러한 항산화제 상승제 및 킬레이트 제제의 예는 시트르산, 말산, 에디트산 및 이의 염, 레시틴, 및 타르타르산을 포함한다.
예시적인 산성 항산화제는 아스코르브산, 아스코르빌 팔미테이트와 아스코르빌 스테아레이트와 같은 아스코르브산의 지방산 에스테르, 및 소듐, 칼슘, 또는 포타슘 아스코르베이트와 같은 아스코르브산의 염을 포함한다. 비-산성 항산화제는 또한 안정한 정제 제형에 사용될 수 있다. 비-산성 항산화제는 베타-카로틴, 알파-토코페롤을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 산성 첨가제는 정제 제형의 안정성을 강화하기 위해 첨가될 수 있고, 시트르산 또는 말산을 포함한다. 소분자 항-산화제는 티올, 예를 들어 시스테인, N-아세틸 시스테인, 글루타티온 등, 또는 티올레이트 폴리머(폴리머-SH), 예를 들어 폴리카르보필-시스테인, 폴리메타크릴-SH, 카르복시 메틸셀루로오스-시스테인 등, 또는 아스코르브산, 메티오닌, 아스코르빌 팔미테이트 등과 같은 소분자 항-산화제를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 이러한 항-산화제는 GIT을 통하여 이동하는 동안, 구체적으로 위로부터의 거리에 따라 GIT의 pH가 증가함에 따라 투약형에 안정성을 부여한다.
일실시예에서, 2개 이상의 환원제 항산화제의 조합이 바람직하다. 다른 실시예에서, 2개 이상의 환원제 항산화제와 산 항산화제 상승제 및/또는 킬레이트 제제의 조합이 바람직하다.
윤활제는 고체 제형의 안정성, 경도 및 균질성을 개선한다. 예시적인 윤활제는 스테아릴 푸마레이트와 마그네슘 스테아레이트를 포함한다. 다른 예시적인 윤활제는 천연 또는 합성 오일, 지방, 왁스, 또는 마그네슘 스테아레이트와 같은 지방산을 포함한다.
선택적으로 본 발명의 안정한 제형은 또한 만니톨, 하이드록시 프로필 셀룰로오스, 마이크로크리스탈린 셀룰로오스, 또는 수크로오스, 트레할로오스(trehalose), 메레지토스(melezitos), 플랜테오스(planteos), 및 라피노오스(raffinose)와 같은 비-환원당과 같은 다른 첨가물을 포함할 수 있다. 환원당은 BH4와 반응할 수 있다. 본 명세서에서 설명된 조성물에 유용한 다른 예시적인 첨가물은 디칼슘 포스페이트와 같은 포스페이트를 포함하나 이에 제한되지 않는다.
본 명세서에 설명된 조성물에 사용하는 계면 활성제는 음이온성, 양성 또는 중성이 될 수 있다. 본 명세서에 설명된 조성물에 사용하는 예시적인 계면 활성제는 레시틴, 포스포리피드, 옥틸 설페이트, 데실 설페이트, 도데실 설페이트, 테트라데실 설페이트, 헥사데실 설페이트와 옥타데실 설페이트, Na 올레이트 또는 Na 카프레이트, 1-옥타노일아미노에탄-2-설폰산, 1-데카노일아미노에탄-2-설폰산, 1-도데카노일아미노에탄-2-설폰산, 1-테트라데카노일아미노에탄-2-설폰산, 1-헥사데카노일아미노에탄-2-설폰산, 및 1-옥타데카노일아미노에탄-2-설폰산과 같은 1-아실아미노에탄-2-설폰산, 및 타우로콜산과 타우로데옥시콜산, 콜산, 디옥시콜산과 소듐 글리코콜레이트, 소듐 카프레이트 또는 소듐 라우레이트, 소듐 올레이트, 소듐 라우릴 설페이트, 소듐 세틸 설페이트, 설페이트 캐스터 오일와 소듐 디옥틸설포숙시네이트, 코카미도프로필베타인과 라우릴 베타인, 지방 알코올, 콜레스테롤, 글리세롤 모노- 또는 -디스테아레이트, 글리세롤 모노- 또는 디올레이트와 글리세롤 모노- 또는 -디팔미테이트, 및 폴리옥시에틸렌 스테아레이트와 같은 담즙산 및 그들의 염을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
본 명세서에 설명된 조성물에 유용한 예시적인 감미료는 수크로오스, 프럭토오스, 락토오스 또는 아스파탐을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 본 명세서에 설명된 조성물에 사용하는 예시적인 향미료는 페퍼민트, 윈터그린 오일 또는 체리나 오렌지 향과 같은 과일 향을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 본 명세서에 설명된 조성물에 사용하는 예시적인 코팅 물질은 젤라틴, 왁스, 셀락(shellac), 설탕 또는 다른 생물학적 분해 가능한 폴리머를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 본 명세서에 설명된 조성물에 사용하는 예시적인 보존제는 메틸 또는 프로필 파라벤, 소르브산, 클로로부탄올, 페놀 및 티머로살을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
BH4 형은 또한 거품이 있는 정제나 분말로 제형화될 수 있고, 이는 수용성 환경에서 분해되어 마시는 용액에 제공된다. 서방제형이 위장관 내 체액과 접촉할 때 활성제의 조절된 방출이 이루어지고 혈액 플라즈마에서 활성제의 실질적 계속적이고 효과적인 농도를 제공하기 위해서 또한 제조될 수 있다, 상기 크리스탈 형은 생물학적 분해 가능한 폴리머, 수용성 폴리머 또는 양자의 혼합물, 선택적으로 적절한 계면 활성제의 폴리머 매트릭스에서 본 목적을 위해 도입될 수 있다. 본 내용에서 도입은 폴리머 매트릭스 내 마이크로-입자의 도입을 의미할 수 있다. 조절된 방출 제형은 또한 알려진 분산 또는 에멀젼 코팅 기술을 통해서 분산된 마이크로-입자 또는 에멀젼화된 마이크로-방울의 캡슐 봉입을 통해 얻어질 수 있다.
본 명세서에 설명된 조성물에 사용된 BH4는 바람직하게 디하이드로클로라이드 염으로 제형화되나 이는 다른 BH4의 염 형이 의도된 생물학적 활성을 보유한다는 것을 제시하고, 결과적으로 다른 BH4의 염 형이 사용될 수 있다. 구체적으로, 무기 또는 유기산의 BH4 염이 바람직하다. 대안적인 BH4 염형의 예시는 아세트산, 시트르산, 옥살산, 타르타르산, 푸마르산, 및 만델산의 BH4 염을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
약학적으로 허용 가능함 베이스 부가 염은 알칼리 및 알칼리 토금속 또는 유기 아민과 같은 금속 또는 아민과 형성될 수 있다. 화합물의 약학적으로 허용 가능한 염의 화합물은 또한 약학적으로 허용 가능한 양이온과 함께 제조될 수 있다. 적절한 약학적으로 허용 가능한 양이온은 당업계의 기술자에게 잘 알려져 있고 알칼리, 알칼리 토, 암모늄 및 4급 암모늄 양이온을 포함한다. 카보네이트 또는 하이드로겐 카보네이트 또한 가능하다. 양이온으로 사용되는 금속의 예는 소듐, 포타슘, 마그네슘, 암모늄, 칼슘, 또는 철 등이다. 적합한 아민의 예는 이소프로필아민, 트리메틸아민, 히스티딘, N,N' 디벤질에틸렌디아민, 클로로프로케인, 콜린, 디에탄올아민, 디사이클로헥실아민, 에틸렌디아민, N 메틸글루카민, 및 프로케인을 포함한다.
약학적으로 허용 가능한 산 부가 염은 무기 또는 유기산 염을 포함한다. 적합한 산 염의 예는 하이드로클로라이드, 아세테이트, 시트레이트, 살리실레이트, 니트레이트, 포스페이트를 포함한다. 다른 적합한 약학적으로 허용 가능한 염은 당업계의 기술자에게 잘 알려져 있고, 예를 들어 아세트산, 시트르산, 옥살산, 타르타르산, 또는 만델산, 하이드로클로르산, 하이드로브롬산, 황산, 또는 인산; 유기 카르복시산, 설폰산, 설포 또는 포스포 산 또는 N 치환된 설팜 산, 예를 들어 아세트산, 프로피온산, 글리콜산, 숙신산, 말레산, 하이드록시말레산, 메틸말레산, 푸마르산, 말산, 타르타르산, 락산, 옥살산, 글루콘산, 글루카르산, 글루쿠론산, 시트르산, 벤조산, 신남산, 만델산, 살리실산, 4 아미노살리실산, 2-페녹시벤조산, 2 아세톡시벤조산, 엠본산, 니코틴산, 또는 이소니코틴산; 및 천연에서 단백질 합성과 관련되는 20 알파 아미노산과 같은 아미노산이 있는, 예를 들어 글루탐산 또는 아스파트산, 및 또한 페닐아세트산과 함께하는, 메탄설폰산, 에탄설폰산, 2 하이드록시에탄설폰산, 에탄 1,2 디설폰산, 벤젠설폰산, 4 메틸벤젠설폭산, 나프탈렌 2 설폰산, 나프탈렌 1,5 디설폰산, 2 또는 3 포스포글리세레이트, 글루코오스 6 포스페이트, N 사이클로헥실설팜산(사이클라메이트의 형성을 함께), 또는 아스코르브산과 같이 다른 산 유기 화합물과 함께 하는 것을 포함한다.
예시적인 안정한 경구 제형은 안정성 또는 제형의 다른 특성을 개선하는 다음의 부가 성분을 하나 이상 포함한다: 결합제, 분해제, 산성 항산화제, 또는 윤활제 또는 이들의 조합. 예시적인 안정한 정제 제형은 결합제 및 분해 제제, 선택적으로 산성 항산화제와 함께 그리고 선택적으로 윤활제를 더 포함하여 포함한다. 결합제의 예시적인 농도는 약 1 wt% 내지 약 5 wt% 사이, 또는 약 1.5와 3 wt% 사이이다; 결합제와 BH4의 예시적인 중량비는 약 1:10 내지 약 1:20의 범위이다. 분해제의 예시적인 농도는 약 1 wt% 내지 약 20 wt% 사이이다; 분해제와 BH4의 예시적인 중량비는 약 1:5 내지 약 1:10의 범위이다. 항산화제의 예시적인 농도는 약 1wt%와 약 3wt% 사이이다; 항산화제와 BH4의 예시적인 중량비는 약 1:5 내지 1:30의 범위이다. 일실시예에서, 아스코르브산은 항산화제이고 1:1보다 적은, 예를 들어 1:2 이하 또는 1:10 이하의 BH4에 대한 비율이 사용된다. 본 발명의 안정한 정제 제형에서 윤활제의 예시적인 농도는 약 0.1 wt%와 약 2 wt% 사이이다; BH4에 대한 윤활제의 예시적인 중량비는 약 1:25 내지 1:65의 범위이다.
안정한 고체 제형은 선택적으로 처리된 조건에 적합한 다른 치료적 제제를 포함할 수 있고, 이는 예를 들어 폴레이트 전구체, 폴산, 또는 폴레이트 유도체를 포함한 폴레이트; 및/또는 알기닌; 및/또는 비타민 C 및/또는 비타민 B2(리보플라빈) 및/또는 비타민 B12와 같은 비타민; 및/또는 L-도파 또는 카르비도파와 같은 신경전달물질 전구체; 및/또는 5-하이드록시트립토판이다.
예시적인 폴레이트 전구체, 폴산, 또는 폴레이트 유도체를 포함한 폴레이트는 미국 특허 번호 6,011,040 및 6,544,994에 개시되어 있고, 이들 모두는 참조로서 본 명세서에 도입되며, 폴산(프테로일모노글루타메이트), 디하이드로폴산, 테트라하이드로폴산, 5-메틸테트라하이드로폴산, 5,10-메틸렌테트라하이드로폴산, 5,10-메테닐테트라하이드로폴산, 5,10-포름이미노테트라하이드로폴산, 5-포르밀테트라하이드로폴산(류코보린), 10-포르밀테트라하이드로폴산, 10-메틸테트라하이드로폴산, 폴일폴리글루타메이트 중 하나 이상, 폴산 또는 폴일폴리글루타메이트의 프테린 모이어티의 피라진 고리가 환원되어 디하이드로폴레이트 또는 테트라하이드로폴레이트를 제조하도록 하는 화합물, 또는 여러 산화 농도에서 N-5 또는 N-10 위치가 하나의 탄소 단위를 운반하는 모든 상기 화합물의 유도체, 또는 그의 약학적으로 이용 가능한 염 또는 그의 둘 이상의 조합을 포함한다. 예시적인 테트라하이드로폴레이트는 5-포르밀-(6S)-테트라하이드로폴산, 5-메틸-(6S)-테트라하이드로폴산, 5,10-메틸렌-(6R)-테트라하이드로폴산, 5,10-메테닐-(6R)-테트라하이드로폴산, 10-포르밀-(6R)-테트라하이드로폴산, 5-포름이미노-(6S)-테트라하이드로폴산 또는 (6S)-테트라하이드로폴산, 및 그의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함한다. 예시적인 염은 소듐, 포타슘, 칼슘 또는 암모늄 염을 포함한다.
예시적인 BH4의 폴레이트, 알기닌에 대한 상대적 중량비는 약 1:10:10 내지 약 10:1:1일 수 있다.
본 발명의 안정한 제형은 만일 상업적으로 의도될 수 있다면, 예를 들어 건조 캡슐 또는 파우치와 함께 제공되는 HDPE 병의; 또는 호일-온-호일 블리스터(foil-on-foil blister) 패키징의, 또는 폴리머 필름을 통해 볼 수 있는 것을 포함하는 블리스터 패키징의 정제 또는 환제 또는 캡슐이다.
Ⅳ. BH4-반응성 질환의 치료
고페닐알라닌혈증, 신경심리학적 또는 신경정신병적 장애
본 발명의 방법은 예를 들어, 감소된 페닐알라닌 하이드록시라제, 티로신 하이드록시라제, 또는 트립토판 하이드록시라제 활성에 의해 야기될 수 있는 상승된 페닐알라닌 농도 또는 감소된 티로신 또는 트립토판 농도와 관련된 상태의 치료를 위해 사용될 수 있다. 상승된 페닐알라닌 농도와 관련된 상태는 구체적으로 경증(mild) 및 전형적(classic) 페닐케톤뇨증, 명세서에 설명된 고페닐알라닌혈증을 포함하고, 예시적인 환자 모집단은 본 명세서에 설명된 환자 하위그룹뿐만 아니라 정상 이상의 페닐알라닌 농도를 나타내는 어떤 다른 환자를 포함한다.
감소된 티로신 또는 트립토판 농도와 관련된 상태는 신경전달물질 결핍, 파킨슨씨병과 같은 신경학적 및 신경정신병적 장애, 근육긴장이상(dystonia), 척수소뇌변성증(spinocerebellar degeneration), 통증, 피로, 우울증, 다른 감정적인 장애 및 정신분열증을 포함한다. nNOS에 의한 NO 과잉생산은 뇌졸중, 편두통, 알츠하이머병, 및 모르핀에 대한 내성 내지는 의존과 밀접하게 관련 있다. BH4는 이들 상태 중 어떤 것을 위해 투여될 수 있다. BH4가 투여될 수 있는 다른 예시적인 신경정신병적 장애는 파킨슨씨병, 알츠하이머병, 정신분열증, 정신분열 장애, 분열정동장애, 간단한 정신병적 장애, 망상장애, 공유 정신병적 장애, 일반적 치료 상태로 인한 정신병적 장애, 물질-유도된 정신병적 장애, 다른 정신병적 장애, 지연성 운동 이상증, 마카도 조셉병, 척추소뇌변성증, 소뇌성 운동 실조증, 근육긴장이상, 만성 피로 증후군, 급성 또는 만성 우울증, 만성 스트레스 증후군, 섬유조직염, 편두통, 주의력 결핍 과잉행동 장애, 양극성 장애 및 자폐증을 포함한다.
안정한 제형은 또한 예를 들어 도파-반응성 근육 긴장 이상(DRD), 세피아프테린 환원제(SR) 결핍, 또는 디하이드로프테리딘 환원제(DHPR) 결핍을 포함하나 이에 제한되지 않는 이의 합성을 위한 경로의 결함에 기한 BH4 결핍을 앓는 환자들을 치료하기 위해 사용될 수 있다.
본 발명의 안정한 제형으로 치료하기 위한 적절한 대상은 치료받은 적이 없고 상승된 플라즈마 페닐알라닌 농도, 예를 들어 1800μM/L 이상, 또는 1600μM 이상, 1400μM 이상, 1200μM 이상, 1000μM 이상, 800μM 이상, 또는 600μM 이상, 420μM 이상, 300μM 이상, 200μM 이상, 또는 180μM 이상을 가진 대상이다. 경증(mild) 페닐케톤뇨증은 일반적으로 600μM/L 이하의 플라즈마 페닐알라닌 농도로 정의되고, 중등도(moderate) 페닐케톤뇨증은 600μM/L 내지 약 1200μM/L 사이의 플라즈마 페닐알라닌 농도로 정의되며 전형적 또는 중증(classic or severe) 페닐케톤뇨증은 1200μM/L 이상의 페닐알라닌 농도로 정의된다. 바람직하게 안정한 제형 단독 또는 단백질-제한 식이를 병행하는 치료는 대상에게 있어 플라즈마 페닐알라닌 농도를 600μM/L 이하, 또는 500μM/L 이하, 또는 360μM/L±15μM/L 또는 그 이하, 또는 200μM/L 이하, 또는 100μM/L 이하로 낮춘다. 다른 적절한 대상은 감소된 페닐알라닌 하이드록시라제(PAH) 활성, BH4 결핍과 관련된 부정형 또는 악성 페닐케톤뇨증, 간 장애와 관련된 고페닐알라닌혈증, 및 말라리아와 관련된 고페닐알라닌혈증을 가지는 것으로 진단된 대상을 포함한다. 감소된 PAH 활성은 PAH 효소의 변이, 예를 들어, PAH 또는 F39L, L48S, I65T, R68S, A104D, S110C, D129G, E178G, V190A, P211T, R241C, R261Q, A300S, L308F, A313T, K320N, A373T, V388M E390G, A395P, P407S, 및 Y414C로 구성된 그룹에서 선택된 하나 이상의 촉매 도메인의 변이로부터 야기될 수 있고; 또는 임산부, 임신을 고려하고 있는 가임기 여성, 또는 0 내지 3살, 또는 0-2, 0-1.5 또는 0-1 사이의 영아인 대상; 또는 1회 용량의 BH4 로딩 테스트 또는 4-용량 또는 7-일 로딩 테스트와 같은 다수 용량 멀티 테스트에 대해 24시간 이내에 반응이 없는 것으로 진단된 대상이다. 예시적인 환자 모집단 및 예시적인 BH4 로딩 테스트는 국제 출원 공개 번호 WO2005/049000에 설명되어 있고, 이는 전체가 참조로서 본 명세서에 도입된다.
미국 특허 번호 4,752,573; 4,758,571; 4,774,244; 4,920,122; 5,753,656; 5,922,713; 5,874,433; 5,945,452; 6,274,581; 6,410,535; 6,441,038; 6,544,994; 및 미국 특허 공개 US 20020187958; 미국 20020106645; 미국 2002/0076782; 미국 20030032616(각각은 참조로서 본 명세서에 도입됨) 각각은 비-페닐케톤뇨증 치료를 위해 BH4 조성물을 투여하는 방법을 설명한다. 각 환자들은 당업계의 기술자에게 알려진 BH4 조성물 투여 방법의 일반적 교시를 제공하는 것으로 참조로서 본 명세서에 도입되고, 이는 본 명세서에 설명된 치료를 위해 개조될 수 있다.
개개인의 요구가 다양한 한, 각 성분의 효과적인 양의 최적의 범위에 대한 결정이 당업계 기술 내에 있다. BH4의 정형적인 용량은 하루에 약 1 내지 약 20 mg/kg 체중을 포함하고, 이는 일반적으로 약 5(1mg/kg ×5kg 체중) 내지 3000 mg/일(30mg/kg ×100kg 체중)의 양일 것이다. 계속되는 동안, 하루 투여가 고려되는데, HPA를 위해 이것은 페닐알라닌 농도가 특정 역치 농도 아래로 감소될 때의 증상일 때 BH4 치료를 중단하는 것이 바람직할 것이다. 물론, 상기 치료는 페닐알라닌 농도가 다시 높아지는 경우 다시 시작될 수 있다. 적절한 용량은 관련된 용량 반응 데이터와의 관계에서 혈액 페닐알라닌 농도를 결정하는 확립된 분석의 사용을 통해 규명될 수 있다.
예시적인 실시예에서, 본 발명의 방법은 이를 필요로 하는 환자에게, 약 10 mg/kg 내지 약 20 mg/kg 사이의 BH4 1일 용량을 제공할 것이 제시된다. 물론, 당업계의 기술자는 본 용량을 투여에 의해 성취되는 효과에 따라 줄이거나 늘리는 조정을 할 수 있다. 1일 용량은 1회 용량으로 투여될 수 있고 또는 선택적으로 편리한 간격을 두고 여러 번의 용량으로 투여될 수 있다. 예시적인 실시예에서, 상기 1일 용량은 1 mg/kg, 2 mg/kg, 3mg/kg, 4mg/kg, 5mg/kg, 6mg/kg, 7mg/kg, 8mg/kg, 9mg/kg, 10mg/kg, 11mg/kg, 12mg/kg, 13mg/kg, 14mg/kg, 15mg/kg, 16mg/kg, 17mg/kg, 18mg/kg, 19mg/kg, 20mg/kg, 22mg/kg, 24mg/kg, 26mg/kg, 28mg/kg, 30mg/kg, 32mg/kg, 34mg/kg, 36mg/kg, 38mg/kg, 40mg/kg, 42mg/kg, 44mg/kg, 46mg/kg, 48mg/kg, 50mg/kg, 또는 그 이상 mg/kg,일 수 있다.
저용량 용법
본 발명의 저용량 치료 방법에서, 저용량, 예를 들어 하루에 0.1 내지 2 mg/kg, 또는 0.1 내지 3 mg/kg, 또는 1 mg/kg 내지 5 mg/kg의 용량을 포함하는 0.1 내지 5 mg/kg이 제시된다. 하루에 5 mg/kg보다 작은 용량이 바람직하다. 본 발명에 따라, 이러한 용량은 관련 시험의 결론 개선을 제공하는 것이 기대되고, BH4 유도체는 이러한 용량에서 천연 BH4에 비해 개선된 생물학적 특성을 지니는 것이 기대된다. 구체적으로, 본 발명은 본 명세서에 설명된 1',2'-디아실-(6R,S)-5,6,7,8-테트라하이드로-L-바이오프테린 또는 유지질 테트라하이드로바이오프테린 중 어느 하나가 저용량에서 개선된 생물학적 특성을 나타낸다는 것을 제시한다.
본 발명은 또한 구체적으로 BH4, 또는 이의 전구체 또는 유도체를 BH4-반응성 질환을 치료하기 위해, 0.1 내지 5 mg/kg 체중/일의 범위의 용량에서, 경구 투여를 포함하나 이에 제한되지 않는 어떤 투여 경로를 통해, 1일 용량을 하루에 한 번 또는 하루에 여러 번 나누어(예를 들어 2,3 또는 4), 최소 1, 2, 3, 또는 4주 또는 그 이상, 또는 1, 2, 3, 4, 5, 6 개월 또는 그 이상의 기간 동안 사용하는 것을 제시한다. 예시적인 용량은 5mg/kg/일 이하, 4.5mg/kg/일 이하, 4mg/kg/일 이하, 3.5mg/kg/일 이하, 3mg/kg/일 이하, 2.5mg/kg/일 이하, 2mg/kg/일 이하, 1.5mg/kg/일 이하, 1mg/kg/일 이하, 또는 0.5mg/kg/일 이하를 포함한다. 신체 표면적 당 동등한 용량이 또한 제시된다.
평균 체중/체표면적(예를 들어 70 kg)의 사람에게 있어, 본 발명은 400mg 이하의 총 1일 용량을 제시한다. 예시적인 이러한 총 1일 용량은 360mg/일, 350mg/일, 300mg/일, 280mg/일, 210mg/일, 180mg/일, 175mg/일, 150mg/일, 또는 140mg/일을 포함한다. 예를 들어, 350mg/일 또는 175mg/일은 175mg 경구 투약 제형으로 하루에 한 번 또는 두 번 용이하게 투여될 수 있다. 다른 예시적인 총 1일 용량은 320mg/일 이하, 160mg/일 이하, 또는 80mg/일 이하를 포함한다. 이러한 용량은 80 또는 160mg의 경구 투약 제형으로 용이하게 투여될 수 있다. 다른 예시적인 총 1일 투여 용량은 45, 90, 135, 180, 225, 270, 315 또는 360mg/일 또는 그 이하를 포함하고 45 또는 90mg의 경구 투약 제형으로 용이하게 투여될 수 있다. 또 다른 예시적인 총 1일 용량은 60, 120, 180, 240, 300, 또는 360mg/kg을 포함하고 60 또는 120mg 경구 투약 제형으로 쉽게 투여될 수 있다. 다른 예시적인 총 1일 용량은 70, 140, 210, 280, 또는 350mg/kg을 포함하고, 70 또는 140mg의 경구 투약 제형으로 쉽게 투여될 수 있다. 예시적인 총 1일 용량은 또한 55, 110, 165, 220, 275 또는 330mg/kg을 또한 포함하고, 55mg의 경구 투약 제형으로 쉽게 투여될 수 있다. 다른 예시적인 총 1일 용량은 예를 들어 65mg 또는 75mg의 투약형으로, 65, 130, 195, 260, 또는 325 mg/일, 또는 75, 150, 225, 300 또는 375mg/일을 포함한다.
일산화질소 합성 효소 기능 장애과 관련된 질환
본 발명은 나아가 본 발명의 안정한 제형이 일산화질소 합성 효소 활성의 강화로 이득을 얻을 상태로 고통을 받는 대상 및 심혈관 질환, 허혈 또는 염증성 질환, 또는 인슐린 내성을 앓고 있는 환자들의 치료에 사용될 수 있는 것을 제시한다. 상기 치료는 예를 들어, 일산화질소 합성 효소 활성의 결핍을 경감할 수 있거나, 예를 들어 일산화질소 합성 효소 활성을 보통 수준 이상으로 증가시키는 것을 제공할 수 있다. 일산화질소 합성 효소 활성의 결핍으로 고통받고 있는 환자들은 폴레이트 전구체, 폴산, 또는 폴레이트 유도체를 포함하는 폴레이트로 함께 치료받는 것이 유리하다.
일산화질소는 혈압 및 혈관 톤의 조절에 주요한 생리적 역할을 하는 혈관내피세포에 의해 구조적으로 생산된다. 이는 일산화질소 생활성의 결핍이 관상동맥 질환을 포함하는 혈관 기능 장애, 관상동맥, 경동맥, 대뇌, 말초 혈관 동맥을 포함하는 어떤 동맥의 죽상동맥경화증, 허혈성-재관류 손상, 고혈압, 당뇨병, 당뇨성 혈관장애, 심혈관질환, 말초혈관질환, 또는 뇌졸중과 같이 허혈 및/또는 염증에 기초한 신경퇴행 상태의 발병과 관련된다는 것을 나타내며, 이러한 발병은 손상된 내피, 기관 및 조직으로의 불충분한 산소 흐름, 상승된 전신 혈관 저항(고혈압), 혈관 평활근 증식, 혈관 협착(좁아짐) 및 염증의 진행을 포함한다. 그러므로, 본 발명의 방법에 따른 이러한 상태의 치료가 제시된다.
이는 또한 일산화질소 합성 효소 활성의 강화가 상승된 활성산소 농도의 감소, 증가된 인슐린 민감도, 및 인슐린 내성과 관련된 혈관 기능 장애의 감소를 또한 야기한다는 것을 제시하고, 이는 본 명세서에 참조로 도입된 미국 특허 번호 6,410,535에 설명된다. 따라서 본 발명에 따른 당뇨병(타입 Ⅰ또는 타입 Ⅱ), 고인슐린혈증, 또는 인슐린 내성의 치료가 제시된다. 인슐린 내성과 관련된 혈관 기능 장애를 가지는 질환 또는 장애는 인슐린 내성 또는 인슐린 내성에 의한 악화에 의해 야기되거나 이를 위한 치료가 인슐린 내성에 의해 저지되는 것을 포함하고, 이는 비정상적 혈관 탄력성(compliance), 내피 기능 장애 및 고혈압, 인슐린 민감도 및 글루코오스 조절 장애, 간헐성 파행증(intermittent claudication), 감소된 말초 혈류, 감소된 피부 혈류, 불완전한 상처 치료 및 말초 순환 장애와 같은 비정상적 말초 혈류, 고지혈증, 동맥경화증, 관상동맥 혈관 수축 협심증(coronary vasoconstrictive angina), 노력형 협심증(effort angina), 뇌혈관 수축 병변(cerebrovascular constrictive lesion), 뇌혈관 폐쇄부전(cerebrovascular insufficiency), 뇌혈관 연축(cerebral vasospasm), 경피적 관동맥 혈관 재건법(PTCA) 또는 관상 동맥 우회술(CABG) 후 관상동맥재협착증(arteriorestenosis), 비만, 인슐린-비의존 당뇨병, 고인슐린혈증, 지질 대사 이상, 관상 동맥경화성 심장 질환, 울혈성 심부전, 울혈성 심부전을 동반하거나 동반하지 않은 폐혈관 고혈압, 운동-관련 협심증, 관상 동맥 질환 및 관련된 죽상동맥경화증; 시신경 위축 및 당뇨성 망막 질환과 같은 안과적 질환; 및 당뇨성 신장 질환에서의 미세알부민뇨, 신장 이상 및 감소된 사구체 여과 속도와 같은 신장 질환을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
이러한 질환을 가진 환자에게 투여될 때, BH4는 NOS 기능을 활성화하고, NO 생산을 증가시키며, 활성 산소 종류의 생산을 억제함으로써 혈관 내피 세포의 장애를 개선하여 이러한 질환을 예방하거나 치료할 수 있다는 것이 제시된다.
본 발명은 폐혈관 질환, 용혈성 빈혈(hemolytic anemia), 뇌졸중 및 관련된 허혈성 혈관 질환(뇌졸중, 심장 또는 관상동맥 질환, 죽상동맥경화증, 또는 말초 혈관 질환), 혈전증, 이식-관련된 내피 기능 장애(endotherial dysfunction), 및 심장 또는 관상동맥 질환으로 구성된 그룹으로부터 선택된 당뇨병과 관련되지 않은 혈관 질환을 가진 것으로 진단된 대상을 치료하는 방법을 제공한다. 일실시예에서, 폐혈관 질환은 겸상 적혈구 빈혈증(sickle cell anemia) 및 다른 헤모글로빈 이상 혈색소증, 특발성 폐 고혈압, 신생아의 저항성 폐 고혈압(PPHN)에서 폐혈관 긴장을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 다른 실시예에서, 용혈성 빈혈은 유전성 용혈성 빈혈 및 후천적 용혈성 빈혈을 포함한다. 유전성 용혈성 빈혈은 겸상 적혈구 빈혈증, 지중해 빈혈(thalassemia), G6PD 결핍에 기인한 용혈성 빈혈, 피루베이트(pyruvate) 키나제 결핍, 유전성 타원형 적혈구증(elliptocytosis), 유전성 구상 적혈구증(spherocytosis), 유전성 유구 적혈구증(stomatocytosis), 유전성 난형 적혈구증(ovalocytosis), 발작성 야간혈색뇨증(paroxysmal nocturnal hemoglobinuria), 및 헤모글로빈 SC 질환을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 후천적 용혈성 빈혈은 미세혈관병 용혈성 빈혈(microangiopathic hemolytic anemia), 자가면역 용혈성 빈혈(idiopathic autoimmune hemolytic anemia), 화학적 또는 물리적 제제 또는 장치(좌심실 보조 장치, 기계적 심장 판막 및 우회 장치)에 의해 야기된 비-면역 용혈성 빈혈(non-immune hemolytic anemia), 및 2차 면역 용혈성 빈혈을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
다른 실시예에서, 뇌졸중 및 관련된 허혈성 혈관 질환은 뇌졸중 후 뇌혈관 연축과 같은 혈관 경련을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 혈전증은 혈전 생성증, 혈전증, 덩어리, 및 응고를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 다른 실시예에서, 이식-관련된 내피 기능 장애는 실질 장기 이식 후 혈관 장애 및 사이클로스포린 A로 인한 내피 기능 장애를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 또 다른 실시예에서, 심장 또는 관상 동맥 질환은 울혈성 심부전, 혈관 기능 장애 및 고콜레스테롤혈증과 관련된 협심증, 및 혈관 기능 장애 및 흡연과 관련된 협심증을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
BH4는 또한 패혈증을 포함하나 이에 제한되지 않는 활성 산소 종류의 과잉 생산 또는 관련된 손상과 연관된 다른 장애를 예방하거나 치료할 수 있다.
본 발명에 따른 조성물의 적절한 용량은 연령, 건강 및 투여받는 자의 체중, 병행 치료의 종류, 만약 있다면, 치료의 빈도, 및 의도된 효과의 특징(즉, 의도된 플라즈마 페닐알라닌 농도의 감소량)에 의존한다는 것으로 이해된다. 투여의 빈도 또한 페닐알라닌 수치에 대한 약력학적 효과에 의존한다. 만일 1회 용량으로 24시간 동안 효과가 지속된다면, 그러나 가장 바람직한 투약은 대상 개개인에게 맞춘 것이 될 수 있고, 이는 당업계의 기술자에 의해 과도한 실험 없이 이해되고 결정될 수 있다. 이는, 예를 들어 만일 환자가 저체중을 가진다면 용량을 감소하는 것과 같은 표준 용량의 조정과 정형적으로 관련한다.
BH4 투여의 빈도는 제제의 약물 동태의 파라미터 및 투여 경로에 의존할 것이다. 최적의 약학적 제형은 투여 경로 및 의도된 용량에 따라 당업자에 의해 결정될 것이다. 본 명세서에 참조로 도입된 레밍턴의 약제학 과학 18th Ed.(1990, Mark Publ. Co, Easton PA 18042) pp 1435 1712을 보라. 이러한 제형은 신체적 상태, 안정성, 투여된 제제의 생체 내 방출 속도 및 생체 내 클리어런스 속도에 영향을 줄 것이다. 투여 경로에 따라, 적당한 용량은 체중, 체표면적 또는 장기 사이즈에 따라 계산될 수 있다. 적절한 치료 용량을 결정하기 위해 필요한 계산식의 다른 정의는 과도한 실험 없이, 특히 본 명세서에 개시된 복약 정보 및 분석뿐만 아니라 동물 또는 인간 임상 실험에서 관찰된 약물 동태 데이터를 고려하여 당업계의 기술자에 의해 통상적으로 만들어진다.
최종 투약 용법은 예를 들어 약물 특유의 활성과 같은 약물 작용, 환자 손상의 심각도 및 반응성, 환자의 연령, 상태, 체중, 성별 및 식이, 감염의 심각도, 투여 시간 및 다른 임상적 요소를 변형한 요소들을 고려하여 주치 의사에 의해 결정될 것이다.
Ⅴ. 조합 치료
본 발명의 특정 방법은 본 발명의 안정한 제형 및 하나 이상의 다른 치료 제제를 조합한 사용과 관련한다.
이러한 조합 치료에서, 본 발명의 안정한 제형의 투여는 2개 제제 모두 치료 효과를 발휘할 수 있는 시간이 겹치는 기간인 한, 제2의 치료 제제 투여와 동시에 또는 앞서 또는 후에, 예를 들어 몇 분 내지 몇 시간의 간격 범위로 할 수 있다. 따라서 본 발명은 제 2 치료 제제와 함께 사용하기 위한 본 발명의 안정한 제형을 제시한다. 본 발명은 또한 안정한 테트라하이드로바이오프테린, 전구체, 유도체 또는 본 발명의 유사물 제형과 함께 투여하기 위한 약물 제조에서 제 2 치료 제제의 사용을 제시한다.
테트라하이드로바이오프테린 치료는 다양한 형의 HPA를 가진 환자에게서 치료 결과를 발휘하기 위해 단백질 식이 제한과 조합될 수 있다. 예를 들어, 대상에게 의도한 치료 결과를 생산하기에 효과적인 조합된 양으로 BH4 조성물 및 저-페닐알라닌 의약 단백질 조성물을 투여할 수 있었다(즉, 플라즈마 페닐알라닌 농도를 낮추고/낮추거나 플라즈마 페닐알라닌 농도의 부수적인 증가 없이 더 많은 페닐알라닌/단백질 복용량을 허용할 수 있다). 본 과정은 BH4 조성물 및 식이 단백질 치료용 조성물을 동시에 투여하는 것과 관련할 수 있다. 이는 식이 단백질 요구량을 모두 포함하고 또한 단백질 제형 내에 BH4 또한 포함하는 단일 조성물 또는 약물학적 단백질 제형의 투여에 의해 이루어질 수 있다. 선택적으로, 식이 단백질(보충적 또는 보통 단백질 식사)는 BH4의 약물학적 제형(정제, 주사 또는 드링크)와 대략 동시에 복용된다.
몇몇 실시예에서, 단백질-제한 식이는 티로신, 발린, 이소류신 및 류신과 같은 아미노산으로 보충된 것이다. 상기 환자에게 L-티로신, L-글루타민, 20mg/100g 보충제 농도의 L-카르니틴, 40mg/100g 보충제 농도의 L-타우린 및 셀레늄을 포함할 수 있는 저-페닐알라닌 단백질 보충제가 함께 투여될 수 있다. 이는 권장 일일 미네랄 용량, 예를 들어 칼슘, 인 및 마그네슘을 더 포함할 수 있다. 상기 보충제는 L-류신, L-프롤린, L-라이신 아세테이트, L-발린, L-이소류신, L-알기닌, L-알라닌, 글라이신, L-아스파라긴 모노하이드레이트, L-트립토판, L-세린, L-트레오닌, L-히스티딘, L-메티오닌, L-글루탐산, 및 L-아스파트산으로 구성된 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산의 권장 일일 용량을 더 포함할 수 있다. 게다가, 상기 보충제는 비타민 A,D, 및 E의 권장 일일 용량으로 강화될 수 있다. 선택적으로, 상기 보충제는 보충제 에너지의 최소 40% 이상을 제공하는 지방 함량을 포함한다. 이러한 보충제는 분말 보충제 또는 단백질 바의 형태로 제공될 수 있다. 특정 실시예에서, 단백질-제한 식이는 상기 단백질 보충제와 동일한 조성물이 제공되는 단백질 보충제 및 BH4를 포함한다.
다른 선택 사항에서, 상기 BH4 치료는 몇 분 내지 몇 시간 간격 범위로 식이 단백질 치료 전 또는 후일 수 있다. 상기 단백질과 상기 BH4 조성물이 따로 투여되는 실시예에서, 각 전달 시간 사이에 의미 있는 기간이 끝나지 않았고, BH4가 환자에게 유리한 효과를 여전히 발휘할 수 있을 것이라는 것을 일반적으로 보증할 것이다. 이러한 실시예에서, 식이 단백질 복용의 약 2-6시간 이내에(전 또는 후), 예를 들어 단지 약 1시간 이하의 지연 시간을 가지고 BH4가 투여될 것이라는 것이 제시된다. 특정 실시예에서, BH4 치료가 BH4의 일일 용량이 불분명하게 환자에게 투여되는 연속 치료가 될 것이 제시된다. 다른 상황에서, 예를 들어 단지 보다 약한 형의 PKU 및 HPA를 가지는 임산부에 있어, BH4 치료는 여성이 임산부 및/또는 수유부인 한 그저 계속된다는 것이 될 수 있다.
더욱이, BH4의 전달과 식이 단백질 조절에 단독으로 기초한 치료에 부가하여, 본 발명의 방법은 HPA 중 하나 이상의 증상을 구체적으로 타겟하는 제3의 조성물을 이용한 조합 치료를 또한 제시한다. 예를 들어, HPA에 의해 야기된 티로신 결핍은 신경전달물질 도피민 및 세로토닌의 결핍을 가져온다고 알려져 있다. 따라서 본 발명의 내용에서, BH4 및 전달 단백질에 기초한 방법은 L-도파, 카르비도파 및 5-하이드록시트립토판 신경 전달 물질의 투여와 함께 더 조합될 수 있었고, 식이에서 감소된 양의 티로신에 의해 야기된 결함을 바로잡을 수 있었다.
게다가, PAH(Christensen et al., Mol. Gent. And Metalbol. 76:313-318, 2002; Christensen et al., Gene theraphy, 7:1971-1978, 2000) 및 페닐알라닌 암모니마-리아제(PAL Liu et al., Arts. Cells. Blood. Subs and Immob. Biotech. 30(4)243-257, 2002) 모두에 의한 유전자 치료는 당업계의 기술자에 의해 제시되어 왔다. 이러한 유전자 치료 기술은 조합된 BH4/식이 단백질 제한에 기초한 본 발명의 치료를 조합하여 사용될 수 있었다. 다른 조합 치료에서, 환자의 더 낮은 페닐알라닌 농도를 해하는 페닐라제가 주입 가능한 효소로 제공될 수 있다. 페닐라제의 투여가 티로신을 생산하지 않을 것이기 때문에(PAH 투여와는 달리), 이러한 치료는 여전히 이러한 환자들에게 티로신이 필수 아미노산이 되도록 할 것이다. 그러므로 티로신을 함유한 식이 보충제는 BH4 치료와 조합되어 페닐라제를 받는 환자들에게 바람직할 수 있다.
BH4는 신경생리학 또는 신경정신병적 장애를 위해 본 발명의 방법에 따라 항우울제, 트립토판, 티로신, 세로토닌과 같은 신경 전달 물질 전구체, 로페프라민(lofepramine), 데시프라민(desipramine), 레보세틴(reboxetine), 티로신과 같이 노르아드레날린계를 활성화하는 제제, 바람직하게 세로토닌에 작용하는 제제, 벤라파신(venlafaxine), 두로세틴(duloxetine) 또는 밀나시프란(milnacipran)과 같이 조합된 노르아드레날린 및 세로토닌 저해제, 또는 부프로피온(bupropion)과 같이 조합된 도파민 및 노르아드레날린 재흡수 저해제인 약물을 포함하는 하나 이상의 다른 신경정신병 활성 제제가 함께-투여될 수 있다.
관련된 실시예에서, BH4는 당뇨병, 혈관 질환, 고지혈증을 치료하기 위해 보통 사용되는 다른 치료제와 함께 투여된다. 당뇨를 치료하기 위해 사용되는 제제는 PPAR 감마 리간드(티아졸리딘돈, 글리타존, 트로글리타존, 로시글리타존(아반디아), 피오글리타존)와 같이 인슐린 민감도를 개선하는 제제, 설포닐우레아(글리퀴돈, 톨부타마이드, 글리메프라이드, 클로르프로파마이드, 글리피자이드, 글리부라이드, 아세토헥사마이드) 및 메글리티나이드(메글리티나이드, 레파글리나이드, 네이트글리나이드)와 같은 인슐린 분비 촉진제, 메트포르민과 같이 간 글루코즈 생산을 감소하는 제제를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 혈관 질환을 치료하기 위해 사용되는 제제는 보센탄(bosentan), 다루센탄(darusentan), 엔라센탄(enrasentan), 테조센탄(tezosentan), 아트라센탄(atrasentan), 암브리센탄(ambrisentan) 시타센탄(sitasentan)과 같이 고혈압 및 다른 내피 기능 장애-관련 장애의 치료를 위해 보통 사용되는 엔도셀린(endothelin) 수용체 길항제; PDE5 저해제(간접-작용) 및 미녹시딜(직접-작용)과 같은 평활근 이완제; 캅토프릴, 에나라프릴, 리시노프릴, 포시노프릴, 퍼인도프릴, 퀴나프릴, 트랜도라프릴, 베나제프릴, 라미프릴과 같은 안제오텐신 전환 효소(ACE) 저해제; 이베르사르탄, 로사르탄, 발사르탄, 에프로사르탄, 올메사르탄, 칸데사르탄, 텔미사르탄과 같은 안지오텐신 Ⅱ 수용체 차단제; 아테노롤, 메토프로롤, 나도롤, 비소프로롤, 핀도롤, 아세부토롤, 베탁소롤, 프로프라노롤과 같은 베타 차단제; 하이드로클로로티아자이드, 푸로세마이드, 토르세마이드, 메토라존과 같은 이뇨제; 암로디핀, 페로디핀, 니솔디핀, 니페디핀, 베라파밀, 딜티아젬과 같은 칼슘 채널 차단제; 독사조신, 테라조신, 알푸조신, 탐수로신과 같은 알파 수용체 차단제; 및 클로니딘과 같은 중추성 알파 작동제를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 고지혈증을 치료하기 위해 사용되는 제제는 스타틴(아토르바스타틴, 플루바스타틴, 로바스타틴, 프라바스타틴, 로수바스타틴 칼슘, 심바스타틴) 및 니코틴산과 같이 LDL을 더 낮추는 제제, 콜레스테릴 에스터 전이 단백질 저해제(토르세트라핍과 같은), 피브레이트, 겜피브로질, 페노피브레이트, 베자피브레이트, 시프로피브레이트와 같이 PPAR 알파를 촉진하는 제제, 담즙산 교환수지, 콜레스티라민 및 콜리스티폴, 및 콜레스테롤 흡수 저해제와 같이 담즙산의 재흡수를 결합하고 방지하며 콜레스테롤 농도를 낮추는 제제를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
BH4는 또한 혈관 확장 신경제 일산화 질소(NO) 생산을 강화하거나 일반화하는 요소 또는 요소들의 조합과 함께 단독 또는 치료제와 조합하여 투여될 수 있다. 일실시예에서, 이러한 요소(들)는 BH4의 새로운 생합성의 활성 또는 발현을 강화하고 구아노신 트리포스페이트 사이클로하이드로라제 Ⅰ(GTPCH1), 6-피루보일테트라하이드로프테린 합성 효소(PTPS) 및 세피아프테린 환원제로 구성된 그룹에서 선택된다. 본 발명의 바람직한 실시예에서, BH4 합성은 하나 이상의 사이클릭 아데노신 모노포스페이트(cAMP) 유사물 또는 작동제의 사용에 의한 GTPCH1 발현의 발현을 증가시킴에 의해 증가되고, 이는 포르스콜린(forskolin), 8-브로모 cAMP 또는 cAMP 매개 세포 신호를 증가시키는 기능을 하는 다른 제제, 예를 들어 사이토카인 및 인터루킨-1, 인터페론-감마(IFN-γ), 종양괴사인자 알파(TNF-α), C-반응성 단백질, HMG-CoA-환원제(아토르바스타틴과 같은 스타틴) 신경성장인자(NGF), 상피재생인자(EGF)를 포함하는 성장인자, 아드레노메둘린과 에스트라디올 벤조에이트를 포함하는 호르몬, 및 NADPH와 NADPH 유사물, 카페인, 3-이소부틸-1-메틸 크산틴을 포함하는 사이클로스포린 A 메틸-크산틴, 테오필린, 레세르핀, 과산화수소과 같은 다른 화합물을 포함한다.
그러므로 발명의 일실시예는 PDE1, PDE3, PDE5를 포함하는 11개의 포스포디에스터라제 계열(PDE 1-11)의 저해제를 사용한 3'5'-사이클릭 뉴클레오타이드의 분해를 저해함으로써 GTPCH1 농도를 증가시키는 것과 관련한다. 본 발명의 상기 PDE 저해제는 비아그라/실다네필, 시알리스/타다라필, 바르데나필/레비트라, 우데나필, 8-메톡시메틸-IBMX, UK-90234, 덱사메타손, 헤스페레틴, 헤스페레딘, 이르소그라딘, 빈포세틴, 실로스타마이드, 로리프람, 에틸 베타-카르보린-3-카르복실레이트(베타-CCE), 테트라하이드로-베타-카르보린 유도체, 3-O-메틸쿼세틴 등을 포함한다.
본 발명의 다른 실시예는 유전자 치료 또는 BH4 합성 기구의 폴리뉴클레오타이드 내피-타겟 전달에 의한 BH4-합성 효소의 농도를 증가시킴에 의해 BH4의 농도를 증가시키는 것과 관련한다. 본 발명의 또 다른 실시예는 BH4-합성 효소 GTPCH1, PTPS, SR, PCD, DHPR 및 DHFR의 보충에 의해 BH4의 농도를 증가시키는 것과 관련한다. 이는 BH4-합성 효소가 단백질 변이를 포함하는 모든 천연 및 비천연 형의 효소를 포괄한다는 것을 제시한다.
본 발명의 다른 실시예는 알칼라인 포스파타제(AP) 대신 AP 활성을 저해함에 의해 기질 7,8-디하이드로네오프테린 트리포스페이트를 BH4 합성 효소 PTPS로 전환함으로써 BH4 농도를 증가시키는 것과 관련한다. AP 활성을 저해하는 제제 또는 화합물은 포스페이트 유사물, 레바미솔(levamisole), 및 L-페닐알라닌을 포함한다. 본 발명의 다른 실시예는 알칼라인 포스파타제의 합성을 저해하기 위해 작은 억제 RNA(siRNA), 안티센스 RNA, 이중 가닥 DNA(dsDNA), 소분자, 중성화 항체, 단일 사슬, 키메릭, 인간화된 항체 조각을 포함한다는 것과 관련한다.
본 발명의 다른 실시예는 BH4 새로운 합성 경로 중 효소의 합성에 필요한 촉매 또는 보조 인자의 활성을 강화하는 제제 또는 화합물을 포함한다.
본 발명의 다른 실시예는 BH4의 합성에 필요한 효소의 분해를 예방하는 제제 또는 화합물을 포함한다. 본 발명의 또 다른 실시예는 BH4의 합성에 필요한 촉매 및 GTPCH1, PTPS 및 SR을 포함하는 이의 합성 효소의 분해를 예방하는 제제 또는 화합물을 포함한다.
본 발명의 다른 실시예는 구출(salvage) 경로를 통해 BH2의 환원을 증가시킴으로써 BH4의 농도를 증가시키는 것과 관련한다. 생체 내에서, BH4는 BH2로 산화된다. BH2는 퀴노이드 형(qBH2) 및 7,8-디하이드로프테린으로 존재하고, 이는 각각 DHPR과 DHFR에 의해 BH4로 환원된다. 본 발명의 일실시예는 경로 NADPH, 티올, 퍼클로로머큐리벤조에이트, 과산화수소 등 제제 또는 화합물을 사용하여 효소 PCD, DHPR 및 DHFR의 활성 및 합성을 조정함으로써 BH2에서 BH4의 재생산 또는 구출을 증가시키는 것과 관련한다.
본 발명의 다른 실시예는 아스코르브산(비타민 C), 알파 토코페롤(비타민 E), 토코페롤(예를 들어, 비타민 A), 셀레늄, 베타-카로틴, 카르티노이드, 플라본, 플라보노이드, 폴레이트, 플라본, 플라바논, 이소플라본, 카테킨, 안토시아니딘, 및 칼콘을 포함하는 항산화제와 같은 제제 또는 화합물을 사용하여 BH4의 산화를 감소시킴으로써 BH4를 안정화하는 제제와 관련한다.
다른 실시예에서, 이러한 요소(들)는 일산화질소 합성 효소의 활성 또는 발현을 증가시킬 수 있고 그래서 NO의 생산을 강화할 수 있다.
또 다른 실시예에서, 본 발명은 GTPCH 피드백 조절 단백질, GFRP를 저해하는 요소를 제시한다. 본 발명의 일실시예는 BH4가 GTPCH1/GFRP 복합체로 결합하는 것을 저해하여 BH4에 의한 피드백 저해를 예방하는 제제 또는 화합물과 관련한다. 본 발명의 제제 또는 화합물은 상기 복합체, 구조적 유사물 등에 변경된 친화도를 가진 BH4의 변경된 형과 같은 경쟁적 저해제를 포함한다. 본 발명의 또 다른 실시예는 BH4의 합성을 유도하는 CTPCH1/GFRP로 L-페닐알라닌의 결합을 강화하는 제제 또는 화합물을 포함한다. 본 발명의 다른 실시예는 L-페닐알라닌의 전구체와 같은 L-페닐알라닌의 농도를 증가시키는 제제 또는 화합물을 포함하고, 이는 GFRP 및 BH4에 의한 GTPCH1의 피드백 저해를 저해하기 위해 제공된다.
본 발명의 또 다른 실시예는 GFRP의 활성 또는 합성을 조정하는 제제 또는 화합물과 관련한다. 본 발명의 일실시예는 GFRP의 활성을 저해하는 제제 또는 화합물을 포함한다. 본 발명의 다른 실시예는 GFRP의 합성을 저해하기 위해 siRNA, 소분자, 항체, 항체 조각 등의 사용을 포함한다.
Ⅵ. 바이오프테린 분석
플라즈마, 혈액 및 다른 조직의 총 바이오프테린 및 산화된 바이오프테린의 농도는 Fukishima et al(Anal. Biochem. 102:176(1980))의 방법에 기초하여 결정된다. 바이오프테린은 환원된 바이오프테린의 2가지 형, R-테트라하이드로바이오프테린(BH4) 및 퀴노노이드 R-디하이드로바이오프테린(q-BH2) 및 산화된 바이오프테린의 2가지 형, 디하이드로바이오프테린(BH2) 및 바이오프테린(B)을 포함하는 4가지 다른 형을 가진다. 이러한 4가지 형 중에서, 오직 환원된 형의 바이오프테린만이 공효소적 활성을 가진다. 환원된 바이오프테린은 산성 조건 하에서 이오딜레이션(iodylation)에 의해 B로 전환되고, 반면 알칼리 조건 하에서는 프테린으로 전환된다. 산화된 바이오프테린은 산성 및 알칼리 조건 하에서 이오딜레이션에 의해 B로 전환된다. 이러한 특성의 장점을 취함으로써, 총 바이오프테린의 양은 산성 조건 하에서 이올딜레이션하여 결정되고 산화된 바이오프테린은 알칼리 조건 하에서 이오딜레이션하여 결정되는데, 그리하여 환원된 바이오프테린의 양이 이들 양의 차이를 통해 계산된다. 공효소로 사용할 때 BH4는 q-BH2로 전환된다. 상기 q-BH2는 디하이드로프테린 환원제에 의해 BH4로 즉시 전환되거나, 만일 환원되지 않는다면 BH2 또는 DHPT로 산화된다. 생체 내에서 바이오프테린이 q-BH2형으로 존재하는 것은 어렵기 때문에, 환원된 바이오프테린이 BH4로 잘 치환된다.
채취된 플라즈마 및 전 혈액 샘플은 산성 산화 용액(0.6% 포타슘 요오드(KI), 0.3% 요오드(I2) 및 0.6N 트리클로로아세트산(TCA)을 포함하는 물 내 0.6N HCl 용액) 및 알칼리성 산화 용액(0.7N 소듐하이드록사이드(NaOH))로 즉시 산화되도록 한다. B의 결정은 HPLC 및 액체 신틸레이션 계수기를 사용하여 측정된 방사능에 의해 수행된다.
텐덤 질량 분석기(LC/MS/MS)가 커플된 역상 HPLC(RP)를 사용한 BH4의 측정: 역상 고성능 액체 크로마토그래피(RP)와 텐덤 질량 분석기(LC/MS/MS)의 조합한 사용은 인간 플라즈마의 BH4에 선택적이 된다는 것을 보여주었는데, BH4 민감도는 5-1000 ng/mL의 범위이었다. 본 방법은 채취 및 보관 동안의 산화에 기인한 약 50% BH4 전환과 관련된다. 샘플은 에틸렌디아민테트라아세트산의 디포타슘 염(K2EDTA) 플라즈마에서 3개월 넘게 안정하다. 전처리 단계에서부터 회복은 약 75%이다. 본 방법의 정확도와 정밀도는 15% 미만의 변동 계수(CV)%로 결정되었다(최저 정량 한계, LLOQ에서 20%).
HPLC와 텐덤 질량 분석기를 조합한 사용은 BH4 테스트 물품을 결정할 때 HPLC 단독으로 할 때보다 향상된다는 것을 보여주었고, 그 이유는: (1) 이의 약물-BH4에 대한 증가된 선택성(한편 HPLC는 총 바이오프테린을 측정함), (2) 더 넓은 정성 범위, (3) 확립된 전환 정량, (4) 넓은 특성화 및 인간 대상에게 증명된 유용성, 및 (5) 다른 종류 및 모체에 대한 새롭고 유용한 측정이다.
향상된 방법은 다음 단계를 포함한다. 혈액, 플라즈마, 조직 호모게네이트 샘플, 또는 뇨를 산성 또는 알칼리 산화되도록 한다. 산성 산화에 있어, (1) 샘플이 염화칼륨(KCl), 염산(HCl), 또는 TCA에 1시간 동안 처리된다; (2) 이후 산 산화된 샘플이 요오드 적정 된다; (3) 상기 샘플이 이온 교환 컬럼을 통과한다; (4) BH4, q-BH2(생체 내에서 즉시 BH4로 환원되어 측정된 환원된 바이오프테린은 주로 BH4에 기반함), BH2, 및 B가 HPLC와 텐덤 질량 분석기를 사용하여 측정된다. 알칼리 산화된 샘플에 있어, (1) 상기 샘플이 KI, I2 또는 NaOH에 1 시간 동안 처리된다; (2) 이후 상기 알칼리성 산화된 샘플이 HCl 또는 TCA로 산성화되도록 한다; (3) 요오드 적정된다; (4) 상기 샘플이 이온 교환 컬럼을 통과한다; (5) BH2와 B를 포함한 산화된 바이오프테린이 측정된다; (6) HPLC 및 텐덤 질량 분석기를 사용하여 다른 종류가 측정된다; 및 (7) 환원된 바이오프테린(BH4 + q-BH2)의 양이 총 바이오프테린에서 산화된 형을 뺀 차이로 계산된다.
바이오프테린 측정의 플로 차트 및 분석 검토(validation)의 요약이 도 16 및 17에 제공된다.
최적화된 분석
전기화학적 검출(ECD) 및 형광(FL) 검출을 사용한 HPLC 방법은 각 개별적인 바이오프테린 화합물(BH4, BH2 및 B)뿐만 아니라 유사물의 측정을 가능하게 하는 장점이 있다.
BH4는 효소계 일산화질소 합성 효소(NOS)를 위한 보조인자로, 이는 일산화질소(NO)를 생산한다. NO의 생산은 혈관 항상성을 유지하기 위해 중요하다. BH4의 세포 내 농도가 제한되면, NO 생산이 감소되고(감소된 NOS 활성에 기인), 손상한 자유 라디칼 활성산소(O2-)의 생성을 유도한다. 과도한 O2-는 내피 기능 장애를 유도할 수 있고 BH4의 BH2로의 산화에 기여할 수 있다, BH4 대 BH2의 낮은 비율은 내피 손상을 촉진할 수 있으며, 반면, 높은 BH4 대 BH2의 비율은 내피 건강을 촉진할 수 있다. 그러므로, BH4 대 BH2 비율 특성은 내피 건강의 예지 인자로 작용할 수 있다.
다른 바이오프테린(BH4, BH2 및 B) 또는 유사물의 농도는 분리를 위해 역상 HPLC를 먼저 사용하고, 이후 ECD와 FL 검출에 의해 결정된다.
산화환원반응-민감성이고, 비-형광 분자인 BH4는 ECD를 사용하여 측정된다. BH4(및 그의 유사물)은 ECD를 사용하여 측정되는데, BH4(또는 유사물)은 전극 1에 의해 퀴노노이드 디하이드로바이오프테린 형(예를 들어, qBH2), 짧은 수명의 디하이드로바이오프테린 중간물로 산화되고, 이후 다시 전극 2에서 BH4(또는 유사물)로 환원된다. 이후 상기 검출기는 본 환원 반응에 의해 생성된 전류를 사용하여 BH4 또는 이의 유사물의 농도를 결정한다(내인성 qBH2는 무시 가능하다).
BH2, B 및 그의 유사물은 형광 검출에 의해 동일한 주입에서 측정될 수 있다. 최적의 전위에서 컨디셔닝 가드(conditioning guard) 세포 조절을 사용한 BH2 또는 그의 유사물의 후-ECD 산화는 BH2 또는 그의 유사물을 B 또는 상응하는 바이오프테린 유사물로 산화한다. 이는 BH2가 형광 활성이 아니거나 쉽게 측정되지 않으며, 형광을 사용하여 쉽게 측정되는 B로 반드시 전환되기 때문에 바람직하다. 일단 B로 전환된 내인성 BH2, 및 내인성 B는 각 분자에 대한 HPLC 컬럼 상 다른 체류 시간에 기인한 두 개의 분리 형광 피크에 의해 서로 구별된다.
전체에서 상기 방법은 종류들 BH4, BH2, 및 B, 및 그의 유사물을 측정하는데 사용될 수 있다. 상기 바이오프테린은 바람직하게 본 명세서에서 설명된 2% MeOH-포함 이동상을 사용하여 측정된다. 발린 바이오프테린 유도체와 같은 바이오프테린 유사물은 10% MeOH-포함 이동상을 예로 들 수 있는 이동상에서 더 높은 메탄올 함량에 더 적합하게 될 수 있다.
그러므로, 바이오프테린 종류의 혼합물에서 바이오프테린을 검출하는 방법은 (a) 역상 HPLC에 의해 혼합물 내 바이오프테린 종류를 분리하고; BH4 및 그의 유사물의 경우, (b1) BH4 및 그의 유사물을 산화하여 퀴노노이드 디하이드로바이오프테린 형으로 제 1 전극에 나타내고, 이후 퀴노노이드 형의 환원에 의해 다시 BH4 및 그의 유사물로 돌린 것이 제 2 전극에 나타나고, 환원 반응에 의해 생성된 전류를 측정하여 종류의 농도를 결정하는 전기 화학적 검출의 수행; 및/또는 (b2) BH2, 그의 유사물, 바이오프테린, 또는 그의 유사물인 경우, BH2 종류를 바이오프테린으로의 후-컬럼 산화 이후 형광 검출에 의한 이러한 종류의 측정을 포함할 수 있다. 바람직하게, 상기 이동상은 본 명세서에 개시된 것이다.
일실시예에서, 상기 바람직한 이동상은 메탄올과 함께인 소듐 아세테이트, 시트르산, EDTA, 및 1,4-디티오에리스리톨(DTE)을 포함한다. 바람직한 농도는 2% 메탄올과 함께인 50mM 소듐아세테이트, 5mM 시트르산, 48μM EDTA, 및 160μM DTE이다.
도 1은 6R-(L-에리스로)-5,6,7,8-테트라하이드로바이오프테린의 크리스탈 다형체 형(form) B의 분말 엑스-레이 회절 패턴 특징을 보여준다.
도 2는 (6R)-L-에리스로-테트라하이드로바이오프테린 디하이드로클로라이드의 형 A에 의해 나타나는 특징적 엑스-레이 회절 패턴의 그래프이다.
도 3은 (6R)-L-에리스로-테트라하이드로바이오프테린 디하이드로클로라이드의 형 F에 의해 나타나는 특징적 엑스-레이 회절 패턴의 그래프이다.
도 4는 (6R)-L-에리스로-테트라하이드로바이오프테린 디하이드로클로라이드의 형 J에 의해 나타나는 특징적 엑스-레이 회절 패턴의 그래프이다.
도 5는 (6R)-L-에리스로-테트라하이드로바이오프테린 디하이드로클로라이드의 형 K에 의해 나타나는 특징적 엑스-레이 회절 패턴의 그래프이다.
도 6은 (6R)-L-에리스로-테트라하이드로바이오프테린 디하이드로클로라이드의 수화물 형 C에 의해 나타나는 특징적 엑스-레이 회절 패턴의 그래프이다.
도 7은 (6R)-L-에리스로-테트라하이드로바이오프테린 디하이드로클로라이드의 수화물 형 D에 의해 나타나는 특징적 엑스-레이 회절 패턴의 그래프이다.
도 8은 (6R)-L-에리스로-테트라하이드로바이오프테린 디하이드로클로라이드의 수화물 형 E에 의해 나타나는 특징적 엑스-레이 회절 패턴의 그래프이다.
도 9는 (6R)-L-에리스로-테트라하이드로바이오프테린 디하이드로클로라이드의 수화물 형 H에 의해 나타나는 특징적 엑스-레이 회절 패턴의 그래프이다.
도 10은 (6R)-L-에리스로-테트라하이드로바이오프테린 디하이드로클로라이드의 수화물 형 O에 의해 나타나는 특징적 엑스-레이 회절 패턴의 그래프이다.
도 11은 (6R)-L-에리스로-테트라하이드로바이오프테린 디하이드로클로라이드의 용매화물 형 G에 의해 나타나는 특징적 엑스-레이 회절 패턴의 그래프이다.
도 12는 (6R)-L-에리스로-테트라하이드로바이오프테린 디하이드로클로라이드의 용매화물 형 I에 의해 나타나는 특징적 엑스-레이 회절 패턴의 그래프이다.
도 13은 (6R)-L-에리스로-테트라하이드로바이오프테린 디하이드로클로라이드의 용매화물 형 L에 의해 나타나는 특징적 엑스-레이 회절 패턴의 그래프이다.
도 14는 (6R)-L-에리스로-테트라하이드로바이오프테린 디하이드로클로라이드의 용매화물 형 M에 의해 나타나는 특징적 엑스-레이 회절 패턴의 그래프이다.
도 15는 (6R)-L-에리스로-테트라하이드로바이오프테린 디하이드로클로라이드의 용매화물 형 N에 의해 나타나는 특징적 엑스-레이 회절 패턴의 그래프이다.
도 16은 바이오프테린의 측정을 위한 플로 차트(flow chart)이다.
도 17은 바이오프테린 분석 검토(validation)의 요약이다.
도 18은 쥐에게 사프로프테린(BH4)의 1회-용량 투여 후 플라즈마 바이오프테린 농도 및 환원-형 비율을 보여준다.
도 19는 쥐에게 사프로프테린(BH4)의 1회 경구 투여 후 플라즈마 중 총 바이오프테린의 약물 동태 파라미터를 보여주는 표이다.
도 20은 원숭이에게 사프로프테린(BH4)의 1회-용량 투여 후 플라즈마 바이오프테린 농도 및 환원-형 비율을 보여준다.
도 21은 원숭이에게 사프로프테린(BH4)의 1회-용량 투여 후 플라즈마 중 총 바이오프테린의 약력학적 파라미터를 보여주는 표이다.
도 22는 안전성 평가를 위한 이벤트 스케줄을 보여준다.
도 23은 건강한 자원자에게 금식 상태 하에서 용해된 정제와 정제 그대로 및 식이 상태 하에서 정제 그대로를 10mg/kg로 BH4를 경구 투여한 후에 BH4의 평균 플라즈마 농도를 보여준다-직선 축.
도 24는 건강한 자원자에게 금식 상태 하에서 용해된 정제와 정제 그대로 및 식이 상태 하에서 정제 그대로를 10mg/kg로 BH4를 경구 투여한 후에 BH4의 평균 플라즈마 농도를 보여준다-반-대수 축.
도 25는 건강한 자원자에게 금식 상태 하에서 용해된 정제와 정제 그대로 및 식이 상태 하에서 정제 그대로를 10mg/kg로 BH4를 경구 투여한 후에 BH4의 약물 동태 파라미터를 요약한 표를 보여준다.
도 26은 건강한 자원자에게 금식 상태 하에서 용해된 정제와 정제 그대로 및 식이 상태 하에서 정제 그대로를 10mg/kg로 BH4를 경구 투여한 후에 BH4의 약물 동태 파라미터의 통계적 비교를 보여준다.
도 27은 수용성 용액에서 5% 만니톨로 제형화한 BH4를 -20℃에서 2주 보관한 전과 후 모두에 대한 안정성 실험을 보여준다.
도 28은 BH4 캡슐 제형을 40℃에서 57일 동안 보관한 전과 후 모두에 대한 용해 프로파일을 보여준다.
도 29는 두 개의 BH4 제형-BH4 바이오흡착(bioadhesive) 정제 및 BH4 바이오흡착 과립-의 용해 프로파일을 보여준다.
도 30은 BH4의 여러 가지 서방제형의 용해 프로파일을 보여준다.
도 31은 BH4의 여러 가지 서방제형의 용해 프로파일을 보여준다.
도 32는 BH4의 부형 투약 제형의 도식 다이아그램을 보여준다.
도 33은 여러 가지 부형 투약 제형의 용해 프로파일을 보여준다.
도 34는 BH4의 가스 생성 투약 제형의 도식 다이아그램을 보여준다.
도 35는 여러 가지 BH4 제형의 약물 동태 프로파일을 보여준다.
도 36은 35일 이상 pH4에서 BH4 정맥 주사 제형의 안정성 시험을 보여준다.
도 37은 350시간 이상 여러 가지 BH4 정맥 주사 제형의 안정성 시험을 보여준다.
도 38은 여러 BH4 농도의 BH4 정맥 주사 제형의 안정성 시험을 보여준다.
[실시예]
다음의 실시예는 본 발명의 바람직한 실시예를 나타내기 위해 포함된다. 상기 실시예에 개시된 기술은 본 발명의 실행에 있어서 잘 기능하도록 발명자에 의해 발견된 기술을 나타낸 것으로 당업자에게 인식될 것이고, 그러므로 이의 실행을 위한 바람직한 양식을 구성하는 것으로 여겨질 수 있다. 그러나, 당업자는 본 발명의 개시를 고려하여, 개시된 구체적 실시예에서 많은 변경이 이루어질 수 있고, 본 발명의 본질 및 범위를 벗어나지 않고 동일한 또는 유사한 결과를 여전히 얻을 수 있다는 것을 인식할 것이다.
실시예 1
쥐에게 1회 경구 투약 후 플라즈마의 바이오프테린 농도 시간 곡선
본 시험의 목적은 쥐에게 1회 경구 투여 후 BH4의 약물 동태를 분석하기 위한 것이었다. BH4의 1회 용량을(10 및 100mg/kg) 금식 상태 하의 수컷 스프라구 다우리(Sprague Dawley) 쥐(6주령)에게 경구 투여하였다.
결과
투약 2시간 및 1시간 후 플라즈마의 총 바이오프테린 최대 농도는 각각 108 ng/ml(즉, 약 3×내인성 농도) 및 1227 ng/ml(즉, 약 30×내인성 농도)이었다(도 18). 그 이후, 바이오프테린의 제거 반감기(t1/2)는 약 1.1시간이었고, 10mg/kg 용량 투약 9시간 후 및 100mg/kg 용량 투약 24시간 후 내인성 농도로 돌아왔다(도 18).
10mg/kg 정맥 투여 동안 내인성 농도를 빼서 얻어진 플라즈마 농도-시간 곡선 하 면적(△AUC)에 기초한 10 및 100mg/kg 경구 투여 후 생체 이용률(F)은 각각 6.8% 및 11.8%이었다. 뇨에서 방사능 마커를 사용하여 측정하였을 때, GI 흡수 비율은 8.8%이었다. 추정의 실제 값은 이러한 데이터에 기초하여 대략 10% 경구 생체 이용률이 될 것이다.
플라즈마에서 총 바이오프테린에 대한 환원된 바이오프테린의 비율은(즉, 환원된-형 비율) 각각 변화가 없었다(73%-96%)(도 19).
실시예 2
원숭이에게 1회 경구 투약 후 플라즈마의 바이오프테린 농도 시간 곡선
본 시험의 목적은 키노몰구스(cynomolgus) 원숭이에게 1회 경구 투여 후 사프로프테린의 약물 동태를 평가하기 위한 것이었다, 사프로프테린의 1회 용량(10 mg/kg)은 금식 상태 하 암컷 키노몰구스 원숭이에게 경구 투여되었다.
결과
투여 3시간 후 총 플라즈마 바이오프테린 농도(△C)는 그의 최대값에 도달하였다(344 ng/ml, 대략 20×내인성 농도)(도 20). 바이오프테린의 플라즈마 제거 반감기는 대략 1.4시간이었고, 투약 24시간 이내에 내인성 농도로 되돌아왔다. 총 바이오프테린에 대한 환원된 바이오프테린의 비율은 테스트 시간 동안 거의 일정했다. 암컷 원숭이에게 10 mg/kg 경구 투여 후 △AUC 경구/정맥 비율로 계산된 생체 이용률(F)는 약 9%이었다(도 21).
실시예 3
물에 정제(들)를 용해한 후 투여되거나 정제(들) 그대로 투여된 테트라하이드로바이오프테린(BH4) 각각의 생체 이용률, 및 건강한 피시험자에서 흡수에 대한 음식의 영향
목적
본 시험의 제 1 목적은: (1) 정제(들)를 물에 용해한 후 투여되거나 정제(들) 그대로 투여될 때 테트라하이드로바이오프테린(BH4, 사프로프테린 디하이드로클로라이드) 각각의 생체 이용률을 평가하고; (2) 건강한 피시험자에서 BH4의 생체 이용률에 대한 음식의 영향을 비교하는 것이었다. 본 시험의 제 2 목적은 건강한 피시험자에게 BH4 1회 경구 용량의 안전성과 내약성을 평가하기 위한 것이었다.
방법론
본 시험은 오픈-라벨, 무작위, 3가지-치료, 6가지-시퀀스, 3가지-기간 크로스오버 시험이었으며, 30명이 3회 단일 용량 투여 기간을 마쳤고, 6가지 시퀀스 그룹 중 하나로 무작위 추출되었다(그룹 1, 2, 3, 4, 5, 및 6):
그룹 1: a,b,c
그룹 2: b,c,a
그룹 3: c,a,b
그룹 4: a,c,b
그룹 5: b,a,c
그룹 6: c,b,a
모든 투약 그룹은 10mg/kg BH4를 경구로 다음과 같이 받았다:
a: 금식 상태 하에서 음식 없이 정제(들)를 물에 용해한 후 투여함
b: 금식 상태 하에서 음식 없이 정제(들) 그대로를 투여함
c: 식이 상태에서 고-칼로리, 고-지방 식사를 섭취하기 시작 30분 후 정제(들) 그대로를 투여함
각 피시험자는 각 치료 기간 동안 10mg/kg의 BH4 1회 용량을 받았다. 각 용량 투여 사이에 최소 7일간의 세척(washout) 기간이 있었다. 시험 후 평가는 3번째 치료 기간이 끝나고 5-7일 후 수행되었다. 약물 동태(PK) 분석을 위한 혈액 샘플은 각 시험 기간 동안 계획된 채혈 시간에 뽑았다: 투약 전 30분 이내, 및 투약 후 0.5, 1.0, 1.5, 2.0, 2.5, 3.0, 3.5, 4.0, 5.0, 6.0, 8.0, 10.0, 12.0, 18.0, 및 24.0.
투여 용량 및 방법
BH4 정제는 치료 기간 당 10mg/kg 용량으로 투여되었다. 정제는 a) 금식 상태에서 물에 용해되어, b) 금식 상태에서 정제 그대로로, 또는 c) 식이 상태에서 정제 그대로로 투여되었다.
시험 약물의 각 용량은 물과 혼합된 액체(용액) 형으로 제조되고 투여되었다. 공급된 물은 주변 온도의 맹물이었다. 투여 용액은 계획된 투여 시간의 15분 이내에 제조되었다. 정제가 액체에 용해되는데에는 대략 1 내지 3분이 소요되었다. 상기 정제는 용해 속도를 향상시키기 위해 용해 전에 투약 컵에서 부수어지거나 뭉개졌다.
계획된 아침 투여 시간에, BH4는 120mL의 물이나 오렌지 주스에 용해되어 10mg/kg과 동등한 정제의 양으로 경구 투여되었다. 각 피시험자는 조제 15분 이내에 전체 120mL 용량을 거의 소비하는 것으로 관찰되었다. 상기 용량이 소비된 후 즉시, 상기 투약 컵은 60mL의 물로 헹구어졌고, 피시험자는 그 헹굼물을 소비하였다. 두 번째 60mL 물이 투약 컵에 부가되었고, 이후 피시험자는 두 번째 헹굼물을 소비하였다. 상기 전체 투여 과정은 1분 기간에 마쳐졌다. 자격 있는 스태프가 상기 투여를 마친 후 즉시 투약 컵 및 각 피시험자의 입을 조사하여 전체 용량이 소비되었음을 보증하였다, 선택적으로, 상기 피시험자는 물이 용해된 것이 아닌 BH4를 포함한 환제를 삼켰다. 각 개개인에게서, 상기 투여 기간은 투여 사이에 최소 7일의 간격을 가졌다.
음식 섭취 스케줄
스낵이 체크-인 하였던 저녁에 제공되었다. 모든 피시험자들은 이후 투여 전 최소 10시간 동안 금식이 요구되었다.
금식 상태
금식 조건 하에서 투여 치료를 받은 피시험자들은 밤새 먹지 않고 최소 10시간이 지난 후 투여받았다.
상기 피시험자들은 투여 후 4시간 동안 금식을 유지했다. 투약 전 1시간 내지 투약 후 1시간을 제외하고는 시험 동안 물은 자유롭게 허용되었다. 표준화된 식사가 약물 투여 대략 4 및 10시간 후 및 이후 적절한 시간에 제공되었다.
비-금식 상태
비-금식 상태 하에서 투여 치료를 받은 피시험자들은 고-칼로리, 고-지방 아침 식사를 소비한 후 투여받았다. 피시험자는 투여 스케줄 전 30분에 시작되어 투여 전 5분 이내에 마친(마지막 씹은 것), 표준 고-지방(대략 식사 총 칼로리 내용의 50%), 고-칼로리(대략 1000 칼로리) 아침 식사 후에 투여 받았다.
버터로 한 달걀 프라이 2개
베이컨 2 조각
버터 발린 토스트 2조각
해쉬 브라운 포테이토 4온스
전지 우유 8온스
본 식사는 대략 150 단백질 칼로리, 250 탄수화물 칼로리, 및 500-600 지방 칼로리를 포함했다. 동등한 식사가 메뉴 및 칼로리 내용 기록과 함께 대체되었다.
이후 피시험자는 투약 후 4시간 동안 금식하였다. 투약 전 1시간 내지 투약 후 1시간을 제외하고는 시험 동안 물은 자유롭게 허용되었다. 표준화된 식사가 약물 투여 후 대략 4와 10시간 및 이후 적절한 시간에 제공되었다.
치료 기간
3번의 1회-용량 치료 기간은 각각 최소 7일의 간격을 가졌다.
사후 방문이 마지막 치료 방문 후 5 내지 7일에 행해졌다.
안전성 변수: 평가 및 방법
적어도 1번 이상 BH4를 투여받은 모든 환자에 대해 안전성이 평가되었다.
평가된 효과와 안전성 측정 및 플로 차트
안전성은 부작용의 발생, 12-리드(lead) ECG 파라미터의 변화, 바이탈 사인 및 신체 검사 결과, 및 실험실 테스트 값의 베이스라인(baseline) 변화에 의해 평가되었다. 이러한 평가 스케줄은 도 22에 나타난다.
신체 검사 및 바이탈 사인
각 피시험자는 시험자에 의해 통상의 신체 검사를 받았다. 신체 검사는 머리, 눈, 귀, 코, 목구멍, 목, 심장, 가슴, 폐, 배, 사지, 말초 맥박, 신경 상태, 피부 및 다른 평가되어야할 신체 상태에 대한 평가를 포함했다. 본 시험 프로토콜은 비뇨 생식기 검사는 요구하지 않았다.
키(센티미터) 및 체중(킬로그램)이 측정되었고 체질량지수(BMI)가 계산되었다(BMI = 체중(kg)/[키(m)]2).
혈압이 미국 심장 협회 기준에 따라 앉은 자세에서 측정되었다. 혈압이 측정될 때 피시험자는 앉은 자세에서 5분 동안 바닥에 발을 놓고 쉬었다.
심장(맥박) 속도는 피시험자가 앉은 자세에 있는 동안 측정되었다.
규격화된 12-리드 심전도(ECG) 기록이 스크리닝과 시험 수행 때 취해졌다. ECG들은 자격 있는 조사원들에 의해 평가되었다. ECG 카피 및 평가 보고서는 각 피시험자 파일 중 일부로 유지되었다.
병력, 임상 실험실 테스트 결과 및 ECG 추적(들)은 주 조사원에 의해 리뷰되고 평가되어 본 시험에 참가한 각 피시험자의 임상 적격을 평가하였다.
임상 실험실 평가
혈액학
다음이 평가되었다: 헤모글로빈, 적혈구 용적률(hematocrit), 전체 및 특이한 백혈구 숫자, 적혈구(RBC) 및 혈소판 숫자.
이에 부가하여, 혈액은 B형 간염 표면 항원, C형 간염 항체 및 인간 면역 결핍 바이러스(HIV)에 대해 테스트되었다.
화학:
다음이 평가되었다: 알부민, 혈중뇨질소(BUN), 크레아틴, 총 빌리루빈, 알칼라인 포스페이트(ALP), 아스파테이트 트랜스미나제(AST), 알라닌 트랜스미나제(ALT), 소듐(Na+), 포타슘(K+), 클로라이드(Cl-), 락틱 디하이드로게나제(LDH), 요산, 및 글루코즈.
뇨 분석:
다음이 뇨 계량법에 의해 평가되었다: pH, 비중, 단백질, 글루코오스, 케톤, 빌리루빈, 혈액, 아질산염, 및 우로빌리노겐. 만일 단백질, 잠혈, 또는 아질산염 수치가 범위 밖이라면, 현미경 검사가 수행된다.
뇨 샘플은 또한 약물 오용(암페타민, 바비튜레이트, 벤조디아제핀, 카나비노이드, 코카인 및 아편)에 대해 테스트되었다.
부작용
본 시험에서, 부작용(AE)은 피시험자 또는 임상시험 피시험자에게 어떤 용량으로 BH4를 투여하였을 때, 약물이 부작용과 인과 관계가 있는지 여부를 불문하고 뜻밖의(untoward) 의학적 증상으로 정의되었다. 그러므로 부작용은 BH4와 관련 있는지를 불문하고, 우호적이지 않으며 의도하지 않은 것으로 BH4의 사용과 임시적으로 관련된 사인(비정상적 실험실 발견을 포함), 증상, 또는 질환일 수 있다. 본 정의는 중간에 생긴 질환 또는 손상 및 예전에 존재한 상태의 악화(빈도, 심각도 또는 특이성의 증가)를 포함했다.
부작용의 보고 기간은 BH4의 첫 투여로 시작하였다. 심각한 부작용(SAEs)에 대한 보고 기간은 정보 제공 동의 사인한 때부터 더 빨리 시작했다. SAEs는 본 섹션에서 이후 정의되었다. 시험자는 해결될 때까지 모든 AEs를 모니터하거나, 만일 AE가 만성적인 것으로 판정된 경우라면, 원인을 확인하였다. 만일 AE가 시험 말미에 해결되지 않은 것으로 남아 있는 경우에는, PI 및 의료 모니터가 AE의 계속된 추이에 정당한 근거가 있는지 여부에 따라 임상 평가를 하였고, 그 결과를 기록하였다. AEs 및 SAEs의 평가 중 심각도의 평가는 시험자의 책임 중 하나였다. 시험자는 그 또는 그녀의 임상 판단을 적용하여 BH4에 대한 각 AE의 인과 관계를 평가할 책임이 있었다.
심각한 부작용
심각한 부작용(SAE)는 다음의 결과 중 최소한 하나를 가지는 부작용(AE)으로 정의되었다:
사망 야기
생명 위협, 즉 피시험자가 발생한 부작용에 의해 즉각적인 사망의 위기에 놓임
본 정의는 보다 심각한 형에서 발생한, 사망의 원인이 될 수 있었던 반응을 포함하지 않았다
매우 입원하고 싶거나 당시 입원을 연장해야 하는 필요성
AE의 결과로 인한 병원의 입원 허가, 만일 피시험자가 동일한 날 퇴원했다하더라도 입원으로 취급한다. 응급실 방문은 입원으로 인정되지 않았다.
지속적이거나 중요한 장애 또는 능력 상실의 야기
만일 피시험자의 일상적인 삶을 영위할 능력이 실질적으로 붕괴한 것과 관련되는 경우 지속적이거나 중요한 장애 또는 능력 상실로 취급되는 증상이다. 본 정의는 상대적으로 부수적이거나 일시적으로 의학적 의미 있는 것을 겪은 것을 포함할 의도는 아니었다.
선천적인 변형 또는 선천적 기형, 즉, 수태 전 또는 임신 중에 시험 약물에 노출된 피시험자의 아이 또는 태아에게 발생한 AE
상기 기준 중 어느 하나를 충족하지 않는 중요한 의학 증상이지만, 피시험자를 위험에 빠트릴 수 있었거나 상기 나열된 결과 중 하나를 예방하기 위해 의학적 또는 외과적 개입이 요구된 경우
상기 결과 중 하나 이상을 어떤 특정 증상에 적용할 수 있었던 경우
측정의 적정성
본 시험에서 안전성의 측정은 통상적인 신체 검사, 바이탈 사인, 부작용 발생 및 심각도, 및 임상 및 실험실 처리였다.
약물 농도 측정
혈액(플라즈마) 약물 동태 특성은 시험 약물의 각 투여 후 평가되었다. 모든 피시험자들은 투약 후 4시간 동안 직립 자세로 앉아 있었다. 혈액 샘플은 투여 30분 전 및 투여 후 0.5, 1.0, 1.5, 2.0, 2.5, 3.0, 3.5, 4.0, 5.0, 6.0, 8.0, 10.0, 12.0, 18.0, 및 24.0 시간에 채취되었다. 샘플은 적절히 라벨된 6mL K2-EDTA 퍼플 탑 배큐테이너?(Vacutainer?) 시험관에 채집되었다. 혈액 샘플은 4℃에서 10분 동안 약 3000rpm으로 원심분리되었다. 결과 플라즈마로부터 정확히 1mL가 피펫을 사용하여 각 샘플에서 제거되었고, 0.1% w/v 디티오에리스리톨을 포함하는 시험관에 나누어 두었다. 상기 샘플은 마개로 막고 VWR 미니 보르텍서(Vortexer)를 속도 6으로 사용하여 약 10초간 회전시켰다. 이러한 단계를 마친 후에, 상기 샘플을 이소프로필/건조 아이스 배스(bath)에서 초냉동(flash frozen)하고 분석 중 -70℃ 냉동실에 두었다.
대략 80mL의 혈액이 각 치료 기간 동안 PK 분석을 위해 채취되었다(시간대별 5mL).
약물 동태:
플라즈마 BH4 농도-시간 데이터의 약물 동태(PK) 분석은 다음의 PK 파라미터 추정치를 얻기 위해 비-구획적 방법을 사용하여 수행되었다:
내삽법을 사용하지 않고 데이터로부터 직접 얻은 피크 플라즈마 농도(Cmax) 및 피크 농도에 이르는 시간(Tmax).
최종 플라즈마 농도의 로그-선형 회귀에 의해 결정된 명백한 최종 제거 속도 상수, λz
선형 사다리꼴 법에 의해 계산된 0시간에서 최종 측정 가능한 농도 시간까지의 플라즈마 농도-시간 곡선 하 면적[AUC(0-t)];
0.693/λz로 계산된 명백한 제거 반감기(t1/2);
0시간에서 무한까지의 플라즈마 농도-시간 곡선 하 면적[AUC(inf)], 상기에서 AUC(inf) = AUC(0-t) + Ct/λz이고 Ct는 마지막 측정 가능한 농도이다.
흡수 비율 추정
피시험자에게 BH4의 10mg/kg 경구 또는 정맥 투여가 주어졌고, 뒤이어 플라즈마 총 바이오프테린 농도 증가(△Cp)-시간 곡선 하 면적(△AUC)으로부터 위장관 트랙에서의 BH4 흡수 비율을 결정하기 위해 총 바이오프테린 농도의 연속 측정이 있었다. 동일한 수준의 생체 이용률을 달성하기 위해 BH4가 경구로 투여될 때에 비해 정맥으로 투여될 때에는 더 낮은 용량의 BH4가 요구되는 것으로 예상되었다. 예를 들어, 정맥으로 투여될 때의 1mg/kg BH4과 동일한 수준의 생체 이용률을 이루기 위해서 10mg/kg의 BH4가 경구로 주어질 것이 요구될 수 있다. 투여 방법이 생체 이용률을 강화한 덕분에 BH4 1mg/kg 정맥 투여와 동일한 생체 이용률을 이루기 위해 단지 5mg/kg의 BH4만이 필요할 수 있다.
BH4 투여 후 위장관에서의 BH4 흡수 비율은 플라즈마 총 바이오프테린 농도 증가(△Cp)-시간 곡선 하 면적(△AUC)으로부터 다음 공식을 사용하여 추정되었다:
AUC로부터 추정
흡수 비율 (%) = (경구 투여 후 △AUC / 정맥 투여 후 △AUC) × (정맥 투여량/경구 투여량 × 100)
통계적 방법:
BH4에 대한 약물 동태 파라미터 Cmax, AUC(0-t), 및 AUC(inf)의 비교는 독립 변수인 파라미터의 자연로그를 사용한 변수 분류로서 시퀀스, 시퀀스 내의 피시험자, 치료, 및 기간으로 변수 분석(ANOVA) 모델을 사용하여 행해졌다. 금식 상태에서 용해된 정제 및 정제 그대로와 식이 및 금식 상태에서 정제 그대로 간의 이익 비교가 있었다.
최소 2 개의 시험 기간을 마친 모든 피시험자로부터 얻은 데이터를 PK 통계 분석에 포함했다. 시험 약물을 1번 이상 받은 모든 환자들이 안전성 분석에 포함되었다.
모든 PK 및 관계된 통계 분석은 윈도우? 버전 9.1.3 또는 그보다 높은 버전을 위한 SAS?를 사용하여 행해졌다.
본 시험의 목적을 총족할 만큼 충분한 신뢰를 제공하기 위해, 샘플 사이즈는 각 3번의 치료 기간을 가진 약 30명이었고, 이득 차이 비교의 추정치를 제공하기에 적합한 것으로 여겨졌다, 형식적 샘플 사이즈 계산은 행해지지 않았다.
결과
약물 동태
정제 그대로 대 용해된 정제
BH4의 평균 플라즈마 농도는 BH4가 정제 그대로일 때보다 용해된 정제로 투여될 때 더 낮았다(도 23 및 24). 평균 Cmax는 AUC(0-t) 및 AUC(inf)의 평균값과 마찬가지로 정제 그대로일 때 더 높았다(도 25). 상기 정제 그대로 대 용해된 정제의 기하학적 평균 비율은, 118% 내지 121% 범위이었고, 관련 90% 신뢰 구간의 상한은 125% 보다 컸으며(도 26), 정제 그대로가 고-칼로리, 고-지방 식사와 함께 투여될 때 흡수는 용해된 정제 및 정제 그대로 투여 간의 흡수와 차이가 통계적으로 의미 있는 증가를 나타낸다. Tmax의 중앙값과 범위는 용해된 정제와 정제 그대로에 대한 것과 본질적으로 동일하였고(도 25), 정제 그대로에서 보여지는 증가가 흡수 비율이 아니라 정도의 차이라는 것을 나타낸다.
약물 흡수에 대한 고-칼로리,고-지방 음식의 영향
예상한대로, 표준 고-지방 고-칼로리 식사와 함께 한 정제 그대로의 투여는 평균 플라즈마 BH4 농도(도 23) 및 Cmax, AUC(0-t), 및 AUC(inf)의 평균 값(도 25)의 실질적인 증가를 야기했다. 기하학적 평균 비율(식이-대-금식)은 126% 내지 139% 범위였으며, 결론적으로, 관련 90% 신뢰 구간의 상한은 125% 이상이었고, 정제 그대로와 비교할 때 흡수에 대한 음식의 영향에서 통계적으로 유의한 차이를 나타냈다. Tmax의 중앙값 및 범위는 식이 및 금식 상태 하에서 필연적으로 동일하였으며(도 25), 이는 음식과 함께일 때 보여지는 증가가 흡수의 비율이 아니라 정도이었다는 것을 암시한다.
안전성:
본 시험에서 심각한 부작용(SAEs)은 없었다. 5명의 피시험자에게 총 9건의 부작용(AEs)이 보고되었다. 이 9건 AE 중 8건은 가벼운 것으로 평가되었고 1건은 심각도에 있어 중등도로 평가되었다. 가장 흔한 AE는 두통이었다; 1명의 피시험자는 시험 약물과 관련 없는 것으로 평가된 중등도의 두통을 겪었고, 1명의 피시험자는 두 가지 원인에 의한 가벼운 두통을 겪었는데, 2가지 모두 관련 가능성이 있다고 평가되었다. 모든 경우에 있어, 5건의 부작용은 관련이 없는 것으로 판단되었고 4건은 시험 약물과 관련 가능성이 있는 것으로 판단되었다. 시험 종결 평가, ECG 및 신체 검사 평가는 어떤 임상적 유의점 발견이 없을 때 종결되었다.
결론:
정제 그대로로 BH4의 투여는 용해된 정제에 비해 흡수 정도가 대략 20% 증가하는 결과를 낳았다.
식이 상태 하에서 고-칼로리, 고-지방 식사와 함께 정제 그대로로 BH4를 투여하는 것은 금식 상태에 비해 흡수 정도가 대략 30% 증가하는 결과를 낳았다.
어떤 임상적으로 유의할만한 이슈 및 안전성 파라미터 안전성 이슈도 본 시험 집단에서 확인되지 않았다. 본 연구에서 심각하다고 여겨지는 AE는 없었다. 보고된 9건의 AEs 중에서, 오직 한 건 있은 두통의 경우 가벼웠으며, 시험 약물과 무관한 것으로 평가되었다. 피로와 두통의 경우 시험 약물과 관련 가능성이 있는 유일한 AE이었으나 심각도에 있어 가벼운 것으로 평가되었다.
실시예 4
BH4의 생체 이용률을 강화하기 위한 제형 접근
2개의 대조 제형(BH4 정맥 투여 제형 및 경구용 BH4 정제 용액)과 6개의 시험 제형이 동물 시험에서 테스트를 위해 선택되었다. 각 제형 기본형(prototype)은 BH4 80mg 또는 100mg을 포함했다.
BH4 정맥 투여 제형
표 3은 정맥 투여 제형의 조성을 목록화하였다. 만니톨이 받았을 때 사용된 한편, BH4는 사용 전에 320 메쉬(mesh) 스테인레스 스크린을 통과하였다. 본 제형은 병에 분말이 충전되었고 투여 전에 멸균 주사용수를 사용하여 만들어졌다. 각 병은 흰색 고-밀도 폴리에틸렌(HDPE) 스크류 뚜껑을 가진 투명한 폴리에틸렌 테레프탈레이트 코폴리에스터(PETG) 병에 100mg의 BH4와 5g의 만니톨을 포함했다. 투여 전에, 상기 제형은 멸균 주사용수 100mL를 사용하여 만들어 최종 농도 1mg/mL를 수득했다. 상기 정맥 투여 제형은 병에 건조 분말로 제공되었고, 각 병은 API 및 만니톨을 포함했다. 상기 분말은 정맥 경로로 투여되기 전에 멸균 주사용수에 용해되고, 여과되었다.
BH4 정맥 제형 조성
성분 %(w/v) mg/mL
BH4 0.1 1.0
만니톨(낮은 내독소)USP/Ph.Eur. 5.0 50.0
멸균 주사용수 qs 100mL qs 1mL
경구 용액을 위한 BH4 정제
표 4는 경구 용액 제형을 위한 조성을 목록화한다. 10개의 BH4 정제(100mg)가 흰색 HDPE 마개를 가진 눈금 있는 125mL PETG 병에 놓여졌다. 투여 전에, 상기 제형은 100mL 주사용수로 최종 농도 10mg/mL를 수득했다.
BH4 정제 100mg 조성
성분 %(w/w) mg/정제
BH4 33.33 99.99
아스코르브산, USP/EP 1.67 5.01
크로스포비돈, USP/EP 4.5 13.5
무수 디칼슘 포스페이트, USP/EP 2.18 6.54
만니톨(파르텍 M 200), USP/EP 57.06 171.18
리보플라빈 유니버셜, USP/EP 0.01 0.03
소듐 스테아릴 푸마레이트(PRUV), NF/EP 1.25 3.75
전체 100.00 300.00
낮은 위-장관 운동성을 가진 제형 기본형
표 5는 지연된 위장 배출 시간 기본형의 조성을 목록화한다. BH4는 사용 전에 #20 메쉬 스테인레스 스틸 스크린을 통과하였다. 카프멀(Capmul) GMO-50이 37℃ 워터 배스에서 용융되었다. BH4와 아스코르브산의 무게를 재었고 격렬하게 교반되는 동안 용융된 카프멀에 서서히 부가되었다. 상기 고체 분산은 피펫을 사용하여 사이즈 #2 캡슐 내로 드랍 방식으로 부가되었다. 3개의 충전된 캡슐이 열-유도 봉인 마개를 가진 100cc 고밀도 폴리에틸렌(HDPE)에 놓여졌다.
BH4의 지연된 위 배출 시간 경구 캡슐 제형 조성
성분 %(w/w) mg/캡슐
BH4 25 80
글리세릴 모노/디-올레이트(카프멀 GMO-50) 65 208
아스코르브산 미세 분말 10 32
전체 100 320
바이오흡착 기본형
표 6은 바이오흡착 기본형 조성을 목록화한다. 카르보폴 71G를 제외한 모든 물질은 #20 메쉬 스테인레스 스틸 스크린을 통과하였다. 모든 물질의 무게를 재었고 지퍼-잠김 마개가 있는 비닐백에 부가되었으며, 이후 혼합물이 균일하게 보일 때까지 수분 동안 흔들어졌다. 상기 분말은 글로브 파마(Globe Pharma) MTCM-Ⅰ 매뉴얼 프레스 상에서 600 psi로 1/4" 표준, 둥근, 오목한, 평평한 면의 B 도구를 사용하여 정제 내로 압축되었다. 3개의 정제가 실리카 겔 건조제 통과 함께 열-유도 봉인 마개를 가진 100cc HDPE에 팩킹되었다.
BH4 바이오흡착 경구 정제 제형 조성
성분 %(w/w) mg/정제
BH4 48.5 80.00
카르보폴 71G 20.0 32.99
폴리카르보필(노베온 AA1) 20.0 32.99
아스코르브산 미세 분말 10.0 16.49
소듐 스테아릴 푸마레이트(PRUV) 1.5 2.47
전체 100.0 164.94
서방 기본형
표 7은 원숭이에게 테스트된 서방 기본형 조성을 목록화한다. 메토셀 K100M 프리미엄 CR을 제외한 모든 물질이 #20 메쉬 스테인레스 스틸 스크린을 통과하였다. 모든 물질의 무게를 재었고 지퍼-잠김 마개가 있는 비닐백에 부가되었으며, 혼합물이 균질하게 보일 때까지 수분 동안 흔들어졌다. 상기 분말은 글로브 파마 MTCM-Ⅰ 매뉴얼 프레스 상에서 1200 psi로 1/4" 표준, 둥근, 오목한, 평평한 면의 B 도구를 사용하여 정제 내로 압축되었다. 정제가 실리카 겔 건조제 통과 함께 열-유도 봉인 마개를 가진 100cc HDPE에 팩킹되었다.
BH4 서방 정제 제형 조성
성분 %(w/w) mg/정제
BH4 53.5 80.00
메토셀 K100M 프리미엄 CR 35.0 52.34
아스코르브산 미세 분말 10.0 14.95
소듐 스테아릴 푸마레이트(PRUV) 1.5 2.24
전체 100.0 149.53
양성자 공여 폴리머 기본형
표 8은 원숭이에게 테스트된 양성자 공여 폴리머 기본형 조성을 목록화한다. 유드라짓(Eudragit) L100-55 및 콜리돈(Kollidon) CL을 제외한 모든 물질이 #20 메쉬 스테인레스 스틸 스크린을 사용하여 미리-스크린되었다. 모든 물질의 무게를 재었고 지퍼-잠김 마개가 있는 비닐백에 부가되었으며, 혼합물이 균질하게 보일 때까지 수분 동안 흔들어졌다. 미리 무게를 잰 분량의 분말이 사이즈 #2 캡슐 내로 충전되었다.
코팅 용액은 유드라짓 L100-55 및 카르보왁스 PEG 4600를 에틸 알코올 내 용해하여 제조되었다. 상기 유드라짓 L100-55 및 카르보왁스 PEG 4600의 무게를 재었고 눈금 있는 125mL 폴리에틸렌 테레프탈레이트 코폴리에스터 병(PETG)에 부가되었다. 상기 에틸 알코올은 PETG 병에 부가되었고, 이는 용액이 투명해질 때까지 초음파 분해되면서 40℃ 워터 배스에 놓여졌다.
파우더 충전된 캡슐은 수동으로 코팅 용액 내로 담궈졌고 40℃에서 20분 동안 건조되었다. 상기 건조된 캡슐의 무게를 재었고 이후 잔여 찌꺼지를 제거하기 위해 실로이드(Syloid) FP244에서 굴려졌다. 3개의 캡술이 열-유도 봉인 마개를 가진 100cc HDPE 병에 팩킹되었다.
BH4 양성자 공여 캡슐 제형 조성물
캡슐 조성물 성분 %(w/w) mg/캡슐
BH4 40.0 80
유드라짓 L100-55 44.5 89
크로스포비돈(콜리돈 CL) 4.0 8
아스코르브산 미세 분말 10.0 20
소듐 스테아릴 푸마레이트(PRUV) 1.5 3
전체 100.0 200
캡슐 코팅 조성물 성분 %(w/w) mg/캡슐1
유드라짓 L100-55 5.0 ND
폴리에틸렌 글리콜 4600(카르보왁스 센트리) 5.0 ND
에틸 알코올, 200 프루프 100mL ND
1 캡슐 코팅 및 40℃ 오븐에서 건조 후, 상기 캡슐은 폴리머 코팅 중 약 1 내지 3% 중량을 얻음.
ND = 판별되지 않음
부형 전달 시스템
표 9는 부형 전달 시스템 조성을 목록화한다. 유드라짓 L100-55를 제외한 모든 물질은 #20 메쉬 스테인레스 스틸 스크린을 통과하였다. 본 정제 기본형은 3개의 층을 포함한다; 약물 성분이 포함된 중간층은 2개의 물-불용성 외층 사이에 끼여있었다. 안쪽 및 바깥 물질의 무게를 재었고 지퍼-잠김 마개가 있는 비닐백에 분리되어 부가되었으며, 이후 혼합물이 균질하게 보일 때까지 흔들어졌다.
2개의 외층(각 12mg) 및 내층(14.5mg)의 무게를 재었다. 외층 중 하나가 상기 프레스에 부가되었고, 뒤이어 내층, 이후 마지막 외층이 프레스에 부가되었다. 상기 층은 그로브 파마 MTCM-Ⅰ 매뉴얼 프레스 상에서 200 psi로 3/16" 둥근, 경사진, 평평한 면의 B 도구를 사용하여 정제 내로 압축되었다.
코팅 용액은 에토셀(Ethocel)과 PEG 4600을 에틸 알코올 및 정제된 물 혼합물에 용해시켜 제조되었다. 상기 성분은 PETG 병에 부가되었고, 이는 혼합되었으며 용액이 투명해질 때까지 초음파 분해되면서 40℃ 워터 배스에 놓여졌다.
상기 정제는 수동으로 코팅 용액 내로 담궈졌고 40℃에서 20분 동안 건조되었다. 각 정제를 코팅 후 다시 무게를 재었다. 7개의 정제가 각 사이즈 #2 연장된 캡슐 내에 놓여졌다. 3개의 캡슐이 열-유도 봉인 마개를 가진 100cc HDPE 병에 팩킹되었다.
BH4 부형 투약 제형 조성
외층 1 및 3 성분 %(w/w) mg/정제
유드라짓 L100-55 49.5 5.94
스테아르산 49.5 5.94
소듐 스테아릴 푸마레이트(PRUV) 1.0 0.12
전체 100.0 12.00
중간층 2 성분 %(w/w) mg/정제
BH4 79.0 11.46
스테아르산 10.0 1.45
아스코르브산 미세 분말 10.0 1.45
소듐 스테아릴 푸마레이트 1.0 0.15
전체 100.0 14.51
캡슐 내 7개 정제 성분 %(w/w) mg/캡슐
BH4 29.8 80.19
스테아르산 34.6 93.31
아스코르브산 미세 분말 3.8 10.15
유드라짓 L100-55 30.8 83.16
소듐스테아릴 푸마레이트(PRUV) 1.0 2.70
전체 100.0 269.51
정제 코팅 용액 성분 %(w/w) mg/캡슐1
에토셀 표준 10FP 5.0 ND
카르보왁스 PEG 4600 5.0 ND
에탄올 200 프루프 95mL ND
정제수 5.0mL ND
1 캡슐 코팅 및 40℃ 오븐에서 건조 후, 상기 캡슐은 폴리머 코팅 중 약 3 내지 8% 중량을 얻음.
ND = 판별되지 않음
가스 생성 부형 전달 시스템
표 10.은 가스 생성 부형 전달 시스템 조성을 목록화한다. 본 제형은 가스-생성 외층으로 둘러싸이고 약물 성분을 포함한 코어 정제로 구성된다. 소듐 바이카보네이트 및 메토셀 K100M CR을 제외한 모든 물질은 #20 메쉬 스테인레스 스틸 스크린을 사용하여 미리 스크린되었다. 상기 안쪽 코어 및 외층 물질의 무게를 재었고 지퍼-잠김 마개를 가진 비닐 백에 분리되어 부가되었으며, 닫고 혼합물이 균질하게 보일 때까지 흔들어졌다. 상기 안쪽 코어용 블렌드된 분말(35mg)은 그로브 파마 MTCM-Ⅰ 매뉴얼 프레스 상에서 800 psi로 1/8" 둥근, 경사진, 평평한 면의 B 도구를 사용하여 정제 내로 압축되었다.
코팅 용액은 에토셀 및 PEG 4600을 사용하여 에틸 알코올에 용해시킴으로써 제조되었다. 상기 안쪽 코어 정제는 수동으로 코팅 용액 내로 담궈졌고 40℃에서 20분 동안 건조되었다. 외층용 블렌드된 분말(40mg)의 무게를 재었다. 1/2이 상기 프레스에 부가되었고, 다음으로 안쪽 코어 정제, 이후 외층의 두 번째 1/2이 프레스에 부가되었다. 상기 정제는 그로브 파마 MTCM-Ⅰ 매뉴얼 프레스 상에서 800 psi로 3/16" 둥근, 경사진, 평평한 면의 B 도구를 사용하여 압축되었다. 4개의 정제가 각 사이즈 #2 캡슐 내에 놓여졌다.
가스 생성 부형 투약 제형 조성
안쪽 정제 코어 성분 %(w/w) mg/정제
BH4 58.3 20.39
아스코르브산 미세 분말 19.4 6.80
HPMC K100MCR 19.4 6.80
소듐스테아릴 푸마레이
트(PRUV)		 2.9 1.02
전체 100 35.01
바깥 정제 층 성분 %(w/w) mg/정제
HPMC K100MCR 46.1 18.46
무수 시트르산 34.2 13.68
소듐 바이카보네이트 17.1 6.84
소듐스테아릴 푸마레이트 2.6 1.03
전체 100 40.01
캡슐 내 4개 정제 성분 %(w/w) mg/캡슐
BH4 27.2 81.55
아스코르브산 미세 분말 9.1 27.18
HPMC K100MCR 33.7 101.03
무수 시트르산 18.2 54.70
소듐 바이카보네이트 9.1 27.35
소듐 스테아릴 푸마레이트 2.7 8.18
전체 100 299.99
코팅 용액 성분 %(w/w) mg/캡슐1
에토셀 표준 10 FP 5.0 ND
1 캡슐 코팅 및 40℃ 오븐에서 건조 후, 상기 캡슐은 폴리머 코팅 중 중량을 얻음.
ND = 판별되지 않음
바이오흡착 과립 기본형
표 11은 바이오흡착 과립 기본형의 조성을 목록화한다. 메토셀 K100M CR을 제외한 모든 물질이 #20-메쉬 스테인레스 스틸 스크린을 사용하여 미리 스크린되었다. 소듐 스테아릴 푸마레이트(PRUV)를 제외한 모든 물질의 무게를 재었고 사이즈 #1 제립기 보울(LB Bohle 미니 제립기 BMG) 내에 놓여졌다. 상기 분말은 혼합물이 균질하게 보일 때까지 5분 동안 속도 300rpm의 임펠러(impeller) 및 속도 2500rpm의 차퍼(chopper)에서 혼합되었다. 임펠러와 차퍼의 속도를 유지하면서, 5mL 에틸 알코올을 과립이 형성될 때까지 혼합물에 드랍 방식으로 부가하였다. 젖은 덩어리를 과립 보울에서 제거하고 18-메쉬 스테인레스 스틸 스크린을 통하여 스크린하였다. 상기 과립을 모으고 40℃ 오븐에 두어 1시간 동안 건조하였다. 건조 과립의 손실은 1시간 건조 후에 1.93%로 판별되었다. 과립의 무게를 재었고 지퍼-잠김 마개가 있는 비닐 백 내에 놓여졌다. 소듐 스테아릴 푸마레이트(PRUV)가 백 내 건조된 과립에 부가되었다. 상기 백을 닫고 소듐 스테아릴 푸마레이트(PRUV)가 과립 속에 잘 분배된 것으로 보일 때까지 흔들었다. 상기 과립의 무게를 재었다(134mg). 사이즈 2 연장된 캡슐을 과립 부분과 부분적으로 수소화된 식물성 오일(350μL)의 방울로 번갈아 충전하였다. 3개의 캡슐이 열-유도 봉인 마개를 가진 100cc HDPE 병에 팩킹되었다.
BH4 바이오흡착 과립 캡슐 제형 조성
성분 %(w/w) mg/캡슐
BH4 60 80.00
메토셀 K100M CR 19 25.33
카르보폴 971 10 13.33
아스코르브산 미세 분말 10 13.33
소듐 스테아릴 푸마레이트(PRUV) 1 1.33
푸레코 HSC-1 오일 350μL
전체 100 133.33
시험관 내(In Vitro) 약물 방출
정제에 대한 시험관 내 약물 방출 테스트는 Aglient UV-비져블 스펙트로스코피 시스템(Aglient Technologies, 산타클라라, 캘리포니아)와 함께 디스텍(Distek) 2100C 용해 테스터(디스텍, 인크., 북 브룬스윅, 뉴저지)를 사용하여 USP 27 장치 Ⅱ 설명서에 따라 행해졌다. BH4 방출 테스트에 사용된 용해 매질은 900mL의 0.1N HCl이었다. 용해 테스트 동안, 각 용기의 매질은 37°±0.5℃로 유지되었고 50rpm에서 교반되었다. 5mL의 샘플 부피는 미리 정해진 시간대에 취해졌다. 샘플 내 BH4의 농도를 결정하기 위해서, 각 샘플 중 250μL가 500μL의 0.1N HCl로 희석되었고 상기 흡수는 UV 스펙트로미터(8453 UV-비져블 스펙트로포토미터, Aglient technologies, 산타 클라라, 캘리포니아)를 사용하여 265nm에서 측정되었다. 상기 데이터는 켐스테이션 소프트웨어(Rev. A.09.01[76], 산타클라라, 캘리포니아)를 사용하여 수집되었다. 모든 용해 테스트는 3번씩 행해졌다.
정제 부력 테스트
부형 기본형 정제의 부력은 25-50mL의 0.1 HCl이 담긴 플라스틱 컵에 정제를 넣음으로써 먼저 판정되었다. 본 테스트는 정제가 부유하기 위해 필요한 시간뿐만 아니라 교반 없이 그들의 부유가 지속되는 시간을 결정한다. 4시간 이상 부유한 기본형은 용해 테스트에 들어갔다. 용해 테스트 동안 정제의 부력은 패들 법을 사용하여 회전 속도 50rpm에서 판정되었다. 정제의 상태가 여러 시간대에서 육안으로 체크되었다.
분해 테스트
분해 테스트는 디스텍 3100 시리즈 분해 테스터(디스텍 인크., 북 브룬스윅, 뉴저지)를 사용하여 USP-27 분해 테스트 설명서에 따라 행해졌다. 사용된 분해 매질은 900mL의 0.1N HCl 또는 900mL의 0.2M 포타슘 포스페이트 pH 5.8이었다. 분해 테스트 동안 용기 내 매질은 37°±0.5℃로 유지되었다. 상기 정제 및 캡슐은 분해에 대해 시각적으로 관찰되었다.
정제 경도 테스트
정제 경도는 슈레우니걸 박사(Dr. Schleuniger) 파마톤 8M 정제 경도 테스터(Dr. Schleuniger? 파마톤 인크., 맨체스터, 뉴햄프셔)를 사용하여 판정되었다. 상기 정제는 경도 테스터의 입구에 놓여졌고, 상기 경도는 킬로폰즈(Kp)로 측정되었다.
정제 두께
정제의 두께는 미투토요 디지매틱 인디케이터(Mitutoyo Digimatic Indicator)(Mitutoyo Absolute, Dr. Schleuniger? 파마톤 인크., 맨체스터, 뉴햄프셔)를 사용하여 측정되었다. 상기 정제는 두께 계량기에 놓여졌고, 나타난 값을 밀리미터(mm)로 기록하였다.
결과 및 토의
여러 가지 기본형이 세 가지 개념에 기초하여 개발되었다: 위 체류, 장 pH를 변화시키는 양성자 공여 폴리머, 및 서방 투약 형. 아래의 섹션은 각 기본형의 제형 개발을 설명한다.
BH4 정맥 주사 제형 - 멸균수 구성 후에, 상기 결과 용액은 등장, pH 3.2이었고, 1mg/mL BH4를 포함했으며, 0.22 마이크론 필러를 통과하는 멸균 여과 후에 정맥 투여에 적합했다. 주변 온도에서 보관된 1mg/mL 용액의 안정성은 3시간 동안 매 시간마다 HPLC에 의해 분석되었다. 상기 숙성된 용액 샘플은 이후 -20℃에서 보관되었고 2주 후에 HPLC로 분석되었다. 도 27은 용액이 구성 후 주변 온도에서 3시간 이상 안정했고, -20℃에서 보관 중 2주 이상 안정했다는 것을 나타낸다.
경구 용액용 BH4 정제
각 병은 10개의 100mg BH4 정제를 포함하도록 팩킹되었다. 정제수 또는 멸균 주사용수 100mL가 각 병의 내용에 부가되었다. 병을 격렬하게 흔들고 나니, 상기 정제가 5분 이내에 신속하게 분해되었다. 상기 결과 용액은 경구 투여용 BH4 10mg/mL를 포함했다. 정제 내 성분 모두가 용해되는 것은 아니고, 비록 최종 용액은 흐리거나 반투명하였지만, 활성 약학 성분은 완전하게 용해되었고 미세 입자는 불완전하게 용해한 비활성 성분이었다.
위-장관 운동성을 늦추기 위한 제형 기본형
BH4 및 아스코르브산으로 구성된 본 캡슐 제형은 반-고체 지방산 유도체(그리세릴 모노/디-올레이트, 녹는점 86℉(30℃))에서 분산된다. GMO가 화학적으로 BH4와 융화되기 쉬우므로 글리세릴 모노/디-올레이트(GMO)가 또한 선택된다. 도 28에 설명된 상기 용액 프로파일은 약물의 90% 이상이 2시간 내에 방출되었으며, 상기 용액 프로파일은 캡슐이 40℃에서 57일간 보관된 후에도 변하지 않은 채로 남아 있었다는 것을 보여주었다.
반-고체, 용융된 GMO 중 약물 분산은 경질 젤라틴 캡슐에 수동으로 충전되었다. 빈-고체의 밀도는 1g/mL보다 크고, 25% 약물 로딩에서 사이즈 #2 캡슐에 80mg 이상이 충전되는 것이 가능했다. 사이즈 #0 캡슐은 같은 제형을 사용하여 200mg 이상의 약물을 포함하는 것이 가능해야 한다고 예상된다. 캡슐에서 지방산의 누수가 40℃에서 보관하는 동안 관찰되었다. 바람직하게, 보관 동안 지방산 누수를 방지하기 위해 캡슐 또는 소프트젤 캡슐 제형이 밴드될 것이다.
바이오흡착 기본형
많은 바이오흡착제가 합성 또는 천연 폴리머 중 하나로 만들어진다. 현재 합성 바이오흡착 폴리머 대부분은 폴리아크릴산 또는 셀룰로오스 유도체이다. 폴리아크릴산-기초 폴리머의 예는 카르보폴, 폴리카르보필, 폴리아크릴산(PAAc) 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 셀룰로오스 화합물은 하이드록시프로필 셀룰로오스 및 하이드록시프로필메틸 셀룰로오스(HPMC)을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 2개의 바이오흡착 기본형은 동물 시험에서 테스트되기 위해 개발되었다. 첫 번째 기본형은 바이오흡착 정제 제형이었고 두 번째는 바이오흡착 과립을 포함하는 캡슐이었다.
폴리카보로필 및 카보머 폴리머는 첫 번째 바이오흡착 정제 기본형의 개발을 위해 선택되었다. 카보폴 71G는 카보머의 과립형이고 우수한 분말 유동 성질을 가진다. 모든 배치(batch)는 허용 가능한 약물 내용(용액 프로파일에서 약물 방출이 100%에 근접한 것으로 나타남) 및 허용 가능한 경도를 가진 우수한 질의 가공된 정제이다. 표 12는 카보머 및 폴리카르보필을 포함하는 바이오흡착 기본형의 견본 정제 중량, 두께, 및 경도를 목록화하였다.
카보머 및 폴리카르보필을 포함하는 바이오흡착 기본형의 견본 정제 중량, 두께 및 경도
정제 일련 번호 압축 압력(psi) 중량(mg) 두께mm) 경도(Kp)
11210-83 600 165.4 5.24 10.5
11229-4 600 166.7 5.64 10.3
11229-4 800 164.1 5.27 14.4
11229-4 1000 164.9 5.12 18
HPMC 및 카보머 폴리머는 두 번째 바이오흡착 과립의 개발을 위해 사용되었다. HPMC는 저-밀도 하이드로콜로이드 시스템 및 pH에 독립적인 조절된 약물 방출로 사용되기 때문에 선택된다. 과립은 투약형의 표면적을 증가시킴에 의해 바이오흡착 기회를 증가시켜 정제보다 선택된다. 용해 매질에서 과립-충전된 캡슐의 분리를 용이하게 하기 위해, 상기 과립은 수소화된 오일로 부분적으로 코팅된다. 오일 코팅 없이는, 상기 과립이 수화했고 각각 과립 내로 분해 없이 캡슐-모양의 매트릭스를 형성했다.
두 가지 바이오흡착 기본형(정제와 과립)의 방출 프로파일이 도 29에 보여지고, 이는 정제의 방출 프로파일이 과립보다 더 길다는 것을 보여준다. 약물 방출은 정제 및 과립 바이오흡착 투약 형에 있어, 각각 4시간 동안 약 90% 및 1시간 동안 95%이었다. 수분 보호 없이(열 유도 봉인 없이) 1달 동안 40℃ 및 주변 습도에서 보관한 경우, 상기 정제 기본형은 약물 용해에서 감속을 나타냈다(도 29). 카보머 포함 기본형의 경우 미리 가능한 수화로부터 정제를 보호하기 위해 수분 보호 예방 조치가 취해져야만 한다.
서방 기본형
하이드록시프로필메틸셀룰로오스(HPMC)는 경구 조절된 약물 전달 시스템의 제조를 위해 친수성 이동 수단으로 사용된다(Colombo, Adv. Drug Deliv. Rev., 1993, 11,37). HPMC 매트릭스는 여러 약물의 방출을 조절하는 것으로 알려져 있다(Chattaraj, et al. Drug Develop. Ind. Pharm., 1996, 22, 555; Pabon, et al., Drug Develop. Ind. Pharm., 1992, 18, 2163; Lee, et al., Drug Develop. Ind. Pharm., 1999, 25, 493; Basak, et al., Indian J. Pharm. Sci., 2004, 66, 827; Rajabi-Siabhoomi, et al., J. Pharma. Pharmacol., 1992, 44, 1062). BH4의 방출을 조절하기 위한 다양한 점도 등급의 HPMC(K4M, K15M 및 K100M)가 본 시험에서 평가되었다. 다양한 등급의 HPMC로 이루어진 정제의 용해 프로파일이 도 30에 나타난다. 약물 방출 프로파일은 점도 등급에 관계없이 20% HPMC에서 유사했고; 상기 약물의 80% 넘게 2시간에 방출되었다. HMPC 폴리머가 수용성 매질에 노출될 때, 급속한 수화 및 체인 풀림이 나타나 젤 층을 형성했다(Naruhashi, et al., Pharm Res. 2003, 19:1415-1421). 20%에서 HPMC는 BH4 방출을 유의미하게 늦추는 실질적인 젤 장벽 층을 형성할 수 없다.
다양한 농도(20% 내지 40%)의 높은 점도 등급 HPMC(메토셀 K100M CR)으로 생산된 정제의 용해 프로파일이 도 30에 나타난다. 35% 내지 40% 메토셀 K100M CR을 포함한 정제는 4시간 이하 동안 느린 약물 방출을 보였던 반면 20% HPMC는 2시간 동안 약물을 방출 하였다(도 31). 35% HPMC(메토셀 K100M)을 포함한 정제는 동물 시험에서 테스트를 위한 기본형으로 선택되었는데, 이는 이것이 4시간 이하의 느린 약물 방출에 요구되는 최소한 양의 HPMC를 포함하고 있기 때문이다. 이와 같이, 정제는 용해 프로파일에서 약물 방출이 100%에 가까운 것으로 증명된 허용 가능한 약물 내용으로 우수한 질을 가지는 것으로 나타났다.
양성자 공여 폴리머 기본형
BH4의 경구 흡수를 증가시키기 위해, 중앙 소장의 pH를 감소시킴으로써 약물을 안정화하는 접근이 있다. 장관강(intestinal luminal)의 pH를 조정하기 위하여, 유드라짓 L100-55, 장용 코팅에 보통 사용되는 수소-방출 폴리머가 선택되었다. 이 폴리머는 산성 조건 하에서 용해되지 않고, 이의 카르복실기 때문에 약산성(pH > 5.5) 내지 알칼리 조건 하에서 수소를 방출하여, 장관강 pH를 산성으로 조절한다. Naruhashi, et al.(2003)은 루멘의 pH가 유드라짓 L100-55 농도-의존법에서 감소되고, 회장 루프에서의 세파드록실과 세픽심 흡수가 산성 폴리머가 존재할 때 증가된다는 것을 발견하였다(Nozawa, et al., J. Pharm Sci. 2003, 92(11), 2208-2216). Nozawa, et al(2003)은 유드라짓이 장 루프의 pH를 감소시키고 루프에서 세파드록실 및 세픽심의 소실을 증가시킨다는 것을 보여주었다.
표 8에서 보여지는 BH4 및 유드라짓 L100-55를 포함한 분말 제형은 정제 내로 압축되고 캡슐 내로 충전되었다, 상기 정제 제형은 용해 테스트 동안 가상 위액(SGF)에서 1시간에 약 27% 약물을 방출하였다. 그러나, 분해 테스트 동안, 상기 정제는 SGF 및 pH 5.8 포스페이트 버퍼(PB)에서 적어도 2시간 동안 그대로 남아 있었다. 초-분해제(크로스포비돈 또는 크로스카멜로오스)가 존재할 때조차도, 상기 정제는 분해되는데 실패했다. 상기 약물은 산성화한 유드라짓이 될 수 있고 낮은 마이크로 pH 환경을 만드므로 폴리머가 이온화되지 않고 용해되지 않은 채로 남아 있게 할 수 있다.
분말 충전된 캡슐 약물-유드라짓 제형은 SGF에서 급속하게 분해되었다. 중앙 소장에서 수소 방출을 타겟하기 위해, 장용 코팅이 캡슐에 적용되었다. 캡슐이 코팅되고 40℃ 오븐에서 건조된 후, 상기 캡슐은 폴리머 코팅 중 약 1 내지 3% 중량을 얻었다. USP 용해 기구Ⅱ(패들)을 사용하여 테스트하였을 때, 용해 매질 0.1N HCl은 회전 속도 50rpm, 37℃에서 유지되었고, 코팅된 캡슐은 1시간에 약 25% 약물을 방출하였다. 1시간의 산(0.1N HCl) 전처리 후에, 500mL의 pH 5.8 포스페이트 버퍼를 가진 USP 분해 기구에 놓여진 상기 코팅된 캡슐은 37℃에서 유지되었으며, 상기 코팅된 캡슐은 약 1시간에 분해되었다. 정제나 코팅되지 않은 캡슐보다 장용-코팅된 캡슐이 수소-방출 폴리머를 타겟 사이트로 더 전달하는 경향이 강하기 때문에 장용-코팅된 캡슐 기본형이 선택되었다.
부형 전달 시스템
2개의 부형 전달 시스템이 개발되었다. 첫 번째 기본형은 부형 복합 단위 투약형이었고; 이 투약형의 목적은 단위 중 하나가 위 부분에 남게 될 것이고 그래서 약물의 위 체류 시간을 연장하는 기회를 증가시키기 위함이었다. 이 투약형은 캡슐 내 7개의 3층 정제로 구성되고; 상기 중간층은 약물 성분을 포함했고, 두 개의 물-불용성 바깥층 사이에 끼여 있었다(도 32). 상기 바깥 층은 스테아르산, 소수성 및 물-불용성 지방산을 포함했고, 이는 부형 정제에 필수적인 부력을 제공했다. 각 정제는 에틸셀룰로오스와 폴리에틸렌 글리콜 MW 4600(PEG)의 알코올성 용액을 사용하여 수동으로 코팅되었다. 에틸셀룰로오스는 정제 및 PEG 주변에 물 불용성 필름을 형성했고, 이는 작은 구멍 형성제로 작용하며, 방출 속도를 조절했다. 에틸셀룰로오스 및 다양한 농도의(20% 내지 40%) PEG 용액으로 코팅된 정제의 용해 프로파일을 도 33에 나타냈다. 상기 코팅된 3층 정제가 무차(zero-order)에 가까운 방출 동태를 이루었다는 것이 주목되었다. 예상한 바와 같이, 약물 용해 비율은 PEG 농도가 증가함에 따라 증가했다. 상기 정제는 용해 시험 동안 4시간 이상 가상 위 매질에서 부유했다. 표 9는 동물 시험에서 테스트된 제형 조성을 나타낸다.
두 번째 기본형은 가스-생성 투약형이었다. 이는 그러한 방법으로 제형화되었고, 이것이 산성 위 내용물과 접촉하였을 때 이산화탄소가 유리되었으며 팽창된 하이드로콜로이드에 빠졌고, 이는 투약형에 부력을 제공했다(도 33). 이 제형은 용해 시험 동안 4시간 이상 가상 위 매질에서 부유했다. 그러나, 이러한 시스템이 계속적으로 작동하기 위해서, 상기 정제는 조기 산 및 염기 반응을 막기 위해 낮은 습도 환경에서 생산되어야 한다. 보관 동안 정제 내 BH4와 소듐 바이카보네이트 사이에 잠재적 상호작용이 있을 수 있었다. 이러한 이유로, 본 투약형은 동물 시험에서 테스트되지 않았다.
장 pH를 증가시키기 위한 양성자 공여 폴리머, 위 체류 투약형, 및 서방 제형을 포함하는 다양한 제형 접근이 도입된 6개의 기본형 테스트 제형이 동물 생체 이용률 시험을 위해 개발되었다.
실시예 5
새로운 BH4 제형의 생체 이용률
본 시험의 목적은 위장관(GI) 트랙에서 약물의 체류 시간을 증가시키는 투약 형을 개발함으로써 BH4의 흡수를 강화하기 위한 것이었다.
방법: 3마리의 건강한 3-4 kg 중량 시노몰구스 원숭이가 용해된 BH4 제형 대조군과 대비한 7개 제형의 생체 이용률을 판정하기 위해 오픈, 8-기간 비-크로스오버 시험에 사용되었다. 밤새 금식한 후, 상기 원숭이들은 분리되어, 여러 새로운 제형 시험 사이에 최소 1주간의 세척 기간을 가지면서 동일한 새로운 제형 1회 용량 80mg이 경구 또는 정맥 주사로 주어졌다. 정맥 투여의 경우, 혈액 샘플이 투여 전 및 다음으로 투약 후 5, 15 및 30분 및 1.0, 2.0, 4.0, 6.0, 8.0, 12 및 24시간에 채취되었다. 경구 투여의 경우, 혈액 샘플이 투여 전 및 다음으로 각 투여 후 15 및 30분 및 1.0, 2.0, 3.0, 4.0, 6.0, 8.0, 12 및 24시간에 채취되었다. 플라즈마를 원심 분리에 의해 분리한 다음, 200-μL로 나누어진 각 샘플이 즉시 0.1% DTE를 포함한 개별 시험관으로 옮겨졌고 총 L-바이오프테린 분석을 준비할 때까지 -70℃에서 냉동되었다.
시험 제형: 투여된 각 제형은 표 13에서 알 수 있다. 상기 제형 중 3개는 GI 체류 시간을 증가시키는 바이오흡착 또는 부유 메커니즘을 통해 위 체류하도록 개념적으로 디자인 되었다(카보머-기초, 복합-미립자 부형 과립 및 바이오흡착 과립). 다른 개념은 제형의 체류 시간을 증가시키기 위해 GI 운동성을 지연시키고(글리세릴 모노-올레이트), 소장의 pH를 감소시켜 정제 그대로(수소 펌프) 또는 지연 전달 제형의 흡수가 가능하도록 BH4의 화학적 안정성을 강화하는 것이 흡수를 강화할 것인지 여부를 확인하는 것을 기초로 한다.
상 기본형 투약 형 개념 성분
상 Ⅰ 정맥 주사 제형 정맥 주사 용액, 1mg/mL 대조군 BH4, D(-)-만니톨
상 Ⅱ 용액용 쿠반(Kuvan) 정제 경구 용액, 10mg/mL 대조군 린에 의해 제조된 BH4 정제(일련번호 140651)
상 Ⅲ 글리세롤 모노 올레이트 캡슐, 80mg GI 운동성 늦춤 BH4 카프멀 GMO-50, 아스코르브산
상 Ⅳ 카보머 기본형 정제, 80mg 위-체류, 바이오흡착 BH4, 카르보폴 71G, 노베온 AA1, 아스코르브산, PRUV
상 Ⅴ HPMC 기본형 정제, 80mg 서방 BH4, 메토셀 K100M 프리미엄 CR, 아스크로브산, PRUV
상 Ⅵ 유드라짓 기본형 캡슐, 80mg 낮은 GI pH를 위한 양성자 공여 폴리머 BH4, 유드라짓 L100-55, 아스코르브산, 콜리돈 CL, PRUV, 코팅(유드라짓 L100-55, 카르보왁스 PEG 4600, 에틸 알코올 200 프루프)
상 Ⅶ 멀티-부형 단위 캡슐 내 멀티 정제, 80mg 위-체류, 부유 안쪽 층(BH4, 아스코르브산, 스테아르산, PRUV), 코팅(에토셀 표준 10FP, 카르보왁스 PEG 4600, 95% 에탄올)
상 Ⅷ 바이오흡착 과립 캡슐 내 과립, 80mg 위-체류, 바이오흡착 과립 내(BH4, 메토셀 K100M 프리미엄 CR, 카르보폴 971, 아스코르브산), 과립 외(PRUV, 푸레코 HSC-1 오일)
바이오프테린의 플라즈마 분석: 플라즈마 내 BH4 농도는 확인된, 구체적, 역-상 LC/MS/MS법에 의해 판정된다. 상기 표준 곡선은 농도 범위 50ng/mL 내지2500ng/mL를 넘는 선형이었다. L-바이오프테린의 최저 정량 한계는 5% 이하의 변이 계수에 의해 나타나는 인트라데이(intraday) 정밀도를 가진 50ng/mL이었다. L-바이오프테린은 분석 때까지 -70℃에서 0.1% DTE로 안정화된 냉동 원숭이 플라즈마에서 안정하다. BH4 농도는 판정된 L-바이오프테린 농도로부터 계산되었다.
약물동태 및 통계적 분석: 약물 동태 파라미터는 경구 및 정맥 주사 제형의 투여 후 플라즈마 BH4에 대해 결정되었다. 상기 약물 동태 파라미터는 표 14에 제공된다.
상, 제형 AUClast
(ng-hr/mL)		 AUC∞
(ng-hr/mL)		 Cmax(ng/mL) Clast a(ng/mL) Tmax(hr) t1/2(hr)
2, 용해된 정제 641(88) 805(36) 93.6(31.3) 9.60(2.20) 2.33(0.58) 11.7(2.1)
3, 글리세릴 모노-올레이트 716(154) 858(317) 133(83) 6.47(3.60) 2.00(0) 12.1(10.3)
4, 바이오흡착 폴리머 593(50.6) 648(114) 108(15) 4.46(3.36) 2.67(0.58) 6.89(3.51)
5, 서방 355(134) 472(36) 86.0(43.1) 12.9(12.4) 3.33(0.58) 5.30(1.73)
6, 양성자 공여 276(49.8) 282(49) 68.3(25.3) 2.97(0.71) 3.33(0.58) 1.59(0.74)
7, 부형 투약형 304(78) b 59.9(31.8) 5.90(0.94) 4.00(2.00) b
8, 바이오흡착 과립 292(79) 366(40.6) 42.5(12.6) 5.11(2.4) 3.0(0) 15.3(8.2)
결과
본 시험의 목적은 용해된 정제 제형 대조군에 비해 BH4 생체 이용률을 강화하는 제형을 확인하는 것이었다. BH4 경구 투여 이후 여러 가지 투약형 및 대조군 제형의 평균 플라즈마 BH4 농도-시간 프로파일은 도 35에 나타나고, 플라즈마 약물 농도-시간 프로파일에서 파생된 BH4 약물 동태 파라미터는 표 14에 주어진다. 상기 대조군 제형(상 2)은 용해된 정제이다.
도 35에서 볼 수 있는 바와 같이, 상기 글리세릴 모노-올레이트 제형은 각각 716 ng-hr/mL 및 858 ng-hr/mL인 가장 높은 AUClast 및 AUC∞를 제공했다. 대조군 용해된 BH4 정제 제형은 각각 641 ng-hr/mL 및 805 ng-hr/mL인 AUClast 및 AUC∞를 나타냈다(표 14). 생체 이용률이 가장 높은 것에서부터 가장 낮은 제형의 순위는: 글리세릴 모노-올레이트 > 용해된 정제 > 바이오흡착 폴리머 정제 > 서방정제 > 부형 투약형 > 바이오흡착 과립 캡슐 제품 > 양성자 공여 캡슐 제품 순이다.
실시예 6
테트라하이드로바이오프테린 정맥 주사 제형의 제조
제형 전(preformation) 안정성 평가
일반적으로, 본 시험의 목적은 pH 1 내지 7의 pH 범위의 버퍼 용액에 있는 경우(표 15를 보라) 및 항산화제가 존재하는 경우와 존재하지 않는 경우 및 반응 용액에 불활성 가스가 있는 경우 또는 없는 경우(표 16을 보라)의 BH4의 안정성을 평가하기 위함이었다.
BH4의 제형 전 안정성 시험을 위해 사용되는 버퍼 용액의 성분 및 조성
성분 양
pH 1.2 버퍼(0.1N HCl)
농축된 HCl(12N)
염화나트륨
증류/탈이온 수 qs
8.33mL
2.92g
1000mL
pH 2.1 버퍼 (0.01N HCl)
pH 1.2(0.1N HCl) 버퍼
염화나트륨
증류/탈이온 수 qs
100mL
7.79g
1000mL
pH 3 버퍼
인산, 15M, 85%
무수 소듐모노베이식 포스페이트(NaH2PO4)
염화나트륨
증류/탈이온 수 qs
.347mL
6.17g
6.16g
1000mL
pH 4 버퍼
결정 아세트산 100%
아세트산 나트륨, 삼수화물
염화나트륨
증류/탈이온 수 qs
2.38mL
1.29g
8.22g
1000mL
pH 5 버퍼
결정 아세트산 100%
아세트산 나트륨, 삼수화물
염화나트륨
증류/탈이온 수 qs
.87mL
4.78g
6.72g
1000mL
pH 6 버퍼
4-모르핀에탄설폰(MES)산 일수화물
MES 나트륨 염
염화나트륨
증류/탈이온 수 qs
4.99g
5.75g
7.23g
1000mL
pH 7 버퍼
소듐 모노베이식 포스페이트, 일수화물(NaH2PO4)
무수 소듐 디베이식 포스페이트(Na2HPO4)
염화나트륨
증류/탈이온 수 qs
2.56g
4.44g
2.18g
1000mL
항산화제가 있는 경우 또는 없는 경우 및 가스 살포가 된 경우 및 아닌 경우의 BH4를 포함한 안정성 시험을 위한 버퍼 용액의 조성
pH 시험 그룹 번호
1 2 3 5 6
버퍼 시험 버퍼+아스코르브산 시험 버퍼+L-시스테인 시험 버퍼+아르곤 살포 시험 버퍼+산소 살포 시험
1 pH 1.2 버퍼의 1mg/mL BH4 pH 1.2 버퍼 의 1mg/mL BH4 및 1mg/mL 아스코르브산 pH 1.2 버퍼의 1mg/mL BH4 및 1mg/mL L-시스테인 pH 1.2 버퍼의 1mg/mL BH4 및 살포된 아르곤과 봉인된 아르곤 덮개 pH 1.2 버퍼의 1mg/mL BH4 및 살포된 산소와 봉인된 O2 덮개
2 pH 2.1 버퍼의 1mg/mL BH4 pH 2.1 버퍼의 1mg/mL BH4 및 1mg/mL 아스코르브산 pH 2.1 버퍼의 1mg/mL BH4 및 1mg/mL L-시스테인 pH 2.1 버퍼의 1mg/mL BH4 및 살포된 아르곤과 봉인된 아르곤 덮개 pH 2.1 버퍼의 1mg/mL BH4 및 살포된 산소와 봉인된 O2 덮개
3 pH 3 버퍼의 1mg/mL BH4 pH 3 버퍼의 1mg/mL BH4 및 1mg/mL 아스코르브산 pH 3 버퍼의 1mg/mL BH4 및 1mg/mL L-시스테인 pH 3 버퍼의 1mg/mL BH4 및 살포된 아르곤과 봉인된 아르곤 덮개 pH 3 버퍼의 1mg/mL BH4 및 살포된 산소와 봉인된 O2 덮개
4 pH 4 버퍼의 1mg/mL BH4 pH 4 버퍼의 1mg/mL BH4 및 1mg/mL 아스코르브산 pH 4 버퍼의 1mg/mL BH4 및 1mg/mL L-시스테인 pH 4 버퍼의 1mg/mL BH4 및 살포된 아르곤과 봉인된 아르곤 덮개 pH 4 버퍼의 1mg/mL BH4 및 살포된 산소와 봉인된 O2 덮개
5 pH 5 버퍼의 1mg/mL BH4 pH 5 버퍼의 1mg/mL BH4 및 1mg/mL 아스코르브산 pH 5 버퍼의 1mg/mL BH4 및 1mg/mL L-시스테인 pH 5 버퍼의 1mg/mL BH4 및 살포된 아르곤과 봉인된 아르곤 덮개 pH 5 버퍼의 1mg/mL BH4 및 살포된 산소와 봉인된 O2 덮개
6 pH 6 버퍼의 1mg/mL BH4 pH 6 버퍼의 1mg/mL BH4 및 1mg/mL 아스코르브산 pH 6 버퍼의 1mg/mL BH4 및 1mg/mL L-시스테인 pH 6 버퍼의 1mg/mL BH4 및 살포된 아르곤과 봉인된 아르곤 덮개 pH 6 버퍼의 1mg/mL BH4 및 살포된 산소와 봉인된 O2 덮개
7 pH 7 버퍼의 1mg/mL BH4 pH 7 버퍼의 1mg/mL BH4 및 1mg/mL 아스코르브산 pH 7 버퍼의 1mg/mL BH4 및 1mg/mL L-시스테인 pH 7 버퍼의 1mg/mL BH4 및 살포된 아르곤과 봉인된 아르곤 덮개 pH 7 버퍼의 1mg/mL BH4 및 살포된 산소와 봉인된 O2 덮개
보다 구체적으로, 불활성 가스가 존재한 경우 또는 존재하지 않는 경우에 조합한 2개의 항산화제의 영향을, 액체 제품의 제형을 지지하기 위해 pH 4에서, 불안정성의 기여를 확인하기 위해 pH 7에서, 원숭이와 인간에서 낮은 생체 이용률의 화합물에 대해 생체 pH에서 평가하였다(표 17 및 18을 보라). BH4의 안정성은 온도에 의존하는 것으로 예상된다. 그러므로, 다른 온도에서 화합물의 예상되는 장-기간 보관의 결정을 지지하기 위해 생체 화합물 안정성이 2-8℃, 25℃, 30℃ 및 37℃에서 평가되었다. 37℃의 생체 온도에서 화합물 안정성의 판별은 GI 트랙의 흡수 부위에서 제형화된 경구 투약형의 안정성 유지 기간의 추정을 뒷받침하는 데이터를 제공한다.
BH4의 pH 4 안정성 시험을 위한 버퍼 용액 조성
pH4 pH4
버퍼+아스코르브산+L-시스테인 시험 버퍼+아스코르브산+L-시스테인+아르곤 살포 시험
pH 4 버퍼의 1mg/mL BH4 및 1mg/mL 아스코르브산 및 1mg/mL L-시스테인 pH 4 버퍼의 1mg/mL BH4 및 1mg/mL 아스코르브산 및 1mg/mL L-시스테인 및 살포된 아르곤 및 봉인된 아르곤 덮개
BH4의 pH 7 안정성 시험을 위한 버퍼 용액 조성
pH7 pH7
버퍼+아스코르브산+L-시스테인 시험 버퍼+아스코르브산+L-시스테인+아르곤 살
포 시험
pH 7 버퍼의 1mg/mL BH4 및 1mg/mL 아스코
르브산 및 1mg/mL L-시스테인		 pH 7 버퍼의 1mg/mL BH4 및 1mg/mL 아스코
르브산 및 1mg/mL L-시스테인 및 살포된
아르곤 및 봉인된 아르곤 덮개
여러 가지 버퍼 용액에서 행해진 시험을 위해 제안된 샘플링 시간은 pH 3.1에서의 단일 시험 반감기와 Davis, et. al에서 pH 6.8 트리스 및 포스페이트 버퍼 중 얻은 데이터의 비교에 의해 추정되었다(1988; Eur J. Biochem. 173, 345-351,(1988)). pH 3.1 용액의 안정성 연구는 17769분(12.3일)의 추정된 t1/2을 수득했고, Davis et al의 작업은 포스페이트 pH 6.8 버퍼에서 10분의 t1/2 및 pH 6.8 트리스 버퍼에서 14분의 t1/2 를 수득했다. 이러한 2개의 시험은 pH가 1 증가할 때마다 BH4 반감기의 10배에 이르는 감소(즉, 반응성의 10배에 이르는 증가)가 있다는 것을 나타낸다(표 19를 보라). 본 근사치에 기초하여, pH 1.2 내지 pH 3 용액이 초기에는 일주일마다 샘플링되었고 샘플링 시간 수정은 처음 2 데이터 점을 얻은 다음 필요한 경우 행해졌다. 25℃에서 추정된 샘플링 시간은 표 19에 제공된다.
측정된 BH4의 반감기 및 이들로부터 파생된 이론적 반감기에 기초한 여러 pH에서 제안된 샘플링 시간
pH 측정된 t1/2(분) pH 3에서 얻은 t1/2에 기초하여 추정된 t1/2(분)a 초기에 제안된c 샘플링 시간
1.0 - 776900.0(1234일) 매 7일
2.0 - 177690.0(123.4일) 매 7일
3.0 17769.0(12.34일) 17769.0(12.34일) 매 96시간
4.0 - 1776.9(1.23일) 매 12시간
5.0 - 177.7(0.12일) 매 1/2시간
6.0 - 17.7(0.01일) 매 5분d
6.8b 10(포스페이트)
14(트리스)
7.0 - 1.8 매 1/2분d
a 추정된 t1/2은 pH의 매 1 변화에 대하여 pH 3에서 얻은 반감기의 10배씩 변화를 기초로 한다. 단계별로 10배씩 pH<3은 증가된 방향인 반면 pH>3은 감소된 방향으로, Davis, et. al에 의해 얻은 pH 6.8 데이터와 대충 매치한다.
b Davis, et. al. 1988; Eur J. Biochem. 173, 345-351,(1988)에서 얻은 데이터
c 샘플링은 조정될 수 있다
d 반응 용액은 가능한 한 빨리 샘플되고 퀀치되며, 스톱워치와 2사람이 필요한데, 1 사람은 샘플링/퀀치하고 나머지는 공책에 분 및/또는 초 단위로 정확히 시간을 기록한다.
시험들은 pH 1-7 버퍼 용액 및 5℃, 25℃, 30℃ 및 37℃에서 수행되었다. 비록 이 시험들이 밀폐되지 않은 봉인된 용기에서 수행되었지만, 항-산화제 단독(아스코르브산 또는 L-시스테인) 또는 함께 조합(아스코르브산 + L-시스테인)이 BH4의 손실 또는 분해 비율을 감소시켰다(도 36 및 도 37을 보라). 아스코르브산과 L-시스테인을 모두 포함한 살포한 용액은 BH4의 안정성을 강화했다.
BH4의 분해 비율은 농도-독립적이다(도 38을 보라). 그러므로 BH4의 고 용량, 높게 농축된 제형은 제형의 상승적인 안정화를 위해 더 낮은 농도의 안정화제가 필요하다는 것을 보여주었다.
본 결과는 긴 보관 기간, 안정한, 액체 제형이 본 명세서에 설명된 방법 및 조성물에 따라 제조될 수 있고, 이는 제형 구성에 있어 멸균 주사용 액체, 경구 액체, 및 동결 건조된 및 멸균 분말을 포함한다.
실시예 7
경구 및 비경구 사용을 위한 테트라하이드로바이오프테린의 액체 및 동결 건조된 제형
제형 조성의 예
안정화제로서 아스코르브산을 가진 pH 4.0에서 버퍼링된 구체적 제형
성분 양(mg) % 중량/부피 작용
BH4 1.00 0.10 활성 성분
아스코르브산 10.00 1.00 항산화제
시트르산 6.56 0.66 버퍼링 제제
소듐 시트레이트,이수화물 5.53 0.55 버퍼링 제제
주사용수 qs 1.00mL 1.00mL 희석제
두 가지 안정화제의 조합을 포함하는 pH 4.0에서 버퍼링된 제형 : 아스코르브산 및 소듐 메타바이설파이트
성분 양(mg) % 중량/부피 작용
BH4 1.00 0.10 활성 성분
아스코르브산 2.50 0.25 항산화제
소듐 메타바이설파이트 2.50 0.25 항산화제
시트르산 6.56 0.66 버퍼링 제제
소듐 시트레이트,이수화물 5.53 0.55 버퍼링 제제
주사용수 qs 1.00mL 1.00mL 희석제
3 가지 안정화제의 조합을 포함하는 pH 4.0에서 버퍼링된 제형 : L-시스테인, 아스코르브산 및 소듐 메타바이설파이트
성분 양(mg) % 중량/부피 작용
BH4 1.00 0.10 활성 성분
아스코르브산 2.00 0.20 항산화제
소듐 메타바이설파이트 2.00 0.20 항산화제
L-시스테인 4.00 0.40 항산화제
시트르산 6.56 0.66 버퍼링 제제
소듐 시트레이트,이수화물 5.53 0.55 버퍼링 제제
주사용수 qs 1.00mL 1.00mL 희석제
안정화제로 아스코르브산만을 단지 포함하는 pH 7.0에서 버퍼링된 제형
성분 양(mg) % 중량/부피 작용
BH4 10.00 1.00 활성 성분
아스코르브산 50.00 5.00 항산화제
소듐 모노베이식 포스페이트, 일수화물 10.24 0.10 버퍼링 제제
소듐 디베이식 포스페이트 17.76 0.18 버퍼링 제제
주사용수 qs 1.00mL 1.00mL 희석제
안정화제로 아스코르브산 소듐 메타바이설파이트를 포함하는 pH 7.0에서 버퍼링된 제형
성분 양(mg) % 중량/부피 작용
BH4 10.00 1.00 활성 성분
아스코르브산 20.00 2.00 항산화제
소듐 메타바이설파이트 15.00 1.50 항산화제
소듐 모노베이식 포스페이트, 일수화물 10.24 0.26 버퍼링 제제
소듐 디베이식 포스페이트 17.76 0.44 버퍼링 제제
주사용수 qs 1.00mL 1.00mL 희석제
안정화제로 아스코르브산, 소듐 메타바이설파이트 및 L-시스테인을 포함한 pH 7.0에서 버퍼링된 제형
성분 양(mg) % 중량/부피 작용
BH4 10.00 1.00 활성 성분
아스코르브산 20.00 2.00 항산화제
소듐 메타바이설파이트 15.00 1.50 항산화제
L-시스테인 10.00 1.00 항산화제
소듐 모노베이식 포스페이트, 일수화물 10.24 0.26 버퍼링 제제
소듐 디베이식 포스페이트 17.76 0.44 버퍼링 제제
주사용수 qs 1.00mL 1.00mL 희석제
고 용량 액체 제형
안정화제로 아스코르브산만 포함하는 pH 6.0에서 버퍼링된 제형
성분 양(mg) % 중량/부피 작용
BH4 50.00 0.10 활성 성분
아스코르브산 7.50 0.75 항산화제
시트르산 5.30 0.53 버퍼링 제제
소듐 시트레이트, 이수화물 51.4 5.14 버퍼링 제제
주사용수 qs 1.00mL 1.00mL 희석제
2가지 안정화제의 조합을 포함하는 pH 6.0에서 버퍼링된 제형 : 아스코르브산 및 소듐 메타바이설파이트
성분 양(mg) % 중량/부피 작용
BH4 50.00 5.00 활성 성분
아스코르브산 2.50 0.25 항산화제
소듐 메타바이설파이트 2.50 0.25 항산화제
시트르산 5.30 0.53 버퍼링 제제
소듐 시트레이트,이수화물 51.4 5.14 버퍼링 제제
주사용수 qs 1.00mL 1.00mL 희석제
3가지 안정화제의 조합을 포함하는 pH 6.0에서 버퍼링된 제형
성분 양(mg) % 중량/부피 작용
BH4 50.00 0.10 활성 성분
아스코르브산 2.00 0.20 항산화제
소듐 메타바이설파이트 2.00 0.20 항산화제
L-시스테인 4.00 0.40 항산화제
시트르산 5.30 0.53 버퍼링 제제
소듐 시트레이트,이수화물 51.4 5.14 버퍼링 제제
주사용수 qs 1.00mL 1.00mL 희석제
안정화제로 아스코르브산만을 포함한 pH 3.0 시트레이트 버퍼에서 버퍼링된 경구 제형
성분 양(mg) % 중량/부피 작용
BH4 10.00 1.00 활성 성분
아스코르브산 20.00 2.00 항산화제
수크로오스 200.00 20.00 감미료
오렌지향 1.00 0.10 향미제
시트르산 8.98 0.90 버퍼링 제제
소듐 시트레이트, 이수화물 2.13 0.21 버퍼링 제제
주사용수 qs 1.00mL 1.00mL 희석제
안정화제로 아스코르브산 및 소듐 메타바이설파이트를 포함하는 pH 3.5 타르트레이트 버퍼에서 버퍼링된 경구 제형
성분 양(mg) % 중량/부피 작용
BH4 10.00 1.00 활성 성분
아스코르브산 20.00 2.00 항산화제
소듐 메타바이설파이트 5.00 0.50 항산화제
수크로오스 200.00 20.00 감미료
포도향 1.00 0.10 향미제
타르타르산 1.34 0.13 버퍼링 제제
소듐 타르트레이트 디베이식 이수화물 8.39 0.84 버퍼링 제제
주사용수 qs 1.00mL 1.00mL 희석제
안정화제로 아스코르브산 및 소듐 메타바이설파이트를 포함하고 말산 기초 버퍼에서 pH 3.5로 버퍼링된 경구 제형
성분 양(mg) % 중량/부피 작용
BH4 10.00 1.00 활성 성분
아스코르브산 20.00 2.00 항산화제
소듐 메타바이설파이트 15.00 1.50 항산화제
수크로오스 200.00 20.00 감미료
사과향 1.00 0.10 향미제
말산 3.07 0.31 버퍼링 제제
소듐 말레이트 디베이식 4.91 0.49 버퍼링 제제
주사용수 qs 1.00mL 1.00mL 희석제
상지 제형화되거나 컴파운드(compound)된 용액은 선택적으로 컴파운딩 탱크에서 불활성 가스(예를 들어, 아르곤이나 질소) 또는 이산화탄소가 살포되고 1차 용기는 용기 빈 공간의 산소를 제거하기 위해 바람직하게 불활성 가스 또는 이산화탄소 덮개로 봉인된다. 상기 제형은 적절한 확대 계수에 의해 화합물 양을 다양하게 하여 어떤 부피로도 확대될 수 있다.
실시예 8
염기 상태 하에서 산화되었을 때 L-바이오프테린 농도의 측정을 통한 인간 플라즈마에서 테트라하이드로바이오프테린(BH4)의 LS/MS/MS 결정
테트라하이드로바이오프테린(BH4)는 페닐케톤뇨증(PKU) 환자의 치료를 위한 소분자 치료제이다. 인간 플라즈마에서 BH4 농도를 측정하는 정확하고 구체적인 방법을 가지는 것이 중요하다. 그러나, BH4의 낮은 내인성 농도 및 불안정성 때문에 인간 플라즈마에서 BH4를 정량하는 것을 어려운 과제이다. 염기 상태 하에서, BH4는 디하이드로바이오프테린(BH2) 및 최종적으로 L-바이오프테린으로 산화된다. 더욱이, 상기 BH4에서 L-바이오프테린으로의 산화 전환 비율은 거의 23주까지 유지된다. 그러므로, 염기 상태하에서 산화하였을 때 L-바이오프테린 농도를 측정하고 분자 전환 비율을 적용함으로써, 인간 플라즈마에서 BH4의 농도를 확실하게 판정할 수 있다.
공지된 방법은 후쿠시마와 닉손(Fukushima and Nixon)(Anal. Biochem., 102, 176-188(1980))에 의해 개발된 형광 검출을 하는 HPLC를 사용하는 고전적인 방법에 기초한다. LS/MS/MS 법에서, 인간 플라즈마 샘플은 항산화제로 안정화되었고, 내부 표준(IS) 용액을 넣고 소듐 하이드록사이드 용액으로 염기화되었으며, 이후 요오드 용액으로 산화되었다. 실온의 암소에서 배양하는 동안, 아스코르브산이 과다한 요오드를 환원하기 위해 부가된다. 산화된 샘플은 단백질 침전에 의해 추출되었다. 재구성된 추출물 내 L-바이오프테린은 터보 이온 스프레이? MS/MS 검출을 하는 역-상 HPLC 사용에 의해 분석되었다. L-바이오프테린의 음이온은 MRM 모드에서 모니터링되었다. 표준의 약물-대-IS 피크 면적 비율이 1/x2 가중 최소 제곱법 회귀 분석을 사용하여 선형 검정 곡선을 만드는데 사용되었다.
BH4에서 L-바이오프테린의 산화 전환 비율이 여러 시간대에서 평가되었다: 0, 1, 2, 4, 8, 12 및 23주, 처음 3개의 연속적인 시간-점에서 결정된 명목 분자 전환 비율 47.3%가 모든 테스트된 시간 점에서 유지된다는 것을 발견하였다. 다른 시간-점과 명목값 간의 전환 비율 차이는 -2.3 내지 6.3% 범위이다, LS/MS/MS 법이 5 내지 100ng/mL의 선형 검정 범위(BH4 11 내지 2114 ng/mL와 동등)에서 K2 EDTA 인간 플라즈마의 L-바이오프테린을 정량하기 위해 확인되었다. 상기 분석 정밀도 및 정확도는 품질관리샘플(QCs)로 평가되었고 상기 결과는 4.7 내지 14.5%CV 사이의 인트라데이 정밀도; -7.1 내지 7.4% 명목값 사이의 인트라데이 정확도; 각각 7.4 내지 16.4%CV 및 -8.3 내지 3.7% 명목값의 인터데이(interday) 정밀도 및 정확도를 나타냈다. L-바이오프테린의 평균 추출 회복은 65.3%였다. K2 EDTA 인간 플라즈마에서, L-바이오프테린은 실온에서 4시간 이상 및 4 냉동 해동 사이클 후, 그리고 -70℃에서 275일 이상 안정하다는 것이 발견되었다.
실시예 9
전기화학적 및 형광 검출을 하는 HPLC를 사용한 BH4/BH2/B의 결정
시험은 인간 플라즈마의 테트라하이드로바이오프테린(BH4), 디하이드로바이오프테린(BH2) 및 바이오프테린(B) 농도를 형광 검출(FD)과 전기화학적 검출(ECD)을 하는 역상 고성능액체크로마토그래피(HPLC)를 사용하여 결정하는 방법을 개발하기 위해 수행되었다. 상기 방법은 Cai, et al.(Cardiovascular Research 55:838-849, 2002)에 기초한다.
BH4(20mM HCl의), BH2 및 B(DMSO의)의 스톡 용액(stock solution)이 최종 농도 10mM로 만들어져 -80℃에서 보관되었다. 검정 표준 작업 용액은 0.1%(w/v) 1,4-디티오에리스리톨(DTE)로 조절된 K2 EDTA 인간 플라즈마에서 100, 10, 7.5, 5, 2.5, 및 1nM의 스톡 용액으로부터 제조되었다. BH4, BH2 및 B의 품질 관리 작업 용액은 0.1%(w/v) DTE로 조절된 K2 EDTA 인간 플라즈마의 5, 8, 25 및 50nM에서 제조되었고 -80℃에서 보관되었다.
샘플 처리를 위해, 플라즈마는 재현탁 버퍼에서 1:10으로 희석되었다. 180μl의 희석된 플라즈마로 하기 위해, 20μl의 10X 침전 버퍼가 부가되었다. 플라즈마 희석 및 침전의 본 처리는 모든 플라즈마 표준, 플라즈마 샘플 및 플라즈마 QCs에 적용되었다. 10X 침전 버퍼를 부가한 후에, 상기 샘플은 비-특정 플라즈마 잔재를제거하기 위해 4℃에서 5분 동안 최대 속도로 원심분리 되었다. 150mL 상청액이 이후 샘플 바이알로 옮겨졌고 다음으로 100mL 주입용 오토 샘플러에 놓여졌다.
이동상(2L)이 13.6g 소듐아세테이트(50mM), 2.1g 시트르산(5mM) 36mg EDTA(48mM), 49.4mg DTE(160mM), 및 물 부피당 2% 메탄올로 제조되었다. pH는 5.22로 조절되었다. 재현탁 버퍼(20mL)가 20mL의 PBS pH 7.4(50mM), 20uL의 1M DTE(1mM), 및 100mL의 100uM EDTA로 제조되었다. 상기 10X 침전 버퍼(25mL)는 2.88mL 인산(1M), 9.39g 트리클로로아세트산(2M) 및 20mL 1M DTE(1mM)로 갓 만들어졌다.
테트라하이드로바이오프테린(BH4), 디하이드로바이오프테린(BH2), 및 바이오프테린(B)는 역상 HPLC 분리를 사용하여 분리되었다. BH4는 전기화학적 검출을 사용하여 측정되었고, 여기서 BH4는 전극 1에 의해 퀴노노이드 디하이드로바이오프테린(qBH2)으로 산화되었으며, 이후 전극 2에서 BH4로 다시 환원되었다. 이후 상기 검출기는 본 환원 반응에서 생성된 전류를 사용하여 BH4의 농도를 결정한다. BH2와 B는 형광 검출을 사용하여 동일한 주입에서 측정될 수 있다. 최적 전위에서 컨디셔닝 가드 세포를 사용한 BH2의 후 컬럼 산화는 BH2를 바이오프테린으로 산화한다.
HPLC 분리는 ACE C-18(250mm × 4.6mm) 컬럼, 5μM, 13분의 가동 시간을 가지고 1.3mL/분의 유동 속도에서 수행되었다. 전기화학적 검출 세팅은 E1 : +100mV(배경 전류 +500nA 내지 +600nA) 및 E2 : -300mV(배경 전류 -50nA 내지 -60nA)이었다. 후-컬럼 산화는 900mV에 세팅되었다. 형광 검출 세팅은 여기(excitation) 파장 : 350nM 및 방출 파장 : 450nM이었다.
상기 방법의 선형성 및 범위는 플라즈마 및 버퍼의 표준 정밀도 및 정확도에 기초하여 평가되었다. 표준 곡선 농도는 각 분석물 당 최소 4-6 제로 이외의 농도를 사용하여 이루어졌다. 상기 표준의 농도는 1, 2.5, 5, 7.5, 10, 및 100nM이었다. 상기 결과는 BH4, BH2, 및 B의 선형 회귀가 1 내지 100nM이며 R2 > 0.99라는 것을 보여주었다.
정확도는 분석물의 알려진 양(2, 8, 25, 및 50nM)을 포함하는 품질 관리 샘플의 반복된 분석에 의해 결정되었고 퍼센트 정확도로 표현되었다. 정밀도는 품질 관리의 데이터에 기초하여 또한 계산되었다. 인트라-분석 정밀도 및 인터-분석 정밀도는 CV%에 기초하여 평가되었다. 세 개의 분리 실험 과정의 각 분석물 농도는 플라즈마에서 제조되었고 분석되었다. 이에 부가하여 10nM의 BH4, BH2, 및 B가 정확도 및 회복을 결정하기 위하여 인간 플라즈마 샘플에 "첨가"되었다. 8, 25, 및 50nM에서 BH4, BH2, 및 B의 측정이 112%-89% 이내의 정확도를 증명했고, 2.5%-20%의 정밀도(CV%)를 나타냈다. 인간 플라즈마의 임상 샘플 중 10nM BH4, BH2, 및 B를 사용한 첨가 회복 실험은 70%-130% 사이의 회복을 나타냈다. 상기 결과는 상기 방법이 2nM 이상의 농도를 가진 샘플에서 정확하고 정밀하다는 것을 나타낸다.
6개의 다른 플라즈마 군(lot)에서 내인적 방해의 존재를 검사하기 위해, 10nM BH4, BH2, 및 B가 6개의 다른 군에 첨가되었고 상기 결정 정확도 및 정밀도가 각 플라즈마 샘플에 대해 결정되었다. 선택적 실험은 6개 각각 정량 한계 아래 내지 2.48nM 사이의 내인성 베이스라인(baseline) BH4 농도를 가졌다는 것을 보인다. 유사하게, BH2 및 B의 농도는 0.02 내지 10nM의 범위였다. 10nM 첨가된 분석물의 회복은 69%-87% 범위였다. 10nM에서 첨가되었을 때 각 플라즈마 샘플 및 분석물의 교차 변동(CV%)은 23%-37%의 범위였다. BH4, BH2 및 B의 내인성 농도의 변동은 0-9.96nM의 범위였다. 또한, 상기 결과는 추출 동안 매트릭스 방해 또는 손실을 나타내는 경향을 지적하나, 각각 사이의 강한 선택성을 지적하지는 않는다.
플라즈마 또는 버퍼에서 제조된 매트릭스 효과 표준 곡선을 측정하기 위해 정확도(회복), 선형성 및 상관 관계가 비교되었다. 플라즈마에서 제조된 표준 대 버퍼에서 제조된 표준의 비교는 적당한 매트릭스 효과 및 일반적으로 우수한 상관 관계를 나타낸다. 3개 분석물 모두 플라즈마 및 버퍼에 대한 매우 뛰어난 성형 회귀를 가졌다. BH4와 B는 농도 범위에 걸쳐 중요한 매트릭스 효과를 나타내지 않았다. 그러나, BH2는 가장 높은 표준 농도(100nM)에서 덜 회복되었다. 버퍼 및 플라즈마에서 제조된 품질 관리 샘플은 우수한 정확도를 나타냈다. 전체적으로, 매트릭스 효과는 최소한으로 나타났으며, 플라즈마에서와 비교할 때 버퍼에서 덜 회복되는 경향을 가졌다. BH4와 BH2가 쉽게 산화되기 때문에, 채취된 플라즈마와 샘플 버퍼는 항산화제를 포함해야만 했고, 가능한 경우 낮은 pH를 가져야 했다.
250nM의 BH4, BH2 및 B가 첨가된 플라즈마 및 버퍼 샘플을 정확하게 희석하는 능력을 테스트하기 위해, 플라즈마는 연속 3-배 희석으로 블랭크 플라즈마(blank plasma)를 사용하여 희석되었다. 상기 희석된 샘플은 분석되었고 희석 계수를 적용한 후에 명목값과 비교되었다. 고농도 BH4, BH2, 및 B의 희석이 정확하게 만들어질 수 있다. 희석 후 BH4의 관찰된 농도는 83.33nM와 3.07nM 사이의 농도에서 83%-104% 사이의 정확도였다. BH2는 정량 범위(83nM-3nM)에 걸쳐서 74%-80% 정확도였다. B는 정량 범위(83nM-3nM)에 걸쳐서 119%-113%였다. 그러므로, 정량 한계를 넘는 샘플은 정확하게 희석될 수 있다.
4개 농도의 분석물(2, 8, 25 및 50nM)이 플라즈마에서 제조되었고 24시간 이상의 사이클 1번 및 각 12시간 이상의 다른 사이클 3번 이상으로 냉동되었다. 샘플은 냉동 기간 사이에 실온에서 도움 없이 해동되었다. 각각 및 모든 냉동-해동 사이클 후 정확도 및 변동성은 샘플이 겪을 수 있었던 최대 숫자의 사이클을 정립하기 위해 평가되었다. BH4-, BH2, 및 B-포함 샘플은 측정의 정확도 또는 정밀도에서 유의미한 변화 없이 3번 이하의 냉동-해동 사이클을 겪을 수 있다. 8nM-50nM BH4를 가진 플라즈마 샘플은 121%-91% 정확도 및 10% 미만의 CV%를 가진다. 유사하게 BH2 측정은 분석의 정량 범위에 걸쳐 77%-88% 정확도를 가졌다. B 측정은 정량 범위에 걸쳐 98%-99% 정확도를 가졌고 5%-8% 정밀도(CV%)를 가졌다. 2nM의 BH4, BH2, 및 B 샘플은 반복된 냉동-해동 후 정확도 또는 정밀도가 증명되지 않았었다. 그러므로, 표준, 품질 관리 및 시험 샘플은 3번 이하로 냉동되고 해동될 수 있다.
상기 분석물이 산화에 민감하기 때문에, 예상 보관 상태를 가상하기 위해 장-기간 냉동 능력을 시험했다. 4개의 농도 값(2, 8, 50, 및 100nM)의 BH4, BH2, 및 B가 플라즈마에서 제조되었고 8주 동안 -70℃에서 보관되었다. 안정성 샘플은 만든 즉시 그리고 3, 5, 6, 및 8주에 분석되었다. BH4 및 B는 우수한 장기간 냉동 안정성을 가졌다. BH2는 연장된 보관 후 감소된 샘플 농도를 나타냈다. 8주 이상의 보관 동안 BH4를 포함한 플라즈마 샘플은 93%-94% 정확도 및 31%-0.21% CV%를 가졌고, 2nM 농도에서 가장 변동을 보였다. BH2 측정은 테스트된 농도에 걸쳐 63%-85% 정확도를 가졌고 2nM 및 100nM 농도에서 감소된 정확도를 가졌다. 정밀도(CV%)는 이 샘플들에 있어 37% 내지 18% 범위였다. B 측정은 테스트된 농도에 걸쳐 88%-101% 정확도를 가졌고, 23%-0.14%의 정밀도(CV%)를 가졌으며, 2nM 농도에서 가장 높은 변동성을 가졌다. 또한, 본 데이터는 분석물 농도의 감지 가능한 손실 없이 8주까지 샘플을 보관한다는 권장 사항을 뒷받침한다. BH2는 가장 분해(산화)되기 용이한 것으로 여겨진다.
오토 샘플러에서 BH4, BH2, 및 B의 안정성을 측정하기 위해, 재구성 용매에서 각 분석물 중 8nM가 0.25, 4, 및 11시간 동안 오토 샘플러에 머물렀다. 상기 측정의 정확도 및 정밀도가 비교되었다. 관찰된 BH4 측정은 각 시간 점에서 이론상 5% 이내의 정확도를 가졌고 3개 모두의 측정에 걸쳐 정확도 및 정밀도는 각각 102% 및 0.054%였다. BH2의 측정은 4시간 후 감소한 정확도 및 증가한 변동성을 가졌다. 11시간 후 오토 샘플러 상 약 50%의 BH2가 측정되었다. 이는 가동 버퍼(run buffer)에서 열악한 오토샘플러 안정성을 지적한다. B의 측정은 11시간 후 여전히 이론상 125% 이내의 정확도였다. 그러므로, 4시간을 넘지 않는 가동 시간이 추천된다.
주입 연기를 결정하기 위해, 추출된 베이스라인 플라즈마 샘플이 가장 높은 표준 농도 100nM 후에 삽입되었다. 이는 연기로 인해 저농도 샘플에서 분석물의 농도를 과대 평가할 가능성을 가상하여 행해졌다. BH4, BH2, 및 B의 주입 연기는 최소화하였고 정량 한계 이상에서 100nM 피크 면적 1% 이상에 대해서는 평가하지 않는다. 약 5%-20%의 최저 정량 한계를 가지는 주입 연기 평가는 낮은 품질 관리(2nM)로부터 얻은 평균 피크 면적에 기초했다. 그러므로, 바람직하게 상기 샘플은 가장 낮은 것에서부터 높은 것까지 정렬될 것이며(즉, 전 투약 먼저, 이후 후 투약 샘플) 가동 동안 바람직하게 주기적으로 컬럼을 깨끗이 하기 위한 추가적인 세척이 이루어져 잠재적인 지연을 최소화할 것이다.
확고하고, 구체적이며, 정확하고 정밀한 정량된 방법이 개발되었다. 본 방법은 약물 동태 및 약물 시험에서 플라즈마의 BH4, BH2 및 B의 농도를 정량하기에 적절하다.
본 명세서에서 인용된 모든 특허, 간행물 및 참조는 참조로서 본 명세서에 전체적으로 채용된다. 본 개시와 채용된 특허, 간행물 및 참조 간 불일치가 있는 경우, 본 개시가 제어할 것이다.

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  1. 인간에 대한 치료방법.
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Families Citing this family (56)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1708690B1 (en) 2003-11-17 2016-07-20 BioMarin Pharmaceutical Inc. Treatment of phenylketonuria with bh4
HUE058030T2 (hu) 2007-04-11 2022-06-28 Biomarin Pharm Inc Tetrahidrobiopterin emelt fenilalanin szintekkel összefüggõ állapotok kezelésében történõ alkalmazásra
TR201910287T4 (tr) * 2008-08-12 2019-07-22 Orpha Swiss Gmbh Tetrahidrobiopterin ihtiva eden farmasötik dozaj şekli.
EP2456432B1 (en) 2009-07-22 2024-02-28 University of Massachusetts Compositions to reduce oxidative stress
US20130197000A1 (en) 2010-04-22 2013-08-01 Nihon University Drug and food/drink for preventing or improving cerebral dysfunction
EP4349369A3 (en) * 2010-12-03 2024-05-15 Nalpropion Pharmaceuticals LLC Increasing drug bioavailability in naltrexone therapy
KR20140021585A (ko) * 2011-03-01 2014-02-20 루비콘 리서치 피브이티. 엘티디. 테트라하이드로바이옵테린의 안정한 조성물
US9549563B2 (en) 2011-10-24 2017-01-24 Kickass Candy Llc Sweet tart energy tablet
US9216178B2 (en) * 2011-11-02 2015-12-22 Biomarin Pharmaceutical Inc. Dry blend formulation of tetrahydrobiopterin
NZ627781A (en) 2012-01-23 2016-10-28 Sage Therapeutics Inc Neuroactive steroid formulations and methods of treating cns disorders
KR102411809B1 (ko) 2012-01-26 2022-06-22 반다 파마슈티칼즈, 인코퍼레이티드. 일주기 리듬 장애의 치료
US11918557B2 (en) 2012-01-26 2024-03-05 Vanda Pharmaceuticals Inc. Treatment of circadian rhythm disorders
CN102650621B (zh) * 2012-05-02 2014-06-25 安徽农业大学 一种从蚕体提取的墨蝶呤的鉴定方法
IL275725B (en) 2012-08-21 2022-08-01 Sage Therapeutics Inc Treatment methods for epilepsy and status epilepticus
JP2016507753A (ja) 2013-02-08 2016-03-10 ユニバーシティー オブ アイオワ リサーチ ファウンデーション 子癇前症発症を予測する診断ツール
US11090285B2 (en) 2013-11-12 2021-08-17 Vanda Pharmaceuticals Inc Treatment of circadian rhythm disorders
US10376487B2 (en) 2013-11-12 2019-08-13 Vanda Pharmaceuticals Inc. Method of treatment
US20150204834A1 (en) * 2014-01-22 2015-07-23 Sarfaraz K. Niazi Thermodynamic equivalence surrogate test (test) for bioequivalence
DK2926805T3 (en) * 2014-03-31 2016-07-25 Vasopharm Gmbh Solid pharmaceutical compositions comprising biopterine derivatives and uses of such compositions
JOP20200195A1 (ar) 2014-09-08 2017-06-16 Sage Therapeutics Inc سترويدات وتركيبات نشطة عصبياً، واستخداماتها
MA41124A (fr) * 2014-12-05 2017-10-10 Sun Pharmaceutical Ind Ltd Compositions en suspension à libération prolongée à rétention gastrique
JP6996713B2 (ja) 2015-10-06 2022-02-04 エイチエルビー・セラピューティクス・カンパニー・リミテッド チモシンベータ４を含む眼科用製剤の製造方法
KR102408399B1 (ko) 2016-03-08 2022-06-13 세이지 테라퓨틱스, 인크. 신경활성 스테로이드, 조성물, 및 그의 용도
MX2019006206A (es) * 2016-11-29 2019-08-14 Censa Pharmaceuticals Inc Polimorfos de sepiapterina y sales de los mismos.
CN110312721A (zh) * 2016-11-29 2019-10-08 显莎制药公司 墨蝶呤的多晶型物
CN108627576A (zh) * 2017-03-17 2018-10-09 武汉宏韧生物医药科技有限公司 一种人血浆中他达拉非的定量分析方法
CA3066361A1 (en) 2017-06-07 2018-12-13 Shifamed Holdings, Llc Intravascular fluid movement devices, systems, and methods of use
CN110996944A (zh) * 2017-07-06 2020-04-10 萃微Tw001公司 依达拉奉在口服治疗氧化应激介导的神经退行性疾病中的用途
CA3079245A1 (en) * 2017-07-13 2019-03-21 Tab Protein, Llc Supplement tablet and packaging
WO2019046849A1 (en) * 2017-09-01 2019-03-07 Censa Pharmaceuticals Inc. PHARMACEUTICAL COMPOSITION COMPRISING SEPAPTERINE AND USES THEREOF
US11511103B2 (en) 2017-11-13 2022-11-29 Shifamed Holdings, Llc Intravascular fluid movement devices, systems, and methods of use
RU2746503C1 (ru) * 2017-11-20 2021-04-14 Медибикон Инк. Способ получения и анализа флуоресцентных соединений в плазме
CN109946412B (zh) * 2017-12-21 2021-10-15 上海产业技术研究院 一种体液蝶呤谱检测试剂盒及其使用
WO2019152875A1 (en) 2018-02-01 2019-08-08 Shifamed Holdings, Llc Intravascular blood pumps and methods of use and manufacture
CN110269099B (zh) * 2018-03-16 2023-01-31 共生地球生物科技有限公司 多重pH缓冲配方与蛋白质消化助剂的组合物及其用途
US20210219569A1 (en) * 2018-03-16 2021-07-22 Eco-Geo Bio-Technology Company Limited Use and composition of buffer formulation with multiple ph values and protein digestion enhancer
LT3801536T (lt) * 2018-05-30 2024-09-25 Ptc Therapeutics Mp, Inc. Sepiapterino vartojimas nevalgius, skirtas panaudoti taikant sepiapterino koncentracijos plazmoje padidinimo būdą
AU2019277372A1 (en) * 2018-05-30 2021-01-21 Ptc Therapeutics Mp, Inc. Pharmaceutically acceptable salts of sepiapterin
JP7547215B2 (ja) * 2018-05-30 2024-09-09 ピーティーシー セラピューティクス エムピー，インコーポレイテッド テトラヒドロビオプテリン血漿曝露を増加させるための組成物及び方法
CN108813410B (zh) * 2018-07-06 2021-12-14 浙江工商大学 一种降低发酵香肠中生物胺的方法及其应用
JP7553906B2 (ja) * 2018-11-01 2024-09-19 宏 一瀬 Ｓｐｒをコードするポリヌクレオチドを含む組換えベクター、及びそれを含む組成物
CN110174363A (zh) * 2019-01-09 2019-08-27 北京九强生物技术股份有限公司 6-磷酸葡萄糖脱氢酶突变体及其在制备检测试剂中的用途
US20200276200A1 (en) * 2019-02-28 2020-09-03 Clark Gerald Sullivan Treatment of cns and developmental disorders using high-dose 5-formyl-(6s)-tetrahydrofolate
JP2022540616A (ja) 2019-07-12 2022-09-16 シファメド・ホールディングス・エルエルシー 血管内血液ポンプならびに製造および使用の方法
EP3999013A4 (en) * 2019-07-15 2023-07-26 R.P. Scherer Technologies, LLC SOFT GEL CAPSULE WITH ENTERIC PROTON PUMP INHIBITOR
WO2021016372A1 (en) 2019-07-22 2021-01-28 Shifamed Holdings, Llc Intravascular blood pumps with struts and methods of use and manufacture
TR201914416A1 (tr) 2019-09-23 2021-04-21 Sanovel Ilac Sanayi Ve Ticaret Anonim Sirketi Sapropteri̇n di̇hi̇droklorürün efervesan formülasyonlari
WO2021062270A1 (en) 2019-09-25 2021-04-01 Shifamed Holdings, Llc Catheter blood pumps and collapsible pump housings
WO2021062265A1 (en) 2019-09-25 2021-04-01 Shifamed Holdings, Llc Intravascular blood pump systems and methods of use and control thereof
CN111505179B (zh) * 2020-04-07 2021-07-13 厦门大学 海洋水体中生物蝶呤的检测方法
CN112057423A (zh) * 2020-10-21 2020-12-11 兆科药业（广州）有限公司 一种含有盐酸沙丙蝶呤的颗粒剂药物及其制备方法
CN112697919B (zh) * 2020-12-22 2023-02-28 北京和合医学诊断技术股份有限公司 度洛西汀的检测方法
WO2022204517A1 (en) * 2021-03-26 2022-09-29 Emory University Managing the acute and long-term effects of coronaviral infections and compositions related thereto
CN113607870B (zh) * 2021-07-22 2024-06-21 中国食品药品检定研究院 一种头孢羟氨苄原料药及其制剂中聚合物杂质的检测方法
CN114814036B (zh) * 2022-05-09 2024-02-20 上海谱锐赛思生物技术有限公司 血浆中阿齐沙坦和氨氯地平浓度的测定方法
WO2024084421A1 (en) * 2022-10-18 2024-04-25 Qrgenetics Ltd. Treatment of vascular diseases associated with genetic variations in acta2

Family Cites Families (56)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6019A (en) * 1849-01-09 Cast-iron car-wheel
US6021A (en) * 1849-01-09 Cast-iron cab-wheel
US2601215A (en) 1948-03-17 1952-06-17 American Cyanamid Co Process of preparing dihydropterins
US3505329A (en) 1968-02-06 1970-04-07 Smithkline Corp Process for the synthesis of biopterin
JPS5883691A (ja) 1981-11-13 1983-05-19 Kanegafuchi Chem Ind Co Ltd １′，２′−ジアシル−（６ｒ，ｓ）−５，６，７，８−テトラヒドロ−ｌ−ビオプテリンおよびその製法
JPS5925323A (ja) 1982-03-03 1984-02-09 鐘淵化学工業株式会社 プテリン誘導体からなる脳内神経伝達物質の関わる疾病の治療剤
JPS5921685A (ja) 1982-07-28 1984-02-03 Suntory Ltd Ｌ―エリスロ―バイオプテリンの製造法
ZA836957B (en) 1982-09-20 1985-04-24 Wellcome Found Neurologically active chemical compounds
GB8318833D0 (en) 1983-07-12 1983-08-10 Wellcome Found Chemical compounds
US5196533A (en) 1983-04-11 1993-03-23 South Alabama Medical Science Foundation, Usa Cyclization of 5 amino-pyrimidines to quinoid 6,6 disubstituted dihydropteridines
US4587340A (en) 1983-09-19 1986-05-06 Burroughs Wellcome Co. Biopterin analogs
JPS60178887A (ja) 1984-02-23 1985-09-12 Kanegafuchi Chem Ind Co Ltd ５，６，７，８−テトラヒドロ−ｌ−ビオプテリンの製造法
JPS60199889A (ja) 1984-03-24 1985-10-09 Kanegafuchi Chem Ind Co Ltd ５，６，７，８−テトラヒドロ−ｌ−エリスロ−ビオプテリンの硫酸塩およびその製法
US4550109A (en) * 1984-05-31 1985-10-29 The Board Of Regents, The University Of Texas System Lipoidal biopterin compounds
DE3437944A1 (de) 1984-10-17 1986-07-31 Biotest-Serum-Institut Gmbh, 6000 Frankfurt Verwendung von pterinen zur steigerung der aktivitaet von lymphokinen und anderen blutfaktoren, sowie ein diagnostisches oder therapeutisches praeparat, das pterine in kombination mit lymphokinen enthaelt
US4713454A (en) 1985-01-28 1987-12-15 Shiratori Pharmaceutical Co., Ltd. Preparation process of (6R)-tetrahydro-L-biopterin
JPS61277618A (ja) 1985-06-04 1986-12-08 Suntory Ltd 自閉症治療剤
JPS621688A (ja) * 1985-06-28 1987-01-07 Nippon Kokan Kk <Nkk> ばら積船
ATE81779T1 (de) * 1985-08-22 1992-11-15 Gropep Pty Ltd Peptidanalogedes insulinaehnlichen wachstumsfaktors-1 bei saeugetieren.
DE3853711T2 (de) 1987-11-30 1996-01-11 Vitamin Kenkyusho Kk Zwischenverbindungen für die Synthese von 5,6,7,8-Tetrahydro-L-erythro-biopterin und seiner Derivate.
JP3137333B2 (ja) 1990-07-21 2001-02-19 サントリー株式会社 テトラヒドロビオプテリンの製法およびそれに用いる酵素
JP2534423B2 (ja) 1991-12-26 1996-09-18 コーネル・リサーチ・ファンデーション・インコーポレイテッド 酸化窒素の過剰生産から生じる血管失調を阻止する阻害剤
US5198547A (en) 1992-03-16 1993-03-30 South Alabama Medical Science Foundation, Usa Process for N5-formylating tetrahydropteridines
DE4308739C1 (de) 1993-03-19 1994-06-23 Henning Berlin Gmbh Pterinderivate, ihre Herstellung und ihre Verwendung
US5945452A (en) 1993-06-11 1999-08-31 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Treatment of vascular degenerative diseases by modulation of endogenous nitric oxide production or activity
US5502050A (en) 1993-11-29 1996-03-26 Cornell Research Foundation, Inc. Blocking utilization of tetrahydrobiopterin to block induction of nitric oxide synthesis
ES2177654T3 (es) 1994-08-05 2002-12-16 Suntory Ltd Remedio contra la degeneracion espinocerebelosa.
JP2711828B2 (ja) 1996-06-25 1998-02-10 白鳥製薬株式会社 （６ｒ）−テトラヒドローｌ−バイオプテリン塩酸塩の製造法
US20020076782A1 (en) 1996-07-05 2002-06-20 John P.N. Rosazza Purified nitric oxide synthase
GB9617990D0 (en) 1996-08-29 1996-10-09 Scotia Holdings Plc Treatment of pain
CH693255A5 (de) 1997-06-13 2003-05-15 Eprova Ag Verwendung von Tetrahydrofolaten in der natürlichenstereoisomeren Form zur Herstellung einer pharmazeutischenZubereitung geeignet zur Beeinflussung des Homocystein-Spiegels.
US5922713A (en) 1997-06-26 1999-07-13 Werner; Ernst Inhibition of nitric oxide synthase
US6723560B2 (en) * 1998-10-08 2004-04-20 Mayo Foundation For Medical Education And Research Using polyamide nucleic acid oligomers to engender a biological response
JP4306825B2 (ja) 1998-02-27 2009-08-05 アスビオファーマ株式会社 インスリン抵抗性が関与する血管機能異常を伴う疾患の予防または治療剤
JP4486167B2 (ja) 1998-02-27 2010-06-23 アスビオファーマ株式会社 薬剤性腎障害の予防または治療剤
US6200758B1 (en) 1999-02-19 2001-03-13 New York State Office Of Mental Health Phenylalanine hydroxylase gene variants, and amino acid and pterin homeostasis, in the definition, detection, treatment and prevention of psychotic, mood and personality disorders
AU4013900A (en) 1999-03-19 2000-10-09 Enos Pharmaceuticals, Inc. Increasing cerebral bioavailability of drugs
GB2355191A (en) 1999-10-12 2001-04-18 Laxdale Ltd Combination formulations for fatigue, head injury and strokes
US6544994B2 (en) 2000-06-07 2003-04-08 Eprov Ag Pharmaceutical preparation for treating or preventing cardiovascular or neurological disorders by modulating of the activity of nitric oxide synthase
KR100916163B1 (ko) * 2000-08-31 2009-09-08 아스비오파마 가부시키가이샤 비오프테린류의 제조방법
RU2180233C1 (ru) * 2001-06-26 2002-03-10 Общество с ограниченной ответственностью "Протеиновый контур" Способ получения жидких лекарственных форм рекомбинантных белков
US20040058962A1 (en) * 2002-06-14 2004-03-25 Amedeo Leonardi Phenylalkylamines and pyridylalkylamines
DE10260263A1 (de) * 2002-12-20 2004-07-15 Biocrates Life Sciences Gmbh Verwendung von Tetrahydrobiopterinderivaten zur Behandlung und Ernährung von Patienten mit Aminosäurestoffwechselstörungen
WO2005021046A1 (en) * 2003-09-01 2005-03-10 Fh Faulding & Co Ltd Compositions and methods for delivery of biologically active agents
EP1708690B1 (en) 2003-11-17 2016-07-20 BioMarin Pharmaceutical Inc. Treatment of phenylketonuria with bh4
CA2678124C (en) 2003-11-17 2014-10-07 Merck Eprova Ag Crystalline forms of (6r)-l-erythro-tetrahydrobiopterin dihydrochloride
US7732599B2 (en) 2003-11-17 2010-06-08 Biomarin Pharmaceutical Inc. Process for preparing tetrahydrobiopterin and analogs of tetrahydrobiopterin
AU2005239939C1 (en) 2004-05-11 2011-06-30 Daiichi Sankyo Company Limited BH4-responsive hyperphenylalaninemia remedies
CA2601716C (en) 2004-06-25 2011-05-31 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods and compositions for the treatment of attention deficit hyperactivity disorder and hyperphenylalanemia
CA2580679A1 (en) 2004-09-17 2006-03-30 Biomarin Pharmaceutical Inc. Variants and chemically-modified variants of phenylalanine ammonia-lyase
CN101132776A (zh) 2004-11-17 2008-02-27 生物马林药物股份有限公司 稳定的四氢生物喋呤片剂制剂
US20060194808A1 (en) * 2005-01-14 2006-08-31 Chronorx Llc, An Alaska Limited Liability Company Clinical applications of tetrahydrobiopterin, lipoic acid and their salts and methods of preparing tetrahydrobiopterin bis-lipoate
EP1964566A4 (en) 2005-12-22 2009-01-07 Asubio Pharma Co Ltd PREPARATION HAVING IMPROVED BIOABSORPTION CAPACITY OF SAPROPTERIN CHLORHYDRATE
US20080075666A1 (en) 2006-08-25 2008-03-27 Dudley Samuel C Jr Methods and compositions for treating diastolic dysfunction
ES2732293T3 (es) 2007-02-22 2019-11-21 Childrens Hospital & Res Center At Oakland Formulaciones de ácidos grasos y métodos para el uso de las mismas
HUE058030T2 (hu) 2007-04-11 2022-06-28 Biomarin Pharm Inc Tetrahidrobiopterin emelt fenilalanin szintekkel összefüggõ állapotok kezelésében történõ alkalmazásra

Also Published As

Publication number Publication date
US20130237543A1 (en) 2013-09-12
JP2013163691A (ja) 2013-08-22
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LT3461503T (lt) 2022-03-10
EP2139485B1 (en) 2012-10-17
US20170000793A1 (en) 2017-01-05
US20090076014A1 (en) 2009-03-19
CA2682598A1 (en) 2008-10-23
EP3461503B9 (en) 2022-05-11
PT2139485E (pt) 2013-01-16
EP2139485A2 (en) 2010-01-06
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HRP20210239T1 (hr) 2021-04-02
JP2010523708A (ja) 2010-07-15
HRP20121072T1 (hr) 2013-01-31
AU2008240259B2 (en) 2013-07-11
AU2008240259A1 (en) 2008-10-23
US7947681B2 (en) 2011-05-24
PL2545939T3 (pl) 2021-05-17
DK3461503T3 (da) 2022-02-14
US7612073B2 (en) 2009-11-03
IL201101A (en) 2016-04-21
MX2009010977A (es) 2010-02-12
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HUE053107T2 (hu) 2021-06-28
PL2139485T3 (pl) 2013-03-29
US20110281880A1 (en) 2011-11-17
ES2397746T3 (es) 2013-03-11
EP3461503B1 (en) 2022-02-09
CY1113543T1 (el) 2016-06-22
KR101721198B1 (ko) 2017-03-29
SI2545939T1 (sl) 2021-04-30
AU2008240259C1 (en) 2022-11-24
BRPI0809470A2 (pt) 2014-09-09
KR20150080026A (ko) 2015-07-08
CY1124976T1 (el) 2022-11-25
KR20160065998A (ko) 2016-06-09
SI3461503T1 (sl) 2022-04-29
HK1139864A1 (en) 2010-09-30
DE22154751T1 (de) 2022-09-08
ES2906582T3 (es) 2022-04-19
PT3461503T (pt) 2022-02-17
KR20160064248A (ko) 2016-06-07
CA2682598C (en) 2016-06-07

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